(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程；
ｂ）単離した捕獲細胞からＲＮＡを抽出し、次いでそのＲＮＡを増幅する工程；
ｃ）工程ｂ）の増幅したＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを検出可能な標識で標識して標識したｃＤＮＡを作製する工程；
ｄ）固定化ＤＮＡマイクロアレー上のＤＮＡプローブと工程ｃ）の標識したｃＤＮＡをハイブリダイズさせる工程；及び
ｅ）定量的に、そして／または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化ＤＮＡが標識したｃＤＮＡとハイブリダイズしたかを決定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
ａ）レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程；
ｂ）単離した捕獲細胞からＲＮＡを抽出し、次いでそのＲＮＡを増幅し、増幅したＲＮＡを検出可能な標識で標識して標識した増幅ＲＮＡを作製する工程；
ｃ）固定化ＤＮＡマイクロアレー上の固定化ＤＮＡと工程ｂ）の標識した増幅ＲＮＡをハイブリダイズさせる工程；及び
ｄ）定量的に、そして／または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化ＤＮＡが標識した増幅ＲＮＡとハイブリダイズしたかを決定する工程
を含んでなる方法。
【請求項３】
ａ）レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程；
ｂ）単離した捕獲細胞からＲＮＡを抽出し、次いでそのＲＮＡを増幅し、増幅したＲＮ
Ａを検出可能な標識で標識して標識した増幅ＲＮＡを作製する工程；
ｃ）工程ｂ）の増幅したＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、次いでそのｃＤＮＡを検出可能な標識で標識して標識したｃＤＮＡを作製する工程；
ｄ）固定化ＤＮＡマイクロアレー上のＤＮＡと標識した増幅ＲＮＡ及び／または標識したｃＤＮＡをハイブリダイズさせる工程；及び
ｅ）定量的に、そして／または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化ＤＮＡが標識した増幅ＲＮＡ及び／または標識したｃＤＮＡとハイブリダイズしたかを決定する工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
現在、ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレー（総説1-3）により一緒に何千もの遺伝子の遺伝子発現概要を調べることができる。最近、酵母4 5並びに哺乳類細胞系6、一次細胞7及び組織8における遺伝子発現変化を調べた研究が報告されている。
【０００２】
しかしながら、マイクロアレー技術の現在の応用は、与えられた組織／器官（すなわち、インサイチュー）に存在する個々の細胞型からの遺伝子発現の研究を含まない。そのような研究は、正常及び疾病状態の隣接する細胞型間でインビボで存在する複雑な相互作用の我々の理解を非常に促進する。本発明は、レーザー捕獲顕微解剖9［laser capture microdissection（ＬＣＭ）］及びＴ７に基づくＲＮＡ増幅10の技術をｃＤＮＡマイクロアレー11と組み合わせることにより隣接する細胞型からの遺伝子発現概要をうまく得ることができることを示す。
【０００３】
発明の要約
本発明は、特定の一組の細胞における特定のメッセンジャーＲＮＡの発現の再現性のある測定及び評価方法を提供する。この方法は、新しいやり方で非常に少数の特定の細胞の遺伝子発現分析の概要を作製するためにレーザー捕獲顕微解剖、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅、増幅したＲＮＡからのｃＤＮＡの作製及び多種多様な特定の遺伝子の固定化ＤＮＡ分子を含有するＤＮＡマイクロアレーの既知の技術を組み合わせ、利用する。レーザー捕獲技術により所望する細胞を個々に同定し、基質に結合させ、捕獲細胞を残りの細胞から分離する。次に、捕獲細胞からＲＮＡを抽出し、Ｔ７に基づく増幅技術を用いて約百万倍に増幅し、場合により、増幅したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。捕獲細胞中に存在するかもしくはしない可能性がある、またはあるレベルで存在する目的の特定の核酸とハイブリダイズする多種多様な特定のＤＮＡ分子を調製し、それらのＤＮＡ分子を適当な基質上に固定してマイクロアレーを形成する。アレー上の固定化ＤＮＡにｃＤＮＡがハイブリダイズできる条件下で捕獲細胞から作製したｃＤＮＡをマイクロアレーに添加する。