(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を保存するための方法であって、
（a）保存されるべき赤血球を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、赤血球の第1の懸濁液を形成する工程と；
（b）該第1の懸濁液の液体部分から赤血球を濃縮し赤血球の密集体を形成する工程と；
（c）該赤血球の密集体を添加剤溶液と混合し第２の赤血球懸濁液を形成する工程と；
（d）該第２の赤血球懸濁液中の酸素を飽和レベルの５ないし８％にまで減少させ、酸素を減少させた赤血球の第２の懸濁液を形成する工程と；
（e）上記の酸素を減少させた赤血球の第２の懸濁液を嫌気性貯蔵雰囲気中で４℃に冷却する工程と；
からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
該第２の赤血球懸濁液から酸素を減少させる工程が第２の赤血球懸濁液にガスを繰返し吹き込むことからなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
該第２の赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、パラジウム触媒を備えた水素発生システムを有する嫌気性チャンバーからなる嫌気性雰囲気にて置く工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
該第２の赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、酸素除去剤を収容した嫌気性雰囲気にて置く工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
該第２の赤血球懸濁液にアンモニア・フォスフェトを添加しアデノシン・トリフォスフェトの赤血球中レベルを増大する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
該第２の赤血球懸濁液から酸素を減少させる工程が該第２の赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程の前に行われる請求項１記載の方法。
【請求項７】
アンモニア・フォスフェトの赤血球中の濃度を下げるため、使用に供する前に赤血球をグルコースを含む塩溶液で洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
赤血球を保存するための方法であって、
（ａ）赤血球の密集体を形成する工程と；
（ｂ）該赤血球の密集体を添加剤溶液と混合し第２の赤血球懸濁液を形成する工程と；
（ｃ）該第２の赤血球懸濁液中の酸素を減少させ、酸素を飽和レベルの５ないし８％にまで減少させた赤血球の第２の懸濁液を形成する工程と；
（ｄ）上記の酸素を減少させた赤血球の第２の懸濁液を嫌気性貯蔵雰囲気中で４℃に冷却する工程と；
からなることを特徴とする方法。
【請求項９】
該赤血球懸濁液から酸素を減少させる工程が該赤血球懸濁液にガスを繰返し吹き込むことからなる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、パラジウム触媒を備えた水素発生システムを有する嫌気性チャンバーからなる嫌気性雰囲気にて置く工程をさらに含む請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、酸素除去剤を収容した嫌気性雰囲気にて置く工程をさらに含む請求項８記載の方法。
【請求項１２】
該第２の赤血球懸濁液にアンモニア・フォスフェトを添加しアデノシン・トリフォスフェトの赤血球中レベルを増大する工程をさらに含む請求項８記載の方法。
【請求項１３】
該赤血球懸濁液から酸素を減少させる工程が該第２の赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程の前に行われる請求項８記載の方法。
【請求項１４】
アンモニア・フォスフェトの赤血球中の濃度を下げるため、使用に供する前に赤血球をグルコースを含む塩溶液で洗浄する工程をさらに含む請求項８記載の方法。
【請求項１５】
該添加剤溶液がグルコース、アデニン及び/又は塩を含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該添加剤溶液がグルコース、アデニン及び/又は塩を含む請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は血液の保存に係わり、特に酸素の非存在下での血液の冷凍保存に関する。本発明は米国エネルギー省によるカリフォニア大学評議委員会に対する契約Ｎｏ．Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６に基づき政府援助のもとで成されたものである。従って、米国政府は本発明に対し、ある種の権利を有する。
発明の背景
