(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）遊離プロテインＳに特異的に結合するリガンドを生物学的液体と接触させて、少なくとも１つの液体相からなる反応混合物を形成させる工程であって、該リガンドは、（ｉ）少なくともＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）のβ鎖のＮ末端の最端のＳＣＲ−モジュール；または（ｉｉ）Ｃ４ＢＰと本質的に同じプロテインＳ結合性質を有し、かつ、Ｃ４ＢＰのプロテインＳ結合部位に相同または類縁のアミノ酸残基配列を含む、その機能的改変体を含む、工程；
（ｂ）上記液体中で上記リガンドが遊離プロテインＳに結合するための時間上記反応混合物を保持して、遊離プロテインＳ／リガンド複合体を形成させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）で形成した該遊離プロテインＳ／リガンド複合体の量を検出する工程；
（ｄ）工程（ｃ）における該遊離プロテインＳ／リガンド複合体の量に基づいて、該生物学的液体における該遊離プロテインＳのレベルを決定する工程
を含む、血液、血漿または血清などの生物学的液体中における遊離プロテインＳのレベルを測定する方法。
【請求項２】
工程（ａ）のリガンドが固体担体に作動的に連結され、工程（ａ）で形成される反応混合物が液相および固相からなり、工程（ｂ）で形成される複合体が担体に連結されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）で形成される反応混合物が液相の１つの相から成ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
指示手段を工程（ａ）の混合物に添加し、その際この指示手段を別個に、またはリガンドに作動的に連結する形態で添加し、そしてこの指示手段は工程（ｂ）での複合体の形成時に直接的または間接的に検出可能なシグナルを産生することが可能であり、工程（ｂ）で形成される複合体は指示手段を包含し、そして工程（ｃ）での定量はその複合体中の指示手段の量を検出することからなることを特徴とする、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）での検出は、工程（ｂ）で形成した担体に結合されたプロテインＳ含有複合体をプロテインＳに特異的な抗体と接触させて液相および固相を有する免疫反応混合物を形成し、次いで上記抗体が上記複合体と免疫反応して固相に連結した免疫反応生成物を形成する時間接触させ、その免疫反応生成物中に存在する抗体の量を検出し、それによって工程（ｂ）で形成されたプロテインＳ／リガンド複合体の量を定量することからなることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
プロテインＳに特異的な抗体が、プロテインＳに高い親和性を有する抗体であって、プロテインＳ中のＣ４ＢＰに対する結合部位とは異なるプロテインＳ中の結合部位に結合していることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で使用するリガンドが、本質的にＣ４ＢＰのβ鎖の最端のＮ末端ＳＣＲ−モジュールであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドは、Ｃ４ＢＰフラグメントを含み、該Ｃ４ＢＰフラグメントは、Ｃ４ＢＰのβ鎖のＮ末端の最端のＳＣＲ−モジュールを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）で使用するリガンドが、１つまたはそれ以上のＣ４ＢＰフラグメントからなるハイブリッド分子であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）で使用するリガンドが、複数のサブユニットを含み、各サブユニットがＣ４ＢＰのプロテインＳ結合部位を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）および（ｂ）が、Ｃａ++イオンの存在下で実施されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
血液、血漿または血清などの生物学的液体中における遊離のプロテインＳをアッセイするための診断キットであって、
（ａ）Ｃ４ｂ−結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）のβ鎖のＮ末端の最端のＳＣＲ−モジュールを含むリガンドまたはＣ４ＢＰと本質的に同じプロテインＳ結合性質を有し、かつ、Ｃ４ＢＰ分子のプロテインＳ結合部位に相同または類縁のアミノ酸配列を含む、その機能的改変体であって、該リガンドは、該生物学的液体中の遊離プロテインＳと結合して遊離プロテインＳ／リガンド複合体を形成することができるリガンド；
該遊離プロテインＳ／リガンド複合体に結合する、抗体または抗体フラグメント；
該遊離のプロテインＳ、リガンド、および該抗体または抗体フラグメントの間の複合体の形成を示す検出可能なシグナルを産生することができる指示手段；および
該生物学的液体中の遊離プロテインＳのレベルを決定するために適切な予め割り当てられた濃度の遊離プロテインＳを含むサンプル
を包含することを特徴とする診断キット。
【請求項１３】
前記サンプル中の前記予め割り当てられた濃度の遊離プロテインＳは、希釈緩衝液中で該サンプルを希釈することによって複数のサンプルを調製するために適切であり、ここで該複数のサンプルの各々は、正常血漿における０〜２００％の範囲の遊離プロテインＳ濃度の異なる予め決定された遊離プロテインＳ濃度を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記サンプル中の前記予め割り当てられた濃度の遊離プロテインＳは、希釈緩衝液中で該サンプルを希釈することによって複数のサンプルを調製するために適切であり、ここで該複数のサンプルの各々は、正常血漿における１５〜２５０％の範囲の遊離プロテインＳ濃度の異なる予め決定された遊離プロテインＳ濃度を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記サンプル中の前記予め割り当てられた遊離プロテインＳ濃度は、正常血漿において約１００％の遊離プロテインＳ濃度である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットは、複数のサンプルを含み、該サンプルの各々は、予め割り当てられた異なるプロテインＳ濃度を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記複数のサンプルの各々は、正常血漿における０〜２００％の範囲の遊離プロテインＳ濃度の異なる予め割り当てられた遊離プロテインＳ濃度を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１８】
前記複数のサンプルの各々は、正常血漿における１５〜２５０％の範囲の遊離プロテインＳ濃度の異なる予め割り当てられた遊離プロテインＳ濃度を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１９】
前記キットは、希釈緩衝液をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項２０】
リガンドが担体に作動的に連結されていることを特徴とする、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
担体がマイクロタイタープレートであることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
担体がビーズであることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
担体が、プレート、ビーズ、マトリックス、ゲル、シート、ストリップ、およびチューブからなる群から選択される構造から成ることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
担体が、デキストラン、アガロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、およびナイロンからなる群から選択される材料から成ることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
リガンドがＣ４ＢＰ分子のβ鎖の最端のＮ末端ＳＣＲ−モジュールを包含することを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項２６】
指示手段が、色素原標識、蛍光原標識、化学ルミネッセンス原標識、酵素標識、および放射標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項２７】
指示手段が、西洋ワサビペルオキシダーゼを包含することを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項２８】
検出可能なシグナルを可視化するための基質をさらに包含することを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項２９】
