(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の存在及び／又は活性について試料を分析する方法であって：
疎水性物質を提供する工程；
疎水性部分及び親水性部分を有する両親媒性基質を提供する工程、ここで該親水性部分はその上にリポーター成分を含み、該基質は前記酵素により切断され、その結果該リポーター成分を含む親水性フラグメントを生成することが可能である工程；
前記疎水性物質中に前記基質を配置する工程；
前記基質がその中に配置されている前記疎水性物質を、前記試料及び極性溶媒と接触させ、これにより該試料中に存在するいずれかの酵素が、該基質を切断し、かつ標識された親水性フラグメントを生成し、このフラグメントが該極性溶媒へと移動する工程；及び
前記極性溶媒中又は前記疎水性層中の前記リポーターの存在を検出する工程であり；これにより、該極性溶媒中のリポーターの存在及び／又は該疎水性層中のリポーター量の減少が、前記酵素が活性であることを示す工程を含む、方法。
【請求項２】
前記疎水性物質が、層を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リポーターの存在を検出する工程が、前記疎水性層中の該リポーターの量を検出する工程を含み；ここで、該疎水性層中の該リポーターの濃度は、前記酵素の活性に逆比例している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記リポーターの存在を検出する工程が、前記極性溶媒中の前記リポーターの量を検出する工程を含み；ここで、該極性溶媒中の該リポーターの濃度は、前記酵素の活性に比例している、請求項１記載の方法。
【請求項５】
疎水性物質を提供する工程が、更に支持体上に該疎水性物質を固定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記支持体がマイクロウェルプレートを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が多数のビーズを含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記リポーターが放射性物質であり、かつこの場合前記支持体が放射反応性材料を含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記リポーターが、非放射性物質であり、かつこの場合前記支持体が反応性材料を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記疎水性層が、前記支持体に共有結合により結合している、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記疎水性層が脂質である、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質がホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
試料中の酵素の存在について試料を分析するアッセイであり：
疎水性物質の本体；
前記疎水性物質中に配置された両親媒性基質であり、この両親媒性基質は、その中に該基質を保持するために該疎水性物質と相互作用する疎水性部分、及びその上にリポーター成分を有する親水性部分を含み、該基質は前記酵素によって切断され、該リポーター成分を含む親水性フラグメントを生成するような、両親媒性基質を含む、アッセイ。
【請求項１４】
前記疎水性物質の本体が、支持体の上に配置される、請求項13記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記疎水性物質が、該支持体に共有結合により結合している、請求項14記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記疎水性物質が脂質である、請求項13記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記脂質がホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項16記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記リポーターが放射性物質又は非放射性物質を含む、請求項13記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、例えば固体支持体上に形成された脂質層であり、親水性領域上のリポーターで標識された両親媒性酵素基質を疎水的相互作用によって組込んでいる脂質層のような疎水性層、及び抽出工程を伴うことなくいろいろな酵素アッセイを行うためのその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの細胞内及び細胞間のプロセスは、膜に媒介されているので、これらのプロセスを調べる方法としての生体膜の再構築に関する非常に多くの研究がある。