(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌糸体エキスとして、バガス（ｂａｇａｓｓｅ）を基材とする固体培地上に、椎茸菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を解束し、この解束された固体培地に、水およびセルラーゼまたはプロテアーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下に粉砕および擂潰して椎茸菌糸体エキスを抽出し、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌してなる椎茸菌糸体エキスを含むことを特徴とする骨軟化症予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、骨軟化症予防剤に関し、さらに詳しくは椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスを含有する骨軟化症予防剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヒトや動物の骨（骨組織）では、「類骨」なる未完成の骨様組織ができ、そこへカルシウムが沈着して、固い骨が完成するという新陳代謝が行われている。カルシウムの沈着が不十分だと類骨部分の多い骨となり、軟らかくて変形しやすい。
【０００３】
カルシウム沈着は、カルシウムが血液中のリンと結合することにより燐酸カルシウム（石灰化）の形で生じ、この代謝を促進しているのがビタミンＤである。よって、ビタミンＤ不足があると骨軟化症が発症する。
すなわち骨軟化症とは、成人で、石灰化異常により正常なカルシウム沈着ができずに骨が軟らかくなっている状態をいい、子供ではこれをくる病といい、症状としては、臀部に広がる骨痛、筋肉の脱力、カルシウム不足の症状、口のまわりのしびれ、手足のしびれ、手あるいは足の痙攣等が挙げられる。（なお、骨軟化症の類似疾患に、骨粗鬆症などがあるが、骨粗鬆症では、骨軟化症と異なり、石灰化障害はない。）
このような骨軟化症の原因は多数あり、例えば、食事からのビタミンＤの摂取不足、肝、腎障害、胃切除による慢性下痢などのため胃や腸でのビタミンＤの吸収障害、日光浴（紫外線照射）の不足により、体内にビタミンＤを合成する機能が低下していることなどがある。その他の要因として、ビタミンＤ代謝の先天的あるいは後天的な障害、腎不全やアシドーシス、食事量が不十分なために起こるリン酸塩不足や腎臓病によるリン再吸収能力の低下、てんかん発作の治療薬による副作用などがある。
【０００４】
このように、骨軟化症は様々な原因で起こり得るが、多くは、前述したようなビタミンＤの摂取不足の場合に発症するとされている。
従って、例えば、大人が、戸外に出ず、室内で長期間生活し、しかも乳糖不耐症のために牛乳の摂取を避けている場合、非常に強力な日焼け止め剤を使用して日光に当たる時間が不足している場合、労働衛生環境が悪く日照時間が短い場合やひどいスモッグ発生地域に住んでいるなど住環境等が悪く日照時間が短い場合などには、体内でのビタミンＤの生合成が妨げられ、骨軟化症が発症する可能性が高くなる。このような骨軟化症は、成人１０００人当たり一人の割合で見られる。
【０００５】
そして、既に発症した骨軟化症患者には、その潜在的な原因に対応して活性型ビタミンＤ、カルシウム、リンの経口補助薬を投与し、また腸にビタミンＤの吸収障害のある骨軟化症患者には、紫外線照射と平行して、ビタミンＤを普通より多く投与する等の処置が施されている。
このような種々の原因で発症する骨軟化症のうちで、例えば、ビタミンＤの欠乏が原因で発症するタイプの骨軟化症は、基本的には、ビタミンＤを強化した乳製品を摂り、日光に十分当たることにより予防できる。
【０００６】
しかしながら、例えば、乳糖不耐症の場合、乳製品の摂取は安価で高栄養価を有していても困難である。また今日の高層化および高密度化した都市型住環境下では、日常的に十分な日光浴を行うこともままならず、特に高齢者では、日光の届かない室内で過ごす時間が増加するなど、骨軟化症が発症する誘因は多い。
ここで、もし、日常的に摂取する乳製品等のカルシウム含有量などが少量であっても、食品に含まれるカルシウムを効率よく体内、特に骨組織に取り込むことができれば、骨軟化症の予防に有益であり、骨軟化症を軽減、治療する選択肢が増えるため好ましい。
【０００７】
