(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の所望の核酸分子をクローンニングまたはサブクローニングする方法であって、以下：
（ａ）インビトロで以下を組合せる工程、
（ｉ）少なくとも２つの組換え部位と隣接する１つ以上の所望の核酸セグメントを含む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、挿入ドナー分子；
（ｉｉ）少なくとも２つの組換え部位を含む１つ以上のベクタードナー分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクタードナー分子；および、
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
（ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の該ベクタードナー分子に移すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって１つ以上の所望の産物核酸分子を生成する、工程；
（ｃ）インビトロで以下を組合せる工程
（ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する該所望のセグメントを含む１つ以上の該産物分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、産物分子；
（ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む１つ以上の異なるベクタードナー分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクタードナー分子；および
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに
（ｄ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の異なるベクタードナー分子に移すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これにより１つ以上の異なる産物分子を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
１つ以上の前記所望のセグメントを前記異なるベクタードナー分子に移すのに十分な条件下で、１つ以上の異なるベクタードナー分子と前記異なる産物分子とをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所望の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングする方法であって、以下：
（ａ）インビトロで以下を組合せる工程、
（ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する１つ以上の核酸セグメントを含む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、挿入ドナー分子、
（ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む２つ以上の異なるベクタードナー分子であって、ここで該組換え部位は実質的に互いに組換わらないベクタードナー分子；および、
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに、
（ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを該異なるベクタードナー分子に移すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって２つ以上の異なる産物分子を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記挿入ドナー分子がゲノムＤＮＡ由来である、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記挿入ドナー分子がｃＤＮＡ由来である、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入ドナー分子が化学合成により生成される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクタードナー分子が少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記選択マーカーが以下：
（ａ）レシピエント細胞が耐性を提供されなければ毒性である化合物に対する該耐性をレシピエント細胞に提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｂ）ＤＮＡセグメントがコードしなければレシピエント細胞において欠けている産物をコードする該ＤＮＡセグメント；
（ｃ）レシピエント細胞中の遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｄ）同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｅ）レシピエント細胞中で細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）の任意の該ＤＮＡセグメントの活性を阻害するＤＮＡセグメント；
（ｇ）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント；
（ｈ）タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または化学物質により認識され得る特定のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント；
（ｉ）欠失した場合に、レシピエント細胞内の特定の化合物による細胞の殺傷に対する感受性を直接的または間接的に与える、ＤＮＡセグメント；
（ｊ）レシピエント細胞中で毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント；ならびに、
（ｋ）所望の分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント、
からなる群から選択された少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む、方法。
【請求項９】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクタードナー分子が原核生物および／または真核生物ベクターを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核生物ベクターが、酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核生物細胞、哺乳動物細胞、および／または昆虫細胞中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原核生物ベクターが、グラム陰性またはグラム陽性細菌中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記原核生物ベクターが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属および／またはＰｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ属の細菌中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記原核生物ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクタードナー分子が、クローニングベクター、配列決定ベクター、発現ベクター、融合ベクター、２−ハイブリッドベクター、逆２−ハイブリッドベクター、またはその誘導体または改変体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核生物ベクターが、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ＹＡＣｎｅｏ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４、ｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ならびにｐＥＢＶＨｉｓまたはその誘導体もしくは改変体からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記原核生物ベクターが、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＲＳＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ３８８−１、ならびにｐＰｒｏＥｘ−ＨＴまたはその誘導体もしくは改変体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記２−ハイブリッドおよび逆２−ハイブリッドベクターが、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡならびにｐＹＥＳＴｒｐまたはその誘導体もしくは改変体からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記挿入ドナー分子がベクターを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記挿入ドナー分子が増幅により生成されたＤＮＡセグメントを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅がＰＣＲである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記挿入ドナーが直鎖状である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記挿入ドナーが、前記直鎖状分子の片側または両側の末端でまたはその近傍で少なくとも１つの組換え部位を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換え部位がｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒｅｓからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
前記セグメントが化学合成により生成される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。操作された組換え部位を有するＤＮＡおよびベクターが、組換えタンパク質を用いるＤＮＡセグメントの効率的かつ特異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供される。このＤＮＡ、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける、ＤＮＡのサブクローニングのような種々のＤＮＡ交換のために有用である。
【０００２】
（関連技術）
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物（例えば、ウイルスおよび細菌）において存在するタンパク質であり、そしてエンドヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼは（いくつかの場合においては関連するタンパク質とともに）、ＤＮＡ中の塩基の特異的配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、総称して「組換えタンパク質」と称する（例えば、Ｌａｎｄｙ，  Ａ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７  （１９９３）を参照のこと）。
【０００３】
種々の生物由来の多数の組換え系が記載されている。例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（６）：２２８７  （１９８６）；  Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１（１）：３９１  （１９８６）；  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４（２３）：７４９５  （１９９２）；  Ｑｉａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７（１１）：７７９４  （１９９２）；  Ａｒａｋｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２５（１）：２５  （１９９２）；  ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ    Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３０：１７０−１７６（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）を参照のこと。
【０００４】
これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：４３３−４４０  （１９８６））。おそらく、これらの中で最も十分に研究されたのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ．  Ａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  ３：６９９−７０７  （１９９３））、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；  ９０−１０９頁）、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４  （１９８２））である。
【０００５】
これらの組換え系は特定の生物について特徴付けられたが、関連技術は、インビボにおける組換えについて、組換え部位により隣接される組換えＤＮＡを用いて教示されたのみである。
【０００６】
Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，６４０号）は、野生型組換え部位ａｔｔＢおよびａｔｔＰを用いる酵素学的部位特異的組換えによりＤＮＡセグメントを生成するタンパク質を組み換えるためのλリコンビナーゼのインビボにおける使用を開示する。
【０００７】
ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ  ５６：１４５−１５１  （１９８７））は、プロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の分子内組換えのためのインビボにおけるλＩｎｔリコンビナーゼの使用を開示する。これらの部位の方向は互いに逆であるので、これは目的の遺伝子に対して不可逆的なプロモーター領域のフリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）を引き起こす。
【０００８】
Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ  ８８：２５−３６  （１９９０）は、クローン化されるＤＮＡ配列の外側および野生型ｌｏｘＰ部位間に配置された制限部位を含有するバクテリオファージλアームを有するファージλベクターを開示する。これらのファージベクターを用いる、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＥ．  ｃｏｌｉ細胞の感染は、ｌｏｘＰ部位間での組換えおよびプラスミドレプリコン（クローン化ｃＤＮＡを含む）のインビボ切り出しを生じる。
【０００９】
Ｐｏｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：２３９２−２３９８  （１９９４））は、ゲノムＤＮＡ中へ、２つの野生型ＦＲＴ認識配列により隣接される選択マーカーを有する部分的発現ベクターを挿入するための方法を開示する。細胞中に存在するＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼが、ベクターをゲノム中に所定の部位において組み込むために使用される。レプリコンが機能的である条件下において、このクローン化ゲノムＤＮＡは増幅され得る。
【００１０】
Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０６６号）は、２つのｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡのためのＣｒｅのような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位間のインビボ組換えのために使用されることを開示する。
【００１１】
Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：８１７−８２１（１９９３））は、Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するＣｒｅ部位特異的リコンビナーゼにより作用される野生型ｌｏｘＰ部位を含有する脱リン酸化されたベクターの分子間連結を促進する条件を用いて平滑末端ＤＮＡのクローニングを容易にする方法を開示する。
【００１２】
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＰＣＴ第９３／１９１７２号およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１（９）：２２６５  （１９９３））は、特定の抗体のＬ鎖およびＨ鎖がｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１部位の間で異なるファージベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなＥ．  ｃｏｌｉ細胞を形質転換するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主細胞において２つの親分子（１つはプラスミド、１つはファージ）に作用する）は４つの産物を平衡して生成した：２つの異なる共挿入（ｌｏｘＰ部位またはｌｏｘＰ  ５１１部位のいずれかにおける組換えにより生成される）、および２つの娘分子（その１つが所望された産物であった）。
【００１３】
他の関連技術とは対照的に、ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｂｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１  （１９９４））は、各々が野生型およびスペーサー変異されたＦＲＴ組換え部位により隣接される、規定された染色体位置において発現カセットを交換するためのインビボ方法を開示する。二重相互交叉（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が部位特異的組換えのためにこのＦＬＰ／ＦＲＴ系を用いることにより、培養哺乳動物細胞において媒介された。
【００１４】
トランスポゼース。酵素のファミリーであるトランスポゼースもまた、レプリコン間で遺伝子情報を移動するために使用されている。トランスポゾンは構造的に可変性であるが（単純（ｓｉｍｐｌｅ）または複合（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と記載される）、代表的には逆方向に組織されるＤＮＡ配列により隣接されるリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであり得るかまたは高度に特異的であり得る。Ｔｎ７（これは高度に部位特異的である）のような代表物が、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボにおける移動に適用された（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４５６６−４５７９  （１９９３））。
【００１５】
ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：３７６５−３７７２  （１９９４）は、ＤＮＡセグメントのインビトロにおけるレシピエントＤＮＡ分子中への挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示する。この系は、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的のＤＮＡセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様エレメントＴＹ１の末端間にクローン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下において、生じるエレメントは第２の標的ＤＮＡ分子中へランダムに組み込まれる。
【００１６】
ＤＮＡクローニング。ＤＮＡセグメントのクローニングは、現在、多数の研究所における日常的な慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必要な工程として生じている。しかし、これらのクローニングの目的は多様であり、２つの一般的な目的は以下にように考えられ得る：（１）大きなＤＮＡまたはＲＮＡセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、ｍＲＮＡなど）からのＤＮＡの最初のクローニング（ｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのような比較的少ない公知のベクターにおいて実施される）、および（２）これらのＤＮＡセグメントの特殊化されたベクター中への機能的分析のためのサブクローニング。多量の時間および努力が、ＤＮＡセグメントの最初のクローニングベクターからより特殊化されたベクターへの移動においての両方で費やされている。この移動はサブクローニングと呼ばれる。
【００１７】
クローニングのための基本的な方法は長年公知であり、そしてその間にほとんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは以下のとおりである：
（１）  目的のＤＮＡを１つまたは２つの制限酵素で消化し；
（２）  既知の場合目的のＤＮＡセグメントをゲル精製し；
（３）  適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精製など（適切なように）によりベクターを調製し；
（４）  未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを除去するための適切なコントロールを用いて、ＤＮＡセグメントをベクターに連結し；
（５）  生じるベクターをＥ．  ｃｏｌｉ宿主細胞中に導入し；
（６）  選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ；
（７）  ＤＮＡミニプレップを作製し；そして
（８）  アガロースゲル上で（しばしば診断的制限酵素消化の後）またはＰＣＲにより、単離されたプラスミドを分析する。
【００１８】
ＤＮＡセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベクターは、機能的に多様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定されない：種々の生物において遺伝子を発現させるためのベクター；遺伝子発現を調節するためのベクター；タンパク質精製を補助するため、または細胞におけるタンパク質の追跡を可能にするためのタグを提供するためのベクター；クローン化されたＤＮＡセグメントを改変（例えば、欠失の生成）するためのベクター；プローブの合成（例えば、リボプローブ）のためのベクター；ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートの調製のためのベクター；タンパク質コード領域の同定のためのベクター；種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクター；多量の目的のＤＮＡを提供するためのベクターなど。特定の研究が、目的のＤＮＡセグメントをいくつかの異なる特殊化されたベクター中へサブクローニングする工程を包含することは一般的である。
【００１９】
当該分野において公知であるように、単純なサブクローニングは１日で実施され得る（例えば、ＤＮＡセグメントが大きくなく、そして制限部位がサブクローニングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、他の多くのサブクローニング（特に、未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数週間かかり得る。従って、ＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、しばしば、可能な限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。ＤＮＡセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が、例えば以下の参考文献におけるように記載されている。
【００２０】
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，  Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １６：１９１  （１９８１）は、酵母ＤＮＡのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開示する。このベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母ＤＮＡセグメントのクローンが部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクター中に連結され得る。もとのクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を有する場合には、形質転換の前に精製は必要ではない。なぜなら、選択はカナマイシンについてであるからである。
【００２１】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ  ４１：１２５  （１９８６）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内のユニークなクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主において、優性感受性遺伝子における挿入または欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択を生き残る。
【００２２】
従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、時間がかかり、そして比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そして２日目以降に所望のサブクローンが候補プラスミドの中で見出され得なければ、次いで、全体のプロセスが意図される別の条件で繰り返されなければならない。部位特異的リコンビナーゼがＤＮＡをインビボにおいて組換えるために使用されたが、インビトロにおけるこのような酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱えると予想された。例えば、部位特異性および効率は、インビトロにおいて異なると予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてＤＮＡ基質および組換えタンパク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なると予想された（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：６６１−７３  （１９９２）を参照のこと）。インビボにおいて長時間続き得る反応は、インビトロにおいて酵素が不活性になる前に有意により短い時間で生じると予想された。複数のＤＮＡ組換え産物が、使用される生物学的宿主において予想され、サブクローニングの不満足な信頼性、不満足な特異性または不満足な効率を生じた。従ってインビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を生じるに十分に効率的であるとは予想されなかった。
【００２３】
従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超えて利点を提供する別のサブクローニング系を提供することが、長い間必要と感じられていた。
【００２４】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および少なくとも１つの組換え部位を用いる、増幅されたキメラ核酸分子または増幅された組換え核酸分子を得るための、核酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの方法は、標準のクローニングまたはサブクローニング技術より、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的のために有用なＤＮＡもしくはＲＮＡのクローニングまたはサブクローニング、調節または交換を容易にする。
【００２５】
本発明は、所望の性質および／またはＤＮＡセグメントを有する、キメラＤＮＡ分子を提供するための、少なくとも１つの組換え部位および少なくとも１つの組換えタンパク質を用い、核酸セグメント（好ましくは、ＤＮＡセグメントまたはフラグメント）を移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関連する。従って、本発明の使用は、種々のベクター内に、このような核酸分子をクローニングまたはサブクローニングすることを可能にする。一般に、１つ以上の親核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ分子）が組換えられて、１つ以上の娘分子を与え、その少なくとも１つが所望の産物分子であり、好ましくは、それが所望の核酸セグメントを含むベクターである。従って、本発明は、交換をもたらすための、および／または１つ以上の所望の産物を選択するための、核酸分子、ベクターおよび方法に関する。
【００２６】
本発明の１つの実施態様は、キメラＤＮＡの作製方法に関し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）  インビトロまたはインビボにおいて、
（ｉ）  第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望の核酸セグメントを含む、１つ以上の挿入ドナーＤＮＡ分子であって、ここで第１および第２の組換え部位は、実質的に互いに組換えない；
（ｉｉ）  第３の組換え部位および第４の組換え部位を含む、１つ以上のベクタードナー分子であって、ここで、第３および第４の組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および