人工の平らなリン脂質二重層膜を生成する最初に開発された方法（Muellerら、1962年）、及び平らな膜にイオンチャネルを含む小胞を融合することの実証（Mueller及びRacker、1976年）から、いろいろな人工の膜システム、及び生体膜に取り込まれるか又は結合された機能性分子を研究する様々な方法（Hoekstra及びDuzgunes、1993年）が、研究に使用されている。一部の研究者は、人工膜に、ビオチン化された脂質（例えば、Wright及びHuang、1992年を参照のこと）又は機能的酵素（例えば、Hianikら、1996年を参照のこと）を組込んでいる。しかしその目的は、膜又は組込まれる分子の特性を研究することであって、本発明におけるように外来性分子の特性を研究するための道具として合成膜を使用することではない。この分野における現在の技術及び研究の検証については、Ottova及びTien(1997年)を参照されたい。
【０００３】
ホスホリパーゼC（PLC）は、ジアシルグリセロール及び、例えばセリン、コリン、イノシトール、グリセリン又はエタノールアミンのようなリン酸化されたアルコールへの、ホスホグリセリドの加水分解を触媒する酵素の総称である。例えば、特定のホスホリパーゼCは、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PIP)又はホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PIP2)を加水分解し、それぞれの場合、2種の第二メッセンジャーである、疎水性のジアシルグリセロール及び親水性のイノシトールリン酸（各々、IP2又はIP3）を生じる。この加水分解は、内在性又は外来性の標識をつけた基質を用いる様々な方法によってモニタリングすることができる。
【０００４】
De Vivo（1994年）は、PIP2の加水分解を測定するために使用される現行法について説明している。内在性基質の方法において、問題の細胞は、ミオ-[3H]-イノシトール存在下で培養される。この細胞は、ホスファチジルイノシトールシンターゼにより、イノシトールをホスファチジルイノシトール(PI)に転換し、次にPIが、ホスファチジルイノシトールキナーゼによって、PIP-[3H]及びPIP2-[3H]に転換される。ポリホスホイノシチドのプールが安定した状態へと標識された場合、PIP及びPIP2の分解は、適切な刺激因子を細胞の培養培地へ添加することによって開始される（例えば、天然のままの細胞のための受容体作用薬、又は透過処理された細胞のためのグアニリルヌクレオチド）。
【０００５】
外来性基質の方法においては、標識をつけられた精製されたリン脂質が基質として使われる。これらのリン脂質は、界面活性剤の存在下又は非存在下において混合され、かつ短時間氷上で超音波処理され、小胞を調製する。この基質のアリコートは、PLCの供給源（膜又は精製された酵素）及びしばしばG-タンパク質サブユニットと混合される。
【０００６】
内在性及び外来性の両基質の方法においては、溶媒抽出法が、親水性の反応生成物を疎水性の基質から分離するために使われる。スフィンゴミエリナーゼのアッセイのための現行法も、溶媒抽出法工程を必要とする。この抽出工程を省略することは、環境上及び健康上の理由のために望ましいであろう。加えて、例えば医薬品候補の高処理量スクリーニングに必要とされるような、多数の試料の抽出を自動化することは難しい。
【０００７】
（発明の概要）
本願明細書において説明した発明は、抽出工程を必要とすることなく、様々な酵素の酵素活性の定量的又は定性的測定を可能にするものである。本発明は、基質が特異的酵素によって切断される際に、標識された親水性フラグメントが生成されるように、標識された両親媒性酵素基質が疎水的相互作用によって組込まれている人工脂質層のような疎水性層で被覆された固体支持体を、基質として使用する。この標識された親水性フラグメントは水相に移動し、これにより最早固体支持体とは結合せず、酵素活性のアッセイのための基本(basis)を形成する。適当な標識された基質を選択することで、様々な酵素を用いる本発明を使用することができる。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明に特有の特徴は、反応生成物の抽出を必要とせずに試料中の酵素活性を調べることを可能とする基質の使用である。