(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで真核生物細胞を核酸によってトランスフェクトする方法であって、
（ａ）共有結合的にDNA結合基と結合する、フソゲンペプチド、核局在化シグナル配列を包含するペプチド、及び真核生物細胞の表面の結合部位に結合し、任意に全複合体のエンドサイトーシスを誘導するペプチドからなる群より選択されるペプチドを核酸と混合することによりペプチド-核酸複合体を形成する工程であって、該ペプチド-核酸複合体のDNA結合基が非共有結合的に核酸と会合したスペルミンである、工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）から得られるペプチド-核酸複合体にカチオン脂質を添加する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）から得られるカチオン脂質集合体を該真核生物細胞と接触させる工程
とを包含する、前記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、フソゲンペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フソゲンペプチドが、インフルエンザウイルス、水泡性口内炎ウイルス、およびαウイルスからなる群から選択されたウイルス由来のウイルスフソゲンタンパク質のペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスフソゲンタンパク質が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、または水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスフソゲンペプチドが、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの両親媒性ペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記両親媒性ペプチドが、ヘマグルチニンのK5ペプチド、またはE5ペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、核局在化シグナル配列を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核局在化シグナル配列が、サルウイルス40（simian virus 40）に由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核局在化シグナル配列が、SV40 large Ｔ抗原に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、真核生物細胞の表面の結合部位に結合し、任意に全複合体のエンドサイトーシスを誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、RGDペプチド配列を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、NLSペプチド、VSVGペプチド、E5ペプチド、K5ペプチドである、またはRGDペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カチオン脂質が多価カチオン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記多価カチオン脂質が、2,3-ジオレイルオキシ-N-［2（スペルミンカルボキシアミド）エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）においてペプチド-核酸複合体を形成した後、前記工程（ｂ）において、カチオン脂質と中性脂質との混合体を前記ペプチド-核酸複合体に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記中性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核生物細胞が動物初代（primary）細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記真核生物細胞がヒト初代細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核生物細胞が繊維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドがNLSペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
DNA結合基に共有結合的に結合した前記ペプチドが、VSVG-spまたはNLS-spである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが１つ以上のペプチドの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチド混合体が、ヘマグルチニンの両親媒性ペプチドとフソゲンペプチドとの混合体である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチド混合物が、VSVGとE5との混合物である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチド-核酸複合体が、スペルミンに結合した核局在化シグナル配列を包む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
カチオン脂質がペプチド-核酸複合体を凝集させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜26のいずれかに記載の方法の（ａ）及び（ｂ）の工程によって産生される、真核生物細胞をトランスフェクトするための組成物。
【請求項２８】
インビトロで真核生物細胞を核酸によってトランスフェクトする方法であって、真核生物細胞を請求項27に記載の組成物に接触させる工程を含む方法。
【請求項２９】
前記真核生物細胞が動物初代細胞株である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記真核生物細胞がヒト初代細胞株である、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記真核生物細胞が繊維芽細胞である、請求項28に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
任意にDNA結合集団（DNA-binding groups）に結合したペプチドとカチオン脂質とを含有し、真核細胞をトランスフェクトするのに有用な組成物が開示される。そのような組成物を用いて真核細胞をトランスフェクトする方法も開示される。
発明の背景
リポソームのような脂質集合体は、DNA、RNAおよびタンパク質のような巨大分子の生体細胞内への導入を助長するように機能し得る。カチオン脂質成分を含む脂質集合体は、核酸等の大型のアニオン分子の特定の種類の細胞内への送達および導入に効果的であり得る。Felgner, P.L.およびRingold, G.M.（1989）Nature 337:387-388ならびにFelgner, P.L.ら（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413を参照。ほとんどの細胞の膜は正味負電荷（net negative charge）を有するので、アニオン分子、特に分子量の大きいものは容易には細胞に取り込まれない。カチオン脂質は、核酸のようなポリアニオンに凝集および結合し、負電荷を中性化する傾向がある。細胞内への核酸のトランスフェクションに関するカチオン脂質の有効性は、細胞に対するカチオン脂質-核酸集合体の高められた親和性ならびに親油性成分の膜融合の機能に起因すると考えられている。
カチオン脂質は、あらゆる種類の細胞のトランスフェクションに普遍的に有効であるわけではない。異なる細胞のトランスフェクションの有効性は、特定のカチオン脂質組成物および形成される脂質集合体の種類に依存する。一般に、真核細胞をトランスフェクトする場合、モノカチオン脂質（monocationic lipids）よりもポリカチオン脂質の方が有効である。Behr, J-P.ら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6982-6986, Hawley-Nelson, P.ら（1993）FOCUS 15:73および米国特許第5,334,761号（Gebeyehuら）。例えば、Behrらおよび欧州特許庁特許公開公報第304 111号（1990）は、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（5-carboxyspermylglycine dioctadecyl-amide）（DOGS）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミル-アミド（dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermylamide）（DPPES）を含むカルボキシスペルミン（carboxyspermine）含有カチオン脂質を用いた改良トランスフェクションを記載している。その比較的高い有効性にもかからわず、ポリカチオン脂質試薬を用いた真核細胞培養物のトランスフェクションを成功させるためには、大量の核酸（細胞毎に約105DNA分子）が必要となる。
生体物質の多くは、受容体仲介エンドサイトシスによって細胞に取り込まれる。PastanおよびWillingham（1981）Science 214:504-509を参照。このメカニズムは、リガンドの細胞表面受容体への結合、リガンド結合受容体のクラスタ形成、および被覆小窩の形成、そして、その後のリガンドのエンドソームへの内部移行（internalization）を含む。インフルエンザウィルスおよびアルファウィルスのような包膜ウィルス、ならびにアデノウィルスのような非包膜ウィルスは共に、エンドサイトシスメカニズムによって細胞を感染させる。Pastan, I.ら（1986）in Virus Attachment and Entry into Cells,（Crowell, R.L.およびLonberg-Holm, K.編）Am. Soc. Microbiology, Washington, p. 141-146; Kielian, M.およびHelenius, A.（1986）「Entry of Alphaviruses」in The Togaviridae and Flaviviridae,（Schlesinger, S.およびSchlesinger, M.J.編）Plenum Press, New York p.91-l19; FitzGerald, D.J.P.ら（1983）Cell 32:607-617を参照。
一般に、ウィルス感染によって仲介される外来DNA配列の真核細胞への導入は、カチオン脂質試薬を用いたトランスフェクションに比べて数桁効率が高い。細胞培養物のウィルス感染のために細胞毎に必要となるウィルス粒子（virus particles）は、10未満である。融合の詳細なメカニズムは完全には分かっておらず、ウィルスによって異なるが、典型的に、ウィルス融合には、ウイルスタンパク質、ウィルススパイク糖タンパク質（viral spike glycoprotein）およびウィルススパイク糖タンパク質のペプチド等の特定の融合誘導因子が関与する。例えば、水疱性口内炎ウィルス（VSV）融合には、VIV糖タンパク質（Ｇタンパク質）と膜脂質との相互作用が関与すると考えられている（Schlegel, R.ら（1983）Cell 32:639-646）。報告されているところによると、VSVＧタンパク質は、酸性リン脂質ホスファチジルセリン等の飽和性受容体に優先的に結合する（Schlegel, R.およびM. Wade（1985）J. Virol. 53（1）:319-323）。インフルエンザウィルスの融合には、血球凝集素HA-2 Ｎ末端融合誘導ペプチドが関与する。Kamata, H.ら（1994）Nucl. Acids Res. 22（3）:536-537を参照。
