(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性の測定方法であって、該方法は、一般式（Ｉ）：
【化１】
0004220603.tif 000014
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ含有試料とを、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤の存在下、反応させ、それによって遊離する発色性化合物又は蛍光発色性化合物の量を測定することを含み、該血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ含有試料が、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、羊水、細胞、臓器、又は細胞及び臓器の抽出液であり、該阻害剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である、測定方法。
【請求項２】
前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
さらに、キレート剤を共存させる、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡである、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキル硫酸のアルカリ金属塩又はアルキルスルホン酸のアルカリ金属塩である、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
前記胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体が、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロリトコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ、又はデオキシ-ＢＩＧＣＨＡＰである請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
試料中の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用試薬であって、該試薬は、一般式（Ｉ）：
【化２】
0004220603.tif 000015
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤とを含有し、該試料が、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、羊水、細胞、臓器、又は細胞及び臓器の抽出液であり、該阻害剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である、試薬。
【請求項９】
前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
さらに、キレート剤を共存させる、請求項８又は９に記載の試薬。
【請求項１１】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡである、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキル硫酸のアルカリ金属塩又はアルキルスルホン酸のアルカリ金属塩である、請求項８から１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１３】
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項８から１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
前記胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体が、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロリトコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ、又はデオキシ-ＢＩＧＣＨＡＰである請求項８から１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
請求項８から１４いずれかの項に記載の試薬を含む、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用キット。
【請求項１６】
試料中の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用キットであって、該キットは、一般式（Ｉ）：
【化３】
0004220603.tif 000016
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質を含む容器と、
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤及びキレート剤を含有する溶液を含む容器とを有し、
該試料が、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、羊水、細胞、臓器、又は細胞及び臓器の抽出液であり、該阻害剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である、
キット。
【請求項１７】
前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記基質が、溶液あるいは溶媒中に溶解されている、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらに、前記基質を溶解するための溶液あるいは溶媒を含有する容器を有する、請求項１５から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
一般式（Ｉａ）で表される化合物：
【化４】
0004220603.tif 000017
（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）
【請求項２１】
前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性の測定方法であって、該方法は、一般式（Ｉａ）で表される化合物：
【化５】
0004220603.tif 000018
（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ含有試料とを反応させ、それによって遊離する発色性化合物又は蛍光発色性化合物の量を測定することを含み、該血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ含有試料が、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、羊水、細胞、臓器、又は細胞及び臓器の抽出液である、測定方法。
【請求項２３】
前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である、請求項２２に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床的に重要な血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性を測定する方法、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用試薬、その試薬を利用する血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血小板活性化因子（platelet activating Factor：１−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、以下、ＰＡＦと省略する）は、炎症やアレルギー反応等広範囲の各種病態発症に関するメディエーターである。一方、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（以下、ＰＡＦ-ＡＨという）は、ＰＡＦの持つ強力な生物活性を消去する機能を有しており、生体内ＰＡＦレベルを調節し、生体の恒常性維持に関与している。そして、川崎病、全身性エリトマトーデス、溶血性尿毒症症候群等の疾患において、これらの病態の進行に伴い、健康時には認められない血清中のＰＡＦ-ＡＨ活性の変動が観察されている。
【０００３】
このように、血清または血漿中のＰＡＦ-ＡＨ活性は各種炎症性患者の発症、病態変化を反映しているので、ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定は、これらの疾患の診断に有用な情報をもたらす新規な臨床検査法として重要なものである。さらに、血清ＰＡＦ-ＡＨ欠損者が存在し、この酵素欠損が重篤な小児喘息のリスクファクターとみなされており、ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定は予防医学の面からも重要であることが示唆されている。
【０００４】
従来、ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定には、バイオアッセイによる方法と放射性同位元素を用いる方法とが用いられてきた。
【０００５】
バイオアッセイ法は、ＰＡＦ-ＡＨと基質のＰＡＦとを一定時間反応させ、残存するＰＡＦによる血小板凝集能をモニターすることにより、ＰＡＦ−ＡＨを測定する方法であるが、血小板を使用時に調製しなければならない、高価な試薬を用いなければならない等の欠点があり、一般の検査法として利用するには困難な問題点が存在した。
【０００６】
他方、放射性同位元素を用いる方法（ＲＩＡ法）は、３Ｈ又は１４ＣでＰＡＦのアセチル基を標識してＰＡＦ-ＡＨと反応させ、遊離された放射能活性を測定するか、又はアルキル基を標識してＰＡＦ-ＡＨと反応させ、反応生成物であるリゾＰＡＦ又は未反応のＰＡＦを回収して放射能活性を測定する方法である。しかし、この放射性同位元素を用いる方法では、放射性物質の使用者及び使用設備が限定される上、安全性の問題、放射性試薬の廃棄等の問題がある。さらに、標識されたリゾＰＡＦあるいは未反応の標識されたＰＡＦを回収して残存する放射能活性を測定する場合には、リゾＰＡＦあるいはＰＡＦを有機溶剤で抽出し、クロマトグラフィーで分離しなければならない等の煩雑な操作が必要とされる等、一般の検査法として利用するには困難な問題点が存在した。
【０００７】
そこで、このような煩雑な操作を要することなく、ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定する方法が検討されている。その一つの方法は、合成基質を用いる方法であり、近年、種々のＰＡＦ-ＡＨの基質並びにＰＡＦ-ＡＨの測定法が開発されている。
【０００８】
例えば、特開平７−５９５９７号公報には、ＰＡＦ-ＡＨの作用によりジカルボン酸を遊離するＰＡＦ類似化合物を基質として、ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定する方法が記載されている。この方法は、この基質に試料中のＰＡＦ-ＡＨを作用させてジカルボン酸を生成させ、ついで生成したジカルボン酸に特異的に反応する酵素を作用させ、さらに連続する酵素反応系を組み合わせて、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又は過酸化水素等の汎用されているマーカー物質を生成させ、これらのマーカー物質を公知の方法により測定することにより、ジカルボン酸の生成速度又は生成量を求め、これによりＰＡＦ-ＡＨ活性を測定する方法である。この方法は、検出系に多数の酵素を組み合わせた酵素的測定法であるため、使用する酵素の安定性や特異性等の問題があり、試薬の性能を維持するのに注意を払う必要がある等の問題点がある。
