(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
充実性腫瘍の処置のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１もしくはその受容体に対する中和抗体またはＣＳＦ−１もしくはその受容体に対するアンチセンス核酸の使用。
【請求項２】
医薬を充実性腫瘍の成長を阻害するために製造することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬を悪性腫瘍疾患を遅延させるために製造することを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記アンチセンス核酸により細胞が遺伝子的に改変されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子的改変がＣＳＦ−１またはその受容体の遺伝子の少なくと一部の欠失である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
医薬を腫瘍内投与のために製剤化することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
医薬を、胚細胞性腫瘍、上皮性腫瘍および腺癌からなる群から選択される充実性腫瘍の処置のために製造することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＣＳＦ−１活性のインヒビターの用途に関する。
【０００２】
コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）は、主にマクロファージコロニーを形成することができるサイトカインである。天然のＣＳＦ−１は、グリコシル化された二量体であり、種々の長さ、種々の分子量を有するこの分子の様々な形態がヒトの体内に存在している。例えば、それぞれ２２４および５２２アミノ酸を有するＣＳＦ−１の主要な２つの形態は、選択的スプライシングにより形成されることが分かっている。さらに、この因子の最短の長さがおよそ１５０アミノ酸であることが知られている。さらに、ＣＳＦ−１は、生理学的状態に特異的に依存するあるいは組織特異的な、種々のグリコシル化パターンで存在し得る。
【０００３】
ＣＳＦ−１は、例えば化学療法を原因とする、患者における免疫抑制を克服するために用いられてきた。更に、バクテリア、ウイルスまたは真菌による感染の処置もしくは予防、白血球の刺激および創傷治癒の支援に関する適用があった。
【０００４】
さらに、ＣＳＦ−１は腫瘍疾患の処置にも使用されており（米国特許第５,７２５,８５０号）、これは、免疫抑制された腫瘍患者を支援するだけでなく、腫瘍細胞を直接殺傷するためのものである。この場合では、ＣＳＦ−１の投与によって、主に肉腫（sarcoma tumor）細胞を殺傷することができることが分かった（米国特許第５,１０４,６５０号）。
【０００５】
しかしながら、従来技術においては、ＣＳＦ−１の抗腫瘍効果は明らかでなく、Andersonら（Gynecol. Oncol. 74 (2) (1999), 202-207）は、ＣＳＦ−１もその受容体も子宮肉腫の病因には関与していないと報告している。一方、子宮内膜腺癌について、ＣＳＦ−１およびその受容体のいずれもがその腫瘍の進行に関係していることが知られている。最後に、ＣＳＦ−１欠損およびマクロファージ欠損マウスにおいて、特定の１つの腫瘍について腫瘍成長の減少が認められた（ルイス肺癌）。だが、腫瘍成長の減少にもかかわらず、このＣＳＦ−１欠損マウスは腫瘍を有する対照のマウスよりも早く死亡した（Nowicki et al., Int. J. Cancer 65 (1996), 112-119）。推定寿命の短縮もまた、ＣＳＦ−１欠損マウスにおけるネクローシス形成が大きかった結果であると考えられた。
【０００６】
したがって、ＣＳＦ−１の抗腫瘍剤としての役割が、現にいまだに議論され続けているが、これまで腫瘍の処置に対するＣＳＦ−１の負の作用は先行技術において議論されたことも可能性があると考えられたこともなかった。
【０００７】
本発明の目的は、特にＣＳＦ−１の腫瘍における役割を含めて、腫瘍患者を処置するための薬剤を提供することである。
【０００８】
本発明によれば、この目的は、腫瘍疾患の処置のための薬剤を製造するためのＣＳＦ−１活性阻害化合物の使用によって達成される。本発明に際して、ＣＳＦ−１自身はいかなる抗腫瘍効果も有しないという、これまで先行技術において示唆されていた効果に反して、意外にも、腫瘍の成長はＣＳＦ−１またはその受容体を阻害する化合物を投与することによって遅延または阻止することができ、これが生存率の増加につながることが分かった。現に、先行技術においては、いくつかの腫瘍において、ＣＳＦ−１が腫瘍成長の進行に関係していることが分かっているが、これまでは、ＣＳＦ−１およびＣＳＦ−１受容体の成分は腫瘍成長に対する作用は有していないと考えられており、逆に、増加したＣＳＦ−１産生が腫瘍の退化につながると、先行技術では考えられていた。例えば、米国特許第５,７２５,８５０号は、増加したＣＳＦ−１濃度を用いて、マウス悪性腫瘍ＴＵ５細胞を殺傷するマクロファージの刺激することができると開示しているが、この活性は、実のところ、ＣＳＦ−１がインターロイキン−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γと組み合わせて使用した場合にのみ真に有効であることも開示している。したがって、先行技術において報告されたこの悪性腫瘍殺傷効果は、恐らく、ＣＳＦ−１とともに、さらに投与されたリンホカインによるものであったのであろう。
【０００９】
対照的に、ＣＳＦ−１阻害物質またはＣＳＦ−１受容体阻害物質の投与が実際に抗腫瘍効果を有することは、本発明の範囲において認識された。これは、これまで先行技術において展開されていた教示に反するものである。
【００１０】
これまでのところ、本発明の知見による、腫瘍疾患に関係するＣＳＦ−１の負の効果に焦点を当てた効果のみが、ＣＳＦ−１欠損、マクロファージ欠損マウスにおける腫瘍成長を遅延した。これに関連して、（先行技術にこれまで記載されたＣＳＦ−１自身の抗腫瘍効果に基づいて予想されたとおり）ＣＳＦ−１欠損マウスにおけるＬＬＣ腫瘍成長がＣＳＦ−１依存性マクロファージの不在によって促進されないと結論付けられたことにより、腫瘍支質の形成におけるＣＳＦ−１依存性マクロファージの役割が指摘された（Nowicki et al.参照）。そこでは、ＣＳＦ−１によるマウスのインビボ処置において示すことができた有意の抗腫瘍効果も指摘された。ＬＬＣ腫瘍が移植されたＣＳＦ−１欠損マウスにおいて、正常マウスと比較して腫瘍の成長が増加しないことが示されたけれども、実際には、欠損マウスは支質組織をほとんど有していなかった。これらの動物におけるＬＬＣ腫瘍は、実質的により壊死性であり、このことも、成長の減少の原因のようであった。いずれにせよ、ＣＳＦ−１欠損マウスは、腫瘍を患っている対照マウスよりも早く死亡した。Nowickiらは、まず、ＬＬＣ腫瘍は、中和抗腫瘍免疫におけるＣＳＦ−１の関与を実証するための代表的な腫瘍ではないと主張した。Nowickiらのモデルにおいて、この腫瘍が用いられたのは、対照マウスおよびＣＳＦ−１マウスの両方において、この腫瘍が再現性をもって成長したからに過ぎない。
【００１１】
同様に、Nowickiらは、特に、先行技術において報告されているように外来ＣＳＦ−１による刺激が起きるならば、ＣＳＦ−１欠損マウスで得られたデータは、ＣＳＦ−１依存性マクロファージは誘導された抗腫瘍応答において重要な役割を担うという仮説と矛盾しないと主張した。
