(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫活性を有するタンパク毒素をコードする組換えＤＮＡであって、
（ａ）配列番号１から成るヌクレオチド；
（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）に規定されたヌクレオチドと相補的なヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド
から成る群から選択される前記組替えＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１の配列から成る請求項１の組替えＤＮＡ。
【請求項３】
発現ベクターである、請求項１から２のいずれか一項に記載の組替えＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３の発現ベクターで形質転換された宿主生物。
【請求項５】
１以上の他の殺虫性タンパク質も発現するように操作又は選択された請求項４に記載の宿主生物。
【請求項６】
宿主が植物である請求項４または５に記載の宿主生物。
【請求項７】
宿主が昆虫病原性ウイルスである請求項４または５に記載の宿主生物。
【請求項８】
請求項１または２の組替えＤＮＡによってコードされるタンパク毒素。
【請求項９】
（ｉ）昆虫に経口施用するためのものであって、（ｉｉ）請求項８のタンパク毒素を含む殺昆虫組成物であって、農業上許容可能なキャリヤーを更に含む前記組成物。
【請求項１０】
Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓにおいて発見されない更なる殺虫性材料を更に含む請求項９の組成物。
【請求項１１】
更なる殺虫性材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得される材料を含む請求項１０の組成物。
【請求項１２】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得される材料がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細胞である請求項１１の組成物。
【請求項１３】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得される材料がδ内毒素を含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
農業上許容可能なキャリヤーが昆虫飼料物品を含む請求項９から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の組成物を害虫に経口施用するか、またはその環境に施用することを含む昆虫害虫駆除又は防除方法。
【請求項１６】
害虫が鱗翅目又は相翅目昆虫である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの殺虫性材料を害虫に経口施用するか、またはその環境に施用することを更に含む請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は細菌、特にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種に由来する殺虫活性をもつ材料、薬剤及び組成物に関する。本発明は更に、このような化合物及び組成物を利用する生物及び方法にも関する。
例えば作物防御又は昆虫媒介病の防除用として殺虫活性をもつ材料、薬剤、組成物及び生物は常に必要とされている。既存殺虫剤に対する耐性の問題を解決するためには新規材料が必要である。このような材料は製造費用が安く、安定しており、（単独使用又は併用時に）毒性が高く、害虫標的が経口摂取した場合に有効であることが理想的である。従って、これらの性質の全てに優れた材料、薬剤、組成物又は生物を提供するような発明がなされるならば、技術的前進となろう。
Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種は自然界で線虫宿主と共生していることが多く、この共生を利用して害虫活性を防除できることが知られている。例えば、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種のうちには宿主の血液嚢に注入すると単独で昆虫宿主を死滅させるものがあることが知られている。
更に、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓから１種の細胞外殺昆虫毒素が単離されている（この種は最近Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属から外されたが、この属内の種に密接に関連している）。この毒素は摂取した場合には有効でないが、ある種の昆虫幼虫に注入すると極めて毒性である（Ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔｓ  Ｖｏｌ．２，Ｂｅｃｋａｇｅ，Ｎ．Ｅ．ら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３参照）。
Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ及びＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来し、静脈内又は局所施用した場合に抗生物性をもつ所定の低分子量複素環化合物も知られている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｓ．Ｈ．ら，ＰＣＴ  ＷＯ８４／０１７７５参照）。
しかしながら、これらの従来技術材料のうちで上記理想的殺虫特性をもつものは皆無であり、特に、経口施用した場合に毒性活性が得られない。
本発明はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種に由来する殺虫剤及び組成物、このような化合物及び組成物を産生する生物、並びにこれらの薬剤、組成物及び生物を利用する方法を提供し、従来技術の問題の一部を解消するものである。
本発明の１側面によると、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞又は該種に由来するかもしくは該種から獲得可能な殺虫性材料を害虫に経口施用することを特徴とする昆虫害虫の駆除又は防除方法が開示される。
