(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
X1-X2-X3-Leu-X4-Glu-Leu-X5-X6-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-
Arg-Thr-Asn-X7-Z3［配列番号２７］
［式中、（ａ） X1は、基 Z1-Ser-Thr-Z2-Val-Leu［配列番号２８］であり、ここに、Z1は、LeuまたはそのN-アシル化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であるか、またはZ1はアルカノイル基であって；
Z2は、Ala、SerおよびCysよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｂ） X2は、GlyまたはAibよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｃ） X3は、 Arg、およびLysのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｄ） X4は、基Ser-Glnであり；
（ｅ） X5は、HisおよびAibよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｆ） X6は、Arg、およびLysのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｇ） X7は、
（i） Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号２９］
（ii） Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３０］
よりなる群から選択される６つのアミノ酸残基を有する基であって；
（ｈ） Z3はNH2であり；
但し、該化合物は、配列番号１４ないし２６のいずれの式も有しない］
で表される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号１］；
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Aib-
Lys(For) -Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-
Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-
Pro［配列番号２］；
Ac-Leu-Ser-Thr-Ser-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号３］；
Leu-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号４］；
Leu-Ser-Thr-Ser-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号５］；
Ac-Leu-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Tyr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号６］；
Ac-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号７］；
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-
Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-
Tyr［配列番号１０］；および
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-
Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Asn-Tyr-
Tyr［配列番号１１］
よりなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１または２記載の化合物を医薬上許容される担体に含む組成物。
【請求項４】
請求項１または２記載の化合物の治療上有効量を含む、対象における糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
該糖尿病がＩ型糖尿病である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
該糖尿病がII型糖尿病である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１または２記載の化合物の治療上有効量を含む、対象における胃腸運動を有益に調節するための医薬組成物。
【請求項８】
胃腸運動の該有益な調節が、胃内容排泄を遅延させることを含む請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１または２記載の化合物の治療上有効量を含む、対象における損なわれたグルコース耐性、食後の高血糖、肥満、および症候群Ｘよりなる群から選択される障害を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アミリンのある種の活性を阻害するが、また、他のアミリン活性に関してアミリン・アゴニストとしても作用する化合物に指向される。これらの化合物は、限定するものではないが、Ｉ型糖尿病およびII型糖尿病を含む真性糖尿病、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性および症候群Ｘを含めた哺乳動物の食物代謝における妨害を治療するのに有用である。
【０００２】
発明の背景および序文
真性糖尿病は、血中グルコースの慢性的に上昇したレベル（高血糖症）の存在によって定義される重篤な代謝障害である。高血糖症のこの状態は、ペプチドホルモンであるインスリンの活性の相対的なまたは絶対的な損失の結果である。インスリンは、膵臓のベータ細胞によって産生され分泌される。インスリンは、グルコース利用、蛋白質合成、およびグリコーゲンとしての炭水化物エネルギーの形成および貯蔵を促進することが報告されている。グルコースは、重合したグルコースの形態であるグリコーゲンとして体内に貯蔵され、代謝の必要があるとグルコースに逆変換できる。通常の条件下では、インスリンは、ベース速度にておよびグルコース刺激に続いての増強された速度にての両者で分泌され、グルコースのグリコーゲンへの変換によって代謝的ホメオスタシスを維持する。
【０００３】
真性糖尿病なる用語はいくつかの異なる高血糖状態を含む。これらの状態は、Ｉ型（インスリン依存性真性糖尿病またはＩＤＤＭ）およびII型（インスリン非依存性真性糖尿病またはＮＩＤＤＭ）糖尿病を含む。Ｉ型糖尿病の個人に存在する高血糖症は、不十分な、低下したまたは存在しないインスリンレベルと関連付けられ、それは生理学的範囲内の血中グルコースレベルを維持するために不十分である。Ｉ型糖尿病の治療は、一般的に非経口経路による補充用量のインスリンの投与を含む。II型糖尿病の個人に存在する高血糖症は、最初には正常レベルまたは上昇したレベルのインスリンと関連し；しかしながら、これらの個人は、末梢組織および肝臓におけるインスリン抵抗性の状態のために、および疾患が進むにつれ、インスリンの分泌を担う膵臓β細胞の進行性の悪化のために代謝的ホメオスタシスを維持できなくなる。かくして、II型糖尿病の初期治療は、スルホニル尿素のごとき経口低血糖剤での治療によって増加した食事およびライフスタイルの変化に基づくであろう。インスリン治療は、しかしながら、特に該疾患の後期の状態において、高血糖のいくらかのコントロールを生じさせ、疾患の合併症を最小にすることを企ててしばしば必要とされる。
【０００４】
アミリンの構造および生物学は、従前に概説されている。例えば、Young、Current Opinion in Endocrinology and Diabetes、４：２８２-２９０(１９９７)；GaetaおよびRink、Med. Chem. Res. 、３：４８３-４９０(１９９４)；およびPittnerら、J. Cell. Biochem.、５５S：１９-２８(１９９４)参照。アミリンは、３７個のアミノ酸のペプチドホルモンである。それは、死亡したヒトII型糖尿病患者の膵臓の小島においてアミロイド沈着物の主成分として単離、精製され、化学的に特徴付けられた(Cooperら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４：８６２８-８６３２(１９８７))。アミリン分子は、２つの重要な翻訳後修飾：Ｃ末端をアミド化し、すなわち第３７番目の残基をチロシンアミドとし、次いで、２および７位のシステインを架橋させて、分子内Ｎ末端ループを形成する、を有し、この双方が十分な生物学的活性につき重要である(Cooperら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５：７７６３-７７６６(１９８８))。アミリンは、１９９４年１１月２２日に発行された米国特許番号第５,３６７,０５２号の主題である。
【０００５】
Ｉ型糖尿病および後期ステージのII型糖尿病において、アミリンが欠乏していることが示され、インスリンと組み合せた置き換えが、インスリン依存性糖尿病の全形態におけるインスリン単独を超える好ましい処置として提唱されいる。真性糖尿病の治療でのアミリンおよびアミリン・アゴニストの使用は、１９９２年１２月２９日に発行された米国特許番号第５,１７５,１４５号の主題である。アミリンおよびアミリン＋インスリンを含有する医薬組成物は、１９９２年６月２３日に発行された米国特許番号第５,１２４,３１４号に記載されている。
【０００６】
過剰なアミリン作用は、早期のステージのII型糖尿病の重要な特徴を模倣すると言われ、アミリン遮断が新規な治療戦略として提唱された。アミリンが骨格筋中のグリコーゲンへの標識グルコースの基本的なおよびインスリン刺激の取り込みを共に低下させることが１９９３年１１月３０日に発行された米国特許第５,２６６,５６１号に開示されている。また、後者の効果は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）によって占められることも開示された(LeightonおよびCooper、Nature、３３５：６３２-６３５(１９８８)も参照)。アミリンおよびＣＧＲＰはほぼ等効力で、１ないし１０ｎＭにて著しい活性を示す。また、アミリンは、骨格筋へのグルコースのインスリン刺激した取り込みを低下させ、グリコーゲン含量を低下させると報告されている(Youngら、Amer. J. Physiol. 、２５９：４５７４６-１(１９９０))。アミリン・アンタゴニストでのII型糖尿病およびインスリン抵抗性の治療は開示されている。
【０００７】
アミリンは、膵臓ベータ細胞中で初期合成され、グルコースおよびアルギニンのごとき栄養刺激に応答して分泌される。クローン化ベータ細胞腫瘍系(Mooreら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 、１７９(１)(１９９１)および灌流したラット膵臓(Ogawaら、J. Clin. Invest.、８５：９７３-９７６(１９９０))での研究は、１０ないし２０分間の短いパルス、グルコースおよびアルギニンのごとき栄養分泌促進剤が、アミリンならびにインスリンの遊離を刺激することを示した。分泌された蛋白質のアミリン：インスリンのモル比は、約０.０１ないし０.４の調製物間で変わるが、いずれの調製物においても急性刺激で大きくは変わらないようである。しかしながら、グルコースの上昇による延長した刺激の間、アミリン：インスリンの比は、漸増できる(Gedulinら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１８０(１)：７８２-７８９(１９９１))。かくして、アミリンおよびインスリンは、常に一定比率で分泌されるとは限らない。
【０００８】
アミリンのある種の作用が、ＣＧＲＰおよびカルシトニンの非代謝作用と同様であり、；しかしながら、この最近確認された蛋白質の研究中に見出されたアミリンの代謝作用が、その初期の生物学的役割を反映しているらしいことが見出され報告された。これらの代謝作用の少なくともいくらかは、著しい血管拡張する用量においてもＣＧＲＰと類似する。(例えば、LeightonおよびCooper、Nature、３３５：６３２-６３５(１９８８))；Molinaら、Diabetes、３９：２６０-２６５(１９９０)参照)。
【０００９】
アミリンの最初に見出された作用は、ラット骨格筋中でのグリコーゲンへのグルコースのインスリン刺激した取り込みの低下(LeightonおよびCooper、Nature、３３５：６３２-６３５(１９８８))であり；かくして、その筋肉は「インスリン抵抗性」である。ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにてのラットヒラメ筋での続いての研究は、アミリンがグリコーゲン合成活性を低下させ、不活性なｂ形態から活性なａ形態へのグリコーゲンホスホリラーゼの変換を促進し、（インスリン存在下または不存在下にて）グリコーゲンの正味の損失を促進し、グルコース-６-リン酸レベルを増大させ、乳酸塩産生を増大できることを示した(例えば、１９９２年７月２３日に発行された国際特許出願番号PCT／US９２／００１８５（国際公開WO ９２／１１８６３）参照）。アミリンそれ自体は、グルコース輸送に影響しないようである(例えば、Pittnerら、FEBS Letts. ３６５(１)：９８-１００(１９９５))。アミリンおよびインスリンの用量反応関連の研究は、アミリンが骨格筋においてインスリンの非競合的または機能的アンタゴニストとして働くことを示す(Youngら； Am. J. Physiol. 、２６３(２)：E２７４-E２８１(１９９２))。アミリンが、その受容体に対するインスリン結合、またはインスリン受容体チロシンキナーゼの続いての活性化を妨げるという証拠はない(Follettら、Clinical Research、３９(１)：３９A(１９９１))；Koopmansら、Diabetologia、３４：２１８-２２４(１９９１))。
