(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸および一般
0004380796.tif 000004
［式中、ｍは２〜６の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、かつ、ｍは２つのアミン間に含まれる様々な炭素基の間で変化することができ、そして
Ｒは水素原子または一般式
0004380796.tif 000005
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、同一もしくは異なり、それぞれ、飽和ＣpＨ2p+2脂肪族基または不飽和ＣpＨ2pもしくはＣpＨ2p-2脂肪族基を表し、pは１２〜２２の整数であり、そしてＲ′は水素原子、炭素原子１〜４を含有し、場合によって、フェニル基で置換されていてもよいアルキル基を表す）の基または一般式
0004380796.tif 000006
（ここで、Ｘはメチレン基（−ＣＨ2−）またはカルボニル基（−ＣＯ−）を表し、そしてＲ３およびＲ４は、同一もしくは異なり、それぞれ、飽和Ｃp′Ｈ2p′+2脂肪族基または不飽和Ｃp′Ｈ2p′もしくはＣp′Ｈ2p′-2脂肪族基を表し、p′は１１〜２１の整数である）の基を表すが、但し、ｍおよびｎどのような値であっても、Ｒの一つのみが一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の基を表す］
のリポポリアミンを含んでなり、かつ、核酸の負電荷に対するリポポリアミンの正電荷の比が、０．１から１．９の間であることを特徴とするインビボ投与のための医薬組成物。
【請求項２】
リポポリアミンのポリアミン領域が、スペルミンであることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
リポポリアミンが、下式：
0004380796.tif 000007
でそれぞれ表される、ＤＯＧＳおよびＤＰＰＥＳから選択されることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
核酸がリボ核酸であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
核酸が化学的に修飾されていることを特徴とする、請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項７】
核酸がアンチセンスであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
核酸が治療遺伝子を含むことを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
核酸の負電荷に対するリポポリアミンの正電荷の比が０．５から１．５の間であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
核酸の負電荷に対するリポポリアミンの正電荷の比が０．８から１．５の間であることを特徴とする、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
核酸および一般
0004380796.tif 000008
［式中、ｍは２〜６の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、かつ、ｍは２つのアミン間に含まれる様々な炭素基の間で変化することができ、そして
Ｒは水素原子または一般式
0004380796.tif 000009
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、同一もしくは異なり、それぞれ、飽和ＣpＨ2p+2脂肪族基または不飽和ＣpＨ2pもしくはＣpＨ2p-2脂肪族基を表し、pは１２〜２２の整数であり、そしてＲ′は水素原子、炭素原子１〜４を含有し、場合によって、フェニル基で置換されていてもよいアルキル基を表す）の基または一般式
0004380796.tif 000010
（ここで、Ｘはメチレン基（−ＣＨ2−）またはカルボニル基（−ＣＯ−）を表し、そしてＲ３およびＲ４は、同一もしくは異なり、それぞれ、飽和Ｃp′Ｈ2p′+2脂肪族基または不飽和Ｃp′Ｈ2p′もしくはＣp′Ｈ2p′-2脂肪族基を表し、p′は１１〜２１の整数である）の基を表すが、但し、ｍおよびｎどのような値であっても、Ｒの一つのみが一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の基を表す］
のリポポリアミン、さらに中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含んでなり、かつ、核酸の負電荷に対するリポポリアミンの正電荷の比が、０．１から１．９の間であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
リポポリアミンが請求項２または３に規定されるものであることを特徴とする、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
