(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンに対する代謝活性が低下しているか否かの検査方法であって、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸がトレオニンからセリンへの変異をもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、テストステロン６β-水酸化活性が低下しているものと判定される方法。
【請求項２】
被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンに対する副作用の可能性の有無を検査する方法であって、請求項１に記載の方法によりテストステロン６β-水酸化活性が低下しているものと判定された場合に、副作用の可能性があるものと判定される方法。
【請求項３】
ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、該遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型が、シトシンからグアニンへの変異である、請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者から得られた試料からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４いずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者から得られた試料からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者から得られた試料からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者から得られた試料からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）被検者から得られた試料からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における多型を検出する工程
【請求項１１】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部分を含むＤＮＡ領域と相補的な配列からなるポリヌクレオチドであって、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズし、15〜100ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝されるテストステロンに対する代謝活性を検査するための試薬。
【請求項１２】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部分を含むＤＮＡ領域と相補的な配列からなるポリヌクレオチドであって、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズし、15〜100ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンに対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬。
【請求項１３】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝されるテストステロンに対する代謝活性を検査するための試薬。
【請求項１４】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンに対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンに対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または細胞抽出液に対し、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンを接触させる工程
（ｃ）被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝されるテストステロンを接触させた細胞または細胞抽出液におけるＣＹＰ３Ａ４のテストステロン６β-水酸化活性を検出する工程
（ｄ）被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロムP450（CYP）スーパーファミリーのメンバーは、臨床的、生理的および毒物学的に重要な化合物の膨大な配列（array）を代謝している(Guengerich, F. P.: Structure, Mechanism and Biochemistry. In Ortiz de Montellano, P. R. (ed.): Cytochrome P450, Plenum Press, New York , 1995, pp. 473-535.; Waxman, D. J., Attisano, C., Guengerich, F. P., and Lapenson, D. P.: Human liver microsomal steroid metabolism: identification of the major microsomal steroid hormone 6 β-hydroxylase cytochrome P-450 enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 263, 424-436 (1988); Shimada T. and Guengerich F. P.: Evidence for cytochrome P-450NF, the nifedipine oxidase, being the principal enzyme involved in the bioactivation of aflatoxins in human liver. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 86, 462-465 (1989))。ヒトCYP3A4は、肝、腎および小腸における主要CYPであり(Watkins, P. B.: Non-invasive tests of CYP3A enzymes. Pharmacogenetics 4, 171-184 (1994))、かつCYPにより代謝される薬物代謝の約50％に関与している(Bertz R. J. and Granneman G.R.: Use of in vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. Clin. Pharmacokinet. 32, 210-258 (1997))。CYP3A4は発現レベルにおいて顕著な個体間変動を示すので(Guengerich, F. P.: Structure, Mechanism and Biochemistry. In Ortiz de Montellano, P. R. (ed.): Cytochrome P450, Plenum Press, New York , 1995, pp. 473-535)、薬物療法は、選択された亜集団における治療失敗、有害作用、および毒性を含む、予測が困難な様々な臨床の転帰につながり得る。薬物代謝において認められた変動の原因のひとつは、遺伝的多型である。今日までに、いくつかのCYP3A4の対立遺伝子が発見されており、これらは薬物代謝における個体間差の原因であろう。
【０００３】
変異型CYP3A4対立遺伝子に関する最初の報告は、CYP3A4*1Bに関するものであり、その変化は、CYP3A4遺伝子の5'-フランキング領域（A-290G）に位置していた(Walker A. H., Jaffe J. M., Gunasegaram S., Cummings S. A., Huang C. S., Chern H. D., Olopade O. I., Weber B. L. and Rebbeck T. R.: Characterization of an allelic variant in the nifedipine-specific element of CYP3A4: ethnic distribution and implications for prostate cancer risk. Mutations in brief no. 191. Online. Hum Mutat. 12, 289 (1998))。その頻度は、アフリカ系アメリカ人（53％）の方が、他の人種（白人9％、台湾人0％）よりも高い。Sataらは、Ser222Pro置換を伴うCYP3A4*2対立遺伝子の頻度が、白人系フィンランド人集団では2.7％であるが、これは中国人や黒人集団においては認められないことを報告している(Sata F., Sapone A., Elizondo G., Stocker P., Miller V. P., Zheng W., Raunio H., Crespi C.L. and Gonzalez F.J.: CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered catalytic activity. Clinical Pharmacol. Ther. 67, 48-56 (2000); Peltonen L., Jalanko A., and Varilo T.: Molecular genetics of the Finnish disease heritage. Hum. Mol. Genet. 8, 1913-1923 (1999))。この変異は、野生型と比較した場合のニフェジピン固有クリアランスの低下につながる。他方で、Met445Thrを伴うCYP3A4*3対立遺伝子も、中国人被検者1名において発見された(Sata F., Sapone A., Elizondo G., Stocker P., Miller V. P., Zheng W., Raunio H., Crespi C.L. and Gonzalez F.J.: CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered catalytic activity. Clinical Pharmacol. Ther. 67, 48-56 (2000))。
