(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）由来のＤ−アミダーゼ、又は
(b)配列番号２に対して９０％を上回る同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミダーゼの活性を有する、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）由来のＤ−アミダーゼ。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)の核酸。
(a)配列番号１の核酸
(b)(a)の一本鎖核酸または相補的な一本鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＤ−アミダーゼをコードする核酸
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むことを特徴とする、プラスミドまたはベクター。
【請求項４】
バリオボラックス・パラドクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）１９−３  ＤＳＭ１４４６８。
【請求項５】
配列番号３または４で示される核酸配列からなる、請求項２に記載の核酸をＰＣＲにより製造するためのプライマー。
【請求項６】
カルボン酸またはキラルエナンチオリッチなアミノ酸を製造するための、請求項１に記載のＤ−アミダーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属の有機体由来のアミダーゼに関し、さらに前記酵素をコードする核酸およびその核酸を含有するビヒクルに関する。
【０００２】
本発明は、特に、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  １９−３  ＤＳＭ１４４６８由来のアミダーゼに関し、さらに、前記酵素をコードする核酸およびその株自体に関する。
【０００３】
【従来の技術】
アミダーゼおよびアミド加水分解酵素はＥ．Ｃ．系で２つのサブクラスに分類され、Ｅ．Ｃ．３．５．１．１．〜３．５．１．７７およびＥ．Ｃ．３．５．２．１〜３．５．２．１４である。最初のサブクラスの代表例は、例えば、アスパラギナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１）、ウレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５）およびここでより詳細に考察されるのは、アシルアミドアミド加水分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．５．１．４）である。
【０００４】
アシルアミドアミドヒドラーゼは微生物に広く分布しており、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｉおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ等の種で生じる。これらは一般的に誘導性の酵素であり、その特性は有機体毎にそれぞれ大きく異なっている（Maestracci, M.; Bui, K.; Thiery, A.; Arnaud, A.; Galzy, P. (1988), The Amidases from a Brevibacterium Strain: Study and Applications, Adv. Biochem, Eng. 36, 69〜115）。
【０００５】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ  ＡＴＣＣ２５７９５由来の酵素（Hermes, H. F. M.; Tandler, R. F.; Sonke, T.; Dijkhuizen, L.; Meifer, E. M. (1994), Purification and Characterization of an L-Amino Amidase from Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, Appl. Environ. Microbiol. 60, 153〜159）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１２６３３由来の酵素（Hermes, H. F. M.; Sonke, T.: Peters, P. J. H.; van Balken, J, A. M.; kamphuis, J.; Dijkhuizen, L.; Meijer, E. M. (1993), Purification and Characterization of an L-Aminopeptidase from Pseudomonas putida ATCC 12633, Appl. Environ. Microbiol. 59, 4330〜4334）は、Ｌ−アミノ酸アミドの加水分解にとって工業的に特に重要である。いずれの酵素もＮ−分枝アミノ酸アミドまたはジペプチドに比較的高い親和性を有し、従って、アミノペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）に分類される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａＡＴＣＣ  １２６３３に由来するＬ−アミノペプチダーゼは、Ｄ,Ｌ−フェニルグリシンアミド混合物を、Ｄ−フェニルグリシンアミドおよびＬ−フェニルグリシンへ立体特異的に分解するために使用される。ＤＳＭによって開発された方法では、Ｄ,Ｌ−アミノ酸アミドから純粋なＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を製造するためにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの全細胞を使用する（Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; Broxterman, Q. B.; Hermes, H. F. M.; Balkan van, J. A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990), New developments in the chemoenzymatic production of amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42, 133〜186）。
【０００６】
Ｄ,Ｌ−α−アミノニトリルからＬ−アミノ酸およびアミノ酸アミドを製造する方法がまた、ＳｃｈｅｒｉｎｇＡＧによって特許されている（Klages, U.; Weber, A. (1988), Verfahren zur Herstellung von L-Aminosaeuren und Aminosaeureamiden, DE 3816063 A1; WO 8910969）。この全細胞を用いた生体内変化では、Ｄ,Ｌ−アミノニトリルがＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ３８７５により最初にＤ,Ｌ−アミノ酸アミドに加水分解される。Ｌ−アミノ酸への完全な変換は、原則的に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ.  ＡＴＣＣ  ３１６５２またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ.ＡＴＣＣ  ３１６６２のＬ−アミノ酸アミダーゼおよびアミノ酸アミドラセマーゼにより達成できる。
【０００７】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａおよびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.中でアミノ酸アミドラセマーゼが発見された結果、アミノ酸アミドをラセミ化し、Ｌ−またはＤ−アミダーゼにより加水分解して、相当のアミノ酸を得る方法が、Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｉ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｔａｍｉｃａｒｂｏｎ  Ｂ.Ｖ.、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｅｈｅｒｌａｎｄｓ（Godtfredsen, S. E.; Clausen, K.; Ingvorsen, K.; Hermes, H. F.; Van Balken, J. A.; Meifer, E. M. (1989), EP 0307023, WO 8901525）によって特許され得た。Ｄ−アミダーゼ活性はここに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＮＣＩＢ  ４００４２およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＮＣＩＢ  ４００４１中のものが記載されている。
【０００８】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ中の別のアミノ酸ラセマーゼの発見が、Ｈｅｒｍｅｓと同僚により記載されている（Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.; Peters, P. J. (1990), EP 0383403)。
【０００９】
アミノ酸アミドに関してＤ−特異性を有する別のアミダーゼが、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｂｏｒａｎｓ  ＥＰＯ−２７７１−４（Hayashi, T.; Yamamoto, K.; Matsuo, A.; Otsubo, K.; Muramatsu, S.; Matsuda, A.; Komatsu, K.-I.(1997)、 Characterization and Cloning of an Enantioselective Amidase from Comamonas acidoborans KPO-2771-4, J. ferment. Bioeng. 83, 139〜145）およびＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ、ＳＣＲＣＣ１−３８の２株（Asano, Y.; kato, Y.; Yamada, A.; Kondo, K. (1992) Structural Similarity of D-Aminopeptidase to Carboxypeptidase DD and  β-Lactamases, Biochem. 31, 2316〜2328; Asano, Y.; Nakazawa, A.; Kato, Y.; Kondo,K. (1989), Properties of a Novel D-Stereosoecific Aminopeptidase from Ochrobacttrum anthropi, J. Biol. Chem. 264, 14233〜14239）およびＳＣＲＣ−ＳＶ３（Komeda, H. and Asano, Y. (2000), Gene cloning, mucleotide sequencing, and purification and characterisation of the D-stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3, Eur. J. Biochem. 267, 2028〜2035; Asano, Y.; Mori, T.; Hanamoto, S.; Kato, Y.; Nakazawa, A. (1989), A New D-Stereospecific Amino Acid Amidase From Ochrobactrum anthropi, Biochem Biophys. Res. Commun. 162, 470〜474）に記載される。
【００１０】
にもかかわらず、特にその基質スペクトルが１００％を網羅していないので、Ｄ−アミダーゼはさらに必要とされているが、現在、新規酵素の発見により、以前の僅かに変換性の基質は経済的に有利な条件下で工業規模の製造が可能となっている。
【００１１】
【特許文献１】
DE 3816063 A1; WO 8910969  Klages, U.; Weber, A. (1988), Verfahren zur Herstellung von L-Aminosaeuren und Aminosaeureamiden
【特許文献２】
EP 0307023, WO 8901525  Godtfredsen, S. E.; Clausen, K.; Ingvorsen, K.; Hermes, H. F.; Van Balken, J. A.; Meifer, E. M. (1989)
【特許文献３】
EP 0383403  Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.; Peters, P. J. (1990)
【特許文献４】
EP 0383403, WO 8901525  Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.;Peters, P. J. (1990),
【特許文献５】
WO 8910969  Wilms, L.; Bartsch, K. (1995), EP 0690133; Klages, U.; Weber, A (1989)
【特許文献６】
DE 19920712  Farwick, M.; London, M.; Dohmen. J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.
