(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列番号１：
Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを認識する、細胞アポトーシスの発生を確認する抗体または該抗体の抗原結合部分。
【請求項２】
下記の配列番号４：
Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp
1               5                  10
のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを認識する、細胞アポトーシスの発生を確認する抗体または該抗体の抗原結合部分。
【請求項３】
担体および／または標識と結合した、請求項１または２に記載の抗体または該抗体の抗原結合部分。
【請求項４】
ヒトを含む哺乳類由来の器官、組織または体液のサンプルを含む生物学的サンプルにおいて、細胞アポトーシスの発生を確認する方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を用いる免疫学的検定によって確認を行う、前記方法。
【請求項５】
細胞アポトーシスの発生率を確認する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
確認された細胞アポトーシスの発生率が、変性性疾患および癌のようなアポトーシスを伴う疾病の検査および／または治療効果のモニターに使用される、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医薬、診断法、ならびにそれらの化合物を認識する抗体または抗原結合ペプチドにプログラムされた細胞死すなわちアポトーシスと呼ばれるタイプの細胞死の検出、モニター、測定、および調節方法に有用なサイトケラチン１８断片のようなアポトーシスに関連する抗原化合物、およびそれら化合物を認識する抗体または抗原結合ペプチドに関する。細胞アポトーシスの発生の確認はさらに、治療処置の効果のモニターに使用され得る。
【０００２】
【発明の背景】
アポトーシスは植物および昆虫から脊椎動物まで、高等真核生物のあらゆる種類で見られる(Kroemer G, Petit P, Zanzami N, Vayssiere J-L, Mignotte B:プログラムされた細胞死の生化学 The FASEB Journal 9:1277-1287 (1995))。アポトーシスは一般に致命的に重大な現象である。アポトーシスの低下は先天異常、癌および自己免疫疾患につながり、またアポトーシスの増強は変性性疾患、毒素産生微生物による感染などの急性疾患および移植臓器の拒絶反応をもたらす。
【０００３】
従ってアポトーシス検出、モニター、測定および調節は記載の症状の診断および治療処置における重要な因子である。
【０００４】
最近、Caulin C., et al (The Journal of Cell Biology, Vol 138, pp. 1379-1394)はケラチン１８のキャスパス(caspase)切断および上皮細胞アポトーシス中の中間径フィラメントの再構築を研究した。ケラチン１８はキャスパス−６、−３および−７によってin vitroで切断され、３つのキャスパスに共通の切断部位がＫ１８の保存されたＬ１−２リンカー領域に位置する配列ＶＥＶＤ／Ａであったと述べられている。
【発明の説明】
【０００５】
ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）と反応する有用な新規の特異的抗体を発見することを目的とする研究中に、すでに考慮中のことに加え、驚くべきことにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＣＫ１８のアミノ酸配列の特定の部分でマウスを免疫化した後に得られる）は培養上皮細胞の初期のアポトーシス変異を認識することがわかった。このＭＡｂはＭ３０と称せられた。
【０００６】
多数のアミノ酸（ａａ）配列の合成と検定をはじめとする詳細な解析によりＭＡｂ  Ｍ３０の特異的エピトープおよび結合部位がアミノ酸配列：ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤからなることが明らかになった。この１０個のアミノ酸からなるペプチド配列はヒトＣＫ１８の二次コイルから始まり、アミノ酸Ｎｏ．３８３−３９２を表す。この特異的エピトープはアポトーシス中に遊離される新たなエピトープであり、完全なＣＫ１８分子では発現しない。ＣＫ１８の完全なアミノ酸はOshima et al.(Oshima RG, Millan JL, and Ceccena G. (1986)によって発表されている。移植に先立ち、中間径フィラメントであるマウスおよびヒトケラチン１８の比較が示された。区分３３：６１−６８。
【０００７】
本発明の種々の態様はｍＡｂ  Ｍ３０、すなわちアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、配列番号１：
0004372340.tif 000002
または配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列の最適結合部位に基づいている。