とくに、昔から食用されていた食品から抽出された物質がそのような生理作用を示すなら、かかる活性物質を主成分とする薬剤では、長期間の服用でも副作用がないか、あっても少なく使いやすいことが期待される。さらにそれを配合した保健薬または健康食品であれば、一般の人々がビタミン剤または栄養滋養剤と変わらない形態で摂取することも可能であり、高齢化社会の疾病のひとつである骨軟化症の予防に大いに貢献するものとして期待される。
【０００８】
ところで古来より、椎茸、松茸、エノキ茸などの担子菌類の茸は食用されており、中には、担子菌類サルノコシカケ科に属する茸のように漢方薬として重用されているものもある。さらに椎茸菌糸体あるいはその抽出物等には、制癌作用、便秘予防、肥満や糖尿病の予防、食品中の毒性物質の排除促進、自己防御能の向上など、健康維持、増進に有益な種々の作用があると報告されている。
【０００９】
例えば、（１）特公昭６０-２３８２６号公報において、本願出願人らは、接種菌として椎茸菌を用いた以外は上記特願昭６２−３４１２３号記載の方法と同様の方法にて保健飲料を製造する方法を提案している。この公報では、得られる保健飲料には、血圧降下作用、利尿作用、疲労回復作用などがあると記載されている。
【００１０】
（２）特開昭５７−１７０１７３号公報には、砂糖きびあるいは砂糖大根等の原糖及び植物繊維を多量に含有する素材を用いて培養基とし、これに椎茸等の食用茸の種菌を接種して、菌糸体を培養させた後、子実体発生寸前または直後の培養基を粉砕、加水、加温して前記菌糸体に自己消化を生じさせて該菌糸体に含有されている有効成分を培養基に溶脱させ、しかる後乾燥させて微細に粉砕した、食用菌糸体の有効成分及び食物繊維を含有した粉末食品の製造方法が開示されている。該公報には、この方法で得られる粉末食品は、大腸癌、動脈硬化症、糖尿病等に有効であると記載されている。
【００１１】
また、本願出願人等は、（３）特許第２５１９７８５号（特開平２−１０７１７１号公報）にて、トウモロコシ随、フスマ及び米糠からなる植物繊維と水とを含む固体培地に、エノキタケ菌糸を接種して培養し、培養終了後この培地を破砕し、乾燥することによる、食物繊維含有食品の製造方法を提案しており、該公報には、この方法により得られる食品を摂取すると、便秘予防、肥満、糖尿病、動脈硬化の予防、食品中の毒性物質の排除促進、自己防御能の向上などが期待できる旨記載されている。
【００１２】
また、（４）特開平２−１３４３２５号公報には、担子菌の１種である椎茸菌の菌糸体培養物から抽出された成分からなるエイズ治療剤が記載されている。
また、（５）「キノコの化学・生化学」（水野、河合編、学会出版センター刊）には、キノコの食物繊維には、薬理作用、結腸癌、直腸癌の予防効果が期待でき、エノキタケ抽出物ではその発癌予防効果が動物実験でも証明されていると記載されている。
【００１３】
（６）「きのこ抗腫瘍研究２０年」（池川等、社団法人  長野県農村工業研究所発行、平成元年３月１日刊）には、エノキタケ菌糸体から分離されたプロフラミンは、制癌剤として機能し、経口投与しても毒性がなく、その他の副作用も認められないと記載されている。
さらに、本発明者らは、前記（１）特公昭６０-２３８２６号公報に記載の方法と同様の方法にて得られる椎茸菌糸体エキスが、ＨＩＶ型ウイルス活性阻害効果を有することを見出し、（７）特開平７−１７３０７０号公報（特許第３０１７６３０号）において、該方法で得られるＨＩＶ型ウイルス活性阻害剤を提案している。
【００１４】
しかしながら、担子菌類の椎茸（菌糸体培養物）などから抽出される椎茸菌糸体エキスなどの担子菌類菌糸体エキスには、上記のような効果に加えて、他にどのような効果があるかという点については、未だ、知られていないことが多い。
そこで、本発明者は、椎茸菌糸体エキス等の、従来より食用され漢方に利用されている担子菌類の菌糸体エキスの薬理作用について鋭意研究を重ねたところ、椎茸菌糸体エキスなどの担子菌類菌糸体エキスには、驚くべきことに、著しい骨軟化症予防効果が認められること、上記椎茸菌糸体抽出物は医薬品として利用することができ、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品として利用することにより、上記効果を期待できることなどを新たに見出して、本発明を完成するに至った。
【００１５】
【発明の目的】
本発明は、上記のような従来技術に伴う問題点を解決しようとするものであって、骨軟化症を予防でき、しかも副作用の恐れがなく安全性に優れた骨軟化症予防剤を提供することを目的としている。
