(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可能性のある形質転換作用因子の形質転換能力を定量する方法であって、アポプチンをコードするプラスミドまたはアポプチンを発現するウイルスベクタによって非形質転換細胞に誘発可能なアポトーシス活性を付与し、該細胞を該形質転換作用因子に露呈し、次いで当該細胞内での細胞質から核へのアポプチンの移動を定量するか、または当該細胞におけるアポトーシスの誘発を定量することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
該アポトーシス活性が、該細胞に該活性をエンコードする組換え核酸分子を移入することにより提供されるものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該可能性のある形質転換作用因子がタンパク質性物質であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該タンパク質性物質が該アポトーシス活性をもつ該非形質転換細胞中で同時に発現されるものであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞の腫瘍細胞となる性向を定量する方法であって、アポプチンをコードするプラスミドまたはアポプチンを発現するウイルスベクタによって誘発可能なアポトーシス活性を当該細胞に付与し、該細胞を比較的緩和な腫瘍化活性に曝し、次いで当該細胞内のアポトーシスを定量するか、および／または当該細胞中の細胞質から核へのアポプチンの移動を定量することを特徴とする方法。
【請求項６】
該緩和な腫瘍化活性がＵＶ−照射であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
癌の遺伝型につき被験者の性向を定量する方法であって、かかる被験者の関連細胞サブセット標本を請求項５または６に記載の方法に付すことを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
細胞において発癌活性および／または形質転換活性を有する遺伝子突然変異を定量する方法であって、当該細胞を請求項５または６に記載の方法に付すことを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断試験キットであって、アポプチンまたはその機能的誘導体もしくはフラグメントをエンコードする核酸であって真核細胞に移入することが可能であり、かつ、かかる細胞において発現され得る核酸を含み、さらに緩和な腫瘍化活性に細胞を曝す手段を含んでなることを特徴とする診断試験キット。
【請求項１０】
該タンパク質性物質がＳＶ４０の大型Ｔ抗原であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は癌診断および癌治療の分野、ならびに腫瘍化または腫瘍促進の疑いのある作用因子（２つの用語は本明細書において互換使用する）の形質転換能力を定量する分野に関する。
【０００２】
本発明の共通の要素は上記分野のすべてが、アポプチンまたはその誘導体および／またはフラグメント（本明細書においてはすべてアポプチン活性を有するものとして引用する）を本発明に従い応用し得る分野であるということである。アポプチンはニワトリ貧血ウイルスに当初見出されたタンパク質であり（ノートボーン（Noteborn）ら、１９９１）、当初はＶＰ３と呼ばれていた。このタンパク質のアポトーシス活性は本発明者のグループにより発見された（ノートボーンら、１９９４）。
【０００３】
上述のように本発明はアポプチンのアポトーシス誘発効果を使用する。
アポトーシスは余分な、または過度に損傷した、または悪性化した細胞を除去するためにプログラムされた活性な生理プロセスである（アーンショウ（Earnshaw）、１９９５、デューク（Duke）ら、１９９６）。アポトーシスは細胞の萎縮、核の分断および細胞質の断片形成、ＤＮＡのドメイン・サイズ・フラグメントへの縮合と切断により特徴づけられ、殆どの細胞ではヌクレオソーマル間分解を伴う。アポトーシス性細胞は膜包摂アポトーシス体に分解する。最終的に、近傍細胞および／またはマクロファージがこれら死亡細胞を迅速に食作用により取込む（ウイリー（Wyllie）ら、１９８０、ホワイト（White）、１９９６）。組織培養条件下で増殖した細胞および組織からの細胞は染色体ＤＮＡ染色試薬、例えば、ＤＡＰＩまたは沃化プロピジウムによりアポトーシスの徴候を分析することができる。該試薬は正常のＤＮＡ（染色性）を強く通常どおりに染色するが、アポトーシス性染色質の染色は弱いかおよび／または異常である（ノートボーンら、１９９４、テルホード（Telford）ら、１９９２）。
【０００４】
アポトーシスのプロセスは多様な調節刺激により開始させることができる（ウイリー、１９９５、ホワイト、１９９６、レバイン（Levine）、１９９７）。細胞生存率の変化はヒトの病因、例えば、増殖の増強および／または細胞死の減少によって惹き起こされる癌発生などにおいて重要な役割を果たしている（カー（Kerr）ら、１９９４、パウロビッチ（Paulovich）、１９９７）。種々の化学療法作用因子および照射は、多くの場合、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３の介在する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発することが証明されている（トンプソン（Thompson）、１９９５、ベラミイ（Bellamy）ら、１９９５、シュテラー（１９９５）、マックドーネル（McDonell）ら、１９９５）。
【０００５】
しかし、多くの腫瘍はその発生に際しｐ５３の突然変異を獲得し、それがしばしば癌治療に対する不十分な応答と相関している。ＤＮＡ腫瘍ウイルスの形質転換タンパク質は間接的にまたはｐ５３に直接結合することによりｐ５３を不活化する（テオドロ（Teodoro）、１９９７）。かかる作用因子の一例はＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ４０の大型Ｔ抗原である。特定の造血系腫瘍において、Ｂｃｌ−２癌遺伝子の高発現レベルは、種々のアポトーシス誘発化学療法剤に強く抵抗することと関連している（ホッケンベリー（Hockenberry）１９９４、ザックスおよびローテム（Sachs and Lotem）、１９９７）。多くの細胞毒性作因に抵抗するこのような癌については、代わり得る抗腫瘍治療法がアポトーシス誘発に基づき開発されつつある（トンプソン、１９９５、およびパウロビッチ、１９９７）。
【０００６】
