(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症治療における血液処理に使用される免疫吸着剤であって、C3aおよび／またはC5aおよびリポポリサッカリド(LPS)に特異的である抗体が結合した有機ポリマーまたは合成ポリマーの担体を含んで成り、ここで、
a) C3a に対する抗体が、NH2-KCCEDGMRQNPMR-COOH、NH2-RFSCQRRTRFISL-COOH及びNH2-ITELRRQHARAS-COOHから成る群から選択される少なくとも１つのペプチドに特異的であり、そして
b) C5a に対する抗体が、NH2-QADYKDDDDKLPAE-COOH及びNH2-DDKLPAEGLDIENS-COOHから成る群から選択される少なくとも１つのペプチドに特異的である、
ことを特徴とする、免疫吸着剤。
【請求項２】
抗体がポリクロナール抗体であることを特徴とする請求項１記載の免疫吸着剤。
【請求項３】
抗体がIgY型の鳥類抗体であることを特徴とする請求項２記載の免疫吸着剤。
【請求項４】
TNF、インターロイキン1、インターロイキン6、インターロイキン8および／またはインターロイキン10から成る群から選択される少なくとも１の敗血症メディエーターに特異的な少なくとも１つの固定化抗体をさらに含んで成る、請求項１記載の免疫吸着剤。
【請求項５】
免疫吸着剤に含まれる固定化抗体が、血中に実際に含まれる前記敗血症メディエーターに応じて変更されることを特徴とする、請求項４記載の免疫吸着剤。
【請求項６】
固定化抗体がインターロイキン1αおよび1βの次のペプチド配列：
インターロイキン1α：NH2-NCYSENEEDSSSID-COOH
NH2-GAYKSSKDDAKIT-COOH
NH2-WETHGTKNYFTS-COOH
インターロイキン1β：NH2-RISDHHYSKGFRQA-COOH
NH2-VQGEESNDKIPVA-COOH
NH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH
の少なくとも１つに特異的である、請求項４記載の免疫吸着剤。
【請求項７】
固定化抗体がインターロイキン6の次のペプチド配列：
インターロイキン6：NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOH
NH2-QNRFESSEEQARA-COOH
NH2-AITTPDPTTNAS-COOH
の少なくとも１つに特異的である、請求項４記載の免疫吸着剤。
【請求項８】
固定化抗体がインターロイキン10の次のペプチド配列：
インターロイキン10：NH2-SPGQGTQSENSCT-COOH
NH2-QMKDQLDNLLLKES-COOH
NH2-MPQAENQDPDIKA-COOH
NH2-LPCENKSKAVEQ-COOH
の少なくとも１つに特異的である、請求項４記載の免疫吸着剤。
【請求項９】
固定化抗体が次のペプチド配列：
TNFα：NH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOH
NH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH
の少なくとも１つに特異的である、請求項４記載の免疫吸着剤。
【請求項１０】
有機ポリマーまたは合成ポリマーが、ポリスチレン、炭水化物、セルロース、アガロース誘導体及びアクリレートから成る群の１又は複数の膜または粒子をさらに含んで成る、請求項１記載の免疫吸着剤。
【請求項１１】
固定化抗体が前記担体と共有結合していることを特徴とする請求項１記載の免疫吸着剤。
【請求項１２】
固定化抗体がスペーサーまたはリンカーを介して担体に固定されていることを特徴とする請求項１記載の免疫吸着剤。
【請求項１３】
請求項１記載の免疫吸着剤を生成するための方法であって、C3aおよび／またはC5aおよびLPSに特異的な抗体、並びに場合によっては、TNF、インターロイキン1、インターロイキン6、インターロイキン8および／またはインターロイキン10から選択される、さらなる敗血症メディエーターに対する抗体を、前記担体に共有結合または吸着結合させることを特徴とする方法。
【請求項１４】
哺乳類又は鳥類を対応する抗原で免疫化することにより、前記抗体を生成することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マウス、ラット、ウサギ、又はニワトリから成る群から選択される１又は複数の動物を免疫化することにより前記抗体を生成することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、敗血症療法のための免疫吸着剤、特に補体因子およびリポポリサッカリド（LPS）、ならびに場合によってはTNFおよびインターロイキンを体液から除去するための免疫吸着剤、この免疫吸着剤を生成する方法およびその使用に関する。