捕獲細胞の増幅したＲＮＡまたは場合により増幅したＲＮＡから作製したｃＤＮＡ及びマイクロアレー上の特定の固定化ＤＮＡ分子を用いたハイブリダイゼーション結果の分析から捕獲細胞の発現概要を得る。ハイブリダイゼーション結果は、例えば、マイクロアレー上にプローブとして示されるもののうちどの遺伝子が捕獲細胞からのｃＤＮＡにハイブリダイズされるか、及び／または特定の遺伝子発現の量を示す。ハイブリダイゼーション結果は、捕獲細胞の遺伝子発現概要を示す。異なる一組の捕獲細胞の遺伝子発現概要と比較するために捕獲細胞の遺伝子発現概要を用いることができ、そして類似点及び相違点は、異なる細胞型間の遺伝子発現の違い及び異なる条件下での同じ細胞型間の違いを決定するために有用な情報を与える。
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の選択した一組の細胞における遺伝子発現概要の作製のための新規な方法を提供する。本発明の方法は、分析のために所望される細胞のみを正確に単離する方法論を与えるために新しいやり方で組み合わされる既知の技術を利用する。これはレーザー捕獲解剖により成し遂げられ、その場合、器官または組織サンプルのような、細胞の混合集団からの個々の細胞は、捕獲のために選択した特定の細胞にかけられたレーザーエネルギーにより基質に結合するようになる。捕獲細胞は非捕獲細胞から分離されて組内に含まれるように特異的に選択された一組の細胞を与える。選択規準は、組内に含まれることが所望される細胞のいかなる特性であってもよい。この技術を用いて、所望される特性を有する一組の細胞を集め、それは細胞の均一な収集を表す。次に、抽出されたＲＮＡを生成するために捕獲細胞を用いる。既知の技術を用いて捕獲細胞からＲＮＡを抽出する。次に、既知の技術を用いてこの抽出されたＲＮＡを約百万倍増幅まで増幅し、場合により、既知の技術を用いてｃＤＮＡを作製するために増幅されたＲＮＡを用いる。
【０００５】
技術のこの組み合わせを示すために、後根神経節（ＤＲＧ）における大型及び小型ニューロン間の異なる遺伝子発現を調べた。一般に、大型ＤＲＧニューロンは有髄で、迅速に伝導し、機械感覚情報を伝達し、一方、小型ニューロンは無髄で、ゆっくりと伝導し、侵害情報を伝達する12。（１）多数の異なって発現される遺伝子（小型対大型）が以前に報告されており；従って、この実験の成功を評価できるはずであり、そして（２）多数の小型及び大型ニューロンは相互に隣接しており、従って、個々のニューロンを正確に捕獲できるかどうかを試験するので、この系を選択した。
【０００６】
図１に示されるように、大型（＞４０μｍの直径）及び小型（直径＜２５μｍ）ニューロンをニッスル染色したラットＤＲＧの１０μｍ切片からＬＣＭにより正確に個々に捕獲した。この研究では、２組の１０００大型ニューロン及び３組の１０００小型ニューロンをｃＤＮＡマイクロアレー分析のために捕獲した。
ＲＮＡ増幅は個々の組のニューロン間で再現性がある
ＲＮＡを各組のニューロンから抽出し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより概算して１０6倍に直線状に増幅した。いったん増幅すると、個々に増幅したＲＮＡ（ａＲＮＡ）から３個の蛍光的に標識したプローブを合成し、４７７ ｃＤＮＡ（以下に記述したチップ設計を参照）に加えて（非特異的核酸ハイブリダイゼーションの測定のための）植物遺伝子をコードする３０ ｃＤＮＡを含有するマイクロアレー（ａ．ｋ．ａ．チップ）に三重反復でハイブリダイズさせた。（小型ニューロンはＳ１、Ｓ２及びＳ３、大型ニューロンはＬ１及びＬ２と称する）各ニューロン組における発現をこのように三重反復でモニターし、全部で１５マイクロアレーを必要とした。マイクロアレーデータの質を図２Ａに例示し、それはニューロン組Ｓ１由来のプローブへのハイブリダイゼーションから生じたもの及びニューロン組Ｌ２からのものの疑似色つき（pseudo-color）アレーを示す。図２Ａにおいて、チップの拡大部分は、特定のｃＤＮＡの蛍光強度（すなわち、発現レベル）のいくらかの違いを示し、異なるｃＤＮＡを含有するスポットは大きさが比較的が均一であること及びスポット間のバックグラウンドが比較的低いことを示す。
【０００７】
特定のｃＤＮＡに対応するシグナルが異なるチップ間で再現性があるかどうかを決定するために、各ニューロン組に対して、変動係数を計算した（ＣＶまたは標準偏差／平均 Ｘ １００％）。これらの値から、ニューロン組当たりの全ての４７７ ｃＤＮＡの総合平均ＣＶを計算して：１５．８１％＝Ｓ１、１６．９３％＝Ｓ２、１７．７５％＝Ｓ３、２０．１７％＝Ｌ１及び１９．５５％＝Ｌ２であった。
【０００８】
より重要なことには、同じニューロンサブタイプの異なる組の別個の増幅（〜１０6倍）は全く類似した発現パターンを生じた。例えば、Ｓ１対Ｓ２間のシグナル強度の相関関係はＲ2＝０．９６８８であり、Ｓ１対Ｓ３間はＲ2＝０．９３９９であった（図２Ｂ）。類似した結果が２組の大型ニューロン間で得られた：Ｌ１対Ｌ２でＲ2＝０．９２９（図２Ｂ）。
