(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズ担体を用いた酵素免疫測定法により試料溶液中の測定対象物質を定量する方法であって、測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体を微小流路内に１個又は当該微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するように配置するとともに、前記ビーズ担体上で抗原抗体反応を生じさせた後、基質を含む基質溶液を前記微小流路に送液しながら前記ビーズ担体近傍における発光又は発色を検出することを特徴とする物質の定量方法。
【請求項２】
前記試料溶液と酵素標識した測定対象物質を含む溶液とを混合した混合溶液を送液し、前記試料溶液中の測定対象物質及び酵素標識した測定対象物質を競合反応させて前記ビーズ担体に酵素を結合させた後、前記基質溶液を送液することを特徴とする請求項１記載の物質の定量方法。
【請求項３】
前記混合溶液の送液の後、洗浄溶液を送液し、次いで前記基質溶液を送液することを特徴とする請求項２記載の物質の定量方法。
【請求項４】
前記微小流路に前記混合溶液、前記洗浄溶液及び前記基質溶液を連続的に送液することを特徴とする請求項３記載の物質の定量方法。
【請求項５】
前記発光が蛍光であることを特徴とする請求項１記載の物質の定量方法。
【請求項６】
前記微小流路内に前記ビーズ担体を高さ方向に重なり合わないように配置することを特徴とする請求項１記載の物質の定量方法。
【請求項７】
前記基質溶液の送液時の流量を１μｌ／分以上、１０μｌ／分以下とすることを特徴とする請求項１記載の物質の定量方法。
【請求項８】
前記混合溶液の送液時の流量を１μｌ／分以上、１０μｌ／分以下とすることを特徴とする請求項２記載の物質の定量方法。
【請求項９】
液体を導入する試料導入部を共用するとともに送液後の液体を排出する試料排出部が個別に形成されている複数の微小流路を用いる場合において、全ての前記試料排出部を閉じた後、前記試料排出部のいずれか１つを開放するとともに前記試料導入部から前記混合溶液を導入し前記微小流路のいずれかに送液する工程を有し、各微小流路に対し前記工程を順次行うことを特徴とする請求項２記載の物質の定量方法。
【請求項１０】
ビーズ担体を用いた酵素免疫測定法による試料溶液中の測定対象物質の定量に用いられる定量デバイスであって、測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体が配置される微小流路と、前記微小流路の途中に設けられ、液体を流しかつ前記ビーズ担体の下流への移動を妨げる狭隘部とを有し、前記狭隘部において前記ビーズ担体が１個又は当該微小流路の幅方向にほぼ１列に配列されるとともに、前記ビーズ担体上で抗原抗体反応を生じさせた後、基質を含む基質溶液が送液されながら前記ビーズ担体近傍における発光又は発色が検出されることを特徴とする物質の定量デバイス。
【請求項１１】
前記微小流路は基板上に形成された溝であることを特徴とする請求項１０記載の物質の定量デバイス。
【請求項１２】
前記基板上に配置され、前記基板の前記溝が形成された面と対向する面に凸部を有する蓋体を有し、前記狭隘部が前記凸部と前記溝とにより形成されることを特徴とする請求項１１記載の物質の定量デバイス。
【請求項１３】
前記ビーズ担体が高さ方向に重なり合わないように配置されることを特徴とする請求項１１記載の物質の定量デバイス。
【請求項１４】
前記微小流路の深さが、前記ビーズ担体の直径を超え、前記ビーズ担体の直径の２倍以下であることを特徴とする請求項１１記載の物質の定量デバイス。
【請求項１５】
前記微小流路を複数有し、各微小流路は液体が導入される試料導入部を共用するとともに、送液後の液体が排出される試料排出部が個別に形成され、各試料排出部は独立して開閉可能であることを特徴とする請求項１０記載の物質の定量デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素免疫測定法を利用して試料中の測定対象物質を定量する物質の定量方法及びこの定量方法に用いられる物質の定量デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に含まれる微量の薬剤や環境汚染物質等の物質を定量する方法としては、抗原と抗体との特異的な結合を利用するとともに、酵素反応による例えば蛍光の程度により抗原（測定対象物質）を定量する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）が知られている。例えばガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）や高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等の分析方法が非常に煩雑な操作や長時間の測定を必要とするのに対し、ＥＬＩＳＡは通常、９６ウェルマイクロプレート等を用いることにより、従来の分析方法に比べて測定操作を大幅に簡略化でき、しかも高感度な検出を実現していることから現在幅広く普及している。【０００３】
従来のＥＬＩＳＡ、例えば競合法の一種である直接競合ＥＬＩＳＡは、図１８に示すように、マイクロプレートのウェルや試験管等の担体１０１表面に固定した抗体１０２に、測定対象物質（サンプルや標準物質）１０３及び酵素で標識した抗原１０４を添加して競合反応させ、抗体１０２に結合しなかった測定対象物質１０３や標識抗原１０４を洗浄除去した後、酵素基質１０５を添加して酵素反応により例えば蛍光物質１０６を生成させ、すなわち蛍光させ、ついで蛍光強度を比色計等で測定し、測定対象物質の標準品の蛍光強度と比較することにより測定対象物質の濃度を測定する方法である。直接競合法による検量特性は減衰曲線となる。【０００４】
前記のＥＬＩＳＡの他にも様々な極微量の物質の定量方法が開発されており、例えば微量分析が必要となる環境ホルモンの分析の例としては、ビーズ表面に固定した女性ホルモン受容体に対し、既知量の蛍光標識女性ホルモンと未知量の環境ホルモンとの競合反応を起こさせ、女性ホルモン受容体に結合した蛍光標識女性ホルモンの蛍光強度から環境ホルモンの存在量を測定する方法が提案されている（例えば特開２００１−１１６７５３号公報等を参照。）。特開２００１−１１６７５３号公報においては、特に、カラムに担体としてのビーズを充填し、フローで測定する例が記載されている。【０００５】
前述のように、ＥＬＩＳＡ法は従来の分析方法に比べて簡便且つ高感度な定量方法として知られているものの、例えば薬剤の血中濃度をモニタリングする必要がある臨床検査や、環境ホルモン分析等、極微量の物質の定量を行う分野においては、さらなる高感度での定量が可能な濃度測定方法の開発が強く望まれている。【０００６】