【０００９】
また、特開平４−３４６７９７号公報には、チオＰＡＦおよびチオＰＡＦ類似体化合物を基質とするＰＡＦ-ＡＨ活性測定法が記載されている。この方法は、ＳＨ基と反応して定量的に呈色する呈色試薬を利用する方法である。この公報には、ＰＡＦ-ＡＨによりチオＰＡＦ等の基質から生成するリゾチオＰＡＦの−ＳＨ基と５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）との置換反応によって遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の黄色を追跡する方法が一例として記載されているが、この方法は、反応液や検体中に共存する他のチオール化合物や酸化還元性物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビン、システイン又はグルタチオン等の干渉を受けやすく、酵素的測定法と同様に試薬の性能維持の面で問題がある。
【００１０】
また、ＰＡＦ類似化合物である１−ドデカノイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリンを基質とするＰＡＦ−ＡＨ活性測定法が知られている（Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 16巻, No 4 591-599 (1996)）。しかしながら、この測定法では、血漿あるいは血清等の検体中に存在する種々のエステラーゼあるいはエステラーゼ様物質によっても基質が加水分解されることから、測定値は大きな正の影響を受け、正確なＰＡＦ-ＡＨ活性の測定は困難であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、種々のエステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けることのないＰＡＦ-ＡＨ活性の測定方法であって、放射性基質を用いることなく、安全でかつ操作が簡便な直接測定方法が望まれていた。すなわち、ＰＡＦ-ＡＨに特異性の高い基質、あるいは、種々のエステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けることが少ない測定系の開発が望まれていた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ＰＡＦ-ＡＨに比較的特異性が高い基質及び種々のエステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けることのないＰＡＦ-ＡＨ測定系を見出し、放射性基質を用いない、安全でかつ操作が簡便な、直接ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定できる方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定方法であって、一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化６】
0004220603.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ含有試料とを、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤の存在下、反応させ、それによって遊離する発色性化合物又は蛍光発色性化合物の量を測定することを含む方法に関する。
【００１６】
好適な実施態様においては、前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である。
【００１７】
好適な実施態様においては、本発明の測定方法に用いられる阻害剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤、胆汁酸塩、胆汁酸塩誘導体及びキレート剤からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である。
【００１８】
また、好適な実施態様においては、本発明の測定方法に用いられるアニオン性界面活性剤が、アルキル硫酸のアルカリ金属塩又はアルキルスルホン酸のアルカリ金属塩である。
【００１９】
また、好適な実施態様においては、本発明の測定方法に用いられる非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。
【００２０】
また、好適な実施態様においては、本発明の測定方法に用いられる胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体が、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロリトコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ、又はデオキシ-ＢＩＧＣＨＡＰである。
【００２１】
また、本発明は、ＰＡＦ−ＡＨ活性測定用試薬に関し、一般式（Ｉ）：
【００２２】
【化７】
0004220603.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、ＰＡＦ−ＡＨを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤とを含有する、試薬に関する。
【００２４】
好適な実施態様においては、ＰＡＦ−ＡＨとの反応に伴って、基質から芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物が遊離される。
【００２５】
好適な実施態様においては、本発明の試薬に含まれる阻害剤が、アニオン性界面活性剤、非イオン界面活性剤、胆汁酸塩、胆汁酸塩誘導体及びキレート剤からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である。
【００２６】
また、好適な実施態様においては、本発明の試薬に含まれるアニオン性界面活性剤が、アルキル硫酸のアルカリ金属塩又はアルキルスルホン酸のアルカリ金属塩である。
【００２７】
また、好適な実施態様においては、本発明の試薬に含まれる非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。
【００２８】
また、好適な実施態様においては、本発明の試薬に含まれる胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体が、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロリトコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ、又はデオキシ-ＢＩＧＣＨＡＰである。
【００２９】
本発明は、さらに、前記試薬を含む、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定用キットに関する。
【００３０】
また、本発明は、ＰＡＦ−ＡＨ活性測定用キットであって、上記一般式（Ｉ）：
【００３１】
【化８】
0004220603.tif 000004
【００３２】
（式中、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ａは酸素原子が介在してもよい飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質を含む容器と、
ＰＡＦ−ＡＨを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤を含有する溶液を含む容器とを有する、キットに関する。
【００３３】
好適な実施態様においては、ＰＡＦ−ＡＨとの反応に伴って、基質から芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物が遊離される。
【００３４】
好適な実施態様においては、前記基質が、溶液あるいは溶媒中に溶解されている。
【００３５】
別の好適な実施態様においては、本発明のキットは、さらに、前記基質を溶解する溶液あるいは溶媒を含有する容器を有する。
【００３６】
さらに、本発明は、一般式（Ｉａ）で表される化合物：
【００３７】
【化９】
0004220603.tif 000005
【００３８】
（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）に関する。
【００３９】
好適な実施態様においては、前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である。
【００４０】
また、本発明は、ＰＡＦ−ＡＨ活性の測定方法に関し、一般式（Ｉａ）で表される化合物：
【００４１】
【化１０】
0004220603.tif 000006
【００４２】
（式中、Ｒ１は炭素数６から２０のアシル基、アルキル基又はアルケニル基を表し、Ｘは遊離したときに発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる基を表し、Ｒ２はモノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基を表す。）で表される基質と、ＰＡＦ−ＡＨ含有試料とを反応させ、それによって遊離する発色性化合物又は蛍光発色性化合物の量を測定することを含む測定方法に関する。
【００４３】
好適な実施態様においては、前記発色性化合物が芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物である。
【００４４】
上記の発明により、ＰＡＦ-ＡＨに比較的特異性が高い基質、及び種々のエステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けることのないＰＡＦ-ＡＨの直接測定系が提供される。さらに、本発明は放射性基質を用いないので、日常の検査に安全、迅速、簡単な測定方法として充分利用できる方法を提供する。このように本発明のＰＡＦ−ＡＨの測定方法は、（１）従来の方法より測定時間が短縮される、（２）種々のエステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けない、（３）発色性化合物または蛍光発色性化合物をモニターすることにより直接ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定できる等の利点を有することから、従来法である発色系へ誘導する酵素や試薬を使用する方法よりも正確な測定が可能である。従って、本発明は、疾患の検定、予後の経過を短時間で診断できるため極めて有用性が高い発明である。
【００４５】
さらに、本発明により、ＰＡＦ-ＡＨ測定用の試薬並びにこれを含むキットが提供される。これらの試薬、キットにより、直接かつ簡便にＰＡＦ-ＡＨ活性が測定できるので、ＰＡＦ-ＡＨ活性の変化に基づく疾患の診断、病状の進行が把握できる。従って、本発明の医療における貢献は大きい。
【００４６】
【発明の実施の形態】
（本発明の測定方法の特徴）
本発明の、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ-ＡＨ）活性の測定方法の特徴は、上記一般式（Ｉ）で表される基質と共に、ＰＡＦ-ＡＨ以外のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤を添加することにより、これらのエステル分解活性関連物質による非特異的加水分解による発色性化合物あるいは蛍光発色性の化合物の放出を防止して、より精度よく、ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定する点にある。すなわち、基質から遊離される発色性あるいは蛍光発色性の化合物が、できるだけＰＡＦ-ＡＨにのみ由来する様に測定系を設計することにある。また、一般式（Ｉ）の基質のうち、一般式（Ｉａ）で表される基質を用いれば、さらに感度よく測定することができる。
