(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物にグリフォセート耐性を付与するキメラ遺伝子であって、転写方向に、プロモーター領域、プラスチド局在化を可能とするトランジットペプチド領域をコードする配列、グリフォセート耐性タンパク質をコードする配列と、ポリアデニル化信号領域とを含み、前記プロモータ領域が植物Ｈ４ヒストン遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする前記キメラ遺伝子。
【請求項２】
グリフォセート耐性タンパク質をコードする配列が細菌に由来することを特徴とする請求項１に記載のキメラ遺伝子。
【請求項３】
グリフォセート耐性タンパク質をコードする配列が植物に由来することを特徴とする請求項１に記載のキメラ遺伝子。
【請求項４】
グリフォセート耐性タンパク質がEPSPSであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項５】
トランジットペプチド領域が転写方向に、プラスチド局在化酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードするDNA配列１つ以上を含み、さらにプラスチド局在化酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部の部分配列を含んでもよく、またさらにプラスチド局在化酵素をコードする植物遺伝子の第二のトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでもよいことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
植物ヒストン遺伝子のプロモーターが双子葉植物に由来することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
植物ヒストン遺伝子のプロモーターがシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項８】
植物ヒストン遺伝子のプロモーターが単子葉植物に由来することを特徴とする、請求項１〜５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、植物形質転換用ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含むアグロバクテリウム種。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換植物細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞から得られた、優れた除草剤耐性を有する形質転換された双子葉植物、イネまたはトウモロコシ。
【請求項１３】
双子葉植物であることを特徴とする請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
イネまたはトウモロコシであることを特徴とする請求項１２に記載の植物。
【請求項１５】
請求項１〜８までのいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を構築する方法であって、少なくとも１つの植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーター、１つのプラスチド局在化を可能とするトランジットペプチド領域をコードする配列、１つのグリフォセート耐性コード配列と、適当なポリアデニル化信号領域とを個々に単離し、その後これらをグリフォセート耐性コード配列の転写方向に組み合わせる前記方法。
【請求項１６】
植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーターが、２つの植物ヒストン遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１７】
植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーターの一部が重複していることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１８】
重複した領域が植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーターの中央領域であることを特徴とする、請求項１７に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１９】
植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーターが、植物において天然に発現し得る異なる遺伝子に由来するプロモーターと結合した植物ヒストンＨ４遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２０】
植物において天然に発現し得る異なる遺伝子に由来するプロモーターが、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、請求項１９に記載のキメラ遺伝子。
【請求項２１】
植物において天然に発現し得る異なる遺伝子に由来するプロモーターが、重複していることを特徴とする、請求項１９または２０に記載のキメラ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なプロモーター、このプロモーターを有する新規なキメラ遺伝子、及び植物の除草剤耐性の向上に前記新規なキメラ遺伝子を用いることに係わる。本発明はまた、上記遺伝子を用いて形質転換させた植物細胞と該細胞から再生させた形質転換植物、及びこの形質転換植物を用いた交雑育種によって得られる植物にも係わる。
【０００２】
【従来の技術】
グリフォセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、サルフォセート（ｓｕｌｆｏｓａｔｅ）及びフォサメチン（ｆｏｓａｍｅｔｉｎｅ）は、ホスホノメチルグリシン系の広スペクトル浸透除草剤である。これらは実質的に５−（エノールピルビル）シキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．１９）即ちＥＰＳＰＳの、ＰＥＰ（ホスホエノールピルベート）に対する拮抗阻害剤として機能する。これらの除草剤は、植物に対して散布されると植物内部で移動して、急速に成長する部分、特に茎頂及び根端に蓄積し、それによって鋭敏な植物を弱らせ、時には枯死させる。
