(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ヒト細胞系K562であり、
（ii）主要組織適合クラスI（MHC-I）抗原および主要組織適合クラスII（MHC-II）抗原を自然に欠損しているか、または改変されてMHC-I抗原およびMHC-II抗原を欠損するものであり、かつ
（iii）顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）をコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列を含有する核酸分子を導入することにより改変されるものであって、
少なくとも500 ngGM-CSF/106 細胞/24時間を発現する、
普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項２】
少なくとも1,000 ng GM-CSF/106 細胞/24時間を発現する請求項１に記載の普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項３】
既知組成の培地中で成長する請求項１または２に記載の普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項４】
上記プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターである請求項１〜３のいずれかに記載の普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項５】
上記核酸分子が、ハイグロマイシン耐性をコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列をさらに含有し、上記普遍的バイスタンダー細胞系が、少なくとも400μg/mlのハイグロマイシンを含有する培養培地中で成長することにより選択されるものである請求項１〜４のいずれかに記載の普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項６】
上記普遍的バイスタンダー細胞系が、少なくとも1,000μg/mlのハイグロマイシンを含有する培養培地中で成長することにより選択されるものである請求項５に記載の普遍的バイスタンダー細胞系。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の普遍的バイスタンダー細胞系と、癌抗原とを含有する組成物。
【請求項８】
（i）MHC-I抗原およびMHC-II抗原を欠損するヒト細胞系K562を得て；
（ii）上記ヒト細胞系K562を、GM-CSFをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列と、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列とを含有する核酸分子を上記ヒト細胞系に導入することにより改変し；かつ
（iii）選択可能マーカーを使用して、少なくとも500ng GM-CSF/106細胞/24時間を産生する細胞を単離する、
ことを包含する普遍的GM-CSF発現バイスタンダー細胞系の製造方法。
【請求項９】
（i）ヒト細胞系K562を得て;
（ii）上記ヒト細胞系K562をMHC-I抗原およびMHC-II抗原を欠損するように改変し；
（iii）上記ヒト細胞系K562を、GM-CSFをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列と、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列とを含有する核酸分子を上記ヒト細胞系に導入することによりさらに改変し；かつ
（iv）選択可能マーカーを使用して、少なくとも500ng GM-CSF/106細胞/24時間を産生する細胞を単離する、
ことを包含する普遍的GM-CSF発現バイスタンダー細胞系の製造方法。
【請求項１０】
上記選択可能マーカーが、ハイグロマイシン耐性である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
改変されるヒト細胞系K562が、ml培養培地あたり少なくとも400μgのハイグロマイシンを含有する培養培地中で培養される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
改変されるヒト細胞系K562が、次いでml培養培地あたり少なくとも1,000μgのハイグロマイシンを含有する培養培地中で培養されるものである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記培養培地が、既知組成のものである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
GM-CSFをコードする核酸配列が機能的に連結されるプロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターである請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の組成物を含有する、ヒト患者における癌に対する免疫応答刺激剤であって、
上記癌抗原が上記癌の抗原であり、上記組成物が上記患者へ投与される前に放射線照射されるものである剤。
【請求項１６】
上記癌抗原が、上記癌の細胞である請求項１５に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、1998年2月2日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第60/073, 405号の優先権を主張するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
（発明の技術分野）
本発明は、普遍的免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系(universal immunomodulatory cytokine-expressing bystander cell line)、このような細胞系と癌抗原とを含有する組成物、このような細胞系の製造方法、およびこのような組成物の使用方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
（発明の背景）
癌免疫療法は、癌の治療的処置の１つである。これは、自然に発生する腫瘍を拒絶する免疫系の不全が、腫瘍抗原に対して適切に応答する免疫系の不全に関連するという前提に基づいている。機能している免疫系において、腫瘍抗原はプロセシングされ、主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびII分子〔これはヒトの場合、「ヒト白血球関連（human leukocyte associated）」(HLA)分子ともいう〕において細胞表面上に発現される。抗原と複合体形成すると、MHCクラスIおよびII分子はそれぞれCD8+およびCD4+T細胞に認識される。この認識は、二次的な細胞シグナルのセットと、細胞間の相互作用を媒介し、宿主防御を刺激して疾患を退ける特異的サイトカイン〔すなわち可溶性のいわゆる「生物学的応答調節物質（biological response modifier）」〕のパラクリン放出を生じさせる。次いで、サイトカインの放出が抗原特異的T細胞の増殖をもたらす。
