(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、そのＮ末端から５１番目までのアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列と一または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性が、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡが、配列番号２で表される塩基配列の８０から１３２４番目の塩基配列からなるＤＮＡである、請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＶＬ１３９３−ｉである、請求項５記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項８】
形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
形質転換体が、Escherichia属に属する微生物である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項１０】
微生物が、Escherichia coli MM294/pVL1393-i（ＦＥＲＭＢＰ−６１４５）である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
形質転換体が、動物細胞または昆虫細胞である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項１２】
動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Namalwa細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞から選ばれる動物細胞である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
昆虫細胞が、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusianiの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞から選ばれる昆虫細胞である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項５または６記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドの製造法。
【請求項１５】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する請求項８記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドの製造法。
【請求項１６】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する請求項８記載のトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリペプチドの製造法。
【請求項１８】
動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞よりポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖に対する抗体（抗ｉ抗体）と強く反応する細胞を選別し、該細胞より細胞内で発現させたときに該細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加させる活性を有するポリぺプチドをコードするＤＮＡを採取することを特徴とする、請求項３または４記載のＤＮＡの製造法。
【請求項１９】
請求項７記載の形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖タンパク質、該糖脂質または該オリゴ糖を採取することを特徴とする、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖の製造法。
【請求項２０】
請求項１または２記載のポリペプチド、UDP-GlcNAc、および、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖タンパク質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖脂質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖およびラクトースから選ばれる受容基質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトサミン構造の末端にあるガラクトースにβ1,3結合でN-アセチルグルコサミンの付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該受容基質のラクトサミン構造の末端にあるガラクトースにβ1,3結合でN-アセチルグルコサミンの付与された反応産物の製造法。
【請求項２１】
請求項２０記載の製造法で得られる生産物、UDP-Galおよびβ１,4-ガラクトース転移酵素を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該生産物中のN-アセチルグルコサミンにβ1,4結合でガラクトースの付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該生産物のN-アセチルグルコサミンにβ1,4結合でガラクトースの付与された反応産物の製造法。
【請求項２２】
請求項１または２記載のポリペプチド、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、β１,4-ガラクトース転移酵素、および、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖タンパク質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖脂質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖およびラクトースから選ばれる受容基質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトサミン構造の末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該受容基質のラクトサミン構造の末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の付与された反応産物の製造法。
【請求項２３】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する請求項８記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該動物中より該糖タンパク質、該糖脂質または該オリゴ糖を採取することを特徴とする、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖の製造法。
【請求項２４】
生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２３記載の製造法。
【請求項２５】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡを保有する請求項８記載のトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該植物中より該糖タンパク質、該糖脂質または該オリゴ糖を採取することを特徴とする、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖の製造法。
【請求項２６】
請求項３または４記載のＤＮＡを用いる、請求項１または２記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項２７】
請求項３記載のＤＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡから選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列からなるＤＮＡ、該ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡ、またはこれらＤＮＡの誘導体ＤＮＡ。
【請求項２８】
誘導体ＤＮＡが、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がＮ３'−Ｐ５'ホスフォアミデート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースが２'−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体ＤＮＡおよびＤＮＡ中のリボースが２'−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体ＤＮＡから選ばれる誘導体ＤＮＡである、請求項２７記載のＤＮＡ。
【請求項２９】
請求項２７または２８記載のＤＮＡを用いる、請求項１または２記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法を用いた、炎症または癌の検出法。
【請求項３１】
請求項３、４、２７および２８記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡを用い、請求項１または２記載のポリぺプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
【請求項３２】
請求項３、４、２７および２８記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡを用いた、炎症または癌の検出法。
【請求項３３】
請求項１または２記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３４】
請求項３３記載の抗体を用いる、請求項１または２記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
【請求項３５】
請求項３３記載の抗体を用い、請求項１または２記載のポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
【請求項３６】
請求項１または２記載のポリペプチドを検出することを特徴とする、請求項３３記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
【請求項３７】
請求項１または２記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法。
【請求項３８】
請求項１または２記載のポリぺプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、抗ｉ抗体を用いて、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項３９】
請求項１または２記載のポリぺプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項３３記載の抗体を用いて、請求項１または２記載のポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項４０】
請求項１または２記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の上流に存在するプロモーターおよび該プロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用い、動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
【請求項４１】
プロモーターが、ヒトメラノーマ細胞、ヒト大腸癌細胞、またはヒト白血球細胞で機能しているプロモーターである、請求項４０記載のスクリーニング法。
【請求項４２】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、請求項４０記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの製造法、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを含有する形質転換体、該新規ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドを用いたポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の製造法、該組換え体ベクターを含有する形質転換体を用いたポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖鎖は、発生・分化、細胞認識といった生命現象に関与しているほか、炎症、癌、感染症、自己免疫疾患、およびその他多くの病気の発生、進行に深く関係していると考えられている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（1993年）、Glycobiology, 3, 97 (1993)〕。
糖鎖は、タンパク質や脂質に付加して、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質として存在するほか、オリゴ糖としても存在する。
【０００３】
本発明で対象とするポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、N-アセチルラクトサミンがβ1,3結合で繰り返し結合した構造〔（Galβ1-4GlcNAcβ1-3）n；ｎは2以上〕を有する糖鎖で、糖タンパク質のN-グリコシド結合型糖鎖やO-グリコシド結合型糖鎖中に存在するほか、糖脂質の糖鎖中やオリゴ糖中にも存在する。
【０００４】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、β1,4-ガラクトース転移酵素とβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が交互に働くことにより合成される。前者のβ1,4-ガラクトース転移酵素の遺伝子は既にクローン化されているが、後者のβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子はこれまでにクローン化されていない。ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素に関しては、これまでに部分精製の報告があるだけで、アミノ酸配列の情報も得られていない〔J. Biol. Chem., 268, 27118 (1993)、J. Biol. Chem., 267, 2994 (1992)、J. Biol. Chem., 263, 12461 (1988)、Jpn. J. Med. Sci. Biol.,42, 77 (1989)〕。
【０００５】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖中のガラクトース残基には、しばしばN-アセチルグルコサミンがβ1,6結合で結合し、Galβ1-4GlcNAcβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Galβ1-4GlcNAcのような分岐鎖を有するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が合成される。この分岐部分のβ1,6結合したN-アセチルグルコサミンを転移する糖転移酵素がβ1,6-N−アセチルグルコサミン転移酵素（I-branching enzyme）である。本酵素遺伝子も既にクローン化されている。直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖（i抗原）は、抗ｉ抗体により、分岐鎖を有するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖（Ｉ抗原）は、抗Ｉ抗体により特異的に認識される〔J. Biol. Chem., 254, 3221 (1979)〕。
【０００６】
直鎖型または分岐型のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖上には、フコース、シアル酸、N-アセチルガラクトラクトサミン、ガラクトースなどの糖、または硫酸基などが付加し、細胞特異的あるいは時期特異的に様々な糖鎖（機能性糖鎖、血液型糖鎖、癌関連糖鎖など）が形成される〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（1993年）〕。
顆粒球、単球、または活性化Ｔ細胞上には、糖鎖の末端にSialyl-Lewis x糖鎖構造を有するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が存在していることが知られており、これらの糖鎖は接着分子であるＥ−セレクチンやＰ−セレクチンのリガンドとして機能し、これらの白血球が炎症部位へ集積するのに関与していると考えられている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（1993年）〕。
【０００７】
また、大腸癌などの癌細胞上にも、末端にSialyl-Lewis x糖鎖やSialyl-Lewisa糖鎖構造を有するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が存在していることが知られており、これらの糖鎖もＥ−セレクチンやP-セレクチンのリガンドとして機能し、癌の転移に関与していることが示唆されている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（1993年）〕。
【０００８】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の構造は、胚発生、細胞分化、または細胞の癌化の過程で変化することが知られている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（1993年）〕。ヒトの胎児の赤血球では直鎖型のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が発現しているのに対し、成人の赤血球では分岐型のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が発現する〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ▲１▼「糖鎖の多様な世界」、講談社、1993年〕。これら赤血球上のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の末端には、ABO式の血液型抗原が発現している。分岐したポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖のそれぞれの末端に血液型抗原が発現されると多価の抗原となり、血液型糖鎖に対する抗体との結合能は、直鎖型の抗原に比較して103以上も増加する。
【０００９】
マウスの初期胚の発生過程においては、一連の糖鎖抗原が規則正しく発現されることが知られている。SSEA-1（stage specific embryonic antigen-1）抗原は、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖末端に存在するLewis x糖鎖〔Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc〕であるが、この抗原の発現は８細胞期に始まり、桑実胚でピークとなり、胚盤胞期以降は徐々に消失していく〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ▲３▼「細胞社会のグリコバイオロジー」、講談社、1993年〕。桑実胚期は、それまで細胞分裂による単純な数的増加を繰り返してきた胚細胞が、初めて分化した「形態」をもった胚盤胞の段階へ移行していく移行期にあたる。桑実胚の細胞は胚盤胞を形成する直前に互いに緊密に寄り集まり、細胞緊密化（cell compaction）を起こす。SSEA-１抗原を有するオリゴ糖を添加すると、この細胞緊密化は阻害され、その後の正常な発生も阻害される〔J. Exp. Med., 160, 1591 (1984)〕。また、マウスのテラトカルシノーマ細胞の接着が、抗SSEA-１抗体により阻害されることも知られている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ▲３▼「細胞社会のグリコバイオロジー」、講談社、1993年〕。以上のことは、SSEA-１抗原が接着分子あるいは糖鎖シグナルとして作用し、初期胚の発生に重要な役割を果たしていることを示している。
【００１０】
癌細胞では、対応する正常細胞に比較して、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を多く発現することが知られている〔J. Biol. Chem., 259, 10834 (1984)、J. Biol. Chem., 261, 10772 (1986)、J. Biol. Chem., 266, 1772 (1991)、J. Biol. Chem., 267, 5700 (1992)〕。NIH3T3細胞にN-rasプロトオンコジーンを発現させると、細胞表面のN-結合型糖鎖の分子量が増加し、細胞は浸潤能を獲得するが、この時、N-結合型糖鎖中のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量が増加するとともに、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ1,4-ガラクトース転移酵素とβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加していることが知られている〔J. Biol. Chem., 266, 21674 (1991)〕。
【００１１】
