(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式
［(O1/2)3Ge-A-CO2H]n
（式中、ｎは１以上の数、Aは低級アルキル基）で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする膵炎の発症予防または治療剤。
【請求項２】
Aが炭素数１から３の低級アルキル基である、請求項１に記載の膵炎の発症予防または治療剤。
【請求項３】
有機ゲルマニウム化合物が、以下の立体構造式
【化１】
0004381495.tif 000011
(式中、Rは−CH2CH2COOH、ｍはプロパゲルマニウムプロピルエステルの重量平均分子量から換算した重量平均重合度であり、１３７±８４［平均値±標準誤差（3σ）］を示す。）、
最小構成単位 (O1/2)3GeCH2CH2COOH、及び実験式 C6H10Ge2O7にて示される3ーオキシゲルミルプロピオン酸８員性構造体である、請求項１または２に記載の膵炎の発症予防または治療剤。
【請求項４】
膵炎が急性膵炎である、請求項１〜３のいずれかに記載の膵炎の発症予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機ゲルマニウム化合物、好ましくは3ーオキシゲルミルプロピオン酸を有効成分とするＭＣＰ−１受容体拮抗剤、さらには、ＭＣＰ−１が関与する炎症性疾患及び臓器障害、即ち、単球等の炎症細胞の浸潤等に起因する炎症性疾患及び臓器障害の発症予防または治療剤に係る。
【０００２】
【従来技術】
有機ゲルマニウム化合物、殊に3−オキシゲルミルプロピオン酸は、複雑な重合性を有する化合物として知られており、特公昭５７−５３８００号には、各種構造体の存在の可能性が記載されている。本発明者等は、さらに複数の構造体の存在を発見し、高活性構造体を特定するに至った（特開平７−２３８０２２号）。
また、この物質は、抗ウイルス作用（特公昭５７−５３８００号）を初めとして、多様な薬理活性を有することから、多くの用途に関する研究がなされている。本発明者等は、インターフェロン産生増強作用（特開平２−１３４８１８号）、インターフェロン効果増強作用（特開平７−２３８０２２号）を発見し開示してきた。しかし、ケモカインに対する作用、及び、ケモカインに起因する各種疾患に対する作用については明らかにされていなかった。
【０００３】
ケモカイン（chemokine,chemotactic  cytokineの略称)は白血球の遊走活性を有するポリペプチドの総称である。一般に、白血球の炎症局所への浸潤は、(i)白血球の血管内皮細胞への接着、(ii)白血球の血管内皮細胞間隙の通過と基底膜の破壊、(iii)白血球の血管外への遊出とその後の組織への遊走の過程を経る。これら一連の白血球の動作を制御する因子として種々のメデイエーターとともに炎症局所から産生されるケモカインが重要な役割を果たす。
【０００４】
ケモカインのアミノ酸配列には特徴的な４つのシステインが含まれており、そのシステインの配列様式によってケモカインは２つのグループに大別される。即ち、最初の２つのシステインが１個のアミノ酸で隔てられているCXCケモカインサブファミリー（αケモカインサブファミリー）と、１番目と２番目のシステインが隣りあっているCCケモカインサブファミリー（βケモカインサブファミリー）である。CXCケモカインサブファミリーには、インターロイキン8（IL-8）などがあり、CCケモカインサブファミリーには、Monocyte  Chemotactic  Protein-1（以下には、「ＭＣＰ−１」と略記する。）、MIP-1α/β（Macrophage  Inflammatory  Protein-1α./βの略称）、RANTES(Regulated  on  Activation,  Normal  T  cell  expressed  and  Secretedの略称）などがある。IL-8を初めとするCXCケモカインサブファミリーは、急性炎症において、主に好中球に作用する。一方、CCケモカインサブファミリーは、主に単球、リンパ球に作用する。
【０００５】
ＭＣＰ−１は、CCケモカインサブファミリーに属するケモカインであり、細胞表面の7回膜貫通型レセプターに属するCCR2を受容体とする。ＭＣＰ−１は76個のアミノ酸からなる分子量8,700の蛋白で、単球乃至マクロファージに強い遊走活性を示し、また、好塩基球や活性化リンパ球にも遊走活性を示すが、好中球や好酸球に対する遊走活性は認められていない。