なお、前記特開２００１−１１６７５３号公報記載の発明では、受容体に結合した蛍光標識ホルモンからの蛍光を検出に利用しているが、この場合、受容体に結合したホルモンの蛍光分子のみが発光するため発光強度は極めて弱く、低い測定感度しか得られないという問題がある。【０００７】
そこで本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、測定対象物質を極めて高感度に定量することが可能な物質の定量方法及び物質の定量デバイスを提供することを目的とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが長期にわたり検討を重ねた結果、ＥＬＩＳＡ法においては、担体表面における酵素反応生成物（発光物質又は発色物質）の滞留が発光強度又は発色強度の測定時に大きな影響を与えており、この影響を回避するためには、ＥＬＩＳＡとフロー式の定量方法とを組み合わせることが極めて有効であることを見出した。【０００９】
本発明に係る物質の定量方法はこのような知見に基づいて完成されたものであり、酵素免疫測定法により試料溶液中の測定対象物質を定量する方法であって、測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体を微小流路内に１個又は当該微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するように配置し、前記試料溶液と酵素標識した測定対象物質を含む溶液とを混合した混合溶液を送液した後、基質を含む基質溶液を送液しながら、前記ビーズ担体近傍における発光又は発色を検出することを特徴とする。【００１０】
以上のような物質の定量方法では、発光又は発色の程度を検出する際に基質を含む溶液をビーズ担体表面に流し続けることにより、酵素と基質との反応により連続的に生成する発光物質又は発色物質を速やかにビーズ担体表面から除去して下流に流し、ビーズ担体表面でとどまることを防いでいる。このため、余計な発光物質又は発色物質の影響を極力受けることなく、発光物質又は発色物質の生成速度がほぼ正確に発光強度又は発色強度に反映される。【００１１】
また、本発明に係る物質の定量方法においては、微小流路内に配置するビーズ個数を１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するような少数とすることで、他のビーズ近傍において生成し発光物質又は発色物質の影響を極力低減し、検出感度の向上を図っている。【００１２】
さらに、本発明においては、検出時に酵素基質をビーズ表面に供給し続けることにより発光物質又は発色物質を連続的に生成させているため、ビーズ個数が少数であっても十分高い光強度又は発色強度が確保され、高感度検出が実現される。【００１３】
また、本発明に係る物質の定量デバイスは、酵素免疫測定法による試料溶液中の測定対象物質の定量に用いられる定量デバイスであって、測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原が固定されたビーズ担体が配置される微小流路と、前記微小流路の途中に設けられ、液体を流しかつ前記ビーズ担体の下流への移動を妨げる狭隘部とを有し、前記狭隘部において前記ビーズ担体が１個又は当該微小流路の幅方向にほぼ１列に配列されるとともに、前記微小流路に前記試料溶液と酵素標識した測定対象物質を含む溶液とを混合した混合溶液が送液された後、基質を含む基質溶液が送液されながら前記ビーズ担体近傍における発光又は発色が検出されることを特徴とする。【００１４】
以上のような定量デバイスを用いて測定対象物質の定量を行うに際しては、先ず微小流路途中の狭隘部に抗体又は抗原を固定したビーズ担体が配置された状態で、試料として未知濃度の測定対象物質、及び既知濃度の酵素標識された測定対象物質（競合物質）を微小流路に供給し、測定対象物質及び酵素標識された測定対象物質を例えば競合反応させビーズ担体に結合させる。次に、定量デバイスの微小流路に酵素基質を含有する溶液を供給し、ビーズ担体表面の酵素と基質との反応による発光又は発色を検出する。【００１５】
発光又は発色の程度を検出する際に基質溶液を微小流路、すなわちビーズ担体表面に流し続けることによって、酵素と基質との反応によりビーズ担体表面で生成した発光物質又は発色物質が速やかに担体表面から除去され、下流に流される。このため、発光物質又は発色物質の生成速度がほぼ正確にビーズ単体表面近傍の発光又は発色の程度に反映され、余計な蛍光物質又は発光物質の影響を極力受けることなく極めて高感度での定量が実現される。また、ビーズ担体を少数とすることで、他のビーズ担体近傍で生成した発光物質又は発色物質の影響が最小限に抑えられ、さらなる高感度での定量が実現される。さらに、本発明の定量デバイスは、微小流路に各種溶液を順次送液するといった容易且つ簡便な操作で定量が可能であり、煩雑な操作が不要であることや、短時間での測定が可能であるといった利点も有する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ビーズ担体を１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配置するととともに、発光又は発色の検出時にビーズ担体表面に基質溶液を流し続けることで、高感度での定量が可能な物質の定量方法を提供することができる。また、本発明によれば、測定対象物質の高感度な測定を容易且つ簡便に実現することが可能な定量デバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明を適用した定量方法の一例を説明するための模式図である。
【図２】図２は、本発明を適用した定量方法により、ビーズの表面に供給された基質が酵素と反応して発光した状態を示す写真である。
【図３】図３は、本発明を適用したマイクロフローチップの一例を示す概略斜視図である。
【図４】図４は、図３に示すマイクロフローチップの微小流路の長さ方向に沿った概略断面図である。
【図５】図５は、図３に示すマイクロフローチップの微小流路の幅方向に沿った概略断面図である。
【図６】図６は、図３に示すマイクロフローチップの狭隘部付近を平面から見た拡大写真である。
【図７】図７は、本発明を適用したマイクロフローチップであり、複数の微小流路を備えた例を示す概略平面図である。
【図８】図８は、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）による測定原理を説明するための模式図である。
【図９】図９は、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシジェノキサジンを用いた蛍光の検出原理を説明するための模式図である。
【図１０】図１０は、抗体固定化の確認及び最適ＦＫ−５０６ＰＯＤ濃度を決定するための特性図である。
