(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体および他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された抗体調製物を調製する方法であって、
（ａ）出発溶液のｐＨを３．８〜４．５に調整して中間溶液を生成する工程、
（ｂ）中間溶液にカプリル酸イオン源を添加し、そして沈殿物と抗体を含む上澄液とを形成するようｐＨを調整する工程、
（ｃ）上澄液を、活性エンベロープ・ウイルスの力価が少なくとも２  ｌｏｇユニットまで低下するかまたは検出できないレベルに低下する時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度の条件下でインキュベートしてウイルスの不活性化された溶液を生成する工程、
（ｄ）ウイルスの不活性化された溶液を、少なくとも一定の他の物質をアニオン交換樹脂に結合させるが、抗体を該アニオン交換樹脂に結合させない条件下で、少なくとも１種の該アニオン交換樹脂と接触させる工程、ならびに
（ｅ）抗体を回収する工程、
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項２】
免疫グロブリンおよび他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を調製する方法であって、
（ａ）出発溶液のｐＨを３．８〜４．５に調整して中間溶液を生成する工程、
（ｂ）中間溶液に、カプリル酸イオン源を添加し、そして第１の沈殿物と免疫グロブリンを含む第１の上澄液とが形成されるｐＨに調整する工程、
（ｃ）第１の上澄液を第１の沈殿物から分離する工程、
（ｄ）第１の上澄液を、活性エンベロープ・ウイルスの力価が少なくとも２  ｌｏｇユニットまで低下するかまたは検出できないレベルに低下する時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度条件下でインキュベートし、第２の沈殿物と免疫グロブリンを含む第２の上澄液とを形成する工程、  （ｅ）第２の上澄液を第２の沈殿物から分離する工程、
（ｆ）第２の上澄液を、免疫グロブリンが第１のアニオン交換樹脂に実質的には結合されないが、他の物質が第１の該アニオン交換樹脂に結合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第１の該アニオン交換樹脂と接触させる工程、
（ｇ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む画分を、工程（ｆ）で得られた該アニオン交換樹脂から分離する工程、
（ｈ）工程（ｇ）の画分を、免疫グロブリンが第２のアニオン交換樹脂に実質的には結合されないが、他の物質が第２の該アニオン交換樹脂に結合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第２の該アニオン交換樹脂と接触させる工程、および
（ｉ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む精製され、ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を、工程（ｈ）で得られた該アニオン樹脂から分離する工程、
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項３】
抗体および他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された抗体調製物を調製する方法であって、
（ａ）出発溶液のｐＨを３．８〜４．５に調整して中間溶液を生成する工程、
（ｂ）中間溶液にカプリル酸イオン源を添加し、そして沈殿物と抗体を含む上澄液とを形成するようｐＨを調整する工程、
（ｃ）上澄液を、活性エンベロープ・ウイルスの力価が少なくとも２  ｌｏｇユニットまで低下するかまたは検出できないレベルに低下する時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度の条件下でインキュベートしてウイルスの不活性化された溶液を生成する工程、および
（ｄ）ウイルスの不活性化された溶液を、アニオン交換樹脂で処理することにより、精製され、ウイルスの不活性化された抗体調製物を取得する工程、
を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項４】