【００１６】
【発明の概要】
本発明に係る骨軟化症予防剤は、担子菌類の菌糸体培養物から抽出された担子菌類菌糸体エキスを含むことを特徴としている。上記担子菌類としては、椎茸菌、山伏茸菌、エノキタケ菌、エリンギ菌、霊芝菌等が挙げられる。
本発明においては、上記担子菌類の菌糸体エキスとしては、
バガス（bagasse）を基材とする固体培地上に、椎茸菌などの担子菌類を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を解束し、
この解束された固体培地に、水およびセルラーゼまたはプロテアーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下に粉砕および擂潰して椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスを抽出し、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌してなるものであることが望ましい。
【００１７】
このような骨軟化症予防剤を、例えば、経口摂取すれば、低カルシウム食を摂取していても骨密度を著しく向上させて骨軟化症を予防でき、しかもこの骨軟化症予防剤には、副作用の恐れが全くなく安全性に優れている。
【００１８】
【発明の具体的説明】
以下、本発明に係る骨軟化症予防剤について具体的に説明する。
［骨軟化症予防剤の製造］
本発明に係る骨軟化症予防剤には、担子菌類の菌糸体エキスが含まれている。
担子菌類（Basidiomycota）としては、古来より我が国で食用菌類として食用され、あるいは漢方で使用されている、松茸目あるいはハラタケ目(Agaricales）の茸、サルノコシカケ目あるいはヒダナシタケ目（Aphyllophorales）の茸、キクラゲ目(Auriculariales）またはシロキクラゲ目(Tremellales)の茸、アンズタケ目（cantharellales）の茸等が挙げられる。
【００１９】
より具体的には、松茸目あるいはハラタケ目(Agaricales）の茸としては、
松茸(Tricholoma Matsutake Ito et Imai.)、
椎茸(Lentinula edodes (Berk.) Sing.)、
エノキ茸(Flammulina Velutipes (Fr.)Sing.)、
平茸（Pleurotus ostreatus (Jacq.Ex Fr)Kummer）、
なめこ（Pholiota nameko(I.Ito)S.Ito et IMAI）、
イグチ属(Boletus Dill.ex Fr.)、
シメジ（Lyophyllum shimeji (Kawam.)Hongo）、
チチタケ(Lactarius volemus(Fr.)Fr.）、
エリンギ（pleurotus eryngii）等が挙げられる。
【００２０】
また、サルノコシカケ目あるいはヒダナシタケ目（Aphyllophorales）の茸としては、
コフキサルノコシカケ(Elfvingia applanatus(Pers.)Karst.)、
ツガサルノコシカケ(Fomitopsis pinicola (Fr.)Karst.)、
カワラ茸（Coriolus versicolor(Fr.)Quel.）、
マンネン茸すなわち霊芝(Ganoderma lucidum(W.Curt.ex Fr.)Karst.)、
舞茸(Grifola frondosa(Fr.)S.F.Gray)、
メシマコブ(P.yucatensis(Murr.)Imaz.,)等が挙げられる。
【００２１】
キクラゲ目(Auriculariales）またはシロキクラゲ目(Tremellales)の茸としては、
キクラゲ(Auricularia auricula(Hook.)Underw.)、
シロキクラゲ(Tremellinea fuciformis Berk.)等が挙げられる。
アンズタケ目（cantharellales）の茸としては、
ハリタケ科（Hydnaceae）の山伏茸すなわちハリタケ（hydnum）等が挙げられる。
【００２２】
本発明では、これら担子菌類のうちでも、椎茸(Lentinula edodes (Berk.) Sing.)、山伏茸、エノキ茸(Flammulina Velutipes (Fr.)Sing.）、霊芝菌が好ましく用いられる。
