(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁作用性薬剤の中から特定の作用点を有する薬剤をスクリーニング方法であって、下記の工程：
(1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
(2) 上記微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
(3)工程(2)で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法。
【請求項２】
レポータータンパク質由来物の糖鎖の分析がレポーター蛋白質由来物の分子量測定により行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レポーター蛋白質がグリーン・フルオレッセント・プロテインである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞壁作用性薬剤が抗真菌剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記工程(1)に先立って、細胞壁作用性薬剤のスクリーニングを下記の工程：
(A1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
(A2)上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
(A3)レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
により行ない、上記工程(A3)により細胞壁に対して選択的な阻害作用を有すると判定された薬剤について上記(1)〜(3)の工程を行なう請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞壁作用性薬剤の作用点の推定方法であって、下記の工程：
(1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
(2) 上記微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
(3)工程(2)で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光蛋白質などのレポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を利用した細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
深在性真菌症の発生頻度は易感染患者の増加とともに、ますます増加する傾向にあり、有効な治療薬が望まれている。現在、国内で上市されている深在性真菌症治療薬はわずか５剤のみであり、このうち３剤はアゾール系薬剤(ミコナゾール,フルコナゾール,イトラコナゾール)である。その代表であるフルコナゾールは作用が静菌的であることに加え、使用量の増加とともに耐性菌の出現も懸念されている。一方、殺菌効果の高いポリエン系抗生物質であるアムホテリシンＢは毒性も強く、必ずしも安全に使用できる薬剤ではない。これらの理由から、深在性真菌感染症での医療満足度は総じて低く、殺菌的かつ真菌選択的な新規薬剤への需要は依然として大きい。
【０００３】
真菌細胞に特徴的に存在する細胞壁は選択性の観点から魅力的な標的である。パン酵母を例にとると細胞壁を構成する主要な糖ポリマーは、(1,3)-β-グルカン、(1,6)-β-グルカン、キチン、マンナンである。これらの糖ポリマーの合成経路のうち、マンナン合成経路は動物および真菌細胞間での存在自体や生合成経路についての共通性が高いため、真菌に特異的な標的を見出すことは不可能ではないものの、一般的に困難であると考えられる。(1,3)-β-グルカン合成経路およびキチン合成経路には、FKS遺伝子群およびCHS遺伝子群などのように、真菌に特異的かつ生育に必須な酵素の存在が明らかになっており、これらを標的とした抗真菌剤の探索や開発が進められている。そして、(1,3)-β-グルカン阻害作用を有するカンジン系抗真菌薬が実際に開発されている。これに対して、(1,6)-β-グルカン合成経路も真菌に特異的な経路であると考えられ、遺伝学的解析の結果から真菌の生育に必須であると考えられる酵素の存在が明らかとなっているが、酵素レベルでのアッセイ系が確立されていないため阻害物質の報告もなく、この合成経路を阻害する抗真菌剤は未だ知られていない。
【０００４】
一般に、真核細胞には広くGPIアンカー蛋白質と総称される蛋白質が存在し、これらはGPIアンカーにより細胞膜に固定化される (Ferguson, M.A., et al., Ann. Rev. Biochem., 57, pp.285-320, 1988)。GPIアンカー蛋白質はＮ末端及びＣ末端に疎水性の高いシグナルペプチド領域を持ち、翻訳後の修飾によりこれらのシグナルは切断されるとともにC末端にGPIアンカーの付加を受け、ER(粗面小胞体)膜に固定される。その後、ER膜に固定化されたGPIアンカー蛋白質は膜上を輸送され、細胞膜に固定化される(Ferguson, M.A., et al., Ann. Rev. Biochem., 57, pp.285-320, 1988; Lu, C．F., et al.， Mol. Cell Biol., 14, pp.4825-4833, 1994)。
【０００５】
パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）においては、細胞膜に固定化されたGPIアンカー蛋白質の一部はさらにGPIアンカーの一部が切断されて、新たに(1,6)-β-グルカンをアンカーとして細胞壁に固定化される(Lu, C．F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pp.4825-4833, 1994; Kollar, R., et al., J. Biol. Chem., 272, pp.17762-17775, 1997)。
【０００６】
すなわち、パン酵母では細胞膜あるいは細胞壁に固定化された２種類のGPIアンカー蛋白質が存在し、この局在性の違いはC末端のシグナルペプチドの違いにより制御されることが予想されている (Hamada, K., et al., Mol. Gen. Genet., 258, pp.53-59, 1998; Caro, L., Yeast, 13, pp.1477-1489, 1997)。最近、このような蛋白質の細胞壁への局在化機構を利用して、外来の任意の蛋白質を細胞壁に固定化した酵母(アーミングイースト)の作出が報告された(Varrt, J.M.V.D., et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pp.615-620, 1997; Murai, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pp.1362-1366, 1997)。
上述したように、(1,6)-β-グルカンはGPIアンカー蛋白質を細胞壁に固定化するためのアンカーとしての機能を有しており、これまでの解析結果では、遺伝子破壊によって(1,6)-β-グルカンの生合成を阻害すると、これらの蛋白質は細胞外へ流出する(Lu, C．F., et al.， Mol. Cell Biol., 14, pp.4825-4833, 1994; Lu, C.F., et al., J. Cell. Biol., 128, pp.333-340, 1995)。
【０００７】
最近、土屋らによりブドウ球菌細胞壁ペプチドグリカン結合型レポーター蛋白質の発現系の構築が報告されている（日本薬学会第１２０年会、要旨集２、第１５３頁、演題番号３０[ＰＢ]１５−７１）。この系は、グラム陽性菌の細胞壁にレポーター蛋白質としてセファロスポリナーゼをアンカリングさせたものである。しかしながら、この系の用途については明らかにされておらず、細胞壁作用性薬剤のスクリーニングに使用できることを示唆ないし教示していない。
【０００８】
また、従来、細胞壁作用性の薬剤の作用点を簡便かつ的確に推定する方法は（1,3）-β-グルカンやキチンなどの細胞壁関連薬剤のスクリーニング方法以外に知られておらず、特定の作用点に作用する薬剤をスクリーニングする方法もその作用点以外のスクリーニングには利用できなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、細胞壁に対して阻害作用を有する薬剤の作用点を簡便かつ適切に判定することにより、特定の作用点に作用する薬剤を効率的にスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、先に、検出の容易な蛋白質(レポーター蛋白質)を細胞膜又は細胞壁に固定した２種類の酵母(各々、膜型アーミングイースト又は壁型アーミングイーストと称する。)を作出し、実質的に壁型アーミングイーストでのみレポーター蛋白質が流出することを指標とすることで、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤、例えば細胞壁を構成する(1,6)-β-グルカン生合成酵素に対して選択的な阻害作用を有する薬剤をスクリーニングし得ることを見出した（PCT/JP01/3630）。
