(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRL-12568としてアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ American Type Culture Collection ）に寄託されている細胞をプロモーターに作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子の活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチドでトランスフェクションした細胞を、該タンパク質を発現するのに十分な条件下で成長させ、次いで該タンパク質を単離することを特徴とする、第ＶＩＩＩ因子の活性を有するタンパク質の単離および生産方法。
【請求項２】
タンパク質が配列番号１に表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を血漿由来のタンパク質を含まない培地で成長させた場合に、該タンパク質が少なくとも２μＵ／ｃ／ｄのレベルで発現されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が少なくとも４μＵ／ｃ／ｄのレベルで発現されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が少なくとも５μＵ／ｃ／ｄのレベルで発現されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
CRL-12582としてアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ American Type Culture Collection ）に寄託されている細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願：ＭＳＢ−７２４１（米国第０９／２０９，９２０号）、「哺乳動物遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）への出願、およびＭＳＢ−７２５４（米国第０９／２０９，９１５号）、「エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列を有するベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）」と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）およびチャン（Ｃｈａｎ）への出願は関連する主題を含有する。双方の出願は１９９８年１２月１０日に出願された。
【０００２】
（発明の背景）
分野：本発明は第ＶＩＩＩ因子およびその誘導体の改良された製造方法に関する。該方法は、全般的に、ベクター構築、トランスフェクション、およびタンパク質を含まない条件下で高められた生産性をもつ細胞系の選択に関する。とりわけ、本発明は、工業的スケールでの第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性をもつタンパク質の製造方法に関する。
【０００３】
背景：ヒト第ＶＩＩＩ因子は補助因子として第Ｘ因子および第ＩＸａ因子の活性化に関与する微量の血漿糖タンパク質である。第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠乏は第Ｘ因子に関連する出血性障害、血友病Ａをもたらす。血友病Ａは精製された第ＶＩＩＩ因子で成功裏に治療することができる。血友病Ａの置換療法は、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子の使用から、哺乳動物細胞中で第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡをクローン化しかつ発現することにより得られる組換え第ＶＩＩＩ因子の使用まで進化した。（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３０）。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子はＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２のドメイン構造を有し、そして２３５１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドとして合成され、小胞体の管腔への移動に際してこれから１９アミノ酸のシグナルペプチドが切断される。第ＶＩＩＩ因子ははなはだしくグリコシル化されるという事実のため、第ＶＩＩＩ因子の高レベル発現（＞０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）は達成するのが困難であった（リンド（Ｌｉｎｄ）ら、１９９５、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、１９８９、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１２３３−１２４２）。哺乳動物細胞中での第ＶＩＩＩ因子の発現は、類似のベクターおよびアプローチを使用して他の遺伝子で観察されるものより典型的に２〜３桁より低い。第ＶＩＩＩ因子のための産生細胞系の生産力は０．５〜１μＵ／ｃ／ｄ（０．１〜０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）の範囲にあった。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは凝血促進活性に重要でないことが立証されている。第ＶＩＩＩ因子の短縮変異体を使用する、哺乳動物細胞中での第ＶＩＩＩ因子の改良された発現が多様なグループにより報告されている（リンド（Ｌｉｎｄ）ら、１９９５、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３２：１９−２７；田島（Ｔａｊｉｍａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ  ６th  Ｉｎｔ  Ｓｙｍｐ  Ｈ．Ｔ．ｐ．５１−６３；アルムシュテット（Ａｌｍｓｔｅｄｔ）への米国特許第５，６６１，００８号、１９９７）。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子の変異体の発現レベルは、安定な細胞クローンからは１ｐｇ／ｃ／ｄを下廻ったままであった。
