(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の結晶と、製薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２】
3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の結晶と、製薬学的に許容される担体とを含有する4型ホスホジエステラーゼ阻害剤。
【請求項３】
呼吸器疾患の予防又は治療剤である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
気管支喘息の予防又は治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
慢性閉塞性肺疾患(COPD)の予防又は治療剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
固形製剤である請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、4型ホスホジエステラーゼ（PDE4）阻害剤として有用なナフチリジン誘導体を含有する医薬、殊に呼吸器疾患の予防又は治療剤、並びにこれらの医薬の製造原体として有用な当該ナフチリジン誘導体の結晶に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホジエステラーゼ（PDE）は少なくともPDE1〜7の7ファミリーに分類され、それぞれ分布又は機能に違いがあることが解明されてきた（Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 63, 1-38 (1999)）。特にPDE4は、ヌクレオチドの中でもグアノシン3',5'-サイクリック一リン酸（cGMP）に作用することなく、cAMPを特異的に分解するものであり、気道平滑筋及び浸潤細胞の両者でその存在が認められている。
PDE4阻害剤は、モルモットにおける抗原及び血小板活性化因子による好酸球浸潤に対し、抑制作用を示し（Eur. J. Pharmacol., 255, 253-256 (1994)）、好酸球からの障害性蛋白（MBP、ECP）の遊離を抑制する（Br. J. Pharmacol., 115, 39-47(1995)）ことが報告されている。さらに収縮物質（ヒスタミン、メサコリン、LTD4）による気道平滑筋の収縮に対し抑制作用を示すこと（Br. J. Pharmacol., 113, 1423-1431 (1994)）、喘息に深く関与すると言われているサイトカインであるIL-4の産生を阻害すること（J. Invest. Dermatol., 100, 681-684 (1993)）、気道における血管透過性の亢進に対して抑制作用を発現すること（Fundam. Clin. Pharmacol., 6, 247-249 (1992)）、気道過敏症に対して抑制作用を示すこと（Eur. J. Pharmacol., 275, 75-82 (1995)）が報告されている。よって、PDE4阻害剤は喘息治療剤として期待されている。
さらにPDE4阻害剤は、COPDにおける気道炎症に関与しているとされる好中球に対し浸潤抑制作用を有すること(Pulm. Pharmacol. Ther. 2001 Mar; 14(2): 157-164)が報告され、また、臨床試験においてもPDE4阻害剤は、COPD患者の呼吸機能を改善しうることが示され(Clin. Exp. Allergy. 1999 Jun; 29 Suppl 2: 99-109)、COPD治療剤としても期待されている。
【０００３】
WO96/06843号公報にPDE4阻害活性を有する4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン等のナフチリジン誘導体が報告されているが、当該ナフチリジン誘導体の３位は、無置換又は低級アルキル置換のみであり、その３位置換基に伴う有利な効果に関する記載はない。
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、PDE4を良好かつ選択的に阻害し、副作用の少ない気管支喘息、COPD等の呼吸器疾患の予防・治療に有用な新規な医薬を提供することを目的として研究を行った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、PDE4に対して阻害活性を有する化合物につき鋭意検討し、新規化合物3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸を見出した。該化合物は強力なPDE4阻害作用を有し、また、経口吸収性及び持続性に優れることから、気管支喘息やCOPD等の呼吸器疾患の予防又は治療剤として有用であることを知見して、本発明を完成した。
更に、該化合物には２種の結晶多形が存在し、意外にもいずれの結晶も本発明医薬組成物の製造原体として好適であることを見出した。本発明はこれらの結晶をも包含する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、下記式で示される3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬、特にPDE4の関与する疾患の予防又は治療剤、殊に呼吸器疾患、中でも気管支喘息又はCOPD等の予防・治療剤に関する。
【化１】
0004240193.tif 000002
【０００６】
本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸は塩基との塩を形成することができる。かかる塩が製薬学的に許容される塩であれば、当該塩を含有する医薬組成物は本願に包含される。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