ＷＯ９５／００６４７として公開されたＣＳＩＲＯのＰＣＴ出願は、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓに由来する毒性と思われるタンパク質を開示しているが、このタンパク質の毒性の詳細は示されておらず、経口殺昆虫剤としての使用が開示されていないことは明白である。
そこで、本発明は、
（ｉ）昆虫に経口施用するのに適しており、
（ｉｉ）Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から獲得可能なタンパク性殺虫性材料、その殺虫性フラグメント、又はこれらのいずれかの殺虫性変異体もしくは誘導体を含み、
経口施用した場合に各々毒性活性をもつ殺昆虫組成物を提供する。
組成物は実際にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞を含むものでもよいし、あるいはＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細胞培養物から抽出した上清を含むものでもよい。但し、組成物は追って例示するようなＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓから単離可能な毒素を含むものが好ましい。
図２の配列は４０ｋｂのオーダーの長さである。この配列は、各々単独又は一緒に調節可能であるか又は殺昆虫性となり得る２種以上のタンパク質をコードする場合もあると考えられる。どの部分が殺昆虫活性に必要又は十分であるかは慣例通りに決定できる。
本明細書で使用する「変異体」なる用語は、活性は類似するが、アミノ酸配列が改変された毒素を意味する。アミノ酸のうちには活性の種類をさほど変えずに別のアミノ酸で置換できるものがある。置換は、あるアミノ酸を広義の類似性質のアミノ酸に置換する「保存置換」でもよいし、非保存置換でもよい。但し、一般に変異体は天然毒素と少なくとも６０％、適切には少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％相同である。
「誘導体」なる用語は、例えば化学的又は生化学的方法により改変された毒素を意味する。
これらの毒素は新規であり、これらの毒素と該毒素をコードする核酸は本発明の別の側面を構成する。
好ましいＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種は細菌Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓである。本発明の範囲で有用なＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの特定株はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ（ＮＣＩＭＢ）から入手可能なＡＴＴＣ１９０６１株である。また、１９９７年７月１０日付けでＮＣＩＭＢに寄託された２種の新規Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株（受託番号ＮＣＩＭＢ４０８８６及びＮＣＩＭＢ４０８８７）も利用できる。これらの株も本発明の別の側面を構成する。
全株は下表１に示すような共通特性をもつ。
0004338057.tif 000002
害虫標的は昆虫が好ましく、より好ましくは鱗翅目、特にＰｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅもしくはＰｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ又は双翅目、特にＣｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｃｉａｔｕｓである。
本発明の好ましい態様では、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞又はこれに由来する薬剤を経口殺虫剤としてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと併用する。
別の態様では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ自体を使用せずに、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから獲得可能な殺虫性材料（例えばδ内毒素又は他の単離物）をＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種と併用する。
「〜から獲得可能」なる用語は、該当細菌から直接単離された材料のみならず、その後、他の生物にクローニングされ、産生された材料も意味する。
従って、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属の細菌（及びこれに由来する材料）がこれを摂取させた場合に殺虫活性をもち、このような細菌及び材料をＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（及びこれに由来する毒素又は材料）と有利に併用できるという予想外の発見は、本発明の別の側面の基礎となる。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物単独の殺虫活性は十分に立証されている。しかし、このような単離物とＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種の細菌（又はこれに由来する材料）の相乗殺虫活性は未だ立証されていない。
本発明の更に別の態様では、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞の代わりにＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種、特にＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの培養物から抽出した培養上清を上記方法で使用する。
これらの全方法は特に害虫防除に使用することができる。