ガレクチンは、β-ガラクトシドに親和性を有する一群のレクチンで、細胞の接着や情報伝達に関与し、癌などの疾患との関連も示唆されている〔Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 9, 9 (1997)〕。哺乳類ではこれまでに１０種類のものが知られている。このうちガレクチン-1および-3は、直鎖上のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖と高親和性で結合することが知られており、それらの糖鎖を含有する特定の糖タンパク質が、これらのガレクチンのリガンドであると推定されている〔Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 9, 9 (1997)、Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 9, 47 (1997)〕。
末端にシアル酸が付加したポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、マイコプラズマや微生物の受容体となっている〔Acta Paediatrica, 82, 903 (1993)〕。
このように、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、多くの機能性糖鎖（セレクチンリガンド糖鎖、微生物やウイルスの受容体糖鎖、SSEA-1糖鎖、癌関連糖鎖など）や血液型糖鎖の骨格糖鎖を形成し、それらの糖鎖を効率的に提示するのに重要な役割を果たしている。
Sialyl Lewis x糖鎖を有するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、セレクチンのアンタゴニストとして、抗炎症効果あるいは癌転移抑制効果を有する医薬品となることが期待される。
【００１２】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖上に多価（4個）のSialyl Lewis x（４糖）が結合したオリゴ糖では、多価にしていないSialyl Lewis xオリゴ糖（４糖）に比較して、1／100以下の低濃度でセレクチンアンタゴニストとしての活性を示すことが知られている〔J. Exp. Med., 182, 1133 (1995)、Glycobiology, 6, 65 (1996)、Glycobiology, 7, 453 (1997)、Eur. J. Immunol., 27, 1360 (1997)〕。
これらのオリゴ糖のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖部分の合成には、部分精製されたβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素が利用されたが、この酵素の供給が律速となり、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を多量に合成することは難しい〔Glycobiology, 7, 453 (1997)〕。
【００１３】
一方、化学合成によってもポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を合成可能であるが、その合成は非常に煩雑なスッテプを必要とする〔Tetrahedron Letter, 24, 5223 (1997)〕。
以上のことより、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の効率良い合成法が求められている。
【００１４】
ヒトの乳中には、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖構造を有する様々なオリゴ糖が存在することが知られている〔Acta Paediatrica, 82, 903 (1993)〕。これらのオリゴ糖には、乳児がウイルスや微生物に感染するのを防ぐ働きや、毒素を中和する働きがあると考えられている。また、善玉の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性もある。一方、ウシやマウスなどの動物の乳中に存在するオリゴ糖の種類は少なく、大部分がラクトースであり、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を含有するオリゴ糖はほとんど存在しない〔Acta Paediatrica, 82, 903 (1993)、J. Biol. Chem., 270, 29515 (1995)〕。
【００１５】
ヒトの乳中に含まれるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を母核とする様々なオリゴ糖、あるいはそれらが含まれたミルクを効率よく生産することができれば、産業上非常に有用と思われるが、これまでにそのような方法は知られていない。
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖は、糖タンパク質の安定化にも重要である。
【００１６】
lysosome associated membrane glycoprotein-1（lamp-1）およびlysosome associated membrane glycoprotein-2（lamp-2）は、リソソームに存在する糖タンパク質（一部は細胞表面にも存在する）で、リソソーム膜の内面をほとんどもれなくおおっている。lamp-1およびlamp-2には多くの糖鎖（いくつかはポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を含む）が付加しており、lamp-1およびlamp-2がリソソーム中の加水分解酵素によって分解されるのを防いでいる。ヒトの前骨芽球系細胞株であるHL-60をジメチルスルフォキシド（dimetyl sulfoxide）で処理すると、顆粒球系の細胞に分化するが、この分化の過程で、lamp-1およびlamp-2に付加するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の数が増加し、それとともにlamp-1およびlamp-2の代謝速度（分解速度）が低下することが知られている〔J. Biol. Chem., 265, 20476 (1990)〕。
【００１７】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖はタンパク質の安定化に寄与していることから、任意のタンパク質に人為的にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、タンパク質を安定化できると考えられる。また、血中タンパク質の腎臓からのクリアランス速度は、タンパク質の実効分子量が大きいほど遅くなることから、任意のタンパク質に人為的にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を付加し、実効分子量を増加させることにより、腎臓からのクリアランス速度を低下させ、血中安定性を増加させることができると考えられる。さらに、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、任意のタンパク質を特定の細胞にターゲティングできる可能性もある。
【００１８】
F9細胞をレチノイン酸で処理した場合や、Swiss 3T3細胞をTGF-βで処理した場合に、細胞の膜結合糖タンパク質の糖鎖にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が付加することが示されている〔J. Biol. Chem., 268, 1242 (1993)、Biochim.
Biophys. Acta.,1221, 330 (1994)〕。
NIH3T3細胞にN-rasプロトオンコジーンを発現させると、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ1,4-ガラクトース転移酵素とβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加し、膜タンパク質のN-結合型糖鎖中のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖量が増加することが知られている〔J. Biol. Chem., 266, 21674 (1991)〕。
【００１９】
Ｔ細胞株EL-4中でコア２β1,6-N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を発現させると、細胞表面の膜タンパク質であるCD43、CD45、またはCD44の分子量が増加する〔J. Biol. Chem., 271, 18732 (1996)〕。これは、コア２β1,6-N−アセチルグルコサミン転移酵素により合成された糖鎖が、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ1,3-N−アセチルグルコサミン転移酵素のよい基質となるためと考えられる。
【００２０】
また、HL-60細胞を２７℃で培養すると、lamp-1またはlamp-2に付加するポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量が増加することが知られている〔J. Biol. Chem., 266, 23185 (1991)〕。
しかし、組換え糖タンパク質の生産に適した宿主細胞において、上述した方法が有効かどうかは定かではない。したがって、組換え糖タンパク質の生産に適した宿主細胞（例えばNamalwa細胞、Namalwa KJM-1細胞、CHO細胞など）のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成能を増加させる方法の開発は、産業上重要な課題である。
【００２１】
上述の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制することによって、炎症反応を抑制したり癌転移を防止できることが期待される。しかし、これまでにポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の発現を効率よく抑制する方法は知られていない。
また、炎症性白血球や癌細胞、あるいは血清中でのポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する遺伝子（例えばポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖合成の鍵酵素であるβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子などがあげられる）、またはそれらがコードするポリペプチドの発現を調べることにより、炎症性疾患や癌の悪性度を診断できることが期待される。しかし、これまでにそのような方法は知られていない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗炎症、抗感染症、癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品、および、タンパク質の改善法、炎症性疾患や癌の悪性度の診断法を提供する。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの製造法、該ＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ＤＮＡあるいは該ポリペプチドを用いるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の製造法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドあるいは該抗体を用いた炎症または癌等の疾病の診断および治療、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法に関する。
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであり、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。
【００２５】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドとしては、例えば、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、該ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、上述のＤＮＡによりコードされるポリペプチドをあげることができ、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドなどをあげることができる。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドは、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,79, 6409(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,81,5662 (1984)、Science,224, 1431 (1984)、PCT WO85／00817(1985)、Nature, 316, 601 (1985)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of ClonedＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の方法に準じて調製することができる。
本発明の抗体は、上述のポリペプチドを認識する抗体をあげることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
（１）ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの製造法
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を発現している細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２９】
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング  第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology），サプルメント１〜34（Supplement 1〜34），グリーン・パブリシング・アソシエイツ・アンド・ウェイリーインターサイエンス（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience），1987-1996年版（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー  サプルメント１〜34と略記する）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning；ギブコＢＲＬ（Gibco BRL）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ZAP-cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン社製〕を用いる方法などがあげられる。
【００３０】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を発現している細胞としては、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を発現している細胞であればいかなる細胞でも用いることができ、例えば、ヒト・メラノーマ細胞株WM266-4（ATCC CRL 1676）、ヒト大腸癌細胞株SW1116（ATCC CRL 233）、ヒト単球系細胞株THP-1（ATCC TIB 202）、ヒト単球系細胞株U-937（ATCC CRL 1593）、ヒト顆粒球系細胞株HL-60（ATCC CCL 240）等を用いることができる。
【００３１】
cＤＮＡライブラリーを作成するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）, 17, 9494 (1989)〕、λｚａｐ II（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡクローニング、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning, A Practical Approach ）, 1, 49 (1985)〕、Lambda BlueMid（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、pT7T3 18U （ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）, 3, 280 (1983)〕、ｐＵＣ１８〔ジーン（Gene）, 33, 103 (1985)〕、ｐＡＭｏ〔J.Biol.Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名pAMoPRC3Sc（特開平05-336963）〕等をあげることができる。
【００３２】
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli C600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、Escherichia coli Y1088〔Science,222, 778 (1983)〕、Escherichia coli Y1090〔Science,222, 778 (1983)〕、Escherichia coli NM522〔J. Mol. Biol.,166, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Biol.,16, 118  (1966)〕およびEscherichia coli JM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕等が用いられる。
【００３３】
ｃＤＮＡライブラリーとしては、WM266-4またはSW1116由来のｍＲＮＡよりGIBCO BRL社製のｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Synthesis System）キットを用いてｃＤＮＡを合成し、該ＤＮＡの両末端にＳｆｉＩリンカーを付与した後、クローングベクターｐＡＭｏのＳｆｉＩ部位に挿入して作製されたプラスミドを用い、E. coli LE392を形質転換して得られたｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
【００３４】
該ｃＤＮＡライブラリーより挿入ＤＮＡを切り出し、動物細胞あるいは昆虫細胞で発現できるベクターに組み込む。ｃＤＮＡライブラリー作製時に、動物細胞あるいは昆虫細胞で発現できるベクターを用いた場合には、該操作を行うことなく、以下に述べる発現ベクターとして利用することができる。
該ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem.,101, 1307 (1987)〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平05-336963）〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、pVL1392（インビトロジェン社製）、pVL1393（インビトロジェン社製）、pBlueBacIII（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００３５】
ｃＤＮＡライブラリーより切り出されたＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを、該発現ベクターを用いて目的とするＤＮＡを発現可能な動物細胞あるいは昆虫細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。
該発現ベクターの導入方法としては、動物細胞あるいは昆虫細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Baculovirus Expression Vectors,W.H.Freeman and Company, New York (1992)、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Current Protocols in Molecular Biology、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等をあげることができる。
【００３６】
動物細胞あるいは昆虫細胞としては、ヒトの細胞であるNamalwa細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63−299）、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors (1992)〕、Trichoplusianiの卵巣細胞であるHigh 5（インビトロジェン社製）等を用いることができる。好ましい宿主細胞としては、Namalwa細胞をあげることができる。
【００３７】
得られた形質転換細胞を抗ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖抗体またはポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチンを用いて蛍光染色した後、フルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter；以下、FACSと略記する）を利用して、直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体またはレクチンの結合量が増加した細胞を濃縮分離する。
【００３８】
ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖に対する抗体としては、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖と反応する抗体であれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、直鎖上のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体である抗ｉ抗体〔J.Biol.Chem., 254, 3221 (1979)〕をあげることができる。また、抗体の代わりにポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチンを使用することもでき、例えば、Daturastramoniumレクチン（DSA）、Lycopersiconesculentumレクチン(LEA)、Phytolaccaamericana レクチン(PWA)をあげることができる。
【００３９】
このようにして濃縮分離された細胞から公知の方法、例えば、ハート法〔Mol. Cell. Biol., 8, 2837 (1988)〕により、本発明のＤＮＡを含むプラスミドを回収し、該ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を取得することができる。
本発明のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、pVL1393-iをあげることができる。pVL1393-iを含む大腸菌であるEscherichia coli MM294/pVL1393-iは、平成９年１０月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６１４５として寄託されている。
【００４０】
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
【００４１】
該方法により取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表されるペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができ、具体的には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
【００４２】
また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと略記する）〔モレキュラー・クローニング  第２版およびＰＣＲProtocols Academic Press (1990)〕等を行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
【００４３】
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、常法あるいはＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４４】
該オリゴヌクレオチドも本発明のＤＮＡとしてあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のＤＮＡとしてあげることができる。該誘導体ＤＮＡとしては、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がＮ３'−Ｐ５'ホスフォアミデート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースが２'−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体ＤＮＡ、あるいはＤＮＡ中のリボースが２'−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体ＤＮＡ等をあげることができる〔細胞工学, 16, 1463 (1997)〕。
【００４５】
（２）ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドの製造法
上記の方法により得られた本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング  第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー  サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いることができる。
【００４６】
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
【００４７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。
プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４８】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（STRATAGENE社）、pBluescript II SK(+)（STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４,６８６,１９１、ＵＳ４,９３９,０９４、ＵＳ５,１６０,７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社製）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社製）、ｐＥＴシステム（Novagen社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Invitrogen社）、ｐＭＡＬ−ｃ２（New England Biolabs社）、ｐＥＧ４００〔J. Bacteriol.,172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
【００４９】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、PletIプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００５０】
宿主細胞としては、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli GI698、Escherichia coli GI724、Escherichia coli TB1、Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefacines、Brevibacteriumammmoniagenes、Brevibacteriumimmariophilum ATCC14068、Brevibacteriumsaccharolyticum ATCC14066、Brevibacteriumflavum ATCC14067、Brevibacteriumlactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacteriumammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp. D-0110、Serratiamarcescens、Serratiaficaria、Serratiafonticola、Serratialiuefaciens等をあげることができる。
【００５１】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
【００５２】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporonpullulans、Schwanniomycesalluvius等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol.,153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
【００５３】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem.,101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００５４】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Long Terminal Repeat Promoter）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。  宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637（特開昭63−299）等をあげることができる。
【００５５】
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293（ATCC: CRL-1573）、293等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、  リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【００５６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、モレキュラー・バイオロジーア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント1-３８（Current Protocols in Molecular Biology）、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
【００５７】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００５８】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusianiの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
【００５９】
Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusianiの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyxmori N4等をあげることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００６０】
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends in Biotechnology,15, 45 (1997)〕に準じてタンパク質を生産することができる。
【００６１】
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
【００６２】
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻などの植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等をあげることができる。
【００６３】
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のタンパク質を生産することもできる。例えば、公知の方法〔American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996)、American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のタンパク質を生産することができる。
【００６４】
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
【００６５】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードするポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
【００６６】
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードするポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６７】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００６８】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。  培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００６９】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７０】
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science,122, 501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００７１】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（Life Technologies社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature), 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
【００７２】
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００７３】
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA,86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、または特開平05-336963、特開平06-823021等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００７４】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。
【００７５】
例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【００７６】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
【００７７】
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ポリペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００７８】
また、糖転移酵素の精製法を利用することもできる。該精製法として、例えば、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の部分精製に使用された方法〔Methods Enzymol.，83, 458 (1982)、J. Biol. Chem., 268, 27118 (1993)、J. Biol. Chem., 267, 2994 (1992)、J. Biol. Chem., 263, 12461 (1988)、Jpn.J.Med.Sci.Biol, 42, 77 (1989)〕をあげることができる。
【００７９】
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、特開平05-336963、特開平06-823021に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００８０】
本発明のポリペプチドがβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する場合、公知の測定法〔J. Biol. Chem., 268, 27118 (1993)、J. Biol. Chem., 267, 2994 (1992)、J. Biol. Chem., 263, 12461 (1988)、Jpn. J. Med. Sci. Biol, 42, 77 (1989)〕に準じてβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素の活性を測定することができる。
【００８１】
（３）ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖またはその修飾糖鎖が付加した糖タンパク質、糖脂質、またはオリゴ糖の製造法
上述（２）の本発明のポリペプチドを製造できる形質転換体で、糖鎖合成のできる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該培養物中よりポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を採取することにより、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を製造することができる。
培養は上述（２）に準じて行うことができる。
【００８２】
形質転換体が糖転移酵素遺伝子（例えばβ１,4−ガラクトース転移酵素遺伝子）を同時に発現する場合には、より効率的にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖を生産できる。
また、本発明のポリペプチドおよび任意の組換え糖タンパク質（例えば医薬用組換えタンパク質）を、形質転換体中で同時に生産させることにより、該組換え糖タンパク質にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖を付加することができる。
【００８３】
更に上記形質転換体が、糖転移酵素遺伝子（例えばβ１,4-ガラクトース転移酵素遺伝子）も同時に発現する場合には、より効率的にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した組換え糖タンパク質を生産できる。
上記方法により生産されるポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から公知の酵素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一部を切り出すことができる〔日本生化学会編，続生化学実験講座，第４巻,複合糖質研究法Ｉ,ＩＩ,東京化学同人，（1986年）、谷口直之・鈴木明身・古川清・菅原和幸  監修，グリコバイオロジー実験プロトコール，秀潤社，（1996年）〕。
【００８４】
本発明のポリペプチドがβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドの場合には、該本発明のポリペプチド、UDP-GlcNAc、および、ラクトサミン構造（Galβ１-４GlcNAc構造）を糖鎖の非還元末端に有する糖タンパク質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖脂質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖およびラクトース（Galβ１-４Glc）から選ばれる受容基質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトサミン構造の末端にあるガラクトースにβ1,3結合でN-アセチルグルコサミンの付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該受容基質のラクトサミン構造の末端にあるガラクトースにβ1,3結合でN-アセチルグルコサミンの付与された反応産物を製造することができる。
【００８５】
さらに、該製造法で得られた生産物、UDP-Galおよびβ１,4-ガラクトース転移酵素を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該生産物中のN-アセチルグルコサミンにβ1,4結合でガラクトースの付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該生産物のN-アセチルグルコサミンにβ1,4結合でガラクトースの付与された反応産物を製造法することができる。
【００８６】
また、本発明のポリペプチド、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、β１,4-ガラクトース転移酵素、および、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖タンパク質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する糖脂質、ラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖およびラクトースから選ばれる受容基質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトサミン構造の末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖〔（Galβ1-4GlcNAcβ1-3）n；ｎは2以上〕の付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該受容基質のラクトサミン構造の末端にポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の付与された反応産物を製造することができる。
【００８７】
β１,4-ガラクトース転移酵素としては、ウシやヒトのミルクから精製された酵素（Sigma社から市販）や組換え酵素（Calbiochem社から市販）などを利用することができる。
また、動物個体または植物個体を用い、上記（２）の方法に準じて、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を製造することができる。
【００８８】
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該動物中よりポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を採取することにより、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