（ｉｉｉ）  第１および第３の組換え部位および／または第２および第４の組換え部位を組換え得る、１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
それにより、組換えを生じさせ得、その結果少なくとも１つのコインテグレート核酸分子、上記所望のセグメントを含む少なくとも１つの所望の産物核酸分子、および必要に応じて副産物核酸分子を生成する工程；次いで、必要に応じて、
（ｂ）  産物または副産物ＤＮＡ分子について選択する工程。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、キメラ分子の生成の方法に関し、以下の工程を包含する
（ａ）  インビトロまたはインビボにおいて、
（ｉ）  ２つ以上の組換え部位に隣接する所望の核酸セグメントを含む、１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；
（ｉｉ）  ２つ以上の組換え部位を含む、１つ以上のベクタードナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および
（ｉｉｉ）  １つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせる工程、
（ｂ）  １つ以上の上記ベクタードナー分子内に１つ以上の上記所望のセグメントを移すために十分な条件下で上記組み合わせ物をインキュベートする工程であって、これにより１つ以上の産物分子を生成する工程。生じた産物分子を、コインテグレート分子、副産物分子、および未反応のベクタードナー分子または挿入ドナー分子のような別の分子から離れて、必要に応じて選択し得るか、または必要に応じて単離し得る。本発明の好ましい局面において、挿入ドナー分子を、１つ以上の異なったベクタードナー分子と結合し、これにより異なった産物分子の生成を可能にし、ここで目的の核酸を、単段階で任意の数の異なったベクター内に移す。
【００２８】
本発明に従って、上記方法は逆転されて、元々の挿入ドナー分子を提供し得、次いで、この挿入ドナー分子を１つ以上の異なったベクタードナー分子と組み合わせて使用して、新規の産物分子または副産物分子を生成し得る。あるいは、本発明の方法により生成された産物分子は、１つ以上の異なったベクタードナー分子と直接組み合わせて使用され得る挿入ドナー分子として作用し得、これによって、新規の産物分子または副産物分子を生成し得る。従って、目的の核酸分子を、任意の数の所望のベクターに移し得、または移動し得、これによって、目的の分子をサブクローニングするための効果的な手段を提供する。
【００２９】
従って、本発明は、第２の産物分子を生成するための第２のベクタードナー分子と産物分子を組み合わせすることに関する。次に、第２の産物ＤＮＡ分子を、第３の産物分子を生成するために第３のベクタードナー分子と組み合わせて利用し得る。本発明のこのプロセスを、任意の数の異なったベクター内に目的の挿入物を移すまたは移動するために任意の回数を繰り返し得る。本発明のこの局面において、２つ以上の異なったベクタードナー分子の組合わせを、単段階で異なった産物分子を生成するための産物分子と組み合わせ得る。ここで、所望の核酸セグメント（産物ＤＮＡ分子由来）を、任意の数の異なったベクターに移す。
【００３０】
特に、本発明は、１つ以上の所望の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングするための方法に関し、以下の工程を包含する：
（ａ）インビトロまたはインビボにおいて、
（ｉ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した１つ以上の所望の核酸セグメントを含む、１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；
（ｉｉ）少なくとも２つの組換え部位を含む、１つ以上のベクタードナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および
（ｉｉｉ）１つ以上の上記部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせる工程、
（ｂ）  １つ以上のこのベクタードナー分子内に１つ以上のこの所望のセグメントを移し得るために十分な条件下で上記の組み合わせ物をインキュベートする工程であって、これによって、１つ以上の産物分子を生成する工程；
（ｃ）  上記の産物分子を必要に応じて選択または単離する工程；
（ｄ）  インビトロまたはインビボにおいて
（ｉ）２つ以上の組換え部位に隣接した所望の核酸セグメントを含む、１つ以上の産物分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；
（ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む、１つ以上の異なったベクタードナー分子であって、ここで、この組換え部位は、実質的に互いに組換えない；および    （ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせる工程；および
（ｅ）１つ以上の異なったベクタードナー分子内に１つ以上の所望のセグメントを移すために十分な条件下で該組み合わせ物をインキュベートする工程であって、これにより、１つ以上の異なった産物分子を生成する、工程。
【００３１】
本発明に従って、ベクタードナー分子は、種々の系または宿主細胞において機能し得るベクターを含み得る。本発明に使用するための好ましいベクターは、原核細胞ベクター、真核細胞ベクター、または種々の原核生物系および／または真核生物系の間で往復し得るベクター（例えば、シャトルベクター）を含む。本発明に使用するための好ましい原核生物ベクターは、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属の細菌を含むグラム陰性細菌および／またはグラム陽性細菌において、ならびに好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ種において増殖および／または複製し得るベクターを含むが、これに限定されない。本発明に使用するための真核生物ベクターは、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、（特にヒト細胞）、真菌細胞、昆虫細胞、魚細胞などにおいて増殖および／または複製するベクターを含む。目的の特定のベクターは、クローニングベクター、配列決定ベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクター、遺伝子治療ベクター、および逆方向ツーハイブリッドベクターを含むが、これに限定されない。このようなベクターは、特定のベクターに依存して原核生物系および／または真核生物系において使用され得る。
【００３２】
本発明に従って使用した挿入ドナー分子は、好ましくは、ドナー分子の挿入物（例えば、目的の核酸セグメント）を、本発明に従って１つ以上のベクタードナー分子内に移する、または移動することを可能にするための２つ以上の組換え部位を含む。本発明の挿入ドナー分子を、目的の分子を付加した２つ以上の組換え部位により、任意の多数の技術によって調製し得る。本発明の挿入ドナー分子を調製するために組換え部位を含むためのこのような技術は、核酸分子の変異誘発（例えば、ランダムまたは部位特異的変異誘発）、組換え技術（例えば、アダプターの連結または核酸分子の組換え部位を含む直鎖分子への連結）、増幅（例えば、組換え部位またはその部分を含むプライマーを使用する）遺伝子転移（例えば、組換え部位を含むトランスポゾンを使用する）、組換え（例えば、組換え部位を含む１つ以上の相同な配列を使用する）、核酸合成（例えば、組換え部位を含む分子の化学的合成または種々のポリメラーゼもしくは逆転写酵素を使用する酵素学的合成）などを含む。本発明に従って、１つ以上の組換え部位が付加される核酸分子は、任意の供給源から由来する任意の核酸分子であり得、そして非天然に存在する核酸を含み得る（例えば、ＲＮＡ’ｓ、米国特許第５，５３９，０８２および５，４８２，８３６を参照のこと）。特に好ましい核酸分子は、ＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）である。さらに、挿入ドナー分子を生成するための目的の核酸分子は、直鎖または環状であり得、そしてさらに、目的の特定の配列（例えば、遺伝子）を含み得るか、または分子の集団（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから作製された分子）であり得る。
【００３３】
従って、本発明は、挿入ドナー分子およびこのような方法で作製された挿入ドナー分子を作製するための多数の方法に関する。本発明の１つの局面において、１つ以上の組換え部位またはその部分を含むプライマーを、本発明の挿入ドナー分子を調製するための核酸合成または核酸増幅に使用する。従って、本発明は、核酸分子を合成するための方法に関連し、以下の工程を包含する：
（ａ）  ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーと、１つ以上の核酸テンプレートとを混合する工程；および
（ｂ）  このテンプレートの全部または一部分に相補的な１つ以上の核酸分子および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子を合成するために十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程。本発明に従って、テンプレートを含む組換え部位の全部または一部分に相補的な核酸分子を合成するために適切な条件下で、テンプレートとして、１つ以上の該組換え部位を含む合成された核酸分子を使用し得、それによって、１つ以上の組換え部位を含む二本鎖分子を形成する工程。好ましくは、１つ以上の組換え部位を含む、１つ以上のプライマーの存在下で、このような第２合成段階を行なう。なお別の局面において、１つ以上の組換え部位を含み得るプライマーを用い、合成された二本鎖分子を増幅し得る。
【００３４】
本発明の別の局面において、任意の数の核酸増幅技術により、核酸分子に１つ以上の組換え部位を付加し得る。特に、このような方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）  ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドの存在下で、前記第１の核酸分子の一部分に相補的な第１のプライマー分子と、第１の核酸分子を接触する工程、および第２の核酸分子の一部分に相補的な第２プライマー分子と、第２の核酸分子を接触させる工程；
（ｂ）  第１核酸分子の全部または一部分に相補的な第３の核酸分子を形成するために十分な条件下で該分子をインキュベートする工程、および第２の核酸分子の全部または一部分に相補的な第４の核酸分子を形成するために十分な条件下で該分子をインキュベートする工程；
（ｃ）  第１および第３、ならびに第２および第４の核酸分子を変性させる工程；および
（ｄ）  段階（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程であって、ここで、該第１および／または該第２プライマー分子は、１つ以上の組換え部位またはその部分を含む。
【００３５】
本発明のなお別の局面において、核酸分子に１つ以上の組換え部位を付加するための方法は、以下の工程を包含し得る：
（ａ）  １つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のアダプターまたは核酸分子と、１つ以上の核酸分子を接触させる工程；および
（ｂ）  この核酸分子に１つ以上の組換え部位を付加するために十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程。好ましくは、直鎖分子を、本発明に従って、このようなアダプターまたは分子に付加するために使用し、そしてこのようなアダプターまたは分子を、好ましくは、このような直鎖分子の１つ以上の末端に付加する。機械的に（例えば、超音波処理または剪断）または酵素的に（例えば、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ）を含む任意の技術により、直鎖分子を調製し得る。従って、本発明の方法は、１つ以上のヌクレアーゼ（好ましくは、任意の制限エンドヌクレアーゼ）で核酸分子を消化する工程、および目的の分子にアダプターまたは分子を含む１つ以上の組換え部位を連結する工程をさらに包含し得る。平滑末端または突出末端分子を用い、連結を成し遂げ得る。あるいは、本発明に従って、組換え部位を導入するために、トポイソメラーゼを使用し得る。トポイソメラーゼを、核酸分子を開裂し、そして再結合し、そのために、ヌクレアーゼおよびリガーゼの代わりに使用し得る。
【００３６】
別の局面において、デノボ合成により核酸分子に、１つ以上の組換え部位を付加し得る。従って、本発明は、合成プロセスの間、ヌクレオチドの適切な配列を付加することにより組換え部位を付加することにおいて、１つ以上の核酸分子を化学的に合成することを含むこのような方法に関する。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、１つ以上の組換え部位を、以下の工程を包含する方法により目的の核酸分子に付加し得る：
（ａ）  １つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上の組み込み配列と、１つ以上の核酸分子を接触させる工程；および
（ｂ）核酸分子内に組み込み配列を含む組換え部位を取り込むために十分な条件下で混合物をインキュベートする工程。本発明のこの局面に従って、組み込み配列は、組換えによって、または組み込みにより目的の核酸分子の一部分になる任意の核酸分子を含み得る。本発明のこの局面に従って、インビボまたはインビトロの組換え（相同組換えまたは非正統的な組換え）によって、またはトランスポゾン、配列挿入、組み込みウイルス、ホーミングイントロン、または他の組み込みエレメントを用いることにより、インビボまたはインビトロの導入により、組み込み配列を導入し得る。
【００３８】
他の局面において、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットに関し、そしてより詳細には、クローニングまたはサブクローニングキットおよび本発明の挿入ドナー分子を作製するためのキットに関する。このようなキットは、任意の数の容器をその中に受け入れ、そして保持するために区切られた担体または容器を含み得る。このような容器は、本発明の方法およびこのような成分の組み合わせを実行するための、任意の数の成分を含み得る。特に、本発明のキットは、１つ以上の組換えタンパク質またはリコンビナーゼ、１つ以上のベクタードナー分子、１つ以上の挿入ドナー分子および１つ以上の宿主細胞（例えば、コンピテントセル）からなる群より選択された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。
【００３９】
本発明の挿入ドナー分子を作製するためのキットは、任意または多数の成分を含み得、そしてこのようなキットの組成は、含まれる特定の方法に非常に依存して変化し得る。増幅により挿入ドナー分子を合成するためのキットは、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ、そして最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上プライマーからなる群より選択された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。組換え部位を目的の核酸分子に挿入または付加するためのキットは、１つ以上のヌクレアーゼ（好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ）、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のトポイソメラーゼ、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子またはアダプターを含み得る。組換え部位を１つ以上の目的の核酸分子内に組み込むためのキットは、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の組み込み配列からなる群より選択された１つ以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。このような組み込み配列は、１つ以上のトランスポゾン、組み込みウイルス、相同組換え配列、１つ以上の宿主細胞などを含み得る。
【００４０】
本発明はまた、本発明の方法を実行するための組成物、または本発明の方法を実行することにより生成される組成物に関する。特に、このような組成物は、１つ以上の挿入ドナー分子、１つ以上のベクタードナー分子、および１つ以上の組換えタンパク質（または、その組み合わせ）を含み得る。さらなる局面において、本発明の組成物は、１つ以上のコインテグレート分子、１つ以上の産物分子、および１つ以上の副産物分子（またはその組み合わせ）を含み得る。
【００４１】
挿入ドナー分子を調製することに関連した組成物は、所望の挿入ドナー分子を調製することに利用される特定の方法に非常に依存して変化し得る。増幅によりこのような分子を調製するための組成物は、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチド、および増幅するための１つ以上の核酸分子（またはその組み合わせ）を含み得る。所望の核酸分子に組換え部位を挿入することまたは付加することに関連した組成物は、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子またはアダプター、１つ以上のリガーゼ、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ、１つ以上のトポイソメラーゼ、およびこのような組換え部位を含むために所望される１つ以上の核酸分子（またはその組み合わせ）を含み得る。所望の核酸分子に組換え部位を組み込むことに関連した組成物は、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の組み込み配列、および組換え部位を含むために所望される１つ以上の核酸分子を含み得る。
【００４２】
本発明の特に好ましい局面において、ライブラリー（例えば、ランダム配列または縮重オリゴヌクレオチドのようなデノボ合成により生成されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの集団、あるいは核酸分子の集団）を、本発明に従って利用する。核酸分子のこのような集団に組換え部位を挿入、または付加することにより、挿入ドナー分子の集団を生成する。本発明の組換え方法により、異なったベクター（またはベクターの組み合わせ）内に、従って、ライブラリーまたはライブラリー由来の特定の配列もしくはクローンを評価および分析するための異なった宿主系（原核生物および真核生物）内に、ライブラリーを容易に移動し得る。あるいは、所望の分子を含むベクターを、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の生成のためのインビトロ発現系のようなインビトロ系において使用し得る。特に好ましい局面において、１つ以上の組換え部位を、以下の工程を包含する方法によりライブラリーの核酸分子に付加する：
（ａ）  直鎖核酸分子の集団と１つ以上の組換え部位を含む１つ以上のアダプターとを混合する工程、
（ｂ）  直鎖分子の１つ以上の末端に１つ以上のアダプターを付加するために十分な条件下で混合物をインキュベートする工程。好ましい局面において、核酸分子の集団は、二本鎖ＤＮＡ分子（好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。本発明において使用するための直鎖フラグメントの集団を、ゲノムまたはｃＤＮＡを（機械的手段にまたは酵素学的手段により）開裂することにより調製し得る。好ましい局面において、直鎖分子の１つ以上の末端にアダプターを付加する。
【００４３】
本発明の別の特に好ましい局面において、本発明の挿入ドナーＤＮＡ分子の集団を調製するために、ｃＤＮＡライブラリーを使用する。特に、本発明のこの局面は、以下の工程を包含する方法に関する：
（ａ）  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはポリＡ＋ＲＮＡテンプレートの集団と逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、および１つ以上の組換え部位を含む１つ以上のプライマーを接触する工程、
（ｂ）  テンプレートに相補的なＤＮＡ分子の第１の集団を合成するために十分な条件下で混合物をインキュベートする工程であって、ここでＤＮＡ分子は、１つ以上の組換え部位を含む。本発明のこの局面は、ＤＮＡ分子の第１の集団の全部または一部に相補的なＤＮＡ分子の第２の集団を生成するために十分な条件下で、合成されたＤＮＡをインキュベートする工程をさらに含み得、これによって１つ以上の組換え部位を含む二本鎖ＤＮＡ分子の集団を形成する。
【００４４】
特に好ましい局面において、本発明の挿入ドナー分子は、少なくとも２つの組換え部位を含み、ここで挿入ドナー分子は、直鎖であり、このような２つ以上の組換え部位を、好ましくは、分子の両末端に、またはその近くに配置する。本発明に従って、さらなる組換え部位（２つ以上）の使用を、このような組換え部位の形態および配置に依存する、挿入ドナー分子内に異なった挿入物のサブクローニングを容易にするために使用し得る。
【００４５】
別の実施態様は、本発明の方法において有用なＤＮＡおよびベクターを含む。特に、１つの実施態様において、ベクタードナー分子を提供し、ここで、ベクタードナー内のＤＮＡセグメントを、（ｉ）  環状ベクタードナーにおいて、少なくとも２つの組換え部位で、または（ｉｉ）  直鎖状ベクタードナーにおいて、少なくとも１つの組換え部位で、のいずれかにより分離し、ここで、組換え部位は、好ましくは、組換えの特異性または効率を増強するように操作される。１つのベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含む。第２のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、毒性遺伝子を含む。第３のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの選択マーカーの不活性フラグメントを含み、ここで選択マーカーの不活性フラグメントは、第１または第２の組換え部位を少なくとも１つの選択マーカーの別の不活性フラグメントで横切って組み換えられる場合に機能的な選択マーカーを再構成し得る。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施態様は、当該分野において公知であることに照らして、本発明の以下の図面および記載に照らして、そして特許請求の範囲に照らして当業者に明白である。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
可逆的なおよび／または繰り返しの可能なクローニングまたはサブクローニング反応が組換えタンパク質および組換え部位を使用してキメラ核酸を形成するための核酸を操作するために使用され得ることが、本発明において予期せずに発見される。従って、本発明による組換えクローニングは、インビトロおよびインビボにおける核酸分子のセグメントを移動または交換するための少なくとも１つの選択された組換え部位を有する組換え核酸分子と共に組換えタンパク質を使用する。
【００４８】
これらの方法は、所望の特性（単数または複数）および／または核酸セグメント（単数または複数）を有するキメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生成するために組換え反応を使用する。本発明の方法は目的の核酸分子が任意の数のベクター系に移動または移入され得る手段を提供する。本発明に従って、種々のベクター系へのこのような移入は、別々に、連続的にまたは集団で（例えば、１工程において任意の数の異なったベクター中で）達成され得る。本発明の改良された特異性、速度および／または収量は、任意の関連した目的のために有用なＤＮＡまたはＲＮＡのクローニング、サブクローニング、調節または交換を容易にする。このような目的としては、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントのインビトロ組換え、および転写されたか、複製されたか、単離されたかもしくはゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡのインビトロまたはインビボにおける挿入あるいは改変が挙げられる。
【００４９】
（定義）
以下の記載において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が広く利用される。明細書および請求の範囲（このような用語に与えられるべき範囲を含む）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００５０】
副産物：これは、クローン化またはサブクローン化されることが所望されるセグメントを欠く、娘分子（組換えクローニングプロセスの間、第２の組換え事象の後に産生される新たなクローン）である。
【００５１】
コインテグレート：これは、親（出発）分子の両方を含む、本発明の少なくとも１つの組換え中間体核酸分子である。これは通常環状である。いくつかの実施態様においては、これは直鎖状であり得る。
【００５２】
宿主：これは、組換えクローニング産物のレシピエントであり得る、任意の原核生物または真核生物である。本明細書において用いられる用語「宿主」は、遺伝子操作され得る原核生物または真核生物を包含する。このような宿主の例については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８２）を参照のこと。
【００５３】
挿入物（単数または複数）：これは、本発明の方法により操作され得る所望の核酸セグメントまたは核酸セグメントの集団（図１のセグメントＡ）を含む。従って、用語「挿入物（単数または複数）」は、特定の核酸（好ましくはＤＮＡ）セグメントまたはセグメントの集団を含むことを意味する。このような挿入物（単数および複数）は１以上の遺伝子を含み得る。
【００５４】
挿入ドナー：これは、挿入物を有する、本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のうちの１つである。この挿入ドナー分子は、両方の末端において組換え部位に隣接される挿入物を含む。この挿入ドナーは直鎖状または環状であり得る。本発明の１つの実施態様において、この挿入ドナーは環状ＤＮＡ分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む（図１を参照のこと）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団が挿入ドナーを作製するために使用される場合、挿入ドナーの集団が生じ、そして本発明に従って使用され得る。
【００５５】
産物：これは、組換えクローニングプロセスの間、第２の組換え事象の後に産生される、ＡおよびＤ配列を含む１つの所望の娘分子である（図１を参照のこと）。この産物は、クローン化またはサブクローン化されるべきであった核酸を含む。本発明に従って、挿入ドナーの集団が使用される場合、生じた産物分子の集団は、挿入ドナーの挿入物の集団のすべてまたは一部を含み、そして好ましくは、挿入ドナーの最初の分子の代表的集団を含む。
【００５６】
プロモーター：これは、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領域として一般に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写はプロモーター領域で開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に応答して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加する。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化し得るが、特異的に調節されない。
【００５７】
認識配列：認識配列は、タンパク質、化学物質、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識し、そして結合する、特定の配列である。本発明において、認識配列は通常、組換え部位のことをいう。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための認識配列は、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として作用する）からなる３４塩基対の配列である、ｌｏｘＰである。Ｓａｕｅｒ，  Ｂ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７  （１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例としては、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対の重複領域を含む約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型Ｉｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳ、およびエグジショナーゼ（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）（Ｘｉｓ）のための部位を含む約２４０塩基対の配列である。Ｌａｎｄｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７  （１９９３）を参照のこと。このような部位はまた、本発明に従って操作され、本発明の方法における産物の産生を増強し得る。このように操作された部位が組換え反応を不可逆的にするためにＰ１またはＨ１ドメインを欠く場合（例えば、ａｔｔＲまたはａｔｔＰ）、このような部位は、これらの部位のドメインが何らかの方法で修飾されることを示すためにａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’と命名され得る。
【００５８】
リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素である。
【００５９】
組換えクローニング：これは、本明細書において記載される方法であって、これにより核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまたはインビボにおいて、交換、挿入、取り替え（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）または改変される。
【００６０】
組換えタンパク質：これは、１つ以上の組換え部位を含む組換え反応に関与する、切り出しタンパク質または組み込みタンパク質、酵素、コファクターまたは会合タンパク質を包含する。Ｌａｎｄｙ  （１９９４）（下記）を参照のこと。
【００６１】
抑制カセット：これは、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカーのリプレッサーを含む核酸セグメントである。
【００６２】
