(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液の特異的体外浄化のための機能性担体であって、
機能性担体の表面が以下の条件を満たす官能基を含み：
−少なくとも約１５℃〜約４５℃の温度において安定しておいる；
−血液適合性を有している；
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも１つに対して、特にガンマ線に対して安定している；
担体の表面は、第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、前記第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、前記第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示す、
ことを特徴とする、生体液の特異的体外浄化のための機能性担体。
【請求項２】
前記カルボン酸基が下記の基を有するリガンドと直接的又は間接的に共有結合を形成することを特徴とする、請求項１に記載の機能性担体。
0004224621.tif 000022
【請求項３】
前記カルボン酸基が、
（１）それぞれＮＨ2、ＯＨ及びＳＨ基とアミド結合、エステル結合及びチオエステル結合を形成する；
（２）修飾されてヒドラジンになり、アルデヒドとヒドラゾン結合を形成する；
（３）修飾されてアミンになり、アルデヒドと共にイミンを形成し、還元によってアミンとして安定化されうる；あるいは、
（４）修飾されて１，２−ジケトンになり、グアニジンと共有結合を形成しうる、
ことを特徴とする、請求項１に記載の機能性担体。
【請求項４】
第三の分子がカルボン酸基に共有結合しており、この第三の型の分子は、立体障害を減少させる、且つリガンド及び／又は分子又は浄化される成分のその後の結合を促進するスペーサー機能を有することを特徴とする、請求項１に記載の機能性担体。
【請求項５】
第四の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第四の分子は、非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増加させる機能を有することを特徴とする、請求項１に記載の機能性担体。
【請求項６】
第五の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第五の分子は一度結合されると、もう１つの種類の基を示し、特に基−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ2を有するリガンドともう１つの共有結合カップリングを可能にすることを特徴とする、請求項１に記載の機能性担体。
【請求項７】
生体液の体外浄化のための機能性担体であって、
機能性担体の表面が以下の条件を満たす官能基を含み：
−少なくとも約１５℃〜約４５℃の温度において安定しており；
−血液適合性を有しており；
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも１つに対して、特にガンマ線に対して安定している、
担体の表面は、第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、該第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、該第二の分子は共有結合した遊離カルボン酸基を示し：
第三の分子がカルボン酸基に共有結合しており、この第三の分子は、立体障害を減少させる、且つリガンド及び／又は分子又は浄化される成分のその後の結合を促進するスペーサー機能を有し：及び／又は、
第四の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第四の分子は、非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増加させる機能を有し：及び又は、
第五の分子が共有結合によってカルボン酸基上に結合され、この第五の分子は一度結合されると、もう１つの種類の基を示し、特に基−ＣＨＯ−、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ2を有するリガンドともう１つの共有結合カップリングを可能にする、
ことを特徴とする、生体液の体外浄化のための機能性担体。
【請求項８】
アクリロニトリル及びメタリルスルホン酸ナトリウムのコポリマーから製造される半透膜を含むことを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項に記載の機能性担体。
【請求項９】
前記第一の分子又は巨大分子が、分子量１０，０００〜２，０００，０００ダルトンの置換型又は非置換型のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であることを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項に記載の機能性担体。
【請求項１０】
前記第二の分子又は巨大分子が、以下の化学式を有するジカルボン酸無水物であることを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項に記載の機能性担体：
式：
0004224621.tif 000023
（ここにおいてＸ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である）。
【請求項１１】
前記第二の分子又は巨大分子が、以下の化学式を有するモノカルボン酸無水物であることを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項に記載の機能性担体。
式：
0004224621.tif 000024
【請求項１２】
一つの分子が、第三、第四、及び第五の分子の機能を果たし、この分子は式：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2
（ここにおいてＹは好ましくは基（ＣＨ2）mであり、ここにおいてｍは２〜６である）
のジヒドラジンであることを特徴とする、請求項４ないし７の何れか一項に記載の機能性担体。
【請求項１３】
多孔質又は非多孔質の平面フィルム、中実又は中空の繊維、多孔質又は非多孔質の微小球、又はこれらの組合わせの形態で、膜、特に透析膜の成分中に入っていることを特徴とする、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の機能性担体。
【請求項１４】
生体液の特異的体外浄化用モジュールであって、生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、前記区画の少なくとも一部は、請求項１ないし１３の何れか一項に記載のイオン性機能性担体により区切られている、体外浄化用モジュール。
【請求項１５】
前記機能性担体の第二の分子のカルボン酸基が、結合を形成し得る又は修飾され得る遊離カルボン酸基であることを特徴とする、請求項１４に記載のモジュール。
【請求項１６】
生体液の非特異的体外浄化用モジュールであって、生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、前記区画の少なくとも一部は、請求項７ないし１２の何れか一項に記載のイオン性機能性担体により区切られている、体外浄化用モジュール。
【請求項１７】
生体液の特異的体外浄化のための多目的機能性担体の調製方法であって、
前記機能性担体の表面が、
以下の条件を満たす官能基を含み：
−少なくとも約１５℃〜約４５℃の温度において安定している；
−血液適合性を有している；
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも１つに対して、特にガンマ線に対して安定している；
第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、前記第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、前記第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示し、
前記生体液の体外浄化は、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための治療であり、
ａ．一定の病気に応じて適切なリガンド又はリガンド混合物を選択する、
ｂ．担体を前記リガンド又はリガンド混合物と結合させ、カップリング生成物を得る、
ことにより特徴付けられる、方法。
【請求項１８】
生体液の体外浄化のための多目的機能性モジュールの調製方法であって、
生体液の循環のための区画を少なくとも一つ含み、
前記区画は、生体液の特異的体外浄化のための生物学的適合性を有するイオン性機能性担体により区切られており、
前記機能性担体の表面が、
以下の条件を満たす官能基を含み：
−少なくとも約１５℃〜約４５℃の温度において安定しておいる；
−血液適合性を有している；
−医療装置に用いることができる滅菌方法の少なくとも１つに対して、特にガンマ線に対して安定している；
第一の分子又は巨大分子がイオン結合によって結合していることにより電荷を帯びており、該第一の分子は第二の分子に共有結合したアミン基を示しており、該第二の分子は特異的リガンドとの直接的又は間接的共有結合を可能にする遊離カルボン酸基を示し、
前記生体液の体外浄化は、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための治療であり、
ａ．一定の病気に応じて適切なリガンド又はリガンド混合物を選択する、
ｂ．担体を該リガンド又はリガンド混合物と結合させ、カップリング生成物を得る、
ことにより特徴付けられる、方法。
【請求項１９】
前記リガンドが、修飾された担体の体外における使用に適した活性化物質の作用により共有結合していることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンドが、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、又は糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害物質、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、又はハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記病気が、自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記病気が、関節リウマチであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記病気が、播種状エリテマトーデスであり、前記リガンドがリポ酸であることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２４】
生体液の浄化のために体外回路に用い得る特異的リガンドを含むカートリッジを、無菌的かつその場で調製しうることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１７又は１８に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に：
0004224621.tif 000025
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、
ａ）置換又は非置換の、分子量１０，０００〜２，０００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；
ｂ）式：
0004224621.tif 000026
のジカルボン酸の無水物の溶液
（ここにおいて、Ｘ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である）、
又は式：
0004224621.tif 000027
のモノカルボン酸の無水物の溶液、
との反応生成物と、イオン性を有する担体とを接触させることからなり、
ｃ）このように修飾された担体が、場合によっては式：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2
（Ｙは、補体を活性化しない親水基を有するという特性と、γ線に対して安定であるという特性の二重の特性を有する基から選ばれ、好ましくは基［ＣＨ2］m（ここにおいてｎは２〜６である））
のヒドラジドと接触させられる機能性担体の調整方法。
【請求項２６】
請求項１７又は１８に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に：
0004224621.tif 000028
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、下記工程を備える方法：
ａ）処理された担体を形成するために、固定アニオン基を有する担体と、置換又は非置換の分子量１０，０００〜２，０００，０００を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とを接触させる工程；
ｂ）ａ）で処理された担体と、式：
0004224621.tif 000029
（ここにおいて、Ｘ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である）のジカルボン酸の無水物、
又は式：
0004224621.tif 000030
のモノカルボン酸の無水物、の溶液とを接触させる工程；
ｃ）場合によって、工程ａ）及びｂ）によって修飾された担体と、式：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2
（ここにおいてＹは好ましくは基（ＣＨ2）mであり、ここにおいてｍは２〜６である）
のジヒドラジドとを接触させる工程。
【請求項２７】
請求項１７又は１８に記載の方法において用いられる担体の調整方法であって、
前記担体は、有機基、特に：
0004224621.tif 000031
と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性を有する機能性担体であって、
前記方法は、下記工程を備える方法：
