(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター感染症の治療または予防に使用するための単離されたヘリコバクター抗原であって、
(i)  分子質量が約３６ｋＤａであり、クローンＥ２．５（配列番号４）の推定配列のアミノ酸配列を含むヘリコバクター抗原、
(ii)   配列番号３に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる抗原、
(iii)  上記抗原(i)または(ii)の免疫原性断片であって、哺乳動物宿主における特異的な防御免疫応答を誘導することができるもの、
からなる群から選択されるヘリコバクター抗原。
【請求項２】
少なくとも１種類のH. pyloriまたはH. felis抗原、またはその免疫原性断片を含む、請求の範囲第１項に記載の単離抗原。
【請求項３】
哺乳動物宿主においてヘリコバクター感染の治療または予防に使用するためのワクチン組成物であって、
(i) 分子質量が約３６ｋＤａであり、クローンＥ２．５（配列番号４）の推定配列のアミノ酸配列を含むヘリコバクター抗原、
(ii)  配列番号３に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる抗原、
からなる群から選択される単離ヘリコバクター抗原の免疫学的に有効量を、１個以上の薬学上許容可能なキャリヤーおよび／または希釈剤と共に含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項４】
Helicobacterウレアーゼ、リポ多糖類、Ｈｓｐ６０、ＶａｃＡ、ＣａｇＡ、およびカタラーゼから選択される少なくとも１種類の他のヘリコバクター抗原をも含む、請求の範囲第３項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
アジュバントを更に含む、請求の範囲第４項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
アジュバントが粘膜アジュバントである、請求の範囲第５項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
経口投与用である、請求の範囲第３項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
非経口投与用である、請求の範囲第３項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記宿主がヒトである、請求の範囲第３項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防のためのワクチン組成物の製造における、請求の範囲第３項に定義された単離ヘリコバクター抗原の使用。
【請求項１１】
前記単離抗原がアジュバントと共に投与される、請求の範囲第１０項に記載の使用。
【請求項１２】
前記アジュバントが粘膜アジュバントである、請求の範囲第１１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記単離抗原が、前記宿主に経口投与される、請求の範囲第１０〜１２項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記単離抗原が、前記宿主に非経口投与される、請求の範囲第１０〜１２項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記宿主がヒトである、請求の範囲第１０〜１４項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
請求の範囲第１項に記載の単離抗原に特異的な抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である、請求の範囲第１６項に記載の抗体。
【請求項１８】
哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防において使用するための組成物であって、請求の範囲第１６項または１７項に記載の抗体を、１種類以上の薬学上許容可能なキャリヤーおよび／または希釈剤と一緒に含んでなる組成物。
【請求項１９】
哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防のためのワクチン組成物の製造における請求の範囲第１０項または１７項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
請求の範囲第１項に定義されたヘリコバクター抗原をコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子であって、配列番号３に示されるヌクレオチドの配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項に記載の核酸分子に機能的に結合した発現制御配列を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記発現制御配列がプロモーター配列および開始配列を含み、ヌクレオチドの配列がプロモーターおよび開始配列に対して３′に位置する、請求の範囲第２１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２３】
請求の範囲第２１項または請求の範囲第２２項に記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなる組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクター。
【請求項２４】
前記ベクターがプラスミドである、請求の範囲第２３項に記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクター。
【請求項２５】
請求の範囲第２１項または請求の範囲第２２項に記載の組換えＤＮＡ分子、または請求の範囲第２３項または２４項に記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクターでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞がE. coliである、請求の範囲第２５項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求の範囲第２５項または請求の範囲第２６項に記載の宿主細胞における発現によって製造される組換えポリペプチド。
【請求項２８】
哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防に使用する製剤であって、請求の範囲第１項に定義された単離したヘリコバクター抗原またはその免疫原性断片を発現するワクチンベクターを含んでなる、製剤。
【請求項２９】
前記ベクターが哺乳動物宿主の胃腸管でコロニー形成する細菌である、請求の範囲第２８項に記載の製剤。
【請求項３０】
前記ベクターがSalmonella、Shigella、Yersinia、Vibrio、EscherichiaまたはＢＣＧ細菌である、請求の範囲第２８項に記載の製剤。
【請求項３１】
哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防のためのワクチン組成物の製造における、請求の範囲第２８〜３０項のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、防御用ヘリコバクター抗原、特にH. pylori抗原に関し、詳細にはH. pyloriの感染に伴う胃十二指腸疾患の治療または予防のためのこれらの抗原の使用に関する。
発明の背景
Helicobacter pyloriは、ヒトの胃の内層に感染するグラム陰性の螺旋状細菌である。これは広範囲に分布しており、世界の人口のほぼ半数が慢性的に感染している。この細菌は、口−口または糞便−口伝播によってヒトからヒトへ蔓延するが、環境上の貯蔵器は認められていない。
この細菌に感染すると、胃の粘膜または胃の内層に炎症が起こる。通常は、これは消散せず、感染および炎症は数十年間持続すると考えられる。これは症状を伴わないことも多いが、この慢性感染症は多くの余病の危険性の増大を伴っている。この感染過程において胃がそれ自身の消化生成物に対して有する通常の防御機構が破壊されると、感染したもののかなりの部分で十二指腸または胃の消化性潰瘍が生じる。また、長期間の感染では胃壁の腺癌またはリンパ腫の発生の危険性が増加する。
従って、H. pylori感染症の防止または治療は、慢性感染症の余病から生じるかなりの死亡率および罹病率を防止する可能性を有する。
初期の実験では、H. pyloriは通常の実験動物には感染しなかった。しかしながら、関連性の高い生物であるHelicobacter felisを用いるH. pylori感染の実験マウスモデルは開発されている(Lee et al.,1990 ; Dick-Hegedus and Lee, 1991)。このモデルは、新規な抗微生物治療法のスクリーニングにおいて極めて有用であることが明らかになっている。
H. felisは、H. pyloriと極めて近接したＤＮＡ相同性を共有している螺旋状の細菌である。この細菌は、H. pyloriがヒトの胃にコロニー形成するのと同様な方法で、マウスの胃にコロニー形成する。主要な生態学的ニッシェは胃粘液であり、コロニー形成は主として胃の洞に見られる。無菌マウスでは、H. felisの感染により、多形核白血球浸潤を伴う単核細胞の慢性的炎症を有するヒトのH. pylori感染症と極めて類似した胃炎を誘発する。いずれの生物に感染しても、それぞれH. pyloriおよびH. felisに対して同様な高くなった全身的体液性の免疫応答が誘導される(Lee et al.,１９９０年）。
H. felisモデルは、ヒトの抗−H. pylori療法の効果の予測に極めてよく役立つことが明らかになっている。従って、エリスロマイシンのような高いインビトロ活性を有する薬剤による単一療法(monotherapy)は、エリスロマイシンが、イン・ビトロでは高い抗菌作用を示すにも拘らず、ヒトでは抗−H. pylori効果を全く示さないのと同様に、マウスではH. felisに対して有意のイン・ビボ効果を示さない。対照的に、ビスマス化合物、メトロニダゾールおよびテトラサイクリンまたはアモキシシリンの三薬療法では、H. felisに感染したマウスでは極めて高い根治率が得られる(Dick-Hegedus and Lee,１９９１年）。このような治療法は、ヒトの抗−H. pylori療法の最も成功したものである。
H. felisモデルは、マウスをヘリコバクター抗原で経口で免疫し、マウスを感染から防御すること(Chen et al., １９９２年）、またはそれらが既に感染しているときにはそれらを治療して、感染症を根絶するようにすることができることを示すためにも用いられている(Doidge et al., １９９４年）。これらのワクチンに用いられた抗原としては、H. felisまたはH. pyloriからの破壊された細胞製剤、およびH. pyloriウレアーゼ分子の総てまたは一部を発現するE. coliクローンから産生したH. felisまたはH. pyloriからの細菌性酵素ウレアーゼまたはそのサブユニット等があげられる（Michetti et al., １９９４年；国際特許公表ＷＯ９０／０４０３０号、ＷＯ９３／０７２７３号およびＷＯ９４／０９８２３号明細書も参照されたい）。H. pylori熱ショックタンパク質（ＨｓｐまたはＨＳＰ）も、防御抗原であることが示されている(Ferrero et al.,１９９５年）。
国際特許公表ＷＯ９３／１８１５０号明細書（出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／００４７２号明細書）には、組換えH. pylori細胞毒（ＣＴまたはＶａｃＡ）、H. pylori細胞毒関連免疫支配抗原(cytotoxin-associated immunodominant antigen)（ＣＡＩまたはＣａｇＡ）、またはH. pylori熱ショックタンパク質の１種類以上を、場合によってはH. pyloriウレアーゼと共に含んでなるワクチンまたは治療組成物が開示されている。国際特許公表ＷＯ９５／２７５０６号明細書（出願番号ＰＣＴ／ＦＲ９５／００３８３号明細書）には、実質的に精製したH. pyloriカタラーゼを活性成分として含む抗−H. pylori免疫組成物が開示されており、国際特許公表ＷＯ９５／１４０９３号明細書（出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／０３２５９号明細書）には、ヘリコバクターの感染に対する防御抗体を誘発することができる免疫原性組成物であって、H. pyloriまたはH. felis由来の少なくとも１種類のウレアーゼ構造ポリペプチドと、場合によってはヘリコバクター由来のウレアーゼ関連熱ショックタンパク質またはチャペロニン(chaperonin)とを含んでなる組成物が開示されている。