選択マーカー：これは、特定の条件下でしばしば、それを含有する分子または細胞について、あるいはそれを含有する分子または細胞に対して選択することを可能にする、ＤＮＡセグメントである。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生のような（これらに限定されない）活性をコードし得るか、あるいは、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物などのための結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：（１）そうでなければ毒性ある化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（２）レシピエント細胞において別に欠如している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）；（５）そうでなければ細胞の生存および／または機能に有害である産物に結合するＤＮＡセグメント；（６）そうでなければ上記番号（１）〜（５）に記載のＤＮＡセグメントのいずれかの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望の分子（例えば、特定のタンパク質結合部位）を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント；（９）そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する耐性または感受性を与えるＤＮＡセグメント；および／または（１１）レピシエント細胞において毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント。
【００６３】
選択スキーム：これは、挿入ドナー、ベクタードナー、任意の中間体、（例えば、コインテグレート）および／または副産物を含む混合物からの、所望の産物（単数または複数）の、選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である。１つの好ましい実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に連結されているまたは連結されていないのいずれかである、少なくとも２つの成分を有する。一方の成分は選択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーのインビトロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マーカーを有するプラスミドを有する細胞の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現を制御するための他の手段が使用され得る。リプレッサーが使用されるかアクチベーターが使用されるかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポジティブ選択用であるかネガティブ選択用であるか、および種々のＤＮＡセグメントの正確な配列に依存する。好ましい必要条件は、選択スキームが１つ以上の所望の産物のみの選択または富化を生じることである。本明細書において定義されるように、ＤＮＡ分子について選択は、（ａ）所望のＤＮＡ分子の存在について選択または富化する工程、および（ｂ）所望のＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子の存在に対して選択または富化する工程を包含する。
【００６４】
１つの実施態様において、この選択スキーム（これは、逆に実施され得る）は、３つの形態のうちの１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選択マーカーおよびそのリプレッサーについて本明細書において例示される）は、セグメントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子について選択する。第２は、セグメントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有する分子について選択する。第２の形態の可能な実施態様は、その中にインビトロ反応産物が導入されるべき細胞に対して毒性な遺伝子を保持するＤＮＡセグメントを有する。毒性遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはＲＮＡ）として発現されるＤＮＡであり得るか、またはそれ自体でおよびそれだけで毒性であり得る（後者の場合において、毒性遺伝子はその古典的な定義の「遺伝性の特性（ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｔｒａｉｔ）」を有すると理解される）。
【００６５】
このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１またはｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミリーのメンバー）、レトロウイルス遺伝子（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の毒性遺伝子産物を含む）、ディフェンシン（例えば、ＮＰ−１、逆方向反復または対の回文構造のＤＮＡ配列、バクテリオファージ溶解遺伝子（例えば、φＸ１７４またはバクテリオファージ  Ｔ４由来の遺伝子）；抗生物質感受性遺伝子（例えば、ｒｐｓＬ）、抗菌剤感受性遺伝子（例えば、ｐｈｅＳ、プラスミド殺傷遺伝子、バクテリアに対して毒性の遺伝子産物を産生する真核生物転写ベクター遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ−１）および抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢまたはｃｃｄＢ）を含むがそれらに限定されない。あるいは、毒性遺伝子はインビトロにおいて選択され得る（例えば、制限部位）。
【００６６】
誘導プロモーターに対して作動可能に連結した制限エンドヌクレアーゼについてコードする多くの遺伝子が知られ、そして本発明において使用され得る。例えば、米国特許第４，９６０，７０７号（ＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ）；同第５，００，３３３号、５，０８２，７８４号、および同第５，１９２，６７５号（ＫｐｎＩ）；同第５，１４７，８００号（ＮｇｏＡＩＩＩおよびＮｇｏＡＩ）；５，１７９，０１５号（ＦｓｐＩおよびＨａｅＩＩＩ）；同第５，２００，３３３号（ＨａｅＩＩおよびＴａｑＩ）；同第５，２４８，６０５号（ＨｐａＩＩ）；同第５，３１２，７４６号（ＣｌａＩ）；同第５，２３１，０２１号および同第５，３０４，４８０号（ＸｈｏＩおよびＸｈｏＩＩ）；同第５，３３４，５２６号（ＡｌｕＩ）；同第５，４７０，７４０号（ＮｓｉＩ）；同第５，５３４，４２８号（ＳｓｔＩ／ＳａｃＩ）；同第５，２０２，２４８号（ＮｃｏＩ）；同第５，１３９，９４２号（ＮｄｅＩ）；および同第５，０９８，８３９号（ＰａｃＩ）を参照のこと。Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ．Ｇ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：２５３９−２５６６（１９９１）；およびＬｕｎｎｅｎ、Ｋ．Ｄら、Ｇｅｎｅ  ７４：２５−３２（１９９８）もまた参照のこと。
【００６７】
第２の形態において、セグメントＤは選択マーカーを有する。この毒性遺伝子は、ベクタードナー、コインテグレート、および副産物分子を有する形質転換体を除去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞について、および挿入ドナーのみを有する細胞に対して選択するために使用され得る。
【００６８】
第３の形態は、同一の分子上にシスでセグメントＡおよびセグメントＤの両方を有する細胞については選択するが、異なる分子上にトランスで両方のセグメントを有する細胞については選択しない。これは、２つの不活性なフラグメント（各々１つがセグメントＡおよびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具体化され得る。
【００６９】
このフラグメントは、セグメントが組換え事象により一緒にもたらされる場合、それらが機能性の選択マーカーを再構成するように、組換え部位に関して配列される。例えば、この組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と連結し得、構造遺伝子の２つのフラグメントを連結し得、または生存のために必要なヘテロダイマー遺伝子産物をコードする遺伝子を連結し得、またはレプリコンの部分を連結し得る。
【００７０】
部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表的には少なくとも以下の４つの活性（またはその組合わせ）を有するリコンビナーゼの型である：（１）１または２つの特異的核酸配列の認識；（２）前記配列（単数または複数）の切断；（３）鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性；および（４）核酸の切断された鎖の再封鎖（ｒｅｓｅａｌ）をするリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７  （１９９４）を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーについての高度の特異性により、相同組換えおよび転位から区別される。鎖交換機構は、ＤＮＡ合成の非存在下における特異的ＤＮＡ配列の切断および再結合を含む（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５８：９１３−９４９）。
【００７１】
サブクローニングベクター：これは、好ましくは、適切なレプリコンを含む環状または直鎖状核酸分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクローニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、最終産物中に組み込まれて、クローン化されたＤＮＡ挿入物（図１におけるセグメントＡ）に対して作用するか、またはそれとともに作用することが所望される、機能性および／または調節エレメントを含み得る。このサブクローニングベクターはまた、選択マーカー（好ましくはＤＮＡ）を含み得る。
【００７２】
ベクター：これは、挿入物に、有用な生物学的または生化学的性質を提供する核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ）である。例としては、インビトロまたは宿主細胞において複製し得るかまたは複製され得る、あるいは所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の位置に運搬し得る、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、動原体および他の配列が挙げられる。ベクターは、そこにおいて配列が、ベクターの本質的な生物学的機能を損失することなく決定可能な様式で切断され得、そしてその中に核酸フラグメントが、その複製およびクローニングを生じさせるためにスプライスされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣＲのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同組換え、転移または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントの挿入方法（例えば（これらに限定されない）、ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号、その全体が本明細書中に参考として援用される）、Ｔ：Ａクローニングなど）はまた、本発明に従って使用されるべきクローニングベクター中へフラグメントをクローン化するために適用され得る。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用のために適切な１つ以上の選択マーカーをさらに含み得る。
【００７３】
ベクタードナー：これは、所望の産物の部分になるべきＤＮＡベクターを含むＤＮＡセグメントを有する、本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つである。このベクタードナーは、組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターＤ（または、挿入ドナーが既にクローニングベクターを含まない場合、これはクローニングベクターと呼ばれ得る）および組換え部位によって隣接したセグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記で述べたように、所望の産物娘分子についての選択に貢献するエレメントを含み得る。組換えシグナルは、同一であるかまたは異なり得、そして同一のまたは異なるリコンビナーゼにより作用され得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または環状であり得る。
【００７４】
プライマー：これは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の増幅または重合中にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのことをいう。好ましい局面において、このプライマーは、１以上の組換え部位またはこのような組換え部位の部分を含む。組換え部位の部分は少なくとも２塩基、少なくとも５塩基、少なくとも１０塩基または少なくとも２０塩基の目的の組換え部位を含む。組換え部位の部分が使用される場合、組換え部位のミッシング部分は、新しく合成された核酸分子によって提供され得る。このような組換え部位はプライマー内および／またはプライマーの１つもしくは両終端に配置され得る。好ましくは、さらなる配列は、組換えを増強または改良し、および／または組換え中の組換え部位を安定化するために組換え部位（単数または複数）に隣接したプライマーに添加される。このような安定化配列は任意の長さの任意の配列（好ましくはＧ／Ｃに富む配列）であり得る。好ましくは、このような配列は、サイズで１〜約１０００塩基、１〜約５００塩基、および１〜約１００塩基、１〜約６０塩基、１〜約２５塩基、１〜約１０塩基、２〜約１０塩基および好ましくは約４塩基の範囲である。好ましくは、このような配列は、１塩基長より大きく、そして好ましくは２塩基長より大きい。
【００７５】
テンプレート：これは、増幅され、合成され、または配列決定される２本鎖または１本鎖核酸分子のことをいう。２本鎖分子の場合、第１鎖および第２鎖を形成するためのその鎖の変性は、好ましくはこれらの分子が増幅され、合成されまたは配列決定される前に行われ、あるいは２本鎖分子は直接テンプレートとして使用され得る。１本鎖テンプレートに関して、テンプレートの部分に対して相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）が前記テンプレートのすべてまたは部分に相補的な核酸分子を合成し得る。あるいは、２本鎖テンプレートに関して、１以上のプロモーターが、このテンプレートのすべてまたは部分に対して相補的な核酸分子を作製するために１以上のポリメラーゼと組み合わせて使用され得る。本発明に従って新しく合成された分子は、長さにおいて元のテンプレートと同じかまたは短くあり得る。さらに、元のテンプレート集団の代表的な核酸分子の集団を作製するために核酸テンプレートの集団は、合成または増幅中に使用され得る。
【００７６】
アダプター：これは、１以上の組換え部位（またはこのような組換え部位の部分）を含むオリゴヌクレオチドもしくは核酸フラグメントまたはセグメント（好ましくはＤＮＡ）であり、この組み換え部位は、本発明に従って環状または直鎖状挿入ドナー分子、ならびに本明細書中に記載の他の核酸分子に加えられ得る。組換え部位の部分を使用する場合、ミッシング部分は、挿入ドナー分子によって提供され得る。このようなアダプターは、環状または直鎖状分子内の任意の位置に加えられ得るが、このアダプターは、好ましくは直鎖状分子の１端もしくは両端に、あるいはその近傍に加えられる。好ましくは、アダプターは、特に目的の核酸分子の両側に（隣接する）位置するように配置される。本発明に従って、アダプターは、標準の組換え技術（例えば、制限消化および連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ））によって目的の核酸分子に加えられ得る。例えば、アダプターは、適切な制限酵素を使用した最初に消化した分子によって環状分子に加えられ得、切断部位にアダプターを加え、そして切断部位にアダプター（単数または複数）を含む環状分子を再構成する。あるいは、アダプターは、直鎖状分子の１以上のおよび好ましくは両末端に直接連結され得、それによって１つまたは両末端にアダプターを有する直鎖状分子を生ずる。本発明の１つの局面において、アダプターは、直鎖状分子の集団（例えば、切断または消化されたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡ）に加えられ、前記集団のすべてまたは実質的な部分の１つおよび好ましくは両末端でアダプターを含む直鎖状分子の集団を形成し得る。
【００７７】
ライブラリー：これは、核酸分子のコレクションのことをいう（環状または直鎖状）。１つの好ましい実施態様において、ライブラリーは、生物（「ゲノム」ライブラリー）のＤＮＡ含有量のすべてまたは重要な部分の代表、あるいは細胞、組織、器官または生物における発現された遺伝子（ｃＤＮＡライブラリー）のすべてまたは重要な部分の代表的な核酸分子の１つのセットである。ライブラリーはまた、デノボ合成、１以上の配列の変異誘発などによって作製されるランダムな配列を含み得る。このようなライブラリーは、１以上のベクター中に含まれてもよいし、含まれなくてもよい。
【００７８】
増幅：これは、ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチド配列のコピー数を増加するためのインビトロでの任意の方法をいう。核酸の増幅は、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子あるいはプライマーにヌクレオチドの組み込みを生じ、これによってテンプレートに対して相補的な新しい分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書に使用されるように、１回の増幅反応は、多くのラウンドの増幅からなり得る。ＤＮＡ増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。１回のＰＣＲ反応は、５〜１００「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。
【００７９】
オリゴヌクレオチド：これは、共有結合的に連結したヌクレオチド配列を含む合成または天然の分子のことをいい、これは、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’位と隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’位の間のホスホジエステル結合によって結合される。
【００８０】
ヌクレオチド：これは、塩基−糖−リン酸の組み合わせのことをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位である。用語、ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸であるＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはその誘導体を含む。このような誘導体には、例えば、[αＳ]ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰを含む。本明細書中に使用されるように、用語、ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびこれらの誘導体をいう。例示されたジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例には、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は非標識であり得、または周知の技術によって直接標識され得る。検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を含む。
【００８１】
ハイブリダイゼーション：用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズしている」は、２本鎖分子を生じるための２つの相補的１本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基の対合をいう。本明細書中で使用されるように、２つの核酸分子はハイブリダイズされ得るが、塩基の対合は完全に相補的ではない。従って、ミスマッチした塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用された場合、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【００８２】
組換えＤＮＡ技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、本明細書中で使用されるように、当業者によって一般に、理解される。
【００８３】
（組換えスキーム）
本発明のインビトロまたはインビボの方法についての１つの一般的なスキームは図１に示され、ここで挿入ドナーおよびベクタードナーは、環状ＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡのいずれかであり得るが、環状として示される。ベクターＤは、最初のクローニングベクターＢと交換される。この挿入ドナーはベクターを含む必要がない。本発明の方法は、挿入物Ａが任意の数のベクターに移入されることを可能にする。本発明に従って、この挿入は特定のベクターに移入され得、または１つの工程で多数のベクターに移入され得る。さらに、この挿入物は、異なったベクタードナーと組み合わせて挿入ドナーとして例えば、産物ＤＮＡ分子を使用して、連続的に任意の数のベクターに移入され得る。目的の核酸分子は、新しいベクターに移入され得、それによって新しい産物ＤＮＡ分子を産生する。次いで、この新しい産物ＤＮＡ分子は、出発材料として使用され、新しいベクターに目的の核酸分子を移入し得る。このような連続的な移入は、任意の数の異なったベクターにおいて多くの回数、達成され得る。従って、本発明は、核酸分子をクローニングまたはサブクローニングすること可能にし、そしてその容易性および単純性のため、これらの方法は、特に、高生産性（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ）適用に適合する。本発明に従って、エレメントＡおよびＤを含み、そして１以上のコインテグレート（単数および複数）を含む、他の分子に対する娘分子について選択することが所望され得る。この四角および円は、異なったセットの組換え部位（例えば、ｌｏｘ部位またはａｔｔ部位）である。セグメントＡまたはＤは、少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複製起点、または検出、選択、発現、マッピング、もしくは配列決定したＤＮＡに関する特定の機能を含み得、ここでＤは、この実施例で使用される。このスキームはまた、本明細書中で記載されるように本発明に従って、逆にされ得る。次いで、生じた逆反応の産物（例えば、挿入ドナー）は、１つまたは多くのベクターを組み合わせて使用され、この挿入物が任意の数のベクターに含まれる新しい産物分子を調製し得る。
【００８４】
エレメントＡまたはＤの部分であり得る所望のＤＮＡセグメントの例は、ＰＣＲ産物、大きなＤＮＡセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、ｃＤＮＡクローンまたはフラグメント、機能性エレメントなど、および有用な核酸またはタンパク質をコードする遺伝子または部分的遺伝子を含むが、それらに限定されない。さらに、本発明の組換えクローニングは、タンパク質発現（ネイティブもしくは融合タンパク質）および／または遺伝子治療のための、エクソビボおよびインビボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用され得る。
【００８５】
図１において、そのスキームは以下のようにＡおよびベクターＤを含む所望の産物を提供する。挿入ドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質により、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の組換え部位においてまず組換えて、Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂの各々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の組換え部位において組換えが生じて、産物ＤＮＡ（ＡおよびＤ）ならびに副産物ＤＮＡ（ＣおよびＢ）を形成する。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコインテグレートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。
【００８６】
本発明のインビトロまたはインビボ組換えクローニング方法の１つの実施態様において、少なくとも１つの所望の産物ＤＮＡを選択するための方法が提供される。これは、図２に示されるプラスミドｐＥＺＣ７２６のマップの考慮により理解され得る。２つの例示的な組換え部位は、ａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。これらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。組換え反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物を受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。
【００８７】
２つの異なる組のプラスミドを、インビトロ方法を実証するために構築した。Ｃｒｅリコンビナーゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベクター６０２およびサブクローニングベクター６２９（図３））は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１部位を含有した。Ｃｒｅおよびインテグラーゼでの使用のための第２の組（クローニングベクター７０５およびサブクローニングベクター７２６（図２））は、ｌｏｘＰおよびａｔｔ部位を含有した。所望の娘プラスミドの産生の効率は、Ｃｒｅ単独を使用するよりも、両方の酵素を使用すると、約６０倍高かった。Ｃｒｅ単独反応由来の２４コロニー中１９が、所望の産物を含んだが、インテグラーゼ＋Ｃｒｅ反応由来の３８コロニー中３８が、所望の産物プラスミドを含んだ。
【００８８】
種々の他の選択スキームは、組換えクローニングが実施される特定の目的に適合し得る場合、当該分野において公知であるそれらが、使用され得る。個々の嗜好および要求に依存して、多数の異なる型の選択スキームが本発明の組換えクローニングまたはサブクローニング方法において使用され得る。当業者は、多数のＤＮＡセグメントまたはそれらを作製するための方法、および当該分野において慣例的に使用される異なる選択方法の有効性を利用し得る。このようなＤＮＡセグメントは、活性（例えば、ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生、しかしこれらに限定されない）をコードするＤＮＡセグメント、またはこのようなＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質のための結合部位を提供するＤＮＡセグメントを含むが、これらに限定されない。選択スキームの考案において使用されるＤＮＡ分子の例は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に示される。
【００８９】
さらなる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ）ＰＣＲのための新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）；
（ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質、リボザイムなどにより作用されるＤＮＡ配列の含有；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学物質などにより認識されるＤＮＡ配列の含有（例えば、集団についての選択または集団からの排除のためのアフィニティータグとしての使用のための）（Ｄａｖｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：７０２−７０６（１９９６）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：８０２７−８０３４（１９９５））あるいはインビトロ転写に関するプロモーターを並置するために；
（ｉｖ）ランダマイズされ、そしてｃＤＮＡ由来のＲＮＡライブラリーを用いることによる、エプスタインバーウイルス発現ＲＮＡに会合するリボソームＬ２２タンパク質についてのＲＮＡリガンドのインビトロ選択；
（ｖｉ）その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント（例えば、（ａ）トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパク質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え（例えば、インビトロＲＮＡ合成を可能にするプロモーター配列の再構成）を生じる組換え部位）の配置。このＲＮＡは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のＤＮＡ構築物を入手し得る；
（ｖｉｉ）分子（単数または複数）のサイズ（例えば、画分）または他の物理的性質による所望の産物の選択；および
（ｖｉｉｉ）その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のために必要とされるＤＮＡ配列の含有。
【００９０】
本発明の方法における産物および副産物の形成後、特定の組換えクローニング手順において必要に応じて考案された特定の選択スキームに依存して、選択工程はインビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され得る。
【００９１】