【０００２】
毎年、アメリカ合衆国、日本およびＥＵでは約350万人が敗血症に罹患する。これらの国々の人口は合計7億8500万人であり、罹患率は0.5％未満である。しかし入院患者の発症頻度を調べると、入院100件当たり2.0±0.16件の割合で敗血症が見られる。最新の設備（集中治療設備）で有能な専門医による集中治療を受けた場合でも、これらの患者の約25％が敗血症性ショックの症候群に苦しみ、死亡率が45％を越えるという事実は、保健政策上でも個人的にも重大な意味を持っている。
【０００３】
特に多重外傷を受けた患者（交通事故、火傷、大手術）において、敗血症性ショックの発症リスクは非常に高い。外部からの感染と並び、これらの患者が免疫系の機能を部分的に喪失した結果として、通常腸内で発生するグラム陰性菌に対する腸障壁が破られて「内部」から感染することが証明されている。
【０００４】
症例の50％以上で、グラム陰性菌もしくはそれらの細胞壁成分、内毒素（リポポリサッカリド、LPS）が敗血症性ショックを誘起する。細菌の作用によって遊離したLPSは血清タンパク質（LBP）と結合し、その後で単球／大食細胞（CD14）のLPS受容体によって受容される。活性化されたCD14＋細胞はサイトカイン（TNFα、インターロイキン-1（IL-1）、IL-6、IL-8）を産生し、これらは目標細胞のサイトカイン受容体を介して作用を及ぼす。
【０００５】
単球および大食細胞の刺激と平行して、補体系が活性化される。補体系は、細菌性の微生物や異物粒子を直接的かつ非特異的に排除するための、哺乳動物の免疫防御に不可欠の要素である。血清中に発生する補体タンパク質、好ましくはタンパク質分解によって活性化される酵素前駆体のうち、中心的な役割を果たすのは血清濃度約1g/lのC3タンパク質である。微生物がC3と接触した後、補体タンパク質C3aが分解され、その際に生じるC3bによってC5コンベルターゼの生成（別経路の補体活性化）が開始される一方で、血清因子の沈着によりC3bがC3コンベルターゼに変化することにより反応が増幅される。同様に血清中に発生する補体タンパク質C5は、多量に産生されたC5コンベルターゼにより分解されてC5aを生成する。こうして発生したC5bに別の補体タンパク質（C6-C9）が沈着して、最後に疎水性重合膜攻撃複合体（ＭＡＫ）が生成される。これは細菌膜内に侵入して（オプソニン化）微孔を形成し、微生物（および結合したＭＡＫ）の食作用、ひいてはその除去を招く。補体活性化のプロセスで遊離した複合体因子C3aおよびC5a（アナフィラトキシン）は、血管浸透性を高めるとともに、化学毒の遊離を誘起することによって、細菌発生箇所に食菌細胞を引き寄せる働きをする。細菌の数の減少は補体系の活性化を低減させる。この直接的かつ非特異的な反応は他の免疫防御系と密接に絡み合っており、たとえば細胞性防御に必要なサイトカインの合成および遊離補体因子によって調節される。炎症作用を媒介するために、C3aとC5aが非特異的な細胞受容体に結合され、これらの受容体はまた免疫活性に応じて種々の強さで発現する。免疫防御を恒久的に反応し得る状態に維持するために、活性化された補体因子は、微生物の発生後に検出可能なだけでなく、1-10ng/mlの濃度で正常人の血清の不可分な成分をなしている。
【０００６】
特に発達した敗血症、急性肺不全および瀕死の患者では、アナフィラトキシンの血漿レベルが1000倍以上にまで上昇することもある。
【０００７】
種々の補体因子の作用を除去するために、ほぼもっぱらin vitro試験に基づき、たいてい非特異的に作用する、極めて多様な解決手段が存在するが、副作用が予想されるためin vivo条件では試験できない（例：WO-A-98/34959）。
【０００８】
人工的な体外表面（例：表面被覆）で補体活性化を予防するex vivo法により、非特異的補体活性化を行って成功した。さらにUS5853722により、特異的なC5抗体を利用して活性化された補体因子を選択的に除去することが知られている。これは、とりわけ補体系のすべての成分に対して親和性の高い抗体が生成されているので望ましい。
【０００９】
