(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性コラーゲンまたはゼラチンを非イオン性高分子または蛋白質変性剤および陰イオン界面活性剤を用いて処理することを特徴とするコラーゲンまたはゼラチンのα１鎖とα２鎖との分離方法。
【請求項２】
変性コラーゲンまたはゼラチンの加水分解物を非イオン性高分子または蛋白質変性剤および陰イオン界面活性剤を用いて処理することを特徴とするコラーゲンまたはゼラチン加水分解物由来のα１鎖フラグメントとα２鎖フラグメントとの分離方法。
【請求項３】
前記非イオン性高分子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストランまたはそれらの混合物から選択され、蛋白質変性剤が尿素または塩酸グアニジンから選択され、陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムから選択される請求項１または２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記非イオン性高分子がポリエチレングリコールであり、蛋白質変性剤が尿素であり、陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールの分子量が２００〜１００００である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
一方の分離物の構成成分が主としてコラーゲンまたはゼラチンのα１鎖を含む請求項１、３、４または５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項７】
他方の分離物の構成成分が主としてコラーゲンまたはゼラチンのα２鎖を含む請求項１、３、４または５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項８】
一方の分離物の構成成分が主として変性コラーゲンまたはゼラチン加水分解物由来のα１鎖フラグメントを含む請求項２、３、４または５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項９】
他方の分離物の構成成分が主として変性コラーゲンまたはゼラチン加水分解物由来のα２鎖フラグメントを含む請求項２、３、４または５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項１０】
請求項６記載の分離物をさらに加水分解して変性コラーゲンまたはゼラチンのα１鎖由来のフラグメントを得る方法。
【請求項１１】
請求項７記載の分離物をさらに加水分解して変性コラーゲンまたはゼラチン由来のα２鎖フラグメントを得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコラーゲンまたはゼラチンの構成成分鎖を分離する方法に関し、また、コラーゲンまたはゼラチンの単一種類の構成成分鎖からなる分離物の製造技術に関する。さらに、本発明は、コラーゲンまたはゼラチンの単一構成成分分離物のみまたは殆ど単一構成成分を含む変性コラーゲンまたはゼラチン分離物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンまたはゼラチンのポリペプチド鎖は３本鎖（α１鎖が２本、α２鎖が１本）からなり、これらの分別は、従来、液体クロマトグラフ法やアルコールと硫安による沈殿法が知られているが、これらは主として分子量による分別である。これらはポリペプチド鎖を分離する方法であるが、分子量差による分離であり、α１鎖成分とα２鎖成分の分離は出来ない。
【０００３】
コラーゲンまたはゼラチンのα１鎖成分とα２鎖成分は基本的に殆ど同じＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘのアミノ酸シーケンスを持つポリペプチドで、アミノ酸組成の差も小さいため、分子量や等電点などの基本特性の違いは極僅かであり、分離は非常に困難となっている。蛋白質の分離方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧと略すことがある）−デキストラン系の様な高分子の二相分離を利用した分配法が用いられるが、コラーゲンの鎖分離には成功していない。
【０００４】
α１鎖成分とα２鎖成分との分離は通常は電気泳動、特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳと略することがある）を用いた、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行われるが、これらの方法は分析用であり、分離した物を分取できない。又、分離能を低くした調製用のゲル電気泳動装置を用いても、処理量は多くてmgのオーダーであり、実用的分取法として使用することはできない。このため、従来はコラーゲンまたはゼラチンのポリペプチド鎖のα１鎖成分とα２鎖成分を分取し、これらの成分を含む何らかの製品を作る考えは存在せず、分取の試みもなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、コラーゲン、ゼラチン及びそれらの加水分解物に含まれる、α１鎖成分とα２鎖成分またはそのフラグメントを分離し、実用的に分取する方法を提供することにある。