例えば、選択のインビトロ方法が、挿入物ドナーおよびベクタードナーＤＮＡ分子について案出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後に、希な切断部位が副産物中に至るように、出発環状ベクターにおいて希な制限部位を操作することを含み得る。従って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制限酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加されると、希な切断部位を有するＤＮＡ分子（すなわち、出発ＤＮＡ分子、同時組込み、および副産物）の全ては切断され、そして意図される宿主細胞において複製不能にされる。例えば、セグメントＢおよびＣにおける切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外のすべての分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、セグメントＤについて（例えば、Ｂ上に見出されない薬物耐性遺伝子により）選択し得る場合、Ｃにおける切断部位のみが必要とされる。
【００９２】
同様に、直鎖状ＤＮＡ分子を扱う場合、インビトロ選択方法が案出され得る。ＰＣＲプライマー配列に相補的なＤＮＡ配列が、産物分子にのみ、組換えクローニング方法により、移入されるように操作され得る。反応が完了した後、適切なプライマーが反応溶液に添加され、そしてサンプルがＰＣＲに供される。従って、産物分子の全てまたは一部が増幅される。
【００９３】
他のインビボ選択スキームが、種々の宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ株を用いて使用され得る。１つのスキームは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメント上にリプレッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他方のセグメント上にそのリプレッサーにより制御される薬物マーカーを置くことである。別のスキームは、サブクローニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー遺伝子を置くことである（図１）。もちろん、このようなプラスミドを増殖させるための方法が存在しなくてはならない。すなわち、それにおいてキラー遺伝子が死滅させない状況が存在しなければならない。Ｅ．ｃｏｌｉの特定の株を必要とする公知の多数の遺伝子が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵素ＤｐｎＩ（これは、その認識配列ＧＡＴＣがメチル化されない限り切断しない）を使用することである。多数の普及した一般的なＥ．ｃｏｌｉ株はＧＡＴＣ配列をメチル化するが、その中でクローン化されたＤｐｎＩが害なしに発現され得る変異体が存在する。その他の制限酵素遺伝子もまた、選択のための毒性遺伝子として用いられ得る。このような場合、対応するメチラーゼ遺伝子をコードするゲノム（ｇｅｍ）を含む宿主が、本発明における使用のための保護された宿主を提供する。同様に、ｃｃｄＢタンパク質は、ＤＮＡジャイレースの潜在的な毒物であり、切断可能な複合体中のジャイレース分子を効率的にトラップし、ＤＮＡ鎖切断および細胞死を引き起こす。ＤＮＡジャイレースのｇｙｒＡサブユニット中の変異、特に、ｇｙｒＡ４６２変異は、ｃｃｄＢに対する耐性を付与する（ＢｅｒｎａｒｄおよびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２６（１９９２）７３５−７４５）。ｇｙｒＡ４６２変異を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＤＢ２が構築されている。ｃｃｄＢ遺伝子を発現するプラスミドを含むＤＢ２細胞は、ｃｃｄＢにより殺されない。この株は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であり、そして１９９７年１０月１４日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５、Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ  ６１６０４  ＵＳＡのコレクションに、寄託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−２１８５２として寄託されている。
【００９４】
もちろん、類似の選択スキームが他の宿主生物のために案出され得る。例えば、Ｔｎ１０のｔｅｔリプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子発現を制御するように適合させられた（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。従って、本明細書において例証されるｔｅｔリプレッサーによる薬物耐性の同じ制御または本明細書に記載の他の選択スキームが、真核生物細胞において産物を選択するために適用され得る。
【００９５】
（組換えタンパク質）
本発明において、ＤＮＡセグメントの交換は、組換えタンパク質（リコンビナーゼならびに会合するコファクターおよびタンパク質を含む）の使用によって達成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコンビナーゼの例には以下が含まれる：
Ｃｒｅ:  バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（３）：１５０９−１５１４（１９８４））は、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐ  ＤＮＡ配列間の交換を触媒する（すなわち、組換えを引き起こす）（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（５）：２２８７（１９８６）を参照のこと)。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．６９２４７−１）。Ｃｒｅによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。熱力学的考察からは、Ｃｒｅ媒介性組込み（１つの分子を形成する２つの分子間の組換え）が、Ｃｒｅ媒介性切り出し(２つの娘分子を形成する同一分子中の２つのｌｏｘＰ部位間の組換え）より、はるかに効率的でないことは驚くべきことではない。Ｃｒｅは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムまたはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。ＤＮＡ基質は、直鎖状または超らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Ｈｏｅｓｓら、前掲）。これらの１つｌｏｘＰ  ５１１は、別のｌｏｘＰ  ５１１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組み換えない。
【００９６】
インテグラーゼ：λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込みを媒介する、バクテリオファージλ由来のタンパク質。バクテリオファージλＩｎｔ組換えタンパク質は、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質ａｔｔ部位間の組換えを促進する。組換え反応の可逆性は、組込み組換えおよび切り出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。各経路は特有であるが重複する、ａｔｔ部位ＤＮＡを含む１５のタンパク質結合部位のセットを使用する。４つのタンパク質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦおよびＦＩＳ）が関与する協同的および競合的相互作用が組換えの方向を決定する。
【００９７】
組込み組換えには、ＩｎｔおよびＩＨＦタンパク質、ならびに部位ａｔｔＰ（２４０ｂｐ）およびａｔｔＢ（２５ｂｐ）が関与する。組換えは、２つの新たな部位：ａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成を生じる。切り出し組換えは、ａｔｔＰおよびａｔｔＢを生成するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓ、ならびに部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲを必要とする。特定の条件下で、ＦＩＳは、切り出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、ａｔｔＰおよびａｔｔＢは、同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物（ａｔｔＬを有するものおよびａｔｔＲを有するもの）を生成し得ることを理解すべきである。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子との間での分子間組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓの存在下で、組込み組換えならびにａｔｔＰおよびａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、ＤＮＡセグメントを、操作したａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り出し組換えまたは組込み組換えを、互いの逆反応として導き得る。
【００９８】
ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア配列を含む。機能的重要性の個々の配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境界を横切って存在する（Ｌａｎｄｙ，Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３（１９８９））。種々のａｔｔ部位間の効率的な組換えは、中心共通領域の配列が組換えパートナー間で同一であることを必要とする。しかし、現在は、正確な配列は改変可能であることが見出されている。その結果、コア内に変化を有する、ａｔｔ部位の誘導体が、少なくとも天然のコア配列と同程度に効率的に組換えることが、現在は見出されている。
【００９９】
インテグラーゼはバクテリオファージλ上のａｔｔＰ部位（約２４０ｂｐ）をＥ．ｃｏｌｉゲノム上のａｔｔＢ部位（約２５ｂｐ）と組換えて（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．およびＬａｎｄｙ，Ａ．Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ、ｐ．２１１（１９８３）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ａｔｔＬ（約１００ｂｐ）およびａｔｔＲ（約１６０ｂｐ）部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非存在下（下記参照のこと）で、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼおよびＩＨＦによって媒介される組込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００：２１０−２１６（１９８３）によって記載されるように入手され得る。ＩＨＦは、Ｆｉｌｕｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  １４７：１４９−１５０（１９９４）によって記載されるように入手され得る。
【０１００】
種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供される教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６））。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４  （１９８２））が、最も良く研究されている。
【０１０１】
部位特異的リコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるリゾルベースファミリー（例えば、γδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＣｉｎ）もまた公知である。リコンビナーゼのこの高度に関連するファミリーのメンバーは、代表的には、分子内反応（例えば、反転および切り出し）に制約され、そして宿主がコードする因子を必要とし得る。宿主因子の要求性のいくつか（ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６）および分子内組換えの制約のいくつかを軽減する変異体が単離されている。
【０１０２】
λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびＰ１  Ｃｒｅに類似の他の部位特異的リコンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換し得る。このようなリコンビナーゼは公知である。多くの場合、このような他のリコンビナーゼの精製は、当該分野において記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出物が使用され得るか、またはＣｒｅおよびＩｎｔについて記載された手順を使用して、酵素が部分的に精製され得る。
【０１０３】
ＣｒｅおよびＩｎｔが例として詳細に記載されているが、多くの関連するリコンビナーゼ系が存在し、そして記載された発明に対するそれらの適用もまた、本発明に従って提供される。部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、例えば、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１によりコードされる部位特異的組換えタンパク質のような、本発明のための別の組換えタンパク質および組換え部位を提供するために使用され得る。この群のタンパク質は、配列の予想し得ないほど大きな多様性を示す。この多様性にも関わらす、すべてのリコンビナーゼは、そのＣ末端側の半分において整列され得る。
【０１０４】
Ｃ末端付近の４０残基領域は、すべてのタンパク質において、特によく保存されており、そして酵母２μプラスミドＦｌｐタンパク質のＣ末端付近の領域と相同である。３つの位置がこのファミリー内で完全に保存されている：ヒスチジン、アルギニンおよびチロシンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアラインメント位置３９６、３９９および４３３に見出される。これらの残基は、このファミリーのリコンビナーゼの活性部位に寄与し、そしてチロシン-４３３が鎖切断および再結合の間にＤＮＡと一時的に共有結合を形成することを示唆する。例えば、Ａｒｇｏｓ，Ｐ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：４３３−４０  （１９８６）を参照のこと。
【０１０５】
接合性トランスポゾン（例えば、Ｔｎ９１６）（ＳｃｏｔｔおよびＣｈｕｒｃｈｗａｒｄ．１９９５．Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４９：３６７；ＴａｙｌｏｒおよびＣｈｕｒｃｈｗａｒｄ、１９９７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：１８３７）のようないくつかのトランスポゾンのリコンビナーゼは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属し、そしていくつかの場合には、特異的組込み部位に対する強い選択性を示す（Ｉｋｅら、１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：１８０１；Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら、１９９３．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：１７９）。
【０１０６】
あるいは、ＩＳ２３１および他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの転移エレメントが、組換えタンパク質および組換え部位として使用され得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、その毒性が、農業的な有害生物ならびにヒトおよび動物の疾患のベクターに対して活性である、胞子嚢中のデルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原性（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌である。これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子のほとんどは、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列（ＩＳ２３１、ＩＳ２３２、ＩＳ２４０、ＩＳＢＴ１およびＩＳＢＴ２）ならびにトランスポゾン（Ｔｎ４４３０およびＴｎ５４０１）と構造的に関連している。これらの可動エレメントのいくつかは活性であり、そして結晶遺伝子の可動性に関与し、そのことによって細菌毒性の変動に寄与することが示されている。
【０１０７】
イソＩＳ２３１エレメントの構造分析により、それらがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＩＳ１１５１に関連し、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＩＳ４およびＩＳ１８６に遠縁に関連することが示される。他のＩＳ４ファミリーのメンバーと同様に、それらは、他のＩＳファミリーおよびレトロウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−インテグラーゼモチーフを含む。さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＩＳ２３１Ａから収集した機能的データは、特異的な標的に対して優先性を有する、非複製様式の転位を示す。同様な結果はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおいても得られた。例えば、Ｍａｈｉｌｌｏｎ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃａ  ９３：１３−２６（１９９４）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７４９５−７４９９（１９９２）を参照のこと。
【０１０８】
リコンビナーゼの非関連ファミリーである、トランスポザーゼもまた、レプリコン間の遺伝情報を移入するために用いられている。トランスポゾンは構造的に変動可能であり、単一物または複合物として記載されるが、代表的には、逆向きに組織化されたＤＮＡ配列が隣接するリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組込みは、ランダムまたは高度に特異的であり得る。高度に部位特異的である、Ｔｎ７のような代表例は、レプリコン間のＤＮＡセグメントの効率的な移動に適用された（Ｌｕｃｋｌｏｗら、１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６７：４５６６−４５７９）。
【０１０９】
関連するエレメントであるインテグロンはまた、１つのレプリコンから他への薬物耐性カセットの移動を転座可能に促進する。しばしば、これらのエレメントは、欠損性トランスポゾン誘導体である。トランスポゾンＴｎ２１は、Ｉｎ２と呼ばれるクラスＩインテグロンを含む。Ｉｎ２からのインテグラーゼ（ＩｎｔＩＩ）は、このクラスのすべてのインテグロンに共通であって、２つの５９ｂｐエレメント間、または５９ｂｐエレメントとａｔｔＩ部位との間の組換えを仲介し、これは、レシピエントのインテグロン中への挿入をもたらし得る。このインテグラーゼもまた、切除的組換えを触媒する（Ｈａｌｌ、１９９７．Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  ２０７：１９２；Ｆｒａｎｃｉａら、１９９７．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：４４１９）。
【０１１０】
グループＩＩイントロンは、触媒的ＲＮＡおよびタンパク質をコードする移動性遺伝子エレメントである。このタンパク質成分は、逆転写酵素、マチュラーゼ、およびエンドヌクレアーゼ活性を持ち、その一方このＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ活性を持ち、そしてイントロンが組込まれる標的部位の配列を決定する。このＲＮＡ配列の部分を改変することにより、このエレメントが組込まれる組込み部位を規定し得る。外来ＤＮＡ配列を、イントロンの両末端間に取込み得、特異的部位を標的にすることを可能にする。このプロセスは、レトロホーミングと呼ばれ、ＤＮＡ：ＲＮＡ中間体を経由して生じ、これは、ｃＤＮＡ中、そして最終的には、二本鎖ＤＮＡ中にコピーされる（Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １９９７；Ｇｕｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９７）。多くのインロトンにコードされるホーミングエンドヌクレアーゼが同定されている（ＢｅｌｆｏｒｔおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９７．ＮＡＲ  ２５：３３７９）。このような系は、記載されたサブクローニング方法への適用に容易に採用され得る。
【０１１１】
組換え反応を駆動するために添加されるリコンビナーゼの量は、公知のアッセイを用いることによって決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用して、精製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽出物の適切な量を決定する。
【０１１２】
（操作された組換え部位）
上記リコンビナーゼおよび対応するリコンビナーゼ部位は、本発明に従う組換えクローニングにおける使用に適切である。しかし、野生型組換え部位は、本発明の方法において適用されるような、組換え反応の効率もしくは特異性または産生分子の機能を低下させる配列を含む。例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびｌｏｘＰ組換え部位における複数の終止コドンが、両方の鎖上の複数のリーディングフレーム中に生じる。従って、翻訳の効率は、例えば、コード配列が組換え部位を横切らなければならない（１つのリーディングフレームのみがｌｏｘＰおよびａｔｔＢ部位の各鎖上で利用可能である）場合、低下するか、または（ａｔｔＰ、ａｔｔＲもしくはａｔｔＬにおいて）不可能である。
【０１１３】
従って、本発明はまた、これらの問題を克服する操作された組換え部位を提供する。例えば、ａｔｔ部位は、組換え反応の特異性または効率および産物ＤＮＡの性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔｔ２、およびａｔｔ３部位）、逆反応を減少させるために（例えば、ａｔｔＲからのＰ１およびＨ１の除去）、１または複数の変異を有するように操作され得る。これらの変異体の試験は、どの変異体が、本発明に従う組換えサブクローニングに適切であるに十分な組換え活性を生じるかを決定する。
【０１１４】
従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得る。このような変異には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位（これは、融合タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位（その結果、これらは、それらの相同なパートナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図されるべき反応を可能にする）および組換え部位のヘアピン形成を防ぐ変異体が含まれるが、これらに限定されない。どの特定の反応が起こるかは、どの特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定され得る。例えば、三部分タンパク質融合体は、組換え部位ａｔｔＲ１およびａｔｔＬ１；ならびにａｔｔＢ３；ａｔｔＲ１；ａｔｔＰ３および１０ｘＰ；ならびに／またはａｔｔＲ３および１０ｘＰ；ならびに／またはａｔｔＲ３およびａｔｔＬ２を含む親プラスミドを用いて達成され得る。
【０１１５】
特定の変異を核酸配列に導入するための周知の手順が存在する。これらの多くはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９−１９９６））に記載されている。変異は、オリゴヌクレオチド中に設計され得、これは、既存のクローニングされた配列を改変するために、または増幅反応において使用され得る。所望の変異体ＤＮＡまたはＲＮＡを単離するために適切な選択方法が利用可能である場合、ランダム変異誘発もまた用いられ得る。所望の変異の存在は、核酸を周知の方法によって配列決定することにより確認され得る。
【０１１６】
以下の限定されない方法が、所定の組換え部位のコア領域を改変または変異して、本発明で使用され得る変異した部位を提供するために、使用され得る：
１．部位特異的（例えば、ａｔｔＢを得るためのａｔｔＬおよびａｔｔＲ）組換え機構または他の（例えば、相同）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配列の組換えによる。この親ＤＮＡセグメントは、最終的な変異コア配列を生じる１つ以上の塩基変化を含む；
２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発（部位特異的、ＰＣＲ、ランダム、自発的など）による；
３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親ＤＮＡ配列の変異誘発（部位特異的、ＰＣＲ、ランダム、自発的など）による；
４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写による；および
５．所望の塩基変化を有する配列のデノボ合成（化学合成）。
【０１１７】
変異体組換え部位の機能性は、所望の特定の特性に依存する方法で示され得る。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパク質を発現させることによって示され得る。相同なパートナー間の組換えの特異性は、適切な分子をインビトロ反応に導入し、本明細書中に記載したように、または当該分野において公知のように、そして組換え産物について、アッセイすることによって、示され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基配列の他の公知の機能が存在することまたは存在しないことを包含し得る。組換え部位における特定の機能的特性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に従って使用され得る。例えば、（相互作用しない一対の部位から）相互作用するパートナーを提供するための部位の改変は、毒性物質をコードするＤＮＡ配列のこれら部位間の組換えを介しての欠失を要求することよって達成され得る。同様に、翻訳終止配列を除去する部位についての選択、タンパク質結合部位の存在または非存在などは、当業者によって容易に案出され得る。
【０１１８】
従って、本発明は、選択マーカーおよび／または所望のＤＮＡセグメントに隣接する少なくとも２つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む核酸分子を提供する。ここで、上記組換え部位のうち少なくとも１つは、同時組込みＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成においてインビトロで組換えを増強する、少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む。
【０１１９】
好適な実施では、組換え部位は配列が異なり、そして互いに相互作用しないが、同じ配列を含む部位を操作して、互いとの組換えを阻害し得ることが認識される。このような概念も考慮され、そして本明細書中に援用される。例えば、タンパク質結合部位を、部位の一つに隣接して操作し得る。このような部位を認識するタンパク質の存在下で、リコンビナーゼは、この部位にアクセスし得ず、そしてそれ故、他の部位が優先的に用いられる。融合体では、この部位は、もはや反応し得ない。なぜなら、それは、例えば、ａｔｔＢからａｔｔＬに変化しているからである。この融合体の分解において、タンパク質は不活性化され得（例えば、抗体、熱または緩衝液の交換）、そして第２の部位が組換えを行い得る。
【０１２０】
核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つの増強を付与する、少なくとも１つの変異を有し得る。この増強は、実質的に（ｉ）組込みを優先すること；（ｉｉ）組換えを優先すること；（ｉｉ）宿主因子の要求性を軽減すること；（ｉｉｉ）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の効率を増加させること；および（ｉｖ）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の特異性を増加させることからなる群より選択される。
【０１２１】
核酸分子は、好ましくは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲ（例えば、ａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’）に由来する少なくとも１つの組換え部位を含む。より好ましくは、ａｔｔ部位は、本明細書に記載のように、ａｔｔ１、ａｔｔ２、またはａｔｔ３から選択される。
【０１２２】
好ましい実施態様において、コア領域は、以下からなる群より選択されるＤＮＡ配列：
（ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；
（ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；
（ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；
（ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；
（ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＰ１）（配列番号５）；
（ｆ）ＲＢＹＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＤ（ｎ−ａｔｔ）（配列番号３９）；
（ｇ）ＡＳＣＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＷ（ｎ−ａｔｔＢ）（配列番号４０）；
（ｈ）ＡＳＣＣＷＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＧＴＴＧＧ（ｎ−ａｔｔＬ）（配列番号４１）；
