(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンクラスがＩｇＧである抗体を含有する抗体含有安定化製剤であって、抗体の生物活性低下を抑制するための安定化剤としてアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩を含み、ここで、該アセチルトリプトファン誘導体はアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミドおよびクロロアセチルトリプトファンから選択され、製剤が安定化剤として実質的にタンパク質を含まない、抗体含有安定化製剤。
【請求項２】
安定化剤がアセチルトリプトファン又はその塩である請求項１記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項３】
抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体である請求項１又は２記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項４】
抗体が抗体断片、抗体修飾物又は抗体断片の修飾物である請求項１〜３のいずれかに記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項５】
抗体が抗組織因子抗体である請求項３又は４に記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項６】
抗組織因子抗体がヒト型化抗組織因子抗体である請求項５記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項７】
凍結乾燥製剤である請求項１〜６のいずれかに記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項８】
溶液製剤である請求項１〜６のいずれかに記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項９】
アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩の添加量が１〜１００ｍＭである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体含有安定化製剤。
【請求項１０】
アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩を添加することを特徴とする、免疫グロブリンクラスがＩｇＧである抗体を含有する抗体含有製剤における抗体の生物活性低下を抑制する方法であって、ここで、該アセチルトリプトファン誘導体はアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミドおよびクロロアセチルトリプトファンから選択され、製剤が安定化剤として実質的にタンパク質を含まない、前記方法。
【請求項１１】
免疫グロブリンクラスがＩｇＧである抗体を含有する抗体含有製剤における抗体の生物活性低下を抑制するための、アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩の使用方法であって、ここで、該アセチルトリプトファン誘導体はアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミドおよびクロロアセチルトリプトファンから選択され、製剤が安定化剤として実質的にタンパク質を含まない、前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は抗体含有製剤に関し、特に長期保存した後も抗体の生物活性が損なわれない、安定化した抗体含有製剤に関する。
背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。これらの製剤は安定性を確保するため、凍結乾燥したタンパク質成分粉末とこれを溶解するための水溶性希釈液とを別途包装し、使用時に溶解する形態で提供されるか、あるいは安定性を向上させるための添加剤を加えたタンパク質溶液製剤の形で提供されている。
近年、種々の抗体製剤を溶液製剤の形で提供することが検討されているが、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ヒト型化抗体等の抗体は不安定なタンパク質であり、精製工程において実施するウイルス除去のための濾過ストレス、濃縮ストレス、熱ストレスなどによって会合、凝集などの物理的、化学的変化を生じやすい。さらに、抗体製剤では生体内での抗原との結合活性を保持することが不可欠であるが、長期間保存するうちに抗体の生物活性が低下するという問題がある。
また、化学的、物理的変化を抑制するための安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質といった高分子類或いはポリオール類、アミノ酸及び界面活性剤等といった低分子類を添加することによる安定化効果が見出されている。しかしながら、ヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミネーションを除去する等のために非常に煩雑な工程を必要とする等の問題がある。
タンパク質へのアセチルトリプトファンの添加としては、アルブミン、ヒト成長ホルモン、ヒトＢ細胞分化因子（ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＣＤＦ）等で行われている（特公平７−６８１３７号、特開平１０−２６５４０４号、特開平３−２７３２０号）。また、Ｇ−ＣＳＦやＥＰＯのような造血因子に対してアセチルトリプトファンを添加して安定化させることが本出願人により報告されている（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０１５２４）。
しかしながら現在までのところ、抗体製剤に対してアセチルトリプトファンを添加して安定化させることについては知られていない。また、上述した従来のアセチルトリプトファン添加製剤はいずれも、アセチルトリプトファンを添加することによるタンパク質の残存率向上を記載するものであり、タンパク質製剤、特に抗体製剤の生物活性低下の抑制に及ぼす効果については全く知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、長期間保存した後にも抗体の残存率が高く、かつ抗体の生物活性が高く保持された、安定な抗体製剤を提供することである。
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤としてアセチルトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩を添加することによって、長期保存後でも抗体残存率が高く、かつ抗体の生物活性が高く保持されている製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。
すなわち、本発明は、抗体の生物活性低下を抑制するための安定化剤としてアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩を含む抗体含有安定化製剤を提供する。
本発明はさらに、アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩を添加することを特徴とする、抗体含有製剤における抗体の生物活性低下を抑制する方法を提供する。
本発明はさらに、抗体含有製剤における抗体の生物活性低下を抑制するための、アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩の使用方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生させる蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。該抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２参照）。
本発明の安定化製剤に含まれる抗体としては、抗組織因子抗体、抗ＩＬ−６レセプター抗体、ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）などを挙げることができるが、これに限定されない。
