(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方では、タンパク質源として使用することができる生成物を、かつ他方では、純粋な形態のＧＭＰを回収することを目的とした、ＧＭＰを含む液状乳原料のイオン交換処理方法において、その方法はつぎの工程：
i）ｐＨが１から４．５の数値を有するように、液状乳原料を脱カチオン化すること、
ii）前記の液を、ｐＨが安定化するまで、主にアルカリ性の形態の、疎水性マトリックスの弱アニオン樹脂と接触させること、
iii）樹脂と回収される液状生成物との分離、および
iv）ＧＭＰの樹脂からの脱離、
を含むことを特徴とする、上記のＧＭＰを含む液状乳原料のイオン交換処理方法。
【請求項２】
原料は、１０から２３重量％に予備濃縮され、かつカチオンがないか又は完全に脱塩された、チーズ製造由来のスィートホエーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
原料は、ラクトースを含まず、かつカチオンを含まないスィートホエーのタンパク質濃縮物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
原料は、脱脂乳を無機酸により酸沈澱させるか又は生物学的酸性化により酸沈澱して得たネイティブカゼインの、プロテアーゼによる加水分解生成物、脱脂乳のミクロ濾過により得たミセルカゼインの、プロテアーゼによる加水分解生成物、又は別法としてカゼイネートのプロテアーゼによる加水分解生成物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
原料はスィートホエーの限外濾過の透過物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
液状原料を、主にアルカリ性の形態の弱アニオン樹脂と、ゆるやかに攪拌する反応器の中で、５０℃未満の温度で、１時間から数時間接触させ、これにより、処理した液のｐＨを、安定が得られるまでゆるやかに増加させ、ついで液を樹脂から濾過又は遠心分離により分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マクロ孔質の又はマクロ架橋結合したゲルの形態の弱塩基性アニオン交換樹脂であって、マトリックスが疎水性である樹脂、を使用することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
そのように処理した液を、蒸発によって濃縮し、ついでそれを乾燥塔の中で噴霧乾燥により乾燥することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＧＭＰをそれから純粋の形態で分離するため、樹脂を最初に洗浄によって処理し、ついでＧＭＰの酸性の、塩基性の又は塩類の水溶液で脱離し、次にそれを脱塩水ですすぎ、ついで溶出液とすすぎ液を一緒にし、次にそれらを、平均分画分子量が３０００ダルトンの膜での限外濾過又はナノ濾過により脱塩すること、および保留分を凍結乾燥により乾燥することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、グリコマクロペプチド又はカゼイノグリコマクロペプチド（以下ＧＭＰ）を含む乳原料の処理方法に関し、ＧＭＰを乳原料から分離することを目的とする。
ＧＭＰは、哺乳動物の乳のカッパカゼインにプロテアーゼ、例えばレンネットを作用させて形成される、加リン酸化したおよび部分的にシアル化したマクロペプチドである。それは、チーズ製造中、カゼインの分離後に得られるスィートホエー中のタンパク質の約２０重量％に相当する。