【００４７】
本発明に用いる基質は、ＰＡＦ-ＡＨと反応すると、発色性あるいは蛍光発色性の化合物と結合したジカルボン酸誘導体を遊離するが、このジカルボン酸誘導体は遊離されると、発色性あるいは蛍光発色性の化合物を遊離（放出）するという特徴を有している。すなわち、本発明に用いる基質とＰＡＦ-ＡＨとが反応したとき、ＰＡＦ-ＡＨ活性と比例する量の発色性あるいは蛍光発色性置換芳香族化合物を遊離するため、その遊離された発色性あるいは蛍光発色性の化合物をモニターすることで、直接的にＰＡＦ-ＡＨ活性を測定することができる。
【００４８】
従来の測定法は、基質とＰＡＦ-ＡＨを接触させて生成するジカルボン酸を酵素的に発色系に導くか、あるいは、５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）との置換を通して、遊離する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の発色系に導いており、直接的な発色ではないため、基質自体の分解だけでなく酵素の失活や他の発色系へ導く組成物の劣化等、測定の不正確性に関与する要素が多く、正確にＰＡＦ-ＡＨ活性値を得られないことがあった。
【００４９】
本発明の測定法によって、これら問題点が解決されるという格別な効果が奏される。すなわち、本発明による測定方法においては、ＰＡＦ-ＡＨによって直接的に検出可能な発色性あるいは蛍光発色性の化合物を生成するので、血清試料、血漿試料等に含まれるエステル分解活性関連物質による測定誤差をできるだけ小さくして、精度良くＰＡＦ-ＡＨ活性を測定することができる。
【００５０】
本願明細書において「エステル分解活性関連物質」には、エステル分解酵素（エステラーゼ）、エステル分解酵素（エステラーゼ）様物質などの、エステル結合を切断する酵素あるいは物質が含まれる。エステル分解酵素（エステラーゼ）様物質としては、例えば、ＬＤＬに含まれるアポリポタンパクＢ等のエステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００５１】
以下、本発明に用いる基質、その製造方法、本発明に用いる阻害剤、ＰＡＦ-ＡＨの測定用試薬、その試薬を用いる測定方法、及びＰＡＦ-ＡＨの測定用キットについて、順次説明する。
【００５２】
（本発明に用いる基質）
本発明のＰＡＦ-ＡＨ測定方法に用いる基質は、一般式（Ｉ）で表される。
一般式（Ｉ）：
【００５３】
【化１１】
0004220603.tif 000007
【００５４】
において、Ｒ１はアシル基、アルキル基又はアルケニル基が好ましい。炭素数は約６から約２０位が好ましい。より好ましくは、約８から約１８である。
【００５５】
Ａとしては、飽和または不飽和の、置換又は非置換の炭素数２〜７の炭化水素基が好ましい。なかでも、炭素数２の化合物が好ましい。また、この炭化水素基は、酸素原子が介在してもよい。すなわち、-C-O-C-等の構造を有してもよい。
【００５６】
Ｘは、ＰＡＦ-ＡＨと基質とが反応して、ジカルボン酸誘導体が遊離すると遊離（放出）される化合物であり、発色性あるいは蛍光発色性であることが好ましい。Ｘは、好ましくは、加水分解されたときに、芳香族ヒドロキシ化合物又は芳香族チオール化合物となる基であり、例えば、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２−フルオロ−４−ニトロフェニル基、３−フルオロ−４−ニトロフェニル基、４−ニトロチオフェニル基、５−インドリルオキシ基、２，６−ジフェニル−４−ニトロフェニル基が挙げられる。
【００５７】
蛍光発色性化合物としては、４−メチルクマリル基、クマリル基、フラボンオキシル基等が挙げられる。
【００５８】
Ｒ２としては、モノメチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基又はトリメチルアミノエチル基が挙げられる。トリメチルアミノ基が好ましい。
【００５９】
基質の中でも、Ａの炭素数が２である基質は、一般式（Ｉａ）で表わされる。
【００６０】
【化１２】
0004220603.tif 000008
【００６１】
一般式（Ｉａ）中、Ｒ１、Ｘ、及びＲ２は、それぞれ、前記Ｒ１、Ｘ、及びＲ２と同じである。一般式（Ｉａ）である化合物としては、例えば、１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリンが好ましい。この化合物は、Ａの炭素数が３である場合の、１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロホスホコリンに比べて、４倍以上も感度が上昇するという効果を有している。
【００６２】
本発明に用いられる基質として、上記の基質の他に、以下の基質が例示されるが、基質はこれらに限定されない。
１−オクタノイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−デカノイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ラウロイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−オレオイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−アルキル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−アルケニル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルアジポイル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルピメロイル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルスベロイル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルアゼロイル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（２−クロロ−４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−メチルクマリルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（２−フルオロ−４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（３−フルオロ−４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロチオフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（５−インドリルオキシグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（２，６−ジフェニル−４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルグライコリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−［５−ジメチルアミノ−２−（２−チアゾリルアゾ）フェニルサクシニル］−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−［１−（２−トリアゾリルアゾ）−２−ナフチルサクシニル］−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−［（４−ニトロフェニル）ジメチルサクシニル］−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−［（６−フラボンオキシル）サクシニル］−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、及び
１−パルミトイル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン。
【００６３】
（本発明に用いる基質の製造方法）
本発明に用いるＰＡＦ-ＡＨの基質は、それ自体公知の方法に準じて製造できる。後述の合成例で詳細が説明される。例えば、特開昭５２−８９６２２号公報に記載の方法は、ホスホリパーゼＡ2を用いて得られる１−アシルグリセロホスホコリン、１−O−アルキルホスホコリン（市販のリゾＰＡＦ）、１−O−アルケニルホスホコリン（市販のリゾホスホコリンプラズマローゲン）等を出発原料として用い、これらの出発原料と無水ジカルボン酸（例えば無水コハク酸）とを、無水クロロホルムと無水ジクロロメタン混液中、トリエチルアミンを触媒として反応させて、２位に所望のジカルボン酸を導入して、１−アシル−２−モノジカルボニル−ホスホコリンを得る。無水コハク酸を用いた場合、１−アシル−２−サクシニル−ホスホコリンが得られる。
【００６４】
このようにして得られた１−アシル−２−モノジカルボニル−ホスホコリンを、William N. Washburnら、J. Am. Chem. Soc. 112巻、2040-2041頁（1990）の記載に従って、塩化オキザリルによってクロライド化し、発色団である芳香族ヒドロキシ化合物、例えばｐ−ニトロフェノールをトリエチルアミン存在下でエステル化し、１−アシル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ホスホコリンを得る。
【００６５】
また、２位にメチレン基の長いジカルボン酸を導入する場合は、無水ジカルボン酸と保護基ベンジルアルコールとの反応により得られるモノベンジルカルボン酸エステル（第４版  実験化学講座２２  有機合成  ＩＶ  131頁）を用いることができる。前記の特開昭５２−８９６２２号公報に記載された方法により、モノベンジルカルボン酸エステルと１−アシルグリセロホスホコリンとを反応させて、１−アシル−２−モノベンジルカルボニルホスホコリンを得る。次いで、得られたモノベンジル体を、パラジウム／炭素を用いて、水素ガス雰囲気下で脱ベンジル化し、１−アシル−２−モノカルボニルホスホコリンを得る。このようにして得られた１−アシル−２−モノカルボニルホスホコリンを塩化オキザリルによりクロライド化し、発色団である芳香族ヒドロキシ化合物、例えばｐ−ニトロフェノールをトリエチルアミン存在下でエステル化し、１−アシル−２−（４−ニトロフェニルアゼロイル）−ホスホコリンを得る。
【００６６】
（本発明に用いる阻害剤）
本発明の測定方法としては、ＰＡＦ-ＡＨを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤の存在下で行なう方法が好ましい。ここで、「ＰＡＦ-ＡＨを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤」とは、ＰＡＦ-ＡＨを阻害しないが他のエステル分解活性関連物質を阻害するという意味と、ある濃度ではＰＡＦ-ＡＨを阻害はしないが、他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤であるという意味の、両方の意味を含む。
【００６７】
ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定において、血清あるいは血漿試料中に存在する他のエステル分解活性関連物質により、非特異的に基質のエステル結合が加水分解され、一般式（Ｉ）または（Ｉａ）におけるＸ（例えば、発色性化合物）が遊離され、ＰＡＦ-ＡＨ活性のノイズとなるので好ましくない。そこで、血清あるいは血漿試料のＰＡＦ−ＡＨを測定する場合は、ＰＡＦ-ＡＨを阻害しないが、他のエステル分解活性関連物質（活性）を阻害する阻害剤（以下、非特異反応抑制剤ということもある）を存在させることが好ましい。
【００６８】