【０００６】
（発明の要約）
われわれは、今や、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の極めて高い生産性を伴う細胞系を生じさせる方法、および（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の血漿タンパク質を使用しない製造方法を発見した。
【０００７】
第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の工業的スケールでの製造方法。新たに創製された細胞宿主を使用し、２〜４ｐｇ／細胞／日（１０〜２０μＵ／ｃ／ｄ）の範囲の比生産性(specific productivity)をもつ細胞クローンを生じさせた。血清を含まない条件下で１個のクローンは２〜４ｐｇ／ｃ／ｄの１日の生産力を継続した。この高レベルの生産力をもつクローンは、１５リットルの灌流醗酵槽中で１日あたり３〜４百万単位を生産することが可能である。１単位の第ＶＩＩＩ因子の活性は、定義として、血漿１ミリリットル中に存在する活性である。１ｐｇの第ＶＩＩＩ因子は一般に約５μＵの第ＶＩＩＩ因子の活性に同等である。
【０００８】
本明細書で使用されるところの第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質は、インビトロもしくはインビボのモデル系において第Ｘ因子の活性化を引き起こすタンパク質である。制限するものでない例として、この定義は、完全長の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（その配列を図１に記述する）を包含する。
【０００９】
第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の高レベルの発現は、血漿由来タンパク質を含まない培地中で成長される場合に最低約２μＵ／ｃ／ｄ、もしくはより好ましくは最低約４μＵ／ｃ／ｄ、もしくは最も好ましくは最低約５μＵ／ｃ／ｄの第ＶＩＩＩ因子の活性、または、血漿由来タンパク質を補充された培地中で成長される場合に最低約４μＵ／ｃ／ｄ、もしくはより好ましくは最低約８μＵ／ｃ／ｄ、もしくは最も好ましくは最低約１０μＵ／ｃ／ｄの第ＶＩＩＩ因子の活性を意味する。発現されるタンパク質がＢＤＤ−ＦＶＩＩＩである場合、本明細書に記述される方法により、約１５μＵ／ｃ／ｄまで、より好ましくは約２０μＵ／ｃ／ｄまでの比生産性を有する細胞系を得ることができる。
【００１０】
細胞系の起源を記述するために本明細書で使用されるところの「に由来」は、限定されるものでないが正常の有糸分裂の細胞分裂、およびトランスフェクション、細胞融合のような方法、または細胞を変えるもしくは新たな特性をもつ細胞を生じさせるのに使用される他の遺伝子工学技術を挙げることができることを意図している。
【００１１】
（特定の態様）
FＶＩＩＩアッセイ
メトトレキセート（ＭＴＸ）耐性の細胞集団中での組換え遺伝子発現から得られた第ＶＩＩＩ因子誘導体の活性を発色性アッセイにより測定した。製造元の説明書に従い、コアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／４キット（クロモゲニックス（Ｃｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、スウェーデン・モルンダル）を使用して活性を定量した。ＭＥＧＡ  １（生物学研究・審査局（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗ）、メリーランド州ベセスダ）として知られる米国の標準的抗血友病因子（第ＶＩＩＩ因子）をこのアッセイで測定の標準として使用した。バロウクライフ（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ）、１９９３、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍ  ７０：８７６を参照されたい。
Ｂドメイン欠失FＶＩＩＩのための発現ベクターの構築
Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）FＶＩＩＩの配列を図１に示す。１４アミノ酸よりなるリンカーにより９０ｋＤおよび８０ｋＤの鎖を連結した。１９９６年４月１６日に出願された、チャン（Ｃｈａｎ，Ｓ．−Ｙ．）、「混合組成のリポソーム様物質の存在下での組換え第ＶＩＩＩ因子の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｌｉｋｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、米国特許出願第０８／６３４，００１号を参照されたい。標準的組換えＤＮＡ技術を使用してＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの発現ベクターを作成した。該発現ベクター（ｐＣＩＳ２５ＤＴＲ）の構造を図３に示す。該ベクターは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの転写ユニットおよび選択可能なマーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を包含する。加えて、組込み効率を増大させるために、高められた薬剤選択比を示すエプスタイン−バーウイルスからの末端反復配列（図２）をベクターに挿入した。該ベクターは、本質的に、図１に示される配列に対応する転写ユニットを包含するよう工作されているベクター（寄託されたＡＴＣＣ  ９８８７９）の構築物である。末端反復配列についてのさらなる情報は、本出願と同一日に出願されたＭＳＢ−７２５４、「エプスタイン−バーウイルスの末端反復配列は薬剤選択比を高める（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｄｒｕｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）」と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）とチャン（Ｃｈａｎ）への関連特許出願（引用により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【００１２】
