(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する精製および単離されたポリペプチド。
【請求項２】
免疫原性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
共有付加修飾を有する請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記共有付加修飾が、ポリエチレングリコールの共有付加を含む請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記共有付加修飾が、その他のポリペプチドの全部または一部との融合である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
生物学的に有効量の請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドと、医薬上容認されうる添加剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１または２に記載のポリペプチドの生物学的活性、すなわち、内皮細胞および繊維芽細胞の接着を促進する生物学的活性を有し、かつ配列番号：４に記載の第163位〜第229位のアミノ酸残基および配列番号：４に記載の第170位〜第185位のアミノ酸残基からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする当該ポリペプチドの断片、類似体および誘導体。
【請求項１０】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９に記載の断片、類似体および誘導体をコードする単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号：３に記載の配列を有する精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項10に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項10に記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
以下の工程、すなわち、
（ａ）好適な栄養条件下で請求項14に記載の宿主細胞を培養し、
（ｂ）当該宿主細胞または当該宿主細胞の生育培地からヒトCyr61ポリペプチドを精製する
工程を含む、ことを特徴とするヒトCyr61ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
以下の工程、すなわち、
（ａ）抗ヒトCyr61抗体またはαvβ3インテグリンのいずれかの特異的生物分子に対して配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む生物材料を曝し、
（ｂ）当該ポリペプチドと当該特異的生物分子とを特異的に結合せしめ、および
（ｃ）当該ポリペプチドを溶出して精製する
工程を含む、ことを特徴とする配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１７】
前記生物材料が、ヒト細胞を含む請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記特異的生物分子が、抗ヒトCyr61抗体である請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程、すなわち、
（ａ）脈管を形成できる第１の生物学的試料を、生物学的に有効量のポリペプチドおよびモジュレーター推定物と接触させ、
（ｂ）第２の生物学的試料を、生物学的に有効量のポリペプチドと接触させて対照を別途に取得し、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で出現した脈管形成のレベルを測定し、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定された脈管形成のレベルの比較において、工程（ｂ）の対照と比較して確認された脈管形成レベルの変化能力に基づいて脈管形成のモジュレーターを同定する、
工程を含み、かつ当該ポリペプチドが、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または
（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体の生物学的活性、すなわち、内皮細胞および繊維芽細胞の接着を促進する生物学的活性を有し、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列の少なくとも第163位〜第229位または第170位〜第185位のアミノ酸を含むポリペプチドである、
ことを特徴とする、脈管形成のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２０】
前記モジュレーターが、前記対照と比較した場合の脈管形成のレベルを減少させる脈管形成阻害剤である請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程、すなわち、
（ａ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドを含む第１インプラントと、請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドとモジュレーター推定物とを含む第２インプラントを調製し、
（ｂ）ヒト以外の動物の第１の角膜内に当該第１インプラントを埋植し、そして、ヒト以外の当該動物の第２の角膜内に当該第２インプラントを埋植し、
（ｃ）当該第１角膜および第２角膜での血管の発生を測定し、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定される血管の発生レベルを比較して、当該第２角膜での血管発生と比較した場合の当該第１角膜での血管発生レベルの変化に基づいて、脈管形成のモジュレーターを同定する、工程を含む、
ことを特徴とする脈管形成のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２２】
以下の工程、すなわち、
（ａ）軟骨を形成できる第１の生物学的試料を、生物学的に有効量の請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドおよびモジュレーター推定物と接触させ、
（ｂ）軟骨を形成できる第２の生物学的試料を、生物学的に有効量の請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドと接触させて対照を別途に取得し、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で出現した軟骨形成レベルを測定し、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定された軟骨形成のレベルの比較において、工程（ｂ）の対照と比較して確認された軟骨形成レベルの変化能力に基づいて軟骨形成のモジュレーターを同定する、
工程を含む、ことを特徴とする軟骨形成のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２３】
前記モジュレーターが、前記対照と比較した場合の軟骨形成のレベルを減少させる軟骨形成阻害剤である請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程、すなわち、
（ａ）細胞接着に適合しうる表面を調製し、
（ｂ）当該表面に接着可能な第１および第２の生物学的試料を、別途に調製し、
（ｃ）当該第１の生物学的試料を、モジュレーター推定物と、生物学的に有効量のポリペプチドとを接触させ、
（ｄ）当該第２の生物学的試料を、生物学的に有効量のポリペプチドと接触させて対照を別途に取得し、
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）で出現した細胞接着のレベルを測定し、および
（ｆ）工程（ｅ）で測定された細胞接着のレベルの比較において、工程（ｄ）の対照と比較して確認された細胞接着レベルの変化能力に基づいて細胞接着のモジュレーターを同定する、
工程を含み、かつ当該ポリペプチドが、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または
（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体である、
ことを特徴とする細胞接着のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２５】
以下の工程、すなわち、
（ａ）ポリペプチドおよび細胞移動のモジュレーター推定物を含むゲルマトリックスを形成し、
（ｂ）ポリペプチドを含む対照ゲルマトリックスを調製し、
（ｃ）工程（ａ）のゲルマトリックスおよび工程（ｂ）の対照ゲルマトリックス上に、細胞移動できる内皮細胞を播種し、
（ｄ）当該内皮細胞をインキュベートし、
（ｅ）当該ゲルマトリックスおよび当該対照ゲルマトリックスの内部において、細胞に関する検査を行って細胞移動のレベルを測定し、および
（ｆ）工程（ｅ）で測定された細胞移動のレベルの比較において、工程（ｂ）の対照と比較して確認された細胞移動レベルの変化能力に基づいて細胞移動のモジュレーターを同定する、
工程を含み、かつ当該ポリペプチドが、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または
（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体である、
ことを特徴とする細胞移動のモジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２６】
前記内皮細胞が、ヒト内皮細胞である請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲルマトリックスが、基底膜タンパク質を含む請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ｅ）が、顕微鏡検査を含む請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程、すなわち、
（ａ）その各々が二つの表面を有する第１ゼラチン化フィルターおよび第２ゼラチン化フィルターを形成し、
（ｂ）各フィルターの第１の表面を、移動可能な内皮細胞に接触させることで、当該各フィルターに接着させ、
（ｃ）当該第１ゼラチン化フィルターの第２の表面に、ポリペプチドおよび細胞移動のモジュレーター推定物を、そして、当該第２ゼラチン化フィルターの第２の表面にポリペプチドを塗布し、
（ｄ）当該各フィルターをインキュベートし、
（ｅ）当該各フィルターの第２の表面上の細胞を検出し、および
（ｆ）当該第１ゼラチン化フィルターの第２の表面上の細胞の存在と、当該第２のゼラチン化フィルターの第２の表面上の細胞の存在とを比較し、これによって、第２のゼラチン化フィルター上で測定される細胞移動と比較して確認された第１のゼラチン化フィルター上にて測定される細胞移動レベルの変化能力に基づいて細胞移動のモジュレーターが同定される、
工程を含み、かつ当該ポリペプチドが、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または
（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体である、
ことを特徴とする、細胞の移動をin vitroでスクリーニングする方法。
【請求項３０】
前記内皮細胞が、ヒト微小血管内皮細胞である請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記フィルターを、Boydenチャンバーに導入する工程をさらに含む請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
細胞移動のモジュレーターに関するin vivoスクリーニングに用いる試薬であって、（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体のいずれかを含む、ことを特徴とするin vivoスクリーニング用試薬。
【請求項３３】
前記スクリーニングが、以下の工程、すなわち、
（ａ）第１の生体適合性スポンジの第１の中心部分と、第２の生体適合性スポンジの第２の中心部分を取り出し、
（ｂ）当該第１の中心部分に、前記ポリペプチドおよびモジュレーター推定物を、そして当該第２の中心部分に前記ポリペプチドを塗布し、
（ｃ）当該第１の中心部分を当該第１の生体適合性スポンジに、そして、当該第２の中心部分を当該第２の生体適合性スポンジに再会合させ、
（ｄ）当該第１の生体適合性スポンジの第１の表面に第１フィルターを、そして当該第１の生体適合性スポンジの第２の表面に第２フィルターを接着させ、
（ｅ）当該第２の生体適合性スポンジの第１の表面に第３フィルターを、そして当該第２の生体適合性スポンジの第２の表面に第４フィルターを接着させ、
（ｆ）ヒト以外の動物に、当該中心部分および当該フィルターを具備した当該生体適合性スポンジの各々を埋植し、
（ｇ）一定時間インキュベートした後にそれぞれの当該スポンジを取り出し、
（ｈ）当該生体適合性スポンジの各々に認められる細胞を測定し、
（ｉ）当該第１の生体適合性スポンジ中の細胞の存在と、当該第２の生体適合性スポンジ中の細胞の存在とを比較し、これによって、当該第２の生体適合性スポンジを用いて測定される細胞移動と比較して確認された第１の第１の生体適合性スポンジを用いて測定される細胞移動レベルの変化能力に基づいて細胞移動のモジュレーターが同定される、
工程を含む、請求項32に記載の試薬。
【請求項３４】
前記工程（ｇ）に先駆けて前記動物に放射性標識を提供する工程をさらに含み、および、前記工程（ｈ）が、前記第１および第２の生体適合性スポンジ中の該放射性標識を検出する工程を含む請求項33に記載の試薬。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、ヒドロンと会合している請求項38または34に記載の試薬。
【請求項３６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９に記載の断片、類似体および誘導体を含有する組織移植片の血管新生促進剤。
【請求項３７】
請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９に記載の断片、類似体および誘導体を含有する骨インプラントの埋植促進剤。
【請求項３８】
以下の工程、すなわち、
（ａ）増殖が可能な細胞を播植し、
（ｂ）当該細胞の第１の部分を、ポリペプチドおよびマイトジェン推定物を含む溶液と接触させ、
（ｃ）当該細胞の第２の部分を、ポリペプチドを含む溶液と接触させて対照を別途に取得し、
（ｄ）当該細胞をインキュベートし、
（ｅ）当該細胞の第１の部分および当該細胞の第２の部分の生育を検出し、および
（ｆ）当該細胞の第１の部分および当該細胞の第２の部分の生育の比較において、当該細胞の第２の部分と比較して確認された当該細胞の第１の部分での生育をより強く誘導する能力に基づいてマイトジェンを同定する、
工程を含み、かつ当該ポリペプチドが、
（ｉ）請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチド、または
（ii）請求項９に記載の断片、類似体および誘導体である、
ことを特徴とするマイトジェンをスクリーニングする方法。
【請求項３９】
前記細胞が、内皮細胞または繊維芽細胞である請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞の第１および第２の部分を核酸標識に接触させ、および前記細胞での当該核酸標識を検出する工程をさらに含む請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸標識が、［3Ｈ］-チミジンである請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
請求項19、21、22、24、25、29および38のいずれかに記載の方法に用いられるキットであって、請求項１乃至５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ことを特徴とするキット。
【請求項４３】
前記基底膜タンパク質が、ラミニン、コラーゲン、フィブリン、ニドゲンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンからなるグループから選択される請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1996年３月15日に出願せる米国特許出願第60/013,958号の出願日の優先権を主張して行うものである。
発明の分野
本発明は、細胞外マトリックスシグナリング分子（増殖因子に対する細胞応答に関わるポリペプチド）に関与する物質及び方法に関する。さらに詳細には、本発明は、Cyr61、Fisp12、及びCTGF関連ポリヌクレオチド、ポリペプチド、その組成物、これらのポリペプチドを精製する方法、ならびにこれらのポリペプチドを使用する方法に関するものである。
発明の背景
哺乳類の細胞の成長は増殖因子ポリペプチドによって厳密に調節されている。動物成体において、ほとんどの細胞は代謝的に活性であるが、細胞分裂に関して言えば静止状態にある。特定の条件のもとでは、これらの細胞が刺激されて、細胞周期に再入し、分裂することができる。静止細胞が、細胞周期の活発な生長及び分裂期に再入すると、多くの特異的な遺伝子、即時型初期遺伝子が速やかに活性化される。活性な細胞周期への再入は、必然的に厳密に調節されている。これは、かかる制御の崩壊によって、ガンと認められることが多い、制御の外れた成長が惹起されうるからである。特定の細胞の増殖期への再入が制御されていることは、脈管形成（例えば、血管の成長及び修復）、軟骨形成（例えば、骨格筋の発生及びプロテーゼの組み込み）、腫瘍形成（例えば、ガン細胞転移及び腫瘍血管新生）、ならびに他の増殖を必要とするプロセスなどといった、生物学的プロセスに必須である。
脈管形成（既存の血管の内皮細胞からの新しい血管の形成）は、内皮細胞の遺伝子発現の変更プロファイルを含む、細胞移動、増殖、及び分化に関係した複雑なプロセスである。脈管形成は、親血管の基底膜の局所的な破壊で開始される。生体内では、基底膜（主として、ラミニン、タイプIVコラーゲン、ニドゲン（nidogen）／エンタクチン、及びプロテオグリカンから構成される）は内皮細胞を支持して、下にある間質とこれらの細胞を分かつ障壁を提供している。基底膜は、発生及び分化などの際における細胞接着、移動、及び増殖を包含する様々な生物学的活性にも影響を及ぼす。
基底膜の破壊に続いて、少なくとも部分的に化学誘引物（chemoattractant）に起因して、内皮細胞は親血管から間質性の細胞外マトリックス（ECM）へと移動する。移動している内皮細胞は、毛細管芽（capillary aprout）を形成し、これが伸長する。かかる伸長は、前記芽での細胞の移動及び増殖の結果として生じることである。先導する毛細管の先端に位置する細胞は、脈管形成刺激の方に移動するが、DNA合成も分裂も行わない。一方、これらの先導する先端細胞の後で、他の内皮細胞は迅速な増殖を行い、新しい血管の形成のための内皮細胞の充分な供給を請け負う。毛細管芽は、次いで先端にて分岐し、その枝は互いに吻合または連結して管腔を形成し、基底膜が再構成され、そして血管の接続が確立し、血流が生じる。
脈管形成の際には、少なくとも３つの内皮細胞機能における変化が起こる。すなわち、１）ECMとの相互作用のモジュレーション（細胞と基質との接触の変化、及び基質分解性のタンパク質分解酵素の生産を必要とする）；２）脈管形成性の刺激に対する細胞の変位をもたらす、内皮細胞の移動の初期増加及びその後の減少；ならびに３）成長及び伸長している血管に細胞を提供し、次いで血管が形成されれば休止細胞状態に戻すような、細胞増殖の一過性の増大が引き起こされる。これら３つの機能は、それぞれ接着性、化学誘引性、及び有糸分裂誘起性の相互作用または応答によって認められている。従って、脈管形成の制御には、３つの異なる細胞活性すなわち、１）細胞接着、２）細胞移動、及び３）細胞増殖が必要とされるのである。同様の細胞活性の複雑なアレイが関係する他の生物学的プロセスは、軟骨形成である。
軟骨形成は、骨及び軟骨の発生を包含する骨格形成の一因を担う細胞プロセスである。軟骨形成は、脈管形成と同様に、細胞周期の増殖期への休止細胞の制御された再入が関係するものである。増殖期への移行は、細胞接着特性の変化、細胞移動のパターンの変化、及び細胞増殖の一過性の増大が関与する。軟骨形成は、原性の未分化間葉細胞による、軟骨形成能の初期の発生（すなわち、原初分化状態）に関係している。この段階には、典型的な軟骨ECMを生産する能力を持たずに軟骨細胞特異的マーカーを生産する工程が含まれる。続いて、細胞には、軟骨細胞に分化するにつれて軟骨特異的なECMを生産する能力が発生する。Langille, Microscop.Res.& Tech. 28巻455〜469頁（1994）。軟骨細胞の移動、接着、及び増殖は、次いで骨性及び軟骨性の骨格の発生に寄与する。軟骨形成のプロセスに関与する細胞の、プログラムされた発生の異常な同化（elaboration）の結果、美容的な関心から生命を脅かす障害に至るまでの問題を提起する骨格の欠損が引き起こされる。
脈管形成及び軟骨形成と同様に、腫瘍形成は細胞接着、移動、及び増殖における変化によって特徴付けられる。転移しているガン細胞は、接着及び移動特性の変化を呈する。腫瘍塊の樹立には、細胞増殖の増大と腫瘍の血管新生の際の脈管形成の特徴である細胞特性の同化が必要である。
脈管形成または軟骨形成の異常な進行は、単なる腫瘍形成の進行と同様に、罹患者のための生命の質を実質的に損ない、さらに近年の健康管理のコストを追加させるものである。これらの複雑な生物学的プロセスに共通な特徴は、細胞接着、移動及び増殖の変化を含んでおり、これら細胞活性の３つすべてに影響を及ぼすことができる薬剤が、前記の複雑な生物学的プロセスをスクリーニングし、そしてモジュレートするうえで有効であろうとことが示唆される。当該技術分野において、個々の細胞活性、例えば、インテグリン及びセレクチン（細胞接着）、ケモカイン（細胞移動）、ならびに種々の増殖因子またはサイトカイン（細胞増殖）に影響を及ぼす薬剤は知られているが、近年までヒトにおける３つの細胞活性すべてに対して影響を奏する薬剤はまったく同定されていない。
ネズミCyr61（システイン・リッチタンパク質、CYsteine-Rich protein）は、これらの３つの細胞活性の各々に影響を及ぼしうる、活発に生育及び分裂している細胞において発現されているタンパク質である。RNase保護分析によって、ネズミCyr61をコードしている遺伝子であるネズミcyr61は、発生中のマウス胚にて転写されることが示されている。O’Brienら、Cell Growth & Diff. 3巻、645〜654頁（1992）。in situハイブリダイゼーション分析によって、マウス胚発生時のcyr61の発現は、外胚葉及び中胚葉に由来する、間葉細胞の軟骨細胞への分化に密接に関連していることが示された。加うるに、cyr61は、発生中の循環系の血管壁に発現されている。これらの観察により、ネズミcyr61は、細胞増殖及び分化の際に発現されることが示唆されているが、これは細胞増殖周期を制御する調節カスケードに関係する遺伝子の発現の特徴なのである。
Cyr61ポリペプチドのさらなる特徴付けは、タンパク質を有用な量だけ精製することが不可能なために妨げられてきた。真核細胞または原核細胞のいずれかから過剰発現することによってCyr61を大量に精製する努力は、典型的には失敗に終わってしまう。Yang、University of Illinois at Chicago, Ph.D. Thesis（1993）。有用な量のCyr61を得る試みに関連する１つの問題は、Cyr61の過剰発現によって誘導される哺乳類の成長速度の減少である。Cyr61の精製に伴う他の問題は、組換えDNA技術を用いて細菌の細胞で発現させた場合に、システイン・リッチなポリペプチドが不溶性のタンパク質塊にしばしば認められることである。それでも、Cyr61は、39のシステイン残基、疎水性のN-末端シグナルと推定される配列、及び潜在的はN-結合性グリコシレーション部位（Asn28及びAsn225）を含む349アミノ酸のポリペプチドとして特徴付けられている。米国特許第5,408,040号明細書、第３カラム、第41〜54行、Grotendorstら、引用することにより本明細書に組み入れる（’040特許）。
近年、Cyr61に関連するタンパク質の特徴付けがなされている。例えば、ヒトタンパク質である、結合組織増殖因子（CTGF）が同定されている（’040特許）。CTGFは、繊維芽細胞及び内皮細胞などの、活発に成長している細胞において発現され（’040特許、第５カラム、第62〜64行）、発現パターンはCyr61と共通である。機能に関して言えば、CTGFは、その第１の生物学的活性はマイトジェン活性であるとの主張がなされているので、タンパク質増殖因子として報告されている（’040特許、第２カラム、第25〜27行及び第53〜55行）。加えて、CTGFは報告によれば化学走性活性を呈する。’040特許、第２カラム、第56〜59行。構造について言えば、CTGFをコードするポリヌクレオチド配列、及びCTGFのアミノ酸配列が公開されている。それぞれ、’040特許の配列番号：７及び８。
他の、見かけ上関連しているタンパク質は、マウスFisp12（繊維芽細胞分泌タンパク質）である。Fisp12は、アミノ酸配列分析に付され、システインに富む一次構造が明らかになった。Ryseckら、Cell Growth & Diff. 2巻、225〜233頁（1991）、引用することにより本明細書に組み入れる。タンパク質はさらに、分泌タンパク質の特徴であるシグナル配列を示唆するN-末端配列も有している。
Cyr61、Fisp12、CTGF、及び他のタンパク質に関する配列分析は、システイン・リッチな分泌タンパク質のファミリーの同定に貢献している。ファミリーのメンバーは、類似の配列を呈する遺伝子によってコードされる類似の一次構造を共有している。この新生ファミリーに含まれるタンパク質の各々は、さらに、タンパク質の分泌型における、疎水性N-末端シグナル配列及び38のシステイン残基の存在によってさらに特徴付けられる。今日までに同定されたファミリーのメンバーには、前記のCyr61（ヒト及びマウス）、Fisp12（マウス）、ならびにCTGF（Fisp12のヒトオーソログ（ortholog））、さらにCEF10（ニワトリ）、及びNov（トリ）が包含される。
細胞接着、移動、及び増殖特性に影響することができる、精製タンパク質の種々の適用の一つに、安定、長期のex vivo造血幹細胞培養が包含される。高い用量の化学療法に付された患者者では、造血が抑制されて、幹細胞の増加（expansion）、様々な造血系統細胞（hematopoietic lineage）への当該細胞の成熟、及び循環血への成熟細胞の移動が完了するために何週間も要する。このような患者や、造血細胞の移植を必要とする患者のために、培養系で操作して増加させておいた自家幹細胞をかかる患者に導入することが有利である。かかる造血幹細胞（HSC）は、CD34幹細胞抗原を発現しているが、系統細胞関連抗原は発現していない。これらの細胞は、すべての血液細胞系統細胞（例えば、内皮細胞、リンパ球、及び骨髄球）を最終的に上昇させることができる。
長期培養を開始及び維持させることができる造血前駆細胞（すなわち、長期培養系開始細胞、つまりLTC-IC）は、幹細胞の原初集団を呈示している。LTC-ICの頻数は、正常なヒト骨髄で104細胞当たりわずか1〜2であって、高度に精製されたCD34+副次集団中、50〜100細胞当たりわずか約1であると概算されている。しかして、in vivoの造血系の再占有（repopulation）のために使用される。原初且つ多能性のヒトHSCを維持及び増加させる、長期細胞培養用の方法及びシステムを有することは有用であろう。
造血の細胞培養モデルにより、様々なコロニー刺激因子、インターロイキン、幹細胞因子、及びc-キットリガンドを包含する、造血プロセスにおいて役割を果たすと考えられる多数のサイトカインが明らかになっている。しかしながら、ex vivoの培養において、これらサイトカインの相異なる組合せが、関連前駆細胞の相違するセットの増加のために好都合である。例えば、臍帯血血漿の中の因子は、顆粒球−赤血球−巨核球コロニー形成単位（CFU-GEMM）前駆細胞の増加を増強したが、これらの細胞における増加は、細胞のより成熟した下位集合の方を優先するものであった。従って、in vivoの造血を疑似する培養系を樹立することは、なおもって困難である。
HSC培養系は、適切な誘導のもとに、長期の再占有及び最終的な系統細胞の関与の双方を行うことができる、数多くの複数機能性あるいは多機能性の幹細胞を維持及び増加させるはずである。しかしながら、ほとんどのex vivoの培養系で、LTC-ICを含む細胞集団の画分は、もはや多機能性を有しない造血前駆細胞のさらに成熟した下位集合によって培養物が占有されるので、培養の継続と共に徐々に減少していき、数週間後には最初のレベルの20％にまで低下してしまうことが多い。さらに、個々のLTC-ICによって呈される増殖能は、広く変化しうるものである。かくして、当該技術分野において、LTC-IC細胞などの細胞の多機能性の潜在能を維持または促進する生物学的薬剤を含むHSC培養系に対する要求が存在している。ex vivoのHSC培養系を開発する上での役割に加えて、細胞接着、移動及び増殖に影響を及ぼす生物学的薬剤は、広範囲なる他の情況においても有用である。
それ自体はマイトジェン活性を有しないけれどもマイトジェンの活性を強化するタンパク質は、造血などのプロセスにおいてシグナリング分子として重要な役割を果たしうるものである。さらに、これらのシグナリングタンパク質は、さらなるマイトジェン（その多くが同定または特徴付けされていない）を検索する際のプローブとしても役立つことができる。いくつかの生物学的因子は、それ自体マイトジェンとならずに、他の因子のマイトジェン活性を強化することが示されている。これらの強化剤のいくつかは、細胞表面及び／または細胞外マトリックスに会合している。この群に含まれるのは、分泌型の塩基性繊維芽細胞増殖因子結合タンパク質（bFGF-結合タンパク質）、基底板タンパク質パーレカン（perlecan）、及びヒト免疫不全ウイルス-1 TATタンパク質であり、それぞれのタンパク質が、bFGFで誘導された細胞増殖及び脈管形成を促進することができる。マインジェン強化剤のこの群にさらに含まれるのは、トランスフォーミング増殖因子-βの潜在型を活性化することができるトロンボスポンジン、及び血管平滑筋細胞由来の、未同定分泌型増殖強化因子（Nakanoら、J.Biol.Chem. 270巻、5702〜5705頁（1995））であり、後者の因子は、表皮増殖因子で、またはトロンビンで誘導されるDNA合成の効率良い活性化のために必要とされている。さらに、B細胞刺激因子-1／インターロイキン-4である、立証可能なマイトジェン活性を有しないT細胞産物は、１）顆粒球−マクロファージ前駆細胞の、顆粒球−コロニー刺激因子に対する増殖性の応答を増強し、２）赤血球前駆細胞のエリスロポエチンに対する増殖性の応答を増強し、そして３）エリスロポエチンと共に、多機能性前駆細胞によるコロニー形成を誘導することができる。同様に、インターロイキン-7は、それ自体は増殖性の効果を有しないが、インターロイキン-7は原初性のネズミ骨髄前駆細胞による、幹細胞因子により誘導されるコロニー形成を増強した。加えて、リンパ球増殖増強因子（LGEF）は、マイトジェンで刺激されるヒト末梢血リンパ球（PBL）または精製されたT細胞の増殖を、用量依存的に増強することが見出された。LGEFは、それだけでPBLまたはT細胞の増殖を刺激することはなかった。