免疫グロブリンおよび他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を調製する方法であって、
（ａ）出発溶液のｐＨを３．８〜４．５に調整して中間溶液を生成する工程、
（ｂ）中間溶液を、第１の沈殿物と免疫グロブリンを含む第１の上澄液とが形成される、ｐＨ、温度およびカプリル酸塩濃度の条件に調整する工程、
（ｃ）第１の上澄液を第１の沈殿物から分離する工程、
（ｄ）第１の上澄液を、活性エンベロープ・ウイルスの力価が少なくとも２  ｌｏｇユニットまで低下するかまたは検出できないレベルに低下し、かつ、第２の沈殿物と免疫グロブリンを含む第２の上澄液とが形成される、時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸塩濃度の条件下でインキュベートする工程、
（ｅ）第２の上澄液を第２の沈殿物から分離してウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を生成する工程、および
（ｆ）ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を、アニオン交換樹脂で処理することにより、精製され、ウイルスの不活性化された抗体調製物を取得する工程、
を含むことを特徴とする上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、タンパク質精製およびウイルス不活性化／除去、そして具体的には、血漿および他の給源からのγ−グロブリン精製のための改良法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カプリル酸のようなカルボン酸は、血漿産物の調製（タンパク質の沈殿）とウイルスの不活性化の両方に使用されてきた。例えば、Sengらによるそのような使用の概要（1990）、参照。
【０００３】
カプリル酸塩を用いる分画：
ヒト免疫グロブリンの調製の際、カプリル酸は、一般に、温度やイオン強度のようなパラメーターが最適化される限り、ｐＨ４．８において、ほとんどの血漿タンパク質の効果的な沈殿剤として認識されている。Steinbuchら(1969)は、ＩｇＧ、セルロプラスミンおよびＩｇＡに影響を与えずに、カプリル酸を用いる大部分の血漿タンパク質の沈殿を記述している。Steinbuchらは、カプリル酸を用いて哺乳動物血清からＩｇＧを単離し、そして広範囲の非免疫グロブリンの沈殿が、やや酸性側ではあるがｐＨ４．５以下ではないｐＨで、最も良好に得られることを報告した。血漿は、０．０６Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ４．８により２：１希釈され、次いで、２．５ｗｔ％カプリル酸塩により処理して沈殿を開始させた。ＤＥＡＥ−セルロースへのその上澄液のバッチ吸着は、単離されたＩｇＧ画分から付加的な不純物を除去するために使用された。Steinbuchらによるその後の研究は、コーン・エタノール画分ＩＩＩに存在するほとんどのタンパク質およびリポタンパク質（免疫グロブリン以外の）を沈殿させるためのカプリル酸の使用を示した。（Steinbuch et al., 1973）。
【０００４】
上記、Steinbuchの方法は、ＩｇＧの回収に０．８６ｗｔ％カプリル酸を用いて、細胞培養培地およびマウスからの腹水症液（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）に応用された。（Russo et al., 1983）。同じ方法は、２．１６ｗｔ％カプリル酸塩を用いて希釈されたヒト血漿に応用された。（Habeeb et al., 1984）。Habeebらは、カプリル酸沈殿に続いてＤＥＡＥセルロースでの分画を行った。得られる血漿由来のＩｇＧは、凝集体、プラスミンおよびプラスミノーゲンを含まなかった。その上、得られたＩｇＧは、抗補体活性において低く、そして貯蔵中比較的安定であった。
【０００５】
これらの研究の結果として、科学者らは、さらに、ＩｇＡ、ＩｇＧ、α−１酸糖タンパク質およびプレアルブミンを精製するためのいくつかの技術を開発して、現在では、沈殿反応が高い温度とｐＨ依存性であると結論した。（Steinbuch et al., 1969; Steinbuch et al., 1973; またTenold, 1996,参照）。
【０００６】
