(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。
【請求項２】
さらに、プロテアーゼインヒビターを含有する請求項１に記載の抽出液。
【請求項３】
カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１または２に記載の抽出液。
【請求項４】
カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。
【請求項５】
カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。
【請求項６】
カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。
【請求項７】
プロテアーゼインヒビターがフェニルメタンスルホニルフルオリドである、請求項２〜６のいずれかに記載の抽出液。
【請求項８】
カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用液状組成物であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程を少なくとも含む調製法によって得られることを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用液状組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法。
【請求項１０】
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含むことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
【請求項１１】
抽出用液がプロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するものである請求項１０に記載の調製方法。
【請求項１２】
カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除去する処理を施すことを特徴とする請求項１０または１１に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞系のタンパク質合成に使用できる抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。
【０００５】
しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極めて煩雑であるという欠点がある。
小麦胚芽の抽出液の調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素とシクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を行い、小麦胚芽を純化する。
このように小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合がある。
【０００６】
また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク質の保護や安定化因子として機能しているものと考えられる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であり、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような無細胞系のタンパク質合成が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２３６８９６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する抽出液が、調製が容易であるとともに、それを用いた無細胞系のタンパク質合成において大量のタンパク質合成が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。
（２）さらに、プロテアーゼインヒビターを含有する上記（１）に記載の抽出液。
（３）カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである、上記（１）または（２）に記載の抽出液。
（４）カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（５）カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（６）カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（７）プロテアーゼインヒビターがフェニルメタンスルホニルフルオリドである、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の抽出液。
（８）カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用液状組成物であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程を少なくとも含む調製法によって得られることを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用液状組成物。
（９）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法。
（１０）カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含むことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
（１１）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するものである上記（１０）に記載の調製方法。
（１２）カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除去する処理を施すことを特徴とする上記（１０）または（１１）に記載の調製方法。
【００１０】
なお本明細書において「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。
カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００１１】
本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
【００１２】
本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
【００１３】
本明細書における「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指すものとする。
【００１４】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出液における「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織由来であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）由来に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）由来であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）由来であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織由来であってもよい。
なお上記「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）からの抽出物である必要はない。
【００１６】
本発明の抽出液中におけるカイコ組織由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００１７】
なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００１８】
上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれかであることが望ましい。抽出液中にカイコ幼虫由来の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物が含有されているか否かは、たとえばアルドラーゼについてのアイソザイム解析を行うことによって判別することができる（Nagaokaら(1995)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825）。
【００１９】
カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を少なくとも含有すると、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるというような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。
【００２０】
カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出物は、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なお５齢期の脂肪体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパク質であるＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２１】
カイコの胚由来の抽出物は、胚が１つの個体であるために、他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なおカイコの胚については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｌ）などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２２】
抽出物がカイコ幼虫の後部絹糸腺または脂肪体由来である場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明に使用できるが、当該後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来であるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫においては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質合成が可能である、というような利点を有する。