例えば、レンネットによって加水分解される酸カゼイン又はカゼイネート、又は別法としてチーズ製造から脱塩されかつラクトースを含まないスィートホエーのような乳起源の原料を、トリクロロ酢酸で処理して、タンパク質を沈殿させ、ついで上澄液を回収し、それを透析し、最後にその透析物を乾燥することより成る、実験室レベルでＧＭＰを製造する方法は知られている。そのような方法は工業的でない。
ＥＰ−Ａ−第０，４８８，５８９号明細書に記述されている工業的規模のＧＭＰの製造法は、ホエー製品をイオン交換で処理し、吸着されなかった画分を回収し、それを濃縮し、次にそれを限外濾過、透析濾過、適切な場合には逆浸透により脱塩し、ついでＧＭＰを回収することからなる。
ホエータンパク質画分の製造方法は、ＵＫ−Ａ−第２，１８８，５２６号明細書に記述されている。その方法は、乳製品を強アニオン樹脂で、処理される材料のタンパク質および幾らかのペプチドが樹脂に複合体の形態で非選択的に吸着されるような条件下で処理することである。そのような複合体は続いて樹脂から溶出することが困難である。溶出液は、４．５未満のｐＨおよび室温において水にけん濁すると、堅いゲルを形成する特徴がある。タンパク質画分は、ミルクセーキタイプの飲料およびデザートのムースに使用することができる。
日本特許公開第０７１３２０４９号明細書に、マトリックスが親水性である弱アニオン交換樹脂を使用して、シアル化ペプチドをホエーから分離することが提案されている。使用される方法は、ｐＨを前もって４から６の値に正確に調節した原料を、塩基性の交換基でグラフトした、天然の多糖類か又は合成ポリビニルから成る親水性の高分子支持体を通過させることである。マトリックスとして使用される支持体は、工業的に容易に適用することができない。
本発明の目的は、単一の操作により工業的規模で高収率により、ＧＭＰを乳原料の他の成分から選択的に分離することである。
そこで、本発明は、一方ではタンパク質源として直接に使用することができる生成物を、そして他方では精製された形態のＧＭＰを回収することを目的とする、ＧＭＰを含む液状乳原料のイオン交換処理方法に関し、その方法は次の工程を含むことを特徴とする。
i）ｐＨが１から４．５の数値を有するように、液状乳原料を脱カチオン化すること、
ii）前記の液を、ｐＨが安定化するまで、主にアルカリ性の形態の、疎水性マトリックスの弱アニオン樹脂と接触させること、
iii）樹脂と回収される液状生成物との分離、および
iv）ＧＭＰの樹脂からの脱離。
乳原料として、本発明の方法では、ＧＭＰを含む製品又は副生物を使用することができる。指針として記述する。
−  レンネットで凝固したカゼインの分離後得たスィートホエー、
−  例えば、電気透析、イオン交換、逆浸透、電気脱イオン化、又はこれらの方法の組み合わせによって、かなりの程度に脱塩した、スィートホエー又はそのようなホエー
−  スィートホエーの濃縮物、
−  例えば、電気透析、イオン交換、逆浸透、電気脱イオン化、又はこれらの方法の組み合わせにより、かなりの程度に脱塩したスィートホエーの濃縮物、
−  例えば、限外濾過により、続いて透析濾過（洗浄を伴う限外濾過）により得た、実質的にラクトースを含まないスィートホエーのタンパク質濃縮物、
−  スィートホエーからのラクトースの結晶化の母液、
−  スィートホエーの限外濾過の透過液、
−  適切な場合にはカルシウムイオンを添加して、脱脂乳を無機酸で、又は生物学的酸性化により酸沈殿することによって得た天然カゼインの、又は別法として例えば脱脂乳のミクロ濾過で得たミセルカゼインの、プロテアーゼによる加水分解生成物、
−  カゼイネートのプロテアーゼによる加水分解生成物。