このＭＣＰ−１が、炎症病変部位への血中単球及びマクロファージの集積を惹起し、かつこれらを活性化することにより病変の発症進展に深く関与している。慢性関節リウマチ患者においては、滑液中には高濃度のＭＣＰ−１が認められ、また滑膜被覆細胞には免疫組織学的にＭＣＰ−１陽性像が認められている。また、セルレイン誘起膵炎や腎炎においても、炎症組織にMCP-１の強い発現が認められている。さらに、グルカン誘起ラット肺肉芽腫症や肺線維症でも、単球の浸潤が病変の発症進展を誘導するとされており、ＭＣＰ−１の関与が強く示唆されている。
また、I型糖尿病、アトピー性皮膚炎、喘息などの疾病においても、病巣において発現されたＭＣＰ−１が病巣への単球浸潤を促進し、病変の発症、進展に深く関与することが推測されている。
【０００６】
更に、慢性炎症組織において、疼痛発生部位には、メモリーＴ細胞の浸潤が認められる。このメモリーＴ細胞には、ＭＣＰ−１受容体であるCCR2が発現しており、ＭＣＰ−１が疼痛の発生に関与することが推察される。また、メモリーＴ細胞は、βエンドルフィンを内包しており、刺激によりβエンドルフィンを遊離して疼痛抑制に働くことも明らかになってきたが、βエンドルフィンの遊離がCCR2の消失とともに起こることも、ＭＣＰ−１又はその受容体が疼痛の発生に関与することを物語っている。
【０００７】
よって、ＭＣＰ−１受容体に拮抗する薬剤は、単球等の炎症性細胞の浸潤を阻害する等のメカニズムにより、慢性関節リウマチ、膵炎、腎炎、肺肉芽腫症、肺線維症及びI型糖尿病（糖尿病性組織炎症）等の炎症性疾患及び臓器障害の予防または治療剤、また、アトピー性皮膚炎及び喘息等の疾患の予防または治療剤、更に、癌性疼痛やリウマチ性疾患の疼痛及び痛風等に例示される慢性炎症に伴う疼痛の抑制剤となることが期待される。
【０００８】
この作用メカニズムを応用した薬剤に関するものとしては、現在のところ、抗ＭＣＰ−１抗体（FASEB  Ｊ.,10,1418-1425,1996）やＭＣＰ−１のアナログ（J.Exp.Med.，181,631-640,1995）が、ＭＣＰ−１の関与する炎症モデルにおいて炎症性疾患及び臓器障害の発症予防または治療剤として基礎研究が進められている。しかしながら、これらの物質については、生産・単離・精製過程において、純度・収率・経済性等の問題が山積しており、実用化までにはさらに時間が必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＭＣＰ−１が関与する炎症性疾患及び臓器障害、即ち、ＭＣＰ−１受容体であるCCR2発現炎症性細胞（単球等）の浸潤等に起因する炎症性疾患及び臓器障害に対する発症予防または治療剤、例えば、慢性関節リウマチ、膵炎、腎炎、肺肉芽腫症、肺線維症、I型糖尿病（糖尿病性組織炎症）、アトピー性皮膚炎及び喘息、更に疼痛の発症予防または治療剤を提供するものである。
尚、これらの具体的疾患は、広い意味ではすべて炎症性疾患であり、１つの概念で捉えることができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、ＭＣＰ−１とCCR2との結合を阻害する拮抗剤のスクリーニングを行い、その拮抗剤の炎症性疾患及び臓器障害の発症に対する予防または治療剤としての可能性について検討した。その結果、当該化合物が、単球のＭＣＰ−１に対する走化性（chemotaxis）を抑制し、さらに、単球等の炎症性細胞の浸潤が深く関与する炎症動物モデルにおいて、当該細胞の浸潤を著しく抑制する作用等を有すると共に、炎症性疾患や臓器障害の発症を顕著に抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される有機ゲルマニウム化合物は、以下式
［(O1/2)3Ge-A-CO2H]n
（式中、ｎは１以上の数、Aは低級アルキル基）で表される化合物で、好ましくは、以下式
［(O1/2)3Ge-A-CO2H]n
（式中、ｎは１以上の数、Aは炭素数１から３の低級アルキル基）で表され、更に好ましくは、以下立体構造式、
【化２】
0004381495.tif 000002