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決すべくさらに研究を続けた結果、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点に応じて、遊離するレポータータンパク質に付加している細胞壁を構成する上記糖鎖の分子量がそれぞれ異なり、遊離したレポータータンパク質の分子量を測定することによって薬剤の作用点を推定できることを見出した。すなわち、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点に応じて遊離するレポーター蛋白質の糖鎖が異なるとの現象を発見したのである。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、細胞壁作用性薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工程：
(1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
(2) 上記微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
(3)工程(2)で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法を提供するものである。この方法は、好ましくは、細胞壁作用性薬剤の中から、所望の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために用いられる。
【００１３】
上記の発明の好ましい態様によれば、レポータータンパク質由来物の糖鎖の分析が、レポーター蛋白質由来物の分子量測定により行われる上記方法；レポーター蛋白質を細胞壁の(1,6)-β-グルカンに固定した微生物を用いる上記の方法；微生物が酵母である上記の方法；レポーター蛋白質が蛍光蛋白質である上記の方法；蛍光蛋白質がグリーン・フルオレッセント・プロテインである上記の方法；並びに細胞壁に対する阻害作用が細胞壁の構築過程および／または糖鎖の生合成酵素（糖鎖の伸長に関する酵素）に対する阻害作用である上記の方法が提供される。細胞壁作用性薬剤は好ましくは抗真菌剤である。
【００１４】
本発明のさらに好ましい態様では、上記方法の前に、細胞壁作用性薬剤をスクリーニングする工程を含む。この態様では、まず細胞壁作用性薬剤のスクリーニングを下記の工程：
(A1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
(A2)上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
(A3)レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
に従って行ない、この工程(A3)により細胞壁に対して選択的な阻害作用を有すると判定された薬剤について、上記(1)〜(3)の工程を行って、該薬剤の中から所望の作用点を有する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００１５】
別の観点からは、細胞壁作用性薬剤の作用点の推定方法であって、下記の工程：
(1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
(2) 上記微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
(3)工程(2)で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報（特に、分子量あるいは分子量パターン等）に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程
を含む方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のスクリーニング方法は、細胞壁作用性薬剤の中から特定の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために好適に用いることができる。一般的には、細胞壁作用性薬剤、好ましくは細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤を多数の化合物を含むライブラリーなどから１次スクリーニングにより選抜した後、その薬剤の作用点を確認するため、あるいは特定の作用点を有する薬剤をさらにスクリーニングするなどの目的で用いることができる。もっとも、本発明の方法の使用態様は上記のものに限定されることはなく、薬剤が細胞壁作用性であることがすでに分かっている場合、あるいは予測可能な場合には、上記の１次スクリーニングを省略して、その薬剤の作用点を確認する目的で被験薬剤に本発明の方法を直接適用してもよい。本発明の範囲にこのような態様が包含されることは言うまでもない。
【００１７】
本明細書において「細胞壁作用性」という用語は、例えば、以下の酵素の一種又は二種以上に作用して、その酵素の働きを干渉することを意味している。
(a)微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素；
(b)微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素の働きを補助する酵素；
(c)微生物の細胞壁を構成する成分（糖ポリマー）の合成酵素の働きを抑制する酵素；
(d)上記(b)と(c)に属する酵素が上記(a)の合成酵素の働きを補助又は抑制するために必要な過程やこれに関わる酵素；
(e)異なる糖ポリマー同士の架橋に働く過程やこれに関わる酵素；
(f)糖ポリマーに限らず、細胞壁を構成する成分（例えば、細胞壁に存在するGPI蛋白質）の細胞壁へのアンカリング過程や、この過程に関わる酵素；
(g)糖ポリマーが細胞壁内で正常に構築される過程やこれに関わる酵素；
(h)細胞壁の合成を調節する過程や経路、およびこれに関わる酵素；
(i)微生物細胞の分裂過程に働く過程やこれに関わる酵素；
(j)微生物細胞の形態を変化させる過程やこれに関わる酵素；
(k)構築された微生物細胞の細胞壁を消化する過程やこれに関わる酵素；
(l)微生物が外界の環境変化に対応して、その細胞壁組成を大きく変化させる過程やこれに関わる酵素；及び
(m)その他、上記の例にのみ限定されることはなく、微生物細胞壁の構築や合成、細胞壁の構造を変化させる過程やそれに関わる酵素。
【００１８】
また、本明細書において「細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する」とは、細胞壁の合成や分解などを含めて、上記の(a)から(m)に記載の事象に関して特異的な阻害作用を有することを意味している。本明細書において、「薬剤」とは、低分子化合物又は高分子化合物のほか、天然物、蛋白質又はその一部、あるいはポリペプチド、そしてオリゴヌクレオチドなどの核酸などを含めて、生物学的な作用を有する物質を全て包含する概念として用いる。いかなる意味においても「薬剤」の語を限定的に解釈してはならなず、最も広義に解釈しなければならない。
【００１９】
本発明の方法を行うに先立って、細胞壁作用性の薬剤を化合物ライブラリーからスクリーニングすることが好ましい（本明細書において上記目的で行われるスクリーニングを「１次スクリーニング」と呼ぶ場合がある）。この方法は、通常、PCT/JP01/3630号明細書に記載された方法に従って行うことができる。より具体的には、細胞壁作用性薬剤は、下記の工程：
(A1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養する工程；
(A2)上記各微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する工程；及び
(A3)レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しない場合に、該被検薬剤が細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると判定する工程；
を含むスクリーニング方法にて選抜可能である。
【００２０】
上記の１次スクリーニングでは、レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物、及びレポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞膜に固定した微生物のそれぞれを被検薬剤の存在下で培養した後、培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物を測定する。培地や温度、培養時間などの条件は微生物の種類に応じて適宜選択すればよい。微生物として酵母を用いる場合の培養の具体的方法については、PCT/JP01/3630号明細書に具体的に説明されている。なお、本明細書において用いられる「GPIアンカー蛋白質」という用語は、特定の蛋白質を意味するものではなく、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００２１】
レポーター蛋白質はその性質が明らかになっている蛋白質であれば限定されず、蛍光測定などの分光学的手段、高速液体クロマトグラフィー、マススペクトル、又は酵素反応などの生化学的手段などの通常の手段によって検出可能な蛋白質であればその種類は特に限定されないが、例えば、蛍光性蛋白質などを好適に用いることができる。例えば、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)又はその変異体(EGFP: Dormack, B.P., et al., Gene, 173, pp.33-38など)を用いることが好ましい。本明細書において「グリーン・フルオレッセント・プロテイン」という用語はGFP及びその変異体を含めた概念として用いる。微生物としてはGPIアンカー蛋白質を有する真核細胞微生物であればその種類は特に限定されないが、例えばパン酵母(S. cerevisiae)などの酵母を用いることが好ましい。
【００２２】