【００１２】
しかし、実際は、これは、それぞれ、抗腫瘍応答を引き起こすかまたは腫瘍疾患の処置に使用することができるのはＣＳＦ−１自身の投与ではなく、ＣＳＦ−１活性の阻害により有効な腫瘍処置を達成することができることが、本発明の範囲において認められた。
【００１３】
したがって、本発明は、腫瘍疾患の処置のための医薬の製造のためのＣＳＦ−１活性のインヒビターの使用に関する。ＣＳＦ−１活性のインヒビターを含有する腫瘍疾患を処置するための本発明の薬剤は、このように、抗腫瘍効果がむしろＣＳＦ−１自身に帰する、あるいは少なくとも大部分の腫瘍疾患においてＣＳＦ−１の中立的な役割が想定されていた、一般に普及していた教示に反するものである。
【００１４】
本発明に関して、腫瘍疾患の処置の方法では、ＣＳＦ−１活性のインヒビターの有効量を腫瘍患者に投与する。
【００１５】
ＣＳＦ−１活性が阻害される形式は特に重要ではない。先行技術においては、数多くのＣＳＦ−１活性阻害物質が記載されてている。
【００１６】
ＣＳＦ−１活性の阻害のための２つの本質的な解決手段は、ＣＳＦ−１活性自身の抑制、およびＣＳＦ−１受容体の活性の抑制である（米国特許第５,４０５,７７２号参照）。
【００１７】
本発明によれば、ＣＳＦ−１またはその受容体に対する中和抗体が、ＣＳＦ−１活性のインヒビターとして好ましい。そのような中和抗体（Weir et al., J. Bone and Mineral Research 11 (1996), 1474-1481に記載の）は、ＣＳＦ−１またはＣＳＦ−１受容体に、それぞれ、ＣＳＦ−１活性が、阻害されるかまたは有効にならないように結合する。
【００１８】
別法として、アンチセンス技術の助けによってＣＳＦ−１活性を阻害することができ、一本鎖核酸の短い配列を用いてＣＳＦ−１またはその受容体あるいはＣＳＦ−１活性のシグナル伝達機構の別の部分の発現を阻止する。当業者は、アンチセンス技術についてよく理解しており（例えば、参考のため本明細書の一部を構成する、"Antisense Technology-A Practical Approach", Lichtenstein and Nellen (Eds.), IRL Press, Oxford University Press 1997 および "Oligonucleotides as Therapeutic Agents"Ciba Foundation Symposium 209, John Wiley & Sons 1997）、何らかの適当な配列によってＣＳＦ−１またはＣＳＦ−１受容体に対してその技術を容易に適合させることができる。
【００１９】
全体としてまたはその有効な断片として、アンチセンス処置について考慮すべき配列は、本明細書に特に引用することによってその一部を構成する、米国特許第４,８４７,２０１号、米国特許第５,７９２,４５０号、米国特許第５,６８１,７１９号、米国特許第５,８６１,１５０号、米国特許第５,１０４,６５０号および米国特許第５,７２５,８５０号に記載されている。
【００２０】
さらに、ＣＳＦ−１活性の合成インヒビターを、本発明の範囲内で用いることができる。
【００２１】
本発明のＣＳＦ−１活性の阻害は、充実性腫瘍の成長を阻害または遅延するのに特に適している。
【００２２】
本発明の方法は、胚細胞性腫瘍、上皮性腫瘍および腺癌からなる群から選択される充実性腫瘍の処置に特に有効であることが分かった。造血系の悪性腫瘍疾患（即ち白血病）は処置することができない。
【００２３】
抗体を中和することによるまたはアンチセンス技術を用いることによる、あるいはＣＳＦ−１またはその受容体の化学的インヒビターもしくは競争物質を用いることによるＣＳＦ−１活性の上記の好ましい阻害とは別に、本発明にしたがって、細胞または充実性腫瘍の細胞を、それらがその充実性腫瘍の成長および進行を妨げるように遺伝子的に改変することができる。遺伝子治療の方法によって、ＣＳＦ−１の活性またはＣＳＦ−１受容体の活性を、遺伝子的に改変されたＣＳＦ−１またはその受容体またはそれらの突然変異体の誘導された発現によって、特に、ＣＳＦ−１またはその受容体をコードする遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、阻害することができる。
【００２４】
特に、（胚細胞系を除いて）すべての適当な細胞の種類を本発明にしたがってそれに対して使用することができるこの細胞性インヒビターについては、本発明にしたがって製造される医薬を腫瘍内投与用に製剤化して、それをその腫瘍の部位で直接利用できるようにする。これもまた、存在するインヒビターのための投与の好ましい変法である。
【００２５】
但し、本発明の医薬を、別の方法で、特に、局所的、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、胸腔内、くも膜下で、またはカチオン脂質と組み合わせて投与してもよい。
【００２６】
前記のとおり、本発明の特に好ましい変法は、アンチセンス法の使用。即ち、ＣＳＦ−１またはその受容体をコードするｍＲＮＡのある特定の領域が逆方向に存在している方法にある。したがって、ＣＳＦ−１活性の本発明の阻害は、遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物によって引き起こすこともできる。
【００２７】
これらのＣＳＦ−１アンチセンス構築物は、例えば、以下の工程を行うことによって製造することができる：
ａ）ＰＣＲによるＣＳＦ−１ＤＮＡの増幅
ｂ）ＣＳＦ−１のＰＣＲ産物のアンチセンス方向でのサブクローニング
ｃ）工程（ｂ）のE. coli ＤＮＡの挿入、および
ｄ）E. coli 増幅されたＣＳＦ−１アンチセンス構築物の単離。
【００２８】
適当なＴａｑ−ＤＮＡポリメラ−ゼの添加により、ＣＳＦ−１ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのわずかな量を、ＰＣＲによるＣＳＦ−１ＤＮＡの増幅の間に増幅させる。次いで、増幅産物、即ちＣＳＦ−１のＰＣＲ産物を、ベクターへアンチセンス方向にサブクローニングし、回収した組換えＤＮＡ、即ちベクター中にクローニングしたＣＳＦ−１アンチセンス配列を形質転換によりE. coli に導入し、増幅して、E. coli 増幅したＣＳＦ−１アンチセンス構築物、即ちプラスミドを、標準的な方法により細菌細胞から単離し、更なる使用のために供給する。単離については、例えばプラスミド単離のためのアルカリ溶解のそれ自体公知の方法を用いることができる。次いで、増幅されクローニングされたＣＳＦ−１アンチセンス構築物の配列決定を行ってもよい。本方法は、特に簡単で正確であるという特徴があり、本発明の方法によって、特異的に活性なＣＳＦ−１アンチセンス構築物の高い収量を迅速且つ確実に得ることができる。この方法の詳細を、以下の工程を実行することで説明することができる：
ａ）ＰＣＲによるＣＳＦ−１−ＤＮＡの増幅
ｂ）ＣＳＦ−１のＰＣＲ産物のアンチセンス方向でのサブクローニング
ｃ）工程（ｂ）で得られたＣＳＦ−１アンチセンスｃＤＮＡ構築物の増幅、および
ｄ）組換えウイルストランスファーベクターへの組込み
ｅ）工程（ｃ）で得られた構築物の増幅、および培養細胞におけるアデノウイルスＤＮＡとの同時トランスフェクション
ｆ）アデノウイルスＤＮＡを用いたＣＳＦ−１アンチセンスｃＤＮＡ構築物の組換え
ｇ）培養細胞における組換え体の増幅
ｈ）組換えアデノウイルスＣＳＦ−１アンチセンス構築物の調製および精製
ｉ）および哺乳類生物（培養腫瘍細胞の遺伝子治療）、試験動物（マウス、ラット）におけるそれらの使用、腫瘍患者における使用
ｊ）オリゴヌクレオチドアンチセンス阻害に適当なＣＳＦ−１一次配列領域の選択
