(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルスにおいて、上記シンドビスウイルスがトランスメンブレンドメインでウイルス糖タンパク質Ｅ２のアミノ酸配列の位置３９１でリシンを欠失しているトランスメンブレンタンパク質をコードし、上記リシンの欠失がトランスメンブレンタンパク質を供給し、このトランスメンブレンタンパク質は、上記シンドビスウイルスが昆虫細胞内部で複製すると上記膜エンベロープを貫く（span）ことができるが、上記シンドビスウイルスが哺乳動物細胞内部で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができない、遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルス。
【請求項２】
昆虫細胞が、蚊の細胞である請求項１記載の遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルス。
【請求項３】
蚊細胞が、アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）細胞である請求項２記載の遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルス。
【請求項４】
膜エンベロープを有するシンドビスウイルスのトランスメンブレンタンパク質のトランスメンブレンドメイン内でウイルス糖タンパク質Ｅ２のアミノ酸配列の位置３９１でリシンの欠失を工学的に起こさせて、工学処理されたシンドビスウイルスをつくりだし、上記トランスメンブレンタンパク質が、上記工学処理されたシンドビスウイルスが昆虫細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫く(span)ことができるが、上記工学処理されたシンドビスウイルスが哺乳動物細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができず、そして上記工学処理されたシンドビスウイルスが昆虫細胞内で複製を続けることができるようにするステップと、
上記工学処理されたシンドビスウイルスを昆虫細胞内に導入するステップと、そして
上記工学処理されたシンドビスウイルスを上記昆虫細胞内で複製させるステップ
を含む遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルスから遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するシンドビスウイルスを製造する方法。
【請求項５】
昆虫細胞が、蚊の細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
蚊細胞が、アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）細胞である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は一般的にはウイルス学及び疾病抑制に関している。具体的には本発明は突然変異した節足動物媒介ウイルスとそれらのワクチンとしての利用に関している。
【０００２】
節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）は自然界で吸血昆虫によって伝達されるウイルス性媒介物である。これらのウイルスの多くはウイルス粒子の保護膜を構成する会合した膜内在性タンパク質を有する膜二重層を有している（トガウイルス）（Schlesinger，S．及びM．J．Schlesinger，1990）。
【０００３】
節足動物媒介ウイルスは統計的に見ると、世界中でヒト及び動物における昆虫媒介疾病及び死亡要因としてはマラリアについで第２位である（Berge A．O．1975）。これらのウイルス性媒介物にはイースタン、ウエスタン及びベネズエラウマ脳炎ウイルス、デング熱、日本脳炎、サン・アンジェロ熱、及び黄熱病などがある。さらに、これらの媒介物によって引き起こされる疾病は蚊媒介体アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）が入ってきた結果として（Sprenger及びWuithiranyagool，1985）、北米では再び広まる勢いにある（ＮＩＡＩＤ Report of the Task Force on Microbiology and Infectious Diseases 1992、ＮＩＨ Publication No.92−3320）。
【０００４】
自身の性質から、アルボウイルスは無脊椎昆虫及び哺乳動物ホストの両方の組織内で複製できなければならない（Brown，D．T.，及びL．Condreay，1986、Bowersら、1995）。これら２つのホスト細胞システムの遺伝子的及び生化学的環境における違いは一方の宿主では複製できるが他方では複製できない（宿主域変異）ウイルスを生産するための根拠を提供してくれる。
【０００５】
現在、デング熱及び西部ウマ脳炎、そしてその他の昆虫が運ぶウイルスは米国では再び広がる勢いを見せている。米国陸軍及びその他の政府機関は1960年代以降これらのウイルスに対するワクチン開発を行ってきているが、ほとんど成功は収めていない。従って、先行技術はほとんどの節足動物媒介ウイルス及びその他の膜被覆ウイルスに対するワクチンにおいて不足している。本発明はこの技術分野におけるこうした長年のニーズと要望を果たすものである。
【０００６】
本発明のひとつの目的は、遺伝子工学処理された、膜エンベロープを有するウイルスにおいて、その１つまたは複数のアミノ酸欠失を有していて上記工学処理されたウイルスが昆虫細胞内で複製する場合はウイルスの膜を貫くことができ、哺乳動物細胞内で自己増殖する場合はそのウイルスの膜を貫くことができないようなトランスメンブレンタンパク質をコードする遺伝子工学的に処理された、膜エンベロープを有するウイルスを提供することである。本発明の１つの実施の形態は上記の遺伝子工学処理された、膜エンベロープを有するウイルスとして節足動物媒介ウイルスを提供する。さらに好ましい実施の形態では、上記節足動物媒介ウイルスはトガウイルス、フラビウイルス、及びブニヤウイルス並びに哺乳動物細胞と昆虫細胞の両方で自然に複製できるすべての他のエンベロープを有するウイルス、さらにはウイルスか細胞の遺伝子工学処理よって哺乳動物及び昆虫細胞内で複製できるようにすることができるエンベロープを有するウイルスで構成される群から選択することができる。
【０００７】
