(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAを含む試料が採取されたウシ動物における、該動物の筋過形成の存在を判定するための診断用キットであって、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAの一部における変異の、それぞれ上流および下流のDNAのヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーである、DNA増幅のための第1および第2のプライマーを含み、該変異が該動物に筋過形成をもたらす変異であって、かつ
(a)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失；
(b)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド419位から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入；
(c)  配列番号：2のアミノ酸204位のグルタミン（Q）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド610位におけるCからTへの置換；
(d)  配列番号：2のアミノ酸226位のグルタミン酸（E）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド676位におけるGからTへの置換；
(e)  (a)〜(d)の変異の組み合わせ；ならびに
(f)  配列番号：2のアミノ酸313位のシステイン（C）残基をチロシン（Y）残基へと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換と、(a)〜(d)の変異との組み合わせ
からなる群から選択されるものである、キット。
【請求項２】
請求項１の(a)〜(f)のいずれか１つの変異に対して相補的な第3のプライマーをさらに含む、請求項1記載の診断用キット。
【請求項３】
1対のプライマーのうち第2のプライマーの全体が、請求項１の(a)〜(f)からなる群から選択された1つまたは複数の変異の上流または下流に位置する、請求項１記載の診断用キット。
【請求項４】
第３のプライマーをさらに含む、請求項３記載の診断用キットであって、第1のプライマーが変異(a)の配列番号：11として特定される欠失したヌクレオチド配列を含まず、該第３のプライマーが配列番号：11として特定されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、診断用キット。
【請求項５】
第３のプライマーをさらに含む、請求項３記載の診断用キットであって、第1のプライマーが変異(b)の挿入配列に対して相補的である配列を含み、該第３のプライマーが変異(b)の7ヌクレオチド欠失に対応する配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、診断用キット。
【請求項６】
第３のプライマーをさらに含む、請求項３記載の診断用キットであって、第1のプライマーが変異(c)の置換されたヌクレオチドを含み、該第３のプライマーが該置換を欠く対応領域を含む配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、診断用キット。
【請求項７】
第３のプライマーをさらに含む、請求項３記載の診断用キットであって、第1のプライマーが変異(d)の置換されたヌクレオチドを含み、該第３のプライマーが該置換を欠く対応領域を含む配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、診断用キット。
【請求項８】
第３のプライマーをさらに含む、請求項３記載の診断用キットであって、第1のプライマーが変異(f)の配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換を含み、該第３のプライマーが該置換を欠く対応領域を含む配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、診断用キット。
【請求項９】
ウシ動物における筋過形成の存在を判定するための方法であって、
該動物からのDNAを含む材料の試料の採取、ならびに
DNAの一部における変異の、それぞれ上流および下流のヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーである第1および第2のプライマーの存在下で該動物からのDNAを増幅することによる、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAが試料中に存在するか否かの確認
を含み、
該変異が該動物の双方の対立遺伝子に存在する場合に該筋過形成をもたらす変異であって、かつ
(a)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失；
(b)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド419位から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入；
(c)  配列番号：2のアミノ酸204位のグルタミン（Q）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド610位におけるCからTへの置換；
(d)  配列番号：2のアミノ酸226位のグルタミン酸（E）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド676位におけるGからTへの置換；
(e)  (a)〜(d)の変異の組み合わせ；ならびに
(f)  配列番号：2のアミノ酸313位のシステイン（C）残基をチロシン（Y）残基へと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換と、(a)〜(d)の変異との組み合わせ
からなる群から選択されるものであり、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む該DNAが存在せずに該変異が存在することにより、該動物における筋過形成の存在が示される、方法。
【請求項１０】
ウシ動物における筋過形成の存在を判定するための方法であって、
該動物からのDNAを含む材料の試料の採取、ならびに
該動物の双方の対立遺伝子に存在する場合に該筋過形成をもたらす変異の少なくとも一部を含むプライマーの存在下で該動物からのDNAを増幅することによる、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAが試料中に存在するか否かの確認
を含み、
該変異が
(a)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失；
(b)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド419位から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入；
(c)  配列番号：2のアミノ酸204位のグルタミン（Q）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド610位におけるCからTへの置換；
(d)  配列番号：2のアミノ酸226位のグルタミン酸（E）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド676位におけるGからTへの置換；
(e)  (a)〜(d)の変異の組み合わせ；ならびに
(f)  配列番号：2のアミノ酸313位のシステイン（C）残基をチロシン（Y）残基へと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換と、(a)〜(d)の変異との組み合わせ
からなる群から選択されるものであり、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む該DNAが存在せずに該変異が存在することにより、該動物における筋過形成の存在が示される、方法。
【請求項１１】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAが存在するか否かの確認に、該配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列に基づくプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
筋過形成を呈していないウシ動物のDNAが、配列番号：1として特定される配列からなるヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAが存在するか否かの確認に、配列番号：１の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAが存在するか否かの確認に、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれぞれN末端およびC末端をコードするヌクレオチド配列に基づくプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１５】
ウシ動物における筋過形成の存在を判定するための方法であって、
該動物からのmRNAを含む材料の試料の採取、ならびに
mRNAの一部における変異の、それぞれ上流および下流のヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーである第1および第2のプライマーの存在下で該動物からのmRNAを増幅することによる、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むmRNAが試料中に存在するか否かの確認
を含み、
該変異が、該動物の双方の対立遺伝子に存在する場合に該筋過形成をもたらすものであり、かつ
(a)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失；
(b)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド419位から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入；
(c)  配列番号：2のアミノ酸204位のグルタミン（Q）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド610位におけるCからTへの置換；
(d)  配列番号：2のアミノ酸226位のグルタミン酸（E）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド676位におけるGからTへの置換；
(e)  (a)〜(d)の変異の組み合わせ；ならびに
(f)  配列番号：2のアミノ酸313位のシステイン（C）残基をチロシン（Y）残基へと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換と、(a)〜(d)の変異との組み合わせ
からなる群から選択されるものであり、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAが存在せずに該変異が存在することにより、該動物における筋過形成の存在が示される、方法。
【請求項１６】
ウシ動物における筋過形成の存在を判定するための方法であって、
該動物からのmRNAを含む材料の試料の採取、ならびに
該動物の双方の対立遺伝子に存在する場合に該筋過形成をもたらす変異の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含むプライマーの存在下で該動物からのmRNAを増幅することによる、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むmRNAが試料中に存在するか否かの確認
を含み、
該変異が
(a)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失；
(b)  配列番号：1のコード部分のヌクレオチド419位から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入；
(c)  配列番号：2のアミノ酸204位のグルタミン（Q）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド610位におけるCからTへの置換；
(d)  配列番号：2のアミノ酸226位のグルタミン酸（E）残基を終結コドンへと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド676位におけるGからTへの置換；
(e)  (a)〜(d)の変異の組み合わせ；ならびに
(f)  配列番号：2のアミノ酸313位のシステイン（C）残基をチロシン（Y）残基へと変化させる、配列番号：1のコード部分のヌクレオチド938位におけるGからAへの置換と、(a)〜(d)の変異との組み合わせ
からなる群から選択されるものであり、
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAが存在せずに該変異が存在することにより、該動物における筋過形成の存在が示される、方法。
【請求項１７】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むmRNAが存在するか否かの確認に、該蛋白質をコードするヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーの存在下でのmRNAの増幅が含まれる、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
筋過形成を呈していないウシ動物のmRNAが、配列番号：1として特定される配列からなるヌクレオチド配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むmRNAが存在するか否かの確認に、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれぞれN末端およびC末端をコードするヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーの存在下でのmRNAの増幅が含まれる、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項２０】
変異が配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失であり、筋過形成を呈していない動物のDNAが配列番号：2として特定される配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ第1のプライマーが配列番号：２の第274位のグルタミン酸をコードするコドンの上流に位置するように選択され、第2のプライマーが配列番号：２の第273位のアスパラギン酸をコードするコドンの下流に位置するように選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
変異が配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失であり、筋過形成を呈していない動物のDNAが、配列番号：2として特定される配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつプライマーが該欠失を含むDNA配列の塩基対第817位および第818位を含むヌクレオチド配列にまたがるよう選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
変異が配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失であり、筋過形成を呈していない動物のmRNAが配列番号：2として特定される配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ第1のプライマーが配列番号：２の第274位のグルタミン酸をコードするコドンの上流に位置するように選択され、第2のプライマーが配列番号：２の第273位のアスパラギン酸をコードするコドンの下流に位置するように選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
該変異が配列番号：1のコード部分のヌクレオチド818位から始まる11ヌクレオチドの欠失であり、筋過形成を呈していない該動物のmRNAが配列番号：2として特定される配列からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつプライマーが該欠失を含むDNA配列の塩基対第817位および第818位を含むヌクレオチド配列にまたがるように選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
試料が筋組織である、請求項９〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
筋組織が骨格筋組織である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
動物がベルジアンブルー、アストゥリアーナ、パルテネーズおよびルビア・ガレガから選択される種のものである、請求項９〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
動物がベルジアンブルーおよびアストゥリアーナから選択される種のものである、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物、特に家畜における筋発達に影響を及ぼす因子に関する。特に、本発明は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーの一つであるミオスタチン遺伝子のクローニング、家畜の筋過形成（muscular hyperplasia）におけるその関与、およびミオスタチン遺伝子型の判定のための方法に関する。