酵母においては、細胞膜に固定化されたGPIアンカー蛋白質の一部が(1,6)-β-グルカンをアンカーとして細胞壁に固定化されることが知られている(Lu, C．F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pp.4825-4833, 1994; Kollar, R., et al., J. Biol. Chem., 272, pp.17762-17775, 1997)。また、融合蛋白質の製造によって酵素を微生物の細胞壁に固定化する方法が知られている（クリスら、特表平7-508652号公報）。こうした知見を利用して、外来の蛋白質を酵母の細胞壁に固定化する方法が開発されている(Varrt, J.M.V.D., et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pp.615-620, 1997; Murai, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pp.1362-1366, 1997)。GPIアンカー蛋白質はGPIアンカー型蛋白質ともよばれ、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型蛋白質、ホスファチジルイノシトールアンカー型蛋白質、PIアンカー型蛋白質などとも呼ばれる場合がある。
【００２３】
従って、微生物として酵母を用いることが好ましいが、酵母を用いる場合には、上記の刊行物に記載された方法に従って、レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁又は細胞膜に固定した酵母を作出することができる。PCT/JP01/3630号明細書の実施例にはその具体的方法が示されており、当業者は上記刊行物に記載された方法に従って、所望の微生物を生産することが可能である。
【００２４】
本明細書のスクリーニング法において、レポーター蛋白質由来物とは、薬剤の作用により細胞壁から遊離し、かつレポーター蛋白質の全部又はその主要な部分を含む単一の蛋白質又は複数の蛋白質の集合体である（本明細書において、レポーター蛋白質由来物の用語は、特に言及しない場合には単一物質又は複数の物質の混合物のいずれの意味でも用いる）。後述するように、レポーター蛋白質が細胞壁に固定されている場合には、細胞壁作用性薬剤の作用点の違いに応じて、各々特有の糖鎖を有するレポーター蛋白質由来物が生成する。
【００２５】
上記の１次スクリーニングの培養工程において（この１次スクリーニングの場合、レポーター蛋白質由来物には、細胞壁から遊離するものだけでなく、細胞膜から遊離するところの、細胞壁のレポーター蛋白質由来物に対応した蛋白（類）も含まれる）、培養液中にレポーター蛋白質由来物の流出が認められる場合には、その微生物の細胞壁又は細胞膜が被検薬剤の作用により損傷を受けたと解釈でき、レポーター蛋白質由来物が流出するものと考えられる（Lu, C．F., et al.， Mol. Cell Biol., 14, pp.4825-4833, 1994; Lu, C.F., et al., J. Cell. Biol., 128, pp.333-340, 1995）。例えば、真菌に対して選択毒性を有する薬剤として細胞壁を選択的に損傷させる薬剤をスクリーニングする場合には、レポーター蛋白質を細胞壁に固定した微生物から培養液中にレポーター蛋白質由来物が流出し、かつレポーター蛋白質を細胞膜に固定した微生物からは培養液中にレポーター蛋白質由来物が実質的に流出しないことを判定基準として、その条件を満足する薬剤を選択すればよい。この判定基準により陽性と判断される薬剤は、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤であると推定できる。
【００２６】
１次スクリーニングにおいて、レポーター蛋白質由来物の測定は、レポーター蛋白質の種類や性質に応じて適宜の方法を選択すればよい。例えば、レポーター蛋白質としてグリーン・フルオレッセント・プロテインを用いる場合には、培養液の蛍光スペクトルを測定することによりレポーター蛋白質由来物の流出を検出することが可能である。
【００２７】
本発明の方法は、好ましくは上記の１次スクリーニングにより選抜された細胞壁作用性薬剤から特定の作用点を有する薬剤をスクリーニングするために用いられ、下記の工程：
(1)レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定した微生物を細胞壁作用性の被検薬剤の存在下で培養する工程；
(2) 上記微生物の培養液中に流出したレポーター蛋白質由来物の糖鎖を分析する工程；及び
(3)工程(2)で得られたレポータータンパク質由来物の糖鎖の情報に基づいて該被検薬剤の細胞壁に対する作用点を推定する工程；
を含むことを特徴としている。
【００２８】
本発明の方法において用いられる微生物は、上記の１次スクリーニングについての説明で言及した微生物のうち、GPIアンカー蛋白質としてレポーター蛋白質が細胞壁に固定した微生物であり、好ましい態様では、レポーター蛋白質を細胞壁の(1,6)-β-グルカンに固定した微生物などを用いることができる。また、１次スクリーニングの説明で言及したとおり、微生物としては酵母を用いることが好ましい。本発明の方法において用いられる微生物において、レポーター蛋白質としては蛍光蛋白質を用いることが好ましく、グリーン・フルオレッセント・プロテインを用いることが特に好ましい。
【００２９】
本発明の方法では、細胞壁作用性薬剤の作用点の違いによってレポーター蛋白質由来物に結合する糖鎖が変化することを利用し、その糖鎖を分析することにより、好ましくはレポーター蛋白質由来物の分子量（特に、分子量変化や分子量パターン）を測定することにより、被験薬剤の作用点を推定することを特徴としている。
【００３０】
GPIアンカー蛋白質として細胞壁に固定されたレポーター蛋白質には、通常、アンカリングに関与する(1,6)-β-グルカン及び／又は(1,3)-β-グルカンのほか、N-グリコシル鎖及び0-グリコシル鎖などの複数の種類の糖鎖が結合している。細胞壁作用性薬剤、例えば、(1,6)-β-グルカンの合成阻害薬、(1,3)-β-グルカンの合成阻害薬、マンナンの合成阻害薬（N型糖鎖またはO型糖鎖）、ヘテロ糖鎖のクロスリンクの阻害剤、糖鎖合成の調節を阻害する薬剤、及びGPIアンカーの合成阻害剤などは、上記微生物に作用してそれぞれレポーター蛋白質由来物を流出させる能力を有するが、これらの薬剤は上記の各糖鎖に対して異なる作用点で作用することから、レポーター蛋白質に結合した上記糖鎖はこれらの薬剤の作用点に応じて特徴的に変化する。この結果、薬剤の作用により遊離したレポーター蛋白質由来物は、これらの薬剤の作用点に応じた異なる糖鎖断片を有する（あるいは特定の糖鎖を欠落する）ことになる。
【００３１】
本発明の方法において、レポーター蛋白質由来物の糖鎖の分析方法は特に限定されない。本明細書において用いられる「糖鎖の分析」という用語は、糖鎖部分の分子量の測定や構造決定のほか、レポーター蛋白質由来物全体についての分子量測定などを含めて、最も広義に解釈する必要がある。糖鎖の違いを証明できる手段であればいかなる方法を採用してもよい。最も簡便には、ポリアクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動によりレポーター蛋白質由来物全体の分子量を測定することによって糖鎖を分析することができ、ウエスタンブロッティングなど当業者に周知かつ汎用の手法により、糖鎖の違いを反映したレポーター蛋白質由来物の分子量分布を可視的に確認することが可能である。本明細書において用いられる「分子量の測定」という用語は、分子量の比較を行うのに十分な情報を与えるものであればよく、その用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００３２】
本発明の方法は、細胞壁作用性薬剤の中から、例えば、(1,6)-β-グルカンの生合成阻害作用を有する薬剤、又は(1,6)-β-グルカンの生合成に関与する１又は２以上の酵素に対して阻害作用を有する薬剤をスクリーニングするために特に好適に利用できる。さらに本発明の方法は(1,3)-β-グルカン阻害薬やその他の作用によって細胞壁の合成や構築が阻害される薬剤（これは作用点が未知であってもよい）をスクリーニングすることも可能である。そして、細胞壁作用性薬剤の具体例としては、例えば、抗真菌剤などを挙げることができるが、本発明の方法によりスクリーニング可能な薬剤は抗真菌剤に限定されることはない。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１（参考例）
(1)材料および方法
(A)使用菌株および形質転換
Escherichia coli JM109, TOP10F'およびDH5α株, S. cerevisiae YPH500株(MATαade2, his3, leu2, lys2, trp1, ura3), IFO 0565株, IFO 1226株およびKRE6破壊株を用いた。形質転換法は公知の方法またはyeast transformation kit(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)を用いて指示書にしたがって実施した。
(B)使用薬剤
下記に示す薬剤を使用した。
【００３４】
【表１】
0004204471.tif 000002
【００３５】
(C)オリゴヌクレオチド
以下に示すオリゴヌクレオチドを実験に供試した。M13 universal primerおよびM13 reverse primerはファルマシア社より購入し、それ以外は合成したものを用いた。これらは、レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として微生物の細胞壁又は細胞膜に固定するために用いる遺伝子として利用できる。
GFP-SM2(5'-GGCATGGATGAGATCTACAAATAATG-3')
