(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６に特異的に結合しその生理活性を阻害するペプチドであって、配列番号１１に記載したアミノ酸配列からなるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩＬ−６（インターロイキン−６）に特異的に結合し、ＩＬ−６の生理作用を阻害するペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６は、免疫、造血、炎症等に対する生体防御系において重要な役割を果たしていることから、その生理作用を高める物質は、免疫の増強、造血作用の促進、炎症等に対する生体防御力の増大用の医薬品として期待されている。
【０００３】
その一方でＩＬ−６は、過剰産生されると自己免疫疾患、ミエローマ、骨そしょう症等の病因因子となることも知られており、この意味においてはＩＬ−６の作用を阻害する物質もまた、これら疾病の予防あるいは治療用の医薬品として期待されている（平野、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、９巻、１６６頁、１９９１年）。
【０００４】
ＩＬ−６の生理作用の発現には、シグナル伝達因子であるｇｐ１３０蛋白質の関与と、ｇｐ１３０蛋白質が刺激を受けることが必要であるが（例えば特開平２−１４００６９号公報）、ｇｐ１３０蛋白質の刺激にはＩＬ−６Ｒ（ＩＬ−６レセプター）が不可欠である（例えば特開平２−２８８８９８号公報）。
【０００５】
このため、前記したＩＬ−６の作用を高める物質として、ＩＬ−６自体（ＩＬ−６を投与してその濃度を高めることによりその作用を高める）やＩＬ−６Ｒ等を使用することが提案されており、既にＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒを組み合わせによる血小板増多剤や造血幹細胞増幅剤が報告されている（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、２８５９頁１９９５年等）。
【０００６】
これとは逆にＩＬ−６の生理作用を阻害するには、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及びｇｐ１３０蛋白質間の相互作用を妨害すればよいとの考えから、ＩＬ−６に対する抗体（特願平８−２４２５２５号公報）、ＩＬ−６Ｒに対する抗体（特願平３−１３９２９３号公報）又はｇｐ１３０に対する抗体（特願平４−１３４３２９号公報）を使用することが提案されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに提案されたＩＬ−６の生理作用を阻害する物質、即ちＩＬ−６に対する抗体、ＩＬ−６Ｒに対する抗体又はｇｐ１３０に対する抗体は、いずれも巨大な蛋白質分子である。従って、このような巨大な蛋白質分子を用いて自己免疫疾患、ミエローマ、骨そしょう症等のＩＬ−６が関与する疾病予防又は治療用の医薬品を開発するには、経口投与が不可能であったり、製造コストが高い等といった種々の課題を克服する必要がある。
【０００８】
そこで本願発明の目的は、ＩＬ−６に特異的に結合するペプチドを材料として、これを改良することにより、ＩＬ−６に対する抗体と同等にＩＬ−６の生理活性を阻害し得る低分子ペプチドを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成すべくなされた本願請求項１の発明は、ＩＬ−６に特異的に結合しその生理活性を阻害するペプチドであって、ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列の両端にシステイン残基を有することを特徴とする前記ペプチドである。そして本願請求項２の発明は、かかるペプチドの中でも特に阻害効果の高い、配列番号１乃至１０で示されるアミノ酸配列の両端にシステイン残基を有するペプチドである。以下本願発明を詳細に説明する。
【００１０】
本願発明におけるＩＬ−６と特異的に結合するアミノ酸配列としては、ＩＬ−６と特異的に結合し得るアミノ酸配列であれば特に制限はないが、ＩＬ−６と特異的に結合してその生理活性を阻害するという特徴以外に、低分子であるという特徴をも有する本願発明のペプチドを得るのであれば、好ましくは１０アミノ酸残基以下、より好ましくは６〜８アミノ酸残基からなる配列であることが好ましい。５以下のアミノ酸残基しか含まないペプチドでは、一般に、ＩＬ−６に対する特異性が充分に発揮できない懸念があるが、ＩＬ−６に対する特異的な結合性を有しているペプチドであれば本願発明に用いることができる。
【００１１】
このようなアミノ酸配列としては、具体的に例えば特願平９−２５６６０４号公報に記載された配列番号１〜３のようなアミノ酸配列を用いることができる（なお、配列番号１〜３のアミノ酸配列のみのペプチドは、後述するＭＨ６０ハイブリドーマの増殖を指標とするＩＬ−６の生物活性測定法を行った結果、ＩＬ−６の生理活性を阻害しないと考えられるペプチドである）