従って、脈管形成、軟骨形成、及び腫瘍形成などのような複雑な生物学的プロセスを、まとめて特徴付けている１以上の特定の機能に対して、協奏的且つ協調的影響を及ぼすことができる生物学的薬剤に対する要求が存在し続けている。加えて、例えばHSC培養系の開発などの、ex vivo環境でのこれらin vivoプロセスの再現に寄与する薬剤に対する当該技術分野での要求が存続している。さらに、例えばマイトジェンプローブなどの、それが存在しないことでかかるプロセスを有利にモジュレートして、それによって制御を行う努力が妨げられる、これら複雑なプロセスの残る生物学的成分を検索するためのツールに対する要求が持続している。
発明の要約
本発明は、細胞外マトリックス（ECM）シグナリング分子関連物質及び方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、ECMシグナリング分子及びその断片または類似体、ECMシグナリング分子関連ポリペプチドならびにその断片、類似体及び誘導体をコードするポリヌクレオチド、ECMシグナリング分子を生産する方法、そしてECMシグナリング分子を使用する方法に関する。
本発明の１つの特徴は、ECMシグナリング分子を含む精製及び単離されたポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、細胞接着、細胞移動、または細胞増殖を刺激する能力；脈管形成、軟骨形成、または腫瘍形成をモジュレートする能力；免疫原性あるいは免疫応答を導き出す能力；ならびに抗体及びインテグリンを含む、ECMシグナリング分子に対する特異的な結合部位を有するポリペプチドに結合する能力などのECMシグナリング分子の少なくとも１つの生物学的活性を維持している。ポリペプチドは、天然のものでも組換え分子でもよい。さらに、本発明は、全長のECMシグナリング分子、及びその断片を企図する。加えて本発明のポリペプチドは、未変性または、天然もしくは非天然の未変性パターンに従って変性させた（derivatized）ものでもよい。さらに本発明は、天然の、すなわち自然界に発生するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその変異体（すなわち、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、類似体（すなわち、標準的でないアミノ酸または、従来のアミノ酸のセットからのその他の構造的変化を有するポリペプチド）及び相同体（すなわち、他のポリペプチドと進化上共通の祖先を共有するポリペプチド）をも含むものである。ポリエチレングリコール、または他のタンパク質もしくはペプチドなどの、他の化合物に共有結合されたポリペプチド、すなわち、融合タンパク質が、本発明によって企図される。
ECMシグナリング分子の例には、哺乳類Cyr61、Fisp12及びCTGFポリペプチドが含まれる。ECMシグナリング分子以外には、前記抗体産物の如き、本発明のECMシグナリング分子に特異的に結合するポリペプチドが、本発明に包含される。ポリクローナル及びモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、CDR-移植抗体、「ヒト化」抗体、ならびに当該技術分野において知られている他の抗体を包含する、広範なる抗体産物が、本発明の範囲に含まれる。ECM分子の活性部位に結合するように設計され、それによりかかる活性を阻害するペプチド、炭水化物または脂質などの他の分子もまた、本発明によって企図される。しかしながら、ECM分子の活性を増強または強化するペプチドなどの分子も、本発明の範囲に含まれる。さらに本発明は、生物学的に有効な量のポリペプチドと、医薬上容認されうる添加剤、賦形剤、または担体を含む本発明の医薬組成物をさらに含むものである。生物材料の「生物学的に有効な量」とは、生物材料を各対照と比較した場合に生物学的試料に検出可能な応答を引き起こすに充分な量である。
本発明のさらなる特徴は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む精製及び単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAで、一本鎖または二本鎖であるとよく、天然の供給源から精製及び単離されても、あるいは当該技術分野において知られている合成または組換え技術を使用して製造してもよい。本発明はさらに、ECM分子の断片をコードするポリヌクレオチド、類似体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、標準のヌクレオチドを有しないポリヌクレオチド）、相同体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、他のポリヌクレオチドと進化上共通の祖先を有するポリヌクレオチド）、変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列の異なるポリヌクレオチド）、及び誘導体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、第１次ヌクレオチド配列に構造上関係しないように相違するポリヌクレオチド）をも含むものである。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも企図される。加えて、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も、本発明は企図している。
本発明の他の特徴は、本発明のポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドを製造または使用するための方法に関する。本発明のポリペプチドを製造するための方法は、好適な宿主細胞にて本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、及びかかるポリペプチドを精製する工程を含む。本発明のポリペプチドを製造するための方法は、当該技術分野で知られている、天然ポリペプチドの単離及び精製、またはポリペプチド製造のための合成技術の使用、などの技術を用いるものである。特に、ヒトCyr61などのECMシグナリング分子を精製する方法は、ヒトCyr61を含有する供給源を同定し、抗ヒトCyr61抗体などの、Cyr61と結合するヒトCyr61特異的生物分子にその供給源を曝し、そして抗体または他の生物分子からヒトCyr61を溶出し、それによりヒトCyr61を精製する工程を含むものである。
本発明のさらなる特徴は、脈管形成のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）脈管形成を行うことができる第１の生物学的試料を、生物学的に有効な（すなわち、脈管形成に有効な）量のECMシグナリング分子関連生物材料及びモジュレーター推定物（阻害剤または強化剤）と接触させ；（ｂ）別途に、第２の生物学的試料を、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させて対照となし；（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）により生じる脈管形成のレベルを測定し；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で測定される脈管形成のレベルを比較し、これによって、工程（ｂ）の対照と比較した場合の脈管形成レベルを変化させる能力により脈管形成のモジュレーターを同定する工程を含む方法である。モジュレーターは、脈管形成の阻害剤または強化剤のいずれであってもよく、そしてECMシグナリング分子関連生物材料には、Cyr61、ならびにその断片、変異体、相同体、類似体、誘導体、及び抗体が含まれるがこれらに限定されることはない。
本発明はさらに、脈管形成のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）Cyr61を含む第１インプラントと、Cyr61及びCyr61脈管形成のモジュレーター推定物を含む第２インプラントを調製し；（ｂ）被検動物の第１の角膜内に前記第１インプラントを埋植し（implantation）、そしてその被検動物の第２の角膜内に前記第２インプラントを埋植し；（ｃ）第１及び第２角膜における血管の発生を測定し；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で測定される血管の発生レベルを比較し、これによって、前記第２角膜での血管発生と比較した場合の前記第１角膜における血管発生レベルを変化させる能力により、脈管形成のモジュレーターを同定する工程を含む方法も含んでいる。
本発明のさらなる特徴は、軟骨形成のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）軟骨形成を行うことができる第１の生物学的試料を、生物学的に有効な（例えば、軟骨形成に有効な）量のECMシグナリング分子関連生物材料及びモジュレーター推定物と接触させ；（ｂ）別途に、軟骨形成を行うことができる第２の生物学的試料を、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させて対照となし；（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）により生じる軟骨形成のレベルを測定し；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で測定される軟骨形成のレベルを比較し、これによって、工程（ｂ）の対照と比較した場合の軟骨形成レベルを変化させる能力により軟骨形成のモジュレーターを同定する工程を含む方法に関する。モジュレーターは、軟骨形成の促進剤または阻害剤のいずれでもよく、ECMシグナリング分子には、先に定義したものや、マンノース-6-ホスフェート、ヘパリン、及びテナシンなどの化合物が含まれる。
本発明はさらにまた、腫瘍形成のモジュレーターをスクリーニングするin vitroの方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）第１の腫瘍及び第２の腫瘍を誘発させ；（ｂ）該第１の腫瘍に、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料及びモジュレーター推定物を投与し；（ｃ）別途に、前記第２の腫瘍に、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料を投与して対照となし；（ｄ）工程（ｂ）及び工程（ｃ）により生じる腫瘍形成のレベルを測定し；ならびに（ｅ）工程（ｄ）で測定される腫瘍形成のレベルを比較し、これによって、工程（ｃ）の対照と比較した場合の腫瘍形成レベルを変化させる能力により腫瘍形成のモジュレーターを同定する工程を含む方法に関する。本発明により企図されるモジュレーターには、腫瘍形成の阻害剤が含まれる。腫瘍は、化学物質、例えば発ガン物質などの投与、及びガン細胞の埋植を含む様々な技術によって誘導されうるが、これらに限定されることはない。本発明の関連する特徴は、固形腫瘍を処置するための方法であって、以下の工程すなわち、治療的に有効な量のCyr61阻害剤を個体へ移送する工程を含み、これにより該腫瘍の血管新生阻害するものである方法にある。阻害剤には、「RGD」モチーフを有するペプチドなどの阻害ペプチド、及び細胞毒素などが含まれるがこれらに限定されることはなく、これはCyr61などの分子に接着されていても、または接着されていなくてもよい。
本発明のさらに別の特徴は、細胞接着のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）細胞接着に適合しうる表面を調製し；（ｂ）別途に、前記表面上に細胞接着することができる、第１及び第２の生物学的試料を準備し；（ｃ）第１の生物学的試料を、モジュレーター推定物と、ヒトCyr61、ヒトCyr61断片、ヒトCyr61類似体、及びヒトCyr61誘導体よりなる群から選択される生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させ；（ｄ）別途に、第２の生物学的試料を、ヒトCyr61、ヒトCyr61断片、ヒトCyr61類似体、及びヒトCyr61誘導体よりなる群から選択される生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させて対照となし；（ｅ）工程（ｃ）及び工程（ｄ）より得られる細胞接着のレベルを測定し；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で測定される細胞接着のレベルを比較し、これによって、工程（ｄ）の対照と比較した場合の細胞接着のレベルを変化させる能力により、細胞接着のモジュレーターを同定する工程を含む方法に関する。
本発明はさらに、細胞移動のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）Cyr61及び細胞移動のモジュレーター推定物を含むゲルマトリックスを形成させ；（ｂ）Cyr61を含む対照ゲルマトリックスを調製し；（ｃ）工程（ａ）のゲルマトリックス及び工程（ｂ）の対照ゲルマトリックス上に、細胞移動を行うことができる内皮細胞を播種し、（ｄ）該内皮細胞をインキュベートし；（ｅ）前記ゲルマトリックス及び前記対照ゲルマトリックスの内部を細胞について検査することによって、細胞移動のレベルを測定し；（ｆ）工程（ｅ）で測定される細胞移動のレベルを比較し、これによって、対照ゲルマトリックスにおける細胞移動のレベルと比較した場合の、ゲルマトリックスにおける細胞移動のレベルを変化させる能力により、細胞移動のモジュレーターを同定する工程を含む方法も企図している。前記内皮細胞には、ヒト細胞、例えば、ヒト微少血管内皮細胞が包含されるが、これに限定はされない。マトリックスは、マトリゲル（Matrigel）、コラーゲンもしくはフィブリン、またはこれらの組合せなどの、ゲル化材料より形成されるとよい。
本発明のさらなる特徴は、細胞の移動をスクリーニングするin vitroの方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）第１ゼラチン化フィルター及び第２ゼラチン化フィルターを形成し、各フィルターは２面を有しており；（ｂ）該各フィルターの第１面を内皮細胞に接触させ、しかして細胞を各フィルターに接着させ；（ｃ）第１ゼラチン化フィルターの第２面に、ECMシグナリング分子及び細胞移動のモジュレーター推定物を、そして第２ゼラチン化フィルターの第２面にECMシグナリング分子を塗布し；（ｄ）各フィルターをインキュベートし；（ｅ）各フィルターの第２面の上の細胞を検出し；ならびに（ｆ）第１ゼラチン化フィルターの第２面上の細胞の存在と、第２のゼラチン化フィルターの第２面上の細胞の存在とを比較し、これによって、第２のゼラチン化フィルター上にて測定される細胞移動と比較した場合に第１のゼラチン化フィルター上にて測定される細胞移動のレベルを変化させる能力により、細胞移動のモジュレーターが同定される工程を含む方法に関する。内皮細胞は、上記定義付けの通りである。ECMシグナリング分子は、ヒトCyr61を含むものであり、前記各フィルターは、改良型Boydenチャンバーを含む、Boydenチャンバーなどの装置に入れられるとよい。
本発明はまた、細胞の移動をスクリーニングするin vivoの方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）第１の生体適合性スポンジの第１の中心部分と、第２の生体適合性スポンジの第２の中心部分を取り出し；（ｂ）第１の中心部分に、ECMシグナリング分子及びモジュレーター推定物を、そして第２の中心部分にECMシグナリング分子を塗布し；（ｃ）第１の中心部分を第１の生体適合性スポンジに、そして第２の中心部分を第２の生体適合性スポンジに再会合させ；（ｄ）第１の生体適合性スポンジの第１面に第１フィルターを、そして第１の生体適合性スポンジの第２面に第２フィルターを接着させ；（ｅ）第２の生体適合性スポンジの第１面に第３フィルターを、そして第２の生体適合性スポンジの第２面に第４フィルターを接着させ；（ｆ）被検動物に、生体適合性スポンジの各々を埋植し、各々の生体適合性スポンジは、前記中心部分及び前記フィルターを含んでおり；（ｅ）一定時間インキュベートした後に各スポンジを取り出し；（ｆ）生体適合性スポンジの各々の中に認められる細胞を測定し；ならびに（ｇ）第１の生体適合性スポンジ中の細胞の存在と、第２の生体適合性スポンジ中の細胞の存在とを比較し、これによって、第２の生体適合性スポンジを用いて測定される細胞移動と比較した場合に第１の生体適合性スポンジを用いて測定される細胞移動のレベルを変化させる能力により、細胞移動のモジュレーターが同定される工程を含む方法も企図している。ECMシグナリング分子には、ヒトCyr61が含まれるがこれには限定されず、そしてECMシグナリング分子は、ヒドロン（Hydron）と会合していてもよい。加えて、細胞移動のモジュレーターをスクリーニングするin vivoの方法は、被検動物に放射性標識を提供し、そして１以上のスポンジ中の放射性標識を検出する工程を含んでもよい。
本発明のさらなる特徴は、止血をモジュレートするための方法であって、以下の工程すなわち、医薬上容認されうる添加剤、賦形剤、または担体中にてECMシグナリング分子を投与する工程を含む方法に関する。また、本発明は、組織における創傷治癒の誘導方法であって、以下の工程すなわち、創傷組織に、生物学的に有効な量のCyr61を接触させ、それによって創傷治癒を促進する工程を含む方法を企図する。ECMシグナリング分子は、ECMシグナリング分子ポリペプチドまたはECMシグナリング分子核酸の形態で、例えば遺伝子治療技術を使用して提供するとよい。例えば、核酸は、ECMシグナリング分子に作動可能に連結された制御発現配列を含むとよく、次いでこれが創傷組織の細胞内に導入される。コード配列の発現は、例えば、ヒフ組織にて作動可能なK14プロモーターなどの組織特異的プロモーターを使用することなどによって制御され、創傷治癒の制御された誘導に作用する。核酸は、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、及びワクシニアウイルスなどのベクターを含んでもよい。この方法による処置のために好適な創傷組織には、ヒフ組織及び肺上皮が包含されるが、これらに限定されることはない。関連法には、臓器の再生を促進するために、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子、例えばCyr61を動物に投与する工程を含む方法が含まれる。障害を有する臓器は、例えば、施術などの外傷や、疾患の結果によるものでもよい。本発明の別の方法は、例えば、ヒフ移植などの移植片の血管新生を向上させることに関するものである。本発明のさらなる方法は、骨移植を含む、骨の埋植を促進するための方法に関する。骨の埋植を促進するための方法は、以下の工程すなわち、生物学的に有効な（すなわち、軟骨形成に有効な）量のECMシグナリング分子を骨インプラントまたは受容部位に接触させる工程を含む。かかる接触部位は、生物分解性ガーゼなどの生体適合性ラップにECMシグナリング分子を塗布し、そのラップを骨インプラントに接触させ、それによって骨の埋植を促進することにより成し遂げられてもよい。骨インプラントには、天然骨及びその断片、さらには、プロテーゼなどの、生体適合性を有する非動物界由来のもの及び合成物を含む。骨、プロテーゼ、または受容部位へのECMシグナリング分子の直接的な適用に加えて、本発明は、ガーゼなどの適用材に加えて、ECMシグナリング分子の放出制御のためのマトリックス材の使用を企図している。
本発明のさらなる特徴は、細胞増殖のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）細胞増殖を行うことができる第１の生物学的試料を、モジュレーター推定物ならびに、ヒトCyr61、ヒトCyr61断片、ヒトCyr61類似体、及びヒトCyr61誘導体よりなる群から選択される、生物学的に有効な（すなわち、マイトジェンとして有効な）量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させ；（ｂ）別途に、細胞増殖を行うことができる第２の生物学試料を、ヒトCyr61、ヒトCyr61断片、ヒトCyr61類似体、及びヒトCyr61誘導体よりなる群から選択される、生物学的に有効な量のECMシグナリング分子関連生物材料と接触させて対照となし；（ｃ）第１及び第２の生物学的試料をインキュベートし；（ｄ）工程（ｃ）より得られる細胞増殖のレベルを測定し；ならびに（ｅ）工程（ｄ）で測定される細胞接着のレベルを比較し、これによって、工程（ｂ）の対照と比較した場合の細胞接着のレベルを変化させる能力により、細胞増殖のモジュレーターを同定する工程を含む方法に関する。
本発明によってさらに企図されるのは、培養にて、未分化造血幹細胞の集団を増加させるための方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）供与者から造血幹細胞を入手し；及び（ｂ）生物学的に有効な（すなわち、造血に有効な）量のCyr61の存在下に好適な栄養条件のもとでかかる細胞を培養する工程を含む方法である。
本発明のさらなる方法は、マイトジェンをスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、（ａ）細胞増殖を行うことができる細胞を播種し；（ｂ）その細胞の第１の部分を、Cyr61及びマイトジェン推定物を含む溶液と接触させ；（ｃ）その細胞の第２の部分をCyr61を含む溶液と接触させて対照となし；（ｃ）この細胞をインキュベートし；（ｄ）細胞の第１の部分及び細胞の第２の部分の生育を検出し；ならびに（ｅ）細胞の第１及び第２の部分の生育を比較し、これによって、細胞の第２の部分の生育と比較した場合に、細胞の第１の部分において生育をより強く誘導する能力により、マイトジェンを同定する工程を含む方法である。前記細胞には、内皮細胞及び繊維芽細胞が包含されるが、これらに限定されることはない。さらに、この方法は、細胞を核酸標識、例えば［3H］-チミジンに接触させ、ならびにかかる細胞における標識の存在を検出する工程を含んでもよい。他の方法は、移植片の血管新生の速度を向上させるに有効な量のCyr61を動物に投与する工程を含む、組織移植を改善することに関する。
以下の図面及び発明の詳細な説明を考慮すれば、本発明の多くのさらなる特徴及び利点が明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
図１は、成長−調節タンパク質の、システイン・リッチなタンパク質ファミリーのメンバーのアミノ酸配列の比較を表す図である。
発明の詳細な説明
マウスにおいて、Cyr61タンパク質は、細胞接着、移動、及び増殖に影響を及ぼすことが認められている。cyr61遺伝子は、Cyr61をコードしており、マウス繊維芽細胞において血清増殖因子により転写活性化される、即時型初期遺伝子である。Lauら、EMBO J. 4巻、3145〜3151頁（1985）（引用することにより本明細書に組み入れることとする）；Lauら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84巻、1182〜1186頁（1987）（引用することにより本明細書に組み入れることとする）。ネズミcyr61 cDNAコード配列は、配列番号：１に示す。（ヒトcyr61 cDNAコード配列は、配列番号：３に提示する）。ネズミCyr61のアミノ酸配列は、配列番号：２に示す。（ヒトCyr61のアミノ酸配列は、配列番号：４に表す）。Cyr61は、プロセッシングを受けないタンパク質を構成している379アミノ酸のおよそ10％に当たる、39のシステイン残基を呈する41kDaのポリペプチドである。Yangら、Cell Growth & Diff. 2巻、351〜357頁（1991）（引用することにより本明細書に組み入れることとする）。研究によって、ネズミCyr61がヘパリンに結合して分泌されることが明らかになっている。Yangら。Cyr61の分泌型の観察に一致しているのは、ネズミcyr61 cDNA配列を調べた結果から推測される、発生しようとしているCyr61におけるN-末端配列を同定したものである。Yangら。加えて、Cyr61は、cyr61を発現している培養細胞の馴化培地には認められず、細胞外基質（ECM）及び細胞表面に会合していることが認められている。Yangら、構造的に類似するシステイン・リッチな哺乳類タンパク質を特徴付けした。
Fisp12は、システイン・リッチなネズミのタンパク質であるが、Cyr61と構造上の類似性を呈するものである。Fisp12をコードするcDNA配列を配列番号：５に示し、Fisp12のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。ネズミのFisp12は、Cyr61と同様に、細胞接着、増殖及び移動に影響を及ぼす。Fisp12のヒト・オーソログは、結合組織増殖因子（CTGF）で、これはCyr61と構造及び機能が類似しているタンパク質である。しかしながら、Fisp12及びCTGFは、Cyr61と区別することができる。例えば、Cyr61の場合よりも、分泌型Fisp12は培地に高い割合で見出され、これに対応してCyr61で見出されるよりも低い割合でしか、Fisp12は発現している細胞の領域（細胞表面及び近傍の細胞外マトリックス）に局在していない。本発明のECMシグナリング分子を含むタンパク質間のさらなる類似点及び相違点は、以下の詳説で明らかになるはずである。
本発明は、以下の実施例によって例証される多くの特徴を有するものである。実施例１には、ECMシグナリング分子のシステイン・リッチなタンパク質ファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドのクローニングを記載する。実施例２には、配列分析を記載する。実施例３には、RNA分析を記載する。実施例４には、トランスジェニック動物の生産を記載する。実施例５には、Cyr61ポリペプチドの発現を記載する。実施例６にはFisp12ポリペプチドの発現を記載する。実施例７には、ポリペプチド精製の方法を述べる。実施例８には、本発明のポリペプチドの特徴付けを示す。実施例９には、システイン・リッチなタンパク質ファミリーのポリペプチドのメンバーについてのヘパリン結合アッセイを開示する。実施例１０は、ポリペプチドに対する受容体に関する。実施例１１には、抗ECMシグナリング分子抗体を記載する。実施例１２は、阻害ペプチドに関する。実施例１３には、細胞接着のプロセスに影響を及ぼすための、細胞接着及びポリペプチド・ベース法を記載する。実施例１４には、ポリペプチドによって影響を受ける繊維芽細胞の移動を記載する。実施例１５には、内皮細胞の移動及び移動についてのin vitroアッセイを記載する。実施例１６には、内皮細胞移動の阻害剤のin vitroアッセイを記載する。実施例１７には、内皮細胞移動についてのin vivoアッセイを記載する。実施例１８には、本発明のポリペプチドによるマイトジェンの強化を記載する。実施例１９には、脈管形成因子及びモジュレーターについてのin vivo角膜アッセイを記載する。実施例２０は、本発明のポリペプチドを使用して血液凝固に影響を及ぼすための方法に関する。実施例２１には、ex vivo造血幹細胞培養のためのポリペプチドの使用を開示する。実施例２２には、臓器再生について述べる。実施例２３には、軟骨形成、及び間葉細胞における細胞外マトリックスシグナリング分子の発現を記載する。実施例２４には、本発明のポリペプチドを使用した軟骨形成のプロセスにおける細胞接着の促進を記載する。実施例２５には、軟骨形成、及び細胞凝集に対する本発明のポリペプチドの影響を記載する。実施例２６には、軟骨形成のプロセスにおける本発明のポリペプチドによる細胞増殖の促進を記載する。実施例２７には、軟骨形成に作用させるように本発明のポリペプチドを使用するための方法を述べる。そして実施例２８には、本発明のポリヌクレオチドの使用への遺伝的アプローチを示す。これらの実施例は、本発明の例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
実施例１
ポリヌクレオチドのクローニング
ヒトcyr61 cDNAを、当該技術分野における標準技術を用いてネズミcyr61 cDNA配列を用いたプローブ探針によりヒト胎盤cDNAライブラリーから単離した。Sambrookら（引用することにより本明細書に組み込むこととする）を参照されたい。BALB/c 3T3（ATCC CRL-1658）cDNAライブラリーからの完全なネズミcyr61 cDNAの単離が、報告されている。O’Brienら、Mol. Cell. Biol. 10巻、3569〜3577頁（1990）（引用することにより本明細書に組み込むこととする）。ネズミcyr61のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、GenBankデータベースより受入番号M32490で入手できる。ネズミcyr61のヌクレオチド配列は、配列番号：１に示し、ネズミCyr61のアミノ酸配列は配列番号：２に示している。
ヒトのcDNAライブラリーは、ベクターとしてλgt11（Promega Corp.、Madison、ウィスコンシン州）を使用して構築し、大腸菌にトランスフェクトしてＬＢアガーに播種した。cyr61コード配列［O’Brienら、（1990）の番号付けを用いるとヌクレオチド第56〜1560位；配列番号：１を参照のこと］の全長を含むpGEM-2にクローニングしたネズミcDNA発現構築体（O’Brienら、［1991］）を、プローブとして使用した。マウスcDNAプローブは、当該技術分野での標準技術によって放射線標識した。Sambrookら。マウスのプローブを使用したプラークのスクリーニングは、標準技術を使用して実施した。Sambrookら。
さらに詳細には、前記のヒトcDNAライブラリーを含むアガープレートを、ニトロセルロースフィルター（BA85、82mm、Schleicher & Schuell、Keene、ニューハンプシャー州）に曝し、それを各プレート上に置いた。プラーク吸収の後（およそ２０分）、フィルターを取り出しておよそ３０分間風乾した。各フィルターは、0.2M NaOH、1.5M NaCl（100ml）；2 X SSC、0.4M Tris-HCl、pH7.4（100ml）；及び0.2 X SSC（100ml）に３０〜６０秒間連続的に浸漬した。次いでフィルターを室温にておよそ１時間乾燥させ、減圧下に２時間、80℃に付した。フィルターを、放射線標識したネズミcyr61 cDNAを用いてプローブ探針した。