指示手段がリガンドに作動的に連結されているか、またはリガンドの中に取り込まれていることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項３０】
指示手段が抗体または抗体フラグメントに作動的に連結されているか、または試薬の中に取り込まれていることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項３１】
抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
指示手段が抗体またはそのフラグメントに作動的に連結されているか、または抗体またはそのフラグメントの中に取り込まれていることを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
さらにカルシウムイオンを含有することを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項３４】
リガンドが合成または組換えであることを特徴とする、請求項１２に記載のシステム。
【請求項３５】
リガンドが複数のサブユニットを含有し、各サブユニットがプロテインＳ結合部位を含むことを特徴とする、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
リガンドが血液から単離されたＣ４ＢＰ由来であることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項３７】
リガンドが酵素的切断を介してＣ４ＢＰから誘導されることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項３８】
前記リガンドが、Ｃ４ＢＰのβ鎖のＮ末端の最端のＳＣＲ−モジュールを含むＣ４ＢＰのフラグメントを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項３９】
前記抗体は、前記遊離プロテインＳ／リガンド複合体中のプロテインＳに結合した該抗体の量の定量を可能にする指示手段を有する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的液体中におけるプロテインＳの検出および定量ならびにそれに使用するための試薬に関する。さらに詳しくは、遊離のプロテインＳが、遊離のプロテインＳとプロテインＳに特異的に結合するリガンドからなる分子の間に形成される受容体／リガンド複合体として測定される。
プロテインＳは、天然に存在する抗凝固プロテインＣシステム（血液凝固系の一部）のメンバーの１種で、プロテインＣの活性化状態、ＡＰＣ（活性化プロテインＣ）に対する補因子として作用し、他の補因子は完全な血液凝固第Ｖ因子である。このシステムは、ＡＰＣが血液凝固を促進する血液凝固第Ｖａ因子および血液凝固第VIIIａ因子を分解するように働くので抗血液凝固作用を表わす。
ヒト血漿中では、プロテインＳは遊離のタンパク質および他の血漿タンパク質Ｃ4ｂ−結合タンパク質（C4BP）との複合体の両方として循環する
0004224138.tif 000002
血漿中の総プロテインＳの約60％は、Ｇ4ＢＰに結合し、この型のプロテインＳはＡＰＣ−補因子として機能的に活性ではないことに注意すべきである。すなわち、Ｃ4ＢＰのプロテインＳへの結合はプロテインＳのＡＰＣ−補因子機能を消失させる。プロテインＳの抗凝固タンパク質としての重要性は、プロテインＳの欠乏と血栓塞栓性疾患の間の関連により示される。きわめて稀なホモ接合型欠乏は新生児の致命的な疾患を誘発するが、ヘテロ接合型欠乏は成人の生命には静脈血栓症の危険因子である。実際に、プロテインＣ欠乏またはプロテインＳ欠乏は静脈血栓症を発症している全個体の約５〜10％に見出される。
プロテインＳの欠乏症を有する個体は、すなわち、静脈性の血栓塞栓状態に陥る危険性が高い。したがって、プロテインＳの血液中または血漿中レベルの測定方法は重要な臨床的有用性を有する。数名の研究者がプロテインＳ欠乏の診断には総プロテインＳまたは結合型のプロテインＳのレベルよりも、遊離のプロテインＳのレベルを測定すべきであることを示している
0004224138.tif 000003
ことから、特に遊離プロテインＳのレベルの測定方法が推奨される。この理由はプロテインＳ欠乏をひき起こす遺伝的な欠陥に関してより高い感受性および特異性が、総プロテインＳまたは結合プロテインＳを測定するアッセイよりも遊離プロテインＳのアッセイによって達成されるからである。
遊離のプロテインＳの既に知られている測定方法は２つの試験原理、すなわちポリエチレングリコール沈殿性の差およびモノクローナル抗体の使用にそれぞれ基づくものである。
ポリエチレングリコール（PEG）を用いて、プロテインＳの測定の前に結合プロテインＳおよび遊離プロテインＳからなる液体から結合プロテインＳを選択的に除去する方法は、プロテインＳの複合結合型（PS：C4BP）がＰＥＧ濃度約3.75〜５％で既に沈殿し、一方、大部分の遊離プロテインＳは溶液中に残存することの発見に基づくものである。この原理は様々な市販のプロテインＳアッセイに広範に使用されている。すなわち、遊離プロテインＳのアッセイにおいては、血漿サンプルを通常、ＰＥＧ（3.75〜５％）による沈殿に付し、次いで遠心分離後に上清中に残ったプロテインＳを免疫学的方法、たとえばELISA、ＲＩＡまたはローレルロケットによって測定する。このような方法は、Am. J. Clin. Path. 94：176-186, 1990；Anal. Biochem. 10：358-361, 1985；Blood 67：504-508, 1986に開示されている。しかしながら、これらの方法には主としてＰＥＧ沈殿操作によるある種の欠点がある。すなわちＰＥＧ沈殿が高度に標準化された場合でも、この操作は低い再現性ならびのその労力および時間を要するため容易ではない。
上述の第二の試験原理はモノクローナル抗体の使用によるものである。このようなモノクローナル抗体はプロテインＳの遊離型に特異的であり、すなわちこれらの抗体に対するエピトープが、プロテインＳ分子上のＣ4ＢＰの結合部位またはその付近に位置する（Amiralら，Blood Coag.Fibrinol. 5：176-186, 1994およびWolfら，Blood Coag.Fibrinol. 5：187-192, 1994）。
上述のようにプロテインＳに結合し、それによって血中を循環する遊離のプロテインＳの量を減少させるＣ4ＢＰは、相補性のプロテインＣ4ｂに対する結合部位をそれぞれ含有するほぼ７個の同一のα鎖、および１個の単一のβ鎖から構成される。α鎖はそれらのＣ末端領域において互いに、そしてさらに単一のβ鎖に連結する。Ｃ4ＢＰ分子のこれらの７個のα鎖および単一のβ鎖は車のスポークのように配置されて、蜘蛛の巣状の分子構造を形成する
0004224138.tif 000004
プロテインＳ結合部位は単一のβ鎖上に位置することそしてごく最近になって
0004224138.tif 000005
全プロテインＳ結合部位は、β鎖のＮ末端の最端のＳＣＲ−モジュール（ＳＣＲは短いコンセンサスリピートの略であり、約60個のアミノ酸残基を含有するタンパク質モジュールである）上に位置することが明らかにされた。このモジュールがプロテインＳ結合部位を含有することは以前に（Fernandez & Griffin, J. Biol. Chem. 269：2535-2540, 1994）提案されていたが、全プロテインＳ結合部位がβ鎖のこの最初の（最端の）ＳＣＲ−モジュールに存在することはこれまで知られていなかった。
プロテインＳとＣ4ＢＰの間の複合体形成の知識は、遊離型のプロテインＳに特異的な抗体の産生に使用されてきた。すなわち、Ｃ4ＢＰの結合に関与するプロテインＳの領域に特異的に結合し、プロテインＳのＣ4ＢＰ結合型では、これらの抗体に特異的なプロテインＳにおけるこのような結合部位が既にＣ4ＢＰで占拠されているので、プロテインＳの遊離型にしか結合しない抗体の産生が試みられてきた。しかしながら、上述の特異性を有する抗体の産生における前提条件は、プロテインＳ分子上のＣ4ＢＰ結合部位に特異的な知識である。この結合部位は従来技術では詳細に解明されていなかったが、SHBGと命名されたプロテインＳの大Ｃ末端モジュール中の２つの領域の関与が主張されていた。最初の報告では成熟プロテインＳの残基番号605〜614が関与することが示唆され（Walker, J. Biol. Chem. 264：17645-17648, 1989）、一方、残基413〜433からなる他の領域が、さらに最近になってプロテインＳに対するＣ4ＢＰの結合に重要であることが示唆された（Fernandezら，J. Biol, Chem. 268：16788-16794, 1993）。
WO93／01209には、Ｃ4ＢＰの結合に関与する成熟プロテインＳの特異的な領域に関する、遊離のプロテインＳの精製または検出のための診断方法およびシステムに有用なモノクローナル抗体が開示されている。これらの特異的な領域からなるプロテインＳポリペプチドも開示されている。しかしながらこれらの領域は以下に開示されるＣ4ＢＰの結合領域とは異なっている。