本発明は、同種又は異種のいずれかのアッセイ様式で使用することができ、かつ放射分析用基質又は非放射分析用基質のいずれかを使用することができる。適切な基質を設計することで、本発明は、そのアッセイ法が別の状況では抽出工程を必要とするような、様々な酵素（例えばホスホリパーゼ）を研究するために使用することができる。本発明における使用に適した基質は、リン脂質、スフィンゴ脂質、並びに他のいずれかの両親媒性分子、例えばグリコシルジアシルグリセロール、セラミド、ガングリオシド、及びカルジオリピンのような複合リン脂質を含むが、これらに限定されるものではない。使用される酵素は、精製、半精製、あるいは、粗抽出物であることができる。
【０００９】
極性基で標識された両親媒性の酵素基質は、固体支持体上に形成され、かつ疎水的相互作用によって及び／又は共有結合による結合によって保持されているいずれか適当な疎水性層、例えば脂質層に、疎水的相互作用によって組込まれている。適当な疎水性層は、疎水的相互作用によって両親媒性の基質を結合する成分を組込むようなものである。使用するための特定の基質は、問題の酵素の作用に対するその感受性及び標識の適切な位置について設計又は選択される。基質を標識するために使用される適当なリポーター基（複数）は、放射性同位元素、酵素、発蛍光物質、発色物質、磁性物質、化学発光性物質もしくは電気化学的物質、又は特異的結合対の一員を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
適当な固相支持体は、合成の高分子支持体、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、置換されたポリスチレン、例えば積層された又はカルボキシル化されたポリスチレンなど；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリ塩化ビニルなど；ガラスビーズ；アガロース；ニトロセルロース；ナイロン；ポリビニリデンジフルオリド；表面が改質されたナイロンなどを含むが、これらに限定されるものではない。固相支持体として96-ウェルFlashPlateを使用するホスホリパーゼの均一なアッセイ法は、周知の作業である。（FlashPlateは、96ウェルの白色ポリスチレンマイクロプレートであり、各ウェルの内部は、ポリスチレンをベースにしたシンチラントの薄層で覆われている。）
【００１１】
従って本発明は、迅速な酵素をベースにしたアッセイを行うための方法及び材料に関する。これらのアッセイは、定量的又は定性的であり、かつ大規模な試料調製又は抽出工程を必要としない。このアッセイは、酵素と反応する両親媒性基質の使用に頼っている。この両親媒性基質は、リポーター成分（又は標識と称される）を保持する親水性部分、及び疎水性部分を含む。
【００１２】
典型的なアッセイにおいて、予測される目標の酵素を含む材料の試料を、疎水性層（既に示したように、好ましくは支持体上に配置されている）と接触するように配置する。試料は、典型的には水を含む極性溶媒中に配置され、かつ試料中に存在する酵素の少なくとも一部は、そこで基質材料と相互作用する。この相互作用は基質の切断をもたらし、そしてこれはリポーター物質を含む親水性フラグメントを放出する。親水性フラグメントは疎水性層との親和性が低く、外側の極性溶媒へと移動する。この反応の検出は、疎水性層に残留するリポーター活性を測ることによって達成されることが好ましく、かつこの残留するリポーター活性は、試料中の酵素活性に逆比例するであろう。あるいは、酵素活性は、水性材料中のリポーター標識フラグメントを検出することによって測定することができる。
【００１３】
前述のように、リポーター成分は、トリチウムのような放射性種を含むことができ、一部の例では疎水性層は、その中にシンチレーター物質を含む支持体上に配置することができる。別の例では、リポーター物質が、磁気によって標識された物質、蛍光標識された物質、抗体／抗原対の一員、蛍光剤、発色剤、化学発光物質、アッセイの目的の酵素とは異なる酵素、電気化学的に活性のある物質などを含むことができ、かつこのようなリポーター物質の他のものは、当業者には明らかであろう。
下記実施例は、本発明を例証することを意図している。
【００１４】
実施例I
スフィンゴミエリナーゼのアッセイ