【０００８】
初期には、アポトーシスに重要な部分は、ＤＡＬＤ（Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ）のすぐ後でのキャスパス酵素による切断に関連していると信じられていた。なぜなら、この配列はＣＫ１８に発生し、かつ、キャスパスはＤＸＸＤ（ここでＸは定義されていないアミノ酸を表す）の後で切断することが知られていたからである。
【０００９】
しかしながら配列番号ＤＡＬＤは、ＣＫ１−８、ビメンチン、デスミン、種々のアクチン、神経フィラメントおよびラミンのような他の中間径フィラメントには見られない。これらには以下の配列：それぞれＬＡＬＤ、ＭＡＬＤ、ＭＡＬＤ、ＶＡＬＤ、ＭＡＬＤおよびＬＡＬＤが認められる。
【００１０】
ｍＡｂ  Ｍ３０は心筋、巨核球、骨髄芽細胞、および胎児の神経組織（ＣＫ１８を含んでいるとは知られていない）などの非上皮細胞におけるアポトーシスの変異を認識するので、今般、Ｃ末端配列ＡＬＤを有するタンパク質断片が検出されれば初期のアポトーシスを示すものと確信されている。
【００１１】
このように、本発明の１つの態様は、次に配列番号１：
0004372340.tif 000003
のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体と特異的に結合するアポトーシス関連抗原化合物、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列または機能的に同等の配列を有する露出した抗原部位を含んでなるアポトーシス関連抗原化合物に向けられる。
【００１２】
露出抗原部位または抗体結合部位の三次元構造は、抗体の相当する三次元構造に特異的に結合する抗原化合物の結合部分の構造を決定する。従って本発明の抗原化合物は、配列番号１、すなわちその配列自体または機能的に同等な配列、すなわち少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能において相同なもの配列の構造に基づく化合物、例えば配列番号１の三次元構造が模倣されている限り、先に明示されたアミノ酸に、他の分子部分、Ｄ型アミノ酸、非天然アミノ酸および／または誘導体による１または数個のアミノ酸置換を有する化合物などを含んでなる。従って本発明の抗原化合物の共通の特徴は、次ぎに配列番号１のアミノ酸に特異的に結合する抗体に特異的に結合することであり、すなわち、抗原化合物は配列番号１のアミノ酸配列または少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を有する抗原部位を含んでなる。
【００１３】
完全なＣＫ１８分子は先に明示した隠れた配列を有しているのでその配列と特異的に結合する抗体と反応せず、これにより認識はアポトーシス、すなわちＣＫ１８分子が配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  ＡｓｐのＣ末端Ａｓｐの後ですでに切断されているという場合に特異的なものとなると言える。
【００１４】
本発明のこの態様の好ましい具体例では、アポトーシス関連化合物はＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなるペプチドまたはタンパク質断片である。このペプチドは配列番号１との相同体、伸長型または末端切断型であってもよく、すなわち配列番号１のアミノ酸配列と同一の抗体に結合する、そのペプチドの能力が消失してしまわない限り、いくつかのアミノ酸置換、伸長、切断および／または欠失を有する相同配列を持っていてもよい。
【００１５】
本発明のこの態様のもう１つの具体例では、本発明の抗原化合物は、Ｃ末端アミノ酸配列Ｘａａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ（ここでＸａａはＡｓｐ  Ｌｅｕ  ＭｅｔおよびＶａｌから選択される）を含んでなるペプチドまたはタンパク質断片である。
【００１６】
本発明のペプチドの一例は、
配列番号１：
0004372340.tif 000004
のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。
【００１７】
もう１つの例としては、
配列番号２：
0004372340.tif 000005
のアミノ酸配列（ＥＤＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤＳＳＮＳＭＱＴ）（すわなち、Ｎ末端において３個、およびＣ末端において７個のアミノ酸で伸長した配列番号１）を有するオリゴペプチドがある。
【００１８】
さらなる例としては、
配列番号３：
0004372340.tif 000006
のアミノ酸配列（ＬＥＤＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤＳＳＮＳ）を有するオリゴペプチドはある。
【００１９】