さらに、血漿中の遊離プロテインＳを捕獲する標準ELISA（固相酵素免疫測定法）において固定化抗体として使用される遊離プロテインＳに対する固定化モノクローナル抗体に基づく遊離プロテインＳのアッセイが、文献に記載され、Stagoから市販されている（Amiralら，Blood Coag.Fibrinol. 5：179-186, 1994およびWolfら，Blood Coag. Fibrinol. 5：187-192, 1994）。このような試験においては、カルシウムを含む緩衝液中の血漿希釈液を遊離のプロテインＳに特異的なモノクローナル抗体を含有するマイクロタイタープレート中でインキュベートし、次いで洗浄工程ののち、モノクローナル抗体に結合したプロテインＳを、プロテインＳに対する第二のモノまたはポリクローナル抗体を用いて検出することができる。しかしながら、このようなアッセイはきわめて高価につく。しかも、これらの試験に使用される抗体は十分に特徴が明らかにされておらず、プロテインＳへのＣ4ＢＰの結合への関与が示唆されているプロテインＳの領域に対して特異的に産生されてはいなかった。むしろ、これらの抗体は全プロテインＳ分子に対して励起され、次いで遊離プロテインＳに対する特異性を有する抗体が選択されていた。
本発明の目的は、生物学的液体中における遊離のプロテインＳの測定のための簡単で信頼性のあるアッセイを提供することである。本発明によればこの目的は、遊離のプロテインＳに特異的に結合するリガンドをプロテインＳからなる生物学的液体に添加してプロテインＳ／リガンド複合体を形成させ、次いで遊離プロテインＳのレベルを上記液体中に形成されたプロテインＳ／リガンド複合体として測定し、上記リガンドは少なくともＣ4ｂ−結合タンパク質（C4BP）の部分からなるアッセイによって達成される。この場合、Ｃ4ＢＰは遊離のプロテインＳに対する天然のリガンド、あるいはＣ4ＢＰのプロテインＳ結合部位に対し同族もしくは類縁のアミノ酸配列または本質的にＣ4ＢＰと同じプロテインＳ結合性を有するアミノ酸配列からなる化合物である。
さらに特定すれば、本発明は請求項１に定義された方法に関する。
本発明の適切な実施態様によれば、プロテインＳに結合する上記リガンドは、Ｃ4ＢＰ自体に由来するかまたは全タンパク質もしくは適当なプロテインＳ結合能を有するその（ポリ）ペプチドフラグメントから構成される。このフラグメントは、Ｃ4ＢＰの全体または実質的に全体のプロテインＳ結合部位からなることが適当である。
Ｃ4ＢＰがプロテインＳに結合する天然のリガンドであることは、本発明の前からよく知られていたが、ＰＳ：Ｃ4ＢＰとして結合したプロテインＳの存在下における遊離プロテインＳのレベルを、生物学的液体サンプル中で、主として遊離プロテインＳとＣ4ＢＰまたはその適当なフラグメントの間の複合体の形成のみに基づく試験において測定するツールとしての使用は示唆されたことがない。
本発明によれば、しかしながらＣ4ＢＰは、遊離プロテインＳの定量のために本明細書に開示されたようなアッセイにおける試薬成分として使用できることが全く予期に反して見出されたのである。Ｃ4ＢＰは、大部分のタンパク質とは異なり、長時間にわたって安定であり、熱に比較的非感受性である。しかも、形成された複合体の解離速度は、その定性的および定量的な両測定を十分可能にする程遅い。
本発明との関連における「リガンド」の語は受容体分子たとえばタンパク質、ペプチド、ポリペプチド等のアミノ酸配列に結合して分子複合体を形成するアミノ酸配列からなる分子構造を指示して使用される。本発明の場合には、受容体はプロテインＳから構成される。すなわち、本発明のリガンドは抗体パラトープから、または抗体パラトープを決定するアミノ酸配列からなる分子たとえば抗体もしくはそのフラグメントから構成することができる。
本発明の一実施態様によれば、適当には精製型の全Ｃ4ＢＰ分子が、それ自体遊離プロテインＳとの複合体の形成にリガンドとして使用され、次いで形成された複合体すなわちＰＳ：Ｃ4ＢＰがよく知られた技術に従って測定される。このアッセイ中に形成されるこのＰＳ：Ｃ4ＢＰ複合体はもちろん、血液中に自然に存在するＰＳ：Ｃ4ＢＰ複合体とは区別する必要がある。これはよく知られていて以下にさらに詳細に開示されるアッセイにリガンドとして使用されるＣ4ＢＰのたとえば標識化および／または固定化により達成される。
本発明の他の実施態様は、Ｃ4ＢＰ分子中のプロテインＳ結合部位の正確な局在位置の知識に基づくものである。初期の報告に反し、最近、この結合部位は、Ｃ4ＢＰ分子のβ鎖の最端のＮ末端ＳＣＲ−モジュールに存在することが見出された。
したがって、本発明はまた、Ｃ4ＢＰ分子のプロテインＳ結合部位からなり、同じアッセイフォーマットの使用により全Ｃ4ＢＰ分子として同じ目的のためにプロテインＳに結合するリガンドとして使用できるＣ4ＢＰ分子のフラグメント、すなわち短いポリペプチドに関する。よく知られているように、このようなフラグメントはＣ4ＢＰから、たとえばその酵素消化により誘導することができる。相当するアミノ酸配列の決定後は、このようなフラグメントまたはポリペプチドは慣用の合成方法たとえば固相Merrifieldタイプの合成を用いて製造するのが便利である。組換え技術に基づく方法も使用できる。
本発明の他の実施態様は、ネイティブなプロテインＳ中のＣ4ＢＰ結合部位の局在位置に関する。局在位置に基づき、上記結合部位からなるプロテインＳポリペプチドを得ることが可能であり、したがって、この結合部位および遊離プロテインＳに特異的な抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を励起するのに使用することができる。明らかに、このような抗体は、Ｃ4ＢＰと複合体化したプロテインＳに結合せず、複合体化したプロテインＳ中の相当する抗原決定基もしくはエピトープは既にＣ4ＢＰ分子によって占拠されていることから、Ｃ4ＢＰに結合したプロテインＳの存在下に遊離のプロテインＳの測定に使用することができる。
すなわち、本発明の他の実施態様は、ネイティブなプロテインＳのＣ4ＢＰ結合領域およびこれらの領域に特異的な、すなわちＣ4ＢＰとＰＳの間の結合相互作用を阻害する抗−ＰＳポリペプチド抗体からなる上記プロテインＳポリペプチド（ＰＳポリペプチド）に関する。このようなポリクローナルまたはモノクローナル抗体は遊離のプロテインＳと免疫反応し、したがって、診断試薬および治療剤の両方として重要な有用性を有している。
したがって本発明はまた、遊離のプロテインＳに結合し、したがってプロテインＳのＰＳ：Ｃ4ＢＰ複合体の形成による不活性化を防止する上記抗体からなる治療用組成物に関する。本発明はまた、Ｃ4ＢＰに対する遊離プロテインＳの結合を阻害し、Ｃ4ＢＰ中の遊離プロテインＳの結合部位に結合してそれを遮断するのに十分な量の本発明のポリペプチドまたはモノクローナル抗体、および医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤からなる治療用組成物に関する。
本発明のさらに他の実施態様は、本発明の方法に従い生物学的液体中の遊離のプロテインＳをアッセイするための好ましくはキット型の診断システムに関する。このシステムは別個にパッケージされた試薬、本発明のリガンドおよびさらにアッセイの実施に必要な少なくとも１種の指示手段、緩衝液等のような試薬からなる。これらのシステムはアッセイの実施に必要なすべての試薬からなることが適当である。通常、パッケージされた試薬の使用説明書はこのシステムに包含される。
本発明の診断システムおよび遊離のプロテインＳを測定するための方法は、慣用される様々なフォーマット好ましくは直接イムノアッセイとして設計することができる。このようなアッセイは、一方ではプロテインＳのＣ4ＢＰ結合領域と、他方では、Ｃ4ＢＰもしくはそのフラグメントまたはＣ4ＢＰのプロテインＳ結合部位に同族もしくは類縁のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または本発明の抗−ＰＳポリペプチド抗体パラトープの間の特異的な結合相互作用に基づくものである。
他の実施態様においては、このようなシステムおよび方法はまた液体サンプルから遊離のプロテインＳを精製するためにも使用することができる。すなわち、本発明はまた、固体担体に作動性に連結した本発明のリガンドよりなる水性溶液から遊離のプロテインＳを精製するための組成物、上記溶液を上記組成物と接触させて上記固体担体に結合したプロテインＳ／リガンド複合体を形成させ、上記複合体を上記溶液から分離し、上記複合体からプロテインＳを放出させることからなる水性溶液から遊離のプロテインＳを精製する方法に関する。
以下に本発明をその適当な実施態様を参照しながら、さらに詳細に開示する。本発明は主としてヒト起源のプロテインＳに関するものであるが、本発明はまた他のたとえばウシ起源のプロテインＳにも適用可能である。
上述のように、本発明は主としてプロテインＳとＣ4ＢＰの間の結合相互作用に関する。さらに詳しくは、本発明は、たとえば遊離プロテインＳのアッセイにおいて、遊離プロテインＳを捕獲するために使用できるプロテインＳに特異的なリガンドの使用に関する。この場合の「遊離プロテインＳ」の表現は、生体内をＣ4ＢＰとの複合体の形態で循環するプロテインＳとは区別して使用される。本発明の一実施態様は、単に天然に存在するタンパク質Ｃ4ＢＰ自体のリガンドとしての使用に基づくものであるが、本発明の他の実施態様は、このような相互作用の詳細すなわちプロテインＳとＣ4ＢＰの間の複合体形成に関与するプロテインＳおよびＣ4ＢＰ中の相互作用結合部位それぞれの局在位置および／または特異的アミノ酸配列の特異的な知識に関する。すなわち本発明は、Ｃ4ＢＰ関連リガンドならびに遊離のプロテインＳに結合する抗体またはそのフラグメントの使用に関する。
１）Ｃ4ＢＰからなるまたはＣ4ＢＰから誘導されるリガンドの使用