【０００４】
また、ごく最近になって、3種の新たな変異が認められた。2種は、Ile118ValおよびPro218Arg置換を伴う点変異であり、残りの1種はエクソン9の初期（early）終始コドンのフレームシフト変異により引き起こされた挿入であった(Hsieh K. P., Lin Y.Y., Cheng C.L., Lai M.L., Lin M.S., Siest J.P. and Huang J.D. : Novel mutations of CYP3A4 in Chinese. Drug Metab. Dispos. 29, 268-273 (2001))。これらの変異の結果、CYP3A4の典型的反応であるコルチゾールの6β-水酸化が低下することが知られている(Ged C., Rouillon J.M., Pichard L., Combalbert J., Bressot N., Bories P., Michel H., Beaune P. and Maurel P.: The increase in urinary excretion of 6beta-hydroxycortisol as a marker of human hepatic cytochrome P450IIIA induction. Br. J. Clin. Pharmacol. 28, 373-387 (1989))。
【０００５】
このようにCYP3A4の変異は薬物代謝活性の低下を引き起こし、該変異を有している被検者は、該薬物に対する解毒能が低下しているものと考えられる。従って、CYP3A4により代謝される薬物を医薬品として投与する場合、CYP3A4の変異を有する患者に副作用が発現し易いことが想起される。この副作用を忌避するためには、薬物代謝活性の低下を引き起こすようなCYP3A4上の変異（多型）の同定が期待されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、CYP3A4の薬物代謝活性を低下させる新たな多型を同定し、該多型を指標とした薬物代謝活性に関する検査方法を提供することである。より詳細には、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法、該検査方法に使用するための試薬、および、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、34種の確立された日本人由来の細胞株を用い、CYP3A4遺伝子の3種の一塩基多型（SNP）を発見した。これらの3種のSNP（T185S、L293PおよびT363M）は、すでにその配列が報告されており、L293P変異およびT363M変異は触媒活性との関連が明らかにされていた。これに対し、T185S変異と触媒活性の関連については明確ではなかった。本発明者らは、野生型CYP3A4およびT185S変異型CYP3A4におけるテストステロンの水酸化の測定を、哺乳類の発現システムを用いて実施した。HepG2細胞におけるcDNAが媒介した一過性発現において、野生型CYP3A4と比べ変異型CYP3A4であるT185Sによるテストステロン6β-水酸化、2β-水酸化、および15β-水酸化は低下していた。ウェスタンブロット分析により、T185S変異型CYP3A4量は野生型CYP3A4量に比べてはるかに低いことが示唆された。しかしノーザンブロット分析では、それらのmRNAレベル間に有意差を示さなかった。従って、CYP3A4におけるT185S置換は、タンパク質発現効率または酵素タンパク質の安定性のいずれかに影響を及ぼすものと考えられる。
【０００８】
以上の結果から、T185SをもたらすCYP3A4遺伝子の多型を指標とすることにより、薬物代謝活性の検査が可能となった。また、CYP3A4により薬物が代謝されない場合、該薬物による副作用が出現しやすいと考えられる。よって、上記検査により該薬物による副作用の予測が可能になるものと大いに期待される。
【０００９】
即ち、本発明は、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法に関し、より具体的には、
〔１〕  ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法であって、薬物代謝活性を低下させるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、薬物代謝活性が低下しているものと判定される方法、
〔２〕  被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査する方法であって、〔１〕に記載の方法により薬物代謝活性が低下しているものと判定された場合に、副作用の可能性があるものと判定される方法、
〔３〕  多型が一塩基多型である、〔１〕または〔２〕に記載の検査方法、
〔４〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらす多型である、〔１〕または〔２〕に記載の検査方法、
〔５〕  ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異が、トレオニンからセリンへの変異である、〔４〕に記載の検査方法、
〔６〕  ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のアミノ酸変異をもたらすＣＹＰ３Ａ４遺伝子の多型が、該遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型である、〔４〕または〔５〕に記載の検査方法、
〔７〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の１５７２１番目の塩基部位の多型が、シトシンからグアニンへの変異である、〔６〕に記載の検査方法、
〔８〕  ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物が、テストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤、または、カルバマゼピンである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検査方法、
〔９〕  薬物がテストステロンであり、薬物代謝活性がテストステロン６β-水酸化活性である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における多型を検出する工程
〔１６〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬、
〔１７〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬、
〔１８〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬、
〔１９〕  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子における１５７２１番目の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む、被検者におけるＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬、
〔２０〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）１８５番目のアミノ酸がセリンであるＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または細胞抽出液に対し、被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物およびＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物を接触させた細胞または細胞抽出液におけるＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を検出する工程
