(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケール乾燥物のエタノール抽出物を含有するニューロペプチドＹ受容体拮抗剤（肥満に対する治療・予防用途を除く）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ニューロペプチドＹ受容体あるいはメラニン凝集ホルモン受容体に拮抗作用を有し、肥満の予防又は／及び治療、あるいは肥満に関連した疾患の予防又は／及び治療に有効な剤、それらを含有する経口用組成物又は非経口用組成物、食品又は医薬に関する。
【０００２】
【従来技術】
肥満症は、生活習慣病との関連もあり、大きな問題となっている。肥満の原因の一つに、ストレスによる過食や脂肪の高い食生活などの過剰栄養摂取が挙げられる。厚生労働省の1998年の国民栄養調査によると肥満の指標の一つであるbody mass index(BMI)が25以上である肥満人口（15歳以上）は統計で2300万人と推定されている。BMIの平均値は年々増加しており、これに伴う糖尿病や高脂血症、高血圧などの疾患も急増している。
【０００３】
日本で医薬品として使用されている、食欲低下剤のマジンドールは、視床下部の食欲調節中枢に作用し、摂食を抑制するものだが、高度肥満症（BMIが35以上）を対象としている。しかし、精神症状等の副作用の問題を抱えている。従って、この様な問題点のない、新しいタイプの摂食抑制剤を開発することは臨床上非常に意義のあることであり、本発明は、この課題を解決することを目的とする。これまでに、摂食抑制に関連したものとして、セロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン及びヒスタミンの先駆体を使用する方法（特表2000−515139）、ヒラタケの子実体（特開平9−20675号公報）、アボガド（特開2002−53474）などが報告されている。しかし、これらには摂食行動とエネルギー代謝調節に関与しているニューロペプチドＹ（以下、NPYと略す）やメラニン凝集ホルモン（以下、ＭＣＨと略す）については、述べられていない。
【０００４】
NPYは、摂食を亢進するペプチドであり、36個のアミノ酸から構成され、中枢神経系に広範に分布する（Trends Pharmacol.Sci.12,111-115,1991）。NPYが作用する視床下部のNPY受容体にはY1〜Y6のサブタイプが報告されており、NPY受容体を拮抗化することにより、摂食が抑制されることが知られている(Eur.J.Pharmacol,2002,440(23),173-187)。
【０００５】
また、ＭＣＨは、体内で分泌される生理活性物質の一つで、神経機能を調整する因子の一つで、ヒトの体内では、食欲の刺激因子として働くことが知られている。
【０００６】
近年、ＭＣＨに関する研究が積極的に行われており、このＭＣＨ受容体を蓋することにより、マウスの実験で体重が減少したことから、ＭＣＨに拮抗的に作用を示す化合物が肥満の予防又は／治療に効果があることが明らかとなった（Jon Chambersら；Nature, 400, 261-265, 1999）。
【０００７】
本発明の肥満の予防又は治療剤は、NPY受容体あるいはＭＣＨ受容体拮抗作用を有しており、様々な摂食障害、特に、摂食中枢の亢進あるいは満腹中枢の抑制（不機能）などによる食欲の異常亢進を抑制し、また、それに伴う肥満亢進の防止や肥満状態の改善にあるいは、肥満に関連した疾病の予防又は／及び治療に有効である。さらに様々なストレス性疾患時に認められる過食の予防、治療にも有望である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、安定性、安全性、価格に優れたNPYあるいはＭＣＨに関連する疾患、例えば肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療を目的とした組成物を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上述した課題を解決するために鋭意研究を行った結果、青汁と称されて搾汁を飲用しているアブラナ科植物のケールにＮＰＹ受容体拮抗作用及び抗癌作用や免疫賦活作用などの目的で健康補助食品に利用されているプロポリスにＭＣＨ受容体拮抗作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、
ケール乾燥物のエタノール抽出物を含有するニューロペプチドＹ受容体拮抗剤（肥満に対する治療・予防用途を除く）、
に関する。
【００１１】
【発明の実施形態】
本発明で使用されるケール（Brassicca Oleracea L.var.acephala DC.）には、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード、緑葉カンランなどがある。アブラナ科の植物でもともと南ヨーロッパ原産の野菜であり、キャベツの原種といわれている。葉など通常食用として供されているもので構わないし、栽培方法や栽培地も特に限定されるものでもない。
本発明で使用するプロポリスは、蜂が集めた樹脂状の黒い塊であり、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリス、オーストラリア産プロポリス、ウルグアイ産プロポリス、日本産プロポリスなど何れの産地のものでもよく、特に限定されるものではないが、汎用性の面から見て、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリスが好ましい。
【００１２】
本発明におけるケール又はプロポリスは、それら自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１３】
例えば、ブラジル産プロポリスの原塊乾燥物１Kgに99.5％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１４】
