(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中における目的の核酸配列の存在を検出する方法であって、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下において、サンプルを下記（ｉ）および（ｉｉ）に接触させる工程と、
（ｉ）目的の核酸配列の増幅開始に適したＤＮＡプライマー
（ｉｉ）触媒性核酸分子をコードするが、その触媒性核酸分子のアンチセンス配列である、ＤＮＡチモーゲンであって、前記プライマーおよび前記チモーゲンが、前記目的の核酸配列が存在する場合に、前記目的の核酸配列および前記触媒性核酸分子の両方の配列を含む１回増幅された核酸分子が得られるように、互いに対して位置する、ＤＮＡチモーゲン
（ｂ）前記触媒性核酸活性の存在を決定し、これにより前記サンプル中における前記目的の核酸配列の存在を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ａ）から生じた前記サンプル中における前記触媒性核酸活性の量を定量的に決定し、このように決定した活性の量を既知の標準値と比較し、これにより前記目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程をさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記プライマーおよび前記チモーゲンが別々のＤＮＡ分子上に存在していて、前記プライマー開始型核酸増幅がローリング・サークル型増幅である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記サンプルが２つのＤＮＡ分子に接触し、これらの各分子がプライマーを含み、少なくとも一方の前記分子がチモーゲンを含み、前記プライマーが前記チモーゲンの３’に位置している、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の（ｉｉ）で得られる１回増幅された核酸分子が、この増幅された核酸分子上に共存する前記チモーゲンによってコードされる触媒性核酸分子により認識されてシス型に切断されるヌクレオチド配列をさらに含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記チモーゲンによってコードされる触媒性核酸分子が１０−２３ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記工程（ａ）の（ｉ）のＤＮＡプライマーが、前記１０−２３ＤＮＡｚｙｍｅにより認識されてシス型に切断される部位の５’側として作用する少なくとも１個のプリン・リボヌクレオチド残基を含む、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、
前記ＤＮＡ分子の少なくとも２つが前記プライマーと前記チモーゲンの両方を含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、
前記目的の核酸配列がＤＮＡ分子である、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、
前記目的の核酸配列がＲＮＡ分子であり、前記の工程（ａ）が、前記サンプルを前記プライマーおよび前記チモーゲンに接触させる前に、前記目的の核酸配列が存在する場合は、これをＤＮＡに逆転写する工程をさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、
前記触媒性核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、
前記触媒性核酸分子活性が検出可能な化学基質の修飾を含み、この修飾が、ホスホジエステル結合の形成および切断、核酸の連結および切断、ポルフィリンの金属化、および炭素−炭素結合、エステル結合およびアミド結合の形成から成る群から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記検出可能な化学基質の修飾が蛍光標識した核酸分子の切断である、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記蛍光標識した核酸分子がＤＮＡ／ＲＮＡキメラである、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、
前記目的の核酸配列が、ヒト、細菌、マイコプラズマ、およびウイルスから成る群から選択される生物に由来する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記目的の核酸配列がヒトに由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、
前記サンプル中における前記目的の核酸配列の存在が遺伝子障害を示唆する、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、
前記サンプルが法医学的サンプルである、方法。
【請求項１８】
サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を同時に検出する方法であって、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを下記（ｉ）および（ｉｉ）に接触させる工程と、
（ｉ）検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、これらの目的の核酸配列の増幅開始に適した少なくとも１つのＤＮＡプライマーが存在する複数のＤＮＡプライマー
（ｉｉ）検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコードするがその触媒性核酸分子のアンチセンス配列である少なくとも１つのＤＮＡチモーゲンが存在する複数のＤＮＡチモーゲンであって、前記プライマーおよび前記チモーゲンが、対応する目的の核酸配列が存在する場合に、その目的の核酸配列および対応する触媒性核酸分子の両方の配列を含む１回増幅された核酸分子が得られるように、互いに対して位置する、複数のＤＮＡチモーゲン
（ｂ）それぞれの触媒性核酸活性の存在を同時に決定し、これによりサンプル中における対応するそれぞれの目的の核酸配列の存在を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記工程（ａ）から生じたサンプルにおける各触媒性核酸活性の量を定量的に決定し、このように決定した各活性の量を既知の標準値と比較し、これによりそれぞれの目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程をさらに含む、方法。
【請求項２０】
請求項１、２、４〜１９のいずれかに記載の方法であって、
前記核酸増幅を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、およびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って実施する、方法。
【請求項２１】
サンプル中における目的の核酸配列の存在の決定に使用するためのキットであって、
（ａ）目的の核酸配列の増幅開始に適したＤＮＡプライマーと、
（ｂ）触媒性核酸配列をコードするが、その触媒性核酸配列のアンチセンス配列であるＤＮＡチモーゲンであって、前記プライマーおよび前記チモーゲンが、前記目的の核酸配列が存在する場合に、前記目的の核酸配列および前記触媒性核酸分子の両方の配列を含む１回増幅された核酸分子が得られるように、互いに対して位置する、ＤＮＡチモーゲンと、
（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬と、を含む、キット。
【請求項２２】
サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在の決定に使用するためのキットであって、
（ａ）検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、これらの目的の核酸配列の増幅開始に適した少なくとも１つのＤＮＡプライマーが存在する複数のＤＮＡプライマーと、
（ｂ）検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸配列をコードするがその触媒性核酸配列のアンチセンス配列である少なくとも１つのＤＮＡチモーゲンが存在する複数のＤＮＡチモーゲンであって、前記プライマーおよび前記チモーゲンが、対応する目的の核酸配列が存在する場合に、その目的の核酸配列および対応する触媒性核酸分子の両方の配列を含む１回増幅された核酸分子が得られるように、互いに対して位置する、複数のＤＮＡチモーゲンと、
（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬と、を含む、キット。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のキットであって、