ネイティブなプロテインＳに結合するＣ4ＢＰの少なくとも一部またはすべての部位からなるリガンドに関しては、全Ｃ4ＢＰ分子の使用が便利であり、本発明の適当な実施態様を構成するが、プロテインＳに結合する特異的なアミノ酸配列または少なくともその一部からなるＣ4ＢＰのフラグメントの使用によっても利点が得られると期待される。最近（上記参照）、Ｃ4ＢＰ中のネイティブなプロテインＳ結合部位は、Ｃ4ＢＰ分子のβ鎖の最端の（最初の）ＳＣＲ−モジュールに現れることが示された。すなわち、本発明によってリガンドとして使用できるフラグメントは、Ｃ4ＢＰ分子の無傷のβ鎖、またはこの鎖の本質的に上記Ｎ末端ＳＣＲ−モジュールからなるかまたはそれから構成されるフラグメントである。全タンパク質に代えてこのようなポリペプチドのフラグメントの使用は、リガンドの製造が容易である点で有利であり、このようなフラグメントを遊離のプロテインＳの測定のための本発明の方法においてリガンドとして使用する場合、親和性の改良を達成することができる。
上述のように、このようなフラグメントは、慣用のペプチド合成または組換え技術に基づく方法によって製造することができたが、一方、Ｃ4ＢＰ自体の使用では通常、血漿からＰＳ：Ｃ4ＢＰ錯体の形態でのＣ4ＢＰの単離、Ｃ4ＢＰのプロテインＳからの分離および更なる精製を包含する。適当なＣ4ＢＰのフラグメントはまた、たとえば上述のように血液から得られたＣ4ＢＰの酵素的切断によって血液から誘導することもできる。
さらに、組換え技術の使用は、このようなリガンドを遊離プロテインＳの捕獲リガンドとして特異的に有用にする性質をもつＣ4ＢＰ様リガンドの設計の可能性を開くものである。すなわち、組換え技術の使用によりＣ4ＢＰの２つのタイプの鎖すなわちα鎖およびβ鎖の間ハイブリッド分子が形成された。この構築体では、β鎖の最端のＮ末端ＳＣＲがα鎖の相当するモジュールによって置換されている。得られる組換え生成物はそれぞれプロテインＳ結合部位を含有する多重ジスルフィド連結サブユニットを有するＣ4ＢＰ様分子である。
遊離プロテインＳのアッセイにおける捕獲リガンドとしてきわめて効率的であり得るＣ4ＢＰ様分子を設計することが可能ではあるが、本発明の適当な実施態様は全Ｃ4ＢＰ分子、またはむしろβ鎖からなるＣ4ＢＰ種、すなわちＣ4ＢＰβのこのようなアッセイにおけるリガンドとしての使用を基盤とするものである。Ｃ4ＢＰβ上の結合部位は、生理的濃度のカルシウムの存在下に、プロテインＳと極めて高い親和性（ＫD＝0.1nM）で結合し、カルシウムイオンの存在下における会合速度定数は高く（ほぼ105M-1s-1）、解離速度定数は低い（約５×10-4ｓ-1）のでＣ4ＢＰβ（β鎖上に占拠されていないプロテインＳ結合部位を含有）は遊離プロテインＳのきわめて特異的かつ効率的なリガンドであり、遊離のプロテインＳおよびＰＳ：Ｃ4ＢＰ複合体を含有する溶液中において遊離のプロテインＳを特異的に結合することができる。
本発明のアッセイにおいてリガンドとして使用されるＣ4ＢＰが、実質的にβ鎖、したがってプロテインＳ結合部位鎖を含有するＣ4ＢＰ種からなることは、もちろん必須である。これは、本発明の方法において使用されるＣ4ＢＰが上述のように７個のα鎖と１個のβ鎖を有するその主要なアイソフォームＣ4ＢＰβから実質的に構成されること、β鎖を欠くその副次的なアイソフォームは存在しないかまたは低比率でしか存在しないことを意味する。
本発明の遊離のプロテインＳのアッセイに適当な実施態様によれば、Ｃ4ＢＰβは担体たとえばマイクロタイタープレート上に固定化され、遊離のプロテインＳおよびＰＳ：Ｃ4ＢＰ複合体の両方を含有する溶液に接触させ、すなわちそれとインキュベートして特異的に結合させ、すなわち上記溶液から遊離のプロテインＳを抽出し、次いで固定化リガンドに結合するプロテインＳをプロテインＳに特異的なモノまたはポリクローナル抗体によって検出することができる。
カルシウムの存在下における高い会合速度定数は、この一次的捕獲のために使用されるインキュベーション時間を著しく短縮することを可能にする。適当には、上記モノまたはポリクローナル抗体とのインキュベーション前に、数回の洗浄工程を実施する。原理的には、プロテインＳに特異的な任意の抗体を使用できる。しかしながら、本発明の方法の適当な実施態様によればモノクローナル抗体が使用され、ある種のユニークな性質をもつモノクローナル抗体が最も適当である。ＨＰＳ54と呼ばれているこの抗体は、特徴が解明され
0004224138.tif 000006
プロテインＳに極めて高い親和性を有することが知られている。そのエピトープはプロテインＳの最初のＥＧＦ様ドメインに位置し、すなわち、ＳＨＢＧ領域に存在するＣ4ＢＰβの結合部位とは異なり、プロテインＳへの上記抗体の結合の高い親和性を達成するためにはカルシウムが要求される。これらのユニークな性質から、この抗体は固定化されたＣ4ＢＰβによって保持されたプロテインＳの検出のために適当な試薬となる。プロテインＳ／リガンド複合体が結合したＨＰＳ54モノクローナル抗体も有する固定化されたリガンドに結合したプロテインＳの検出を可能にするためには、ＨＰＳ54をその検出が可能なように直接標識するか、または二次工程によりたとえばこのモノクローナル抗体に対する二次抗体によって検出する。
リガンドとしてＣ4ＢＰを用いる上に開示された方法は、本発明の例示のためのみに提供されたものである。本発明は、この実施態様に限定されるものではなく、遊離のプロテインＳの測定のために記載された原理を用いるほぼ無限の可能な方法があり、アッセイ原理の多くの異なる設計が可能である。すなわち、本発明の改変および更なる実施態様は本技術分野の熟練者には自明である。
２）遊離プロテインＳに特異的な抗体からなるリガンドの使用
本発明によれば、遊離のプロテインＳを捕獲するために使用されるリガンドはまた、遊離のプロテインＳに特異的な抗体を含んでいてもよい。すなわち本発明は、プロテインＳとＣ4ＢＰの結合相互作用に関与することが見出されているプロテインＳの領域に対して直接励起された抗体に関する。
このような抗体は、上記の特異的領域からなる本発明のＰＳポリペプチドの使用によって得られる。所望の特異性を有する抗体を得るために使用される上記ポリペプチドは、たとえば適当な動物への投与（免疫処置）による接種材料の調製に用いられる。
これらのＰＳポリペプチドは、従来技術においてＣ4ＢＰの結合に関与することが示唆されたプロテインＳの領域と異なる成熟プロテインＳの領域からなる。
本発明によれば、Ｃ4ＢＰの結合に関与することが見出され、したがって抗原たとえばポリペプチド中に存在すると、遊離のプロテインＳに特異的な抗体の励起に免疫原または抗原として潜在的に有用なプロテインＳの領域は、すべて成熟プロテインＳの式：SGIAQFHIDY NNVSによって表されるアミノ酸残基447〜460を包含する。
本発明はしたがって、成熟プロテインＳの少なくともアミノ酸残基447〜460からなるポリペプチドであるＰＳポリペプチドに関する。上記ポリペプチドは、場合により、プロテインＳの相当する隣接領域とは異なる付加的なＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基をもっていてもよい。ＰＳポリペプチドは447〜460アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端部分および成熟プロテインＳの残基に相当するそれぞれ付加的なＮ末端またはＣ末端隣接残基から構成されてもよく、また全447〜460アミノ酸配列と両末端に成熟プロテインＳの残基に相当する付加的な隣接残基から構成されていてもよい。このようなＰＳポリペプチドの例としてはそれぞれアミノ酸残基439〜460、447〜468および435〜468からなるポリペプチドがある（表１）。本発明者らは上記配列に相当する合成ポリペプチドがプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用を阻害できることを示したが、従来技術においてＣ4ＢＰの結合に関与することが示唆された残基405〜437および595〜628に相当する合成ポリペプチド（表１）は、プロテインＳに対して過剰に（2000倍）使用しても阻害作用は全く示さなかった。すなわち、本発明のポリペプチドは、成熟プロテインＳのアミノ酸残基447〜460に相当するアミノ酸残基配列、および場合により一方もしくは両末端に成熟タンパク質の付加的な隣接配列を有するが、それらのＮ末端における成熟プロテインＳのアミノ酸残基438またはそれらのＣ末端における成熟プロテインＳのアミノ酸残基526を越えて伸展しないことが適当である。プロテインＳから誘導されるのとは別に、本発明のポリペプチドは慣用のポリペプチド合成により調製することもできる。
プロテインＳの上述のアミノ酸のナンバリングは、たとえば
0004224138.tif 000007
に使用された慣用のナンバリングであり、これらの参考文献にはプロテインＳのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が開示されている。
したがって、本発明の適当な実施態様は、上述のＰＳポリペプチドに対して励起され、したがって、遊離プロテインＳに対するＣ4ＢＰの高親和性結合に関与することが見出されたプロテインＳの上記アミノ酸残基配列と免疫反応することができる抗体、ポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体に関する。上に説明したように、このような抗体は遊離プロテインＳに特異的であり、Ｃ4ＢＰと複合体を形成したプロテインＳには結合しない。
