(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器アセンブリは既知容積の室を有し、その室は第１壁、側壁および第１壁と対立して配置される透明の試料観察部分により画定され、膨潤可能なヒドロゲル層は室の第１壁を被覆し、膨潤可能なヒドロゲル層は室の試料観察部分に面する平坦面を有し、膨潤可能なヒドロゲル層はそのヒドロゲルがその室を本質的に満たしかつヒドロゲル層がその成形試料成分を除いて本質的にすべての流体試料の水性画分を吸収することにより膨潤する場合、任意の成形試料成分をヒドロゲルのその平面に捕集する量で存在し、水をベースとする生物流体試料に含まれる成形成分の試験に使用する容器アセンブリであって、
その流体試料は、尿、脳脊髄流体、胸膜流体、腹水、甲状腺および胸の嚢胞のような嚢胞から吸引された流体、流体に入れた細胞学験体、大便試料の水性サスペンジョン、血小板プラズマ試料、調製した細菌成長体水性混合物からなる群から選ばれる、
容器アセンブリ。
【請求項２】
室の第１壁は平面である、請求項１記載の容器アセンブリ。
【請求項３】
室の試料観察透明部分は室の透明壁を含む、請求項１記載の容器アセンブリ。
【請求項４】
さらにヒドロゲル層平坦面に配置される光学的に検出できるボディを含み、ヒドロゲル層が室内で膨潤した後、光学ボディはヒドロゲル層平坦面に位置するように操作できる、請求項１記載の容器アセンブリ。
【請求項５】
ヒドロゲル層平坦面に少なくとも３つの光学的に検出できるボディがある、請求項４記載の容器アセンブリ。
【請求項６】
複合生物流体試料の水性成分から成形成分を分離するのに使用する容器アセンブリであって、
この容器アセンブリは既知容積の室を有し、室は底部壁、側壁および底部壁と対立して配置される透明の試料観察部分により画定され、
膨潤可能なヒドロゲル層は室の底部壁に配置され、膨潤可能なヒドロゲル層は室の試料観察部分に面する平坦面を有し、
膨潤可能なヒドロゲル層は、当該ヒドロゲル層が前記複合生物流体試料中の実質的にすべての水性成分を吸収することにより膨潤したとき、前記ヒドロゲルは本質的に室を満たす容積を有し、
前記ヒドロゲルは前記複合生物流体試料中の成形成分を吸収できないものである、上記容器アセンブリ。
【請求項７】
水をベースとする生物流体試料に含まれる少なくとも１つの成形成分の特性を試験する方法であって、
ａ）既知容積を有する試料室を含む試料容器を供する工程、室は第１壁、側壁および第１壁と対立して配置される透明の試料観察部分により画定され、室はさらに室の第１壁に配置された膨潤可能なヒドロゲル層を含み、膨潤可能なヒドロゲル層は室の試料観察部分に面する平坦面を有し、ヒドロゲル層が本質的にすべての流体試料の水性成分を吸収する結果膨潤する場合、膨潤可能なヒドロゲル層はヒドロゲルがその室を本質的に満たす容積を有し、
ｂ）流体試料を室のヒドロゲル層に導入し、流体試料の水性成分を吸収させてヒドロゲル層を膨潤させ、その間流体試料から室中の膨潤可能なヒドロゲル層の表面に成形成分を捕集する工程、および
ｃ）室の膨潤できるヒドロゲル層の表面に捕集した少なくとも１つの成形成分を試験することを含む、上記試験方法。
【請求項８】
ヒドロゲル層の表面は平面であり、ヒドロゲル層が膨潤する間平面のままである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
平坦面はヒドロゲル層が膨潤した後平坦面の位置を確認できる、そこに配置された光学的に識別できるボディを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
水をベースとする複合生物流体試料から少なくとも１つの成形成分を分離する方法であって、
ａ）既知容積を有する試料室を含む試料容器を供する工程、室は底部壁、側壁および底部壁と対立して配置される透明の試料観察壁により画定され、室はさらに室の底部壁上に配置された膨潤可能なヒドロゲル層を含み、ヒドロゲル層は室の試料観察壁に面する平面を有し、およびヒドロゲル層が流体試料の本質的にすべての水性成分を吸収する結果膨潤する場合、ヒドロゲル層は、室を本質的に満たすために操作することができ、