【０００９】
逆に、３つ全ての小型ニューロン組（Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）対２つの大型組（Ｌ１及びＬ２）間の比較は、はるかに低い相関関係を生じ（Ｒ2＝０．６７８９）、予測されたように遺伝子のサブセットが２つのニューロンサブタイプ間で異なって発現されることを示す（図２Ｂ）。
小型及び大型ニューロン間で異なった遺伝子発現が示される。
【００１０】
大型及び小型ニューロン間で異なって発現されるｍＲＮＡを同定するために、全ての４７７ ｃＤＮＡを調べ、１．５倍またはそれより大きい違い（Ｐ＜０．０５で）を有するものをシークエンスし、表１及び２に示す。マイクロアレー上のｃＤＮＡの収集の中で、より多くのｍＲＮＡが小型ニューロンにおいて優先的に発現することが見いだされ（小型における２７ ｍＲＮＡに対して大型における１４ ｍＲＮＡ）；これは単にこのチップ上に用いたｃＤＮＡの組を反映する可能性がある。
【００１１】
認められた異なる遺伝子発現を確かめるために、これらのｃＤＮＡのサブセットでインサイチューハイブリダイゼーションを実施した。
【００１２】
小型ニューロンでは、以下のもの：脂肪酸結合タンパク質（ジーンバンク受託番号Ｍ１３５０１）、ＮａＮ（ナトリウム電位依存性チャネル、ＡＦ０５９０３０）、ホスホリパーゼＣデルタ−４（Ｕ１６６５５）、ＣＧＲＰ（Ｌ００１１１）及びアネキシンＶ（８２４６２）をコードする５つのｍＲＮＡを調べた。５つ全てのｍＲＮＡは小型ニューロンにおいて優先的に発現される（５つのうち３つを図３に示す、５つ全ては表３を参照）。これは、与えられたｍＲＮＡに対して（１）小型及び大型ニューロンにおけるシグナルの全体的な強度並びに（２）小型または大型ニューロンのいずれかの全集団内の標識された細胞の％を測定する（表３）定量測定に基づいた。
【００１３】
それらの結果は、ＮａＮ ｍＲＮＡ13及びＣＧＲＰ ｍＲＮＡ14のインサイチューハイブリダイゼーション研究を裏付け、そしてアネキシンＶ15での免疫蛍光研究と一致する。ホスホリパーゼＣデルタ４は以前に、細胞周期のＳ期で誘導され、核に存在することが示されている16。ニューロンは有糸分裂後であることを考えれば、この結果は、この酵素が小型ニューロンのサブセットにおいて異なる役割を果たす可能性があることを示唆する。大型ニューロンでは、ニューロフィラメントＮＦ−Ｌ（Ｍ２５６２８）及びＮＦ−Ｈ（Ｊ０４５１７）並びに電位依存性ナトリウムチャネルのβ−１サブユニット（Ｍ９１８０８）の３つのｃＤＮＡを調べた。図３及び表３に示されるように、これらのｍＲＮＡの優先的発現が大型ＤＲＧニューロンにおいて見られた。最近のインサイチューハイブリダイゼーション研究もこれら３つのｍＲＮＡの大型ニューロンにおける優先的発現を示している14 17。さらに、以前のインサイチューハイブリダイゼーション研究は、Ｐ２Ｘ３受容体ｍＲＮＡ（Ｘ９０６５１）、ＮＦ−中間（middle）（Ｊ０４５１７）、ｈｓｐ ２７18及びペリフェリン（Ｍ２６２３２）14 19 20の小型及び大型ニューロンにおける異なる発現に関するこのｃＤＮＡチップデータと一致する。しかしながら、一つの報告はペリフェリンｍＲＮＡ発現に関して小型及び大型ニューロン間でいかなる違いも見いださない14。一般に、与えられたｍＲＮＡに対して、ｃＤＮＡチップデータ及びインサイチューハイブリダイゼーション研究からの結果は一致する。しかしながら、大部分の場合において、インサイチューハイブリダイゼーション研究は、小型及び大型間の発現においてｃＤＮＡチップデータから認められるものよりかなり大きい違いを示す（表１及び２対表３）。これは低い強度のシグナルに対して特に明白である。例えば、ホスホリパーゼＣデルタ４発現はほとんど小型ニューロンにおいてのみ見られたが（表３）、チップデータは発現の２．７６倍の違いのみを示す（表２）。大部分において、非特異的核酸ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナル（すなわち、植物ｃＤＮＡからのハイブリダイゼーションシグナル）が各ｃＤＮＡ強度から引かれていないことによりこれを説明できる。以下に示すように、植物ｃＤＮＡの７５百分位数値バックグラウンドシグナルは小型ニューロン組では４８．６８、大型では４０．９４である。従って、ホスホリパーゼＣデルタ４の大型ニューロンに対する小型の発現の比率は、「非特異的」バックグラウンドを引く場合、２．７６倍の違いから〜２２倍の違いまでになる。このバックグラウンドを引かない理由は、分母（すなわち、シグナルの強度−７５％植物値）が０に近づくにつれてそれは非常に大きい、潜在的に偽の倍数の違いももたらす可能性があることである。
【００１４】