【００１０】
アミリンは、原形質膜に存在する受容体を介して作用すると考えられている。アミリンおよびＣＧＲＰならびに選択的アンタゴニストの効果の研究は、アミリンがＣＧＲＰ受容体で最初に作用するという他の研究者の結論（例えば、Chantryら、Biochem. J. ２７７：１３９-１４３(１９９１))；Zhuら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１７７(２)：７７１-７７６(１９９１))とは対照的に、アミリンがそれ自身の受容体を介して作用することを報告した(Beaumontら、Br. J. Pharmacol.、１１５(５)：７１３ -７１５( １９９５)；Wangら、FEBS Letts.、２１９：１９５-１９８(１９９１ ｂ))。アミリン受容体、およびアミリン・アゴニストおよびアンタゴニスト化合物のスクリーニングおよびアッセイ方法におけるそれらの使用は、１９９３年１１月２３日に発行された米国特許第５,２６４,３７２号に記載されている。
【００１１】
アミリンはｉｎ ｖｉｖｏにて肝臓食物代謝に対して効果を示すが、アミリン作用が単離された肝細胞または灌流した肝臓において見られるとの一般的な合意はない。入手可能なデータは、アミリンが肝臓のグリコーゲン分解を促進するとの考えを支持せず、すなわち、グルカゴンのように作用しない(例えば、Stephensら、Diabetes、４０：３９５-４００(１９９１)；Gomez-Foixら、Biochem J. 、２７６：６０７-６１０(１９９１))。アミリンが肝臓に作用して、グリコーゲンへの乳酸塩の変換を促進し、グルカゴンによって自由にできるグルコース量を増強することを示唆する。このように、アミリンは、筋肉中のその異化作用とは対照的に、肝臓中のインスリンに対して同化パートナーとして作用できる。
【００１２】
脂肪細胞において、筋肉のその作用に比較して、アミリンは、インスリン刺激したグルコースの取り込み、トリグリセリドへのグルコースの取り込み、ＣＯ2産生(Cooperら、Proc. Natl. Acad. Sci.、８５：７７６３-７７６６(１９８８))  エピネフリン刺激した脂肪分解または脂肪分解のインスリン阻害(LupienおよびYoung、「Diabetes Nutrition and Metabolism-Clinical and Experimental」、vol. ６(１)、１３１８頁(１９９３年２月))に対して検出可能な作用を有しない。かくして、アミリンは、骨格筋に対する直接作用、肝臓に対する（基質の供給を介して）著しく間接的な効果およびおそらく直接的効果で組織特異的効果を発揮するが、含脂肪細胞は、アミリンの存在または不存在に対してわかりにくい。
また、アミリンがインスリンの分泌に著しい効果を有し得ることも報告されている。灌流した膵臓(Silvestreら、Reg. Pept.、３１：２３-３１(１９９０))において、および無傷なラット(Youngら、Mol. Cell. Endocrinol.、８４：R１-R５(１９９２))において、いくらかの実験は、アミリンがインスリン分泌を阻害することを示す。しかしながら、他の研究者は、単離されたβ細胞、単離された小島に対してまたは全動物においてアミリンの効果を検出できなかった(Broderickら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 、１７７：９３２-９３８(１９９１)およびその中の参考文献参照)。
【００１３】
また、アミリンおよびアミリン・アゴニストは、グルカゴン分泌を抑制することが示されている。グルカゴン分泌とは別に影響するであろう影響がコントロールされる場合（血漿中グルコース、インスリンおよび血圧）に、アミリンはラットにおいてアルギニン対するグルカゴン応答を抑制すると報告された。Gedulinら、Metabolism、４６：６７-７０(１９９７)。アミリンアナログであるプラムリンチド（pramlintide）は、Ｉ型糖尿病の対象のグリコーゲン濃度における食後の急上昇を消失させると報告されている。Finemanら、Diabetes、４０：３０A(１９９７)。プラムリンチドおよび他のアミリン・アゴニストアナログは、１９９７年１１月１１日に発行された米国特許第５,６８６,４１１号に記載され特許請求されている。アミリンのグルカゴン静止作用は、単離され、灌流された膵臓においては示されておらず(Silvestreら、Regul. Pept. 、３１：２３-３１(１９９０)）、それはアミリンが特別な膵臓機構を介してそのグルカゴン静止作用を発揮できることを示す。インシュリン誘導した低血糖症の間のヒトにおいて、グルカゴン分泌の抑制がアミリンアナログのプラムリンチドで引き起こされないという観察(Nyholmら、J. Clin. Endocrin. Metab.、８１：１０６３-１０８９(１４９６)；Koltermanら、Diabetologia、３９：４９２-４９９(１９９６))は、この効果がα細胞に対して直接的ではなく、中枢的に媒介できるという考えをさらに支持する。
【００１４】
アミリンおよびアミリン・アゴニストは、ラット(Youngら、Diabetologia ３８(６)：６４２-６４８(１９９５))、イヌ(Brownら、Diabetes ４３(suppl １)：１７２A(１９９４))およびヒト(Macdonaldら、Diabetologia ３８(Suppl １)：A３２(アブストラクト１１８)(１９９５))における胃内容排泄を強力に阻害する。胃内容排泄は、アミリン欠乏のＩ型糖尿病ＢＢラット(Youngら、Diabetologia、前記；Nowakら、J. Lab. Clin. Mad. 、１２３(１)：１１０-６(１９９４))において、およびアミリン・アンタゴニストであるＡＣ１８７で処置したラット(Gedulinら、Diabetologia、３８(Suppl １)：A２４４(１９９５)）において促進されると報告されている。胃内容排泄に対するアミリンの効果は、生理的である（通常に循環する濃度にて効果をもたらす）らしい。
【００１５】
アミリンの非代謝作用は、ＣＧＲＰ血管受容体との相互作用によって媒介できる血管拡張作用を含む。報告されたｉｎ ｖｉｖｏ試験は、アミリンが、血管拡張剤としてのＣＧＲＰより少なくとも約１０ないし１０００倍小さな効力であることを示唆する(Brainら、Eur. J. Pharmacol.、１８３：２２２１(１９９０)；Wangら、FEBS Letts. 、２９１：１９５-１９８(１９９１))。
【００１６】
脳内に注射されたまたは非経口投与されたアミリンは、食物摂取（例えば、Chanceら、Brain Res. 、５３９：３５２-３５４(１９９１)）、ＣＧＲＰおよびカルシトニンと共有する作用を抑制すると報告されている。この作用を媒介する細胞での有効濃度は知られていない。また、アミリンは、単離された破骨細胞に対して細胞を休止させ、ｉｎ ｖｉｖｏにてページェット病のラット、ウサギおよびヒトにおいて２０％まで血漿中カルシウムを低下させる両効果を有することが報告された(Zaidiら、Trends in Endocrinal. and Metab. 、４：２５５-２５９(１９９３)参照）。入手可能なデータから、アミリンは、これらの作用につきヒトカルシトニンより１０ないし３０倍小さな効力であるらしい。興味深いことには、アミリンが、破骨細胞のｃＡＭＰ産生を増加させるが細胞質Ｃａ2+を増加させず、一方、カルシトニンは両者を増加させるようである(Alamら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 、１７９(１)：１３４-１３９(１９９１))。アミリンは単一の受容体タイプを介して作用するが、カルシトニンは２つの受容体を介して作用でき、それらのうちの一つはアミリン活性に共通することが、確立されてはいないが、示唆された。
【００１７】
また、驚くべきことには、その前記の腎血管拡張および他の特性ゆえに、アミリンは、血圧のいずれの妨害をも避けるように皮下的に与えらる場合に無傷のラットにおける血漿中レニン活性を著しく増大させる。低下した血圧がレニン遊離に対する強力な刺激でるために、この後者の点は重要である。ＣＧＲＰおよび／またはカルシトニン受容体に比較してアミリン受容体に選択的なものを含めたアミリン受容体アンタゴニストのごときアミリン・アンタゴニストは、血漿中レニン活性のアミリン誘発の上昇をブロックするために用いることができる。レニン関連障害を治療するためのアミリン・アンタゴニストの使用は、１９９４年１２月２７日に発行された米国特許第５,３７６,６３８号に記載されている。
【００１８】
正常なヒトでは、絶食時のアミリンレベルは１ないし１０ｐＭであり、食後またはグルコース投与後のレベルは、５ないし２０ｐＭであると報告されている(例えば、Kodaら、The Lancet、３３９：１１７９-１１８０(１９９２)参照)。肥満のインスリン抵抗性の個人において、食事後のアミリンレベルはより高くなり、約５０ｐＭまで達する。比較では、絶食および食後インスリンについての値は２０ないし５０ｐＭであり、健康な人々においては各々１００ないし３００ｐＭであり、インスリン抵抗性の人々においてはおそらく３ないし４倍高レベルである。Ｉ型糖尿病において、ベータ細胞が破壊された場合、アミリンレベルは、検出レベル以下であり、グルコースに応答して上昇しない(Kodaら、The Lancet、３３９：１１７９-１１８０(１９９２))。正常なマウスおよびラットにおいて、基本的なアミリンレベルは、３０ないし１００ｐＭと報告されているが、６００ｐＭまでの値がある種のインスリン抵抗性の糖尿病の種の齧歯類において測定された(例えば、Huangら、Hypertension、１９：Ｉ-１０１-Ｉ-１０９(１９９１))。
【００１９】
哺乳類において、カルシトニンは、骨髄ターンオーバーおよびカルシウム代謝の調節に機能する。血清中カルシウムの上昇によって甲状腺から遊離されるカルシトニンは、骨および他の器官に対して作用し、血清中カルシウムレベルを低下させる傾向にある。カルシトニンは、破骨細胞活性を阻害し、骨吸収を低下させ、それによって血清中カルシウムレベルを低下させる。また、カルシトニンは、腎臓によって、カルシウム、リン酸塩および電解質の排泄を変更するが、これの生理学的有意さは報告されていない。カルシトニンは、カルシウム代謝の障害および痛みの治療に臨床的に用いられ、哺乳動物におけるグルコースレベルの増大とのその関連性は、多様な報告の主題であった。例えば、Azriaら、「Calcitonin -- physiological and Pharmacologlcal Aspects」、pp. ２４-２５(springer-Verlag １９８９)参照。真性糖尿病の治療におけるカルシトニンの使用は、１９９４年６月１４日に発行された米国特許第５,３２１,００８号および１９９６年４月１６日に発行された米国特許第５,５０８,２６０号に記載されている。
【００２０】
カルシトニン誘導体であると報告されたある種の化合物は、カルシウム血漿レベルを低下させ、骨代謝に影響すると言われている（Cardinauxらに対する米国特許第４,７５８,５５０号）。
【００２１】
発明の概要
本発明は、哺乳動物におけるアミリンによって媒介される代謝効果を調節する活性を有する新規な化合物を提供する。驚くべきことには、これらの化合物は、アミリンのある種の効果を阻害し、また、他のアミリンの効果についてアミリン・アゴニストとして作用する。
【００２２】
因子中とりわけ、本発明は、本発明の化合物がＣＧＲＰ受容体にて比較的弱い結合で結合した混合した、アミリン拮抗および作動の生物学的プロフィールを示すという発明者らの予期されない発見に基づいている。特に、これらの化合物は、筋肉におけるアミリン作用と関連したグルカゴン関連応答をブロックするアミリン・アンタゴニストとして作用し、また、胃内容排泄の阻害においてアミリン・アゴニストとして作用すると決定された。生物学的効果のこの驚くべき組合せのために、これらの化合物は、胃内容排泄の阻害に対するその効果のために、Ｉ型糖尿病を含めた糖尿病を治療するのに有用であり、また、グルコース代謝に対するその効果のために、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、II型糖尿病、特に早期のII型糖尿病および症候群Ｘを治療するのに有用であろう。さらに、血漿中カルシウムレベルに対するその作用のために、当該化合物は、特に有利であろう。
【００２３】
また、本発明の化合物は、受容体の特徴付け、例えば、アミリンが結合する受容体の特徴付けに関連する研究を行うのに有用である。さらに、当該化合物は、後記の実施例に記載されたアッセイにおける試験化合物および対照試料として有用である。
【００２４】
本発明により、式：
X1-X2-X3-Leu-X4-Glu-Leu-X5-X6-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-X7-Z3［配列番号２７］
