(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のＤＮＡ、またはこの配列に対し１または複数の塩基の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対して１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対して１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号１に記載のＤＮＡ、またはこの配列に対し１または複数の塩基の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物へ導入し、該宿主微生物を培養する工程を含む、コエンザイムＱ10の製造方法。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対して１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡを宿主微生物へ導入し、該宿主微生物を培養する工程を含む、コエンザイムＱ10の製造方法。
【請求項６】
宿主微生物がEscherichia coliである、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
Escherichia coli ＨＢ１０１ pQ AD１ (FRPM BP-６５３８)を培養することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
配列番号１に記載のＤＮＡ、またはこの配列に対し１または複数の塩基の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードするＤＮＡを含有する、発現ベクター。
【請求項９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対して１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡを含有する、発現ベクター。
【請求項１０】
発現ベクターｐＵＣＮＴにＤＮＡを導入してなる、請求項８または９記載の発現ベクターｐＱＡＤ１。
【請求項１１】
配列番号１に記載のＤＮＡ、またはこの配列に対して１または複数の塩基の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードするＤＮＡにて形質転換された、宿主微生物。
【請求項１２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対して１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡにて形質転換された、宿主微生物。
【請求項１３】
Escherichia coliを形質転換して得られる、請求項１１または１２記載の微生物。
【請求項１４】
Escherichia coli ＨＢ１０１ ｐＱＡＤ１ (FERM BP-６５３８)である、請求項１３記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10の製造に関する。さらに詳細には、コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素であるコエンザイムＱ10側鎖合成酵素、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をRhizobiaceae科に属する細菌より単離し、これを微生物に導入することによりコエンザイムＱ10を生成させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のコエンザイムＱ10の製造法は、タバコなどの植物由来のコエンザイムを単離してその側鎖長を合成法により調製する等によって工業的には生産されている。
【０００３】
また、コエンザイムＱ10は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり、操作が煩雑であったりして、生産性が良くなかった。
【０００４】
コエンザイムＱ10の生物による生合成経路については、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。しかし、基本的には大きく３つのステップ、すなわち、コエンザイムＱ10のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコエンザイムＱ10を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ10の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。そこで、コエンザイムＱ10を効率よく生産させる為には、生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられるが、その遺伝子源としてはコエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているRhizobiaceae科に属する細菌が有力な候補となる。
【０００５】
これまでにデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子としては、Schizosaccaromyces pombe（特開平９-１７３０７６）やGluconobacter suboxydans（特開平１０-５７０７２）などいくつかの種類の微生物より分離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイムＱ10の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこで、さらにコエンザイムＱ10を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の生産に関する問題を解決するべく、Rhizobiaceae科に属する細菌由来のコエンザイムＱ10の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物によってコエンザイムＱ10を効率よく生産することを目的とする。
【０００７】
上記目的を達成する為に、本発明では、まず、Rhizobiaceae科に属する細菌よりコエンザイムＱ10の生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離した。そして、該遺伝子を大腸菌などの微生物に導入して発現させることにより、コエンザイムＱ10を効率よく生産させることが可能となった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているRhizobiaceae科に属する細菌からデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を分離するための検討を重ね、該遺伝子を分離することに成功した。
【０００９】
即ち本発明は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列、およびこの配列に対し１または複数の塩基の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列、およびこの配列に対し１または複数のアミノ酸の欠失、追加、挿入を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、さらにこのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記DNA配列を宿主微生物に導入し、該宿主微生物を培養する工程を含む、コエンザイムＱ10の製造方法を提供する。本発明の方法において用いる、宿主微生物としては特に限定されないが、Eschericha coliが好適に用いられる。Eschericha coliの産生するコエンザイムＱは、コエンザイムＱ8であるが、本発明の方法によって、コエンザイムＱ10を産生させることが可能となった。
【００１１】
さらに本発明は、上記ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、従来知られているベクター系いずれを用いても良く、例えば発現用ベクターｐＵＣＮＴへ配列番号１の配列を導入してなる、ｐＱＡＤ１が提供される。
【００１２】