再構成ヒト型化抗体としてはヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３を参照）が好ましい。また、ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１４５８０を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１３３８８を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
さらに、本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、抗原分子に結合し、当該抗原の活性を阻害する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理して抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６，Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３，Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９，Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は抗原分子の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が抗原分子を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、当該抗原分子を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させて癌細胞に特異的に傷害を与え、癌細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
本発明の安定化製剤に含まれる抗体の免疫グロブリンクラスは何であってもよいが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧが好ましく、ＩｇＧ４がさらに好ましい。
本発明では、抗体含有試料とは、生体由来抗体であるか、あるいは組換え抗体であるかを問わず、いかなる抗体を含む試料であってもよく、好ましくは、培養により得られた抗体を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
本発明で「抗体の生物活性」とは、抗体の対応抗原に対する結合活性、又は抗原分子に対する中和活性、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性等の、抗体が抗原分子に結合して生じる種々の生物活性をいう。「抗体の生物活性低下を抑制する」とは、抗体製剤調製時における抗体の生物活性と比較して、８０％以上、好ましくは９０％以上の生物活性を保持することをいう。抗体の生物活性は例えばＥＬＩＳＡ、表面プラズモンセンサーなどを用いた方法により測定することができる。
本発明の抗体製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。
本発明で安定化剤として使用するアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩は、遊離のアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体ならびにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の製剤に使用するアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩はＤ−、Ｌ−またはＤＬ−体であってよく、より好ましいのはＬ−体である。アセチルトリプトファン誘導体にはアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミド、クロロアセチルトリプトファン等があるが、これに限定されない。
本発明の製剤に添加するアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩の添加量は、使用する抗体の種類、抗体の濃度、製剤形態（凍結乾燥製剤又は溶液製剤）及び使用する誘導体により異なる。凍結乾燥製剤の場合には、一般に最終投与量として、０．１〜３００ｍＭであり、好ましくは１〜２００ｍＭ、さらに好ましくは１〜１００ｍＭである。溶液製剤の場合には、一般に最終投与量として、０．１〜３０ｍＭであり、好ましくは０．５〜２０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１０ｍＭである。なお、凍結乾燥製剤の場合、０．１〜３０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０ｍＭとすると、安定で且つ再溶解性に優れた抗体製剤を提供することができる。
抗体とアセチルトリプトファンの重量比は、一般に、１００：１〜０．１：１である。ヒト型化抗組織因子抗体の場合は、好ましくは１０：１〜０．５：１、さらに好ましくは２：１〜１：１である。
本発明の抗体製剤は、例えば、抗体がヒト型化抗組織因子抗体であるときには、４０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるヒト型化抗組織因子抗体残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であり、抗体の生物活性保持率が８０％以上、好ましくは９０％以上である。
本発明の抗体製剤のｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、さらに好ましくはｐＨ５〜７．５である。しかしながら、ｐＨは含まれる抗体により異なり、これらに限定されるものではない。例えばヒト型化抗組織因子抗体の場合には好ましくはｐＨ４〜７であり、さらに好ましくはｐＨ５〜６である。ｐＨの調整にはＮａＯＨなどを用いてもよいが、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸又は塩基性アミノ酸誘導体、又はそれらの塩を用いてｐＨ調整を行うことによって抗体の凝集体の生成を少なくすることができる。
本発明の製剤には等張化剤として、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類を用いることができる。
本発明の製剤には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。
本発明のタンパク質製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般には０．０００１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．００１〜５％であり、さらに好ましくは０．００５〜３％である。
本発明のタンパク質製剤には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。
本発明の製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製し、あるいはこのようにして調製された溶液製剤を定法により凍結乾燥、又は噴霧乾燥することによって製造できる。溶液製剤の場合には、グリシン緩衝液及び／又はヒスチジン緩衝液中に抗体を溶解すると加熱による凝集体の生成を抑制する点において好ましい。またグリシン及び／又はスクロースの添加によりさらに凝集体の生成を抑制することもできる。
本発明の安定化された抗体製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明の安定化製剤は、溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。
