(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備えた組織から細胞を分離する装置であって、前記第１の端部は、組織消化室及び細胞分散室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、細胞分散液から細胞を濾過することができるフィルタを含み、
前記第１の端部は、未消化の組織が細胞隔離ユニットに入ることを阻止するフィルタを有する細胞分離装置。
【請求項２】
前記第２の端部のフィルタの孔の前記寸法は、０．１μｍ乃至１０００μｍの範囲である請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記細胞隔離ユニットは、管の形態であり、前記室は、閉鎖した端部を有する管の形態である請求項１又は２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記室は、前記細胞隔離ユニットの端部に受け入れ可能なシュリンジである請求項１から３のうちいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記細胞隔離ユニットは、内径が変化し、前記第１の端部及び第２の端部の直径は、１０ｃｍまでであり、前記細胞隔離ユニットの小さい内径は、０．１ｍｍ乃至２ｍｍの範囲である請求項１から４のうちいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部のフィルタの孔の寸法は、１０μｍ乃至１０００μｍの範囲であり、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部のフィルタの前記孔は、０．４μｍ乃至１０μｍの範囲である請求項１から５のうちいずれか１つに記載の細胞分離装置。
【請求項７】
ａ）第１の開放端部及び第２の開放端部を有する細胞隔離ユニットを用意する工程と、
ｂ）組織消化室で組織の解体材料によって消化された組織から細胞を形成するために組織供給源を用意する工程と、
ｃ）廃棄室を用意する工程と、
ｄ）血清室に血清源を用意する工程と、
ｅ）細胞分散室を用意する工程と、
ｆ）細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記組織消化室を、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記廃棄室を接続する工程と、
ｇ）前記組織消化室の細胞を前記細胞隔離ユニットに通るように力を加え、前記ユニットの前記第１の端部のフィルタに未消化の組織を捕捉し、前記ユニットの前記第２の端部のフィルタに細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｈ）前記組織消化室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｉ）前記ユニットの前記第１の端部のフィルタを取り除いて、前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記血清室を接続する工程と、
ｊ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記細胞分散室に洗い流される工程と、を有する細胞を隔離する方法。
【請求項８】
前記工程ｇ）及びｊ）の力は遠心力である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織の解体材料は、酵素である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素は、ディスパーゼ、ニューラミダーセ（シアリダーセ）、パンクレアチン・プロテイナーゼＫ、ブロメライン、プロナーゼＥ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、エラスターゼ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、コラゲナーゼ、サブチリスン、クロストリドペプチダーゼＡ、フィシン、カルボキシペプチダーゼＡ、ペクチナーゼ、ペクチネステラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシダーゼ、中性プロテーゼ、グリコシダーゼ、エンドペプチダーゼ、パンクレアチン、メタロプロチナーゼ、セリンプロテーゼ及びその混合物から成るグループから選択された請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を採取する装置及び方法に関する。さらに詳細には、本発明の１つの実施形態は、医療または研究の分野で組織から細胞を直接分散することができる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療科学及び医療上の治療における進歩に伴って、医療用または研究用の処置に使用するための生体細胞を隔離し収集する方法及び装置に対するニーズが急激に生じている。このような処置は、火傷による組織の移植、受容者自身の病気により、または損傷した肝臓のような組織または器官を補助し増大するために特定の細胞を治療する際、細胞の挿入をさらに改善するために分離した細胞の植え込み（seeding）を含む。