第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質を発現する細胞を得るために、類似のベクターが当業者により構築かつ使用されることができる。例えば、凝血促進活性を保持する第ＶＩＩＩ因子の既知の変異体をコードするコーディング配列をＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのコーディング配列の代わりに用いることができる。また、ｄｈｆｒの代わりに、グルタミン合成酵素（ｇｓ）もしくは多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）のような他の選択可能なマーカーを使用することができる。選択剤の選択は当該技術分野で既知であるとおり相応して行わなくてはならない。すなわち、ｄｈｆｒについては好ましい選択剤はメトトレキセートであり、ｇｓについては好ましい選択剤はメチオニンスルホキシミンであり、そしてｍｄｒについては好ましい選択剤はコルヒチンである。
【００１３】
（作業実施例）
ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを発現する細胞系の派生：トランスフェクション、薬剤選択および遺伝子増幅
２ｍｍキュベット（ＢＴＸ部品番号６２０）を使用する、３００ボルトおよび３００マイクロファラドに設定された電気穿孔法（ＢＴＸ電気細胞操作装置（Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）６００）により、３０マイクログラムのｐＣＩＳ２５ＤＴＲのＤＮＡをＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ  １２５６８――２９３Ｓ細胞およびヒトバーキットリンパ腫細胞のハイブリッド、本出願と同一日に出願されかつＭＳＢ−７２４１と呼称されるチョウ（Ｃｈｏ）らへの米国特許出願（引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）細胞に導入した。ＨＫＢ１１細胞を用いる作業と平行するよう行われた比較実験では、ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により提供されるプロトコルに従って、陽イオン性脂質試薬ＤＭＲＩＥ−Ｃ（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）を使用して、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）および２９３Ｓ（ヒト胚腎）細胞をトランスフェクションした。ヒポキサンチンおよびチミジンを欠くＭＴＸ選択培地（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ユタ州ローガンからの５％透析ウシ胎児血清を含むヒポキサンチンおよびチミジンを含まないＤＭＥ／Ｆ１２培地）中、９６穴プレートあたり細胞１×１０6個で、増大するメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度（１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭおよび８００ｎＭ）を用い、トランスフェクションされた細胞の増幅を行った。ＭＴＸ耐性の細胞を成長について評価し、そしてトランスフェクション後約２〜３週間にコアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子キットを使用してＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの分泌をスクリーニングした。細胞の培養は加湿された５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で行った。
限界希釈クローニング
血清を含まない条件下での９６穴プレート中の高生産集団の限界希釈クローニング（ＬＤＣ）により単一細胞クローン（ＳＣＣ）を生じさせた。細胞は、１０μｇ／ｍｌのヒュームリン［Ｈｕｍｕｌｉｎ］（商標）組換えインスリン（リリー（Ｌｉｌｌｙ）、インディアナ州インディアナポリス）、１０×必須アミノ酸（ライフ  テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）、およびプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ヒト血漿タンパク質画分（バイエル（Ｂａｙｅｒ）、ノースカロライナ州クレイトン）を補充されたＤＭＥ／Ｆ１２培地中、ウェルあたり細胞１〜１０個で植え付けた。プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ヒト血漿タンパク質（ＨＰＰ）画分はヒトアルブミン（８８％）および多様なグロブリン（１２％）を含有する。コアテスト［Ｃｏａｔｅｓｔ］（商標）第ＶＩＩＩ因子キットを使用して、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの生産性についてクローンをスクリーニングした。最高の産生クローンを振とうフラスコ中での安定性の評価に選択した。ＨＫＢ細胞については、５％透析ＦＢＳを補充された選択培地を使用して第１回のＬＤＣを実施した。第２回のＬＤＣは、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を補充された血清を含まない培地中で適応された第一のＳＣＣを使用して、血清を含まないがしかしプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を含有する培地中で行った。
ＨＫＢクローン２０Ｂ８の派生
