(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
gag/pol遺伝子に操作可能に結合したプロモーターとポリアデニル化配列とを含むgag/pol発現カセットとenv発現カセットとを含むパッケージング細胞株であって、ここで、該gag/pol遺伝子はgagの縮重であるコドンを含有するように改変されており、gag/pol発現カセット及びenv発現カセットは共通した20個のヌクレオチドより多い連続配列を有しない、前記パッケージング細胞株。
【請求項２】
前記gag/pol遺伝子の５’末端がレトロウイルスパッケージングシグナル配列を欠いている請求項１に記載のパッケージング細胞株。
【請求項３】
gag/pol発現カセット中の前記プロモーターが異種プロモーターである請求項１又は２に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４】
gag/pol発現カセット中の前記プロモーターがＣＭＶ  ＩＥ、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要−後期プロモーター及びＳＶ４０プロモーターからなる群から選択される請求項３に記載のパッケージング細胞株。
【請求項５】
gag/pol発現カセット中の前記ポリアデニル化配列が異種ポリアデニル化配列である請求項１〜４のいずれか1項に記載のパッケージング細胞株。
【請求項６】
前記異種ポリアデニル化配列がＳＶ４０後期ポリＡシグナル及びＳＶ４０前期ポリＡシグナルからなる群から選択される請求項５に記載のパッケージング細胞株。
【請求項７】
パッケージング細胞の製造方法であって、該方法は
（a）請求項１〜６のいずれか１項に記載のgag/pol発現カセットを動物細胞内に導入し；
（b）高レベルのgag/polを発現するgag/pol発現カセットを含有する細胞を選択し；
（c）env発現カセットを選択した該細胞内に導入し；そして
（d）高レベルのenvを発現する細胞を選択し、そしてそれによって該パッケージング細胞を製造する、
ことを含む、方法。
【請求項８】
レトロウイルスベクター構築物を請求項７に記載の方法で製造されたパッケージング細胞株内に導入することを含む組み換え体レトロウイルス粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は一般的には、遺伝子伝達に使用されるレトロウイルスベクター、そして更に詳細には組換えによって複製コンピテントウイルスを形成しないように構築されているレトロウイルスベクターに関するものである。
発明の背景
レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体によって宿主細胞のゲノム中に複製しそして組込むことができるＲＮＡウイルスである。このＤＮＡ中間体又はプロウイルスは宿主細胞ＤＮＡ中に安定的に組込むことができる。レトロウイルスは、例えばＡＩＤＳや多種の癌を含むヒト及び動物の多種の疾病の原因であることが知られている。
レトロウイルスは疾病を引き起こすことがあるが、レトロウイルスはまた疾病の遺伝子治療の最も有望な技術の１つと考えられるようになる多数の特性も有している。これらの特性には:（１）細胞中への遺伝子材料（ベクターゲノム）の効率的な導入;（２）標的細胞核中への活発で効率的な導入方法;（３）比較的高レベルの遺伝子発現;（４）標的細胞に与える病理学的影響が最小であること；並びに（５）遺伝子発現のベクター・標的細胞の結合制御及び組織特異性制御によって特別の細胞サブタイプを標的化する能力、が含まれる。遺伝子治療法にレトロウイルスを使用する際には、問題の外来遺伝子を正常なレトロウイルスＲＮＡの代わりにレトロウイルス中に導入することができる。レトロウイルスがそのＲＮＡを細胞中に注入するとき外来遺伝子も細胞に導入され、そしてその後外来遺伝子はあたかもレトロウイルス自体であるかのように宿主細胞ＤＮＡ中に組込むことができる。
遺伝子治療法用に開発された大部分のレトロウイルスベクター系はネズミレトロウイルスに基づいている。簡単に言えば、これらのレトロウイルスは２つの形態で、即ち、宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれたプロウイルスとしてか又は遊離ビリオンとして存在している。ウイルスのビリオン形態はレトロウイルスの構造及び酵素タンパク質（逆転写酵素を含む）、ウイルスゲノムの２つのＲＮＡコピー並びにウイルスのエンベロープ糖タンパク質中に埋め込まれている細胞の血漿膜部分を含有している。ゲノムは４つの主要領域:ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）並びにgag、pol及びenv遺伝子中に組織化されている。ＬＴＲはプロウイルスゲノムの両末端に見られ、ＲＮＡゲノムの５’末端と３’末端の複合物であり、そして転写開始及び終結に必要なcis−作用要素を含有している。３つの遺伝子、gag、pol及びenvは末端ＬＴＲ間に位置している。gag及びpol遺伝子はそれぞれ、内部ウイルス構造及び酵素タパク質（例えば、インテグラーゼ）をコードする。env遺伝子はウイルスの感染性及び宿主範囲特異性を付与するエンベロープ糖タンパク質（gp70及びpl5eと称される）並びに機能が決定されていない「Ｒ」ペプチドをコードする。
遺伝子治療法にレトロウイルスを使用する際の重要な考慮事項は「安全な」レトロウイルスの利用可能性である。この関心事を満たすためにパッケージング細胞株及びベクター産生株が開発されている。簡単に述べると、この方法は２つの成分、レトロウイルスベクターとパッケージング細胞株（ＰＣＬ）を使用する。レトロウイルスベクターはロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、伝達すべき外来ＤＮＡ及びパッケージング配列（Ψ）を含有している。このレトロウイルスベクターは、構造及びエンベロープタンパク質をコードする遺伝子をベクターゲノム内に含有していないので、それ自体では再生産しない。ＰＣＬはgag、pol及びenv遺伝子をコードする遺伝子を含有しているが、パッケージングシグナル（Ψ）は含有していない。かくして、ＰＣＬはそれ自体ではエンプティビリオン粒子を形成することしかできない。この一般的な方法では、レトロウイルスベクターがＰＣＬ中に導入され、それによってベクター産生細胞株（ＶＣＬ）を創製する。このＶＣＬはレトロウイルスベクターの（外来）ゲノムしか含有していないビリオン粒子を産生するので、治療で使用するのに安全なレトロウイルスベクターであるとこれまで考えられてきた。
しかし乍ら、ＶＣＬの現在の使用に関しては幾つかの欠点がある。１つの問題点はＶＣＬによる「生存ウイルス」（即ち、複製コンピテントレトロウイルス;ＲＣＲ）の発生に係わるものである。簡単に述べると、ＲＣＲは、（１）ベクターゲノムとヘルパーゲノムが互いに組換えを行う;（２）ベクターゲノム又はヘルパーゲノムが産生細胞中で同種の潜在的内在性レトロウイルス要素と組換えを行う;又は（３）潜在的内在性レトロウイルス要素が再活性化する（例えば、マウス細胞内のキセノトロピックレトロウイルス）とき、慣用の産生細胞内で産生されることがある。
もう１つの問題点は、マウスに基づくＶＣＬが所望のレトロウイルスベクターをパッケージする効率に近い効率で内在性レトロウイルス様要素（これは腫瘍形成遺伝子配列を含有することができる）をパッケージする傾向があることである。このような要素は、それらのレトロウイルス様構造のため、所望のレトロウイルスベクター配列の伝達に匹敵する頻度で処理すべき標的細胞に伝達される。
第３の問題点は、（１）多数の細胞（例えば、108〜1010個）を処理し;そして（２）商業的に実行可能な費用でベクター粒子を製造するのに十分なレトロウイルスベクター粒子を適当な濃度で製造する能力である。
より安全なＰＣＬを構築するために研究者はヘルパー要素の５’ＬＴＲの欠失と３’ＬＴＲの部分欠失を発生させた（Miller及びButtimore、Mol. Cell. Biol. 6:2895〜2902、1986年参照）。このような細胞を使用するとき、野生型の複製コンピテントゲノムを形成するためには２つの組換えを行うことが必要である。それにも拘わらず、幾つかの実験室の結果は、幾つかの欠失が存在しているときであっても、未だＲＣＲが発生する可能性があることを示している（Bosselman等、Mol. Cell. Biol. 7:1797〜1806、1987年; Danos及びMulligan、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:6460〜6464、1988年、参照）。加えて、構築された５’及び３’ＬＴＲ欠失を有する細胞株は、比較的低い力価を生じさせるので、これまでのところ有用であることが証明されていない（Dougherty等、J. Virol. 63:3209〜3212、1989年）。
より安全なパッケージング細胞株を構築する更に最近の試みの１つは、ヘルパーウイルス要素の相補的部分を２つの別個のプラスミド間、即ち、gag及びpolを含有する１つとenvを含有するもう１つの間に分割して使用することに係わるものである（Markowitz等、J. Virol. 62:1120〜1124;及びMarkowitz等、Virology 167:600〜606、1988年参照）。この二重プラスミド系の1つの利点は、複製コンピテントゲノムを発生するためには３つの組換えが起こる必要があることである。それにも拘わらず、これらの二重プラスミドベクターもレトロウイルスＬＴＲの部分を含有し、そしてそれ故感染性ウイルスを産生する可能性が残っているという欠点を有している。
本願発明は、以前のパッケージング細胞株の多くに関連した組換えの困難性と低力価を克服し、そしてそれに加えて他の関連利点を提供する。
発明の要約
簡単に述べると、本願発明は、相同性組換えによるＲＣＲの形成を妨げるパッケージング細胞株を構築するための組成物及び方法を提供する。本発明の１つの特徴では、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ又はそれより多い異種配列、二次鎖ＤＮＡ合成源、及び３’ＬＴＲを含む組換え体レトロウイルスベクター構築物（構造体）（RETROVECTOR（登録商標））が提供され、その際このレトロウイルスベクター構築物はgag／pol及びenvコード化配列を欠いている。本発明の１つの実施態様では、レトロウイルスベクター構築物は延長されたパッケージングシグナルを欠いている。１つの実施態様では、レトロウイルスベクター構築物は５’ＬＴＲの上流にレトロウイルスの核酸配列を欠いている。好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター構築物は５’ＬＴＲの上流にenvコード化配列を欠いている。本願発明のレトロウイルスベクター構築物は、例えば、多種のアンホトロピック、エコトロピック、キセノトロピック及びポリトロピックウイルスを含む１つ又はそれより多いレトロウイルスから構築することができる（例えば、図17Ａ、Ｂ及びＣ参照）。
上記したように、本願発明のレトロウイルスベクター構築物は１つ又はそれより多い異種配列を含んでいる。本発明の或る実施態様では、異種配列は少なくともｘkbの長さであり、その際ｘは１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される。１つの実施態様では、異種配列は例えばリシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、ポークウィード、抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌トキシン及びシュードモナスエキソトキシンＡのような細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子である。他の実施態様では、異種配列はアンチセンス配列又は免疫アクセサリー分子であることができる。免疫アクセサリー分子の代表的な例には、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−13及びＩＬ−14が含まれる。特に好ましい免疫アクセサリー分子はＩＬ−２、ＩＬ−12、ＩＬ−15及びガンマインターフェロンからなる群、又はＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、β−ミクログロビン、ＬＦＡ３、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスII分子からなる群から選択することができる。
本発明の他の実施態様では、異種配列は、殆ど又は全く細胞毒性を有していない化合物を毒性生成物に活性化する遺伝子産生物をコードすることができる。このような遺伝子産生物の代表的な例にはＨＳＶＴＫやＶＺＶＴＫのようなタイプＩチミジンキナーゼが含まれる。もう１つの実施態様では、異種配列はリボザイムであることができる。更に他の実施態様では、異種配列は、因子ＶIII、ＡＤＡ、ＨＰＲＴ、ＣＦ及びＬＤＬレセプターのようなタンパク質をコードする置換遺伝子である。他の実施態様では、異種配列はＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＦeＬＶ、ＦＩＶ及びＨＩＶから選択されるウイルスの免疫原性部分をコードする。
本願発明の他の特徴では、gag／pol遺伝子に操作して結合したプロモーター及びポリアデニル化配列を含むgag／pol発現カセットが提供され、その際gag／pol遺伝子はgagの縮重であるコドンを含有するように修正されている。１つの実施態様では、gag／pol遺伝子の５’末端はレトロウイルスパッケージングシグナル配列を欠いている。他の特徴では、gag／pol遺伝子に操作して結合したプロモーターとポリアデニル化配列を含むgag／pol発現カセットが提供され、その際該発現カセットは複製コンピテントウイルスと一緒にはキャプシド内に包含されていない。
本願発明のもう１つの特徴では、gag／pol遺伝子に操作して結合したプロモーターとポリアデニル化配列を含むgag／pol発現カセットが提供され、その際gag／pol遺伝子の３’末端が欠失されておりインテグラーゼの生物学的活性をもたらさない。１つの実施態様では、gag／pol遺伝子の５’末端は、gagの縮重であるコドンを含有するように修正されている。更なる実施態様では、gag／pol遺伝子の５’末端はレトロウイルスパッケージングシグナル配列を欠いている。他の実施態様では、３’末端はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１のヌクレオチド5751の上流（５’）が欠失されている。
本願発明の他の特徴では、env遺伝子に操作して結合したプロモーターとポリアデニル化配列を含むenv発現カセットが提供され、その際env遺伝子の上流には僅か６個のレトロウイルスヌクレオチドしか含有されていない。もう１つの特徴では、env遺伝子に操作して結合したプロモーターとポリアデニル化配列を含むenv発現カセットが提供され、その際env発現カセットはgag／pol遺伝子中に見られる８個のヌクレオチドより多いヌクレオチド連続配列を含有していない。更にもう１つの特徴では、env遺伝子に操作して結合したプロモーターとポリアデニル化配列を含むenv発現カセットが提供され、その際env遺伝子の３’末端が欠失されておりenvの生物学的活性をもたらさない。１つの実施態様では、発現カセットによって完全なＲペプチドが産生されないように遺伝子の３’末端が欠失されている。更なる実施態様では、env遺伝子がタイプＣレトロウイルスから誘導され、そしてenv遺伝子がＲペプチドをコードする18個の核酸より少ない核酸を含有するように３’末端が欠失されている。好ましい実施態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１のヌクレオチド7748から下流で３’末端が欠失されている。
