(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法であって、
ａ）  i）リパーゼ活性を有し、且つ配列番号:２に対する同一性が少なくとも90%のアミノ酸配列を有する親ポリペプチド、及び
ii）該親ポリペプチドのC末端に付加したHTPSSGRGGHR、HTPSSGRGG、HTPSSGR、HTPSS、HTP、LVY、RHT、SVF及びTADから成る群から選択されるペプチド延長鎖、
を含むアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチドを調製するステップ；
ｂ）リパーゼ活性を有し、かつ親ポリペプチドに比して
ｉ）短鎖脂肪アシルエステル対長鎖脂肪アシルエステルに対する活性比が低く、
ii）中性pH対アルカリ性pHでの活性比が低く、そして／又は
iii ）脂肪で汚れた繊維製品小切れを該ポリペプチド入りの酵素で洗濯したときに異臭を形成する傾向が低い、
ポリペプチドを選択するステップ；及び
ｃ）該選択されたポリペプチドを生産するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号：２に対して少なくとも95％又は少なくとも98％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、親ポリペプチドをコードするプラスミドと２〜15個のアミノ酸からなる延長鎖に対応する終止コドンをもつオリゴヌクレオチドとを使用して突然変異誘発法により調製される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
リパーゼ活性を有し、かつ
a)リパーゼ活性を有し、且つ配列番号:２に対する同一性が少なくとも90%のアミノ酸配列を有する親ポリペプチド、及び
b)該親ポリペプチドのC末端に付加したHTPSSGRGGHR、HTPSSGRGG、HTPSSGR、HTPSS、HTP、LVY、RHT、SVF及びTADから成る群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド延長鎖、
を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号：２に対して少なくとも95％又は少なくとも98％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記親ポリペプチドが、配列番号:２に比べて、E1又はQ249の15オングストロ−ム（Å）以内の立体構造表面の非荷電又は負荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による置換を含む請求項４又は５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記親ポリペプチドが、配列番号:２に比べて、位置1〜11、90、95、169、171〜175、192〜211、213〜226、228〜258又は260〜262のいずれかに対応する位置の非荷電又は負荷電アミノ酸の置換を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記親ポリペプチドが、配列番号:２に比べて、位置90〜101に対応する領域に、負荷電アミノ酸と組合わされたE99Kに対応する置換を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記親ポリペプチドが、配列番号:2の位置E210に対応する位置に負荷電アミノ酸を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記親ポリペプチドが、配列番号:2の位置90〜101に対応する領域に負荷電アミノ酸を含む請求項４〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記親ポリペプチドが、配列番号:２のN94に対応する位置に非荷電又は負荷電アミノ酸を含み、そして/又は配列番号:2の位置90〜101に対応する領域に負の又は電気的に中性の正味電荷を含む、請求項４〜10のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
界面活性剤と請求項４〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドとを含む洗剤組成物。
【請求項１３】
請求項４〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、臭気発生の可能性が小さいリパーゼ変異体に、また該変異体の製造方法に関連する。本発明は特に洗剤組成物への使用に適した変異体に、とりわけ乳脂肪で汚れた衣類の洗濯に際して一次洗浄効果と低い臭気発生傾向とを示すサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）リパーゼ変異体に関連する。
【０００２】
発明の背景技術