配列番号２および３のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドが合成されており、それらはＥＬＩＳＡにおいてｍＡｂ  Ｍ３０と結合する［比活性：それぞれ配列番号１では１００；配列番号２では１１；また配列番号３では８．３］。しかしながら、ｍＡｂ  Ｍ３０は、それらがＣ末端配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを有する新規なエピトープを提示するまでＣＫ１８断片とは結合できないので、これら２種のペプチドはアポトーシスに特異的なＣＫ１８の切断断片を表すとは考えられない。
【００２０】
なおさらなるもう１つの例としては、
配列番号４：
0004372340.tif 000007
のアミノ酸配列（ＧＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ）を有するオリゴペプチドがある。
【００２１】
本明細書および請求の範囲では、抗原化合物の抗体への特異的結合、または抗体のアミノ酸配列への特異的結合は、少なくとも１０７リットル／モル、好ましくは少なくとも１０９リットル／モルの親和定数を要する。
本発明のこの態様の１つの具体例では、抗原化合物は担体および／または標識と結合している。担体は、例えば、マイクロプレート、ビーズなどようなプラスチック面；ビオチンのような有機分子；ウシ血清アルブミンのようなタンパク質；ペプチドリンカー、ポリペプチド、例えば結果として生じる融合タンパク質であってもよい。
【００２２】
標識は、放射性同位元素、酵素、蛍光マーカーなどのような多様な種々の標識から選択すればよい。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、医薬に使用される本発明の抗原化合物に向けられる。
【００２４】
本発明のこの態様の好ましい具体例では、本発明の抗原化合物は細胞アポトーシスの阻害のための医薬の製造に使用される。
【００２５】
細胞アポトーシスの阻害は拒食症、エイズ、臓器移植、乾癬、およびアルツハイマー症のような変性性疾患の治療に望ましいと考えられる。
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはタンパク質断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離型または組換え核酸配列に向けられる。
【００２６】
本発明の核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡ）の形態のいずれかであってよい。ＤＮＡは二本鎖でも、一本鎖であってもよい。ＤＮＡ配列が一本鎖である場合、それはコード配列（センス鎖）であっても非コード配列（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。本発明の核酸配列は遺伝子コードによって、本発明により包含されるペプチドまたはタンパク質断片のアミノ酸配列から設計される。
【００２７】
本発明の核酸配列は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドの製造に使用できる。本発明のこの態様の特殊な具体例では、核酸配列は本発明の核酸配列に基づくアンチセンス配列であり、これは配列番号１のコード部分の総てまたは少なくとも一部において、本発明のペプチドまたはタンパク質断片をコードするセンス配列と相補的である。細胞内へ導入された際、アンチセンス核酸配列はセンス鎖のによってコードされた遺伝子の発現を阻害することができる。
【００２８】
本発明のこの態様はまた、本発明の核酸配列を含んでなるベクターを含む。かかかるベクターは、本発明のペプチドまたはタンパク質断片の製造に、あるいはおそらくは、in vivoまたはin vitroで標的細胞内で配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質断片または少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ含んでなるその機能的同等体を一定量に調節することに使用され得る。本発明の好ましい具体例で、ベクターとはプラスミドである。
【００２９】
本発明のなおもう１つの態様は、本発明の抗原化合物を認識する抗体または抗原結合ペプチドに向けられる。
本発明の抗体は、本発明の抗原化合物を認識するまたはそれと特異的に結合する、すなわち配列番号１のアミノ酸配列もしくは少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を認識するまたはそれと特異的に結合するモノクローナル抗体または単一特異性ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は当技術分野で十分に公知の免疫化法を用いて、または真核生物もしくは原核生物起源の好適な宿主細胞を使用する組換え技術に基づく十分に巧緻な方法によって作製可能である。
【００３０】
本発明の抗原化合物を認識する抗原結合ペプチドは、抗体の抗原結合部分、または配列番号１のアミノ酸配列もしくは少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなるその機能的同等体に少なくとも部分的に相当するアミノ酸配列を有するが、反対の電荷を持つアミノ酸を有するタンパク質もしくはペプチドであってもよい。かかる抗原結合ペプチドはアンタゴニストとして機能するであろう。
【００３１】
アゴニストの開発におては以下の指標が使用され得る：
