(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターに目的DNA断片を組み込んでクローニングを行う、DNAクローニングの結果としてのDNA塩基配列から、ベクター内の塩基配列の一部としてのベクター部塩基配列を除去するベクター部の自動除去方法において、
前記ベクター部を前記クローニング結果のDNA塩基配列から検索するための検索キーとして、制限酵素サイトの塩基配列を前部検索キーおよび後部検索キーとし、
前記前部検索キーおよび後部検索キーを用いたホモロジー検索によって塩基が設定された類似度以上で一致する塩基配列をベクターとDNA断片の境界を示す境界部位候補として特定し、
前記前部検索キーまたは後部検索キーに対して、前記ベクターのマルチクローニングサイト内で前または後に隣接すべき部分を追加して第２の前部検索キーまたは第２の後部検索キーを作成し、
前記境界部位候補の中から該第２の前部検索キーおよび第２の後部検索キーを用いたホモロジー検索によって塩基が設定された類似度以上で一致する塩基配列をベクターとDNA断片の境界を示す境界部位として特定し、
該特定された境界部位の塩基配列を含むベクター部の塩基配列の自動除去を行うこと、
を特徴とするDNA塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法。
【請求項２】
前記DNAクローニング結果としてのDNA塩基配列がDNAの塩基配列決定用シーケンサの出力であることを特徴とする請求項１記載のDNA塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法。
【請求項３】
前記ベクター内で、前記マルチクローニングサイトの更に前または後で該マルチクローニングサイトに隣接すべき部分を更に追加して、前記第２の前部検索キーまたは第２の後部検索キーを作成することを特徴とする請求項１記載のDNA塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法。
【請求項４】
前記特定された境界部位が、前記目的DNA断片の前および後でそれぞれ１つのみであり、かつ該目的DNA断片の前の境界部位と後の境界部位がオーバーラップしていない時、該特定された境界部位を除去することを特徴とする請求項１または３記載のDNA塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法。
【請求項５】
ベクターに目的DNA断片を組み込んでクローニングを行う、DNAクローニングの結果としてのDNA塩基配列から、ベクター内の塩基配列の一部としてのベクター部塩基配列を除去するベクター部の自動除去装置において、
前記ベクター部を前記クローニング結果のDNA塩基配列から検索するための検索キーとして、
制限酵素サイトの塩基配列を前部検索キーおよび後部検索キーとする手段と、
前記前部検索キーおよび後部検索キーを用いたホモロジー検索によって塩基が設定された類似度以上で一致する塩基配列をベクターとDNA断片の境界を示す境界部位候補として特定する手段と、
前記前部検索キーまたは後部検索キーに対して、前記ベクターのマルチクローニングサイト内で前または後に隣接すべき部分を追加して第２の前部検索キーまたは第２の後部検索キーを作成する手段と、
前記境界部位候補の中から該第２の前部検索キーおよび第２の後部検索キーを用いたホモロジー検索によって塩基が設定された類似度以上で一致する塩基配列をベクターとDNA断片の境界を示す境界部位として特定する手段と、
該特定された境界部位の塩基配列を含むベクター部の塩基配列の自動除去を行う手段とを備えることを特徴とするDNA塩基配列に含まれるベクター部の自動除去装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はクローン、すなわち増産すべき遺伝子を含んだＤＮＡの断片を、ベクターと呼ばれる環状ＤＮＡ分子に化学的に結合させ、そのベクターを例えば大腸菌などの細胞内で増殖させることにより、目的のＤＮＡの断片を増産するＤＮＡクローニングにおいて、増産後のベクターから目的のＤＮＡ断片を取り出す時、取り出される断片の内部に含まれるベクターの一部を自動的に除去するベクター部自動除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の構成単位はヌクレオチドであり、このヌクレオチドは塩基、糖、リン酸の３成分が結合したものである。ヌクレオチドはヌクレオシドにリン酸が結合したものでもあり、リン酸はヌクレオシドをはしかけして、ポリマーが作られ、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）とＲＮＡ（リボ核酸）のいずれかが形成される。
【０００３】
核酸を構成する塩基にはプリン塩基とピリミジン塩基の２種類があり、プリン塩基にはアデニンＡとグアニンＧがあり、またピリミジン塩基にはシトシンＣとチミンＴがある。
【０００４】
ポリヌクレオチド鎖構造と呼ばれる構造を持つＤＮＡは、前述の４つの塩基アデニンＡ、グアニンＧ、シトシンＣ、およびチミンＴが一列に並んだ細長い糸のような構造を持っており、例えば１個のヒトの細胞の染色体からＤＮＡを引き出し、それらを繋ぎ合わせると１ｍにもおよび、この上に３０億個の塩基が並んでいると言われる。
【０００５】