細胞受容体に結合するペプチドを用いても細胞結合が向上あるいは促進され得る。例えば、アデノウィルスコートのペントン基タンパク質は、インテグリンへの結合ならびに受容体仲介エンドサイトシスによるウィルスの内部移行を仲介するペプチドモチーフRGD（Arg-Gly-Asp）を有する（Wickham, T.J.ら（1995）Gene Therapy 2:750-756）。
近年、カチオン脂質トランスフェクションの効率が、ウィルス粒子全体をトランスフェクション混合物に添加することによって向上することが分かった。Yoshimuraら（1993）J. Biol. Chem. 268:2300を参照。特定のウィルス成分もまた、カチオン脂質仲介トランスフェクションの効率を高め得る。本明細書中に参考としてその全体が援用される、1993年７月12日出願の米国特許出願第08/090,290号および1994年７月12日出願の米国特許出願第08/274,397号を参照。また、近年、脂質仲介トランスフェクションを向上させるためのウィルスタンパク質からのペプチドの使用がKamataら（1994）Nucl. Acids Res. 22:536によって示唆された。Kamataらは、トランスフェクション混合物にインフルエンザウィルス血球凝集素ペプチドを加えることによって、「LIPOFECTIN」仲介トランスフェクションが３〜４倍向上し得ることを示唆している。これらの初期の徴候は肯定的であったが、融合誘導ペプチドを脂質トランスフェクション組成物内に含めることの有効性に関する結果はまちまちである。Remyら（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1744は、「（ポリカチオン脂質-DNA複合体）粒子への融合誘導あるいは核局在化ペプチド頭基を有する脂質の添加は、既に効率的なシステムをそれ程は向上させない。」と報告している。
本発明は、ウィルスタンパク質からのペプチド配列が、真核細胞のカチオン脂質仲介トランスフェクションの効率を大幅に向上させ得るという発見に基づいている。本発明の組成物および方法は、トランスフェクション試薬を添加する前に核酸に結合した場合にトランスフェクションの効率を大幅に向上させる融合誘導受容体-リガンドあるいは核局在化ペプチドを包含する。これらの融合誘導物、受容体-リガンドおよび核局在化ペプチドが、DNAとの非共有性の結合体（association）あるいは複合体を形成する。複合体形成は、結合集団とDNAとの間の配座あるいは電荷の相互作用を通して核酸に結合するDNA結合集団にペプチドを共有結合させることによって高められ得る。これらの結合した核酸は、より効率的に細胞内および細胞核に運搬され、これにより、核酸出発材料が比較的少なくてすむ。本発明のカチオン脂質組成物は、向上したトランスフェクション頻度（transformation frequency）等、従来技術による組成物にはなかった大きな利点を提供する。
発明の要旨
本発明は、核酸を用いて、真核細胞、特に、より高等な真核細胞をトランスフェクトするための組成物および方法を提供する。核酸であるDNAおよびRNAが共に、その生物学的な機能が維持されるように細胞内に導入される。ペプチド-核酸複合体およびカチオン脂質を含む真核細胞をトランスフェクトする組成物が提供される。トランスフェクトする組成物は、核酸に結合し、融合誘導性であり、あるいは核局在化機能を有するまたは受容体-リガンドとして機能するペプチドあるいは改質ペプチド（modified peptides）を含む。受容体-リガンドペプチドは、細胞ターゲティングあるいは細胞接着の機能を有する細胞表面受容体あるいはサイトゾル受容体に結合するものを含み、また、内部移行あるいはエンドサイトシスを誘発するものを含む。ペプチド-核酸複合体は、ペプチドあるいは改質ペプチドを核酸と相互作用させることによって形成される。改質ペプチドは、DNA結合集団に共有結合したペプチドを含む。その後、ペプチド-核酸複合体をカチオン脂質と結合させ、これにより、核膜を含む細胞膜を通したアニオン核酸の導入を助長するペプチド-核酸-脂質集合体を形成する。ここで、用語ペプチドは広義に用いられており、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
トランスフェクション組成物に有用なペプチドは、融合誘導性であり、核局在化機能を有し、受容体リガンドであり、細胞接着信号、細胞ターゲティング信号、細胞内部移行信号あるいはエンドサイトシス信号を含むタンパク質（またはポリペプチド）あるいはその官能部（functional portions）、ならびに、ウィルス融合誘導タンパク質、ウィルス核局在化信号、受容体-リガンド、細胞接着信号、細胞ターゲティング信号、あるいは内部移行-またはエンドサイトシス-誘発信号のペプチドあるいはその官能部を含む。本発明に有用なペプチドは、天然に存在するペプチドおよび合成類似体または天然に存在するペプチドの機能的等価物を含む。インフルエンザウィルス、水疱性口内炎ウィルスおよびサルウィルス40のウィルスペプチドを含むトランスフェクトする組成物は特に興味深い。DNA結合集団に共有結合するように改質されたウィルスペプチド（ならびにタンパク質およびポリペプチド）を有するトランスフェクトする組成物、例えばスペルミンあるいはこれに関連するポリアミンもまた本発明の方法に有用である。
カチオン脂質トランスフェクション組成物内にペプチド-あるいは改質ペプチド-核酸複合体を含めることによって、核酸のトランスフェクションが、カチオン脂質のみによって仲介される核酸のトランスフェクションに比べて大幅に（２倍以上）向上する。ペプチドあるいは改質ペプチドによるトランスフェクションの向上は、ヒト一次細胞株（human primary cell lines）を含む様々な細胞株において明白である。
トランスフェクトする組成物には、一価あるいは好ましくは多価のカチオン脂質を用いる。好適な多価カチオン脂質は、リポスペルミンであり、具体的にはDOSPA（2,3-ドロレロシ-N-［2（スペルミンカルボキシアミド）エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）（2,3-droleylocy-N-［2（sperminecarboxamido）ethyl］-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate）である。カチオン脂質を、任意に、非カチオン脂質、特に中性脂質、例えば、DOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（dioleoylphosphatidylethanolamine））等の脂質に結合させる。DOSPAおよびDOPEの3:1（w/w）混合物からなるカチオン脂質組成物は、概して、本発明のトランスフェクトする組成物に有用である。好適なトランスフェクション組成物は、より高等な真核細胞株の実質的なトランスフェクションを誘導するものである。
本発明の方法は、任意にDNA結合集団に結合した、融合誘導性、核局在化、あるいは受容体-リガンドペプチドを含むトランスフェクトする組成物に真核細胞を接触させる工程を含み、上記ペプチドあるいは改質ペプチドは核酸に非共有結合している。ペプチド-核酸複合体を形成した後、これをカチオン脂質に結合させる。本発明の方法は、中でも、インフルエンザウィルス、水疱性口内炎ウィルスあるいはサルウィルス40のウィルスペプチドを用いる。本発明の方法は、接着あるいは懸濁細胞株（adherent or suspension cell lines）のトランスフェクションに、一般には動物細胞株に、具体的には哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および昆虫の細胞株に、そしてより具体的には動物一次細胞株、ヒト一次細胞株、幹細胞株および繊維芽細胞に適用可能である。
１つの具体的な実施形態においては、先ず、融合誘導性ペプチドを、細胞内に導入する核酸に結合させる。次いで、ペプチド-核酸複合体をカチオン脂質に混ぜて、そして得られた混合物を用いて細胞をトランスフェクトする。好適なカチオン脂質は、カチオン脂質組成物、より好適にはポリカチオン脂質組成物、そして最も好適にはリポフェクタミンである。
第２の具体的なトランスフェクション方法においては、融合誘導ペプチドあるいは受容体-リガンドペプチドをDNA結合集団に結合させて改質ペプチドを生成し、次いでこれを、細胞内に導入する核酸に結合させる。次いで、改質ペプチド-核酸複合体をカチオン脂質に混ぜて、そして得られた混合物を用いて細胞をトランスフェクトする。具体的には、上記ペプチドをスペルミンに結合させ、上記スペルミン-改質ペプチドを核酸と複合化させ、そしてカチオン脂質と混ぜる。優先順位として、上記カチオン脂質は、カチオン脂質組成物、より好適にはポリカチオン脂質組成物、最も好適にはリポフェクタミンである。
第３の具体的な実施形態においては、１つ以上の融合誘導性ペプチド、受容体-リガンドペプチドあるいは核局在化ペプチドの混合物を、細胞内に導入する核酸と混合および複合化する。次いで、上記ペプチド-核酸複合体をカチオン脂質に混ぜて、そして得られた混合物を用いて細胞をトランスフェクトする。
本発明のトランスフェクション方法は、真核細胞のインビトロおよびインビボのトランスフェクション、特に、動物細胞を含むより高等な真核細胞のトランスフェクションに適用され得る。本発明の方法は、有用な遺伝子生成物を発現するトランスフェクトされた細胞を生成するために用いられ得る。本発明の方法は、遺伝子組換え動物の生成の１工程としても用いられ得る。本発明の方法は、遺伝子治療およびウィルス阻害の方法を含むあらゆる治療法における１工程として、また、アンチセンスまたはアンチ遺伝子（antigene）あるいはこれに関係する阻害核酸の細胞内への導入に有用である。具体的には、これらの方法は、癌治療、インビボおよびエキソビボ遺伝子治療、ならびに診断方法に有用である。
ペプチド、タンパク質、ペプチドフラグメント、あるいは改質されたペプチド、タンパク質またはペプチドのフラグメントを含む本発明のトランスフェクション組成物は、研究の目的で行われるあらゆる真核細胞のトランスフェクションにおける研究試薬としても用いられ得る。上記トランスフェクション組成物は、生理的培地（physiologic medium）が適切に選択されれば、治療および診断の用途に用いられ得る。
本発明の方法によってトランスフェクトされ得る核酸は、天然あるいは非天然のものを含むあらゆるソースからのDNAおよびRNAを含み、そして、細胞内の治療的あるいは有用なタンパク質をコードし且つそれを発現することができるもの、細胞内の核酸の望ましくない発現を阻害するもの、望ましくない酵素活性を阻害するあるいは望ましい酵素を活性化するもの、反応を触媒するもの（リボゾーム）、および診断的アッセイにおいて機能するものを含む。
ここに開示される内容を考慮すれば、ここに提供される組成物および方法を容易に調整して、とりわけ、ポリアミン、ポリアミン酸、ポリペプチドおよびタンパク質を含む核酸以外の生理活性巨大分子を真核細胞内に導入することができる。本発明の方法によってペプチドおよび改質ペプチドに結合し得るとともに真核細胞内に導入され得る、例えば治療薬、診断材料、研究試薬として有用な他の材料もある。
【図面の簡単な説明】
図１は、リポフェクタミン-DNAトランスフェクション混合物に様々なペプチドを加えたときの、ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの向上を示す棒グラフである。
図２は、リポフェクタミンを加える前にDNAに複合化させた様々な濃度のスペルミン-NLSおよびスペルミン-VSVGを含めることによる、ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの向上を示すグラフである。
図３は、DNAとスペルミンとの組合せ、スペルミンとペプチド-DNA複合体の混合物、および様々なペプチド-DNA複合体を含めることによる、ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの向上を示す棒グラフである。
図４は、試薬を加える順番がヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの向上に及ぼす影響を示す棒グラフである。
図５は、NLS-DNAおよびポリ-L-リジン-DNA複合体をリポフェクタミン内に含めることによる、ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの向上を示す棒グラフである。
図６は、スペルミン-NLS-DNA複合体の濃度がBHK-21細胞のトランスフェクションの向上に及ぼす影響を示す棒グラフである。
