(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端側が細胞内に、Ｃ末端側が細胞外に位置する膜貫通ドメインのＣ末端側に抗原蛋白質が融合した融合蛋白質を発現する発現ベクターを非ヒト動物に接種し、この非ヒト動物から抗原蛋白質に対する抗体を単離・精製することを特徴とする抗体作製法。
【請求項２】
膜貫通ドメインが、配列番号２の少なくとも位置1−26のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１の抗体作製法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、遺伝子免疫による抗体作製法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、医薬・診断薬・研究用試薬等として有用な抗体を容易に作製することができる方法と、この方法に使用する発現ベクターに関するものである。
背景技術
抗体は、特定の蛋白質を認識して結合する性質を有するため、蛋白質の検出、精製、除去、活性阻害等の目的で、研究試薬として広く利用されている。最近では、研究用試薬としてのみならず、医薬・診断薬としての用途も広がっている。
従来、抗体を作製するには、抗原となる蛋白質を大量に精製した後、ウサギやマウスなどの動物に注射し、血清中に産生される抗体を得るという方法が取られてきた。しかし、精製抗原蛋白質を大量に得るには、多くの時間と労力を要した。そこで、より簡便な抗体作製法が望まれている。
最近、インフルエンザウイルス核蛋白質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これをＤＮＡのままマウスの筋肉に注射すると、マウス体内でウイルス蛋白質が生産され、しかも血清中にこの蛋白質に対する抗体が産生されることが報告された（Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，１９９３；Ｇｉｎｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９３”）。その結果、マウスがウイルスに対する免疫能を獲得することから、この発現ベクターは新型のワクチン、すなわちＤＮＡワクチンとして注目を集めている。このように、抗原蛋白質の発現ベクターを直接動物に接種して、免疫能を付与することを遺伝子免疫と呼んでいる。ただし、遺伝子免疫を用いた場合、抗原の種類によっては、産生される抗体の力価が非常に小さかったり、抗体が得られない場合もある。
遺伝子免疫の効率に及ぼす抗原蛋白質の発現部位の影響を調べるために、オボアルブミンをトランスフェリンレセプターの膜貫通ドメインの下流に融合して膜型にしたものを、マウスの筋肉あるいは皮下に注射して遺伝子免疫を行った例が報告されているが、膜型にすることによって、抗体の力価はむしろ減少している（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．９：１８９７−１９０６，１９９７）。
この出願の発明は、従来の遺伝子免疫法では作製困難な蛋白質に対する抗体を作製する方法を提供することを課題としている。
また、この出願の発明は、前記の抗体作製法に使用する発現ベクターを提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、Ｎ末端側が細胞内に、Ｃ末端側が細胞外に位置する膜貫通ドメインのＣ末端側に抗原蛋白質が融合した融合蛋白質を発現する発現ベクターを動物に接種し、この動物から抗原蛋白質に対する抗体を単離・精製することを特徴とする抗体作製法を提供する。
＿この抗体作製法においては、膜貫通ドメインが、配列番号２の少なくとも位置１−２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを好ましい態様としている。
また、この出願は、Ｎ末端側が細胞内に、Ｃ末端側が細胞外に位置する膜貫通ドメインのＣ末端側に抗原蛋白質が融合した融合蛋白質を発現する発現ベクターを提供する。
この発現ベクターにおいては、膜貫通ドメインが、配列番号２の少なくとも位置１−２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを好ましい態様としている。
発明を実施するための最良の形態
この発明の抗体作製法において、動物に接種する発現ベクターは、抗原蛋白質をコードするポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドを保有する発現ベクターとして構築する。
抗原蛋白質は、生体内で抗原抗体反応を生じさせる蛋白質であればどのようなものであってもよい。抗原蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しているものであれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどいかなるポリヌクレオチドでもよい。抗原蛋白質が本来分泌蛋白質である場合には、これらの蛋白質由来のシグナル配列ペプチドを除去したものを用いる。
