(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
−Ｆ−Ａｓm−Ｒn−Ｙ−
（式中、
ＦはヒルジンをコードするＤＮＡ配列であり、
Ａｓは化学結合（ｍ＝０）または遺伝子コードによってコード可能なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、
ｍは０〜１０の整数であり、
Ｒは化学結合（ｎ＝０）またはアルギニンコドンであり、
ｎは０または１であり、
ＹはプロインスリンをコードするＤＮＡ配列である）
で表される融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
発現カセットは、式
Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ａｓm−Ｒn−Ｙ−Ｔ
（式中、
ＰはプロモーターＤＮＡ配列であり、
Ｓはシグナル配列をコードするＤＮＡ配列であり、
ＴはターミネーターＤＮＡ配列である）
で表される請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
Ｆはレピルジン、Ser−ヒルジンまたはAla−ヒルジンをコードするＤＮＡ配列である、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡによってコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項５に記載のプラスミドを有する宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを有する宿主細胞。
【請求項８】
細胞がE. coli、B. subtilisおよびStreptomycesからなる群より選択され、請求項５に記載のプラスミドおよび請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡが宿主細胞のゲノムに場合により挿入される請求項６または７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞内で発現させ、そして（ｂ）発現した融合タンパク質を単離する、融合タンパク質の培養による製造方法。
【請求項１０】
上清を宿主細胞から分離し、そして発現したタンパク質を上清から単離する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
沈殿後上清中の発現タンパク質を濃縮する工程は、精密ろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
発現したタンパク質の単離には、培養培地または上清の成分を沈殿させ、一方発現したタンパク質は溶液中に残留させる工程を包含する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
培養後、メルカプタンまたはシステイン塩酸塩をpH６〜９で培養上清に添加し、遊離ＳＨ基濃度を０.０５〜２.５mMとする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞から培養上清を分離したのち、宿主細胞を新鮮な培地中で反復培養し、放出された融合タンパク質を培養時に得られた各上清から単離する請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
pH６〜９の細胞培養上清にメルカプタンまたはシステイン塩酸塩を、遊離ＳＨ基の濃度が０.０５〜２.５mMに達するように添加する請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法で得られる発現タンパク質から、
（ｂ）インスリンまたはインスリン誘導体を酵素的または化学的切断によって放出させ、
（ｃ）それを単離する、
インスリンまたはインスリン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は融合部分と興味あるタンパク質からなる融合タンパク質に関し、この２つのタンパク質の組み合わせによって、細菌宿主の上清への融合タンパク質の分泌を招来し、興味あるタンパク質はその正しい三次元構造で存在する。融合タンパク質についての遺伝子配列は、細菌宿主内における発現を可能にする発現カセットの一部分である。本発明は、この発現カセットを用いる、このような融合タンパク質の培養、発現および後処理方法、その発現カセットを含有するプラスミド、染色体に結合された発現カセットおよび／またはレプリコンたとえばプラスミドとして発現カセットを含有する細菌宿主細胞、融合部分としてヒルジンまたはその誘導体を有する上記融合タンパク質、ならびにヒルジンまたはその誘導体から融合タンパク質を調製およびインスリンを製造するための方法におけるその発現カセットの使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
