(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の二つ以上のコレクション中の核酸配列の相対的コピー数を比較する方法であって、その方法が
（a）固体担体に結合された複数の標的要素を用意し、各々の標的要素は１μmから１mmの間の直径を有し及び標的核酸を含んでいて、該標的核酸が染色体上の位置又はｃＤＮＡクローンに由来するヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、
（b）該標的要素を
（i）複数の第一核酸配列を含む第一標識された核酸分子のコレクションであって、各々の該配列が異なる標的核酸に実質的に相補的であって、該第一核酸配列が予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で特異的に該標的核酸にハイブリダイズする、コレクション、及び
（ii）複数の第二核酸配列を含む第二標識された核酸分子のコレクションであって、各々の該配列が異なる標的核酸に実質的に相補的であって、該第二核酸配列が予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で特異的に該標的核酸にハイブリダイズする、コレクション
と接触させ、ここで第一標識と第二標識とは互いに区別でき、そして
（c）同じ標的核酸への第一標識された核酸分子と第二標識された核酸分子との結合の量を比較し、それによって少なくとも１の第二核酸配列のコピー数に対する少なくとも１の第一核酸配列のコピー数を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
標的核酸がゲノムＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的核酸がｃＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一標識された核酸分子及び第二標識された核酸分子のコレクションがヒトＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸が1,000〜1,000,000ヌクレオチドの複雑度である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一標識した核酸のコレクションにおける相対的コピー数が決定される配列の複雑度が該コレクションの全複雑度の１％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体担体が複数のビーズである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
固体担体がガラスである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一標識及び第二標識が蛍光標識である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第一標識された核酸分子及び第二標識された核酸分子のコレクション中にある反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックする工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第一標識された核酸分子及び第二標識された核酸分子のコレクションを反復配列を含む未標識ブロッキング核酸と混合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
未標識ブロッキング核酸がCot-1 DNAである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第一標識された核酸分子のコレクションが試験細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含み、及び第二標識された核酸分子のコレクションが基準細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第一標識された核酸分子のコレクションが試験ゲノムからのものであり、及び第二標識された核酸分子のコレクションが正常基準ゲノムからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
試験ゲノムが胎児組織からの核酸分子を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試験ゲノムが腫瘍からの核酸分子を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１記載の核酸分子の２以上のコレクションにおける核酸配列の相対的コピー数を比較する方法を実施するためのキットであって、該キットが
（a）２以上の標的要素のアレイを有する固体担体であって、各々の標的要素が１μmから１mmの間の直径を有し及び前もって選択された標的核酸を含み、該標的核酸が染色体上の位置又はｃＤＮＡクローンに由来するヌクレオチド配列を含む単離された核酸である、固体担体、及び
（b）基準核酸分子を含む容器であって、該基準核酸分子が、予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で少なくとも１の標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする配列と特異的にハイブリダイズしない配列とを含んでいる、容器
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
特異的にハイブリダイズしない配列に対する特異的にハイブリダイズする配列のモル比が1:100未満である請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
各標的要素が1,000〜1,000,000ヌクレオチドの複雑度である請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
キットが２種の異なる蛍光標識を更に含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
固体担体がガラスである請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
基準核酸分子が哺乳類ゲノム核酸分子である請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
哺乳類ゲノム核酸分子がヒト起源のものである請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
標識された核酸分子の２よりも多いコレクションを、予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で該標的要素と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