ｋ）ヌクレア−ゼ耐性ＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製および修飾
ｌ）哺乳類生物（培養腫瘍細胞の遺伝子治療）、試験動物（マウス、ラット）におけるこれらの使用、腫瘍患者における使用。
【００２９】
全ＣＳＦ−１（当然、この方法はＣＳＦ−１受容体に対して１：１で用いることができる）またはその一部の増幅は、３'プライマーまたは５’プライマーをそれぞれ用いて好ましく行うことができる。プライマー長は具体的には１５〜３０ヌクレオチドであり、特に正確で的確な標的化を得るために、特に特異的増幅のために、好ましくは以下の３’プライマー
【化１】
0004307775.tif 000002
および、５’プライマー
【化２】
0004307775.tif 000003
をそれぞれ用いることができる。
【００３０】
特に正確で特異的な増幅を達成するために、本発明の方法は、好ましくは、ＣＳＦ−１ＤＮＡの増幅をＰＣＲ機械において、変性、アニーリングおよび伸張を２０〜４０サイクル、特に２５〜３５サイクル行うように実施し、この方法の進行を正確にするためにプログラム可能なＰＣＲ機械が特に用いられる。本発明によれば、変性は８５〜１００℃にて２０秒〜４分間、特に９３℃〜９８℃にて３０秒〜２分間、それによりタンパク質配列の完全な、ほぼ１００％の変性が保証される。本発明によれば、アニーリングは３０〜７０℃にて３０秒〜４分間、特に３７〜６５℃にて１分間〜２分間好ましく行われ、この方法を実行することが可能な広範囲の温度間隔によってこの方法の進行にしたがってアニーリングが可能な限り完全行われることを保証することができ、特に、変性後、多くの既知の方法における場合の様に、アニーリングのための温度を体温とほぼ等しい温度まで下げる必要がないので、エネルギーの観点から適当な方法の進行を達成することができる。最後に、伸張は、好ましくは６５℃〜８０℃にて３０秒〜６分間、特に７２℃〜７４℃にて１〜４分間行い、特に、ＰＣＲ機械における方法の過程全体から、結果として、増幅された全ＣＳＦ−１またはその一部を得るための数多くの工程にも関わらず、本方法の所要時間を比較的短いまま維持することができる。
【００３１】
さらなる簡便性のため、特に本発明に従う方法の過程を完全にするために、本方法は、それぞれ、変性、アニーリングおよび伸張およびその後のサイクルの前に、増幅を開始する時点で、約９５℃でのさらなる変性工程を約２分間行い、増幅の終了時に、７２℃〜７４℃での最終の伸張を約５〜１０分間行うやりかたで実行する。反応開始時でのさらなる変性によって、高いパーセンテージのタンパク質が本方法のサイクルが実行される前に既に変性され、これが、特に最初のサイクルにおいてより完全な回転率につながる。最後に、最終の伸張を用いることにより、得られる産物がさらに増大することが分かっている。
【００３２】
ＣＳＦ−１のＰＣＲ産物として合成されたｃＤＮＡのサブクローニングのために、ＣＳＦ−１のＰＣＲ産物として合成されたｃＤＮＡが、プラスミドベクター、特にｐＣＲＩＩ、にサブクローニングされ、４〜２５℃で１〜２４時間インキュベーションすることによりｐＣＲＩＩベクターのＭＣＳに組み込まれるように進行するのが好ましい。その場合、プラスミドベクター、好ましくは、例えばInVitrogenから購入できる、適当であることが分かっている既知のｐＣＲＩＩベクターへのサブクローニングを最初に行う。ｐＣＲＩＩベクターのＭＣＳ（即ち、マルチプル・クローニング部位）へのｃＤＮＡの組込みは、様々な既知のインキュベーション方法に従って温和なインキュベーションによって行い、ここで、挿入物とベクターの１：３のモル比は特に確実で完全なライゲーションをもたらすことが示された。ｃＤＮＡをベクターに組み込むとき、例えば、ＭＣＳのＥｃｏＲＩ認識配列を開裂部位として用いことができ、本方法の更なる改善をはかることができる。
【００３３】
最後に、ＤＮＡの特に効果的で信頼性のあるE. coli への挿入は、E. coli 細胞と形質転換するＤＮＡの氷冷混合物の約４０℃〜４４℃、特に４２℃へのショックタイプ加熱による熱ショック、次いで氷浴中で急速に冷却した後インキュベーションおよび培養により、細菌の形質転換によるE. coli への挿入を好ましく実施することによって得ることができる。
【００３４】
本発明にしたがう好ましい別の方法としては、具体的には２５μＦ、２．５ｋＶおよび抵抗２００Ωでのエレクトロポレーション、次いで再生、インキュベーションおよび細胞コロニーの培養による、プラスミドＤＮＡを用いたE. coliの形質転換により、E. coli へのＤＮＡの挿入を行う。
【００３５】
E. coli への挿入の手順はいずれも、コロニーが成長した場合の高い収量によって特徴付けられ、この方法で、悪性腫瘍の治療における更なる使用に十分な量の本発明の構築物を、単純な形質転換法により得ることができる。本発明にしたがう方法の更なる利点は、構築物が高い純度と高い選択性で得られ、その結果、その構築物を単離した後さらに精製する必要がなく、これにより、この方法の所要時間と費用を明らかに少なくすることができるということである。
【００３６】
既に存在しているｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるＣＳＦ−１の増幅およびその単離の可能性とは別に、好ましくは、ＰＣＲによって増幅されるＣＳＦ−１−ＤＮＡは、ＣＳＦ−１発現細胞、具体的には線維芽細胞に由来する全ＲＮＡまたはｍＲＮＡの単離、次いでＰＣＲを用いた逆転写によるｃＤＮＡの合成によって調製することができる。このようなクローニング法は一般的に当業者に知られており、ＰＣＲにより増幅される特別なＣＳＦ−１−ＤＮＡが得られるように適当に適合させ確立されている。その際、ＣＳＦ発現細胞、具体的には線維芽細胞に由来する全ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出のためのグアニジノチオシアネート法を用いることにより、特に好ましいやり方で得ることができ、ここで、別法で用いたｍＲＮＡを単離するためにオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーを用いることができ、これは生成物が非常に高い収量で得られる非常に特異的な反応過程である。全ＲＮＡまたはｍＲＮＡの単離後に必要な、ＰＣＲによる逆転写は、本発明にしたがう方法において記載されたのと同様のやり方で行うことができ、この方法に関して、完全なまたは選択的な生成物がそれぞれ得られるよう、ＰＣＲ機械でのサイクル数を若干増加させるべきであることが示されている。最終の伸張についても同様の考慮が有用であり、少なくとも１０分間に行うのが適当である。しかし、本発明にしたがって行われる全ＲＮＡまたはｍＲＮＡの単離およびその後のｃＤＮＡ合成に関して、ｍＲＮＡライブラリーを用いる方法と比較して、より特異的で純粋な生成物を入手することができ、わずかな消費時間とコストの増加だけでこの生成物を得ることができる。
【００３７】
本方法過程の更なる改善、特に、さらに高い、生成物の特異性または純度をそれぞれ得るために、アダプターにライゲーションする前にゲル濾過による精製を行うことができ、それにより出発物質が、本発明に従う方法の過程には不要な小さなフラグメントから精製される。さらに、ＤＮＡのリン酸化、および標準的なＤＮＡ精製プロトコルまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いることによる、回収されたｃＤＮＡの精製により、この方法過程によるクローニング効率が増大し得る。収量の更なる増大、および特に純度の改善は、ＴＥ緩衝液を用いた更なる抽出によって得ることができる。