【図１１】図１１は、ビーズを約１００個用いた場合の検量線を示す特性図である。
【図１２】図１２は、ビーズ個数による検量線の変化を示す特性図である。
【図１３】図１３は、ビーズ１０個を用いた場合の検量線を示す特性図である。
【図１４】図１４は、ビーズを１０個使用し、マイクロフロー抗体型チップを使用したときのビーズの発光を示す写真である。
【図１５】図１５は、ビーズを１０個使用し、マイクロフロー抗体型チップを使用したときの検量線を示す特性図である。
【図１６】図１６は、ビーズを１個使用し、マイクロフロー抗体型チップを使用したときの検量線を示す特性図である。
【図１７】図１７は、ビーズを１個使用し、マイクロフロー抗体型チップを使用したときのビーズの発光を示す写真である。
【図１８】図１８は、直接競合ＥＬＩＳＡの原理を説明するための図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を適用した物質の定量方法及び定量デバイスについて、図面を参照しながら詳細に説明する。先ず、本発明を適用した物質の定量方法の原理について説明する。【００１９】
本発明を適用した定量方法は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を応用して試料中の測定対象物質を定量する方法であって、微少流路にビーズ担体を１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するように配置するととともに、酵素が結合したビーズ担体の表面に基質を含む基質溶液を流しながら、個々のビーズ担体の表面近傍における酵素と基質との反応による例えば蛍光の程度を検出するものである。例えば直接競合ＥＬＩＳＡを利用する場合、先ず、測定対象物質と特異的に結合する抗体を表面に固定したビーズ担体を微小流路内に所定数配置し、ビーズ担体表面に測定対象物質及び酵素標識した既知濃度の測定対象物質を供給して競合的に反応させる。次に、基質を含有する基質溶液をビーズ担体表面に連続的に供給しながら、酵素と基質との反応によるビーズ担体表面近傍での蛍光を検出し、検出された蛍光の程度に基づいて測定対象物質を定量する。【００２０】
測定対象物質としては特に限定されるものではなく、例えば免疫抑制剤等の薬剤、ダイオキシン等の発癌性物質等の種々の化合物等、あらゆる物質を採用できる。【００２１】
測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定するビーズ担体は、表面積が大きく多量の抗体等を固定できること、試料溶液との接触面積が広いこと、微小流路への配置が容易であること等から有効である。ビーズ担体としては、測定対象物質に特異的に結合する抗体等を固定することができるものであれば特に問わないが、例えばガラス、ポリスチレン等を用いることができる。ビーズ担体は、測定後に固定した抗体を除去し、洗浄することにより再利用することも可能である。【００２２】
本発明の定量方法では、ビーズ表面の酵素に基質を連続的に供給することにより次々に生成する蛍光物質の蛍光を検出するので、たとえビーズが１個であっても十分な蛍光強度が得られ、高感度な検出が可能である。また、ビーズ担体の個数を１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するような少数とすることで、個々のビーズ表面近傍における蛍光を検出するに際し、他のビーズ近傍で生成した蛍光物質の影響を抑えることができる。さらに、使用するビーズ担体の個数を少数とすることで、所望数のビーズ担体を簡単且つ正確に微小流路に配置することができる。ビーズ担体個数を１個とすることは、解析上の誤差を低減できる点において有利である。【００２３】
測定対象物質の標識に用いる酵素としては特に限定されるものではないが、ペルオキシターゼ、ガラクトシダーゼ等、基質と反応することにより蛍光物質を生成する酵素を用いることができる。また、基質溶液に含まれる基質としては、酵素反応により例えばレゾルフィンのような蛍光物質となる蛍光基質を用いることができる。例えばルシフェリン等の他の発光基質や発色基質に比べて、蛍光基質の使用は高感度検出が可能な点で好ましい。【００２４】
ここで、本発明の原理について図１を参照しながら詳しく説明する。図１の説明では、測定対象物質に特異的に結合する物質として抗体を用い、直接競合ＥＬＩＳＡを利用して測定対象物質濃度を測定する場合を例に挙げる。【００２５】
先ず、図１（ａ）に示すように、測定対象物質に特異的に結合する抗体１が固定されたビーズ２を準備し、液体を流すがビーズ２の流れを妨げるような微小流路にビーズ２を配置する。このとき、ビーズ２の個数は、１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するような個数とする。【００２６】
次に、図１（ｂ）に示すように、未知濃度の測定対象物質３を含む試料溶液と、測定対象物質（抗原）を酵素で標識した標識物質４（既知濃度）を含む溶液との混合溶液をビーズ１表面に例えば５分間供給し、測定対象物質３と標識物質４とを競合反応させる。微小流路に試料溶液と酵素標識測定対象物質を含む溶液との混合溶液を送液する際には、抗原抗体反応を確実に進める観点から、混合溶液の流量を１０μｌ／分以下とすることが好ましい。ただし、混合溶液の流量が小さすぎるとビーズ表面で非特異的吸着が発生するおそれがあるため、例えば１μｌ／分以上とすることが好ましい。【００２７】
次に、図１（ｃ）に示すように、バッファー等を例えば５分間供給し、ビーズ１表面に非特異的に吸着した測定対象物質３や標識物質４を洗浄除去する。【００２８】
最後に、図１（ｄ）に示すように、酵素と特異的に反応する基質５を含む基質溶液を供給し、この基質溶液を流しながら、酵素反応により生じた蛍光物質の蛍光を検出する。そして、別途作成した検量線に基づいて、試料溶液中の測定対象物質３の濃度を求める。【００２９】
微小流路に基質溶液を送液する際には、バックグラウンドを軽減させる観点から流量を大きくすることが好ましいが、流量が大きすぎると蛍光の検出が困難となるおそれがある。このため、基質溶液の流量を１０μｌ／分以下とすることが好ましい。ただし、基質溶液の流量が小さすぎると酵素反応によって生成した蛍光物質がビーズ周囲に滞留してしまい、バックグラウンドレベルが増加するおそれがあるため、基質溶液の流量は１μｌ／分以上とすることが好ましい。【００３０】
なお、基質溶液の流量については、基質の供給速度がビーズ１表面の酵素の反応速度より大きくなるように設定することが好ましい。基質の供給速度が酵素の反応速度より小さい場合、酵素の反応速度が飽和し、正確な蛍光強度を測定できないおそれがある。【００３１】