リパーゼはたとえば、衣類などの繊維製品から油汚れを落とす洗剤用酵素として、パンなどベーカリー製品の生地への添加剤として有用である。たとえばサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus)(異名フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、欧州特許第258068号及び305216号)に由来するリパーゼは洗剤用としてLipolase(登録商標)(Novo Nordisk A/S商品)の商品名で販売されている。WO 00/60063は洗浄液中で特に優れた一次洗浄効果を発揮するサーモミセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus）リパーゼ変異体を開示している。WO 97/04079、WO 97/07202及びWO 00/32758もまたサーモミセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus）リパーゼ変異体を開示している。
【０００３】
用途次第では臭気を発生させる短鎖脂肪酸の形成を極力抑えることが重要である。たとえばリパーゼ入り洗濯洗剤では周知のように牛乳で汚れた衣類に付着した残留臭気が残ることもある(欧州特許第430315号)。
【０００４】
発明の要約
本発明者はリパーゼのC末端アミノ酸にペプチド延長鎖を付加すると臭気形成傾向が弱まることを発見した。この発見は、比較的短鎖(たとえばC8以下)の脂肪アシル基を含む脂肪たとえばバター脂肪を含む乳製品又はやし油やパーム核油などのような熱帯植物油で汚れた繊維製品を洗濯しても臭気があまり発生しないリパーゼ変異体の開発につながるであろう。そうした変異体は短鎖アシル基よりも長鎖アシル基に対する特異性が強い、及び/又は中性pHよりもアルカリ性pHでの活性比が大きいすなわち洗浄液のpHに近いアルカリ性pH(たとえばpH 9又は10)でのリパーゼ活性に比してすすぎ洗い時の中性pHでのリパーゼ活性が相対的に低いであろう。
【０００５】
従って本発明は、親リパーゼのC末端へのペプチド延長鎖を付加し、そしてその結果得られるポリペプチドを上記のうちいずれかの性質の改善を伴うリパーゼについてスクリーニングすることによりリパーゼを生産する方法を提供する。
本発明はまた、リパーゼ活性を有し、かつリパーゼ活性をもつ親ポリペプチドと親ポリペプチドのC末端に付加されたペプチド延長鎖とを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
本発明はさらに、前記の性質を有するリパーゼを使用した洗剤組成物及び洗剤製造方法を提供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
親リパーゼ
親リパーゼは、配列番号:2に示すサーモミセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus）の配列との同一性が50%以上のアミノ酸配列を有する真菌リパーゼでもよい。
たとえば親リパーゼは、本明細書中のDNA配列を基礎にして設計されたプローブを使用してタラロミセス（Talaromyces）属又はサーモミセス（Thermomyces）属、特にタラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）、サーモミセス・イバダネンシス（Thermomyces ibadanensis）、タラロミセス・エメルソニル（Talaromyces emersonil）又はタラロミセス・ビソクラミドイデス（Talaromyces byssochlamydoides）の菌株から取り出してもよい。
【０００７】
より詳細には、親リパーゼは下記の生物から単離された、表示のアミノ酸配列を有するリパーゼでもよい。対応する遺伝子を含む大腸菌（Escherichia coli）株はブダペスト条約に基づきDSMZに次のとおり寄託した:
【０００８】
【表１】
0004287149.tif 000002
【０００９】
以上のソース生物は以下の菌株保存機構から商業ベースで自由に分譲が受けられる:
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell-kulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE
ATCC (American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA.
CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands.
UAMH(University of Alberta Herbarium & Culture Collection), Devonian Botanic Garden, Edmonton, Alberta, Canada, T6G 3GI.