（ｄ）被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程、を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らにより、CYP3A4遺伝子（GenBankアクセッション番号AF209389のヌクレオチド配列中1番目の塩基Aを1番目とする）の15721番目の塩基CがGに、20178番目の塩基TがCに、または、21973番目の塩基CがTに変異することにより、各々、185番目のアミノ酸残基がトレオニンからセリン、293番目がロイシンからプロリン、363番目がトレオニンからメチオニンに変異したCYP3A4が見出された（各々、c15721g/T185S、t20178c/L293P、c21973t/T363M）。このうち、CYP3A4の185番目のアミノ酸が変異したT185S 変異型CYP3A4は、薬物代謝との関連が報告されていないものであった。この変異の結果、CYP3A4量の低下またはCYP3A4の安定性の低下により、CYP3A4により代謝される薬物の生体内での代謝が抑制され、該薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。従って、CYP3A4により代謝される薬物を投与する前に上記の変異について検査し、その結果に基づき該薬物の投与量を調節すること等により、該薬物の副作用を予め忌避することが可能となる。なお、本発明においては、野生型CYP3A4遺伝子の塩基配列を配列番号：１に記載し、野生型CYP3A4のアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。
【００１１】
本発明は、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性の検査方法であって、薬物代謝活性を低下させるCYP3A4遺伝子の多型を検出する工程を含み、多型が検出された場合に、薬物代謝活性が低下しているものと判定される方法を提供する。さらに、該方法により薬物代謝活性が低下しているものと判定された場合に、被検者についてCYP3A4により代謝される薬物に対する副作用の可能性があるものと判定される検査方法を提供する。
【００１２】
本発明におけるCYP3A4は、臨床的、生理的および毒物学的に重要な化合物の膨大な配列（array）を代謝しているチトクロムP450（CYP）スーパーファミリーのメンバーの一つである。特に、ヒトCYP3A4は、肝、腎および小腸における主要CYPであり、かつCYPにより代謝される薬物代謝の約50％に関与している。本発明におけるCYP3A4とは、CYP3A4と同様な活性を有するタンパク質をも含み、そのアミノ酸配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に限定されるものではない。例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログであって、機能的に同等なタンパク質も本発明におけるCYP3A4に含まれる。機能的に同等とは、通常、薬物代謝活性が低下していることを指し、より具体的には、薬物がテストステロンである場合には、テストステロンに対する6β水酸化活性が低下していることを言う。
【００１３】
本発明において、CYP3A4により代謝される薬物とは、CYP3A4の作用により生体内で代謝される化合物、または該化合物を有効成分として含有する医薬組成物を言う。例えば、テストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤（例えばドセタキセルまたはパクリタキセル）、およびカルバマゼピン、並びに、これらの化合物を有効成分として含む医薬組成物等が挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００１４】
CYP3A4の薬物代謝活性は、通常、薬物を水酸化することにより不活性化させる活性として測定することができる。例えば、薬物がテストステロンの場合は、テストステロン6β-水酸化活性を測定することにより、CYP3A4の薬物代謝活性を評価することができる。上記水酸化活性の測定は、当業者においては一般的な方法、例えば、水酸化された生成物をHPLCによって検出する方法により実施することができる。より具体的には、後述の実施例に示す方法により上記水酸化活性を測定することができる。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には、人口中1％以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、1％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（SNP）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。さらに、多型部位の数についても特に制限はなく、1個以上の多型を有していてもよい。
【００１６】
本発明における多型としては、好ましくはCYP3A4の185番目のアミノ酸変異をもたらすようなCYP3A4遺伝子上の多型であり、より好ましくはCYP3A4遺伝子の15721番目の塩基部位の多型であり、さらに好ましくはCYP3A4遺伝子の15721番目の塩基がCからGに変異し、その結果、CYP3A4の185番目のアミノ酸残基をトレオニンからセリンへと変異する多型を示すことができる。
【００１７】
本発明の検査方法において、CYP3A4遺伝子に生じた多型の検出は、例えば、被検者のCYP3A4遺伝子の塩基配列を直接決定することにより行うことができる。この方法においてはまず、被検者からDNA試料を調製する。ゲノムDNA試料は、例えば被検者の肝臓、腎臓、小腸などの組織または細胞や血液、口腔粘膜、皮膚、毛髪等から抽出した染色体DNAを基に、あるいはイントロンを含まないcDNAは、mRNAを基に調製することができる。
【００１８】
本方法においては、次いで、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、CYP3A4遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００１９】
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）CYP3A4遺伝子の配列を言う。一般に健常人のCYP3A4遺伝子の配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のCYP3A4遺伝子の配列と比較することを意味するが、GenBankに野生型として登録されているCYP3A4遺伝子の配列（AF209389）と比較してもよい。
【００２０】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００２１】
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。
【００２２】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR−RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRでCYP3A4遺伝子を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２４】
該方法としては、例えばPCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００２５】
具体的には、まず、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００２６】
さらに別の方法は、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２７】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを本発明のプライマー等を用いたPCR法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するDNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００２８】
さらに別の方法は、まず、被検者から調製したCYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNA、および該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。次いで、該DNAと該基板を接触させる。さらに、該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、CYP3A4遺伝子多型を検出する。
【００２９】
このような方法としては、DNAアレイ法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）が例示できる。被検者からのCYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。染色体DNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えばCYP3A4遺伝子を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNAを鋳型としたPCR等によってCYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを調製することも可能である。調製したDNA試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００３０】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