ａ）処理された担体を形成するために、固定アニオン基を有する担体と、置換又は非置換の分子量１０，０００〜２，０００，０００を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とを接触させる工程；
ｂ）ａ）で処理された担体と、式：
0004224621.tif 000032
（ここにおいて、Ｘ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である）のジカルボン酸の無水物、
又は式：
0004224621.tif 000033
のモノカルボン酸の無水物、の溶液とを接触させる工程；
ｃ）カルボン酸基に：
立体障害を減少させ、リガンド及び／又は分子又は浄化される有形成分のその後の固定を促進するためのスペーサー機能を有する第三の分子；及び／又は
非特異的相互作用を制限するために、担体の親水性を増す機能を有する第四の分子；及び／又は
一度結合されると、もう１つの種類の基を示し、特に基−ＣＨＯ又は−ＣＯＯＨを有するリガンドともう１つの型の共有結合カップリングを可能にする第五の分子、
を共有結合させる工程。
【請求項２８】
前記イオン性担体が、アクリロニトリルコポリマー及びメタリルスルホン酸ナトリウムである、請求項１７、１８、又は２５ないし２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１ないし１３のいずれか一項に定義されている担体と、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、又は糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害物質、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、又はハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選ばれるリガンドとのカップリング生成物。
【請求項３０】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の担体、又は請求項１４ないし１６のいずれか一項に記載のモジュールを組込んでいる、血液の体外循環のための装置。
【請求項３１】
透析装置であることを特徴とする、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子の除去のための装置であることを特徴とする、請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
前記病気が、自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記病気が、播種状エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は関節リウマチであることを特徴とする、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
次のものを含むキット：
−請求項１４から１６のいずれか一項に記載の多目的に使用しうるモジュール；
−機能性担体とリガンドとの反応の活性化溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋；
−場合によっては選ばれたリガンドの溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋；
−場合によってはリガンドの活性化及び／又は共有結合カップリングに必要な緩衝溶液又はリンス溶液。
【請求項３６】
活性化溶液がカルボジイミドであり、リガンドがリポ酸であることを特徴とする、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
活性化溶液が、過ヨウ素酸ナトリウムであり、リガンドが抗体であることを特徴とする、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生体液の生体内浄化用膜に関する。
浄化又は生体内浄化とは、この明細書全体において、生体液中に存在する内因性の又は外因性の分子又は巨大分子であって、これの一部又は全部除去が求められているような分子又は巨大分子の一部又は全部を除去するプロセスのことを言う。この分子又は巨大分子は、孤立しているか又は他の物質と複合して、場合によっては溶解状態にある。
本発明はまた、生体液浄化用の、多目的に使用しうる装置にも関する。この装置は、血液処理用の体外回路に用いる場合、血球適合性のある機能化担体から構成されている。この装置の特徴は、生体液の活性又は組成を変えるために用いることができるあらゆる型のリガンドを、共有結合的に固定しうることである。
本発明はまた、単独で、あるいは特異的リガンドを保持することのできる担体をその場で調合できる調製用キット中に組込んだ担体の製造方法及び使用方法にも関する。
腎不全患者の透析のために、生理的適合性のある半透膜が開発された。これらの担体は、平らな膜、あるいは中空繊維の形態を取ることができる。合成ポリマーをベースとした、あるいは変性セルロースをベースとした多くの膜が、製造業者によって、ユーザーが入手できるようにされている。用いられているポリマーはホモポリマーであることはめったになく、ポリアクリロニトリルのみから構成されている膜はまったくない。
例えばアサヒ社（Ａｓａｈｉ）の膜ＰＡＮは、アクリロニトリルコポリマー、メタクリル酸メチル、及びアクリル酸から構成されている。この膜は、血液と接触する濃密層と、透析物側のスポンジ状壁とから成る非対称微孔構造である。アンカ社（ＥＮＫＡ）の膜ＳＰＡＮも、アクリロニトリル、メタリルスルホン酸ナトリウム、及びメタクリル酸メチルをベースとする非対称微孔膜である。
オスパル社（ＨＯＳＰＡＬ）（フランス国メジウ（Ｍｅｙｚｉｅｕ，Ｆｒａｎｃｅ））によって製造販売されている膜ＡＮ６９は、アクリロニトリルコポリマーと、メタリルスルホン酸ナトリウムとをベースとするものである。この膜は、その生物学的適合性と転移性によって知られている。ポリマーＡＮ６９のアニオン部位（メタリルスルホン酸ナトリウムコモノマーに由来するもの）の含有量は、６００ｍＥｑ／ｋｇである。この膜の含有量は、約１８０Ｅｑ／ｋｇである（ポリマー含有量は概略３０％）。
その他のポリマー、特にポリスルホンポリマーもまた、非対称微孔性構造を示す。これらは基本的に疎水性であり、十分な拡散性を備えた透析膜を形成するには、親水性成分、例えばポリビニルピロリドンと混合しなければならない。
対称親水性担体は、所望の用途に従って中空繊維形態であっても、平らな膜であっても、さらに、その生物学的適合性に関して次のような機能的利点を有する。すなわちこれらは、わずかに補体を活性化するものであり、血栓を発生させず、大きな拡散能力を有するという点である。
一般的には、例えばアクリロニトリルコポリマーのような、生物学的適合性アニオン性ポリマーはすべて、本発明の方法によって機能化可能な担体を生じうる。
２つの型の生体内浄化が本発明に関わっている。１つには、腎透析の際に普通に用いられている透析及び／又は血液濾過型の非特異的生体内浄化に関しており、もう１つには、生体液から望ましくない分子又は巨大分子を除去しようとする生体内浄化に関しており、これは、親水性担体と共有結合によって組合わされた１つ又はそれ以上のリガンドと共に除去される分子又は巨大分子の特異的相互作用によるものである。
透析及び血液濾過
体外循環による血液の処理のための装置は、医学的用途又は医療関係の様々な用途に用いられる。例えば透析又は血液濾過による腎不全の治療、治療用及び非治療用のプラスマフェレーゼ及びアフェレーゼ、血液の酸素付加、免疫浄化等である。
これらの装置の製造に用いられる材料はすべて、できるだけ生物学的適合性になるように選ばれ、血液が異物と接触する時に生じる反応（特に凝固）が生じないように、あるいは比較的軽いレベルでしか生じないようにする。
その生物学的適合性を改良するために、血液と接触することになる材料の、全体あるいは表面を処理することが知られている。既知の処理は、装置のうちの種々の部分を製造するために用いられるポリマー溶液の製造の際（全体処理）、あるいは装置の様々な部分が組立てられた後であって装置の滅菌の前、あるいは装置の使用直前にその場で実施される。
次の条件を尊重しつつ、装置の活性要素（例えば透析膜）の生物学的適合性を改良しようとする場合に、特に解決が難しい問題を生じる：
１）処理及び処理方法に用いられる物質の選択は、結果として既知の活性要素の変更をもたらすことになるものでなければならず、この変更は、既知の品質のすべて（例えば透析／血液濾過膜の場合、拡散性及び対流性転移性能、望ましくない物質の吸着能力等）を保持しながら、活性要素の生物学的適合性を改良する効果を生む；
２）装置の滅菌は処理に影響を及ぼしてはならない；
３）処理は、ユーザー側での特別な操作を必要としないものでなければならない。
より特定すれば、本発明は、前記の条件を満足させる装置であって、処理前に表面が負の電荷を示すような活性要素を有する装置の製造方法を提案することを目的とする。血液が負電荷表面と接触するとき、血液は、接触相の活性化と呼ばれる生物学的現象起こり、これは、不活性物質すなわちプレカリクレイン及びＸＩＩ因子からの、活性物質すなわちカリクレイン及びＸＩＩａ因子の発生として発現する。
接触相の活性化それ自体は良性なものであるが、いくつかの撹乱因子（患者によるＩＥＣ型の降圧剤の摂取、塩水の満たされた装置を透過する血液の希釈、これに付随するｐＨ低下）と同時に生じる場合、望ましくない反応の原因になるようである。これらの反応は、アナフィラキシー反応と呼ばれ、これは治療開始の数分後に様々な症状として現れる。これらの症状としては、全体が熱っぽい感じ、指、唇、舌のしびれ、息切れ、嘔吐、喉頭浮腫がある。アナフィラキシー反応は、血液区画の内側表面が負電荷であるような医療装置の使用とのみ関連しているわけではないことを再確認する必要がある。これらの反応は、様々な化学組成の膜を有する交換器の場合に見られ、ある時は最初の使用時、またある時は交換器を一回の使用後に捨てずに、何度も再使用し、使用する都度リサイクルすることで何度も用いた後に発生する。最初の使用時に望ましくない反応が生じた交換器の例として、ポリメチルメタクリレート及びポリアクリロニトリル膜を有する透析器を挙げることができる。酢酸セルロース及びポリスルホン膜を備えた透析器の再利用に関する反応も、多くの文献に示されている（キドニー・インターナショナル「中空繊維血液透析器の再使用及びＡＣＥ阻害剤に関連したアナフィラキシー反応（Ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｕｓｅ  ｏｆ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｚｅｒｓ  ａｎｄ  ＡＣＥ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、第４２巻（１９９２年）、１２３２−１２３７頁参照）。
特異的生体内浄化
固体担体への巨大分子の共有結合固定に関して、多くの開発が行われている。より詳しくは、例えば吸着により、特異的固定率を増加させるため、及び非特異的固定率を低下させることを目的とした開発である。例えば特許出願ＷＯ９２／０７０２３号、９２／０７００６号、及びＷＯ９２／０５２０１号を挙げることができる。これらの特許出願は、担体が非負荷親水性ポリマーで覆われているという技術を開発している。すなわちポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に共有結合的に結合しているＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−エポキシである。これら３つの特許出願に記載された方法は、非極性反応媒質中で実施される。すなわちＰＥＧエポキシは、ＰＥＩと安定な関係を形成し、これは反応媒質のｐＨを低下させながら直接反応によって、不溶性担体上に固定される。従ってエポキシ型の機能化担体が得られる。それにもかかわらず、これらの担体は、これらのヒドロキシル基の存在によって多くの場合過剰に親水性であるという欠点を示し、これらの過剰な親水性によって、リガンドとして用いるべき蛋白質が、エポキシ反応基と接触するのを妨げる。これは結果としてリガンドの担体上への固定率を減少させるものである。
この問題を取り除くため、リガンドと親水性担体との接触を促進するように、リガンドを含むミクロエマルジョンが開発された（ＷＯ９２／０７０２３号）。
担体上への生物学的巨大分子の固定についての以前から考えられていた特別な用途の１つは、分子又は巨大分子の精製を目的とする液体の特異的浄化である。この用途の特別な例は血漿蛋白質の免疫浄化であるが、これは通常、血漿、あるいはよりまれではあるがドナーからの採取によって得られた血液を、固体担体上を通過させて実施される。この固体担体上には、特異的に、かつ可能であれば得たいと望んでいる分子と良好な親和性をもって反応しうるリガンドが結合している。
精製に対して特に有利なリガンドには、モノクローン抗体類がある。抗原とこれらの相互作用の特異性によって、及び対応する抗原とのこれらの高い親和性によって、これらの使用は、親和性クロマトグラフィの数多くの用途における、試験管内特異性免疫浄化において検証されている（「免疫学における現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第２節、単元８−２）。それにもかかわらず、血漿中の物質の最大限の浄化を目的とする体外免疫浄化は、精製及び／又は濃縮物質の製造を目的とする試験管内免疫浄化とは、多くのパラメーターによって根本的に異なる。特に次のパラメーターである：
−上記のような修飾担体に必要な生物学的適合性、
−その機能的一体性を保持させることができる方法によるリガンドの共有結合固定、
−抗原のそれらのエピトープに対する親和性は、循環における抗原の塩析が最小限になるようなものでなければならないが、一方で、精製物質を得るための試験管内免疫浄化は、その代り固定収率がより少なくなるリスクを冒しても、前記物質の変性を伴なわずに塩析が可能にされるものでなければならない。
