(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、バチルス属微生物由来の、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する作用を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質を生成させる工程、得られるα−イソマルトシルグルコ糖質にイソマルトデキストラナーゼを作用させてイソマルトースを生成させる工程、及び、得られるイソマルトース又はイソマルトース含有糖質を採取する工程を含むことを特徴とするイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【請求項２】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が、下記＜Ａ＞又は＜Ｂ＞に記載の理化学的性質を有する酵素である請求項１記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
＜Ａ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１４０，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４０℃；
１ｍＭＣａ２＋存在下では、４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０乃至６．５；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、３５℃まで安定；
１ｍＭＣａ２＋存在下では、４０℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ４．５乃至９．０で安定；
＜Ｂ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１３７，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．２±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、４５℃；
１ｍＭＣａ２＋存在下では、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、４０℃まで安定；
１ｍＭＣａ２＋存在下では、４５℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ５．０乃至１０．０で安定；
【請求項３】
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、バチルス属微生物由来の、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する作用を有するα−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ及び澱粉枝切酵素から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする、請求項１又は２記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【請求項４】
α−イソマルトシル転移酵素が、下記＜ａ＞又は＜ｂ＞に記載の理化学的性質を有する酵素である請求項３記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
＜ａ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１１２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．５±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、４５℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応で、ｐＨ６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、４０℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ４．０乃至９．０で安定；
＜ｂ＞
（１）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、１０２，０００±２０，０００ダルトン；
（２）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ５．６±０．５；
（３）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、５０℃；
（４）  至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５乃至６．０；
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、４０℃まで安定；
（６）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ４．５乃至９．０で安定；
【請求項５】
イソマルトデキストラナーゼを作用させた後に、グルコアミラーゼを作用させることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【請求項６】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求項１乃至５のいずれかに記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【請求項７】
イソマルトース又はイソマルトース含有糖質を採取する工程に於いて、アルカリ金属形及び／又はアルカリ土類金属形強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【請求項８】
イソマルトース含有糖質が、固形物当たりイソマルトースを４０質量％以上含有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載のイソマルトース又はイソマルトース含有糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イソマルトースの新規な製造方法とその用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質からイソマルトースを高収率で得るためのイソマルトースの製造方法とその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イソマルトースは、醗酵食品などに微量存在している難結晶性で優れた保湿性を有する低甘味糖質で、従来、グルコース、マルトース、パノースなどとの混合糖質として、各種食品、化粧品、医薬品等に幅広く使用されている有用な糖質である。
【０００３】
イソマルトースは、天然界に於いては、醗酵食品などに微量存在するに過ぎない希少糖質で、工業的には、酸触媒を用いるデキストランの部分加水分解反応、デキストラナーゼやイソマルトデキストラナーゼなどを用いる酵素反応、グルコースからのグルコアミラーゼ又は酸触媒を用いる逆合成反応、マルトース又はマルトデキストリンからのα−グルコシダーゼを用いるグルコース糖転移反応などによる製造方法が知られている。しかしながら、従来法により得られる反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当り約１０乃至約２５質量％（以下、本明細書に於いては、特にことわらない限り、「質量％」を単に「％」と略記する。）程度に過ぎず、イソマルトースの工業的製造方法としては純度が低く、到底満足できるものではなかった。この問題点を改善する方法として、例えば、特開昭５８−７２５９８号公報に開示されたカラムクロマトグラフィーがある。この方法によれば、固形物当り、イソマルトース含有量が約１０乃至約２５％の原料糖液から、高純度イソマルトースを得ることができる。しかしながら、このイソマルトースの製造方法に於いても、得られるイソマルトースの純度、収率は、原料糖液中のイソマルトース含有量に依存せざるを得ないとの問題点があった。
【０００４】
斯かる状況下、イソマルトースを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る新規な製造方法の確立が鶴首されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来技術に鑑み、イソマルトースを工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得るイソマルトースの製造方法とその用途を確立することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等が前記課題を解決することを目的として鋭意研究する中、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に於いて、主として、４個のグルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合により交互に連なった構造を有するアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させて得られる、分子内にイソマルトース構造を有するサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する四糖類（以下、『環状四糖』と略記する。）の報告があった。
【０００７】
一方、本発明者等は、特願２０００−２２９５５７号明細書に於いて、パノース等の澱粉由来の糖質から環状四糖を生成する、α−イソマルトシル転移酵素を用いる環状四糖の製造方法を開示すると共に、特願２０００−２３４９３７号明細書に於いては、前記α−イソマルトシル転移酵素と、マルトオリゴ糖等からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とを澱粉原料に作用させて環状四糖を効率よく製造する方法を開示している。
【０００８】
その後、本発明者等は、前記α−イソマルトシルグルコ糖質及び環状四糖が、それら分子内にイソマルトース構造を有していることに着目し、これらの糖質からイソマルトースを製造する方法について研究した。即ち、本発明者等は、これらα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の酵素反応メカニズムについて研究した結果、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトースを遊離する作用を有するイソマルトース遊離酵素とを作用させると、イソマルトースの生成収率が飛躍的に向上し、しかも、工業的に容易に実施し得ることを見出した。更に、本発明者等は、斯かる製造方法により得られるイソマルトースの用途を確立して本発明を完成した。具体的には、本発明は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質及び／又は環状四糖を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法とその用途を確立して、本発明の課題を解決したものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とは、澱粉質からα−イソマルトシルグルコース（別名、パノース）、α−イソマルトシルマルトース、α−イソマルトシルマルトトリオース、α−イソマルトシルテトラオースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する酵素を意味し、具体的には、特願２０００−２３４９３７号明細書に開示された、２０００年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３として寄託されているバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９、及び、２０００年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４として寄託されているバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、及び特願２００１−５４４１号明細書に開示された遺伝子組換え型α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド等を例示することができる。
【００１０】
又、本発明で用いるα−イソマルトシル転移酵素とは、パノース、イソマルトシルマルトースのようなα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する酵素を意味し、特願２０００−２２９５５７号明細書に開示されたバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）及びバチルス  グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）由来のα−イソマルトシル転移酵素、及び特願２０００−３５０１４２号明細書に開示された遺伝子組換え型α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチド等を例示することができる。
【００１１】
更に、本発明で用いるイソマルトース遊離酵素は、α−イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖から、イソマルトースを遊離する作用を有する酵素を意味し、例えば、『ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７５巻、１０５乃至１１２頁（１９７４年）に報告されているアルスロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｔ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−４４２５）、東京大学応用微生物研究所から分譲提供される、アルスロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）（ＩＡＭ １２１０３）、及び『カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）』、第８９巻、２８９乃至２９９頁（１９８１年）に報告されている、アクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）Ｒ１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４１１）等の微生物由来のイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．９４）を例示することができる。
【００１２】
本発明で用いる非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質とは、例えば、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉及びそれら部分加水分解物（澱粉部分分解物）を意味する。前記澱粉部分分解物は、通常、上記した地上乃至地下澱粉を水に懸濁して、通常、濃度１０％以上、より好ましくは、１５％乃至６５％、更に好ましくは、２０％乃至５０％の澱粉乳とし、これを加熱して液化するか、又は、上記した地上乃至地下澱粉を酸剤或いは酵素剤により液化して得ることができる。液化の程度は、比較的低く設定するのがよく、通常、ＤＥ１５未満、好ましくは、ＤＥ１０未満、より好ましくは、ＤＥ９乃至０．１の範囲とするのが望ましい。酸剤で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などの酸剤により液化した後、通常、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ剤を用いて所望のｐＨに中和する方法を採用する。酵素剤で液化する場合には、α−アミラーゼ、殊に、耐熱性の液化型α−アミラーゼが本発明に於いては好適に用いることができる。
【００１３】
これら非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、環状四糖を生成させ、この生成物にイソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することにより、イソマルトースを高収率で得ることができる。又、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させるに際し、α−イソマルトシル転移酵素、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、『ＣＧＴａｓｅ』と略記する。）、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及び澱粉枝切酵素（イソアミラーゼ、プルラナーゼ等）から選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させるか、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後に、α−イソマルトシル転移酵素、ＣＧＴａｓｅ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることにより、イソマルトースをより高収率で製造することができる。殊に、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の存在下でα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて得られる環状四糖にイソマルトース遊離酵素を作用させる場合、環状四糖からのイソマルトース生成率を最大１００％にまで高めることが可能となる。本発明に於いて複数の酵素を用いる場合の順序は、イソマルトースの生成収率、反応時間、反応条件等を勘案しながら設定すればよく、複数の酵素を同時に作用させることも、又、これら酵素の必要量を数回に分けて、異なるタイミングで作用させることも可能である。本発明で用いる酵素を作用させるときのｐＨは、前記酵素がそれらの酵素活性を発揮し得るｐＨであればよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至８の範囲から選択される。又、酵素を作用させるときの温度は、通常、１０乃至８０℃、好ましくは、３０乃至７０℃の範囲から選択される。酵素量は、各酵素の反応条件、反応時間を考慮して適宜増減すればよく、通常、基質固形物グラム当たり、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、それぞれ０．０１乃至１００単位の範囲から、イソマルトース遊離酵素及び澱粉枝切酵素は、それぞれ１乃至１０，０００単位の範囲から、及びＣＧＴａｓｅ、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ及びイソアミラーゼは、０．０５乃至７，０００単位の範囲から適宜選択して用いられる。又、用いる酵素反応時間は、酵素量に依存するものの、イソマルトースの生成収率を勘案しながら適宜選択すればよく、通常、１乃至２００時間、好ましくは、５乃至１５０時間、１０乃至１００時間で全酵素反応を完結するよう設定する。尚、個々の酵素反応時のｐＨ及び温度は、本発明に於ける酵素反応が完了する迄の工程で適宜変更することも可能である。
【００１４】