複数の標的要素が１cm2の面積を占めるアレイを形成する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
標的要素の密度が１０4/cm2から１０7/cm2の間である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は種々の疾患と関連する遺伝子異常の検出方法及びマッピング方法に関する。特に、本発明は配列のその他のコレクション中のこれらの配列のコピー数に対し配列のコレクション中の特別な核酸配列のコピー数を比較するための核酸ハイブリダイゼーション方法の使用に関する。
多くのゲノム研究及び遺伝子研究は疾患の研究及び検出のための細胞集団間の遺伝子量または発現の相違の同定に関する。例えば、多くの悪性度は癌遺伝子の活性化または腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化をもたらすＤＮＡ配列の獲得または損失を伴う。腫瘍性形質転換及びその後の進行をもたらす遺伝的イベントの同定は、疾患に関する生物学的基礎を形成し、治療応答の予知を改善し、かつ早期の腫瘍検出を可能にしようとする努力を促し得る。
加えて、周産期の遺伝的問題は染色体セグメントの損失または獲得、例えば、トリソミー21症候群またはミクロ欠失症候群から頻繁に生じる。こうして、このような異常の周産期の検出方法は疾患の早期診断に有益であり得る。
細胞遺伝学は、増幅または欠失された染色体領域を検出するための従来の方法である。しかしながら、細胞遺伝学技術の分解能は約10Mb（ギムザ染色された染色体中のバンドのおそよの幅）よりも大きい領域に制限される。多数のトランスロケーション及びその他の遺伝子変化を有する複雑な核型において、従来の細胞遺伝学的分析は殆ど実用性がない。何となれば、核型情報が充分に解読し得ないからである。更に、通常の細胞遺伝学的バンディング分析は時間を浪費し、多大の労力を要し、しかも頻繁に充分な中期染色体を得ることの困難なことのために困難であり、または不可能である。加えて、遺伝子増幅、均一な染色領域（HSR）、またはDM染色体の細胞遺伝学的用法指示は、増幅される配列の同定に寄与する情報を与えない。
更に最近の方法は分子技術を使用してサンプル中の所定の核酸配列の量を評価することを可能にする。これらの方法（例えば、サザンブロッティング）は単離されたＤＮＡにハイブリッド形成されるクローン化ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを使用する。サザンブロッティング及び関連技術は、たとえゲノムが有益な核型情報を排除するように重度に再配列されるとしても有効である。しかしながら、これらの方法は分析すべき配列に特異性のプローブの使用を必要とする。こうして、ゲノムの特別な推測領域に関する先の情報が利用できない場合、一度に非常に多くの個々のプローブを使用して夫々の標本の完全ゲノムを調査することが必要である。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）は増幅または欠失された配列の存在を検出し、その位置を同定する更に最近のアプローチである。Kallioniemiら，Science 258:818-821（1992）及びWO 93/18186を参照のこと。CGHはゲノム再配列にもかかわらず増加及び減少を明らかにする。CGHの一つの実施において、ゲノムＤＮＡが正常な基準細胞からだけでなく、試験細胞（例えば、腫瘍細胞）から単離される。２種の核酸が差別的に標識され、次いで基準細胞の中期染色体にin situでハイブリッドを形成される。基準ＤＮＡ及び試験ＤＮＡの両方中の反復配列が除去され、またはそれらのハイブリダイゼーション能力が或る手段により低下される。増加または減少されたコピー数である試験細胞中の染色体領域が、２種のＤＮＡからのシグナルの比が変化されている領域を検出することにより迅速に同定し得る。例えば、試験細胞中のコピー数の減少された領域は、ゲノムのその他の領域と比較して基準よりも試験ＤＮＡから比較的低いシグナルを示すであろう。試験細胞中のコピー数の増加された領域は試験ＤＮＡから比較的高いシグナルを示すであろう。
こうして、CGHは配列の先の知識がなくても変異体コピー数を有する配列の位置を発見し、マッピングする。特定配列のプローブが必要とされず、単一ハイブリダイゼーションのみが必要とされる。コピー数の減少または増加が配列の一つのコピーの損失または獲得に制限される場合、CGH分解能は通常約5-10Mbである。
増大された感度、染色体異常の更に正確な局在化を与え、遺伝子発現のレベルの相違を検出し得る新しい技術が疾患の診断に特に望ましい。本発明はこれらの利益及びその他の利益を提供する。
発明の要約
本発明は核酸分子の第一コレクション中の少なくとも二つの核酸配列のコピー数を第二コレクション中の同配列のコピー数に対して定量的に比較する方法を提供する。その方法は第一コレクション中の核酸分子及び第二コレクション中の核酸分子を夫々第一標識及び第二標識で標識することを含む。第一標識及び第二標識は互いに区別できるべきである。こうして生成されたプローブが、標的要素への核酸ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で複数の標的要素と接触される。プローブは同時または連続に標的要素に接触し得る。
夫々の標的要素は固体担体に結合された標的核酸分子を含む。標的要素中の夫々の配列の一つ以上のコピーが存在し得る。標的要素中の標的核酸の配列複雑度は標識された核酸の第一コレクション及び第二コレクションの配列複雑度よりも極めて小さい。
標的要素及びプローブの両方に関する核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。核酸はあらゆる生物に由来していてもよい。通常、標的要素及びプローブ中の核酸は同種からのものである。
標的要素は複数のビーズの如き別々の担体にあってもよく、または標的要素のアレイがガラス顕微鏡スライドの如き単一固体表面にあってもよい。標的要素中の標的核酸の核酸配列は、比較コピー数情報が所望される核酸配列である。例えば、要素の配列は疾患と関連することが知られている染色体位置に由来していてもよく、疾患との関連が試験される染色体領域の代表であるように選択されてもよく、または転写が分析される遺伝子に相当していてもよい。
プローブを標的要素に接触させた後に、夫々の結合の量、及び結合比が夫々の標的要素について測定される。典型的には、標的要素への結合の比が大きい程、その要素に結合する２種のプローブ中の配列のコピー数の比が大きい。こうして、標的要素間の比の比較がプローブ中の異なる配列のコピー数の比の比較を可能にする。
これらの方法は典型的には蛍光in situハイブリダイゼーションに適した技術を使用して行われる。こうして、第一標識及び第二標識は通常蛍光標識である。
標的核酸へのプローブ中の反復配列のハイブリダイゼーションを抑制するために、未標識ブロッキング核酸（例えば、Cot-1 DNA）がプローブと混合し得る。こうして、本発明はゲノム中の非反復配列の分析に集中する。
