(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含有する特発性肺胞蛋白症診断薬。
【請求項２】
抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子自己ＩｇＧ抗体を測定するものである請求項１記載の特発性肺胞蛋白症診断薬。
【請求項３】
抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子自己ＩｇＧ抗体が、下記性質を有する請求項２記載の特発性肺胞蛋白症診断薬。
（１）特発性肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液又は血清より得られる。
（２）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるヒト末梢血単球及び腫瘍細胞株ＴＦ−１の増殖を抑制するが、インターロイキン−３によるヒト末梢血単球及び腫瘍細胞株ＴＦ−１の増殖を抑制しない。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬や診断薬として有用な、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下ＧＭ−ＣＳＦと略す）に特異的な自己抗体及びその測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞、血管内皮細胞により産生される糖蛋白質であり、顆粒球、マクロファージの前駆細胞に作用し、それらの増殖と分化を促進するものである。また、ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示細胞を賦活化することにより生体防御に寄与している反面、アレルギー疾患や自己免疫疾患の局所においては炎症を激化していると考えられている。
【０００３】
かかるＧＭ−ＣＳＦの作用をコントロールできれば、各種の炎症性疾患が治療できることから、ＧＭ−ＣＳＦに作用する物質の開発が熱望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、進行性の呼吸困難を来たす肺胞蛋白症に着目し、当該患者の気管支肺胞洗浄液中の成分について種々検討してきたところ、特発性肺胞蛋白症（以下、ＩＰＡＰと略す）患者の気管支肺胞洗浄液（以下、ＢＡＬＦと略す）中に、ＧＭ−ＣＳＦと特異的に結合しＧＭ−ＣＳＦの作用をコントロールする蛋白質を見出した。そしてさらに検討を続けたところ、全く意外にもこの蛋白質が抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体であり、ＧＭ−ＣＳＦを用いて当該自己抗体を測定すれば特発性肺胞蛋白症の診断が容易かつ確実に行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、下記性質を有する抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を提供するものである。
（１）特発性肺胞蛋白症（ＩＰＡＰ）患者の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）又は血清より得られる。
（２）ＧＭ−ＣＳＦによるヒト末梢血単球及び腫瘍細胞株ＴＦ−１の増殖を抑制するが、インターロイキン−３（ＩＬ−３）によるヒト末梢血単球及び腫瘍細胞株ＴＦ−１の増殖を抑制しない。
また、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦを含有することを特徴とするヒト検体中の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定試薬を提供するものである。
さらにまた本発明は、ヒト検体にＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体を反応させ、当該反応生成物を測定することを特徴とするヒト検体中の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体は、特発性肺胞蛋白症（ＩＰＡＰ）患者の気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）又は血清から得られる。ＩＰＡＰ患者のＢＡＬＦから、抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を採取するには、このＢＡＬＦから常法により蛋白画分を得、当該蛋白画分とＧＭ−ＣＳＦを結合させて、結合する画分を採取すればよい。