斯くして得られる酵素反応液中のイソマルトース含有量は、固形物当たり、通常、３０％以上、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、最大９９％以上にも達する。とりわけ、これら非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、α−イソマルトシル転移酵素及びイソマルトース遊離酵素を同時又はこの順序で添加するときには、固形物当たりのイソマルトース含有率が５０％以上の酵素反応液を容易に得ることができる。前記酵素反応液は、通常、濾過、遠心分離などの常法により酵素反応液中の不溶物を除去し、次いで、活性炭により脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂等で脱塩し精製し、濃縮してシラップ状製品とするか、更に、これを乾燥して粉末状製品とする。必要ならば、更に、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒を用いる分別、膜分離法等の１種又は２種以上を適宜組み合わせて精製し、イソマルトース高含有物とすることも可能である。とりわけ、イソマルトース高含有物の工業的大量製造方法としては、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーの採用が好適である。具体的には、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報及び特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている、スルフォン基を結合したスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂のＮａ＋形、Ｋ＋形等のアルカリ金属形、及びＣａ２＋形、Ｍｇ２＋形等のアルカリ土類金属形の１種又は２種以上の強酸性カチオン交換樹脂を用いるイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによるときには、イソマルトース高含有物を工業的に高収率、大量、容易かつ安価に製造することができる。前記強酸性カチオン交換樹脂の市販品としては、ダウケミカル社製の商品名『ダウエックス５０ＷＸ２』、『ダウエックス５０ＷＸ４』及び『ダウエックス５０ＷＸ８』、ローム・アンド・ハース社製の商品名『アンバーライトＣＧ−１２０』、東京有機化学工業社製の商品名『ＸＴ−１０２２Ｅ』、三菱化成工業社製の商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』、『ダイヤイオンＳＫ１０２』及び『ダイヤイオンＳＫ１０４』等を例示することができる。前記イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーに於いては、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも可能である。斯かる方法によれば、イソマルトースの固形物当たりの純度を、通常、６０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９９％以上の最高純度にまで高めることが可能である。尚、最高純度のイソマルトース以外のイソマルトース、つまり、イソマルトース高含有物は、通常、イソマルトース以外に、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、他の澱粉部分加水分解物、α−ソマルトシルグルコ糖質、及びα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース（以下、『開環四糖』と略称することもある。）から選ばれる１種又は２種上の糖質を、固形物当たり、通常、１乃至６０％含んでい��。
【００１５】
斯くして得られる本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、良質で上品な甘味を有すると共に、虫歯の原因の一つであるデキストランの生成を阻害する作用を有しており、虫歯を起こしにくい甘味料として好適に利用される。又、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、保存安定性も優れている。殊に、イソマルトース結晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの公知の結合剤と併用して、錠剤の糖衣剤としても有利に用いることができる。又、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの有用な性質をも兼備している。従って、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などの各種組成物に有利に用いることができる。
【００１６】
本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、各種物品の甘味付けのための調味料としても用いることができる。必要に応じて、例えば、粉飴、ブドウ糖、フラクトース、ラクトスクロース、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、スクラロース、アセスルファムＫ、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上と併用することも、必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などの増量剤の１種又は２種以上と併用することも随意である。
【００１７】
又、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物、とりわけ、これらの粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、適宜の増量剤、賦形剤、結合剤、甘味料などの１種又は２種以上と併用して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体状、錠剤状、フィルム状又はシート状などの各種形状に成型して用いることも随意である。
【００１８】
更に、本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、自体、耐酸性、耐熱性も大きいので、各種飲食物の甘味付け、呈味改良に、又品質改良を目的として用いることができる。具体的には、例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に利用できる。又、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品、健康食品などの各種飲食物に有利に利用できる。
【００１９】
更に、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物用の飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤などの各種固形物用甘味剤として、又はそれらの呈味改良剤、矯味剤、品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００２０】
本発明のイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、品質改良剤及び／又は安定剤として、有効成分、活性成分又は生理活性物質を含む健康食品、医薬品などに配合することにより、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品を得ることができる。前記有効成分や生理活性物質としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スプレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、α−グリコシルアスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、ルチン、α−グリコシルルチン、ナリンジン、α−グリコシルナリンジン、ヘスペリジン、α−グリコシルヘスペリジンなどのビタミン類、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、笹エキス、梅エキス、松エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどを例示することができる。
【００２１】
以上述べた各種組成物に、本発明のイソマルトース又はイソマルトース高含有物を含有させる方法は、これらの組成物が完成するまでの工程で含有させればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、前記組成物質量当たり、０．１％以上、好ましくは、１％以上、より好ましくは、２乃至９９．９９％配合する。
【００２２】
以下、本発明を実験例により具体的に説明する。
【００２３】
＜実験例１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』（アサヒビール株式会社製）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００２４】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、当該上清は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）を有していた。当該上清は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素含有酵素剤として用いることができる。
【００２５】
尚、前記酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、高速液体クロマトグラフィー（以下、『ＨＰＬＣ法』と略記する。）で定量して行った。ＨＰＬＣ法は、『ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製）を用いて行なった。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。
【００２６】
又、α−イソマルトシル転移酵素活性は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量して行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。
【００２７】
更に、環状四糖生成活性は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を上記ＨＰＬＣ法で定量した。環状四糖生成活性１単位は、上記条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量と定義した。
【００２８】
＜実験例２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の単離＞
【００２９】
＜実験例２−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の単離＞
実験例１で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位と、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位と、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性および環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。
【００３０】
更に、前記α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００３１】
【表１】
0004224302.tif 000002
【００３２】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により本酵素の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。
【００３３】
＜実験例２−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験例２−１で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００３４】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００３５】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。尚、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下又は１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００３６】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
0004224302.tif 000003
【００３８】
表２の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００３９】
＜実験例２−３：α−イソマルトシル転移酵素の単離＞
実験例２−１で得たα−イソマルトシル転移酵素活性画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたとき、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルから溶出し、本酵素活性画分を集めた。再度、この回収画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。各精製ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表３に示す。
【００４０】
【表３】
0004224302.tif 000004
【００４１】
＜実験例２−４：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験例２−３で得た精製α−イソマルトシル転移酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００４２】
精製α−イソマルトシル転移酵素を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
【００４３】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．０乃至９．０であった。
【００４４】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
0004224302.tif 000005
【００４６】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００４７】
前記したバチルス  グロビスポルス  Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素のいずれも本発明に於いては好適に用いることができる。
【００４８】
＜実験例３：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００４９】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９、１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）であった。
【００５０】
更に、前記培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位を有することが判明した。この粗酵素液を、実験例２−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この非吸着画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は、硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。
【００５１】
＜実験例４：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素の単離＞
【００５２】
＜実験例４−１：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の単離＞
実験例３で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチルートヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【００５３】
【表５】
0004224302.tif 000006
【００５４】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により本酵素の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。
【００５５】
＜実験例４−２：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験例４−１で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００５６】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００５７】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。尚、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下又は１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。
【００５８】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
0004224302.tif 000007
【００６０】
表６の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００６１】
＜実験例４−３：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列＞
本発明はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素自体に関する発明ではないこと、又、その詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２００１−５４４１号明細書に詳細に開示されていることから割愛するが、実験例４−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、特願２００１−５４４１号明細書に開示されているポリペプチドと同様、配列表に於ける配列番号１に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至１２８４番目のアミノ酸配列を有する。
【００６２】
＜実験例４−４：α−イソマルトシル転移酵素の単離＞
実験例３で得たα−イソマルトシル転移酵素活性画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ  Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表７に示す。
【００６３】
【表７】
0004224302.tif 000008
【００６４】
＜実験例４−５：α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験例４−４で得た精製α−イソマルトシル転移酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００６５】
精製α−イソマルトシル転移酵素を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
【００６６】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００６７】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【００６８】
【表８】
0004224302.tif 000009
【００６９】
表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。又、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００７０】
＜実験例４−６：α−イソマルトシル転移酵素のアミノ酸配列＞
