(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換された糸状菌の生成方法であって、
（１）  糸状菌に導入されるべき少なくとも１つの発現可能な遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、まずアグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のベクター中に、そのベクター中に存在するＴ−ＤＮＡボーダー間にクローニングし；
（２）  Ｔ−ＤＮＡボーダー間に上記ＤＮＡフラグメントを含むベクターを、ＤＮＡ中にｖｉｒ領域を含むアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株に導入し；
（３）  ｖｉｒ誘導化合物の添加によって上記アグロバクテリウム・トゥメファシエンスから上記ＤＮＡフラグメントを含むＴ−ＤＮＡを放出させ、形質転換されるべき糸状菌とともにこのアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株をインキュベートし；そして
（４）  形質転換された糸状菌を、導入されたＤＮＡ又はその発現生成物の特徴に依存して非形質転換糸状菌から選択すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
工程（４）において、前記形質転換された糸状菌を選択した後に培養することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
糸状菌が、真菌類（Eumycota）の群に属する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
糸状菌が、子嚢菌類（Ascomycotina）、担子菌類（Basidiomycotina）、不完全菌類（Deuteromycotina）、鞭毛菌類（Mastigomycotina）、及び接合菌類（Zygomycotina）の菌類亜門からなる群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡフラグメントが、所望の遺伝子の複数のコピーを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡフラグメントが、糸状菌ゲノムの選択された遺伝子座に組み込まれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡフラグメントが、糸状菌ゲノムのｐｙｒＧ遺伝子座（黒色アスペルギルス（A. niger）についてはｐｙｒＡ遺伝子座及びアカパンカビ（Neurospora crassa）についてはｐｙｒ４遺伝子座として知られる）に組み込まれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
形質転換された糸状菌が、周縁リピート、ボーダー、Ｔ−ＤＮＡボーダー、またはボーダー配列、あるいはそれらの組合せを含む２４塩基対の不完全なダイレクトリピートを含まない、請求項６記載の方法。
【請求項９】
周縁リピート、ボーダー、Ｔ−ＤＮＡボーダー、またはボーダー配列、あるいはそれらの組合せを含む２４塩基対の不完全なダイレクトリピートを含まない、請求項８記載のアグロバクテリウム媒介性形質転換によって得られる形質転換された糸状菌。
【請求項１０】
所望のタンパクの生産を誘導することを含む、請求項９記載の形質転換された糸状菌の培養方法。
【請求項１１】
ＤＮＡフラグメントが、糸状菌ゲノム中にランダムに組み込まれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ−ＤＮＡボーダー配列の１又は２以上の部分を含む、請求項１１記載のアグロバクテリウム媒介性形質転換によって得られる形質転換された糸状菌。
【請求項１３】
所望のタンパクの生産を誘導することを含む、請求項１２記載の形質転換された糸状菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、糸状菌、特にアスペルギルス（Aspergillus）属に属する糸状菌の形質転換に関する。
発明の背景及び先行技術
（1）微生物のための一般的形質転換技術
組換えＤＮＡ技術において、細菌及び酵母のための形質転換技術はよく開発されているが、糸状菌についての形質転換頻度は比較的低い。
例えば、細菌Escherichia coli（大腸菌）の遺伝子形質転換においては、化学的形質転換法を用いて約５×１０8形質転換体／μｇベクターＤＮＡという形質転換頻度がルーチンに得られている。約３．５％の生存可能な細胞が形質転換された（Hanahan; J. Mol. Biol.１６６（１９８３） ５５７−５８０）。もっと最近では、１０9〜１０10形質転換体／μｇベクターＤＮＡという、更に高い頻度が、高電圧エレクトロポレーション（電気穿孔法）の後に報告された（Dower et al.; Nucleic Acids Research １６（１９８８） ６１２７−６１４５）。他の細菌については、より低い形質転換頻度が記載されている（例えば、Chassy and Flickinger; FEMS Microbiology Letters ４４（１９８７） １７３−１７７； Miller et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５（１９８８） ８５６−８６０）。酵母については、ベクターＤＮＡ１μｇあたり１×１０7までの形質転換頻度が得られている（Meilhoc et al.; Bio/Technology ８（１９９０） ２２３−２２７；及びGietz et al.; Yeast １１（１９９５） ３５５−３６０）。
糸状菌については、形質転換頻度は以下のように変化する：
-  Agaricus bisporusについて、わずか０．１〜０．５形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Van Rhee et al.; Mol. Gen. Genet. ２５０（１９９６） ２５２−２５８）から、
-  Fusarium graminearum Ａ３／５について、５形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Royer et al.; Bio/Technology １３（１９９５） １４７９−１４８３）を経て、
-  Aspergillus awamoriについて、約１２形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Ward et al.; Experimental Mycology １３（１９８９） ２８９−２９３）、及び
-  Aspergillus nidulansについて、２０〜３００形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Yelton et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８１（１９８４） １４７０−１４７４）、
-  Neurospora crassaについて、約１０4形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Volmer and Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ８３（１９８６） ４８６９−４８７３）まで。
糸状菌の形質転換に関する総説記事については、以下の記事が参照される：
-  John R.S. Finchamによる「Transformation in Fungi」、Microbiological Reviews（１９８９年３月）の１４８〜１７０頁に刊行されたもの。菌類、すなわち酵母及び糸状菌の両方についての可能な形質転換方法の概略を与える。
-  Timberlake, W.E.及びMarshall, M.A.による「Genetic engineering of filamentous fungi」、Science ２４４（１９８９） １３１３−１３１７。
-  David B. Finkelsteinによる「Transformation」（「Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products」（１９９２）という書籍の第６章、１１３〜１５６頁、Finkelstein and Ball編）。
これらの文献から、より多くの数の糸状菌類を形質転換するためにいくつかの形質転換技術が開発されてきたことは明白である。ほとんどの形質転換プロトコールは、プロトプラストを利用する。プロトプラストは、Trichoderma reesei由来の多酵素調製物であるＮｏｖｏｚｙｍｅ ２３４Rを用いて、菌糸培養物又は発芽中の分生子から調製することができる。ＤＮＡでのプロトプラストの形質転換は、エレクトロポレーションによって、又はＣａＣｌ2とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との組み合わせによって、媒介される。いくつかの代替的な方法は、プロトプラストの作製の必要性を回避し、手順をより迅速で簡便にしている。インタクトな細胞は、リチウムアセテート及びＰＥＧの組み合わせ、粒子砲撃法（particle bombardment）（Lorito et al.; Curr. Genet. ２４（１９９３） ３４９−３５６、及びHerzog et al.; Appl. Microbiol. Biotechnol. ４５（１９９６）３３３−３３７）、又はエレクトロポレーション（Ozeki et al.; Biosci. Biotech. Biochem. ５８（１９９４） ２２２４−２２２７）を用いて形質転換することができる。
細菌及び酵母の形質転換頻度に関して比較的低い糸状菌の形質転換頻度の観点から、糸状菌におけるより高い形質転換頻度に対する必要性が存在する。
（2）アグロバクテリウムを用いる植物形質転換
植物のために開発された別の形質転換技術は、感染した双子葉植物の傷部位にクラウンゴール腫瘍を起こすグラム陰性土壌細菌であるAgrobacterium tumefaciensの使用に基づいている。腫瘍誘導の間、アグロバクテリウムは、植物細胞に付着し、次にその腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドの一部分である移入ＤＮＡ又はＴ−ＤＮＡを細胞に移入し、その移入されたＤＮＡ又はＴ−ＤＮＡは、細胞で植物核ゲノムに組み込まれる。Ｔ−ＤＮＡは、２４塩基対の不完全なダイレクトリピートに挟まれている。これらのダイレクトリピートは、「周縁リピート」又は「ボーダー」又は「Ｔ−ＤＮＡボーダー」又は「ボーダー配列」又はこれらの組合わせとしても知られている。Ｔ−ＤＮＡは、１セットの遺伝子を含む。これらの遺伝子のサブセットであるｏｎｃ遺伝子の発現は、植物細胞の増殖及び腫瘍の形成を誘導する植物ホルモンの産生をもたらす。移入のプロセスは、Ｔｉプラスミドにコードされている１セットの毒性遺伝子の誘導に依存する。移入系は、ＶｉｒＡがアセトシリンゴン（ＡＳ）のような傷を受けた植物からの誘導化合物を感知したときに活性化される。転写活性化因子ＶｉｒＧを介して、残りのｖｉｒ遺伝子座が活性化され、線状一本鎖ＤＮＡであるＴ−ストランドが、ｖｉｒＤ１／Ｄ２にコードされた部位特異的エンドヌクレアーゼによるボーダーリピートへのニック導入の後に産生される。ＶｉｒＤ２タンパクは、共有結合により５′末端に付着したままとなる。Ｔ−ストランドは、一本鎖結合タンパクＶｉｒＥによってコートされ、生じる複合体が植物細胞に移入される。Ｔ−ＤＮＡ複合体が細菌から植物細胞に移送されるメカニズムは充分に理解されていないが、Ｔ−ＤＮＡ複合体はｖｉｒＢオペロンによってコードされるタンパクからなる膜貫通構造を通じてアグロバクテリウム細胞を去ると考えられている。Agrobacterium tumefaciens形質転換に関する広範な総説については、Hooykaas and Schilperoort（Plant Molecular Biology ９１（１９９２） １５−３８）及びHooykaas and Beijersbergen（Annu. Rev. Phytopathol. ３２（１９９４） １５７−１７９）を参照されたい。Agrobacterium tumefaciensがそのＴ−ＤＮＡを植物細胞（そこでそれがその核ゲノムに安定に組み込まれる）に移入する能力は、植物及び植物細胞への遺伝子移入のためのこの生物の広く行き渡った使用をもたらしてきた。Agrobacterium tumefaciens形質転換の後に植物の再生を可能にするためには、Ｔ領域のｏｎｃ遺伝子は、欠失されており、これは、武装解除した又は非発ガン性のＴ−ＤＮＡをもたらす。植物形質転換のために、２つのタイプのベクター系が開発されてきた。第一はバイナリー系であり、この中では、新規な遺伝子が人工的Ｔ−ＤＮＡを含有するプラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー間にクローニングされる。このプラスミドは、続いて、インタクトなｖｉｒ領域を有するがＴ領域を欠くＴｉプラスミドを持つアグロバクテリウム株へと導入される（Hoekema et al.; Nature ３０３（１９８３） １７９−１８０、及びBevan; Nucl. Acids Res. １２（１９８４） ８７１１−８７２１）。第二は共組み込み（co-integrate）系であり、この中では、新規な遺伝子は、インタクトなｖｉｒ領域を有するＴｉプラスミド上に既に存在する人工Ｔ−ＤＮＡ中に相同組換えを介して導入される（Zambryski et al.; EMBO J. ２（１９８３） ２１４３−２１５０）。