【０００２】
関連技術の説明
TGF-βスーパーファミリーは、多くの種類の哺乳動物細胞における広範な分化過程を制御する多機能性ポリペプチドの一群からなる。GDF-8はTGF-βスーパーファミリーのメンバーの一つである。このスーパーファミリーに属するメンバーはすべて、分泌のための短いペプチドシグナル、および高度に保存された蛋白質分解部位での蛋白質分解によって生理活性をもつカルボキシ末端断片から分離されるN末端ペプチド断片を含む、共通の構造を有する。生理活性をもつカルボキシ末端ドメインは、分子内および分子間ジスルフィド結合に関与する高度に保存された位置にあるシステイン残基を特徴とする。機能性分子は、カルボキシ末端ドメインが共有結合（S-S結合を介して）した二量体である（Mastersonら、1996）。
【０００３】
最近、GDF-8をコードする遺伝子に欠損のあるマウスには全身性筋過形成という特徴があることが報告された（McPherronら、1997）。GDF-8欠損マウスは、「遺伝子ノックアウト」と呼ばれる方法である、胚性幹細胞における相同組換えを用いた遺伝子ターゲティングによって作出された。このマウスの全身性筋過形成は、その発現の点で「ダブルマスル（double-muscled）」ウシの特徴である筋過形成と極めて類似しているように思われた。この観察結果は、GDF-8をコードするウシ遺伝子（すなわち、マウスGDF-8遺伝子のウシでの進化的相同体）がウシのダブルマスル表現型に関与するという興味深い可能性を提示した。また、このことは、GDF-8をコードするヒト遺伝子（すなわち、マウスGDF-8遺伝子のヒトでの進化的相同体）がヒトでの筋発達の調節、特に骨格筋の形成に関与するという可能性をも提示した。ヒトGDF-8遺伝子の単離には、GDF-8の発現の増強または抑制を介した、筋変性疾患の治療における治療的用途／適応があると考えられる。
【０００４】
一般に「ダブルマスル」動物として知られる、明瞭な全身性筋過形成を特徴とする動物は、世界各地のいくつかのウシ品種で報告されている。ダブルマスル・ウシの最初の文書による記載は、古く1807年にさかのぼる（Culley、1807）。この特徴が最も詳細に分析されている品種の一つがベルジアンブルー・ウシ種（Belgian Blue Cattle Breed）（「ベルジアンブルー種」）である。これはダブルマスル形質が体系的に選択され、ダブルマスル表現型が事実上固定されたわずかな品種のうちの一つである。ベルジアンブルー種においてダブルマスル個体を通常の個体と比較すると、筋肉量には平均20％の増加が認められるが、その他の全臓器のサイズは減少している（Hanset、1986および1991）。この筋肉肥大は主として表在筋に影響を及ぼし、総脂質含有率の50％低下およびヒドロキシプロリン含有率によって測定される結合組織の減少を伴う組織学的過形成であることが示されている（Hansetら、1982）。ダブルマスル動物では飼料摂取量が減少し、飼料転換比が改善されることが示されている（Hansetら、1987）。通常の動物との対比によるダブルマスル動物の重要な経済的利益は、販売価格および農場経営者の純利益の実質的な増加である（Hansetら、1987）。
【０００５】
ダブルマスル化に関する最も詳細な一連の研究の一つは、ベルジアンブルー種に関するハンセット（Hanset）らのものである。標準化された条件で飼育された150匹の無作為に選択された動物に関して、下ごしらえによる除去率（dressing-out percentage）、赤身および脂肪の比率、血漿ならびに赤血球クレアチンおよびクレアチニン濃度などの筋発達の客観的基準が測定された。これらの検討により、ダブルマスル表現型が異常な二峰性分布をとることが明瞭に示され、ダブルマスルおよび通常の動物に対して育種家が伝統的に行ってきた視覚的分類が客観的に確かめられた。この表現型分布に最尤法を用いることにより、共通の分散を有し、形質によって異なるものの標準偏差の3倍から4倍の平均差がある2成分からなる正規母集団に分離されることが判明した。このことは、母集団での頻度が50％に近い、筋発達に大きな影響を及ぼす対立遺伝子が存在することを示唆する（HansetおよびMichaux、1985b）。しかし、このような対立遺伝子の存在を裏づける最も有力な証拠は、ダブルマスルのベルジアンブルー雄ウシと雌のホルスタイン乳牛との間の実験的交雑（後者の動物は筋発達が極めて乏しい）によって得られた。F1子孫はホルスタイン種の母ウシと極めて類似した表現型分布を示したが、これらのF1のダブルマスル雄ウシとの戻し交雑では二峰性BC世代が生じたが、このことは劣性「mh」（筋肥大）対立遺伝子のメンデル分離を明らかに意味するものであった（HansetおよびMichaux、1985a）。
【０００６】
後に、同じ種類の実験的交雑を用いて、マーカー地図に基づくマイクロサテライトを用いた全ゲノムスキャンが行われた。連鎖解析を行うために、動物はダブルマスルまたは通常型に分類された。オッズスコアの対数値（ロッドスコア）は第2染色体に関して極めて有意であり（＞17）、マルチポイント連鎖解析ではこの染色体の動原体末端部の最も近いマイクロサテライトマーカー：TGLA44から[2]センチモルガン離れた箇所にmh遺伝子座の位置が特定された。形質のすべての分散の原因となる対応する染色体領域は、この実験では完全に浸透性（penetrant）であると想定された（Charlierら、1995）。
【０００７】
ヒトでは、筋ジストロフィーなどのいくつかの型の筋肉異常をコードする遺伝子が単離されている。本発明は、平滑筋または心筋などの他の種類の筋肉ではなく、骨格筋のみの発達を調節する遺伝子を提供する。本発明により、過形成反応を生じるほかないヒトでの骨格筋の再生におけるGDF-8遺伝子またはその受容体の役割に関する理解が得られると考えられる。
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、ウシ・ミオスタチン蛋白質をコードする遺伝子（cDNAおよびゲノム）の同定および配列決定を行った。核酸コード配列は配列番号：1として特定され、蛋白質配列は配列番号：2として特定される。ウシのゲノム配列は配列番号：54として特定される。コード配列が、ミオスタチン活性を有するウシ蛋白質をコードする配列のうち11塩基対の連続配列（配列番号：11）を欠く変異型遺伝子（配列番号：3）の配列も決定された。ミオスタチン活性を欠く変異型遺伝子に関してホモ接合性であるベルジアンブルー種のウシはダブルマスルとなることが示されている。ダブルマスル化をもたらすその他のウシ変異も明らかになっており、本明細書ではそれぞれnt419（del7-ins10）、Q204X、E226XおよびC313Yとして特定される。
【０００９】
このため、1つの面において、本発明は哺乳動物における筋過形成の存在を判定するための方法を提供する。本方法は、DNAを含む材料の試料を哺乳動物から採取すること、ならびに(a)ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質、をコードするDNAの配列が存在するか否か、および(b)(a)の活性を欠く対立蛋白質、をコードするDNAの配列が存在するか否かを確認することを含む。(a)が存在せずに(b)が存在することにより、その哺乳動物における筋過形成の存在が示される。
【００１０】
当然ながら、活性欠如の原因となる変異は、本明細書で示されるベルジアンブルー、アストゥリアーナ（Asturiana）、パルテネーズ（Parthenaise）またはルビア・ガジェガ（Rubia Gallega）種の場合のように、天然に生じる変異でもよい。
【００１１】
哺乳動物はヒト、ウシなどでありうる。
【００１２】
試料中に特定のヌクレオチド配列が存在するか否かを判定するための方法はいくつか知られている。一般的な方法はポリメラーゼ連鎖反応である。このため、本発明の1つの好ましい面は、(a)をコードするDNAの配列が存在するか否か、および(b)をコードするDNAの配列が存在するか否かの確認に、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列に基づくプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれるような段階を含む。
【００１３】
例えばPCRに用いられる本発明のプライマーは、それが基づく配列に対して十分に相補的であって、増幅しようとする核酸分子の対応部分と選択的に結合するため、およびPCRで一般に用いられるインビトロ条件下でその合成を開始するために十分な長さをもつ核酸分子である。同じく、本発明のプローブは、例えば、種々の配列を有する核酸分子の存在下において、関心対象の核酸配列の検出のために高または低ストリンジェンシー条件下でそれと選択的に結合する十分な長さおよび関心対象の核酸分子に対する十分な相補性を有する、核酸分子などの分子である。
【００１４】
好ましい面において、プライマーは配列番号：7（ヒトcDNA配列）または配列番号：54として特定される配列に基づく。
【００１５】
もう1つの面において、本発明は、哺乳動物からmRNAを含む材料の試料を採取することを含む、哺乳動物における筋過形成の存在を判定するための方法である。このような方法は、(A)ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質、をコードするmRNAの配列が存在するか否か、および(B)そのmRNAの配列に実質的に対応する欠損したヌクレオチド配列によって少なくとも一部がコードされる、(A)の活性を欠く蛋白質、をコードするmRNAの配列が存在するか否かを確認することが含まれる。(A)が存在せずに(B)が存在することにより、その哺乳動物における筋過形成の存在が示される。
【００１６】
(A)をコードするmRNAおよび欠損した配列は、哺乳動物のDNAの対立遺伝子に対応しうる。
【００１７】
さらに、(A)をコードするmRNAの配列が存在するか否か、および(B)をコードするmRNAの配列が存在するか否かの確認にPCRなどの増幅法が用いられる場合には、この方法には、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列に対して相補的な1対のプライマーの存在下でのmRNAの増幅が含まれる。このような各プライマーは、例えば配列番号：7として特定される配列に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含みうる。欠損した配列は、例えば配列番号：7の50個の連続したヌクレオチドに実質的に対応する少なくとも50個の連続したヌクレオチドを含みうる。
【００１８】
もう1つの面において、本発明は、哺乳動物からmRNAを含む材料の試料を採取すること、およびミオスタチンの生物活性を欠く変異型ミオスタチン蛋白質をコードするmRNAが存在するか否かを確認することを含む、哺乳動物における筋過形成の存在を判定するための方法である。変異型ミオスタチン蛋白質をコードするこのようなmRNAの存在により、その哺乳動物における筋過形成の存在が示される。
【００１９】
このため、もう1つの面において、本発明はウシ個体における筋過形成の存在を判定するための方法を提供する。本方法は、動物からのDNAを含む材料の試料の採取、およびミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するDNAが存在するか否かの確認を含む。このようなヌクレオチド配列を有するDNAが存在しないことにより、その動物における筋過形成の存在が示される。ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するDNAの確認には、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列に基づくプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれうる。
【００２０】
特に、本方法は、配列番号：1として特定される配列を有する核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を有することが知られている、筋過形成を呈していないウシ個体などの動物からの試料を用いて実施することができる。
【００２１】
ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するDNAが存在するか否かの確認には、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質のそれぞれN末端およびC末端をコードするヌクレオチド配列に基づくプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれうる。
【００２２】
プライマー、すなわち第1および第2のプライマーは、天然に生じることが知られていて両方の対立遺伝子に存在する場合にこのような動物に筋過形成をもたらすような変異と隣接した領域であって隔たって位置する蛋白質の領域をコードする、第1および第2のヌクレオチド配列に基づくことができる。
【００２３】
また、筋過形成を呈していないこのような動物のDNAが、配列番号：2として特定される配列を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、筋過形成を呈するこのような動物のDNAのコード配列がコード配列の第821位の塩基対から始まる11塩基対の欠失を含み、前記第1のプライマーが第275位のグルタミン酸をコードするコドンの上流に位置するように選択され、第2のプライマーが第274位のアスパラギン酸をコードするコドンの下流に位置するように選択されることも可能である。
【００２４】
また、筋過形成を呈していないこのような動物のDNAが、配列番号：2として特定される配列を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでもよいと思われる。筋過形成を呈するこのような動物のDNAのコード配列が、コード配列の第821位の塩基対から始まる11塩基対の欠失を含むことが知られていてもよい。1つのプライマーは、この欠失を含むDNA配列の第820および821位の塩基対を含むヌクレオチド配列にまたがるように選択しうる。
【００２５】
動物はベルジアンブルー種のものでありうる。
【００２６】
1つの特定の面において、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するDNAが存在するか否かの確認には、天然に生じることが知られていて両方の対立遺伝子に存在する場合に前記動物に筋過形成をもたらすような変異の少なくとも一部を含むプライマーの存在下でのDNAの増幅が含まれる。
【００２７】
もう1つの面において、本発明は、mRNAを含む動物の試料を採取すること、およびミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするmRNAが試料中に存在するか否かを確認することを含む、ウシ個体における筋過形成の存在を判定するための方法である。前記mRNAが存在しないことにより、その動物における筋過形成の存在が示される。
【００２８】
mRNAを含む試料は、筋組織、特に骨格筋の組織でありうる。
【００２９】
1つの特定の面において、本発明は、DNAを含む材料の試料を動物から採取すること、および配列が存在しないことによってその動物におけるダブルマスル化が示されるような、DNAが配列番号：11として特定されるヌクレオチド配列を含むか否かの確認を含む、ウシ個体におけるダブルマスル化の存在を判定するための方法である。
【００３０】
1つの特定の面において、動物はベルジアンブルー種のものである。
【００３１】
もう1つの面において、本発明は、育種の目的には知っていることが望ましいと思われるような哺乳動物のミオスタチン遺伝子型を判定するための方法である。本方法は、異種核酸が混入していない核酸である哺乳動物の核酸を含む材料の試料の採取、試料が(i)ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードする核酸分子、を含むか否かの確認、および試料が(ii)ミオスタチンの生物活性を欠く蛋白質をコードする対立核酸分子、を含むか否かの確認を含む。哺乳動物はウシでありうる。
【００３２】
もう1つの面において、対象はヒトであって、(i)は配列番号：7として特定される配列と実質的に相同（同一性の意味で）な核酸配列を含む。
【００３３】
本発明には、ミオスタチンが内部で発現される筋細胞を有する哺乳動物の筋肉量を増加させる方法であって、ミオスタチンをコードするmRNAの少なくとも一部に対して実質的に相補的であって筋肉量が増加するようにミオスタチンの発現を十分に低下させるのに十分な長さの核酸分子の有効量をその哺乳動物に投与することを含む方法が含まれる。1つの特定の面において、哺乳動物はウシである。
【００３４】
もう1つの態様において、本発明は、リボザイム活性およびミオスタチンをコードするmRNAの少なくとも一部に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を有し、それと選択的に結合してミオスタチンの発現を低下させて筋肉量を増加させるのに十分な長さの核酸分子の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の筋肉量を増加させる方法である。
【００３５】
本発明には、哺乳動物のDNAを含む試料が採取された哺乳動物における筋過形成の存在を判定するための診断用キットが含まれる。本キットは、ヌクレオチド配列の少なくとも1つがミオスタチン遺伝子の非コード領域から選択されるような、哺乳動物に筋過形成をもたらすミオスタチンをコードするDNAの一部における変異の上流および下流のDNAのヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーである、DNA増幅のためのそれぞれ第1および第2のプライマーを含む。本キットは、ミオスタチン遺伝子のコード部分の天然に生じる変異に対して相補的な第3のプライマーを含むこともできる。
【００３６】