０＝疎水性アミノ酸
＋＝陽性アミノ酸
−＝陰性アミノ酸
±＝中性アミノ酸
配列番号１：                    ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ
−−０±０±−００−
対応するアンタゴニスト部位：    ＋＋０±０±＋００＋
例えば、    ＫＲＷＱＦＧＲＬＡＲ
いくつかのアンタゴニスト候補が前記指針、特に＋位にＫおよびＲが用いられる変異体を用いて設計され得る。
【００３２】
本発明のこの態様の具体例では、抗体もしくは抗原結合ペプチドが担体および／または標識と結合している。
【００３３】
担体は例えば、マイクロプレート、ビーズなどのようなプラスチック面；ビオチンのような有機分子；ウシ血清アルブミンのようなタンパク質；例えば融合タンパク質を生じるペプチドリンカー、ポリペプチドであってもよい。
【００３４】
標識は放射性同位元素、酵素、蛍光マーカーなどのような多様な種々のタイプの標識から選択してよい。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、医薬に用いられる本発明の抗体および抗原結合ペプチドに向けられる。
【００３６】
本発明のこの態様の好ましい具体例では、本発明の抗体もしくは抗原結合ペプチドは、特に先天異常、癌および自己免疫疾患などの症状、すなわち制御されないまたは過剰な細胞増殖に関する症状において、アポトーシスの刺激のための医薬の製造に使用される。
【００３７】
本発明のもう１つの具体例では、製造された医薬は多くの変性性疾患、または毒素産生微生物による感染もしくは虚血性再狭窄障害などの急性疾患、および移植組織もしくは移植臓器の拒絶反応など、アポトーシスの増強が関与する疾病の治療に望ましい。ここで、アポトーシスの医療制御が最も重要であると思われる。
【００３８】
本発明のさらにもう１つの態様は、哺乳類の身体または培養細胞を含む生物学的物質において、Ｃ末端アミノ酸配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなるタンパク質断片の遊離を調節する薬剤に向けられる。
【００３９】
本発明のかかる薬剤の例としては、配列番号１の配列または特に配列番号１と同一の抗体もしくは抗原結合ペプチドと結合する配列、すなわち少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を含んでなるタンパク質の発現を阻害する（センス鎖）か、あるいは刺激する（アンチセンス鎖）かのいずれかの本発明の配列、ならびに酵素、酵素アクチベーターおよび阻害剤がある。
【００４０】
本発明のなおもう１つの態様は、ヒトを含む哺乳類由来の臓器、組織または体液のサンプルを含む生物学的サンプルにおいて、細胞アポトーシスの発生を確認する方法に向けられ、ここではＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなるタンパク質断片の発生が確認される。
【００４１】
本発明のこの態様の好ましい具体例では、かかる確認は本発明の抗体を用いる免疫学的検定を用いて実施される。
【００４２】
本発明のもう１つの好ましい具体例では、細胞アポトーシスの発生率が求められる。求められた細胞アポトーシス率は変性性疾患および癌のようなアポトーシスを伴う疾患の診断、ならびに治療効果のモニタリングに使用され得る。
【００４３】
この態様におけるサンプルの起源としては下記のものが挙げられる：in vivoまたはin vitroのヒトもしくは動物身体いずれもの臓器、正常もしくは変異した組織、標本および体液、例えば肝臓、肺、腎臓、心臓、脾臓、脳、内臓、リンパ器官、骨髄、生殖器、骨格、筋肉、皮膚、感覚器官、腺、血液、血清、尿、腹水、胸膜液、脳脊髄液、羊水、膿瘍液、洗液、穿刺、切片および本明細書における細胞または体液起源のいずれかの調製物。
【００４４】
かかるタンパク質断片の確認は、体液サンプルにおいてＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなるペプチド断片を検出、好ましくは定量できるいずれかの技術によって行ってもよい。好ましくはかかるタンパク質断片は少なくとも配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と同一の抗体もしくは抗原結合ペプチドと特異的に結合する配列、すなわち少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を含んでなる。このような断片と特異的に結合するモノクローナル抗体は種々の免疫学的検定で使用でき、所望により用いられる実際の検定に応じて標識できる。
【００４５】
本発明のかかる方法の１つの具体例では、確認は免疫学的検定を用いて行われる。また、抗体部位を有する構造体および／または抗体の使用に適した検出系を使用してもよい。本発明ので使用できる多くの免疫学的検定のうちのいくつかの例として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫検定法（ＲＩＡ、ＩＲＭＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、化学発光酵素標識免疫測定法、発光免疫検定法（ＬＩＡ）、解離増強経時分解蛍光免疫検定法(Dissociation enhancement time-resolved fluoroimmunoassay)（ＤＥＬＦＩＡ）が挙げられる。この検定は手動であっても自動であってもよい。
