(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む単離エストロゲン受容体。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換するか又はこれをトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされるエストロゲン受容体を発現させることを特徴とするエストロゲン受容体の生産方法。
【請求項９】
ヒトエストロゲン受容体に結合できるか否か分かっていないリガンドがヒトエストロゲン受容体に結合できるか否かを判定するための方法であって、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むヒトエストロゲン受容体をコードする単離ＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、エストロゲン受容体に結合することが分かっているリガンドの結合を可能にする条件下でリガンドと接触させ、
（ｂ）ヒトエストロゲン受容体に結合したリガンドの存在を検出し、
（ｃ）リガンドがヒトエストロゲン受容体に結合するか否かを判定することを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は新規エストロゲン受容体とこの受容体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明はこの受容体に結合するリガンドの同定方法、こうして同定されたリガンド及びこのようなリガンドを含む医薬組成物にも関する。本発明は更に、エストロゲン受容体に媒介される疾患又は症状の治療又は予防に有用な医薬組成物にも関する。
【０００２】
発明の背景
核内受容体は細胞分化、ホメオスタシス、種々の臓器と組織の成長と機能及び転写等の複雑な細胞イベントの調節に関与するタンパク質の大分類である。核内受容体はホルモンからの細胞外化学シグナルを転写応答に変換することにより機能すると考えられる。
【０００３】
エストロゲン受容体は大分類である核内受容体のサブクラスである。エストロゲン受容体はエストロゲンとエストロゲン様分子に応答性のタンパク質である。エストロゲン受容体は哺乳動物内分泌系、生殖器、乳組織、骨組織及び血管系で重要な役割を果たすと考えられ、更に、異常骨吸収、心血管疾患、癌及び中枢神経系障害等の種々の病状の発生及び進行に関与すると考えられる。エストロゲン受容体の活性を調節するための適当なリガンド即ち薬剤の開発により、種々の病態及び症状を治療又は予防できると考えられる。従って、エストロゲン受容体とその作用モードを同定し、これらの受容体の作用を調節するためのリガンドを同定する必要がある。
【０００４】
少なくとも２種の異なる型のエストロゲン受容体が報告されている。いずれも参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＧｒｅｅｎ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２０，ｐｐ．１３４−１３９（１９８６）とＧｒｅｅｎｅ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１，ｐｐ．１１５０−１１５４（１９８６）には５９５アミノ酸をもつエストロゲン受容体が開示されている。これらの文献は受容体に対応するＤＮＡ配列も開示している。
【０００５】
報告されている他方の型のエストロゲン受容体は２つの研究グループにより開示されており、「β」と呼ばれている。一方の研究グループはラット、ヒト及びマウスから得られる４８５アミノ酸β受容体と、対応するＤＮＡ配列を開示している。参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＫｕｉｐｅｒ，Ｇ．Ｇ．Ｊ．Ｍ．らの１９９７年３月１３日付け公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／０９３４８号参照。他方の研究グループは４８３アミノ酸を含む同種のエストロゲン受容体を開示している。対応するＤＮＡ配列も開示されている。参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＭｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｓ．ら，ＥＲβ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９２，ｐｐ．４９−５３（１９９６）参照。
【０００６】
本発明では、従来開示されている５９５アミノ酸、４８５アミノ酸及び４８３アミノ酸エストロゲン受容体とは異なる５４８アミノ酸単位をもつ新規エストロゲン受容体をヒト組織から同定及び単離した。この新規エストロゲン受容体は哺乳動物生理機能に重要な役割を果たすと考えられる。この新規エストロゲン受容体はエストロゲン受容体により媒介される広範な疾患又は症状を治療及び／又は予防するための医薬組成物に使用するリガンドを同定及び設計するための重要な研究ツールである。
【０００７】
従って、本発明の目的は新規単離エストロゲン受容体を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は新規エストロゲン受容体のアミノ酸配列を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は新規エストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は新規エストロゲン受容体の単離方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は新規エストロゲン受容体に結合することが可能なリガンドを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は新規エストロゲン受容体に結合することが可能なリガンドを含む医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的はエストロゲン受容体により媒介される疾患又は症状の治療及び／又は予防方法を提供することである。
【００１４】
上記及び他の目的は以下の詳細な説明から容易に理解されよう。
【００１５】
発明の要約
本発明は図１のアミノ酸配列（配列番号１にも対応）を含む単離エストロゲン受容体に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は図１のアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列をもち、少なくとも５３１アミノ酸を含む単離エストロゲン受容体に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は少なくとも５３１アミノ酸を含み、図１のエストロゲン受容体と実質的に同一のリガンド結合性又は実質的に同一のＤＮＡ結合性をもつ単離エストロゲン受容体に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に由来する単離エストロゲン受容体に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２０】