多様な植物種がこのような系を用いて形質転換されてきた。これには、多くの農業的に重要な双子葉類の種、例えばジャガイモ、トマト、大豆、ヒマワリ、サトウダイコン及びワタが含まれる（総説については、Gasser and Fraley; Science ２４４（１９８９） １２９３−１２９９）を参照されたい）。単子葉類植物のアグロバクテリウム形質転換は、長い間不可能であるように思われてきたが、現在では、トウモロコシ（Ishida et al.; Nature-Biotechnology １４（１９９６） ７４５−７５０）及びイネ（Almeida and Hodges; Planta １９９（１９９６） ６１２−６１７）のようないくつかの種がアグロバクテリウムを用いて形質転換されている。なぜこの方法が植物形質転換において広く用いられてきたかの理由の１つは、その高い形質転換頻度である。例えば、タバコプロトプラストとの共培養実験においては、約２５％の微小カルス（アグロバクテリウムとの共培養後にプロトプラストから再生されたもの（平均２０％））が、形質転換された（Depicker et al.; Mol. Gen. Genet. ２０１（１９８５） ４７７−４８４、及びVan den Elzen et al.; Plant Molecular Biology ５（１９８５） １４９−１５４）。これは、約５％までの細胞が形質転換されることを意味する。更に、この方法は、裸のＤＮＡを用いる他の植物形質転換法と比較してはるかに容易である。それは、葉、茎、根及び塊茎の部分のようなインタクトな植物組織に適用可能である。その上、この方法は、導入されるべき外来ＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡのみが植物ゲノムに組み込まれるという利点を有する。細菌においてベクターの選択及び複製に必要なベクター配列は、細菌から植物細胞に移送されない。したがって、これは比較的清浄な形質転換方法である。
別のアグロバクテリウム種であるAgrobacterium rhizogenesは、同様の天然の遺伝子移入系を有する。
（3）アグロバクテリウムを用いる微生物の形質転換
Agrobacterium tumefaciensを用いる植物の形質転換に関する多くの刊行物に加えて、最近、微生物を形質転換するためのAgrobacterium tumefaciensの使用に関するいくつかの研究の結果が刊行された。Beijersbergenら（Science ２５６（１９９２） １３２４−１３２７）は、A. tumefaciensの毒性系が、アグロバクテリウム間の接合移入を媒介できることを明らかにしたが、これは同じ種の異なる株の形質転換のみに関する。
Bundockら（EMBO J. １４（１９９５） ３２０６−３２１４）は、この土壌細菌による酵母の形質転換の成功について報告した。この結果は、続いてPiersら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６） １６１３−１６１８）によって確認された。両グループとも、酵母においてＴ−ＤＮＡを安定化するために、酵母２μ由来（Bundock et al.; EMBO J. １４（１９９５） ３２０６−３２１４）又は酵母テロメア配列及びＡＲＳ１複製起点（Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６） １６１３−１６１８）のようなS. cerevisiaeからのＤＮＡ配列を用いた。ごく最近、Risseeuwら（Mol. Cell. Biol. １６（１９９６） ５９２４−５９３２）及びBundockとHooykaas（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６） １５２７２−１５２７５）は、S. cerevisiaeにおけるＴ−ＤＮＡ組み込みのメカニズムに関する結果を報告した。
これらの刊行物によって利用可能にされたデータは、Agrobacterium tumefaciensによる微生物の形質転換は、植物のそれよりもはるかに効率が悪いことを示す。上述したように、植物においては約５％までの細胞が形質転換されているが、酵母については、はるかに低い形質転換細胞／レシピエント細胞の比が報告されており、具体的には３×１０-3（Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６） １６１３−１６１８）及び３．３×１０-6（EMBO J. １４（１９９５） ３２０６−３２１４）である。
更に、微生物のA. tumefaciensによる形質転換は、微生物についての従来の形質転換技術よりも効率が低いことが証明された。通常、裸のＤＮＡ移入についての形質転換頻度は、ベクターＤＮＡ１μｇあたりの形質転換体の数として表されるが、一方、A. tumefaciens形質転換についての形質転換頻度は、しばしばレシピエント細胞の数に関して得られ得る形質転換細胞の数として表現される。酵母の従来の形質転換に関する先行する刊行物（Gietz et al.; Yeast １１（１９９５） ３５５−３６０）において、形質転換体／μｇベクターＤＮＡに関する数字とレシピエント細胞あたりの形質転換細胞に関する数字との両方が与えられており、これは、形質転換頻度を計算する２つの方法の間のリンクを与える。Ｇｉｅｔｚらは、そのＬｉＡｃ／ＳＳ−ＤＮＡ／ＰＥＧ手順を用いて反応中の最大約４％の酵母細胞が形質転換され得たこと、すなわち４×１０-2までの形質転換頻度であったことを決定した。この刊行物の図１Ａ及び対応する説明から、この４％が８×１０5形質転換体／μｇベクターＤＮＡに相当することを計算することができる。酵母のA. tumefaciens形質転換については、報告された最大の形質転換頻度は、３×１０-3（Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６） １６１３−１６１８）及び３．３×１０-6（Bundock et al.; EMBO J. １４（１９９５） ３２０６−３２１４）であり、これは、Ｇｉｅｔｚらにより報告された裸のＤＮＡを用いる酵母の最大形質転換頻度（４％）よりも、それぞれ約１０又は１０，０００倍低い。
したがって、この証拠に基づいて、A. tumefaciensは、微生物の形質転換のための更なる有望な道具であるようには思われない。これは、A. tumefaciensを用いて得られる形質転換頻度は、酵母の従来の形質転換方法よりはるかに低いからである。
発明の概要
本発明は、アグロバクテリウムを糸状菌の形質転換に用いるというアイデアに基づいている。たった１つの酵母種、すなわちSaccharomyces cereviciaeを用いて得られた、すぐ上に示した低い形質転換頻度にもかかわらず、本発明者らは、糸状菌Aspergillus awamoriのAgrobacterium tumefaciens媒介性形質転換を研究することを決定した。Aspergillus awamoriは、酵素、タンパク及び代謝産物の生産について重要な糸状菌であるが、上記の数字によって示されるように従来の糸状菌形質転換技術は比較的効率が悪いという不利な点を有する（Wardらを参照されたい）。
驚くべきことに、Agrobacterium tumefaciensを用いる植物形質転換技術が、糸状菌Aspergillus awamoriに成功裏に適用可能であることが見出された。いくつかの実験の後、１０7個のレシピエント細胞あたり７０００個を超える形質転換体の形質転換頻度が得られたが、これは、従来の形質転換を用いて得られた形質転換頻度の約４００倍である（以下の実施例１を参照されたい）。続いて、この技術は、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Fusarium solani pisi（ＣＢＳ  ２３０．３４）、Fusarium graminearum（ＡＴＣＣ  ２０３３４）、Trichoderma reesei（ＣＢＳ  ３８３．７８）、Colletotrichum gloeosporiodes（ＣＢＳ  ８６２．７０）、Neurospora crassa（ＣＢＳ  １９５．５７），Pleurotus ostreatus（Ｓｏｍｙｃｅｌ  3015株;「Proefstation voor de Champignoncultuur」から購入したもの）、及びAgaricus bisporus（Ｈｏｒｓｔ Ｕ１市販株、これも「Proefstation voor de Champignoncultuur」から購入したもの）を含め、多様な糸状菌に成功裏に適用された。以下の表１に示すように、これらの糸状菌は、異なる分類学的背景に属する。以下の表２は、Eumycotaの各門内の属及び種のおよその数を与える。Mastigomycotina亜門は、Chytridiomycetes及びOomycetesを含む。実施例１１に記載したように、Agaricus bisporus Ｈｏｒｓｔ  Ｕ１株の直接の形質転換は、以前には行われたことがなかった。したがって、本発明は、この商業的に重要なＨｏｒｓｔ  Ｕ１株の直接の形質転換を初めて提供する。
したがって、広い意味において、本発明は、糸状菌（糸状菌類firamentous fungiとしても知られる）の形質転換に関する。以下に与える実施例は、合わせて糸状菌種の約９５％を構成するEumycotaの３つの主要な亜門を表す（表２を参照されたい）。
0004307563.tif 000002
0004307563.tif 000003
Colletotrichum gloeosporioidesについては、本発明の方法は、裸のＤＮＡ移入について刊行されている頻度よりも約５〜１０倍優れている（実施例５を参照されたい）。Fusarium graminearum（実施例７を参照されたい）、Neurospora crassa（実施例８を参照されたい）、Trichoderma reesei（実施例９を参照されたい）、及びPleurotus ostreatus（実施例１０を参照されたい）のような試験した他の糸状菌のいくつかは、アグロバクテリウム形質転換の後、最適な裸のＤＮＡ移入方法と同様の形質転換頻度を与えた。糸状菌Aspergillus nidulans、Aspergillus niger及びFusarium solaniは、アグロバクテリウム形質転換の後、裸のＤＮＡ移入よりも低い形質転換頻度を与えた。Aspergillus種については、これは、おそらく形質転換体の選択に伴う問題によって引き起こされている（実施例３及び４を参照されたい）。その他の糸状菌の形質転換は最適化されていないことは注意されるべきである。植物におけるアグロバクテリウム形質転換での経験に基づいて、形質転換効率が更に増大され得る可能性が高い。
これらの糸状菌の多くは、工業、農業及び基礎生物学研究において重要である。
例えば、Aspergillus awamori、Aspergillus niger、Trichoderma reesei、及びFusarium graminearumは、相同及び非相同タンパクの大量生産について魅力的な宿主であることが示されている（Van den Hondel et al.;「Heterologous gene expression in firamentous fungi」（第１８章）、書籍「More Gene Manipulations in Fungi」（１９９１）中、３９７〜４２８頁、Bennett及びLasure編； Verdoes et al.; Appl. Microbiol. Biotechnol. ４３（１９９５） １９５−２０５； Royer et al.; Bio/Technology １３（１９９５） １４７９−１４８３）。これらは、実質的な量のタンパクを培地中に分泌する能力を有し、大量発酵が一般によく確立されており、そして、それらは、ＧＲＡＳ（一般に安全であるとの認識）地位を有し、それが、これらの種を食品及び食品加工産業において使用することを可能にする。
更に、糸状菌Fusarium graminearum Ａ３／５、ＱｕｏｒｎR  マイコタンパク菌類は、英国において１０年以上にわたって商業的な人間の食品源として用いられてもきた（Royer et al.; Bio/Technology １３（１９９５） １４７９−１４８３）。
糸状菌Fusarium solani及びColletotrichum gloeosporioidesは、菌類の病原因子である（Marek et al.; Curr. Genet. １５（１９８９） ４２１−４２８； Hwang et al.; The Plant Cell ７（１９９５） １８３−１９３）。
Aspergillus nidulans及びNeurospora crassaの両方は、遺伝メカニズム、生化学的経路及び細胞生理学の基礎研究のための重要な生物であった（Vollmer and Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８３（１９８６） ４８６９−４８７３；書籍「Aspergillus: 50 year on」（１９９４）、Martinelli及びKinghorn編）。
きのこ類Pleurotus ostreatus及びAgarucus bisporusは、食用であり、商業的に重要である。本発明の方法を用いた成功裏の形質転換は、実施例１０及び１１に記載されている。
１つの発現可能な遺伝子がこれらの糸状菌に導入され得るだけでなく、このような遺伝子の複数コピーさえも、そのうえ例えば染色体ｐｙｒＧ遺伝子座にターゲティングすることも可能であることが更に見出された。これらの複数コピーは、所望の相同又は非相同タンパクをコードする遺伝子のものであることができる。本発明のこの態様は、実施例１２に説明されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＵＲ５７５０の構築を示す。構築スキームにおいて使用されている略号の説明は、以下のとおりである：
ＲＢ＝右Ｔ−ＤＮＡボーダー、
Ｐｎｏｓ＝ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター配列、
ｎｐｔII＝Ｔｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子のコード領域、
Ｔｏｃｓ＝オクトピンシンターゼ遺伝子のターミネーター配列、
ＴｔｒｐＣ＝A. nidulans trpC遺伝子由来のターミネーター配列、