本発明によると、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種、好ましくはＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからの細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを併有する殺虫組成物も入手可能になる。上記方法と同様に、本発明の組成物ではＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの殺虫性毒素（好ましくはδ内毒素）を使用してもよい。
同様に、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種からの細胞の代わりにＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種、好ましくはＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの培養物から抽出した培養上清を使用してもよい。
このような組成物は特に、例えば作物に噴霧することにより作物防御や、家畜類防御に使用することができる。更に、本発明の組成物は媒介生物防除にも使用することができる。
本発明は更に、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種から単離可能な新規殺虫剤にも関する。このような殺虫剤の単離方法は当業者に自明である。
特に、このような方法では毒素タンパク質をタンパク質レベル又はＤＮＡレベルで分離及び同定する。
本願出願人は殺昆虫活性をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ＮＣＩＭＢ４０８８７からのＤＮＡの領域をクローニングし、部分的に配列決定し、これを後記図２（配列番号１）として示す。従って、好ましい態様では、本発明は配列番号１のＤＮＡ又はその変異体もしくはフラグメントによりコードされる毒素も提供する。
本発明はこのような毒素をコードする組換えＤＮＡも提供する。本発明の組換えＤＮＡは図２の配列を含むものでもよいし、その変異体又はフラグメントを含むものでもよい。遺伝暗号の縮重の結果として他のＤＮＡ配列が類似タンパク質をコードする場合もある。本発明はこのような全配列を包含する。
本発明で提供する配列から、毒素遺伝子のＤＮＡを同定した後に抽出するために使用可能なプローブを作製することができる。その後、当業者に自明のようにこのＤＮＡをベクター及び宿主細胞にクローニングすることができる。
図２の配列を含むか又はストリンジェント条件下でこの配列とハイブリダイズするＤＮＡも本発明の別の側面を構成する。
「〜とハイブリダイズする」なる用語は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ著“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に例示されているようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で塩基配列が図２の配列の全部又は一部とアニールすることを意味する。
任意の特定解析法で使用される配列の長さはその方法の種類、配列の相補度、配列の種類及び特にプローブ又はプライマーのＧＣ含量と使用する特定ハイブリダイゼーション条件に依存する。高ストリンジェンシー条件下では、完全に相補的な配列しか結合しないが、低ストリンジェンシー条件下では、標的配列に６０％、より適切には８０％相同な配列が結合する。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」なる用語は高ストリンジェンシー条件と低ストリンジェンシー条件の両者を含む。
図２のＤＮＡの適切なフラグメント、即ち殺虫剤をコードするフラグメントは標準技術を使用して同定することができる。例えばＨ．Ｓ．Ｓｉｅｆｅｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８６）８３，７３５−７３９に記載されているように、例えばトランスポゾン突然変異誘発法を使用することができる。種々のトランスポゾンを使用してコスミドｃＨＲＩＭＩ等のベクターを突然変異させた後、殺昆虫活性の低下をスクリーニングすればよい。こうして毒性活性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡの領域を同定することができる。
例えば、ｃＨＲＩＭ１  ＤＮＡを大腸菌ＲＤＰ１４６（ｐＬＢ１０１）にエレクトロポレートしてこの株を大腸菌ＲＤＰ１４６（ｐＯＸ３８）、次いで大腸菌ＮＳ２１１４Ｓｍと交配することにより、ミニトランスポゾンｍＴｎ３（ＨＩＳ３）をｃＨＲＩＭ１等の毒性Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓクローン（以下、「クローン１」と呼ぶ）に導入すればよい。最終株はトランスポゾンｍＴｎ３（ＨＩＳ３）の単独挿入部位をもつｃＨＲＩＭ１ＤＮＡを含む。後記実施例８に記載するように、これらのコロニーを培養し、殺昆虫活性を試験すればよい。制限マッピングやＤＮＡシーケンシングを使用すると、ｍＴｎ３（ＨＩＳ３）の挿入点、従って毒性に関与するＤＮＡの領域を同定することができる。Ｔｎ５やｍＴｎ５等の他のトランスポゾンでも同様のアプローチを使用できる。
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏｏｋ著“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに要約されているようなｃＨＲＩＭ１の部位特異的突然変異誘発を使用してもＤＮＡの特定領域の毒性活性を試験することができる。
あるいは、サブクローニング法を使用して殺昆虫活性をコードするクローン化ＤＮＡの領域を同定することもできる。この方法では、ＤＮＡの特定の小さいフラグメントをサブクローニングし、活性を測定する。このためには、コスミドＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、ｐＵＣ１９等のプラスミドベクター上の適合可能な制限部位に連結すればよい。連結混合物を大腸菌に形質転換し、抗生物質耐性等の選択マーカーを使用してプラスミドベクター上でコードされる形質転換クローンを選択する。これらの技術の詳細は例えばＭａｎｉａｔｉｓら，前出（３９０〜３９１頁参照）や、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｂｎｅｒ及びＪ．Ｆ．Ｂａｔｔｅｙ著Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２２２〜２２４頁参照）に記載されている。