本発明の種々の実施態様では、上記したgag／pol及びenv発現カセットのプロモーターはＣＭＶＩＥ、ＨＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要−後期プロモーター及びＳＶ40プロモーターのような異種プロモーターである。他の実施態様では、ポリアデニル化配列はＳＶ40後期ポリＡシグナル及びＳＶ40前期ポリＡシグナルのような異種ポリアデニル化配列である。
本願発明のもう１つの特徴では、gag／pol発現カセットとenv発現カセットを含むパッケージング細胞株が提供され、その際gag／pol発現カセットはenv発現カセット中に見られる20個の連続ヌクレオチドより多い、好ましくは15個より多い、更に好ましくは10個より多い、そして最も好ましくは８個より多いヌクレオチド連続配列を欠いている。他の特徴では、gag／pol発現カセット、env発現カセット及びレトロウイルスベクター構築物を含む産生細胞株が提供され、その際gag／pol発現カセット、env発現カセット及びレトロウイルスベクター構築物は共通した20個のヌクレオチドより多い、好ましくは15個より多い、更に好ましくは10個より多い、そして最も好ましくは８個より多いヌクレオチド連続配列を欠いている。このようなレトロウイルスベクター構築物、gag／pol及びenv発現カセットの代表的な例は以下で更に詳細に記載する。
本願発明の更にもう１つの特徴では、上記したようなパッケージング細胞株及びレトロウイルスベクター構築物を含む産生細胞株が提供される。本願発明のもう１つの特徴では、gag／pol発現カセット、env発現カセット及びレトロウイルスベクター構築物を含む産生細胞株が提供され、その際gag／pol発現カセット、env発現カセット及びレトロウイルスベクター構築物は共通した８個のヌクレオチドより多い連続配列を欠いている。
本発明の他の特徴では、（ａ）上記したようなgag／pol発現カセットを動物細胞内に導入し;（ｂ）高レベルのgag／polを発現するgag／pol発現カセットを含有する細胞を選択し、（ｃ）env発現カセットを上記の選択した細胞内に導入し、そして（ｄ）高レベルのenvを発現する細胞を選択しそしてそれによってパッケージング細胞を製造する段階を含むパッケージング細胞株の製造方法が提供される。本発明の他の特徴では、先ずenv発現カセットが細胞内に導入され、続いてgag／pol発現カセットが導入される。他の特徴では、レトロウイルスベクター構築物を上記したようにしてパッケージング細胞内に導入する段階を含む組換え体レトロウイルス粒子の製造方法が提供される。好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター構築物は上記したレトロウイルスベクター構築物の１つである。
本願発明のこれらの特徴及び他の特徴は、以下の詳細な説明及び添付した図面を参照して明白となろう。更に、或る種の方法又は組成物（例えば、プラスミド等）を更に詳細に記載している種々の参照文献を以下に述べ、そしてそれ故それらの全体を参照として組み入れる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＫＳ2＋Ｅco571−ＬＴＲ（＋）の概略図である。
図２は、ｐＫＳ2＋Ｅco571−ＬＴＲ（−）の概略図である。
図３は、ｐＫＳ2＋ＬＴＲ−ＥcoＲＩの概略図である。
図４は、ｐＲ1の概略図である。
図５は、ｐＲ2の概略図である。
図６は、ｐＫＴ1の概略図である。
図７は、ｐＲ1−ＨＩＶenvの概略図である。
図８は、ｐＲ2−ＨＩＶenvの概略図である。
図９は、Ｍo ＭＬＶ gag／polの代表的な「ゆらぎ前」配列である（ＳＥＱ  Ｉ．Ｄ．Ｎo.11及び12も参照のこと）。
図10は、Ｍo ＭＬＶ gag／polの代表的な「ゆらぎ」配列である（ＳＥＱ  Ｉ．Ｄ．Ｎo.9及び10も参照のこと）。
図11は、ｐＨＣＭＶ−ＰＡの概略図である。
図12は、ｐＣＭＶ gag／polの概略図である。
図13は、ｐＣＭＶgpＳmaの概略図である。
図14は、ｐＣＭＶgp−Ｘの概略図である。
図15は、ｐＣＭＶ env−Ｘの概略図である。
図16は、ｐＲgpＮeoの概略図である。
図17Ａ、Ｂ及びＣは、本願発明のレトロウイルスベクター構築物、gag／pol発現カセット及びenv発現カセットを構築するために使用できる種々のレトロウイルスを記載している表を含む。
図18は、p ＣＭＶ  Ｅnvam−Ｅag−Ｘ−lessの概略図である。
図19Ａは「ゆらぎ」−gag構築物の図式図である。図19Ｂは「通常の」−gag構築物の図式図である。
発明の詳細な記述
本発明を説明する前に、以下で使用されるある種の語句の定義を最初に説明することがその理解を助けることとなろう。
「レトロウイルスベクター構造体（構築物）」は、本発明の好適態様では１つもしくはそれ以上の当該配列または遺伝子の発現を指定可能な組み立て体をさす。簡単に述べると、レトロウイルスベクター構造体は５′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つもしくはそれ以上の異種配列、二次鎖ＤＮＡ合成および３′ＬＴＲを含むべきである。例えば蛋白質（例えば、細胞毒性蛋白質、疾病−関連抗原、免疫補助分子、もしくは代行遺伝子）をコード付けするか、または分子自身として（例えば、リボザイムもしくはアンチセンス配列として）有用である配列を含む広範囲の異種配列がベクター構造体内に含まれる。或いは、異種配列は単に「スタファー」または「フィラー」配列であってもよく、それはＲＮＡゲノムを含有するウイルス粒子を製造可能にさせるのに十分な寸法のものである。好適には、異種配列は長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８ｋＢである。
レトロウイルスベクター構造体は、転写プロモーター／エンハンサーまたは１つもしくはそれ以上の座規定要素を、或いは例えば代替スプライシング、核ＲＮＡエクスポート、メッセンジャーの後翻訳修飾または蛋白質の後転写修飾の如き手段により遺伝子発現を調節する他の要素も包含する。場合により、レトロウイルスベクター構造体は、例えばＮｅｏ、ＴＫ、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノールまたはＤＨＦＲの如き選択可能なマーカー、並びに１つもしくはそれ以上の特異的制限部位および翻訳終結配列も包含する。
「発現カセット」は、１つもしくはそれ以上の当該配列または遺伝子の発現を指定できる組み立て体をさす。発現カセットは、転写される時に１つもしくはそれ以上の当該配列または遺伝子と操作できるように結合させるプロモーター、並びにポリアデニル化配列を包含すべきである。本発明の好適態様では、プロモーターおよびポリアデニル化配列の両者がヘルパー要素（すなわち、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）に対して異種である源からのものである。本発明の発現カセットを利用してｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子またはｅｎｖ遺伝子を発現させることができる。さらに、この発現カセットを利用してｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ発現カセットからまたは全く異なる発現カセットから１つもしくはそれ以上の異種配列を発現させることもできる。
本発明の好適態様では、ここに記載されている発現カセットがプラスミド構造体内に含有されていてもよい。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構造体は複製の細菌源、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構造体を一本鎖ＤＮＡ（例えば、複製のＭ１３源）として存在させるようなシグナル、多重クローニング部位、および複製の「哺乳動物」源（例えば、ＳＶ４０または複製のアデノウイルス源）を含んでいてもよい。
レトロウイルスベクター構造体、ＧＡＧ／ＰＯＬ発現カセットおよびＥＮＶ発現カセットの製造
上記の如く、本発明は相同性組み換えにより複製競合ウイルスの生成を妨げるパッケージング細胞を構成するための組成物および方法を提供する。下記の章はレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット、およびｅｎｖ発現カセットの製造を記載する。
１．レトロウイルスベクター構造体の構成
本発明の一面では、５′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つもしくはそれ以上の異種配列、二次鎖ＤＮＡ合成源および３′ＬＴＲを含んでなり、ベクター構造体がｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖコード付け配列を欠くレトロウイルスベクター構造体が提供される。簡単に述べると、長い末端反復（ＬＴＲ）がＵ５、ＲおよびＵ３と指定される三要素に副分割される。これらの要素は、例えばＵ３内に位置するプロモーターおよびエンハンサー要素を含むレトロウイルスの生物学的活性に起因する種々のシグナルを含有する。ＬＴＲはゲノムのどちからの端部におけるそれらの正確な複製によりプロウイルス内で容易に同定できる。
生物学的に活性であるためにはｔＲＮＡ結合部位および二次鎖ＤＮＡ合成源もレトロウイルスが重要であり、そして当技術の熟練者により容易に同定できる。例えば、ワトソン−クリック塩基対形成法によりｔＲＮＡがレトロウイルスｔＲＮＡ結合部位と結合し、そしてレトロウイルスゲノムと共にウイルス粒子中に運ばれる。ｔＲＮＡは次に逆転写によるＤＮＡ合成用のプライマーとして利用される。ｔＲＮＡ結合部位は５′ＬＴＲからすぐ下流のその位置を基にして容易に同定できる。同様に、二次鎖ＤＮＡ合成源も、その名が示唆する通り。レトロウイルスの二次鎖ＤＮＡ合成用に重要である。ポリ−プリントラクトとも称されるこの源は３′ＬＴＲのすぐ上流に位置する。
５′および３′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、並びに二次鎖ＤＮＡ合成源の他に、本発明のレトロウイルスベクター構造体はパッケージングシグナル、並びに１つもしくはそれ以上の異種配列を含んでなり、それらの各々は以下でさらに詳細に論じられている。
本発明のレトロウイルスベクター構造体は例えばＢ、Ｃ、およびＤタイプのレトロウイルス並びにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む広範囲のレトロウイルスから容易に構成することができる（RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985参照）。簡単に述べると、ウイルスはしばしば電子顕微鏡で観察されてそれらの形態に従い分類される。タイプ「Ｂ」のレトロウイルスは偏った芯を有するようであるが、タイプ「Ｃ」のレトロウイルスは中心芯を有する。タイプ「Ｄ」のレトロウイルスはタイプＢおよびタイプＣのレトロウイルスの間にある中間的形態を有する。適しているレトロウイルスの代表例には、下記の図１７Ａ、ＢおよびＣに示されているもの（RNA Tumor Viruses, 2-7頁参照）並びに種々のキセノトロピー性レトロウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ9-1（O’Neill et al., J. Vir. 53:100-106, 1985））およびポリトロピー性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Kelly et al., J. Vir. 45（1）:291-298, 1983参照））が包含される。そのようなレトロウイルスは例えばジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（”ATCC”, Rockville, Maryland）の如き預託または収集所から容易に得られるかまたは一般的な入手技術を用いて既知の源から分離される。
本発明のレトロウイルスベクター構造体の製造または構成用に特に好適なレトロウイルスには、トリの白血症ウイルス、ウシの白血病ウイルス、ネズミの白血病ウイルス、ミンク−細胞焦点−誘発性ウイルス、ネズミの肉腫ウイルス、網内症ウイルス、ギボン・エープ白血病ウイルス、メーソン・フィザー・サルウイルス、およびロウス肉腫ウイルスが包含される。特に好適なネズミ白血病ウイルスには、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（Hartley and Rowe, J. Virol. 19:19-25, 1976）、アベルソン（ATCC No.VR-999）、フレンド（ATCC No.VR-245）、キルステン、ハーヴェイ肉腫ウイルスおよびラウシャー（ATCC No.VR-998）、およびモロニーネズミ白血病ウイルス（ATCC No.VR-190）が包含される。特に好適なロウス肉腫ウイルスには、ブラチスラヴァ、ブライアン高力価（例えば、ATCC No.VR-334、VR-657、VR-726、VR-659、およびVR-728）、ブライアン標準、カール−ジルバー、エンゲルブレス−ホルム、ハリス、プラグ（例えばATCC No.VR-772、および45033）、並びにシュミット−ルッピン（例えばATCC No.VR-724、VR-725、VR-354）が包含される。
ここに示されている開示および標準的な組み換え技術（例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82:488, 1985）により、本発明のレトロウイルスベクター構造体、パッケージング細胞、またはプロデューサー細胞を組み立てまたは構成するために、上記のレトロウイルスのいずれでも利用することができる。さらに、本発明のある種の態様では、レトロウイルスベクター構造体の一部が異なるレトロウイルスから由来していてもよい。例えば、本発明の一態様では、レトロベクターＬＴＲはネズミの肉腫ウイルスから、ｔＲＮＡ結合部位はロウス肉腫ウイルスから、パッケージングシグナルはネズミの白血病ウイルスから、そして二次鎖合成源はトリの白血症ウイルスから由来していてもよい。同様に、パッケージング細胞株の一部が異なるウイルスから由来してしていてもよい（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットはモロニーネズミの白血病ウイルスから、そしてｅｎｖ発現カセットはメーソンフィザーサルのウイルスから構成されていてよい）。
上記の如く、本発明の種々の面で、パッケージングシグナルを有し且つｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖコード付け配列を欠くレトロウイルスベクター構造体が提供される。本発明の概念において使用される時には、パッケージングシグナルはウイルス性ＲＮＡまたはウイルスの組み立て体の合成、処理または翻訳を必要としないがゲノム性ＲＮＡのカプシド化をｃｉｓで必要とするヌクレオチドの配列をさすと理解すべきである（Mann et al., Cell 33;153-149, 1983; 前記のRNA Tumor Viruses, Second Edition参照）。さらに、ここで使用される時には、「ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖコード付け配列を欠く」という句は、ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子中で、そして特にレトロウイルスベクター構造体用のパッケージング細胞株を規定するために使用されるｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ発現カセット内で見られる２０より少ない、好適には１５より少ない、より好適には１０より少ない、そして最も好適には８より少ない、連続的ヌクレオチドを含有するレトロベクターをさすと理解すべきである。そのようなレトロウイルスベクター構造体の代表例は以下および実施例１にさらに詳細に示されている。