【００３８】
更なる目的によれば、本発明は、遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物が調製される方法を目的とし、この目的は、ＣＳＦ−１ｃＤＮＡをプラスミドベクターから切り出し、次いでアデノウイルストランスファーベクターへアンチセンス方向にクローニングすることによって組換えの感染性のアデノウイルスを形成することにより、遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物を調製することで達成される。その際、ＣＳＦ−１ｃＤＮＡを、プラスミドベクター、具体的にはｐＣＲＩＩから制限酵素を用いて切り出し、次いで、制限酵素によって開裂したトランスファーベクター内へアンチセンス方向にクローニングし、E. coli をそれ自体公知の方法で形質転換した後、組換えプラスミドについてスクリーニングを行う。この方法では、アンチセンス方向で組み込まれたＣＳＦ−１−ｃＤＮＡを含む組換えトランスファーベクターを高い収量で得ることができる。次いで、その組換えトランスファーベクターをアデノウイルスＤＮＡへ、アデノウイルストランスファーベクターが得られるように挿入する。その際、本発明にしたがって、組み込まれたＣＳＦ−１ｃＤＮＡを含むトランスファーベクターとアデノウイルスゲノムプラスミド、特にＡｄ５、との間での相同性組換えによって、感染性の組換えアデノウイルスが形成するように進行するのが好ましい。組換えアデノウイルスベクターが、トランスファーベクターと、この例ではヒト腫瘍細胞系２９３において存在するそのアデノウイルスのゲノムプラスミドとの間での相同的組換えによって得られるという、事実により、一方でＣＳＦ−１をアンチセンス方向で含み、他方で複製欠損ウイルスを含む生成物が得られ、これは、その欠損部位、例えばＥＩＡおよびＥＩＢ遺伝子などを、トランス位でもたらす細胞においてのみ増殖させることが可能であり、ウイルスの選択的な増殖を保証することができる、複製欠損ウイルスのこの選択的な増殖によって、このウイルスの同様な選択的使用が可能である。
【００３９】
本発明にしたがって用いられる組換えＡｄ５ウイルスは、本発明にしたがって好ましく用いられるヒト２９３細胞系において増殖することができるヘルパー非依存性ウイルスである。
【００４０】
本発明によれば、ＣＳＦ−１−ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（５−プロピニルアナログ）、ＣＳＦ−１−メチルホスホネート−アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＳＦ−１−２'−Ｏ−メチル−アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは末端修飾されたＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＣＳＦ−１受容体の対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドとして使用することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、非常に様々な成長因子について先行技術において知られており、標準的な方法により調製される。
【００４１】
遺伝子特異的オリゴデオキシヌクレオチドに基づく「アンチセンス阻害技術」では、一本鎖の、合成ＤＮＡ分子を、ヌクレア−ゼ耐性が増大するように修飾することが必要である。ホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較してより高い安定性を有している、即ち、Ｏ原子の、ホスホジエステル架橋において存在するＳによる置換。この方法では、例えば、低用量の適用でより長い活性が得られる。この方法で修飾されたオリゴヌクレオチドは、細胞内のヌクレア−ゼ分解に対し、より高い耐性を有し、遺伝子発現を阻害するためのアンチセンス分子として、および化学療法剤として本発明にしたがって使用することができる。当然、治療的使用におけるオリゴヌクレオチドもまた、短いまたは欠陥付加物（faulty adducts）または合成副生成物が使用前に分離されているであろう、精製された形態でのみ使用できるという事実に注意を払わなければならない。本発明によれば、完全に修飾されたオリゴヌクレオチド、および単に部分的に修飾された、ホスホロチオエート架橋を有するオリゴヌクレオチドの両方を使用することができ、この場合、上で言及したように、オリゴヌクレオチドの作用形式および活性は、例えば、標的配列とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間の増大した親和性ならびに細胞への改善された取り込み、ヌクレア−ゼ分解に対する増大した耐性およびより高い検出性を有する、末端修飾されたＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドと若干相違する。しかし、原則として、悪性腫瘍の治療においてすべてのオリゴヌクレオチドをＣＳＦ−１アンチセンス構築物に同じように使用することができ、本発明に従う適用は好ましくは局所的、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、またはカチオン脂質との組み合わせである。
【００４２】
本発明にしたがって調製し用いることができる遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物を腫瘍内に投与するのが好ましい。なぜなら、腫瘍内投与により、複製欠損ウイルスが腫瘍細胞が、必要とされる部位での体内の腫瘍細胞の感染に用いられることが保証されるからである。原則として、理論的には、遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物を、局所的、静脈内、動脈内、皮下などの慣用的な方法でも投与することができるが、この場合、効力が明らかに限定されるようである。
【００４３】
ＣＳＦ−１アンチセンス構築物、ＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物の製造および使用によって、生物学的な物質の製造および使用が可能となり、悪性腫瘍細胞の成長と増殖が明らかに阻害され、それにより、本発明にしたがって製造された構築物による選択的で標的化された悪性腫瘍の治療が可能になる。
【００４４】
特に好ましい使用によれば、ヌクレオチド１〜１８０（ヒトＣＳＦ−１遺伝子配列、ＥＭＢＬ受託番号Ｍ３７４３５、ＬＯＣＵＳ：ＨＵＭＣＳＤＦ１に由来する）のＣＳＦ−１配列として、特に以下の１４マー：
【化３】
0004307775.tif 000004
開始コドン（ＡＴＧ）（ヌクレオチド１２０〜１０６）に続く最初の１４ヌクレオチドに相同な１４マー
【化４】
0004307775.tif 000005
開始コドン（ＡＴＧ）（ヌクレオチド１０５〜９１）の前の１４ヌクレオチドに相同な１４マー
【化５】
0004307775.tif 000006
ｍＲＮＡの転写開始（ヌクレオチド１４〜１）に続く１４ヌクレオチドに相同な１４マー
を使用して、本発明にしたがって進める。
【００４５】
以下の実施例によって本発明がさらに詳細に説明される。当然、これには限定されない。
【００４６】
実施例１：
ＣＳＦ−１−ｃＤＮＡ構築物の調製
出発物質として使用される、ＣＳＦ−１発現細胞（Ｌ９２９線維芽細胞）から全ＲＮＡを単離するために、グアニジノ−チオシアネート法をＲＮＡ抽出に用いた。以下のようにして行う：
・Ｌ９２９線維芽細胞から培地を除き、１ｍＬの変性溶液を添加し、ピペッティングにより細胞を溶解し、