後記実施例８に記載するように、特定クローン化フラグメントを含む個々のコロニーを培養し、活性を試験することができる。同一方法を使用して殺昆虫活性をもつサブクローンを更に切断し、活性をコードするＤＮＡの領域を更に同定することができる。
本発明は更に、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ又はその変異体の培養物から獲得可能であり、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対して経口殺虫活性をもち、５５℃まで実質的に熱安定性であり、タンパク性であり、経口殺虫剤としてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞と相乗作用し、トリプシン及びプロテイナーゼＫによるタンパク分解に実質的に耐性であることを特徴とする単離殺虫剤も開示する。
「５５℃まで実質的に熱安定性」とは、懸濁した薬剤を５５℃まで１０分間加熱後に試験した場合に薬剤が所定の殺虫活性を維持し、好ましくは未処理活性の少なくとも５０％を維持することを意味する。
「タンパク分解に実質的に耐性」とは、薬剤が３０℃で２時間プロテアーゼに暴露した場合に所定の殺虫活性を維持し、好ましくは未処理活性の少なくとも５０％を維持することを意味する。
「相乗作用」とは、成分の併用による活性が成分を個々に使用した場合に予想されるよりも高いことを意味する。例えば、単独使用時に２５％死亡率を与えるために十分な濃度の薬剤と経口殺虫剤としてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞を併用すると、単独使用時にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅの５０％死亡率を与えるために必要なＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞材料の濃度は少なくとも８０％低減する。
材料の活性は３０ｋＤａカットオフフィルターにより保持されるが、１００ｋＤａフィルターでは一部しか保持されないことが判明した。
好ましくは、薬剤は２５℃でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−０．１％、６０分）及びアセトン（５０％、６０分）で処理することにより殺虫活性が失われることを更に特徴とする。
当然のことながら、上記単離薬剤の特性を利用してＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種細胞及び培養液上清からこの薬剤を精製したり、その濃度を高めることができる。異種混合物からのタンパク質の精製方法は当該技術分野で周知である（例えば硫安沈殿、タンパク分解、既知分子量カットオフフィルターによる限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等）。経口殺虫活性に基づき、各段階後又は各溶離液試料中の薬剤濃度を簡便に定量することができる。このような方法は当業者に容易に実施される。
本発明は更に、１種以上の上記薬剤を含む経口殺虫組成物も開示する。このような組成物はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ種以外からの他の殺虫性材料も含んでいることが好ましい。
これらの他の材料は上記薬剤と相補性をもつように又は相乗作用するように選択する。
好ましくは、経口殺虫組成物は１種以上の上記殺虫剤とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（又はこれに由来する毒素、好ましくは内毒素）を併有する。
前記タンパク質をコードする組換えＤＮＡも本発明の別の側面を構成する。当業者に自明の通り、ＤＮＡはプロモーター、エンハンサー、シグナル配列等の適切な調節因子の作用下に発現ベクターに組み込むことができる。これらの発現ベクターも本発明の別の側面を構成する。これらの発現ベクターを使用すると、毒素を産生するように宿主生物を形質転換させることができる。
本発明によると、上記殺虫剤をコードする塩基配列を含む宿主生物も入手可能になる。
特性決定したタンパク質の配列を宿主生物にクローニングする方法は当該技術分野で周知である。例えば、タンパク質を精製及び配列決定すればよいが、配列決定に活性は不要であるので、ＳＤＳゲル電気泳動後にゲルのブロッティングを使用するとタンパク質を精製できる。タンパク質配列を使用し、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ遺伝子ライブラリーから適切なゲノムフラグメントを同定するためにそれ自体使用可能なヌクレオチドプローブを作製することができる。その後、タンパク質を発現することが可能な宿主生物に適切なベクターを介してこれらのフラグメントを挿入すればよい。このような一般法は通常使用されており、当業者に容易に実施できる。このような方法は、図２の配列によりコードされる以外のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の生成にも適用できる。
物性又は毒性を最適化するようにその遺伝子配列（従ってタンパク質構造）を改変することにより薬剤を操作（例えば突然変異）することが望ましい場合もある。
また、他の殺虫性タンパク材料（例えばＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからのδ内毒素）をも発現するように宿主を操作又は選択することが望ましい場合もある。また、薬剤の活性部分とこれらの他の毒性強化材料から構成される融合タンパク質を発現する宿主生物を作製することが望ましい場合もある。
宿主は例えば薬剤をコードする遺伝子で形質転換したＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを使用することにより、多量の精製用殺虫性材料を作製するように選択してもよい。但し、害虫耐性の改善が望まれる植物を宿主とすることが好ましい。利用可能な植物ベクターは当業者に周知であり、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのＴｉプラスミドが挙げられる。あるいは、例えば昆虫バキュロウイルスのように、害虫に直接病原性となるような宿主を選択してもよい。