(式中、Rは−CH2CH2COOH、mはプロパゲルマニウムプロピルエステルの重量平均分子量から換算した重量平均重合度であり、１３７±８４［平均値±標準誤差（3σ）］を示す。）
最小構成単位  (O1/2)3GeCH2CH2COOH
実験式        C6H10Ge2O7
にて示される3ーオキシゲルミルプロピオン酸８員性構造体であり、表１及び表２に記載の物理化学的性質を有する。
（表中本発明物質を「ＳＫー８１８」として記載する。表１は光散乱法による分子量測定結果を、表２は粉末X線解析により求めた格子定数を示す。）
【００１２】
【表１】
0004381495.tif 000003
【００１３】
【表２】
0004381495.tif 000004
【００１４】
本発明による3-オキシゲルミルプロピオン酸は、ＭＣＰ−１受容体拮抗剤等として提供される。すなわち、ＭＣＰ−１が関与する炎症性疾患及び臓器障害の発症予防または治療剤として提供されるものである。具体的には、慢性関節リウマチ、膵炎、腎炎、肺肉芽腫症、肺線維症、I型糖尿病（糖尿病性組織炎症）、アトピー性皮膚炎及び喘息、更に疼痛に対して適用される。
【００１５】
本発明による3-オキシゲルミルプロピオン酸を実際にヒトに投与する場合は、本発明物質を0.005重量%〜5重量%に対して作用活性化安定化担体を0.005重量%〜50重量%を含有するように調製された組成物として使用されることが好ましい。
作用活性化安定化担体としては、乳糖・ショ糖・デキストラン類等の糖類、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース系高分子性物質、アルブミン等の天然性高分子物質が使用される。
さらには、これに、一般に使用されている直接的治療効果の高い薬剤類（たとえばアレルギー疾患であれば抗アレルギー剤、炎症疾患であれば抗炎症剤等）を混合製剤化する事もできる。
【００１６】
本発明による3-オキシゲルミルプロピオン酸は、通常は経口製剤として用いられるが、座剤、鼻腔製剤、注射製剤等としても利用することができる。
剤型及び投与量に関しては、本発明による3-オキシゲルミルプロピオン酸は、通常の剤型形態でも使用できうるものであるが、配合する薬剤との特性に合わせて腸溶性とすることもできる。なお、本発明薬剤をヒトに投与する場合の投与量は、剤型・患者の年齢等に依存するが、一日あたり1mg〜1500mgの範囲内であり、体重５０ｋｇの成人に対する経口投与では、一日あたり60mg〜120mgが好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下には本発明物質の製造例、薬効薬理試験例、製剤例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。
【００１８】
製造例
２５２ｇ(1モル）の３−トリクロロゲルミルプロピオン酸を、エチルアルコール２リットル中に溶解させ、この溶液温度を20℃に保ちつつ、水1．5リットルを数時間をかけて添加する。一昼夜放置した後、吸引ろ過により結晶を濾取し、アセトンにて洗浄し減圧乾燥する事により、収率90%で3-オキシゲルミルプロピオン酸重合体を得た。
得られた本発明化合物は、光散乱法により分子量を測定し、粉末Ｘ線解析法により格子定数を測定した。結果は表１及び表２に示す通りであった。
【００１９】
組成物製造例
ヒドロキシプロピルセルロース１重量に対して、本発明物質２重量をエタノールを浸潤剤として練合し、50℃以下の温度で乾燥後粉末または粒状の組成物を得た。
【００２０】
［カプセル剤］
以下の処方で常法によりカプセル剤を調製した。
３−オキシゲルミルプロピオン酸重合体          １０．０
乳糖                                        １６５．５
ヒドロキシプロピルセルロース                    ２．７
ステアリン酸マグネシウム                        １．８
合計重量                                    １８０．０ｍｇ
【００２１】
［錠剤］
以下の処方により圧縮錠剤を調製した。
３−オキシゲルミルプロピオン酸重合体          １０．０
乳糖                                        １５９．２