リポポリアミンの１当量に対して中性脂質が０．１〜２０当量含まれることを特徴とする、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
リポポリアミンの１当量に対して中性脂質が１〜５当量含まれることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
注入可能な配合物について医薬的に許容され得る賦形剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
皮膚および／または粘膜に投与するために医薬的に許容され得る賦形剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、核酸に基づく組成物、その調製および使用に関する。より詳細には、本発明は少なくとも１つの核酸および１つのリポポリアミンを含んでなる組成物、およびその遺伝子治療における、特に核酸転移のための使用に関する。
遺伝子治療は、不全症または異常性（突然変異、異常型発現等）を矯正すること、あるいは悪化している細胞または器官に遺伝的情報を導入することにより、治療目的のタンパク質の発現を提供することにある。この遺伝情報は、器官から抽出された細胞中にインビトロで導入し、次にモディファイした細胞を器官に再導入するか、あるいは適切な組織に直接インビボ導入するかのいずれかである。様々な技法がこの遺伝情報を運ぶために記載され、それらにはＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストラン複合体（Paganoら、J.Virol.,1（1967）,891）、ＤＮＡおよび核タンパク質複合体（Kanedaら、Science,243（1989）,375）、ＤＮＡおよび脂質複合体（Felgnerら、PNAS,84（1987）ならびにＤＮＡおよびポリリシン複合体、リポソームの使用（Fraleyら、J.Biol.Chem.,255（1980）,10431）等を必要とする様々なトランスフェクション法を含む。さらに最近では、これらの物理化学的トランスフェクション法に代わる有望な方法として、遺伝子転移の媒介物としてウイルスが使用されるようになってきた。この点で、様々なウイルスが特定の細胞群を感染できる能力について試験された。特にレトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ−伴生ウイルスおよびアデノウイルスである。
しかし、これまでに開発された技法は、遺伝子を細胞および／または生物に転移することに関連する難しさを十分に解決できていない。特に核酸の細胞中への浸入に関しては、完全に解決されていない。事実、核酸のポリアニオン的性質は、核酸が細胞膜を通過することを妨げる。裸の核酸が特定の型の細胞の形質膜をインビボで通過できるということが示されたが（特に、国際公開第90/11092号明細書を参照にされたい）、トランスフェクション効率はかなり低いままである。さらに裸の核酸は酵素によるその分解により、および尿路によるそれらの除去から、血漿半減期が短い。さらに、組換えウイルスが核酸の転移効率を向上させることができても、その使用は病原性、トランスミッション、複製、組換え、形質転換、免疫原性等の一定の危険性がある。
本発明は、これらの様々な問題に対して有利な解決法を提案する。出願人は、実際、核酸およびリポポリアミンを含んで成るある種の組成物が、該核酸を細胞および／または器官に高効率で、かつ毒性無くインビボ転移できることを可能にすることを示した。本発明のこの組成物により、ウイルスベクターの使用に関する不利益（潜在的な危険性、転移する遺伝子の大きさの限界、高いコスト等）を回避することも可能となる。
細胞培養物のインビトロトランスフェクションのための一定のリポポリアミンの使用は、従来技術にすでに記載された。すなわち欧州特許出願公開第394,111号明細書は、複数の細胞株のインビトロトランスフェクションのためにある種のポリリポアミンの使用を記載している。Demeneixら（Int.J.Dev.Biol.,35（1991）,481）による文献は、同様にリポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＯＧＳ）を、核酸のオボトランスフェクッション（ovo transfection）に使用することを記載している。これらの文献によれば、リポポリアミンはリポポリアミンの正電荷／核酸の負電荷の比が、２から５の間、好ましくは３または４に等しくなるような条件下で使用されなければならない。しかし驚くべきことには、本出願の実施例８および９に示すように、これらの文献のいずれにも記載されていない条件で、核酸のインビボトランスフェクションが可能となる。陰イオン性の高分子または組織の細胞外マトリックスとの相互作用により、これらの条件下で形成した粒子は実際、投与部位から拡散できず、したがっていかなる核酸もインビボに転移させることができない。さらにこれらの文献に記載された調製条件は、有意な核酸量を含む医薬組成物を形成することに応用できない。出願人は今回、一定の条件下でリポポリアミンを核酸のインビボトランスフェクションに使用することができることを示した。より詳細には、出願人は核酸およびリポポリアミンを含んで成る組成物が、リポポリアミンの正電荷／核酸の負電荷の比が２以下のような条件下で、驚くべきことに、該核酸を高効率でインビボトランスフェクションすることを可能にすることを見いだした。さらに出願人は、有意な量の核酸を包含するこれらの医薬組成物の調製を可能にする一定の条件を開発した。したがって本発明の医薬組成物は、核酸をインビボで投与および転移するための特に有利な道具を構成する。