H. pylori由来の抗原を用いてH. felis感染からマウスを防御することができることは、これら２種の間に交差反応性および交差防御抗原があることを示唆している。すなわち、H. pyloriに含まれる分子であって、マウスに免疫応答を誘発して、H. felis上の標的を認識することによりマウスをH. felis感染から防御することができるものがある。これらのH. pylori分子に対する免疫応答がマウスをH. felis感染から防御する場合には、同様な免疫応答がヒトをH. pylori感染から防御し、または既に感染しているときには、ヒトを感染から治癒すると思われる。ウレアーゼは、H. felisマウスモデルにおけるこのような交差防御分子であることが示されている（Michetti et al.,１９９４年）。
本発明へと導く研究において、交差反応および交差防御抗原を更に同定するために、H. pylori菌株由来のＤＮＡライブラリーを構築し、破壊したH. felis細胞から製造したワクチンおよび粘膜アジュバント(mucosal adjuvant)で経口的に免疫したマウスからの血清を用いてスクリーニングし、抗−H. felis抗体によって認識されるH. pyloriタンパク質を発現するE. coliクローンを同定した後、抗原性の防御H. pyloriタンパク質を同定した。
発明の概要
一つの態様では、本発明は、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防に用いる抗原性製剤であって、
(i)     分子質量(molecular mass)が約１９ｋＤａの抗原であって、分子質量が約１７ｋＤａの成熟形にプロセスされる抗原、
(ii)    分子質量が約１３ｋＤａの抗原、
(iii)   分子質量が約３６ｋＤａの抗原、
(iv)    分子質量が約５０ｋＤａの抗原、
(v)     分子質量が約２９ｋＤａの抗原、および
(vi)    上記抗原(i)〜(v)のいずれかの免疫原性断片であって、哺乳動物宿主における特異的な防御免疫応答を誘導することができるもの、
からなる群から選択される少なくとも１種類のヘリコバクター抗原の少なくとも部分的に精製した調製物を含んでなる抗原製剤を提供する。
もう一つの態様では、本発明は、
(i)     分子質量が約１９ｋＤａの抗原であって、分子質量が約１７ｋＤａの成熟形にプロセスされる抗原、
(ii)    分子質量が約１３ｋＤａの抗原、
(iii)   分子質量が約３６ｋＤａの抗原、
(iv)    分子質量が約５０ｋＤａの抗原、
(v)     分子質量が約２９ｋＤａの抗原、および
(vi)    抗原(i)〜(v)のいずれかの免疫原性断片であって、哺乳動物宿主における特異的な防御免疫応答を誘導することができるもの、
からなる群から選択される、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または防御に用いる単離されたヘリコバクター抗原を提供する。
前記の抗原のそれぞれは、更に抗−H. felis抗体と反応性であることを特徴とする。
好ましくは、前記の抗原(i)は、後記のクローンＢ４．６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．（配列番号）１０）の推定配列に実質的に相当するアミノ酸配列、またはその対立形質(allelic)または他の変異体を含み、前記の抗原(ii)は、後記のクローンＣ３．５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）の推定配列に実質的に相当するアミノ酸配列、またはその対立形質または他の変異体を含み、前記の抗原(iii)は、後記のクローンＥ２．５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）の推定配列に実質的に相当するアミノ酸配列、またはその対立形質または他の変異体を含み、前記の抗原(iv)は、後記のクローンＧ３．８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）の推定配列に実質的に相当するアミノ酸配列、またはその対立形質または他の変異体を含み、前記の抗原(v)は、後記のクローンＨ５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）の推定配列に実質的に相当するアミノ酸配列、またはその対立形質または他の変異体を含むのが好ましい。
適当な変異体が哺乳動物宿主において特異的な防御免疫応答を誘導することができる場合には、この変異体は前記のアミノ酸配列の一つに対して少なくとも５０〜６０％、更に好ましくは少なくとも７０〜８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の類似性を有することができる。
本明細書で用いる「少なくとも部分的に精製した」という用語は、特定の抗原の含量が、ヘリコバクター細菌の全細胞音波処理生成物中の抗原の含量より多い、好ましくは少なくとも３０％多い、更に好ましくは少なくとも５０％多い調製物を表す。好ましくは、この調製物は、抗原が「実質的に純粋」であるもの、すなわち特定の抗原の含量が調製物中の全ヘリコバクター抗原の少なくとも８０％であり、更に好ましくは少なくとも９０％であるものである。
本明細書で用いる「単離した」という用語は、抗原が少なくとも１つの精製または単離段階を受け、好ましくは抗原がワクチン組成物で使用するのに適した形態であることを表す。
本発明は、前記のヘリコバクター細菌の特定の抗原だけでなく、特定の抗原（１または複数）の免疫原性断片、すなわち哺乳動物宿主において特異的な防御免疫応答を誘導することができる抗原（１または複数）の断片にも敷衍されることを理解すべきである。適当であれば、免疫原性断片は、特定の抗原（１または複数）の少なくとも５個、更に好ましくは少なくとも１０個の隣接するアミノ酸残基を含む。このような免疫原性断片は、ヘリコバクター特異抗体、特にヘリコバクターの感染に対して防御または治療効果を有する抗体によっても認識することもできる。
もう一つの態様では、本発明は、哺乳動物宿主においてヘリコバクター感染の治療または予防に使用するためのワクチン組成物であって、抗原性製剤または前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原の免疫学的に有効量を、必要に応じてアジュバントと共同して、１個以上の薬学上許容可能なキャリヤーおよび／または希釈剤と共に含むワクチン組成物提供する。
更にもう一つの態様では、本発明は、哺乳動物宿主においてヘリコバクター感染症の治療または予防の方法であって、前記宿主に、抗原性製剤または前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原の免疫学的に有効量を、場合によってはアジュバントと共に投与することを特徴とする方法を提供する。
関連の態様では、本発明は、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防のため、抗原性製剤または前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原の免疫学的に有効量を、場合によってはアジュバントと共に含んでなるワクチン組成物の使用を提供する。
本明細書における「免疫学的に有効量」という用語の使用により、哺乳動物宿主へのその量の、単回投与でまたは連続の一部としての、投与がヘリコバクター感染症の治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康および肉体的条件、治療を受ける個体の分類学的群、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望な防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況の評価、および他の関連因子によって変化する。この量は、日常の試験によって決定することができる比較的広範囲になることが予想される。
本発明の抗原性製剤は、宿主に経口投与し、粘膜アジュバントと共に投与するのが好ましいが、必須ではない。しかしながら、本発明は、この抗原性製剤の非経口投与にも敷衍される。
本発明は、モノクローナルまたはポリクロナル抗体でありうる、抗原性製剤または前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原に特異的な抗体にも敷衍される。このような抗体は、当業者に周知の方法によって製造することができる。
この態様では、本発明は、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防の方法であって、抗原性製剤または前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体の有効量を投与することによる前記宿主の受動免疫を含む方法も提供する。
本発明のヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原は、ヘリコバクター細菌の全細胞音波処理物のような天然供給源から精製または単離することによって製造することができる。しかしながら、抗原性製剤または単離した抗原は、合成的、好ましくは組換体の手法によって製造することもできる。組換体の手法によって製造するときには、この抗原は天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有することができ、またはそれに対するアミノ酸の１または２以上の置換、欠失および／または付加のような、配列の変更の後にも分子が天然に存在するヘリコバクター抗原に対して特異的な防御免疫応答を誘導することができる限り、このようなアミノ酸配列の変更を含むことができる。組換体分子または天然に存在する分子のいずれから作成したものであっても、抗原の任意の断片または誘導体には同様な免疫原性の要件が必要である。従って、ここでヘリコバクター抗原とは、天然に存在する分子、その組換体の形態、および任意の変異体(mutants)、誘導体、断片、同族体(homologues)または類似体(analogues)のような、分子が、天然に存在するヘリコバクター抗原に対して特異的な防御免疫応答を誘発する限り、これらの分子を表すものとする。また、２または３以上のヘリコバクター抗原の間の、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼのような他の分子との融合分子を含む他の分子（１または複数）との融合分子も包含される。
本発明は、本発明のヘリコバクター抗原をコードし、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、３、５、７または９の一つに記載された、またはその総てまたは一部と実質的に同様なヌクレオチド配列を有する単離した核酸分子も包含する。「実質的に同様な」という用語は、少なくとも４０〜５０％、更に好ましくは少なくとも６０〜７０％、最も好ましくは少なくとも８０％の同一性を有することを意味する。これに関して「一部」とは、少なくとも１５個のヌクレオチドの、更に好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチドの隣接した一続きを意味する。
この態様によれば、前記に広汎に記載したヘリコバクター抗原をコードし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、３、５、７または９の一つに記載の核酸配列の総てまたは一部に対して、またはその相補性形態に対して低緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含む核酸分子が提供される。
もう一つの態様では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、３、５、７または９の一つに実質的に記載されたヌクレオチドの配列またはその部分を含む核酸分子を提供する。
核酸分子は、一本鎖または二本鎖で、線状または共有結合的に閉鎖した環状形態のＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。緊縮(stringency)の程度を画定するため、Sambrook et al.（１９８９年）、３８７−３８９頁を好都合に参照することができ、前記文献の内容は、引用によって本明細書に包含され、第１１節の洗浄段階は高緊縮性であると考えられる。低緊縮性は、ここでは０．１〜０．５ｗ／ｖ  ＳＤＳにおいて３７〜４５℃で２〜３時間でのものとして定義される。ハイブリダイゼーションに関与する核酸の供給源および濃度によって、他の条件の緊縮性、例えばここでは≧４５℃で２〜３時間で０．２５〜０．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳであると考えられる中緊縮条件またはSambrook et al.（１９８９年）によって開示された高緊縮条件を用いることもできる。
本発明のこの態様のヌクレオチドの配列は、天然、合成または半合成供給源から得ることができ、またこのヌクレオチド配列は天然に存在する配列であることができ、またはこのような配列を含む核酸分子が前記に広汎に記載したヘリコバクター抗原として発現させることができる限り、このような天然に生ずる配列に対して単回または複数回の塩基置換、欠失、挿入および逆位(inversion)などの突然変異によるものにも関連する。