【００３１】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００３２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００３３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、CYP3A4遺伝子の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のCYP3A4遺伝子、あるいは多型を有するCYP3A4遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するCYP3A4遺伝子を含むDNA、または多型を有するCYP3A4遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。
【００３４】
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。
【００３５】
本発明においては、次いで、該cDNA試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNA試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３６】
本発明においては、次いで、該DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００３７】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、CYP3A4遺伝子を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだCYP3A4遺伝子cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３８】
その他の本発明の多型の検出が可能な方法としては、
1)質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、
2)Taq-Man PCRによる方法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)、CYPへの応用例：Hiratsuka M et al., Biol. Pharm. Bull. vol.23, pp1131-1135, (2000)）、
3)Pyrosequencingによる方法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）、
4)Invader法による方法（Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)、メディカルドゥ社発行「遺伝子医学」  vol.4, No.1, pp44-51およびpp68-72 (2000)）
を挙げることができる。以上、種々の検出方法を例示したが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明はまた、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性を検査するための試薬を提供する。このような試薬は、被検者におけるCYP3A4により代謝される薬物に対する副作用の可能性の有無を検査するための試薬になりうる。
【００４０】
本発明の試薬の一つの態様は、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドを含む試薬である。
【００４１】
該ポリヌクレオチドは、CYP3A4遺伝子を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該ポリヌクレオチドは、検出するCYP3A4遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００４２】
該ポリヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、多型部分を含むCYP3A4遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４３】
また、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成ポリヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば市販のポリヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、ポリヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。また、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、基板として用いても良い。
【００４６】
また、本発明における検査薬の別の態様は、CYP3A4遺伝子における15721番目の塩基部位を含むDNAを増幅するように設計されたフォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む試薬である。プライマーの長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、多型部分を含むCYP3A4遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４７】
上記の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００４８】
また本発明は、CYP3A4により代謝される薬物に対する代謝活性を上昇させる医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
本方法においては、まず、185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞、または細胞抽出液を提供する。用いられる「細胞」の由来としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられるが、これらの由来に制限されない。「185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞」としては、内因性の185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4遺伝子を発現している細胞、または外因性の遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性の185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4遺伝子が発現した細胞は、通常、該遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。一方、「185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞抽出液」は、当業者であれば周知の方法で作製することができる。例えば市販の試験管内転写翻訳系に185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4遺伝子が挿入された発現ベクターを添加することで調製することができる。
【００５０】
本方法においては、次いで、185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞、または細胞抽出液に対し、被験化合物およびCYP3A4により代謝される薬物を接触させる。
【００５１】
本方法に用いる被験化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００５２】
本方法に用いるCYP3A4により代謝される薬物としては、上述の薬物などが挙げられるが、テストステロンを好適に使用することができる。
【００５３】
185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞への被験化合物およびCYP3A4により代謝される薬物の「接触」は、通常、該遺伝子を発現する細胞の培養液に被験化合物およびCYP3A4により代謝される薬物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。また、185番目のアミノ酸がセリンであるCYP3A4を発現する細胞抽出液への被験化合物およびCYP3A4により代謝される薬物の「接触」方法としては特に制限はなく、例えば該抽出液に直接添加することによって行う。被験化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞または該細胞抽出液へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００５４】