図７は、スペルミン-VSVG-DNA複合体の濃度がBHK-21細胞のトランスフェクションの向上に及ぼす影響を示す棒グラフである。
図8A〜図8Eは、RGD-スペルミンペプチドの濃度が接着細胞のリポフェクタミン仲介トランスフェクションに及ぼす影響を示す１組の棒グラフである。グラフはそれぞれ、ピーク発現点を示している。
図9Aおよび図9Bはそれぞれ、RGD-スペルミンペプチドの濃度が、ジャーカットおよびK562細胞のリポフェクタミン仲介トランスフェクションに与える影響を示す棒グラフである。グラフはそれぞれ、ピーク発現点を示している。
発明の詳細な説明
本発明は、ペプチドまたは修飾ペプチドおよびカチオン脂質を用いることにより核酸を有する真核細胞をトランスフェクトする、改良された方法を提供する。改良は、カチオン脂質を媒介とするトランクフェクションの効率を向上させるためのペプチド−核酸複合体の使用に関連する。ペプチド−核酸複合体は、核酸に結合されたペプチド、またはDNA結合基に共有結合するように修飾され上記DNA結合基が核酸に結合されたペプチドを含む。本発明は、カチオン脂質を用いるトランスフェクションの従来の方法に対して有意な利点を有する。本発明のペプチドは、fusagenicペプチド、核ローカリゼーションペプチド、およびレセプター−リガンドペプチドを含む。レセプター−リガンドペプチドは、特に、細胞付着ペプチドの中でも、細胞標的ペプチド、インターナリゼーショントリガリングペプチド、およびエンドサイトーシストリガリングペプチドを含む。本発明において有用なペプチドは、融合のために機能するペプチド配列（fusagenic配列）、核ローカリゼーションのために機能するペプチド配列、またはレセプターへの結合を媒介するペプチド配列を含み得る。ペプチドは、これらの機能の１より多い機能を有する配列を含む多機能ペプチドであり得る。ペプチドは、必要に応じて、ポリアミンを含むDNA結合基に共有結合され、核酸と共に複合体を形成する。ペプチド複合核酸は、より効率的に細胞および細胞核に輸送され、それによりカチオン脂質を媒介とする細胞トランスフェクションの効率を向上させる。トランスフェクションの効率が改良されるために、効果的なトランクフェクションに要する核酸が大幅に少なくなる。本発明のトランスフェクション組成物は、核酸とペプチドまたは修飾ペプチドとの間の複合体形成のために、従来のカチオン脂質トランスフェクション組成物に比べて向上したトランスフェクションを提供する。
以下の定義は、本明細書および請求の範囲で用いられる。
用語「トランスフェクション」は、ここにおいて、概して、核酸が細胞内でその機能を保持するような様式で行われる、例えば真核細胞などの細胞への生物学的に機能的な核酸の送達および導入を意味する。本発明のトランスフェクション方法は、インビトロまたはインビボにおいて細胞に適用され得る。用語トランスフェクションは、細胞が核酸を発現させる能力を与えられるように、発現可能な核酸を細胞に送達および導入するという、より特定された意味を含む。発現という用語は、一過性の発現および安定した発現の両方を含む、細胞内の核酸の機能的存在に関する如何なる出現をも意味する。核酸は、天然および非天然基を含むいずれかのソースからのDNAおよびRNAの両方を含み、サイズの限定はない。核酸は、様々な生物学的機能を有し得る。核酸は、タンパク質をコードし、調節領域を含み、遺伝子またはRNA発現のインヒビター（例えば、アンチセンスDNAまたはRNA）として機能し、タンパク質のインヒビターとして機能し、細胞成長を阻止する又は細胞を殺すように機能し、反応を引き起こし、または診断又は他の分析アッセイ中で機能する。
トランスフェクション効率は、本明細書の実施例に記載する核酸の生物学的機能を測定するプロトコルを用いて、少なくとも約５パーセント、好適には約１０パーセント、より好適には約２０パーセントの向上が示されると、「向上する」。トランスフェクションは、本明細書に記載するように少なくとも約２倍（すなわち１００％以上）の効率向上が測定されると、実質的に向上する。
用語「DNA結合基」は、ここにおいて、概して、核酸と非共有結合（associate）する能力を有する、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたはポリアミンを意味するために用いられる。DNA結合基の、核酸への結合は、核酸配列に対して特異的であり得るし、または上記配列に対して非特異的であり得る。連結のメカニズムは、特定の結合基に依存するが、配列特異性は概して、結合基と標的DNAとの間の互いに好ましい相互作用のアンサンブルの結果起こる。いくつかのDNA結合基は、例えば、水素結合、塩橋、およびファンデルワールス力を含む直接接触を介してDNA塩基対および糖−リン酸鎖と相互作用する。他の基は、DNAとタンパク質との間の配列特異性水素結合からではなく、DNA中の配列特異性コンフォーメーション変化を介して機能する。用語「DNA結合基」は、結合のメカニズムにかかわらず、核酸を結合する能力を有する、如何なるタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたはポリアミンをも含むことが理解される。DNA結合基は、当該分野で知られており、商業的に広く入手可能である。
用語「ペプチド」は、ここにおいて、短ペプチド（代表的には、１００アミノ酸未満）、ポリペプチド（代表的には、１００アミノ酸を越える）およびタンパク質（１以上のポリペプチド鎖を有する）を広く含む包括的な用語として用いることが意図される。本発明のペプチドは、代表的には２を越えるアミノ酸を有し、好適なペプチドは、４を越えるアミノ酸を有する。
本発明のペプチドは、fusagenicペプチド（またはタンパク質）、核ローカリゼーションペプチド（またはタンパク質）、およびレセプター−リガンドペプチド（またはタンパク質）としての生物学的機能を有する。
本発明のレセプター−リガンドペプチドは、細胞表面膜または可溶レセプター分子に結合し、必要に応じて別の生物学的機能を有し、そして必要に応じてインターナリゼーションまたはエンドサイトーシスをトリガーするタンパク質またはペプチドを含む。レセプター−リガンドペプチドは、細胞付着ペプチド（およびタンパク質）および細胞標的ペプチド（およびタンパク質）を含む。
レセプター−リガンドペプチドは、付着性ペプチドを含む。付着性ペプチドは、代表的には、エンドサイトーシスをトリガーしない。付着性タンパク質は、フィブロネクチン、ビクロネクチン、テネイシン、ラミニン、コラーゲン、thrombospondins、フィブリノーゲンおよび機能的等価物を含む。表１は、付着性タンパク質およびペプチドを示す。
0004338106.tif 000002
付着性タンパク質のフラグメントは、表１に挙げるRGD含有ペプチド（RGDペプチド）を含む。CS-1ペプチドは、その配列を表１に示すが、カルボキシル末端ヘパリンIIドメインおよびタイプIII結合（connecting）セグメント（IIICS）（Wayner, E.A.ら、（1989）”Identification and Characterization of T Lymphocyte Adhesion Receptor for an Alternative Cell Attachment Domain（CS-1）in Plasma Fibronectin”J. Cell Biol. 109:1321-330）の一部を含むプラズマフィブロネクチンの38 kDトリプシンフラグメントから得られる。
レセプターリガンドペプチドはまた、インターナリゼーションおよび／またはエンドサイトーシスをトリガーするものを含む。例えば、ペントンベースは、インテグリンレセプター結合モチーフ、Arg-Gly-Asp（RGD）の５つの複製を含むアデノウイルスのペンタマーコートタンパク質である。ペントンベースは、ウイルスによって、インテグリンαvβ3とαvβ5とを結合するために用いられる。ファイバーコートタンパク質による細胞へのアデノウイルス付着（attach）の後、インテグリンレセプターは、宿主細胞へのウイルスのインターナリゼーションを媒介する。ペントンベース（野生型）RGD配列は、HAIRGGTFAT（SEQ ID NO:21）（Wickham, T. J.ら、（1995）Gene Therapy 2:750-756）である。
付着性ペプチドは、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞付着（attach）促進効果を複製または阻止し得るトリペプチド配列Arg-Gly-Aspを含むペプチド（Pierschbacher, M. D.、およびRuoslahti, E.（1987），J. of Biol. Chem. 262:17294-8）であるRGDペプチド、または同様の結合モチーフを有する他のペプチドを含む。
本発明のレセプター−リガンドペプチドは、インテグリンαvβ5に結合するペプチドなどの様々な細胞タイプ中で広く発現するレセプター分子に親和性を有する、又は結合するペプチドを含む。本発明のレセプター−リガンドペプチドはまた、限定された数の細胞タイプ中で特異的に発現する（例えば、組織特異性の）または特定の細胞タイプ（例えば、ある種のメラノーマおよびグリア芽細胞腫中で高度に発現する、インテグリンαvβ5に結合する細胞などの癌細胞）中において高度に発現するレセプター分子に結合するペプチドをも含む。
用語「修飾ペプチド」は、ここにおいて、概して、共有結合（attach）されたDNA結合基を含むように化学的に修飾されているペプチド（ペプチドまたはタンパク質）を意味する。用語「修飾ペプチド」は、ここにおいて、共有結合（attach）されたDNA結合基がポリアミンである「ポリアミン−ペプチド結合体」を含み、上記「ポリアミン−ペプチド結合体」は、DNA結合基がスペルミンである「スペルミン−修飾ペプチド」を含む。いくつかの場合には、ペプチド自体が核酸に結合し得、他の場合には、核酸への結合のため、または核酸への結合を向上させるためにペプチドの修飾が必要となる。当然、生じるペプチドまたはタンパク質は、スペルミンまたは他のポリアミンへの結合を可能にする追加の修飾を必要とする。例えば、結合を容易にするために、システインがペプチドのＣ末端またはＮ末端に添加され得るか、またはペプチド内に導入され得る。結合を容易にするために用いられるいずれのペプチド修飾も、好適にはペプチド結合にもペプチドの機能にも影響を与えるべきではない。
用語「ペプチド−核酸複合体」は、概して、ペプチドと核酸との間の非共有結合（attach）を意味する。この複合体のペプチドは、上記で定義したように修飾ペプチドであり得る。ここで用いられる「ペプチド−核酸複合体」は、トランスフェクション組成物に対するカチオン脂質の添加に先だって形成される。
「脂質集合体」は、単層および複層の全てのタイプのリポソームおよびベシクル、ミセルおよびよりアモルファスな集合体を含む包括的な用語である。カチオン脂質集合体は、好適には非カチオン脂質と組み合わされた、脂質集合体が正味の正電荷を有するために十分なカチオン脂質を含む脂質集合体である。カチオン脂質および脂質集合体は、本発明のペプチド−核酸複合体を集合する能力を有する。
用語カチオン脂質組成物は、一価のまたは多価のいずれでもあり得る、カチオン脂質またはカチオン脂質の混合物を含む組成物を含む。カチオン脂質組成物は、必要に応じて、中性脂質を含む。特に興味をひくのは、当該分野で、トランスフェクション方法において有用であると認められるカチオン脂質組成物である。好適なカチオン脂質組成物は、多価のカチオン脂質を含み、より好適であるのは、DOSPAおよびその類似体または相同体を含む組成物であり、最も好適なカチオニック組成物は、リポフェクタミンである。
トランスフェクション活性または効率は、細胞内のトランスフェクトされた核酸の存在を検出することにより測定される。これは、しばしば、細胞内の核酸の生物学的機能を測定することにより評価され、最もしばしば、トランスフェクトされた核酸中に含まれるレポーター遺伝子の一過性のまたは安定した発現のレベルを測定することにより評価される。レポーター遺伝子の発現は、特に、トランスフェクトされた核酸の量および細胞内のプロモーター機能に依存する。トランスフェクション活性はまた、トランスフェクトされているサンプルの中の細胞のパーセンテージを決定することにより、例えば、細胞カウントまたはインサイチュ染色方法を用いてレポーター遺伝子の発現を評価することによっても評価され得る。カチオン脂質と組み合わせたペプチドを用いる本発明のトランスフェクション方法は、相当するカチオン脂質のみを用いるトランスフェクションよりも大幅なトランスフェクションの向上（２倍以上）を示し得る。