本発明はα−イソマルトシル転移酵素自体に関する発明ではないこと、又、その詳細なアミノ酸配列の分析方法については、特願２０００−３５０１４２号明細書に詳細に開示されていることから割愛するが、実験例４−４で得たα−イソマルトシル転移酵素は、特願２０００−３５０１４２号明細書に開示されているとおり、配列表に於ける配列番号２に併記したアミノ酸配列に於ける第３０乃至１０９３番目のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
＜実験例５：α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の各種糖質への作用＞
各種糖質（基質）に対するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の作用について試験した。即ち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、α，α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製し、これらの溶液に、実験例２−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、又は実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２％（ｗ／ｖ）に調製し、３０℃、ｐＨ６．０で２４時間反応させた。酵素反応前後の反応液を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、『ＴＬＣ法』と略記する。）分析に供した。ＴＬＣ法は、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開して糖質を分離し、次いで、アルミプレート上に硫酸−メタノールを噴霧して発色させて全糖質を検出し、更に、還元糖質は、ジフェニルアミン−アニリン法で発色させて検出する方法により行った。ＴＬＣ法の結果を表９に示す。
【００７２】
【表９】
0004224302.tif 000010
【００７３】
表９の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【００７４】
＜実験例６：マルトオリゴ糖からの生成物＞
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース又はマルトペンタオース水溶液に、実験例４−１で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、固形物グラム当たり、マルトースおよびマルトトリオースに対しては２単位、マルトテトラオースに対しては０．２単位、マルトペンタオースに対しては０．１単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させた後、１００℃で１０分間保持して酵素を失活させて反応を停止した。得られた酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ法により測定した。ＨＰＬＣ法としては、『ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー社製）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件下で行い、検出は示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０１２』、東ソー株式会社製）を用いて行なった。その結果を表１０に示す。
【００７５】
【表１０】
0004224302.tif 000011
【００７６】
表１０の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、マルトトリオース、イソマルトース、α−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）を少量生成することが判明した。又、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルマルトースとが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ及び生成物Ｚが生成することが判明した。
【００７７】
基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘを固形物収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【００７８】
＜実験例７：生成物の構造解析＞
実験例６の方法で得た生成物Ｘおよび生成物Ｙを用いて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表１１にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１７（生成物Ｘ）、図１８（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび帰属を図１９（生成物Ｘ）、図２０（生成物Ｙ）、表１２にまとめた。
【００７９】
【表１１】
0004224302.tif 000012
【００８０】
【表１２】
0004224302.tif 000013
【００８１】
これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルグルコトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【００８２】
構造式１：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【００８３】
又、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルグルコテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
【００８４】
構造式２：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【００８５】
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
（１）本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度２以上の糖質（マルトオリゴ糖）に作用し、その非還元性末端のグルコシル基を他の分子の非還元性末端のグルコシル基の６位に転移する作用を有する分子間６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２）本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【００８６】
＜実験例８：転移受容体特異性＞
各種糖質を用いて、本酵素の糖転移受容体になり得るかどうかの試験をした。即ち、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン又はγ−サイクロデキストリンを用いて濃度１．６％の溶液（糖転移受容体溶液）を調製し、これに、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験例２−１の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素又は実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、糖供与体固形物グラム当たり、それぞれ１単位ずつ加え、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間反応させた。酵素反応後の反応液を、糖受容体が単糖又は二糖類の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、『ＧＬＣ法』と略記する。）で、糖受容体が三糖類以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖受容体が、本酵素による糖転移受容体になるか否かを確認した。尚、ＧＬＣ法に於いて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を用い、流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折形で分析した。結果を表１３に示す。
【００８７】
【表１３】
0004224302.tif 000014
【００８８】
表１３の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、その糖転移受容体として種々の糖質が利用でき、特に、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース及びスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボ−ス及びＮ−アセチルグルコサミンにも転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移する作用を有する酵素である。
【００８９】
＜実験例９：培養物からの環状四糖の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス  グロビスポルス  Ｃ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。この上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物グラム当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物グラム当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤアイオンＰＫ２１８』と『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。本糖質粉末は、環状四糖を９９．９％以上含有していた。
【００９０】
＜実験例１０：環状四糖の生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。糖質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）又はグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）を用い、それらの水溶液を別々に調製した。
【００９１】
これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり１単位と、実験例４−４の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を各種糖質に２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３）  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４）  α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
【００９２】
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験例１と同様のα−グルコシダーゼとグルコアミラーゼとを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１４に示す。
【００９３】
【表１４】
0004224302.tif 000015
【００９４】
表１４の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみの作用およびα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用すると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約８７％に増加し、澱粉部分分解物では約６４％に増加することが判明した。
【００９５】
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコシル基に作用し、そのグルコシル基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコシル基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２）α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコシル基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（３）続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。
（４）切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）乃至（３）の反応を経由することによって、新たに環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用して環状四糖の生成量が増加すると推定される。
【００９６】
＜実験例１１：澱粉液化度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり２単位と、実験例４−４の方法で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り２０単位とを加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験例１と同様にα−グルコシダーゼとグルコアミラーゼとを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１５に示す。
【００９７】
【表１５】
0004224302.tif 000016
【００９８】
表１５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度は約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ５約以下が適していることが判明した。
【００９９】
＜実験例１２：澱粉部分分解物濃度の影響＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至約５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり１単位と、実験例４−４で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り１０単位加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験例１と同様にα−グルコシダーゼとグルコアミラーゼを用いて、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１６に示す。
【０１００】
【表１６】
0004224302.tif 000017
【０１０１】
表１６の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物の濃度により変化することが判明した。
【０１０２】
＜実験例１３：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり１単位と、実験例４−４で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を固形物グラム当り１０単位と、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＣＧＴａｓｅを固形物グラム当り０乃至０．５単位加え、両酵素を併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。次いで、酵素反応液をα−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を用いて、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１７に示す。
【０１０３】
【表１７】
0004224302.tif 000018
【０１０４】
表１７の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
【０１０５】
＜実験例１５：イソマルトース遊離酵素の調製＞
デキストラン３．０ｗ／ｖ％、ペプトン０．７ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター グロビホルミス（ＩＡＭ  １２１０３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、７２時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のイソマルトース遊離酵素としてのイソマルトデキストラナーゼ活性は約１６．５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、本酵素は約１６単位／ｍｌの活性（総活性約２８８、０００単位）であった。尚、イソマルトデキストラナーゼ活性の測定は、濃度０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む濃度１．２５ｗ／ｖ％デキストラン水溶液４ｍｌを基質液とし、その基質液に酵素液１ｍｌ加えて、４０℃で２０分間酵素反応し、その反応液から１ｍｌを採り、それをソモギー銅液２ｍｌに加えて反応を停止させた後、生成したイソマルトースの還元力をソモギー・ネルソン法で定量することにより行った。イソマルトデキストラナーゼの活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのイソマルトースに相当する還元力を生成する酵素量と定義した。培養上清約１８ＬをＵＦ膜で約２Ｌに濃縮した後、８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（１０、０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液を『Ｓｅｐａｂｅａｄｓ  ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量２Ｌ）に供した。イソマルトデキストラナーゼ活性は、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した。その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解後、同緩衝液に対して透析して、イソマルトデキストラナーゼ活性として１６１，０００単位を含む部分精製酵素液約５００ｍｌを得た。
【０１０６】
＜実験例１６：α−イソマルトシルグルコ糖質及び環状四糖からのイソマルトースの調製＞
最終固形物濃度０．２％のパノース、α−イソマルトシルマルトース、α−イソマルトシルトリオース、α−イソマルトシルテトラオース、又は環状四糖水溶液に、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを、固形物グラム当たり１００単位（環状四糖の場合、１００単位又は３０００単位）を加えて、４０℃、ｐＨ５．５で２４時間作用させ、１００℃で２０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０４ＳＳ』カラム（三菱化学株式会社製）を用い、溶離液として水を用いて、カラム内温度８０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製）を用いて行なった。その結果を表１８に示す。
【０１０７】
【表１８】
0004224302.tif 000019
【０１０８】
表１８の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質にイソマルトデキストラナーゼを作用させた結果、基質としてのパノースからは、グルコースとイソマルトースのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルマルトースからは、イソマルトースとマルトースとのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルトリオースからは、イソマルトースとマルトトリオースのみが生成し、基質としてのα−イソマルトシルテトラオースからは、イソマルトースとマルトテトラオースのみが生成することが判明した。一方、基質としての環状四糖からは、生成物Ａを中間体として、イソマルトースのみが生成することが判明した。