【００４６】
さらに本発明の態様は、患者において癌および変性性疾患などのアポトーシスを伴う疾病の治療方法であって、細胞アポトーシスを調節する量の本発明の抗体もしくは抗原結合ペプチドまたは本発明の抗原化合物を患者に投与することを含んでなる方法に向けられる。
【００４７】
本発明のもう１つの態様は、癌細胞を作出する方法であって、細胞アポトーシスを阻害する量の本発明の抗原化合物を培養細胞または実験動物に投与することを含んでなる方法に向けられる。かかる培養細胞または実験動物は所望のポリペプチドもしくはタンパク質の生産、または抗癌剤の評価に使用できる。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体または抗原結合ペプチドを含んでなり、予防、治療または診断に用いる担体に向けられる。本発明のかかる担体は、配列番号１のようなＣ末端アミノ酸配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる断片、または少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列を発見する標的物質として機能し、それは種々の薬剤および／または予防、治療または診断目的の標識と結合させてもよい。
【００４９】
以下、実験の説明および発明の具体例を参照して本発明をさらに説明するが、これらは請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
本発明のペプチドの合成
本発明のペプチドは、プロテアーゼによる精製タンパク質の制御下での分解または他の化学的方法など、公知のアミノ酸配列作製法のいずれによっても作出できる(Allen G., Sequencing of proteins and peptide, 1989, Elsevier Science Publishers B.V.)。化学合成は一般に液相でアミノ酸残基またはペプチド断片を正しい順で互いに結合させることにより行い、所望のペプチドを作製する。もう１つの通常の戦略としては、固相（樹脂）から始めて、そこにその配列の最後のアミノ酸のＣ末端がそこに結合し、その終わりから２番目のアミノ酸のＣ末端と最後のアミノ酸のＮ末端と結合しているというようにアミノ酸を互いに結合させ、最後にこの固相から構築されたペプチドを遊離させること（いわゆる固相法）である。
【００５１】
本発明を示すために作製されたオリゴペプチドは、酸ハンドル誘導体化したポリエチレンの支持体を用いるマルチピンペプチド合成法により合成された(Valerio, R.M., Bray, A.M. and Maeji, N.J. (1994) Multiple peptide synthesis on acid-labile handle derivatized polyethylene supports. Int. J. Peptide Protein Res. 44:158-165を参照)。かかる合成はヒドロキシエチレンメタクリレートをグラフトし、トリフルオロ酢酸に不安定なリンクアミド形成ハンドルで機能化した着脱可能なピン上で行った。ＮおよびＣの双方の末端が切断された一連の配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤおよび他の配列を表すペプチドが合成された。これらのペプチドはテトラペプチドリンカー配列−ＳＧＳＧ−または−ＳＧＳＢ−（Ｂ＝βアラニン）を用いてビオチンでキャップし、酵素結合免疫吸着検定法のおいてストレプトアビジン被覆プレートに付着させた。
【００５２】
アミノ酸配列は純度に関して、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびイオンスプレー質量分析法（ＩＳ−ＭＳ）によって確認した(Van Dorsselear et al., (1990) Application of electrospray mass spectrometry to characterization of recombinant proteins up to 44kDa. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19:692-704を参照)。
【００５３】
イオンスペクトルは、酸性（トリフルオロ酢酸または酢酸）溶液からペプチドを気化させることにより得られる陽イオンとして収集した。このイオン数に対する生の質量−荷電比のスペクトルから、分子量（ダルトン）に対する全イオン数のパーセンテージを得た。ＩＳ−ＭＳ純度は標的ペプチドに帰すことができるイオン数であり、イオン総数のパーセンテージとして表した。
【００５４】
マウスの免疫化
免疫化材料の調製