【特許文献７】
DE19920712  Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.
【非特許文献１】
Maestracci, M.; Bui, K.; Thiery, A.; Arnaud, A.; Galzy, P. (1988), The Amidases from a Brevibacterium Strain: Study and Applications, Adv. Biochem, Eng. 36, 69〜115
【非特許文献２】
Hermes, H. F. M.; Tandler, R. F.; Sonke, T.; Dijkhuizen, L.; Meifer, E. M. (1994), Purification and Characterization of an L-Amino Amidase from Mycobacterium neoaurum ATCC 25795, Appl. Environ. Microbiol. 60, 153〜159
【非特許文献３】
Hermes, H. F. M.; Sonke, T.: Peters, P. J. H.; van Balken, J, A. M.; kamphuis, J.; Dijkhuizen, L.; Meijer, E. M. (1993), Purification and Characterization of an L-Aminopeptidase from Pseudomonas putida ATCC 12633, Appl. Environ. Microbiol. 59, 4330〜4334
【非特許文献４】
Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; Broxterman, Q. B.; Hermes, H. F. M.; Balkan van, J. A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990), New developments in the chemoenzymatic production of amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42, 133〜186
【非特許文献５】
Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; Broxterman, Q. B.; Hermes, H. F. M.; Balkan van, J. A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990), New developments in the chemoenzymatic production of amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42, 133〜186
【非特許文献６】
Hayashi, T.; Yamamoto, K.; Matsuo, A.; Otsubo, K.; Muramatsu, S.; Matsuda, A.; Komatsu, K.-I.(1997)、 Characterization and Cloning of an Enantioselective Amidase from Comamonas acidoborans KPO-2771-4, J. ferment. Bioeng. 83, 139〜145
【非特許文献７】
Asano, Y.; kato, Y.; Yamada, A.; Kondo, K. (1992) Structural Similarity of D-Aminopeptidase to Carboxypeptidase DD and  β-Lactamases, Biochem. 31, 2316〜2328
【非特許文献８】
Asano, Y.; Nakazawa, A.; Kato, Y.; Kondo,K. (1989), Properties of a Novel D-Stereosoecific Aminopeptidase from Ochrobacttrum anthropi, J. Biol. Chem. 264, 14233〜14239
【非特許文献９】
Komeda, H. and Asano, Y. (2000), Gene cloning, mucleotide sequencing, and purification and characterisation of the D-stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3, Eur. J. Biochem. 267, 2028〜2035
【非特許文献１０】
Asano, Y.; Mori, T.; Hanamoto, S.; Kato, Y.; Nakazawa, A. (1989), A New D-Stereospecific Amino Acid Amidase From Ochrobactrum anthropi, Biochem Biophys. Res. Commun. 162, 470〜474
【非特許文献１１】
Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of clones genes, Methods Enzymol. 185, 61〜89
【非特許文献１２】
Glover, D. M.(1985), DNA cloning: A Practical Approach, vol. I〜III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T.(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179〜204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzamol. 185, 3〜7
【非特許文献１３】
Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
【非特許文献１４】
Wright F. and Bibb M. J.(1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55〜56
【非特許文献１５】
Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J.(1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779〜783
【非特許文献１６】
1984, Oligonucleotid synthesis: a practical approach IRL Press Ltd., Oxford; Innis. M. A.
【非特許文献１７】
Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J. and White, T. J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego
【非特許文献１８】
Eigen, M. and Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967〜978
【非特許文献１９】
Chen, K. and Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073〜1077
【非特許文献２０】
Horwitz, M. and loeb, L. (1986). Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405〜7409
【非特許文献２１】
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【非特許文献２２】
Stemmer, P. C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389〜391およびStemmer, P. C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747〜10751
【非特許文献２３】
Vogel, A. I. (1989), Vogel's textbook of quantitative chemical analysis, John Wiley & Sons, Inc., 5th ed., 679〜698, New York
【非特許文献２４】
Wagner, R., (1969), Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Wasser, VCH-Verlag, vol. 36, 263〜318, Winheim
【非特許文献２５】
Bergmeyer, H.U., and Beutler, H. -O.(1985), Ammonia, in: Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim
【非特許文献２６】
Brueckner,H., Wittner R., and Godel H.(1991), Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with o-phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cycteine. Application to food samples, Anal. Biochem. 144, 204〜206
【非特許文献２７】
Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycollate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46〜54
【非特許文献２８】
Balbas, P. and Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14〜37
【非特許文献２９】
Rodriguez, R. L. and Ddnhardt, D. T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205〜225, Butterworth, Stoneham
【非特許文献３０】
Triglia T.; Peterson, M. G. and Kemp, D. J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186
【非特許文献３１】
Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham
【非特許文献３２】
Bergmeyer, H. U., and Beutler, H-O.(1985), Ammonia. In : Methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim
【非特許文献３３】
Straathof, A. J. J. and Jongejan, J. A. (1997), Th enantiomeric ratio: origin, determination and prediction, Enzyme microb. Technol. 21, 559〜571
【非特許文献３４】
Bergmeyer, H. U., and Beutler, H. -O. (1985), Ammonia.. In: Methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition. vol. 8: 454〜461, Weinheim
【非特許文献３５】