好ましい原料はチーズ製造からの、好ましくは１０から２３重量％に予備濃縮した、かつ脱カチオン化した又は完全に脱イオン化した、即ちカチオンもアニオンも含まないスィートホエーである。
他の好ましい原料はラクトースもカチオンも含まないスィートホエーのタンパク質濃縮物である。
これらの原料は、液状でも又は粉末でも供することができ、かつ後者の場合、それらは、次の処理を見込んで、好ましくは脱塩した水に分散する。
これらの原料は乳牛、山羊、羊又は水牛のような反芻動物の乳から得ることができる。
本発明の方法の第１の実施態様によれば、液状原料は、反応器中で、ゆるやかに攪拌しながら、５０℃未満、好ましくは０から１５℃の温度で、弱アニオン樹脂と接触させる。攪拌は、樹脂床が流動化するように十分に行うべきである。それは、例えば、攪拌機によって、又は好ましくは、流動体（例えば空気又は窒素）の流れを反応器の底部を通して加圧下に導入することによって生ずる。
マトリックスが疎水性であり、かつ交換基が弱塩基性であるアニオン交換樹脂であって、マクロ孔質の又はマクロ架橋結合した、好ましくはポリスチレン又はポリアクリルの（特にポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体をベースとする）ゲルの形態の樹脂を使用することができる。浸透圧衝撃に対する抵抗を考慮すると、ゲルは、マクロ架橋結合したものが好ましい。活性基は一般に第一級から第三級アミンである。そのような樹脂は主にアルカリ性の形態（以下ＯＨ-形と称する）であるべきであるから、その活性部位は、好ましくは、主としてこの形態に再生すべきである。
この接触の間に、樹脂の活性部位はＧＭＰ分子に対しイオン交換され、処理した液のｐＨは、安定した最終値（例えば、使用する原料に応じて４．５から５．５）まで徐々に増加する。操作の持続期間ならびに樹脂および処理された液のそれぞれの量は、出発物質の組成および所望のＧＭＰの量の関数として選択される。この操作は１から１０時間、例えば約４時間継続される。樹脂および処理される液のそれぞれの割合は、所望のＧＭＰの分離の程度に応じて大きく異なり、体積比で１：１から１：３０、好ましくは１：１から１：１０である。
他の実施態様によれば、液は樹脂を満たしたカラムを通って浸出することができ、処理された液をそれから取り出し、かつ樹脂に吸着されたＧＭＰを溶離によって回収する。これを行うために、その処理は連続的に又は半連続的に、例えば飽和された樹脂をカラムから向流方式で抜き取り、次にそれを新たに再生された樹脂と取り替えることによって行うことができる。
前記の実施態様では、反応器の中およびカラムの中は、例えば混合装置を使用して結ぶことができ、混合装置の上部は、攪拌用要素又は樹脂を含む流動床を作るための要素を備え、かつカラムより成る低部から格子又は濾過器により分離された反応器であり、カラムでは処理の最後に、樹脂を、例えば傾しゃ法により回収することができ、かつ処理された液を取り出すことができる。
このように処理された液は、例えば蒸発により濃縮することができ、ついで例えば乾燥塔の中で噴霧乾燥により乾燥することができる。
このようにして得た粉末は、幼児用製品の調製の際のタンパク質原料として有利に役に立ち、かつその望ましいアミノ酸プロフィールの点から注目すべきであり、そのアミノグラムはトレオニンの減少およびトリプトファンのような芳香族アミノ酸の豊富さを示す。
