(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアン化合物分解能を有するバークホルデリア・グラディオリ F7B4 株（FERM P−17743）又はCDC gr.IV C-2 F4B4 株（FERM P−17742）に属する微生物。
【請求項２】
シアン化合物が金属シアノ錯体又はニトリル化合物である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
金属シアノ錯体が鉄シアノ錯体又はニッケルシアノ錯体である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
ニトリル化合物がジニトリルである請求項２記載の微生物。
【請求項５】
シアン化合物を含有する土壌、排水又は地下水に、請求項１乃至４のいずれかの項記載の微生物又はこれらの混合微生物を添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法。
【請求項６】
シアン化合物が金属シアノ錯体又はニトリル化合物である請求項５記載の処理方法。
【請求項７】
金属シアノ錯体が鉄シアノ錯体又はニッケルシアノ錯体である請求項６記載の処理方法。
【請求項８】
ニトリル化合物がジニトリルである請求項６記載の処理方法。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれかの項記載の微生物又はこれらの混合微生物を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シアン化合物分解微生物に関し、さらに、該微生物を用いてシアン化合物（例えば鉄シアノ錯体、ニッケルシアノ錯体、ニトリル化合物等）を含有する土壌、排水又は地下水を処理する方法に関する。さらに、本発明は、シアン化合物分解微生物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアン化合物を含有する土壌、排水及び地下水はその毒性により生態系に悪影響を及ぼすため、これらの土壌、排水及び地下水を環境中へ放出するには、その中に含まれているシアン化合物（シアンイオン(CN-)又は金属錯体として存在する）を処理して無害化する必要がある。
【０００３】
排水中のシアンイオン又は金属シアノ錯体を処理する技術としては、物理化学的手法及び微生物による生物学的手法が挙げられる。前者の方法として、難分解性の鉄シアノ錯体を含有する排水の処理をするため、紫外線〜可視光線を照射して易分解性の遊離シアンに分解したのち、酸化処理する方法（特開平10-118664号公報）、あるいは第一鉄塩と第二鉄塩とを添加し、アルカリ剤によりpHを調整することで難溶性の鉄シアノ錯体を形成させ沈殿除去した後、活性汚泥を用いて未反応のシアンイオンを分解除去する方法が開示されている（特開平10-57974号公報）。また、後者の方法として、バチリス・ズブチリス・クボタという微生物を用いてシアンイオンを生物的に分解除去する方法（特開平1-293195号公報）、あるいはニッケルシアノ錯体について、その分解菌であるフザリウム・オキシスポルムを用いて処理する方法が知られている（特開平10-262651号公報）。
鉄シアノ錯体は難分解性であるため、土壌、排水又は地下水から速やかに除去することが望まれ、さらに環境問題やコスト的な観点から、環境負荷及び処理コストが比較的少ない生物処理技術をさらに開発することが望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、シアン化合物分解微生物を提供することを目的とし、さらに該微生物を用いてシアン化合物を含有する土壌、排水又は地下水を処理する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、シアン化合物分解微生物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、土壌からシアン化合物分解能を有する微生物を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
なお、本発明において「シアン化合物」とは、無機シアン化合物及び有機シアン化合物のいずれをも意味する。
【０００６】
すなわち、本発明は、シアン化合物分解能を有するバークホルデリア・グラディオリ又は CDC gr.IV C-2に属する微生物である。そして、バークホルデリア・グラディオリに属する微生物としてはバークホルデリア・グラディオリ F7B4 株が、 CDC gr.IV C-2に属する微生物としてはCDC gr.IV C-2 F4B4株がそれぞれ挙げられる。これらの菌株は金属シアノ錯体を始め、遊離シアンやニトリル類等多くのシアン化合物を窒素源として資化し得るものである。