また本願発明では、後述する実施例や例えば特願平９−２５６６０４号公報に記載された手法によって知見される、例えば配列番号４〜１０のアミノ酸配列を用いることもできる。この手法は、一定数のアミノ酸残基がランダムに並んだペプチドを含む蛋白質を発現するファージの集団である、ファージライブラリーを用いる手法であるが、特に、６〜８アミノ酸残基のペプチドを含む蛋白質を発現するファージライブラリーを用いることが好ましい。その理由の一つは、６〜８アミノ酸残基のペプチドが前記したような理由により本願発明に特に好ましいからであり、他の理由は、９以上のアミノ酸残基がランダムに並んだペプチドの数は２０9種類（アミノ酸残基の種類を２０種類とした場合）と膨大であるため、ペプチドを単離する操作に長期間を要するとともに、かかる数のペプチドからＩＬ−６に対して特異的に結合するペプチドを選択し得る確率も減少してしまうからである。
【００１２】
むろん、５以下のアミノ酸残基がランダムに並んだペプチドからＩＬ−６と特異性に結合するペプチドを選択する場合には、操作自体は容易であるから、前記した制限を満足し得るのであれば特に問題はない。ただし、５以下のアミノ酸残基がランダムに並んだペプチドは全体数が少ないため、これを母集団としてその中から選択しようとすれば、ＩＬ−６と特異的に結合するペプチドを選択し得る確率は低くなるおそれもある。
【００１３】
この手法を実施する場合には、例えば、市販のファージライブラリー（ニューイングランドバイオラボ社製、商品名Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）等を使用することができる。該キットは、７アミノ酸残基がランダムに並んだペプチドを含む蛋白質を発現しているファージのライブラリーである。
【００１４】
このようなライブラリーからＩＬ−６と特異的に結合するペプチドを選択するには、上記ファージライブラリーとＩＬ−６の結合性を調査すれば良い。この結合性の調査には、ＩＬ−６を適当な担体等に結合等して使用するが、使用するＩＬ−６は精製された天然のヒトＩＬ−６に限らず、リコンビナントヒトＩＬ−６等をも使用することができる。リコンビナントのＩＬ−６は、均質であるという観点から上記選択に使用するＩＬ−６として特に好ましい（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｅｔｔ．、１２巻、６７３頁、１９９０年）。
【００１５】
ファージライブラリーからＩＬ−６と特異的に結合するペプチドを含む蛋白質を発現しているファージを選択するには、まずＩＬ−６と非特異的に結合するものを極力排除しつつ、ＩＬ−６と特異的に結合し得るものを最大数得ることが重要である。このため、前記したようにＩＬ−６を適当な担体（例えばマイクロタイタープレート、ビーズ又はフィルター等の水不溶性担体等）に結合させ、ＢＳＡ（牛胎児血清）やヘモシアニン等でブロッキング処理を行った後、ＩＬ−６とファージライブラリーを接触せしめ、十分な洗浄を行って非特異的に担体やＩＬ−６と結合したファージを除去すると良い。最終的に残ったファージで大腸菌等を感染させ、当該ファージを増殖する操作を１サイクルとして、前サイクルで増殖されたファージを用いて同様の操作を５サイクル程度行い、この過程において担体に結合させたＩＬ−６を用いる等してＩＬ−６と非特異的に結合するものを除去していくことが例示できる。
【００１６】
なおファージの増殖や大腸菌をファージで感染させる手法は、ファージの種類に応じて適宜行えば良いが、種々のファージに関するこれらの手法は従来から良く知られている。
【００１７】
最終的に、残ったファージの中から真にＩＬ−６と特異的に結合するペプチドを含む蛋白質を発現しているファージを選択するには、例えば好ましくは以上に説明した操作を何度か行う等して２０以上のファージを得ておき、これらが産生する蛋白質をコードしている遺伝子を取得して解析し、その塩基配列を相互比較した上で複数のファージ間で同一又は類似性の高い塩基配列を決定し、決定された配列に基づいてＩＬ−６と特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を推定することが例示できる。
【００１８】
ＩＬ−６と特異的に結合するペプチドの候補として複数のペプチドを推定した後は、各ペプチドを含む蛋白質を発現するファージを単離し、大腸菌に感染させて増殖させた後、一定数、例えば１０10個程度のファージを前記したようなＩＬ−６が結合した担体と対照としてのＩＬ−６を結合していない担体の両方に接触させ、洗浄後に回収されるファージ数を求め、この比をもってＩＬ−６に対する結合性の指標として本願発明に使用する配列を決定することが例示できる。なお、得られたアミノ酸配列の異なる複数のペプチド間でこの比を相互比較することにより、ＩＬ−６との結合性の相対的な強弱を求めることもできる。