このようにＤＮＡは塩基が一列、すなわち鎖状に結合した塩基一次配列の構造を持ち、その鎖は一般的に非常に長いが、遺伝子工学においては、多種類の遺伝子を持つＤＮＡを切断して、切断結果としての多数のＤＮＡ断片の中から特定の遺伝子情報を持つものを選び出し、選び出されたＤＮＡ断片、すなわち目的ＤＮＡ断片を多量に生成させる必要があることが多い。
【０００６】
このような目的のために、目的ＤＮＡ断片をベクターと呼ばれるＤＮＡ、一般に環状のＤＮＡに化学結合によって連結させ、目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡの結合物である組替えＤＮＡを大腸菌などの適当な細胞に取り込ませ、その細胞を増殖させることにより組替えＤＮＡを多量に生成し、結果として目的ＤＮＡ断片を大量に生成するクローニングと言う操作が行われる。
【０００７】
すなわち、一般に配列のユニークな目的ＤＮＡ断片はその量が微量であることが多く、この目的ＤＮＡ断片（ＤＮＡフラグメント）をベクターに組み込んでクローニングが行われる。ベクターは一般的に環状の二重らせん構造のＤＮＡであり、この二重らせん構造のある特定の箇所を制限酵素と呼ばれる酵素で切断し、その切断箇所に目的ＤＮＡフラグメントが組み込まれる。制限酵素によるＤＮＡの切断について説明するために、まずＤＮＡの構造について更に説明する。
【０００８】
ＤＮＡは、前述のように塩基が一列、すなわち鎖状に結合した塩基一次配列の構造を持っている。このＤＮＡ鎖には向きがあり、ＡＴＧＣＡＣＧＡ→とＡＴＧＣＡＣＧＡ←（すなわちＡＧＣＡＣＧＴＡ→）とは別のものである。
【０００９】
このＤＮＡ鎖の両側、すなわち末端には名称がついており、糖の３′の位置に水酸基がついた末端は３′末端と呼ばれ、また他方の末端、すなわち糖の５′の位置にリン酸基がついた末端は５′末端と呼ばれる。そしてＤＮＡ鎖を記述する際には、一般に５′末端が左、３′末端が右となるように記述する。
【００１０】
ＤＮＡは通常、向きが異なって相補的な２本の塩基配列がくっついた二重鎖の状態で存在する。この時２本の塩基配列において、お互いに向かい合う塩基の間には一定の関係があり、アデニンＡはチミンＴと、またグアニンＧはシトシンＣと向き合うようになっている。この例を次に示す（上下の塩基がペアとなっている）。
【００１１】
【数１】
0004286332.tif 000002
【００１２】
このようにＤＮＡは、相補鎖となる２本の塩基配列が組となって１つの遺伝的意味を持つが、制限酵素はこのような塩基配列のうちの４〜６個の塩基から成る塩基配列であって、その制限酵素に特有の塩基配列を識別し、その箇所でＤＮＡを切断する。図２１はこの制限酵素によるＤＮＡ塩基配列の切断の説明図である。同図において、例えばＨpaＩと呼ばれる制限酵素は、ＤＮＡの２本鎖の同一の位置でＤＮＡを切断するが、ＥcoＲＩなどの場合は２本の鎖の切断位置が異なっている。
【００１３】
図２１に示されるように、多くの制限酵素が識別するヌクレオチド配列は塩基対６個であり、この識別領域、すなわち制限酵素サイトにおける２本の鎖のヌクレオチド配列は逆向きに同一である。多くの制限酵素は、それが切断する２本の鎖の切断位置が異なり、互い違いの末端、すなわちコヒーシブ末端を作り出すことになる。
【００１４】
制限酵素で切断された位置に前述の目的ＤＮＡ断片が組み込まれる。図２２はこの目的ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みの説明図である。同図において、環状のプラスミドＤＮＡ分子が制限酵素によって切断され、コヒーシブ末端を持つ直線状プラスミドＤＮＡ分子となる。ここでプラスミドとは、例えばバクテリアなどの中に含まれ、染色体ＤＮＡとは異なって自律的に増殖する環状ＤＮＡである。この直線状プラスミドＤＮＡ分子と、目的ＤＮＡ断片、すなわち染色体ＤＮＡを同じ制限酵素で切断して作った多種類のＤＮＡ断片の１つとが、塩基対形成、すなわちコヒーシブ末端のアニーリングによって環状のＤＮＡとして結合しやすくなる。
【００１５】
このように制限酵素によって作られるコヒーシブ末端は組替えＤＮＡ技術にとって重要であり、同じ制限酵素で切断することによりどんなＤＮＡ断片でも繋ぎ合わせることができる。最後に２本鎖ＤＮＡの１本鎖切断部を修復する酵素であるＤＮＡリガーゼを作用させることにより、直線状プラスミドＤＮＡ分子と目的ＤＮＡ断片とが結合され、染色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡ分子が作られる。
【００１６】
このようにして生成されたプラスミドＤＮＡ分子は細菌、または酵母の中で殖やすことができる。これがＤＮＡクローニングである。
このＤＮＡクローニングに用いられるベクターと、そのベクター内で多種の制限酵素によってそれぞれ切断される多くの制限酵素サイトが集中しているマルチクローニングサイトの例を図２３に示す。同図では異なるマルチクローニングサイトを持つ２種のベクターが示されている。
【００１７】
このＤＮＡクローニングの結果として大量に生成されたプラスミドＤＮＡ分子から目的ＤＮＡ断片を切り出す場合には、クローニングされたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を正確に決定し、不必要な部分の塩基を削除して、正確な構造を持つＤＮＡ断片を取り出す必要がある。このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定するために、ＤＮＡ塩基配列を自動的に読み取る装置としてのＤＮＡシーケンサが用いられる。