以上のような定量方法によりビーズ担体の表面に供給された基質が酵素と反応した状態を、図２に示す。図２に示すように、酵素反応により生じた蛍光物質による蛍光が、ビーズ担体の表面に沿って観察される。本発明においては、基質溶液を流し続けることで、酵素と基質との反応により連続的に生成する蛍光物質を速やかに下流へ流し、ビーズ担体近傍での蛍光物質の滞留を防いでいる。これにより、十分な蛍光強度を確保しつつバックグラウンドの減少を図ることが可能となる。また、ビーズ担体の個数を１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するような少数とすることにより、他のビーズ担体の近傍で生成した蛍光物質が相互に影響を及ぼし合うことを最低限に抑えることができる。したがって、本発明によれば、十分な蛍光強度を確保しつつ個々のビーズ担体表面近傍での蛍光強度（蛍光物質の生成速度）を正確に知ることができ、測定対象物質の高感度な定量が可能となる。【００３２】
これに対し、例えば従来のＥＬＩＳＡのように基質溶液の流れを止めた状態で蛍光強度を測定する場合、ビーズ周囲に蛍光物質が滞留することにより蛍光強度が大幅に上昇し、蛍光強度の正確な測定が難しくなる。また、例えばビーズ担体を微小流路の幅方向に２列以上配列させる等のようにビーズ担体を多数用いる場合、ビーズ担体近傍の蛍光が相互に影響し合い、やはり蛍光強度の正確な測定が難しくなる。【００３３】
なお、ビーズ担体表面に試料溶液をフローで流して測定対象物質の定量を行う方法については、前述の特開２００１−１１６７５３号公報にも記載されているが、特開２００１−１１６７５３号公報記載の発明は、ビーズ担体表面の物質（ホルモン受容体）に蛍光標識物質を直接結合させこの状態で蛍光を観察するものであり、ビーズ担体表面に酵素を結合させた後、基質を導入して酵素により発光させる本発明の技術とは原理的に異なるものである。特開２００１−１１６７５３号公報記載の発明においては、ビーズ担体に直接結合させた蛍光を検出しているため、ビーズ担体を例えば流路の幅方向にほぼ１列に並ぶような少数とした場合には弱い蛍光しか得られない。本発明のように酵素を用いるとともに基質溶液を流し続けることで、ビーズ担体の使用数が少数であっても強い蛍光を得ることができるのである。【００３４】
以上のような物質の定量方法は、例えば次に説明するような、極めて狭い微小流路を持つことによりビーズ担体周囲の溶液の流れが微妙にコントロールされた定量デバイス（マイクロフローチップ）を用いることにより、確実且つ簡便に行うことができる。図３は、マイクロフロー型のチップ１１の斜視図、図４は、チップ１１の微小流路に沿った断面図、図５は、狭隘部付近であって微小流路の幅方向断面図、図６は、狭隘部を平面から見た拡大写真である。マイクロフロー型のチップ１１には、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：polydimethylsiloxane）等の透明な樹脂材料等からなる基板１２の表面に、溝状の狭い微小流路１３が形成され、微小流路１３内に、ビーズ担体に抗体や抗原等を結合させたビーズ１４が配置される。微小流路１３上には、試料導入用の穴（試料導入部）１５及び試料排出用の穴（試料排出部）１６が形成された蓋体１７が載せられる。蓋体１７の微小流路１３の長さ方向の中ほどには凸部１８が設けられ、微小流路１３での溶液の流れを許容する一方で、ビーズ１４の下流への流れを妨げるための狭隘部１９を形成する。蛍光を検出する際には、狭隘部１９より上流側にとどまったビーズ１４の表面付近の蛍光を検出するように、チップ１１の周辺に比色計等の検出器２０を配置する。【００３５】
微小流路１３の最適な形状及び寸法は、配置されるビーズ１４の形状及び寸法に応じて変わるが、微小流路１３の溝の深さについては、微小流路１３に配置されるビーズ１４の直径を超え、ビーズ１４の直径の２倍以下であることが好ましい。このような深さの微小流路１３とすることで、ビーズ１４が溶液内に完全に浸漬し、且つビーズ１４が高さ方向に例えば１個だけ並ぶように、すなわち、ビーズ１４が高さ方向（検出方向）に重ならないようになる。ビーズ１４同士が高さ方向に重ならないようにすることで、蛍光を検出する際の装置の焦点が合わせやすくなり、個々のビーズ１４の表面近傍での蛍光を測定すること、すなわち測定対象となるビーズ表面近傍での蛍光を他の蛍光と空間的に区別して測定することが容易となり、強度の測定をより正確に行なうことができる。したがって、ＳＮ比が向上し、飛躍的な感度の向上が可能となる。【００３６】
微小流路１３の溝の幅方向については、例えば複数個のビーズ１４を微小流路１３内に配置したときに、微小流路１３の幅方向に沿ってこれらビーズ１４が一列に並ぶ程度とする。【００３７】
ビーズ１４の微小流路３内への配置は、ピンセット等で手作業により行なっても、例えばシリンジポンプを用いた送液により行なっても構わない。微小流路１３に配置されるビーズ１４の個数は、高感度な測定を行なう観点から少数とし、本発明では１個又は微小流路の幅方向にほぼ１列に配列するような個数とする。【００３８】
以上のようなチップ１を用いて測定対象物質を定量する方法について説明する。先ず、測定対象物質に特異的に結合する抗体が固定されているビーズ１４を準備し、微小流路１３の狭隘部１９の上流側に所定の個数配置する。【００３９】
次に、試料導入部１５に接続された溶液導入用チューブ（図示せず）から、シリンジポンプ等を用いて、測定対象物質を含む試料及び酵素標識された測定対象物質（競合物質）の混合溶液を微小流路１３に導入し、ビーズ１４の表面に供給する。これにより、測定対象物質等をビーズ１４表面の抗体に結合させる。【００４０】
次に、適当な緩衝液等を用いて、未結合又は非特異的に結合した測定対象物質及び酵素標識物質を洗浄する。【００４１】
次に、試料導入部１５に接続された溶液導入用チューブ（図示せず）から、シリンジポンプを用いて基質溶液を微小流路に供給する。そして基質溶液を供給しながら、検出器２０にてビーズ１４表面近傍での蛍光を検出する。このとき、シリンジポンプにより基質を流し続けているため、ビーズ１４に結合した酵素へ基質が連続的に供給されるのと同時に、酵素反応で生じた蛍光物質が溶液の流れにより試料排出部１６から排出され続ける。このため、ビーズ１４近傍に蛍光物質が停滞せず、バックグラウンド等の影響が軽減され、正確な蛍光強度を測定できる。したがって、本発明のチップ１を用いることで、ＳＮ比を向上させることができ、検出感度を飛躍的に向上させ正確な定量を行うことが可能となる。【００４２】
また、本発明のチップ１は小型であるため、可搬性に優れるといった利点を有する。さらに、チップ１に形成された微小流路は非常に微小な空間であるため、各種溶液の使用量の増大を抑えるとともに測定時間の短縮を図ることができる。【００４３】