したがって本発明の第一の主題は、少なくとも１つの核酸および１つのリポポリアミンを含んで成る組成物であり、この中のＲ＝リポポリアミンの正電荷／核酸の負電荷の比は２以下である。
本発明の意味の範囲内で、用語リポポリアミンは少なくとも１つの親水性ポリアミン領域および１つの親油性領域を含んで成る任意の両親媒性分子を示す。リポポリアミンのカチオンに荷電したポリアミン領域は、負に荷電した核酸と可逆的に結合することができる。この相互作用は、核酸を強く圧縮する。親油性領域は、脂質層と形成された核酸脂質粒子を被覆することにより、このイオン的相互作用を外部媒質に対して非感受性にする。
有利には、本発明に関して使用するリポポリアミンのポリアミン領域は、一般式
Ｈ2Ｎ-（-（ＣＨ）m-ＮＨ-）n-Ｈ
に対応し、式中、ｍは２以上の整数であり、そしてｎは１以上の整数であり、ｍについては２つのアミン間に含まれる様々な炭素基の間で変化できる。好ましくは、ｍは２から６の間を含み、そしてｎは１から５の間を含む。さらに一層好ましくは、ポリアミン領域はスペルミンまたはＤＮＡへの結合特性を保持するスペルミン類似体による代表される。
親油性領域は、ラメラまたはヘキサゴナル相を形成できる飽和または不飽和炭化水素鎖、コレステロール、天然脂質または合成脂質であることができる。
本発明に関し、リポポリアミンの使用は有利には欧州特許出願公開第394,111号明細書に定義されているようになされる。本出願はこれらリポポリアミンを調製するために使用できる方法も記載する。
本発明に関し、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPES）の5-カルボキシスペルミルアミドの使用が特に有利に行われる。
本発明の組成物の最適効果を得るために、ポリアミンおよび核酸の各々の比率は、好ましくはリポポリアミンの正電荷／核酸の負電荷の比Ｒが0.1から1.9の間、そしてより好ましくは0.5から1.5の間になるように定められる。
本発明の組成物では、核酸はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方であることができる。天然および合成起源の配列、そして特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列、あるいは合成または半−合成配列であることができる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌またはウイルス起源等でよい。それらを当業者に周知な任意の方法により得ることができ、そして特にバンクをスクリーニングすることにより、化学合成により、あるいはバンクをスクリーニングすることにより得た配列の化学的または酵素的修飾を含む混合方法により得ることができる。さらにそれらを、プラスミドベクターのようなベクター中に組み入れることができる。
よリ詳細には、デオキシリボ核酸は一本鎖または二本鎖であることができる。これらのデオキシリボ核酸は治療用遺伝子、転写または複製を調節する配列、アンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域等を担持することができる。
本発明の意味の範囲内で、治療用遺伝子は特に治療効果を有するタンパク質性生成物をコードする任意の遺伝子を意味すると理解される。このようにコードされるタンパク質性生成物は、タンパク質、ペプチド等であることができる。タンパク質性生成物は、標的細胞に関してホモロガス（すなわち、標的細胞がいかなる病気もあらわさない時、該細胞中で通常発現される生成物）であることができる。この場合、タンパク質の発現は例えば、細胞中の不十分な発現、あるいは修飾により不活性または活性が弱いタンパク質の発現、あるいは該タンパク質の過剰発現を克服することを可能にする。治療用遺伝子は、増大した安定性、モディファイされた活性等を有する細胞タンパク質の突然変異体をコードすることもできる。このタンパク質性の生成物は、標的細胞に対してヘテロロガスでもよい。この場合、発現したタンパク質は例えば、細胞中で欠失している活性を補充するか、またはそれに貢献し、病気を制御するか、または免疫反応の刺激を可能にする。