CMC-Na                                        ８．０
軽質無水ケイ酸                                  ２．０
ステアリン酸マグネシウム                        １．８
合計重量                                    １８０．０ｍｇ
【００２２】
薬理試験例
以下に本発明物質である3-オキシゲルミルプロピオン酸の薬理試験例を示す。尚、本発明物質である3-オキシゲルミルプロピオン酸は、「ＳＫー８１８」と示す。
試験例１
THP-1細胞のＭＣＰ−１に対する遊走に於けるＳＫー８１８の阻害能の測定
（１）実験方法
48穴マイクロケモタキシスチャンバー（NeuroProve:登録商標）と、5μmポアサイズのポリカーボネートフィルター（PVP-coat  NeuroProve:登録商標）（以下、試験例１中の記載において、「フィルター」という。）を用いた。ヒト単球由来細胞株THP-1細胞を10%FBS添加RPMI1640培地で6×106cells/mlに調製し、ＳＫー８１８を最終濃度0.1μg/ml〜3μg/mlとなるように添加し、細胞を3×106cells/mlとして45分間インキュベートした。
また、ヒト・リコンビナントＭＣＰ−１(Peprotech社製)を培地により最終濃度5nMに希釈し、これをケモタキシスチャンバーの下室に26μl添加した後、フィルターを置き、上室をセットした。
上室にインキュベーション終了後のTHP-1細胞3×106cells/mlを50μl入れ、37℃、5%CO2下に２時間インキュベートした。その後、フィルターを取り出し、Diff  Quick染色液（国際試薬製）にてフィルター下面に遊走したTHP-1細胞を固定染色し、顕微鏡下で遊走細胞数を算定した。データは、4穴の平均値により示した。
（２）結果及び考察
下記の表３に結果を示した。ＳＫー８１８は、0.1μg/ml〜1μg/mlで用量依存的にヒト単球由来細胞株THP-1細胞のケモタキシスを抑制した。
【００２３】
【表３】
0004381495.tif 000005
【００２４】
試験例２
好中球のIL-8に対する遊走に於けるＳＫー８１８の阻害能の測定
（１）実験方法
48穴マイクロケモタキシスチャンバー（NeuroProve:登録商標)と、3μmポアサイズのポリカーボネートフィルター（PVP-free  NeuroProve:登録商標）（以下、試験例２中の記載において、「フィルター」という。）を用いた。ヒト末梢血より好中球を分離し、0.5%BSA添加RPMI1640培地（15mM HEPES,pH7.4）に4× 106cells/mlとなるように調製し、ここにＳＫー８１８を最終濃度0.1μg/ml〜3μg/mlとなるように添加して、好中球数を2×106cells/mlとして45分間インキュベートした。
また、ヒト・リコンビナントIL-8（Genzyme社製）を培地で最終濃度5nMに希釈して、ケモタキシスチャンバーの下室に26μlを添加し、フィルターを置き、上室をセットした。上室にインキュベーション終了後の好中球2×106cells/mlを50μlを入れ、37℃、5%CO2下に1時間インキュベートした。
フィルターを取り出し、Diff  Quick染色液（国際試薬製）にてフィルター下面に遊走した細胞を固定染色し、顕微鏡下で遊走細胞数を算定した。データは、4穴の平均値により示した。
（２）結果及び考察
下記の表４に結果を示した。ＳＫー８１８は、好中球のケモタキシスをほとんど抑制しなかった。
【００２５】
【表４】
0004381495.tif 000006
【００２６】
試験例３
チオグリコレート刺激マウスの腹腔マクロファージ浸潤に対するＳＫー８１８の効果
（１）実験方法
ICR系雄性マウスの腹腔に3%チオグリコレート培地1mlを注射し、2及び3日後にＳＫー８１８（1mg/kg及び3mg/kg）を経口投与した。4日後に腹腔をPBSにより洗浄することで浸潤細胞を採取し、コールターカウンターにより計数した。
（２）結果及び考察
下記の表５に結果を示した。チオグリコレート培地注射4日後に、腹腔浸潤細胞は正常マウスに比較して20倍以上になった。ＳＫー８１８は1mg/kg及び3mg/kgでマクロファージの腹腔浸潤を有意に抑制した。