現在の血液供給は需要に比べて可なり少ない。保存血液は保存時における着実な劣化により約５−６週間で使用不能になると考えられている。なぜならば、そのような血液は輸血後の循環において生存し得ないからである。この劣化はヘモグロビンの酸化、退化、アデノシン・トリホスフェート（ＡＴＰ）涸渇が一部関係している。さらに、非自己由来の供血者からの血を受けた場合の危険性も大きい。この現在の需要に対処するためには、血液保存技術は簡単で、安価で長期間保存可能でなければならない。
赤血球（ＲＢＣｓ）は人体中にて激しい流れの条件下でタンパク合成なくして約４ケ月生存する。酸素（Ｏ2）はヘモグロビン（Ｈｂ）をメト−Ｈｂに変換させるのに必須のものである。このメト−Ｈｂが分解すると、毒性生成物、例えばヘミクローム、ヘミン、遊離Ｆｅ3+が生じる。Ｏ2とともに、これらの生成物は触媒として機能し、ヒドロキシル・ラジカル（ＯＨ・）を生じさせる。このＯＨ・およびメト−Ｈｂ分解生成物が赤血球の脂質薄膜、薄膜骨格、血球成分を損傷させる。後述のように、現在の赤血球保存に対するアプローチの仕方はヘモグロビン分解損傷経路に対処するものではない。
冷凍は生体でのメト−Ｈｂ還元に必要な酵素を不能にし、破壊性Ｏ2の赤血球中の溶解度を増大させ（ほぼ２倍）、糖分解速度を減少させる（４℃ではその速度は３７℃の約１％）ことによりＡＴＰのレベルを減少させる。赤血球中ＡＴＰの減少はエキノサイト（赤血球中の不安定な形態）の形成を生じさせ、薄膜の小胞形成を促し、赤血球の表面積を縮小させ、脾臓マクロファージにより腐骨形成を加速させる。小胞形成は冷凍保存期間中継続し、エキノサイト形成により悪化し、赤血球薄膜面積を減少させることにより赤血球の生存を減少させる。
血液保存においてＡＴＰレベルを向上させたり保持させるための研究が行われている。例えば、文献、Vox Sang 65，87-94（1993），Greenwalt et al，“変性フォスフェート−アンモニウム添加溶液の用いた生体内、生体外の赤血球保存−７の研究”において、著者は２０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、３０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２ｍＭのアデニン、１１０ｍＭのデキストロース、５５ｍＭのマンニトールを含み、ｐＨが７．１５の実験添加剤溶液（ＥＡＳ−２）がヒトＲＢＣｓの貯蔵寿命を従来の５−６週間から８−９週間に延長させるのに効果があったとしている。包装されたＲＢＣｓは簡単な洗浄工程の後、上澄液を除去することにより輸液を行うのに適している。Greenwalt et alはＡＴＰ濃度以外の要因が保存５０日後のＲＢＣ生存力を決定するのに重要な役割を果たしていると結論している。文献、Transfusion 7，401-408（1967），L.Wood，E.Beutler“フォスフェート・アデニン媒体に貯蔵したヒト血液の生存力”を引用し、実験の結果、ＡＴＰ濃度を２４時間ＲＢＣ生存との関係は８週間の保存後においてはっきりしなくなったと述べている。E.Beutler，C.Westは赤血球ＡＴＰ濃度と生存力との関係は長期の保存後においては弱いことを、文献、J.Lab.Clin.Med.102，53-62（1983）“ＣＰＤ−Ａ中での赤血球濃縮物の４２日、４９日間の保存”で述べている。
文献、Vox Sang 51，27-34（1986），Hogman et al，“＋４℃での液体保存における赤血球に対するＯ2の影響”において、著者は赤血球中のＡＰＴ含量は２−３週間後において嫌気性保存の方が好気性保存よりも若干良好であったと述べている。静脈液を冷凍し、窒素雰囲気中で酸素透過性のバッグに入れて酸素を与えることなく保存し、これにより酸素のレベルを徐々に減少させた。その結果、４℃での保存の間、酸素濃度が徐々に減少し、６０％の濃度から５週間で３０％の濃度に減少させた。その結果、保存赤血球の全体的品質に対するその効果についてはっきりした結論は得られなかった。これらの著者はヘモグロビンに対する酸素依存性損傷、ヘモグロビン分解生成物による酸素媒介損傷について取組んでおらず、またそれらを可なり減少させることをしていない。
したがって、本発明の目的は、ヘモグロビン分解、赤血球分解（ヘモリシス）およびＡＴＰ涸渇の問題を、自己由来の輸血、高められた異質組織輸血の実行に即した方法で取扱うものであり、赤血球の冷凍保存がその後の使用に障害をもたらす虞れのない保存期間の延長を達成することである。
本発明の他の目的は、輸血サンプルを製造するのに必要な手続きの複雑性を少なくすることができる延長された血液の保存方法を提供するものである。
本発明の他のその他の目的、利点、新規な特徴は以下の記載から明らかであろう。
本発明の概要