典型的な実施態様において、プローブ核酸の一つのコレクションが研究中の試験細胞、細胞集団、または組織から調製され、プローブ核酸の第二コレクションが基準細胞、細胞集団、または組織から調製される。基準細胞は正常な非疾患細胞であってもよく、またはそれらは疾患のその他の局面に関する標準として利用できる疾患組織のサンプルからのものであってもよい。例えば、基準プローブが正常細胞から単離されたゲノムＤＮＡである場合、その他に対するそのプローブ中の夫々の配列のコピー数が知られている（例えば、夫々の常染色体配列の二つのコピー、及びジェンダーに依存する夫々の性染色体配列の一つまたは二つのコピー）。試験プローブとのこれの比較が正常からの変化の検出を可能にする。また、基準プローブは、その異なる配列間のコピー数の実質的な変化を含み得る原発性腫瘍からのゲノムＤＮＡから調製されてもよく、また試験プローブがその腫瘍からの転移細胞のゲノムＤＮＡから調製されてもよく、その結果、その比較は原発性腫瘍とその転移の間の相違を示す。更に、両方のプローブが正常細胞から調製されてもよい。例えば、異なる組織の正常細胞の間のｍＲＮＡ集団の比較は組織分化の重要な特徴である分化遺伝子発現の検出を可能にする。こうして、一般に、試験及び基準という用語は２種のプローブを区別するために便宜上使用されるが、それらはそれらが含む核酸のその他の特徴を意味しない。
また、本発明は本発明の方法を実施するのに有益な物質を含むキットを提供する。本発明のキットは標的核酸のアレイを結合した固体担体及び正常基準ゲノムに相当する核酸、または基準細胞型からのｃＤＮＡ等を含む容器を含む。更に、キットは２種の異なる蛍光体、試験ゲノム、別の基準ゲノムを標識するための試薬等を含んでいてもよい。
定義
“核酸アレイ”は複数の標的要素であり、夫々がプローブ核酸にハイブリッドを形成させる固体表面に固定された一種以上の標的核酸分子を含む。
標的要素の“標的核酸”は典型的にはゲノムの特定領域中にそれらの起点を有し（例えば、ゲノムライブラリーからのクローンまたは幾つかの連続クローン）、または機能性遺伝単位に相当し、これは完全であってもよく、また完全でなくてもよい（例えば、完全ｃＤＮＡまたは部分ｃＤＮＡ）。また、標的核酸はinter-Aluまたはこのようなクローンに由来する縮重オリゴヌクレオチドプライマーPCR産物を含み得る。遺伝子発現が分析されている場合、標的要素は完全ｃＤＮＡまたは部分ｃＤＮＡを含み得る。
標的要素の標的核酸は、例えば、特定遺伝子を含んでいてもよく、または関係する細胞、例えば、腫瘍細胞中に増加または減少されたコピー数で存在すると推測される染色体領域であってもよい。また、標的要素は、異常なレベルで転写されると推測される、ｍＲＮＡ、またはこのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含んでいてもよい。
また、標的要素は未知の重要性または位置の核酸を含んでいてもよい。このような要素のアレイは、サンプルが完全ゲノム、単一染色体、または染色体の一部を含むが、これらに限定されないゲノムの所望の部分を連続的に、または別の位置でサンプリングする位置に相当し得る。標的要素の数及び夫々中の核酸の複雑度はサンプリングの密度を決めるであろう。例えば、夫々の標的が異なるゲノムクローンからのＤＮＡを含む、300の標的要素のアレイは、10メガベースの間隔で完全ヒトゲノムをサンプリングし得る。夫々がゲノムＤＮＡの100kbを含む、30,000の要素のアレイはヒトゲノムの完全な包含を与え得る。
同様に、アノミマスｃＤＮＡクローンからの核酸を含む標的要素のアレイは関係する幾つかの細胞中で差別的に発現し得るこれらの同定を可能にし、それにより注意をこれらの遺伝子の研究に集中するであろう。
種々の寸法の標的要素が本発明のアレイに使用し得る。一般に、小さい標的要素が好ましい。典型的には、標的要素は直径が約1cm未満であろう。一般に、要素サイズは１μmから約３mmまで、好ましくは約５μm〜約１mmである。
アレイの標的要素は異なる密度で固体表面に配置し得る。標的要素の密度は幾つかの因子、例えば、標識の性質、固体担体等に依存するであろう。
当業者は、夫々の標的要素が異なる長さ及び配列の標的核酸の混合物を含み得ることを認めるであろう。こうして、例えば、標的要素はＤＮＡのクローン化断片の一つより多いコピーを含んでもよく、また夫々のコピーが異なる長さの断片に分解されてもよい。本発明の標的配列の長さ及び複雑度は本発明に重要ではない。当業者はこれらの因子を調節して所定のハイブリダイゼーション操作に最適のハイブリダイゼーション及びシグナル発生を得、かつ異なる遺伝子またはゲノム位置の間の必要とされる分解能を得ることができる。典型的には、標的配列は約１kb〜約１Mbの複雑度を有するであろう。
好ましい実施態様において、本発明の標的は、それらが由来する縮合中期染色体と関連する上部構造を実質的に欠いている核酸である。真核染色体へのＤＮＡの詰め込みの一般的な性質は当業者に公知である。簡単に言えば、真核染色体の上部構造は多くのオーダーの複雑度を含む。ＤＮＡがヒストンコアー付近で覆われて規則的な反復ヌクレオソームを形成し、これらが順に互いに詰め込まれてしっかりと縮合された30nmのクロマチン繊維を生じる。次いでクロマチン繊維が種々のループ状ドメインで詰め込まれて中期染色体中に高次の折り畳み及び縮合を生じる。本発明の核酸標的は天然産の縮合中期染色体のこれらの特徴の幾つかまたは全部を欠いている。真核染色体の全般の構造の一般的な説明について、Albertsら，Molecular Biology of the Cell第二編，496-506頁，Garland Publishing Inc.New York,1989を参照のこと。
“核酸”または“核酸分子”という用語は一本鎖形態または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表し、特に限定しない限り、天然産ヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの既知類縁体を含むであろう。
本明細書に使用される“プローブ”は一つ以上の型の化学結合、通常水素結合形成により相補配列の標的核酸に結合することができる核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の集合と定義される。プローブは以下に記載されるように直接または間接に標識されることが好ましい。それらは典型的には高複雑度のものであり、例えば、細胞または細胞集団から単離された完全ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから調製される。
“複雑度”という用語は、Brittenら，Methods of Enzymol.29:363（1974）により確立されたようなこの用語の通常の意味に従って本明細書に使用される。
また、核酸複雑度の更なる説明について、Cantor and Schimmel Biophysical Chemistry:Part III 1228-1230を参照のこと。