前記核酸増幅を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、およびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って実施する、キット。
【請求項２４】
プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含むＤＮＡ分子であって、
前記プライマーが前記チモーゲンの３’に位置する、ＤＮＡ分子。
【請求項２５】
目的の核酸分子を増幅するための組成物であって、
（ａ）プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含む第１のＤＮＡ分子であって、
（ｉ）前記ＤＮＡｚｙｍｅが１０‐２３ＤＮＡｚｙｍｅであり、
（ｉｉ）前記プライマーが前記チモーゲンの３’に位置する、第１のＤＮＡ分子と、
（ｂ）プライマーを含む第２のＤＮＡ分子であって、前記プライマーが、前記ＤＮＡｚｙｍｅによって認識されシス型に切断される部位の５’側として作用する少なくとも１つのプリン・リボヌクレオチド残基を有する、第２のＤＮＡ分子と、を含み、
前記第１のＤＮＡ分子の前記プライマーが、前記第２のＤＮＡ分子の前記プライマーによって増幅される鎖に相補的な核酸分子の鎖の増幅を開始する、組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、
前記第２のＤＮＡ分子の前記プライマーが、前記ＤＮＡｚｙｍｅによって認識されシス型に切断される部位の３’側として作用するリボヌクレオチド残基をさらに含む、組成物。
【請求項２７】
目的の核酸分子を増幅するための組成物であって、
（ａ）プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含む第１のＤＮＡ分子であって、
（ｉ）前記ＤＮＡｚｙｍｅが１０‐２３ＤＮＡｚｙｍｅであり、
（ｉｉ）前記プライマーが前記チモーゲンの３’に位置する、第１のＤＮＡ分子と、
（ｂ）プライマーを含む第２のＤＮＡ分子と、を含み、
前記第１のＤＮＡ分子の前記プライマーが、前記第２のＤＮＡ分子の前記プライマーによって増幅される鎖に相補的な核酸分子の鎖の増幅を開始する、組成物。
【請求項２８】
プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含むＤＮＡ分子であって、
前記プライマーが、前記チモーゲンの３’に位置すると共に、水、食物、または土壌のサンプル中に含まれている生物に由来する核酸配列に相補的である、ＤＮＡ分子。
【請求項２９】
プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含むＤＮＡ分子であって、
前記プライマーが、前記チモーゲンの３’に位置すると共に、動物、植物、細菌、ウイルス、およびマイコプラズマから成る群から選択される生物に由来する核酸配列に相補的である、ＤＮＡ分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載のＤＮＡ分子であって、
前記動物が、マウス、ラット、イヌ、モルモット、シロイタチ、ウサギ、および霊長類から成る群から選択される、ＤＮＡ分子。
【請求項３１】
請求項３０に記載のＤＮＡ分子であって、
前記霊長類がヒトである、ＤＮＡ分子。
【請求項３２】
プライマー、およびＤＮＡｚｙｍｅをコードするがそのＤＮＡｚｙｍｅのアンチセンス配列であるチモーゲンを含むＤＮＡ分子であって、
（ｉ）前記プライマーが前記チモーゲンの３’に位置し、
（ｉｉ）前記ＤＮＡ分子が、癌、嚢胞性線維症、異常血色素症、ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、および結核から成る群から選択される疾患に対する被検動物の診断に有用である、ＤＮＡ分子。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＤＮＡ分子であって、
前記被検動物がヒトである、ＤＮＡ分子。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＤＮＡ分子であって、
前記プライマーがＫ‐ｒａｓ遺伝子に相補的であり、
前記ＤＮＡｚｙｍｅが１０‐２３ＤＮＡｚｙｍｅである、ＤＮＡ分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＤＮＡ分子であって、
（ａ）5’GAGAACTGCAATTCGTTGTAGCTAGCCTTTCAGGACCCACGTCCACAAAATGATTCTGA3’（配列番号２）
（ｂ）5’CCACTCTCGTTGTAGCTAGCCTATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTCTTGC3’（配列番号８）、および
（ｃ）5’ACTTGTGGTAGTTGGATCGTTGTAGCTAGCCCTGGTGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC3’（配列番号１０）から成る群から選択される、ＤＮＡ分子。
【請求項３６】
請求項１８または１９に記載の方法であって、
前記プライマーおよび前記チモーゲンが別々のＤＮＡ分子に存在し、
前記プライマー開始型核酸増幅がローリング・サークル型増幅である、方法。
【請求項３７】
サンプル中における目的の核酸配列の存在を検出する方法であって、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下において、サンプルを請求項２４に記載のＤＮＡ分子に接触させる工程と、
（ｂ）前記触媒性核酸活性の存在を決定し、これにより前記サンプル中における前記目的の核酸配列の存在を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項３８】
サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を同時に検出する方法であって、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下において、サンプルを、請求項２４に記載の複数のＤＮＡ分子に接触させる工程であって、検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、これらの目的の核酸配列の増幅開始に適した少なくとも１つのプライマーと、明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコードするがその触媒性核酸分子のアンチセンス配列である少なくとも１つのチモーゲンとが存在する、工程と、
（ｂ）それぞれの触媒性核酸活性の存在を同時に決定し、これによりサンプル中における対応するそれぞれの目的の核酸配列の存在を決定する工程と、を含む、方法。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の方法であって、
前記核酸増幅を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、およびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って実施する、方法。
【請求項４０】
請求項２１または２２に記載のキットであって、
前記プライマーおよび前記チモーゲンが別々のＤＮＡ分子に存在し、
前記プライマー開始型核酸増幅がローリング・サークル型増幅である、キット。
【請求項４１】
サンプル中における目的の核酸配列の存在の決定に使用するためのキットであって、
（ａ）請求項２４に記載のＤＮＡ分子と、
（ｂ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬と、を含む、キット。
【請求項４２】
サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在の決定に使用するためのキットであって、
（ａ）検出すべき目的の核酸配列のそれぞれに対して、これらの目的の核酸配列の増幅開始に適した少なくとも１つのプライマーと、明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコードするがその触媒性核酸分子のアンチセンス配列である少なくとも１つのチモーゲンとが存在する、請求項２４に記載の複数のＤＮＡ分子と、
（ｂ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬と、を含む、キット。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載のキットであって、
前記核酸増幅を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、およびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って実施する、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
本特許出願を通して、種々の刊行物を引用している。これらの刊行物の開示は本発明が関係する技術をさらに完全に説明するために本特許出願に参考文献として含まれる。