ｈｐｈ＝E. coli由来のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコード領域、
Ｐｇｐｄ＝A. nidulans gpd遺伝子のプロモーター配列、
ＬＢ＝左Ｔ−ＤＮＡボーダー。
図２は、プラスミドｐＵＲ５７５１の構築を示す。構築スキームにおいて使用されている略号の説明は、以下のとおりである：
ＡＭＡ１＝Aspergillus nidulans由来のＡＭＡ１プラスミドレプリケーター。
図３は、８つの独立のAspergillus awamori形質転換体（ｎｒ．１〜８）のサザーンブロットのオートラジオグラフを示す。ゲノムＤＮＡをＢｇｌII又はＨｉｎｄIIIで消化し（パネル１）又は消化しなかった（パネル２）。「Ｍ」は、１ｋｂのＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）を表し、ハイブリダイズするバンドは、１．６ｋｂマーカーフラグメントを表す。「Ｎ」（上のパネル中）は、非形質転換糸状菌組織の陰性対照試料である。
図４は、９つの独立の糸状菌形質転換体のサザーンブロットのオートラジオグラフを示す。番号１及び２は、Aspergillus niger形質転換体、番号５及び６は、Trichoderma reesei形質転換体、番号７及び８は、Fusarium graminearum形質転換体、番号９及び１０は、Neurospora crassa形質転換体、及び番号１１は、Colletotrichum gloeosporioides形質転換体である。レーン３、４及び１２は、ＤＮＡを含んでいなかった。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIII（上のパネル）又はＢｇｌII（下のパネル）で消化した。「Ｐ」（上のパネル中）は、陽性対照を表し、これは、Aspergillus awamori形質転換体７の未消化ＤＮＡである（図３を参照されたい）。「Ｎ」（下のパネル中）は、非形質転換糸状菌の陰性対照である。「Ｍ」は、１ｋｂのＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）を表し、ハイブリダイズするバンドは、０．５及び１．６ｋｂのマーカーフラグメントを表す。
図５は、４つの独立のAgaricus bisporus形質転換体（ｎｒ．１〜４）のサザーンブロットのオートラジオグラフを示す。ゲノムＤＮＡをＢｇｌIIで消化し（１Ｂ〜４Ｂを参照されたい）、又は消化しなかった（１Ｕ〜４Ｕを参照されたい）。「Ｍ」は、１ｋｂのＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）を表す。
図６は、糸状菌A. awamori中の遺伝子の複数コピーの部位特異的組み込みのための方法の実験デザインを示す。
Ａ．  野生型ｐｙｒＧ遺伝子を、図の上部に描く。この遺伝子のコード領域は、明灰色を付けた四角で示す。
Ｂ．  この下には、ｐｙｒＧ遺伝子の残りの非機能的５′部分を含む標的遺伝子座及びA. awamoriのＡＷＣＳＣＥ株の染色体ｐｙｒＧ遺伝子座の３′フランキング配列を示す。この株は、ｐｙｒＧ遺伝子の残りの５′部分の下流に位置するＩ−ＳｃｅＩ部位を他の目的に使用した他の形質転換実験についても使用された。「ＳａｌＩ−Ｉ−ＳｃｅＩ−ＨｉｎｄIII」は、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄIII部位に隣接したＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼのための１８ｂｐの認識部位（５′−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３′=配列番号１）を含む合成ＤＮＡリンカーを意味する。Ｉ−ＳｃｅＩは、Saccharomyces cerevisiae由来の切断部位の稀な（レアカッターの）制限エンドヌクレアーゼである。
Ｃ．  ＡＷＣＳＣＥ株に導入されたフラグメントは、染色体標的位遺伝子座でｐｙｒＧ遺伝子の残りの５′部分に部分的に相同なｐｙｒＧ遺伝子の非機能的３′部分、単数又は複数の所望のタンパクをコードする単数又は複数の構造遺伝子を含む１又は複数の遺伝子コピー（暗灰色を付けた四角１、２及びｎで示される）、及び標的遺伝子座でＩ−ＳｃｅＩ部位のすぐ下流に存在する配列に相同なｐｙｒＧ遺伝子座由来の更なる配列を含む。このフラグメントは、Agrobacterium tumefaciensのベクター中に、そのベクター中に存在するＴ−ＤＮＡボーダー間に存在し、このベクターは、ｖｉｒ領域を含むAgrobacterium tumefaciens株中にそのＤＮＡ中に導入される。
Ｄ．  相同組換えの後、インタクトなｐｙｒＧ遺伝子が回復され、複数の遺伝子コピーが同時にｐｙｒＧ遺伝子座に組み込まれる。これは、図の下方に説明されている。
図７は、プラスミドｐＵＲ５７１０、ｐＵＲ５７１１、及びｐＵＲ５７１２の構築を示す。この構築スキームにおいて用いられている略号は、以下のとおりである：
ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子
ｐｙｒＧ＝A. awamori由来のｐｙｒＧ遺伝子、‘ｐｙｒＧ又はｐｙｒＧ’は、この遺伝子がそれぞれ５′又は３′末端で短縮されていることを示す。
図８は、プラスミドｐＵＲ５７１３（図８Ａ）及びｐＵＲ５７１４（図８Ｂ）の構築を示す。この構築スキームにおいて用いられている略号は、以下のとおりである：
ｐＢＳ−ＳＫ＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR−ＳＫ。
図９は、プラスミドｐＵＲ５７１６及び５７１８の構築を示す。この構築スキームにおいて用いられている略号は、以下のとおりである：
ｃｏｓ＝ｃｏｓ部位。
図１０は、プラスミドｐＵＲ５７２９の構築を示す。この構築スキームにおいて用いられている略号は、以下のとおりである：
ＰｅｘｌＡ＝A. awamoriの１，４−β−エンドキシラナーゼＡ遺伝子のプロモーター配列、
ｃｕｔ＝F. solani pisiクチナーゼ遺伝子のコード領域（ｃＤＮＡの合成コピー）、
ＴｅｘｌＡ＝A. awamoriの１，４−β−エンドキシラナーゼＡ遺伝子のターミネーター配列。
図１１は、コスミドｐＵＲ５７２５の構築を示す。
図１２は、プラスミドｐＵＲ５７５６の構築を示す。図１０〜１２については、「ｃｕｔ」又は「ｃｕ」は、クチナーゼ発現カセットを示すために使用した。
発明の詳細な説明
本発明は、
（１）糸状菌に導入されるべき少なくとも１つの発現可能な遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、最初に、Agrobacterium tumefaciensのベクター中に、そのベクター中に存在するＴ−ＤＮＡ間にクローニングし；
（２）Ｔ−ＤＮＡボーダー間にＤＮＡフラグメントを含むベクターを、ｖｉｒ領域をＤＮＡ中に含むAgrobacterium tumefaciens株中に導入し；
（３）上記Agrobacterium tumefaciensから、ｖｉｒ誘導化合物を添加することによって上記ＤＮＡフラグメントを含むＴ−ＤＮＡを放出させ、このAgrobacterium tumefaciensを、形質転換されるべき糸状菌とともにインキュベートし；そして、
（４）導入されたＤＮＡ又はその発現生成物の特徴に依って、形質転換された糸状菌を形質転換されていない糸状菌から選択し、
そして場合によっては、形質転換された糸状菌を培養すること
を特徴とする、形質転換された糸状菌の生成方法を提供する。
形質転換された糸状菌の選択は、選択可能なマーカーを使用することによって行うことができる。例えば、このような選択可能なマーカーは、天然の、野生型の糸状菌株に特徴的であるが、一方、形質転換されるべき糸状菌株はその突然変異株であって、その選択可能なマーカー、例えば野生型Aspergillus awamoriには存在するオロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ遺伝子）が欠損している。好適な選択可能なマーカーとしては、抗生物質耐性マーカー、その糸状菌株においては通常用いられない代謝産物の利用のための遺伝子、及びアッセイの容易な生成物を産生させる遺伝子が挙げられる。
糸状菌に導入されたＤＮＡは、しばしば選択可能なマーカーとして使用することができる。例えば、導入されたＤＮＡが発現された場合、それは、形質転換されていない糸状菌では産生されないが、多かれ少なかれアッセイ可能な生成物をもたらしうる。あるいは、ＤＮＡの存在又は非存在を、ＰＣＲ技術を適用することにより決定することができる。
好ましくは、糸状菌は、Eumycotaの菌類門に属し、より好ましくは、菌類亜門：
-  Ascomycotina、これは、種Aspergillus nidulans及びNeurospora crassaを含む、
-  Basidiomycotina、これは、Bjerkandera、Coprinus、Coriolus種、及び種Agaricus bisporus、Flammulina velutipes（エノキタケ）、Lentinus edodes（シイタケ）、Phanerochaete chrysosporium、Schizophyllum commune、Trichoderma matsutake、及びPleurotus ostreatusを含む、
-  Deuteromycotina、これは、Beauveria及びMetarhizium種（昆虫に対する生物学的防除剤として好適である）、Acremonium及びPenicillium種（抗生物質の生産に好適である）及び種Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Fusarium solani、Fusarium graminearum、Trichoderma reesei、及びColletotrichum gloesporioidesを含む、
-  Mastigomycotina、これはAchiya（医薬的に活性なタンパクの生産に好適である）、Phytophtora、Pythium、及びPlasmopara種を含むOomycetesと、Rhizophydium及びRhizophlyctis種を含むChytridiomycetesとを含む、及び
-  Mucor及びRhizopus種を含むZygomycotina
の１つに属する。
本発明の好ましい態様においては、ＤＮＡフラグメントが所望の遺伝子の複数のコピーを含んでいる方法が提供される。あるいは、ＤＮＡフラグメントは、いくつかの遺伝子の少なくとも１つのコピーを含んでいてもよく、又は、融合遺伝子の１又は２以上のコピーを含んでいてもよい。
本発明の別の好ましい態様によれば、ＤＮＡフラグメントは、糸状菌ゲノムの選択された遺伝子座に組み込まれる。そのような選択された遺伝子座の一例は、糸状菌ゲノムのｐｙｒＧ遺伝子座（これは、A. nigerについてはｐｙｒＡ遺伝子座、そしてNeurospora crassaについてはｐｙｒ４遺伝子座として知られている）である。これは、Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む望ましくない細菌ＤＮＡ配列をまったく含まない形質転換された糸状菌の作製を可能にする。
したがって、本発明は、本発明にしたがったアグロバクテリウム媒介性形質転換によって得られる、Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む望ましくない細菌ＤＮＡ配列をまったく含まない形質転換された糸状菌を提供する。このような形質転換された糸状菌は、所望のタンパクを生産するために形質転換された糸状菌を培養するための方法において用いることができる。
本発明の別の態様によれば、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列の１又は２以上の部分を含む、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって得られる形質転換された糸状菌と同様に、ＤＮＡフラグメントが糸状菌ゲノム中にランダムに組み込まれる方法、及び所望のタンパクを生産するためのこのような形質転換された糸状菌の培養方法が提供される。
猛毒性A. tumefaciens株の使用は、それらが比較的高い形質転換頻度を与えるので、好ましい。このような株、その使用及びそのような株の作製のためのベクターは、文献に記載されている。植物形質転換についてはJinら（J. Bacteriology １６９（１９８７） ４４１７−４４２５及びMolecular Microbiology ７（１９９３） ５５５−５６２）、Raineriら（BIO/TECHNOLOGY ８（January １９９０） ３３−３８）及びIshidaら（Nature Biotechnology １４（１９９６） ７４５−７５０）、及び酵母の形質転換についてはPiersら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６）１６１３−１６１８）を参照されたい。
形質転換は、アグロバクテリウムを用いる植物形質転換に関するセクション（２）において上述したような植物形質転換について公知の方法と同様の方法で共組み込みによって又はバイナリー系によって行うことができる。
プロトプラスト、分生子胞子、発芽胞子、菌糸体、及びペレットを含むすべてのタイプの糸状菌組織を用いることができ、これらのうち、プロトプラスト、分生子及び再水和された凍結乾燥培養物材料を以下に例示する。
アグロバクテリウム媒介性形質転換の利点としては、以下のものが挙げられる：
-  「食品等級」の方法であり、細菌の抗生物質耐性マーカー、又は複製起点のような他の細菌性配列の残存がない糸状菌株をもたらす。
-  より大きい部分のＤＮＡを導入することができる。約４０ｋｂまでのＤＮＡを導入することができる裸のＤＮＡでの糸状菌形質転換の古い方法とは対照的に、アグロバクテリウム媒介性植物形質転換を用いると、少なくとも１５０ｋｂの外来ＤＮＡを植物ゲノム中に導入することができる（Hamilton et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９３） ９９７５−９９７９）。