体外浄化の例として挙げることができる唯一の製品は、セファローゼ球に付け加えられた蛋白質Ａから構成されるカラムであり、イムノソルバ（エクスコリム社（Ｅｘｃｏｒｉｍ））カラムという名称で販売されているものである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ壁から抽出された蛋白質Ａは、ＩｇＧのＦｃ断片に親和性があり、同様にイミュノソルバカラムは、ＩｇＧのみではあるが、これらの抗原特異性による区別なしにすべてのＩｇＧが除去される限り、用途が非常に限定される。このことは明らかに大部分の場合に求められるものではない。
本発明者らは、生体液、特に血漿を浄化するための体外循環物質として存在する系の有利な物理的機能的特性を利用したいと考えた。このような浄化は、このようなものが存在することによって、あるいくつかの病気又はあるいくつかの生物学的機能障害を発生させる分子又は巨大分子、より詳しくはアルブミン（６６，４００ダルトン）より大きい分子量の毒性分子及び巨大分子であって、血液濾過又は血液透析技術によって浄化されないものの除去のための治療となりうる。
本発明は、生体液の循環のための区画を備えた生体液の体外浄化用モジュールを提供することを目的とする。この区画は少なくとも一部、機能化担体又は機能化基を有する表面を持つ壁によって画定されており、次の条件を満たしている：
−少なくとも約１５℃〜約４５℃の温度で安定であること；
−血球適合性を有すること；
−医療装置に用いうる滅菌方法の少なくとも１つの型、特にガンマ線に対して安定であること；
−場合によっては、活性化物質の存在下に官能基を発生させるのに適していること、この意味において、次の基を有するリガンドと共有結合を形成するのに適していること：
0004224621.tif 000002
−巨大分子の非特異的固定を防ぐのに十分ではあるが、臨界閾値より低く、この値を超えるとリガンドの共有結合固定率が低くなるか、さもなければゼロになるような親水性を有すること。親水性は固有のものであってもよく、化学的処理によって与えられたものであってもよい。
この明細書全体において、機能化担体とは、室温において、及び商品としての使用に適合した時間の間安定な基を有するあらゆる壁又は表面のことを言うが、これらは活性化物質の存在下に、官能基を発生させるのに適している。これらの官能基自体が、リガンドと直接的又は間接的カップリングのために、−ＣＨＯ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ型の有機基と反応するのに適しており、リガンド自体は、浄化したいと望む生体液の分子又は有形成分と特異的に相互作用するのに適している。
特に機能化担体のベースは、平面フィルム又は中空繊維の形態；平面フィルム又は非多孔質中実又は中空繊維の形態；多孔質又は非多孔質超微粉、又は前記のものの組合わせの形態にあるあらゆる透析膜を構成するであろう。
生体液の体外浄化のためのモジュールはまた、表面が電荷を示す機能化担体を備えていてもよい。これらの電荷を介して、イオン結合により、第一の型の分子又は巨大分子が結合される。第一の型の分子は、一度結合したら遊離アミン基を示し、これらのアミン基には共有結合によって第二の型の分子が固定されており、これらの第二の型の分子は一度結合されると遊離カルボン酸基を示し、これらの遊離カルボン酸基は、１）各々ＮＨ2、ＯＨ、及びＳＨ基と共にアミド結合、エステル結合、及びチオエステル結合を形成するのに適している；あるいは、２）修飾されてヒドラジンになり、アルデヒドとヒドラゾン結合を形成するのに適している；あるいは、３）修飾されてアミンになり、アルデヒドと共にイミンを形成するのに適しており、還元によってアミンとして安定化されうる；あるいは、４）修飾されて１，２−ジケトン（例えばシクロヘキサジオン、グリオキサール等）になり、次のものと共有結合を形成するのに適している：
0004224621.tif 000003
第一の型の分子の例は、１０，０００〜２，０００，０００ダルトンの分子量のポリエチレンイミンである。
第二の型の分子の例は、次式のジカルボン酸の無水物である：
0004224621.tif 000004
ここにおいてＸ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である。
第二の型の分子のもう１つの例は、モノカルボン酸の無水物であり、例えば次式の酢酸の無水物である：
0004224621.tif 000005
特異的生体内浄化への使用のためには、遊離カルボン酸基は、特異的生体内浄化を可能にするリガンドと、あるいは１つ又は複数の下記機能を有しうる第三の型の分子とアミド結合を形成してもよい：
−立体障害を減少させ、リガンド及び／又は分子又は浄化される有形成分のその後の固定を促進するためにスペーサーを添加すること、
−蛋白質又はこのような相互作用を行なうことができるあらゆる物質との非特異的相互作用を制限するために、膜又は担体の親水性を増すこと、
−その他の種類の基、例えばアミン基、特に基−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2を有するリガンドともう１つの型の共有結合を可能にするものを示すこと。
これらの様々な機能性が累積されて、単一の分子に存在することもある。前記の３つの機能性を組合わせた第三の型の分子の有利な例は、次の式のジヒドラジドである：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2
ここにおいてＹは好ましくは基（ＣＨ2）mであり、ｍは２〜６である。
さらにＹは、次のようにして選ばれなければならない。すなわちＹは、親水基を有していなければならず、どんな場合でも補体の活性化剤であってはならず、医療装置の少なくとも１つの滅菌方法、例えばガンマ線に対して安定でなければならない。
体外回路における本発明によるモジュールの使用は、前記担体の固有の性質が存在することを前提としている。すなわち、
−最小限の非特異的吸着；
−接触相の活性化の不存在、すなわち１リットルあたり１０単位以下のカリクレインの発生；
−非毒性。
さらには特異的生体内浄化の使用のためには、これらは特異的リガンドとの高いカップリング能力を有するものでなければならない。
前記担体から作られたモジュールは、考慮されている治療方法に適合した条件において、生体液の循環を可能にするものでなければならない。
本発明のモジュールは、好ましくは膜として、ＡＮ６９型の、アクリロニトリルコポリマー及びメタリルスルホン酸ナトリウムから製造された半透膜を含むものである。
本発明はまた、有機基と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性機能化担体の製造方法にも関する。特に、
0004224621.tif 000006
であり、下記工程を含む：
ａ）固定アニオン基を有する担体と、分子量１０，０００〜２，０００，０００ダルトンのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とを接触させる工程であって、ＰＥＩは置換又は非置換である；
ｂ）ａ）で処理された担体と、次式のジカルボン酸の無水物：
0004224621.tif 000007
（ここにおいてＸ＝［ＣＨ2］nであり、ｎは２又は３であるか、又はＸ＝−ＣＨ＝ＣＨ−である）
又はモノカルボン酸の無水物、例えば次式の酢酸の無水物：
0004224621.tif 000008
の溶液とを接触させる工程。
末端カルボン酸基は、カルボジイミドを添加するか、あるいはカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドの形態の活性化エステルに転換して、リガンドのカップリングのために直接用いることができる。
ｃ）場合によっては、工程ａ）及びｂ）によって修飾された担体と、次式：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、
のジヒドラジドとを、カルボキシル基の活性化カップリング剤、例えばカルボジイミドの存在下に接触させる工程。
Ｙは、補体を活性化させず、例えばγ線のような医療装置の滅菌方法の少なくとも１つの型に対して安定な基から選ばれる。Ｙは好ましくは［ＣＨ2］mであり、ｍは１〜４である。
本発明の方法のこの第一の変形例は、以下の明細書において「アセチル化後」と呼ばれる。
本発明の方法は、同等の結果を生じる変形例を含めてもよい。この変形例においては、工程ｂ）の無水カルボン酸は、工程ａ）で提案された担体の処理の前に、工程ａ）のＰＥＩと反応している。換言すれば、この変形例において、有機基と共有結合を形成するのに適した基を有する生物学的適合性機能化担体、特に：
0004224621.tif 000009
は、イオン性を有する担体と、次のものの反応生成物との接触によって得られる：すなわち分子量１０，０００〜２，０００，０００ダルトンのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であって、前記ＰＥＩは置換又は非置換であるものと、式：
0004224621.tif 000010
（ここにおいてＸは上記と同じ意味を有する）
のジカルボン酸の無水物、又は式：
0004224621.tif 000011
のモノカルボン酸の無水物、の溶液との反応生成物である。
このように修飾された担体は、次いで式：
ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2
（Ｙは上記と同じ意味を有する）
のジヒドラジドと接触させられる。
前記方法のいずれか１つにおいて、アニオン性を有する担体は好ましくは、前記のようなＡＮ６９型の、アクリロニトリルコポリマーとメタリルスルホン酸ナトリウムから成る膜である。ＰＥＩは好ましくは、分子量が１０，０００〜２，０００，０００ダルトンである。
ジカルボン酸の無水物は、好ましくは次式のコハク酸の無水物である：
0004224621.tif 000012
この無水物は、アセトニトリル中の０．５Ｍ〜２Ｍの濃度の溶液として用いられる。この第二変形例は、第一変形例と区別しやすくするために、「アセチル化前」と呼ばれる。
無水酢酸、あるいは無水コハク酸とＰＥＩとのアミド結合によるカップリング後、全体をアニオン性担体と接触させる。予備スクシニル化ＰＥＩでの処理の場合、−ＣＯＯＨ官能基は、ジヒドラジドと反応することができる。このジヒドラジドは好ましくはＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）であり、ここにおいてｍは４である。
本発明はより一般的には、この方法又は前記の変形例によって得ることができる担体、並びにこれを含む生体内浄化モジュールに関する。これらの担体は、上に列挙されたものと同じ条件を満足させなければならない。
前記のような本発明の方法は、透析及び／又は血液濾過膜の調製のために用いることができる。本発明は、これらの方法によって得ることができる膜であって、ＰＥＩのアセチル化後、又はＰＥＩのアセチル化前から成るものに関する。
このようにして作られた膜を含む透析モジュールは、本発明の一部を成す。
機能化担体と組合わせることができるリガンドは、均質性又は異質性のものであってもよい。すなわちこれらは、単一の分子種から構成されていてもよく、あるいは複数の分子の生体液を同時に浄化しようとする場合、複数の分子種の適合性混合物から構成されていてもよく、あるいは分子の異なる部位に対して異なる親和性を有するリガンドを有する単一の分子から構成されていてもよい。例えばリガンドが抗体又は抗体断片である場合、異なる特異性を有する抗体の混合物であっていてもよい。前記リガンドの共有結合的カップリングによってこのように修飾された担体と生体液との接触によって、１つ又は複数のリガンドとの親和性を有する、１つ又は複数の分子種又は巨大分子種、あるいは生体液の有形成分を選択的に除去することができる。
リガンドは、あらゆる既知の方法によって、修飾された担体の体外使用と適合する活性化物質の作用によって、共有結合的に固定されるであろう。このような手段は、次の文献に記載されている。すなわち米国特許第４，２１７，３３８号；Ｔｈｏｍａｓら「コロイド及びＡ表面（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ）（１９９３年）第７７巻、１２５−１３９頁；Ｍａｌｍｓｔｅｎら「Ｊ．コロイド及び界面科学（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（１９９６年）第１７７巻、７０−７８頁である。
カッコ内の数字は、この明細書の全体について、この記載の最後にリストが挙げられている参考文献に対応している。
リガンドが抗体である場合、これを行なうためには２つの方法が可能である。第一の方法は、抗体のアミン基と担体のカルボキシル基との間のアミド結合によって、抗体をカップリングすることから成る。
第二の方法は、過ヨウ素酸ナトリウムによって抗体を酸化し、次いで分子のグルコース基上に発生したアルデヒド基と、ジヒドラジドによる機能化担体のヒドラジド酸との間のヒドラゾン結合の形成によって、これらをカップリングすることから成る。これらの条件下におけるカップリング効率は、ｐＨが４〜６である時に最大である。
これらの方法の各々の例は、図１及び２に示されている。
生体液の生体内浄化が治療上利点があるような状況をすべて列挙することは、手間のかかることでもあり、無駄であろう。代謝及び病理プロセスに関する知識は絶えず進歩しているので、新たな浄化方法の候補が絶えず発生しているからである。当業者なら、決定される治療方法によって、適切なリガンド又はリガンド混合物を選び、選択することができよう。例えば場合によっては、分子又は複合混合物の浄化の場合、異なるエピトープ又は抗原特異性の抗体の混合物を組合わせることもできよう。要するに、浄化される物質に対してではなく、浄化したいと考えている物質に対して特異的に複合されたもう１つの物質に対して親和性を示すリガンドによって、生体液を浄化することを選ぶこともできよう。
抗体は、単一特異的であるか、あるいは複数のエピトープ的又は分子的特異性が混合されたポリクローン抗体、あるいは好ましくはモノクローン抗体であってもよい。例えば次のものを挙げることができる：
−敗血症ショックの治療において、あるいは炎症性現象、例えば慢性関節リューマチの治療においては、炎症に効果がある抗サイトカイン抗体（ＩＬ−１β；ＴＮＦα；ＩＬ−６）；
−新生児の溶血疾患の治療及び予防における抗ＲｈＤ抗体；
−臓器移植の予防法における抗ＨＬＡ抗体。
同様に、例えば抗体、受容体、レクチン等のような適切なリガンドによって、例えば細胞又は血小板のような血液の有形成分を特異的に浄化することを選ぶこともできよう。
本発明の機能化担体とリガンド、特にモノクローン抗体又はポリクローン抗体とのカップリング生成物は新規であり、これらも本発明の一部を成し、及び生体液の浄化におけるこれらの使用もこの発明の一部である。