【０００７】
本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸（下記式中の化合物（Ｉ））は以下の製法により製造することができる。
【化２】
0004240193.tif 000003
(式中、Lは脱離基を、Rはエステル残基やCN等のCO2Hに容易に変換可能な基をそれぞれ示す。)
【０００８】
第１工程は、アミノピリジン誘導体（II）にアシル化剤（III）を反応させアミド誘導体（IV）とする工程である。
Lが示す脱離基としては、好ましくは、ハロゲン、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ等の炭酸エステル、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ等の有機スルホン酸残基が挙げられる。Rは-CO2-C1-6アルキル、-CO2-ベンジル基やCN等、容易にCO2Hに変換可能な基であればよく、例えば、グリーン（Greene）及びウッツ（Wuts）著、「Protective Groups in Organic Synthesis（第３版）」に記載のカルボキシル基の保護基が適用できる。あるいは、アシル化剤（III）としてグルタル酸無水物を使用することができ、かかる場合には化合物（IV）及び（V）におけるRはCO2Hを意味し、第３工程は省略することができる。
反応はジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン等のエーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）等の反応に不活性な有機溶媒中または無溶媒下、冷却下〜加熱下に行われる。反応に際しては、アミノピリジン誘導体（II）とアシル化剤（III）とを当量若しくは一方を過剰に用いることができ、有機塩基（好ましくは、トリエチルアミン、ピリジン、2,6-ルチジン、4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン）、無機塩基（好ましくは、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム）又は金属塩基（水素化ナトリウム、メトキシナトリウム、tert-ブトキシカリウム等）の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
なお、原料化合物であるアミノピリジン誘導体（II）は、WO97/19078公報19−21頁に記載の方法によって製造することができる。
【０００９】
第２工程は、アミド化合物（IV）を閉環反応に付し、化合物（V）を得る工程である。
反応はハロゲン化炭化水素類、芳香族炭化水素類、エーテル類、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）等の反応に不活性な有機溶媒中または無溶媒下、加熱下に行われる。反応に際しては、上記の有機塩基、無機塩基又は金属塩基等の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
また、第１工程の反応後、アミド誘導体（IV）を単離せず、続けて第２工程の反応を行ってもよい。
第３工程は、化合物（V）より本発明の化合物（Ｉ）を得る工程である。
反応は加水分解の常法等を用いることができ、例えば、前述の「Protective Groups in Organic Synthesis（第３版）」のカルボキシル基の脱保護反応に記載の方法等を適用することができる。
また、第２工程の反応後、化合物（V）を単離せず、続けて第３工程の反応を行ってもよく、第１〜第３工程を続けて行ってもよい。
【００１０】
更に、本発明は、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の結晶にも関する。本発明の結晶は、医薬の製造原体として使用可能な程度に安定な結晶であればよく、特に下記物性値を有するＡ型又はＢ型の結晶が好ましい。各結晶はそれぞれ下記の粉末X線回折スペクトル[2θ(°)]で特徴付けられる。尚、粉末Ｘ線回折はデータの性質上、結晶の同一性認定においては、結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、相対強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少変わりうるものであるから、厳密に解されるべきではない。
Ａ型：5.92, 8.48, 9.86, 11.70, 14.10, 16.00及び16.60。
Ｂ型：6.72, 10.18, 13.46, 14.20, 15.46及び17.70。
また、DSC分析で、Ａ型結晶は約158℃に、Ｂ型結晶は約159℃にそれぞれ熱吸収ピークを有する。
【００１１】
Ａ型及びＢ型いずれの結晶も40℃、相対湿度75％下で３ヶ月間は安定であり、医薬の製造原体として使用可能であり、特に固形製剤の原体として好適である。Ａ型結晶は、再結晶操作における晶出時に、溶液を比較的すみやかに冷却し晶出させることにより得ることができ、小スケールでの製造で晶出しやすい。また、Ｂ型結晶は、ゆっくりと冷却し、時間をかけて晶出することにより再現性良く得ることができ、工業的生産における大スケールでの製造で晶出しやすい。更に、再結晶時にＡ型結晶の晶出後、引き続き長時間攪拌することでＢ型結晶へと変換し、Ｂ型結晶を得ることができる。したがって、大量合成にはＢ型結晶が好適である。本発明は、Ａ型結晶、Ｂ型結晶及びそれらを含有する混合物をも包含する。