以上に示した機能的な連鎖は、特に生体内に侵入した細菌を除去する働きをする。しかし侵入した細菌の数および／または菌力と免疫系の除去能力との間に不調和が生じると（例：外傷後免疫不全）、すぐに過剰活性化が現れ、次いで「ショックメディエーター」（インターロイキン、血小板活性化因子（PAF）、さらに酸素ラジカル、プロスタグランジンおよびそれらの代謝生成物）の大量遊離を伴い、これがLPSに対する除去能力を一層制限する。さらにLPSによってCD14陰性細胞（例：内皮細胞）も活性化される。なぜならば、血漿中で可溶のCD14（sCD14）がLPS捕獲体として存在していて、これらの細胞への結合を容易にするとともに、他のショックメディエーターの生成および遊離を誘起し、それによって悪循環が強化されるからである。ショックメディエーターの作用は選択的ではあるが非特異的なので、種々の細胞や器官（凝血系、循環、補体系）で機能制限が見られ、その結果として生体全体を襲う炎症反応がショックを発生させ、不可逆的な器官損傷、循環崩壊、さらには死に至る。
【００１０】
この機能連鎖を中断するために、種々の治療戦略が研究された。
【００１１】
動物実験を援用した種々の敗血症モデルにおいて、タンパク質（LBP、sCD14）、受容体（CD14）、サイトカインまたはサイトカイン受容体とのLPS結合を中断する抗体によるか、または受容体の機能範囲を阻害するアンタゴニストによって連鎖を中断すると、肯定的な結果をもたらしたものの、今日まで臨床試験によって確認された予防および／または治療成果は報告されていない。
【００１２】
研究結果が高い期待に応えることができなかったのは、LPSがこの治療で損なわれない細胞や組織にも影響を及ぼし、それらの機能状態を変化させるということが次第に認識されたためである。さらに考慮しなければならないのは、生物学的反応性を恒久的に排除するためには、抗体／アンタゴニストにより不活性化されたLPS（免疫複合体）を除去しなければならないことである。この除去も免疫系の機能であるが、免疫系が著しく弱体化しているために、その課題に応えることができないか、または不十分にしか応えられない。
【００１３】
敗血症性ショックは一次的に種々異なる形成過程が非常にダイナミックに進展した結果であり、短時間内に種々のメディエーターが非常にさまざまな反応を誘起する。これらの反応は当初の生命維持機能を経た後、調節障害により急速に敗血症性ショックの症状をきたす。
【００１４】
本発明の課題は、患者特異的に血漿レベルおよび組織レベルの減少を可能にする、特に体外解毒因子に対するモジュール構造の免疫吸着系を提供することである。
【００１５】
本発明は特にTNFαがこの調節系において重要な場所を占めるという認識に基づいている。TNFαは、極めて種々の「外的」影響、たとえば負傷、炎症、感染、敗血症などによってマクロファージから放出されて、サイトカイン連鎖（IL-1、IL-6）により非特異的および特異的防御系を局所的および系統的に活性化する。臨床的には多量のTNFα遊離は体温上昇、食欲不振、異化作用的代謝のあらゆる付随症状となって現れる。敗血症の発病において、この疾患の早期段階ではマクロファージに活性化、ひいてはTNFα遊離が、患者の生存にとって重要な意味を持っていると思われるが、その後の経過においては持続的な活性化状態はすべての防御反応の代償不全を伴う。
【００１６】
本発明の課題は、敗血症療法のための免疫吸着剤によって解決された。特に本発明による免疫吸着剤は、特に補体因子およびリポポリサッカリド（LPS）、ならびに場合によってはその他の敗血症メディエーター、たとえばTNFおよびインターロイキンを体液から除去する働きをする。この免疫吸着剤は、補体因子C3aおよび／またはC5aに対するポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体、ならびにリポポリサッカリド（LPS）に対する抗体が結合した有機ポリマーまたは合成ポリマーからなる担体物質を特徴とする。好ましい実施例において、その他の敗血症メディエーターに対する抗体も担体に結合されている。
抗体がポリクロナール抗体、特にIgY型の鳥類抗体であることが好都合である。敗血症メディエーターに対するその他の抗体が調節障害の状態に応じて含まれている。
【００１７】
本発明に従い、抗体はTNF、IL1、IL6、IL8および／またはIL10を目標としている。
【００１８】
補体因子C3aに対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも1つに対して特異的な活性を有している。
【００１９】
NH2-KCCEDGMRQNPMR-COOH
NH2-RFSCQRRTRFISL-COOH
NH2-ITELRRQHARAS-COOH
補体因子C5aに対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも1つに対して特異的な活性を有している。
【００２０】
NH2-QADYKDDDDKLPAE-COOH
NH2-DDKLPAEGLDIENS-COOH