本発明の他の実施の形態においては、工学処理されたウイルスをつくりだすためにウイルストランスメンブレンタンパク質内でアミノ酸欠失を発生させ、トランスメンブレンタンパク質が上記工学処理されたウイルスが昆虫細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができるが、そのウイルスが哺乳動物細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができず、そして上記ウイルスが昆虫細胞内で複製し続けることができようにするステップと、上記突然変異ウイルスを昆虫細胞内に導入するステップと、そして上記突然変異ウイルスを上記昆虫細胞内で複製させてウイルスワクチンをつくりだすステップで構成された哺乳動物ワクチン接種用に遺伝子工学処理された、膜結合ウイルスからのウイルスワクチンをつくりだす方法が提供される。
【０００８】
本発明の別の実施の形態においては、本発明によるウイルスワクチンを哺乳動物細胞に導入して免疫監視のための細胞及び組織の非増殖的感染を引き起こすステップで構成された個体のワクチン接種のための方法が提供される。
【０００９】
最後に、本発明は工学処理されたウイルスをつくりだすためにウイルストランスメンブレンタンパク質内でアミノ酸を遺伝子工学処理して、そのトランスメンブレンタンパク質が上記工学処理されたウイルスが昆虫細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができるが、そのウイルスが哺乳動物細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができず、そして上記ウイルスが昆虫細胞内で複製し続けることができるステップと、上記突然変異ウイルスを野生蚊群に導入するステップと、そして、突然変異ウイルスに上記野生蚊群内で複製させて、その蚊が噛んだ時に上記ウイルスを哺乳動物に伝達するように、上記ウイルスのワクチン株を有しているが、野生種（病原性の）ウイルスを排除する蚊の群をつくりだすようにさせるステップで構成される蚊の群によってひろがる疾病に対するウイルスワクチンをつくりだすための方法を提供するという課題も有している。
【００１０】
本発明のその他の、そしてさらなる特徴は以下の現段階での本発明の好ましい実施の形態に関する説明から明らかになるであろう。これらの実施の形態は開示の目的で提供されるものである。
【００１１】
本発明の範囲と精神を逸脱せずにここに開示されている本発明に対して種々の置き換えや修正が可能であることは当業者であれば容易に分かるであろう。
【００１２】
ここで用いられている『膜結合ウイルス』とはその保護的な外層膜の一部として脂質膜二重層を含んでいるウイルスのことである。
【００１３】
ここで用いられている『ウイルスエンベロープ』とは膜を有するウイルスの脂質膜成分及びそこに会合するタンパク質を意味している。
【００１４】
ここで用いられている『節足動物媒介ウイルス』あるいは『アルボウイルス』とは節足動物（昆虫）あるいは哺乳動物細胞内で複製及び子孫ウイルスを生産するウイルス性作用物を意味している。これにはトガウイルス、フラビウイルス、及びブニヤウイルスなどが含まれる。
【００１５】
ここで用いられている『トガウイルス』とはアルファウイルスを含む膜含有ウイルスの一般的分類を意味している。
【００１６】
ここで用いられている『膜二重層』という用語は向き合った両親媒性リン酸脂質で構成される構造である。この二重はその断面が極性頭部基から非極性炭素鎖、非極性炭素鎖、極性頭部基に変化する構造となっている。
【００１７】
ここで用いられている『糖タンパク質トランスメンブレンドメイン』という用語は上記膜二重層を貫く膜会合タンパク質の領域のアミノ酸配列を意味している。
【００１８】
ここで用いられている『ウイルスワクチン』という用語はウイルスの抗原性は有しているが病気を発生させることはできないウイルス、あるいは突然変異ウイルスを意味している。
【００１９】
ここで用いられている『免疫監視』という用語は、血液リンパ球が哺乳動物の細胞及び組織を監視して外来（ウイルス）タンパク質の存在を判定し、その外来タンパク質をつくりだす細胞に向かわせて破壊することができるリンパ球の生産を促進するプロセスを意味している。このプロセスは外来タンパク質に対する循環抗体の産出にもつながる。
【００２０】
ここで用いられている『感染性ウイルス粒子』はそれらが子孫ウイルスをつくり出すことができるかどうかには関係なく、細胞に入り込んでウイルスタンパク質をつくりだすことができるウイルスを意味している。
【００２１】
ここで用いられている『非感染性ウイルス粒子』とは細胞に感染したりその内部に入り込むことができないウイルスを意味している。
【００２２】
ここで用いられている『脊椎動物細胞』とはいずれかの哺乳動物細胞を意味している。
【００２３】
ここで用いられている『無脊椎動物細胞』とはいずれかの昆虫細胞を意味している。
【００２４】
本発明は遺伝子工学処理された膜エンベロープを有するウイルスに関するものであり、上記ウイルスはトランスメンブレンタンパク質をコードし、そのトランスメンブレンタンパク質はその内部に１つか複数のアミノ酸の欠失を有しており、その遺伝子工学処理されたウイルスが昆虫細胞内部で複製するとウイルスの膜を貫くことができるが、哺乳動物細胞内で複製するとそのウイルス膜を貫くことができないようになっている。本発明のこの目的のひとつの実施の形態はトガウイルス、フラビウイルス、及びブニヤウイルス、及び哺乳動物細胞と昆虫細胞の両方で自然に複製することができる他のすべてのエンベロープを持つウイルス、そして、ウイルス又は細胞のいずれかを遺伝子工学処理することで哺乳動物及び昆虫細胞で複製できるようにするエンベロープを有する被覆ウイルスで構成される群から選択される節足動物媒介ウイルスを提供する。
【００２５】
本発明は又、工学処理されたウイルスをつくりだすためにウイルストランスメンブレンタンパク質内でアミノ酸欠失を発生させ、そのトランスメンブレンタンパク質が上記工学的処理されたウイルスが昆虫細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができるが、そのウイルスが哺乳動物細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができず、そして上記ウイルスが昆虫細胞内で複製し続けることができようにするステップと、上記突然変異したウイルスを昆虫細胞内に導入してワクチンとして機能することができる突然変異ウイルスの生産をもたらす哺乳動物ワクチン接種用に遺伝子工学処理された、膜結合ウイルスからウイルスワクチンをつくりだす方法にも関連している。
【００２６】
