(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法に使用する医薬の製造におけるSerrate、DeltaまたはDSLドメインおよびEGF様反復を含むそれらの断片の使用。
【請求項２】
免疫療法がＴ細胞仲介の疾病または感染症の治療を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｔ細胞仲介の疾病または感染症が、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍によって誘導されるＴ細胞系の異常、ならびにマラリア原虫（Plasmodium）種、ミクロフィラリア（Microfilariae）、腸内寄生虫（Helminths）、マイコバクテリウム（Mycobacteria）、HIV、サイトメガロウィルス（Cytomegalovirus）、シュウドモナス（Pseudomonas）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、エキノコッカス（Echinococcus）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）Ｂ型、麻疹、Ｃ型肝炎またはトキシカラ（Toxicara）などに起因する感染症の１つまたはそれ以上によるものである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
アレルゲンまたは抗原の存在下で、Serrate、DeltaまたはDSLドメインおよびEGF様反復を含むそれらの断片を発現または過剰発現する抗原提示細胞とともにＴ細胞をインキュベートするかまたは該抗原提示細胞にＴ細胞を曝露することを含む、該アレルゲンまたは抗原に対しＴ細胞を寛容化する方法。
【請求項５】
Serrate、DeltaまたはDSLドメインおよびEGF様反復を含むそれらの断片の（過剰）発現が、それらを発現することができるウイルスでトランスフェクトした抗原提示細胞によるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞が樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、または脂質膜などの合成抗原提示細胞から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
免疫療法に用いる医薬の製造における、DeltaまたはSerrateの細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦcセグメントを含む融合タンパク質の使用。
【請求項８】
ＦcセグメントがIgGFcまたはIgMFcである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Serrate、DeltaまたはDSLドメインおよびEGF様反復を含むそれらの断片を含む、免疫療法のための組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明はＴ細胞活性化の修正における治療用化合物の使用に関する。特に、本発明はNotchタンパク質ファミリーの構成員とそれらのリガンドとの間の相互作用の調節におけるこれらの使用、ならびに移植片拒絶、自己免疫、アレルギー、喘息、感染症および腫瘍などの病状の治療におけるこれらの化合物の使用に関する。
Ｔ細胞間ならびに抗原提示細胞（APC）−Ｔ細胞間の制御された相互作用はヒト免疫系の機能の核心である。しかし、いくつかの病理学的状態においては、これらの相互作用を正方向または負方向に修正することが治療上有益になることがある。例えば、自己免疫、アレルギーおよび移植片拒絶などの病状においては、負のＴ細胞またはＴ細胞−APC相互作用の刺激による免疫応答のダウンレギュレーションを誘導することが望ましい。「感染寛容」および「連鎖抑制（linked suppression）」のモデルは、寛容が少数のＴ細胞中で誘導され、そして次にこれらのＴ細胞がこの寛容を別のＴ細胞に伝達し、こうして有効な免疫学的攻撃を阻止することを示唆している。腫瘍によって誘導される免疫抑制、寄生性ウイルスまたは細菌感染症などの別の病状においては、免疫抑制が共通する性質である。こうした情況下では、したがって、感染寛容を伝えるＴ細胞の相互作用を阻害することが望ましい。
しかし、現在まで、こうしたＴ細胞およびＴ細胞−APC相互作用の基礎となる機構については理解されていなかった。
WO 92/19734はヒトNotchおよびDelta遺伝子のヌクレオチド配列ならびにそれらによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を開示することを趣旨としている。この開示は、Drosophilaなどの昆虫の正しい発生学細胞系統（embrayological cell lineage）の発生に必須であるとして、Notch遺伝子ファミリーが十分特性決定されたことを示している。
Notchファミリーに属するタンパク質は、いくつかの保存されたペプチドモチーフを含む膜貫通レセプターである。このファミリー内の各タンパク質は特徴的な細胞外EGF（表皮成長因子）様反復および膜近接Lin-12/Notchモチーフを示す。その上、各タンパク質はPEST配列とともに細胞質側尾部に6〜8アンキリン反復モチーフを有している。Notchリガンドはタンパク質のアミノ末端で、かつ細胞外表面の3〜8個のEGF様反復の間に、20〜22アミノ酸を含む、特徴的なDSLドメイン（D,Delta、S,Serrate、L,Lag2）を有する。このタンパク質は非保存機能性ドメインを含む短い細胞質側尾部を有する。