（ｉ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＳＴＫＧＷ（ｎ−ａｔｔＲ）（配列番号４２）；
（ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＴＴＲＴＡＣＷＡＡＧＴＴＧＧ（ｎ−ａｔｔＰ）（配列番号４３）；
あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含む。ここで、米国特許法施行規則§１．８２２（本明細書中に参考としてその全体を援用する）に示されているように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり、コア領域は、１以上のリーディングフレームにおいて終止コドンを含まない。
【０１２３】
コア領域はまた、好ましくは、以下からなる群より選択されるＤＮＡ配列：
（ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；
（ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；
（ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴ（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；
（ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；
（ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴ（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；
（ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴ（ａｒｒＲ３）（配列番号１１）；
（ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ１）（配列番号１２）；
（ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；
（ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；
（ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＰ１）（配列番号１５）；
（ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧ（ａｔｔＰ２、Ｐ３）（配列番号１６）；または、対応するかもしくは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
【０１２４】
従って、本発明はまた、核酸分子を作製するための方法を提供する。この方法は、上記配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０〜９９％の相同性（あるいはその中の任意の範囲または値）を有する少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組換え部位を有する核酸分子、あるいは、当該分野において公知のように、ストリンジェントな条件下で、その核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する工程を包含する。
【０１２５】
明らかなことではあるが、このような周知のインビトロおよびインビボ選択方法の種々のタイプおよび変更が存在する。これらの各々については、簡略にするために、本明細書に記載されない。しかし、このような変形および変更は、本発明の異なる実施態様であると意図されており、そしてそのようにみなされる。
【０１２６】
インビトロ組換え反応である好ましい実施態様の結果として、非生物学的分子（例えば、ＰＣＲ産物）が、本発明の組換えクローニング方法により操作され得ることに注目することが重要である。１つの例において、直鎖状分子を環状ベクターにクローニングすることが可能である。
【０１２７】
本発明には多くの適用がある。これらの使用には、ベクターを変化させること、プロモーターを遺伝子の隣に並べること（ａｐｐｏｓｉｎｇ）、融合タンパク質に対する遺伝子を構築すること、コピー数を変化させること、レプリコンを変化させること、ファージにクローニングすること、ならびに例えば、ＰＣＲ産物（一方の端にａｔｔＢ部位、そして他方の端にｌｏｘＰ部位を有する）、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡをクローニングすることが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
（ベクタードナー）
本発明に従って、任意のベクターを用いて本発明のベクタードナーを構築するために使用し得る。特に、当該分野で公知のベクターおよび市販されているベクター（およびそれらの改変体または誘導体）を本発明に従って操作し、本発明の方法における使用のための一つ以上の組換え部位を含め得る。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得られ得る。次いでこのようなベクターは、例えば、目的の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングするために用いられ得る。特定の目的のベクターの一般的なクラスは、原核生物および／または真核生物クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベクター、異なる宿主における使用のためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、大挿入片などを受け入れるためのベクターなどを含む。
【０１２９】
目的の他のベクターは、ウイルス起源ベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリオファージλベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、高、低および調節可能コピー数ベクター、単一宿主中における組み合わせ使用のための適合レプリコンを有するベクター類（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）および真核生物エピソーム性複製ベクター（ｐＣＤＭ８）を含む。
【０１３０】
目的の特定のベクターは、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、およびＣ、ｐＲＳＥＴＡ、Ｂ、およびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＧＥＭＥＸ−１、およびｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＴベクター類（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸベクター類、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、およびｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、およびｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のような原核生物発現ベクターおよびそれらの改変体および誘導体を含む。ベクタードナーはまた、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｓｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のような真核発現ベクターおよびそれらの改変体または誘導体から作成され得る。
【０１３１】
特定の目的のその他のベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ類（酵母人工染色体）、ＢＡＣ類（細菌人工染色体）、Ｐ１（Ｅ．ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＱＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびそれらの改変体または誘導体を含む。
【０１３２】
目的のさらなるベクターは、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）；λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ，ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから）；ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７−ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎから）；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ  ＧＬ、ｐＧＡＤ  ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ���１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＰＦ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶβ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）；λＺＡＰＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＫ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨ、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ  Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ  ＫＳ＋／−、ｐＢＣ  ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣｌｎｅｏ  ＰｏｌｙＡ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから）を含む。
【０１３３】
特定の目的のツーハイブリッドおよび逆ツーハイブリッドベクターは、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐおよびそれらの改変体および誘導体を含む。
【０１３４】
（ポリメラーゼ）
逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド（すなわち、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡ分子の合成を触媒し得るポリペプチド）としては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎ウイルス逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、および細菌逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。逆転写酵素活性を有するこれらのポリペプチドが特に好ましく、これはまた、ＲＮＡａｓｅ  Ｈ活性（すなわち、「ＲＮＡｓｅ  Ｈ」ポリペプチド）が実質的に低減されている。「ＲＮＡａｓｅ  Ｈ活性が実質的に低減されて」いるポリペプチドによって、このポリペプチドが、野生型のＲＮＡａｓｅ  Ｈ活性または野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のようなＲＮａｓｅ  Ｈ+酵素の、約２０％未満、より好ましくは約１５％、約１０％、または約５％未満、最も好ましくは約２％未満であることが意味される。このＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、種々のアッセイ（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）に記載されるようなアッセイ、これらの全ての開示は、本明細書中に参考として援用される）によって決定され得る。本発明における使用のために適切なＲＮＡａｓｅ  Ｈ-ポリペプチドとしては、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶＨ-逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＨＩＶ  Ｈ-逆転写酵素およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTMＩ逆転写酵素、およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTMＩＩ逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されている。
【０１３５】
本発明の方法における使用のために適切な核酸ポリメラーゼ活性を有する他のポリペプチドとしては、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＴ５ポリメラーゼ、ならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられ、これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶｅｎｔ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆｕまたはＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】
本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合が容易に明らかであり、そして発明の範囲またはそれらの任意の実施態様から逸脱することなくなされ得ることは、関連分野の当業者に理解される。ここで、本発明を詳細に記載しているが、同じことが以下の実施例を参照してより明らかに理解される。これは、説明の目的のみが本明細書に挙げられ、本発明を限定することを意図しない。
【０１３７】
（実施例）
本発明の組換えクローニング法は、クローニングベクターの変化のような、あるものを使用者にとって有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成する。これらのセグメントは、互いに関して適切な方向にある組換えシグナルによって両側で隣接されなければならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分子（例えば、プラスミド）を、挿入ドナーおよびベクタードナーと呼ぶ。挿入ドナーは、ベクタードナーによって寄与された新しいベクターに結合されるようになるセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換え中間体は、コインテグレートと呼ばれる。第２の組換え事象は、２つの娘分子を産生し、これらは産物（所望の新しいクローン）および副産物と呼ばれる。
【０１３８】
（緩衝液）
本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素については、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献から容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。
【０１３９】
（実施例１〜３）  λインテグラーゼのための１つの例示的な緩衝液には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５〜７．８）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、ならびに必要に応じて１０％グリセロールが含まれる。
【０１４０】
Ｐ１  Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの好ましい緩衝液には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、３３ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、および０．５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンが含まれる。
【０１４１】
λ  ＩｎｔおよびＰ１  Ｃｒｅに類似する他の部位特異的リコンビナーゼのための緩衝液は、当該分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らして、当業者によって経験的に決定され得るかのいずれかである。
【０１４２】
（実施例１：ＣｒｅならびにＣｒｅおよびＩｎｔを用いる組換えクローニング）
２対のプラスミドを、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニング法を行うために構築した。一方の対であるｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２６（図２Ａ）を、Ｃｒｅおよびλインテグラーゼとともに用いられる、ｌｏｘＰおよびａｔｔ部位を用いて構築した。他方の対であるｐＥＺＣ６０２およびｐＥＺＣ６２９（図３Ａ）は、ＣｒｅのためのｌｏｘＰ（野生型）部位、１塩基（全３４中）がｌｏｘＰと異なる第２の変異体ｌｏｘ部位（ｌｏｘＰ  ５１１）を含んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、各プラスミドにおける２つの組換え部位（一般に、ＸおよびＹ、ならびにＸ’およびＹ’）である。いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート（例えば、ＸおよびＸ’）を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方が組換えて、コインテグレート（例えば、ＹおよびＹ’）から産物または副産物プラスミドを切り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え部位は、組換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Ｃｒｅのみを用いて行われ得ることが見出された。
【０１４３】
（Ｃｒｅのみ）
２つのプラスミドを、この概念を示すために構築した（図３Ａを参照のこと）。ｐＥＺＣ６２９が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤マーカー（クロラムフェニコール耐性）、複製起点、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１部位、条件的薬剤マーカー（トランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリン耐性オペロンのオペレーター／プロモーターによってその発現が制御されるカナマイシン耐性）、およびｔｅｔリプレッサータンパク質に対する構成性に発現される遺伝子ｔｅｔＲを含んでいた。ｐＥＺＣ６２９を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞は、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐性であるが、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンに対して感受性であった。ｐＥＺＣ６０２が、挿入ドナープラスミドであり、これは、異なる薬剤マーカー（アンピシリン耐性）、複製起点、ならびにマルチクローニング部位に隣接しているｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１部位を含んだ。
【０１４４】
本実験は、以下の２つのパートから構成された：
パートＩ：各々約７５ｎｇのｐＥＺＣ６０２およびｐＥＺＣ６２９を全容積３０μｌのＣｒｅ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン−ＨＣｌ、５００μｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）中で混合した。２つの１０μｌアリコートを、新しいチューブに移した。１つのチューブに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（約４単位／μｌ；ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９（１９８４）に従って、部分精製した）を入れた。両方のチューブを、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、７０℃で１０分間インキュベートした。各反応物のアリコートを希釈し、そしてＤＨ５αに形質転換した。発現後、アリコートを、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール；１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン＋２００μｇ／ｍｌ  メチシリン；または１００μｇ／ｍｌ  カナマイシン上にプレートした。
【０１４５】
結果：表１を参照のこと。Ｃｒｅを含まない反応物は、１．１１×１０6個のアンピシリン耐性コロニー（挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；７．８×１０5個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ６２９由来）；および１４０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンド）を生じた。Ｃｒｅを添加した反応物は、７．５×１０5個のアンピリン耐性コロニー（挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；６．１×１０5個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ６２９由来）；および７６０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンドコロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニーの混合物）を生じた。分析：Ｃｒｅの存在において、カナマイシンプレート上のコロニーの数がずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラスミドを含むと予測された。
【０１４６】
【表１】
0004303418.tif 000002
パートＩＩ：「＋Ｃｒｅ」カナマイシンプレート由来の２４コロニーをひろい、そして１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地中に接種した。ミニプレップを行い、そしてミニプレップＤＮＡ（非切断あるいはＳｍａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで切断）を電気泳動した。結果：２４個のミニプレップ中１９個は、産物プラスミドについて予測されるサイズの超らせん状のプラスミドを示した。１９個の全ては、予測されるＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを示した。分析：Ｃｒｅのみのスキームを示した。詳細には、約７０％（２４個中１９個）の産物コロニーを生じることが決定された。効率は、約０．１％（６．１×１０5個のクロラムフェニコール耐性コロニーから７６０個のカナマイシン耐性クローンが得られた）であった。
【０１４７】
（Ｃｒｅ＋インテグラーゼ）
本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであるｐＥＺＣ７２６がｌｏｘＰ  ５１１の代わりにａｔｔＰ部位を含んでいたこと、および挿入ドナープラスミドであるｐＥＺＣ７０５がｌｏｘＰ  ５１１の代わりにａｔｔＢ部位を含んだことを除き上記で使用されたプラスミドに正確に類似する（図２Ａ）。
【０１４８】
この実験は、以下の３つのパートから構成された：
パートＩ：約５００ｎｇのｐＥＺＣ７０５（挿入ドナープラスミド）を、アンピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するＳｃａＩを用いて切断した。（λインテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のａｔｔＢプラスミドを用いて行われている（Ｈ．Ｎａｓｈ，私信）ので、これを行った）。しかし、インテグラーゼ反応は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが後に見出された。次いで、直鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして２０μｌのλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）中で溶解した。また、約５００ｎｇのベクタードナープラスミドｐＥＺＣ７２６をエタノール沈殿し、そして２０μｌのλインテグラーゼ緩衝液中で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μｌ、３９３μｇ／ｍｌ）を融解し、そして１８μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液を添加することにより希釈した。１μｌのＩＨＦ（組み込み宿主因子、２．４ｍｇ／ｍｌ、アクセサリータンパク質）を、１５０μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液中で希釈した。各ＤＮＡのアリコート（２μｌ）を、全量１０μｌで、λインテグラーゼ緩衝液（各々１μｌのλインテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは含まない）と混合した。混合物を、２５℃で４５分間インキュベートし、次いで、７０℃で１０分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。結果：インテグラーゼおよびＩＨＦの存在下で、全ＤＮＡの約５％が、直鎖状のコインテグレート形態に転換された。分析：インテグラーゼおよびＩＨＦの活性を確認した。
【０１４９】
パートＩＩ：３μlの各反応物（すなわち、インテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは含まない）を、２７μｌのＣｒｅ緩衝液（上記）中で希釈し、次いで、各反応物を２つの１０μｌアリコートに分割した（全部で４つ）。これらの反応物の２つに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（上記）を添加し、そして全ての反応物を３７℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベートした。各反応物に、ＴＥ緩衝液（９０μｌ；ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、そして各１μｌを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。形質転換混合物を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン＋２００μｇ／ｍｌ  メチシリン；３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール；または１００μｇ／ｍｌ  カナマイシン上にプレートした。結果：表２を参照のこと。
【０１５０】
【表２】
0004303418.tif 000003
分析：Ｃｒｅタンパク質は、形質転換を減少させた。この効果について調節した場合、カナマイシン耐性コロニー数は、Ｃｒｅおよびインテグラーゼの両方を用いた場合、コントロール反応物と比較して、１００倍より多く増加した。これは、９９％より高い特異性を示唆する。
【０１５１】
パートＩＩＩ：３８個のコロニーを、インテグラーゼ＋Ｃｒｅプレートからひろい、ミニプレップＤＮＡを作製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで切断して診断マッピング情報を得た。結果：３８個全てが正確に予測されたフラグメントサイズを有した。分析：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法は、Ｃｒｅのみよりずっと高い特異性を有することが観察された。結論：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法を示した。効率および特異性は、Ｃｒｅのみよりもずっと高かった。
【０１５２】
（実施例２：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の真核生物細胞における発現のためのベクターへのサブクローニングのためのインビトロ組換えクローニングの使用（図４Ａ））
ｌｏｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａｔｔＢ部位の間でクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、挿入ドナープラスミドであるｐＥＺＣ８４３を構築した（図４Ｂ）。ｌｏｘＰ部位に隣接するサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む、ベクタードナープラスミドであるｐＥＺＣ１００３を構築した（図４Ｃ）。１μｌアリコートの各超らせん状のプラスミド（約５０ｎｇの粗製ミニプレップＤＮＡ）を、等量のλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）およびＣｒｅリコンビナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、０．５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）、２単位のＣｒｅリコンビナーゼ、１６ｎｇの組み込み宿主因子、および３２ｎｇ  λインテグラーゼを含む１０μｌの反応物中で合わせた。３０℃で３０分間インキュベートした後、７５℃で１０分間インキュベートし、１μｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。形質転換体のアリコートを、２００μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む寒天プレート上に広げ、そして３７℃で一晩インキュベートした。それ以外の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラスミドのみを含んだ。コントロール反応形質転換の１０％を受けたプレートから、１つのコロニーを得た；組換えクローニング反応の１０％を受けたプレートからは１４４のコロニーを得た。これらの数は、９９％より多い組換えクローニングコロニーが、所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。６個の組換えクローニングコロニーから作製したミニプレップＤＮＡから、予測されたサイズのプラスミド（５０２６塩基対）であるＣＭＶＰｒｏｄを得た。ＮｃｏＩを用いた制限消化から、６個全てのプラスミドについてＣＭＶプロモーターの下流にクローニングしたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと予測されるフラグメントを得た。