さらに、本発明は本発明による上記ウイルスワクチンを個体の細胞に導入するステップと、そしてそのウイルスにその個体内部で免疫監視用のウイルスタンパク質をつくりださせるステップで構成された個体のワクチン接種のための方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は工学処理されたウイルスをつくりだすためにウイルストランスメンブレンタンパク質内でアミノ酸を遺伝子工学的処理して、そのトランスメンブレンタンパク質が上記工学処理されたウイルスが昆虫細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができるが、そのウイルスが哺乳動物細胞内で複製すると上記膜エンベロープを貫くことができず、そして上記ウイルスが昆虫細胞内で複製し続けることができるステップと、上記突然変異ウイルスを野生蚊群に導入するステップと、そして、突然変異ウイルスに上記野生蚊群内で複製させて、その蚊が噛んだ時にワクチンを哺乳動物に伝達するように、上記ウイルスのワクチン株を有しているが、野生種（病原性の）ウイルスを排除する蚊の群をつくりだすようにさせるステップで構成される蚊の群によってひろがる疾病に対するウイルスワクチンをつくりだすための方法を提供する。
【００２８】
本発明によれば、先行技術の範囲内での従来のタイプの分子生物学、微生物学、そして遺伝子組み替え技術を用いることができる。こうした技術については例えばManiatis，Fritsch ＆ Sambrook，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual（1982），“ＤＮＡ Cloning：A Practical Approach，”VolumesＩ及びII（D．N．Glover編1985）；“Oligonuclcotide Synthesis”（M．J．Gait編1984）；“Nucleic Acid Hybridization”（B．D．Hames及びS．J．Higgins編（1985））；“Transcription and Translation”（B．D．Hames ＆ S．J．Higgins eds.（1984））；“Animal Cell Culture”（R．I．Freshney編（1986））；“Immobilized Cells And Enzymes”（IRL Press，（1986））；B．Perbal，“A Practical Guide To Molecular Cloning”（1984）などに詳細に紹介されている。
【００２９】
従って、ここにおいて記載された場合、以下の用語の定義は以下の通りである。
【００３０】
『ベクター』とはプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなど、取り付けられた部分の複製を引き起こすように別のＤＮＡ部分を取り付けることができるレプリコンである。被投与動物がその投与に耐えられる場合は、そのベクターは『薬学的に受容可能』とされる。投与された量が生物学的に有意である場合、そうした薬剤は『治療上有効な量』と言われる。その存在が被投与哺乳動物の生理に変化をもたらす場合、その薬剤は生理学的に有意であるとされる。例えば、ウイルス感染の処置において、その感染の程度、あるいはその感染による生理学的被害を減少させる化合物は治療上有効であるとされる。
【００３１】
『ＤＮＡ分子』とは単鎖あるいは二重鎖らせん形状の、ポリマー形状のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）を指している。この用語はこの分子の一次及び二次構造だけを指し、いずれの具体的な三次形態にも限定されない。従って、この用語は特に線形ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体で見出される二重鎖ＤＮＡを含む。以下の説明では、構造はＤＮＡの非転写ストランドに沿った５′−３′方向の配列だけを示す従来の方法に従って示す。
【００３２】
ＤＮＡ『コードディング配列』とは、適切な規制配列の制御下に置かれるとインビボでポリペプチド内に転写及び翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。このコード表現配列の境界は５′（アミノ酸）末端の開始コドンと３′（カルボキシル）末端の停止コドンによって決められる。コードディング配列は真核性ｍＲＮＡ、真核性（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノム性ＤＮＡ配列、あるいは合成ＤＮＡ配列には限定されない。ポリアデニル化信号及び転写停止配列は通常コード表現配列に対して３′に配置される。
【００３３】
転写及び翻訳制御配列はホスト細胞でのコードディング配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニール化信号などのＤＮＡ規制配列である。
【００３４】
『プロモーター配列』とは細胞内でのＲＮＡポリメラーゼを結合させたり、下流（３′方向）の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明について明確に定義する目的で、プロモーター配列はその３′端末で転写開始サイトによって結合され、上流（５′方向）に延びて背景と比較して検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基及び元素を取り込む。プロモータ配列内に転写開始サイト（通常はヌクレアーゼＳＩによるマッピングによって示される）と、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域（コンセンサス配列）が見出されるであろう。真核性プロモーターは、常にではないが、しばしば“ＴＡＴＡ”ボックスと“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる。ベクターを動かすためには種々のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
ここで用いられている『オリゴヌクレオチド』あるいは『プローブ』という用語はリボ核酸又はデオキシリボ核酸によって構成される分子を意味している。オリゴヌクレオチドあるいはプローブの正確なサイズは、最終的な機能とそのオリゴヌクレオチドの使用目的に依存するところの多くの要因に依存している。プローブの長さは重要ではないが、通常は約12の塩基、より多くの場合は少なくとも16の塩基で構成されており、そのプローブは基本的にはその微生物ゲノムの一部と基本的に相補性をなしているが、そのプローブがそのゲノムと完全な相補性を持っていなければならないとは限らない。プローブは適切な合成技術で合成することができ、ほとんどの場合転出可能なラベルを含んでいる。通常、合成配列は一般的な公的に利用できるクローニングベクター、そして適切なホスト内でそのプローブを大量に入手するために拡張される。拡張されるベクターはそれ自体をプローブとして用いるためにラベルしても差し支えないし、あるいは相補的なストランドを含むより短いフラグメントを切り出してラベルしてもよい。診断用テストのためのヌクレオチドプローブの調製と利用については上に述べた参考文献や、Falkowらに対する米国特許No.4,358,535に述べられている。