【００１０】
あるいは、親リパーゼは以上のうち任意のリパーゼのアミノ酸配列を改変することにより得られる変異体、特にWO 00/60063に記載の、又は本明細書で以下に記載する一次洗浄活性を有する変異体でもよい。
【００１１】
C末端のペプチド延長鎖
本発明は親リパーゼのC末端アミノ酸への(たとえば配列番号:2に示すサーモミセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus)リパーゼのL269への)、ペプチド結合によるペプチド延長鎖の付加を提供する。このペプチド延長鎖は部位指定又はランダム突然変異誘発で付加してもよい。
C末端のペプチド延長鎖は2〜15個のアミノ酸残基、特に2〜11個又は3〜10個たとえば2、3、4、5、7、9又は11個の残基からなってもよい。
【００１２】
延長鎖は特に(本来のC末端から数えた)表示された位置に次の残基を有してもよい:
・  第1位に負荷電アミノ酸残基(E又はDなど)
・  第2位及び/又は第3位に小さな非荷電アミノ酸残基(S、T、V又はLなど)、及び/又は
・  第3〜7位、特に第4、5又は6位に、正荷電アミノ酸残基(H又はKなど)。
ペプチド延長鎖はHTPSSGRGGHR、又はその短縮形たとえばHTPSSGRGG、HTPSSGR、HTPSS又はHTPでもよい。他の例はKV、EST、LVY、RHT、SVF、SVT、TAD、TPA、AGVF及びPGLPFKRVなどである。
【００１３】
ペプチド延長鎖は、親ポリペプチドをコードするベクター(プラスミド)とC末端からアミノ酸2〜15個分の延長鎖に対応する終止コドンを有するオリゴヌクレオチドとを使用して突然変異誘発法によって付加してもよい。C末端と終止コドンの間のヌクレオチドはランダムでよいし、前述のアミノ酸の側に偏ってもよい。これを行う1つの方法は、所望のランダム突然変異を含むと同時に目的遺伝子の3末端とのハイブリダイゼーションに必要な配列を有するDNAオリゴを設計することであろう。このDNAオリゴは、(周知の)逆方向DNA鎖とハイブリダイズしうるオリゴと共にPCRに使用する。次いでPCR断片を所望の場(発現ベクター)にクローニングする。
【００１４】
長鎖/短鎖特異性の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比して長鎖/短鎖特異性が大きくても[たとえば長鎖(C16-C20)トリグリセリドに対する活性と短鎖(たとえばC4-C8)トリグリセリドに対する活性の比が大きくても]よい。これは基質としてのオリーブ油のSLUと基質としてのトリブチリンのLUの比として測定されよう(測定方法については後述)。
【００１５】
アルカリ性/中性活性比の増大
本発明のリパーゼは親酵素に比してアルカリ性/中性活性比すなわちアルカリ性pH (たとえばpH 9〜10)でのリパーゼ活性の中性pH (pH 7程度)での活性に対する比が大きくてもよい。これは後述のように基質としてのトリブチリンを使用して測定されよう。
【００１６】
正荷電アミノ酸による置換
親リパーゼは、配列番号:2のE1又はQ249に対応する位置付近の非荷電又は負荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による1又は複数(たとえば2〜4、特に2)の置換を含んでもよい。正荷電アミノ酸はK、R又はHでもよい。非荷電又は負荷電アミノ酸は他の任意のアミノ酸でよい。
【００１７】
前記置換は、配列番号:2のE1又はQ249から15Å以内の立体構造表面に、たとえば位置1〜11、90、95、169、171〜175、192〜211、213〜226、228〜258又は260〜262のいずれかに対応する位置に存在する。
前記置換は、E1又はQ249から10Å以内、たとえば位置1〜7、10、175、195、197〜202、204〜206、209、215、219〜224、230〜239又は242〜254のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
【００１８】
前記置換は、E1から15Å以内、たとえば位置1〜11、169、171、192〜199、217〜225、228〜240、243〜247、249、261〜262のいずれかに対応する位置に存在してもよい。
前記置換は、最も好ましくはE1から10Å以内、たとえば位置1〜7、10、219〜224及び230〜239のいずれかに対応する位置に存在する。