【０００１】
【発明の分野】
本発明は核酸増幅によりサンプル内の目的の核酸分子を検出および定量化する方法に関連する。本発明の方法において、触媒性核酸および目的の配列の両方を含む単一の増幅生成物（アンプリコン（amplicon））が生成される。この触媒性核酸は目的物が存在する場合にのみそのアンチセンスであるチモーゲン性の前駆体から合成される。
【０００２】
【発明の背景】
インビトロでの核酸増幅の方法は遺伝学、病気の診断および法医学において広く応用されている。最近の１０年間において、既知の核酸配列（「目標物（targets)」）の増幅のための多くの技法が報告されている。これらはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）（文献１乃至７，４１）、分子鎖置換増幅アッセイ（「ＳＤＡ」）（文献８）および転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）（文献９，１０）（自己−持続型配列複製（「ＳＳＲ」）としても知られている）を含む。ＰＣＲおよびＳＤＡにより生成される増幅生成物（「アンプリコン（amplicons）」）はＤＮＡであるが、ＲＮＡアンプリコンはＴＭＡにより生成される。これらの方法により生成されたＤＮＡまたはＲＮＡアンプリコンは特定の異常症状に付随する核酸配列のマーカーとして使用できる。
【０００３】
幾つかの方法は密閉系すなわち単一の均一反応系における同時の増幅および検出を可能にする。これらの方法はSunrise(商標）プライマー（文献１１）、モレキュラー・ビーコン（文献１２）およびTaqman（商標）システム（文献１３）を含む。均一の密封した試験管の形態を使用することは増幅反応の後にアンプリコンを別々に分析する上で幾つかの利点を有している。密閉系の方法は必要とする取り扱いが少ないために比較的に迅速で簡単である。また、密閉システムは別の反応からのアンプリコンによる汚染に付随する偽陽性の可能性を排除する。均一反応は同時にモニターすることができ、ゼロ時間における信号により当該反応系におけるバックグラウンド信号の測定が可能である。従って、バックグラウンド信号を推定するための付加的な制御反応が必要ではない。この場合に、信号強度における変化がサンプル内に存在する特定の核酸配列の増幅を示す。
【０００４】
目標の核酸を増幅する代わりに、別の戦略としてリポーター信号を増幅することが含まれる。分岐ＤＮＡアッセイ（文献１４）は二次的なリポーター分子（例えば、アルカリ・ホスファターゼ）を用いることにより信号を増幅するが、蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）は信号の電気的増幅を用いる（文献１５）。
【０００５】
別の増幅技法の場合と同様に、触媒性核酸が近年において集中的に研究されている。例えば、治療薬剤として触媒性核酸を用いる遺伝子機能の抑制における潜在的能力が文献に広く論じられている（文献１６乃至文献２２）。また、触媒性ＲＮＡ分子（「リボザイム」）はホスホジエステル結合の形成および開裂において触媒作用を示すことが示されている（文献１６および文献２３）。さらに、開裂（文献２１、２２および２４）および核酸の連結（ligation）（文献２５）、ポルフィリン金属化反応（文献２６）、および炭素−炭素結合（文献２７）、エステル結合（文献２８）およびアミド結合（文献２９）の形成を含むさらに広い範囲の反応において触媒作用を示し得る別の核酸を見出すためにインビトロでの進化技法が用いられてきた。
【０００６】
リボザイムはＲＮＡ（文献１６）およびＤＮＡ（文献２１）の両方を開裂できることが示されている。同様に、触媒性ＤＮＡ分子（「ＤＮＡザイム」）もまたＲＮＡ分子（文献１７，２４）およびＤＮＡ分子（文献２２，３０）の両方を開裂できることが報告されている。触媒性核酸は基質が緊縮型配列の必要条件を満たす場合に目的の核酸基質を開裂できる。この目的となる基質は、触媒性核酸のハイブリッド形成（hybridizing)領域に対して相補的であって、かつ開裂部位における特異的な配列を含有している必要がある。開裂領域における配列の必要条件の例として、ＤＮＡザイムの種類（「１０−２３モデル」または「１０−２３ＤＮＡザイム」）に対応するプリン：ピリミジン配列に対する必要条件（文献２４）、およびＵ：Ｘに対する必要条件が含まれ、この場合のＸは、ハンマーヘッド・リボザイム（文献１６）については、Ａ、ＣまたはＵに等しいがＧではない。
【０００７】
治療の潜在的能力を有することに加えて、触媒性核酸分子は遺伝学的診断アッセイにおける分子ツールとしても使用できる。例えば、リボザイムは２段階法における信号増幅を促進するために使用されている（文献３１乃至文献３３）。すなわち、第１の段階において、試験サンプルが不活性なオリゴヌクレオチドと接触する。この接触により、サンプルが目的の配列を含有している場合に、「トリガリング（triggering）」ＲＮＡオリゴヌクレオチドが生成される。次に、第２の段階において、トリガリングＲＮＡオリゴヌクレオチドは増幅カスケードを誘発する。このカスケードにより大量の触媒的に活性なリポーター・リボザイムが生成され、このリポーター・リボザイムは、検出される場合に、試験サンプル内に目的の配列の存在を示す。この目的の配列はそれ自体では上記処理中において増幅されない。むしろ、リポーター信号のみが増幅されるだけである。
【０００８】
要するに、目的の核酸の増幅およびこれを可能にする反応条件は既知である。さらに、触媒性核酸分子およびこれらを活性化する反応条件もまた既知である。
【０００９】
しかしながら、単一の反応環境における核酸増幅および触媒性核酸活性の同時的処理を可能にする方法はこれまで存在していなかった。さらに、増殖生成物が目的物および触媒性核酸分子に対応する配列を含有する単一の核酸分子である目的物増幅方法はこれまで全く行われていなかった。加えて、これまでの目的物増幅方法は、目的の配列が存在している場合にのみその「センス」すなわち触媒性の形態で増幅される触媒性核酸分子のアンチセンスであるチモーゲン性の配列を使用するものは存在しなかった。
【００１０】
【発明の概要】
本発明はサンプル中における目的の核酸配列の存在を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、（ｉ）目的物の増幅開始に適するＤＮＡプライマー、および（ｉｉ）触媒性核酸分子をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス・配列であるＤＮＡチモーゲンに接触させる工程から成り、上記のプライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｂ）触媒性核酸の活性の存在を決定することにより、サンプル中における目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る。
【００１１】
また、本発明はサンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を同時に検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、（ｉ）検出すべき各目的物に対応する複数のプライマーに接触させ、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在しており、さらに、（ｉｉ）検出すべき各目的物に対応する複数のチモーゲンに接触させる工程から成り、当該少なくとも１個のチモーゲンが明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス配列であり、上記のプライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｂ）各触媒性核酸の活性の存在を決定することにより、サンプル中における対応する各目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る。
【００１２】
さらに、本発明はプライマーおよびチモーゲンから成るＤＮＡ分子を提供し、当該プライマーはチモーゲンの３’側に位置している。
【００１３】
さらに、本発明はサンプル中における目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するためのキットを提供し、当該キットは、（ａ）目的物の増幅開始に適するプライマーと、（ｂ）触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列であるチモーゲンとから成り、上記のプライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸の活性を可能にする試薬から成る。
【００１４】
さらに、本発明はサンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するためのキットを提供し、当該キットは、（ａ）検出すべき各目的物に対応する複数のプライマーから成り、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在しており、さらに、（ｂ）検出すべき各目的物に対応する複数のチモーゲンから成り、当該少なくとも１個のチモーゲンが明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列であり、上記のプライマーおよびチモーゲンが、対応する目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸の活性を可能にする試薬から成る。