基質の調製−ストレプトアビジンで被覆されたFlashPlates（登録商標）は、NENライフサイエンスプロダクツ（NEN Life Science Products）社から得た。ビオチン化されたホスファチジルエタノールアミン（PE）（Avanti）を、PBS（0.01Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）中の0.1M NaCl）中に10μg/mLに希釈し、かつ各ウェルに0.1mLを添加した。室温で一晩インキュベーションし、ストレプトアビジンに結合させた後、残っている溶液を吸引しウェルから取り除いた。スフィンゴミエリン（卵）[コリンメチル-3H]（NENライフサイエンスプロダクツ社）は、0.1%のウシ血清アルブミン[BSA]を含有するトリス-HCl、pH 7.0により、1.0μCi/mLに希釈し、かつ0.1mLを各ウェルに添加した。一晩室温でインキュベーションする間に、スフィンゴミエリンは、疎水的にPEと相互作用し、3H-標識された固相脂質層を形成した。その後プレートを吸引し、風乾した。
【００１５】
酵素アッセイ−スフィンゴミエリナーゼ（シグマ社）を、1mg/mL CaCl2及び1mg/mL MgCl2（バイオ・ホイッテカー社）を含有するPBSで、連続的に希釈し、かつ各ウェルに0.1mLを添加し、室温で一晩インキュベーションした。スフィンゴミエリナーゼの活性によってスフィンゴミエリンから切断された親水性3H-標識されフラグメントは、疎水性の固相脂質層から、水溶液へと移動し、カウントされるシンチラントの十分に近傍で3H量を減少させた。表Iの結果は、スフィンゴミエリナーゼの量を増すと、ウェル中で検出される放射能量の減少を生じることを示している。スフィンゴミエリナーゼ非含有のウェルを、陰性対照として使用した。
【００１６】
【表１】
表１
0004287049.tif 000002
【００１７】
実施例II
ホスホリパーゼCのアッセイ
基質の調製−FlashPlatesを、3H-標識した固相脂質層の調製においてスフィンゴミエリン-[3H]の代わりにPIP2[イノシトール-2-3H(N)]（NENライフサイエンスプロダクツ社）を添加した以外は、実施例Iと全く同様に調製した。
【００１８】
PLCの部分的精製−（Campsら、1992年；Campsら、1990年；Glorschikら、1989年）。継代のために、HL-60細胞（ATCC CCL-240）を、1リットルの回転フラスコの中で、10% CO2で、20%ウシ胎仔血清（FBS）、1%L-グルタミン及び0.1%ゲンタマイシンを補充したイスコブ(Iscove)培地中で培養した。ホスホリパーゼCを誘導するために、5日間、又は、生存細胞の密度が約2-3 x 106個に達するまでは、細胞を1.25%ジメチルスルホキシド（DMSO）を補充した培地で培養した。遠心により収集した後、洗浄バッファー（20mMトリス-HCl（pH 7.5）、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、3mMベンズアミジン、1mM ロイペプチン、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び0.002mMダイズトリプシン阻害因子）で2回洗浄し、細胞を約2 x 1010個含む最終のペレット（圧縮細胞量30mL）を、50〜100mLの溶解バッファー（250mMスクロース、20mMトリス-HCl [pH 7.5 ]、1.5mM MgCl2、1mM ATP、3mMベンズアミジン、0.001mMロイペプチン、1mM PMSF、0.002mMダイズトリプシン阻害因子）で再懸濁した。細胞は、処理の間に1分間の休止を設定し、Polytronホモジェナイザーにより各1分間冷温中で4回処理し、その後、処理の間に1分間の休止を設定し、1分間の氷浴中での超音波処理によって溶解した。この溶解液に、1.25mMまでのEGTAを補充し、デブリを、4℃で1445×g、20分間の遠心によって取り除いた。得られる上清は、17,593×gで20分間、4℃で遠心した。この工程から得られた上清は、112,594×gで60分間、4℃で遠心した。最終の上清（サイトゾル）は、細孔径0.45μmのフィルターを通した。タンパク質濃度を測定した後、サイトゾルを瞬間凍結し、ホスホリパーゼCの供給源として使用する時まで-80℃で貯蔵した。
【００１９】
酵素アッセイ−ホスホリパーゼC活性をアッセイするために、解凍したHL-60サイトゾルを、0.4mM CaCl2及び0.21mM GTP-γ-Sを含有するPBSで、いろいろなタンパク質濃度に希釈した。希釈したサイトゾル（0.1mL）を、PIP2-[3H]を伴う固相脂質層を含んでいるFlashPlate(登録商標)の各ウェルに添加し、室温で一晩インキュベーションした。ホスホリパーゼCの活性によってPIP2から切断された親水性3H-標識フラグメントは、疎水性の固相脂質層から、水溶液へ移動し、カウントされるシンチラントの十分に近傍の3H標識の量を減少させた。表2の結果は、ホスホリパーゼC量を増やすと、ウェル中で検出される放射能量の減少を引き起こすことを示している。ホスホリパーゼC非含有のウェルを、陰性対照として使用した。