このような阻害剤としては、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、胆汁酸塩、胆汁酸塩誘導体等が用いられるが、これらに限定されない。阻害剤は、１種のみ用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。好適な組み合わせはアニオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤、あるいは、アニオン性界面活性剤と胆汁酸塩又は胆汁酸塩誘導体との組み合わせである。同種の阻害剤を２以上用いてもよい。
【００６９】
アニオン性界面活性剤としては、脂肪酸塩（例えば、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム等）、アルキル硫酸エステル塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えば、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、４-n-オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）、アルキルナフタレンスルホン酸塩（例えば、２-ナフタレンスルホン酸ナトリウム等）、アルキルスルホコハク酸塩（例えば、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等）、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸塩（例えば、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム等）、アルキルリン酸塩（例えば、アルキルリン酸カリウム等）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン等）、ポリオキシエチレンアルキルアリル硫酸エステル塩（例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等）、アルキルスルホン酸塩（例えば、オクタンスルホン酸ナトリウム、ノナンスルホン酸ナトリウム、デカンスルホン酸ナトリウム、トリデカンスルホン酸ナトリウム等）、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物（例えば、β-ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩等）、ポリオキシエチレンアルキルリン酸エステルからなる群から選択される、少なくとも１つのアニオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００７０】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等）、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル等、）、ポリオキシエチレン誘導体（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンジステアレート等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えば、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット等）、グリセリン脂肪酸エステル（例えば、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノオレエート等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えば、ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオエチレングリコールモノオレエート、ポリエチレングリコールジステアレート等）、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミドからなる群から選択される、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００７１】
胆汁酸塩並びに胆汁酸塩誘導体としてはコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、デヒドロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロリトコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ：3-［(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio］propanesulfonic acid、ＣＨＡＰＳＯ：3-［(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio］-2-hydroxypropanesulfonic  acid、ＢＩＧＣＨＡＰ：N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide、deoxy-ＢＩＧＣＨＡＰ：N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamideから選択される、少なくとも１つの胆汁酸塩並びに胆汁酸塩誘導体が好ましい。
【００７２】
（ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬）
本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬は、上記一般式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表されるＰＡＦ-ＡＨの基質を含む。基質は、0.001ｍＭ〜250ｍＭ、より好ましくは0.01ｍＭ〜100ｍＭ、さらに好ましくは0.01ｍＭ〜10ｍＭの濃度範囲で使用する。
【００７３】
なお、ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬は、好適には、溶液であり、ＰＡＦ-ＡＨの基質は、各基質の安定なｐＨを選択して、好ましくは、ｐＨ約３〜約９の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）に溶解される。
【００７４】
また、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬は、好ましくは、上記非特異反応阻害剤を含む。非特異反応阻害剤の濃度は、阻害剤がＰＡＦ-ＡＨを阻害しない場合は、特に制限はないが、ＰＡＦ-ＡＨを阻害する場合は、ＰＡＦ-ＡＨを阻害しない濃度を予め決定して、それ以下の濃度で用いればよい。
【００７５】
本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬は、これらの成分以外に、ＰＡＦ-ＡＨの基質を溶解するために、必要に応じて、水混和性有機溶媒を含んでもよい。水混和性有機溶媒としては、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール）、ケトン（例えば、アセトン、メチルイソブチルケトン）、エステル（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。水混和性有機溶媒は、ＰＡＦ-ＡＨの活性に影響を与えないように、好ましくは最終の溶液重量に基づいて、約３０重量％以下、より好ましくは約２０重量％以下含まれる。
【００７６】
本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬は、発色性あるいは蛍光発色性の化合物の解離を促進する物質を含んでもよい。これらの物質としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、あるいはこれらのシクロデキストリンに塩基性官能基（例えば、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル、あるいはトリメチルアンモニオエチル等の４級アンモニウム塩）を導入したシクロデキストリン類が挙げられる。これらの化合物は、約０．５％含まれてもよい。
【００７７】
また、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬には、キレート試薬を共存させることが好ましい。キレート試薬を共存させることにより、アリルエステラーゼやＣａ２＋依存性のホスホリパーゼＡ２による、本発明に用いる基質の分解反応を抑制することができ、ＰＡＦ-ＡＨ活性を特異的に測定することができるようになる。このキレート試薬としては、ＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ等の適切なキレート剤が使用できる。キレート剤は、約２０ｍＭ含まれてもよい。
【００７８】
さらに、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬には、、上記の他に、緩衝剤、安定化剤、活性化剤、賦形剤等の酵素の活性測定に一般に用いられているものを含んでいてもよい。
【００７９】
また、後に詳細に説明するが、本発明においては、ＨＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨ活性、ＬＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨ活性、及び総血清型ＰＡＦ-ＡＨ活性をそれぞれ測定することができる。ＨＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定するために、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬には、ＬＤＬを凝集させる物質として、アニオン性化合物（例えば、デキストラン硫酸、硫酸化シクロデキストリン、硫酸化オリゴ糖、ヘパリン、ペパラン硫酸、リンタングステン酸等）等のイオン性化合物、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、等のカチオン、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（例えば、抗アポリポタンパクＢ抗体等）等を適量含めることができる。
【００８０】
また、ＬＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨを分別定量するために、本発明のＰＡＦ−ＡＨ活性測定用試薬には、、ＨＤＬを凝集させる物質として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（抗アポリポタンパクＡ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体等）を適量含めることができる。
【００８１】
（ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定）
本発明の測定方法は、上記で作成したＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬にＰＡＦ-ＡＨ活性を有する（と思われる）試料を添加して反応させ、遊離する発色性あるいは蛍光性化合物の吸光度、励起された蛍光を測定して定性的にあるいは定量的に測定する方法である。
【００８２】
ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定する試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿もしくは羊水等の体液、そして、ヒト又は動物の細胞、臓器若しくは細胞及び臓器の抽出液等が用いられる。ＰＡＦ−ＡＨ精製品及び血清、血漿等ＰＡＦ-ＡＨを含む被検試料は、ｐＨ６〜９の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）で適宜希釈して、２０〜４０℃に保持して、測定反応に使用する。これらの緩衝液には、適切な塩濃度となるように、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等を添加してもよい。