哺乳動物の遺伝物質、特にウシのものの試料の遺伝子型を判定するための1つの特定の診断用キットは、プライマーのうち第1のものが、(a)配列番号：1のコード部分のヌクレオチド821から始まる11ヌクレオチドの欠失、(b)コード配列のヌクレオチド419から始まる7ヌクレオチドの欠失およびその位置への配列AAGCATACAAの挿入、(c)コード配列のヌクレオチド204の欠失およびその位置へのTの挿入、(d)コード配列のヌクレオチド226の欠失およびその位置へのTの挿入、(e)コード配列のヌクレオチド313の欠失およびその位置へのAの挿入、ならびにそれらの組み合わせの結果として生じる変異の群から選択される変異、を含む核酸分子の増幅を開始させる程度に配列番号：1の変異に対して十分に相補的なヌクレオチド配列を含む、ミオスタチン蛋白質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に対応する遺伝物質の一部を増幅するための1対のプライマーを含む。1対のプライマーのうち第2のものは、その全体が選択された1つまたは複数の変異の上流または下流に位置することが好ましい。1つのキットでは、前記第1のプライマーが変異(a)にまたがり、配列番号：11を含む核酸分子の増幅を開始させる程度に配列番号：11として特定されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的な第3のプライマーがさらに含まれる。もう1つ（または同一のキット）の場合には、前記第1のプライマーが、変異(b)を含む核酸分子の増幅を開始させる程度に変異(b)の挿入配列に対して十分に相補的であり、変異(b)の7ヌクレオチド欠失を含む核酸分子の増幅を開始させる程度に変異の7ヌクレオチド欠失に対応する配列に対して十分に相補的な第3のプライマーが含まれる。もう1つ（または同一のキット）の場合には、前記第1のプライマーが変異(c)にまたがり、変異(c)を欠く核酸分子の増幅を開始させる程度に変異(c)を欠く対応領域にまたがる配列に対して十分に相補的な第3のプライマーが含まれる。もう1つ（または同一のキット）の場合には、前記第1のプライマーが変異(d)にまたがり、変異(d)を欠く核酸分子の増幅を開始させる程度に変異(d)を欠く対応領域にまたがる配列に対して十分に相補的な第3のプライマーが含まれる。もう1つ（または同一のキット）の場合には、前記第1のプライマーが変異(e)にまたがり、変異(e)を欠く核酸分子の増幅を開始させる程度に変異(e)を欠く対応領域にまたがる配列に対して十分に相補的な第3のプライマーが含まれる。
【００３７】
本発明は、ミオスタチンの生物活性を有し、配列番号：2として特定されるアミノ酸配列または保存的に置換されたその変異体を有する精製された蛋白質を含む。本発明は、ミオスタチンの生物活性を有する精製ウシ蛋白質、またはミオスタチンの生物活性を有する精製ヒト蛋白質（配列番号：8）を含む。
【００３８】
本発明は、上記の蛋白質をコードする単離された核酸分子を含む。特に、本発明には、配列番号：1もしくは配列番号：3もしくは配列番号：7として特定されるヌクレオチド配列または遺伝暗号の縮重のためにその配列とは異なる配列を有するDNA分子、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で少なくとも1つの前記核酸分子とハイブリダイズしうる核酸鎖を含む、単離された核酸分子が含まれる。
【００３９】
本発明は、本発明の核酸分子に対応する配列を有するDNAから転写された、単離されたmRNAを含む。
【００４０】
本発明は、組換えクローニングベクター中にある単離されたDNA、および本発明の異種DNAを包含または発現する微生物細胞を含む。
【００４１】
本発明は、本発明の蛋白質を発現するトランスフェクションを受けた細胞系を含む。
【００４２】
本発明は、蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片の調製、DNA断片を含んでいて複製を行いうる組換えDNA分子を得ることを目的とした発現ベクター中へのDNA断片の組み入れ、蛋白質を発現しうる形質転換体を作製することを目的とした組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換、蛋白質の産生のための形質転換体の培養、およびこの結果得られた培養混合物からの蛋白質の回収を含む、本発明の蛋白質を生産するための工程を含む。
【００４３】
本発明は、ミオスタチンに対する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における筋肉量の増加を誘導するためにミオスタチンを阻害する方法を含む。
【００４４】
本発明は、哺乳動物においてミオスタチンに対する自己抗体を産生させることによって、哺乳動物における筋肉量を増加させる方法を含む。自己抗体の産生には、ミオスタチン活性を有する蛋白質を哺乳動物に投与することが含まれる。
【００４５】
本発明は、配列番号：1または配列番号：5または配列番号：7として特定される配列の少なくとも一部に対するアンチセンス核酸または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における筋肉量を増加させる方法を含む。この一部の長さは少なくとも5ヌクレオチドまたはそれ以上である。哺乳動物はウシであってよく、配列は配列番号：1として特定されるものであってよい。
【００４６】
本発明は、ミオスタチンに対する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、ミオスタチンの産生の阻害を、それを必要とする哺乳動物において行う方法を含む。
【００４７】
本発明は、配列番号：1として特定される配列またはその相補物に対してストリンジェント条件下でそれと結合する程度に十分に相補的な核酸分子を含むプローブを含む。プローブの長さは約8から約1195ヌクレオチドの間でありうる。
【００４８】
本発明は、ウシにおけるミオスタチンをコードするDNAの存在を検出するために有用なプライマー組成物を含む。本組成物は、ウシミオスタチンをコードする核酸配列に対して実質的に相補的な核酸プライマーを含みうる。核酸配列は配列番号：1として特定されるものでありうる。
【００４９】
本発明は、筋過形成を呈する哺乳動物のミオスタチン蛋白質をコードする変異型遺伝子のヌクレオチド配列を同定するための方法を含む。本方法には、DNAを含む材料の試料を哺乳動物から採取すること、および変異型遺伝子のヌクレオチド配列を同定するためにミオスタチンをコードする既知の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいた核酸プローブを用いて試料のプロービングを行うことが含まれる。1つの特定の手法において、プローブは配列番号：1、配列番号：5または配列番号：7として特定されるヌクレオチド配列に基づく。プローブの長さは少なくとも8核酸であることが好ましい。試料のプロービングの段階にはハイブリダイズ条件下でDNAをプローブに対して曝露することを含むことができ、ハイブリッドを形成した核酸分子を単離することもさらに含まれる。本方法はさらに、単離されたDNAの配列決定の段階を含みうる。本方法は、完全な変異型ミオスタチン蛋白質をコードするcDNAまたはmRNAの単離および配列決定の段階を含みうる。本方法は、筋過形成を呈していない哺乳動物からの機能的野生型ミオスタチンの単離および配列決定の段階を含みうる。
【００５０】
本方法は、完全な変異型ミオスタチン蛋白質の完全なコード配列を、このような哺乳動物からの機能的野生型ミオスタチンに関するコード配列が既知である場合には(1)その既知の配列と、このような哺乳動物からの機能的野生型ミオスタチンに関するコード配列が未知である場合には(2)請求項63または請求項66に従って決定される配列と、比較し、変異型遺伝子における任意の変異の位置を決定することを含みうる。
【００５１】
本発明は、本発明の方法に従って決定される変異の上流に位置するヌクレオチド配列に基づく第1の核酸分子および変異の下流に位置するヌクレオチド配列に基づく第2の核酸分子を含むミオスタチンをコードするヌクレオチド配列の検出に有用なプライマー組成物を含む。
【００５２】
本発明のプローブは、本発明に従って決定される変異にまたがるヌクレオチド配列に基づく核酸分子を含みうる。
【００５３】
本発明は、配列番号：1、配列番号：3もしくは配列番号：7として特定されるヌクレオチド配列、または本発明のその他の蛋白質によってコードされる蛋白質に対する抗体を含む。
【００５４】
本発明は、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を欠くゲノムを有するトランスジェニックウシ、ミオスタチンの生物活性を有するヒト蛋白質をコードする遺伝子を含む、またはミオスタチンの生物活性を有するウシ蛋白質をコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ミオスタチンの生物活性を有するウシ蛋白質をコードする遺伝子およびその遺伝子に対する異種ヌクレオチド配列アンチセンスを有するトランスジェニックウシを含む。このトランスジェニックウシは、リボザイム活性を有していて遺伝子のヌクレオチド配列アンチセンスと転写的に関連した核酸をコードする遺伝子を含みうる。
【００５５】
本発明は、筋過形成を特徴とする表現型を有するトランスジェニック哺乳動物、通常は非ヒト性のものであって、前記表現型が哺乳動物の体細胞および生殖細胞内に含まれる、ドミナントネガティブ変異を有するミオスタチン蛋白質をコードする導入遺伝子によって付与されるものを含む。トランスジェニック哺乳動物は雄であってよく、導入遺伝子はY染色体上に位置しうる。哺乳動物はウシであってよく、導入遺伝子は通常はミオシン遺伝子のプロモーターであるプロモーターの制御下にあるように位置しうる。
【００５６】
本発明のもう1つのトランスジェニック哺乳動物、通常は非ヒト性のものは、哺乳動物のミオスタチン蛋白質をコードする配列に対するアンチセンス配列を有する導入遺伝子によって表現型が付与される、筋過形成を特徴とする表現型を有する。哺乳動物は雄のウシであってよく、導入遺伝子は通常はミオシン遺伝子のプロモーターであるプロモーターの制御下にあるように位置しうる。
【００５７】
筋過形成を特徴とする表現型を有する本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、誘導可能であって、両側にJ oxPが隣接したミオスタチン遺伝子および誘導可能なプロモーターの依存下にあるCre導入遺伝子によって付与される表現型を有しうる。
【００５８】
筋過形成を特徴とする表現型を有する本発明の雄のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、両側にJ oxPが隣接したミオスタチン遺伝子およびY染色体上に位置するCre導入遺伝子によって付与される表現型を有しうる。
【００５９】
本発明は、遺伝物質がミオスタチンの生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むか否かの確認を含み、前記配列が存在しないことによってその動物における筋過形成の存在が示されるような、哺乳動物の遺伝物質の試料が筋過形成を特徴とする表現型を付与しうるか否かを判定するための方法を含む。
【００６０】
好ましい態様の詳細な説明
特定の表現型の原因となる遺伝子を単離するために用いられる方法は、位置的候補遺伝子クローニング（positional candidate cloning）として知られている。これには、(i)連鎖解析における遺伝子マーカーを用いた特定の表現型の原因となる遺伝子の染色体上の位置の決定、および(ii)対応する領域に位置することが知られた「候補」遺伝子の中からの特定の表現型の原因となる遺伝子の同定が含まれる。ほとんどの場合、これらの候補遺伝子はヒトおよびマウスにおいて入手しうるマッピング情報から選択される。
【００６１】
最初の位置決定（上記の(i)の段階）を行うために必要なツールは、家畜種に関して入手可能であってパブリックドメイン中に見いだされるマイクロサテライトマーカー地図である（Bishopら、1994、Barendseら、1994、Georgesら、1995およびKappes、1997）。位置的候補遺伝子クローニングのために必要なツール、特にYACライブラリー（上記の(ii)の段階）の一部はパブリックドメインから入手可能である。酵母人工染色体（YAC）を用いて作製された大きな挿入物を有するゲノムライブラリーは、ウシを含む大部分の家畜種に関してパブリックドメインから入手可能である。ヒトおよびマウスのマップの相互参照の際には位置的候補遺伝子（positional candidate）を同定することが必要であり、これは低分解能で入手可能であるが、適切なレベルの分解能を得るためにはいかなる個々の場合でも精細化が必要となる。後者の目的を達成するための多数の独創的な戦略が本明細書に記載される。位置的候補遺伝子クローニングの一般的原理については、コリンズ（Collins）、1995ならびにジョルジュ（Georges）およびアンダーソン（Andersson）、1996を参照されたい。
【００６２】
位置的候補遺伝子クローニング手法の一部としてウシおよびヒトの遺伝子地図を相互参照しうるように、HSA2q31-32（ヒト第2染色体の長腕マップ、細胞遺伝学的バンドq31-32）およびBTA2q12-22（ウシ第2染色体の腕マップ、細胞遺伝学的バンドq12-22）を、下記の通りに、一致したウシYACに基づいて統合した。
【００６３】
最近、108匹の戻し交雑個体を含む以前に記載された実験的［（正常×ダブルマスル）×ダブルマスル］戻し交雑集団を用いて、連鎖解析により、mh遺伝子座がウシ第2染色体（BTA2）の動原体性先端、連鎖地図の最も近いマーカー：TGLA44から3.1センチモルガンの近位部にマッピングされた（Charlierら、1995）。また、これまでの研究により、プロ-α(III)コラーゲン（Col3A1）がmh遺伝子座と同じ染色体領域に位置することも知られている。Col3A1はインサイチューハイブリダイゼーションによってBTA2q12-22にマッピングされており（Solinas-Toldoら、1995）、Col3A1 RFLPマーカーがTGLA44と密に連鎖することが示されている（θ＝2％）（Fisherら、1996）。これはヒトマップ上でCol3A1と隣接する領域、すなわちHSA2q31-32がオルソロガス（orthologous）なヒト染色体区域である可能性が高いことを特定する。この仮定は、Zoo-FISH実験によるデータ（Solinas-Toldoら、1995）のほか、体細胞雑種に関するI型マーカーのマッピングデータ（O'Brienら、1993）とも整合性があり、このことはHSA2qおよびBTA2の区域の間に進化的対応関係があることを立証するものである。
【００６４】
HSA2q31-33およびBTA2q12-22のマップ間の対応関係を詳細に調べるために、比較アンカータグ付加配列（Comparative Anchored Tagged Sequence）換言すればCATS、すなわち異なる種におけるオルソロガス遺伝子からの配列タグ付加部位、換言すればSTSを増幅すると思われるプライマーの対（Lyonsら、1996）を、ヒトマップ上でCol3A1と隣接していてその配列情報が複数の哺乳動物において入手可能である一連の遺伝子に対して開発した。Col3A1のほか、α2(V)コラーゲン（Col5A2）、イノシトールポリリン酸-1ホスファターゼ（INPP1）、組織因子経路阻害因子前駆体（TFPI）、タイチン（TTN）、n-キマエリン（n-chimaerin）（CHN）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ67（GAD1）、細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白質4（CTLA4）およびT細胞膜糖蛋白質CD28（CD28）に関する作動性のCATSも入手した。対応するプライマー配列は表1に示されている。
【００６５】
【表１】
0004368522.tif 000002
読み取りは左から右および下へ、表1に示された配列はそれぞれ配列番号：12から配列番号：53までとして特定される。
【００６６】
これらのCATSを用いて、リベール（Libert）ら、1993に記載された通りの三次元プーリング法を用いるPCRにより、6-ゲノムに相当するウシYACライブラリーをスクリーニングした。同じYACライブラリーを、BTA2近位部、すなわちTGLA44、BM81124、BM3627、ILSTS026、INRA40およびTGLA431に関して入手可能なすべてのマイクロサテライトマーカーによってもスクリーニングした（Kappesら、1997）。
【００６７】
この一団のSTSを用いて得られたYAC同士の間に考えられるオーバーラップ部を、共通のSTSの内容のほか、個々のYACからのSINE-PCR産物同士の間のクロスハイブリダイゼーションに基づいて探索した。この解析により、関心対象の領域内に3つの独立したYACコンティグ、すなわち（i）マイクロサテライトTGLA44、BM81124およびI型マーカーINPP1を含むコンティグA、（ii）Col3A1およびCol5A2を含むコンティグB、ならびに（iii）マイクロサテライトマーカーBM3627、ILSTS026およびINRA40およびI型マーカーTFPIを含むコンティグCが生じた。
【００６８】
入手可能なマイクロサテライトはいずれもコンティグBにはマッピングされず、このため、このYACクラスターは他の2つのコンティグの関連からはウシにおける位置特定を行えないと考えられる。しかし、ヒトで入手可能なマッピング情報により、コンティグBの位置がコンティグAおよびCの間であるとの予測が可能であった。この仮説を検証するために、コンティグBからBULGE20およびBULGE28という2つの新たなマイクロサテライトマーカーを単離した。BULGE20は多型性であり、実験的戻し交雑集団の遺伝子型分析が可能なことが明らかになった。
【００６９】
さらに、コンティグAに関して入手可能なマーカーの情報性を高めるために、本コンティグからBULGE23およびBULGE27という2つの新たなマイクロサテライトマーカーを開発した。BULGE23は多型性であることが明らかとなり、同じ家系の材料の型分析に用いられた。
【００７０】