【０００４】
活性免疫療法は、癌または腫瘍細胞を注射して新しいまたは増強した全身性免疫応答を生じさせることを含む。用いる腫瘍細胞は、自己由来（すなわち、治療される宿主由来）または同種異系由来（すなわち、治療される宿主以外の宿主由来）であってよい。このような方策は、抗原源（例えば、無傷の癌または腫瘍細胞）を確立された転移性癌に対する免疫応答を刺激するのに使用するという意味で（予防免疫法ではない）「ワクチン」と呼ばれる。
【０００５】
「ワクチン」として自己由来腫瘍細胞を使用して抗腫瘍免疫を増大することは、広範囲にわたって研究されている(Oettgen et al., in Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., eds. (Lippincott, Philadelphia, PA), pp. 87-119(1991))。少数の患者は自己由来癌ワクチンから利益を受けているようであるが、それらの使用は部分的かつ束の間の結果しか達成していない。従って、癌ワクチンの効力を改良するために膨大な試みが行われている。このような試みには、放射線照射および／または化学的改変、患者に再注射する前に自己由来腫瘍細胞にウイルスを感染させること、および免疫学的関連分子（例えば、サイトカイン、またはT細胞共同刺激分子）をコードする遺伝子による腫瘍細胞のトランスフェクション／形質導入が含まれる。これらの試みは、まずはマウス腫瘍モデルにおいて探求されているが、遠隔部位において微小転移性腫瘍の拒絶を媒介し得る全身性免疫応答をプライミングできることを実証している。このようなワクチン接種を通じて生じる抗腫瘍免疫応答の機構の分析により、腫瘍拒絶における免疫系のT細胞武装の重要性が強調されている。ほとんど改良されていないけれども、非特異的免疫刺激剤もまた使用されている。
【０００６】
臨床的レベルにおいて、免疫学的関連分子をコードする遺伝子による腫瘍細胞のトランスフェクション/形質導入には、腫瘍切除、該腫瘍から単離した細胞の培養、サイトカイン（例えば、GM-CSF）のような免疫学的関連分子をコードする遺伝子による該培養した腫瘍細胞のトランスフェクション／形質導入、該トランスフェクトされた／形質導入された腫瘍細胞の放射線照射、および該放射線照射された腫瘍細胞の患者への投与が含まれる。遺伝学的に改変されて種々の因子（例えば、IL-4、IL-2、IFN-γ、TNF-α、G-CSF、JE、IL-7およびIL-6）を発現する腫瘍細胞は、同一遺伝子型宿主中の該遺伝学的に改変された細胞の拒絶を導くことが示されている(Tepper et al., Cell 57:503-512 (1989); Li et al., Mol. Immunol. 27:1331-1337(1990); Golumbek et al., Science 254: 713-176 (1991); Fearon et al., Cell 60: 397-403 (1990); Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172:1217-1224 (1990); Gansbacher et al., Cancer Res. 50: 7820-7825 (1990); Watanabe et al., PNAS USA 86: 9456-9460 (1989); Asher et al., J. Immunol. 146: 3227-3234 (1991); Blankenstein et al., J. Exp. Med. 173:1047-1052 (1991); Teng et al., PNAS USA 88: 3535-3539 (1991); Colombo et al., J. Exp. Med. 173: 889-897 (1991); Rollins et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3125-3131 (1991); Hock et al., J. Exp. Med. 174: 1291-1298 (1991); Aoki et al., PNAS USA 89: 3850-3854 (1992); Porgador et al., Cancer Res. 52: 3679-3686 (1992))。全身性免疫性がIL-4、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-7またはIL-6を発現する細胞とともに増加することが示されている(Golumbek et al. (1991)、上記; Porgador et at. (1992)、上記)。
【０００７】
放射線照射された、サイトカイン形質導入自己由来腫瘍細胞を比較する種々の研究は、GM-CSFが形質導入された自己由来腫瘍細胞が長持ちする特異的腫瘍免疫性の最も強力な誘導物質であることを示している(Dranoff et al., PNAS USA 90: 3539-3543 (1993); また、Asher et al., J. Immunol. 146: 3327-3334 (1990); Sanda et al., J. of Urology 151: 622-628 (1994); Simons et al., Cancer Research 57:1537-1546 (1997)も参照)。このGM-CSFが形質導入されたワクチンの効力は、黒色腫、リンパ腫、ならびに肺、結腸、腎臓および前立腺の癌の前臨床モデルにおいて示されている(Dranoff et al. (1990)、上記; Golumbek et al. (1991)、上記; Sanda et al. (1994)、上記; Jaffee et al., J. Immunother. 18:1-9 (1995); Caducci et al., Cancer (Phila.) 75: 2013-2020 (1995); Vieweg et al., Cancer Res. 54:1760-1765 (1994); Jaffee et al., J. Immunother. 19: 1-8 (1996); Levitsky et al., J. Immunol. 156: 3858-3865 (1996))。ワクチン接種の部位において、GM-CSFは、樹状突起細胞およびマクロファージを含む、抗原呈示細胞(APC)を局所的に活性化する(パラクリン)。その後、APCは、CD4+およびCD8+T細胞（これは転移部位において腫瘍関連抗原を認識する）をプライミングし、これにより全身性抗腫瘍免疫性を媒介する。
【０００８】