ＧＭ−ＣＳＦと結合する画分の検出には、ＧＭ−ＣＳＦ及び標識マウス抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いたＥＬＩＳＡを採用するのが好ましい。抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の精製は通常の蛋白精製手段と当該ＥＬＩＳＡを組み合せて行えばよく、例えばブタノール処理、陽イオン交換樹脂カラム（ＭｏｎｏＳカラム）、陰イオン交換樹脂カラム（ＭｏｎｏＱカラム）、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム）、陰イオン交換樹脂カラム（ＲｅｓｏｕｒｓｅＱカラム）及び陽イオン交換樹脂カラム（ＲｅｓｏｕｒｓｅＳカラム）と当該ＥＬＩＳＡを組み合せて、ＧＭ−ＣＳＦと結合する蛋白を採取すればよい。
【０００７】
本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体は、成人発症の肺胞蛋白症の９０％以上を占めるＩＰＡＰ患者のＢＡＬＦからは得られるが、続発性肺胞蛋白症患者及び健常者のＢＡＬＦからは得られない。
【０００８】
本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ存在下におけるヒト末梢血単球の増殖及び腫瘍細胞株ＴＦ−１の増殖を、いずれも抑制する。すなわち、ヒト末梢血単球及びＴＦ１は、いずれもＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養すると増殖することが知られているが、この培養系に本発明抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を共存させるとこれらの増殖が抑制される。
【０００９】
一方、ＩＬ−３は機能的にはＧＭ−ＣＳＦと同様とされており、ヒト末梢血単球及びＴＦ−１は、いずれもＩＬ−３の存在下で培養すると増殖する。しかし、この培養系に本発明抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を共存させてもこれらの増殖は抑制されない。従って、本発明自己抗体はＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するものであることが明らかである。
【００１０】
また、本発明自己抗体は、ＧＭ−ＣＳＦのＴＦ−１への結合を濃度依存的に阻害する。そして、このＧＭ−ＣＳＦのＴＦ−１への結合は、本発明自己抗体とＴＦ−１を予め混合した後に、洗浄したＴＦ−１を用いた試験では阻害されないことから、本発明自己抗体はＴＦ−１や単球側に作用するのではなく、ＧＭ−ＣＳＦ自体に作用して、それらの細胞の増殖を抑制していることがわかる。
【００１１】
さらに本発明自己抗体は、次の性質を有する。
（３）本発明自己抗体は、ＧＭ−ＣＳＦとラット抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体との結合を阻害する。当該結合阻害実験は、例えばＧＭ−ＣＳＦのＥＬＩＳＡ、例えばラット抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を固相化し、これにＧＭ−ＣＳＦと本発明自己抗体とを反応させ、次いで標識マウス抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を反応させて、結合した標識量を測定することにより行われる。
【００１２】
（４）本発明自己抗体は、トリプシン、リゾチーム又はプロテアーゼＫにより分解されない。すなわち、本発明自己抗体は、トリプシン、リゾチーム又はプロテアーゼＫを作用させた後でも、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合活性を失なわない。
【００１３】
（５）本発明自己抗体は、１００℃１０分間処理、クロロホルム処理又はメタノール処理すると失活するが、５５℃３０分処理、ｎ−ブタノール処理、ＥＤＴＡ処理及び２−メルカプトエタノール処理に対しては安定である。さらに、本発明自己抗体はpH４〜１１の範囲で３０分処理しても安定である。
【００１４】
（６）本発明自己抗体のドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量は、非還元条件で１８０ｋＤ、還元条件で５７ｋＤである。
【００１５】
（７）本発明自己抗体は、イムノグロブリン分画中に存在する。また、アイソタイプはＩｇＧである。
【００１６】
本発明の自己抗体はＧＭ−ＣＳＦと特異的に結合し、ＧＭ−ＣＳＦの種々の作用をコントロールしていると考えられる。従って、本発明自己抗体は、ＧＭ−ＣＳＦの過剰産生が観察される炎症性疾患、特に皮膚アレルギー性疾患や喘息、慢性関節リュウマチ、移植後免疫反応、特発性間質性肺炎、特発性肺胞蛋白症などの治療薬としても利用できるが、ヒト検体中の本発明自己抗体を測定すればこれらの疾患、特に特発性肺胞蛋白症の診断が可能である。