組換えタンパク質に基づいて医薬を製造する至適方法の開発は２つの観点から可能な限り正当に評価されなければならない課題である。すなわち第一に、方法はできるだけ費用効果のあるものでなければならず、第二に生成物は最高の純度のものでなければならない。
【０００３】
この関連では発現システムの選択が特定の製造方法のコースを決定し、タンパク質化学における新技術の開発、広範囲の生物化学的可能性および既知の技術の新しい組み合わせが常に、現存の方法の改良を可能にすることは熟練者には自明である。
【０００４】
所望のタンパク質の性質は、その合成のために使用される宿主細胞系の選択を決定的な形で決定する。細菌たとえばE. coliはその助力により、安価な培地中、数グラムの粗収量で、迅速にタンパク質を産生することが可能な細胞系を提供する。この系は、修飾する必要のないタンパク質およびインビトロにおいてそれらの生物学的に活性な型に再生できるタンパク質にとくに有用である。たとえばインスリンのように高品質を要求されるタンパク質では、封入体の形態でタンパク質の細胞内蓄積を導く発現率が目標である。細胞の溶解後、タンパク質が溶解され、さらに工程段階を経由してフォールディングされる。しかしながら、フォールディングのプロセスは定量的ではない。この理由は、細胞溶解時の損傷およびフォールディング時の誤りに対応する封入体形成時の不可逆的な損傷である。「悪い」フォールディングまたは修飾を受けた分子は、更なる分離工程において除去されなければならない。これは、製造コストに悪影響を与える。さらにまた、上記分子の痕跡が、最終製品に再出現することがある。医薬は高い純度基準を条件とすることから、適当に注意深い、経費集約的な精製が必要である。好ましい経費／粗収率比のために、正しくフォールディングされた型での興味あるタンパク質のE. coliによる培養培地中への輸送が可能になるプロセスが望ましい。しかしながら、これは今日まで例外的な場合にしか成功していない。
【０００５】
国際特許出願PCT/EP00/08537にはこのような例外が記述されている。レピルジン、医薬Refludan（登録商標）の活性成分の合成および輸送は、輸送のために特定のシグナル配列を用いた場合に、グラム量でのE. coliにより成功した。ドイツ特許出願100 33 195.2（未公開）には、ヒルジンおよびヒルジン誘導体とマダニからのファクターXaインヒビターおよびその誘導体から構成される二官能性タンパク質について記述されている。上記タンパク質は同様に、E. coliによる高収率で合成および輸送が可能である。この発見に加えてついで驚くべきことに、ヒルジンは、TAPとの融合タンパク質としてのみでなく、プロインスリン誘導体のようなポリペプチドとの融合タンパク質の一部分としても高収率に輸送され、それは生物学的に活性であり、しかも融合パートナー、たとえばプロインスリンは、驚くべきことに、正しい三次元構造として存在することが見出されたのである。この予期しなかった結果は、無視できない収率の損失を伴う細胞内における発現後のインビトロ再フォールディング工程を省略でき、より単純なタンパク質精製過程を生じることから、たとえばインスリンの細菌／ベクターシステムによる、さらに経費効率的な産生の可能性を導くものである。他の利点はE. coliにおける従来のインスリンの製造方法において、融合タンパク質を溶解するために添加されるカオトロピックな補助を必要としないことである。生態学的に、これは相当する廃液を回避することによって環境汚染の低下を招来する。
【０００６】
チスイビルの１種であるヒルからは、たとえばトロンビン阻害ヒルジンの様々なアイソフォームが開発されてきた。ヒルジンはその分子の人工的な改変、たとえばＮ−末端アミノ酸の置換により、医薬的要求のために至適化されている（たとえば、EP-A 0 324 712）。
【０００７】
本発明は、融合タンパク質たとえばシミアンプロインスリンまたはその誘導体の形成のためのヒルジンおよびヒルジン変異体の使用を包含する。本発明の特定の実施態様では天然のヒルジンアイソフォームの一つが使用される（天然のアイソフォームは、ともに「ヒルジン」と呼ばれる）。天然のアイソフォームは、たとえばVal−Val−ヒルジンまたはIle−Thr−ヒルジンである。本発明の他の実施態様では、天然ヒルジンのアイソフォームの改変体が使用される。変異体は天然のヒルジンアイソフォームから誘導されるが、たとえば天然のアイソフォームと比較してアミノ酸の付加および／またはアミノ酸の欠失および／またはアミノ酸の置換が含まれる。ヒルジン変異体には天然のヒルジンアイソフォームとは別のペプチドセグメントおよび新たなアミノ酸を含有していてもよい。ヒルジン変異体は既知であり、たとえばDE 3 430 566に記載されている。ヒルジン変異体はタンパク質の形で市販されている（Calbiochem （登録商標）Biochemicals, カタログ番号377-853, -950-960）。