【０００７】
さらに、本発明は、シアン化合物を含有する土壌、排水又は地下水に、上記微生物又はこれらの混合微生物を添加することを特徴とする土壌、排水又は地下水の処理方法である。
さらに、本発明は、上記微生物又はこれらの混合微生物を含む、土壌、排水又は地下水用の処理剤である。
【０００８】
さらに、本発明は、土壌をシアン化合物を窒素源として含有する培地に懸濁して集積培養し、得られる培養物をシアン化合物を含有する寒天プレートに塗布し、該寒天プレート上に形成されるコロニーとしてシアン化合物分解能を有する微生物を採取することを特徴とする該微生物のスクリーニング方法である。そして、この微生物としては例えばバークホルデリア・グラディオリ F7B4 株、CDC gr.IV C-2 F4B4株が挙げられる。
【０００９】
上記各発明におけるシアン化合物としては金属シアノ錯体、ニトリル化合物等が挙げられ、また、金属シアノ錯体としては鉄シアノ錯体又はニッケルシアノ錯体が、ニトリル化合物としてはジニトリルがそれぞれ挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物（菌又は菌株ともいう）は、シアン化合物、例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等を分解することにより土壌、排水又は地下水を無害化することのできるものである。ここで、金属シアノ錯体とは、錯体中の中心原子となる遷移金属に配位子CNが金属の酸化状態に応じた数や構造で配位してできる化合物を意味し、その例としては鉄シアノ錯体、ニッケルシアノ錯体、銅シアノ錯体、コバルトシアノ錯体等が挙げられる。
１．本発明の微生物を単離（スクリーニング）するための概要を、シアン化合物の一つであって、金属シアノ錯体の範疇に属する鉄シアノ錯体を例に説明する（図8)。
【００１１】
日本国内の各地点から土壌を採取し、1.0mMの鉄シアノ錯体入りFeCN基本培地〔組成(1l中)：K４[Fe(CN)６] 1.0mM,  グルコース0.25％，KH２PO４ 0.15 ％, Na２HPO４ 0.35％, NaCl 0.025％, MgSO４・7H２O 0.001％, FeCl３・6H２O 0.001 ％, ビタミン混合物((1l中)Ca- パントテン酸 400mg, イノシトール 200mg, ナイアシン 400mg, パラ- アミノ安息香酸 200mg, ピリドキシン塩酸塩 400mg, チアミン 400mg, ビオチン 400mg, ビタミン B１２ 0.5mg )0.1 ％〕（pH 7.2)5 ml に懸濁し、30℃で2週間培養する。この培養液を植菌し、同様の培地で同様の培養条件で2回繰り返す(図8(a)) 。3回目の同培養液をK４[Fe(CN)６] 1.0mM を含む寒天培地上に移してコロニーを形成させる。(図8(b)) 。
【００１２】
そして、単一のコロニーを形成した菌を鉄シアノ錯体入りFeCN基本培地に移して培養した後（図８(c))、鉄シアノ錯体分解試験に供し、鉄シアノ錯体の高分解能を有すると認められた単一菌の同定を行う（図8(d)) 。
単一菌の同定は、公知の任意の手法を用いることにより行うことができる。例えば、形態観察、生理的性状及び基質資化能等の分析試験による手法を用いて同定する。
【００１３】
２．本発明の微生物の菌学的性質
本発明において単離された微生物を、形態・性状等により同定した。本発明の微生物の菌学的性質を表１に示す。
【００１４】
【表１】
0004303391.tif 000002
【００１５】
以上の諸性質を P.R.Murray et al.,Manual of clinical Microbial 6ｔｈed .,ASM Press,1995及びE.Yabuuch et al., Microbial.Immunol., 36, 1251-1275, 1992   に基づいて検索したところ、分離株F4B4は鞭毛の着生状況が周毛であることから Alcaligenes( アルカリゲネス) 属に属する菌群と考えられ、生理性状試験からは A.faecalis, A.denitrificans, CDC gr.IV C-2 などが示唆されますが、MacConkey 寒天での生育陽性、炭水化物の利用性陰性、ＴＳＩ寒天で硫化水素非産生であることからCDC gr.IV C-2 が最も近縁な菌群と考えられる。
【００１６】
分離株F7B4は生理性状試験から以前Pseudomonas ( シュードモナス) 属に属していた Burkholderia cepacia(バークホルデリア・セパシア), B. gladioli( バークホルデリア・グラディオリ) 等が示唆されるが、オキシダーゼ陰性、黄色色素非産生の点からBurkholderia gladioli がより妥当性があり、Burkholderia gladioli( バークホルデリア・グラディオリ) と同定した。