本方法においては、次いで、被験化合物およびCYP3A4により代謝される薬物を接触させた細胞または細胞抽出液におけるCYP3A4の薬物代謝活性を検出する。CYP3A4の薬物代謝活性の検出は、CYP3A4により代謝される薬物（例えばテストステロン、イリノテカン、タキサン系抗癌剤（例えばドセタキセルまたはパクリタキセル）、または、カルバマゼピン）を水酸化する活性を測定することにより実施できるが、薬物としてテストステロンを用いた場合は、好ましくはテストステロン6β-水酸化活性を測定する。
【００５５】
本方法においては、次いで、被験化合物が接触させない場合の活性と比較して、検出された活性を増加させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、本発明の多型を有する被検者において、CYP3A4により代謝される薬物による副作用を防止または軽減する医薬品候補化合物である。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法により取得される医薬品候補化合物は、分子自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。例えば経口投与の場合、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等、経皮投与の場合、ハップ剤等を示すことができるが、これらに制限されない。投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。これらの化合物がDNAである場合、該DNAを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター、或いは、naked DNAの形態で利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５８】
（１）試薬
テストステロンおよび11α-ヒドロキシプロゲステロンは、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した。ヤギ抗ヒトCYP3A4ポリクローナル抗体は、第一化学薬品株式会社（東京、日本）から購入した。ホースラディシュペルオキシダーゼに複合したウサギ抗ヤギIgGは、（株）医学生物学研究所(名古屋、日本)から購入した。[α-32P]-デオキシCTPは、Amersham Pharmacia Biotech（Buckinghamshire, 英国）から得た。他の化学物質および試薬は全て、最高級を利用した。
【００５９】
（２）DNA抽出
34名の個別の日本人に由来する確立された細胞株を、ヒューマンサイエンス研究資源（HSRR）バンク（大阪、日本）または国立医薬品食品衛生研究所の厚生労働省研究資源バンク（東京、日本）から入手した。これらの細胞を、バンクの指示に従い培養した。DNA抽出は、血液・細胞培養DNAキット（Qiagen, Hilden, 独国）を用い、およそ5 X 107個の細胞から行った。
【００６０】
（３）CYP3A4遺伝子の配列決定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用のプライマーは、Sataらの報告(Sata F., Sapone A., Elizondo G., Stocker P., Miller V. P., Zheng W., Raunio H., Crespi C.L. and Gonzalez F.J.: CYP3A4 allelic variants with amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered catalytic activity. Clinical Pharmacol. Ther. 67, 48-56 (2000))を基にデザインした。PCRは、先に記されたように行った(Nakamura T., Saito Y., Murayama N., Saeki M., Soyama A., Sai K., Ozawa S. and Sawada J.: Apparent low frequency in sequence variability in the proximal promoter region of cytochrome P450 (CYP) 3A5 gene in established cell lines from Japanese individuals. Biol. Pharmac. Bull. 24, 954-957 (2001))。
【００６１】
（４）組換えDNA操作
1.5kbの完全長野生型CYP3A4 cDNAを含むpUCプラスミド（pUC3A4）は、Dr. F. J. Gonzalezより入手した(Gonzalez F. J., Schmid B. J., Umeno M., Mcbride O. W., Hardwick J. P., Meyer U.A., Gelboin H. V. and Idle J. R.: Human P450PCN1: sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA 7, 79-86 (1988))。T185S、L293PおよびT363Mをコードしている変異型CYP3A4 cDNAを、pUC3A4プラスミドDNAを鋳型とし、Quick Change位置指定突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用い構築した。野生型CYP3A4 cDNAおよびその変異型CYP3A4 cDNAの配列を、DNAシークエンス法により確認した。前向きプライマー：5'-GTAAGGAAAGTAGTGATGGCT-3'（配列番号：３）および後向きプライマー5'-AGTCCTTTAGGAAAATTCAGG-3'（配列番号：４）をデザインし、野生型CYP3A4 cDNAおよびその変異型CYP3A4 cDNAの全1.5kbのコード配列を増幅した。PCR産物を、pCR3.1ベクターに、TAクローニングキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、直接クローニングした。野生型CYP3A4 cDNAおよび変異型CYP3A4 cDNAのヌクレオチド配列を再度確認した。
【００６２】
（５）細胞培養および一過性トランスフェクション
ヒト肝細胞癌細胞株であるHepG2細胞を、ペニシリン100単位、100mg/mlストレプトマイシンおよび10％ウシ胎仔血清を含むDulbeccoの変更イーグル培地（D-MEM）において、5％ CO2、37℃の加湿した大気中で培養した。HepG2細胞（1x105細胞）を、35mm培養皿に播種した。24時間培養した後、細胞を血清非含有のOPTI MEM （Life Technologies, Rockville, MD）ですすぎ、その後トランスフェクションした。先に説明された方法(Murayama N., Sai K., Nakajima Y., Kaniwa N., Ozawa S., Ohno Y. and Sawada J. : Expression of CYP2A6 in tumor cells augments cellular sensitivity to tegafur. Jap. J. Cancer Res. 92, 524-528 (2001))に従い、Lipofectamine PLUS試薬（Life Technologies）を用い、pCR3.1/CYP3A4、pCR3.1/T185S、pCR3.1/L293PおよびpCR3.1/T363Mプラスミド1μgをトランスフェクションした。
【００６３】
（６）テストステロンの水酸化アッセイ
トランスフェクションの24時間後、培養培地を、100μMテストステロンを含有する新鮮なD-MEM（1ml/皿）と交換し、かつこれらの細胞を更に3時間培養した。インキュベーション後、培地をガラス製チューブに移し、これに11α-ヒドロキシプロゲステロンを内部標準として添加し、かつテストステロンの代謝産物を、酢酸エチル2mlで抽出した。6β-ヒドロキシテストステロン、2β-ヒドロキシテストステロンおよび15β-ヒドロキシテストステロンの生成を、先に記されたように(Murayama N., Shimada M., Yamazoe Y., Sogawa K., Nakayama K, Fujii-Kuriyama Y. and Kato R.: Distinct effects of phenobarbital and its N-methylated derivative on liver cytochrome P450 induction. Arch. Biochem. Biophys. 328, 184-192 (1996))HPLCで測定した。
【００６４】
（７）CYP3A4タンパク質の免疫ブロッティング
