(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
【化１】
0004380913.tif 000011
で表される化合物であることを特徴とするＦＴ−０５５４物質。
【請求項２】
糸状菌に属し、下記式［Ｉ］
【化２】
0004380913.tif 000012
で表されるＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有するアスペルギルス  ニガー  ＦＴ−０５５４  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４３を培地で培養し、培養物中にＦＴ−０５５４物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＴ−０５５４物質を採取することを特徴とするＦＴ−０５５４物質の製造法。
【請求項３】
請求項１に記載のＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有するアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger)ＦＴ−０５５４  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４３株。
【請求項４】
下記式［Ｉ］
【化３】
0004380913.tif 000013
で表されるＦＴ−０５５４物質を有効成分とするＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、寄生虫とくに蠕虫の感染症に有効な新規ＦＴ−０５５４物質およびその製造法に関するものである。
従来の技術
寄生虫症は衛生環境の改善、駆虫薬の進歩等により減少してきたが、近年になって輸入寄生虫症、人獣共通寄生虫症、日和見寄生虫症、生鮮食品に由来する寄生虫症などが目立つようになり、改めて大きな問題となっている。また牧畜や農業においても、寄生虫症は多大な経済的負担をもたらしている。寄生虫の中で蠕虫の感染症については、現在、たとえばイベルメクチン、メベンダゾール、プラジカンテルなど多くの化合物が使用されている。
発明が解決しようとする課題
しかし、現在、使用されているこれらのイベルメクチン、メベンダゾール、プラジカンテルなどの抗蠕虫剤がその有効性、毒性などの面ですべて満足できるとはいい難く、これらの問題点を解決し得る薬剤が強く要望されている。
従って、本発明はこのような要望を満足し得る新規ＦＴ−０５５４物質およびその製造法を提供するにある。
課題を解決するための手段
本発明者らは、抗蠕虫剤の有望な標的の一つである電子伝達系の中のＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼに注目し、本酵素の阻害物質について微生物培養物中からの探索を続けた。その結果、糸状菌に属するＦＴ−０５５４株の生産する新規化合物のＦＴ−０５５４物質が、ＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記式〔Ｉ〕
0004380913.tif 000002
で表される化合物であることを特徴とするＦＴ−０５５４物質に関する。
更に、本発明は下記式〔Ｉ〕
0004380913.tif 000003
で表される糸状菌に属するＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養物中にＦＴ−０５５４物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＴ−０５５４物質を採取することを特徴とするＦＴ−０５５４物質の製造法に関する。
更にまた本発明は、糸状菌に属し、ＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有する微生物が、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＴ−０５５４である。またさらに本発明は、糸状菌に属し、ＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有する微生物であり、該微生物がアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｎｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＴ−０５５４である。
ＦＴ−０５５４物質生産菌については、糸状菌で、ＦＴ−０５５４物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明のＦＴ−０５５４物質を生産するために使用される菌株の好適な一例としては、本発明者らによって新たに採取した海綿より分離された糸状菌ＦＴ−０５５４株が挙げられる。
本菌株の菌学的性状を示すと以下の通りである。
ＦＴ−０５５４株の菌学的性状
（１）各種寒天培地上での培養性状
本菌を２５℃、７日間培養した場合の肉眼的に観察した結果は第１表に示したとおりである。
0004380913.tif 000004
0004380913.tif 000005
（２）形態的特徴
本菌株は、海水（塩分濃度３．４％）を５０％含むツァペック・イーストエキス寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖２０％入りツァペック・イーストエキス寒天培地、バイレショ・ブドウ糖寒天培地などで良好に生育し、分生子も豊富に着生した。
ツァペック・イーストエキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は透明で隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸より直生し、その長さは５００μｍ〜２．５ｍｍで、基部にはｆｏｏｔ−ｃｅｌｌを生じる。分生子柄の先端は球形から亜球形に肥大し、直径３５〜６０μｍの頂嚢を形成する。