“実質的に結合する”はプローブ核酸と標的核酸の間の相補ハイブリダイゼーションを表し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少して標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を得ることにより調節し得るわずかな不適合を含む。
“特異的ハイブリダイゼーション”または“特異的にハイブリッドを形成する”という用語は、プローブ核酸が標的核酸に実質的に結合し、かつ特定のストリンジェンシー条件下でアレイ中のその他の核酸に実質的に結合しないハイブリダイゼーションを表す。当業者はハイブリッド形成条件のストリンジェンシーの緩和が配列不適合を寛容させることを認めるであろう。寛容される不適合の程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調節により調節し得る。
また、当業者は、本明細書に記載された特別な核酸の正確な配列がその他に“実質的に同一”であり、かつ相補核酸に実質的に結合する能力を保持するプローブまたは標的を生成するように或る程度修飾し得ることを認めるであろう。このような修飾は本明細書中の個々の配列を参考にすることにより特別に包含される。ポリヌクレオチド配列の“実質的な同一性”という用語は、通常のパラメーターを使用して以下に記載される方法を使用して、ポリヌクレオチドが基準配列と比較して少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
２種の核酸配列は、２種の配列中のヌクレオチドの配列が以下に記載されるように最大の一致のために配列される時に同じである場合に“同一”であると言われる。“相補性”という用語は、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部または一部に相補性であることを意味するために本明細書に使用される。
２種（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は典型的には二つの配列の配列を“比較ウインドー”にわたって比較して配列類似性の局所領域を同定し、比較することにより行われる。本明細書に使用される“比較ウインドー”は少なくとも約20、通常約50〜約200、更に通常約100〜約150の連続位置のセグメントを表し、この場合、二つの配列が最適に整列された後に配列が連続位置の同じ数の基準配列と比較し得る。
比較のための配列の最適の整列は、Smith及びWaterman Adv.Appl.Math.2:482（1981）の局所相同性アルゴリズム、Needleman及びWunsch J.Mol.Biol.48:443（1970）の相同性整列アルゴリズム、Pearson及びLipman Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）85:2444（1988）の類似性方法に関する研究、これらのアルゴリズムの計算機化された実施により行われてもよい。
“配列同一性の％”は、比較ウインドーにわたって二つの最適に整列された配列を比較することにより測定され、その比較ウインドー中のポリヌクレオチド配列の部分は二つの配列の最適の整列のための基準配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。％は、同じ核酸塩基が両方の配列中に生じて適合位置の数を生じる位置の数を測定し、適合位置の数を比較のウインドー中の位置の合計数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の％を得ることにより計算される。
ヌクレオチド配列が実質的に同じであるという別の指示は、二つの分子がストリンジェント条件下で同じ配列にハイブリッドを形成するかどうかである。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境中で異なるであろう。一般に、ストリンジェント条件は特定のイオン強度及びpHで特定配列の熱融点（Tm）よりも約５℃低いように選ばれる。Tmは、標的配列の50％が完全に適合したプローブにハイブリッドを形成する温度（特定のイオン強度及びpHにおける）である。
【図面の簡単な説明】
図１はcMYC癌遺伝子の増幅を検出する本発明の方法の能力を示す実験の顕微鏡写真を示す。cMYC癌遺伝子の増幅を含む標識Colo-320 DNA、及び標識正常ヒトＤＮＡを二つの標的要素からなるアレイにハイブリッドを形成させた。一つの標的要素はクローン化cMYC癌遺伝子配列を含み、他方はColo-320細胞系中で増幅されないことが知られているヒトゲノム（21D7）の領域からのクローン化配列を含んでいた。夫々の標的要素はクローンに相当する一本鎖断片を含む。断片をアビジン被覆ガラス粒子に固定した。
好ましい実施態様の説明
本発明は異常な核酸コピー数の比較方法及び疾患と関連する染色体異常のマッピング方法を提供する。本発明の方法は固体担体に固定された標的核酸を使用し、これに差別標識プローブ核酸がハイブリッドを形成される。次いで標的への標識核酸のハイブリダイゼーションが通常の技術を使用して検出される。
本発明の方法は標的要素に結合することができる配列のコピー数を比較する。本発明の方法により検出し得るコピー数の変化は異なる方法で生じ得る。例えば、コピー数は染色体領域の増幅または欠失の結果として変化し得る。また、コピー数は、プローブまたは標的核酸中の配列を変化してそれらの結合を充分に減少する遺伝的再配列により減少し得る。
標的核酸
本発明の標的核酸は実際にはあらゆる起源に由来し得る。典型的には、標的は関係する染色体、関係する染色体領域、関係する完全ゲノム、ｃＤＮＡライブラリー等に沿った代表的な位置に由来する核酸分子であろう。これらの標的核酸は、例えば、ゲノムクローンのinter-Alu PCR産物、ゲノムクローン、ｃＤＮＡクローン等の制限消化産物から得られた核酸の比較的長い（典型的には、数千の塩基）断片であってもよい。幾つかの実施態様において、標的核酸は関係する特別な領域をスパンするクローンの先にマッピングされたライブラリーである。
使用するための標的核酸の選択は或る種の症状との特別な染色体または染色体領域の関連の先の知識により影響されるかもしれない。国際出願WO 93/18186、上記文献は染色体異常及び関連疾患のリストを提供し、これらが科学文献に記載されている。また、コピー数中の頻繁な変化を受ける新しい領域を同定する完全ゲノムスクリーニングが本発明の方法を使用して行い得る。これらの実施態様において、標的要素は通常完全ゲノムにわたって分布された位置の代表的な核酸を含む。幾つかの実施態様（例えば、高い複雑度の多数の標的要素を使用する）において、ゲノム中の全ての配列がアレイ中に存在し得る。
幾つかの実施態様において、関係する特別な染色体領域からの先にマッピングされたクローンが標的として使用される。このようなクローンが遺伝子学の世界的なイニシアチブの迅速な発展の結果として利用可能になりつつある。