・ホモジネートを５ｍLのチューブに移し、０．１ｍＬの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を添加し、混合した後、水飽和フェノール１ｍLを加えて混合し、クロロホルム／イソアミールアルコール（４９：１）０．２ｍLを加えて混合し、懸濁液を０〜４℃にて１５分間インキュベーションし、
・４℃にて１０，０００ｇで２０分間遠心し、水相を新しいチューブに移し、
・１００％イソプロパノール１体積を加えることによりＲＮＡを沈殿させ、試料を−２０℃に３０分間冷却した後、４℃にて１０，０００ｇで１０分間遠心し、上清溶液を捨て、
・上で形成したＲＮＡペレットを０．３ｍLの変性溶液に溶解し、
・−２０℃にて３０分間次いで４℃にて１０分間、０．３ｍＬの１００％イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させた後、１０，０００ｇで遠心し、上清の溶液を捨て、
・ＲＮＡペレットを７５％エタノール中で再懸濁し、激しく攪拌し、室温で１０〜１５分間インキュベーションし、
・１０，０００ｇで５分間遠心し、上清溶液を捨て、ＲＮＡペレットを５〜１０分間真空乾燥し、
・ＲＮＡペレットを２００μＬのＤＥＰｃ処理した水中に溶解し、ＵＶ分光法により２６０ｎｍにてＲＮＡを定量する。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）によるＣＳＦ−１ＲＮＡの増幅
【００４８】
回収したＣＳＦ−１ＲＮＡ１μｇをマイクロ遠心チューブに入れ、７０℃にて１０分間インキュベーションし、手短かに遠心した後、氷に浸ける。
【００４９】
以下の試薬をＣＳＦ−１ＲＮＡに加えることにより、反応物２０μＬを調製する：
ＭgＣl2、２５ｍＭ                                  ４μL
逆転写緩衝液、１０×                                ２μL
ｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭ                            ２μL
Ｒｎａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター            ０.５μL
ＡＭＶ逆転写酵素                                    １５単位
オリゴ（ｄＴ）プライマー                            ０.５μｇ
ＣＳＦ−１ＲＮＡ                                    １μｇ
ヌクレア−ゼ不含水を加えて合計２０μLとする。
【００５０】
次いで、反応物を４２℃にて１５分間インキュベーションした後、これを９９℃にて５分間加熱し、０〜５にて５分間再びインキュベーションする。増幅のために、溶液を以下のように希釈する：第１鎖ｃＤＮＡ合成反応物を、ヌクレアーゼ不含水で１００μLに希釈した後、５０μLのＰＣＲ増幅反応混合物を以下の試薬と混合することにより調製する（したがって、テンプレート特異的上流および下流プライマー、即ちＣＳＦ−１特異的プライマーをここに添加しなければならない）：
【表１】
0004307775.tif 000007
【００５１】
以下のＰＣＲ反応混合物を使用した：Ｈ2Ｏ
【表２】
0004307775.tif 000008
【００５２】
この場合、Ｔａｑポリペプチドメラ−ゼの添加を最後にした。
【００５３】
ＰＣＲ機械を、以下のとおり、変性、アニーリングおよび伸張のための時間と温度についてプログラムした：
反応開始時の変性：９５℃で５分間１サイクル
【表３】
0004307775.tif 000009
最後の伸張：最終のサイクルの後、７２℃にて５分間。
【００５４】
混合物は、ＰＣＲ機械がスイッチオフになるまで４℃に保ち、試料を取り出す。各ＰＣＲ反応物に、１００μLのクロロホルムを加え、これを攪拌し、２.００分遠心し、上相をさらに処理するため保存する。生成物のサイズ決定については、１０μLのＰＣＲ産物をＤＮＡサイズマーカーとともにアガロースゲルに加える。
【００５５】
次いで、ＰＣＲ産物を以下の通り精製する：
・ＰＢ緩衝液２５０μLをＰＣＲ反応物５０μLに加え、
・ＱＩＡquickスピンカラムを５ｍLの遠心チューブに入れ、
・試料をカラムに加えて３０００ｇで１分間遠心し、
・洗浄：ＰＥ緩衝液０.７５ｍLを加え、１分間遠心する。
・ＱＩＡquickカラムをマイクロ遠心チューブに移す。１０，０００ｇで１分間遠心する。
・ＱＩＡquickカラムを１.５ｍLの反応容器に入れる。
・５０μLの１０ｍＭＴris−Ｃl（ pＨ８.５）を加えることによりＤＮＡを溶出し、マイクロ遠心機にて、最高速にて１分間遠心する。
回収した溶出液：約４８μL。２６０ｎｍでのＵＶ分光法によりＤＮＡ濃度を測定する。
【００５６】
更なる反応について、ＥｃｏＲＩアダプターライゲーションを以下のようにして適当に行う：
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液                      ３μL
アセチル化ＢＳＡ、１ｍg／ｍL                        ３μL
ｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μL）                            ５μL
アダプター（２０倍モル過剰：１０ｐｍアダプター）      １μL
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｗｅｉｓｓ単位）                ２.５μL
ヌクレアーゼ不含水を加えて３０μLにする
【００５７】
調製した溶液を１５℃にて一晩インキュベーションし、反応混合物を７０℃にて１０分間加熱することにより酵素を不活化し、最後に反応物を氷上で冷却する。
【００５８】
反応を問題なく行うために、挿入ＤＮＡを以下のようにしてリン酸化する：
ライゲーション混合物                                            ３０μL
Ｔ４  ＰＮＫ１０×緩衝液                                          ４μL
ＡＴＰ、０.１ｍＭ（１０ｍＭストック溶液の１：１００希釈水溶液）  ２μL
Ｔ４  ＰＮＫ（１０Ｕ／μL）                                      １μL
ヌクレアーゼ不含水                                              ３μL
全体積                                                          ４０μL
【００５９】
溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした後、１体積のＴＥ飽和フェノール：クロロホルムを加え、３０秒間攪拌し、マイクロ遠心機にて最高速で３分間遠心し、上部の水相を新しいチューブに移す。次いで、過剰のアダプターを以下の通りに除去する：
【００６０】
２５０μLのＰＢ緩衝液をリン酸化反応物に加え、ＱＩＡquickスピンカラムを５ｍLの遠心チューブに入れ、試料をカラムに加え、３０００ｇで１分間遠心した後、０.７５ｍLのＰＥ緩衝液を加えることにより洗浄し、再び１分間遠心し、ＱＩＡquickカラムをマイクロ遠心チューブに移し、１０，０００ｇで１分間遠心し、ＱＩＡquickカラムを１.５ｍLの反応容器に入れ、５０μLの１０ＭＴris−Ｃl（ pＨ８.５）を加えることによりＤＮＡを溶出し、マイクロ遠心機にて最高速で１分間遠心する。回収した溶出液：約４８μL。