結局、大型または小型ニューロンのいずれかにおいて優先的に発現される４１ ｍＲＮＡのうち、これらのｍＲＮＡの１２に対してインサイチューハイブリダイゼーション研究により類似した結果が示されている。この成功レベルは、他の３０ ｍＲＮＡの大部分も小型または大型ニューロンにおいて異なって発現されることを示唆する。
細胞型特異性を含有する遺伝子発現データベースの構築
ＬＣＭ、ａＲＮＡ及びｃＤＮＡチップを組み合わせることにより、インサイチューから得られた異なる細胞型をうまく選別し、続いて異なる遺伝子発現を同定できることが示された。この研究はＤＲＧニューロン内の異なる発現を有するｍＲＮＡを同定したが、単に小型及び大型以外にＤＲＧニューロン内に多量のより異種性が存在する。例えば、小型ニューロン（すなわち、侵害ニューロン）内には、遺伝子発現に関して異種性があり、それはおそらく少なくとも一つには伝達される異なる感覚様式を表す。このより複雑な異種性に取り組むために、ＬＣＭへの免疫細胞化学の連結及びそれに続くａＲＮＡ及びＤＮＡチップ分析を実施することができる。さらに、大型及び小型ニューロン間の異なる遺伝子発現をより完全に同定するために、より多数のｃＤＮＡ（すなわち、＞１０，０００）を含有するチップを完成することができる。
【００１５】
本明細書に示した結果は、既知の技術のこの組み合わせにより作製した発現概要がｃＤＮＡをスクリーニングするためだけでなく、より重要なことには、細胞型特異的遺伝子発現を含有するデータベースを作るためにも有用である可能性があることを示す。データベース内の細胞型特異性は、特定の正常または疾病状態への個々の細胞型の寄与を理解することにおいて研究者により多くの影響力を与え、従って、はるかに優れた仮説を続いて作製することができる。さらに、データベースが様々な細胞型（またはニューロンサブタイプ）からの多数の遺伝子発現概要を含有するようになるにつれて、与えられた細胞型内で同等に発現される遺伝子を同定することができる。また、同等な遺伝子発現は、コードされるタンパク質間の機能的連結も示唆する可能性があり、従って、現在クローン化されたｃＤＮＡの膨大な大多数に対して機能を決定しようとする試みを促進する。
表１
大型ＤＲＧニューロンにおいて豊富なｍＲＮＡ．［ＧＢ］ジーンバンク受託番号；［平均］ＤＮＡチップマイクロアレーの平均強度；［Ｓ．Ｅ．Ｍ．］平均の標準誤差；［比率］小型ＤＲＧニューロンに対する大型ＤＲＧの平均強度比率；［＊］植物値の７５％から有意に異ならない（ｐ＞０．０５）平均強度。
表２
小型ＤＲＧニューロンにおいて豊富なｍＲＮＡ．［ＧＢ］ジーンバンク受託番号；［平均］ＤＮＡチップマイクロアレーの平均強度；［Ｓ．Ｅ．Ｍ．］平均の標準誤差；［比率］大型ＤＲＧニューロンに対する小型ＤＲＧの平均強度比率；［＊］植物値の７５％から有意に異ならない（ｐ＞０．０５）平均強度。
表３
選択したｃＤＮＡクローンのインサイチューハイブリダイゼーション．［強度］＝以下のような細胞当たりの概算したｍＲＮＡ発現レベル：［−］バックグラウンドより上の発現なし；［±］弱い発現；［＋］低い発現；［＋＋］中程度の発現；［＋＋＋］強い発現。［％］＝バックグラウンドより上の目的のｍＲＮＡを発現するＤＲＧニューロンの％。
【００１６】
【表１】
0004338316.tif 000002
【００１７】
【表２】
0004338316.tif 000003
【００１８】
【表３】
0004338316.tif 000004
【００１９】
実施例１
レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）．  ２匹の成体メスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットをこの研究に用いた。メトファン（メトキシフルラン、カタログ番号５５６８５０、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｃ．Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＬ、ＵＳＡ）で動物に麻酔をかけ、断頭により屠殺した。ＲＮアーゼを含まない条件を用いて、頸部後根神経節（ＤＲＧ）を素早く切断して出し、凍結型中に置き、凍結組織包埋媒質ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）で覆い、ドライアイスで冷やした２−メチルブタン（〜−６０℃）中で凍らせた。次に、ＤＲＧをクリオスタットで７−１０μｍで切片を作り、普通の（被覆していない）きれいな顕微鏡スライド上に載せ、ドライアイスの塊上ですぐに凍らせた。それらの切片をさらに使用するまで−７０℃で保存した。
【００２０】