［式中、（ａ） X1は、（i）Leu-Leu、Val-Leu、Ile-Leu、tert-Leu-Leu、Nle-LeuおよびAla-ThrおよびそのN-アシル化誘導体よりなる群から選択される２つのアミノ酸残基の基であり；または（ii）基 Z1-Ser-Thr-Z2-Val-Leu［配列番号２８］、ここに、Z1は、Leu、Val、Ile、tert-Leu、Nva、AbuおよびNleまたはそのN-アシル化誘導体から選択されるアミノ酸残基であるか、またはZ1はアルカノイル基であって；Z2は、Ala、Ser、CysおよびThrよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｂ） X2は、Gly、Glu、AsnまたはAibよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｃ） X3は、 Arg、Orn、Lysおよびそのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｄ） X4は、Ser-Gln、Thr-Gln、Ala-AsnおよびThr-Asnよりなる群から選択される２つのアミノ酸残基の基であり；
（ｅ） X5は、His、Aib、Ile、LeuおよびValよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｆ） X6は、Arg、Orn、Lysおよびそのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｇ） X7は、
（i） Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号２９］
（ii） Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３０］
（iii） Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号３１］
（iv） Val-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３２］
よりなる群から選択される６つのアミノ酸残基を有する基であって；
（ｈ） Z3はOHまたはNH2であり；
但し、該化合物は、配列番号１４ないし２６のいずれの式も有しない］
で表される化合物またはその医薬上許容される塩を提供する。
【００２５】
定義
本発明により、また本明細書で用いるごとく、以下の用語は、特に明示的に述べない限りは、以下の意味を有すると定義する。
「アミリン」なる用語は、膵臓のベータ細胞から分泌されたヒトペプチドホルモンのアミリンを含むと理解される。
【００２６】
また、「アミリン・アゴニスト」なる用語は、当該技術分野において知られた用語であり、アミリンの生物学的活性を有する化合物をいう。アミリン・アゴニストは、ペプチド化合物または非ペプチド化合物であってもよい。かかる化合物は、アミリン・アゴニストとして働き、通常、アミリン受容体もしくは他の受容体、またはアミリン自体が相互作用して生物学的応答を得る受容体に結合するか、そうでなければそれらと直接的にまたは間接的に相互作用することによると現在考えられている。
【００２７】
「アミリン・アンタゴニスト」なる用語は、アミリンの効果を阻害する化合物をいう。アミリン・アンタゴニストは、ペプチド化合物または非ペプチド化合物であってもよい。
「アルカノイル」なる用語は、Ｒが直鎖のまたは分岐鎖のアルキル基である基ＲＣ(=Ｏ)-をいい、それは対応するカルボン酸から誘導できる。
【００２８】
「アミノ酸」なる用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログをいい、それらの構造が立体異性体形態を許容する場合には、それらのDおよびL立体異性体のすべてをいう。天然アミノ酸には、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)およびバリン(Val)が含まれる。非天然アミノ酸には、限定されるものではないが、アゼチジンカルボン酸、２-アミノアジピン酸、３-アミノアジピン酸、ベータ-アラニン、アミノプロピオン酸、２-アミノ酪酸（Abu）、４-アミノ酪酸、６-アミノカプロン酸、２-アミノヘプタン酸、２-アミノイソ酪酸（Aib）、３-アミノイソ酪酸、２-アミノピメリン酸、第三級-ブチルグリシン、２,４-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２,２'-ジアミノピメリン酸、２,３-ジアミノプロピオン酸、Ｎ-エチルグリシン、Ｎ-エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、３-ヒドロキシプロリン、４-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、Ｎ-メチルアラニン、Ｎ-メチルグリシン、Ｎ-メチルイソロイシン、Ｎ-メチルペンチルグリシン、Ｎ-メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン（Nva）、ノルロイシン（Nle）、オルニチン（Orn）、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが含まれる。アミノ酸アナログには、例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ-(カルボキシメチル)-システイン、Ｓ-(カルボキシメチル)-システインスルホキシドおよびＳ-(カルボキシメチル)-システインスルホンのごとき、それらのＮ-末端アミノ基またはそれらの側鎖基に対して可逆的にまたは不可逆的に化学的にブロックされ、または修飾された天然および非天然のアミノ酸が含まれる。
【００２９】
「アミノ酸アナログ」なる用語は、Ｃ-末端カルボキシ基、Ｎ-末端アミノ基または側鎖官能基のいずれかがもう一つの官能基に化学的に体系化された（codified）アミノ酸をいう。例えば、アスパラギン酸-(ベータ-メチルエステル)は、アスパラギン酸のアミノ酸アナログであり；Ｎ-エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸アナログであり；またはアラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸アナログである。
【００３０】
「アミノ酸残基」なる用語は、(１) -Ｃ(Ｏ)-Ｒ-ＮＨ-、ここに、Ｒは典型的には-ＣＨ(Ｒ')-であり、ここに、Ｒ'はアミノ酸側鎖、典型的にはＨまたは炭素を含む置換基であり；または（２）
【００３１】
【化１】
0004372345.tif 000002
【００３２】
［式中、ｐは１、２または３であり、各々、アゼチジンカルボン酸、プロリンまたはピペコリン酸残基を表す］構造を有する基をいう。
アルキル基のごとき有機基と関連して本明細書で言及される「低級」なる用語は、約６個以下の、好ましくは４個以下の、有利には１または２個の炭素原子を有するかかる基を定義する。かかる基は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
【００３３】
「医薬上許容される塩」には、本発明の化合物と有機酸または無機酸との組合せから誘導された本発明の化合物の塩が含まれる。実際問題としては、塩形態の使用は帰するところ塩基形態の使用となる。本発明の化合物は、遊離塩基および塩形態の双方で有用であり、両形態とも本発明の範囲内に存在すると考える。
【００３４】
さらに、以下の略語は、以下のことを表している：
「AC」とはアセチルをいう。
「ACN」または「CH3CN」とはアセトニトリルをいう。
「Boc」、「tBoc」または「Tboc」とはt-ブトキシカルボニルをいう。
「DCC」とはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドをいう。
「Fmoc」とはフルオレニルメトキシカルボニルをいう。
「For」とはホルムアミド化をいい、例えば、「Lys(For)」とは、ホルムアミド化したリジンをいう。
「HBTU」とは２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェートをいう。
「HOBt」とは１-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物をいう。
【００３５】
発明の詳細な記載
好ましい化合物
本発明により、式：
X1-X2-X3-Leu-X4-Glu-Leu-X5-X6-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-
Thr-Asn-X7-Z3［配列番号２７］
［式中、（ａ） X1は、（i）Leu-Leu、Val-Leu、Ile-Leu、tert-Leu-Leu、Nle-LeuおよびAla-ThrおよびそのN-アシル化誘導体よりなる群から選択される２つのアミノ酸残基の基であり；または（ii）基 Z1-Ser-Thr-Z2-Val-Leu［配列番号２８］、ここに、Z1は、Leu、Val、Ile、tert-Leu、Nva、AbuおよびNleまたはそのN-アシル化誘導体から選択されるアミノ酸残基であるか、またはZ1はアルカノイル基であって；Z2は、Ala、Ser、CysおよびThrよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｂ） X2は、Gly、Glu、AsnまたはAibよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｃ） X3は、 Arg、Orn、Lysおよびそのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｄ） X4は、Ser-Gln、Thr-Gln、Ala-AsnおよびThr-Asnよりなる群から選択される２つのアミノ酸残基の基であり；
（ｅ） X5は、His、Aib、Ile、LeuおよびValよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｆ） X6は、Arg、Orn、Lysおよびそのε-アミド化誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
（ｇ） X7は、
（i） Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号２９］
（ii） Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３０］
（iii） Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号３１］
（iv） Val-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３２］
よりなる群から選択される６つのアミノ酸残基を有する基であって；
（ｈ） Z3はOHまたはNH2であり；
但し、該化合物は、配列番号１４ないし２６のいずれの式も有しない］
で表される化合物を提供する。また、本発明の範囲内には、これらの化合物の医薬上許容される塩が含まれる。
【００３６】
好ましいX1基は、Z1-Ser-Thr-Z2-Val-Leuを含む。
好ましくは、Z1はカルボン酸でセリンのN末端アミド化誘導体を得るためのアルカノイル基またはLeuである。適当なカルボン酸は、１ないし約１０個の炭素原子の、より好ましくは約６ないし約８個の炭素原子の直鎖のまたは分岐鎖のカルボン酸を含む。より好ましくは、Z1はN末端アミド化を得るためのアルカノイル基である。特に好ましいZ1基は、４-メチルペンタノイルである。好ましいZ2基はAlaまたはCysを含み、より好ましくはAlaである。
好ましいX2基は、Glyを含む。
【００３７】
好ましいX3基は、１ないし８個の炭素原子を有するカルボン酸でアミド化したε-アミド化誘導体を含む。好ましいX3基は、ギ酸または酢酸でε-アミド化したLysである。特に好ましいX3基は、Lys(For)を含む。
好ましいX4基は、Ser-Gluを含む。
好ましいX5基は、HisまたはAibを含む。より好ましくは、X5はAibである。
好ましいX6基は、１ないし８個の炭素原子を有するカルボン酸でアミド化したε-アミド化誘導体を含む。好ましいX3基は、ギ酸または酢酸でε-アミド化したLysである。特に好ましいX3基は、Lys(For)を含む。
好ましいX7基は、Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号２９］およびThr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３０］を含む。
好ましくは、Z3はNH2である。
【００３８】
特に好ましい態様により、X2がGlyであり、X5がHisまたはAibであり、X4がSer-Gluであり、X7がThr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2［配列番号２９］またはThr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2［配列番号３０］であり、X1がZ1-Ser-Thr-Z2-Val-Leuであり、ここに、好ましくは、Z1はLeu、またはカルボン酸でセリンのN末端アミド化を得るためのアルカノイル基であって、Z2はAlaまたはCysであり；X3およびX6がカルボン酸でε-アミド化された化合物が提供される。Z1では、１ないし約１０個の炭素原子、より好ましくは約６ないし約８個の炭素原子を有するカルボン酸が好ましい。特に好ましいカルボン酸は、４-メチルペンタン酸を含む。より好ましいZ1は、N末端アミド化を得るためのアルカノイル基である。より好ましいX3およびX6は、ギ酸または酢酸でアミド化されたLysである。特に好ましいX3およびX6基は、Lys(For)を含む。