本発明の製剤中に含まれる抗体の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１２０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の製剤では、後述する実施例の結果から、アセチルトリプトファンを添加することにより、長期保存後においても抗体の高い残存率を保持しながら、かつ抗体の高い生物活性を保持することができる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例１：アセチルトリプトファンのヒト型化抗組織因子抗体残存率及び生物活性に及ぼす効果
（１）材料
ヒト型化抗組織因子抗体は国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３の実施例４で作成したヒト型化抗体であり、免疫グロブリンクラスはＩｇＧ４である。
（２）被験試料
ヒト型化抗組織因子抗体２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、及び０、１．２５もしくは２．５ｍｇ／ｍＬのアセチルトリプトファンを含む各調剤液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに１ｍＬずつ正確に充填した。尚、使用したヒト型化抗組織因子抗体はＣＨＯ細胞を用いて得られた組換えヒト型化抗組織因子抗体であり、添加したアセチルトリプトファンはＬ−体である。
このように無菌的に調製したヒト型化抗組織因子抗体含有溶液製剤を、４０℃の恒温槽内に１ヶ月間静置して加速試験を行った後、被験試料とした。
（３）抗体含量の測定方法及び残存率の算出方法
試料は、カラム（東ソーＧ３０００ＳＷＸＬ）を用い、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを移動相に用い、流速０．７ｍＬ／分で行ったゲル浸透クロマトグラフィー法（ＧＰＣ）によりヒト型化抗組織因子抗体含量を測定した。
本方法で測定したヒト型化抗組織因子抗体含量を用い、下記の式に基づき、加速試験後の残存率（％）を算出した。
0004342941.tif 000002
（４）抗体の生物活性の測定方法
ヒト型化抗組織因子抗体の生物活性を以下の方法で測定した。ヒト型化抗組織因子抗体の抗原である組織因子は血液凝固ＩＩＩ因子あるいは組織トロンボプラスチンとも呼ばれ、組織液中の凝固促進物質である。組織因子は外因系凝固開始因子の血液凝固ＶＩＩ因子の補助因子であり、ＶＩＩ因子ないし活性型ＶＩＩａ因子と分子複合体を形成し、Ｘ因子及びＩＸ因子の活性化に働く。従って、ヒト型化抗組織因子抗体の生物活性測定では、抗体試料を血液凝固ＩＩＩ因子、ＶＩＩａ因子、Ｘ因子と反応させて、生じたＸａ因子により基質を分解させることで発色させて吸光度を測定することにより求めることができる。
試薬
Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社製（凝固ＩＩＩ因子を含む試薬）
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製
Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製
テストチーム発色基質Ｓ−２２２２：第一化学社製
ＴＢＳ：ＴＡＫＡＲＡ社製
ＣａＣｌ２：市販品
ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ社製
ヘキサジメチリンブロマイド：Ｓｉｇｍａ社製
ＥＤＴＡ：市販品
試薬調製
Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を４ｍＬ／ｖｉａｌ加え、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ（２００ｍｇ／ｖｉａｌ）を溶解する。１００μＬ／ｔｕｂｅで分注後、−８０℃で保存する。使用前には、室温で解凍した後、３７℃で１５分間加温する。
凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ：Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（以下Ａ．Ｂ．）で５００ＰＥＵ／ｍＬに調製する。２０μＬ／ｔｕｂｅで分注後、−８０℃で保存する。
凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ：Ａ．Ｂ．で、２５ＰＥＵ／ｍＬに調製する。１００μＬ／ｔｕｂｅで分注後、−８０℃で保存する。
発色基質Ｓ．２２２２：１７ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で溶解し、４℃で保存する。
ＥＤＴＡ：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５００ｍＭに調製する。
ポリブレン液：ヘキサジミチリンブロマイドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で、０．６ｍｇ／ｍＬに溶解する。
Ｂｕｆｆｅｒおよび溶液調製
Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ．Ｂ．）：５ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳ（ｐＨ７．６）。
凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ＆  Ｔｈｒｏｎｂｏｒｅｌ  Ｓ混合溶液：Ａ．Ｂ．で、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａは最終濃度として０．１ＰＥＵ／ｍＬ，、Ｔｈｒｏｎｂｏｒｅｌ  Ｓは１２０倍（ｖ／ｖ）に希釈したもの。
凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ溶液：Ａ．Ｂ．で凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘを、最終濃度として０．２５ＰＥＵ／ｍＬに希釈したもの。
１００×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ａ．Ｂ．を用いて、ヒト型化抗組織因子抗体を１８０μｇ／ｍＬに調製したもの。
１００×ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ａ．Ｂ．を用いて、各サンプル中のヒト型化抗組織因子抗体を１２０μｇ／ｍＬに調製したもの。
発色基質Ｓ−２２２２混合液：発色基質Ｓ−２２２２：ポリブレン液＝１：１に調製したもの。
操作
１．凝固ＶＩＩａ因子＆Ｔｈｒｏｎｂｏｒｅｌ  Ｓ混合溶液を６０μＬ／ｗｅｌｌでプレートに分注し、室温で６０分間静置する。
２．各１００×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎと１００×ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ溶液で１００倍に希釈する。
３．さらに、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは１８００ｎｇ／ｍＬから３５６ｎｇ／ｍＬまで、ｓａｍｐｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは１２００ｎｇ／ｍＬから５３３ｎｇ／ｍＬまで、公比１．５の濃度水準で、凝固因子Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ溶液を用いて希釈する。
４．希釈したサンプルを４０μＬ／ｗｅｌｌでプレートに分注し、３０分間静置する。
５．５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液を１０μＬ／ｗｅｌｌで加え反応を止めた後、発色基質Ｓ−２２２２混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌでプレートに分注し、室温で６０分間静置する。
６．４０５ｎｍ−６５５ｎｍで吸光度を測定する。
（５）結果
得られた結果を表１に示す。
0004342941.tif 000003
表１から明らかなように、アセチルトリプトファンを添加した試料は、高い抗体残存率を保持しながら、生物活性の低下がほとんどない顕著な安定化効果が観察された。