本発明の方法は、ペプチド−核酸複合体（または修飾ペプチド−核酸複合体）およびカチオン脂質を含むトランスフェクション組成物を有する真核細胞に対する接触を含む。トランスフェクション組成物は、必要に応じて、非カチオン脂質、好適には中性脂質を含む。ペプチドは、ウイルス性のタンパク質のfusagenicペプチドであり得る。好適なfusagenicペプチドは、インフルエンザウイルスまたは小胞口内炎ウイルスのものである。ペプチドは、核ローカリゼーションシグナルペプチドであり得る。好適な核ローカリゼーションシグナルペプチドは、サルウイルス４０のものであり、特に、SV40ラージＴ抗原の核ローカリゼーション配列である。Kalderonら（1984）Cell 39:499、およびLandfordら（1986）Cell 46:575。本発明のペプチドは、レセプター−リガンドペプチドであり得る。好適なレセプター−リガンドペプチドは、細胞付着ペプチド、特にRGDペプチドである。DNA結合基に結合されたウイルス性タンパク質のペプチドを含む組成物をトランスフェクトすることが、特に好適である。好適なDNA結合基は、ポリアミン、特にスペルミンである。
本発明の向上したトランスフェクション方法は、サルウイルス４０からの原型核ローカリゼーションシグナルペプチドおよびインフルエンザからの原型核ローカリゼーションシグナルペプチド（HApep; E5およびK5両親媒性ペプチド）、小胞口内炎ウイルスからの原型核ローカリゼーションシグナルペプチド（Ｇタンパク質）、およびフィブロネクチンの細胞付着（attach）部位から取られたRGDペプチド（GRGDSPC）（SEQ ID NO:10）で示される。用いられてきたDNA結合基は、核酸の塩基対との非共有結合（association）を形成する能力を有するポリアミンである。本発明の向上したトランスフェクション方法を、原型DNA結合基であるスペルミンを用いて更に例示する。
いくつかの場合には、ペプチドは、核酸との直接非共有結合（association）または複合体を形成する。上記核酸複合体は、ペプチドとDNAの塩基対との間のコンホメーションまたは電荷相互作用の結果として形成される。ペプチド−核酸複合体は、適切な媒体中で自発的に形成される。これらのペプチド−核酸複合体を含むトランスフェクション複合体は、まず核酸とペプチドとを相互作用させ、次いで得られた複合体をカチオン脂質組成物に添加することにより調製される。
本発明のペプチドは、DNA結合基（修飾ペプチド）に共有結合されたとき、核酸との非共有結合（association）または複合体を形成し得る。この修飾ペプチド−核酸複合体は、DNA結合基とDNAとの間のコンホメーションまたは電荷相互作用の結果として形成される。例えば、原型スペルミン−ペプチド−核酸複合体は、スペルミンのアミンとDNAバックボーンのリン酸との間の電荷相互作用の結果として形成される傾向にある。修飾ペプチド−核酸複合体は、適切な媒体中で自発的に形成される。これらの修飾ペプチド−核酸複合体を含むトランスフェクション組成物は、まず核酸と修飾ペプチドとを相互作用させ、次いでカチオン脂質組成物を添加することにより調製される。ペプチド−核酸または修飾ペプチド−核酸複合体を含むトランスフェクション溶液は、その後、単独又は非カチオン脂質と組み合わされた状態でカチオン脂質と混合されて、ペプチド−核酸−脂質集合体を形成する。ペプチド−核酸−脂質集合体は、適切な媒体内で自発的に形成されるか、または所望のタイプの脂質集合体を生成するために様々なよく知られた技術が用いられ得る。カチオン脂質と非カチオン脂質との相対的量は、集合体が用いられる細胞および環境（例えば媒体）に対する脂質の毒性を含む、多くの要因に依存する。用いられる脂質の種類および量は、代表的には、細胞の毒性を最小にし且つトランスフェクション効率を最大にするためにバランスを取られる。
核酸の送達は、細胞標的、細胞付着または結合ペプチドの使用により向上され得る。RGD配列を含むペプチドが、DNA結合基として作用するポリカチオンスペルミンに結合された。
RGD−スペルミンペプチドは、細胞標的、より重要には細胞付着を介してトランスフェクションを向上させると考えられる。付着性タンパク質に対する、およびいくつかの場合においては他の細胞に対する付着は、しばしばインテグリンによって媒介される。細胞外マトリクス中および血液中に存在する多くの付着性タンパク質は、細胞認識部位としてトリペプチドアルゲニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）（Ruoslahti, E.およびPierschbacher, D.（1987）Science 238:491）を含む。細菌などの病原体、およびより特定すると、口蹄疫ウイルス（FMDV）（Masonら、（1994）、Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 1932-1936）およびアデノウイルス（Wickham, T. J.ら（1995）、”Targeting of adenovirus penton base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs”、Gene Therapy 2: 750-756）は、表面上に発現したタンパク質を含むRGDを有し、上記タンパク質は、宿主細胞上でインテグリンと相互作用してインターナリゼーションを容易にする。RGDおよびRGD−スペルミンペプチドは、リポフェクタミンを媒介とするトランスフェクションを向上させる。
ウイルス性ペプチドは、様々なよく知られた技術、例えば、Glushakova, S. E.ら（1985）”Influenza viral glycoproteins isolation using cationic detergent dodecylmethylammonium bromide and its subsequent internationalization into liposomal membrane”Mol. Genet. Microbiol. Virol. 4:39-44に記載のカチオニック洗剤DTABを用いて、単離され得る。あるいは、ウイルス性ペプチドは、様々な標準的化学合成方法により生成され得る。例えば、ウイルス性fusagenicペプチドは、例えば、Stewartら（1984）Solid Phase Peptide Synthesis、Pierce Chemical Company、Rockford、Illinoisに記載の自動化固相ペプチド合成を用いて合成され得る。例として挙げた赤血球凝集素ペプチド、K5およびE5両親媒性ペプチド、およびＧタンパク質を含む、インフルエンザおよび小胞口内炎ウイルスからのfusagenicペプチドが、本発明の方法において特に有用である。例として挙げたNLSペプチドを含む、サルウイルス４０からの核ローカリゼーションシグナルペプチドもまた、好適である。
修飾ペプチドは、様々なよく知られた結合（coupling）技術、例えば、本明細書の実施形態に記載のヘテロ二官能架橋試薬を用いて調製され得る。スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−SMPB）、ジスクシンイミジルスベレート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）、４−（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（SMPT）、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−LC−SPDP）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（LC−SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−SMCC）などのスクシンイミジル又はマレイミジル架橋剤、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−MBS）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−SIAB）、およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（SIAB）を含む様々な架橋試薬が、限定なく、当該分野において知られており商業的に広く入手可能である。ペプチドおよびポリアミンを結合する方法は、当該分野においてよく知られている。代表的な方法は、Staros, J. V.（1982）Biochemistry 21:3990に開示されている。
トランスフェクションにおいて用いられる媒体は、好適には、血清または高塩レベルなどの、カチオン脂質を媒体とする細胞のトランスフェクションを阻止し得るコンポーネントを有するべきではない。
様々なカチオン脂質が当該分野において知られている。概して、一価または多価のいずれの如何なるカチオン脂質もが、本発明の組成物および方法において用いられ得る。多価カチオン脂質が概して好適である。カチオン脂質は、アミン、アミドまたはその誘導体の飽和および不飽和のアルキルおよび脂環エーテルおよびエステルを含む。カチオン脂質の直鎖および分鎖アルキルおよびアルケン基は、１〜約２５炭素原子を含み得る。好適な直鎖または分鎖アルキルまたはアルケン基は、６以上の炭素原子を有する。脂環基は、約６〜３０炭素原子を含み得る。好適な脂環基は、コレステロールおよび他のステロイド基を含む。カチオン脂質は、特に、Cl-、Br-、Ｉ-、F-、アセテート、トリフルオロアセテート、硫酸塩、、亜硝酸塩、および硝酸塩を含む、様々な対イオン（アニオン）で調製され得る。
よく知られたカチオン脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）である。Felgner, P. L.ら、（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417を参照のこと。DOTMAおよび類似体ジエステルDOTAP（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３（トリメチルアンモニウム）プロパン）は一般的に入手可能である。DOTMAに構造的に関連する更なるカチオン脂質は、ここに参考のため全体を援用する米国特許第4,897,355号に記載されている。
DOTMAおよびDOTAPに関連した、他の有用なカチオン脂質の群は、通常DORIエーテルまたはDORIエステルと称される。DORI脂質は、トリメチルアンモニア（trimethylammonium）群のメチル群の１つがヒドロキシエチル群と置き換わっている点で、DOTMAおよびDOTAPと異なる。DORI脂質は、ホスホリパーゼＡのRosenthal阻害物質（RI）と類似している（Rosenthal、A.F.およびGeyer、R.P.（1960）J. Biol. Chem. 235:2202-2206）。DORI脂質のオレオイル群は、パルミトイル（palmitoyl）またはステアロイル（stearoyl）群などの他のアルキルまたはアルケン群と置き換えられ得る。DORIタイプ脂質のヒドロキシル群は、さらなる機能化（functionalization）、例えば、カルボキシスペルミンのようなアミンへのエステル化のための部位などとして使用され得る。
本発明の組成物および方法において採用され得るさらなるカチオン脂質（additional cationic lipids）には、1991年10月17日に発行された、PCT出願第WO 91/15501号、Pinnaduwage、P.ら（1989）、Biochem. Biophys. Acta. 985:33-37 ; Rose, J.K.ら（1991）、BioTechniques 10:520-525 ; Ito、A.ら（1990）Biochem, Intern, 22:235-241に、細胞のトランスフェクションのために有用と記載されるものが含まれる。
ポリリシンをDOPEと結合させることによって形成されるポリカチオン脂質（Zhou、X.ら（1991）、Biochem. Biophys. Acta 1065:8-14）、および他のリポポリリシンも、本発明の方法および組成物において採用され得る。