【００１８】
ＤＮＡにおけるＡ，Ｇ，Ｔ、およびＣの配列順序を知ることは、すなわち遺伝情報を解明することにつながり、この塩基配列を決めるシーケンス技術は他の分野の技術と互いに関連しながら進歩しており、その発展は制限酵素や核酸関連酵素の発見、ＤＮＡのクローニング、核酸化学などの技術分野の発展と大いに関連している。
【００１９】
最近ではコンピュータ技術がシーケンス法の１つとして活用され、人間の能力を越えた膨大なデータの入力や蓄積が可能となり、塩基配列の決定にとってコンピュータは必須の道具として用いられるようになっている。
【００２０】
ＤＮＡの塩基配列を自動的に読み取る装置であるＤＮＡシーケンサにおいては、ジデオキシ法、またはサンガ法と呼ばれる方法が塩基配列決定のために用いられる。一般にＤＮＡの二重鎖の一方の相補鎖の一部分を、ＤＮＡ合成のきっかけとなるプライマーとしてＤＮＡ合成を行う際に、ジデオキシヌクレオチドと言うヌクレオチドが取り込まれると、そこでＤＮＡ合成がストップし、様々な長さのＤＮＡの断片（フラグメント）が得られるが、プライマーを用いたＤＮＡ合成反応の際に、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣの各塩基に対応するジデオキシヌクレオチドを加えることにより、それぞれの塩基の位置で鎖の伸びがストップした様々な長さのＤＮＡ断片が得られる。
【００２１】
図２４は特定のヌクレオチド、この場合アデニンＡの所で切断されてできるＤＮＡ断片の作り方の説明図である。この場合にはＤＮＡ鎖から１個のヌクレオチド、すなわちアデニンＡを取り除く程度の穏やかな化学処理が行われ、５′末端にリン酸基を持つ左側の断片のみが放射性の断片となり、これらの断片をゲル電気泳動させることにより、放射性の断片のみはその断片の長さ、例えば分子量に対応する位置で検出される。
【００２２】
ＤＮＡシーケンサでは、ジデオキシ法の反応生成物としてのＤＮＡ断片が蛍光標識され、その結果としての蛍光標識されたいろいろの長さの鎖を持つＤＮＡ断片が、ゲル電気泳動によって分離される。ゲル内を泳動されてくるＤＮＡ断片に対してゲル上のある位置においてレーザ照射により蛍光色素を励起発光させ、この蛍光を光検出器で検出する。電気泳動と同時に経時的に蛍光を検出していくことにより、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣの各塩基に対応するＤＮＡ断片の泳動パターンのデータを得ることができる。このようにして得られたデータがコンピュータによって解析され、塩基配列データに変換される。
【００２３】
ＤＮＡシーケンサの出力データとしては、ＤＮＡ塩基配列そのものと、配列の決定に使われた波形データがある。この波形データはゲル電気泳動パターンのデータに対応し、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣの各波形において波形の蛍光強度のピークの位置がその塩基の存在する位置に対応する。
【００２４】
しかしながら、前述のように一般にＤＮＡの塩基配列における塩基の個数は非常に多いので、ＤＮＡシーケンサによって一度に塩基配列の全てを決定することはできず、一般に配列を決定したいＤＮＡを複数の断片にフラグメント化して、各フラグメントの塩基配列を決定し、それらの塩基配列を結合することによって全体の塩基配列を決定する方法がとられている。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、目的ＤＮＡ断片をベクターに組み込み、ＤＮＡクローニングを行った後にＤＮＡシーケンサを用いて塩基配列を決定し、不必要な塩基を削除して正確な目的ＤＮＡ断片を生成することになるが、一般にシーケンサの出力としてのシーケンス結果には、目的ＤＮＡ断片に加えてクローニングに用いたベクターの一部の塩基配列が含まれ、その一部の塩基を削除することが困難であると言う問題点があった。
【００２６】
このようなベクターの一部の塩基としてのベクター部は、シーケンス結果の５′末端部、および３′末端部に混入する可能性が高く、正確な目的ＤＮＡフラグメントを生成するためには、これらのベクター部を確実に取り除く必要がある。従来は、目的ＤＮＡフラグメント塩基配列の前後にくる可能性があるベクター部の塩基配列を用いて、全ての塩基が完全に一致しなくても検索結果を出力する検索法としての、ホモロジーサーチを用いてベクター部を削除していた。しかしながら混入したベクター部の塩基配列が短かったり、３′末端側でのミスシーケンシング等の影響により混入したベクター部を的確に見つけ出すことができず、正しい構造の目的ＤＮＡフラグメントを生成することができないという問題点があった。
【００２７】
本発明は、ＤＮＡシーケンス結果に混入したベクター部を高い確率で検索し、その検索結果からベクター部を自動的に削除することを目的とする。
【００２８】
【課題を解決するための手段及び作用】
図１は本発明の機能ブロック図である。同図はベクター、例えば環状プラスミドＤＮＡ分子を切断し、その切断箇所に目的のＤＮＡ断片を組み込んでクローニングを行う、ＤＮＡクローニング結果のＤＮＡ塩基配列からベクター内の塩基配列の一部としてのベクター部を除去するベクター部自動除去方法の機能ブロック図である。