ｂ）流体試料を室のヒドロゲル層に導入し、流体試料の水性成分をヒドロゲル層中に吸収し、膨潤させ、その間流体試料から少なくとも１成分を室の膨潤ヒドロゲル層の表面で捕集する工程
を含む、上記分離方法。
【請求項１１】
膨潤した透明または半透明ヒドロゲルの上部表面を試料室に位置させる方法であって、
ａ）試料室を含む試料容器を供する工程、室は第１壁、側壁および第１壁と対立して配置される透明試料観察壁により画定され、室はさらに室の第１壁に配置された透明または半透明ヒドロゲルの膨潤可能な層を含み、ヒドロゲル層は室の試料観察壁に面する平面を有し、
ｂ）ヒドロゲル層の平坦面を室の識別できる焦点を合せる成形体に光学機器が焦点を合せる位置に移動させるためにヒドロゲル層を膨潤させる工程、および
ｃ）光学機器が成形体に焦点を合せるように室を位置させる工程、成形体はヒドロゲルの平坦面に位置し、かつ、ヒドロゲルの平坦面は室の試料観察壁の低部表面と共通平面であること
を含む、上記方法。
【請求項１２】
ヒドロゲルの膨潤前、焦点を合せる成形体はヒドロゲルの平面に位置させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
室に含まれる生物試料の視野像を重複する方法であって、
ａ）既知容積を有する試料室を含む試料容器を供する工程、室は第１壁、側壁および第１壁と対立して配置される透明の試料観察部分により画定され、室はさらに室の第１壁に配置された膨潤可能なヒドロゲル層を含み、膨潤可能なヒドロゲル層は室の試料観察部分に面する平坦面を有し、ヒドロゲル層が本質的にすべての流体試料の水性成分を吸収する結果膨潤する場合、膨潤可能なヒドロゲル層はヒドロゲルがその室を本質的に満たす容積を有し、
ｂ）流体試料を室のヒドロゲル層に導入し、流体試料の水性成分を吸収させてヒドロゲル層を膨潤させ、その間流体試料から室中の膨潤可能なヒドロゲル層の表面に成形成分を捕集する工程、
ｃ）流体試料の第１視野像を室に形成し、そして成形体の位置パターンを第１視野像に記録する工程、
ｄ）室の第１視野像のＸ、Ｙグリッド位置を記録する工程、
ｅ）記録した視野のＸ、Ｙグリッド位置に戻す工程、
ｆ）そこに戻した後その視野を再映像する工程、
ｇ）工程ｃ）およびｆ）から得た視野像の成形体の位置を比較する工程、
ｈ）第１視野像を再映像視野に複製するために、第１視野像の成形体位置に再映像視野の成形体位置を重ねる工程
からなる、上記重複方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光学機器を成形成分の試験に有利に使用するために、生物流体試料の液体成分から成形成分を分離する装置および方法に関する。更に詳述すれば、本発明は装置の平坦面に配列する成形成分を形成し、平坦面を光学機器のフォーカルプレーンに適合させる装置および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
複合生物流体試料中の成形成分は、一般的に成形成分の詳細な試験ができるように試料の液体成分中に単離し、または液体成分から分離する。フローサイトメトリは血液試料の血球のような成形成分を同定する一手法である。この技術を使用して、血液中の各種型の血球その他の成形成分は相互に区別し、計数できる。この方法を行なうには、血液試料はフロー血球計算器を通す前に稀釈しなければならない。上記サイトメトリ技術は血液試料中の細胞または他の成形成分を静止状態で試験することはできない。この技術は、ノールウェイのダイネルが提示した型の磁気粒子ビーズ強化方法のような強化処理に試料を供しない限り、血液試料の稀少成分を有効に検知するために使用することはできない。
【０００３】