【００１７】
ヒト検体中の本発明自己抗体を測定するには、ＧＭ−ＣＳＦを用いればよい。すなわち、ヒト検体にＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体を反応させ、当該反応生成物を測定すればよい。当該測定法には、通常の免疫測定法をすべて用いることができる。すなわち、免疫比濁法及び標識化免疫測定法を用いることができる。標識化免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイのいずれでもよい。
ヒト検体としては、ＢＡＬＦ、血漿、血清等が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦの標識体としては、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等のラジオアイソトープ；パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；ビオチン、ジゴキシゲニン等の化合物が挙げられる。
【００１８】
ヒト検体とＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体との反応は、基本的にはヒト検体とＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体とを接触させればよく、例えばヒト検体とＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体を液体中で接触させるか、ヒト検体と固相化されたＧＭ−ＣＳＦ又はその標識体とを接触させる方法が挙げられる。
【００１９】
反応生成物の測定手段としては、反応生成物を直接測定する方法、反応生成物である自己抗体とＧＭ−ＣＳＦの複合体を凝集させる方法（ラテックスビーズ凝集法、オクタロニー法など）、さらにヒト抗体に対する２次抗体を反応させる方法（例えばＥＬＩＳＡ法）などが挙げられる。また、この測定は、ＧＭ−ＣＳＦが自己抗体と反応することによるＧＭ−ＣＳＦの活性の低下を測定することによっても行うことができる。ＧＭ−ＣＳＦの活性の低下は、ＴＦ−１細胞存在下に前記のＧＭ−ＣＳＦと自己抗体との反応を行い、ＧＭ−ＣＳＦによるＴＦ−１細胞の増殖率を測定すればよい。
【００２０】
かくしてヒト検体中の本発明自己抗体が測定できるが、特発性肺胞蛋白症患者血清中には、ほぼ全例本発明自己抗体が存在しており、その測定により特発性肺胞蛋白症の血清診断が感度と特異性ともに良くできる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１（抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の調製）
Ｉ．材料及び方法
（１）試薬
リコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦ（比活性2.25×108U/mg）はキリンビール株式会社より提供された。リコンビナントＩＬ−３はＲ＆Ｄシステム社より購入した。ラット抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体は医科学研究所の北村助教授より供与を受けた（Kitamura, T. et al, J. Cell. Physiol. 140：323-334）。ペルオキシダーゼラベル抗ＧＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体はＲ＆Ｄシステム社から購入した。放射性ヨード化リコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦはNEN Life Science Products 社から購入した。ＲＰＭＩ １６４０培地は日水株式会社より購入した。HiTrapS, HiTrapQ, Sephacryl 2000, ResourceQ, ResourceSカラムはファルマシアバイオテク社より購入した。
【００２３】
（２）対象者
ＩＰＡＰ１ １例、続発性２例、健常非喫煙者に気管支肺胞洗浄を施行した。肺胞蛋白症の診断は、ＢＡＬＦの生化学的解析と肺生検の病理組織診により行った。ＩＰＡＰ患者は病歴と現症を詳細に調べ、他に疾患がないことを確認した。２例の続発性例はいずれも慢性骨髄性白血病と診断されていた。全例から、記述されたインフォームドコンセントを得た。
【００２４】
（３）気管支肺胞洗浄液上清（ＢＡＬＦ）