【０００８】
インスリンは５１個のアミノ酸のポリペプチドであり、それらは２つのアミノ酸鎖：２１アミノ酸のＡ鎖および３０アミノ酸のＢ鎖の間に分配されている。この鎖は互いに２つのジスルフィド橋で連結されている。インスリンの組成物は何年も前から糖尿病の治療に使用されてきた。これには、天然に存在するインスリンのみでなく、インスリン誘導体および類縁体の使用も包含される。
【０００９】
インスリン誘導体は、天然に存在するインスリン、すなわち、ヒトインスリンまたは動物インスリンの誘導体である。これらは他の点では天然に存在するインスリンと同じであるが、天然に存在する少なくとも１個のアミノ酸残基の置換および／または少なくとも１個のアミノ酸残基および／または有機残基の付加により対応するインスリンと異なる。
【００１０】
一般に、インスリン誘導体はヒトインスリンに比べてわずかに修飾された作用を有する。
【００１１】
作用の開始が加速されたインスリンは、EP 0 214 826, EP 035 437およびEP 0 678 522に記載されている。EP 0124 826はとくにＢ27およびＢ28の置換に関する。EP 0 678 522は位置Ｂ29に様々なアミノ酸、好ましくはプロリン（ただしグルタミン酸ではない）を有するインスリン誘導体が記載されている。EP 0 375 437にはＢ28にリジンまたはアルギニンを有し、さらにＢ３および／またはＡ21において適宜修飾されたインスリン誘導体が包含される。
【００１２】
EP 0 419 504には、Ｂ３におけるアスパラギンおよび位置Ａ５、Ａ15、Ａ18またはＡ21における少なくとも１個の他のアミノ酸修飾により、化学的修飾に対して保護されているインスリン誘導体が開示されている。
【００１３】
WO 92/00321には、位置Ｂ１〜Ｂ６の少なくとも１個のアミノ酸がリジンまたはアルギニンによって置換されたインスリン誘導体が開示されている。この種のインスリンはWO 92/00321によれば長期に持続する作用を示すという。
【００１４】
遺伝子工学によってインスリンおよびインスリン誘導体を製造する場合はしばしば、インスリンの前駆体、Ｂ、ＣおよびＡ鎖からなる「プロインスリン」が発現する。上記プロインスリンは、適当な正しいフォールディングおよびジスルフィド橋の形成後に、Ｃ鎖の酵素的または化学的除去によってインスリンまたはインスリン誘導体に変換することができる。プロインスリンは多くの場合、融合タンパク質の形態で発現される。「望ましくない」融合パートナーも、同様に化学的または酵素的に除去する必要がある。
【００１５】
組換え宿主／ベクター系の選択が、組換え細胞の培養、増殖および培養方法を決定することは当業者には自明の通りである。これは同様に本発明の主題である。
【００１６】
融合タンパク質は酸性培地に驚くべき良好な溶解性を示し、これはタンパク質の化学的な処理に関してきわめて有利である。第一に、上清の望ましくない成分の多くは上述の条件下に沈殿し、第二にペプチダーゼまたはプロテアーゼは不活性である。したがって、操作の最後に培養培養液を酸性にすると、融合タンパク質から望ましくない上清タンパク質を宿主細胞とともに直接分離し、更なる工程で上記融合タンパク質を濃縮することができる。これは同様に本発明の主題である。
【００１７】
培養の終わりには、フォールディングの過程はまだ１００％完全ではない。メルカプタンたとえばシステイン塩酸塩の添加がこの過程を完了させる。これは同様に本発明の主題である。
【００１８】
２つのタンパク質が、他の位置では融合タンパク質を効果的には切断しないエンドプロテアーゼによって特異的に認識されるアミノ酸のリンカーを介して融合させると、ついで興味あるタンパク質を直接、活性型で切断することが可能である。インスリンの製造の場合には、ヒルジンとプロインスリンの間のリンカーは好ましくは、カルボキシ末端にアルギニンを含有する。同時プロセッシングではトリプシン変換により融合部分が切断され、プロインスリンは、モノ- またはジ−Arg−インスリンに変換することができる。上記リンカーはインスリンのプロセッシングに関連して、ヒルジン部分の切断除去が、インスリンのＢおよびＡ鎖に連結するＣペプチド配列またはその誘導体における切断よりも遅くないように至適化されなければならない。これは同様に本発明の主題である。使用できる発現系の例は、欧州特許 0 468 539の図１に記載されているベクターpJF118である。
【００１９】