抗凝固全血液試料中の白血球および血小板を同定および計数する第２の技術は米国特許第４，０２７，６６０号およびロバート・エイ・レビンおよび／またはステフエン・シー・ワードローの他の特許明細書に記載される。この技術は長いインサートを配置させた毛細管を利用する。血液試料はアクリジンオレンジのような染料と混合し、毛細管中で遠心分離する。白血球や血小板はフロートと管壁間の管内に沈降するので白血球および血小板層は約１０倍に伸びる。白血球および血小板層の伸びは対立する細胞層の界面間の距離を測定し、ついで測定値をセルカウントに換算することにより管内の白血球および血小板数を区別して確かめることができる。この第２技術も血液試料中の個々の血球を試験することはできない。
【０００４】
同時係属中の米国特許出願番号０８／９７６，８８６号明細書には、異常な上皮細胞および／または血液学前駆細胞が存在するか、しないかに対し抗凝固全血液試料の分析方法を記載する。この方法は全血液試料を透明試料管に入れ、試料管は十分な容積を占めるインサートを含み、インサートと管間に個々の細胞を単離し、試験できる十分に画定された環状区域を試料管に形成するようにすることを含む。試料管の十分に画定された区域は少なくとも１００倍の倍率下で試験され、それにより個々の細胞の形態がそこで検査できる。注意することは、上記方法は単離細胞を検査する前に試料管の全血液試料を遠心分離する必要があることである。
【０００５】
複数成分の流体試料は遠心分離して試料の成形成分から試料の液体成分を分離することができる。この技術は尿分析にもっとも通常的に使用される。細胞または他の微粒子を含有する生物流体試料では、微粒子は重量法で液体成分から分離沈降し、細胞と微粒子も比重により相互に分離する。試料の遠心分離後、試料の液体および成形成分画分は相互に分離され、いずれかをさらに分析する。
【０００６】
尿分析の場合、遠心分離が完了すると、９０〜９５％の上澄液はデカントまたは廃棄し、細胞および微粒子はより少量の残留液に再懸濁しそして室に入れ、または検査するため顕微鏡スライド上に置く。遠心分離技術を使用する各種型の細胞または微粒子の検査は時間がかかり、技術者の役割ではかなりの熟練を必要とする。この技術はまた遠心分離中試料成分の損失または分解のため正確ではなく、尿分析の場合、デカンテーションおよび再懸濁工程の不正確さのため正確ではない。
【０００７】
成形成分は生物流体試料から濾過により分離することもできる。この技術を使用して、或る寸法の成形成分の通過を防止する細孔寸法を有するフィルターに流体試料を通す。こうして試料に見出される目標成形成分の寸法が既知である場合、試料から目標成分を分離するのに適当なフィルターを選択できる。成形成分がフィルターに捕集されると、これらは取出し、培養し、またはさらに分析することができる。この技術で遭遇する問題は各種フィルターのコスト、目標とする成形成分の寸法を知ることの必要性、試料をフィルターに通すのに必要な水道設備、およびフィルターの目詰まりの可能性を含む。
【０００８】
遠心分離および／または濾過により溶液から単離できる成形成分は、生物流体の微生物；尿の円柱；体細胞および血液以外の体液中の血球；包嚢；ブラッシング、吸引または擦過により得た、液体媒体に入れた細胞学験体からの細胞；大便試料に見出される卵および寄生虫；および抗凝固全血液からのがん上皮および血液学前駆細胞を含む。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、生物流体試料の液体成分から成形成分を分離する公知技術はすべて試料の遠心分離または試料の濾過を含む。静態の生物流体試料の液体成分から比較的稀少な成形成分を分離する技術を供することは望ましい。この技術は静止方法で操作し、安価であり、遠心分離、流体水道設備およびフィルターのような高価な補助道具の使用を必要とせず、かつ使用するため高度の専門技術および経験を必要としない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は水性流体試料混合物の液体成分から成形成分の分離に使用する方法および装置に関する。候補の水性試料混合物は尿、脳脊髄流体、胸膜流体、腹水、甲状腺および胸の嚢胞のような嚢胞から吸引された流体、流体に入れた細胞学験体、大便試料の水性サスペンジョン、血小板プラズマ試料、調製した細菌成長体水性混合物などを含む。