HepG2細胞中の野生型CYP3A4および変異型CYP3A4のレベルを測定するために、テストステロン6β-水酸化の測定に使用した細胞から細胞溶解液を調製した。これらのタンパク質濃度は、タンパク質アッセイキット（Bio-Rad, Hercues, CA）を用いて測定した。細胞溶解液（25μgタンパク質）を、SDS-試料緩衝液中に溶解し、10％ SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、かつニトロセルロース膜に移した（Schleicher & Schuell Inc. Dassel, 独国）(Towbin H., Staehelin T. and Gordon J.: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 76, 4350-4354 (1979))。免疫染色のために、ヤギ抗ヒトCYP3A4ポリクローナル抗体（第一化学薬品（株））を一次抗体とし、かつホースラディッシュペルオキシダーゼに複合したウサギ抗ヤギIgG（（株）医学生物学研究所）を二次抗体として使用したCYP3A4を、化学発光増強（Enhanced Chemiluminescence）キット（Amesham Pharmacia Biotech）で可視化した(Pampori N. A., Pampori M. K. and Shapiro B. H.: Dilution of the chemiluminescence reagents reduces the background noise on western blots. Biotechniques 18, 588-590 (1995))。
【００６５】
（８）ノーザンブロット
総RNAを、培養した細胞（1x107〜1x108細胞）から、RNeasyミニキット（Qiagen）を製造業者の指示に従い使用し単離した。ノーザンブロット分析は、標準の方法を用いて行った(Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 7.37-7.57.)。CYP3A4のハイブリダイゼーションプローブとして、完全長CYP3A4 cDNAを、pCR3.1/CYP3A4のPCRにより増幅し、かつ得られたPCR産物をゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製した。ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）cDNAも、同じくRT-PCR Control Amplimer Sets （Clontech, Palo Alto, CA）を用い、PCR合成した。調製したPCR産物を、Rediprime II Random Prime Labelling System （Amersham Pharmacia Biotech）を用い、[α-32P]デオキシCTPで標識し、かつSephadex G-50カラム（G-50 Micro Column, Amersham Pharmacia Biotech）で精製した。
【００６６】
[実施例１]   生体内代謝に関与するCYP3A4の遺伝子多型の検出
本発明者らは、テストステロン、イリノテカン等の生体内の代謝に関与するCYP3A4の遺伝子多型を検出を試みた。その結果、個別の日本人34名から確立された細胞株から、CYP3A4遺伝子のコード領域に3種の非同義一塩基多型（SNP）を発見した。これら3種のSNPは各々独立して、表1に記した各3種の細胞株に個別に認められた。これらの3種のSNP（T185S、L293PおよびT363M）は、すでにその配列が報告されており、L293PおよびT363Mは触媒活性との関連が明らかにされていた（Dai, D. et al., J Pharmacol Exp Ther, 2001, 299, 825-831.、Eiselt, R. et al., Pharmacogenetics, 2001, 11, 447-458.）。これに対し、T185Sとの触媒活性の差異については明確ではなかった。なお、c15721g、t20178cおよびc21973tの周辺配列を、それぞれ、配列番号：５、６および７に示す。
【００６７】
【表１】
0004305609.tif 000002
【００６８】
[実施例２]   野生型CYP3A4およびその変異型CYP3A4の触媒活性の評価
野生型CYP3A4 (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 7.37-7.57.)およびその変異型CYP3A4の触媒活性を評価するために、まず、完全長野生型CYP3A4断片より、Quick Change Site-directed Mutagenesis kit（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて3個の変異型CYP3A4（T285S、L293P、T363M）を作製した。さらに、野生型ヒトCYP3A4並びにT185S、L293PおよびT363M変異型CYP3A4をコードしている完全長cDNA挿入断片を含むpCR3.1プラスミドを調製した。このプラスミドDNAを、ヒト肝癌細胞株HepG2にLipofectamine PLUS試薬を用いてトランスフェクションした。この一過性トランスフェクションシステムを、ウェスタンブロット法により評価し、最大レベルのCYP3A4発現がトランスフェクションの24時間後に認められることがわかった。従って、野生型CYP3A4および3種の変異型CYP3A4のテストステロンヒドロキシラーゼ活性を、トランスフェクションの24時間後の培養物にテストステロンを添加し、かつ3時間培養物の上清中の代謝物を定量することにより測定した。
【００６９】
その結果、高いテストステロン6β-ヒドロキシラーゼ活性が、野生型CYP3A4が発現しているHepG2細胞において認められる一方（表２）、非常に低レベルの6β-水酸化（23.4±6.9pmol/時/皿）がpCR3.1ベクターをトランスフェクションしたヌル細胞において認められた。テストステロン6β-水酸化活性は3種の変異型CYP3A4全てにおいて認められたが、T185SおよびT363M変異型CYP3A4は、野生型CYP3A4と比べて有意に低い1皿あたりの活性を示した（表２）。他方L293P変異型CYP3A4は、野生型CYP3A4よりも約1.5倍高いテストステロン6β-ヒドロキシラーゼ活性を示した（表２）。同様の傾向が、2β-および15β-水酸化活性についても認められた。野生型CYP3A4と3種の変異型CYP3A4の間で、6β-ヒドロキシラーゼ活性の総テストステロンヒドロキシラーゼ活性（6β-ヒドロキシラーゼ、2β-ヒドロキシラーゼおよび15β-ヒドロキシラーゼ）に対する比には、有意差は認められなかった（表２）。トランスフェクションの24時間後の細胞数において著しい変化を示した変異型CYP3A4はなかった。まとめると、テストステロン6β-水酸化活性の低下は、T185SおよびT363M変異型CYP3A4において認められたが、L293P変異型CYP3A4では認められなかった。CYP3A4の185番目のアミノ酸残基がトレオニンからセリンに変化した多型の機能変化をテストステロン6β-水酸化活性の減弱として捉えたことは本実施例が初めてである。
【００７０】
【表２】
0004305609.tif 000003
【００７１】
なお、表２に示す活性は、pmol産物/時/皿として表示されている。また、6β-OH、2β-OHおよび15β-OHは、それぞれ、6β-水酸化、2β-水酸化および15β-水酸化を示す。また、*はp＜0.001対野生型（スチューデントt-検定）を示す。さらに、NDは活性が検出されなかったことを意味する。
【００７２】
[実施例３]   野生型CYP3A4および変異型CYP3A4の免疫ブロット分析解析
次に本発明者らは、HepG2細胞において発現された野生型CYP3A4および変異型CYP3A4の免疫ブロット分析を行った。先のテストステロン水酸化の測定に使用したものと同じ細胞を分析した。免疫ブロット分析は、野生型CYP3A4（図１Ａ、レーン２）および変異型CYP3A4（図１Ａ、レーン３〜８）を発現している細胞において、52kDaに移動した免疫反応性タンパク質の発現を確認した(Donanski T. L., Liu J., Harlow G. R and Halpert J. R.: Analysis of four residues within substrare recognition site 4 of human cyrochrome P450 3A4: role in steroid hydroxylase activity and α-naphthoflavone stimulation. Arch. Biochem. Biohys. 350, 223-232 (1998))が、ヌル細胞（図１Ａ、レーン１）においてはこれを確認しなかった。ヒト肝ミクロソームにおいて、本発明者らは、同じ位置に移動した太いタンパク質バンドを発見した（図１Ａ、レーン９）。CYP3A4の発現レベルは、公知のヒト肝ミクロソームにおけるCYP3A4レベル（127pmol CYP3A4/mgタンパク質）を基に推定した（Gentest Corp., Woburn, MA）。それらの含量は、野生型CYP3A4は28.9±1.2pmol/mgタンパク質、T185S変異型CYP3A4は23.6±4.2pmol/mgタンパク質、L293P変異型CYP3A4は30.3±4.4pmol/mgタンパク質、およびT363M変異型CYP3A4は16.6±0.5pmol/mgタンパク質であった。CYP3A4の含量は、cDNAが発現した試料におけるテストステロン6β-水酸化活性とよく相関していた（r=0.71）。
【００７３】
[実施例４]   CYP3A4 mRNAの発現レベルの測定