カップリング生成物は、効率的であるためには、抗原の各型に対して可変であるような固定抗体の最適量を特徴とするものでなければならない。例えば約２ｍｇ／ｍ2を固定することができる。
抗原はまた、生体液の浄化に対して有利な候補の一種でもある。特に自己免疫疾患の場合に、自己抗体の除去に有利である可能性がある。
今日、自己免疫疾患は、心臓血管病及び癌に次ぐ三番目に大きな病理プロセスであり、これらには対症療法しか存在しない。
自己免疫疾患は何よりもまず、Ｂリンパ球の活動亢進が際立っており、その他の生物学的症状のうちでも自己抗原に逆らって進む多数の自己抗体の存在を特徴としている。例えば、様々な各抗抗原抗体、抗ＤＮＡ抗体、酵素に対する、及びＲＮＡ転写及び翻訳プロセスに介入する核蛋白質に対する抗体を挙げることができる。自己免疫疾病の典型的な例は、播種性エリテマドーシス（ＬＥＤ）又は慢性関節リューマチである。複数の全身的疾患に存在することがある自己抗体の多様性によって、臨床的には症状が混在することが多いだけに、診断が非常に難しくなる。
自己抗体の産生が自己免疫疾患患者の場合の特徴であるとすれば、この産生はまた、健康な個人の場合に年齢と共に増加する（８、１４、１８）が、だからといってこれらの個人は自己免疫病を発病しないことを認めるのは興味深いことである。さらには、これらの同じ人たちの場合に生じた自己抗体の標的自己抗原（ＤＮＡ、ヒストン、酵素、及び核蛋白質）は、自己免疫疾患、特にＬＥＤの場合に見られるものと同じである（１１）。
一方で、多くの研究が免疫複合体の発病性について報告している。実際、ＬＥＤ患者の場合の死因の１つである腎不全は、腎臓内の免疫複合体、特にＤＮＡ／抗ＤＮＡ免疫複合体の沈積によって誘発されることが証明されている（９、１０）。最近Ｓａｓａｋｉらは、ＤＮＡ／抗ＤＮＡ免疫複合体の存在と、増殖性瀰漫性糸球体腎炎の罹患率とを結び付けることになるいくつかの要素について発表した。このために、すべての腎合併症が出る前に、循環する免疫複合体の形成に関わる抗原及び抗体を除去して、患者側にこれらが形成されるのを減らすのが有利であることになる。
現在用いられている種々の治療方法は、主として：
ａ）糖質コルチコイドによる治療。これは高い用量（０．７〜１ｍｌ／ｋｇ）で、明らかな臨床的改善が生じ、種々の自己抗体率の低下、免疫複合体の消滅、及び血清補体率の再上昇を伴なう；
ｂ）免疫抑制剤、これの使用についてはより異論が多い。
ｃ）血漿交換又はプラスマフェレシス。
この後者の技術は、いくらかの狼瘡患者には効果があることが証明されてはいるが、いくつかの欠点がある。すなわちこの技術は費用がかかり、実施が難しく、除去は選択的ではない。その理由は、この技術では病原性免疫複合体だけでなく、必須成分、例えば免疫グロブリン、凝固因子、補体の分子、及び調整活性を有するその他の多くの化合物をも浄化するからである。従ってこれは臓器に対して、特異的技術よりもはるかに外傷性がある。
結局この治療の後では、「リバウンド」現象が起こることが多く、免疫複合体及び自己抗体率が、治療停止の数日後に劇的に増加する。
ｄ）通常、血漿又はこれよりまれではあるが血液を、リガンドが結合されている固体担体上に通過させて実施されるアフェレーゼ。このリガンドは、特異的かつ可能であれば高い親和性を持って、標的細胞上又は低分子量又は高分子量の成分上に存在する部位と反応しうるものである。
ＬＥＤの場合、可能な治療方法は、病原抗体、この場合抗ＤＮＡ抗体を、この方法によって特異的に除去することから成る。最初のデータは、Ｔｅｒｍａｎらによってもたらされたものであるが、これらの研究者らは、狼瘡患者の血液を浄化するために、コロイド形態のＤＮＡカラムを用いた。しかしながらリガンドとしてのＤＮＡの使用は、次の理由によって非常に限定されている。１つには、例えばヌクレアーゼ及び血漿エステラーゼのような酵素と接触した場合に不安定であるからであり、もう１つには、潜在的な変形性と関連した潜在的危険性のためである。これは、血清蛋白質と複合した、循環中のその塩析が示すことがあるものである。それにもかかわらず、抗ＤＮＡ抗体は、ＤＮＡによってではなく、これらの抗体が交叉反応を生じるその他の化合物によって特異的に捕らえられる。多くの研究者、例えばＬａｆｅｒら、次いでＳｈｏｅｎｆｅｌｄは、ネズミ及びヒトの抗ＤＮＡ抗体は、ＤＮＡとは非常に異なる化合物、例えばカルジオリピン又はその他の負電荷リン脂質分子と反応しうることを証明した。Ｓｕｓｕｋｉらは、担体の再生装置と組合わされた硫酸デキストランゲル上での連続的アフェレーゼ装置を考案し、狼瘡患者の場合の抗ＤＮＡ抗体率の減少を証明した。しかしながらこの治療戦略の利点は、抗ＤＮＡ抗体のみが一部除去され、これらは狼瘡患者の病変の原因の唯一の自己抗体ではないという事実によって、限定されるようである。
リポ酸（ＡＬ）又は６，８−ジチオオクタンリポ酸（ＡＴ）は、炭素６及び８に対して２個の硫黄原子と結合した、炭素原子８個の分子であり、ジチオランヘテロ環を形成する：
0004224621.tif 000013
代謝面においては、これはデヒドロゲナーゼオキソ酸に対して必須の補助因子を構成する。これらは酵素、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）又はオキソグルタル酸デヒドロゲナーゼに対して必須の多酵素複合体であり、これらにおいて、これは共有結合的にリジンのＮＨ2基に結合している（１、２、２１）。
免疫面においては、リポ酸の固定部位に対応するＰＤＨの部分が、初期胆汁性肝硬変患者の場合に自己抗体によって確認することができる自己抗原を構成することは明らかに示されている（７）。最近になって数人の研究者は、この自己抗原上にリポ酸が存在することが、これらの患者の場合のこの認識についての決定要因であることを証明した（６、７）。
さらに免疫の分野において、スルフヒドリル基を有する化合物、例えば２−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールは、培養中のリンパ球の場合、抗体の産生を刺激しうることが証明された（３、４、１５、１７）。
Ｏｈｍｏｒｉは、試験管内で、場合によって生じる免疫刺激性を明らかにするためにＡＬの効果を研究した（１６）。ＡＬの存在下における抗原刺激の結果生じる抗体応答の増加は、Ｔ個体群に依ることは明白であるようである。実際、副Ｔリンパ球の枯渇は、ＡＬの作用を無効にする。さらには得られた刺激は用いられた抗原に特異的なものである。
ＬＥＤの免疫浄化による治療におけるリガンドとしてリポ酸の選ぶことは、次の観察事項に基づいている。
１）ＬＥＤ患者の血清は、図３に表れているように正常な被験者とは異なって、ＩｇＧ類、特にＩｇＭ類の高い率の抗ＡＬ抗体を含んでいる。
２）抗ＡＬ抗体率は、ネズミＭＲＬ／ｌｐｒの血清においては年齢とともに増加する。その他にこれらのネズミは、年を取るとＬＥＤを自然発生的に発病する。ネズミＭＲＬ／ｌｐｒと、ＭＲＬ／ｍｐと呼ばれる対照ネズミの場合の抗ＡＬ抗体率の動物の年齢による比較研究によって、抗ＡＬ抗体の滴定量、ネズミＭＲＬ／ｌｐｒの場合１２週目から増加し、一方この率は、対照ネズミＭＲＬ／ｍｐの場合低いままであることが明らかにされる。結果を図４に示す。
３）抗ＡＬ抗体は、二本鎖ＤＮＡと反応するが、一本鎖ＤＮＡとは反応しない（１３）。あるいはこのＬＥＤは、ある一定の時の抗ＤＮＡ二本鎖抗体疾患の存在を特徴とする。
４）ＬＥＤ疾患患者の血清からの抗ＡＬ抗体の浄化は、同時に抗ＤＮＡ二本鎖抗体率をも減少させる（図５）。
上記の観察事項と結果によって、リポ酸は狼瘡病において血漿を抗ＡＬ及び抗ＤＮＡ抗体浄化するための優れた方法の候補であるようであった。
リポ酸は、アミン基とのアミド結合によって機能化担体とカップリングされうる。これらのアミン基は、例えば、モノヒドラジドによって、ジヒドラジドによって、あるいは式：ＮＨ2−（ＣＨ2）n−ＮＨ2（ｎは２〜６である）のジアミンによって、あるいはＮＨ2−（ＣＨ2）x−ＮＨ−（ＣＨ2）y−ＮＨ2（ｘ及びｙは３〜６である）のポリアミンによって与えられたものである。ＬＥＤの治療のためのリポ酸との本発明によるカップリングの実施例は、次の実施例において示される。
本発明はまた、本発明による機能化担体と、リポ酸とのカップリング生成物にも関しており、及びＬＥＤ患者の血清の浄化のためのこれの使用にも関する。このカップリング生成物を含む装置は、自己免疫疾患、より詳しくはＬＥＤを治療するのに特に成績がよい。
当業者であれば、場合によっては、前記の抗体及び抗原の他に、ペプチド、糖蛋白質、ホルモン、酵素、これらの補助因子、これらの基質又は阻害剤、多糖類、レクチン、毒素又は抗毒素、核酸又はポリヌクレオチド酸、ハプテン、ハプテンのリガンド、顔料又は色素から成る群から選んで、一定の病気の治療に適したリガンドを選ぶことができよう。
一定の病気の治療は、同時にあるいは逐次に、複数のカップリング生成物の使用により、リガンド混合物によって実施することができる。
本発明は、本発明の方法の実施の結果生じた前記のような機能化担体の、多目的に使用しうるモジュールの製造への使用に関する。このモジュールは、生体液の体外浄化のためのものであり、このモジュールでは、生体液中に存在する、除去が求められている生化学種又は細胞、特に抗原、抗体、又はハプテンが浄化される。
本発明はまた、機能化担体と、生体液の浄化用の１つ又は複数の特異的リガンドとの本発明によるカップリング生成物の調製のための、多目的に使用しうるキットにも関する。前記キットは少なくとも次のものを含んでいる：
１−リガンドと共有結合的にカップリングされうる担体を有する装置；
２−機能化担体とリガンドとの反応の活性化溶液を含む滅菌容器又は滅菌袋；
−適切な溶液及び濃度のリガンド；
−場合によっては１つ又は複数のリンス溶液。
実施態様が図１０に示されている本発明のキットは、前記方法によって得られる修飾担体を組合わせた治療用溶液を提供するものである。この担体の多孔度及び修飾は、リガンドに適しており、１つ又は複数の分子、又は生体液中の除去したいと考えている有形成分の種類及び濃度に適しているものである。
キットにおいて、装置は有利には透析カートリッジ、より詳しくは、例えば前記のような機能化カートリッジＡＮ６９であってもよい。
本発明のキットのリガンドがリポ酸であり、担体上に存在する基がアミン基である場合、活性溶液は好ましくは水溶性形態のカルボジイミドであろう。
本発明のキットのリガンドが抗体である場合、活性化溶液は例えば過ヨウ素酸ナトリウムである。カップリングに用いられる反応は、当業者によく知られた従来の反応であり、これは、選ばれたリガンドに従って、活性化剤の種類によっても、反応の物理化学条件によっても、最も性能のよい操作条件を用いることができるものであろう。
本発明のキットは有利には、看護人、あるいはこれらと関連した資格のある人によって用いられ、好ましくは血液又は血漿であるような生体液の浄化のために、体外循環において使用しうる特異的リガンドを有するカートリッジを、無菌的かつその場で調製するためのものである。
本発明は前記のようなキットの、哺乳動物、より詳しくはヒトのあらゆる予防的又は治療的処理においての使用に関する。
本発明は要するに、本発明の少なくとも１つのモジュールを含む装置の体外循環による、ヒト又は動物の血液又は血漿の特異的生体内浄化方法に関する。図１１の概略図において、血液全体は、本発明のモジュ−ル内の通過及び患者への再投与によって、体外循環により処理される。このような処理の枠内において、必要であれば、血液の一部を限外濾過することも可能である。
本発明のその他の特徴および利点は、図１〜22を参照しながら、以下の実施例の中で明らかになるであろう。
図１は、低分子量の分子、グリシン、あるいはＰＥＩで機能化された支持体を持つ抗体と、スクシニル化されたアミノ基との結合を例示したものである。
図２は、低分子量の分子（ピルビン酸塩）あるいは高分子量の分子（酸化された抗体）とのヒドラゾン結合による同様の連結を示す。
図３は、ＭＬＲマウス血清におけるリポ制酸性抗体の力価を示す。明灰色の部分はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける割合、影を付けた濃灰色はＭＲＬ／ｍｐマウスにおいて得られた割合を示す。
図４は、種々の疾病におけるリポ制酸性ＩｇＭの割合の比較を示す。Ｃは対照、ＰＢＣは原発性胆汁性肝硬変、Ｍは筋無力症、ＲＡは慢性関節リウマチ、ＳＬＥは播種状エリテマトーデス、Ｓは梅毒、ＴＨは甲状腺炎を示す。
図５は、リポ酸が共有結合している支持体上を狼瘡血清が通過したあとの浄化された抗ＤＮＡ抗体の減少を示す。
図６は、無水コハク酸によるＡＮ６９-ＰＥＩの機能化後に使用しうる部位の数を示す。曲線は、スクシニル化した単独ＡＮ６９（丸でつないだ曲線）およびスクシニル化したＡＮ６９-ＰＥＩに導入されたエタノールアミンの量に対して、得られた無水物の量を示す。定量は、ユニットの入口（三角でつないだ曲線）、中央部（菱形でつないだ曲線）および出口（四角でつないだ曲線）で行った。
図７、８および９は、機能化していないあるいは各々ＥＤＣおよびＡＤＨ、無水コハク酸、ＥＤＣおよびＡＤＨ、ならびにＰＥＩ、無水コハク酸、ＥＤＣおよびＡＤＨで機能化したＡＮ６９への14Ｃピルビン酸の固定を示す。
図１０は、処置ユニットの準備方法を示し、図１１は体外循環による処置方法を示している。
図１２は、ＥＤＣという活性化剤の存在下でリポ酸と共有結合を形成するのに適したプトレシンに連結した、エポキシ表面で構成される支持体を得る方法を図式的に表わしたものである。
図１３は、比較として、ＡＬとエポキシのＯＨ基との直接エステル結合による支持体の形成を示す。
図１４は、エステル結合（黒い点）あるいはアミド結合（黒い菱形）によって得られたＡＮ６９-ＡＬ支持体で得られる抗ＡＬ  ＩｇＭの割合、すなわち浄化の割合を比較したものである。
図１５は、支持体がＡＮ６９-ＡＬで構成されるカラムを連続的に通過させた後に得られる浄化率を比較したものである。
図１６は、同じ支持体を数回通過した後に溶出されるタンパクの１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で得られるプロフィールを示す。
図１７は、ＰＥＩと反応する漸増量の無水コハク酸に対してのＰＥＩ-Ｐのアミン置換率を示す。
図１８は、接触活性化へのＰＥＩのスクシニル化後の影響を示す。
図１９は、スクシニル化の度合に応じて、ＡＮ６９の小ユニットによってスクシニル化される前のＰＥＩ-Ｐの量を示す。