プロインスリンまたはプロインスリン誘導体をコードするDNA配列を含有するプラスミドは、たとえば特許EP-A 0 489 780およびPCT/EP00/08537に記載されている。
【００２０】
EP-A 0 324 712の記載に従い、ヒルジンの配列を含有するプラスミドpK152は、ヒルジンのためのDNA配列の供給源として使用される。
【００２１】
細菌の内膜を通過する興味あるタンパク質の輸出適合性は分泌に重要である。この関連では、様々なタンパク質に、多かれ少なかれ至適なシグナル配列の選択が重要である。特許出願PCT/EP00/08537には、PCR-ベースのシグナル配列のスクリーニング系が記載されている。この系には、驚くべきことに、ヒルジン活性が完全に維持され、したがって、トロンビン阻害アッセイで上清中に容易に検出されるので、N-末端融合部分としてヒルジンを有する融合タンパク質にも適用することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、式：
−Ｆ−Ａｓm−Ｒn−Ｙ−
（式中、
Ｆは培養培地中へのタンパク質Yの分泌を可能にするアミノ酸配列をコードするDNA配列であり、
Ａｓは化学結合または遺伝子コードによってコード可能なアミノ酸をコードするDNA配列であり、
ｍは０〜１０の整数であり、
Ｒは化学結合またはアルギニンコドンであり、
ｎは０または１であり、
Ｙは、興味あるタンパク質をコードするDNA配列であり、正しくフォールディングされたこのタンパク質は、培養培地中の融合タンパク質の一部分であり、
とくにヒルジンまたはその誘導体をコードするDNA配列(Ｆ)およびプロインスリンまたはその誘導体をコードするDNA(Ｙ)である）
で表される融合タンパク質をコードするDNA（別名：発現カセット）に関する。
【００２３】
本発明はさらに、式
Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ａｓm−Ｒn−Ｙ−Ｔ
（式中、
Ｐはプロモーターであり、
Ｓは至適収率を可能にするシグナル配列をコードするDNA配列であり、
Ｔは非翻訳、発現エンハンシングDNA配列である）
で表される発現カセット（別名：DNA）に関する。
【００２４】
本発明はさらに、上述の発現カセットを含有するプラスミドおよび上述のプラスミドを含有する宿主細胞、または好ましくは宿主ゲノム中に結合された発現カセットを含有する宿主細胞に関し、宿主細胞はE. coli, B. subtilisおよびStreptomycesからなる群より選択される。
【００２５】
本発明はまた、
（ａ）上述のDNA分子を上述の宿主細胞内で発現させ、
（ｂ）発現した融合タンパク質を単離する
上述の融合タンパク質の培養による製造方法に関する。
この方法では、とくに、発現したタンパク質を単離するために上清を宿主細胞から分離し、発現したタンパク質を上清から単離する。さらにここで、沈殿後、上清中の発現したタンパク質を濃縮するための工程段階には、マイクロろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される。ここでその特定の実施態様では、発現したタンパク質の単離は培養培地または上清の成分を沈殿させ、一方、発現したタンパク質は溶液中に残す工程を含む。さらに好ましい本発明の実施態様においては、培養後、pH６〜９の培養上清にメルカプタンまたはシステイン塩酸塩を、遊離SH基の濃度が０.０５〜２.５mMに達するように添加する。
【００２６】
本発明の特定の実施態様は宿主細胞から培養上清を分離し、宿主細胞を新鮮な培地中でさらに培養し、放出された融合タンパク質を上清から単離することからなる。換言すれば、本発明の更なる実施態様は、上述の方法において、宿主細胞から培養上清を分離し、宿主細胞を新鮮な培地中で反復培養し、培養時に得られる各上清から、放出された融合タンパク質を単離する方法である。
【００２７】
本発明はさらに、インスリンまたはインスリン誘導体を製造する方法において、
（ａ）上述の方法で得られる発現したタンパク質から、
（ｂ）興味あるタンパク質、とくにインスリンまたはインスリン誘導体を酵素的または化学的切断により放出させ、
（ｃ）単離する方法に関する。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例は本発明を、限定の意図ではなく、さらに詳細に記述するものである。
【００２９】
実施例１：Pseudomonas fluorscensからのoprF遺伝子産物のシグナル配列に付加したレピルジン―GNSAR−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