本発明の抗体は抗−ＰＳ抗体とも呼ばれ、遊離プロテインＳに対する免疫特異性を特徴とする。さらに、それらはＣ4ＢＰに対するプロテインＳの結合を阻害すること、したがって血液中の遊離プロテインＳの量を増加させる薬剤としての有用性が期待できる。
本発明の適当な抗−ＰＳ抗体は、成熟プロテインＳのアミノ酸残基447〜460からなるポリペプチドとの免疫反応が可能であり、上記抗体はまた遊離プロテインＳの同じアミノ酸配列と免疫反応する。
本発明の抗体は、市販のプロトコールを用いて一般に知られた方法に従って製造することができる。一般的には、動物好ましくは哺乳動物に、成熟プロテインＳのアミノ酸残基447〜460からなる本発明のＰＳポリペプチドを、その動物に抗体の産生を誘導するのに十分な量を用いて接種たとえば注射を行う。次いで生成した抗体を動物から、適当には血清、腹水もしくは他の体液、または抗体産生臓器たとえば脾臓から収集し、組換え技術による抗体の製造に使用する。
所望の免疫特異性を有するそれらの抗体は好ましくは、たとえば体液から適当には免疫親和性クロマトグラフィーまたは他のよく知られた技術によって単離される。もし、固相に付着した免疫処理ポリペプチドからなる免疫親和性クロマトグラフィーを用いて抗体を精製すると、これらの免疫特異性は増強される。このような免疫親和性クロマトグラフィーでは、抗体を固相に付着した免疫処置ポリペプチドと接触させて固相に付着した免疫複合体を形成させ、次いで、この免疫複合体から抗体を分離する。
動物の免疫処置に使用されるＰＳポリペプチドは短いポリペプチドであることから、それらは担体に連結して接合体を形成させた接種材料中に包含させることが好ましい。このような接合体の使用は、約35またはそれ未満のアミノ酸からなるペプチドには好ましい。適当な担体は本技術分野でよく知られていて、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、カブトガニからのヘモシアニン（Limulus polyphemus）、エデスチン、サイログロブリン、アルブミン等がある。
ポリペプチドの担体への接合を補助するには、ポリペプチドはポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加されたアミノ酸残基から構成されてもよい。適当には、システイン残基を添加し、ジスルフィド結合の形成によってポリペプチド／担体接合体が得られるように遊離のシステイン残基からなる担体を使用する。このような添加されたシステイン残基は、たとえば添加されたシステイン残基からなる免疫処置ポリペプチドを遊離システイン残基からなる親和性マトリックス、たとえばThiolSepharose(R)（Pharmacia Fine Chemicals）に結合させることによって上述の免疫親和性による精製を行なう際の助けとなる。
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよく、通常、モノクローナル抗体が好ましい。「抗体」の表現は全抗体のみでなくその適当なフラグメントも意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープと免疫反応できる抗体結合部位またはパラトープの１個の単一種のみを含有する。しかしながら、モノクローナル抗体は２個以上の抗体結合部位から構成されてもよく、このような抗体は多重特異的、たとえば二重特異的である。適当には、本発明のモノクローナル抗体は単一特異性であり、本発明のＰＳポリペプチドに特異的な単一のパラトープからなり、したがって、また遊離のプロテインＳに特異的である。
モノクローナル抗体の製造は、本技術分野においてよく知られていて、最初はKoehler & Milstein, Nature 256：495-497, 1975に開示された。この文献に論じられているように、モノクローナル抗体はハイブリドーマと呼ばれる１個の単細胞のクローンによって産生される。これらのハイブリドーマは抗体産生細胞、通常はリンパ球の骨髄腫または他の自己永続化細胞系との融合により形成され、それらはハイブリドーマ細胞培養液の上清に抗体を分泌する。本ハイブリドーマの製造には、抗原として本発明のＰＳポリペプチドで予め過免疫した動物から収集したリンパ球を使用する。本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞およびこのようなハイブリドーマ細胞を含有する細胞培養液に関する。
好ましくは、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、本明細書の実験の部に開示される本発明のＰＳポリペプチドと免疫反応し、したがって遊離プロテインＳと高い特異性で免疫反応する。
本発明の適当な実施態様によれば、このような抗体は、液体サンプルたとえば血液、血清または血漿中の遊離プロテインＳの検出または定量のためのELISAフォーマットにおける使用を意図し、この抗体が固相に結合され、酵素−抗原接合体がサンプル中の抗原、すなわち遊離のプロテインＳの量を検出および定量に使用される試験システム、たとえば診断キットに使用することができる。
上述のように、本抗体およびＣ4ＢＰ関連リガンドは、遊離のプロテインＳをアッセイするための診断システムにおいて使用することができる。本発明によればこのようなシステムは通常、本発明のアッセイにおいて形成される受容体／リガンド複合体の定性的または定量的測定を容易にする指示手段も包含する。このような指示手段は、基板へのリガンドの固定に加えて、遊離型すなわち固相担体、マトリックス等に結合していない上記複合体のアッセイを可能にする別法として使用できる。
このような指示手段または標識は、本発明のリガンドに連結するかまたは導入できる単一の原子または分子から構成されるかまたは別個に使用され、本発明の受容体／リガンド複合体の形成を指示する検出可能なシグナルの産生に直接または間接に関与する。付加的試薬が必要な場合もあり、たとえば酵素標識に関してはシグナルを可視化するため相当する基質が要求される。有用な指示手段または標識は、本技術分野でよく知られていて、たとえば色素原、蛍光原および化学ルミネッセンス原標識があり、蛍光原標識、たとえばフルオレセインイソシアナート（FIC）が特に適している。使用できる他の標識には酵素、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）および放射性同位元素たとえば125Ｉがある。
本発明のリガンドは、たとえば吸着によって固体マトリックスに固着させるのが適当である。有用な固体マトリックスは本技術分野において周知であり、水不溶性材料たとえばPharmacia Fine Chemicalsから登録商標Sephadexとして入手できる架橋デキストラン；アガロース；Abbott Laboratories of North Chicago, ILから入手可能な直径約１μm〜５mmのポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパデル状の塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウエブ；たとえばポリスチレンもしくは塩化ポリビニルから作成されたチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウエルがある。
本明細書に記載された診断システムの試薬成分は、溶液または液体分散液として提供することができる。しかしながら、実質的には乾燥粉末が適当であり、凍結乾燥形態がより好ましい。指示手段として酵素を使用する場合は、相当する基質はシステムの別のパッケージで提供することもできる。固体支持体たとえば上述のマイクロタイタープレートおよび１種または２種以上の緩衝液も、この診断システム中の個別にパッケージされたエレメントとして包含しうる。
本発明の適当な実施の態様を以下の実施例において、添付の図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は正常血漿希釈液（１：40〜１：640）で得られた標準曲線を示す。490mmにおける吸収値（Ａ490）を対数希釈値に対してプロットする。別にＡ490値を遊離プロテインＳのレベル（％）に対してプロットする（下方のｘ軸）。
図２は線型回帰分析の結果を示す。実施例２のアッセイで得られた値（％）を（ｙ軸）インハウスＲＩＡで得られた値（％）に（ｘ軸）対しプロットする。
図３および図４は実施例２のアッセイで得られた値（ｙ軸）とStago（図３）による市販ELISAおよびインハウスＲＩＡ（図４）で得られた値（ｘ軸）の間の相関を示す。
図５Ａおよび図５Ｂは平衡結合アッセイ（図５Ａ）および表面プラスモン共鳴アッセイ（図５Ｂ）におけるプロテインＳ／Ｃ4ＢＰ相互作用のペプチド阻害を示す。
実施例１〜４
これらの実施例においては、血漿サンプル中の遊離プロテインＳを捕獲するためにＣ4ＢＰを固定支持体上に固定化されたリガンドとして使用した、本発明による遊離プロテインＳの特異的アッセイが開示される。固体支持体としてはマイクロタイタープレートを使用した。
実施例１．アッセイに用いられるプレートおよび他の材料たとえば試薬および血漿サンプルの調製
Ａ．固定化されたＣ4ＢＰを含有するマイクロタイタープレートの調製