【０００６】
さらに本発明の課題は、α２鎖成分を含まないか、極めて少ししか含まないα１鎖成分を実用的に得る方法を提供すること、およびα１鎖成分のフラグメントを得る方法を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の課題は、これらのα１鎖等に分離した変性コラーゲン、ゼラチンまたはポリぺプチドの分離物を実用的必要量を充分満たす程度の量で得る方法を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明の課題は、これらの有用物質を安価に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＳＤＳのような陰イオン界面活性剤とＰＥＧような非イオン性高分子または尿素のような蛋白質変性剤を共存させて、変性コラーゲンまたはゼラチンを処理することにより、コラーゲンまたはゼラチンのα１鎖成分とα２鎖成分を分離し、実用的量を分取することに成功し、本発明を完成した。さらに、この分離方法は、変性コラーゲンまたはゼラチンの加水分解物であって、α鎖成分を有することが認められるものにも応用できることも見いだした。
【００１０】
したがって、本発明は、変性コラーゲンまたはゼラチンを非イオン性高分子または蛋白質変性剤および陰イオン界面活性剤を用いて処理することを特徴とするコラーゲンまたはゼラチンのα１鎖とα２鎖との分離方法にある。
【００１１】
さらに、本発明は変性コラーゲンまたはゼラチンの加水分解物を非イオン性高分子または蛋白質変性剤および陰イオン界面活性剤を用いて処理することを特徴とするコラーゲンまたはゼラチン加水分解物由来のα１鎖フラグメントとα２鎖フラグメントとの分離方法にある。
【００１２】
以下に本発明の内容を説明するが、本発明はここに例示したものに限定されない。
コラーゲンまたはゼラチンのα鎖の分離はポリアクリルアミドゲル電気泳動と同様にＳＤＳ溶液を添加することにより可能となるが、α２鎖の沈殿の中にα１鎖成分が含まれ、α１鎖の上澄みの中にα２鎖成分が含まれるために完全な分離には至らない。
【００１３】
本発明者らは非イオン性高分子または蛋白質変性剤を添加しておくことにより、この分離が完全になることを見出した。また、本発明者らは電気泳動による分離はゲル中でのみ行われるが、非イオン性高分子または蛋白質変性剤を添加すると液中での相分離に於いてもこの分離が可能であることを見出した。電気泳動ではゲル中から目的物を含む部分を切り取り、抽出する必要があるため操作が非常に煩雑となり、殆ど実施されていなく、さらに、得られる量もμｇのオーダーであり実用的でない。これに対し、本発明は簡便で、大量に処理可能で、電気泳動のような分析的方法と全く異なる実用的な分離方法である。
【００１４】
本発明の方法は、原料の変性コラーゲンまたはゼラチン溶液に、非イオン性高分子または蛋白質変性剤の存在下に陰イオン界面活性剤を作用させてα２鎖を沈殿させる、または陰イオン界面活性剤と非イオン性高分子または蛋白質変性剤とを同時に作用させてα２鎖を沈殿させるのいずれの方法でも良い。現在のところ、非イオン性高分子または蛋白質変性剤の存在下に陰イオン界面活性剤を作用させてα２鎖を沈殿させる方法が、分離の程度と回収率が最も良い。上記の作用は、α２鎖の沈殿反応が完全に終了するが、ゼラチン全体が沈殿しないような量で行う。
【００１５】
原理に拘束されるものではないが、本発明は負荷電を持つ陰イオン界面活性剤がα２鎖と優先的に結合し、非イオン性高分子または蛋白質変性剤を予めまたは同時に添加することにより、ゼラチン鎖の選択性を促進させるものと思われる。
【００１６】
本発明の原料となる変性コラーゲンは、コラーゲンを熱、酵素及び変性剤その他の薬剤により変性乃至分別して得た変性コラーゲンを使用することが出来る。また、コラーゲンを変性して得た物で、商用ゼラチン以外のものを変性コラーゲンと称する。
【００１７】
本発明の原料となるゼラチンは、コラーゲンからゼラチン製造工程を経て得られた全てのゼラチンを使用することができ、アルカリ法ゼラチン、酸性法ゼラチン等の工程によるゼラチンの種類を問わない。又、骨原料、皮原料等の原料依存性も持たない。
【００１８】
変性コラーゲンまたはゼラチンの原料となるコラーゲンは、生体の硬組織の主成分となる蛋白質で、3本のα鎖がヘリックスをなす構造を持っている。本発明においては、コラーゲンには生体原料からの製造に当たり、酵素、アルカリ、酸、または塩で可溶化した全ての種類のコラーゲンを使用することができる。原料には各種生物の骨または皮等の硬組織が利用可能であり、使用するコラーゲンは原料及び組織依存性を持たない。
【００１９】