【０１５３】
（実施例３：終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接されるサブクローニングされたＤＮＡセグメント）
パートＩ：背景
上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、ａｔｔＲ部位およびｌｏｘＰ部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従って、コード配列が組換え部位を横断しなければならない（１つのリーディングフレームのみがｌｏｘＰ部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は困難であり得るか、または不可能であり得る（ａｔｔＲまたはａｔｔＬにおいて）。
【０１５４】
サブクローニングのための主要な理由は、タンパク質ドメインを融合することである。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインの目的のタンパク質への融合は、融合タンパク質がグルタチオンアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，１９９５カタログ）に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製されることを可能にする。目的のタンパク質が連続的なヒスチジンの連続（例えば、Ｈｉｓ６）に融合される場合、融合タンパク質は、金属イオンを含むキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。活性、溶解性、安定性などについてアミノ末端融合体とカルボキシ末端融合体とを比較することがしばしば望まれる。
【０１５５】
バクテリオファージλ組み込み系のａｔｔＢ部位を、ｌｏｘＰ部位に対する代替物として試験した。なぜなら、それらは小さく（２５ｂｐ）、そしていくらかの配列可撓性を有するからである（Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４０４９−４０５３（１９８７））。全ての終止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクローニングのための有用な組換え部位を得ることは以前には示唆されていなかった。
【０１５６】
λバクテリオファージにおける部位特異的組換えのための標準的な表記（Ｗｅｉｓｂｅｒ，Ｌａｍｂｄａ  ＩＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における組換え反応に関与するヌクレオチド領域を以下に示す：
【０１５７】
【化１】
0004303418.tif 000004
ここで：Ｏは、ファージおよびＥ．ｃｏｌｉゲノムの両方に見出される１５ｂｐコアＤＮＡ配列を示す；ＢおよびＢ’は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中のコアに隣接する約５塩基を示す；およびＰ１、Ｈ１、Ｐ２、Ｘ、Ｈ２、Ｃ、Ｃ’、Ｈ’、Ｐ’１、Ｐ’２、およびＰ’３は、バクテリオファージλゲノム中のタンパク質結合ドメインをコードする公知のＤＮＡ配列を示す。
【０１５８】
反応は、タンパク質Ｘｉｓ（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であり；ａｔｔＬとａｔｔＲとの間の組換えは、その組み込まれた状態からλゲノムを正確に切り出し、ａｔｔＰ、およびａｔｔＢを含む直鎖状Ｅ．ｃｏｌｉゲノムを含む環状λゲノムを再生する。
【０１５９】
パートＩＩ：変異体ａｔｔ部位を含むプラスミドの構築および試験
変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を構築した。重要なことに、Ｌａｎｄｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３（１９８９））は、ａｔｔＰのＰ１およびＨ１ドメインの欠失が、切り出し反応を容易にし、そして組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆的にさせることを観察した。従って、変異がａｔｔＲに導入されて、Ｐ１およびＨ１ドメインもまた欠失されたので、本実施例におけるａｔｔＲ’部位は、Ｐ１領域およびＨ１領域を欠き、そして取り除かれたＮｄｅＩ部位を有し（塩基２７６３０をＣからＧに改変した）、そしてバクテリオファージλ座標２７６１９〜２７７３８（ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｌｅａｓｅ  ９２．０，ｂｇ：ＬＡＭＣＧ、「バクテリオファージλの完全な配列」）に対応する配列を含む。
【０１６０】
野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の組換えによって産生されるａｔｔＢの配列は以下のとおりである：
【０１６１】
【化２】
0004303418.tif 000005
終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、およびａｔｔＰの配列はａｔｔＢ配列に由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ内（座標２７６１９〜２７８１８）に含まれたことに留意のこと。
【０１６２】
変異体ａｔｔＲ１’部位（ａｔｔＲ’）およびａｔｔＬ１部位を組み換えた場合、配列ａｔｔＢ１が産生された（変異を太字の、大きな文字で表す）：
【０１６３】
【化３】
0004303418.tif 000006
４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。
【０１６４】
ａｔｔＲ１（ａｔｔＲ’）配列およびａｔｔＬ１配列（太字）にさらなる変異を導入した場合、ａｔｔＲ２（ａｔｔＲ’）部位およびａｔｔＬ２部位を得た。ａｔｔＲ２およびａｔｔＬ２の組換えは、ａｔｔＢ２部位を産生した：
【０１６５】
【化４】
0004303418.tif 000007
上記のａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ’部位の組換え活性を以下のようにアッセイした。プラスミドｐＥＺＣ７０５のａｔｔＢ部位（図２Ｂ）を、ａｔｔＬｗｔ、ａｔｔＬ１、またはａｔｔＬ２と置換した。プラスミドｐＥＺＣ７２６のａｔｔＰ部位（図２Ｃ）を、ａｔｔＲｗｔ、ａｔｔＲ１（Ｐ１およびＨ１領域を欠くａｔｔＲ’）、またはａｔｔＲ２（Ｐ１およびＨ１領域を欠くａｔｔＲ’）と置換した。従って、得られたプラスミドは、Ｃｒｅによって媒介されて、それらのｌｏｘＰ部位を介して組換え得、そしてＩｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦによって媒介されて、それらのａｔｔＲ’部位およびａｔｔＬ部位を介して組換え得る。プラスミドの対を、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦと混合しそして反応させ、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞に形質転換し、そしてカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。結果を表３に示す：
【０１６６】
【表３】
0004303418.tif 000008
上記のデータは、野生型ａｔｔ部位およびａｔｔ１部位は低い程度に組換えたが、ａｔｔ１部位およびａｔｔ２部位は互いに検出可能には組換えないことを示す。
【０１６７】
パートＩＩＩ：目的のＤＮＡセグメントに隣接する両方のａｔｔＢ部位のコア領域が終止コドンを含まない場合の、組換えが示された。関与するプラスミドの物理的な状態が、組換え効率に影響することが見出された。
【０１６８】
適切なａｔｔ部位を、ｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２６中に移動し、プラスミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）（ａｔｔＲ’１およびａｔｔＲ’２）ならびにｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）（ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）を作製した。本実験における所望のＤＮＡセグメントは、ｐＥＺＣ１５０２の２つのａｔｔＬ部位の間にクローニングされたクロラムフェニコール耐性遺伝子のコピーであった。プラスミドの対を、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（ｌｏｘＰ部位が存在しなかったのでＣｒｅはなし）を用いてインビトロで組換えた。１００ｎｇの各プラスミドを、１０μｌの、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、１６．５ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３％グリセロールの反応物（これは、８．１ｎｇのＩＨＦ、４３ｎｇのＩｎｔ、４．３ｎｇのＸｉｓ、および２単位のＣｒｅを含む）中でインキュベートした。反応物を、２５℃で４５分間、６５℃で１０分間でインキュベートし、そして１μｌのアリコートを、ＤＨ５α細胞に形質転換し、そしてカナマイシンプレートに広げた。表４に示すように、親プラスミドの両方が環状である場合、または一方のプラスミドが環状でありかつ他方が直鎖状の場合に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定した：
【０１６９】
【表４】
0004303418.tif 000009
分析：変異体ａｔｔＲ部位および変異体ａｔｔＬ部位を用いる組換えクローニングを確認した。所望のＤＮＡセグメントは、いずれの鎖においても終止コドンを全く含まないａｔｔＢ部位の間にサブクローニングされる。両方の関与する分子が超らせん状であり、そしてタンパク質が制限されている場合、切り出し反応がより効率的であった初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合の）産物ＤＮＡの増大した収率は、予測外であった（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｃｅｌｌ  ５０：７７９−７８８（１９８７））。
【０１７０】
（実施例４：逆方向反復を有さない組換えクローニングの実証）
パートＩ：原理
上記実施例３は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、プラスミドｐＥＺＣ１５０２中のａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）（図５Ｈ）が、組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接される所望のＤＮＡセグメントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボおよびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆方向でａｔｔＢ部位によって隣接される所望のＤＮＡセグメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖ＲＮＡ分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。
【０１７１】
類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列反復配置のａｔｔ部位に配置することにより回避し得る。親プラスミドの各々が野生型ａｔｔＬ部位および野生型ａｔｔＲ部位を直列反復で有する場合、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦタンパク質は、分子内反応においてそれらの部位によって隣接されるＤＮＡセグメントを単に取り除く。しかし、上記の実施例３に記載の変異体部位は、分子内組換えを所望のように進行させながら、分子内反応を阻害することが可能であり得ることを示唆した。
【０１７２】
パートＩＩ：組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの構造
プラスミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）中のａｔｔＲ２配列を、反対方向でのａｔｔＬ２と置換し、ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ）を作製した。ｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）のａｔｔＬ２配列を、反対方向でのａｔｔＲ２と置換し、ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）を作製した。これらのプラスミドの各々は、ａｔｔ１コアとａｔｔ２コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を含んだ（実施例３、上記を参照のこと）。
【０１７３】
プラスミドｐＥＺＣ１４０５、ｐＥＺＣ１５０２、ｐＥＺＣ１６０３およびｐＥＺＣ１７０６を、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で精製した。プラスミドｐＥＺＣ１４０５およびｐＥＺＣ１６０３のアリコートを、ＸｂａＩを用いて直鎖化した。プラスミドｐＥＺＣ１５０２およびｐＥＺＣ１７０６のアリコートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖化した。１００ｎｇのプラスミドを、Ｉｎｔ（４３．５ｎｇ）、Ｘｉｓ（４．３ｎｇ）、およびＩＨＦ（８．１ｎｇ）を含む最終容量１０μｌの緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、１６．５ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３％グリセロール）中で混合した。反応物を２５℃で４５分間、６５℃で１０分間インキュベートし、そして１μｌをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。発現後、アリコートを、２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げ、そして３７℃でインキュベートした。
【０１７４】
コロニー数／１μｌの組換え反応物として表した結果を表５に示す：
【０１７５】
【表５】
0004303418.tif 000010
分析：全ての構造において（すなわち、環状または直鎖状）、ｐＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対（逆方向反復配置でのａｔｔ部位を有する）は、ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６対（ヘアピン形成を回避するために変異されたａｔｔ部位を有する）よりもより効率的であった。ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６対は、ｐＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対より高いバックグラウンドおよびより低い効率を与えた。あまり効率的ではないが、ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６反応由来の８０％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含むと予測された。１つのパートナーを直鎖状にすることが、全ての場合において反応を刺激した。
【０１７６】
（パートＩＩＩ：産物プラスミド構造の確認）
直鎖状ｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）×環状ｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）、環状ｐＥＺＣ１４０５×直鎖状ｐＥＺＣ１５０２、直鎖状ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ）×環状ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）、および環状ｐＥＺＣ１６０３×直鎖状ｐＥＺＣ１７０６反応物由来の各々６個のコロニーを富化培地に接種し、そしてミニプレップＤＮＡを調製した。ＳｓｐＩでの診断的切断により、２４個すべてのコロニーについて予想された制限フラグメントを得た。
【０１７７】
分析：同一の分子上の変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を有するプラスミド間の組換え反応により、高い程度の特異性を有する、所望のプラスミド産物を得た。
【０１７８】
（実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えクローニング）
（パートＩ：背景）
制限酵素ＤｐｎＩは、配列ＧＡＴＣを認識し、そしてＡがｄａｍメチラーゼによってメチル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ株は、ｄａｍ+である。細胞の染色体が多数の断片に切断されるので、Ｅ．ｃｏｌｉのｄａｍ+株におけるＤｐｎＩの発現は致死性である。しかし、ｄａｍ-細胞において、ＤｐｎＩの発現は無害である。なぜなら染色体は、ＤｐｎＩ切断に対して免疫性であるからである。
【０１７９】
ベクタードナーが、組換え部位によって分離される２つのセグメントＣおよびＤを含む一般的な組換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択は、セグメントＤの存在およびセグメントＣの非存在についての選択に依存する。元の実施例において、セグメントＤは、セグメントＣ上に見出されるリプレッサー遺伝子によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子（Ｋｍ）を含んだ。Ｃが存在する場合、Ｄを含む細胞は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシンに対して耐性ではなかった。
【０１８０】
ＤｐｎＩ遺伝子は、上記実施態様のリプレッサー遺伝子を置換し得る毒性遺伝子の例である。セグメントＣがＤｐｎＩ遺伝子産物を発現するする場合、ｄａｍ+宿主へのプラスミドＣＤの形質転換は細胞を死滅させる。セグメントＤを、例えば組換えクローニングによって新しいプラスミドに移入する場合、毒性遺伝子がもはや存在しないので、次いで薬剤マーカーについての選択は成功する。
【０１８１】
（パートＩＩ：毒性遺伝子としてＤｐｎ  Ｉを用いるベクタードナーの構築）  ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＴＡＧ３’（配列番号１７）および５’ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＴＧＴ３’（配列番号１８）ならびに鋳型としてＤｐｎ  Ｉ遺伝子を含むプラスミド（Ｓａｎｆｏｒｄ  Ａ．Ｌａｃｋｓ，  Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから入手したプラスミド由来であり；またＡＴＣＣ  ６７４９４としてアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０１８２】
さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプライマーを用いる既存のａｔｔＬドメインおよびａｔｔＲ’ドメインを増幅することによって、それぞれ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ’のＢ領域およびＢ’領域に導入した。変異体ａｔｔＬ３（オリゴＸｉｓ１１５を用いて作製された）およびａｔｔＲ’３（オリゴＸｉｓ１１２を用いて作製されたａＴＴＲ’）の組換えにより、以下の配列（太字がａｔｔＢ１と異なる）を有するａｔｔＢ３を得た：
Ｂ                    Ｏ                    Ｂ’
ＡＣＣＣＡ  ＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡ  ＧＴＧＧＴ（配列番号８）
ＴＧＧＧＴ  ＣＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＴ  ＣＡＣＣＡ（配列番号４７）
既存の遺伝子ドナープラスミドのａｔｔＬ２の代わりにａｔｔＬ３配列をクローン化し、プラスミドｐＥＺＣ２９０１を得た（図７Ａ）。既存のベクタードナープラスミドのａｔｔＲ’２の代わりにａｔｔＲ’３配列をクローン化し、プラスミドｐＥＺＣ２９１３を得た（図７Ｂ）。ＤｐｎＩ遺伝子をプラスミドｐＥＺＣ２９１３にクローン化して、ｔｅｔリプレッサー遺伝子を置換した。得られたベクタードナープラスミドをｐＥＺＣ３１０１と名付けた（図７Ｃ）。ｐＥＺＣ３１０１をｄａｍ-ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した場合、数百のコロニーを得た。同じプラスミドをｄａｍ+ＤＨ５α株に形質導入した場合、たとえＤＨ５α細胞がＳＣＳ１１０細胞より約２０倍コンピテントであっても、ほんの１コロニーを生じただけであった。ＤｐｎＩ遺伝子を含まない関連するプラスミドを同じの２つの細胞株に形質転換した場合、ＤＨ５α細胞から４４８のコロニーが得られたが、ＳＣＳ１１０細胞からは２８個のコロニーが生じた。これは、ＤｐｎＩ遺伝子がプラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）上で発現され、そしてｄａｍ+ＤＨ５α細胞を死滅させるが、ｄａｍ-ＳＣＳ１１０細胞を死滅させないという証拠である。
【０１８３】
（パートＩＩＩ：ＤｐｎＩ選択を用いる組換えクローニングの実証）
プラスミド対を使用し、毒性遺伝子ＤｐｎＩに依存する産物についての選択を用いる組換えクローニングを示した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）を、ＭｌｕＩを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドｐＥＺＣ２９０１（図７Ａ）と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択を用いるプラスミドの第２の対を、コントロールとして使用した：プラスミドｐＥＺＣ１８０２（図７Ｄ）を、ＸｂａＩを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）と反応させた。緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  約７．８、１６．５ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジン、０．３７５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５％  グリセロール）ならびにタンパク質Ｘｉｓ（２．９ｎｇ）、Ｉｎｔ（２９ｎｇ）、およびＩＨＦ（５．４ｎｇ）を含む８マイクロリットルの反応物を、２５℃で４５分間、次いで７５℃で１０分間インキュベートし、そして１μｌのアリコートを、表６に示すようにＤＨ５α（すなわち、ｄａｍ+）コンピテント細胞に形質転換した。
【０１８４】
【表６】
0004303418.tif 000011
ミニプレップＤＮＡを、反応＃２由来の４つのコロニーから調製し、そして制限酵素Ｓｓｐ  Ｉを用いて切断した。全てから予想されるフラグメントを得た。
【０１８５】
分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサブクローニングを示した。予想される構造のプラスミドを産生した。
【０１８６】
（実施例６：融合タンパク質作製のための、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いる遺伝子のクローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子のサブクローニング）
（パートＩ：既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナーへの変換）
既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下のように作製した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、末端を平滑にするためにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで処理し、所望でないＤＮＡフラグメントを小さくするためにＳｍａＩ、ＨｐａＩ、およびＡｌｗＮＩを用いてさらに消化し、そしてａｔｔＲ’Ｉ−ＣｍR−ＤｐｎＩ−ａｔｔＲ’−３ドメインを含む２．６ｋｂカセットをゲル精製した。精製されたカセットの濃度を、約７５ｎｇＤＮＡ／μｌであると評価した。
【０１８７】
プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ（図８Ａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、タンパク質グルタチオンＳトランスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位にインフレームで挿入され得る任意の第２のコード配列との間の融合を可能にする。ｐＧＥＸ−２ＴＫ  ＤＮＡを、ＳｍａＩを用いて消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。約７５ｎｇの上記の精製ＤＮＡカセットを、約１００ｎｇのｐＧＥＸ−２ＴＫベクターと５μｌ連結物中で２．５時間連結し、次いで、１μｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＲＬ３０５６細胞（ＤＨ１０Ｂのｄａｍ-誘導体；市販のｄａｍ-株は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，由来のＤＭ１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ由来のＳＣＳ１１０を含む）に形質転換した。形質転換混合物のアリコートを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（耐性遺伝子は、ｐＧＥＸ−２ＴＫ上に存在する）および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（耐性遺伝子は、ＤＮＡカセット上に存在する）を含有するＬＢ寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップＤＮＡを作製した。ｐＧＥＸ−２ＴＫ中のカセットの方向を、ＥｃｏＲ  Ｉを用いる診断的切断によって決定した。所望の方向を有するプラスミドを、ｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）と名付けた。
【０１８８】
（パートＩＩ：３つのリーディングフレームでのレポーター遺伝子の組換えクローニング遺伝子ドナープラスミドへのクローニング）
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）クローニングは、クローニングベクターへＰＣＲ増幅産物をクローニングするための方法である（米国特許第５，３３４，５１５号、本明細書中でその全体が参考として援用される）。簡単に述べれば、所望のＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅を、それらの５’末端にチミジン塩基の代わりにウラシル塩基を含むプライマーを用いて実施する。このようなＰＣＲ産物を酵素ＵＤＧと共にインキュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取り除かれる。これらの塩基の欠損は、ＰＣＲ産物ＤＮＡの末端における塩基対合を弱め、そして適切な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした場合、このような産物の末端は、主として一本鎖化される。ＰＣＲ産物の３’末端に相補的である突出した３’テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこのようなインキュベーションを行った場合、塩基対合は、効率的にクローニングベクターにＰＣＲ産物をアニーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換によってＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入した場合、インビボプロセスは、効率的にそれを組換えプラスミドに変換する。
【０１８９】
３つ全てのリーディングフレームでの任意のＰＣＲ産物のクローニングを可能にするＵＤＧクローニングベクターをｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）から以下のように調製した。８つのオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得られた（全て５’→３’で記載される：ｒｆ１  上部（ＧＧＣＣ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ）（配列番号１９）、ｒｆ１  下部（ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＡＴＣ）（配列番号２０）、ｒｆ２  上部（ＧＧＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ）（配列番号２１）、ｒｆ２  下部（ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＡＴＣＴ）（配列番号２２）、ｒｆ３  上部（ＧＧＣＣＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ）（配列番号２３）、ｒｆ３  下部（ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＴＴ）（配列番号２４）、カルボキシ上部（ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ）（配列番号２５）、およびカルボキシ下部（ＴＣＧＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ）（配列番号２６））。ｒｆ１、２および３上部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。プラスミドｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）をＮｏｔ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを用いて切断し、そして切断プラスミドのアリコートをカルボキシ−オリゴ二重鎖（Ｓａｌ  Ｉ末端）およびｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖のいずれか（Ｎｏｔ  Ｉ末端）と混合した（２５０ｐｍｏｌカルボキシオリゴ二重鎖と１０μｇ（約５ｐｍｏｌ）切断プラスミドとを混合し、３つの２０μｌ容積に分割し、ｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖の５μｌ（２５０ｐｍｏｌ）および２μｌ＝２単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを各反応物に添加した）。室温での９０分の連結後、各反応物を調製用アガロースゲルに供し、そして２．１ｋｂのベクターバンドを溶出し、そして５０μｌのＴＥに溶解した。