代わりに、ヒトcyr61 cDNAクローンは、RT-PCRによって作製したプローブを用いて同定した。詳細には、ヒト胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブは、対数的に増殖しているWI38細胞からの総RNAのRT-PCRにより、縮重プライマーを用いて作製されたPCR断片であった。プライマーは、マウスcyr61 cDNAの読み取り枠の最も保存された領域に対応する配列に由来するものであった。１つのプライマーはH61-5［5’-GGGAATTCTG(TC)GG(GATC)TG(TC)TG(TC)AA(GA)GT(GC)TG-3’］と命名されており、EcoRI部位を導入するために使用された5’端での「GGGAATTC」配列を例外として縮重配列を含み、配列番号：１に示されるマウスcyr61配列のヌクレオチド第327〜346位（センス鎖）に由来している。縮重は、配列番号：１のコドンの第３番目に対応する位置に現れる。ヒトcyr61配列のPCR増幅のために使用された第２プライマーは、H61-3［5’-CCGGATCC(GA)CA(GA)TT(GA)TA(GA)TT(GA)CA-3’］と命名され、BamHI部位を導入するために用いられる5’配列「CCGGATCC」を例外として、配列番号：１で示されるマウスcyr61配列のヌクレオチド第1236〜1250位に相補的なアンチセンス鎖に対応している。縮重は、配列番号：１に示すマウスcyr61のコドンの第３番目に相補的な位置に出現する。増幅されたcyr61 cDNAは、pBlueScript SK+ベクター（Stratagene、La Jolla、カリホルニア州）へとクローニングし、シーケナーゼIIキット（U.S.Biochemicals、Cleveland、オハイオ州）を用いて配列決定した。
ヒト胎盤cDNAライブラリーを連続的にスクリーニングすることにより、ヒトcyr61 cDNAを含むクローンの単離へと導いた。ヒトcyr61 cDNAは、およそ1,500bpの長さである、ヒトcDNAは、pGEM-2のEcoRI部位へとクローニングされたEcoRI断片に含まれている。配列番号：３に示すように、ヒトcDNA配列はヒトCyr61に対する全コード領域を、120bpの5’フランキング配列、及び150bpの3’フランキング配列と共に含んでいる。
本発明のポリヌクレオチドは、全体的または部分的に合成された、DNAまたはRNA、そして一本または二本鎖であってよい。本発明のポリヌクレオチドは、ECMシグナリング分子タンパク質の断片であってよいECMシグナリング分子ポリペプチドをコードするものであるので、ポリヌクレオチドはECMシグナリング分子の部分配列をコードしていてもよい。本発明のポリヌクレオチド配列は、組換え法によるECMシグナリング分子の生産のため、及びECMシグナリング分子をコードするポリヌクレオチド用のハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
本発明のDNAポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、及びECMシグナリング分子のコード配列を含むオリゴヌクレオチド、または前記のごとき、脈管形成、軟骨形成、及び腫瘍形成などの生物学的プロセスにおけるような細胞接着、細胞移動もしくは細胞増殖を促進する能力、あるいはECMシグナリング分子を認識する抗体を引き出す能力などといったECMシグナリング分子の生物学的活性の少なくとも１つを保有する、ECMシグナリング分子の断片もしくは類似体を包含する。
本発明の他のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドがECMシグナリング分子の生物学的活性の少なくとも１つを保有するタンパク質をコードするのであれば、天然のECMシグナリング分子ポリヌクレオチド内に含まれる配列と、配列上異なっているものである（すなわち、ヌクレオチドの付加、欠失、挿入、または置換）。本発明のポリヌクレオチド配列は、それにコードされるアミノ酸の配列を変化させないサイレント突然変異によって、天然のECMシグナリング分子ポリヌクレオチドとは異なっていてもよい。加えて、本発明のポリヌクレオチドは、前記のような天然のECMシグナリング分子配列またはサブ配列とはアミノ酸配列で相違するECMシグナリング分子と特定しうるものである。例えば、１以上のアミノ酸残基の保存的置換により天然のECMシグナリング分子とアミノ酸配列で相違するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本発明によって企図される。本発明はまた、本発明のECMシグナリング分子をコードするポリヌクレオチドと標準的なストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または遺伝コードの縮重がなければハイブリダイズするであろうポリヌクレオチドも含むものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、50％ホルムアミド、5 X SSC、20mM Na・PO4、pH6.8で、42℃にてハイブリダイゼーション及び0.2 X SSCで55℃にて洗浄することが挙げられる。当業者には、ハイブリダイズするべき配列の長さ及びＧＣヌクレオチド含量に基づく、これらの条件の変更が想起されることは理解される。当該技術分野における標準慣用技術が、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）§§9.47-9.51を参照されたい。
RNAを含むECMシグナリング分子ポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲に入る。本発明の好ましいRNAポリヌクレオチドは、ヒトcyr61のmRNAである。本発明の他のRNAポリヌクレオチドには、ECMシグナリング分子に関係する生物学的活性を保有するポリペプチドをコードするという条件付きで、ヌクレオチドの挿入、欠失、付加、または置換によって天然のECMシグナリング分子mRNAと相違するRNA（前記参照）を包含する。本発明のさらに別のRNAには、アンチセンスRNA（すなわち、ECMシグナリング分子mRNAと相補的なRNA配列を含むRNA）が包含される。
従って、別の実施態様において、まとめてヒトcyr61 cDNAに及びDNA断片の一組をpGEM-2及びM13誘導体へ、ヌクレオチド配列分析を容易ならしめるべく、当該技術分野でよく知られている方法を使用してクローニングした。pGEM-2クローンは、当該技術分野で知られた技術を使用して、一連の欠失の酵素的作製のための基質を提供した。まとめて、cyr61 cDNAコード領域の様々な部分にわたる一連のDNA断片を含む。このクローンのコレクションは、本発明の方法に有用である。こうして得られたネステッドpGEM-2クローンの組は、次に、酵素的鎖終結技術を用いたヌクレオチド配列分析のための基質を提供する。断片は、核酸プローブとして、そしてCyr61欠失または欠損類似体を調製するためにも有用である。例えば、cyr61 cDNAクローンは、市販のヒトゲノムライブラリーからcyr61クローンを単離するためにも使用されうる。（Clontech Laboratories, Inc.、Palo Alto、カリホルニア州）。ゲノムクローンは、変わって、ヒトゲノムにおけるcyr61座（既知の疾患の座と関係があるかもしれない座）をマッピングするために使用されうる。
他の実施態様には、プラスミド、ウイルス（例えば、ラムダファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、ウイルスのM13-fl-fdファミリー、レトロウイルス、バキュロウイルス、及び他のウイルスなどに由来する、原核性及び真核性のウイルスベクター）、ファージミド、コスミド、及びYAC（すなわち、酵母人工的染色体）ベクターを含む、様々なベクターの中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが包含する。
さらに別の実施態様には、異種ポリヌクレオチド環境の中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが包含される。本発明のポリヌクレオチドは、異種ゲノムに挿入され、それによって、本発明のトランス遺伝子、及びトランスジェニックマウスを作出する。特に、部分的なネズミcyr61遺伝子配列を含む遺伝子融合体の２つの型が、トランスジェニックマウスを作製するために使用されている。（下記参照）。融合遺伝子の１つの型は、cyr61のコード配列を、１）K14ケラチンプロモーター、２）β−アクチンプロモーター、または３）ホスホグリセロキナーゼプロモーターの３つの異なるプロモーターのうちの１つと共に組み換え製造したものであった。Adraら、Gene 60巻、65〜74頁（1987）。これらの融合構築体は、標準技術を用いて、以下にホスホグリセロキナーゼプロモーター（pgk-1）-cyr61融合体の内容について述べるとおりに作製した。全長のcyr61コード領域及びすべてのイントロンを含むが、転写開始部位及びポリアデニル化シグナルを欠くXhoI-ScaIゲノムDNA断片を、lacZコード配列を置換して、プラスミドpgk/β-galにクローニングした。得られた構築体は、あらゆる細胞において活性な、強いpgk-1プロモーターの制御下にcyr61を配置したものであった。
第２の型の遺伝子融合体は、大腸菌β-ガラクトシダーゼをコードする配列と共にcyr61発現制御配列（すなわち、プロモーター）を組換え製造したものであった。cyr61-lacZ融合遺伝子は、以下のアプローチ法を使用して構築した。転写開始ヌクレオチドに関連する、ヌクレオチド第-2065位から+65位までにわたるDNA断片を使用して、平滑末端クローニングによりプラスミドpgk/β-galにてpgk-1プロモーター（Adraら、Gene 60巻、65〜74頁［1987]）を置換させた。加えて、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを、その融合遺伝子を含むプラスミドにクローニングした。得られた構築体の、プラスミド2/lacZは、cyr61プロモーターを含む2kbのDNA断片の転写制御下に大腸菌lacZ遺伝子を有している。関連するプラスミド1.4/lacZは、AflII部位の上流に認められる約600bpのcyr61 DNAを除去することにより、プラスミド2lacZより得られたものである。また、プラスミド2M/lacZは、PCRによって作出された、CArGボックスにおけるCからTへの変化を除いては、プラスミド2/lacZと共通である。これらの構築体は、NotI消化によりベクターから切り出され、GeneClean［Bio101, Inc.、La Jolla、カリホルニア州］を使用して精製され、そしてトランスジェニックマウスを作製するために使用された。
マウスfisp12をコードするcDNA断片もまた、標準技術を使用してクローニングされている。Ryseckら、Cell Growth & Diff. 2巻、225〜233頁（1991）（引用することにより本明細書に組み込むこととする）。クローニングは、fisp12 cDNAコード領域を含むXhoII断片を、BamHIで切断されたpBlueBacIII（バキュロウイルス発現ベクター）（Invitrogen Corp.、San Diego、カリホルニア州）に連結することによって成し遂げられた。組換えバキュロウイルスクローンは、Summersら、TX Ag.Exp.Sra.、Bulletin 1555（1987）に記載される通りにして得られた。
fisp12のヒト・オーソログ（CTGFをコードする遺伝子）は、米国特許第5,408,040号、第12カラム第６行から第13カラム第29行（参照することにより本明細書の一部とする）に記載されるとおりに、抗血小板由来増殖因子（抗-PDGF）抗体を用いて融合CTGF-ライブラリーをスクリーニングすることによってクローニングされた。スクリーニングのストラテジーは、CTGFとPDGFの免疫学的交差反応性を活用した。
クローニングされたcyr61、fisp12、及びctgf cDNAのコピーは、ゲノムコード領域のみならず、ゲノムDNAまたはcDNAの対立変異体の単離を容易ならしめるポリヌクレオチドプローブ用のすぐに使用可能な供給源を提供するものである。加えて、現存するcDNAクローン、または前記のようにしてプローブ探針することにより単離されたクローンを、トランスジェニック生物を作製するために使用してもよい。例えば、cyr61を収容しているトランスジェニックマウスが、次の実施例に記載するように、標準的な技術を用いて作製されている。
クローン、hCyr61cDNAは、配列番号：３に示すヒトcyr61 cDNA配列を含んでおり、そのクローンで形質転換された細菌株のEschelichia coli DH5α（hCyr61cDNA）は、1997年３月14日に、メリーランド州、ロックビレ、パークローンドライブ12301番地に所在の、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。
実施例２
配列分析
ネズミcyr61のヌクレオチド配列はすでに報告されており、O’Brienら、（1990）；Latinkicら、Nucl.Acids.Res. 19巻、3621〜3267頁（1991）、本明細書中、配列番号：１で示している。
ネズミCyr61の推定されるアミノ酸配列は、これまでに報告されており、O’Brienら、（1990）、そして配列番号：２で示している。
ヒトcyr61 cDNAは、Sambrookらに記載されるとおりに、Sangerの方法を使用して決定した。配列決定の鋳型は、前記実施例１に記載のとおりにpGEM-2ヒトcyr61 cDNAクローンから一連のネステッド欠失体を構築することによって作製した。ヒトcyr61 cDNA配列を配列番号：３に示す。ヒトCyr61のアミノ酸配列は、ヒトcyr61 cDNA配列より推定し、そして配列番号：４に示している。
マウスとヒトCyr61配列の比較は、それぞれ配列番号：２及び配列番号：４にそれぞれ示したが、91％の類似性が明らかになっている。双方の配列はプロセッシングされ、且つ分泌されたタンパク質のN-末端シグナル配列を呈し、双方のタンパク質とも双方のタンパク質に分布するがネズミ及びヒトのCyr61の双方の中心領域には明らかに存在しない、38のシステイン残基を含んでいる。明らかにマウスとヒトCyr61をコードする領域の間の最も大きな配列の相違（divergence）の領域は、システイン残基が存在しないこの中心領域である。しかしながら、マウス及びヒトcyr61 cDNAの5’非翻訳領域は、さらにもっと相違している（67％の類似性）。これに対し、3’非翻訳領域は最も類似している領域（91％の類似性）である。全体の鎖長で、コードされるネズミCyr61は379アミノ酸を有し、ヒトCyr61は381アミノ酸を有している。
fisp12 cDNA配列もまた決定され、それを配列番号：５に示す。Fisp12のアミノ酸配列は、fisp12 cDNA配列から推定され、配列番号：６に示している。ネズミCyr61とFisp12のアミノ酸配列の比較により、２つのタンパク質は65％の同一性であることが明らかである。Cyr61とFisp12の構造上の類似性は、２つのタンパク質の下記の類似の機能的特性に合致するものである。
完全なCTGFのコード領域を含むCTGFの部分cDNA配列もまた、決定されている。’040特許の第12カラム、第68行から第13カラム、第14行に報告されているごとく、酵素的配列決定反応を行うための鋳型としてM13クローンを用いて、CTGF cDNA配列を得た。二本鎖酵素的配列決定反応を併用したさらなるクローニングによって、CTGFをコードするcDNAの全配列が明らかになった。米国特許第5,408,040号の第14カラム、第44行から第15カラム、第８行（引用することにより本明細書に組み込むこととする）。CTGFをコードするcDNAの推定されたアミノ酸配列を、配列番号：８に示す。
実施例３
RNA分析
正しく設計されたプローブは、転写レベルでのcyr61遺伝子発現レベルや局在性を明らかにすることができるので、ポリヌクレオチドプローブは、脈管形成、及び他のCyr61発現に関連する障害に対する有用な診断ツールである。また、cyr61の発現は、脈管形成のプロセスを制御している遺伝子が、典型的な、または期待されるレベル発現されているか否かを示唆するものである。
これらのツールを用い、RNase保護技術を使用してマウスcyr61 mRNA発現パターンを調べた。O’Brienら、（1992）。詳細には、ネズミcyr61 mRNAの246ヌクレオチド（O’Brienらの番号付けを用いるとヌクレオチド第67から313位）を保護するはずである、289ヌクレオチドのアンチセンスリボプローブを使用した。アッセイにより、未分化状態または第１，２及び３の分化段階からのPSA-1細胞（10μgの総RNA）におけるcyr61 mRNAのレベルが示された（PSA-1細胞は、以下の妊娠後の時間のマウス胚細胞に対応する３段階の分化を行う：4.5〜6.5日［PSA-1段階１］；6.5〜8.5日［PSA-1段階２］；8.5〜10.5日［PSA-1段階３］）。胚全体及び胎盤の総RNA（各20μg）の保護の比較によって、cyr61が細胞分化及び増殖のプロセスに符合した時点で発現されることが示された。
ヒトcyr61の発現の特徴をノザン分析によって、当該技術分野における標準技術を用いて調べた。Sambrookら。RNAは、ヒト二倍体繊維芽細胞系WI38（ATCC CCL-75）から単離した。加えて、RNAはラット細胞（REF52）、ハムスター細胞（CHO）、及びサル細胞（BSC40）から単離した。各々の細胞系を、MEM-10（Earleの塩［GIBCO-BRL, Inc.］、2mMグルタミン、及び10％胎児ウシ血清［fcs］を含むイーグル最小必須培地）にて周密にまで生育し、そして２日間MEM-0.5（0.5％血清培地）中に継代した。次いで、培養液を当該技術分野において知られた方法でシクロヘキサミドの存在下または非存在下に20％fcsで刺激した。Lauら（1985；1987）。次いで、これらの細胞系から単離されたRNAのアリコート10マイクログラムを、ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動によって分画し、ニトロセルロースフィルター上に転写して固定化し、そして高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、［32P］-放射標識した全長のネズミcyr61 cDNAプローブに曝した。ヒトcyr61 RNA発現は、ネズミcyr61発現に類似していた。マウス及びヒトの双方のcyr61発現によって、およそ2キロベースのRNAが得られた。加えて、マウス及びヒトの双方のCyr61発現は、血清によって刺激され、シクロヘキシミドに対して耐性であった。
ヒトcyr61 mRNAの分布も、複数組織ノザンブロット（Clontech）を使用して調べた。ブロット膜は、製造業者のプロトコルに従って、ExpressHyb Solution（Clontech）にてハイブリダイズさせた。その結果より、cyr61 mRNAは、ヒト心臓、肺、膵臓及び胎盤に豊富に存在し、骨格筋、腎臓及び脳に低レベルで存在し、そして肝臓では検出不能であることが示された。これらの結果は、マウス組織でのcyr61の発現と一致している。
加えて、休止期の、指数的に生育中の、血清により刺激された、またはシクロヘキシミドに曝されたうちのいずれかのヒトヒフ繊維芽細胞（HSF）から総RNAを単離した。HUVE細胞（ATCC CRL1730）は、10％fbs（Intergene）、100μg/mlヘパリン（Gibco BRL）及び30μg/ml内皮細胞増殖補助剤（Collaborative Biomedical Products）を補充したHam’s F12培地中で継代した。ヒトのヒフ繊維芽細胞（HSF、ATCC CRL-1475）及びWI38繊維芽細胞（ATCC CCL-75）は、10％fbsを補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）にて生育した。休止期のHSFは、周密になるまで10％fbsを補充したDMEMにて生育し、その後２日間、培地を0.1％fbsを含有するDMEMに変えることによって調製した。血清による刺激は、培地を１時間、20％fbsに変えることによって行った。示した場合には、血清と同時にシクロヘキシミド10μg/mlを３時間添加した。
前記した細胞からのRNAを、グアニジンイソシアネート・プロトコルを用いて単離した。Chomczynskiら、Anal.Biochem. 162巻、156〜159頁（1987）。RNA試料は、ホルムアルデヒドアガロースゲルにおける電気泳動による分離の後、ナイロンフィルターに転写することによって分析した。ブロット膜を、cyr61またはGAPDHのいずれかを鋳型として用いてハイブリダイズさせた。Adamsら、Nature 355巻、632〜634頁（1992）。その結果、ヒトcyr61 mRNAは休止期のヒトヒフ繊維芽細胞には検出可能に存在しておらず、対数的に生育しているHSF及び血清で刺激されたHSFに豊富に存在しており、そしてシクロヘキシミドによって格段に誘導されることが示唆された。
CTGFをコードするRNAの分析もまた、当該技術分野における標準技術にかかるものである。詳細には、CTGFをコードするRNAの研究は、米国特許第5,408,040号、第１１カラム、第59行から第１２カラム、第14行、及び第１３１カラム、第10〜29行に記載される（引用することにより本明細書に組み込むこととする）とおりに実施された総RNAの単離及びノザン分析を含むものであった。2.4kbのRNAが同定された。CTGFの発現は、胎盤、肺、心臓、腎臓、骨格筋及び膵臓で高かった。しかしながら、CTGF発現は肝臓及び脳においては低かった。
実施例４
トランスジェニック動物
組換えcyr61配列の完全なコピーを保有するトランスジェニックマウスは、融合遺伝子を含む線状DNAを使用して成し遂げられた。cyr61をコードする配列は、別々に前記のβ−アクチン、K14、及びpgkプロモーターに融合させた。cyr61の発現を、トランスジェニックマウスにおいて、これらのプロモーターによって駆動させた。融合遺伝子は、標準技術を用い、適切な制限エンドヌクレアーゼ消化によって製造した。融合遺伝子断片を、Swiss Websterマウスの単細胞接合体へと注射した。注射された接合体は、次いで偽妊娠の雌性に移植された。このようにして、いくつかの腹子のマウスを生産した。異常な表現型を呈している新生児を、さらなる分析に供した。例えば、pgkプロモーターの制御下にcyr61を発現している新生のトランスジェニックマウスは、渦巻状尻尾、固定関節、及び湾曲肢を包含する骨格の奇形を呈しており、その結果、運動困難を発症していた。これらのマウスは、典型的には生後第７日以内に小さくなって死亡した。β−アクチンプロモーターの制御下にcyr61を発現しているトランスジェニックマウスは、マウスが小さいことを除いては顕著な表現型を示していなかった。トランス遺伝子を保有するマウスを近交系のC57BL/6に戻し交配させると、子孫のマウスは、継続的な戻し交配に伴い漸進的により小さくなっていった。このような戻し交配を３から４回行った後には、本質的に生き残る子孫がいなくなり、繁殖させることはできなかった。K14プロモーターの制御下にcyr61を発現しているトランスジェニックマウスは、繊維性皮膚炎を形成した。その病理学は、時として出血を生じる程の、表面の過度の引掻（scratching）を包含していた。cyr61のノックアウト変異を有するトランスジェニック生物もまた、これらの標準的な技術（Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press 1944））を用いて作出することができ、これは病態のモデルとして有用である。
実施例５
Cyr61発現
天然のCyr61は、胚組織に発現されており、そして様々な創傷組織に誘導されている。下記参照；さらにO’Brienら（1992）も参照されたい。Cyr61の組織分布は、旧来の免疫学的技術（Harlowら、1987）を使用して誘発させ、アフィニティー精製された、ウサギ抗Cyr61ポリクローナル抗体を用いて調べた。本発明に従いアフィニティー精製された抗Cyr61ポリクローナル抗体を使用して、平滑筋、心筋細胞、ならびに心血管系の内皮；脳、脊髄、神経節及びニューロン、ならびに神経系の網膜；骨格系の軟骨及び骨；表皮、毛髪、口腔上皮、及び皮膚の角膜；細気管支、及び肺の血管；ならびに胎盤組織を包含する様々な組織におけるcyr61発現を認めた。天然のcyr61に対して行われた発現研究（mRNA及びタンパク質）に加えて、前記のごときcyr61トランス遺伝子を用いた研究は、Cyr61発現の理解に寄与してきているものである。cyr61の発現制御配列及びlacZ（β−ガラクトシダーゼをコードしている）のコード配列を含むトランス遺伝子融合体の使用によって、タンパク質発現のための至便な比色定量アッセイが提供される。
比色定量アッセイは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（すなわち、X-Gal）を、lacZの遺伝子産物であるβ-ガラクトシダーゼに対する基質として使用することを包含している。β-ガラクトシダーゼによるX-galの酵素的切断によって、組織科学的染色において有用な協力に発色するインディゴ染料が生産される。実際には、分析に供される胚組織及び成人組織は、切開され、そして2％ホルムアルデヒド、0.2％グルタルアルデヒド、0.02％Nonidet P-40、及び0.01％デオキシコール酸ナトリウムを含む標準リン酸緩衝性生理食塩水（PBS）にて固定された。固定時間は、分析に供される器官または胚試料のサイズや密度によって、15〜120分に変えた。続いて、試料をPBSで濯ぎ、5mMフェロシアン化カリウム、5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2、0.02％ Nonidet P-40、0.01％デオキシコール酸ナトリウム及び1mg/mlのX-gal（ジメチルスルホキシド［DMSO］中、40mg/ml）を含有するPBS溶液中で、37℃にて終夜染色した。次いで、試料はPBSで濯ぎ、4％パラホルムアルデヒド中で１〜２時間、後固定し、そして顕微鏡検査に供するまで4℃にて70％エタノール中に保存した。cyr61-lacZトランス遺伝子を含むマウスを、cyr61の発現プロファイルをマッピングするために使用した。第12.5日の胚組織についての結果を、表Ｉに示す。
0004307552.tif 000002
この結果、Cyr61は様々な胚細胞型において発現されていることが示された。cyr61のコード配列に組み合わせた異種発現制御配列を含むトランス遺伝子融合体の別の型タイプにより生じるCyr61の異所性の発現から、さらなる情報を収集した。制御配列、K14ケラチンプロモーター、β−アクチンプロモーター、及びホスホグリセロキナーゼプロモーターを、元来の発現とは相違するパターンにおけるCyr61の発現に充てた。
Cyr61を異所的に発現しているトランスジェニックマウスは、通常野生型マウスよりも小型であり、平均寿命の低下を呈した。さらに、これらのトランスジェニックマウスは、異常な心臓（すなわち、肥厚した心室壁とそれに対応する内部容量の減少）ならびに湾曲した脊椎、動部に膨張する関節、及び渦巻状尻尾によって特徴付けられる異常な骨格を有していた。従って、Cyr61の異所性発現は、脈管形成（血管の発生及び心臓の発生）ならびに軟骨形成（骨格の発生）を干渉するものである。加えて、cyr61のノックアウト変異を担持するトランスジェニックマウスを開発して、Cyr61活性の欠失に関わる病態のモデルとして調べてもよい。
組換えcyr61の発現のためのストラテジーは、Sf9細胞においてバキュロウイルス発現ベクターを使用して設計された。バキュロウイルス発現ベクター及びSf9細胞を含む発現系は、Current Protocols in Molecular Biology §§16.9.1〜16.12.6（Ausubelら、編、1987）。本発明の一実施態様は、pBlueBac2の転移ベクターへとネズミcyr61 cDNAをクローニングすることにより、発現ストラテジーを履行するものであった。組換えクローンは、標的AcMNPV（すなわち、Autographa california核ポリヘドロウイルスまたは）DNAと共にMaxBac Kit（Invitrogen, Inc.、San Diego、カリホルニア州）を用い、製造業者のプロトコルに従ってリポソームを介したトランスフェクションによりSf9細胞へと導入した。組換えウイルスをプラーク精製し、感染によりSf9細胞で３代継代することにより増幅した。
ネズミCyr61の合成を駆動するバキュロウイルス構築体で感染したSf9昆虫細胞の馴化培地を、Cyr61の精製用の供給源として使用した（下記参照）。精製された組換えCyr61は、3T3線維芽細胞由来のCyr61の例えばヘパリン結合活性などの内在性タンパク質の特定の特徴を保持しており（後述）、そして、キモトリプシンまたはトリプシン（配列決定用等級；Boehringer-Mannheim, Inc.、Indianapolis、インディアナ州）のいずれかを使用し、タンパク質分解により得られるそれぞれ別々のペプチドプロファイルにより明らかにされた場合、内在性タンパク質との構造的類似性を有していた。
ヒトcyr61も、バキュロウイルス系を使用して発現させた。ヒトcyr61読取り枠全体に及ぶcyr61 cDNAのSmaI-HindIII断片（配列番号：３のヌクレオチド第100〜1649位に相当する）を、pBlueBac3バキュロウイルス発現ベクター（Invitrogen）へとサブクローニングした。組換えバキュロウイルスクローンを得て、プラーク精製し、そして旧来の技術を使用してSf9感染体の３代継代によって増幅した。Sf9細胞の感染及びヒトCyr61（hCyr61）の精製は、若干の修正を加えて標準的な技術を用いて実施した。Sf9細胞は、無血清Sf900-II培地（Sigma）にて継代した。Sf9細胞を150mmディッシュ当たり2〜3 x 106細胞にて、単層培養で播種し、そして細胞当たり5プラーク形成単位（PFU）の組換えウイルスで感染した。感染後８及び96時間で馴化培地を集め、遠心分離（5000 x g、5分）により清澄化して、50mM MES［2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸］、pH6.0、1mM PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）、及び1mM EDTAに調整した。500mlの馴化培地当たり5mlのセファロースSビーズの割合で、負荷用緩衝液（50mM MES、pH6.0、1mM PMSF、1mM EDTA、150mM NaCl）で平衡化したセファロースSビーズに培地を混合し、そして緩やかに攪拌しながら4℃にて（o/n）タンパク質をセファロースSビーズに結合させた。攪拌せずに２０分間沈降させることによりセファロースSビーズを集め、そしてカラムに付した。0.3M NaClを含む負荷用緩衝液をカラムに６倍容量用いてカラムを洗浄し、そして負荷用緩衝液にてNaClの段階的濃度勾配（0.4〜0.8M）を用いて、組換えヒトCyr61をカラムから溶出した。この方法により、500mlの馴化培地から、精製されたCyr61タンパク質が3〜4mg得られ、そしてその精製されたCyr61は、SDSゲルのクマシーブルー染色により判定した場合90％を越える純度であった。