転移性癌を有する患者における多くのフェーズI臨床試験が行われている。ジョンズ・ホプキンズ・ユニヴァーシティでは、転移性腎臓細胞癌腫を有する患者が非改変の放射線照射された自己由来腫瘍細胞か、または形質導入されてGM-CSFを分泌する放射線照射された自己由来腫瘍細胞のいずれかを用いて治療した。測定された免疫性のパラメーターは、マウスモデルにおいて見られたものと一致し、任意抽出は、分子アジュバンドとしてのGM-CSFの役割の明確な例示を可能にした。転移性前立腺癌を有する患者の、GM-CSFが形質導入された自己由来の腫瘍細胞を用いる治療におけるその後の試験は、これらの観察を展開させた。デーナ・ファーバー・キャンサー・インスティチュートでの試験は進行中である。当該試験において転移性黒色腫を有する患者が、GM-CSFが形質導入された自己由来の腫瘍細胞を用いて治療されている。
【０００９】
ジョンズ・ホプキンズ・ユニヴァーシティ、デーナ・ファーバー・キャンサー・インスティチュートおよびその他の場所における先行的な研究は、治療的処置方法としての、放射線照射された、サイトカイン形質導入自己由来腫瘍ワクチンの使用に対してサポートを与えている。多くの悪性腫瘍について、大多数の自己由来腫瘍細胞が、手術または化学療法による緩和に先立って表出の部位で容易に得られる。急性または慢性白血病、リンパ腫、および結腸癌腫のような疾患に関して、大部分の癌治療センターにおいて現在使用されている方法論により、5 x 109をゆうに超える腫瘍細胞を取得し、保存することができる。しかしながら、遺伝子導入を可能にするためにインビトロ培養を必要とすること、ならびに、このような手順を通じて再現性および均一性のある高レベルのGM-CSF産生を得ることができないことは、この治療的アプローチを制限する。
【００１０】
この問題を避ける目的として、多くの研究者が、放射線照射された、GM-CSFトランスフェクト同種異系腫瘍細胞系を用いる免疫法の研究（例えば、前立腺および膵臓癌の治療において）を行っている。このアプローチの論理的根拠は、関連腫瘍抗原が、免疫する同種異系腫瘍細胞系と免疫される患者の腫瘍との間で共有され得ることにある。これらの系の大部分において、関連腫瘍抗原が特定されていないので、この仮定はいまだ証明されてないままである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記を考慮すると、自己由来腫瘍細胞に遺伝子導入するためにインビトロ培養を必要とせず、再現性がありかつ均一な免疫調節サイトカイン（例えば、GM-CSF）産生を可能にする、材料および方法が非常に望ましいだろう。従って、本発明の目的は、このような材料および方法を提供することである。この目的および他の目的、ならびに利点は、本明細書に提供される詳細な説明から明らかとなるだろう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
（発明の要旨）
本発明は、普遍的免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系を提供する。この普遍的バイスタンダー細胞系は、ヒト細胞系であって、主要組織適合クラスI(MHC-I)抗原および主要組織適合クラスII(MHC-II)抗原を自然に欠損しているか、または改変されてMHC-I抗原およびMHC-II抗原を欠損するもののいずれかである。さらに、この普遍的バイスタンダー細胞系は、免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列を含有する核酸分子を導入することより改変される。好ましくはこの免疫調節サイトカインは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。この普遍的バイスタンダー細胞系は、好ましくは少なくとも約500 ng、より好ましくは少なくとも約1,000 ng GM-CSF/106細胞/24時間を発現する。あるいはまた、好ましくは、この免疫調節サイトカインは、 インターロイキン2(IL-2)である。好ましくは、このヒト細胞系は、免疫グロブリンのBリンパ球マーカー、エプスタイン・バー ウイルス(EBV)ゲノムおよび関連核抗原、ならびにEBVに対するレセプターがないことを特徴とする。好ましいヒト細胞系は、慢性骨髄性白血病の急性転化由来である。好ましい細胞系の例は、K562である。好ましくはこの普遍的バイスタンダー細胞系は、既知組成の（defined）、すなわち、無血清培地中で成長する。免疫調節サイトカインをコードする核酸配列が機能的に連結されるプロモーターは、好ましくはサイトメガロウイルスプロモーターである。好ましくは、普遍的バイスタンダー細胞系は、ハイグロマイシン耐性をコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列をさらに含有し、少なくとも約400 μg/mlのハイグロマイシンを含有する培養培地中で成長することにより、好ましくは続いて少なくとも約1,000 μg/mlハイグロマイシンを含有する培養培地中で成長することにより選択される。
【００１３】
本発明により、普遍的バイスタンダー細胞系と癌抗原とを含有する組成物もまた提供される。また、普遍的免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系の製造方法、およびヒト患者中の癌に対する免疫応答を刺激する方法も提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌ワクチンにおいて、癌細胞それ自身が免疫調節サイトカイン（例えば、GM-CSF）を直接産生して該癌細胞に対する免疫応答を刺激する必要はないという観察に基づいたものである。さらに本発明は、空前無比の高いレベルで免疫調節サイトカイン（例えば、GM-CSF）を局所的に産生し得る普遍的バイスタンダー細胞系が得られ得るという驚くべきかつ予期できない発見に基づくものである。本発明は、普遍的バイスタンダー細胞および自己由来癌抗原（例えば、自己由来腫瘍細胞）を含有する組成物の患者への投与を通じて、免疫調節サイトカイン（例えば、GM-CSF）のパラクリン産生、APCの十分な補充、および癌抗原に対する首尾よいプライミングが達成され、これにより各々皆の患者のために、自己由来腫瘍細胞を培養し形質導入する必要性、ならびに、変動し得る、かつ、しばしば非効率的な形質導入効率に取り組む必要性が除かれることで有利である。
【００１５】
上記を考慮して、本発明は、普遍的、免疫調節サイトカイン産生バイスタンダー細胞系を提供する。この細胞系は、主要組織適合クラスI(MHC-I)抗原および主要組織適合クラスII(MHC-II)抗原を自然に欠損しているか、またはMHC-I抗原およびMHC-II抗原を欠損するように改変されている哺乳類（好ましくはヒト）細胞系である。理論的には、免疫調節サイトカインのパラクリン産生をすることができるいかなる哺乳類（好ましくはヒト）細胞系も使用することができる。好ましくは、このヒト細胞系は、免疫グロブリンのBリンパ球マーカー、エプスタイン・バー ウイルス(EBV)ゲノムおよび関連核抗原、ならびにEBVに対するレセプターがないことを特徴とする。好ましいヒト細胞系は、慢性骨髄性白血病の急性転化由来のものである。好ましいヒト細胞系の例は、K562(ATCC CCL- 243; Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int J. Cancer 18: 421-431(1976))である。好ましくは、この普遍的バイスタンダー細胞系は、既知組成の、すなわち無血清培地中で成長する。さらに、好ましくはこの普遍的バイスタンダー細胞系は、懸濁液として成長する。
