(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜投与用組成物であって、この組成物がインフルエンザウイルス抗原と、アジュバントとして有効な量のキトサンとを含有しており、このキトサンが少なくとも８０％が脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記キトサンが少なくとも８５％脱アセチル化されている、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記キトサンが８８％〜９０％脱アセチル化されている、請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
鼻内投与に用いられるものである、請求項１〜３のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原の双方を含有している、請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
鼻内投与に用いられるものであって、精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原と、アジュバントとして有効な量のキトサンとを含有している、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原が、１０〜２５ナノメートルの範囲内の半径を有するロゼットの形で存在している、請求項５または６記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記キトサンが水溶性である、請求項１〜７のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記組成物が５．５〜６．５の範囲内のｐＨを有している、請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ｐＨが６である、請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物と組み合わされており、組成物を鼻内に運ぶのに適合した投薬装置を備えている、薬剤製品。
【請求項１２】
前記投薬装置がエアロゾル送出装置である、請求項１１記載の薬剤製品。
【請求項１３】
インフルエンザによる感染に対して宿主を免疫化するために、この宿主の粘膜の表面へと適用される、請求項１〜１０のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物または請求項１１もしくは１２の薬剤製品を製造するための、少なくとも８０％が脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、キトサンの使用。
【請求項１４】
防御ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身性免疫応答を促進するために、患者の粘膜の表面へと投与される請求項１〜１０のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物または請求項１１もしくは１２の薬剤製品を製造するための、少なくとも８０％が脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、キトサンの使用。
【請求項１５】
赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのようなインフルエンザウイルス抗原の免疫応答を促進するために、当該インフルエンザウイルス抗原と共にキトサンを鼻内投与するのに用いられる、請求項１〜１０のいずれか一つの請求項に記載のワクチン組成物または請求項１１もしくは１２の薬剤製品を製造するための、少なくとも８０％が脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、キトサンの使用。
【請求項１６】
鼻内投与したときに精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのようなインフルエンザウイルス抗原の免疫原性を促進する鼻内アジュバント組成物を製造するための、少なくとも８０％が脱アセチル化されている脱アセチル化キチンである、キトサンの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、鼻内投与用の、インフルエンザウイルス抗原および粘膜アジュバントを含有するワクチン組成物に関するものである。また、本発明は、患者に前記組成物を投与することによってインフルエンザに対して患者を免疫化する方法に関するものであり、およびインフルエンザウイルス抗原の免疫原性を、鼻内投与したときに、これと共に前記アジュバントを同時に投与することによって、エンハンスする方法に関するものである。他の態様においては、本発明は、インフルエンザウイルス抗原を、キトサンと組み合わせて使用し、患者をインフルエンザに対して免疫化するための鼻内投与用のワクチン組成物を製造する方法を提供する。