一つの説明として、本発明の一態様ではｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ配列を欠くレトロウイルスベクター構造体は延長されたパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスベクター構造体を製造することにより構成することができる。ここで使用される時には、「延長されたパッケージングシグナル」という句はパッケージング用に必要な最少の芯配列を越えているために強化されたパッケージングによってウイルス力価の増加を可能にするヌクレオチドの配列をさす。一例として、ネズミの白血病ウイルスであるＭｏＭＬＶに関すると、最少の芯パッケージングシグナルは（５′ＬＴＲキャップ部位から数えて）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１４４付近からＰｓｔＩ部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド５６７）までの配列によりコード付けされる。ＭｏＭＬＶの延長されたパッケージングシグナルには、ヌクレオチド５６７を越えてｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点（ヌクレオチド６２１）を通り、そしてヌクレオチド１０４０を越える配列が包含される。従って、この態様ではヌクレオチド５６７の下流にあるパッケージングシグナルを欠失または切除することにより延長されたパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスベクター構造体をＭｏＭＬＶから構成することができる。
本発明の他の態様では、レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ配列中に伸びるかまたはそれと重なるパッケージングシグナルが欠失または切除されたレトロウイルスベクター構造体が提供される。例えば、ＭｏＭＬＶの代表的な場合には、パッケージングシグナルはｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点の下流（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド６２１）で欠失除または切除される。本発明の好適態様では、パッケージングシグナルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６１０、６１５または６１７で終結する。
本発明の他の面では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点を越える（例えば、ＭｏＭＬＶに関しては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド６２１を越える）パッケージングシグナルを含むレトロウイルスベクター構造体が提供される。そのようなレトロウイルスベクター構造体を利用する時には、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット中のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の５′終結端部がｇａｇを縮重させるコドンを含有するように修飾されている組み換え体ウイルス粒子の製造用にパッケージング細胞株を使用することが好ましい。そのようなｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットは以下の２章および実施例３にさらに詳細に記載されている。
本発明の他の面では、５′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二次鎖ＤＮＡ合成源および３′ＬＴＲを含んでなり、ここでレトロベクタープラスミド構造体が５′ＬＴＲの上流のレトロウイルス核酸配列を含有しないレトロウイルスベクター構造体が提供される。本発明の概念で使用される時には、「５′ＬＴＲの上流のレトロウイルス核酸配列を含有しない」という句は、レトロベクタープラスミド構造体がレトロウイルス中で、そして特に５′ＬＴＲの上流にあるかおよび／またはそれと連続しているレトロウイルスエリスロポエチン構造体中で見られる２０より少ない、好適には１５より少ない、より好適には１０より少ない、そして最も好適には８より少ない、連続的ヌクレオチドを含有することを意味すると理解すべきである。好適態様では、レトロベクタープラスミド構造体は５′ＬＴＲの上流のｅｎｖコード付け配列（以下で論じられている）を含有しない。そのようなレトロベクタープラスミド構造体の特に好適な態様は以下の実施例１にさらに詳細に示されている。
本発明の別の面では、５′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二次鎖ＤＮＡ合成源および３′ＬＴＲを含んでなり、ここでレトロベクタープラスミド構造体が３′ＬＴＲの下流のレトロウイルスパッケージングシグナル配列を含有しないレトロベクタープラスミド構造体が提供される。ここで使用される「パッケージングシグナル配列」という語はＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分な配列を意味すると理解すべきである。そのようなレトロウイルスベクター構造体の代表例は以下の実施例１にさらに詳細に示されている。
２．ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの構成
上記の如く、本発明は本発明のレトロウイルスベクター構造体およびｅｎｖ発現カセットと組み合わせて、複製競合ウイルスの生成を妨げるパッケージング細胞株およびプロデューサー細胞株の構成を可能にする種々のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットも提供する。簡単に述べると、レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は芯マトリックスおよびヌクレオカプシドを作成する種々の構造的蛋白質をコード付けするｇａｇ領域、並びに（１）ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ蛋白質の処理用のプロテアーゼ、（２）逆転写ポリメラーゼ、（３）ＲＮａｓｅ  Ｈ、および（４）宿主ゲノム中へのレトロウイルスプロベクターの一体化に必要なインテグラーゼをコード付けする遺伝子を含有するｐｏｌ領域を含有する。レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を利用して本発明のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを構成することもできるが、種々の他の非−レトロウイルス（および非−ウイルス）遺伝子を利用してｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを構成することもできる。例えば、レトロウイルスＲＮａｓｅ  Ｈをコード付けする遺伝子を細菌性（例えば大腸菌またはThermus thermophilus）ＲＮａｓｅ  Ｈをコード付けする遺伝子で代行することもできる。同様に、レトロウイルスインテグラーゼ遺伝子を同様な機能を有する他の遺伝子（例えば、酵母レトロトランスポソンＴＹ３インテグラーゼ）により代行することもできる。
本発明の一面では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子と操作できるように結合されているプロモーター、およびポリアデニル化配列を含んでなり、ここでｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子がｇａｇを縮重させるコドンを含有するように修飾されているｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットが提供される。簡単に述べると、上記の如く野生型レトロウイルスではレトロウイルスの延長されたパッケージングシグナルがｇａｇおよびｐｏｌをコード付けする配列と重なる。従って、レトロウイルスベクター構造体とｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットとの間の交差の可能性を排除するため、並びにｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよび複製競合ウイルスまたはレトロウイルスベクター構造体の共−カプシド化の可能性を排除するために、重複配列は除去すべきである。本発明の一態様では、そのような重複の除去はｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（およびより特に、例えば延長されたパッケージングシグナルの如きレトロウイルスベクター構造体と重複する領域）を修飾してｇａｇに関して縮重させている（すなわち、「ゆらぐ」）コドンを含有することにより行われる。特に、本発明の好適態様では生物学的に活性な（すなわち、競合レトロウイルス粒子をｅｎｖ発現要素、およびＲＮＡゲノムと組み合わせて製造できる）ｇａｇ／ｐｏｌ蛋白質をコード付けしそして特に延長されたパッケージングシグナル配列を含むパッケージングシグナル配列を欠くコドンが選択される。ここで使用される時には、「レトロウイルスパッケージングシグナル配列を欠く」とう句は、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットがレトロウイルスパッケージングシグナル中で見られる配列（例えば、ＭｏＭＬＶの場合には、ヌクレオチド数１５６１付近にあるＸｈｏＩ部位までそしてそれを通って伸びている）と同一である２０より少ない、好適には１５より少ない、より好適には１０より少ない、そして最も好適には８より少ない、連続的なヌクレオチドを含有することを意味すると理解すべきである。ｇａｇに関して縮重しているそのような修飾されたコドンの特に好適な例は図１０および実施例３に示されているが、本発明はそのように限定されるべきではない。特に、他の態様では、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５または１３５ｇａｇにおいてコドンが修飾されているかまたは本発明のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット内で天然ｇａｇ配列から「ゆらいで」いる。
レトロウイルスベクター構造体とｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子との間の重複を排除することの他に、異種組み換えの可能性を防ぐためにｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子との間の重複可能性も除くことが好ましい。これは少なくとも２つの原則的方法で、すなわち（１）インテグラーゼ蛋白質をコード付けするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の部分および特にｅｎｖコード付け配列と重複するインテグラーゼ蛋白質をコード付けする遺伝子の部分を欠失されることにより、または（２）インテグラーゼおよび／もしくはｅｎｖを縮重させるコドンを選択することにより、行われる。
従って、本発明の一面では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子と操作できるよう式に結合されているプロモーター、および遺伝子の３′終結端部がインテグラーゼの生物学的活性に影響を与えずに欠失されているポリアデニル化配列またはシグナルを含んでなるｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットが提供される。（インテグラーゼの生物学的活性はＤＮＡ分析によりまたは導入された遺伝子の発現により一体化事象の検出により容易に測定することができる、Roth et al., J. Vir. 65（4）:2141-2145, 1991参照）。一例として、ネズミの白血病ウイルスであるＭｏＭＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子はヌクレオチド６２１〜５８３４によりコード付けされる。この配列内では、蛋白質インテグラーゼはヌクレオチド４６１０〜ヌクレオチド５８３４によりコード付けされる。インテグラーゼをコード付けするｇａｇ／ｐｏｌ配列の一部はｅｎｖ（これはヌクレオチド５７７６で始まる）もコード付けする。従って、本発明の一態様では、インテグラーゼの生物学的活性に影響を与えずにｅｎｖ遺伝子との交差を避けるためにｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の３′終結端部が欠失または切断される。他の好適態様では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子はインテグラーゼコード付け配列の開始点から下流の（３′）ヌクレオチドで、そして好適にはｅｎｖ遺伝子配列の開始点の前で欠失されている。一態様では、ｇａｇ／ｐｏｌをコード付けする配列はＭｏＭＬＶ配列であり、そしてｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は例えばヌクレオチド５７７５、５７７０、５７６５、５７６０、５７５５、５７５０を含むヌクレオチド４６１０〜５５７６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の）の間のヌクレオチドにおいて欠失されている。
本発明の他の態様では、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットはｇａｇ／ｐｏｌ（およびインテグラーゼを含む）をコード付けするがｅｎｖ遺伝子中で見られる配列を欠く配列を含有する。「ｅｎｖ遺伝子中で見られる配列を欠く」という句は、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットがｅｎｖ配列と同一でありそして好適にはｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットと共に使用してパッケージング細胞を生成するｅｎｖ発現カセット中で見られる少なくとも２０の、好適には少なくとも１５の、より好適には少なくとも１０の、そして最も好適には少なくとも８の、連続的ヌクレオチドを含有しないことを意味すると理解すべきである。そのような発現カセットは、インテグラーゼに対して縮重されており、そして生物学的に活性なｅｎｖをコード付けしないコドンを選択することにより容易に製造することができる。（Morgenstern and Land, Nuc. Acids Res. 18:3587-3596, 1990参照。）
本発明の他の態様では、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットは異種プロモーター、および／または異種ポリアデニル化配列を含有する。ここで使用される「異種」プロモーターまたはポリアデニル化配列はｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（並びに好適にはｅｎｖ遺伝子およびレトロウイルスベクター構造体）が由来する異なる源からのプロモーターまたはポリアデニル化配列をさす。適しているプロモーターの代表例には、サイトメガロウイルス中間体早期（ＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（ＨＳＶＴＫ）プロモーター、ロウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、アデノウイルス主要−後期プロモーターおよびＳＶ４０プロモーターが包含される。適しているポリアデニル化シグナルの代表例にはＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルが包含される。