【００２０】
【表２】
表２
0004287049.tif 000003
【００２１】
実施例III
ホスファチジルエタノールアミンの共有結合のためのFlashPlatesの化学的表面修飾
2種の化学物質が関連している：一方は、ジビニルスルホン（DVS）を使用し、他方は1-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）を使っている。
ジビニルスルホンのプレート活性化：1% DVS溶液は、使用直前に、0.1M炭酸ナトリウム（pH 11.5）を溶媒として調製される。アリコート（0.2ml）を、個々のウェルに分注し、かつ少なくとも30分間、室温で静置した。その後、このプレートを、0.1M炭酸ナトリウム（pH 10.5）で3回洗浄し、次に脂質を添加する直前まで風乾した。ホスファチジルエタノールアミン（PE）25μg/mlの溶液を、25〜50mM炭酸ナトリウム、pH 9.8〜10.2を溶媒として調製し、かつ0.2mlを各ウェルに分注した。プレートは、少なくとも3時間室温で再度インキュベーションした。最後に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、0.04%デオキシコレートで2回洗浄し、PBS単独で2回洗浄した。その後プレートを風乾し、密封したバッグに入れ室温・暗所に保管した。
【００２２】
EDACプレート活性化：EDACの0.5mg/m溶液を、25μg/ml PEを含有する10〜50mM MES、pH 6.8〜7.2を溶媒として調製し、0.2mlを個々のウェルに分注した。プレートを、暗所に一晩、室温で静置した。最後に、プレートを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、0.04%デオキシコレートで2回、及びPBS単独で2回洗浄した。その後プレートを風乾し、かつ密封したバッグに入れ室温・暗所で貯蔵した。
【００２３】
導入：
イノシトール特異性のホスホリパーゼC（PLC）類は、ペプチドホルモン及び神経伝達物質のような多様な多くの細胞が媒介した応答のシグナル伝達における重要な酵素である（Rhee及びChoi、1992年）。これらの酵素は、ホスホイノシチドの特異的加水分解酵素である。ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸（PIP2）のPLCによる酵素反応は、イノシトール1,4,5-トリリン酸（IP3）及びジアシルグリセロールの生成をもたらす。これは、細胞を通じて調節シグナルカスケードを形成するこれらの生成物を生成する。IP3は、IP3受容体との特異的相互作用を介して小胞体からの貯蔵Ca2+の細胞内動員を誘発する一方で、ジアシルグリセロールは、プロテインキナーゼCの強力な活性化剤である。これらの細胞の活性の事象は、細胞活性を調整する一連の経路の刺激作用である。
【００２４】
古典的には、PLC酵素は、β、δ及びγと称される3種のファミリーに分けられている。β及びγは、各々、G-タンパク質共役型経路及び受容体媒介型チロシンキナーゼ経路により調節される。これらの酵素の活性は、痕跡量の[3H、イノシトール] PIP2を含むリン脂質小胞を使った溶液ベースのアッセイを使って、以前から研究されている（DeVivo、1994年）。加水分解反応は、酸性化された有機溶媒の添加及びそれに続く相分離によってモニタリングされる。[3H]IP3は、水相に留まる一方で、酸性の標識された脂質は、有機相へと分配される。従って、水相の単独の放射分析は、PLC活性を計る簡便な方法を提供する。しかしこのアッセイの限界は、それが高処理量スクリーニング（HTS）用に容易に修正できないことである。
【００２５】
高処理量の方式においてこれらの酵素を研究するために、結合した[3H ]ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸を含むFlahPlates（登録商標）上で、PLC活性をモニタリングする方法が開発された。FlashPlate（登録商標）は、その表面上に標識されたリン脂質を捕獲するように修飾され、かつこれにより、PLC活性を正確に測る機能的基質を提供している。
【００２６】
方法：