【００１６】
MHC-I抗原を欠損する細胞は、そのα鎖の発現および／または輸送を妨害することにより得られる。MHC-II抗原を欠損する細胞は、αおよびβ鎖の発現および／または輸送を妨害することにより得られる。MHC-Iおよび-II抗原の不活性化は、多様な方法において達成することができる(例えば、米国特許第5,574,205号参照)。例えば、「優性ネガティブ（dominant negative）」を作ることができる。単一改変されたβ2ミクログロブリン遺伝子（その蛋白質産物は効果的にMHC-I分子との複合体を産生し、おとり（decoy）として作用する）を過剰に発現させ、これによりMHC-I抗原が膜へ挿入されるのを防止することができる。宿主細胞のサブユニットと複合体を形成する欠損αまたはβサブユニットをコードする改変遺伝子を過剰発現させてそれらが機能しないようにすることにより、MHC-II抗原について類似のアプローチを使用することができる。トランスフェクション、レトロウイルスの感染または相同的組換えを使用して、改変MHCまたはβ2ミクログロブリン遺伝子の発現または遺伝子の不活性化を達成することができる。
【００１７】
細胞表面上のMHC-I抗原のレベルは、アデノウイルスのE19蛋白質をコードする配列を、トランスフェクションまたはレトロウイルスの感染により細胞に導入することにより低減することができる。この蛋白質は、粗面小胞体において特異的にMHC-I抗原と複合体を形成し、原形質膜へのMHC-I分子の通常輸送を防止する(Andersson et al., Cell 43: 215-222 (1985); Pabo et al., Advances in Cancer Research 42:151-163 (1989))。
【００１８】
MHC-IおよびMHC-II抗原が欠損していることまたは改変されてMHC-IおよびMHC-II抗原を欠損することに加えて、哺乳類（好ましくはヒト）細胞系は、免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列を含有する核酸分子の導入により改変される。
【００１９】
「改変される」とは、サイトカイン（細胞系中で発現されないか、または核酸分子の提供の結果として、現時点で高いレベルで発現される）をコードする核酸配列を含有する核酸分子（例えば、ベクター）の普遍的バイスタンダー細胞系への提供を意味する。「ベクター」は、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルのようなDNA分子を包含し、これは１以上の異種または組換えDNA配列（例えば、サイトカイン遺伝子または機能的プロモーターおよびことによるとエンハンサーの制御下にある、対象とするサイトカインをコードする配列）を含有し、この用語が当業者に理解されているようにベクターとして機能し得るものである。
【００２０】
真核生物細胞、または特に哺乳類（例えば、ヒト）細胞のような動物細胞に核酸を導入するために適したいかなる適当なベクターも用いることができる。好ましくは、ベクターは細胞と適合性であり、例えば、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列の発現を付与することができるものであり、細胞内で安定に維持されるか、比較的安定に維持される。望ましくは、ベクターは複製起点を含む。サイトカインコーディング配列を導入するとき（すなわち、それ自体のプロモーターを有するサイトカイン遺伝子と対照的に）、最適にはベクターは、コーディング配列の発現を駆動することができ、コーディング配列に機能的に連結されたプロモーターも含有する。プロモーターがコーディング配列の転写を指示することができるとき、コーディング配列はプロモーターに「機能的に連結される」（例えば、コーディング配列とプロモーターの両方が一緒になって天然（native）または組換えサイトカイン遺伝子を構成するとき）。
【００２１】
適当なウイルスベクターとしては、シミアンウイルス40、ウシパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物、特に哺乳類（例えば、ヒト）における使用に適当ないかなるプラスミドも本発明において使用することができる。望ましくは、このプラスミドは、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）、複製起点（例えば、SV4O複製起点）、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性）を含有し、ポリAテールを有するmRNAを提供する。プラスミドの好ましい例は、pCEP4である(実施例１参照)。
【００２２】
ベクターまたは他のDNA配列に関して「組換え」というときは、自然から単離された際には通常結合していないDNA配列が結合していることを単に意味するだけである。「遺伝子」は蛋白質または初期mRNA分子をコードする任意の核酸配列である。遺伝子はコーディング配列および非コーディング配列（例えば、調節）配列を含むが、「コーディング配列」は非コーディングDNAを含まない。「プロモーター」はRNAポリメラーゼの結合を指示し、それによりRNA合成を促進するDNA配列である。「エンハンサー」は近傍の遺伝子の転写を刺激または阻害するＤＮＡのシス作動性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーはどちらの方向にも、数キロ塩基対（kb）まで離れていても、さらに転写領域の下流に位置していても機能し得る点で、エンハンサーはプロモーターにのみ見つかる配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質とのDNA結合部位（これは「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）と異なる。
【００２３】
本明細書で用いるように、サイトカイン「遺伝子」または「コーディング配列」は、該遺伝子またはコーディング配列が、サイトカインの特徴的な機能（すなわち、宿主免疫応答を刺激する能力）を有する蛋白質を発現することができる限り、自然から単離したか、または全合成もしくは部分合成したかにかかわらず、サイトカインのゲノミックまたはcDNA配列、そのより大きい配列およびより小さい配列およびその変異体を包含する。遺伝子またはコーディング配列を改変する手段は当分野でよく知られており、商業的に入手可能なキットを用いて行うこともできる（例えば、New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA）。サイトカイン遺伝子またはコーディング配列は適当ないかなる源からのものでもよく、例えば、ヒトのようないかなる哺乳類種から単離されたものでもよい。しかしながら、好ましくは、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列はGM-CSF配列を含有し、特にヒトGM-CSF cDNA配列を含めたヒトGM-CSF遺伝子またはコーディング配列を含有する（例えば、Cantrell et al., PNAS USA 82: 6250-6254 (1985)に記載）。