アポプチンはニワトリ貧血ウイルスから誘導される小型のタンパク質（ＣＡＶ；ノートボーンおよびデ・ボアー（Noteborn and De Boer）、１９９５、ノートボーンら、１９９１、ノートボーンら、１９９４）であり、ヒト悪性腫瘍細胞系および形質転換細胞系においてアポトーシスを誘発するが、非形質転換ヒト細胞系では誘発しない。in vitroにおいてアポプチンは正常リンパ系細胞、皮膚線維芽細胞、表皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞のプログラムされた細胞死を誘発し得ない。しかし、正常細胞が形質転換されると、例えば、ＳＶ４０の形質転換遺伝子によりそれらはアポプチンによるアポトーシスを受けやすくなる（ダネン−バン・オーショット（Danen-van Ooschot）、１９９７およびノートボーン、１９９６）。正常ヒト線維芽細胞におけるアポプチン長期発現は、アポプチンがこれらの細胞において毒性または形質転換活性をもたないことを明らかにした。正常細胞においては、アポプチンが細胞質に優先的に見出されたが、形質転換細胞または悪性腫瘍細胞においてはそれが核に位置していた。このことはアポプチンの局在化がその死亡誘発活性に関連していることを示唆している（ダネン−バン・オーショットら、１９９７）。
【０００７】
さらに、我々は、アポプチンは機能的ｐ５３の不在下にアポトーシスを誘発し（ツアング（Zhuang）ら、１９９５ａ）、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｒ−ａｂｌ（ツアングら、１９９５）、Ｂｃｌ−２−会合タンパク質ＢＡＧ−１、およびカスパーゼ阻害牛痘タンパク質ＣｒｍＡによってはブロックされないことを確立した（ダネン−バン・オーショットら、１９９７、ノートボーン、１９９６）。最終的に、不死化しただけで形質転換が最少であった細胞はアポプチンにより殺滅され得ると思われる。
【０００８】
したがって、アポプチンは、機能的ｐ５３の欠如、Ｂｃｌ−２または他のアポトーシス阻害遺伝子の（過剰）発現のために、（化学）治療剤に対し非感受性または弱感受性の腫瘍に対しても非常に強力な抗腫瘍剤である。アポプチンが正常の形質転換ヒト細胞のアポトーシスを誘発しないという事実は、in vivoでのアポプチン処理毒性効果が非常に低いことを示唆する。さらに、前悪性状態で最小限に形質転換された細胞でも、アポプチンの死亡−誘発効果に感受性であると思われる。
【０００９】
本発明者らは、アポプチンが正常細胞には極めて安全であるが、細胞が形質転換される、および／または不死化（該用語は相互に交換可能なものしてここでは使用した）するやいなや、アポトーシスを誘発することを知り、この知見に基づくいくつかの用途を設計した。
【００１０】
かくして、本発明は可能性のある形質転換作用因子の形質転換能力を定量する方法を提供し、その方法は非形質転換細胞に誘発可能なアポプチン様アポトーシス活性を付与し、該細胞を該形質転換作用因子に露呈し、次いで当該細胞内での該アポトーシス活性の局在化を定量するか、または当該細胞におけるアポトーシスの誘発を定量することを含む。
【００１１】
上記アポトーシス活性とは当該活性を有する実体を意味すると理解される。当該細胞に該アポトーシス活性を付与するには、該細胞に該活性をエンコードする組換え核酸分子を移入することにより行う。アポプチン様活性は、本明細書においては、ニワトリ貧血ウイルスのＶＰ３またはアポプチンと同様の活性を有する物質（好ましくはタンパク質性物質）と定義される。当該定義の中に特に包含されるのはアポプチンの対立遺伝子変異体、誘導体および／またはフラグメントであり、そこでの誘導体とはアポトーシス活性をすべて失うこととはならないアミノ酸置換を有するものと定義される。同様の活性とはその種の活性が量は異なっても同じであることを意味すると解される。本発明による方法は、当該可能性のある形質転換作用因子がタンパク質性物質である場合の適用に特に適している。この場合は当該タンパク質性物質が該アポトーシス活性をもつ該非形質転換細胞中で同時に発現されることを可能とする。タンパク質性物質の例としては、ＳＶ４０の大型Ｔ−抗原またはその機能等価物である。
【００１２】
本発明はまた、非形質転換細胞および形質転換／腫瘍化細胞の核にアポプチンが浸入するのを可能とするアポプチンタンパク質上に変化をもたらし、アポトーシスの誘発に至らしめるアポプチン遺伝子の修飾法を提供する。アポプチンタンパク質はＳＶ４０の核局在化シグナルにより増補される。アポプチンの当該定義に特に包含されるのは、アポプチンの対立遺伝子変異体、誘導体および／またはフラグメントであり、そこでの誘導体とはアポトーシス活性をすべて失うこととはならないアミノ酸置換を有するものと定義される。これはアポプチンタンパク質が該アポトーシス活性をもつ非形質転換細胞中で発現されることを可能とする。該アポプチン活性をもつがそれ自身の配列では非形質転換細胞または形質転換細胞の核に入り得ないアポプチンフラグメントが修飾という手段により浸入し、アポトーシスを誘発することができる。
【００１３】
本発明は細胞の腫瘍細胞となる性向を定量する方法を提供し、該方法は誘発可能なアポプチン様アポトーシス活性を当該細胞に付与し、該細胞を比較的緩和な腫瘍化活性に曝し、次いで当該細胞内のアポトーシスを定量するか、および／または当該細胞中の該アポトーシス活性の局在化を定量することによる。この場合、前記検討のように形質転換作用を有すると思われる作用因子が、癌原性または腫瘍化活性に導く突然変異因子としてすでに当該細胞中に存在する。その様な場合に、アポプチンのみがすでに形質転換を受けている細胞においてアポトーシスを誘導するという事実は、細胞が形質転換活性、例えば、ＵＶ照射およびＸ線処理に緩和に露出したとき不死化または形質転換に導くような突然変異をもつようになるか否かをチェックする可能性を提供する。
【００１４】
この方法において、癌化する可能性のある一群の細胞を決定し得る。この方法は勿論、癌に罹患する遺伝的リスクをもち、予防的治療を施すべき人々の見込みを診断する領域に適用し得るが、これも本発明の今一つの目的である。この種の診断は、子供の時期に癌になり易いと見込まれる人々への助言にも適用し得る。
【００１５】
かくして、本発明はまた癌の遺伝型につき被験者の性向を定量する方法を提供し、該方法はかかる被験者の関連細胞サブセット標本を本明細書記載の方法に付すことを含む。また、本発明はさらに細胞において発癌活性および／または形質転換活性を有する遺伝子突然変異を定量する方法を提供し、該方法は当該細胞を本発明による方法に付すことを含む。
【００１６】
前述のように本発明の他の目的は、細胞のサブセットが癌化傾向にある被験者の細胞サブセットの予防的処理手段を提供することにある。これらの手段はアポプチン様活性をエンコードする核酸を包含し、好ましくは遺伝子送達媒体の形状で提供される。遺伝子送達媒体はウイルス由来または他のものであってもよい。多くの媒体が技術的に開示されており、当業者既知である。それらはアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス粒子形状のもの、レトロウイルスベクター、好ましくは組換えレトロウイルスのもの、同種のベクターではあるが他のウイルスから誘導されたもの、リポソームまたは他の担体分子などであるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明はまた作用因子の腫瘍化能力を定量する際の本発明による方法を実施するための診断試験キットを提供し、該キットはアポプチンまたはその機能的誘導体もしくはフラグメントをエンコードする核酸を移入した非形質転換細胞、および要すれば該試験を実施し、結果を検出するのに必要な他の材料すべてを含んでなる。
【００１８】