【０１０９】
次いで、基質としての環状四糖からの中間体である生成物Ａの精製と単離を行った。即ち、分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  Ｒ３５５−１５Ｓ−１５  １２Ａ』（株式会社ワイエムシィ社製）を用いて生成物Ａを精製し単離することにより、上記の環状四糖からの反応物から、純度９８．２％以上の生成物Ａを固形物収率約７．２％で単離した。
【０１１０】
生成物Ａについて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析とを行なった。メチル化分析結果は表１９にまとめた。ＮＭＲ分析結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１に示した。又、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２２に示し、それらの帰属を表２０にまとめた。
【０１１１】
【表１９】
0004224302.tif 000020
【０１１２】
【表２０】
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【０１１３】
これらの結果から、イソマルトデキストラナーゼによる環状四糖からイソマルトースを生成する際の中間体である生成物Ａは、環状四糖のα−１，３結合のいずれか一つが加水分解して開環化した四糖類で、構造式３で表わされるα−グルコシル−（１→６）−α−グルコシル−（１→３）−α−グルコシル−（１→６）−α−グルコース（開環四糖）であることが判明した。
【０１１４】
構造式３：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→３）αＤ−Ｇｌｃｐ−（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ
【０１１５】
以上のことから、イソマルトデキストラナーゼのα−イソマルトシルグルコ糖質に対する作用は以下のように判断される。
【０１１６】
イソマルトデキストラナーゼは、基質として、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するα−イソマルトシルグルコ糖質に作用し、その非還元性末端のイソマルトシル基とグルコース（マルトオリゴ糖）残基間のα−１，４結合を特異的に加水分解して、イソマルトースとグルコース（マルトオリゴ糖）とを生成する。又、イソマルトデキストラナーゼは、基質として、環状四糖にも作用し、そのα−１，３結合を加水分解して、開環して、中間体として開環四糖を生成し、さらに、開環四糖にも作用し、そのα−１，３結合を加水分解して、イソマルトースを生成する。
【０１１７】
＜実験例１７：各種基質からのイソマルトースの生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びイソマルトデキストラナーゼの作用によるイソマルトースの生成について試験した。即ち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、又は澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）と塩化カルシウムを用いて、それぞれ水溶液の糖質最終濃度が５％、塩化カルシウム最終濃度が１ｍＭとなるように調製した。次いで、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり０．２単位と、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り１００単位とを加え、これらを４０℃、ｐＨ５．５で反応させた。反応条件は、下記２つの系で行った。
【０１１８】
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を糖質に６５時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、イソマルトデキストラナーゼを６５時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとを併用で糖質に６５時間作用させた後、両酵素を加熱失活させた。次いで、加熱処理した酵素反応液中のイソマルトース生成量をＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表２１に示す。
【０１１９】
【表２１】
0004224302.tif 000022
【０１２０】
表２１の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼの作用によってイソマルトースが生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にイソマルトデキストラナーゼを作用させた場合には、約１５％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとを共に作用させると、いずれの糖質に於いても、イソマルトースの生成量は向上し、特に、マルトヘプタオース、アミロース、澱粉部分分解物では６０％以上にまで増加することが判明した。このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用におけるイソマルトースの生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推定される。
【０１２１】
（１）α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、アミロースや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコシル基に作用し、そのグルコシル基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコシル基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２）イソマルトデキストラナーゼは、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基とα−１，４グルカン鎖間α−１，４結合を加水分解して、イソマルトースとグルコース重合度が２減じたグルカン鎖とを生成する。
（３）切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）乃至（２）の反応を受けることによって、新たにイソマルトースが生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとの併用で、上記したように、両酵素が繰り返し作用してイソマルトースの生成量が増加すると推定される。
【０１２２】
＜実験例１８：イソアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（最終濃度５％、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルス  Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験例１５で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当り１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り０乃至２５０単位加え、４０℃、ｐＨ５．５で併用で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表２２に示す。
【０１２３】
【表２２】
0004224302.tif 000023
【０１２４】
表２２の結果から明らかなように、イソアミラーゼを添加することによって、イソマルトースの生成量が増加することが判明した。
【０１２５】
＜実験例１９：澱粉部分分解物濃度の影響＞
濃度の異なる８種類の澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至約５）水溶液（最終濃度１乃至４０％の水溶液、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、それぞれに、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を固形物グラム当たり０．２単位と、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり２５０単位加え、４０℃、ｐＨ５．５で併用で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表２３に示す。
【０１２６】
【表２３】
0004224302.tif 000024
【０１２７】
表２３の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が１％の低濃度では、イソマルトースの生成量は約７３％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、イソマルトースの生成量は約５１％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存してイソマルトースの生成量が変化することが判明した。
【０１２８】
＜実験例２０：澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃にオートクレーブし、約４０℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに最終澱粉濃度５％、ｐＨ５．５に調整した後、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物グラム当たり０．２単位と、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り１００単位と、シュードモナス・アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物グラム当たり２５０単位を加え、４０℃で６５時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表２４に示す。
【０１２９】
【表２４】
0004224302.tif 000025
【０１３０】
表２４の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼとによるイソマルトース生成率は、澱粉の液化度の影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からのイソマルトースの生成率は高く、逆に、液化の程度が高い、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からのイソマルトースの生成率が低いことが判明した。具体的には、澱粉の部分分解の程度はＤＥ約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１３１】
＜実験例２３：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとグルコアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（最終濃度２０％、１ｍＭ塩化カルシウム含有）を調製し、実験例４−１で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．２単位と、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り１００単位と、シュードモナス  アミロデラモサ由来イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り２５０単位と、バチルス  ステアロサーモフィルス由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所）を０乃至０．５単位加え、これら酵素を併用して、４０℃、ｐＨ５．５で６５時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当り２０単位加え、５０℃で２４時間作用させた後、１００℃で２０分間熱処理して酵素を失活させた。生成したイソマルトースをＨＰＬＣ法で定量した。それらの結果を表２５に示す。
【０１３２】
【表２５】
0004224302.tif 000026
【０１３３】
表２５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とイソマルトデキストラナーゼの酵素反応系に、ＣＧＴａｓｅを添加することにより、イソマルトースの生成量が増加することが判明した。尚、前記グルコアミラーゼは、ＣＧＴａｓｅ存在下で生成した、イソマルトースに１個以上のＤ−グルコース残基を結合した糖質から、Ｄ−グルコース残基を遊離させてイソマルトースを更に生成させる目的で用いたものである。
【０１３４】
以下、実施例１乃至５及び実施例６乃至１６に於いて、本発明のイソマルトース又はイソマルトース高含有物の製造方法とその用途について詳細に説明する。
【０１３５】
【実施例１】
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００Ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験例４−１の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１単位と、実験例４−４の方法で得たバチルス  グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素を澱粉グラム当り１０単位加えて４８時間反応させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この酵素反応液の一部をとり、ＨＰＬＣ法により環状四糖の生成量を調べたところ、糖組成で約８４％であった。尚、ＨＰＬＣ法は、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製）を用いて行なった。この酵素反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼ・アマノ』、天野エンザイム株式会社製）を澱粉グラム当たり１５００単位と、グルコアミラーゼ（商品名『ＸＬ−４』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり７５単位とを加えて２４時間反応させて残存する還元性オリゴ糖等を加水分解し、更に、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し、温度９０℃で１時間保持して酵素を失活させ、次いで、不溶物を濾別した。この濾液を逆浸透膜（商品名『ホロセップＨＲ５１５５ＰＩ』、東洋紡績株式会社製）を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って、脱色、脱塩、濾過、濃縮することにより、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。本糖液を、イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ＋形）型』、オルガノ社製）を充填したカラム（ゲル量約２２５Ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５Ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行った。溶出液の糖組成を前記ＨＰＬＣ法でモニターして、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、これを常法に従って、脱塩、脱色、濾過、濃縮して、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。本糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。得られた環状四糖含有糖液をエバポレーターで濃度約５０％にまで濃縮した後、この濃縮液約５ｋｇを円筒状プラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させて環状四糖を晶析させた。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し、環状四糖結晶を湿質量として１，３６０ｇ回収し、更に、６０℃で３時間乾燥して、環状四糖結晶粉末を１，１７０ｇ得た。本結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖結晶粉末の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
【０１３６】
次いで、前記環状四糖結晶粉末を脱イオン水に溶解し、濃度１％、ｐＨ５．５、温度５０℃に調整した後、実験例１５の方法で調製したイソマルトデキストラナーゼを固形物グラム当り５００単位加え、ｐＨ５．５、５０℃で７０時間反応させた。９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃度約７５％に濃縮して、シラップ状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。
【０１３７】
本品は、固形物当たり、イソマルトース９６．１％、開環四糖２．８％、及びその他の糖質を１．１％含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１３８】
【実施例２】
実施例１の方法で得られたシラップ状イソマルトース高含有物を、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０』、Ｎａ＋形、オルガノ株式会社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。即ち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム１０本に充填し、これらカラムを直列接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記シラップを樹脂量に対して１．５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターしながら、イソマルトース高含有画分を採取し、これを精製し、イソマルトース高含有液を得た。イソマルトースの固形物当たりの収率は約８０％であった。本液を、常法に従って、脱色、脱塩、濃縮して、濃度約７５％のシラップ状イソマルトース高含有物を得た。
【０１３９】
本品は、固形物当たり約９９．９％以上の極めて高純度のイソマルトースを含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１４０】
【実施例３】
タピオカ澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験例２−１の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当り０．２単位と、実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当り１００単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り２５０単位と、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り０．５単位になるように加え、ｐＨ５．５、温度４０で６４時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、温度５０℃に調整した後、グルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物グラム当たり１０単位加え、２４時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮し、乾燥し、粉末化し、造粒して顆粒状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。