最近の証拠によれば、Notchシグナル伝達は、胸腺内の未成熟Ｔ細胞の系列参加（lineage commitment）に寄与し、胸腺細胞の発生をMHC認識に無関係なCD8+系統の方に偏向させることが示唆されている（Robey E.ら、Cell 1996,87:483-492）。胸腺内での成熟中に、Ｔ細胞は自己寛容と称される過程である、自己抗原を非自己抗原から識別する能力を獲得する（von Boehmer H.ら、Ann Rev Immunol.1990,8:531）。寛容の誘導および維持については、末梢においても機構が存在し、多くの面で、これらの重要性を評価中である。抗原で免疫することによってレシピエントの特異的不応答性（寛容またはアネルギー）状態を誘導する能力を明確に説明する、移植片拒絶、自己免疫疾患およびアレルゲンに対する特異的応答の実験モデルが多数ある。これらの系から、２つの重要な知見が生起する。第１に、選択された条件下での抗原のペプチド断片の１つでの免疫は、チャレンジ免疫のためにその完全ペプチドを使用するならば、それ自体に対するばかりでなく、同一の分子の別の領域に対する特異的応答をも阻害することがある（連鎖抑制；Hoyne GFら、J.Exp Med.1993;178:183.、およびMetzler B, Wraith DC. Int.Immunol.1993;5:1159）。第２に、これは移植の実験モデルにおいて最もよく記載されているが、特定の抗原に対して寛容となった免疫担当細胞が他の細胞の応答を阻害することができて、さらにこの第２細胞集団が調節性および寛容になるものと仮定される、「感染寛容」の現象である（Qin SX，ら、Science 1993;258:974）。この現象の基礎となる免疫学的機構はこれまでは特性化されていなかった。
本発明は、末梢免疫系の正常な成人細胞の細胞表面にNotchレセプターファミリーならびにそのリガンド、DeltaおよびSerrateが発現されるという発見から生起する。
したがって、本発明によって、免疫療法での使用のための医薬の製造における、Notch-リガンドの使用が提供される。
正常な末梢成人免疫系におけるNotchファミリーのレセプターおよびそのリガンドの発現パターンは以前には記載されていないが、本発明者らは、Ｔ細胞はNotch１ ｍＲＮＡを構成的に発現するが、Deltaの発現は末梢リンパ組織のＴ細胞の１サブセットのみに限定されることを示した。Serrate発現は末梢の抗原提示細胞（APC）の１サブセットに制限されるようである（図１）。したがってこのレセプターリガンドファミリーは、他の組織で示されたように、胚の発生以後に、免疫系中での細胞の運命の決定を調節し続けるらしい（Ellisen LW，ら、Cell 1991;66:649）。Notchシグナル伝達は末梢の不応答性（寛容またはアネルギー）の誘導に中心的な役割を果たすようであり、そして連鎖抑制および感染寛容の物理的説明を提供するようである。
本発明は、さらに、Ｔ細胞が仲介する反応の治療におけるNotch-リガンドの使用に関する。これは、アレルゲンまたは抗原の存在下で、未感作のＴ細胞集団をAPCによって発現させたNotch-リガンドに曝露することにより、Notch-リガンドはこのＴ細胞集団をそのアレルゲンまたは抗原に対して寛容にすることができることが観察された。さらに、このＴ細胞集団を、続いて第２の未感作Ｔ細胞集団に曝露すると、その第２の集団をこのアレルゲンまたは抗原に対して寛容にすることができる。
このように、本発明は連鎖寛容および／またはバイスタンダー（bystander）寛容（当分野では感染寛容としても知られている）に影響を与えるためのNotch-リガンドの使用にも関する。
さらに別の本発明の実施態様は機能性Notch-タンパク質の発現またはNotchシグナル伝達経路の調節におけるNotch-リガンドの使用に関する。
本発明の上記の実施態様において、アレルゲンまたは抗原の存在下でNotch-リガンドを発現または過剰発現する抗原提示細胞（APC）またはその類似物とＴ細胞をインキュベート／混合することによって、Ｔ細胞にNotch-リガンドを曝露させることができる。Notch-リガンド遺伝子の（過剰）発現は、Notch-リガンドを発現することができる遺伝子でトランスフェクトされたAPC群、または内在性Notch-リガンド遺伝子（群）の発現をアップレギュレートすることができる薬剤に曝露したAPC群によってもたらすことができる。
Notch-リガンドの発現に影響を与える好適な薬剤として、Deltaおよび／またはSerrate遺伝子の発現に影響する薬剤が含まれる。例えば、Delta発現については、細胞外BMP群（骨形態形成タンパク質、Wilson,P.A.and Hemmati-Brivanlou A.1997 Neuron 18:699-710, Hemmati-Brivanlou,A and Melton,D.1997 Cell88:13-17）のそれらのレセプターへの結合は、Achaete/Scute複合体転写因子の発現の阻害に起因してダウンレギュレートされたDelta転写をもたらす。この複合体はDelta発現のレギュレーションに直接関与するものと信じられている。したがって、BMP群のそれらのレセプターへの結合を阻害するどんな薬剤でも、Deltaおよび／またはSerrateの発現の増大をもたらすことができる。こうした薬剤として、Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGF群、Fringeならびにこれらの誘導体および変異体が含まれる（NogginについてSmith W.C.and Harland,R.M Cell 70:829-840、ChordinについてSasai Yら、1994 Cell 79:779-790の文献を参照されたい）。NogginおよびChordinはBMP群に結合し、それによって、Delta転写の減少に導くこれらのシグナル伝達カスケードの活性化を阻止する。
