(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から１１、１４から２１、２４から２９、および３１から３５のいずれかに同定された配列を含む遺伝子またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に含まれる遺伝子、または少なくとも８５％の配列同一性を有するこれらの変異体を含む場合に、当該遺伝子が欠失または不活性化されている変異細菌であって、当該遺伝子がＶＧＣ２領域内に存在することを特徴とする変異細菌。
【請求項２】
細菌が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から１１、１４から２１、２４から２９、もしくは３１から３５として同定された配列を含む遺伝子、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に含まれる遺伝子、もしくは少なくとも８５％の配列同一性を有するこれらの変異体を含む場合に、前記遺伝子が欠失または不活性化されている変異細菌を含むワクチン。
【請求項３】
ワクチンとしての、請求項２定義の変異細菌または微生物。
【請求項４】
請求項２定義の細菌または微生物と薬学的に許容できるキャリアーとを含む薬学的組成物。
【請求項５】
予防を必要とする宿主における微生物感染を予防する方法であって、細菌が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から１１、１４から２１、２４から２９、もしくは３１から３５として同定された配列を含むビルレンス遺伝子、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に含まれるビルレンス遺伝子を含む場合に、当該遺伝子が不活性化または欠失した変異細菌を、宿主に投与することを含む方法（ここで前記宿主はヒト以外の動物である）であって、当該遺伝子がＶＧＣ２領域内に存在することを特徴とする方法。
【請求項６】
病原に対するワクチンを宿主に接種する方法であって、細菌が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から１１、１４から２１、２４から２９、もしくは３１から３５として同定された配列を含むビルレンス遺伝子、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に含まれるビルレンス遺伝子を含む場合に、当該遺伝子が不活性化または欠失した変異細菌を、宿主に投与することを含み、前記変異細菌が、別の病原の抗原性エピトープをコードするＤＮＡをさらに含む方法（ここで前記宿主はヒト以外の動物である）であって、当該遺伝子がＶＧＣ２領域内に存在することを特徴とする方法。
【請求項７】
前記遺伝子が、コード領域の一部分の欠失または挿入不活性化により変異される、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
細菌が、Salmonella菌、好ましくはSalmonella typhimurium、Salmonella aberdeen、Salmonella gallinarum、Salmonella cubanaおよびSalmonella typhiのいずれか一つである、請求項５ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細菌感染が、Salmonella spp.細菌によって引き起こされる、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
有効成分が請求項５定義の変異細菌からなる、微生物感染を予防するための治療剤。
【請求項１１】
有効成分が請求項６定義の変異細菌からなる、病原に対して宿主にワクチン接種するための治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、環境に対する微生物の適応に係る遺伝子の同定方法、特に病原性微生物の毒性（ビルレンス）の原因となる遺伝子の同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌および他の病原体における抗生物質耐性は、益々重要になりつつある。それゆえ、病原性微生物を攻撃する新規の治療的アプローチを見出すことが重要である。
【０００３】
病原性微生物は、宿主の防御機構を避ける必要があり、少ない栄養環境下で生育して感染を確立することができる。そうするためには、微生物の多くの“毒性（ビルレンス）”遺伝子が必要である。
【０００４】
毒性遺伝子が古典遺伝学を用いて検出され、種々のアプローチが、細菌毒性遺伝子の同定のためのトランスポゾン突然変異を開発するために用いられた。例えば、突然変異は、例えば鉄制御タンパク質の欠失等の定義された生理学上の欠点について選別されるか（Hollandら, 1992）、もしくは上皮細胞の浸透（Finlayら, 1988）並びにマクロファージ内での生存（Fieldsら, 1989; Millerら, 1989a; Groismanら, 1989）を調べるアッセイで選別された。トランスポゾン突然変異は、感染した生きた動物モデルにおいて変更された毒性についても試験された（Millerら, 1989b）。このアプローチは、感染の種々の段階で重要な遺伝子が同定される利点を備えているが、毒性に対する変更について個々に広い範囲の突然変異を調べる必要性により厳しく限定される。Millerら（１９８９ｂ）は、８〜１０匹のマウスのグループを用い、種々の突然変異体で９５の別個のグループを経口的に感染させ、７６０〜９５０匹のマウスを用いた。極端に多くの動物が必要になるために、毒性遺伝子について細菌ゲノムの包括的な選別は不可能である。
【０００５】
最近、感染中に特異的に誘発されるサルモネラ（Salmonella）遺伝子を積極的に選別する遺伝システム（in vivo発現技術［ＩＶＥＴ］）が記載された（Mahanら, 1993）。この技術は、感染工程における特定の段階に発現される遺伝子を同定する。しかしながら、転写後に制御される毒性遺伝子を同定せず、さらに重要なことに、同定された遺伝子（類）が実際に感染工程に必要なのか、あるいは寄与しているのかについての情報を提供しない。
【０００６】
LeeとFalkow (1994) Methods Enzymol. 236, 531-545は、高進入性(hyperinvasive)突然変異を単離することによって、in vitroにおいて、Salmonellaの哺乳動物細胞への進入に影響を与えるファクターを同定する方法を記載している。
【０００７】
WalshとCepko (1992) Science 255, 434-440は、ラットの大脳皮質の発達中における大脳皮質始原細胞の空隙位置を追跡する方法を記載している。WalshとCepkoの方法は、独特の核酸配列を含むタグ(tag)とｌａｃＺ遺伝子を使用するが、使用可能な突然変異体もしくは遺伝子が、これらの方法によって検出されるという示唆はない。
【０００８】
国際公開第９４／２６９３３およびSmithら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6479-6483は、既知の遺伝子、もしくは、いくつかの配列情報が利用できる少なくとも一つのＤＮＡ分子の機能的領域の同定に向けられた方法を記載している。
【０００９】
Groismanら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1033-1037は、Salmonellaに特異的な分子的、機能的および進化的分析を記載している。
【００１０】
いくつかの毒性遺伝子は、病原性微生物、例えば、Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, Shigella flexneriおよびListeria monocytogenesについて既に知られているが、どの場合にも、全体の比較的少数しか同定されていない。
Salmonella typhimuriumがマウスに引き起こす疾患は、腸チフスの良好な実験モデルを提供する（CarterとCollins, 1974）。Salmonella毒素に影響する約４２の遺伝子が、これまでに同定されている（GroismanとOchman, 1994）。これらは、予想された毒性遺伝子の全体数の約１／３を示す（GroismanとSaier, 1990）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の目的は、効率よく、環境に対する微生物の適応に係る遺伝子を同定すること、特に病原性微生物のさらなる毒性遺伝子を同定することである。さらなる目的は、毒性遺伝子を同定することに用いられる実験動物の数を低減することである。本願発明のさらなる目的は、ワクチン、および毒性を低減する薬剤を選別する方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の第一の態様は、特定の環境に対する適応が低減した微生物を同定する方法を提供することであり、以下の工程を含む。
（１）それぞれの変異体が異なるマーカー配列を含むように、独特のマーカー配列を含む核酸を備えた遺伝子を挿入不活性化することによって、独立に変異した複数の微生物、もしくはその微生物のクローンを用意し、
（２）工程（１）で調製した各変異体の貯蔵サンプルを個々に用意し、個々の変異体から独特のマーカー配列を含む個々に貯蔵された核酸を用意し、
（３）工程（１）で調製した複数の変異体を前記特定の環境に導入し、生育可能な微生物を前記環境下で生育させ、
（４）前記環境から微生物もしくはその選択された部分を回収し、回収された微生物から核酸を単離し、
（５）工程（４）で単離された核酸中のあらゆるマーカー配列を、工程（２）で貯蔵した各変異体の独特のマーカー配列と比較し、かつ、
（６）工程（４）で単離されたいずれのマーカー配列も含まない個々の変異体を選択する。
【００１３】
しかして、この方法は、環境下で増殖する能力が低減した微生物を同定するネガティブ選択を用いる。
微生物は多くの種々の環境下で生育することができ、特定の遺伝子およびそれらの産物が、微生物を特定の環境に適応させることが知られている。例えば、病原性細菌もしくは病原性真菌等の病原性微生物が宿主中で生存していくためには、一つ以上の毒性遺伝子の産物が必要である。それゆえ、本願発明の好ましい実施態様では、微生物を特定の環境に適応させる微生物の遺伝子が、毒性遺伝子である。
【００１４】
都合良く、特定の環境は、植物や動物等の分化した多細胞生物である。多くの細菌および真菌が植物に感染することが知られており、毒性遺伝子の存在もしくは毒性遺伝子からの発現により、植物の内部に生存して疾患を引き起こすことが可能である。特定の環境が植物である場合の適切な微生物は、特にグレープに腫瘍（虫こぶ）を形成する細菌Agrobacterium tumefaciens；Erwinia amylovara；広範囲の植物に枯れ(wilt)を生じるPseudomonas solanacearum；豆類に疾患を引き起こすRhizobium leguminosarum；柑橘類の果物に癌腫病を引き起こすXanthomonas campestris p.v. citriを含み、かつ、ライスブラスト病(rice blast disease)を引き起こす真菌Magnaporthe grisea；種々の植物病を引き起こすFusarium spp.；Erisyphe spp.；Colletotrichum gloeosporiodes；穀類および草類に根および頂点の疾患を引き起こすGaeumannomyces graminis；Glomus spp., Laccaria spp.；Leptosphaeria maculans；Phoma tracheiphila；Phytophthora spp., Pyrenophora teres；Verticillium alboatrumおよびV. dahliae；およびMycosphaerella musicola並びにM. fijiensisを含む。以下により詳細に記載するように、微生物が真菌である場合には、そのライフサイクルに単相(a haploid phase)が必要である。
【００１５】
同様に、細菌、真菌、原生動物亜界およびトリパノソーマ類を含む多くの微生物は、動物、特にヒトを含む哺乳動物に感染することが知られている。動物内部における微生物の生存および微生物が疾患を引き起こす能力は、大部分が毒性遺伝子の存在および毒性遺伝子からの発現に依存している。適切な細菌は、特にB. pertussis等のBordetella spp.、特にC. jejuni等のCampylobacter spp.、特にC. botulinum等のClostridium spp.、特にE. faecalis等のEnterococcus spp.、特にE. coli等のEscherichia spp.、特にH. DucreyiやH. influenzae等のHaemophilus spp.、特にH. pylori等のHelicobacter spp.、特にK. pneumoniae等のKlebsiella spp.、特にL. pneumophila等のLegionella spp.、特にL. monocytogenes等のListeria spp.、特にM. smegmatisやM. tuberculosis等のMycobacterium、特にN. gonorrhoeaeやN. meningitidis等のNeisseria spp.、特定のPs. aeruginosa等のPseudomonas spp.、Salmonella spp.、Shigella spp.、特にS. aureus等のStaphylococcus spp.、特にS. pyogenesやpneumoniae等のStreptococcus spp.、特にY. pestis等のVibrio spp.やYersinia sppを含む。これらの細菌の全てが、ヒトに疾患を引き起こし、疾患の動物モデルも存在する。しかして、これらの細菌を本願発明の方法に用いた場合には、特定の環境としては、感染することができ、そこで疾患を引き起こす動物である。例えば、Salmonella typhimuriumがマウスを感染するために用いられた場合には、マウスは、ヒトで腸チフスのモデルとして役立つ疾患を生じる。Staphylococcus aureusは、マウスに菌血症と腎臓膿瘍形成を引き起こし（Albusら (1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014）、ウサギに心内膜炎を引き起こす（PerlmanとFreedman (1971) Yale J. Biol. Med. 44, 206-213）。
【００１６】
真菌もしくは高等真核寄生虫は、その生涯の内の関連部分（環境下での生育等）で単相体であることが必要である。好ましくは、ＤＮＡ−仲介組み込み形質転換システム（a DNA-mediated integrative transformation system）が利用でき、微生物がヒト病原体である場合には、都合良くヒトの疾患の動物モデルが利用できるものである。ヒトに対して病原性のある適切な真菌は、あるAspergillus spp.（例えばA. fumigatus等）、Cryptococcus neoformansとHistoplasma capsulatumを含む。明らかに上記真菌は単相を備えており、ＤＮＡ−仲介組み込み形質転換システムを利用することができる。感染中に単相を備えた寄生虫であるToxoplasmaも利用することができる。細菌は単相体ゲノムを有する。
【００１７】
ヒト疾患の動物モデルは、動物がマウス、ラット、ウサギ、イヌもしくはサルがしばしば利用される。動物がマウスであると好ましい。ヒト疾患の動物モデルを用いて本願発明の方法によって検出された毒性遺伝子は、明らかにヒトにおける微生物の毒性を決定する遺伝子と言えそうである。
本願発明の方法で使用するのに特に好ましい微生物は、Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosaおよびAspergillus fumigatusである。
【００１８】
本願発明の好ましい実施態様を以下に記載する。
独特のマーカー配列を含む核酸は、以下のように調製される。二本鎖ＤＮＡ配列“タグ（tags）”の複合プールを、オリゴヌクレオチド合成およびポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を用いて作製する。各ＤＮＡ“タグ”は、約２０〜８０ｂｐ、好ましくは約４０ｂｐの独特の配列を備え、その配列には約１５〜３０ｂｐ、好ましくは約２０ｂｐの“腕”が隣接しており、これは全ての“タグ”に共通である。独特の配列のｂｐの総数は、大きな数（例えば＞１０１０）の独特の配列が、ランダムオリゴヌクレオチド合成によって調製されるのに十分なものであるが、ＰＣＲと抵触する二次構造を形成するほど大きくないものである。同様に、腕の長さは、ＰＣＲでオリゴヌクレオチドの効率的な開始をするに十分なものとすべきである。
【００１９】
オリゴヌクレオチドの５’末端の配列は、増幅されるべき標的配列に適合する必要がないことはよく知られている。
“プライマーダイマー”と称される人為的産物の形成を促進するかもしれないので、通常、ＰＣＲプライマーは、特にその３’末端において、互いに２塩基より長い相補的構造を含まない。二つのプライマーの３’末端がハイブリダイズする場合、“プライマー鋳型(primed template)”複合体を形成してしまい、プライマーの伸長により、“プライマーダイマー”と称される短い二重産物を生じる。
【００２０】
内在性二次構造は、プライマーにおいては避けるべきである。対称的ＰＣＲ(symmetric PCR)では、一つの塩基だけで長い鎖を形成することなく、Ｇ＋Ｃ含量が両方のプライマーに対して４０−６０％であることがしばしば推奨される。ＤＮＡプローブハイブリダイゼーションの研究と関連して用いられる古典的溶解温度計測により、しばしば、所定のプライマーが特異的温度でアニールすること、もしくは７２℃の伸長温度が早まってプライマー／鋳型ハイブリッドを分離することが予想される。実際には、ハイブリッドは、簡単なＴｍ計測によって一般に予想されるよりもＰＣＲ工程でより効果的である。
【００２１】
最適なアニーリング温度は、経験的に決められ、かつ予想より高くても良い。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、３７−５５℃の領域で活性を備えるため、プライマー伸長がアニーリング段階で起こり、ハイブリッドが安定化される。プライマー濃度は通常の（対称的な）ＰＣＲの場合と同じであり、典型的には０．１−〜１−μＭの範囲内である。
【００２２】
独特のマーカー配列を含有する核酸を形成するために、“タグ”は、トランスポゾンもしくはトランスポゾン様部位にリゲートされる。都合良く、トランスポゾンは、“ヘルパー”生物体中のプラスミドとして保持されるが、本願発明の方法の微生物への伝達後には失われる自殺ベクター（a suicide vector）に保有される。例えば、“ヘルパー”生物体があるEscherichia coliの株であり、微生物をSalmonellaとすることができ、伝達を接合伝達（a conjugal transfer）とすることができる。トランスポゾンは伝達後に失われ得るが、ある割合の細胞では、例えこの方法で用いられた微生物のゲノムに、独特のタグを伴ってランダムに組み込まれるとしても、転位を受ける。トランスポゾンもしくはトランスポゾン様部位が選択されうることが最も好ましい。例えば、Salmonellaの場合には、カナマイシン耐性遺伝子をトランスポゾン中に存在させることができ、接合完了体(exconjugants)はカナマイシン含有培地で選別される。独特のマーカーを含む核酸に機能遺伝子を備えた感受性のある細胞において、栄養素要求性マーカーを補うこともできる。この方法は、真菌が用いられる場合に特に便利である。
好ましくは、補足機能的遺伝子は受容個体微生物と同じ種から誘導されたものではなく、非ランダムな組み込みが起こっても良い。
【００２３】