【０００３】
上記製剤の主要標的であるプラスチドＥＰＳＰＳは芳香族アミノ酸生合成経路内の酵素で、一つ以上の核内遺伝子によってコードされて細胞質前駆体の形態に合成され、その後プラスチド内に局在化されて、そこに成熟形態で蓄積する。
【０００４】
或る植物の、グリフォセート及び同系製剤に対する耐性は、当該植物のゲノムに植物または細菌由来のＥＰＳＰＳ遺伝子を安定に導入することによって得られ、その際前記遺伝子は該遺伝子の産物がグリフォセートによって阻害される特性に関して突然変異を起こしていてもよい。グリフォセートの所与の作用モードの下で上記遺伝子の翻訳産物を発現させ、かつその相当量をプラスチド内に蓄積させることができれば有益である。
【０００５】
ＥＰＳＰＳがプラスチド内部に局在化された後に該酵素をその拮抗阻害剤（グリフォセート）に対してより耐性とする少なくとも一つの突然変異を起こしているＥＰＳＰＳをコードする遺伝子を植物のゲノムに導入することによって当該植物に上記のような除草剤、特にＮ−（ホスホノメチル）グリシン即ちグリフォセートに対する耐性を付与することは、例えば米国特許第４，５３５，０６０号から公知である。しかし、この技術は、得られた植物を農学的諸条件下に用いる際の信頼性を高めるべく改良されなければならない。
【０００６】
本明細書中で、“植物”という語は光合成可能な任意の分化多細胞生物を意味し、また“植物細胞”という語は、カルスのような未分化組織や胚または植物の一部分、植物全体もしくは種子のような分化組織を構成し得る任意の植物由来細胞を意味すると理解される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、除草剤全般、なかでもホスホノメチルグリシン系除草剤に対して優れた耐性を有する形質転換された植物を、前記除草剤に対する耐性のための遺伝子を含む新規なキメラ遺伝子を用いて形質転換させた細胞からの再生によって製造することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的は本発明によって達成される。本発明はまた、新規なキメラ遺伝子を提供し、かつ急速に成長する部分の除草剤耐性の改善により除草剤に対してより耐性とされた形質転換植物と、この形質転換植物を用いた交雑育種によって得られる植物とを提供する。更に本発明は、上記キメラ遺伝子の構築に用いる新規なプロモーターも提供し、このプロモーターは、除草剤に耐性のタンパク質を除草剤蓄積領域において発現させ得る植物ヒストン遺伝子のプロモーターまたはそのフラグメントを転写方向に一つ以上含む、植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子のプロモーター領域として機能し得るＤＮＡ配列を含む。
【０００９】
本発明は特に、植物の、ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤に対する耐性を高めるキメラ遺伝子を提供し、この遺伝子は転写方向にプロモーター領域と、トランジットペプチド領域と、グリフォセート耐性酵素をコードする配列と、ポリアデニル化信号領域とを含み、前記プロモーター領域が、除草剤耐性タンパク質をグリフォセート蓄積領域において選択的に発現させ得る植物ヒストン遺伝子のプロモーターフラグメント一つ以上から成ることを特徴とする。
【００１０】
上記ヒストン遺伝子は、例えば小麦、トウモロコシまたは米といった単子葉植物に由来するか、または好ましくは、例えばアルファルファ、ヒマワリ、大豆、セイヨウアブラナ、または好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｈａｂｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．８，  １９８７，  ｐｐ．１７９−１９１参照）といった双子葉植物に由来する。
【００１１】
Ｈ３型か、または好ましくはＨ４型のヒストンの遺伝子を単体で、または多重形態、特に重複形態で用いることが好ましい。
【００１２】
本発明によるキメラ遺伝子のプロモーター領域は、ヒストン遺伝子のプロモーターフラグメントに加えて、植物において天然に発現する遺伝子のプロモーターフラグメント、即ち例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）の３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのようなウイルス由来のプロモーターや、例えばトウモロコシまたはヒマワリといった作物のリブロース１，５−ジホスフェートカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子の小サブユニットのプロモーターのような植物由来のプロモーターを一つ以上有利に含み得る。
【００１３】
トランジットペプチド領域は転写方向に、プラスチド局在化（ｐｌａｓｔｉｄ−ｌｏｃａｌｉｓｅｄ）酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列一つ以上と、プラスチド局在化酵素をコードする植物遺伝子のＮ末端成熟部の部分配列をコードするＤＮＡ配列と、更に続いて、好ましくはＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子であるプラスチド局在化酵素をコードする植物遺伝子の第二のトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列とを含む。
【００１４】
トランジットペプチド領域に用い得るトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列はそれ自体公知であり得、例えばトウモロコシ、ヒマワリ、エンドウ豆、タバコ等のような植物に由来し得る。第一及び第二のトランジットペプチドは互いに同じでも、類似しても、また相違してもよい。これらのトランジットペプチドはまた、一つ以上のトランジットペプチドユニットをそれぞれ含み得る。