たとえば、若干の特定の置換はS3R、S224R、P229R、T231R、N233R、D234R及びT224Rに対応する。
【００１９】
位置90〜101及び210のアミノ酸
親リパーゼは特に、位置90〜101及び210の荷電アミノ酸に対する特定の制限条件を満たす場合もある。この電荷制限を満たすリパーゼは陰イオン分が高い洗剤に特に有効である。
たとえばアミノ酸210は負荷電でもよい。E210は不変のままでも、又は置換体E210D/C/Y特にE210Dでもよい。
前記リパーゼは位置90〜101 (特に94〜101)のうちの任意の位置たとえばD96及び/又はE99に負荷電アミノ酸を含んでもよい。
【００２０】
さらに、前記リパーゼは位置N94に非荷電又は負荷電アミノ酸すなわちN94 (非荷電又は負荷電)たとえばN94N/D/Eを含んでもよい。
また、前記リパーゼは領域90〜101 (特に94〜101)の正味電荷が負又は中立でもよい、すなわち「負荷電アミノ酸の数」が「正荷電アミノ酸の数」と同じか又は大きくてもよい。たとえば、前記領域はLipolaseのまま無変化で、2個の負荷電アミノ酸(D96とE99)と1個の正荷電アミノ酸(K98)を有してもよく、1個の非荷電アミノ酸(N94)を有してもよく、あるいは1又は複数の置換を含んでもよい。
【００２１】
あるいは3個のアミノ酸N94、N96及びE99のうち2個が負の又は無変化の電荷を有してもよい。従って3アミノ酸がすべて無変化のままでもよいし、保存的置換又は負荷電置換により変化してもよい、すなわちN94(非荷電又は負荷電)、D(負荷電)及びE99(負荷電)となってもよい。例はN94D/E及びD96Eである。
さらに3個のアミノ酸N94、N96及びE99のうち1個が置換により電荷を増して、N94(正荷電)、D96(非荷電又は正荷電)又はE99(非荷電又は正荷電)となってもよい。例はN94K/R、D96I/L/N/S/W又はE99N/Q/K/R/Hである。
【００２２】
親リパーゼは、E99Kに対応する置換と位置99〜101に対応する領域内の1負荷電アミノ酸たとえばD96D/Eとを含んでもよい。
非荷電アミノ酸の負荷電アミノ酸による置換(N94D/DE)は陰イオン洗剤の性能を向上させよう。非荷電アミノ酸の正荷電アミノ酸による置換(N94K/R)は陰イオン洗剤と陰イオン/非イオン洗剤(全界面活性剤中の陰イオン比率がたとえば40〜70%の洗剤)の両方で優れた性能を発揮する変異体リパーゼをもたらすであろう。
【００２３】
他位置のアミノ酸
親リパーゼは随意に他アミノ酸の置換を、特に10個未満又は5個未満のそうした置換を含んでもよい。例は配列番号:2中のQ249R/K/H、R209P/S及びG91Aに対応する置換である。周知の原理に従ってさらなる置換たとえばWO 92/05249、WO 94/25577、WO 95/22615、WO 97/04079及びWO 97/07202に記載の置換を行ってもよい。
【００２４】
親リパーゼ変異体
親リパーゼは、配列番号:2に、G91G/A+E99E/D/R/K+ T231T/S/R/K+N233N/Q/R/K+Q249Q/N/R/Kに対応する置換を含んでもよい。若干の具体例は下記に対応する置換を含む変異体である:
【００２５】
【表２】
0004287149.tif 000003
【００２６】
アミノ酸改変の命名法
本書で突然変異の識別に使用した命名法は基本的にWO 92/05249に準拠している。たとえばT231Rは位置231におけるTがRにより置換されていることを表わす。
270PGLPFKRVは配列番号:2のC末端(L269)に付加したペプチド延長鎖を表わす。
【００２７】
アミノ酸のグループ分け
本明細書ではアミノ酸を、洗剤で一般的なpH 10での電荷をもとに負荷電、正荷電又は非荷電(電気的中性)に区分する。たとえば負荷電アミノ酸はE、D、C(システイン)及びY特にEとDである。正荷電アミノ酸はR、K及びH特にRとHである。非荷電アミノ酸はG、A、V、L、I、P、F、W、S、T、M、N、Q及びジスルフィド結合の一部としてのCである。同じグループ(負荷電、正荷電又は非荷電)内の他アミノ酸による置換は保存的置換という。
非荷電アミノ酸は疎水性又は非極性(G、A、V、L、I、P、F、W及びジスルフィド結合の一部としてのC)と親水性又は極性(S、T、M、N、Q)に分けてもよい。
【００２８】
アミノ酸の同一性