【００２４】
好ましくはすべての適切な転写、翻訳およびプロセシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニレーションシグナル）は、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列がそれが導入された細胞内で適切に転写および翻訳されるように、ベクター上に正しく配置されている。宿主細胞内での適切な発現を確実にするためのこのようなシグナルの操作は、当業者の知識および技術の範囲でよく知られている。サイトカイン遺伝子はそれ自体のプロモーターにより制御される（すなわち、機能的に連結される）が、別のプロモーター（構成的プロモーターを含む）、例えば、アデノウイルスタイプ2（Ad2）またはタイプ5（Ad5）主要後期プロモーター（MLP）および三分リーダー(tripartite leader) 、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター／エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（RSV-LTR）、およびその他のものをサイトカインコーディング配列の発現を命令するために用いることもできる。CMVプロモーターが好ましいプロモーターである。
【００２５】
あるいは、組織特異的プロモーター（すなわち、所定の組織で優先的に活性化され、その活性化が起こった組織内で結果として遺伝子産物を発現するプロモーター）をベクター中に用いることができる。そのようなプロモーターとしては、膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子調節領域（Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984)およびMacDonald, Hepatology 7: 425-515, (1987)に記載）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, Nature 315: 115-122 (1985)に記載）；アルブミンまたはα1−アンチトリプシンの肝細胞特異的プロモーター（Frain et al., Mol. Cell. Biol. 10: 991-999 (1990)およびCiliberto et al., Cell 41: 531-540 (1985)に記載）；および共に肝臓で活性なアルブミンおよびα1−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Pinkert et al.,Genes and Devel. 1: 268-276 (1987) およびKelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987) に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
同様に、結腸癌腫（カルシノーマ）に対する癌胎児性抗原（Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10: 2738-2748 (1990)に記載）のような腫瘍特異的プロモーターをベクター中に用いることができる。同じ趣旨で、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は胎児と成人では異なって転写される）を特定のタイプの癌の遺伝子治療に用いることができる。
【００２７】
別の選択肢は、IL-8プロモーター（TNFに対して応答性である）、または6-16プロモーター（インターフェロンに対して応答性である）のような誘導性プロモーターを用いることであり、あるいは宿主に存在するかまたは外来的に投与することのできる、他のサイトカインまたは他の因子に応答性である他の同様のプロモーターを用いることである。サイトカイン誘導性プロモーターを使用することはサイトカイン遺伝子の自己誘導性発現を可能にするというさらなる利点がある。本発明によれば、所望の結合能とプロモーター強度を有する限り、どのようなプロモーターも突然変異誘発により変化させることができる。
【００２８】
インビトロで細胞に核酸分子(例えば、ベクター)を運ぶために種々の方法を使用することができる。例えば、そのような方法としては、エレクトロポレーション、リポソームを用いる膜融合、DNAでコーティングしたマイクロプロジェクタイルを用いる高速発砲法、リン酸カルシウム-DNA沈殿物とのインキュベーション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、修飾ウイルス核酸を用いる感染、単細胞への直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。他の方法も利用可能であり、当業者に知られている。
【００２９】
癌免疫療法に関して普遍的バイスタンダー細胞系が使用される場合、免疫調節サイトカインは、癌細胞または癌抗原（すなわち、免疫応答を引き出し得る任意の蛋白質、炭水化物または他の構成要素）に対する免疫応答を刺激するものである。阻害サイトカイン、すなわちプライミングを防止するサイトカインは、癌免疫療法に関して使用することはできない。核酸分子は、好ましくは単一の免疫調節サイトカインをコードするが、該核酸分子は、２以上の免疫調節サイトカイン（例えば、相乗作用的に作用するサイトカイン）をコードし得る。
【００３０】
適当な免疫調節サイトカインの例は、インターフェロン（例えば、IFNα、IFNβ、およびIFNγ）、インターロイキン（例えば、IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10およびIL-12）、腫瘍壊死因子（例えば、TNFαおよびTNFβ）、エリスロポエチン（EPO）、FLT-3リガンド、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を包含する。最適には免疫調節サイトカインは、ヒトGM-CSFのようなGM-CSFである。別の好ましい免疫調節サイトカインは、IL-2である。
【００３１】
望ましくは、普遍的バイスタンダー細胞系は、空前無比の高いレベルの免疫調節サイトカイン（これは好ましくはGM-CSPである）を発現する。好ましくは、普遍的バイスタンダー細胞系は、少なくとも約500 ng GM-CSF/106細胞/24時間を発現する。より好ましくは、普遍的バイスタンダー細胞系は、少なくとも約1,000 ng GM-CSF/106細胞/24時間を発現する。
【００３２】