【００１２】
本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。特に、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の結晶を製造原体とする経口投与用の錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等、及び非経口投与用の吸入剤、経鼻剤等は安定な固形製剤として有利である。
経口投与のための固形製剤においては、本発明化合物が、少なくとも一つの不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
【００１３】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な溶剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、矯味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤を含む。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート80（商品名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体、半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば、ラクトースや澱粉のような賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００１４】
投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、経口投与の場合、成人１日当たり0.001 mg/kg乃至10 mg/kg程度であり、これを１回で、あるいは２〜４回に分けて投与する。また、吸入の場合は、通常、成人１回当たり0.0001 mg/kg乃至1 mg/kgの範囲で１日に１回乃至複数回投与する。
【００１５】
また、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸を有効成分として含有する医薬組成物は、治療上有効な他の有効成分、例えば、フォルモテロール等のβ２アゴニスト、ステロイド剤、抗コリン剤、ロイコトリエン拮抗剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、サイトカイン阻害剤等と適宜組み合わせて、併用してもよい。これらと併用する場合は、同時に投与するための配合剤として、あるいは順次に投与するために組み合わされた別個の製剤として使用してもよい。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また原料化合物は、WO97/19078号公報に記載の方法により、下記参考例に従い製造した。
粉末X線回折の測定には、MAC Science MXP18TAHF22を用い、管球：Cu、管電流：40 mA、管電圧：40 kV、サンプリング幅：0.020°、走査速度：3°/min、波長：1.54056Å、測定回折角範囲(2θ)：5〜40°の条件で測定した。
熱分析(DSC及びTGA)はそれぞれ次の条件で測定した。
DSC：Perkin-Elmer Pyris 1、25℃〜250℃ (10℃/min)、N2 (20 ml/min)、アルミニウム製サンプルパン。TGA：Perkin-Elmer TGA 7、25℃〜250℃ (10℃/min)、N2 (20 ml/min)、白金製サンプルパン。
【００１７】
参考例１
60％水素化ナトリウムのテトラヒドロフラン(THF)懸濁液に、3-クロロベンゾニトリル、アセトニトリル、tert-ブタノール及びTHFの混合物を滴下し、油浴温度50℃で加熱下攪拌した。常法により後処理精製して得た3-アミノ-3-(3-クロロフェニル)-2-プロペンニトリルにクロロホルム及び3M塩酸を加え、室温で攪拌した。以下、常法により後処理精製して、3-オキソ-3-(3-クロロフェニル)プロパンニトリルを得た。FAB-MS [(M+H)+]：180。
参考例２
3-オキソ-3-(3-クロロフェニル)プロパンニトリルにポリリン酸を加え油浴温度110℃で加熱下攪拌した。以下、常法により後処理精製して、3-オキソ-3-(3-クロロフェニル)プロパナミドを得た。FAB-MS [(M+H)+]：198。
参考例３
3-オキソ-3-(3-クロロフェニル)プロパナミドのエタノール溶液に1,1-ジメトキシ-3-ブタノン及びナトリウムメトキシドを加え、加熱還流下攪拌した。以下、常法により後処理精製して、3-(3-クロロベンゾイル)-6-メチルピリジン-2-オンを得た。FAB-MS [(M+H)+]：248。
【００１８】
参考例４
3-(3-クロロベンゾイル)-6-メチルピリジン-2-オンのジクロロエタン溶液に、塩化p-トルエンスルホニル、トリエチルアミン及び4-ジメチルアミノピリジンを加え、油浴温度50℃で加熱下攪拌した。常法により後処理精製して得た3-(3-クロロベンゾイル)-6-メチルピリジン-2-イル  p-トルエンスルホナートに70％エチルアミン水溶液を加え、封管中110℃で加熱下攪拌した。以下、常法により後処理精製して、3-(3-クロロベンゾイル)-2-エチルアミノ-6-メチルピリジンを得た。FAB-MS [(M+H)+]：275。
参考例５
3-(3-クロロベンゾイル)-2-エチルアミノ-6-メチルピリジン、塩化グルタル酸モノエチル及び2,6-ルチジンのTHF溶液を、油浴温度50℃で加熱下反応させた。以下、常法により後処理精製して、4-{N-[3-(3-クロロベンゾイル)-6-メチルピリジン-2-イル]-N-エチルカルバモイル}ブタン酸エチルを得た。FAB-MS [(M+H)+]：417。