例として、ＩｇＡが、ｐＨ４．８における存在するカプリル酸によるＩｇＡ溶解度に基づき、コーン画分ＩＩＩからの日常的な分画副産物として調製された。（Pejaudier et al., 1972)。ＤＥＡＥ−セルロース吸着と溶出によって低温エタノール画分ＩＩＩから単離されたＩｇＡは、さらに、カプリル酸沈殿によって精製された。沈殿条件は、１．５〜２％タンパク質濃度、０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ５．０、１．１２ｗｔ％カプリル酸であった。
【０００７】
哺乳動物血清および腹水症液からの免疫グロブリンの２段階精製が報告された（McKinney et al., 1987）。最初に、アルブミンおよび他の非免疫ＩｇＧタンパク質がカプリル酸を用いて沈殿され、次いで、硫酸アンモニウムが上澄液に添加されてＩｇＧを沈殿させた。
【０００８】
Kotheらに対する米国特許第5,164,487号（1992）は、凝集体、血管作動性物質およびタンパク質分解酵素を含まない静脈内で許容されるＩｇＧ調製物製造のためのカプリル酸の使用に関する。その方法は、イオン交換または疎水性マトリックスによるクロマトグラフィー精製の前に、ＩｇＧを含有する出発材料を０．４％〜１．５％カプリル酸と接触させることを含む。
【０００９】
また、カプリル酸ナトリウムは、アルブミンを精製するために使用されてきた。これらの方法によれば、カプリル酸ナトリウムは、血漿処理のために添加され、その処理工程が高温にさらされる時にアルブミンを保護する。極端な温度は、処理工程のグロブリンを変性するだけでなく、不純物、ネオ抗原を生じる。（Schneider et al., 1979; Condie, 1979; またPlan, 1976、参照）。
【００１０】
Tenold（1996）は、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩまたはＩＶ−１流出液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）からのアルブミンの単離のために、分配剤としてのカプリル酸塩の使用を示している。再び、カプリル酸ナトリウムは、グロブリンを変性（および沈殿）するために使用される。
【００１１】
ウイルス不活性化：
Sengらによる米国特許第4,939,176号（1990）は、生物学的に活性なタンパク質溶液中のウイルスを、その溶液をカプリル酸と接触させることによって不活性化する方法を報告している。その方法について述べられた好適な条件は、ｐＨ４〜ｐＨ８、および非イオン型のカプリル酸０．０７％〜０．００１％であった。化学薬剤の使用によるウイルス不活性化の他の方法が知られている。Neurathらに対する米国特許第4,540,573号（1985）は、抗ウイルス剤としてリン酸ジ−またはトリ−アルキルの使用を教示する。Lembachらによる米国特許第4,534,972号（1985）は、治療学的または免疫学的に活性なタンパク質の溶液を、実質的に感染性因子を含まなくする方法を記述している。Lembachの方法では、タンパク質の溶液は、遷移金属錯体、例えば銅フェナントロリンおよび還元剤と接触して、実質的にタンパク質の活性に影響を与えずにウイルスの不活性化が実施される。
【００１２】
アニオン交換クロマトグラフィー：
Bloomら（1991）は、抗体調製物を精製するためのアニオン交換クロマトグラフィーの使用の例を提供する。それらの方法は、抗体を含み、そしてプロテインＡが混入する溶液を、アニオン交換樹脂と接触させ、次いで、イオン強度を増加する条件下でその樹脂から抗体を溶出することを含む。
【００１３】
Friesenに対するカナダ特許第1,201,063号は、血漿画分を、２種の異なるアニオン交換樹脂を用いる２段階分離法にかけることによって、静脈内使用に適切なＩｇＧの調製を教示している。各段階で、アニオン交換樹脂を平衡化するために使用されるバッファーは、また、樹脂からＩｇＧ含有画分を溶出するのに使用される。
【００１４】
静脈内投与のためのヒトＩｇＧおよびアルブミン含有組成物を単離する方法は、Kimuraら（1984）によって記述されている。その方法は、ｐＨ、エタノール濃度、イオン強度および温度の制御条件下での沈殿段階を必要とする。
【００１５】
【発明の構成】