【００３９】
本発明の好ましいペプチド化合物は、配列番号１ないし１３のアミノ酸配列を有するもの（各々、「化合物１ないし１３」）を含む。特に好ましいペプチド化合物は、化合物１および２を含む。
【００４０】
アミリン関連活性
本発明の化合物の活性は、実施例Ａに後記する受容体結合アッセイ、実施例Ｂに後記するアデニルシクラーゼ刺激アッセイ、実施例Ｃに後記するヒラメ筋アッセイ、実施例Ｄに後記のごとき血漿中のグルコース、乳酸塩およびカルシウムレベルの測定および実施例Ｆに後記する胃内容排泄アッセイを含めた種々のスクリーニングアッセイを行うことによって確認でき、かつ定量できる。
【００４１】
膜結合アミリン受容体に特異結合する化合物の能力を測定する競合アッセイである側坐核（nucleus accumbens）受容体結合アッセイは、１９９３年１１月２３日に発行された米国特許第５,２６４,３７２号（その開示をここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載されている。また、側坐核受容体結合アッセイは以下の実施例Ａに記載される。アッセイに用いた膜標本の好ましい源は、側坐核および周囲領域からの膜を含む前脳基底である。アッセイすべき化合物は、これらの受容体標本への結合につき125Ｉ Bolton Hunter ラットアミリンと競合する。結合量（Ｂ）をリガンドの濃度の対数の関数としてプロットした競合曲線は、４変数のロジスティックな等式に対する非線形回帰（Inplotプログラム：GraphPAD Software、San Diego、California）またはDeLeanらのALLFITプログラムによる解析(ALLFIT、Version ２.７(NIH、Bethesda、MD ２０８９２))を用いてコンピューターによって解析する。MunsonおよびRodbard、Anal. Biochem. １０７：２２０-２３９(１９８０)。
【００４２】
ＣＧＲＰ受容体に特異結合するための化合物の能力を測定するＳＫ-N-MC細胞結合アッセイは、以下の実施例Ａに記載されている。当該アッセイに用いた膜標本の好ましい源は、ＳＫ-N-MCヒト神経芽腫細胞であり、それはアデニルシクラーゼに結合する高親和性のＣＧＲＰ受容体を含み、いくつかの他の組織に存在するＣＧＲＰ受容体に類似する結合特性および特異性特性を有することが示されている(VanValenら、Neuroscience Letters １１９：１９５-１９８、(１９９０)。
【００４３】
カルシトニン受容体に特異結合する化合物の能力を測定するT４７D細胞結合アッセイは、以下の実施例Ａに記載されている。膜は、T４７D乳癌細胞培養物から調製する。カルシトニン受容体に対する結合を標識サケカルシトニンの置き換えによって定量する。
カルシトニン受容体での化合物の機能的活性は、以下の実施例Ｂに記載したアデニルシクラーゼアッセイにより測定できる。ヒトのT４７DおよびMCF７乳癌細胞は、アデニルシクラーゼ活性の刺激に連結したカルシトニン受容体を含む。これらの細胞において、カルシトニンは、サイクリックＡＭＰ蓄積の増大を刺激する。
【００４４】
ヒラメ筋における化合物の生物学的活性のアッセイは、従前に記載された方法を用いて行うことができ(Leighton、B.およびCooper、Nature、３３５：６３２-６３５(１９８８)；Cooperら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：７７６３-７７６６(１９８８))、アミリン・アゴニスト活性がインスリン刺激されたグリコーゲン合成の阻害を測定することによって評価できる。また、ヒラメ筋アッセイは以下の実施例Ｃに記載されている。
血漿中グルコース、乳酸塩およびカルシウムレベルに対する化合物の効果を測定する方法は、実施例ＤおよびＥに記載されている。
【００４５】
胃内容排泄の速度を測定する方法は、例えば、Youngら、Diabetologia、３８(６)：６４２-６４８(１９９５)に記載されている。以下の実施例Ｆに記載されるフェノールレッド法において、覚醒ラットは、メチルセルロースおよびフェノールレッド指示薬を含有する無カロリーゲルをガバージにより受ける。ガバージの２０分後に、動物をハロタンを用いて麻酔し、胃を開き、幽門および下部食道括約筋にてクランプし、取り出し、アルカリ溶液中へ開けた。胃内容量は、５６０ｎｍの波長での吸収によって測定されたアルカリ溶液中のフェノールレッドの強度から得られた。トリチウム化グルコース法において、覚醒ラットは水中のトリチウム化グルコースでガバージされる。ラットを尾によって穏やかに拘束し、その先端をリドカインを用いて麻酔する。尾の血液から分離した血漿中のトリチウムを種々の時点で集め、ベータカウンターで検出する。通常、試験化合物はガバージの約１分前に投与される。
【００４６】
好ましくは、本発明の化合物は、約１ないし５ｎＭより小さな、より好ましくは約１ｎＭより小さなオーダーで側坐核受容体結合アッセイにおいて活性を示す。ヒラメ筋アッセイにおいては、これらの化合物は、好ましくは、１-１００ｎＭの濃度範囲で、より好ましくは５-５０ｎＭの範囲でアミリンの効果を阻害し、約１ないし２μＭより小さなオーダーでのＩＣ50値を示す。胃内容排泄においては、好ましい化合物は、１００μｇ／ラットより小さな、より好ましくは１０μｇ／ラットより小さなオーダーでのＥＤ50値を示す。
【００４７】
化合物の調製
本発明の化合物は、標準的な固相ペプチド合成技術および、好ましくは、自動または半自動のペプチド合成機を用いて調製できる。典型的には、かかる技術を用いて、α-Ｎ-カルバモイル保護アミノ酸および樹脂上の伸長するペプチド鎖に結合したアミノ酸を、ジイソプロピルエチルアミンのごとき塩基の存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１-ヒドロキシベンゾトリアゾールのごときカップリング剤の存在下、ジメチルホルムアミドのごとき不活性溶媒中で室温にてカップリングさせる。トリフルオロ酢酸またはピペリジンのごとき試薬を用いて、α-Ｎ-カルバモイル保護基を得られたペプチド-樹脂から除去し、ついで、ペプチド鎖に付加すべき次の所望のＮ-保護アミノ酸を用いて該カップリング反応を繰返す。適当なＮ-保護基は当業者によく知られているが、ここにおいては、ｔ-ブチルオキシカルボニル（ｔＢＯＣ）およびフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が好ましい。Ｃ末端アミドを送達するＦｍｏｃ化学を用いる好ましい樹脂は、Rink Amide MBHA樹脂（４-(２',２'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミド-ノルロイシル-ＭＢＨＡ樹脂）である。
【００４８】
ペプチド合成機で用いる溶媒、アミノ酸誘導体および４-メチルベンズヒドリル-アミン樹脂は、Applied Biosystems Inc.（Foster City、CA）から購入できる。RinkアミドMBHA樹脂は、Novabiochem（La Jolla、CA）から入手できる。以下の側鎖保護アミノ酸：Boc-Arg（Mts）、Fmoc-Arg（Pmc）、Boc-Thr（Bzl）、Fmoc-Thr（t-Bu）、Boc-Ser（Bzl）、Fmoc-Ser（t-Bu）、Boc-Tyr（BrZ）、Fmoc-Tyr（t-Bu）、Boc-Lys（Cl-Z）、Fmoc-Lys（Boc）、Boc-Glu（Bzl）、Fmoc-Glu（t-Bu）、Fmoc-His（Trt）、Fmoc-Asn（Trt）およびFmoc-Gln（Trt）は、Applied Biosystems，Inc.から購入できる。Boc-His（BOM）は、Applied Biosystems，Inc.またはBachem Inc.（Torrance，CA）から購入できる。アニソール、無水酢酸、イソカプロン酸、ジメチルスルフィド、フェノール、エタンジチオールおよびチオアニソールは、Aldrich Chemical Company（Milwaukee、WI）から得ることができる。Air Products and Chemicals（Allentown、PA）はＨＦを供給している。エチルエーテル、酢酸およびメタノールは、Fisher Scientific（Pittsburg、PA）から購入できる。
【００４９】
固相ペプチド合成は、ＮＭＰ／ＨＯＢｔシステムおよびｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学（Applied Biosystems User’s Manual for the ABI ４３０A Peptide Synthesizer、Version １.３B、１９８８年７月１日、第６章、４９-７０頁、Applied Biosystems Inc.社製、Foster City、CA）を用いる自動ペプチド合成機（Model ４３０A， Applied Biosystems Inc.社製，Foster City、CA）で行い得る。Boc-ペプチド-樹脂はＨＦ（-５℃ないし０℃にて１時間）を用いて切断できる。水と酢酸とを交互に用いて該樹脂からペプチドを抽出でき、その濾液を凍結乾燥できる。Fmoc-ペプチド樹脂は、標準的な方法（Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems Inc.社製、１９９０年、６-１２頁）に従って切断できる。ペプチドは、Advanced Chem Tech Synthesizer（Model MPS ３５０，Louisville、Kentucky）を用いてアセンブリーさせることもできる。
【００５０】
ペプチドは、Waters Delta Prep ３０００システムを用いるＲＰ-ＨＰＬＣ（分取および分析用）によって精製できる。Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分取用カラム（１０μ、２.２×２５ｃｍ；Vydac社製，Hesperia，CA）を用いてペプチドを単離することができ、純度はＣ４、Ｃ８またはＣ１８分析用カラム（５μ、０.４６×２５ｃｍ；Vydac社製）を用いて決定できる。溶媒（Ａ＝０.１％ ＴＦＡ／水およびＢ＝０.１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）は１.０ｍｌ／分の流速で分析用カラムに流すことができ、１５ｍｌ／分の流速で分取用カラムに流すことができる。アミノ酸分析は、Waters Pico Tag system上で行い、Maximaプログラムを用いてプロセシングできる。ペプチドは、気相酸加水分解（１１５℃にて２０-２４時間）によって加水分解できる。加水分解物は、標準的な方法（Cohenら、The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, １１-５２頁, Millipore Corporation社, Milford, MA(１９８９)）によって誘導化および分析できる。高速原子衝撃分析は、M-Scan，Incorporated（West Chester，PA）によって行うことができる。質量較正は、ヨウ化セシウムまたはヨウ化セシウム／グリセロールを用いて行うこともできる。飛行時間検出を用いるプラズマ吸光イオン化分析は、Applied Biosystems Bio-Ion ２０質量分析機で行うこともできる。
【００５１】
また、本発明において有用なペプチド化合物は、今や当該技術分野で知られている方法を用いる組換えＤＮＡ技術を用いて調製できる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９）を参照されたし。本発明において有用な非-ペプチド化合物は、当該技術分野で知られている方法によって調製できる。
【００５２】
上記に参照した化合物は、種々の無機および有機の酸および塩基と塩を形成していてもよい。かかる塩には、有機酸および無機酸、例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、Ｈ3ＰＯ4、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、フマル酸、琥珀酸および酒石酸ならびにカンファスルホン酸で調製される塩が含まれる。塩基で調製される塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムおよびカリウム塩、ならびにアルカリ土類塩、例えば、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。酢酸塩、塩酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が好ましい。該塩は、遊離酸または塩基形態の生成物と１以上の当量の適当な塩基または酸とを、当該塩が不溶性である溶媒または媒質中あるいは水のごとき溶媒中にて反応させ、ついで該水を真空中でまたは凍結乾燥によって除去するか、または適当なイオン交換樹脂上で、存在する塩のイオンを他のイオンに交換することによるごとく、慣用手段によって形成できる。
【００５３】
処方および投与
本発明に有用な化合物は、（静脈内、筋肉内および皮下を含む）非経口または鼻腔もしくは経口投与に適する処方の形態、または適当にカプセル化されるか、経口投与につき公知技術の方法によって調製された処方の形態で簡便に提供できる。適当な投与形式は、各患者個人につき医学実践者によって最良に決定できる。医薬上許容される担体およびその処方は、標準的な処方文献、例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。また、Wang，Y.J.およびHanson，M.A. 「Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers」、Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. １０, supp.４２：２S（１９８８）を参照されたし。