本発明は、上記ＤＮＡ配列にて形質転換された宿主微生物もまた、提供する。本発明の宿主微生物としては、Eschericha coliが好適に用いられる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているRhizobiaceae科に属する細菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、ＰＣＲ法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。
【００１４】
既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣＲプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討したところ、プライマーDPS-１(５'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-３')及びDPS-２(５'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-３')を用い（なお、ここで示した配列中の、RはAまたはG、YはCまたはT、そしてNはG、A、TまたはCを示す。）、ＰＣＲを９４℃、１分間の熱処理の後、９４℃、１分→５０℃、１分→７０℃、１分のサイクルを２５回繰り返すことにより、Rhizobiaceae科に属する細菌、Agrobacterium sp. KNK７１２（FERM BP-１９００）の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約４００bpの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。
【００１５】
そこで次に本酵素遺伝子の全長を取得するためには、Agrobacterium sp. KNK７１２(FERM BP-１９００)の染色体遺伝子を制限酵素EcoRIで切断し、ラムダファージベクターに挿入して組換えファージライブラリーを作製する。そのプラークをナイロン膜に転写した後、標識した該ＰＣＲ断片を用いてプラークハイブリダイゼーションを行えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローンを取得することができる。
【００１６】
得られたクローンに含まれるデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子について塩基配列の決定を行ったところ、配列表、配列番号１に示した配列を持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミノ酸配列にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子として特徴的な配列がみられる。
【００１７】
デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、プロモーターを持つベクターに挿入することにより発現ベクターとすることができる。具体的な例としては、発現用ベクターpUCNT（ＷＯ９４/０３６１３に記載）に該遺伝子を挿入すれば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＱＡＤ１を作製することができる。
【００１８】
そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ10の生産に利用することが可能となる。例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＱＡＤ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ10を、大腸菌が本来生産するコエンザイムＱ8の生産量を遙かに上回る著量生産するように変換できる。この大腸菌菌株Escherichia coli ＨＢ１０１ ｐＱＡＤ１は通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所にFERM  BP-６５３８として寄託されている。
本遺伝子は単独で用いるほか、他の生合成に関与する遺伝子と同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。
【００１９】
【実施例】
（実施例１）Agrobacterium sp. KNK７１２の染色体ＤＮＡをMarmurらの方法（J.Mol.Biol.,第３卷、２０８頁-２１８頁、(１９６１年)）で調製した。既知の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の遺伝子との相同性からＰＣＲに用いるプライマーDPS-１(５'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-３')及びDPS-２(５'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-３')を設計した。なお、ここで示した配列中の、RはAまたはG、YはCまたはT、そしてNはG、A、TまたはCを示す。これらを用いてＰＣＲ(９４℃、１分→(９４℃、１分→５０℃、１分→７０℃、１分):２５サイクル繰り返し→４℃)を行い、０.８％アガロースゲル電気泳動により分析した。そして得られた約４００bpの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット(宝酒造製)を用いて精製した後、ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー(３７３A型、アプライドバイオシステム社製)を用い、ＤＮＡシークエンスキット（アプライドバイオシステム社製、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit With AmpliTaqR DNA polymerase, FS)を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、配列表、配列番号１の５１４から９０５までの塩基配列に示す配列が得られた。この翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル２燐酸合成酵素に特徴的な領域の配列”ＶＧＤＦＬＬＧ”および”ＥＧＥＶＬＱＬ”が見出せたことにより、得られた配列はデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の一部であること同定された。
【００２０】
（実施例２）Agrobacterium sp. KNK７１２の染色体ＤＮＡ０.２５μgを用い、ＰＣＲ用のプライマーNQE-１１(５'-AAGTCCACCGCCCGCACGATCT-３'の配列を持つ)及びNQE-１２(５'-CCGAGGTTCATGCCGTAGGATTTTの配列を持つ)を用いてＰＣＲ(９４℃、１分→(９４℃、１分→４０℃、１分→６０℃、２分):２５サイクル繰り返し→６０℃、５分→４℃)を行い、４％ Nusieve ４:１ アガロース(宝酒造製)によるゲル電気泳動を行い、約３２０bpの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット(宝酒造製)を用いて精製した。このＤＮＡ断片約２５ngを用い、メガプライムＴＭ・ＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社製）を用いて〔α-３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した。
【００２１】
(実施例３）Agrobacterium sp. KNK７１２の染色体ＤＮＡを制限酵素 EcoRＩ、Sac I、Not I、Xho Iで切断し、０,８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ(０.５M NaOH、１.５M NaCl)で変成させ、中和(０.５M Tris・HCl(pH７.５)、１.５M NaCl)した後、ハイボンドＮ＋フィルター(アマシャム社製)をゲルに重ね、１０×SSCを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、プレハイブリダイズ液（２０×SSC  (３M NaCl、０.３Mクエン酸３ナトリウム・２水和物、pH７.０)  １５ml、１０%  SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）  ５ml、５０×Denhardt's液（１０g/l フィコール(FicolR Type ４００、ファルマシア社)、１０g/lポリビニルピロリドン、１０g/l ウシ血清アルブミン(Fraction V、シグマ社)）５ml、１０mg/ml  サケ精子ＤＮＡ（９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し熱変成したもの）０.５ml、水  ２４.５ml）を用いて６０℃、４時間プレハイブリダイズした。