また、第一の所定の条件においては、本発明の第一の態様の方法で用いられる微生物のエピソームに（染色体の一部としてではなく）維持されたベクターにトランスポゾンもしくはトランスポゾン様部位が保有されているが、第二の所定の条件に変えた時に、エピソームが細胞の選択が維持できなくなり、トランスポゾンもしくはトランスポゾン様部位が転位を受け、それを介して、本発明の方法で用いられた微生物のゲノムに、独特のタグと共にランダムに組み込まれることが、特に都合がよい。一度エピソームベクターを保有する微生物が作製されれば、第一の条件から第二の条件に微生物（もしくはそのクローン）の条件を変えることによって、そのたび毎に転位が選別もしくは誘導され、トランスポゾンを微生物のゲノムの異なる部位に組み込むことができるので、この特に便利な実施態様は有利である。しかして、一端、その各メンバーが、エピソームベクター上に保有されたトランスポゾンもしくはトランスポゾン様部位に独特のタグ配列を含む（第一の所定の条件下において）、微生物のマスターコレクションを作製すれば、その各々が異なるタグ配列を含有する（すなわち、プール内で独特）、ランダム挿入変異体のプールを生成するために繰り返し用いられる。この態様は、（ａ）この方法の工程（１）において、多数（“プール”）の独立に変異した微生物を生成するのに必要な操作の手数および複雑さを低減できること；並びに、（ｂ）種々のタグの総数が、この方法の工程（１）における多数の微生物中の微生物の総数と同じであることのみを必要とすることから、特に使用することができる。ポイント（ａ）は、トランスポゾン変異を行うことがより困難な生物（例えば、Staphylococcus aureus）おける本発明の使用をより簡単なものとし、ポイント（ｂ）は、特に良好なハイブリダイゼーション特性を備えたタグ配列を選別することができ、そのため質の調節を容易にすることができることを意味する。以下に、より詳細に記載するように、“プール”サイズは、都合良く１００−２００独立変異微生物とすることができ、それゆえ、微生物のマスターコレクションは都合良く１または２枚の９６ウェルミクロタイタープレートに貯蔵される。
【００２４】
特に好ましい実施態様では、第一の所定の条件は、第一の特定の温度、すなわち２５〜３２℃の温度範囲であって、約３０℃が最も好ましく、第二の所定の条件は、第二の特定の温度、すなわち３５〜４５℃の温度範囲であって、４２℃が最も好ましい。さらに好ましい実施態様では、第一の所定の条件には、ストレプトマイシン等の抗生物質が存在しかつ第二の所定の条件には前記抗生物質が存在せず；あるいは、第一の所定の条件には抗生物質が存在せずに、第二の所定の条件には前記抗生物質が存在する。
【００２５】
グラム陰性細菌のゲノムに組み込むのに適したトランスポゾンは、Ｔｎ５、Ｔｎ１０およびそれらの誘導体を含む。グラム陽性細菌のゲノムに組み込むのに適したトランスポゾンは、Ｔｎ９１６およびその誘導体もしくはアナログを含む。Staphylococcus aureusを用いた使用に特に適したトランスポゾンは、Ｔｎ９１７（Cheungら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6462-6466）およびＴｎ９１８（Albusら (1991) Infect. Immun. 59, 1008-1014）を含む。
トランスポゾンが、Camilliら (1990) J. Bacteriol. 172, 3738-3744に記載されたＴｎ９１７誘導体の特性を備え、かつ、ｐＥ１９４Ｔｓ等の熱感受性ベクター（Villafaneら (1987) J. Bacteriol. 169, 4822-4829）によって保有されれば、特に好ましい。
【００２６】
トランスポゾンは、遺伝子を挿入的に不活性化するのに便利であるが、他の何らかの既知の方法、もしくは将来開発される方法も使用することができると考えることができる。特にStreptococcus等のある細菌において、遺伝子を挿入的に不活性化するさらに便利な方法は、S. pneumoniaeについてMorrisonら (1984) J. Bacteriol 159, 870に記載された挿入複製変異誘発（insertion-duplication mutagenesis）を用いることである。一般的な方法を、特に細菌等の他の微生物に適用することもできる。
【００２７】
真菌では、挿入突然変異は、“タグ”および、好ましくは例えばヒグロマイシンＢもしくはフレオマイシンに対する耐性をコードする選択マーカーを備えたＤＮＡフラグメントもしくはプラスミドを用いた形質転換によって作製される（Smithら (1994) Infect. Immunol. 62, 5247-5254参照）。制限酵素仲介組み込みを用いた糸状菌のゲノムにヒグロマイシンＢ耐性をコードするＤＮＡフラグメントをランダム、単一組み込み（REMI；SchiestlとPetes (1991); Luら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649-12653）が知られている。
真菌の簡単な挿入突然変異技術は、参照としてここに取り込んだSchiestlとPetes (1994)に記載されており、例えば、酵母のＴｙ因子(Ty elements)およびリボソームＤＮＡの使用を含む。
【００２８】
トランスポゾンもしくは他のＤＮＡ配列の不規則な組み込みにより、各突然変異体において異なる遺伝子が挿入的に不活性化され、かつ各変異体が異なるマーカー配列を含む、多数の独立に変異した微生物を単離することができる。
各ウェルが異なる変異微生物を含むように、挿入変異体のライブラリーをウェルが形成された(welled)ミクロタイター皿に並べる。各変異体微生物の独特のマーカー配列を含むＤＮＡ（都合良く、クローンからの全ＤＮＡを用いる）を貯蔵する。都合良く、ミクロタイター皿から微生物のサンプルを除去し、核酸ハイブリダイゼーション膜（ニトロセルロースもしくはナイロン膜等）にスポットし、アルカリで微生物を溶解して、膜に核酸を固定化することによってなされる。しかして、ウェルが形成されたミクロタイター皿の内容のレプリカを作製する。
【００２９】
ウェルが形成されたミクロタイター皿の微生物のプールを作製し、ＤＮＡを抽出する。このＤＮＡを、“タグ”に隣接した共通の“腕”にアニールするプライマーを用いたＰＣＲ用の標的として用い、増幅されたＤＮＡを３２Ｐ等でラベルする。ＰＣＲの産物は、ウェルが形成されたミクロタイター皿のレプリカの参照ハイブリダイゼーションパターンを提供する個々の変異体から貯蔵されたＤＮＡをプローブするために用いられる。これは、実際に、個々の微生物がマーカー配列を含むこと、並びにマーカー配列が効率的に増幅およびラベルされ得ることをチェックするものである。
【００３０】
トランスポゾン変異体のプールを特定の環境に導入する。都合良く、９６ウェルミクロタイター皿が用いられ、このプールは９６のトランスポゾン変異体を含有する。しかしながら、プールについての下限は二つの変異体であり、プールサイズに対する理論的な上限はないが、以下に記載するように、上限は変異体が導入される環境に応じて決定される。
【００３１】
微生物が前記特定の環境に導入されると、可能な微生物は環境の中で生育する。微生物が環境に残る時間の長さは、微生物および環境の性質によって決まる。適切な長さの時間後で、微生物を環境から回収し、ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを“タグ”に隣接する“腕”にアニールするプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として用いる。ＰＣＲ産物を３２Ｐ等でラベルし、ウェルが形成されたミクロタイター皿から複製された個々の変異体から貯蔵されたＤＮＡをプローブするために用いる。環境から回収された微生物から単離されたＤＮＡから生成したプローブを用いて、弱くハイブリダイズする、あるいは全くハイブリダイズしない、貯蔵されたＤＮＡを同定する。これらの非ハイブリダイズＤＮＡ群は、その特定の環境に対する適応が、トランスポゾンもしくは他のＤＮＡ配列の挿入によって弱められた変異体に対応する。
【００３２】
特に好ましい実施態様では、“腕”は、“タグ”に匹敵するラベルを、全くあるいはほとんど具備しない。例えば、ＰＣＲプライマーを、Ｇ残基を全く含まないか、あるいは一つだけ含むように設計し、３２ＰラベルヌクレオチドをｄＣＴＰとした場合、全くあるいは一つのラジオラベルされたＣ残基がそれぞれの“腕”に取り込まれるが、より多くの数のラジオラベルされたＣ残基が“タグ”に取り込まれる。“タグ”が、“腕”より、少なくとも１０倍以上、好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上のラベルを取り込むことが好ましい。都合良く、適切な制限酵素を用いて“腕”が“タグ”から除去することができ、この部位をプライマー設計の際に取り込んでも良い。
【００３３】
上述したように、本願発明の特に好ましい実施態様は、微生物が病原性微生物であり、特定の環境が動物である。この態様では、動物に導入された変異体のプールのサイズは、（ａ）動物中で生存できそうな変異体の細胞数（毒性遺伝子が不活性化されていないと仮定する）と（ｂ）微生物の全接種数によって決まる。（ａ）の数があまりに低いと、誤った陽性結果を生じ、（ｂ）の数があまりに高いと、変異体が所望の方法で生育するチャンスを得る前に動物が死んでしまうことがある。（ａ）の細胞数は、用いられた各微生物について決められるが、好ましくは５０以上、さらに好ましくは１００以上である。
【００３４】
単一の動物に導入される種々の変異体の総数は、好ましくは５０〜５００の間であって、約１００とするのが都合良い。全体の接種が１０６細胞を越えないことが望ましいが（好ましくは１０５細胞）、微生物と動物に依存してこの量の上下で接種のサイズを変えても良い。
特に都合の良い方法では、単一の動物当たり１００の異なる変異体をそれぞれ１０００細胞含有する１０５の接種が用いられる。この方法では、１００の変異体を選別するのに少なくとも１００体の動物を必要とした従来技術の方法と比較して、一体の動物が１００の変異体を選別するために用いられると考えられる。
【００３５】
しかしながら、少なくとも二つを調べて（一つはこの方法の信頼性をチェックするためのレプリカ）、３番目をバックアップとして確保するように、同じプールの変異体で３体の動物を接種すると都合がよい。それでも、この方法は、使用された動物の数において３０倍以上の節約ができる。
プールの変異体を動物に導入してから、微生物を回収するまでの時間は、使用された微生物と動物で変えてもよい。例えば、動物がマウスであり、微生物がSalmonella typhimuriumである場合には、接種から回収までの時間は約３日である。
【００３６】
本発明の一つの実施態様では、微生物を、工程（４）の導入部位から離れた部位で工程（５）において環境から回収するので、調べられる毒性遺伝子は、二つの部位の間に広がった微生物に係るものを含む。
例えば、植物では、茎の傷口もしくは葉の一部に導入し、疾患状態が示されている葉の別の部位から微生物を回収しても良い。
動物の場合では、微生物を、経口、腹腔内、静脈内もしくは鼻腔内に導入し、後に脾臓等の内臓器官から回収しても良い。ある遺伝子は、別の経路ではなくある経路が感染の確立に必要とされるので、経口投与により同定された毒性遺伝子と腹腔内投与により同定されたものを比較することは有益であるかもしれない。Salmonellaが腹腔内に導入されることが好ましい。
【００３７】
毒性遺伝子を同定するために用いられる他の好ましい環境は、培養の動物細胞（特にマクロファージと表皮細胞）および培養の植物細胞である。培養の細胞を用いることはそれ自身の範囲において有益であるが、同様に環境として全体的な動物もしくは植物の使用をも補足するであろう。
環境が動物の体の一部であることも好ましい。所定の宿主−寄生虫相互作用の範囲内で、種々の器官および組織、並びにパイエル板等のその一部を含む多数の種々の環境が可能である。
【００３８】
環境から回収された個々の微生物（すなわち細胞）の数は、環境に導入された種々の変異体の数の、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは１００倍であるべきである。例えば、動物が１００の異なる変異体で接種された場合には、約１００００の個々の微生物および単離されたマーカーＤＮＡが回収されるべきである。
【００３９】
さらに好ましい実施態様は以下の工程を含む：
（１Ａ）工程（１）で生成された複数の変異体から栄養素要求体を除去する；もしくは、
（６Ａ）工程（６）で選別された変異体が栄養素要求体であるか否かを調べる；あるいは、
（１Ａ）と（６Ａ）の両方である。
【００４０】
栄養素要求体（すなわち、野生型もしくは原栄養体には必要とされない成長因子を必要とする変異微生物）と、微生物を特定の環境に適応させる遺伝子が不活性化された変異微生物を区別することが好ましい。これは、工程（１）および（２）の間、もしくは工程（６）の後になされるのが都合が良い。
栄養素要求体は、毒性遺伝子が同定される際に除去されないことが好ましい。
【００４１】
本願発明の第二の態様は、微生物を特定の環境に適応させる遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、本発明の第一の態様の方法に続いて、以下の付加的な工程：
（７）工程（６）で選別された個々の変異体から挿入不活性化遺伝子もしくはその一部を単離する工程
を含む。
独特のマーカーを含む遺伝子の単離方法は、分子生物学の分野で周知である。
【００４２】
さらに好ましい実施態様は、さらに以下の付加的工程：
（８）工程（７）で単離された挿入不活性化遺伝子もしくはその一部をプローブとして用いて対応する野生型遺伝子を野生型微生物から単離する工程
を含む。
遺伝子プロービングの方法は、分子生物学の分野で周知である。
本願発明の実施における使用に適した分子生物学的方法は、ここに参照として取り込まれたSambrookら (1989)に記載されている。
【００４３】
微生物が動物にとって病原性の微生物であり、遺伝子が毒性遺伝子であり、トランスポゾンが挿入的に遺伝子を不活性化するために用いられた場合には、トランスポゾンの外側を切断する制限酵素で工程（６）で選択された個々の変異体からのゲノムＤＮＡを切断し、プラスミドにトランスポゾンを含有するサイズ分画ＤＮＡをリゲートし、かつ、プラスミドではなくトランスポゾンによって授けられた抗生物質耐性に基づいてプラスミド組換え体を選別することによって、毒性遺伝子がクローン化されることが都合がよい。トランスポゾンに隣接する微生物ゲノムＤＮＡは、トランスポゾンの末端領域にアニールする二つのプライマー、および、プラスミドのポリリンカー配列の近くにアニールする二つのプライマーを用いて配列決定される。トランスポゾンが既知の毒性遺伝子を中断しているか否かを調べるために、この配列を、ＤＮＡデータベース調査にかける。しかして、この方法で得られた配列を、ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋ等の一般に利用できるデータベースに存在する配列と比較する。最後に、中断された配列が新規の毒性遺伝子にあることがわかったら、この変異を新規の遺伝的バックグラウンドに転移させ（例えば、Salmonellaの場合であればファージＰ２２−仲介形質導入による）、無毒性の表現型が転位によるものであって、二次的な変異によるものではないことを確かめるために、変異体株のＬＤ５０を調べる。
【００４４】
微生物の毒性遺伝子の全てを検出するために選別された個々の変異体の数は、微生物のゲノムの遺伝子数に依存する。例えば、大多数の毒性遺伝子を検出するために、３０００−５０００のSalmonella typhimuriumの変異体が選別される必要があるが、Salmonellaより大きなゲノムを有するAspergillus spp.の場合には、約２００００変異体が選別される。約４％の非必須S. typhimurium遺伝子が毒性に必要であると考えられ(GrossmanとSaier, 1990)、もしそうであれば、S. typhimuriumゲノムは、約１５０の毒性遺伝子を含む。しかしながら、本願発明の方法は、より速く、より簡単で、より実用向きの、毒性遺伝子を同定する経路を提供する。
【００４５】
本願発明の第三の態様は、本願発明の第一の態様の方法を用いて得られた微生物を提供する。
このような微生物は、特定の環境において生存に適応しない特性を備えているために、有益である。
好ましい実施態様では、病原性微生物が、宿主生物（環境）において生存に適応せず、動物、特に哺乳動物、さらにはヒトに対して病原性である微生物の場合には、本願発明の方法で得られた変異体はワクチンに使用できる。変異体が無毒性であれば、それゆえ患者に投与するのに適していると推定されるが、抗原性であって防御的免疫応答を引き起こすことが予想される。
【００４６】
さらに好ましい実施態様では、本発明の方法で得られた、宿主生物における生存に適していない病原性微生物は、好ましくは他の病原の抗原性エピトープを発現するのに適したＤＮＡ配列の導入によって修飾される。この修飾された微生物は、他の病原のワクチンとして作用することができる。
【００４７】
本願発明の第四の態様は、本願発明の第二の態様の方法を用いて同定された遺伝子に変異を有する微生物を提供する。
しかして、本願発明の第三の態様の微生物は有益ではあるけれども、同定された遺伝子に変異が特異的に導入されることが好ましい。好ましい実施態様では、特に微生物がワクチンに使用される場合には、遺伝子の変異は削除もしくはフレームシフト変異、あるいは実質的に復帰不可能な他の突然変異である。そのような遺伝子特異的突然変異は、自律性レプリコン（プラスミドもしくはウイルスゲノム等の）上の変異遺伝子のコピーを微生物中に導入すること、並びに、微生物のゲノムの遺伝子のコピーに変異を導入する相同的組換えに頼ること等の標準的な方法を用いて作製される。
【００４８】
本願発明の第五および第六の態様は、ワクチンに使用するのに適した微生物、並びに、適切な微生物および薬学的に許容されるキャリアーを含むワクチンを提供する。
適切な微生物は、上述した無毒性の変異体である。
患者の能動免疫が好ましい。このアプローチでは、一つ以上の変異微生物を適切なアジュバントおよびキャリアーを含む免疫学的製剤に調製し、既知の方法で患者に投与する。適切なアジュバントは、完全もしくは不完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、欧州特許出願第１０９９４２号、１８０５６４号および２３１０３９号の“Iscoms”、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ-デキストラン、中性油（ミグリオール(miglyol)）、植物油（ピーナツ油）、リポソーム、プルロニックポリオール（Pluronic polyols）もしくはリビ(Ribi)アジュバントシステムを含む（例えば、独国特許公開第２１８９１４１号公報参照）。“プルロニック”は、登録商標である。免疫される患者は、微生物の毒性型によって引き起こされる疾患から保護される必要のある患者である。
【００４９】
本願発明の上記無毒性微生物もしくはその製剤は、経口および非経口（例えば皮下もしくは筋肉内）注入を含む従来の方法で投与することができる。処置は、一回の投与もしくは一定時間で複数回の投与からなるものでもよい。
本願発明の無毒性微生物は、単独で投与することもできるが、一つ以上の許容できるキャリアーと共に、薬学的製剤として存在することが好ましい。キャリアー（類）は、本願発明の無毒性微生物に適合するという意味で、“許容できる”ものでなければならず、また、宿主に対して有害であってはならない。典型的に、キャリアーは、無菌かつ発熱物質を含まない水または食塩水である。
本願発明のワクチンは、その微生物成分に依存して、ヒトの医学および獣医学の分野で使用することができると考えられる。
微生物によって引き起こされた疾患は、家畜等の多くの動物において知られている。適切な無毒性微生物、特に無毒性細菌を含む場合には、本発明のワクチンは、ヒトに使用できるばかりでなく、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコ、並びに、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウ等の家禽等にも使用できる。
【００５０】
本願発明の第七および第八の態様は、本願発明の第二の態様の方法によって得られた遺伝子、並びにそれらにコードされたポリペプチドを提供する。
“遺伝子”によって、ポリペプチドをコードするＤＮＡの領域のみではなく、転写、翻訳、並びにある微生物ではＲＮＡのスプライシングを制御するＤＮＡの領域等のＤＮＡの制御領域も含む。しかして、遺伝子は、プロモーター、転写ターミネーター、リボソーム結合配列、並びにある生物えはイントロンおよびスプライス認識部位を含む。
典型的に、工程７で得られた不活性化された遺伝子の配列情報が誘導される。都合良く、トランスポゾンの末端に近い配列は、シークエンシングプライマーのハイブリダイゼーション部位として用いられる。誘導された配列または不活性化遺伝子そのものに隣接したＤＮＡ制限フラグメントは、野生型生物から、対応する野生型遺伝子を同定および単離するためのハイブリダイゼーションプローブを作製するために用いられる。
【００５１】
関連遺伝子ではなく、遺伝子が確実に得られるように、ハイブリダイゼーションプロービングが厳密な条件下でなされることが好ましい。“厳密”によって、遺伝子が膜に固定化され、かつ、プローブ（この場合、長さが＞２００ヌクレオチド）が溶液の形態をとる場合に、遺伝子がプローブにハイブリダイズし、かつ固定された遺伝子／ハイブリダイズしたプローブを６５℃で１０分間、０．１ｘＳＳＣで洗浄することを意味する。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである。
Salmonella毒性遺伝子をクローニングするのに好ましいプローブ配列は、図５および６に示され、かつ、実施例２に記載されている。