【００５４】
本発明において有用な化合物は、注射または点滴用の非経口組成物として提供でき、それは、例えば、不活性油剤、好適にはゴマ油、落花生油、オリーブ油のごとき植物油または他の許容できる担体中に懸濁させることができる。好ましくは、それを水性担体、例えば約５.６ないし７.４のｐＨの等張緩衝液中に懸濁する。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌するか、または濾過滅菌できる。該組成物は、ｐＨ緩衝化剤のごとき、生理条件に近づけるために必要な医薬上許容される補助剤物質を含み得る。有用な緩衝液には、例えば、酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が含まれる。治療上有効量の調製物が経皮注射または送達の後、多くの時間または日数にわたって血流中に送達されるように、持続性または「貯蔵」形態の徐放性調製物を用いることができる。
【００５５】
好ましくは、こららの非経口投与形態は、「アミリン・アゴニストペプチド用の非経口の液体処方」と題する共有の出願特許である、１９９７年１月８日に出願されたシリアル番号６０／０３５,１４０（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）により調製され、それは、約３.０ないし６.０の最終組成物のｐＨを得るために、約０.０２ないし０.５％（w／v）の酢酸、リン酸、クエン酸またはグルタミン酸緩衝液と共に水系において、各々、約０.０１ないし０.５％（w／v）の化合物、ならびに水性連続相において約１.０ないし１０％（w／v）の炭水化物または多価アルコール等張化剤を含む。ｍ-クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびフェノールよりなる群から選択される約０.００５ないし１.０％（w／v）の抗菌保存剤を患者が多回投与をやめるのを可能とするように設計された好ましい処方の製品において存在させる。十分量の注射用水を用いて、所望の濃度の溶液を得る。塩化ナトリウムならびに他の賦形剤も所望ならば存在させてもよい。最も好ましくは、非経口投与用の処方において、多価アルコールはマンニトールであり、緩衝液は酢酸緩衝液であり、保存剤は約０.１ないし０.３w／v％のｍ-クレゾールであって、ｐＨは３.７ないし４.３である。
【００５６】
所望の等張性は、塩化ナトリウム、またはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、（マンニトールおよびソルビトールのごとき）ポリオールのごとき他の医薬上許容される薬剤、あるいは他の無機または有機の溶質を用いて達成できる。塩化ナトリウムが、ナトリウムイオンを含有する緩衝液用に特に好ましい。所望ならば、上記の組成物の液剤をメチルセルロースのごとき増粘剤で粘度を増すことができる。それらは、油中水または水中油のいずれかの乳化形態において調製してもよい。いずれの非常に様々な医薬上許容される乳化剤も、例えば、アラビアゴム粉末、（Tweenのごとき）非イオン界面活性剤、または（アルカリポリエーテルアルコールスルフェートまたはスルホネート、例えば、Tritonのごとき）イオン性界面活性剤を含めて使用できる。
【００５７】
本発明に有用な組成物は、一般的に容認された手順に続いて成分を混合することによって調製する。例えば、選択した成分は、ブレンダーまたは他の標準的な装置中で単に混合して、濃縮した混合物を得、次いで、水または増粘剤の添加によって最終の濃度または粘度に調整し、可能な緩衝液でｐＨをコントロールし、またはさらなる溶質で等張性をコントロールしてもよい。
【００５８】
医師による使用では、該組成物は、本発明のある量の化合物、例えば、選択されたレベルでの治療効果を得るために単回ないし多回投与において有効であろう化合物を含有する投与単位形態で提供されるであろう。インスリン抵抗性と関連した高血糖症を含めた高血糖症のコントロールに使用される治療上有効量の本発明の化合物は、食後グルコース濃度の曲線下面積を比較することによって測定できるごとき、コントロールに関して食後グルコースレベルをかなり低下させるものである。当業者によって認識されるように、有効量の治療剤は、患者の年齢および体重、患者の身体的状態、得るべき作用および他の因子を含めた多くの因子で異なるであろう。
【００５９】
有効な単回の、分割したまたは連続投与の化合物は、典型的には、約１μｇ／ｋｇ／日ないし約１００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０.１μｇ／ｋｇ／日ないし約１０μｇ／ｋｇ／日の範囲で、単回または多回用量で投与されるであろう。
当業者によって認識されるように、有効量の治療剤は、患者の年齢および体重、患者の身体的状態、得るべき作用および他の因子を含めた多くの因子で異なるであろう。経口的に活性な化合物は、経口で摂取され、しかしながら、用量は、５-１０倍増加し、または前記の比で増加させる（または減少させる）べきである。
【００６０】
本発明を理解するのを助けるために、いくつかの実験結果を記載する以下の実施例を含む。本発明に関連する実験は、もちろん、何ら公知のまたは後に開発された発明および発明のかかる変形を限定するように構成されるものではなく、それは当業者の視野内にあり、本明細書に記載され、後記の特許請求された本発明の範囲内にあると考えるべきである。
【００６１】
実施例１
化合物１の調製
以下の式：
Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号１］
を有する化合物１は、Ｆｍｏｃ-保護アミノ酸(Applied Biosystems、Inc.社製)を用いて４-(２'-４'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミドノルロイシルノルロイシンＭＢＨＡ樹脂(Novabiochem社製、０.４４ミリモル／ｇ)上で組立てた。合成中シングルカップリングサイクルを用い、Ｆａｓｔ Ｍｏｃ(ＨＢＴＵ活性化)化学を使用した。完成したペプチド樹脂は、標準方法(Introduction to Cleavage Techniques、Applied Biosystems、Inc.社製)に従って、トリエチルシラン(０.２ｍｌ)、エタンジチオール(０.２ｍｌ)、アニソール(０.２ｍｌ)、水(０.２ｍｌ)およびトリフルオロ酢酸(１５ｍｌ)の混合液を用いて脱保護し切断した。該ペプチドは、エーテル／水(５０ｍｌ)中で沈澱させ、遠心した。沈澱物をＧＡＡに復元して凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドを水に溶解した。粗純度は、約５５％であった。
【００６２】
精製工程で用いたのは、溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)であった。
ペプチドを含む溶液を分取用Ｃ-１８カラムに適用し、精製した(４０分間にわたる溶媒Ａ中の１０％ないし４０％溶媒Ｂ)。該ペプチドは、３１分間の観察した保持時間を有した。画分の純度は、Ｃ-１８分析用カラムを用いてアイソクラティック的に決定した。純粋な画分をプールして、上記のペプチドを供給した。収量は、８４.２ｍｇ（理論値の１０.２％）であった。凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)は、１７.５分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析(Ｍ)：計算値 ３３０８.７；測定値 ３３０８.０。
【００６３】
実施例２
化合物２の調製
以下の式：
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Aib- Lys(For)-
Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu- Gln-Thr-Tyr-Pro-
Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro［配列番号２］
を有する化合物２は、最終的合成サイクルにおいてイソカプロン酸を用いてＮ末端イソカプロイル基を組込む以外は実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。分取用ＰＲ-ＨＰＬＣは、Ｃ-１８分析用カラム(４０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし４５％溶媒Ｂ)を用いて行った。該ペプチドは、２２分間の観察した保持時間を有した。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の３０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１８.５分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析［Ｍ＋Ｈ]+：計算値 ３１１４.７；測定値 ３１１４.７。
【００６４】
実施例３
化合物３の調製
以下の式：
Ac-Leu-Ser-Thr-Ser-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-
His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-
Asn-Thr-Tyr［配列番号３］
を有する化合物３は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。アセチル化は、無水酢酸を用いて達成した。分取用ＰＲ-ＨＰＬＣは、２００ｍｌ／分の流速でのＣ-１８ Supelco LC-１８０B（２１×２５０ｍｍ）カラム(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし４５％溶媒Ｂ)を用いて行い、１７分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)は、１６.７分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。ＦＡＢ質量分析［Ｍ＋Ｈ]+：計算値 ３２７７.６；測定値 ３２７８.３。
【００６５】
実施例４
化合物４の調製
以下の式：
Leu-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号４］
を有する化合物４は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例３に記載されたもののごときＣ-１８カラムを用い、勾配(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし４５％溶媒Ｂ)で溶出させて、１３分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１５.０５分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ３２７６.７；測定値 ３２７７.８。
【００６６】
実施例５
化合物５の調製
以下の式：
Leu-Ser-Thr-Ser-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-
Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-
Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号５］
を有する化合物５は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例３に記載されたもののごときＣ-１８カラムを用い、勾配(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし４５％溶媒Ｂ)で溶出させて、１４分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１５.５分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ３２９２.７；測定値 ３２９３.９。
【００６７】
実施例６
化合物６の調製
以下の式：
Ac-Leu-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Tyr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号６］
を有する化合物６は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。アセチル化は、無水酢酸を用いて達成した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例１に記載のごときＣ-１８カラムを用い、勾配(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし４５％溶媒Ｂ)で溶出させて、１７分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１６.９１分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ３２６１.６；測定値 ３２６２.５。
【００６８】
実施例７
化合物７の調製
以下の式：