【００１１】
本発明の装置は透明な試料観察部分を有する試料室を含み、試料室は水性媒体の存在で膨潤しうる、平面の膨潤可能壁を含む。このような壁はヒドロゲルであり、本発明によれば、水溶液を添加して膨潤させる。媒体は膨潤前、媒体の平衡能以下の水溶液量を含有でき、こうして媒体をさらに水和および膨潤させることができ、または媒体はキセロゲル、すなわち水を吸収するとヒドロゲルになり、本方法で膨潤する乾燥ポリマー構造であることができる。単純化するため、本発明で使用する「ヒドロゲル」とは乾燥状態から十分に膨潤した平衡状態の水で膨潤可能なポリマーマトリックス構造をいう。ヒドロゲル層壁は試料観察部分と反対に配置する。ヒドロゲル層は一定の厚さを有するので、室の試料観察部分にもっとも接近するヒドロゲル層の表面は平面である。装置を試料の分析に使用する場合、室は試験する試料量で満たされ、試料はヒドロゲル層の上面に付着する。試料室は既知容積を有し、水吸収ヒドロゲル層の容積は、さらに水和すると、本質的にすべての試料水分を吸収し、試料室をヒドロゲルにより実質的に満たす。
【００１２】
流体試料を室に添加後、室は膨潤ヒドロゲルにより実質的に完全に満たされるまで、ヒドロゲルは室の試料観察部分の方向に膨潤する。室の試料観察部分にもっとも接近する膨潤ヒドロゲルの表面はヒドロゲル層が膨潤するとき平面で残こる。生物試料の水性成分はヒドロゲル中に吸収され、それによりヒドロゲルの膨脹または膨潤を生ずる。ヒドロゲルが膨潤する場合、試料に含有される任意の成形成分は移動するヒドロゲルの平坦面に捕集され、ヒドロゲルが連続して膨潤する時ヒドロゲルの表面にそのまま残こる。ヒドロゲルがその最終膨潤容積に達すると、試料中の実質的にすべての液体成分はヒドロゲル中に吸収され、試料のすべての成形成分はヒドロゲルの表面に捕集される。ヒドロゲルの捕集表面は平面のままで残こり、好ましくは室の試料観察部分に対し圧縮されるので、試料の捕集成形成分は捕集成形成分の試験に使用する機器のフォーカルプレーンを占有することができる平坦面に固定される。試料に含まれ、再水和ヒドロゲルの表面に捕集される各種成形成分は測定対象物特異剤によりはっきり区分けできるので、各種成形成分は相互に区分けできる。成形成分は染色することもできるので、これらはヒドロゲル表面上で形態学的に検査することができる。各種のはっきり区分けした成形成分は計数することもできる。室に添加した試量容積は既知であるので、試料単位容積当りの成形成分計数は誘導できる。ヒドロゲル表面の成形成分の単離および濃縮はヒドロゲル表面から特異的成形成分を収集し、さらに収集成分を分析することもできる。本発明装置は顕微鏡、または光学的区分け機器のような光学的走査機器により走査することができる。
【００１３】
従って静止生物流体試料に含有される成形成分に関する情報を取得するのに使用する方法および装置を供することは本発明の目的である。
【００１４】
試料の成形成分が試料容器に配置された膨潤ヒドロゲルの平坦面に捕集される特徴を有する方法および装置を供することは本発明の付加的目的である。
【００１５】
本発明の別の目的は、試料の液体成分は試料容器に配置された水吸収性ヒドロゲル層を膨潤させる特徴を有する方法および装置を供することである。
【００１６】
膨潤ヒドロゲルの平坦面は試料容器と同時に使用する光学的試験機器に対しフォーカルプレーンを形成する、記載特徴を有する方法および装置を供することは本発明のそれ以上の目的である。
【００１７】
個々の成形成分は、ヒドロゲルが室で膨潤した後ヒドロゲルの平坦面から収集できる、記載特徴を有する方法および装置を供することは本発明のさらなる目的である。
【００１８】
試料の単位容積につき目標とする成形成分の数と型は誘導できる、記載特徴を有する方法および装置を供することはそれ以上の本発明の目的である。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および利点は図面と併せて見る場合本発明の態様の次の詳細な記載から一層容易に明らかになろう。