【００１５】
定義
本発明において、以下に示す意味を有する幾つかの用語を頻繁に使用する。すなわち、「触媒性核酸分子（catalytic nucleic acid molecule）」、「触媒性核酸（catalytic nucleic acid）」、および「触媒性核酸配列（catalytic nucleic acid sequence)」は同等であり、それぞれ、別個の基質を特異的に認識して当該基質の化学的修飾において触媒として作用するＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有分子（あるいは「ＤＮＡザイム」として当該技術分野において知られている）またはＲＮＡまたはＲＮＡ含有分子（あるいは「リボザイム」として当該技術分野において知られている）を意味する。これらのＤＮＡザイムおよびリボザイムにおける核酸塩基は塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，ＴおよびＵ、およびこれらの誘導体とすることができる。これらの塩基の誘導体は当該技術分野において周知であり、参考文献４０に例示されている。
【００１６】
目的の核酸配列の「増幅（amplification)」とは、その（線形的な増幅に対する）指数関数的な増幅を意味し、各増幅サイクルはそのサイクルの直前に存在する目的の増幅生成物（amplicons)の数を２倍にする。指数関数的増幅の方法として、ＰＣＲ、ＳＤＡおよびＴＭＡが含まれるが、これらに限らない。指数関数的増幅は線形的増幅とは異なっており、線形的増幅の場合は、各増幅サイクルはそのサイクルの直前に存在する目的の増幅生成物の数よりも一定の数だけ増加させる。
【００１７】
「リポーター基質（reporter substrate）」、「化学的基質（chemical substrate）」および「基質（substrate)」は同等であり、それぞれ、触媒性核酸分子により特異的に認識されて修飾される任意の分子を意味する。さらに、「目的（物）（target）」および「目的の核酸配列（target nucleic acid sequence）」は同等であり、それぞれ、本発明により検出されて測定される関与の核酸配列を意味し、当該核酸配列は本発明の方法においてプライマーと接触する場合に当該プライマーと共にハイブリッド形成する一定の配列から成り、１個の分子全体またはその一部分のいずれでもよい。また、「プライマー（primer）」はＤＮＡまたはＤＮＡ含有の核酸分子の短いセグメントを意味し、（ｉ）増幅すべきＤＮＡまたはＲＮＡ配列の適当な部分に対して増幅条件下にアニールし、（ｉｉ）ポリメラーゼ媒介合成を開始して、それ自体が物理的に伸長される。さらに、「チモーゲン（zymogene）」は検出可能な活性を有する触媒性核酸分子のアンチセンス（すなわち、相補的な）配列から成り、その転写生成物が対応する触媒性核酸分子である核酸配列を意味する。
【００１８】
本発明の実施形態
本発明はサンプル中における関心のある目的の核酸配列を検出して定量的に測定する迅速かつ処理的に柔軟な方法を提供する。この方法は単一の反応容器内において触媒性核酸活性による目的物の増幅および検出を同時に行う点において特異的である。さらに、この方法はその増幅生成物が目的物および触媒性核酸分子に対応する配列を含有する単一の核酸分子である点において特異的である。加えて、この方法は、最初に目的物の配列が存在している場合にのみ、その「センス」すなわち触媒性の形態で増幅される触媒性核酸分子のアンチセンスであるチモーゲン配列を使用する。
【００１９】
さらに具体的に言えば、本発明はサンプル中における目的の核酸配列の存在を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、（ｉ）目的物の増幅開始に適するＤＮＡプライマー、および（ｉｉ）触媒性核酸分子をコードするが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス配列であるＤＮＡチモーゲンに接触させる工程から成り、上記のプライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｂ）触媒性核酸の活性の存在を決定することにより、サンプル中における目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る。
【００２０】
実施形態の一例において、本発明の方法は、さらに、工程（ａ）から生じたサンプルにおける触媒性核酸の活性の量を定量的に決定して、当該決定した活性の量を既知の標準値と比較することにより、目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程から成る。この既知の標準値は定量的決定のために任意の標準値または対照値を使用することができる。このような標準値の例として、（ｉ）既知の反応速度論的情報、および（ｉｉ）触媒的活性を有さない、あるいは、所定量の触媒的活性を有するサンプルを用いて得た信号測定値が含まれる。
【００２１】
実施形態の一例において、上記のプライマーおよびチモーゲンは別々のＤＮＡ分子上に存在していて、上記のプライマー開始型核酸増幅方法がローリング・サークル型増幅方法（既知の増幅方法）である。また、別の実施形態において、上記ＤＮＡ分子の少なくとも２種類が上記プライマーおよびチモーゲンから成る。
【００２２】
さらに別の実施形態において、上記サンプルは２種類のＤＮＡ分子に接触し、各分子がプライマー、およびチモーゲンから成る少なくとも１種類の分子から成り、当該プライマーがチモーゲンの３’側に位置している。
【００２３】
この実施形態の一つの形態において、上記のチモーゲンによりコード化されるＤＮＡザイムは増幅された核酸分子自体に実際に存在する配列を認識して開裂（すなわち、ＤＮＡザイムが異なる分子上に位置する基質を開裂する場合のトランス開裂に対するシス開裂）する。さらに具体的に言えば、上記の単一の増幅処理された核酸分子は、さらに、当該増幅処理された分子上に共存するチモーゲン−コード化された触媒性核酸のＤＮＡザイムにより認識されてシス状態で開裂されるヌクレオチド配列から成る。
【００２４】
このシス型ＤＮＡザイム−触媒処理された開裂を用いる方法の好ましい実施形態において、上記のチモーゲン−コード化されたＤＮＡザイムは１０−２３ＤＮＡザイムであり、上記の本発明の方法における工程（ａ）の（ｉ）において使用するＤＮＡプライマー（すなわち、「キメラ」プライマー）は当該１０−２３ＤＮＡザイムにより認識されてシス状態で開裂される部位の５’側部分として作用する少なくとも１個のプリン・リボヌクレオチド残基を含有している。すなわち、このキメラ・プライマーにおけるプリン・リボヌクレオチド残基は１０−２３ＤＮＡザイムによる開裂において必要である。従って、このキメラ・プライマーを使用することにより、上記のような１０−２３ＤＮＡザイム開裂部位をＰＣＲ反応において生成することができる。さらに、このキメラ・プライマーは、例えば、１０−２３ＤＮＡザイムにより認識されてシス状態で開裂される部位の３’側部分として作用するリボヌクレオチド残基を含むことも可能である。
【００２５】
本発明において、プライマーおよび／またはチモーゲンから成る核酸分子もまた目的物に対して相補的な配列のような付加的な配列により構成できる。
【００２６】
上記の本発明において検出または定量化された目的の配列は任意の核酸配列とすることができる。実施形態の一例において、この目的の核酸配列はＤＮＡ分子である。また、別の実施形態において、この目的の核酸配列はＲＮＡ分子であり、上記の工程（ａ）はさらにサンプルをプライマーおよびチモーゲンに接触させる前に目的のＲＮＡ配列をＤＮＡにまず逆転写するのに必要な工程から成る。
【００２７】
上記のチモーゲンによりコード化される触媒性核酸分子はリボザイムまたはＤＮＡザイムとすることができる。実施形態の一例において、この触媒性核酸分子はリボザイムである。また、別の実施形態においては、この触媒性核酸分子はＤＮＡザイムである。
【００２８】
また、本発明において測定される触媒性核酸の活性は核酸増幅反応と同一の環境内において同時に生じ得る（必要に応じて、測定できる）任意の活性とすることができる。この触媒性核酸の活性は、例えば、検出可能な化学的基質の修飾から成り、この修飾はホスホジエステル結合の形成および開裂、核酸の連結および開裂、ポルフィリン金属化、および炭素−炭素結合、エステル結合およびアミド結合の形成から成る群から選択される。実施形態の一例において、上記検出可能な化学的基質の修飾は蛍光ラベル化された核酸分子、好ましくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ分子の開裂である。
【００２９】