【００２２】
標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、６０℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを５×ＳＳＣに０.５%  ＳＤＳを添加した溶液を用い室温で２回洗浄後、１×ＳＳＣに０.１%  ＳＤＳを添加した溶液を用い６０℃から７５℃まで徐々に温度を上げながら洗浄した。このフィルターを乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。
【００２３】
その結果、制限酵素 EcoR Iで切断した約７.２ｋｂ、Sac Iで切断した約４.７ｋｂ、Not Iで切断した約８.３ｋｂ、Xho Iで切断した約４.７ｋｂの断片に強くハイブリダイズしていた。
【００２４】
（実施例４）Agrobacterium sp. KNK７１２の染色体ＤＮＡを制限酵素EcoRＩで切断し、０.８％アガロースによるゲル電気泳動を行い、約７ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルより切り出して精製することにより、クローン化に用いるＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をλ-ZAPＲIIファージキット（ストラテジーン社製）を用いてそのファージのEcoRＩサイトに組み込み、インビトロパッケージングキット(アマシャム社製)でパッケージングを行った。そして、大腸菌XL１-Blue MRF'に感染させてNZY平板培地(５g/l NaCl,２g/l MgSO４・７H２O, ５g/l酵母エキス, １０g/l NZアミン、 １８g/l 寒天 (pH７.５))上にNZY軟寒天培地(NZY平板培地の寒天のみ ８g/l)とともに重層し、てプラークとした。これをハイボンドＮ＋フィルター(アマシャム社製)にトランスファーしアルカリ(０.５M NaOH、１.５M NaCl)で変成した後、中和(０.５M Tris・HCl(pH７.５)、１.５M NaCl)、乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った。
【００２５】
焼き付け後のフィルター２４枚を用い、実施例３と同様にプレハイブリダイゼーション、標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、このフィルターを洗浄した。このフィルターを乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。この分離したプラークのファージを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてプラークとし、フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、確認を行ったところ、１２株のファージが選択できた。
【００２６】
このファージの懸濁液を用い、上記のNQE-１１及びNQE-１２を用いＰＣＲを行ったところ、８株に３２０bpのＤＮＡ断片が検出できた。そこでλ-ZAPＲIIファージキットの取り扱い説明書に従って、２株についてファージミドを調製した。
【００２７】
（実施例５）調製した２株のファージミドＤＮＡを用いて、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子のＤＮＡ塩基配列を（実施例１）と同様の方法で配列決定した。挿入ＤＮＡ断片のうちの、約１.６kbのＤＮＡについてその塩基配列を決定したが、その結果を配列表、配列番号１に示す。また、このDNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００２８】
得られた配列を、特開平１０-５７０７２に記載のGluconobacter suboxydansのデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と比較したところ、アミノ酸配列では、約４７％、ＤＮＡ配列では約６０％の相同性を有していた。図３、図４および図５にその結果を示す。また、特開平９-１７３０７６に記載のSchizosaccharomyces pombe由来のデカプレニル二燐酸合成酵素と比較したところ、アミノ酸では３０％、ＤＮＡでは４６％の相同性を有していた。
【００２９】
（実施例６）調製したファージミドよりデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子部分のみを切り出す為、合成ＤＮＡプライマー NQE-２２(５'-AGTCAAGCTTCAGCTCACCCGGTCGATC-３'の配列を持つ)及びNQE-２３(５'-AGCTCATATGATACCGCTGGAAGACAGC-３'の配列を持つ)を用いて実施例３と同様にＰＣＲを行い、制限酵素NdeI及びHindIIIで切断した後、発現用ベクターpUCNT（ＷＯ９４/０３６１３に記載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＱＡＤ１を作製した。得られた発現ベクター、ｐＱＡＤ１の制限酵素地図を図１に示す。なお、DPSとは、デカプレニル２燐酸のコード領域を意味する。
【００３０】
（実施例７）作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター ｐＱＡＤ１を大腸菌 ＨＢ１０１に導入し、１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離(３０００回転、２０分間)で集めた。
【００３１】
この菌体を１ｍｌの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍｌの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍｌのヘキサン・イソプロパノール(１０:２)を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１.５mlを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを０.５mlのエタノールに溶解し、その２０μlを高速液体クロマトグラフィー(島津製作所製、LC-１０A)により分析した。分離には逆相カラム(YMC-pack ODS-A, ２５０×４.６ mm, S-５μm,１２０A)を用い、エタノール・メタノール(２:１)を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５nmの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ10を検出した。結果を図２に示した。図２に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ10を、生産するようになったことが分かった。
【００３２】
得られた組換え大腸菌株Escherichia coli ＨＢ１０１ ｐＱＡＤ１は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年１０月１日に寄託した（受託番号FERM BP-６５３８）。
【００３３】
【発明の効果】
コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をRhizobiaceae科の細菌より単離し、配列決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10を効率的に製造することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を持つプラスミド、ｐＱＡＤ１の制限酵素地図を示す。
【図２】  デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌において、生産されたコエンザイムＱ10を高速液体クロマトグラフィーによって検出したチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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