上記目的を達成するための本発明の赤血球保存方法は以下の工程からなることを特徴とする。すなわち、保存されるべき赤血球を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し赤血球の第１の懸濁液を形成する工程と、該第１の懸濁液の液体部分（血漿）から赤血球を濃縮し赤血球の密集体を形成する工程と、該赤血球の密集体をグルコース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合し第２の赤血球懸濁液を形成する工程と、該第２の赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、該第２の赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程とからなることを特徴とする方法を提供するものである。
好ましくは、この冷却された赤血球がさらに酸素に接することがないようにする。
本発明の他の態様として、以下の赤血球保存方法が提供される。すなわち、赤血球の密集体を形成する工程と、該赤血球の密集体をグルコース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合し赤血球懸濁液を形成する工程と、該赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、該赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程とからなることを特徴とするものである。
好ましくは、この冷却された赤血球がさらに酸素に接することがないようにする。
本発明の利点は、ヘモグロビンの劣化を防止させるところの無酸素の環境を生じさせる結果、ＡＴＰのレベルが維持され、ヘモリシスの減少および冷凍ＲＢＣｓに薄膜小胞の蓄積の減少が図られ、その結果、有効な冷凍保存の期間を延長させることができることである。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明の具体例を説明記載とともに示すもので、これにより本発明の原理の理解を容易にするものである。ここで、
図１は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の薄膜小胞の蓄積量に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すものである。
図２は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合のヘモリシスの割合に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すものである。
図３は赤血球をアンモニウム・フォスフェートの存在の有無の条件下で４℃で保存した場合の細胞質ＡＴＰレベルに対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すものである。
図４は酸素除去の効果が、全赤血球ＡＴＰ，ヘモリシスの割合および発生小胞の蓄積量に及ぼす影響を、赤血球を４℃で３．５週間保存した場合について示すもので、これを無処理の対照サンプルとの比較で表している。
発明の詳細な説明
本発明の特徴を簡単に述べると、赤血球の長期の保存を酸素を除去した状態で４℃で行い、かつ保存されたＲＢＣｓがその後さらに酸素に触れることを避けることにより、輸血された赤血球の生体での生存特性を改善したことにある。これはヘモリシス、小胞生成、ＡＴＰレベルの生体診断により総合的に見ることにより赤血球の生体生存への有効性を知ることができる。さらに、保存赤血球におけるアデノシン・トリホスフェートのレベルがアンモニウム・フォスフェートを添加した或るサンプルにおいて高められていることが判明した。
酸素除去および種々の添加剤溶液の作用を、ジ−（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）可塑化剤を含む標準の塩化ビニル（ＰＶＣ）バッグで、これにクエン酸塩、フォスフェート、塩化ナトリウム、アデニン、デキストロース（抗凝固／緩衝溶液、ＡＳ３）を収容したものに赤血球を入れて保存したものについて、遠心分離後に検査した。酸素は血液バッグにアルゴンを７ないし１０回吹き込むことにより常温のＲＢＣｓから除去した。その結果、ＲＢＣｓ中の酸素レベルは飽和レベルの８ないし５％となった。各血液ユニットを再分割（約１２０ｍＬ区分）にし、ＤＥＨＰ可塑化ＰＶＣトランスファーバッグ（容量１５０ｍＬ）に収容した。血液は遮光血液バンク冷凍庫中で４℃で保存しサンプルを滅菌隔膜サンプリングポートを介して取り出した。急速パージングの後の急速冷却はＲＢＣｓ中に乳酸が蓄積するのを防止する上で必要なことである。さらに、酸素はＲＢＣｓが冷却された後に、除去することも可能である。しかし、ＲＢＣｓは一旦冷却されると酸化作用に対し無防備になり、かつ、酸素除去は４℃で行うよりも３７℃あるいは２１℃で行う方がより急速に酸素除去がなされるため、好ましい方法としては、酸素除去を行った後に冷却を行うことである。上記のHogman et alにより報告されているように、従来のＰＶＣバッグは酸素透過性のものであり、包装された赤血球は従来の保存方法では約４週間で完全に酸化されてしまう。貯蔵用ガスで置換した長期効果を評価するため、トランスファーバッグをアルゴンなどの不活性ガスで満たされた嫌気性チャンバーに保存した。嫌気性チャンバーを部分的真空に曝し、ついで適当なガスで満たすサイクルを２ないし３回繰り返すことにより血液バッグのガス置換をさらに促進させることができた。さらにパラジウム触媒を備えた水素発生システムを嫌気性チャンバーに配置し、中の血液バッグからの微量の酸素を連続的に除去した。