【００１７】
CDC gr.IV C-2 F4B4株は、F4B4株として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に平成12年２月23日付で寄託しており、その寄託番号は、FERM P-17742であり、バークホルデリア・グラディオリF7B4株についてはF7B4株として同日付けで同研究所に寄託しており、その寄託番号は、FERM P-17743である。
本発明においては、上記F4B4株及びF7B4株の他、これらの菌株を自然的又は人工的手段によって変異させて得られる変異株であっても、前記したシアン化合物分解能を有するものはすべて本発明に包含される。
【００１８】
２．土壌、排水又は地下水の処理方法
本発明の微生物はシアン化合物の分解活性を有するため、シアン化合物（例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等）、を含有する土壌、排水又は地下水の処理（浄化）に使用することができる。
【００１９】
本発明の微生物を土壌、排水又は地下水の処理に使用するには、その処理に必要とされる量まで増殖させておくことも考えられる。本発明の微生物を増殖させるには、通常の培養法が挙げられる。培養は、好気的条件で行うことが好ましく、無機塩、窒素源、その他栄養源を含む無機栄養培地、有機栄養培地等に本発明の微生物を接種し、例えば振盪培養法、通気攪拌培養法などにより培養を行う。上記培養における温度条件は、使用する微生物の生育温度の範囲(例えば 10 〜50℃)、好ましくは最適生育温度の範囲(20〜40℃)に設定することができる。なお、培地のpHは6.0〜8.0の範囲に設定すればよい。
【００２０】
無機塩として培地に添加する物質としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、アンモニウム塩、リン酸塩、その他微量金属塩が挙げられる。また、窒素源としては、例えばヘキサシアノ鉄（II）酸カリウム3水和物、ヘキサシアノ鉄（III）カリウムやテトラシアノニッケルカリウム等の金属シアノ錯体を始めとするシアン化合物が挙げられる。これらの窒素源は１種でもよく、２種以上を適宜組合わせて用いてもよい。さらに、本発明の微生物の増殖を促進するための栄養源として、グルコース、エタノール、グリセロール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトンなどを適量添加することもできる。
培養時間は、シアン化合物（例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等）の量やグルコース等の栄養源の量により異なるが、6 〜50日間、好ましくは10日間以上である。
【００２１】
本発明において分解処理の対象となる土壌、排水又は地下水は、ヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム３水和物、テトラシアノニッケルカリウム等の金属シアノ錯体やニトリル化合物等を含むものである。上記シアン化合物が含まれる土壌又は排水（めっき工場、選鉱製錬所、鉄鋼熱処理工場、コークス製造工場からの排水等）あるいは地下水に、本発明の微生物を添加する。土壌、排水又は地下水への添加は、単一の微生物又は混合微生物群の適当な量（10２〜10８個/g土壌又は10２〜10５個/ml排水又は地下水）を土壌、排水又は地下水に散布するか、回収した土壌、排水又は地下水に本発明の微生物を混合した後、元に戻す方法により行う。添加量は、シアン化合物の濃度により適宜定めることができ、特に限定されるものではない。鉄シアノ錯体の場合は、150〜300mg/Lの鉄シアノ錯体濃度あたり10７個以上が好ましく、10８〜10９個がさらに好ましい。なお、排水又は地下水の温度は10〜30℃であることが好ましい。
【００２２】
ここで、シアン化合物（例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等）が分解されたか否かの活性は、測定の対象となる排水若しくは地下水に、又は土壌懸濁液に本発明の微生物を添加して培養したのち、残存するシアン濃度を測定することにより行うことができる。微生物は、20〜30℃の培養条件で10〜40日、好ましくは25日以上培養する。また、シアン濃度は、例えばピリジン-ピラゾロン吸光光度等により測定する。
【００２３】
３．土壌、排水又は地下水の処理剤
本発明の微生物は、土壌、排水又は地下水の処理剤として使用することができる。すなわち、本発明の処理剤は、単一菌又は混合菌の状態でそのまま、あるいは適当な液体又は固体の担体と組み合わせて使用することができる。