抗原精製のための出発材料はヒト結腸癌細胞系統ＷｉＤＲ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２１８）細胞培養培地の上清であった(Rydlander L, Ziegler E, Bergman T, Schoberl E, Steiner G, Bergman A-C, Zetterberg M, Bjorklund P, Skern T, Einarsson R and Jornvall H (1996): Molecular characterization of a tissue-polypeptide-specific-antigen epitope and its relationship to human cytokeratin 18. Eur. J. Biochem. 241:309-314)。第１の工程では５０％（質量／容量）硫酸アンモニウムによる沈殿を用いた。次ぎに、１４ｍＭリン酸塩／８５ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．５中、フェニルセファロースでの疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムを洗浄した後、疎水性タンパク質を水で溶出し、画分を回収した。第３の工程は、８Ｍ尿素、０．１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中でのセファクリルＳ−３００排除クロマトグラフィーからなった。第４の工程では、０．１ｍＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、８Ｍの尿素で平衡化したＱセファロースを使用した。
【００５５】
０．１２Ｍ  ＮａＣｌで溶出した画分は約８８２精製されており、一方は１３ｋＤ、他方は２２ｋＤの２種の有効成分を含んでいた。それらはサイトケラチン１８のサブタイプと同定され、双方ともアミノ酸３９６で終わり、すなわち断片はＣ末端アミノ酸配列ＡＬＤを含んでなるであった。
【００５６】
免疫化の手順
４個体のＢａｌｂＣマウスに１００μｌのフロイントの完全アジュバントを懸濁させ、１０７μｇの第１のバッチの精製抗体を含有する１００μｌの平衡化生理食塩水（ＰＢＳ）を１度、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。３、６および９週間後、このマウスにフロイントの完全アジュバントの代わりに追加量の抗原バッチで同じ注射を行った。最後の注射から８週間後、１００μｌＰＢＳ中アジュバントを含まない新たな抗原バッチ５３μｇを追加として静注し、さらに同量を腹膜内に投与した。
【００５７】
リポペプチドアジュバント：（Ｐａｍ３ｃｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）４，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ１４２８  ７６４，ロット１３１２  ７０２４）と結合させた適当量の合成ペプチドＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤによるＢａｌｂＣマウスの免疫化の結果、合成オリゴペプチドに対するモノクローナル抗体を産生する免疫適格細胞が開発されることとなる。
【００５８】
ハイブリダイゼーション
マウスの追加抗原注射から３日後、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（細胞系統：Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３，Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ）とハイブリダイズさせた。得られた多数のハイブリドーマ培養物からの培地をウサギ抗マウス抗体と反応させ（固相）、そこに免疫化抗原およびブロッキングマウスグロブリンを加えた後、ＨＲＰ標識した、ＣＫ１８に対する検出抗体を加えた。
【００５９】
免疫組織化学的解析により、得られた雑種細胞系統（Ｎｏ．３０）により産生された抗体の１つ培養細胞と反応し、活性もなく、また壊死もないことが観察された。供試細胞はＩＭＤＭ９０％＋１０％ウシ胎児血清＋２ｍｍのＬ−グルタミンおよび１０μｇのゲンタマイシン中で増殖させたＨｅｒａ細胞（Ｇｅｙ  １９５２）、膀胱癌細胞系統Ｔ２４、乳腺細胞系統Ｔ４７ｄ、結腸癌細胞系統ＷｉＤｒ  ＣＣＬ２１８であった。予期しない観察から、免疫化学的および免疫組織化学的技術による抗体特異性の詳細な研究を行うこととなった。Ｍ３０で示されるＭＡｂはアポトーシス細胞および体液と特異的に反応することが明らかとなった。
【００６０】
免疫化学
ＭＡｂ  Ｍ３０エピトープを化学的に同定するために、この目的のために特に作製した多数の合成ペプチドに対してＭ３０を試験した。最適特異性エピトープはアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤからなることがわかった。この配列および関連配列は表１に示されており、これはアミノ酸配列の、本発明のモノクローナル抗体Ｍ３０との反応性を示している。
【００６１】
【表１】
0004372340.tif 000008
【００６２】
表１から明らかなように、アミノ末端からＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤまでの配列の段階的に短縮することで最大活性が得られた。他方の末端で最後のＤ（Ａｓｐ）を除去するか、あるいは最後のＤにＳ（Ｓｅｒ）を付加した結果、活性は完全に消失した。