GFP-SM3(5'-CATGATTACGCCGAGCTCGCATGCCTG-3')
GFP-SM4(5'-CAACACTTGTCACTACGTTAACTTATGGTGTTCAATG-3')
YEX-SM2(5'-CCTGTGATTTCTCCAGCTCGAATTC-3')
YEX-SM3(5'-GATTCATTAATGCATGCTGGCACGACAGG-3')
YEX-SM4(5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGAC-3')
YEX-SM5(5'-CTCACGGTATCGCCCTCGAGATCTCTGAATCC-3')
YEX-SM6(5'-GAGACCCTCTTCTGAGCTCTCTGAATCC-3')
YEX-SM7(5'-AAACCAAAAGATCGACTAGTATAAAATGAATATA-3')
YEX-SM8(5'-CATTAATGCATGCTGGCACGAC-3')
YEX-SM9(5'-CTTTAACGAGTCCGCGGATTTCTCCAGCTCG-3')
SUC2-sen1(5'-GCACTAGTATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTC-3')
SUC2-anti2(5'-GCGAGCTCTTTGATGCAGATATTTTGGCTGCAA-3')
GAS1-sen1(5'-GCAGATCTGTAGTGTTGATTTGGGTTCCGG-3')
GAS1-anti3(5'-GCCCGCGGCTTATCGAGTTATTATGTATGTGTCGAAGC-3')
CWP2-sen1(5'-GCAGATCTACTTTGTTGCCGCTGAATCCG-3')
CWP2-anti1(5'-GCGAATTCGAGAAATCACAGGACTCGTTAAAG-3')
MEL1-sen1(5'-GCGAATTCGAGAGCAACGGTAATAAAAGCAACGACG-3')
MEL1-sen3(5'-CGGAGCTCGGTGTCTCCGAGTTACAATGGC-3')
MEL1-anti1(5'-GCAGATCTAGAAGGCGATACCGTGAGCTGGAAC-3')
MEL1-anti2(5'-CGGAGCTCCATCAATACTTCTCGCCCTGCT-3')
MEL1-anti3(5'-GCAGATCTAAGAAGAGGGTCTCAACCTATAGAAG-3')
M13 universal primerおよびM13 reverse primer
【００３６】
(D)プラスミド
pUC19, YEp13, YEp24 (以上、Pouwels, P.H. et al., Cloning vectors, Elsevier science publishers B.V., 1985), pYPR2831 (Horiuchi, H. et al., Agric. Biol. Chem., 54, 1771-1779, 1990), pGFPuv (Clontech, Palo Alto, CA, USA)およびpYEX-S1 (Amrad, Victoria, Australia)を用いて、以下のプラスミドを作製して用いた。これらには、レポーター蛋白質をGPIアンカー蛋白質として微生物の細胞壁又は細胞膜に固定するために用いる遺伝子を含む組換えベクターが含まれる。PCR産物のサブクローニングにはpGEM-T vector system (Promega, Madison, WI, USA)を用い、変異の導入にはTransformer site-directed mutagenesis kit (Clontech)を用いた。アガロースからのDNA断片の回収、脱リン酸化、平滑化、ライゲーションおよび制限酵素消化は常法に従って行った。主なプラスミドの構造を第１図に示した。図中、oriB: 大腸菌の複製起点、ori Y: パン酵母の複製起点、Ampr: アンピシリン耐性遺伝子、dLEU2: LEU2の部分欠損マーカー、Pro: フォスフォグリセレートキナーゼ・プロモーター、SS: 分泌シグナル、Ter: フォスフォグリセレートキナーゼ・ターミネーターを示す。
【００３７】
pUXS1: YEp24のHindIII消化断片をpUC19のHindIII siteに挿入した。
pUXS2: YEp13のXhoI, SalI消化断片をpUC19のSalI siteに挿入した。
pUAC1: CWP2 (Varrt, J.M. et al., J. Bacteriol., 177, 3104-3110, 1995)の一部をPCRで増幅(鋳型;YPH500株染色体DNA,プライマー;CWP2-sen1およびCWP2-anti1)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUACla: pUAClをEcoRI, PstI消化後、self-ligationさせた。
pUAC3:MEL1 (Liljestrom, P.L., Nucl. Acids Res., 13, pp.7257-7268, 1985)の一部をPCRで増幅(鋳型;IFO 0565株染色体DNA,プライマー; MEL1-sen1およびMEL1-anti1)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAC5a: pUAC3のScaI, BglII消化断片をpUAC1aのScaI, BglII siteに挿入した。
pUAC8: MEL1の一部をPCRで増幅(鋳型; IFO 1226株染色体DNA, プライマー; MEL1-sen3およびMEL1-anti1)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAC12: SUC2 (Taussig, R. et al., Nucl. Acids Res., 11, pp.1943-1954, 1983)の一部をPCRで増幅(鋳型; YHP500株染色体DNA, プライマー; SUC2-sen1およびSUC2-anti2)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAC13: MEL1の一部をPCRで増幅(鋳型;IFO 0565株染色体DNA,プライマー;MEL1-sen3およびMEL1-anti3)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
【００３８】
pUAC14: pGFPuvに変異を導入した(プライマー; GFP-SM2, GFP-SM3)。
pUAC15: pEAC8aをStuI消化後、self-ligationさせた。
pUAC15a: pUAC15に変異を導入した(プライマー; YEX-SM4, YEX-SM7)。
pUAC16: pUAC12のNaeI, SpeI消化断片をpUAC15aのSpeI, StuI siteに挿入した。
pUAC19: pUXS1のEcoRV, PvuII消化断片をpEAC12のEcoRV siteに挿入した。
PUAC19a: pUAC19に変異を導入した(プライマー; GFP-SM4, YEX-SM8, YEX-SM9)。
pUAC20: pUXS2のEcoRV, PvuII消化断片をpEAC12のEcoRV siteに挿入した。
pUAC20a: pUAC20に変異を導入した(プライマー; GFP-SM4, YEX-SM8, YEX-SM9)。
pUAC21: pYPR2831のPstI消化断片を平滑化し、pEAC12のEcoRV siteに挿入した。
pUAC21a: pUAC19aのSacI, BglII消化断片をpUAC21のSacI, BglII siteに挿入した。
pUAC28: GAS1 (Vai, M., et al., J. Biol. Chem., 266, 12242-12248, 1990)の一部をPCRで増幅(鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; GAS1-sen1およびGAS1-anti3)させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
【００３９】
pUAC29b: pUAC28のBglII, SacII消化断片をpUAC20aのBglII, SacII siteに挿入した。
pUAC30b: pUAC29bのBglII, BamHI消化断片をpUAC19aのBglII siteに挿入した。
pUAC31b: pUAC29bのBglII, BamHI 消化断片をpUAC21aのBglII siteに挿入した。
pEAC3: pUAC5aのEcoRI, SalI消化断片をpYPR2831のEcoRI, SalI siteに挿入した。
pEAC6: pEAC3の一部をPCRで増幅(鋳型; pEAC3, プライマー; MEL1-sen3およびMEL1-anti2)させ、pGEM-TにサブクローニングしたプラスミドのSacI消化断片をpYEX-S1のSacI siteに挿入した。
pEAC6a: pEAC6に変異を導入した(プライマー; YEX-SM2, YEX-SM3)。
pEAC7: pUAC8のSacI, BglII消化断片をpEAC6aのSacI, BglII siteに挿入した。
pEAC7a: pEAC7に変異を導入した(プライマー; YEX-SM4, YEX-SM5)。
pEAC8: pUAC13のSacI, BglII消化断片をpEAC6aのSacI, BglII siteに挿入した。
pEAC8a: pEAC8に変異を導入した(プライマー;YEX-SM6)。
pEAC9: pUAC14のSacI, BglII消化断片をpEAC6aのSacI, BglII siteに挿入した。
pEAC11: pEAC7aのSacI, NdeI消化断片をpUAC16のSacI, NdeI siteに挿入した。
pEAC12: pEAC9のSacI, BglII消化断片をpEAC11のSacI, BglII siteに挿入した。