【００１５】
Ｎ末端成熟部の部分配列をコードするＤＮＡ配列は、例えばトウモロコシ、ヒマワリまたはエンドウ豆等のような植物の、プラスチド局在化酵素をコードする遺伝子に由来し、その起源の植物種は第一及び第二のトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列がそれぞれ由来する植物種と同じでも、類似しても、また相違してもよい。Ｎ末端成熟部の部分配列は、様々な個数、即ち通常１５〜４０個、好ましくは１８〜３３個のアミノ酸から成り得る。
【００１６】
トランジットペプチド領域全体の形成方法はそれ自体公知であり得、特に融合その他の任意の適当手段が該領域の形成に用いられ得る。本発明の一特徴であるこのトランジットペプチド領域は成熟タンパク質の、好ましくは無傷での最も効率的な放出を実現するべく機能する。
【００１７】
本発明によるキメラ遺伝子に用い得る除草剤耐性コード配列は、相当程度のグリフォセート耐性を有するＥＰＳＰＳ突然変異体をコードする。特にＥＰＳＰＳ遺伝子の突然変異がもたらすこの配列は、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ（この細菌に由来する除草剤耐性コード配列を以後“ＡｒｏＡ遺伝子”と呼称）のような細菌から得ることも、また例えばペチュニアやトマトといった植物から得ることも可能である。本発明に用いる除草剤耐性コード配列は、例えばＰｒｏ１０１〜ＳｅｒやＧｌｙ９６〜Ａｌａに対応する１箇所以上に突然変異を有し得る。
【００１８】
本発明によるキメラ遺伝子の３′に位置する翻訳されないポリアデニル化信号領域は任意の起源を有し得、例えばノパリンシンターゼ遺伝子のような細菌遺伝子に由来しても、またトウモロコシやヒマワリのＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットのような植物遺伝子に由来してもよい。
【００１９】
本発明によるキメラ遺伝子は、これまで説明した主要部分の他に、細菌、ウイルスまたは植物に任意に由来し得る翻訳されない中間領域（リンカー）をプロモーター領域とコード配列との間に含み得る。
【００２０】
【実施例】
実施例１：キメラ遺伝子の構築
本発明によるキメラ遺伝子を、次の四つの要素を用いて構築する。
【００２１】
１）  プロモーター：プロモーターは、Ｃｈａｂｏｕｔｅが述べている（１９８７年にストラスブール大学から発行された学位論文、及びＰｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．８，  １９８７，  ｐｐ．１７９−１９１参照）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ストラスブール株）由来のＨ４  Ａ７７７ヒストンクローン及びＨ４  Ａ７４８ヒストンクローンそれぞれから単離する。単離に用いたＸｈｏＩ部位同士の間が約１ｋｂｐであるこれらのプロモーターはそのままでか、重複形態でか、または一重もしくは二重のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと融合した、即ち一部重複した形態で用いる。
【００２２】
２）  トランスファー領域：この領域に用いる、トランジットペプチドをコードする二つのＤＮＡ配列及び成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、（１９８７年に）Ｌｅｂｒｕｎ等が述べている遺伝子に相当するトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットのクローンｃＤＮＡ、及び（１９８７年に）Ｗａｋｓｍａｎ等が単離したヒマワリＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットのクローンｃＤＮＡに由来する。特に、トランスファー領域は翻訳方向に、
―ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列、
―トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットの、Ｎ末端成熟部の２２個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列、及び
―トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含む。
【００２３】
他の類似遺伝子は、１０〜４０個、好ましくは１８〜３３個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
【００２４】
比較例として、転写方向に“二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／ｎｏｓ”を含むキメラ遺伝子（ｐＲＰＡ−ＢＬ４１０）も形成した。
【００２５】
３）  構造遺伝子：構造遺伝子は、（１９８５年に）Ｓｔａｌｋｅｒ等が単離したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍの突然変異（Ｐｒｏ１０１〜Ｓｅｒ）ＥＰＳＰＳ遺伝子に由来する。（Ｃａｌｇｅｎｅ提供の）ｐＭＧ３４−２クローンをＸｂａＩで直鎖状とし、続いてＶｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａヌクレアーゼで処理した。ＳｍａＩで再切断後、二つのブラントエンドを連結した。得られるクローンは、開始コドンＡＴＧ中にＮｃｏＩ部位を、また終止コドン下流に１７ｂｐのＳａｌＩ部位を有する。このクローンを“ｐＲＰＡ−ＢＬ１０４”と命名した。
【００２６】
４）  ポリアデニル化信号領域：このフラグメントはｐＴｉ３７（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）のノパリンシンターゼ遺伝子に由来する。前記遺伝子は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、かつＭ１３  ｍｐ１８のＳｍａＩ部位においてクローニングして５′末端及び３′末端にＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ導入した２６０ｂｐのＭｂｏＩフラグメント（Ｆｒａｌｅｙｅｔ  ａｌ．，  １９８３；  ＰＣＴ特許出願第８４／０２９１３号）に含まれる。