親リパーゼはサーモミセス・ラヌギノサス（T. lanuginosus）リパーゼ(配列番号:2)とのアミノ酸同一性が50%以上、特に55%以上、60%以上、75%以上、85%以上、90%以上、95%超又は98%超である。
この同一性は周知のコンピュータープログラムたとえばGCGプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. 1970, Journal of Molecular Biology, 48, 443-45) 中のGAPを用いて、ポリペプチド配列比較のための設定をギャップ挿入ペナルティー3.0、ギャップ延長ペナルティー0.1として決定するのが適当であろう。
【００２９】
アミノ酸配列のアラインメント
本明細書では配列番号:2を基準にしてアミノ酸残基を識別する。他リパーゼ配列中の対応位置を求めるには、GAPアラインメントを用いて配列番号:2に該配列を合わせる。GAPはGCGプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. 1970, Journal of Molecular Biology, 48, 443-45)に入っている。ポリペプチド配列比較には次の設定を用いる:ギャップ挿入ペナルティー3.0、ギャップ延長ペナルティー0.1。
【００３０】
DNA配列、発現ベクター、宿主細胞、リパーゼの産生
本発明は本発明のリパーゼをコードするDNA配列、該DNA配列を収めた発現ベクター、及び該DNA配列又は発現ベクターを導入した形質転換宿主細胞を提供する。これらは周知の方法により得られよう。
本発明はまた、リパーゼの産生につながるような条件下で形質転換宿主細胞を培養し培養液からリパーゼを回収することによりリパーゼを生産する方法を提供する。該方法は周知の原理に従って実行されよう。
【００３１】
リパーゼ活性
中性及びアルカリ性pHでのトリブチリンに対するリパーゼ活性 (単位: LU7及びLU9)
アラビアゴムを乳化剤としてトリブチリン(グリセリントリブチラート)を乳化し、リパーゼの基質を調整する。pHスタット滴定試験で30℃、pH7又は9でのトリブチリンの加水分解を追跡する。1単位のリパーゼ活性(1 LU7又は1 LU9)はpH7又は9で1μmol酪酸毎分を遊離しうる酵素量に等しい。LU7は単にLUともいう。
中性及びアルカリ性pHでの相対リパーゼ活性はLU9/LU7として表示されよう。これは2.0以上であろう。
【００３２】
トリオレインに対するリパーゼ活性(単位: SLU)
安定化オリーブ油乳濁液(Sigmaカタログ番号800-1)を基質として、40mM NaClと5mM塩化カルシウムとを添加した5mMトリス緩衝液中でリパーゼ活性を30℃、pH9で測定する。2.5mlの基質を12.5mlの緩衝液と混合し、pHを9に調整し、0.5mlの希釈リパーゼ試料を添加し、オレイン酸形成量をpHスタット滴定試験で追跡する。
【００３３】
1 SLUはこれらの条件下で1μmol滴定可能オレイン酸毎分を遊離するリパーゼ量である。
本発明のリパーゼは特に少なくとも4000又は5000 SLU/mg-酵素タンパク質の活性を有するであろう。
アルカリ性pHでのトリグリセリドの長鎖及び短鎖アシル結合に対する相対活性はSLU/LU9比として表示されよう。SLU/LU9は2.0以上、3.0以上又は4.0以上であろう。
【００３４】
一次洗浄効果
リパーゼの一次洗浄効果は次の要領で測定する:
Style 400綿布を95℃の脱イオン水で洗濯し、9×9cmの小切れにカットする。各小切れの中心に50μlのラード/スーダンレッド(0.75mg-色素/g-ラード)を付着させ、この汚染小切れを70℃で25分間加熱処理し、一晩置く。7枚の汚染小切れを、硬度15°dH (Ca2+/Mg2+ 4:1)の水に試験洗剤4g/Lを溶かした1000mlの洗浄液(30℃)によりTerg-O-Tometer洗浄試験用洗濯機で20分間洗濯し、次いで水道水で15分間すすぎ洗いし、一晩干す。
【００３５】
洗浄液へのリパーゼ添加量は0.25mg-酵素タンパク質/Lとする。コントロール洗浄液はリパーゼ無添加で調製する。
一次洗浄サイクル後に460nmでの反射率を測定して汚れ落ちを評価し、その結果を、同じ条件で、ただしリパーゼ無添加で洗浄したブランクの反射率を差し引いてΔRとして表示する。
【００３６】
試験洗剤
【表３】
0004287149.tif 000004
【００３７】
洗剤添加剤