同定および選択の目的のために、好ましくは、免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列を含有する核酸分子は、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列をさらに含有する。好ましくは、選択可能マーカーは、抗生物質耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性)である。選択可能マーカーがハイグロマイシン耐性である場合、好ましくは普遍的バイスタンダー細胞系は、少なくとも約400 μg/mlのハイグロマイシン、より好ましくは少なくとも約1,000 μg/mlのハイグロマイシンを含有する培養培地中で成長することにより選択される。
【００３３】
上記に加えて、本発明は、上述した普遍的バイスタンダー細胞系および癌抗原を含有する組成物を提供する。この癌抗原は、癌細胞または癌細胞表面抗原（例えば、組換え的に産生されたか、または免疫沈降されたもの）であり得る。好ましくは、癌抗原は癌細胞であり、その単離法および培養法は当該分野の範囲内である(例えば、WO 97/24132、特に実施例４参照)。細胞表面抗原が同定および特徴付けられ、および抗癌免疫応答を誘導することが決定されている場合、細胞表面抗原を、細胞の代わりに使用することができる。これに関して、普遍的バイスタンダー細胞系は、遺伝学的に改変されて癌抗原を発現するものであり得る。例えば、バイスタンダー細胞は、遺伝学的に改変されて、黒色腫の治療のためMAGE、膵臓癌の治療のためにras、および慢性骨髄性白血病の治療のためにBCR-ABLを発現するものであり得る。
【００３４】
インビボ投与に適した医薬組成物またはインプラントは、適切な担体または希釈剤（これらは、さらに医薬的に許容し得るものであり得る）を含有することができる。このような組成物またはインプラントを製造する手段は当分野で知られている（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed, Mack, ed. (1980)参照）。この組成物において、平衡塩類溶液（例えば、ハンクスの平衡塩類溶液）を使用することが好ましい。
【００３５】
医薬投与形態において、組成物は単独でまたは適当な組み合わせで、ならびに当該分野で公知の他の医薬的活性化合物と組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明の組成物は、単独でまたは他の活性薬剤との適当な組み合わせで、各投与単位が所定量の組成物を含む単位投与形態で提供することができる。本明細書で用いる「単位投与形態」という語は、ヒトおよび他の哺乳類の患者にとって単回投与形態として適当な物理的に分離した単位をいい、各単位は所望の効果を生じさせるのに十分な量として算出された所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて、適当な場合、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に含有する。本発明の新規な単位投与形態の詳細については、特定の宿主における医薬組成物に関連する特定の薬力学により決定される。
【００３７】
また、本発明は、普遍的免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系の製造方法を提供する。一実施態様において、この方法は、(i)MHC-I抗原およびMHC-II抗原を発現しない哺乳類（好ましくはヒト）細胞系を得て、(ii)免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列と、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列とを含有する核酸分子を哺乳類（好ましくはヒト）細胞系に導入することにより該哺乳類（好ましくはヒト）細胞系を改変し、および(iii)選択可能マーカーを使用して、少なくとも約500 ng 上記免疫調節サイトカイン/106細胞/24時間を産生する細胞を単離することを包含する。別の実施態様においては、この方法は、(i)哺乳類（好ましくはヒト）細胞系を得て、(ii)該哺乳類（好ましくはヒト）細胞系をMHC-I抗原およびMHC-II抗原を発現しないように改変し、(iii)免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列と、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列とを含有する核酸分子を該哺乳類（好ましくはヒト）細胞系に導入することにより該哺乳類（好ましくはヒト）細胞系をさらに改変し、および(iv)選択可能マーカーを使用して、少なくとも約500 ng 上記免疫調節サイトカイン/106細胞/24時間を産生する細胞を単離することを包含する。
【００３８】
免疫調節サイトカインをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列と、選択可能マーカーをコードし、プロモーターに機能的に連結される核酸配列とを含有する核酸分子は、上述したように遺伝子導入に適した任意の核酸分子であり得る。レトロウイルスのMFGベクター（これは、米国特許第5,637,483号に記載されている）は、全身性免疫効果のための多数の可能性のある免疫賦活剤の迅速なスクリーニングおよび分子の複雑な組み合わせにおける活性の評価を可能にする。また、それは、高い力価および高い遺伝子発現を提供する。使用することができる他のレトロウイルスのベクターには、pLJ、pEmおよびαSGCが含まれる(米国特許第5,637,483号、特に実施例１２参照)。抗腫瘍免疫応答を刺激するいかなる免疫調節サイトカインも使用することができる(アッセイについては米国特許第5,637,483号参照)。最も好ましい免疫調節サイトカインはGM-CSFである。別の好ましい免疫調節サイトカインはIL-2である。任意の選択可能マーカーを使用することができるが、好ましくは、選択可能マーカーは抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性）であり、この場合、改変される哺乳類（好ましくはヒト）細胞系は、少なくとも約400 μg ハイグロマイシン/ml培養培地を含有する培養培地中で培養される。より好ましくは、改変される哺乳類（好ましくはヒト）細胞系は、その後、少なくとも約1,000 μg ハイグロマイシン/ml培養培地を含有する培養培地中で培養される。好ましくは、培養培地は既知組成のもの（すなわち、無血清のもの）である。この方法において免疫調節サイトカインの発現のために好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターである。
【００３９】
本発明により、哺乳類（好ましくは、ヒト）患者中の癌に対する免疫応答を刺激する方法がさらに提供される。望ましくは、この方法は全身性免疫応答（すなわち、癌に対するT細胞応答）をもたらす。この方法は、患者に上述した組成物を投与することを包含する。ここで、普遍的バイスタンダー細胞系は哺乳類（好ましくはヒト）細胞系由来であり、癌抗原は患者中の癌の抗原であり、および組成物は、例えば、放射線照射により、増殖不能に変えられる。該組成物の投与により、癌に対する免疫応答が刺激される。