【００２７】
ＢａｍＨＩで切断し、かつＶｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａヌクレアーゼで処理した後ＥｃｏＲＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理して得られたフラグメントをベクターｐ−ＢＬ２０（フランス特許出願第８８／０４１３０号参照）に插入し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理した。ＳａｌＩ及びＳｓｔＩで再び切断すると、ＳａｌＩ部位側に３′ｎｏｓ配列を有し、かつＳｓｔＩ部位側にＴ−ＤＮＡの右側端部を有する約０．４ｋｂｐのフラグメントが得られる。
【００２８】
上記４要素総てを次のようにして組み合わせた。
【００２９】
“トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”融合：
トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列は、（１９８７年に）Ｌｅｂｒｕｎ等が述べているトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子のＳＳＵ遺伝子に対応するｃＤＮＡから得られる１９２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントに由来し、このフラグメントは翻訳開始コドンにかかるＮｃｏＩ部位と、トランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列の切断部位に相当するＳｐｈＩ部位とを有する。
【００３０】
ＳｐｈＩ部位末端をバクテリオファージＴ４ポリメラーゼで処理した後、ｐＲＰＡ−ＢＬ１０４のＡｒｏＡ遺伝子のＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理済みのＮｃｏＩ部位末端と連結し、かつＥｃｏＲＩで再切断することによって、トランジットペプチドをコードするトウモロコシ由来のＤＮＡ配列と細菌由来のＥＰＳＰＳ遺伝子であるＡｒｏＡ遺伝子とが融合した翻訳融合体が得られる。
【００３１】
“トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の２２個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”融合：
同様にトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ遺伝子のＳＳＵのｃＤＮＡから得られる２２８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントを、ｐＲＰＡ−ＢＬ１０４のＡｒｏＡ遺伝子のＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理済みのＮｃｏＩ部位末端に連結し、ＥｃｏＲＩで再切断する。トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列と、トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の２２個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列と、細菌由来のＥＰＳＰＳ遺伝子であるＡｒｏＡ遺伝子との翻訳融合体が得られる。
【００３２】
ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列：
このフラグメントは、（１９８７年に）Ｗａｋｓｍａｎ及びＦｒｅｙｓｓｉｎｅｔが単離したｃＤＮＡに由来する。トランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列の切断部位に、Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈの方法（１９８４年）によってＳｐｈＩ部位を創出した。このようにして得られるヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列は、１７１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントである。
【００３３】
“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の２２個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”融合：
“トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列”を含む構造体をＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩで切断してから、ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列に相当する１７１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントと連結した。得られる構造体はＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメント置換を呈し、この構造体は“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”翻訳融合体である。
【００３４】
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、３′ｎｏｓ配列及びＴ−ＤＮＡ右側端部を含むＳａｌＩ−ＳｓｔＩフラグメントと連結した。このようにして得られる、“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／３′ｎｏｓ／Ｔ−ＤＮＡ右側端部”を含むＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメントで、二重ＣａＭＶプロモーターを含むプラスミド１５０Ａα２のＴ−ＤＮＡ右側端部を含むＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメントを置換する。ベクター１５０Ａα２に插入した“二重ＣａＭＶプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／３′ｎｏｓ”転写融合体を、“ｐＲＰＡ−ＢＬ２９４”と命名した。