特許出願PCT/EP00/08537の実施例2には、Pseudomonas fluorscens  oprF遺伝子産物のシグナル配列（De, E.ら, FEMS Microbiol Lett. 127, 263-272, 1995）を介して、E. coliのために使用される培地中にRefludanの発現および分泌を可能にする発現ベクターを記載している。このベクターは、Refludan−GNSAR−シミアンプロインスリン融合タンパク質（GNSAR＝配列番号：1）の構築に役立ち、pBpfu_hirと命名される。
【００３０】
更なる出発原料はpJF118（EP 0 468 539）およびpK152（PCT/EP00/08537）プラスミドDNAである。以下のオリゴヌクレオチドが要求される：
プライマーpfuf1
【化１】
0004243104.tif 000002
プライマーinsu1 1hindIII
【化２】
0004243104.tif 000003
プライマーHir_insf1
【化３】
0004243104.tif 000004
プライマーHir_insrev1
【化４】
0004243104.tif 000005
プライマーpfuf1は、発現ベクター中のシグナル配列とレピルジンの接合部をコードするDNA領域とハイブリダイズする。
【００３１】
太字で示したプライマーHir_insrev1の部分は、プラスミドpINT90d中のプレプロインスリンおよびシミアンプロインスリン配列の接合部をコードするDNA領域、およびプラスミドpK152中のヒルジン配列の3'末端の配列とハイブリダイズする。プライマーHir_insrev1はプライマーHir_insf1と100％相補性である。プライマーInsu11HindIIIは、pINT90d中にクローン化され、シミアンプロインスリン配列をコードするDNA領域の3'末端をマークし、さらに、制限酵素HindIIIによって認識するためのヘキサヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Hir_insf1／Insu11HindIIIプライマー対、鋳型としてプラスミドpINT90d、およびpfuf1／Hir_insrevプライマー対、鋳型としてプラスミドpBpfu_hirを使用して実施する。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーpfuf1／Insu11HindIIIを用いた第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。この結果物は、配列シグナル（部分的）−レピルジン−GNSAR−シミアンプロインスリンを含有するDNA産物である。制限酵素BamHIおよびHindIIIを用いてDNAフラグメントを変換する。BamHIはレピルジン配列で、HindIIIはプロインスリンコード配列の3'末端で切断する。
【００３３】
平行した反応で２つの酵素を用い、ベクターpBpfuを変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をT4リガーゼ反応で変換する。E. coli株K12Mc1061のコンピテント細胞（Sambrookら, “Molecular Cloning", Cold Spring Habor Laboratory Press 1989）をリゲーション混合物で形質転換し、25μg／mLのアンピシリンを含むNAプレート上に置く。特性解析のために、形質転換体からプラスミドDNAを単離する。同時に、プラスミド分析において特性を解析した形質転換体を含むプレートを、維持の目的で調製する。DNAは、制限分析およびDNA配列分析によって特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、pBpfuHir_Insと命名された。
【００３４】
実施例２：S. typhimuriumの外膜タンパク質のシグナル配列（fimD）に付加されたSer-ヒルジン−GNSAR−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
この構築は、実施例１に記載の計画に従って実施される。
特許出願PCT/EP00/08537の実施例１０には、S. typhimuriumの外膜タンパク質のシグナル配列を介してレピルジンを輸送するためのベクターの構築が記載されている（Rioux, C. R., Friedrich, M. J. & Kadner, R. J.；J. Bacteriol., 172 (11), 6217-6222, 1990）。得られたプラスミドは実験室目的でpBstyfim_hirと命名される。プラスミドpK152およびplNT90dのDNAは各場合に鋳型として働く。
【００３５】
この構築には４つのプライマーが必要である。