【００１９】
実施例１
4-{N-[3-(3-クロロベンゾイル)-6-メチルピリジン-2-イル]-N-エチルカルバモイル}ブタン酸エチル 985 mgのエタノール 10 ml溶液にナトリウムメトキシド 200 mgを加え、油浴温度80℃で1時間加熱攪拌した。反応溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液 10 mlを加え、さらに油浴温度80℃で1時間加熱攪拌した。室温まで冷却した後、約半分になるまで溶媒を減圧下留去した。1M塩酸で中和した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の粗結晶(微黄色) 432 mgを得た。1H NMR(DMSO-d6)：δ(ppm) 12.07 (1H, s), 7.55-7.65 (2H, m), 7.45 (1H, s), 7.27-7.33 (1H, m), 7.19 (1H, d, J=8.1Hz), 7.09 (1H, d, J=8.1Hz), 4.52 (2H, q, J=7.0Hz), 2.30-2.60 (7H,m), 1.27 (3H, t, J=7.0Hz)。
【００２０】
実施例２（Ａ型結晶の製造）
1 lの丸底フラスコ中、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の粗結晶24.2 g及びエタノール水(エタノール：水=2：1) 242 mlを、溶液が沸騰するまで加熱し、桐山ロート（S-60, ろ紙No.5）を用い熱時濾過を行った。濾液を1 lの三頸フラスコに移し、内温が70℃になるまで加熱して、析出し始めた結晶を再度完全に溶解させた。加熱を止めた後、放冷しながら直径5 cmの半月型の攪拌翼で100 rpmの速度で攪拌を行った。溶液の内温が50℃まで下がったところで、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のA型結晶種をごく微量添加し、46℃まで下がったところで再度A型結晶種をごく微量添加して攪拌を続けた。2度目の結晶の添加から1時間経過したところで攪拌を止め(内温32℃)、結晶を濾取し、エタノール水(エタノール：水=2：1)で洗浄を行った後、5分間通風乾燥させ、湿重量27.5 gの結晶を得た。この結晶を減圧下45℃で19時間乾燥し、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のA型結晶16.0 gを白色針状晶として得た。
尚、上記製造法におけるA型結晶種の添加を行わず、他の操作を同様に行い、結晶の析出から1時間経過したところで結晶を濾取してもA型結晶を得ることができる。
実施例３（Ｂ型結晶の製造）
3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の粗結晶10.0 gを2-プロパノール：水（6：4）150 mlに加え、内温70℃付近まで加熱し溶解させ10分間撹拌した。この溶液を桐山ロート（SB-60、ろ紙No.4）にてろ過した。ろ液を再加熱し、45℃付近で3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＢ型結晶種10 mgを加えた。その後放冷して内温20〜25℃とし19時間撹拌し晶析させた。内温0〜5℃としさらに21時間撹拌した。析出した結晶をワットマンロート（ろ紙：トーヨーアドバンテックNo.131）で濾取し、2-プロパノール：水（6：4）20 mlで洗浄し、湿重量14.0 gの結晶を得た。これを60℃で１夜減圧乾燥して、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＢ型結晶7.90 gを微帯黄白色針状晶として得た。
尚、上記製造法におけるＢ型結晶種の添加を行わず、他の操作を同様に行い、結晶が析出してから更に二日間撹拌後結晶を濾取してもＢ型結晶を得ることができる。
【００２１】
また、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の活性は以下の試験により確認した。
実施例４（PDE4阻害活性）
１）PDE4を含有する溶液を、以下の通りラット心室筋より精製した。雄性ウイスターラットよりエーテル麻酔下で摘出した心臓を生理食塩水で洗浄後、心室を分離した。分離した心室をはさみで細かく切断し、これを1％PROTEASE INHIBITOR COCKTAIL For Mammalian Cell Extracts (SIGMA)を含む緩衝液Ａ (20 mM Bis-Tris、50 mM 酢酸ナトリウム、2 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM benzamidene、0.05 mM phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride、pH 6.5)に懸濁後、ポリトロンにより細胞を破壊し、超遠心(100,000 G、60分間、4℃)することにより可溶性画分を得た。
２）緩衝液Ａで平衡化された2.6×10 cm Ｑセファロースカラムに、得られた可溶性画分を充填した。ついで該カラムを緩衝液Ａ 1200 mlで洗浄し未結合蛋白を除去した。該カラムに結合した蛋白を0.05〜1.00 M酢酸ナトリウムの線形勾配液を含有する緩衝液Ａ 750 mlを用いて溶出し、7 ml分画110本を回収した。cGMP及びカルシウム／カルモジュリン存在または非存在下で得られた各分画のcAMP代謝PDE活性について検査した。各分画中のcAMPの代謝活性を有しかつcGMP又はカルシウム／カルモジュリンの存在によりcAMP代謝活性が影響を受けない分画をPDE4阻害活性を検査するための貯蔵溶液として使用した。