ヌクレオチド配列は、その隣接位置に発現制御配列を有することができ、このような制御配列は通常は異種供給源から誘導される。
本発明は、プロモーター配列および開始配列を有する発現制御配列と、ヘリコバクター抗原をコードするヌクレオチド配列であって、プロモーターおよび開始配列に対して３′に位置するヌクレオチド配列とを含んでなる組換えＤＮＡ分子も提供する。更にもう一つの態様では、本発明は、ヘリコバクター抗原を発現することができる組換えＤＮＡクローニングビヒクル(vehicle)であって、プロモーター配列および開始配列を有する発現制御配列と、ヘリコバクター抗原をコードするヌクレオチド配列であって、プロモーターおよび開始配列に対して３′に位置するヌクレオチド配列とを含んでなるビヒクルを提供する。もう一つの態様では、組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよび／または前記のような組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞が提供される。
適当な発現制御配列、および宿主細胞／クローニングビヒクルの組合わせは当該技術分野で周知であり、例えばSambrook et al.（１９８９年）に記載されている。
更にもう一つの態様では、本発明のヘリコバクター抗原と、追加のポリペプチド、例えば融合したクローニングビヒクルのＤＮＡによってコードされるポリペプチドとを含んでなる融合ポリペプチドが提供される。このような融合ポリペプチドは、前記の組換えＤＮＡクローニングビヒクルで形質転換したまたは感染した宿主細胞によって産生させることができ、これを次に宿主細胞から単離して、他の宿主細胞タンパク質を実質的に含まない融合ポリペプチドを提供することができる。
本発明は、本発明のヘリコバクター抗原の抗原性を示す合成ポリペプチドにも敷衍される。本明細書で用いる「合成」という用語は、ポリペプチドが化学的または生物学的手段によって、例えば化学合成によってまたは生物学的合成へと至る組換えＤＮＡ技術によって産生されたことを意味する。このようなポリペプチドは、前記のような融合ポリペプチドの開裂および当該技術分野で周知の方法によるクローニングビヒクルのＤＮＡによってコードされた付加的ポリペプチドから所望のポリペプチドを分離することによって得ることができることは勿論である。あるいは、所望なポリペプチドのアミノ酸配列が、所望なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を決定することによって確立されてしまえば、ポリペプチドは例えば周知のMerrifieldの固相合成法によって合成することができる。
本発明の組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよび／またはヘリコバクター抗原を発現する宿主細胞が同定されてしまえば、例えば融合タンパク質のような宿主細胞によって合成される発現されたポリペプチドを、当業者に周知の手法によって宿主細胞成分の混入が実質的にない状態で単離することができる。
ヘリコバクター抗原に相当するアミノ酸配列を含んでなるまたは部分的に含む単離したポリペプチドを用い、十分に確立された手順でウサギ、マウス、または他の動物を免疫することによってポリクローナル抗血清を生じさせることができる。また、このようなポリペプチドを用いて、当該技術分野で周知の手法によってモノクローナル抗体を製造することもできる。
また、融合ポリペプチドを包含する本発明によるポリペプチドを活性免疫原として用いて、ワクチン製造の技術分野で周知の方法によって単一(single)または多価ワクチンを製造し、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防に用いることができる。
あるいは、融合ポリペプチドを包含する本発明によるポリペプチドを、ヒトまたは他の哺乳動物患者の血清試料などの試料中のヘリコバクターに対する抗体を検出するための診断用イムノアッセイにおける抗原として用いることもできる。このようなイムノアッセイは当該技術分野で周知であり、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなアッセイ法が挙げられる。
本明細書において、特に断らない限り、「含む」という単語、または「含んでなる」または「含んでなり」のような変化体は、記載される完全体(integer)または完全体の群を包含するが、任意の他の完全体または完全体の群を除外するものではないことを意味するものと理解されるべきである。
発明の詳細な説明
好ましくは、本発明の抗原性製剤または単離した抗原は、H. pyloriまたはH. felis抗原（１または複数）を含んでいる。また好ましくは、この抗原性製剤または単離した抗原は、粘膜アジュバント(mucosal adjuvant)を含む経口投与用のワクチン組成物に用いる。
本発明の特に好ましい態様では、前記に広汎に記載したH. pylori抗原（１または複数）を含んでなる抗原性製剤または単離した抗原を粘膜アジュバントと共に含んでなる経口ワクチン組成物を、ヒト宿主におけるH. pylori感染症の治療または予防のために用いる。
場合によっては、および好ましくは感染した宿主に本発明のヘリコバクター抗原性製剤と共に投与される粘膜アジュバントは、コレラ毒素である、本発明で用いることができるコレラ毒素以外の粘膜アジュバントとしては、Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、化学的に修飾したコレラ毒素、またはコレラ毒素アミノ酸配列の修飾によって産生される関連タンパク質のようなコレラ毒素の無毒性誘導体が挙げられる。これらは、ヘリコバクター抗原性製剤に加え、またはこの製剤と抱合することができる。同じ手法は、粘膜アジュバントまたはEscherichia coliの熱に不安定な毒素のようなデリバリー(delivery)特性を有する他の分子に適用することができる。粘膜アジュバントまたはデリバリー活性を有する他の化合物、例えば胆汁；ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリオルニチンなどのポリカチオン；ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムのような界面活性剤；脂質に抱合された材料；ストレプトマイシンのような抗生物質；ビタミンＡ；および粘膜表面の構造的または機能的完全性を変更する他の化合物を用いることができる。他の粘膜活性化合物としては、ＭＤＰのような微生物構造体の誘導体、アクリジン、およびシメチジンなどが挙げられる。
本発明のヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原は、本発明により、ISCOMSTM（免疫刺激複合体）、ＣＴＢ、リポソームを含むまたはアクリレートまたはポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコシド）のような化合物にカプセル化されたISCOMSTMで投与してＭ細胞による吸着に適した大きさのミクロスフェアを形成することができる。また、マイクロまたはナノ粒子を特異的な腸レセプターを有するビタミンＢ１２のような分子に共有結合することもできる。ヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原は、油性エマルジョンに配合して、経口的に投与することもできる。アジュバントの総てを網羅したものではないが、詳細なリストは、CoxおよびCoulter（１９９２年）に見出だすことができる。
他のアジュバント、ならびに通常の薬学上許容可能なキャリヤー、賦形剤、緩衝剤または希釈剤を、本発明の予防または治療用ワクチン組成物に配合することもできる。このワクチン組成物は、例えば重炭酸ナトリウム緩衝剤をヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原、およびコレラ毒素粘膜アジュバントと共に含む腸溶性コーティングを施したゼラチンカプセルに処方することができる。
このような予防または治療用ワクチン組成物の処方物は、当業者には周知である。適当な薬学上許容可能なキャリヤーおよび／または希釈剤としては、任意および総ての通常の溶媒、分散媒質、充填剤、固形キャリヤー、水溶液、コーティング剤、抗細菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。このような媒質および薬剤の薬学活性物質のための使用は当該技術分野で周知であり、例えばRemingtonの薬科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)、第１８版、Mack Publishing Company,ペンシルバニア、米国に記載されている。任意の通常の媒質または薬剤が活性成分と不相容性であることを除いては、本発明のワクチン組成物におけるその使用が意図される。補足的活性成分を組成物に配合することもできる。
本発明のヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原を、ワクチン組成物に唯一の活性免疫原として投与することができる。しかしながら、ワクチン組成物は、ウレアーゼ、リポ多糖類、Ｈｓｐ６０、ＶａｃＡ、ＣａｇＡまたはカタラーゼのような他のヘリコバクター抗原、ならびに他の病原性種に対する免疫活性抗原を含む他の活性免疫原を含むこともできる。
治療または予防用ワクチン組成物の形態のヘリコバクター抗原性製剤または単離した抗原を投与する代わりに、抗原またはその免疫原性断片を、生ワクチンベクターを用いて、特に生の組換え細菌、ウイルス、または外来ポリペプチドとして免疫原性断片の抗原の発現に必要な遺伝子材料を含む他の生の薬剤を用いて、哺乳動物宿主に投与することができる。特に、Salmonella、Shigella、Yersinia、Vibrio、EscherichiaおよびBCGのような胃腸でコロニー形成する細菌がワクチンベクターとして開発されており、これらおよび他の例はHolmgren et al.（１９９２年）およびMcGhee et al.（１９９２年）によって報告されている。
従って、本発明は、前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原またはその免疫原性断片を発現するワクチンベクターを用いる宿主への投与にも敷衍される。従って、もう一つの態様では、本発明は、哺乳動物宿主のヘリコバクター感染症の治療または予防に使用する製剤であって、前記に広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原またはその免疫原性断片を発現するワクチンベクターを含んでなる製剤を提供する。
この態様では、本発明は、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防の方法であって、前記宿主に前記の広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原またはその免疫原性断片を発現するワクチンベクターの投与を特徴とする方法に敷衍される。
更に、本発明は、前記の広汎に記載した単離したヘリコバクター抗原またはその免疫原性断片を発現するワクチンベクターの哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染症の治療または予防への使用に敷衍される。
本発明の更なる特徴を、下記の実施例に更に詳細に記載する。しかしながら、この詳細な説明は、単に本発明の例示のために包含されると理解すべきであり、前記のような本発明の広汎な説明についての制限であるとは決して理解べきではない。
添付の図面において、
第１ＡおよびＢ、２ＡおよびＢ図は、E. coli XLOLRから発現されたクローニングしたH. pyloriタンパク質を示す。
(1A)    ４〜２０％グラディエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ＣＢＢ染色によって可視化した。レーンＭ、分子量標準（ｋＤａ）；レーン１、ファミリーＡ；レーン２、ファミリーＢ；レーン３、ファミリーＣ；レーン５、ファミリーＦ；レーン６、ファミリーＧ；レーン７、ファミリーＨ；レーン８、ネガティブ・コントロール、E. coli XLOLR；レーン９、ポジティブ・コントロール、Helicobacter pylori総細胞タンパク質、
(1B)    相当するウェスターンブロット試料、レーンの順序はパネルＡについてと同じ、
(2A)    ４〜２０％グラディエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ＣＢＢ染色によって可視化した。レーンＭ、分子量標準（ｋＤａ）；レーン２、ファミリーＥ、
(2B)    相当するウェスターンブロット試料、レーンの順序はパネルＡについてと同じ。
実施例１
抗−H. felis抗体によって認識されるH. pyloriタンパク質を発現するE. coliクローンの同定
Ａ．  材料および方法
細菌の菌株