抽出されたケール又はプロポリス抽出物の溶液中のケール又はプロポリス抽出物濃度は特に制限はないが、１５〜７０質量％、好ましくは２０〜６０質量％程度が好ましい。この濃度が１５質量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０質量％超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１５】
これらの本発明によるケールの乾燥物又は抽出物にＮＰＹ受容体拮抗作用、プロポリスの乾燥物又は抽出物にＭＣＨ受容体拮抗作用を有することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。
【００１６】
本発明によるケール又はプロポリスは、卓越したＮＰＹ受容体拮抗作用、ＭＣＨ受容体拮抗作用を有しており、肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療を目的とした食品又は医薬として使用可能である。
【００１７】
本発明のケールをＮＰＹ受容体拮抗剤、プロポリスをＭＣＨ受容体拮抗剤、肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療剤含有食品又は医薬として製造することができる。
【００１８】
本発明のＮＰＹ受容体拮抗剤、ＭＣＨ受容体拮抗剤、肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療剤のような医薬の適用方法としては、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００１９】
食品としては、そのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、ＮＰＹ受容体拮抗剤、ＭＣＨ受容体拮抗剤、肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療剤に有用な保健用食品又は食品素材として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、茶、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００２０】
本発明のケールの有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、経口投与の場合、乾燥重量として、通常成人換算で0.1kg／体重kg以上であり、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２１】
また、プロポリスの投与量としては、一般に乾燥重量として１日当たり10〜500ｍg/kg体重程度、好ましくは、１日当たり150〜350mg/kg体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２２】
ケール及びプロポリスの毒性は低く、例えばブラジル産プロポリスのエタノール抽出物を毎日1000mg/kg、100日間という長期間に亘ってラットに経口投与しても、死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００２４】
［製造例１］ケール抽出物の製造
ケールの葉を90℃で乾燥させ、苦みの渋味成分となる酵素を失活させた。その粉砕物4ｋｇを電熱式水浴機で加熱還流しながら、99.5％エタノール（和光純薬工業）20Ｌを用いて抽出を行い、ケール抽出物80ｇを得た。
［製造例２］プロポリス抽出物の製造
ブラジル産及び中国産プロポリス原塊それぞれ10gに99.5％エタノール（和光純薬工業）3Lを加え、50℃で一晩浸漬した後、ロータリーエバポレーターにてエタノールを除去することにより、プロポリス抽出物をそれぞれ324mg、216mgを得た。
【００２５】
［実施例１］ＮＰＹ受容体結合阻害試験
ＮＰＹ受容体結合阻害試験は、M.Munozらの方法（Molecular and Endocrinology, 107, 77-86, 1995）を参考に行った。
【００２６】
すなわち、NPYcDNAをバキュロウイルス発現ベクターに挿入し，Sf21昆虫細胞で発現させた。それから膜標品の調製は、既存の方法に従って行い、最終的に緩衝液A[50 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、120 mM 塩化ナトリウム、5 mM 塩化カリウム、2 mM 塩化カルシウム、1 mM 塩化マグネシウム、0.1％牛血清アルブミン（BSA）、pH7.4]に懸濁し、受容体膜標品とした。この膜標品（25μgの蛋白質含む）に、［125I］ペプチドYY（最終濃度0.05 nM）、製造例１で得られたケール抽出物（最終濃度：500μｇ／ml）を加え（最終液量500μl）、室温で2時間インキュベーションさせた後、上記緩衝液A（BSAを除く）を用いて遠心し洗浄操作をした。これを3回行った後、緩衝液B［0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、2％炭酸ナトリウム、0.1 N水酸化ナトリウム］で懸濁し、受容体結合放射活性をγカウンターで測定した。
【００２７】
また、非特異的結合は、1μＭのNPY存在下で測定した。結果を表1に示すが、ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝100−〔（C１−B0）／（C0 −B0）〕×100
（式中、C1 は、既知量のサンプルと［125I］ペプチドYYが共存している状態での［125I］ペプチドYYの膜画分に対する結合量を表わし、C0 は、サンプルを除いた時の［125I］ペプチドYYの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ0は、過剰のNPY（1μM）存在下での［125I］ペプチドYYの膜画分に対する結合量を表わす。）
【００２８】
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのNPY受容体の作動化剤であるNPYのIC50値（NPY受容体結合を50％阻害する濃度）は0.61 nMであった。