実施例
本発明を、用いた材料及び方法の記載に続いて、以下の実施例１〜１２によって例示する。これらの実施例は、プロトプラスト（実施例１）及び分生子（実施例２）の両方のA. awamori、A. nidulansの分生子（実施例３）、A. nigerの分生子（実施例４）、Colletotrichum gloeosporioides（実施例５）、Fusarium solani pisiの分生子（実施例６）、分生子及び再水和された凍結乾燥されたＡＴＣＣの材料の両方のFusarium graminearum（実施例７）、Neurospora crassaの分生子（実施例８）、Trichoderma reeseiの分生子（実施例９）、Pleurotus ostreatusの分生子（実施例１０）、及びAgaricus bisporusの分生子（実施例１１）の形質転換を示す。更に、実施例１２は、ｐｙｒＧ遺伝子座にクチナーゼ発現カセットの複数のコピーを導入することによるA. awamoriの形質転換を示す。
材料及び方法
細菌及び糸状菌株
細菌クローニングについては、Escherichia coli株ＤＨ５α（ゲノタイプ：Ｆ-、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒk-ｍk+）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｌａｍｂｄａ-、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃＩＺＹＡ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ（ｐｈｉ８０ｄ−（ｌａｃｚ）ΔＭ１５）； Hanahan; J. Mol. Biol. １６６（１９８３） ５５７−５８０）を用いた。Agrobacterium tumefaciens株ＬＢＡ１１００を、糸状菌の形質転換に用いた（Beijersbergen et al.; １９９２，Science ２５６，ｐ．１３２４−１３２７）。糸状菌株Aspergillus awamori ＃４０（A. awamori ＣＢＳ  １１５．５２の誘導体、ＷＯ９３／１２２３７、９頁１３行にも言及されている）、Aspergillus niger（株Ｎ４０２、Aspergillus niger var. niger ＡＴＣＣ  ９０２９、ＣＢＳ  １２０．４９ののｃｓｐＡ１（短い分生子胞子）突然変異体、ユニリバー（Unilever）のＷＯ９１／１９７８２に記載）、Aspergillus nidulans（Lab collection ＵＲＬ−ＶＬ）、Fusarium solani pisi（ＣＢＳ  ２３０．３４）、Fusarium graminearum（ＡＴＣＣ  ２０３３４）、Trichoderma reesei（ＣＢＳ  ３８３．７８）、Colletotrichum gloeosporioides（ＣＢＳ  ８６２．７０）、Neurospora crassa（ＣＢＳ  １９５．５７）、及びPleurotus ostreatus株Ｓｏｍｙｃｅｌ  ３０１５及びAgaricus bisporus株Ｈｏｒｓｔ  Ｕ１（ともに「Proefstation voor de Champignon cultuur」、P.O.Box ６０４２、５９６０ AA Horst、The Netherlandsから購入したもの）を、Agrobacterium tumefaciensでの形質転換のレシピエントとして用いた。
A. awamori ＃４０（A. niger var. awamori ＃４０としても知られている）の調製は、ＷＯ９１／１９７８２の１３頁、２９〜３９行に記載されていた。ここには以下のとおり記載されている：
「しかし、A. niger var. awamori形質転換体の産生レベルは、明らかに野生型の株よりも多いキシラナーゼを産生するA. niger var. awamori ＃４０のような好適なA. niger var. awamori突然変異株を用いることによって更に増大させることができる。
突然変異体A. niger var. awamori ＃４０は、A. niger var. awamori胞子の突然変異誘発及びキシラナーゼ産生についての選択によって得られた。ふすま培地中で「ｘｙｌＡ」A. niger var. awamori ＃４０形質転換体は、１９０，０００単位のキシラナーゼを産生したが、これは、最高の産生をするA. niger var. awamori形質転換体に対してかなりの増大である。」
本明細書においては、以下のエンドヌクレアーゼ制限部位：
突出末端を生じるもの 平滑末端を生じるもの
Afl II        C↓TTAAG            SmaI  CCC↓GGG
Bam HI        G↓GATCC
Bgl II        A↓GATCT
Eco RI        G↓AATTC
Hind III      A↓AGCTT
Kpn I         GGTAC↓C
Not I         GC↓GGCCGC
Pst I         CTGCA↓G
Sac I         CAGCT↓C
Sal I         G↓TCGAC
及びSaccharomyces cerevisiae由来のレアカッター制限エンドヌクレアーゼであるＩ−ＳｃｅＩ  １８ｂｐ：
0004307563.tif 000004
を用いた。
プラスミドの構築
プラスミドｐＵＲ５７５０（図１を参照されたい）は、ベクターｐＡＮ７．１（Punt et al.; Gene ５６（１９８７） １１７−１２４）に存在し、A. nudulans ｇｐｄ遺伝子由来のプロモーターがE. coli ｈｐｈ遺伝子のコード領域に融合され、その後にA. nidulansのｔｒｐＣ遺伝子由来のターミネーター配列が続くものを含む４ｋｂのＢｇｌII／ＨｉｎｄIIIフラグメントを、バイナリーベクターｐＢＩＮ１９（Bevan, M.; Nucleic Acids Res. ２２（１９８４） ８７１１−８７２１）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII部位にクローニングすることによって構築した。
プラスミドｐＵＲ５７５１（図２を参照されたい）は、Aspergillus nidulans由来のプラスミドレプリケーターＡＭＡ１（Aleksenko and Clutterbuck; Molecular Microbiology １９（１９９６） ５６５−５７４）を、プラスミドｐＵＲ７９８４由来の５．３ｋｂのＨｉｎｄIIIフラグメントとして、ｐＵＲ５７５０のＨｉｎｄIII部位にクローニングすることによって構築した。ｐＵＲ７９８４は、ｐＨＥＬＰ１（Clutterbuckにより提供されたもの）由来の５．３ｋｂ  ＡＭＡ１  ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ｐＡＮ７．１のＨｉｎｄIII部位にクローニングすることによって得た。この５．３ｋｂ  ＡＭＡ１  ＨｉｎｄIIIフラグメントは、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪ  ヌクレオチド配列データライブラリーにＡｃ．ｎｏ．Ｘ７８０５１として寄託されている配列の３６７位のＨｉｎｄIII部位と５６２０位のＨｉｎｄIII部位との間のフラグメントである。
アグロバクテリウム株ＬＢＡ１１００は、Beijersbergenら（Science ２５６（１９９２） １３２４−１３２７）に最初に記載され、後のいくつかの刊行物に引用されたものであるが、これを、Mozo及びHooykaas（Plant Mol. Biol. １６（１９９１） ９１７−９１８）にしたがって構築物ｐＵＲ５７５０及びｐＵＲ５７５１を用いてエレクトロポレーションした。
このアグロバクテリウム株ＬＢＡ１１００は、ブダペスト条約の下にオランダ、ＢａａｒｎのCentraalbureau voor Schimmelculturesに１９９７年３月２７日に寄託された（番号：ＣＢＳ  ６３４．９７）。
形質転換実験
バイナリーベクターｐＵＲ５７５０を含むアグロバクテリウム株を、以下の濃度の適切な抗生物質を含有するＬＢプレート上で２９℃で一晩生育させた：カナマイシン、１００μｇ／ｍｌ；スペクチノマイシン、２５０μｇ／ｍｌ；リファンピシン、２０μｇ／ｍｌ。単一コロニーを最少培地上にストリークした。最少培地（ＭＭ）は、１リットルあたり以下のものを含有する：１０ｍｌ  Ｋ−緩衝液、ｐＨ７．０（２００ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、１４５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4）、２０ｍｌ  Ｍ−Ｎ（３０ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）、１ｍｌ  １％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（Ｗ／Ｖ）、１０ｍｌ  ２０％グルコース（Ｗ／Ｖ）、１０ｍｌ  ０．０１％ＦｅＳＯ4（Ｗ／Ｖ）、５ｍｌ  胞子元素類（１００ｍｇ／ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ／ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ／ｌ  Ｈ3ＢＯ3、１００ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ／ｌ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ）及び２．５ｍｌ  ２０％  ＮＨ4ＮＯ3（Ｗ／Ｖ）（Hooykaas et al.; J. Gen. Microbiol. １１０（１９７９） ９９−１０９）、１５ｇ／ｌのバクトアガー、及び適切な抗生物質。プレートを、２９℃で１〜２日間インキュベートした。いくつかのコロニーを適切な抗生物質を含有する最少培地に接種し、２９℃で一晩生育させた。アグロバクテリウム細胞を約０．１５のＯＤ660ｎｍに誘導培地で希釈した後、培養物を、２９℃で６時間生育させた。誘導培地（ＩＭ）は、１０ｍｌ  ２０％グルコース（Ｗ／Ｖ）が１０ｍＭ  グルコースで置き換えられ、４０ｍＭ  ＭＥＳ（ex Sigma）（ｐＨ５．３）、０．５％グリセロール（Ｗ／Ｖ）及び２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ）が添加されていることにおいて最少培地と異なる。アグロバクテリウムによる糸状菌の形質転換がＴ−ＤＮＡの移入に依存することを確認するために、ｖｉｒ誘導剤ＡＳを除外した陰性対照を含ませた。分生子は、糸状菌株を、ＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天）上に置いたニトロセルロースフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Amersham）上で数日間室温で生育させ、続いて、フィルターを生理塩類溶液で洗浄することによって得た。A. awamoriのプロトプラストは、Punt及びVan del Hondelによって記載されたように調製した（Methods in Enzymology ２１６（１９９３） ４４７−４５７）。プロトプラストの形質転換については、１０6〜１０7個のプロトプラストを含有する１００μｌのアリコートを、１００μｌのアグロバクテリウム培養物と混合した。分生子の形質転換については、分生子を生理塩類溶液中で１０6、１０7、又は１０8分生子／ｍｌの濃度に希釈し、１００μｌを１００μｌのアグロバクテリウム培養物と混合した。続いて、この混合物を、５ｍＭグルコース含有ＩＭプレート（１５ｇ／ｌのバクトアガーを含有するＩＭ培地）上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温又は２９℃で、２、３、５又は６日間（実施例に示すように）インキュベートした。陰性対照試料は、ｖｉｒ誘導剤ＡＳを除外したＩＭプレート上でインキュベートした。その後、フィルターをAspergillus最少培地プレート（Bennett and Lasure、Growth Media、Bennett and Lasure編、「More Gene Manipulations in Fungi」、Academic Press、San Diego（１９９１）中、４４１−４５８頁）又はアグロバクテリウム細胞を殺すた��の２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するためのハイグロマイシン（濃度については実施例を参照されたい）を含有するＰＤＡプレートに移した。
ＤＮＡの単離及びサザーン解析