Helicobacter pylori菌株HP921023をＤＮＡドナーとして用いて、遺伝子ライブラリーを作成した。Escherichia coli菌株ER1793(New England Biolabs)は、ファージ感染およびLambda ZAP Expressのプレーティングに用いた宿主であった。E.coli菌株XLI-Blue MRF′およびXLOLR(Stratagene)を用いて、ファージミド(phagemid)ｐＢＫ−ＣＭＶを除去し、クローニングした遺伝子のタンパク質発現を行なった。
H. pylori染色体ＤＮＡの単離
H. pyloriからの全細胞ＤＮＡを、本質的にMajewskiおよびGoodwin（１９８８年）によって報告された方法で作成した。
抗血清の作成
マウス抗血清を、１週間毎の間隔でHelicobacter felisに対して４回の経口(ora)−胃免疫によって生成させた。それぞれのワクチン用量は、音波処理したH. felis細胞１ｍｇ（タンパク質）とコレラ毒素１０μｇとからなっていた。血液を採取して、血清をプールした。この血清を、ＴＢＳ中に５％ｗ／ｖ脱脂乳および０．０５％ｖ／ｖTween 20を含む５０％ｖ／ｖE. coli抽出物(Promega)に吸着させ、最終的に１：１００の希釈であった。この製剤を室温で４時間インキュベーションした後、イムノスクリーニングを行ない、抗血清と宿主タンパク質との非特異的反応性を除去または減少させた。血清の特異性を、H. pyloriの全細胞の希釈物をポジティブ・コントロールに、そしてE. coli XLOLRをネガティブ・コントロールとして用いてドット・ブロットおよびウェスターンブロット法によって確かめた。
細菌の成長条件
Lambda ZAP Expressで感染させるため、菌株ER1793細胞を、最初に０．２％ｗ／ｖマルトースおよび１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を補足したLuria-Bertani（ＬＢ）ブロス(broth)中で３０℃で成長させた。感染の後、細胞をＬＢブロスに３７℃１５分間保持した後、ＮＺＹ寒天培地にプレーティングし、４２℃で４時間、次いで３７℃で一晩インキュベーションした。ファージミドの除去およびプラスミドの単離のため、E. coli菌株XL1-BlueおよびXLOLRをＬＢブロス中で３７℃で成長させ、形質転換したXLOLR細胞を３７℃でＬＢ／カナマイシンプレート（５０μｇ／ｍｌ）上で選択した。
H. pylori遺伝子ライブラリーの構築
H. pylori発現ライブラリーを、ＢａｍＨＩで予備消化し、末端の５′リン酸を子ウシ腸ホスファターゼで除去したLambda ZAP Expressベクター(Stratagene)で標準的手順(Sambrook et al.、１９８９年）を用いて構築した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡをゲル電気泳動によって分画し、６〜１２ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化したラムダアーム１．０μｇと連結した。組換えファージＤＮＡを、Gigapack II抽出物(Stratagene)を用いてイン・ビトロでパッケージングした。ライブラリーを、E. coli菌株ER1793またはXL1-Blue MRF′細胞をパッケージングしたファージのアリクウォットで感染させることによって滴定し、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを含むインジケータープレートにプレーティングした。非組換えファージ対組換えファージの比率は１：５であった。組換えライブラリーのタイターは、ラムダＤＮＡ１μｇ当たり１×１０６ｐｆｕと計算された。
H. pyloriゲノムライブラリーの抗体スクリーニング
ライブラリーの一部を、プラークイムノブロット分析法によってスクリーニングした。総数が１０，０００個のプラークをプレーティングし（２，０００バクテリオファージプラーク／プレート）、Hybond-Cエキストラニトロセルロースフィルター(Amersham)に上げ、Sambrook et al.（１９８９年）の方法によりプロセスした。フィルターを抗−H. felisマウス血清の１：１００希釈液で室温で一晩スクリーニングした。０．０５％ｖ／ｖTween 20／ＴＢＳで洗浄した後、フィルターを１：２０００抱合ヤギ抗−マウスイムノグロブリンＧ−抱合西洋ワサビペルオキシダーゼ中で１．５時間インキュベーションした。フィルターを前記と同様に洗浄し、ＴＭＢ基質(KPL Inc.)を用いてカラー反応を展開した。陽性のファージクローンを同定したならば、プラークを含む寒天プラグを採取し、ファージをＳＭ緩衝液に溶出した。プラークの純度を得るため、細菌の感染、再プレーティングおよびイムノスクリーニングを繰り返した。
ラムダZAP ExpressベクターからのプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶのイン・ビボでの切除
ラムダZAP ExpressからのH. pylori ＤＮＡを含むｐＢＫ−ＣＭＶのイン・ビボでの切除(excision)は、E. coli菌株XL1-Blue MRF′をインサートＤＮＡを含むLambda ZAP ExpressおよびExAssistヘルパーファージＭ１３で同時に感染させることによって行なった。切除したファージミドを繊維状ファージ粒子としてパッケージングし、宿主細胞から分泌した後、これを熱殺した。このファージミドを、XLOLR細胞を感染させＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレートにプレーティングすることによって取り戻した。プレート上に現われる細菌コロニーは、H. pylori由来のクローニングしたＤＮＡインサートを有するｐＢＫ−ＣＭＶ二本鎖ファージミドを含んでいた。次に、これらのコロニーをタンパク質発現について分析した。
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンブロット分析
E. coli XLOLRでクローニングしたH. pylori ＤＮＡによって産生される総タンパク質を、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンブロット法（Sambrook et al.、１９８９年；Towbin et al.、１９７９年）によって分析した。発現プラスミドを含むXLOLRの培養物１０ｍｌをスーパーメディウム(supermedium)中で３７℃で一晩成長させた。培養物を２つに分けて、一方をＩＰＴＧで誘導し、最終濃度を１ｍＭとして、２〜４時間インキュベーションを継続した。１ｍｌのアリクウォットを収集し、細胞を遠心分離によってペレット化し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁した。細胞を、等容のＳＤＳ試料還元緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。タンパク質を４〜２０％グラディエントＴｒｉｓ−グリシンゲル(Novex)上で電気泳動によって分割し、クーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で染色した。平行して行なったゲルをニトロセルロースメンブラン(BioRad)にエレクトロトランスファーし、前記の抗−H. felisマウス血清を用いてH. pyloriの免疫反応性タンパク質を検出した。
分子質量の計算のため、クマシー・ブルーで染色した湿潤ゲルをMolecular Dynamics 300A型デンシトメーターを用いてスキャンし、見掛けの分子質量をImage Quantバージョン３．３ソフトウェアを用いて標準タンパク質に対して決定した。
タンパク質のＮ−末端配列の決定
Ｎ−末端の配列決定を行なうタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ｌｘＣＡＰＳエレクトロブロッティング緩衝液中ＰＶＤＦメンブラン(Novex)に移した後、１％ｗ／ｖＣＢＢ／５０％ｖ／ｖメタノールで染色し、タンパク質バンドが見えるようになるまで５０％ｖ／ｖメタノールで脱色した。ウェスタンブロットによって同定した免疫陽性タンパク質に相当するバンドを切除して、配列決定した。アミノ酸配列決定は、メルボルン大学、獣医科学校、動物バイオテクノロジーセンターのApplied Biosystems Inc. 473A型シークエンサー上で行なった。他の配列決定は、Auspep Pty. Ltd.によって提供された。
クローンのＤＮＡ調製物および姉妹細胞分析
プラスミドＤＮＡを、異なるH. pylori ＤＮＡインサートを有するE. coli XLOLRクローンの培養物からアルカリリーシス法（Sambrook et al.、１９８９年）によって単離した。制限酵素による消化は、酵素製造業者(Promega Inc.)によって推奨される方法で行なった。プローブとして用いられるクローニングしたH. pylori ＤＮＡの制限断片を０．８％アガロース中でゲル電気泳動によって分割して、臭化エチジウムで染色し、ゲルから切除して、核酸精製のためのBresacleanキット(Bresatec Ltd.)で精製した。大きさが２．５〜７．０ｋｂのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を、Random Primers ＤＮＡ標識キット(Gibco BRL)を用いて（32Ｐ）ｄ−ＡＴＰで標識した。
交差ハイブリダイゼーション分析を行って関連クローンを決定するため、XLOLRクローンの細胞懸濁液をニトロセルロース上にドットし、製造業者(Amersham)のプロトコールに従って処理した。フィルターを、２ｘＰＥ、１％ｗ／ｖ脱脂乳および７％ｗ／ｖＳＤＳを含む溶液中で６５℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２ｘＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中で室温で１５分間１回、２ｘＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中で６５℃で３０分間２回洗浄した。ハイブリダイゼーションの結果を、Kodak Biomaxフィルム上でオートラジオグラフィによって可視化した。
Ｂ．  結果および討論
Helicobacter pyloriの可能性のある防御用抗原をクローニングするため、株HP921023のゲノムライブラリーをラムダ発現ベクターLambda ZAP Express中で構築した。ライブラリーを、Helicobacter felisで接種したマウス由来の血清で免疫反応性についてスクリーニングし、H. felis抗原と交差反応するH. pylori抗原を発現するクローンの検出を試みた。約１０，０００のプラークを、抗−H. felisマウス血清を用いてスクリーニングした。様々なシグナル強度を有する５０個の免疫陽性クローンがマウス血清によって認識された。これらを採取し、精製して、発現プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶを切除して、クローニングしたＤＮＡおよびコードされたタンパク質を更に特性決定した。これらの組換えプラスミドによって発現されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第１Ａおよび２Ａ図）およびウェスターンブロッティング（第１Ｂおよび２Ｂ図）によって分析した。