本発明のリパーゼは一般に洗剤組成物に添加剤として使用されよう。この添加剤は非飛散型顆粒、安定化液、懸濁液又は被防護酵素などとして調製すると好都合である。その調製法は周知である。
【００３８】
洗剤組成物
本発明の洗剤組成物はたとえば洗濯用添加剤組成物や汚れた布地の前処理用組成物を含めた手洗い及び機械洗い用洗濯洗剤組成物、、すすぎ洗い用柔軟剤組成物、及び家庭用硬質表面クリーニング・食器洗い用組成物などとして調製してもよい。
【００３９】
本発明の洗剤組成物は本発明のリパーゼと界面活性剤とを含む。また随意に、ビルダー、別の酵素、泡止め剤、柔軟剤、色移り防止剤、及び洗剤に通常使用される他の成分たとえば汚れ懸濁剤、汚れ遊離剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、変色防止剤、色素剤、及び/又はカプセル入り又は非カプセル入り香料などを含んでもよい。
【００４０】
本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、バー、タブレット又は顆粒タイプとすることができる。pH(使用濃度の水溶液で測定)は通常、中性又はアルカリ性たとえば7〜11特に9〜11であろう。本発明の顆粒状組成物は「コンパクトタイプ」でもよい、すなわち550〜950g/lという通常の顆粒状洗剤よりも高密度にしてもよい。
【００４１】
本発明のリパーゼ又は随意に別のリパーゼ(酵素タンパク質)の洗剤組成物中の含量は通常、組成物重量の0.00001%〜2%、好ましくは0.0001%〜1%、なお好ましくは0.001%〜0.5%、さらになお好ましくは0.01%〜0.2%である。
本発明の洗剤組成物は1〜5,000 LU/g-洗剤、好ましくは2〜500  LU/gたとえば10〜100LU/gに相当する量のリパーゼを含んでもよい。洗剤は水に溶かして、2.5〜1,500 LU/リットル-洗浄液特に10〜500 LU/lたとえば30〜200 LU/lに相当する量のリパーゼを含む洗浄液としてもよい。リパーゼタンパク質の量は0.001〜10 mg/g-洗剤又は0.001〜100 mg/l-洗浄液としてもよい。
【００４２】
界面活性剤系は非イオン、陰イオン、陽イオン、両性、及び/又は双性イオン界面活性剤を含んでもよい。前述のように、本発明のリパーゼ変異体は陰イオン界面活性剤70〜100重量%と非イオン界面活性剤0〜30重量%の、特に陰イオン界面活性剤80〜100重量%と非イオン界面活性剤0〜20重量%の混合物を含む洗剤に特に好適である。さらに前述のように、本発明のある種の好ましいリパーゼは40〜70%の陰イオン界面活性剤と30〜60%の非イオン界面活性剤とを含む洗剤にも好適である。界面活性剤の含量は一般に0.1〜60重量%、たとえば1〜40重量%特に10〜40重量%、好ましくは約3〜約20重量%である。以下、界面活性剤の若干例を挙げる。
【００４３】
陰イオン界面活性剤の例はアルキル硫酸塩、アルキルエトキシスルファート、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩などである。
非イオン界面活性剤の例は酸化ポリアルキレン(たとえば酸化ポリエチレン)、アルキルフェノール縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの酸化エチレンとの縮合生成物、アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一級及び第二級脂肪族アルコールの縮合生成物、アルキル多糖類、アルキルフェノールエトキシラート及びアルコールエトキシラートなどである。
さらに詳細には、本発明のリパーゼはWO 97/04079、WO 97/07202、WO 97/41212、WO 98/08939及びWO 97/43375で開示されている洗剤組成物に使用してもよい。
【００４４】
実施例
実施例1．C末端ライブラリーを使用したリパーゼ変異体の調製
ライブラリーの創出
目的はC末端に3個の追加アミノ酸を付加することであった。C末端上の追加アミノ酸は短鎖トリグリセリドに対する活性に比して長鎖グリセリドに対する活性を増し、またpH10での活性に比してpH7での活性を妨げ、もって洗剤中のリパーゼに起因する臭いを洗濯中及び洗濯後に減じる可能性がある。
【００４５】
配列番号:2に示すアミノ酸配列に、置換G91A+E99K+T231R+ N233R+Q249Rを導入したリパーゼをコードする遺伝子でプラスミドpENi1576を構築した。