本発明の好適面では、上記の如きｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットは複製競合ウイルスと一緒に共−カプシド化しない。共−カプシド化の代表的な一測定方法は実施例８に示されている。
３．ｅｎｖ発現カセットの構成
本発明の他の面では、上記のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびレトロウイルスベクター構造体と組み合わせ、異種組み換えによる複製競合ウイルスの生成を妨げそして生じたベクター粒子の特別な特異性（例えば、アンフォトロピー性、エコトロピー性、キセノトロピー性またはポリトロピー性、ｚｕ１７並びに以上の論議を参照のこと）を与えるｅｎｖ発現カセットが提供される。簡単に述べると、野性型レトロウイルスでは、ｅｎｖ遺伝子が２つの主要蛋白質である表面糖蛋白質「ＳＵ」およびトランスメンブラン蛋白質「ＴＭ」をコード付けし、それらはポリ蛋白質として翻訳されそして引き続き蛋白質分解による分裂により分離される。ＳＵおよびＴＭ蛋白質の代表例はＨＩＶ中のｇｐ１２０蛋白質およびｇｐ４１蛋白質、並びにＭｏＭＬＶ中のｇｐ７０蛋白質およびｐ１５ｅ蛋白質である。ある種のレトロウイルスでは、測定されていない機能を有する「Ｒペプチド」と指定される第三の蛋白質もｅｎｖ遺伝子から発現されそして蛋白質分解による分裂によりポリ蛋白質から分離される。ネズミの白血病ウイルスであるＭｏＭＬＶでは、Ｒペプチドは「ｐ２」と指定される。
ここに示されている開示を使用しそして本発明で異種組み換えを妨げるために利用される広範囲のｅｎｖ発現カセットを構成することができる。本発明の一面では、ｅｎｖ遺伝子と操作できるように結合されているプロモーターを含んでなり、ここで６、８、１０、１５、または２０以下の連続的なレトロウイルスヌクレオチドが該ｅｎｖ遺伝子の（５′）の上流におよび／またはそれと連続して含まれているｅｎｖ発現カセットが提供される。本発明の他の面では、ｅｎｖ遺伝子と操作できるように連結されており、ここでｅｎｖ発現カセットがｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子中で、そして特にｅｎｖ発現カセットと共に使用されてパッケージング細胞株を作成するｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット中で見られる２０より大きい、好適には１５より少ない、より好適には１０より少ない、そして最も好適には８もしくは６より少ない、連続的ヌクレオチドを含有していないｅｎｖ発現カセットが提供される。
本発明の他の面では、ｅｎｖ遺伝子と操作できるよう式に結合されているプロモーター、およびｅｎｖの生物学的活性に影響を与えずにｅｎｖ遺伝子の３′終結端部が欠失されているポリアデニル化配列を含んでなるｅｎｖ発現カセットが提供される。ここで使用される「ｅｎｖの生物学的活性」という句は、ウイルスまたはベクター粒子の表面上で蛋白質がエンベロープ発現させそして宿主細胞の感染を成功させる能力をさす。生物学的活性を評価するための実際的な一方法は、ｅｎｖ発現カセットを予め測定された機能性ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを含有する細胞、および選択可能なマーカーを発現するレトロウイルスベクター構造体中に一時的に導入することである。生物学的に機能的するｅｎｖ発現カセットは導入された細胞中で製造されたベクター粒子が選択可能なマーカーを生の敏感性細胞中に伝達させてマーカー薬品選択に対して耐性になるようにさせる。本発明の好適態様では、ｅｎｖ遺伝子の３′終結端部を欠失または切除した完全なＲペプチドが発現カセットにより製造されないようにする。ＭｏＭＬＶの代表例では、Ｒペプチドをコード付けする配列（ヌクレオチド７７３４で始まる）が欠失されるか、切除されるか、または例えばヌクレオチド７７４０、７７４５、７７４７、７７５０、７７５５、７７６０、７７６５、７７７０、７７７５、７７８０、またはそれらの間のヌクレオチドにおける停止コドンの挿入により終結させる。
本発明の他の面では、異種プロモーター、および／または異種ポリアデニル化配列を含有するｅｎｖ発現カセットが提供される。ここで使用される「異種」プロモーターまたはポリアデニル化配列は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（並びに好適にはｅｎｖ遺伝子およびレトロウイルスベクター構造体）が由来する異なる源からのものであるプロモーターまたはポリアデニル化配列をさす。適しているプロモーターの代表例には、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要−後期プロモーターおよびＳＶ４０プロモーターが包含される。適しているポリアデニル化シグナルの代表例にはＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルが包含される。
異種配列
上記の如く、本発明のレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット、およびｅｎｖ発現カセットは１つもしくはそれ以上の異種配列を含有（および発現）することができる。例えば細胞毒性遺伝子、アンチセンス配列、遺伝子生成物をコード付けして細胞毒性がほとんどまたは全くない化合物（すなわち、「プロドラッグ」）を毒性生成物に活性化させる配列、疾病−関連性抗原の免疫原部分をコード付けする配列および免疫補助分子をコード付けする配列を含む広範囲の異種配列を本発明の概念内で使用できる。細胞毒性遺伝子の代表例には、蛋白質をコード付けする遺伝子、例えばリシン（Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148:265-270, 1985）、アブリン（Wood et al., Eur. J. Biochem. 198:723-732, 1991; Evensen, et al., J. of Biol. Chem. 266:6848-6852, 1991; Collins et al., J. of Biol. Chem. 265:8665-8669, 1990: Chen et al., Fed. of Eur. Biochem. Soc. 309:115-118, 1992）、ジフテリア毒素（Tweten et al. J. Biol. Chem. 260:10392-10394, 1985）、コレラ毒素（Mekalanos et al., Nature 306:551-557, 1983, Sanchez & Holmgren, PNAS 86:481-485、1989）、ゲロニン（Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255:6947-6953, 1980）、ポークウィード（Irvin, Pharmac. Ther. 21:371-387, 1983）、抗ウイルス蛋白質（Barbieri et al., Biochem. J. 203:55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200:418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169:522-528, 1975）、トリチン、シゲラ毒素（Calderwood et al., PNAS 84:4364-4368, 1987; Jackson et al., Microb. Path. 2:147-153, 1987）、およびシュードモナス・エキソトキシンＡ（Carroll and Collier, J. Biol. Chem. 262:8707-8711, 1987）の如き蛋白質をコード付けする遺伝子である。
本発明の他の態様では、生じうる分類Ｉの制限応答を誘発させるためにアンチセンスＲＮＡを細胞毒性遺伝子として使用できる。簡単に述べると、ＲＮＡに結合しそしてそれにより特異的なｍＲＮＡの翻訳を防止する他に、高水準の特異的なアンチセンス配列を利用して大量の二本鎖ＲＮＡの生成による（ガンマ−インターフェロンを含む）インターフェロンの発現の増加を誘発させることができる。増加したガンマインターフェロンの発現はまたＭＨＣ分類Ｉ抗原の発現も急増させる。これに関する使用に好適なアンチセンス配列には、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮＡ、およびヒストンＲＮＡが包含される。アクチンＲＮＡとの不適性性を生ずるアンチセンスＲＮＡが特に好適である。
本発明の他の態様では、細胞成長に必要な臨界的蛋白質の細胞合成を防止することにより例えば腫瘍細胞成長、ウイルス複製、または遺伝的疾病を抑制するアンチセンス配列が提供される。そのようなアンチセンス配列には、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロホレートレダクターゼ（Maher and Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253:214-220, 1987; Bzik et al., PNAS 84:8360-8364, 1987）、アンチセンスＨＥＲ２（Coussens et al., Science 230:1132-1139, 1985）、アンチセンスＡＢＬ（Fainstein et al., Oncogene 4 1477-1481, 1989）、アンチセンスＭｙｃ（Stanton et al., Nature 310:423-425, 1984）およびアンチセンスｒａｓ、並びにヌクレオチド生合成経路中で酵素を遮断するアンチセンス配列が包含される。
本発明の他の面では、細胞毒性がほとんどまたは全くない化合物（すなわち、「プロドラッグ」）を毒性生成物に活性化させる遺伝子生成物の発現を指定するレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットが提供され。そのような遺伝子生成物の代表例には、バリセラ・ゾスター・ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶＴＫ）、ヘルペス・シンプレックス・ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）（Field et al., J. Gen. Virol. 49:115-124, 1980; Munir et al., Protein Engineering 7（1）:83-89, 1994; Black and Loeb, Biochem 32（43）:11618-11626, 1993）、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（１９９３年１１月１８日に出願された「Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes」という名称の米国特許出願番号０８／１５５，９４４参照、また「Vecters Including Foreign Genes and Negative Selection Markers」という名称のＷＯ９３／１０２１８、「Cytosine Deaminase Negative Selection System for Gene Transfer Techniques and Therapies」という名称のＷＯ９３／０１２８１、「Trapped Cells and Use Thereof as a Drug」という名称のＷＯ９３／０８８４３、「Transformant Cells for the Prophylaxis or Treatment of Diseases Caused by Viruses, Particularly Pathogenic Retroviruses」という名称のＷＯ９３／０８８４４、および「Recombinant Therapies for Infection and Hyperproliferative Disorders」という名称のＷＯ９０／０７９３６も参照のこと）が包含される。本発明の好適な態様では、レトロウイルスベクター構造体が細胞毒性がほとんどまたは全くない化合物を病原性試薬の存在下で毒性生成物に活性化させ、それにより病原性試薬に対して局在化された療法に影響を与える遺伝子生成物の発現を指定する（ＷＯ９４／１３３０４参照）。
本発明の一態様では、ＨＳＶＴＫ遺伝子下流の発現をＨＩＶプロモーター（これはＨＩＶｔａｔ蛋白質により活性化された時以外は転写的に活発でないことが知られている）の転写調節条件下で指定するレトロウイルスベクター構造体が提供される。簡単に述べると、ＨＩＶが感染しておりそしてベクター構造体を運ぶヒト細胞中のｔａｔ遺伝子生成物の発現がＨＳＶＴＫの生成増加を生ずる。細胞（試験管内または生体内）を次に例えばガンシクロヴィル、アシクロヴィルまたはその同族体（ＦＩＡＵ、ＦＡＣ、ＤＨＰＧ）の如き薬品に露呈する。そのような薬品はＨＳＶＴＫにより（しかし細胞状チミジンキナーゼによってではなく）ホスホリル化されてそれらの対応する活性な三燐酸ヌクレオチド形になることが知られている。アシクロヴィルおよび三燐酸ＦＩＡＵは一般的に細胞状ポリメラーゼを抑制して、トランスジェニックマウス中でＨＳＶＴＫを発現する細胞の特異的な破壊をもたらす（Borrelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7572, 1988参照）。組み換え体ベクターおよび発現性ＨＩＶｔａｔ蛋白質を含有するこれらの細胞は特異的な投与量のこれらの薬品の存在により選択的に殺される。
本発明の他の面では、本発明のレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットは疾病−関連性抗原の免疫原部分をコード付けする１つもしくはそれ以上の配列の発現も指定する。本発明の概念で使用される時には、抗原が細胞（または有機体）を疾病状態にさせることに関連しているかまたは一般的に疾病状態に関連しているが細胞を疾病状態にさせるためには必要もしくは必須でないなら、それらは「疾病−関連性」と考えられる。さらに、抗原が適当な条件下で免疫応答（細胞性または体液性）を引き起こすことができるなら、それらは「免疫原性」であると考えられる。免疫原性「部分」は可変寸法であってもよいが、好適には少なくとも９つのアミノ酸の長さであり、そして抗原全体を含むことができる。
例えば、通常は腫瘍細胞と関連している変更された細胞状成分の免疫原性の非−腫瘍原性の形を含む広範囲の「疾病−関連性」抗原が本発明の範囲内であると考えられる（ＷＯ９３／１０８１４参照）。通常は腫瘍細胞と関連している変更された細胞状成分の代表例には、ラット*（ここで「*」は非−腫瘍原性に変更された抗原をさすと理解される）、ｐ５３*、Ｒｂ*、ウィルムの腫瘍遺伝子によりコード付けされた変更された蛋白質、ウビキチン*、ムシン、ＤＤＣ、ＡＰＣおよびＭＣＣ遺伝子によりコード付けされた蛋白質、並びにレセプターまたはレセプター様構造体、例えばｎｅｕ、チロイドホルモンレセプター、血小板由来成長因子（ＰＤＣＦ）レセプター、インシュリンレセプター、皮膚成長因子（ＥＣＦ）レセプター、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプターが包含される。
「疾病−関連性」抗原は種々の真核、原核またはウイルス病原体の全てまたは一部を含むと理解される。ウイルス病原体の代表例には、ヘパチチスＢウイルス（「ＨＢＶ」）およびヘパチチスＣウイルス（「ＨＣＶ」、ＷＯ９３／１５２０７参照）、ヒトのパピロマウイルス（「ＨＰＶ」、ＷＯ９２／０５２４８、ＷＯ９０／１０４５９、ＥＰＯ１３３，１２３参照）、エプステイン−バルウイルス（「ＥＢＶ」、ＥＰＯ１７３，２５４、ＪＰ１，１２８，７８８および米国特許第４，９３９，０８８号および第５，１７３，４１４号参照）、ネコの白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」、ＷＯ９３／０９０７０、ＥＰＯ３７７，８４２、ＷＯ９０／０８８３２、ＷＯ９３／０９２３８参照）、ネコの免疫欠損症ウイルス（「ＦＩＶ」、米国特許第５，０３７，７５３号、ＷＯ９２／１５６８４、ＷＯ９０／１３５７３、およびＪＰ４，１２６，０８５参照）、ＨＴＬＶ  ＩおよびII、並びにヒト免疫欠損症ウイルス（「ＨＩＶ」、ＷＯ９３／０２８０５参照）が包含される。