マウス血清によって認識されたクローニングしたタンパク質の分子質量は、約１３ｋＤａ〜約６２ｋＤａであった。クローンによって表われたパターンを、タンパク質プロフィールおよびタンパク質の大きさによってファミリーに分類することができた（後記の第１表を参照されたい）。ファミリーを、便宜上アルファベット順に命名した（例えばファミリーＡ、Ｂ、Ｃなど）。ファミリーＡは、約６２ｋＤａおよび約３３ｋＤａの２種類の主要なタンパク質によって同定された５個の構成員からなっていた（第１Ｂ図、レーン１）。ファミリーＢは、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａの２種類のタンパク質を発現する１４種類の関連クローンを有している（第１Ｂ図、レーン２）。２種類のタンパク質の小さな方は、約１９ｋＤａのタンパク質よりも多量に産生され易い。培養条件によって、約１９ｋＤａのタンパク質は約１７ｋＤａのタンパク質と等量でまたはかなり少ない量で含まれることがある。これにより、ウェスターンブロッティングによって可視化したときに、約１７ｋＤａのタンパク質が約１９ｋＤａよりも強い免疫陽性バンドとして観察されることが多い理由を説明することができる。ファミリーＣは、１０個の構成員であって、ＣＢＢ染色ゲル上よりもウェスターンブロット上で一層容易に識別されやすい大きさが約１３ｋＤａの小さなタンパク質（第１Ｂ図、レーン３）を特徴とするものを有する。存在するタンパク質およびブロット上のシグナルの発現水準におけるクローン変動は、弱いものから強いものまで変化することができる。ファミリーＥは、約３６ｋＤａのタンパク質をコードする１個のクローンによって表される（第２図、レーン２）。ファミリーＦも、約５５ｋＤａのタンパク質を多量に発現する１個のクローンによって表される（第１Ｂ図、レーン５）。総てのクローニングしたタンパク質の内、このタンパク質は、ウェスターンブロットで観察したとき、抗−H. felisマウス血清によって最も強く認識される。ファミリーＧは、同等な大きさの宿主E. coliタンパク質（第１Ａ図、レーン６）に加えてＣＢＢ染色したゲル上で容易に可視化することができる量では産生されない約５０ｋＤａのタンパク質（第１Ｂ図、レーン６）を発現する２個の構成員を有する。しかしながら、マウス血清中の抗体はこのタンパク質に対して結合するが、レーン８で行ったE. coliタンパク質に対しては結合しないことを明確に示している。このクローニングしたH. pyloriタンパク質が多量に発現しないが、極めて免疫陽性であれば、これは十分Helicobacter pylori感染症に対する強い免疫応答を誘導するのに重要な抗原でありうる。レーン７（第１Ａおよび１Ｂ図）は、ファミリーＨの唯一の代表である約２９ｋＤａのタンパク質を含むが、これは発現が弱く、ウェスターンブロットでは他のファミリーのタンパク質より弱いシグナルを与える。レーン８、第１図およびレーン４、第２図は、H. pyloriインサートなしのネガティブ・コントロールであるE. coli XLOLRを有する発現プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶを含んでいる。マウス血清がE. coli抽出物を吸収すると、宿主細胞タンパク質に対する非特異的結合が大幅に妨げられた。基質の展開時間の長さによって、未吸収マウス血清でプローブしたブロット上に現れる宿主細胞タ��パク質の多くと比較して、総てのレーンに亙って最大６種類のE. coliタンパク質が認識された（データーは示されていない）。主要な宿主細胞タンパク質は、３７ｋＤａで認識される。レーン９は、大きさが１１〜９５ｋＤａの範囲の約１０個の免疫陽性バンドを有するHelicobacter pyloriの全細胞タンパク質である陽性コントロールを含む。姉妹(sibling)ＤＮＡ分析の結果（データーは示されていない）により、クローニングしたH. pyloriタンパク質の７個のファミリーが存在するというウェスターンブロットデーターが確かめられた。
ライブラリーの生成に用いたゲノムＤＮＡは、H. pyloriのUre B陽性株から得られ、ウレアーゼはすでにクローニングされている既知の防御用抗原であるので（Michetti et al.、１９９４年）、クローンをウレアーゼの存在についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチドプローブを用いてUre AおよびUre B遺伝子に対してハイブリダイゼーションを行ったところ、５個のクローンはウレアーゼＡおよびウレアーゼＢ  ＤＮＡ配列のいずれについても陽性であることが明らかになった（第１表）。総てのウレアーゼ陽性クローンは、ファミリーＡに属する。ファミリーＡの外側に存在する他のクローンは、ウレアーゼ陽性ではなかった。約６２ｋＤａおよび約３３ｋＤａのタンパク質の同一性をＮ−末端配列決定によって確かめた。データーベースSwiss-Prot/GenPeptideでのタンパク質相同性の探索では、Helicobacter pyloriのウレアーゼＢサブユニットを有する約６２ｋＤａの１５アミノ酸残基の１００％相同性を同定した。約３３ｋＤａのタンパク質の１８アミノ酸配列は、ウレアーゼＡサブユニットと９４．４％の相同性を有し、ミスマッチしたアミノ酸残基は１個にすぎないことが分かった。
ファミリーＢ、ファミリーＣ、ファミリーＦおよびファミリーＧについての予備的Ｎ−末端配列も得られた。ファミリーＢの約１９ｋＤａのタンパク質のタンパク質配列は、Helicobacter pyloriの膜に関連したリポタンパク質抗原（Ｌｐｐ２０）に相当することが分かった（Kostrzynska et al.、１９９４年）。
ファミリーＣの約１３ｋＤａのタンパク質またはファミリーＧの約３６ｋＤａのタンパク質に対するデーターベースには重要な相同性は見られなかった。
ファミリーＦからの５５ｋＤａのタンパク質についてのタンパク質配列データは、Helicobacter pyloriの熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）配列の最初の１５個のＮ−末端アミノ酸と８０％相同性を有し、マッチしなかったものは３個の残基にすぎないことがわかった。この知見はウェスターンブロッティングの結果を支持しており、Ｈｓｐ６０は強力な抗体応答を誘発することが知られているので、この免疫反応性バンドの高いシグナル強度を説明している。
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その後、ＤＮＡ配列決定は、前記で決定したＮ−末端アミノ酸配列における幾つかのエラーを同定した。
実施例２
クローニングしたH. pylori抗原ファミリーＣ、Ｅ、Ｇ、ＨおよびＢ（第１表）からの選択された代表的クローンを、下記のようにして配列決定した。
(i)   クローンＣ．３．５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１および２）
クローンＣ３．５における４４２３ｂｐのインサートを配列決定するのに用いた方法としては、下記に要約した手順の組み合わせが含まれる。
１．  プラスミドＤＮＡを、改変したアルカリリーシス(alkaline lysis)手順を用いて作成した。
２．  ネスト欠失(nested deletions)は、ＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼを用いてＴ７およびＴ３末端の両分から生成した。
３．  欠失クローンの大きさを選択して、アガロースゲル上で電気泳動によってＤＮＡ配列決定した。
４．  ＤＮＡ配列決定は７−デアザ(deaza)ｄＧＴＰを含む標準的なジデオキシヌクレオチド停止反応を用いて行った。必要ならば、７−デアザｄｌＴＰを用いて厳しいＧＣバンド圧縮を分割した。［35Ｓ］ｄＡＴＰを、標識として用いた。
５．  配列決定反応は、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。総ての試料は、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃの順に載せた。
６．  内部配列決定プライマーを必要に応じて合成した。
(ii)  クローンＥ２．５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３および４）
クローンＥ２．５における２４３５ｂｐのインサートを配列決定するのに用いた方法としては、下記に要約した手順の組み合わせが含まれる。
１．  ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ断片を平滑末端として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋(Stratagene)のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞の形質転換に用いた。
２．  プラスミドＤＮＡを、改変アルカリリーシス法を用いて作成した。欠失クローンは、元のクローンおよびＥｃｏＲＶサブクローンの両方から生成した。
３．  プラスミドＤＮＡを、改変アルカリリーシス法を用いて作成した。
４．  欠失クローンの大きさを選択して、アガロースゲル上で電気泳動によってＤＮＡ配列決定を行った。
５．  ＤＮＡ配列決定は、７−デアザｄＧＴＰを含む標準的なジデオキシヌクレオチド停止反応を用いて行った。必要ならば、７−デアザｄｌＴＰを用いて厳しいＧＣバンド圧縮を分割した。［35Ｓ］ｄＡＴＰまたは［33Ｐ］ｄＡＴＰを、標識として用いた。
６．  配列決定反応は、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。総ての試料は、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃの順に供給した。
７．  内部配列決定プライマーを必要に応じて合成した。
(iii) クローンＧ３．８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５および６）
クローンＧ３．８における６０８１ｂｐのＢａｍＨＩインサートを配列決定するのに用いた方法としては、下記に要約した手順の組み合わせが含まれる。
１．  ネスト欠失(nested deletions)は、ＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼを用いてＴ７およびＴ３末端の両方から生成した。
２．  プラスミドＤＮＡを、改変アルカリリーシス法を用いて作成した。
３．  欠失クローンの大きさを選択して、アガロースゲル上で電気泳動によってＤＮＡ配列決定した。
４．  ＤＮＡ配列決定は７−デアザｄＧＴＰを含む標準的なジデオキシヌクレオチド停止反応を用いて行った。必要ならば、７−デアザｄＩＴＰを用いて厳しいＧＣバンド圧縮を分割した。［35Ｓ］ｄＡＴＰを、標識として用いた。
５．  配列決定反応は、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。総ての試料は、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃの順に載せた。
６．  内部配列決定プライマーを必要に応じて合成した。
(iv)  クローンＨ５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７および８）
クローンＨ５．１における１１９９ｂｐのインサートを配列決定するのに用いた方法としては、下記に要約した手順の組み合わせが含まれる。
１．  ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片を平滑末端として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋(Stratagene)のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞の形質転換に用いた。
２．  ネスト欠失(nested deletions)は、ＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼを用いてＴ７およびＴ３末端の両方から生成した。
３．  プラスミドＤＮＡを、改変アルカリリーシス法を用いて作成した。
４．  欠失クローンの大きさを選択して、アガロースゲル上で電気泳動によってＤＮＡ配列決定を行った。
５．  ＤＮＡ配列決定は、７−デアザｄＧＴＰを含む標準的なジデオキシヌクレオチド停止反応を用いて行った。必要ならば、７−デアザｄｌＴＰを用いて厳しいＧＣバンド圧縮を分割した。［35Ｓ］ｄＡＴＰを、標識として用いた。
６．  配列決定反応は、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。総ての試料は、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃの順に供給した。
７．  内部配列決定プライマーを必要に応じて合成した。
(v)   クローンＢ４．６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９および１０）
クローンＢ４．６における４５１８ｂｐのインサートを配列決定するのに用いた方法としては、下記に要約した手順の組み合わせが含まれる。
１．  プラスミドＤＮＡは、改変アルカリリーシス法を用いて作成した。
２．  ネスト欠失(nested deletions)は、ＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼを用いてＴ７およびＴ３末端の両方から生成した。
３．  欠失クローンの大きさを選択して、アガロースゲル上で電気泳動によってＤＮＡ配列決定を行った。
４．  ＤＮＡ配列決定は、７−デアザｄＧＴＰを含む標準的なジデオキシヌクレオチド停止反応を用いて行った。必要ならば、７−デアザｄｌＴＰを用いて厳しいＧＣバンド圧縮を分割した。［35Ｓ］ｄＡＴＰを、標識として用いた。
５．  配列決定反応は、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。総ての試料は、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃの順に載せた。
６．  内部配列決定プライマーを必要に応じて合成した。
実施例３
H. pyloriマウスモデルにおける組換えH. pylori抗原のサブクローニング、発現、精製、および試験
１．  H. pyloriマウスモデルの開発
１．１  緒論
H. pyloriのヒト菌株は、マウス胃粘膜で生き残り、H. pylori感染症の有用なモデルを生成するように適合させている。このモデルを用いてこれらのワクチン研究を行った。下記の詳細な説明は、本発明の組換え抗原の有効性を示すのに用いるマウスモデルおよび方法の特徴を示すこの菌株の誘導体形成の方法である。
１．２  マウスの適合