ＤＲＧニューロンを同定するために急速ニッスル（クレシルバイオレットアセテート）染色を用いた。これを以下のように完了した。切片を含有するスライドをスライドホルダー上に素早く載せ、すぐに１００％エタノール中で１分間固定し、続いて、ＲＮアーゼを含まない脱イオンＨ2Ｏ中に希釈した９５％、７０％、５０％エタノールの連続段階により再水和させた（各５秒）。次に、スライドを０．５％ニッスル／０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで１分間染色し、段階的エタノール（各５秒）中で脱水し、キシレン中できれいにした（１分）。いったん風乾させると、スライドはＬＣＭに使用できた。
【００２１】
Ａｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）からのＰｉｘＣｅｌｌ II ＬＣＭTM（商標）システムをレーザー捕獲に用いた。製造業者のプロトコルに従って、２組の大型及び３組の小型ＤＲＧニューロン（１組当たり１０００細胞）をレーザー捕獲した。大型及び小型ＤＲＧニューロンの規準は以下のとおりである：ＤＲＧニューロンが直径＜２５μｍに加えて同定できる核を有する場合、それを小型として分類し、一方、直径＞４０μｍに加えて同定できる核を有するＤＲＧニューロンを大型として分類した。
【００２２】
実施例２
ＬＣＭサンプルのＲＮＡ抽出．  いくらか改変してＭｉｃｒｏ ＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、ＬＣＭサンプルから全ＲＮＡを抽出した。簡潔に言えば、ＬＣＭサンプルを２００μｌの変性バッファー及び１．６μｌのβ−ＭＥと室温で５分間インキュベートした後、ＬＣＭサンプルを２０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、２２０μｌのフェノール及び４０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。水層を集め、次に、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌキャリヤーグリコーゲンと混合し、２００μｌのイソプロパノールで沈殿させた。７０％エタノール洗浄及び風乾後、ペレットを１６μｌのＲＮアーゼを含まないＨ2Ｏ、２μｌの１０Ｘ ＤＮアーゼＩ反応バッファー、１μｌのＲＮａｓｉｎ及び１μｌのＤＮアーゼＩ中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートしてあらゆるゲノムＤＮＡ混入を除いた。次に、フェノールクロロホルム抽出を上記のように繰り返した。ペレットを１１μｌのＲＮアーゼを含まないＨ2Ｏ中に再懸濁し、そのうち１μを取っておき、逆転写ＰＣＲの陰性コントロール（ＲＴなしコントロール）として用い、そして残り（１０μｌ）をＲＴ−ＰＣＲ及びＲＮＡ増幅のために処理した。
【００２３】
実施例３
ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）．  上記からの１０μｌの精製したＲＮＡ及び１μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ Ｔ７−オリゴｄＴプライマー（５’ＴＣＴＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＴ21−３’）を一緒に添加することにより第一鎖合成を完了した。プライマー及びＲＮＡを７０℃で１０分間、続いて４２℃で５分間インキュベートした。次に、４μｌの５Ｘ第一鎖反応バッファー、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μｌのＲＮａｓｉｎ及び１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加し、４２℃で１時間インキュベートした。次に、３０μｌの第二鎖合成バッファー、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、４μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ、１μｌのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅＨ、１μｌのエシェリキア・コリＤＮＡリガーゼ及び９２μｌのＲＮアーゼを含まないＨ2Ｏを添加し、１６℃で２時間インキュベートし、続いて、２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加して１６℃で１０分間インキュベートした。次に、ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μｌのＨ2Ｏで３Ｘ洗浄した。カラムから集めた後、ｃＤＮＡをインビトロ転写のために８μｌまで乾燥させた。
【００２４】
実施例４