膜貫通ドメインとしては、Ｎ末端側が細胞内にあり、Ｃ末端側が細胞外にくるものであれば、いかなるものでもよい。例えば、ＩＩ型膜蛋白質の膜貫通ドメインや、マルチスパン型膜蛋白質の膜貫通ドメインを用いることができる。これらの膜貫通ドメインのＣ末端側に抗原蛋白質を融合させた蛋白質は、抗原蛋白質部分が細胞膜表面に存在する形になる。膜貫通ドメインとして、例えば、ヒトＩＩ型膜蛋白質ＨＰ１００８５（配列番号２）の膜貫通ドメインを用いることができる。この場合、抗原蛋白質と融合させる膜貫通ドメインは、配列番号２の少なくとも位置１のメチオニン（Ｍｅｔ）から位置２６のリジン（Ｌｙｓ）までのポリペプチドであり、これをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１（ヒトＩＩ型膜蛋白質ＨＰ１００８５  ｃＤＮＡ）の少なくとも位置１５１−２２８の塩基配列を有している。このポリヌクレオチドと、前記の抗原蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを連結し、膜貫通ドメイン（ポリペプチド）のＣ末端側に抗原蛋白質が融合した融合蛋白質を発現する融合ポリヌクレオチドを用いて発現ベクターを構築することができる。
融合蛋白質発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよく、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクターなどが例示できる。これらのベクターに、前記２種類のポリヌクレオチドをクローン化し、それぞれがコードする蛋白質を融合蛋白質として発現する発現ベクターを作製する。
発現ベクターを接種する動物としては、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳類動物、ニワトリなどの鳥類など、一般に抗体作製に使用される動物が用いられる。動物への発現ベクターの接種は、遺伝子銃などを用いて行うのが好ましい。遺伝子銃を用いる場合は、発現ベクターを金粒子などに吸着させたものを、ガス圧などにより皮膚に噴射することによって接種する。発現ベクターの接種量は動物によって異なるが、一匹当たり０．１μｇ−１ｍｇの範囲内が好ましい。接種は一回でもよいが、抗体生産を確実にするために一定間隔を置いて２回以上行なうことが望ましい。
抗体産生の有無は、血液を採取後、血清を分離し、抗原蛋白質との結合反応を調べることによって行なう。例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、抗体染色など公知の方法を用いることができる。これらの方法で血清中に抗体が存在することを確認したのち、血清をそのままポリクローナル抗体試料として用いることもできるし、アフィニティカラムクロマトグラフィーなどによりＩｇＧを精製して用いることもできる。また免疫能を獲得した動物から脾臓を摘出し、常法によりモノクローナル抗体を作製することもできる。
実施例
次に実施例を示して、この出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
（１）ウロキナーゼ融合蛋白質発現ベクターの構築
抗原蛋白質としてウロキナーゼを用いる場合、分泌発現用、膜型発現用、細胞内発現用の３種類の発現ベクターを用いた。すなわち、分泌発現用としては、ウロキナーゼのシグナル配列とウロキナーゼのプロテアーゼドメインを発現するｐＳＳＤ１−ＵＰＡ２２（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６３：１９３−１９６，１９９５）、膜型発現用として、ＩＩ型膜蛋白質ＨＰ１００８５（配列番号２）のＮ末端から第３５番目のプロリン（Ｐｒｏ）までとウロキナーゼのプロテアーゼドメインを融合させた蛋白質を発現できるｐＳＳＤ３−１００８５Ｈ（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２８：１６１−１６７，１９９９）、細胞内発現用として、ウロキナーゼのシグナル配列を除去し、ウロキナーゼのプロテアーゼドメインのみを発現するｐＳＳＤ１−ＵＰＡ２（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６３：１９３−１９６，１９９５）をそれぞれ用いた。それぞれの融合遺伝子部分の構造を図１に示した。いずれも融合蛋白質をコードする部分以外は同じ構造を有している。すなわち、ＳＶ４０の初期プロモーター、ＳＶ４０の１６Ｓ  ｍＲＮＡスプライシング領域、およびＳＶ４０のポリ（Ａ）付加部位を有している。
（２）核蛋白質融合蛋白質発現ベクターの構築
抗原蛋白質として、核内のスプライセオソームに局在する蛋白質ＨＰ１０４９６を用いた。この蛋白質をコードしているｃＤＮＡクローンｐＨＰ１０４９６は、ヒト胃癌ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／２１３２８）からクローン化されたもので、配列番号３の塩基配列ならびにＯＲＦを有しており、ＯＲＦは配列番号４のアミノ酸配列からなる蛋白質ＨＰ１０４９６をコードしている。ＥｃｏＲＶ認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる３０ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号５のオリゴヌクレオチド）と、ＥｃｏＲＶ認識部位を付加した停止コドンまでを含む３０ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号６のオリゴヌクレオチド）を用い、ｐＨＰ１０４９６を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶで消化し、膜型ウロキナーゼ発現ベクターｐＳＳＤ３−１００８５ＨのＥｃｏＲＶ−Ｎｏｔｌ（平滑末端化）部位に挿入し、融合遺伝子発現ベクターｐＨＰ１００８５Ｎ−１０４９６を構築した。