リガンドとしては、プロテインＳ結合β鎖を含み、Ｃ4ＢＰβと命名されたＣ4ＢＰ種をマイクロタイタープレート上のウエル（NUNC, DenmarkからのMaxisorb）に以下の標準操作を用いて固定化した。すなわち、10μg／mlの精製Ｃ4ＢＰを50mMの炭酸緩衝液、pH9.6、50μl／ウエル中で一夜インキュベートする。ウエルを50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、pH7.5（TBS）に0.1％Tweenを加えた液（TBS洗浄緩衝液）で３回洗浄し、次いでＴＢＳに希釈した１％ウシ血清アルブミン（BSA）と室温で30分間インキュベートした。プレートを次いでＴＢＳ洗浄緩衝液で洗浄して冷蔵庫に保存した。これらの条件下で遊離プロテインＳアッセイにおけるプレートの効率は少なくとも５週間は許容されることが見出された。
Ｂ．Ａ項において固定化されたリガンドとして使用されるＣ4ＢＰβの調製Ｃ4ＢＰβは、最初にプロテインＳ／Ｃ4ＢＰ複合体の形態でヒト血漿から単離された。次いでこの複合体を解離し、Ｃ4ＢＰβを３Ｍグアニジン塩酸塩中ゲルろ過クロマトグラフィーによってプロテインＳから分離し、Ｃ4ＢＰβをさらにモノクローナル抗体親和性クロマトグラフィー法で精製した。この方法によれば、得られる生成物は主としてＣ4ＢＰβであるが、β鎖のない少ない比率のＣ4ＢＰ種がＣ4ＢＰβとともに分離される可能性がある。Ｃ4ＢＰの単離は以前に報告されている
0004224138.tif 000008
Ｃ．標準曲線のための血漿サンプルの調製
正常なクエン酸ヒト血漿のプール（約40名のドナーから）を用いて標準曲線を構築した。血漿を患者サンプルに用いたのと同じ緩衝液で１：40〜１：640に希釈し、患者サンプルと同じ方法で処理した。
Ｄ．プロテインＳ枯渇血漿の調製
正常ヒト血漿（標準方法によりクエン酸三ナトリウムで抗凝固化した20ml）をプロテインＳ用の親和性マトリックス、15mlのHPS54−Sepharose（固定化モノクローナル抗体HPS54を含有するSepharose）と混合し、穏やかに攪拌しながら４℃で２時間インキュベートした。プロテインＳ枯渇血漿は遠心分離によって収集し、−70℃で保存した。
実施例２．標準曲線の確立および患者血漿サンプルのアッセイのためのアッセイ操作
正常血漿希釈サンプル中の遊離のプロテインＳの測定のために以下のアッセイ操作を使用し、標準曲線を構築した。同じ操作を患者血漿サンプルのアッセイに用いた。
アッセイ操作：分析すべきサンプル（患者血漿；通常１：100血漿希釈液、希釈用の緩衝液は１％ＢＳＡ、２mM塩化カルシウムおよび１mMベンザミジン含有ＴＢＳである）のアリコート（50μl）をＣ4ＢＰ−マイクロタイタープレートのウエルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ウエルを次いでＴＢＳ洗浄緩衝液で洗浄し、ビオチン化モノクローナル抗体ＨＰＳ54（１％ＢＳＡ、２mM塩化カルシウム含有ＴＢＳ中に１：1000に希釈，約0.1〜１μg／mlに相当）を添加した。未結合ＨＰＳ54を３×ＴＢＳ洗浄緩衝液で洗い落とした。ペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン（Dakopatts AS；製造業者の指示書に従って調製し、１：2500に希釈した）（50μl／ウエル）を加えて、室温で15分間インキュベートした後、未結合の複合体を３×ＴＢＳ洗浄緩衝液で洗い落とした。ペリオキシダーゼ基質ＯＰＤ（Dakopatts ASからの２mgの錠剤の形態の1,2−オルトフェニレンジアミン）のアリコート（100μl／ウエル）を0.1Ｍクエン酸−リン酸緩衝液、pH5.0中1.5mg／mlで（Dakopattsの指示書に従って調製）Ｈ2Ｏ2（0.015％）とともに添加した。正確に５分後、反応を100μl／ウエルの１Ｍ H2SO4によって停止させ、吸収を490nmで測定した。
標準曲線を確立するために、血漿希釈サンプルについて上に得られた吸収値をｙ軸に対数目盛のｘ軸上の血漿希釈度（１：40〜１：640）に対し標準様式でプロットした（図１）。患者のサンプルは１：100の希釈度で試験し、得られた吸収を使用して遊離のプロテインＳの量を計算した。値は、正常血漿中に存在する遊離プロテインＳの％として表した。遊離プロテインＳの％での値は図１中の別の（下方）ｘ軸上から直接読み取ることができる。アッセイはまた、指定されたプロテインＳレベルを有する国際標準または精製プロテインＳの標準に対して検量することもできる。
実施例２のアッセイの最終プロトコールは、様々な工程について条件を注意深く試験したのちに決定した。実際、各工程を試験の精度を犠牲にすることなく迅速なアッセイの結果を目標に評価した。すなわち、上述の操作は様々の希釈度、温度およびインキュベーション時間の影響を統合的に評価し、多くの可能な組合せから満足できるアッセイ操作となる唯一のものであった。現時点で好ましい条件および他の適当な条件は以下の記載から明らかである。
Ｃ4ＢＰ−マイクロタイタープレート中希釈血漿のインキュベーション時間
室温は固定化Ｃ4ＢＰへの遊離プロテインＳの結合を迅速化し、したがって、冷蔵庫でのインキュベーションよりもよく使用される。３種の異なる血漿希釈度（１：60、１：120および１：240）で30分〜５時間インキュベートしたのち、アッセイの残部を完結させた。１：60の希釈により最大の応答（高い吸収）が既に１時間後に得られ、１：120の希釈では２時間後、１：240の希釈では４〜５時間後にその最大応答に到達した。実際的な目的には、30分のインキュベーション、および１：100の患者血漿の希釈が好ましかった。
ビオチン化ＨＰＳ54のインキュベーション時間および希釈度
ビオチン化モノクローナル抗体の希釈液（１：500〜１：4000）をアッセイにおいて15〜30分間インキュベートした。高い希釈度は低い希釈度とほぼ同じ吸収値を与えた。したがって、１：1000の希釈および15分間のインキュベーションが好ましかった。
ペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンのインキュベーション時間および希釈度ならびに基質の展開時間
上述の場合と類似の方法において、酵素についてのインキュベーション時間および希釈ファクターは、１：2500の希釈および15分のインキュベーション時間が好ましいことが確立された。基質の変換時間は好ましくは５分であった。
実施例２に実質的に開示されたように行われる本発明のアッセイは、操作が容易な信頼性ある試験である。プロテインＳのＣ4ＢＰ上のその結合部位への速やかな結合速度はインキュベーション時間の短縮を可能にする。Ｃ4ＢＰからのプロテインＳの遅い解離速度は、洗浄操作、ならびに結合プロテインＳに対するモノクローナル抗体の添加、酵素接合体および最後に酵素の基質の添加を含めた以後の工程の実施を可能にする。しかもカルシウムの存在下に結合速度は早くなり、解離速度は遅くなることが見出された。この理由から、アッセイに使用される緩衝液はカルシウムを含有することが好ましい。これは多分、アッセイの優れた効率に寄与する重要な因子であると思われる。さらに、各工程を至適化することにより、アッセイの実施に要する時間を短縮することができる。すなわち、２時間以内に実施可能な速やかなアッセイを設計することができる。さらにまた、アッセイは自動化に適し、多数のサンプルの処理が可能になる。
実施例３．リガンドとしてＣ4ＢＰを用いるアッセイの特異性および感度
Ａ．遊離プロテインＳのアッセイの特異性
遊離プロテインＳのアッセイの特異性を試験するため２つの異なる実験を実施した。第１の実験では、プロテインＳ枯渇血漿を本発明のアッセイによって試験して、検出不能なレベルのプロテインＳを含有することが見出された。これはアッセイが血漿中の他の成分は検出しなかったことを示している。再構築実験すなわちプロテインＳ枯渇血漿にプロテインＳを再補充したのちには、プロテインＳの回収率は80〜90％であった。すなわち、プロテインＳ枯渇血漿に３種の濃度（20、10および５μg／ml）の高度に精製されたプロテインＳを添加したアッセイではそれぞれ約17.5、8.5および３μg／mlの値を与え、正常血漿の100％レベルは遊離プロテインＳ 10μg／mlに相当することを示した。この値は文献に示唆されている（Malmら，”Changes in the plasma levels of Vitamin K-dependent protein C and S and C4b-binding protein during pregnancy and oral contraception”, Brit.J.Haematol. 68：437-443, 1988）。すなわち実験誤差の範囲内でこの実験はアッセイがプロテインＳに特異的であり、またプロテインＳの遊離型に特異的であるとの結論を支持する。この後者の点を証明するため、Ｃ4ＢＰをヒト血漿に添加し（血漿中に１：１、２：１および10：１のＣ4ＢＰ：遊離プロテインＳのモル比を理論的に与える量−この場合も正常血漿中の遊離プロテインＳの量は10μg／mlと仮定した）、37℃で１時間インキュベートした。この実験の考え方はＣ4ＢＰが遊離プロテインＳを結合することが可能で、これにより遊離プロテインＳの測定量の低下が生じるとするものであった。これは、遊離プロテインＳに比較して２倍モル過剰のＣ4ＢＰの添加が遊離プロテインＳの90％低下を生じた場合にも認められた。遊離のプロテインＳに対するアッセイの特異性はさらに、遊離プロテインＳについての２種の従来技術のアッセイによって得られた結果を本発明のアッセイの結果と比較することによっても証明された。この比較は実施例４にさらに詳細に記述する。アッセイの変動係数はインター−アッセイ測定で8.5％（ｎ＝15）、イントラー−アッセイ測定で７％（ｎ＝20）であった。