【０００３】
生体細胞を分離するために開示された種々の方法及び装置の中に、ＥＰ特許４４６４５０Ｂ１号に開示されているものがある。この特許は、内皮の細胞生成物をつくるために組織を消化処理する装置を開示している。開示された装置は、５つの主なサブシステム、即ち、１）脂肪収集ユニット（図１参照）、２）消化ユニット（図２参照）、３）内皮細胞分離ユニット（図３参照）、４）血管移植処理ユニット（図４参照）、５）内皮細胞デポジッションユニット（図４参照）から成る。３つの室、すなわち、消化室２１０、廃棄室２１２及び隔離室２１４から成る他の実施形態（図１４参照）が開示されている。消化室２１０は、通常は閉鎖されたチェック弁２２０を含むプレート２１８によって廃棄室２１２から分離されている。フローティング玉チェック弁２２４を含む換気弁２２２が破棄室２１２から隔離室２１４に延びている。消化室２１０は、一連のポート２２８，２２９，２３０によって外部と連通している。消化室２１０は、スクリーン２３２によって隔離室２１４から分離している。隔離室２１４は、２つのポート２３４及び２３６を有し、その各々は、２つの位置弁２３８及び２４０を含む。第１の位置は、アンプル２３５の中間部分とアンプルの上方部分及び下方部分との間で連通を可能にする。第２の位置は、アンプル２３５の中間部分と外側ポート２３４及び外側ポート２３６との間で連通を可能にする。最初は、双方のアンプル弁２３８及び２４０は、第１の位置にある。装置は、ポート２２８及びポート２３０に接続された脂肪吸引真空ラインと直線的なキャッチトラップとして使用される。脂肪が収集された後、脂肪吸引ラインが分離され、ポート２２８及びポート２３０は、キャップがつけられ、洗浄溶液（Media 199E, Hanks, saline, PBSまたは他の生理バッファ食塩水）がポート２２９を通して導入される。脂肪は、シェーキング装置のような外部装置によって洗浄溶液で撹拌される。この装置は、アンプルの側面を上にして遠心分離器に配置され、通常閉鎖されたチェック弁２２０が開放され、洗浄溶液が廃棄室２１２に挿入されるまで回転される。換気弁２２２のボール弁２２４は、遠心力が加えられる間に開放し、廃棄室２１２を換気することができるようにし、空気は、洗浄溶液によって移動されることができるようにする。消化酵素溶液（コラーゲン、ディスパーゼ、トリプシン、または他の組織の分離酵素）がポート２２９を通して導入され、再び撹拌が行われる。消化が完了するとき、装置は、側面を下にして再び遠心分離器にかけられる。アンプル２３５に分離されている内皮細胞を隔離するために、双方の弁２３８及び２４０がそれらの第２の位置に回転される。この細胞の「ペレット」は、アンプルポート２３４またはアンプルポート２３６の一方に圧力ラインを取り付けることによって流し出すことができる。
【０００４】
また、米国特許第５，４０９，８３３号は、組織から識別可能なある細胞を受け、クリーニングし、消化し、隔離するために使用される単一の装置が開示され、この装置は、処理室を含むスクリーンバスケットを含むハウジングを有する。処置室は、下方の円錐形部分と、スクリーンバスケットの下方部分を画定する円錐形部分を含むスクリーンバスケットとを有する。スクリーンバスケット及びその円錐形部分は、処理室内に配置され、このバスケットの下方円錐形部分は、ハウジングからスクリーンバスケットを分離するギャップを画成し、このギャップの寸法は、スクリーンバスケットとその円錐形部分にわたってほぼ一定である。使用において、装置は、遠心分離器にかけられた後に微少血管細胞の細胞ペレットをつくるために弁の使用を含むいくつかの洗浄工程と、細胞消化工程とを必要とする。このペレットは、ペレットの上流のポートを通じた無菌バッファ液の導入によって取り除かれなければならず、この液体により装置の外部に通じる第２のポートを通してペレットを押し出す。このポートは、弁により開閉される必要がある。連続した処置の装置を再使用することは、装置の通路と弁の配置によって複雑になる殺菌作業が必要になることが予想される。
【０００５】
前述した特許は、単一の装置のような細胞分離装置の実施形態を開示しているが、操作者によってポートと、ポートへの種々の接続のための弁機構とのすべての機能に精通していなければならないという点で操作が難しいことは明らかである。さらに、これらの装置の再使用は、装置の無菌の再使用を保証するために装置の通路の複雑性によって無菌及びクリーニング手順が必要になる。
【０００６】
本発明は、以降説明するような簡単で迅速な手順で組織から細胞を隔離する無菌装置及び方法を提供することによって従来技術についての改善を行う。また、本装置は、前に開示した装置の通路の複雑性がないのでクリーニング及び殺菌をする弁機構を必要とせず、簡単に使用することができる。さらに、本発明の装置は、使い捨ての用途に特に適しており、それによって、使用される装置のクリーニング及び殺菌の問題を解消する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの実施形態は、第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備えた組織から細胞を分離する装置に関する。前記第１の端部は、組織消化室及び分散細胞室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを含む。