【００１９】
本願発明のポリペプチドは、このようにして得られるＩＬ−６と特異的に結合するアミノ酸配列の両端にシステイン残基を導入したものである。このポリペプチドを製造するには、ファージの遺伝子情報（ＤＮＡの塩基配列）に基づき、ＩＬ−６と特異的に結合するアミノ酸配列をコードする遺伝子の５’側及び３’に、システイン残基をコードするコドンが付加された遺伝子をデザインし、これを適当な宿主細胞で発現する等すれば良い。この他にも、例えばＩＬ−６と特異的に結合するアミノ酸配列情報に基づき、そのＮ末端側及びＣ末端側にシステイン残基が付加されたペプチドを、化学合成の手法によりペプチド合成機を用いて直接製造することもできる。
【００２０】
製造された本願発明のポリペプチドがＩＬ−６と特異的に結合し、かつ、ＩＬ−６の生理活性を阻害するか否かは、従来から知られているＩＬ−６の生物活性測定法を用いた評価系により知ることができる。ＩＬ−６の生物活性測定法としては、例えば実施例に示したＭＨ６０ハイブリドーマの増殖を指標とする方法（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻、９５１頁、１９８８年）を例示することができる。
【００２１】
本願発明のペプチドは、ＩＬ−６に対する特異性を有するアミノ酸配列の両端にシステイン残基が導入されたペプチドである。両端に導入されるシステイン残基は各１残基以上であれば良いが、一端又は両端に２以上のシステイン残基を導入しても良い。また本願発明のペプチドでは、Ｎ末端側に導入されたシステイン残基の更にＮ末端側及び／又はＣ末端側に導入されたシステイン残基の更にＣ末端側にシステイン残基以外のアミノ酸残基が存在しても良い。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために発明の実施の形態として実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  ＩＬ−６と特異的に結合するペプチドを含む蛋白質を発現しているファージの選択
市販の９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、１００μｇ／ｍｌの濃度になるように、リコンビナントヒトＩＬ−６（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｅｔｔ．、１２巻、６７３頁、１９９０年）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．６）に溶解した溶液を０．１５ｍｌずつ加え、一晩放置した。翌日、ウェルの溶液を除去した後、０．５％  ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．０２％  ＮａＮ3を含む溶液（ｐＨ８．６）を各ウェルに０．２ｍｌずつ加えて２時間放置し、ブロッキング処理した。
【００２４】
各ウェルに、市販のファージライブラリー（ニューイングランドバイオラボ社製、商品名Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）を２×１０11個のファージ相当分（０．１ｍｌ）ずつ加え、１時間放置した。溶液を除去し、ＴＢＳ−Ｔで１５回洗浄する事によりＩＬ−６と結合しなかったファージを除去した後、溶出液（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．２Ｍグリシン−塩酸溶液（ｐＨ２．２））を加え、ＩＬ−６と特異的に結合したファージを遊離させた。定法により遊離させたファージで大腸菌を感染させ、増殖させ、次のスクリーニング用のライブラリーとした。
【００２５】
上記操作を１つのサイクルとして５サイクル目で選択されたファージで大腸菌を感染させた後、プレートに接種し、一晩放置した。翌日、１００以下のプラークができたプレートから任意に２１クローンを選び、これをそれぞれ別個の大腸菌に感染させ、選択されたファージを調製した。
【００２６】
実施例２  アミノ酸配列の決定
実施例１で選択したファージから、常法によりＤＮＡを抽出し、その塩基配列を決定して該ファージが発現する蛋白質のアミノ酸配列を推定し、類似性を指標としてグループ分けを行った。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
0004253900.tif 000002
【００２８】