カルボキシスペルミンを含有するポリカチオン脂質も、本発明の組成物および方法において有用である。Behr、J-Pら（1989）、Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6982-6986およびEPO発行出願第304 111号（1990）は、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシル-アミド（DOGS）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミルアミド（DPPES）を含むカルボキシスペルミン含有カチオン脂質を記載している。さらなるカチオン脂質は、DOGSおよびDPPESのオクタデシルおよびパルミトイル群をそれぞれ、他のアルキルまたはアルケン群と置換することによって得られることができる。
本明細書においてその全体が参考として援用される米国特許第5,334,761号も、本発明において有用なカチオン脂質を記載している。
本発明のトランスフェクション組成物において、カチオン脂質は、非カチオン脂質、好ましくは中性脂質と随意に結合されて、修飾ペプチド核酸複合体に結合する脂質集合体を形成し得る。本発明において有用な中性脂質には、数多い中：レシチン；ホスホチジルエタノールアミン；DOPE（ジオレオイルホスファチジル-エタノールアミン）、POPE（パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；DOPC（ジオレオイルホスフィジルコリン）、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、POPC（パルミトイルオレオイル-ホスファチジルコリン）およびディステアロイルホスファチジルコリンなどのホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；DOPG（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、DPPG（ジパルミトイルホスファチジル−グリセロール）、およびジステアロイルホスファチジルグリセロールなどのホスファチジルグリセロール；ホスファチジル-セリン；ジオレオイル-またはジパルミトイル-ホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン；ジホスファチジルグリセロール；脂肪酸エステル；グリセロールエステル；スフィンゴ脂質；カルドリピン（cardolipin）；セレブロシド；セラミド、ならびにそれらの混合物が含まれる。中性脂質にはまた、コレステロールおよび他の3βOH-ステロールが含まれる。
本発明は、特定のペプチドまたは修飾ペプチドが、核酸で真核生物細胞のトランスフェクションの効率を有意に増強し得るという発見に基づいている。ペプチドまたは修飾ペプチドは、DNAと結合し、フサゲン（fusagenic）ペプチドとして機能、核局在化または細胞付着のために機能する。核酸への結合を増強するために必要または所望であれば随意に修飾され、取り込み誘発シグナル（internalization-triggering signals）またはエンドサイトーシス誘発シグナルとして機能するペプチドも、本発明のトランスフェクション法において機能する。本発明の組成物および方法は、トランスフェクション試薬を添加する前に核酸と結合した場合にトランスフェクションの効率を有意に向上する、随意にDNA結合群により共有結合的に修飾されたペプチドを含む。これらの結合された核酸は、細胞および細胞核へより効率的に輸送されるため、より少ない核酸出発材料を必要とする。本発明は、カチオン脂質送達システムを用いて例示しているが、フサゲンおよび核局在化ペプチドは、種々の公知の送達システムを用いたトランスフェクションを増強するのに効果的である。本発明は、従って、これらのペプチドを使用して、以下に限定されることなく、エレクトロポレーション（T.K. WongおよびE. Neumann（1982）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584およびE. Neumannら（1982）、EMBO J. 1:841）、リン酸カルシウム（F.L. GrahamおよびA.J. Vander Eb（1973）、Virology 52:456）、マイクロインジェクション（M.R. Capecchi（1920）22:479）、DNAでコートされた微小粒子を用いた弾道形質転換（ballistic transformation）（D.T. Tomesら（1990）、Plant Mol. Biol. Manual A13:1-22およびG.N. Yeら（1990）、Plant. Molec. Biol. 15:809）、DEAEデキストラン（A. VaheriおよびJ.S. Pagano（1965）、Science 175:434）、ならびにポリブレン（polybrene）-DMSO（S. KawaiおよびM. Nishizawa（1984）、Molec. Cell. Biol. 4:1172）などの他の送達手段を用いたトランスフェクションを増強することを意図している。
本発明のトランスフェクション組成物には、核局在化配列、フサゲンペプチド、もしくはポリカチオンに架橋された受容体リガンドペプチド配列を含むペプチドまたはタンパク質を用いて、真核生物細胞をトランスフェクトするための組成物が含まれる。核局在化配列、フサゲンペプチド、またはポリカチオンに架橋された受容体リガンドシグナルを有するペプチドも、本発明の一部である。好ましい架橋剤（crosslinker）には、例えば、ヘテロ二価性架橋剤が含まれる。ポリカチオンは、好ましくは、ポリアミン、最も好ましくはスペルミンである。先に記載したように、本発明のトランスフェクション組成物およびペプチドは、以下に限定されることなく、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、弾道形質転換、DEAE-デキストラン、およびポリブレン-DMSOを含む、広く種々の送達システムに対して有用である。従って、本発明は、核酸で真核生物細胞をトランスフェクトする方法を含み、この方法は、（１）ペプチドまたは修飾ペプチドを核酸と混合してペプチド-核酸複合体を形成する工程と、（２）工程（１）で得たペプチド-核酸複合体を、公知の送達手段を用いて細胞に導入する工程とを概して包含する。当業者であれば、本開示を含む、当該分野の一般知識に基づいて、過度な実験を要することなく、あらゆる送達システムによって、本発明の組成物およびペプチドを使用することができる。
当業者には、最適なトランスフェクションのために、多くのパラメータが重要であることが容易に理解されるであろう。これらのパラメータには、カチオン脂質濃度、カチオンおよび非カチオン脂質の相対量、核酸濃度、トランスフェクションに採用する媒体、細胞がトランスフェクション組成物とインキュベートする時間の長さ、採用するペプチドの量、採用するDNA結合群またはポリアミドの量、ならびにトランスフェクション組成物の成分を合わす手法が含まれる。トランスフェクトする各種類の細胞に対して、これらのパラメータを最適化することが必要であり得る。そのような最適化は、本明細書に記載のガイダンス、および本明細書中の実施例に記載のようにトランスフェクションアッセイを採用することにより常套手段となる。
本発明のトランスフェクション組成物を作成、および本発明のトランスフェクション方法を実施するために、本明細書に特に詳細に記載されているもの以外の代替の方法、試薬、手続き、および技術が採用、または容易に適合され得ることも当業者には明らかであろう。そのような代替の方法、試薬、手続き、および技術は、本発明の精神および範囲内にある。
本発明のトランスフェクション組成物および方法を、以下の限定することのない実施例においてさらに説明する。本明細書において使用する全ての省略形は、当該分野において標準の省略形である。実施例で詳細に説明していない特定の手続きは、当該分野においてよく知られている。
本明細書において参照する全ての発行物および特許は、それらの全体を参考として特に援用する。
実施例
実施例１：細胞培地およびプラスミド
ヒト初代繊維芽細胞（HPF）を新生児の包皮真皮（neonatal foreskin dermis）から単離し、本明細書において参考として援用されるHayley-Nelson、P.ら（1993）、Focus 15:73に記載のように調製し、最高20継代（20 passages）まで培地した。HT1080（ヒト線維肉腫細胞）、CHO-K1（中国ハムスター卵巣）、NIH/3T3（NIHスイスマウス胎芽、接触阻止繊維芽細胞）、K562（ヒト慢性骨髄性白血病）、Jurkat（急性Ｔ細胞リンパ腫、ヒト）、および新生ハムスター腎臓（BHK-21）細胞をAmerican Type Culture Collection（Rockville, MD）から得た。付着細胞（adherent cells）の培地を、10％（v/v）胎児ウシ血清（FBS）、100U／mLのペニシリン（PEN）、および100mg/mLのストレプトマイシン（STREP）を含有するダルベッコ改変イーグル媒体（DMEM）中で成長させた。培地を、0.25%（v/v）トリプシン、0.1mM EDTAを用いたコンフルエンス時で継代した（passaged at confluence）。懸濁細胞の培地（JurkatおよびK562）を、以下の実施例に記載のように成長させた。全ての培地試薬は、Gibco/BRL（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）から得た。
プラスミドベクターpCMVβgalおよびpCMVSPORTβgalは、サイトメガロウイルスプロモータの制御下でE.coliβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）遺伝子を含む既成品（それぞれ、Clontech, CAおよびG1B60-BRL）の哺乳動物レポーターベクター（mammalian reporter vector）である。MacGregorら（1989）、Nucleic Acids Res. 17:2365 ; Nortonら（1985）Mol. and Cell Biol. 5:281 ; Alam（1990）、Anal. Biochem. 188:245を参照。プラスミドDNAを標準塩化セシウム法によって精製した。
実施例２：ペプチドおよびペプチド-スペルミン結合体
ペプチドを、例えば、Stewartら（1984）、Solid Phase Peptide Synthesis、Pierce Chemical Company、Rockford、Illinoisに記載のように、自動固定相ペプチド合成を使用して合成した。ペプチドを、ポリアミド-珪藻土（kieselguhr）複合体樹脂およびMilliGen 9050ペプチド合成器（MilliGen/Biosearch、Burlington、MA）を用いて合成した。結合サイクル（coupling cycles）を、以下を含む製造者側の推奨に従って行った：9-フルオレニル-メチロキシ-カルボニル（Fmoc）アミノ酸をペンタフルオロフェニルエステル（-OPfpエステル）として活性化する、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の20%ピペリシンによってα-アミノ群を脱保護し、樹脂からペプチドを切削し95％トリフルオロ酢酸（TFA）によって脱保護し、沈殿させ、粗ペプチド（crude peptide）をエーテルで洗浄する。ペプチドを、Watersのシステムを用いて、Vy-Dac C（18）逆相カラム上で高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。移動相は、0.01%TFA含有95%水/アセトニトリルから、0.01%TFA含有25%水/アセトニトリルの勾配で構成されていた。ペプチド配列を、表１および２に示す
ペプチド-スペルミン結合体を、ヘテロ二価性架橋剤スルホ-SMPB（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を用いて調製した。簡単にいえば、100mg/mLスルホ-SMPB含有DMFを、50mMナトリウムホスファート緩衝液（pH7.5）を用いて20mg/mLにまで希釈した。50mg/mLスペルミン含有50mMナトリウムホスファート緩衝液を、次いで、スルホ-SMPB溶液に、モル比3:1で添加した。室温にて１時間後、反応混合液を、ナトリウムホスファート緩衝液を用いて画分化した（LH-20カラム）。最初の主要なピーク（スペルミン-MPB）を回収し、純粋粉末形態またはアセトニトリル/水溶液のいずれかで、1:1.5から1:2の比率で合成ペプチドと混合した。過剰ペプチドを、LH-20カラム上で水で溶離して分離した。ペプチド-スペルミン結合体は、使用するまで冷凍保存した。