本発明の他の面では、上記のレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットは１つもしくはそれ以上の免疫補助分子の発現を指定することもできる。ここで使用される「免疫補助分子」という句は免疫応答（細胞性または体液性）の認識、表示もしくは活性化を増加または減少させる分子をさす。免疫補助分子の代表例には、αインターフェロン、βインターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５）、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（Wolf et al., J. Immun. 46:3074, 1991; Gubler et al., PNAS 88:4143, 1991;  ＷＯ９０／０５１４６；ＥＰＯ４３３，８２７）、ＩＬ−１３（ＷＯ９４／０４６８０）、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＤ３（Krissanen et al., Immunogenetics 26:258-266, 1987）、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−１（Simmons et al., Nature 331:624-627, 1988）、ＩＣＡＭ−２（Singer, Science 255, 1671, 1992）、β−マイクログロブリン（Parnes et al., PNAS 78:2253-2257, 1981）、ＬＦＡ−１（Altmann et al., Nature 338 521, 1989）、ＬＦＡ３（Wallner et al., J. Exp. Med. 166（4）:923-932, 1987）、ＨＬＡ分類Ｉ、ＨＬＡ分類II分子、Ｂ７（Freeman et al., J. Immun. 143:2714, 1989）並びにＢ７−２が包含される。好適な態様では、異種遺伝子がガンマ−インターフェロンをコード付けする。
本発明の好適な面では、ここに記載されているレトロウイルスベクター構造体は１つより多い異種配列の発現を指定できる。そのような多重配列は１個のプロモーターにより、または好適には他の副プロモーター（例えば、内部リボソーム結合部位すなわち「ＩＲＢＳ」）により調節することができる。本発明の好適な態様では、レトロウイルスベクター構造体は相乗的に作用する異種配列の発現を指定する。例えば、一態様では、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−  、ガンマインターフェロン、またはＴH１経路中で細胞性表示を増加させるために作用する他の分子の如き分子の発現を、疾病−関連性抗原の免疫原性部分に沿って指定するレトロウイルスベクター構造体が提供される。そのような態様では、疾病−関連性抗原の免疫表示および処理は免疫補助分子の存在により増加するであろう。
本発明の他の面では、「代行」遺伝子をコード付けする１つもしくはそれ以上の異種配列の発現を指定するレトロウイルスベクター構造体が提供される。ここで使用される時には、「代行遺伝子」という語は遺伝性または非遺伝性の遺伝子欠失を予防、阻害、安定化または逆転させる治療用の蛋白質をコード付けする核酸分子をさす。そのような遺伝子欠失の代表例には、代謝、免疫調整、ホルモン調整、および酵素性または膜関連性の構造的機能における疾病が包含される。そのような欠失により引き起こされる疾病の代表例には、嚢胞性線維症（ＣＦ、Dorin et al., Nature 326614）、パーキンソン病、アデノシンデアミナーゼ欠失症（ＡＤＡ、Hahma et al., J. Bact. 173:3663-3672, 1991）、β−グロビン障害、血友病ＡおよびＢ（VIII因子欠損症、Wood et al., Nature 312:330, 1984参照）、ゴシェ病、糖尿病、通風性関節炎およびレシュ−ナイラー病（ＨＰＲＴ欠失症による、Jolly et al., PNAS 80:477-481, 1983参照）および家族性高コレステロール血症（ＬＤＬレセプター突然変異、Yamamoto et al., Cell 39:27-38, 1984参照）が包含される。
上記の異種遺伝子をコード付けする配列は種々の源から容易に得られる。例えば、免疫補助分子をコード付けする配列を含有するプラスミドは例えばジ・アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC, Rockville, Maryland）の如き預託所から、または例えばブリティッシュ・バイオ−テクノロジー・リミテッド（Cowey, Oxford England）の如き商業的出所から得られる。上記の免疫補助分子をコード付けする代表的な源ノ配列には、ＢＢＧ１２（１２７個のアミノ酸の成熟蛋白質をコード付けするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）、ＢＢＧ６（これはガンマインターフェロンをコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９６５６（これはＴＮＦをコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０６６３（これはアルファインターフェロンをコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１９０２、３１９０２および３９５１７（これはベータインターフェロンをコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７０２４（これらはインターロイキン−１をコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６３７（これらはインターロイキン−２をコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９９、５９３９８、および６７３２６（これらはインターロイキン−３をコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ５７５９２（これはインターロイキン−４をコード付けする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９４および５９３９５（これらはインターロイキン−５をコード付けする配列を含有する）、並びにＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７１５３（これはインターロイキン−６をコード付けする配列を含有する）が包含される。蛋白質の全配列または蛋白質の生物学的に活性な部分をコード付けする適当な部分を使用できることは当技術の熟達者にも自明であろう。
或いは、細胞毒性遺伝子または他の異種遺伝子をコード付けする既知のｃＤＮＡ配列はそのような配列を発現するかまたは含有する細胞から得られる。簡単に述べると、一態様では当該遺伝子を発現する細胞からのｍＲＮＡを糖ｄＴまたは不規則的プライマーを用いて逆転写酵素で逆転写する。次に所望する配列のいずれかの側面上で配列を補充する糖ヌクレオチドプライマーを使用して一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができる（米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号および第４，８００，１５９号参照）。PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich（ed.）, Stockton Press, 1989も参照のこと、これらの全てはここに引用することにより本出願の内容となる）。特に、二本鎖ＤＮＡは熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的ＤＮＡプライマー、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰの存在下で加熱することにより変性される。合成が完了する時に二本鎖ＤＮＡが生成する。このサイクルを複数回繰り返して、所望するＤＮＡの因子的増幅を生ずることができる。
上記の遺伝子をコード付けする配列は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッドＤＮＡシンセサイザー（例えば、ＡＢＩ  ＤＮＡシンセサイザー・モデル（Foster City, California）上で合成することもできる。
レトロウイルスパッケージング細胞株の製造および組み換え体ウイルス粒子の生成
上記の如く、本発明のｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットを使用してそれらを適当な親細胞株の中に加えてパッケージング細胞株を作成し、その後にレトロウイルスベクター構造体を加えてプロデューサー細胞株を作成することにより導入競合レトロウイルスベクター粒子を生成することができる（ＷＯ９２／０５２６６参照）。そのようなパッケージング細胞株は、Ｎ２−タイプのベクター構造体（Armemano et al., J. of Vir. 61（5）:1647-1650, 1987）の加入で、１０5ｃｆｕ／ｍｌより大きい、そして好適には同様な導入されたＰＡ３１７細胞より２０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い力価を生ずる（Miller and Buttimore, Mol. and Cell. Biol. 6（8）:2895-2902, 1986）。
本発明の一面では、（ａ）ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを動物細胞の中に加え、（ｂ）高水準のｇａｇ／ｐｏｌを発現するｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを含有する細胞を選択し、（ｃ）選択された細胞の中にｅｎｖ発現カセットを加え、そして（ｄ）高水準のｅｎｖを発現する細胞を選択し、そしてそれによりパッケージング細胞を作成する段階を含んでなるパッケージング細胞株を作成する方法が提供される。本発明の他の面では、（ａ）ｅｎｖ発現カセットを動物細胞の中に加え、（ｂ）高水準のｅｎｖを発現する細胞を選択し、（ｃ）選択された細胞の中にｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを加え、そして（ｄ）高水準のｇａｇ／ｐｏｌを発現するｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを含有する細胞を選択しそしてそれによりパッケージング細胞を作成する段階を含んでなるパッケージング細胞株を作成する方法が提供される。ここで使用される時には、「高」水準のｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖはＰＡ３１７細胞より少なくともｚ倍多く生成するパッケージング細胞をさし、ここでｚは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０よりなる群から選択される。
ヒト、マカク、イヌ、ラットおよびマウスの細胞を含む広範囲の動物細胞を利用して本発明のパッケージング細胞を製造することができる。本発明のパッケージング細胞株の製造において使用するのに特に好適な細胞株は、利用するレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットと同種であるゲノム配列を欠くものである。同種性を測定する方法は例えばハイブリッド分析により容易に行うことができる（Martin et al., PNAS 78:4891-4896, 1981参照、ＷＯ９２／０５２６６も参照のこと）。
例えば電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション（Felgne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989）、直接的ＤＮＡ感染（Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991）、微発射衝撃（Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991）、数タイプのリポソーム（例えば、Wang et al., PNAS 84:7851-7855, 1987）、ＣａＰＯ4（Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984）、ＤＮＡリガンド（Wu et al., J. of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989）、核酸の単独投与（ＷＯ９０／１１０９２）、または死滅したアデノウイルスに結合されたＤＮＡの投与（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992）の如き種々の物理的方法による導入を含む多くの技術により本発明の発現カセットを細胞中に加えることができる。
上記のレトロウイルスベクター構造体をパッケージング細胞株の中に加えることにより、次にプロデューサー細胞株（ベクター−生成線すなわち「ＶＣＬ」とも称される）を容易に製造することができる。本発明の好適な態様では、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット、ｅｎｖ発現カセット、およびレトロウイルスベクター構造体を含んでなり、ここでｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット、ｅｎｖ発現カセットおよびレトロウイルスベクター構造体が２０、好適には１５、より好適には１０、そして最も好適には１０または８より多いヌクレオチドの連続的配列を共通して欠くプロデューサー細胞株が提供される。
薬学的組成物
本発明の他の面では、上記の組み換え体ウイルス粒子を薬学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせて含んでなる薬学的組成物が提供される。そのような薬学的組成物は液体溶液として、または投与前に溶液中に懸濁させる固体形（例えば親液性にされている）として製造することができる。さらに、組成物は局所的投与、注射、または経口的、鼻内、膣内、舌下、吸入もしくは直腸投与用の適当な担体または希釈剤を用いて製造することもできる。
薬学的に許容可能な担体または希釈剤は使用する投与量および濃度において受容者に対して無毒である。注射溶液用の担体または希釈剤の代表例には、水、好適には生理的ｐＨに緩衝されている等張性食塩水溶液（例えば燐酸塩で緩衝された食塩水またはトリス−緩衝された食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、並びにポリペプチドまたは蛋白質、例えばヒト血清アルブミンが包含される。特に好適な組成物はレトロウイルスベクター構造体または組み換え体ウイルス粒子を１０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭのＮａＣｌ中に含んでなる。この場合、組み換え体ベクターは約１ｍｇの物質を表すから、それは高分子量物質の１％より少なくてよく、そして合計物質（水を含む）の１／１００，０００より少なくてよい。この組成物は−７０℃において少なくとも６ヶ月間安定である。