【００３６】
ここで用いられる『プライマー』という用語は精製制限消化におけるように自然に発生したり、あるいは合成的につくりだされるかには関係なく、核酸ストランドに相補的なプライマー拡張生成物が誘発される条件、例えば、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在と適切な温度及びpHの下に置かれた場合に合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指している。このプライマーは単鎖でも二重鎖でもよく、誘発剤の存在下で望ましい拡張生成物の合成が開始されるのに十分な長さでなければならない。このプライマーの正確な長さは温度やそのプライマーの供給源及びその使用方法などを含む種々の要因に依存している。例えば、診断的な応用目的のためには、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドは通常15〜25あるいはそれ以上の数のヌクレオチドを含んでいるが、それより少ないヌクレオチドの数でも差し支えない。
【００３７】
プライマーはここでは特定の標的ＤＮＡ配列の異なったストランドに対して『物質的に』相補的であるように選択される。このことは、そのプライマーがそれらと対応するストランドとハイブリダイズするのに十分な程度に相補的でなければならないことを意味している。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプライマーの５′末端に取り付けて、そのプライマー配列の残りの部分がそのストランドに相補的であるようにしてもよい。また、プライマーが配列との十分な相補性を有しているか、あるいはそれとハイブリダイズして、それによって拡張生成物の合成のためのテンプレートを形成するものであれば、非相補的な塩基あるいはより長い配列をプライマーに切断してもよい。
【００３８】
ここで用いられている『制限エンドヌクレアーゼ』という用語はそのそれぞれが特定のヌクレオチド配列、あるいはその近くで二重鎖ＤＮＡを切断するバクテリア酵素を意味している。
【００３９】
そうしたＤＮＡが細胞内部に導入された場合に、細胞が外来性あるいは異種ＤＮＡによって『トランスフェクト』されたとされる。トランスフェクトされたＤＮＡはその細胞のゲノムに一体化（共有結合）される場合もあれば、されない場合もある。『クローン』はひとつの細胞あるいは共通の祖先から有糸分裂によって誘導される細胞の群である。『細胞株』とは多くの世代にわたって安定して成長できる一次細胞のクローンである。
【００４０】
ＤＮＡ構成物の『異種』領域とは、自然の中のより大きな分子と結合した状態では見出されないより大きなＤＮＡ分子内部のＤＮＡの確認可能なセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードすると、遺伝子は通常は供給源生物のゲノム内で哺乳動物のゲノム性ＤＮＡをフランクしていないＤＮＡによってフランクされる。別の例では、コーディング配列とはそのコーディング配列自体が自然では見出されない構成物（例えば、ゲノムコード表現配列がイントロンを含んでいるｃＤＮＡ、あるいは天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列）である構成物である。
【００４１】
本発明による新規の突然変異ウイルスを用いて医薬品組成物をつくることが意図される。そうしたひとつの例で、医薬品組成物は本発明による新規のウイルスと薬学的に受け入れ可能な基質とから構成される。この分野の当業者であれば、過重な実験を行わなくても、このウイルスワクチン化合物の投与量及び投与経路を判定することはできるであろう。インビボで治療に用いる場合、本発明によるワクチンは患者、あるいは動物に対して治療上有効な量、つまり、措置を受ける個人をその特定のウイルスと関連した疾病から免疫化してくれる量で投与される。通常は経口的に投与されるが、好ましくは静脈注射によって投与され、しかし他の投与経路も適切に用いることができる。投与されたワクチンの量は通常は患者の体重あたり約103〜約106pfu/kgの範囲である。こうした処方は措置の否定的な効果とのバランスを図りながら、有効性を最大限化するまで継続される。Remington's Pharmaceutical Science、17版（1990）、Mark Publishing Co.，Easton，Penn.；及びGoodman and Gilman's：The Pharmacological Basis of Therapeutics  ８版（1990）、Pergamon Press参照。これらは引例として本明細書に組み入れられている。経口投与の場合、ワクチンは最も一般的には単位用量注射可能形状（溶液、懸濁液、乳剤）で薬学的に受け入れ可能な経口媒体と組み合わせて製剤される。こうした媒体とは好ましくは非毒性で、治療的には効果のないものである。こうした媒体の例としては水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、そして５％ヒト血清アルブミンである。
【００４２】
本発明のワクチンは膜エンベロープを有するウイルスのタンパク質のトランスメンブレンドメインの欠失突然変異に基づいている。これら突然変異を発生させる方針は以下の情報に基づいている。哺乳動物の細胞膜の場合とは違って、昆虫細胞の膜はコレステロールを含んでいない（Clayton 1964，Mitsuhashiら、1983）。膜内部にコレステロールが存在していると、通常はその膜がより厚めになり、膜の厚さの増大はコレステロール増大につながる（Bretscher，1993）。多くの膜エンベロープを有するウイルスはそれらの表面に膜糖タンパク質を有しており、これらは標的細胞の特定と感染に関与している（Schlesinger，S及びM．J．Schlesinger，1990）。これらの膜糖タンパク質はタンパク質を膜二重層に固定させる疎水性の膜スパンニングドメインを有している（Riceら、1982）。
【００４３】