【００８９】
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を生成・蓄積させ、該植物中よりポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を採取することにより、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖タンパク質、ポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖の付加した糖脂質またはポリ-N-アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を製造することができる。
【００９０】
（４）本発明のＤＡＮまたはオリゴヌクレオチドを用いた疾患の治療や診断等への利用
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)〕を用いた炎症や癌等の疾病の治療、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いたそれら疾病の診断に利用することが可能である。
【００９１】
例えば、上記（１）記載の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。
また、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
【００９２】
更に、本発明のＤＮＡをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。例えば、ヒトメラノーマ細胞、ヒト大腸癌細胞、またはヒト白血球細胞において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するプロモータ領域をあげることができる。該プロモーターは後述のスクリーニング法に利用することができる。
【００９３】
（５）本発明のポリペプチドを認識する抗体の調製
（ｉ）ポリクローナル抗体の調製
上記（２）に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を抗原として用い、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。ペプチド合成機で合成した本発明のポリペプチドの部分アミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いることもできる。
【００９４】
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。
【００９５】
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊 1976年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
【００９６】
抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００９７】
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
(a)抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
【００９８】
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００９９】
(b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。たとえば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol.,81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol.,123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
【０１００】
(c)ハイブリドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と(b)で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
【０１０１】
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
【０１０２】
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
【０１０３】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
【０１０４】
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の(d)で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【０１０５】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１０６】
(d)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、(c)で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
【０１０７】
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。また、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株の培養上清中からも同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
【０１０８】
抗体のクラスおよびサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
抗体のクラスとは抗体のアイソタイプのことでヒトでは、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEがあげられる。サブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、ヒトでは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4があげられる。
【０１０９】
（６）本発明の抗体の利用
（ａ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することができる。具体的にはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法等を用いた検出法に本発明の抗体を用いることができる。
（ｂ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現する細胞の免疫組織染色に利用できる。
（ｃ）本発明の抗体を用いて、炎症または癌等の疾病の診断や治療に利用することができる。
【０１１０】
（７）スクリーニング法への応用。
本発明のポリペプチドは、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有することから、該ポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物を用いて、細胞におけるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。
【０１１１】
また、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該ポリペプチドの発現を制御し、細胞におけるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を制御することが可能である。
上記化合物は、炎症や癌などの疾病の治療や、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に有用である。
該化合物は、以下（ａ）〜（ｅ）に示す方法により取得可能である。
【０１１２】
（a）上記（２）で記載した本発明のポリペプチド、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を合成することのできる細胞の抽出液、被験試料、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、および受容基質糖鎖（ラクトサミン構造を末端に有する糖鎖）の存在下、公知の方法〔J. Biol. Chem., 268, 27118 (1993)、J. Biol. Chem., 267, 2994 (1992)、J. Biol. Chem., 263, 12461 (1988)、Jpn. J. Med. Sci. Biol, 42, 77 (1989)〕に準じて反応、測定を行い、該反応により生成される生産物の量を増加または低下させる化合物を選択・取得する。
【０１１３】
（b）本発明のポリペプチドがβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドの場合には、上記（２）で記載した方法を用いて調製した該ポリペプチド（該ポリペプチドを発現する形質転換体の細胞抽出液あるいは精製物）を酵素として用い、被験試料の存在下、上述した方法を用いてβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定し、β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
【０１１４】
（ｃ）本発明のポリぺプチドを発現する細胞または上記（２）で記載した形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞表面のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の量を抗ｉ抗体を用いて測定し、該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
抗ｉ抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
【０１１５】
（ｄ）本発明のポリぺプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリぺプチド量を、上記（５）で記載した本発明の抗体を用いて測定し、該ポリぺプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
【０１１６】
（ｅ）本発明のポリぺプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で2時間から1週間培養後、細胞中の該ポリぺプチドをコードする遺伝子転写産物の量を、上記（４）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等の方法を用いて測定し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
【０１１７】
（ｆ）上記（４）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記（２）記載の動物細胞に、上記（２）記載の方法に準じて導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編, 新細胞工学実験プロトコール, 秀潤社 (1993),Biotechniques,20, 914 (1996)、J. Antibiotics, 49, 453 (1996)、Trends in Biochemical Sciences, 20, 448 (1995)、細胞工学, 16, 581 (1997)〕を用いて測定し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
【０１１８】
【実施例】
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された公知の方法を用いた。
【０１１９】
実施例１  抗ｉ抗体（Den）との反応性を増加させる遺伝子（ｃＤＮＡ）のクローン化
（１）ヒトメラノーマ細胞株WM266-4およびヒト大腸癌細胞株SW1116からのｍＲＮＡの取得
1×108個のヒト・メラノーマ細胞株WM266-4（ATCC CRL 1676）およびヒト大腸癌細胞株SW1116（ATCC CRL 233）より、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるファーストトラック（Fast Track；商品番号K1593-02）を用いて、それぞれ約30μgのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに付与されている説明書に従った。
【０１２０】
（２）WM266-4およびSW1116のｃＤＮＡのライブラリーの作製
上記（１）で取得したWM266-4およびSW1116由来のｍＲＮＡ各々８μｇ、およびGIBCO BRL社製のｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Synthesis System）キットを用い、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ただし、逆転写酵素はキットに含まれているMoloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverse transcriptaseではなく、同社のSuper ScriptTMＲＮＡse H− Reverse Transcriptaseを用いた。
【０１２１】
これら二本鎖ｃＤＮＡの両末端に以下の方法でＳｆｉＩリンカーを付与した。〔ＳｆｉＩリンカーの付与〕
配列番号３で示された一本鎖ＤＮＡおよび配列番号４で示された一本鎖ＤＮＡをアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成一本鎖ＤＮＡをそれぞれ５０μgずつ、別々に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＡＴＰを含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３０単位を加えて、３７℃で１６時間リン酸化反応を行ない、１１塩基および８塩基のリンカーを取得した。
【０１２２】
１１塩基のリンカー４μｇ、８塩基のリンカー２．９μｇおよび上記で合成した２本鎖ｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液４５μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０５０単位を加え、１６℃で１６時間反応させ、該二本鎖ＤＮＡ各々にＳｆｉＩリンカーを付与した。
得られた反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．６ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
【０１２３】
また、上記で得られたWM266-4由来のｍＲＮＡ 8μgを用い、GIBCO BRL社製のｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Synthesis System）キットを用いて、ランダムプライマーをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。本合成反応においても、逆転写酵素には同社のSuper ScriptTMＲＮＡse H− Reverse Transcriptaseを用いた。
該ｃＤＮＡの両末端に、上記と同様の方法でＳｆｉＩリンカーを付与後、アガロースゲル電気泳動を行ない、約１．２ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
【０１２４】
直接発現クローニングベクター（Expression Cloning Vector）であるｐＡＭｏ〔J.Biol.Chem., 268, 22782(1993)、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平05-336963）〕２４μｇを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）５９０μｌに溶解後、８０単位のＳｆｉＩ（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行なった。
【０１２５】
該反応液に４０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で調製したＳｆｉＩリンカーを付与した３種類のＤＮＡ（ｍＲＮＡ８μｇ由来分）を別々にＴ４リガーゼ緩衝液２５０μｌに溶解後、それぞれの溶解液に、該約８．８ｋｂのＤＮＡ断片２μｇおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
【０１２６】
反応後、それぞれの反応液にトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、得られた沈殿を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）２０μｌに溶解した。
該反応液を用い、エレクトロポーレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)〕により大腸菌ＬＥ３９２株〔モレキュラー・クローニング第２版〕を形質転換し、オリゴｄＴプライマーを用いたWM266-4由来のＤＮＡを用いた場合には約２６万個の、ランダムプライマーを用いたWM266-4由来のＤＮＡを用いた場合には約３０万個の、オリゴｄＴプライマーを用いたSW1116由来のＤＮＡを用いた場合には約４８万個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、それぞれのＤＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１２７】
（３）抗ｉ抗体（Den）との反応性を増加させる遺伝子（ｃＤＮＡ）のクローン化
上記（２）で取得したｃＤＮＡライブラリーごとに、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである／plasmid／maxi kit（商品番号  41031）を用いてプラスミドを調製した。
該プラスミドをエタノール沈殿後、1μg/μlになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【０１２８】
該プラスミド溶解液を用いて、リポフェクション法により無血清培地馴化Namalwa細胞（Namalwa KJM-1細胞）〔Cytotechnology, 1, 151 (1988)〕にプラスミドを導入した。プラスミドの導入には、リポフェクチン（Lipofectin：GIBCO  BRL社製）を用い、該製品説明書に記載のリポフェクション法に準じた方法を用いた。該方法において、無血清培地としてはペニシリン・ストレプトマイシンを含まないRPMI1640・ITPSGF培地〔７．５％ＮａＨＣＯ3を１／４０量、２００ｍＭＬ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を０．５％、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルフォニック・アシッド（N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-sulfonic acid; ＨＥＰＥＳ）（１０ｍＭ）、インシュリン（３μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（５ｍＭ）、亜セレン酸ナトリウム（１２５ｎＭ）、ガラクトース（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）〕を用いた。
【０１２９】
具体的には、ペニシリン・ストレプトマイシンを含まないRPMI1640・ITPSGF培地で１．０×１０6細胞／ｍｌに調製した細胞懸濁液０．８ｍｌに対し、３．２５μｌのリポフェクチンと２μｇのプラスミドを加え、ＣＯ2インキュベーター中（３７℃）で終夜培養した。
培養後、６．５ｍｌのRPMI1640・ITPSGF培地を添加し、さらに２日間培養した後、１０倍量のRPMI1640・ITPSGF培地とＧ４１８（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製；終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、さらに１０日培養し、安定形質転換細胞を得た。
【０１３０】
該方法により、オリゴｄＴプライマーを用いたWM266-4由来ｃＤＮＡライブラリーに関しては約３３μｇのプラスミドを、ランダムプライマーを用いたWM266-4由来ｃＤＮＡライブラリーに関しては約３９μｇのプラスミドを、オリゴｄＴプライマーを用いたSW1116由来ｃＤＮＡライブラリーに関しては約６０μｇのプラスミドをNamalwa KJM-1細胞に導入し、安定形質転換細胞を得た。
得られた形質転換細胞をライブラリー毎に混合後、直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体である抗ｉ抗体（Den）〔J. Biol. Chem., 254, 3221 (1979)〕を用いた間接蛍光抗体染色に供した。具体的方法を以下に示す。
【０１３１】
約４×１０7の安定形質転換細胞を５０ｍｌの遠心チューブ（２０５９チューブ：ファルコン社製）にとり、遠心分離（１３０×ｇ、１０分間）により細胞を集めた。
該細胞を、０．１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ−ＰＢＳ：８ｇ／ｌＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌＮａ2ＨＰＯ4（無水）、０．２ｇ／ｌＫＨ2ＰＯ4、０．１％アジ化ナトリウム）２０ｍｌを用いて洗浄した。
【０１３２】
該洗浄菌体に、Ａ−ＰＢＳで１００倍希釈した抗ｉ抗体（Ｄｅｎ）を０．５ｍｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