Cole, S. T. et. al. (1988), Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, Nature 393, 537〜544
【非特許文献３６】
Mayaux, J. -F,; Cerbelaud, E.; Soubrier, F.; Yeh, P.; Blanche, F.; Petre, D. (1991), Purification, Cloning, and Primary Structure of a New Enantiomer-Selective Amidase from a Rhodococcus Strain: Structural Evidence for a Conserved Genetic Coupling with Nitrile Hydratase, J. Bacteriol 173, 6694〜6704
【非特許文献３７】
Sharma B. P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierete Biomaterialiern-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836〜852
【非特許文献３８】
Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009〜5010
【非特許文献３９】
Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971〜1974
【非特許文献４０】
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【非特許文献４１】
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【非特許文献４２】
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【非特許文献４３】
Hummel, W.; Kula, M. -R.(1989), A Simple Method for Small Scale Disruption of Bacteria and Yeasts, J. Microbiol. Methods 9, 201〜209
【非特許文献４４】
Bradford, M. M. (1976), A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding, Anal. Biochem. 72, 248〜254
【非特許文献４５】
DSMZ, Catalogue of Strains (1998), Braunschweig
【非特許文献４６】
Hopwood, D. A.; Bibb, M. J.; Chater, K. F.; Kieser, T.; bruton, C. J.; Kieser, H. M.; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H. (1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich
【非特許文献４７】
Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Ehrilich, H. A. (1988), Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science 239; 487〜491
【非特許文献４８】
Bergmeyer, H., U., and Beutler, H. -O. (1985) Ammonia, In: Methods of Enzymatic Analysis. VCH- Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim
【非特許文献４９】
Brueckner, H., Wittner R., and Godel H., (1991) Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with 0-phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine. Application to food samples. Anal. Bioche,. 144(1): 204〜206
【非特許文献５０】
Bergmeyer, H., U. and Beutler, H. -O. (1985), Ammonia. In: methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinhaeim
【非特許文献５１】
Brueckner, H.; Wittner R. and Godel H. (1991), Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids dericatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cycteine. Application to food samples. Anal. Biochem. 144, 204〜206
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は従って、新規Ｄ−アミダーゼを提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
課題は請求項のものにより達成される。請求項１は、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ属由来のＤ−アミダーゼに関する。請求項２は、より好ましいＤ−アミダーゼに関する。請求項３は、これらの酵素をコードする核酸を保護している。順に、請求項４は本発明の核酸を含むビヒクルに関し、請求項５は本発明の核酸とハイブリダイズする核酸に関し、請求項６は好ましいプライマーを保護する。請求項７は、本発明の核酸を出発物質とするＤ−アミダーゼの改良法に関し、請求項８は特に改良されたｒｅｃ−アミダーゼおよびそれをコードする核酸に関する。請求項９および１０は、それぞれ、本発明のＤ−アミダーゼおよび本発明の核酸の特別な使用に関する。請求項１１から１３は、全細胞触媒に関する。請求項１４は、新規有機体であるＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  １９−３  ＤＳＭ  １４４６８を保護する。
【００１４】
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ種由来のＤ−アミダーゼを提供することにより、有利な方法で記載の課題を達成できる可能性がもたらされる。Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ、好ましくは１９−３  ＤＳＭ  １４４６８（配列２）由来のＤ−アミダーゼの使用がここでは特に非常に好ましい。
【００１５】
本発明のＤ−アミダーゼは、広範囲のカルボン酸アミドスペクトルが相当のカルボン酸への加水分解するのを触媒できる。この反応では、例えばアミノ酸アミドのようなラセミ混合物が、ある場合に、厳密にＤ−選択的に変換される。意外にも、本発明によれば、工業的手段に適したターンオーバー頻度で、ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからエナンチオリッチなＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを得ることができる。
【００１６】
本発明の次の態様は、本発明のＤ−アミダーゼをコードする核酸である。
【００１７】
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ株が容易に培養できかつクロマトグラフィー法により酵素が容易に評価できるとはいえ、本発明のＤ−アミダーゼをコードする核酸を示すことにより、組換え技術を介して、エナンチオリッチな化合物を製造するための酵素工業的方法に必要な適量の酵素を確保できる物質に、より好ましい状態で到達する。核酸を用いることにより、急速に成長する宿主有機体から高い収量で酵素を得ることが可能になる。本発明の遺伝子配列は、さらに、改良された変異体を製造するために使用される。
【００１８】
本発明の次の態様は、本発明の核酸を１種以上含有するプラスミドまたはベクターに関する。
【００１９】
可能なプラスミドまたはベクターは、原則的に、この目的のために専門家が使用できる全ての形態である。このようなプラスミドおよびベクターは、例えばＳｔｕｄｉｅｒとその同僚の文献（Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of clones genes, Methods Enzymol. 185, 61〜89)またはＮｏｖａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＧｉｂｃｏＢＲＬのパンフレットで得ることができる。さらに好ましいプラスミドおよびベクターは、Glover, D. M.(1985), DNA cloning: A Practical Approach, vol. I〜III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T.(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179〜204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzamol. 185, 3〜7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに見出される。本発明の核酸を含む遺伝子構造体と一緒に非常に有利な方法で宿主有機体にクローン化されたプラスミドは；ｐＵＣ１８（Roche Biochemicals)、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Roche Biochemicals)、ｐＢＴａｃ３（Roche Biochemicals、ｐＫＫ−２３３−３（Stratagene）またはｐＥＴ（Novagen）である。
【００２０】
本発明は同様に、本発明の核酸を有する微生物に関する。
【００２１】
核酸をクローン化した微生物を、十分な量の組換え酵素を増加し獲得するために使用する。この方法は専門家に公知である（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。使用できる微生物は原則的にこの目的のために専門家が使用可能な全ての有機体であり、例えば、酵母、例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ.およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、原核生物、例えばＥ．ＣｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ  または真核生物、例えばほ乳動物細胞および昆虫細胞である。Ｅ．Ｃｏｌｉ株をこの目的に有利に使用する。以下は特に非常に有利な株である：Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０-またはＨＢ１０１。本発明の核酸を含む遺伝子構造体を宿主有機体に有利にクローン化するためのプラスミドは前記の通りである。
【００２２】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下に、本発明の一本鎖核酸またはそれと相補的な一本鎖核酸とハイブリダイズする核酸も包含する。例えば配列５の遺伝子プローブがそれに該当する。
【００２３】