本発明は、ヒト血漿および他の給源からの抗体（特にＩｇＧタイプの）の精製のための改良法である。本方法は、ｐＨ３．８〜４．５における抗体の懸濁、続いてカプリル酸（または他のカプリル酸塩源）の添加、そしてｐＨ５．０〜５．２へのｐＨシフトを伴う。混入しているタンパク質、脂質およびカプリル酸塩の沈殿物が生成し、そして除去されるが、一方、大多数の抗体は溶液中に残る。再び、カプリル酸ナトリウムが、少なくとも約１５ｍＭの最終濃度まで添加される。この溶液が、活性なウイルスの力価を実質的に低下するのに十分な条件下でインキュベートされる（例えば２５℃で１時間）。沈殿物（主としてカプリル酸塩）が除去され、そして清澄な溶液は、イオン強度を低下するために純水で希釈される。２種の異なる樹脂を用いるアニオン交換クロマトグラフィーが利用されて、出発時の分布に類似の抗体サブクラス分布をもつ非常に純粋な抗体調製物を得る。
【００１６】
この方法は、処理スキムの必須部分としてウイルス不活性化および除去を組み合わせ、そしてγ−グロブリン溶液の後ウイルス処理操作を最小にするので、先行技術とは異なる。処理スキム中にウイルス処理を統合することによって、この方法は、収率を最大にし、純度９９％を超えるγ−グロブリンを生産する。
【００１７】
材料および方法
ｐＨの調整は、１Ｍ酢酸。２Ｍ酢酸、６％ＮａＯＨ、１ＭＮａＯＨもしくは１ＭＨＣｌを用いて行った。カプリル酸ナトリウム保存液は、注射用水中３０％カプリル酸ナトリウムを混合することにより溶解することによって作成された。ヒト血漿画分ＩＩ＋ＩＩＩは、Lebingら（1994）によって記述されたように生産された。すべての試薬は、ＵＳＰグレードまたはそれ以上であった。ネフェロ分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ  ３６０  ＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒおよびＢｅｃｋｍａｎキットを用いて行われた。分析用ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｇ３０００ＳＷおよびＧ４０００ＳＷ  ＳＥＣカラムをもつＨＰ１０５０システムを用いて行われた。タンパク質は、ビューレット法を用いて測定された。
【００１８】
操作は、しっかりしていて（ｒｏｂｕｓｔ）そして単純である（図１、参照）。工程は、沈殿した抗体を、ｐＨ４．２付近において純水中に再溶解することによって始まる。実際には、ペースト１単位当たりの水の量を増加することが、収量増加をもたらす。しかしながら、ペースト数百キログラムを処理する場合には、作業限界内に容器およびカラムスケールを保つために、若干の収量を犠牲にすることが実際的である。免疫グロブリンの需要は、一般に、供給をはるかに上回っているので、溶解段階、ウイルス不活性化およびクロマトグラフィーを横断する収率は、相対的に重要である。
【００１９】
エンベロープ・ウイルスの不活性化は、ｐＨ感受性沈殿物の大部分が、不活性化段階の前に除去される必要がある。その上、カプリル酸ナトリウム含量は、エンベロープ・ウイルスの完全な不活性化を達成するためには、２５℃維持の間１５〜６０ｍＭでなければならない。ウイルス不活性化の研究は、１６ｍＭまたは１８ｍＭのカプリル酸塩が、２４℃で３０分間に、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスおよび偽狂犬病ウイルスの４  ｌｏｇユニット以上を不活性化することを確認した。この付加的な化学的ウイルス不活性化は、また、製造工程中に組み入れられたｐＨ４．２５維持段階のウイルス不活性化を補足する。
【００２０】
工程の主要な段階は、次のように規定される：
１）  沈殿した免疫グロブリンを含有する組成物を、激しく混合しながら５℃において、注射用純水（ＷＦＩ）中に懸濁すること。好適な実施態様では、画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストが使用されるが、他の給源、例えば腹水症液、抗体を含有する組織培養培地、他のヒト血漿画分または動物血漿画分も、また使用されてもよい。
【００２１】
２）  その混合液をさらに激しく混合しながら、酸、好ましくは酢酸の添加によってｐＨ３．８〜４．５、好ましくは４．２に低下させることにより、免疫グロブリンを溶液に溶解すること。
【００２２】
３）  カプリル酸イオン源（例えば４０％ｗ／ｖカプリル酸ナトリウム水溶液）を、最終濃度１５ｍＭ〜２５ｍＭ、好ましくは２０ｍＭまで添加し、そして塩基（例えば１ＭＮａＯＨ）を用いてｐＨ５．０〜５．２、好ましくは５．１まで上げるよう調整すること。
【００２３】