本発明では、これらの担子菌類を、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。なお、これらの担子菌類の多くは、「キノコの事典」（中村克哉編、朝倉書店、１９８９年）、「キノコ類の培養法」（岩出亥之助著、地球社、昭和６０年再訂５版）あるいは「原色日本菌類図鑑」（今関等共著、保育社、昭和５８年、２７刷）などに詳説されている。
【００２３】
椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスの製法には特に制限はなく、前記従来技術の項に挙げたような方法で得られる担子菌類菌糸体エキスでもよく、例えば、椎茸菌糸体エキスでは、特開平２−１３４３２５号公報に記載されているように、椎茸菌糸体培養物を必要により自己消化させた後、熱水抽出し、その熱水抽出物をアルコールに沈殿させて得られるものでもよく、また、必要により、この沈殿物をさらにクロマトカラムにて分画し、エチレングリコール等にて溶出画分を分取して用いてもよい。
【００２４】
また、本願出願人が先に提案した、特開平９−２３４０８６号公報に記載の「菌糸体含有培地からの有用成分の抽出方法」で得られた抽出物を用いてもよい。すなわち、本発明では、「バガスを基材とする固体培地上に担子菌類を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を圧搾し、搾汁液(i)を得ると共に、搾汁液(i)が分離された菌糸体を含む固体残渣成分に、水および酵素を添加して３０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃に保ちながら攪拌して菌糸体細胞壁を溶解させ、次いで、９５℃までの温度に加熱し上記酵素を失活させるとともに滅菌して細胞壁溶解生成物含有液(ii)を得ることを特徴とする菌糸体含有培地からの有用成分の抽出方法。」にて得られた搾汁液(i)、細胞壁溶解生成物含有液(ii)の何れか一方または両者を用いることもできる。なお、上記酵素としては、セルラーゼ、プロテアーゼ、β-１，３−グルカナーゼ、キチナーゼの内の何れか１種または２種以上が好ましく、さらには、該酵素が、β-１，３−グルカナーゼを主成分とし、さらにキチナーゼ、セルラーゼを含有していることが好ましい。
【００２５】
また、本発明では、該公報に記載の「バガスを基材とする固体培地上に担子菌類を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を圧搾して、搾汁液(i)を得ると共に、搾汁液(i)が分離された菌糸体を含む固体残渣成分を解束し、この解束された固体残渣成分に、水および酵素を添加して３０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃に保ちながら前記固体成分を粉砕および擂潰して菌糸体細胞壁を溶解させ、次いで、９５℃までの温度に加熱して上記酵素を失活させるとともに滅菌して細胞壁溶解生成物含有液(ii)を得ることを特徴とする菌糸体含有培地からの有用成分の抽出方法。」にて得られた搾汁液(i)、細胞壁溶解生成物含有液(ii)の何れか一方または両者を用いることもできる。この場合も上記と同様の酵素を用いることが好ましい。
【００２６】
本発明では、骨軟化症予防効果の点で特に好ましくは、該椎茸菌糸体エキスでは、特公昭６０-２３８２６号公報に記載された方法を利用して調製したものが望ましい。また、椎茸菌糸体エキス以外の上記したような他の担子菌類菌糸体エキスの場合も、椎茸菌糸体エキスと同様の方法にて調製したものが好ましい。
以下、椎茸菌糸体エキスの調製法の例を挙げて、以下に詳説する。
【００２７】
椎茸菌糸体エキスを調製するには、具体的には、まずバガスからなる固体培地に水、好ましくは純水を適度に混ぜた後、椎茸菌を接種する。なお、このバガス培地に、米糠の他、必要によりリン、鉄、ゲルマニウム等のミネラル類、落花生表皮、玄米などを添加してもよい。
次いで、このように椎茸菌が接種された培地を、温度および湿度が調節されさらには照度も調節された培養室内に入れて、菌糸体を増殖させる。
【００２８】
菌糸体が固体培地に蔓延し、子実体の発生直前・直後の時期に、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるようにすることが望ましい。なお、バガス基材培地の解束は、上記のように子実体の発生直前・直後の時期に行うことが好ましいが、子実体がかなり成長した後の時期に行ってもよい。
【００２９】