H. pyloriの多数のバイオプシーおよび新鮮な臨床的単離物は、患者から得た。ホモジナイズしたバイオプシーおよび／または新鮮な臨床的単離物を、特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに経口（ｏｓ）で接種した。感染したマウスからの胃試料を、直接相顕微鏡法およびウレアーゼアッセイによって検討した。４種類の臨床単離物の混合物を接種した動物の１群は螺旋状の細菌によるコロニー形成が見られ、陽性のウレアーゼの結果を得た。コロニー形成した動物からの胃粘液を、５％ウマ血液、およびバンコマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ポリミキシンＢ（３．３μｇ／ｍｌ）、バシトラシン（２００μｇ／ｍｌ）、ナリジキシン酸（１０．７μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（５０μｇ／ｍｌ）を含む血液寒天基剤上で培養した。代表的なコロニーを位相差顕微鏡法によって検討し、ウレアーゼおよびカタラーゼ活性を測定した。ＤＮＡを、H. pyloriの特徴、すなわち螺旋状でウレアーゼおよびカタラーゼ陽性を有することが分かったコロニーから抽出した。単離物は、ヘリコバクター特異的ＰＣＲによってヘリコバクター属に属することが確かめられた。４種類の臨床単離物のいずれがマウスでコロニー形成したかを同定するため、ＲＡＰＤを行った。元のヒト臨床単離物およびマウス単離物由来の生成するフィンガー(finger)を比較した。この比較の結果、初めに接種した４種類の臨床単離物の１つだけにより、総てのマウスでコロニー形成したことが示された。ヒトおよびマウス単離物も、ＰＣＲによりｖａｃＡおよびｃａｇＡ陽性であることが分かった。次に、マウス単離物を、更に３回マウスに継代接種した。
ＨｐＭ８と命名した単離物の一つであって元の培養物でコロニー形成したＳＪＬマウスから得られたもの、および感染マウスからのホモジネートを本発明者の標準的マウスに適合した培養物として選択した。この単離物は、H. pyloriの「シドニー菌株(Sydney Strain)」と呼ばれている（この菌株はＳｙｄ１と再命名され、ニューサウス・ウェールズ大学の微生物学および免疫学学校のカルチャー・コレクション（ワールド・ダイレクトリー・オブ・コレクションズ・オブ・カルチャーズ・オブ・マイクロオーガニズムス(World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms)、登録番号２４８）に寄託された。
１．３  マウスの系統の特異性
単離物Ｓｙｄ１は、ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ、ＳＪＬ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／６およびＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ／Ｓｗｉｓｓなどのマウスの系統の多くでコロニー形成することが分かった。細菌は、マウスの胃の総ての領域、すなわち洞(antrum)、本体(body)、および噴門同等領域にコロニー形成し、細菌はマウスの幾つかの系統の洞と本体粘膜との間の境界領域に優先的にコロニー形成することが分かった。コロニー形成パターンは、接種されたマウスの系統によって変動することが分かった。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、本発明の研究に選択した。電子顕微鏡法により、細菌と上皮表面とに密接な関連があり、ヒトの感染症で見られるように付着ペデスタル(adhesion pedestals)を形成することもある。コロニー形成の日常的分析のため、ウレアーゼ反応性は細菌数とよく相関することが示されたので、H. pyloriコロニー形成のアッセイ法として用いた。
２．  E. coli発現ベクターへの抗原コード領域のサブクローニング
H. pyloriをクローニングしたファミリーＢ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨからの特異抗原コード配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、特定の発現ベクターへのクローニングを行うことができるようにデザインしたオリゴヌクレオチドを用いて代表的なクローンのＰＣＲ増幅によって単離した（第２表）。
ファミリーＢ、ＣおよびＥからの増幅生成物を、ｐＧＥＸ−ＳＴＯＰベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ−１(Pharmacia)の改変バージョンであって、終止コドンがＧＳＴのＮ−末端付近に挿入され、リボソーム結合部位、制限部位外(extra restriction sites)および六−ヒスチジン・タグ(tag)を多重クローニング部位内に挿入したもの）のＸｍａｌ／ＢｇＩＩＩ部位にクローニングした。これにより、Ｃ−末端ヘキサ−ヒスチジン・タグ（ヘキサーＨＩＳ）を有する非融合タンパク質の産生が可能となった。ファミリーＣおよびＢの構築物はE. coli菌株ER1793で発現し、ファミリーＥはE. coli BL21で発現した。
ファミリーＧからの増幅生成物を、ｐＳＥ４２０(Invitrogen)のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、E. coli菌株JM109で発現させ、精製タグを含まない非融合タンパク質を得た。
天然タンパク質の産生は困難な仕事であることが分かっているファミリーＨの場合には、増幅生成物をｐＧＥＸ−３ＸのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、E. coli菌株JM109でＧＳＴ融合タンパク質を産生した。
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３．  成長条件および組換えタンパク質の産生
これらの組換えクローンをTerrificブロス(TartofおよびHobbs（１９８７年）で３７℃で増殖させ、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加して一晩継続インキュベーションすることによって、組換えタンパク質産生を誘発させた。細胞を回収して、冷凍保存した後でタンパク質精製、または音波処理して、全細胞免疫源として使用した。
４．  組換えタンパク質の精製
４．１  Helicobacter pylori組換えプロテインＢの単離および精製
４．１．１  緒論
プロテインＢをＨｅｘａ−ＨＩＳタグで発現させ、精製過程で固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いることができるようにした。
４．１．２  E. coli細胞ペレットからプロテインＢの単離
プロテインＢを発現するE. coli細胞の培養物（約３２リットル）から、細胞ペレットを得た。ペレットを、５０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５の５２０ｍｌに加え、緩やかに攪拌することによって再懸濁した。懸濁液を氷上で１５μｍの振幅で各１分の音波処理の後１分の中断により全部で３分間の音波処理を行った。完全な細胞溶解を、光学顕微鏡法によって確認した。
音波処理を行った懸濁液を、JA-10ローター(Beckman、米国）中で３２００×ｇで３０分間遠心分離した。上清のほとんどを傾瀉し、ペレットをリン酸塩／ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭリン酸塩／０．５ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５）４００ｍｌに再懸濁し、５０００×ｇで遠心分離した。生成するペレットを０．１％Tweenを含むリン酸塩／ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁して、遠心分離し、ペレットを最終的に７．５Ｍ尿素を含むリン酸塩／ＮａＣｌ緩衝液に氷上で一晩攪拌することによって可溶化した。次に、この調製物を１００００×ｇで遠心分離し、上清を集めて、更に２回遠心分離し、生成する上清（６９０ｍｌ）を集めた。追加量のプロテインＢは、更に培養物３２リットル由来のE. coli細胞ペレットからも作成した。
４．１．３  固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によるプロテインＢの部分精製
記載したプロテインＢのそれぞれの最終調製物を、製造業者の指示に従ってニッケルを充填したChelating Sepharose Fast Flow（５０ｍｍ×１００ｍｍまたは２６ｍｍ×１０４ｍｍ、Pharmacia、スウェーデン）のカラム（流速、２ｍｌ／分）に適用した。カラムに結合する汚染物質を、２０ｍＭリン酸塩／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍイミダゾール／７．５Ｍ尿素、ｐＨ７．５の１０カラム容を用いてカラムを洗浄して溶出した。プロテインＢは、２０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／７．５Ｍ尿素、ｐＨ６．０を３ｍｌ／分の流速で用いてカラムから溶出した。画分を集めて、カラムから溶出するピークを２８０ｎｍでの吸光度によって監視した。画分をHelicobacter pyloriに対して生じたウサギ血清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターン転移によって検査した。
４．１．４  プロテインＢの再生および更なる精製
部分精製したプロテインＢから再生して尿素を除去するため、プロテインＢを含むＩＭＡＣカラムから溶出した画分をプールし、２０ｍＭリン酸塩／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５リットル）に対して緩衝液を１回交換して透析した後２０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。保持物をGPR遠心分離機(Beckman)中３０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を集めて取って置き、更に精製した。ペレットを７．５Ｍ尿素を含む２０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁した後、０．８Ｍアルギニン１０倍容に対して透析し、タンパク質の再生を助け、尿素を部分的に除去した。生成する保持物のタンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを標準として用いて製造業者の指示に従ってDC Proteinアッセイ(BioRad、米国）によって評価した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびDensitometer(Molecular Dynamics)を用いる分離試料の走査によって純度を分析した。最後に、スクロースを保持物に加えて、最終濃度を１０％（ｗ／ｖ）として、マリクウォットを−２０℃で保存した。
４．１．５  Ｂ可溶性画分の一層の精製
前記で調製したプロテインＢの可溶性画分を、尿素を含まない緩衝液を用いて４．１．３と同様にしてＩＭＡＣカラム（１６ｍｍ×１３６ｍｍ）を通過させることによって更に精製した。プロテインＢを、０〜１００％の０．５Ｍイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の線形グラディエントを用いて３ｍｌ／分の流速で４５分間ＩＭＡＣカラムから溶出した。プロテインＢを含む画分をプールし、ＰＢＳに対して徹底的に透析した。保持物を、最後に純度およびタンパク質含量について評価し、スクロースを前記の調製物に加えた。この調製物のアリクウォットを−２０℃で保存した。
４．２  Helicobacter pylori組換えプロテインＣの単離および精製
４．２．１  緒論
プロテインＣタンパク質をＨｅｘａ−ＨＩＳタグで発現させ、精製過程で固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いることができるようにした。
４．２．２  E. coli細胞ペレットからプロテインＣの単離
プロテインＣを発現するE. coli細胞の培養物（約５６リットル）から、細胞ペレットを得た。細胞ペレットに、一定容積（９００ｍｌ）の５０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．５を加え、ペレットを緩やかに攪拌することによって再懸濁した。懸濁液を氷上で１６μｍの振幅で各１分の音波処理の後１分の中断により全部で３分間の音波処理を行った。完全な細胞リーシスを、光学顕微鏡法によって確認した。