プライマーinsu11HindIII, Hir_insf1およびHir_insrev1は実施例１に記載されている。
プライマーstyfimf1serは新たに合成され、以下の配列を有する：
【化５】
0004243104.tif 000006
【００３６】
太字で示したDNAトリプレットはセリンのコドンを示す。結果として、ヒルジンが産生され、このヒルジンは、アミノ酸配列の１位にロイシンの代わりにセリンを有する。
【００３７】
実施例１に相当して、２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Hir_insf1/Insu11 HindIIIプライマー対、鋳型としてpINT90d DNA、およびstyfimf1ser/Hir_ insrevプライマー対、鋳型としてpK152 DNAを使用して実施される。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーstyfimf1ser/Insu11HindIIIを用いた第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。この結果は、配列シグナル（部分的）-Ser-ヒルジン−GNSAR−シミアンプロインスリンを含有するDNA産物である。制限酵素BamHIおよびHindIIIを用いてDNAフラグメントを変換する。
【００３８】
平行した反応で２つの酵素を用い、ベクターpBstyfim_Hirを変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をT4リガーゼ反応で変換する。E. coli株K12Mc1061のコンピテント細胞をリゲーション混合物で形質転換し、特性解析のために形質転換体からプラスミドDNAを単離する。同時に、プラスミド分析によって特性を解析した形質転換体を含むプレートを維持の目的で調製する。DNAは制限分析およびDNA配列分析によって特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、pBstyfim_SerHir_ Insと命名された。
【００３９】
実施例３：E. coliアルカリホスファターゼ前駆体タンパク質のシグナル配列に付加されたAla-ヒルジン−Ｒ−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
E. coliアルカリホスファターゼ前駆体は次のシグナル配列を有する。
【化６】
0004243104.tif 000007
（Shuttleworth H., Taylor J., Minton N.; Nucleic Acids Res. 14: 8689, (1986））
ペプチド配列は、E. coli 高コドン使用基準を用いて、GCGプログラムBack translate（Wisconsin Package Version 10.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.）によりDNAに逆翻訳される。
これは、以下の配列を生じる。
【化７】
0004243104.tif 000008
【００４０】
この配列を、１位にアミノ酸アラニンを有することによって特性づけられたヒルジンをコードするDNA配列（EP-A 0 488 093）にクローン化し、付加するために、上記配列は太字で示した配列によって延長される。
【化８】
0004243104.tif 000009
部分的に重複する２つのオリゴヌクレオチド配列はそれから誘導される。
プライマーphoaf1は以下の配列を有する：
【化９】
0004243104.tif 000010
プライマーphoaf2は以下の配列を有する：
【化１０】
0004243104.tif 000011
【００４１】
発現ベクターの構築には、プライマー insu11HindIII, Hir_insf2およびHir_ insrev2ならびにプラスミドpK152, pINT90dおよびpJF118のDNAを要求する。
プライマーHir_insf2は以下の配列を有する：
【化１１】
0004243104.tif 000012
プライマーHir_insrev2は以下の配列を有する：
【化１２】
0004243104.tif 000013
【００４２】
上の場合の太字レターはプロインスリンとハイブリダイズする配列を指示し、一方、上の場合の普通文字レターはヒルジン配列の3'末端との重複を示している。下の場合の下線を施した太字レターはアルギニンリンカーのコドンを表す。
【００４３】