IL1α／βに対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも１つに対して特異的な活性を有している。
【００２１】
NH2-NCYSENEEDSSSID-COOH
NH2-GAYKSSKDDAKIT-COOH
NH2-WETHGTKNYFTS-COOH
NH2-RISDHHYSKGFRQA-COOH
NH2-VQGEESNDKIPVA-COOH
NH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH
IL6に対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも1つに対して特異的な活性を有している。
【００２２】
NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOH
NH2-QNRFESSEEQARA-COOH
NH2-AITTPDPTTNAS-COOH
IL10に対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも1つに対して特異的な活性を有している。
【００２３】
NH2-SPGQGTQSENSCT-COOH
NH2-QMKDQLDNLLLKES-COOH
NH2-MPQAENQDPDIKA-COOH
NH2-LPCENKSKAVEQ-COOH
TNFαに対する好ましい抗体は、以下に掲げるペプチド配列の少なくとも1つに対して特異的な活性を有している。
【００２４】
NH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOH
NH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH
本発明による免疫吸着剤は、担体物質として有機ポリマーまたは合成ポリマー、たとえばポリスチレン、炭水化物、たとえばセルロース誘導体、アガロース誘導体またはアクリレートからなる、それ自体通常の膜または粒子を有している。
【００２５】
本発明による免疫吸着剤の生成は、C3aおよび／またはC5aおよびLPSに対する抗体、並びに場合によってはその他の敗血症メディエーターに対する抗体を、それ自体公知の方法有機ポリマーまたは合成ポリマーからなる担体物質に共有結合または吸着結合させることによって行われる。
【００２６】
特異的な抗体は、好ましくは小型哺乳類、たとえばマウス、ラットまたはウサギ、あるいは鳥類、たとえば鶏などを対応する抗原により、それ自体公知のやり方で免疫化することにより生成される。
【００２７】
本発明は、患者特異的な状況に応じて、補体因子、LPSおよび場合によってはその他のメディエーターを血漿などの体液から除去するための装置で免疫吸着剤を使用することにも関する。
【００２８】
敗血症または敗血症性ショックを有する患者において、敗血症療法でプラスマフェレーシスに対して免疫吸着剤を用いることが好ましい。
【００２９】
ほとんどの物質に対して公知の方法で種々の担体に結合できる抗体が提供され得るにもかかわらず、鳥類抗体を使用することが好都合である。なぜならば鳥類抗体は哺乳類抗体とは異なり、補体系を活性化しないからである。活性化性質は哺乳類抗体のFc部に結合されているので、原理的にはパパインで分解されたFabフラグメントも使用できる。
【００３０】
現在の知見によれば、固定化した鳥類抗体はヒトの免疫系に対して非特異的な作用を全く有していない。鳥類、好ましくは鶏は、通常の方法でアジュバントを用い、または用いずに免疫できる。特異的な免疫グロブリンを卵黄に析出させ、通常の方法で単離できる。これらは公知の方法によりFc部を介して微粒子または膜に共有結合できる。
【００３１】
体外解毒に対する本発明による免疫吸着系により、患者特異的に使用可能であり、免疫系の調節障害によって除去できる選択的な系が初めて提供される。
【００３２】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００３３】
実施例１
免疫源ペプチドによるポリクロナール抗体の生成
固相合成により表１に掲げるペプチドが生成される。
【００３４】
【表１】
0004307743.tif 000002
【００３５】
上記のペプチドを標準処方に従い担体（KLH）に結合する。抱合体をPBSに溶解し、フロイントアジュバントと等分に混合する。個々の種痘用量を調節して、相応の抗原に属するペプチドをそれぞれ200μｇ含むようにする。これらの混合物を生後15週間のヒヨコに皮下投与して免疫し、4週間おきに4回追加投与する。
【００３６】
実施例２
リポポリサッカリド（LPS）を用いたポリクロナール抗体の生成