なお、データとしては示さないが、本実験モデルでは、チオグリコレート刺激後、1乃至2日後には好中球が腹腔内に浸潤する。このモデルに対し、チオグリコレート刺激日当日及び1日後にＳＫー８１８を投与しても、2日後の好中球浸潤には影響しなかった。
【００２７】
【表５】
0004381495.tif 000007
【００２８】
試験例４
セルレイン投与マウス急性膵炎に対するＳＫー８１８の効果
セルレイン投与マウスでは病態の進展に単球浸潤が関与し、セルレイン投与60分後に膵臓でＭＣＰ−１が発現し、病態進行につれて増加することが知られている。
（１）実験方法
６週齢雄性ICR系マウスを使用した。セルレイン（Sigma社）をPBSに溶解し、 50μg/kgで1時間おきに７回腹腔内に投与した。ＳＫー８１８を最終セルレイン投与直後に1mg/kg及び10mg/kgで経口投与した。初回セルレイン投与12時間後に採血し、血清アミラーゼ活性をアミラーゼ測定キット（和光純薬）を用いて測定した。また、膵重量を測定した。
（２）結果及び考察
表６に結果を示した。ＳＫー８１８は、セルレイン投与による膵臓の肥大（重量増加）およびアミラーゼ活性増加を有意に抑制した。
【００２９】
【表６】
0004381495.tif 000008
【００３０】
試験例５
コラーゲン関節炎マウスに対するＳＫー８１８の効果
（１）実験方法
DBA/1J雄性マウスを用いた。0.05M酢酸に溶解希釈したタイプIIコラーゲン（ウシ、コラーゲン技術研究会）をフロイント・コンプリート・アジュバント（Freunt's  complete  adjuvant、Difco社製）とエマルジョンを作成し、200μgをマウス尾基部皮内に注射した。21および35日後にコラーゲン200μg/mouseを腹腔内に投与してブーストを行なった。46日目にLPS（0111:B4,Difco）1.0μgを腹腔内に投与した。ＳＫー８１８は初回コラーゲン感作後から、実験終了時まで60日間、１日１回連日経口投与した。関節炎は四肢の腫脹を４段階にスコアー化し、各肢のスコアーの合計をarthritis  scoreとした。
（２）結果及び考察
結果を表７に示した。LPS投与後に四肢の腫脹は急激に増大し、その後しだいに減少した。ＳＫー８１８は四肢の腫脹を全期間にわたり有意に抑制した。対照薬剤のD-penicillamineは無効であった。
【００３１】
【表７】
0004381495.tif 000009
【００３２】
試験例６
ＳＫー８１８の疼痛抑制効果
（１）実験方法
SD系ラットを使用した。右後肢足蹠（foot  pad）の皮下にフロイント・コンプリート・アジュバント（CALBIOCHEM社製）0.15mlを注射し、4日後に後肢足蹠（hind  paw）の疼痛閾値を圧力測定器（analgesy-meter、Ugo  Busic社製）を用いて測定した。ＳＫー８１８は、疼痛閾値測定の３時間前に投与した。尚、疼痛閾値の測定は、左右の後肢について、３回の平均値を算出し、同一個体の左後肢（非炎症足）の疼痛閾値を100とし、右後肢（炎症足）の疼痛閾値の割合を求めた。
（２）結果及び考察
表８に結果を示した。ＳＫー８１８は炎症足における疼痛閾値（paw  pressure  threshold）を上昇させた。非炎症足においては、ＳＫー８１８による疼痛閾値の変化は認められなかった。
【００３３】
【表８】
0004381495.tif 000010
【００３４】
上記の試験例１〜試験例６に示された結果は、in  vivo 及び in  vitro において、本発明物質が、ＭＣＰ−１により惹起されるCCR2発現炎症性細胞（単球等）のケモタキシスを抑制することや、当該細胞に対し何らかの作用をすることを示している。これは、本発明物質が、当該炎症性細胞の組織浸潤を抑制する等のメカニズムにより、ＭＣＰ−１が関与する炎症性疾患及び臓器障害に効果を発現することを示している。
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、有機ゲルマニウム化合物、好ましくは3ーオキシゲルミルプロピオン酸、ことに8員性構造体が、ＭＣＰ−１受容体拮抗作用、例えば、ＭＣＰ−１により惹起されるCCR2発現炎症性細胞（単球等）のケモタキシスを顕著に抑制することを示す。本化合物は、ＭＣＰ−１が関与する炎症性疾患及び臓器障害、即ち当該炎症性細胞の浸潤等に起因する炎症性疾患、臓器障害に対する有効な予防または治療剤となる。