実施例３：ヒト初代繊維芽細胞およびBHK-21細胞のトランスフェクション
トランスフェクションのために、細胞を処置の前日にトリプシン化し、24-ウェルプレートで１ウェルにつき８×104または１×105（ヒト繊維芽細胞）、もしくは２×104（BHK-21）細胞で再度平板培地した。細胞を、トランスフェクション前に、一度血清非含有DMEMでリンスし、0.25mL血清非含有DMEMを各ウェルに添加した。プラスミドDNAを、HEPES緩衝液、2,400mg/Lナトリウム重炭酸塩、ヒポキサンチン、チミジン、ナトリウムピルベート（pyruvate）、L-グルタミン、微量元素および成長因子（Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）媒体を含有する「OPTI-MEM」-I還元血清媒体（MEM（Eagleの）の改変）中で10mg/mLまで希釈し、室温にて30分間、種々の濃度（7〜470μM）の増強ペプチドと結合または複合させた。「LIPOFECTAMINE」（Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）を、「OPTI-MEM」-I（40〜400μg/mL）中で別々に希釈し、室温にて５分間インキュベートさせた。「LIPOFECTAMINE」は、ポリカチオン脂質、2,3-ジオレイルオキシ-N-［2（スペルミンカルボキシアミド）エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（DOSPA）、およびDOPEの3:1（w/w）混合液である。この予備インキュベーション期間の後、希釈したペプチドDNA複合体混合液を、同等体積の希釈されたトランスフェクション試薬と徐々に混合した。反応混合物を、室温にて30分間インキュベートし、ペプチド-DNA-脂質集合体を形成した。集合体を、次いで、血清非含有DMEMで６倍に希釈し、0.3mLの希釈された集合体を各ウェルに添加した。細胞を、37℃にてインキュベートした。約５時間後、１mLの成長媒体（13%FBSを含有するDMEM）を各ウェルに添加した。翌日、細胞をβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
実施例４：一過性トランスフェクションアッセイ
インサイチュ染色を用いて、β-ガラクトシダーゼ発現を証明した（Sanes, J.R.ら（1986）、EMBO J. 5:3133）。細胞をPBSでリンスし、2%（v/v）ホルマルデヒド中で５分間固定し、0.2%グルタルアルデヒド含有PBS、PBSで２度リンスし、0.1%X-gal（Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）、５mMフェロシアン化カリウム、５mMフェロシアン化カリウム、２mM MgCl2含有PBS中で１晩染色した。リンスした細胞を、Hoffman光学系を有するNikon逆転顕微鏡（inverted microscope）上の10×対物レンズを使用して写真を撮った。トランスフェクション効率を、β-gal陽性（青色に染色された）細胞の数を数えるまたは見積もることによって評価した。
溶解した細胞抽出物の酵素活性を使用して、異なる処置プロトコルから生じた発現レベルを比較した。トランスフェクションの１、２日後、細胞をPBSで一度リンスし、0.15〜0.25mL/ウェル 0.1%「TRITON」X-100（ｔ-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO；「TRITON」はUnion Carbide, Inc.の商標である）および0.lM Tris（pH8.0）中で-70℃にて冷凍した。37℃での急速な解凍後、遠心分離により溶解物質を取り除いた。溶解した細胞抽出物を、基本的にSambrookら（1989）、Molecular Cloning A Laboratory Manual、2ndEd.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、p.16.66に記載のような方法を採用して、β-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。簡単に言えば、2〜6μgタンパク質を含有するやや溶けやすい細胞抽出物を、１mM MgCl2、50mMβ-メルカプトエタノール、および0.88mg/mLのσ-ニトロフェニル-β-D-ガラカトピラノシド（galacatopyranoside）（ONPG）を含有する96-ウェルマイクロタイタープレート中の100μl 0.1Mナトリウムリン酸緩衝液（pH7.5）に添加した。10〜70ngβ-ガラクトシダーゼ（Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）の標準曲線をプレートに含めた。37℃にて５〜20分で黄色が発色した。150μl １M Na3CO2を添加して反応を止め；OD420をマイクロタイタープレートリーダの上で同定した。
実施例５：カチオン脂質およびウイルスペプチドを用いたヒト繊維芽細胞のトランスフェクション
実施例２に記載のように、以下のウイルスペプチドを自動固定相ペプチド合成を用いて合成した：インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ペプチドE5およびK5の膜融合領域（Kamata、H.ら（1994）、Nucleic Acids Res. 22:536-537を参照）；ヘマグルチニンペプチド、HApep（Epandら（1992）、Biopolymers 32:309を参照）；水疱性口内炎ウイルスＧ-タンパク質、VSVG（Schlegel, R.およびWade, M.（1985）J. Virol. 53:319を参照）；ならびにSV40 large Ｔ抗原の核局在化シグナル、NLS（Lanfordら（1986）、Cell 46:575を参照）。実施例12および13のRGDペプチドも、実施例２と同様に合成した（Ruoslahti, E.およびPierschbacher, D.（1987）Science 238:491）。
ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿上で１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクションの前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。「OPTI-MEM」-I媒体の２つの25μlアリコート（一方は、３μg「LIPOFECTAMINE」を含有し、他方は0.2μgのpCMVβgal DNAを含有する）を合わせて、室温にて30分間複合体を形成した。ペプチドを、最終濃度の250×のジメチルスルホキシド（DMSO）中で溶解した（表１を参照）。１μlペプチド溶液を、250μl血清非含有DMEMトランスフェクション媒体に添加、およびリンスした細胞に添加した。E5、K5、HApep、およびVSVGの１つ、ならびに互いと合わせたE5＋K5およびVSVG＋K5を含有する処置を、ペプチドを含有しない（「LIPOFECTAMINE」＋DNAのみ）トランスフェクション試料と比較した。２つのペプチドを合わせた処置では、E5、K5、およびVSVGは全て５μMの濃度で用いた。DNA-脂質は、「OPTI-MEM」-I中のDNA-脂質集合体を、次いで、細胞上に添加ペプチドを有したトランスフェクション媒体に添加した。37℃での24時間のインキュベーションの後、実施例４に記載のように、細胞を収穫、抽出、およびβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
図１に示すように、コントロールと比較して、HApepならびにVSVGおよびE5の組合わせを除いてはトランスフェクションの増強が比較的小さいことを認めた。VSVG＋E5の組合わせは、「LIPOFECTAMINE」のみの場合と比べて２倍を上回る増強を示した。最適なトランスフェクションを生じたペプチド濃度を表２に示す。
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実施例６：カチオン脂質およびスペルミン-ペプチド結合体を用いたヒト繊維芽細胞のトランスフェクション
NLSおよびVSVGペプチド（実施例５）を、N-またはC-末端位においてシステインで合成し、次いで、実施例２に記載のようにスペルミンと結合した。これらのスペルミン-ペプチド結合体を、次いで、共有結合的に結合したスペルミンのトランスフェクションの効率に対する効果を同定するために評価した。ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェルプレートで１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクション前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。0.15mMスペルミン修飾ペプチドの水溶液を調製し、6μg/mLのDNAを含有する「OPTI-MEM」-Iを用いてそれぞれを50μM濃度まで希釈し、次いで室温にてインキュベートした。15分後、120μg/mL「LIPOFECTAMINE」を含有する同等体積の「OPTI-MEM」-Iを添加し、混合液を30分間インキュベートして複合体形成を行った。「OPTI-MEM」-I中のこれらの複合体を、血清非含有DMEMで６倍に希釈し、0.3mLの希釈複合体を各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーション後、10%（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、細胞を固定し、X-galで染色した。発現レベルを観察により見積もり、ペプチドなしのピーク「LIPOFECTAMINE」トランスフェクションレベルの何倍の増強であるかを報告した。結果を表３に示す。表３に示すように、スペルミンのNLSおよびVSVGペプチドへの共有結合的な結合によって、カチオン脂質トランスフェクションの効率に有意な増強が生じる。
0004338106.tif 000004
スペルミン-NLSおよびスペルミン-VSVG結合体を、増強のための最適濃度を同定するためにさらにテストした。ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿で１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクションの前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。「OPTIMEM」-I媒体の25mLアリコートを２つ調製した；一方は3μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、２つ目は0.2μgのpCMVβgal DNAを含有した。スペルミン-ペプチド結合体を、それらの最終濃度の25倍に水中で溶解した。10μlのスペルミン-ペプチド溶液を、「OPTI-MEM」-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」溶液を、次いで、DNA-ペプチド溶液に添加し、混合液を室温にて30分間インキュベートし、複合体形成を行った。複合体溶液を血清非含有DMEMで0.3mLにまで希釈し、各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーションの後、10%（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、細胞を収穫し、溶解し、溶解細胞抽出物をβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を表２に示す。表２に示すように、トランスフェクション媒体中のスペルミン-修飾ペプチドの最終濃度は５から17μMの場合（DNAでの予備インキュベーションで５〜10倍高い濃度）が最適であると認められた。
実施例７：ヒト初代繊維芽細胞のトランスフェクションについてのペプチド、スペルミン-ペプチド結合体、およびスペルミン/ペプチド混合液の比較