本発明はまた癌化性向細胞を定量する本発明による方法を実施するための診断試験キットを提供し、該キットはアポプチンまたはその機能的誘導体もしくはフラグメントをエンコードする核酸であって真核細胞に移入することが可能であり、かつ、かかる細胞において発現され得るもの、および要すれば該試験を実施し、結果を検出するのに必要な他の材料すべてを含んでなる。また、好ましくは、ＵＶ照射およびＸ線処理などの緩和な腫瘍化活性に細胞を曝す手段が提供される。
【００１９】
本発明はまた形質転換マウスモデルにおいて、化学物質、ウイルス類、ＵＶ−およびＸ−線照射などの形質転換作用因子によるアポプチン誘発アポトーシスの誘発研究法をも提供し、この方法により腫瘍形成を阻害する。トランスジェニック−アポプチン・マウスを用いて、遺伝型癌を担持し、アポプチンを発現し得るトランスジェニックキメラにおいてアポプチンの抗腫瘍効果を分析することができる。さらに、in vivoモデルにおけるアポプチン発現の効果を上記のトランスジェニック−アポプチン・マウスを用い検討することができる。
【００２０】
発明の詳細な説明
我々は以前に、ウイルスタンパク質アポプチンがヒトおよびげっ歯類両方の培養した形質転換細胞においてアポトーシスを誘発するが、正常ヒト細胞では誘発しないことを示した。我々が今回観察したのは、アポプチンが培養したマウス（またはラット）胚線維芽細胞においてアポトーシスを誘発し得ないことである。（培養物は１６〜１８日令のマウス（ラット）胚から誘導された。）このことが示すのは、アポプチンは未処理胚、少なくとも胚発生のそれ程早期ではない胚では毒性を伴うことなく発現され得ることである。
【００２１】
我々は今回、生存可能なトランスジェニック−アポプチン・マウスを生産し得るようになった。我々はトランスジェニック・マウスの構成的アポプチン発現が致死的あるいは他の生命に脅威となる／生命を制限するような効果を生じないという証拠を提供する。我々はまた、アポプチン遺伝子およびＳＶ４０形質転換遺伝子を有する培養した正常ヒト線維芽細胞の同時トランスフェクションがアポトーシスのプロセスを活性化し、それがアポプチンタンパク質の細胞質（当初そこに蓄積する）から核への移動を伴うということを観察した。
【００２２】
記載の発明は、アミノ酸がアポプチンタンパク質またはそのフラグメントに付加し、それらが細胞核内へ浸入することおよび／または蓄積することを可能とし、アポトーシスの誘発に至るという原理を提供する。
【００２３】
本発明は潜在的に形質転換性である遺伝子の検出用診断試験の原理を提供する。ヒトおよび／またはげっ歯類細胞などの正常二倍体哺乳類細胞がかかる試験に用いられる。その目的のために、正常二倍体細胞には、検討すべき遺伝子を含むプラスミドとアポプチンをエンコードするプラスミドを同時に移入するか、あるいは検討すべき遺伝子を移入し、さらにアポプチン発現ウイルスベクターを感染させる。アポプチン−誘発アポトーシスの誘発および／または核内アポプチンの存在は、実験した遺伝子が形質転換／腫瘍化潜在力を取込んでいることを示す。
【００２４】
さらに、我々は、腫瘍サプレッサー遺伝子において生殖系列突然変異を担持し、結果として特定スペクトルの腫瘍を発生させる性向（本明細書では癌性向ともいう）のある個体から単離した二倍体ヒト細胞が、アポプチンのアポトーシス誘発効果に抵抗するが、しかし、健常人からの二倍体細胞はその細胞培養物を紫外線照射した場合に過敏になるということを発見した。
【００２５】
このことは我々に癌化性向を予測する診断アッセイ法の開発を可能とする。腫瘍サプレッサー遺伝子の生殖系突然変異のために遺伝的に癌化性向をもつ家族において、染色体ＤＮＡの広範な分析なくして、家族の一員が悩んでいるのか、病因遺伝子もっているのか否かを予測するのは殆ど不可能である。我々の結果はアポプチン遺伝子を使用することにより、それが簡単な方法となることを示している。その目的のために、二倍体皮膚線維芽細胞またはリンパ球を試験すべき個体から単離し、培養した細胞にアポプチン遺伝子を移入し、次いでＵＶ光（２６６ｎｍ）を照射する。もし移入した細胞がＵＶ照射後アポトーシス性にはなるが、ＵＶ露光なしにはアポトーシスに入らないならば、それはその個体が癌化性向にあることを強く示すものである。腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異による癌化性向について、すべてのタイプではないが、これまでにアポプチン／ＵＶアッセイ法により試験した。しかし、同じ現象が他の癌化性向細胞には観察されないだろうと保証する理由はない。癌化性向を予測する同様の診断試験が、ＵＶ照射の代りにＸ線処理を用いることにより実施することもできる。
【００２６】
本発明はまた、癌化性向およびその特定ストレス応答との関係、例えば、高揚した再活性化（ＥＲ）の分子レベルでのさらなる情報を我々が得ることを可能とする（アブラハム（Abrahams）ら、１９９６）。高揚した再活性化は特定のＤＮＡ損傷作用因子に対する正常（ヒト）細胞の一種の反応であり、細胞の癌原性形質転換に対する感受性を反映していると思われる。
【００２７】
本発明を以下の実験の部においてさらに詳細に説明する。この実験の部は説明を目的とするものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００２８】
実験の部
細胞および細胞培養条件
ラット胚線維芽細胞（ＲＥＦ）を１４日令ラット胚から調製した。該細胞を液体窒素から融解し、１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中培養し、次いで細胞継代第２期にプラスミドＤＮＡを移入した。
【００２９】
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をｐ５３＋／＋マウスからまたはｐ５３−／−ノックアウトマウスから調製した（タイラー・ジャックス（Tyler Jacks）、１９９４および１９９６；タイラー・ジャックスら、１９９４）。該細胞は１０％仔ウシ血清添加Ｆ１５培地中コーニング皿上増殖させた。Ｐ１９細胞はマウス胚癌／奇形癌腫から誘導される（バーニイ（Burney）ら、１９８２）。該細胞は８％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中ゼラチン化ペトリ皿上増殖した。
【００３０】
ＢＲＫ／ｘｈｏ細胞は乳仔ラット腎臓細胞からアデノウイルス・タイプ５Ｅ１領域で形質転換することにより調製する（シュライアー（Schrier)ら、１９８３）。該細胞は１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で培養した。
【００３１】
ヒト二倍体包皮線維芽細胞ＶＨ１０およびＶＨ２５（クライン（Klein）ら、１９９０）は１０％仔ウシ血清添加ダルベッコ修飾イーグル培地中で増殖させた。
【００３２】
ヒト表皮ケラチン細胞（ＦＳＫ−１）の一次培養物は、ポネック（M. Ponec）ら（１９８１）に従い若干修飾したラインワルドおよびグリーン（Rheinwald and Green）（１９７５）記載の完全培地中で開始し、その後、ケラチン細胞血清不含培地（ＫＳＦＭ）中培養した。ここに記載の実験では、継代数３を用いた。
【００３３】
Ｆ９６０５細胞は異型母斑症候群（ＤＮＳ）の患者から誘導されるｐ１６−／−の二倍体線維芽細胞であり、家族性非定型多発性母斑−メラノーマ（ＦＡＭＭＭ）症候群の前駆体であると仮定される（グルース（Gruis）ら、１９９５）。
【００３４】