本発明の意味の範囲内の治療用生成物の中で、特に挙げることができるのは酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（仏国特許出願公開9,203,120号明細書）、成長因子、神経伝達物質またはその前駆体あるいは合成のための酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プリオトロフィン（pleiotrophin）等、アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡIV、ＡｐｏＥ等（仏国特許出願公開93 05125号明細書）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（仏国特許出願公開91 11947号明細書）、膵線維症に関連するタンパク質ＣＦＴＲ、腫瘍−抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等（仏国特許出願公開93 04745号明細書）、凝固に関与する因子をコードする遺伝子：第VII、VIIIまたはIX因子、ＤＮＡの修復に参加する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）等である。
治療用遺伝子は、標的細胞中の発現が細胞ｍＲＮＡ転写または遺伝子発現を制御することを可能にする、アンチセンス配列または遺伝子であることができる。そのような配列は例えば、欧州特許出願公開第140 308号明細書に記載の技術に従い、細胞ｍＲＮＡの相補鎖ＲＮＡとして標的細胞中で転写され、従ってそれらがタンパク質に翻訳されるのを遮断できる。アンチセンス配列は、リボザイム（これは標的ＲＮＡを選択的に破壊できる）をコードする配列も含んで成る（欧州特許出願公開第321,201号明細書）。
上述のように、この核酸はヒトまたは動物に免疫反応を生じることができる免疫原性ペプチドをコードする１つ、または複数の遺伝子を含んで成ることもできる。特別な態様では、本発明は特に微生物、ウイルスまたは癌に対して、ヒトまたは動物に投与されるワクチンまたは免疫療法物質のいずれかの生産を可能にする。これはまたエプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、（欧州特許出願公開第185,573号明細書）または仮性狂犬病ウイルス（欧州特許出願公開第259,212号明細書）に特異的な、あるいは腫瘍に特異的な抗原性ペプチドにも関する。
核酸は好ましくは、所望の細胞または器官中で治療用遺伝子および／または抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列も含んで成る。これらは、これらの配列が感染細胞中で操作できると考えられる時、遺伝子発現の自然な原因である配列であることができる。これらの配列は様々な起源の配列であることができる（他のタンパク質の発現の原因、または合成タンパク質でも）。これらの配列は特に、真核またはウイルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えば、それらの配列は感染させようとする細胞のゲノムから得たプロモーター配列であることができる。同様に、それらの配列はウイルスのゲノムから得たプロモーター配列であることができる。これに関連して、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶまたはＲＳＶ遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。これらの発現配列を、さらに活性化配列、調節配列等を付加することによりモディファイすることができる。
さらにまた核酸は、合成された治療用生成物を標的細胞中の分泌経路に向けるシグナル配列を、特に治療用遺伝子の上流に含んで成ることができる。このシグナル配列は、治療用生成物の天然のシグナル配列であってもよいが、他の機能的なシグナル配列または合成シグナル配列であってもよい。
別の態様では、本発明は核酸、リポポリアミンおよびリポポリアミン／核酸複合体を結合することができ、そしてトランスフェクション能力を向上させることができる補助剤を含んで成る組成物に関する。出願人は実際、リポポリアミンのトランスフェクション能力が、リポポリアミン／核酸複合体を結合できる一定の補助剤（例えば脂質またはタンパク質）の存在で、予期せず増大することを示した。本発明の実施例４−７に示すように、この向上はインビトロおよびインビボの両方で現れる。
さらに好ましくは、本発明の組成物は補助剤として、１つまたは複数の中性脂質を含んで成る。特にそのような組成物は、比率Ｒが低い時に特に有利である。出願人は実際、中性脂質の添加により核脂質（nucleolipid）粒子の形成を向上させ、そして驚くべきことには粒子の細胞中への浸入が細胞膜を不安定化させることにより向上することを示した。
さらに好ましくは、本発明に関して使用する中性脂質は２脂肪鎖を含む脂質である。
特に有利な方法では、生理的条件下で両イオン性またはイオン電荷が無い天然または合成脂質が使用される。さらに具体的には、これはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（POPE）、ジステアロイル−、−パルミトイル−または−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、およびそれらが１から３回N-メチル化された誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシドのような）、スフィンゴリピッド（特にスフィンゴミエリンのような）、あるいはアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１およびアシアロＧＭ２のような）から選択できる。