【００３５】
“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”融合：
上記構造体をＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡｒｏＡ遺伝子を放出させる。次に、該構造体を、“トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”融合体を含む１．５ｋｂｐのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結する。得られる構造体はＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント置換を呈し、この構造体は“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子”翻訳融合体である。
【００３６】
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、３′ｎｏｓ配列及びＴ−ＤＮＡ右側端部を含むＳａｌＩ−ＳｓｔＩフラグメントと連結した。このようにして得られる、“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／３′ｎｏｓ／Ｔ−ＤＮＡ右側端部”を含むＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメントで、二重ＣａＭＶプロモーターを含むプラスミド１５０Ａα２のＴ−ＤＮＡ右側端部を含むＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメントを置換する。ベクター１５０Ａα２に插入した“二重ＣａＭＶプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／３′ｎｏｓ”転写融合体を、“ｐＲＰＡ−ＢＬ４１０”と命名した。
【００３７】
いずれの構造体も、上述のようにして得られるｐＲＰＡ−ＢＬ４１０構造体の二重ＣａＭＶプロモーター領域をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位において切断して、次のような様々なプロモーター要素を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置換することによって得た。
【００３８】
Ａ）  一重Ｈ４  Ａ７４８ヒストンプロモーター
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨ４  Ａ７４８ヒストンプロモーターを含む約１ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩフラグメント（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．８，  １９８７，  ｐｐ．１７９−１９１）を、ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１９と連結した。このクローンを、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理したＸｂａＩ、及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理したＥｃｏＲＩで切断し、その後断端同士を再環化促進条件下に連結した。上記ヒストンプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで、ｐＲＰＡ−ＢＬ４１０の二重ＣａＭＶプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを置換した。
【００３９】
得られるクローンは“Ｈ４ヒストンプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／ｎｏｓ”を含み、このクローンを“ｐＲＰＡ−ＢＬ４９８”と命名した。
【００４０】
Ｂ）  一重Ｈ４  Ａ７７７ヒストンプロモーター
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＨ４  Ａ７７７ヒストン遺伝子の５′近接領域を総て含む約１ｋｂｐのＸｈｏＩフラグメント（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．８，  １９８７，  ｐｐ．１７９−１９１参照）をプラスミドｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位においてクローニングし、その際ｐＵＣ１９は、ＸｂａＩ部位からＥｃｏＲＩ部位に達するｐＵＣ１９ポリリンカーの前記両部位が転写開始部位より下流に位置するような配向を有した。
【００４１】
“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジット領域／ＡｒｏＡ遺伝子”融合
トランジットペプチド、及び成熟タンパク質の３０個のアミノ酸をコードする、（１９８７年に）Ｗａｋｓｍａｎ及びＦｒｅｙｓｓｉｎｅｔが単離したヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントを、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ部位においてクローニングした。
【００４２】
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを単離して、（Ｃａｌｇｅｎｅ提供の）ｐＭＧ３４−２のＡｒｏＡ遺伝子上流でＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位に插入した。二つのコード領域をフレームに配するべく、このクローンのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ插入体をＭ１３  ｍｐ１９のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に插入した。