該細胞は１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で増殖させた。
ＧＭ１４９２細胞はヒト二倍体線維芽細胞であり、ｐ５３を発現せず、ブルーム症候群（癌発現率の高い常染色体性疾患）の患者から誘導される（バン・ラー（Van Larr）ら、１９９４）。該細胞は１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で増殖させた。
【００３５】
ＬＦ２６７５Ｔはリ−フローメニイ（Li−Fraumeni）症候群（ＬＦＳ）の患者からの二倍体皮膚線維芽細胞である。この疾患はｐ５３遺伝子の１対立遺伝子における生殖系列突然変異と種々タイプの癌の早期発病により特徴づけられる（スリバスタバ（Srivastava）ら、１９９０；アブラハムら、１９９６）。該細胞は１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で増殖させた。
【００３６】
４０１細胞は種々タイプの癌発生率の高いリンチ（Lynch）タイプ２症候群ファミリーの個体から採取した二倍体線維芽細胞である。該細胞は乳癌により死亡した個体から誘導された（アブラハムら、１９９６）。該細胞は１０％仔ウシ血清添加ＤＭＥＭ中で増殖させた。
【００３７】
培地はすべてＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより入手し、抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有していた。
【００３８】
細胞培養物の照射
順化培地を培養物から除去し、細胞をＰＢＳにより２度すすいだ。ＰＢＳ除去後、培養物はすでに記載されているようにＵＶ照射するか（アブラハムら、１９８４）、またはアンドレックス２２５ＳＭＡＲＴ（アンドレックスＳｔ、コペンハーゲン）を用い、２００ＫＶ、４ｍＡで１−ｍｍＡ１フィルターによりＸ線（５グレイ）処理した。線量および線量率はＰＴＷ線量計によりモニターした。ＵＶ処理後、順化培地に戻し、培養混合物を３７℃で培養した。
【００３９】
プラスミド
発現プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３はアポプチンタンパク質のみをエンコードするＣＡＶ ＤＮＡ配列を含み（ｎｔ４２７〜８６８；ノートボーン（Noteborn）ら、１９９１、ノートボーンおよびデ・ボアー（De Boer）、１９９６）、プラスミドｐＣＭＶ−ｄｅｓは筋肉細胞の構造タンパク質であるデスミン（desmin）をエンコードする（メンケ（Menke）ら、１９９７）。プラスミドｐＣＭＶ−ｎｅｏはアポプチン誘発アポトーシスに潜在的効果を有する遺伝子産物をエンコードするプラスミドに対し「エンプティ」陰性対照として用いられる。発現遺伝子はすべてサイトメガロウイルス（初期）増強プロモーターの調節下にある。
【００４０】
プラスミドＳＶ４０はそれ自身で調節されるＳＶ４０大型Ｔ抗原−および小型Ｔ抗原−コーディング領域の両方を含むＳＶ４０起源−欠損（ｏｒｉ−）初期領域クローンを含む（ディンサート（Dinsart）ら、１９８４）。プラスミドｐＲ−s８８４はラウスニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ；デ・ロンデ（De Ronde）ら、１９８９；スミッツ（Smits）ら、１９９２）の長鎖末端繰返し（ＬＴＲ）の転写制御下、完全ＳＶ４０大型Ｔ抗原および末端切除小型Ｔ抗原を発現する。プラスミドＰＲ−ＳＶｔはＲＳＶ ＬＴＲに融合したＳＶ４０小型Ｔ遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を含む（フィリップおよびブンデル（Philips and Bundell）１９８８）。
【００４１】
発現プラスミド２１ＥｃｏＡはマウスＨ−２Ｋｂ組織適合性抗原遺伝子／プロモーター領域（メラー（Mellor）ら、１９８２）およびｐＢｒ３２７配列から構成されるが、エラスムス大学教授フランク・グロスベルド博士（Dr. Frank Grosveld）（ロッテルダム、オランダ）からの恵与である。プラスミド２１ＥｃｏＡはＨ−２Ｋｂ遺伝子の第一エキソン内にＮｏｔ１を含み、Ｈ−２Ｋｂプロモーターにより調節されることとなる外来遺伝子の取込みを可能とする。アポプチンをエンコードする配列含有ＢａｍＨ１フラグメントはｐＣＭＶ−ＶＰ３から単離され、Ｎｏｔ１−ＢａｍＨＩリンカーを用いて２１ＥｃｏＡプラスミドのＮｏｔ１部位にクローン化された。Ｈ−２Ｋｂプロモーターの調節下にアポプチン遺伝子を含む最終プラスミドはｐ２１ＥｃｏＡ−ＶＰ３と呼称した。次いで、アポプチン遺伝子に隣接するＥｃｏＲ１−部位はこの特異ＥｃｏＲＩ部位でのプラスミドｐ２１ＥｃｏＡ−ＶＰ３線状化とクレノーポリメラーゼ処理により欠失させた。このプラスミドをｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏと呼称する。
【００４２】
アポプチン遺伝子をもつＨ−２ｋＢ発現ユニットを含むＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ消化およびアガロース−ゲル電気泳動により原核細胞ＤＮＡ配列から分離した。
【００４３】
プラスミドＤＮＡはＣｓＣｌ勾配での遠心分離およびセファクリルＳ５００（ファルマシア、スゥエーデン）でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。
一過性トランスフェクション
細胞には実質的にフィッシャー（Fischer）ら（１９９６）の記載どおりにトランスフェクション剤ＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム、ＦＲＧ）を単層培養物中で移入するか、またはグラハムおよびバン・デル・エブ（Graham and Van der Eb）（１９７３）の記載どおりにリン酸カルシウム沈殿法によりプラスミドＤＮＡを移入した。
【００４４】
間接的免疫蛍光法
細胞はすべて顕微鏡スライドグラス上で増殖させた。スライドグラスは未被覆とするか（ＶＨ１０、ＶＨ２５）、または３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＴＥＳＰＡ；ＦＳＫ−１）で被覆した。細胞は室温で１０分間８０％アセトンにより固定し、（バン・デン・ヒューベル（Van den Heuvel）、１９９０）記載のとおりに間接的免疫蛍光法に用いた。移入した細胞中にアポプチンの存在および／または局在化を証明するために、マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（８５．１；ノートボーン（Noteborn）ら、１９９１）を用いた；ヒト・デスミンについてはマウスＭａｂ３３（モノサン（Monosan）、ウーデン、オランダ）を、ＳＶ４０Ｔ抗原についてはＰａｂ４１９（ライデン大学ヨヒムセン博士（Dr. A.−G Jochemsen）（オランダ）の恵与）をそれぞれ使用した。フルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗マウス抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー・インク、ウエストグローブ、ペンシルヴェニア、米国）を第二抗体として使用した。核ＤＮＡは２，４−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により染色した。