【００８３】
本発明のＰＡＦ-ＡＨの活性測定法においては、基質の加水分解により遊離される発色性あるいは蛍光発色性の量を測定する。定量は、吸光度の測定により行なう。測定はエンド法でもレート法でも行うことができる。エンド法の場合は、まず、基質を除いた測定試薬と試料とを反応させて、検体ブランクを測定する必要がある。レート法の場合には、定量的に測定が行える時間内に吸光度の測定を行えば良い。なお、ＰＡＦ-ＡＨの活性値の算出は、遊離される発色性あるいは蛍光発色性物質の分子吸光係数より行うことができる。
【００８４】
また、本発明のＰＡＦ-ＡＨの活性測定方法は、用手法でも自動分析装置を用いても行うことができる。基質から遊離される発色性または蛍光発色性の化合物の吸光度変化を測定する。例えば、発色性化合物の場合、波長２８０〜５６０ｎｍにおける吸光度変化を、また、蛍光発色性化合物の場合、レーザー光を照射して蛍光を励起させることにより分光学的に検出し、単位時間当たりの吸光度変化量を求める（いわゆるレートアッセイ法）ことで、精度良くＰＡＦ-ＡＨ活性を求めることができる。
【００８５】
例えば、本発明の一般式（Ｉ）のＡの炭素数が２である基質（すなわち、一般式（Ｉａ））の１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリンを用いると、４−ニトロフェノールが生成する。このとき４−ニトロフェノールの増加に伴って、４―ニトロフェノールの吸収波長である４０５ｎｍにおける吸光度も定量的に増加するので、４０５ｎｍにおける吸光度の増加速度又は増加量が算出される。
【００８６】
さらに、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定法を用いて、ＨＤＬassociated-ＰＡＦ−ＡＨ活性、ＬＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨ活性、及び総血清型ＰＡＦ-ＡＨ活性を分別して、それぞれ、正確に測定できる。ＬＤＬを凝集させる物質を含有する測定試薬を用いることにより、ＬＤＬを凝集、除去し、ＨＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨを定量することができる。また、ＨＤＬを凝集させる物質を含有する測定試薬を用いることにより、ＨＤＬを凝集、除去し、ＬＤＬassociated-ＰＡＦ-ＡＨを定量することができる。どちらも添加しなければ、総血清型ＰＡＦ-ＡＨ活性が測定される。
【００８７】
具体的な測定方法を以下に述べる。まず、適切な緩衝液に溶解した阻害剤を含む阻害剤試薬（例えば、阻害剤と150ｍＭ ＮａＣｌを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)）、基質溶液（例えば、16％エタノール、基質及び150ｍＭ ＮａＣｌを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)）とを準備する。ヒトプール血清あるいはＰＡＦ−ＡＨ精製品溶液の適量を阻害剤溶液と混合した後、これに基質溶液を加えて反応させる。反応のｐＨは、好ましくは、約６．５〜約８．０、最も好ましくは、約７．４である。反応温度は、20℃〜40℃、好ましくは37℃である。基質溶液添加後、適当な時間（例えば、２分目から５分目にかけて）、吸光度を測定し、単位時間当たりの吸光度の変化量を求め、発色性化合物あるいは蛍光発色性化合物の分子吸光係数から、ＰＡＦ-ＡＨ活性値（nmol/min/試料1ml）を求めることができる。
【００８８】
また、レート法により自動測定する場合には、まず、上記阻害剤溶液、基質溶液を準備する。例えば、Ｈ−７１７０型自動分析装置（日立製作所）を用いて、測定のパラメーターに従って、測定する。ヒトプール血清あるいはＰＡＦ−ＡＨ精製品と阻害剤溶液とを混合し、一定時間後、基質溶液を混合して反応を開始する。このときの吸光度変化（タイムコース）をモニターし、反応開始後２分目から５分目にかけての単位時間（１分間）当たりの吸光度の変化量を求める。試料から得られる単位時間当りの吸光度の変化量（ΔＥs）と、試料の代わりに精製水を加えて得られた単位時間当りの吸光度の変化量（ΔＥＢ）、及び反応溶液における発色性化合物あるいは蛍光発色化合物の分子吸光係数（ε）から、下記式により、各血清試料のＰＡＦ-ＡＨ活性値を算出する。
【００８９】
【数１】
0004220603.tif 000009
【００９０】
（ＰＡＦ-ＡＨ活性測定キット）
本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用キットは、基質、必要に応じて、非特異反応抑制剤及びその他の添加剤が添加された上記ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬を含む。キットは、例えば、ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬を含むアンプルの形態、ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬がウエルに一定量注入された形態、あるいはＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬を含む容器と測定用のウエルとを含む形態であり得る。これらの形態のキットに付属のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬に血清試料を添加することにより、ＰＡＦ-ＡＨ活性が測定される。
【００９１】
また、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定用キットは、基質、必要に応じて、非特異反応抑制剤及びその他の添加剤が添加された上記ＰＡＦ-ＡＨ活性測定用試薬を含有する試験片であり得る。試薬が溶液の場合、試薬に浸漬後、乾燥した試験片であってもよい。これを血清等に浸すことにより、定性的にＰＡＦ-ＡＨ活性が確認できる。また、比色表を用いておよその活性を知ることもできる。従って、容器には、このような試験片も含まれる。
【００９２】
さらに、本発明のキットは、上記一般式（Ｉ）で表される基質と、ＰＡＦ-ＡＨを阻害しないが他のエステル分解活性関連物質を阻害する阻害剤（非特異反応抑制剤）を含有する溶液とがそれぞれ、独立した容器に充填されており、使用に際して混合されるようにされていてもよい。この場合、基質は溶液あるいは溶媒に溶解されていてもよく、基質を溶解するための溶液及び／又は溶媒が別途独立した容器に含まれてもよい。どのような形態を選択するかは、基質の安定性、操作性、使用量等を考慮して決定すればよい。
【００９３】
さらに、上記の基質等の他に、吸光度測定のための用具、装置等もキットに含まれ得る。
【００９４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、この実施例によって何等限定されるものではない。
【００９５】
（実施例１：基質の製造）
化合物番号１〜２５の製造例を以下に示す。
【００９６】
（化合物番号１：1-オクタノイル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-オクタノイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ３４０ｍｇ(０．６８ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル８００μｌ(１.６ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール １０４ｍｇ(０.７５ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １３８μＬ(１.３６ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２.５時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、ジエチルエーテルを加え、白濁させ一夜放置した。上澄みを取り、残渣をクロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色油状物 ２１８ｍｇ（５２％）を得た。
【００９７】
（化合物番号２：  1-デカノイル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-デカノイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２７２ｍｇ(０．５５ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル５５０μｌ(１.１ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール ８４ｍｇ(０.６ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １０１μＬ(１.１ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２.５時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮しメタノールでシリカゲルカラム精製をし、さらにクロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色アモルファス晶 １１４ｍｇ（３２％）を得た。
【００９８】
（化合物番号３：1-ラウロイル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ラウロイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２９０ｍｇ(０．５２ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル５２０μｌ(１.０４ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール ７９ｍｇ(０.５７ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １１５μＬ(１.０４ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２.５時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮しクロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、目的画分 １７１ｍｇ（４９％）を得た。
【００９９】
（化合物番号４：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２８３ｍｇ(０．４９ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル４９０μｌ(０.９８ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール １０２.１ｍｇ(０.７４ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １３７μＬ(０.９８ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下2時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）７５ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色アモルファス １８２ｍｇ（５３％）を得た。