リン脂質で修飾されたFlashPlates（登録商標）は、いろいろな被覆面を試験するために、種々の異なる方法によって作製した。96ウェルのリン脂質FlashPlates（登録商標）を、少なくとも3時間、0.25〜1μCi/mlの濃度の[1-3H、イノシトール] PIP2（〜20Ci/mmol（NEN社））を含んでいる溶液0.2mlで覆った。これらのウェルを、0.04%デオキシコール酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回、及びPBS単独で2回洗浄した。一般的に、変異係数(coefficient of variance)は、8〜12％の間であった。これらの凡例に示されたバッファー中のウェルにおいて直接反応を生じ、かつPackard TopCount（登録商標）機器でモニタリングした。
PLC活性1ユニットとは、典型的な溶液ベースのアッセイを用いて、酵素1mg当たりで1分間に[3H ]IP3が1nmol生成されることと定義される（DeVivo、1994年）。
【００２７】
HL60細胞は、収集に先立ち、後期対数増殖期まで増殖し、サイトゾル画分を既報のように調製するか（Campsら、1990年；Campsら、1992年）、もしくは、HL60のサイトゾル抽出物を、ABS社から購入した。A43lヒト表皮がん細胞は、収集に先立ち、10％ウシ胎仔血清（FCS）を含有するダルベッコの変更されたイーグル培地（DMEM）の入った150cm2の培養フラスコにおいて増殖した。A431細胞は、〜50％の密集度に到達するまで培養した。細胞は、フラスコの底から付着した細胞塊をこすり落して、かつ低速で遠心して収集した。その後細胞ペレットを、PBSで2回すすいだ。細胞を、10ユニット/mlストレプトリシンＳを含有する反応用バッファーの最小容量に再懸濁し、かつ個々のウェルに等分する前にカウントした。
全ての他の化学薬品又は試薬は、試薬等級以上であった。
【００２８】
結果：
我々の最初の作業は、リン脂質FlashPlate（登録商標）の標識された表面が、加水分解のための酵素に対しイノシトールの頭状基を効果的に提示することができることを確かめるのに役立った。17.5時間の反応経過を通じて、精製した組換え型PLCγ1は、濃度依存した方式で結合したカウントを放出する能力を示した（図１を参照のこと）。全ての例において、PLCγ1の反応は、反応の最初5時間で安定状態（プラトー）に達し、かつその後はカウントの放出をほとんど生じなかった。試験した酵素の最高濃度である130μgで、75%以上の放射能が、プレートの表面から放出された。これらの結果は、表面に結合した[3H] PIP2の大部分が、該酵素の基質として容易に利用できることを示した。表面に結合したカウントの放出が実際に[3H ]PIP2の加水分解によるものであることを確かめるために、個々のウェルを吸引し、酸性条件下で2容量のクロロホルム−メタノールで抽出した（CHCl3：CH3OH：HCl、2：1：0.01）。有機相及び水相の放射能の相対的な分布は、各々、標識されたPIP2及びIP3を示している。表３に示すように、標識されたリン脂質FlashPlate（登録商標）からの放射能の放出は、HL60サイトゾル抽出物からの粗PLC調製物及び組換え型PLCの両方による結合した[3H] PIP2の加水分解に主に起因していた（対照ウェルは、放射能をほとんど放出しないか、もしくは、全く放出しなかった、データは示さず）。両方の例で、放射能は、大部分は水相に分布し（〜90%以上）、これは[3H]IP3を示していた。この結果は、標識されたIP3が特にリン脂質FlashPlate（登録商標）から特異的に放出され、かつ表面に結合した標識PIP2が、実際HL60サイトゾル抽出物の粗酵素的PLC調製物に加え、精製された組換え型PLCの両方について、基質として実行可能であることを示している。
【００２９】
【表３】
表３
[3H]PIP2で被覆されたリン脂質FlashPlate（登録商標）の個々のウェルからの水性試料の反応後有機抽出
0004287049.tif 000004
【００３０】
この反応は、更に、先に示された、デオキシコレート（Crooke及びBennett、（1989））又はスペルミン（Haberら、（l991））のいずれかの存在下で混合ミセルを使用する溶液ベースのアッセイに関する特性と同じ多くの特性を示した。これらのアッセイについて、組換え型PLCδ1は、デオキシコール酸ナトリウムの添加時に（図2Aを参照のこと）、又は添加されたスペルミンの存在下で（図2Bを参照のこと）、濃度依存した方式で加水分解活性が増強されることを明らかにした。これらの結果は、先に発表されたような（Crooke及びBennett、1989年；Haberら、1989年）、PLC活性の刺激に対するこれらの化合物の作用を確認し、かつ溶液ベースのミセルアッセイと比べて、本プレートの様式が有用であることを証明した。
【００３１】