ＧＭＰをそれから分離するために、樹脂は最初に例えば脱塩水で洗浄処理し、ついで適切である場合に、希塩水又は希酸性溶液で洗浄処理し、次にそれを脱塩水ですすぐ。ＧＭＰの実際の脱離は、酸、塩基又は塩の水溶液で、好ましくは、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＣＡ（ＯＨ）2の塩基性水溶液で、有利には８重量％未満の、好ましくは０．５から３重量％の濃度の塩基性水溶液で行い、続いて脱塩水で洗浄する。このように、樹脂は同時に再生される。次に、溶出液および洗浄液を一緒にし、ついでそれらを例えば約３０００ダルトンの平均分画領域（mean cut-off region）の膜で限外濾過又はナノ濾過（nanofiltration）によって脱塩し、次に残留物を例えば凍結乾燥により乾燥する。
このようにして得たＧＭＰは、実質的に脂肪およびラクトースが存在せず、ホエータンパク質が少ない。
それは、好ましくは：
１重量％未満の脂肪、
０．２重量％未満のラクトース、および
３重量％未満の純ホエータンパク質
を含む。
ＧＭＰは、例えば、抗血栓剤、抗下痢剤、又は抗菌剤として又は好ましくは歯科衛生用の組成物の歯垢用および虫歯用薬剤として経口の、非経口の又は皮下用医薬組成物における生物学的特性のための既知の適用に使用することができ、又は別に、歯垢に対するおよび虫歯に対する特性のための食品、例えば糖菓製品において、乳化剤、ゲル化剤又は発泡剤のような機能上の特性のための、又はそれがフェニルアラニンを含まないために、例えば抗フェニルケトン尿症幼児用組成物の特別食用の特性のための、既知の適用に使用することができる。
本発明方法の重要な利点は、１５０までの処理サイクルの後でさえ、樹脂の性能の減退又は樹脂の堆積がないことである。
下記の例は、本発明、および本発明を行うために望ましい装置を図式的に示すが限定を意味しない図１の図面を具体的に説明する。例において、部およびパーセントは、特に断わらない限り、重量による。
例１
処理のために、反応器１を使用する。その上部に、主タンク２の直径より小さな直径を持つ区画３と低部で連結する主タンク２から成る。タンク２には、すすぎ液入口管４、加圧下のガス入口５、反応器１のガス圧を調節する安全弁６を備えている。タンク２は、基底に近い高さに、ストレーナー７および液排出管８を備えている。
反応器は、区画３のレベルに、ｐＨメーター９、ガス入口１０を備えており、かつ三方バルブ１１によって、被処理液用の入口管１２および処理済液の排出管１３に連結している。区画３の基底部に、格子又は穴のあいた平板１４を備えており、その役割は樹脂ビーズ１５を回収することである。格子１４の下で、排出管１６は、液を、ポンプ１７を通ってレベル制御装置１９を備えた緩衝タンク１８に導き、そこからポンプ２１を通って管２０に導く。管２０は管１２又は排出オーバーフロー２２の何れかに接続する。
普通に電気透析によって処理し、かつ強カチオン樹脂でカチオンを除去したウシのスィートホエータンパク質濃縮物を、溶液が６．５％の乾物含量を有するように脱イオン水に分散させる。
濃縮物は下記の組成を有する。
0004286325.tif 000002
１２℃の温度の初期ｐＨ４．２５の分散液１２７ｋｇを、管１２を通して反応器１に移す。その基底の空気を区画３のレベルで入り口１０により逆止弁２３を介して泡立てて導入しポリスチレンをベースとする疎水性マトリックス（IMAC HP 661▲Ｒ▼、ローム＆ハース、０Ｈ-形に再生）の弱アニオン樹脂２３ｋｇを含む樹脂ビーズ１５の流動床をつくる。樹脂ビーズ１５は、流動化により作られた乱流により、分散液と接触して４時間攪拌される。ｐＨは、ｐＨメーター９によってコンスタントに制御される。ｐＨが５．０８に安定化することは、反応の終了を示す。次に１０における空気の供給を中断し、空気を５の反応器の上部を通って液面２４の上に導入し、それは液を押すことおよび樹脂ビーズを、格子１４によってそれらを保持している、反応器２の低部３に沈降させる効果を有する。処理済液は、重力によって管８を通って、そしてポンプ１７によって管１６を通って緩衝タンク１８に流出され、次にポンプ２１によって管２０で、さらに管１２および１３で出口に排出される。