最近のインフルエンザワクチンは、不活化全粒子、分離ワクチン（スプリットワクチン）、またはこの膜の糖タンパク質の赤血球凝集素（ヘマグルチニン：ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の精製調製物であるサブユニットワクチンのいずれかからなる。赤血球凝集素とノイラミニダーゼとは、防御抗体反応の対象となる抗原であり、赤血球凝集素が主要な防御抗原である。これらの非経口的に投与されるワクチン類の効能の評価は、大きく変動する。これらのワクチン類は、主として、気管下部へと浸出する循環性の抗赤血球凝集素ＩｇＧ抗体を引き出すことによって作用するものと考えられている。
Ｍ．Ｌ．クレメンツ（Clements）他の「臨床微生物学誌：J．Clinical Micorbiology」２４，１５７〜１６０頁、１９８６年において以前に報告されたところでは、分泌型ＩｇＡおよび血清ＩｇＧの双方が、インフルエンザウイルスへの免疫性に加わっている。更に、マウスにおいては、多数の刊行された研究で、インフルエンザへの感染に対する防御に、呼吸器系のＩｇＡが重要であることが示されてきた。また、インフルエンザへの局所的なＩｇＡの応答を刺激すると、これがしばしば血清応答よりも広い特異性を有しており、従って、ワクチンに存在している赤血球凝集素分子と異なる赤血球凝集素分子を有するウイルスに対して交差防御をもたらしうるために有利であることが、見いだされてきた。従って、局所的な分泌型および血清抗赤血球凝集素応答の双方を引き出すインフルエンザワクチンは、現在のワクチンよりも優れた免疫性をもたらすはずである。しかし、非経口的なワクチン投与（筋肉内、皮下等）は、その前に粘膜への暴露（例えば感染）が存在しなかった場合には、局所的な抗体の産生をひきだすのには有効ではない。この粘膜免疫系を刺激するためには、ワクチンを粘膜の表面に局所的に適用しなければならない。
インフルエンザワクチンを粘膜に投与することは、従来の非経口的な免疫化投薬方法と比べて多数の利点を有しうる。これらの利点の中で重要なのは、気管の局所的な粘膜免疫系を一層有効に刺激すること、および注射に伴う恐怖と不快感とを回避できるであろうことから、ワクチンの摂取速度が増加するであろうという見込みがあることである。従って、粘膜インフルエンザワクチンを開発するために、多くの試みがなされてきた。しかし、欠点は、不活化ワクチンを粘膜から投与した場合には、しばしば免疫原性が乏しいことである。この問題を克服するための、経口的にまたは鼻内に投与されるインフルエンザワクチンの免疫原性を向上させるための相異なるアプローチとしては、コレラ毒素（ＣＴＢ）のＢサブユニットをアジュバントとして使用すること、種々のミクロスフィア中にワクチンをカプセル化すること、および弱毒生株を使用することが挙げられてきた。しかし、現在まで、粘膜に投与されるインフルエンザワクチンの免疫原性を促進する実用的な方法は開発されてこなかった。
ここで本発明者が見いだしたところでは、インフルエンザの赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原を、特定のキトサン誘導体と共に、鼻内調合物中で投与することによって、良好なＩｇＧおよび良好なＩｇＡ応答を達成することが可能である。
キトサンは、Ｎ−アセチル基の大部分が加水分解によって除去されているキチンまたはポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの誘導体である。
キトサンは、以前には薬剤調合物中で使用されてきており、欧州特許公開０４６００２０に粘膜吸収促進剤として開示されている。しかし、欧州特許公開０４６００２０には、キトサンが、ワクチン組成物中に投与された場合にアジュバントとしての作用をもたらしうることは、開示も示唆もされていない。
ここで本出願人が見いだしたところでは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素抗原を含有する鼻内ワクチン組成物中へとキトサンを含有させた場合には、良好な全身性および局所的な免疫応答が得られる。
従って、本発明の第一の態様においては、粘膜投与に適したワクチン組成物を提供し、この組成物は、インフルエンザウイルス抗原と、アジュバントとして有効な量のキトサンとを含有している。
このワクチン組成物は、好ましくは、鼻内投与に適合している。
好ましくは、この組成物は赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原の双方を含有している。
本発明の好適な態様においては、鼻内投与に適したワクチン組成物を提供し、この組成物は、精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼインフルエンザウイルス抗原と、アジュバントとして有効な量のキトサンとを含有している。