図１はその壁に吸水性ヒドロゲル成分を有する試料受容室を含む試料分析容器の概略横断面図である。
図２はヒドロゲル被覆は実質的に室を満たすように膨潤する。図１に示す型の容器の横断面図である。
図３は室の膨潤ヒドロゲルの上部表面に捕集される試料から成形成分の配列を示す図１および２の容器の概略平面図である。
図４は試料室の初めの視野の試験品の複合像および同じ視野の試験品のその後の像である。
【００２０】
図面に言及する。図１は一般に数字２により表わされる試料容器の略図である。この容器２は側壁６および平面底部壁８により画定される室４を含む。好ましくは透明または半透明のヒドロゲル９の一定の厚さの層が室４の底部壁８に配置される。適当なヒドロゲルは「ＰＨＹＴＡ」ゲルを含み、これはグルクロン酸、ラムノースおよびグルコースから形成されるヒドロゲルである。これは透明無色であるから、成形成分の検出に使用するのにすぐれた物質である。このヒドロゲルはシグマ・ダイアグノスチックスの製品である。
【００２１】
他の適当なヒドロゲルにはポリエチレンオキシド、ポリ（エチレンオキシド−コプロピレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（アクリル酸）［Ｎａ+形の］、ポリ（アクリル酸−コアクリルアミド）［Ｎａ+形の］、ポリ（メタクリル酸）［Ｎａ+形の］、ポリ（メタクリル酸−コアクリルアミド）［Ｎａ+形の］、ポリ（アクリロニトリル−コアクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、および親水性ポリ（ウレタン）がある。
【００２２】
ヒドロゲル層９の上部表面１０は平面で、室４の平面底部壁８を反映する。室４に配置されるヒドロゲル層９の容積は、ヒドロゲル９が室に添加された試料から水を吸収する場合、実質的に室４を満たし、本質的に試料のすべての水を吸収するようなものである。室４は好ましくは顕微鏡カバースライド形を取ることができる透明部分１２が供され、これは窓となり、窓を通してゲル９の上部表面１０が観察される。複数の同定可能な成形体１４はゲル表面１０に予備的に位置され、図２に示すようにヒドロゲルの膨潤後ヒドロゲル９の上部表面に光学機器１６の焦点を合せて使用することができる。
【００２３】
成形体１４は３つの機能を遂行する。第１はヒドロゲル表面１０に光学機器の焦点を合せることであり、第２は機器１６が表面の何らかの他の成形成分を検知しない場合、表面１０の位置を確認することである。後者の場合、機器１６は分析試料が何らかの成形体を含有しないことを記録する。成形体１４の第３機能は光学的位置合せまたは航海点として働くことである。この機能は行われる試料分析が室の複数区域で長時間反復試験することが必要である場合有用である。大部分の分析機器は表面の所定点の正確な再位置設定はできず、むしろおよその再位置設定であるので、任意の特別の視野における実施された成形体位置の地図は同じ視野のその後の像を再整列するために使用できるので、その視野における連続比較測定を長時間にわたって実施できる。
【００２４】
図４は成形体１４の上記再整列の有用性を説明する。図４は多数の成形成分Ｂが見出される特別の視野を説明することに注意すべきである。視野はまた偶然三角形パターンで整列する３つの成形体１４を含む。この視野は走査機器により映像化され、この視野のＸ、Ｙ座標の位置は機器により記録される。機器はいくつかの理由でこの特別の視野に戻るようにプログラムされていると仮定すると、記録されたＸ、Ｙ座標を使用してその視野に戻るであろう。その視野に戻ると、成形成分Ｂの位置または成形体１４の位置を正確に再生できない、従って再視野の像の成形体の位置は図４に幻想で示され、その位置は数字１４′により表わされる。次に機器は再映像成形体１４′の位置を初めの成形体１４の位置と比較し、体１４′の再映像位置を体１４の初めの映像位置と重ねることにより、初めの視野により再映像視野を調整する。この方法で、体１４および視野におけるその位置は同じ視野像に戻すために使用することができる。成形体１４は試料全体にランダムに分配されるので、特別の視野に見られる成形体１４の任意の模様はその視野で独特であることが認められるであろう。試料の試験に使用できる機器は１９９９年２月２３日提出の同時係属米国特許出願番号０９／２５５，６７３号明細書に示し、記載した機器と同様のものでよい。