実施例1に相当して、２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Hir_insf1/Insu11 HindIIIプライマー対を、鋳型としてpINT90d  DNA、およびphoaf1/Hir_ insrevプライマー対を、鋳型としてpK152 DNAを使用して実施する。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーphoa／Insu11HindIIIとともに第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。結果は、配列シグナル-Ala-ヒルジン−GNSAR−シミアンプロインスリンを含有するDNA産物である。DNAフラグメントは制限酵素BamHIおよびHindIIIを用いて変換される。平行した反応で２つの酵素を用いてベクターpjF118を変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をT4−リガーゼ反応で変換する。E. coli株K12Mc1061のコンピテント細胞をリゲーション混合物で形質転換し、特性解析のために形質転換体からプラスミドDNAを単離する。同時に、プラスミド分析によって特性を解析された形質転換体を含むプレートを維持の目的で調製する。DNAは制限分析およびDNA配列分析により特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、pNS22と命名された。
【００４４】
実施例４：トロンビン阻害アッセイ
ヒルジン濃度はGriessbachらの方法（Thrombosis Research 37, pp. 347-350, 1985）に従って決定される。この目的には、校正曲線を確立するため、特定量のRefludan標準を測定に包含させる。これからmg／Lでの収率が直接測定できる。生物学的活性も、融合タンパク質のプロインスリン成分の正しいフォールディングの直接的な指標となる。また正しい -S-S- 橋の形成を決定するため、蛋白分解S. aureus消化、ついでRP-HPLC系における分析を用いることも可能である。
【００４５】
実施例５：融合タンパク質の発現
組換え細胞を、100μg／mLのアンピシリンを含有する2YT培地（１Ｌあたり、ペプトン16ｇ，酵母抽出物10ｇ，NaCl 5ｇ）中、一晩培養する。この一晩培養液を新鮮な培地で１：50に希釈し、細胞を約0.8 OD600の密度まで培養する。
ついで、IPTGを濃度0.05〜２mMが確立されるように加えて発現を誘導する。この方法で誘導された細胞をさらに３〜２６時間インキュベートする。
【００４６】
３時間後、ヒルジンの抗トロンビン作用が上清中に明瞭に測定できる。クマシーブルー染色後のSDS PAGE分析によれば、誘導された細胞にのみポリクローナル抗−インスリン抗体とウエスタンブロット分析で反応する新しいバンドが現れることから、上述の作用は所望の融合タンパク質の分泌に帰することができる。培養実験においては、誘導は有意に高い光学密度に培養したのちにのみ開始される。これにより、最小培地に基づく好ましい合成培地が得られる。
細胞の生産性は、細菌ミルキングの原理を使用することにより、すなわち至適誘導時間ののちに上清から細胞を注意深く取り出して、それらをさらに再度イデューサーを加えた新鮮な培地中でインキュベートすることにより向上する。回収された上清から平行してインスリンが製造される。
【００４７】
実施例６：融合タンパク質の精製
誘導の終了後、細胞上清のpHを2.5〜３に調整し、細胞および上清成分を遠心分離またはろ過により除去する。沈殿の上清を陽イオン交換カラム（S-Hyper DF, Source 30S）に適用し、pH 3.5 において30％ ２−プロパノールの存在下、150〜450mM NaClの直線勾配を用いて分画する。個々の分画をRP- HPLCにより分析する。プロインスリン-ヒルジン融合タンパク質は約300mM濃度のNaClで溶出される。十分に純粋な分画を合わせ、0.1％TFAで希釈し、ポンプによってRPカラム（PLRP-S 7.5×50mm）に適用する。溶出は20〜50％のアセトニトリル勾配を用いて実施する。２グループの分画をプールする。溶媒を除去したのち、物質を凍結乾燥する。物質の純度をSDSポリアクリルアミド電気泳動によりチェックする。精製された融合タンパク質をマススペクトル（ESI）によって分析する。融合タンパク質の実験的に測定した分子量は、シグナルペプチド除去後の、その理論的に期待される分子量に相当する。
【００４８】
実施例７：ジスルフィド橋連結の決定
融合タンパク質をトリプシンで消化し、形成されたフラグメントをRP-HPLCついでマススペクトルによって分析する。de-(B30)インスリンとして認識されるフラグメントは、その質量が5706Daであることから、成功裡に同定される。この生成物をS. aureus V8プロテアーゼ消化に付す。RP-HPLC分析では、期待されるペプチドパターンが示される。