好ましい実施形態において、上記のリポーター基質が開裂されて、この開裂を測定することが触媒活性の測定手段になる。例えば、リポーター基質が放射線ラベル化されている場合に、開裂した基質の存在がゲル電気泳動の後の蛍光画像処理（phosphorimaging)によりモニターできる。また、開裂した基質の存在は当該基質内の開裂した部位の反対側に組み込まれた蛍光／消光剤色素分子の分離により生じる蛍光における変化によりモニターすることもできる。従って、このようなシステムにより、リアルタイムでモニターできる均一アッセイを行うことができる。なお、蛍光発光における変化をモニターする方法は当該技術分野において周知である。例えば、このような方法には、視覚的観察および分光蛍光光度計によるモニターが含まれる。
【００３０】
上記目的の核酸配列は任意の生体から入手したものとすることができ、上記サンプルは核酸分子を含むまたは含むと考えられる任意の組成物とすることができる。実施形態の一例において、この目的物は植物から得たもの、または、例えば、マウス、ラット、犬、ギニア豚、フェレット、ウサギ、および霊長類動物等の動物から得たものである。別の実施形態において、上記目的物は水または土のような供給源から得たサンプル内に存在するものである。さらに別の実施形態においては、上記目的物はバクテリア、ウイルスまたはマイコプラズマを含有するサンプルから得たものである。
【００３１】
好ましい実施形態において、上記目的物は人間から入手したものである。本発明の方法は、例えば、診断、公共衛生および法医学を含む種々の目的のために使用できる。
【００３２】
実施形態の一例において、本発明の方法は診断用に使用される。特に、本発明は一定の異常症状が存在していない場合には存在しない少なくとも１個の目的の核酸配列の存在により特徴付けられる被験体における一定の異常症状を診断するために使用できる。このような異常症状は当該技術分野において周知であり、例えば、癌、嚢胞性線維症、および種々の異常血色素症等を含む。また、本発明は感染性の病原因子の存在に伴う異常症状を診断するために使用できる。このような異常症状は、例えば、エイズ、Ｃ型肝炎、および結核等を含む。好ましい実施形態において、上記の診断される被験体は人間であり、上記の異常症状は癌である。
【００３３】
別の実施形態において、上記目的の核酸分子の存在および量を試験するためのサンプルは公共衛生の目的のために採取されたものである。このようなサンプルの例として、バクテリア、ウイルスおよびマイコプラズマのような病原体を含有する可能性のある水、食物および土が含まれる。
【００３４】
さらに別の実施形態において、上記目的の核酸分子の存在および量を試験するためのサンプルは法医学的サンプルである。このようなサンプルの例として、犯罪現場のような任意の供給源から入手した体液、組織および細胞が含まれる。
【００３５】
また、本発明はサンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を同時に検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、（ｉ）検出すべき各目的物に対応する複数のプライマーに接触させ、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在しており、さらに、（ｉｉ）検出すべき各目的物に対応する複数のチモーゲンに接触させる工程から成り、当該少なくとも１個のチモーゲンが明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス配列であり、上記のプライマーおよびチモーゲンが、対応する目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｂ）各触媒性核酸の活性の存在を決定することにより、サンプル中における対応する各目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る。
【００３６】
実施形態の一例において、上記複数の目的物の存在を同時に検出する方法は、さらに、工程（ａ）から生じたサンプルにおける各触媒性核酸の活性の量を定量的に決定して、当該決定した各活性の量を既知の標準値と比較することにより、各目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程から成る。なお、このような本発明の方法により同時に検出できる多数個の目的物の例が参考文献３９に開始されている。
【００３７】
本発明はさらにプライマー、およびチモーゲンから成るＤＮＡ分子を提供し、当該プライマーがチモーゲンの３’側に位置している。この分子は本発明の方法に従って使用できる。
【００３８】
さらに、本発明はサンプル中における目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するための装置を提供し、当該装置は、（ａ）目的物の増幅開始に適するプライマーと、（ｂ）触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列であるチモーゲンとから成り、上記のプライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸の活性を可能にする試薬から成る。
【００３９】
さらに、本発明はサンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するための装置を提供し、当該装置は、（ａ）検出すべき各目的物に対応する複数のプライマーから成り、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在しており、さらに、（ｂ）検出すべき各目的物に対応する複数のチモーゲンから成り、当該少なくとも１個のチモーゲンが明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列であり、上記のプライマーおよびチモーゲンが、対応する目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸の活性を可能にする試薬から成る。
【００４０】
実施形態の一例において、上記の装置はさらに被験体またはサンプルから核酸分子のサンプルを単離するために有用な試薬から成る。この装置の各構成要素は市販のものまたは以下の実施例の詳細な説明において例示するような当該技術分野において周知の方法に従って作成したもののいずれでもよい。さらに、この装置における各構成要素は必要に応じて溶液の状態または凍結乾燥した状態にすることができる。実施形態の一例において、上記の各構成要素は同一の区画部分内に存在しており、別の実施形態においては、これらの構成要素は別別の区画部分内にそれぞれ存在している。好ましい実施形態において、上記の装置はさらに使用のための説明書を備えている。
【００４１】
本発明の方法および装置において、上記の核酸増幅処理は当該技術分野において周知の任意の適当な方法に従って行うことができ、ＰＣＲ、ＳＤＡおよびＴＭＡから成る群から選択される１個の方法に従って行うのが好ましい。
【００４２】
本発明に関連する多くの方法が当該技術分野の熟練者において周知である。これらの方法として、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、即時溶解およびカラムにおける捕捉を含む核酸分子を単離するための方法（文献３４乃至文献３８）、核酸分子の検出および定量化の方法、触媒性核酸活性の検出および定量化の方法、例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡおよびＴＭＡ（ＳＳＲとしても知られている）を含む核酸配列を増幅する方法（文献１乃至文献１０および文献４１）、特定の目的配列を増幅するためのプライマーを設計および作成する方法、および、例えば、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動および蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）等を含む増幅処理した核酸セグメントの触媒性核酸分子による開裂を決定する方法（文献２５および文献３１）などが含まれる。
【００４３】
本発明は以下の実施例の詳細な説明に基づいてさらに明瞭に理解できるが、当該技術分野の熟練者であれば、これらの詳細な特定の実施例が本発明の例示を目的とするものに過ぎず、本発明の範囲が特許請求の範囲に完全に記載されていることが容易に理解できる。
【００４４】
【実施例の詳細な説明】
実施例１：腫瘍細胞ＤＮＡにおけるＫ−ラス（K-ras）の検出
Ａ．ＰＣＲプライマー