【００２５】
図３は本発明により分析する尿試料に見出すことができる成形成分の一般的分類を説明する。焦点を合している成形体１４は図３に示す。例えば細菌Ａ、赤血球Ｂ、円柱Ｃ、および結晶Ｄのような捕集された成形成分はヒドロゲル９の表面１０に見られる。いくつかの個々の成分Ａ、Ｂ、ＣまたはＤは区分け染色され、そうでなければハイライトにより、超生体染色は或る種の成分の形態学的試験をするために試料に使用することができ、および個々の成分はヒドロゲル表面１０から取り出してさらに試験を行なうことができることは認められるであろう。成分が機器１６により固定されると、成分の正確な位置が分かり、変化しない、従ってこの成分は再配置できる。
【００２６】
試料室を試料分析に対し準備する１つの方法は次の通りである。水和ヒドロゲルの上部表面が平面であり、室カバー１２の低部表面の平面と共通平面であるように、空の試料室に少なくとも部分水和ヒドロゲルを満たすことができる。こうして満たした室アセンブリは次に室のヒドロゲル層を収縮させ、ヒドロゲル成分の上部表面をカバー２の低部表面から下方に移動させるためにヒドロゲルから水を蒸発させる環境処理することができる。次に成形成分に対し分析する水をベースとする試料の分取試料は試料室の収縮したヒドロゲル成分上に導入し、次に後者は試料から水を吸収して初めの容積に戻り膨潤できる。再膨潤ゲル成分の上部表面は、試料の任意の捕集された成形成分をカバー１２の低部表面と一致する焦点面に移動させるためカバー１２に対しこうして押し出される。試料を収縮ゲルに添加前、成形体１４は収縮ゲルの上部表面に置くことができる。
【００２７】
試料室を準備するために使用できる別の方法は次の通りである。「軟質」（すなわち、部分水和）ヒドロゲルを水吸収剤として使用する場合、これらの軟質ゲルは試料室のその場所で部分脱水されない。これらは試料室の外側で予め製造された。例えば、ゲルシートからゲル円板を切り取り、切り取った円板は室の底部に粘着するように室の底部に置くことができる。どんな場合でも、ゲルは試料の本質的にすべての水を吸収できなければならない。ゲルが膨潤する場合、カバー１２を室から離して上げてはならない。
【００２８】
本発明方法および装置は成形成分に対し或る生物流体試料を検査する安価な手法を供する。試料に見出すことができる異なる成形成分は相互に区分けでき、装置から収集でき、計数できる。試料の成形成分は、さらにヒドロゲルを水和させるためにその水性平衡状態にない親水性ヒドロゲルに液体成分を吸収させることにより試料の液体成分から分離される。ヒドロゲルのそれ以上の水和中、試料の任意の成形成分はヒドロゲルの膨潤表面に捕集される。
【００２９】
本発明開示態様の多くの変化および変形は本発明の概念から逸脱せずに行なうことができるので、請求範囲に記載されるもの以外には本発明を限定するつもりはない。
【図面の簡単な説明】
【図１】試料分析容器の概略断面図である。
【図２】図１に示す試料容器のヒドロゲルが水を吸収して膨潤した時の断面図である。
【図３】膨潤ヒドロゲル表面に捕集された成形成分の配置を示す図１および２の断面図である。
【図４】験体の初めの視野とその後の視野における像の配置を示す。
【符号の説明】
２  試料容器
４  室
６  側壁
８  底部壁
９  ヒドロゲル
１０  ヒドロゲル層の上部表面
１２  透明部分
１４  成形体
１６  光学機器
Ａ  細菌
Ｂ  赤血球
Ｃ  円柱
Ｄ  結晶
【図１】
0004372322.tif 000002
【図２】
0004372322.tif 000003
【図３】
0004372322.tif 000004
【図４】
0004372322.tif 000005