ところで、本発明の定量方法に用いられるチップは、図３〜図６に示すような単一の微小流路１３が形成されたものに限定されず、複数の微小流路が形成されているものであっても構わない。このようなマルチフロー式のチップの一例を、図７に示す。図７に示すチップは、透明材料からなる基板１２の表面に１１本の微小流路１３がくし形に並列配置されている。このチップにおいては、試料導入部１５を共用するとともに、送液後の液体を排出するための試料排出部１６が各微小流路１３に個別に形成されている。微小流路１３のうち１０本は検量線作成用の微小流路であり、残りの１本は試料溶液用の微小流路である。【００４４】
このチップを用いる際には、試料排出部１６にそれぞれ接続された溶液排出用チューブ（図示せず）を予め全て閉じておく。そして、任意のいずれか１つの微小流路１３に対応するチューブを開放するとともに、試料導入部１５から例えば検量線作成用の所定濃度の標準物質溶液を流して測定を行なう。他の検量線作成用の溶液や、試料溶液の測定の際には、このプロセスを各微小流路１３に対して繰り返す。複数の微小流路１３をチップ上に形成することで、１つのチップ上で検量線の作成及び試料中の測定対象物質の濃度測定が容易に行える。また、図７のように微小流路１３をくし形に配置することで、ビーズ担体や試料溶液等が他の微小流路１３へ混入することを抑制できる。【００４５】
複数の微小流路１３の狭隘部付近にピンセット等の手作業で所定個数のビーズ担体を配置するのは低効率であるため、図７のように複数の微小流路１３を備えるチップの場合、例えばシリンジポンプによる送液により、ビーズ担体を各微小流路に配置することが好ましい。これにより、ビーズ担体を微小流路に配置する時間が大幅に短縮され、より簡便に定量を行なうことができる。【００４６】
なお、以上の説明では、直接競合ＥＬＩＳＡを例に挙げたが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば間接競合ＥＬＩＳＡに適用することも可能である。間接競合ＥＬＩＳＡは、免疫原に使用した抗原や免疫原とは異なるタンパク質と結合させたハプテンをビーズ等の担体表面に固定したものに、測定対象物質及び一次抗体を添加して競合反応させ、固定した抗原と結合しなかった測定対象物質や一次抗体を洗浄除去した後、二次抗体を添加して一次抗体と結合させ、次に、基質を添加して酵素の反応により蛍光発光させ、この発光を検出することにより測定対象物質の濃度を測定する方法である。間接競合ＥＬＩＳＡに本発明を適用する場合も、直接競合ＥＬＩＳＡと同様の効果を得ることができる。また、本発明は、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡに適用することも可能である。前述の競合法は測定対象物質が低分子である場合に適用して好適であるのに対し、サンドイッチ法は測定対象物質の分子量が比較的大きい場合に適用して好適である。【００４７】
また、以上の説明では、基質として蛍光基質を用い、酵素反応により生成したレゾルフィン等の蛍光物質の蛍光を検出する場合を例に挙げたが、本発明はこれに限定されるものではなく、蛍光以外の発光、例えば化学発光や生物発光等を利用することも可能である。具体的には、蛍光基質以外の発光基質、具体的にはルシフェリン等の発光基質を用いて基質溶液を調製するとともに、基質に応じて最適な酵素を適宜選定し、酵素反応に伴う生物発光（化学発光）を検出に利用することができる。【００４８】
さらに、本発明においては、前記発光に限らず、例えば発色を検出に利用しても構わない。この場合、発色基質を用いて基質溶液を調製するとともに、基質に応じて最適な酵素を適宜選定し、酵素反応に伴う発色を検出すればよい。発色基質としては、例えばｏ−フェニレンジアミン（o-Phenylenediamine：OPD）や、テトラメチルベンジジン（Tetramethyl benzidine：TMB)等が挙げられる。【００４９】
以下、本発明を適用した定量方法及び定量デバイスの具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。臓器移植時の免疫抑制剤として用いられる薬剤ＦＫ５０６を測定対象物質とし、系を単純化する目的で短微小流路のマイクロフロー抗体型チップを用い、ＥＬＩＳＡによる定量を行なった。定量法としては、ポリエチレンビーズに固定したＦＫ５０６抗体を微小流路に配置し、その微小流路にＦＫ５０６およびＦＫ５０６−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＦＫ５０６）混合溶液を添加し、競合反応を起こさせ、ペルオキシダーゼと基質によって生成した蛍光物質を光学検出系を用いて測定した。本実施例では、以下のように作製したマイクロフロー抗体型チップを用いた。【００５０】
なお、以下の実験において、試薬および材料としては、抗ＦＫ５０６マウスモノクローナル抗体（フナコシ社製）、ＦＫ５０６、ＦＫ５０６−ＰＯＤ（藤沢薬品工業社より提供）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製）、Ａｍｐｌｅｘ（ＴＭ）  ｒｅｄ  ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社製）、過酸化水素（３０％水溶液、生化学用、和光純薬工業）、ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：polydimethylsiloxane）（ダウコーニング・アジア社製、Silpot 184 Silicon Elastmer kit）、ＦＥＰチューブ（ＢＡＳ社製）、ポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製、直径９０μｍ）、ガラス平板（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）、イムノモジュール（ストリップ＆フレーム、Ｆ１６、ＮＵＮＣ社製）を用いた。また、装置としては、実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製、ＭＺＦＬ  III）、ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製、ＯＲＣＡ−ＥＲ）、シリンジポンプ（ＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ社製）、分光光度計（ＪＡＳＣＯ社製、  Ｖ５３０）を用いた。【００５１】
＜測定原理＞
マイクロフロー抗体型チップによるＦＫ５０６の定量は、直接競合ＥＬＩＳＡにより行った。直接競合ＥＬＩＳＡは、抗体をマクロプレートや試験管等にコーティング（固定化）したものに、測定対象物質（サンプルや標準物質）および酵素を標識した抗原を添加して競合反応させ、抗体に結合しなかった測定対象物質や標識抗原を洗浄除去後、酵素基質を添加して酵素による発光反応をさせ、ついで発光の程度を比色計等で測定し、測定対象物質の標準品の発光度と比較することにより測定対象物質の濃度を測定する方法である。【００５２】