糸状菌細胞が形質転換され、所望のＤＮＡがゲノム中に組み込まれたことを分子レベルで確認するために、サザーン解析を行った。ゲノムＤＮＡの単離のための菌糸体材料を得るために、約１０8個の糸状菌分生子を、０．５％酵母エキストラクトを添加したAspergillus最少培地５０ｍｌに接種し、振とう器中、２００ｒｐｍで３０℃で２２時間〜３日間にわたる期間、インキュベートした。菌糸体は、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（登録商標）（Calbiochem）を通して収穫し、液体窒素中で急速凍結した。凍結試料を、Ｍｉｋｒｏ−Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（登録商標）（ex Braun Biotech International）を用いて１７５０ｒｐｍで１分間、細かい粉末にすりつぶした。糸状菌ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎゲノムチップ（カタログ番号１０２２３）及び供給者から提供される糸状菌類からのゲノムＤＮＡ精製のためのプロトコールを用いて単離した。細胞壁物質の消化のための工程は省略した。約２．５μｇのＤＮＡを、ＢｇｌII又はＨｉｎｄIII（４単位／μｇ）を用いて１６時間消化し、０．８％アガロースＴＢＥゲル上で分離した。ＤＮＡを、キャピラリブロッティング（一晩）によってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜に移し、この膜を、Ｈｙｂｏｎｄのプロトコールにしたがって（プレ）ハイブリダイズさせた。図３に掲げたサザーンブロットについては、上述のｐＡＮ７．１由来の４ｋｂのＢｇｌII／ＨｉｎｄIIIフラグメントをプローブとして用いた。図４及び５に掲げたサザーンブロットについては、ｐＡＮ７．１由来の０．８ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして用いた。これは、E. coliのｈｐｈ遺伝子の一部を含んでいた。α32Ｐ−ｄＣＴＰで標識されたＤＮＡプローブを、ＧｉｂｃｏＢＲＬからのＲＴＳ  ＲａｄＰｒｉｍｅ  ＤＮＡラベリングシステム（カタログ番号１０３８７−０１７）を用いて得た。電気的オートラジオグラフは、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Packard）を用いて得た。
実施例１：  Ａ．  ａｗａｍｏｒｉプロトプラストの形質転換
プロトプラストの単離のために、２００ｍｌの０．５％酵母エキストラクト含有ＭＭ培地を含む振とうフラスコに、１０6分生子／ｍｌのA. awamoriを接種し、振とう器中、２００ｒｐｍで１８時間、３０℃でインキュベートした。菌系体を、滅菌したＭｉｃｒｏｃｌｏｔｈ（登録商標）を通して収穫し、氷冷した０．６Ｍ  ＭｇＳＯ4で洗浄した。菌糸体を、ＯＭ培地（１リットルあたり：５００ｍｌ  ２．４Ｍ  ＭｇＳＯ4、４８０ｍｌ  Ｈ2Ｏ、１６．８ｍｌ  ０．５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３．２ｍｌ  ０．５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ５．８〜５．９）中に５ｍｌ／ｇ菌糸体で再懸濁した。続いて、菌糸体１ｇあたり５ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ２３４（登録商標）及び６ｍｇのＢＳＡを添加した。振とう器中、８０〜１００ｒｐｍで３０℃で１〜２時間、プロトプラスト化を進行させた。プロトプラストの形成は、光学顕微鏡を用いてチェックした。プロトプラストを、滅菌したＭｉｒａｃｌｏｔｈ（登録商標）を通してろ過し、試料を、ファルコンチューブ中に３０ｍｌのアリコートに小分けした。ＳＴＣ（１．２Ｍ  ソルビトール、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）を添加して容量を５０ｍｌとし、２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心することによりプロトプラストを収穫した。このプロトプラストを、５０ｍｌのＳＴＣ中で再び洗浄し、約１０8プロトプラスト／ｍｌの濃度でＳＴＣ中に再懸濁した。A. tumefaciensを用いる形質転換の頻度をＰＥＧ形質転換と比較するために、ＰＥＧ形質転換も行った。５μｇのｐＡＮ７．１を、１００μｌ（１０7）のプロトプラストのアリコートに添加し、混合して、氷上で２５分間インキュベートした。ＰＥＧを２つの２００μｌアリコートと１つの８５０μｌアリコートとに分けて添加し、混合物を、室温で２０分間インキュベートした。最後に、混合物を、１０ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２０００ｒｐｍで室温で１０分間の遠心によって収穫し、試料を、形質転換体の選択のために１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上にプレーティングした。
A. tumefaciens形質転換については、３×１０6〜１０7個のプロトプラストを含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したとおりに生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この試料から、１／１０、１／１００及び１／１０００の希釈物をＩＭ中に作製した。続いて、この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温又は２９℃で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillusＭＭプレートに移した。３回の別個の実験を、バイナリーベクターｐＵＲ５７５０を含むA. tumefaciensを用いて行った。各実験において、形質転換は、２重に行い、ＡＳなしの陰性対照を含ませた。結果を、以下の表３に示す。形質転換されたハイグロマイシン耐性細胞は、ＡＳを含有する培地でのみ得られた。陰性対照は、形質転換体細胞をまったく生じなかった。これらの結果から、曖昧ではなく、糸状菌細胞へのＴ−ＤＮＡの移入にはｖｉｒ遺伝子の誘導が必須であり、したがってA. tumefaciensは糸状菌Aspergillus awamoriを形質転換することができることが明らかである。形質転換頻度は、約３００〜７２００形質転換体／１０7プロトプラストまで変化したが、これは、初期の刊行されていない実験において得られたＰＥＧ形質転換について得られた値よりもはるかに高い。ｐＡＮ７．１（ｐＵＲ５７５０にも存在する、ハイグロマイシン遺伝子を選択可能マーカーとして有する同じ発現カセットを含有する；材料及び方法を参照されたい）を用いたＰＥＧ形質転換については、１８個までの形質転換体／μｇ／１０7プロトプラストが得られた。これは、Ｗａｒｄらにより刊行された約１２形質転換体／μｇベクターＤＮＡの値と一致する（上記を参照されたい）。
これらのデータは、A. tumedaciens媒介性糸状菌形質転換を用いることによって、ＰＥＧ形質転換を用いるよりも４００倍まで多い形質転換体（／μｇ／１０7プロトプラスト）が生成され得ることを明らかにしている。
更に、実験３（以下の表３を参照されたい）においては、同じバッチのプロトプラストを用いて両形質転換方法間で直接比較がされた。２回のＰＥＧ形質転換においては、１０7個のプロトプラストの形質転換あたり５μｇのｐＡＮ７．１を用いて、それぞれ６及び１６個の形質転換体が得られた。これは、平均して、２．２形質転換体／μｇ／１０7プロトプラストである。A. tumefaciens形質転換を用いて、３００及び４８０形質転換体／１０7レシピエント細胞が得られ、したがって平均で３９０形質転換体／１０7レシピエント細胞であった。
そこで、A. tumefaciensを用いる本発明の方法を適用することによって、約１８０倍多くの形質転換体が得られた。
0004307563.tif 000005
0004307563.tif 000006
0004307563.tif 000007
実験１及び２において、プレーティング効率（出発細胞の数に関する生存細胞の％）は、ハイグロマイシンなしのＭＭプレート上に１／１０００及び１／１０，０００希釈物をプレーティングすることによって決定した。実験１においては、プレーティング効率は５％であり、実験２においては２．６％であった。
形質転換体のＨｙｇ耐性表現型は、７８個のランダムに拾った形質転換体について、２００μＭセフォタキシム及び１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上に分生子をストリークすることによって確認した。これらの形質転換体の８個から、個々のコロニーからの分生子を、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上に再びストリークした。これを２回繰り返した。続いて、分生子を単離し、培養物を生育させて、ゲノムＤＮＡ単離のための菌糸体を得た。ＤＮＡの単離及びサザーン解析は、材料及び方法に記載してある。ゲノムＤＮＡを、ＢｇｌII又はＨｉｎｄIIIで消化した。ＢｇｌIIはＴ−ＤＮＡ内では切断しないので、この消化によってＴ−ＤＮＡ全体及び左右のＴ−ＤＮＡの両方のボーダー部位に隣接する染色体配列にわたるフラグメントが生成されることになる。このフラグメントは、少なくとも７．５ｋｂであろう。ＨｉｎｄIIIは、Ｔ−ＤＮＡ中で１カ所切断し、ｐＡＮ７．１プローブは、左のＴ−ＤＮＡボーダーに隣接する染色体配列及びハイグロマイシン発現カセットを有するＴ−ＤＮＡフラグメントのみを検出する。このフラグメントは、少なくとも５ｋｂであろう。消化されていないＤＮＡは、高分子量染色体ＤＮＡ中のＴ−ＤＮＡの存在を確認するために含まれていた。サザーンブロットのオートラジオグラフを、図３に示す。８個すべての形質転換体において、Ｔ−ＤＮＡは、単一の染色体遺伝子座に組み込まれていた。８個のうちの７個はまた、単一のＴ−ＤＮＡの取り込みを含んでいた。１つのケースにおいて、Ｔ−ＤＮＡは、タンデムリピートとして組み込まれていた。未消化ＤＮＡ試料を用いると、ハイブリダイゼーションシグナルは、高分子量ＤＮＡと一致し、Ｔ−ＤＮＡが染色体中に組み込まれていることが確認される。
A. tumefaciensを用いる形質転換を、バイナリーベクターｐＵＲ５７５０だけでなく、バイナリーベクターｐＵＲ５７５１を用いても行った（図２を参照されたい）。このベクターは、Aspergillus nidulans由来のプラスミドレプリケーターＡＭＡ１を含有している。ＡＭＡ１レプリコンを有するプラスミドは、Aspergillus nidulans中で自律的に維持されることができる。したがって、このＴ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡが染色体外要素として存在する形質転換細胞を生じることができるはずである。２つの実験の結果を、上記の表３に示す。形質転換頻度は、約３００〜９５０形質転換体／１０7プロトプラストまで変化した。形質転換体のＨｙｇ耐性表現型は、２０個のランダムに拾った形質転換体について、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上に胞子をストリークすることによって確認した。
実施例２：Aspergillus awamori分生子の形質転換
Aspergillus awamori分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０7個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この試料から、１／１０又は１／１００希釈物をＩＭ中で作製した。続いて、この混合物を、５ｍＭグルコースを含むＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus ＭＭプレートに移した。２回の実験の結果を、上の表３に示す。また、この場合にも、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。形質転換頻度は、約１０００〜２０００形質転換体／１０7分生子まで変化したが、これは、プロトプラスト形質転換後の頻度と同じ範囲内である。形質転換体のＨｙｇ耐性表現型は、１５個のランダムに拾った形質転換体について、２００μＭセフォタキシム及び１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上に分生子をストリークすることによって確認した。
実施例３：Aspergillus nidulans分生子の形質転換
Aspergillus nidulans分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０7個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１０００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。フィルターに、同じ濃度のセフォタキシム及びハイグロマイシンを含有するＭＭ寒天を重層した。
Aspergillus nidulansを用いては、選択が面倒であることがわかった。明らかに、共培養中に分生子が発芽し、厳密な選択を可能にするには程遠く生育した。この観察は、Cullenら（Gene５７（１９８９） ２１−２６）によって得られた結果と一致する。彼らは、選択開始前のインキュベーション時間が良好な結果のために非常に重要であることを決定した。選択が開始される前に１６時間を超えるインキュベーション期間を適用すると、有意なバックグラウンドの生育がもたらされ、一方、８時間のみのこのようなインキュベーションの後は、まったくコロニーが観察されなかった。報告された数字は、１２時間のこのようなインキュベーションの後でも得られた。彼らは、ハイグロマイシン感受性に関して実質的な株変動性をも観察した。Cullenらの結果からみて、この実施例の形質転換頻度は、選択を適用する前のインキュベーション期間を最適化することによって改良され得る。
結果を、上の表３に示す。全部で１５の推定形質転換コロニーが得られた。更に、陰性対照は、３個の生育し、胞子形成するコロニーを生じた。形質転換された表現型を確認するために、分生子を、２００μＭのセフォタキシム及び１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上にストリークした。陰性対照は生育せず、１５の推定形質転換体のうち３個のみが生育できた。したがって、この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。
ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いるＰＥＧ形質転換に関する文献データは、５〜２０形質転換体／μｇベクターＤＮＡの形質転換頻度を示す（Cullen et al.; Gene５７（１９８９）２１−２６； Punt et al.; Gene５６（１９８７）１１７−１２４）。別の選択可能なマーカーであるａｒｇＢ遺伝子を用いて、Funganoら（FEMS Microbiology Letters １２５（１９９５）２９３−２９８）は、ベクターＤＮＡ１μｇあたり８１までの形質転換体を得、一方、ｔｒｐＣ遺伝子をマーカーとして用いて２０〜３００形質転換体／μｇベクターＤＮＡが得られた（Yelton et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８１（１９８４）１４７０−１４７４）。これらの文献データは、アグロバクテリウムによる形質転換を用いて得られる形質転換体の数は、別の選択可能なマーカーを用いることによって改良することができることを示唆する。
実施例４：Aspergillus niger分生子の形質転換
Aspergillus niger分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０5、１０6又は１０7個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。一般に、選択は面倒であることがわかった。明らかに、共培養中に、分生子は発芽し、厳密な選択を可能にするには程遠く生育した。これは、フィルター上に、２００μＭのセフォタキシム及び２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭ寒天からなる重層を用いることによって、ある程度改良できた。
典型的な実験の結果を上の表３に示す。この実験では、陰性対照プレート上に６個の生育するコロニー、及びＡＳを含有する形質転換プレート上に６個の推定形質転換コロニーが生じた。これらのコロニーのハイグロマイシン耐性表現型を確認するために、１２個すべてのコロニーからの分生子を、２００μＭのセフォタキシム及び２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上にストリークした。６個の推定形質転換体のうち、５個のみが新しい選択プレート上で生育した。残りの推定形質転換体及び陰性対照実験からのコロニーは、生育しなかった。したがって、この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。２個の形質転換体をサザーン解析に供した。ゲノムＤＮＡをＢｇｌII又はＨｉｎｄIIIで消化した。ＢｇｌIIは、Ｔ−ＤＮＡ内では切断せず、したがって、この消化は、Ｔ−ＤＮＡ全体及びＴ−ＤＮＡの左右のボーダー部位に隣接する染色体配列にわたるフラグメントを生じるであろう。このフラグメントは、少なくとも７．５ｋｂであろう。ＨｉｎｄIIIは、Ｔ−ＤＮＡ中で１カ所切断し、ｐＡＮ７．１からのｈｐｈ遺伝子についてのプローブは、左のＴ−ＤＮＡボーダーに隣接する染色体配列及びハイグロマイシン発現カセットを有するＴ−ＤＮＡフラグメントのみを検出する。このフラグメントは、少なくとも５ｋｂであろう。サザーン解析（図４を参照されたい）によって、両形質転換体において、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、これによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いるＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換に関する文献データは、５〜２０形質転換体／μｇベクターＤＮＡ（Punt et al.; Gene ５６（１９８７） １１７−１２４）及び１７，０００までの形質転換体／μｇ（Mohr and Esser; Appl. Microbiol. Biotechnol. ３４（１９９０） ６３−７０）の形質転換頻度を示す。しかし、後者の著者は、その刊行物中で；
「完全培地上での一次単離物のコロニー精製の後、ほんのわずかの株（約１０％）のみしかハイグロマイシン培地上で生育しなかった。」
と述べている。
明らかに、彼らは、その選択方法について問題を有していた。ａｒｇＢ遺伝子を用いるエレクトロポレーションによるインタクトな発芽中の分生子の形質転換については、０．５〜４形質転換体／μｇベクターＤＮＡの形質転換頻度が記載されている（Ozeki et al.; Biosci. Biotech. Biochem. ５８（１９９４） ２２２４−２２２７）。
実施例５：Colletotrichum gloeosporioides分生子の形質転換
Colletotrichum gloeosporioides分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０5又は１０6個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。室温で５日間のインキュベーションの後、コロニーが形質転換プレート上に出現した。１０5個の分生子を用いた形質転換は、７個の形質転換体を生じ、一方、１０6個の分生子を用いた形質転換は、１７５個の形質転換体を生じた。陰性対照プレート上にはコロニーは得られなかった。１日後、小さいコロニーが陰性対照プレート上に出現し始めた。明らかに、選択は、非形質転換細胞の生育が完全に阻害されるほど充分にきついものではなかった。Ｈｙｇ耐性表現型を確認するために、１１個の推定形質転換コロニー及び３個の陰性対照からのコロニーからの菌糸体を、２００μＭのセフォタキシム及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上に移した。１１個の推定形質転換体のうち、８個が新しい選択プレート上で生育した。３個の残りの推定形質転換体及び３個の陰性対照実験からのコロニーは、生育しなかった。したがって、この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。上の表３に示した結果は、得られた偽陽性について修正されている。形質転換により、５００〜１３００形質転換体／１０7分生子が生じた。１個の形質転換体を、実施例４に記載したとおりにサザーン解析に供した。これによって、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、それによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
Stephensonら（Aust. Soc. Biochem. Mol. Biol. ２６（１９９４） Ｐｏｓ−１−３１）は、１００未満の形質転換体／μｇの形質転換頻度を報告した。以前、ArmstrongとHarris（Phytopathology ８３（１９９３） ３２８−３３２）は、選択のためにベノミル殺真菌剤耐性を用いた場合、２〜５０形質転換体／１０8プロトプラストの形質転換頻度を報告していた。
実施例６：Fusarium solani pisi分生子の形質転換
Fusarium solani pisi分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０5又は１０7個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。結果を、上の表３に示す。
１０7個の分生子の形質転換により、１個の形質転換体が生じた。陰性対照プレート上には、コロニーは得られなかった。形質転換体のＨｙｇ耐性表現型を、２００μＭのセフォタキシム及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＭプレート上で形質転換体を生育させることによって確認した。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。
プロトプラストのＰＥＧ形質転換のために、ハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した場合、１０，０００形質転換体／μｇ／１０7プロトプラストの形質転換頻度が、Fusarium solani f. sp. cucurbitae race ２について報告された（Crowhurst et al.; Current Genetics ２１（１９９２） ４６３−４６９）。ＰＥＧ及びリチウムアセテートによるFusarium solani f. sp. phaseoliの形質転換は、Marekらの報告（Curr. Genet. １５（１９８９） ４２１−４２８）によると、０．２〜３．３形質転換体／μｇを生じた。
実施例７：Fusarium graminearum分生子及び再水和された凍結乾燥ＡＴＣＣ材料の形質転換
Fusarium graminearum分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、４×１０5の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。また、再水和されたAmerican Type Culture Collectionから入手した凍結乾燥培養物も、形質転換に用いた。二重のバイアル中に存在する凍結乾燥材料を、０．４ｍｌの滅菌水を添加することによって再水和し、室温で３０分間インキュベートした。形質転換に使用されたこの材料は、４℃で約２週間貯蔵された。ＡＴＣＣ材料の１００μｌのアリコートを、２００μｌのA. tumefaciensと混合した。これらの混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。ＡＴＣＣ材料の半分は、ＩＭプレート上で５日間共培養した。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＰＤＡプレートに移した。
結果を、上の表３に示す。４×１０5個の分生子の形質転換により１個の形質転換体が生じた。これは、２５形質転換体／１０7分生子である。ＡＴＣＣ材料については、５日間共培養した場合に５個の形質転換体が得られた。陰性対照プレート上ではコロニーは得られなかった。形質転換体のＨｙｇ耐性表現型を、２００μＭのセフォタキシム及び１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＰＤＡプレート上で形質転換体を生育させることによって確認した。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。ＡＴＣＣ材料の形質転換後に得られた２個の形質転換体を、実施例４に記載したとおりにサザーン解析に供した。これによって、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、それによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
ＰＥＧ形質転換法を用いたA. nidulansのアセトアミダーゼ遺伝子での５×１０6〜２×１０7個のFusarium graminearumのプロトプラストの形質転換は、５形質転換体／μｇの形質転換頻度をもたらした（Royer et al.; Bio/Technology １３（１９９５） １４７９−１４８３）。
実施例８：Neurospora crassa分生子の形質転換
Neurospora crassa分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０5個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。結果を、上の表３に示す。最初の実験においては、１０5個の分生子の形質転換により、約５０個の形質転換体が生じ、一方、１／１０希釈物では５個の形質転換体が生じた。２番目の実験においても、１０5個の分生子の形質転換により、約５０個の形質転換体が生じた。これは、形質転換により５０００までの形質転換体／１０7分生子が生じることを意味する。２０個の形質転換体のＨｙｇ耐性表現型を、２００μＭのセフォタキシム及び２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレート上で形質転換体を生育させることによって確認した。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。２個の形質転換体を、実施例４に記載したようにサザーン解析に供した。これによって、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、それによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
Neurospora crassaは、多様な方法を用いて形質転換されてきた。発芽分生子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いるエレクトロポレーションによって形質転換され、３０００〜６０００形質転換体／μｇ／１０7分生子の形質転換頻度が得られた（Chakraborty et al.; Can. J. Microbiol. ３７（１９９１）８５８−８６３）。発芽分生子のリチウムアセテート形質転換は、２〜１０形質転換体／μｇ／１０7分生子の形質転換頻度をもたらした（Dhawale et al.; Curr. Gen. ８（１９８４） ７７−７９）。プロトプラストのＰＥＧ形質転換は、４００〜１５，０００形質転換体／μｇの範囲にわたる形質転換頻度をもたらした（Vollmer and Yanofsky; Proc.Natl. Acad. Sci. USA ８３（１９８６）４８６７−４８７３）。
実施例９：Trichoderma reesei分生子の形質転換
Trichoderma reesei分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、１０5個又は１０7個の分生子を含む１００μｌのアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１００μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で２日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレートに移した。