【００４３】
上記クローンのＤＮＡの複製形態を、ＸｂａＩで直鎖状としてからＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａヌクレアーゼで処理した。再環化及び形質転換を促進する条件下での連結後、幾つかのクローンのＤＮＡを配列決定法によって解析した。得られるクローンの一つではＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵ要素とＡｒｏＡフラグメントとの翻訳融合が実現し、その際ＡｒｏＡフラグメントの開始コドンＡＴＧは消失する。上記２要素の結合部の配列は、
ＧＡＣ  ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡ
ＳＳＵ      リンカー      ＡｒｏＡ
となる。
【００４４】
従って、この融合体は翻訳方向に、“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の３０個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列／中間リンカーに対応する３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ”を含む。
【００４５】
ｐＲＰＡ−ＢＬ２４０の構築
上述のＨ４  Ａ７７７ヒストン遺伝子のプロモーターを含むプラスミドをＸｂａＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩでの再切断によって得られるフラグメントを単離した。上記“ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジット領域／ＡｒｏＡ遺伝子”融合体を含むプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、やはりＨｉｎｄＩＩＩでの再切断によって得られるフラグメントを単離した。これら二つのフラグメントの連結を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１９の存在下に実施した。得られるクローンの一つは、“ヒストンプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードする領域／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の３０個のアミノ酸をコードする領域／中間リンカーに対応する３個のアミノ酸をコードする領域／ＡｒｏＡ遺伝子領域”という構造を有する。
【００４６】
このクローンをＳａｌＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理してからＨｉｎｄＩＩＩで再び切断することによって単離したフラグメントを、ポリアデニル化領域を含むプラスミドと連結し、ＢａｍＨＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、その後ＨｉｎｄＩＩＩで再び切断した。
【００４７】
得られるクローンの一つは、“ヒストンプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードする領域／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、Ｎ末端成熟部の３０個のアミノ酸をコードする領域／中間リンカーに対応する３個のアミノ酸をコードする領域／ＡｒｏＡ遺伝子領域／３′ｎｏｓ”という構造を有する。
【００４８】
上記プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状とし、ベクターｐＲＰＡ−ＢＬ１２７のただ一つのＨｉｎｄＩＩＩ部位に插入した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＬ１２７は、マンノピンシンターゼ遺伝子と（Ｃａｌｇｅｎｅ提供の）Ｔｍ１遺伝子のターミネーターとの制御下にハイグロマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＣＧＮ１１５２をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、かつ該ベクター自身と連結して、クローニング部位となるＨｉｎｄＩＩＩ部位をただ一つとしたものである。
【００４９】
得られるクローンの一つは、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＬ１２７のＴ−ＤＮＡの左側端部から“ヒストンプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジット領域／ＡｒｏＡ／３′ｎｏｓ”の順に融合した転写融合体から成る。このクローンをｐＲＰＡ−ＢＬ２４０と命名した。
【００５０】
Ｃ）  ヒストンプロモーターの重複（＝二重ヒストンプロモーター）
上述のｐＵＣ１９に插入したＨ４ヒストンプロモーターをＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理してからＨｉｎｄＩＩＩで再び切断した。除去したフラグメントに替えて、Ｈ４ヒストンプロモーターを插入したプラスミドを消化することによって精製したＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを導入した。得られるクローンの一つは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＮｄｅＩ部位に達する５３０ｂｐのＨ４プロモーターの５′領域と、直接反復される二つの、ＮｄｅＩ部位からＥｃｏＲＶ部位に達する３３０ｂｐのフラグメントに対応する重複領域と、ＥｃｏＲＶ部位からＥｃｏＲＩ部位に達する１４０ｂｐのＨ４プロモーターの３′領域とから成る構造を有する。
【００５１】