４）  周囲温度（例えば５〜２５℃）における濾過による沈殿したタンパク質、脂質およびカプリル酸塩の除去。濾過は、濾過助剤（例えば、この場合は、濾過助剤が２％〜５％ケイソウ土である）の添加を要する。溶液は、通常の流下濾過を用いて濾過される。この段階は、非エンベロープ・ウイルスの有意な減少をもたらす。遠心分離が濾過に置き換わってもよい。
【００２４】
５）  さらにカプリル酸塩を添加して、濃度約１５ｍＭ〜約６０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭまで戻すよう調整するが、一方ｐＨは、酸（例えば１Ｍ酢酸）の添加によって５．０〜５．２、好ましくは５．１に維持される。
【００２５】
６）  温度は、約２５〜３５℃、好ましくは２５℃に上げられ、そして約１５分〜約６時間、好ましくは約１時間の間維持される。より長いインキュベーション時間が、収量における若干の犠牲はあるが使用されてもよい。主としてカプリル酸塩および若干の付加的なタンパク質の沈殿物が、この段階で形成される。
【００２６】
７）  濾過助剤（ケイソウ土）が添加され、そして沈殿物が通常の流下濾過によって除去される。エンベロープ・ウイルスは、カプリル酸塩維持によって不活性化され、そして非エンベロープ・ウイルスは、濾過床上に捕捉される。
【００２７】
８）  清澄液は、純水により希釈されて、伝導率１〜８ｍＳ／ｃｍ、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ未満に低下される。
【００２８】
９）  その溶液を、連続して結合された２種のアニオン交換クロマトグラフィーを通過させること。アニオン交換体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミンおよび他の残っているタンパク質不純物を除去する能力に関して選ばれる。負荷後、カラムは平衡化バッファーを用いて洗浄される。通過および洗浄画分が精製ＩｇＧとして回収される。両カラムは、同じバッファーにより、そして同じｐＨにおいて平衡化される。
【００２９】
数種のアニオン交換樹脂の組み合わせ物が、樹脂の選択性に依存して利用されてもよい。アニオン交換樹脂は、アルコール／ｐＨ沈殿した血漿画分中に見いだされる不純物を選択的に除去する能力に関して選ばれる。この方法の開発において、満足できる精製が、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｑ  ＆  ＡＮＸ樹脂およびＥ．Ｍｅｒｃｋ  ＴＭＡＥ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌの組み合わせ物により得られた。
【００３０】
クロマトグラフィーについて述べられる条件は、一般に、ｐＨ５．０〜５．２にわたる。ｐＨ＜５．０では、不純物はカラムを通過する。ｐＨ＞５．２では、収量が犠牲にされる。純度の低下は、イオン強度がクロマトグラフィーの間に増加するように観察されるので、クロマトグラフィーの間のイオン強度は、比較的に重要である。
【００３１】
好適な実施態様では、溶液は、ｐＨ５．１において２０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化された第１のアニオン交換体に直接適用される。この後に、第１のアニオン交換カラムからの非結合画分（通過液）が、第２のアニオン交換カラム上に直接適用される。このカラムもまた、ｐＨ５．１において２０ｍＭ酢酸バッファーで平衡化されている。タンパク質溶液は、典型的には、５０〜１１０ｍｇＩｇＧ／ｍｌ充填樹脂の割合で第１のカラム上に負荷される。タンパク質溶液は、典型的には、７５〜９５ｍｇＩｇＧ／ｍｌ充填樹脂の割合で第２のカラム上に負荷される。また、タンパク質対樹脂の比は、これらの限界を越えても調節できるが、そうすることは、収率および純度に影響をもたらすであろう。タンパク質溶液は、続いて、約２倍カラム量の平衡化バッファーを添加され、それが、すべての非結合ＩｇＧをカラムから洗い出す。非結合画分は、高度に精製されたＩｇＧとして回収され、次いで、それはダイアフィルトレーションされ、そしてタンパク質が最終製剤価まで濃縮される。
【００３２】
最終産物のための好適な条件は、この製造者によって保有される特許に基づいて選択される。これらの条件（低ｐＨおよび低塩）は、理論的に、いかなるＩｇＧ産物にも好都合であろう。回収されたタンパク質はｐＨ４．２に調整される、それは、濃度約５％（ｗ／ｖ）まで限外濾過される。次いで、純水に対してダイアフィルトレーションされる。