３種類のＰＣＲプライマー（５ＫＩＤ、３Ｋ２Ｄｚ３および３Ｋ２）はOligos Etc.社（米国、オレゴン州、ウィルソンビル）により合成されたものである。この５’ＰＣＲプライマー（５ＫＩＤ）は人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的である。また、３’プライマーの３Ｋ２Ｄｚ３は（ａ）活性なＤＮＡザイムに対して相補的な触媒的に不活性なアンチセンス配列を含有する５’領域および（ｂ）人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的な３’領域を含有するチモーゲンＰＣＲプライマーである。これらの５ＫＩＤおよび３Ｋ２Ｄｚ３を用いるＰＣＲ増幅処理中に、５ＫＩＤの伸長により生成されたアンプリコン（増幅生成物）は３’領域内に組み込んだＤＮＡザイムのＫ−ラス配列および触媒的に活性なセンス配列のコピーの両方を含有する。この活性なＤＮＡザイムはＲＮＡ／ＤＮＡリポーター基質（Ｓｕｂ１）を開裂するように設計されている。プライマー３Ｋ２は３Ｋ２Ｄｚ３内に組み込まれているＫ−ラス−特異的配列と同一の配列を含有する対照（Control)プライマーである。しかしながら、このプライマーはチモーゲン配列を全く含有していない。これらのＰＣＲプライマーの各配列を以下に示す。なお、下線を引いた配列は人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的であり、太字で示した配列は活性なＤＮＡザイムに相補的な不活性な（アンチセンス）配列である。
５ＫＩＤ（５’Ｋ−ラス・プライマー）
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATA
３Ｋ２Ｄｚ３（３’Ｋ−ラス・チモーゲン・プライマー）
0004318856.tif 000002
３Ｋ２（対照反応のための３’Ｋ−ラス・プライマー）
CGTCCACAAAATGATTCTGA
【００４５】
Ｂ．リポーター基質
上記のリポーター基質（Ｓｕｂ１）はOligos Etc.社（米国、オレゴン州、ウィルソンビル）により合成されたものである。このＳｕｂ１はＲＮＡ（太線、下線部分）およびＤＮＡの塩基部分の両方を含有するキメラ分子である。この分子は３’ホスフェート基を有していて、このホスフェート基がＰＣＲ中のＤＮＡポリメラーゼによるこの分子の伸長を阻止している。このＳｕｂ１は標準的な技法（文献３４）により３２Ｐにより５’側末端がラベル化されている。このＳｕｂ１の配列は以下のように示される。
0004318856.tif 000003
【００４６】
Ｃ．対照開裂反応のためのＤＮＡザイム
ＤＮＡザイムのＤｚ３ａはOligos Etc.社（米国、オレゴン州、ウィルソンビル）により合成されたものである。このＤＮＡザイムはチモーゲン・プライマーの３Ｋ２Ｄｚ３によるＰＣＲ増幅処理中に生成される活性なＤＮＡザイムにより開裂されるものと同一の配列においてＳｕｂ１を開裂するように設計されている。このＤｚ３ａの配列は以下のように示される。
Ｄｚ３ａ
TCCTGAAAGGCTAGCTACAACGAATTGCAGT
【００４７】
Ｄ．腫瘍細胞系からのゲノムＤＮＡの調製
人間の細胞系のＫ５６２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル）から入手した。Ｋ５６２は野生型のＫ−ラス配列を含有する白血病性細胞系である。さらに、ゲノムＤＮＡをカチオン性ポリマー抽出法（文献３８）により調製した。
【００４８】
Ｅ．Ｋ−ラス遺伝子のＰＣＲ増幅処理
Ｋ５６２から単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。反応系（Ａ１およびＡ２）はゲノムＤＮＡ（５００ナノグラム）、５０ピコモルの５ＫＩＤ、１ピコモルの３Ｋ２Ｄｚ３、５０フェムトモルの３２Ｐラベル化したＳｕｂ１、１００ｍＭＮａＣｌ中における１００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、５０ｍＭのトリスバッファ（ｐＨ８．３、２５℃）および８ｍＭのＭｇＣｌ2 を含有していた。６単位のTaqＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｌ、AmpliTaq、Perkin Elmer)を１．８μｌの抗体希釈バッファ（Clontech)中で２μｌのTaqStart(商標)抗体（１．１ｍｇ／ｍｌ）に混合した。このTaqＤＮＡポリメラーゼ／TaqStart(商標）混合物を上記のＰＣＲ混合物に加える前に１５分間室温でインキュベートした。その後、合計の反応容量を５０μｌにした。１個のネガティブ対照反応系（Ｂ）はゲノムＤＮＡを除く全ての反応成分を含有していた。別のネガティブ対照反応系（Ｃ）は３Ｋ２Ｄｚ３を１ピコモルの３Ｋ２に置き換えた以外は全ての反応成分を含有していた。さらに、ポジティブ対照開裂反応系（Ｄ）は対照反応系Ｃにおける全ての反応成分に加えて３０ピコモルのＤｚ３ａを含有していた。これらの反応系をGeneAmp PCR システム９６００（Perkin Elmer）の中に入れて９４℃で２分間変性した後に、２０サイクルの９２℃で２０秒間および５８℃で３０秒間の処理を加えてから、さらに、２０サイクルの９２℃で２０秒間、７４℃で１秒間および４０℃で２０秒間の処理を加えた。
【００４９】
Ｆ．開裂したリポーター基質Ｓｕｂ１の検出
各反応物の３μｌの分量を１６％変性ポリアクリルアミド・ゲル上における電気泳動により後続の操作を加えることなく分析した。このゲルをPhosphoImager: 445SI（Molecular Dynamics）における蛍光画像処理法により視覚化した。放射性ラベル化した２５個塩基のＳｕｂ１リポーター基質は開裂してポジティブ対照開裂反応系Ｄにおいて１３個塩基の放射性ラベル化したフラグメントを生成した。同一の１３個塩基フラグメントはゲノムＤＮＡおよびチモーゲン・プライマー３Ｋ２Ｄｚ３の両方を含有するＰＣＲ反応系Ａ１およびＡ２において存在しており、ＰＣＲによるＫ−ラス遺伝子の有効な増幅を示した。ネガティブ対照反応系Ｂ（ゲノムＤＮＡを全く含まない）においては２５個塩基フラグメントのみが認められ、基質の開裂が目的のＤＮＡの増幅の存在しない場合においては生じないことが分かった。さらに、チモーゲン・プライマーがＫ−ラス配列のみを含有するプライマーに置き換えられているネガティブ対照反応系Ｃにおいては、活性なＤＮＡザイムがこの反応系において生成されないために、基質が開裂されなかった。
【００５０】
実施例２：蛍光リポーター基質の開裂
Ａ．リポーター基質
リポーター基質のＳｕｂＣｚ２はOligos Etc.社（米国、オレゴン州、ウィルソンビル）により合成されたものである。このＳｕｂＣｚ２の配列を以下に示す。このＳｕｂＣｚ２はＲＮＡ（以下に小文字で示す）およびＤＮＡヌクレオチドの両方を含有するキメラ分子である。このＳｕｂＣｚ２は当該配列のＰＣＲ中におけるＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止する３’ホスフェート基を有している。ＳｕｂＣｚ２は５’ヌクレオチド（〔〕内、下線部）に連結した６−カルボキシフルオレセイン（6-carboxyfluorescin）（「６−ＦＡＭ」）部分およびＲＮＡの塩基に対して最初の「Ｔ」デオキシリボヌクレオチド（〔〕内、下線部）の３’側に連結したＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）部分をもって合成される。このリポーター基質の開裂は４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）における励起により５３０ｎｍ（ＦＡＭ発光波長）においてモニターできる。
ＳｕｂＣｚ２
5’ 〔C〕CACTCguA〔T〕TAGCTGTATCGTCAAGCCACTC 3’
【００５１】
Ｂ．ＰＣＲプライマー
２種類のプライマーはBresatec Pty.社（オーストラリア、サウスオーストラリア、アデレード）またはPacific Oligos Pty.社（オーストラリア、ニューサウスウエールズ、リズモア）により合成されたものである。この５’ＰＣＲプライマー（５Ｋ４９）は人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的である。また、３’プライマー（３Ｋ４５Ｚｃ２）は（ａ）活性なＤＮＡザイムの触媒的に不活性なアンチセンス配列を含有する５’領域および（ｂ）人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的である３’領域を含有しているチモーゲンＰＣＲプライマーである。５Ｋ４９および３Ｋ４５Ｚｃ２を用いたＰＣＲ増幅処理中に、５Ｋ４９の伸長により生成された増幅生成物はそれらの３’領域内に組み込まれたＤＮＡザイムのＫ−ラス配列および触媒的に活性なセンス配列のコピーの両方を含有する。この活性なＤＮＡザイムはＲＮＡ／ＤＮＡリポーター基質ＳｕｂＣｚ２を開裂するように設計されている。このＰＣＲプライマーの配列を以下に示す。この配列における下線を引いた部分は人間のＫ−ラス遺伝子に対して相補的であり、〔〕内に示した配列は活性なＤＮＡザイムに対して相補的な不活性な（antisense)配列である。
５Ｋ４９（５’Ｋ−ラス・プライマー）
5’ CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA 3’
３Ｋ４５Ｚｃ２（３’Ｋ−ラス・チモーゲン・プライマー）
5’ 〔CCACTCTCGTTGTAGCTAGCCTATTAGCTGTATCGTCAAGCCACTC〕TTGC 3’
【００５２】
Ｃ．腫瘍細胞系からのゲノムＤＮＡの調製
人間の細胞系Ｋ５６２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル）から入手した。Ｋ５６２は野生型Ｋ−ラス配列を含む白血病性細胞系である。さらに、ゲノムＤＮＡをカチオン性ポリマー抽出法（文献３８）により調製した。