“ストリンジェントな条件下”という表現は、ここで、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載したものと理解される（sambrook, J.; Fritsch, E. F. and maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）および０.１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で５０℃、有利には５５℃、より有利には６２℃、最も有利には６８℃で１時間、より有利には０.２×ＳＳＣおよび０.１％  ＳＤＳで５０℃、有利には５５℃、より有利には６２℃、最も有利には６８℃で１時間洗浄した後に、陽性のハイブリダイゼーションシグナルがまだ観察される場合、本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションが有利に起こったとされる。
【００２４】
本発明の以下の態様は、本発明の遺伝子配列をあらゆる種類のＰＣＲで製造するためのプライマーに関する。これらには、相当のアミノ酸配列または相補ＤＮＡ配列をコードするセンスおよびアンチセンスプライマーが含まれる。好適なプライマーは、原則的に、専門家に公知の方法で得られる。本発明のプライマーは、公知のＤＮＡ配列と比較することにより、または問題の有機体の有利なコドンの考慮下にアミノ酸配列を翻訳することにより、発見される（例えばStreptomyces: Wright F. and Bibb M. J.(1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55〜56）。所謂スーパーファミリーのタンパク質のアミノ酸配列の共通の特徴もプライマーを見出すのに役立つ（Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J.(1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779〜783）。これに関する更なる情報がＧａｉｔ、Ｍ．Ｊ．の文献に見出される（1984, Oligonucleotid synthesis: a practical approach IRL Press Ltd., Oxford; Innis. M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J. and White, T. J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego）。極めて有利なプライマーは以下の通りである：
【００２５】
【外１】
0004307826.tif 000002
【００２６】
更に次の態様では、本発明は、改良されたｒｅｃ−Ｄ−アミダーゼの製法、この方法で得られるｒｅｃ−Ｄ−アミダーゼまたはそれをコードする遺伝子に関し、ここで前記製法は、本発明のＤ−アミダーゼをコードする本発明の核酸から出発し、
ａ）核酸を突然変異させ、
ｂ）ａ）で得られた核酸を好適なベクター中にクローン化し、これを好適な発現系に移入し、
ｃ）改良された活性および／または選択性を示すタンパク質を検出および単離する
の工程から成る。この方法は１回で、または連続して所望の回数で実施してよい。
【００２７】
本発明の酵素を突然変異により改良する方法について、専門家は十分に精通している。可能な突然変異法は、この目的のために専門家が利用できる全ての方法である。特に、飽和突然変異誘発（saturation mutagenesis）、ランダム突然変異誘発、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え法および指定部位突然変異誘発である（Eigen, M. and Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967〜978; Chen, K. and Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073〜1077; Horwitz, M. and loeb, L. (1986). Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405〜7409; Dube, D. and L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703〜5707; Stemmer, P. C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389〜391およびStemmer, P. C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747〜10751）。
【００２８】
得られる新規核酸配列を、以下に記載の方法により宿主有機体にクローン化し（以下の文献参照）、この方法で発現された酵素を好適なスクリーニング法で検出して単離する。検出に適した方法は、原則的に、アンモニアおよびアンモニウムイオンを検出できる全ての反応であり、例えばネスラー試薬（Vogel, A. I. (1989), Vogel's textbook of quantitative chemical analysis, John Wiley & Sons, Inc., 5th ed., 679〜698, New York)、ベルトロー法とも呼称されるインドフェノール反応、（Wagner, R., (1969), Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Wasser, VCH-Verlag, vol. 36, 263〜318, Winheim）、特にグルタメートデヒドロゲナーゼ法による酵素検出（Bergmeyer, H.U., and Beutler, H. -O.(1985), Ammonia, in: Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim）およびアンモニウム−感受性電極による検出である。ＨＰＬＣ法もアミノ酸の検出に利用でき、例えばｏ−フタルジアルデヒドおよびＮ−イソブチリルシステインをベースとする、アミノ酸のエナンチオ選択のための誘導法も利用できる（Brueckner,H., Wittner R., and Godel H.(1991), Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with o-phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cycteine. Application to food samples, Anal. Biochem. 144, 204〜206）。
【００２９】
本発明はまた、突然変異により改良されいてよい本発明のＤ−アミダーゼの、カルボン酸または任意にキラルエナンチオリッチな有機化合物、例えばアミノ酸の製造への使用に関する。
【００３０】
問題のＤ−アミダーゼをコードする本発明の核酸および更に改良された核酸は、全細胞触媒の製造に関して有利に適している。
【００３１】
本発明はまた、ニトリルヒドラターゼのクローン化遺伝子およびアミダーゼ、有利にはＤ−アミダーゼのクローン化遺伝子、および場合によりα−アミノニトリルラセマーゼ、シアノヒドリンラセマーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸ラセマーゼまたは（α−またはβ−）アミノ酸アミドラセマーゼのクローン化遺伝子を含む全細胞触媒を提供する（Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.;Peters, P. J. (1990), EP 0383403;およびWO 8901525; Wilms, L.; Bartsch, K. (1995), EP 0690133; Klages, U.; Weber, A (1989), WO 8910969）。
【００３２】
本発明の全細胞触媒は有利にＶａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミダーゼを含有すべきである。Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ、有利にはＤＳＭ１４４６８由来のＤ−アミダーゼが極めて有利である。このような有機体の製造については、専門家が精通している（Farwick, M.; London, M.; Dohmen. J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE 19920712）。
【００３３】
このような有機体の利点は、両方の酵素系を同時に発現できることであり、すなわち反応に使用しなければならないのが唯１種類のｒｅｃ−有機体であることを意味する。変換率にその酵素発現を合致させるために、相当のコード核酸フラグメントを、異なるコピー数および／または異なる強度で遺伝子を発現させるのに使用される異なる効力を有するプロモーターで、異なるプラスミド上に作用させることができる。このような合致した酵素系では、有利に、効果を阻害する中間化合物の蓄積が起こらず、当の反応を全体として至適な速度で実施できる。しかし、このことは専門家が十分知っている（Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycollate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46〜54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712)。
【００３４】
本発明の核酸は従って、有利にｒｅｃ−Ｄ−アミダーゼの製造に使用できる。専門家が十分に知っている組換え技術により（下記参照）、問題の酵素を工業的な方法で十分な量供給できる有機体に到達する。本発明のｒｅｃ−酵素の製造は、専門家に公知の遺伝子技術法により実施される（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T.(1989), Molecular cloning: a laboratory manual , 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. and Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14〜37; Rodriguez, R. L. and Ddnhardt, D. T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205〜225, Butterworth, Stoneham）。一般的な方法に関して（ＰＣＲ、クローニング、発現等）、以下の文献を参照し、ここに引用する；Universal GenomeWalker ＴＭ Ket User Manual, Clontech, 3/2000およびそこに引用される文献；Triglia T.; Peterson, M. G. and Kemp, D. J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor L-aboratory Press, New York; Rodriguez, R. L. and Denhardt, D. T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham）。
【００３５】
本発明はまた、ブダペスト条約によりＤＳＭＺへ１４４６８の番号で２００１年８月２２日に寄託された微生物Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ１９−３を提供する。
【００３６】