【００６１】
次の工程として、ｃＤＮＡをエタノール沈殿により、以下の通り濃縮する：
ＤＮＡを０.５体積の７.５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２.５体積の冷却した（−２０℃）１００％エタノールと混合し、−７０℃で３０分間混合し、静置した後、マイクロ遠心機にて最高速で１５分間遠心し、上清の溶液を除き、形成したペレットを１ｍLの冷却（−２０℃）７０％エタノールで洗浄して、マイクロ遠心機にて最高速で５分間遠心し、上清の溶液を除き、ペレットを手短に真空乾燥し、更なる処理のために沈殿物を５０μLのＴＥ緩衝液中で再懸濁する。ＵＶ分光法により２６０ｎｍにてＤＮＡ濃度を測定する。
【００６２】
ｐＣＲＩＩベクターをホスファターゼ処理に付する。ベクターは、ホスファターゼ処理の前にＥｃｏＲＩによる制限開裂によって以下のとおり線状化する：
制限フォーミュレーション：
１μｇのｐＣＲＩＩＤＮＡ
２μLの１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液
２単位のＥcoＲＩ
水を加えて全体積２０μLとする。
３７℃にて２時間インキュベーションする。
【００６３】
ベクターＤＮＡの脱リン酸化：
１／１０体積の１０×脱リン酸化緩衝液の添加。１単位のアルカリホスファターゼを添加したのち３７℃で６０分間インキュベーション。６５℃で１５分間加熱することによるアルカリホスファターゼの不活化。
【００６４】
次いで、合成したｃＤＮＡをベクターｐＣＲＩＩのＥcoＲＩ開裂部位にクローニングする。
【００６５】
ライゲーションフォーミュレーション：
１００ｎｇのベクターＤＮＡ
５０ｎｇのＣＳＦ−１ｃＤＮＡ
１μLのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｗｅｉｓｓ単位）
１.５μLのＴ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液
ヌクレアーゼ不含水を加えて１５μLとする。反応混合物を室温で３時間インキュベーションし、ｐＣＲＩＩ−ＣＳＦ−１組換えプラスミドを回収する。
【００６６】
E. coliにおけるＤＮＡの挿入：
以下のとおり、プラスミドｐＣＲＩＩ−ＣＳＦ−１を形質転換によりE. coli に導入し、増幅する：
エレクトロポレーションによる細菌の形質転換
・氷上のキュベット中で、１００μLの電気反応性E. coli を半分の体積のライゲーションフォーミュレーション（７.５μL）と混合し、
・エレクトロポレーション：２５μＦ、２.５ｋＶ、２００Ω
・細胞を再生するために、１ｍLのＳＯＣ培地を添加し、細胞をチューブに移し、３７℃にて１時間インキュベーションした後、。アンピシリン選択プレートに蒔き、コロニーを３７℃にて一晩培養する。
【００６７】
プラスミドの単離：
選択プレートから単一のコロニーを取り、アンピシリンを添加した３ｍLのＬＢ中で３７℃にて８時間インキュベーションし、１００ｍLのＬＢ培地中で１／５００に希釈し、激しく攪拌しながら３７℃にて１２時間増殖させる。次いで、４℃にて６０００ｇで１５分間遠心することにより細菌を回収し、細菌のペレットを１０ｍLのＰ１緩衝液中に溶解し、１０ｍLのＰ２緩衝液を加え、十分に混合して、室温で５分間インキュベーションする。次いで、１０ｍLの氷冷Ｐ３緩衝液を加え、これをすぐに注意深く混合して氷上で２０分間インキュベーションし、４℃にて２０，０００ｇで３０分間遠心する。上清の溶液を、もう一回４℃にて２０，０００ｇで１５分間遠心し、１０ｍLのＱＢＴ緩衝液で平衡化したＱＩＡＧＥＮ−５００カラムに移す。２×３０ｍLのＱＣ緩衝液でカラムを洗浄したら、ＤＮＡを１５ｍLのＱＦ緩衝液で溶出し、１０.５ｍLのイソプロパノール（室温）を添加することによりＤＮＡを沈殿、溶出させる。混合し、すぐに４℃にて１５，０００ｇで３０分間遠心した後、上清の溶液を除き、ＤＮＡペレットを５ｍLの７０％エタノール（室温）で洗浄し、１５，０００ｇで１０分間遠心し、上清溶液を除く。形成したペレットを５分間風乾し、ＤＮＡを１００μLのＴＥ（ pＨ８.０）に溶解する。ＵＶ分光法により２６０ｎｍにてＤＮＡ濃度を測定する。
【００６８】
最後に、増幅しクローニングしたＣＳＦ−１構築物のすべての配列を、Sangerの標準的な方法（鎖終端法）にしたがう配列決定法により決定する。ＣＳＦ−１構築物をここでそのまま使用してもよいし、またはそれを薬学的に許容し得る製剤にさらに加工してもよい。
【００６９】
実施例２：
遺伝子治療により発現可能なＣＳＦ−１アンチセンス構築物の調製
組換え感染性アデノウイルスの調製
ＣＳＦ−１ｃＤＮＡを、実施例１のプラスミドｐＣＲＩＩ−ＣＳＦ−１から切り出した後、アデノウイルストランスファーベクターへアンチセンス方向にクローニングする：
挿入物を、以下のとおりＥｃｏＲＩを用いて制限開裂によって切り出す：
制限フォーミュレーション
１μｇのｐＣＲＩＩ−ＣＳＦ−１ＤＮＡ
２μLの１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液
２単位のＥｃｏＲＩ
水を加えて全体積２０μLとする。
３７℃で２時間インキュベーションする。
【００７０】
次いで、以下の試薬を添加することにより、Klenow酵素とのフィル・アップ反応において平滑末端を形成する：
２μLの１０×ＮＴＢ；１μLの１ｍＭｄＮＴＰ；１単位のＫｌｅｎｏｗ。３７℃で１５分間インキュベーションし、５〜１０分間６５℃に加熱してＫｌｅｏｗ酵素を不活化する。
【００７１】
その後、トランスファーベクターｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５ＢＦＰを制限酵素ＢａｌＩＩで開裂する：
制限フォーミュレーション：
１μｇのトランスファーベクターＤＮＡ
２μLの１０×緩衝液Ｍ
２単位のＢａｌＩＩ
水を加えて全体積２０μLとし、３７℃にて２時間インキュベーションし、形成したフラグメントを１％ＴＡＥアガロースゲルで分離し、１６４１ｂｐのＣＳＦ−１フラグメントならびにトランスファーベクターを以下のようにしてアガロースゲルから別々に精製する：
【００７２】
アガロースゲルから得たＤＮＡフラグメントをそれぞれ小刀で切り出し、ゲル切片の重量を計り、１体積のゲルに対し３体積のＱＧ緩衝液を加えた後、５０℃にて１０分間インキュベーションする。インキュベーション中は、２分ごとに攪拌し、混合物の色が黄色かどうかをチェックし、次いで１ゲル体積のイソプロパノールを試料に加えて、混合する。ＱＩＡquickスピンカラムを２ｍLの反応容器に入れ、試料をカラムに加え、１分間遠心する。カラムを新しい反応容器に入れる。０.７５ｍLのＰＥ緩衝液をカラムに加えることによって洗浄し、１分間遠心した後、余分な水を捨て、１０，０００ｇで１分間カラムを遠心する。
【００７３】
ＤＮＡの溶出：５０μLの１０ｍＭＴris−Ｃl（ pＨ８.５）を加え、最高速で１分間遠心する。次いで、トランスファーベクターｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５ＢＦＰへのＣＳＦ−１ｃＤＮＡのライゲーション、即ち：
以下のようにして、精製したＣＳＦ−１フラグメントを線状化したトランスファーベクターへクローニングする：
ライゲーションフォーミュレーション：
２００ｎｇのトランスファーベクターＤＮＡ
１００ｎｇのＣＳＦ−１ｃＤＮＡ
１μLのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｗｅｉｓｓ単位）