【００２４】
製剤に使用する液体担体としては、例えば水が挙げられる。この場合は、純水、又は無機塩類(塩化ナトリウム、塩化カリウム等)、糖(グルコース、ショ糖等)若しくは有機資材（牛肉エキス、酵母エキス等）の水溶液を用いることができる。
【００２５】
また、製剤に使用する固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、高分子性天然物(結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等)等が挙げられ、これらの1種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００２６】
本発明の微生物を混合する担体の量は、微生物1,000個あたり粉末では200〜2000mg、水和剤では1〜10g、ゲルビーズでは10〜20gであるが、使用目的によって適宜変更してもよい。
本発明の処理剤は、散布法、注入法等を用いて、シアン化合物（例えば鉄シアノ錯体やニトリル化合物等）を含有する土壌、排水又は地下水に直接投与することができる。
【００２７】
以上の通り、本発明の微生物は、例えば鉄シアノ錯体であるK４Fe(CN)６、ニトリル化合物を含んだ培地上で該シアン化合物を窒素源として生育し、該シアン化合物を迅速に分解する能力を発揮する。従って、安定な化合物である金属シアノ錯体を含んだ排水又は地下水処理にも安価で環境負荷の小さな生物処理を適用できる。また、本発明の微生物は、土壌中でのシアンの存在形態とされる鉄、ニッケル等の金属シアノ錯体を分解できる菌であることから、シアン汚染土壌の処理にも対応可能な菌である。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕混合微生物の単離
ニッケルシアノ錯体分解菌のスクリーニングについて記載されている文献を参考に、各種土壌から以下の方法でスクリーニングを行った(Silva-Avalos J et.al.,Appl Environ Microbiol,56 no.12 p3664-3670 (1990))。
【００２９】
日本各地で採取した土壌サンプルを、1mM の鉄シアノ錯体、K４Fe(CN)６(FeCN)
を唯一の窒素源とし、炭素源として0.25％のグルコースを含む無機塩基本培地(FeCN 培地))に懸濁し、30℃で集積培養を行った。集積培養を5回繰り返した後、菌生育により濁度が上昇した培養液を上記組成の寒天平板培地に塗布して、コロニーを形成させた。同寒天平板培地上に比較的大きなコロニーを形成した株、F4B4株及びF7B4株を選択した。
F4B4株及びF7B4株のそれぞれの菌学的性質及び同定結果は前記の通りであり、F4B4株はCDC gr.IV C-2 と、F7B4株はバークホルデリア・グラディオリとそれぞれ同定された。
【００３０】
〔実施例２〕 F4B4 株とF7B4株の鉄シアノ錯体分解活性試験
鉄シアノ錯体の定量法（全シアン測定法）
a)全シアンの回収
1)500 ml の平底フラスコに5mlの培養液と250mlの蒸留水を加える。
2)フェノールフタレイン溶液を2 から3 滴加える。
3)10 ％スルファミン酸アンモニウム溶液を0.75ml添加する。
4)10 ％EDTA(pH7.0) を5mlとリン酸5mlを添加する。
5)蒸留開始する。
6)蒸留液中の遊離シアンは、2％NaOH 10ml を含む三角フラスコにその全容量が    50mlになるように回収する。
【００３１】
アルカリ回収中のシアンの定量( ピリジン・ピラゾロン法)
b) 3NNaOH 溶液(250μl)、アルカリ回収シアン液(250μl)、1.5M  酢酸水溶液 (550μl)、1.25％クロラミンT溶液( 50μl)、ピリジンピラゾロン混液 1.5ml及び蒸留水 7.5mlを試験管に入れ、ゆっくりと転倒混和した後にそのまま30min,室温(20 〜25℃) に放置して置いた後、吸光度(620nm) を測定する。
【００３２】
F4B4株とF7B4株を１mM  鉄シアノ錯体  を唯一の窒素源とし、0.25％のグリセロールを炭素源として含む無機塩合成培地〔組成(1l中)：K４[Fe(CN)６] 1.0mM,グリセロール0.25％，KH２PO４ 0.15 ％, Na２HPO４ 0.35％, NaCl 0.025％, MgSO４・7H２O 0.001％, FeCl３・6H２O 0.001％, ビタミン混合物((1l中)Ca- パントテン酸 400mg, イノシトール 200mg, ナイアシン 400mg, パラ- アミノ安息香酸