気管支肺胞洗浄液は１０００×ｇにて１５分遠心して、さらにその上清を４００００×ｇで６０分遠心し、上清を採取した（以後ＢＡＬＦと略す）。蛋白濃度は、Bardfordの方法により決定した。
【００２５】
（４）ヒト末梢血単球の分離
ヒト末梢血単核球は健常者血液より、フィコールパック比重遠心法により得た。これをＲＰＭＩ １６４０培地に再浮遊させ、予め１０％ヒトＡＢ型非働化血清でコートしたプラスチックフラスコに撤き、３７℃５％ＣＯ2 環境下で１５分培養し、非付着細胞はＰＢＳにて５回洗浄することにより除去した。付着細胞は、０．０５％トリプシン／ＰＢＳで１０分処理した後、セルスクレーパー（住友ベークライト）を用いて収集した。得られた細胞は、形態と非特異的エステラーゼ染色により９８％以上単球であると判定された。生細胞率はトリパンブルー色素除外法により求めた。
【００２６】
（５）ＴＦ−１細胞の培養
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、エリスロポエチン依存性の腫瘍細胞株ＴＦ−１は、ＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＣＳ／１０ng／mlＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した。使用する前に細胞はＰＢＳで４回洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦを除いた。
【００２７】
（６）ＴＦ−１と単球の増殖測定
ＴＦ−１と単球の増殖測定はＭＴＴアッセイにより行った。単球（１×１０4／well）あるいはＴＦ−１（２×１０4／well）を９６穴プレートで、様々な濃度のＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−３（0, 12.5, 25, 50, 100ng／ml）とＩＰＡＰあるいは健常者のＢＡＬＦ（0, 12.5, 25, 50, 100ng／ml）の存在下で３日間培養し、位相差顕微鏡下で観察後、ＭＴＴ（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；シグマ社）５μｇ／mlを添加し、２時間培養後、生細胞によるホルマザン形成を１００μｌのイソプロパノール／ＨＣｌに溶解し、ＯＤ５５０nmの吸光度を測定した。
【００２８】
（７）放射性ヨードラベル化ＧＭ−ＣＳＦと受容体結合の測定
ＧＭ−ＣＳＦの受容体への結合はChiba, S. らの方法（Leukemia 4：29-36）に従った。簡単には、ＴＦ−１（５×１０5）をＲＰＭＩ １６４０培地１mlに浮遊させ、１５０pMの放射性ヨード化ＧＭ−ＣＳＦと様々な濃度のＩＰＡＰあるいは健常者のＢＡＬＦとともに１５℃で９０分反応させた。バックグランドの反応として同じ反応液の中にさらに過剰量の非放射性ＧＭ−ＣＳＦを加えたものも用意した。細胞浮遊液は２５０×ｇで５分遠心、洗浄を３回行い、γカウンターを用いて放射活性を測定した。
【００２９】
（８）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によるＧＭ−ＣＳＦと抗体との結合阻害の測定
ＧＭ−ＣＳＦと抗体との結合阻害の測定はＧＭ−ＣＳＦのＥＬＩＳＡにより行った。マイクロエライザープレートに、１００μｌの０．５μｇ／ml抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（２３Ｂ６）により一昼夜４℃でコートし、ＰＢＳで５回洗浄後、プレートはブロッキング試薬（スタビリコート、ＢＳＩ社）を加え、室温にて１時間処理した。ブロッキング試薬を除去後、５０μｌの２５ng／mlＧＭ−ＣＳＦと５０μｌの様々な濃度（０〜５００μｇ／mg）のＢＡＬＦの混合液を室温で２時間各ウエル中で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼラベルされた抗ヒトＧＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を各ウエルに加えて３７℃で１時間反応させた。発色はＴＭＢ溶液（Color Reagents, R&D 社）を用いて行った。４５０nmの吸光度はmicroplate spectrophotometer Model 3550 （バイオラット社）を用いて測定した。ＴＮＦ、ＩＬ６、ＭＣＰ−１は市販のアッセイキットを用いて行った。パーセント阻害（％）は以下の式により求めた。
パーセント阻害（％）＝〔１−検出されたＧＭ−ＣＳＦ（ng／ml）／２５（ng／ml）〕×１００
【００３０】
（９）架橋法による結合蛋白の検出