特に好ましい実施態様では、Salmonella毒性遺伝子が、図５および６に示され、実施例２に記載された配列を含む。
【００５２】
さらに好ましくは、遺伝子は、図１１および１２に示された配列に含まれる配列、またはその少なくとも一部であり、本願発明の第二の態様の方法で同定されたものである。図１１および１２に示された配列は、毒性遺伝子クラスター２（ＶＧＣ２）と称されるSalmonella typhimuriumの遺伝子クラスターの一部である。トランスポゾン挿入の位置は配列内部に示唆されており、これらのトランスポゾン挿入は、生物の毒性決定因子を不活性化する。以下、特に実施例４により完全に開示するように、本願発明の第二の態様の方法がSalmonella typhimuriumの遺伝子の毒性を同定するのに用いられる場合には、多くの核酸挿入（それゆえ、同定された遺伝子）がゲノムの比較的小さい部分に密集される。この領域、ＶＧＣ２は、以下に記載するように、本願発明の一部を形成する他の毒性遺伝子を含む。
【００５３】
本願発明の方法で単離される遺伝子は、適切な宿主細胞中で発現される。しかして、遺伝子（ＤＮＡ）は、本願発明のポリペプチドの発現および産生用の適切な宿主細胞を形質転換するために用いられる発現ベクターを作製するための、ここに含まれた教示の観点で修飾された既知の技術に従って用いられる。このような技術は、Rutterらに１９８４年４月３日に交付された米国特許第４４４０８５９号、Weissmanに１９８５年７月２３日に交付された米国特許第４５３０９０１、Crowlに１９８６年４月１５日に交付された米国特許第４５８２８００号、Markらに１９８７年１２月１日に交付された米国特許第４６７７０６３号、Goeddelに１９８７年７月７日に交付された米国特許第４６７８７５１号、Itakura等に１９８７年１１月３日に交付された米国特許第４７０４３６２号、Murrayに１９８７年１２月１日に交付された米国特許第４７１０４６３号、Toole, Jrらに１９８８年７月１２日に交付された米国特許第４７５７００６号、Goeddelに１９８８年８月２３日に交付された米国特許第４７６６０７５号、およびStalkerに１９８９年３月７日に交付された米国特許第４８１０６４８号に開示されたものを含み、これらの全てを参照としてここに取り込む。
【００５４】
本願発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、適切な宿主に導入するために広い範囲の種々の他のＤＮＡ配列に連結されても良い。伴うＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入方法、並びにエピソームの維持または組み込みが望まれるか否かに依存する。
【００５５】
一般的に、ＤＮＡは、発現に適した方向および正しい読み枠でプラスミド等の発現ベクター中に挿入される。必要であれば、ＤＮＡは所望の宿主に認識される適切な転写および翻訳制御ヌクレオチド配列に連結されても良いが、このような制御は一般的に発現ベクター中で利用できる。ベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。一般的に、宿主の全てがベクターによって形質転換されるわけではない。それゆえ、形質転換した宿主細胞を選別する必要がある。一つの選別技術は、抗生物質耐性等の形質転換細胞における選択的特徴をコードする、何らかの必須制御部を備えたＤＮＡ配列を発現ベクター中に導入することを含む。あるいは、このような選択的特徴の遺伝子が別のベクターに存在してもよく、所望の宿主細胞を共形質転換（co-transform）するのに用いられる。
【００５６】
本願発明の組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるために、ここに記載された技術の観点で当業者に既知の十分な時間かつ適切な条件下で培養し、ポリペプチドを回収する。
細菌（例えばE.coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）、糸状菌（例えばAspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。
ベクターが他の非原核細胞タイプにおける発現のために用いられる場合であっても、ベクターは、原核生物における繁殖のためにCoIE1 ori等の原核レプリコンを含む。また、ベクターは、それで形質転換された、E.coli等の細菌宿主細胞における遺伝子の発現（転写および翻訳）に方向付け得る真核プロモーター等の適切なプロモーターを含むこともできる。
【００５７】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を引き起こすＤＮＡ配列によって形成された発現制御部である。模範的細菌宿主に適合するプロモーター配列は、本願発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含むプラスミドベクターに典型的に与えられる。
典型的な原核ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories（Richmond, CA, USA）から利用できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、並びに、Pharmacia, Piscataway, NJ, USAから利用できるｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway, NJ, USAから利用できるｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を誘導するＳＶ４０後期プロモーターを用い、最も高いレベルの発現は、ＣＯＳ−１細胞等のＴ抗原産生細胞に見出される。
【００５８】
誘導哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、これもPharmaciaから利用できる。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を誘導するために、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端重複（the mouse mammary tumour virus long terminal repeat）のグルココルチコイド誘導プロモーターを利用する。
使用できる酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６並びにｐＲＳ４１３−４１６であり、一般的に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから利用できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド類（ＹＩｐｓ(Yeast Integrating plasmids)）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド類（ＹＣｐｓ(Yeast Centromere plasmids)）である。
【００５９】
相補的付着末端を介してベクターにＤＮＡを操作的に連結するために、種々の方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマー管(complementary homopolymer tracts)は、ベクターＤＮＡに挿入されるようにＤＮＡセグメントに付加されうる。ベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的ホモポリマーテイル間の水素結合によって連結され、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００６０】
一つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する方法を提供する。前述したエンドヌクレアーゼ制限切断により生成されたＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼもしくはE.coliＤＮＡポリメラーゼＩで処置され、この酵素は、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で突き出した３’一本鎖末端を除去し、その重合活性でへこんだ３’末端を満たす。
それゆえ、これらの活性の組み合わせにより、平滑末端ＤＮＡセグメントが生成される。平滑末端セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ等の平滑末端ＤＮＡ分子のリゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大過剰のモル数のリンカー分子と共にインキュベートされる。しかして、この反応の産物は、その末端に重合リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは適当な制限酵素で切断され、このＤＮＡセグメントと適合する末端を生じる酵素で切断された発現ベクターにリゲートされる。
【００６１】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を備えた合成リンカーは、International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USAを含む多数の源から商業的に利用することができる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saikiら (1988) Science 239, 487-491に記載されたポリメラーゼチェーン反応を使用することである。
この方法では、酵素によって増幅されるＤＮＡには、それ自身増幅ＤＮＡに取り込まれる二つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーが隣接する。前記の特異的プライマーは、当該技術分野で知られた方法を用いて、発現ベクターにクローニングするために用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでも良い。
【００６２】
遺伝子の変異形も、本願発明の一部を形成する。この変異形が、本発明の方法で単離された遺伝子と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を備えていることが好ましい。もちろん、置換、欠失および挿入も許容されてもよい。一つの核酸配列と他との類似性の程度は、the University of Wisconsin Computer GroupのＧＡＰプログラムを用いて調べることができる。
同様に、遺伝子にコードされたタンパク質の変異形が含まれる。
“変異形”は、挿入、欠失および置換を含み、保存的であっても非保存的であってもよいが、そのような変化によりタンパク質の正常な機能は実質的に変更されないものである。
“保存的置換”とは、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；およびＰｈｅ，Ｔｙｒ等の組み合わせを意味する。
このような変異形は、タンパク質工学および部位特異的変異誘発の周知の方法を用いて作製することができる。
【００６３】
本願発明の第九の態様は、（１）本願発明の第二の態様の方法で得られた遺伝子もしくは（２）この様な遺伝子にコードされたポリペプチドの機能と抵触する化合物を選別する工程を含む、特定の環境に適応する微生物の能力を低減する化合物を同定する方法を提供する。
野生型細胞だけでなく本発明の方法で単離された遺伝子を過剰産生する細胞にも影響する化合物の組ごとの選別（Pairwise screens）は、本発明のこの態様の一部をなす。
例えば、ある実施態様では、第一の細胞が野生型細胞で、第二の細胞が、本願発明の方法で単離された遺伝子を過剰発現するように作製されたSalmonellaである。どの化合物が野生型細胞だけでなく前記遺伝子を過剰発現する細胞の生存能力もしくは生育を低減するのかを同定するために、特定の環境における各細胞の生存能力および／または生育を、試験される化合物の存在下で調べる。
遺伝子が毒性遺伝子であると好ましい。
【００６４】
例えば、一つの実施態様では、微生物（例えばS. typhimurium）は、本願発明の第一の態様の方法によって同定された毒性遺伝子を過剰発現するように作製される。（ａ）“過剰発現”微生物と（ｂ）等価微生物（毒性遺伝子を過剰発現しない）のいずれかを、培養の細胞を感染するために用いられる。特定の試験化合物が毒性遺伝子機能を選択的に阻害するか否かは、（ａ）過剰発現微生物と（ｂ）等価微生物による宿主細胞の感染を妨げるのに必要とされる試験化合物の量を評価することによって決定される（少なくともある毒性遺伝子産物では、毒性遺伝子産物に結合することによって、試験化合物がそれらを不活性化し、それ自身が不活性化されることが予想される）。（ｂ）よりも（ａ）による感染を妨げるのにより多くの化合物が必要であれば、化合物が選択的であることを示唆する。微生物（例えば、Salmonella）がゲンタマイシン（宿主細胞を浸透しない）等の穏やかな抗生物質によって細胞外に破壊され、かつ、微生物による細胞の感染を妨げることにおける試験化合物の効果を、前記細胞を溶解して、どれくらい多くの微生物が存在するかを調べる（例えば寒天上にプレーティングする）と好ましい。
【００６５】
組ごとの選別および化合物の他の選別は、一般的にKirschとDi Domenico (1993) “治療能力を備えた天然産物の発見(The Discovery of Natural Products with a Therapeutic Potential)” (Ed, V.P.Gallo)、第６章、１７７−２２１頁、Butterworths, V.K.（参照としてここに取り込む）に記載されている。
組ごとの選別は、遺伝的に関連した二つの株を用いて化合物に対する相対的感受性を比較する多数の関連形式で設計することができる。もし株が単一の座で異なるのであれば、その標的に特異的な化合物は阻害剤に対する各株の感受性を比較することによって同定することができる。例えば、標的に特異的な阻害剤は、別の同質遺伝子姉妹株(isogenic sister strain)と比較した場合に、超感受性試験株(a super-sensitive test strain)に対してより活性である。寒天拡散形式では、化合物を有する皿もしくはウェルを取り巻く阻害ゾーンの大きさを測定することによって決定される。拡散のために、化合物の連続的な濃度勾配が形成され、阻害剤に対する株の感受性は、皿もしくはウェルからゾーンの縁までの距離に比例する。通常の抗菌剤、もしくは所望以外の活性の形式を備えた抗菌剤が、二つの株に対して同様の活性を備えているように一般的に観察される。
【００６６】
組みの株を含む、他のタイプの分子遺伝学的選別は、クローン化された遺伝子産物が対称株と比べて一つの株に過剰発現される。この種のアッセイの原理は、通常量の標的タンパク質を含む、同質遺伝子株よりクローン化された遺伝子産物に特異的な阻害剤に対して、標的タンパク質の向上した質を含む株が、より耐性であるべきである。寒天拡散アッセイでは、特異的化合物を取り巻くゾーンサイズが、他の同質遺伝子株と比べて標的タンパク質を過剰発現する株においてより小さいことが期待される。
【００６７】
化合物のさらなるあるいは別の選別は、以下の工程で達成される：
１．  本願発明の第一の態様の方法を用いて得られた変異体微生物を対照として用いる（例えば無毒性等の所定の表現型を備えている）。
２．  試験されるべき化合物を野生型微生物と混合する。
３．  野生型微生物を環境に導入する（試験化合物を伴うもしくは伴わない）。
４．  野生型微生物が環境に適応できないならば（化合物処置後、もしくは化合物存在下）、その化合物は、特定の環境に適応もしくは生存する、微生物の能力を低減するものである。
環境が動物の体であり、微生物が病原性微生物である場合には、この方法で同定された化合物は、微生物との感染を防止もしくは改良する薬剤に使用することができる。
【００６８】
本願発明の第十の態様は、第九の態様の方法で同定される化合物を提供する。
第十の態様の化合物の使用は、それが同定される方法、特に病原性微生物の宿主に関連すると考えられる。例えば、化合物が、哺乳動物に感染する細菌の毒性遺伝子もしくはそれにコードされるポリペプチドを使用する方法によって同定される場合には、その化合物を、細菌による哺乳動物の感染を処置することに使用することができる。
同様に、化合物が、植物に感染する真菌の毒性遺伝子もしくはそれにコードされるポリペプチドを用いる方法によって同定される場合には、その化合物を、その真菌による植物の感染を処置することに使用することができる。
【００６９】
本願発明の第十一の態様は、本願発明の第七の態様の遺伝子もしくはその核酸産物と選択的に相互作用し、かつ実質的にその機能を阻害する分子を提供する。
“その核酸産物”とは、あらゆるＲＮＡ、特に遺伝子から転写されたｍＲＮＡを含む。
好ましくは、前記遺伝子もしくは前記核酸産物と選択的に相互作用し、かつ実質的にその機能を阻害する分子は、アンチセンス核酸もしくは核酸誘導体である。
さらに好ましくは、前記分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的核酸配列に特異的に結合することができる一本鎖核酸である。適切な標的配列に結合することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。これらが遺伝子のセンスもしくはコード鎖に相補的であるから、これらの核酸はしばしば“アンチセンス”と称される。最近になって、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖に結合する、トリプルヘリックス形成の可能性が示された。オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡダブルヘリックスの主要な溝の配列を認識しうることを見出した。トリプルヘリックスは、それによって形成される。これは、主要な溝の水素結合部位の認識を介して二本鎖ＤＮＡを特異的に結合する配列特異的分子を合成することができることを示唆する。
明らかに、アンチセンス核酸もしくはオリゴヌクレオチドの配列は、問題の遺伝子のヌクレオチド配列との関係によって容易に決定することができる。例えば、アンチセンス核酸もしくはオリゴヌクレオチドを、図１１または１２に示された配列の一部、特に毒性遺伝子の一部を形成する配列に相補的となるように設計することができる。
【００７１】
オリゴヌクレオチドは、細胞内在性ヌクレアーゼによって分解もしくは不活性化される。この問題に対抗するために、例えば変更された内部ヌクレオチド結合を備えたものであって、自然に生じたホスホジエステル結合が別の結合に置換されているもの等の、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、Agrawalら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083は、オリゴヌクレオチドホスホラミダート類およびホスホロチオアート類を用いたＨＩＶ−１の組織培養の阻害が増大することを示した。Sarinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451は、オリゴヌクレオチドメチルホスホナート類を用いたＨＩＶ−１の阻害が増大したことを示した。Agrawalら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794は、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレオチドホスホロチオアートを用いた、早期感染および慢性的に感染した細胞培養の両方においてＨＩＶ−１複製の阻害を示した。Leitherら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434は、オリゴヌクレオチドホスホロチオアートによるインフルエンザウイルス複製の組織培養における阻害を報告している。
【００７２】
人工的な結合を備えたオリゴヌクレオチドは、in vivoにおける分解に耐性があることが示された。例えば、Shawら (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750は、ほかに修飾されていないオリゴヌクレオチドが、あるキャップ構造で３’末端がブロックされると、in vivoでヌクレアーゼに対してより耐性が強まること、並びに、キャップが付加されていないオリゴヌクレオチドホスホロチオアートはin vivoで切断されないことを報告している。
【００７３】