【０１４１】
本品は、グルコース１１．０％、イソマルトース６６．５％、その他の２糖類を２．４％、３糖類以上を２０．１％含有していた。本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１４２】
【実施例４】
バチルス  グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１４３）を実験例１の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を８．８単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２６．７単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。とうもろこし澱粉を濃度約２７％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更に実験例１５の方法で得たイソマルトデキストラナーゼを澱粉グラム当り１００単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り２５０単位と、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り０．５単位となるように加え、ｐＨ５．５、温度４０℃で７０時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、温度５０℃に調整した後、グルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位加え、２４時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７５％のシラップ状イソマルトース高含有物を固形物当たり約９５％の収率で得た。
【０１４３】
本品は、固形物当り、グルコース３２．６％、イソマルトース５９．４％、その他の２糖類を１．２％、３糖類以上を６．８％含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１４４】
【実施例５】
実施例４の方法で得られたイソマルトース含有シラップを原糖液とし、イソマルトースの含量を高めるため、実施例２の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なった後、イソマルトース高含有画分を採取し、これを精製し、濃縮して、イソマルトース高含有シラップを固形物当たり約６０％の収率で得た。
【０１４５】
本品は、固形物当たり、グルコース４．８％、イソマルトース８５．３％、その他の２糖類を３．９％、３糖類以上を６．０％含有していた。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１４６】
【実施例６】
甘味料
実施例１の方法により得た粉末状イソマルトース高含有物０．８質量部に、トレハロース含水結晶（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）０．２質量部、α−グリコシルステビオシド（商品名『αＧスィート』、東洋精糖株式会社販売）０．０１質量部、及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１質量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性を有するイソマルトースを含有する低甘味料組成物である。又、本品は、室温保存下、変質劣化の懸念が無く、安定である。
【０１４７】
【実施例７】
ハードキャンディー
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例２の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物５０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６質量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起きず、吸湿性少ない安定で高品質のハードキャンディーである。
【０１４８】
【実施例８】
チューインガム
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水結晶マルチトール２質量部、キシリトール２質量部、実施例５の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物２質量部、及びトレハロース含水結晶１質量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューインガムとして好適である。
【０１４９】
【実施例９】
粉末ペプチド
４０％食品用大豆ペプチド溶液（商品名『ハイニュートＳ』、不二製油株式会社販売）１質量部に、実施例４の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸材料、健康食品材料としても有用である。
【０１５０】
【実施例１０】
浴用剤
ユズの皮ジュース１質量部に対して、実施例３の方法で得た顆粒状イソマルトース高含有物１０質量部及び環状四糖１質量部の割合で混合し、粉末化して、ユズの皮エキス含有イソマルトース含有粉末を得た。
【０１５１】
本粉末５質量部に、焼塩９０質量部、トレハロース含水結晶２質量部、無水ケイ酸１質量部及びα−グルコシル  ヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジン』、株式会社林原販売）０．５質量部を混合して浴用剤を製造した。
【０１５２】
本品は、ユズの香りも豊かで、入浴用の湯に１００乃至１０，０００倍に希釈して利用すればよく、入浴後は、肌がしっとりしなめらかで、湯冷めしない高品質の浴用剤である。
【０１５３】
【実施例１１】
化粧用クリーム
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例２の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物２質量部、α−グルコシル  ルチン（商品名『αＧルチン』、株式会社林原販売）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１，３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【０１５４】
【実施例１２】
練歯磨
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例５の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物１５質量部、サッカリン０．０２質量部および防腐剤０．０５質量部を水１３質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【０１５５】
【実施例１３】
流動食用固体製剤
実施例１の方法で得た粉末状イソマルトース高含有物１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。
【０１５６】
本品は、整腸作用に優れた流動食である。１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【０１５７】
【実施例１４】
錠剤
アスピリン５０質量部に実施例２の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物１４質量部、コーンスターチ４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。
【０１５８】
本品は、イソマルトースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
【０１５９】
【実施例１５】
糖衣錠
質量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例１の方法で得た粉末状イソマルトース高含有物４０質量部、プルラン（平均分子量２０万）２質量部、水３０質量部、タルク２５質量部および酸化チタン３質量部からなる下掛け液を用いて、錠剤質量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、環状四糖結晶粉末６５質量部、プルラン１質量部および水３４質量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【０１６０】
【実施例１６】
外傷治療用膏薬
実施例５の方法で得たシラップ状イソマルトース高含有物１００質量部およびマルトース３００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、イソマルトースにより、ヨウ素、メタノールの揮散が防止され、経時変化の少ない商品価値の高い膏薬である。
【０１６１】
又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【０１６２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、イソマルトースの新規な製造方法とその用途に関し、より詳細には、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度２以上の糖質に、α−イソマルトシル転移酵素の非存在下又は存在下で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させて、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度３以上のα−イソマルトシルグルコ糖質、及び／又は、環状四糖を生成させ、次いで、イソマルトース遊離酵素を作用させてイソマルトースを生成させ、この生成したイソマルトースを採取することを特徴とするイソマルトースの製造方法とその用途に関する発明である。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用なイソマルトース及びイソマルトース高含有物を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得ることなった。斯かる本発明によるイソマルトース及びイソマルトース高含有物は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。
【０１６３】
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明である。
【０１６４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> Process for producing isomaltose and uses thereof
<130> WO899
<150> JP 130,922/01
<151> 2001-4-27
<160> 2
<210> 1
<211> 5180
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (877)...(4731)
<400> 1
atctaccggt ttttgtgaag tttggcagta ttcttccgat gaatttgaac gcgcaatatc  60
aagtgggcgg gaccattggc aacagcttga cgagctacac gaatctcgcg ttccgcattt 120
atccgcttgg gacaacaacg tacgactgga atgatgatat tggcggttcg gtgaaaacca 180
taacttctac agagcaatat gggttgaata aagaaaccgt gactgttcca gcgattaatt 240
ctaccaagac attgcaagtg tttacgacta agccttcctc tgtaacggtg ggtggttctg 300
tgatgacaga gtacagtact ttaactgccc taacgggagc gtcgacaggc tggtactatg 360
atactgtaca gaaattcact tacgtcaagc ttggttcaag tgcatctgct caatccgttg 420
tgctaaatgg cgttaataag gtggaatatg aagcagaatt cggcgtgcaa agcggcgttt 480
caacgaacac gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc 540
ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg 600
ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag 660
tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta 720
gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac 780
ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc 840
cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg 876
atg cgt cca cca aac aaa gaa att cca cgt att ctt gct ttt ttt aca  924
Met Arg Pro Pro Asn Lys Glu Ile Pro Arg Ile Leu Ala Phe Phe Thr
1               5                  10                  15
gcg ttt acg ttg ttt ggt tca acc ctt gcc ttg ctt cct gct ccg cct  972
Ala Phe Thr Leu Phe Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro
20                  25                  30
gcg cat gcc tat gtc agc agc cta gga aat ctc att tct tcg agt gtc 1020
Ala His Ala Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val
35                  40                  45
acc gga gat acc ttg acg cta act gtt gat aac ggt gcg gag ccg agt 1068
Thr Gly Asp Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser
50                  55                  60
gat gac ctc ttg att gtt caa gcg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg 1116
Asp Asp Leu Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val
65                  70                  75                  80
gat tat cgt cca aat agc ata acg ccg agc gcg aag acg ccg atg ctg 1164
Asp Tyr Arg Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu
85                  90                  95
gat ccg aac aaa act tgg tca gct gta gga gct acg att aat acg aca 1212
Asp Pro Asn Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr
100                 105                 110
gcc aat cca atg acc atc acg act tcc aat atg aag att gag att acc 1260
Ala Asn Pro Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr
115                 120                 125
aag aat cca gta cga atg acg gtc aag aag gcg gac ggc act acg cta 1308
Lys Asn Pro Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu
130                 135                 140
ttc tgg gaa cca tca ggc gga ggg gta ttc tca gac ggt gtg cgc ttc 1356
Phe Trp Glu Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe
145                 150                 155                 160
ctt cat gcc aca ggg gat aat atg tat ggc atc cgg agc ttc aat gct 1404
Leu His Ala Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala
165                 170                 175
ttt gat agc ggg ggt gac ctg ctg cgg aat tcg tcc aat cat gcc gcc 1452
Phe Asp Ser Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala
180                 185                 190
cat gcg ggt gaa cag gga gat tcc ggt ggt ccg ctt att tgg agt acg 1500
His Ala Gly Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr
195                 200                 205
gca gga tat gga cta tta gtc gat agc gat ggc ggc tac ccc tat aca 1548
Ala Gly Tyr Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr
210                 215                 220
gat agc aca acc ggt caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct 1596
Asp Ser Thr Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro
225                 230                 235                 240
gag gga cgt cgt tat gcg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg ctc 1644
Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu
245                 250                 255