別の態様では、本発明はＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡである単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つこれに相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
別の態様では、本発明はＡＴＣＣ寄託番号２０９２３８、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２３９及びＡＴＣＣ寄託番号２０９２４０から構成される群から選択されるＡＴＣＣ寄託株に含まれるエストロゲン受容体ポリヌクレオチドによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は図２のヌクレオチド配列（配列番号２にも対応）を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は図２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つこれに相補的であり、少なくとも１５９３ヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
別の態様では、本発明はＤＮＡを含むベクターに関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は本発明のベクターで形質転換するか又はこれをトランスフェクトした宿主細胞に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は本発明のエストロゲン受容体の生産方法に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明はリガンドが本発明のエストロゲン受容体に結合できるか否かを判定するための方法に関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は本発明の方法により検出されたリガンドに関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は本発明のリガンドを含む医薬組成物に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は有効量の本発明の医薬組成物を投与することによりエストロゲン受容体により媒介される疾患又は症状を治療又は予防するための方法に関する。
【００３２】
本明細書に記載する寄託株は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて保存される。これらの寄託株は単に便宜として記載し、３５ＵＳＣ§１１２の規定により寄託株が必要であると認めるものではない。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列とこれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考資料としてその全体を本明細書の一部とし、本明細書中の配列の記載と矛盾する場合には元の配列を採用する。寄託材料を製造、使用又は販売するためにはライセンスが必要であり、本発明によりこのようなライセンスを許諾するものではない。
【００３３】
本明細書で使用する全百分率及び比は特に指定しない限り重量に基づく。本発明は本明細書に記載する必須及び任意成分、配合剤並びに方法から構成又は主に構成され得る。
【００３４】
発明の説明
本発明の１側面によると、図１の推定アミノ酸配列をもつか、１９９７年９月８日付けでＡＴＣＣ寄託番号２０９２３８として寄託されたクローンのｃＤＮＡ、１９９７年９月８日付けでＡＴＣＣ寄託番号２０９２３９として寄託されたクローンのゲノムＤＮＡ又は１９９７年９月８日付けでＡＴＣＣ寄託番号２０９２４０として寄託されたクローンのゲノムＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をもつポリペプチド即ちエストロゲン受容体が提供される。本発明はこのようなエストロゲン受容体のフラグメント、類似体及び誘導体にも関する。
【００３５】
図１のエストロゲン受容体又は寄託ＤＮＡによりコードされるエストロゲン受容体について「フラグメント」、「誘導体」及び「類似体」と言う場合には、このようなエストロゲン受容体とほぼ同一の生物機能又は活性を維持するポリペプチドを意味する。従って、類似体はプロタンパク質部分の開裂により活性化すると活性な成熟エストロゲン受容体を生産することができるプロタンパク質を含む。
【００３６】
本発明のエストロゲン受容体は図１の配列又は寄託ＤＮＡによりコードされる配列の組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。図１の受容体又は寄託ＤＮＡによりコードされる受容体のスプライス変異体も本発明の範囲に含む。
【００３７】
図１のエストロゲン受容体又は寄託ＤＮＡによりコードされる受容体のフラグメント、誘導体又は類似体は、（ｉ）置換後のアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるか否かを問わずにアミノ酸残基の１個以上を保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換したものでもよいし、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個以上が置換基を含むものでもよいし、（ｉｉｉ）エストロゲン受容体の半減期を増すための化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物と成熟エストロゲン受容体を融合したものでもよいし、（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列又は成熟エストロゲン受容体の精製に使用する配列又はプロタンパク質配列等の付加アミノ酸を成熟エストロゲン受容体に融合したものでもよい。このようなフラグメント、誘導体及び類似体は本明細書の教示から当業者に容易に理解されるとみなされる。
【００３８】
本発明は更に、図１のエストロゲン受容体と実質的に同一のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体も包含する。本発明の別の態様では、単離エストロゲン受容体は少なくとも５３１アミノ酸単位を含み、図１に示す配列と少なくとも約７５％相同である。本発明の更に別の態様では、単離エストロゲン受容体は少なくとも５３１アミノ酸単位を含み、図１に示す配列と少なくとも約９０％相同である。本発明の更に別の態様では、単離エストロゲン受容体は少なくとも５３１アミノ酸単位を含み、図１に示す配列と少なくとも約９５％相同である。本発明の更に別の態様では、単離エストロゲン受容体は少なくとも５３１アミノ酸単位を含み、図１に示す配列と少なくとも約９９％相同である。
【００３９】