本発明の教示及び範囲はこれらの宿主生物と、該生物により発現される薬剤、突然変異薬剤又は薬剤−融合材料の全てを包含する。
従って、本発明によると、工業的に利用可能な殺虫活性をもち、作物防御又は昆虫媒介病防御の改善に特に適した方法、組成物、薬剤及び生物が入手可能になる。
以下、非限定的な実施例と図面を参考に、本発明の方法、組成物及び薬剤を単に例示として説明する。当業者には、以下の記載から本発明の範囲に該当する他の態様も予想されよう。
図面
図１は実施例３に記載するようなＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＴＣＣ１９０６１の増殖とＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する細胞及び上清の活性の経時変化を示す。
図２はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓからのクローン化毒素遺伝子の主要部分の配列を示す。
図３は２種のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株（上記クローン１及び下記クローン３）からのクローン化毒素遺伝子の制限地図の比較を示す。
実施例
実施例１−経口殺昆虫剤としてのＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞の使用
細胞増殖：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの継代培養物（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能なＡＴＣＣ１９０６１株９９６５）を使用し、１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及びＮａＣｌ  ５ｇを含有するルリアブロス５０ｍｌを入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種した。フラスコを回転震盪器で４０時間２７℃で培養した。
細胞懸濁液の調製：培養液を５０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１回洗浄し、ｐＨ７．４の等容量のリン酸緩衝塩類溶液（１リットル当たりＮａＣｌ  ８ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4  １．４４ｇ及びＫＨ2ＰＯ4  ０．２４ｇ）に再懸濁した。
細胞懸濁液の対昆虫活性：次のようにバイオアッセイを行った。
Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ：（ＤａｖｉｄとＧａｒｄｉｎｅｒ（１９６５）Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ，２０７，８８２−８８３に記載されているような）人工寒天飼料に細胞懸濁液の連続希釈液を加え、幼虫に与えた。バイオアッセイは各用量につき幼虫最低２５匹として５用量を使用して実施した。未処理細胞と熱処理（１０分間５５℃）細胞を試験した。温度を２５℃に維持して２及び４日後に死亡率を記録した。
0004338057.tif 000003
Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ：細胞懸濁液を５種の異なる濃度で脱イオン水に希釈し、この連続希釈液に幼虫を暴露した。９．５ｃｍプラスチックカップで５０ｍｌ細胞懸濁液の希釈液毎に２用量を使用し、各用量につき第２齢幼虫２５匹としてバイオアッセイを実施した。未処理細胞と熱処理（１０分間５５℃又は８０℃）細胞を試験した。温度を２５℃に維持して２日後に死亡率を記録した。
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Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｃｉａｔｕｓ：細胞４ｘ１０7個／ｍｌを含む単一濃度細胞懸濁液に幼虫を暴露した。９．５ｃｍプラスチックカップで各カップにつき第２齢幼虫２５匹として５０ｍｌ細胞懸濁液２容量を使用してバイオアッセイを実施した。未処理細胞と熱処理（１０分間５５℃又は８０℃）細胞を試験した。温度を２５℃に維持して２日後に死亡率を記録した。
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これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからの細胞は多数の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として有効である（特にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対して強力である）。殺昆虫活性は細胞生存率に依存しない（即ち細胞生存率を＞９９．９９％低下させる５５℃までの加熱下でさほど変化しない）が、大半のタンパク質が変性する温度である８０℃まで加熱すると活性は著しく低下する。
実施例２−経口殺昆虫剤としてのＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清の使用
細胞増殖：実施例１と同様に培養した。
上清の調製：培養液を１０分間１００００ｘｇで２回遠心分離した。細胞ペレットを捨てた。
上清の対昆虫活性：次のようにバイオアッセイを行った。
細胞懸濁液の代わりに上清の連続未処理希釈液を使用した以外は実施例１のＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅと同様に新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅと２日齢Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ幼虫に対する活性を測定し、４日後のみに死亡率を記録した。
0004338057.tif 000006
更に、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清を加えた人工飼料をＭａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫に与えた処、寸法減少活性（７日間で６２％減少）が検出された（結果は示さず）。
これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ培養液からの上清は多数の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として有効であり、特にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対して強力である。
上清を１０分間５５℃まで加熱すると、活性は部分的に低下したが、８０℃にすると活性は完全に失われた。ＳＤＳ（０．１％ｗ／ｖ、６０分）及びアセトン（５０％ｖ／ｖ、６０分）で処理した場合も活性は完全に失われたが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％、６０分）、非飼料Ｐ４０（０．１％、６０分）、ＮａＣｌ（１Ｍ、６０分）又は２週間４℃もしくは−２０℃の低温保存下では変化しなかった。これらの全性質はタンパク質に一致する。
Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及び上清の一般作用方式即ち高用量で２日以内の幼虫寸法減少と死滅及び他の性質（例えば耐熱性）も同様であると思われ、単独薬剤又は単独種の薬剤が細胞及び上清の両者の経口殺昆虫活性に関与していると考えられる。
実施例３−摂取性殺昆虫活性の出現の経時変化
細胞増殖：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの一晩培養物１ｍｌを使用して三角フラスコに接種した。次いで、実施例１と同様に細胞を培養した。６００ｎｍの光学密度を測定することにより増殖を推定した。
細胞懸濁液及び上清の調製：実施例１及び２と同様に調製した。
細胞及び上清の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性：ブロス５０μｌ／ｇ飼料に等価の単一用量の懸濁細胞を使用し、２日後に死亡率を測定した以外は、実施例１と同様に細胞懸濁液バイオアッセイを実施した。上清５０μｌ／ｇ飼料（即ちＬＣ５０の>２倍）に等価の単一用量を使用し、２日後に死亡率を測定した以外は、実施例２と同様に細胞上清バイオアッセイを実施した。
結果を図１に示す。これらの結果から明らかなように、Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ培養液から抽出した細胞は僅か５時間後にＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する経口殺昆虫剤として非常に有効であり、上清は２０時間後に非常に有効である。初期増殖段階に多少の細胞溶解が観察されたが、この点を過ぎると有意細胞溶解は全く観察されなかったため、上清活性は（細胞分解後のみに放出されるものではなく）真の細胞外物質に起因すると思われる。
実施例４−Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末調製物の相乗作用
細胞増殖及び懸濁：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例１と同様に増殖及び懸濁した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＨＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ  ４３２１０，ＵＳＡ）をＤｕｌｍａｇｅら（１９７０）Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５，１５−２０に記載されているように培養し、回収し、粉末状にした。
Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓとＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを併用又はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞粉末を単独で使用してバイオアッセイを実施した。バイオアッセイはＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の種々の希釈液を使用した以外は、実施例１と同様に実施した。併用実験では、更に２５％死亡率を与えるために十分な一定用量のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞懸濁液を飼料に加えた。２日後に死亡率を記録した。
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これらの結果は、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅに対する経口殺昆虫剤として作用する場合のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の相乗作用を明白に立証するものである。
実施例５−Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の相乗作用
細胞増殖及び上清の調製：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例２と同様に増殖させ、上清を調製した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを実施例４と同様に増殖させ、処理した。
Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清及びＢｔ細胞粉末の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを併用又はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末を単独で使用してバイオアッセイを実施した。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓの代わりにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの種々の希釈液を使用した以外は実施例２と同様に、新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅと２日齢Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ及びＰｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ幼虫に対するバイオアッセイを実施した。併用実験では、更に２５％死亡率を与えるために十分な一定用量のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清を飼料に加えた。４日後に死亡率を記録した。