図４（ａ）に要約されるとおり、最初の集団１Ｃ１０は、５％ＦＢＳを含む選択培地中での４００ｎＭのＭＴＸでの増幅後にｐＣＩＳ２５ＤＴＲでトランスフェクションされたＨＫＢ細胞由来であった。５％ＦＢＳを補充された選択培地を使用してＬＤＣにより１Ｃ１０から生じられた最初の単一細胞クローン（ＳＣＣ）の１種、１０Ａ８を、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を補充された血清を含まない培地中で適応させた。予期しないことに、１０Ａ８はこの段階で極めて増大されたレベルのｒＦＶＩＩＩ産生を示した（図４ｂ）。従って、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分で補充された培地を使用して第二のＬＤＣを行った。第二のＬＤＣ由来のＳＣＣ（例えば２０Ｂ８）の生産性は、プラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分で適応された１０Ａ８と同様であった。２０Ｂ８は、血清を含有する培地中での第一のＬＤＣから生じられた元の１０Ａ８よりも高レベルのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを示した。最後に、２０Ｂ８を、血漿タンパク質を含まない（ＰＰＦ）培地中での成長に適応させた。２０Ｂ８のサンプルをアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ヴァージニア州マナサス）に寄託した（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１２５８２）。
【００１４】
表１に示されるとおり、ＨＫＢクローンはＢＤＤ−ＦＶＩＩＩについて優れた生産性を表す。トランスフェクションされたＣＨＯおよび２９３Ｓ細胞由来のクローンと比較された場合に、ＨＫＢ細胞で生産性の１０〜２０倍の増大が観察された。懸濁培養で成長される場合に細胞の大型の凝集物を形成しないＨＫＢ細胞は、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有するタンパク質の発現に好ましい細胞である。
【００１５】
表１．ヒトおよびげっ歯類細胞系におけるＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの発現
比生産性（μＵ／ｃ／ｄ）*
ＦＶＩＩＩ誘導体 ＢＨＫ  ２９３ｓ ＣＨＯ  ＨＫＢ
完全長ＦＶＩＩＩ ０．４５ １．２  ０．５  １．０
ＢＤＤ−ＦＶＩＩ ＮＤ  ２．５  １．０  ２０
*５個の高産生クローンの平均（血清を含まない培地中）
ＮＤ＝行われていない
クローンの血漿タンパク質を含まない適応
血清を含まない懸濁培養物として成長するよう適応されたＨＫＢクローンを、血漿タンパク質補充物からさらに引き離した。引き離し(weaning)は、血漿由来タンパク質を含まない培地を使用して細胞約０．５×１０6個／ｍｌの細胞密度で、滅菌のポリカーボネート振とうフラスコ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州コーニング）中で行った。血漿タンパク質を含まない（ＰＰＦ）培地は、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８（０．１％）、ＣｕＳＯ4（５０ｎＭ）およびＦｅＳＯ4／ＥＤＴＡ（５０μＭ）を補充されたＤＭＥ／Ｆ１２培地であった。完全な培地交換を４８時間ごとに行い、そして振とうフラスコに細胞０．５×１０6個／ｍｌで再植え付けした。
クローン２０Ｂ８の醗酵
クローン２０Ｂ８の生産性を１５リットル灌流醗酵槽中で評価した。醗酵槽に細胞約３×１０6個／ｍｌの密度でクローン２０Ｂ８細胞を植え付けた。先行する段落で記述されたとおり、１日あたり４体積の速度で血清を含まない生産培地で醗酵槽を還流した。評価期間（４５日）を通じて細胞２×１０7個／ｍｌの最終細胞密度を継続した。図５に示されるとおり、醗酵の最初の４週間の間、クローン２０Ｂ８はプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を補充された血清を含まない生産培地で灌流し、そして高生産性を継続することが可能であった。第２８日から醗酵運転の終了まで、同一の血清を含まないしかしプラスマネート［Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ］（商標）ＨＰＰ画分を含まない生産培地で細胞を灌流した。図５に示されるとおり、細胞は、血漿由来タンパク質を含まない環境中で高レベルのＦＶＩＩＩを産生し続けた。「血漿由来タンパク質を含まない」は、本質的に、血漿から単離されたタンパク質が培地に添加されていなかったことを意味する。
考察
ＨＫＢ細胞の派生は、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのみならずしかし他の治療的タンパク質も同様に製造するためのタンパク質を含まない生産系を提供する。ＨＫＢ細胞から産生されるタンパク質は、インビボでのある種の糖タンパク質の半減期を向上させるかも知れないヒトのグリコシル化パターンを有する。これらの細胞はまた、遺伝子治療の目的上設計されたアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス株の製造にも有用であるはずである。
【００１６】
上の実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、そして当業者に変形物が思い浮かぶであろうと考えられる。従って、本発明の範囲は下の請求の範囲によってのみ制限されるべきであることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】発明にかかる、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）。
【図２】発明にかかる、エプスタイン−バーウイルスから単離された末端反復（ＴＲ）配列の配列（配列番号２）。
【図３】発明にかかる、ｐＣＩＳ２５ＤＴＲのプラスミド地図。
【図４（ａ）】発明にかかる、クローン２０Ｂ８の派生。
【図４（ｂ）】発明にかかる、多様な培地中での数種のクローンの生産性の比較。各クローンの２ヶ月安定性試験からの３個のデータ点を提示する。
【図５】発明にかかる、クローン２０Ｂ８の体積測定の生産性。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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