オリゴヌクレオシドホスホロチオアートを合成するＨ−ホスホナートアプローチの詳細な説明は、AgrawalとTang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544に与えられており、その教示するところを参照としてここに取り込む。オリゴヌクレオシドメチルホスホナート類、ホスホロジチオアート類、ホスホラミダート類、ホスファートエステル類、架橋ホスホラミダート類および架橋ホスホロチオアート類が、当該技術分野で知られている。例えば、AgrawalとGoodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539；Nielsenら (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911；Jagerら (1988) Biochemistry 27, 7237；Uznanskiら (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401；Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517；CrosstickとVyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693；Agrawalら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405を参照。これらの教示するところを参照としてここに取り込む。別の合成もしくは産生方法も可能である。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）も合成および適用することができる。
【００７４】
本願発明で使用できるオリゴヌクレオチドは、内在性ヌクレオリティック酵素による分解に対抗するように設計されることが好ましい。オリゴヌクレオチドのin vivo分解によって、長さが短くなったオリゴヌクレオチド分解産物が生じる。このような分解産物は、対応する全長と比べて、非特異的ハイブリダイゼーションに従事しそうであり、効果が弱そうである。しかして、体内での分解に耐性であり、標的細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを用いることが望ましい。本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば結合のリン酸をイオウで置換することにより、天然のホスホジエステル結合の一つ以上の内部人工インターヌクレオチド結合(internucleotide linkages)を置換することによってin vivoでの分解に対して耐性にすることができる。用いられる結合の例は、ホスホロチオアート類、メチルホスホナート類、スルホン、スルファート、ケチル(ketyl)、ホスホロジチオアート類、種々のホスホラミダート類、ホスファートエステル類、架橋ホスホロチオアート類および架橋ホスホラミダート類を含む。他のインターヌクレオチド結合は当該技術分野で周知であるため、この様な例は限定的と言うよりむしろ例証的である。例えば、Cohen, (1990) Trends in Biotechnology参照。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合に代えて置換された一つ以上のこれらの結合を備えたオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野でよく知られており、混合インターヌクレオチド結合を備えたオリゴヌクレオチドを産生する合成経路を含む。
【００７５】
５’もしくは３’末端ヌクレオチドに類似した基を“キャッピング(capping)”もしくは取り込むことによって内因性酵素による伸長に対して耐性とすることができる。キャッピング用試薬は、Applied BioSystems Inc, Foster City, CAのAmino-Link IIＴＭ等、商業的に利用することができる。キャッピング方法は、例えばShawら (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750およびAgrawalら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (17), 7595-7599に記載されており、その教示するところを参照としてここに取り込む。
【００７６】
ヌクレアーゼ攻撃に対するオリゴヌクレオチドを作成するさらなる方法は、ここに参照として取り込むTangら (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735に記載されているように、それらが“自己安定化”されることである。自己安定化されたオリゴヌクレオチドは、３’末端にヘアピンループ構造を備え、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび胎児性ウシ血清による分解に対して耐性の増大を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定化領域は、相補的核酸とのハイブリダイゼーションを妨害することなく、マウスにおける薬力学および安定性の研究により、それらの直線状部に関して自己安定化オリゴヌクレオチドのin vivoにおける持続性が増大することが示された。
【００７７】
本発明によれば、塩基対形成のアンチセンスオリゴヌクレオチド特性の固有の結合特異性は、in vivoの意図した座にアンチセンス化合物の有効性を限定することによって増強され、使用される用量をより低くし、全身的な影響を最小にする。しかして、オリゴヌクレオチドは、所望の効果を達成するために局在的に用いられる。所望の座におけるオリゴヌクレオチドの濃度は、オリゴヌクレオチドを全身的に投与した場合よりずっと高く、その治療効果は、顕著に低い全体量を用いて達成することができる。局在的高濃度のオリゴヌクレオチドは、標的細胞の浸透を増強し、標的核酸配列の翻訳を効果的にブロックする。
【００７８】
オリゴヌクレオチドは、薬剤の局在化投与に適したあらゆる手段によって座に運ばれる。例えば、オリゴヌクレオチド溶液は、部位に直接注入することができ、また、注射器を用いて注入することによって輸送されてもよい。また、オリゴヌクレオチドを、所望の部位に配された場合に、周りの座にオリゴヌクレオチドが放出される移植器に取り込むこともできる。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル材を介して投与されるのが最も好ましい。ヒドロゲルは、非炎症性かつ生分解性である。現在のところ、この様な材料の多くが知られており、天然および合成ポリマーからなるものも含まれる。好ましい実施態様では、この方法は、体温以下では液状であるが、体温付近では形状維持半固形ヒドロゲルを形成するヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロゲルは、エチレンオキシド−プロピレンオキシド繰り返し単位のポリマーである。ポリマーの特性は、ポリマーの分子量、並びに、ポリマーにおけるポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドの相対的割合に依存する。好ましいヒドロゲルは、約１０〜約８０重量％のエチレンオキシドと、約２０〜約９０重量％のプロピレンオキシドを含む。特に好ましいヒドロゲルは、約７０重量％のポリエチレンオキシドと、約３０重量％のポリプロピレンオキシドを含む。用いられるヒドロゲルは、例えば、BASF Corp., Parsippany, NJの、商品名PluronicＲを利用することができる。
【００８０】
この実施態様では、ヒドロゲルを液体状態まで冷却し、この液体に、ヒドロゲルのグラム当たり約１ｍｇのオリゴヌクレオチドの濃度となるまでオリゴヌクレオチドを混合する。得られた混合物を、例えば診察中にスプレーもしくは塗布することによって、あるいはカテーテルもしくは内科的方法を用いて、処置されるべき表面上に適用する。ポリマーが温められるにつれ、固化してゲルが形成され、ゲルの正確な組成物によって決められた時間をかけて、オリゴヌクレオチドがゲルから周辺細胞へと拡散する。
【００８１】
オリゴヌクレオチドを、リポソーム、ミクロカプセル、および移植可能な装置を含む、商業的に利用可能あるいは科学文献に記載された他の移植手段によって投与することができる。例えば、移植は、ポリアンヒドリド類、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸およびポリグリコール酸並びにこれらのコポリマー類、コラーゲン、およびタンパク質ポリマー類等の生分解材料、もしくはエチレンビニルアセタート（ＥＶＡｃ）、ポリビニルアセタート、エチレンビニルアルコール、およびその誘導体等の非生分解材料を、オリゴヌクレオチドを局所的に輸送するために用いることができる。融解もしくは溶剤蒸発技術を用いて、この材料が重合もしくは固化されるとき、もしくは、この材料と共に機械的に混合して、オリゴヌクレオチドを材料中に取り込むことができる。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、デキストラン被覆されたシリカビーズ、ステント、カテーテル等の移植可能な装置のための被覆に混合もしくは適用される。
【００８２】
オリゴヌクレオチドの用量は、オリゴヌクレオチドの大きさと、投与の目的に依存する。一般的に、その範囲は、処置される組織の表面積に基づいて計算される。有効量のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さおよび化学的組成に幾分依存するが、一般的には、組織表面積の平方センチメートル当たり約３０〜３０００μｇの範囲である。
【００８３】
オリゴヌクレオチドは、治療および予防の両方の目的のために患者に全身的に投与しても良い。オリゴヌクレオチドは、非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内）もしくは経口的、鼻腔内、もしくはオリゴヌクレオチドが患者の血流に到達して循環できる他の手段等の有効な方法によって投与することができる。全身的に投与されたオリゴヌクレオチドは、局所的に投与されたオリゴヌクレオチドに付加されることが好ましいが、局在的投与無しでも利用できる。この目的には、成人に対して投薬当たり約０．１〜約１０グラムの範囲の用量が一般的に有効である。
【００８４】
本願発明のこの態様の分子は、遺伝子が単離された微生物、もしくは前記微生物の近縁によって引き起こされたあらゆる感染を処置もしくは予防することに使用できると考えられる。しかして、前記分子は抗生物質である。
しかして、本願発明の第十二の態様は、薬剤に使用するための、本願発明の第十一の態様の分子を提供する。
【００８５】
本願発明の第十三の態様は、微生物に感染した、あるいは感染の疑いのある宿主を処置する方法を提供し、この方法は、本願発明の第十一の態様に係る有効量の分子を投与することを含み、遺伝子が前記微生物、もしくは前記微生物の近縁中に存在する。
“有効量”とは、感染を実質的に防止もしくは改善する量を示す。“宿主”とは、微生物に感染されうるあらゆる動物もしくは植物を含む。
【００８６】
本願発明の第十一の態様の分子の薬学的製剤は、本願発明の一部をなすと考えられる。この様な薬学的製剤は、一つ以上の許容できるキャリアーと共に前記分子を含む。キャリアー（類）は、本願発明の前記分子と適合しかつその受容側にとって有毒でないという意味において“許容可能”でなくてはならない。キャリアーは、典型的に、無菌および発熱性物質を含まない水もしくは生理食塩水である。
【００８７】
上述したように、以下の実施例４に詳細に記載するように、ある毒性遺伝子が、ＶＧＣ２と称するクロモソームの領域で、Salmonella typhimuriumに凝集していることを見出した。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験により、ＶＧＣ２の少なくとも一部に相同な配列が、Salmonellaの多くの種および株に見出されるが、試験したE.coliおよびShigella株には存在しないことが調べられた（実施例４参照）。これらの配列は、少なくともSalmonellaにおいて、保存された遺伝子、および毒性遺伝子の少なくともいくつかにほぼ確実に対応している。他のSalmonella種の等価遺伝子、並びに、もし存在するならば、他の腸もしくは別の細菌の等価遺伝子も毒性遺伝子であると信じられる。
ＶＧＣ２領域内の遺伝子が毒性遺伝子であるか否かは、容易に調べられる。例えば、本願発明の第二の態様の方法で同定されたＶＧＣ２内の遺伝子（Salmonella typhimuriumに適用され、かつ環境がマウス等の動物である場合）は、毒性遺伝子である。また、毒性遺伝子も、遺伝子に変異を起こし（好ましくは非極性変異）、変異株が無毒であるか否かを調べることにより同定される。選択された遺伝子に変異体を作成する方法は、周知であり、以下に記載する。
【００８８】
本願発明の第十四の態様は、Salmonella typhimuriumのＶＧＣ２ ＤＮＡもしくはその一部、あるいは前記ＤＮＡの変異形もしくはその一部の変異形を提供する。
Salmonella typhimuriumのＶＧＣ２ ＤＮＡは、図８に図式的に描写され、実施例４に与えられた情報を用いてSalmonella typhimurium ATCC 14028（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAから利用できる；またＮＣＴＣ, Public Health Laboratory Service, Colindale, UK  受託番号ＮＣＴＣ１２０２１にも受託されている）から容易に得られる。例えば、図１１および１２に示された配列から得られるプローブは、Salmonella typhimuriumゲノムライブラリーからλクローンを同定するのに用いることができる。標準的なゲノム歩行法は、全てのＶＧＣ２ ＤＮＡを得るために用いることができる。図８に示された制限地図は、ＶＧＣ２のＤＮＡフラグメントを同定および局在化するために用いることができる。
【００８９】
“Salmonella typhimuriumのＶＧＣ２ ＤＮＡの一部”とは、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドのＶＧＣ２を含むあらゆるＤＮＡ配列を意味する。ＶＧＣ２ ＤＮＡの特に好ましい一部は、図１１に示された配列、もしくはその一部である。ＶＧＣ２ ＤＮＡの他の特に好ましい一部は、図１２に示された配列もしくはその一部である。
有利に、ＶＧＣ２ ＤＮＡの一部は遺伝子もしくはその一部である。
【００９０】
遺伝子は、当該技術分野で知られたコンピュータープログラムを用いた読み取り枠の統計学的解析によって、ＶＧＣ２領域内に同定することができる。読み取り枠が約１００コドン以上であれば、それは遺伝子であろう（しかし、これより短い遺伝子が知られている）。読み取り枠が遺伝子のポリペプチドコード領域に対応するか否かは、実験的に調べることができる。例えば、読み取り枠に対応するＤＮＡの一部を、前記ＤＮＡにハイブリダイズする、ｍＲＮＡが発現されるか否かを調べるために、ノーザン（ＲＮＡ）ブロットのプローブとして使用することができ、もしくは、さらに、変異を読み取り枠に導入してもよく、微生物の表現型に与える変異の効果を調べることができる。もし表現型が変更されれば、読み取り枠は遺伝子に対応する。ＤＮＡ配列内の遺伝子の同定方法は当該技術分野で周知である。
【００９１】
“前記ＤＮＡの変異形もしくはその一部の変異形”とは、本願発明の第七の態様の用語“変異形”によって定義されたあらゆる変異形を含む。
しかして、Salmonella typhimuriumのＶＧＣ２ ＤＮＡの変異形は、Salmonella typhiおよびSalmonella enterica等の他のSalmonella種の等価遺伝子もしくはその一部、並びに、他の腸内細菌等の他の細菌の等価遺伝子もしくはその一部を含む。
“等価遺伝子”とは、機能的に等価な遺伝子、並びに、変異が類似した表現型（無毒性等）へと導く遺伝子を含む。本願発明の以前には、ＶＧＣ２もしくはそれに含まれた遺伝子は同定されておらず、毒性決定因子に関連づけられなかったと考えられる。
【００９２】
しかして、本願発明のさらなる態様は、細菌がＶＧＣ２の遺伝子と同じもしくは等価の遺伝子を正常に含む場合には、前記遺伝子が変異もしくは欠失した変異細菌；細菌がＶＧＣ２の遺伝子と同じもしくは等価の遺伝子を正常に含む場合には、前記遺伝子が変異もしくは欠失した変異細菌を作製する方法を提供する。以下は、ＶＧＣ２遺伝子を不活性化するのに好ましい方法である。最初に、ハイブリダイゼーションのプローブとしてＶＧＣ２のフラグメントを用いて、Salmonella λＤＮＡライブラリーもしくは他のＤＮＡライブラリーから、ＤＮＡフラグメントの遺伝子をサブクローニングし、制限酵素部位について遺伝子をマッピングし、Escherichia coliにおいてＤＮＡシークエンシングを行って遺伝子を調べる。できれば制限酵素によってクローン化遺伝子のコード領域の一部を削除した後に、制限酵素を用いて、遺伝子のコード領域に抗生物質（例えばカナマイシン）耐性をコードするＤＮＡセグメントを導入する。方法および抗生物質耐性マーカーを含むＤＮＡ構築物を利用して、関心の向けられた遺伝子の不活性化が、好ましくは非極性であること、すなわち、関心の向けられた遺伝子の下流の遺伝子の発現に影響しないことを確実にすることができる。次いで、遺伝子の変異形を、ファージＰ２２形質導入を用いてE.coliからSalmonella typhimuriumに転移させ、クロモソームへの変異遺伝子の相同的組換えについてサザンハイブリダイゼーションによって形質導入体をチェックする。
【００９３】
このアプローチは、一般にSalmonellaで用いられ（S. typhiで用いることもできる）、さらに詳しいことは、Galanら (1992) 174, 4338-4349を含む多くの文献に見られる。
さらなる態様は、ワクチンにおける変異細菌の使用；前記細菌および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物；Salmonella typhimuriumのＶＧＣ２ＤＮＡもしくはその一部にコードされたポリペプチド、もしくはその一部の変異形；宿主に感染もしくは疾患を引き起こす細菌の能力を低減する化合物を同定する方法；前記方法によって同定されうる化合物；ＶＧＣ２の遺伝子と選択的に相互作用し、かつ実質的に機能を阻害する分子もしくはその核酸産物；並びにその医療的使用および薬学的組成物を提供する。
【００９４】
ＶＧＣ ＤＮＡは、本発明の第一および第二の態様の方法で同定された遺伝子、並びにその局在によって同定された遺伝子（しかし、本願発明の第一および第二の態様の方法で同定されうる）を含む。本願発明のこれらのさらなる態様は、本願発明の第四、五、六、七、八、九、十、十一、十二および十三の態様に密接に関連しており、従って、これらの態様について与えられた情報、並びにこれらの態様に関連して示された選択を、これらのさらなる態様に適用する。
遺伝子が、ＶＧＣ２に由来し、S. typhi等のSalmonellaの別の種に由来する等価遺伝子であることが好ましい。変異細菌が、S. typhimurium変異体、もしくはS. typhi等のSalmonellaの別の種の変異体であると好ましい。
少なくともいくつかのＶＧＣ２の遺伝子が、S. typhimurium等の細菌が細胞に侵入する能力を与えると信じられる。
【００９５】
本願発明を、以下の実施例および図面を参照しながら記載する。
図１は、本願発明の特に好ましい方法を図式的に例証する。
図２は、EcoRVで切断した後の、１２のS. typhimuriumの接合個体(exconjugants)に由来するＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を示す。フィルターを、小型Ｔｎ５トランスポゾン(mini-Tn5 transposon)のカナマイシン耐性遺伝子でプローブした。
図３は、半分のミクロタイター皿からの、４８のS. typhimurium接合個体（Ａ１−Ｈ６）に由来するＤＮＡのコロニーブロットハイブリダイゼーション解析を示す。フィルターを、最初の２４コロニー（Ａ１−Ｄ６）のプールから単離されたＤＮＡからのラベルされ増幅されたタグを含むプローブとハイブリダイズした。
【００９６】
図４は、マウスに注入された、ミクロタイター皿の９５のS. typhimurium接合個体（Ａ１−Ｈ１１）のＤＮＡコロニーブロットハイブリダイゼーション解析を示す。複製フィルターを、プールからの標識され増幅されたタグとハイブリダイズし（接種パターン）、もしくは、感染した動物の脾臓から回収された１００００以上のプールされたコロニーから単離されたＤＮＡからのラベルされ増幅されたタグとハイブリダイズした（脾臓パターン）。コロニーＢ６、Ａ１１およびＣ８は、両方のフィルターに弱いハイブリダイゼーションシグナルを生じた。コロニーＡ３、Ｃ５、Ｇ３（aroA）およびＦ１０からのハイブリダイゼーションシグナルは、接種パターンには存在するが、脾臓パターンには存在しない。
図５は、本願発明の方法を用いて単離されたSalmonella遺伝子の配列と、Escherichia coli clpプロテアーゼゲノムとの比較を示す。