【００４０】
「投与」とは、組成物を宿主に実際に物理的に導入することを意味する。組成物を宿主に導入する、いかなるそして全ての方法を本発明は意図している。この方法は、いかなる特定の導入手段に依存するものではなく、またそのように解釈すべきではない。導入手段は当業者によく知られており、本明細書においても例示されている。
【００４１】
いかなる適切な投与経路も使用することができる。好ましくは、組成物は、皮下的にまたは腫瘍内的に投与される。一以上の経路を投与に用いることができるが、ある特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を与えることが当業者には理解される。局所または全身送達は、体腔への製剤の適用または滴注、エアロゾルの吸入または通気を含む投与により、あるいは筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、または皮内投与を含む非経口導入により行うことができる。腫瘍が中枢神経系中に存在する場合には、この組成物を腫瘍内的に投与しなければならない。なぜなら、中枢神経系では免疫系のプライミングがないからである。
【００４２】
望ましくは、免疫調節サイトカインは、ヒトサイトカインと実質的に同種であり、かつ同様の活性を示すことがわかっている場合には非ヒト源由来のサイトカインを使用することができるけれども、ヒト由来である。好ましくは、癌抗原は、治療される癌細胞、すなわち、自己由来癌細胞である。組成物を放射線照射により増殖不能にする場合、通常、普遍的バイスタンダー細胞および癌細胞を組織培養プレートにプレーティングし、137Ｃｓ源を用いて室温で放射線照射する。好ましくは、細胞を約50〜約200 rad/分、いっそう好ましくは約120〜約140 rad/分の線量速度で照射する。好ましくは、大部分の細胞、すなわち好ましくは約100％の細胞のインビトロにおける増殖を阻害するのに十分な総線量を細胞に照射する。よって、望ましくは、約10,000〜20,000 rad、最適には約15,000 radの総線量を細胞に照射する。
【００４３】
さらに、癌抗原（例えば、治療される癌の細胞、すなわち、自己由来癌細胞）は、最適には投与の前に免疫原性を増強すべく処理される。好ましくは、この処理は、本明細書で説明するように、さらに遺伝子操作、例えば、他のサイトカインまたは免疫共同刺激機能を導入するような遺伝子操作、または例えば、フロイント完全または不完全アジュバント、細菌およびマイコバクテリアの細胞壁成分を含有するエマルジョンなどを含めた非特異的アジュバント（これらに限定されるものではない）との混合を含む。
【００４４】
一般に、自己由来癌細胞の濃度は、その部位にAPCを補充し、このような治療がない場合の結果よりも治療される癌に対する高い免疫応答をもたらすようにするために十分であるべきである。好ましくは少なくとも約 1 x 106〜約 1 x 109 癌細胞、いっそう好ましくは約1 x 107〜約 5 x 108 癌細胞が使用される。しかしながら、幾分細胞は、投与経路および他の活性化剤の存在等に依存して使用することができる。
【００４５】
所定の投与における自己由来癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、免疫調節サイトカイン産生バイスタンダー細胞の存在による利益が得られるようにすべきである。GM-CSF産生バイスタンダー細胞に関して、所定の投与における自己由来癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、少なくとも36 ng GM-CSF/106細胞/24時間が産生されるようにすべきである。GM-CSF量がこれより低い場合、抗癌免疫は落ち込む。この量を超えるサイトカインレベルは、効力をさらに増強しない。GM-CSF閾値に加えて、自己由来癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、１：１よりも大きくすべきではない;そうでなければ、免疫応答の全般的な効力は損なわれる。さらに、単離された癌抗原に対するバイスタンダー細胞の適切な比率は、当該分野で慣例の方法を使用して決定することができる。
【００４６】
当業者はまた、本発明の組成物を投与したときに治療的（すなわち、全身性免疫）応答をモニターするための手段を知っている。特に、治療的応答は腫瘍増殖の減衰および／または腫瘍退縮をモニターすることにより評価することができる。治療に対する応答における腫瘍増殖の減衰または腫瘍退縮は、当業者に知られている幾つかのエンドポイント法（例えば、腫瘍の数、腫瘍質量または大きさ、または転移の減少／予防を含む）を用いてモニターすることができる。記載したこれらの方法は包括的なものではなく、特定の適用に適したさらなる方法が当業者には明らかであろう。
【００４７】
本発明の方法に従って、いかなるタイプの癌も治療することができる。本明細書において用いる「癌」は、異常な細胞増殖および接触阻害がないこと（このことは腫瘍形成により証明することができる）により特徴付けられる癌、特に上皮由来の癌を包含する。この語は腫瘍内に局在化する癌、および腫瘍内に局在化していない癌（例えば、腫瘍から浸潤により局所的に拡大した癌細胞）を包含する。従って、本発明の方法は、切除した癌の局所アジュバント療法、および膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、および胃の癌腫（カルシノーマ）のような腫瘍増殖の局所コントロールに適用することができ、腫瘍が肉腫（例えば、繊維肉腫または横紋筋肉腫）、リンパ球系または骨髄系の造血腫瘍、または黒色腫、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、神経芽細胞腫、またはグリオームを含めた他の腫瘍（これらに限定されるものではない）の治療に用いることができる。
【００４８】
本発明の方法は、他の癌治療方法と組み合わせることができる。このような方法の例には、放射線照射、手術および化学療法が含まれる。さらに、本発明の方法は、例えば、非ヒト哺乳類細胞系を用いて普遍的バイスタンダー細胞系および免疫調節サイトカインの非ヒト哺乳類源を産生することにより、非ヒト哺乳類に適用することができる。
【００４９】
また、本発明の免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系は、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症等）を抑制するために使用することができる。さらに、本発明のバイスタンダー細胞系は、感染症（例えば、HIV感染、AIDSおよびマラリア等）、移植片対宿主拒絶反応、および移植片拒絶反応に対する免疫応答を増強するために使用することができる。
【００５０】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５１】
実施例１
本実施例は、普遍的免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞系の製造を説明する。