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼはＥ．Ｃ．系によりアシルアミドアミド加水分解酵素に分類される（Ｅ．Ｃ．３．５．１．４）。Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼの完全な遺伝子配列を配列１に示す。Ｄ−アミダーゼの遺伝子部位を、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応によりＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓから得た。プライマー、ＡＡＨ−Ｎ１（配列３）を、決定されたアミノ酸配列のＮ−末端から得ることができた。第二のプライマー、ＡＡＨ−Ｃ１（配列４）を、代表的ないわゆるアミダーゼファミリーのＮ−末端との配列の類似性をベースとして、コンセンサス領域から誘導した。これら２種類のプライマーを使用して、一般的に遺伝子プローブとして使用される、５０９ｂｐの大きさのＤ−アミダーゼフラグメントをＰＣＲ技術により増幅した。そのベースペア配列を配列５に示す。
【００３７】
このフラグメントを用い、全遺伝子を発見するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔ（Univcersal GenomeWalker TM Kit User Manual, Clontech, 3/2000およびそこに引用される文献）の方法に必要な遺伝子−特異的プライマー（配列６〜９）を構築した。
【００３８】
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ−Ｋｉｔの方法により、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のゲノムＤＮＡを最初に各制限酵素、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩおよびＳｔｕＩで切断した。得られたＤＮＡフラグメントを有するバッチを、２種類のプライマーを有するＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒTMＡｄａｐｔｅｒで連結した。
【００３９】
テンプレートとしてのこれらのバッチを用い、列挙した遺伝子特異的プライマーの１つ、ＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ１（配列６）またはＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ１（配列８）およびアダプタープライマーを用いて両方向で、ＰＣＲ反応を実施した。プライマーＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ２（配列７）またはＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ２（配列８）およびアダプタープライマーを有する、いわゆるネストＰＣＲ（Universal GenomeWalker ＴＭ Kit User Manual, Clontech, 3/2000およびそこに引用される文献）は、非特異的ＰＣＲ産物の形成を回避すべきである。Ｄ−アミダーゼの完全な遺伝子配列は、（下流）３５００ｂｐまでおよび（上流）１８００ｂｐまでの得られたＰＣＲフラグメントに近似している。
【００４０】
更なる処理および遺伝子配列の確認のために、開始コドンより９２ｂｐ前および停止コドンより８０ｂｐ後まで有する全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を、ゲノムＤＮＡと以下のプライマー（配列１０および１１）とから出発し、プルーフリーディング機能を有する２種類の異なるＤＮＡポリメラーゼを含有する３種の類似のバッチ中で、増幅した（VentR （Ｒ）, New England Biolabs and Herculase （Ｒ）, Stratagene）。
【００４１】
得られたＰＣＲ産物を、平滑末端ライゲーションによりベクターｐＵＣ１８に導入し、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ１Ｂｌｕｅに形質転換させた。プラスミドＤＮＡから始めることにより、Ｄ−アミダーゼ配列（配列１）を保護し確認できた（Sequiserve, Vaterstetten, Germany）。
【００４２】
Ｄ−アミダーゼの発現のために、ＰＣＲ反応によりＥｃｏＲＩ切断部位を５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を３’末端に導入し（配列１２および１３）、ＰＣＲ産物をｐＢＴＡＣベクターに結合させ、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ  １０１を形質転換した。
【００４３】
最初の発現実験において、粗抽出物中のＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２の８０〜２１０ｍＵ／ｍｇの特異的活性を測定できた。粗抽出物中の２０〜３０ｍＵ／ｍｇのＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓの特異活性と比較することにより、明かな過剰発現を起こすことができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより粗抽出物の可溶性および不溶性フラクションを分析することにより、発現したＤ−アミダーゼの大部分が、細胞ペレット中に不溶性形、いわゆる封入体形で存在することが明かになった。
【００４４】
アミダーゼは、３種のクロマトグラフィー工程で精製され、通常、第２工程後ですでに、外来タンパク質は非常に低い含量でしか存在していない。
【００４５】
１．イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Pharmacia）
２．疎水性相互作用クロマトグラフィー：Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Pharmacia）
３．ゲル濾過：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＧ（Pharmacia）。
【００４６】
８８％の収率が最初の２つの精製工程で算出でき、基質としてのＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２に対する特異活性は０.６８Ｕ／ｍｇであった。Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘｐａｒａｄｏｘｕｓ由来の同様のＤ−アミダーゼでは、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２に対して特異活性は１.４Ｕ／ｍｇであった。
【００４７】
アミダーゼが好適であることを、以下の実験により実証した：
１．酸アミド：
グルタメートデヒドロゲナーゼにより、アンモニウムイオンを測定して活性を測定した（Bergmeyer, H. U., and Beutler, H-O.(1985), Ammonia. In : Methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim）。使用する酵素は、第２のクロマトグラフィー工程後の部分精製Ｄ−アミダーゼであり、特異活性は０.５１Ｕ／ｍｇであった。基質は、コハク酸ジアミドおよびアジピン酸ジアミド各１０ｍＭおよびベンジルアミド２０ｍＭ以外、４０ｍＭで酵素試験に使用した。活性は各ケースで１種の基質濃度でしか測定しなかったので、相対活性を記載した。
【００４８】
【表１】
0004307826.tif 000003
【００４９】
２．アミノ酸アミドおよびα−ヒドロキシカルボン酸アミド
プロリンアミド、およびα−ヒドロキシカルボン酸アミド、乳酸アミド（Ｌａｃ−ＮＨ２）および２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプトブチロールアミド（ＭＨＡ−ＮＨ２）、メチオニン類似α−ヒドロキシカルボン酸アミドには、これまでのＨＰＬＣ分析による生成物の測定は不可能である。これらの基質に対しては、ＮＨ４＋測定により活性を測定した。使用する酵素は、第２クロマトグラフィー工程後の部分的に精製したＤ−アミダーゼであり、特異活性は０.５６Ｕ／ｍｇであった。全ての基質を４０ｍＭで酵素試験に使用した。更に比較するための第４カラムにおいて、少ない方のエナンチオマー活性を１に設定し、有利なエナンチオマーの相対活性をそこから算出した。
【００５０】
【表２】
0004307826.tif 000004
【００５１】
以下の式で表されるラセミＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２の動的切断にＤ−アミダーゼがどれほど適しているかをさらに調査した。
【００５２】
【化１】
0004307826.tif 000005
【００５３】
ラセミＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２の動的切断の適性を評価するために、エナンチオ選択性を変換の関数として測定した。第１クロマトグラフィー工程後の部分的に精製された酵素（イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Pharmacia））では、４５％を上回る変換で、Ｄ−Ｔｌｅへの９６.６％エナンチオ選択性がすでに測定された。ほぼ類似した酵素では、９９.４〜９９.６％のｅｅ値が、４５〜５０％の変換の範囲で測定された。従って、両方の一連した実験において、１００を上回るＥ値（Straathof, A. J. J. and Jongejan, J. A. (1997), Th enantiomeric ratio: origin, determination and prediction, Enzyme microb. Technol. 21, 559〜571）が算出される。このことは、所望されるほぼ完全なＤ−エナンチオマーの変換を伴うラセミ切断の非常に好ましい根拠である。
【００５４】
ＤＬ−バリン−、ＤＬ−ロイシン−およびＤＬ−フェニルアラニンアミドをさらにこの点で試験した。このために、第１クロマトグラフィー工程後の部分的に精製されたＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ１９−３由来の酵素を用いて、エナンチオ選択性を変換の関数として測定した。図１は、変換の関数としてのＤ−Ｖａｌ、Ｄ−ＬｅｕおよびＤ−Ｐｈｅのエナンチオ選択性を示している。
【００５５】
幾つかの測定値に関して、特に５０％の変換領域とそこから算出されるＥ値を実施例を通して、以下の表に列記した。
【００５６】
【表３】
0004307826.tif 000006
【００５７】
４０〜５０％の範囲の変換で、Ｄ−Ｖａｌのエナンチオ選択性は９８.１〜９５.１％であり、Ｄ−Ｌｅｕは９６.７〜９０.８％の範囲およびＤ−Ｐｈｅは５５％の領域という結果であった。ラセミＶａｌ−ＮＨ２およびＬｅｕ−ＮＨ２では、１００を越える平均Ｅ値が算出され、Ｐｈｅ−ＮＨ２ではＥ値５であった。
【００５８】
所望されるほぼ完全なＤ−エナンチオマーの変換に関するラセミ体の切断の点では、従って、ＤＬ−Ｖａｌ−ＮＨ２およびＤＬ−Ｌｅｕ−ＮＨ２にとってＤ−アミダーゼが原則的に特に非常に好適である。
【００５９】
基質スペクトラムの拡張：
ラセミＮ−ホルミル化アミノ酸アミドの切断を、本発明のＤ−アミダーゼにより調査した。
【００６０】
使用した酵素は、第１クロマトグラフィー工程後の部分的に精製されたＤ−アミダーゼである。活性はグルタメートデヒドロゲナーゼによるＮＨ４＋イオンの測量により測定された（Bergmeyer, H. U., and Beutler, H. -O. (1985), Ammonia.. In: Methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition. vol. 8: 454〜461, Weinheim）。以下の基質は酵素試験において１０ｍＭで使用された。