【０００８】
本発明の他の実施形態は、ａ）第１の開放端部及び第２の開放端部を有する細胞隔離ユニットを用意する工程と、
ｂ）組織消化室で組織の解体材料によって消化された組織から細胞を形成するために組織供給源を用意する工程と、
ｃ）廃棄室を用意する工程と、
ｄ）血清室に血清源を用意する工程と、
ｅ）細胞分散室を用意する工程と、
ｆ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記組織消化室を、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記廃棄室を接続する工程と、
ｇ）前記組織消化室の細胞を前記細胞隔離ユニットに通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部で細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｈ）前記組織消化室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｉ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記血清室を接続する工程と、
ｊ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記分散細胞室に洗い流される工程とを有する細胞を分離する方法に関する。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、すでに消化されるか、分散された組織から細胞を分離する装置を含む。種々のタイプ及び寸法の細胞を含む分散液から細胞を分離することが好ましい。この実施形態において装置は、第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備え、前記第１の端部は、第１の分散細胞室及び第２の分散細胞室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを有する組織から細胞を分離する細胞分離装置を含む。
【００１０】
本発明による他の方法は、ａ）第１の開放端部及び第２の開放端部を有する細胞隔離ユニットを用意する工程と、
ｂ）第１の細胞分散室で分離された細胞の第１の分散を実行する工程と、
ｃ）廃棄室を用意する工程と、
ｄ）血清室に血清源を用意する工程と、
ｅ）第２の細胞分散室を用意する工程と、
ｆ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第１の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記廃棄室を接続する工程と、
ｇ）前記第１の組織分散室の前記細胞が前記細胞隔離ユニットを通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部に細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｈ）前記第１の細胞分散室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｉ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第２の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記血清室を接続する工程と、
ｊ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記第２の細胞分散室に洗い流される工程とを有する細胞を隔離する方法を含む。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備え、前記第１の端部は、第１の分散細胞室及び第２の分散細胞室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、分散室から細胞を濾過することができるフィルタを有する組織から細胞を分離する細胞分離装置を含む。
【００１２】
この装置は、次の工程によって組織から細胞を分離する。
この工程は、ａ）前記第１の細胞分散室で細胞の第１の分散を行う工程と、
ｂ）前記第１の分散細胞室を前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に接続し、前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に接続する工程と、
ｃ）前記第１の組織分散室の前記細胞が前記細胞隔離ユニットを通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端で細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｄ）前記第１の細胞分散室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｅ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第２の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に血清を含む血清室を接続する工程と、