【００５２】
ヒトGM-CSF遺伝子は、ヒト末梢血からPCRによりクローニングした。このPCR産物を、ヒトCMVプロモーターを利用し、選択可能マーカーとしてハイグロマイシン耐性もコードするベクターpCEP4(Invitrogen, Carlsbad, CA)のHindIII-Not I 部位へクローニングした。この構築物のEBNA-1部分を、制限酵素Cla IおよびAvr IIで消化することにより切り出した。
【００５３】
線状プラスミドを使用して、ヒト細胞系K562をエレクトロポーレートした。まず、薬剤耐性細胞を400 μg/mlのハイグロマイシン存在下で選択した。安定したトランスフェクタントを得た後、該バルク培養物を、ELISAアッセイを使用してヒトGM-CSFの産生について評価した。次いで、ハイグロマイシンの濃度を最大用量の1200 μg/mlまで増加させて、GM-CSF産生バルク培養物を選択した。高用量のハイグロマイシンに対して抵抗性である細胞を1200 μg/mlのハイグロマイシン存在下でサブクローニングした。個々のサブクローンを増加させ、次いで、R&D Quantikine Kit (R & D, Minneapolis, MN)を使用するELISAにより、24時間当たりの百万細胞当たりに産生したGM-CSF量について試験した。この結果を図１（これは細胞系に対するng GM-CSF/106細胞/24時間の棒グラフである）に示す。K562のサブクローンは、1,000 ng/106細胞/24時間を上回って産生した。その後、細胞ベース当たりの最高GM-CSF量を産生したサブクローンを採用し、いかなる胎仔ウシ血清も存在しない100%AIM-V培地(Life Technologies/GIBCO, Gaithersburg, MD)中で培養した。この細胞は、放射線照射後少なくとも4日間GM-CSFを産生し続けた。
【００５４】
得られた細胞集団を、HLAクラスおよびクラスII分子発現について特性解析した。GM-CSF発現K562細胞およびヒト前立腺癌腫細胞系(患者から得られ、株化されたもの; Pro 22、ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ、ボルチモア MD)から得られた細胞を、培地単独か、またはヒト組換えIFNγ(100 単位/ml x 24時間)を補足した培地のどちらかで培養した。細胞を一次モノクローナル抗体W632(抗ヒトクラスI重鎖)、L243(抗ヒトクラスII)、またはmAbl4.4.4(抗マウスI-Ed、イソタイプ適合無関連コントロール抗体（isotype-matched irrelevant control antibody）)で染色した。次いで、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスIgG2aFITC (Caltag, Burlingame, CA)で染色した。一万のゲーティングをFACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA)で収集し、CellQuestソフトウェア・パッケージを使用してデータを分析した。GM-CSF発現K562細胞とPro 22細胞との間でのMHC-IおよびMHC-II抗原における発現の相違は、図２Ａおよび図２Ｂにそれぞれ示す。これらは相対蛍光に対する計数のグラフである。
【００５５】
また、得られた細胞集団を、電離放射線に対するそれらの感受性についても特性解析した。GM-CSF発現K562細胞を、セシウム・ガンマ・照射装置（irradiator）を介して10,000 radか、または15,000 radのいずれかで放射線照射し、次いで各2.5 x 106細胞を、15 mlの培地での培養においた。細胞を数え、トリパンブルー陰性細胞のパーセントを記録した。この結果を図３に示す。これは放射線照射後の日数に対する%生存細胞(トリパンブルー陰性)のグラフである。
【００５６】
実施例２
本実施例は、本発明による組成物において使用される自己由来腫瘍細胞に対する普遍的バイスタンダー細胞の比率を説明する。
【００５７】
本発明による組成物は、少なくとも36 ng GM-CSF/106細胞/24時間が産生されることを確実にするために十分多くのバイスタンダー細胞を含有しなければならない。さらに、腫瘍細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は１：１より大きいものであってはならない；そうでなければ、免疫応答の全般的な効力が損なわれるだろう。
【００５８】
BALB/cマウスに、1 x 105の生存A20野生型細胞(NCI, Bethesda, MD)を０日目に静脈内注射した。５日後、マウスを図４（これは腫瘍チャレンジ後の日数に対する%腫瘍フリー生存のグラフである）に示される組成物で皮下的に免疫した。マウスGM-CSFをコードするレトロウイルス(MFG)で形質導入されたC3H(H-2k)リンパ腫から同種異系バイスタンダー細胞を誘導した（これは、100 ng/106細胞/24時間を産生した）。A20細胞を同じ構築物で形質導入し、130 ng GM-CSF/106細胞/24時間の結果を得た。全ての組成物に使用される細胞は注射前に5,000 radで放射線照射した。
【００５９】
図４に示されるように、GM-CSF産生K562細胞のサブクローンは、1,000ng/106細胞/24時間を上回って産生した。このようなサブクローンを使用すると、100ng/l06細胞/24時間を目標にしていることにより、36ngGM-CSF/106細胞/24時間というGM-CSF閾値よりも安全性に明らかなゆとり（margin）を持って、10個の自己由来腫瘍細胞当たり１個のバイスタンダー細胞という程度の少なさで使用することが可能になる。
【００６０】
本明細書において明記した全ての文献（特許、特許出願、および刊行物を含む）は、言及したことで、その全体が本明細書に組み入れられるものである。
【００６１】
好適な実施態様を強調して本発明を説明したが、当業者には好適な実施態様を変更しうることができ、本発明は、本明細書で特に説明した以外でも実施できることを意図していることが明らかであろう。従って、以下の請求の範囲により定義される発明の精神および範囲内に包含される全ての変形を本発明は包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、細胞系に対するng GM-CSF/106細胞/24時間の棒グラフである。
【図２】  図２Ａは、MHC-I抗原発現についての相対蛍光に対する計測数のグラフである。
図２Ｂは、MHC-II抗原発現についての相対蛍光に対する計測数のグラフである。
【図３】  図３は、放射線照射後の日数に対するパーセント(%)生存細胞(トリパンブルー陰性)のグラフである。
【図４】  図４は、腫瘍チャレンジ後の日数に対する%腫瘍フリー生存のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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