精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原が、ロゼットの形で存在していることが好ましい。好ましくは、このロゼットは、１０〜２５ナノメートルの範囲の半径を有する粒子である。
これらのロゼットは実質的に脂質がないことが好ましく、更には、精製された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原調合物が全体として実質的に脂質がないことが好ましい。
本発明の組成物に使用するのに適した赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ調合物の例は、連合王国マーシーサイド、スペクのエバンスメディカルリミテッドが製造、販売する「フルブィリン（Fluvirin）」製品であり、またＳ．レンフリー（Renfrey）およびＡ．ワッツ（Watts）の「ワクチン（Vaccine）」１９９４年、第１２巻、８号、７４７〜７５２頁を参照。
この組成物は単一のウイルス株からの、または複数の株からのインフルエンザウイルス抗原を含有していてよい。例えば、この組成物は、最大三種以上のウイルス株からとった抗原を含有していてよい。純粋に例示として、この組成物は、一種以上のインフルエンザＡ型株からの抗原を、一種以上のインフルエンザＢ型株からの抗原と共に含有していてよい。
好ましくは、このキトサンは水溶性である。
このキトサンは、少なくとも８０％脱アセチル化された脱アセチル化キチンであることが有利である。
好ましくは、キトサンは少なくとも８５％脱アセチル化されており、一層好ましくは８８％〜９０％脱アセチル化されている。
特定の脱アセチル化されたキトサンは、ノルウェイ国ドランメンのプロタン  バイオポリマーＡ／Ｓから入手できるグルタミン酸キトサンである「シー  キュアー（Sea Cure）＋」である。
他の態様においては、本発明は、インフルエンザによる感染に対して宿主を免疫化する方法を提供し、この方法は、この宿主の粘膜の表面に（好ましくは鼻内に）、前述したように、精製赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原のようなインフルエンザウイルス抗原を、アジュバントとして有効な量のキトサンと共に含有するワクチン組成物を投与することからなる。
他の態様において、本発明は、前述したように、精製赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原のようなインフルエンザウイルス抗原と、アジュバントとして有効な量のキトサンとを含有するワクチン組成物を、患者の粘膜の表面へと（好ましくは鼻内に）投与することによって、防御ＩｇＡ粘膜免疫応答とＩｇＧ全身性免疫応答とを促進する方法を提供する。
更に他の態様においては、本発明は、精製赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのようなインフルエンザウイルス抗原の免疫応答を（例えば鼻内投与した場合に）、これを前述したようにキトサンと共に同時投与することによって促進する方法を提供する。
本発明の組成物、および特に鼻内組成物は、エアロゾルまたは点滴剤として投与するために、液状または乾燥粉末として調合できる。
点鼻剤として投与する組成物には、こうした組成物に通常含有されているタイプの一種以上の左薬、例えば防腐剤、粘度調整剤、浸透圧調整剤、緩衝剤等を含有させることができる。
キトサンが水性培地中で確実に可溶性になるようにし、また赤血球凝集素が過度に酸性のｐＨによって悪影響を受けないようにするために、（例えば鼻内投与用の）溶液は、好ましくは５．５〜６．５の範囲内のｐＨを有しており、最も好ましくは約６のｐＨを有している。
また、本発明は、精製された表面抗原のようなインフルエンザウイルス抗原とキトサンとの鼻内調合物を投薬するための方法を提供することを目的としている。例えば、投薬装置は、エアロゾル供給装置の形をとっていてよく、一回分の用量のみを投薬するか、または多数回の用量を投薬するように設けられていてよい。
このワクチンは、患者に対して、この患者の防御免疫応答を刺激するのに有効な量投薬される。例えば、一回以上の用量でヒトに対して投与することができ、各用量には、各ウイルス株から調整されたタンパク質が１〜２５０マイクログラム，一層好ましくは５〜５０マイクログラム含まれている。例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ調合物を、三種類のウイルス株、例えば２種のインフルエンザＡ型および１種のインフルエンザＢ型から調製した場合には、投与されるウイルスタンパク質の全用量は、１５〜１５０マイクログラムの範囲内であってよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＳＡによって免疫化されたマウス内の血清ＩｇＧ抗赤血球凝集素応答を示している。各棒は、四匹のマウスの幾何学的平均力価を示す。各誤差棒は、前記平均の一標準誤差を示す。カットオフ値は５０であり、これは検出の下限である。