【００４０】
第１図において、pEAC6a: Reporter=α-ガラクトシダーゼ、pEAC8a: Reporter=GFPuv、pUAC19: Reporter=EGFP, Marker=URA3, AS=CWP2アンカリングシグナル、pUAC19a: Reporter=EGFP, Marker=URA3, AS=CWP2アンカリングシグナル、pUAC20a: Reporter=EGFP, Marker=LEU2, AS=CWP2アンカリングシグナル、pUAC21a: Reporter=EGFP, Marker=TRP1, AS=CWP2アンカリングシグナル、pUAC29b: Reporter=EGFP, Marker=LEU2, AS=GAS1アンカリングシグナル、pUAC30b: Reporter=EGFP, Marker=URA3, AS=GAS1アンカリングシグナル、pUAC31b: Reporter=EGFPuv, Marker= TRP1, AS=GAS1アンカリングシグナルである。
【００４１】
(E)アーミングイーストの作出
レポーター蛋白質としてS. cerevisiae由来のα-ガラクトシダーゼ (Turakainen, H., et al., Appl. Environ. Microbiol., 59, 2622-2630, 1993; MEL1)またはグリーン・フルオレセント・プロテイン (green fluorescent protein: GFP)を選択した。GFPはGFPuvおよびEGFPuv (Cormack, B.P., et al., Gene, 173, 33-38, 1996; GFPuvにPhe64→LeuおよびSer65→Thrになるように変異を導入したもの)を用いた。次いで、これらの蛋白質のN末端側にSUC2の分泌シグナル、C末端側にCWP2のGPIアンカリングシグナルをそれぞれ付加した融合蛋白質をコードする遺伝子を設計してホスホグリセレートキナーゼのプロモーターとターミネターの間に挿入し、発現カセットとした。この発現カセットをYEp型ベクターに挿入したプラスミド(pEAC6a, pEAC8aおよびpEAC9)をそれぞれ形質転換(AYE1, AYE2およびAYE3株)、またはYIp型ベクターに挿入したプラスミド(pUAC19a, pUAC20aおよびpUAC21a)を線状化した後に、菌株の染色体DNAに組み込んで壁型アーミングイースト(AY-2, AY-5, AY-16, AY-14, AY-17株)を作出した。膜型アーミングイースト(AY-12, AY-15株)はGPIアンカリングシグナルをGAS1由来のものに置き換えて(pUAC29b, pUAC30bおよびpUAC31b)作出した。作出した菌株を表２に示した。
【００４２】
【表２】
0004204471.tif 000003
【００４３】
(F)培地
YPAUD (1% イーストエクストラクト, 2% ペプトン, 2% グルコース, 40μg/mlアデニン, 20μg/mlウラシル), RPMIB [RPMI1640 (Sigma), 1 Mソルビトール, 100 mMリン酸カリウムバッファー (pH 4.0〜7.0), 2% グルコース, 40μg/mlアデニン, 20μg/mlウラシル], YNB [0.67% yeast nitrogen base without amino acid, (Difco), 2% グルコース, 添加栄養素 (40μg/mlアデニン, 20μg/mlヒスチジン, 60μg/mlロイシン, 30μg/mlリジン, 40μg/mlトリプトファン, 20μg/mlウラシル)]を適宜用いた。また、寒天培地は上記の液体培地に1.5〜2% アガロースを添加した。
【００４４】
(G)α-ガラクトシダーゼ活性の測定
Schreuderら (Schreuder, M.P., et al., Yeast, 9, 399-409, 1993)の方法を用いた。すなわち、YNBで培養した対数増殖後期の培養液160μ1に1 M酢酸バッファー(pH 4.5)および0.1 M p-ニトロフェニル-α-ガラクトピラノシド (Boehringer manheim)を各20μ1加え、37℃で 5分間反応させた。反応液に1 mlの2% 炭酸ナトリウムを加えた後に、吸光度(OD410)を測定した。
【００４５】
(H)GFP発現株の蛍光強度測定
RPMIB(pH 7.0)で培養した対数増殖期の菌を集め、水にOD595=1.0になるように浮遊させて測定した。蛍光強度および至適波長の測定は蛍光光度計 (F-2000, 日立工機)を用いて行った。また、個々の細胞の蛍光の検出には蛍光顕微鏡 (Axioplan, Zeiss)を用いた。
【００４６】
(I)Zymolyase作用によるGFP流出効果の測定
液体培地で培養した対数増殖期の酵母を集め、適当なバッファーに浮遊させた。これにZymolyase 100T (生化学工業)を添加(400〜6.25μg/ml)し、30℃で30分間振盪した。反応後、フィルターでろ過して酵母とバッファーを分離し、バッファー中の蛍光強度を蛍光光度計で測定した(excitation = 487 nm, emission = 513 nm)。
【００４７】
(J)GFPの局在比較
液体培地で培養した対数増殖期の菌(AY-2株)をガラスビーズを用いて物理的に粉砕したのち、細胞壁、細胞膜および可溶性蛋白質を分画し、適当なバッファーに懸濁した。それぞれの画分の蛍光強度を測定し(excitation = 487 nm, emission = 513 nm)、各画分の蛍光強度を菌全体の総蛍光強度に対する比率で表した。
【００４８】
(K)KRE6破壊株のGFP流出効果の測定
KRE6破壊株(AY-16株)を30℃で振盪培養し、3および6時間後にフィルターで培養液をろ過して培地中の蛍光強度を測定した。
【００４９】
(L)既存抗真菌試薬によるGFP流出効果の測定
培養した対数増殖期の菌(AY-2株およびAY-12株)を集め、各種の薬剤を作用させた。培養上清の蛍光強度はCytofluor2300蛍光測定装置 (Millipore)を用いて測定した(excitation = 480 nm, emission = 530 nm)。各種薬剤作用時の蛍光強度は薬剤無添加対照の蛍光強度との差で示した。
【００５０】
(2)結果
(A)各種壁型アーミングイーストの性状解析
レポーター蛋白質としてα-galactocidase、GFPuv、及びEGFPuvの3種類を、発現方法として高コピーベクターを用いる方法と染色体へ挿入する方法を用いて種々の壁型アーミングイーストを作出し、これらの菌株のα-ガラクトシダーゼ活性および蛍光強度を比較した。その結果、α-ガラクトシダーゼ発現株(AYE-1株およびAYE-2株)には、いずれも微弱な活性が認められるのみであった。また、GFPuvを高コピーベクターを用いて発現させた菌株(AYE-3株)を蛍光顕微鏡で観察した結果、個々の細胞間での蛍光強度に大きなバラツキが認められたことから、プラスミドの安定性に問題があると考えられた。一方、EGFPuvおよびGFPuv発現カセットを染色体へ挿入した菌株(AY-5株およびAY-17株)の蛍光強度を比較した結果(表３)、EGFPuvの蛍光強度はGFPuvのそれより3倍以上強かった。以上の結果から、レポーター蛋白質として蛍光蛋白質を用いることが適当であり、EGFPuvをレポーター蛋白質として染色体に組込んだ株が特に好適であると結論できた。本菌株の至適波長を測定した結果、excitation max = 487 nm, emission max = 513 nmであった。
【００５１】
【表３】
0004204471.tif 000004
対数増殖期の菌株を水に懸濁し、蛍光強度を測定した。
【００５２】
(B)Zymolyase作用によるGFP流出効果の測定
AY-2株を試験管内で増殖させ、菌体を集めてZymolyaseを作用させた。作用後の培養上清中の蛍光強度を測定した。浸透圧保護下でAY-2株にZymolyaseを作用させた結果、添加したZymolyaseの濃度に依存してバッファー中の蛍光強度が上昇した(表４)。この結果から、大量のGFPが細胞壁に固定化されていることが示唆された。
【００５３】
【表４】
0004204471.tif 000005
【００５４】
(C)KRE6破壊株のGFP流出効果の測定
Saccharomyces cerevisiae(パン酵母)における(1,6)-β-グルカンの生合成には少なくとも６種類の酵素が関与していることが推定されている。これらの酵素のうち、ゴルジ体に存在するKRE6-遺伝子がコードする産物（蛋白質）およびそのホモログであるSKN1遺伝子がコードする産物（蛋白質）の少なくとも1つは生育に必須であることが明らかとなっている(Gaughran, J.P. et al., J. Bacteriol., 176, pp.5857-5860, 1994)。また、KRE6ホモログはCandida albicans(代表的な病原性真菌)などの真菌にも広く存在すると推定されている。以上の知見から、Kre6p（KRE6遺伝子の産物）は新規な抗真菌剤を開発するために好ましい標的であると推測される。
【００５５】
KRE6の破壊によるGFP流出効果を確認する目的で、AY-5株およびAY-16(KRE6破壊)株を試験管内で培養し、経時的にGFPの流出を測定した(第２図)。その結果、両株の培養液(菌＋培地)にはいずれの培養時間においても同等の蛍光強度が検出されたのに対し、培養上清の比較では、AY-16株の方がAY-5株よりも明らかに高かった。さらに、これら２株の酵母を試験管内で培養し、対数増殖期にある菌を蛍光顕微鏡下(×400)で観察したところ、AY-16株では蛍光強度が減弱していた。これらの結果は、KRE6の破壊がGFPの流出を促進することを示しており、作出した微生物（アーミングイースト）を用いてKRE6-遺伝子の産物を阻害する薬剤をスクリーニングし得る実験成績であった。