中でも特に、絹糸の主成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、本発明の抽出液は、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢期の３日目〜７日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽出物を必須成分として含有していることが好ましい。
【００２３】
また本発明の抽出液においては、外来ｍＲＮＡが、上記のカイコ組織由来の抽出物とともに必須成分として含有される。ここで、「外来ｍＲＮＡ」は、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡを指し、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、抽出液において、含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるかカイコ組織に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００２４】
なお本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００２５】
当該抽出液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１５μｇ／ｍＬ〜１７００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬを越えると、これを用いたタンパク質合成の際にタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００２６】
このようなカイコ組織由来の抽出物と外来ｍＲＮＡとを含有する抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるカイコ由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。
さらに、このような抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
【００２７】
また本発明の抽出液は、上記のカイコ組織由来の抽出物および外来ｍＲＮＡに加えて、プロテアーゼインヒビターをさらに含有することが好ましい。プロテアーゼインヒビターをさらに含有することによって、調製が容易であり、タンパク質（糖タンパク質も含む）の合成を効率的に行うことができ、無細胞系タンパク質用として非常に有用な抽出液を提供することができる。これは、プロテアーゼインヒビターによりカイコ組織由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパク質の不所望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるためであると考えられる。
【００２８】
このようなプロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、カイコ組織由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でも、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。
また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類のプロテアーゼインヒビターの混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２９】
当該抽出液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３０】
また本発明の抽出液は、上記の抽出物、外来ｍＲＮＡおよびプロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。これにより、本発明の作用に必須な成分を安定に保つことができる、というような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の抽出液を実現できる。
【００３１】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００３２】
当該抽出液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３３】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００３４】
当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３５】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３６】
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
【００３７】
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３８】
すなわち、本発明の抽出液は、後部絹糸腺、脂肪体および胚のうちの少なくともいずれかの抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００３９】
本発明はまた、無細胞系タンパク質合成用抽出液の新規な調製方法を提供する。
本発明の抽出液の調製方法は、カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とするものである。本発明の抽出液の調製方法においては、カイコ組織からの抽出を行う処理を少なくとも含有し、好ましくは、カイコ組織からの抽出後、精製を行う。具体的には、次のような手順にて行う。
【００４０】
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有する抽出用液を使用する。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００４１】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。抽出液の調製方法としては、該遠心分離を１回行った後の上清（以下、「上清１」と呼ぶ。）をそのまま用い、これに外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする方法（以下、「調製方法１」と呼ぶ。）や、該上清に上記の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（以下、「上清２」と呼ぶ。）に外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする方法（以下、「調製方法２」と呼ぶ。）が挙げられるが、本発明の抽出液の調製方法としては、上記遠心分離で得られた上清をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得られた液状物に外来ｍＲＮＡを添加する（以下、「調製方法３」と呼ぶ。）。図１は、上記調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。
【００４２】
本発明の抽出液の調製方法３は、具体的には以下の手順にて行う。まず、遠心分離後の上清についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液にグリセロールを添加したものであることが好ましい。これにより、タンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点がある。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。
【００４３】
ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
【００４４】
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにして得られる画分に外来ｍＲＮＡを添加して、本発明の抽出液を得る。なお本発明の抽出液は、上記２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の複数の画分を混合したものに外来ｍＲＮＡを添加したものであっても当然よい。
【００４５】
また、本発明の抽出液は、タンパク質合成能のより高い抽出液を得る観点からは、液状フィブロインを除去する工程を含有する以下の調製方法（以下、「調製方法４」と呼ぶ。）によって、調製されるのが好ましい。抽出液に液状フィブロインが混入していると、この液状フィブロイン自体によって該抽出液を用いた後述するタンパク質合成反応が阻害される虞があり、また、カイコ組織中のタンパク質合成反応に必須な成分（たとえば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、各種翻訳因子など）が液状フィブロイン中に取り込まれてしまい、それら成分を抽出することが困難となり、結果として抽出液中に含有される必須成分量が減少するため、タンパク質合成量が低下する虞があるためである。また液状フィブロインの混入により、抽出液自体の粘性が高くなってしまい、タンパク質合成反応が進行しづらく、操作性も悪くなる虞もある。
【００４６】
図２は、上記調製方法４を簡略化して示すフローチャートである。具体的には、まず、ｐＨ４〜１０の抽出用液を用いて上記の抽出を行った後、上述したようにして１回の遠心分離を行って得られた上清（上記上清１）、再度の遠心分離を行って得られた上清（上記上清２）、または該再度の遠心分離によって得られた下層をインキュベーションした後、凍結させる。解凍後、遠心分離して得られた上清（以下、「上清３」と呼ぶ。）をゲル濾過して得られた濾液（２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分）に、外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする。
かかる調製方法４では、まず、ｐＨ４〜１０の抽出用液を用いることで、カイコ組織からの抽出の際に液状フィブロインを固化させ、その結果、液状フィブロインが除去された抽出液を調製する。さらに、上記上清１、上清２または下層を、インキュベーションした後凍結させる処理を行うことで、液状フィブロインの固化をより進行させて、液状フィブロインを効果的に除去することが可能であり、かつ、液状フィブロインに取り込まれていたタンパク質合成反応に必須な成分を効率的に抽出することが可能である。
【００４７】
上記調製方法４にて抽出液を調製する場合、抽出用液としては、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７のものを用いる。ｐＨ４未満の抽出用液を用いると、後述するタンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう虞があるためである。また、ｐＨが１０を越える抽出用液を用いると、上記と同様にタンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう虞があり、また液状フィブロインの固化が生じない虞もあるためである。