＜ポリスチレンビーズ表面への抗体固定化＞
本実施例では、抗体をポリスチレンビーズ表面に固定し、マイクロフロー抗体型チップの微小流路中に配置させて測定を行なった。抗体固定化ビーズは、以下の手法により調製した。【００５３】
先ず、直径約９０μｍのポリスチレンビーズの懸濁水溶液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。これに、３５μｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈した抗ＦＫ５０６抗体を加えて終夜浸漬させ、ビーズ表面に疎水結合により固定した。ビーズ表面への固定化を確実にする目的で、抗体固定化に用いた抗体溶液は高濃度とした。固定化を行った後、固定化ビーズをＰＢＳで洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（ＢＴ−ＰＢＳ）を加えて終夜浸漬させ、ビーズ表面のブロッキングを行った。得られたビーズは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、Ｔ−ＰＢＳ中、温度４℃で使用するまで保存した。【００５４】
＜抗体固定化の確認およびＦＫ５０６−ＰＯＤ最適濃度の検討＞
次に、ビーズ表面への抗体の固定を確認するとともに、ＦＫ５０６−ＰＯＤの必要量を検討した。ビーズ溶液１０μｌ（ビーズ約１００個）をＰＢＳで洗浄し、ＦＫ５０６−ＰＯＤ（５０００倍希釈液）をＢＴ−ＰＢＳでさらに９段階（１倍〜１０7倍）に希釈した溶液をそれぞれ加え、終夜浸漬させ、抗原抗体反応を行った。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、基質溶液（ＯＰＤ  ０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０３％過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ＝５．４）２００μｌを加えて室温で２０分間反応させた。次に、２Ｍ硫酸（５０μｌ）を加えて酵素反応を止めた。反応液を９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。検出原理を図８に示す。【００５５】
＜ＯＰＤによる検量線作成検討＞
ＦＫ５０６の１０μｌ／ｍｌメタノール溶液を作製し、これをメタノールで希釈して０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を作製した。それぞれ１０μｌずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。ＦＫ５０６−ＰＯＤをＢＴ−ＰＢＳで１０倍希釈し、それぞれ２００μｌずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を１８０μｌずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液１０μｌ（ビーズ約１００個分）を加え、２時間、室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をＴ−ＰＢＳで３回洗浄した後、基質溶液（ＯＰＤ  ０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０３％過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ＝５．４））２００μｌを加えて室温で２０分間反応させた。次いで２Ｍ硫酸（５０μｌ）を加えて酵素反応を止めた。反応液を９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００５６】
＜ビーズ個数の検討＞
ＦＫ５０６の１０μｌ／ｍｌメタノール溶液を作製し、これらをメタノールで希釈して０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を作製した。それぞれ５０μｌずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。ＦＫ５０６−ＰＯＤをＢＴ−ＰＢＳで３倍希釈し、それぞれ１００μｌずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を９０μｌずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液５μｌを加えて２時間室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をＴ−ＰＢＳで９回洗浄した後、９６ウェルプレートにビーズ１個、３個、１０個をそれぞれ２連で配置した。基質溶液（ＯＰＤ  ０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０３％過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ＝５．４））２００μｌを加えて室温で２０分間反応させた。次いで２Ｍ硫酸（５０μｌ）を加えて酵素反応を止めた。反応液を９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００５７】
＜ビーズ１０個を用いた検量特性評価＞
ＦＫ５０６の１０μｌ／ｍＬメタノール溶液を作製し、これらをメタノールで希釈して０．０００１ｎｇ／ｍｌ、０．００１ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を作製した。それぞれ５０μｌずつガラス管に加えて、窒素気流下で濃縮乾固した。ＦＫ５０６−ＰＯＤをＢＴ−ＰＢＳで３倍希釈し、それぞれ１００μｌずつ加えて溶解した。得られたサンプル溶液を９０μｌずつエッペンチューブにとり、そこにビーズ溶液５μｌを加えて、２時間、室温で抗原抗体反応を行った。得られた反応液をＴ−ＰＢＳで９回洗浄した後、９６ウェルプレートにビーズ１０個をそれぞれ配置した。基質溶液（ＯＰＤ  ０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０３％過酸化水素、リン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ＝５．４））２００μｌを加えて室温で２０分間反応させた。次いで２Ｍ硫酸（５０μｌ）を加えて酵素反応を止めた。反応液を９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００５８】
＜ＰＤＭＳチップ作製＞