その結果得られたすべての遺伝子型を用いて、ILINKプログラム（LathropおよびLalouel、1984）を用いた連鎖地図を作製した。可能性の高い順に以下のような隣接マーカー間の性別平均組換え率が得られた：［TGLA44-（0％）-BULG23］-（6.1％）-BULG20-（1.6％）-ILSTS026-（2.3％）-INRA40-（7.1％）-TGLA431。TGLA44とILSTS026との間のBULGE20の位置により、3つのコンティグの順序が予想通りであることが確認された。図1は、この結果得られたマッピング情報の概要である。
【００７１】
新たなマーカー地図に関するmh遺伝子座の位置を特定するために、LINKMAPを用いて多点連鎖解析を行った。連鎖解析は、mh／mh個体に対して完全浸透を、他の2つの遺伝子型に対してゼロ浸透を仮定する単純な劣性モデルを用いて行った。mh遺伝子座の位置をTGLA44-BULGE20区間とし、関連した最大LODスコアが26.4となる、図1に示したLODスコア曲線が得られた。3つの戻し交雑個体では、BULGE20および遠位マーカーとの組換えは生じるが、TGLA44およびBULGE23との組換えは生じないことから、mh遺伝子座がこのマーカーに近接することが示された。1つの個体では、TGLA44およびBULGE23とは組換えが生じるがさらに遠位部のマーカーとは組換えが生じないことから、mh遺伝子座がTGLA44およびBULGE23よりも遠位部に位置することが示された。INPP1およびCol3A1に関するこれらのマイクロサテライトマーカーの相対位置をヒトおよびウシのマップの統合によって推定された通りに仮定すると、これらの結果はmh遺伝子座がINPP1およびCol3A1を境界とする染色体区域内に存在する可能性が高いことを示している。
【００７２】
最近、マクフェロン（Mcpherron）ら（1997）は、GDF-8またはミオスタチンのノックアウト欠失に関してホモ接合性であるマウスには、骨格筋量の全身性の増加という特徴があることを示した。発表された2676bpのマウスミオスタチンcDNA配列（ジェンバンク（GenBank）寄託番号U84005）を用いたところ、ユニジーン（Unigene）データベース中に、3つのcDNAクローン（221299、300367、308202）および6つのEST（発現配列タグ）配列（H92027、H92028、N80248、N95327、W07375、W24782）を示す暫定的ヒトコンセンサス（Tentative Human Consensus（THC））クラスターが同定された。対応するTHCはヒトミオスタチン遺伝子の1296bpをカバーしており、配列全体にわたる平均ではマウス配列との相同性は78.1％であり、ヒトおよびマウス遺伝子（566bp）の翻訳部分のみを検討した場合には91.1％であった。したがって、このTHCはマウスミオスタチン遺伝子のヒトでのオルソログ（orthologue）に対応する可能性が高いと考えられる。このため、ヒトミオスタチンの第2エキソンからの272bp断片を増幅するためにプライマー（5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3'（配列番号：9）および5'-GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3'（配列番号：10））を調製し、全ゲノムのジーンブリッジ-4（Genebridge-4）ラディエーション・ハイブリッド・パネル（radiation hybrid panel）（Walterら、1994）遺伝子型分析に用いた。ホワイトヘッド（Whitehead）／MIT式の構造をもつラディエーション・ハイブリッド・マップに関するミオスタチン遺伝子の位置の決定にはRHマッパー（RHMapper）プログラム（Slonimら、未発表）を用い、これが関連ロッドスコア＞3でHSA2マップの948.7cRの位置にあることが示された。ミオスタチン分離ベクターおよびこの領域に位置する全マーカーからのベクターとの対立に関するより詳細な検討により（データリリース11.9、1997年5月）、それがHSA2の946.8cRの位置にある、ホワイトヘッド／MITラディエーション・ハイブリッド・マップ上に位置するEST SGC38239（Hudsonら、1995）と同一であることが示された。これはヒトミオスタチン遺伝子が、RHマップ上でCol3A1（EST W116343‐942.5cR）とINPP1（EST L08488‐950.2〜951.2cR）との間の区間に位置することを示す（図1）。このため、ミオスタチンはmh遺伝子の極めて有力な位置的候補遺伝子である。
【００７３】
ウシにおけるダブルマスル化の決定におけるミオスタチンの関与の可能性を検討するために、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてウシcDNAからの全コード配列を増幅することを目的として、入手可能なマウスおよびヒトのミオスタチン配列に基づくプライマーの対を設計した。このため、可能な場合には常に、マウスとヒトとの間に100％の相同性が認められるミオスタチン配列の一部分に位置する。ウシコード配列の98.4％に加えて74bpの3'非翻訳配列を表すと予想されるものを増幅し、2つのオーバーラップするDNA断片の長さがそれぞれ660（プライマーGDF8.19‐GDF8.12）および724bp（プライマーGDF8.11‐GDF8.21）である2つのプライマー対が同定された。正常（ホモ接合性+／+）（配列番号：1）およびダブルマスル（ホモ接合性mh／mh）（配列番号：3）動物ともに骨格筋から作製したcDNAから予想されたDNA産物が首尾よく増幅され、両方のストランドに対してサイクルシークエンシングを行った。
【００７４】
正常な対立遺伝子に対応するヌクレオチド配列は、マウスミオスタチン配列（配列番号：5）との一致率が88.9％であって1067bpがオーバーラップしており、マウスミオスタチン（配列番号：6）との一致率が92.9％であって354アミノ酸がオーバーラップしている蛋白質（配列番号：2）をコードする予想されたオープンリーディングフレームを含む。TGFβスーパーファミリーのメンバーに関して予想された通り、ウシミオスタチン遺伝子は、より長いN末端断片からの生理活性をもつカルボキシ末端ドメインの切断を媒介すると考えられている蛋白質分解性プロセシング部位、ならびに特徴的な間隔によって分離され、分子内および分子間ジスルフィド架橋に関与すると推定されている9個のシステイン残基を特徴とする（McPherronおよびLee、1996）。
【００７５】
mh対立遺伝子から得られたヌクレオチド配列は、ヌクレオチド821から831までに関する11bpの欠失があることを除き（開始コドンからの計算）、その全長にわたって正常対立遺伝子と同一であった。カルボキシ末端ドメインの最初のシステイン残基の後に生じるこのフレームシフト変異は、下流のアミノ酸配列を激しく破壊し、図2に見られる通り、13アミノ酸の後に早期終末コドンを呈する。変異型核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は配列番号：4として特定される。この変異は分子の生理活性部分を破壊するため、劣性のダブルマスル化表現型の原因である可能性が極めて高い。従来の命名法に従い、この変異はnt821（del11）と呼ぶものとする。
【００７６】
この変異の原因に関する仮定をさらに補強するため、この欠失に隣接するプライマー対（図2）を調製し、実験的戻し交雑集団からのすべての動物から得た対応するDNA区域を増幅した。増幅産物を放射標識するために、dCTP32の存在下でPCRを行った。増幅産物を変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーによって検出した。正常対立遺伝子については188bpの産物が予想され、nt821（del11）対立遺伝子については177bpの産物が予想されると考えられる。表現型と遺伝子型との相関を家系全体に関して合致させた。10匹のBBCBダブルマスル父ウシはいずれもnt821（del11）変異に関してホモ接合性であることが判明したが、41匹のF1雌はすべてヘテロ接合性であり、53匹のダブルマスル子孫は変異に関してホモ接合性であり、残る55匹の通常の動物はヘテロ接合性であった。
【００７７】
異なる通常種およびダブルマスル種におけるnt821（del11）変異の分布を検討するために、2つの乳牛種（ホルスタイン種、レッド・アンド・ホワイト（Red-and-White）種）を表す25匹の正常個体からなるコホート、および4品種（BBCB、Asturiana、Maine-AnjouおよびPiemontese）を表す52匹のダブルマスル動物のコホートに関して遺伝子型分析を行った。結果は表2にまとめている。レッド・アンド・ホワイト（Red-and-White）種の雄ウシ1匹がヘテロ接合性であると示されたことを除き、乳牛はすべて正常なホモ接合型であった。乳牛においてごく一部に変異を有する個体が生じたことは、この種ではこの表現型が時に記載されているため、予想外のことではなかった。BBCBおよびAsturianaですべてのダブルマスル動物がnt821（del11）欠失に関してホモ接合性であったことは、これらの2つの種における対立遺伝子の同質性を指し示す。ダブルマスルのMaine-AnjouおよびPiemontese動物はホモ接合的に「正常」であり、すなわちnt821（del11）欠失は認められなかったが、別の研究者によって同定された（Kambadurら、1997）ダブルマスルPiedmontese動物における明瞭なシステインからチロシンへの置換（C313Y）が見いだされた。
【００７８】
【表２】
0004368522.tif 000003
【００７９】
10匹の欧州産ウシ品種からのダブルマスル個体におけるミオスタチン遺伝子に関する全コード配列も決定し、ミオスタチン機能を破壊する一連の変異が同定された。
【００８０】
4匹の対照ホルスタイン種およびジャージー種の個体のコード配列はすでに記載された野生型対立遺伝子と同一であり（Grobetら、1997）、このことはそれが増幅された真のミオスタチンコード配列であって非機能性の偽遺伝子ではなかったことをさらに示すものである。
【００８１】
32匹のダブルマスル動物から、図3にまとめた通り、コード領域内に7つのDNA配列変異体が見いだされた。
【００８２】
上記の第3エキソンにおけるnt821（del11）変異に加えて、ミオスタチンの機能を破壊すると予想される4つの新たな変異が見いだされた。7塩基対が明らかに関連しない10塩基対によって置換される、開始コドンから数え始めて第419位での挿入／欠失により、N末端潜伏期関連ペプチド中の第140位のアミノ酸の箇所に早期終結コドンが生じる。この変異はnt419（del7-ins10）と呼ばれる。第2エキソンにおける2種類の塩基対置換、すなわちヌクレオチド610位でのC→T置換およびヌクレオチド676位でのG→T置換はそれぞれ、同じN末端潜伏期関連ペプチド中のアミノ酸204位および226位に早期終結コドンをもたらす。これらの変異はそれぞれQ204XおよびE226Xと呼ばれる。さらに、ヌクレオチド938位でのG→A置換はシステインのチロシンによる置換をもたらす。この変異はC313Yと呼ばれる。このシステインは、TGF-βスーパーファミリーに典型的であって特にTGF-β1、-β2および-β3、ならびにインヒビン-βAおよび-βBに共通してみられる9個の高度に保存されたシステイン残基のうち5番目である（McPherron & Lee、1996）。これは、生理活性をもつカルボキシ末端ペプチドの三次元コンフォメーションを安定化する分子内ジスルフィド架橋にかかわると考えられている。このため、これが置換されると蛋白質の構造および機能が影響を受ける可能性が高い。このC313Yはカムバデュア（Kambadur）ら（1997）によっても最近報告されている。
【００８３】
第1エキソンにおけるアミノ酸94位でも、ミオスタチン遺伝子のヌクレオチド282位でのC→A置換による保存的なフェニルアラニンからロイシンへの置換が見いだされている。アミノ酸置換が保存的性質をもつとすれば、保存性の低いN末端潜伏期関連ペプチドにおけるその位置、およびこの変異が例外的な筋発達の徴候を何ら示さない動物においてホモ接合的な状態で観察されていることから、この変異は仮にあったとしてもコードされる蛋白質の筋伸展機能を大きく妨げることはないと思われる。この変異はF94Lと呼ばれる。このマウス蛋白質は対応するアミノ酸位置にチロシンがあることを特徴とする。
【００８４】
第2エキソンの138番目のシトシンコドンの3番目の位置でのサイレントC→T転位も同定され、nt414（C-T）と命名された。
【００８５】
ミオスタチン遺伝子のコード領域内で検出されたこれらのDNA配列多型に加えて、おそらく中性多型であると思われ、以下の記号が割り当てられたイントロン配列における4つのDNA配列変異体も見いだされた：イントロン1におけるnt374-51（T-C）、nt374-50（G-A）、nt374-16（dell）およびイントロン2におけるnt748-78（del1）（図3）。
【００８６】
図4は、分析した試料において観察された変異の分布を品種別に並べたものである。検討した品種の大半について、分析したダブルマスル動物はミオスタチンの機能を破壊すると予想される5種類の記載された変異のうち1つに関してホモ接合性であるか、またはこれらの変異のうち2つに関して複合的なヘテロ接合性であった。これは、これらのすべての品種においてダブルマスルの状態が劣性様式で遺伝するとの仮説と整合する。
【００８７】
リムザン（Limousin）およびブロンド・ドアキテーヌ（Blonde d'Aquitaine）のみにおいては、観察された筋肥大の決定におけるミオスタチンの機能喪失型変異の役割に関して明瞭な根拠が得られなかった。大部分のリムザン個体は、上記の通り、これらの動物の特徴である筋肥大の原因になるとは考えにくい保存的なF94L置換に関してホモ接合性であった。1匹のリムザン個体はこの変異に関してヘテロ接合性であってその他の対立遺伝子は「野生型」のものであることが明らかになった。ブロンド・ドアキテーヌは全て「野生型」のホモ接合性であった。これらのデータは、これらの2品種の特徴であるダブルマスルの状態にミオスタチン遺伝子が関与していないか、またはコード領域以外に付加的なミオスタチン変異があるかのいずれかであることを示す。リムザン種ではダブルマスル化の状態がその他の品種に比べて顕著でないとみなされることがしばしばである。
【００８８】
このデータは、nt821del(11)およびC313Yなどのいくつかの変異は複数の品種に共通しており、このことから対応集団間で遺伝子移動があったと考えられるが、その他のものは特定の品種に限定されたと思われることを示すものである。さらに、いくつかの品種（特にベルジアンブルー種）は本質的に遺伝的に均一であると思われるが、その他のものでは対立遺伝子の不均一性に関する明瞭な証拠が認められた（メーヌ・アンジュー（Maine-Anjou）など）。
【００８９】
対立遺伝子の不均一性が観察されたことは、イギリス諸島からのショートホーン種の波及に伴って19世紀初頭に欧州大陸全域に単一のmh変異が広まったとする古典的な見解とは対立する（Menissier、1982）。少なくとも変異のうち2つは複数の品種に共通しており、このことは何らかの程度の遺伝子移動はあったものの明らかに単一の源からのものではないことを示している。
【００９０】
マウス、およびさらにインビトロで作製されたミオスタチンノックアウトマウス（McPherron およびLee、1997）において、compact変異はミオスタチン遺伝子の箇所で天然に生じた変異によると考えられる。compact遺伝子座はマウス第1染色体のD1Mit375-D1Mit21区間にマッピングされており、これはHSA2q31-32およびBTA2q12-22とオルソロガスであることが知られている（Vargaら、1997）。
【００９１】
応用的な観点からは、ダブルマスル化に関係したミオスタチン遺伝子における一団の変異の特徴が明らかになることは、ウシにおけるマーカー補助による選択またはこの状態への対策を可能とするような診断的スクリーニング系の確立に寄与する。
【００９２】
実施例1
遺伝的および物理的マッピング
以下の通りに、一致したYACを用いることによってHSA2q31-32およびBTA2q12-22マップを統合し、mh遺伝子座の位置をCol3A1およびINPP1に隣接する区間内に特定した。遺伝的マッピングは以前に記載されている、108匹の情報となる個体を有する（ホルスタイン種×ベルジアンブルー種）×ベルジアンブルー種の実験的戻し交雑集団を用いて行った（Charlierら、1995）。マイクロサテライト遺伝子型分析は、表1に示したプライマー配列を用い、標準的な手順に従って行った（Georgesら、1995）。連鎖解析はLINKAGE（バージョン5.1）およびFASTLINK（2.3Pバージョン、1995年6月）パッケージ（Lathrop およびLalouel、1984；Cottinghamら、1993）のMLINK、ILINKおよびLINKMAPプログラムを用いて行った。YACライブラリーのスクリーニングは、リベール（Libert）ら、1993に記載された通りの三次元プーリング法を用いるPCRによって行った。ライブラリーのスクリーニングに用いたCATSに対応するプライマー対は表1に示している。個々のYACのSINE-PCR産物同士の間のクロスハイブリダイゼーションは、レンストラ（Lenstra）ら（1993）にて報告されたプライマーを用い、ハンター（Hunter）ら（1996）に従って行った。マイクロサテライトはコーネリス（Cornelis）ら（1992）に従ってYACから単離した。
【００９３】
実施例2
ジーンブリッジ-4-パネル（Genebridge-4-panel）上でのヒトミオスタチン遺伝子のマッピング