本発明においては、コラーゲンまたはゼラチン加水分解物にはコラーゲンまたはゼラチンを酸、アルカリ及び酵素等により加水分解したものを使用することができる。ただし、この加水分解物はα鎖の分離が必要な程度までα鎖構成成分を残存するものである。また加水分解物は、その構成成分について言及する場合は「ポリペプチド」と、分解状態について言及する場合は「フラグメント」と称するが、これらは全てコラーゲンを構成するα鎖の加水分解物であり、基本的には同義である。
【００２０】
本発明においては、原料となるコラーゲン、ゼラチン及び変性コラーゲンをα鎖のみからなるように、またはα鎖を非常に多く含むように前処理をすることが好ましい。前処理はコラーゲン、ゼラチン及び変性コラーゲンの製造工程の適当な工程において可能であり、処理方法は当業界で公知の処理方法の全てを採用できる。例えば、コラーゲンの可溶化に酵素、アルカリ、酸、または塩を使用できるが、アルカリ処理により分子鎖末端のテロペプチド部分にある架橋を切断することが好ましい。又、ゼラチン及び変性コラーゲンは限外濾過、分別沈殿等によりα鎖のダイマー及びオリゴマーを除去することができるが、精製法はこれらの例に限定されるものではない。
【００２１】
本発明においては、非イオン性高分子は、非イオン界面活性剤、ビニル化合物、セルロース誘導体、多糖類等が使用可能であるが、非イオン性水溶性高分子が好ましい。非イオン性高分子には、例えば、ＰＥＧ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ＣＭＣ、デキストラン等があり、最も好ましくはＰＥＧが選ばれる。非イオン性高分子の分子量はα鎖を分離できればどのようなものでもよいが、例えば、２００〜５００００程度である。非イオン性高分子の使用量は、α鎖を分離できればどのような量でもよいが、分離液全体を基準にして重量％で０．０１％〜１０％程度の含有量である。例えば、ＰＥＧの場合、分子量は低分子量の物でも効果があるが、分子量が大きい程効果も大きくなる。しかし、ＰＥＧは分子量が大きくなると粘度が高くなって固化するため、ＰＥＧの分子量は実用的には２００〜１００００程度、好ましくは４００〜４０００程度、最も好ましくは１０００〜２０００程度が選ばれる。分離液中のＰＥＧの濃度に制限はないが、濃過ぎるとゼラチンが沈殿するため、実用的には重量％で０．０１〜１０％程度、好ましくは０．０５〜２％程度、最も好ましくは０.１〜０.５％が選ばれる。使用できるＰＥＧは市販の非イオン界面活性剤のグレードで良いが、分取する製品の用途により、精製品または低級品の何れでも使用可能である。
【００２２】
本発明において蛋白質変性剤には尿素、グアニジン塩酸塩等が使用可能であるが、好ましくは尿素が選ばれる。蛋白質変性剤の使用量は、α鎖を分離できればどのような量でもよいが、分離液全体での濃度で０．００１モル濃度〜１２モル濃度が好ましい。例えば、尿素の場合、その濃度に制限はないが、高濃度過ぎるとゼラチン全体が沈殿するため０.００１モル濃度〜８モル濃度、好ましくは０．０５モル濃度〜２モル濃度、最も好ましくは０．０１モル濃度〜１モル濃度が選ばれる。
【００２３】
本発明においては、陰イオン界面活性剤は、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、リン酸塩及び他の陰イオン界面活性剤が使用可能であるが、好ましくはＳＤＳ、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等、最も好ましくはＳＤＳが選ばれる。陰イオン界面活性剤の使用量は、分離して得る目的のα１鎖またはα２鎖の純度に依存して決定される。α１鎖の純度を上げる目的の場合は、α２鎖の沈殿反応が完全に終了するまで添加される。例えば、ＳＤＳを使用する場合、添加するＳＤＳの溶液濃度に制限はないが、重量％で１〜２０％程度、好ましくは５〜１０％溶液が選ばれる。ＳＤＳは、分取する製品の用途により、市販の陰イオン界面活性剤及び工業薬品グレードで使用可能である。
【００２４】
本発明に用いる変性コラーゲンまたはゼラチン原料溶液の濃度に制限はないが、重量を基準に０．５〜１５％、好ましくは１〜５％が選ばれる。これらの溶液のｐＨはゼラチンの等電点以下であれば良いが、ｐＨ２〜８．５、アルカリ処理コラーゲン及びゼラチンでは好ましくはｐＨ３〜６、最も好ましくはＨ３.５〜４.５が選ばれる。溶液の温度に制限はなく、常温で良いが、コラーゲンの場合は可溶化し、予め変性温度以上で変性させる必要がある。
【００２５】
変性コラーゲンまたはゼラチンを加水分解して得たα１鎖またはα２鎖由来のフラグメントからなるポリペプチドは、変性コラーゲンまたはゼラチンを本発明の方法を使用してα１鎖成分とα２鎖成分を分離した後、通常の方法で分解して得ることが望ましい。この場合、分解方法は蛋白質分解酵素、酸及びアルカリにより常法に従って分解し、分子量を目的とする値に制御する。酵素、酸及びアルカリは通常使用されている物全てが適用可能であり、特別な仕様を必要としない。一方、α鎖構成成分が残存している分子量が1万以上である比較的高分子の変性コラーゲンまたはゼラチンの加水分解物については、市販の加水分解物または目的の分子量に分解した加水分解物を原料にしてα１鎖由来成分とα２鎖由来成分を分離することにより得ることも可能である。この場合の分解方法も、蛋白質分解酵素、酸及びアルカリによる常法に従って実施することが出来る。