マッピングされたクローンは単一染色体、多種染色体、または染色体のセグメントから構築されたライブラリーから調製し得る。通常の技術がベクター、例えば、コスミド、酵母人工染色体（YAC）、バクテリア人工染色体（BAC）及びP1ファージ中の適当なサイズの断片をクローン化するのに使用される。
上記のようにしてクローンライブラリーを生じることが可能であるが、完全染色体をスパンするライブラリーがまた市販されている。例えば、ヒトゲノム及びその他のゲノムからの染色体特異性ライブラリーがClonetech（South San Francisco,CA）またはATCCから入手し得る（ATCC/NIH Repository of Catalogue of Human and Mouse DNA Probes and Libraries,第７編，1993を参照のこと）。
必要により、上記クローンは遺伝的または物理的にマッピングし得る。例えば、FISH及びデジタル画像分析が所望の染色体に沿ってコスミドを局在化するのに使用し得る。この方法が、例えば、Lichterら，Science,247:64-69（1990）に記載されている。次いで物理的にマッピングされたクローンがCGHまたはその他の方法を使用して同定された関係する領域を最終的にマッピングするのに使用し得る。
固体表面への標的核酸の付着
核酸を種々の固体表面に固定する多くの方法が当業界で知られている。例えば、固体表面は膜、ガラス、プラスチック、またはビードであってもよい。所望の成分が非特異的結合により共有結合または非共有結合付着し得る。固体表面における核酸の固定が以下に充分に説明される。
天然及び合成の両方の、多種の有機ポリマー及び無機ポリマー、並びにその他の物質が固体表面の材料として使用し得る。例示の固体表面として、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、及びセルロースアセテートが挙げられる。その他に、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等が使用し得る。使用し得るその他の材料として、紙、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、サーメット等が挙げられる。その他に、ゲルを生成する物質が使用し得る。このような材料として、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース及びポリアクリルアミドが挙げられる。固体表面が多孔質である場合、種々の細孔サイズが系の性質に応じて使用し得る。
表面を調製する際に、種々の性質を得るために、多数の異なる材料が特にラミネートとして使用し得る。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）または巨大分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）が非特異的結合を避け、共有結合接合を簡素化し、シグナル検出等を増進するのに使用し得る。
化合物と表面の間の共有結合が所望される場合、表面は通常多官能であり、または多官能化し得るであろう。表面に存在し、結合に使用し得る官能基として、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が挙げられる。多種の化合物を種々の表面に結合する方法が公知であり、文献に充分に説明されている。例えば、分子への種々の官能基の導入による核酸の固定方法が知られている（例えば、Bischoffら，Anal.Biochem.164:336-344（1987）;Kremskyら，Nuc.Acids Res.15:2891-2910（1987）を参照のこと）。修飾ヌクレオチドを含むPCRプライマーを使用して、または修飾ヌクレオチドによる酵素末端標識により、修飾ヌクレオチドが標的に入れられる。
本発明の核酸アレイ用の膜担体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン）の使用が、標的を比較的高い要素密度（例えば、30-40/cm2まで）で配置する手動方法及びロボット方法を使用する良く開発された技術のために有利である。加えて、このような膜が一般に入手でき、膜へのハイブリダイゼーションに関するプロトコル及び装置が公知である。しかしながら、多くの膜材料はかなりの蛍光放出を有し、この場合、蛍光標識がハイブリダイゼーションを検出するのに使用される。
所定のアッセイフォーマットを最適化するために、当業者は膜型、蛍光体、励起バンド及び放出バンド、スポットサイズ等の異なる組み合わせについて蛍光検出の感度を測定し得る。加えて、低い蛍光バックグラウンド膜が記載されている（例えば、Chuら，Electrophoresis 13:105-114（1992）を参照のこと）。
候補膜に関する種々の直径のスポットの検出の感度は、例えば、蛍光末端標識ＤＮＡ断片の一連の希釈液をスポットすることにより容易に測定し得る。次いでこれらのスポットが通常の蛍光顕微鏡を使用して画像形成される。こうして、蛍光体及び膜の種々の組み合わせから得られる感度、直線性、及びダイナミックレンジが測定し得る。既知の相対比率の蛍光体の対の連続希釈液がまた分析されて精度を測定することができ、その蛍光比測定は検出器及び膜蛍光により許されるダイナミックレンジにわたって実際の蛍光体比を反映する。
膜よりも極めて低い蛍光を有する基材、例えば、ガラス、石英、または小さいビーズ上のアレイが極めて良好な感度を達成し得る。例えば、直径約１mmから約１μmまでの範囲の種々のサイズの要素がこれらの材料とともに使用し得る。少量の濃縮された標的ＤＮＡを含む小さいアレイメンバーが高い複雑度の比較ハイブリダイゼーションに都合良く使用される。何となれば、夫々の要素への結合に利用できるプローブの合計量が制限されるからである。こうして、得られるシグナルが高度に局在化され、かつ鮮明であるように、少量の濃縮された標的ＤＮＡを含む小さいアレイメンバーを有することが有利である。このような小さいアレイメンバーは典型的には104/cm2より大きい密度でアレイにおいて使用される。面積１cm2の定量的蛍光画像を形成することができる比較的簡単なアプローチが記載されており、単一画像中の多数のメンバーからのデータの獲得を可能にする（例えば、Wittrupら，Cytometry 16:206-213（1994）を参照のこと）。
ガラスまたは合成石英ガラスへの標的核酸の共有結合付着が幾つかの既知技術に従って達成し得る。このような基材は非常に低い蛍光基材、及び高度に有効なハイブリダイゼーション環境を与える。
市販の試薬を使用する、核酸をガラスにカップリングするための多くの可能なアプローチがある。例えば、幾つかの官能基を有するシラン処理された（silanized）ガラスの調製用の材料が市販されており、または通常の技術を使用して調製し得る。また、ガラスよりも少なくとも10倍低い自己蛍光を有する、石英カバースリップがシラン処理し得る。