ジーンブリッジ-4-パネル（Walterら、1994）からのDNAをリサーチジェネティクス（Research Genetics）社（Huntsville、Alabama）から購入し、標準的な手順および以下のヒトミオスタチンプライマー対（5'-GGCCCAACTATGGATATATTTG-3'および5'-GGTCCTGGGAAGGTTACAGCA-3'）を用いるPCRによって遺伝子型分析を行った。マッピングは、ホワイトヘッド研究所（Whitehead Institute）／MITゲノム研究センター（Center for Genome Research）のWWWサーバーを介して、フレームワークとなるマップに対してマーカーの位置を特定するためのそのRHマッピング用プログラム（Slonim, D.、Stein, L.、Kruglyak, L.、Lander, E.、未発表）を用いて行った。より正確な位置を得るために、照会マーカーの分離ベクターをデータリリース11.9（1997年5月）全体における関心対象の領域にあるすべてのマーカーからのベクターと比較した。これにより、ミオスタチンの位置は3を上回るLODスコアでヒトマップ上のINPP1-Col3A1中に特定された。
【００９４】
実施例3
RT-PCR
ウシミオスタチンのオルソログをクローニングするために、骨格筋cDNAからのRT-PCR増幅に基づく方法を選択した。チャーグウィン（Chirgwin）ら（1979）に従って骨格筋（上腕三頭筋）から全RNAを抽出した。RT-PCRは、ジーン-アンプ（Gene-Amp）RNA PCRキット（Perkin-Elmer）および表1に記したプライマーを用いて行った。キアクイック（QiaQuick）PCR精製キット（Qiagen）を用いてPCR産物を精製して、表2に記したプライマーを用い、ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション（Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction）（Perkin-Elmer）およびABI373自動シークエンサーを用いて塩基配列を決定した。
【００９５】
実施例4
nt821（del11）欠失の診断
nt821（del11）を診断するために、nt821（del11）欠失に隣接する以下のプライマー配列を設計した：5'-TCTAGGAGAGATTTTGGGCTT-3'（配列番号：53）および5'-GATGGGTATGAGGATACTTTTGC-3'（配列番号：52）。これらのプライマーによって正常個体からは188bp断片、ダブルマスル個体からは177bp断片が増幅された。ヘテロ接合性個体では2つの増幅産物が認められた。これらの増幅産物は種々の方法を用いて検出しうる。本実施例では、PCR産物をdCTP32取り込みによって標識し、変性アクリルアミドゲル上で分離した上でオートラジオグラフィーによって可視化した。3種の異なる遺伝子型を区別するために用いうるその他の手法は当業者に周知であり、これにはアガロースゲル中での分離および臭化エチジウムによる可視化、直接シークエンシング、タックマン（TaqMan）アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、逆ドットブロット法、RFLP分析および他にいくつかが含まれると思われる。検査の特異性は検出される変異と関連しており、検出法に用いるプライマーとは関連しない。このことは、同じ要求基準を満たすと思われる前記ウシミオスタチン配列に基づいて他のプライマーを容易に設計しうることを意味する。
【００９６】
実施例5
その他の品種における変異の決定
高頻度から中程度の頻度でダブルマスル個体が生じることが知られている以下の10種類の欧州ウシ品種から、極度の筋発達がみられる合計32匹の個体をサンプリングした：（i）ベルギー：ベルジアンブルー（4）、（ii）フランス：ブロンド・ドアキテーヌ（Blonde d'Aquitaine）（5）、シャロレー（Charolais）（2）、ガスコーヌ（Gasconne）（2）、リムザン（Limousin）（5）、メーヌ・アンジュー（Maine-Anjou）（4）、パルテネーズ（Parthenaise）（3）,（iii）スペイン：アストゥリアーナ（Asturiana）（2）、ルビア・ガジェガ（Rubia Gallega）（2）、（iv）イタリア：ピエモンティーズ（Piedmontese）（2）。サンプリングした動物のダブルマスル表現型の決定は経験を積んだ観察者により視覚的に行った。ホルスタイン種（2）およびジャージー種（2）の乳牛集団から標本抽出した通常の表現型をもつ4匹の動物を対照として分析した。
【００９７】
ゲノムDNAからのミオスタチンコード配列の検討を容易にするために、ウシ遺伝子のエキソン-イントロン境界の配列を決定した。マウスでは、ミオスタチン遺伝子は長さがそれぞれほぼ1.5および2.4kbである2つのイントロンによって分断されていることが知られている（McPherron およびLee、1997）。このため、マウスとウシとの間で遺伝子構成が保存されているとの仮定に立ち、2つのイントロンに隣接すると予測された、それぞれウシエキソン1および2ならびにエキソン2および3における2つのプライマー対を設計した（図3および表3）。これらのプライマーの組を用いることにより、ウシミオスタチン遺伝子を含むYACクローン（179A3）から（Grobetら、1997）、長さがそれぞれ2kbおよび3.5kbの2つのPCR産物が生じた。このPCR産物をキアクイック（QiaQuick）PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製し、ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション（Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction）（Perkin-Elmer）およびABI373自動シークエンサーを用いて一部の配列を決定した。ウシcDNA配列との整列化により、4つのエキソン-イントロン境界と予想されるものが同定された。ウシゲノムDNAに対応するヌクレオチド配列は配列番号：54として特定される。
【００９８】
【表３】
PCR増幅およびサイクルシークエンシングに用いたプライマー
0004368522.tif 000004
【００９９】
ウシミオスタチン遺伝子に関して入手可能なエキソンおよびイントロン配列に基づき、ともに用いることによってゲノムDNAからの全コード配列を簡便に増幅することができる3つのプライマー対を設計した。対応するプライマーの位置を図3に示し、対応する配列を表3に記している。
【０１００】
上記の3つの断片におけるゲノムDNAからの全コード配列をPCR増幅した後に、これらをキアクイック（QiaQuick）PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製して、増幅用のプライマーならびに一連のネストプライマー（nested primer）（図3および表3）を用い、ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション（Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction）（Perkin-Elmer）およびABI373自動シークエンサーを用いて配列を決定した。ABI373シークエンサーを用いて作成された染色体ファイル（chromat file）は、フレッド（Phred）（Ewing、B.およびGreen、P.（1992）、未発表）、フラップ（Phrap）（Green、P.（1994）、未発表）およびコンセッド（Consed）（Gordon、D.（1995）、未発表）を含む一連の配列解析プログラムの一部であるポリフレッド（Polyphred）アプリケーション（D. Nickerson、私的交流による）を用いて解析したが、当業者に周知のように、任意の適した配列決定プログラムでもよいと思われる。
【０１０１】
ミオスタチンに対して特異的なモノクローナル抗体（Mab）は有用である。配列番号：2として特定されるアミノ酸配列を有するウシ蛋白質の場合には、例えば、抗体を筋組織中のミオスタチン蛋白質濃度を測定するなどの診断的目的に用いることができる。これらの抗体を産生させるために精製ミオスタチンを調製する。ミオスタチンは、ベクターpGEX2（Pharmacia）を用いてグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として細菌細胞内で産生させることができる。これにより、GSHアフィニティークロマトグラフィーによる融合蛋白質の精製が可能となる。もう1つの手法では、ミオスタチンは細菌マルトース結合ドメインとの融合蛋白質として発現される。このため、この融合蛋白質は細菌抽出物から、抽出物をアミロース樹脂カラムに通した後にマルトースによって融合蛋白質を溶出させることにより回収される。この融合作製物については、ニューイングランドバイオラブス（New England Biolabs）社から入手しうるベクターpMalC2を用いることができる。MAbの予備的スクリーニングには第2の融合蛋白質を調製することも有用である。
【０１０２】
ミオスタチン蛋白質を認識するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマの作製は以下の通りに行う：BALB／cマウスに蛋白質／アジュバントの腹腔内注射を1カ月間隔で3回行った後に、細胞融合の少し前に尾静脈内に最後の注射を行う。脾細胞を回収し、標準的な手順（Kennett、1979、Mirski、1989）に従ってポリエチレングリコール4000を用いてNS-1骨髄腫細胞（American Type Culture Collection、Rockville、MD）と融合させる。細胞融合の工程は、以下により詳細に説明する通りに行う。
【０１０３】
融合細胞を、フィーダー層としてのBALB／Ccマウス由来の腹腔滲出細胞および照射脾細胞とともに96穴プレート中に播き、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（HAT培地）による選択を行う。
【０１０４】
初期スクリーニング手順としてELISAアッセイを用いる。PBS中に溶解した1〜10μgの精製ミオスタチン（融合蛋白質が切断されたもの）を個々のウェルのコーティングに用い、1ウェル当たり50〜100μlのハイブリドーマ上清をインキュベートした。比色アッセイには西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体を用いる。
【０１０５】
限界希釈によって陽性ハイブリドーマをクローン化し、凍結および抗体産生のために大量に増殖させる。ウエスタンブロット法および免疫組織化学における有用性、ならびに例えばマウスおよびヒト蛋白質などの種々の種に由来するミオスタチン蛋白質との交差免疫性に関して、種々の陽性ハイブリドーマを選択する。
【０１０６】
または、宿主動物の少量の抗原への直接曝露による内因性抗体の産生による能動免疫を用いることもできる。能動免疫には、生理的反応を誘発しないと思われ、短時間で分解されると思われる微量の抗原（g）の注入が含まれる。抗原は、疾患抵抗性の付与に用いられる技法（Pellら、1997）とほとんど同じ様式で初回および追加免疫として投与されるのに必要な程度のみでよいと考えられる。
【０１０７】
動物個体の筋肉量を増加させることを目的としてミオスタチン産生を阻害するために、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチド（RNAまたは好ましくはDNA）を用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、典型的には15から20塩基長のものは、関心対象の蛋白質をコードするセンスmRNAまたはプレmRNAの領域と結合し、結合したmRNAの蛋白質への翻訳を阻害しうる。このため、ミオスタチンをコードするcDNA配列を用いて、あわせるとcDNA配列の大部分、さらにはcDNA全体にもまたがる一連のオリゴヌクレオチドを設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドを試験することにより、蛋白質の発現に対して最大の阻害作用を及ぼすものを判定することが可能である（Stewart、1996）。最も適したmRNA標的部位は、5'-および3'-非翻訳領域のほかに開始コドンも含む。その他の領域が幾分効果的あるいは大して効果的でないことが判明することも考えられる。または、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドはミオスタチンのコードまたは調節配列と結合してもよい。
【０１０８】
核酸レベルでミオスタチン遺伝子の発現を阻害することによってミオスタチン活性を低下させる代わりに、例えば適切な低分子またはモノクローナル抗体などの作用物質（agent）との結合によってミオスタチン蛋白質の活性を直接阻害することもできる。
【０１０９】
これによる制限の意図はないが、当然ながら、本明細書で開示される蛋白質のミオスタチン活性の原因となる構造を保持しつつも種々のアミノ酸置換が可能であることは理解されるであろう。保存的置換は、例えば米国特許第5,264,558号または第5,487,983号などの特許文献に記載されている。このため、例えば、非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間の交換は可能と思われる。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間の置換もおそらく可能である。同様に、荷電性酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸の間の置換は恐らく可能であり、荷電塩基性アミノ酸であるリジンおよびアルギニンの間の置換も可能であると考えられる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む芳香族アミノ酸の間の置換も可能である可能性が高い。これらの種類の置換および交換は当業者には周知である。その他の置換も同じく可能であると考えられる。当然ながら、変異型蛋白質と天然に生じる蛋白質との相同性、すなわち配列類似性の比率が高いほど、代謝活性の保持の程度も大きいと予想される。当然ながら、本明細書で記載されるミオスタチンの活性を有する蛋白質変異体は本発明の範囲に含まれ、このような変異体をコードする核酸についても同様である。
【０１１０】
当技術分野で知られたキメラ型の蛋白質により、さらなる利点が得られると思われる。このため、融合蛋白質を作製するために、蛋白質全体または蛋白質の一部をコードするDNA配列を、大腸菌β-ガラクトシダーゼのC末端部分をコードする配列と連結することが可能である。例えば、ヒト呼吸器合胞体ウイルス糖蛋白質FおよびGが、994年2月22日に発行された米国特許第5,288,630号およびその中で引用された参考文献に記載されている。
【０１１１】
本発明の組換え発現ベクターは、上記の通り、プラスミドでありうる。本発明の組換え発現ベクターは、さらに、ウイルス核酸中に導入された核酸の発現を許容するウイルスまたはその一部でもありうる。例えば、複製に欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを用いることが可能である。
【０１１２】
本発明の組換え発現ベクターは、組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を作製するために用いることができる。「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けた原核または真核細胞を含むものとする。「による形質転換を受けた」「によるトランスフェクションを受けた」「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野で知られた多くの可能な技法のうち1つによる、細胞内への核酸（例えばベクター）の導入を含むものとする。原核細胞の核酸による形質転換は、例えば電気穿孔法または塩化カルシウムを介した形質転換によって行うことができる。哺乳動物細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法または微量注入法などの従来の技法によって行いうる。宿主細胞の形質転換およびトランスフェクションのために適した方法は周知である（Sambrook、1989）。
【０１１３】
上記のものなどの技法によって本発明の組換え発現ベクターによる形質転換を受けた宿主細胞の数は、用いる組換え発現ベクターの種類および用いる形質転換法の種類に依存すると考えられる。哺乳動物細胞内に導入されたプラスミドベクターは、低い頻度でしか宿主細胞DNAには組み込まれない。これらの組込み成分（integrant）を強化するためには、一般には、関心対象の遺伝子とともに選択マーカー（selectable marker）（例えば抗生物質に対する耐性）を含む遺伝子が宿主細胞内に導入される。好ましい選択マーカーには、G418およびハイグロマイシンなどの特定の薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーは関心対象の核酸とは別のプラスミドに導入することもできるが、好ましくは同じプラスミドに導入される。本発明の核酸および選択マーカーに関する遺伝子を含む1つまたは複数の組換え発現ベクターによる形質転換を受けた宿主細胞は、選択マーカーを用いて細胞を選択することによって同定しうる。例えば、選択マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子（pRc／CMVなど）をコードする場合には、G418を用いて形質転換細胞を選択することができる。選択マーカーの遺伝子が組み入れられた細胞は生存するが、他の細胞は死滅すると考えられる。
【０１１４】