【００６１】
【表４】
0004307826.tif 000007
【００６２】
ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２よりも２.８倍の好ましい範囲で変換された、ラセミＮ−ホルミル−バリンアミドの変換は興味深い。
【００６３】
【表５】
0004307826.tif 000008
【００６４】
Ｄ−アミダーゼの至適温度およびｐＨ：
図２および図３は、温度およびｐＨに関する活性の依存性を示している。Ｄ−アミダーゼの４７〜４８℃の範囲の至適温度が見出された。図３では、ほぼ同一の活性で７.５〜９.５の範囲の広い至適ｐＨが示されている。ｐＨ９の炭酸ナトリウムバッファーの場合に最も高い活性が測定された。
【００６５】
本発明のＤ−アミダーゼの全アミノ酸配列とインターネットを介したＮＣＢＩのタンパク質データバンクに存在するアミダーゼ（プログラムＢＬＡＳＴＰ２.２.１を有するhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast、データベース：nr, pat, SwissProt）の比較により、多くの公知のアミダーゼとの類似性が導かれる。最も良好なケースでは、アミノ酸配列の類似性は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の可能なアミダーゼに対して６６％（３０３／４５７ＡＡ）であり、５０％同一（２２９／４５７ＡＡ）であることが分かった（gi: 6225047; Cole, S. T. et. al. (1988), Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, Nature 393, 537〜544）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種由来の５２％および３７％のエナンチオ選択的アミダーゼは、２番目によく似たタンパク質であり（gi: 152052; Mayaux, J. -F,; Cerbelaud, E.; Soubrier, F.; Yeh, P.; Blanche, F.; Petre, D. (1991), Purification, Cloning, and Primary Structure of a New Enantiomer-Selective Amidase from a Rhodococcus Strain: Structural Evidence for a Conserved Genetic Coupling with Nitrile Hydratase, J. Bacteriol/ 173, 6694〜6704）、これはＮ−末端の比較においてすでにＤ−アミダーゼと高い相同性を有する。
【００６６】
すなわち本発明は、特に、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２を優れたｅｅ値および収量でＤ−Ｔｌｅへ変換することができる新規Ｄ−アミダーゼに関する。これまでアミノ酸の光学対掌体を得ることは困難であるとされてきたので、新規Ｄ−アミダーゼの報告は、生物活性ペプチド類似体に有利に使用できる非天然アミノ酸の工業的製造に向けての重要な一歩を意味するものである。
【００６７】
使用にあたり、問題の酵素は、均質に精製した化合物または組換え法により製造された酵素として、遊離の形で使用できる。酵素はさらに、任意の所望の程度まで精製し、未処理のゲスト有機体の成分として、またはホスト有機体の破壊細胞マスと組み合わせて使用できる。固定形での酵素の使用も可能である（Sharma B. P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierete Biomaterialiern-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836〜852）。固定は有利に凍結乾燥により実施される（Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009〜5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971〜1974; Otamiri M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291〜305）。界面活性物質、例えばＡｅｒｏｓｏｌ  ＯＴまたはポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＢｒｉｊ５２（ジエチレングリコールモノセチルエーテル）（Kamiya, N.; Okazaki, S. -Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375〜378）の存在下での凍結乾燥が、特に非常に有利である。ＣＬＥＣとしての使用も想定できる（St. Clair, N.; Wnag, Y. -F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-inked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380〜383）。
【００６８】
本発明の内容において、光学的にリッチな（エナンチオリッチな、エナンチオマーリッチな）化合物とは、他方との混合物の中で、一方の光学対掌体が＞５０ｍｏｌ％で存在していることを意味すると理解される。
【００６９】
核酸という用語には、一本鎖または二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡのあらゆる種類またはそれらの混合物が包含される。
【００７０】
改良されたｒｅｃ−酵素とは、請求項のものを意味し、特に、変化した基質スペクトルを有し、より活性でありかつ／または選択的でありまたは反応条件下でより安定な酵素であると理解される。
【００７１】
また、本発明において請求されるタンパク質配列および核酸配列は、当該配列の活性または目的様式が維持される限り、当該配列の１つに対して８０％を上回る、有利には９０％、９１％、９２％、９３％または９４％を上回る、より有利には９５％または９６％を上回る、および特に有利には９７％、９８％または９９％を上回る相同性を有する（自然縮重を除く）。ここで使用される用語“相同性”（または同一性）は、式Ｈ（％）＝[１−Ｖ／Ｘ]×１００で示され、ここでＨは相同性を表し、Ｘは比較配列の核酸塩基／アミノ酸の総数を表し、Ｖは問題の配列の比較配列と異なる核酸塩基／アミノ酸の数を表す。あらゆる場合に、アミノ酸配列をコードする核酸という用語には、遺伝暗号の縮重によって可能と思われる全ての配列が含まれる。
【００７２】
本明細書に引用される参考文献も開示により組み込まれたものと見なす。
【００７３】
【配列表】
【００７４】
【外２】
0004307826.tif 000009
【００７５】
【外３】
0004307826.tif 000010
【００７６】
【外４】
0004307826.tif 000011
【００７７】
【外５】
0004307826.tif 000012
【００７８】
【外６】
0004307826.tif 000013
【００７９】
【外７】
0004307826.tif 000014
【００８０】
【実施例】
実施例：
１.  Ｄ−アミダーゼを誘導するための株Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＤＳＭ  １４４６８の培養
Ｄ−アミダーゼを誘導するために、株Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  １９−３  ＤＳＭ  １４４６８を、窒素源としてラセミＴｌｅ−ＮＨ２を用いて、最少培地中で培養した；最少培地の組成は以下の通りである：
【００８１】
【表６】
0004307826.tif 000015
【００８２】
【表７】
0004307826.tif 000016
【００８３】
１.２ｂａｒ下に１２１℃で２０分オートクレーブすることにより、滅菌した。グルコース、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ビタミン溶液およびＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２がこの種の滅菌と敏感に反応するので、これらをオートクレーブ後にのみ、０.２μｍ膜（Sartorius）で濾過滅菌して栄養溶液に添加した。
【００８４】
２.  Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓおよびＥ.Ｃｏｌｉ由来の粗抽出物の獲得
遠心により回収した後、培養物をリン酸カリウムバッファー、１００ｍＭ  ｐＨ７.５で一度洗浄し、２０％の細胞懸濁液に調節した。分析規模での細胞破壊を、Ｒｄｔｓｃｈ社製の振動ミルでの湿破砕（Hummel, W.; Kula, M. -R.(1989), A Simple Method for Small Scale Disruption of Bacteria and Yeasts, J. Microbiol. Methods 9, 201〜209）またはＢｒａｎｓｏｎ社製のＰｕｌｓｅｓ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒを用いた超音波により実施した。
【００８５】
プロテアーゼ活性を低めるために、全ての処理工程を４℃までの冷却下で実施した。粗抽出物のブラッドフォードのタンパク質含量測定（Bradford, M. M. (1976), A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding, Anal. Biochem. 72, 248〜254）により、破壊物の質が評価できる。
【００８６】
振動ミルによる湿破砕：
ガラスビーズ１.２ｇ（直径０.３３ｍｍ）および細胞懸濁液０.６ｍｌを１.５ｍｌのエッペンドルフカップに導入し、振動ミルにより、最大振動速度で１０分破壊した。ガラスビーズおよび細胞破壊屑を、１００００ｒｐｍで４℃で１０分遠心分離することにより、細胞ホモジネートから分離し、上清を酵素試験の粗抽出物として使用した。
【００８７】
超音波破砕：
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ培養液を、最大１０ｍづつ、それぞれ６０秒の中間冷却を実施しながら、７０％パルス、８０％強度で８×６０秒バーストして破壊した。Ｅ.Ｃｏｌｉ培養液を、１ｍｌづつ、それぞれ６０秒の中間冷却を実施しながら、７０％パルス、８０％強度で４×６０秒バーストして破壊した。細胞ホモジネートを遠心分離し、粗抽出物を回収した。
【００８８】
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓからＤ−アミダーゼを精製するための破壊を、２０〜２００ｍｌの体積で、ＩＭＡ社製Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  Ｓ  中で実施した。このために、細胞懸濁液とガラスビーズ（直径０.３ｍｍ）とを、１：１.５の割合で混合し、細胞を３５００ｒｐｍで２０分破壊した。
【００８９】
２.  ＤＳＭＺ完全培地Ｎｏ.１中でのＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＤＳＭ  １４４６８株の培養およびゲノムＤＮＡの製造
このために、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ株をＤＳＭＺ完全培地Ｎｏ.１中で培養し、約１.０の光学密度ＯＤ６６０とした；組成（DSMZ, Catalogue of Strains (1998), Braunschweig）：