【０１００】
NMR（CDCl3)：0.89(t,3H,J=7.0Hz) , 1.25(s,20H), 150-1.65(m,2H), 1.95-2.12 (m,2H), 2.29(t,2H,J=7.7 Hz), 2.40-2.55(m,2H), 2.71(t,2H,J=7.3 Hz) , 3.38(s,9H),  3.80(br,2H), 3.92-4.05(m,2H), 4.10-4.20(m,1H), 4.25-4.45(m,3H), 5.15-5.30(m,1H), 7.31(d,2H), 8.29(d,2H)；
MS(SIMS)：703(MH+)
【０１０１】
（化合物番号５：1-オレオイル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-オレオイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ３５０ｍｇ(０．５５ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル５５０μｌ(１.１ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール ８４ｍｇ(０.６１ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １５３μＬ(１.１ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２.５時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、シリカゲルカラム精製（メタノール）をし、目的画分 ３０３ｍｇ（７３％）を得た。
【０１０２】
（化合物番号６：1-アルキル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-アルキル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２６７ｍｇ(０．４５ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル４５０μｌ(０.９ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール ６９ｍｇ(０.５ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １２５μＬ(０.９ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２.５時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮しメタノールでシリカゲルカラム精製をし、さらにクロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色アモルファス晶 １４６ｍｇ（４５％）を得た。
【０１０３】
（化合物番号７：1-アルケニル-2-(4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンンの合成)
化合物番号６の合成と同様に実施し、黄色アモルファス晶 ９８ｍｇ（６０％）を得た。
【０１０４】
（化合物番号８：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルサクシニル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-サクシニルホスファチジルコリン ２００ｍｇ(０．３５ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル３５０μｌ(０.７１ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 4-ニトロフェノール １５４ｍｇ(０.３９ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン ９８μＬ(０.７１ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下１.５時間撹拌した後この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、淡黄色油状物２２９ｍｇ（６４％）を得た。
【０１０５】
NMR（CDCl3)：0.80-0.95(m,3H), 1.26(br,20H), 1.57(br,2H), 2.22-2.29(m,2H), 2.75-2.82(m,2H), 2.82-2.93(m,2H), 3.34(s,9H), 3.79(br,2H) , 4.01(br,2H) , 4.10-4.22(m,1H), 4.22-4.48(m,4H), 5.27(br,1H), 7.30-7.36(m,2H), 8.27-8.32(m,2H)；MS(SIMS)：689(MH+)
【０１０６】
（化合物番号９：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルアジポイル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
化合物番号８の合成と同様に実施し、黄色油状物  １６７ｍｇ（５２％）を得た。
【０１０７】
（化合物番号１０：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルピメロイル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
化合物番号８の合成と同様に実施し、黄色油状物  ３４１ｍｇ（８２％）を得た。
【０１０８】
（化合物番号１１：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルスベロイル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
化合物番号８の合成と同様に実施し、黄色油状物  １１４ｍｇ（３４％）を得た。
【０１０９】
（化合物番号１２：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルアゼロイル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
化合物番号８の合成と同様に実施し、黄色油状物  １９０ｍｇ（７６％）を得た。
【０１１０】
NMR（CDCl3)：0.89(m,3H) , 1.20-1.50(m,26H) , 1.60(br,4H) , 1.70-1.85(m,2H), 2.30(m,4H), 2.61(t,2H,J=7.46 Hz), 3.38(s,9H), 3.83(br,2H), 3.90-4.02(m,2H), 4.10-4.22(m,1H), 4.25-4.50(m,3H),  5.23(br,1H)，7.21-7.35(m,2H)，8.20-8.35(m,2H)。
【０１１１】
（化合物番号１３：1-ミリストイル-2-(2-クロロ-4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン １７７ｍｇ(０．３ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル３００μｌ(０.６ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、2-クロロ-4-ニトロフェノール １０４ｍｇ(０.６ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン ８４μＬ(０.６ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下３日間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色油状物 １５６ｍｇ（７１％）を得た。
【０１１２】
（化合物番号１４：1-ミリストイル-2-[(4-メチル）クマリルグルタリル]-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン １９１ｍｇ(０．３３ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル３２８μｌ(０.６７ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、４−（メチル）クマリン １１５ｍｇ(０.６７ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン ９１.４μＬ(０.６７ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下４日間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）６０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、無色アモルファス１８３.２ｍｇ（７６.５％）を得た。
【０１１３】
NMR（CDCl3)：0.89(t,3H,J=6.9 Hz),  1.25(br,20H), 1.50-1.65(m,2H), 1.95-2.12(m,2H), 2.29(t,2H,J=7.7 Hz), 2.44 (s,3H), 2.47-2.51(m,2H), 2.70(t,2H,J=7.2 Hz), 3.38(s,9H), 3.82(br,2H), 3.98-4.03(m,2H)，4.11-4.22(m,1H), 4.30-4.48(m,3H), 5.19-5.32 (m,1H), 6.27(s,1H), 7.00-7.11(m,1H), 7.11-7.20(m,1H), 7.58-7.70(m,1H)；MS(SIMS)：726(MH+)
【０１１４】
（化合物番号１５：1-ミリストイル-2-(2-フルオロ-4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２６６ｍｇ(０．４６ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル４５７μｌ(０.９１ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下１.５時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、 2-フルオロ−４−ニトロフェノール １０７.７ｍｇ(０.６９ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １２７.４μＬ(０.９１ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下３時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）７０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色アモルファス ２６０ｍｇ（７９％）を得た。
【０１１５】
（化合物番号１６：1-ミリストイル-2-(3-フルオロ-4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
化合物番号１５の合成と同様に実施し、黄色アモルファス晶  １７１ｍｇ  （６２％）を得た。
【０１１６】