反応後、細胞をＡ−ＰＢＳ２０ｍｌで１回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体（ＤＡＫＯ社製）をＡ−ＰＢＳで３０倍希釈した溶液を３００μｌ加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。
【０１３３】
反応後、細胞をＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、Ａ−ＰＢＳ１ｍｌに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター〔エピックス・エリート・フローサイトメーター（EPICS Elite Flow Cytometer）；コールター（COULTER）社製〕を用いて、蛍光強度の高い細胞（上位２．８％）を無菌的に分離回収した（図１）。
【０１３４】
回収した細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むRPMI1640・ITPSGF培地で培養し増殖させた後、上記と同様の操作により蛍光強度の高い細胞を無菌的に分離回収した。該操作を再度繰り返し、蛍光強度の高い細胞を分離濃縮した。
２回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位1.3％）を、３回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位1.1％）を分離回収した（図１）。
【０１３５】
該分離操作により、蛍光強度の増加した細胞、すなわち直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の発現量の増加した細胞を取得した（図１参照）。
該細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むRPMI1640・ITPSGF培地で培養後、約２×１０6個の細胞からハート法〔Mol. Cell. Biol., 8, 2837(1988)〕によりプラスミドを回収した。
【０１３６】
該プラスミドを、エレクトロポーレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)〕により大腸菌MC1061A株に導入し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体７５個より、クラボ（KURABO)社製のプラスミド自動分離装置ＰＩ−１００を用いてプラスミドを調製し、それぞれのプラスミドを、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して挿入されたｃＤＮＡの構造を調べた。
【０１３７】
その結果、取得したプラスミドは１８種類に分類された。
該１８種類のプラスミドについて、フェノール／クロロホルム（1:1）抽出とエタノール沈澱を行った後、ＴＥ緩衝液１０μlに溶解し、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕によりそれぞれのプラスミドをNamalwa KJM−1細胞に導入した。
即ち、１．０〜１．６×１０6個の細胞（２００μｌ）に対し、上記で調製したプラスミド３μｌ、またはｐＡＭｏ（コントロールプラスミド）４μｇをそれぞれ導入した後、８ｍｌのRPMI1640・ITPSGF培地に懸濁し、ＣＯ2インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。
【０１３８】
培養後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、さらに１０〜１４日培養し、形質転換細胞を取得した。
得られた形質転換細胞について、抗ｉ抗体（Den）を用いた間接蛍光抗体染色を行なったところ、１６−２−１２と命名したプラスミドを導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、抗ｉ抗体（Den）への反応性（ヒストグラムのピーク値）が約７倍に増加していた（図２）。一方、他のプラスミドを導入した形質転換細胞の抗ｉ抗体（Den）への反応性は、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）を導入した細胞と比較してほとんど変化がみられなかった（図２）。
【０１３９】
以上の結果より、プラスミド１６−２−１２中に挿入されているｃＤＮＡにより形質転換細胞の抗ｉ抗体（Den）への反応性が増加することが明らかとなった。
抗ｉ抗体（Den）を用いた間接蛍光抗体染色は以下のようにして行なった。
約１×１０6個の形質転換細胞をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：エッペンドルフ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
【０１４０】
該細胞をＡ−ＰＢＳ０．９ｍｌで洗浄した後、該洗浄細胞に、Ａ−ＰＢＳで１００倍希釈した抗ｉ抗体（Ｄｅｎ）を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
【０１４１】
反応後、細胞をＡ−ＰＢＳ０．９ｍｌで１回洗浄した後、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体（ＤＡＫＯ社製）をＡ−ＰＢＳで３０倍希釈した溶液を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。
反応後、細胞をＡ−ＰＢＳ０．９ｍｌで１回洗浄した後、Ａ−ＰＢＳ０．６ｍｌに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター(FACSCaliber;Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA社製）を用いて解析を行なった。また対照実験として、抗ｉ抗体（Den）の代わりにＡ-ＰＢＳを用いて同様の解析を行なった（図２の細線）。
【０１４２】
（４）プラスミド１６−２−１２中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定（３）で得られたプラスミド１６−２−１２が含むｃＤＮＡの制限酵素地図を作成後、該ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片をpBluescript II SK(+)にサブクローニングし、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
即ち、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである／plasmid／maxi kit（商品番号 41031）を用いてプラスミド１６−２−１２を調製し、該プラスミドを種々の制限酵素で切断することにより、該プラスミドが含むｃＤＮＡの制限酵素地図を作成した。結果を図３に示す。
【０１４３】
該プラスミド１６−２−１２のＨｉｎｄＩＩＩ-ＳｔｕＩ断片（約０．８ｋｂ：図３のＮｏ．２断片）およびＨｉｎｄＩＩＩ-ＳｍａＩ断片（約０．６ｋｂ：図３のＮｏ．１２断片）を単離し、pBluescript II SK(+)のＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｃＩＩ間にサブクローニングした。また、プラスミド１６−２−１２のＨｉｎｄＩＩＩ-ＳｍａＩ断片（約１．０ｋｂ：図３のＮｏ．１３断片）を単離し、pBluescript II SK(+)のＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｃＩＩ間にサブクローニングした。また、プラスミド１６−２−１２のＨｉｎｄＩＩＩ-Ａｓｐ７１８断片（約０．６ｋｂ：図３のＮｏ．７断片）およびＨｉｎｄＩＩＩ-Ａｓｐ７１８断片（約０．４ｋｂ：図３のＮｏ．１１断片）を単離し、pBluescript II SK(+)のＨｉｎｄＩＩＩ-Ａｓｐ７１８間にサブクローニングした。また、プラスミド１６−２−１２のＳｔｕＩ-ＳａｃＩ断片（約０．７ｋｂ：図３のＮｏ．１９断片）を単離し、pBluescript II SK(+)のＳａｃＩ-ＨｉｎｃＩＩ間にサブクローニングした。
【０１４４】
上記のようにして作製した6種類のサブクローン化プラスミドを鋳型として、それらが含むｃＤＮＡ断片の塩基配列をパーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて決定した。塩基配列の決定は、パーキンエルマー社のキットを使用し、キットの指示に従って行った。その結果をつなぎ合わせることにより、プラスミド１６−２−１２が含むｃＤＮＡの全塩基配列（２０１１ｂｐ）を決定した。
【０１４５】
該ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示した。
該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する４１５アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。該ポリペプチドはこれまでに構造が明らかになった公知のタンパク質のアミノ酸配列とは相同性を示さなかった。該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【０１４６】
該ポリペプチドは、Ｎ末端の８アミノ酸を細胞質側に出し、それに続く２８アミノ酸からなる疎水性に富む領域で膜に結合し、残りの大半のＣ末端部分（触媒部位を含む）をゴルジ体内腔に露出するといった構造をとると考えられる。
以下、該ｃＤＮＡをｉＧｎＴｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質をｉＧｎＴと呼ぶ。
【０１４７】
実施例２．実施例１で取得したｉＧｎＴｃＤＮＡの発現プラスミドを導入したNamalwa KJM−1細胞におけるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成
（１）ｉＧｎＴｃＤＮＡを動物細胞で発現するためのプラスミドｐＡＭｏ−ｉの造成（図４）
1μgのｐＡＭｏをＹ−５０緩衝液20μlに溶解し、20単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、37℃で２時間消化反応を行った。
【０１４８】
反応後、ＮａＣｌを１５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＮｏｔＩを加え、さらに３７℃２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、実施例１で取得したプラスミド１６−２−１２を1μg、Ｙ−５０緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１４９】
反応後、ＮａＣｌを１５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＢｓｔＸＩを加え、さらに３７℃２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＸＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、プラスミド１６−２−１２（１μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１５０緩衝液と略記する）３０μｌに溶解し、２０単位のＢｓｔＸＩと２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．５ｋｂのＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０１５０】
上記で取得した約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．０２μｇ、約０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＸＩ処理ＤＮＡ断片０．０２μｇ、および約１．５ｋｂのＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．０５μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１５１】
該反応液を用いて大腸菌ＭＭ２９４株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。以下、該プラスミドをｐＡＭｏ−ｉと呼ぶ（図４）。
【０１５２】
（２）ｐＡＭｏ−ｉを導入したNamalwa KJM−1細胞におけるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成（図５）
プラスミドｐＡＭｏおよびｐＡＭｏ−ｉをそれぞれ、1μg/μl になるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、実施例１の（３）で記載したリポフェクション法により、Namalwa KJM−1細胞に導入し、形質転換細胞を得た。
直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体である抗ｉ抗体（Den）は、非還元末端にシアル酸が付加したポリ-Ｎ-アセチルラクトサミン糖鎖は認識しにくいと考えられる〔Roelckeら：Vox Sanguinis,48, 181-183 (1985)〕。そこで、上記で得られた形質転換細胞をシアリダーゼ（sialidase）処理することにより、末端のシアル酸を除去した後に、抗ｉ抗体（Den）を用いて間接蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞における直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の発現を調べた。
【０１５３】
ｐＡＭｏ−ｉまたはコントロールプラスミドｐＡＭｏを導入したNamalwa KJM-1細胞（５×１０6個）を、２０ｍＵのClostridium perfringensのノイラミニダーゼ（neuraminidase、Sigma社製 N 2133）を含む１００μｌのＰＢＳに懸濁して、３７℃で１時間反応することにより、形質転換細胞のシアリダーゼ処理を行った（＋sialidase）。対照細胞は、ノイラミニダーゼを含まないＰＢＳ中で３７℃で１時間反応して調製した（-sialidase）。
これら約１×１０6個の細胞を、抗ｉ抗体（Den）またはＡ−ＰＢＳを用いて、間接蛍光抗体染色し、直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の発現を調べた。
【０１５４】
間接蛍光抗体染色は、実施例１の（３）に記載した方法に従って行った。結果を図５に示した。
シアリダーゼ処理により、ｐＡＭｏ−ｉまたはコントロールプラスミドｐＡＭｏを導入したNamalwa KJM-1細胞の抗ｉ抗体（Den）との反応性が増加することより、これらの形質転換細胞が、非還元末端にシアル酸が付加した直鎖状のポリ-Ｎ-アセチルラクトサミン糖鎖を発現していたことがわかる。
【０１５５】
コントロールプラスミドｐＡＭｏを導入したNamalwa KJM-1細胞において、抗ｉ抗体（Den）で染色した細胞の蛍光強度（図５太線）は、A-PBSで染色した対照細胞の蛍光強度（図５細線）と比較して強いことより、Namalwa KJM-1細胞がもともと直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を発現していることがわかる。
一方、ｐＡＭｏ−ｉを導入したNamalwa KJM−1細胞の抗ｉ抗体（Den）との反応性は、シアリダーゼ処理および無処理のいずれの条件においても、コントロールプラスミドｐＡＭｏを導入したNamalwa KJM−1細胞に比較してさらに強くなっている。
【０１５６】
このことは、ｉＧｎＴｃＤＮＡをNamalwa KJM−1細胞で発現させることにより、細胞表面の糖タンパク質あるいは糖脂質の糖鎖上に直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖が新たに合成されていることを意味し、更に、ｉＧｎＴｃＤＮＡを発現させた細胞から分泌される糖タンパク質の糖鎖にも、直鎖状のポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖を新たに合成できることが理解できる。
以上のことより、該ｃＤＮＡを発現させた細胞を宿主として、有用な糖タンパク質を分泌生産することにより、分泌生産される糖タンパク質にポリ-N-アセチルラクトサミンを含有する糖鎖を付与することが可能である。
【０１５７】
実施例３  Namalwa KJM−1細胞を宿主としたプロテインＡ融合型ｉＧｎＴの分泌生産
（１）ｉＧｎＴ分泌発現用プラスミドｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓの造成（図６、７）クローン化したｉＧｎＴはその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（２８アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３７９アミノ酸）からなると推定されるため、ｉＧｎＴのＮ末端側の細胞質領域と膜結合領域を除去し、該除去領域にヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域を付加することによりｉＧｎＴの分泌発現を試みた。
【０１５８】
触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号１の52番目のセリンから415番目のシステインまで〕をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法を用いて調製し、下記記載のα1,3-フコース転移酵素（Ｆｕｃ-ＴIII）を分泌発現するためのプラスミドであるｐＡＭｏＡ−ＦＴ３中のＦｕｃ-ＴIII遺伝子部分を、ｉＧｎＴの推定触媒領域をコードするＤＮＡで置き換えることにより、ｉＧｎＴを分泌発現するためのプラスミドｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓを造成した。
【０１５９】
ｐＡＭｏＡ−ＦＴ３は下記の方法で造成した（図６）。
１μｇのｐＡＭｏＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、１００ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液
（以下、Ｙ−１００緩衝液と略記する）２０μｌに溶解し、２０単位のＳｔｕＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１６０】
反応後、ＮａＣｌを１５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＮｏｔＩを加え、さらに３７℃２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約９．１ｋｂのＳｔｕＩ-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏ−ＦＴ３〔ササキ(Sasaki)ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.), 269, 14730-14737(1994)〕２μgをＹ−１００緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１６１】
反応後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＢａｍＨＩ消化によって生じた５'突出末端を平滑末端に変えた。
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１６２】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．８ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、約９．１ｋｂのＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片０．０５μｇと約１．８ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片０．０５μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１６３】
該反応液を用いて大腸菌MM294株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。このプラスミドをｐＡＭｏＡ−ＦＴ３と呼ぶ。
【０１６４】
ｉＧｎＴを分泌発現するためのプラスミドｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓを以下の方法で造成した（図７）。
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号５で示されるＤＮＡ（以下、Ｃ１２−７と呼ぶ）および配列番号６で示されるＤＮＡ（以下、Ｃ１２−９と呼ぶ）を合成した（サワディー・テクノロジーから購入することも可能）。
Ｃ１２−７にはＢａｍＨＩサイトがＣ１２−９にはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされているため、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後に、ｐＡＭｏＡ−ＦＴ３のＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイト間に組み込むことができる。
【０１６５】
ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM ＤＮＡ Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant TaqＤＮＡ Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、ＤＮＡサーマルサイクラー（PERKIN ELMER CETUSＤＮＡ Thermal Cycler；宝酒造社販売）を用いて、９４℃-３０秒、６５℃-１分、７２℃-２分の反応を１０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、実施例２で造成したプラスミドｐＡＭｏ−ｉを１０ｎｇ使用した。