ｆ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記第２の細胞分散室に洗い流される工程とを有する。
【００１３】
本発明の装置の工程は、上述した第１の方法の実施形態に説明したような組織のサンプルの消化によって始まり、細胞隔離を完了する方法の工程を含むことに留意すべきである。
【００１４】
本発明の利点は、組織から細胞を隔離する簡単で迅速な方法を含む。本発明によれば、４５分ほどで提供者から組織のサンプルが取られ、部分細胞に消化され、消化された細胞が分離され、所望な用途において植え込み用細胞として適用される。この装置は、理想的には、単一回の使用が適しており、それによって、使用後のクリーニングと殺菌の必要性を解消する。しかしながら、所望であれば、再使用も可能である。本発明の装置は、再使用する前に完全なクリーニング及び殺菌の問題がある弁装置を必要としないからである。本発明の他の利点は、装置の使用が最小限の装置の動作に関する指示、コスト及び追加される装置を含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態及びその利点は、次の説明及び図面を参照することによって最もよく理解することができる。図面においては、同じ部品には同じ参照符号が使用されている。
【００１６】
図１は、本発明の装置１００の実施形態の基本的な部品を示す全体図である。装置１００は、隔離ユニット２００、組織消化材料３２０を含む組織消化室３００、廃棄物収集室４００、血清５１０を含む血清室５００、及び分散細胞室６００を含む。
【００１７】
細胞隔離ユニット２００は、第１の端部２０１と、第２の端部２０２とを有する。第１の端部２０１は、開口を有する取り外し可能なゲージまたはフィルタ２１０を選択的に含み、開口は、大きな未消化の組織がフィルタ２１０を通過することを防止しながら、ほぼ０．１μｍ乃至１０００μｍの寸法の範囲の消化された細胞が、通過することができるような十分な大きさである。第２の端部２０２は、消化された細胞が通過されることを阻止する寸法の開口を有するフィルタ２２０を有する。通常、フィルタ２２０の開口は、０．１μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは０．４μｍ乃至１０μｍの範囲である。フィルタ２１０及びフィルタ２２０は、絹、モスリン、ステンレススチール、ファイバガラス、セルロースアセテート、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、ナイロン及びニトロセルロースを含む適当な生物適合性材料からつくることができる。フィルタ２１０の好ましい材料は、ナイロンであり、フィルタ２２０に好ましい材料は、ニトロセルロースである。また、フィルタ２１０及びフィルタ２２０は、濾過を補助する次第に狭くなる開口を有し、一連の大きなフィルタを有し、このフィルタは、大きな細胞または未消化の組織が細かな開口を有するフィルタにつまらないように阻止する。細胞収集器２００のこの実施形態に示されているのは選択通路２３０である。通路２３０は、第１の端部２０１と第２の端部２０２に比較して狭い直径の通路である。通路２３０の目的は、消化細胞の分離の際に補助することであり、このような塊状物は、フィルタ２２０に到達する前に固まることがある。また、通路２３０は、第１の端部２０１と通路２３０との間に遷移領域２３２を有し、通路２３０と第２の端部２０２との間に遷移領域２３４を有するように図示されている。大部分の用途において、通路２３０の直径は、ほぼ０．１ｍｍ乃至２ｍｍの範囲であり、端部２０１及び端部２０２の直径は１ｍｍ乃至１０ｃｍの範囲であると考えている。また、図１は、１つの通路２３０のみを示しているが、本発明の他の実施形態では、複数の通路を有することも考えられることに留意すべきである。
【００１８】
図１において、組織消化室３００、廃棄物収集室４００、血清室５００及び分散細胞室６００が１つの閉鎖端及び１つの開放端を有する管として図示されている。消化室３００の開放端３０１、廃棄物収集室４００の開放端４０１、血清室５００の開放端５０１及び分散細胞室６００の開放端６０１全体は、細胞隔離ユニット２００に適用に接続可能である。別の例として図示はしないが、室３００，４００，５００及び６００は、各々がプランジャ端部及び解放端部を有するシュリンジタイプの装置を有する。室の解放端部は、細胞隔離ユニット２００の開放端２０１及び開放端２０２に適当に接続可能である。この実施形態において、注射器タイプの室は、消化組織溶液を濾過し、消化細胞をフィルタ２２０に収集するように室の内容物に圧力をかけることができる。同様に、収集された細胞は、シュリンジタイプの血清室５００を取り付けることによって分散され、これにより、収集された細胞とは反対方向に細胞をフィルタ２２０から洗い流す。
【００１９】
細胞収集器２００、組織消化室３００、廃棄室４００、血清室５００及び分散細胞室６００は、生物適合性材料からつくることができる。適当な材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルフォン、テフロン（登録商標）ＦＥＰ、テフロン（登録商標）ＰＦＡ、ポリスチレン、ポリカーボネート、スツリレン、アクリロニトリル、アクリル、ガラス等を含む。