別の実施態様において、完全なヒトcyr61 cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（Hayashiら、PCR：The Polymerase Chain Reaction 3-13［Mullisら、編、Birkhauser、1994］）とTaqポリメラーゼを、編集機能を用いて使用し、次にベクターにPCR断片を挿入するための旧来のクローニング技術によって、pBK-CMV（Stratagene、LaJolla、カリホルニア州）などのサイトメガロウイルスベクターへとクローニングする。次いで、リポソームを介するトランスフェクションによって、発現ベクターをHUVE細胞に導入する。ベクターにより産生されるneo遺伝子を含む受入クローンを、G418を使用して選択する。選択されたクローンを増やし、そして逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（すなわち、RT-PCR；Chellyら、PCR：The Polymerase Chain Reaction 97-109［Mullisら、編、Birkhauser、1994］）または酵素関連免疫吸収アッセイ（すなわち、ELISA；Stitesら、Basic and Clinical Immunology 243巻［Stitesら、編、Appleton及びLange1991］）などのアッセイによってCyr61発現を同定する。
本発明の他の実施態様において、使用される細胞型にて作動可能なプロモーターに連結されたcyr61 cDNAコード領域を用い、細菌細胞または他の発現系（例えば、酵母）においてCyr61タンパク質を発現させる。これらのアプローチの１つを用いて、脈管形成、軟骨形成、または腫瘍形成障害を処置するために、例えば静脈内経路によって、直接的に患者に投与することができる形状にてCyr61タンパク質が得られる。当業者であれば、例えば、局所または局所適用、リポソームを介する送達技術、または皮下、皮内、もしくは筋肉注射などの他の投与経路も使用可能であることを認めるはずである。
実施例６
Fisp12発現
Fisp12の発現、ならびにCyr61及びFisp12の発現の特徴の比較を、免疫組織学的技術を使用して調べた。これらの免疫組織学的分析のため、組織試料（下記）を先ずメチルカルノア固定液（60％メタノール、30％クロロホルム及び10％氷酢酸）に２〜４時間付した。次いでそれらを脱水し、清澄化して最短時間55〜56℃にてParaplast X-traワックスにて浸透させた。7μmの厚みの切片を、ポリ-L-リジンを被覆したスライド（Sigma）上に集め、載置して脱ロウした。次に、内在性のペルオキシダーゼ活性を不活性化するために、H2O2の0.03％水溶液を含むメタノールで３０分間処置を行った。再度水和した後、切片をTris緩衝性の生理食塩水（TBS：10mM Tris、pH7.6及び140mM NaCl）に１５分間入れた。その時点で、過剰のTBSを除去するためにペーパータオルで切片を吸い取り、そして湿潤チャンバーにて１０分間、3％正常ヤギ血清を含むTBSでブロッキングした。次に、過剰の緩衝液を排出し、そして一次抗体を付した。アフィニティー精製された抗Cyr61抗体を、3％の正常ヤギ血清−TBS溶液で1：50に希釈した。アフィニティー精製された抗Fisp12抗体についての希釈率は、1：25であった。通常の対照は、3％正常ヤギ血清−TBS、または無関係な抗体（例えば、モノクロナール抗平滑筋細胞α−アクチン）であった。染色の特異性は、切片を付す前の少なくとも２時間、氷上で過剰量の対応する抗原と抗Cyr61または抗Fisp12抗体とのインキュベーションを行うことによって確認した。完璧な競合が観察された。これと対照的に、交差的競合（抗Cyr61抗体とFisp12抗原のインキュベーション、及びその逆）は起こらなかった。
一次抗体を、4℃にて終夜切片上に付しておいた。次いでそれらをTBSで２回洗浄し、そして室温にて二次抗体と３０分間インキュベートした。使用した二次抗体は、Boehringer-Mannheim, Inc.、Indianapolis、インディアナ州より入手した、ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体であった（1：400の希釈率で使用）。切片をTBSで２回洗浄し、そして発色体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ基質を５分間付した（1mg/mlのジアミノベンチジンを含む50mM Tris-HCl、pH7.2及び0.03％H2O2）。次いで、切片をエールリッヒのヘマトキシリンまたはアルシアン（Alcian）ブルーにて対比染色し、Permountに載置した。
発生の神経褶（E8.5）と後期器官形成（E18.5）段階との間のマウス胚を切断して、抗原でアフィニティー精製されたウサギ抗Cyr61及び抗Fisp12抗体での免疫染色に付した。胚発生に伴い様々な器官が発生するにつれてのCyr61及びFisp12の存在を定量した。Cyr61及びFisp12は、数多くの組織及び器官に共に局在化していた。顕著な例は胎盤であり、双方のタンパク質とも容易に検出することができた。特に、Cyr61及びFisp12のいずれも、トロホブラスト巨細胞の中及び周囲に認められ、以前に行われた、in situハイブリダイゼーションによるこれらの細胞におけるcyr61 mRNAの検出（O’Brien及びLau、1992）の確証となるものであった。免疫組織化学的染色において、Cyr61及びFisp12の双方のシグナルは、対応するCyr61またはFisp12抗原のいずれかによって阻止され、相互間で阻止されることはなく、また無関係なタンパク質によって阻止されることもなかったので、特異性が立証された。一般に、Cyr61及びFisp12タンパク質は、細胞内及び細胞外に検出されることができる。
胎盤に加えて、Cyr61及びFisp12のいずれとも、平滑筋、心筋細胞、及び内皮を包含する心血管系にて検出された。双方のタンパク質は、細気管支及び肺の血管にも認められた。低レベルの抗Cyr61及び抗Fisp12染色を、骨格筋にて一過性に検出することができた。この染色は、筋細胞（ミオサイト）よりも結合組織シートに会合しており、この場合に染色パターンは、明瞭に細胞外にあった。
分布のさらに複雑なパターンが、表皮及び内皮にて認められた。Cyr61及びFisp12の双方の染色は、胚表皮の初期の単細胞層で検出されたばかりでなく、後期の多層の分化している表皮にも検出された。表皮におけるFisp12は、妊娠期間の終盤までには検出不能のレベルにまで減衰し、そして成人期を通じてそのままであったが、一方Cyr61は、表皮にて容易に検出することができた。新生児では、Fisp12に対する強い染色が口腔上皮に認められ、ここではCyr61染色は随分弱く、一方Fisp12が観察されなかった上顎骨に、Cyr61が認められた。口腔上皮における抗Fisp12シグナルは、徐々に増加し、そして成人期まで強いままであった。舌では、Cyr61及びFisp12の双方が角化した上皮に認められたが、Fisp12の染色パターンは糸状乳頭を除くものであったのに対し、Cyr61の場合は除くものではなかった。
局在化の前記部位とは別に、Cyr61及びFisp12は様々な器官系にも独自に局在化していた。例えば、Cyr61は骨格系及び神経系に存在していたが、Fisp12は違っていた。in situハイブリダイゼーションの結果（O’brien及びLau、1992）から予測される通りに、Cyr61タンパク質は体節の硬節塊にて、そして発生の後期にある軟骨及び骨において容易に検出することができた。これと対照的に、Fisp12は骨格系に検出することができなかった。軟骨細胞分化との相関はcyr61発現の最も顕著な特徴である（O’brien及びLau、1992）ので、骨格系にFisp12が存在しないことは、Cyr61とFisp12との生物学的な役割における重要な相違を強調することかもしれない。E14.5胚において、Cyr61を腹側脊髄、背側神経節、体軸筋及び硬節由来の軟骨性椎に検出することができる。しかしながら、Fisp12はこららの組織に検出されなかった。
対照的に、Fisp12は様々な分泌組織に独特に存在していた。E16.5に始まり、Fisp12は膵臓、腎臓、及び唾液腺にて検出することができた。膵臓では、Fisp12はランゲルハンス島の末梢に厳密に局在していた。腎臓では、強いFisp12染色が集合管及びヘンレ係蹄（Cyr61が認められない領域）に認められた。粘液型の顎下唾液腺では、集合管のみがFisp12で染色され、一方粘液−漿液性の混合型唾液腺では漿液性腺房及び集合管が染色された。腺房におけるシグナルは末梢にあり、Fisp12が被膜に会合している可能性が考えられた。単純全分泌性脂腺では、無細胞性の強いFisp12シグナルが検出された。
まとめると、Cyr61及びFisp12は、胎盤、心血管系、肺及びヒフに局在している。いずれのタンパク質も消化系または内分泌腺には検出されなかった。Cyr61の独自の局在は、骨格及び中枢神経系に検出することができ、そしてFisp12は、Cyr61が存在しない分泌組織に認められた。
タンパク質発現に密接に関連する問題は、発現されたタンパク質の代謝的運命に関するものである。システイン・リッチなタンパク質ファミリーのメンバーは、局在している。前記のとおり、分泌されたCyr61はECM中及び細胞表面上に認められるが、培地中には認められず（Yang及びLau、1991）、それでも分泌されたFisp12は培地中に容易に検出された（Ryseckら，1991）。Fisp12もまたECMに会合しているか否かの疑問を解決するために、Cyr61及びFisp12の双方の運命を、パルス追跡実験を用いて辿った。血清で刺激された、亜周密なNIH 3T3繊維芽細胞を、１時間代謝的にパルス標識し、冷培地中で様々な時間追跡した。試料は細胞、ECM、及び培地画分へと分画し、次に免疫沈降によってCyr61及びFisp12を検出した。双方のタンパク質は、細胞画分でおよそ３０分という同様の半減期を有しており、これには新しく合成された細胞内タンパク質ばかりでなく細胞表面に会合した分泌タンパク質も含まれている（Yang及びLau、1991）。Cyr61は合成後に定量的に分泌され、そして少量の画分のみがECMに安定に会合するので、分泌されたCyr61の大半は細胞表面に会合している（Yang及びLau、1991）ことは銘記すべきである。
Cyr61の画分をECMについて追跡したが、ここでは数時間の安定を維持していた。Fisp12の大画分を馴化培地へ追跡し、ここではCyr61を検出することはできなかった。馴化培地中のFisp12も、約２時間の半減期を有していた。従って、Cyr61はECMに強く会合している一方で、Fisp12はより一過性にECMに会合している。この結果により、Fisp12はその合成及び分泌部位から離れた部位で作用することができるかもしれないこと、一方Cyr61はより局所的に作用するかもしれないことが示唆される。
多くのECMタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を介して基質と会合しており、タンパク質がヘパリンと結合する親和性は、ECMとのそのタンパク質の相互作用の因子であるかもしれない。ヘパリン結合アッセイの結果を後述するが、これはかかる仮説に合致するものである。
実施例７
タンパク質精製
血清で刺激されたNIH 3T3繊維芽細胞を溶解して、天然のネズミCyr61の供給源が得られた。Yangら。同様に、ヒト繊維芽細胞は天然のヒトCyr61の供給源である。
完全なcyr61をコードする配列を含む、前記の組換えバキュロウイルスベクターを保有しているSf9細胞から組換えのネズミCyr61を精製した。細菌細胞の抽出物の場合のごとく、Sf9細胞溶解液中のネズミCyr61は不溶性の凝集物を形成したが、合成されたおよそ10％のCyr61は、可溶性型にて培地中に分泌された。従って、可溶性の、Cyr61の分泌型を精製に供した。
最初に、単層培養にある亜周密のSf9細胞を、補充Grace培地（GIBCO-BRL,Inc.、Grand Island、ニューヨーク州）にて作製した。Grace、Nature 195巻、788頁（1962）。次いで、Sf9細胞を、10プラーク形成単位/細胞の組換えバキュロウイルスベクターで感染させ、１６時間インキュベートし、そして無血清のGrace培地を供給した。これらの細胞を無血清Grace培地で増やした。感染後４８時間で馴化培地を集めたが、Cyr61発現は感染後２４時間の培地に検出できた。続いて、馴化培地を5000 x gで５分間遠心分離することにより清澄化し、4℃に冷却し、50mM MES、pH6.0、2mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、1mM PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）に調整し、そして4℃にてセファロースSカラム（Sgima Chamical Co.、St Loius、ミズーリ州）に付した（500ml培地に対し、5mlの空隙容量）。カラムを150mMのNaClを含有する緩衝液（50mM MES、pH6.0、2mM EDTA、0.5mM PMSF）で洗浄し、そして結合したタンパク質を同じ緩衝液のNaCl濃度勾配（0.2〜1.0M）で溶出させた。集められたCyr61の画分は、0.6〜0.7MのNaClで明確な広いピークとして溶出された。カラムの画分は、当該技術分野における標準技術を用いて10％SDS-PAGEの後にクマシーブルー染色またはウェスタン分析を行って定量したところ、90％の純度であった。Yangら；Sambrookら、前出も参照された。ウェスタン分析のためには、Yangら、前出に記載されるごとくに、アフィニティー精製された抗Cyr61抗体でブロットをプローブ探針した。抗体でプローブ探針した後、ウェスタンブロットをECL（商標名）（すなわち、増強化学ルミネセンス）検出試薬（Amersham Corp.、Arlington Heights、イリノイ州）で染色した。Cyr61を含む画分を集め、Tris、pH7.5でpH7.5に調整し、そしてアリコートを−70℃で保存する前に10％グリセロールを添加した。タンパク質濃度を、BioRadタンパク質アッセイキット（BioRad Laboratories Inc.、Hercules、カリホルニア州）を用いてLowry法変法で定量した。この精製方法を少なくとも５回繰り返し、同様の結果を得た。典型的な収率は、馴化培地500mlから90％の純度のCyr61タンパク質3〜4mgであった。
Cyr61精製のスキーム（Kireevaら、Experimental Cell Research、印刷中）の変法を用いて、Fisp12を精製した。細胞当たり10pfuで感染させたSf9細胞の無血清馴化培地（500ml）を、感染後４８時間で集め、そして5mlのセファロースS（Sigma Chemical Co.、St. Louis、ミズーリ州）カラムに付した。0.2M及び0.4M NaClで充分に洗浄した後、結合したタンパク質を0.5M NaClを含む50mM MES（pH6.0）で段階的に溶出することによって回収した。80％を越える純度のFisp12を含む画分を集め、0.15MにNaClで調整し、そして0.5mlのセファロースSカラムにて0.6M NaClでタンパク質を溶出し、タンパク質を３〜５倍に濃縮した。
この精製スキームによって、500mlの無血清馴化培地から少なくとも80％の純度の組換えFisp12タンパク質1.5mgを単離することができた。
米国特許第5,408,040号、第７カラム、第１５行から第９カラム、第６３行（引用することにより本明細書に組み込むこととする）に記載されるとおり、CTGFとPDGFとの間の抗PDGF交差反応性を使用し、アフィニティークロマトグラフィーによってCTGFを精製した。
実施例８
ポリペプチドの特徴付け
ネズミCyr61タンパク質は、41,000分子量を有し、そしてN-末端分泌シグナルを含む379アミノ酸の鎖長である。ヒトのタンパク質の381アミノ酸配列と、91％のアミノ酸配列同一性がある。マウス及びヒトタンパク質の両者の類似性に寄与している領域は、２つのポリペプチドが共有し、本明細書に開示されている生物学的活性に関与することが期待されよう。しかしながら、各タンパク質でシステインを欠いている、タンパク質の中心部分において、マウス及びヒトタンパク質は有意に相違している。O’Brienら、Cell Growth & Diff. 3巻、645〜654頁（1992）を参照のこと。ネズミCyr61アミノ酸配列におけるシステインを含まない領域は、アミノ酸残基第164位と第226位との間に認められる（配列番号：２）。対応するシステイン残基を含まない領域は、アミノ酸残基第163位から第229位（配列番号：４）の間のヒトCyr61アミノ酸配列に認められる。さらに詳細には、マウス及びヒトCyr61タンパク質は、Cyr61アミノ酸の第170〜185位と第210〜225位との間で最も相違している。システイン・リッチなタンパク質のECMシグナリング分子ファミリーの他のメンバー、例えば、Fisp12（配列番号：６）及びCTGF（配列番号：８）は、システイン残基を多く含む配列を有する分泌タンパク質を示唆する類似構造を呈している。
ネズミCyr61は、355アミノ酸の分泌タンパク質中に38のシステイン残基を含んでいるので、Cyr61三次構造に対するジスルフィド結合形成の寄与を調べた。Cyr61を10mMジチオスレイトール（DTT）に１６時間曝しても、細胞接着を媒介するCyr61の能力には影響を及ぼさなかった（下記参照）。しかしながら、Cyr61は75℃にて５分間加熱することにより、100mM HClにてインキュベートすることにより、またはキモトリプシンでの充分な消化によって不活性化された。これらの結果は、活性なコンホメーションが還元剤に対しては感応性でない、熱及び酸に不安定なタンパク質であることを示唆するものである。ネズミとヒトCyr61ポリペプチドの前記の構造類似性は、ヒトCyr61もまた熱または酸に感応性であるが還元剤には不応性であるかもしれないことを示唆している。加えて、Cyr61はリン酸化もグリコシル化もされていない。
精製された前記組換えネズミCyr61が、天然のネズミCyr61と同じであるか否かを判明させるために、マウスCyr61のさらなる２つの特徴を調べた。最初に、組換え及び天然のネズミCyr61の２つの別々のタンパク質フィンガープリントを得た。精製された組換えネズミCyr61及び血清で刺激された3T3細胞の溶解液（天然のネズミCyr61を含有することが知られている）を、トリプシンまたはキモトリプシンのいずれかを用いた制限タンパク質分解に付し、その消化産物を比較した。組換えタンパク質及び細胞溶解液の双方の部分的なトリプシン消化の結果、およそ21及び19kDaの２つのCyr61断片が得られた。同様に、部分的なキモトリプシン消化による双方の調製物のフィンガープリンティングによって、組換えネズミCyr61及び天然のネズミCyr61から安定な23kDaの断片が生産された。
組換えCyr61の特性を評価するために使用される他の規準は、下記のごときヘパリンに結合する能力である。精製された組換えネズミCyr61は、0.15M NaClでヘパリン−セファロースに定量的に結合し、そして0.8〜1.0M NaClで溶出された。このヘパリン結合能は、無血清のマウス繊維芽細胞から得られた天然のネズミCyr61に類似している。ネズミ及びヒトCyr61タンパク質の類似性のゆえに、組換えヒトCyr61はネズミポリペプチドについての場合と同様に、天然のヒトCyr61に類似の特徴を組換えヒトCyr61は呈するはずである。
本発明のポリペプチドにはまた、ヒト及びマウスCyr61などの、前記した全長のECMシグナリング分子の断片、類似体、及び誘導体も含まれる。本発明は、前記のような、ECMシグナリング分子の少なくとも１つの生物学的活性を保有するECMシグナリング分子のペプチド断片を企図している。ECMシグナリング分子の少なくとも１つの生物学的活性を保有する断片の候補には、既知のECMシグナリング分子の保存された領域に対応するアミノ酸配列を有する断片が包含される。例えば、ECMシグナリング分子の保存されたシステイン残基の１以上を保有する断片が、少なくとも１つの生物学的活性を保有するECMシグナリング分子断片の候補となりうると考えられる。ECMシグナリング分子断片の天然に存在するアミノ酸配列よりもさらに、本発明のポリペプチドには、天然のECMシグナリング分子のアミノ酸配列または副配列の類似体が包含される。
ECMシグナリング分子類似体は、天然のECMシグナリング分子とはアミノ酸配列が異なるけれども、前記のごとき天然のECMシグナリング分子の少なくとも１つの生物学的活性を保有しているものである。これらの類似体は例えば、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によって、天然のECMシグナリング分子とアミノ酸配列が相違するものでもよい。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特徴（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸に置換することは、当該技術分野において典型的な副次的変更として認識されている。これらの副次的な変更は、当該技術分野にて理解されるごとき、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスを考慮することにより部分的に同定することができる。Kyteら、J.Mol.Biol. 157巻、105〜132頁（1982）。アミノ酸のハイドロパシー・インデックスは、その疎水性及び電荷に基づくものであり、以下の数値を含んでいる。すなわち、アラニン（+1.8）、アルギニン（-4.5）、アスパラギン（-3.5）、アスパラギン酸（-3.5）、システイン／シスチン（+2.5）、グリシン（-0.4）、グルタミン酸（-3.5）、グルタミン（-3.5）、ヒスチジン（-3.2）、イソロイシン（+4.5）、ロイシン（+3.8）、リジン（-3.9）、メチオニン（+1.9）フェニルアラニン（+2.8）、プロリン（-1.6）、セリン（-0.8）、スレオニン（-0.7）、トリプトファン（-0.9）、チロシン（-1.3）、及びバリン（+4.2）。当該技術分野において、類似のハイドロパシー・インデックスを有するアミノ酸を置換して、タンパク質の機能を温存することができることは知られている。好ましくは、±2のハイドロパシー・インデックスを有するアミノ酸が置換される。
アミノ酸の疎水性も、タンパク質の生物学的機能を保有する結果を生じると考えられる置換を明らかにするために使用することができる。ポリペプチドに含まれるアミノ酸の疎水性を考慮することで、そのポリペプチドの局部的平均疎水性の最大値を算出することができ、これは抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な基準である。米国特許第4,554,101号（引用することにより本明細書に組み込むこととする）。共通のアミノ酸の各々に対する疎水性値は、米国特許第4,554,101号に報告されるとおり、アラニン（-0.5）、アルギニン（+3.0）、アスパラギン（+0.2）、アスパラギン酸（+3.0±1）、システイン（-1.0）、グリシン（0）、グルタミン酸（+3.0±1）、グルタミン（+0.2）、ヒスチジン（-0.5）、イソロイシン（-1.8）、ロイシン（-1.8）、リジン（+3.0）、メチオニン（-1.3）フェニルアラニン（-2.5）、プロリン（-0.5±1）、セリン（+0.3）、スレオニン（-0.4）、トリプトファン（-3.4）、チロシン（-2.3）、及びバリン（-1.5）である。当該技術分野で知られているように、類似の疎水性値を有するアミノ酸の置換によって、例えば免疫源性などの生物学的活性を保有しているタンパク質を得ることができる。好ましくは、互いに±2以内の疎水性値を有するアミノ酸との置換が実施される。アミノ酸配列の疎水性インデックス及び疎水性値の双方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察に一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、そのアミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的な類似性（疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特徴によって示されるようなもの）に依存することは理解される。
さらに、水溶性溶媒に接近可能になりやすいアミノ酸配列ドメインを予測することの助けになるように、計算機化アルゴリズムが使用できる。これらのドメインは、タンパク質の外側に向かって配置されることが多く、それにより抗原決定部位を含む結合性決定部位に潜在的に寄与することが当該技術分野で知られている。DNA配列を入手して、当該技術分野で良く知られた（例えば、部位特異的）変異誘発及びその他の技術による方法で、かかる類似体の調製が成し遂げられる。
ECMシグナリング分子の誘導体も、本発明によって企図される。ECMシグナリング分子の誘導体は、一次構造（すなわち、アミノ酸配列）以外に天然のECMシグナリング分子と相違する、タンパク質またはペプチドである。例示すれば、ECMシグナリング分子誘導体は、転写後修飾の１つの型であるグリコシル化を受けることにより、天然のECMシグナリング分子と相違していてもよい。例えば、ポリペプチドは異種系での発現のためにグリコシル化のパターンを呈するかもしれない。これらのペプチドが天然のECMシグナリング分子の少なくとも１つの生物学的活性を保有しているならば、これらポリペプチドは、本発明のECMシグナリング分子誘導体である。他のECMシグナリング分子誘導体には、共有結合により修飾されたN-またはC-末端を有する融合タンパク質、PEG化されたポリペプチド、脂質部分と会合されたポリペプチド、アルキル化されたポリペプチド、他のポリペプチドまたは化学物質に、アミノ酸側鎖官能基を介して結合されたポリペプチド、及び当該技術分野にて理解されるさらに別の修飾などが含まれるが、これらに限定されることはない。加えて、本発明は、後記のごときECMシグナリング分子受容体に結合する、ECMシグナリング分子関連ポリペプチドも企図している。
前記のような本発明の様々なポリペプチドは、独立したポリペプチドまたは、例えば、共有結合により他の化合物に結合せしめられたポリペプチドとして提供されるとよい。例えば、Keyhole Limpet Hemocyaninなどの免疫源担体を、本発明のECMシグナリング分子に結合させてもよい。
実施例９
ヘパリン結合アッセイ
Yangらによって報告された天然のネズミCyr61に対するヘパリン結合アッセイを、精製された組換えネズミタンパク質のために改良した。最初に、精製された組換えCyr61をRIPA（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液（150mM NaCl、1.0％NP-40、0.5％デオキシコール酸、0.1％SDS、50mM Tris-HCl、pH8.0、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル）に懸濁させた。次に、ヘパリンセファロースCL 6Bビーズ（Pharmacia-LKB Biotechnology, Inc.、Piscataway、ニュージャージー州）の50％（容量／容量）スラリー200μlを100μlの組換えCyr61溶液に添加し、そして１時間インキュベートした。これらの条件下に、ヒトCyr61はヘパリン−アガロースに定量的に結合した。RIPA緩衝液での塩濃度勾配の適用の結果、0.8〜1.0MのNaClにて組換えネズミCyr61の溶出が成し遂げられた。組換えタンパク質の溶出プロファイルは、天然のネズミCyr61に対する溶出プロファイルと類似していた。
Fisp12は、Cyr61ほど強くECMと相互作用しないので、Cyr61よりも低い親和性でヘパリンと結合するだとうと考える向きがあるかもしれない。この可能性を調べるために、代謝的に標識された［35S-システイン；100mmディッシュ当たり100μCi、ICN］細胞溶解液をヘパリンアガロースビーズとインキュベートし、これを引き続き洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。結合したタンパク質は、塩濃度を増加させて溶出した。細胞溶解液由来のFisp12は、ヘパリンアガロース上に保持されたが、0.2から0.6M NaClにより溶出され、0.4M NaClに溶出ピークがあった。これは、かなり高濃度のNaClで溶出されたCyr61の場合と対照的である。ヘパリン結合のこのような差異は、ECMに対するCyr61及びFisp12の親和性の相違に一致しており、従って、ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合が、双方のタンパク質がECMに会合する第一義的な機構であるかもしれないことを示唆するものである。
実施例１０
受容体
ヒトCyr61は、ネズミCyr61と同様に細胞表面及びECMに局在していた。細胞表面へのCyr61の局在は、Cyr61に結合する細胞表面受容体に関わっていると考えられる。この関わり合いに一致して、Cyr61の生物学的効果は、αvβ3インテグリン、またはビトロネクチン受容体によって媒介される。αvβ3インテグリンは、他のインテグリンと共同して、細胞骨格接着のための活動中心を提供しているタンパク質クラスターを形成する。Cyr61は、αvβ3インテグリンを含むタンパク質クラスターを含む、タンパク質クラスターの形成を誘導する。加えて、in vitroアッセイを用いて行った結果、Cyr61により誘導される細胞接着及び有糸分裂生起を包含するCyr61の生物学的効果は、２つのモノクロナール抗体−LM609（Cheresh、Proc.Natl.Acad,Sci.［USA］84巻、6471〜6475頁［1987］）またはαvβ3インテグリンに対して作動された抗-VnR 1（Chenら、Blood 86巻、2606〜2615頁［1995］）のうちのいずれか１つを追加することによって損なわれた。このデータにより、Cyr61の受容体としてαvβ3インテグリンが同定されることとなった。
実施例１３に後述するHUVE細胞接着のCyr61誘導によって、HUVE細胞により発現される二価陽イオン感受性細胞表面受容体を調べることが可能となる。Cyr61の細胞接着特性を、二価陽イオン感受性細胞表面受容体である受容体を同定するために使用した。細胞接着を媒介するCyr61の能力は、プロセスにおける二価陽イオンの厳密な要求性と併せて、Cyr61がインテグリン、セレクチン、またはカドヘリンファミリー由来の二価陽イオン依存性細胞接着分子の１つと相互作用することを示唆するものであった。Ruoslahtiら、Exp.Cell Res. 227巻、1〜11頁（1996）。受容体の同定のために良好に特徴付けられたアプローチを用いて、一連の阻害実験を行った。特異性の程度が様々である阻害剤、または阻止剤（EDTA、前記のEGTAと同様；RGDS、SDGR、及びRGDSPKなどのRGD（一文字のアミノ酸コード）インテグリン認識モチーフを有する阻害ペプチド（Ruoslahtiら、Science 238巻、491〜497頁（1987）、Ruoslahti、E.Ann.Rev. of Cell and Dev.Biol. 12巻、698〜715頁（1996））；ならびに既知の特異的抗受容体抗体）を、Cyr61受容体を同定するために用いた。その受容体は、αvβ3インテグリンであり、ビトロネクチン受容体として機能することも知られていた。特異的抗αvβ3インテグリン抗体である抗体LM609が、細胞接着に対するCyr61の効果を阻止できることを示すことによって、その同定の確証が得られた。インテグリンは細胞−細胞間及び細胞−マトリックス間の相互作用に関わり、広範囲のリガンド特異性を有する、ヘテロダイマーの接着受容体の大きなファミリーを形成している。二価陽イオンに対する要求性と細胞マトリックス接着事象における関与［Hynes, R.O. Cell 69巻、11〜25頁（1996）］に加え、インテグリンは細胞移動[Damskyら、Curr.Opin.Cell Biol. 4巻、772〜781頁（1992）；Doreeら、J.biol.chem. 271巻、2443〜447頁（1996）]及び増殖［Julianoら、J.Cell Biol. 120巻、577〜585頁（1993）；Plopperら、Mol.Biol.Cell 6巻、1349〜1365頁（1995）；及びClarkら、Science 268巻、233〜239頁（1995）］の、Cyr61活性に関係する２つのさらなるプロセスにも関わっている。αvβ3インテグリンは、Cyr61によって媒介される細胞接着に必須であることが見出された。