図２は、精製表面抗原（ＰＳＡ）で免疫化されたマウスの鼻内ＩｇＡ抗赤血球凝集素応答を示す。図１におけるように、各棒は、四匹のマウスの幾何学的平均力価を示し、誤差棒はこの平均の一標準誤差を示す。
図３ａおよび図３ｂは、精製表面抗原で免疫化したマウスの鼻内および肺性の抗赤血球凝集素分泌細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した結果を示す。図３ａは対数目盛りを使用し、一方図３ｂは線型目盛りを使用している。
例１
インフルエンザＢ型精製表面抗原／グルタミン酸キトサン調合物の調製
１Ａ．グルタミン酸キトサンを．０．８％塩化ナトリウム中に溶解させることによって、１％グルタミン酸キトサン溶液、約１１％の残留Ｎ−アセチル基を有する培地粘度に脱アセチル化されたキチンを調製した。使用したグルタミン酸キトサンの等級は、ノルウェイ国ドランメンのプロタン  バイオポリマーＡ／Ｓから入手できる「シー  キュアー（Sea Cure）＋２１０」であった。
１Ｂ．インフルエンザＡ型とインフルエンザＢ型タンパク質との双方を含有するインフルエンザ精製表面抗原（ＰＳＡ）は、イギリス連合王国マーシーサイド、スペクのエバンスメディカルリミテッドから、「フルブィリン（Fluvirin）」という商標の下に商業的に入手可能であるが、リン酸緩衝液中で調合し、約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。このＰＳＡは、ほぼ全体がスパイクタンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）からなっているが、しかし幾らかのノイラミニダーゼを含有している。
１Ｃ．グルタミン酸キトサン溶液とＰＳＡ溶液との１：１混合物を調製し、０．５％のグルタミン酸キトサン（１１％アセチル化）、０．８％ＮａＣｌ、０．１％ＰＳＡおよびリン酸緩衝液を含有する、ｐＨ６の溶液を得、鼻内ワクチン組成物を得た。
１Ｄ．前記と同じ濃度のＰＳＡを含有しているが、しかしグルタミン酸キトサンを含有していない対照溶液、および前記と同じ濃度のグルタミン酸キトサンを含有しているが、しかしＰＳＡを含有していない対照溶液をも調製した。更に、既知のアジュバントであるアルヒドロゲル（水酸化アルミニウム）上へと吸着された前記と同じ濃度のＰＳＡを含有する組成物を調製した。このＰＳＡは、アルヒドロゲル上へと、４℃で終夜吸着させた。
例２
マウスの免疫化研究
２Ａ．例１に記載したようにして調製した四種類の組成物を、次のようにして十二匹の大人の（６〜８週間）雌のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる各グループへと投与した。
グループ１：  ２０μｌ（鼻腔ごとに１０μｌ）のＰＳＡ／キトサン溶液を、鼻内投与した。ＰＳＡの用量は１０μｇ。
グループ２：  ２０μｌのＰＳＡを鼻内投与した（ＰＳＡの全用量は１０μｇ）。
グループ３：  ２００μｌのＰＳＡ／アルヒドロゲルを皮下投与した（ＰＳＡの用量は１０μｇ）。
グループ４：  ２０μｌのキトサン溶液を鼻内投与した。
グループ５：  毎日２０μｌのＰＳＡ（鼻腔当たり１０μｌ）を三日間投与した（四匹のマウスのグループを、この研究のために採用した）。
２Ｂ．免疫化手順を、月一回の間隔を置いて三回実施し、グループ５では例外として、毎日の投薬を三日続けてマウスを免疫化した。この免疫化および試料採取計画を、表１に示す。
免疫化および試料採取計画
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各試料採取点において、各グループから四匹のマウスを、心臓穿刺による出血で臨終させ、これらの頭部を取り除き、マウスの鼻腔を１ｍｌのＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミンによって洗浄した。グループ５では、四匹のマウスしか含まれていないので、最初の二つの試料については尾の穿刺によって血液を得、三回目の試料採取点においては鼻腔の洗浄のみを実施した。
抗体アッセイ
すべてのアッセイにおいて、全インフルエンザワクチン（ＷＩＶ）を抗原として使用した。ＷＩＶは約５０％ＨＡだけであるけれども、このアッセイは種として抗ＨＡ抗体を測定するものと考えた。この仮定を、ＷＩＶをＰＳＡ（約１００％のＨＡ）で置き換え、何回かのアッセイを繰り返すことによって確認した。これらの結果は、各抗原について類似していた。ＨＡ特異的血清ＩｇＧおよび鼻内ＩｇＧ抗体を、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。バックグラウンドについて修正した後に、各光学密度（ＯＤ）希釈率の曲線をプロットし、これらの力価を測定した。０．２のＯＤの読み取り値を与える血清の希釈率か、または０．１のＯＤの読み取り値を与える鼻腔洗浄液の希釈率として、力価を測定した。