200mg, ピリドキシン塩酸塩 400mg, チアミン 400mg, ビオチン 400mg, ビタミン B１２ 0.5mg )0.1 ％〕中で、30℃、5 日間、振とう培養し、それらの生育と鉄シアノ錯体の分解を調べた。これら菌株の生育度は培養液の濁度をOD 610nmで測定し、鉄シアノ錯体はJIS 法に従い、全CN量として測定した。分離株、F4B4とF7B4は鉄シアノ錯体を窒素源としていずれも生育した。F4B4株は11日間の培養後では、約 0.2 mM の鉄シアノ錯体を分解した。F7B4株は11日間の培養で0.1 mMを分解した（  1 ）。
【００３３】
1 モルの鉄シアノ錯体分子中には、6モルのシアノ基が含まれることから、これら菌株は11日間で約1.2 mMの鉄シアノ錯体に含まれるシアンが分解できる、優れた鉄シアノ錯体分解活性を有する鉄シアノ錯体分解菌であることが明らかにな1 た。
【００３４】
〔実施例３〕  F4B4株とF7B4株の鉄シアノ錯体分解に及ぼす炭素源の影響
バイオレメデイエーションを想定し、F4B4株とF7B4株の鉄シアノ錯体分解に及ぼす炭素源の影響を検討した。1 mMの鉄シアノ錯体を窒素源として、炭素源として0.25％のグリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、酢酸、エタノール、あるいはメタノールを添加して、30℃で振とう培養を行った。経時的に、菌株の生育と鉄シアノ錯体分解を測定した。F4B4株とF7B4株はともに、特に際だった炭素源に対する資化特性は示さないが（図2,図3 ）、鉄シアノ錯体の分解においては、グリセロール、フルクトース、あるいはエタノールが有効であり、これらの炭素源を利用することができることがわかる。
【００３５】
〔実施例４〕 F4B4 株とF7B4株のシアン化合物分解特性
F4B4株とF7B4株の様々なシアン化合物に対する分解性を明らかにするために、金属シアノ錯体として K４[Fe(CN)６], K３[Fe(CN)６], K２[Ni(CN)４], KCNO, 脂肪族モノニトリルとしてアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、脂肪族ジニトリルとしてサクシノニトリル、芳香族ニトリルとしてベンゾニトリル、さらに、ＣＮ基の加水反応により生成されるアミドとしてアセトアミド、ホルムアミドを窒素源として0.2 ％とになるように添加した培地を用いて培養した（図4,図5 ）。２週間の培養で、F4B4株は K４[Fe(CN)６]に比較してK３[Fe(CN)６]
では生育に誘導期が認められたが、K２[Ni(CN)４] を窒素源としてよく生育した。F4B4株及びF7B4株のニトリル類に対する資化性にも特徴が認められ、アセトニトリルやサクシノニトリルなどのモノあるいはジニトリルを窒素源として生育することが明らかになった。F7B4株の金属シアノ錯体に対する資化性はF4B4株とは相違が認められ、K２[Ni(CN)４] での生育は殆ど認められなかった。
【００３６】
また、両菌株間での金属シアノ錯体に対する資化性の相違は分解性に現れており、F4B4株はK４[Fe(CN)６] とK２[Ni(CN)４] を速やかに分解したが、 F7B4株ではK４[Fe(CN)６] は分解するもののK２[Ni(CN)４] の分解は観察されなかった( 図6,図7)。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によりシアン化合物（例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等）分解微生物、及び該微生物のスクリーニング方法が提供される。さらに、本発明により該微生物を用いてシアン化合物（例えば金属シアノ錯体、ニトリル化合物等）を含有する土壌、排水又は地下水を処理する方法が提供される。本発明の微生物は、シアン汚染土壌、排水又は地下水の浄化処理に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  F4B4株とF7B4株による鉄シアノ錯体の分解を示す図。
【図２】  F4B4株の鉄シアノ錯体分解に及ぼす炭素源の影響を示す図。
【図３】  F7B4株の鉄シアノ錯体分解に及ぼす炭素源の影響を示す図。
【図４】  F4B4株の生育に及ぼすシアン化合物の影響を示す図。
【図５】  F7B4株の生育に及ぼすシアン化合物の影響を示す図。
【図６】  F4B4株及びF7B4株による鉄シアノ錯体の分解能を示す図。
【図７】  F4B4株及びF7B4株によるニッケルシアノ錯体の分解示す図。
【図８】本発明の微生物の分離工程の概要を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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