ＩＰＡＰと健常者のＢＡＬＦ（５００μｇ／ml）を放射性ヨードラベルされたＧＭ−ＣＳＦと結合バッファー（２５mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 10mM KCl, 10mM CaCl2）中にて９０分間室温にて反応させた。コントロールとして１００倍過剰量の非放射性ＧＭ−ＣＳＦを添加したものを同様に反応させた。架橋反応は３００μＭジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）の添加により、４℃１５分間行った。反応は、消光バッファー（50mM Tris-HCl pH8.0, 15mM NaCl, 2mM EDTA）を１ml加えて終了させた。反応液はＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルを乾燥させた後、オートラジオグラフィーを施行した。
【００３１】
（10）ＩＰＡＰ患者ＢＡＬＦよりＧＭ−ＣＳＦ結合蛋白の精製
ＩＰＡＰ患者ＢＡＬＦ４００mlに同量の蒸留水飽和ｎ−ブタノールを添加し、５分間激しく振とうし、１０分間静置後、３０００回転１０分遠心し、水層を回収した。その操作を３回繰り返した後集めた水層を超純水に対し透析した後、凍結乾燥した。凍結乾燥した蛋白は２０mM酢酸アンモニウムpH６．０に溶解後、HiTrapS 陽イオン交換カラムにかけ、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌにて溶出した。ＧＭ−ＣＳＦ結合活性をＥＬＩＳＡで検出し、活性のあるフラクションを集め、２０mM Tris HCl pH9.0 に対して透析し、HiTrap Q 陰イオン交換カラムにかけ、同様に溶出させ、得られた活性のあるフラクションを１０mM  酢酸アンモニウムに対して透析後、凍結乾燥し、ＰＢＳ／０．１％  ＮＰ４０に溶解後、Superose １２ゲル濾過カラムにかけた。上記と同様に溶出後、活性のあるフラクションを２０mM  Ｔｒｉｓ ＨＣｌ pH９．０に対して透析後、Resourse Qカラムにかけた。活性のあるフラクションを２０mM  酢酸アンモニウムpH６．０に対して透析後、Resourse S 陽イオン交換カラムにかけて同様に溶出後、活性のあるフラクションを回収した。各ステップの蛋白純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検討した。
【００３２】
（11）アイソトープラベルされたＧＭ−ＣＳＦを用いたウエストウエスタンブロッティングによるＧＭ−ＣＳＦ結合蛋白の検出
特発性肺胞蛋白症患者の肺胞洗浄液又は、血清を非還元状態で電気泳動し、ポリビニリデンフルオライド膜に転写。膜をアルブミン含有バッファーにてブロッキングしたのち、アイソトープラベルされたＧＭ−ＣＳＦと反応させる。膜を洗浄後、オートラジオグラフィーにて検出する。
【００３３】
II．結果
（１）ＧＭ−ＣＳＦ依存的細胞増殖のＩＰＡＰのＢＡＬＦによる抑制
１ng／mlのＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した単球及びＴＦ−１の増殖がＩＰＡＰ患者のＢＡＬＦにより抑制された。増殖抑制は、ＢＡＬＦ濃度に依存的で、ＧＭ−ＣＳＦの替わりにＩＬ−３を加えたときには見られなかった。１１例のＩＰＡＰ及び２例の続発例、１０例の健常者で増殖抑制を調べたが、ＩＰＡＰのみにこの効果が見られた（図１）。１ng／mlのＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した単球の生細胞率は１００μｇ／mlのＩＰＡＰのＢＡＬＦの存在下で５％以下であるのに対し、同量の健常者のＢＡＬＦの存在下で９５％以上であった。以上の結果は、ＩＰＡＰ患者のＢＡＬＦはＧＭ−ＣＳＦの生物活性を特異的に阻害することを示している。
【００３４】
（２）ＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１細胞の結合のＩＰＡＰのＢＡＬＦによる拮抗阻害
ＩＰＡＰのＢＡＬＦによるＧＭ−ＣＳＦの生物活性の阻害がＧＭ−ＣＳＦとその受容体の結合以前かあるいは結合後に起こることなのかを明らかにするために、放射性ヨードラベル化ＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１細胞との結合がＩＰＡＰのＢＡＬＦによって阻害されるかどうか調べた。図２に示すように、この結合はＩＰＡＰのＢＡＬＦにより濃度依存的に阻害された。また、予めＴＦ−１細胞をＩＰＡＰのＢＡＬＦに浮遊させた後、よく洗浄して放射性ヨード化ＧＭ−ＣＳＦと反応させても、結合阻害が見られないことから、ＩＰＡＰのＢＡＬＦは受容体に作用して結合阻害を起こすのではなく、ＧＭ−ＣＳＦ自体に作用して阻害することが示された。
【００３５】
（３）ＩＰＡＰのＢＡＬＦによるＧＭ−ＣＳＦの特異抗体への結合阻害