【００２９】
図１において、１でベクターの種類とベクターの切断時に使用された制限酵素、および目的ＤＮＡ断片を得るために使用された制限酵素とに応じて、クローニング結果のＤＮＡ塩基配列からベクター部塩基配列を検索するための検索キーとなる塩基配列が作成され、２でその作成された検索キーを用いてベクター部塩基配列が特定され、特定されたベクター部塩基配列の自動除去が行われる。
【００３０】
前述の検索キーとしては、例えば前部検索キーと後部検索キーとが用いられる。これらの検索キーは、クローニング結果としてのＤＮＡ塩基配列のうちで、ベクター部と目的ＤＮＡ断片とのそれぞれが対応する制限酵素によって切断された末端部を含み、かつベクター部と目的ＤＮＡ断片のそれぞれの接合前の制限酵素サイトに対応する塩基配列を含む領域であって、目的ＤＮＡ断片の前にあるものが前部検索キー、後にあるものが後部検索キーである。
【００３１】
まずクローニング結果としてのＤＮＡ塩基配列に対する前部検索キーおよび後部検索キーを用いた検索において、あらかじめ設定された類似度以上となることを条件としてホモロジー検索が行われ、その検索結果がベクター・目的ＤＮＡ断片接合部候補として求められる。このベクター・目的ＤＮＡ断片接合部候補のうち前部検索キーに対応するものが５′側境界部位の１次候補とされ、後部検索キーに対応するものが３′側境界部位の１次候補とされる。
【００３２】
これらの５′側、および３′側境界部位の１次候補は一般にそれぞれ複数となる可能性があるため、本発明においては更に第２の前部検索キーおよび第２の後部検索キーを用いた検索が行われる。第２の前部検索キー、第２の後部検索キーは、ベクターのマルチクローニングサイト内で前述の前部検索キー、または後部検索キーに対してそのキーの前または後で隣接すべき部分が追加されたものであり、この第２の前部検索キーと第２の後部検索キーとに対応して前述と同様にしてホモロジー検索が行われ、その検索結果を含んで検索結果の以前、または以後の全ての領域がベクター部の候補として特定される。
【００３３】
更にこれらのベクター部候補が目的ＤＮＡ断片の前および後でそれぞれ１つのみであり、かつ前のベクター部候補と後のベクター部候補とがオーバーラップしていない時、その特定されたベクター部候補がベクター部として自動除去される。
【００３４】
以上のように本発明によれば、例えば制限酵素サイトの塩基配列が前部検索キー、および後部検索キーとして用いられて境界部位の１次候補が求められ、更に前部検索キー、後部検索キーのそれぞれ前、後の塩基配列の一部が追加された第２の前部検索キー、および第２の後部検索キーに基づくホモロジー検索によってベクター部の候補が求められ、求められたベクター部候補が適当である時にベクター部の自動除去が行われる。
【００３５】
【実施例】
図２は本発明のベクター部自動除去方法の基本処理フローチャートである。同図において、まずステップＳ６で使用されたベクターの種類がベクターリストの中から選択されてベクターの入力が行われ、ステップＳ７で使用された制限酵素が制限酵素リストの中から選択されて制限酵素の入力が行われ、ステップＳ８でベクターと制限酵素の情報から検索キーが作成されてベクター部が検索される。すなわち検索キーとマルチクローニングサイトとのホモロジーがチェックされ、ベクター部の絞り込みを行うベクター部特定プログラムが実行され、ステップＳ９でこのベクター部特定プログラムによって特定されたベクター部が除去されて処理を終了する。
【００３６】
図３は本発明のベクター部自動除去処理の全体フローチャートである。同図は、ＤＮＡシーケンサを用いて読み取られたＤＮＡ塩基配列、すなわちフラグメントからベクター部を自動的に削除する、ベクター部自動除去処理の全体フローチャートである。
【００３７】
図３において、まずステップＳ１１でベクター部自動除去の対象となるクローン（ＤＮＡフラグメント）が選択され、ステップＳ１２で例えばディスプレイ上に表示されたメニューからユーザによってベクター部自動除去が選択され、それによってベクター部自動除去ダイアログ（対話形式メニュー）が表示され、ステップＳ１３でそのダイアログを用いて、使用されたベクターがベクターリストから選択される。
【００３８】
更にベクター部自動除去ダイアログを用いて、ステップＳ１４〜Ｓ１７でベクターの前部、後部の切断部、目的ＤＮＡの前部、後部の切断部の作成に使用された制限酵素、一般的には４種類の制限酵素が選択され、ステップＳ１８でベクター部特定・除去プログラムが実行され、処理を終了する。
【００３９】
ステップＳ１８のベクター部特定・除去プログラムの詳細を説明する前に、その他のステップにおける処理を具体的に説明する。まずステップＳ１１では、メインウィンドウに表示されたクローンのうちでベクターの自動除去を行うべきクローンが選択され、ステップＳ１２でディスプレイ上に表示されたメニュー項目の中からベクター部自動除去メニューがユーザによって選択されると、ベクター・制限酵素選択用のダイアログが開く。このダイアログにはすでにベクターデータベースに登録されているベクター名がリストとして表示されており、ステップＳ１３において実際に使用されたベクターがこのベクターリストから選択される。
【００４０】