【００９０】
【表８】
0004307826.tif 000017
【００９１】
培養物を滅菌条件下に回収し、滅菌リン酸カリウムバッファー２０ｍＭ  ｐＨ６.５で一度洗浄した。
【００９２】
ゲノムＤＮＡをＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Qiagen）で製造した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｄｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（４／９９）のグラム陰性菌に関するプロトコールに従って製造した。
【００９３】
【表９】
0004307826.tif 000018
【００９４】
記号Ｓは、ＡＡＨ−Ｎ１およびＡＡＨ−Ｃ１（重複の同一性に関するＩＵＢグループコード）の配列中のＧ＋Ｃを表す。
【００９５】
４.  遺伝子操作法
ここで使用される全ての遺伝子操作法は、特に記載のない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）Ｈｏｐｗｏｏｄ等の記載（Hopwood, D. A.; Bibb, M. J.; Chater, K. F.; Kieser, T.; bruton, C. J.; Kieser, H. M.; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H. (1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich）に従うものとする。全ての酵素および相当のバッファーを製造者の指示に従って使用した。シークエンスは、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ、Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎにより実施した。
【００９６】
５.  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を、Ｓａｉｋｉ等の方法によりＢｉｏｍｅｔｒａ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Goettingen）で実施した（Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Ehrilich, H. A. (1988), Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science 239; 487〜491）。
【００９７】
製造者の提供する熱安定ポリメラーゼＶｅｎｔＲ（Ｒ）（New England Biolabs）およびＨｅｒｃｕｌａｓｅＴＭ（Stratagene）ならびにバッファーを使用した。使用したプライマーペアを表１０に列挙する。
【００９８】
ＰＣＲにより、ＧｅｎｏｍｅＷｌａｋｅｒ法（Stratagene）によるゲノムＤＮＡから、最初に５０９ｂｐの大きさを有するＤ−アミダーゼ遺伝子のフラグメントを増幅し、Ｄ−アミダーゼの全遺伝子配列が存在した後に、全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を増幅した。ベクターｐＵＣ１８中でのＤ−アミダーゼ遺伝子配列の保護および確認後、プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用した。
【００９９】
【表１０】
0004307826.tif 000019
【０１００】
ＰＣＲバッチを、軽油約５０μｌの層で覆った。ＰＣＲプログラムのために、アニーリング温度ＴＡを、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ溶融温度（Ｔｍ）により決定した。ＤＮＡポリメラーゼの連鎖反応時間Ｘは、原則として１ｋｂ＝１分であった。
【０１０１】
【表１１】
0004307826.tif 000020
【０１０２】
工程２〜４を１０回実施し、工程３のアリーリング温度は１サイクル毎に−１℃低下させた。工程５〜７を２０回実施した。
【０１０３】
【表１２】
0004307826.tif 000021
【０１０４】
工程２〜３を１０回実施し、次いで工程４〜５を２０回実施した。
【０１０５】
【表１３】
0004307826.tif 000022
【０１０６】
工程２〜４を１２回実施し、工程３のアニーリング温度を１サイクル毎に−１℃低下させた。工程５〜７を２０回実施した。
【０１０７】
ＰＣＲ産物の精製および単離を、ＰＣＲ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen）または全ＰＣＲバッチのアガロースゲル電気泳動により直接実施し、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｒａｋｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen）によりＤＮＡフラグメントを単離した。
【０１０８】
６.  全Ｄ−アミダーゼ遺伝子を見出すためのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ法（Clontech）
すでに公知の５０９ｂｐの大きさを有するＤ−アミダーゼフラグメント（配列５）の助成により、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔは、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のゲノムＤＮＡから出発して、全Ｄ−アミダーゼのＰＣＲ−仲介クローニングを可能にした。
【０１０９】
いわゆる“ＧｅｎｏｍｅＷｌａｋｅｒライブラリー”のために、ゲノムＤＮＡを４種の異なる制限酵素で加水分解した（ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｓｃａ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩおよびＳｔｕ  Ｉ）。ＤＮＡ制限バッチの精製後に、含有のＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプターを用いてそれぞれ平滑末端結合させるが、このために２つのアダプタープライマー（ＡＰ１およびＡＰ２）が存在する。ゲノムＤＮＡ制限およびアダプターの結合を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（３／２０００、Clontech）に従って実施した。
【０１１０】
ライブラリーは、最初のＰＣＲ反応（プライマリーＰＣＲ）のためのテンプレートとして機能した。両方向のＰＣＲ反応のそれぞれに、プライマーペアＡＰ１／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ１（下流）およびＡＰ１／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ１（上流）を使用した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｒ）（Stratagene）ＤＮＡポリメラーゼとして使用して、大きなＤＮＡフラグメント（“長鎖ＰＣＲ”）の増幅を可能にした。
【０１１１】
【０１１２】
【表１４】
0004307826.tif 000023
【０１１３】
ＰＣＲバッチを、軽油約５０μｌの層で覆った。
【０１１４】
【表１５】
0004307826.tif 000024
【０１１５】
工程２〜３を１０回繰り返した。工程４〜５を２５回繰り返し、工程５の時間を、１サイクル毎に１０秒間延長した（時間の延長）。
【０１１６】
第２ＰＣＲ（セカンダリーまたはネストＰＣＲ）を、得られたＰＣＲ産物により、プライマーペアＡＰ２／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｆ２（下流）およびＡＰ２／ＡＡＨ−ＧＷ−Ｒ２（上流）を用いて実施し、これにより、非特異的ＰＣＲ産物の形成が最小化できた。ＰＣＲ増幅産物を濃度に応じて、脱塩水（aq. demin.）により１：５０以上に希釈し、この形でテンプレートとして使用した。
【０１１７】
【表１６】
0004307826.tif 000025
【０１１８】
ＰＣＲバッチを軽油約５０μｌの層で覆った。
【０１１９】
【表１７】
0004307826.tif 000026
【０１２０】
工程２〜３を１０回実施し、次いで工程４〜５を２０回実施した。
【０１２１】
第２のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル中で分離し、主要な増幅産物を精製し、記載のようにして配列決定した。要約すると、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒライブラリーから出発して、第２のＰＣＲ後に以下のようなＰＣＲ増幅産物が得られた。
【０１２２】
【表１８】
0004307826.tif 000027
【０１２３】
６.  ＰＣＲ産物のベクターｐＵＣ１８への結合およびその後のＥ.ＣｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅへのクローニング
更なる処理のために、開始コドンの前に９２ｂｐを有しかつ停止コドンの後に８０ｂｐを有する３種の類似バッチ由来のＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８（Rochie Biochemicals）へ結合し、Ｅ.ＣｏｌｉＸｌ１Ｂｌｕｅを形質転換した。これらの技術はＳａｍｂｒｏｏｋ等（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）およびＨｏｐｗｏｏｄ等（Hopwood, D. A.; Bibb, M. J.; Chater, K. F.; Kieser, T.; Bruton, C. J.; Kieser, H. M; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H.(1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich）が詳細しており、従って専門家が精通している。
【０１２４】
プラスミドのＤ−アミダーゼ遺伝子配列（配列１）をシークエンスにより確認したところ、３種のバッチで同一であった。プラスミドをｐＵＣ−ＡＡＨと呼称した（図４）。ｐＵＣ−ＡＡＨのプラスミドマップを図４に示す。ｐＵＣ１８中の、ａａｈ遺伝子を含み１.６ｋｂの大きさで、開始コドンの前に９２ｂｐおよび停止コドンの後に８０ｂｐを有するＰＣＲ産物を示す（プライマーペア：ＡＡＨ−Ｋ−Ｎ２／ＡＡＨ−Ｋ−Ｃ２）。
【０１２５】
７.  Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼ酵素のＥ.ＣｏｌｉＪＭ１０１中での異種発現
すでに項目５で述べたように、ＰＣＲ反応によりＤ−アミダーゼの発現のためにプラスミドｐＵＣ−ＡＡＨから出発し、ＥｃｏＲＩ切断部位を５’末端に導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を３’末端に導入し、ＰＣＲ産物をｐＢＴＡＣベクターに結合させ、発現株Ｅ.ＣｏｌｉＪＭ１０１に形質転換させた。
【０１２６】
標準的な異種発現をＳａｍｂｒｏｏｋ等の方法により実施した（Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
【０１２７】