Ｂ．アッセイの感度
アッセイを実施例２に記載のプロトコールに従って実施した場合、１：100の希釈で遊離プロテインＳほぼ100ng／mlに相当する100％を示した（非希釈血漿中の遊離プロテインＳの量は10μg／mlと仮定）。このアッセイは15〜250％の遊離プロテインＳレベルの正確な定量を可能にする（血漿希釈度１：100を用いた場合）。これは遊離プロテインＳ 15〜250mg／mlに相当する。他の血漿希釈度、たとえば１：５または１：10の使用によってもアッセイはさらに感度がよく、ある種の場合たとえば胎児がプロテインＳのホモ接合型欠損であるか否かについての出生前診断において興味がある１％程度の低レベルの測定が可能である。
実施例４．遊離プロテインＳの従来技術アッセイとの比較
実施例２のプロトコールに従ってプロテインＳについて本発明のアッセイの効率を遊離プロテインＳの２つの他のアッセイの場合と比較した。アッセイ１は、きわめてよく特徴が明らかにされ、ある時期国際的評価において信頼できる標準と考えられたホームメイドラジオイムノアッセイ（RIA）とした。このアッセイは以前に、Malmらの”Changes in the plasma levels of Vitamin K−dependent protein C and S and C4b−binding protein during pregnancy and oral contraception”, Brit. J. Haematol. 68：437−443, 1988に記載されている。このアッセイでは、放射標識プロテインＳおよびポリクローナルプロテインＳ抗血清を包含する標準ＲＩＡ操作によって総プロテインＳおよび遊離プロテインＳが測定される。総プロテインＳは血漿希釈液で直接測定されるが、遊離のプロテインＳは血漿中のプロテインＳ／Ｃ4ＢＰ複合体を５％ポリエチレングリコール（PEG）6000で沈殿させたのち測定される。このアッセイは時間がかかり（通常２日以上）、労力を要する。比較に用いられた第２のアッセイは、２種のモノクローナル抗体を使用する市販のELISAであり、この場合の１つの抗体は遊離プロテインＳに特異的で、捕獲抗体として（すなわち実施例２のアッセイにおけるＣ4ＢＰと同じ目的で）使用される。このアッセイはＳｔａｇｏから入手可能であり、Amiralならびに共同研究者らによる報告”New direct assay of free protein S antigen using two distinct monoclonal antibodies specific for the free form”,Blood Coaguration and Fibrinolysis, 5：179−186, 1994に記載されている。
Ａ．比較した患者群
１．血漿プロテインＳレベルの評価のために、ＲＩＡを使用して分析している
0004224138.tif 000009
の大学病院のCoaguration laboratoryからの血漿サンプル（ｎ＝220）を用いた。患者の大部分は深部静脈血栓症の病歴をもつ患者であった。
２．プロテインＳ欠乏家族のメンバー。多くのプロテインＳ欠乏家族が上述のCoaguration laboratoryにおいてＲＩＡによって評価され、その結果は
0004224138.tif 000010
および共同研究者らによって”Evaluation of the relationship between protein S and C4b−binding protein isoforms in hereditary protein S deficiency demonstrating type I and type III deficiencies to be phenotypic variants of the same genetic disease”, Blood 85：3524-3531, 1995に報告されている。これらの家族からの150の血漿サンプルをランダムに選択し、実施例２のアッセイならびにDiagnostica Stagoからの遊離プロテインＳのAsserachromeアッセイで試験した。さらに、その結果をインハウスＲＩＡで得られた結果と比較した。
３．長期間にわたってビタミンＫ−アンタゴニスト（ワルファリン）による経口抗凝固剤処置を受けている患者（プロテインＳの欠乏症のあるものまたはないもの）からの血漿サンプル。血栓症の病相を有する患者からの61サンプルを含み、23例の患者はプロテインＳ欠乏症を有する家族からの患者であった。
Ｂ．比較試験の結果
１．実施例２に開示された遊離プロテインＳのアッセイで得られた値を、遊離プロテインＳのインハウスＲＩＡによって得られた結果と比較した。いずれのアッセイについても、遊離プロテインＳは遊離プロテインＳの正常レベルの％として表した。線型回帰分析（図２）から、２つのアッセイが同じパラメーターを測定し、それらがよく相関することが明らかである。線型回帰分析式はｙ＝0.984x＋1.62、Ｒ2＝0.88（Ｒ＝0.94）Ｐ＝0.0001であった。域外値はなかった。
２．プロテインＳの欠乏が分かっている家族に属する個体からの血漿サンプル（ｎ＝155）を３種のアッセイすなわち実施例２の本発明のアッセイ、StagoアッセイおよびインハウスＲＩＡで試験した。図３および図４に例示するように、相関は優れていて、Ｒ2値は0.95に近かった。３種のすべてのアッセイが同じパラメーターを測定し、プロテインＳの欠乏が疑われる個体の同定に同等に有効であった。Stagoアッセイと比較した場合、回帰式はｙ＝1.218ｘ−16.42（ｘ軸に対する本アッセイ）であり、これは本発明のアッセイよりも急峻な用量−応答曲線を示す。さらに、本発明のアッセイは低値についてより正確で、０％に近い低値を与えたのに対し、Stagoアッセイでは５％未満の値を与えたサンプルはなかった。かなり負に寄った裁片−16.42を示した。一方本発明のアッセイをインハウスＲＩＡと比較すると截片は正（＋9.526）（回帰式はｙ＝1.024ｘ＋9.526）であった。この比較では傾斜は１に近かった。
３．経口抗凝固剤処置を受けている患者で得られた相関は満足できるものであった。ＲＩＡと比較した試験では回帰式はｙ＝0.88ｘ−２、Ｒ2＝0.86であった。ｙはＲＩＡからの値を意味する。
上記実施例１〜４から、Ｃ4ＢＰは遊離プロテインＳのアッセイにおける捕獲リガンドとして適当であり、このアッセイは従来技術のアッセイと比べて少なくとも同様に高い精度を有することが明らかである。さらにＣ4ＢＰを包含する本発明のアッセイは時間を要せず、定常的に実施するのが容易である。
以下の実施例５は、プロテインＳにおけるＣ4ＢＰの結合部位と特異的に免疫反応する抗体を捕獲リガンドとして、および本発明のプロテインＳ関連ポリペプチドを使用する本発明の実施態様に関する。実施例５においては、本発明のポリペプチドのＣ4ＢＰへの結合およびプロテインＳのＣ4ＢＰの結合のそれらによる阻害能力、したがって、プロテインＳ／Ｃ4ＢＰ相互作用を本発明の範囲外のポリペプチド（一部の従来技術のポリペプチドを含む）と比較して検討した。上述の性質を有する本発明のポリペプチドは、本発明のアッセイで捕獲リガンドとして使用できる本発明の抗体を産生するための免疫原または抗原として有用である。
実施例５．プロテインＳ関連ポリペプチド
Ａ．ペプチド合成および精製
表１に掲げたプロテインＳ関連線状ペプチドは、MilliGen 950 Plusシンセサイザーにより「連続フローペプチド合成」として、活性エステルたとえばペンタフルオロフェニルエステルでのＦmoc化学を用いて合成した。これらのペプチドは以下の表１に掲げたように、それらのポリペプチド記号によって呼ぶことにする。表１にはまた、各ペプチドのアミノ酸残基および成熟プロテインＳの相当するアミノ酸配列番号を掲げる。合成に際して最初のアミノ酸（Ｃ末端アミノ酸）はMilliporeからの樹脂PEF−PS支持体（登録商標；ポリエチレングリコールポリスチレン）にカップリングした。合成後、樹脂を濯いで乾燥した。ペプチドは、ペプチドのアミノ酸組成に応じて92〜95％ＴＦＡ含有の異なるスカベンジャーを用い、Ｎ2気体下暗所で２時間切断して樹脂から放出させた。樹脂をろ過して除き、濃ＴＦＡで洗浄した。濃縮後、冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させ４回洗浄した。エーテルを蒸発させ、ペプチドを0.1％TFA／H2O（または0.1％TFAに溶解しにくいSL１、SL２、SL４、SL６およびSL７ペプチドについては50〜70％酢酸）に溶解させた。ペプチドをＨＰＬＣ（Waters 600E Systemコントローラー、Waters 486 Tunable Absorbance検出器、Ｃ８カラム、Kromasil 5、100A C8、250mm×21.2mm）上にて、Ａ）0.1％TFA／H2O、そしてＢ）0.1％TFA／80％アセトニトリル／H2Oの直線勾配を用いて精製した。ペプチドはSpeedvacによって濃縮し、凍結乾燥した。
0004224138.tif 000011
Ｂ．ペプチドのフォールディング