これらの様々な脂質は、合成により、あるいは当業者に周知の従来技術により、器官（例えば：脳）または卵からから抽出することにより得ることができる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒により行うことができる（レーニンジャーの生化学も参照にされたい）。
本発明の組成物は、好ましくはリポポリアミン１当量あたり0.1から20、より好ましくは１から５当量の補助剤を含んで成る。
本発明の組成物は、局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻内、静脈、筋肉内、皮下、眼内および経皮投与等を目的として配合できる。本発明の医薬組成物は、特に好ましくは所望の器官に直接注入するための輸液用組成物に、あるいは局所的投与（皮膚および／または粘膜上に）に許容できる医薬賦形剤を含む。これらは特に等張の滅菌溶液または乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり、これは状況に応じて滅菌水または生理的血清を添加することにより、輸液を調製することができる。注入に使用する核酸の投与量、ならびに投与回数は様々なパラメーターに従い、そして特に使用する投与法、考慮すべき病気、発現すべき遺伝子あるいは望ましい治療期間の関数として変化しうる。
このように本発明は疾患を治療するための特に有利な方法を提供し、この方法は上記のような条件下で、該疾患を矯正できる核酸をリポポリアミンと組み合わせてインビボ投与することを含んで成る。さらに具体的には、本方法はタンパク質性または核酸生成物の不全から生じる疾患に適用でき、そして投与された核酸は該タンパク質性生成物をコードするか、あるいは該核酸生成物を含む。
本発明を、説明であって制限するものではないと考える以下の実施例を使用して、さらに詳細に記載する。
実施例１−インビボ遺伝子転移に使用するプラスミド
３種類の構築物を、本発明の組成物の活性を実証するために使用した：ルシフェラーゼ（Luc）をコードする遺伝子を含むプラスミド、β-ガラクトシダーゼ（LacZ遺伝子）をコードする遺伝子を含むプラスミド、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードする遺伝子を含むプラスミド。
１．１．Luc遺伝子を含むプラスミド
pCMV-lucプラスミドは、ベクターpcDNA3（インビトロゲン：Invitrogen）から、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に位置する制限酵素M1uＩおよびHindIIIで切断することにより抽出し、ベクターpGL基本ベクター（プロメガ：Promega）のMluＩおよびHindIII部位に挿入したサイトメガロウイルス（CMV）のプロモーターを含む。
１．２．LacZ遺伝子を含むプラスミド
pCMV-βGalプラスミド（クローンテック：Clontech）は、大腸菌のβ-ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子の上流に位置するCMVプロモーターを含む。このpSV-nls LacZ（pAOnlsLacZ）ベクターは、同じプロモーターおよびフェイズ内かつLacZ遺伝子上流に位置する核局在化配列（SV40ウイルスから得た）を含む。この構築物により、nls-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を細胞の核内に発現させることが可能となる（De Luzeら、PNAS,90（1993）,7322に注意されたい）。
１．３．CAT遺伝子を含むプラスミド
レポーター遺伝子としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードする遺伝子を、RSV（pRSV-CAT）およびSV40（pSV40-CAT）プロモーターの制御下に有するプラスミドが公開された（Boutillerら、Prog.NeuroPhychoPharmacol.and Biol.Psychiat.,16（192）,959;de Luzeら、PNAS,90（1993）,7322）。
実施例２−比Ｒ＝0.8のリポポリアミンを使用する、新生児マウス脳への核酸のインビボ転移
この実施例は、pCMV-lucプラスミドの新生児マウス脳へのインビボ転移を記載する。
30μgのpCMV-lucプラスミド（実施例１．１．）を、30μlの150mMの滅菌NaCl（濃度1μg/μl）中に希釈した。100％エタノール中に調製した0.6μlの40mMジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）を次に加えた。
混合物を素早くボルテックス処理し、そして新生児マウスの脳内注射に使用した。これを行うために、マウスを冷やすことにより麻酔をかけ（氷に接触したアルミニウムシート上に置いた）、そしてマウスあたり２μlの混合物（２μgの核酸）を注射した。注射は、微小電極に連結したマイクロマニュピレーターおよびマイクロシリンジを使用して皮質中に行った。