【００５３】
Ｄ．Ｋ−ラス遺伝子のＰＣＲ増幅処理
Ｋ５６２から単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。反応系は２０ピコモルの５Ｋ４９、３ピコモルの３Ｋ４５Ｚｃ２、１０ピコモルのＳｕｂＣｚ２、８ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ、および１×バッファ（１０ｍＭのトリスバッファ（ｐＨ８．３、２５℃）による７５ｍＭのＫＣｌ溶液）を含有していた。このＰＣＲ法において使用した全ての溶液をＤＥＰＣ−処理水において作成した。３単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｌ、AmpliTaq、Perkin-Elmer）をTaqStart（商標）抗体（Clontech）と混合してTaq ＤＮＡポリメラーゼ：TaqStart（商標）抗体の最終的なモル比率を１：１０にした。このTaq ＤＮＡポリメラーゼ／TaqStart（商標）抗体の混合物を上記のＰＣＲ混合物に加える前に室温で１５分間インキュベートした。さらに、全体の反応容量を５０μｌにした。重複した反応系を調製し、この反応系に５００ナノグラムのＫ５６２ゲノムＤＮＡを含有させた。また、対照の反応系はゲノムＤＮＡを除いた全ての反応成分を含んでいた。これらの反応系をABI Prism 7700配列検出システム内に入れて、（基準線読取を行うために）４０℃で１分間インキュベートし、９４℃で３分間変性処理した後に、１サイクル毎に１℃の温度低下を伴って７０℃で１分間の処理を２０サイクル行い、さらに、９４℃で５秒間のインキュベーションを行った。この処理の後に、さらに４０℃で１分間の処理を５０サイクル行った後に、９４℃で５秒間のインキュベーションを行った。
【００５４】
蛍光をＰＣＲのアニール／伸長期中にABI Prism 7700配列検出システムにより測定した。この結果、ゲノムＤＮＡを伴う反応系は対照の反応系において観察された蛍光よりも多くの５３０ｎｍにおけるＦＡＭ蛍光における増加が見られた。すなわち、この蛍光の増加により、ＰＣＲ処理中のＫ−ラス増幅生成物の蓄積がモニターできた。これらの結果から、チモーゲンＰＣＲ処理が均一な増幅処理を容易にして簡単な蛍光測定形態でのリアルタイム検出を可能にすることが確認できた。
【００５５】
実施例３：変異型対立遺伝子を区別するためのチモーゲンの使用：Ｋ−ラスコドン１２における変異の検出
Ａ．戦略
チモーゲン・プライマーを用いるＰＣＲはまた点変異の分析に使用できる。この実施例において、チモーゲン・プライマーはＰＣＲ中に活性なＤＮＡザイムの合成を容易にする。これらのＤＮＡザイムはそれらのハイブリッド形成アームがＫ−ラス遺伝子内のコドン１２の位置１に対して完全に相補的である場合にのみ、シス状態（in cis）でＰＣＲ増幅生成物を開裂するように設計されている。Walder他（文献４１）は、Taq ＤＮＡポリメラーゼが１個または２個の３’末端リボース残基を含有するＤＮＡ／ＲＮＡキメラ・プライマーを伸長できることを既に示している。これらのキメラ・プライマーはこの場合において１０−２３ＤＮＡザイムに対する基質として作用するＰＣＲ増幅生成物を生成するために使用される。
【００５６】
５’ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ・プライマー（５Ｋ４２ｒ）および３’チモーゲン・プライマー（３Ｋ４２Ｄｚ２）を用いるＰＣＲはＫ−ラスの領域を増幅した。５Ｋ４２ｒはコドン１２に隣接するＫ−ラス配列に対してハイブリッド形成して、潜在的なＤＮＡザイム開裂部位を形成するプリン：ピリミジン残基を含有する。一方、チモーゲン・プライマー３Ｋ４２Ｄｚ２はＫ−ラス遺伝子に対して相補的な３’領域およびＤＮＡザイムのアンチセンスを含有する５’領域を有している。このチモーゲン・プライマーはそれ自体で固有の触媒的活性を全く有していなかったが、５Ｋ４２ｒと共に使用されると、（ａ）５’末端の近くにおけるＤＮＡザイム開裂部位および（ｂ）３’末端の近くに活性な（センス）ＤＮＡザイムを有する増幅生成物を生成を容易にした。このＤＮＡザイムは増幅生成物の５’側末端をシス状態で開裂するように設計されている。さらに、このＤＮＡザイムの５’側アームはコドン１２における野生型である配列に対して完全に相補的である。それゆえ、ＤＮＡザイムの５’側アームとのミスマッチを生じさせるＫ−ラス・コドン１２における変異がＤＮＡザイムの開裂作用の効果を顕著に減少することが予想できる。
【００５７】
Ｂ．プライマー配列
５’キメラ・プライマー５Ｋ４２ｒ
（大文字：デオキシリボヌクレオチド残基、
小文字：リボヌクレオチド残基）
5’ TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT 3’
３’チモーゲン・プライマー３Ｋ４２Ｄｚ２
（１０：２３触媒性コアの相補部分を〔〕内に示す）
5’ ACTTGTGGTAGTTGGA〔TCGTTGTAGCTAGCC〕CTGGTGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC 3’
【００５８】
これらのプライマーはPacific Oligos Pty.社（オーストラリア、ニューサウスウエールズ、リズモア）またはOligos ETC.社（米国、オレゴン州、ウィルソンビル）により合成されたものである。５’プライマー５Ｋ４２ｒは、２５μｌの２０μＭのプライマーを２．５μｌのポリヌクレオチド・キナーゼ（１０×１０3 Ｕ／ｍｌ、３’ホスファターゼ−フリー、Boehringer Mannheim)、２．５μｌのｒＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ、組換えｒＲＮａｓｉｎ（登録商標）、リボヌクレアーゼ・インヒビタ−、Promega)、５μｌのポリヌクレオチド・キナーゼ・バッファ（Boehringer Mannheim）、１０μｌのｇ−32Ｐアデノシン５’−三リン酸（２．５μＭ、Stable Label Gold(商標）、Brestec）および５μｌのＤＥＰＣ水により３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ｇ−32Ｐで５’末端をラベル化したものである。
【００５９】
Ｃ．Ｋ−ラスＤＮＡテンプレート
コドン１２における変異型（ＣＧＴまたはＡＧＴ）または野生型（ＧＧＴ）のいずれかであるＫ−ラス・エクソン１（K-ras exon 1）配列を含有するｐＵＣ１８プラスミド・ベクターをＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートとして用いた。
【００６０】
Ｄ．チモーゲンＰＣＲによる増幅処理および反応中に合成されたＤＮＡザイムによる開裂
ＰＣＲ混合物は０．２ピコグラム／μｌのＫ−ラス・プラスミドＤＮＡ、１０ピコモルのｇ−32Ｐラベル化した５Ｋ４２ｒ、２ピコモルの３Ｋ４２Ｄｚ２、１ｍＭのＤＴＴ、８ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．４単位／μｌのｒＲＮａｓｉｎ（登録商標）、および１×バッファ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３、２５℃）を伴う１００ｍＭのＮａＣｌ）を含有していた。重複した反応系を各ＤＮＡテンプレートに対して設定した。その後、６単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｌのAmpliTaq、Perkin-Elmer）をTaqStart（商標）抗体（Clontech）と混合してTaq ＤＮＡポリメラーゼ：TaqStart（商標）抗体の最終的なモル比率を１：５にした。このTaq ＤＮＡポリメラーゼ／TaqStart（商標）抗体の混合物を上記のＰＣＲ混合物に加える前に室温で１５分間インキュベートした。さらに、全体の反応容量を５０μｌにした。これらの反応系をGeneAmp PCR 9600(Perkin-Elmer)の中に入れて、９４℃で２分間変性してから、３０サイクルの６０℃で１分間の処理、続いて９４℃で２０秒間の処理を行った。この反応物をさらに１０工程の５０℃で１分間の処理、続いて９４℃で２０秒間処理した。
【００６１】
２．５μｌの分量の各反応物を２．５μｌの装填色素（９７．５％のホルムアミド、０．１％のキシレンシアノール、０．１％のブロモフェノールブルーおよび０．０１ＭのＥＤＴＡ）と混合して、７５℃で２分間インキュベートした後に、速やかに予備加温した１６％変性（尿素）アクリルアミド・ゲル上に装填した。これらのゲルを約１時間電気泳動処理した。このゲルをモレキュラー・ダイナミクス・ホスホイメージャ４４５ＳＩにより走査してＰＣＲ生成物および開裂フラグメントを可視化した。
【００６２】