【０１６６】
反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＢａｍＨＩおよび２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で３時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
また、上記で得たｐＡＭｏＡ−ＦＴ３を１μｇ、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＢａｍＨＩとＮｏｔＩを加え３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１６７】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約９．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
上記で取得した、約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．１μｇと約９．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０ｍｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１６８】
該反応液を用いて大腸菌ＭＭ２９４をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。このプラスミドをｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓと呼ぶ。
【０１６９】
（２）分泌型ｉＧｎＴのNamalwa KJM-1細胞での発現と分泌型ｉＧｎＴの取得
コントロールプラスミドｐＡＭｏＡおよび上記で造成したｉＧｎＴの分泌発現用プラスミドｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓをキィアジェン(Qiagen)社製のプラスミド調製キット（／plasmid／maxi kit；商標番号41031)を用いて調製した。
調製取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
溶解後、実施例１で述べたリポフェクション法により、両プラスミドをそれぞれNamalwa KJM-1細胞に導入し、形質転換体を取得した。
【０１７０】
取得した形質転換体を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含むRPMI1640・ITPSGF培地３０ｍｌに５×１０4細胞／ｍｌになるように懸濁し、ＣＯ2インキュベーターで３７℃、９日間培養した。
培養後、１６０×ｇ、１０分間および１５００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離することにより細胞を除き、上清を回収した。
該培養上清は、−８０℃で保存することが可能で、使用時に解凍して用いることができる。
【０１７１】
プラスミドｐＡＭｏＡ−ｉ５２ＳのコードするｉＧｎＴは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合タンパク質として分泌発現されることになるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose）を用いて、容易に精製が可能である。
上記で取得した培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した後、製品説明書に従って前処理したＩｇＧセファロース〔ファルマシア（Pharmacia）製〕を３０μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
【０１７２】
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することによりＩｇＧセファロースを回収し、該セファロースを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。
洗浄後、０．５Ｍ酢酸緩衝液（酢酸アンモニウムでｐＨを３．４に調整したもの）３０μｌでＩｇＧセファロースに吸着したタンパク質を溶出後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することによりＩｇＧセファロースを除いた。
該溶出液に２Ｍトリスを９μｌ添加しｐＨを７．０に調整した。
【０１７３】
このようにして調整した溶出液１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、銀染色キットワコー（和光純薬工業社製）を用いて銀染色を行った（図８）。
ｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、約５７ｋＤのバンドが確認された。一方、ベクターであるｐＡＭｏＡを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、約５７ｋＤのバンドは検出されなかった。
以上の結果より、分泌型ｉＧｎＴは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として培養上清中に分泌生産可能であり、該融合タンパク質はＩｇＧセファロースを用いて容易に精製可能であることが示された。
【０１７４】
実施例４  Namalwa KJM−1細胞を宿主としたＦｌａｇ融合型ｉＧｎＴの分泌生産
（１）Ｆｌａｇ融合型分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成（図９）
Ｆｌａｇペプチド（配列番号１７）を任意のタンパク質のＮ末端に付加した形で分泌発現するための分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成を行った。免疫グロブリンκのシグナル配列およびＦｌａｇペプチドをコードするＤＮＡは、６種の合成ＤＮＡを用いて作製した。
【０１７５】
1μgのｐＡＭｏを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、８０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−８０緩衝液と略記する）２０μlに溶解し、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩと２０単位のＡｓｐ７１８を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０１７６】
また別に、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＡｓｐ７１８切断部位を連結するためのリンカーとして以下の６種のＤＮＡ［ＩｇＫ−１（配列番号７）、ＩｇＫ−２（配列番号８）、ＩｇＫ−３（配列番号９）、ＩｇＫ−４（配列番号１０）、ＩｇＫ−５（配列番号１１）、ＩｇＫ−６（配列番号１２）］を合成した。なお、これらのＤＮＡによって構築されるリンカー中にはＰｍａＣＩ、ＳｔｕＩ、ＳｎａＢＩの各制限酵素切断部位が組み込まれている。６種のＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ０．２μｇずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）３０単位を加えて、３７℃で２時間リン酸化反応を行なった。
【０１７７】
上記で取得した６種のリン酸化合成ＤＮＡ（各々５ｎｇ）と約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-Ａｓｐ７１８処理ＤＮＡ断片０．０５μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＭＭ２９４株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化と塩基配列決定により確認した。以下、該プラスミドをｐＡＭｏＦ２と呼ぶ（図９）。
【０１７８】
（２）Ｆｌａｇ融合型ｉＧｎＴ分泌発現用プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成（図１０、１１）
クローン化したｉＧｎＴはその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（２８アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３７９アミノ酸）からなると推定されるため、ｉＧｎＴのＮ末端側の細胞質領域と膜結合領域を除去し、該除去領域に免疫グロブリンのシグナル配列ならびにＦｌａｇペプチドを付加することによりｉＧｎＴの分泌発現を試みた。
【０１７９】
まず、ｉＧｎＴの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号１の５２番目のセリンから４１５番目のシステインまで〕をコードするＤＮＡ断片（実施例１で調製）を、Ｔ−ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込むことにより、プラスミドｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ  Ｎｏ．３を造成した。
ｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ  Ｎｏ．３は下記の方法で造成した（図１０）。
【０１８０】
実施例３の（１）で調製した約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片０．１μｇと、Ｔ−ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）０．０２μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＭＭ２９４をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。このプラスミドをｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ  Ｎｏ．３と呼ぶ（図１０）。
【０１８１】
次いで、Ｆｌａｇ融合型ｉＧｎＴ分泌発現用プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成を行った（図１１）。
１μｇのｐＡＭｏＦ２をＹ−１００緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＳｔｕＩと２０単位のＢａｎＩＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約７．２ｋｂのＳｔｕＩ-ＢａｎＩＩＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、１μｇのｐＡＭｏをＹ−１００緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＢａｎＩＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１８２】
反応後、ＮａＣｌを１５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＮｏｔＩを加え、さらに３７℃２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、１μgのｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ  Ｎｏ．３をＹ−１００緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１８３】
反応後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＢａｍＨＩ消化によって生じた５'突出末端を平滑末端に変えた。
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０１８４】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
上記で得た、７．２ｋｂのＳｔｕＩ-ＢａｎＩＩＩ処理ＤＮＡ断片０．０５μｇと約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．０１μｇ、および約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片０．０５μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
【０１８５】
該反応液を用いて大腸菌MM294株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した。このプラスミドをｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓと呼ぶ（図１１）。
【０１８６】
（２）Ｆｌａｇ融合型分泌型ｉＧｎＴのNamalwa KJM-1細胞での発現
コントロールプラスミドｐＡＭｏＦ２および上記で造成したｉＧｎＴのＦｌａｇ融合型分泌発現プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓをキィアジェン(Qiagen)社製のプラスミド調製キット（／plasmid／maxi kit；商標番号41031)を用いて調製した。
調製取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【０１８７】
溶解後、実施例１で述べたリポフェクション法により、両プラスミドをそれぞれNamalwa KJM-1細胞に導入し、形質転換体を取得した。
取得した形質転換体を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、牛胎児血清を２％含むRPMI1640培地３０ｍｌに５×１０4細胞／ｍｌになるように懸濁し、ＣＯ2インキュベーターで３７℃、９日間培養した。
【０１８８】
培養後、１６０×ｇ、１０分間および１５００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離することにより細胞を除き、上清を回収した。
該培養上清は、−８０℃で保存することが可能で、使用時に解凍して用いることができる。
プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２ＳのコードするｉＧｎＴは、Ｆｌａｇペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されることになるため、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲル（Anti-Flag  M1  Affinity  Gel；コスモ・バイオ社）を用いて、容易に精製が可能である。
【０１８９】
上記で取得した培養上清にアジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化カルシウムを、それぞれ最終濃度0.1％、１５０ｍＭ、および２ｍＭになるように添加した後、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲル（Anti-Flag M1 Affinity Gel；コスモ・バイオ社）を３０μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することにより抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲルを回収し、該ゲルを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液１ｍｌで２回洗浄した。
【０１９０】
洗浄後、該ゲルに５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。該ゲルに再度５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行った。
該溶出液には、最終濃度が４ｍＭになるように１Ｍ塩化カルシウムを添加した。
【０１９１】
このようにして調整した１回目の溶出液の１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、銀染色キットワコー（和光純薬工業社製）を用いて銀染色を行った（図１２）。
ｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、約４９ｋＤのバンドが確認された。一方、ベクターであるｐＡＭｏＦ２を導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、約４９ｋＤのバンドは検出されなかった。
以上の結果より、Ｆｌａｇ融合型ｉＧｎＴが培養上清中に分泌生産され、抗ＦｌａｇＭ１アフィニティーゲルを用いて精製可能であることが示された。
【０１９２】
実施例５  昆虫細胞を宿主としたｉＧｎＴ生産用組換えウイルス溶液の調製
（１）ｉＧｎＴを昆虫細胞で発現するための組換えウィルスの作製
目的タンパク質をコードするＤＮＡをトランスファーベクターと呼ばれる特殊なプラスミドに組み込む工程（工程１）と、工程１で作製した目的ＤＮＡを組み込んだトランスファーベクターと野生型ウィルスとを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組換えウィルスを取得する工程（工程２）の２工程で、組換えウィルスを作製した。
該工程は、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号PM-21001K）を用い、該キットのマニュアルに従い以下の手順で行った。
【０１９３】
(工程１)ｉＧｎＴｃＤＮＡのトランスファーベクターへの組み込み（図１３）
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３に存在するマルチクローニングサイトのＳｍａＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間に、ｉＧｎＴｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＶＬ１３９３−ｉの造成を行った。
1μｇのｐＶＬ１３９３を、２５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、２０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｋ−２０緩衝液と略記する）に溶解し、２０単位のＳｍａＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
【０１９４】
反応後、ＮａＣｌを８０ｍＭになるように添加し、２０単位のＢｓｔＰＩを加え、さらに６０℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約３．２ｋｂのＳｍａＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、１μｇのｐＶＬ１３９３を、２５μｌのＹ−８０緩衝液に溶解し、２０単位のＢｇｌＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
【０１９５】
反応後、２０単位のＢｓｔＰＩを加え、さらに６０℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約６．４ｋｂのＢｇｌＩＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
１μｇのｐＡＭｏ−ｉを、２５μｌのＹ−１５０緩衝液に溶解し、２０単位のＢｇｌＩＩと２０単位のＥｃｏＲＶとを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
【０１９６】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約２．０ｋｂのＥｃｏＲＶ-ＢｇｌＩＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＶＬ１３９３由来の約３．２ｋｂのＳｍａＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片0.1μgとｐＶＬ１３９３由来の約６．４ｋｂのＢｇｌＩＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片0.2μg、およびｐＡＭｏ−ｉ由来の約２．０ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ処理ＤＮＡ断片０．２μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌MM294株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＶＬ１３９３−ｉと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した（図１３）。
【０１９７】
（工程２）組換えウィルスの作製
ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）を用いて培養した昆虫細胞Ｓｆ９（ファーミンジェン社製）に、線状バキュロウィルスＤＮＡ〔バキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡ（BaculoGold baculovirusＤＮＡ）、ファーミンジェン社製〕および上記プラスミドｐＶＬ１３９３−ｉをリポフェクチン法〔蛋白質核酸酵素、37, 2701(1992)〕により導入することにより、以下のようにして組換えバキュロウィルスを作製した。
【０１９８】
１〜５μｇのｐＶＬ１３９３−ｉおよび１５ｎｇの線状バキュロウィルスＤＮＡを１２μｌの蒸留水に溶解後、リポフェクチン(GIBCO BRL社製)６μｌ（６μg）と蒸留水６μｌとを混和したものを添加し、室温で１５分間放置した。