音波処理を行った懸濁液を、JA-10ローター(Beckman、米国）中で５０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を集めて、１６０００×ｇで遠心分離により更に清浄化した。生成する上清のほとんど（１０２５ｍｌ）を集め、部分浄化した上清を０．４５μｍメンブラン(Millipore、米国）を通過させて濾過し、取って置いた。上清を更に２回遠心分離し、ペレットが実質的に見られなくなるようにした。最終的な上清（８２５ｍｌ）を濾液（４５ｍｌ）と合わせて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィカラムに入れた。
４．２．３  固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によるプロテインＣの精製
前記のプロテインＣの調製物を、製造業者の指示に従ってニッケルを充填したChelating Sepharose Fast Flow（５０ｍｍ×１００ｍｍ、Pharmacia、スウェーデン）のカラム（流速、３ｍｌ／分）に適用した。カラムに結合する汚染物質を、２０ｍＭリン酸塩／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．５の１０カラム容を用いてカラムを洗浄して溶出した。プロテインＣは、０〜１００％の０．５Ｍイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸塩／５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の洗浄グラディエントを用いて１０ｍｌ／分の流速で１００分間カラムから溶出した。画分（１５ｍｌ）を集めて、カラムから溶出するピークを２８０ｎｍでの吸光度によって監視した。画分をHelicobacter felisに対して生じたマウス血清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターン転移によって検査した。
４．３  Helicobacter pylori組換えプロテインＥの単離および精製
４．３．１  音波処理
プロテインＥを発現するE. coli細胞をペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；７．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）に再懸濁した。細胞を氷上に置き、音波細胞破壊装置で３分間（１分間隔で３×１分駆動）音波処理した。細胞が完全に破壊されたことを、位相差顕微鏡法によって確認した。次に、音波処理生成物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットを保持した。次に、ペレットをＰＢＳで洗浄し、遠心分離を繰り返した。
音波処理物のペレットを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７Ｍ尿素、ｐＨ９．５中で室温で２時間可溶化した。残っている総ての粒子を、２５０００×ｇで３０分間３回遠心分離することによって除去した。精製する上清をクロマトグラフィ用に保持した。
４．３．２  クロマトグラフィ
６０×１００ｍｍのQ Sepharose High Performance（アニオン交換）カラム(Pharmacia)を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７Ｍ尿素、ｐＨ９．５の３カラム容と８５ｃｍ／時（４０ｍｌ／分）で平衡させた。可溶化材料をカラムに注入し、同じ緩衝液３カラム容で洗浄した。未結合材料を、洗浄液の最初の２カラム容と共に集めた。次に、結合した材料を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５の更に３カラム容でカラムから除去した。
クロマトグラフィからの未結合材料を、ＹＭ１０（１０ｋＤａカットオフ）メンブランを用いて窒素雰囲気下にて攪拌した細胞中で濃縮した。次に、濃縮液（２５ｍｌ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ尿素、ｐＨ８（５リットル）に対して４℃で３６時間透析し、試料の尿素濃度を低下させた。
４．４  Helicobacter pylori組換えプロテインＧの単離および精製
プロテインＧを発現するE. coli細胞を、精製のため細胞ペレットとして収納した。細胞を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ Pefabloc SC(Boehringer Mannheim、ドイツ）の約２容に懸濁し、氷上で音波処理（ＭＳＥ）によって溶解した。溶解生成物を３０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を取り出し、１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。
ｐＨを８．０に調整し、伝導率を＜５．５ｍＳに調整した後、上清をHiload Q Sepharose HP XK 26/10(Pharmacia)カラムに加えた。結合タンパク質を、線形グラディエント０〜１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。０．２Ｍ  ＮａＣｌで溶出したピークを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、プロテインＧを含むことを同定した。このピークからの画分をプールした。
タンパク質濃度を、BioRad（米国）タンパク質アッセイおよびウシ血清アルブミン標準を用いて評価した。
４．５  Helicobacter pylori組換えプロテインＨの単離および精製
４．５．１  工程の概要
簡単に説明すれば、この工程は、E. coli細胞の音波処理、界面活性剤中の不純物の可溶化、遠心分離、遠心分離ペレットの再音波処理、界面活性剤中の不純物の可溶化、遠心分離、遠心分離ペレットの７Ｍ尿素中での可溶化、濾過、アニオン交換カラムでの不純物の捕捉、限外濾過膜上でのカラムに吸着しないものの濃縮、ｐＨを９．５に調整、アニオン交換カラムでの不純物の捕捉、限外濾過膜上でのカラムに吸着しないものの濃縮、および部分希釈からなっている。
タンパク質濃度は、総タンパク質についてBradford色素結合分析アッセイによって決定した。総ての段階は、断らない限り環境温度で行った。
４．５．２  音波処理によるE. coli細胞の破壊
細胞を−７０℃で保存した。冷凍した細胞を３７℃の水槽で解凍し、培養物１ｍｌ当たり音波処理緩衝液（１０ｍＭリン酸塩＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）５０μｌに懸濁した。E. coli細胞を約１０μの振幅で３５ｍｌロット中で１分間音波処理の後、１分間静止し、３回別個に破壊した。試料は、音波処理中は氷水に浸していた。音波処理前および後の細胞を、音波処理工程中には破砕氷に保存した。
４．５．３  界面活性剤中の不純物の可溶化
界面活性剤Triton X100 20% v/vを、音波処理したE. coli細胞調製物に攪拌しながら徐々に加え、最終Triton X100濃度を１％ｖ／ｖとした。これを、磁気フレア(magnetic flea)で３０分間緩やかに攪拌した。
４．５．４  遠心分離
Triton X100で処理した音波処理物を、次に３４，０００ｇのＲＣＦで３０分間遠心分離し、生成するペレットを−２０℃で一晩保存した。
４．５．５  遠心分離ペレットの再音波処理
遠心分離ペレットを、その３倍容の音波処理緩衝液（１０ｍＭリン酸塩＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に加え、約２分間激しく攪拌することによって再懸濁した。これを、前記と同様に音波処理した。
４．５．６  界面活性剤中の不純物の可溶化
界面活性剤Triton X100、２０％ｖ／ｖを、再音波処理した遠心分離ペレット調製物に攪拌しながら徐々に加え、最終Triton X100濃度を１％ｖ／ｖとした。これを、磁気フレアで３０分間緩やかに攪拌した。
４．５．７  遠心分離
Triton X100で処理した音波処理物を、３４，０００ｇのＲＣＦで３０分間遠心分離した。
４．５．８  尿素での可溶化
界面活性剤処理した再音波処理生成物の遠心分離ペレットを、細胞培養物５０００ｍｌ当たり１００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミン＋７．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０を加えることによって可溶化し、これを磁気フレア(magnetic flea)で１０分間攪拌した。
４．５．９  濾過
可溶化した遠心分離ペレットを、一連のフィルターで濾過した。最初にMillipore pre-filter AWで、次いでMillipore filter 0.8μm（AA型）、最後にMilliporeフィルター0.45μm（HVLP型）。
４．５．１０  アニオン交換クロマトグラフィによる不純物の捕捉
濾過した調製物６０ｍｌを、Pharmacia Q Sepharose HPカラム（寸法２．６×１０．９ｃｍ）に載せた。カラムを、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミン＋７．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）の３カラム容と平衡させた。試料を５０ｃｍ／時でカラムに載せ、載荷の後、カラムを緩衝液Ａで１２０ｃｍ／時で洗浄した。カラムから出てくる非吸着画分は抗原を含み、汚染材料の多くはカラムに結合した。
４．５．１１  濃縮
非吸着画分を、AMICON YM30 ３０ｋＤａカットオフ限外濾過膜を用いて１０倍に濃縮した。
４．５．１２  アニオン交換クロマトグラフィによる不純物の捕捉
濃縮した非吸着画分の総てのｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで８．０から９．５間で調整した。これを、Pharmacia Q Sepharose HPカラム（寸法２．６×１０．９ｃｍ）上に置いた。カラムを、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミン＋７．０Ｍ尿素、ｐＨ９．５（緩衝液Ａ）の３カラム容で平衡した。試料をカラムに載せた後、緩衝液Ａで５６ｃｍ／時で洗浄した。カラムから出てくる非吸着画分は抗原を含み、汚染材料の多くはカラムに結合した。
４．５．１３  濃縮および希釈
非吸着画分を、AMICON YM30 ３０ｋＤａカットオフ限外濾過膜を用いて約１０倍に濃縮した。尿素の濃度を、最終生成物を１０ｍＭリン酸塩＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で希釈することによって減少させた。
５．  免疫化プロトコール
５．１  方法
６〜８週齢のＳＰＦ  ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、実験に選択した。マウスを、２００μｇまでのタンパク質＋１０μｇコレラ毒素(Sigma)を経口−胃を介して免疫した。
試験群としては、一回精製した組換えタンパク質抗原、および幾つかのタンパク質の組合わせも包含した。組換え抗原を発現する音波処理したE. coli細胞の調製物であって、精製処理を行わなかったものも試験した。これらの音波処理物の組合わせも試験した。H. pylori音波処理生成物＋ＣＴの陽性コントロール群も包含された。また、陰性コントロール群はＣＴだけまたはＰＢＳだけで免疫化し、（両者とも抗原投与し）および免疫化していない、抗原投与していない動物であった。マウスの典型的な部分は、尾静脈から採血する前に抗原投与を行った。マウスに、免疫化から１週間後から開始してH. pyloriの３用量により抗原投与を行った。H. pylori抗原投与の３週間後、マウスを安楽死させ、胃、血清、唾液および胆汁を集めて、感染および免疫応答を評価した。
５．２  投薬割合
マウスに、下記の計画による用量を投与した。
１００μｌ／用量／マウス
(a)   ＨｐＣＴ：全細胞H. pylori音波処理生成物１ｍｇ＋１０μｇＣＴ
(b)   ＣＴのみ：１０μｇＣＴ／ＰＢＳ
(c)   精製したＣ：２００μｇタンパク質＋１０μｇＣＴ
(d)   Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈの音波処理生成物＋１０μｇＣＴ
１５０μｌ／用量／マウス
(e)   精製したＧ：２００μｇタンパク質＋１０μｇＣＴ
２５０μｌ／用量／マウス／
(f)   精製したＢ：約１１４μｇのタンパク質＋１０μｇＣＴ
(g)   精製したＥ：５０μｇタンパク質＋１０μｇＣＴ
(h)   組合わせＡ：等量の精製したタンパク質Ｂ、ＣおよびＧ＋１０μｇＣＴ
(i)   組合わせＢ：Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨからの等量の音波処理生成物＋１０μｇＣＴ
３５０μｌ／用量／マウス
(j)   精製したＨ：約５０μｇのタンパク質＋１０μｇＣＴ
２用量投与し、１回は２００μｌの用量で、次いで１５０μｌの用量。
５．３  実験の概要
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５．４  抗原投与