【００３３】
精製されたＩｇＧは、安定な液状製剤（Tenold,1983記載のように）や、また他の適当な最終製剤（例えば、凍結乾燥製剤）のいずれのためにも濃縮される。液状製剤では、精製ＩｇＧは濃縮されて、無菌濾過後に５％または１０％ＩｇＧ（ｗ／ｖ）のいずれかを得る。濾過前にｐＨは、３．８０〜４．２５に調整され、そしてマルトースまたはグリシンが添加されて、静脈内注射に適合しうるように浸透性を調整される。次いで、無菌バルクは、抗補体活性を低下させ、そしてエンベロープ・ウイルスを不活性化するために、少なくとも２１日間は保存される。
【００３４】
本明細書で使用されるように、濃度についてのパーセント値は重量／容量に基づいて測定される。
【００３５】
本明細書で使用されるように、活性ウイルスの力価を実質的に低下させることは、少なくとも約２  ｌｏｇユニット、より好ましくは少なくとも約３  ｌｏｇユニット、もっとも好ましくは少なくとも約４  ｌｏｇユニットで活性ウイルスを低下させることを意味する。
【００３６】
本明細書で使用されるように、実質的にすべてのタンパク質は、少なくとも約９０％のタンパク質を意味する。実質的にタンパク質がないということは、タンパク質が約５％未満であることを意味する。
【００３７】
【実施例】
（実施例１）
コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストからＩｇＧの精製
画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを、５℃の純水１２倍の容量中に可溶化した。混合液のｐＨを酢酸でｐＨ４．２に調整し、１時間混合した。この段階はＩｇＧを溶液にした。
【００３８】
次いで、混合液ｐＨをＮａＯＨおよびカプリル酸ナトリウムを用いてｐＨ５．２まで調整した（「ｐＨスイング（ｓｗｉｎｇ）」）。タンパク質および脂質が沈殿した。混合液を濾過して、ウイルス不活性化を妨害する沈殿物を除去することによって清澄化した。カプリル酸塩濃度をｐＨ５．１において２０ｍＭに調整し、そして混合液を２５℃で１時間インキュベートして、エンベロープ・ウイルスの不活性化を実施した。
【００３９】
その混合液を濾過して、クロマトグラフィーのための澄明な溶液を作成した。溶液の伝導率を、純水を用いて２．０〜３．０ｍＳ／ｃｍに調整した。伝導率の調整後、溶液のｐＨを５．０〜５．２に調整した。
【００４０】
次いで、溶液を、２種のアニオン交換カラム（強アニオン交換体に続いて弱アニオン交換体）に直接適用した。２種のカラムは直列に結合された。ＩｇＧはカラムを通過したが、不純物（カプリル酸を含む）は２種のアニオンカラムに結合した。
【００４１】
クロマトグラフィーから回収された通過液のｐＨを、酢酸を用いて３．８〜４．０に調整した。それを、バッファー（純水）を７回交換してダイアフィルトレーションした。次いで、それを濃縮し、そしてｐＨ４．２において最終製剤化した。
【００４２】
ペーストの溶解から最終産物までの総収率は６９％であった（表、参照）。これは、アルコール処理洗浄を用いる先行法の収率（４８％）を上回る有意な改良であった（先行法の概要を示す図２参照）。
【００４３】
【表１】
0004359347.tif 000002
【００４４】
（実施例２）
細胞培養培地からＩｇＧの精製
最初に、モノクローナル抗体を含有する細胞系増殖培地を、適当なｐＨおよび伝導率に調整する。これは、ｐＨを酢酸で４．２に調整しながら純水に対するダイアフィルトレーションによって行った。伝導率は１．０ｍＳ／ｃｍ未満にしなければならない。
【００４５】
モノクローナル抗体の精製を、上記の段階にしたがって達成する。次いで、精製されたモノクローナル抗体を濃縮し、そしてグリシン、マルトースまたは他の適切な添加剤を用いてｐＨ４．２に最終製剤化する。ｐＨ４．２における製剤化によって、５℃で２年間安定な液剤が達成できる。これは商業的観点から非常に望ましいことである。
【００４６】
（検討）
免疫グロブリンは、コーンのアルコール分画の間にＩＩ＋ＩＩＩ画分とともに沈殿する。沈殿は、タンパク質表面の総電荷とその溶媒との相互作用に依存する。厳密な塩、アルコールおよびｐＨ範囲は、タンパク質が沈殿する範囲をいくぶんは限定できる。しかしながら、ほとんどのタンパク質は、広範囲のｐＨおよびアルコール濃度（１．５ｐＨ単位および１０％アルコール）にわたって沈殿する。かくして、タンパク質の沈殿範囲はオーバーラップしがちである。すべて３種の主要な免疫グロブリンタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭは、それらの等電点の類似性により共沈殿する。免疫グロブリンのさらなる分離は、この類似性によって複雑になる。それ故、沈殿を利用する製造スキムは、ＩｇＧの有意な量が、必ずＩｇＡおよびＩｇＭとともに共沈殿することになる。