図２０は、スクシニル化の度合に応じて、また様々な濃度のスクシニル化前のＰＥＩ-Ｐについて、ＡＮ６９の小ユニットによってスクシニル化される前のＰＥＩ-Ｐの量を示す。
図２１は、ＰＥＩ-Ｐのスクシニル化前の割合に応じて得られる結果を説明する、コハク酸の電荷した基の様相を図式的に表わしたものである。
図２２は、スクシニル化の度合に応じて、カリクレインの生成によって測定した接触相の活性化を示す。
図２３は、スクシニル化前の割合に応じて、スクシニル化前のＰＥＩ-Ｐで被覆した小ユニットに固定されるヘパリンの量を示す。
特異的生体内浄化および透析と血液濾過のための機能化された支持体の調製方法：
以下の試験は、後アクリル化あるいは前アクリル化によって処理した、アクリロニトリルコポリマー型の膜の調製に基づく。この試験によって、非特異的（透析および／あるいは血液濾過膜）あるいは特異的（浄化する分子の単数または複数の特異的リガンドの連結）生体内浄化における適用のための第二の方法の利点を明らかにすることができる。
次の事柄を目的としてＰＥＩの修正を行った：
-機能化の割合、すなわち場合によってリガンドと連結するのに適した反応基の割合を最適化する；
-非特異的固定、たとえばヘパリンの固定を避けながら、処理していない多アニオン性膜に関して認められるトロンボゲン形成を抑制する。
これらの実験で使用したＰＥＩは、ＢＡＳＦによって市販されている、光拡散によって測定した平均分子質量が７５０，０００ダルトンのＬＵＰＡＳＯＬ−Ｐである。
その他のタイプのＰＥＩ、特に同じ会社が市販している平均分子質量２５，０００のｌｕｐａｓｏｌ-ＷＦも使用することができる。
使用したカルボキシル酸無水物は無水コハク酸である。アクリル化はこの場合にはスクシニル化である。
１．方法：
１．１  表面の修正：
すべての実験は、１７０本の中空ファイバーＡＮ６９（内径：２１０μｍ；壁の厚さ：４２μｍ：長さ：０．１８ｍ）および生理的血清（ＮａＣｌ  ０．１４Ｎ）溶液として修正したあるいは修正していないトリチウム標識ＰＥＩ-Ｐを含む小透析器を用いて実施した。２つのアプローチを使用した：
ａ）まず最初にトリチウムで標識したＰＥＩ-Ｐでユニットを処理し、その後スクシニル化した；
ｂ）あらかじめ完全にあるいは部分的にスクシニル化しておいたトリチウム標識ＰＥＩ-Ｐでユニットを被覆した。
１．２  様々な割合でスクシニル化されたＰＥＩ-Ｐの調製：
ホウ酸緩衝液０．０５Ｍ  ｐＨ８．６  ５０ｍｌ中のＰＥＩＰ３ｍｇに、アセトニトリルに溶解した無水コハク酸（ＡＳ）を加えた。
スクシニル化の度合に応じて加えたＡ．Ｓ．の量は次の通りであった：
１００％のスクシニル化：ＡＳ１６２μｍｏｌ
８０％のスクシニル化：ＡＳ５４μｍｏｌ
６０％のスクシニル化：ＡＳ３１μｍｏｌ
４０％のスクシニル化：ＡＳ１８μｍｏｌ
２０％のスクシニル化：ＡＳ８μｍｏｌ
必要に応じて０．１ＭソーダでｐＨを８．６に調整しながら撹押下で１時間の接触期間を置いたあと、１２Ｍ酢酸を加えてｐＨを５に下げることにより反応を停止させた。
アミンの置換の割合を、バルトスとテッセ（Ｊ．Ｂａｒｔｏｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔｅｓｅｚ）の「熱量測定および蛍光光度法による生体分析の実施」、第２版、１９８４年、マッソン、ｐ．８４〜８５（図１７）の中に述べられている方法に従って、フルオレスカミンを用いて検査した。
小ユニットを被覆するために、ｐＨを８に調整した。
１．３  ＰＥＩで被覆したＡＮ６９膜の安定性の評価：
種々の濃度（０．１４Ｍ、１、２および４Ｍ）のＮａＣｌ溶液の循環を明らかにすることにより、表面修正の安定性を評価した。
１．４  生物学的評価：
本発明に従って処理した小ユニットが接触相を活性化するかどうかを評価するため、次のような試験に供した：表面が負に電荷した膜との接触によってカリクレインの生成を刺激するのに適した生物学的液体を調製した。試験に使用した生物学的液体は、クエン酸塩を加えた生理的血清中で５％に希釈した、血小板欠乏のヒト血漿であった（使用した試験条件は、血液の体外循環のための装置の使用条件とは異なっている：希釈の比率が非常に高く、選択した液体は血液ではなく血漿であり、血漿はクエン酸塩を加えたため酸性化されているのに対し、透析では使用する抗凝固剤はヘパリンである。これらの試験条件は、接触相の活性化を刺激し、増大することから、故意に選択した）。この液体１５０ｍｌを、０．５ｍｌ／分の流量で３０分間、小ユニットの血液区画において開放回路で循環させた。バイオジェニック（ＢＩＯＧＥＮＩＣ）社の基質Ｓ２３０２から、古典的色素産生試験によって時間間隔を置いて採取した液体サンプル中の血漿カリクレインを定量した。
使用した色素産生試験の感受性を考慮すると、カリクレインの濃度が約１０単位／リットルまでにとどまっていれば、カリクレインの比率の有意の上昇はないとみなすことができる。
２．得られた結果：
２．１  表面の修正：
２．１．１  スクシニル化後：
まず最初にトリチウム標識したＰＥＩ-Ｐでユニットを被覆し、その後スクシニル化した。その結果を以下の表Ｉに示す：
0004224621.tif 000014
これらの結果は、スクシニル化後がＰＥＩ-Ｐの４３％の再放出を引き起こすことを示している。
さらに、カリクレイン生成のバイアスによって測定した接触相の活性化のレベルが図１８に示されている。この図は、裸の状態のＡＮ６９膜、ＰＥＩ-Ｐで被覆したＡＮ６９膜、およびＰＥＩ-Ｐで被覆してその後スクシニル化したＡＮ６９膜について、リットル当り単位で測定したカリクレイン生成を比較したものである。
この図は、ＰＥＩ-Ｐで処理したＡＮ６９が接触相を活性化しないことを示している。それに対し、スクシニル化後はＰＥＩ-Ｐを部分的に脱着させるので、スクシニル化後のＰＥＩ-Ｐで処理したＡＮ６９は接触相を活性化させる。
２．１．２  スクシニル化前の作用；
トリチウム標識したＰＥＩ-Ｐで被覆した小ユニットを種々の度合でスクシニル化前を行い（図１７）、ＡＮ６９に吸着されたスクシニル化前トリチウム標識ＰＥＩ-Ｐの量を測定した。その結果が表１９に示されている。
図１９は、ＡＮ６９に吸着されるＰＥＩ-Ｐの量がスクシニル化の度合と共に増加し、最大６０％に達することを示している。６０％を超えると、吸着されるＰＥＩ-Ｐの量は急速に減少する。
さらに、吸着されるＰＥＩ-Ｐの量は、スクシニル化の度合（図１９に示すように）と同様に、小ユニットに導入されるスクシニル化前のＰＥＩ-Ｐの濃度と共に増加する。最大吸着は、ＰＥＩ-Ｐの６０％のスクシニル化前に関して認められ、これはすべての場合に当てはまる。
図２０は、小ユニットに吸着されるＰＥＩ-Ｐの量が、小ユニットに導入されるスクシニル化前ＰＥＩ-Ｐの濃度が６０ｍｇ／ｌまたはそれ以上である場合には、２１６μｇのプラトーに達することを示している。
２．１．３  結論：
スクシニル化前のＰＥＩ-ＰのＡＮ６９ユニットへの吸着の増加は、アミンとカルボキシルの電荷基の間での静電相互作用の変化から生じる立体配座変化の結果であると考えられる。
図２１は、スクシニル化前していないＰＥＩ（上の図）と３０％、６０％および１００％スクシニル化前のＰＥＩのＡＮ６９膜への吸着を図式的に表わしたものである。
ＰＥＩ-Ｐがスクシニル化前されていない時には、膜のイオン基と相互作用するＰＥＩ-Ｐのモル当りのアミン基の数（５０-3）が大きい。スクシニル化前は、スクシニル化前のＰＥＩ−Ｐの立体配座変化を引き起こすＰＥＩ−Ｐのモル当りのアミン基の数を減少させ、そのことが吸着されるＰＥＩ−Ｐの量を増加させ、結果として特異的生体内浄化のために使用しうる反応部位の数を増加させる。さらに、スクシニル化前の割合を制御することにより、このように処理したＡＮ６９膜上で得られる可能性のある反応部位の量をコントロールすることができる。
これに対し、スクシニル化後の場合には、図２１の最初の図で、反応性のＮ＋部位数が比較的少ないことが認められ、従ってスクシニル化後の反応性カルボキシル部位数がスクシニル化前の場合よりも少なくなる。
２．２  スクシニル化していないトリチウム標識ＰＥＩと、漸増食塩濃度で小ユニットを洗浄したあとスクシニル化前したトリチウム標識ＰＥＩの安定性
スクシニル化後の場合、無水コハク酸のＰＥＩへの連結は、ＮＨ3+基と膜のＳＯ3-基の結合が弱まることにより（上記の表Ｉで示されたように）３０〜４０％のＰＥＩの再放出を導く脱プロトン化の段階を通過する。
下記の表ＩＩは、食塩濃度を漸増して洗浄した後のＰＥＩ-Ｐの脱着のパーセンテージを示す。
0004224621.tif 000015
上記の結果は、小ユニットを４０、６０および１１０ｍｇ／ｌのスクシニル化前のＰＥＩ-Ｐで処理し、その後生理的血清２０ｍｌ（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した時、ＰＥＩ-Ｐの脱着は起こらず、これが１Ｍの食塩濃度まで続くことを示している。これに対し、小ユニットを２Ｍまたはそれ以上のモル濃度の食塩水で洗浄した時には、すべての場合にスクシニル化前のＰＥＩ-Ｐの部分的な脱着が認められた。
スクシニル化前のＰＥＩ-Ｐの脱着のレベルは、スクシニル化前の度合と共に上昇する。
最大の機能性部位を得るためには、６０％スクシニル化前のＰＥＩ-Ｐによる小ユニットの処理が至適である。
２．３  血液適合性
図２２は、２０〜７０％スクシニル化前のＰＥＩ-Ｐで処理したＡＮ６９が接触相の活性化を生じさせないことを示している。これに対し、１００％スクシニル化前のＰＥＩ-ＰでＡＮ６９の処理を行うと（図２２）、認められる接触相の活性化は、ＡＮ６９をＰＥＩ-Ｐで処理していない場合と同等である。
スクシニル化前のＰＥＩ-ＰによるＡＮ６９の表面処理の追加的な利点は、支持体へのヘパリンの吸着が、スクシニル化していないＰＥＩ-Ｐで処理したＡＮ６９に関して認められる吸着に比べて少ないことである（図２３）。ヘパリンはしばしば抗凝固剤として使用されるので、これらの膜を血液透析／血液濾過において使用する際に、このことが大きな利点となる。
３．結論
これらの比較実験から、機能化したＡＮ６９膜の調製、特にそれらをスクシニル化前のＰＥＩ-Ｐで処理する時の至適条件を定義することができた。カルボキシル酸の無水物がコハク酸の無水物である場合、条件は次の通りである：
-スクシニル化の度合は６０％；
-スクシニル化前の６０ｍｇ／ｌ濃度のＰＥＩによる表面処理。
これによって次の結果が導かれる：
-２μｍのＣＯＯＨ／ｍ2膜という最大の機能性；
-イオン価の高い（１モル濃度まで）媒質中での極めて良好な安定性；
-血液の接触相の活性化なし；
-この種の膜を透析／血液濾過において使用する時大きな利点となる、支持体へのヘパリンの限られた吸着。
一般に、この手法は処理した膜上に存在する反応性部位の数を再現可能に制御することができる、すなわち：
-特異的生体内浄化に適用するための反応性部位数の増加；
-本発明の膜の適用全体として、得られる反応性部位数の再現性。
上記の実験はさらに、スクシニル化後に比べてスクシニル化前の有利さを明らかにした；実際に、スクシニル化後では、あらかじめ固定したＰＥＩの再放出がおそらくＡＮ６９膜の被覆中に「孔」の形成を生じさせるのであろう。そのような「孔」の存在は好ましくない作用、特に被覆していない裸の膜に関して認められた、接触相の活性化作用を導く。
実施例１：ＡＮ６９  ＰＥＩ-ＰＥＧエポキシドへの抗ＩＬ６Ａｃの固定：
抗ＩＬ６Ａｃを不溶性支持体、たとえばセファロースに固定するための最良の方法を定義し、ひとたび方法が確立すればそれをＡＮ６９に適用するための実験を試みた。
２つの手法によるＡＣの連結を、トリチウム［3Ｈ］標識したＩｇＧを用いて実施した。
ａ）ＩｇＧのタンパク鎖中のリシンのεＮＨ2へのアミド結合による連結；
ｂ）次の資料に述べられている手法に従って、ＩｇＧのＦｃ部分に存在する、あらかじめ酸化された炭水化物群へのヒドラゾン結合による連結：米国特許第４２１７３３８号；Ｑｕａｓｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９７８年、第２２巻、１６５−１７４頁参照。
セファロースのビーズと抗ＩＬ６Ａｃを、加えるＡｃＩＬ６の濃度を漸増させてビーズの容量１対ＡｃＩＬ６の容量１の割合で２時間接触させた。
各々のビーズサンプルについて得られた放射能の量を、パッカードＭＩＮＡＸＩ  β液体シンチレーションコンピュータで測定した。
その結果を以下の表ＩおよびＩＩに示す：
0004224621.tif 000016
表１の結果は次の事柄を示している：
１）使用する抗ＩＬ６Ａｃの濃度が低い場合は、結合したＡｃの量は加えたＡｃの量の２０％であり、これは２つの手法について同様である（表Ｉ）。
２）加える抗ＩＬ６Ａｃの濃度を高くすると、２つの手法によって結合する抗ＩＬ６  Ａｃの量が増加する。抗ＩＬ６Ａｃをアミド結合によって連結した時、ビーズ４０ｃｍ2について結合した抗ＩＬ６Ａｃは０．５４μｇから１３．６μｇに増加した。この量は、抗ＩＬ６Ａｃをヒドラゾン結合によって連結した時には、ビーズ４０ｃｍ2につき結合した抗ＩＬ６Ａｃが０．３８μｇから１８μｇとなった。
３）抗ＩＬ６Ａｃをヒドラゾン結合によって連結した時には、結合の収率は加える抗ＩＬ６Ａｃの量に従って上昇し、２０％から４２％になったが、一方アミド結合によって連結した抗ＩＬ６Ａｃについては、結合抗ＩＬ６Ａｃの収率は加えたＡｃの量にかかわらず一定なままであった（２６％）。
酸化されたあるいは酸化されていない抗ＩＬ-６抗体のセファロースビーズへの吸着の度合を調べるために実施した実験は、この吸着が７％を越えないことを示した。
それ故、結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が、２つの手法について、加える抗ＩＬ６Ａｃの量に従って増加するとすれば、これらの抗ＩＬ６Ａｃの結合効率は、抗ＩＬ６Ａｃをヒドラゾン結合によって連結した時の方が優れていると思われる。
このことは加えるＡｃの濃度が高い場合により著明である：
-ヒドラゾン結合については４２％、
-アミド結合については２６％。
実施例２：ＡＮ６９  ＰＥＩ-ＰＥＣエポキシドでのＩＬ６抗原の免疫浄化：
２．１  アミド結合あるいはヒドラゾン結合によって連結した抗ＩＬ-６Ａｃとセファロースビーズに関して：
下記のものを用いてＩＬ６の免疫浄化試験を実施した：
-一方では、１．１）項および表Ｉに述べられている手法に従って同じ比率で、アミド結合あるいはヒドラゾン結合により抗ＩＬ６Ａｃを漸増量で結合したビーズ、
-他方で、被検血清中に存在するＩＬ６の割合を変化させた。このために、あらかじめ検査した陰性血清の混合物中で、非常に高い比率のＩＬ６（血清１ｍｌ当りＩＬ６  １．７μｇ）を含む血清を希釈した。最終的に、試験した血清はＩＬ６の最終比率が３３，０５０、２２，４７０、１１，２３５および３，１５７ｐｇ／ｍｌであった。