いくつかの病態において、身体が免疫的に弱体化し、この強制された免疫抑制を克服するために、Deltaおよび／またはSerrateの発現をダウンレギュレートすることが望まれることがある。こうした情況において、Deltaおよび／またはSerrateの発現を阻害する薬剤を使用することができる。Deltaおよび／またはSerrateの発現を阻害する薬剤の例として、Tollタンパク質（Medzhitov,R.ら、1997 Nature 388:394-397）BMP群、ならびにNoggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGF群およびFringeの産生を減少させるかまたは妨害するその他の薬剤が含まれる。このように、本発明はさらに、細菌感染症または腫瘍誘導免疫抑制を逆転するために使用する医薬の製造における、DeltaまたはSerrateの発現をダウンレギュレートすることができる薬剤の使用に関する。
上記考察のように、本発明はNotch-タンパク質の発現または細胞膜上での提示あるいはシグナル伝達経路の修正にも関する。これらは寛容（連鎖および／またはバイスタンダー）の誘導に携わる、Ｔ細胞によって仲介される応答に関与することが示された。細胞表面での完全機能性Notch-タンパク質の提示を強化する薬剤として、DrosophilaのKuzbanian遺伝子（Dkuz,Pan,D and Rubin,G.M.1997 Cell 90:271-280）およびその他のADAMALYSIN遺伝子ファミリーの産物などのマトリックス金属プロテイナーゼが含まれる。完全機能性細胞膜タンパク質としての提示を減少または妨害する薬剤として、ヒドロキシメートを主体とする阻害剤などのMMP阻害剤が含まれる。
本明細書で使用する用語「抗原提示細胞など」とは、APC群に限定するつもりではない。当業者は所望のNotch-リガンドをＴ細胞集団に提示することができるどんなベヒクル（vehicle）でも使用することができることを理解するはずであるが、便宜上、これらのすべてを称するために用語APC群を使用する。このように、好適なAPC群の例として、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、または脂質膜などの合成APC群が含まれる。
Notch-リガンドを発現することができる遺伝子でAPC群をトランスフェクトする場合、トランスフェクションはレトロウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスによるか、またはその細胞にこの遺伝子を送達することができるその他の任意のベヒクル若しくは方法によって、実施することができる。これらとして遺伝子治療において有効であることが示されているどんなベヒクルまたは方法も含まれ、レトロウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアなどのその他のウイルス、リン酸カルシウムで沈殿させたＤＮＡ、DEAEデキストランで援護したトランスフェクション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール、タンパク質−ＤＮＡ複合体が含まれる。
これらのベヒクル若しくは方法を単独で、または組合せて使用して、遺伝子の特定の細胞集団への部位を特定した送達が可能であり、これによって本発明の方法をin vivoで実施することが可能になる。例えば、ＤＮＡの取り込みの効率を増大させるため、ウイルスをリポソームと組合せて使用することができる。送達の部位特異性はウイルスコートまたはリポソーム内への特定のタンパク質（例えば樹状細胞／マクロファージについてはCD11cと反応性がある一本鎖抗体）の封入によって達成することができる。
好ましくは、遺伝子（例えばSerrate）の発現が抗原の発現と結びつくような構築物を使用する。したがってSerrateを（過剰）発現するAPC群は関連する抗原をも高レベルで発現するようにし、そして適切な特異性を有するＴ細胞と優先的に相互作用することになる。
本発明のさらに別の実施態様は、Ｔ細胞アレルゲンまたは抗原部分に機能的に連結したNotch-リガンド部分を含む分子であって、かつＴ細胞に曝露したときに両部分がそれぞれ対応する部位に結合することができるようにした分子に関する。このような分子は、必要なNotch-リガンドの特異性がアレルゲンまたは抗原部分の付近に密接して提供されるので、抗原／アレルゲン特異的Ｔ細胞に、アレルゲンまたは抗原部分の元になるアレルゲンまたは抗原に対する寛容を与えることができる。
この抗原またはアレルゲン部分は、例えば合成MHC-ペプチド複合体でもよい。これは抗原の１要素を保有する抗原溝（antigen groove）を有するMHC分子の断片である。このような複合体はAlman JDら、Science 1996 274:94-6に記載されている。
さらに別の好ましい実施態様において、化合物はNotchまたはNotchリガンドの細胞外ドメインのセグメントとイムノグロブリンFcセグメント、好ましくはIgGFcまたはIgMFcを含む融合タンパク質である。
上記のすべての本発明の実施態様において、Notch-リガンドがSerrateファミリーのタンパク質若しくはDeltaファミリーのタンパク質、それらの誘導体、断片、または類似体のものが好ましい。