これらのトランスメンブレンタンパク質の膜スパンニングドメインはそのタンパク質を膜に保持、あるいは固定させるためにその二重層の一方の端から他方の端に届くのに十分な長さを持っていなければならない。実験では、これらの領域がその領域内のアミノ酸の欠失で短くなった場合、タンパク質は膜と適切に結合せず、落ちてしまうことが示されている（Adams及びRose，1985）。
【００４４】
昆虫はその細胞膜内にコレステロールを持っていないので、昆虫で発生したウイルス膜はその断面が哺乳動物由来のウイルス膜より薄くなる。昆虫の膜の方が薄いので、昆虫の細胞膜に一体化されたタンパク質の膜状に広がった領域は哺乳動物の細胞膜に一体化したものほど長くなくてもよい。従って、工学的処理された遺伝子でウイルス糖タンパク質の膜スパンニング領域からアミノ酸を取り除いた欠失をつくり出すことは可能である。このことは昆虫細胞内で複製されたウイルスの膜には正常に組み込まれることができるが、哺乳動物の細胞内で複製するウイルスには組み込まれない糖タンパク質をもたらす。このようにして、突然変異されたウイルスは親の野生種のウイルスと同様、昆虫細胞内部でもつくりだされ、複製する。一方、哺乳動物においてはこの突然変異体ウイルスはウイルス性タンパク質をつくりだすホストに感染することはできるが、突然変異ウイルスの糖タンパク質が広がらず、哺乳動物の細胞膜に固定されないので、子孫ウイルスは哺乳動物の細胞ではつくり出すことができない。本発明の方式のさらなる利点は、その突然変異体が欠失突然変異体として発生されるので、従って、野生型表現型に戻るというウイルスワクチンによくある問題は決して起きない。
【００４５】
本発明によって構想されるワクチンは脊椎動物及び無脊椎動物細胞内で成長するすべての膜エンベロープを有するウイルスに対して作用する。実際、本発明は昆虫細胞内で成長するように工学的処理することもできる膜エンベロープを有するウイルスに適用することもできるし、遺伝子的に修飾した昆虫細胞内で成長する膜エンベロープを有するウイルスにも適用することができる。
【００４６】
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明するためのものであって、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００４７】
実施例１：Toto 1101の特定のサイトに向けた突然変異生成
先に記載された（Liuら、1996、Riceら、1987）アルファウイルスシンドビスの完全な長さのクローンを用いて、ウイルス糖タンパク質Ｅ２のアミノ酸配列の位置391でリシンをコードする３つの塩基をなくした欠失を構築した。このリシンはこのタンパク質の推定膜スパンニングドメイン（Riceら、1982）の一部である。
【００４８】
インビトロでそのクローンから感染性ＲＮＡを転写するのに用いることができる（Riceら、1987、Liu及びBrown，1993ａ）全長シンドビスｃＤＮＡ及びＳＰ６プロモータを含むプラスミドであるToto 1101内で欠失突然変異体（Lys391）を発生させるために、特定のサイトに向けた突然変異生成を用いた。先に記載されたＰＣＲ突然変異生成のメガプリンタ法（Sarkar及びSommer，1990）を用いて（Liu及びBrown，1993ａ）、Toto 1101のｃＤＮＡクローンからヌクレオチド（nts）9801，9802，9803の３つのヌクレオチドを取り除き、結果的にコドンＡＡＡ（Ｋ391）が除去された。
【００４９】
この配列の30塩基オリゴヌクレオチド、５′ＣＴＣＡＣＧＧＣＧＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＣＴＧＣ３′（配列番号：１）を突然変異生成プライマーとして用いた。このプライマーは『フォーワードプライマー』５′ＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ３′（配列番号：２；18mer）と共に518塩基『メガプリンター』（ヌクレオチド  9295〜9813）を発生させた。第２のＰＣＲ反応は0.5μgのメガプリンター、100μｇのToto 1101テンプレート、及び『リバースプライマー』５′ＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＧＣ３′（配列番号：３）によって構成されていた。すべてのＰＣＲ反応では95度で１分、64度で１分、72度で１分、そして72度で８分の最終培養で構成されるサイクルを30回行った。得られたＰＣＲ生成物（1149nts）をＢＣＬ  Ｉ及びＳＰＬで切断してから、Toto 1101の対応するサイトに挿入したところ、欠失突然変異体Ｋ391がつくりだされた。シーケナーゼTM（U．S．Biochemical，Cleveland，OH）を用いてサブクローンされた領域全体でジデキシヌクレオチドシーケシングによって欠失を確かめた後、ＳＰ６ポリメラーゼを用いて感染性ＲＮＡをインビトロで転写し、ＢＨＫ−21細胞内に導入（トランスフェクト）した。
【００５０】
実施例２：インビトロでの転写とＲＮＡトランスフェクション
シンドビス・ウイルスＫ391あるいは野生種ＲＮＡの全長ｃＤＮＡコピーを含むプラスミドＤＮＡをＸhoＩで線形化して、前に述べたように（Riceら、1987）ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写された。１μgのＸhoＩで線形化されたＫ391  ｃＤＮＡあるいは野生種シンドビス・ウイルスｃＤＮＡを20μl中に80mM  Hepes  pH7.5，12mMのＭｇＣｌ，10mM  ＤＴＴ及び２mMスペルミジンで構成される緩衝液と３mM  each  ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，1.5mM  ＧＴＰ及び4.5mM  ｍ7ＧpppＧ、20単位のＳＰ６  ＲＡＮポリメラーゼ及び20単位のＲＮaseインヒビターを含む100μgm  ＢＳＡ内で転写した。37℃で２時間培養を行った後、ＲＮＡ生成を１％アガロースゲル上に２μlのＲＮＡを泳動させて評価を行った。
【００５１】
ベイビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ21）細胞及びアエデス・アルボピクタス（蚊）細胞を突然変異体あるいは野生種クローンから誘導したＲＮＡでトランスフェクトさせた。蚊の細胞のトランスフェクションは20mM  Hepes  pH7.05，137mM  ＮａＣｌ，0.7mM  Ｎａ2ＨＰＯ4及び６mMでキストランで構成される電気穿孔緩衝液内で再懸濁させた５×106個の細胞を用いて行った。これらの細胞の最適電気穿孔パラメータは２Kv  25μF，Ｉ抵抗であることが分かった。トランスフェクトされた細胞を細胞変性効果が認められるまで（約24時間）、37℃の温度で培養した。
【００５２】