（化合物番号１７：1-ミリストイル-2-(４−ニトロチオフェニル）グルタリルホスファチジルコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２２７ｍｇ(０．３９ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル３９０μｌ(０.７８ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、４−ニトロチオフェノール ９０.８ｍｇ(０.５９ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １０８.３μＬ(０.７８ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）７０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、褐色油状物 ２０２ｍｇ（７２％）を得た。
【０１１７】
NMR（CDCl3)：0.80-0.98(m,3H), 1.27(br,20H), 1.59(br,2H)，1.92-2.12(m,2H), 2.20-2.35(m,2H),  2.35-2.52(m,2H), 2.70-2.88(m,2H), 3.37(s,9H), 3.82(br,2H), 3.90-4.02(m,2H), 4.02-4.20(m,1H), 4.22-4.47(m,3H), 5.22(br,1H), 7.51-7.65(m,2H), 8.15-8.31(m,2H)；  MS(SIMS)：719(MH+)。
【０１１８】
（化合物番号１８：1-ミリストイル-2-(5-インドリルオキシグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２０５ｍｇ(０．３５ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル３５２μｌ(０.７ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、５−ヒドロキシインドール ７０.４ｍｇ(０.５３ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン ９８.２μＬ(０.７ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下２時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）７０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮しクロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色油状物  １４３ｍｇ（５９％）を得た。
【０１１９】
NMR（CDCl3)：0.80-1.00(m,3H), 1.20-1.40(m,20H), 1.50-1.65(m,2H), 1.91-2.15(m,2H), 2.18-2.35(m,2H), 2.35-2.51(m,2H), 2.51-2.70(m,2H), 2.78(s,9H), 3.00-3.29(m,3H), 3.89-4.27(m,5H), 4.27-4.50(m,1H), 5.21(br,1H), 6.41(s,1H), 6.70-6.90(m,1H), 7.21(s,1H), 7.40-7.65(m,1H), 11.18(s,1H)；  MS(SIMS)：697(MH+)。
【０１２０】
（化合物番号１９：1-ミリストイル-2-(2,6-ジフェニル-4-ニトロフェニルグルタリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グルタリルホスファチジルコリン ２５４ｍｇ(０．４４ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル  ４３７μｌ(０.８７ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、室温撹拌下、２，６−ジフェニル−４−ニトロフェノール  １９１ｍｇ(０.６５ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン １２２μＬ(０.８７ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下１６時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）７０ｍｌを加え、水洗（１５ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色油状物  ２１９ｍｇ（５８％）を得た。
【０１２１】
NMR（CDCl3)：0.89(t,3H,J=7.2 Hz), 1.26(br,20H), 1.26-1.61(m,4H), 1.91(t,2H,J=7.6 Hz), 2.14(t,2H,J=7.1 Hz), 2.26(t,2H,J=7.8 Hz), 3.31(s,9H), 3.74(br,2H), 3.92(t,2H,J=6.0 Hz), 4.00-4.15(m,1H), 4.28(br,2H), 4.30-4.42(m,1H), 5.14(br,1H), 7.32-7.50(m,10H), 8.28(s,2H)；  MS(SIMS)：855(MH+)。
【０１２２】
（化合物番号２０：1-ミリストイル-2-(4-ニトロフェニルグライコリル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成)
1-ミリストイル-2-グライコリルホスファチジルコリン 164ｍｇ(０．28ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル  281μｌ(０.56ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、４−ニトロフェノール  43.0ｍｇ(０.31ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン 78μＬ(０.56ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下2時間撹拌した後、０.１規定塩酸 １ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）56ｍｌを加え、水洗（14ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、黄色油状物  102ｍｇ（５1％）を得た。
【０１２３】
（化合物番号２１：1-ミリストイル-2-[5-ジメチルアミノ-2-（２−チアゾリルアゾ）フェニルサクシニル]-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成）
1-ミリストイル-2-サクシニルホスファチジルコリン 419ｍｇ(０．74ｍｍｏｌ) をクロロホルム（脱水)6ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル  738μｌ(1.48ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下２.5時間撹拌した。減圧濃縮後クロロホルム（脱水)6ｍｌに溶解し室温撹拌下、5-ジメチルアミノ-2-（２−チアゾリルアゾ）フェノール  202ｍｇ(０.81ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン 206μＬ(1.48ｍｍｏｌ)、クロロホルム（脱水)6ｍｌの溶液を加えた。室温下2時間撹拌した後、０.１規定塩酸 2ｍｌを加えた。この溶液にクロロホルム：メタノール（2：1）150ｍｌを加え、水洗（30ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮し、クロロホルム-メタノール-水系でシリカゲルカラム精製を行い、赤色油状物  247ｍｇ（42％）を得た。
【０１２４】
（化合物番号２２：1-ミリストイル-2-[1-（２−トリアゾリルアゾ）−２−ナフチルサクシニル]-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成）
化合物番号２１の合成と同様に実施し、赤褐色油状物  64mg (14%)  を得た。
【０１２５】
（化合物番号２３：1-ミリストイル-2-[（４−ニトロフェニル）ジメチルサクシニル]-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成）
化合物番号２１の合成と同様に実施し、白色アモルファス晶  150ｍｇ（49％）を得た。
【０１２６】
（化合物番号２４：1-ミリストイル-2-[（６−フラボンオキシル）サクシニル]-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成）
化合物番号２１の合成と同様に実施し、白色アモルファス晶  ２９５ｍｇ（６８％）を得た。
【０１２７】
NMR（CDCl3)：0.87(t,3H,J=6.9 Hz), 1.24(br,20H), 1.46-1.64(m,2H), 2.25(t,2H,J=7.7 Hz), 2.65-3.09(m,6H), 3.33(s,9H), 3.78(br,2H), 4.00(t,2H,J=6.7Hz), 4.09-4.20(m,1H), 4.23-4.43(m,3H), 5.17-5.31(m,1H), 5.41-5.56(m,1H), 7.10-7.65(m,8H)。
【０１２８】
（化合物番号２５：1-パルミトイル-2-（４−ニトロフェニルグルタニル）-ｓｎ-グリセロ-ホスホコリンの合成）
1-パルミトイル-2-グルタリルホスファチジルコリン 320ｍｇ(0.51ｍｍｏｌ) をジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し、氷冷下２Ｍ塩化オキザリル  765μｌ(1.53ｍｍｏｌ)を加えた後、室温下1.5時間撹拌した。減圧濃縮後ジクロロメタン（脱水)３ｍｌに溶解し室温撹拌下、４−ニトロフェノール  104ｍｇ(0.75ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン 139μＬ(1.02ｍｍｏｌ)、ジクロロメタン（脱水)３ｍｌの溶液を加えた。室温下2.5時間撹拌した後、減圧濃縮した。これにクロロホルム：メタノール（2：1）75ｍｌを加え、水洗（15ｍｌ）した。下層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム精製（メタノール）を行い、黄色アモルファス203.6ｍｇ（55％）を得た。
【０１２９】
（実施例２：ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定；基質特異性）
（酵素ＰＡＦ-ＡＨの精製例）
ヒト血漿約４００ｍｌをＫＢｒで比重ｄ＝１．０６３に調製し、遠心分離して、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、及びＬＤＬを含む画分を得た。10ｍＭ ＣＨＡＰＳを含む50ｍＭ トリス-塩酸（Tris-HCl）緩衝液（pH 7.4）で透析後、予め 10ｍＭ ＣＨＡＰＳを含む50ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（pH 7.4）で平衡化したＱセファロースカラムに付した。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ(0-0.5M)の直線グラジュエントにより溶出した。溶出されたＰＡＦ−ＡＨ活性部分をセントリップ３０で濃縮し、10ｍＭ ＣＨＡＰＳ, 0.3Ｍ ＮａＣｌを含む50ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（pH 7.4）で平衡化したセファクリルＳ−２００に付した。同じ緩衝液で溶出させたＰＡＦ−ＡＨ活性部分をセントリップ３０で濃縮すると共に緩衝液を10ｍＭ ＣＨＡＰＳ, 0.3Ｍ ＮａＣｌを含む25ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（pH 7.4）で平衡化したブル−セファロースカラムに付した。同じ緩衝液で洗浄した後、10ｍＭ ＣＨＡＰＳ, 1.5Ｍ  ＮａＣｌを含む50ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）で溶出した。ＰＡＦ−ＡＨ活性部分をセントリップ３０で濃縮し、精製ＰＡＦ−ＡＨとした。