別の実験を、粗細胞抽出物からのPLC活性の刺激が、先に発表されたプロトコール（Rhee及びChoi、1992年；DeVivo、1994年）を用いて、リン脂質FlashPlate（登録商標）上でモニタリングされ得るかどうかを調べるように設計した。様々なタンパク質濃度のHL60サイトゾル抽出物を、非加水分解性アナログGTPγSの存在下又は非存在下で処理し、かつ放射能の減少を速度論的にモニタリングした。図3に示すように、該アナログが存在しない場合、結合したカウントの放出は、添加されたタンパク質の量に応じた濃度であることが示され、かつこの反応は、3時間までに〜15%まで漸減していった。試料へのGTPγSの添加は、試験したあらゆるタンパク質濃度で、PLC活性の刺激をもたらした。しかし、加えられたタンパク質の濃度依存性は失われるように見え、これは恐らく低濃度の基質だけが表面上で利用できるという事実のためであろう。これにもかかわらず、明らかに2〜3倍の刺激が、使用された各タンパク質濃度について明白であった。
【００３２】
この様式の更に別の試験として、我々は、透過処理されたA431ヒト表皮がん細胞からの放出として、PLC活性を分析した（図4を参照）。この場合、[3H ]PIP2で被覆されたリン脂質FlashPlateに対するいろいろな量の細胞の添加は、細胞数に依存した方式での放射能の放出をもたらした。細胞数が2x105細胞/ml又はそれ以下であると、反応上の初期のラグ相を示し、これは細胞からのPLC活性放出の遅延を示している。更に、細胞数約2x105細胞/mlで、該表面からの放射能の放出が、天然のままの脂質及びIP3の放出によることを示すことができた（データは示さず）。従って多い細胞数での結果は、他の細胞の成分が、非加水分解的反応において表面から脂質を除去することが可能であることを示唆している。これらの結果の積み重ねは、[3H]PIP2 被覆されたリン脂質FlashPlate（登録商標）上で高処理量方式において、透過処理された細胞及びサイトゾル抽出物の両方から、PLC活性をモニタリングすることができることを証明する。
【００３３】
結論：
本研究は、受容体に結合した機能アッセイの高処理量スクリーニングに関してPLC活性をモニタリングするための、[3H]PIP2 被覆されたリン脂質FlashPlate（登録商標）の有用性を明らかに証明する。これらの結果は、PLC活性が、精製された組換え型酵素調製物から粗細胞溶解液及び透過処理された細胞までを含むいろいろな供給源で、簡単にモニタリングすることができることを示す。更にこの様式は、古典的な標識をつけられたミセル試験に使用されるものと同等の表面を提供し、かついろいろな多種の医薬品スクリーニングアッセイにおいて、PLC活性を測定するための本アッセイの実施可能性を例証している。
【００３４】
本発明の原理は、当業者には全て明らかであるような様々な酵素／基質システムに適合させることができる。前述のことを考慮して、先に記した発明の多くの修飾及び変更を容易に行うことができることは、理解・評価されるであろう。本願明細書において記した考察、説明及び実施例は、本発明の特定の実施態様を例証するものであるが、それらの実践に限定されることを意図するものではない。全ての同等物を含む上記の「特許請求の範囲」が、本発明の範囲を定義する。
【００３５】
引用文献
Camps et al. (1992)  Eur. J. Biochem. 206:821-831
Camps et al. (1990)  Biochem. J. 271:743-748
Crooke and Bennett (1989)  Cell Calcium, 10:309-23
De Vivo (1994)  Assays for G-protein regulation of phospholipase C activity. Methods in Enzymology 238:131-141
Gierschik et al. (1989)  Eur. J. Biochem. 183:97-105
Haber et al. (1991)  Arch. Biochem. Biophys., 288(1):243-6
Hianik et al (1996) Immobilization of enzymes on lipid bilayers on a metal support allows study of the biophysical mechanisms of enzymatic reactions.  Bioelectrochemistry and Bioenergetics 41:221-225
Hoekstra and Duzgunes (1993) Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems.  Meth. Enz. 220:15-32