表１中、グループ１として示したように、２１クローンのうちＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ、そして、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅというアミノ酸配列を有するクローンが１０クローンと、他の配列を有するものと比較して高い割合で選択された。本実施例の結果から、グループ１のアミノ酸配列、即ちＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ、そして、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅというアミノ酸配列を含む、具体的には配列番号４〜１０のものも、ＩＬ−６と特異的に結合し得ることが明らかになった。
【００２９】
実施例３  ＩＬ−６との結合性の確認
実施例２においてＩＬ−６と特異的に結合し得ると推定されたアミノ酸配列のうち、配列番号１のものについて実際にＩＬ−６との結合性を確認した。
【００３０】
実施例１と同様に、ＩＬ−６を結合したウェルに配列番号１のペプチドを含む蛋白質を発現するファージ溶液を２．６×１０11個のファージ相当分を加え、４０分間放置した後、１５回洗浄し、溶出液（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．２Ｍグリシン−塩酸溶液（ｐＨ２．２））を加えて特異的に結合したファージを遊離し、遊離したファージ数を常法により計数した。同様の操作をＩＬ−６を結合していないウェルについて行い、得られた結果を前記計数結果と比較した。結果を表２に示す。なお表２には、ブロッキング剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）又はＨＣ（ヘモシアニン）を使用して得られた結果をそれぞれ示す。
【００３１】
【表２】
0004253900.tif 000003
【００３２】
なお表２では、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白質を発現するファージが２．６×１０11個相当分含まれる溶液を、ＢＳＡ又はＨＣだけでブロッキング処理したウェルに加えて洗浄後、溶出液で遊離したファージの数をＢＳＡ（Ｘ）、ＨＣ（Ｙ）とし、ファージが２．６×１０11個相当分含まれる溶液をＩＬ−６を結合した後にＢＳＡ又はＨＣだけでブロッキング処理したウェルに加えて洗浄後、溶出液で遊離したファージの数をＩＬ−６＋ＢＳＡ（Ｚ）、ＩＬ−６＋ＨＣ（Ｚ’）としてある。また表２におけるＺ／Ｘ、Ｚ’／Ｙは、ＩＬ−６と有意に結合したファージの割合をそれぞれ示すものである。
【００３３】
表２から、配列番号１のアミノ酸配列はＩＬ−６と特異的に結合することが明らかである。
【００３４】
実施例４  ペプチドの合成
ペプチド合成機を用いて、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１のアミノ酸配列の両端にシステインを含むアミノ酸残基を導入した配列番号１１のペプチドを合成した。
【００３５】
実施例５  ペプチドによるＩＬ−６の生物活性阻害の測定
ＩｇＭタイプの抗ＩＬ−６モノクローナル抗体（αＢＳＦ２−６０）を産生する細胞で、その細胞増殖にはＩＬ−６を要求することからＩＬ−６の生物活性測定法として広く用いられているＭＨ６０ハイブリドーマを用い、実施例４で合成した２種類のペプチドを測定した。
【００３６】
ＭＨ６０細胞の懸濁液を９６穴プレートに５×１０3細胞／穴となるように添加し、ＩＬ−６を５０ｐｇ／ｍｌとなるように添加した。合成したペプチドを２から６００μｇ／ｍｌとなるように希釈して添加し、５％二酸化炭素恒温装置中で３７℃で培養した。６７時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ  ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて参照波長を６５５ｎｍとしたときの４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３７】
この結果を、同じプレート上で８０から６００μｇ／ｍｌとなるように希釈したペプチドを添加したときの吸光度と比較することにより、ペプチドのＩＬ−６阻害濃度を求めた。結果を図１及び図２に示す。
【００３８】
図１はＭＨ６０細胞の増殖に対するＩＬ−６添加濃度の関係について示したものであり、図２はＭＨ６０細胞の増殖に対するペプチドの阻害効果について示したものである。
【００３９】
両端にＣｙｓ残基を導入していない配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、実施例２の結果からＩＬ−６と特異的に結合することが明らかであるが、ＭＨ６０細胞を用いた生理活性測定では阻害効果が認められなかった。一方、このペプチドの両端にシステイン残基を導入した配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドでは、ＭＨ６０細胞を用いた生理活性測定で明らかな阻害効果が認められ、５０％増殖阻害濃度は、２６０μｇ／ｍｌであった。
【００４０】