本発明の薬学的組成物はさらに、細胞分割を刺激しそしてその結果として組み換え体レトロウイルスベクターの吸収および加入を刺激する因子を含んでいてもよい。代表例には、黒色腫用のメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）または胸部もしくは他の表皮癌用の表皮成長因子が包含される。
組み換え体ウイルスを保護するために特に好ましい方法および組成物は「Methods for Preserving Recombinant Viruses」という名称の米国特許出願中に記載されている（ＷＯ９４／１１４１４参照）。
投与の方法
本発明の他の面では、温血動物に上記の組み換え体ウイルス粒子を病原性試薬が阻害または破壊されるような方法で投与することを含んでなる温血動物中で病原性試薬を阻害または破壊する方法が提供される。本発明の種々の態様では、組み換え体ウイルス粒子を生体内にまたは生体外に投与できる。生体内投与用の代表的方式には、皮膚内（ｉ．ｄ．）、頭蓋内（ｉ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、鞘内（ｉ．ｔ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または腫瘍中への直接的投与が包含される。
或いは、本発明の細胞毒性遺伝子、アンチセンス配列、遺伝子生成物、レトロウイルスベクター構造体またはウイルス粒子を温血動物に種々の他の方法により投与することもできる。代表例には、リポフェクション（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989）、直接的ＤＮＡ注射（Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991）、微発射衝撃（Williams et al.,PNAS 88:2726-2730, 1991）、数タイプのリポソーム（例えばWang et al., PNAS 84:7851-7855, 1987参照）、ＣａＰＯ4（Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984）、ＤＮＡリガンド（Wu et al., J. of Biol. Chem. 264:16985-a6987, 1989）、核酸の単独投与（ＷＯ９０／１１０９２）、または死滅したアデノウイルスに結合されたＤＮＡの投与（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992）の如き種々の物理的方法による導入が包含される。
本発明の好適な面では、レトロウイルス粒子（またはレトロウイルスベクター構造体だけ）を利用して例えば腫瘍の如き病原性試薬を直接処置することができる。好適態様では、レトロウイルス粒子または上記のレトロウイルスベクター構造体を腫瘍に例えば腫瘍本体内に数種の位置で直接的注射により直接投与することができる。或いは、腫瘍に作用する動脈を同定し、そしてベクターをそのような動脈に注射してベクターを腫瘍に直接的に分配させることもできる。他の態様では、壊死中心を有する腫瘍を吸引し、そして腫瘍の現在空になっている中心にベクターを直接注射することができる。さらに他の態様では、レトロウイルスベクター構造体を腫瘍の表面に、例えばレトロウイルスベクター構造体または好適には組み換え体レトロウイルス粒子を含有する局所的な薬学的組成物の適用により、直接投与することができる。
本発明の他の面では、（ａ）選択された腫瘍と関連する腫瘍細胞を温血動物から除去し、（ｂ）除去した細胞に少なくとも１つの抗−腫瘍試薬の発現を指定するレトロウイルスベクター構造体を感染させ、そして（ｃ）感染させた細胞を選択された腫瘍の成長が遺伝子−修飾された腫瘍細胞に対して発生した免疫応答により阻害されるような方法で温血動物に分配させる段階を含んでなる温血動物における選択された腫瘍の成長を阻害する方法が提供される。本発明の概念では、「選択された腫瘍の成長を阻害する」は、腫瘍細胞の実質的膨張の抑制をもたらす（１）腫瘍細胞分割の直接的阻害、もしくは（２）免疫細胞性腫瘍の細胞溶解、またはそれらの両者をさす。これらの二機構のいずれかによる腫瘍成長の阻害は当技術の通常の熟達者により多くの既知の方法を基にして容易に測定することができる（米国特許出願番号０８／０３２，８４６参照）。抗−腫瘍試薬として作用する化合物または分子の例には、免疫補助分子、細胞毒性遺伝子、および以上で論じられたアンチセンス配列が包含される（これも米国特許出願番号０８／０３２，８４６を参照のこと）。細胞は例えば選択された腫瘍を含む種々の位置から除去することができる。さらに、本発明の他の態様ではベクター構造体を例えば皮膚からの細胞（皮膚線維芽細胞）または血液からの細胞（例えば末梢血液白血球）を含む非−腫瘍原細胞の中に挿入することもできる。希望するなら、例えばＴ細胞サブセットまたは幹細胞の如き細胞の特定部分も血液から特異的に除去することができる（例えば、ＰＣＴ  ＷＯ  ９１／１６１１６、「Immunoselection Device and Method」という名称の出願を参照のこと）。上記の技術のいずれかを使用してベクター構造体を次に除去された細胞に接触させ、その後、細胞を温血動物に、好適には腫瘍付近または腫瘍内に戻す。本発明の一態様では、腫瘍細胞を温血動物から除去した後に、例えば物理的破壊または蛋白質消化によりシグナル細胞懸濁液を生成することもできる。さらに、細胞の分割は例えば黒色腫用のメラニン細胞刺激因子または胸部癌用の表皮成長因子の如き種々の因子の添加により増加させて、組み換え体ウイルスベクターの吸収、ゲノム一体化および発現を促進させることもできる。
本発明の概念では、除去された細胞は同一動物に戻されるだけでなく選択された腫瘍細胞の成長を他の異種動物中で阻害するためにも利用できる点を理解すべきである。そのような場合には、病歴相容的に適合する動物であることが一般的に好ましい（必ずしも常にではないが、例えばYamamoto et al., ”Efficacy of Experimental FIV Vaccines”1st International Conference of FIV Researchers, University of California at Davis, September 1991を参照のこと）。
上記の方法はさらに、腫瘍細胞を温血動物から除去した後に線維芽細胞または他の非−汚染腫瘍細胞を除外する段階、および／または細胞を例えば照射により不活性化させる段階も含んでいてもよい。
上記の如く、本発明のある面では数種の抗−腫瘍試薬を同時にまたは連続的に投与して選択された腫瘍の成長を本発明の方法に従い阻害することができる。例えば、本発明の一態様ではγ−ＩＦＮの如き抗−腫瘍試薬を温血動物にＩＬ−２またはＩＬ−１２の如き他の抗−腫瘍試薬と一緒に同時にまたは連続的に投与して病原性試薬を阻害または破滅させることができる。そのような治療用の組成物は少なくとも２種の抗−腫瘍試薬の発現を指定する１つのベクター構造体を利用して直接的に投与することができ、または他の態様では独立したベクター構造体から発現させることもできる。或いは、１種の抗−腫瘍試薬（例えば、γ−ＩＦＮ）をベクター構造体を利用して投与しながら、他の腫瘍試薬（例えば、ＩＬ−２）を（例えば、薬学的組成物として静脈内に）直接投与することもできる。
特に好適な態様では、γ−ＩＦＮ遺伝子およびＩＬ−２をコード付けする他の遺伝子の両方を分配させそして発現させるレトロウイルスベクター構造体を患者に投与することもできる。そのような構造体では、一方の遺伝子がレトロベクターＬＴＲから発現されそして他方はＬＴＲ間で見られる他の転写プロモーターを利用することもできまたは多分内部リボソーム結合部位を利用するポリスストロン性のｍＲＮＡとして発現させることもできる。生体内遺伝子変換後に、患者の免疫系をγ−ＩＦＮの発現により活性化させる。炎症細胞を用いる死滅腫瘍の浸潤が一方では免疫表示を増加させそしてさらに腫瘍に対する患者の免疫応答を改良する。
本発明の他の面では、抗原の免疫原性部分に対する免疫応答を発生させて疾病を予防または処置するため（例えば米国特許出願番号０８／１０４，４２４、０８／１０２，１３２、０７／９４８，３５８、０７／９６５，０８４参照）、移植拒否を抑制するため（米国特許出願番号０８／１１６，８２７参照）、免疫応答を抑制するため（米国特許出願番号０８／１１６，８２８参照）、並びに自動免疫応答を抑制するため（米国特許出願番号０８／１１６，９８３参照）の方法が提供される。
ここに提示されている開示により当技術の通常の熟達者が理解するように、ここに記載されているレトロウイルスベクター構造体は組み換え体ウイルス粒子としてだけでなく、直接的な核酸ベクターとしても分配させることができる。そのようなベクターは例えば以上で論じられている方法を含む遺伝子変換の適当な物理的方法を使用して分配させることができる。
下記の実施例は説明のためであり限定するために供されるものではない。
実施例１
レトロベクター・バックボーンの構成
Ａ．延長されたパッケージング配列を含有しないレトロウイルスベクター構造体（Ψ）の製造
この実施例は部位特異的突然変位誘発を使用するレトロウイルスベクター構造体の構成を記載する。この実施例では、レトロベクターのパッケージングシグナル「Ψ」がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の塩基対６１７で終止しており、それによりｇａｇのＡＴＧ開始点が除かれたＭｏＭＬＶレトロウイルスベクター構造体が製造される。従って、レトロウイルスベクター構造体と以下の実施例３に記載されているｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットとの間で交差が起きない。
簡単に述べると、ｐＭＬＶ−Ｋ（Miller, J. Virol 49:214-222, 1984 - an infectious clone derived from pMLV-1 Shinnick et al., Nature. 293:543-548, 1981）をＥｃｏ５７Ｉで消化させ、そして１．９ｋｂフラグメントを分離する。（Ｅｃｏ５７Ｉは３′LＴＲから上流を切断し、それにより全てのｅｎｖコード付け部分をレトロウイルスベクター構造体から除去する。）次にこのフラグメントをＴ４ポリメラーゼ（New England Biolabs）および全部で４種のデオキシヌクレオチド類を用いて平滑末端処理し、そしてファージミドpBluescript II KS+（Stratagene, San Diego, Calif.）のＥｃｏＲＶ部位の中にクローニングさせた。この工程でｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）（図１）およびｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（−）（図２）と指定される二種の構造体が生成し、それらを制限分析によりふるい分けた。（＋）一本鎖ファージミドが発生する時には、ＭｏＭＬＶのセンス配列が分離される。
ｇａｇのＡＴＧ開始コドンを除去するために新しいＥｃｏＲＩ部位を次に構造体ｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）の中で作成する。特にＥｃｏＲＩ部位はKunkleの一本鎖突然変位誘発方法（PNA 82:488. 1985）を用いて作成される。ｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（＋）は、ｐＭＬＶ−ＫからのＥｃｏ５７Ｉフラグメントを含有するpBluescriptTMII+ファージミド（Stratagene, San Diego, Calif.）である。それはＭｏＭＬＶ  ＬＴＲおよび塩基対１３８までの下流配列を含む。一本鎖ファージミドが生成する時には、ＭｏＭＬＶのセンス配列が分離される。オリゴヌクレオチドである5′GGT AAC AGT CTG GCC CGA ATT CTC AGA CAA ATA CAG（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が作成されそして使用されて、塩基対６１７−６２２でＥｃｏＲＩ部位を発生させる。この構造体はｐＫＳ２＋ＬＴＲ−ＥｃｏＲＩ（図３）と指定される。
Ｂ．延長されたパッケージング配列（Ψ＋）中のノンセンスコドンの代行
この実施例は部位特異的突然変位誘発による延長されたパッケージングシグナルの修飾を記載する。特に、この修飾は停止コドンＴＡＡをｇａｇの正常ＡＴＧ開始部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６３１−６３３）でそして他の停止コドンＴＡＧをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６３７−６３９で代行する。
簡単に述べると、ｐＮ２（Amentano et al., J. Virol. 61:1647-1650, 1987）からのＥｃｏ５７Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＭｏＭＬＶ塩基対７７１〜約１０４０）を最初にＳａｃIIおよびＥｃｏＲＩ部位（相容性）でpBluescript II KS+ファージミド中にクローニングさせる。アンチセンスＭｏＭＬＶ配列を含有する一本鎖ファージミドをヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Stratagene, San Diego, Calif.）を用いて作成する。オリゴヌクレオチドである5′CTG TAT TTG TCT GAG AAT TAA GGC TAG ACT GTT ACC AC（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）が合成され、そしてΨ領域内の配列を修飾してヌクレオチド６３１−６３３および６３７−６３９で停止コドンをコード付けするために上記のKunkleの方法に従い使用される。
Ｃ．３′LＴＲから下流のレトロウイルスパッケージング配列の除去
３′LＴＲから下流にあるレトロウイルスパッケージング配列を本質的に以下に記載されているようにして欠失させる。簡単に述べると、ｐＫＳ２＋Ｅｃｏ５７Ｉ−ＬＴＲ（−）（図２）をＢａｌＩおよびＨｉｎｃIIで消化し、そしてＢａｌＩをＭｏＭＬＶのパッケージング領域を含有するＨｉｎｃIIＤＮＡを除外しながら追放する。
Ｄ．ベクターバックボーンの構成
シスで必要な全ての要素を含有しそしてｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ発現要素のレトロベクター部分中に含有されている８つもしくはそれ以上の以上の核酸の全ての配列を除外するレトロベクターバックボーンを作成するために、上記のＡおよびＣ章で製造されたかまたは上記のＢおよびＣ章からの構造体を以下に記載されているプラスミドベクターと組み合わせる（実施例３および４参照）。
１．部分ＡおよびＢを以下の通りに組み合わせる：Ａの生成物をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＬＴＲおよび最小Ψを含有する１０３４塩基対フラグメントを分離する。このフラグメントを部分Ｃの生成物中に独特な（相容性）制限部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにおいて連結反応させる。生じた構造体はｐＲ１と指定される（図４）。
２．部分ＢおよびＣを以下の通りに組み合わせる：Ｂの生成物をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化しそしてＬＴＲおよび修飾されたΨ＋領域を含有する１４５６塩基対フラグメントを分離する。このフラグメントをＣの生成物中に独特な（相容性）制限部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにおいて連結反応させる。生じた構造体はｐＲ２と指定される（図５）。
実施例２
ｐＲ１およびｐＲ２中への当該遺伝子の挿入