標的はまた市販の被覆ビーズまたはその他の表面に固定し得る。例えば、ビオチン末端標識核酸が市販のアビジン被覆ビーズに結合し得る。また、ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体が、例えば、通常のプロトコル（例えば、Smithら，Science,258:1122-1126（1992）を参照のこと）に従ってプロテインＡを使用するタンパク質媒介カップリングによりシラン処理されたガラススライドに付着し得る。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識核酸が通常の技術に従って調製し得る。
ビーズに付着された核酸へのハイブリダイゼーションは、それらをハイブリダイゼーション混合物中で懸濁させ、次いでそれらを洗浄後に分析用のガラス基材に付着することにより行われる。また、アビジン被覆を有し、またはそれを有しない、常磁性粒子、例えば、酸化鉄（III）粒子が使用し得る。
従来技術はまたハイブリダイゼーションによる配列決定及び特別な配列の検出を含む種々の用途のための高密度アレイを生じることができる技術を記載している（例えば、Fodorら，Science 767-773（1991）及び米国特許第5,143,854号明細書を参照のこと）。
プローブ核酸の調製
標的核酸について、多種の核酸が本発明の方法においてプローブ核酸として使用し得る。プローブは、例えば、特別な生物、組織または細胞型からの完全ゲノムに相当するゲノムＤＮＡを含んでいてもよく、または単一染色体の如きゲノムの一部を含んでいてもよい。
一種以上の特別な遺伝子の発現レベルを比較するために、プローブ核酸は関係する生物、組織または細胞から調製されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに由来し得る。例えば、試験ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡは、正常な基準細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに、標準化ｃＤＮＡライブラリーからのクローンのアレイにハイブリッド形成し得る。加えて、２種の細胞集団からのゲノムＤＮＡからつくられたプローブがｃＤＮＡアレイにハイブリッド形成されて、ゲノム中の変異体ＤＮＡコピー数の領域から得られるｃＤＮＡを検出し得る。
本発明の方法は核酸の二つ以上の集団のあらゆる組み合わせ中の特別な配列のコピー数を比較するのに適している。当業者は、比較されるサンプル核酸の特別な集団が本発明に重要ではないことを認めるであろう。例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡが２種の関連種から比較し得る。また、２種以上の組織または細胞型中の特別な遺伝子の発現のレベルが比較し得る。上記のように、これらの方法は疾患の診断に特に有益である。
通常の操作が適当な組織から核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を単離するのに使用し得る（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.（1985）を参照のこと）。また、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの通常の調製方法が使用し得る。
核酸が単離される特別な細胞または組織は特別な用途に依存するであろう。典型的には、癌と関連する異常の検出のために、ゲノムＤＮＡが腫瘍細胞から単離される。疾患の出生前の検出のために、胎児組織が使用されるであろう。
組織サンプルが小さく、その結果、少量の核酸が入手できる場合、縮重プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の如き増幅技術が使用し得る。PCRの一般的な説明について、PCR Protocols,Innisら編集，Academic Press,1990を参照のこと。加えて、PCRは高コピー数の反復配列の間で配列を選択的に増幅するのに使用し得る。これらの方法は高度に反復散在された配列（例えば、Alu）に相補性のプライマーを使用して、Aluファミリーの二つの員の間にある配列を選択的に増幅する（Nelsonら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6686（1989）を参照のこと）。
上記のように、細胞遺伝レベルのCGHは、例えば、正常ゲノムと腫瘍ゲノムの間のコピー数の相違の領域を同定することにより疾患遺伝子に関する研究を促進している。例えば、CGH研究は乳癌におけるコピー数変化の分析に適用されていた（例えば、Kallioniemiら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2156-2160（1994）を参照のこと）。
CGHにおいて、コピー数変化がマッピングし得る分解能は数メガベースのオーダーである。本発明では、分解能は標的要素中のゲノムＤＮＡセグメントの長さ及び隣接クローン間の地図位置の相違の関数である。通常のCGHによるよりも10倍より良好な分解能が本発明により得られる。この改良された局在化は疾患に関与する重要な遺伝子を同定し、微小欠失症候群におけるようなゲノムの小さい領域を伴う異常の更に感度の良い検出を可能にしようとする努力を促すであろう。
核酸プローブの標識
上記のように、標的核酸にハイブリッドを形成される核酸は標識されてハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にすることが好ましい。下記のハイブリダイゼーションに使用された核酸プローブはハイブリダイゼーション反応の前に検出可能に標識し得る。また、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識が選択し得る。上記のように、標的核酸アレイは同時または連続に２種以上のプローブ核酸にハイブリッドを形成される。こうして、プローブは別々かつ区別できる標識で夫々標識される。
プローブ核酸に付着された特別な標識または検出可能な基は、それが標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションに有意に干渉しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は検出可能な物理的性質または化学的性質を有するあらゆる物質であり得る。このような検出可能な標識が核酸ハイブリダイゼーションの分野で良く開発されており、一般にこのような方法に有益な殆どの標識が本発明に適用し得る。こうして、標識は分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気学的手段、光学的手段または化学的手段により検出可能なあらゆる組成物である。本発明に有益な標識として、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射能標識（例えば、3H、125I、35S、14C、または32P）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びELISAに普通使用されるその他の酵素）が挙げられる。