本発明は更に、少なくとも５３１アミノ酸単位を含み、図１のエストロゲン受容体と実質的に同一のリガンド結合性又は実質的に同一のＤＮＡ結合性をもつエストロゲン受容体も包含する。換言するならば、受容体の夫々のリガンド結合又はＤＮＡ結合ドメインは図１の受容体の夫々のリガンド結合及びＤＮＡ結合ドメインの各々に少なくとも約７５％の相同度、好ましくは約９０％の相同度、より好ましくは約９５％の相同度、最も好ましくは約９９％の相同度をもつ。
【００４０】
本発明の別の側面によると、図１の推定アミノ酸配列をもつ成熟エストロゲン受容体又は寄託クローンのＤＮＡによりコードされる成熟エストロゲン受容体をコードする単離核酸即ちポリヌクレオチドが提供される。
【００４１】
本発明のエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドは、ヒト精巣ｃＤＮＡでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、ＪＭ１０９大腸菌でベクターにサブクローニングすることにより獲得できる。あるいは、ヒト精巣に由来するヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりポリヌクレオチドを獲得することもできる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ形態でもよいし、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡ等のＤＮＡ形態でもよい。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよく、１本鎖の場合にはコーディング鎖でも非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成熟エストロゲン受容体をコードするコーディング配列は図２に示すコーディング配列又は寄託クローンのコーディング配列と同一でもよいし、配列は異なるが、遺伝コードの重複又は縮重の結果として図２のＤＮＡ又は寄託ＤＮＡと同一の成熟エストロゲン受容体をコードするコーディング配列でもよい。
【００４３】
図１の成熟エストロゲン受容体又は寄託ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列のみを含むものでもよいし、成熟ポリペプチドのコーディング配列とリーダーもしくは分泌配列又はプロタンパク質配列等の付加コーディング配列を含むものでもよいし、成熟ポリペプチドのコーディング配列と、（場合により付加コーディング配列と）イントロンや成熟ポリペプチドのコーディング配列の５’及び／又は３’の非コーディング配列等の非コーディング配列を含むものでもよい。
【００４４】
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語はポリペプチドのコーディング配列を含むポリヌクレオチドと、付加コーディング及び／又は非コーディング配列を含むポリヌクレオチドにも及ぶ。
【００４５】
本発明は更に、図１の推定アミノ酸配列をもつポリペプチド又は寄託クローンのＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、類似体及び誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体にも関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然対立遺伝子変異体でもよい。本発明は更に、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして本発明のエストロゲン受容体を推定するために使用可能な図２のポリヌクレオチド配列から構築したポリヌクレオチドプローブ又はＰＣＲ法により増幅した図２の配列のセグメントにも関する。
【００４６】
従って、本発明は図１に示すと同一の成熟エストロゲン受容体又は寄託クローンのＤＮＡによりコードされる同一成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、図２のポリペプチド又は寄託クローンのＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体又は類似体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体を含む。このようなヌクレオチド変異体としては欠失変異体、置換変異体及び付加又は挿入変異体が挙げられる。
【００４７】
上記のように、ポリヌクレオチドは図２に示すコーディング配列又は寄託クローンのコーディング配列の天然対立遺伝子変異体であるコーディング配列をもつものでもよい。当技術分野で公知のように、対立遺伝子変異体はコードされるポリペプチドの機能を実質的に変えずに１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を含み得るポリヌクレオチド配列の代替形態である。
【００４８】
本発明は更に、図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関する。本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約７５％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９０％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９５％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は図１のアミノ酸配列をもつエストロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９９％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。
【００４９】
本発明は少なくとも１５９３ヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は少なくとも１５９３ヌクレオチドを含み、図２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約７５％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は少なくとも１５９３ヌクレオチドを含み、図２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９０％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は少なくとも１５９３ヌクレオチドを含み、図２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９５％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。本発明は図２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つ少なくとも約９９％相補的である単離ポリヌクレオチドに関する。