以上の結果から、ＩＬ−６に対して特異的に結合するアミノ酸配列の両端にシステイン残基を導入した本願発明のポリペプチドは、ＩＬ−６と特異的に結合し、かつ、その生理活性を阻害できることが分かる。
【００４１】
【発明の効果】
本願発明が提供するペプチドは、ＩＬ−６と特異的に結合し、その生理活性を阻害するものである。従って、ＩＬ−６作用抑制剤、強いてはＩＬ−６が引き起こす種々の疾病を予防し又は治療するための医薬品として応用することも可能である。
【００４２】
ＩＬ−６の生理活性を阻害する物質としてＩＬ−６に対する抗体等が知られているが、本願発明のペプチドはこれら既知の物質と比較して低分子であり、前記したような医薬品に応用する場合には経口投与を可能とする効果を有する。更に本願発明のペプチドは通常のペプチド合成機で製造することが可能であり、ＩＬ−６に対する抗体等と比較してその製造コストが極めて安いという効果も奏するものである。
【００４３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Tosoh Corporation
<120> ＩＬ−６に特異的に結合し生理活性を阻害するペプチド
<130> ２１０−９７５０
<160> 4
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 1
Lys Leu Trp Thr Ile Pro Gln                7
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 2
Pro Ser Leu His Phe Lys Gln                7
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 3
Ser Lys Val Tyr His Pro Arg                7
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 4
Lys Leu Trp Thr Ile Pro Met                7
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 5
Lys Leu Trp Val Ile Pro Gln                  7
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 6
Lys Leu Trp Ser Ile Pro Arg                  7
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 7
Lys Val Trp Tyr Ile Thr Pro                  7
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 8
Lys Val Trp Val Leu Pro Ile                  7
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 9
Lys Val Phe Leu Leu Pro Arg                7
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合するアミノ酸配列
<400> 10
Lys Val Phe Asn Trp Pro Trp                  7
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＩＬ−６に特異的に結合しその生理活性を阻害するペプチド
<400> 11
Gly Gly Cys Lys Leu Trp Thr Ile Pro Gln Cys Gly Gly      13
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例５で行ったＭＨ６０細胞の増殖に対するＩＬ−６添加濃度の影響について示すものである。図中縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を、横軸はＩＬ−６濃度をそれぞれ示す。
【図２】図２は、実施例５で行ったＭＨ６０細胞の増殖に対する２種類のペプチドの阻害効果について示すものである。図中縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を、横軸はペプチドの濃度をそれぞれ示し、黒三角は配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの、そして黒四角は配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドの結果である。
【図１】
0004253900.tif 000004
【図２】
0004253900.tif 000005