形質転換したＥ.ＣｏｌｉＪＭ１０１誘導体をＬＢ培地（０.１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で一晩インキュベートした。培地３０ｍｌ（バッフルフラスコ中のアンピシリン０.１ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地）を、一晩培養した培養物（１：１００）０.３ｍｌと一緒にインキュベートした。アミダーゼの発現を１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液（培養物１ｍＭ中の濃度；ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオガラクトシド）０.３μｌを用いて、細胞密度ＯＤ６００ｎｍ＝０.４〜０.６で誘導した。３０℃で４〜６時間インキュベートした後、細胞を回収した。
【０１２８】
前記の方法で培養した発現クローンの粗抽出物では、基質としてＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２を用いて測定して、総タンパク質に対するＤ−アミダーゼの活性が８０〜２１０ｍＵ／ｍｇであった。
【０１２９】
８.  Ｄ−アミダーゼ活性の実証
Ｄ−アミダーゼによるｔｅｒｔ−ロイシンアミド（gen. acid amides）の変換において、アンモニアまたはアンモニウムイオンおよびｔｅｒｔ−ロイシン（gen. acid）が等量で形成される。ＨＰＬＣによるアンモニウムイオンおよびｔｅｒｔ−ロイシン形成の増加の測定は、従って、アミダーゼ活性を実証するのに利用できた。含有される成分の濃度変化は、酵素試験で測定でき、この試験では、試験バッチを３０℃で１０〜６０分インキュベーションする。
【０１３０】
【表１９】
0004307826.tif 000028
【０１３１】
酵素試験は、基質を添加することにより開始され、反応は、９５℃で３分加熱することにより停止した。反応生成物の分析は、アンモニウムイオンに関してグルタメートデヒドロゲナーゼにより（Bergmeyer, H., U., and Beutler, H. -O. (1985) Ammonia, In: Methods of Enzymatic Analysis. VCH- Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinheim）ならびにＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンおよびＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに関してＨＰＬＣにより（Brueckner, H., Wittner R., and Godel H., (1991) Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids derivatized with 0-phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine. Application to food samples. Anal. Bioche,. 144(1): 204〜206）実施された。基質を添加していないバッチをコントロールとした。
【０１３２】
９.  グルタメートデヒドロゲナーゼによるアンモニウムイオンの酵素測定
酵素グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ；Ｅ.Ｃ.１.４.１.３）は、２−オキソグルタレートをＬ−グルタメートに変換し、この際アンモニウムイオンを消費し、ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ＋を生じる（Bergmeyer, H., U. and Beutler, H. -O. (1985), Ammonia. In: methods of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd edition, vol. 8: 454〜461, Weinhaeim）。
【０１３３】
反応中に消費されるＮＡＤＨの量はアンモニウムイオンの量に等しい。ＮＡＤＨ濃度の変化が測定パラメーターであり、３４０ｎｍの波長で分光光度計により測定できる。
【０１３４】
試験溶液：
２−オキソグルタレート／ＡＤＰ／ＴＥＡバッファー：脱塩水１００ｍｌ中、ＴＥＡ  ９.３ｇ、ＡＤＰ  ９５ｍｇ、２−オキソグルタレート  ６７０ｍｇ、ｐＨ８.０。
【０１３５】
ＮＡＤＨ溶液：ＮＡＤＨ  ３０ｍｇ、ＮＡＨＣＯ３  ６０ｍｇを脱塩水６ｍｌに溶解。
【０１３６】
グルタメートデヒドロゲナーゼ：５０％グリセロール中の子牛肝臓に由来するもの、１２０Ｕ／ｍｇ。
【０１３７】
【表２０】
0004307826.tif 000029
【０１３８】
試験成分をプラスチック製のセルにピペットで分注し（少量の使い捨てセル、Brand、１.５ｍｌ）、混合し、３４０ｎｍでの吸光度を５分後に測定した。ＧｌｕＤＨ１０μｌを添加し、反応終了後（原則として３０分後）に、吸光度を再度測定した。
【０１３９】
吸光度の変化ΔＥを、最初の値から２回目の値を引くことにより算出した。特定のサンプルでは２ｍＭまでの範囲のアンモニウムイオンの測定値が得られた。
【０１４０】
サンプルバッチとコントロールとの比較で、計測値が、Ｄ,Ｌ−Ｔｌｅ−ＮＨ２から遊離したアンモニウムに対して計測されたものであるかまたは粗抽出物中にすでに存在したアンモニウムに対して計測されたものであるのかが分かる。
【０１４１】
塩化アンモニウムの量による検定線のプロットから、吸光度変化に由来するアンモニウムイオン濃度を測定できる。
【０１４２】
１０.  ＨＰＬＣでＤ−およびＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを測定するためのＯＰＡ／ＩＢＣ誘導化
エナンチオマーＤ−およびＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの分離および定量的測定を、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）／Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システインまたはＮ−イソブチリル−Ｄ−システインをベースとする“キラル誘導化”により実施した（Brueckner, H.; Wittner R. and Godel H. (1991), Fully automated high-performance liquid chromatographic separation of DL-amino acids dericatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cycteine. Application to food samples. Anal. Biochem. 144, 204〜206）。形成されたジアステレオマーイソインドール誘導体をＲＰ−１８（逆相）カラムで分離し、蛍光検出した。水性酢酸バッファーおよびアセトニトリル／水混合物の２種類のバッファー系を移動相に使用した。
【０１４３】
クロマトグラフィー条件：
固定相：ＫｒｏｍａｓｉｌＴＭＨＰＬＣカラム、２５０×４ｍｍ、５μｍ、１００Å（Eka Nobel）
移動相：
移動相Ａ：酢酸ナトリウム２３ｍＭ、ｐＨ６.０
移動相Ｂ：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）および脱塩水：  １０：１.５（ｖ／ｖ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル体積：２０μｌ
検出：蛍光：励起３４０ｎｍ／発光４４０ｎｍ。
【０１４４】
【表２１】
0004307826.tif 000030
【０１４５】
１１.  Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼの精製
Ｄ−アミダーゼの精製を、細胞破壊後の３種のクロマトグラフィー工程で実施した。
【０１４６】
１.  イオン交換クロマトグラフィー：
カラム材料：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Pharmacia）
バッファーＡ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ６.５
バッファーＢ：バッファーＡ＋１５０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４
直線勾配により溶離。
【０１４７】
２.  疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム材料：Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（Pharmacia）
バッファーＡ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ６.５＋１５０ｍＭＮａ２ＳＯ４
バッファーＢ：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ６.５
直線勾配により溶離。
【０１４８】
３.  ゲル濾過クロマトグラフィー
カラム材料：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＧ（Pharmacia）
バッファー：リン酸カリウムバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ６.５＋１８０ｍＭ  ＮａＣｌ
第２工程後には一般的に外来タンパク質は低含量でしか存在しない。最初の２段階の精製工程で８８％の収率が算出でき、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２に対して０.６８Ｕ／ｍｇの特異活性が存在した。均質に精製したＶａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ由来のＤ−アミダーゼでは、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２に対して１.４Ｕ／ｍｇの特異活性が得られた。
【０１４９】
１２.  Ｄ−アミダーゼの至適温度の決定
実質的に均質に精製された特異活性約１.３Ｕ／ｍｇの酵素を、至適温度の決定に使用した。項目８のように、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２を基質として使用した活性の測定を、２０℃〜５０℃で５℃毎に実施し、４０℃〜５５℃で更に測定して詳細を調査した。選択したインキュベーション時間は比較的短く１５分であった。温度の関数としての一連の活性を図２に示す。
【０１５０】
１３.  Ｄ−アミダーゼの至適ｐＨの決定
このために、イオン交換クロマトグラフィー後の部分的に精製された酵素を用いて、以下のバッファー物質を使用し、３.５〜１１の範囲のｐＨ値で活性を測定した。
【０１５１】
【表２２】
0004307826.tif 000031
【０１５２】
項目８のように、ＤＬ−Ｔｌｅ−ＮＨ２を基質としかつ３０℃で３０分インキュベートすることにより活性を測定した。ｐＨおよび特異的バッファー物質の関数としての一連の活性を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】変換の関数としてのＤ−Ｖａｌ、Ｄ−ＬｅｕおよびＤ−Ｐｈｅのエナンチオ選択性を示す図である。
【図２】温度に関する活性の依存性を示す図である。
【図３】ｐＨに関する活性の依存性を示す図である。
【図４】ｐＵＣ−ＡＡＨのプラスミドマップを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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