H. pylori Syd 1を、液体培養（５％ウマ血清およびSkirrowの選択的補足物を補足したＢＨＩブロス）で、微好気性条件下で２日間培養した。細胞を９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、濃度を約１０９細胞／ｍｌに調整した。免疫したマウスおよびコントロールを、ワクチン計画の完了から１週間後に、毎日新たに作成したこの懸濁液０．１ｍｌで抗原投与を行った。コロニー形成を検出するための動物のウレアーゼアッセイを、抗原投与から２４日後に行った。
６．  結果
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これらの結果は、５種類の精製した組換えタンパク質のいずれかを粘膜アジュバントと共に用いて経口−胃免疫化を行うと、マウスのH. pyloriによる感染から防御されることを示している。未精製E. coli全細胞音波処理物の結果は、防御を示すには更に高水準の発現または精製が必要であることを示唆している。免疫マウス(H. felis音波処理生成物で免疫化した）からの血清を用いる遺伝子スクリーニング法により、２種類の既知のH. pylori防御抗原、ウレアーゼおよび熱ショックタンパク質、および５種類の他のタンパク質を同定した。ここに報告した結果は、これら５種類も防御抗原であることを示している。５種類の抗原の１つは以前に知られている化合物であるが(Kostrzynska et al. 、１９９４年）、この化合物が防御抗原であるかどうかは以前は知られていなかった。防御免疫源性製剤を用いて感染症を治療することならびにそれを予防することができることを本発明者らが示したので、これらの防御抗原を用いて、ヒトにおけるヘリコバクター感染症を治療しならびに防止することができることが予想される。これらのHelicobacter pylori抗原を同定するのに用いたHelicobacter felisマウスモデルの有効性は、これらの抗原が最近開発されたH. pyloriマウスモデルでマウスを防御することができることによって示された。従って、これらの抗原は、単独または組合わせて、ヒトにおけるヘリコバクター感染症の治療または予防に用いられる生成物における防御抗原となることが予想される。
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Majewski, S.L.H., and Goodwin, C.S. (1988). 迅速抽出法を用いるCampylobacter pyloriのゲノムの制限エンドヌクレアーゼ分析：重要なゲノム変動の証拠 (Restriction endonuclease analysis of the genome of Campylobacter pylori with a rapid extraction method: evidence for considerable genomic variation. J. Inf. Dis. 157(3): 465-471.
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配列表
(2)配列番号１についての情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３７８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ｃＤＮＡ
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(vii)直接の起源：
(B)クローン：クローンＣ．３．５
(ix)特徴：
(A)特徴を表わす記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．３７５
(xi)配列の記載：配列番号１
0004368944.tif 000006
(2)配列番号２についての情報
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１２５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号２
0004368944.tif 000007
(2)配列番号３についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：９９０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ｃＤＮＡ
(vi)起源
(A)生物：Helicobacter pylori
(vii)直接の起源
(B)クローン：クローンＥ２．５
(ix)特徴：
(A)特徴を表わす記号：ＣＤＳ
(B)存在場所：１．．９８７
(xi)配列の記載：配列番号３：
0004368944.tif 000008
0004368944.tif 000009
0004368944.tif 000010
(2)配列番号４についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３２９アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号４：
0004368944.tif 000011
0004368944.tif 000012
(2)配列番号５についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１３０２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ｃＤＮＡ
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(vii)直接の起源：
(B)クローン：クローンＧ３．８
(ix)特徴：
(A)特徴を表わす記号：ＣＤＳ
(B)存在位置：１．．１２９９
(xi)配列の記載：配列番号５
0004368944.tif 000013
0004368944.tif 000014
0004368944.tif 000015
(2)配列番号６についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４３３アミノ酸
(B)種類：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号６：
0004368944.tif 000016
0004368944.tif 000017
0004368944.tif 000018
(2)配列番号７についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：７７１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ｃＤＮＡ
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(vii)直接の起源：
(A)ライブラリー：クローン  Ｈ５．１
(ix)特徴：
(A)特徴を表わす記号：ＣＤＳ
(B)存在場所：１．．７６８
(xi)配列の記載：配列番号７：
0004368944.tif 000019
0004368944.tif 000020
(2)配列番号８についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５６アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号８：
0004368944.tif 000021
0004368944.tif 000022
(2)配列番号９についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５２８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ｃＤＮＡ
(vi)起源：
(A)生物:Helicobacter pylori
(vii)直接の起源：
(B)クローン：クローン  Ｂ４．６
(ix)特徴：
(A)特徴を表わす記号：ＣＤＳ
(B)存在場所：１．．５２５
(xi)配列の記載：配列番号９：
0004368944.tif 000023
(2)配列番号１０についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１７５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号１０：
0004368944.tif 000024
(2)配列番号１１についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１０アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(v)フラグメントの種類：Ｎ−末端
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１１：
0004368944.tif 000025
(2)配列番号１２についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(v)断片の種類：Ｎ−末端
(vi)起源：
(A)生物:Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１２：
0004368944.tif 000026
(2)配列番号１３についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１８アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(v)断片の種類：Ｎ−末端
(vi)起源：
(A)生物:Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１３：
0004368944.tif 000027
(2)配列番号１４についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(v)断片の種類：Ｎ−末端
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１４：
0004368944.tif 000028
(2)配列番号１５についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１５：
0004368944.tif 000029
(2)配列番号１６についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ペプチド
(v)断片の種類：Ｎ−末端
(vi)起源：
(A)生物：Helicobacter pylori
(xi)配列の記載：配列番号１６：
0004368944.tif 000030
(2)配列番号１７についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１７：
0004368944.tif 000031
(2)配列番号１８についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＹＥＳ
(xi)配列の記載：配列番号１８：
0004368944.tif 000032
(2)配列番号１９についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１９：
0004368944.tif 000033
(2)配列番号２０についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＹＥＳ
(xi)配列の記載：配列番号２０：
0004368944.tif 000034
(2)配列番号２１についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２１:
0004368944.tif 000035
(2)配列番号２２についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＹＥＳ
(xi）配列の記載：配列番号２２：
0004368944.tif 000036
(2)配列番号２３についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２３：
0004368944.tif 000037
(2)配列番号２４についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＹＥＳ
(xi)配列の記載：配列番号２４：
0004368944.tif 000038
(2)配列番号２５についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２５：
0004368944.tif 000039
(2)配列番号２６についての情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３３塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
(iv)アンチ−センス：ＹＥＳ
(xi)配列の記載：配列番号２６：
0004368944.tif 000040
【図１】
0004368944.tif 000041
【図２】
0004368944.tif 000042