脳を48時間後に摘出し、均質化および遠心し、そして上清をルシフェラーゼを定量的に測定するために使用した。これを行うために、上清をルシフェリン、コエンザイムＡおよびＡＴＰを含んでなる緩衝液中でインキューベーションし、そしてルミノメーターで発光を測定（一般的に10秒間）した（Wood K.（1990）プロメガノート（Promega Note））。
得られた結果は標準化した相対的光学単位として、プラスミド単独で行った転移のときの100RLU／脳（RLU＝相対的光学単位）の標準化活性（10の動物平均）に対して、Ｒ＝0.8の本発明の組成物により行った転移のときは、425RLU／脳の標準化活性（10の動物平均）を示す。
実施例３−比Ｒ＝1.5および0.8のリポポリアミンを使用する、新生児マウス脳への核酸のインビボ転移の比較
３．１．pCMV-lucプラスミドの転移
Ｒ＝0.8については、条件は実施例２に記載したものである。Ｒ＝1.5については、30μgのpCMV-lucプラスミド（実施例１．１．）を30μlの150mMの滅菌NaCl（濃度1μg/μl）中に希釈した。100％エタノール中に調製した1.13μlの40mMジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）を次に加えた。
混合物を素早くボルテックス処理し、そして新生児マウスの脳内注射に使用した。これを行うために、マウスを冷やすことにより麻酔をかけ（氷に接触したアルミニウムシート上に置いた）、そしてマウスあたり２μlの混合物（２μgの核酸）を注射した。注射は、微小電極に連結したマイクロマニュピレーターおよびマイクロシリンジを使用して皮質中に行った。
脳を48時間後に摘出し、均質化および遠心し、そして実施例２に記載した方法に従い、上清をルシフェラーゼを定量的に測定するために使用した。得られた結果は、Ｒ＝0.8の本発明の組成物により行った転移のときの100RLU／脳の標準化活性（11の動物平均）に対して、Ｒ＝1.5の本発明の組成物により行った転移のときは、89RLU／脳の標準化活性（12の動物平均）を示す。
３．２．PSV-nls LacZプラスミドの転移
上記実施例３．１．と同じ手順を、SV40（シミアンウイルス40）プロモーターの制御下にβ-ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子を含有するPSV-nls LacZプラスミドの転移に使用した。この構築物（実施例１．２．）は核局在化を発信するペプチドもコードし、したがって酵素β-ガラクトシダーゼは核に向かって輸送され、そしてこの核酸により生成する酵素的反応は、この非細胞の領域に限定される。注射はpCMV-lucプラスミドと同様に行い、そして脳をトランスフェクション後48時間に摘出し、パラホルムアルデヒド（２％）で24時間固定し、そして次にβ-ガラクトシダーゼ反応のために処理した。次に脳の発現部位を調べ、陽性領域をクリオスタットに切断し（15μm）、スライドに載せ、そして写真を取った。２連の独立した実験で、10匹のうちの３匹の動物は注射ゾーンの周りに、中の核が顕著な青色発色（β-ガラクトシダーゼ活性の特徴）を有する細胞群を示す。
実施例４−核酸のインビトロ転移：リポポリアミン／補助剤比の至適化
この実施例では、様々な条件下で核酸、リポポリアミンおよび補助剤（中性脂質）を含んで成る本発明の組成物による、核酸のインビトロ転移（細胞培養物について）を記載する。
105個の3T3繊維芽細胞およびHepG2ヒト肝細胞株を、それぞれ１および２μgのpCMV-βGalまたはpCMV-Lucプラスミドの存在下で様々な条件下でインキューベーションした：
−付加比Ｒ＝1および1.5のDOGS存在下
−１、２、５または１０当量の補助剤（DOPE）の存在または不在下
ルシフェラーゼに関するトランスフェクション能力を、実施例２に記載した条件下で決定するか、あるいはLacZ活性に関する顕著な青色発色を有する細胞を割合を測定することにより決定した。得られた結果を以下の表に示す。
0004380796.tif 000002
0004380796.tif 000003
実施例５−比Ｒ＝1のリポポリアミンおよび中性脂質を使用することによる、新生児マウス脳への核酸のインビボ転移
この実施例では、DOGSの40mMのエタノール性溶液を、等容量の80mMジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）溶液（クロロホルム/エタノール（1/5）混合物中に調製した）と混合した。すなわち１当量のDOGSについて、組成物は２当量のDOPEを含む。
30μgのpCMV-lucプラスミド（実施例１．１．）を、30μlの150mMの滅菌NaCl（濃度1μg/μl）中に希釈した。次に上記のように調製した1.5μlのDOGS/DOPE混合物を加えた。
残りの手順（注射、摘出、定量的測定）は、実施例３．１．に記載したものと同一である。得られた結果は、同じ付加比Ｒ＝１において、DOGS単独の存在下で行った転移のときの100RLU／脳の標準化活性（13匹の動物平均）に対して、補助剤（中性脂質）の存在下で行った転移のときは、241RLU／脳の標準化活性（13の動物平均）を示す。