図６は、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜３６）。
【００９７】
図７は、S. typhimuriumクロモソームのＶＧＣ２のマッピングを示す。（Ａ）ＶＧＣ２の３つの領域からのＤＮＡプローブは、Mud-P22プロファージにロックされたものを含む一組のS. typhimurium株からの溶解物のサザンハイブリダイゼーション解析に用いられた。７．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメント（図８のプローブＡ）にハイブリダイズした溶解物が示されている。使用された他の二つのプローブが、同じ溶解物にハイブリダイズした。（Ｂ）ファージの挿入ポイントおよびパッケージング方向は、分単位でマップ位置と共に示されている（edition VIII, 実施例４の参考文献２２）。ファージの名称は、以下の株に対応する：１８Ｐ、ＴＴ１５２４２；１８Ｑ、１５２４１；１９Ｐ、ＴＴ１５２４４；１９Ｑ、ＴＴ１５２４３；２０Ｐ、ＴＴ１５２４６および２０Ｑ、ＴＴ１５２４５（実施例４の参考文献）。マッピングされた遺伝子の局在箇所が水平な棒で示され、他の遺伝子のおよその位置が示されている。
【００９８】
図８は、ＶＧＣ２の物質的かつ遺伝学的なマップを示す。（Ａ）１６のトランスポゾン挿入の位置が線の上に示されている。ＶＧＣ２の範囲は、太線で示されている。産物が、種々の二つの成分制御システムの、それぞれセンサーおよび制御成分に類似するＯＲＦ１２および１３を除いて、類似した遺伝子の名称と共に、実施例４の説明で記載されたＯＲＦ群の転写の位置および方向が、線の下の矢印で示されている。（Ｂ）重複クローンの局在箇所およびＭｕｄ−Ｐ２２プロファージ株ＴＴ１５２４４からのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限フラグメントが塗りつぶされた棒として示されている。マッピングされたλクローンの部位のみが示されており、クローンはこれらの限度を超えて伸長しても良い。（Ｃ）制限部位の位置がマークされている：Ｂ，BamHI；Ｅ，EcoRI；Ｖ，EcoRV；Ｈ，HindIII；Ｐ，PstIおよびＸ，XbaI。図７でプローブとして用いられた７．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメント（プローブＡ）の位置、および図１０でプローブとして用いられた２．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（プローブＢ）の位置が、制限地図の下に示されている。配列１（図１１に記載）および配列２（図１２に記載）の位置が、細い矢印で示されている（ラベルされた配列１および配列２）。
【００９９】
図９は、ＶＧＣ２の境界をマッピングを記載する。（Ａ）E.coli K12クロモソームの３７〜３８分にマップされた遺伝子の位置は、S. typhimurium LT2クロモソームの対応する領域と共に並んでいる（３０〜３１分）。ＶＧＣ２領域の拡大されたマップは、プローブとして用いられた１１のS. typhimurium (S.t.)ＤＮＡフラグメント（太い棒）と、それらを作製するために用いられた制限部位：Ｂ，BamHI；Ｃ，ClaI；Ｈ，HindIII；Ｋ，KpnI；Ｐ，PstI；Ｎ，NsiIおよびＳ，SaiIと共に示されている。E.coli K12(E.c.)ゲノムＤＮＡにハイブリダイズしたプローブは＋で示され、ハイブリダイズしなかったプローブは−で示されている。図１０は、ＶＧＣ２がSalmonellae間で保存され、かつ特異的であることを示している。Salmonella血液型亜型(serovars)と他の病原性細菌のゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩ（Ａ）、ＨｉｎｄIIIもしくはＥｃｏＲＶ（Ｂ）で制限し、プローブとしてλクローン７からの２，２ｋｂのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを用いて、サザンハイブリダイゼーション解析にかける（プローブＢ図２）。フィルターを、厳密（Ａ）もしくは非厳密（Ｂ）な条件下でハイブリダイズし、洗浄する。
【０１００】
図１１は、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
図１２は、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
図７〜１２は、実施例４に最も関連する。
【０１０１】
【実施例】
実施例１：Salmonella typhimuriumの毒性遺伝子の同定
材料および方法
細菌株とプラスミド
Salmonella typhimurium株１２０２３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）株１４０２８と等価）を、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー（ＮＣＴＣ）, Public Health Laboratory Service, Colindale, London, UKから得た。この株の自発的ナリジキシン酸耐性変異体（１２０２３Ｎａｌｒ）を研究室で選別した。株１２０２３の別の誘導体、ＣＬ１５０９（ａｒｏＡ：：Ｔｎ１０）をFred Heffronから入手した。Escherichia coli株ＣＣ１１８λｐｉｒ（△［ａｒａ−ｌｅｕ］、ａｒａＤ、△ｌａｃＸ７４、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｐｈｏＡ２０、ｔｈｉ−１、ｒｐｓＥ、ｒｐｏＢ、ａｒｇＥ（Ａｍ）、ｒｅｃＡ１、λｐｉｒファージ溶原(lysogen)）およびＳ１７−１λｐｉｒ（Ｔｐｒ、Ｓｍｒ、ｒｅｃＡ、ｔｈｉ、ｐｒｏ、ｈｓｄＲ−Ｍ＋、ＲＰ４：２−Ｔｃ：Ｍｕ：ＫｍＴｎ７、λｐｉｒ）をKenneth Timmisから入手した。E.coli ＤＨ５αを、S. typhimurium ＤＮＡを含有するｐＵＣ１８（Gibco-BRL）とBluescript（Stratagene）プラスミドを繁殖させるために用いた。プラスミドｐＵＴ小型Ｔｎ５Ｋｍ２（de Lorenzoら, 1990）は、Kenneth Timmisから入手した。
【０１０２】
半ランダム配列タグの構築とリゲーション
オリゴヌクレオチドプール：
「配列１」
0004220195.tif 000002
を、オリゴヌクレオチド合成装置（Applied Biosystems, model 380B）で合成した。１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、および標的として２００ｐｇのＲＴ１を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）；２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；１００ｐＭのプライマーＰ３およびＰ５；並びに２．５ＵのAmplitaq(Perkin-Elmer Cetus)を含んだ１００μｌのＰＣＲで、ＲＴ１から二本鎖ＤＮＡタグを調製した。温度循環条件は、９５℃で３０秒、５０℃で４５秒、７２℃で１０秒を３０サイクルであった。ＰＣＲ産物をゲル精製し（Sambrookら, 1989）、エルチップＤ(elutipD)カラムを通し（SchleicherとSchullのものを利用できる）、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＴ小型Ｔｎ５Ｋｍ２にリゲーションする前にＫｐｎＩで切断した。リゲーションでは、プラスミドをＫｐｎＩで切断し、小ウシ腸アルカリホスファターゼ（Gibco-BRL）で脱リン酸化した。切断されたプラスミドＤＮＡから未切断のものを除去するために、リゲーションの前に、直線状になったプラスミド分子をゲル精製した（Sambrookら, 1989）。リゲーション反応溶液は、約５０ｎｇの各プラスミドと二本鎖タグＤＮＡを、酵素を添加したバッファーに１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Gibco-BRL）を含有した２５μｌに含む。
【０１０３】
リゲーションは２４℃で２時間行った。プラスミドＤＮＡの自己リゲーションもしくは未切断プラスミドＤＮＡのいずれかから生じる細菌コロニー比率を調べるために、二本鎖タグＤＮＡをリゲーション反応から省略した対照反応を行った。二本鎖タグＤＮＡを含有するリゲーション反応から１８５コロニーが生じたのと比較して、これは、E.coli CC118（Sambrookら, 1989）の形質転換後にアンピシリン耐性細菌コロニーを産生しなかった。
【０１０４】
細菌性形質転換および交配
ｐＵＴ小型Ｔｎ５Ｋｍ２と二本鎖タグＤＮＡとの間のいくつかのリゲーションの産物を、E.coli CC118(Sambrookら, 1989)を形質転換するために用いた。全体で約１０３００の形質転換体をプールし、そのプールから抽出されたプラスミドＤＮＡをE.coli Ｓ−１７λｐｉｒ（de Lorenzo & Timmis, 1994）を形質転換するために用いた。交配実験では、約４００００のアンピシリン耐性E.coli Ｓ−１７λｐｉｒ形質転換体のプールと、S. typhimurium １２０２３ Ｎａ１ｒを、光学密度（ＯＤ）５８０が１．０となるまで分けて培養した。各培養の分注量（０．４ｍｌ）を５ｍｌ １０ｍＭのＭｇＳＯ４に混合し、Millipore膜（０．４５μｍ径）で濾過した。このフィルターを、Ｍ９塩（de Lorenzo & Timmis, 1994）を含有する寒天の表面に置き、３７℃で１６時間インキュベートした。この細菌を、３７℃で４０分間液体ＬＢ培地にフィルターを振り混ぜることによって回収し、１００μｇｍｌ−１ナリジキシン酸（ドナー株に対する選別）および５０μｇｍｌ−１カナマイシン（受容個体株の選別）を含むＬＢ培地上に前記懸濁液をプレートすることによって接合個体を選別した。ナリジキシン酸耐性（ｎａｌｒ）、カナマイシン耐性（ｋａｎｒ）コロニーを、MacConkey ラクトース指示培地（E.coliとS. typhimuriumとを区別するため）およびアンピシリン含有ＬＢ培地に移すことによって各接合個体をチェックした。約９０％のｎａｌｒ、ｋａｎｒコロニーがアンピシリンに敏感であり、これらが確実な転位から得られたことを示している（de Lorenzo & Timmis, 1994）。個々のアンピシリン感受性接合個体を、ＬＢ培地を含む９６ウェルのミクロタイター皿に貯蔵した。−８０℃で長期間貯蔵するために、７％ ＤＭＳＯもしくは１５％ グリセロールのいずれかをこの培地に添加した。
【０１０５】
変異体の表現型の特徴決定
栄養素要求体を同定するために、Ｍ９塩類と０．４％グルコース（Sambrookら, 1989）を含む固相培地上に、変異体をミクロタイター皿からレプリカプレーティングした。寒天プレート上のコロニーを低倍率の顕微鏡で調べることによって、荒れたコロニー形態の変異体を検出した。
【０１０６】
コロニーブロット、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、ＤＮＡラベリングおよびハイブリダイゼーション
コロニーブロットハイブリダイゼーションでは、４８ウェルの金属レプリケーター（Sigma）を用いて、５０μｇｍｌ−１のカナマイシンを含有するＬＢ寒天の表面上に置かれたHybond N ナイロンフィルター（Amersham, UK）にミクロタイター皿から接合個体を移した。３７℃で夜通しインキュベートした後、細菌コロニーを支持するフィルターを除去し、室温で１０分間乾燥させた。細菌を０．４Ｎ ＮａＯＨで溶解し、フィルターを、フィルター製造元の指示通りに０．５Ｎ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．０で洗浄した。細菌性ＤＮＡをStratalinker（Stratagene）のＵＶ光にあててフィルターに固定した。３２Ｐラベルプローブへのハイブリダイズを、先に記載されたように厳密な条件下で行った（Holdenら, 1989）。ＤＮＡ抽出のために、S. typhimuriumトランスポゾン変異株を、ミクロタイター皿で液状ＬＢ培地に生育するか、固体培地で生育させた後にＬＢ培地に再懸濁した。全ＤＮＡを、Ausubelら（1987）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法で調製した。簡単に言えば、１５０〜１０００μｌの細胞を遠心して沈降させ、５７６μｌのＴＥに再懸濁した。これに、１５μｌの２０％ ＳＤＳおよび３μｌの２０ｍｇｍｌ−１のプロテイナーゼＫを添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、１６６μｌの３Ｍ ＮａＣｌを添加し、徹底的に混合し、次いで、８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢと０．７Ｍ ＮａＣｌを添加した。徹底的に混合した後、この溶液を６５℃で１０分間インキュベートした。フェノールとフェノール−クロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをイソプロパノールの添加によって沈降させ、７０％エタノールで洗浄し、約１μｇ μｌ−１の濃度になるようにＴＥに再懸濁した。
【０１０７】
ラベルされたプローブを生成するために、ＤＮＡサンプルを２回のＰＣＲにかけた。最初のＰＣＲは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３；５０ｍＭ ＫＣｌ；２ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０；各々２００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ；２．５ユニットのAmplitaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus）；各々７７０ｎｇのプライマーＰ２およびＰ４；および５μｇの標的ＤＮＡを含む１００μｌの反応液で行った。９５℃で４分間の最初の変性後、温度サイクルは、５０℃で４５秒、７２℃で１０秒、および９５℃で３０秒を２０サイクルからなる。ＰＣＲ産物を、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／１）で抽出し、エタノールで沈降させた。ＤＮＡを１０μｌのＴＥに再懸濁し、ＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファー中の１．６％Seaplaque（FMC Bioproducts）を電気泳動することによって精製した。約８０ｂｐのフラグメントを含むゲルスライスを切り出し、第二のＰＣＲに用いた。この反応は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．３；５０ｍＭ ＫＣｌ；２ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０；各々５０μＭのｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ；１０μｌ ３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Amersham）；各々１５０ｎｇのプライマーＰ２およびＰ４；約１０ｎｇの標的ＤＮＡ（最初のＰＣＲ産物を含有する１−２μｌの１．６％Seaplaqueアガロース）；０．５ユニットのAmplitaqポリメラーゼを含む２０μｌの反応液で行った。この反応液に２０μｌのミネラルオイルを載せ、温度サイクルを上述の通りに行った。放射活性ラベルの取り込みを、Whatman DE81ペーパーへの吸収によって定量した（Sambrookら, 1989）。
【０１０８】
感染の研究
タグが付されたトランスポゾンを含有する各々のSalmonella接合個体を、３７℃で夜通し、ミクロタイタープレートで、２％トリプトン、１％イースト抽出物、０．９２％ ｖ／ｖ グリセロール、０．５％ Ｎａ２ＰＯ４、１％ ＫＮＯ３（ＴＹＧＰＮ培地）（Ausubelら, 1987）で生育させた。金属レプリケーターを用いて、少量のオーバーナイト培養物を新鮮なミクロタイタープレートに移し、その培養物をＯＤ５８０（Titertek Multiscanミクロタイタープレートリーダーを用いて測定）が各ウェルとも約０．２となるまで３７℃で培養した。個々のウェルの培養をプールし、ＯＤ５５０を分光光度計を用いて調べた。培養物を、約５ｘ１０５  ｃｆｕｍｌ−１となるまで無菌食塩水で希釈した。さらに、希釈物を、ナリジキシン酸（１００ｍｇ ｍｌ−１）およびカナマイシン（５０ｍｇ ｍｌ−１）を含むＴＹＧＰＮ上にプレートして、接種物にｃｆｕが存在することを確認した。
【０１０９】
３匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（２０−２５ｇ）のグループに、約１ｘ１０５ｃｆｕ ｍｌ−１を含む０．２ｍｌの細菌懸濁液を腹腔内に注入した。接種後３日でマウスをと殺し、細菌を回収するために脾臓を取りだした。それぞれの脾臓の半分を、ミクロフュージチューブ(a microfuge tube)の１ｍｌの無菌食塩水にホモジェナイズした。細胞片を沈殿させ、懸濁液の状態にある細胞を含有する１ｍｌの食塩水を新鮮なチューブに移し、ミクロフュージで２分間遠心した。上清を吸引し、ペレットを１ｍｌの無菌蒸留水に再懸濁した。一連の希釈を無菌蒸留水に作製し、１００ｍｌの各希釈物を、ナリジキシン酸（１００ｕｇ ｍｌ−１）およびカナマイシン（５０ｕｇ ｍｌ−１）を含むＴＹＧＰＮ寒天上にプレートした。細菌を、１０００〜４０００コロニーを含むプレートから回収し、各脾臓から回収された全部で１００００以上のコロニーをプールし、コロニーブロットを選別するプローブのＰＣＲ生成用ＤＮＡを調製するために用いた。
【０１１０】
毒性遺伝子クローニングおよびＤＮＡシークエンシング
全ＤＮＡをS. typhimurium接合個体から単離し、それぞれSstI、SalI、PstI、SphIで切断した。分解物をアガロースゲルで分画し、Hybond Ｎ＋膜（Amersham）に移し、プローブとしてｐＵＴ小型Ｔｎ５Ｋｍ２のカナマイシン耐性遺伝子を用いてはサザンハイブリダイゼーション解析を行った。このプローブは、ジゴキシゲニン（Boehringer-Mannheim）でラベルされ、化学発光検出を製造元の指示に従って行った。ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、上述の通りである。３−５ｋｂの範囲のハブリダイズしたフラグメントを生じる制限酵素を用いて、調製用アガロースゲル用のＤＮＡを切断し、ハイブリダイゼーションシグナルのサイズに対応するＤＮＡフラグメントをこれから切り出し、精製して、ｐＵＣ１８にリゲートした。リゲーション反応は、E. coli DH5aをカナマイシン耐性に形質転換するために用いられた。カナマイシン耐性形質転換体のプラスミドを、エルチップＤカラムを通過させて精製し、制限酵素切断でチェックした。プラスミド挿入物を、−４０プライマーと逆シークエンシングプライマー（United States Biochemical Corporation）、並びにそれぞれＴｎ５のＩおよびＯ末端にアニールするプライマー６（５’−ＣＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）およびＰ７（５’−ＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ７）を用いてジデオキシ法（Sangerら, 1977）で部分的に配列決定した。ヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列を、Macintosh SE/30コンピューターでMacvector 3.5ソフトウェアパッケージを用いて作製した。配列を、ヒトゲノム地図作製計画資源センター（the Human Genome Mapping Project Resource Centre, Harrow, UK）のＵＮＩＸ（登録商標）／ＳＵＮコンピューターシステムを用いて、ＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋ ＤＮＡデータベースと比較した。
【０１１１】
結果
タグ設計