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅（ａＲＮＡ）．  Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた：８μｌの二本鎖ｃＤＮＡ、２μｌの１０Ｘ Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７バッファー、１．５μｌの各１００ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ及び２μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、４２℃で３時間。ａＲＮＡをＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００カラムで３Ｘ洗浄し、集め、１０μｌまで乾燥させた。
次の一連のａＲＮＡ増幅．  １回目の増幅からの１０μｌのａＲＮＡを１μｌの１ｍｇ／ｍｌランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と一緒に７０℃で１０分間混合し、氷上で冷やし、室温で１０分間平衡化し、次に、４μｌの５Ｘ第一鎖バッファー、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μｌのＲＮａｓｉｎ及び１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ IIを添加し、室温で５分間、続いて３７℃で１時間インキュベートした。次に、１μｌのＲＮアーゼＨを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。第二鎖ｃＤＮＡ合成のために、１μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ Ｔ７−オリゴｄＴプライマーを添加し、７０℃で５分間、４２℃で１０分間インキュベートした。次に、３０μｌの第二鎖合成バッファー、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、４μｌのポリメラーゼＩ、１μｌのエシェリキア・コリＲＮアーゼＨ、１μｌのエシェリキア・コリＤＮＡリガーゼ及び９０μｌのＲＮアーゼを含まないＨ2Ｏを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次に、２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを１６℃で１０分間添加した。タンパク質を除くためにｃＤＮＡの二本鎖を１５０μｌのフェノールクロロホルムで抽出し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製して取り込まれなかったヌクレオチド及び塩から分離した。ｃＤＮＡは上記のような２回目のＴ７インビトロ転写、そして次に続く３回目のａＲＮＡ増幅に使用できる。
【００２５】
実施例５
マイクロアレー設計．  ２つの別個の示差展示（differential display）21実験からチップ上に存在するｃＤＮＡを得た。第一に、脳、腎臓及び肝臓に対してＤＲＧにおいて優先的に発現されるｍＲＮＡをクローン化するために選別を実施した。第二に、反対側の（「コントロール」）腰椎５及び６ＤＲＧに対して後根神経節の末梢にきつく連結された同側の（「処置した」）腰椎５及び６ＤＲＧ（「Ｃｈｕｎｇ」モデル22）において減少したまたは増加した濃度を有するｍＲＮＡを同定する／クローン化するために選別を実施した。
マイクロアレープリント．  （上記のような）我々の以前の示差展示研究からのベクターＰＣＲ ２．１中の４７７クローンをシリル化したスライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）上につけた。ｃＤＮＡを５’アミノ−連結プライマーでＰＣＲ増幅し、Ｑｉａｇｅｎ ９６ ＰＣＲ精製キットで精製した。プリントスポットは約１２５μｍの直径であり、中心から中心まで３００μｍの間隔を置いて配置した。また、３０植物遺伝子も非特異的ハイブリダイゼーションのコントロールとしてスライド上につけた（Ｍａｒｋ  Ｓｃｈｅｎａからの贈与）。
【００２６】
実施例６
マイクロアレープローブ合成．  ｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ選択システム（Superscript Choice System for cDNA Synthesis）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）でＬＣＭ ＤＲＧのａＲＮＡからＣｙ３標識したｃＤＮＡプローブを合成した。簡潔に言えば、５μｇのａＲＮＡ、３μｇのランダムヘキサマーを（ＲＮアーゼを含まないＨ2Ｏを含有する）２６μｌの全容量で混合し、７０℃に１０分間加熱し、氷上で冷やした。次に、１０μｌの第一鎖バッファー、５μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、１．