【０１３０】
（活性の測定）
上記合成した化合物番号１〜１３、１５〜１７、２０及び２５について、ＰＡＦ−ＡＨ活性を測定した。
以下の溶液、
緩衝液：150ｍＭ  ＮａＣｌ、10ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)；及び、
基質溶液：４ｍＭの基質、90ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び４０％エタノールを含む３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)を調製した。
【０１３１】
上記方法で得られたＰＡＦ−ＡＨ精製品10ｕlと緩衝液900ｕlとを混合し、37℃の恒温槽に5分放置した後、基質溶液を100ｕl添加して、反応を開始した。基質溶液添加後、２分目から５分目にかけての単位時間（１分間）当たりの吸光度の変化量（ΔＥＳ）とパラニトロフェノールの分子吸光係数ε＝12000（ただし、化合物番号１３、１５及び１６の化合物においては分子吸光係数ε＝18000を使用）とからＰＡＦ-ＡＨ活性値（nmol/min/試料1ml）を上記の式により、算出した。その結果を表１に示す。式中、ΔＥＢは試料の代わりに精製水を加えて測定した値である。
【０１３２】
【表１】
0004220603.tif 000010
【０１３３】
この結果から、化合物番号８の１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（一般式（Ｉ）のＡ＝２）が最も基質特異性が高いことがわかった。これは、一般的に使用される化合物番号４の１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（一般式（Ｉ）のＡ＝３）よりも、４倍以上も基質特異性が高いことを示している。
【０１３４】
一般式（Ｉ）のＡ＝４〜７の化合物（化合物番号９〜１２）もＰＡＦ−ＡＨ活性が検出されたが、Ａが小さいほど活性は高い傾向にある。また、一般式（Ｉ）のアシル基（Ｒ１）の炭素数が８〜１８（化合物番号１〜５、及び２５）の場合も活性が検出された。また、Ｒ１がアルキル基、アルケニル基（化合物番号６及び７）の場合も活性が検出された。Ｒ１は、あまり活性には大きな影響を与えないようであった。更に、ハロゲン置換ニトロフェニル化合物を遊離する基質（基質番号１３、１５及び１６）も、有用であることが示された。
【０１３５】
以下、特異性が高い基質（化合物番号８：１−ミリストイル−２−（４−ニトロフェニルサクシニル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、以下、本発明の基質という）を用いた実施例を示す。
【０１３６】
（実施例３：ＰＡＦ-ＡＨ活性の測定；阻害剤の効果）
以下の阻害剤溶液と基質溶液とをそれぞれ、調製した。
阻害剤溶液：表２に記載の阻害剤を、150ｍＭ ＮａＣｌを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)に、表２に記載の濃度で溶解した。
基質溶液：４ｍＭの本発明の基質、４０％エタノール及び９０ｍＭ ＮａＣｌを含む３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)。
【０１３７】
ヒトプール血清又はＰＡＦ−ＡＨ精製品10ｕlと阻害剤溶液900ｕlとを混合し、37℃の恒温槽に5分放置した後、基質溶液100ｕlを添加して、反応を開始した。基質溶液添加後、２分目から５分目にかけての単位時間（１分間）当たりの吸光度の変化量（ΔＥ）とパラニトロフェノールの分子吸光係数ε＝12000とからＰＡＦ-ＡＨ活性値（nmol/min/試料1ml）を算出した。その結果を表２に示す。
【０１３８】
【表２】
0004220603.tif 000011
【０１３９】
各種阻害剤存在下において、ヒトプール血清とＰＡＦ−ＡＨ精製品とでは、その阻害の程度に大きな差異が観察された。すなわち、ＰＡＦ−ＡＨ精製品が、ほぼ、90％以上の活性を保持している（阻害剤による活性の低下が小さい）のに対し、ヒトプール血清には90％以上の活性が保持されているものがない。これは、ＰＡＦ−ＡＨ精製品が精製された結果、非特異的加水分解反応を生じる物質の含有量が少ないため、阻害剤により相対活性が低下しにくいと考えられるのに対して、ヒトプール血清には非特異的加水分解反応を生じる物質が多く含まれており、阻害剤によってこの非特異的加水分解活性が抑制された結果、相対活性が低下したことを示唆する。
【０１４０】
（実施例４：ＰＡＦ−ＡＨ活性の測定：従来法との相関）
以下の試薬を準備した。
試薬１(A)：150ｍＭ ＮａＣｌを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)
試薬２(A)：基質溶液；1.6ｍＭの本発明の基質、16％エタノール及び150ｍＭ ＮａＣｌを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)；
試薬１(B)：阻害剤溶液；150ｍＭ ＮａＣｌ、10ｍＭ EDTA、1ｍＭ ラウリル硫酸ナトリウム、5ｍＭ ＣＨＡＰＳを含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)；及び
試薬２(B)：阻害剤を含む基質溶液；150ｍＭ ＮａＣｌ、10ｍＭ EDTA、1ｍＭ ラウリル硫酸ナトリウム、5ｍＭ ＣＨＡＰＳ、16％エタノール及び 1.6ｍＭの本発明の基質を含む50ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH7.4)。
血清試料：５種類の試料Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５。
【０１４１】
ＰＡＦ−ＡＨ活性の測定には、Ｈ−７１７０型自動分析装置（日立製作所）を使用した。測定時のパラメーターは、以下の通りである。
【０１４２】
【表３】
0004220603.tif 000012
【０１４３】
上記パラメーターに従って、血清試料５ｕlと試薬１(A)（緩衝液）又は１(B)（阻害剤溶液）240ｕlとを分注して混合し、一定の恒温時間（37℃、５分間）の後、試薬２(A)（基質溶液）又は試薬２(B)（阻害剤を含む基質溶液）80ｕlを添加、混合して、反応を開始した。このときの吸光度変化（タイムコース）を図１ならびに図２に示す。試料と試薬１(A)又は１(B)の混合液に本発明の基質を含む溶液を添加すると、ＰＡＦ−ＡＨと本発明の基質との反応によって本発明の基質から生成する４−ニトロフェノールに由来する吸光度の上昇が確認された。
【０１４４】
図１及び図２の比較から明らかなように、阻害剤が存在しない場合（図１）より、阻害剤が存在する場合（図２）の方が吸光度の上昇が抑制されている。このことも、阻害剤により基質の非特異的加水分解が抑制されることを示唆している。
【０１４５】
ＰＡＦ−ＡＨ活性は、基質（試薬２(A)又は試薬２(B)）の添加後２分目から５分目にかけての単位時間（１分間）当たりの吸光度の変化量（ΔＥ）とパラニトロフェノールの分子吸光係数ε＝12000を用いて計算し、各血清試料のＰＡＦ-ＡＨ活性値を算出した。
【０１４６】
他方で、従来法である、放射性標識したＰＡＦを基質に用いてヒト血清ＰＡＦ-ＡＨ活性を測定し、本発明の方法の有用性を確認した。
【０１４７】
１-O-オクタデシル［オクタデシル-９,10-３H(N)］２-O-アセチル-ｓｎ-グリセロホスホコリン（NEN社, NET-1009）５pmole（18.5kBq）、1-O-オクタデシル-２-O-アセチル-ｓｎ-グリセロホスホコリン(BACHEM FEINCHEMIKALIEN AG社, O-1355)34pmole、及びヒト血清適量（50-100倍希釈、6.5-37.5ul、各サンプル３濃度段階）を 100ｍＭ トリス-塩酸緩衝液(pH7.4), 5ｍＭ EDTAに懸濁し、全量を0.1mlにして37℃で10分間インキュベートした。反応終了後、Bligh & Dyer法により脂質を抽出した。即ち、クロロホルム0.125mlとメタノール0.25mlを加えて2分間振とうし、次に、クロロホルム0.125mlを加えて30秒間振とうし、最後に、水を0.1ml加えて30秒間振とうする。その後、遠心分離(400g、3分間)し、下層（有機層）0.04mlをＴＬＣ（Merck, 5554-1M）にスポットし、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝65：35：6）で展開した。放射能は、フジフィルム社製バイオイメージングアナライザーMacBAS5000を用いて測定した。酵素活性は試料であるヒト血清の用量（μｌ）と反応時間（１０分）とで測定された放射能により換算される生成リゾＰＡＦ量（ｎｍｏｌ）を用いて、単位時間、単位液量当りに生成するリゾＰＡＦのモル数を求め、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌで表した。
【０１４８】
本発明の基質を用いた測定の結果（Ｙ）と放射性標識ＰＡＦを用いた測定結果（Ｘ）との相関を、阻害剤なしの場合を図３に、阻害剤ありの場合を図４にそれぞれ示した。阻害剤なしの場合（図３）の回帰直線は、Ｙ＝２０６Ｘ＋３０７、相関係数は、Ｒ＝０．９７０であった。阻害剤ありの場合（図４）の回帰直線は、Ｙ＝１７９Ｘ＋９３．６、相関係数は、Ｒ＝０．９９７であった。このように、いずれの場合においても、強い相関関係がみられ、かつ、阻害剤がある場合は、極めて強い相関関係が見られ、本発明の基質及び本発明の測定方法の有用性が確認された。
【０１４９】
（実施例５：ＰＡＦ-ＡＨの測定）
実施例４と同様、本発明の基質を用い、正常域プール血清（商品名：ネスコール-Ｘ  製造元  財団法人 化学及血清療法研究所、発売元株式会社アズウェル）中のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定した。それらの各試験を10回繰り返し行った測定結果を表４に示す。
【０１５０】
【表４】
0004220603.tif 000013
【０１５１】
表４に示すように、本発明の方法は、精度良く血清中のＰＡＦ−ＡＨ活性を測定する方法であることが確認された。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定法によれば、放射性標識基質を用いることなく、試料中のＰＡＦ-ＡＨ活性を直接測定することが可能となるので、日常の検査に安全、迅速、簡単な測定方法として充分利用できる。
また、本発明のＰＡＦ-ＡＨ活性測定法は、従来の方法より測定時間が短縮されること、種々エステラーゼやエステラーゼ様物質の影響を受けないこと、発色性化合物をモニターすることにより直接的にＰＡＦ-ＡＨ活性を測定することができる等の利点を有するため、従来の、発色系へ誘導する酵素や試薬を使用する方法に比べて、より正確、かつ迅速な測定が可能であることから、疾患の検定、予後の経過を短時間で診断できるようになる。従って、本発明は、極めて有用性が高い、ＰＡＦ−ＡＨ活性測定法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】阻害剤がない場合の試料中のＰＡＦ-ＡＨ活性を測定した時のタイムコースを示した図である。
【図２】阻害剤がある場合の試料中のＰＡＦ-ＡＨ活性を測定した時の吸光度の変化を示した図である。
【図３】阻害剤を用いない測定方法と放射性標識基質を用いる測定方法との相関を示した図である。
【図４】阻害剤を用いる場合の測定方法（本発明の測定方法）と放射性標識基質を用いる測定方法との相関を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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