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これらの結果は、数種の昆虫種に対する経口殺昆虫剤として作用する場合のＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清とＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ粉末の相乗作用を明白に立証している。Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞及び上清の両者がこの相乗作用を示すという事実は、単独薬剤又は単独種の薬剤が試験した活性に関与していることを強く示唆するものである。
実施例５−Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ上清からの殺昆虫剤のタンパク分解による特性決定
細胞増殖及び上清の調製：Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ細胞を実施例２と同様に増殖させ、上清を調製した。
上清のタンパク分解：培養上清（５０ｍｌ）を４℃で４８時間０．５Ｍ  ＮａＣｌ（３ｘ１リットル）で透析した。ポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で覆い、透析管内の上清の容量を５倍に減量した。試料を取り出し、０．１ｍｇプロテアーゼ／ｍｌ試料の濃度のトリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８２５３＝１０，０００ユニット／ｍｇ）又はプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０３９０＝１０ユニット／ｍｇ）で３０℃で２時間処理した。
プロテアーゼで処理した上清の対Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性：直径４．５ｃｍのプラスチックポットで実施例１に記載した人工寒天飼料に各「処理物」２５μｌを塗沫することにより、新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫に対するバイオアッセイを実施した。各処理物毎に幼虫を１０匹ずつ入れたポット４個を使用した。１及び２日後に死亡率を記録した。水のみ、トリプシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用した対照も同様に試験した。
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実施例６
他のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの殺昆虫活性
実施例１及び２の方法を使用して４種のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株を害虫に対して試験した。得られた結果は以下の通りであった。
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全４株とも８０℃に１０分間加熱すると、細胞と上清の殺昆虫活性は＞９９％低下することが判明した。
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更に、全株ともＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの成長を有意に抑制した。
実施例７
Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株からの毒素遺伝子のクローニング
Ｑｕｉａｇｅｎゲノム精製ＤＮＡキットを使用してＮＣＩＭＢ４０８８７及びＡＴＣＣ１９０６１から全細胞ＤＮＡを単離した。細胞をＬブロス（１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及びＮａＣｌ  ５ｇ）中２８℃で震盪（１５０ｒｐｍ）しながら光学密度１．５Ａ600まで増殖させた。培養物を４０００ｘｇで遠心分離して回収し、バッファーＢ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７．０）３．５ｍｌに再懸濁し、３０分間５０℃でインキュベートした。Ｑｕｉａｇｅｎ  １００／Ｇチップを製造業者の指示通りに使用して細菌溶解液からＤＮＡを単離した。得られた精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中−２０℃で保存した。
制限酵素Ｓａｕ３ａで部分的に消化したＮＣＩＭＢ４０８８７及びＡＴＣＣ１９０６１の全ＤＮＡを使用して代表的ＤＮＡライブラリーを構築した。各株からのＤＮＡ約２０μｇを酵素０．２５ユニットと共に３７℃でインキュベートした。１０、２０、３０、４５及び６０分間隔で試料を取り出し、６５℃に１５分間加熱した。ＤＮＡフラグメントの寸法を可視化するために、試料を０．５％ｗ／ｖアガロースゲルで電気泳動した。
３０〜５０ｋｂフラグメントを最高の割合で含むＤＮＡ試料を集め、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）４ユニットで１５分間３７℃で処理した後、６５℃で熱処理し、ホスファターゼを不活化した。
寸法選択したＤＮＡフラグメントをコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ！（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨ１部位に連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩパッケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従って使用して大腸菌株ＸＬ  Ｂｌｕｅ  １にパッケージングした。