これらのセファロースビーズ／抗ＩＬ６Ａｃを、修正した種々の血清混合物と、ビーズの容量１対血清の容量１の割合で接触させた。
通過の前後に血清中に存在したＩＬ６の比率をサンドイッチ型酵素免疫測定法によって測定した。
その結果を以下の表ＩＩに示す。
0004224621.tif 000017
0004224621.tif 000018
これらの結果は次のことを示している：
１）ヒドラジンで処理したあるいは処理していない支持体単独（抗ＩＬ６Ａｃを伴わないビーズ）ではＩＬ６を固定しない。
２）結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が多いほどＩＬ６の免疫浄化は有効であり、これは使用した２つの結合手法のいずれにも当てはまる。
３）抗ＩＬ６Ａｃが１３．６μｇ／４０ｃｍ2（アミド結合）および１８μｇ／４０ｃｍ2（ヒドラゾン結合）の割合で結合する時、ＩＬ６の免疫浄化は、使用した２つの結合手法について、また低い比率あるいは高い比率のＩＬ６を含む血清について、９０-１００％有効である。
４）結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が１３．６μｇ／４０ｃｍ2（アミド結合）および１８μｇ／４０ｃｍ2未満である場合には、結合する抗ＩＬ６Ａｃの量に従って、ならびに血清中に存在するＩＬ６の比率に従って、ＩＬ６の免疫浄化が低下する。
実際に、抗ＩＬ６Ａｃがアミド結合により２．６４μｇ／４０ｃｍ2結合する時には、免疫浄化の効率が３，１５７ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての９８％から、３５，０３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての８１．３％まで低下する。同様に、抗ＩＬ６Ａｃが０．５４μｇ／４０ｃｍ2結合する時には、免疫浄化効率は、３，１５７ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての８６．９％から、３５，０３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての１８．５％に低下する（表ＩＩ）。
抗ＩＬ６Ａｃがヒドラゾン結合により２．７２μｇ／４０ｃｍ2結合する時には、免疫浄化の効率が３，１５７ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての９０％から、３５，０３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての５４．２％まで低下する。同様に、抗ＩＬ６Ａｃが０．３８μｇ／４０ｃｍ2結合する時には、免疫浄化効率は、３，１５７ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての５７．１％から、３５，０３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清についての２８．５％に低下する（表ＩＩＩ）。
結論：
アミド結合あるいはヒドラゾン結合による抗ＩＬ６Ａｃの結合は、ＩＬ６に対する活性を保存する。
３５，０００ｐｇ／ｍｌまでを含む血清中に存在するＩＬ６の免疫浄化が９０-１００％有効であるためには、結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が約０．４μｇ／ｃｍ2でなければならない。この免疫浄化効率は、アミド結合であれヒドラゾン結合であれ結合する抗ＩＬ６Ａｃについて同様である。
結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が０．４μｇ／ｃｍ2未満である場合には、ＩＬ６の免疫浄化は、血清中に存在するＩＬ６の比率が高いほど効率が低くなる。この所見は２つの結合型のいずれにも当てはまるが、それにかかわらず、抗ＩＬ６Ａｃがアミド結合によって連結している時には、ＩＬ６の免疫浄化は一般に、抗ＩＬ６Ａｃがヒドラゾン結合によって連結している時よりも有効である。
ＩＬ６の総免疫浄化についてｃｍ2当りに結合する抗ＩＬ６Ａｃの至適量をビーズに関して定義したので、ＡＮ６９の小ユニットに関するＩＬ６の免疫浄化に移った。
２．２  ＡＮ６９小ユニットでのＩＬ６の免疫浄化試験：
第ＷＯ９２／０７０２３号に述べられている方法に従って小ユニットを親水化し、機能化した（Ｈ＆Ｆ）。
１）方法：
長さ１８ｃｍのＡＮ６９の中空ファイバー１７０本を含む小ユニットを組み立てた（内表面積：２５６ｃｍ2）。エポキシド群を生成するため、これらの小ユニットをＰＥＧテトラポキシドによる処理に供した。
プロピオネート3Ｈで標識した抗ＩＬ６Ａｃを、ヒドラゾン結合により０．４μｇ／ｃｍ2の割合でビーズの場合と同じ条件下で２つのＡＮ６９小ユニットのひとつに結合した。ＡＮ６９ファイバーへの結合効率がセファロースビーズへの結合効率と同様であるとみなせば、この０．４μｇ／ｃｍ2という結合Ａｃは、理論的には加えたＡｃの４２％に相当する。
そこで、ファイバー１ｃｍ2当り０．９５μｇのＡｃ、すなわちファイバー２５６ｃｍ2につき２４３μｇのＡｃを接触させた。
他方で、対照のヤギのＡｃを、常にヒドラゾン結合によって、ＡＮ６９小ユニット＋抗ＩＬ６Ａｃの場合と同じ条件下で２番目のＡＮ６９小ユニットに結合した。
１１，２０３ｐｇ／ｍｌのＩＬ６を含む血清３ｍｌを、これらの小ユニット上で２時間再循環させた（０．５ｍｌ／分）。
その後、これらの小ユニットの通過の前後に、存在するＩＬ６の比率をサンドイッチ型酵素免疫測定法によって測定した。
表ＩＩＩによれば、対照Ａｃを加えたＡＮ６９を通過した後は、ＩＬ６の１４％が非特異的に除去されただけであったのに対し、抗ＩＬ６Ａｃを結合したＡＮ６９の通過後には免疫浄化率が７７．５％まで上昇したことから、免疫浄化は有効であり、且つ特異的であったと思われる。
0004224621.tif 000019
使用した実験条件下では、ＡＮ６９小ユニットへの抗ＩＬ６抗体の固定率は０．１１μｇ／ｃｍ2であった。
このＡＮ６９ファイバーへの抗ＩＬ６Ａｃの結合の平均収率を説明することができる最も可能性の高い仮説は、ファイバー表面のエポキシド部位の少なさであり、従ってアジピン酸ジヒドラジドによる処理後の、酸化されたＡｃの炭水化物部分のアルデヒドとのヒドラゾン結合を生成するために使用しうるヒドラジン基の少なさである。
ＩＬ６の比率が≦３５，０００ｐｇ／ｍｌである血清については、結合する抗ＩＬ６Ａｃの量が少なくとも０．４μｇ／ｃｍ2であることを条件として、ＩＬ６の免疫浄化は１００％の効率であることがわかっている。ところで、我々は、おそらくｃｍ2当りで共有結合するＡｃのそのような密度を得ることができない、従ってＩＬ６の免疫浄化を制限する系（ＡＮ６９ファイバー）を有している。
２．３  補体を固定する能力の検査：
抗ＩＬ６Ａｃを結合して親水化し、機能化した小ユニットＡＮ６９Ｈ＆Ｆによる血清ＩＬ６の浄化効率が明らかになったので、化学的に修正したこの同じ小ユニットが、補体系に対するその無反応性に関して最初の特性を保持しているかどうかを検討した。すなわち、補体を固定する能力の有無について試験した。
ＡＮ６９  Ｈ＆Ｆの膜は、０．６２５ＵＨ５０あるいは２．５ＵＨの割合で加えた補体を固定しなかった。
Ａｃを結合したＡＮ６９  Ｈ＆Ｆカートリッジは、対応するＡｇを特異的に除去することができ、補体の固定を生じさせなかった。
実施例３：特異的生体内浄化のためのスクシニル化後のＡＮ６９ＰＥＩの調製：
この調製は、小ユニットをＰＥＩ  ＷＦで処理したあと、スクシニル化した後実施した。
３．１  ＡＮ６９-ＰＥＩ上の、低分子量（ＦＰＭ）分子の固定のために使用しうる部位数の測定：
１）無水コハク酸によるＡＮ６９-ＰＥＩの機能化後：
この試験のために、１ｍ2の表面積を持つ平らな膜で構成されるユニットを使用した。このユニットをＰＥＩで処理し、その後、ユニットの両端と中央部で鉗子を用いて４．５ｃｍ2の膜サンプルを採取できるように分解した。
放射標識したＦＰＭ分子：［14℃］エタノールアミンを用いて、これらのＡＮ６９-ＰＥＩトローチと対照ＡＮ６９トローチの使用可能部位数を比較した。
その後次のプロトコールに従って無水コハク酸を固定した：
-アセトニトリル中での１Ｍ無水コハク酸溶液の調製；
-５０ｍＭ  ｐＨ８．５のホウ酸緩衝液中で上記の溶液を１／１０に希釈し、対照ＡＮ６９トローチとＡＮ６９  ＰＥＩトローチに１５分間接触させる；
-２回目の操作を開始する；
-Ｈ2Ｏで十分に洗浄する。
このようにして得られた部分上に、次のようにして標識エタノールアミンを固定した：
ａ）生成されたＣＯＯＨ基の活性化：
ａ-１）：ＮａＨ2ＰＯ4  １０ｎＭ中で１  エチル３（３  ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）（ＥＤＣ）（５０ｎＭ）とＮ．ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）（５０ｎＭ）の溶液を調製し、トローチと１５分間接触させる。
ａ-２）：活性化溶液を除去する。
ｂ）エタノールアミンの固定：
ｂ-１）：低温エタノールアミン／標識エタノールアミンの同位体希釈液を調製する
-低温４ｎｍｏｌ／標識０．４ｎｍｏｌ
-低温４０ｎｍｏｌ／標識０．４ｎｍｏｌ
-低温４００ｎｍｏｌ／標識０．４ｎｍｏｌ
-低温４０００ｎｍｏｌ／標識０．４ｎｍｏｌ
各々の溶液は、最終ｐＨ８の５０ｍＭホウ酸緩衝液中で調製する。
ｂ-２）：対照ＡＮ６９とＡＮ６９-ＰＥＩトローチを撹拌下で２時間接触させ、その後ホウ酸塩／ＮａＣｌ  ０．５Ｍ中で洗浄し、計数する。
図６は次の事柄を示している：
-ＡＮ６９＋ＰＥＩ＋無水コハク酸に固定されるエタノールアミンの最大量は５．６ｎｍｏｌ／トローチである；
-ＡＮ６９＋無水コハク酸に固定されるエタノールアミンの量は１．２ｎｍｏｌ／トローチである。
従って、ＡＮ６９＋スクシニル化ＰＥＩに実際に固定されたエタノールアミンの量は、５．６−１．２＝４．４ｎｍｏｌ／４．５ｃｍ2、すなわち１ｎｍｏｌ／ｃｍ2あるいは１０μｍｏｌ／ｍ2である。
最後に、図６は、ＡＮ６９＋スクシニル化ＰＥＩに固定されたエタノールアミンの量がユニット全体に関して均一であることを示している。ユニットの入口、中央部および出口で同じ部位数が認められたからである。
２）アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）によってスクシニル化したＡＮ６９-ＰＥＩの機能化後
次のようにしてＡＤＨを固定する：
ＣＯＯＨ基を活性化した後（ａ）参照）、ホウ酸緩衝液５０ｍＭ  ｐＨ８．５中５０ｍＭのＡＤＨ溶液を長関市、ＡＮ６９トローチと１時間接触させる。
ホウ酸緩衝液中で、次にＨ2Ｏで、さらにアセテートで十分に洗浄する。
次のようにしてピルビン酸14Ｃのトローチへの固定を行なう：
５０ｍＭ  ｐＨ５．４のアセテート１ｍｌ中で低温ピルビン酸／標識ピルビン酸の同位体溶液を調製する：
-低温０ｎｍｏｌ／標識５ｎｍｏｌ
-低温２０ｎｍｏｌ／標識５ｎｍｏｌ
-低温２００ｎｍｏｌ／標識５ｎｍｏｌ
-低温２０００ｎｍｏｌ／標識５ｎｍｏｌ；
トローチと２時間接触させた後、アセテート、ＮａＣｌ  ０．５Ｍで洗浄し、計数する。
図７は、ＡＮ６９＋ＡＤＨに保持されるピルビン酸の至適量が、支持体の活性化（ＥＤＣ）の有無にかかわらず０．１ｎｍｏｌ／トローチであることを示している。
図８は、スクシニル化ＡＮ６９＋ＡＤＨに固定されるピルビン酸の至適量が、導入されるピルビン酸の量が１５０ｎｍｏｌ／トローチを越える場合には、支持体の活性化（ＥＤＣ）の有無にかかわらず０．５ｎｍｏｌ／トローチであることを示している。
図９は次のことを示している：
-ＡＮ６９＋ＰＥＩ＋無水コハク酸＋ＡＤＨに結合するピルビン酸の量は、ＡＤＨのアミド結合による固定のために支持体上に生じるカルボキシル基の活性化（無水コハク酸を通して）後には、少なくとも１．１ｎｍｏｌ／トローチである；
-支持体上に生成されるカルボキシル基が活性化されない時には、ＡＮ６９＋ＰＥＩ＋スクシニル化＋ＡＤＨに吸着されるピルビン酸の量は、０．４５ｎｍｏｌ／トローチである。
結論として、まず最初にＰＥＩ、次いで無水コハク酸によるＡＮ６９の機能化は、低分子量分子のために使用しうる部位数を少なくとも５倍増加させる。この増加はＡＤＨによる処理後とほぼ同じ大きさである。
３．２  高分子量（ＨＰＭ）分子の固定のために使用しうるＡＮ６９-ＰＥＩ上の部位数の測定：
この試験のために、２種類の濃度（５μｇと６０μｇ）の酸化した免疫グロブリン（Ｉｇ）あるいは酸化していない免疫グロブリンを機能化したあるいは機能化していないＡＮ６９のトローチと接触させた。
0004224621.tif 000020
まず最初にＰＥＩ、次に無水コハク酸、そして最後にＡＤＨによるＡＮ６９の機能化は、高分子量分子のために使用しうる部位数を少なくとも２倍増加させることができる。
実施例４：スクシニル化後のＡＮ６９-ＰＥＩでの抗リポ酸（ＡＬ）抗体の免疫浄化：
ＬＥＤに関して、図１、２および３に示された結果から我々は、ＬＥＤを発症した患者の血漿中の抗ＡＬＡｃを特異的に除去することができるカートリッジに注目するに至った。ＡＬは分子量１００ｋＤａのハプテンであるので、開発された手法は官能性ＣＯＯＨ基を含む他のハプテンにも拡大することができるであろう。
不溶性支持体への共有結合によるＡＬの固定は次のようにして実施する：
-エポキシ末端の官能基を直接プトレシンで置換して、αＮＨ２で終わる腕を形成し、そこにアミド結合によってリポ酸を付け加える（図１参照）。
２つの理由からこの操作が必要である：一方では、アルカリ性媒質中でＡｃを溶出した後カートリッジを再使用できるようにし、また他方で、アミド結合は、ＡＬを加水分解したエポキシドのＯＨ基に直接連結した場合に生じるエステル結合（図２参照）よりも本質的にはるかに安定である（図５参照）。
４．１  ＡＬ結合の種類に従った免疫浄化の比較試験：
図５は、ＡＬをアミド結合によって連結した時に、抗ＡＬＩｇＭの免疫浄化が明らかにより有効であることを示している。エステル結合によって連結したＡＬは約８％というごくわずかな抗ＡＬＩｇＭの低下をもたらすだけであるのに対し、前記の場合には抗ＡＬが完全に除去されるからである。
アミド結合によって連結したＡＬによる抗ＡＬＡｃの免疫浄化の有効性が証明されたので、次の段階は再使用を検討すること、従って支持体の安定性を調べることであった。