24時間培養した後、感染された細胞株とＲＮＡに感染されていない比較対象の群の両方から培地を回収した。各細胞株からの培地について蚊及びＢＨＫ−21細胞単層上でプラークアッセイ（Renz及びBrown，1976）で感染性ウイルスが存在しているかどうかについてテストした（表１）。
【００５３】
【表１】
0004318399.tif 000002
【００５４】
表１に示すように、突然変異体Ｋ391は昆虫の細胞内で自己増殖する場合だけ感染性ウイルス粒子をつくりだす。このウイルスは、次に蚊の細胞の中だけでプラークをつくりだした。Ｋ391でトランスフェクトされたＢＨＫ細胞は、ＢＨＫとアエデス・アルボピクタスのいずれで調べても検出可能なウイルスはつくりださなかった。ＢＨＫの培養体をトランスフェクトされた蚊の細胞からつくりだしたウイルスで感染させた場合、検出可能なウイルスはつくりだされなかった。ＲＮＡコード表現野生種ウイルスは感染性のウイルスをつくりだし、このウイルスは次に両方の細胞株でプラークをつくりだした（表１）。
【００５５】
実施例３：ウイルスタンパク質の代謝的放射性標識
25cm2フラスコ内のＢＨＫ21細胞の半融合状態の単層を上に述べた方法で野生種あるいはＫ391突然変異体ＲＮＡによってトランスフェクトさせた。単層を１％ＦＣＳ，２mMグルタミン、及び５％ＴＰＢを含むメチオニンとシステインを含まない（ＭＥＭ−Ｅ）培養液（枯渇培養液）内で30分間枯渇させた。トランスフェクトさせてから16時間後に、50μCi/ml［35Ｓ］Met/Cysタンパク質ラベリング混合物を含む枯渇培養液で20分間パルスラベルした。ラベリング終了後この単層を75μg/mlシクロヘキサミドで洗浄した。この単層を通常の10倍のメチオニン及びシステインと75μg/mlシクロヘキサミドを含む培養液内で45分間培養した。
【００５６】
実施例４：免疫沈降及びポリアクリルアミドゲル電気泳動
放射性物質でラベルしたウイルスタンパク質を公知の方法（Knipfer及びBrown，1989）に従って抗血清で免疫沈降させた。［35Ｓ］Met/Cysでラベルした細胞を冷たいＰＢＣ内で二度洗浄して、細胞溶解緩衝液：0.5％  ＮＰ−40，0.02Ｍ  トリスＨＣｌ  pH7.4，0.05Ｍ  ＮａＣｌ，0.2mM  ＰＭＳＦ，0.2mM  ＴＰＣＫ、及び0.02mM  ＴＬＣＫ内で細胞溶解させた。遠心分離で核をペレット化してから、廃棄した。上澄液を細胞溶解緩衝液内に懸濁させた100μlのタンパク質Ａ／セファロースビーズ（Sigma社）で予め吸収させた。予備吸収された上澄液を200μlのウサギ抗ＳＶＨＲ血清又はＥ２テール単一特殊性ポリクローナル血清に結合させたタンパク質Ａ／セファロースビーズで処理して、４℃の温度で一昼夜攪拌した。この免疫沈降させたビーズ抗体タンパク質複合体を細胞溶解緩衝液で三度洗浄して、12％グリセロール、４％  ＳＤＳ，50mM  トリス  pH6.8，５％メルカプトエタノール、及び0.02％ブルムフェノールブルーで構成されるＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液内に溶かした。このサンプルを95℃で３分間加熱して、遠心分離によってサンプルからビーズを取り除いた。10.8％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいは16％トリシンゲル上で前に述べた方法に従って（Liu及びBrown，1993ａ，ｂ）ゲル電気泳動を行った。公開されている方法（Bonner及びLaskey，1974）に従ってフルオログラフィーを行い、乾燥させたゲルをKodak  ＸＡＲ−５フィルムに露出させた（図１参照）。
【００５７】
実施例５：透過型電子顕微鏡
トランスフェクトされた蚊の細胞からつくりだされたＫ391で感染された、あるいはＫ391  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−21細胞単層を望ましい時点でトリプシン処理によってフラスコから取り出して、低速遠心分離によって細胞をペレット化させた。細胞ペレットをＰＢＳ内で二度洗浄して、４％グルタラルアルデヒド内で４℃の温度で一昼夜かけて固定させた。その後これらの細胞を0.2Ｍカコジレイト緩衝液（pH7.2）で三度洗浄してから、２％オスミウムテトロキサイドを用いて室温で１時間さらに固定してから、カコジレイト緩衝液内で三度洗浄した。これらの細胞を0.5％酢酸ウランを用いて室温で１時間en bloc染色した。三度洗浄した後、細胞ペレットを１％アガロース内に入れて、段階的エタノール／酢酸シリーズを通じて脱水させた。最終的な埋め込みはMollenhauer（1964）のエポン−アラルダイト・エポキシ混合物＃１内で70℃の温度下で２日間行われた。Sorvall  ＭＴ5000マイクロトーム上で非常に薄い部分を切断して、150メッシュ銅グリッド上で回収した。断面を１％酢酸ウラン及び／又はクエン酸鉛で染色してから、Jeol 100ＣＸ透過型電子顕微鏡で撮影した（図２参照）。
【００５８】
Ｋ391ウイルスで感染させた、あるいはＫ391  ＲＮＡでトランスフェクトさせたＢＨＫ細胞はプラークアッセイで検出できるレベルのウイルスはつくりださなかったが、ＰＡＧＥによってそれらがすべてウイルス構造のタンパク質をつくりだすことが示された（図１）。さらに、電子顕微鏡で、それらが細胞内の（非感染性）ウイルスコアを集めることが示された（図２）。
【００５９】
実施例６：シンドビス欠失突然変異体Ｋ391及び他のトガウイルス内でつくられる同様の突然変異のための使用
Ｋ391は蚊の細胞内で複製するとシンドビスウイルス粒子をつくりだす。これらのタンパク質の露出された領域（ecto領域）はその配列が野生種である。これら野生種のタンパク質はウイルスが哺乳動物の細胞に入って、ウイルス性タンパク質をつくりさせるようにするが（図１）、新しいウイルスは図２の電子顕微鏡によって示されるように集められない。
【００６０】
Ｋ391はワクチン株である。それは培養された昆虫細胞内で非常に高い濃度でつくりだされる。しかしながら、これらのウイルスを哺乳動物ホストに注入すると、ウイルスが広がって哺乳動物ホストの細胞に感染し、これら感染された細胞は免疫監視のためのウイルスタンパク質をつくりだすが、膜領域の先端が切断されているので、感染は接種物によって最初に感染された細胞に限定される。ワクチン株は欠失突然変異の結果であるので、野生種病原性表現型への復帰は不可能である。
【００６１】