【００２６】
本発明の分離法は純粋な変性コラーゲン、ゼラチンまたはその加水分解物水溶液に対して実施されるが、必要に応じて添加物を加えた状態及び溶媒を変更した場合においても、添加物の組み合わせにより同様の分離効果を得ることができる場合には適用される。
【００２７】
本発明により得られた分離物はゼラチンの有用特性であるゼリー強度が大幅に改善されたゼラチンを供給する。この物性改善により、本ゼラチンはハードカプセル用ゼラチン及び写真用ゼラチンとしての利用が期待できる。
【００２８】
【実施例】
（実施例１）
（１）４０℃の１％アルカリ法牛皮ゼラチン溶液２０ｍｌをビーカーにとり、０.２％ポリエチレングリコール溶液（平均分子量１５４０：和光純薬）２０ｍｌと混合した後、この液を１Ｎ塩酸でｐＨ３.８に調整した。この液に１０％ＳＤＳ（分析溶試薬を使用）溶液を少量ずつ添加し、液が白濁した後、この第一段目の白濁が一定になったところで添加を終えた。このまま添加を続けると、ゼラチン全体が沈殿し、分離が不可能となる。使用したＳＤＳ溶液の量は約０．１６ｍｌであった。白濁した溶液を遠心分離器にセットし、温度２５℃、回転数１９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上澄みと沈殿を分離した。約４０ｍｌの上澄み液にエタノール８ｍｌを加え、ロータリーエバポレータで約２０ｍｌにまで濃縮した。濃縮液に４０ｍｌのアセトンを加え、沈殿を生じさせた。この懸濁液を前と同一条件で遠心分離器にかけ、ゼラチンの沈殿を得た。沈殿を４０℃の蒸留水２０ｍｌに再溶解し、室温に冷却した後、４０ｍｌのアセトンで再沈殿させ、遠心分離により精製したゼラチン得た。ゼラチンは再度４０℃の蒸留水２０ｍｌに溶解した後、凍結乾燥して保存し、分析した。この製品の回収率は２３％であった。
【００２９】
図１にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析結果を示した。
この分析は「コラーゲン実験法」永井裕・藤本大三郎編講談社サイエンティフィック（１９８６）に従って実施した。比較例として無処理の市販アルカリ法ゼラチンを同時に泳動した。図１より、分離した上澄みは殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（２）ＳＤＳ溶液の使用量を０．１０ｍｌとした以外は、実施例１（１）と同様にして分離し、ＳＤＳで沈殿したゼラチンを凍結保存し、分析した。図２にその分析結果を示した。沈殿は殆どα２鎖成分から成っている事が確認できる。
（実施例２）
平均分子量４０００のポリエチレングリコール(和光純薬)を用いて、実施例１と同様に分離を行った。図３にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。この図から分かるように、上澄みは殆どα１鎖成分から成っていた。
（実施例３）
特公昭４６−１５０３３号公報に記載されている方法により製造したアルカリ可溶化コラーゲン１０ｇを６０℃の蒸留水ｌリットルに溶解した。変性を確実にするために６０℃で更に３０分保持した。この溶液から５ｍｌを分取し、パギイ法（写真用ゼラチン試験法）に従って分子量分布を測定し、α鎖成分が８０％以上あることを確認した。別に、前記変性コラーゲン溶液から２００ｍｌをビーカーに分取し、０.２％ポリエチレングリコール溶液（平均分子量１５４０）２００ｍｌと混合した。以後の処理を実施例１と同様に操作し、５回の分離を併せて５．５ｇの上澄みの乾燥α１成分を得た。図４から分かるように、本製品は殆どα１鎖成分から成っている。
（実施例４）
市販のアルカリ法骨ゼラチン２００ｇを５リットルのビーカーにとり、４リットルの水を加えて膨潤後、６０℃で溶解して、５％のゼラチン溶液を得た。この溶液を５％塩酸でｐＨ３に調整した後、８５℃で５時間加水分解した。この加水分解物から少量のサンプルを採り、パギイ法（写真用ゼラチン試験法）に従って分子量分布を測定し、重量平均分子量３万の値を得た。この溶液を陽イオン交換樹脂ＳＫ１Ｂ（日本錬水製）、陰イオン交換樹脂ＳＡ１０Ａ（日本錬水製）の各５０ｍｌに通液した後、蒸留水で２倍に希釈した。
【００３０】
本溶液から２００ｍｌを分取し、１Ｎ塩酸でｐＨ３．５に調整後、実施例１と同様にして処理した。但し、ＰＥＧは０．５％溶液のもの８０ｍｌを使用した。図４に分離した上澄みから得た変性コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。図４より、本製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（実施例５）