この実施例は選択可能マーカーを用いて当該遺伝子であるｇｐ１２０、ｇｐ４１、およびｒｅｖをｐＲ１またはｐＲ２中に挿入する方法を記載する。簡単に述べると、ｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｒｅｖをコード付けする配列は構造体ｐＫＴ１（図６、Chada et al., J. Vir. 67:3409-3417, 1993も参照のこと）から採取され、ここでこのベクターはＮ２III Ｂｅｎｖとも称される。特に、ｐＫＴ１を独特なＡｓｕII部位（位置５９５９）で最初に消化する。端部を平滑末端処理し、そしてＸｈｏ  Ｉ  リンカーをその部分で連結反応させる（New England Biolabs）。構造体を次にＸｈｏＩおよびＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１２０およびｇｐ４１）を含有する４３１４ｂｐフラグメント、ＳＶ４０早期プロモーターで消化し、そしてＧ４１８耐性遺伝子を分離する。ｐＲ１またはｐＲ２を独特のＥｃｏＲＩ制限部位で消化し、平滑末端処理し、そしてＳａｌＩリンカー（New England Biolabs）を中で連結させる。４３１４ｂｐＫＴ１フラグメントを次にｐＲ１またはｐＲ２中に新しいＳａｌ部位で連結反応させ、そして正確な配向を測定する（図７および８参照）。これらの構造体の両者（ｐＲ１−ＨＩＶｅｎｖおよびｐＲ２−ＨＩＶｅｎｖ）では、ＨＩＶ遺伝子はＭＬＶ  ＬＴＲから発現され、そしてＧ４１８抵抗はＳＶ４０プロモーターから発現される。
実施例３
ＧＡＧ−ＰＯＬ発現カセットの構成
Ａ．発現カセットバックボーンｐＨＣＭＵ−ＰＡの構成
ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現カセットの両者用のバックボーンを製造するためにベクターを最初に作成する。簡単に述べると、pブルースクリプトＳＫ−ファージミド（Stratagene, San Diego, Calif., GenBanc accession number 52324、”SK”と照合される）をＳｐｅＩで消化しそしてＫｌｅｎｏｗで平滑末端処理する。ＤｒａＩ（ｂｐ２３６６）からＤｒａＩ（ｂｐ２７２９）までのＳＶ４０（Fiers et al.,”Complete nucleotide sequence of SV40 DNA”Nature 273 113-20, 1978）の平滑末端を次にＳＫ−に挿入し、そしてＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルがＳＫ−のＬａｃＺ遺伝子と反対に配向されている構造体を分離する。この構造体はＳＫ−ＳＶ４０Ａと指定される。
ヒトのサイトメガロウイルス主要中間早期プロモーター（”HCMV-IE”, Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985）（ＨｉｎｃII，ｂｐ１４０からＥａｇｌ，ｂｐ８１４まで）をＨｉｎｃIIおよびＥａｇｌを用いる消化後に分離し、そしてＥａｇｌ部位を平滑末端処理する。６７４平滑末端処理されたフラグメントをＳＫ−ＳＶ４０Ａ中に連結反応させる。ｐＨＣＭＶ−ＰＡと指定された最終的構造体を次に分離する（図１１参照）。この構造体はＬａｃＺ遺伝子と反対に配向されたＨＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０の後期ポリアデニル化シグナルから上流を含有する。
Ｂ．５′Ｇａｇ用の新しいコドンの作成
この実施例は、ｇａｇ開始点から上流の非−コード付け配列を欠失させ、それによりｇａｇ／ｐｏｌ発現要素とレトロウイルスベクター構造体のΨ＋配列との間の組み換え能力を減少させ、そしてレトロベクターと一緒のｇａｇ／ｐｏｌ発現要素の共パッケージングを阻害するｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを記載する。そのような発現カセットを構成するためには、下記の特徴を有するＤＮＡの４４８ｂｐを合成する：５′ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ部位）ＡＣＣＡＴＧ（開始コドン、位置６２１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を、その後、別のコドンを用いて４１０ｂｐコード付け１３６＋アミノ酸基（図９および１０参照）を、その後、ＧＧＣＧＣＣ（ＮａｒＩ部位）ＡＡＡＣＣＴＡＡＡＣ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
簡単に述べると、オリゴ１５〜２４（以下の表１に示されている）の各々をＰＣＲ反応管に各最終濃度が１μＭとなるように加える。オリゴ２５および２６を管に各最終濃度が３μＭとなるように加える。１２μＬの２．５ｍＭ原料三燐酸デオキシヌクレオチド（ｄＧ，ｄＡ，ｄＴ，ｄＣ）を管に加える。５μＬの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Perkin Elmer）を加える。水を５０μＬの最終容量になるまで加える。ワックスビーズを加え、そして水層上で５５℃において融解し、そして次に２２℃に冷却する。頂部水層を下記のようにして加える：５μＬの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、７．５μＬのジメチルスルホキシド、１．５μＬのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer）および３６μＬの水。次に４０サイクルのＰＣＲを下記のようにして行う：９４℃、３０秒間；５６℃、３０秒間；および７２℃、３０秒間。ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットの組み立てまでＰＣＲ生成物を−２０℃で貯蔵する。
0004303315.tif 000002
Ｃ．Ｐｏｌ用の新しい３′末端の作成
全長のｇａｇ／ｐｏｌを発現するｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを製造するために、ｐＣＭＶｇａｇ／ｐｏｌを構成する。簡単に述べると、Ｐｓｔ１（ＢＰ５６７）からＮｈｅ１（ｂｐ７８４７）までのＭｏＭＬＶ配列をｐＵＣ１９（New England Biolabs）のＰｓｔ１−Ｘｈａ１部位中にクローニングする。生じた中間体をＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏ１で消化し、そしてｇａｇリーダー配列を含有する１００８ｂｐフラグメントを分離する。同じ中間体をＸｈｏ１およびＳｃａＩでも消化し、そして残りのｇａｇおよびｐｏｌ配列を含有する４３１２ｂｐフラグメントを分離する。２つの分離されたフラグメントを次に上記のｐＨＣＭＶ−ＰＡのＨｉｎｄIIIおよびＳｍａＩ部位中にクローニングする。ＣＭＶｇａｇ／ｐｏｌ（図１２）と指定された生じた構造体はＭｏＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させる。
ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ中で発見されたｐｏｌ遺伝子の３′末端を短縮させるために、ＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよび最後の２８個のコドン以外の全てのｇａｇ−ｐｏｌを含有する５５３１塩基対ＳｎａＢＩ−ＸｍａＩフラグメントをｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌから分離する。このフラグメントをｐＨＣＭＶ−ＰＡのＳｎａＢＩおよびＸｍａＩ部位中にクローニングする。この構造体はカルボキシ−末端に５個の新しいアミノ酸（Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ）を発現させる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（ｐＣＭＶｇｐＳｍａ）。
或いは、ｐＣＭＶｇｐＳｍａＩをＳｍａＩで消化しそしてＮｈｅＩ（末端コドンは三相である）リンカー（5′-CTA GCT AGC TAG、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、New England Biolabs）を短縮されたｐｏｌ配列の末端に加えることによりこれらの５個のアミノ酸を除去することもできる。これらの構造体の両者はｇａｇ／ｐｏｌとｅｎｖ発現カセットとの間の交差の可能性を排除する。
Ｄ．Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現カセット
上記からの部分ＢおよびＣを組み合わせてＣＭＶ  ＩＥプロモーターである新しいＣｌａＩ部位から始まり（その後、ACC ATGおよび別のすなわち「ゆらぐ」ｇａｇコード付け配列が続き）そして本質的に以下に記載されているＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続いているＳｍａＩ部位で終了するｇａｇ−ｐｏｌを含有する発現ベクターを与える。簡単に述べると、部分Ａからの約４５１ｂｐの二本鎖ゆらぎフラグメントをｐＣＲTMIIＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp.）中に連結反応させる。ゆらぐＰＣＲ生成物はもちろん各々の末端に３′A−オーバーハングを含有するため、ｐＣＲTMIの３′T−オーバーハング中でクローニングすることができる。ｐＣＲTMI Ｉクローンからの４２２ｂｐＣｌａＩ−ＮａｒＩゆらぎフラグメントを除去しそしてｐＣＭＶｇｐＳｍａ（部分Ｂ）（またはｐＣＭＶｇｐＮｈｅ）のＣｌａＩ（位置６７９、図ｐＣＭＶｇｐＳｍａ）およびＮａｒＩ（位置１５８５）部位中に連結反応させる。（位置５１１４におけるＣｌａＩ部位はメチル化されそしてＣｌａＩで切断されない）。この連結反応の生成物をＮａｒＩで消化し、そしてＭＬＶ−ＫＮａｒＩフラグメント（位置１０３５〜１３７８）を挿入する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。この構造体はｐＣＭＶｇｐ−Ｘと指定される（図１４）。
実施例４
発現カセットの構成
Ａ．新しい５′ＥａｇＩ制限部位の作成
ｐブルースクリプトIIＫｓ＋ベクター（開始コドンを含有する）中でクローニングされた４０７０Ａアンフォトロピー性エンベロープ（Chattopodhyay et al., J. Vir. 39:777, 1981; GenBank accession # MLV4070A, and #MLVENVC; ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）からのＥａｇｌ−ＥｃｏＲＩ６２６ｂｐサブフラグメントで始まり、ACCATCCTCTGGACGGACATG...（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；Genebank配列＃ＭＬＶＥＮＶＣの位置２０−４０）をACCCGGCCGTGGACGGACATG...（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に変化させそして位置２３に新しいＥａｇｌ部位を作成するために部位特異的突然変位誘発を翻訳開始部位の上流で行う。この修飾により、実施例２Ａに記載されているようなｇａｇ−ｐｏｌ発現要素と同種の上流４０７０Ａ配列を排除する発現ベクター中へのアンフォトロピー性エンベロープのクローニングが可能になる。
Ｂ．Ｅｎｖ用の新しい３′末端の作成
膜内領域（ｐ１５Ｅ）の末端からＲ−ペプチド下流をコード付けする配列を終結させることによりエンベロープ発現要素の新しい３′末端を作成する。簡単に述べると、上記の構造体ｐＨＣＭＶ−ＰＡを最初にＮａｔＩ（位置１０９７）を用いる消化により修飾し、平滑末端処理しそして連結反応させて同じ位置でのブルースクリプトＥａｇＩ部位を消す。修飾されたｐＨＣＭＶ−ＰＡをＥａｇＩ（位置６７１）およびＳｍａＩ（位置７１２）で消化しそして２つのフラグメント中で連結反応させることによりｐＣＭＶ  Ｅｎｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓを次に構成する。第一のものは４０７０Ａ（位置１−１４５５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）からのＥａｇＩ−ＮｃｏＩフラグメントである。第二はＶＩＬＶ−Ｋエンベロープフラグメント、ＮｃｏＩ−ＰｖｕII（位置７２２７−７７４７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）である。三方向連結反応から生じた構造体はＨＣＭＶプロモーター、それに続く４０７０Ａエンベロープの配列をコード付けするＳＵ（ＧＰ７０）、ＭｏＭＬＶのＴＭ（ｐ１５ｅ）コード付け配列、およびＲ−ペプチドの８個の基をコード付けする配列を含有する。さらに、このエンベロープ発現カセット（ｐＣＭＶ  Ｅｎｖ  ａｍ＝Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ）（図１８）は実施例１に記載されている無交差レトロベクターバックボーンと配列を共有していない。
Ｃ．エンベロープ発現要素
以上からの部分ＡおよびＢを組み合わせてＣＭＶプロモーター、４０７０Ａ  ＳＵ、ＭｏＭＬＶ  ＴＭおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをブルースクリプトＳＫ−プラスミドベクター中に含有するアンフォトロピー性発現要素を完成させる。この構造体はｐＣＭＶｅｎｖ−Ｘ（図１５）と称される。簡単に述べると、新しいＥａｇＩ制限部位を有する部分Ａに記載されている構造体をＥａｇＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして５７１ｂｐフラグメントを分離する。ｐＣＭＶ  Ｅｎｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ（部分Ｂから）をＫｐｎＩおよびＥａｇＩで消化しそして６９５ｂｐフラグメントを貯蔵する。ｐＣＭＶＥｎｖａｍ−Ｅａｇ−Ｘ−ｌｅｓｓ（部分Ｂから）をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化しそして４６４９ｂｐフラグメントを貯蔵する。これらの２つのフラグメントを部分ＡのＰＣＲ構造体から消化された５７１ｂｐＥａｇＩ〜ＸｈｏＩと一緒に連結反応させる。ｐＣＭＶｅｎｖ−Ｘは配列をクロスレスレトロベクターバックボーンと共有せず、またはｇａｇ−ｐｏｌ発現要素ｐＣＭＶｇｐ−Ｘを共有しない。
実施例５
ＧＡＧ−ＰＯＬおよびＥＮＶ発現カセットに関する機能試験
ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ発現カセットが生物学的に活性であることを確認するために迅速試験を開発した。これらの試験用の物質は一時的発現用に使用される細胞株（典型的には２９３個の細胞、ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １５７３）、感染に敏感な目標細胞株（典型的にはＨＴ１０８０細胞、ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ  １２１）およびｐＲｇＮｅｏ（図１６）またはｐＬＡＲＮＬ（Emi et al., J. Virol 65:1202-1207, 1991）からなる。二種の後期プラスミドはＧ４１８抵抗を克服する救済可能なベクターを発現させ、そしてＲｇｐＮｅｏの場合にはｇａｇ−ｐｏｌを、またはｐＬＡＲＮＬの場合にはｅｎｖも発現させる。便宜上、ＲｇｐＮｅｏ（図１６）の構成を以下に示す。