ＧＭ−ＣＳＦの特異的モノクローナル抗体（２３Ｂ６）への結合はＩＰＡＰのＢＡＬＦによって阻害された。図３に示すように、この阻害は１１例のＩＰＡＰで観察されたが、２例の続発例、３例の健常者では見られなかった。ＩＰＡＰのＢＡＬＦはＴＮＦα、ＩＬ６、ＭＣＰ−１のそれぞれの特異抗体への結合は阻害しなかった。％阻害率はＩＰＡＰのＢＡＬＦの濃度依存的に増加した。
【００３６】
（４）ＩＰＡＰのＢＡＬＦ中のＧＭ−ＣＳＦ結合因子の存在
以上の結果から考えて、ＩＰＡＰのＢＡＬＦの中にＧＭ−ＣＳＦに結合する因子が存在すると考えて、放射性ヨード化ＧＭ−ＣＳＦとＩＰＡＰのＢＡＬＦを反応後、ＤＳＳ（ジスクシンイミジル  スベラート）を用いて化学的に架橋し、還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、３９ｋＤと４１ｋＤに特異的なバンドが得られ（図４、レーンｃ）、健常者のＢＡＬＦではこのバンドは得られなかった（図４、レーンｂ）。このバンドは過剰量の非放射性ＧＭ−ＣＳＦの存在下で放射性ヨード化ＧＭ−ＣＳＦとＩＰＡＰのＢＡＬＦを反応させたときには著しく減弱したことから（図４、レーンｄ）、ＧＭ−ＣＳＦとの特異的な結合であると思われた。この結果より、ＩＰＡＰのＢＡＬＦの中にＧＭ−ＣＳＦと結合する物質の存在が確認された。
【００３７】
（５）ＩＰＡＰのＢＡＬＦ中ＧＭ−ＣＳＦ結合蛋白の精製とその性質
ＩＰＡＰのＢＡＬＦはリン脂質に富むことから、脂質と蛋白を分離するためにＢＡＬＦをｎ−ブタノールで抽出したところ、ＧＭ−ＣＳＦ結合活性は水層に認められた。このフラクションをMono S, Mono Q, Superose 12, Resourse Q, Resourse S カラムの各ステップを経てＳＤＳ−ＰＡＧＥ上銀染色で分子量１８万の単一のバンドを得た。この蛋白の性質を表１に示した。
【００３８】
【表１】
0004372904.tif 000002
【００３９】
（11）ウエストウエスタンブロッティングによる検出（10）で得た精製蛋白はＧＭ−ＣＳＦに対して特異的に結合することがアイソトープラベルされたＧＭ−ＣＳＦを用いたウエストウエスタンブロッティングにより確認された。
【００４０】
実施例２
実施例１で得られたＧＭ−ＣＳＦ結合蛋白が、自己抗体であることを確認するために次の試験を行った。
（１）ＮＨ2末端アミノ酸分析
精製蛋白を還元状態で電気泳動して得られた５７ｋＤと２８ｋＤの２種類の蛋白のうち、５７ｋＤの蛋白をＮＨ2末端アミノ酸分析したところ、ＮＨ2末端２０残基がヒトイムノグロブリンＨ鎖に１００％一致した。
（２）抗体であることの確認
特発性肺胞蛋白症患者の肺胞洗浄液からリコンビナントプロテインＡを用いてイムノグロブリン成分を抽出すると、ＧＭ−ＣＳＦ結合活性はイムノグロブリン分画に存在することを確認した。このことより、特発性肺胞蛋白症患者の肺胞洗浄液中に存在するＧＭ−ＣＳＦ結合蛋白は抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体であることが明らかになった。
（３）アイソタイプの決定
ＥＬＩＳＡ法を用いてこの自己抗体は主としてＩｇＧであることを確認した。
【００４１】
実施例３（血清中にも存在することの確認）
アイソトープラベルされたＧＭ−ＣＳＦを用いたウエストウエスタンブロッティングにより、特発性肺胞蛋白症患者（５例）の血清中にも全例でこの抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体が存在することを確認した。
【００４２】
実施例４
125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦを用いたウエストウエスタン法による抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の検出：
（方法）
特発性肺胞蛋白症患者又は健常者の血清を總蛋白量として１mg／mlになるように希釈し、１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を１０分の１量加え、蛋白を沈殿させた後、２〜１５％グラディエントポリアクリルアミドゲル電気泳動（３０mA定電流、約２時間）を行い、ＰＶＤＦ膜に転写する（１２ｖ定電圧で７５分）。膜は１０％酢酸：５０％メタノールにて１分固定後、１％  牛アルブミン／リン酸緩衝液中（pH７．２）に４℃下で一昼夜放置後、０．２５μCiの125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦ／リン酸緩衝液（pH７．２）の入ったビニール袋に入れ、室温で１時間放置する。膜を取り出し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝液中で４回洗浄後、風乾し、オートラジオグラフィーを行う。