【００４７】
収率低下に加えて、古典的な沈殿法は、エタノールの使用が必要である。エタノールはタンパク質を変性するので、タンパク質の安定性を増大するためには、処理の間、低温（典型的には−５℃）が要求される。クロマトグラフィーは、沈殿法戦略において通常起きるタンパク質の変性問題を回避できる。タンパク質のクロマトグラフィー段階は、一般に、タンパク質の安定性に好ましい条件下で行うことができる。エタノール分画法のその他の欠点は、アルコールが、その化学的性質により潜在的な爆発危険物であって、爆発防止設備と特別な操作法を要することである。この事実は分画法のコストを有意に増大するので、慣用のクロマトグラフィー法にはない欠点である。
【００４８】
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質とイオン交換媒体の両方における表面分布および電荷密度という利点を利用する。アニオン交換樹脂は、陽性に帯電した表面を提供する。電荷密度は樹脂に特異的であり、そして一般に、ｐＨに依存しない（樹脂の作業範囲内では）。典型的なアニオン交換体は、正味の陰電荷をもつ（すなわち、溶液のｐＨがタンパク質の等電点以上である場合に）タンパク質を結合するであろう。事実、タンパク質の表面は、単一電荷が存在せず；むしろ、それは、陽性、陰性および中性電荷のモザイクである。表面構造は、与えられたタンパク質に特異的であり、そしてイオン強度やｐＨのような溶液条件によって影響されるであろう。この独特な性質は、個々のタンパク質が、アニオン交換樹脂に結合したり、またそこから離れたりする、特定の条件を確立するために利用できる。これらの条件を確立することによって、ただわずかに異なる表面または電荷の性質をもつタンパク質が、高収率（＞９５％）で効果的に分離できる。
【００４９】
クロマトグラフィー樹脂支持体の構造上の改良は、大規模なクロマトグラフィーを、より普通の精製方法へ実際的に変えることができた。強固な樹脂は、大容量を急速に（＜５時間）処理することを可能にし、そして高いリガンド密度は、大容量処理に必要な能力を増大する。高い収率、生産物純度および処理の簡易性と結び付くこれらのファクターは、大規模な製造におけるクロマトグラフィーの使用には好都合である。
【００５０】
【発明の効果】
本明細書に述べられたクロマトグラフィー法は、非常に特異的なクロマトグラフィー樹脂の利点を利用する。２種のアニオン交換体は、タンパク質不純物とウイルス不活性化剤を選択的に除去するのに使用される。得られる生産物は、ネフェロ分析かサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）のいずれによってアッセイした場合でも、純度＞９９％である。
【００５１】
また、本方法は、ＩｇＧの損失を最小にするよう計画される。ウイルス不活性化および除去は、溶解およびクロマトグラフィー段階中に注意深く組み入れられており、それ故、本方法の効率を高めている。ペースト溶解から最終産物までの総収率は６９％である（表、参照）。これは、アルコール処理洗浄（４８％）を用いる現行処理の収率を超える有意な改良である。
【００５２】
本方法は、実施例１において、ヒトのコーン画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストについて行われた。しかしながら、本方法が、ヒト以外の動物から単離された血漿画分について、同等の結果をもって良好に使用できることが期待される。
【００５３】
前記実施例は、本発明を具体的に説明することを意図しており、そしてその改変が当業者によって行われるであろうと考えられる。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって制約されることを意図しない。
【００５４】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００５５】
１．  初発ｐＨにおいて抗体および他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された抗体調製物を調製する方法であって、次の段階：