５μｌのＲＮａｓｉｎ、１μｌの２５ｍＭ ｄ（ＧＡＴ）ＴＰ、２μｌの１ｍＭ ｄＣＴＰ、２μｌのＣｙ３−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２．５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ IIを添加し、室温で１０分間、次に３７℃で２時間インキュベートした。ａＲＮＡ鋳型を分解するために、６μｌの３Ｎ ＮａＯＨを添加し、６５℃で３０分間インキュベートした。次に、２０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１２μｌの１Ｎ ＨＣｌ及び１２μｌのＨ2Ｏを添加した。プローブをＭｉｃｒｏｃｏｎ ３０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、次にＱｉａｇｅｎヌクレオチド除去カラムで精製した。プローブを真空乾燥させ、マウスＣｏｔ１ ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含有する２０μｌのハイブリダイゼーションバッファー（５Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ）中に再懸濁した。
マイクロアレーハイブリダイゼーション及び洗浄．  スライドへのｃＤＮＡのアミノ−連結を確実にするために、プリントしたガラススライドをホウ水素化ナトリウム（sodium borohydrate）溶液（０．０６６Ｍ ＮａＢＨ4、０．０６Ｍ Ｎａ  ＡＣ）で処理した。次に、ｃＤＮＡを変性させるためにスライドを水中で２分間沸騰させた。Ｃｙ３標識したプローブを９９℃で５分間、室温で５分間加熱し、スライドに添加した。スライドをガラスカバーガラスで覆い、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）で密封し、６０℃で４−６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの終わりにスライドを室温まで冷却した。スライドを１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で５５℃で５分間、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で５５℃で５分間洗浄した。０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で素早くすすいだ後、スライドを空気を送って乾燥させ、走査に使用できた。
マイクロアレー定量．  ＳｃａｎＡｒｒａｙ ３０００（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いてｃｙ３蛍光に関してｃＤＮＡマイクロアレー（すなわち、顕微鏡スライド）を走査した。次に、ＩｍａＧｅｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を続いて定量に用いた。３チップ／ニューロン組（本文参照）で、全部で１５チップを処理した。簡潔に言えば、即時周囲バックグラウンドを引くことにより各スポット（すなわち、ｃＤＮＡ）の強度を修正した。次に、修正した強度を各ｃＤＮＡ（すなわち、スポット）について以下の式：強度（バックグラウンド修正した）／全チップの強度の７５百分位数値 ｘ １０００で正規化した。「非特異的」核酸ハイブリダイゼーションを測定するために、各ニューロン組からの各植物ｃＤＮＡ（全部で３０の異なるｃＤＮＡ）の個々の平均から７５百分位数値を計算した。Ｓ１、Ｓ２及びＳ３の総合７５百分位数値＝４８．６８、Ｌ１及びＬ２の総合７５百分位数値＝４０．９４。
統計的分析．  ニューロンの個々の組間（例えば、図２ＢにおけるＳ１対Ｓ２）または２種のニューロンサブタイブ間（すなわち、図２ＢにおけるＳ１、Ｓ２及びＳ３対Ｌ１及びＬ２）の各ｃＤＮＡの強度値の相関関係を評価するために、散布図を用い、直線関係を測定した。計算した測定係数Ｒ2は、ある群に対する別の群の強度値の変動を示す。
【００２７】
マイクロアレー定量から測定した強度値が真のシグナルであるかどうかを統計的に決定するために、各チップ上に存在する（非特異的核酸ハイブリダイゼーションを表す）３０植物ｃＤＮＡの７５百分位数値に対して１サンプルｔ試験により各強度を比較する。７５百分位数値から有意に異ならない値を表１及び２に示し、そのように表す。どのｃＤＮＡが大型及び小型ニューロン間のそれらの異なる遺伝子発現において統計的に有意であるかを決定するために、大型ニューロン（Ｌ１及びＬ２）並びに小型ニューロン（Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）のニューロン組からの各ｃＤＮＡの強度をそれぞれ一緒に分類し、強度値を各対応するｃＤＮＡについて平均した。小型ニューロン及び大型ニューロン間の遺伝子発現差を検出するために片側仮説のための２サンプルｔ試験を用いた。