結果を、上の表３に示す。１０7個の分生子の形質転換により、約２４０個の形質転換体が生じ、一方、１０5個の分生子の形質転換により、１２個の形質転換体が生じた。これは、形質転換頻度が２４０〜１２００形質転換体／１０7分生子の間で変化することを意味する。９個の形質転換体のＨｙｇ耐性表現型を、２００μＭのセフォタキシム及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するAspergillus最少培地プレート上で形質転換体を生育させることによって確認した。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。２個の形質転換体を、実施例４に記載したようにサザーン解析に供した。これによって、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、それによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
同じハイグロマイシン選択可能マーカー遺伝子（ｐＡＮ７．１）をプロトプラストのＰＥＧ形質転換に使用した場合、約１００形質転換体／μｇ／１０7プロトプラストが得られた（Mach et al.; Current Genetics ２５（１９９４） ５６７−５７０）。ハイグロマイシン遺伝子にTrichoderma reesei自身に由来する相同発現シグナルが隣接していた場合、Ｍａｃｈらは、１８００〜２５００形質転換体／μｇ／１０7プロトプラストの増大した形質転換頻度を報告した。同様な結果は、Gruber（Curr. Genet. １８（１９９０） ４４７−４５１）によって報告された。非相同ベクターを用いて、彼らは、約８００〜１５００形質転換／μｇを得た。相同ｐｙｒＧ遺伝子を含むベクターは、１２，０００までの形質転換体／μｇを生じた。
実施例１０：Pleurotus ostreatus分生子の形質転換
食用きのこの形質転換に関しては、ほとんど刊行物が知られていない。Pengら（Curr. Genet. ２２（１９９２）５３−５９）は、Pleurotus ostreatusを形質転換するのに成功したが、形質転換された株は不安定であった。しかし、最近、Yanaiら（Biosci. Biotech. Biochem. ６０（１９９６） ４７２−４７５）は、安定なPleurotus ostreatus形質転換体を得た。
Pleurotus ostreatus分生子のA. tumefaciensによる形質転換のために、２つの手順を用いた。実験１においては、１．２５×１０7個の分生子のアリコートを、材料及び方法に記載したように生育させた１５０μｌのA. tumefaciensと混合した。この混合物を、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングした。実験２においては、２．５×１０7個の分生子を、ＰＤＡプレート上に置いたニトロセルロースフィルター上にプレーティングし、室温で４日間プレインキュベートした。続いて、フィルターをシャーレに移し、２５ｍｌのＩＭ中のアグロバクテリウム培養物（材料及び方法に記載したように６時間生育させたもの）に浸け、室温で１時間インキュベートした。その後、フィルターを、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置いた。このプレートを、室温で３〜６日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための７５μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＰＤＡプレートに移した。６日間の共培養後の結果を、上の表３に示す。１０7個の分生子の形質転換により、約４８個の形質転換体が生じた。
分生子を直接形質転換に用いた場合、形質転換体は、６日間の共培養後のみに得られた（実験１）。しかし、分生子を形質転換前に４日間プレインキュベートした場合（実験２）、形質転換体は、３日及び６日の共培養後に得られたが、３日後では６日後よりも形質転換体の数が少なく、４８ではなく１０であった。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。
同じハイグロマイシン選択可能マーカー遺伝子（ｐＡＮ７．１）をプロトプラストのＰＥＧ形質転換に使用した場合、約５〜４６形質転換体／μｇ／１０7生存プロトプラストが得られた（Peng et al.; Current Genetics ２２（１９９２）５３−５９）。優性選択マーカーとしてバイアラフォス（bialaphos）を用いて、Yanaiら（Biosci. Biotech. Biochem. ６０（１９９６） ４７２−４７５）は、約２形質転換体／μｇを得た。
実施例１１：Agaricus bisporus分生子の形質転換
A. tumefaciensによる形質転換のために、市販のＨｏｒｓｔ  Ｕ１株由来のAgaricus bisporus分生子を使用した（「Proefstation voor de Champignoncultuur」、P.O. Box ６０４２、５９６０ AA Horst、The Netherlandから購入した）。以下の培地を用いて分生子を発芽させた。Ｏｘｏｉｄから購入したＭａｌｔｅｘｔｒａｃｔ寒天（ＭＯｘ；５０ｇ／ｌ、マルトエキストラクト、菌学的ペプトン及び寒天を含有）又は「Proefstation voor de Champignoncultuur」によって特定されたとおりのＭａｌｔｅｘｔｒａｃｔ寒天（ＭＰｒｆ；２％マルトエキストラクト、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１．５％寒天、ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）。約１．２×１０7個の分生子を、ＭＯｘ又はＭＰｒｆ培地のいずれかの上のニトロセルロースフィルター上にプレーティングした。Agaricus bisporus育種顆粒（これも「Proefstation voor de Champignoncultuur」から購入）を、分生子の発芽を促進するために、フィルターの周囲の寒天上に置いた。シャーレをパラフィルムでシールした。プレートを、室温で５日又は７日間プレインキュベートした。続いて、フィルターをシャーレに移し、２５ｍｌのＩＭ中のAgribacterium tuemfaciens培養物（材料及び方法に記載したように６時間生育させたもの）に浸けた。形質転換のためには、A. tuemfaciens株ＬＢＡ１１２６（Bundock & Hooykaas,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３（１９９６）１５２７２−７５）を用い、その中にバイナリーベクターｐＵＲ５７５０を導入した。この株ＬＢＡ１１２６は、Bundockらが勤務しているState University Leidenから使用上の制限付きで入手した。フィルターを、室温で１時間インキュベートした。その後、フィルターを、５ｍＭグルコースを含有するＩＭプレート上に置き、このプレートを、室温で５日間インキュベートした。その後、フィルターを、アグロバクテリウム細胞を殺すための２００μＭセフォタキシム及び形質転換体を選択するための２５μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Van Rhee et al.; Mol. Gen. Genet. ２５０（１９９６） ２５２―２５８）を含有するＭＯｘ又はＭＰｒｆプレートに移した。ハイグロマイシン耐性コロニーは、約５週間のインキュベーション後に出現した。５回の形質転換で１０個の形質転換体が得られた（上の表３を参照されたい）。形質転換体は、両培地を用いて、形質転換前の５日及び７日のプレインキュベーション後に得られた。この場合もまた、形質転換は、ＡＳによるｖｉｒ遺伝子の誘導に依存した。７個の形質転換体を、２５μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む、又は含まない、２００μＭセフォタキシムを含むＭＰｒｆプレート上で更に培養した。４個の形質転換体を、実施例４に記載したようにサザーン解析に供した。サザーン解析（図５を参照されたい）によって、Ｔ−ＤＮＡは単一の染色体遺伝子座に組み込まれていることが明らかになり、これによって形質転換された表現型が分子レベルで確認された。
栽培きのこAgaricus bisporusは、最近、Van Rheeらによって形質転換された（Mol. Gen. Genet. ２５０（１９９６）２５２−２５８）。しかし、彼らは、単一のホモカリオート株ＡＴＣＣ  ２４６６３を形質転換できた一方で、食用きのこの生産に広く使用されている市販のヘテロカリオート株Ｈｏｒｓｔ  Ｕ１を直接形質転換することはできなかった。この株については、彼らは、形質転換体を得る前に、最初にＡＴＣＣ  ２４６６３表現型に似た派生株を選択しなければならなかった。したがって、１９９０年に１５０万トンの世界中での生産がされた重要な作物である（Van Rhee et al.; Mol. Gen. Genet. ２５０（１９９６）２５２−２５８）この種における生物工学の適用は、一般に適用可能な形質転換系の欠如によって未だに妨げられていた。きのこ栽培に対する生物工学技術の適用は、質及び作物の収量を大幅に改良することができる。
実施例１２：Aspergillus awamoriへの複製コピーの遺伝子の部位特異的組み込み
実験のセットアップ
糸状菌A.awamoriへの複数コピーの遺伝子の部位特異的組み込みのための方法の実験デザインを、図６に示す。この系は、２つの成分、すなわち（１）３′欠失を有するｐｙｒＧ遺伝子を含む菌株、及び（２）組換えに際してｐｙｒＧ遺伝子を回復するのに好適なバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム株に基づいている。このバイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡボーダーの間に、５′欠失を有するｐｙｒＧ遺伝子を有する修復構築物を、短縮された両ｐｙｒＧ遺伝子が組換え部位として機能する共通のｐｙｒＧ遺伝子の部分を持つように含む。他方の組換え部位は、組換えに際してｐｙｒＧ遺伝子が回復されるように、ｐｙｒＧ遺伝子の下流になければならない。
少なくとも１つの他の遺伝子を導入するために、このバイナリーベクターは、所望のタンパクをコードする少なくとも１つの遺伝子の複数のコピーを、２つの組換え部位間に、好ましくは短縮されたｐｙｒＧ遺伝子の下流に含むべきである。代替法として、少なくとも１つの遺伝子の導入を伴う組換えが、標的遺伝子座が５′欠失を含み、修復構築物が３′欠失ｐｙｒＧ遺伝子の上流に導入されるべき遺伝子を含み、導入されるべき遺伝子の上流に第二の組換え部位を含む場合にも起こることを考えることができる。しかし、この状況においては、ｐｙｒＧ遺伝子のプロモーターが妨害されないように注意しなければならない。
相同組換えによる組み込みを特異的に検出するために、内在性ｐｙｒＧ遺伝子を選択可能なマーカー遺伝子（Gouka et al.; Current Genetics ２７（１９９５）５３６−５４０）として用いた。
標的部位の構築
プラスミドｐＵＲ５７１０（図７を参照されたい）を、プラスミドｐＡＷ４．１（Goukaら；上記を参照されたい）に存在するｐｙｒＧ遺伝子の５′部分を含む２．０ｋｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化した一般クローニングベクターｐＩＣ２０Ｒ（Marsh et al.; Gene ３２（１９８４） ４８１−４８５）中にクローニングすることによって構築した。続いて、ＳａｌＩ部位とＨｉｎｄIII部位とに隣接するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼのための１８ｂｐ認識部位（５′−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３′＝配列番号１）を含む合成ＤＮＡリンカーを、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄIIIで消化したｐＵＲ５７１０中にクローニングした。これによりプラスミドｐＵＲ５７１１が得られた（図７を参照されたい）。プラスミドｐＵＲ５７１２（図７を参照されたい）は、プラスミドｐＡＷ４．４（Goukaら；上記を参照されたい）に存在するｐｙｒＧコード領域の下流の配列を含む２．０ｋｂのＨｉｎｄIIIフラグメントをＨｉｎｄIIIで消化したプラスミドｐＵＲ５７１１中にクローニングすることによって構築した。ｐｙｒＧ遺伝子のコード領域と比較したこのＨｉｎｄIIIフラグメントの向きは、野生型の場合と同じであった。プラスミドｐＵＲ５７１２を、A.awamori突然変異体ｐｙｒＧ-株ＡＷＣＳＣＥを構築するために用いた。
A.awamori突然変異体ｐｙｒＧ-株ＡＷＣＳＣＥの構築
野生型A.awamori株の形質転換を、Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位を欠失の部位に有する突然変異ｐｙｒＧ遺伝子を含むプラスミドｐＵＲ５７１２（図６及び７を参照されたい）から得られた精製（Ｑｉａｅｘゲル抽出キット；Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２００２１）ＥｃｏＲＩフラグメントを用いて行った。形質転換１回あたり、２×１０6個のプロトプラストを１０μｇのＤＮＡで形質転換した。ｐｙｒＧ-株は、５−ＦＯＡ（５−フルオロ−オロチン酸；Boeke et al.; Mol. Gen. Genet. １９７（１９８４） ３４５−３４６）に耐性であるため、ｐｙｒＧ-形質転換体は、野生型株から直接選択することができる。形質転換体を、１０ｍＭプロリンを窒素源として、１０ｍＭウリジン及び０．７５ｍｇ／ｍｌの５−ＦＯＡを添加したＭＭプレート（ＡｓｐＡをＡｓｐＡ−Ｎで置き換えた；５０×Ａｓｐａ−Ｎ＝０．３５Ｍ  ＫＣｌ、０．５５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4、ＫＯＨでｐＨ６．５に調整したもの）上で選択した。得られた形質転換体の突然変異表現型を、これらのコロニーをウリジンを含まないＭＭプレート上で生育させることによりチェックした。ウリジンなしで生育することができなかった２個の形質転換体を、サザーンブロット解析で更に解析した。観察されたＤＮＡパターンは、株ＡＷＣＳＣＥについて予測されたパターンと一致した。