大腸菌J5の精製LPS（SIGMA）をPBSに溶解し、フロイントアジュバントと等分に混合する。この混合物を生後15週間のヒヨコに皮下投与して免疫する。LPS用量は１回の投与につき１mgLPSとする。これを4週間おきに4回追加投与する。
【００３７】
実施例３
卵黄から抗体（IgY）を製出
免疫したニワトリが産んだ卵を集める。抗体を含んでいる卵黄を分離した後、−20°Ｃで保存する。必要に応じて卵黄を溶かし、以下の図式に従って調製する（C.SCHWARZKOPF,B.THIELE(1996)ALTEX13Suppl.16,35-3）。
A TBS：20mM Tris/HCl, pH7.5 0.5M Nacl
B Aの溶液に10%(w/v)デキストラン硫酸
C 1M CaCl2
D 0.5M EDTA, pH7.5
E 飽和硫酸アンモニウム溶液
卵黄（容積は10-20ml/卵黄に相当）を卵黄当たり100mlTBSに懸濁させる。脂質およびリポタンパク質をデキストラン硫酸（100mlTBS卵黄懸濁液当たり5mlB）とＣａ++（100mlTBS卵黄懸濁液当たり15mlC）で沈殿させ、30~60分室温下で撹拌し、5,000g遠心分離すｒｕ。ペレットを少量のTBS（約20mlg/卵黄）で洗浄し、再び遠心分離する。
【００３８】
混合された残渣を濾紙で濾過し、濾液0.5M EDTAに最終濃度約30mM EDTA（100ml当たり6ml）まで添加して、残留Ca++を結合する。次いで上澄みを24.3g硫酸アンモニウムそれぞれ100ml(40%飽和に相応)と混ぜ、＋4°Ｃで30分間培養する。発生した沈渣（IgY）を最初に30%（NH4)2SO4(30mlE＋70ml蒸留水）で洗浄し、遠心分離し、次に最小量のTBS（約10ml/使用した卵黄）に溶解し、TBSに対して透析する。
【００３９】
IgYの含量を光度測定により275nmと規定する。
【００４０】
実施例４
a）担体の活性化
実施例３に従って精製したIgYを適当な担体に結合する。この目的のために、たとえばセファロースを、以下に記載する要領で活性化することができる（H.F.Boeden, W.Buettner, C.Rupprich, D.Buettner, S.Heinrich, M.Becker, M.Holtzhauer(1992), Makromol.Chem.193,865-887）。アガロース担体を段階的に、すなわちアセトンの量を20%ずつ増やして変質させる。最後にこの担体を閉じた容器内で5倍の容積の無水アセトン床に載せて一晩放置し、再び5~10容積単位の無水アセトンで洗浄し、G2フリット（半融ガラス原料）に短時間吸着させる。
【００４１】
分析当たり、沈殿した担体10mlに、10ml無水アセトンに溶かした400mgN-(クロロカルボニルオキシ)-5-ノルボルネン-2.3-ジカルボキシミド(CICOONB)を添加する。振り混ぜながら15分以内に280μlトリエチルアミンと20mg40-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の溶液を、乾燥したアセトン5mlに滴加する(モル比はCICOONB:トリエチルアミン:DMAP=1:1.2:0.1)。さらに15分間振り混ぜた後、担体を約200ml無水アセトンで洗浄する。
b）IgYを固相担体に結合
実施例4a）によって活性化されたポリサッカリド・マトリクス（ゲル）を段階的に水溶性媒質に移行させ、それから直ちに配位子を含む結合溶液に撹拌しながら混ぜる。結合緩衝剤としてクエン酸緩衝剤pH4.2を使用する。結合は、室温下で2時間軽く振り混ぜながら行う。次にエタノールアミンを添加して自由結合を遮断する。表2に、若干の抗体に対する具体的な条件を示す。
【００４２】
【表２】
0004307743.tif 000003
【００４３】
実施例５
実施例4に従って固定化された抗体を利用して、緩衝液、血清または血漿などの液相媒質から、リポポリサッカリド、インターロイキン、TNFまたは補体因子を除去する。
【００４４】
この目的のために担体を洗浄して生理的緩衝剤（PBS）に移し、気泡が生じないようにプラスチック管またはガラス管に包入する。これをクロマトグラフィ装置に接続して完全な構成とする。吸着すべき試料（抗原を配合した緩衝剤、抗原を配合した、または天然抗原含量を有する血清試料または血漿試料）を重力により、または適当なポンプで、記載の抗原に特異的な固定化された抗体を通して案内できる。現存する抗原はIgYによって識別され固く結合されて、管を貫流する媒質から除去される。効果の証明は、抗原含量が減少した管通過液の分析（ELISA）によって行う。管を生理的緩衝剤で洗浄した後で、適当な溶離剤（0.1Mクエン酸緩衝剤pH3）による結合した抗原の脱離、溶離物の分画と分析が行われる。抗原の定量的証明を免疫吸着剤の能力規定に利用する。