米国特許第5,408,040号、第１１カラム第１０行から、第１２カラム第１４行に引用されているように、（これは、引用することにより本明細書に組み込むこととする）、細胞へのCTGF結合の特徴付けは、PDGF-BB（PDGFのBBイソフォーム）にも相互作用する細胞表面受容体を通じてもなされると報告されている。前記受容体の同定によって、ECM分子の活性を阻害するそれぞれの受容体に結合する分子を設計及び生産することが可能となる。
実施例１１
抗−ECMシグナリング分子抗体
本発明によって、抗体（後述するように、標識または毒素へ任意に接着されるもの）も企図される。ヒトcyr61 cDNA配列及びCyr61推定タンパク質配列の入手可能性によって、当該技術分野で標準の数多くの技術を使用し、抗Cyr61抗体を作製するために設計される方法の履行が容易になる。
一つの実施態様において、Cyr61に対して作製されたポリクローナル抗体が作製される。ヒトCyr61抗体に対して特異的な抗Cyr61抗体の作製は、例えば、適切な抗原を設計することによって至適化される。ヒトCyr61タンパク質は、N-末端分泌シグナルを含めて381アミノ酸の長さである。前記したように、ヒトCyr61はマウスタンパク質の379アミノ酸配列と91％のアミノ酸配列同一性を呈している。しかしながら、マウス及びヒトのタンパク質は、タンパク質の中心部分にて最も著しく相違しており、ここにはシステインが欠落している（前記参照）。これらの配列の相違を利用して、ヒトタンパク質における相違領域の１つに由来する配列を有するペプチドを抗原として使用することにより、ヒトCyr61に対する特異抗体が作製されるが、本発明によれば、保存領域に対して作製される抗体も企図される。
本発明の別の実施態様において、完全な組換えヒトCyr61を使用してモノクロナール抗体が作製されるが、断片を使用してもよい。細菌によって生産されたかまたは真核細胞にて生産された組換えヒトCyr61（5〜50μg）0.25mlと完全フロインドアジュバンド0.25mlの混液を、雌性のBALB/cマウスに腹腔内接種する。１４日後に、完全フロインドアジュバンドに替えて不完全フロインドアジュバンドを用いて、注射を繰り返す。さらに２週間経過した後に、不完全フロインドアジュバンドに含まれるヒトCyr61の注射をさらに行う。第３回目の注射の後、約２週間で、尻尾の採血を行い、放射標識された組換えヒトCyr61を用いて免疫沈降することにより、ヒト抗Cyr61抗体について血清試料をスクリーニングする。最初の注射から約２カ月後に、最高の抗体価を生じる血清のマウスにCyr61の追加免疫注射（不完全フロインドアジュバンドに5〜50μg含有するもの、0.1mlを静脈内及び0.1mlを腹腔内）を施す。追加免疫注射の３日後に、マウスを屠殺する。次いで、脾臓細胞各マウスから標準的な技術を用いて単離し、そして細胞を洗浄して、当該技術分野にて知られている技術によりポリエチレングリコールを用いて個々にミエローマ細胞系、例えば、X63Ag8.653細胞系（Harlowら）と融合させる。脾臓細胞との融合のために好適な他の細胞系は、Harlowら、第144頁、第6.2表に記載されており、これを引用することにより本明細書に組み込むこととする。融合された細胞は、PEG溶液から取り出し、対抗選択培地（例えば、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン、すなわち、HAT培地など）にて希釈して、融合していないミエローマ細胞を死滅させ、そして複数ウェルの組織培養ディッシュへ播種する。
約１〜２週間後に、生育しているハイブリドーマを含むウェルから組織培養上清の試料を取り出し、そしてニトロセルロースに結合された組換えヒトCyr61に結合させて、標識された抗免疫グロブリンを用い標準的な抗体捕獲アッセイにてスクリーニングすることによって、抗Cyr61抗体の存在について試験した。陽性のウェルからの細胞を生育して、脾臓細胞のフィーダー層上で単一細胞をクローニングする。クローニングされた細胞は凍結保存される。モノクローナル抗体を集め、そして例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの標準技術を用いて精製する。別の方法では、抗原として用いたCyr61ペプチドを、キーホールリンペットヘモシニアン担体タンパク質などの免疫源性担体に接着させ、モノクローナル抗Cyr61抗体を作製してもよい。
他の実施態様には、融合タンパク質にて有用なエピトープを呈するに足るタンパク質配列を包含する、ヒトCyr61の一部またはすべてを含む融合タンパク質に対する抗体産物の製造が包含される。ネズミCyr61とアントラニル酸シンターゼの大サブユニット（すなわち、TrpE）の融合体、ネズミCyr61とグルタチオンS-トランスフェラーゼ（すなわち、GST）の融合体が、ネズミCyr61に対する抗体を誘発するために成功裡に用いられている。Yangら。加えて、当該技術分野にてよく知られている、広範囲にわたるポリペプチドを、本発明のCyr61融合ポリペプチドの形成に使用してもよい。
さらに詳細には、Yangが、pATH1ベクターのSacI部位へとヌクレオチド第456位からヌクレオチド第951位（Cyr61アミノ酸第93〜379位をコードしている）までを含むネズミcyr61 cDNAの断片をクローニングすることにより組換えクローンから発現された、TrpE-Cyr61融合ポリペプチドを報告した。Dieckmanら、J.Biol.Chem. 260巻、1513〜1520頁（1985）。組換え構築体を細菌宿主、例えば、大腸菌K12へと形質転換し、そして生育培地に25μg/mlのインドールアクリル酸を添加することによって、融合タンパク質の発現を誘導した。続いて細胞を溶解し、そして7.5％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により総細胞溶解液を分画した。予測されるサイズの融合タンパク質は、インドールアクリル酸により誘導される唯一のバンドであり、そのバンドをゲルから溶出し、当該技術分野において標準的な技術を用いてニュージーランド白色ウサギ（Langshaw Farms）に免疫付与するための抗原として使用した。Harlowら。ポリクローナル抗体に加えて、本発明はかかる融合タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体も企図するものである。
本発明の他の実施態様において、組換え抗体産物が使用される。例えば、キメラ抗体産物、「ヒト化」抗体産物、及びCDR移植抗体産物などが、本発明の範囲に含まれる。Kashmiriら、Hybridoma 14巻、461〜473頁（1995）（引用することにより本明細書に組み入れることとする）。本発明によりさらに企図されるのは抗体断片である。抗体産物には、単離された抗体としてまたは標識に接着された抗体として使用される抗体産物に前記の型のものが包含される。標識は、シグナル発生酵素、抗原他の抗体、レクチン、糖質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、毒素、重金属、及び当該技術分野にて知られる他の化合物が可能であり、接着技術も当該技術分野にてよく知られたものである。
抗Cyr61抗体は、下記実施例２０で詳細に説明するとおり、血栓症の危険性を診断するのに有用である。加えて、抗Cyr61抗体は、異常なレベルのCyr61がその原因となる、望ましくない凝血を防止または緩和するために設計される治療法で使用される。さらに、本発明の抗体は、当該技術分野でよく知られた技術を用いて、リシンなどの毒素に接着することができる。本発明のこれら抗体産物は、例えば、固形腫瘍の血管新生に関与している細胞などの、Cyr61を発現している細胞に、特異的に標的化した細胞毒素を送達するのに有用である。これらの抗体は、当業者によって理解されると考えられる、担体または賦形剤を含む医薬組成物で、様々な投与経路によって送達される。
Fisp12を特的に認識する抗体も、融合タンパク質を用いて作製されている。抗Fisp12抗体を誘発するために用いられる抗原は、Fisp12の中心部分にグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）が結合されたもの（GST-Fisp12）であり、かかる中心部分には、Cyr61との配列の類似性がないのである（O’Brien及びLau、1992）。Fisp12のアミノ酸第165位から200位をコードするcDNAを含む構築体を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）をコードする配列に融合した。これは、5’BamHI制限酵素部位と3’EcoRI制限酵素部位とに隣り合うfisp12の断片を包含するDNAの断片の合成を成し遂げる、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することによって行われた。5’プライマーは、5’-GGGGATCTGTGACGAGCCCAAGGAC-3’（配列番号：９）の配列を有し、そして3’プライマーは、5’-GGGAATTCGACCAGGCAGTTGGCTCG-3’（配列番号：１０）の配列を有している。Cyr61特異性の抗血清用には、5’プライマー5’-GGGGATCCTGTGATGAAGACAGCATT（配列番号：１１）及び3’プライマー5’-GGGAATTCAACGATGCATTTCTGGCC-3’（配列番号：１２）を使用して、同じようにFisp12との配列の類似性部分を含まないCyr61の中心部分（アミノ酸第163位から第229位）とGSTとを融合した構築体を作製した。これらは、pGEX2Tベクター（Pharmacia-LKB, Inc.）へ正方向にクローニングされ、そのクローンはあ配列決定によって確認された。GST-融合タンパク質を、製造業者の説明書に従ってグルタチオンセファロース 4B（Pharmacia-LKB, Inc.）にて単離し、そしてニュージーランド白色ウサギに免疫付与するために使用した。アフィニティー精製のために、先ずGSTに対して作製された抗体を除去するためのGST-タンパク質アフィニティーカラムに抗血清を通し、次いで、GST-Fisp12またはGST-Cyr61タンパク質アフィニティーカラムに通して、抗Fisp12または抗Cyr61抗体を単離した（Harlowら、1988）。
これらの抗体は、fisp12 mRNAによってin vitroに合成された正しいサイズのFisp12タンパク質産物を免疫沈降させた。抗体は、Fisp12ポリペプチドに対して特異的であって、Cyr61との交差反応性はしめされていない。
CTGFを認識するポリクローナル抗体も知られている。米国特許第5,408,040号、第７カラム、第４１行から第９カラム、第６３行（引用することによりこれまでに本明細書に組み入れた）には、前記のとおり、PDGFとCTGFとの間の免疫学的交差反応性が明らかになっている。
実施例１２
阻害ペプチド
本発明のさらなる実施態様には、Cyr61タンパク質の活性を阻害するために設計される療法的ストラテジーにおける、阻害ペプチドの使用が包含されている。１つのアプローチは、Cyr61のタンパク質配列に基づき阻害ペプチドを合成することである。例えば、ネズミCyr61（配列番号：２）とヒトCyr61（配列番号：４）との間で保存されているアミノ酸配列を含むペプチドが、天然のCyr61とその結合部位について競合する。この競合は、それにより天然のCyr61の作用を阻害する。例えば、よく知られた経路によって阻害ペプチドを投与することで、Cyr61が血液凝固、腫瘍の脈管形成、または眼の異常な脈管形成（例えば、網膜または硝子体液の脈管形成により特徴付けられる障害）等を結果的に生じる事象のカスケードに影響を及ぼす能力を阻害する。特に、阻害ペプチドは後述するように組織因子経路阻害剤、すなわち、TFPIの作用をCyr61が阻害することを妨げる。
本発明の一実施態様において、阻害ペプチドがCyr61と競合するように設計された。阻害ペプチドは、前記実施例の抗体と同様に、本明細書に開示されるCyr61活性のための様々なアッセイの概略に記載されるような、Cyr61活性のモジュレーターを例証するものである。ペプチドの設計は、ネズミCyr61、Fisp12、及びNov（トリのプロト・オンコジン）の間の配列の比較によって指南された。このファミリーのいくつかのメンバーのアミノ酸配列を、図１に比較する。これらのタイプの配列比較によって、様々な阻害ペプチドの合理的な設計のための基礎が提供される。これら設計されたペプチドのいくつか、例えば配列番号：２のアミノ酸第48〜68位（配列番号：１３）、第115〜135位（配列番号：１４）、第227〜250位（配列番号：１５）、第245〜270位（配列番号：１６）及び第310〜330位（配列番号：１７）にわたるペプチドが合成されている。ネズミCyr61アミノ酸配列とヒトCyr61アミノ酸配列との比較によって、ヒトタンパク質由来の類似のドメインがヒトCyr61を阻害するペプチドの設計に使用されうることが明らかになる。加えて、配列の比較にはヒトCyr61アミノ酸配列にかかるものであってよく、Fisp12や、やはりこのタンパク質ファミリーのメンバーとして同定されている結合組織増殖因子のなどのヒト相同体にかかる比較でもよい。O’Brienら（1992）。
阻害ペプチドは、例えばFisp12またはCTGFなどの他のECMシグナリング分子と、それらに対応する受容体との結合について競合するように設計されてもよい。阻害ペプチドの設計はECMシグナリング分子間のアミノ酸配列における類似性によって容易ならしめられる。加えて、阻害ペプチドの設計は、機能性ドメインを含むらしいと考えられるアミノ酸配列（例えば、外側／表面タンパク質ドメインとしての疎水性アミノ酸配列；膜貫通ドメインとしてのα−ヘリックス形成に適合する配列）を同定するために当該技術分野にて知られている一以上の方法によって指南されうる。これらの方法は、当業者に知られた市販のソフトウェアの形式で履行されている。例えば、Intelligenetics Suite of Analytical Programs for Biomolecules. Intelligenetics, Inc., Mountain View、カリホルニア州を参照されたい。これらのアプローチを使用して、Cyr61、Fisp12またはCTGFなどのECMシグナリング分子の生物学的活性を干渉する阻害ペプチドを設計してもよい。阻害ペプチドのアミノ酸配列の設計と共に、かかるペプチドの生産も、組換え生産及び化学合成（これらに限定されない）を包含する様々な周知の技術によって実現されうる。Cyr61の少なくとも１つの生物学的活性を特異的に阻害することが示されている、例として挙げられるペプチドには、実施例１０に前記したような、「RGD」モチーフ、または「RGDS」、「RGDSPK」、「GDR」、もしくは「SDGR」などの変異モチーフ（Ruoslahtiら、Science 238巻、491〜497頁（1987）、Ruoslahti、E.Ann.Rev. of Cell and Dev.Biol. 12巻、698〜715頁（1996））を呈するペプチドが包含される。
実施例１３
細胞接着
本発明の別の実施態様は、細胞外マトリックスへの細胞接着を媒介するCyr61の使用に関するものである。細胞接着の誘導は、ネズミCyr61、フィブロネクチン、及びウシ血清アルブミン（BSA）を使用して調べられた。免疫学用96ウェルプレート（Falcon製）を、0〜30μg/mlの濃度のネズミCyr61またはフィブロネクチンの存在下に、4℃にて0.1％BSAを含む50μlのPBSで被覆した。かかる被覆用緩衝液に２時間曝した後、希釈していない免疫抗血清もしくは免疫前抗血清（30μg/ウェル）、またはアフィニティー精製された抗Cyr61抗体を添加した。いくつかのウェルについては、被覆用緩衝液は10mM DTTまたは100mM HClに調整された。１６時間インキュベートした後、被覆用溶液を除き、ウェルの表面を室温にて１時間、1％BSAを含むリン酸緩衝性生理食塩水（PBS）でブロッキングした。Hamの完全F12K培地［GIBCO-BRL, Inc.；Ham、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）53巻、786頁（1965）］中に5 x 103〜104細胞／ウェルでHUVE細胞を播種した。播種直前にシクロヘキシミドを100μg/mlとなるように添加し、そして播種の１４時間前にモネンシン（monensin）を1μMとなるように添加した。37℃にて２時間インキュベートした後、PBSでウェルを洗浄し、付着した細胞を固定化してメチレンブルーで染色した。接着効率は、定量的な染料の抽出と、650nmにおける抽出物の吸光度の測定によって定量した。Oliverら、J.Cell.Sci. 92巻、513〜518頁（1989）。
HUVE細胞は、BSAのみで処置したディッシュにはあまり接着しなかったが、フィブロネクチンで被覆したウェルには良好に接着した。ネズミCyr61が被覆された表面も、フィブロネクチンと同様に用量依存的にHUVE細胞を支持した。例えば、1μg/mlで、Cyr61及びフィブロネクチンでは0.1のA650値が得られた。0.5のA650値は、6 x 103細胞数の接着に対応していた。試験を行った濃度範囲のもう一方の終端値である30μg/mlでは、Cyr61によれば0.8のA650値が得られ、フィブロネクチンによれば0.9のA650値得られた。Cyr61はさらに、NIH 3T3細胞の接着も促進したが、これはフィブロネクチンよりも効果が小さかった。Cyr61によって媒介される細胞接着は、光学顕微鏡で可視化すると、播種後３０分程度の速さで観察することができる。
ネズミCyr61が被覆された表面上へのHUVE細胞の接着は、抗Cyr61抗血清及びアフィニティー精製された抗Cyr61抗体によって特異的に阻害されたが、免疫前の血清によって阻害されることはなかった。これに対し、フィブロネクチンが被覆されたディッシュの接着は、抗Cyr61抗血清またはアフィニティー精製された抗Cyr61抗体のいずれによっても影響を受けなかった。これらの結果より、細胞接着の増強は、Cyr61タンパク質の特異的な活性であることが示される。さらに、Cyr61によって媒介される細胞接着は、シクロヘキシミドまたはモネンシン処置に対しては不応性であり、ECM成分のde novo合成、フィブロネクチンの刺激、またはコラーゲン分泌を誘導することによって作用するのではないことを示唆している。また、そのデータによって、接着に効果を及ぼすうえでの、細胞に対するCyr61の直接的な作用が示されている。HUVE細胞のCyr61によって媒介される接着は、EGTAの存在によって完全に廃されたのであるが、この接着は、CaCl2またはMgSO4のいずれかを培地に添加することによって回復した。これらの結果から、Cyr61とその細胞表面受容体との間の相互作用は、二価陽イオンを必要とすることが示され、これは前記実施例１０にて述べたCyr61受容体としてのαvβ3インテグリンの同定を導いた観察と一致していた。
Cyr61が細胞接着を促進する能力、及びそのプロセスを抗Cyr61抗体などの分子が阻害する能力は、細胞接着のモジュレーターに対するアッセイに活用される。そのアッセイには、例えばCyr61及び細胞接着のモジュレーター推定物で被覆されたプラスチック組織培養ウェルなどの表面への細胞接着を比較することが包含される。対照として、同様の表面をCyr61のみで被覆する好適な細胞と接触させた後に、表面に接着している細胞数を測定する。Cyr61で被覆された表面への細胞接着のレベルに対する、モジュレーター推定物の存在下での細胞接着の相対的な増加によって、細胞接着の促進剤が同定される。モジュレーター推定物の存在下における細胞接着の相対的な減少により、細胞接着の阻害剤が同定される。
Cyr61受容体の同定によって、Cyr61に対する、迅速で特異的なリガンド−受容体アッセイ（すなわち、インテグリン結合アッセイ）の開発が可能となった。モノクローナル抗体LM609（抗αvβ3）が報告されている。Cheresh、1987。モノクローナル抗体JBS5（抗フィブロネクチン抗体）は、Chemiconより購入した。抗ヒト及び抗ウシビトロネクチン抗血清は、Gibco BRLより購入した。HRP-接合ヤギ抗ウサギ抗体は、KPLより購入した。RGDSPKペプチドはGibco BRLより、RGDS及びSDGRペプチドはAmerican Peptide Companyより購入した。機能性アッセイ用のペプチドは、10mg/mlにてPBSに溶解し、そしてpHをNaOHで7.5〜8.0に調整した。ヒト血漿ビトロネクチンは、Collaborative Biomedical Productsより購入した。
HUVE細胞溶解液からのαvβ3インテグリンの精製は、Pytelaら、Meth.Enzymol.、144巻、475〜489頁（1987）に記載されているとおりに実施した。概略説明すると、108の細胞を、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.5mM PMSF及び100mMオクチルグルコシドを含む1mlのPBS中で溶解させた。溶解液をRGDSPKセファロース（Lam, S.C.-T.、J.Biol.Chem.、267巻、5649〜5655頁（1992）に記載されているとおりに、シアン化臭素で活性化されたセファロースCL 4Bより調製したもの）を含む0.5mlのカラムに４回通した。カラムは、室温にて、10mlの溶解用緩衝液で洗浄し、そして1mM RGDSペプチドを含有する同じ緩衝液2mlで、結合したタンパク質を溶出した。RGDSペプチドを除去するために、1mM CaCl2、1mM MgCl2、5mMオクチルグルコシド及び0.1mM PMSFを含むPBSに対してαvβ3インテグリンを透析し、透析用緩衝液は３回交換した。タンパク質はアリコートとして−70℃に保存した。インテグリンの純度は、非還元条件下でのSDS-PAGEと、その後銀染色を行うことによって判定した、抗CD47抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、このαvβ3インテグリン調製物は、インテグリンに会合したタンパク質をまったく含んでいないことが示された。
インテグリン結合アッセイは、Brooksら、Cell、85巻、683〜693頁（1996）、及びLam, S.C.-T.（1992）における開示に従って行った。96ウェルの免疫学用Pro-Bindプレート（Falcon）のウェル当たり、およそ50ngのインテグリン（総容量50μl）を加え、4℃にて終夜インキュベートした。非特異的な部位は、20ng/mlのBSAを含む同様の緩衝液でブロッキングし、その緩衝液で４回洗浄した。処置後のプレートを、1μg/mlのCyr61または0.1μg/mlのビトロネクチンで３時間室温にてインキュベートした。EDTA（5mM）、RGDSペプチド（0.5mM）及びブロッキング抗体は、タンパク質リガンドの添加前１時間に、固定化されたインテグリンとプレインキュベートするか、または、リガンドと一緒に添加した。LM609腹水の最終的な希釈率は1：200であった。結合したタンパク質は、特異的なポリクローナル抗血清（1mM CaCl2、1mM MgCl2、及び5mg/ml BSAを含むPBSにて、抗Cyr61抗血清は1：500に希釈し、抗ビトロネクチン抗血清は1：1000に希釈した）に次いで二次抗体セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体（同様の緩衝液にて1：20000に希釈）によって、検出した。各インキュベートの後に、1mM CaCl2及び1mM MgCl2を含むPBSで４回濯いだ。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、HRPイムノアッセイキット（Bio-Rad Laboratories）を用いて検出した。発色反応は、室温にて１５〜３０分間展開し、H2SO4の添加によって停止し、そして450nmにおける吸光度を測定した。当業者であれば、例示された酵素に関連する免疫学的アプローチに替わって様々な検出技術を用いられることが理解されるはずである。例えば、放射標識などの他の標識や、蛍光化合物等を、例えば共有的に、Cyr61などの興味の対象となるペプチドを認識する抗体または他の薬剤と結合させることができよう。
インテグリン結合アッセイの結果、ビトロネクチン及びCyr61は、固定化されたインテグリンに結合することが示された。さらに、αvβ3へのCyr61及びビトロネクチンの双方の結合は飽和しうるものであった。飽和に達したときのCyr61の濃度は、飽和に必要とされるビトロネクチンの濃度よりも有意に高かった。この差は、ビトロネクチンに比較してCyr61に対応するαvβ3の親和性がより低いことを反映しているのかもしれず、これは、HUVE細胞が、濃度依存的に、ビトロネクチンに結合し、そしてもっと弱くCyr61に結合することを示す、細胞接着アッセイの結果に一致している（後述）。二価陽イオンの妨害、RGDSペプチドの競合、及びLM609抗体阻害を包含する様々な技術のいずれかを使用してインテグリンのリガンド結合部位をブロッキングすることにより、相互作用の特異性を調べた。αvβ3との双方のタンパク質（Cyr61及びビトロネクチン）の相互作用は、EGTA、RGDSペプチド、及びLM609抗体によって阻害された。αvβ3とのCyr61の相互作用のこれらの特性は、細胞接着アッセイの結果とも一致しており、そしてCyr61へのHUVE細胞の接着はαvβ3インテグリンとのCyr61の直接的な相互作用によって媒介されることが示唆された。
加えて、Cyr61は集中性接着（focal adhesion）、すなわち、細胞骨格の接着のための細胞表面集中（cell surface foci）を誘導する。これらのタンパク質クラスターは、インテグリンファミリー由来の様々な受容体、及び様々なタンパク質キナーゼを包含する複合体である。Cyr61による集中性接着の誘導は、これら細胞表面タンパク質クラスターの特定のメンバーを誘導するCyr61の能力に反映される。例えば、Cyr61は、125kDaのポリペプチドである集中性接着キナーゼ（Focal Adhesion Kinase）、及び集中性接着細胞表面タンパク質複合体に関与することが知られている別の既知タンパク質であるパキシリン（Paxillin）のリン酸化を誘導する。さらに、間接的な免疫蛍光実験によって、集中性接着プラーク内の受容体（前記参照）にCyr61が結合することが示されている。そしてこのプラークは、集中性接着タンパク質複合体に特徴的なものである。集中性接着キナーゼ、パキシリン及びαvβ3インテグリンは、Cyr61によって誘導される集中性接着複合体形成により生産される、集中性接着プラークに共局在する。これらの集中性接着タンパク質複合体は、細胞表面でCyr61に結合し、複合体はまた細胞骨格内部にも接着するのである。従って、ネズミCyr61、及びヒトCyr61（下記参照）は、部分的には接着分子であり、これはCyr61を従来の増殖因子と区別する特徴である。当業者であれば、Cyr61の受容体への結合のモジュレーターをスクリーニングするために、Cyr61と組み合わせてαvβ3インテグリンを用いることができることも、認識するはずである。一実施態様において、インテグリンが、（ａ）Cyr61及び受容体結合のモジュレーター推定物；または（ｂ）Cyr61のみ、のいずれかに固定化及び曝露される。続いて、結合されたCyr61が、例えば、放射性標識、蛍光標識などの当該技術分野にて知られた技術を使用して標識された抗Cyr61抗体によって、または酵素触媒による発色反応を用いて、結合したCyr61を検出する。Cyr61受容体へのCyr61の結合の促進剤は、Cyr61のみによる結合に対して、Cyr61の結合を増強する（そして阻害剤は減少させる）と考えられる。
本発明の別の実施態様において、細胞形態形成に対するネズミCyr61の効果を、細胞伸展アッセイによって評価した。ポリスチレン製ペトリディッシュを、0.1％BSAを含むPBS中、Cyr61またはフィブロネクチンの10μg/ml溶液2mlで被覆し、そして前記のとおりに処置した。第３のプレートは、BSAで処理し、対照として用いた。各ディッシュに、7 x 106細胞を入れ、そして２時間インキュベートした。細胞伸展は、１００倍の倍率で顕微鏡検査によって分析した。その結果、ネズミCyr61はフィブロネクチンとほぼ同様の程度にHUVE細胞の伸展を誘導することが示唆される。ネズミCyr61が被覆された基質上での細胞の効率良い接着及び伸展は、Cyr61がシグナルを導入する細胞表面受容体と相互作用するかもしれず、これにより細胞骨格の転位（rearrangement）及び細胞膜接着（focal contact）が導かれうることを示唆していた。結論として、Cyr61及びCyr61関連ポリペプチドは、細胞接着、例えば、ガン細胞の転移、臓器の修復及び再生、またはプロテーゼ埋設の軟骨細胞コロニー形成（後述）などに伴う細胞接着事象などを制御するのに有用なことが立証されよう。
HUVE細胞の接着及び移動の双方を媒介するマウスCyr61とは対照的に、hCyr61は細胞接着を媒介するがHUVE細胞の伸展を媒介することはないことが見出された。免疫学用プレート（96ウェルProBindアッセイプレート、Falcon）に、0.1％プロテアーゼ不含BSA（Sigma）を含有するリン酸緩衝性生理食塩水（PBS）中にて0.1〜30μg/mlのhCyr61、フィブロネクチン（Gibco BRL）またはビトロネクチン（Gibco BRL）を、4℃で１６時間被覆した。ウェルは1％BSAを含むPBSで室温にて１時間ブロッキングし、そしてPBSで洗浄した。0.02％EDTAを含むPBSを用いてHUVE細胞を採集し、無血清F12培地で２回洗浄して、無血清F12培地に再度懸濁した。いくつかの実験では、5〜10％のfbsを添加した。また、ビトロネクチンが被覆されたプレートを用いた実験では、ウシポリクローナル抗ビトロネクチン抗体（Gibco）を使用して、イムノアフィニティークロマトグラフィーによりfbsから内在性ビトロネクチンを除去した。Norrisら、J.Cell Sci.、95巻、255〜262頁（1990）。細胞は、ウェル当たり104細胞数を播種した。２時間後に、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、メチレンブルーで染色して前記のとおりに定量した。Oliverら、J.Cell Sci.、92巻、513〜518頁（1989）。
無血清の条件下に、hCyr61は細胞接着を媒介したが、HUVE細胞の伸展は媒介しなかった。hCyr61が被覆されたプレートへのHUVE細胞の接着は、培養培地中に血清を包含させることによって増強された。HUVE細胞は、フィブロネクチンについて認められると同様に、血清の存在下にhCyr61上に接着及び伸展した。ヒトCyr61は、高血清（10％）及び低血清（0.5％）の双方の条件下で、用量依存的にHUVE細胞接着を支持した。しかしながら、10％fbsの存在下には、低濃度のhCyr61で接着している細胞の比率の最高値と、接着された細胞の比率は、より高かった。ヒトCyr61は、HUVE細胞接着及び伸展を促進するうえで、ビトロネクチンと協同することも見出された。哺乳動物の血清中に認められる２つの主要な細胞接着タンパク質は、フィブロネクチン及びビトロネクチンであり、これらは「血清伸展因子」としても知られている。概説については、Felding-Habermannら、Curr. Opin. Cell Biol.、5巻、864〜868頁（1993）を参照されたい。組織培養プラスチック上での細胞接着、伸展及び成長は、以下の理由のゆえに、血清中のフィブロネクチンよりむしろビトロネクチンに依存するものであった。すなわち、（１）4℃での「凝血」に起因してfbsのバッチ中のフィブロネクチンがかなり枯渇していること、及び他の血清タンパク質が過剰量存在するもとではフィブロネクチンがプラスチックに効率よく被覆されえないこと、がその理由である。対照的に、ビトロネクチンは同じ条件下にプラスチック表面へ効率よく被覆された。