このように解束された固体培地に、水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、固体培地を３０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃に保ちながら添加する。添加される酵素としては、セルラーゼが好ましい。
酵素の添加量は、固体培地１ｋｇに対して０．５〜５ｇ好ましくは１〜３ｇであることが好ましい。また水は、金属イオン等のイオン類を含まない純水が好ましく、この解束された培地１ｋｇに対して、水（例：純水）１〜１０ｋｇ好ましくは２〜６ｋｇを加えてバガス含有混合物とする。
【００３０】
次いでこのバガス含有混合物から椎茸菌糸体エキスを抽出するが、このように椎茸菌糸体エキスを抽出するには、培地含有混合物を、例えば変速機付ギヤーポンプ等を用いて循環させながら、固体培地に粉砕および擂潰作用を加えてバガス繊維の約７０重量％以上が１２メッシュ通過分となるようにすることが望ましい。
【００３１】
バガス含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を３０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃に保ちながら行ってもよく、温度を上記温度より徐々に上昇させながら行ってもよいが、温度を上昇させながら行うことが好ましい。水温が６０℃以上好ましくは７０℃以上となったときに、バガス含有混合物中に室温の空気を噴入をさせると、空気泡は急激に加熱されて破壊し、バガス繊維に衝撃を与え有効成分の抽出をより効率的に行うことができる。
【００３２】
次いで、このようにして処理されたバガス含有混合物をさらに加熱して９５℃までの温度、好ましくは７５〜９０℃程度の温度に加熱し、この温度で数十分間保持して該混合物中の酵素を失活させるとともに、該混合物を殺菌すると、椎茸菌糸体エキスが得られる。
なお、得られた椎茸菌糸体エキスを必要に応じて、５０〜１２０メッシュ好ましくは６０〜１００メッシュ程度の濾布を用いて濾過してもよい。
【００３３】
このようにして得られる椎茸菌糸体エキスは、濃縮して用いることもでき、また凍結乾燥して粉末状として用いることもできる。
以上、椎茸菌糸体エキスの好ましい調製法の例を詳説したが、本発明で用いられる前記したその他の担子菌類菌糸体エキスも、上記椎茸菌に代えて、霊芝、エノキ茸、メシマコブ、山伏茸、マイタケ、エリンギなどの担子菌類を用いる点以外は、上記と同様にして、調製することができる。
【００３４】
本発明の骨軟化症予防剤には、上記椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスは、どのような量で含まれていてもよい。
このような骨軟化症予防剤は、顆粒状、液状、錠剤、カプセル状など各種剤形にて経口投与してもよく、また骨軟化症患者に使用する注射液としての開発も可能である。また、上記の菌糸体エキス原液が含まれた骨軟化症予防剤は、骨密度を向上させて骨軟化症を予防、改善する効果があり、希釈せずにそのまま骨密度異常者に投与することもできるが、例えば精製水、アルコール等で適宜希釈して投与することもできる。
【００３５】
このような骨軟化症予防剤は、該骨軟化症予防剤中の担子菌類菌糸体エキス固形分換算量として、体重１ｋｇ当たり、１日につき、通常１〜１００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの量で摂取することが望ましい。
上記のように、本発明に係る骨軟化症予防剤を骨密度異常者特に骨軟化症患者に投与すると、それらの症状を改善することが期待される。
【００３６】
このように本発明に係る骨軟化症予防剤は骨密度を向上させ骨軟化症を予防することができるとともに、骨軟化症を改善することも期待されるのは、次のような理由によるのであろうと思われる。
すなわち、この椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスからなる骨軟化症予防剤には、本発明者らの研究によれば、椎茸菌糸体等の担子菌類菌糸体から抽出される有効成分と、椎茸菌糸体などの担子菌類菌糸体が培養された固体培地とから抽出される有効成分とが多数混在し、これらの成分（未同定である）がカルシウムの吸収、骨組織への沈着なども含めて総合的に作用する結果、骨密度が向上し、骨軟化症も予防され、さらに好ましくは罹患してる骨軟化症の改善も期待できるのであろうと考えられる。
【００３７】