核酸は、検出可能な抗リガンドが利用できるリガンドを使用して間接的に標識し得る。例えば、ビオチニル化核酸が当業界で公知の技術に従って標識されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出し得る。その他に、抗原分子またはハプテン分子が標識された抗血清またはモノクローナル抗体を使用して検出し得る。例えば、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン標識プローブまたはジゴキシゲニン標識プローブがこれらの化合物と特異的に免疫反応性の抗体（例えば、FITC標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー・マンハイム））を使用して検出し得る。その他に、チミジン−チミジン二量体の標識抗体が使用し得る（Nakaneら，ACTA Histochem.Cytochem.20:229（1987））。
一般に、できるだけ少ないコピー数で検出可能であり、それによりアッセイの感度を最大にし、しかもバックグラウンドシグナルより上で検出可能である標識が好ましい。局在化シグナルを与え、それにより夫々の標的要素からのシグナルの空間的分解能を与える標識が選択されることが好ましい。
標識は当業者に知られている種々の手段でＤＮＡにカップリングし得る。好ましい実施態様において、プローブはnick翻訳またはランダムプライマー伸長を使用して標識されるであろう（Rigbyら，J.Mol.Biol.,113:237（1977）またはSambrookら，Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.（1985））。
標的への標識核酸のハイブリダイゼーション
２種のプローブ中の特別な核酸配列のコピー数は、プローブを一つ以上の標的核酸アレイにハイブリッドを形成することにより比較される。標的要素の夫々に関してプローブにより生じた、ハイブリダイゼーションシグナル強さ、及び強さの比が測定される。典型的には、標的要素に関するシグナル強さの比が大きい程、その要素に結合する２種のプローブ中の配列のコピー数の比が大きい。こうして、標的要素間のシグナル強さの比の比較が、プローブ中の異なる配列のコピー数の比の比較を可能にする。
通常のハイブリダイゼーション技術が標的核酸アレイを探査するのに使用される。好適な方法がCGH技術を記載する文献（Kallioniemiら，Science 258:818-821（1992）及びWO 93/18186）に記載されている。一般的な技術に関する幾つかのガイド、例えば、Tijssen,Hybridization with Nucleic Acid Probes,パートＩ及びII（Elsevier,アムステルダム1993）が利用できる。in situハイブリダイゼーションに適した技術の説明について、Gallら，Meth.Enzymol.,21:470-480（1981）及びAngererら，Genetic Engineering:Principles and Methods Setlow及びHollaender編集，７巻，43-65頁（plenum Press,ニューヨーク1985）を参照のこと。
一般に、核酸ハイブリダイゼーションは下記の主要工程を含む。（1）標的核酸の固定;（2）標的ＤＮＡの接近可能性を増大し、かつ非特異的結合を減少するためのプレハイブリダイゼーション処理;（3）固体表面上の核酸への核酸の混合物のハイブリダイゼーション;（4）ハイブリダイゼーション中に結合されなかった核酸断片を除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄及び（5）ハイブリッドを形成した核酸断片の検出。これらの工程の夫々中に使用される試薬及び使用に関するそれらの条件は特別な適用に応じて変化する。
幾つかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。反復配列のハイブリダイゼーション能力を除去し、かつ／または損なうための幾つかの方法が知られている（例えば、WO 93/18186を参照のこと）。
例えば、バルク操作が使用し得る。ヒトゲノムを含む多くのゲノム中で、共有された反復ＤＮＡの主要部分がAluの如き高度に反復された配列の二三のファミリー中に含まれる。これらの方法は、相補配列のハイブリダイゼーション比がそれらの濃度の増加につれて増大するという事実を利用する。こうして、一般に高濃度で存在する反復配列が変性及びハイブリダイゼーション条件下のインキュベーション後にその他の配列よりも迅速に二本鎖になるであろう。次いで二本鎖核酸が除去され、残りがハイブリダイゼーションに使用される。二本鎖配列からの一本鎖配列の分離方法は、ヒドロキシアパタイトまたは固体担体に付着された固定された相補核酸を使用することを含む。また、部分的にハイブリッドを形成された混合物が使用でき、二本鎖配列は標的にハイブリッドを形成するのに使用できないであろう。
また、ハイブリダイゼーション能が抑制されるべきである配列に相補性である未標識配列がハイブリダイゼーション混合物に添加し得る。この方法は反復配列だけでなく、その他の配列のハイブリダイゼーションを抑制するのに使用し得る。例えば、“Cot-1”DNAがサンプル中の反復配列のハイブリダイゼーションを選択的に抑制するのに使用し得る。Cot-1 DNAを調製するために、ＤＮＡが抽出され、剪断され、変性され、Cot-1に再生される（再会合速度論及びCot値の説明について、Tijssen,上記文献48-54頁を参照のこと）。高度の反復配列は更に迅速に再アニールするので、得られるハイブリッドはこれらの配列について高度に濃縮されている。残りの一本鎖配列（即ち、単一コピー配列）がS1ヌクレアーゼで消化され、二本鎖Cot-1 DNAが精製され、サンプル中の反復配列のハイブリダイゼーションをブロックするのに使用される。Cot-1 DNAは上記のように調製し得るが、それはまた市販されている（BRL）。
ハイブリダイゼーションからの検出可能なシグナルの分析
標識プローブにより生じたシグナルの検出及び分析のための通常の方法が使用し得る。特別な方法はプローブに使用した標識に依存するであろう。一般に、蛍光標識が好ましい。こうして、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）に好適な方法が本発明に好適である。核酸アレイは蛍光顕微鏡中で多色ビーム−スプリッターで画像形成されて着色依存性画像シフトを避ける。異なる着色画像がCCDカメラで得られ、デジタル化画像がコンピューター中に貯蔵される。次いでコンピュータープログラムがアレイにより生じたシグナルを分析するのに使用される。