３）所望の濃度の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸を、40 mM Tris-HCl(pH 8.0)、5 mM 塩化マグネシウム、4 mM 2-メルカプトエタノール、1μM cAMP、1 μCi/ml [3H]cAMP及びPDE4貯蔵溶液の含有している反応混合液中で30℃で10分間反応させた。反応液に半量の18 mM 硫酸亜鉛、5 μM 3-ISOBUTYL-1-METHYLXANTHINE(IBMX)を含む20 mg/ml Polylysine coated yttrium silicate SPA beads(Amersham)懸濁液を加え反応を停止させ、放射活性を測定した。
IC50はPDE4の代謝活性を50％阻害する試験化合物濃度として算出した。
上記阻害活性測定試験の結果、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸はPDE4に対し0.24 nMのIC50値を有することが確認された。
【００２２】
実施例５（肝ミクロソームを用いたin vitro薬物代謝試験）
１）ヒト及びラット肝ミクロソーム懸濁液（ヒトミクロソーム：Xenotech社、ラットミクロソーム：チャールズリバー社）はタンパク量が0.5 mg/mlになるように100 mM Na-Kリン酸緩衝液（pH 7.4）で希釈した。この懸濁液100μlに、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸溶液（10μg/mlアセトニトリル溶液）2μl、200 mM Na-Kリン酸緩衝液（pH 7.4）500μl、1 mM EDTA-NaOH（pH 7.4）50μl及び精製水 200μlを加えて基質溶液とした（反応溶液中での濃度：肝ミクロソーム(タンパク量) 0.05 mg/ml、試験化合物 20 ng/ml、100 mM Na-Kリン酸緩衝液、0.1 mM EDTA-NaOH）。
２）NADP 42 mg、100 mM グルコース-6-フォスファターゼ(G6P) 5 ml及び100 mM MgCl2 5 mlを混合し、G6P脱水素酵素（約1750 U/5mg/ml）57μlを添加しNADPH生成系を調製した。37℃で5分間加温した後、使用に供するまで氷冷した。
３）基質溶液900μlを37℃で5分間プレインキュベーションした後、NADPH生成系100μlを加え、37℃で10、20、30分間反応させた。酢酸エチル 2 mlを加えて反応を停止させた後、氷冷した。尚、コントロールサンプルは、酢酸エチル2 mlを加えた後にNADPH生成系100μlを加えることにより調製した（反応0分）。
４）反応液に一定濃度の内部標準物質（アセトニトリル溶液）100μl、0.5 Mリン酸 1 ml及び酢酸エチル 2 mlを加えて10分間振とうした。2500 rpmで10分間遠心分離した後、酢酸エチル層を分取し蒸発乾固させ、残渣をHPLCの移動相溶媒100μlに溶解した。下記条件で試験化合物は約12分に、内部標準物質は約16分に溶出された。（HPLC測定条件  移動相：アセトニトリル／20 mM 酢酸アンモニウム＝ 2：3（v/v）、カラム：Discovery RP Amide C16，4.6 x 35 mm（SUPELCO社）、流速：0.8 ml/min、検出：UV 286 nm）
５）コントロールにおける試験化合物のピーク高さ比(内部標準物質とのピーク高さ比)に対する反応10、20、30分後のピーク高さ比の割合(残存率)を算出した。
上記測定試験の結果、3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸は、肝ミクロソーム中に存在するP450薬物代謝酵素によって代謝を受けにくいことが確認された。
【００２３】
実施例６（PDE4阻害活性を指標とした経口吸収性及び体内動態評価試験）
１）0.5%メチルセルロース(以下MC、信越化学工業)水溶液に懸濁した3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＡ型結晶を7週齢雄性フィッシャーラットに3mg/kgで経口投与した。また対照群においては溶媒(0.5%MC水溶液、3ml/kg)を同様に投与した。経口投与後、経時的にエーテル麻酔を施したラットの尾静脈よりヘパリン存在下で採血を行い、常法に従って血漿を調製した。
２）試験化合物または溶媒が投与されたラットから調製された血漿を最終濃度が0.1%になるように上記試験例１で示したPDE4測定系に添加し、PDE4阻害活性を測定した。
本試験の結果、８時間後に採血した血漿での阻害率は、本願発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸は77％であるのに対し、比較化合物（4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン：WO96/06843号公報実施例91の化合物）は4％の阻害率であった。従って、本発明化合物は良好な経口吸収性及び持続性を示すことが判明した。
【００２４】
実施例７（抗原誘発ラット気道内好酸球浸潤に対する作用）