Ac-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号７］
を有する化合物７は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。アセチル化は、無水酢酸を用いて達成した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例１に記載のごときＣ-８カラムを用い、勾配(４０分間にわたる溶媒Ａ中の１５％ないし３０％溶媒Ｂ)で溶出させて、３２分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１６.８３分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ３３５０.８；測定値 ３３４９.５。
【００６９】
実施例８
化合物８の調製
以下の式：
Val-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Gl-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号８］
を有する化合物８は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例１に記載のごときＣ-８カラムを用い、勾配(４０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし５０％溶媒Ｂ)で溶出させて、１２分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(２０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし４０％溶媒Ｂ)は、１９.１７分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ２８７９.５；測定値 ２８７９.４。
【００７０】
実施例９
化合物９の調製
以下の式：
Ac-Val-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号９］
を有する化合物９は、実施例１に記載されたものと同様の方法で調製した。アセチル化は、無水酢酸を用いて達成した。分取用ＲＰ-ＨＰＬＣは、実施例１に記載のごときＣ-８カラムを用い、勾配(４０分間にわたる溶媒Ａ中の２５％ないし５０％溶媒Ｂ)で溶出させて、１３分間の観察した保持時間を有するペプチドを得た。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂ)は、１４.２４分間の観察した保持時間を有する生成物ペプチドを与えた。電子スプレー質量分析（Ｍ）：計算値 ２９２１.５；測定値 ２９２１.１。
【００７１】
実施例１０
化合物１０の調製
以下の式：
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-
Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-
Tyr［配列番号１０］
を有する化合物１０は、Ｆｍｏｃ-保護アミノ酸(Applied Biosystems、Inc.社製)を用いて４-(２'-４'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミド-ノルロイシルＭＢＨＡ樹脂(Novabiochem社製、０.５５ミリモル／ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護し、最終的合成サイクルにおいて４-メチルペンタン酸を用いてＮ末端４-メチルペンタノイル基を組込む以外は実施例１と同様の方法で精製する。分析で用いたのは、溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)である。次いで、凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(３０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)を行い、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレー質量分析(Ｍ)：計算値 ３２３７.４３。
【００７２】
実施例１１
化合物１１の調製
以下の式：
４-メチルペンタノイル-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib-Lys(For)-Leu-
Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Asn-Tyr-
Tyr［配列番号１１］
を有する化合物１１は、Ｆｍｏｃ-保護アミノ酸(Applied Biosystems、Inc.社製)を用いて４-(２'-４'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミド-ノルロイシルＭＢＨＡ樹脂(Novabiochem社製、０.５５ミリモル／ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護し、最終的合成サイクルにおいて４-メチルペンタン酸を用いてＮ末端４-メチルペンタノイル基を組込む以外は実施例１と同様の方法で精製する。分析で用いたのは、溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)である。次いで、凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(３０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)を行い、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレー質量分析(Ｍ)：計算値 ３２６９.４９。
【００７３】
実施例１２
化合物１２の調製
以下の式：
Ala-Thr-Aib-Lys(For)-Leu-Ala-Asn-Glu-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号１２］
を有する化合物１２は、Ｆｍｏｃ-保護アミノ酸(Applied Biosystems、Inc.社製)を用いて４-(２'-４'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミド-ノルロイシルＭＢＨＡ樹脂(Novabiochem社製、０.５５ミリモル／ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護し、実施例１と同様の方法で精製する。分析で用いたのは、溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)である。次いで、凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(３０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)を行い、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレー質量分析(Ｍ)：計算値 ２８０９.８９。
【００７４】
実施例１３
化合物１３の調製
以下の式：
Ac-Ala-Thr-Aib-Lys(For)-Leu-Ala-Asn-Glu-Leu-Aib-
Lys(For)-Leu-Gln-Thr-Thy-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Asn-Thr-Tyr［配列番号１３］
を有する化合物１３は、Ｆｍｏｃ-保護アミノ酸(Applied Biosystems、Inc.社製)を用いて４-(２'-４'-ジメトキシフェニル-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシアセトアミド-ノルロイシルＭＢＨＡ樹脂(Novabiochem社製、０.５５ミリモル／ｇ)上で組立て、樹脂から切断し、脱保護し、実施例１と同様の方法で精製する。アセチル化は、無水酢酸を用いて達成した。分析で用いたのは、溶媒Ａ(水中０.１％ ＴＦＡ)および溶媒Ｂ(ＡＣＮ中０.１％ ＴＦＡ)である。次いで、凍結乾燥したペプチドの分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(３０分間にわたる溶媒Ａ中の２０％ないし５０％溶媒Ｂの勾配)を行い、生成物ペプチドの保持時間を測定する。電子スプレー質量分析(Ｍ)：計算値 ２８５１.９２。
【００７５】
実施例Ａ
受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイは、放射性ヨウ素化ペプチド、および比較的高密度の測定されるべき受容体を含む細胞または組織からの膜を用いて行った。
アミリン受容体への試験化合物の結合は、前記のラット側坐核からの膜への125Ｉ-ＢＨ-ラットアミリン（Ｎ末端リジン上の125Ｉ-Bolton Hunter標識）の結合によって測定した。
ＣＧＲＰ受容体への試験化合物の結合は、ヒトＳＫ-Ｎ-ＭＣ神経芽腫細胞からの膜への（ヒスチジンにて125Ｉ標識した）125Ｉ-L-αＣＧＲＰの結合によって測定した。
カルシトニン受容体への試験化合物の結合は、高密度のアデニルシクラーゼ結合したカルシトニン受容体を発現するヒトＭＣＦ７乳癌細胞からの膜への（チロシンにて125Ｉ標識した）125Ｉ-ヒトカルシトニンの結合によって測定した。親ＭＣＦ７細胞系から単離したクローンサブライン（ＭＣＦ７-７）をこの実験に用いた。
【００７６】
ラット側坐核膜（アミリン受容体）への結合
アミリン受容体への化合物の結合の評価は、以下の通り行った。125Ｉ-ＢＨ-ラットアミリンは、Amersham Corporation(Arlington Heights、IL)から購入した。使用した時点での特異活性は、１９５０ないし２０００Ｃｉ／ミリモルの範囲にあった。非標識ペプチドは、BACHEM Inc.(Torrance、CA)およびPeninsula Laboratories(Belmont、CA)から得た。
雄性Sprague Dawleyラット（２００ないし２５０グラム）を断頭により犠牲にした。脳は冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移した。切断は、腹側表面から、嗅索と側面で接し、これらの索から内側に４５度の角度にて伸ばした視床下部の吻側に行った。側坐核および周囲領域を含む前脳基底組織を重量測定し、氷冷の２０ｍＭ ＨＰＥＴＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ酸、２３℃にてＮａＯＨでｐＨを７.４に調整）中でホモジナイズした。膜は、４８０００×ｇにて１５分間の遠心によって新たな緩衝液で３回洗浄した。最終的な膜ペレットを０.２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有した２０ｍＭ ＨＰＥＴＳ緩衝液に懸濁した。
【００７７】
125Ｉ-アミリン結合を測定するために、４ｍｇのオリジナルの湿重量の組織からの膜を、０.５ｍｇ／ｍｌバシトラシン、０.５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび０.２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭ ＨＰＥＴＳ緩衝液中で１２ないし１６ｐＭの125Ｉ-アミリンとインキュベートした。溶液を２３℃にて６０分間インキュベートした。インキュベーションは、放射性標識したペプチドの特異的結合を低下させるために、０.３％ポリエチレンイミン中で４時間予め浸漬させたＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルター(Whatman Inc. 、Clifton、NJ)を通しての濾過によって終了した。濾液を濾過直前に５ｍｌ冷ＰＢＳで、次いで濾過直後に１５ｍｌ冷ＰＢＳで洗浄した。濾液を取り出し、７７％のカウント効率にてガンマカウンターで放射活性を調べた。
【００７８】
ＳＫ-N-MC細胞からの膜（ＣＧＲＰ受容体）への結合
ＳＫ-N-MC細胞(ＡＴＣＣ番号HTB-１０)をｐＨ７.４の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中でホモジナイズし、膜を４８０００×ｇにて１５分間の遠心によって集めた。０.１ないし０.２ｍｇ蛋白質／０.２ｍｌアリコートの濃度にて懸濁した膜を、ウシ血清アルブミン、バシトラシンおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するｐＨ７.４の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中で、（10His、２００Ｃｉ／ミリモルで標識した）１５ｐＭ [125Ｉ]ヒト-ＣＧＲＰおよび非ペプチドとインキュベートした。さらなる方法は、アミリン受容体アッセイについて記載されたものと同様である。Ｋiは、[Ｌ]が１５ｐＭであってＫdが３ｐＭであるＩＣ50／(１＋([Ｌ]／Ｋd))として誘導した。
ＳＫ-Ｎ-ＭＣヒト神経芽腫細胞は、アデニールシクラーゼに結合する高親和性ＣＧＲＰ受容体を含み、いくつかの他の組織に存在するＣＧＲＰ受容体に類似する結合および特異性no
特徴を有することが示されている(VanValenら、１９９０)。Ｋi値は、ＳＫ-Ｎ-ＭＣ細胞からの膜に結合する[125Ｉ]ｈＣＧＲＰの阻害から導かれた。
【００７９】
Ｔ４７Ｄ細胞からの膜（カルシトニン受容体）への結合