モックの免疫枯渇をさせたfbsと、抗ウシビトロネクチン抗体で免疫的に枯渇させた血清の存在下、hCyr61が被覆されたプレートへHUVE細胞が接着する能力を比較した。無血清培地またはビトロネクチンの免疫枯渇をさせたfbsを追加した培地の存在下の場合よりも、可溶性ビトロネクチンまたはモックの免疫枯渇をさせたfbsの存在下の方が、HUVE細胞はhCyr61が被覆された表面に有意に良好に接着した。ビトロネクチンの免疫枯渇をさせた血清にビトロネクチン（30μg/ml）を添加すると、細胞接着アッセイで使用された全血清の場合に観察されたと同様のレベルまで、hCyr61が被覆されたプレートにHUVE細胞が接着及び伸展する能力が回復した。さらに、可溶性のビトロネクチンのみでは、10％血清でのレベルと同様の濃度（30μg/ml）で、10％血清の存在下に認められるレベルにまで細胞接着及び伸展のレベルが回復した。従って、ビトロネクチンは、hCyr61が被覆されたプラスチック表面上でのHUVE細胞の接着及び伸展に寄与している必要且つ充分な血清成分である。対照実験によって、ビトロネクチンの効果は、hCYR61の存在下でのプラスチック表面上の優先的な保持に起因するものではないことが示された。
さらに、ビトロネクチンの存在量を増加させた場合でのHUVE細胞の接着及び伸展を調べた。ディッシュを被覆するための溶液は、hCyr61の量を固定し（10μg/ml）、ビトロネクチンの量を増加して（0〜10μg/ml）含有するものであった。その結果、ビトロネクチンとhCyr61との個々の接着能を加えることによって推測されるよりも多くの細胞が、２つのタンパク質で被覆されたプレートに接着することが示された。ビトロネクチン及びhCyr61の存在下での、かかる非相加的な接着の増大は、プラスチック上に吸収されたビトロネクチンの量が高いことに起因するのではなかった。抗ヒトビトロネクチン抗体を用いたELISAアッセイによって、ビトロネクチン／hCyr61の混合物に曝されたプラスチックディッシュに吸収されるビトロネクチンの量は、ビトロネクチンのみの場合より20％以上も越えたりしていないことが示された。この差は、細胞接着において観察された差（異なる実験によって３〜５倍）を説明するには不充分である。加えて、高濃度の純粋なビトロネクチン（10μg/ml）または純粋なhCyr61（10μg/ml）で被覆されたディッシュに接着することが認められたよりも、被覆溶液が希釈されたビトロネクチン（2.5μg/ml）を含む場合に、タンパク質の混合物へより高い比率でHUVE細胞が接着した。かくして、ビトロネクチン及びhCyr61は機能的に協同し、HUVE細胞接着に対して相乗的な効果を奏するものである。
細胞接着に影響するFisp12の能力についても精査した。Fisp12細胞接着アッセイは、本質的に以前報告されたとおりに実施した（Oliverら、1989）。96ウェルの免疫学用プレートを、0.1mg/mlのBSAを含むPBS中で20μg/mlのCyr61、Fisp12またはフィブロネクチン（Gibco BRL）にて4℃で１６時間被覆し、そして10mg/mlのBSAで室温にて１時間ブロッキングした。10％FBS（Hyclone Laboratories, Inc.、Logan、ユタ州）を含むF12K培地中でHUVE細胞をウェル当たり104細胞数播種し、10％FBSを含む最小必須培地（MEM）中で、NIH 3T3繊維芽細胞はウェル当たり3 x 104細胞数播種し、そしてMvlLu細胞はウェル当たり5 x 104細胞数を播種した。１時間インキュベートした後、細胞を固定し、メチレンブルーで染色して前記のとおりに定量した（Oliverら、1989）。細胞伸展は、Cyr61、Fisp12またはフィブロネクチンの20μg/ml溶液2.5mlで被覆された100mmのポリスチレンペトリディッシュ上に播種した細胞について実験した。各ディッシュに107細胞数を播種し、そして播種後９０分で１００倍の倍率での顕微鏡検査により細胞伸展を分析した。
その結果、プラスチックディッシュに被覆された場合、Cyr61だけでなくFisp12も３種の異なる細胞型すなわち、HUVE細胞、NIH 3T3繊維芽細胞、及びミンク肺上皮（MvlLu）細胞の接着を促進した。これらの細胞は、被覆されていないプラスチックディッシュまたはウシ血清アルブミンで被覆されたプラスチックディッシュにはあまり接着しなかったが、フィブロネクチン、Cyr61、またはFisp12のいずれかで被覆されたディッシュには有意に良好な接着を行った。Cyr61またはFisp12のいずれかが細胞接着を媒介する能力は、すべての３つの細胞型についてフィブロネクチンの能力に匹敵するものである。以前にCyr61が細胞接着を媒介する能力が繊維芽細胞及び内皮細胞について検証されたが（Kireevaら、1996）、上記本実験は内皮細胞及び繊維芽細胞に加えて上皮細胞における、Fisp12及びCyr61双方についての細胞接着活性を示すものである。
フィブロネクチン及びCyr61への細胞接着と同様に（Kireevaら、1996）、Fisp12で媒介される細胞接着は培養培地にEDTAが添加されると阻害を受けた。この阻害は、過剰量のMgCl2を添加することによって完全に廃され、従ってFisp12で媒介される細胞接着における二価陽イオンの要求性を示唆していた。細胞接着に加えて、Fisp12は細胞伸展をも促進する。フィブロネクチン、Cyr61、またはFisp12のいずれかで被覆されたディッシュ上にNIH 3T3細胞を播種した場合に、同様の細胞伸展が認められたが、BSAの場合には認められなかった。内皮及び上皮細胞も、フィブロネクチン、Cyr61、またはFisp12上に播種すると、やはり伸展した。
実施例１４
繊維芽細胞の移動
Cyr61はさらに、軟骨細胞、例えば細胞骨格発生に関わる繊維芽細胞にも影響を及ぼす。特に、骨性の骨格の発生及び維持に専ら影響を及ぼす様々な成長関連タンパク質と対照的に、Cyr61は軟骨の発生、及びおそらくは維持に影響を及ぼすものである。改良型Boydenチャンバー（Neuroprobe Inc.、カタログ番号AP48）を使用して、NIH 3T3細胞のネズミCyr61に対する化学走性応答を調べた。精製されたCyr61タンパク質は、ウシ血清アルブミン（BSA、0.2mg/ml）を含有するDMEMにて連続的に希釈され、そしてチャンバーの下方ウェルに添加された。下方のウェルを次いで、コラーゲンで被覆したポリカーボネートフィルター（8μm孔径、Nucleopore Corp.、Pleasanton、カリホルニア州）で覆った。５時間インキュベートした（10％CO2、37℃）後、そのフィルターを取り出し、そして細胞を固定してライト・ギムザ染色（Harleco製剤、EM Diagnostic Systems、Gibbstown、ニュージャージー州）を用いて染色した。次にフィルターの上面の細胞を、組織用スワブで擦掃することによって取り出した。フィルターの下面の、任意に選択した１０の高出力の顕微鏡視野（倍率４００倍）にて検出される、移動細胞の総数を計数することにより、化学走性応答を定量した。各実験について３重の試験を実施し、データの再現性を確実にするために実験を３回繰り返した。
NIH 3T3細胞は、Boydenチャンバーでのアッセイにて化学走性因子としてのCyr61に対して用量依存的に応答した。Cyr61なしでは、高出力視野当たりおよそ4.8の細胞が移動していた。Cyr61の濃度が1.5及び10μg/mlに上昇するに伴い、視野当たりで検出される移動細胞の平均数は、7.5、18.5、及び18.7に上昇した。このように、ネズミCyr61は繊維芽細胞に対する化学誘引剤として作用するのである。Cyr61の化学走性活性に対する至適濃度は、本アッセイでは1〜5μg/mlであり、この濃度範囲は、他のECM分子が有効な化学走性刺激を提供するに有効であるとして報告された範囲に一致している。同様のBoydenチャンバーアッセイを使用して調べた場合、例えば、トロンボスポンジンは、5〜50μg/mlで内皮細胞に対して化学走性効果を奏し（Tarabolettiら、J.Cell Biol. 111巻、765〜772頁（1990））；フィブロネクチンも1〜30μg/mlで化学走性剤として機能する（Carsonsら、Role of fibronectin in Rheumatic Diseases、Fibronectin、［Mosher編、Academic Press 1989］；Carsonsら、Arthritis.Rheum. 28巻、601〜612頁（1985））。ヒトCyr61ポリペプチドは、ネズミCyr61と類似の方法で繊維芽細胞に化学走性を与えるために使用することができる。ヒトCTGFもまた、米国特許第5,408,040号、第７カラム、第６５行から第１１カラム第７行に記載の通り（引用することにより本明細書に組み入れることとする）、NIH 3T3細胞（マウス繊維芽細胞）及びBASM細胞（ウシ大動脈平滑筋細胞）などの非ヒト哺乳類細胞の移動を誘導することが報告されている。
さらに別の実施態様において、軟骨細胞の移動などの細胞移動のモジュレーターのためのアッセイには、細胞移動のモジュレーター推定物とCyr61との組合せをBoydenチャンバーの下方ウェルに添加することが包含される。対照として、Cyr61が他のBoydenチャンバーの下方ウェルに別々に添加される。次いで、相対的な細胞移動が測定される。Cyr61のみに応答した細胞移動に対する、モジュレーター推定物の存在下での細胞移動の増加によって、軟骨細胞移動の促進剤が同定され、そしてモジュレーター推定物の存在下での細胞移動の相対的な減少によって阻害剤が同定される。
実施例１５
内皮細胞の移動−In Vitroアッセイ
in vitro脈管形成の最終産物は、毛細管様チューブの明確なネットワークである。ゲルマトリックス、例えばコラーゲン、フィブリン、またはMatrigelゲル上で培養した場合、内皮細胞は成熟した脈管を形成する前に、先ずマトリックスに侵入しなければならない。（Matrigelは、ラミニン、IV型コラーゲン、ニドゲン／エンタクチン、及びプロテオグリカンヘパリン硫酸、そして付加的な増殖因子を包含する基底膜タンパク質の複合混合物である。Kleinmanら、Biochem. 25巻、312〜318頁（1986）。侵入構造は、最終的に吻合して血管様構造を形成する索（cord）である。ヒト臍静脈内皮細胞の周密単層に対するヒトCyr61の脈管形成効果は、Cyr61の存在下または非存在下での、三次元コラーゲンまたはフィブリンゲル上への細胞の播種によって評価される。HUVE細胞は、かかるゲルに自発的に侵入するのではないが、腫瘍プロモーターなどの物質によって誘導された場合に侵入するのである。
コラーゲンゲルは、先ずＩ型コラーゲン（Collaborative Research, Inc.、Bedford、マサチューセッツ州）を氷酢酸の滅菌した1：1000（容量／容量）希釈液（コラーゲンのグラム数当たり300ml）にて溶解することによって調製した。得られた溶液を滅菌した三重のガーゼに通して濾過し、そして16,000 x gで4℃にて１時間遠心分離を行った。上清を0.1Xイーグル最小必須培地（MEM：GIBCO-BRL, Inc.）に対して透析し、そして4℃で保存した。このコラーゲン溶液のpH及びイオン強度を迅速に上昇させることによって、再構成されたコラーゲン繊維のゲルを調製した。pH及びイオン強度の調整は、滅菌フラスコ内で、冷コラーゲン溶液７容量を１容量の10X MEM及び２容量の重炭酸ナトリウム（11.76mg/ml）と素早く混合することによって成し遂げた。速やかなゲル化を防ぐために溶液は氷上に保存した。冷却した混合液を18mmの組織培養ウェルに分配し、そして37℃で１０分間ゲル化させた。
フィブリンゲルは、フィブリノーゲン（Sigma Chemical Co.、St. Louis、ミズーリ州）を使用直前にカルシウム不含のMEMに、2.5mgタンパク質/mlの最終濃度となるように溶解することによって調製した。プラスチックチューブにて、1.35mlのフィブリノーゲン溶液を、25U/mlのトロンビン（Sigma Chemical Co.）を含有する10X MEMの15μlと速やかに混合することによって、凝固を開始した。混合物を直ちに18mmの組織培養ウェルに移し、そして37℃で約２分間ゲル化させた。
あるウェルでは、ゲル化の前にCyr61をゲルマトリックス内へと混合し（最終濃度10μg/ml）、また他のウェルでは、ゲルマトリックス内にCyr61を入れずに細胞が周密に達した後に培養液の一部として添加した（マトリックス内におけると同様の濃度範囲）。HUVE細胞は、10％胎児ウシ血清、100μg/mlヘパリン、及び30μg/ml内皮細胞増殖因子を含有する、ハムF12K培地［GIBCO-BRL, Inc.］中、ウェル当たり5 x 104細胞でゲルマトリックスの表面に播種した。細胞が周密に達したら培地を除き、PBSで細胞を濯いで、内皮細胞増殖因子を含まない新鮮な培地を供給した。ある培養液には精製された組換えCyr61を添加し、他のものにはCyr61及びポリクローナル抗Cyr61抗体を添加した。かくして、周密状態の様々な培養物には以下のものが包含されていた。すなわち、ａ）Cyr61を含まない培養物；ｂ）マトリックス内にCyr61を含む培養物；ｃ）培地に追加したCyr61を含む培養物；及びｄ）ポリクローナル抗Cyr61抗体と共に、培地に追加したCyr61を含む培養物。
ゲルマトリックスの侵入は、周密な培養物の処置後約４〜７日で定量した。各ウェル内の任意に選択された計量用の1.0mm x 1.4mmの視野を、位相差鏡検下にZeiss Axiovert倒立顕微鏡写真機で写真撮影した。単層表面の下の単一レベルにて写真を撮った。侵入は、単層表面の下に貫入した全ての細胞の総索長を測定することによって定量した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の各々による、少なくとも３つの任意に選択された視野について、１つの視野当たりの平均の長さ（ミクロン）として表した。
毛細血管様チューブについて、マトリックス内の索のネットワークを調べるために、2.5％グルタルアルデヒド及び1％タンニン酸を含む100mMカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.4を用い、培養物をin situにて終夜固定した。次に、100mMカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.4を用いて培養物を充分に洗浄した。ゲルを2mm x 2mmの断片に切断し、1％四酸化オスミウムを含むベロナール酢酸緩衝液中で（組織の膨潤を最小限にするため；Hayat、Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications 1巻、38頁[Litton Educational Publishing, Inc. 1970]を参照のこと）４５分間後固定し、0.5％酢酸ウラニルを含むベロナール緩衝液で４５分間、一括して染色し、段階的な一連のエタノールに曝すことによって脱水して平押し金型内のEponに埋設した。培養面に対して垂直に、中程度の薄さの切片を超ミクロトームで細切し、1％トルイジンブルーで染色して、Axiophot顕微鏡写真機（Zeiss）を用いて透過光の下に写真撮影した。
さらに別の実施態様において、脈管形成のモジュレーター推定物をCyr61と組合せ、その組合せをゲルの形成前または形成後に添加する。この実施態様においては、Cyr61のみを使用することにより対照が確立される。次いで、モジュレーター推定物及びCyr61に応答した細胞の移動を、Cyr61のみに応答した細胞の移動と比較する。促進剤または陽性のエフェクターは、細胞移動を増加させるはずであり、一方阻害剤または陰性のエフェクターは細胞の移動を減少させるはずである。
脈管形成活性に対する別のin vitroのアッセイにおいて、内皮細胞移動についてのアッセイを開発した。この化学走性アッセイにより、ng/mlのオーダーのCyr61濃度の効果が検出されることが示されている。初代ヒト微少血管内皮細胞（HMVEC PO51；Clonetics、San Diego、カリホルニア州）を、10％供与（donor）ウシ血清（Flow Laboratories、McLean、バージニア州）及び100μg/ml内皮細胞マイトジェン（Biomedical Technologies Inc.、Stoughton、マサチューセッツ州）を含むDMEM中で継代した。細胞は第１０代と第１５代の間で使用した。移動を測定するために、0.1％BSAを含有するDME中で細胞を飢餓状態にし、採集して0.1％BSAを含むDMEに再懸濁し、そして反転させた改良型Boydenチャンバーにおいて、ゼラチン化された0.5μmフィルター（Nucleopore Corporation、Pleasanton、カリホルニア州）の下面上に、ウェル当たり1.75 x 104細胞数で播種した。37℃で１〜２時間後（その間細胞のフィルターへの接着を許容した）に、チャンバーを正常な配置に戻した。別のチャンバーの頂部のウェルに、塩基性繊維芽細胞増殖因子（陽性の対照）、Cyr61、または陰性対照の溶液（化学誘引剤が含まれていないことが知られている馴化培地またはBSAを含むDME、下記参照）を、10ng/mlから10μg/mlの範囲の濃度で添加した。次に、移動を許容するべく37℃にて３〜４時間チャンバーをインキュベートした。チャンバーを分解し、膜を固定及び染色して、フィルター上部に移動していた細胞の数を３箇所の高出力視野で測定した。Tolsmaら、J.Cell Biol. 122巻、497〜511頁（1993）（参照することにより本明細書に組み入れることとする）及びそれに引用されている参考文献。0.1％BSAを含むDMEを陰性の対照として用い、そしてbFGF（10ng/ml）または血管由来のハムスター細胞系（20μg/ml総タンパク質）からの馴化培地を陽性の対照として用いた。Rastinejadら、Cell 56巻、345〜355頁（1989）。単一の実験において、各試料を四重に（Cyr61などの被験化合物、陽性対照、陰性対照としての馴化培地、及び陰性対照としてのBSAを含むDME）試験し、実験は少なくとも２回繰り返した。
異なる日に実施した実験の比較を許容するために、移動のデータは、BSAを含むDMEの存在下で観察されたバックグランドの移動を差し引いて計算した後の、陽性対照に対する移動の最高値の百分率として報告される。内皮細胞の無作為な動きを抑制する被験化合物は、移動の百分率について負の数値を示した。非常に高い濃度のトロンボスポンジン（TSP）は、内皮細胞に膜からの剥離を引き起こした。剥離は、膜の下面の上の細胞数を計数することによって検出した。細胞の喪失が10％を越える場合には、この喪失に対応して移動細胞の数を修正した。これらの結果から、0.01〜10μg/mlのbFGFは３つの高出力顕微鏡視野当たり、一定して92の細胞数の移動を誘導したことが示される。Cyr61の存在下での移動は、濃度への依存性がもっと高いことが明らかになった。10ng/mlでは、Cyr61は、鏡検を行った３つの高出力視野当たり、平均64の細胞数の移動を誘導していた。100ng/mlのCyr61では３つの視野におよそ72の細胞数が認められ、1μg/mlのCyr61では最高87の細胞数が移動しており、およそ7μg/mlのCyr61では約61の細胞数が観察され、そして10μg/mlのCyr61では、およそ57の細胞数が移動していることが認められた。陰性の対照によって、３つの高出力顕微鏡視野当たり、定常の基底レベルとして53の細胞数の内皮細胞の移動が明らかになった。これらの結果に加えて、下記のようにin vitroアッセイによる結果とin vivoの角膜アッセイによる結果との間に完全な相関が存在する。
毒性を監査するために、移動アッセイにて使用したと同じ条件にある濃度範囲の被験化合物をそれぞれ用いて内皮細胞を処置した。次いで細胞をトリパンブルーで染色しトリパンブルーで染色されない細胞数を計数した。その結果、細胞は生存したままであり、移動の阻害は毒性に起因するのではありえないことが示された。場合によって、内皮細胞には、移動アッセイに使用する前に0.1％BSAを含むDME中、20μMにて３６〜４８時間、ペプチドで前処置を施した。毒性も、３回以上のフレームについて試験を行い、無視しうることが見出された。
Cyr61が、HUVE細胞によるマトリックス侵入及び索形成を誘導する能力は、ヒト微少血管内皮細胞の移動を誘導する能力と共に、このタンパク質の脈管形成特性を例証するものである。Fisp12及びCTGFなどの、システイン・リッチなタンパク質のECMシグナリング分子ファミリーの他のメンバーが、脈管形成条件をスクリーニングするため及びモジュレートするための本発明の方法に使用されうる、前記に類似した特性を有していることが予想される。特に、当業者にあっては脈管形成阻害剤に対するin vitroのアッセイは、阻害剤候補物存在下及び非存在下での、有効量のCyr61の使用を包含する、前記のこときアッセイにかかるものであることが理解されよう。
実施例１６
内皮細胞の移動−脈管形成阻害剤に対するIn Vitroアッセイ
上記実施例にて記載したin vitro移動（すなわち、化学走性）アッセイでCyr61などのECMシグナリング分子を有効量用いることによって、ECMシグナリング分子及び脈管形成の阻害剤を検出するために設計されるアッセイが提供される。固形腫瘍の生育及び転移などのプロセスにおける血管新生の役割が重大であるため、これらのプロセスに拮抗しうる化合物を検出するためのアッセイの開発は有用であろう。
前記したin vitro移動アッセイを、ECMシグナリング分子のCyr61を包含するように適用した。Cyr61は、力価の実験で至適用量であることが認められた1μg/mlで用いた。上記実施例におけるとおり、ヒト微少血管内皮細胞（Clonetics）を使用した。一つのアッセイのシリーズでは、種々の糖質及び糖質誘導体を分析した。これらの化合物には、10mMマンノース、10mMマンノース-6-ホスフェート、及び10mMガラクトースが含まれていた。これらのアッセイの結果、Cyr61にマンノースを加えると３つの高出力顕微鏡視野（前記参照）の組につきおよそ73の細胞数が認められることが示された。Cyr61のガラクトースを加えると、３つの高出力視野の組につきおよそ74の細胞数の移動が誘導された。しかしながら、Cyr61にマンノース-6-ホスフェートを加えた場合、実験を行った３つの高出力視野の組それぞれにつき、およそ２の移動細胞数が認められた。対照実験から、マンノース-6-ホスフェートによるCyr61活性の阻害は特異的であることが立証されている。
塩基性FGF（10ng/ml）の脈管形成活性についても、前記の通りにマンノース-6-ホスフェートの存在下及び非存在下に調べた。10mMマンノース-6-ホスフェートの存在下、bFGFは３つの高出力視野の組につき51の細胞数の移動を誘導した。非存在下にあっては、bFGFはおよそ52細胞数の移動を誘導した。しかしながら、Cyr61またはインシュリン増殖因子II（IGF-II）のいずれかについて調べた場合、マンノース-6-ホスフェートは、それぞれおよそ48または47細胞数から、それぞれおよそ12または11細胞数にまで移動細胞の数を減少させた。マンノース-6-ホスフェートは共通の受容体（IGF II受容体）に対してIGF IIと競合することが知られているので、IGF II活性に対するマンノース-6-ホスフェートのの効果は予測されるものであった。このように、マンノース-6-ホスフェートは、ヒト内皮細胞に対するCyr61の化学走性活性を特異的に阻害する。さらに、後述するようにin vitro移動アッセイとin vivo脈管形成アッセイとの間には本質的に完全な相関があるので、マンノース-6-ホスフェートは本明細書に開示されるアッセイの結果に基づき脈管形成の阻害剤として同定されるものである。従って本発明は、脈管形成を阻害する方法であって、マンノース-6-ホスフェートなどのCyr61の脈管形成活性の阻害剤を投与する工程を含む方法を企図する。前記したようなアッセイは、ガンなどの脈管形成に関わる疾患、及び血管新生を伴う眼の疾患を処置するのに有用でありうる脈管形成の他の阻害剤をスクリーニングするためにも使用することができる。
本発明の一実施態様において、脈管形成のモジュレーターをスクリーニングする方法には、競合的アッセイが包含される。条件の一組には、Cyr61と細胞移動のモジュレーター推定物との配合物に細胞を曝すことが包含される。対照として、細胞をCyr61のみに曝すことによるアッセイが平行して実施される。細胞移動の促進剤は、Cyr61のみ存在の場合の移動の割合に対して、in vitroで細胞移動の割合を上昇させるものであり、Cyr61の化学走性能の阻害剤はその逆である。
実施例１７
内皮細胞の移動−In Vivoアッセイ
内皮細胞移動に対するin vivoアッセイの開発も行っている。概して、アッセイのプロトコルはTolsmaら、1993の開示に一致している。肉芽組織（すなわち、治癒の際の創傷周辺の、新形成された、増殖性の繊維芽ヒフ組織）の形成に伴う脈管形成を評価するために、以前報告されたとおりに（Fajardoら、Lab.Invest. 58巻、718〜724頁（1988））スポンジのインプラントを使用した。先ずスポンジの中心の2mmの直径の核芯を取り出すことによって、ポリビニルアルコールフォーム（foam）ディスク（直径10mm x 厚さ1mm）を調製した。PBSまたは100μMのRGDSペプチド（可能な他の被験化合物としては、Cyr61、RGDSペプチドの断片、マンノース-6-ホスフェートなどの小分子が挙げられる）をスポンジの核芯に添加し、次いでこれを5μlのHydron（Interferon Sciences、New Brunswick、ニュージャージー州）で被覆した。固めた後に、被覆された核芯をスポンジの中心に戻し、次いで両面を5μmのフィルターで覆い、そして接着剤（Millipore Corp.、Bedford、マサチューセッツ州）で適切な場所に固定した。次に、１つの対照ディスク及び１つの被験ディスクを、麻酔をかけたBalb/c雌性マウスの下腹部へ皮下に、肉芽組織がディスクの自由端部外周辺に侵入できるところに埋植した。創傷は、オートクリップで閉止し、動物には屠殺するまで平静状態を維持した。
以前報告されたとおりに（Polveriniら、J.Immunol. 118巻、529〜532頁（1977））、ディスク内の内皮細胞へのin situでのチミジンの取り込みの定量的評価を行った。スポンジのインプラントを、埋植後５、７、１０及び１４日に評価した。屠殺する３０分前に、体重１グラム当たり1μCiのレベルとなるように、［3H］-チミジンを含む生理食塩水（比活性6.7μCi/mM；New England Nuclear/Du Pont、Wilmington、デラウェア州）の溶液をマウスに注射した。スポンジを取り出し、そして周辺全体の均一な切片が得られるように、対面して（facially）埋設した。組織を10％の中性緩衝性ホルマリンにて固定し、段階的な一連のアルコールを用いて脱水し、そしてグリコールメタクリレート（Polysciences、Miles、イリノイ州）中に埋設した。酸で清浄化したスライドガラス上に載置された切片をNTB２型エマルジョン（Eastman Kodak）に浸けることによって、オートラジオグラムを調製した。4℃にて４週間曝露した後、半分の強度のD-19現像剤にてオートラジオグラフを現像し、Kodak Rapid Fixerにて固定し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。内皮細胞の標識の定量は、油浸漬（x1,000）のもとに直線スキャンニングによって、スポンジの外周から中心にに向かって伸延する毛細血管及び小静脈に並ぶすべての内皮細胞を計数することによって実施した。合計500〜700の内皮細胞が、PBS、TSP、またはペプチド断片（すなわち、トロンボスポンジン断片）のいずれかを含む２つのスポンジの各々で計数された。核のまわりに５以上の粒子（grain）が検出されていれば、細胞が標識されていると考えた。標識された細胞の百分率を計算し、そして対照及び実験のスポンジに由来するデータのカイ２乗検定を実施した。
前記アッセイの結果、トロンボスポンジン断片が脈管形成のプロセスを阻害できることが確立された。さらに一般的には、当業者であれば本発明の範囲が、細胞移動を誘導するCyr61の化学走性能などのECMシグナリング分子活性の、モジュレーター推定物に対するこのようなin vivoアッセイにも及ぶことを理解するはずである。本発明の他のアッセイとしての比較アッセイには、Cyr61活性のモジュレーター推定物の存在下または非存在下にCyr61を搭載したスポンジに、in vivoで細胞を曝すことが包含される。埋植し、インキュベーションし、そして取り出した後に、細胞移動の相対的な割合を定量する。Cyr61活性の促進剤は、Cyr61のみによって誘導される細胞移動に対する細胞移動の割合を増加させるものであり、阻害剤は、Cyr61のみに起因するレベルに対して細胞移動の割合を減少させるものである。
実施例１８
マイトジェン強化
本発明の他の特徴において、ネズミCyr61は繊維芽細胞及び内皮細胞に対する増殖因子のマイトジェン効果を増強した。NIH 3T3繊維芽細胞またはHUVE細胞を飽和していない用量の塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）または血小板由来増殖因子（PDGF-BB）のいずれかで処置た場合に、ネズミCyr61の添加によって、増殖因子のみで処置した細胞に比較して放射標識したチミジンの取り込みが有意に増加していた。チミジンの取り込みアッセイは、細胞がＳ期に入ってDNAを合成している程度を評価することにより、細胞が活発に生育しているか否かを判定するための標準的な技術である。bFGFまたはPDGF-BBで誘導されたチミジンの取り込みのCyr61による増強は、用量依存性であり、いずれの細胞型についても、組換えタンパク質の最低濃度として0.5〜1.0μg/mlを必要とした。Cyr61によるDNA合成の増強は、特異的な抗Cyr61抗血清の添加によって阻害された。
さらに詳細には、NIH 3T3繊維芽細胞を、24ウェルのプレートにウェル当たり3 x 104細胞数で播種し、10％胎児ウシ血清（Intergen Co.、Purchase、ニューヨーク）を含むDMEM中で３〜４日間生育し、そして0.2％FBSを含有する培地で次なる４８時間インキュベートした。次に、以下の化合物を、0.2％fbs及び［3H］-チミジン（1μCi/mlの最終濃度；ICN Biomedicals, Inc.、Costa Mesa、カリホルニア州）を含有する新鮮なDMEM中にて、播種された細胞へ括弧内に示した最終濃度で添加した：bFGF（15ng/ml）、PDGF-BB（30ng/ml）、及びネズミCyr61（0.5〜5μg/ml）。これらの化合物は、以下の様式に従って、個々のプレートに添加した：１）添加なし；２）ネズミCyr61；３）bFGF；４）ネズミCyr61及びbFGF；５）PDGF-BB；ならびに６）ネズミCyr61及びPDGF。１８〜２０時間インキュベートした後に、PBSで細胞を洗浄し、10％トリクロロ酢酸で固定した。0.1N NaOHでDNAを溶解し、チミジンの取り込みを定量した。その結果、増殖因子の非存在下には、トリチウム化されたチミジンの取り込みによって測定されたDNA合成を、ネズミCyr61は刺激しないことが示唆された。添加物を加えない場合に3T3細胞は、Cyr61の存在下または非存在下におよそ1.8 x 104cpmの［3H］-チミジンを取り込んだ。bFGFのみに曝された細胞は、約1.2 x 105cpmを取り込み、bFGF及びネズミCyr61に接触した細胞は、2 x 105cpmを取り込んだ。、PDGF-BBに接触した細胞は、約1.2 x 105cpmを取り込み、そしてPDGF-BB及びネズミCyr61に曝された細胞は、およそ2.4 x 105cpmを取り込んだ。従って、ネズミCyr61はそれ自身はマイトジェンとして機能しなかったが、bFGF及び及びPDGF-BBの２つの既知の増殖因子のマイトジェン活性を強化した。