Miller and Racker (1976)  J. Membr. Biol. 26:319
Mueller et al. (1962)  Circulation 26:1167
Ottova and Tien (1997) Self-assembled bilayer lipid membranes: from mimicking biomemebranes to practical applications.  Bioelectrochemistry and Bioenergetics 42:141-152
Rhee and Choi (1992)  J. Biol. Chem., 267(18): 12393-6
Wright and Huang (1992) Bilayer stabilization of phosphatidylethanolamine by N-biotinylphosphatidylethanolamine.  Biochim. Biophys. Acta 1103:172-178
【００３６】
添付図面と共に、上記及び下記の詳細な説明を参照することにより本発明がよりよく理解されることで、本発明のその他の利点は容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  [3H]PIP2で被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate（登録商標）に対する、様々な量の精製された組換え型PLCγ1の速度論的活性を示すグラフである。様々な濃度の精製された組換え型PLCを、個々のウェルの、50mM NaPi、pH 6.7、0.1M NaCl、0.1mM CaC12、0.1mM  EGTAの0.1ml中に添加し、かつ放出された放射能を、Packard TopCount（登録商標）（パッカード・インスツルメント社（メリデン、コネティカット州）製造のマイクロプレート・スキャン・システム）上で時間の関数としてモニタリングした。
【図２】  図２Ａは、[3H]PIP2で被覆した96ウェルリン脂質FlashPlate（登録商標）に対するPLCδ1添加の作用を説明し、ここで放射能の放出に対する様々な濃度のデオキシコレートの作用は、0.2mM HEPES-NaOH、pH 7.0、0.14M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、%(wt/vol) [デオキシコレート] 中の13mU PLCで、時間の関数として示されている。
図２Bは、50mM HEPES-NaOH 0.2ml、pH 6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM  EGTA、0.04%（wt/vol）のデオキシコレート中の100mU PLCに対する、0.2mMスペルミン添加の作用を示すグラフである。放射能の放出は、Packard TopCount（登録商標）を用いてモニタリングした。
【図３】  [3H]PIP2で被覆した96ウェルリン脂質FlashPlate（登録商標）上で測定した、GTPγSによる粗HL60サイトゾル調製物への、GTPγSの添加によるPLC活性の刺激を示すグラフである。様々な量のHL60サイトゾルタンパク質を、50mM HEPES-NaOH、pH 6.7、0.15M KCl、0.1mM CaC12、0.1mM EGTA、0.04%（wt/vol）のデオキシコレートを0.2ml含有する個々のウェルに、0.2mM GTPγSの存在下又は非存在下のいずれかで添加した。放射能の放出は、Packard TopCount（登録商標）上でモニタリングした。
【図４】  [3H]PIP2で被覆した96ウェルリン脂質FlashPlate（登録商標）上で測定した、ストレプトリシンS透過処理したA431ヒト癌細胞からの細胞内PLC活性の放出を示している。再懸濁されたA431細胞のアリコートを、50mM HEPES-NaOH、pH 6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、0.04%（wt/vol）デオキシコレート、10ユニット/mlストレプトリジンＳを含み、容量を反応バッファーで0.2mlに調節したものを含有するウェルに分注した。放射能の放出は、Packard TopCount（登録商標）でモニタリングした。
【図１】
0004287049.tif 000005
【図２】
0004287049.tif 000006
【図３】
0004287049.tif 000007
【図４】
0004287049.tif 000008