液を蒸発によって乾燥物質２８％までに濃縮した後、濃縮物を乾燥塔の中で噴霧乾燥する（これらの操作は示されていない）。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により濃縮物を分析した結果、反応が出発ＧＭＰの９１％を除去したことを示す。さらに、粉末は出発ホエータンパク質の９５％を含む。
ＧＭＰを回収するため、反応器および樹脂は脱塩水で洗うが、管２５およびバルブ２６から出発し、次いで管４に至り、反応器を通り、管１２および１３を経て出口迄洗浄をする。ＧＭＰを、管２７およびバルブ２８によって分配された４０ｌの２％ＮａＯＨ水溶液で、同じ循環路を通って二度溶出し、次に３０ｌの脱塩水ですすぎを行う。溶出液とすすぎ液の総量を一緒にした後、全体を、公称分画分子量（nominal cut-off）が３０００ダルトンの膜での限外濾過又はナノ濾過によって２５ｌの容量に濃縮し、ついで残留分を凍結乾燥して（これらの操作は示されない）、出発ＧＭＰと比較して８２％の収率に相当する７５０ｇのＧＭＰを得る。
１０容量の樹脂床に相当する物を処理した場合、樹脂は定期的にアルカリ性の再生後酸性の再生を受ける。これを行うために、上記のごとくアルカリ性溶液によるＧＭＰの溶出後、濃ＨＣｌの水溶液は管２９およびバルブ３０によって、水についてはそれぞれ２５によって供給される。次に樹脂は、濃厚なＮａＯＨの水溶液を管２７から、水はそれぞれ２５から、次に４を通過させることにより、ＯＨ-形に変換され、次に管１６によって反応器１を離れ、ポンプ１７によって緩衝タンク１８に上げ、ついでポンプ２１、管２０およびオーバーフロー２２により、流出液処理のために流出する。この操作に続いて、樹脂は他の処理サイクルのため準備をする。
例２
あらかじめ１７％の乾燥物質に濃縮し、ついで電気透析により脱塩し、強カチオン樹脂カラムでカチオンを除き、弱アニオン樹脂カラムでアニオンを除き、かつ乾燥塔の中で噴霧乾燥した、下記の組成：
0004286325.tif 000003
の牛のスィートホエーを使用する。
この脱塩したホエー粉を脱塩水に溶解する。カチオンの除去後、溶液は３．８の初期のｐＨを有する。前述の設備で、この溶液３９２ｋｇを、８℃の温度で、反応器中でポリスチレンをベースとする疎水性マトリックス（IMAC HP 661▲Ｒ▼，ローム＆ハース，ＯＨ-形に再生）弱アニオン樹脂２３ｋｇの存在下において４時間攪拌しながら、処理をする。ｐＨの４．８９における安定化は、反応の終了を示す。次に液を抜き出して、樹脂を上記の如く再生する。
液を蒸発によって４５％乾燥物質に濃縮後、濃縮物を乾燥塔の中で噴霧乾燥する。
ＨＰＬＣによる濃縮物の分析は、反応が出発ＧＭＰの８９％を除去したことを示す。さらに、粉末は９．１％のホエータンパク質を含み、それはホエータンパク質の９０％の収率に相当する。
ＧＭＰを回収するため、樹脂を連続的に、脱塩水で、３０ｌの０．５％ＨＣｌ水溶液で、つぎに３０ｌの脱塩水で洗浄し、ついでＧＭＰを４０ｌの２％Ｃａ（ＯＨ）2水溶液で２度溶出し、すすぎを３０ｌの脱塩水で行う。溶出液およびすすぎ液の総量を一緒にした後、全体を３０００ダルトンの分画分子量を有する膜により限外濾過して２５ｌの容量に濃縮し、ついで残留分を凍結乾燥して、出発ＧＭＰと比較して８０％の収率に相当する９００ｇのＧＭＰを得る。
例３
１８％の乾燥物質に予備濃縮し、強カチオン樹脂のカラムで処理してカチオンを除去した初期ｐＨ１．０９のスィートホエーを、出発物質として使用する。