約２×１０6個のＳｆ９細胞を２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地(GIBCO BRL社製)に懸濁し、直径３５ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた後、ｐＶＬ１３９３−ｉ、線状バキュロウィルスＤＮＡ、およびリポフェクチンの混和溶液全量を添加し、２７℃で３日間培養した。
【０１９９】
該培養液より、組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを採取した。
該培養上清を取得したシャーレには、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１ｍｌ加え、更に２７℃で４日間培養した。培養後、同様にして組換えウィルスを含む培養上清を更に１．５ｍｌ取得した。
【０２００】
（２）組み換えウィルス溶液の取得
約８×１０6個のＳｆ９細胞を５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、２５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに１ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地と上記（１）で取得した組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加した。
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを４ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。
【０２０１】
該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液５．５ｍｌを得た。
約２×１０7個のＳｆ９細胞を１５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地と上記で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
【０２０２】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。
該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、換えウイルスが感染したＳｆ９細胞および組み換えウィルス溶液１５ｍｌを得た。
【０２０３】
該組み換えウィルス溶液のウィルスの力価を以下の方法で算定した〔ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアル〕。
約６×１０6個のＳｆ９細胞を４ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、直径６０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で３０分間放置して細胞をシャーレに付着させた後、上清を除き、該シャーレにＳｆ９００−ＩＩ培地４００μｌおよびＳｆ９００−ＩＩ培地で１０-4または１０-5に希釈した上記組み換えウィルス溶液１００μｌを添加した。
【０２０４】
添加後、該シャーレを室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた。
接触後、シャーレより培地を除去し、該シャーレに、２％低融点アガロース〔アガープラーク・アガロース（Agarplaque Agarose）；ファーミンジェン社製〕を含む２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地（４２℃に保温）と、２ｍｌのＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（４２℃に保温）の混合液を流し込み、室温で１５分間放置した。
【０２０５】
放置後、乾燥を防ぐために該シャーレにビニルテープをまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、２７℃で５日間培養した。
培養後、該シャーレに０．０１％ニュートラルレッドを含むＰＢＳ緩衝液１ｍｌを加え、更に１日培養した後、出現したプラークの数を数えた。
以上の操作より該組換えウィルス溶液は約１．2×１０8プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのウィルスを含んでいることがわかった。
また、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３を用いて、コントロール用の組換えウイルスと該ウイルスが感染したＳｆ９細胞を調製した。コントロール用の組換えウィルス溶液は約１．4×１０8プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのウィルスを含んでいることがわかった。
【０２０６】
実施例６  昆虫細胞を宿主としたプロテインＡ融合型ｉＧｎＴの分泌生産
実施例３で示したプロテインＡ融合型ｉＧｎＴの昆虫細胞での分泌発現を行った。
（１）プロテインＡ融合型ｉＧｎＴを昆虫細胞で分泌発現するための組換えウィルスの作製(工程１)プロテインＡ融合分泌型ｉＧｎＴをコードするＤＮＡのトランスファーベクターへの組み込み（図１４）
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３に存在するマルチクローニングサイトのＳｍａＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に、実施例３で示したプロテインＡ融合分泌型ｉＧｎＴをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＶＬ１３９３−Ａｉ５２Ｓの造成を行った。
【０２０７】
1μｇのｐＶＬ１３９３を、Ｋ−２０緩衝液に溶解し、２０単位のＳｍａＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
反応後、ＮａＣｌを８０ｍＭになるように添加し、２０単位のＢｓｔＰＩを加え、さらに６０℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約３．２ｋｂのＳｍａＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
また、１μｇのｐＶＬ１３９３を、２５μｌのＹ−８０緩衝液に溶解し、２０単位のＢｓｔＰＩを加え、６０℃で２時間消化反応を行なった。
【０２０８】
反応後、ＮａＣｌを１５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＮｏｔＩを加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行なった。
【０２０９】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約６．４ｋｂのＮｏｔＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２１０】
１μｇのｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓ（実施例３で作製）を、２５μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、２０単位のＳａｌＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
反応後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＳａｌＩ消化によって生じた５'突出末端を平滑末端に変えた。
【０２１１】
該反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．４ｋｂのＳａｌＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２１２】
上記で得られたｐＶＬ１３９３由来の約３．２ｋｂのＳｍａＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片0.1μgとｐＶＬ１３９３由来の約６．４ｋｂのＮｏｔＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片0.2μg、およびｐＡＭｏＡ−ｉ５２Ｓ由来の約１．４ｋｂのＳａｌＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．２μｇをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行なった。
【０２１３】
該反応液を用いて大腸菌MM294株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を得た。該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＶＬ１３９３−Ａｉ５２Ｓと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した（図１４）。
【０２１４】
（工程２）組換えウィルスの作製
実施例５の（工程２）で示した方法と同様にして、ｐＶＬ１３９３−Ａｉ５２Ｓ由来の組換えバキュロウィルス溶液を１．５ｍｌ取得した。
（２）組換えウイルスが感染したＳｆ９細胞と組み換えウィルス溶液の取得
実施例５の（２）で示した方法と同様にして、約８×１０6個のＳｆ９細胞を上記（１）で取得した組換えウィルスで感染させ、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液５．５ｍｌを得た。
【０２１５】
また、実施例５の（２）で示した方法と同様にして、約２×１０7個のＳｆ９細胞を上記で取得した組換えウィルスで感染させ、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液１５ｍｌを得た。
また、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３を用いて、コントロール用の組換えウイルスと該ウイルスが感染したＳｆ９細胞を調製した。
【０２１６】
（３）プロテインＡ融合型ｉＧｎＴポリペプチドの分泌生産と精製
プラスミドｐＶＬ１３９３−Ａｉ５２Ｓ由来の組換えウイルスのコードするｉＧｎＴは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合タンパク質として分泌発現されることになるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose）を用いて、容易に精製が可能である。
約２×１０7個のＳｆ２１細胞を１５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地と上記（２）で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
【０２１７】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。
該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、分泌型ｉＧｎＴを含むと思われる培養上清を１５ｍｌを得た。
上記で取得した培養上清１０ｍｌにアジ化ナトリウムを最終濃度０．１％になるように添加した後、製品説明書に従って前処理したＩｇＧセファロース〔ファルマシア（Pharmacia）製〕を１００μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
【０２１８】
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することによりＩｇＧセファロースを回収し、該セファロースを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液１ｍｌで３回洗浄した。
洗浄後、０．５Ｍ酢酸緩衝液（酢酸アンモニウムでｐＨを３．４に調整したもの）１００μｌでＩｇＧセファロースに吸着したタンパク質を溶出後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することによりＩｇＧセファロースを除いた。
該溶出液に２Ｍトリス３０μｌを添加しｐＨを７．０に調整した。
【０２１９】
このようにして調整した溶出液１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クーマジ・ブリリアント・ブルーを用いて染色を行った（図１５）。
ｐＶＬ１３９３−Ａｉ５２Ｓ由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、約５０ｋＤのバンドが確認された。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、約５０ｋＤのバンドは検出されなかった。
以上の結果より、分泌型ｉＧｎＴは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合タンパク質として培養上清中に分泌生産可能であり、該分泌タンパク質は、ＩｇＧセファロースを用いて精製可能であることが示された。
【０２２０】
実施例７  昆虫細胞を宿主としたＦｌａｇペプチド融合型ｉＧｎＴの分泌生産
実施例４で示したＦｌａｇペプチド融合型ｉＧｎＴの昆虫細胞での分泌発現を行った。
（１）Ｆｌａｇペプチド融合型ｉＧｎＴを昆虫細胞で分泌発現するための組換えウィルスの作製(工程１)Ｆｌａｇペプチド融合分泌型ｉＧｎＴをコードするＤＮＡのトランスファーベクターへの組み込み（図１６）
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３に存在するマルチクローニングサイトのＳｍａＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に、実施例４で示したＦｌａｇペプチド融合分泌型ｉＧｎＴをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓの造成を行った。
【０２２１】
実施例４で作製したｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを１μｇ、２５μｌのＹ−８０緩衝液に溶解し、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
反応後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を３０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、３７℃で６０分間反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生じた５'突出末端を平滑末端に変えた。
【０２２２】
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１５０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＮｏｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２２３】
上記で得た約１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）-ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片０．２μｇと、実施例５の（１）で得たｐＶＬ１３９３由来の約３．２ｋｂのＳｍａＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片０．１μg、および実施例５の（１）で得たｐＶＬ１３９３由来の約６．４ｋｂのＮｏｔＩ-ＢｓｔＰＩ処理ＤＮＡ断片０．２μgをＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌MM294株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ（図１６）と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
【０２２４】
（工程２）組換えウィルスの作製
実施例５の（工程２）で示した方法と同様にして、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ由来の組換えバキュロウィルス溶液を１．５ｍｌ取得した。
（２）組換えウイルスが感染したＳｆ９細胞と組み換えウィルス溶液の取得
実施例５の（２）で示した方法と同様にして、約８×１０6個のＳｆ９細胞を上記（１）で取得した組換えウィルスで感染させ、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液５．５ｍｌを得た。
実施例５の（２）で示した方法と同様にして、約２×１０7個のＳｆ９細胞を上記で取得した組換えウィルスで感染させ、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液１５ｍｌを得た。
また、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３を用いて、コントロール用の組換えウイルスと該ウイルスが感染したＳｆ９細胞を調製した。
【０２２５】
（３）Ｆｌａｇペプチド融合型ｉＧｎＴポリペプチドの分泌生産と精製
プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ由来の組換えウイルスのコードするｉＧｎＴは、Ｆｌａｇペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されることになるため、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲル（Anti-Flag M1 Affinity Gel；コスモ・バイオ社）を用いて、容易に精製が可能である。
約２×１０7個のＳｆ２１細胞を１５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに５ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地と上記（２）で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
【０２２６】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、分泌型ｉＧｎＴを含むと思われる培養上清を１５ｍｌを得た。
上記で取得した培養上清１０ｍｌにアジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化カルシウムを、それぞれ最終濃度0.1％、１５０ｍＭ、および２ｍＭになるように添加した後、抗ＦｌａｇＭ１アフィニティーゲル（Anti-Flag M1 Affinity Gel；コスモ・バイオ社）を８０μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
【０２２７】
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することにより抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲルを回収し、該ゲルを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液１ｍｌで２回洗浄した。
洗浄後、該ゲルに５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液８０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。該ゲルに再度５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液８０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行った。
【０２２８】
該溶出液には、最終濃度が４ｍＭになるように１Ｍ塩化カルシウムを添加した。
このようにして調整した溶出液の１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クーマジ・ブリリアント・ブルーを用いて染色を行った（図１７）。
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ由来の組換えウイルスを感染させたSf21の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、約４３ｋＤのバンドが確認された。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたSf21の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、約４３ｋＤのバンドは検出されなかった。
以上の結果より、Ｆｌａｇ融合型ｉＧｎＴが培養上清中に分泌生産され、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。
【０２２９】
実施例８  ｉＧｎＴ転写産物のＰＣＲ法による定量法の確立と各種細胞における発現量の検討ｉＧｎＴ転写産物の定量は、定量的ＰＣＲ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,87, 2725 (1990)〕に従って行った。各種細胞および細胞株におけるｉＧｎＴ転写産物の量は、いずれの細胞においても同程度発現していると考えられるβ-アクチンの転写産物の量を１００とした時の相対値として表示した。
【０２３０】
（１）スタンダード用プラスミドｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３の造成(図１８)