NLSおよびVSVGペプチド（実施例５）を、N-またはC-末端位におけるさらなるシステインと合成し、次いで、実施例２に記載のように、スペルミンと結合した。これらのスペルミン-ペプチド結合体を、次いで、対応するスペルミン/ペプチド混合液と比較して、トランスフェクションの増強について評価した。ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に24-ウェル皿上で１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクション前に、血清非含有DMEMで細胞をリンスした。「OPTIMEM」-I媒体の25μlアリコートを２つ調製した（一方は３μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、２つ目は0.2μgのpCMVβgal DNAを含有した）。スペルミン-ペプチド結合体、またはスペルミンを含有するまたは含有しないペプチドの混合物を、それらの最終濃度の25倍で水中で溶解した。10μlのペプチドを、「OPTI-MEM」-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」溶液を、次いで、DNA-ペプチド溶液に添加し、室温にて30分間インキュベートし、複合体形成を行った。複合体溶液を、血清非含有DMEMで0.3mLにまで希釈し、各ウェルに添加した。37℃にて約５時間のインキュベーションの後、10%（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、細胞を収穫し、溶解し、溶解細胞抽出物をβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を図３に示す。図３に示すように、非結合ペプチドへのスペルミンの添加はトランスフェクションを増強しない。驚くことに、末端スペルミン残留のないNLSペプチドの添加は、「LIPOFECTAMINE」を添加する前にDNAと複合化した場合には、スペルミン-NLS結合体と同等またはそれ以上にトランスフェクションを増強した。
実施例８：ヒト初代繊維芽細胞のトランスフェクションに対する試薬の順序（order）の影響
スペルミン-NLSおよびスペルミン-VSVGペプチドを、実施例２に記載のように合成した。スペルミン-修飾ペプチドとDNAとの複合体形成のトランスフェクションに対する影響をテストするために、試薬の添加順序を変えたことを除いて、トランスフェクションプロトコルは、実施例３に記載の通りであった。結果を図４に示す。
ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿上で１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクションの前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。「OPTI-MEM」-I媒体の25μlアリコートを２つ調製した（一方は、３μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、他方は0.2μgのpCMVβgal DNAを含有する）。スペルミン-修飾-ペプチド-DNA複合体を形成するために、スペルミン-ペプチド結合体を、その最終濃度の25倍で水中で溶解し、次いで、10μlのペプチド溶液を「OPTI-MEM」-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。試薬について、添加順序の影響をテストするために、ペプチドをまず、「OPTI-MEM」-I中の希釈された「LIPOFECTAMINE」に添加し、DNA溶液と混合する前に、室温にて15分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」/ペプチド溶液を、次いで、DNA溶液に添加し、室温にて30分間インキュベートし、脂質-DNA複合体形成を行った。複合体溶液を、血清非含有DMEMで0.3mLまで希釈し、各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーションの後、10％（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、細胞を収穫し、溶解し、溶解した細胞抽出物をβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を、図４に示す。図４に示すように、DNAとの複合化の前のトランスフェクション脂質へのスペルミン-ペプチド結合体の添加は、トランスフェクションの効率を下げる。
実施例９：スペルミン修飾ペプチドまたはポリ-Ｌ-リシンおよびカチオン脂質を用いたヒト初代繊維芽細胞のトランスフェクション
スペルミン-NLSペプチドを、実施例２に記載のように合成した。ポリ-Ｌ-リシン（MW 5200）をSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した。トランスフェクションに対するポリ-アミノ酸/DNA複合体の効果を、スペルミン-ペプチド-DNA複合体の効果と比較するためにポリ-Ｌ-リシンを使用したことを除いては、トランスフェクションプロトコルは、実施例３に記載の通りであった。ヒト繊維芽細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿上で１ウェルにつき８×104で平板培地した。トランスフェクションの前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。「OPTI-MEM」-I媒体の25μlのアリコートを２つ調製した（一方は、３μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、他方は0.2μgのpCMVβgal DNAを含有する）。スペルミン-結合NLSおよびポリ-Ｌ-リシンを、それらの最終濃度の25倍で水中で溶解した。10μLのペプチドを、OPTI-MEM-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」溶液をDNA-ペプチド溶液に添加し、室温にて30分間インキュベートし、脂質-DNA-ペプチド複合体形成を行った。複合体溶液を、血清非含有DMEMで0.3mLにまで希釈し、各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーションの後、10%（v/v）FBSを含有する1mLのDMEMを各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、細胞を収穫し、溶解し、溶解した細胞抽出物をβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を図５に示す。図５に示すように、脂質トランスフェクション試薬との複合体形成前のDNAとの0.1mMのポリ-Ｌ-リシン（MW5200）の複合体形成により、DNAに予備複合体化したスペルミン-NLSと少なくとも同等にトランスフェクションを増強した。
実施例10：スペルミン-NLS結合体およびカチオン脂質を用いたBHK-21細胞のトランスフェクション
実施例２に記載のように、スペルミン-NLSペプチドを合成した。複合体の濃度を変えたことを除いては、トランスフェクションプロトコルは、実施例３に記載の通りであった。BHK-21細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿上で１ウェルにつき２×104で平板培地した。トランスフェクション前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。各ウェルに、0.25mL血清非含有DMEMトランスフェクション媒体を供給した。「OPTI-MEM」-I媒体の25μlアリコートを２つ調製した（一方は、３μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、２つ目は0.4μgのpCMVβgal DNAを含有する）。スペルミン-ペプチド結合体を、それらの最終濃度の25倍で水中で溶解した。10μlのペプチドを、「OPTI-MEM」-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。DNA-ペプチド溶液に「LIPOFECTAMINE」溶液を添加し、室温にて30分間インキュベートし、複合体形成を行った。1:4および1:10に希釈された50μlの全強（full-strength）複合体および複合体を、各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーションの後、13%（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを添加した。翌日、実施例４に記載の通り、細胞を収穫、溶解し、溶解した細胞抽出物を、β-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を図６に示す。図６は、希釈複合体の用量反応範囲（dose-response）にわたるピーク発現レベルを示す。図６に示すように、脂質トランスフェクション試薬との複合体形成前のDNAとのスペルミン-NLSの予備複合体形成により、より少ない合計DNAで増強したトランスフェクションが可能となる。
実施例11：スペルミン-VSVG結合体およびカチオン脂質を用いたBHK-21細胞のトランスフェクション
実施例２に記載のようにスペルミン-VSVGペプチドを合成した。複合体の濃度を変えたことを除いては、トランスフェクションプロトコルは、実施例３に記載の通りであった。BHK-21細胞を、トランスフェクションの前日に、24-ウェル皿上で１ウェルにつき２×104で平板培地した。トランスフェクションの前に、細胞を血清非含有DMEMでリンスした。各ウェルに、0.25mLの血清非含有トランスフェクション媒体を供給する。「OPTI-MEM」-I媒体の25μlのアリコートを２つ調製した（一方は３μgの「LIPOFECTAMINE」を含有し、２つ目は0.4μgのpCMVβgal DNAを含有する）。スペルミン-VSVG結合体を、それらの最終濃度の25倍で水中で溶解した。20μlペプチドを「OPTI-MEM」-DNAアリコートに添加し、室温にて15分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」溶液をDNA-ペプチド溶液に添加し、室温にて30分間インキュベートし、複合体形成を行った。1:4および1:10に希釈された50μlの全強（full-strength）複合体および複合体を、各ウェルに添加した。37℃での約５時間のインキュベーションの後、10%（v/v）FBSを含有する１mLのDMEMを添加した。翌日、実施例４に記載の通り、細胞を収穫し、溶解し、溶解した細胞抽出物を、β-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を図７に示す。図７は、希釈複合体の用量反応範囲にわたるピーク発現レベルを示す。図７に示すように、脂質トランスフェクション試薬との複合体形成前のDNAとのスペルミン-VSVGの予備複合体形成によって、より少ない合計DNAで増強したトランスフェクションが可能となる。
実施例12：RGD-スペルミンペプチドを用いた、BHK-21、HT1080、CHO-K1、NIH/3T3、およびヒト繊維芽細胞（HPF）のトランスフェクション
トランスフェクションのため、細胞を、処置の前日にトリプシン処理し、24-Falconプレート上で１ウェルにつき６×104細胞で再度平板培地した。細胞を、トランスフェクション前に血清非含有DMEMで一度リンスし、0.25mLの血清非含有DMEM＋必須ではないアミノ酸（NEAA）を各ウェルに添加した。プラスミドDNAを、「OPTI-MEM」-I（Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）中で8.0μg/mLまで希釈した。各ウェルに、25μLの希釈されたDNAを、滅菌丸底96ウェルコースタープレートの適切なウェルに添加した。適切なウェルに、種々の濃度のRGD-スペルミンペプチド（０〜12μg/ウェル）が、室温にて30分間DNAと複合体化が可能であった。RGD-スペルミンペプチドの配列は以下の通りである：GRGDSPC-スペルミン。「LIPOFECTAMINE」（GIBCO/BRL:Life Technologies, Inc.）を、個別に「OPTI-MEM」-I（０〜1.5μL）で希釈し、室温にて10分間インキュベートした。「LIPOFECTAMINE」は、ポリカチオン脂質、2,3-ジオレイルオキシ-N-［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミナムトリフルオロアセテート（DOSPA）、およびDOPEの3:1（w/w）混合液である。この予備インキュベーション期間の後、同等体積の希釈したトランスフェクション試薬を、希釈したペプチド-DNA複合体混合液と徐々に混合した。反応混合液を、室温にて、30分間インキュベートし、ペプチド-DNA-脂質集合体を形成した。集合体を、次いで、0.25mLの血清非含有DMEM＋NEAAを含有する24-ウェルプレートの適切なウェルに移す；細胞を37℃でインキュベートする。約５時間後、１mL修飾成長媒体（DMEM＋NEAA＋13% FBS、NIH/3T3細胞、DMEM＋NEAA＋13%子ウシ血清）を各ウェルに添加した。翌日、実施例４に記載のように、β-ガラクトシダーゼ活性について細胞をアッセイした。