抗体検出用の抗原蛋白質を得るため、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を大腸菌で発現させるための発現ベクターを構築した。ＥｃｏＲＩ認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる２８ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号７のオリゴヌクレオチド）と、ＳａｌＩ認識部位を付加した停止コドンまでを含む３２ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号８のオリゴヌクレオチド）を用い、ｐＨＰ１０４９６を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＢＬ２１の形質転換を行った。ＬＢ培地中で３７℃で５時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるように加え、さらに３７℃で２．５時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．２％ＳＤＳ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に溶かし、一度−８０℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。１０００ｘｇで３０分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭグルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。その結果、分子量約４７ｋＤａのＧＳＴ−ＨＰ１０４９６融合蛋白質を得た。
（３）遺伝子免疫
遺伝子免疫は、遺伝子銃（Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社）を用いて行った。プロトコールに従って発現ベクタープラスミドＤＮＡを金粒子に付着させた。プラスミドＤＮＡ２μｇに相当するＤＮＡ被覆金粒子を遺伝子銃を用いて、一検体当たり３匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の鼠径部の皮膚に射入した。週２回、４週間免疫を行った後、血液を採取した。
（４）ＥＬＩＳＡによる抗体の検出
抗原蛋白質として、市販のウロキナーゼ（和科盛純薬）と大腸菌で発現させたＧＳＴ−ＨＰ１０４９６をコートしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡを行った。ウロキナーゼ、核蛋白質ＨＰ１０４９６を抗原として遺伝子免疫した血清を用いて抗体の力価を測定した結果を、それぞれ図２と図３に示す。いずれの場合にも、ＨＰ１００８５のＮ末端を融合させた蛋白質発現ベクターで免疫した場合のみ抗体の産生が認められた。
（５）種々のＩＩ型膜蛋白質の膜貫通ドメインとウロキナーゼの融合蛋白質を用いた遺伝子免疫
ヒト完全長ｃＤＮＡバンクの中から、次の５種類のＩＩ型膜蛋白質ｃＤＮＡ、ＨＰ０１３４７（配列番号９）、ＨＰ１０３２８（配列番号１０）、ＨＰ１０３９０（配列番号１１）、ＨＰ１０４３３（配列番号１２）、ＨＰ１０４８１（配列番号１３）を同定し、それぞれの膜貫通ドメインとウロキナーゼの融合蛋白質を発現するベクターを構築した（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２２８：１６１−１６７，１９９９）。それぞれのＮ末端のアミノ酸配列を図４に示す。
これらの発現ベクターを用いて、（３）に記載の方法で遺伝子免疫を行い、（４）に記載の方法でウロキナーゼに対する抗体の検出を行ったところ、いずれの場合にも、ＨＰ１００８５の場合と同様の抗体産生が認められた。
産業上の利用可能性
この発明により、従来の遺伝子免疫法では困難であった抗原蛋白質に対する抗体を作製することができる。得られた抗体は、医薬・診断薬・研究用試薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ウロキナーゼ融合遺伝子の構造を示した図である。
図２は、ウロキナーゼ発現ベクターで遺伝子免疫を行った場合のＥＬＩＳＡによる抗体力価測定例を示す図である。
図３は、核蛋白質ＨＰ１０４９６発現ベクターで遺伝子免疫を行った場合のＥＬＩＳＡによる抗体力価測定例を示す図である。
図４は、各種膜蛋白質の膜貫通ドメインとウロキナーゼとの融合蛋白質のそれぞれのＮ末端のアミノ酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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