【０１９０】
（パートＩＩＩ：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子のＰＣＲ）
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼ遺伝子であるｐｈｏＡを増幅するために、プライマーをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。プライマーは、ウラシル塩基を含む１２塩基５’伸長を有し、その結果ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）でのＰＣＲ産物の処理は、ＤＮＡの各末端での塩基対合を弱め、そして３’鎖が上記のｒｆ１、ｒｆ２、およびｒｆ３ベクターの突出する３’末端とのアニーリングを可能にする。プライマーの配列（全て５’→３’で記載）は以下のとおりであった：ＣＡＴ左、ＵＡＵ  ＵＵＵ  ＣＡＧ  ＧＧＵ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ（配列番号２７）；ＣＡＴ右、ＵＣＣ  ＣＡＣ  ＵＵＡ  ＵＵＡ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＡＴＣ（配列番号２８）；ｐｈｏＡ左、ＵＡＵ  ＵＵＵ  ＣＡＧ  ＧＧＵ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＣＧＧ（配列番号２９）；およびｐｈｏＡ右、ＵＣＣ  ＣＡＣ  ＵＵＡ  ＵＵＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  Ｃ（配列番号３０）。次いで、プライマーを公知の方法工程（例えば、米国特許第５，３３４，５１５号（これは本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）を用いるＰＣＲ反応のために使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反応増幅産物は、開始ＡＴＧを有するがいかなる転写シグナルも有さないＣＡＴまたはｐｈｏＡ遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の切断部位をコードし、そしてカルボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なＴＡＡナンセンスコドンをコードした。
【０１９１】
非精製ＰＣＲ産物（約３０ｎｇ）を、１×ＲＥａｃｔ４緩衝液（ＬＴＩ）および１単位のＵＤＧ（ＬＴＩ）を含む１０μｌの反応物中で、ゲル精製された、直鎖状ｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３クローニングベクター（約５０ｎｇ）と混合した。３７℃での３０分後、各反応の１μｌアリコートを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（ＬＴＩ）に形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップＤＮＡの分析は、ＣＡＴ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０１）（図８Ｃ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６０９）（図８Ｄ）、およびリーディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６１７）（図８Ｅ）でクローン化され、そしてｐｈｏＡ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０６）（図８Ｆ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６１３）（図８Ｇ）、およびリーディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６２１）（図８Ｈ）でクローン化されたことを示した。
【０１９２】
（パートＩＶ：ＣＡＴまたはｐｈｏＡのＵＤＧクローニングベクターからＧＳＴ融合ベクターへのサブクローニング）
３つ全てのリーディングフレームでのＧＳＴとＣＡＴまたはｐｈｏＡのいずれかとの間の融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによって構築した。ＧＳＴベクタードナーｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）（上記のＰｈａｒｍａｃｉａプラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ由来）のミニプレップＤＮＡを、Ｃｌａ  Ｉを用いて直鎖状にした。約５ｎｇのベクタードナーを、緩衝液および組換えタンパク質Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（実施例５）を含む８μｌの反応物中、ＣＡＴまたはｐｈｏＡを含む各約１０ｎｇの適切な環状遺伝子ドナーベクターと混合した。インキュベーション後、１μｌの各反応物を、Ｅ．  ｃｏｌｉＤＨ５α株に形質転換し、そして表７に示すようにアンピシリン上にプレートした。
【０１９３】
【表７】
0004303418.tif 000012
（パートＶ：融合タンパク質の発現）
各形質転換由来の２つのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１７×１００ｍｍのプラスチックチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２０５９，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中の２ｍｌのリッチ培地（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ，  Ｂｉｏ１０１  Ｉｎｃ．）中にひろい、そして３７℃で約４時間強く振盪し、その時培養物は視覚的に濁っていた。１ｍｌの各培養物を、ＧＳＴの発現を誘導するために１０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＩＰＴＧを含む新しいチューブに移した。さらなる２時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度を有した；１つの培養物のＡ６００は、１．５であった。０．３５ｍｌの各培養物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝液（ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含む）で処理し、そして細胞の約０．１５のＡ６００単位に等価なアリコートを、Ｎｏｖｅｘ  ４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルに供した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
【０１９４】
結果：単一のタンパク質のバンドの増大した発現は、１２の培養物の全てで見出された。これらのタンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディングフレームでＣＡＴ（図８Ｉ）またはｐｈｏＡ（図８Ｊ）に（終止コドンを含まないａｔｔＢ組換え部位を介して）融合されたＧＳＴの予想したサイズと良く相関した：ＣＡＴ  ｒｆ１＝２６９アミノ酸；ＣＡＴ  ｒｆ２＝３０３アミノ酸；ＣＡＴ  ｒｆ３＝４７８アミノ酸；ｐｈｏＡ  ｒｆ１＝２８２アミノ酸；ｐｈｏＡ  ｒｆ２＝２８０アミノ酸；およびｐｈｏＡ  ｒｆ３＝７０５アミノ酸。
【０１９５】
分析：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子の両方を、３つ全てのリーディングフレームでＧＳＴ融合ベクターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質の発現を示した。
【０１９６】
（実施例７：逆組換えおよび組換えによるサブクローニング）
２つのプラスミドを、本発明に従う逆組換えを実証するために構築した。ａｔｔＢ組換え部位を含み、そしてａｔｔＢ親プラスミド（このベクターは、産物ＤＮＡに相当し得る）と称するベクターｐＥＺＣ５６０１（図１０Ａ）は、上記のように、さらにアンピシリン耐性遺伝子、複製起点、ａｔｔＢ２部位、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびａｔｔＢ０部位を含んだ。ａｔｔＰ組換え部位を含み、ａｔｔＰ親プラスミド（このベクターは、副産物ＤＮＡに相当し得るか、または異なるベクタードナーＤＮＡに相当し得る）と称するプラスミドｐＥＺＣ６７０１（図１０Ｂ）もまた、カナマイシン耐性遺伝子、複製起点、ａｔｔＰ２部位、毒性タンパク質ｃｃｄＢをコードする遺伝子、およびａｔｔＰ０部位を含んだ。１０×インテグラーゼ緩衝液には、０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、０．７Ｍ  塩化カリウム、５０ｍＭ  塩酸スペルミジン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡが含まれた。ａｔｔＰ０およびａｔｔＰ２がＰ１ドメインおよびＨ１ドメインを含んでいたことに注目のこと。インテグラーゼ（４３５ｎｇ／μｌを１．５μｌ）およびＩＨＦ（１×インテグラーゼ緩衝液中１６ｎｇ／μｌを１．５μｌ）を１３．５μｌの１×Ｉｎｔ緩衝液と混合してリコンビナーゼ混合液を作製した。
【０１９７】
２つの８μｌ反応液を集めた。反応Ａには、３００ｎｇのｐＥＺＣ６７０１プラスミドおよび１×インテグラーゼ緩衝液中の２μｌのリコンビナーゼ混合液が含まれた。反応Ｂには、３００ｎｇのｐＥＺＣ５６０１、３００ｎｇのｐＥＺＣ６７０１、および１×インテグラーゼ緩衝液中の２μｌのリコンビナーゼ混合液が含まれた。両方の反応を、２５℃で４５分間、次いで７０℃で５分間インキュベートし、次いで冷却した。ＴＥ緩衝液（７９２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各々の反応に添加し、そして１μｌのこの希釈反応液をＤＨ５α  ＵｌｔｒａＭａｘコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に形質転換した。非選択培地中での１時間の発現の後、各々の形質転換体の１０分の１（１００μｌ）を、１００μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む寒天プレート上に広げた。
【０１９８】
３７℃における一晩のインキュベーション後、反応Ａからのプレートは１つのコロニーを含んだが、一方反応Ｂからのプレートは３９２コロニーを含んだ。１２のコロニーを反応Ｂプレートからひろい上げて、富化液体培地に移し、そして一晩増殖させた。これらの培養物から調製したミニプレップＤＮＡを、アガロースゲル上で切断せずに泳動し、そして１２のコロニーすべてが約３．８ｋｂのプラスミドを含んだ。ミニプレップＤＮＡのうちの６個を制限酵素ＣｌａＩで切断し、そしてこれもまたＣｌａＩで切断したｐＥＺＣ６７０１（カナマイシン耐性の親のプラスミド）とともに泳動した。プラスミドｐＥＺＣ６７０１を１回ＣｌａＩで切断して、約３．８ｋｂのフラグメントを得た。６個のミニプレップＤＮＡを２回ＣｌａＩで切断して、約９００塩基対および約２９００塩基対のフラグメントを得た。
【０１９９】
分析：ｐＥＺＣ６７０１上のａｔｔＰ部位とｐＥＺＣ５６０１上のａｔｔＢ部位との間の組換えは、アンピシリン耐性遺伝子およびｃｃｄＢ遺伝子を含む、２つの娘のプラスミド、ａｔｔＬ産物プラスミドの産生を生じる（図１０Ｃ）（これは、ベクタードナーＤＮＡまたは新しい副産物ＤＮＡに一致し得る）。そしてカナマイシンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むａｔｔＲ産物プラスミドの産生を生じる（図１０Ｄ）（これは、挿入ドナーＤＮＡまたは新しい産物ＤＮＡに一致し得る）。ａｔｔＬ産物プラスミド、ａｔｔＰ親プラスミドｐＥＺＣ６７０１、または組換え中間体を受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を、毒性のｃｃｄＢ遺伝子産物によって殺傷した。ａｔｔＢ親プラスミドｐＥＺＣ５６０１を受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を、カナマイシン選択によって殺傷した。カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む、所望のａｔｔＲ産物プラスミドを受容するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞のみが、コロニーを形成するために生存した。選択ストラテジーの成功は、片方の親のプラスミドのみを含む反応に比較して、両方の親のプラスミドを含む反応からの多数のコロニーによって、示される。その反応機構は、その所望の産物プラスミドが２つのＣｌａＩ制限部位を含み、１つはｐＥＺＣ６７０１  ａｔｔＰ親プラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子中にあり、そしてもう一方はｐＥＺＣ５６０１  ａｔｔＢ親プラスミド由来のテトラサイクリン耐性遺伝子中にあることを予測した。２つの部位の存在、およびＣｌａＩ消化から生じるフラグメントのサイズによって反応機構を確認した。
【０２００】
従って、本発明は図１に示される組換え反応の逆転に関し、ここでは産物ＤＮＡおよび副産物ＤＮＡを合わせて、挿入ドナーＤＮＡおよびベクタードナーＤＮＡを産生し得る。さらに、本発明は、サブクローニング組換えを提供し、ここでは産物ＤＮＡ（図１に従って産生される）を新しいベクタードナーＤＮＡと合わせて、新規な産物ＤＮＡ（異なるベクターバックグラウンド中で）および新規な副産物を産生し得る。
【０２０１】
（実施例８：線状化したフラグメントのサブクローニング）
プラスミドｐＥＺＣ７１０２（図１１Ａ）、ａａｔＰ親プラスミド（これはベクタードナーＤＮＡに対応し得る）は、セグメントａｔｔＰ１、複製起点、カナマイシン耐性、ａｔｔＰ３、クロラムフェニコール耐性、および毒性遺伝子ｃｃｄＢを含み、そして本明細書中で記載される実験においてはスーパーコイル型であった。プラスミドｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）、ａｔｔＢ親プラスミド（これは挿入ドナーＤＮＡまたは産物ＤＮＡに対応し得る）は、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の機能的ドメインを含むベクター中のａｔｔＢ１とａｔｔＢ３部位との間にクローニングされたＧＦＰ遺伝子を含んだ。このａｔｔＰ部位は、Ｐ１およびＨ１ドメインを含んだ。プラスミドｐＥＺＣ７５０１を切断せずに使用するか、またはＳｃａＩでアンピシリン耐性遺伝子内で直鎖状にするか、またはＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断して、ＳａｌＩ末端、２２ｂｐ、ａｔｔＢ１部位、ＧＦＰ遺伝子、ａｔｔＢ３部位、およびＸｂａＩ末端まで１４ｂｐを含むフラグメントを得た：
ＳａｌＩ末端−−２２ｂｐ−−ａｔｔＢ１−−ＧＦＰ−−ａｔｔＢ３−−１４ｂｐ−−ＸｂａＩ末端。
【０２０２】
反応（８μｌ最終容量）は、約４０ｎｇの各ＤＮＡ、１×Ｉｎｔ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  スペルミジンＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、１２．５％グリセロール、８ｎｇ  ＩＨＦ、および４３ｎｇλインテグラーゼを含む。反応を２５℃で４５分間、次いで７０℃で５分間インキュベートし、次いで冷却した。各反応の１μｌアリコートを２連でＤＨ５α  ＵｌｔｒａＭａｘ細胞に形質転換し、そしてカナマイシン寒天プレート上に２連でプレートした。
【０２０３】
（スーパーコイル型）ｐＥＺＣ７１０２のみを含む反応は、平均２コロニー（１〜４の範囲）を与えた。ｐＥＺＣ７１０２およびスーパーコイル型ｐＥＺＣ７５０１の両方を含む反応は、平均６１２コロニー（４８２〜７６２の範囲）を与えた。ｐＥＺＣ７１０２および直鎖状（ＳｃａＩ切断）ｐＥＺＣ７５０１を含む反応は、平均３６０コロニー（１２７〜６０５の範囲）を与えた。ａｔｔＢ部位を超えて（ＳａｌＩおよびＸｂａＩで切断したｐＥＺＣ７５０１）ａｔｔＢ部位および２２ｂｐおよび１４ｂｐを有するフラグメント上にｐＥＺＣ７１０２およびＧＦＰ遺伝子を含む反応は、平均２７４コロニー（２４３〜３０８）を与えた。
【０２０４】
ミニプレップＤＮＡを、ｐＥＺＣ７１０２×スーパーコイル型ｐＥＺＣ７５１０反応由来の４つのコロニーから、そしてｐＥＺＣ７１０２×ｐＥＺＣ７５０１／ＳａｌＩ＋ＸｂａＩ反応由来の１０個のコロニーから調製した。１４個すべてのＤＮＡを、切断せずにアガロースゲル上で泳動し、そしてｐＥＺＣ７１０２×ｐＥＺＣ７５０１／ＳａｌＩ＋ＸｂａＩ反応由来の１０個のＤＮＡをＮｃｏＩおよびＰｓｔＩの混合液で切断し、そしてアガロースゲル上で泳動した。すべての切断していないプラスミドは、約２．８ｋｂのサイズであった。ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩの混合液で切断した１０個すべてのプラスミドは、約７００と２１００ｂｐとの間のフラグメントを与えた。
【０２０５】
結果を表８に示す。
【０２０６】
【表８】
0004303418.tif 000013
分析：プラスミドｐＥＺＣ７５０１上のａｔｔＢ部位とプラスミドｐＥＺＣ７１０２上のａｔｔＰ部位との間の組込み反応は、ｐＥＺＣ７５０１からのＧＦＰセグメント、およびｐＥＺＣ７１０２からのカナマイシン起源セグメントを含む、ａｔｔＬ産物プラスミド（図１１Ｃ）（挿入ドナーＤＮＡに相当する）を産生することが予測された。ａｔｔＰ親プラスミドｐＥＺＣ７１０２（副産物ＤＮＡに対応する）上の毒性遺伝子ｃｃｄＢの存在は、このプラスミドを受容したすべての細胞を殺傷することが予想された。ｐＥＺＣ７５０１が存在する場合にコロニーの数の大きな増加は、所望の反応が起こり、そしてたとえａｔｔＢ親プラスミド（産物ＤＮＡに対応する）が直鎖状である（ＳｃａＩ切断）場合でも反応の効率は十分であることを示し、またはａｔｔＢ部位およびＧＦＰ遺伝子が存在する場合に、フラグメントはａｔｔＢ部位を超えたさらなる配列をほとんど含まなかったことを示した。
【０２０７】
これらの結果は、直鎖状のフラグメントが、本発明の方法によって異なるベクターに適切にサブクローニングされ得ることを示す。
【０２０８】
（実施例９：長いＰＣＲフラグメントのクローニング）
ＰＣＲ産物を、一方の端にａｔｔＢ０（野生型）部位、および他の端にｌｏｘＰ部位を有するように設計した。その理論的根拠は、ａｔｔＰ０×ａｔｔＢ０反応がａｔｔＢ０分子（ＰＣＲ産物）を用いて十分に線状化されること（これは正常なラムダ組込み反応を含むので）、そして同時組込み物からのｌｏｘＰ×ｌｏｘＰ切除はまた、効率的である（単一分子の切除反応が効率的であり、二分子組込み反応がＣｒｅを用いて効率的ではない）ことである。
【０２０９】
ａｔｔＢ含有ＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＡＡＧ  Ｇ−３’（配列番号３１）であった。ｌｏｘＰプライマーの配列は、５’−ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｇ−３’ （配列番号３２）であった。これらのプライマーは、ヒトミオシン重鎖の一部を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、ＥＬＯＮＧＡＳＥTMおよびＫ５６２ヒトＤＮＡを鋳型として使用して行った。ポリメラーゼ連鎖反応を以下のように行った。反応溶液（５０μｌ）は、ＥＬＯＮＧＡＳＥTMＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で１００ｎｇ  Ｋ５６２ヒトＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．２μＭの各プライマー、および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰを含んだ。薄い壁のチューブ中、ミネラルオイルの下で反応溶液を、９４℃で１分間の変性、次いで９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および６８秒間で８分３０秒間の３５回サイクルで行った。温度サイクリングに続いて、反応液を４℃で維持した。５．２ｋｂのＰＣＲ産物（図９Ａ）を、ゲル精製した。
【０２１０】
プラスミドｐＥＺＣ１２０２（図９Ｂ）は、野生型ａｔｔＰ部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｔｅｔリプレッサーをコードする遺伝子、野生型ｌｏｘＰ部位、複製起点、およびカナマイシン耐性遺伝子を転写し、そして転写制御するｔｅｔオペレーター／プロモーターを含んだ。このプラスミドは、クロラムフェニコール耐性を与えたが、カナマイシン耐性を与えなかった。なぜなら、プラスミドの１つのエレメントによって作られたｔｅｔリプレッサーが、カナマイシン耐性遺伝子を遮断したままにしたからである。本実験において使用されたｐＥＺＣ１２０２  ＤＮＡは、その濃度が１μｌあたり約５０ｎｇであると見積もられたミニプレップであった。
【０２１１】
約４０ｎｇのゲル精製された５．２ｋｂＰＣＲ産物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  約７．８、１６ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３７５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン中に約５０ｎｇのスーパーコイル型ｐＥＺＣ１２０２、０．２ユニットのＣｒｅリコンビナーゼ、３．６ｎｇ  ＩＨＦ、および１１ｎｇのＩｎｔを含む１０μｌの反応液中に含めた。ＰＣＲ産物を含まない第２の反応溶液を、コントロールとして含めた。２７℃で４５分間、次いで７０℃で５分間のインキュベーションの後、１μｌのアリコートをＤＨ５α  ＵｌｔｒａＭａｘコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。各発現混合液の５分の１を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天上にプレートし、そしてそのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＲ産物を含んだその反応液は、３４コロニーを与えたが、一方ＰＣＲ産物を欠く反応溶液は３１コロニーを与えた。そのプレートを室温に４日間置いた後に、２６のさらなる小さいコロニーが陽性（＋ＰＣＲ産物）反応からのプレート上に見られたが、一方１つのさらなる小さいコロニーのみが陰性（−ＰＣＲ産物）反応からのプレート上に見られた。
【０２１２】
２６の小さいコロニーのうちの１２個を、２５μｇ／ｍｇ  カナマイシンを含む富化ブロス（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ）中で一晩増殖させ、そしてミニプレップＤＮＡをこれらの培養物から調製した。１２すべてのミニプレップは約８ｋｂのサイズであり、これらは５．２ｋｂＰＣＲ産物を有するｐＥＺＣ１２０２中のクロラムフェニコール耐性遺伝子およびｔｅｔリプレッサー遺伝子の置換について予測されたサイズに対応した。予想された組換え産物を図９Ｃに示す。これらのプラスミドのうちの２つをＡｖａＩ（予想された８部位）およびＢａｍＨＩ（予想された４部位）で切断した。すべての予想されたＡｖａＩフラグメントは存在すると思われた。ＰＣＲ産物中で予想されたＢａｍＨＩ部位のうちの１つの部位（ａｔｔＢ端に最も近いもの）は、両方のミニプレップに存在しなかったが、他のＢａｍＨＩフラグメントはクローニングされた５．２ｋｂのＰＣＲ産物の予測された構造と一致した。
【０２１３】
分析：５．２ｋｂ  ＰＣＲ産物（ヒトミオシン重鎖の一部）を有するｐＥＺＣ１２０２中のクロラムフェニコール耐性遺伝子およびｔｅｔリプレッサー遺伝子の置換は、カナマイシンに対する宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の中程度の耐性を与えたが、この耐性は一晩のインキュベーション後にコロニーが出現することを可能にするには十分ではなかった。従って、所望の組換え産物を含むコロニーはカナマイシンプレートで増殖するが、一晩のインキュベーション後には見られなかった。しかし、そのコロニーはさらなる室温でのインキュベーションの後にのみ見られた。そのヌクレオチド配列から予想された１２のＡｖａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位のうち、１１が実験的に確かめられた。従って、以下の３つの観察は、５．２ｋｂのＰＣＲ産物が組換えによってクローニングされたという結論を支持する：（ａ）小さく、遅い増殖コロニーはＰＣＲ産物を含む反応物からのプレート上にのみ見られた；（ｂ）これらのコロニー由来のミニプレッププラスミドは、予測されたサイズであった；そして（ｃ）診断的な制限切断は、予測されたフラグメントを与えた（上記の１つの例外を伴う）。
【０２１４】
（実施例１０：ＰＣＲフラグメントのクローニング）
ＰＣＲプライマー対の３セット（表９）を設計し、ａｔｔＢ１−ＧＦＰ−ａｔｔＢ３を含むプラスミドｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）内の８３０ｂｐの配列を、２５ｂｐ  ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３組換え部位の外側末端に、さらなるヌクレオチドを有するか、またはさらなるヌクレオチドなしで、増幅した。（ここで「外側（ｏｕｔｅｒ）」とは、ＧＦＰ遺伝子配列に隣接しないａｔｔＢ配列の末端をいう。）プライマーセットＡは、ａｔｔＢ１の上流に１７ヌクレオチドを付加して、そしてａｔｔＢ３の下流に１５ヌクレオチドを付加した；プライマーセットＢは、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３にそれぞれ５および８ヌクレオチドを付加した；そしてプライマーセットＣは、ａｔｔＢ組換え配列のどちらにもさらなるヌクレオチドを付加しなかった。
【０２１５】
このプライマー配列を表９に提供する。
【０２１６】
【表９】
0004303418.tif 000014
（ＰＣＲ反応）
最初に、プライマーセットＡおよびＣを、二連で、５０μｌで、以下のＰＣＲ反応とともに用いた。最終濃度は以下の通りであった：
２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．４
５０ｍＭ  ＫＣｌ
４つすべてのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）０．２ｍＭ
スーパーコイル化ＤＮＡテンプレート、４００ｎｇ／ｍｌ  ｐＥＺＣ７５０１
各プライマー  ０．５μＭ
組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ）１００  Ｕ／ｍｌ
上記反応の二連セットは１Ｍベタインを含有した。
【０２１７】
この反応は最初、９４℃で１分間加熱して、次いで、９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分を２５回繰り返した。
【０２１８】
ＰＣＲ反応産物のサイズを、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有ＴＡＥ緩衝液中で、１％アガロースゲル上で分析した。すべての反応が期待のサイズの産物を生じ、従って二連の反応物をプールした。ベタインの有無により対応する反応物は有意に異ならなかったので、これらもプールし、プライマーセットＡおよびＣを用いた反応の最終プール容量それぞれ２００μｌを得た。
【０２１９】
次いで、プライマーセットＢを、上記で実行したものと同一の反応とともに用いた（反応容量を１００μｌに増加したことを除いて）。二連の複製反応物ならびにベタイン添加反応物およびベタイン無添加反応物をプールしたあと、プライマーセットＢを用いた反応物の最終容量は、４００μｌであった。
【０２２０】
この３つのプールしたプライマー反応産物を４週間、−２０℃で保存した。
【０２２１】
（ＰＣＲ産物精製）
３つのプールされたＰＣＲ産物のそれぞれを、Ｔｒｉｓ緩衝化フェノール、イソアミルアルコールおよびクロロホルムの等量混合液を用いて１回抽出した。次いで、水性の上清を等量のイソブタノールを用いて、２回抽出して、そして水性層を、２容量のエタノール、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．２を用いてエタノール沈殿した。このエタノール沈殿物を、室温で、１３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により回収して、そして上清を廃棄した。この乾燥ペレットをＴＥ（プライマーセットＡおよびＣを用いて調製された反応物については１００μｌ；プライマーセットＢを用いた反応物については２００μｌ）に溶解した。
【０２２２】
ＰＣＲプライマーおよび外来の小さいＰＣＲ産物を除くために、１／２容量の３０％ＰＥＧ  ８０００（Ｓｉｇｍａ）、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2溶液を添加して、よく混合して、そしてすべて室温で１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離をすることにより、ＰＣＲ産物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿させた。この上清を捨てて、そしてペレットをその前の容量のＴＥ緩衝液に溶解した。３つのＰＣＲ産物それぞれの１μｌアリコートを、１％アガロースゲル上でチェックして、回収を定量して、回収は９０％を超えると見積もられた。それぞれのＰＣＲ産物の濃度を、ＴＥを用いて４０ｎｇ／μｌに調整した。
【０２２３】
（プライマーセットＡ、ＢおよびＣのＰＣＲ産物を用いる組換え反応）