【００５０】
上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは図２のｃＤＮＡ又は寄託ＤＮＡによりコードされる成熟エストロゲン受容体と実質的に同一の生物機能又は活性を維持するエストロゲン受容体をコードする。ハイブリダイゼーションは参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＨａｓｔｉｎｇｓらの１９９６年３月６日付け発行米国特許第５，５０１，９６９号に記載されている。
【００５１】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは単離形態で提供することが好ましく、均質精製することが好ましい。
【００５２】
「単離」なる用語は、材料をその初期環境（例えば天然に存在する場合には天然環境）から取り出すことを意味する。例えば、天然に存在するポリヌクレオチド又は動物生体中に存在するポリペプチドは単離されていないが、同一ポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドを天然系に共存する材料の一部又は全部から分離した場合には単離したと言う。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもよいし、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部でもよく、このようなベクター又は組成物はその天然環境を構成しないので、この場合も単離したと言う。
【００５３】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作した宿主細胞及び組換え技術による本発明のエストロゲン受容体の生産にも関する。
【００５４】
宿主細胞は例えばクローニングベクターや発現ベクター等の本発明のベクターで遺伝子操作（形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）する。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態とすることができる。遺伝子操作した宿主細胞はプロモーターを活性化、形質転換細胞を選択又はエストロゲン受容体遺伝子を増幅するように改変した慣用栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現に選択する宿主細胞で従来使用されている条件であり、当業者に自明である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりポリペプチドを生産するために利用することができる。従って、例えばポリヌクレオチド配列を種々の発現ビヒクルの任意のもの、特にエストロゲン受容体を発現するためのベクター又はプラスミドに組み込むことができる。このようなベクターとしては染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列（例えばＳＶ４０の誘導体）、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び偽狂犬病）が挙げられる。但し、宿主で複製可能且つ生存可能である限り、他の任意プラスミド又はベクターも使用することができる。
【００５６】
上述のように、適当なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクターに挿入することができる。一般には、当技術分野で公知の方法によりＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。このような方法及び他の方法は当業者に自明であるとみなされる。
【００５７】
本発明は更に、本明細書に広義に定義する配列の１種以上を含む組換え構築物も包含する。構築物はプラスミドやウイルスベクター等のベクターに本発明の配列を順方向又は逆方向に挿入したものである。多数の利用可能なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。
【００５８】
別の態様では、本発明は上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞等の高等真核細胞でもよいし、酵母細胞等の下等真核細胞でもよいし、細菌細胞等の原核細胞でもよい。構築物の宿主細胞導入はリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法又はエレクトロポレーションにより実施することができる（参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＤａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。
【００５９】
宿主細胞中の構築物は組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するために慣用方法で使用することができる。あるいは、慣用ペプチド合成器により本発明のエストロゲン受容体を合成することもできる。
【００６０】
成熟エストロゲン受容体は哺乳動物細胞、酵母、細菌又は他の細胞で適当なプロモーターの制御下に発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用して無細胞翻訳系を利用することによりこのようなエストロゲン受容体を生産することもできる。原核及び真核宿主で使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは参考資料としてその開示内容全体を本明細書の一部とするＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。
【００６１】
本発明のエストロゲン受容体は高度発現細胞系から発現される天然精製物でもよいし、化学合成法の生成物でもよいし、（例えば培養細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞により）原核又は真核宿主から組換え技術により生産してもよい。あるいは、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系も利用できる。
【００６２】
エストロゲン受容体、そのフラグメントもしくは他の誘導体もしくは類似体、又はこれを発現する細胞を免疫原として使用すると、その抗体を生産することができる。これらの抗体は例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。本発明はキメラ、単鎖及びヒト化抗体と、Ｆａｂフラグメント又はＦａｂ発現ライブラリーの産物も包含する。このような抗体及びフラグメントの生産には当技術分野で公知の種々の方法を使用することができる。
【００６３】