図４はベクターデータベース内に登録されているベクター名リストの例である。同図において本実施例ではＰＵＣ１８が選択されたものとする。ベクターが選択されると、選択されたベクターのマルチクローニングサイトにおける塩基配列のデータ、および制限酵素サイトのデータが抽出され、マルチクローニングサイトの中に存在する制限酵素サイトに対応する制限酵素の名が表示される。
【００４１】
図５はベクターデータベースに格納されているＰＵＣ１８の塩基配列を示す。同図において、塩基配列の第５行目の最後から２番目のＡから、第６行目の後から２６番目のＣまでの部分（アンダーライン部）が、マルチクローニングサイトである。
【００４２】
ステップＳ１３で選択されたベクター、ここではＰＵＣ１８についてデータベースから、マルチクローニングサイトとその前後、それぞれ５つの塩基を含む塩基配列が抽出される。これは検索キーの文字列を少しでも多くしておくためである。またデータベースからは、このマルチクローニングサイトに含まれる制限酵素サイトのそれぞれに対応して、制限酵素情報、すなわち制限酵素の名称、塩基配列、制限酵素サイトの位置、および切断箇所のデータが抽出される。図６はこのようにして抽出されたマルチクローニングサイトと、制限酵素情報の例である。
【００４３】
図３のステップＳ１３で使用されたベクターが選択され、マルチクローニングサイトと制限酵素情報が抽出された後に、ステップＳ１４〜Ｓ１７でベクターと目的ＤＮＡ断片のそれぞれについて、５′側と３′側でＤＮＡ鎖の切断に使用された制限酵素４つが選択される。この選択は、図７に示されるような制限酵素リストの中から、使用された制限酵素を指定することによって成される。図７はベクターとしてＰＵＣ１８が選択された場合の制限酵素のリストを示し、これはベクターのマルチクローニングサイトに含まれる制限酵素サイトを切断する制限酵素のリストである。
【００４４】
ステップＳ１４〜Ｓ１７で制限酵素４つが選択されると、ステップＳ１８のベクター部特定プログラムにおいてベクター部削除のための検索に用いられる検索キーが特定される。一般的にはベクター側とＤＮＡ断片側とで異なる制限酵素を用いてＤＮＡ鎖の切断を行うことができるが、ここでは簡単のためベクター側とＤＮＡ断片側で同一の制限酵素を使用した場合を考える。すなわち本実施例ではベクターとＤＮＡ断片のそれぞれ５′側で同一の制限酵素としてＨＩＮＤ IIIを使用し、またベクターとＤＮＡ断片の３′側で同一の制限酵素、ＸＢＡ Iを使用したものとする。これにより、図２２で示したように、ベクターとＤＮＡ断片との結合部における塩基配列は、制限酵素サイトの塩基配列と同じになる。
【００４５】
図８は図３のステップＳ１８におけるベクター部特定プログラムの全体フローチャートである。同図において処理が開始されると、まずステップＳ２１で検索キーの塩基配列が決定される。すなわちベクターの種類と制限酵素のデータから、５′側と３′側の２つの検索キー、すなわち前部検索キーと後部検索キーが作成され、ステップＳ２２で前部検索キーと後部検索キーを用いたホモロジー検索が行われ、５′側と３′側でそれぞれベクターとＤＮＡ断片の境界を示す境界部位の１次候補のリストが作成される。一般にこの境界部位の１次候補は、５′側と３′側とでそれぞれ複数となることが多い。
【００４６】
続いてステップＳ２３で境界部位の２次候補のリストの作成が行われる。すなわち５′側の境界部位１次候補を含み、その前の領域、および３′側境界部位の１次候補を含み、その後の領域と、前部，後部検索キーを含むマルチクローニングサイトとのホモロジーチェックが行われ、境界部位の２次候補が求められる。ステップＳ２４でそれぞれの境界部位の２次候補がユニーク（１つのみ）であることと、５′側の２次候補と３′側の２次候補との位置関係が調べられ、例えば位置関係に矛盾がなければステップＳ２５で境界部位の２次候補が切断部位として決定されて処理を終了する。
【００４７】
図９は制限酵素サイトとその切断後の制限酵素サイト内の領域の説明図である。制限酵素による制限酵素サイトの切断形式としては、一般的に二重鎖の同一の位置で切断されるとは限らず、(a) に示すように１本鎖領域が３′側についている場合と、(c) に示すように１本鎖領域が５′側についている場合と、(b) に示すように二重鎖が同じ位置で切断される場合とに分類される。なおここで１本鎖領域が３′側についているということは、前述の二重鎖のうちＡ鎖で考えて、(a) において領域Ｂ３は切断後に３′側に残るということを意味する。５′側についているという表現も含めて、以下同様の意味である。
【００４８】
図９において、一般的に制限酵素サイト内で５′側に二重鎖の状態で残る部分を領域Ａ（Ｂ鎖についても同様）、３′側に二重鎖の状態で残る部分を領域Ｃ、１本鎖として５′側についている部分を領域Ｂ５、１本鎖として３′側についている部分を領域Ｂ３と呼ぶことにする。一般的に、ベクターと目的ＤＮＡ側で異なる制限酵素を用いて切断が行われても、領域Ｂの塩基配列が等しければベクターと目的ＤＮＡとを結合することができる。なお図９は切断前の制限酵素サイトを説明するものである。
【００４９】
制限酵素サイトとその切断について、具体例を用いて更に説明する。前述のように一般的にはＤＮＡ二重鎖はＡ鎖１本で表され、例えば次のようになる。
ＡＣＴＡ＾ＧＴ（＾は切断個所を示す）
この表現ではＡ鎖とＢ鎖が次のように切断されることが表されている。
【００５０】