５つの８μｌ反応物を、４０ｎｇのｐＥＺＣ７１０２  ＤＮＡ、２μｌのリコンビナーゼ混合物（１×  Ｉｎｔ緩衝液、５０％グリセロール中に８ｎｇ／μｌ  ＩＨＦ、２２ｎｇ／μｌ  Ｉｎｔ）を含有する、１×  インテグラーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５，２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０，８０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  スペルミジン，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で構築した。反応物は、プライマーセットＡ（反応Ａ）、プライマーセットＢ（反応Ｂ）、もしくはプライマーセットＣ（反応Ｃ）のＰＣＲ産物のどれかの添加により；ＰＣＲ産物を添加しないこと（反応Ｄ）、または陽性コントロールとして４０ｎｇのｐＥＺＣ７５０１  ＳＣ（スーパーコイル化）ＤＮＡの添加（反応Ｅ）により異なる。すべての反応を、二連で実行した。
【０２２４】
この反応を、２５℃で４５分間、７０℃で１０分間インキュベートして、次いで０〜５℃においた。それぞれの反応の２μｌアリコートを、５０μｌの形質転換反応中で、Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α中に形質転換して、そして、５０Ｃ培地中の発現後に、反応物の１／５（１００μｌ）および４／５（４００μｌ）を、カナマイシン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ培養プレート上にプレートした。この二連反応物の結果を表１０に示す。
【０２２５】
【表１０】
0004303418.tif 000015
（得られたコロニーの分析）
ミニプレップＤＮＡを、プライマーセットＡ、ＢまたはＣを用いたそれぞれの組換え反応物の８つのコロニーから調製した。得られたスーパーコイル化ＤＮＡを、１％アガロースゲル上で分析した：プライマーセットＡおよびＢの組換え産物からの８つのすべてのコロニーは、ＰＣＲ産物（約８２４ｂｐ）とｐＥＺＣ  ７１０２によって与えられたａｔｔＢ１−−ｏｒｉ−−ｋａｎ’−−ａｔｔＢ３配列（１９６７ｂｐ）との間の正しい組換えについて予想されるサイズ（２７９１ｂｐ）であった。プライマーセットＣの８つの反応産物のうち３つは、予想されるサイズで；他の５つすべては４ｋｂよりわずかに大きかった。
【０２２６】
反応産物のさらなる分析を、２つの異なる制限酵素、ＡｖａＩおよびＰｖｕＩＩを用いて実行した。これら酵素の各々は、予想組換え産物中で２度切断（ただし違う位置で）する（一度は、ＰＣＲ産物配列中で、そして一度はｐＥＺＣ７１０２により与えられる配列中で）。これらの酵素両方とも、２つの部位で完全なｐＥＺＣ７１０２組換えパートナーのプラスミドを切断し、期待される組換え産物のフラグメントから容易に識別されるフラグメントをもたらすはずである。
【０２２７】
２つの制限酵素消化物は、プライマーセットＡおよびＢを用いた組換え反応物から生成されたコロニーから、ならびに期待されたサイズのスーパーコイル化ＤＮＡを示すプライマーセットＣからの３つのコロニーについて、期待されるサイズのフラグメント（ＡｖａＩでは２３７３および４３０ｂｐ；ＰｖｕＩＩでは２４７３および３３０ｂｐ）を生じた。しかし、より長いＳＣ  ＤＮＡを生じたプライマーセットＣからの他の５つのコロニーについて、ＰｖｕＩＩ消化は、ｐＥＺＣ７１０２の消化から予想されるフラグメントに対して近似のサイズのフラグメントを示したが、ＡｖａＩ消化は、線状化ｐＥＺＣ７１０２（４１６１ｂｐ）のサイズに近似の、単一フラグメントのみを示した。
【０２２８】
（分析）
これらの結果は、ａｔｔＢ部位に隣接される遺伝子を含むテンプレートから生成されたＰＣＲ産物が、逆組換え反応のための効率的基質として働き得ることを示す。ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３部位またはコア領域の末端への短いＤＮＡ配列（例えば、プライマーセットＢにおいて、各々５ｂおよび８ｂｐ）でさえの付加は、この反応を１００倍以上刺激した。驚くべきことに、ａｔｔＢ部位を越えてさらなる配列を含有するＰＣＲ産物を用いる逆組換え反応物が、これらの反応において、スーパーコイル化した陽性コントロールプラスミドｐＥＺＣ７５０１よりも効率的な組換えパートナーであるようであった。
【０２２９】
すべての組換え産物が忠実に生成された。低レベルのバックグラウンドコロニーが、プライマーセットＣを用いた相対的に非効率的な組換え反応物（２５ｂｐのａｔｔＢ部位を越える付加配列を欠いた）から出現した。このバックグラウンドは、活性ｃｃｄＢ死亡遺伝子を欠損するほぼ完全なｐＥＺＣ７１０２（これはカナマイシン抵抗性をコードする）（このことにより、その生存を可能にする）に起因するようであった。このプラスミドにおいてＡｖａＩについての２つの制限部位の１つがまた変化したということがこの解釈と一致する。ＡｖａＩ部位の１つは、ｐＥＺＣ７１０２のｃｃｄＢ領域内に存在する。従って、この部位の変化は、ｃｃｄＢ遺伝子の変異性の不活化に対して二次的であるという可能性がある。
【０２３０】
（実施例１１：ＰＣＲフラグメントのさらなるクローニング）
プラスミドｐＢＲ３２２からＰＣＲ産物を調製するための６プライマーの２つのセットを、テンプレートとして用いた。１つのセット（表１１）は、ＴｅｔＲプロモーターを含むＴｅｔＲ遺伝子に隣接する配列へアニールした。他のセット（表１２）は、そのプロモーターを含むＡｍｐＲ遺伝子に隣接する配列へアニールした。用いた「ｔｅｔ」および「ａｍｐ」プライマーは、ａｔｔＢ配列を含まず、ｐＢＲ３２２プラスミドに固有の配列のみを含む；「ａｔｔＢ」プライマーは、ｐＢＲ３２２配列に加えて、２５ｂｐのａｔｔＢ  ＩまたはａｔｔＢ３配列を含む；「ａｔｔＢ＋４」プライマーは、ｐＢＲ３２２特異的配列および２５ｂｐ  ａｔｔＢ  ＩまたはａｔｔＢ３配列を含み、それぞれ４つのＧを外側末端に有する。（ここで「外側」は、テンプレート特異的プライマー配列に隣接しないａｔｔＢ配列の末端をいう。）
（ｐＢＲ３２２テンプレートの調製）
ＰＣＲ反応の効率性を改善するために、３７℃で、１時間、１５ユニットの制限酵素ＮｄｅＩおよび最終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ならびに５０ｍＭ  ＮａＣｌとともに、２００μｌ反応液中で、３．５μｇのスーパーコイル化（ＳＣ）ｐＢＲ３２２  ＤＮＡをインキュベートすることにより、スーパーコイル化したｐＢＲ３２２  ＤＮＡを、線状化した。
【０２３１】
消化したｐＢＲ３２２  ＤＮＡをフェノール、イソアミルアルコール、およびクロロホルムを用いて１回抽出して、イソブタノールで２回抽出して、そして０．１５Ｍ酢酸ナトリウム添加のエタノール２容量を添加して沈殿させた。この沈殿を、１００％エタノールで１回洗浄して、乾燥して、次いで、ＴＥ緩衝液に溶解した。ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで定量した、ＤＮＡの回収は、８０％より大きいと見積もられた。
【０２３２】
【表１１】
0004303418.tif 000016
【０２３３】
【表１２】
0004303418.tif 000017
（ｔｅｔおよびａｍｐ遺伝子配列のＰＣＲ増幅）
６つのＰＣＲ反応を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，２ｎｇ線状化ｐＢＲ３２２，２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ），ならびに表３および４に挙げたＰＣＲプライマー対それぞれの０．５μＭからなる、１００μｌの中で行った。この反応物を最初、９４℃へ３分間、加熱し；次いで９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５サイクルに供した。１％アガロースゲル分析に基づいて、反応物のすべてが、妥当な収率で期待されたサイズの産物を生成した。
【０２３４】
（ＰＣＲ産物の精製）
上記のように、二連の反応からの産物をプールし；等容量のフェノール、イソアミルアルコールおよびクロロホルムを用いて抽出し；等容量のイソブタノールを用いて２回抽出し；そして、２容量のエタノールを用いて沈殿した。６つの沈殿物を、１００％エタノールで１回洗浄して、乾燥して、そして１００μｌ  ＴＥに溶解した。１μｌのアリコートを、ＰＥＧ沈殿の前に、産物のゲル分析のために取り出した。
【０２３５】
それぞれのチューブに５０μｌの３０％ＰＥＧ  ８，０００、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を添加した。この溶液をよく混合して、そして室温で１３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。この上清を注意深く取り除き、そして沈殿を１００μｌ  ＴＥに溶解した。回収を１％アガロース上で定量して、そして９０％を超えると見積もった。ゲル分析はまた、約３００ヌクレオチドより短い核酸産物が、ＰＥＧ沈殿工程により効率的に除去されたことを示した。
【０２３６】
（組換え反応）
それぞれ、総容量８μｌで、１×インテグラーゼ緩衝液、４０ｎｇ  ｐＥＺＣ７１０２（図１１Ａ）、および２μｌリコンビナーゼ混合物を含有する７つの組換え反応を、実行した（上記、実施例１０参照のこと）。それぞれの反応物はまた、６つの上記ＰＣＲ産物の１つの約４０ｎｇ、または陽性コントロールとして、４０ｎｇのｐＥＺＣ７５０１（図１１Ｂ）を含んだ。末端にａｔｔＢ部位を有するａｍｐおよびｔｅｔ  ＰＣＲ産物を図１２Ａおよび１２Ｂに示す。この反応物を、２５℃で４５分間、７０℃で１０分間インキュベートして、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ．への形質転換に用いるまで０〜５℃で１〜２時間保持した。
【０２３７】
（組換え反応産物を用いるＥ．ｃｏｌｉ．形質転換）
それぞれの組換え反応物の１μｌを、５０μｌ形質転換反応物中で、Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αに形質転換し、そして、ＳＯＣ培地中の発現後に、それぞれの反応物の１／５（１００μｌ）および４／５（４００μｌ）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有の培養プレート上にプレートした。このプレートを一晩インキュベートして、そしてコロニーをカウントした。それぞれの二連反応セットから得られたコロニー数を表１３に示す。
【０２３８】
【表１３】
0004303418.tif 000018
（得られたコロニーの分析）
迅速な表現型スクリーニングとして、ｔｅｔ  ＥＺＣ反応物からの１０のコロニーおよびａｔｔＢ＋４−ｔｅｔ  ＥＺＣ反応物からの３３のコロニーを、テトラサイクリン含有（１５μｇ／ｍｌ）のＬＢ培養プレート上に画線した。テトラサイクリンの効力についてのコントロールとして、ＴｅｔＲ遺伝子を欠落するｐＵＣ１９形質転換細胞の３つのコロニーもまた、プレートに画線した。ａｔｔＢ＋４−ｔｅｔ  ＥＺＣ反応物からのすべてのコロニーはよく増殖した；ｔｅｔＥＺＣ反応物からのコロニーは、非常にわずかにのみ増殖して、そしてｐＵＣ１９コロニーはまったく増殖しなかった。
【０２３９】
類似の結果が、ａｍｐ  ＰＣＲ反応物からのコロニーをアンピシリン含有（１００μｇ／ｍｌ）培養プレート上に画線することにより得られた。ａｔｔＢ＋４−ａｍｐ組換え反応物から生成された２１のコロニーすべてがよく増殖し、一方で、ａｔｔＢ−ａｍｐ反応物からの１３のコロニーでは１つだけがアンピシリンの存在下で増殖した。ａｍｐ  ＰＣＲ産物を用いた組換え反応物からの１５のコロニーではいずれも増殖は見られなかった。
【０２４０】
プラスミドＤＮＡを特徴付けるために、ＰＣＲ産物を用いた６つのＥＺＣ反応物から生成された８つのコロニーを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢブロスに突ついて入れて、そして３７℃で一晩、増殖させた。ミニプレップＤＮＡを、それぞれの培養物の０．９ｍｌから調製して、そしてスーパーコイル化ＤＮＡのサイズを、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で分析した。この結果を表１４に示す。組換え産物の予想される構造を、図１２Ｃおよび１２Ｄに示す。
【０２４１】
【表１４】
0004303418.tif 000019
（分析）
プラスミドｐＢＲ３２２の中の、２つの異なる遺伝子配列、ｔｅｔおよびａｍｐの増幅に基づく、これらの結果は、２５ｂｐのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ３組換え配列を含むプライマーを用いて生成されたＰＣＲ産物が、組換え反応のための高度に効率的な基質として働くことを明らかに実証する。それぞれの２５ｂｐ  ａｔｔＢ部位の外側への短い配列の付加は、実施例１０の実験にも観察されるように、組換え反応を１００倍を超えて刺激する。また実施例１０と同様に、ａｔｔＢ部位を有する線状ＰＣＲ産物を用いる組換え反応の効率は、陽性コントロールＳＣ  ＤＮＡプラスミド、ｐＥＺＣ７５０１で得られる効率を超えた。
【０２４２】
さらに、高いパーセンテージの反応産物は予想される通りである。なぜならａｔｔＢ＋４−ｔｅｔ反応物からの試験された３３コロニーすべてが、機能的なテトラサイクリン抵抗性を示して、そしてａｔｔＢ＋４−ａｍｐ反応物からの２１コロニーすべてが、アンピシリン抵抗性を示したからである。ミニプレップＤＮＡの１６すべて（ａｔｔＢ＋４−ｔｅｔまたはａｔｔＢ＋４ａｍｐのいずれかのＰＣＲ産物のｐＥＺＣ７１０２との組換え反応物から調べられた）が、スーパーコイル化ＤＮＡおよび正しいサイズの制限消化フラグメントを生成した。
【０２４３】
（実施例１２：組換えを刺激するためのトポイソメラーゼの使用）
親のプラスミドの一方を線状にすることによる組換え反応の刺激は、期待されなかった。この刺激が、２つの組換え反応の間に生じる、いくらかの高次構造強制の緩和（コインテグレートの形成および２つの娘分子への分解）から得られる場合、トポイソメラーゼによるプラスミドの巻き戻しはまた、一方または両方の親プラスミドが環状であるときも刺激的であり得る。
【０２４４】
挿入ドナーは、ｐＥＺＣ２９０１（図７Ａ）であり、ベクタードナーは、ｐＥＣＺ３１０１（図７Ｂ）であった。ｐＥＺＣ３１０１の部分を、Ｍｌｕ  Ｉで線状化した。２０ｎｇのｐＥＺＣ２９０１および／または  ｐＥＣＺ３１０１を、それぞれの１０μｌの反応（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ約７．８、１６．５ｍＭ  ＮａＣｌ，３５ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  スペルミジン、０．３７５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％グリセロール中の２９ｎｇ  Ｉｎｔ，２．９ｎｇ  Ｘｉｓ，５．４ｎｇ  ＩＨＦ）中に用いた。トポイソメラーゼＩ（ウシ胸腺；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ，Ｉｎｃより）を、１×  ＥＺＣ緩衝液中で、１５ｕｎｉｔｓ／μｌから、表１５に示す濃度へ希釈した。
【０２４５】
【表１５】
0004303418.tif 000020
これらの反応物を以下の順に構築した：緩衝液；ＴＥ；ＤＮＡｓ；クロナーゼ；トポイソメラーゼ。反応物を、２２℃〜２８℃で４５分間、次いで７０℃で５分間インキュベートした。１μｌのアリコートをＵｌｔｒａＭａｘ  ＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。発現後に、アリコートを１００μｇ／ｍｌカナマイシンにプレートして、そして３０℃で４８時間インキュベートした。結果：表１６を参照のこと。
【０２４６】
【表１６】
0004303418.tif 000021
（分析）
ベクタードナーの線状化は、コロニー数を約１０倍に増加した（反応２対反応７）。環状挿入ドナーおよび線状ベクタードナーを含む反応物へのトポイソメラーゼＩ０．５〜５ユニットの添加は、コロニー数に対してほとんどまたはまったく影響を有さなかった（反応３，４および５と比較して反応２；最大１．４倍）。対照的に、両方の親プラスミドが環状であった場合（反応７〜１０）、トポイソメラーゼＩの添加は、コロニー数を５〜９倍に刺激した。従って、両方の親プラスミドが環状である反応物へのトポイソメラーゼＩの添加は、ベクタードナーの親を線状化するのとほぼ同じぐらい、組換え反応を刺激した。トポイソメラーゼＩは、組換え緩衝液中で、３つの組換えタンパク質と組み合わせて用いた場合、活性であった。組換え反応へのトポイソメラーゼＩの添加は、組換え反応の刺激を獲得するためにベクタードナーを線状化する必要性を軽減する。
【０２４７】
理解を明確にするために例示および実施例によって本発明をいく分詳細に十分に記載してきたが、同様のことが、発明の範囲またはそのいずれの特定の実施態様にも影響することなく、条件、処方および他のパラメーターの広範なおよび同等の範囲内で、本発明を改変または変更することにより実行され得ること、ならびに、このような改変または変更が添付の請求項の範囲内に包含されることが意図されることは当業者にとって明白である。
【０２４８】
本明細書において言及されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を示しており、そして、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願は、参考として援用されるように詳細および個別に示されたかのように同じ程度に、参考として本明細書に援用される。
【０２４９】
【表１７】
0004303418.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の１つの一般的な方法を示し、ここで、開始（親）ＤＮＡ分子は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクターＤをもとのクローニングベクターＢと交換することである。１つの実施態様において、ＡＤについて、およびすべての他の分子（コインテグレートを含む）に対して選択することが所望される。四角および丸は、組換えの部位（例えば、ｌｏｘＰ部位、ａｔｔ部位など）である。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新たな薬剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしくはＤＮＡ配列決定のための特殊化された機能を含み得る。
【図２Ａ】  図２Ａは、挿入ドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７０５）をベクタードナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７２６）と組換え、そして産物ＤＮＡおよび副産物娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ベクタードナー上のａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。これらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８（１０）：２８７５  （１９９０）を参照のこと。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物を受ける細胞においてのみ、カナマイシン耐性を生じる。第１の組換え反応はインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの添加により駆動される。第２の組換え反応はリコンビナーゼＣｒｅをコインテグレート（ここでは、ｐＥＺＣ７  Ｃｏｉｎｔｅｇｒ）へ添加することにより駆動される。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、ｐＥＺＣ７０５の制限地図を示す。
【図２Ｃ】  図２Ｃは、ｐＥＺＣ７２６の制限地図を示す。
【図２Ｄ】  図２Ｄは、ｐＥＺＣ７  Ｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図２Ｅ】  図２Ｅは、Ｉｎｔｐｒｏｄの制限地図を示す。
【図２Ｆ】  図２Ｆは、Ｉｎｔｂｙｐｒｏの制限地図を示す。
【図３Ａ】  図３Ａは、挿入ドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６０２）をベクタードナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６２９）と組換え、そして産物（ここでは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄ）および副産物（ここでは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒ）娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１である。これらの部位により規定されるｐＥＺＣ６２９の１つのセグメントは、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子である。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ６２９の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ６２９により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組換え事象は、同じリコンビナーゼＣｒｅの添加により駆動される。
【図３Ｂ】  図３Ｂは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒの制限地図を示す。
【図３Ｃ】  図３Ｃは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄの制限地図を示す。
【図３Ｄ】  図３Ｄは、ｐＥＺＣ６０２の制限地図を示す。
【図３Ｅ】  図３Ｅは、ｐＥＺＣ６２９の制限地図を示す。
【図３Ｆ】  図３Ｆは、ＥＺＣ６ｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図４Ａ】  図４Ａは、真核生物細胞における発現のために、ベクター中へクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をサブクローニングするための組換えクローニングのインビトロ方法の適用を示す。挿入ドナープラスミドｐＥＺＣ８４３は、ｌｏｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａｔｔＢ部位との間にクローニングされたＥ．ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ１００３は、ｌｏｘＰ部位に並置されたサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む。超らせんプラスミドをλインテグラーゼおよびＣｒｅリコンビナーゼとインビトロで組み合わせた。インキュベーション後、コンピテントＥ．  ｃｏｌｉ細胞を組換え反応溶液を用いて形質転換した。形質転換のアリコートをカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げて、産物分子（ここでは、ＣＭＶＰｒｏｄ）を選択した。
【図４Ｂ】  図４Ｂは、ｐＥＺＣ８４３の制限地図を示す。
【図４Ｃ】  図４Ｃは、ｐＥＺＣ１００３の制限地図を示す。
【図４Ｄ】  図４Ｄは、ＣＭＶＢｙｐｒｏの制限地図を示す。
【図４Ｅ】  図４Ｅは、ＣＭＶＰｒｏｄの制限地図を示す。
【図４Ｆ】  図４Ｆは、ＣＭＶｃｏｉｎｔの制限地図を示す。
【図５Ａ】  図５Ａは、ｐＥＺＣ１３０１のベクター図を示す。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、ｐＥＺＣ１３０５のベクター図を示す。
【図５Ｃ】  図５Ｃは、ｐＥＺＣ１３０９のベクター図を示す。
【図５Ｄ】  図５Ｄは、ｐＥＺＣ１３１３のベクター図を示す。
【図５Ｅ】  図５Ｅは、ｐＥＺＣ１３１７のベクター図を示す。
【図５Ｆ】  図５Ｆは、ｐＥＺＣ１３２１のベクター図を示す。
【図５Ｇ】  図５Ｇは、ｐＥＺＣ１４０５のベクター図を示す。
【図５Ｈ】  図５Ｈは、ｐＥＺＣ１５０２のベクター図を示す。
【図６Ａ】  図６Ａは、ｐＥＺＣ１６０３のベクター図を示す。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、ｐＥＺＣ１７０６のベクター図を示す。
【図７Ａ】  図７Ａは、ｐＥＺＣ２９０１のベクター図を示す。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、ｐＥＺＣ２９１３のベクター図を示す。
【図７Ｃ】  図７Ｃは、ｐＥＺＣ３１０１のベクター図を示す。
【図７Ｄ】  図７Ｄは、ｐＥＺＣ１８０２のベクター図を示す。
【図８Ａ】  図８Ａは、ｐＧＥＸ−２ＴＫのベクター図を示す。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、ｐＥＺＣ３５０１のベクター図を示す。
【図８Ｃ】  図８Ｃは、ｐＥＺＣ３６０１のベクター図を示す。
【図８Ｄ】  図８Ｄは、ｐＥＺＣ３６０９のベクター図を示す。
【図８Ｅ】  図８Ｅは、ｐＥＺＣ３６１７のベクター図を示す。
【図８Ｆ】  図８Ｆは、ｐＥＺＣ３６０６のベクター図を示す。
【図８Ｇ】  図８Ｇは、ｐＥＺＣ３６１３のベクター図を示す。
【図８Ｈ】  図８Ｈは、ｐＥＺＣ３６２１のベクター図を示す。
【図８Ｉ】  図８Ｉは、ＧＳＴ−ＣＡＴのベクター図を示す。
【図８Ｊ】  図８Ｊは、ＧＳＴ−ｐｈｏＡのベクター図を示す。
【図８Ｋ】  図８Ｋは、ｐＥＺＣ３２０１のベクター図を示す。
【図９Ａ】  図９Ａは、５．２ｋｂ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄを示す。
【図９Ｂ】  図９Ｂは、ｐＥＺＣ１２０２のベクター図を示す。
【図９Ｃ】  図９Ｃは、５．２ｋｂクローンのベクター図を示す。
【図１０Ａ】  図１０Ａは、ｐＥＺＣ５６０１のベクター図を示す。
【図１０Ｂ】  図１０Ｂは、ｐＥＺＣ６７０１のベクター図を示す。
【図１０Ｃ】  図１０Ｃは、ａｔｔＬ産物のベクター図を示す。
【図１０Ｄ】  図１０Ｄは、ａｔｔＲ産物を示す。
【図１１Ａ】  図１１Ａは、ｐＥＺＣ７１０２のベクター図を示す。
【図１１Ｂ】  図１１Ｂは、ｐＥＺＣ７５０１のベクター図を示す。
【図１１Ｃ】  図１１Ｃは、ａｔｔＬ産物を示す。
【図１２Ａ】  図１２Ａは、末端ａｔｔＢ部位を有するａｍｐ  ＰＣＲ産物を示す。
【図１２Ｂ】  図１２Ｂは、末端ａｔｔＢ部位を有するｔｅｔ  ＰＣＲ産物を示す。
【図１２Ｃ】  図１２Ｃは、ａｍｐ  ７１０２のの制限地図を示す。
【図１２Ｄ】  図１２Ｄは、ｔｅｔ  ７１０２の制限地図を示す。
【配列表】
0004303418.tif 000023
0004303418.tif 000024
0004303418.tif 000025
0004303418.tif 000026
0004303418.tif 000027
0004303418.tif 000028
0004303418.tif 000029
0004303418.tif 000030
0004303418.tif 000031
0004303418.tif 000032
0004303418.tif 000033
0004303418.tif 000034
0004303418.tif 000035
0004303418.tif 000036
0004303418.tif 000037
0004303418.tif 000038
0004303418.tif 000039
0004303418.tif 000040
0004303418.tif 000041
【図１】
0004303418.tif 000042
【図２Ａ】
0004303418.tif 000043
【図２Ｂ】
0004303418.tif 000044
【図２Ｃ】
0004303418.tif 000045
【図２Ｄ】
0004303418.tif 000046
【図２Ｅ】
0004303418.tif 000047
【図２Ｆ】
0004303418.tif 000048
【図３Ａ】
0004303418.tif 000049
【図３Ｂ】
0004303418.tif 000050
【図３Ｃ】
0004303418.tif 000051
【図３Ｄ】
0004303418.tif 000052
【図３Ｅ】
0004303418.tif 000053
【図３Ｆ】
0004303418.tif 000054
【図４Ａ】
0004303418.tif 000055
【図４Ｂ】
0004303418.tif 000056
【図４Ｃ】
0004303418.tif 000057
【図４Ｄ】
0004303418.tif 000058
【図４Ｅ】
0004303418.tif 000059
【図４Ｆ】
0004303418.tif 000060
【図５Ａ】
0004303418.tif 000061
【図５Ｂ】
0004303418.tif 000062
【図５Ｃ】
0004303418.tif 000063
【図５Ｄ】
0004303418.tif 000064
【図５Ｅ】
0004303418.tif 000065
【図５Ｆ】
0004303418.tif 000066
【図５Ｇ】
0004303418.tif 000067
【図５Ｈ】
0004303418.tif 000068
【図６Ａ】
0004303418.tif 000069
【図６Ｂ】
0004303418.tif 000070
【図７Ａ】
0004303418.tif 000071
【図７Ｂ】
0004303418.tif 000072
【図７Ｃ】
0004303418.tif 000073
【図７Ｄ】
0004303418.tif 000074
【図８Ａ】
0004303418.tif 000075
【図８Ｂ】
0004303418.tif 000076
【図８Ｃ】
0004303418.tif 000077
【図８Ｄ】
0004303418.tif 000078
【図８Ｅ】
0004303418.tif 000079
【図８Ｆ】
0004303418.tif 000080
【図８Ｇ】
0004303418.tif 000081
【図８Ｈ】
0004303418.tif 000082
【図８Ｉ】
0004303418.tif 000083
【図８Ｊ】
0004303418.tif 000084
【図８Ｋ】
0004303418.tif 000085
【図９Ａ】
0004303418.tif 000086
【図９Ｂ】
0004303418.tif 000087
【図９Ｃ】
0004303418.tif 000088
【図１０Ａ】
0004303418.tif 000089
【図１０Ｂ】
0004303418.tif 000090
【図１０Ｃ】
0004303418.tif 000091
【図１０Ｄ】
0004303418.tif 000092
【図１１Ａ】
0004303418.tif 000093
【図１１Ｂ】
0004303418.tif 000094
【図１１Ｃ】
0004303418.tif 000095
【図１２Ａ】
0004303418.tif 000096
【図１２Ｂ】
0004303418.tif 000097
【図１２Ｃ】
0004303418.tif 000098
【図１２Ｄ】
0004303418.tif 000099