１.５μLのＴ４  ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液
ヌクレアーゼ不含水を加えて１５μLとする。
反応混合物を室温で６時間インキュベーションする。
【００７４】
次いで、エレクトロポレーションによる細菌の形質転換を以下の通りに行う：
氷冷下、キュベット中で１００μLの電機応答性E. coli を、半分の体積のライゲーションフォーミュレーション（７.５μL）と混合し、２５μＦ、２.５ｋＶ、２００Ωでエレクトロポレーションを行い、細胞を再生し、１ｍLのＳＯＣ培地を加え、細胞をチューブに移して３７℃にて１時間インキュベーションした後、アンピシリン選択プレートに蒔き、コロニーを３７℃にて生育させる。
【００７５】
次いで、プラスミドを以下のようにして単離する：
選択プレートから単一のコロニーを取り上げ、アンピシリンを添加した３ｍLのＬＢ中、激しく攪拌しながら３７℃にて８時間インキュベーション；最初の培養細胞を１００ｍLのＬＢ培地中、１／５００に希釈し、激しく攪拌しながら３７℃にて１２時間生育させる；４℃にて６０００ｇで１５分間遠心することにより細菌を回収し；細菌のペレットを１０ｍLのＰ１緩衝液中に溶解し、１０ｍLのＰ２緩衝液を加え、それを混合し室温で５分間インキュベーションする；１０ｍLの氷冷Ｐ３緩衝液を加え、これをすぐに注意深く混合して氷上で２０分間インキュベーションし、４℃にて２０，０００ｇで３０分間遠心し、上清の溶液をもう一回４℃にて２０，０００ｇで１５分間遠心し、この上清溶液を１０ｍLのＱＢＴ緩衝液で平衡化したＱＩＡＧＥＮ−５００カラムに移し、２×３０ｍLのＱｃ緩衝液でカラムを洗浄し、ＤＮＡを１５ｍLのＱＦ緩衝液で溶出して、１０.５ｍLのイソプロパノール（室温）を溶出したＤＮＡに添加することにより沈殿させて溶出し、混合して、すぐに４℃にて１５，０００ｇで３０分間遠心し、上清溶液を除く。ＤＮＡペレットを５ｍLの７０％エタノール（室温）で洗浄し、１５，０００ｇで１０分間遠心し、上清溶液を除き、ペレットを５分間風乾し、ＤＮＡを１００μLのＴＥ（ pＨ８.０）に溶解する。ＵＶ分光法により２６０ｎｍにてＤＮＡ濃度を測定する。フラグメントの分離は１％ＴＡＥアガロースゲルにより行い、トランスファーベクターをアガロースゲルから抽出して、以下のようにして精製する：
【００７６】
小刀を用いて線状化したベクターをアガロースゲルから切り出し、ゲル片の重量を計り、１体積のゲルに対し３体積のＱＧ緩衝液を加え、５０℃にて１０分間インキュベーションし、インキュベーション中は、２分ごとに攪拌して、混合物の色が黄色であるかチェックする。次いで、１ゲル体積のイソプロパノールを試料に加え、混合し、ＱＩＡquickスピンカラムを２ｍLの反応容器に配置し、試料をカラムに加え、１分間遠心する。カラムを新しい反応容器に入れ、０.７５ｍLのＰＥ緩衝液をカラムに加え、１分間遠心することによりることによって洗浄する。廃液を捨て、１０，０００ｇで１分間カラムを遠心する。ＤＮＡの溶出：５０μLの１０ｍＭＴris−Ｃl（ pＨ８.０）を加え、最高速で１分間遠心する。収量：約４８μL。
【００７７】
次いで、線状化した組換えトランスファーベクター（ｐＡｄＣＭＶ５−ＣＳＦ−ＢＦＰ）のウイルスＤＮＡ（ＡＤ５ＣＭＶｌａｃＺＥ１／Ｅ３）による２９３細胞における同時トランスフェクションをリン酸カルシウム法により以下のとおり行う：
【００７８】
０.００５体積の２ｍg／ｍLのキャリアーＤＮＡを１×ＨＥＢＳに加え、１分間攪拌することにより混合する。ＨＥＢＳ＋キャリアーＤＮＡを２ｍLずつ、滅菌した透明なプラスティック製の反応容器に取り、２０μｇの線状化した組換えトランスファーベクター（ｐＡｄＣＭＶ５−ＣＳＦ−ＢＦＰ）および２０μｇのウイルスＤＮＡをこの反応容器に加えて注意深く振盪した後、０.１ｍLの２.５ＭのＣaＣl2をゆっくりと加え、注意深く混合し、室温で２５分間インキュベーションする。０.５ｍLのＤＮＡ懸濁液を、生育培地を除去することなく、２９３細胞を加えた６０ｍｍの細胞培養皿に加え、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で５時間インキュベーションし、培地を除去して１０ｍLのＭＥＭＦ１１−アガロース（予め４４℃に平衡化した）を加える。アガロースゲルが固まった後、３７℃でインキュベーションする。プラークが５〜１４日後に現れる。アデノウイルスプラーク単離物のスクリーニングのために、滅菌したパスツールピペットで切り出すことにより、トランスフェクトした培養細胞からプラークを単離し、０.５ｍLの滅菌ＰＢＳ＋１０％グリセロールを入れた反応容器に移す。使用するまで−７０℃で保存する。次いで、６０ｍｍディッシュ中の８０％コンフルエント２９３細胞から培地を除き、０.２ｍLのウイルス（寒天懸濁）を添加する。室温で３０分間吸収させる。完全ＭＥＭＦ１１＋５％ウマ血清を加え、３７℃でインキュベーションする。大部分の細胞が分離したら，ウイルスを回収し、感染細胞のＤＮＡを抽出する。ピペットで培地４ｍLを注意深く取り出し、０.５ｍLの滅菌グリセロールを加えた反応容器に入れる。これらのウイルス候補物を−７０℃で保存する。このディッシュから残りの培地を除く。感染細胞からのＤＮＡ抽出のために、０.５ｍLのプロナーゼ溶液を加え、３７℃で１０時間インキュベーションする。リゼートを１.５ｍLの反応容器に移し、緩衝液飽和フェノールにより１回抽出し、１０分間遠心し、上部の水相を集め、新しい容器に移し、ＤＮＡを沈殿させるために１ｍLのエタノールを加える。十分に混合する。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清溶液吸い上げ、７０％エタノールでペレットを洗浄し、５分間遠心し、上清を吸い上げ、ペレットを風乾する。ＤＮＡを５０μLの０.１×ＳＳＣに溶解し、５μLのＨｉｎｄＩＩＩ（１単位一晩）で制限開裂を行う。消化した試料を、臭化エチジウムを添加した１％アガロースゲルに加える。次いで、細胞ＤＮＡのバックグラウンドスミアによって、紫外線光下でウイルスＤＮＡのバンドが容易に見える。更なる診断用制限酵素開裂により、ならびにＢＦＰ（ブルー蛍光タンパク質）の発現を蛍光顕微鏡下でチェックすることにより、組換えウイルス候補物を検査する。さらに２ラウンドのプラーク精製により正しい組換え体をさらに精製し、スクリーニングした後、高力価ストックを調製する。
【００７９】
次いで、組換えアデノウイルス（ＡＤ５ＣＭＶ−ＣＳＦ）の精製と滴定のために、以下のようにプラークアッセイを行う：
６０ｍｍディッシュ中のコンフルエント２９３細胞から培地を吸い上げる。０.２ｍLのウイルス（プラーク精製については１０-3〜１０-6希釈のＰＢＳ中の寒天懸濁液または滴定については１０-3〜１０-9希釈のストック溶液）を加える。室温でウイルスを４０分間吸収させる。１０ｍLのＭＥＭＦ１１アガロースオーバーレイを加え、３７℃にてインキュベーションする。７および１０日後の滴定のためにプラークを計数する。プラーク精製：上記のとおりプラークを単離する。
【００８０】
最後に、単層細胞の高力価ウイルスストック溶液を以下のとおりに調製する：
１５０ｍｍディッシュに２９３細胞を蒔き、８０％のコンフルエントを達成させ、これらを感染させる：次いで、高力価ストックを調製するために、２９３細胞から培地を除き、細胞あたり１〜１０ＰＦＵの感染多重度（ＭＯＩ）（１５０ｍｍディッシュあたり１ｍLのウイルス懸濁液）で感染を行い、４０分間吸収させた後、ＭＥＭＦ１１＋５％ウマ血清を添加し、３７℃でインキュベーションし、細胞変性効果の徴候を毎日チェックする。細胞変性効果がほぼ完全になれば、ディッシュから細胞を掻き取って回収し、細胞を培地と混合して８００ｇで１５分間遠心する。培地を吸い上げ、細胞ペレットを、１５０ｍｍディッシュあたり２ｍLのＰＢＳ＋１０％グリセロールに再懸濁する。ＣｓＣl密度勾配遠心によりウイルス溶液をさらに精製した後、１０ｍＭＴris−ＨＣl（ pＨ８.０）に対して透析する。滅菌グリセロールを最終濃度１０％になるまで加え、−７０℃で保存する。