Ｔ細胞によって仲介されると記述することができる疾病または感染症として、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、腫瘍に起因するＴ細胞系の異常（abberation）、ならびにマラリア原虫（Plasmodium）種、ミクロフィラリア（Microfilariae），腸内寄生虫（Helminths），マイコバクテリウム（Mycobacteria），HIV，サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus），シュウドモナス（Pseudomonas），トキソプラスマ（Toxoplasma），エチノコッカス（Echinococcus），ヘモフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）B型，麻疹、C型肝炎またはトキシカラ（Toxicara）などに起因する感染症の１つまたはそれ以上が含まれる。このように、これらの疾病または感染を治療するために、適切なアレルゲンまたは抗原と併用して、Notch-リガンドを本発明にしたがって使用することができる。
本発明は、侵入する生物によって誘導される免疫抑制を検出する方法をも提供する。こうした生物は可溶性形態の、Serrate，Notchおよび／若しくはDeltaファミリーの構成員またはそれらの誘導体、あるいはin vivoでこれらの発現に影響を与えて感染寛容免疫抑制を誘導するようなタンパク質を産生することができる。この方法は、in vivoで非膜結合性のSerrate，Delta，Notchまたはそれらの誘導体の存在についてのアッセイを含むものであり、そして好ましくはSerrate，Delta，Notchまたはそれらの誘導体に対する抗体を含む。
Notch，Delta/Serrate発現および／またはプロセシングの増加若しくは減少の検出のためのスクリーニングアッセイにおける使用の方法として、以下のものが含まれる：
１．単離した細胞を培養中の試験化合物に曝露した後、例えば以下のレベルを使用して、Delta/Serrate，NotchおよびFringeの発現を評価する：
（ａ）免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用する、特異的抗体染色によるタンパク質レベル。
（ｂ）定量−逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によるＲＮＡレベル。RT-PCRは、Notch 1およびNotch 2，Serrate 1およびSerrate 2，Delta 1およびDelta 2，Delta 3およびFringeに特異的なプライマーとともに、内在性遺伝子の発現を測定するためのインビルト（in-built）標準を有する対照プラスミドを使用して、実施することができる。この構築物を新規なリガンド構成員を同定するために改変することができる。
（ｃ）細胞接着アッセイにおける機能レベル。
Delta/SerrateまたはNotch発現の増加はNotchおよびそのリガンドDelta/Serrateを発現する細胞間の接着の増加をもたらすはずである。試験細胞を培養物中で特殊な処理をし、そして放射性標識または蛍光標識した（Notch/Delta/Serrateタンパク質でトランスフェクトした）標的細胞を重層する。細胞混合物を37℃で２時間インキュベートする。非接着細胞を洗浄除去し、プレート表面の放射性／イムノフルオレセンスレベルによって、接着レベルを測定する。
こうした方法を使用して、Notch-タンパク質若しくはNotch-リガンドの発現またはプロセシングに影響を与える化合物またはNotch-リガンドを検出することが可能である。本発明はこれらのアッセイ方法によって検出可能な化合物またはNotch-リガンドにも関する。
本発明は、（ａ）Notchタンパク質およびこのNotchタンパク質に結合することができるリガンドを（ｂ）ある化合物と接触させ、この化合物がリガンドのNotchタンパク質への結合に影響を与えるかどうかを決定することを含むアッセイ方法であって、好ましくはNotchタンパク質がＴ細胞に関連している方法、をも包含する。
本発明で使用するNotch-リガンドは好ましくはDeltaまたはSerrateファミリーに属するタンパク質またはポリペプチド、あるいはこれらの誘導体である。これらは好ましくは当業者に周知の組換え技術の標準的な手法を使用して得られる。本発明のこうした化合物を産生させるために使用する適切な遺伝子配列はWO 97/01571，WO 96/27610およびWO 92/19734などの刊行物から得ることができる。しかし、本発明はいかなる意味においても、これらの刊行物に開示されたNotch，DeltaおよびSerrate配列に限定されるものではない。より好ましくは、こうしたNotch，Delta若しくはSerrateまたはそれらのファミリー構成員、あるいはそれらのタンパク質またはポリペプチドまたは誘導体はNotch，Delta若しくはSerrateまたはそれらのファミリー構成員の細胞外ドメインの断片、あるいはこうした断片の誘導体である。本明細書で使用する用語「Notchリガンド」はさらに、Notchタンパク質ファミリー構成員と相互作用する任意のリガンドまたはリガンドファミリー構成員を含み、また「トポリズミック（toporythmic）タンパク質」と称されるタンパク質の群、すなわちDelta，Serrate，Deltex遺伝子およびSplit遺伝子エンハンサー、ならびに遺伝子配列がNotch，DeltaまたはSerrateタンパク質とハイブリダイズする能力またはこれらとの相同性、あるいは遺伝子の表現型相互作用を表示する能力によって同定可能である、この遺伝子ファミリーの他の構成員のタンパク質産物も含まれる。
Notch，DeltaおよびSerrateは最初にDrosophilaにおいて記載されたので、それぞれNotchレセプターおよびNotch-リガンドファミリー構成員の始原型タンパク質を表す。多くの無脊椎動物および脊椎動物種において、多数のNotchタンパク質およびリガンドが現在記載されているが、その学名はハエについて使用されているものとは異なっているようである。例えば、NotchはLin12およびGlp1の同族体であり、Serrate/DeltaはJagged，Apx1およびLag-2の同族体である。