二重ヒストンプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで、ｐＲＰＡ−ＢＬ４１０の二重ＣａＭＶプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを置換した。得られるクローンは“二重ヒストンプロモーター／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／ｎｏｓ”を含み、このクローンをｐＲＰＡ−ＢＬ４８８と命名した。
【００５２】
Ｄ）  ハイブリッド二重ＣａＭＶ／ヒストンプロモーター
先に述べたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩカセット中のＨ４  Ａ７４８ヒストンプロモーター（一重Ｈ４  Ａ７４８ヒストンプロモーター）をＡｃｃＩで切断し、かつＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理してからＥｃｏＲＩで切断する。得られた５８０ｂｐのフラグメントを、ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩで切断した二重ＣａＭＶプロモーターと連結する。この連結によってもたらされる、二重ＣａＭＶプロモーターと上記ヒストンプロモーターの３′部分との融合体を含むクローンをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断して得られるフラグメントで、二重ＣａＭＶプロモーターを含むｐＲＰＡ−ＢＬ４１０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを置換する。得られる構造体は“二重ＣａＭＶプロモーター／ヒストンプロモーターの３′部分／ヒマワリＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵの、アミノ酸２２個から成るＮ末端配列をコードするＤＮＡ配列／トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列／ＡｒｏＡ遺伝子／ｎｏｓ”を含み、この構造体をｐＲＰＡ−ＢＬ５０２と命名した。
【００５３】
実施例２：形質転換植物の耐性
１．形質転換
コスミドｐＴＶＫ２９１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）を持つ非発癌性のアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）にベクターを導入する。形質転換を実現する方法は、Ｈｏｒｓｈ等の操作（１９８５年）に基づく。
【００５４】
２．再生
タバコＰＢＤ６（フランスＳＥＩＴＡから入手）を、３０ｇ／ｌのスクロースと２００μｇ／ｍｌのカナマイシンとを含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩基性培地上で外植葉片から再生させる。温室で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長した植物から外植葉片を採取し、この葉片を円形葉片法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，  Ｖｏｌ．２２７，  ｐｐ．１２２９−１２３１）によって培養し、形質転換を実現する。円形葉片法は連続する３段階から成り、その第１段階は、３０ｇ／ｌのスクロースを添加した、０．０５ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＡＮＡ）と２ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）とを含有するＭＳ培地での１５日間の発芽誘発を含む。第１段階の間に発芽した芽（ｓｈｏｏｔ）を、３０ｇ／ｌのスクロースを添加するが、ホルモンは含有させないＭＳ培地で１０日間培養して発育させる。発育した芽を回収し、２倍に希釈した、即ち塩、ビタミン及び糖の含量を１／２にした、ホルモンを含有させないＭＳ植え付け培地で培養する。約１５日後、深く根付いた芽を土に移植する。対照として、改良しないタバコＰＢＤ６植物を上記と同じ段階まで成長させる。
【００５５】
３．グリフォセート耐性の測定
温室内で、改良タバコの再生によって得られた植物をその５葉段階に、グリフォセートの水性懸濁液を活性物質０．６ｋｇ／ｈａに相当する用量で噴霧することによって処理した後、該植物のうちの最良のものを選択する。選択した植物を自殖させ、得られる種子を、３０ｇ／ｌのスクロースと２００μｇ／ｍｌのカナマイシンとを添加したＭＳ培地上に播く。耐性植物対鋭敏植物の分離比が３：１となった植物から得られた種子を保存した。分子ハイブリダイゼーション解析によって、Ｔ−ＤＮＡのコピーが１個しか組み込まれていない植物を判別できた。このように判別した植物を、交雑育種及び選択によってヘテロ接合またはホモ接合状態とした。これらの植物を野外に自然条件下に播種し、かつその５葉段階にグリフォセートを０．８ｋｇ／ｈａの用量で噴霧した（Ｒｏｕｎｄ  Ｕｐ）。結果は、グリフォセート処理から３０日経過後に測定される植物毒性指数に対応する。このような条件下に、先に述べた構造体で改良した植物が許容可能な耐性を示し（ｐＲＰＡ−ＢＬ２４０及び４１０）、または優れた耐性さえ示す（ｐＲＰＡ−ＢＬ４８８及び５０２）一方で、対照植物は完全に枯死することが観察される。
【００５６】
この結果から、本発明によるキメラ遺伝子をまさにグリフォセート耐性コード遺伝子として用いると有利であることが明らかである。
【００５７】
本発明により形質転換した植物は、グリフォセート耐性の向上した系統及び雑種を創出するための親として用い得る。
【００５８】
実施例３
構造体ｐＲＰＡ−ＢＬ４８８（ｄＨ−Ａｔ−ＰＴＯ−ａｒｏＡ−ｎｏｓ）及びｐＲＰＡ−ＢＬ５０２（ＣａＭＶ／Ｈ−Ａｔ−ＰＴＯ−ａｒｏＡ−ｎｏｓ）を用いるＢＯＵＬＴＥＲ等の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７０，  ｐｐ．９１−９９，  １９９０）を実施することによって、グリフォセートに耐性なＳｐｒｉｎｇ  ｃｏｌｚａｓ，  Ｗｅｓｔａｒ  ｃｕｌｔｉｖａｒが得られた。これらの植物は、遺伝子組み換えを行なっていない植物を枯死させる、グリフォセート４００ｇａ．ｓ／ｈａでの温室内処理に耐性であった。