さらに、工学処理された欠失突然変異体を野生の蚊の群に導入してもよい。これらのウイルスは卵巣を介した伝達で雌の親から子孫に広がることが示されている（Leakey，1984）。これらの蚊が脊椎動物を噛むと、それらはワクチン株（例えば、Ｋ391）の免疫量（106個の感染性粒子）を供給する。Karpf及びBrown（1997）は１つのアルファウイルスを昆虫細胞に感染させると、それらの細胞が、他のより関係の薄いアルファウイルスによって感染されるのを不確定な期間（蚊の寿命は28日であるが、細胞培養内では２年間）防ぐことを示した。従って、ワクチン株の存在（例えば、シンドビス  Ｋ391）はこれらの昆虫による他の関連病原性ウイルスの蔓延を防いでくれる。
【００６２】
実施例７：追加的な欠失突然変異
シンドビスウイルス糖タンパク質Ｅ２の膜スパンニングドメインでの追加的な欠失突然変異を作成した。これらの欠失突然変異をつくりだす手順について以下に説明する。手順はウイルスシンドビスを含むモデルの膜について述べられているが、この手順は他のいずれのウイルス膜糖タンパク質にも適用できる。
【００６３】
シンドビスウイルスのエンベロープ糖タンパク質を６つの膜スパンニングドメインを有する多数貫通タンパク質としてエンドプラズマ細網の膜に一体化させた。従って、トランスメンブレンドメインの正しい一体化を防ぐ欠失突然変異をつくりだす可能性を有する標的個所が６つ存在する（図３参照）。これらの標的個所の一部はこの手順の場合他の個所と比較して不満足な結果を示す。ＴＭＤ＃１（図２）は信号認知粒子によって認識され、ＥＲの膜へのタンパク質合成を指令する信号配列である。この領域を切断すると、哺乳動物及び昆虫の両方の細胞での目標に向かう行動が乱される。ＴＭＤ＃３はカプシドタンパク質を識別し、それと結合するタンパク質配列Ｅ２を含んでいる。この相互作用は自然では非常に特殊なもので、その配列がトランスメンブレンドメインに存在していることを必要としていることが示されている（Liuら、1996；Lopezら、1994）。ＴＭＤ＃３は従ってＴＭＤ＃１と同様、機能性成分と構造性成分の両方を有している。この領域における有意な欠失が起きると、両方の細胞システムでの結合が起きなくなる。これによって膜統合に影響を及ぼす欠失をつくりだすための標的となる４つの膜横断領域が残される（図３、ＴＭＤ２，４，５，６）。
【００６４】
６ｋタンパク質は成熟したウイルスの成分であり、ウイルス集合体でのその機能は明らかではない。ポリタンパク質内においては、Ｅ１の正しい組み込みのためには、適切な統合とＥＲ膜内での６ｋの方向性が基本的な条件である。６ｋのトランスメンブレンドメイン（ＴＭＤ４及び５）は欠失突然変異のためには優れた標的であり、それは、これらの領域のひとつに組み込みすることができないと、ポリタンパク質が間違った構成で膜内に組み込まれるか、あるいはＥ１との組み込みの失敗を引き起こすからである。ＴＭＤ２と６はＥ２及びＥ１の膜スパンニングドメインであり、両方とも欠失突然変異には明白な標的である。このポリタンパク質内の複数の膜スパンニングドメインは、単一のトランスメンブレンドメインでの欠失突然変異が哺乳動物の細胞でのウイルス生産をまったく阻止しなければ、別の膜スパンニングドメインでの欠失はさらに突然変異を無視し得るレベルまで低下させてしまう可能性がある。
【００６５】
実施例８：Ｅ２疎水性膜アンカー（ＴＭＤ＃２）に対する変異原性プライマーの設計
Ｅ２（図３、ＴＭＤ２）のトランスメンブレンドメインに課せられる必要条件をテストするための手順を示す。この手順は他のいずれのシンドビス膜スパンニングドメインあるいは他のいずれのウイルス糖タンパク質に対しての膜スパンニングドメインに対して容易に複製することができる。疎水性シンドビスＰＥ２膜アンカーは26個のアミノ酸によって構成されている。他の膜上にひろがった領域においても共通に認められる傾向であるが、これらアルファウイルス間においてはアミノ酸相同性はほとんど保持されていないが、この疎水性領域の長さは高度に保たれている（Strauss及びStrauss，1994）。この領域の配列保存の欠如はそれがこの領域の疎水性によるものであり、組み込みに必要な配列ではないことを示唆している。
【００６６】
Ｅ２のトランスメンブレンドメインはＥ２配列のアミノ酸365から始まる。この疎水性領域はＶＹＴＩＬＡＶＡＳＡＴＶＡＭＭＩＧＶＴＶＡＶＬＣＡＣ（配列番号：４）によって構成されている。AdamsとRose（1985）は哺乳動物の細胞では適切な固着状態を達成するためにはＶＳＶ  Ｇ糖タンパク質のトランスメンブレンドメインにおいて最低でも14個のアミノ酸が必要であることを示した。従って、Ｅ２膜横断領域の１組のネストされた欠失をつくりだす変異原性プライマーが設計されている。16個のアミノ酸の欠失から始まって（この場合疎水性領域には10個のアミノ酸が残っている）、膜アンカーから最低１個、最大16個のアミノ酸欠失がつくりだされた（図４）。
【００６７】
欠失は独特なＢclＩ及びＳplＩサイトを含む欠失フラグメントを発生させるために、ＰＣＲメガプリンター突然変異を用いて構築した。こうして得られたすべての構築物を突然変異体プラスミドを発生させるために野生型シンドビスｃＤＮＡ構成物内部に取り付けた。ＸhoＩによる線形化とＳＰ６ポリメラーゼを用いての転写を行った後、転写物を（上に述べたような）電気穿孔によってＢＨＫあるいはアエデス・アルボピクタス内部にトランスフェクトさせた。これらのトランスフェクションからの感染性ウイルスの生産をＢＨＫ及びＣ710蚊細胞の両方で力価決定を行ってこれらの構成物のホスト範囲を判定した。表２は欠失した配列とその構成に用いられたプライマー配列を示している。
【００６８】
各構成物に対して同じプライマーを用いてＢclＩ−ＳplＩ領域全体を発生させた。フォーワードプライマーＥ１Ｂｃ12ｌはヌクレオチド9306〜9327からの配列で構成されており、５′−３′ＧＣＧＴＣＧＣＣＴＡＴＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣ（配列番号：５）である。リバースプライマーSplextは５′−３′ＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＧＣ（配列番号：６）の相補性配列であるヌクレオチド10420〜10444からの配列で構成されている。
【００６９】
昆虫細胞のトランスフェクションによってつくられたウイルスの突然変異体Ｅ２  ΔＫ391に関してＢＨＫとＣ７〜10蚊細胞内でプラークをつくりだす能力を持っているかどうか調べた。ＢＨＫ細胞内ではプラークをつくりださないこれらの突然変異体については感染された単層の免疫蛍光アッセイで野生種ウイルスに対してＢＨＫ細胞を感染させる能力をもってるいるかどうかテストした。各突然変異体群の相対的な感染性を判定するために、後者のアッセイを突然変異体及び野生種ウイルスの精製した製剤と比較した。目標はできるだけトランスメンブレンドメインの先端を切断しながら、ＢＨＫ細胞に感染することはできるが成熟したウイルスはつくりだすことができないＣ７〜10蚊細胞内で合理的な量のウイルスを確保することである。単一のトランスメンブレンドメインの先端切断がＢＨＫ細胞内でのウイルスの成長を減らしはするが完全に無くしはしないという状況が発生した場合、第２の領域を切断するなど、最大４つの領域に対して同じ手順を行う。