複数コピーベクターの構築
プラスミドｐＵＲ５７１３（図８Ａを参照されたい）の構築のために、プラスミドｐＡＷ４．４（Goukaら；上記を参照されたい）をＨｉｎｄIIIで消化し、このＨｉｎｄIII部位をクレノウで埋め、続いてフラグメントをＢａｍＨＩで消化した。ｐｙｒＧコード領域の下流の配列を含む得られた１．６ｋｂのフラグメントを単離した。更に、プラスミドｐＡＷ４．２０（Goukaら；上記を参照されたい）をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、上述の１．６ｋｂフラグメントのすぐ上流に存在する配列を含む０．４ｋｂのフラグメントを単離した。この０．４ｋｂのＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩフラグメント及び１．６ｋｂのＢａｍＨＩ／充填されたＨｉｎｄIIIフラグメントを、ＨｉｎｄIII及びＳｍａＩで消化した一般クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR  ＳＫ（Stratagene）中に同時にクローニングした。これによって、プラスミドｐＵＲ５７１３が得られた。
プラスミドｐＵＲ５７１４（図８Ｂを参照されたい）を、ベクターｐＡＷ４．１に存在するｐｙｒＧ遺伝子の３′部分を含む１．０ｋｂのＢｇｌII／ＨｉｎｄIIIフラグメントをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した一般クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR  ＳＫ中にクローニングすることにより構築した。コスミドｐＵＲ５７１６（図９を参照されたい）は、以下の配列（配列番号２を参照されたい）：
（５′−ＡＡＴＴＣ  ＡＴ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  Ｔ−３′
３′−ＴＡ  ＣＧＣＣＧＧＣＧ  ＡＴＣＧＡ−５′）
を有するＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位を含む合成リンカーによってＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIポリリンカーフラグメントを置き換えることによって、コスミドベクターｐＪＢ８（Ish-Horowicz, D. and Burke, J.F.; Nucleic Acids Res. ９（１９８１） ２９８９）から作製した。このクローニング工程において、ＨｉｎｄIII部位は失われている。コスミドｐＵＲ５７１８（図９を参照されたい）は、プラスミドｐＵＲ５７１４由来の１．０ｋｂのＮｏｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとプラスミドｐＵＲ５７１３由来の２．０ｋｂのＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩフラグメントとを、ＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＵＲ５７１６中に同時にクローニングすることにより構築した。それによって、このベクターは、A.awamori突然変異ｐｙｒＧ-株ＡＷＣＳＣＥ中のｐｙｒＧ標的遺伝子座のＩ−ＳｃｅＩ部位の両端と相同な配列を有する。
プラスミドｐＵＲ５７２９（図１０を参照されたい）を、プラスミドｐＵＲ７３８５（Van Gemeren et al.; Applied Microbiology and Biotechnology ４５（１９９６）７５５−７６３）からのAspergillus awamori由来のｅｘｌＡ遺伝子のプロモーター及びターミネーター（Gouka et al.; Applied Microbiology and Biotechnology ４６（１９９６） ２８−３５）の制御下のFusarium solani pisi由来のクチナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む約１．５ｋｂのＰｓｔＩ／ＳａｃＩフラグメント（ｃＤＮＡの合成コピー； Van Gemeren et al.; Journal of Biotechnology ４０（１９９５） １５５−１６２）を、ＰｓｔＩ及びＳａｃＩで消化した一般クローニングベクターｐＩＣ１９Ｈ（Marsh et al.; 上記を参照されたい）中にクローニングすることによって構築した。
コスミドｐＵＲ５７１８に基づいて、（上述のとおりの）ｅｘｌＡ発現シグナルの制御下のクチナーゼ遺伝子の複数コピーを含む新規なコスミド（ｐＵＲ５７２５）を構築した。この発現カセットの単一コピーを、プラスミドｐＵＲ５７２９由来の１．５ｋｂのＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離し、ＨｉｎｄIIIで消化したコスミドｐＵＲ５７１８中に連結した。λ−ＤＮＡインビトロパッケージングモジュール（Amersham；コードＲＰＮ１７１７）を用いる連結ミックスのパッケージングの後、このパッケージングミックスをE. coli株１０４６中に形質転換して導入した（共にこのモジュールに添付のプロトコールにしたがった）。この形質転換によって、９コピーの発現カセットのタンデムアレイを含むコスミドｐＵＲ５７２５（図１１を参照されたい）が得られた。
糸状菌を形質転換するために使用することができるAgrobacterium tumefaciensベクターを作製するために、プラスミドｐＵＲ５７５２を構築した。これは、Ｔ−ＤＮＡの左右のボーダーリピート間に単一のＮｏｔＩ部位を有するバイナリーベクターであり、ｐＳＤＭ１４（R. Offringa; 博士論文「Gene targeting in plants using the Agrobacterium vector system」; Leiden University, Leiden １９９２）から、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩでの消化及び以下のアニーリングしたオリゴヌクレオチド：
0004307563.tif 000008
との連結によって派生する。
プラスミドｐＵＲ５７５２を、A. awamoriエンドキシラナーゼプロモーター及び転写ターミネーターによって制御されたfusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子を有する約１．５ｋｂフラグメントの複数コピーをＮｏｔＩ部位に導入するために用いた。したがって、９コピーのクチナーゼ発現カセットを含むｐＵＲ５７２５（上記を参照されたい）由来の１７ｋｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＵＲ５７５２のＮｏｔＩ部位に連結した。この連結手順を用いて、９コピーの発現カセットを含むプラスミドｐＵＲ５７５６（図１２を参照されたい）及び４コピーのみの発現カセットを含むｐＵＲ５７５５（おそらく分子内組換えを介する連結中のコピーの喪失による）が得られた。
対照として、プラスミドｐＵＲ５７５３（クチナーゼ遺伝子をまったく含まない）を、５′欠失を有するｐｙｒＧ遺伝子及び下流配列を含むｐＵＲ５７１８（上記を参照されたい）由来の３．０ｋｂのＮｏｔＩフラグメントをｐＵＲ５７５２のＮｏｔＩ部位にクローニングすることによって構築した。プラスミドｐＵＲ５７５３は、ＨｉｎｄIII部位間の９コピーの遺伝子が欠如し、以下の要素：左ボーダー、ＮｏｔＩ部位、５′欠失を有するｐｙｒＧ遺伝子、ＨｉｎｄIII部位、ｐｙｒＧ遺伝子の３′下流配列、ＮｏｔＩ部位、右ボーダーを含むプラスミドとなっていることを除き、ｐＵＲ５７５６と同一である。
ｐＵＲ５７５２及びｐＵＲ５７５３の両プラスミドは、任意の相同又は非相同遺伝子をＮｏｔＩ部位又はＨｉｎｄIII部位に導入するように適合させることができる。
形質転換及び形質転換体の解析
A. awamori株ＡＷＣＳＣＥの形質転換のために、バイナリーベクターｐＵＲ５７５３、ｐＵＲ５７５５及びｐＵＲ５７５６を含むA. tumefaciens株ＬＢＡ１１２６（Bundock & Hooykaas; PNAS ９３（１９９３） １５２７２−７５；制限的使用については上記を参照されたい）を用いた。形質転換は、ＩＭ培地のプレートが付加的に１ｍＭウリジンを含有していたことを除き、分生子胞子について材料及び方法に上述したとおりに行った。
形質転換体は、約７日間のインキュベーション後に得られた。１０6個の分生子胞子を用いた平均形質転換頻度は、ｐＵＲ５７５３及びｐＵＲ５７５５についてそれぞれ１７及び３０形質転換体であったが、ｐＵＲ５７５６についてはわずか０．５形質転換体であった。後者の結果は、１０7分生子胞子あたり５個のクチナーゼ発現カセットの複数コピーを有する形質転換体が得られることを意味する。従来のプロトプラスト形質転換を用いては、特異的な遺伝子座に単一コピーの遺伝子を組み込むことが可能であったにすぎず、これは１０7個のプロトプラストの形質転換あたりわずか約１〜２形質転換体の頻度であったので（Goukaら；（１９９５）上記を参照されたい）、この数字は顕著に高い。
多数の形質転換体をAspergillus最小培地上で２回精製し、分生子胞子をＰＤＡプレートから単離した。形質転換体を、ａ）発現カセットのコピー数、ｂ）発現カセットの組み込み部位、及びｃ）Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの外のＤＮＡが組み込まれたかどうか、を確認するために、サザーン解析に供した。ゲノムＤＮＡをＢｇｌII又はＳａｌＩで消化し、０．７％アガロースゲル上でフラグメントをサイズで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜にブロッティングした。プローブとしてクチナーゼ発現カセットに存在するA. awamori exlAターミネーターを含む０．５ｋｂのＡｆｌII／ＳａｃＩフラグメントを用いる前にハイブリダイゼーションを行った。
ＤＮＡをＳａｌＩで消化した場合、すべての形質転換体が外来性ｅｘｌＡ  ＳａｌＩフラグメントに相当する約５ｋｂのハイブリダイズするフラグメントを含んでいた。ｐＵＲ５７５５及びｐＵＲ５７５６を用いて得られた形質転換体は、全ＰｅｘｌＡ−クチナーゼ−ＴｅｘｌＡ発現カセットにわたる第二のハイブリダイズするフラグメントを含んでいるようであった。サイズは、フラグメント上に存在する遺伝子コピーの数の指標である。試験した株においては、種々の数の発現カセットが組み込まれていたことが見出された。例えば、プラスミドｐＵＲ５７５５（当初４コピーを含む）由来のＤＮＡを含むアグロバクテリウムで形質転換された株＃８、＃９及び＃１０には２コピーが存在し、一方、すべてプラスミドｐＵＲ５７５６（当初９コピーを含む）由来のＤＮＡを含むアグロバクテリウムで形質転換された株＃１３、＃１４、＃１５及び＃１７には４コピー、株＃１２には７又は８コピー、株＃１６には９コピーが存在した。これらの結果は、ＢｇｌIIでの消化によって確認された。後者は、発現カセット中で１ヵ所切断し、したがって、すべての発現カセットが単一の１．５ｋｂのハイブリダイズするフラグメントとして表される。このハイブリダイズするフラグメントの強度は、コピー数についての指標であり、ＳａｌＩ制限フラグメントについて上記したコピー数と一致していた。
更に、クチナーゼ発現カセットを含んでいたすべての形質転換体は、付加的に１．８ｋｂのハイブリダイズするフラグメントを含んでおり、これは、プローブとハイブリダイズする５′フランキングフラグメントである。組み込みのパターンは、すべてｐｙｒＧ遺伝子座での組み込みと適合した。これは、A. awamoriのｐｙｒＧ遺伝子を含む２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントでの同様のＤＮＡブロットのハイブリダイゼーションによっても確認された。更に、内在性ｅｘｌＡ遺伝子に相当する５ｋｂのハイブリダイズするフラグメントがすべての形質転換体に存在した。最後に、Ｔ−ＤＮＡボーダーリピートの外のA. tumefaciensＤＮＡ配列を含むｐＵＲ５７５０由来の１１．９ｋｂ  ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩフラグメントを用いて、細菌ＤＮＡ配列のプローブ可能な存在を解析した。形質転換体のいずれも、ハイブリダイゼーションシグナルを示さず、すべてが細菌ＤＮＡを含まないことを示した。
結論として、モデル遺伝子の複数コピーを含むAgrobacterium tumefaciensを用いて、従来の形質転換法よりも高い頻度でA. awamoriを形質転換することができることが示された。この系を用いて、望ましくない（細菌の）配列の組み込みなしに複数遺伝子コピーをｐｙｒＧ遺伝子座にターゲティングすることができる。
参考文献
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ブダペスト条約に基づく微生物寄託に関する情報は、上で１９頁、２６〜２９行に記載されている。ＥＰＣ規則２８（４）又はＥＰＣの締約国でない国についての同様の協定にしたがって、このような寄託物の試料は、要求された場合に、専門家のみに提供されるであろうことをここに要求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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