さらに付言すれば、骨軟化症ではビタミンＤの作用の下、カルシウムとリンが燐酸カルシウムの形で類骨に沈着する過程が円滑に進行していない。これには、カルシウム及び燐酸の摂取と腸管吸収並びに代謝の変調も直接的に影響する。従って、ビタミン、ホルモンなどの関与する調節因子も含めて、骨代謝に対する本発明に係る骨軟化症予防剤の生理的作用を調べることにより、効果の確認は一層明確となると思われる。一つの可能性として、椎茸菌糸体抽出物は、肝臓機能を賦活する効果を有することがこれまで確認されており、また活性ビタミンＤが、肝臓で合成されることから、本発明の骨軟化症予防剤を摂取することにより、ビタミンＤ不足が解消されるとともに、カルシウム、リンの腸管吸収及びその代謝並びに骨組織への沈着も促進され、その結果、骨軟化症も予防されまたは改善されるのであろうと考えられる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、低骨密度を改善し向上させて骨軟化症を予防することができ、しかも、副作用の虞がなく安全性に優れた保健食品あるいは医薬である骨軟化症予防剤が提供される。
本発明で用いられる椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスは、安全性が高く、長期間服用することができ、低ミネラル食摂取者であっても効率よくミネラル分、特にカルシウム分を効率よく吸収して骨密度を向上させることができ、骨軟化症の発症を予防、抑制することができると考えられ、本発明に係る骨軟化症予防剤の開発の意義は大きい。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限されるものではない。
【００４０】
【調製例１】
［椎茸菌糸体エキスからなる骨軟化症予防剤の調製］
バガス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、椎茸種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に置き、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下になるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、純水３．５リットルおよび精製セルラーゼ２．０ｇを固体培地を４０℃に保ちながら加えてバガス含有混合物とした。
【００４１】
次いで培地含有混合物を変速機付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地に該ポンプのギヤー部分において粉砕および擂潰作用を２００分間程度加え、バガス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。バガス含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。
その後、バガス含有混合物をさらに加熱して、９０℃として３０分間放置した。
【００４２】
９０℃への加熱により酵素を失活させ、かつ殺菌を施した。
得られた培地含有混合物を６０メッシュ濾布を用いて濾過し、微小浮遊物を含有する椎茸菌糸体エキスを得た。
この椎茸菌糸体エキスをフリーズドライ法にて粉末化した。
この椎茸菌糸体エキス中のミネラル成分組成は、以下のとおり。
【００４３】
Ｃａ量：９５．１ｍｇ／１００ｇ、Ｆｅ量：８１．７ｍｇ／１００ｇ
【００４４】
【調製例２〜３】
上記調製例１において、椎茸種菌に代えて、エノキ茸種菌（調製例２）、山伏茸種菌（調製例３）を用いた以外は、調製例１と同様にして、エノキ茸菌糸体エキス粉末、山伏茸菌糸体エキス粉末を得た。
これらのエキス中のミネラル成分組成は、以下のとおり。
＜エノキ茸菌糸体エキス＞
Ｃａ量：１６１ｍｇ／１００ｇ、Ｆｅ量：１７．３ｍｇ／１００ｇ
＜山伏茸菌糸体エキス＞
Ｃａ量：１５０ｍｇ／１００ｇ、Ｆｅ量：２３．９ｍｇ／１００ｇ
【００４５】
【試験例１】
上記調製例１で得られた椎茸菌糸体エキス（粉末）からなる、骨軟化症予防剤を用いて、ラットに対する骨硬度の向上、骨軟化症予防効果を調べた。
＜試験方法＞
表１に示す正常飼料と、低ミネラル飼料と、低ミネラル飼料に椎茸菌糸体エキスを配合した該エキス含量が４％の飼料の３種類を用意した。
【００４６】