【００７０】
【表２】
0004318399.tif 000003
【００７１】
本発明で述べた手順はその構造の一部として一体化膜タンパク質を有する、昆虫及び哺乳動物内で複製するウイルス、つまり、トガウイルス、フラビウイルス、及びブニヤウイルス及び哺乳動物と昆虫の両方の細胞で自然に複製できる他のすべてのエンベロープを有するウイルス、及びウイルス蚊細胞の遺伝子工学処理によって哺乳動物細胞及び昆虫細胞の両方で複製するようにさせることができるエンベロープを有するウイルスに有効である。
【００７２】
ウイルスエンベロープに存在するタンパク質の膜スパンニングドメインからアミノ酸を除去することによって、いずれの膜含有ウイルスに対してでもワクチンをつくることができる。これは、上に述べたようなウイルスのｃＤＮＡクローンから塩基を取り除くことで行われる。変成クローンから転写されたＲＮＡを昆虫細胞内にトランスフェクトする。つくりだされたウイルスを大量の突然変異体ウイルスが得られるまで昆虫細胞内で繰り返し成長させて増幅する。このウイルスが哺乳動物に感染して後代をつくりだす能力を持っているかどうか調べる。哺乳動物細胞内で子孫をつくりださないウイルスは実験動物内で免疫性をつくりだすことができるかどうか調べる。免疫性をつくりだすものは先行技術において知られているようなヒト及び動物用ワクチン生産の候補となる。これらの手順はアルボウイルスあるいはその他のエンベロープを有するウイルスと共に用いられる。
【００７３】
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【００７４】
本明細書で取り上げられているすべての特許及び刊行物は本発明が関係する分野の当業者が容易に理解できるレベルである。さらに、これらの特許と刊行物は、個々の刊行物について具体的、具体的に触れられることによって本明細書に組み入れられるのと同様に全体としても本明細書に組み入れられる。
【００７５】
当業者であれば、本発明は上に述べた目的を実行し、課題と利点を達成、及びそれらに本質的に付随した目的、課題、利点を達成するのによく適合していることは容易に理解できるであろう。本実施例は、方法、手順、措置、分子、及び分子と共に現段階での好ましい実施の形態を示すために述べられ、例示であって、本発明の範囲の限定は意図していない。権利請求の範囲に定義されているような本発明の精神の範囲内で、変更や他の使用法が可能であることは当業者には自明であろう。
【００７６】
以下の図面は上に述べた本発明の特徴や利点、そして目的を明らかにし、より詳細に理解できるようにするためのものである。これらの図面は明細書の一部を構成している。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  トランスフェクトされた組織培養細胞から回収された放射性物質でラベルされたシンドビスウイスルの結果について示している。擬似トランスフェクトされたＢＨＫ−21細胞(１)、変異原Δ391  ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−21(２)、そしてΔ391  ＲＮＡでトランスフェクトされたアエデス・アルボピクタス(３)を実施例３で述べるように放射性アミノ酸でラベルした。トランスフェクトしてから24時間後に、実施例４で述べるようにウイルス固有抗血清によって沈殿させた。この図は、欠失変異原のＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−21細胞とアエデス・アルボピクタス細胞の両方とも擬似的にトランスフェクトされた細胞では検出されない３つの構造タンパク質Ｅ１，Ｅ２、及びＣをつくりだすことを示している。
【図２Ａ】  シンドビスウイルス欠失突然変異体Δ391のＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ−21細胞の電子顕微鏡写真である。細胞は実施例２で述べられたようにトランスフェクトされた。これらの細胞が成熟したウイルスはつくりださなくても細胞質内で、ウイルスコア構造のクラスター(Ａ)が見られる。
【図２Ｂ】  シンドビスウイルス欠失突然変異体Δ391のＲＮＡでトランスフェクトされた及びアエデスアルボピクタス細胞の電子顕微鏡写真である。細胞は実施例２で述べられたようにトランスフェクトされた。細胞はウイルスコアのクラスターをつくりだすが、これらのコアはＢＨＫ−21細胞内のものと同様の細胞質を含んでおらず、また、細胞膜と結合していることが認められる。こののケースはＢＨＫ−21細胞では見出されないので、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２は存在しているけれども、それらを結合させる機能は有していないことを示唆している。
【図３】  ＥＲに組み込まれた後のシンドビスウイルス糖タンパク質の構成を示している。このタンパク質は６つの膜スパンンイングドメイン（１−６の数字を付してある）を持つマルチパスタンパク質である。
【図４】  Ｅ2トランスメンブレンドメインにおける欠失アミノ酸を示している。欠失した配列は１欠失−16の範囲で該当するアミノ酸の下側に示されている。nt．9787から始まるヒスチジン及びプロリン配列はそのタンパク質のルーメン側にあるが、これらは変異原性プライマーを設計するためには用いられない。
【符号の説明】
１  初期統合に関する信号配列
２  第１のＥ２膜横断領域（ＴＭＤ）
３  第２のＥ２  ＴＭＤ
４  第１の６ｋ  ＴＭＤ
５  第２の６ｋ  ＴＭＤ
６  Ｅ１  ＴＭＤ
Ｓ  信号ペスチダーゼによる切断点
【配列表】
0004318399.tif 000004
0004318399.tif 000005
0004318399.tif 000006
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0004318399.tif 000014
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0004318399.tif 000016
【図１】
0004318399.tif 000017
【図２Ａ】
0004318399.tif 000018
【図２Ｂ】
0004318399.tif 000019
【図３】
0004318399.tif 000020
【図４】
0004318399.tif 000021