本研究で使用したマイクロフロー型抗体チップの作製手順は、以下のとおりである。シリコンウェハーをダイヤモンドカッターにて４０ｍｍ×３０ｍｍに切り出し、洗浄を行なった。この洗浄は、純水による超音波洗浄、アセトン煮沸の後、フッ化水素酸、フッ化アンモニウム混合液（１：６）に５分間浸漬させ、自然酸化膜を除去した。次に、シリコン基板の表面へＳＵ−８（MicroChem 社製、ＮＡＮＯ  ＸＰ  ＳＵ−８  ５０）をスピンコーターにて塗布し、ホットプレートにて６５℃：１０分、９５℃：３０分の条件でプリベイクを行なった。なお、スピンコートの際、ＳＵ−８の膜厚が１００μｍとなるようにスピンコート条件を変え、塗布を行なった。そして、プリベイクしたシリコン基板にマスクパターン（山田写真製版社製）を通して、マスクアライメント装置により紫外線を照射した後、再度、ホットプレートにて６５℃：３分、９５℃：１０分でポストベイクを行なった。この基板を、ＳＵ−８現像液に約１０分浸漬し、マスクアライメント装置による紫外線照射の際、硬化していない基板上のＳＵ−８を除去し乾燥させた後、目的とする鋳型を得た。【００５９】
得られた鋳型から、基材としてＰＤＭＳを用いたチップの作製を行なった。作製には、ＰＤＭＳプレポリマーと触媒とを混合（１０：１）し、十分に混合させた後、ベルジャー内でロータリー真空ポンプにて減圧し、混合液中に存在する気泡を脱泡させた。次に、鋳型上へＰＤＭＳを流し込み、オーブンにより８０℃にて１時間加熱・硬化させた。なお、ＰＤＭＳを鋳型上へ流し込む際、鋳型上からＰＤＭＳがこぼれないように、シリコンゴムシートにて鋳型へ枠を設けた。加熱・硬化させた後、ＰＤＭＳを鋳型から丁寧に剥がしとり、鋳型を転写したＰＤＭＳチップを作製した。転写したチップは１Ｎ塩酸水溶液に終夜浸漬させ、チップ表面を親水性にし、超純水にて洗浄した後、ＢＴ−ＰＢＳへ浸漬させることにより微小流路中のブロッキングを行なった。【００６０】
次に、ディスポーザブルシリンジニードル（１．２×３８ｍｍ）を用いて、チップへの試料導入及び排出を行なうための導入口及び排出口を形成した。導入口及び排出口には、ＦＥＰ（fluorinated ethylene propylene）チューブが差し込まれる。【００６１】
＜抗体固定化ビーズの配置及び封入＞
最終的にマイクロフロー型抗体チップを得る前に、実体顕微鏡を用いて微小流路を観察しながら、作製したＰＤＭＳチップの微小流路中にピンセットで抗体固定化ビーズを１０個配置した。このとき、ピンセットで微小流路を損傷しないようにした。その後、ＰＤＭＳチップの微小流路側とガラス平板を張り合わせ、図３〜図６に示すような単一流路型のマイクロフロー抗体型チップを得た。なお、ＰＤＭＳに形成された微小流路は、長さ３０ｍｍ、幅１０００μｍ、深さ１００μｍの溝状であり、微小流路の中ほどには、微小流路の底部から高さ５０μｍだけ開口した狭隘部が設けられている。【００６２】
＜マイクロフロー抗体型チップにおける検量特性評価−１＞
マイクロフロー型抗体チップの特性評価における操作手順は、基本的には図１に準じる。先ず、抗体固定化ビーズが配置されたチップの微小流路に、各濃度に希釈したＦＫ５０６とわさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識されたＦＫ５０６（ＦＫ５０６−ＰＯＤ）との混合液を、シリンジポンプを用いて流量１μｌ／分で５分間導入し、抗体固定化ビーズ表面で競合法による抗原抗体反応を行なった。【００６３】
次に、抗体固定化ビーズ表面へのＦＫ５０６及びＦＫ５０６−ＰＯＤの非特異的吸着を除去するために、ＢＴ−ＰＢＳを流量１０μｌ／分で５分間導入し、洗浄操作を行なった。【００６４】
次に、ペルオキシダーゼの基質である終濃度２．０ｍＭとした過酸化水素と終濃度１００μＭとした蛍光基質である１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシジェノキサジン（10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, Amplex（商標） red）との混合溶液を微小流路中へ流量１μｌ／分で導入した。導入後５分間、蛍光顕微鏡に接続されたＣＣＤカメラを用いて酵素反応により生成したレゾルフィンの蛍光画像を撮影した。Amplex（商標） redにより生成したレゾルフィンは、励起光は励起光５４６ｎｍにて励起し、蛍光５９０ｎｍの蛍光画像を撮影した。なお、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシジェノキサジンを用いた検出原理を、図９に示した。得られた蛍光画像を解析ソフトであるＡＱＡＣＯＳＭＯＳ（浜松ホトニクス社製）にて解析した。解析の際には、ビーズ周辺部分にＲＯＩ（Region of Interest）をとり、ＲＯＩにおける単位ピクセルあたりの平均値として蛍光強度を算出した。【００６５】
＜マイクロフロー型抗体チップにおける検量特性評価−２＞
マイクロフロー抗体チップに配置するビーズの個数を１個とし、前述のマイクロフロー型抗体チップにおける検量特性評価−１と同様の操作でＦＫ５０６の濃度測定を行なった。また、実際の血液サンプルを想定し、血液サンプルを調製した。血液サンプルも同様に、マイクロフロー抗体チップにてＦＫ５０６の濃度を測定した。【００６６】
血液サンプルは、次にように調製した。ヘパリン処理したシリンジを用いてアカゲザルの静脈から約１ｍｌの血液を採取し、ＦＫ５０６標準溶液（メタノールで希釈した５ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを窒素気流下で濃縮乾固させた容器に加えた。そこに０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）及び酢酸エチル：ヘキサン＝１：１溶液を加えて、３回抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。以上の操作は、２連で行なった。【００６７】
結果及び考察
＜抗体固定化の確認及びＦＫ５０６−ＰＯＤ最適濃度の評価（９６ウェルプレート）＞
ポリスチレンビーズへの抗体の固定を確認し、及びＦＫ５０６−ＰＯＤの最適濃度を算出するために、ＦＫ５０６−ＰＯＤ各濃度に対する吸光度変化を測定した。この結果を図１０に示す。この結果から、ビーズの結合部位全てを埋めるＦＫ５０６−ＰＯＤ溶液として、１５０００倍希釈以下のものを使用する必要があることが示唆された。したがって、以降の実験では全て、ＦＫ５０６−ＰＯＤとして１５０００倍希釈したものを使用することとした。【００６８】
＜ＯＰＤによる検量線作成検討（ビーズ約１００個）＞