【００４５】
形質転換アポプチン・マウスの生成
形質転換アポプチン・マウスの生成のために、ＦＶＢマウス株の受精オーシストおよび該マウス株からのマウスを里子哺育用として使用した。ブリンスター（Brinster）ら（１９８１）の方法に従いオス前核にマイクロインジェクションを実施した。マイクロインジェクション１回当たり、プラスミドｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏから誘導し、必要なＨ−２Ｋｂ転写ユニットと完全アポプチン遺伝子を含むＥｃｏＲ１ ＤＮＡフラグメント５００コピーを注入した。
【００４６】
結果と考察
アポプチンはげっ歯類形質転換細胞においてアポトーシスを誘発するが、正常胚細胞でな誘発しない。
【００４７】
アポプチンが正常胚げっ歯類細胞においてアポトーシスを誘発し得ないか否かを検討するために、マウス胚細胞およびラット胚細胞の培養物に、アポプチンをエンコードするプラスミドを一過性に移入した。陰性対照として、アポトーシス活性をもたないデスミンをエンコードするプラスミドを細胞に移入した。アポプチンを発現する細胞はＭａｂ８５．１による間接的免疫蛍光法でスクリーンし、デスミン発現細胞はマウスＭａｂ３３でスクリーンした。アポプチン陽性細胞またはデスミン陽性細胞でのアポプチン誘発はＤＡＰＩにより分析した。ＤＡＰＩは未変化の核では正常に染色するが、アポトーシスの核では染色異常および／または染色微弱である。
【００４８】
トランスフェクションの５日後、デスミン陽性細胞の凡そ１０〜２０％がアポトーシス性であったが、その殆どがトランスフェクション事象による基本レベルのものと思われる（データ未開示；メンケ（Menke）ら、１９９７；ダネン−バン・オーショット（Danen-van Oorschot）、１９９７ａ）。トランスフェクションの２、３、４または５日後、アポトーシス性アポプチン陽性細胞の百分比はデスミン陽性培養物で観察されたアポトーシス性細胞の百分比を有意に超えることはなかったが、これはアポプチンが正常胚細胞培養においてアポトーシスを誘発しないことを意味している。アポプチンをエンコードするプラスミドで形質転換したマウス／ラット胚細胞または乳仔ラット腎細胞では、アポプチンがこれらの細胞中アポトーシスを誘発し得ることを証明した。「正常」胚げっ歯類対形質転換げっ歯類細胞におけるアポプチン発現の結果を図１に示す。
【００４９】
これらのデータは、正常の成体および胚げっ歯類細胞ではアポプチンがアポトーシスを誘発し得ないが、ウイルスで形質転換した誘導体においては、少なくとも細胞培養条件においてアポトーシスを誘発することを示している。
【００５０】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原とアポプチンの同時発現は正常ヒト二倍体細胞においてアポプチン誘発アポトーシスに帰着する。
【００５１】
我々は健常個体から誘導した正常ヒト細胞においてのアポプチン誘発アポトーシスに対する形質転換遺伝子発現の影響を検討した。その目的のために、ヒトＶＨ１０二倍体線維芽細胞およびＦＳＫ−１二倍体ケラチン細胞に、アポプチンをエンコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３、およびＳＶ４０大型Ｔ抗原と小型Ｔ抗原両方をエンコードするプラスミドｐＳＶ４０、大型Ｔ抗原をエンコードするｐＲ−ｓ８８４、小型Ｔ抗原をエンコードするプラスミドｐＲ−ＳＶｔ、または陰性対照プラスミドｐＣＭＶ−ｎｅｏのいずれかを一過性に同時移入した。間接的免疫蛍光法により、アポプチン誘発アポトーシスにつき細胞を分析した。アポプチンを対照プラスミドで移入した場合、正常ＶＨ１０細胞およびＦＳＫ−１細胞共にアポトーシスを受けなかった。この結果は予想どおり、アポプチンの発現だけでは正常ヒト二倍体細胞においてアポトーシスを誘発できないことを示しており、ダネン−バン・オーショット（Danen-van Oorschot）（１９９７）記載のデータを確認している。しかし、アポプチンとＳＶ４０大型Ｔ抗原両方を発現する正常二倍体ヒト線維芽細胞およびケラチン細胞は、小型Ｔ抗原を発現するいしないにかかわらず、アポプチン誘発アポトーシスを受けた（図２）。アポトーシス誘発の割合はウイルス性形質転換遺伝子の存在下顕著に増大した。ＳＶ４０小型Ｔ抗原がアポプチンと同時発現されても、アポプチンによるアポトーシスの誘発には至らなかった。正常細胞がアポプチン抵抗性からアポプチン感受性に遷移するのは、恐らく、アポプチンタンパク質が細胞質局在から核局在に移動するという事実により説明することができる。この遷移はＳＶ４０プラスミドのトランスフェクションの略２日後にすでに明らかとなる（図３）。結論し得ることは、この例では形質転換産物がＤＮＡ腫瘍ウイルスからの発現であるために一つの事象が起こり、それがアポプチンを細胞質から核へ移動させることとなり、さらにアポトーシス誘発につながるということである。
【００５２】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原とアポプチンの同時発現は正常げっ歯類二倍体細胞においてアポプチン誘発アポトーシスに帰着する。
【００５３】
次に、我々は、ｐ５３＋／＋マウスから、または形質転換ｐ５３−／−マウスから誘導した正常マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるアポトーシス誘発への形質転換遺伝子とアポプチンの同時発現の影響を検討した。形質転換ＳＶ４０大型Ｔ遺伝子を小型Ｔ抗原とともにまたはなしにアポプチンとの組合わせにおいて同時発現する一過性に移入したＭＥＦの両タイプは急速にアポトーシスを受けたが、一方、対照プラスミドとともにまたは非形質転換小型Ｔ抗原をエンコードするプラスミドとともにアポプチンを発現するＭＥＦはアポプチン誘発アポトーシスには至らなかった。結果を図４に示す。
【００５４】
また、免疫蛍光分析もアポプチンとＳＶ４０大型Ｔ抗原の同時発現がアポプチンを細胞移動させることを明らかにした。検討したＭＥＦにおいて、アポプチンは細胞質に位置している。ＳＶ４０大型Ｔ抗原の発現によりアポプチンは核に入り、次いでアポトーシスを誘発する。比較として、アポプチン陽性形質転換マウス細胞の百分比についても図５に示す。
【００５５】
これらの結果が示すのは、アポプチンはｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−マウス線維芽細胞においてはアポトーシスを誘発しないが、形質転換タンパク質の発現により誘発することである。この情報が重要なのは、「正常」ｐ５３−／−細胞が自発性形質転換に顕著に感受性であり、より高度の形質転換表現型に容易に進行することが知られているからである。しかし、ｐ５３のみの損失では形質転換した特性を生み出すのに十分でない。さらに、この知見はアポプチンがヒト細胞以外の哺乳動物細胞において形質転換タンパク質の発現にもとづきアポトーシスを誘発し得ることを示す。