ＤＮＡタグの構造は、図１ａに示されている。それぞれのタグは、不変配列の“腕”が隣接した可変中心領域からなる。この中心領域配列（［ＮＫ］２０）は、一般に用いられる６ｂｐ認識制限酵素のための部位の発生を妨げるように設計されるが、統計学的に、同じ配列が２ｘ１０１１分子に一度だけ生じることを確実にするのに十分変更可能である（１２の不規則に選択されたタグのＤＮＡ配列は、種々の領域にわたって、どれも５０％以上の同一性を持たないことを示した）。（Ｎはあらゆる塩基（Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）を意味し、ＫはＧまたはＴを意味する。）この腕は、最初のクローニング段階を容易にするために末端の近くにＫｐｎＩ部位を備え、ハイブリダイゼーション解析の前に腕からラジオラベルされた可変領域を解離するために、可変領域に隣接するＨｉｎｄIII部位が用いられた。また、プライマーＰ２およびＰ４が、それぞれグアニン残基を一つだけ含むように腕を設計した。それゆえ、これらのプライマーを用いたＰＣＲでは、独特配列では平均１０であるのに対し、新規に合成された各々の腕には、たった一つのシトシンが取り込まれる。ＰＣＲにラジオラベルされたｄＣＴＰを取り込んだ場合には、各々の腕と比べて、平均して１０倍以上のラベルが独特配列に存在する。これは、ＨｉｎｄIIIで切断して独特配列から解離された後に、腕からのバックグラウンドハイブリダイゼーションシグナルを最小にすることを意図している。二本鎖タグを、プラスミドｐＵＴに保有された小型Ｔｎ５トランスポゾンＫｍ２のＫｐｎＩ部位にリゲートする（de Lorenzo & Timmis, 1994）。このプラスミドの複製は、ｐｉｒ遺伝子のＲ６Ｋ特異的π産物に依存する。これは、種々の細菌種に転移させるＲＰ４プラスミドのｏｒｉＴ配列（Miller & Mekalanos, 1988）、並びに、小型Ｔｎ５部の転位に必要なｔｎｐ＊遺伝子を保有している。タグが付された小型Ｔｎ５トランスポゾンを、接合することによってS. typhimuriumに転移し、転位によって生じた２８８の接合個体をミクロタイター皿のウェルに貯蔵した。これらの内の１２から単離された全ＤＮＡをEcoRVで切断し、プローブとして小型Ｔｎ５トランスポゾンのカナマイシン耐性遺伝子を用いてサザンハイブリダイゼーション解析を行った。どの場合も、接合個体は、細菌ゲノムの異なる部位に一回のトランスポゾンの組み込みの結果として生じた（図２）。
【０１１２】
特異性および感受性の研究
次いで、反応の標的として接合個体ＤＮＡのプールに係るＰＣＲにおけるＤＮＡタグの増幅の効率および単一性を調べた。ＰＣＲにおけるタグの不等価な増幅を最小にする試みでは、アガロースゲルのエチジウムブロミド染色によって視覚化されうる産物を生じる、１００μｌの反応に用いられるＤＮＡ標的の最大量と、ＰＣＲサイクルの最小数を調べた。（それぞれ、５μｇのＤＮＡと２０サイクル）。
【０１１３】
ミクロタイター皿で定常期に達したS. typhimurium接合個体をあわせて、ＤＮＡ抽出に用いた。これにプライマーＰ２およびＰ４を用いたＰＣＲを行った。８０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、３２ＰラベルされたＣＴＰを備えた同じプライマーを用いた第二のＰＣＲの標的として用いた。これにより、ＰＣＲ産物中に６０％以上のラジオラベルされたｄＣＴＰが取り込まれる結果となった。ラジオラベルされた産物を、ＨｉｎｄIIIで切断し、対応するミクロタイター皿からのコロニーブロットＤＮＡをプローブするために用いた。この方法で試験された１５１０変異体の内、３５８は、コロニーブロットの夜通し曝した後のオートラジオグラムで明瞭なシグナルを引き起こさなかった。この可能な説明が３つある。まず第一に、ある割合のトランスポゾンがタグを保有しない可能性がある。しかしながら、タグの存在下もしくは非存在下におけるトランスポゾンに係るリゲーション反応から得られた形質転換頻度を比較することにより、タグの付されていないトランスポゾンが、全体の約０．５％以上になることを説明できそうにない（材料と方法を参照）。より可能性のある原因は、可変配列がいくつかのタグにおいて末端切除されていること、および／またはいくつかの配列が二次構造を形成することであり、これらの両方が増幅を妨げたかもしれない。明確なシグナルを与えられなかった変異体は、さらなる研究には含なかった。効率的に増幅されるタグの特異性を、ミクロタイター皿の２４コロニーからプローブを生成し、プローブを生成するために用いられた２４コロニーを含む４８コロニーのコロニーブロットをプローブするために使用することによって証明した。プローブ生成に用いられなかった２４コロニーからのあらゆるハイブリダイゼーションシグナルの欠如は（図３）、用いられたハイブリダイゼーション条件がラベルされたタグ間のクロスハイブリダイゼーションを妨げるのに十分厳密であることを示し、各接合個体がミクロタイター皿の内部で反復しないことを示唆している。
【０１１４】
動物実験で接種として用いられる最大プールサイズを決定することを、さらなに考察した。各トランスポゾンのラベルされたタグの量は、タグプールの複雑さに反比例するので、ハイブリダイゼーションシグナルがあまりに弱く、オートラジオグラムの夜通し曝した後に検出されない以上のプールサイズまで限定する。より重要なことは、プールの複雑さが増大するにつれ、感染した動物の脾臓で、プールの毒性の代表が十分にラベルされたプローブを産生するのに十分な数で存在しないことである。用いたサルモネラ症のマウスモデルにおけるプールサイズに対する上限を決定していないが、９６以上に違いない。
【０１１５】
トランスポゾン変異の毒性試験
全部で１１５２の独特にタグが付された挿入変異（二つのミクロタイター皿に由来）を、１２プールのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける毒性について試験し、それぞれ９６ウェルのミクロタイター皿を示す。動物に、ミクロタイター皿の９６のトランスポゾン変異体のそれぞれ約１０３細胞（全部で１０５生物体）を、腹腔内投与した。注入から３日後、マウスをと殺し、実験培地上に脾臓ホモジェナートをプレーティングすることによって、細菌を回収した。それぞれのマウスから回収された約１００００コロニーをプールし、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡサンプルに存在するタグを増幅し、ＰＣＲでラベルし、コロニーブロットをプローブし、接種から増幅されたタグを用いて得られたハイブリダイゼーションパターンと比較した（図３）。対称として、S. typhimuriumのａｒｏＡ変異体にタグを付し、接種における９６変異体の一つとして用いた。毒性が強く弱められているので、この株は脾臓で回収されることは予想されない（Buchmeierら, 1993）。ＤＮＡが、接種からのラベルされたタグにハイブリダイズするが、脾臓から回収された細菌からのラベルされたタグにハイブリダイズしない４１の変異体を同定した。この実験を繰り返し、同じ４１変異体を再び同定した。これらの二つは、予想通り、ａｒｏＡ変異体であった（プール当たり一つ）。他は栄養素要求体変異であった（最少培地上で生育できない）。全ての変異体が、正常なコロニー形態学を備えていた。
【０１１６】
実施例２：トランスポゾンに隣接する配列のクローニングおよび部分的特徴決定実施例１に記載された変異体の一つ（プール１、Ｆ１０）からＤＮＡを抽出し、ＳｓｔＩで切断して、カナマイシン耐性に基づいてサブクローン化した。トランスポゾンの一端に隣接した４５０ｂｐの配列を、プライマーＰ７を用いて調べた。この配列は、熱制御プロテアーゼをコードするE.coli clp(lon)遺伝子に８０％の同一性を示す（図５）。知る限りにおいて、以前に、この遺伝子が毒性決定因子に関係があるとは考えられなかった。
【０１１７】
さらに１３のSalmonella typhimurium毒性遺伝子の部分的配列が、図６に示されている（配列Ａ２〜Ａ９およびＢ１〜Ｂ５）。Ｐ２Ｄ６、Ｓ４Ｃ３、Ｐ３Ｆ４、Ｐ７Ｇ２およびＰ９Ｂ７の推定されるアミノ酸配列は、動物および植物の細菌性病原体を通じて保存された分泌関連タンパク質のファミリーに類似しており、Salmonellaではｉｎｖファミリーとして知られている。S. typhimuriumでは、ｉｎｖ遺伝子が、腸組織に細菌侵入するのに必要である。ｉｎｖ変異体の毒性は、経口経路で接種された場合には弱められるが、腹腔内投与された場合には弱められない。腹腔内接種後の毒性に必要とされるｉｎｖ関連遺伝子の発見は、脾臓および他の器官の非食細胞(non-phagocytic cells)の侵入に必要とされる新しい分泌機構を示唆している。これらの新規遺伝子の産物は、確立された感染の処置におけるｉｎｖタンパク質より優れた薬剤標的を示し得る。
この実施例で同定された遺伝子のさらなる特徴決定を、実施例４に記載する。
【０１１８】
実施例３：ＬＤ５０定量およびマウスの予防接種の研究
本願発明の方法で同定された変異は毒性を弱める。
以前には毒性に関係するとされていなかった遺伝子の５つの変異を、Ｐ２２−介在形質導入でS. typhimurium 12028のナリジキシン酸感受性親株に転移させた。形質導入体を制限マッピングでチェックし、腹腔内径路でＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに注入して、５０％致死量（ＬＤ５０）を調べた。変異体Ｓ４Ｃ３、Ｐ７Ｇ２、Ｐ３Ｆ４およびＰ９Ｂ７のＬＤ５０の値は、どれも野生株より高い大きさであった。変異体Ｐ１Ｆ１０では、ＬＤ５０の差異は全く検出されなかった。しかしながら、Ｐ１Ｆ１０株と野生株とを同じ比率で含む接種物を注入したマウスの脾臓から回収されたＰ１Ｆ１０細胞の比率には統計学的に顕著な減少が見られた。このことは、この変異体が、毒性を弱めるものの、ＬＤ５０で検出されない程度までであることを示している。
【０１１９】
変異体Ｐ３Ｆ４とＰ９Ｂ７も、１０７細胞／マウスの接種レベルで経口経路で投与した。どのマウスも病気にならず、このことは、これらの変異体の経口ＬＤ５０レベルが、少なくとも野生株よりは高いことを示している。
マウス予防接種研究では、質量が２０−２５ｇの５匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、Salmonella typhimurium変異株Ｐ３Ｆ４およびＰ９Ｂ７の連続する１０倍希釈を経口（p.o.）もしくは腹腔内（i.p.）に最初に接種した。４週間後、マウスに、５００c.f.uの親の野生株を接種した。死亡を４週間にわたって記録した。
また、変異株を接種したマウスと同じ加齢およびバッチの二匹のマウスに、陽性の対照として５００c.f.uの野生株をi.p.接種した。予防接種されていない両方のマウスが、予想通り４週間以内に死亡した。
【０１２０】
結果は以下の表に示されている。
１）変異株Ｐ３Ｆ４を用いたp.o.での最初の接種
【表ａ】
0004220195.tif 000003
２）変異株Ｐ３Ｆ４を用いたi.p.での最初の接種
【表ｂ】
0004220195.tif 000004
３）変異株Ｐ９Ｂ７を用いたp.o.での最初の接種
【表ｃ】
0004220195.tif 000005
４）変異株Ｐ９Ｂ７を用いたi.p.での最初の接種
【表ｄ】
0004220195.tif 000006
これらの実験から、変異体Ｐ３Ｐ４は、次の野生型のチャレンジに対してある程度の防御を与えそうである。この防御は、i.p.で免疫されたマウスで大きいようである。
【０１２１】
実施例４：Salmonella typhimuriumの第二型III分泌システムをコードする毒性座の同定
この実施例で用いられた略号は、ＶＧＣ１，毒性遺伝子クラスター１；ＶＧＣ２，毒性遺伝子クラスター２である。
【０１２２】
記載された実験の背景
Salmonella typhimuriumは、ヒトの胃腸炎の主要な試薬であり、ヒト腸チフスのモデルとして与えるマウスの全身的な病気を引き起こす（１）。マウスにS. typhimuriumを経口接種した後で、細菌は、腸の細胞もしくはパイアー斑小胞を介して、小腸のルーメンから腸の粘膜を通る（２）。この細菌がマクロファージや好中球に侵入し、細網内皮系に入り、脾臓や肝臓を含む他の器官に広がり、さらに繁殖して、圧倒的かつ致死的菌血症を生じる（３）。宿主細胞に侵入するため、生理学的にストレスのかかる種々の細胞内および細胞外の環境において生存および複製するため、並びに、免疫系の特異的抗菌活性を回避するために、S. typhimuriumは、洗練されたレパートリーの毒性因子を用いる。
【０１２３】
S. typhimuriumと他の病原体の毒性メカニズムのさらに包括的な理解を得るために、便利に“サインが付された変異誘発(signature-tagged mutagenesis)”（ＳＴＭ）と称され、単一の動物の多数の種々の変異体の結末を同時に追跡することができる能力を備えた変異解析の強度を組み合わせた、トランスポゾン変異誘発システムが実施例１に記載されている（５および実施例１；参考文献５は、本願発明の優先日以降に公開された）。このアプローチを用いて、選別した全部で１１５２の変異体から、毒性の弱められた４３の変異体を同定した。これらの変異体の５つのトランスポゾンの挿入ポイントに隣接するＤＮＡのヌクレオチド配列は、これらが、種々の細菌性病原体のタイプIII分泌システムをコードする遺伝子に関連することを示した（６、７）。S. typhimuriumのｉｎｖ／ｓｐａ遺伝子クラスターの産物（８、９）は、表皮細胞に入ることを仲介する表面付属物の集合に要求されるタイプIII分泌システムを形成するタンパク質である（１０）。ゆえに、ｉｎｖ／ｓｐａクラスターに変異を有する株の毒性は、腹腔内に投与された場合ではなく、接種物が経口投与された時にのみ弱められる（８）。対称的に、ＳＴＭで同定された５つの変異体は、腹腔内接種後に無毒である（５）。
【０１２４】
この例では、これらの５つの変異体のトランスポゾン挿入ポイントとＳＴＭで同定されたさらなる１１の変異体の全てが、S. typhimuriumクロモソームの同じ領域にマップされることを示す。さらに、この領域を解析することにより、推定される産物がタイプIII分泌システムの他の成分に配列類似性を備えたさらなる遺伝子が明らかにされる。毒性遺伝子クラスター２（ＶＧＣ２）と称されるこの染色体領域は、多数の他の腸内細菌には存在せず、S. typhimurium毒性に重要な座を示す。
【０１２５】
材料および方法
細菌株、形質導入および生育培地。Salmonella enterica血清型５７９１（aberdeen）、４２３１８０（gallinarum）、７１０１（cubana）および１２４１６（typhimurium LT2）を、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー（the National Collections of Type Cultures, Public Health Laboratory Service, UK）から入手した。Salmonella typhi BRD123ゲノムＤＮＡをG.Douganから入手し、腸病原性(enteropathogenic) Escherichia coli（ＥＰＥＣ）、腸出血性(enterohemorrhagic) E.coli（ＥＨＥＣ）、Vibrio choleraバイオタイプEl Tor、Shigella flexneri血清型２およびStaphylococcus aureusは、the Department of Infectious Diseases and Bacteriology, Royal Postgraduate Medical School, UKから入手された臨床的単離物である。Yersinia pestisのゲノムＤＮＡは、J. Heesemannから入手した。しかしながら、ゲノムＤＮＡは、標準的な方法を用いて単離することができる。S. typhimurium ＮＣＴＣ株１２０２３のサインが付された小型Ｔｎ５トランスポゾン変異体を生成するために用いられた細菌株および方法は、以前に記載されている（５、１１）。プラスミドの機械的な繁殖は、E.coli ＤＨ５α内であった。細菌を、適切な抗生物質を添加したＬＢブイヨン（１２）で生育させた。個々の変異体株の毒性レベルを評価する前に、ファージＰ２２仲介形質導入によって（１２）、変異を、S. typhimurium 12023のナリジキシン酸感受性親株に最初に転移した。形質転換体を接種物として使用する前に制限分解およびサザンハイブリダイゼーションによって解析した。
【０１２６】
ラムダライブラリースクリーニング。ＶＧＣ２をカバーする重複挿入ＤＮＡを備えたラムダ（λ）クローンを、S. typhimurium LT2ゲノムＤＮＡの部分的なＳａｕ３Ａ切断からの挿入物を含むλ１０５９ライブラリー（１４）から、標準的な方法（１３）で得た。このライブラリーは、Salmonella Genetic Stock Centre（ＳＧＳＣ）, Calgary, CanadaからK. Sandersonを介して得られた。
【０１２７】
Ｍｕｄ−Ｐ２２溶原。ラジオラベルされたＤＮＡプローブを、S. typhimuriumゲノムの既知の位置にＭｕｄ−Ｐ２２プロファージを有する一組のS. typhimurium株の溶解物から調製されたＤＮＡを有するＨｙｂｏｎｄ Ｎ（Amersham）にハイブリダイズした。マイトマイシン誘導Ｍｕｄ−Ｐ２２溶解物の調製が記載されている（１２、１５）。この組のＭｕｄ−Ｐ２２プロファージは、元来BensonとGoldmanによって組み立てられ（１６）、ＳＧＳＣから得られた。
【０１２８】
ゲル電気泳動とサザンハイブリダイゼーション。ゲル電気泳動を、０．５ｘＴＢＥで行った１％もしくは０．６％アガロースゲルで行った。ゲル濾過されたＤＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ ＮまたはＮ＋膜（Amersham）に移し、厳密なハイブリダイゼーションと洗浄工程（１０％以下のミスマッチを備えたヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションは許容する）を、Holdenらが記載したようにして行った（１７）。非厳密的条件（５０％のミスマッチを備えた配列間のハイブリダイゼーションは許容する）では、フィルターを１０％ホルムアミド／０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／７％ ＳＤＳで夜通し４２℃でハイブリダイズさせ、最も厳密な段階は、４２℃で２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／１％ ＳＤＳを備える。プローブとして用いられたＤＮＡフラグメントを、“Radprime”システム（Gibco-BRL）を用いて ［３２Ｐ］ｄＣＴＰもしくは［ジゴキシゲニン−１１］ｄＵＴＰでラベルし、放射活性ラベルされたプローブに用いられるのと同じ溶液でハイブリダイゼーションを行ったこと以外は、製造者の指示に従ってジゴキシゲニンシステム（Boehringer Mannheim）を用いて検出した。ゲノムＤＮＡを、以前に記載されたようにして（１３）、サザンハイブリダイゼーション用に調製した。
【０１２９】
分子クローニングとヌクレオチドシークエンシング。制限エンドヌクレアーゼとＴ４ ＤＮＡリガーゼを、Gibco-BRLから得た。一般的な分子生物学的技術は、Sambrookら（１８）に記載されている。ヌクレオチド配列決定をＴ７シークエンシングキット（Pharmacia）を用いたジデオキシ鎖終結法（１９）によって行った。配列を、MacVector3.5ソフトウェアもしくはAssemblyLIGNパッケージで構築した。ヌクレオチドと誘導されたアミノ酸配列を、ヒトゲノム地図作製計画資源センター（the Human Genome Mapping Project Resource Centre, Hinxton, UK）のネットワークサービスで、ウィスコンシン大学のＧＣＧパッケージのＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラム（バージョン８）（２０）を用いて、欧州分子生物学研究所(the European Molecular Biology Laboratory)（ＥＭＢＬ）およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのものと比較した。
【０１３０】
毒性試験。５つのメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（２０−２５ｇ）のグループに、生理食塩水に懸濁された１０倍希釈の細菌を経口（p.o.）もしくは腹腔内（i.p.）接種した。接種物の調製のために、振り動かしながら（５０ｒｐｍ）ＬＢブイヨン中で３７℃で夜通し細菌を生育させ、５６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が０．４〜０．６になるまで、種々の長さの時間、新鮮な培地を接種するために用いた。細胞密度がｍｌ当たり５ｘ１０８コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）以上になるように、培養物を遠心して濃縮し、食塩水に再懸濁した。ｃｆｕ／ｍｌの濃度を、ＬＢ寒天プレート上に一連の希釈された接種物をプレーティングすることによってチェックした。マウスに、０．２ｍｌをi.p.で接種し、かつ、同じ量の接種物を含む栄養をp.o.で接種した。ＬＤ５０の値を、ReedとMeunch（２１）の方法で２８日後に計測した。
【０１３１】
結果