【００２０】
本発明の装置の動作を図２乃至図７を参照して説明する。
図２は、消化室３００に含まれた消化細胞を消化溶液及びもしあれば他の未消化組織から分離するために力（例えば、上述したようなシュリンジタイプ室のような遠心力または圧力）を加える前に組み立てられた装置１００を示す図である。図２を参照すると、組織３１０を隔離細胞（図示せず）に消化する容認可能な組織消化材料３２０の中にある未消化の組織３１０が示されている。消化室３００は、一端が細胞収集器２００に解放可能に接続されている。廃棄室４００は、消化室３００とは反対側で細胞収集器２００に接続されている。
【００２１】
好ましい実施形態において、組織の提供者の組織３１０が使用される。組織３１０は、従来の装置によって提供者から採取される。組織が皮膚のとき、好ましい方法は、表皮性／皮膚接合部の波形部分を捕捉する非常に薄いケラトン（keratome）によって組織を取り除く方法がある。このような技術によって０．２ｍｍに近い厚さで皮膚を取り除くことができる。非常に薄い組織のこれらのスライス部分は、組織を迅速に消化し、組織が取り除かれた組織の提供者の一部分を迅速に回復する補助となる。
【００２２】
容認できる組織消化材料３２０は、組織を隔離細胞に消化する適当な溶液を有する。適当な材料は、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、エステル加水分解機能を有するヒドラーゼのような酵素または同様に試薬を含む。このような酵素は、制限することを意図するわけではないが、ディスパーゼ、ニューラミダーセ（シアリダーセ）、パンクレアチン・プロテイナーゼＫ、ブロメライン、プロナーゼＥ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、エラスターゼ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、コラゲナーゼ、サブチリスン、クロストリドペプチダーゼＡ、フィシン、カルボキシペプチダーゼＡ、ペクチナーゼ、ペクチネステラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシダーゼ及びその混合物を含む。他の適当な酵素は、中性プロテーゼ、グリコシダーゼ、エンドペプチダーゼ、パンクレアチン、メタロプロチナーゼ、セリンプロテーゼ及びその混合物を含む。前述した混合物は、組織の消化用に最適な組成分を構成するために使用することができることは当業者に明らかである。消化される組織が表皮性皮膚である場合には、好ましい酵素は、コラゲナーゼ及びトリプシンである。細胞の量と純粋性を増加する他の薬剤は、例えば、エチレンエジアミン・テトラアセチン酸（EDTA）またはヌクレイン酸消化デオキシリンニュクレイアシダーゼ（DNase）用の酵素である。
【００２３】
組織として表皮性皮膚の０．２ｍｍのサンプルを消化する時間は、通常のコラゲナー及びトリプシンのようなプロテーゼを使用した場合、３７℃でほぼ３０分かかる。もちろん、消化時間は、使用される組織の種類、厚さ、酵素溶液の濃度を変化さ細胞ことによって変化することは当業者には明らかであろう。また、ある種の細胞を増やすことは、使用される酵素によって、及び消化時間を変化することによっていくつかの組織から得ることができる。
【００２４】
組織３１０が十分に消化されて適当な数の隔離細胞が形成されると、隔離細胞は、力を加えることによって酵素溶液３２０から分離される。図３は、遠心力を矢印２５０に示す方向に加えることと、その力の作用を示している。図２と比較すると、図３は、組織消化材料３２０及び隔離細胞３３０が消化室３００から出た状態を示す。隔離細胞３３０は、フィルタ２２０上に蓄積される。消費された組織消化材料３４０は、廃棄室４００に蓄積される。図示はしないが、フィルタ２１０には、選択フィルタ２１０の開口を通過するためには大きすぎる未消化の組織３１０が蓄積される。
【００２５】
上述した実施形態及び次の説明は、細胞の分離を達成するために遠心力のみを説明したが、本発明において、重力、真空、電磁力、及び求心力を含む他の形態の力も含むがそれには制限されない。
【００２６】
図４（ａ）及び図４（ｂ）は、消費された酵素溶液３４０から隔離細胞３３０を分離するために力を加えた後、装置１００を分離したことを示している図である。図４（ａ）を参照すると、矢印２６０は、細胞消化室３００及び廃棄室４００が細胞隔離ユニット２００から取り除かれる方向を示す。図４（ｂ）は、完全に分解された装置１００を示し、細胞隔離ユニット２００は、フィルタ２２０上に隔離細胞３３０を保持している。フイルタ２１０を示しているが、フィルタ２１０は、上述した次の工程が始まる前に取り除かれることが必要である。
【００２７】
図５は、血清室５００及び分散細胞室６００を含むように組立てられた装置１００を示している図である。
血清室５００は、隔離した細胞３３０を分散することができる適当な血清５１０を含む。適当な血清は、バランスのとれた食塩水溶液、等浸透性の溶液、細胞培養媒体、バッファ生理食塩水、全血液、プラズマその混合物を含む。好ましい血清は、ＰＢＳ（フォスフェートバッファ食塩水）の等浸透性バッファ溶液である。
【００２８】
さらに、血清は、栄養素、成長要素、走化性要素、シトキン、オートコイズ、プロスタノイド、グルココルトイド、モルフォゲン、核ホルモン、レセプタアゴイスト及びその混合物を含む。