【００６３】
ＤＡＬＤの最後のＤが必要なことは明らかであり、アポトーシスに必要な構造に関して知られていることと、すなわち活性型キャスパス−３酵素は標的基質におけるＤＸＸＤパターンを認識するということとの関連性が認められるはずである(Nicholson DW, Ali A, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Ding CK, Gallant M, Gareau Y, Griffin PR, Labelle M, Lazebnik YA, Munday NA, Raju SR, Smulson ME, Yamin T-T, Yu VL, Miller DK, et al. (1995))。Identification and inhibition of ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature, 376:37-43)。さらに、キャスパス−６およびキャスパス−７の双方はＤＸＸＤ配列を有する基質を切断できる(Talanian RV, Quinlan C, Trautz S, Hacket MC, Mankovich JA, Banach D, Ghayur T, Brady KD. Wong WW. (1997). Substrate specificities of caspase family protease. J. Biol. Chem. 272:9677-9682)。これまで本明細書に記載の新たな配列は、アポトーシスを示すまでは知られていなかった。
【００６４】
キャスパスサブファミリーのプロテアーゼが哺乳類のアポトーシスに関与しているということは、アポトーシス細胞におけるＤＸＸＤ−Ｘ切断活性およびプロ酵素の活性化、ならびに特異的基質模倣ペプチド阻害剤による種々の系におけるアポトーシスの阻害の観察に及ぶ証拠に従わせることにより支持される(Nobel S. (1997). Thiol redox state in apoptosis: Physiological and toxicant modulation. Dissertation, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. ISBN 91-628-2502-X)。
【００６５】
免疫組織化学
現在、アポトーシスの検出するにはいくつかの方法があるが、サイトケラチン１８の一部と既知のアミノ酸配列との定義された反応に基づくものはない。アポトーシス細胞を同定するのに最も広く用いられている方法としては、光学および電子顕微鏡解析、フローサイトメトリー、アガロースゲル電気泳動、in situニック末端標識（ＩＳＥＬ）およびＴｄＴにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法がある。
【００６６】
予備知見を実証するために、またＭＡｂ  Ｍ３０により認識されるエピトープの発現を適合させるために種々のアポトーシス系の結果を解析し、Ｍ３０免疫組織化学と許容されるアポトーシスアッセイとを比較した。比較は、確立された形態学的基準の次ぐ、例えば非小細胞肺癌系統ＭＲ６５を用い、アネキシン、ＴＵＮＥＬおよびフローサイトメトリーアッセイを用いてなされた。共焦レーザー顕微鏡解析により、アポトーシス細胞はＭＡｂ  Ｍ３０とともにインキュベーションした後、細胞質の明るい免疫蛍光染色が示されるが、生細胞および壊死細胞は陰性となることが明らかになった。
【００６７】
Ｍ３０エピトープの発現は、アポトーシス細胞の検出のためのその他の許容される染色法、すなわちアネキシンＶ、ＴｄＴにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイと極めてよく相関していた。大多数のＭ３０陽性細胞はＧ１ピーク下の「アポトーシス」にあった。Ｍ３０エピトープの発現は、アネキシンＶ反応性または陽性ニック末端標識に先立つ初期にはアポトーシスカスケードに見られる。エピトープは生存能力のある上皮細胞では検出できなかった。アミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列Ａｌａ  Ｌｅｕ
【００６８】
Ａｓｐを含んでなる機能的に同等な配列からなるこのエピトープは、簡単な免疫組織化学的技術を用いてサイトケラチンのレベルでアポトーシス細胞の定量を可能にする。
【００６９】
アポトーシスの検出のために従来許容されていた方法の主な欠点は、時間がかかり、比較的高価で、集中的な労力を要し、さらに必ずしもアポトーシス細胞に特異的ではないということである。加えて、ＴＵＮＥＬアッセイおよびＩＳＥＬはアポトーシス中期および後期しか検出できない。
【００７０】
種々のアポトーシス誘導系の結果を解析し、Ｍ３０免疫組織化学および許容されるアポトーシスアッセイを比較したところ、Ｍ３０はヒト起源の細胞系統および通常得られる生検においては既存のアポトーシス検出アッセイより優れていることがわかった。Ｍ３０は初期段階のプロセスにあるアポトーシス細胞を特異的に認識する。
【００７１】