トランスジェニック動物を作製するために、ミオスタチン蛋白質をコードする蛋白質を用いることができる。トランスジェニック動物（例えばマウス）とは、胚などの出生前の段階で動物または動物の前駆物に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物のことである。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれたDNAのことである。1つの態様では、配列番号：1に示されたヌクレオチド配列、またはその適切な変異体もしくはサブシークエンスを含むウシcDNAを用いて、ウシミオスタチンを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製することができる。同様に、トランスジェニックを作製するために、変異型遺伝子（例えば配列番号：3）などの変異体を用いることもできる。これはヒトミオスタチン蛋白質およびその変異についても同じく行いうると考えられる。上記の通りの「ノックアウト」動物を作製することもできる。トランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製するための方法は当技術分野では一般的なものとなっており、例えば米国特許第4,736,866号および第4,870,009号に記載されている。1つの好ましい態様では、本発明の組換え分子を含むプラスミドがマウス胚に微量注入される。特にプラスミドは受精した1細胞期のマウス卵の雄性前核内に微量注入される。注入を受けた卵を偽妊娠させた代理母動物（foster female）に移植し、代理母動物の体内にあるこの卵を育てて出産させる（Hogan、1986）。または、ミオスタチン蛋白質をコードする核酸を含む発現ベクターによるトランスフェクションを胚性幹細胞系に行い、適したレシピエントマウス系統から得た胚との集合キメラを形成させるために用いることも可能である。続いて、このキメラ胚を適した系統の偽妊娠雌マウスに移植し、胚を育てて出産させることができる。生殖細胞内にトランスフェクトされたDNAを保有する子孫を、一律にトランスジェニック性であるマウスの育種のために用いることができる。
【０１１５】
このような動物は、本来のミオスタチン遺伝子に関連した配列がミオスタチンの生物活性を保持するか否かの判定に用いうると考えられる。このため、例えば、マウスミオスタチン遺伝子がノックアウトされていて配列番号：1として特定される核酸配列を含むマウスを、配列番号：3として特定される核酸配列を含む動物とともに作製することができる。この動物は、特に筋過形成を発現することが知られたノックアウトマウスとの比較により、筋過形成の発現に関して検討しうる。このようにして、配列番号：3によってコードされる蛋白質は本発明の文脈においてミオスタチン活性を欠くが、配列番号：1として特定される核酸配列によってコードされる蛋白質はミオスタチンの生物活性を有することを示すことができる。
【０１１６】
このような実験では、コード遺伝子と機能的に結合した組織特異的エンハンサーの使用により、ミオスタチン（および変異体）導入遺伝子の組み入れに関して筋細胞は特に標的となると考えられる。例えば、筋細胞において優先的に機能的に結合している遺伝子の発現を指向するプロモーターおよび／またはエンハンサーは、筋組織中で優先的にミオスタチン蛋白質を発現するトランスジェニック動物を作製するために用いることができる。胚の段階で動物の生殖系列内に導入されたミオスタチン導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を、種々の組織におけるミオスタチン発現増強の効果を検討するために用いることもできる。
【０１１７】
トランスジェニックマウスにおける本発明の組換え分子の発現のパターンおよび程度は、レポーター遺伝子を組換え分子と融合させ、両方の遺伝子が同時転写されてポリシストロン性mRNAを形成させることによって助長される。レポーター遺伝子は、サムブルック（Sambrook）ら（Sambrook、1989）に記載されたものなどの従来の方法を用いて、組換え分子中に導入することができる。本発明の蛋白質をコードするポリシストロン性mRNAのシストロンおよびレポーター遺伝子の両者の効率的な発現は、ポリオウイルスmRNAに存在するものなどの既知の内在性翻訳開始配列を含めることによって達成しうる。レポーター遺伝子は、本発明の組換え分子の調節配列の制御下にある必要があり、このため、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現のパターンおよび程度はレポーター遺伝子の表現型をアッセイすることによって判定することができる。好ましくは、レポーター遺伝子は、宿主細胞が呈しない表現型をコードし、その表現型は定量的にアッセイしうる。適したレポーター遺伝子の例には、lacZ（β-ガラクトシダーゼ）、neo（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、dhfr（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、aphIV（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、lux（ルシフェラーゼ）、uidA（β-グルクロニダーゼ）が含まれる。好ましくは、レポーター遺伝子はβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZである。β-ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシダーゼによって分解されて青色の産物（Old）を生じるラクトース類似体X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトピラノシド）を用いてアッセイすることができる。
【０１１８】
本発明は、その望ましい効果を得ることを目的として、哺乳動物における野生型ミオスタチンをノックアウトすることを含む。これは、牛肉の生産のために飼養されたウシに関して特に当てはまる。ミオスタチン活性を有する蛋白質をコードするDNAの全配列を欠失させるよりも、欠損遺伝子（例えば配列番号：3またはそのゲノム性類似体）を置換する方が有利であると判明することも考えられる。トランスジェニックウシまたはトランスジェニックウシ胚を作出するための方法は、例えば、1997年5月27日に発行された米国特許第5,633,076号に記載されている。
【０１１９】
本発明のトランスジェニック動物は、ミオスタチンの作用の分子的基盤を調べるために用いることができる。例えば、1つまたは複数の保存されたシステイン残基が欠失したミオスタチン変異体は、このような残基がすべて保持されている野生型ミオスタチン蛋白質と比べて活性が低下していると予想される。さらに、蛋白質分解部位の欠失は、ミオスタチンの生物活性を欠く変異体を生じさせる可能性が高いと考えられる。
【０１２０】
ミオスタチン活性を失活させるためにトランスジェネシス（transgenesis）を用いることができる。これは、従来のトランスジェネシス、すなわち受精卵母細胞の注入によるもの、または後に卵母細胞に注入してその結果生じる生物体の発生に関与しうる、もしくはその核を未受精卵母細胞内に移入させうるES（胚性幹細胞）などの全分化能細胞系を用いる遺伝子ターゲティング法、核移入またはクローニングのいずれかを用いて達成しうる。
【０１２１】
ダブルマスル化形質が優性であるために動物が交雑育種においてより有用と考えられる、遺伝的に改変された動物を作製することも可能である。さらに、1つの特定の面において、この優性形質は雄性特異的であると考えられる。このようにすると、雄ウシはダブルマスルとなるが雌ウシはそうならないと考えられる。これに加えて、または代替的に、形質が出生後まで発現されないか誘導性であることも考えられる。誘導性である場合には、形質は上記の分娩困難を回避するために出生後に誘導することができる。
【０１２２】
優性「mh」対立遺伝子を作製するためには、少なくとも3種類の手法をとりうる。TGF-βスーパーファミリーのメンバーの1つである機能性のミオスタチンは二量体であるため、ドミナントネガティブなミオスタチン変異体を作製することができる（Herskowitzら、1987、Lopezら、1992）。1つの方法によれば、これはミオスタチンの蛋白質分解性プロセシング部位を変異させることによって達成される。ドミナントネガティブ効果を増強するために、遺伝子をCMVプロモーター、または組織特異的、すなわち骨格筋のみで発現されるミオシン遺伝子のものなどのより強力なプロモーターの制御下におくこともできる。または、当業者によって理解される通り、ミオスタチンをコードする配列のアンチセンス配列をDNAに組み入れ、相補的mRNA分子が産生されるようにすることもできると思われる。選択的に、mRNAの分解を増強するためにリボザイムを添加することも可能と思われる。もう1つの手法では、creリコンビナーゼ生成／リボザイム法またはCre-loxP系を用いうると考えられる（Hoessら、1982；Guら、1994）。
【０１２３】
雄性特異性は、相同組換えによってY染色体上に優性mh対立遺伝子を配置することによって達成しうる。
【０１２４】
誘導性は、骨格筋における出生後発現に関するプロモーターを選択すること、またはTet-OnおよびTet-Off系などの誘導系を用いることによって達成しうる（Gossenら、1992；Shockettら、1996）。
【０１２５】
従来式のトランスジェネシスを用いて、例えばミオスタチン遺伝子の配向をその天然のプロモーターおよびエンハンサー配列の前方に逆位させることにより、ミオスタチンアンチセンスをコードする遺伝子が注入される。これに続いて、アンチミオスタチン性リボザイムをコードする遺伝子、すなわち内因性ミオスタチンmRNAと特異的に結合してそれを「リボザイム」活性を介して破壊すると思われるRNAが注入される。
【０１２６】
また、遺伝子ターゲティングにより、従来のノックアウト動物を作製することができ、遺伝子置換による特異的変異を設計することができる。分娩困難を回避するには出生後というように、特定の発生時期にミオスタチン遺伝子を不活性化することができる。上記の通り、これは相同組換えによってミオスタチン遺伝子の前後両側にloxPが設計されたCre-loxP系を用い（遺伝子ターゲティング）、これらの動物を、出生後のみに活性を示す骨格筋特異的プロモーターの依存下にあるCre導入遺伝子（両側にJ oxPが隣接した既存のDNAに対するCreリコンビナーゼをコードする）を有するトランスジェニック動物と交配させることによって達成しうる。これは、ミオスタチン遺伝子が出生後に不活性化されると思われる個体を得るために行われる。上記の通り、動物に例えば抗生物質を摂取させることによって遺伝子のオンおよびオフを可能とする遺伝子ターゲティング系もある。このような場合には、遺伝子のプロモーターと遺伝子自体との間にオペレーターを設計する。このオペレーターは、結合した際に遺伝子を不活性化するリプレッサーの標的である（例えば、大腸菌におけるlacオペロン）。リプレッサーは、従来のトランスジェネシスを用いて、例えばリプレッサーをコードする遺伝子の注入により、細胞内に運ばれる。
【０１２７】
本発明のトランスジェニック動物を、ミオスタチンの作用を阻止、遅延または増強させうる被験物質の検査のために用いることもできる。未処理の対照トランスジェニック動物と並行して、トランスジェニック動物に物質による処理を行うことができる。
【０１２８】
本発明のアンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、ミオスタチン活性を有する蛋白質をコードする核酸（例えばmRNA）の発現を阻害するために有用である。
【０１２９】
本発明の単離された核酸およびアンチセンス核酸は、前述の組換え発現ベクターの構築に用いることができる。これらの組換え発現ベクターは、組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の作製のため、本発明の核酸によってコードされる蛋白質の発現のため、および前述の本発明の蛋白質を単離するために有用である。本発明の単離された核酸およびアンチセンス核酸を、前述のトランスジェニックおよびノックアウト動物の作製に用いることもできる。
【０１３０】
本発明の単離された蛋白質は、前述の通り、ミオスタチン活性を有する蛋白質に反応する抗体を作製するために有用である。または、本発明の抗体を、標準的なイムノアフィニティー法による本発明の蛋白質の単離のために用いることもできる。さらに、二重特異性抗体を含む本発明の抗体は診断目的にも有用である。
【０１３１】
何らかの理由でそれが望ましい場合には、配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含む蛋白質と結合する分子を、その分子を取り込んだ、蛋白質を発現する細胞を死滅させるための方法に用いることもできる。このような細胞の破壊は、毒性または治療的活性を有する物質によって分子を標識することによって達成しうる。本明細書で用いられる「毒性または治療的活性を有する物質」という用語は、放射性同位体、毒素（例えば、ジフテリア毒素またはリシン）または化学療法剤などのその作用が細胞を破壊しうる分子のほか、細胞傷害性細胞などの、その作用が細胞を破壊しうる細胞を含むものとする。ミオスタチンとの分子の結合を毒性または治療的活性を有する物質と直接的に共役させることができ、物質と間接的に関連づけることもできる。1つの実施例において、細胞によって取り込まれる分子の毒性はミオスタチン蛋白質によって活性化される。
【０１３２】
本発明は、例えば腫瘍細胞の試料とのインキュベーションのための配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含む蛋白質と結合する分子を含む細胞を同定するための診断用キット、蛋白質と結合した分子、未反応の蛋白質または非結合型の分子を検出するための手段、試料中の蛋白質の量を測定するための手段、および試料中の蛋白質の量を基準と比較するための手段も提供する。好ましくは、この分子はモノクローナル抗体である。本発明のいくつかの態様において、ミオスタチンと結合する分子の検出感度は前記の結合によって高められる（例えば、蛍光スペクトルの変化、放射性同位体標識の減少）。診断用キットは、キットの使用のための取扱説明書も含みうる。
【０１３３】
本発明はさらに、例えば、筋細胞などの細胞の試料からのmRNAとのハイブリダイゼーションのための、配列番号：1に示された配列またはそのオリゴヌクレオチド断片に対して相補的なヌクレオチドプローブを含む細胞を同定するための診断用キット、試料中のmRNAと結合したヌクレオチドプローブを基準とともに検出するための手段を提供する。1つの特定の面において、本発明は、配列番号：1として特定される配列またはその相補物とストリンジェントな条件下で結合するような、それに対して実質的に相補的な核酸分子を有するプローブである。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者に対する一般的な意味をもつ。例えば、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）で約45℃といった、核酸ハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は当業者に周知である。以下の例は、分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）社、NY（1989）、6.3.1〜6.3.6にみられる：第1の適したハイブリダイゼーション溶液50mlに対して、24mlのホルムアルデヒド、12mlの20×SSC、0.5mlの2M Tris-HCl pH7.6、0.5mlの100×デンハート溶液、2.5mlの脱イオン水、10mlの50％硫酸デキストラン、および0.5mlの10％SDSを混合する。第2の適したハイブリダイゼーション溶液は、1％結晶BSA（画分V）、1mM EDTA、0.5M Na2HPO4 pH 7.2、7％SDSでありうる。洗浄段階における塩濃度は、約2×SSCで50℃という低ストリンジェンシーから約0.2×SSCで50℃という高ストリンジェンシーまでのものから選択しうる。これらの洗浄溶液はいずれも0.1％SDSを含みうる。さらに、洗浄段階における温度は約22℃の室温という低ストリンジェンシー条件から約65℃という高ストリンジェンシー条件まで高めることができる。引用した参考文献にはより詳細な記載があるが、適切な洗浄時のストリンジェンシーは相同性の程度およびプローブの長さに応じて異なる。相同性が100％であれば、高温（65℃から75℃）を用いてよい。相同性が低い場合には、より低い洗浄温度を用いる必要がある。しかし、プローブが極めて短ければ（＜100bp）、相同性が100％であっても低い洗浄温度を用いる必要がある。一般に、洗浄は低温（37℃から40℃）で開始され、バックグラウンド値がオートラジオグラフィーにおける主要な因子とならない程度まで3〜5℃刻みで温度が高められる。診断用キットは、キットの使用のための取扱説明書も含みうる。
【０１３４】
本発明は、例えば哺乳動物の遺伝物質の遺伝子型を判定するために用いることができる診断用キットを提供する。1つのキットは、遺伝物質を増幅するために用いられる一組のプライマーを含む。あるキットは、本明細書に記載される天然に生じる変異のうち1つを含む遺伝物質のある領域を増幅するためのヌクレオチド配列を含むプライマーを含みうる。このようなキットは、機能的ミオスタチンを産生する正常遺伝子の対応領域を増幅するためのプライマーも含みうると思われる。通常、このようなキットは、遺伝子のコードおよび／または非コード部分に対して相補的な関心対象の領域の上流または下流にあるもう1つのプライマーも含むと考えられる。1つの特定のキットは、ミオスタチン遺伝子の非コード配列から選択されるプライマーを含む。このようなプライマーの例は、エキソン1-5'、エキソン1-3'、エキソン2-5'、エキソン3-5'およびエキソン3-3'と命名されて表3に提示されている。これらのプライマーは、関心対象の変異を含む区域を増幅するために用いられる。実際の遺伝子型分析は、本明細書に記載される特定の変異を標的とするとともに、従来のハイブリダイゼーション、タックマン（Taman）アッセイ、OLEアッセイなどにおいて対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとして機能しうるプライマーを用いて行われる。または、マイクロシークエンシングによる遺伝子型分析を可能とするようにプライマーを設計することもできる。
【０１３５】