【００２９】
図６は、矢印２５０によって示されるように図５に示す装置に遠心力を加えることと、力を加えた後とを示す図である。図５と比較するとき、図６は、血清５１０及び隔離細胞３３０が血清室５００及び細胞隔離器２００をそれぞれ出たことを示す。隔離細胞３３０は、図７に示すように分散室６００の血清５１０に分散される。
【００３０】
図８（ａ）及び図８（ｂ）は、分散された隔離細胞の適当な使用を示す図である。図８（ａ）を参照すると、分散室６００の中身がマトリクス７００に配置された後、隔離細胞３３０が、矢印２７０によって示されるように毛管現象で細胞外スカフォールドまたはマトリクス７００に前進されることを示している。
【００３１】
適当なマトリクス７００は、生物学的な合成細胞外マトリクスを含む。適当な生物学的な細胞外マトリクスの例は、コラーゲン、フィブリン、非細胞組織、コーラル、アルジネート、フィブロネクチン、ヒアルロン酸等を含む。合成細胞外マトリクスは、デキストランポリマー、ポリビニルクロライド、ポリグリコリン酸、ポリアクチド酸、ポリラクチン・コグリコリン酸、シリコン、エチエンビニルアセテート、ポリ２ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ブチレンテレフタレート）、セラミックスその混合物を含む。
【００３２】
マトリクス７００に隔離細胞３３０を植え付ける十分な時間が経過した後、細胞が植え付けられたマトリクスは種々の用途に用いられる。
図８（ｂ）は、傷口８００に付着された細胞が植え付けられたマトリクス７００の１つの用途を示す図である。
【００３３】
本発明の装置及び方法は、皮膚、脂肪、筋肉、軟骨、肝臓、膵臓、頸動脈小体、大網、骨を含む。この細胞は、元の表現型に保持されるか、異なる表現型に変異することができるステムス／プロゲニトール型細胞であってもよい。隔離細胞は、生体外で分析するか、培養するために細胞を隔離するために使用される種々の方法によって組織に移植される。隔離細胞は、組織に直接注入されるか、異なる組成分（プロテイン／ポリサッカライド／グリコサミノグリカン／セラミックス）のスカフォールド、ジェルのビヒクル、または担体として作用する材料に適用される。細胞は、遺伝子工学によって操作されるか、元の組織、または他の異質遺伝的な、または自然派生組織に影響する病気を直接治療するために使用される。皮膚、器官、軟骨、骨、骨格、心臓の筋肉、または脂肪組織の再生または治療のために特別の用途がある。
【００３４】
例
組織サンプルの細胞マトリクス及び細胞アタッチメントを溶解するためにコラゲナーゼ及びトリプシンのプロテーゼを使用して組織消化室で３７℃で表皮のサンプルが培養される。培養組織を含む組織消化室は、未消化の組織が細胞隔離ユニットに入ることを防止するために管の開口にメッシュを備えた細胞隔離ユニットの第１の端部に取り付けられている。廃棄室が隔離細胞を収集するためにフィルタを備えた細胞隔離ユニットの第２の端部に取り付けられている。組立られた装置は、細胞からプロテーゼ溶液を除去し、フィルタに細胞を補足するために遠心分離器にかけられる。組織消化室及び廃棄室が取り除かれ、ＰＢＳの等浸透性のバッファ溶液を含む血清室がフィルタの次に配置された細胞隔離ユニットの第２の端部に取り付けられる。分散細胞室は、細胞隔離ユニットの第１の端部に取り付けられる。細胞をフィルタから洗い流すためにユニットが遠心分離器にかけられ、血清が血清室を出て、細胞分散室に入る。血清の細胞は、医療装置のシーディングに使用され、培養され、低温で保存される。
本発明のこれまでの開示及び説明は、例示であり、本発明の精神から逸脱することなく寸法、形状及び材料の変更がなされることを理解すべきである。
【００３５】
本発明の具体的な実施態様は次の通りである。
（Ａ）第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備えた組織から細胞を分離する装置であって、前記第１の端部は、組織消化室及び細胞分散室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを含む細胞分離装置。
（Ｂ）第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを有し、前記第１の端部は、第１の細胞分散室及び第２の細胞分散室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室及び血清室を交互に受けるようになっており、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを含む装置。
（Ｃ）ａ）第１の開放端部及び第２の開放端部を有する細胞隔離ユニットを用意する工程と、
ｂ）組織消化室で組織の解体材料によって消化された組織から細胞を形成するために組織供給源を用意する工程と、
ｃ）廃棄室を用意する工程と、
ｄ）血清室に血清源を用意する工程と、
ｅ）細胞分散室を用意する工程と、
ｆ）細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記組織消化室を、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記廃棄室を接続する工程と、