このために、同じ支持体で、同じ狼瘡血清に由来する６つのサンプルを免疫浄化した。
４．２  小ユニットＡＮ６９  Ｈ＆Ｆ-ＡＬの再使用試験：
図８は、異なるものであるが同じ狼瘡血清に由来する６つのサンプルを、各々の通過の間に溶出段階をはさんで同じ支持体に連続６回通過させると、最初の通過後と６回目の通過後に同じ抗ＡＬＡｃの浄化効果が得られることを示している。
これら６回の通過後に固定されたタンパクの連続的溶出は、ポリアクリルアミドゲルの場合と同じプロフィールを生じる（図９）。
結論：
我々は、ＡＮ６９が体外循環における有効で特異的且つ再使用可能な、抗ＡＬＡｃの免疫浄化系であることを明らかにした。
実施例５：スクシニル化前のＡＮ６９  ＰＥＩ-Ｐで精製したＩｇＧの共有結合による連結：
５．１  実験材料：
実験はＡＮ６９の中空ファイバー（内径：２１０μｍ；壁の厚さ：４２μｍ；長さ：０．１８ｍ）１７０本を含む小透析器で実施した。
ヤギのＩｇＧは、ビオシー（コンピエーニュ、フランス）由来のものである。
ヤギのＩｇＧとウサギのＩｇＧを、各々腹水プールからのタンパクＡセファロースカラムおよびウサギ血清からのＤＥＡＥセルロースで、実験室において精製した。
５．２  実験方法：
５．２．１  放射標識ＩｇＧの調製：
マウス、ウサギおよびヤギのＩｇＧをＮ-スクシニジル（２-３3Ｈ）プロピオネートで放射標識し、過剰の放射能を透析によって除去した。
-透析後のＩｇＧの比放射能：
マウスのＩｇＧ：１．２５  １０6ｃｐｍ／ｍｇタンパク
ウサギのＩｇＧ：１．８６  １０6ｃｐｍ／ｍｇタンパク
ヤギのＩｇＧ：０．７７  １０6ｃｐｍ／ｍｇタンパク
５．２．２  小ユニットの修正
５．２．２．１）６つの小ユニットを脱グリセリン化し、その後６０％スクシニル化前のＰＥＩ-Ｐ溶液で処理した；
５．２．２．２）Ａ、Ｂ、Ｃと名付けた３つの小ユニットをカルボジイミドで活性化し、Ｄ、Ｅ、Ｆと称する他の３つはそのままにしておいた；
５．２．２．３）放射標識したウサギのＩｇＧ  ５０μｇを、小ユニットＡとＤ上をＰＢＳ（最終容量：３ｍｌ）中で２時間再循環させた。
放射標識したマウスのＩｇＧ  ５０μｇを、小ユニットＢとＥ上をＰＢＳ（最終容量：３ｍｌ）中で２時間再循環させた。
放射標識したヤギのＩｇＧ  ５０μｇを、小ユニットＣとＦ上をＰＢＳ（最終容量：３ｍｌ）中で２時間再循環させた。
５．２．２．４）次に６つの小ユニットを放射能の痕跡がなくなるまで洗浄した。
結合したＩｇＧの量は、導入された放射能の量−放出された放射能の量に相当する。
５．３  実験結果：スクシニル化前のＡＮ６９に結合したＩｇＧの量
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参考文献
１-ブラッドフォード、エトケン、ベッグ、クックおよびイーマン（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ａｉｔｋｅｎ，Ａ．，Ｂｅｇ，Ｆ．，Ｃｏｏｋ，Ｋ．Ｇ．ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ，Ｓ．Ｊ．）（１９７８ａ）。ウシ腎の２-オキソグルタール酸デヒドロゲナーゼ複合体のリポ酸補因子を取り巻くアミノ酸配列（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．）。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２、１、２１１
２-ブラッドフォード、ハウェル、エトケン、ジェームスおよびイーマン（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．，Ａｉｔｋｅｎ，Ａ．，Ｊａｍｅｓ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ，Ｓ．Ｊ．）（１９７８ｂ）。ウシ心臓のＰＤＨ複合体のＥ２成分のリポ酸塩結合部位の周囲の一次構造（ＰＲＩＭＡＲＹ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＲＯＵＮＤ  ＴＨＥ  ＬＩＰＯＡＴＥ  ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ  ＳＩＴＥ  ＯＮ  ＴＨＥ  Ｅ２  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴ  ＯＦ  ＢＯＶＩＮＥ  ＨＥＡＲＴ  ＰＤＨ  ＣＯＭＰＬＥＸ．）。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４５（３）、９１９
３-クリック、ベンクおよびアルター（Ｃｌｉｃｋ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｅｎｃｋ，Ｌ．ａｎｄＡｌｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．）（１９７２ａ）。メルカプトエタノールによる抗体反応の増強（ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ  ＯＦ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＢＹ  ＭＥＲＣＡＰＴＯＥＴＨＡＮＯＬ．）。Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、１５６
４-クリック、ベンクおよびアルター（Ｃｌｉｃｋ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｅｎｃｋ，Ｌ．ａｎｄ  Ａｌｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．）（１９７２ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫反応。Ｉ．抗体合成のための培養条件（ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ．Ｉ．ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ．）。Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、２６４
５-フラネリー、バルーズ、バトラー、チェリア、ハミルトン-ミラー、ブルームフィットおよびバウム（Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ａ．Ｋ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｐ．，Ｃｈｅｌｌｉａｈ，Ｊ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ-Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｂｒｕｍｆｉｔｔ，Ｗ．ａｎｄ  Ｂａｕｍ，Ｈ．（１９８９）。原発性胆汁性肝硬変における抗ミトコンドリア抗体は、特異的ペプチドとＭ２属抗原の共有エピトープの両方を認識する（ＡＮＴＩＭＩＴＯＣＨＯＮＤＲＩＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  ＰＲＩＭＡＲＹ  ＢＩＬＩＡＲＹ  ＣＩＲＲＨＯＳＩＳ  ＲＥＣＯＧＮＩＺＥ  ＢＯＴＨ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＳＨＡＲＥＤ  ＥＰＩＴＯＰＥＳ  ＯＮ  ＴＨＥ  Ｍ２  ＦＡＭＩＬＹ  ＯＦ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ．）。Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １０、３７０
６-フッシー、アリ、ゲスト、ジェームス、バッセンディンおよびイーマン（Ｆｕｓｓｅｙ，Ｓ．Ｐ．Ｍ．，Ａｌｉ，Ｓ．Ｔ．，Ｇｕｅｓｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｊａｍｅｓ，Ｏ．Ｆ，Ｗ．，Ｂａｓｓｅｎｎｄｉｎｅ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ，Ｓ．Ｊ．）（１９９０）。大腸菌のジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）との原発性胆汁性肝硬変血清の反応性：主要免疫原性領域の特性指摘（ＲＥＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  ＰＲＩＭＡＲＹ  ＢＩＬＩＡＲＹ  ＣＩＲＲＨＯＳＩＳ  ＳＥＲＡ  ＷＩＴＨ  ＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ  ＣＯＬＩ  ＤＩＨＹＤ  ＲＯＬＩＰＯＡＭＩＤＥ  ＡＣＥＴＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ（Ｅ２Ｐ））。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７、３９８７
７-フッシー、ゲスト、ジェームス、バッセンディンおよびイーマン（Ｆｕｓｓｅｙ，Ｓ．Ｐ．Ｍ．，Ｇｕｅｓｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｊａｍｅｓ，Ｏ．Ｆ．Ｗ．，Ｂａｓｓｅｎｎｄｉｎｅ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ，Ｓ．Ｊ．）（１９８８）。原発性胆汁性肝硬変における主要Ｍ２自己抗原の同定と分析（ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＭＡＪＯＲ  Ｍ２  ＡＵＴＯＡＮＴＩＧＥＮＳ  ＩＮ  ＰＲＩＭＡＲＹ  ＢＩＬＩＡＲＹ  ＣＩＲＲＨＯＳＩＳ．）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、８６５４-８６５８
８-ホールグレン、バクルキー、ギルステンおよびユニス（Ｈａｌｌｇｒｅｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｂｕｃｌｋｅｙ，Ｃ．Ｅ．，Ｇｉｌｌｕｓｔｅｎ，Ｖ．Ａ．ａｎｄ  Ｙｕｎｉｓ，Ｅ．Ａ．）（１９７３）。リンパ球の植物性血球凝集素応答性。高齢男性における免疫グロブリンと自己抗体（ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ  ＰＨＹＴＯＨＥＭＡＧＧＬＵＴＩＮＩＮ  ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥＮＥＳＳ．ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＳ  ＡＮＤ  ＡＵＴＯＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  ＡＧＩＮＧ  ＭＡＮ．）。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１、１１０１
９-アイゼンバーグとコリン（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎ，Ｃ．）（１９８５）狼瘡患者からの腎組織結合免疫グロブリンに関する交叉反応性抗ＤＮＡ抗体イディオタイプの検出（ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＲＯＳＳ−ＲＥＡＣＴＩＶＥ  ＡＮＴＩ−ＤＮＡ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＩＤＩＯＴＹＰＥ  ＯＮ  ＲＥＮＡＬ  ＴＩＳＳＵＥ−ＢＯＵＮＤ  ＩＭＭＵＮＯＧＯＢＵＬＩＮＳ  ＦＲＯＭ  ＬＵＰＵＳ  ＰＡＴＩＥＮＴＳ．）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６、２８７
１０-カルニアン、サハキアンおよびエブリング（Ｋａｌｕｎｉａｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｓａｈａｋｉａｎ，Ｎ．Ｐ．ａｎｄ  Ｅｂｌｉｎｇ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）。全身性エリテマトーデスに関連する免疫グロブリンのイディオタイプ特性（ＩＤＩＯＴＹＰＩＣ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＳ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＳＹＳＴＥＭＩＣ  ＬＵＰＵＳ  ＥＲＹＴＨＥＭＡＴＯＳＵＳ．）。Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３２、５１３
１１-クリンマン、シライ、イシガツボ、コノバーおよびストリンバーグ（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｈｉｒａｉ，Ａ．，Ｉｓｈｉｇａｔｓｕｂｏ，Ｙ．，Ｃｏｎｏｖｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｒｉｎｇｅｒｇ，Ａ．Ｄ．）（１９９１）。全身性エリテマトーデス患者の末梢血中のＩｇＧおよびＩｇＭ分泌Ｂ細胞の定量（ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＩＧＧ  ＡＮＤ  ＩＧＭ  ＳＥＣＲＥＴＩＮＧ  Ｂ  ＣＥＬＬＳ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ  ＢＬＯＯＤ  ＯＦ  ＰＡＴＩＥＮＴＳ  ＷＩＴＨ  ＳＹＳＴＥＭＩＣ  ＬＵＰＵＳ  ＥＲＹＴＨＥＭＡＴＯＳＵＳ．）。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１３４、１４０４