gga acc ccc aag gaa att atg acc gac gta ggg gaa atc aca ggg aaa 1692
Gly Thr Pro Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys
260                 265                 270
ccg cct atg ctg cct aag tgg tcg ctt gga ttc atg aac ttt gag tgg 1740
Pro Pro Met Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp
275                 280                 285
gat acg aat caa acg gag ttt acg aat aat gtg gat acg tat cgt gcc 1788
Asp Thr Asn Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala
290                 295                 300
aaa aat atc ccc ata gat gct tac gcc ttc gac tat gac tgg aaa aag 1836
Lys Asn Ile Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys
305                 310                 315                 320
tac ggg gaa acc aac tat ggt gaa ttc gcg tgg aat acg act aat ttc 1884
Tyr Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe
325                 330                 335
cct tct gcg tca acg act tct tta aag tca aca atg gat gct aaa ggc 1932
Pro Ser Ala Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly
340                 345                 350
atc aaa atg atc gga att aca aaa ccc cgc atc gtt acg aag gat gct 1980
Ile Lys Met Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala
355                 360                 365
tca gcg aat gtg acg acc caa ggg acg gac gcg aca aat ggc ggt tat 2028
Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr
370                 375                 380
ttt tat cca ggc cat aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act 2076
Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr
385                 390                 395                 400
gtg cgt agt atc gat cct tac aat gct aac gaa cgt gct tgg ttc tgg 2124
Val Arg Ser Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp
405                 410                 415
aat cat tcc aca gat gcg ctt aat aaa ggg atc gta ggt tgg tgg aat 2172
Asn His Ser Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn
420                 425                 430
gac gag acg gat aaa gta tct tcg ggt gga gcg tta tat tgg ttt ggc 2220
Asp Glu Thr Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly
435                 440                 445
aat ttc aca aca ggc cac atg tct cag acg atg tac gaa ggg ggg cgg 2268
Asn Phe Thr Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg
450                 455                 460
gct tac acg agt gga gcg cag cgt gtt tgg caa acg gct aga acc ttc 2316
Ala Tyr Thr Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe
465                 470                 475                 480
tac cca ggt gcc cag cgg tat gcg act acg ctt tgg tct ggc gat att 2364
Tyr Pro Gly Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile
485                 490                 495
ggc att caa tac aat aaa ggc gaa cgg atc aat tgg gct gcc ggg atg 2412
Gly Ile Gln Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met
500                 505                 510
cag gag caa agg gca gtt atg cta tcc tcc gtg aac aat ggc cag gtg 2460
Gln Glu Gln Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val
515                 520                 525
aaa tgg ggc atg gat acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc acg acg 2508
Lys Trp Gly Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr
530                 535                 540
aac aat ccg aat ccc gat tta tac gct cgg tgg atg cag ttc agt gcc 2556
Asn Asn Pro Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala
545                 550                 555                 560
cta acg cct gtt ttc cga gtg cat ggg aac aac cat cag cag cgc cag 2604
Leu Thr Pro Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln
565                 570                 575
cca tgg tac ttc gga tcg act gcg gag gag gcc tcc aaa gag gca att 2652
Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile
580                 585                 590
cag ctg cgg tac tcc ctg atc cct tat atg tat gcc tat gag aga agt 2700
Gln Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser
595                 600                 605
gct tac gag aat ggg aat ggg ctc gtt cgg cca ttg atg caa gcc tat 2748
Ala Tyr Glu Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr
610                 615                 620
cca aca gat gcg gcc gtc aaa aat tac acg gat gct tgg atg ttt ggt 2796
Pro Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly
625                 630                 635                 640
gac tgg ctg ctg gct gca cct gtg gta gat aaa cag cag acg agt aag 2844
Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys
645                 650                 655
gat atc tat tta ccg tct ggg tca tgg att gac tat gcg cga ggc aat 2892
Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn
660                 665                 670
gca ata act ggc ggt caa acc atc cga tat tcg gtt aat ccg gac acg 2940
Ala Ile Thr Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr
675                 680                 685
ttg aca gac atg cct ctc ttt att aaa aaa ggt gcc att att cca aca 2988
Leu Thr Asp Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr
690                 695                 700
cag aaa gtg cag gat tac gta ggg cag gct tcc gtc act tcc gtt gat 3036
Gln Lys Val Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp
705                 710                 715                 720
gtg gat gtg ttt ccg gat acg acg cag tcg agt ttc acg tac tac gat 3084
Val Asp Val Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp
725                 730                 735
gat gat ggc gcc agt tat aac tat gag agc ggc act tat ttt aag caa 3132
Asp Asp Gly Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln
740                 745                 750
aat atg act gct cag gat aat ggg tca ggc tcg tta agt ttt act tta 3180
Asn Met Thr Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu
755                 760                 765
gga gca aag agt ggc agt tac acg ccg gct ctc caa tcc tat atc gtt 3228
Gly Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val
770                 775                 780
aag ctg cac ggt tct gct gga act tct gtt acg aat aac agc gca gct 3276
Lys Leu His Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala
785                 790                 795                 800
atg aca tct tat gca agc ttg gaa gca tta aaa gct gct gct ggg gaa 3324
Met Thr Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu
805                 810                 815
ggc tgg gcg act ggg aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa 3372
Gly Trp Ala Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys
820                 825                 830
gtg acg gca ggt aca gct tct tct aaa tct att gct gtt aca ggt gtt 3420
Val Thr Ala Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val
835                 840                 845
gct gcc gtg agc gca act act tcg caa tac gaa gct gag gat gca tcg 3468
Ala Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser
850                 855                 860
ctt tct ggc aat tcg gtt gct gca aag gcg tcc ata aac acg aat cat 3516
Leu Ser Gly Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His
865                 870                 875                 880
acc gga tat acg gga act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc 3564
Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly
885                 890                 895
gct ggt gtc acc ttc tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat 3612
Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn
900                 905                 910
gtc tcc ttg cgt tat gcg aat gct tca ggc acg gct aag tca gtc agt 3660
Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser
915                 920                 925
att ttt gtt aat gga aaa aga gtg aag tcc acc tcg ctc gct aat ctc 3708
Ile Phe Val Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu
930                 935                 940
gca aat tgg gac act tgg tct aca caa tct gag aca ctg ccg ttg acg 3756
Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr
945                 950                 955                 960
gca ggt gtg aat gtt gtg acc tat aaa tat tac tcc gat gcg gga gat 3804
Ala Gly Val Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp
965                 970                 975
aca ggc aat gtt aac atc gac aac atc acg gta cct ttt gcg cca att 3852
Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile
980                 985                 990
atc ggt aag tat gaa gca gag agt gct gag ctt tct ggt ggc agc tca 3900
Ile Gly Lys Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser
995                1000                1005
ttg aac acg aac cat tgg tac tac agt ggt acg gct ttt gta gac ggt 3948
Leu Asn Thr Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly
1010                1015                1020
ttg agt gct gta ggc gcg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct agc 3996
Leu Ser Ala Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser
1025               1030                1035                1040
gca gga agt tat cag gta gcg ctg cga tat gcg aat ggc agt gca gcg 4044
Ala Gly Ser Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala
1045                1050                1055