0004286332.tif 000003
これは図９(c) の場合に相当し、ＡＣが領域Ａ、ＴＡが領域Ｂ５、ＧＴが領域Ｃに該当し、領域Ｂ３に該当するものは存在しない。
【００５１】
同様にＡ＾ＣＴＡＧＴは以下のような切断形式を示す。
0004286332.tif 000004
これは図９(a) に相当し、Ａが領域Ａ、ＣＴＡＧが領域Ｂ３、Ｔが領域Ｃに相当し、領域Ｂ５に相当するものは存在しない。
【００５２】
目的ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みに際しては、目的ＤＮＡ断片の作成時の切断箇所、前後２箇所、およびベクターの切断箇所、前後２箇所、合計４箇所の制限酵素サイトが使用される。一般的には４箇所の切断箇所に対する制限酵素はそれぞれ独立に選択されることになり、切断された後の１本鎖領域がついている側と、それに対応して結合されるべき１本鎖領域の塩基配列が等しければ、２つの断片の末端部を結合することができる。
【００５３】
例えば
ＡＣＴＡ＾ＧＴ  と  ＴＧＴＡ＾ＣＡ
ならば、１本鎖領域はそれぞれ５′側についており、１本鎖領域の塩基配列は“ＴＡ”と同じであるために、結合ができる。
【００５４】
これに対して
ＡＣＴＡ＾ＧＴ  と  ＴＧ＾ＴＡＣＡ
の場合には、１本鎖領域の配列は上の例と同様であるが、１本鎖領域のついている側が異なっているため、断片末端部を結合することはできない。
【００５５】
図１０はベクターと目的ＤＮＡ断片とが接合された状態における制限酵素サイト同士の接合部の説明図である。同図ではベクター５側をＶ１、ベクター３′側をＶ２、目的ＤＮＡ断片５′側をＦ１、目的ＤＮＡ断片３′側をＦ２と呼び、例えばベクターの５′側の切断部の制限酵素サイトのＡ領域であればＶ１Ａという記号で表している。
【００５６】
このようにして表現すると、接合部分の塩基配列のうちで５′側の結合部配列は、１本鎖領域がベクター側にある場合［Ｖ１Ａ］＋［Ｖ１Ｂ５］＋［Ｆ１Ｃ］、１本鎖領域が存在しない場合［Ｖ１Ａ］＋［Ｆ１Ｃ］、１本鎖領域が目的ＤＮＡ断片側にある場合［Ｖ１Ａ］＋［Ｆ１Ｂ３］＋［Ｆ１Ｃ］となる。また３′側の結合部配列は、１本鎖領域が目的ＤＮＡ側にある場合［Ｆ２Ａ］＋［Ｆ２Ｂ５］＋［Ｖ２Ｃ］、１本鎖領域が存在しない場合［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｃ］、１本鎖領域がベクター側にある場合［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｂ３］＋［Ｖ２Ｃ］となる。
【００５７】
本実施例においては、これらの５′側結合部塩基配列と３′側結合部塩基配列が、それぞれ５′側（前部）検索キー、３′側（後部）検索キーとして使用される。
【００５８】
図１１は５′側検索キー決定処理のフローチャートである。同図において処理が開始されると、まずステップＳ３０でベクター５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域が存在するか否か、存在する場合にはその１本鎖領域が５′側と３′側のいずれについているかが判定される。５′側についている場合には、ステップＳ３１で目的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域が５′側に存在するか否かが判定され、存在する場合にはステップＳ３２でそれぞれの１本鎖領域の塩基配列［Ｖ１Ｂ５］と［Ｆ１Ｂ５］とが（５′側から読んで）等しいか否かが判定され、等しい場合は切断箇所の接合が可能となり、ステップＳ３３で５′側検索キーが［Ｖ１Ａ］＋［Ｖ１Ｂ５］＋［Ｆ１Ｃ］と決定されて、処理を終了する。
【００５９】
これに対してステップＳ３１で目的ＤＮＡ断片５′側の１本鎖領域が５′側に存在しない場合、および５′側に存在してもステップＳ３２で１本鎖領域の塩基配列が等しくないと判定された場合には、ステップＳ３４で制限酵素の選択ミスと判定され、制限酵素選択処理に戻り、処理が繰り返される。
【００６０】
ステップＳ３０でベクター５′側の１本鎖領域が存在しないと判定されると、ステップＳ３５で目的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域も存在しないか否かが判定され、存在しない場合にはステップＳ３６で５′側検索キーが［Ｖ１Ａ］＋［Ｆ１Ｃ］と決定されて処理を終了する。またステップＳ３５で目的ＤＮＡ断片の１本鎖領域が存在すると判定されると、ステップＳ３４で制限酵素の選択ミスと判定され、制限酵素選択処理に戻り、処理が繰り返される。
【００６１】
またベクター５′側の１本鎖領域が３′側についているとＳ３０で判定されると、ステップＳ３７で目的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域が３′側に存在するか否かが判定され、存在する場合にはステップＳ３８で１本鎖領域の塩基配列［Ｖ１Ｂ３］と［Ｆ１Ｂ３］が等しいか否かが判定され、等しい場合にはステップＳ３９で５′側検索キーが［Ｖ１Ａ］＋［Ｖ１Ｂ３］＋［Ｆ１Ｃ］として決定され、処理を終了する。これに対してステップＳ３７で１本鎖領域が３′側に存在しない場合、または存在してもステップＳ３８で１本鎖領域の２つの配列が等しくないと判定された時には、ステップＳ３４で制限酵素の選択ミスと判定され、制限酵素選択処理へ戻り、処理が繰り返される。