本発明は更に本発明のエストロゲン受容体のリガンド即ち薬剤にも関する。本明細書で使用する「リガンド」なる用語は、本発明のエストロゲン受容体に結合する任意分子を意味する。これらのリガンドはアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、インバースアゴニスト、又はこれらの性質の混合性質をもつことができる。従って、例えば本発明のエストロゲン受容体に結合するリガンドはその機能を改変、抑制又は削除することができる。こうして、リガンドを使用すると、エストロゲン受容体が関与する疾患を治療又は予防することができる。本明細書で想定するリガンドは本発明のエストロゲン受容体により通常調節される遺伝子を特異的に活性化又は阻害するように選択性をもつものである。
【００６４】
本発明は更に、ヒトエストロゲン受容体に結合できるか否か分かっていないリガンドがヒトエストロゲン受容体に結合できるか否かを判定するための方法にも関する。これらの方法は、ヒトエストロゲン受容体をコードする単離ＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、エストロゲン受容体に結合することが分かっているリガンドの結合を可能にする条件下でリガンドと接触させ、ヒトエストロゲン受容体に結合したリガンドの存在を検出し、リガンドがヒトエストロゲン受容体に結合するか否かを判定することを特徴とする。これらの方法では、哺乳動物細胞は実際に単離ＤＮＡ分子を発現している。このような方法を実施するための一般技術は当業者に周知である。例えば、その開示内容全体を本明細書の一部とするＷｅｉｎｓｈａｎｋらの１９９７年７月６日付け公開ヨーロッパ特許出願第７８７，７９７号参照。あるいは、最終的にエストロゲン受容体をコードするＲＮＡを例えばアフリカツメガエル卵母細胞に注入して発現させ、類似アッセイ実験で使用することもできる。
【００６５】
本発明は更に、本発明のリガンドを含む医薬組成物に関する。このような組成物は医薬的に有効な量のリガンドを含む。本明細書で使用する「医薬的に有効な量」なる用語は、所望治療計画に従って投与した場合に所望の治療効果又は応答を誘導するリガンドの量を意味する。リガンドは一般に、投与方法（即ち経口、静脈内、経鼻、非経口、眼球等）に応じて適切に選択した適切な医薬希釈剤、賦形剤又はキャリヤー（本明細書では「キャリヤー材料」と総称する）と混合投与する。当業者に周知の多種多様の製品及び剤形を使用してこれらのリガンドを投与することができる。
【００６６】
本発明は更に、エストロゲン受容体に媒介される疾患又は症状の治療及び／又は予防方法にも関する。「エストロゲン受容体に媒介される疾患又は症状」とは、エストロゲン受容体が関与する生理的又は病理的状態を意味する。エストロゲン受容体に媒介される疾患又は症状の非限定的な例としては、内分泌系、生殖器、乳組織、骨組織及び血管系の疾患又は症状、特に老年男女に多発する疾患が挙げられる。より具体的には、このような疾患及び症状としては異常骨吸収、心血管疾患、癌、代謝障害及び中枢神経系障害から構成される群から選択されるものが挙げられる。更に具体的には、このような疾患及び症状としては骨粗鬆症、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、糖尿病及びアルツハイマー病から構成される群から選択されるものが挙げられる。
【００６７】
実施例
以下、実施例により本発明の範囲に含まれる態様を更に説明及び実証する。以下の実施例は単に説明を目的とし、本発明を制限するものではなく、発明の精神及び範囲内で多数の変形が可能である。
【００６８】
実施例１：ヒトエストロゲン受容体遺伝子のｃＤＮＡクローンのクローニング及び配列決定
Ｖｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製品＃２５４Ｓ）を使用してヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製品＃７４１４−１）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を２回実施することにより、ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）産物を同定した。第１回目のＰＣＲはヒトエストロゲン受容体βの５’コーディング領域（ＧｅｎＢａｎｋ配列番号Ｘ９９１０１）のオリゴヌクレオチドＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣ（配列番号３）とＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＡＰ１プライマーを製造業者の指示に従って使用して実施した。第２回目のＰＣＲはヒトエストロゲン受容体βクローンの５’末端（ＧｅｎＢａｎｋ配列番号Ｘ９９１０１）に対応する配列ＧＴＧＧＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣ（配列番号４）又はＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧ（配列番号５）をもつ２種の異なる入れ子プライマーのいずれか一方とＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＡＰ２プライマーを製造業者の指示に従って使用して実施した。ＰＣＲ産物をＪＭ１０９大腸菌でＰＣＲＡｍｐＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品＃２１１１８８）にサブクローニングした。配列ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号６）をもつベクター配列に対応するプライマーと、配列ＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＣ（配列番号７）をもつヒトエストロゲン受容体β受容体遺伝子の５’末端のプライマーを使用してサイクルシーケンシング（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製品＃２７−１６９４−０１）により製造業者の指示に従ってこのクローンを両鎖で配列決定した。配列ＧＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＡＡＣＡＧ（配列番号８）、ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＴＡＧＴＧＡＣＴＡＧＣＣ（配列番号９）、ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＧＣＴＡＧ（配列番号１０）及びＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣ（配列番号１１）をもつ４種の付加プライマーを使用して更に配列決定を行った。これらの４種のプライマーは初期配列分析から誘導した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＡｓｓｅｍｂｌｙＬｉｇｎプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ）とＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：パイルアップ）を使用してヌクレオチド及びタンパク質配列の配列整列及び分析を実施した。