トランスポゾン挿入の局在。Salmonella typhimurium小型Ｔｎ５トランスポゾン変異体のバンクの発生(generation)および弱毒化された４３の変異体を同定するために用いられた選別は、以前に記載されている（５）。トランスポゾンと隣接ＤＮＡ領域は、カナマイシン耐性の選別もしくは逆ＰＣＲにより、接合個体からクローン化される。トランスポゾンに隣接するＤＮＡのヌクレオチド配列３００−６００ｂｐを、３３変異体について得た。これらの配列とＤＮＡおよびタンパク質データベースの配列とを比較することにより、１４の変異体が既知の毒性遺伝子にトランスポゾンが挿入されたことによって生じ、７つが腸細菌の既知の遺伝子に類似した新規遺伝子に挿入されたことによって生じ、１２がＤＮＡおよびタンパク質データベースにエントリーされたものと類似しない配列に挿入された子のによって生じたことを示した（参考文献５，実施例１および本実施例）。
【０１３２】
３つの証拠により、最初にＡ、ＢおよびＣと称した、ゲノムの３つの領域に新規配列への１９の内の１６のトランスポゾンが集まっていることが示唆された。第一に、トランスポゾン挿入ポイントに隣接する領域のヌクレオチド配列を、互いにかつデータベースの配列と比較することにより、ある配列が互いに重複するかもしくは、同じ遺伝子の異なる領域に強力に類似することが示された。第二に、いくつかの制限酵素で切断され、かつ、トランスポゾン挿入ポイントに隣接する制限フラグメントでプローブされたゲノムＤＮＡのサザン解析により、あるトランスポゾン挿入が同じ制限フラグメント上に局在することが示唆された。第三に、同じＤＮＡプローブがS. typhimurium λＤＮＡライブラリーのプラークにハイブリダイズした場合、先の二つの段階が関連すると示唆した変異体からのプローブが同じλＤＮＡクローンにハイブリダイズすることが見いだされた。しかして、２つの変異体（Ｐ９Ｂ７およびＰ１２Ｆ５）をクラスターＡとし、５つの変異体（Ｐ２Ｄ６、Ｐ９Ｂ６、Ｐ１１Ｃ３、Ｐ１１Ｄ１０およびＰ１１Ｈ１０）をクラスターＢとし、９つの変異体（Ｐ３Ｆ４、Ｐ４Ｆ８、Ｐ７Ａ３、Ｐ７Ｂ８、Ｐ７Ｇ２、Ｐ８Ｇ１２、Ｐ９Ｇ４、Ｐ１０Ｅ１１およびＰ１１Ｂ９）をクラスターＣとした（図８）。
【０１３３】
これら３つのクラスターからのＤＮＡプローブの、Mud-P22プロファージにロックされた一連のS. typhimurium株の溶解物へのハイブリダイゼーションは（１５，１６）、３つの座が３０〜３１分の領域に全て局在することを示し（エディションVIII、参考文献２２）（図７）、このことは、これら３つの座が密接に関連するかもしくは、一つの大きな毒性座を構成することを示唆している。クラスターＡ、ＢおよびＣをカバーするあらゆるλクローンが重複ＤＮＡ挿入物を含有するか否かを調べるために、各クローンの末端領域のＤＮＡフラグメントを、他のλクローンのサザンハイブリダイゼーション解析のプローブとして用いた。ハイブリダイズするＤＮＡフラグメントは、いくつかのλクローンが重複し、かつ、クラスターＡ、ＢおよびＣが一つの連続領域を含有することを示した（図８）。この領域の末端からのＤＮＡフラグメントを、隣接領域を示す挿入物を含むさらなるクローンを同定するためのλライブラリーをプローブするために使用した。この座の最右端をカバーするλクローンは一つも同定されず、この領域は、Mud-P22プロファージ株ＴＴ１５２４４の溶解物からの６．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントをクローニングすることによって得られた（１６）。
【０１３４】
制限地図およびサザンハイブリダイゼーション解析を用いてこの座の物理的地図を作成した（図８）。よく調べられた６３分のinv/spa遺伝子クラスターからこの座を区別するために（エディションVIII、参考文献２２）（８，９，２３，２４，２５，２６）、前者を毒性遺伝子クラスターＩ（ＶＧＣ１）と呼び、後者を新規の毒性座ＶＧＣ２と称した。図２は、ヌクレオチド配列が調べられたＤＮＡの二つの部分の位置を示す（“配列１”および“配列２”）。ヌクレオチド配列は図１１と図１２に示されている。
【０１３５】
S. typhimuriumクロモソーム上のＶＧＣ２の境界のマッピング。ＶＧＣ２の左側のλクローン７のヌクレオチド配列は、推定されるアミノ酸配列がE.coliのｙｄｈＥ＋＋遺伝子のセグメントの誘導産物に９０％以上同一な読み枠（an open reading frame： ＯＲＦ）の存在を示し、ＶＧＣ２の右側の６．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩクローン化フラグメントの配列は、推定されるアミノ酸配列がｐｙｋＦ遺伝子によってコードされたE.coliのピルビン酸キナーゼＩに９０％以上同一なＯＲＦの存在を示した（２７）。E.coliでは、３７〜３８分のところに、クロモソームｙｄｈＥとｐｙｋＦが互いに密接に局在している（２８）。ＶＧＣ２の長さに沿って分散した１１の非重複ＤＮＡフラグメントを、E.coliとS.typhimuriumゲノムＤＮＡの非厳密サザンハイブリダイゼーション解析においてプローブとして使用した。ハイブリダイズするＤＮＡフラグメントは、ＶＧＣ２を含む約４０ｋｂの領域がE.coliゲノムから欠失し、１ｋｂ以内にＶＧＣ２の境界が局在することを示した（図９）。ＶＧＣ２の右側末端に近いＸｂａＩ部位の局在を（図８）、クロモソームの３０分の領域（２２）の既知のＸｂａＩ部位（２９）のマップと比較することにより、３０．７分のマップ位置がＶＧＣ２に推定される。
【０１３６】
ＶＧＣ２の構造。ＶＧＣ２の一部のヌクレオチド配列決定により、１９のＯＲＦの存在が明らかになった（図８）。ＶＧＣ２の約２６ｋｂのヌクレオチド配列のＧ＋Ｃ容量は４４．６％であり、ＶＧＣ１では４７％（９）、完全なSalmonellaゲノムでは５１−５３％と予想される（３０）。
【０１３７】
ＯＲＦ１−１１の完全に推定されたアミノ酸配列は、タイプIII分泌システムのタンパク質の配列に類似しており（６，７）、植物および動物の種々の細菌性病原における毒性決定因子の輸出に必要とされることが知られている（７）。ＯＲＦ１−８の推定されたタンパク質（図８）は、構成および配列の点で、Yersinia pseudotuberculosisのｙｓｃＮ−Ｕ遺伝子の産物（３１）、Salmonella typhimuriumのＶＧＣ１のinv/spaクラスターのinvC/spaS（８，９）およびShigella flexneriのspa/mxiのspa47/spa40に類似している（３２，３３，３４，３５）。例えば、ＯＲＦ３の推定されたアミノ酸配列（図８）は、Y.pseudotuberculosisのＹｓｃＳに５０％同一であり（３１）、S.flexneriのＳｐａ９に３４％同一であり（３５）、S.typhimuriumのＶＧＣ１のＳｐａＱに３７％同一である（９）。ＯＲＦ９の推定されたタンパク質産物は、Y.enterocoliticaのＬｃｒＤに４３％の同一性（３６）、S.flexneriのＭｘｉＡに３９％の同一性（３２）並びにＶＧＣ１のＩｎｖＡに４０％の同一性（２３）を備えたタンパク質のＬｃｒＤファミリーに密接に関連する。図８に示された残りのＯＲＦの部分的ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ１０から推定されるタンパク質が、Y.enterocolitica YscJ（３７）細菌の外膜に局在するリポタンパク質に最も類似しており、ＯＲＦ１１がS.typhimurium InvG、トランスロカーゼに類似すること（３８）を示している。ＯＲＦ１２とＯＲＦ１３はそれぞれ、二成分制御システムを含む種々のタンパク質の、センサーおよび制御サブユニットに重要な類似性を示す（３９）。ＯＲＦ９と１０、ＯＲＦ１０と１１、ＯＲＦ１９とＶＧＣ２の右側末端との間にさらなる遺伝子の十分なコード容量がある。
【０１３８】
ＶＧＣ２はSalmonellaeの間で保存され、かつ、これらに特異的である。ＤＮＡおよびタンパク質データベースにエントリーされたものに類似した配列を欠くＶＧＣ２の中心に局在する２．２ｋｂのPstI／HindIII（プローブＢ、図８）を、Salmonella血液型亜型と他の病原性細菌のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析におけるプローブとして用いた（図１０Ａ）。非厳密条件下でハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントは、ＶＧＣ２がS.aberdeen、S.gallinarum、S.cubana、S.typhiに存在し、EPEC、EHEC、Y.pestis、S.flexneri、V.cholera、S.aureusに存在しないことを示した。しかして、ＶＧＣ２はSalmonellaeに保存され、これらに特異的なのであろう。
【０１３９】
座の構成が試験したSalmonella serovarsに保存されているか否かを調べるために、二つのさらなる制限酵素で切断したゲノムＤＮＡを用いて厳密なサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズするＤＮＡフラグメントは、S.typhimurium LT2とS.gallinarum、S.cubanaとS.typhiとの間に制限部位の再構成に何らかの不均一性があることを示した（図１０Ｂ）。さらに、S.gallinarumとS.typhiは、調べた他のSalmonellaeに存在するものにさらにハイブリダイズするフラグメントを含み、ＶＧＣ２の領域がこれらの種で二重になっていることを示している。
【０１４０】
ＶＧＣ２はマウスにおける毒性に必須である。先の実験は、トランスポゾン変異体Ｐ３Ｆ４，Ｐ７Ｇ２，Ｐ９Ｂ７およびＰ１１Ｃ３のi.p.接種のＬＤ５０の値が、野生型株より少なくとも１００倍優れていることを示した（５）。感染工程におけるＶＧＣ２の重要性を明確にするために、変異体Ｐ３Ｆ４とＰ９Ｂ７のp.oおよびi.p.ＬＤ５０値を調べた（表１）。両方の変異体が、親株と比較して各接種経路により少なくとも５オーダーの大きさの毒性の低減を示した。接種の両方の経路による毒性の低減は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける上皮細胞浸透後の感染に必要である。
【０１４１】
表１．S.typhimurium株のＬＤ５０値
【表１】
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【０１４２】
論考
弱毒化された一つのグループのシグナルが付されたトランスポゾン変異体の挿入ポイントをマッピングすることにより、クロモソーム上の３０．７分に局在した約４０ｋｂのS.typhimuriumのこれまで未知であった毒性座が同定された（５）。この座は、ＶＧＣ１と改名することを提案した６３分のinv/spa毒性遺伝子（エディションVIII、参考文献２２）から区別するために毒性遺伝子クラスター２（ＶＧＣ２）と称される。ＶＧＣ１およびＶＧＣ２の両方は、タイプIII分泌システムの成分をコードする。しかしながら、これらの分泌システムは機能的に区別される。
【０１４３】
新しい遺伝子への挿入によって生じた１９の変異体の内（参考文献５およびこの例）、１６がクロモソームの同じ領域にマップされた。優先的に小型Ｔｎ５挿入がＶＧＣ２に起こる可能性がある。あるいは、弱毒化した変異体を同定するために用いられたネガティブ選別（５）が非常に厳密なので（ＶＧＣ２変異体の高いＬＤ５０値に反映される）、先に未知の遺伝子の中では、ＶＧＣ２の変異のみが選別で回収されるに十分な弱毒化の程度を生じることが可能である。S.typhimurium毒性決定因子の先の調査がＶＧＣ２を同定できなかったのは、感染した生きた動物モデルよりもむしろ細胞培養アッセイに対する信頼から生じる。Salmonellaeに独特なS.typhimurium LT2クロモソームの領域を同定した先の研究（４０）は、３０．５−３２分にこのような領域（ＲＦ３３３）を局在化した。それゆえ、ＲＦ３３３は、ＶＧＣ２に対応する、しかしながら、ＲＦ３３３が毒性決定因子に関連することはわからなかった。
【０１４４】
YersiniaとShigellaの毒性プラスミドにコードされたタイプIII分泌システム、並びにSalmonellaのＶＧＣ１との比較により、ＶＧＣ２が分泌装置の基本的な構成成分をコードすることが示された。さらに、ＶＧＣ２のＯＲＦ１−８のオーダーは、相同性において、Yersinia、ShigellaおよびS.typhimuriumのＶＧＣ１の遺伝子オーダーと同じである。ＶＧＣ２分泌システムの構成および構造は、ＶＧＣ２の低いＧ＋Ｃ含量と共に、Yersiniaの対応する遺伝子よりもＶＧＣ１に密接に関連していないという事実は、ＶＧＣ２が、ＶＧＣ１のように（４０，４１，４２）、水平伝播を介してS.typhimuriumによって独立に獲得されることを示唆している。ＯＲＦ１２と１３にコードされたタンパク質は、細菌性の二成分制御因子に強力に類似しており（３９）、ＯＲＦ１−１１および／またはこのシステムの分泌されたタンパク質を制御することができる。
【０１４５】
ＶＧＣ１の多くの遺伝子が、上皮細胞へのS. typhimuriumの進入に重要であることが示された。この工程は細菌の接触を必要とし（２）、局在化した膜の乱れを生じる細胞骨格の再構成を引き起こす（４３，４４）。ＶＧＣ１の役割とこの段階の感染への制限は、ＶＧＣ１変異体をp.o.接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて約５０倍の弱毒化が生じたこと、並びに、i.p.投与した場合にはＶＧＣ１変異体が毒性の欠如を示さないという事実に反映される（８）。第二の観察は、ＶＧＣ１変異体が我々の選別で得られなかった理由を説明する（５）。対照的に、ＶＧＣ２の変異体は、p.o.およびi.p.接種の両方で大いに弱毒化される。このことは、ＶＧＣ１とは違って、ＶＧＣ２が上皮細胞浸透後にマウスにおいて毒性を必要とすることを示すが、これらの知見は感染の初期段階でＶＧＣ１の役割を除外しない。
【０１４６】
しかして、要約すると、Salmonella typhimuriumクロモソーム上の１６のシグナルが付されたトランスポゾン変異体の挿入ポイントをマッピングすることにより、３０．７のところに４０ｋｂの毒性遺伝子クラスターを同定した。この座は、調べた他の全てのSalmonella種に保存されているが、他の種々の病原性細菌もしくはEscherichia coli K12には存在しない。この座の一部のヌクレオチド配列決定により、推定されるタンパク質がタイプIII分泌システムの成分をコードする１１の読み枠が示された。これとinv/spa進入座にコードされたタイプIII分泌システムとを区別するために、inv/spa座を毒性遺伝子クラスター１（ＶＧＣ１）と称し、新規の座をＶＧＣ２と称した。ＶＧＣ２は、Salmonellaゲノムよりも低いＧ＋Ｃ含量を備え、産物がE.coli ydhEおよびpykF遺伝子と９０％以上の同一性を備えた遺伝子に隣接している。しかしてＶＧＣ２は、おそらくE.coliのydhEおよびpykF遺伝子の間の領域に対応する領域に挿入することによって水平(horizontally)に得られた。ＶＧＣ２変異体の毒性の研究により、経口もしくは腹腔内接種した野生株と比較して少なくとも５倍のオーダーの弱毒化を受けることが示された。
【０１４７】
この実施例の参考文献
「参考文献１」
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0004220195.tif 000009
0004220195.tif 000010
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【０１４８】
実施例５：Streptococcus pneumoniaeの毒性遺伝子の同定
（ａ）変異誘発
便利なトランスポゾンシステムがない場合、Streptococcus pneumoniaeのタグが付された変異体を作成する最も効率的な方法は、挿入二重変異誘発(insertion-duplication mutagenesis)を用いることである（Morrisonら (1984) J. Bacteriol. 159, 870）。２００−４００ｂｐの不規則なS. pneumoniaeＤＮＡフラグメントは、制限酵素を用いたゲノムＤＮＡ切断によって、あるいは、音波処理で物理的にせん断して、ゲル濾過し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ末端を修復することによって生成される。このフラグメントを、予めポリリンカークローニング部位の一つにＤＮＡ配列タグを取り込むことによって修飾された、プラスミドｐＪＤＣ９（Pearceら (1993) Mol. Microbiol. 9, 1037、E.coliとS.pneumoniaeにおけるエリスロマイシン選別用のerm遺伝子を保有する）にリゲートする。クローン化されたS.pneumoniae ＤＮＡのサイズは、相同な組み替えを確実にするのに十分であり、E.coliにおいて非代理的なライブラリーを生成する可能性が低い（S.pneumoniaeタンパク質の発現は、E.coliに対して毒性となりうる）。異なる選択バーカーを保有する他のベクターを利用することができ、ｐＪＤＣ９の代わりに用いることができる。ＤＮＡフラグメントを保有するタグが付されたプラスミドは、肺炎球菌性肺炎(pneumococcal pneumonia)のマウスモデルにおける血清型および毒性に基づいて選択された適切なS.pneumoniae株に導入される。S.pneumoniaeにおける遺伝的形質転換の能力の制御は能力因子、シカゴのイリノイ大学のDon Morrisonのグループによって最近特徴決定され、Havarstein, CoomaraswamyとMorrison (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11140-11144に記載された１７アミノ酸のペプチドによって制御される。形質転換実験におけるこのペプチドの精密な取り込みにより、あるカプセルに収容された臨床的なS.pneumoniaeの単離物において非常に効率的な形質転換頻度が導かれる。これは、pneumococcalの分子遺伝学の主要なハードルを克服し、ペプチドの有効性が、S.pneumoniae変異体バンクの作成を容易にし、変異される株の選択に柔軟性を与える。形質転換体の比率を解析してプラスミド配列の相同的組み込みを確認し、安定性をチェックした。挿入重複(insertion-duplication)によって生成された変異体に係る非常に低レベルの復帰は、重複領域を短くする（２００−４００ｂｐ）ことによって最小化される。しかしながら、復帰レベルが許容以上に高いと、培養における形質転換体の生育および動物での成育の間に、抗生物質選択が維持される。
【０１４９】
（ｂ）動物モデル
S. pneumoniae変異体バンクを、Swissおよび／またはC57B1/6マウスに接種するためのプールに編成した。予備実験を行って、プールの最適な複合体と最適な接種レベルを調べた。一つの魅力的なモデルは、気管に口から輸送される１０５ｃｆｕの接種を利用する（Veberら (1993) J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473）。Swissマウスは３−４日以内に急性肺炎を引き起こし、C57B1/6マウスは８−１０日以内に準急性肺炎を起こした。これらの肺の感染モデルは、死亡時に１０８ｃｆｕ／肺の収率であった（Veberら (1993) J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473）。必要であれば、血流感染に必要な遺伝子の同定のために腹腔内にも注入する（Sullivanら (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 234）。
【０１５０】
（ｃ）毒性遺伝子同定
感染モデルのパラメーターが最適化されたら、数千株からなる変異体バンクを毒性試験にかける。弱毒化された変異体を、プローブとして“インプット”と“回収”プールからの標識されたタグを用いて、ハイブリダイゼーション解析によって同定する。S.pneumoniaeＤＮＡが容易にコロニーブロットされなければ、染色体ＤＮＡを、ドットブロット装置を用いてナイロン膜上に移す前にミクロタイター皿のウェルの中で化学的もしくは酵素的に遊離させる。組み込まれたプラスミドに隣接するＤＮＡを、E.coliにおけるプラスミドレスキューによってクローン化し（Morrisonら (1984) J. Bacteriol. 159, 870）、配列決定する。ゲノムＤＮＡライブラリーを、E.coliもしくはグラム陽性宿主株のいずれかに維持された適切なベクターに構築し、組み込まれたプラスミドに隣接する制限フラグメントでプローブして、クローン化された毒性遺伝子を単離し、完全に配列決定して、詳細な機能解析を行う。
【０１５１】
実施例６：Enterococcus faecalisの毒性遺伝子の同定
（ａ）変異誘発