【００２８】
実施例７
インサイチューハイブリダイゼーション．  インサイチューハイブリダイゼーションを以前に記述されたように23実施した。簡潔に言えば、線状にしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にｃＤＮＡをサブクローン化し、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼでインビトロ転写により35Ｓ−ＵＴＰを取り込んだ。次に、プローブをＱｕｉｃｋ ＳｐｉｎTM（商標）カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で精製した。Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ）上に載せた１０μｍ、４％パラホルムアルデヒド固定したラットＤＲＧ切片にプローブ（１０7ｃｐｍ／プローブ）をハイブリダイズさせた。５８℃で一晩ハイブリダイズさせ、後洗浄した後、一次データのためにスライドをフィルムに感光させた。続いて、スライドをＫｏｄａｋ感光乳剤液ＮＴＢ２で覆い、耐光性の箱の中で４℃で１−２週間感光させた。スライドをＫｏｄａｋ現像液Ｄ−１９中で現像し、Ｋｏｄａｋ定着液中で定着し、発現分析のためにニッスル染色した。
【００２９】
明視野顕微鏡検査で、特定のｃＤＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを半定量的に分析した。これを以下のように実施した：発現なし（−、粒子はバックグラウンドの＜５倍であった）；弱い発現（±、粒子はバックグラウンドの５−１０倍であった）；低い発現（＋、粒子はバックグラウンドの１０−２０倍であった）；中程度の発現（＋＋、粒子はバックグラウンドの２０−３０倍であった）；強い発現（＋＋＋、粒子はバックグラウンドの＞３０倍であった）。４切片からの大型または小型のいずれかのニューロンから標識された（バックグラウンドより上）及び標識されなかった細胞の数を数えることにより（少なくとも２００細胞を数えた）特定のｍＲＮＡを発現する小型または大型ニューロンの％を得た。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
【表５】
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【００３２】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  成体ラット大型及び小型後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの１０μｍニッスル染色切片からのレーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）を示す。赤色矢印は、捕獲されるＤＲＧニューロンを示す（上のパネル）。真ん中及び下のパネルは、それぞれ成功した捕獲及びフィルム移動を示す。縮尺棒＝２００μｍ。
【図２】  パネルＡ及びＢ−小型（Ｓ）及び大型（Ｌ）ニューロンのｃＤＮＡマイクロアレー発現パターンを示す。２Ａは、得られたｃＤＮＡマイクロアレーデータの例である。白で囲んだものは、（以下に直接示す）拡大したＬ１及びＳ１サンプルのマイクロアレーの同一領域である。２Ｂは、Ｓ１対Ｓ２、Ｓ１対Ｓ３、Ｌ１対Ｌ２並びにＬ（Ｌ１及びＬ２）対Ｓ（Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）の別個の増幅間の相関関係を示す散布図である。
【図３】  パネルＡ及びＢ−選択したｃＤＮＡとラットＤＲＧの放射性同位体インサイチューハイブリダイゼーションの代表的な視野を示す。切片をニッスル対比染色した。左のパネル（パネルＡ）は、高分子量ニューロフィラメント（ＮＦ−Ｈ）、低分子量ニューロフィラメント（ＮＦ−Ｌ）及び電位依存性ナトリウムチャネル（ＳＣＮβ−１）のβ−１サブユニットをコードする放射性標識プローブでの結果を示す。左のパネル中の赤色矢印は、同定できる小型ニューロンを示す。右のパネル（パネルＢ）は、カルシトニン遺伝子関連生成物（ＣＧＲＰ）、電位依存性Ｎａチャネル（ＮａＮ）及びホスホリパーゼＣデルタ４（ＰＬＣ）をコードする放射性標識プローブからの代表的な視野を示す。右のパネル中の赤色矢印は、同定できる大型ニューロンを示す。大きな赤色矢じりは、同様に標識される大型ニューロンを示す。縮尺棒＝１００μｍ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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