【００４８】
上清１、上清２または上記下層のインキュベーションの条件に特に制限はなく、従来より当業者が通常行っている条件によって行えばよいが、インキュベーションの温度は、４０℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。該温度が４０℃を越えると、上記タンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にあるためである。また、インキュベーション時間は、２４時間以下であるのが好ましく、６時間以下であるのがより好ましい。インキュベーションの時間が２４時間を越えると、反応に必須な成分が変性してしまう虞があるためである。
【００４９】
上記インキュベーション後の凍結も、従来より当業者が通常行っている条件によって行えばよく特に制限されるものではないが、−１０℃以下で凍結するのが好ましく、−２０℃以下で凍結するのがより好ましい。−１０℃よりも高い温度で凍結すると、上記タンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にあるためである。また、凍結時間は、７２時間以下であるのが好ましく、４８時間以下であるのがより好ましい。７２時間を越えて凍結しても、液状フィブロインの固化は既に完了しており、更なる固化は期待できないためである。
【００５０】
解凍後の遠心分離の条件としては、たとえば、上記と同様の１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行えばよい。該遠心分離で得られた上清（上清３）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得られた液状物に外来ｍＲＮＡを添加すればよい。上記ゲル濾過および画分の分取処理を行う場合には、上述したのと同様に行えばよい。
【００５１】
所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日目で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日目では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００５２】
なお本発明の無細胞系タンパク質合成用抽出液は、上記の調製方法で得られると、上述したような利点を有する上で好ましいが、必ずしも上記調製方法で得られたものでなくともよい。
【００５３】
また本発明は、カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用の液状組成物も提供する。この液状組成物に含有されるカイコ組織由来の抽出物およびプロテアーゼインヒビターは、本発明の抽出液について上述したのと同様である。また、本発明の液状組成物も、外来ｍＲＮＡを含有しない以外は上述したのと同様の含有量にて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤をさらに含有するのが好ましい。かかる液状組成物を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行う場合には、反応液に外来ｍＲＮＡをさらに添加する以外は、後述の抽出液からの反応液の調製と同様にして行えばよい。
【００５４】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。当該タンパク質合成に使用する反応液としては、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
【００５５】
なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
また、反応液の全体において、外来ｍＲＮＡは、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。
【００５７】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５８】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５９】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６０】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６２】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６４】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６５】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６６】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６７】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６８】
また上記反応液は、グリセロールを含有するのがより好ましい。グリセロールを添加すると、タンパク質合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６９】
さらに、上記反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７０】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００７１】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明の抽出液を含有する反応液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。
【００７２】
また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００７３】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００７４】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【００７５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期に達したカイコ幼虫を１日目から７日目まで１日ごとにサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って各日の後部絹糸腺について抽出を行った。
サンプリングしたカイコ幼虫の数と摘出した後部絹糸腺の量を表１に示す。
【００７６】
【表１】
0004244625.tif 000002
【００７７】
抽出は、まず、５齢期のカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を、それぞれ液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ        ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ      酢酸カリウム
・２ｍＭ          酢酸マグネシウム
・２ｍＭ          ＤＴＴ
・０．５ｍＭ      ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、これに４０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
得られた抽出液について、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。得られた各抽出液のタンパク質濃度は、次のとおりであった。
【００７８】
【表２】
0004244625.tif 000003
【００７９】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００８０】
実施例２
：カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出液の調製
１日目から７日目まで１日ごとにサンプリングしてなる５齢期に達したカイコ幼虫より、脂肪体を摘出して、各日の脂肪体を含有する抽出液をそれぞれ調製した以外は、実施例１と同様に行った。
サンプリングしたカイコ幼虫の数と摘出した脂肪体の量を表３に、得られた各抽出液のタンパク質濃度を表４に示す。
【００８１】
【表３】
0004244625.tif 000004
【００８２】
【表４】
0004244625.tif 000005
【００８３】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００８４】
実験例１
：実施例１，２の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例１、２で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：２０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１ｍＭ            酢酸マグネシウム
・３ｍＭ            ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  ＤｅｓｉｇｎｓＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００８５】
図３は、実施例１の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図３において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
また図４は、実施例２の抽出液（カイコ幼虫の脂肪体を含有）を用いた各反応液についての反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図４において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【００８６】
また図５は、実施例１の抽出液を用いた各反応液（１日目〜７日目の各日のサンプル）についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図５において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図５に示すように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いて調製した無細胞系タンパク質合成用の反応液は、６時間後まで反応が継続し、３９７．４ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていることがわかった。さらに、この反応液を用いた反応では、２３時間後には６５７．４ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００８７】