当分野で周知の原理にしたがって、本発明の医薬組成物を製造することができる。この場合、賦形剤の性質および活性の量は配合する本発明の化合物によって決まる。
好ましくは、医薬組成物は単位投与形態とする。
医薬組成物の形態で患者に投与すべき、本発明の化合物の投与量は、適切な医師であれば決定することができるであろう。
本発明の組成物の好ましい投与経路は、筋肉内および腹腔内、静脈内注射、鼻腔内吸入、肺吸入、皮下、皮内、関節内、クモ膜下、局所、ならびに消化管経由（例えばパイエル板経由）を含む通常の投与方法のいずれか１つである。
本発明のタンパク質またはポリペプチドとの関連で本明細書で使用する用語「誘導体」としては、生成するタンパク質またはポリペプチドがNotch−Notchリガンド相互作用を調節する能力を保有している限り、その配列からまたは配列への１（またはそれ以上の）アミノ酸残基の置換、変更、改変、交換、欠失または付加のいずれもが含まれる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドとの関連で本明細書で使用する用語「変異体」としては、生成するタンパク質またはポリペプチドがNotch−Notchリガンド相互作用を調節（すなわちモジュレート）する能力を保有している限り、その配列からまたは配列への１（またはそれ以上の）アミノ酸残基の置換、変更、改変、交換、欠失または付加のいずれもが含まれる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドとの関連で本明細書で使用する用語「類似体」としては、任意のペプチド類似体、すなわち元のタンパク質またはポリペプチドと同様にNotch−Notchリガンド相互作用を調節する能力を有する化学化合物が含まれる。これらとして、Notch-タンパク質またはNotch-リガンドの発現または活性のアゴニストまたはアンタゴニスト作用をすることができる化合物が含まれる。
ある化合物がNotchとそのリガンドとの相互作用を、好ましくは治療上の効能を提供するのに十分な程度まで阻害または強化のいずれかをする能力がある場合、それはNotch−Notchリガンド相互作用を調節するものとみなされる。
本明細書で使用する表現「Notch−Notchリガンド」とはNotchファミリー構成員と１以上のこうした構成員に結合することができるリガンドとの間の相互作用を意味する。
本明細書で使用する用語、療法は診断および予防への適用を包含するものとされる。
用語「医療」にはヒトおよび脊椎動物への適用を含む。
本明細書で使用する用語、タンパク質およびポリペプチドは同義であるとみなしてもよいが、タンパク質は単に一般的な意味で、ポリペプチド中に存在するものよりも比較的長いアミノ酸配列を示すために使用される。
添付する図面を参照として、本発明を限定するつもりのない実施例によってさらに説明する。図面において、
図１は本明細書の実施例１に記載したように実施したin situハイブリダイゼーションの結果を示す。
図２は実施例４に記載した実験の結果を示す。
図３は実施例５に記載した実験の結果を示す。
図４は実施例６に記載した実験の結果を示す。
図５は実施例７に記載した実験の結果を示す。
図６は実施例８に記載した実験の結果を示す。
図７は実施例９に記載した実験の結果を示す。
図８ａおよび８ｂは実施例10に記載した実験の結果を示す。
図９は実施例11に記載した実験の結果を示す。
実施例１
Notch，DeltaおよびSerrateは末梢免疫系において発現する
Notch 1，Delta 1およびSerrate 1に特異的なアンチセンスＲＮＡプローブを合成し、ジゴキシゲニン標識UTPを組み込んだ。各プローブをハイブリダイゼーション緩衝液に溶解し、70℃に5〜10分加熱し、4％パラホルムアルデヒド＋PBSであらかじめ固定しておいた、脾臓または胸腺の10mm切片を含有するTESPA被覆スライドに添加した。スライドを65℃で一晩ハイブリダイズさせた。翌日、スライドを1×SSC／50％ホルムアミド／0.1％ Tween20で、65℃で２回、および室温（RT）で２回洗浄した。スライドを0.1Mマレイン酸／0.15M NaCl／0.1％ Tween20 pH7.5（MABT）緩衝液でRTで２回洗浄し、その後MABT＋20％ ヤギ血清＋296 Boehringerブロッキング試薬（BBR）で２時間ブロックした。スライドを抗ジゴキシゲニンFab断片とともにRTで一晩インキュベートした。MABTで４回洗浄した後、スライドをアルカリ基質緩衝液でさらに２回洗浄した。スライドを暗所でNBT＋BCIPを含有する基質緩衝液中でインキュベートすることによって、結合したアンチセンスＲＮＡプローブの存在を検出した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、Depx固定媒体で固定した。
結果：これらのハイブリダイゼーションの結果を図１に示す。これは、３ヵ月齢マウスからの脾臓において、DeltaおよびSerrateは細動脈周辺鞘で単離された細胞によって発現されるが、胚中心では発現されないことを示している。Notchもやはり細動脈周辺鞘で多くの細胞中で発現する。
実施例２
Delta-Fc融合タンパク質の製造