【００６２】
図１２は３′側検索キー決定処理のフローチャートである。このフローチャートは５′側に対する図１１とほぼ同様であるので詳細な説明を省略するが、ベクター３′側と目的ＤＮＡ断片３′側の制限酵素サイトの１本鎖領域が共に５′側についている場合には［Ｆ２Ａ］＋［Ｆ２Ｂ５］＋［Ｖ２Ｃ］が、また３′側の１本鎖領域が共に存在しない場合には［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｃ］が、また共に３′側についている場合には［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｂ３］＋［Ｖ２Ｃ］が３′側検索キーとして決定される。
【００６３】
本実施例におけるベクター部特定プログラムの詳細について、具体例を用いて更に説明する。図１３は本実施例における前部検索キー、および後部検索キーの説明図である。ここでは図６で説明したベクターＰＵＣ１８のマルチクローニングサイト内に目的ＤＮＡ断片が組み込まれた場合を具体例として説明する。
【００６４】
すなわちベクターと目的ＤＮＡ断片の両方の５′側で同一の制限酵素としてＨＩＮＤ IIIが使用され、またベクターと目的ＤＮＡの両方の３′側で同一の制限酵素としてＸＢＡ Iが使用されたものとする。この場合、図１３に示されるようにベクターと目的ＤＮＡとの結合部における制限酵素サイトに依存する塩基配列は制限酵素サイトの塩基配列と全く同じになる。従って前部検索キー、すなわち５′側検索キーは制限酵素サイトＨＩＮＤ IIIの塩基配列と等しくなり、後部検索キー、すなわち３′側検索キーは制限酵素サイトＸＢＡ Iの塩基配列と等しくなる。また図６に示したマルチクローニングサイトのうちで、目的ＤＮＡ断片によって置き替えられた以外の部分を本実施例では残留マルチクローニングサイトと呼ぶことにする。
【００６５】
図１４は、図１３の５′側検索キーを用いた５′側境界部位１次候補の検索処理のフローチャートである。同図において処理が開示されると、ステップＳ５１で５′側検索キーを用いた対象クローンの塩基配列中のホモロジー検索が行われ、そしてステップＳ５２で検索キーと一定値以上のホモロジー（例えば６個の塩基のうちで何個が一致するか）を示す領域として検索された結果が、境界部位の１次候補のリストとして獲得され、処理を終了する。
【００６６】
図１５は３′側境界部位１次候補の検索処理のフローチャートである。同図を図１４と比較すると、検索キーとして後部検索キー、すなわち３′側検索キーを用いた検索が行われ、３′側の境界部位１次候補のリストが獲得される点のみが異なっている。
【００６７】
図１６は、図１４によって得られた境界部位１次候補、一般には複数の１次候補の中から２次候補を絞り込む、２次候補検索処理のフローチャートである。同図において処理が開始されると、まずステップＳ６１でベクターのマルチクローニングサイトの中で５′側の切断に使用された制限酵素サイトを含み、この制限酵素サイトから５′側の領域が５′側残留マルチクローニングサイト５ＭＣＳとして定義される。図１３ではこの５ＭＣＳは５′側検索キーと同一となる。
【００６８】
続いてステップＳ６２で、ベクターデータベース内にマルチクローニングサイト以外の塩基配列も含まれる場合、すなわち図１３のように５′側検索キー、ここでは５′側残留マルチクローニングサイトよりも５′側に更に５個の塩基の配列が含まれているが、このような場合には５ＭＣＳの５′側の５つの塩基を５ＭＣＳに追加したものが５′側残留ベクター領域５ＶＡとして定義される。図１３ではこの５ＶＡは塩基配列ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴである。ベクターデータベース内にマルチクローニングサイトの塩基配列のみしか含まれない場合には５ＶＡは５ＭＣＳと同一とされるが、一般的にはデータベース内にマルチクローニングサイトの前後の塩基配列は必ずといってよい程含まれるので、次に述べるホモロジーチェックが有効となる。
【００６９】
この５′側残留ベクター領域５ＶＡが求められた後に、図１４によって求められた境界部位の１次候補のリストの要素全てについてステップＳ６３〜Ｓ６６の処理が行われ、ホモロジーチェックが実行される。まずステップＳ６３で境界部位１次候補（ＬＩＳＴ５）の各候補を含み、各候補より５′側のＤＮＡ塩基配列の配列領域がその候補に対するホモロジーチェック領域５ＨＣＡとして定義され、ステップＳ６４で５ＶＡの塩基数と、５ＨＣＡの塩基数、および２０が比較され、一番少ない塩基数がホモロジーチェックのための塩基数ＨＣＢとして求められる。ステップＳ６５で５ＶＡの３′側からＨＣＢの数だけの塩基が取り出され、５ＨＣＡの３′側からＨＣＢの数だけの塩基とのホモロジーのチェックが行われ、一定値以上のホモロジーが得られた場合に、ステップＳ６６でＤＮＡ塩基配列側のＨＣＢの数だけの塩基が５′側境界部位２次候補とされて、処理を終了する。なお、このＨＣＢを求めるときに比較される２０は多くも少なくもない一定数を意味し、その値自体には特別の意味はない。
【００７０】
図１７はこの５′側の境界部位２次候補検索処理としてのホモロジーチェックの説明図である。同図において、クローンの塩基配列のうちで５′側境界部位１次候補を含み、それより５′側の領域がホモロジーチェックの対象となる領域５ＨＣＡとして定義され、その中で例えば５ＶＡの塩基数と一致するＨＣＢの個数の塩基が取り出され、ホモロジーチェックが行われて境界部位２次候補が決定される。