１２-レイファー、ラウチ、アンドルゼジュースキー、マッド、フューリー、シュバルツおよびストーラー（Ｌａｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｒａｕｃｈ，Ｊ．，Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｃ．Ｊ．Ｒ．，Ｍｕｄｄ．Ｄ．，Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．）（１９８１）。ポリヌクレオチドおよびリン脂質と反応性の多特異性モノクローナル狼瘡自己抗体（ＰＯＬＹＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＬＵＰＵＳ  ＡＵＴＯＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＲＥＡＣＴＩＶＥ  ＷＩＴＨ  ＢＯＴＨ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＤＳ．）。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３、８９７
１３-レガステロワス、トーマス、クァッシュ、メテ、テビブ、モレイラおよびモニエ（Ｌｅｇａｓｔｅｌｏｉｓ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｖ．，Ｑｕａｓｈ，Ｇ．，Ｍｅｔａｉｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｅｂｉｂ，Ｊ．，Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．ａｎｄ  Ｍｏｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．）（１９９４）。リポ酸と反応する自然発生抗体：スクリーニング法、特性指摘および生化学的重要性（ＮＡＴＵＲＡＬＬＹ  ＯＣＣＵＲＲＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＲＥＡＣＴＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＬＩＰＯＩＣ  ＡＣＩＤ：ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＭＥＴＨＯＤ，ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ．）。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７１、１１１
１４-ナオール、ボナビダ、ロビンソン、シバタ、パーシー、チャイアおよびバーネット（Ｎａｏｒ，Ｄ．，Ｂｏｎａｖｉｄａ，Ｂ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｈｉｂａｔａ，Ｉ．Ｎ．，Ｐｅｒｃｙ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｉａ，Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｅ．Ｖ．）（１９７６）。ニュージーランドマウスのトリニトロフェニル化した同系マウス赤血球との免疫反応（ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＯＦ  ＮＥＷＺＥＡＬＡＮＤ  ＭＩＣＥ  ＷＩＴＨ  ＴＲＩＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬＡＴＥＤ  ＳＹＮＧＥＮＥＩＣ  ＭＯＵＳＥ  ＲＥＤ  ＣＥＬＬＳ．）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、７８３
１５-オオモリとヤマモト（Ｏｈｍｏｒｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．）（１９８１）。２-メルカプトエタノールおよび関連チオール化合物によるマウスリンパ球の活性化とその機序。Ｉ．分裂促進活性とｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体合成への作用増強の関係（ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＲＩＮＥ  ＬＹＭＰＯＣＹＴＥＳ  ＢＹ  ２−ＭＥＲＣＡＰＴＯＥＴＨＡＮＯＬ  ＡＮＤ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＴＨＩＯＬ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＭＥＣＨＡＮＩＳＭ．Ｉ．．ＲＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰ  ＢＥＴＷＥＥＮ  ＭＩＴＯＧＥＮＩＣ  ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ  ＡＮＤ  ＡＵＧＭＥＮＴＩＮＧ  ＥＦＦＥＣＴＳＯＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ．）。Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３、３３３
１６-オオモリとヤマモト（Ｏｈｍｏｒｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．）（１９８２）。必須アミノ酸であるシスチン摂取の、２-メルカプトエタノール誘発の刺激による試験管内での抗体反応増強の機序（ＭＥＣＨＡＮＩＳＭ  ＯＦ  ＡＵＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＢＹ  ２−ＭＥＲＣＡＰＴＯＥＴＨＡＮＯＬ−ＩＮＤＵＣＥＤ  ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＰＴＡＫＥ  ＯＦ  ＣＹＳＴＩＮＥ，ＡＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＡＮＩＭＯ  ＡＣＩＤ．）。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５、１２７７
１７-オピッツ、オピッツ、レンケ、ヒューレット、シュレムルおよびフラッド（Ｏｐｉｔｚ，Ｈ．Ｇ．，Ｏｐｉｔｚ，Ｕ．，Ｌｅｍｃｋｅ，Ｈ．，Ｈｅｗｌｅｔｔ，Ｇ．，Ｓｃｈｒｅｍｌ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｌａｄ，Ｈ．Ｄ．）（１９７７）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一次免疫応答におけるウシ胎児血清の役割（ＴＨＥ  ＲＯＬＥ  ＯＦ  ＦＥＴＡＬ  ＣＡＬＦ  ＳＥＲＵＭ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＰＲＩＭＡＲＹ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＳＰＯＮＳＥ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ．）。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５、１０２９
１８-ロンボールとウェイグル（Ｒｏｍｂａｌｌ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．）（１９８７）。実験的自己免疫性甲状腺炎（ＴＨＥ  ＥＦＦＥＣＴ  ＯＦ  ＡＧＩＮＧ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＩＮＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＡＵＴＯＩＭＭＵＮＥＴＨＹＲＯＩＤＩＴＥ．）。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３、１４９０
１９-ササキ、ムロイ、ハタケヤマ、スズキ、サトウ、セイノ、サイトウおよびヨシナガ（Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒｙｏｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ａ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｎｏ，Ｊ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｋ．）（１９９１）。活動性狼瘡腎炎における循環抗ＤＮＡ免疫複合体（ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＮＴＩ−ＤＮＡ  ＩＭＭＵＮＥ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＩＮ  ＡＣＴＩＶＥ  ＬＵＰＵＳ  ＮＥＰＨＲＩＴＩＳ．）。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９１、３５５
２０-シェーンフェルド、アイゼンバーグ、ラウチ、マダイオ、ストーラーおよびシュバルツ（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｙ．，Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．，Ｒａｕｃｈ，Ｊ．，Ｍａｄａｉｏ，Ｍ．，Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｓ．）（１９８３）。モノクローナルヒト狼瘡自己抗体のイディオタイプ交叉反応（ＩＤＩＯＴＹＰＩＣ  ＣＲＯＳＳ−ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＨＵＭＡＮ  ＬＵＰＵＳ  ＡＵＴＯＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ．）。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８、７１８
２１-ステフェン、ダーリソン、ルイスおよびアール（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｄａｒｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒ．，Ｇ．Ｊ．）（１９８３）。大腸菌Ｋ１２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体。ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ成分をコードするヌクレオチド配列（ＴＨＥ  ＰＹＲＵＶＡＴＥ  ＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＯＦ  Ｅ．ＣＯＬＩＫ１２．ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＥＮＣＯＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＤＩＨＹＤＲＯＬＩＰＯＡＭＩＤＥ  ＡＣＥＴＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴ．）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３（３）、４８１
２２-スズキ、ハラ、ハリガイ、イシズカ、ヒロセ、マツキ、カワグチ、キタニ、カワゴエおよびナカムラ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｈａｒａ，Ｍ．，Ｈａｒｉｇａｉ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｔ．，Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｙ．，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｉ，Ａ．，Ｋａｗａｇｏｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．）（１９９１）。全身性エリテマトーデスの患者における、新しい体外免疫吸着系を用いた抗ＤＮＡ抗体の持続的除去（ＣＯＮＴＩＮＵＯＵＳ  ＲＥＭＯＶＡＬ  ＯＦ  ＡＮＴＩ−ＤＮＡ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ，ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＮＥＷ  ＥＸＴＲＡＣＯＲＰＯＲＥＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ，ＩＮ  ＰＡＴＩＥＮＴＳ  ＷＩＴＨ  ＳＹＳＴＥＭＩＣ  ＬＵＰＵＳ  ＥＲＹＴＨＥＭＡＴＯＳＵＳ．）。Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３４、１５４６
２３-テルマン、バッファロー、マッティオリ、クック、ティルキスト、サリバンおよびエイユス（Ｔｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｕｆｆａｌｏｅ，Ｇ．，Ｍａｔｔｉｏｌｉ，Ｃ．，Ｃｏｏｋ，Ｇ．，Ｔｉｌｌｑｕｉｓｔ，Ｒ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｙｕｓ，Ｊ．Ｃ．）（１９７９）。体外免疫吸着：ヒト全身性エリテマトーデスにおける初期実験（ＥＸＴＲＡＣＯＲＰＯＲＥＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ：ＩＮＩＴＩＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＥＮＣＥ  ＩＮ  ＨＵＭＡＮ  ＳＹＳＴＥＭＩＣ  ＬＵＰＵＳ  ＥＲＹＴＨＥＭＡＴＯＳＵＳ．）。Ｌａｎｃｅｔ  ＩＩ、８２４
【図１】
0004224621.tif 000034
【図２】
0004224621.tif 000035
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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