【００５６】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原とアポプチンの同時発現は癌性向ヒト個体から誘導された正常二倍体細胞においてアポプチン誘発アポトーシスに帰着する。
【００５７】
一過性トランスフェクションと免疫蛍光法により、我々はまた、遺伝的欠陥により癌発生率の増大を示す個体から誘導された正常線維芽細胞Ｆ９６０５およびＧＭ１４９２についてアポプチンの影響を検討した。アポプチンはこれら癌性向個体からの正常二倍体細胞においてアポトーシスを誘発し得ない。しかし、ＳＶ４０大型Ｔ抗原が発現すると、アポプチンは核に浸入した後アポトーシスを誘発する（図６）（データ未開示）。
【００５８】
これらのデータは、遺伝的癌性向症候群からの二倍体細胞がアポプチンに感受性ではない一方で、それら細胞が形質転換遺伝子を発現する場合には感受性となることを確認させる。かくして、遺伝性症候群などからの二倍体細胞は、このアッセイ法では「正常」二倍体ヒト細胞に一致する。
【００５９】
ＳＶ４０大型Ｔ抗原核局在化シグナルがアポプチンタンパク質に共有結合することのアポトーシス誘発に及ぼす影響
次に、我々はアポプチンとＳＶ４０ＬＴ抗原（アポプチンのＮ末端に共有結合したＳＶ４０大型Ｔ抗原のアミノ酸Ｎ−プロリン−プロリン−リジン−リジン−リジン−アルギニン−リジン−バリン−Ｃ）の核局在化シグナルからなるキメラタンパク質の発現が、非形質転換および形質転換ヒト細胞においてアポトーシスの誘発に至るかどうかを検討した。キメラタンパク質はＮＬＳ−アポプチンと呼称する。その目的のために、非形質転換ＶＨ１０ヒト線維芽細胞および形質転換ヒト骨肉腫誘導Ｓａｏｓ−２細胞（ダネン−バン・オーショット（Danen-van Oorschot）、１９９７）にキメラタンパク質ＮＬＳ−アポプチンをエンコードするプラスミドを移入した。両細胞型において、ＮＬＳ−アポプチンの発現はアポプチンの核局在化とアポトーシスの誘発に帰着した。ＮＬＳに共有結合した非アポトーシスタンパク質グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ；パインズ（Pines）、１９９５）の発現は、核には入ったが、アポトーシスの誘発には至らなかった。
これらのデータが証明するのは、細胞形質転換非依存様式でその核局在化を可能とする修飾アポプチンが核内に移動し、次いでアポトーシスを誘発し得ることである。
【００６０】
アポプチンの最初のＮ−末端６９アミノ酸と非アポトーシス性ＧＦＰタンパク質との融合産物はアポトーシス誘発には至らしめないが、このことはこのキメラタンパク質が核に入らないという事実と一致する（ノートボーンおよびピーターセン（Noteborn and Pietersen）、１９９８）。今回、我々はＮＬＳの８個のアミノ酸をアミノ酸１〜６９からなるアポプチンフラグメントのＮ−末端に共有結合させた（ＮＬＳ−アポプチン／１〜６９）。非形質転換ＶＨ１０細胞および腫瘍化ヒト細胞（例えば、ヒト骨肉腫−誘導Ｓａｏｓ−２細胞）の両方に、ＮＬＳ−アポプチン／１〜６９をエンコードするプラスミドをトランスフェクションすると、ＮＬＳ−アポプチン／１〜６９の核局在化と、それに続くアポトーシス誘発に至る。
【００６１】
これらのデータが示すのは、アポプチンのＣ−末端部分以外に、Ｎ−末端部分（１〜６９アミノ酸）も、それが核に移入するとそうなるということである。これらの実験においては期待どおりに、ＮＬＳ−ＧＦＰは核内に移動したが、アポトーシスの誘発には至らなかった。
【００６２】
癌性向個体からの正常二倍体細胞はＵＶ照射後アポプチン誘発アポトーシスを受ける。
【００６３】
我々はまた、二倍体細胞上、ＵＶ照射がアポプチンによるアポトーシス誘発にどう影響するかを検討した。健常人（ＶＨ２５）から、または癌性向症候群（リ−フローメニイ（Li−Fraumeni）症候群患者からのＬＦ２６７５Ｔ細胞およびリンチ（Lynch）タイプ２症候群患者からの４０１細胞）の個体から誘導した二倍体線維芽細胞にアポプチンをエンコードするプラスミドを一過性に移入した。トランスフェクションの前に、細胞の一部にＵＶ照射した。陰性対照として、タンパク質デスミンをエンコードするプラスミドを該細胞に移入した。
【００６４】
３種の細胞型、ＶＨ２５、ＬＦ２６７５Ｔおよび４０１はすべてＵＶ照射なしにはアポプチン誘発アポトーシスを示さなかった。しかし、ＵＶ照射との組合わせにおいて、ＬＦ２６７５および４０１細胞は急速にアポプチン誘発アポトーシスを受けた。しかし、ＶＨ２５細胞は受けなかった。我々はこの現象についての説明を成し得ないが、それが他の細胞の性質と相関することは明らかであった。腫瘍サプレッサー遺伝子での生殖細胞系突然変異のために、癌性向性である患者からの二倍体細胞は、ＵＶ照射に対し予期せざる反応を示す。正常二倍体線維芽細胞をＵＶまたは他のＤＮＡ傷害作用因子で処理すると、それらは多様な一過性の応答を示すが、それは例えば、シグナル伝達経路の活性化、様々な遺伝子の発現誘発、細胞性ＤＮＡ複製の阻害、およびＳＯＳ様現象の活性化（例えば、再活性化増強（ＥＲ）および突然変異誘発増強（ＥＭ）など）である。アブラハムら（１９９６）は、腫瘍サプレッサー遺伝子での生殖細胞系突然変異のために遺伝的に癌性向性をもつ患者からの正常二倍体線維芽細胞が、一例の応答（再活性化増強）を除き、ＵＶ照射に対して正常個体からの細胞と同様の応答を示すことを見出した。これら患者からの細胞におけるＥＲ応答は、正常個体からの細胞におけるよりかなり高いが、それ故にこれら患者の細胞はＥＲスーパー（＋）と呼ばれる。ＥＲ現象の分子生物学的原理は未だ不明瞭である。ＥＲの検出は、ＵＶ−傷害（またはＸ線傷害）細胞中ＵＶ−照射ウイルスの（増強された）生存率を非傷害細胞の生存率に比較して測定することにもとづいており、時間のかかる方法である。ＵＶ−照射によるアポプチン誘発アポトーシスにもとづくアッセイは意外に簡単で迅速である（下記参照）。アポプチンがＵＶ−照射により癌性向細胞において活性となるという事実はＥＲのプロセス研究を可能とする。ＥＲがＤＮＡ傷害作用因子による癌誘発プロセスにおいて重要な役割を演じているということを示す証拠がある。
【００６５】
癌性向個体からの正常二倍体細胞はＸ線処理後アポプチン誘発アポトーシスを受ける。
【００６６】
次に、我々はまた、ヒト二倍体細胞上アポプチンによるアポトーシス誘発へのＸ線処理の影響を検討した。健常個体（ＶＨ１０）から、または癌性向症候群の被験者から誘導した二倍体線維芽細胞、例えば、ＬＦ２６７５および４０１細胞にアポプチンをエンコードするプラスミドを移入した。トランスフェクションの前に、細胞の一部をＸ線処理した（線量；５グレイ）。陰性対照として、タンパク質デスミンをエンコードするプラスミドを細胞に移入した。
【００６７】
予測したように、当該細胞系、ＶＨ１０、ＬＦ２６７５および４０１の内、分析した非照射細胞のすべてがアポプチン誘発アポトーシスを示さなかった。しかし、Ｘ線処理と組合わせた場合、癌性向個体から誘導した細胞系はアポトーシスを受けたが、一方、健常者から誘導した細胞系はアポトーシスを受けなかった。トランスフェクションの５日後、これらＸ線処理アポプチン陽性癌性向細胞の大部分がアポトーシス性となった。Ｘ線で処理し、非アポトーシス作用因子デスミンを発現する細胞はアポプチン誘発アポトーシスを受けなかった。
【００６８】
これらの結果は上記ＵＶ−Ｃ処理などのＤＮＡ傷害を引起こすＸ線での処理は、正常非形質転換ヒト細胞においてアポプチンによるアポトーシス誘発に帰着する。