Ｍ３０はアポトーシスの内在性の初期マーカー、すなわちＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列を認識するので、通常得られる新鮮な生検、またホルマリンで固定され、パラフィン包埋された組織切片にも適用できる。このことはＭ３０の利点の１つである。
【００７２】
Ｍ３０免疫反応性はまた、アネキシンＶ結合およびＤＮＡの断片化によって検出され、ＴＵＮＥＬアッセイにより検出されるような膜の非対称性をもたらさずに進行するので、これまで用いられてきた通常のアッセイに明らかな利点を与える。
【００７３】
体液を反映するアポトーシス
ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列を含むアポトーシス産物が体内のアポトーシス細胞領域から血清、腹水、胸膜水などのような体液中に遊離する場合、他の血清アッセイと同様に免疫反応アッセイをＭＡｂ  Ｍ３０とともに用いて血清および体液中の特異な産物の濃度を検出および定量することができる。このように、増加したアポトーシスまたは不十分なアポトーシスすなわち部位ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列と結合するＭＡｂ  Ｍ３０のレベルの上昇または低下により引き起こされる、あるいはそれに関連する疾病を識別することができる。関連する臓器または組織由来の標本はより特異的な診断を与え得る。
【００７４】
配列番号１または機能的に同等な配列の診断上の使用
アポトーシスのプロセスは、誘導期、作動期、および分解期の３段階に分けることができる。サイトケラチン１８の分解およびＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤを含む断片の産生は極めて初期、いずれの公知のアポトーシスアッセイ法が陽性に転じるかなり前に起こる。このことにより、アンタゴニスト医薬、すなわちＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列に対する特異的抗体、またＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列の産生をもたらす酵素の阻害剤または活性化剤を用いて、ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列の産生および機能を極めて初期に介在させることが可能となる。
【００７５】
Ｍ３０陽性標本の濃度および局在性の解析から得られた知見を用いることにより、アポトーシス（プログラムされた細胞死）のプロセスの増強および阻害が望ましいかどうか、また標識されたまたは標識されていないＭ３０抗体、さらに標識されたまたは標識されていないＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤもしくは少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列、ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、もしくはＫＲＷＱＦＧＲＬＡＲなどのような少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列に対する標識されたまたは標識されていないアンタゴニストにより、あるいはＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列を産生する酵素を阻害または増強することによりこのプロセスに影響を与える試みをすべきかどうかがわかる。この選択は、モノクローナル抗体Ｍ３０による、アポトーシスアミノ酸配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤ、または少なくとも配列ＡＬＤを含んでなる機能的に同等な配列の厳密な同定に基づくものである。
【配列表】
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称： Beki AB(Publ.)
（Ｂ）所在地： Fredsforsstigen 22
（Ｃ）市： Bromma
（Ｅ）国：スウェーデン
（Ｆ）郵便番号(ZIP)：１６８  ６６
（Ｇ）電話番号：０８−２９０３７０
（ｉｉ）発明の名称：アポトーシス関連化合物およびその使用
（ｉｉｉ）配列の数：４
（ｉｖ）読み込み可能なコンピューター：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリースＮｏ．１．０
バージョンＮｏ．１．３０（ＥＰＯ）
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｘｉ）配列：配列番号１
0004372340.tif 000009
（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｘｉ）配列：配列番号２
0004372340.tif 000010
（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｘｉ）配列：配列番号３
0004372340.tif 000011
（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｘｉ）配列：配列番号４
0004372340.tif 000012