実施例１の（４）で造成したｉＧｎＴｃＤＮＡのシークエンス決定用のプラスミドの一つ（ｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３と命名）をスタンダードプラスミドとして用いた。該プラスミドは、プラスミド１６−２−１２のＨｉｎｄＩＩＩ-ＳｍａＩ断片（約１．０ｋｂ：図３のＮｏ．１３断片）を、pBluescript II SK(+)のＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｃＩＩ間にサブクローニングすることによって作製した。該プラスミドの造成法を以下に示す。
【０２３１】
プラスミド１６−２−１２を１μｇ、２５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2、６０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩと２０単位のＳｍａＩを加え３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約１．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２３２】
pBluescript II SK(+)を１μｇ、Ｙ−５０緩衝液２５μｌに溶解し、２０単位のＨｉｎｄＩＩＩと２０単位のＨｉｎｃＩＩを加え３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約２．９５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２３３】
上記で得られた、約１．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ処理ＤＮＡ断片０．１μｇおよび約２．９５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ処理ＤＮＡ断片０．０５μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌JM105株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミドをｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３と名付け、その構造を制限酵素消化および塩基配列の決定により確認した。該プラスミドの構造を図１８に示した。
【０２３４】
（２）内部コントロール用プラスミドｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄの造成(図１９)
上記（１）で造成したｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３に含まれるｉＧｎＴｃＤＮＡ内に欠失変異を有するプラスミドｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄの造成を行った。
【０２３５】
ｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３を１μｇ、２５μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、２０単位のＸｈｏＩと２０単位のＳｔｕＩを加え３７℃で２時間消化反応を行った。
【０２３６】
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約３．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
ｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３を１μｇ、２５μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、２０単位のＸｈｏＩと２０単位のＨｉｎｃＩＩを加え３７℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約０．６ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｃＩＩ処理ＤＮＡ断片を回収した。
【０２３７】
上記で得られた、約３．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ処理ＤＮＡ断片０．０５μｇおよび約０．６ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｃＩＩ処理ＤＮＡ断片０．１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＭＭ２９４株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミドをｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。該プラスミドの構造を図１９に示した。
【０２３８】
（３）定量的ＰＣＲ法を用いた各種細胞および細胞株におけるｉＧｎＴ転写産物の定量
（ａ）各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ（定量的ＰＣＲの鋳型として使用）の合成
細胞株としては、Namalwa KJM-1細胞、WM266-4細胞、THP-1細胞、HL-60細胞、U-937細胞、Colo205細胞、LS180細胞、SW1116細胞およびJurkat細胞を用いた。
【０２３９】
WM266-4細胞、THP-1細胞、HL-60細胞、U-937細胞、Colo205細胞およびLS180細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ＡＴＣＣ)より入手した。また、SW1116細胞（ＡＴＣＣより入手可能）およびJurkat細胞（理研ジーンバンク；RIKEN GENE BANKより入手可能）は愛知県がんセンターの高橋博士より入手した。
【０２４０】
また、健康な成人の末梢血よりナイコメッド・ファーマ(Nycomed Pharma)社製のキットであるPolymorphprepTMを用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。
取得した単核球は常法〔J. Immunol.,130, 706 (1983)〕に従ってさらに単球およびリンパ球に分離して取得した。
各細胞の全ＲＮＡは常法〔Biochemistry, 18, 5294 (1977)〕に従って調製した。
【０２４１】
全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（SUPERSCRIPTTM Preamplification System；ＢＲＬ社製）を用いて行った。
細胞株については５μｇの全ＲＮＡから、血球細胞については、１μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍および１０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。
【０２４２】
（ｂ）定量的ＰＣＲ用のスタンダードおよび内部コントロールの調製
上記（１）および（２）で取得したｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３およびｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれｉＧｎＴ転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた。
ＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３およびｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄをそれぞれ１μｇずつＹ−１００緩衝液３６μｌに溶解し、２０単位のＸｈｏＩおよび２０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。
【０２４３】
該反応液の一部１０μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌ含む水で段階的に希釈して使用した。
β−アクチンの転写産物定量用のスタンダードとして、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた〔J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)、特開平06-181759〕。
【０２４４】
β-アクチンの転写産物定量用の内部コントロールとしては、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた〔J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)、特開平06-181759〕。
【０２４５】
（ｃ）定量的ＰＣＲ法を用いたｉＧｎＴ転写産物の定量
（ｂ）で調製した内部コントロール（ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３ｄ）５ｆｇの存在下で、（ａ）で調製した各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号１３に示されたＤＮＡ（以下、Ｃ１２−３と略す）および配列番号１４に示されたＤＮＡ（以下、Ｃ１２−４と略す）を合成した（サワデー・テクノロジーから購入することも可能）。
【０２４６】
ＰＣＲ反応は、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM ＤＮＡ Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant TaqＤＮＡ Polymerase）を用いて行った。
反応液の調製はキットの方法に従った。その際、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）を最終濃度が５％になるように加えた。
【０２４７】
Taq ＤＮＡポリメラーゼ以外を加えた反応液２９μｌをパーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９７℃で５分間処理した後、氷中で急冷した。
【０２４８】
急冷後、該反応液に６．７分の１に希釈したTaq ＤＮＡポリメラーゼ1μlを加え、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラーを用いて、９４℃−３０秒間、６０℃−１分間、７２℃−２分間の反応を2７サイクル行った。
【０２４９】
該反応液の一部７μlをアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをSYBR Green I nucleic acid stain（Molecular Probes社製）で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー（FluorImager SI; Molecular Dynamics社製）で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
また、各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡのかわりに、（ｂ）で調製したスタンダード（ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＢＳＫ＋ｉＧｎＴ１３）を鋳型として同様にＰＣＲを行い、検量線を作成した。
【０２５０】
ｉＧｎＴ転写産物およびスタンダード由来のＤＮＡ断片の大きさは６１５ｂｐ、内部コントロール由来のＤＮＡ断片の大きさは４１６ｂｐであり、両者のＤＮＡ断片の量比からｉＧｎＴ転写産物の量（モル数）を算出した。より正確な転写産物の定量を行なうため、上記のようにして求めた転写産物の量に近い量の内部コントロールを用いて、再度それぞれのサンプルについて同様のＰＣＲを行った。ＰＣＲのサイクル数は内部コントロールの量に応じて変化させた。
【０２５１】
βーアクチンの転写産物の定量についても同様に２段階のＰＣＲにより行った。内部コントロールとしては（ｂ）で述べたＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断したｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄを、スタンダードとしては（ｂ）で述べたＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断したｐＵＣ１１９−ＡＣＴを用いた。
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号１５に示したＤＮＡ（以下、Ａｃ−１と略す）および配列番号１６に示したＤＮＡ（以下、Ａｃ−３と略す）をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成したものを使用した。
【０２５２】
１回目のＰＣＲは内部コントロールを１０ｐｇ用いて、サイクル数１７で行った。
β−アクチンの場合は、ＰＣＲ反応液にジメチルスルホキシドは加えなかった。ｉＧｎＴ転写産物の最終的な発現量は、βーアクチンの転写産物の量を１００としたときの相対値（％）として求めた。
結果を第１表に示す。
上記方法によりｉＧｎＴの転写量を測定できることが示された。
【０２５３】
【表１】
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【０２５４】
【発明の効果】
本発明により、ポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの製造法、該ＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ＤＮＡあるいは該ポリペプチドを用いるポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の製造法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドあるいは該抗体を用いた炎症または癌転移の疾病の診断および治療、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法を提供することができる。
【０２５５】
【配列表】
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【０２５６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：市販のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【図１】発現クローニングの過程を示したものである。WM266-4およびSW1116由来のｃＤＮＡライブラリーを導入したNamalwa KJM-1細胞を、抗ｉ抗体を用いて蛍光染色した後、FACSに供し、抗ｉ抗体との反応性が高い細胞を集めた。バーで示した部分の細胞を集め、次のFACSに供した。3回のFACSの後、抗ｉ抗体との反応性が高い細胞が濃縮された。
【図２】抗ｉ抗体との反応性が高い細胞から回収されたプラスミド（１６−２−１２および16-2-31）、およびコントロールプラスミドpAMoを、それぞれNamalwa KJM-1細胞に導入し、抗ｉ抗体（太線）またはA-PBS（細線）を用いた間接蛍光抗体染色の後、FACSを用いて解析した結果である。
【図３】プラスミド16-2-12が含有するｃＤＮＡ、およびその近傍のベクター部分（太線）の制限酵素マップを示したものである。ナンバーのついたバーは、ｃＤＮＡの塩基配列を決定するためにpBluescriptIISK(+)にサブクローン化したＤＮＡ断片を示している。詳細は本文参照。
【図４】プラスミドpAMo-iの造成工程を示す図である。
【図５】ｉＧｎＴ発現プラスミドpAMo-iおよびコントロールプラスミドpAMoを、それぞれNamalwa KJM-1細胞に導入し、抗ｉ抗体（太線）またはA-PBS（細線）を用いた間接蛍光抗体染色の後、FACSを用いて解析した結果である。間接蛍光抗体染色の前に、細胞をsialidase処理したもの（+sialidase）と、しないもの（-sialidase）で反応性を比較した。
【図６】プラスミドpAMoA-FT3の造成工程を示す図である。
【図７】プラスミドpAMoA-i52Sの造成工程を示す図である。
【図８】プラスミドpAMoA-i52Sを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清から、ＩｇＧセファロースを用いてプロテインＡ融合分泌型ｉＧｎＴを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果である（レーン２）。コントロールとして、pAMoAを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。
【図９】プラスミドpAMoF2の造成工程を示す図である。
【図１０】プラスミドpT7B-i52S  No.3の造成工程を示す図である。
【図１１】プラスミドpAMoF2-i52Sの造成工程を示す図である。
【図１２】プラスミドpAMoF2-i52Sを導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清から、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦｌａｇペプチド融合分泌型ｉＧｎＴを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果である（レーン２）。コントロールとして、pAMoF2を導入したNamalwa KJM-1細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。
【図１３】プラスミドpVL1393-iの造成工程を示す図である。
【図１４】プラスミドpVL1393-Ai52Sの造成工程を示す図である。
【図１５】プラスミドpVL1393-Ai52S由来の組換えウイルスが感染したSf21細胞の培養上清から、ＩｇＧセファロースを用いてプロテインＡ融合分泌型ｉＧｎＴを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果である  （レーン２）。コントロールとして、プラスミドpVL1393由来の組換えウイルスが感染したSf21細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。
【図１６】プラスミドpVL1393-F2i52Sの造成工程を示す図である。
【図１７】プラスミドpVL1393-F2i52S由来の組換えウイルスが感染したSf21細胞の培養上清から、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦｌａｇペプチド融合分泌型ｉＧｎＴを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果である（レーン２）。コントロールとして、プラスミドpVL1393由来の組換えウイルスが感染したSf21細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。
【図１８】プラスミドpBSK+ｉＧｎＴ13の造成工程を示す図である。
【図１９】プラスミドpBSK+ｉＧｎＴ13dの造成工程を示す図である。
【符号の説明】
bp：塩基対 (base pairs)
kb：キロ塩基対 (kilobase pairs)
G418 / Km ：トランスポゾン５(Tn5) 由来G418、カナマイシン耐性遺伝子
Ap：pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子
Tc：pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝子
P1：pBR322由来P1プロモーター
Ptk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス(Herpes simplex virus; HSV) チミジンキナーゼ(tk)遺伝子プロモーター
Sp. BG：ラビットβグロビン遺伝子スプライシングシグナル
A.BG：ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナル
A. SE：シミアン・ウィルス (simian virus) 40 (SV40) 初期遺伝子ポリＡ付加シグナル
Atk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス(Herpes simplex virus ; HSV)チミジンキナーゼ(tk)遺伝子のポリＡ付加シグナル
Pse：シミアン・ウィルス (simian virus) 40 (SV40) 初期遺伝子プロモーター
Pmo：モロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat : LTR）プロモーター
EBNA-1：エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein -Barr virus ）のEBNA-1遺伝子
oriP：エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein -Barr virus ）の複製開始点
S：ヒト顆粒球コロニー刺激因子または免疫グロブリンκのシグナルペプチドをコードする遺伝子部分
A または ProA：黄色ブドウ球菌StaphylococcusaureusのプロテインＡのＩｇＧとの結合領域をコードする遺伝子部分
F：Ｆｌａｇペプチドをコードする遺伝子部分
ｉＧｎＴ：本発明で取得したポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ（全長または部分長）
ｃＤＮＡ：本発明で取得したポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ（全長または部分長）
ｃＤＮＡ del：約0.2kbの欠失を有する、本発明で取得したポリ-N-アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するポリペプチドをコードする部分長ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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