【００６９】
アポプチン誘発アポトーシスにもとづく癌誘発遺伝子の診断アッセイ
ダネン−バン・オーショット（Danen-van Oorschot）（１９９７ａ）らの報告では、アポプチンの細胞局在化が正常非形質転換細胞での局在化に比べて、腫瘍化／形質転換ヒト細胞では異なっていることである。さらに、核内のアポプチン蓄積がアポトーシス誘発と相関する一方、細胞質局在化は細胞生存度および正常増殖能と相関する。
【００７０】
本報告にもとづき、我々は癌誘発および／または形質転換作用因子または遺伝子を同定する診断アッセイ法を開発することができる。第一のタイプのアッセイ法は、「正常」細胞、例えば、ヒトまたはげっ歯類起源の細胞に、推定形質転換／癌誘発遺伝子をエンコードするプラスミドとともに、アポプチンをエンコードするプラスミドを移入すること、あるいは該細胞にアポプチン発現ウイルスベクターを感染させることからなる。次いで細胞について検討した事項は、（１）アポプチン遺伝子によりアポトーシスを受ける能力、および（２）細胞質から核へのアポプチン局在化のシフトについてである。
【００７１】
アポプチンの細胞内局在化は、アポプチン特異モノクローナル抗体、例えば、ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１での免疫蛍光アッセイ法を用い定量することができる。もしアポプチンと推定形質転換／癌誘発遺伝子を同時発現する正常細胞中アポトーシスの百分比が対照プラスミドを発現するアポプチン陽性対照細胞におけるよりも有意に高いならば、分析した遺伝子が実際に形質転換／癌誘発活性をもつと結論することができる。
【００７２】
診断試験の第二の例は、培養した正常二倍体細胞を推定発癌性作用因子で処理することにもとづく。該作用因子は、例えば、様々な長さの時間間隔で培地に加えることができる。次いで、細胞にアポプチンをエンコードするプラスミドを移入するか、またはアポプチンを発現するウイルスベクターを感染させる。この方法では先ず正常細胞をトランスフェクション／感染処理し、次いで細胞を試験すべき作用因子で処理することによっても実施することができる。このアッセイ法の次工程は、第一のタイプの診断アッセイ法について記載したのと同じである。
【００７３】
癌性向の診断アッセイ法
本報告に提示されたデータは、未知の細胞性／遺伝性背景をもつ個体が正常健常人に比較して癌性向であるか否かを決定するためのアッセイ法の開発を我々に可能とする。癌性向個体からの正常二倍体細胞はアポプチン誘発アポトーシスに非感受性であるが、ＵＶ−もしくはＸ線での処理または他のＤＮＡ傷害作用因子での処理後には感受性となる。以下に、かかる診断アッセイ法がＵＶ−照射の影響にもとづくことを記載する。このアッセイ法は他の突然変異誘発／発癌性作用因子により実施することもできる。
【００７４】
一次正常二倍体細胞を試験すべき個体の皮膚生検から単離し、適切な培地中で培養する。次に、細胞にＵＶ照射し、さらにアポプチンをエンコードするプラスミドを移入するか、またはアポプチン発現ウイルスベクターを感染させるか、あるいは先に細胞にトランスフェクション／感染処理を行って、次いで照射を実施する。並行して、正常健常個体からの二倍体細胞を対照として用いる。
【００７５】
アポプチン特異Ｍａｂにもとづく間接的免疫蛍光アッセイを用いることにより、核アポプチンの存在について、および／またはアポトーシスを受けているか否かについて該細胞を分析する。もしアポプチン陽性ＵＶ−処理細胞の中でアポトーシスを受けている細胞の百分比が正常個体のＵＶ−処理細胞におけるアポトーシスの百分比よりも有意に高いならば、それは該細胞を単離した個体が癌性向であることの強力な証拠である。
【００７６】
抗癌療法用製剤におけるアポプチンタンパク質の用途
上記の結果にもとづき、遺伝子（ＤＮＡ）としてではなく、タンパク質としてアポプチンを抗癌療法に適用する方法をも開発することができる。アポプチンは比較的小さなタンパク質であり、それをタンパク質として細胞内に導入するのに適している。（もしアポプチンタンパク質のフラグメントがなお癌細胞に対し所望のアポトーシス効果をもつならば、我々は未処理タンパク質の代りにタンパク質フラグメントを使用するだろう）。我々の目的は活性成分（＝アポプチンまたはそのフラグメント）の安定性を確実にし、また可能であれば標的とする腫瘍細胞に特異性を確保する有効な製剤を開発することにある。
【００７７】
我々が適切なアポプチン含有製剤で処理しようとする組織異常増殖は、治療目的および予防目的のもであって、以下の疾患を包含する：結腸直腸癌の遺伝的形態（家族性腺腫性ポリープ症（ＡＰＣ）および遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ））、肝臓癌（または注入技術により治療し得る他の臓器）、白血病およびリンパ腫（血液循環を経て治療される）、皮膚腫瘍および可能性としての肺腫瘍（呼吸器経由）。
【００７８】
形質転換アポプチン・マウス生成用発現プラスミドの構築と分析
アポプチンが培養したマウス胚線維芽細胞においてアポトーシスを誘発し得ないと今回我々が観察した事実は、アポプチンは毒性を引き出すことなく未処理胚および成体マウスにおいて、少なくとも胚発生のそれ程早期ではない段階において発現されると結論させた。我々はマウスＨ−２Ｋｂ転写ユニットにもとづき発現系を選んだが、これは胚形成に際し、また種々器官の成人期において外来遺伝子の構成的発現を可能とする（ドレッツエン（Drezen）ら、１９９２；モレロ（Morello）ら、１９８６）。
【００７９】
したがって、我々は発現プラスミドｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏを構築したが、これはマウスＨ−２Ｋｂプロモーターの調節下にアポプチンを発現する。さらに、該発現ベクターは他のＨ−２Ｋｂ要素を含んでおり、アポプチン遺伝子の発現を可能とする。図８は形質転換アポプチン発現ベクターｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏを模式図化したものである。
【００８０】
形質転換したＳａｏｓ−２細胞をプラスミドｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏで一過性にトランスフェクションすることにより、我々はアポプチンが実際にＨ−２Ｋｂ配列との関係で発現されることを証明することができた。さらに、発現されたアポプチンはプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３により発現されたアポプチンと同程度のアポトーシス誘発に帰結した（図９参照）。
【００８１】
これらの結果が意味するのは、使用した発現ベクターｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏは、形質転換した細胞がアポトーシスを受けるような方法でアポプチンを発現するということである。
【００８２】
形質転換アポプチン・マウスの生成
総計３００個の受精オーシストにＨ−２Ｋｂ転写ユニットとアポプチン遺伝子からなるＤＮＡフラグメントをマイクロインジェクションし、１１匹の里子哺育マウスに移入した。我々は総計５１匹の新生仔マウスを子孫として集めた。