acg aaa acg ttg agt act tat atc aat gga gcc aag ctg ggg caa acc 4092
Thr Lys Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr
1060                1065                1070
agt ttt acg agt cct ggt acg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg 4140
Ser Phe Thr Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val
1075                1080                1085
caa acg gtg acg tta aat gca ggg gca aac acg att gcg ttt aaa tac 4188
Gln Thr Val Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr
1090                1095                1100
gac gcc gct gac agc ggg aac atc aac gta gat cgt ctg ctt ctt tca 4236
Asp Ala Ala Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser
1105               1110                1115                1120
act tcg gca gcg gga acg ccg gtt tct gag cag aac ctg cta gac aat 4284
Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn
1125                1130                1135
ccc ggt ttc gag cgt gac acg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg 4332
Pro Gly Phe Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp
1140                1145                1150
cat cca ggc acg caa gct gtt gct ttt ggc gtt gat agc ggc tca acc 4380
His Pro Gly Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr
1155                1160                1165
acc aat ccg ccg gaa tcc ccg tgg tcg ggt gat aag cgt gcc tac ttc 4428
Thr Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe
1170                1175                1180
ttt gca gca ggt gcc tat caa caa agc atc cat caa acc att agt gtt 4476
Phe Ala Ala Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val
1185               1190                1195                1200
cct gtt aat aat gta aaa tac aaa ttt gaa gcc tgg gtc cgc atg aag 4524
Pro Val Asn Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys
1205                1210                1215
aat acg acg ccg acg acg gca aga gcc gaa att caa aac tat ggc gga 4572
Asn Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly
1220                1225                1230
tca gcc att tat gcg aac ata agt aac agc ggt gtt tgg aaa tat atc 4620
Ser Ala Ile Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile
1235                1240                1245
agc gta agt gat att atg gtg acc aat ggt cag ata gat gtt gga ttt 4668
Ser Val Ser Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe
1250                1255                1260
tac gtg gat tca cct ggt gga act acg ctt cac att gat gat gtg cgc 4716
Tyr Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg
1265               1270                1275                1280
gta acc aaa caa taa 4731
Val Thr Lys Gln
acaaacaacc agctctcccg ttaatgggag ggctggttgt ttgttatgat aatccatcta 4791
tttagagtgg attaaacgtt ttgaagtgct tgctgaactt cttgcacaat ggataacgcc 4851
gcggtgcggg cacttgagaa agcacgttct gcaagctctc ccttacctgt acagccgtct 4911
ccgcagaagt agaaaggaac gttttccacg cgtatcggca gcagattatt ggaagcaatg 4971
tttttcacgc tggaaaccat cgctttcttg gaaacccgtt tcacggctgt gacatcgcgc 5031
cagcctggat aatgtttatc aaataaggct tccatttgga ggttcttctc ttccaggtac 5091
gctttgcgct gctcctcgtt atcaaagcgg tcgcttaagt atgcgatacc ttgcagcagc 5151
tgcccgcctt ctggtactag tgtgtgatc 5180
<210> 2
<211> 3869
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (241)...(3522)
<400> 2
tcatcgctac tggcaatcgg attcaaacaa atggctgcag ctcgcacaga cgattgtgga  60
aagggaatat ctgatttaac catacggcgg tcgcgattga ttgaatagga ttcgtggccg 120
cctaatattg aaagggggga tgcgtggagc agcgcatgca cggcgaggaa taactgttgt 180
tggagcctct aagtcattca tgtttagcaa acaaatttcg gtacgaaagg ggaaatgttt 240
atg tat gta agg aat cta aca ggt tca ttc cga ttt tct ctc tct ttt 288
Met Tyr Val Arg Asn Leu Thr Gly Ser Phe Arg Phe Ser Leu Ser Phe
1               5                  10                  15
ttg ctc tgt ttc tgt ctc ttc gtc ccc tct att tat gcc att gat ggt 336
Leu Leu Cys Phe Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Tyr Ala Ile Asp Gly
20                  25                  30
gtt tat cat gcg cca tac gga atc gat gat ctg tac gag att cag gcg 384
Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly Ile Asp Asp Leu Tyr Glu Ile Gln Ala
35                  40                  45
acg gag cgg agt cca aga gat ccc gtt gca ggc gat act gtg tat atc 432
Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Val Ala Gly Asp Thr Val Tyr Ile
50                  55                  60
aag ata aca acg tgg ccc att gaa tca gga caa acg gct tgg gtg acc 480
Lys Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser Gly Gln Thr Ala Trp Val Thr
65                  70                  75                  80
tgg acg aaa aac ggt gtc aat caa gct gct gtc gga gca gca ttc aaa 528
Trp Thr Lys Asn Gly Val Asn Gln Ala Ala Val Gly Ala Ala Phe Lys
85                  90                  95
tac aac agc ggc aac aac act tac tgg gaa gcg aac ctt ggc act ttt 576
Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu Gly Thr Phe
100                 105                 110
gca aaa ggg gac gtg atc agt tat acc gtt cat ggc aac aag gat ggc 624
Ala Lys Gly Asp Val Ile Ser Tyr Thr Val His Gly Asn Lys Asp Gly
115                 120                 125
gcg aat gag aag gtt atc ggt cct ttt act ttt acc gta acg gga tgg 672
Ala Asn Glu Lys Val Ile Gly Pro Phe Thr Phe Thr Val Thr Gly Trp
130                 135                 140
gaa tcc gtt agc agt atc agc tct att acg gat aat acg aac cgt gtt 720
Glu Ser Val Ser Ser Ile Ser Ser Ile Thr Asp Asn Thr Asn Arg Val
145                 150                 155                 160
gtg ctg aat gcg gtg ccg aat aca ggc aca ttg aag cca aag atc aac 768
Val Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Lys Pro Lys Ile Asn
165                 170                 175
ctt tcc ttt acg gcg gat gat gtc ctc cgc gta cag gtt tct cca acc 816
Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Leu Arg Val Gln Val Ser Pro Thr
180                 185                 190
gga aca gga acg tta agc agt gga ctt agt aat tac aca gtt tca gat 864
Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ser Asp
195                 200                 205
acc gcc tca acc act tgg ctt aca act tcc aag ctg aag gtg aag gtg 912
Thr Ala Ser Thr Thr Trp Leu Thr Thr Ser Lys Leu Lys Val Lys Val
210                 215                 220
gat aag aat cca ttc aaa ctt agt gtg tat aag cct gat gga acg acg 960
Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Val Tyr Lys Pro Asp Gly Thr Thr
225                 230                 235                 240
ttg att gcc cgt caa tat gac agc act acg aat cgt aac att gcc tgg 1008
Leu Ile Ala Arg Gln Tyr Asp Ser Thr Thr Asn Arg Asn Ile Ala Trp
245                 250                 255
tta acc aat ggc agt aca atc atc gac aag gta gaa gat cat ttt tat 1056
Leu Thr Asn Gly Ser Thr Ile Ile Asp Lys Val Glu Asp His Phe Tyr
260                 265                 270
tca ccg gct tcc gag gag ttt ttt ggc ttt gga gag cat tac aac aac 1104
Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu His Tyr Asn Asn
275                 280                 285
ttc cgt aaa cgc gga aat gat gtg gac acc tat gtg ttc aac cag tat 1152
Phe Arg Lys Arg Gly Asn Asp Val Asp Thr Tyr Val Phe Asn Gln Tyr
290                 295                 300
aag aat caa aat gac cgc acc tac atg gca att cct ttt atg ctt aac 1200
Lys Asn Gln Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala Ile Pro Phe Met Leu Asn
305                 310                 315                 320
agc agc ggt tat ggc att ttc gta aat tca acg tat tat tcc aaa ttt 1248
Ser Ser Gly Tyr Gly Ile Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Lys Phe
325                 330                 335
cgg ttg gca acc gaa cgc acc gat atg ttc agc ttt acg gct gat aca 1296
Arg Leu Ala Thr Glu Arg Thr Asp Met Phe Ser Phe Thr Ala Asp Thr
340                 345                 350
ggg ggt agt gcc gcc tcg atg ctg gat tat tat ttc att tac ggt aat 1344
Gly Gly Ser Ala Ala Ser Met Leu Asp Tyr Tyr Phe Ile Tyr Gly Asn
355                 360                 365
gat ttg aaa aat gtg gtg agt aac tac gct aac att acc ggt aag cca 1392
Asp Leu Lys Asn Val Val Ser Asn Tyr Ala Asn Ile Thr Gly Lys Pro
370                 375                 380
aca gcg ctg ccg aaa tgg gct ttc ggg tta tgg atg tca gct aac gag 1440
Thr Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser Ala Asn Glu
385                 390                 395                 400
tgg gat cgt caa acc aag gtg aat aca gcc att aat aac gcg aac tcc 1488
Trp Asp Arg Gln Thr Lys Val Asn Thr Ala Ile Asn Asn Ala Asn Ser
405                 410                 415
aat aat att ccg gct aca gcg gtt gtg ctc gaa cag tgg agt gat gag 1536
Asn Asn Ile Pro Ala Thr Ala Val Val Leu Glu Gln Trp Ser Asp Glu
420                 425                 430
aac acg ttt tat att ttc aat gat gcc acc tat acc ccg aaa acg ggc 1584
Asn Thr Phe Tyr Ile Phe Asn Asp Ala Thr Tyr Thr Pro Lys Thr Gly
435                 440                 445
agt gct gcg cat gcc tat acc gat ttc act ttc ccg aca tct ggg aga 1632
Ser Ala Ala His Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Phe Pro Thr Ser Gly Arg
450                 455                 460
tgg acg gat cca aaa gcg atg gca gac aat gtg cat aac aat ggg atg 1680
Trp Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Asp Asn Val His Asn Asn Gly Met