【００４３】
（結果）
図５〜７に結果を示す。図５〜７中の上段のカラムは蛋白電気泳動後に転写した膜をクマシーブルー染色で染めたもの、下のカラムは同じ膜に125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦを反応させたオートラジオグラフィーのパターンである。特発性肺胞蛋白症１１例と続発性肺胞蛋白症２例（図５）、健常者２０例（図６）、他の肺疾患１５例（図７）を対象に行ったスクリーニングでは、特発性肺胞蛋白症の患者のみに分子量１８０ｋＤの特異的なバンドが確認できた。
【００４４】
実施例５
ＥＬＩＳＡ法による抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定：
（方法）
リコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ社製）１μｇ／mlを９６穴エライザープレート（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌずつ撒き、カバーシールで封じた後、１昼夜４℃に放置する。プレートは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０にて５回洗浄後、各ウエルに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２００μｌを入れ、室温で１時間ブロッキングする。この溶液を吸引廃棄後、希釈した患者血清又はコントロールの健常者血清５０μｌをウエルに入れ、さらに１時間室温で反応させる。抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体は、コートしたＧＭ−ＣＳＦに結合する。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液にて５回洗浄後、０．３μｇ／mlのperoxidase label抗ヒトＩｇＧウサギ抗体（Ｄａｋｏ社製）を５０μｌ入れ、室温にて１時間反応後、再びプレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄する。各ウエルに５０μｌのＴＭＢ溶液（ＳＣＹＴＥＫ社製）を入れ、１５分反応後、５０μｌのＳＴＯＰ溶液（ＳＣＹＴＥＫ社製）を添加し、反応を止める。各ウエルの４５０nmにおける吸光度をエライザーリーダーで測定する。
【００４５】
（結果）
図８に結果を示す。特発性肺胞蛋白症の患者血清のＯＤ値は０．４９〜１．１０と健常者０．１２〜０．１６、続発性０．１５〜０．１９、先天性０．１３〜０．１４よりも有意（ｐ＜０．０１）に高かった。ＧＭ−ＣＳＦはアルブミンなどの血清蛋白とも親和性があり、何らかの理由で、健常者の血清とも弱く反応して、低レベルのＯＤ値を示しているが、これらのサンプルは、前述したウエストウエスタン法で１８０ｋＤの抗体のバンドは検出できないことから、非特異的な反応と考えられる。
【００４６】
実施例６
受け身凝集法による抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定：
（方法）
ＧＭ−ＣＳＦをカップリングさせるためのビーズはPolybead Microparticles（Polysciences社）を用い、反応は、同社のグルタルアルデヒドキット（Ｃａｔ．♯１９５４０）を用いた。キットの説明書に従ってビーズを活性化し、５００μｌの％ビーズ溶液とリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ１００μｇを室温にて一昼夜反応させ、１５０００回転で６分遠心後、上清を除去し、０．２Ｍエタノールアミン溶液に懸濁させ、３０分反応させた後、再び１５０００回転６分遠心、上清を除去し、キットに付属のＢＳＡ溶液を加えブロッキングを行う。
この方法で約５０％のＧＭ−ＣＳＦがビーズにカップリングされる。最終的に０．０５％のビーズ溶液５０μｌと３００倍希釈した患者あるいは、健常者の血清１０μｌを９６穴丸底プレート内で２４時間反応させ、凝集の有無を肉眼的に判定する。
【００４７】
（結果）
結果を表２に示す。健常者４０人で３８人が陰性だったのに対し、特発性肺胞蛋白症の患者血清は、２５人中２４人が凝集した。また、続発性４人と先天性２人の血清は全く凝集しなかった。
【００４８】
【表２】
0004372904.tif 000003
【００４９】
実施例７
ＴＦ−１細胞を用いたバイオアッセイによる抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定：
（方法）