E.faecalisの変異誘発を、この目的のために開発されたｐＡＴ１１２またはその誘導体を用いて行う。ｐＡＴ１１２は、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方において選別を行うための遺伝子、Ｔｎ１５４５のａｔｔ部位を保有する。それゆえ、宿主株に転位のためのインテグラーゼが存在する必要があり、宿主が切除酵素遺伝子(an excisionase gene)を含まなければ安定な単一のコピーの挿入が得られる（Trieu-Cuotら (1991) Gene 106, 21）。組み込まれたプラスミドに隣接するＤＮＡの回収は、ゲノムＤＮＡの制限切断、分子内リゲーションおよびE.coliの形質転換によって行われる。ｐＡＴ１１２の制限酵素の単一な部位およびその変異体の存在（Trieu-Cuotら (1991) Gene 106, 21）により、接合、エレクトロポレーションもしくは形質転換のいずれかによって、プラスミドｐＡＴ１４５を保有するE.faecalisの毒性株に移す（インテグラーゼ機能を付与するため）前にＤＮＡ配列タグの取り込みができる（Trieu-Cuotら (1991) Gene 106, 21；Wirthら (1986) J. Bacteriol. 165, 831）。
【０１５２】
（ｂ）動物モデル
多数の挿入変異体を、トランスシピエント（transcipients）からのＤＮＡの単離、制限酵素分解およびサザンハイブリダイゼーションによってプラスミドのランダムな組み込みについて解析した。個々の変異体をミクロタイター皿のウェルに貯蔵し、プールされた接種物の形態(complexity)とサイズを、変異バンクの選別の前に最適化する。E.faecalisによって引き起こされた感染の二つの異なるモデルを用いた。最初はよく調べられた心内膜炎（endocarditis）のラットモデルであり、カテーテルが大動脈弁(the arotic valve)を横切って挿入された動物に１０８ｃｆｕまでのE.faecalisを尾の静脈注入することを含む（Whitmanら (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 1069）。接種後種々の時間に動物を死亡させ、大静脈弁の細菌のゆう形成(vegetations)を切り取り、ホモジェナイズし、培養培地にプレートして、細菌コロニーを回収した。毒性細菌を、接種後種々の時間で血液から回収した。第二のモデルは、１０９ｃｆｕのE.faecalisの腹腔内注入後のマウスの腹膜炎である（Chenowethら (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34, 1800）。S.pneumoniaeモデルを用いた場合のように、予備的実験を行って、変異体バンクをスクリーニングする前に、プールの最適な形態と最適な接種レベルを確立した。
【０１５３】
（ｃ）毒性遺伝子同定
複製のそのE.coliオリジンを用いたｐＡＴ１１２の組み込み部位に隣接するＤＮＡの単離は、一般的に用いられたベクターの６ｂｐ認識制限酵素のほとんどの部位を欠くことによって簡単にされる。それゆえ、関心の株のＤＮＡを、これらの酵素の一つで切断し、自己リゲートし、E.coliに形質転換され、プラスミドのａｔｔ部位に隣接する配列に基づくプライマーを用いて配列決定した。E.faecalisのゲノムＤＮＡライブラリーを関心のある配列でプローブし、毒性遺伝子の完全なコピーを同定し、配列決定した。
【０１５４】
実施例７：Pseudomonas aeruginosaの毒性遺伝子の同定
（ａ）変異誘発
トランスポゾンＴｎ５は、Pseudomonas aeruginosaを変異誘発するために他によって用いられ、Salmonella typhimurium毒性遺伝子の同定のために用いられた小型Ｔｎ５誘導体（実施例１）は、いくつかのシュードモナス(pseudomonads)を含むグラム陰性細菌の間で広く利用できることが報告されているので（DeLorenzoとTimaris (1994) Methods Enzymol. 264, 386）、一つ以上の毒性（あるいはムコイド）受容個体株に自殺ベクターを接合転移することによって、P.aeruginosa変異体バンクは、シグナルが付与された小型Ｔｎ５トランスポゾンの現存するプールを用いて構築された。特異的にP.aeruginosa変異体と称されるＴｎ５の他の誘導体（Rellaら (1985) Gene 33, 293）は、小型Ｔｎ５トランスポゾンと共に用いられる。
【０１５５】
（ｂ）動物モデルと毒性遺伝子の同定
P.aeruginosa挿入変異体のバンクを、ラットの慢性的肺感染モデルにおける弱毒化を選別する。P.aeruginosa細胞の懸濁液を、気管切開後の気管支に接種し、３０日後に疾患が生じた（Woodsら (1982) Infect. Immun. 36, 1223）。研究培地に肺のホモジェナートをプレートすることによって細菌を回収し、これらの配列タグを、接種物として用いられた細菌のＤＮＡコロニーブロットをプローブするために用いた。変異体バンクを内在性菌血症（Hirakataら (1992) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36, 1198）およびマウスののう胞性繊維症（Davidsonら (1995) Nature Genetics 9, 351）のモデルにおける毒性試験にかけることもできる。トランスポゾンに隣接するＤＮＡのクローニングおよび配列決定を、実施例１に記載されているようにして行った。遺伝子の完全なコピーを単離および配列決定するためのゲノムＤＮＡライブラリーを、標準的な方法で研究室で作成した。
【０１５６】
実施例８：Aspergillus fumigatusの毒性遺伝子の同定
（ａ）変異誘発
真菌のトランスポゾン変異の機能的等価物は、形質転換ＤＮＡの制限酵素仲介組み込み（restriction enzyme mediated integration:ＲＥＭＩ）である（SchiestlとPetes (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7585）。この方法では、真菌細胞を制限酵素の存在下で選択可能なマーカーを保有するＤＮＡフラグメントで形質転換し、単一コピーの組み込みが異なるゲノム部位に生じ、制限酵素の標的配列によって定義される。ＲＥＭＩはコクリオボルス（Cochliobolus）（Luら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649）とウスティラゴ（Ustilago）（Bolkerら (1995) Mol. Gen. Genet. 248, 547）の毒性遺伝子の単離に用いられており、ヒグロマイシン耐性をコードするプラスミドと共に活性な制限酵素の取り込みにより、A.fumigatusゲノムに直線上プラスミドの一回かつ明らかに不規則な組み込みを生じる。配列タグは、ヒグロマイシン耐性の二つのベクターの一方の便利な部位に取り込まれ、A.fumigatusの臨床的単離物を形質転換するのに用いられる。
【０１５７】
（ｂ）動物モデルと毒性遺伝子同定
好中球減少マウス(neutropenic mice)のアスペルギルス症の低用量モデルは、人の肺の疾患のコースに特に密接に適合する（Smithら (1994) Infect.Immun. 62, 5247）。マウスに１００００００コニジオスポア(conidiospores)／マウスまでを鼻腔内に接種し、肺のホモジェナートを用いて毒性真菌変異体を７−１０日後に回収し、液体培地に接種した。菌糸を数時間後に回収し、そのＤＮＡを増幅し、接種物を含む形質転換体のプールからのＤＮＡのコロニーブロットをプローブするためのタグをラベルするために抽出した。ＲＥＭＩ挿入ポイントに隣接する領域のＤＮＡを、ＲＥＭＩベクターの外側を切断する制限酵素で形質転換ＤＮＡを切断し、自己リゲートし、かつE.coliを形質転換することによってクローン化した。プラスミドの既知の配列に基づくプライマーを用いて、隣接するA.fumigatus ＤＮＡ配列を調べた。ベクターの挿入が無毒表現形の原因であることを調べるために、回収されたプラスミドをクローニングに用いたのと同じ制限酵素で再度切断し、野生型A.fumigatus親株に戻した。相同的組み換えにより生じた形質転換体に毒性試験を行った。
【０１５８】
参考文献（実施例４以外）
「参考文献２」
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  図１ａは、本願発明の特に好ましい方法を図式的に例証する。
【図１ｂ】  図１ｂは、本願発明の特に好ましい方法を図式的に例証する。
【図２】  図２は、EcoRVで切断した後の、１２のS. typhimuriumの接合個体(exconjugants)に由来するＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を示す。フィルターを、小型Ｔｎ５トランスポゾン(mini-Tn5 transposon)のカナマイシン耐性遺伝子でプローブした。
【図３】  図３は、半分のミクロタイター皿からの、４８のS. typhimurium接合個体（Ａ１−Ｈ６）に由来するＤＮＡのコロニーブロットハイブリダイゼーション解析を示す。フィルターを、最初の２４コロニー（Ａ１−Ｄ６）のプールから単離されたＤＮＡからのラベルされ増幅されたタグを含むプローブとハイブリダイズした。
【図４】  図４は、マウスに注入された、ミクロタイター皿の９５のS. typhimurium接合個体（Ａ１−Ｈ１１）のＤＮＡコロニーブロットハイブリダイゼーション解析を示す。複製フィルターを、プールからの標識され増幅されたタグとハイブリダイズし（接種パターン）、もしくは、感染した動物の脾臓から回収された１００００以上のプールされたコロニーから単離されたＤＮＡからのラベルされ増幅されたタグとハイブリダイズした（脾臓パターン）。コロニーＢ６、Ａ１１およびＣ８は、両方のフィルターに弱いハイブリダイゼーションシグナルを生じた。コロニーＡ３、Ｃ５、Ｇ３（aroA）およびＦ１０からのハイブリダイゼーションシグナルは、接種パターンには存在するが、脾臓パターンには存在しない。
【図５】  図５は、本願発明の方法を用いて単離されたSalmonella遺伝子の配列と、Escherichia coli clpプロテアーゼゲノムとの比較を示す。
【図６ａ】  図６ａは、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１１）。
【図６ｂ】  図６ｂは、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜１７）。
【図６ｃ】  図６ｃは、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８〜２３）。
【図６ｄ】  図６ｄは、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜３０）。
【図６ｅ】  図６ｅは、本願発明の方法を用いて単離されたさらなるSalmonella遺伝子の部分的配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１〜３６）。
【図７ａ】  図７ａは、S. typhimuriumクロモソームのＶＧＣ２のマッピングを示す。（Ａ）ＶＧＣ２の３つの領域からのＤＮＡプローブは、Mud-P22プロファージにロックされたものを含む一組のS. typhimurium株からの溶解物のサザンハイブリダイゼーション解析に用いられた。７．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメント（図８のプローブＡ）にハイブリダイズした溶解物が示されている。使用された他の二つのプローブが、同じ溶解物にハイブリダイズした。
【図７ｂ】  図７ｂは、S. typhimuriumクロモソームのＶＧＣ２のマッピングを示す。（Ｂ）ファージの挿入ポイントおよびパッケージング方向は、分単位でマップ位置と共に示されている（edition VIII, 実施例４の参考文献２２）。ファージの名称は、以下の株に対応する：１８Ｐ、ＴＴ１５２４２；１８Ｑ、１５２４１；１９Ｐ、ＴＴ１５２４４；１９Ｑ、ＴＴ１５２４３；２０Ｐ、ＴＴ１５２４６および２０Ｑ、ＴＴ１５２４５（実施例４の参考文献）。マッピングされた遺伝子の局在箇所が水平な棒で示され、他の遺伝子のおよその位置が示されている。
【図８】  図８は、ＶＧＣ２の物質的かつ遺伝学的なマップを示す。（Ａ）１６のトランスポゾン挿入の位置が線の上に示されている。ＶＧＣ２の範囲は、太線で示されている。産物が、種々の二つの成分制御システムの、それぞれセンサーおよび制御成分に類似するＯＲＦ１２および１３を除いて、類似した遺伝子の名称と共に、実施例４の説明で記載されたＯＲＦ群の転写の位置および方向が、線の下の矢印で示されている。（Ｂ）重複クローンの局在箇所およびＭｕｄ−Ｐ２２プロファージ株ＴＴ１５２４４からのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限フラグメントが塗りつぶされた棒として示されている。マッピングされたλクローンの部位のみが示されており、クローンはこれらの限度を超えて伸長しても良い。（Ｃ）制限部位の位置がマークされている：Ｂ，BamHI；Ｅ，EcoRI；Ｖ，EcoRV；Ｈ，HindIII；Ｐ，PstIおよびＸ，XbaI。図７でプローブとして用いられた７．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメント（プローブＡ）の位置、および図１０でプローブとして用いられた２．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（プローブＢ）の位置が、制限地図の下に示されている。配列１（図１１に記載）および配列２（図１２に記載）の位置が、細い矢印で示されている（ラベルされた配列１および配列２）。
【図９】  図９は、ＶＧＣ２の境界をマッピングを記載する。（Ａ）E.coli K12クロモソームの３７〜３８分にマップされた遺伝子の位置は、S. typhimurium LT2クロモソームの対応する領域と共に並んでいる（３０〜３１分）。ＶＧＣ２領域の拡大されたマップは、プローブとして用いられた１１のS. typhimurium (S.t.)ＤＮＡフラグメント（太い棒）と、それらを作製するために用いられた制限部位：Ｂ，BamHI；Ｃ，ClaI；Ｈ，HindIII；Ｋ，KpnI；Ｐ，PstI；Ｎ，NsiIおよびＳ，SaiIと共に示されている。E.coli K12(E.c.)ゲノムＤＮＡにハイブリダイズしたプローブは＋で示され、ハイブリダイズしなかったプローブは−で示されている。
【図１０】  図１０は、ＶＧＣ２がSalmonellae間で保存され、かつ特異的であることを示している。Salmonella血液型亜型(serovars)と他の病原性細菌のゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩ（Ａ）、ＨｉｎｄIIIもしくはＥｃｏＲＶ（Ｂ）で制限し、プローブとしてλクローン７からの２，２ｋｂのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを用いて、サザンハイブリダイゼーション解析にかける（プローブＢ図２）。フィルターを、厳密（Ａ）もしくは非厳密（Ｂ）な条件下でハイブリダイズし、洗浄する。
【図１１ａ】  図１１ａは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｂ】  図１１ｂは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｃ】  図１１ｃは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｄ】  図１１ｄは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｅ】  図１１ｅは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｆ】  図１１ｆは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｇ】  図１１ｇは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｈ】  図１１ｈは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｉ】  図１１ｉは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｊ】  図１１ｊは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｋ】  図１１ｋは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｌ】  図１１ｌは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｍ】  図１１ｍは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｎ】  図１１ｎは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｏ】  図１１ｏは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｐ】  図１１ｐは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｑ】  図１１ｑは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｒ】  図１１ｒは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１１ｓ】  図１１ｓは、ＶＧＣ２の“配列１”のＤＮＡ配列を、中心から左端まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭに同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１２ａ】  図１２ａは、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１２ｂ】  図１２ｂは、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１２ｃ】  図１２ｃは、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１２ｄ】  図１２ｄは、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１２ｅ】  図１２ｅは、ＶＧＣ２の“配列２”のＤＮＡ配列を示す（クラスターＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。ＤＮＡは６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始および終結位置、並びにＳＴＭで同定された種々の変異体のトランスポゾン挿入位置が示唆されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオチドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004220195.tif 000030
【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１１ｊ】
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【図１１ｋ】
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【図１１ｌ】
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【図１１ｍ】
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【図１１ｎ】
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【図１１ｏ】
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【図１１ｐ】
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【図１１ｑ】
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【図１１ｒ】
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【図１１ｓ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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