【００８３】
完全ＶＰ３遺伝子からなる３２Ｐ−標識ＤＮＡフラグメントを用い、ＢａｍＨＩ−またはＸｂａＩ−消化マウス尾部ＤＮＡのサザーン−ブロット分析（サザーン（Southern）、１９７５）により、アポプチン／Ｈ−２Ｋｂユニットが総計７匹の創始（Ｆ０）マウスのゲノムＤＮＡ内に組込まれたことが示された。形質転換アポプチン・マウスはすべて健常と見えた。しかし、未知の理由で１匹の形質転換アポプチン・マウスが５〜６週令で死亡した。形質転換アポプチン・マウスをＦＶＢオスまたはメスと交配させた。その子孫からの尾部ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、アポプチン遺伝子の存在につき分析した。ＰＣＲにはプライマーとしてＰ１（５'−ＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴ−ＣＣＡＣＣＣＧＧ−３'）およびＰ２（ＣＴＴＡＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＴ−ＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧ−３'）を使用した。Ｆ０マウスのすべてから、我々は１匹以上の形質転換アポプチンＦ１−マウスを得た（図１０）。
【００８４】
形質転換アポプチン動物のＦ１−世代であるマウスはすべて生存可能であることが証明され、また、これまでアポプチンの発現と相関するような病因的欠陥も示していない。
【００８５】
ノーザン−ブロット分析により（ノートボーンら、１９９２）、アポプチン遺伝子の発現を期待どおりに種々の臓器において定量することができた。
【００８６】
参考文献は、以下のとおりである。
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【００８７】
0004287588.tif 000003
【００８８】
0004287588.tif 000004
【００８９】
0004287588.tif 000005
【００９０】
0004287588.tif 000006
【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  形質転換げっ歯類細胞系の細胞に対比した「正常」げっ歯類胚線維芽細胞におけるアポプチン誘発アポトーシス活性を示す。細胞は一過性にｐＣＭＶ−ＶＰ３を移入した。次いで、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシス誘発の相対測定値とする。
【図２】  正常個体からの線維芽細胞およびケラチン細胞におけるアポプチン誘発アポトーシスに対するＳＶ４０大型Ｔ抗原および小型Ｔ抗原の影響を示す。ＶＨ１０およびＦＳＫ−１細胞に、プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３およびｐＣＭＶ−ｎｅｏまたはＳＶ４０大型Ｔおよび小型Ｔ抗原を発現するｐＳＶ４０、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するｐＲ−ｓ８８４、およびＳＶ４０小型ｔ抗原を発現するｐＲ−ＳＶｔを一過性に移入した。次いで、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシス誘発の相対測定値とする。
【図３】  アポプチンを単独またはＳＶ４０大型Ｔ抗原および／または小型Ｔ抗原とともに発現する正常ヒト二倍体細胞におけるアポプチンの位置づけを示す。アポトーシス誘発に関し、図２で分析したと同じ細胞について、核または細胞質でのアポプチンの位置づけについても検討した。核にアポプチンを含むが、なおアポトーシスを受けていないアポプチン陽性細胞の百分比を核内のアポプチン局在化の相対測定値とする。
【図４】  正常ｐ５３＋／＋マウスからまたは形質転換ｐ５３−／−ノックアウトマウスから誘導されるマウス線維芽細胞において、ＳＶ４０大型Ｔ抗原および／または小型Ｔ抗原がアポプチン誘発アポトーシスに与える影響を示す。該細胞に、アポプチン発現プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３および対照プラスミドｐＣＭＶ−ｎｅｏを、またはＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するｐＳＶ４０、大型Ｔ抗原を発現するｐＲ−ｓ８８４、および小型Ｔ抗原を発現するｐＲ−ＳＶｔを一過性に移入した。次いで、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシス誘発の相対測定値とする。
【図５】  アポプチンを単独またはＳＶ４０大型Ｔ抗原および／または小型Ｔ抗原とともに発現するマウス胚ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−線維芽細胞におけるアポプチンの位置づけを示す。アポトーシス誘発に関し、ここでは図４で分析したと同じ細胞について、核または細胞質でのアポプチンの位置づけについても検討した。核にアポプチンを含み、なおアポトーシス性であるアポプチン陽性細胞の百分比を核内のアポプチン局在化の相対測定値とする。
【図６】  癌性向個体から誘導される「正常」二倍体ヒト線維芽細胞９６０５またはＧ４９０５において、ＳＶ４０大型Ｔ抗原がアポプチン誘発アポトーシス活性に与える影響を示す。該細胞に、ｐＣＭＶ−ＶＰ３およびｐＣＭＶ−ｎｅｏ、またはＳＶ４０の大型Ｔおよび小型Ｔ抗原両方を発現するｐＳＶ４０、大型Ｔ抗原を発現するｐＲ−ｓ８８４、および小型Ｔ抗原を発現するｐＲ−ＳＶｔを一過性に移入した。次いで、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシス誘発の相対測定値とする。
【図７】  癌性向患者に対比して正常健常個体から誘導される「正常」二倍体ヒト線維芽細胞において、ＵＶ照射がアポプチン誘発アポトーシスに与える影響を示す。該細胞を模擬処理またはＵＶ光処理し、次いでｐＣＭＶ−ＶＰ３またはｐＣＭＶ−ｄｅｓを一過性に移入した。最後に、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシスの相対測定値とする。
【図８】  形質転換アポプチン発現ベクターの模式図を示す。
【図９】  Ｓａｏｓ−２細胞におけるアポプチン誘発アポトーシス活性を示す。該細胞にｐ２１ＥｃｏＡ−Ｖｐ３−Ｅｃｏ、ｐＣＭＶ−ＶＰ３（双方ともアポプチンを発現する）、または非アポトーシス性タンパク質デスミンを発現するｐＣＭＶ−ｄｅｓを一過性に移入する。次いで、細胞をトランスフェクション後、いくつかの時間間隔で固定化し、アポプチン特異Ｍａｂ８５．１を用い、間接免疫蛍光法により分析した。ＤＡＰＩで異常染色したアポプチン陽性細胞の百分比をアポトーシス誘発の相対測定値とする。
【図１０】  ＶＰ３（アポプチン）−形質転換マウスの系統模式図。白色の囲みは創始マウスである。黄色および緑色の囲みは種々アポプチン形質転換創始マウスの子孫（Ｆ１）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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