このため、あるプライマーのキットは、第1、第2および第3のプライマー、それぞれ(a)、(b)および(c)を含む。プライマー(a)は、ミオスタチンの変異を含む領域、例えばnt821del(11)欠失にまたがるミオスタチン遺伝子の領域に基づく。プライマー(b)は、変異を含む遺伝物質が例えば2つのプライマーの存在下におけるPCRによって増幅されるように、プライマー(a)によって増幅される領域の上流または下流にある領域をコードする。プライマー(c)は、プライマー(a)が基づく領域に対応するものの変異を欠く領域に基づく。このため、非変異領域を含む遺伝物質は、プライマー(b)および(c)の存在下で増幅されると考えられる。このため、野生型遺伝子に関してホモ接合性である遺伝物質はプライマー(b)および(c)の存在下で増幅産物を生じると思われる。このため、変異型遺伝子に関してホモ接合性である遺伝物質はプライマー(a)および(b)の存在下で増幅産物を生じると思われる。ヘテロ接合性の遺伝物質は、いずれの場合にも増幅産物を生じると考えられる。
【０１３６】
本発明は、ミオスタチンの生物活性を有する精製された蛋白質を提供する。「単離された」および「精製された」という用語はそれぞれ、組換えDNA技術によって産生された場合には細胞材料または培地を、化学合成された場合には前駆化学物質またはその他の化学物質を、実質的に含まない蛋白質を意味する。ある種の好ましい態様において、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質は配列番号：2として特定されるアミノ酸配列を含む。さらに、上記に考察した通りのストリンジェントな条件下で配列番号：1または配列番号：7として特定されるヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされる、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質も本発明に含まれる。ミオスタチン活性を有する本発明の蛋白質は、当技術分野で知られた技法を用いる適した宿主細胞における発現によって入手しうる。適した宿主細胞には、例えば酵母、大腸菌、昆虫細胞およびCOS-1細胞などの原核もしくは真核生物体または細胞系が含まれる。上記の本発明の組換え発現ベクターを、蛋白質の単離を目的としてミオスタチン活性を有する蛋白質を宿主細胞内で発現させるために用いることができる。本発明は、蛋白質をコードする組換え核酸を宿主細胞に導入すること、宿主細胞内で蛋白質を発現させること、ならびに蛋白質を単離および精製することを含む、本発明の精製蛋白質を調製する方法を提供する。好ましくは、組換え核酸は組換え発現ベクターである。蛋白質は、硫酸アンモニウム沈降、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなど）、電気泳動および究極的には結晶化を含む当技術分野の標準的な手順（概論については「酵素精製および関連技法（Enzyme Purification and Related Techniques）」、Methods in Enzymology、22、233〜577（1971）を参照のこと）に従って、蛋白質を発現する宿主細胞から単離して精製することができる。
【０１３７】
または、蛋白質またはその一部を、固相合成（Merrifield、1964）または均質溶液中での合成（Houbenwcyl、1987）などの蛋白質合成の分野でよく知られた技法を用いる化学合成によって調製することもできる。
【０１３８】
本発明の蛋白質またはその一部は、蛋白質に特異的な抗体を調製するために用いることができる。特定の蛋白質の非保存的な領域にある明瞭なエピトープと結合する抗体を調製することができる。蛋白質の非保存的な領域とは、例えばミオスタチンファミリーのその他のメンバーまたはTGF-βファミリーのその他のメンバーなどのその他の蛋白質と実質的な配列相同性のないものをいう。抗体の調製には従来の方法を用いうる。例えば、ミオスタチン蛋白質のペプチドを用いることにより、標準的な方法を用いてポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる。哺乳動物（例えばマウス、ハムスターまたはウサギ）に対して、その哺乳動物における抗体反応を誘発する免疫原性形態のペプチドによる免疫化を行うことができる。ペプチドに対して免疫原性を付与するための技法には、担体との共役または当技術分野でよく知られたその他の技法が含まれる。例えば、アジュバントの存在下でペプチドを投与することができる。免疫化の進行は血漿または血清における抗体価の検出によって観測しうる。抗体レベルの評価には標準的なELISAまたはその他のイムノアッセイを用いることができる。免疫化の後には抗血清を得ることができ、必要に応じて血清からポリクローナル抗体を単離することもできる。
【０１３９】
モノクローナル抗体の作製のためには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から回収し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合させることによってこれらの細胞を不死化させ、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技法は当技術分野では周知である。例えば、ケーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）によって最初に開発されたハイブリドーマ法（Kohler、1975）のほか、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（Kozbor、1983）、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ法（Cole、1985）およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse、1989）などのその他の方法がある。ペプチドと特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１４０】
本明細書で用いられる抗体という用語は、ミオスタチンの生物活性を有する蛋白質またはそのペプチド断片と同じく特異的に反応するその断片も含むものとする。抗体を従来の技法を用いて断片化し、断片を抗体全体に関する上記のものと同じ様式で有用性に関してスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することにより、F(ab')2断片を作製しうる。Fab'断片を作製するために、この結果得られたF(ab')2断片を、ジスルフィド架橋が還元されるように処理することもできる。
【０１４１】
ヒト定常領域を有するキメラ抗体分子の作製も当技術分野では知られている。例えば、モリソン（Morrison）ら、タケダ（Takeda）ら、キャビリー（Cabilly）ら、ボス（Boss）ら、タナグチ（Tanaguchi）ら、テング（Teng）ら（Morrison、1985；Takeda、1985；Cabilly；Boss；Tanaguchi；Teng、1982）、欧州特許刊行物第0173494号、英国特許第GB2177096B号、PCT刊行物国際公開公報第92／06193号および欧州特許第0239400号を参照されたい。このようなキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象における免疫原性が低いと予想される。
【０１４２】
ミオスタチン蛋白質の生物活性を有する蛋白質またはそのペプチド断片に対して反応する特異的抗体または抗体断片を作製するもう1つの方法は、本発明の核酸分子から産生されたペプチドにより、細菌内に発現された免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全なFab断片、VH領域およびFV領域を細菌内に発現させることが可能である。例えば、ワード（Ward）ら、ヒューズ（Huse）ら、およびマッカファティ（McCafferty）ら（Ward、1989；Huse、1989；McCafferty、1990）を参照されたい。このようなライブラリーを、例えばミオスタチン蛋白質によってスクリーニングすることにより、ミオスタチンと反応する免疫グロブリン断片を同定することができる。または、ジェンファーム（Genpharm）社により開発されたSCID-huマウスを用いて、抗体またはその断片を産生させることもできる。
【０１４３】
種々の生物材料における本発明の蛋白質、その一部または密接に関連したアイソフォームを検出するために、ポリクローナル、モノクローナルまたはキメラモノクローナル抗体を用いることができ、例えばそれらをELISA、ラジオイムノアッセイまたは組織化学的検査に用いることができる。このため、特定の細胞イベントまたは病的状態におけるミオスタチン蛋白質の役割を明らかにすることを目的として、試料中の本発明の蛋白質、その一部または密接に関連したアイソフォームの量を定量化するために抗体を用いることができる。本明細書において前述した方法を用いて、ミオスタチンの非保存的領域に対するポリクローナル、モノクローナルまたはキメラモノクローナル抗体を産生させ、特定のミオスタチンを他の蛋白質から区別するために用いることができる。
【０１４４】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を検出可能な物質またはレポーター系と連結させることができる。「連結した」という用語は、検出可能な物質が抗体と物理的に結合していることを意味して用いられる。適した検出可能な物質には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適した酵素の例には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適した補欠分子団複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適した蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドおよびフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例にはルミノールが含まれ、適した放射性物質の例には125I、131I、35Sおよび3Hが含まれる。1つの好ましい態様において、レポーター系は存在する蛋白質（抗体）の量の定量化を可能とする。
【０１４５】
抗体と結合したこのようなレポーター系は、対象の体液または組織の試料が不足した量または過剰な量の蛋白質を含むか否かを判定するための方法に用いうると考えられる。このため、任意の種類の対象に対してこのような蛋白質に正常閾値濃度が与えられれば、検査キットを開発しうると考えられる。
【０１４６】
本発明は、当業者が二重特異性抗体および四量体抗体複合体を調製することを可能とする。二重特異性抗体は雑種ハイブリドーマを形成させることによって調製しうる（Staerz、1986a & b）。
【０１４７】
本発明の組成物は、医薬品のインビボ投与に適した生物的適合性のある形態にて対象に投与される。「インビボ投与に適した生物的適合性のある形態」とは、組成物の治療的効果があらゆる毒性効果に勝るようにして投与される組成物の形態を意味する。「対象（subject）」という用語は、哺乳動物などの、望ましい治療的反応が誘発されうる生きた生物体を含むものとする。対象の例には、ウシ、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が含まれる。本発明の治療的組成物の治療的活性量の投与とは、望ましい結果を達成するために必要な用量および期間での有効な量と定義される。例えば、ミオスタチン蛋白質の生物活性を阻害する化合物の治療的活性量は、個体の年齢、性別および体重、ならびに標的組織および送達様式などの因子によって変化すると考えられる。投与方式は至適治療反応が得られるように調整しうる。例えば、治療的状況の緊急性によって示される通りに、用量を毎日複数回に分割して投与することもでき、用量を比例的に減らすこともできる。
【０１４８】
米国に関する限り、本出願は先行して1997年7月14日に提出された米国特許出願第08／891,789号の一部継続出願であり、その明細事項は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４９】
当業者は、ルーチンの範囲を超えない実験を用いることにより、本明細書に記載された本発明の具体的な態様に対する多くの同等物を知る、または確認しうると思われる。このような同等物も以下の請求の範囲に含まれるものとする。
【０１５０】
参考文献
上記に引用された参考文献の詳細を以下に示す。列挙された参考文献は全て、本明細書に参照として組み入れられる。
Barendse, W., S.M. Armitage, L.M. Kossarek, A. Shalom, B.W. Kirkpatrick, A.M. Ryan, D. Clayton, L. Li, H.L. Neibergs, N. Zhang, W.M. Grosse, J. Weiss, P. Creighton, F. McCarthy, M. Ron, A.J. Teale, R. Fries, R.A. McGraw, S.S. Moore, M. Georges, M. Soller, J.E. Womack, and D.J.S. Hetzel. 1994. A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genet. 6: 227-235。
Bishop, M.D., S.M. Kappes, J.W. Keele, R.T. Stone, S.L.F. Sunden, G.A. Hawkins, S. Solinas Toldo, R. Fries, M.D. Grosz, J. Yoo, and C.W. Beattie. 1994, A genetic linkage map for cattle. Genetics 136: 619-639。
Boss et al., United States Patent No. 4,816,397。
Cabilly et al. United States Patent No. 4,816,567。
Charlier, C.; Coppieters, W.; Farnir, F.; Grobet, L.; Leroy, P,; Michaux, C.; Mni, M.; Schwers, A.; Vanmanshoven, P.; Hanset, R. & Georges, M. (1995) The mh gene causing double-muscling in cattle maps to bovine chromosome 2. Mammalian Genome 6: 788-792。
Chirgwin, J.M.; Przybyla, A.E.; MacDonald, R.J.; Rutter, W.J. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclrease. Biochemistry 18: 5294-5299。
Cockett, N.E.; Jackson, S.P.; Shay, T.D.; Nielsen, D.; Green, R.D,: Georges, M. (1994). Chromosomal locarization of the callipyge gene in sheep (Ovis aries) using bovine DNA markers. Proceedings of the National Academy of Sciences, US, 91: 3019-3023。
Cockett, N.E.; Jackson, S.P.; Shay, T.D.; Farnir, F.,; Berghmans, S.; Snowder,G.; Nielsen, D.; Georges, M. (1996). Polar overdominance at the ovine callipyge locus. Science 273: 236-238。
Cole et aL (1985). Monoclonal Antbodies in Cancer Therapy. Allen R. Bliss, Inc。
Collins, F.S. 1995. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nature Genet. 9:347-350。
Cornelis, F.; Hashimoto, L.; Loveridge, J.; MacCarthy, A.; Buckle, V.; Julier, C.; Bell, J. (1992). Idendfication of a CA repeat at the TCRA locus using YACs: a generating highly polymorphic markers at chosen loci. Genonomics 13; 520-825。
Cottingham, R.W.; Idury, R.M.; Schaffer, A.A. (1993). Farter sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet. 53: 252-263。
Culley, G. (1807). Observations on livestock. 4th ed., (London, G. VVoodfall)。
Fisher, S.R.; Beever, J.E.; Lewin, H.A. (1996). Genetc mapping of COL3AI to bovine chromosome 2. Mammalian Genome 8: 76-77。
Fuji, J.; Otsu, K.; Zorzato, F.; Deleon, S.; Khanna, V.K.; Weller, J.E. O'Brien. P.J.. MacLennan. D.H. (1991). Idendficadon of a mutation In the porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia, Science 253: 448-451。