本発明者らは、CYP3A4 mRNAの発現レベルをノーザンブロット法により試験した。ヌル構築物でトランスフェクションした細胞において、CYP3A4に関連したmRNAバンドは、検出されなかった（図２、上側パネル、レーン１および１０）。G3PDH mRNAレベルは、使用した全てのトランスフェクションした細胞でほとんど同じであり、したがって相対CYP3A4 mRNAレベルの計算に使用した（図２、下側パネル）。他方、cDNAをトランスフェクションした細胞は、明らかに野生型CYP3A4 mRNAまたは変異型CYP3A4 mRNAを発現した（図２、上側パネル、レーン２〜９）。このCYP3A4 mRNAレベル間に統計学的有意差はなかった（変異型CYP3A4 mRNA対野生型CYP3A4 mRNA比：T185S、1.04；L293P、1.04；T363M、1.00）。従って、これらの変異型CYP3A4は、CYP3A4 cDNAの転写率については変わりないことが分かった。
【００７４】
[実施例５]   変異型CYP3A4のテストステロン6β-水酸化の代謝回転速度の測定
本発明者らは、細胞溶解液中に発現されたタンパク質レベルを基にこれらの変異型CYP3A4のテストステロン6β-水酸化の代謝回転速度を計算した（図３Ａ）。T185S変異型CYP3A4およびT363M変異型CYP3A4に関する速度は、各々、野生型CYP3A4の45.9％および36.3％であった。L293P 変異型CYP3A4については、この速度は野生型CYP3A4と顕著に異なっていなかった（360.8±10.6pmol/時/pmol L293P、対、291.6±35.5pmol/時/pmol野生型CYP3A4）。同様の結果が、2β-水酸化または15β-水酸化についても得られた（図３、ＢおよびＣ）。本発明者らは更に、野生型CYP3A4および変異型CYP3A4を発現しているHepG2細胞からミクロソームを調製した。最終濃度1mg/ml（総タンパク質として）のミクロソームを用い、テストステロン水酸化アッセイ(Pampori N. A., Pampori M. K. and Shapiro B. H.: Dilution of the chemiluminescence reagents reduces the background noise on western blots. Biotechniques 18, 588-590 (1995))を行い、かつT185SおよびT363M変異型CYP3A4が、野生型CYP3A4（389.1pmol/分/nmol CYP3A4）およびL293P変異型CYP3A4（361.3pmol/分/nmol CYP3A4）よりも、より低いテストステロン6β-水酸化を示す（各々、214.9および164.4pmol/分/nmol 変異型CYP3A4）ことが分かった。インキュベーション混合液へのヒトP450レダクターゼの添加は、テストステロン6β-水酸化活性に対しいかなる作用も示さなかった。
【００７５】
以上の結果から、T363M置換が、テストステロン6β-水酸化の最も顕著な低下を引き起こすことがわかった。CYP3A4の活性部位に関する情報の大半は、CYP101（P450cam）およびCYP1O2（P450BM-3）、周知の結晶化した細菌CYPを基にしたホモロジーモデルに由来している(Poulos T.L., Finzel B.C. and Howard A.J.: High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam. J. Mol. Biol. 195, 687-700 (1987); Ravichandran K. G., Boddupalli S. S., Hasermann C. A., Peterson J. A., Deisenhofer J.: Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's. Science 261, 731-736 (1993); Szklarz G. D., Halpert J. R.: Molecular modeling of cytochrome P450 3A4. J. Comput. Aided Mol. Des. 11, 265-272 (1997); Poulos T. L., Finzel B. C., Gunsalus I. C., Wagner G. C. and Kraut J.: The 2.6-Å crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450. J. Biol. Chem. 260, 16122-16130 (1985); Schlichting I., Berendzen J., Chu K., Stock A. M., Maves S. A., Benson D. E., Sweet R. M., Ringe D., Petsko G. A., and Sligar S. G.: The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution. Science 287, 1615-1622 (2000); Williams P. A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E. F. and McRee D. E.: Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity. Mol. Cell. 1, 121-131 (2000); Li H., and Poulos T. L.: The structure of the cytochrome P450BM-3 haem domain complexed with the fatty acid substrate, palmitoleic acid. Nat. Struct. Biol. 4, 140-146 (1997))。Gotohは、哺乳類のCYPにおいて6種の推定基質認識部位（SRS）を提唱している(Gotoh O.: Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. J. Biol. Chem. 267, 83-90 (1992))。Heらは、CYP3A4およびCYP101の配列を整列し、SRS-5をCYP3A4の残基364-377の領域に位置させた(He Y. A., He Y. Q., Szklarz G. D. and Halpert J. R.: Identification of three key residues in substrate recognition site 5 of human cytochrome P450 3A4 by cassette and site-directed mutagenesis. Biochemistry 36, 8831-8839 (1997))。彼らは、SRS-5の突然変異がステロイドヒドロキシラーゼ活性に強く影響することを報告している。例えば、Arg-365およびその水素結合網は、CYP3A4の三次元構造の維持に貢献しているであろう。従ってSRS-5の残基363のトレオニンは、水素結合網の形成に寄与するように思われ、かつそのメチオニンとの置換は、触媒機能の喪失をもたらすであろう。本発明者らの免疫ブロット法のデータは、HepG2細胞におけるトランスフェクションの24時間後に、T363M変異型CYP3A4含量が、野生型CYP3A4よりも明確に低いにもかかわらず、他のmRNAレベルにおいては、有意差は認められないことを指摘している。従って、CYP3A4のThr-363は、CYP3A4の三次元構造の維持に寄与し、かつT363M置換は該タンパク質の安定性の低下を引き起こすであろう。しかし、T363M変異型CYP3A4の翻訳率が比較的低い可能性を排除することはできない。
【００７６】
最近Eiseltらが、213名の中央ヨーロッパおよび西ヨーロッパ人のDNA検体を研究し、T363Mを含む8種の新たな非同義SNPを発見したことを報告した(Eiselt R, Domanski TL, Zibat A, Mueller R, Presecan-Siedel E, Hustert E, Zanger UM, Brockmoller J, Klenk HP, Meyer UA, Khan KK, He YA, Halpert JR, Wojnowski L.: Identification and functional characterization of eight CYP3A4 protein variants. Pharmacogenetics 11, 447-458 (2001))。彼らは、細菌の発現システムを用い、その機能的特徴を説明している。T363M変異型CYP3A4は、テストステロン6β-水酸化、2β-水酸化および15β-水酸化並びにプロゲステロン6β-水酸化において、野生型CYP3A4と比較して低い活性を示した。彼らは更に、T363M変異型CYP3A4の低い発現および／または不安定性は、その活性に影響しうることも結論した。
【００７７】