異なるレベルのbFGFのマイトジェン効果を強化するCyr61の能力について、増殖因子に対する閾値の必要性も明らかになった。ヒト臍静脈内皮細胞は、3T3細胞について前記したと本質的に同様に播種し、一定量のネズミCyr61に曝した。対照にはCyr61を用いなかった。次に、異なるプレートを、0〜10ng/mlの範囲の一連の濃度のbFGFを含む、異なるレベルのbFGFに曝した。［3H］-チミジンの存在下に７２時間培養して生育した後、0〜0.1ng/mlのbFGFに曝された細胞は、Cyr61の存在下または非存在下に、基底レベルのチミジンの取り込み（およそ4 x 102cpm）を呈した。しかしながら、1mg/mlのbFGFでは、HUVE細胞はbFGFの存在下に6 x 102cpmまでチミジンの取り込みを増加させ、1mg/mlのbFGF及びネズミCyr61の存在下では、HUVE細胞は1.3 x 103cpmを取り込んだ。10mg/mlのbFGFでは、bFGFに曝された細胞は、約1.8 x 103cpmのチミジンを取り込み、10mg/mlのbFGF及びCyr61に曝された細胞は、およそ6.1 x 103cpmを取り込んだ。
bFGFのマイトジェン活性を強化するネズミCyr61の能力は、HUVE細胞ならびにbFGF、Cyr61、及び抗Cyr61抗体の様々な組合せを含む、チミジン取り込みアッセイによって立証された。細胞は、前記のとおりに播種及び生育された。次いで、以下の添加物の組合せ（最終播種濃度を括弧内に示す）を、個々のプレートへ添加する前に１時間、プレインキュベートした：１）免疫前抗血清（3％）；２）bFGF（15ng/ml）及び免疫前抗血清（3％）；３）免疫前抗血清（3％）及びCyr61（4μg/ml）；４）免疫前抗血清（3％）、Cyr61（4μg/ml）及びbFGF（15ng/ml）；５）抗Cyr61抗血清（3％）；６）抗Cyr61抗血清及びbFGF（15ng/ml）；７）抗Cyr61抗血清（3％）及びCyr61（4μg/ml）；８）抗Cyr61抗血清（3％）、Cyr61（4μg/ml）及びbFGF（15ng/ml）。
前記のとおりに［3H］-チミジンの存在下でインキュベートした後、免疫前抗血清に曝された細胞は約2 x 102cpmのチミジンを取り込み、免疫前抗血清及びbFGFに接触した細胞は1.3 x 103cpmを取り込み、免疫前抗血清及びCyr61に接触された細胞は1 x 102cpmを取り込み、免疫前抗血清、Cyr61及びbFGFに接触された細胞は3.6 x 103cpmを取り込み、抗Cyr61抗血清に曝された細胞は2 x 102cpmを取り込み、抗Cyr61抗血清及びbFGFに接触された細胞は1.3 x 103cpmを取り込み、抗Cyr61抗血清及びCyr61に接触した細胞は1 x 102cpmを取り込み、そして抗Cyr61抗血清、Cyr61及びbFGFに接触された細胞は1 x 103cpmを取り込んだ。これらの結果、免疫前抗血清は、Cyr61によって誘導されるbFGFマイトジェン活性の強化に対して何らも効果を有していなかったことが示される。しかしながら、抗Cyr61抗血清は、Cyr61によるbFGFの強化を完全に廃した。さらに、抗Cyr61抗血清はbFGF自体のマイトジェン活性に対しては効果を有していなかったので、抗Cyr61抗血清の効果は、Cyr61により誘導されるマイトジェンの強化に特異的なものであった。従って、有用なマイトジェンについてスクリーニングするための試薬としてCyr61を使用することができる。
HUVE細胞及びNIH 3T3繊維芽細胞についてのDNA合成を、以前報告された方法（Kireevaら、Mol.Cell、Biol. 16巻、1326〜1334頁（1996））に若干の変更を加えて、チミジンの取り込みによって測定した。HUVE細胞は、24ウェルプレートにて亜周密状態になるまで生育し、２４時間血清を枯渇させ、そして示したとおりの様々な濃度のCyr61及びFisp12と共に、10％胎児ウシ血清（FBS）、1μCi/mlの［3H］-チミジン及び10ng/mlの塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）（Gibco-BRL, Inc.）を含有するF12K培地で処置した。NIH 3T3細胞は、亜周密にまで生育し、４８時間血清を枯渇させ、そして0.5％FBS、1μCi/mlの［3H］-チミジン、bFGF及び様々な濃度のCyr61またはFisp12を含有する最小必須培地（MEM）で処置した。トリクロロ酢酸不溶性画分へのチミジンの取り込みを、インキュベーションの２４時間後に定量した。対数増殖しているミンク肺の上皮細胞（Mvllu、CCL64）を、様々な濃度のTGF-β1（Gibco-BRL）及び2μg/mlのCyr61またはFisp12で１８時間処理し、次いで［3H］-チミジンを1μCi/mlとなるように２時間添加した。
精製された組換えFisp12タンパク質は、試験を行ったいずれの条件下にもマイトジェン活性をまったく呈しなかった。むしろ、Fisp12はNIH 3T3繊維芽細胞またはHUVE細胞のいずれにおいても、塩基性繊維芽細胞増殖因子によって誘導されるDNA合成を増強することができた。この活性は、Cyr61によって呈された活性とほとんど同様のものであった。
繊維芽細胞及び内皮細胞でCyr61及びFisp12は増殖因子によって誘導されるDNA合成を増強する一方、双方のタンパク質は、増殖因子によって媒介される作用を別の方法にて増強することもできる。TGF-βは内皮細胞でDNA合成を阻害するように作用することが知られている（Satterwhiteら、1994）。Cyr61及びFisp12の双方とも、ミンク肺上皮細胞におけるDNA合成をTGF-βが阻害する能力を増強することが観察された。このデータにより、無血清の供給源より精製された組換えCyr61及びFisp12の双方が、それ自体はマイトジェン活性を有さないが、ポリペプチド増殖因子の作用に共同作用を与える能力を有することが立証される。Cyr61及びFisp12は、FGFによるDNA合成の誘導を増強し、そしてTGF-βによるDNA合成の阻害を増強するのである。
本発明はさらに、真の増殖因子のマイトジェン効果を強化する方法、または真の増殖因子をスクリーニングする方法におけるCTGFの使用も企図している。それらの企図された使用は、既に報告された、マイトジェンまたは増殖因子自体としてのCTGFの使用とは対照をなすものである。米国特許第5,408,040号、第７カラム、第６５行から、第１１カラム、第７行（引用することにより本明細書に組み込むこととする）。
さらに、本発明はマイトジェン強化のモジュレーターをスクリーニングする方法を企図する。比較のアッセイでは、亜周密の細胞をCyr61などのECMシグナリング分子、増殖因子、及びECMシグナリング分子のモジュレーター推定物に曝す。対照として、同様の細胞をECMシグナリング分子及び増殖因子に曝す。さらなる対照では、同様の細胞を増殖因子及びモジュレーター推定物に、ECMシグナリング分子が存在しない状態で曝す。相対的な細胞増殖速度に基づいて（例えば、［3H］-チミジン取り込みなどによって測定）、マイトジェン強化の促進剤（３つの分子すべての存在下に細胞増殖が上昇している場合）またはマイトジェン強化の阻害剤（３つの分子の存在下に細胞増殖が低下している場合）として、モジュレーター推定物の同定を行うことができる。
実施例１９
脈管形成因子及びモジュレーターについての角膜アッセイ
脈管形成のモジュレーターについての他のアッセイは、Cyr61などのECMシグナリング分子関連生物材料の存在下にモジュレーター推定物の脈管形成に対する効果を評価するためのin vivoアッセイたる、角膜アッセイである。角膜アッセイは、角膜に血管がなく、脈管形成因子の存在下に強膜から角膜内へ伸延する毛細血管の検出可能な発生が引き起こされることを利用するものである。Friedlanderら、Science 270巻、1500〜1502頁（1995）。強膜からの新血管の、かかる内方向への伸延は、鏡検によってモニターできる。さらに、目視的に測定される移動速度を、脈管形成速度の変化を評価するために使用することができる。このような角膜アッセイは、広範囲の動物モデルを使用して実施される。好ましくは、ラットを使用して角膜アッセイが実施される。例示目的で、このアッセイを使用する、Cyr61のモジュレーター推定物に対するアッセイを開示する。このアッセイを実施するために、先ずCyr61の有効濃度を調べるために、初代毛細血管内皮細胞を用いてCyr61を滴定する。続いて、モジュレーター推定物の存在下または非存在下に、例えばウサギまたはラットなどの哺乳類実験動物の角膜内に、Cyr61を外科的に埋植する。好ましい実施態様において、当該技術分野における標準的なマトリックス材料及び技術を用いて、Cyr61（または、Cyr61及びモジュレーター推定物）を生体適合性のマトリックスに埋設する。続いて、インプラントを入れた眼を、眼内で容易に目視可能な血管の生育について、目視的に観察する。対照の埋植には、同型のマトリックスの中に埋設された、生理的に平衡化した緩衝液からなるものでよく、Cyr61を含むインプラントを入れたと同型の実験動物の眼に埋植されるとよい。
脈管形成因子についてのin vivo角膜アッセイの開発は、これらの因子についての現存するin vitroアッセイよりも利点を有するものである。脈管形成のプロセスには、４つの異なる位相が含まれている：血管断絶の誘導、内皮細胞移動、内皮細胞増殖、ならびに三次元再構築及び発芽。in vitroアッセイは、これらの段階のわずか２つ、すなわち、内皮細胞の移動及び有糸分裂生起しか評価することができない。かくして、脈管形成因子に対する包括的なアッセイを提供するために、角膜アッセイなどのin vivoアッセイが好ましい。
角膜アッセイは、Cyr61、Fisp12、CTGF、及びNovなどの脈管形成因子の、脈管形成のプロセスに対する効果を確認するために使用される。さらに、これら脈管形成因子のいずれかと、それらの活性のモジュレーター推定物とを包含することにより角膜アッセイを改変することで、脈管形成のモジュレーターに対する角膜アッセイが可能となる。例えば、本発明の一実施態様において、Cyr61などの脈管形成因子の一用量を、Cyr61の脈管形成活性の正の作用物質についての角膜アッセイに用いることができよう。適切なCyr61の用量は、最初に、脈管形成の事象とCyr61の用量依存的相関の滴定によって判定されよう。Cyr61を含まない対照のアッセイも行うことにより、脈管形成に対する直接的な効果を有する化合物が排除されうる。本発明の他の実施態様において、Cyr61などの脈管形成因子の有効な用量を用いて、脈管形成因子の活性の負のモジュレーターについてアッセイすることもできる。さらに別の実施態様において、角膜のインプラントにはCyr61が含まれ、そして他の角膜インプラントにはCyr61及び脈管形成のモジュレーター推定物が含まれる。埋植された角膜における血管の発生を測定することにより、脈管形成の促進剤としてモジュレーター推定物を同定する（モジュレーター推定物を含むインプラントが入れられた角膜における血管発生の上昇）ための基礎が提供される。血管発生の相対的な減少によって、脈管形成の阻害剤が同定される。
角膜アッセイ用の動物モデルとしては、ラットが好ましい。当該技術分野でこれまでに開示されたものに、脈管形成を分析するために充分に検討されたシステムとして、ラットモデルが樹立されている。インプラントの大きさ、タンパク質放出の動力学、及び好適な外科技術などといったパラメータは、充分に検討されている。角膜アッセイにはいかなる系統のラットを使用することもできるが、好ましい系統は、Sprague-Dawley系などの、充分にその特徴が精査された実験動物系のものであろう。
様々な大きさのラットを角膜アッセイに使用することができるが、ラットの場合に好ましい大きさは、１匹150〜200gである。メトキシフルランで麻酔を誘導し、そしてペントバルビタールナトリウム（50mg/kg、腹腔内に投与）を用いて４０〜６０分間維持する。眼を優しく開き、非外傷性の止血鉗子で上瞼を把持することによって定位に固定する。次いで、局所麻酔として作用するように、滅菌済のプロパラカイン塩酸塩（0.5％）を２滴、各々の眼に入れる。No.11 Bard Parkerブレードなどの好適な外科用ブレードを用いて、角膜の中心からおよそ1mmに、およそ1.5mmの切開を加える。切開は、固有質内にまで伸延するが、固有質を通過してはいけない。次に、およそ1.5mmの幅でおよそ5mmの長さの湾曲した虹彩スパーテルを、切開部の傷口の下に挿入し、そして眼の外側眼角の方へ、固有質を通過して穏やかにブラントディセクションを行う。眼球に対してわずかに指の圧力を付すことによって、ディセクション時に眼を安定させることができる。スパーテルは、およそ2.5mm以上には固有質に貫入してはいけない。角膜ポケットができれば、スパーテルを取り出し、そして角膜輪部間の距離及びポケットの基部を測定して、少なくとも約1mmは分離していることを確認する。
角膜への埋植後にタンパク質の緩徐な放出が行われるように、タンパク質をポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート（Hydron）、または同等の薬剤と混合して、およそ5μlのペレットを形成する。このようにして製造されたインプラントは、滅菌済の乳酸加リンゲル溶液１滴を用いて再水和し、前記のとおりに埋植する。埋植の後に、角膜ポケットにエリスロマイシン軟膏で封をする。埋植の後、タンパク質−Hydronペレットは角膜の輪部（角膜−強膜の境界）近傍に留まるべきであり、視覚が有意に損なわれるべきではない。
施術後７日間にわたって毎日、炎症及び応答を確認するために実体顕微鏡を用いて動物の検査を行う。検査を容易ならしめるために、メトキシフルランで動物を麻酔し、検査中ノーズコーンによって継続的に麻酔剤を投与する。かかる７日間のあいだに、埋植位置及び角膜滲出液についても動物を監査する。安楽死の好ましい方法は、瀉血である。動物に先ずペンタバルビタールナトリウム（50mg/kg）で麻酔をかけ、次いで下記のとおりに灌流を行う。
７日後に動物にコロイド状カーボン（例えば、インディア・インク）を用いて環流を行う。麻酔はメトキシフルフランで誘導し、ペンタバルビタールナトリウム（50mg/kg、腹腔内投与）で維持する。各動物を、腹部大動脈を介して、体重150gに対し100〜200mlの温（37℃）乳酸加リンゲル溶液で環流した。動物の口吻が完全に白化したら、頭部及び胸部の器官が完全に黒化するまで、20〜25mlのコロイド状カーボンをリンゲル液と同様に注射する。次いで、眼を摘出して固定する。角膜を切除し、平らにして写真を撮る。
各タンパク質について、典型的には３種の投与量で、当該技術分野の慣習に従って試験を行う。当業者であれば、脈管形成性の応答の同定を支持するためには１投与量当たり６の陽性角膜応答が必要とされることを認識しているはずである。例示的な角膜アッセイには、被検タンパク質の３種の投与量と、各投与量にて試験される６匹のラットの使用が包含される。加えて、６匹の動物が、緩衝液−Hydronのインプラントに曝され、これをもって陰性の対照とする。少なくとも３匹の動物を既知の脈管形成因子−Hydronのインプラントに曝したものが、陽性の対照となされる。最後に、観察された何らかの応答の特異性を例証するために、６匹の動物が、１投与量の被検タンパク質、過剰量の中和抗体、及びHydronを含むインプラントに曝される。
前記のような角膜アッセイを、Cyr61が脈管形成を誘導する能力を評価するために実施した。４匹の動物に、緩衝液−Hydronペレットを含む、陰性の対照となるインプラントを与えた（両眼）。７日後、これらの動物はそれぞれ、何れの眼にも血管の発生を示さなかった。６匹の動物には、片方の眼に生物学的に有効な量（0.15μM）の繊維芽細胞増殖因子を含むインプラントを、そして他方の眼に対照のペレットを入れた。すると、６匹とも、FGFを適用した眼に脈管形成の発生を示し、陰性の対照を適用した眼には血管新生が示されることはなかった。７匹の動物で、片方の眼に1μg/mlのCyr61を入れると、これらの眼の７つすべてで血管の成長が示された。陰性の対照を入れた７つの眼のうち１つが脈管形成の発生を示していた。最後に、４匹の動物に、1μg/mlのCyr61（10μg/mlのCyr61溶液を用いて調製されたHydron）とCyr61に対して３〜４倍過剰量の特異的抗Cyr61抗体を局所的に放出するインプラントを入れると、この群の眼で脈管形成の発生を示したものはなかった。このように、脈管形成についてのin vivoアッセイにより、FGF及びCyr61などの脈管形成因子が同定される。さらにこのアッセイは、Cyr61などのECMシグナリング分子によって誘導される脈管形成の発生の阻害も明らかにすることができる。
実施例２０
血液凝固
ECMシグナリング分子は止血、または異常な血液凝固の是正にも有用である。例えば、cyr61の低レベル発現など、それにより組織因子経路阻害剤（TFPI）がチェックされることなく作用することが許容されてしまうことなどによって引き起こされる血液凝固の不良を、組換えCyr61タンパク質の発現または使用によって是正することができる。
Cyr61は、TFPI（外因性の血液凝固を阻害するタンパク質）と相互作用することができる。TFPIは２工程のプロセスにて血液凝固を阻害する。第１に、TFPIは第Xa因子に結合し、そしてTFPI：Xa複合体は次に組織因子（TF）：第VIIa因子複合体と相互作用して、それにより後者の複合体を阻害する。TF：第VIIa因子複合体は、第IX因子及び第X因子を活性化する複合体である。TF：VIIaを阻害することによって、TFPIは、血液凝固に必要な第IX因子及び第X因子の活性化を妨げることにより凝固を調節する。Cyr61のTFPIとの相互作用によって、TFPIの活性が阻害され、かくして血液凝固が促進される。このように、Cyr61は組織因子のアゴニストである。
Cyr61とTFPIとの相互作用に起因して、TFPIが凝固を阻害する能力をCyr61が制御することができ、それによって止血を調節することができる。Cyr61の欠損により、適切な時期にTFPIを阻害できなくなってしまうことがあり、この結果組織因子の過剰な阻害が起こり、それにより血餅の形成が妨げられる。Cyr61の調節を外れた発現は、逆に、構成的にTFPIの活性を阻害し、しかして組織因子が定常的に活性状態となり、そのために過剰な凝血が引き起こされるであろう。内皮細胞におけるcyr61の発現が調節を外れると、可能性がある結果の一つは血栓症である。
Cyr61に加えて、Fisp12及びCTGFなどの他のECMシグナリング分子が、脈管形成に関与する細胞に対して効果を奏することが示されている。結論として、様々なECMシグナリング分子関連生物材料が、単独または組み合わせて、止血をモジュレートすることを指向した本発明の方法において使用されうることが予期されるものである。
実施例２１
Ex vivo造血幹細胞培養
原初多機能性の幹細胞の成長に対するCyr61の効果を調べるために、造血培養においてこれらの細胞を、より成熟した前駆細胞と区別する様々なアッセイが使用される。これらのアッセイは、未成熟細胞と成熟細胞の下位集合間の物理化学（フィブロネクチン結合）的相違、または生育及び発生に関連する（前駆幼若コロニーの発生）相違を利用するものである。
造血幹細胞（HSC）の供給源として、生育のために馴化培地を必要とする２つの細胞系が使用される。クローン化された、これらの因子依存性ネズミ細胞系は、B6Sut（Greenbergerら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）80巻、2931頁（1983）に記載のごとく、長期の骨髄培養よりクローン化され、そして分化することなく液体培地中で生育することができるが、寒天培養においては多機能性であるもの）及びFDCP-mix（Spooncerら、Nature 310巻、2288頁（1984）に記載のごとく、組換えウイルスsrc-MoMuLVで感染された、長期の骨髄培養細胞よりクローン化され、寒天培養では多機能性であるもの）である。B6Sut細胞は、10％胎児ウシ血清（FCS）及び10％の６倍濃縮WEHI-馴化培地を含むキンケード培地中で増殖する。Greenbergerら。FDCP-mix細胞は、20％ウマ血清及び10％の６倍濃縮WEHI-馴化培地を含むフィッシャー培地中で増殖する。これら細胞系は、37℃にて5％CO2で増殖する。
様々なex vivoまたはin vitro培養物が、外来的に添加されたネズミCyr61またはポリクローナル抗Cyr61抗体の存在下または非存在下に、個体群成長についてアッセイされる。限界希釈条件下で、長期の再占有能（repopulating ability）を有する細胞を同定するために、敷石（cobblestone）領域形成細胞（CAFC）アッセイを用いる。Ploemacherら、Blood、74巻、2755頁（1989）；Ploemacherら、Blood、78巻、2527頁（1991）。CAFCアッセイによって長期の再占有能を有していることが同定された細胞は、次いで３つのパラメータを測定することによって分析される：個体集団倍加速度、分裂指数、及びDNA合成の速度。
Cyr61の添加または非添加のいずれかの長期培養物を、CAFCアッセイで原初HSCのレベルについてアッセイする。van der Sluijsら、Exp.Hematol. 22巻、1236頁（1994）。例えば、M2-10B4間質細胞、B6Sut、及びFDCP-mixなどが、以下にM2-10B4細胞系について記載するような方法で、各々CAFCアッセイに付される。間質細胞層は、5 x 105のM2-10B4間質細胞（骨髄間質からクローニングされた細胞系、Sutherlandら、Blood、78巻、666頁（1991））を、10％FCSを含むDMEMにて96ウェルの培養プレートの各ウェル内に接種することによって調製される。細胞が周密に近づいたら、PBSで濯ぎ、造血を補助する間質の能力に影響を及ぼすことなく、間質内のすべての造血細胞の複製を妨げるように照射（ガンマ線照射20Gy、1.02〜1.04Gy/分）を行う。
造血幹細胞を、Cyr61（最終濃度10μg/ml）の存在下または非存在下に、10％FCSを含むDMEM中で、前記照射された間質細胞に添加する。個体集団倍加速度は、例えば、様々な実験的長期間培養物中に存在する長期再占有細胞（及びさらに成熟した短期前駆細胞）の数を定量するための、細胞形態の顕微鏡観察によって定量する。潜在力を有する長期HSC培養物の増加及び分化能のさらなる研究が、好適な細胞系の候補を確認するために使用される。
当該技術分野における標準法によって、分裂指数が定量される。Keramら、Cencer Genet. Cytogenet. 55巻、235頁（1991）。採集された細胞を、メタノール：酢酸（3：1、容量：容量）にて固定し、計数し、そして固定液中に106細胞数/mlにて再懸濁する。この懸濁液10μlをスライド上に置き、乾燥し、そしてギムザ染色液で処置する。中期にある細胞を光学顕微鏡下に計数し、そしてスライド状の細胞総数で、中期細胞の数を割ることにより分裂指数を算出する。分裂指数の比較の統計的分析は、両側一対ｔ検定を使用して行う。
DNA合成の速度は、チミジン取り込みアッセイを使用して測定される。様々な培養物を、1μCi/mlの［3H］-チミジン（ICN Biomedicals, Inc.、Costa Mesa、カリホルニア州）中で２４〜７２時間増殖させる。採集された細胞をPBSで濯ぎ、そして10％トリクロロ酢酸で固定する。DNAは0.1N Na0Hに溶解し、そしてチミジンの取り込みを、例えば、液体シンチレーション分光測光法によって定量する。
Cyr61などのECMシグナリング分子関連生物材料の用途は、造血幹細胞培養のex vivoでの増加において使用することができる。加えて、１以上のECMシグナリング分子関連分子材料を、これらの培養物を増加させるために使用してもよい。例えば、Cyr61を、その発現を局所的に標的化させて、Fisp12と組み合わせてもよく、それにより培養培地でのFisp12の存在によって明示されたように、さらに拡張的な標的化が呈されうる。別の選択肢として、CTGFをFisp12（そのマウス・オーソログ）に置換してもよい。当業者であれば、本発明の範囲内にあるECMシグナリング分子関連生物分子の他の組合せを考案することができるはずである。
当業者は、Cyr61などのECMシグナリング分子の存在下での造血幹細胞培養物の首尾良い増加によって、その増加プロセスのモジュレーター推定物についてのスクリーニング方法のための基礎が提供されることを認めるはずである。本発明の別の方法において、モジュレーター推定物がCyr61などのECMシグナリング分子と組み合わせられ、そして原初細胞に曝される。平行して、ECMシグナリング分子が同様の細胞に曝される。多能性造血幹細胞培養物を増加させる、ECMシグナリング分子の能力の促進剤、または阻害剤を同定するために、増加の相対速度を用いることができる。
Cyr61は、単独で、または他の造血増殖因子と組み合わせて、患者から採取した幹細胞集団を増加させるために使用してもよく、そしてこれを増加させた後、例えば患者に赤血球の枯渇を生じる化学療法または他の処置様相の後の、当該患者または別の好適な供受患者に戻してもよい。本発明に従って増加された幹細胞集団は、その必要に応じて患者への骨髄移植に使用してもよい。
実施例２２
臓器再生
細胞の生育状態の変化によって引き起こされる様々な細胞プロセスにおけるCyr61の役割によって、このタンパク質が臓器の再生に有効であろうことが示唆される。その目的のために、部分肝切除術後に肝臓組織が存続する際のネズミcyr61の発現プロファイルを調べるための研究を実施した。（部分肝切除術後の残存肝組織の応答は、例えば、毒性レベルの四塩化炭素に曝された場合等の化学的損傷を包含する様々な損傷に対する肝臓の応答のモデルである。）
BALB/c 3T3（Charles River）マウスを、およそ67％の肝組織を除去する部分肝切除術に付した。Higginsら、Archs.Path. 12巻、186〜202頁（1931）。手術後様々な時間に、残存している肝組織から20ミクログラムのRNAのアリコートを取り出し、そして組織のホモジナイズ、次いでグアニジンイソチオシアネート、塩化セシウム沈降によって肝RNAを単離した。Sambrookら。次いでRNAをニトロセルロースフィルターに固定化し、ネズミcyr61 cDNAの種々の領域を含む放射標識されたクローンで、プローブ探針した。その結果は、オートラジオグラフィーによって可視化し、肝組織の除去によってcyr61 mRNAの発現が誘導される（特に損傷部位近傍に認められる細胞で）ことが示唆された。結論として、例えば、組換え技術によるcyr61発現の誘導によって、肝臓などの臓器の再生が促進させるかもしれないと考えられる。例えば、遺伝子の発現を制御する能力を提供するように設計されている組換えcyr61構築体を導入すること（例えば、組織特異的プロモーター（例えばヒフでの発現用のK14プロモーターなど）を使用することによる）によって、cyr61発現を制御することができる。相同組換えを容易ならしめるベクター（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、その他に由来するベクター）を用いた遺伝子療法技術によって、組換えcyr61を関連臓器の細胞に導入してもよい。異種遺伝子を真核細胞へ導入するための技術、及び相同組換えによって宿主染色体に異種遺伝子を一体化するための技術は、当該技術分野においてよく知られている。
ヒフ、その他の器官の発生も、Cyr61によって影響を受ける。cyr61の発現は、ヒフ損傷部に接近した細胞において誘導される。また、前記したとおり、Cyr61は内皮細胞及び繊維芽細胞に対して化学走性効果を有している（すなわち、Cyr61が細胞移動を誘導する）。さらに、Cyr61は内皮細胞及び繊維芽細胞の増殖を誘導する。双方のプロセスとも、ヒフ創傷の治癒に関係している。従って、Cyr61の投与（局所投与または局部輸送）によって、ヒフの再生が促進されるはずである。
Cyr61は、肺上皮にも高度に発現されている。これらの細胞は、環境汚染物に曝されることによって損傷を受けることが多い。特に、肺上皮は、風媒のオキシダントによって傷害を被ることが多い。例えば、噴霧器または吸入器などにてCyr61を投与することで、例えば環境汚染物などによる肺上皮の傷害に治癒に役立つことができる。
実施例２３
軟骨形成−ECMシグナリング分子は間葉に発現される
あるECMシグナリング分子は、間葉細胞などの細胞にも発現され、これは究極的には骨格系の一部となる。本実施例において、Cyr61は、間葉細胞に発現されるECMシグナリング分子の１つとして同定される。肢間葉細胞を、前記のとおりにカバーグラス（Fisher）上で３日間生育した。培養物を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSにて固定し、1mg/mlウシ精巣ヒアルロニダーゼ（IV型、Sigma）と、プロテアーゼインヒビターのフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF、1μg/ml）、ペプスタチン（1μg/ml）、ロイペプチン（1μg/ml）、アプロチニン（1μg/ml）、アミノカプロン酸（50mM）、ベンズアミド（5mM）、及びEDTA（1mM）を含む0.1N酢酸ナトリウム（pH5.5）と室温で３０分間インキュベートし、10％ヤギ血清を含みPBSでブロッキングし、そしてCyr61に対する一次抗体（Yangら、1991）、フィブロネクチン（Gibco）及びテナシン（Gibco）で4℃にて終夜インキュベートした。対照では、精製されたCyr61を1μg/ml用いて中和された抗Cyr61抗体でインキュベートした。次に培養物をFITC-接合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Zymed）と室温にて１時間インキュベートした。
マウント全体の免疫組織染色のため、妊娠第10.5から12.5日由来のマウス胚を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定し、メタノール／PBSで脱水し、そして絶対メタノール中にて−20℃で保存した。再水和の後、Hoganら、Development 120巻、53〜60頁（1994）（引用することにより本明細書に組み込むこととする）に記載されるとおりに、抗Cyr61抗体で胚をインキュベートした。対照では、1μg/mlの精製されたCyr61で中和された抗Cyr61抗体とインキュベートした。免疫染色された胚を固定し、洗浄として写真を撮影した。
軟骨細胞に分化している体節間葉細胞におけるcyr61 mRNAの一過性の発現に一致して（O’Brienら、1992）Cyr61タンパク質は発生中の胚骨格系に認められた。Cyr61は、妊娠第10.5及び12.5日の胚で、マウント全体の免疫組織化学染色により、近位肢芽間葉に局在していた。Cyr61タンパク質は発生している椎骨、頭蓋冠前頭骨及び第１腕弓、さらに心臓及び臍静脈に局在しており、cyr61 mRNAの発現パターン（O’Brienら、1992）に一致していた。