【００６９】
実施例２：ヒトエストロゲン受容体遺伝子のゲノムＤＮＡクローンのクローニング及び配列決定
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングで使用するプローブを得るために、オリゴｄＴプライマーとＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品＃２００４２０）を製造業者の指示に従って使用して先ずヒト精巣ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製品＃６５３５−１）からｃＤＮＡを作製した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ’ｓ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（製品＃１  ７３２  ６４１）と配列ＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧ（配列番号１２）及びＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧ（配列番号１３）をもつ２種のプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＪＭ１０９大腸菌でＴＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製品＃Ａ３６００）にクローニングした。配列ＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣ（配列番号１４）、ＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣ（配列番号１５、配列番号３に同じ）、ＣＣＧＴＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧ（配列番号１６）、ＣＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧ（配列番号１７）、ＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣ（配列番号１８）、ＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号１９）、ＣＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＣ（配列番号２０）、ＣＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＣＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＧＧ（配列番号２１）、及びＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＧＴＣＣＧ（配列番号２２）（公表ＤＮＡ配列（Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｓ．ら，ＥＲβ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９２，ｐｐ．４９−５３［１９９６］）に対応）をもつ９種のプライマーを使用してＰｈａｒｍａｃｉａサイクルシーケンシングキット（製品＃２７−１６９４−０１）により製造業者の指示に従って産物を一方の鎖で配列決定した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＡｓｓｅｍｂｌｙＬｉｇｎプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ）とＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：パイルアップ）を使用してヌクレオチド及びタンパク質配列の配列整列及び分析を実施した。
【００７０】
得られたｃＤＮＡクローンを制限酵素ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、ヒトエストロゲン受容体βｃＤＮＡの５’末端（ＧｅｎＢａｎｋ配列番号Ｘ９９１０１）に対応する約５００塩基対フラグメントを得た。このフラグメントをＰ−３２で標識し、ヒトゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品＃９４６２０６）を製造業者の指示に従ってスクリーニングするために使用した。１００万個のバクテリオファージプラークをスクリーニングし、ハイブリダイズする可能性のある１７個のファージを選択した。これらのファージを再増幅し、僅かに小さいプローブ（即ちヒトＥＲβクローンをＮｃｏＩとＰｓｔＩで消化することにより作製した約３００塩基対フラグメント）を使用してスクリーニングした。２個の陽性ファージをプラーク精製し、ＤＮＡの生産に使用した。ファージをＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化し、ファージＤＮＡの大半をコードするもっと小さいフラグメントを作製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＃５２３２４）にサブクローニングした。一方のファージから約８．５及び６ｋｂの２個のフラグメントと、他方のファージから約７．７及び６．３ｋｂの２個のフラグメントを作製した。５’ＲＡＣＥ産物配列決定（実施例１）から誘導したプライマーを使用してＰｈａｒｍａｃｉａサイクルシーケンシングキット（製品＃２７−１６９４−０１）により製造業者の指示に従って両鎖で８．５及び７．７ｋｂのゲノムサブクローンを配列決定した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＡｓｓｅｍｂｌｙＬｉｇｎプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ）とＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：パイルアップ）を使用してヌクレオチド及びタンパク質配列の配列整列及び分析を実施した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のエストロゲン受容体即ちポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】  本発明のエストロゲン受容体をコードするヌクレオチド配列即ちｃＤＮＡポリヌクレオチドを示す。この配列は翻訳終結コドン「ＴＧＡ」を含む。
【配列表】
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0004307708.tif 000003
0004307708.tif 000004
0004307708.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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