ヒトＴ４７Ｄ乳癌細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ１３３）からの膜は、高密度のカルシトニン受容体を含むことが従前に示された（Findlayら、１９８０）。膜は、ＳＫ-Ｎ-ＭＣ細胞につき記載されたごとく、Ｔ４７Ｄ細胞の密集培養物から調製した。膜は、雰囲気温度にて６０分間、３２ｐＭの[125Ｉ]サケカルシトニン（22Tyrにて標識、２０００Ｃｉ／ミリモル）と、および非標識ペプチドとインキュベートした。さらなる方法は、ＣＧＲＰ受容体アッセイにつき記載されたものと同様である。Ｋiは、[Ｌ]が３２ｐＭであってＫdが１９ｐＭであるＩＣ50／(１＋([Ｌ]／Ｋd))として誘導した。
カルシトニン受容体への結合は、ヒトＴ４７Ｄ癌細胞の膜からの[125Ｉ]サケカルシトニンの置き換えによって定量した。
【００８０】
結果
本発明のある種の化合物を上記の放射性リガンド結合アッセイにおいて試験して、アミリン、カルシトニンおよびＣＧＲＰに対するその親和性を測定した。
競合曲線は、試験化合物の濃度増大の存在下、放射性リガンド結合を測定することによって創製し、反復曲線フィッティングプログラム（４変数のロジスティックな等式；Inplotプログラム；GraphPAD Software、San Diegoを用いる非線形回帰）を用いて半−最大（half-maxial）阻害濃度を決定した。
【００８１】
【表１】
0004372345.tif 000003
【００８２】
全試験化合物は、ＣＧＲＰ（ＳＫ-Ｎ-ＭＣ）受容体に対するそれらの親和性に比較して、アミリン（側坐核）およびカルシトニン（Ｔ４７Ｄ）受容体に対して相対的に親和性を示した。例えば、試験化合物は、アミリン受容体よりＣＧＲＰ受容体に対して、少なくとも３００倍低い親和性を示した。一連の化合物内では、化合物１、４、５、７、８および９が、アミリンおよびカルシトニン受容体に同様な効力を示した。化合物２、３および６は、アミリン受容体に対してよりカルシトニン受容体に対して大きな親和性を示した。
【００８３】
実施例Ｂ
アデニールシクラーゼ刺激のアッセイ
本発明の化合物は、アデニールシクラーゼ活性の刺激に連結したカルシトニン受容体を含むヒトＴ４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ１３３）およびＭＣＦ（ＡＴＣＣ番号２２）乳癌細胞を用いて、カルシトニン受容体での機能的活性につきアッセイした。化合物１では、ラットカルシトニンＣ１ａ受容体での機能的活性は、ラットカルシトニンＣ１ａ受容体で安定な横断を受けたＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）においても測定した。
【００８４】
細胞は、９６穴プレート中で密集まで増殖させた。培地を（シンク中に振盪させ、ティッシュ上へプレートを軽くたたくことにより）除去した。培地は、０.１％ ＢＳＡおよび０.１％グルコースを含有する１００μｌ ｄＰＢＳ（水で１００ｍｌにした１０ｍｌの１０×ダルベッコのＰＢＳ；および０.１ｇＦＡ-フリーのＢＳＡおよび０.１ｇグルコース；７.４にｐＨを調整）で置き換えた。細胞は、空気培養器中で３７℃にて２０ないし３０分間培養した。培地は、０.５ｍＭ ＩＢＭＸを含有する新たなｄＰＢＳ（４.５ｍｇのＩＢＭＸを５０ｍｌの修飾ｄＰＢＳに添加し；混合物をＩＢＭＸが溶解するまで音波処理する）で置き換えた。細胞を１０分間培養した。ホルモンおよび／または試験化合物をＩＢＭＸを含有するｄＰＢＳ培地で希釈した。ホルモン（または試験化合物）溶液の１００μｌのアリコートをプレートに添加した。細胞を湿潤空気培養器中で３７℃にて２０ないし３０分間培養した。反応を２０μｌの５％ ＴＣＡの添加によって停止させた。細胞を含むプレートを１５分間４℃に保った。０.８Ｍ Trizmaの２０μｌのアリコートを添加して培地を中性化した。プレートを振動させ、次いでフロアー遠心機中で２０００ｒｐｍにて回転させた。上清をデカントし、標準的なｃＡＭＰラジオイムノアッセイにおいて酢酸緩衝液中で直接的に用いた。
【００８５】
乳癌細胞において、ヒトカルシトニンは、サイクリックＡＭＰ蓄積の増大を刺激し、ＥＣ50は０.４５ｎＭ（ＭＣＦ７-７）および３.１ｎＭ（Ｔ４７Ｄ）であった。ヒトアミリンは、これらの細胞中のアデニールシクラーゼ活性の刺激において、カルシトニンより５倍（ＭＣＦ７-７）ないし７倍（Ｔ４７Ｄ）小さな効力であった。図１は、Ｔ４７Ｄ細胞中のサイクリックＡＭＰ産生に対する化合物１の効果を示す。化合物１はＴ４７Ｄ細胞中のサイクリックＡＭＰ蓄積を強力に刺激し、図１に示すごとくＥＣ50が２.２ｎＭであった。これらの細胞において、化合物１は、アデニールシクラーゼ活性の刺激において、ヒトカルシトニンより多少大きな効力であった。かくして、化合物１は、ヒト細胞中のカルシトニン受容体での機能的アゴニストである。また、化合物１をラットカルシトニンＣ１ａ受容体を発現する細胞において試験し、再度アデニールシクラーゼ活性を強力に刺激し、ＥＣ50＝０.９７ｎＭであった（データを示さず）。
【００８６】
また、化合物２をカルシトニン受容体での機能的活性につき試験した。化合物２は、ＭＣＦ７-７細胞中で部分的アゴニスト活性を有し、サイクリックＡＭＰの増大を生じさせ、ヒトカルシトニンによる産生増大の約２０％であった。化合物２は、この効果の発生において、１.６ｎＭのＥＣ50（ヒトカルシトニンより３.５倍小さな効力）を有した。
また、化合物４（ＥＣ50＝３.５ｎＭ）および化合物６（ＥＣ50＝３４ｎＭ）は、このアッセイにおいて試験され、ＭＣＦ７-７細胞中でアデニールシクラーゼ活性を刺激することが観察され、ヒトカルシトニンより７倍および８０倍低い効力であった。
【００８７】
実施例Ｃ
ヒラメ筋アッセイ
ヒラメ筋における試験化合物のアミリン・アンタゴニスト活性の測定を以下の通り行った。約２００ｇの大きさの雄性Harlan Sprague Dawleyラットを４０ｍｇ未満の分離したヒラメ筋の大きさを維持するために用いた。動物を断頭による犠牲に先立って４時間絶食した。皮膚を下部の肢より剥ぎ、次いでコルク板にピン止めした。アキレス腱を踵骨の真上で切断し、腓腹筋を脛骨の後方向から外へ示した。次いで、腓腹筋の骨表面上の小さな１５-２０ｍｍ長さの０.５ｍｍ厚さの平らな筋肉であるヒラメ筋を明確に剥し、筋周膜を鋭いハサミおよび鉗子を用いて取り除いた。次いで、ヒラメ筋を筋肉の腹部を通る前方-後方を通して刃を用いて等分に裂き、合計４つの筋肉細片を得た。動物から筋肉を切取った後、それを短時間生理学的な生理食塩水に保った。これはグリコーゲンへの放射性グルコース取り込みに対する効果を示さないので、筋肉は張力下で保つ必要はなかった。
【００８８】
筋肉は、後記のごとく、NaCｌ １１８.５ミリモル(６.９３ｇ)、KCl ５.９４ミリモル(４４３ｍｇ)、CaCl2 ２.５４ミリモル(２８２ｍｇ)、MgSO4 １.１９ミリモル(１４３ｍｇ)、KH2PO4 １.１９ミリモル(１６２ｍｇ) 、NaHCO3 ２５ミリモル(２.１ｇ) 、５. ５ミリモルのグルコース(１ｇ)および組換えヒトインスリン(Humulin-R、Eli Lilly、IN)を含有する１０ｍｌの予め気体処理したクレブスリンゲル炭酸水素塩緩衝液および試験化合物を含む５０ｍｌのErlenmeyerフラスコに入れた。３７℃でのｐＨが７.１と７.４との間になることを確認した。筋肉は、各動物からの４つの筋肉片が異なるアッセイ条件で均等に分布するように異なるフラスコに割り当てた。培養培地は、振動している水浴中で３７℃にて連続的に振動させつつ、表面上にゆっくり吹くカルボジェン（９５％ Ｏ2、５％ ＣＯ2）によってガス供給した。半時間の「事前培養」時間の後、０.５μＣｉのＵ-14Ｃ-グルコースを各フラスコに添加し、さらに６０分間インキュベートした。次いで、各筋肉片をすばやく取り出し、ブロットし、液体Ｎ2中で凍結させ、重量測定し、14Ｃ-グリコーゲンの続いての測定のために貯蔵した。
【００８９】
14Ｃ-グリコーゲン測定を７ｍｌのシンチレーションバイアル中で行った。各凍結筋肉標本をバイアルに入れ、連続的な撹拌下、１ｍｌの６０％水酸化カリウム中で７０℃にて４５分間消化した。溶解したグリコーゲンを３ｍｌの無水エタノールの添加によってバイアルに沈殿させ、-２０℃にて一晩冷却した。上清をゆっくり吸引し、沈殿物を真空下にて乾燥させた。シンチレーションカウントの間のクエンチングを避けるために全てのエタノールを蒸発させた。残留するグリコーゲンを１ｍｌの水および４ｍｌのシンチレーション液中に再溶解させ、14Ｃにつきカウントした。
【００９０】
（マイクロモル／ｇ／時間にて表した）グリコーゲンへのグルコース取り込み速度は、インキュベーション培地の５.５ｍＭグルコース中の14Ｃグルコースの特異活性および各筋肉から抽出されたグリコーゲン中に残留する合計の14Ｃカウントから得た。用量／反応曲線を最小二乗反復ルーチン（ALLFIT、v２.７、NIH、MD）を用いる４変数ロジスティックモデルにフィットさせて、ＥＣ50を導いた。ＥＣ50は、対数-正規分布であるので、対数の±標準誤差で表す。ペアでの比較は、ＳＹＳＴＡＴ(Wilkinson、「SYSTAT：the system for statistics」、SYSTAT Inc.、Evanston IL(１９８９))のｔ検定ベースのルーチンを用いて行った。
【００９１】
用量反応曲線は、７.１ｎM（１０００μＵ／ｍｌ）のインスリンおよび０、１、３ 、１０、３０、１００、３００および１０００ｎＭの（名目上の）最終濃度にて添加した各試験化合物を含む培地に添加された筋肉で生じさせた。また、各アッセイは、凍結乾燥し-７０℃にて貯蔵された、単一バッチの保管されたラットアミリンを含む内部陽性対照を含有した。
ヒラメ筋アッセイにおけるアミリン調製物のＥＣ50測定は、典型的には約１ないし１０ｎＭの範囲にあるが、９０％未満で純粋であるいくらかの市販調製物は、汚染物質が存在する結果、低い活性が測定されるためにおそらく高いＥＤ50を有する。試験化合物の結果を以下におよび図２および３に示す。
【００９２】
単離され、インキュベートされたラットヒラメ筋調製物において、化合物１および化合物２は、グリコーゲンへのグルコースの取り込み阻害において認識可能なアミリン・アゴニスト活性を示さなかった。このアッセイにおいて、インスリンは、１時間にわたる３-４倍までグリコーゲンへの、インキュベーション培地中の14Ｃ標識グルコースから由来する14Ｃの取り込みを増加させた。続いて、グリコーゲンをインキュベートしたヒラメ筋細片から抽出し、分析した。このアッセイにおいて、アミリン作用は、グルコースからグリコーゲンへの14Ｃの取り込みにおける低下が特徴的である（インスリンの存在下の本明細書の図２に示す）。かくして、アミリン作用の拮抗は、グリコーゲンへの14Ｃの取り込みのアミリン媒介の低下の防止によって示される。
【００９３】
化合物１および化合物２での実験結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａは化合物１での結果を示し、図２Ｂは化合物２の結果を示す。各図における第二のバーは、グリコーゲンへの14Ｃの取り込みに対するインスリン（１０００マイクロユニット／ｍｌ、７.１ｎＭ）の刺激効果を示す。各図における第三のバーは、14Ｃグルコースからのインスリン刺激した14Ｃ取り込みの低下におけるアミリン（１００ｎＭ）の効果を示し、それはインスリンの不存在下で観察されたものに近い値である。各図における第四のバーは、化合物１（１００ｎＭ）または化合物２（１００ｎＭ）のいずれもがインスリンに対する応答に影響しないことを示す。すなわち、化合物１または化合物２のいずれもがこのアッセイにおけるアミリン・アゴニスト活性を示さない。第五のセットのバーでは、（第三のセットのバーにおいて示すごとき）グリコーゲン（７.１ｎＭ）へのグルコースのインスリン刺激取り込みに対するアミリンの効果は、化合物１（１μＭ）または化合物２（１μＭ）のいずれかの添加によって逆転する。すなわち、化合物１および化合物２は、このアッセイにおいてアミリン・アンタゴニスト活性を示す。
図３は、単離されたヒラメ筋における14Ｃグルコースからのグリコーゲンへの14Ｃのインスリン刺激の取り込みに対するラットアミリン（１００ｎＭ）の効果の化合物１による逆転についての用量反応曲線を示す。グラフからのＩＣ50値は、化合物１では約４ｎＭである。
【００９４】
実施例Ｄ
血漿中グルコース、乳酸塩およびカルシウムレベルに対する効果
雄性Harlan Sprague Dawleyラットを１２：１２時間の明：暗サイクル(実験は明るいサイクルの間に行う)で２２.７°±０.８℃にて収容し、自由に食餌(Diest LM-４８５、Teklad、Madison、Wis.)および給水した。使用動物は、８７-９４日齢であり、３５３-３９２ｇの体重であった。それらは、実験に先立ち-２０時間の間食物を奪われた。
【００９５】
麻酔は５％ハロタンで導入し、手術中２％にて、記録中では０.８-１％を維持した。気管切開ならびに右側の大腿動脈および伏在静脈のカニュレーションを行った。大腿動脈ラインを圧トランスデユーサー(Spectramed P２３XL トランスデューサー、Model １３-４６１５-５８ 増幅器、Gould、Cleveland、Ohio)に接続し、３.０ｍｌ／時間にてへパリン化生理食塩水（２Ｕ.ｍｌ）で灌流した。結腸温度を、加熱操作テーブルを切り換えることによって閉塞ループコントロールのコア温度を供給するサーミスタープローブおよびコントローラー(Model ７３A、YSI、Yellow springs、Ohlo)を用いて測定した。平均動脈圧のシグナルは、定期的にサンプリングし、コンピューター化データ捕捉システム(DT２８０１A A.D コンバーター、Date Translation、Marlboro、Mass.；AST Premium ３８６ コンピューター、AST Research、Irvine、calif.；Labtech Notebook ソフトウエア、Laboratory Technologies Corp、Wilmington、Mass. )を用いて１Ｈｚにて１２ビット精度で蓄積した。