第三の試料で鼻腔洗浄液を摂取するのと共に、リンパ球を鼻腔と肺との粘膜から分離し、局所的な免疫応答をＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。
結果
１．血清抗ＨＡ血清応答
精製表面抗原（図１および表２）
予期されたように、良好な血清応答が、ＰＳＡ＋アルヒドロゲルによる皮下（Ｓ／Ｃ）免疫化によって引き出された。試験したすべての動物は、初回の免疫化の後に血清変換し、幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が良好であった。この応答は、各追加免疫後に向上し、三回目の投薬後のＧＭＴは、非常に高くなった（約８００，０００）。対照的に、鼻内投与されたＰＳＡのみに対する血清応答は乏しく、四匹のマウスのうち二匹のみが、最初の投薬後に血清変換し、試験したマウスのうちのいずれも、二回目の投薬の後に血清ＨＡ抗体を有しておらず（これらは、最初の免疫化の後に試験したマウスとは別のマウスである）、試験したすべての動物は三回目の投薬の後に血清変換したけれども、そのＧＭＴは、ＰＳＡ＋アルヒドロゲルを一用量摂取した動物のＧＭＴよりも低かった。キトサンは、鼻内投与されたＰＳＡの血清応答を促進し、三回目のワクチン投与の後には、ＰＳＡ＋キトサンを摂取したマウス中の抗体応答は、ＰＳＡのみ（Ｉ／Ｎ）を摂取したマウスの抗体応答よりも３６０倍高かった。このＰＳＡとキトサンとを摂取したマウスにおける血清応答の強度は、Ｓ／Ｃで免疫化したマウスの血清応答に非常に似ており、実際、あらゆる試料採取点（学生ｔ−試験でｐ＞０．０１）において、これらの二つのグループのＧＭＴの間には、統計的な差がなかった。
何匹かのマウスを、三回、連日、ＰＳＡのみを鼻内投与することによって免疫化し、この投薬計画が月に一回投与する投薬計画に比べて有利であったかどうかを研究した。このグループ内のすべてのマウスは、最初の投薬の二一日後に検出可能な血清抗体を有していたが、この時点におけるＧＭＴは、一回分の用量のＰＳＡを鼻内摂取したマウスにおけるよりも大きく、血清陽性のマウスの数は、この研究コースの間に減少した。ＧＭＴは減少しなかったけれども（このグループにおいて、前記と同じマウスを各時点で試料採取した）。この最後の時点では、毎月投与する投薬計画のマウスのＧＭＴは、毎日投与する投薬計画のマウスよりも大きなオーダーの強度を有している。
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２．鼻内洗浄液のＩｇＡ抗ＨＡ応答
精製表面抗原（図２および表３）
皮下投与されたＰＳＡ＋アルヒドロゲルは、鼻内ＩｇＡ応答を引き起こすという点では非常に貧弱であり、これは我々の以前の発見および他人の発見と整合している。単独で鼻内投与されたＰＳＡも、これは応答があった動物の数の点では皮下免疫よりも少し良好であったけれども、貧弱な粘膜免疫原であった。キトサンを添加するとＩｇＡ応答が大きく増進し、この応答は最初の投薬後には低いけれども、四匹のマウスのうち三匹においてＨＡ特異的なＩｇＡを検出することができた。このＩｇＡ応答は、これらのマウスにおいて、２回目の免疫化によって大きく増進した。最後の免疫化の効果は少なかった。実際、平均の特異的ＩｇＡの水準は、少し減少した。
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キトサン単独に対する応答
キトサンのみによって免疫化した対照例のマウスから得た血清および鼻腔洗浄液は、すべてのアッセイにおいて陰性であった。
鼻および肺組織における局所的な抗ＨＡ抗体分泌細胞の応答（ＡＳＣ）
三回目の試料採取点において、四匹のマウスのグループの鼻粘膜と肺の実質組織とからリンパ球を分離した。各マウスから得たリンパ球をプールし、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗インフルエンザ抗体を分泌する細胞をアッセイした。これらの結果を、表３ａおよび３ｂに示す。
ＨＡ特異性抗体を分泌するＢ細胞が、すべてのグループの鼻および肺組織中で検出可能であった。ＰＳＡとキトサンとのグループにおいては、このような細胞の数がはるかに大きく、これらの結果を線型目盛り上にプロットした場合に（図３ｂ）、これは最も明白となる。皮下免疫化されたマウスを除くすべての場合において、ＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）が鼻腔内で優勢を占めており、これに反してＩｇＧまたはＩｇＭの一方が肺の中で優勢を占めていた。この応答の強度は、ＰＳＡとキトサンとを投与したマウスの肺と鼻とにおけると同様である。
前記した例は、本発明を単に例示するものであって、いかなる点でも本発明の範囲の制限を意図するものではなく、これは明細書に添付した請求の範囲のみによって規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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