ＥＡＳ２、つまりＡＴＰを増大させるアンモニウムフォスフェート添加溶液の作用（上述のGreenwalt et alで記載されているように）をさらに本発明者により検査した。上述のように、この添加剤溶液は赤血球が保持するＡＴＰを４℃での保存の間、徐々に増大させた。
次に、本発明の好ましい具体例について図面を参照して説明する。まず、図１には、赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の薄膜小胞の蓄積量に対する種々の保存ガスの効果が時間を関数として示されている。保存時に赤血球から放出され薄膜小胞の形で得られたたんぱく質の量が、ＡＳ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴン（＋印）について示されている。これらの点は５個の平均値を示している。１０ｍＭのＮＨ4+（ＮＨ4Ｃｌとして）および２０ｍＭのＭＰＯ4-3（Ｎａ2ＨＰＯ4として）の添加（ＥＡＳ２）は保存期間を通してＡＴＰレベルを可なり増大させ小胞生成を減少させた。アルゴンおよびＯ2除去剤（Ｈ2／Ｐｄ）で酸素を除去することにより小胞の生成をさらに抑制し得ることが理解できよう。（ＮＨ4）3ＰＯ4の存在下でアルゴンで酸素を除去することによりヘモリシスの割合が減少し、ＡＴＰレベルは、酸素除去なしで（ＮＨ4）3ＰＯ4の存在下で達成されたＡＴＰレベルよりも更に大きく増大した。
図２は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合のヘモリシスの割合に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示している。ヘモリシスの率がＡＳ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴン（＋印）について示されている。これらの点はＡＳ３の場合は１０個、その他は５個の平均値を示している。すべてのサンプルについてヘモリシスの度合いは、生体外診断のため冷凍ＲＢＣｓを繰返しサンプリングするため、その際の反転あるいは混合のため予想より幾分高くなっていた。この結果から、酸素を除去したＲＢＣ懸濁液はヘモリシスの率が減少していることが理解されるであろう。
図３は赤血球をアンモニウム・フォスフェートの存在の有無の条件下で４℃で保存した場合のＡＴＰの濃度に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すものである。合計細胞質ＡＴＰはμｍｏｌＡＴＰ／ｇＨｂで与えられている。このＡＴＰのレベルがＡＳ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴン（＋印）について示されている。これらの点は５ないし１０個の平均値を示している。酸素涸渇サンプルは、検査した１１週間に亘って、（ＮＨ4）3ＰＯ4添加剤存在のものより高いＡＴＰレベルを維持することが分かる。
以下、本発明の方法の詳細について実施例を参照して説明する。
実施例
図４は酸素除去の効果が、全赤血球ＡＴＰ，ヘモリシスの割合および発生小胞の蓄積量に及ぼす影響を、赤血球を４℃で３．５週間保存した場合について示すもので、これを無処理の対照サンプルとの比較で表している。包装された赤血球の６個のユニットをAdsolあるいはＡＳ３保存液にて３−４日商業血液バンクで保存した。約等量の超純粋アルゴンを、赤血球を３００ｍＬ収容した血液バッグに温度２２℃で導入し水平に静かに撹拌した（４０ｒｐｍ）。このガスは４時間に亘って７回交換し、最終的にヘモグロビンの酸素飽和度を５％とした。各血液ユニットをついでトランスファーバッグ（容量１５０ｍＬ）に収容した。このトランスファーバッグはＡｒ９０％、Ｈ2１０％およびパラジウム触媒を収容した気密キャニスターに予め収納したものである。この血液は遮４℃で保存した。その結果、酸素の除去のみで生体生存の全ての兆候の改善を容易に観察することができた。これらの結果は、控え目のものである。なぜならば、これらのサンプルは既に、酸素の存在下で２−４日間冷蔵されたものを用いたからである。
上記記載は説明のためのもので本発明を制限することを意図したものではない。したがって、種々の変更も本発明の趣旨に従って可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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