ｇ）前記組織消化室の細胞を前記細胞隔離ユニットに通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部に細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｈ）前記組織消化室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｉ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記血清室を接続する工程と、
ｊ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記細胞分散室に洗い流される工程と、を有する細胞を隔離する方法。
（Ｄ）ａ）第１の開放端部及び第２の開放端部を有する細胞隔離ユニットを用意する工程と、
ｂ）第１の細胞分散室で分離された細胞の第１の分散を実行する工程と、
ｃ）廃棄室を用意する工程と、
ｄ）血清室に血清源を用意する工程と、
ｅ）第２の細胞分散室を用意する工程と、
ｆ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第１の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記廃棄室を接続する工程と、
ｇ）前記第１の組織分散室の前記細胞が前記細胞隔離ユニットを通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部に細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｈ）前記第１の細胞分散室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｉ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第２の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に前記血清室を接続する工程と、
ｊ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記第２の細胞分散室に洗い流される工程とを有する細胞を隔離する方法。
（Ｅ）第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備え、前記第１の端部は、第１の細胞分散室及び第２の細胞分散室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを有する組織から細胞を分離する細胞分離キットであって、
ａ）前記第１の細胞分散室で細胞の第１の分散を行う工程と、
ｂ）前記第１の細胞分散室を前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に接続し、前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に接続する工程と、
ｃ）前記第１の組織分散室の前記細胞が前記細胞隔離ユニットを通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部に細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットから廃棄室に通過させる工程と、
ｄ）前記第１の細胞分散室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｅ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記第２の細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に血清を含む血清室を接続する工程と、
ｆ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記第２の細胞分散室に洗い流される工程とによって細胞を隔離するキット。
（Ｆ）第１の端部及び第２の端部を有する細胞隔離ユニットを画成するハウジングを備え、前記第１の端部は、組織消化室及び細胞分散室を交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、廃棄室と血清室とを交互に受けるようになっており、前記第２の端部は、分散液から細胞を濾過することができるフィルタを有する組織から細胞を分離する細胞分離キットであって、
ａ）前記組織消化室の組織分解材料によって消化された組織から細胞を形成するために組織源を用意する工程と、
ｂ）前記組織消化室を前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に接続し、前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に接続する工程と、
ｃ）前記組織消化室の細胞が前記細胞隔離ユニットを通るように力を加え、前記ユニットの前記第２の端部で細胞を捕捉し、他の成分を細胞隔離ユニットを通して廃棄室に通過させる工程と、
ｄ）前記組織消化室及び前記廃棄室を前記細胞隔離ユニットから取り外す工程と、