４０℃の４％アルカリ法牛皮ゼラチン溶液１００ｍｌをビーカーにとり、１０％ポリプロピレングリコールトリオール７００（和光純薬）の溶液を２ｍｌ加えた。この液を１Ｎ塩酸でｐＨ３.８に調整した。この液に１０％ＳＤＳ溶液を液が白濁するまで少量ずつ添加した。白濁した溶液を実施例１に従って処理した。この製品の回収率は１８％であった。図４に分離した上澄みから得た変性コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。図４より、本製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（実施例６）
４０℃の１％アルカリ法牛皮ゼラチン溶液１００ｍｌをビーカーにとり、１０％ポリプロピレングリコールトリオール３０００（和光純薬）の溶液を１ｍｌ加えた。この液を１Ｎ塩酸でｐＨ３.８に調整した。この液に１０％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム溶液を液が白濁するまで少量ずつ添加した。白濁した溶液を実施例１に従って処理した。図４に分離した上澄みから得た変性コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。図４より、本製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（実施例７）
実施例３に従い、アルカリ可溶化コラーゲンから１％の変性コラーゲン溶液を１リットル作った。この溶液から各２００ｍｌを４個のビーカーに分取し、各液が尿素の１モル、０.５モル、０．１モル及び０．０１モル溶液になるように尿素を添加した。この各液に１０％ＳＤＳ溶液を少量ずつ添加し、液が白濁した後、この第一段の白濁が完全に終了するところまで添加を続けた。以後の処理を実施例１と同様に操作し、４個の上澄みの乾燥品を得た。図５から、これらの製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（実施例８）
４０℃の１％アルカリ法牛皮ゼラチン溶液１００ｍｌをビーカーにとり、１０％ポリビールアルコール１０００（和光純薬）の溶液を２ｍｌ加えた。この液を１Ｎ塩酸でｐＨ３.８に調整した。この液に１０％ＳＤＳ溶液を液が白濁するまで少量ずつ添加した。白濁した溶液を実施例１に従って処理した。この製品の回収率は１５％であった。図４に分離した上澄みから得た変性コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。図４より、本製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
（実施例９）
４０℃の１％アルカリ法牛皮ゼラチン溶液１００ｍｌをビーカーにとり、１５％デキストラン（和光純薬）の溶液を１ｍｌ加えた。この液を２Ｎ塩酸でｐＨ３.８に調整した。この液に１０％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム溶液を液が白濁するまで少量ずつ添加した。白濁した溶液を実施例１に従って処理した。図４に分離した上澄みから得た変性コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。図４から、本製品は殆どα１鎖成分から成っていることが分かる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の方法により、コラーゲン、ゼラチンおよびそれらの加水分解物に含まれるα鎖構成成分のα１鎖成分とα２鎖成分またはそのフラグメントを実用的規模で分離でき、純度の高いα１鎖またはα２鎖またはそれらのフラグメントを大量に得ることができる。これにより、これらの分離物を大量に提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゼラチンを本発明の方法により分離した上澄み分離物の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図２】ゼラチンを本発明の方法により分離したＳＤＳ沈殿分離物の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図３】ゼラチンを平均分子量４０００のＰＥＧを使用した本発明の方法により分離した上澄み分離物の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図４】種々の変性コラーゲンまたはゼラチンまたは加水分解物を種々の非イオン性高分子および種々の陰イオン界面活性剤を用いて本発明の方法により分離した上澄み分離物の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図５】変性コラーゲンを種々の濃度の尿素を用いて本発明の方法により分離した上澄み分離物の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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