前記の設備において、７０ｋｇのこのホエーは、２５℃の温度で、反応器の中で陰イオン樹脂のポリスチレンをベースとする疎水性マトリックスの弱アニオン樹脂１４ｋｇ（IRA 96▲Ｒ▼，ローム＆ハース，０Ｈ-形に再生）の存在下で４時間攪拌しながら処理をする。攪拌は窒素の泡立ちにより樹脂ビーズの流動床をつくることによって行なう。４．７９におけるｐＨの安定化は反応の終了を示す。次に液は上記の樹脂から分離する。液を蒸発により、４５％の乾燥物質に濃縮した後、濃縮物を乾燥塔の中で噴霧乾燥する。
ＨＰＬＣによる粉末の分析は、反応が出発ＧＭＰの８５％を除去したことを示す。しかし、粉末は、９．２％のホエータンパク質を含み、それはホエータンパク質の９０％の収率に相当する。
濃縮物のアミノグラムの分析は、トレオニンの２８％の減少、アルギニンの１８％の増加およびトリプトファンの２０％の増加を特徴とするプロフィールを示す。
ＧＭＰを回収するために、樹脂を連続的に、脱塩水で、５０ｌの０．０５％ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次に５０ｌ脱塩水で二度洗浄し、ついでＧＭＰを２５ｌの０．６％ＫＯＨ水溶液で二度溶出し、次にすすぎを１０ｌの脱塩水で行う。溶出液およびすすぎ液の総量を一緒にした後、全体を３０００ダルトンの分画分子量を有する膜により限外濾過して２５ｌの容量に濃縮し、残留物を凍結乾燥し、つぎに出発ＧＭＰと比較して８０％の収率に相当する、１７５ｇのＧＭＰを得る。
例４
大部分の塩を除去した、組成が次の通りである、スィートホエー限外濾過透過物の粉末を出発物質として使用する。
0004286325.tif 000004
前述の粉末を、溶液が１９．３５％の乾燥物質含量を有するように、脱塩水に溶解する。この溶液を、強カチオン樹脂（IR 120▲Ｒ▼ローム＆ハース）のカラムに通してカチオンを除去して、１８．７３％の乾燥物質を含むｐＨが２．７７の溶液を得る。
５６５ｇのこの溶液およびポリスチレンをベースとする疎水性マトリックスの弱アニオン樹脂５６．５ｇ（IMAC HP 661▲Ｒ▼，RohmおよびHass，０Ｈ-形に再生した）を１０℃で３時間攪拌し、ｐＨの最終値を４．５３に安定化させる。このように処理した透過物を樹脂ビーズから濾過により分離し、次にそれらを凍結乾燥する。
このように処理したホエータンパク質透過物は１．７５％のタンパク質を含む。そのアミノグラムの分析は、トレオニンの２０％の減少およびトリプトファンの５０％の増加を特徴とするプロフィールを示す。
ＧＭＰを回収するために、樹脂を１ｌの脱イオン水で洗浄し、ついでＧＭＰを５０ｍｌの０．６％ＮａＯＨの水溶液で溶出し、つづいてすすぎを２０ｍｌの脱イオン水で行う。溶出液およびすすぎ水の総量を一緒にした後、全体を３０００ダルトンの分画分子量を有する膜により限外濾過で濃縮し、ついで残留物を凍結乾燥して、８７０ｇのＧＭＰを得る。
例５
３．５ｌの、２０％の乾燥物質に予備濃縮し、強カチオン樹脂のカラムでカチオンを除去した、ｐＨ１．０９のスィートホエーは、ポリスチンをベースとした疎水性マトリックス（IMAC HP 661▲Ｒ▼，ローム＆ハース）の弱アニオン樹脂４５０ｍｌのカラムを、２ベッド容量／時の速度で浸透させる。
６から３の範囲のｐＨの４つの同等な画分から構成され、その中のＧＭＰの量が５０から９％の範囲である（ＨＰＬＰで評価した）、４ベット容量の同等物を回収した。４つの画分を一緒にした後、（出発ホエー原料と比較して）２５％のＧＭＰが除去された、ｐＨ４．５の溶液が得られる。
ＧＭＰを回収するため、例１と同様な方法を行い、ＧＭＰの純度に関して、同等の結果が得られる。
【図１】
0004286325.tif 000005