【００９６】
合成ラットアミリン(Bachem、Torrance、Calif. )をアミリン受容体アッセイにおける結合能力につき、およびヒラメ筋アッセイを用いる生物学的活性につき試験した。試験化合物を上記のごとく固相ペプチド合成法により作製した。
以下の処置群：（１）ｔ＝０にて０.１ｍｌの０.１５M生理食塩水を皮下注射した対照ラット群（ｎ＝５）；（２）ｔ＝０にて０.１ｍｌの生理食塩水中の１００μｇの合成ラットアミリンを腹側部壁に皮下ボーラスとして投与したアミリン注射ラット（ｎ＝５）；（３）試験化合物の事前注射に続いてのアミリン注射ラット（ｎ＝１）を利用した。群３において、（群２のごとき）皮下アミリン注射は、試験化合物のプライミングされた／連続的な静脈注入を先行した。-３０分での０.５ｍｇの試験化合物のボーラス静脈内用量に続いて、ｔ＝１２０分まで試験化合物を１ｍｇ／時間で静脈内注射した。
【００９７】
２５０μｌの動脈試料を（アミリン注射に関して）-３０、-１５、０、１５、３０、４５、６０、９０および１２０分にて非ヘパリン化Natelson試験管に入れ、冷却したＥＤＴＡマイクロファージ（microphage）試験管に移し、回転させ、分離した血漿を固定化酵素化学（グルコースオキシダーゼ、Ｌ‐乳酸オキシダーゼ、Analyzer model ２３００-STAT、YSI、Yellow springs、Ohio）を用いてグルコースおよび乳酸塩につき直ちに分析した。
総血漿中カルシウムを染料結合アッセイ（o‐クレゾールフタレインコンプレクソン、Sigma procedure ５８７；Sigma、St. Louis、MO、USA）を用いて測定した。
【００９８】
１００μｇの化合物１または化合物２の皮下注射に対する応答は、１００μｇのラットアミリンまたは生理食塩水ビヒクル対照のいずれかで得られたものと比較した。血漿中グルコースおよび乳酸塩の濃度は、典型的にはラットアミリン注射に続いて増大することが観察された。アミリンに対するこの応答は、アミリン媒介グリコーゲン分解、筋肉からの乳酸塩の遊離および遊離された乳酸塩からの続いての糖原貯蔵症のために少なくとも部分的であると解釈された。さらに、血漿中カルシウムレベルは、典型的には低下することが観察され；この効果は、カルシトニン受容体でのアミリン作用のためであろう。
【００９９】
図４Ａないし４Ｃは、化合物１の皮下注射後の麻酔ラットにおける血漿中のグルコース（図４Ａ）、乳酸塩（図４Ｂ）およびカルシウム（図４Ｃ）の応答を、ラットアミリンまたは生理食塩水ビヒクル対照に続いてのかかるレベルに比較して示す。図５Ａないし５Ｃは、化合物２の皮下注射後の麻酔ラットにおいける血漿中のグルコース（図５Ａ）、乳酸塩（図５Ｂ）およびカルシウム（図５Ｃ）の応答を、アミリンまたは生理食塩水ビヒクル対照に続いてのかかるレベルに比較して示す。
図４Ａないし４Ｃおよび図５Ａないし５Ｃに示すごとく、化合物１と化合物２のいずれもが血漿中乳酸塩または血漿中グルコースのいずれもを増加させず、その結果は、ヒラメ筋アッセイにおいて観察されたアミリン作動性の損失と一致する（実施例Ｃ参照）。化合物１および２は、血漿中カルシウム濃度の低下を引き起こし、それはカルシトニン・アゴニストとしてのその活性と一致する。
【０１００】
実施例Ｅ
アミリン存在下の血漿中グルコース、乳酸塩および
カルシウムレベルに対する効果
１８ないし２０時間絶食させた雄性Harlan Sprague Dawleyラット（７５ないし８５日齢、体重３００-３５０ｇ）をハロタン麻酔し、注入／注射用の伏在静脈、およびグルコース／乳酸塩／カルシウムの採取用のおよび動脈圧を記録するための大腿静脈を介してカニュレーションした。また、心拍数をＥＣＧを介してモニターした。
【０１０１】
手術の１時間半後に、ラットに１.５ｍｌボーラスの化合物２を注射し、続いてさらに１.５時間３ｍｇ／時間の注入を行った（ｔ＝０.５ないし１.０時間）。ｔ＝０時間にて（プライミングした／連続的な試験化合物の注入の開始後０.５時間）、５０μｇボーラスのラットアミリンを投与し、続いて５０μｇ／ｍｌ時間のラットアミリンを注入し、それを実験が終了するまで続けた。血液試料は、試験の最初の２時間は１０分毎に、次いで３０分毎に採取した。平均動脈圧および心拍数を連続してｔ＝０.５ないしｔ＝＋０.５時間記録した。試験をｔ＝６時間にて終了した。従前に報告されたアミリン・アンタゴニストであるＡＣ２５３(Prickett、K.S.ら、「Design of Receptor Selection Peptides that Antagonize the Actions of Amilin In Vivo」、Peptides Chemistry Structure and Biology(KaumayaおよびHodges編)、６２０ないし６２２頁（１９９６））を陽性対照として含有した。
【０１０２】
図６Ａないし６Ｄは、アミリン投与後の時間の関数として、血漿中グルコース（図６Ａ）、血漿中乳酸塩（図６Ｂ）、血漿中カルシウム（図６Ｃ）および平均動脈圧（図６Ｄ）に対する化合物１および化合物２の効果を示す。このプロトコールにおいて、ラットアミリン・アンタゴニスト活性は、典型的にはアミリン投与に続いての血漿中グルコースおよび乳酸塩の増加の抑制によって示される。化合物１および化合物２の事前注入の結果、生理食塩水で事前注入された対照ラットにおいて観察されたものより、乳酸塩およびグルコースレベルにおいて小さく増加し、それはこれらの化合物がｉｎ ｖｉｖｏにてアミリンの高乳酸および高血糖作用に拮抗したことを示す。血漿中カルシウムレベルの低下は、化合物１または化合物２の注入後に開始され、続いてのアミリン注入によって変化しなかった。血漿中カルシウムに対するこの観察された効果は、典型的なアミリンおよびカルシトニン・アゴニスト活性と考えられる。アミリンの血圧低下効果を逆行させるためのこれらの化合物の能力の欠如は、ＣＧＲＰ受容体を通して媒介さることが知れれた効果であり、試験化合物の選択的活性を示す。
【０１０３】
実施例Ｆ
フェノールレッド胃内容排泄アッセイ
胃内容排泄は、Ｓcarpignatoらのオリジナルの方法(Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. ２４６：２８６-２９５(１９８０))の修飾(Plourdeら、Life Sci. ５３：８５７-８６２(１９９３))を用いて測定した。覚醒ラットは、ガバージによって、１.５％ メチルセルロース(M-０２６２、Sigma Chemical Co、St Louis、MO)および０.０５％ フェノールレッド指示薬を含有する１.５ｍｌの無カロリーゲルを受けた。ガバージの２０分後、ラットを５％ハロタンを用いて麻酔し、胃を開け、動脈鉗子を用いて幽門および下部食道括約筋にてクランプし、取り出し、固定容量まで作成したアルカリ溶液中へ開けた。胃内容量は、５６０ｎｍの波長での吸収によって測定されたアルカリ溶液中のフェノールレッドの強度から得た。大部分の実験において、胃内容物は透明であった。他の実験において、粒状の胃内容物を遠心して、吸光度測定のために溶液を澄明とした。希釈された胃内容物が濁ったままである場合、フェノールレッドによる分光学的吸光度をアルカリ性希釈液−対−酸性化した希釈液中に存在するものの間の差として導いた。７匹のラットに対する別々の実験において、胃および小腸を摘出し、アルカリ溶液に開けた。ガバージの２９分以内に上部胃腸管から回収できたフェノールレッドの量は８９±４％であり；腸管腔表面に回収しがたく結合したらしい染料は残りを説明できる。この小さな損失を補正するために、２０分後に残留している胃内容量のパーセントを同一実験におけるガバージ直後に犠牲にした対照ラットから回収した胃内容量の分数として表した。パーセント胃内容残量=(２０分での吸光度)／(０分での吸光度)。胃内容排泄についての用量反応曲線は、最小二乗反復ルーチン（ALLFIT、v２.７、NIH、MD）を用いる４変数ロジスティックモデルにフィットさせて、ＥＣ50を導いた。ＥＣ50は対数-正規分布であるので、対数の±標準誤差で表す。ペアでの比較は、分散の片側分析およびStudent-Newman-Keulsの多重比較検定(Instat v２.０、GraphPad Software、San Diego、CA)を用いて、有意レベルとしてＰ＜０.０５を用い行った。
【０１０４】
用量反応試験において、０.１５M生理食塩水に溶解したラットアミリン(Bachem、Torrance、CA)は、２０時間絶食したHarlan Sprague Dawleyラット（非糖尿病）および６時間絶食した糖尿病ＢＢラットにガバージの５分後にて、０、０.０１、０.１、１０または１００μｇの用量で０.１ｍｌの皮下ボーラスとして投与した。皮下アミリン注射をフェノールレッド指示薬でのガバージの５分後に与えた場合、用量依存的な抑制の胃内容排泄であった（データは示さず）。胃内容排泄の抑制を１μｇのアミリンを投与した正常なＨＳＤラットにおいて、および１０μｇを投与した糖尿病ラットにおいて完了した（Ｐ＝０.２２、０.１４）。正常ラットにおける胃内容排泄の阻害のＥＤ50は、０.４３μｇ（０.６０ナノモル／ｋｇ）±０.１９ log単位であり、糖尿病ラットでは２.２μｇ（２.３ナノモル／ｋｇ）±０.１８ log単位であった。
【０１０５】
（ラットまたはヒト）アミリンおよび単離されたヒラメ筋におけるアミリン様作用を示す（サケカルシトニン、ＣＧＲＰおよびラットカルシトニンを含めた）化合物が、本覚醒ラットモデルにおいて胃内容排泄を用量依存的に阻害することを観察した。ＣＧＲＰアゴニストとして作用するが、アミリンまたはカルシトニン・アゴニストとして作用しないことが観察されているアドレノメデュリンは、このモデルで用いた最大用量（１００μｇ）にて胃内容排泄を阻害しない（このモデルの胃内容排泄の阻害がＣＧＲＰ実施例によって媒介することがありそうもないことを示す）。
【０１０６】
図７に示すごとく、アミリンおよびラットカルシトニンは、胃内容排泄の阻害において同様の効力を有する（各々、０.２１および０.４１μｇ／ラットのＥＤ50；有意差なし）。サケカルシトニンは、その胃内容排泄阻害効果においてラットカルシトニンより効力があった（ＥＤ50０.１２μｇ／ラット；Ｐ＜０.０３）。カルシトニンおよび化合物２は共に胃内容排泄の阻害において、強力なアミリンおよびカルシトニン・アゴニストとして作用した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例１の化合物（「化合物１」）［配列番号１］によるアデニルシクラーゼのカルシトニン受容体連結した刺激を示す。Ｔ４７Ｄ細胞中のサイクリックＡＭＰ蓄積を試験化合物の濃度の関数として測定した。
【図２Ａおよび図２Ｂ】  図２Ａおよび図２Ｂは、ヒラメ筋アッセイにおける化合物１（図２Ａ）および実施例２の化合物（「化合物２」）［配列番号２］（図２Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアミリン・アンタゴニスト活性を示す。
【図３】  図３は、ヒラメ筋アッセイにおいて測定された化合物１のアミリン・アンタゴニスト活性についての用量反応曲線を示す。 試験化合物の変更用量にての単離されたヒラメ筋における14Ｃ-グルコースのインスリン刺激した取り込みに対するラットアミリンの効果の反転を示す。
【図４Ａ−図４Ｃ】  図４Ａないし図４Ｃは、麻酔ラットにおける血漿中グルコースレベル（図４Ａ）、血漿中乳酸塩レベル（図４Ｂ）および血漿中カルシウムレベル（図４Ｃ）に対する化合物１のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。
【図５Ａ−図５Ｃ】  図５Ａないし図５Ｃは、麻酔ラットにおける血漿中グルコースレベル（図５Ａ）、血漿中乳酸塩レベル（図５Ｂ）および血漿中カルシウムレベル（図５Ｃ）に対する化合物２のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。
【図６Ａ−図６Ｄ】  図６Ａないし図６Ｃは、麻酔ラットのグルコース（図６Ａ）、乳酸塩（図６Ｂ）およびカルシウム（図６Ｃ）の血漿中レベルに対するラットアミリンの阻害効果における化合物１および化合物２のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。また、平均動脈圧を測定した（図６Ｄ）。
【図７】  図７は、ラットにおける胃内容排泄の阻害に対する化合物１および化合物２のｉｎ ｖｉｖｏ効果についての用量反応曲線を示す。
【図８】  図８は、化合物１ないし化合物１３［配列番号１ないし配列番号１３］のアミノ酸配列を示す。
【図９】  図９は、文献に報告されたある種のペプチド化合物のアミノ酸配列を示す［配列番号１４ないし配列番号２６］。 該配列についての文献は次のとおりである：配列番号１４：４-３２サケカルシトニン；配列番号１５：８-３２サケカルシトニン；配列番号１６および１７：米国特許第５,５８０,９５３号；配列番号１８および１９：Gamseら、J. Bone Min. Res. ８(Suppl １)：Ｓ２００、アブストラクト番号３３４(１９９３)；配列番号２０ないし２６：米国特許第４,７５８,５５０号。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0004372345.tif 000015
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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