【００８１】
このように、組換え感染性高力価アデノウイルスＣＳＦ−１アンチセンス構築物を回収し、これは遺伝子治療に直接用いることができる。
【００８２】
実施例３：
細胞の感染における組換え感染性アデノウイルスＣＳＦ−１アンチセンス構築物の使用
試験した細胞の系：
ルイス肺癌細胞、
大腸癌細胞、
乳癌細胞
胚細胞性腫瘍
【００８３】
感染の実行：
６０ｍｍディッシュ中の８０％コンフルエンスの細胞単層に、０.５ｍLのウイルス溶液（ＡＤ５ＣＭＶ−ＣＳＦ）を種々のＭＯＩで加え、室温で３０分間インキュベーションする。
【００８４】
対照の感染をＡＤ５ＣＭＶｌａｃＺ Ｅ１／Ｅ３（ＣＳＦ挿入なしのアデノウイルス）、アデノＧＦＰ（ＧＦＰを有するアデノウイルス）、模擬感染（培地）を用いて行う。６ｍLの培地を加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中でディッシュをインキュベーションする。
【００８５】
感染は以下の作用を示した：
宿主細胞におけるＣＳＦ−１遺伝子発現が懸著に減少した。（全ての形質転換細胞におけるｍＲＮＡ−（ＣＳＦ−１タンパク質）−レベルが、未処理の野生型細胞と比較して３０％未満まで減少。
【００８６】
新たな血管形成が阻害された、即ち抗腫瘍形成効果（細胞増殖の遅延）。
【００８７】
細胞周期を解析すると、アポトーシスの誘発が認められた。
【００８８】
マウスのウイルスのトランスフェクション（アデノウイルス）では、０.５ｍLの容量中、最大１×１０9〜５×１０10ＰＦＵで腫瘍内投与を行った。
【００８９】
２３〜３５μLの容量中、２×１０9ＰＦＵまで組換えウイルスを投与することにより気管内投与を行い、この場合、特に腫瘍内投与において、腫瘍のほぼ完全な退行を観察できた。
【００９０】
実施例４：
ＣＳＦ−１特異的オリゴヌクレオチドの調製およびその使用
ＣＳＦ−１特異的オリゴヌクレオチドの合成
ＣＳＦ−１特異的オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡ−３’（１４マー、塩基対１２０〜１０６の開始コドン（ＡＴＧ）に続く、ＣＳＦ−１−ｃＤＮＡ一次配列の最初の１４ヌクレオチドに相同）の合成は、リン−アミダイト法に基づいて、自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置により行った。合成は、与えられたヌクレオチド配列の３’から５’の方向で行い、合成が完了したら、オリゴヌクレオチドが結合したカラムを最初に３ｍLの濃ＮＨ3で洗う。カラムにＮＨ3が完全に浸透するようにこの操作を数回繰り返す。カラムを室温で２時間ＮＨ3とインキュベーションし（数回リンスする）、最後にオリゴヌクレオチドを回収する。しっかりと密閉した反応容器中で、溶液を５５℃に１６時間加熱する。ロータリーエバポレーター中で、ＮＨ3を回収する（脱トリチル化を防止するために３０μLのトリエチルアミンを添加する）。
【００９１】
Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬によるホスホロチオエート−オリゴヌクレオチドの調製：
キャッピング工程の前に、３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシド（Pharmacia,Sigma）の０.０５Ｍ溶液２４０μLをカラムに直接用いて硫化を行う。このため、適当な反応フラスコに１２ｍLのジクロロジメチルシランと２００ｍLのジクロロメタンの混合物を入れ、溶液を５分後に除去し、メタノールでフラスコをゆすぐ。次いで、フラスコを１１０℃で一晩乾燥させて、乾燥器中で冷却する。０.５ｇ（２.５ｍｍｏｌ)のＢｅａｕｃａｇｅ試薬を５０ｍLの乾燥アセトニトリル中に溶解し、この反応フラスコに入れる。反応フラスコをオリゴシンセサイザーに連結し、ポンプにより試薬をカラム（２×）に送り込む。
【００９２】
分析用逆相ＨＰＬＣ
（カラム：球状粒子（５μｍ、３００Ａ孔サイズ）のシリカ結合Ｃ−１８相、さらにヌクレオシル１００−５ Ｃ−１８、１００ｍｍ×４ｍｍ）
未精製のオリゴヌクレオチド（留去沈殿物）を３００μLの０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ pＨ７）に取る。
【００９３】
紫外線モニターを２６０ｎｍに設定し、流速を１ｍL／分に調整する。８０％アセトニトリル中で、０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ pＨ７）の０〜５０％のグラディエントの緩衝液を５０分間かけて流す。次いで、同緩衝液を５分間で５０〜１００％に増加させる。未精製オリゴヌクレオチドの５μLの少量の試料（全量の２〜５％）をカラムに加え、２６０ｎｍで吸収を記録する。
【００９４】
調製用逆相ＨＰＬＣ
オリゴヌクレオチド溶液の全量３００μLをカラムに加えたことを除いては、ＣＳＦ−１特異的オリゴヌクレオチドの合成のときと同様の操作を用い、２６０ｎｍでの吸収を追跡し、溶出ピークの中央部分を集め、集めた試料をロータリーエバポレ−ター内で析出させ、８０％酢酸１ｍLを乾燥した試料に加え、室温で１時間インキュベーションし、試料を再びロータリーエバポレ−ター内で析出させる。ペレットを１ｍLの蒸留滅菌水に溶解し、ＤＭＴ−ＯＨで２回、酢酸エチルで１回抽出する。試料を乾燥し、ロータリーエバポレ−ター内で析出させる。析出物をある特定の容量の蒸留滅菌水に溶解し、抽出物を２６０ｎｍで測って量を測定する（配列依存的な減衰係数を考慮に入れて希釈率１：１００）。
【００９５】
ＣＳＦ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用
調製したＣＳＦ−１アンチセンスホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを種々の方法で水溶性の純粋な物質（ＨＰＬＣ精製された）として適用し、ＰＢＳ中に溶解する。試験したのは、静脈注射による全身投与、動脈内投与であり、ここで、供給するまたは器官特異的な血管は、できる限り標的に近い物質の投与を可能するよう選択された動脈を考慮した。腫瘍の位置によっては、他の経路、例えば局所または腹腔内投与が例示される。さらに、浸透圧ミニポンプは、ＣＳＦ−１アンチセンスが入れられ皮下のまたは静脈内のインプランテーションによって投与される、リザーバとして供することができる（主として、試験動物としてのマウスについて）。この方法の利点は、単純で信頼性のある適用様式にある。さらに、このポンプは、埋め込まれると４週間まで一定の速度での適用を保証するという利点を有する。この場合、投与するＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量は、ミリグラムの範囲内である。したがって、マウスに対する抗癌治療では、０.１〜２０ｍg／ｋｇ体重／日の用量を使用した。それぞれ体重２００〜３５０ｇを有するラットには１００μLの用量を、０.１〜１μｇ／ｍLの濃度で静脈内投与した。ヒトの系では、０.０５ｍg／ｋｇ／時間の用量が適当である。なぜなら，この用量では、修飾オリゴヌクレオチド単独での投与に起因する毒性作用が生じないからである。ＣＳＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド処置レジメは、少なくとも２週間継続すべきである。