pENi1576を鋳型とし、オリゴ19671及び991222j1 (配列番号: 11及び12)及びPWOポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて全量10μlの反応液中でPCR反応を行った。オリゴ99122j1はC末端に3個の追加アミノ酸を付加する。
PCR断片をBioradカラムで精製し、BamHI/SacIIで切断した。
プラスミドpENI1861をBamHI/SacIIで切断した。
【００４６】
PCR断片とプラスミドベクターを1%ゲルから精製した。
ベクターとPCR断片を一晩ライゲートし、大腸菌（E. coli）株DH10Bに電気穿孔法で導入して123,000個の独立大腸菌（E. coli）形質転換体を生成した。
10個の独立クローンを配列解析すると、満足な多様性を示すことが判明した。
すべてのクローンからDNAを調製した。
【００４７】
Aspergillusの形質転換とスクリーニング
約5μgのDNAプラスミドを(WO 00/24883に記載の)Jal355に導入した。PEGを加えて20分間インキュベートした後、プロトプラストを(CaCl2の除去を目的に)1.2Mソルビトール、10mMトリスpH7.5で2回洗った。
プロトプラストをアルギン酸塩溶液(1.5%アルギン酸塩、1%デキストラン、1.2Mソルビトール、10mMトリスpH7.5)に混ぜた。ポンプ(Ole Dich 110ACR.80G38.CH5A)を使用して、このアルギン酸塩溶液を15cmの高さからCaCl2溶液(1.2Mソルビトール、10mMトリスpH7.5、0.2M CaCl2)中に滴下した。これによりおよそ2個に1個の割合で1個の形質転換プロトプラストを収めた径2.5mm程度のビーズが形成され、55,000個程度の形質転換体が生成した。
【００４８】
形成後のビーズを1.2Mソルビトール、10mMトリスpH7.5、10mM CaCl2に移し、30℃で一晩培養した。ビーズを滅菌水で2回洗った後、1×ボーゲル培地(炭素源なし。炭素源はアルギン酸塩ビーズ中にデキストランとして既に存在)に移し、30℃で一週間培養した。
一週間培養後ビーズを、TIDEとオリーブ油を添加したプレート(1g/Lアガロース、0.1MトリスpH 9.0、5mM CaCl2、25ml/Lオリーブ油、1.4g/L TIDE、0.004%ブリリアントグリーン)に塗った。プレートを37℃で一晩培養した。
【００４９】
384個の陽性ビーズを、各ウェルに150μl 1×ボーゲルと2%マルトースとを入れた96穴マイクロタイタープレート×4に、移した。
プレートを34℃で3日間培養した。
この培地をpH7.5での吉草酸PNP(p-ニトロフェノール)とパルミチン酸PNPに対する活性のスクリーニング検査にかけた。長鎖基質(パルミチン酸PNP)に対する最高活性及び短鎖基質(吉草酸PNP)に対する低活性を有する64個のクローンを小プレート上で単離し、そこから各ウェルに200μl 1×ボーゲルと2%マルトース入れた96穴マイクロタイタープレートに移した。
【００５０】
34℃で3日間培養後、培地を再びpH7.5での吉草酸PNPとパルミチン酸PNPに対する活性並びにpH10でのパルミチン酸PNPに対する活性のスクリーニング検査にかけた。
10個のクローンがpH10でのパルミチン酸PNPに対する高活性とpH7.5での吉草酸PNPに対する低活性を示した。
1個の変異体は偶然にもDNAオリゴに欠失が生じたために、C末端に3個ではなく11個の追加アミノ酸残基が付加された。
【００５１】
1回目で陽性と判明した変異体
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TPA
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
【００５２】
アスペルギルス（Aspergillus）の形質転換及びスクリーニング手順を再び繰り返し、以下の変異体を陽性と判定した:
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LVY
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270KV
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270RHT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TAD