【００２９】
表１から、本発明のケール又はその抽出物は、NPY受容体に対するペプチドYY結合を競合的に阻害し、NPY受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００３０】
【表１】
0004359027.tif 000002
【００３１】
［実施例２］ＭＣＨ受容体結合阻害試験
ＭＣＨ受容体結合阻害試験は、Jon Chambersらの方法（Nature, 400, 261-265, 1999）を参考にして行った。
【００３２】
すなわち、ヒトＭＣＨ受容体であるＳＬＣ１を発現させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（2〜4μg/タンパク質となるように調整）、0.1nMの［125Ｉ］標識した［Phe13，Tyr19］−ＭＣＨ（比活性；2200Ci/mmol、New England Nuclear製）及び最終濃度が500μl/mlになるように調整した製造例２で得られた各プロポリス抽出物とを、22℃で60分間、インキュベートした。その後、グラスファイバーフィルター（Whatman社製、GF/C）を用いて吸引濾過して放射活性をトラップし、次いで、0.3％脱脂粉乳5mlを用いて3回洗浄した。そして、フィルターを乾燥させ、シンチレーション溶液中で一晩浸漬することにより、フィルター中の放射活性を溶出させた後、この溶出物中の放射活性を液体シンチレーションスペクトロメトリー（43％ efficiency）を用いて測定し、以下に示す式を用いてＭＣＨ受容体阻害活性を算出した結果を表２に示した。
【００３３】
また、特異的結合は、0.1μMのＭＣＨと置換される結合と定義し、タンパク質量は、Lowryらの方法（O.H.Lowry, N.J.Rosenbrough, A.L.Farr and R.J.Randall；J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)）により測定した。
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ３−Ｂ）／（Ｃ２ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ３ は、既知量の供試化合物と［125Ｉ］標識した［Phe13，Tyr19］−ＭＣＨが共存している状態での［125Ｉ］標識した［Phe13，Tyr19］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ２ は、供試化合物を除いた時の［125Ｉ］標識した［Phe13，Tyr19］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のＭＣＨ（１×10-5Ｍ）存在下での［125Ｉ］標識した［Phe13，Tyr19］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わす。）
【００３４】
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＭＣＨ受容体作動化薬であるＭＣＨのIC50値は、0.25ｎMであった。
【００３５】
表２から、本発明のプロポリス又はその抽出物は、ＭＣＨ受容体に対するＭＣＨの結合を競合的に阻害し、ＭＣＨ受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００３６】
【表２】
0004359027.tif 000003
【００３７】
以下に処方例を示す。
［錠剤の製造］
製造例１で得られたケールのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組      成）                            （配合：質量％）
ケール抽出物                                  ２４
乳糖                                          ６３
コーンスターチ                                １２
グァーガム                                      １
【００３８】
［ジュースの製造］
製造例２で得られたブラジル産プロポリスのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組       成）                          （配合：質量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁                          ５．０
果糖ブドウ糖液糖                              １１．０
クエン酸                                        ０．２
Ｌ−アスコルビン酸                              ０．０２
香料                                            ０．２
色素                                            ０．１
ブラジル産プロポリス抽出物                      ０．２
水                                            ８３．２８
【００３９】
【発明の効果】
ケール又はその抽出物がＮＰＹ受容体拮抗作用、プロポリス又はその抽出物がＭＣＨ受容体拮抗作用を有することから、これらを含有するＮＰＹ受容体拮抗又はＭＣＨ受容体拮抗剤は、肥満、及びそれらに関連する糖尿病や高脂血症、高血圧などに対する予防又は治療剤、それらを含有する経口用組成物、非経口用組成物、食品又は医薬として有用である。このような組成物は、長期間服用しても安全で、確実な治療を行うことができる。