アスペルギラは、複列性でメトレ、フィアライドからなりそれぞれ大きさは、８．４〜１１．４×２．４〜３．４μｍ、５．４〜８．６×２．８〜３．３μｍで、メトレが頂嚢の全体を覆い、球形から円柱状に分裂した分生子頭を形成する。分生子は球形で大きさは直径３〜４．５μｍでその表面は滑面からやや粗面である。
（３）生理学的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ５〜７、温度１６〜３６℃、海水濃度（注１）５０〜１００％である。
注１：塩分濃度３．４％の天然海水を使用
２）生育範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ３〜１０、温度１２〜４５℃、海水濃度（注２）０〜１００％である。
注２：塩分濃度３．４％の天然海水を使用
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
以上のように、本菌株ＦＴ−０５５４株の培養性状、形態的特徴および生理学的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株をアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）属に属する一菌株と同定し、アスペルギルス  ニガー  ＦＴ−０５５４と命名した。
本菌株は、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＴ−０５５４として、茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在する工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年９月１日付でＦＥＲＭ  Ｐ−１６３９９として寄託されている。更に、本菌株は平成１０年７月３１日に茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求を行い、国際寄託当局より受託番号としてＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４３が付与された。
本発明のＦＴ−０５５４物質を製造するに当たっては、先ず糸状菌に属するＦＴ−０５５４物質を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から分離・精製すればよい。本発明に用いることのできる菌株は上記菌株、その変異株をはじめ、糸状菌に属するＦＴ−０５５４物質生産菌のすべてが使用できる。
上記ＦＴ−０５５４物質生産に適した栄養源としては、糸状菌の栄養源として使用し得るものであればよい。例えば、市販のペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの水和物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、グリセリン、澱粉、グルコース、ガラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使用できる。
その他必要に応じて微量の金属塩、消泡剤として動物・植物・鉱物油等を添加することもできる。これらのものは生産菌が利用しＦＴ−０５５４物質の生産に役立つものであればよく、公知の糸状菌の培養材料はすべて用いることができる。ＦＴ−０５５４物質の大量培養には液体培養が好ましく、培養温度は生産菌が発育し、ＦＴ−０５５４物質を生産できる範囲で適用できる。培養は以上に述べた条件を使用するＦＴ−０５５４物質生産菌の性質に応じて適宜選択して行うことができる。
ＦＴ−０５５４物質は、培養液よりクロロホルム、酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出することができる。上述の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフイー、ゲル濾過クロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイー等を適宜組み合わせあるいは繰り返すことによって純粋に採取することができる。
本発明によるＦＴ−０５５４物質の理化学的性状は次の通りである。
（１）性状：白色粉末または飴状
（２）分子量：３６１．２３７４（Ｍ＋Ｈ、高分解能高速原子衝撃質量分析による）
（３）分子式：Ｃ２２Ｈ３２Ｏ４
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋３５．３°（ｃ＝０．１、１−プロパノール）
（５）紫外部吸収極大（１−プロパノール中）：第１図に示すとおり、２０５ｎｍ（ショルダー、ε＝１０８００）、２３１ｎｍ（ε＝２１０００）に極大吸収を有する。
（６）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：第２図に示すとおり、３４３０、２９６０、２９２０、２８５０、１７４０、１６６０、１４６０、１４００、１３８０、１１８０、１１２０、１０００ｃｍ−１に極大吸収を有する。
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）およびスピン結合定数（Ｈｚ）は第２表に示すとおりである。
（８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中の化学シフト（ｐｐｍ）は第２表に示すとおりである。
（９）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、エタノール、１−プロパノール、トルエン、酢酸エチルに可溶。水、ｎ−ヘキサンに難溶。
（１０）呈色反応：硫酸、ヨウ素に陽性。
0004380913.tif 000006
0004380913.tif 000007
但し、第２表中において、ｓは一重線、ｄは二重線、ｔは三重線、ｑは四重線、ｍは多重線、Ｈはプロトンの数、Ｊはスピン結合（Ｈｚ）を示す。
以上のように、ＦＴ−０５５４物質の各種理化学的性状やスペクトルデータ詳細に検討した結果、ＦＴ−０５５４物質は下記式〔Ｉ〕で表される化学構造であることが決定された。
0004380913.tif 000008