ａ）出発溶液にカプリル酸イオン源を添加し、そして沈殿物および抗体を含む上澄液を形成するようｐＨを調整すること、
ｂ）上澄液を、実質的にすべてのウイルスを不活性化する時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度の条件下でインキュベートすること、
ｃ）上澄液を、少なくとも一定の他の物質を樹脂に結合させるが、抗体を樹脂に結合させない条件下で、少なくとも１種のイオン交換樹脂と接触させること、ならびに
ｄ）抗体を回収すること、
を含む方法。
【００５６】
２．  出発溶液が血漿由来の抗体を含み、段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．６の範囲であり、そして段階ｂ）のｐＨが約５．０〜約５．２の範囲である、第１項の方法。
【００５７】
３．  出発溶液が哺乳動物細胞培養培地から得られ、段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．６の範囲であり、そして段階ｂ）のｐＨが約５．０〜約５．２の範囲である、第１項の方法。
【００５８】
４．  段階ｄ）において回収された抗体を最終剤形に製剤化する段階をさらに含む、第１項の方法。
【００５９】
５．  免疫グロブリンおよび他の物質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物を調製する方法であって、次の段階：
（ａ）出発材料を、第１の沈殿物および免疫グロブリンを含む第１の上澄液が形成される、ｐＨ、温度およびカプリル酸塩濃度の条件に調整すること、  （ｂ）第１の上澄液を第１の沈殿物から分離すること、
（ｃ）第１の上澄液を、第２の沈殿物および免疫グロブリンを含む第２の上澄液が形成される、時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸塩濃度の条件下でインキュベートすること、
（ｄ）第２の上澄液を第２の沈殿物から分離すること、
（ｅ）第２の上澄液を、実質的に、免疫グロブリンは第１の樹脂に結合されないが、他の物質が第１の樹脂に結合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第１のアニオン交換樹脂と接触させること、
（ｆ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む画分を、段階（ｅ）で得られた樹脂から分離すること、
（ｇ）段階（ｆ）の画分を、実質的に、免疫グロブリンは第２の樹脂に結合されないが、他の物質が第２の樹脂に結合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第２のアニオン交換樹脂と接触させること、および
（ｈ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む精製され、ウイルスを不活性化された免疫グロブリン調製物を、段階（ｇ）で得られた樹脂から分離すること、を含む方法。
【００６０】
６．  段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．６の範囲であり、段階ａ）のカプリル酸塩濃度が約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲であり、段階ｃ）のｐＨが約５．０〜約５．２の範囲であり、そして段階ｃ）のカプリル酸塩濃度が約１５ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である、第５項の方法。
【００６１】
７．  免疫グロブリンが免疫グロブリンＧである、第５項の方法。
【００６２】
８．  免疫グロブリンの給源が、ヒト血漿画分、ヒト以外の動物血漿画分および哺乳動物細胞培養培地からなる群から選ばれる、第５項の方法。
【００６３】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を記述する流れ図である。
【図２】抗体を単離するための先行技術法を示す流れ図である。
【図１】
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【図２】
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