【００５３】
実施例2．臭気と洗浄効果の評価
配列番号:2に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した:
N94K+D96L+T231R+N233R+Q249R+270PGLPFKRV
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270AGVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGG
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSS
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTP
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270SVF
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270LVY
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270RHT
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270TAD
【００５４】
ラード/スーダンレッドとバター/スーダンレッドという異なる汚れを付着させた綿布の小切れを対象に洗浄試験を実施した。ラード汚染小切れとバター汚染小切れを25分間70℃に加熱し、一晩置いた。これらの汚染小切れを、硬度15°dHの水に試験洗剤4g/Lを溶かした洗浄液(30℃)によりTerg-O-Tometer洗浄試験用洗濯機で20分間洗濯し、次いで水道水で15分間すすぎ洗いし、一晩干した。
洗浄液へのリパーゼ変異体添加量は0.25又は1.0 mg-酵素タンパク質/リットルとした。リパーゼ変異体無添加でコントロール洗浄液を調製し、またペプチド延長鎖を欠く同一アミノ酸配列のリパーゼ変異体で基準実験を行った。
【００５５】
小切れの二次洗浄はリパーゼ無添加で行った。
以下の要領で洗浄効果を評価した:
・  洗浄後のバター汚染小切れを検査時まで密閉バイアルに保存しておき、臭気発生をパネル官能検査で評価した。
・  洗浄効果は一次又は二次洗浄後のラード汚染小切れの反射率を測定して評価した。いずれの変異体もこの1サイクル洗浄試験で有意の効果を示した。
・  効果/弊害比を「ラード汚染小切れに関する一次又は二次洗浄効果」÷「バター汚染小切れに関する臭気」として計算した。効果/弊害比の改善は、基準より高レベルでリパーゼを使用すれば臭気を抑えながら基準と同レベルの効果があげられることを示唆する。
試験した変異体はいずれも、同じリパーゼC末端にペプチド延長鎖の付加がないものと比較して臭気発生の低減及び/又は効果/弊害比の改善を示した。
【００５６】
実施例3．一次洗浄効果、アルカリ性/中性pHでの活性、長鎖/短鎖活性
配列番号:2に由来する以下のリパーゼ変異体を評価した:
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGGHR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGRGG
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSSGR
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270HTPSS
G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270EST
前述の要領で一次洗浄効果を評価したが、各リパーゼ変異体の反射率の増分(ΔR)は3.0を上回ることが判明した。
リパーゼ活性は前述の方法によりLU7、LU9及びSLUとして測定した。各リパーゼ変異体はLU9/LU7比が2.0を上回り、またSLU/LU9比が2.0を上回ると判明した。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
【表６】
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【配列表】
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