この方法は、自己抗体そのものの存在を見るのではなく、自己抗体により中和されるＧＭ−ＣＳＦの生物活性の減弱をＴＦ−１細胞の増殖を指標として測る方法である。ＴＦ−１細胞は医科学研究所北村俊雄博士より供与された。この細胞はＧＭ−ＣＳＦ依存性に増殖する腫瘍細胞株である。培養はγ線滅菌９６穴平底プレートで行う。ＴＦ−１細胞１万個を１ng／mlのリコンビナントＧＭ−ＣＳＦと０．２５％患者あるいは健常者血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地（１０％子牛血清を含む）１００ml中に懸濁させ、３７℃、５％炭酸ガス存在下で４日間培養する。５mg／mlのＭＴＴ溶液を１０mlずつ各ウエルに添加し、さらに３時間培養する。細胞に取り込まれたＭＴＴを可溶化するため、０．０４規定塩酸イソプロパノール溶液１００mlを加え、色素をよく溶かした後、５６０nmの吸光度をエライザーリーダーを用いて測定する。
【００５０】
（結果）
ＴＦ−１細胞は１ng／mlのＧＭ−ＣＳＦ存在下で非常によく増殖し、４日間の培養で細胞数が約４倍になる。特発性肺胞蛋白症の血清は抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体を含んでいることから、添加したＧＭ−ＣＳＦの効果は中和され、細胞増殖は観察されなかった。ＭＴＴ試薬は細胞内に取り込まれると代謝され疎水性の色素に変化する。その色素の吸光度を測定したところ、図９に示すように特発性肺胞蛋白症の血清のＯＤ値は０．３７〜０．６９と、健常者血清１．３〜１．４、続発性１．０〜１．２、先天性０．９〜１．２に比べて有意に低い値（ｐ＜０．０１）を示した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の自己抗体は、生体中で種々の炎症性疾患に関与していることが知られているＧＭ−ＣＳＦに対する自己抗体であり、これを測定すればこれらの炎症性疾患の診断が可能である。特に特発性肺胞蛋白症の血清診断が感度と特異性ともに良くできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＡＬＦ（１００μｇ／ml）のＴＦ−１細胞（２×１０5）の増殖に対する作用を示す図である。
【図２】ＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１の結合に対するＩＰＡＰのＢＡＬＦによる拮抗阻害作用を示す図である。
【図３】ＢＡＬＦによるＧＭ−ＣＳＦの抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体への結合阻害を示す図である。
【図４】架橋剤を介してＧＭ−ＣＳＦとＩＰＡＰのＢＡＬＦを結合させた蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーンａは放射性ラベルＧＭ−ＣＳＦのみ、レーンｂは健常者ＢＡＬＦを用いた場合、レーンｃはＩＰＡＰのＢＡＬＦを用いた場合、レーンｄは過剰量の非放射性ＧＭ−ＣＳＦ存在下で放射性ラベルＧＭ−ＣＳＦとＩＰＡＰのＢＡＬＦを用いた場合を示す。
【図５】特発性肺胞蛋白症（１〜１１）及び続発性肺胞蛋白症（１２、１３）の血清と125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦとを用いたウエストウエスタン法の結果を示す図である。
【図６】健常者（１４〜３３）の血清と125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦとを用いたウエストウエスタン法の結果を示す図である。
【図７】肺胞症以外の肺疾患患者の血清（３４〜４６）と125Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦとを用いたウエストウエスタン法の結果を示す図である。
【図８】ＥＬＩＳＡ法による患者及び健常者血清中の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定結果を示す図である。
【図９】ＴＦ−１細胞を用いたバイオアッセイによる患者及び健常者血清中の抗ＧＭ−ＣＳＦ自己抗体の測定結果を示す図である。
【図１】
0004372904.tif 000004
【図２】
0004372904.tif 000005
【図３】
0004372904.tif 000006
【図４】
0004372904.tif 000007
【図５】
0004372904.tif 000008
【図６】
0004372904.tif 000009
【図７】
0004372904.tif 000010
【図８】
0004372904.tif 000011
【図９】
0004372904.tif 000012