ｅ）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部に前記細胞分散室を接続し、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部に血清を含む血清室を接続する工程と、
ｆ）前記血清室の成分が前記細胞隔離ユニットを通過するように力を加え、前記細胞が前記細胞隔離ユニットから前記細胞分散室に洗い流される工程とによって細胞を分離するキット。
（１）前記フィルタの孔の前記寸法は、０．１μｍ乃至１０００μｍの範囲である実施態様（Ａ）に記載の装置。
（２）前記細胞隔離ユニットは、管の形態であり、前記室は、閉鎖した端部を有する管の形態である実施態様（１）に記載の装置。
（３）前記室は、前記細胞隔離ユニットの端部に受け入れ可能なシュリンジである実施態様（１）に記載の装置。
（４）前記管は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルフォン、テフロン（登録商標）ＥＰＡ、テフロン（登録商標）ＰＦＡ、ポリスチレン、ポリカーボネート、スチレン、アクリルニトリル、アクリル樹脂、ガラス及びその混合物から成るグループから選択された材料からつくられる実施態様（２）に記載の装置。
（５）前記細胞隔離ユニットは、内径が変化し、前記第１の端部及び第２の端部の直径は、１０ｃｍまでであり、前記細胞隔離ユニットの小さい内径は、０．１ｍｍ乃至２ｍｍの範囲である実施態様（２）に記載の装置。
【００３６】
（６）前記第１の端部は、未消化の組織が細胞隔離ユニットに入ることを阻止するフィルタを有する実施態様（Ａ）に記載の装置。
（７）前記細胞隔離ユニットの前記第１の端部のフィルタの孔の寸法は、１０μｍ乃至１０００μｍの範囲であり、前記細胞隔離ユニットの前記第２の端部のフィルタの前記孔は、０．４μｍ乃至１０μｍの範囲である実施態様（６）に記載の装置。
（８）前記工程ｇ）及びｊ）は遠心力である実施態様（Ｃ）に記載の方法。
（９）前記組織分解材料は、酵素である実施態様（Ｃ）に記載の方法。
（１０）前記酵素は、ディスパーゼ、ニューラミダーセ（シアリダーセ）、パンクレアチン・プロテイナーゼＫ、ブロメライン、プロナーゼＥ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、エラスターゼ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、コラゲナーゼ、サブチリスン、クロストリドペプチダーゼＡ、フィシン、カルボキシペプチダーゼＡ、ペクチナーゼ、ペクチネステラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシダーゼ、中性プロテーゼ、グリコシダーゼ、エンドペプチダーゼ、パンクレアチン、メタロプロチナーゼ、セリンプロテーゼ及びその混合物から成るグループから選択された実施態様（９）に記載の方法。
【００３７】
（１１）前記酵素は、トリプシンである実施態様（１０）に記載の方法。
（１２）前記細胞消化室及び工程ｂ）の組成分は、３７℃近傍または３７℃の温度で培養される請求項３に記載の方法。
（１３）工程ｄ）の血清は、バランスのとれた食塩水溶液、等浸透性の溶液、細胞培養媒体、バッファ処理された食塩水及びその混合物から成るグループから選択される実施態様（Ｃ）に記載の方法。
（１４）前記血清はフォスフェートバッファ処理された食塩水である実施態様（１３）に記載の方法。
（１５）工程ｊ）の細胞室の内容物を移植に適したマトリクスに植え込む工程を有する実施態様（Ｃ）に記載の方法。
（１６）疾病を有するか、または損傷を受けた組織の機能を補助するか、増大するための特定の細胞の治療法として工程ｊ）の細胞分散室の内容を挿入する工程を有する実施態様（Ｃ）に記載の方法。
【００３８】
【発明の効果】
本装置は、前に開示した装置の通路の複雑性がなく、クリーニング及び殺菌をする弁機構を必要としない細胞分離装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の１つの実施形態の基本的には組み立てられていない部品を示す図である。
【図２】本発明の装置が組み立てられ、分離工程のために準備された実施形態を示す図である。
【図３】消化され隔離細胞が細胞フィルタで分離され保持されることを示す図である。
【図４】図４（ａ）は、遠心分離器にかけられた後の装置の取り外しを示し、図４（ｂ）は、細胞が分離された細胞隔離を示す図である。
【図５】収集管内での隔離細胞の洗浄の前に分離器が組み立てられる本発明の実施形態を示す図である。
【図６】隔離細胞が収集管内で洗浄される遠心分離器の工程を示す図である。
【図７】使用のために準備された隔離細胞を含む収集管を示す図である。
【図８】図８（ａ）は、マトリクスに細胞を配置するか、植え付けることを示す図であり、図８（ｂ）は、傷口に細胞が植え付けられたマトリクスを配置することを示す図である。
【符号の説明】
２００  細胞隔離ユニット
２１０  フィルタ
２２０  フィルタ
２３０  通路
３００  組織消化室
４００  廃棄室
５００  血清室
５１０  血清
６００  分散細胞室
７００  マトリクス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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