【００４９】
トリプシン切断は次のように実施する：
凍結乾燥した融合タンパク質を50mM Tris-HCl pH８ に溶解し（１mg／mL）、トリプシン（融合タンパク質１mgあたり１μg）を加える。トリプシンは反応の終了時にpH３で不活性化する。
【００５０】
S. aureus消化は次のように実施する：
単離されたde-(B30)インスリンをpH８の水に溶解し、S. aureusプロテアーゼ（インスリンの量の1/50）を添加し、混合物を37℃で5時間、次に室温で一晩インキュベートする。
【００５１】
実施例８：インスリンの精製
宿主細胞の自然溶解または分泌により上清に見出される大部分の他のポリペプチドとは対照的に、この融合タンパク質は、驚くべきことに、pH 2.5〜3.5 では沈殿しない。したがって、培養培地を適宜酸性にし、ついで沈殿の完了後に、沈殿および細胞を遠心分離または精密ろ過により除去し、濃縮する。
【００５２】
次に、培地のpHを6.8に調整し、分析的HPLC測定と平行して融合タンパク質含量を測定する。測定に続いて、上清にトリプシンを、融合タンパク質１〜1.5 mgあたり約１μgになるように加える。室温で約4時間インキュベートしたのち、精製は2-プロパノールの存在下、pH 3.5 において陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施する。溶出は0.15〜0.45Ｍの勾配を適用して、緩衝液中で実施する。
【００５３】
ジ-Arg-インスリンは約0.3Ｍで溶出する。１：１に希釈したのち、10％濃度のZnCl2溶液を添加し、pH 6.8 においてインスリン含有分画からジ-Arg-インスリンを沈殿させる。インスリンをろ過し、ついで0.05Ｍ Tris-HCl（pH 8.5）に溶解し、２mg／mLの溶液を得る。
ついで、溶液100 mLあたり約１単位量のカルボキシペプチダーゼＢを加え、穏やかに攪拌しながら反応を実施する。ついでクエン酸でpHを5.5に調整し、インスリンをZnCl2の存在下に結晶化させる。結晶を取り、溶解し、RP-HPLCで精製したのち、インスリンを再度結晶化により精製する。
【００５４】
実施例９：培養培地中での融合タンパク質の直接プロセシング
発現期の終わりに、培養培地のpHを6.8に調整し、トリプシンを攪拌しながら加えて、最終濃度４〜８mg／Ｌを確立する。約４時間インキュベートしたのち、この方法で処理した培養液のpHを2.5〜３に調整する。１〜６時間沈殿させたのち、pHを3.5に上げ、形成されたジ-Arg-インスリンを30％ ２−プロパノールの存在下に陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。溶出は0.05〜0.5ＭのNaCl塩の勾配を用いて実施する。生成物含有分画をH2Oで１：１に希釈し、ついで0.1％濃度のZnCl2溶液が形成されるようにZnCl2を加える。ジ-Arg-インスリンをpH 6.8 で沈殿させ、たとえば実施例８に従ってインスリンに変換する。
【００５５】
実施例１０：融合タンパク質の分泌のための更なるシグナル配列
特許出願PCT/EP00/08537によって記述された技術を用いて、ヒルジン−プロインスリン融合タンパク質の分泌を招来する更なるシグナル配列を検出することができる。
Serratia marcescensの主要外膜タンパク質のompA遺伝子から誘導される、シグナル配列smompa（GenEMBL データベースローカス：SMOMPA, 1364 bp DNA BCT 30-MAR-1995）
主要外膜タンパク質をコードするE. coli ompC遺伝子から誘導される、シグナル配列ecoompc（GenEMBL データベースローカス：SMOMPA, 1364 bp DNA BCT 30-MAR-1995）
Bacillus subtilisの浸透防御結合タンパク質前駆体（opuCC）から誘導される、シグナル配列af009352（GenEMBL データベースローカス：AF009352, 4500 bp, DNA BCT 23-JUL-1997）
キシラナーゼＩ前駆体についてのAeromonas caviae xynA遺伝子から誘導される、シグナル配列aeoxyna（GenEMBL データベースローカス：AEOXYNA, 1139 bp DNA BCT 07-FEB-1999）
外膜タンパク質S1についてのS. typhi遺伝子から誘導される、シグナル配列stomps1（GenEMBL データベースローカス：STOMPS1, 1938 bp DNA BCT 24-AUG-1995）
【配列表】
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