ペプチドＢＤ４およびＢＤ６は、ＨＰＬＣ精製（上述の通り）の前に還元した（0.1Ｍ Tris pH8.3中0.1Ｍ DTTおよび６Ｍグアニジン塩酸塩とともに室温で２時間、ペプチド濃度10mg／ml）。精製後、各ペプチド中の２つのシステイン間にジスルフィド結合が形成されるようにそれらをフォールディングした（0.1Ｍ Tris pH8.3中１mM EDTA、３mMシステイン塩酸塩および0.3mMシスチン、Ｎ2気体下室温で16時間、ペプチド濃度0.1mg／ml）。フォールディング後、ペプチドは２回目のＨＰＬＣ精製（上述したのと同様にして）に付した。
Ｃ．化学剤
化学剤はすべて最高級の市販品を用いた。緩衝液およびすべての他の溶液は、使用前にオートクレーブ処理または滅菌ろ過を行った。実験を通じて、滅菌実験用具を使用した。本実施例においは、オートクレーブ処理した緩衝液に以下の略号を使用する。ＴＢＳ＝50mM Tris、0.15Ｍ NaCl、２mM CaCl2、pHをＨＣlにより7.5にセット；TBS／Tween＝0.5％Tweenを加えたTBS；TBS／NaN3＝0.02％NaN3を添加したTBS；ＨＣ＝10mM Hepes、0.15Ｍ NaCl、3.4Ｍ EDTA，0.005％Tween 20、pH7.4；ＰＢＳ＝0.15Ｍ NaClを含有する0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0である。センサーチップCM５、Ｎ−ヒドロキシスキシンイミド（NHS）、Ｎ−エチルN′−（3′−ジエチルアミノプロピル）−カルボキシジイミド（EDC）、およびエタノールアミン塩酸塩を含有するアミンカップリングキットはPharmacia Biosensor AB（Uppsala, Sweden）からの製品である。界面活性剤、Tween 20はRiedel de Haenから入手した。NHS−LC−ビオチン化キットはPierce（Rockford, Illinois）から入手した。ペプチド合成のための化学剤はMilliporeの製品とした。
Ｄ．マイクロタイター中におけるプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用のペプチドによる阻害
マイクロタイタープレートは、Ｃ4ＢＰ 50μl／ウエル、0.075Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中10μg／mlでコートした。プレートを一夜４℃でインキュベートし、次いで0.1％Tween 20を含有するＴＢＳ、pH7.5により洗浄した。反応を停止させたのち（TBS：pH8.0，0.05％Tween 20，３％魚ゼラチンおよび0.02％NaN3含有、100μl／ウエル，30分）洗浄し、10mM ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ中ペプチド（0.1〜3000ｍＭ）または血漿精製ヒトプロテインＳ（0.13〜1333mM）の濃度を増大させながら痕跡量の125Ｉ−標識プロテインＳとともに最終容量が50μlになるように加え、４℃に一夜放置した。次いでウエルを洗浄し、結合プロテインＳの量をγ−カウンターを用いて検出した。
Ｅ．表面プラスモン共鳴試験によるプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用のペプチド阻害
表面プラスモン共鳴試験は、BIAcore装置（登録商標，Pharmacia Biosensor AB）を用いて実施した。センサーチップのデキストラン被覆金表面へのＣ4ＢＰの固定化は、フロー緩衝液としてＨＣを用い、フロー速度５μl／分で実施した。最初に等容量の0.1Ｍ ＮＨＳと0.1Ｍ ＥＤＣを混合し、次いで30μlのこの混合物をセンサーチップ上に流してカルボキシメチル化デキストランを活性化した。次いでＣ4ＢＰをセンサーチップ上に注入し（10mM NaOAc，pH4.75中60μg／ml溶液40μl）、未反応ＮＨＳ−エステル基を１Ｍエタノールアミン（pH8.5）15μlによってブロックした。システムは0.1Ｍ HCl 15μlを添加して非共有結合で結合した分子を除去して再生させた。Ｃ4ＢＰの固定化量は、8000RUであった。プロテインＳの会合は、ＨＣ緩衝液中50nMのヒトプロテインＳを45分間１分あたり１μlで連続的に流してモニターした。各ペプチドのプロテインＳ結合の阻害能は、プロテインＳとペプチドの混合物についてＣ4ＢＰの会合を追跡することによって検討した。BIAcore(R)で結合物質の総量が測定される。ペプチドはプロテインＳより25倍小さく、ペプチド結合によるプロテインＳ結合の阻害は会合相に観察された応答を激しく低下させる。結合プロテインＳ％、Ｘは次のように計算された。
Ｘ＝（Ｓ−0.04 Smax）／0.96 Ｓmax
式中、Ｓは測定された応答であり、Ｓmaxはペプチドの不存在下に得られた応答である。
Ｆ．実験結果
（１）平衡アッセイにおけるプロテインS−C4BP相互作用のペプチド阻害
Ｄ項に示されたように、合成ペプヂドを、それらが固定化Ｃ4ＢＰに対する125Ｉ−標識プロテインＳトレーサーの結合を置換する能力について試験した（図５Ａ）。SL２、SL６およびSL７、すなわち本発明のペプチドはプロテインＳトレーサーのＣ4ＢＰへの結合を完全に阻害することが見出されたが、他のペプチドはプロテインＳ／Ｃ4ＢＰ相互作用に全く影響しなかった。３種の阻害ペプチドでは、血漿精製ヒトプロテインＳ約２μMに比較して、100〜200μＭで50％最大阻害が認められた。
（２）表面プラズモナンスアッセイによるプロテインＳ−C4BPの相互作用のペプチド阻害
Ｅ項に示されたように、合成ペプチドがＣ4ＢＰに対するヒトプロテインＳの結合を阻害する能力はまたBIAcore(R)により表面プラスモン共鳴を用いて検討した。６種のペプチド（SL１、SL３、SL４、SL５、BD４およびBD６）については、プロテインＳ単独の場合と同じ応答が、ペプチドをプロテインＳに対して2000倍過剰（100μMペプチド，50nMプロテインＳ）にしても観察された。しかしながら、３種のペプチド、SL２、SL６およびSL７、すなわち本発明のペプチドはＣ4ＢＰに対するプロテインＳの結合を30〜120μＭのペプチド濃度で最大阻害の50％で防止した（図５Ｂ）。
阻害作用を有する３種のすべてのペプチド、すなわち本発明のペプチド中には残基447〜460が存在するが、上記試験で阻害作用のないペプチドにはその残基はない。
上記実験の結果は図５Ａおよび図５Ｂに示す。これらの図ではプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用のペプチド阻害は、表１に掲げた９種のペプチドの濃度に対する結合したプロテインＳの量（ペプチドの不存在下に結合する量に対して）として示す。（○）SL１、（◆）SL２、（□）SL３、（＋）SL４、（◇）SL５、（●）SL６、（▼）SL７、（△）BD４および（▽）BD６。図５Ａには、マイクロタイターウエル中固定化Ｃ4ＢＰおよび放射標識ヒトプロテインＳを用いた平衡結合アッセイからの結果を示す。このパネルには、放射標識プロテインＳと比較した非標識プロテインＳのデータ（▲）も示す。図５Ｂには、BIAcore(R)センサーチップ上表面プラスモン共鳴アッセイからの結果を示す。結合したプロテインＳの量Ｘは観察されたシグナル強度Ｓから、ペプチドＳmaxの不存在下の最大シグナル強度と比較し、Ｘ＝（Ｓ−0.04）／0.96Ｓmaxとして計算した。
上記結果から、本発明のペプチド、すなわち残基447〜460からなるペプチドのみがプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用を阻害できることが明らかである（SL２＝439〜460、SL６＝447〜468およびSL７＝435〜468）。蛍光分極滴定（結果は示していない）では、これらのペプチドが解離定数：ＫD≦１μMを有するＣ4ＢＰと直接相互作用することを示唆している。したがってペプチド−Ｃ4ＢＰ複合体の解離定数は、Ｃａ2+−遊離プロテインＳとＣ4ＢＰの解離定数（ＫD＝6.5nM，Heら，1996）よりもよりも高々130倍以上であり、Ｃ4ＢＰに対する放射標識プロテインＳの結合の50％最大阻害を得るのにプロテインＳより50〜100倍多いペプチドを要するマイクロタイターウエル中での阻害実験（ＥＤＴＡ含有緩衝液中カルシウムの不存在下に行われる）を考慮すれば合理的な結果である。ペプチドとタンパク質について観察されるＫDの差の一部はタンパク質の翻訳後修飾によるものと考えられる。
しかも、本発明のペプチドは、従来技術においてＣ4ＢＰの結合部位と考えられる位置として報告された配列に接近している成熟プロテインＳのアミノ酸配列に相当するアミノ酸残基配列から構成されるものであるが、このような従来技術の配列（BD４、残基405〜437、およびBD６、残基595〜628）を合成して上述の試験でプロテインＳ−Ｃ4ＢＰ相互作用の阻害を試験した場合には、プロテインＳに対して2000倍過剰に用いても阻害作用は認められなかった。
配列表
0004224138.tif 000012
0004224138.tif 000013
0004224138.tif 000014
0004224138.tif 000015
【図１】
0004224138.tif 000016
【図２】
0004224138.tif 000017
【図３】
0004224138.tif 000018
【図４】
0004224138.tif 000019
【図５】
0004224138.tif 000020
0004224138.tif 000021