【００７１】
図１８は３′側における境界部位２次候補の決定処理のフローチャートであり、図１９は３′側における２次候補検索処理の説明図である。これらは図１６、および図１７とほぼ同様であるので、その詳細な説明を省略する。
【００７２】
図２０はベクター部を除去するための最終的な切断部位の決定処理のフローチャートである。同図において処理が開始されると、まずステップＳ８１で５′側と３′側の境界部位の２次候補がそれぞれ１つであるかどうかが判定され、それぞれ１つである場合にはステップＳ８２で５′側の２次候補と３′側の２次候補がクローン塩基配列上でその相互の位置関係に矛盾がないか、すなわち３′側の２次候補が５′側の前にくるというような矛盾がないか、また２つの２次候補がお互いにオーバーラップするというような矛盾がないか否かが判定され、矛盾がない場合にはステップＳ８３で５′側の２次候補と３′側の２次候補とがそれぞれ切断部位として決定されて、処理を終了する。
【００７３】
一方、ステップＳ８１で５′側と３′側の２次候補がそれぞれ１つでない場合、またはステップＳ８２で２つの２次候補の位置関係に矛盾がある場合には、ステップＳ８４でベクター部の特定は不可能であるとして処理を終了する。
【００７４】
このようにして切断部位が決定されると、図３のステップＳ１８におけるベクター部除去プログラムが実行される。このベクター部除去プログラムにおいては、図２０で決定された切断部位を含んでベクター部が除去される。すなわち切断部位として決定された５′側境界部位２次候補を含む５′側の塩基配列と、３′側境界部位２次候補を含む３′側塩基配列とが共にベクター部として除去される。
【００７５】
これに対して切断部位、すなわち制限酵素サイトの塩基配列を全て含む部位を削除するのでなく、制限酵素サイトについては制限酵素による切断位置からベクター部を除去することも可能であり、具体的な発明の実施方法が以上の記述に限定されないことは当然である。
【００７６】
また以上の説明では記述しなかったが、例えば境界部位１次候補の検索結果や、境界部位２次候補の検索結果など、各種の検索結果をディスプレイ上で識別可能とし、削除すべきベクター部の同定を容易にすることも可能である。
【００７７】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明によればベクター部と目的ＤＮＡ断片との境界部のごく短い塩基配列を検索キーとしてホモロジー検索を行うことにより、一般に複数の境界部位１次候補を求め、その１次候補について更にその前後でのホモロジーチェックを行うことによりベクター部の確実な特定が可能となる。特に一般的にシーケンサの出力において３′末端部側にシーケンシングミスが起こることがあるが、本発明によって３′末端部側に混入したベクター部を正確に削除することが可能となる。また検索結果をそれぞれ区別できる形式でディスプレイ上に表示することにより、自動削除できなかった部分に対してもユーザによるマニュアル削除の可能性を残すことができ、比較的短時間の検索によりベクター部の検索を高精度で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の機能ブロック図である。
【図２】本発明のベクター部自動除去方法の基本処理フローチャートである。
【図３】本発明のベクター部自動除去処理の全体フローチャートである。
【図４】ベクターデータベース内に格納されているベクターリストの例を示す図である。
【図５】ベクターＰＵＣ１８の塩基配列を示す図である。
【図６】ベクターＰＵＣ１８のマルチクローニングサイトと制限酵素情報を説明する図である。
【図７】ベクターＰＵＣ１８に対する制限酵素リストを示す図である。
【図８】ベクター部特定プログラムの全体処理フローチャートである。
【図９】制限酵素サイトの説明図である。
【図１０】ベクターに組み込まれた目的ＤＮＡ断片の説明図である。
【図１１】５′側検索キー決定処理のフローチャートである。
【図１２】３′側検索キー決定処理のフローチャートである。
【図１３】ベクター部特定プログラムで用いられる、ホモロジー検索用検索キーを説明する図である。
【図１４】５′側境界部位１次候補の検索処理フローチャートである。
【図１５】３′側境界部位１次候補の検索処理フローチャートである。
【図１６】５′側境界部位２次候補の検索処理フローチャートである。
【図１７】５′側境界部位１次候補のホモロジーチェックの説明図である。
【図１８】３′側境界部位２次候補の検索処理フローチャートである。
【図１９】３′側境界部位１次候補のホモロジーチェックの説明図である。
【図２０】ベクター部除去のための切断部位決定処理のフローチャートである。
【図２１】制限酵素によるＤＮＡ塩基配列の切断例を説明する図である。
【図２２】目的ＤＮＡ断片を環状プラスミドＤＮＡ分子に結合させる操作を説明する図である。
【図２３】ベクターとマルチクローニングサイトの例を示す図である。
【図２４】ＤＮＡ断片の作り方を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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