pIG-1［D.Simmons，「哺乳類細胞中での一時的表面発現による細胞表面分子のクローニング」pp 93-128，Cellular Interactions in Development Ed.D.Hartley,pub.Ox.Uni.Press（1993）］発現ベクターによって、ヒトIgG1-Fcドメインに連結したDelta 1の細胞外部分を含有する融合タンパク質の製造が可能である。Delta 1タンパク質の細胞外ドメインのみを含有する制限酵素断片をpIG-1ベクター中にクローン化した。生成したプラスミドを大腸菌MC1061中に形質転換し、10μg/mlテトラサイクリン／アンピシリンを含有するSOB中で増殖させた。精製したベクターを使用して、in vitroでCOS細胞をトランスフェクトした。COS細胞を50〜75％の密集度まで増殖させ、DEAE-デキストラン法によって、１ディッシュあたりプラスミドＤＮＡ 10μgでトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間目に、培養培地を1％ FCSを含有する培養培地と交換し、細胞をさらに3〜6日間in vitroで培養した。細胞を5000rpmで5分間遠心して細胞および破砕物をペレット化し、上清を取り出して必要時まで保存した。プロテインa Sepharose（Phamacia）の50％スラリー2mlの添加によって、培養上清からDelta-Fc融合物を精製し、4℃で一晩回転させた。培養上清を0.45mmフィルターに通すことによって、Sepharoseビーズを単離し、洗浄し、そして10mlプラスチックカラムに移した。2mlの溶出緩衝液pH4.0でDelta-Fc融合構築物を溶出させた。1M Tris塩基の添加によって溶出液を中和した。
実施例３
Notch-リガンドシグナル伝達経路を探究することができるモデルの例
自己抗原としてのＴ細胞レセプター（TCR）リガンドが末梢のみで発現する、TCRトランスジェニックマウス中で、自己抗原に対する末梢寛容を分析することができる。レシピエントのＴ細胞抗体での前処置または共刺激の封鎖を含む、いくつかの方法によって、移植抗原に対する末梢寛容を誘導することができる。これによって、連鎖抑制および感染寛容の両方を証明することが可能である。アレルゲンに対する末梢寛容はアレルゲン由来ペプチドの鼻腔内送達によって誘導することができる。アレルゲンの吸入後、気道中に補充された細胞および／またはリンパ組織で、Notch−Notchリガンドの発現を測定し、寛容の修正を証明する。さらに、感染剤での感染実験モデルにおいて、宿主中の生物（病原体）および免疫担当細胞上のNotch−Notchリガンドの発現を測定することができる。
実施例４
Deltaを発現するハイブリドーマは抗原感作したリンパ球の応答を阻害することができる
ハウスダストダニアレルゲン（HDM）の免疫優性エピトープを含有する合成ペプチド、Der p1（p110-31）、またはオボアルブミン（OVA，鶏卵白タンパク質）で、マウスを免疫した。１週間後、リンパ節細胞（LNC）を取り出して、細胞懸濁液を製造した。異なる抗原で免疫した動物のリンパ節を別々にしておいた。これらの細胞を感作LNCと称する。
Ｔ細胞ハイブリドーマを、Deltaが膜タンパク質として発現するように、全長Deltaまたは対照プラスミドでトランスフェクトした。２日後、増殖またはサイトカインの産生を防止するため、培養物中でハイブリドーマに照射した。したがって、アッセイにおいて測定された応答はリンパ節細胞からのものだけである。
感作LNCを含有する培養物に照射ハイブリドーマを次第に数を増加させて添加した。適切な抗原（すなわちp110-131またはOVA）を添加し、細胞を24時間培養した。次に、上清液を採取し、IL-2（主要Ｔ細胞成長因子）含量についてアッセイした。72時間後のリンパ節細胞の増殖応答もまた測定した。
結果：対照プラスミドを発現する照射ハイブリドーマの存在下で培養したリンパ節細胞は図２に示すようにそのまま増殖し、適切な抗原で培養物を刺激した時、IL-2を分泌した。この応答性は1：1 LNC：ハイブリドーマの比で維持された。対照的に、適切な抗原とともに全長Deltaを発現するハイブリドーマの存在下（1：1の比）で培養した時、リンパ節細胞による増殖応答およびIL-2の産生は、少なくとも88％減少した。ハイブリドーマを対照ウイルス（○）、Deltaウイルス（□）でトランスフェクトした。図２は培養開始後72時間目の3Ｈ-Tdrの取り込みを１分間あたりのカウント（cpm）で表したデータを示している。Deltaまたは対照構築物を発現するハイブリドーマとともに培養したリンパ節細胞（LNC）のcpmである。［細胞／ウェル］総数＝4×105である（すなわち、LNCの数はハイブリドーマ対LNCの比にしたがって変化するので、cpmは変化して行く）。p110-131 LNCはDer p1（p110-131）で感作した細胞であり、OVA LNCはOVAで感作した細胞である。2BB11および2BC3は２つの異なるDer p1反応性ハイブリドーマである。
これらのデータは、Deltaを発現するＴ細胞による応答の阻害がトランスで（in trans）もたらされ得ることを示している。この培養系ではDerp 1に特異的なDelta発現ハイブリドーマがOVAで感作したＴ細胞の応答を阻害することができたが、この見かけの特異性の欠如は培養系によって強制された細胞の近接性によるものと見られる。実際、図８ａおよび８ｂに示されたデータは、動物において、Deltaを発現するハイブリドーマは、その免疫原に対する免疫応答を調節する作用がある部分についての免疫原と抗原特異性を共有するに違いないことを示している。この場合は、Deltaを発現するＴ細胞は、同一のAPC上で同一の抗原を認識するならば、応答するＴ細胞の近辺のみにもたらされると考えられる。
実施例５
Serrateを発現する樹状細胞はＴリンパ球の抗原感作を阻止する
樹状細胞（DC）は免疫系において主要抗原提示細胞であり、Ｔ細胞の応答を刺激するのに重要である。脾臓からDCを取得し、全長Serrateタンパク質を発現することができるレトロウイルスまたは対照レトロウイルスのいずれかでトランスフェクトした。また、DCをHDMペプチドp110-131でin vitro，37℃で３時間パルス（pulse）した。次に、DCを洗浄し、105細胞／マウスを使用して、未感作マウス（naive mice）の皮下に免疫するのに使用した。７日後、排出するLNCを回収し、4×105細胞／ウェルの培養物中、ペプチドで再刺激した。マウスはペプチド−パルスDCで免疫しただけであるので、これによって、これらの細胞の免疫応答を感作する能力の尺度が与えられる。