ｐＣＭＶｇｐ−Ｘの如き発現カセットをｇａｇ／ｐｏｌの機能に関して試験するために、プラスミドをｐＬＡＲＮＬと共に１：１比で２９３個の細胞中に導入する。１２時間後に、培地を正常成長培地と交換する。さらに２４時間後に、上澄み流体を２９３個の細胞から除去し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そしてＨＴ１０８０目標細胞の上に置く。この処理から２４時間後に、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する成長培地と交換する。Ｇ４１８耐性コロニーに１週間後に目盛りを付ける。コロニーの正の出現は全ての要素が元の共導入において機能的であり且つ活性であることを示す。
便宜上、ＲｇｐＮｅｏ（図１６）の構成を以下に示す：位置１＝５′ＬＴＲの左端部、位置１−６３２０＝５′ＬＴＲからＳｃａ１制限部位までのＭｏＭＬＶ配列、位置６３２１−６６７５＝ＳＶ４０早期プロモーター、位置６６７６−８００１＝Ｔｎ５（原核生物プロモーターを含む）からのＮｅｏ耐性遺伝子、および位置８００２−８６０６＝複製のｐＢＲ源。
実施例６
パッケージング細胞株およびプロデューサー細胞株の発育
この実施例は、複製競合ウイルスの生成を妨げる上記のレトロウイルスベクター構造体、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットおよびｅｎｖ発現カセットを利用するパッケージングおよびプロデューサー細胞株の製造を記載する。
簡単に述べると、アンフォトロピー性のＭｏＭＬＶを基にしたレトロウイルスベクター構造体用に、ネズミの白血病ウイルスと同種である配列を欠く親細胞株、例えばイヌの細胞株Ｄ１７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １８３）を選択する。ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを次に細胞中に、例えばＤＨＦＲ（Simonsen et al., FNAS 80:2495-2499, 1983）と一緒に加える。耐性コロニーを次に選択し、そして６個のウェル板の中で合流するまで膨張させ、そしてウェスタン・ブロットによりｇａｇ／ｐｏｌの発現に関して検定する。クローンはまたｐＬＡＲＮＩを用いる導入後の高力価ベクター粒子の製造に関してふるい分けされる。
次に最高力価クローンをｅｎｖ発現カセットおよび例えばヒグロシシン（Gritz and Davies, Gene 25:179-188, 1983参照）の如き選択可能なマーカープラスミドを用いて電気穿孔法にかける。耐性コロニーを選択し、６個のウェル板の中で合流するまで膨張させ、そしてウェスタン・ブロットによりｅｎｖの発現に関して検定する。クローンはまたレトロウイルスベクター構造体を用いる導入後に高力価ベクター粒子の製造に関してふるい分けされる。
生じたパッケージング細胞株を液体窒素中に１瓶当たり１０×１０6個の細胞の割合で、１０％の照射された胎牛血清、および８％のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ中に貯蔵する。殺菌性、およびヘルパーウイルス生成のないことを確認するために、別の試験を行ってもよい。好適には、Ｓ＋Ｌ−検定およびＭｕｓ  ｄｍｍｉマーカー救済検定の両者を行うべきである。
プロデューサー細胞株を構成するために、以上の実施例１に記載されているレトロウイルスベクター構造体を上記の方法を使用して製造されたキセノトロピー性パッケージング細胞株中で電気穿孔法にかける。２４−４８時間後に、上澄み流体をキセノトロピー性のパッケージング細胞株から除去し、そして第二のパッケージング細胞株を導入するために利用し、それにより最終的なプロデューサー細胞株を作成する。
実施例７
ヘルパー検出検定、共培養およびマーカー救済
この実施例は複製競合レトロウイルス（ＲＣＲ）の検出用の敏感な検定を記載する。簡単に述べると、５×１０5個のベクター−生成細胞を同数のＮｕｓ  ｄｙｎｎｉ細胞（Lander and Chattopadhyay, J. Virol. 52:695, 1984）と共に培養する。Ｍｕｓ  ｄｍｍｉ細胞はほとんど全てのネズミの白血病関連ウイルスに敏感性であり且つ既知の内因性ウイルスを含有するため、これらがヘルパーウイルス検出用に特に好ましい。最初の培養から３日、６日、および９日後に、５×１０5個の新しいＭｕｓ  ｄｍｍｉ細胞を加える。ベクター生成細胞を用いるＭｕｓ  ｄｍｍｉ細胞の最初の培養から１５日後に、上澄み流体を培養物から除去し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そしてマーカー救済検定にかける。
簡単に述べると、培養流体をＭｄＨテスター細胞株（ｐＬＨＬ（ヒグロマイシン耐性マーカーレトロウイルスベクター、Palmer et al., PNAS 84（4）:1055-1059, 1987参照）から除去しそして試験しようとする培養流体と交換する。ポリブレンを４μｇ／ｍｌの最終的濃度となるまで加える。２日目に、培地を除去しそして１０％のウシ血清を含有する２ｍｌの新しいＤＭＥＭと交換する。３日目に、上澄み流体を除去し、濾過し、そしてＨＴ１０８０細胞に移す。ポリブレンを４μｇ／ｍｌの最終的濃度となるまで加える。４日目に、ＨＴ１０８０細胞中の培地を１０％のウシ血清および１００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンを含有する新しいＤＭＥＭと交換する。選択を５〜２０日目まで続けるとヒグロマイシン耐性コロニーを目盛り付けできるようにり、そして全ての負の対照物（例えば模擬感染ＭｄＨ細胞）は死滅する。
実施例８
ゆらぐＲＮＡ配列のカプシド化用の検定
この実施例はゆらぎまたは正常ｇａｇ配列を含有する構造体からＲＮＡのカプシド化の検出用の敏感な検定法を記載する。簡単に述べると、ＣＭＶプロモーターおよびＹｈｏＩ部位（ＭｏＭＬＶ位置１５６１）までのｇａｇ配列を含有する「ゆらぎ」ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット（実施例３）のフラグメントをＮ２（Armentano et al., supra）またはＫＴ−３（ＷＯ９１／０２８０５もしくはＷＯ９２／０５２６６参照）からのＳＶ４０ｎｅｏ−３′ＬＴＲＤＮＡフラグメントに連結反応させる。この構造体は図１９Ａに図式的に説明されており、そしてそれが５′ＬＴＲおよびプライマー結合部位を欠くため例えばＤＡまたはＨＸ（ＷＯ９２／０５２６６参照）の如きパッケージング細胞株がカプシド化されると予期された。
ゆらぎ配列を正常なｇａｇ配列により置換したこと以外は第一のものと同様にして第二の構造体も製造する。第一の構造体と同様にして、このＤＮＡから転写されたＲＮＡはカプシド化することが予期されない。この構造体は図１９Ｂに図式的に説明されている。
上記の構造体は別個にパッケージング細胞株中に導入される。培地を次に導入可能なＧ４１８−耐性レトロベクターを発生させる能力に関して検定する。いずれの構造体も導入可能なベクターを生じない。
上記の構造体を含有する細胞培養物をレトロベクターＬＨＬ（実施例７参照）を用いて導入させる。選択後に、細胞培養物は目標細胞に対して耐性であるヒドロマイシンを克服するレトロベクターを生成する。さらに、共カプシド化がＬＨＬ  ＲＮＡと上記の構造体からの転写体との間の相互作用により可能になるなら、満足のいく相当なＲＴ−介在性組み換えを行うことができ、目標細胞に対するＧ４１８耐性の移入を生ずる。
本発明の個々の態様を説明目的のために記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り前記の事項から種々の変更を行うことができる。従って、本発明は添付されている請求の範囲以外のものにより制限されるものではない。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Respess, James
（ii）発明の名称：Crossless Retroviral Vectors
（iii）配列の数：26
（iv）連絡先：
（Ａ）あて先：Seed & Berry
（Ｂ）通り：6300 Columbia Center；701 Fifth Avenue
（Ｃ）市：Seattle
（Ｄ）州：Washington
（Ｅ）国：USA
（Ｆ）郵便番号：98104
（ｖ）コンピューター読取形式：
（Ａ）媒体タイプ：Floppy disk
（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible
（Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
（vi）現出願データー：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人／代理店情報：
（Ａ）名称：McMasters, David D.
（Ｂ）登録番号：33,963
（Ｃ）参照／事件番号：930049.424C1
（ix）通信情報：
（Ａ）電話番号：（206）622-4900
（Ｂ）ファックス番号：（206）682-6031
（２）SEQ ID NO：１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：8332塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：
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（２）SEQ ID NO：２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：36塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
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（２）SEQ ID NO：３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：38塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
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（２）SEQ ID NO：４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖
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（２）SEQ ID NO：５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）SEQ ID NO：６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）SEQ ID NO：７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）SEQ ID NO：８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
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（ｉ）配列の特徴：
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（ｉ）配列の特徴：
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（Ａ）名称／キー：CDS
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（２）SEQ ID NO：12についての情報：
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（２）SEQ ID NO：14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）SEQ ID NO：15についての情報：
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（２）SEQ ID NO：16についての情報：
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（２）SEQ ID NO：17についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：17：
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（２）SEQ ID NO：18についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：52塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：18：
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（２）SEQ ID NO：19についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：71塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：19：
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（２）SEQ ID NO：20についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：52塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：20：
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（２）SEQ ID NO：21についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：72塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：21：
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（２）SEQ ID NO：22についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：52塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：22：
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（２）SEQ ID NO：23についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：72塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：23：
0004303315.tif 000031
（２）SEQ ID NO：24についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：52塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：24：
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（２）SEQ ID NO：25についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：19塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：25：
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（２）SEQ ID NO：26についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：26：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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