実施例６−比Ｒ＝1.25のリポポリアミンおよび中性脂質を使用することによる、新生児マウス脳への核酸のインビボ転移
この実施例では、40mMのエタノール性DOGS溶液を、等容量の80mMジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）溶液（クロロホルム/エタノール（1/5）混合物中に調製した）と混合した。すなわち１当量のDOGSについて、組成物は２当量のDOPEを含む。
30μgのpCMV-lucプラスミド（実施例１．１．）を、30μlの150mMの滅菌NaCl（濃度1μg/μl）中に希釈した。次に上記のように調製した1.87μlのDOGS/DOPE混合物を加えた。
残りの手順（注射、摘出、定量的測定）は、実施例３．１．に記載したものと同一である。得られた結果は、同じ付加比Ｒ＝1.25において、DOGS単独の存在下で行った転移のときの100RLU／脳の標準化活性（８匹の動物平均）に対して、補助剤の存在下で行った転移のときは、405RLU／脳の標準化活性（８の動物平均）を示す。
実施例７−比Ｒ＝1.5のリポポリアミンおよび中性脂質を使用することによる、新生児マウス脳への核酸のインビボ転移
この実施例では、40mMのエタノール性DOGS溶液を、等容量の80mMジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）溶液（クロロホルム/エタノール（1/5）混合物中に調製した）と混合した。すなわち１当量のDOGSについて、組成物は２当量のDOPEを含む。
30μgのpCMV-lucプラスミド（実施例１．１．）を、30μlの150mMの滅菌NaCl（濃度1μg/μl）中に希釈した。次に上記のように調製した2.26μlのDOGS/DOPE混合物を加えた。
残りの手順（注射、摘出、定量的測定）は、実施例４．１．に記載したものと同一である。得られた結果は、同じ付加比（Ｒ＝1.5）において、DOGS単独の存在下で行った転移のときの100RLU／脳の標準化活性（11匹の動物平均）に対して、補助剤（中性脂質）を含む本発明の組成物で行った転移のときは、165RLU／脳の標準化活性（10の動物平均）を示す。
実施例８−比Ｒ＝３のリポポリアミンを使用することによる、マウスへの核酸のインビボ転移
この実施例は、pCMV-lucプラスミドの成長マウスへのインビボ転移を記載する。実験はペントバルビタールで麻酔をかけた成長マウスに対して行った。
８．１．静脈経路による転移
各マウス用に、100μgのpCMV-lucプラスミドを100μlの150mM NaClに希釈した。次に7.5μlの40mM DOGSを溶液に加えた。マウスの頸静脈を切開により露出し、そして上記溶液を心臓に向かって頸静脈中に注入した。次に皮膚を再度クリップで閉じた。注入の48時間後、マウスを頸部転位により屠殺し、そして肝臓、肺、脾臓、脳、腎臓および骨格筋試料を摘出した。均質化および遠心後、上清をルシフェラーゼの定量測定のために使用した。この実験は４兎のマウスについて行った。試験した様々な組織中にルシフェラーゼ発現は示されなかった。
８．２．筋肉内経路による転移
60μgのpCMV-lucプラスミドを300μlの150mM NaCl中に希釈した。次に4.5μlの40mM DOGSをこの溶液に加えた。上記のように調製した50μlの混合物（10μgのDNA）を、各マウスに皮膚を介して前方脛骨筋肉中に注射した。注射48時間後、マウスを頸部転位により屠殺し、そして注射した筋肉を取り出した。均質化および遠心後、上清をルシフェラーゼの定量測定のために使用した。この実験は６兎のマウスについて行った。ルシフェラーゼ発現は検出されなかった。
実施例９−比Ｒ＝４のリポポリアミンを使用することによる、マウスへの核酸のインビボ転移
この実施例は、pCMV-lucプラスミドの成長マウスへのインビボ転移を記載する。実験はペントバルビタールで麻酔をかけた成長マウスに対して行った。
９．１．静脈経路による転移
各マウス用に、100μgのpCMV-lucプラスミドを100μlの150mM NaClに希釈した。次に10μlの40mM DOGSをこの溶液加えた。マウスの頸静脈を切開により露出し、そして上記溶液を心臓に向かって頸静脈中に注入した。次に皮膚を再度クリップで閉じた。注入の48時間後、マウスを頸部転位により屠殺し、そして肝臓、肺、脾臓、脳、腎臓および骨格筋試料を摘出した。均質化および遠心後、上清をルシフェラーゼの定量測定のために使用した。この実験は４兎のマウスについて行った。試験した様々な組織中にルシフェラーゼ発現は示されなかった。
９．２．筋肉内経路による転移
60μgのpCMV-lucプラスミドを300μlの150mM NaCl中に希釈した。次に６μlの40mM DOGSをこの溶液に加えた。上記のように調製した50μlの混合物（10μgのDNA）を、各マウスに皮膚を介して前方脛骨筋肉中に注射した。注射48時間後、マウスを頸部転位により屠殺し、そして注射した筋肉を取り出した。均質化および遠心後、上清をルシフェラーゼの定量測定のために使用した。この実験は６兎のマウスについて行った。ルシフェラーゼ発現は検出されなかった。