Georges, M.; Andersson, L (1996). Livestock genomics comes of age. Genome Research 6: 907-921。
Georges, M.; Nielson, D.; Macklnnon, M.; Mishra, A.; Okimoto, R.; Pasquino A.T.; Sargeant, L.S.; Sorensen, A.; Steele, M.R.; Zhao, X; Womack, J.E.; Hoeschel,I. (1995). Mapping quantitative trait loci controlling milk production by exploting progeny testing. Genetics  139,907-920。
Gossen, M. & Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89; 5547-5551。
Grobet, L.; Royo Martin, L.J.; Poncelet, D.; Pirottin, D,; Brouwers, B.; Riquet, J.; Schoeberlein, A.; Dunner, S.; Menissier, F.; Massabanda, J.; Fries, R.; Hanset R,: Georges, M. (1997) A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Nature Genetics 17:71-74。
Gu, H.; Marth, J.D.; Orban, P.C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K, (1994). Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targetting. Science 265: 103-106。
Hanset, R. and Michaux, C. (1985a). On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. I. Experimental data. Genet Sel. Evol. 17: 359-368。
Hanset, R. and Michaux, C. (1985b). On the genetic determinism of muscular hypertrophy in the Belgian White and Blue cattle breed. II. Population data. Genet. Sel. Evol, 17: 369-386。
Hanset, R. (1991). The major gene of muscular hypetrophy in the belgian Blue Cattle Breed. In Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, Owen, Axford, eds. C.A.B. Intenational, pp.467-478。
Herskowitz, I. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative muations. Nature 329:219-222. Hogan, B. et al., (1986). A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory。
Hoess, R.H,; Ziese. M.; Stemberg, N. (1982). P1 site-specific recombination nucleotide sequence of the recombining sites. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,. 3398-3402。
Houbenwcyl, (1987). Methods of Organic Chemistry, ed. E. Waosch. Vol. 15 I and II. Thieme, Stuttgart。
Hudson et al. (1995) Science 270:1945-1954 with supplementary data from the Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Human Genetic Mapping Project, data release 11.9(May 1997)。
Hunter, K.; Riba, L.; Schalkwyk, L.; Clark, M.; Resenchuk, S.; Beeghly, A.; Su, J.; Tinkov, F.; Lee, P.; Ramu, E.; Lehrach, H. and Housman, D. (1996). Toward the Constructon of Integrated Physical and Genetic Maps of the Mouse Genome Using Interspread Repetitive Sequence PCR (IRS/NPCR) Genomics. Genome Research 6, 200-299。
Huse at al., (1989). Science 246,. 1275-1281。
Kambadur, R.; Sherma. M.; Smith, T.P.L.; Bass, J.J. (1997). Mutations in myostatin (GDF8) in double-muscled Belgian Blue Cattle. Genome Research 7: 910-916。
Kappes, S.M.; Keele, J.W.; Stone, R.T.; McGraw, R.A.; Sonstegard, T.S.; Smith, T.P.L.; Lopez-Corrales., N.L. and Beattie, C.W. (1997). A Second-Generaton Linkage Map of the Bovine Genome. Genome Research 7: 235-249。
Kennett, R. (1979). Cell fusion. Methods Enzymol. 58: 345-359。
Kohler and Milstein. (1975). Nature 256, 495-497。
Kozbor et al. (1983). lmmunol. Today 4: 72。
Lathrop, M.; Lalouel, J.M. (1984). Easy calculations of lodscores and genetic risk on small computers. American Journal of Human Genetics 36: 460-465。
Lenstra, J.A.; van Boxtel. J.A.F.; Zwaagstra, K.A.; Schwerin, M. (1993). Short interspersed nuclear element (SINE) sequences of the Bovidae. Animal Genetics 24: 33-39。
Libert, F.; Lefort, A.; Okimoto, R.; Georges, M. (1993) Construction of a bovine genomic library of large yeast artifical chromosome clones. Genomics 18: 270-276。
Lopez, A.R.; Cook, J.; Deininger, P.L.; Derynck, R. (1992). Dominant negauve mutants of transforming growth factor-beta1 inhibit the secretation of different transforming growth factor beta isoforms. Molecular and Cellular biology 12(4):1674-1679。
Lyons, A.L.; Loughlin, T,F,; Copeland, N.G.; Jenkins, N.A.,, Womack, J.E.; O'Brien, S.J.(1996) Comparative Anchor tagged Sequences for Integrative mapping of Mammalian Genomes. Nature Genetics 15: 47-56。
McPherron, A.C.; Lee, S.-J. (1996). The transforming growth factor βsuperfamily. In Growth Fectors and Cytokines in Health and Disease, Volume 1B. pages 357-393 JAL presse Inc.。
McPherron, A.C.; Lawler, A.M.; Lee, S.-J. (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFβ superfamily member. Nature 387: 83-90。
Menissier, F. (1982). Present state of knowedge about the genetic determination of muscular hypertrophy or the double muscled trait in cattle. in Cunent Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, vol, 16: Muscle hypertrophy of genetic origin and its use to improve beef production, pp. 387-428, Ed. King and Menissier, Martinus Nijhoff。
Merrifield,(1964) J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154。
McCafferty et al., (1990). Nature 348: 552-554。
Mrski, S. and Cole, S.P.C. (1989). Antigens associated with multidrug resistance in H69AR, a small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 49: 5719-5724。
Morrison et al., (1985). Proceedings or the National Academy of Science, USA, 81: 6851。
O'Brien, S.J.; Womack. J.E.; Lyons, L.A.; Moore, K.J.; Jenkins, N.A; Copeland, N.G. (1993). Anchored reference locl for comparative genome mapping in mammals. Nature Genetics 3: 103-112。
Old, R.W. and Primrose, S.B., In: Principles of Gene Manipulation. An lntroduction to Genetic Engineering. 4th ed. Oxford University Press. 63-66。
Pell, J.M.; Flint D.J.; (1997). In: Milk Composition, Production and Biotechnology, Ed. Welch et al., Chapter 19。
Sambrook, J.; Fritsch E.F. and Maniatis,T. (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Haobor Lab Press,Cold Spring Harbor,New York。
Shockett,P.E.; Schatz,D.G.(1996).Diverse strategies for tetracycline-regulated inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 934, 5173-5176。
Solinas-Toldo, S.; Lengauer, C; Fries, R. (1995). Comparative genome map of man and cattle. Genomics 27. 489-496。
Staerz & Bevan (1986a). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 1453。
Staerz & Bevan (1986b). Immunology Today 7: 241。
Stewart, A.J., Canitrot, Y., Baracchini, E., Dean, N.M., Deeley, R.G., and Cole, S.P.C. (1996). Reduction of Expression of the multidrug resistance protein (MRP) In human tumor cells by antisense phophorothioate oligonucleotides. Biochem. Pharamcol. 51;461-469。
Takeda et al.,(1985). Nature 314: 452。
Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496。
Teng, et al. (1982) Meth. Enzymol. 92: 3-16。
Varga, L.; Szabo, G.; Darvasi, A.; Muller, G.; Sass, M.; Soller, M. (1997). lnheritance and mapping of compact (Cmpt), a new mutation causing hypermuscularity in mice, Genetics, in the press。
Walter,M.A.;Spillett,D,J.; Thomas, P.; Weissenbach,J.; Goodfellow,P.N.(1994).A method for constructing radiation hybfid maps of whole genomes. Nature Gonetics 722-28. Ward et al., (1989). Nature 341: 544-546。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、ウシmh遺伝子座の周囲の遺伝的、物理的および比較によるマッピング情報の概要図である。マイクロサテライトマーカー地図に関するmh遺伝子座について得られた多点ロッドスコア曲線を示している。用いた家系において情報が得られなかったマーカーは括弧に挟んで示し、それらのマップ上の位置は発表されているマッピングデータから推論している。マーカーおよびそれらが単離されたYACは矢印で連結している。ヒトHSA2の関連した区域のRHマップは、用いたESTのcRの相対位置とともに示している。点線はマイクロサテライトおよびI型マーカーをそれぞれの陽性YACと連結している。クロスハイブリダイズによるSINE-PCR産物を示すYACは赤色の枠で連結されている。
【図２Ａ】  図2(a)は、ダブルマスルおよび通常の動物からのミオスタチンcDNA配列のサイクルシークエンシングによって得られた電気泳動図であり、ダブルマスル動物におけるnt821del(11)欠失（配列番号：11）を示している。ゲノムDNAからの欠失を包含する断片を増幅するために用いたプライマーは、残るヌクレオチドとは間隔をおいて位置する。
【図２Ｂ】  図2(b)は、マウス（上の行）、ウシ正常（中央の行）、ウシnt821del(11)（下の行）対立遺伝子を示している。蛋白質分解部位と推定される箇所は枠で囲み、カルボキシ末端領域における9個の保存的なシステインには下線を施している。正常およびnt821del(11)ウシ対立遺伝子の間の差は二重下線によって示されている。
【図３】  図3はウシミオスタチン遺伝子を、同定されたDNA配列多型の位置および定義とともに示した模式図である。「A」（空白）枠はそれぞれ非翻訳リーダーおよびトレーラー配列（太径）、ならびにイントロン配列（細径）に対応する。「B」「C」および「D」の枠はそれぞれ蛋白質のリーダーペプチド、N末端潜伏期関連ペプチドおよび生理活性をもつカルボキシ末端ドメインを示している。小文字の「e」「f」「g」の矢印はそれぞれ、イントロン増幅、エキソンの増幅および配列決定、ならびにエキソンの配列決定のために用いたプライマーを示しており、対応するプライマー配列は表1に報告されている。同定されたDNA配列多型の位置はそれぞれサイレント、保存的および破壊的変異に関して、ミオスタチン遺伝子上に「h」「i」「j」の線として示されている。各変異は対応するDNA配列および最終的にコードされるペプチド配列の詳細を伝えるボックスと矢印を介して連結されている。各ボックスでは、変異型配列を対照であるホルスタイン種の配列と比較し、その差をカラーで強調している。
【図４】  図4は、検討したさまざまな種において同定された変異の分布を示している。ミオスタチン変異の順序は図3に対応している。分析した動物はすべて、対照として用いた2匹のホルスタイン種および2匹のジャージー種を除いてダブルマスルであった（カラム1）。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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