【００５６】
(D)GFPの局在性の比較
AY-2株(壁型アーミングイースト)およびAY-12株(膜型アーミングイースト)におけるGFPの局在を比較した。各々の菌を試験管内で増殖させ、菌体を集めて細胞壁、細胞膜および可溶性蛋白質に分画した。得られた画分の蛍光強度を測定し、総蛍光強度に対する比率を算出した(単位:%)。結果を表５に示す。壁型アーミングイーストでは細胞壁に、膜型アーミングイーストでは細胞膜にそれぞれ大量のGFPが固定化されていることが明らかとなった。
【００５７】
【表５】
0004204471.tif 000006
【００５８】
(E)既存抗真菌試薬によるGFP流出効果の測定
上記方法がKre6p以外の作用点を有する薬剤のスクリーニングに利用できるか否かを確認する目的で、既存抗真菌試薬作用時のAY-2株(壁型アーミングイースト)およびAY-12株(膜型アーミングイースト)におけるGFP流出効果を比較した。まず、試験管内で培養したAY-2株およびAY-12株を浸透圧を保護した培地(RPMIB)に浮遊させ、薬剤を作用させた。培養後、上清の蛍光強度を測定し、薬剤無添加対照との差を算出した。その結果を第３図に示す。
【００５９】
細胞壁を作用点とするアクレアシンA (Aculeacin A: (1,3)-β-グルカン合成阻害剤)、ツニカマイシン（Tunicamycin: マンナン合成阻害剤）ではAY-2株において顕著なGFP流出効果が認められたが、AY-12株においては流出効果はほとんど認められなかった。細胞膜を作用点とするアムホテリシンB (Amphotericin B)、フルコナゾール (Fluconazole)、およびサリノマイシン(Salinomycin)はどちらの菌株においても若干の流出効果が認められた。上記以外の試薬では、壁型アーミングイースト(AY-2株)に対してのみ明瞭なGFP流出効果を示すものは認められなかった。以上の結果から、上記スクリーニング方法によって、種々の種類の細胞壁作用性薬剤をスクリーニングできることが明らかとなった。
【００６０】
以下の配列表に微生物AY-15株及びAY-14株に保持させた遺伝子を示す。
配列番号１は膜型アーミングイーストであるAY-15株がゲノム組み込み型として保持する遺伝子であり、SS（分泌シグナル）-EGFPuv-膜アンカリングシグナル（ＡＳ）の塩基配列に相当しており、市販のGFPuvに変異を加えてある（312番目をgに、315番目をa、316番目をaに置換した。オリジナルのGFPuvではそれぞれt、c，tである。）。
【００６１】
配列番号２は壁型アーミングイーストであるAY-14株がゲノム組み込み型として保持する遺伝子であり、SS（分泌シグナル）-EGFPuv- 壁アンカリングシグナル（ＡＳ）の塩基配列に相当しており、市販のGFPuvに変異を加えてある（312番目をgに、315番目をa、316番目をaに置換した。オリジナルのGFPuvではそれぞれt、c，tである。）。
【００６２】
例２（本発明）
(1)試験材料および方法
(A)菌株、細胞、形質転換法、及び培地
Escherichia coli JM109およびDH5(株, Saccharomyces cerevisiae YPH499株および YPH500株を用いた。形質転換法としては上記例１に記載された方法、またはyeast transformation kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて指示書に従って実施した。今回用いた菌株を表６に示す。培地は例１に記載した培地を適宜使用した。
【００６３】
【表６】
0004204471.tif 000007
【００６４】
(B)オリゴヌクレオチド
以下に示す24個のオリゴヌクレオチドを合成し、適宜実験に供試した。
KRE6-Sen3(5'-CGCGGCCGTAACAAAACGAACAACATGAGACAAAACCCG-3')
KRE6-Ant3(5'-CGAGGCCTTTAGTTCCCTTTATGACCCGATTTGAAC-3')
SKN1-Sen1(5'-CGAAGCTTCTTCGTATTTTCAGTCGCTC-3')
SKN1-Ant1(5'-CGATGGCTGCTTCCGTACCCAAATCT-3')
GAS1-Sen1(5'-GCGCATGCCGCAAACGTGGAGATGGGAA-3')
GAS1-Ant1(5'-GCCCGCGGCTTATCGAGTTATTATGTATGTGTCGAAGC-3')
GPI1-Sen1(5'-GCGCATGCTTCCTTATGTTAGCTTGTCACC-3')
GPI1-Ant1(5'-GCGCATGCCTTTACACTCAATGGCTTACATGGCA-3')
KEX2-Sen1(5'-GCGCATGCGACGTGTTCTTTCTCTCGTTTC-3')
KEX2-Ant1(5'-GCGCATGCATTTTATTCGCGGGTGCAAACAAT-3')
BCK1-Sen1(5'-GCGCATGCAGCACATACACATTCTAGGTCTGATTCG-3')
BCK1-Ant1(5'-GCGCATGCGGAATTGGTGGTGCCGATTTTGACTTTCC-3')
PMT1-Sen1(5'-GCGCATGCTCATTCTACGCTTGTCATCCAC-3')
PMT1-Ant1(5'-GCGCATGCGCGAAATGATAATACCACTGAAACTACTTG-3')
PMT2-Sen1(5'-GCCAGCTGGTTCTTTCCATATTCACCACGTTTGTCG-3')
PMT2-Ant1(5'-GCCAGCTGAGTACCAGAAGCAACCAATTACAAGTGCCA-3')
PMT4-Sen1(5'-GCGCATGCGTTGAAGTACACGAAGGCCGCGC-3')
PMT4-Ant1(5'-GCGCATGCAAGGCGTTCAGTTCGTTTGTGGTTAGTG-3')
KRE2-Sen1(5'-GCGGATCCACCAGCAACAAACCAATACAGACCA-3')
KRE2-Ant1(5'-GCGGATCCGTTTCATTTGTTTTATCTCGGCTCG-3')
MNN9-Sen1(5'-GCGGATCCAAAAAATCATCATCACATCACAGAACCG-3')
MNN9-Ant1(5'-GCGGATCCAAGCGCATTGACTGGAGAAGGT-3')
FKS1-Sen1(5'-GCGGATCCATGAAACTCTAATCCTACTATCGGCG-3')
FKS1-Ant1(5'-GCGGATCCTGCTCCTCATACCTTAAACCGG-3')
【００６５】
(C)プラスミド
上記例１に記載したpAUC19a, pUAC29b, pUAC20a, pUAC30b, pUAC21a, pUAC31b(以上、第８図), pUC19およびYEp24を用いて以下のプラスミドを作成した。PCR産物のサブクローニングにはpGEM-T vector system (Promega, Madison, WI, USA)を用い、アガロースからのDNA断片の回収、ligationおよび制限酵素消化は例１の方法により行った。
【００６６】
pUXS1: YEp24のHindIII消化断片（Ura3）をpUC19のHindIII siteに挿入した。
pUAO1: KRE6をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; KRE6-sen3およびKRE6-ant3）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB1: SKN1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA,プライマー; SKN1-sen1およびSKN1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB3: GAS1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー;GAS1-sen1およびGAS1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB4: GPI1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー;GPI1-sen1およびGPI1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB5: KEX2をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA,プライマー; KEX2-sen1およびKEX2-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB6: YEp24のClaI, SmaI消化断片をpUAB3のClaI, MscI siteに挿入した。
pUAB7: YEp24のClaI, SmaI消化断片をpUAB4のClaI, HpaI siteに挿入した。
pUAB8: YEp24のClaI, NheI消化断片をpUAB5のClaI, XbaI siteに挿入した。
pUAB9: YEp24のBamHI, EcoRI消化断片をpUAO1のBglII, EcoRI siteに挿入した。
pUAB10: pUXS1のKpnI, PvuII消化断片をpUAB1のClaI, XbaI siteに挿入した。
pUAB11: BCK1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; BCK1-sen1およびBCK1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
【００６７】