結果：図３は、対照トランスフェクト（○）またはSerrate化トランスフェクト（□）樹状細胞（DC）で免疫した動物からの培養72時間後のLNCのcpmで表したデータを示すものである。
Serrateを発現するDCでのマウスの免疫の結果、対照DCでの免疫に比較して、リンパ節から回収された細胞の数は10分の１に減少した。発明者らはさらに、DC＋Serrateで免疫したマウスからのLNCは、対照DCで免疫したマウスからの細胞に比較して、増殖（対照値から93％減少）またはIL-2の分泌が弱まったことを見出した。
実施例６
Deltaを発現するＴ細胞ハイブリドーマは動物中のDer p1抗原に対する免疫の発生を阻害することができる
（Der p1に反応性がある）Ｔ細胞ハイブリドーマをDeltaが細胞表面で発現するようにマウスDeltaを含有させたレトロウイルスまたは対照ウイルスでトランスフェクトした。C57 BLマウスに照射ハイブリドーマ10,000,000個をi.p.注射し、完全Freundアジュバント（CFA）中に乳化した50μgのDer p1で皮下に免疫した。７日後、排出するリンパ節を回収し、Der p1（10μg/ml），Der p1のペプチド110-131（10μg/ml），またはDer p1のペプチド81-102（10μg/ml）とともに、4×105細胞／ウェルで培養した。培養物を37℃で72時間インキュベートし、最後の８時間の培養物にはトリチウム化チミジンを添加した。対照トランスフェクション（Puro）またはDeltaトランスフェクション（Delta-FL）物を注射した動物からの細胞の増殖アッセイの結果を図４に示す。
結果：対照ウイルスでトランスフェクトしたハイブリドーマを注射した動物からのLNCはDer p1、ペプチド110-131またはペプチド81-102の存在下で、培養物中で高レベルのIL-2を産生し、そして増殖した。対照的に、Deltaを発現するハイブリドーマを注射した動物からの細胞はDer p1抗原のいずれにも応答しなかった（図４）。
実施例７
Deltaを発現するヒトＴ細胞は正常Ｔ細胞の応答をブロックすることができる
インフルエンザ反応性ヒトＴ細胞クローン（HA1.7）を、レトロウイルス構築物を使用したマウスDeltaでトランスフェクトし、Deltaタンパク質を細胞表面で発現するようにした。この細胞集団を正常HA1.7と混合すると、続くこれらの正常HA1.7とペプチドHA306-318および抗原提示細胞との反応性を阻止した。5×105個のHA1.7を1×106個の照射DRB1*0101末梢血単核細胞（PBMC）＋1μgのHA306-318と混合し、37℃で培養した。６時間後、5％ Lymphocult（IL-2含有培地）を総容量1mlになるように添加した。培養開始後24時間目に、Deltaまたは対照レトロウイルスを添加するか、あるいは無添加とした。培養開始後７日目に、細胞を収穫し、洗浄し、トランスフェクトされた細胞に照射した。トランスフェクトされた細胞を未処理のHA1.7と2：1の比で混合し、２日間培養した。その後混合培養物を収穫し、洗浄し、2×104生存細胞／ウェルを使用して、
ａ）2.5×104 DRB1*0101 PBMC（培地）
ｂ）2.5×104 DRB1*0101 PBMC＋ペプチド（Ag＋APC）
ｃ）5％ Lymphocult（IL-2）
とともに平板培養した。
最後の８時間はトリチウム標識チミジンを添加して、68時間後に細胞を収穫した。結果を図５に示す。
結果：単独で、または対照ウイルスでトランスフェクトしたHA1.7とともに培養した後、未処理のHA1.7はペプチド＋抗原提示細胞によく応答する。Deltaでトランスフェクトし、照射したHA1.7とのインキュベートによって、未処理のHA1.7の抗原＋APCに対する応答は完全に阻止される。しかし、これらの細胞は未処理のまたは対照ウイルスとインキュベートしたHA1.7と同様にIL-2に応答し、これらが単に増殖できないわけではないことを示している（図５）。
実施例８
抗原提示細胞によるSerrate発現はＴ細胞の応答を阻止する
（抗原提示細胞として）HLA-DRB1*0101を発現するL細胞の存在下で、各細胞型を2×104個使用して、クローンHA1.7をペプチドHA306-318（1.0μg/ml）と混合した。このL細胞を対照（puro）またはserrate（serrate L細胞）を発現するレトロウイルスのいずれかでトランスフェクトした。培養の最後の８時間にトリチウム化チミジンを添加し、72時間後に増殖応答を測定した。HA1.7培養物についての結果を図６に示す。
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結果：serrateを発現するL細胞によって刺激したHa1.7は、対照でトランスフェクトしたL細胞によって刺激したものに比較して、抗原に対する応答が弱かった（図６）。
実施例９
Serrateを発現する抗原提示細胞は調節Ｔ細胞を誘導する
2％ IL-2の存在下で、クローンHA1.7をペプチドHA306-318および（抗原提示細胞としてDRB1*0101を発現する）L細胞と混合した。このL細胞を対照またはserrateを発現するレトロウイルスのいずれかでトランスフェクトした。培養７日後、HA1.7を収穫し、洗浄し、そして（各集団を2×104使用する）新しいHA1.7と混合する前に、照射した。細胞をさらに２日培養した後、ペプチド（1.0μg/ml）＋正常抗原提示細胞（DRB1*0101 PBMC）で刺激した。細胞培養の最後の８時間にトリチウム化チミジンを添加し、72時間後に増殖応答を測定した。新しいHA1.7培養物についての結果を図７に示す。