実験例２
実施例１の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成反応における各成分添加量の影響を調べたところ、最適な反応液組成は、以下のとおりであった。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液（カイコ幼虫５齢期４日目の後部絹糸腺を含有）（反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・７５ｍＭ          酢酸カリウム
・１．５ｍＭ        酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ        ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．５ｍＭ        ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
上記最適化した組成の反応液を用い、反応温度を２５℃とした以外は上記実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
図６は、上記最適化した組成の反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図６において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。図６に示すように、組成を最適化した反応液では、４時間まで反応が継続し、４．６μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていることがわかった。
【００８８】
実施例３
：カイコの胚由来の抽出液の調製
産下後２５℃に保温した０日目、２日目、５日目および７日目のカイコの卵をそれぞれ２ｇ採取し、実施例１と同様の方法で抽出液を調製した。得られた各抽出液のタンパク質濃度は、次のとおりであった。
【００８９】
【表５】
0004244625.tif 000006
【００９０】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約１．５時間であった。
【００９１】
実験例３
：実施例３の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例３で得られた各抽出液を用いた以外は、上記の実験例１と同様の組成で反応液を作成し、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）合成を行った。
その結果、２日目の胚由来の抽出液を用いた場合、１６ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００９２】
実施例４
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期の５日目に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の５日目に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行い、下層を単離した。この下層を室温（２５℃）、６時間インキュベーションを行った後、−８０℃、一昼夜凍結させた。
凍結させた下層を室温にて解凍後、２２０００×ｇ、６０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。得られた上清に、３２０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。この抽出液について分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いた２８０ｎｍにおける吸光度は６２．４であった。
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、２４時間であった。
【００９３】
実験例４
：実施例４の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例４で得られた抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
〔反応液組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：１６０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ            ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ          酢酸カリウム
・１．５ｍＭ          酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ          ＤＴＴ
・１０％（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ          ＡＴＰ
・０．５ｍＭ          ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ        ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ            クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍｌ    クレアチンキナーゼ
・４０μＭ            アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ          ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍｌ    ｔＲＮＡ
図７は、実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図７において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図７に示すように、５齢期５日目カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いて調製した無細胞系タンパク質合成用の反応液は、７時間後まで反応が継続し、２８μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００９４】
実施例５
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期の４日目に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の４日目に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。
脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、これに８０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００９５】
実験例５
：実施例５の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例５で得られた抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
〔反応液組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ            ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ          酢酸カリウム
・１．５ｍＭ          酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ          ＤＴＴ
・１０％（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ          ＡＴＰ
・０．５ｍＭ          ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ        ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ            クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍｌ    クレアチンキナーゼ
・４０μＭ            アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ          ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍｌ    ｔＲＮＡ
結果、抽出液にＰＭＳＦを未添加の場合のタンパク質（ルシフェラーゼ）合成量は、ＰＭＳＦを添加した場合の５０．２％にまで減少していた。
【００９６】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、真核生物由来であるため、糖タンパク質の合成も可能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抽出液の調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。
【図２】抽出液の調製方法４を簡略化して示すフローチャートである。
【図３】実施例１の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【図４】実施例２の抽出液（カイコ幼虫の脂肪体を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【図５】実施例１の抽出液を用いた各反応液（１日目〜７日目の各日のサンプル）についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図６】最適化した組成の反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図７】実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図１】
0004244625.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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