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（紀和実験動物）１５匹を５匹ずつの３群に分けて、それぞれ表１に示す正常飼料、低ミネラル飼料、低ミネラル飼料に椎茸菌糸体エキスを４％となる量で添加した混合飼料（混合飼料中に椎茸菌糸体エキス４％含有）を、自由に摂取させた。（該椎茸菌糸体エキス中のカルシウム量は、実験に影響しない程度の微量である。）
なお、表１に明らかなように、表３に示すハーパー混合ミネラルを４．５％添加した飼料を正常飼料とし、ハーパー混合ミネラルを０．５％に低減した飼料を低ミネラル飼料とした。
【００４７】
飼料の摂取量は、給餌器に入れた粉末飼料の消費量を２８日間、日曜日を除いて毎日測定した。ラットが摂食中に給餌器よりこぼす飼料は無視できる程度の少量であった。ラット体重の測定は、毎週月曜日および木曜日に行った。
試験開始後、２８日目にラットを殺して、その胸腺、肺、心臓、肝臓、脾臓、副腎、腎臓、睾丸を摘出し、部検および湿重量を測定した。また、ラットの下肢（大腿骨および脛骨）を摘出して、脛骨については、その長さと骨硬度の測定も行った。骨硬度は、木屋式硬度計を用いて測定した。
【００４８】
乾燥後の灰分量から骨重量を求めた。すなわち、左右の大腿骨および脛骨をクロロホルム：メタノール＝２：２（容量比）の混液内に４８時間浸したのち、磁性るつぼに入れ、１２０℃で５時間乾燥した後、電気炉で灰化処理を行った。
灰化は、２５０℃で０．５時間保持した後、４５０℃で０．５時間保持し、次いで６００℃で０．５時間保持し、さらに７００℃で２時間保持することにより行った。
【００４９】
結果を表１〜６にそれぞれ示す。
【００５０】
【表１】
0004368540.tif 000002
【００５１】
【表２】
0004368540.tif 000003
【００５２】
【表３】
0004368540.tif 000004
【００５３】
【表４】
0004368540.tif 000005
【００５４】
【表５】
0004368540.tif 000006
【００５５】
【表６】
0004368540.tif 000007
【００５６】
＜試験結果＞
〔１〕飼料の摂取量
飼料の摂取量は、各群で大差が見られなかった。
〔２〕体重の変化
表４の体重欄を参照すれば明らかなように、低ミネラル飼料群摂取のラットでは、正常飼料群摂取のラットや、「低ミネラル飼料＋椎茸菌糸体エキス混合飼料群」摂取のラットと比較すると、明らかに体重の増加が劣り、成長障害が認められた。
【００５７】
▲３▼部検
何れの飼料を与えたラット群とも、各臓器の外観に異常は見られなかった。
また、表４の「臓器と湿重量」の項の記載に明らかなように、何れの飼料を与えたラット群とも、各臓器重量に有意差は認められなかった。
▲４▼脛骨の長さ
表５の記載に明らかなように、何れの飼料を与えたラット群とも、脛骨の長さに有意差は認められなかった。
【００５８】
▲５▼骨硬度
表５に明らかなように、正常飼料摂食群のラットに比べて、低ミネラル飼料摂取群のラットの骨硬度は約１／２に減少していた。
また、「低ミネラル飼料＋椎茸菌糸体エキス混合飼料群」のラットでは、低ミネラル飼料摂取群のラットよりも有意に骨硬度は増加していた。
【００５９】
▲６▼骨重量
骨重量は、脱脂後乾燥した状態で求めたところ、低ミネラル飼料群のラットでは、正常飼料群のラットの約２／３倍に減少したが、「低ミネラル飼料＋椎茸菌糸体エキス混合飼料群」のラットでは、ほぼ正常飼料群のラットと同等になった。
【００６０】
また、表６に示すように、脛骨灰化後の骨重量は、低ミネラル飼料群ラットでは正常飼料群のラットの場合の約１／２倍に減少していたが、「低ミネラル飼料＋椎茸菌糸体エキス混合飼料群」のラットでは、有意に正常飼料群の値に回復した。
上記試験結果によれば、正常飼料を摂取させる場合に比して、低ミネラル飼料を摂取させて４週間ラットを飼育すると、明らかに生育の障害のみならず、骨硬度の減少や骨の乾燥重量および灰化重量の減少が起きる。低ミネラル飼料であっても、この低ミネラル飼料と共に椎茸菌糸体エキスを併せて摂取することで生育の障害のみならず、骨硬度の減少や骨の乾燥重量および灰化重量の減少が顕著に改善されたことが分かる。
【００６１】
骨は、カルシウムだけでなく、結合組織と共存してはじめて丈夫な骨となるが、椎茸菌糸体エキスは、骨組織へのカルシウムの補給や結合組織の再生に何らかの作用を促し、正常へと改善したものと推察される。
なお、椎茸菌糸体エキスに代えて、山伏茸菌糸体エキス、エノキタケ菌糸体エキスなどを用いた場合にも、上記と同様な効果が得られる。