最適ＦＫ５０６−ＰＯＤ濃度が確認されたので、実際にＦＫ５０６希釈液を用いてアッセイを行った。このとき、正確にビーズを１００個数えるのは非常に時間がかかるので、方法を簡略化するために、所定濃度のビーズの懸濁液を分注することにより、ビーズが約１００個含まれるようにした。結果を図１１に示す。図１１に示すように、ばらつきは大きいが、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度までは相関性が得られた。このばらつきの原因は、ビーズの個数のばらつきであると考えられた。懸濁状態でビーズ溶液を分注した場合のビーズ個数を実際に数えたところ、１割程度の誤差が生じていた。このことから、この方法及びビーズ個数でビーズ個数の精度を得るのは困難であると判断される。したがって、以下ではビーズの個数を減らすとともに、実際にビーズの数を数えることでビーズの数を正確なものとし、同様の実験を行なった。【００６９】
＜ビーズ個数の評価＞
実際に短流路のマイクロチップで濃度評価を行なうことを考慮し、１個、３個、１０個のビーズでそれぞれ実験を行なった。しかしながら、ビーズ１個及びビーズ３個では、１ｎｇ／ｍｌまでは相関性が得られたが、さらに濃度の希薄なポイントでは、相関性が認められなかった。また、ビーズ個数が少ない場合、吸光度の変化率が不十分であるため、定量に適していないと考えられた。一方、ビーズ１０個の場合、０．１ｐｇ／ｍｌまで相関性が得られた（図１２）。したがって、十分な感度を確保するためには、ビーズ個数を１０個とすることが適当であると考えられた。【００７０】
＜ビーズ１０個を用いた検量特性評価＞
ビーズ１０個を用いた際の検量特性を、０．１ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌまで検討した。その結果、１ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌまで良好な相関性（ｒ2＝０．９４７）を示した（図１３）。この結果から、ビーズ１０個を用いることにより、ＦＫ５０６の濃度測定に充分な感度を得られることが判明した。したがって、マイクロフロー抗体チップには、充分な感度が得られるビーズ１０個を用いることにした。【００７１】
＜マイクロフロー抗体チップを用いた検量特性評価（ビーズ１０個）＞
抗原抗体反応、続くＰＢＳによる洗浄後、チップの微小流路に基質溶液を流したところ、基質溶液がビーズ周辺に到達し始めると、蛍光発光が開始した。約３０秒程度で定常状態となり、その後１５分間までは少なくとも蛍光強度に差は見られなかった。作製した単一流路マイクロフロー抗体チップのチップ周辺の写真を図１４に、検量特性を図１５に示した。この結果から、本マイクロフロー抗体チップを用いることにより、０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＫ５０６の定量が可能であった（ｒ2＝０．９６６）。また、本実験は同じ日に行った実験ではないが、それにもかかわらず良好な相関性を示したことから、非常に再現性の高いものであることが示唆された。この検量特性は、ビーズを用いた９６ウェルプレート上でのアッセイに比較して約１０倍の感度を有していた。以上の結果から、ビーズ１０個を用いて蛍光発光基質を用いることにより、これまで報告されているＥＬＩＳＡ法に比較して約１０００倍の感度を有していることが判明した。【００７２】
ところで、以上の結果よりマイクロフローチップの有効性が確認されたが、実際の医療現場では、例えば従来のＥＬＩＳＡの感度（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも足りることもあり、マイクロフローチップには検査のさらなる簡略化や検査時間の高速化の面での改善がむしろ重要といえる。そこで、次の実験では、ビーズの数を減らして（ビーズ１個で）同様の実験を行なった。ビーズ１個の場合、９６ウェルプレートを用いた吸光度測定の結果より感度の低下が予想されたが、ビーズ１０個において従来のＥＬＩＳＡ法の１０００倍の感度を有していることから、ビーズ１個においてもＥＬＩＳＡと同等又はそれ以上の感度が期待できる。【００７３】
＜マイクロフロー抗体チップを用いた検量特性評価（ビーズ１個）＞
ビーズ１個を用いたマイクロフロー抗体チップによるＦＫ５０６の検量特性は、図１６に示すように、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で良好な相関性（ｒ2＝０．９８７）を示した。本実験の感度は、ビーズ１０個を用いた際よりも１００分の１になったが、それでも従来のＥＬＩＳＡ法に比較して約１０倍の感度を有していることが判明した。【００７４】
また、ビーズ１０個の場合は測定毎にビーズの配置が変わる（流すたびに変化する）ことで解析上の誤差が生じやすいといった不都合があるが、ビーズ１個の場合は、ＲＯＩのとり方に操作上の誤差が生じにくい（図１７）という解析上の利点がある。さらに、１０個のビーズを数える手間も少ないことから、非常に簡便であるといえる。【００７５】
また、別途行なった全血サンプルの評価結果（図１６）から、資料中に生体成分が混入している場合でもＦＫ５０６の定量に異常をきたさないことが確認された。前述のように、今回の実験においては、ＦＫ５０６標準溶液にサルの血液を加えて、全血サンプルとした。血中濃度５ｎｇ／ｍｌに調製してマイクロフロー抗体チップを用いて評価を行なった結果を、図１６中の白丸で示した。本実験より、２例の平均で３．１ｎｇ／ｍｌという結果が得られた。【００７６】
以上のように、抗体を吸着させたポリスチレンビーズを配置したマイクロフロー型抗体チップを用いることにより、従来法であるＥＬＩＳＡ、ＭＥＩＡ（microparticle enzyme-based immunoassay）で達成が不可能であった、高感度且つ短時間でのＦＫ５０６の濃度測定が実現された。
【図１】
0004253695.tif 000002
【図２】
0004253695.tif 000003
【図３】
0004253695.tif 000004
【図４】
0004253695.tif 000005
【図５】
0004253695.tif 000006
【図６】
0004253695.tif 000007
【図７】
0004253695.tif 000008
【図８】
0004253695.tif 000009
【図９】
0004253695.tif 000010
【図１０】
0004253695.tif 000011
【図１１】
0004253695.tif 000012
【図１２】
0004253695.tif 000013
【図１３】
0004253695.tif 000014
【図１４】
0004253695.tif 000015
【図１５】
0004253695.tif 000016
【図１６】
0004253695.tif 000017
【図１７】
0004253695.tif 000018
【図１８】
0004253695.tif 000019