pUAB12: PMT1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; PMT1-sen1およびPMT1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB13: PMT2をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; PMT2-sen1およびPMT2-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB14: PMT4をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; PMT4-sen1およびPMT4-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB15: KRE2をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; KRE2-sen1およびKRE2-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB16: FKS1をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; FKS1-sen1およびFKS1-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB17: MNN9をPCRで増幅（鋳型; YPH500株染色体DNA, プライマー; MNN9-sen1およびMNN9-ant1）させ、pGEM-Tにサブクローニングした。
pUAB18: YEp24のEcoRI, NheI消化断片をpUAB11のEcoRI, NheI siteに挿入した。
pUAB19: YEp24のEcoRI, SmaI消化断片をpUAB12のEcoRI, EcoRV siteに挿入した。
pUAB20: YEp24のEcoRI, SalI消化断片をpUAB13のXhoI, MunI siteに挿入した。
pUAB21: YEp24のClaI, SmaI消化断片をpUAB14のClaI, HpaI siteに挿入した。
pUAB22: YEp24のEcoRI, SmaI消化断片をpUAB15のEcoRI, EcoRV siteに挿入した。
pUAB23: YEp24のEcoRI, SmaI消化断片をpUAB16のEcoRI, EcoRV siteに挿入した。
pUAB24: YEp24のEcoRI, SmaI消化断片をpUAB17のEcoRI, HpaI siteに挿入した。
【００６８】
(D)アーミングイーストおよび遺伝子破壊株の作出
遺伝子破壊操作は常法に従った。作出した遺伝子操作株を使用したプラスミドとともに上記表６に示した。AY-10k株, AY-10l株, AY-12k株およびAY-12l株は以下の方法で作出した。YPH499株にYEp24を形質転換し、生じた形質転換体をAY-10株またはAY-12株と接合させた。生じた二倍体からプラスミドを除き、それぞれAY-17株およびAY-18株とした。AY-17株およびAY-18株にpUAB7のSphI消化物またはpUAB9のEco52I消化物を形質転換し、得られた形質転換体から半数体を分離した。得られた半数体およびAY-10u株をRPMIB培地にそれぞれ接種し、30(Cで振盪培養した。得られた培養液の蛍光強度を比較し、AY-10u株と同程度の蛍光強度を有するコロニーを選択して、AY-10k株, AY-10l株, AY-12k株およびAY-12l株とした。
【００６９】
(E)遺伝子破壊株のGFP流出と流出GFP分子量の比較
液体培地に接種後、30℃で培養した対数増殖期の菌を集め、同じ新鮮培地に浮遊させて接種菌液を作製した。これを30(Cで培養した。培養上清の蛍光強度をARVO sx (Wallac, 東京)を用いて測定した(excitation=480nm, emission=530nm)。遺伝子破壊株のGFP流出効果は、非遺伝子破壊株（AY-10u株またはAY-12u株）のそれとの差で表した。蛍光測定後、培養上清は限外濾過して濃縮した。これを常法に従ってSDS-PAGEで分離したのちにPVDF膜にブロッティングし、市販の抗GFP抗体（ウサギIgG, Santa Cruz Biotechnology）を用いてGFPを検出し、分子量を比較した（ウエスタンブロッティング）。
【００７０】
(F)薬剤によるGFP分子量の変化
酵母の細胞壁合成に対して阻害作用の確認されている薬剤として、ツニカマイシンtunicamycin (TM;フナコシ,東京),アクレアシンA aculeacin A (AC;和光純薬,大阪)およびスタウロスポリンstaurosporine (SP;ベーリンガーマンハイム,東京)を使用した。菌株はAY-14株を用いた。
【００７１】
(2)結果
(A)遺伝子破壊によるGFPの流出促進
細胞壁糖鎖の合成や正常な細胞壁構築に阻害が見られた際にGFPが細胞壁から培地中に流出する（例１）。第９図に示したように、細胞壁合成に関わる遺伝子（表７参照）を破壊した場合、AY-12株(膜型アーミングイースト)を親株とした遺伝子破壊株では、いずれの株においても有意な流出は観察されなかったが、AY-10株(壁型アーミングイースト)を親株とした遺伝子破壊株では、特に△GAS1株（△はGAS1遺伝子を破壊したことを示す。以下同様である。）、△GPI1株, △KRE6株, および△PMT2株から明らかなGFP流出が観察された。これらの結果は、この方法により(1,6)-β-グルカンの生合成経路(KRE6), GPI-アンカーの生合成(GPI1), O型糖鎖の合成経路 (PMT2)およびヘテロ糖鎖の架橋反応 (GAS1)を阻害する薬剤をスクリーニングできることを示唆している。
【００７２】
【表７】
0004204471.tif 000008
【００７３】
細胞壁ポリマーの合成を阻害する薬剤を用いた実験において、SP(PKC1プロテインカイネースＣの阻害薬), AC((1,3)-β-グルカン合成阻害薬)およびTM(N型糖鎖合成阻害薬)をそれぞれ単独でAY-14株に作用させたところ、GFPの流出が認められた（AC及びTMによる流出効果は例１に示したとおりである）。(1,3)-β-グルカンの合成経路, N型糖鎖の合成経路、糖鎖（グルカン）合成の調節経路などに対する阻害薬などもスクリーニングできることが明らかである。
【００７４】
この方法により選択される薬剤の阻害経路（作用点）のうち、真菌に特異的な酵素が存在し、かつ真菌にのみ存在する経路として示唆されているのは、(1,3)-β-グルカンの合成経路、(1,6)-β-グルカンの合成経路、O型糖鎖の合成経路、およびヘテロ糖鎖同士の重合（または架橋）反応である（表７）。従って、上記のスクリーニングにより選抜される薬剤から、さらに真菌に特異的な経路または生化学反応を阻害する薬剤をその作用点ごとに選別する作業が必要である。
【００７５】
(B)遺伝子破壊株から流出するGFPの分子量の観察
第１０図には、遺伝子破壊株から流出したGFPの分子量をウエスタンブロッティングで解析した結果を示した。この結果から分かるように、遺伝子破壊株から流出したGFPの分子量は様々に変化していた。
【００７６】
(C)細胞壁合成を阻害する薬剤による流出GFP分子量の観察
第１１図には、SP(PKC1プロテインカイネースＣの阻害薬), AC((1,3)-β-グルカン合成阻害薬)およびTM(N型糖鎖合成阻害薬)をそれぞれ単独でAY-14株に作用させ、流出したGFPの分子量を比較した結果を示した。薬剤無作用時に比べ、TMの作用によってGFPは大幅に低分子化した。また、流出GFPの分子量には、ACの作用によって約10kDa以内の高分子化が認められ、SPの作用による場合には約10kDa以内の低分子化が認められた。
【００７７】
すでに述べたように、真菌に特異的な酵素の存在が示唆されているのは、(1,3)-β-グルカン合成経路、(1,6)-β-グルカン合成経路、O型糖鎖合成経路、およびヘテロ糖鎖同士の重合（または架橋）反応である。これらの合成経路または生化学反応を阻害する薬剤を作用させた場合のGFPの分子量変化は、いずれも10kDa以内の小さな変化であった。このような分子量変化を与える薬剤をスクリーニングすることにより、真菌に選択的な、とりわけ真菌細胞壁に選択的な活性を示す薬剤を選択できる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の方法によれば、細胞壁に対して選択的な阻害作用を有する薬剤の作用点を簡便かつ適確に判定することができ、細胞壁作用性薬剤の中から所望の作用点を有する薬剤を効率的にスクリーニングすることが可能である。
【配列表】
【００７９】
Sequence Listing
<110> Daiichi Sankyo Co., Ltd.
<120> Method for screening an agent acting on cell wall
<130> A41102M
<160> 2
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
actagtatgc ttttgcaagc tttccttttc cttttggctg gttttgcagc caaaatatct   60
gcatcaaaga gctcgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accggtagaa  120
aaaatgagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat  180
ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac  240
ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca  300
cttgtcacta cgttaactta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcatatgaaa  360