殺昆虫活性をもつコスミドクローンを選択するために、２５μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬ寒天プレート上で選択した各コロニーを（２５μｇ／ｍｌアンピシリンを加えた）Ｌブロス中で２８℃で一晩増殖させた。ブロス培養液（５０μｌ）を実施例５に記載したように直径４．５ｃｍのポットに入れた昆虫飼料の表面に夫々塗沫した。各容器に新生Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ幼虫１０匹を加えた。２４、７２及び９６時間後に幼虫を試験し、死亡率と生存幼虫の寸法を記録した。試験した合計２２０個のＮＣＩＭＢ４０８８７のクローンのうち、２個は７２時間以内に幼虫成長の抑制と死亡を生じることが判明した。ＡＴＣＣ１９０６１からのクローン３７０個のうち、１個は７２時間以内に幼虫死を生じることが判明した。
実施例８
クローン化毒素遺伝子の対Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ活性
２５μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬブロス中、実施例７からの３種の活性クローンを１５０ｒｐｍの回転震盪器で２４時間２８℃で増殖させた。実施例１に記載したように、完全ブロス培養液を昆虫飼料に加えることにより、新生幼虫に対する毒素クローンの活性を試験した。
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大腸菌毒素クローンを８０℃に１０分間加熱し、１００μｌ／ｇの割合で飼料に加えた処、対幼虫活性は検出されなかった。毒素の熱感受性は顕著である。
実施例９
ＮＣＩＭＢ４０８８７からのクローン化毒素のシーケンシング
Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  ＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用し、ＮＣＩＭＢ４０８８７からの上記殺昆虫性クローン１のコスミドＤＮＡを精製した。一組の制限酵素ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｌ１及びＳａｃ１を使用して図３に示すようなクローン化フラグメントの部分地図を得た。酵素ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ及びＰｖｕＩＩを使用し、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９にクローニングしたコスミドのサブクローンからＤＮＡシーケンシングを開始した。精製コスミドＤＮＡ上でプライマーウォーキングアプローチを使用して配列ギャップを埋めた。ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔとＡｍｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＦＳを製造業者の指示に従って使用して連鎖反応を実施した。製造業者の指示に従ってＡＢＩ自動シーケンサーで試料を解析した。クローン化毒素フラグメントのＤＮＡ配列の主要部分を図２に示す。
実施例１０
クローン３からのクローン化毒素の制限地図
上記殺昆虫性クローン３のコスミドＤＮＡを実施例９に記載したように精製した。制限酵素ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｌ１及びＳａｃ１を使用してクローン化フラグメントの制限地図を得、これを図３に示す。クローン１からの地図（図３）に比較すると、オーバーラップする領域にわたって制限地図は非常によく似ていることが明白である。これらの２種のクローン間の唯一の検出可能な相違は、クローン１の１１．４ｋｂ及び７．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに対応するクローン３の２個のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの寸法が夫々約２Ｋｂ及び２００ｂｐ小さいことであった。これらの結果は、２種の細菌株で毒性をコードするＤＮＡ領域の総合関連性を示している。
実施例１１
サザンブロットハイブリダイゼーション実験
クローン１からのＤＮＡの１０．３ｋｂ  ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１フラグメントをプローブとして使用し、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ株ＡＴＣＣ１９０６１、ＮＣＩＭＢ４０８８６及びＮＣＩＭＢ４０８８７の総ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは２０ｎｇ／ｍｌのＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを使用して６５℃で１８時間実施した。免疫検出前にフィルターを５分間室温で２ｘＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムで２回、１５分間６５℃で０．１ｘＳＳＣ（１５ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで２回洗浄した。非放射性ＤＩＧ  ＤＮＡ標識及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、製造業者の指示に従ってプローブを標識し、実験を行った。プローブは全３種の株の約８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、ＮＣＩＭＢ４０８８７の１１．４ｋｂフラグメントと、ＮＣＩＭＢ４０８８６及びＡＴＣＣ１９０６１の約９ｋｂフラグメントにハイブリダイズした。これらの結果は、ＮＣＩＭＢ４０８８６及びＡＴＣＣ１９０６１株が上記クローン１の毒素遺伝子に高い相同度をもつＤＮＡを含むことを示しており、３種の株により産生される毒素の類似性を裏付けている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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