配列を整列しモデリングする研究から、基質ポケットおよび／または基質接近（access）溝のヘリックスおよびループ構成部位が割り当てられた(Cosme J and Johnson E. F.: Engineering microsomal cytochrome P450 2C5 to be a soluble, monomeric enzyme. Mutations that alter aggregation, phospholipid dependence of catalysis, and membrane binding. J. Biol. Chem. 275, 2545-2553 (2000))。CYP102において、おそらく基質の接近および排出をもたらすであろう、N末端βシートドメインとF-Gループの間、タンパク質の表面から活性部位にかけて、明確な溝があった(Williams P. A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E. F. and McRee D. E.: Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity. Mol. Cell. 1, 121-131 (2000))。基質ポケット内に位置する残基が置換されると、水酸化の領域選択性（regioselectivity）が変わる(Luo Z., He Y. A., and Halpert J. R.: Role of residues 363 and 206 in conversion of cytochrome P450 2B1 from a steroid 16-hydroxylase to a 15 alpha-hydroxylase. Arch. Biochem. Biophys. 309, 52-57 (1994))。二次元構造情報から、CYP3A4のThr-185残基がこの領域に存在していることがわかる(Williams P. A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E. F. and McRee D. E.: Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity. Mol. Cell. 1, 121-131 (2000))。T185S置換は、低下したテストステロン6β-水酸化、2β-水酸化および15β-水酸化をもたらした。T185S-置換したタンパク質レベルは、野生型CYP3A4と比較してわずかな減少のみが認められた（図１ＡおよびＢ）。T185S置換は、基質接近溝の構造を変化することが可能である。
【００７８】
L293P置換は、テストステロンヒドロキシラーゼ活性に顕著な影響を及ぼさなかったが、この置換はSRS-4内において生じ、これは様々な動物の種間で高度に保存され、かつ基質特異性および触媒活性に関連すると考えられている(Gotoh O.: Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. J. Biol. Chem. 267, 83-90 (1992); Johnson E. F. and Waterman M. R.: Structural alignments of P450s and extrapolations to the unknown. In Graham-Lorence S. E. and Peterson J.A (ed.): Methods in Enzymology, Academic Press, 1996, pp. 315-327)。Domanskiらは、F304A置換が、野生型よりもより大きいプロゲステロンヒドロキシラーゼ活性を示すが、T309A変異型CYP3A4は、野生型酵素と同様の酵素活性を有すると報告している(Donanski T. L., Liu J., Harlow G. R and Halpert J. R.: Analysis of four residues within substrare recognition site 4 of human cyrochrome P450 3A4: role in steroid hydroxylase activity and α-naphthoflavone stimulation. Arch. Biochem. Biohys. 350, 223-232 (1998); Stevens J. C., Domanski T. L., Harlow G. R., White R. B., Orton E. and Halpert J. R.: Use of the steroid derivative RPR 106541 in combination with site-directed mutagenesis for enhanced cytochrome P-450 3A4 structure/function analysis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 290, 594-602 (1999))。Domanskiらは、F304A置換が、酵素の固有の機能には影響しないが、おそらく特にプロゲステロンおよびテストステロンの結合に影響するであろうということを示唆している。従って、293番目周辺のアミノ酸置換の作用を、現時点で説明することは難しい。本発明者らの最近の研究から、日本人のDNA検体中にL293P置換も認められた。
【００７９】
【発明の効果】
新たな変異型CYP3A4の発見およびその変異型CYP3A4の特徴決定は、CYP3A4が媒介した薬物代謝を予想する上で非常に重要である。しかし、日本人に関するCYP3A4対立遺伝子の遺伝的多型に関する情報はほとんどなかった。これに対し、本発明者らは、日本人由来のサンプルからT185S変異型CYP3A4を見出し、該変異型CYP3A4は薬物の解毒的代謝能が低下していることを示した。従って、本酵素により代謝される薬物を医薬品として投与する場合、本多型を有する患者に副作用が発現しやすいものと考えられる。本発明によって、CYP3A遺伝子多型を利用した検査方法、および、多型遺伝子を利用した本酵素活性増強のための化合物をスクリーニングする方法などが提供されることにより、上記副作用を忌避できるものと大いに期待される。
【００８０】
【配列表】
0004305609.tif 000004
0004305609.tif 000005
0004305609.tif 000006
0004305609.tif 000007
0004305609.tif 000008
0004305609.tif 000009
0004305609.tif 000010
0004305609.tif 000011
0004305609.tif 000012
0004305609.tif 000013
0004305609.tif 000014
0004305609.tif 000015
0004305609.tif 000016
0004305609.tif 000017
0004305609.tif 000018
0004305609.tif 000019
0004305609.tif 000020
0004305609.tif 000021
0004305609.tif 000022
0004305609.tif 000023
0004305609.tif 000024
0004305609.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型CYP3A4およびその変異型CYP3A4のウェスタンブロット分析結果を示す写真である。Ａは、CYP3A4 cDNAの野生型およびその3種の変異型の各々でトランスフェクションしたHepG2細胞から調製した細胞溶解液、Ｂは、HepG2細胞から調製した該ミクロソームタンパク質を示す。細胞溶解液（20μg）およびミクロソームタンパク質（25μg）を電気泳動し、ブロットした。Ａにおいて、レーン1はpCR3.1/ヌル細胞由来のサンプル、レーン2は野生型CYP3A4、レーン3および4はT185S変異型CYP3A4、レーン5および6はL293P変異型CYP3A4、レーン7および8はT363M変異型CYP3A4、レーン9はヒト肝ミクロソーム（5μg）を示す。Ｂにおいて、レーン1はpCR3.1/ヌル細胞由来のサンプル、レーン2は野生型CYP3A4、レーン3はT185S変異型CYP3A4、レーン4はL293P変異型CYP3A4、レーン5はT363M変異型CYP3A4、レーン6はヒト肝ミクロソーム（5μg）を示す。
【図２】  野生型CYP3A4およびその3種の変異型CYP3A4をコードしているmRNAのノーザンブロット分析結果を示す写真である。トランスフェクションの24時間後、総RNAを各試料から調製し、かつ電気泳動し、膜に移し、特異的プローブでハイブリダイズした。レーン1および10はpCR3.1/ヌル細胞由来のサンプル、レーン2および3は野生型CYP3A4 mRNA、レーン4および5はT185S変異型CYP3A4 mRNA、レーン6および7はL293P変異型CYP3A4 mRNA、レーン8および9はT363M変異型CYP3A4 mRNAを示す。CYP3A4に関連したmRNAおよび対照としてのG3PDH mRNAを、各々上段および下段に示した。
【図３】  野生型CYP3A4およびその変異型CYP3A4のテストステロンヒドロキシラーゼ活性を示す図である。野生型CYP3A4およびその変異型CYP3A4をコードするDNAをHepG2細胞へトランスフェクション後の24時間後に、培地を交換し、テストステロン100μMをこの細胞に添加した。次いで、テストステロン水酸化を測定した。Ａはテストステロン6β-水酸化、Ｂはテストステロン2β-水酸化、Ｃはテストステロン15β-水酸化を示す。各値は、4回の処置の平均を垂直バーで示した標準偏差と共に表している。*は、 P＜0.01対野生型（スチューデントt-検定）を意味する。
【図１】
0004305609.tif 000026
【図２】
0004305609.tif 000027
【図３】
0004305609.tif 000028