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct  420
ttcaaagatg acgggaacta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt  480
gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac  540
aaactcgagt acaactataa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat  600
ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgccac aacattgaag atggatccgt tcaactagca  660
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat  720
tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc  780
cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatgagat ctgtagtgtt  840
gatttgggtt ccggaactga atccagtact gcctcttcta acgcttcggg gtcttcttcc  900
aagtctaact ccggctcttc tggttcttcc agttcttctt cttcttcttc agcttcatct  960
tcatcttcta gcaagaagaa tgctgccacc aacgttaaag ctaacttagc acaagtggtc 1020
tttacctcca tcatttcctt atccattgcc gctggtgtcg gttttgcttt ggtttaaaaa 1080
gcttcgacac atacataata actcgataag ccgcgg                           1116
<210> 2
<211> 1236
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
actagtatgc ttttgcaagc tttccttttc cttttggctg gttttgcagc caaaatatct   60
gcatcaaaga gctcgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accggtagaa  120
aaaatgagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat  180
ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac  240
ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca  300
cttgtcacta cgttaactta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcatatgaaa  360
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct  420
ttcaaagatg acgggaacta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt  480
gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac  540
aaactcgagt acaactataa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat  600
ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgccac aacattgaag atggatccgt tcaactagca  660
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat  720
tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc  780
cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatgagat ctctgaatcc  840
gctgccgcca tttctcaaat cactgacggt caaatccaag ctactaccac tgctaccacc  900
gaagctacca ccactgctgc cccatcttcc accgttgaaa ctgtttctcc atccagcacc  960
gaaactatct ctcaacaaac tgaaaatggt gctgctaagg ccgctgtcgg tatgggtgcc 1020
ggtgctctag ctgctgctgc tatgttgtta taagaaatct ctgatttttt ataatatcta 1080
tatggctttt ttcaaaattt tcggttttac taggtaagtg tttgattctt ttcttttcgt 1140
taatatattt ttacacataa ttttaaataa tttttgttat tttgaatagg tagataccat 1200
aaaaataaaa cactttttac tttaacgagt ccgcgg                           1236
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】  第１図は、実施例で用いた主なプラスミド（pEAC及びpUAC）の構造を示す。
【図２】  第２図は、AY-5株およびAY-16株を試験管内で培養し、経時的に培養液および培養上清の蛍光強度によりGFP流出を測定した結果を示す。
【図３】  第３図は、既存抗真菌試薬によるGFP流出効果を示す。カッコ内は主に障害される高分子を示し、上段の図はAY-2株の結果、下段の図はAY-12株の結果をそれぞれ示し、薬剤は左よりAC: Aculeacin A, TM: Tunicamycin, NM: Nikkomycin, CW: Calcofluor White, CR: Congo red, AMPH: Amphotericin B, SM: Salinomycin, FCZ: Fluconazole, AB: Aureobasidin, CE:Cerulenin, 5-FC: 5-Flucytocine, ZE: Zeocin, NE: Netropsin, CH: Cycloheximide, AS: Azaserine, BC: Bromoconduritol, CA: Caffeinを示す。
【図４】  第４図は、AY-15株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数1116）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号600番までを示す。
【図５】  第５図は、AY-15株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数1116）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号601番〜1116番までを示す。
【図６】  第６図は、AY-14株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数1236）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号660番までを示す。
【図７】  第７図は、AY-14株に導入した遺伝子の塩基配列（塩基数1236）、制限酵素認識サイト、及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列（１文字表記）を示す。図中、核酸番号661番〜1236番までを示す。
【図８】  第８図は、実施例で用いたプラスミドpAUC19a, pUAC29b, pUAC20a, pUAC30b, pUAC21a, 及びpUAC31bの構造を示す。
【図９】  第９図は、細胞壁合成に関わる遺伝子を破壊した場合にAY-12株(膜型アーミングイースト)を親株とした遺伝子破壊株又はAY-10株(壁型アーミングイースト)を親株とした遺伝子破壊株から流出するGFPの量を示す。
【図１０】  第１０図は、遺伝子破壊株から流出したGFPの分子量をウエスタンブロッティングで解析した結果を示す。
【図１１】  第１１図は、SP(PKC1プロテインカイネースＣの阻害薬), AC((1,3)-β-グルカン合成阻害薬)およびTM(N型糖鎖合成阻害薬)をそれぞれ単独でAY-14株に作用させ、流出したGFPの分子量を比較した結果を示す。
【図１】
0004204471.tif 000009
【図２】
0004204471.tif 000010
【図３（Ａ）】
0004204471.tif 000011
【図３（Ｂ）】
0004204471.tif 000012
【図４】
0004204471.tif 000013
【図５】
0004204471.tif 000014
【図６】
0004204471.tif 000015
【図７】
0004204471.tif 000016
【図８】
0004204471.tif 000017
【図９】
0004204471.tif 000018
【図１０】
0004204471.tif 000019
【図１１】
0004204471.tif 000020