この結果、幾つかの帯域がゲル上において目視で識別できるようになった（データ示さず）。これらのフラグメントは、最遅から最速の移動度の順（すなわち、ゲルの原点から底部の順）に、（ａ）ＰＣＲ増幅生成物（二重線として泳動）、（ｂ）組み込まれないプライマー、および（ｃ）開裂したＰＣＲ増幅生成物であった。さらに、５’プライマー内のリボヌクレオチド残基におけるバックグラウンドの加水分解により生じた少量の２個のフラグメントが、プライマーと開裂した増幅生成物の間および開裂した増幅生成物と平行に泳動しているのが認められた。全ての反応系において、ＰＣＲ生成物および組み込まれないプライマーが目視で認められた。コドン１２における野生型の（すなわち、ＤＮＡザイムに対して完全に相補的である）テンプレートＤＮＡを含有する反応系は開裂した増幅生成物を含んでいた。一方、コドン１２における変異型の（すなわち、ＤＮＡザイムに対してミスマッチである）テンプレートＤＮＡを含有する反応系は開裂した増幅生成物を含んでいなかった。また、僅かな量のバックグラウンドの加水分解生成物のみがこれらの反応系においてゲル上のこの位置に認められた。
【００６３】
以下の配列はＤＮＡザイム（太字）がシス状態でハイブリッド形成しているコンホメーションで示されたコドン１２の位置１（下線部）において野生型の増幅生成物である。
0004318856.tif 000004
【００６４】
本発明に基づいて、さらに、プライマー設計の慣用方法により、変異体Ｋ−ラス配列を特異的に開裂するＤＮＡザイムの生成物を生じるチモーゲン・プライマーが容易に設計できる。
本発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
１．サンプル中における目的の核酸配列の存在を検出する方法において、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、
（ｉ）目的物の増幅開始に適するＤＮＡプライマー、および、
（ｉｉ）触媒性核酸分子をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス配列であるＤＮＡチモーゲンに接触させる工程から成り、前記プライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、
（ｂ）触媒性核酸の活性の存在を決定することにより、サンプル中における目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る方法。
２．さらに、前記工程（ａ）から生じたサンプルにおける触媒性核酸の活性の量を定量的に決定して、当該決定した活性の量を既知の標準値と比較することにより、目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程から成る実施態様１に記載の方法。
３．前記プライマーおよびチモーゲンが別々のＤＮＡ分子上に存在していて、前記プライマー開始型核酸増幅がローリング・サークル型増幅である実施態様１に記載の方法。
４．前記サンプルが２種類のＤＮＡ分子に接触し、各分子がプライマーから成り、少なくとも１個の分子がチモーゲンから成り、前記プライマーが当該チモーゲンの３’側に位置している実施態様１に記載の方法。
５．前記工程（ａ）の（ｉｉ）において生成される単一の増幅処理された核酸分子がさらに、当該増幅処理された分子上において共存するチモーゲン−コード化された触媒性核酸により認識されてシス状態で開裂されるヌクレオチド配列から成る実施態様４に記載の方法。
６．前記チモーゲン−コード化された触媒性核酸が１０−２３ＤＮＡザイムであり、前記工程（ａ）の（ｉ）のＤＮＡプライマーが当該１０−２３ＤＮＡザイムにより認識されてシス状態で開裂される部位の５’側として作用する少なくとも１個のプリン・リボヌクレオチド残基を含有している実施態様５に記載の方法。
７．前記ＤＮＡ分子の少なくとも２個が前記プライマーおよびチモーゲンの両方から成る実施態様４に記載の方法。
８．前記目的の核酸配列がＤＮＡ分子である実施態様１に記載の方法。
９．前記目的の核酸配列がＲＮＡ分子であり、前記の工程（ａ）がさらに、前記サンプルを前記プライマーおよびチモーゲンに接触させる前に、当該目的の核酸配列が存在する場合にこれをＤＮＡに逆転写する工程から成る実施態様１に記載の方法。
１０．前記触媒性核酸分子がリボザイムである実施態様１に記載の方法。
１１．前記触媒性核酸分子がＤＮＡザイムである実施態様１に記載の方法。
１２．前記触媒性核酸分子活性が検出可能な化学的基質の修飾から成り、当該修飾がホスホジエステル結合の形成および開裂、核酸の連結および開裂、ポルフィリン金属化、および炭素−炭素結合、エステル結合およびアミド結合の形成から成る群から選択される実施態様１に記載の方法。
１３．前記検出可能な化学的基質の修飾が蛍光ラベル化した核酸分子の開裂である実施態様１２に記載の方法。
１４．前記蛍光ラベル化した核酸分子がＤＮＡ／ＲＮＡキメラである実施態様１３に記載の方法。
１５．前記目的の核酸配列が人間、バクテリア、マイコプラズマおよびウイルスから成る群から選択される生物から得たものである実施態様１に記載の方法。
１６．前記目的の核酸配列が人間から得たものである実施態様１５に記載の方法。
１７．前記サンプル内における目的の核酸配列の存在が遺伝的異常症状を示す実施態様１６に記載の方法。
１８．前記サンプルが法医学的サンプルである実施態様１に記載の方法。
１９．サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を同時に検出する方法において、
（ａ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする条件下においてサンプルを、
（ｉ）検出すべき各目的物ごとに、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在する複数のプライマー、および、
（ｉｉ）検出すべき各目的物ごとに明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸分子をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸分子のアンチセンス配列である少なくとも１個のチモーゲンが存在する複数のチモーゲンに接触させる工程から成り、前記プライマーおよびチモーゲンが、対応する目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、
（ｂ）各触媒性核酸の活性の存在を同時に決定することにより、サンプル中における対応する各目的の核酸配列の存在を決定する工程から成る方法。
２０．さらに、前記工程（ａ）から生じたサンプルにおける各触媒性核酸の活性の量を定量的に決定して、当該決定した各活性の量を既知の標準値と比較することにより、各目的の核酸配列の量を定量的に決定する工程から成る実施態様１９に記載の方法。
２１．プライマーおよびチモーゲンから成るＤＮＡ分子であって、当該プライマーがチモーゲンの３’側に位置しているＤＮＡ分子。
２２．前記核酸増幅がＰＣＲ、ＳＤＡおよびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って行われる実施態様１乃至実施態様１９のいずれか１項に記載の方法。
２３．サンプル中における目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するためのキットにおいて、
（ａ）目的物の増幅開始に適するプライマーと、
（ｂ）触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列であるチモーゲンとから成り、前記プライマーおよびチモーゲンが、目的物が存在している場合に、当該目的物および触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、
（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬から成るキット。
２４．サンプル中における複数の目的の核酸配列の存在を決定するのに使用するためのキットにおいて、
（ａ）検出すべき各目的物ごとに、当該目的物の増幅開始に適する少なくとも１個のプライマーが存在する複数のプライマー、および、
（ｂ）検出すべき各目的物ごとに明瞭に測定可能な活性を有する触媒性核酸配列をコード化するが、それ自体は当該触媒性核酸配列のアンチセンス配列である少なくとも１個のチモーゲンが存在する複数のチモーゲンとから成り、前記プライマーおよびチモーゲンが、対応する目的物が存在している場合に、当該目的物および対応する触媒性核酸分子の両方の配列から成る単一の増幅処理された核酸分子が生成されるように、互いに対して位置付けられており、さらに、
（ｃ）プライマー開始型核酸増幅および触媒性核酸活性を可能にする試薬から成るキット。
２５．前記核酸増幅がＰＣＲ、ＳＤＡおよびＴＭＡから成る群から選択される方法に従って行われる実施態様２３または実施態様２４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の方法の概略図である。この図において、プライマーおよびチモーゲンから成る核酸分子が目的の配列を含むゲノムＤＮＡのセグメントに接触している。このことにより、触媒性核酸および目的物から成る第２の核酸分子が生じる。次に、この触媒性核酸は検出可能な基質を開裂する。
【図１】
0004318856.tif 000005