シグナルを視覚化するのに好ましい方法がKallioniemiら，上記文献及びWO/18186に記載されている。結果のディスプレイを促進し、蛍光強さの小さい相違を検出する感度を改良するために、デジタル画像分析系が使用されることが好ましい。好ましい系はQUIPS（定量的画像処理系に関する頭辞語）であり、これは自動化ステージ、焦点調節及びフィルターホイールを備えた通常の蛍光顕微鏡をベースとする自動化画像分析系（Ludl Electronic Products,Ltd.,Hawthorne,NY）である。フィルターホイールが励起波長の選択のために顕微鏡の蛍光励起通路に取り付けられている。ダイクロイックブロック中の特別なフィルター（Chroma Technology,Brattleboro,VT）が画像レジストレーションシフトを生じないで多種色素の励起を可能にする。顕微鏡は二つのカメラポートを有し、その一つがスライド上の関心のある領域を見つけるのに使用されるだけでなく、焦点調整に使用される感度の良い高速ビデオ画像ディスプレイ用のインテンシファイド（intensified）CCDカメラ（Quantex Corp.,Sunnyvale,CA）を有する。その他のカメラポートは高分解能及び高感度で実際の画像獲得に使用される冷却CCDカメラ（Photometrics Ltd.,Tucson,AZ製のモデル200）を有する。
冷却CCDカメラはVMEバスによりSUN 4/330ワークステーション（SUN Microsystems,Inc.,Mountain View,CA）にインターフェースされる。多色画像の完全な獲得が、画像処理ソフトウェアパッケージSCIL-Image（Delft Centre fpr Image Processing,Delft,オランダ）を使用して調節される。
実施例１
この実施例は、cMYC癌遺伝子の増幅を含む、腫瘍細胞系、Colo-320中の特定の配列の増幅の検出を実証する。
Colo-320 DNAの一つのアリコートをnick翻訳によりFITC-dUTPで標識し、第二アリコートをテキサスレッド-dUTPヌクレオチドで標識した。正常なヒトＤＮＡを基準ゲノムとして使用した。二つのアリコートを試験ゲノムと同様に標識した。
ハイブリダイゼーションアレイは二つの標的要素からなった。一方はcMYC癌遺伝子配列を含み、他方はColo-320細胞系中で増幅されないことが知られているヒトゲノム（21D7）の領域からの配列を含んでいた。これらの二つの遺伝子座に関するP1クローン（インサート長さ約80kb）（LBL/UCSF Resource for Molecular Cytogenicsから得られる）からのＤＮＡを単離し、制限酵素HindIIIで完全に切断し、数百bpから10kb以上までの長さの範囲の断片を生じた。得られるオーバーハングの一つの塩基を、ビオチン-dATPを使用して詰め込み、そのＤＮＡを変性した。こうして、夫々の一本鎖断片を単一ビオチンで末端標識した。夫々のクローンに相当する一本鎖断片をアビジン被覆した調節された多孔質ガラス（CPG Inc.）“５μm粒子”（サイズ及び形状が非常に不均一である）の異なるアリコートと反応させた。こうして、粒子の一つの集団はcMYC標的配列を含み、他方は21D7配列を含んでいた。FITC-dUTPを使用する粒子に関する一本鎖ＤＮＡのランダムプライミング標識は、それがその表面に制限されることを示した。これらの大きい断片は明らかに粒子中の細孔に実質的に侵入しなかった。
二つの比較ハイブリダイゼーションを行って標識プローブの異なる挙動等のための潜在的な人為現象について調節した。
1）FITC標識Colo-320ゲノムＤＮＡ300ng及びテキサスレッド標識正常ゲノムＤＮＡ300ng、並びに未標識Cot-1 DNA10μgをハイブリダイゼーション混合物20μlに溶解して50％のホルムアルデヒド、2xSSC、及び10％のデキストランスルフェートの最終濃度を得た。これを70℃に加熱してＤＮＡを変性し、10μlをcMYC配列を含む少数の粒子に添加した。残りの10μlを同様に21D7を含む少数の粒子に添加した。
2）このハイブリダイゼーションは、蛍光体標識を逆にした以外は最初のものと同様であった。こうして、Colo-320をテキサスレッドで標識し、正常ゲノムＤＮＡをFITCで標識した。ハイブリダイゼーションは37℃で36〜48時間進行し、粒子を洗浄し、蛍光アンチ−フェード（anti-fade）中で懸濁させ、顕微鏡スライドに取り付けた。
粒子を通常の蛍光顕微鏡で観察した。ハイブリダイゼーションシグナルは粒子の表面で顕著であった（不連続の蛍光グラニュールとして現れる）。代表的な粒子中の個々の蛍光体の定量的CCDカメラ画像を粒子の赤道面付近に焦点を合わせた顕微鏡を伴うデジタル顕微鏡系で獲得した。“直径”10〜15μmであるように選択された粒子に関する画像を図１に示す。それらのサイズのために、夫々の粒子の殆どが焦点からはずれていた。上部パネルは、Colo-320 DNAをFITCで標識し、正常ＤＮＡをテキサスレッドで標識した時の結果を示し、一方、下部パネルは標識を逆にした場合の結果を示す。夫々のパネル中で、上部の列はテキサスレッドを示し、下部の列はFITC画像を示す。左の二つの欄は21D7標的配列を含む粒子を示し、一方、右の二つの欄はcMYC配列を含む粒子である。画像の全てに関する露出は１秒であり、それらはコントラストを増強しないで、またバックグラウンドを引かないで示される。
上部パネルは、テキサスレッド標識された正常なゲノムＤＮＡが２種の異なる21D7粒子及び２種のcMYC粒子に関してほぼ等しい強さを生じたことを示す。しかしながら、cMYC粒子へのFITC標識Colo-320 DNAのハイブリダイゼーションの強さが21D7粒子へのハイブリダイゼーションの強さよりも実質的に高かった。これは細胞系中の21D7配列よりも多いcMYCのコピーの存在を示す。何となれば、cMYC粒子に関するColoシグナル対正常シグナルの比が21D7粒子に関する比よりも実質的に高いからである。cMYC粒子に関するFITCシグナルは粒子の端部で環を形成し、優勢な表面染色を示す。
逆標識による下部パネルは、FITC標識正常ゲノムＤＮＡによるシグナルが粒子の全てに関してほぼ等しかったが、一方、テキサスレッド標識Colo-320 DNAがcMYC粒子に関して鮮明なシグナルを生じたことを示す。こうして、検出された増幅は使用した標識スキームとは独立であった。
蛍光比の定量的測定は、粒子の厚さ及び自己蛍光のためにこれらの粒子について困難であった。しかしながら、およその推定は、cMYC粒子に関するColo対基準シグナルの比が21D7粒子に関する比よりも３倍（そしておそらく20倍）よりも大きいことを示した。
以上の実施例は本発明を説明するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。本発明のその他の変化が当業者に容易に明らかであり、請求の範囲により包含される。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は参考として本明細書に含まれる。
【図１】
0004338783.tif 000002