Cyr61タンパク質は、全肢芽及び肢芽間葉細胞のミクロマス培養物におけるイムノブロット分析によって検出することができた。Cyr61タンパク質のレベルは、軟骨形成が起こる期間である４日間の培養期間を通じて比較的一定レベルのままであった。定量的イムノブロット分析を使用して、Cyr61は、間葉細胞培養物中の細胞性タンパク質及び細胞外タンパク質の総量のおよそ0.03％にあたると見積もられた。Cyr61、テナシン（Gibco）、及びフィブロネクチンは、間葉細胞培養物における免疫蛍光染色によれば、軟骨小節に局在していた。Cyr61及びテナシンは主に小節内細胞の間に局在していたが、一方抗フィブロネクチン抗体を用いると、軟骨小節の周囲及び小節間に、原繊維状の染色パターンも観察された。３抗体すべてについて、ミクロマス培養物の横断切片に、同様の免疫蛍光染色パターンが観察された。まとめて、これらの結果より、内在性のCyr61は、in vivo及びin vitroの双方で、発生している肢芽間葉に局在することが示される。
実施例２４
軟骨形成−ECMシグナリング分子は細胞接着を促進する
Cyr61は、組織培養用の処理をしていないプラスチック表面への繊維芽細胞及び内皮細胞の接着を媒介する分泌タンパク質である（Kireevaら、Mol.Cell.Biol. 16巻、1326〜1334頁（1996））。BSA、Cyr61、テナシン、及びフィブロネクチンで被覆された、組織培養用でないディッシュへの肢芽間葉細胞の接着を比較した。
Cyr61、フィブロネクチン（Gibco）、またはテナシン（Gibco）を、0.5mM PMSFと共に0.1％のプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS中に、最終濃度10または50μg/mlとなるように希釈した。ウェル当たり10μlの滴を、組織培養用の処理をしていない24ウェルプレート（Corning）に入れて、室温にて２時間インキュベートした。室温にて１時間、1％BSAを含むPBSでブロッキングし、そして無血清のMEM（変法イーグル培地）で濯いだ。肢間葉細胞を、無血清のMEM中に5 x 105細胞数/mlとなるように懸濁し、ウェル当たり400μlの容量で添加し、そして１時間または３時間、37℃にて5％CO2でインキュベートした。各時点で細胞懸濁液を取り出し、MEMでウェルを濯いで、残存している接着細胞を写真撮影した。
BSAが被覆されたディッシュには細胞はあまり接着しなかったが、Cyr61及びテナシンが被覆されたディッシュには、播種後１時間以内に円形細胞の集塊として細胞が接着していた。これに対し、フィブロネクチンが被覆されたディッシュに播種された細胞は、均一に接着して、伸展し始めていた。細胞を３時間接着させた場合さらに多くの接着細胞が観察された。また、Cyr61及びテナシンの上に播種された細胞では、細胞間の集塊形成及び円形の形態が維持されており、フィブロネクチンの上に播種された細胞は伸展して単層を形成した。これらの観察より、以前に報告されたテナシンの場合（Mackieら、J.Cell Biol. 105巻、2569〜2579頁（1987））と同様に、Cyr61は、間葉細胞の軟骨形成を招く、接着及び円形細胞形態の維持を媒介することが示される。
前記したとおりに、Cyr61などのECMシグナリング分子は、軟骨形成の接着を包含する（これに限定されない）細胞接着のモジュレーターのスクリーニング方法にも使用することができる。前記した比較アッセイでは、ECMシグナリング分子及び細胞接着のモジュレーター推定物の組合せを曝した細胞と、ECMシグナリング分子のみに曝した細胞の相対的な接着レベルを測定し、それにより、相対レベルによって細胞接着の促進剤または阻害剤のいずれかを同定する基礎が提供される。
実施例２５
軟骨形成−ECMシグナリング分子は細胞凝集を促進する
凝集は軟骨分化のために必須の工程であるので（Solursh,M.、The role of extracellular matrix in development、277〜303頁（Trelstad, R.編）（Alan R. Liss、ニューヨーク、1984））、間葉細胞の懸濁培養における細胞間凝集をCyr61が媒介する能力を評価した。単離後、様々な時間に残存している細胞の数を計数した。懸濁液中の未処理間葉細胞は、単離後直ちに凝集し始めた。単一細胞の数は、インキュベーション２時間以内に、最初の数の30％にまで減少していた。アフィニティー精製された抗Cyr61抗体で処理した培養液では、細胞凝集が有意に阻害され、内在性のCyr61が間葉細胞の凝集にとって重要であることを示唆していた。アフィニティー精製された抗Cyr61抗体が、凝集を干渉する未確定成分を含んでいたのかもしれないという可能性をを除外するために、前記の抗Cyr61抗体を、細胞に添加する前に精製されたCyr61タンパク質と一緒にプレインキュベートした。これらのプレインキュベートされた抗体は最早、IgG及びCyr61緩衝液の対照以上に細胞凝集に影響を及ぼすことはなく、抗Cyr61抗体が、間葉細胞の内在性Cyr61タンパク質を中和することによって細胞凝集の阻害を成し遂げたことが示された。
前記懸濁培養における細胞凝集に加えて、ミクロマス培養での間葉細胞凝集に対するCyr61の効果も調べた。精製されたCyr61タンパク質（0.3μg/ml）を肢間葉細胞に添加すると、Cyr61を添加していなかった対照の細胞とは異なり、２４時間以内に早発の細胞凝集が観察された。Cyr61で処理した細胞、または対照の細胞のいずれも、この時点では軟骨小節に分化していなかった。培養第３日目までに、別々の軟骨小節間の小節間細胞濃縮の発生が、Cyr61で処理した細胞でより多くなった。これらの小節間での濃縮の後、引き続き軟骨形成が行われ、かかる軟骨形成は培養第４日目に軟骨マトリックスのアルシアン・ブルー染色で観察された。まとめると、これらの結果より、Cyr61がミクロマス培養物中の間葉細胞の軟骨形成の必須工程である、細胞同士の凝集を促進することができることが示されるのである。
実施例２６
軟骨形成−ECMシグナリング分子は細胞増殖を促進する
Cyr61などのあるECMシグナリング分子は、前記のとおり、ミクロマス培養で肢芽間葉細胞に対する効果によって表されるように、軟骨形成に対して影響を及ぼすものである。Ahrensら、Dev.Biol. 60巻、69〜82頁（1977）は、ミクロマス培養におけるこれらの細胞は、in vivoのプロセスと同様に軟骨形成を行うことを報告した。トリプシン消化（1mg/ml、ブタ膵臓トリプシン（Sigma Chemical Co.）の1：250希釈液）によって、マウス胚肢芽から間葉細胞を得た。細胞をプラスチック組織培養ウェルに外植し、そして37℃にて5％CO2で２時間、細胞を接着させた。次に、10％FBS、ペニシリン（50U/ml）、及びストレプトマイシン（50μg/ml）を含むMEMを用い、37℃にて5％CO2で２４時間細胞をインキュベートした。この時点で、10％FBSを4％NuSerum（Collaborative Biomedical Products, Inc.）に置換することによって培地の組成を変更した。次に、個々の培養物に、Cyr61、フィブロネクチン、ヘパリン（それぞれおよそ1μg/ml）または負の対照としての緩衝液を加えた。さらなる対照としては、標準技術（Harlowら）により誘発及び精製された、アフィニティー精製された抗Cyr61抗体（およそ13μg/mlの保存溶液）の1：100の希釈液を添加したものを採用した。
前記のチミジンアッセイによって、及び顕微鏡による細胞計数により細胞増殖を評価した。軟骨形成は、［35S］-サルフェート（ICN Biomedicals, Inc.）の硫酸化グリコサミノグリカンへの取り込みを定量することによって、及びアシアン・ブルーでの細胞染色による軟骨形成の程度を定性的に調べることによって評価した。前記の培養物を、2.5μCi/mlの、［35S］-サルフェートで１８時間標識付けし、PBSで２回洗浄し、カールの固定液（Pepperら、J.Cell Sci. 109巻、73〜83頁（1995））で固定して、0.5％アシアン・ブルー、pH1.0にて１８時間染色した。軟骨形成の程度は、アシアン・ブルー染色の強度に呼応している。San Antonioら、Dev.Biol. 115巻、313〜324頁（1986）。その結果より、Cyr61は肢芽間葉細胞増殖及び凝集を特異的に増大させ。軟骨形成の増強に導くことが示される。
精製されたCyr61が繊維芽細胞及び内皮細胞において、増殖因子によって誘導されたDNA合成を増強させることの立証に加えて、細胞増殖に対するCyr61の効果を直接的に調べた。４日間培養を行った間の細胞増殖を、細胞数の計数によって、及び、［3H］-チミジンの取り込みによって定量した。細胞数を定量するために、トリプシン／EDTA（Sigma）によって細胞を採集し、Coulter計数器で計数した。平行して行った培養で、、［3H］-チミジン（1μCi/ml；ICN）を培地に１８時間添加し、そしてTCA-不溶層への取り込みを液体シンチレーション計数によって定量した。精製されたCyr61タンパク質を肢の間葉細胞に添加すると、培養より２及び３日経過後に、細胞数の増加とDNA合成の増強の両方が認められたが、４日後にはCyr61で処理された培養物と、Cyr61で処理されたなった培養物の総細胞数は同じレベルに平均化された。
軟骨形成におけるCyr61の役割は、プロテーゼ具の一体化を改善させることにもあるかもしれない。例えば、骨格損傷及び病態は、例えば、股義足、膝義足などのプロテーゼの導入によって処置されることが多い。組織適合性の問題以上に、プロテーゼ具の成功裡の埋植は、外来物が生物の骨格構造に統合されることを必要とする。Cyr61ポリペプチドが細胞接着、移動、及び増殖に影響を及ぼす能力、ならびにCyr61ポリペプチドが間葉細胞の軟骨細胞への分化を誘導する能力は、プロテーゼの埋植による骨格障害の処置にかけがえがないことが、わかるはずである。例えば、当該技術分野にて知られている種々の投与経路を用いて医薬上容認されうる添加剤、担体、もしくは賦形剤中でCyr61を投与することを包含する治療的処置によって、または好適な担体に含まれるCyr61ポリペプチドをプロテーゼ具に被覆することによって、軟骨細胞の定着によるプロテーゼ具の一体化が促進されよう。担体は、ポリペプチドの持続型放出を許容するように、徐放型のビヒクルであってもよい。
以前報告されたように、本発明の方法には、軟骨細胞を含む、細胞増殖のモジュレーターについてのスクリーニングの方法が包含される。ECMシグナリング分子のみ（例えば、Cyr61）を含む対照の存在下、ならびにECMシグナリング分子及び細胞増殖のモジュレーター推定物の組合せの存在下に、細胞増殖の相対速度の比較を行うことによって、軟骨細胞増殖の促進剤または阻害剤としてモジュレーター推定物を同定するための基礎が提供される。
実施例２７
軟骨形成−ECMシグナリング分子は軟骨形成を促進する
軟骨形成分化は、［35S］-サルフェート（ICN）の硫酸化グリコサミノグリカンへの取り込みによって定量し、そしてアシアン・ブルー染色によって定性的に評価した。培養物を、2.5μCi/mlの、［35S］-サルフェートで１８時間標識付けし、カールの固定液で固定して、0.5％アシアン・ブルー、pH1.0にて染色した（Levら、1964）。軟骨形成の程度は、アシアン・ブルー染色の強度に呼応している（San Antonioら、1986）。固定された細胞層への［35S］-サルフェートの取り込みは、液体シンチレーション計数によって定量した。
精製された、外来性のCyr61タンパク質は、肢の間葉細胞凝集を促進し、そして、軟骨形成促進効果を示唆する、ミクロマス培養におけるアシアン・ブルーで染色される軟骨性領域の拡大を引き起こした。この効果は、Cyr61で処理されたミクロマス培養における、硫酸化グリコサミノグリカンへの［35S］-サルフェートの取り込みによって定量された（San Antonioら、1986）。外来性のCyr61は、用量依存的に［35S］-サルフェートの取り込みを増強し、その結果、0.3及び5μg/mlのCyr61で、それぞれ1.5倍及び３倍の増加が引き起こされ、それはアシアン・ブルー染色の増強に、定性的に呼応するものであった。5μg/mlのCyr61用量（120nM）で観察される増強は、実際の軟骨形成の程度より低く見積もられたものである。これは、この用量で形成された大軟骨小節のいくらかが、ディッシュから剥離したためである。10μg/mlのCyr61を用いて処理した培養物は、より充実した軟骨の小丘（mound）を形成した。
文献を精査すると、肢の間葉細胞ミクロマス培養における軟骨形成は、10μg/mlヘパリンの添加で２倍増大し（San Antonioら、1987；Reshら、1985）、そして50μg/mlのテナシン（200nM）で３倍増大していた（Mackieら、1987）。従って、実験の結果より、精製されたCyr61は、この細胞系にて軟骨形成を促進することが知られている他の分子の場合と同様またはそれ以下の濃度（10〜100nM）で有効であることが立証された。
初発の凝集が生じるには、所定の閾値の細胞密度に至らなければならない（Umanskyら、1966；Ahrensら、1977）ので、低密度で播種された胚間葉細胞は、通常は軟骨細胞へと分化することができないが、ヘパリンまたはポリ-L-リジンなどの外来性因子の添加（San Antonioら、1986；San Antonioら、1987）によって、かかる条件下に播種された細胞でにおける軟骨形成が支持されることが示されている。従って、軟骨形成のための閾値を上回る密度及び下回る密度にて播種された間葉細胞の分化をCyr61が促進する能力を評価した。2.5 x 106細胞数/mlで播種された細胞は、ほとんど［35S］-サルフェートを取り込まなかった。しかしながら、Cyr61を添加すると、これらの閾値を下回る密度の培養によって、小節が形成され、そして3 x 106細胞数/mlで播種された培養におけると同様のレベルまでサルフェートを取り込み、軟骨形成が支持されていた。従って、Cyr61は、軟骨形成性でない、閾値を下回る密度で播種された間葉細胞にて、軟骨形成を促進することができるのである。
間葉細胞を高密度ミクロマスにて播種した場合、軟骨形成の程度は最高になり、さらなる外来性因子によって増強され得ない（すべての細胞に接近可能でなくなるかもしれない）と考えられる。しかしながら、3〜10 x 106細胞数/mlの範囲の密度で播種された培養物における［35S］-サルフェートの取り込みが、外来性のCyr61の添加の結果、２倍増強した。従って、Cyr61は、見かけ上分化の程度が最高に達していない、高密度のミクロマス培養における軟骨形成をさらに増強することができる。
Cyr61で処理された培養物における［35S］-サルフェートの取り込みの増強は、Cyr61が細胞増殖も促進することができるので、少なくとも部分的には細胞数の増加に起因する可能性がある。これが真実であれば、細胞数に対するサルフェートの取り込みの標準化によって、対照とCyr61で処理された培養物との差が排除されることになるであろう。これは、あてはまらないことがわかった。Cyr61で処理された培養物は、対照に対して標準化されたサルフェートの取り込みで、およそ２倍の増強を示し、Cyr61が軟骨形成の正味の増強を促進していることが示唆された。培養第２日目に、サルフェート／細胞数の比は、対照に比べてCyr61で処理された細胞で低く、これは、間葉細胞がこれら初期段階の培養において分化しているというよりむしろほとんどが増殖しているので、細胞数に対する［35S］-サルフェートの取り込みのレベルが低いことを反映しているのである。
これらの細胞における、in vivo及びin vitroの双方での内在性Cyr61の存在から、実際に、軟骨形成分化を調節するために、生物学的に機能することができることが示唆される。外来的に添加された、精製されたCyr61が細胞間の凝集を促進し、肢の間葉細胞における［35S］-サルフェートの取り込み及びアシアン・ブルー染色を増大させる能力によって、Cyr61が軟骨形成増強因子として作用することができるこが立証される。前記実施例１１に示すとおり、抗Cyr61抗体はCyr61の細胞接着及びDNA合成増強活性を中和することができる。抗Cyr61抗体は、播種前に間葉細胞培養培地に添加、または細胞懸濁液に混合した。軟骨形成は抗Cyr61抗体で処理された培養物で阻害されたが、これは、抗体を培地に添加、及び細胞に混合した場合にそれぞれ、50％及び30％にまで［35S］-サルフェートの取り込みが減少することによって立証された。これらの観察は、アルシアン・ブルー染色の減少に相関していた。しかしながら、播種前に間葉細胞に抗Cyr61抗体を混合すると、２４時間以内に処理細胞のいくつかで完全な剥離が引き起こされた。
細胞剥離の原因としての、抗体調製物に含まれる未同定成分の可能性を排除するために、細胞と混合する前に、精製された1μg/mlのCyr61タンパク質と共に抗Cyr61抗体をプレインキュベートした。中和された抗Cyr61抗体と混合された間葉細胞における軟骨形成の阻害は、排除された。
一般に、本発明は軟骨形成のモジュレーターをスクリーニングする方法を企図する。比較のアッセイでは、軟骨細胞を、（ａ）軟骨形成のモジュレーター推定物とECMシグナリング分子との組合せ、または（ｂ）ECMシグナリング分子のみ、のいずれかに曝す工程を含む。次いで、軟骨形成の相対速度の測定によって、かかるプロセスの促進剤または阻害剤として軟骨形成のモジュレーター推定物を同定するための基礎が提供される。
本実施例に記載した結果によって、内在性のCyr61が間葉細胞中に存在し、それが軟骨形成にとって重要であることが立証されるものである。従って、骨の治癒を誘導するための、Cyr61などのECMシグナリング分子の使用が、本発明によって企図される。例えば、生物学的に有効な量のCyr61を、前記の如きスポンジなどのマトリックスに導入し、そして次にこの材料を、骨折を固定するために適用するか、または粉砕した骨折片を集めるために使用する。生物分解性のマトリックスを使用するとよく、あるいは、適切な時期にマトリックスを除去してもよい。また、Cyr61を骨に直接適用することもできる。加えて、Cyr61を実施例２６に記載されるごとき生体適合性プロテーゼなどの無生物体に適用してもよい。
実施例２８
遺伝子
ECMシグナリング分子関連生物材料の効果を制御するための他の方法は、活発に生育及び分裂している細胞における関連遺伝子で優性の負の変異を作出することによって不活性化することにある。一つのアプローチには、組換え技術の使用（例えば、HSC培養などのex vivo培養における同型接合性変異遺伝子型の作出）が包含される。次いで、これらの細胞を、例えばヒト患者などの生物に導入して、導入された変異細胞をin vivoで増加させて、ECMシグナリング分子の発現を変更させる機会が提供されよう。かかる変異に対する同型接合性の変異は、他の細胞において、内在性の野生型ECMシグナリング分子の発現に影響を及ぼすことができる。異型接合性の変異により、野生型のECMシグナリング分子と相互作用することができる改変されたECMシグナリング分子が生産されうるかもしれず、やはりこれを発現して、ECMシグナリング分子の活性をモジュレートしたり排除したりできる。
さらに、軟骨形成（すなわち、骨格発生）を調節するうえでCyr61などのECMシグナリング分子によって果たされる役割のゆえに、ヒトCyr61の発現を改変する遺伝子操作は、脈管形成に関わる病態に加え、骨格系の病態に関連する、出生前スクリーニング法及び遺伝子療法的処置のために医療上重要であることが明らかである。例えば、外胚葉及び中胚葉の双方に起源を有する間葉細胞が分化して軟骨細胞を形成する際に、cyr61遺伝子が発現される。しかして、Cyr61が果たしうる役割の一つは、骨格発生に関与する軟骨細胞系への間葉細胞の関わり合いを調節することである。この観点に符合するように、cyr61を異所性に過剰発現しているトランスジェニックマウスは、骨格異常を伴って誕生する。調べられたすべての場合で、骨格の変形の存在は、トランス遺伝子の発現に呼応している。これらの結果、Cyr61のヒト型もまた、軟骨形成及び骨格発生を調節しうることが示唆される。ヒトcyr61遺伝子は、骨格発生または骨の形態形成に関連する先天性異常に影響を及ぼすことが既に知られている遺伝子座に対応する可能性もある。本明細書中、配列番号：４に示すヒトCyr61タンパク質配列、及び本明細書中、配列番号：３に示すcDNAのコード配列によって、様々な遺伝子療法のアプローチの設計のための基礎が提供される。
かかる情報によって、例えば制限断片長多型分析などの遺伝子型分析に有用なプローブの設計のための基礎も提供される。このような分析は、例えば、疾患及び病態ならびにそれらの発症の可能性における遺伝相談や、さらには法廷で用いられる分析などの分野において有用である。
例として、本発明の物質は、血管障害、骨格異常、及びガン病態を包含する様々な病態及び障害を出生前にスクリーニングする上で有用である。例えば羊水穿刺などで胎児細胞を採取するための周知の技術によって、診断のために必要とされる材料が提供される。本発明の一実施態様において、胎児細胞を増加させ、DNAが単離される。別の実施態様においては、胎児細胞が溶解されて、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応が実施される。いずれかのアプローチを用いて、次にDNAが分析に供される。一つの分析的アプローチには、cyr61の特定の領域または遺伝子全体の領域のヌクレオチド配列決定が包含される。本明細書中配列番号：３で示される、使用可能なヒトcyr61コード配列によって、ヌクレオチド配列分析を実用可能な範疇のものとする配列決定用プライマーの設計が進められる。ヌクレオチド配列分析のための他の選択肢は、胎児の核酸の発現の特徴の精査である。発現されるべき胎児核酸の能力は、Cyr61に関連する脈管形成、軟骨形成、または腫瘍形成性の障害の診断の指針となるかもしれない。
さらに本発明は、Cyr61を含むキットを企図する。本発明のキットは、前記した本発明の方法を実施するために有用な形式でCyr61を提供するものである。本発明のキットは、単離及び精製された組換えヒトCyr61を好適な緩衝液中に含むもので、任意には、−20℃での保存用にグリセロールの添加によって安定化が図られる。キットにて提供されるCyr61に加えて、本発明はさらに、様々な緩衝化剤、様々なタイプ及び濃度の塩、ならびにDTTなどの添加用タンパク質安定化剤（すべて当該技術分野にてよく知られているもの）などを適宜に包含することを企図する。本発明の他のキットには、単離及び精製されたネズミCyr61が含まれる。Cyr61ポリペプチド及び阻害ペプチドまたは抗Cyr61抗体（前記）を含むキットも、本発明によって企図される。
配列表
（1）一般情報:
（i）出願人:ラウ，レスター  エフ．
（ii）発明の名称:細胞外マトリックスシグナリング分子
（iii）配列の数:17
（iv）連絡先住所:
（A）名宛人:マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー  アンド  ボーラン
（B）番地:6300シアーズタワー，233サウス  ワッカー  ドライブ
（C）都市名:シカゴ
（D）州名:イリノイ
（E）国名:米国
（F）郵便番号:60606
（v）コンピューター読取形式:
（A）媒体:フロッピー  ディスク
（B）コンピューター:IBM PC互換機
（C）操作システム:PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア:パテント  イン  リリース #1.0、バージョン #1.30
（vi）現出願データ:
（A）出願番号:
（B）出願日:
（C）分類:
（viii）弁護士/弁理士情報:
（A）氏名:クロー，デイビッド  ダブリュ．
（B）登録番号:36,107
（C）参照/事件番号:28758/33766
（ix）通信情報:
（A）電話:（312）474-6300
（B）ファックス:（312）474-0448
（C）テレックス:25-3856
（2）配列番号:1の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:1480塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:CDS
（B）存在位置:180..1316
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「マウスcyr61 cDNAをコードする配列」
（xi）配列:配列番号:1
0004307552.tif 000003
0004307552.tif 000004
0004307552.tif 000005
0004307552.tif 000006
（2）配列番号:2の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:379アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「マウスcyr61 アミノ酸配列」
（xi）配列:配列番号:2
0004307552.tif 000007
0004307552.tif 000008
（2）配列番号:3の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:1418塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:CDS
（B）存在位置:124..1266
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「ヒトCyr61 cDNAをコードする配列」
（xi）配列:配列番号:3
0004307552.tif 000009
0004307552.tif 000010
0004307552.tif 000011
（2）配列番号:4の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:381アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「ヒトCyr61 アミノ酸配列」
（xi）配列:配列番号:4
0004307552.tif 000012
0004307552.tif 000013
0004307552.tif 000014
（2）配列番号:5の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:2267塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「Fisp12 cDNAをコードする配列」
（xi）配列:配列番号:5
0004307552.tif 000015
0004307552.tif 000016
（2）配列番号:6の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:348アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「Fisp12 アミノ酸配列」
（xi）配列:配列番号:6
0004307552.tif 000017
0004307552.tif 000018
（2）配列番号:7の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:2075塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「CTGF cDNAをコードする配列」
（xi）配列:配列番号:7
0004307552.tif 000019
0004307552.tif 000020
（2）配列番号:8の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:349アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（ix）配列の特徴:
（A）配列を表す記号:misc_feature
（D）他の情報:「CTGF アミノ酸配列」
（xi）配列:配列番号:8
0004307552.tif 000021
0004307552.tif 000022
（2）配列番号:9の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:25塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:配列番号:9
0004307552.tif 000023
（2）配列番号:10の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:配列番号:10
0004307552.tif 000024
（2）配列番号:11の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:配列番号:11
0004307552.tif 000025
（2）配列番号:12の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:26塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列:配列番号:12
0004307552.tif 000026
（2）配列番号:13の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:無関係
（D）トポロジー:無関係
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:配列番号:13
0004307552.tif 000027
（2）配列番号:14の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:無関係
（D）トポロジー:無関係
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:配列番号:14
0004307552.tif 000028
（2）配列番号:15の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:24アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:無関係
（D）トポロジー:無関係
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:配列番号:15
0004307552.tif 000029
（2）配列番号:16の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:26アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:無関係
（D）トポロジー:無関係
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:配列番号:16
0004307552.tif 000030
（2）配列番号:17の情報
（i）配列特徴:
（A）長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:無関係
（D）トポロジー:無関係
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:配列番号:17
0004307552.tif 000031
【図１】
0004307552.tif 000032
0004307552.tif 000033