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結果：serrateを発現するL細胞によって誘導されたHA1.7（Serrateで誘導されたHA1.7）は正常HA1.7の正常な抗原刺激に対する応答を阻止した（図７）。これはserrateへの曝露によって寛容化された細胞の天然細胞集団に寛容（感染／バイスタンダー寛容）を伝達する能力を示すものである。
実施例10
deltaを発現するＴ細胞によって誘導される調節は抗原特異性である
deltaまたは対照レトロウイルスのいずれかで形質導入したＴ細胞ハイブリドーマ107個をマウスに注射した。このハイブリドーマはDer p1のペプチド110-131に対する特異性を有する2BC3である。同時に、動物に完全Freundアジュバント中に乳化したDer p1またはオボアルブミンを与えた。７日後、リンパ節細胞を取り出し、（あらかじめ免疫したものと同一の抗原を使用して）Der p1またはオボアルブミンの存在下で、4×105細胞を培養した。
培養開始後24時間目に、IL-2の生成を測定した。対照（puro）またはDelta（delta）レトロウイルスでトランスフェクトしたハイブリドーマを注射した動物についての、IL-2生成に関する刺激指数を図８ａ（Der p1で免疫した動物の応答）および８ｂ（OVAで免疫した動物の応答）に示す。
結果：deltaを発現する2BC3ハイブリドーマを注射した動物においては、Der p1に対する応答は事実上完全に消失し、他方、オボアルブミンに対する応答は影響されなかった。これらのデータは図８ａおよび８ｂに示されている。ここで、各点は抗原に対して各マウスによって生成されたIL-2を、対照の応答（抗原無添加）の刺激指数（SI）として表している。
実施例11
Deltaは寛容の誘導中にＴ細胞上に発現する
APC不在下、ペプチドHA306-318（50μg/ml）の存在下で、HA1.7を培養した。この条件の結果としてHA1.7は寛容状態となった。0，30，120，240または360分後、細胞（1.5×106）を収穫し、ペレット化し、そして凍結させた。細胞ペレットからチオシアン酸グアニジウム溶液中でホモジナイズした後、CsCl密度遠心分離によってＲＮＡを調製した。オリゴdTプライマーを使用して、ＲＮＡ 1μgをｃＤＮＡに変換した。生成したｃＤＮＡの内、ヒトdelta相同体に特異的なプライマーを使用するPCR（40サイクル）に20分の１を使用した。PCRサンプルをゲル電気泳動によって分析した（図９）。ここで、レーン１：マーカー、レーン２：t＝0、レーン３：t＝30分、レーン４：t＝120分、レーン５：t＝240分、レーン６：t＝360分、レーン７：陰性対照、である。
結果：休止HA1.7はDelta ｍＲＮＡを発現しなかったが、寛容化プロトコル開始後２時間以内に転写体が出現した。
実施例12
寛容誘導中のNotch 1，Serrate 1およびDelta 1発現の免疫組織学およびin situハイブリダイゼーションによる分析
C57BL/6Jマウスの鼻腔内を、連続して３日間、Der p1ペプチド110-131 100μgまたは対照溶液（リン酸緩衝食塩水、PBS）のいずれかで処理した。この方法による抗原の鼻腔内投与はその抗原に対する寛容を誘導することが知られている。いくつかの動物をその後２週間休ませて、その後尾の基部の皮下にDer p1/CFA 50μgを注射して、抗原を再チャレンジした。（鼻腔内処理または抗原再チャレンジの最初の日を0日として）その後各時点で、動物の表面付近のリンパ節および脾臓を収穫し、免疫組織学またはin situハイブリダイゼーションのために加工した。免疫組織学のためには、組織を凍結し、3μm切片に切断し、氷冷アセトン中で固定し、Notch 1およびSerrate 1に対して特異的なポリクローナル抗体で染色した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を使用し、基質としてジアミノベンジジンで発色させて、結合した抗体を検出した。この研究について、Delta 1特異的抗体は入手できなかった。in situハイブリダイゼーションのためには、凍結組織を切片にし、4％パラホルムアルデヒド中で固定した。切片を、Notch1，Serrate1およびDelta1に対して特異的なジゴキシゲニン結合アンチセンスＲＮＡプローブと65℃でハイブリダイズさせた。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ジゴキシゲニン抗体によって、基質としてNBTおよびBCIPを使用して発色させ、結合したプローブを検出した。表１および表２に示すデータはそれぞれ免疫組織学およびin situハイブリダイゼーションに関するものである。データは、鼻腔内ペプチドのみ（PBS/p110-131初回感作）または鼻腔内および皮下抗原（PBS/p110-131再チャレンジ）後の別々の５匹のマウスからの組織の分析を表している。
＋弱い染色、＋＋中度の染色、＋＋＋強い染色。
結果：
PBSのみを受けた対照マウスにおいては基底レベルのNotch，DeltaおよびSerrateが発現される。PBSを鼻腔内に、そして抗原を皮下に投与されたマウスは再チャレンジ後８日以内に、３つの分子すべての発現の中度の増加を示した。鼻腔内ペプチドのみまたは鼻腔内ペプチドの後抗原で再チャレンジのいずれかの動物は対照マウスにおけるよりも迅速で大きいNotch，DeltaおよびSerrateの増加発現の同一のパターンを示した。
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本発明のその他の変更は当業者にとって明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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