4週齢のBrown Norway系雌性ラット(日本チャールスリバー、神奈川)に感作用OA溶液(最終濃度：OA；1 mg/ml, Al(OH)3；20 mg/ml)を、3日間連続して１匹当たり1 ml腹腔内投与することにより抗原感作を行った。なお、投与初日をDay 0とした。Day 21又は22に１%OA/生理食塩液を超音波ネブライザー(NE-U12、オムロン)で霧化し、感作ラットに20分間吸入させることで抗原暴露し、気道内への好酸球の浸潤を惹起した。また、生理食塩液を吸入暴露した群を正常対照群として用いた。3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＡ型結晶を0.5%MC水溶液に懸濁し、抗原吸入暴露開始の１時間前に経口投与した。なお動物は、抗原吸入暴露の前日より絶食とし、抗原吸入暴露後に絶食を解除した。抗原吸入暴露から24時間後、動物をネンブタール麻酔下に開腹し腹部大動脈より放血致死させた後、気管にカニューレ(6 Fr-アトム静脈カテーテル、アトム)を挿入し2 mlのヘパリン(1 unit/ml)含有生理食塩液を注入・回収する操作を5回(計10 ml)繰り返すことにより、気管支肺胞洗浄(BAL：Bronchoalveolar Lavage)を行った。回収したBAL液を500xg (4℃、10分間)で遠心後、上清を除去し、その沈渣(細胞画分)を500μlのヘパリン(1 unit/ml)含有生理食塩液で再懸濁した。再懸濁液の総白血球濃度を血球計数装置(Celltac-α、日本光電)で測定した後、塗沫標本を作製し鑑別用血液染色液(ディフ・クイック、国際試薬)で染色後、顕微鏡下で観察し、形態的特徴から好酸球の存在比率を算出した。総白血球数及び好酸球存在比率より、好酸球数の総数を算出し、薬物の効果を評価した。
本試験の結果、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸（Ａ型結晶）は、用量依存的に抗原誘発気道内好酸球浸潤を抑制し、1 mg/kg以上では有意であった。
【００２５】
実施例８（ラットLPS誘発気道内好中球浸潤に対する作用）
適量のケタミン／キシラジン混合液を腹腔内投与することにより麻酔を施した6週齢のWistar系雄性ラット(日本チャールスリバー、神奈川)に、生理食塩液に溶解した10μg/mlのLPS (Lipopolysaccharide E.coli 0127:B8 Boivin、DIFCO)溶液を200μlゾンデを用いて気道内投与することで気道内への好中球の浸潤を惹起した。また、生理食塩液を気道内投与した群を正常対照群として用いた。3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＢ型結晶を0.5%MC水溶液に懸濁し、LPS気道内投与の１時間前に経口投与した。なお動物は、LPS気道内投与の前日より絶食とし、LPS気道内投与後に絶食を解除した。LPS気道内投与から24時間後、動物をネンブタール麻酔下に開腹し腹部大動脈より放血致死させた後、以下上記試験例４と同様にして総白血球濃度を測定した。更に同様にして、顕微鏡下で観察した形態的特徴から好中球の存在比率を算出した。総白血球数及び好中球存在比率より、好中球数の総数を算出し、薬物の効果を評価した。
本試験の結果、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸（Ｂ型結晶）は、10及び30 mg/kgで有意にLPS誘発気道内好中球浸潤を抑制した。
上記の実施例４〜８の結果より、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸はPDE4の関与する疾患、特に喘息やCOPDの予防・治療薬として有用である事が明らかである。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸はPDE4の阻害活性に優れていることから、当該化合物を含有する医薬は、PDE4が関与する呼吸器疾患（例えば気管支喘息（アトピー性喘息を含む）、COPD、慢性気管支炎、肺炎性疾患、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）等）の予防・治療剤として有用である。特に気管支喘息及びCOPDの予防・治療薬として期待できる。また、PDE4の関与が知られているその他の疾患、例えばサイトカイン（IL-1、IL-4、IL-6及びTNF（腫瘍壊死因子））等の関与する疾患（例えば、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌性敗血症、トキシックショック症候群、腎炎、肝炎、感染（細菌及びウイルス）、循環不全（心不全、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中）等）等の予防・治療薬としても有用である。
更に、本発明の3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸の結晶、特にＡ型及びＢ型結晶は安定性に優れ、医薬品の製造原体として有用であり、中でもＢ型結晶は工業的生産における大量合成に有用である。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】  3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＡ型結晶の粉末X線回折図。
【図２】  3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＡ型結晶の熱分析図。
【図３】  3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＢ型結晶の粉末X線回折図。
【図４】  3-[4-(3-クロロフェニル)-1-エチル-7-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル]プロパン酸のＢ型結晶の熱分析図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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