465                 470                 475                 480
aag ctg gtg ctt tgg cag gtc cct att cag aaa tgg act tca acg ccc 1728
Lys Leu Val Leu Trp Gln Val Pro Ile Gln Lys Trp Thr Ser Thr Pro
485                 490                 495
tat acc cag aaa gat aat gat gaa gcc tat atg acg gct cag aat tat 1776
Tyr Thr Gln Lys Asp Asn Asp Glu Ala Tyr Met Thr Ala Gln Asn Tyr
500                 505                 510
gca gtt ggc aac ggt agc gga ggc cag tac agg ata cct tca gga caa 1824
Ala Val Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Arg Ile Pro Ser Gly Gln
515                 520                 525
tgg ttc gag aac agt ttg ctg ctt gat ttt acg aat acg gcc gcc aaa 1872
Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Thr Ala Ala Lys
530                 535                 540
aac tgg tgg atg tct aaa cgc gct tat ctg ttt gat ggt gtg ggt atc 1920
Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly Val Gly Ile
545                 550                 555                 560
gac ggc ttc aaa aca gat ggc ggt gaa atg gta tgg ggt cgc tca aat 1968
Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp Gly Arg Ser Asn
565                 570                 575
act ttc tca aac ggt aag aaa ggc aat gaa atg cgc aat caa tac ccg 2016
Thr Phe Ser Asn Gly Lys Lys Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr Pro
580                 585                 590
aat gag tat gtg aaa gcc tat aac gag tac gcg cgc tcg aag aaa gcc 2064
Asn Glu Tyr Val Lys Ala Tyr Asn Glu Tyr Ala Arg Ser Lys Lys Ala
595                 600                 605
gat gcg gtc tcc ttt agc cgt tcc ggc acg caa ggc gca cag gcg aat 2112
Asp Ala Val Ser Phe Ser Arg Ser Gly Thr Gln Gly Ala Gln Ala Asn
610                 615                 620
cag att ttc tgg tcc ggt gac caa gag tcg acg ttt ggt gct ttt caa 2160
Gln Ile Phe Trp Ser Gly Asp Gln Glu Ser Thr Phe Gly Ala Phe Gln
625                 630                 635                 640
caa gct gtg aat gca ggg ctt acg gca agt atg tct ggc gtt cct tat 2208
Gln Ala Val Asn Ala Gly Leu Thr Ala Ser Met Ser Gly Val Pro Tyr
645                 650                 655
tgg agc tgg gat atg gca ggc ttt aca ggc act tat cca acg gct gag 2256
Trp Ser Trp Asp Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala Glu
660                 665                 670
ttg tac aaa cgt gct act gaa atg gct gct ttt gca ccg gtc atg cag 2304
Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Glu Met Ala Ala Phe Ala Pro Val Met Gln
675                 680                 685
ttt cat tcc gag tct aac ggc agc tct ggt atc aac gag gaa cgt tct 2352
Phe His Ser Glu Ser Asn Gly Ser Ser Gly Ile Asn Glu Glu Arg Ser
690                 695                 700
cca tgg aac gca caa gcg cgt aca ggc gac aat acg atc att agt cat 2400
Pro Trp Asn Ala Gln Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr Ile Ile Ser His
705                 710                 715                 720
ttt gcc aaa tat acg aat acg cgc atg aat ttg ctt cct tat att tat 2448
Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Tyr
725                 730                 735
agc gaa gcg aag atg gct agt gat act ggc gtt ccc atg atg cgc gcc 2496
Ser Glu Ala Lys Met Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met Met Arg Ala
740                 745                 750
atg gcg ctt gaa tat ccg aag gac acg aac acg tac ggt ttg aca caa 2544
Met Ala Leu Glu Tyr Pro Lys Asp Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Thr Gln
755                 760                 765
cag tat atg ttc gga ggt aat tta ctt att gct cct gtt atg aat cag 2592
Gln Tyr Met Phe Gly Gly Asn Leu Leu Ile Ala Pro Val Met Asn Gln
770                 775                 780
gga gaa aca aac aag agt att tat ctt ccg cag ggg gat tgg atc gat 2640
Gly Glu Thr Asn Lys Ser Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp Trp Ile Asp
785                 790                 795                 800
ttc tgg ttc ggt gct cag cgt cct ggc ggt cga aca atc agc tac acg 2688
Phe Trp Phe Gly Ala Gln Arg Pro Gly Gly Arg Thr Ile Ser Tyr Thr
805                 810                 815
gcc ggc atc gat gat cta ccg gtt ttt gtg aag ttt ggc agt att ctt 2736
Ala Gly Ile Asp Asp Leu Pro Val Phe Val Lys Phe Gly Ser Ile Leu
820                 825                 830
ccg atg aat ttg aac gcg caa tat caa gtg ggc ggg acc att ggc aac 2784
Pro Met Asn Leu Asn Ala Gln Tyr Gln Val Gly Gly Thr Ile Gly Asn
835                 840                 845
agc ttg acg agc tac acg aat ctc gcg ttc cgc att tat ccg ctt ggg 2832
Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Asn Leu Ala Phe Arg Ile Tyr Pro Leu Gly
850                 855                 860
aca aca acg tac gac tgg aat gat gat att ggc ggt tcg gtg aaa acc 2880
Thr Thr Thr Tyr Asp Trp Asn Asp Asp Ile Gly Gly Ser Val Lys Thr
865                 870                 875                 880
ata act tct aca gag caa tat ggg ttg aat aaa gaa acc gtg act gtt 2928
Ile Thr Ser Thr Glu Gln Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Thr Val Thr Val
885                 890                 895
cca gcg att aat tct acc aag aca ttg caa gtg ttt acg act aag cct 2976
Pro Ala Ile Asn Ser Thr Lys Thr Leu Gln Val Phe Thr Thr Lys Pro
900                 905                 910
tcc tct gta acg gtg ggt ggt tct gtg atg aca gag tac agt act tta 3024
Ser Ser Val Thr Val Gly Gly Ser Val Met Thr Glu Tyr Ser Thr Leu
915                 920                 925
act gcc cta acg gga gcg tcg aca ggc tgg tac tat gat act gta cag 3072
Thr Ala Leu Thr Gly Ala Ser Thr Gly Trp Tyr Tyr Asp Thr Val Gln
930                 935                 940
aaa ttc act tac gtc aag ctt ggt tca agt gca tct gct caa tcc gtt 3120
Lys Phe Thr Tyr Val Lys Leu Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gln Ser Val
945                 950                 955                 960
gtg cta aat ggc gtt aat aag gtg gaa tat gaa gca gaa ttc ggc gtg 3168
Val Leu Asn Gly Val Asn Lys Val Glu Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Val
965                 970                 975
caa agc ggc gtt tca acg aac acg aac cat gca ggt tat act ggt aca 3216
Gln Ser Gly Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Thr
980                 985                 990
gga ttt gtg gac ggc ttt gag act ctt gga gac aat gtt gct ttt gat 3264
Gly Phe Val Asp Gly Phe Glu Thr Leu Gly Asp Asn Val Ala Phe Asp
995                1000                1005
gtt tcc gtc aaa gcc gca ggt act tat acg atg aag gtt cgg tat tca 3312
Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Met Lys Val Arg Tyr Ser
1010                1015                1020
tcc ggt gca ggc aat ggc tca aga gcc atc tat gtg aat aac acc aaa 3360
Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Val Asn Asn Thr Lys
1025               1030                1035                1040
gtg acg gac ctt gcc ttg ccg caa aca aca agc tgg gat aca tgg ggg 3408
Val Thr Asp Leu Ala Leu Pro Gln Thr Thr Ser Trp Asp Thr Trp Gly
1045                1050                1055
act gct acg ttt agc gtc tcg ctg agt aca ggt ctc aac acg gtg aaa 3456
Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Leu Ser Thr Gly Leu Asn Thr Val Lys
1060                1065                1070
gtc agc tat gat ggt acc agt tca ctt ggc att aat ttc gat aac atc 3504
Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe Asp Asn Ile
1075                1080                1085
gcg att gta gag caa taa 3522
Ala Ile Val Glu Gln
1090
aaggtcggga gggcaagtcc ctcccttaat ttctaatcga aagggagtat ccttgatgcg 3582
tccaccaaac aaagaaattc cacgtattct tgcttttttt acagcgttta cgttgtttgg 3642
ttcaaccctt gccttgcttc ctgctccgcc tgcgcatgcc tatgtcagca gcctagggga 3702
aaatctcatt tcttcgagtg tcaccggaga taccttgacg ctaactgttg ataacggtgc 3762
gccgagtgat gacctcttga ttgttcaagc ggtgcaaaac ggtattttga aggtggatta 3822
tcgtccaaat agcataacgc cgagcgcgaa gacgccgatg ctggatc 3869
【図面の簡単な説明】
【図１】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】  バチルス  グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１２】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１３】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１４】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１５】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１６】  バチルス  グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１７】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１８】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１９】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】  α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２１】  生成物Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】  生成物Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
0004224302.tif 000027
【図２】
0004224302.tif 000028
【図３】
0004224302.tif 000029
【図４】
0004224302.tif 000030
【図５】
0004224302.tif 000031
【図６】
0004224302.tif 000032
【図７】
0004224302.tif 000033
【図８】
0004224302.tif 000034
【図９】
0004224302.tif 000035
【図１０】
0004224302.tif 000036
【図１１】
0004224302.tif 000037
【図１２】
0004224302.tif 000038
【図１３】
0004224302.tif 000039
【図１４】
0004224302.tif 000040
【図１５】
0004224302.tif 000041
【図１６】
0004224302.tif 000042
【図１７】
0004224302.tif 000043
【図１８】
0004224302.tif 000044
【図１９】
0004224302.tif 000045
【図２０】
0004224302.tif 000046
【図２１】
0004224302.tif 000047
【図２２】
0004224302.tif 000048