結果を、種々の付着細胞株におけるピーク発現レベルを図示する図8A〜8Eに示す。「LIPOFECTAMINE」のみの場合に対する比較増強倍数を表４に示す。
実施例13：RGD-スペルミン増強ペプチドを用いたJurkatおよびK562細胞のトランスフェクション
プラスミドDNAを、「OPTI-MEM」-I（Gibco/BRL : Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）中で８μg/mLにまで希釈した。個別の遠心分離チューブに、100μLの希釈DNAを適切なチューブに添加した。各チューブに、０または12μgのRGD-スペルミンペプチドを添加し、室温にて30分間インキュベートした。24-ウェルプレートの適切なウェルに、0.1mL「OPTI-MEM」-I還元血清媒体、および0.4または0.8μのいずれかの「LIPOFECTAMINE」試薬を添加し、室温にて10分間インキュベートした。同時に、細胞を数え、回収し、トランスフェクションの前に「OPTI-MEM」-Iでリンスした。ペプチド-DNA-脂質複合体を形成するために、遠心分離チューブの内容物を、プレートの適切なウェルに移し、室温にて30分間インキュベートした。各ウェルに、「OPTI-MEM」-I中に４×105細胞を含有する40μLの細胞懸濁液を添加し、37℃にてインキュベートした。約４時間後、0.4mLの成長媒体（RPMI 1640＋15% FBS）を各ウェルに添加した。Jurkat細胞に、最終濃度がそれぞれμ/mLおよび50mg/mLのPHA（フィタヘマグルチニン、Sigma）およびPMA（ホルボールミリスチン酸アセテート、Sigma）を、トランスフェクションの後に媒体に添加し、プロモータ活性および遺伝子発現を増強した。K562細胞は、プロモータ活性の増強のためにPMAのみを必要とした。
トランスフェクトされた細胞によって発現されたβ-ガラクトシダーゼの量を定量するために、0.1%「TRITON」X-100を含有する0.1M Tris-HCL（pH8.0）中に細胞を直接収穫した。遠心分離により細胞抽出物を取り除き、ONPG基質を用いて、実施例４に記載のようにアリコートをアッセイした。
結果を、懸濁細胞株、K562およびJurkat細胞のそれぞれのピーク発現レベルを図示する図9Aおよび9Bに示す。「LIPOFECTAMINE」のみの場合に対する比較増強倍数を表４に示す。
0004338106.tif 000005
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ライフテクノロジー、インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：ペプチド増強カチオン脂質トランスフェクション
（iii）配列数：21
（iv）連絡住所：
（A）名称：グリーンリー，ウィナー アンド サリバン，ピー.シー.
（B）番地：5370マンハッタン サークル，スイート201
（C）市：ブールダー
（D）州：コロラド
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：80303
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換機
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース ナンバー1.0，バージョン ナンバー1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：未付与
（B）出願日：1996年６月４日
（C）分類：
（vii）先願の出願データ：
（A）出願番号：US 08/477,354
（B）出願日：1995年６月７日
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：カルサーズ，ジェニー エム.
（B）登録番号：34,464
（C）照会／記録番号：32-95A
（ix）電話回線情報：
（A）電話：（303）499-8080
（B）テレファックス：（303）499-8089
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：20アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号１：
0004338106.tif 000006
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：20アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号２：
0004338106.tif 000007
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：20アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号３：
0004338106.tif 000008
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号４：
0004338106.tif 000009
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：12アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号５：
0004338106.tif 000010
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：13アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（iv）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：改変部位
（B）存在位置：1..13
（D）他の情報：産物＝「システイン」
/標識＝改変
/注＝「Ｃ末端システインはスペルミンに結合することにより共有的に改変されている」
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号６：
0004338106.tif 000011
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：10アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：改変部位
（B）存在位置：1..10
（D）他の情報：/産物＝「システイン」
/標識＝改変
/注＝「C末端システインはスペルミンに結合することにより共有的に改変されている」
（xi）配列：配列番号７：
0004338106.tif 000012
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：13アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：改変部位
（B）存在位置：1..13
（D）他の情報：産物＝「システイン」
/標識＝改変
/注＝「Ｎ末端システインはスペルミンに結合することにより共有的に改変されている」
（xi）配列：配列番号８：
0004338106.tif 000013
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：改変部位
（B）存在位置：1..7
（D）他の情報：/産物＝「システイン」
/標識＝改変
/注＝「C末端システインはスペルミンに結合することにより共有的に改変されている」
（xi）配列：配列番号９：
0004338106.tif 000014
（2）配列番号10の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号10：
0004338106.tif 000015
（2）配列番号11の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号11：
0004338106.tif 000016
（2）配列番号12の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号12：
0004338106.tif 000017
（2）配列番号13の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号13：
0004338106.tif 000018
（2）配列番号14の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号14：
0004338106.tif 000019
（2）配列番号15の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号15：
0004338106.tif 000020
（2）配列番号16の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号16：
0004338106.tif 000021
（2）配列番号17の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：領域
（B）存在位置：1..4
（D）他の情報：/注＝「４位のXaaは種々のアミノ酸であり得る」
（xi）配列：配列番号17：
0004338106.tif 000022
（2）配列番号18の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号18
0004338106.tif 000023
（2）配列番号19の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号19
0004338106.tif 000024
（2）配列番号20の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：25アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：なし
（xi）配列：配列番号20
0004338106.tif 000025
（2）配列番号21の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：10アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：無関係
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：なし
（v）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列：配列番号21
0004338106.tif 000026
【図１】
0004338106.tif 000027
【図２】
0004338106.tif 000028
【図３】
0004338106.tif 000029
【図４】
0004338106.tif 000030
【図５】
0004338106.tif 000031
【図６】
0004338106.tif 000032
【図７】
0004338106.tif 000033
【図８Ａ】
0004338106.tif 000034
【図８Ｂ】
0004338106.tif 000035
【図８Ｃ】
0004338106.tif 000036
【図８Ｄ】
0004338106.tif 000037
【図８Ｅ】
0004338106.tif 000038
【図９Ａ】
0004338106.tif 000039
【図９Ｂ】
0004338106.tif 000040