上記したように、ＦＴ−０５５４物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報告されておらず、ＦＴ−０５５４物質は新規物質であると決定した。
本発明のＦＴ−０５５４物質のＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ阻害活性は次のとおりである。
豚回虫筋肉を１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中でホモジナイズ後３，０００×ｇ、１０分間遠心して上清を集めた。それをさらに１０，０００×ｇ、２０分間遠心して沈殿を集めた。その沈殿を１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）に懸濁することにより、ミトコンドリア画分とした。
次に、９６穴マイクロプレートに１０μｌの５０％ジメチルスルホキシド溶液試料を添加後、０．３５ｍＭのＮＡＤＨ、７．２ｍＭのフマル酸二ナトリウム、１８ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含んだ１２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を加えて、マイクロプレートリーダーＥＬｘ８０８（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）にて３７℃、５分間プレインキュベーション行った。
そこに豚回虫ミトコンドリア画分を１０μｌ（蛋白量０．３ｍｇ）添加して、３７℃、１０分間インキュベーションを行い、３４０ｎｍのＮＡＤＨの吸収を１５秒ごとに測定した。３４０ｎｍの吸光度の減少の傾きをＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ酵素活性として定量した結果、ＦＴ−０５５４物質は２．８μＭの濃度でＮＡＤＨ−フマル酸レダクターゼ活性を５０％阻害した。したがって、ＦＴ〜０５５４物質は蠕虫感染症の治療用あるいは予防用薬剤として使用し得ることが期待される。
本発明のＦＴ−０５５４物質の抗菌活性は次のとおりでる。
濾紙円板（アドバンテック社製、直径６ｍｍ）に本発明物質の１ｍｇ／ｍｌのクロロホルム溶液をそれぞれ１０μｌ浸漬し、一定時間、風乾して溶媒を除去後、これを試験菌含有寒天平板に張りつけ、３７℃あるいは２７℃で２４時間培養後、濾紙円板の周りにできた生育阻止円の直径を下記第３表に示した。
0004380913.tif 000009
0004380913.tif 000010
上記の第３表から明らかなように、本発明のＦＴ−０５５４物質は、いくつかの微生物に対して弱い生育阻害活性を示した。
発明の実施の態様
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定さるものではない。
実施例
寒天斜面培地で培養したアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＦＴ−０５５４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４３）より、グルコース２．０％、ポリペプトン（日本製薬社製）０．５％、寒天０．１％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製）０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、リン酸二水素カリウム０．１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を５０％天然海水（塩分濃度３．４％の天然海水を使用）に溶解し、１００ｍｌずつ分注した５００ｍｌ容三角フラスコ１本に１白金耳ずつ接種し、２７℃で２日間振とう培養した。
次いで、これを種培養液として、ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）２．４％を５０％天然海水（塩分濃度３．４％の天然海水を使用）に溶解した液体培地（ｐＨ６．５）を１００ｍｌずつ分注した５００ｍｌ容三角フラスコ３０本に１ｍｌずつ接種し、２７℃で９６時間振とう培養した。
培養液は遠心分離し、得られた菌体をエタノール３リットルで抽出し、減圧濃縮してエタノールを留去後、更にｎ−ヘキサンで抽出して減圧濃縮し、１．９ｇの粗物質Ｉを得た。これをｎ−ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（９５ｇ、Ｍｅｒｃｋ  Ａｒｔ．７７３４）にのせ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１０：１）で洗浄後ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１０：２）で溶出し、減圧濃縮により２２．７ｍｇの粗物質ＩＩを得た。これをシリカゲル薄層プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ａｒｔ．５７４４）にのせ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で展開して活性画分をかき取り、それをクロロホルム−メタノール（２：１）で溶出し、減圧濃縮することにより、１３．４ｍｇの粗物質ＩＩＩを得た。更に、これを溶出溶媒にクロロホルム−メタノール（１：２）を用いたセファデックスＬＨ−２０カラムにかけ、これを減圧濃縮することで白色粉末のＦＴ−０５５４物質１０．０ｍｇを得た。
発明の効果
以上に説明したように、本発明のＦＴ−０５５４物質は、寄生虫の感染症に対して満足し得る有用な薬剤として期待される。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のＦＴ−０５５４物質の１−プロパノール溶液（５０μＭ）の紫外部吸収スペクトルを示したものである。
第２図は本発明のＦＴ−０５５４物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
【図１】
0004380913.tif 000014
【図２】
0004380913.tif 000015