(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート又は１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネートを含んでなる、Ｌ−グルタミン酸によるＮＭＤＡレセプターの活性化によって生じる神経細胞の死を低減させるための医薬組成物。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン酸によるＮＭＤＡレセプターの活性化によって生じる神経細胞の死を低減させる薬剤の製造のための、１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート又は１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネートの使用。
【請求項３】
１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート又は１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネートを含んでなる、神経障害痛、薬物禁断症／依存症、てんかん、緑内障、慢性神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症、不安障害、脳細胞死、脳虚血、及び脳卒中からなる群より選ばれる疾患又は症状の治療用の、あるいは神経保護剤、抗けいれん剤、鎮静剤若しくは催眠剤又は筋弛緩剤として使用される、医薬組成物。
【請求項４】
慢性神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
神経障害痛、薬物禁断症／依存症、てんかん、緑内障、慢性神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症、不安障害、脳細胞死、脳虚血、及び脳卒中からなる群より選ばれる疾患又は症状の治療用の、あるいは神経保護剤、抗けいれん剤、鎮静剤若しくは催眠剤又は筋弛緩剤として使用される、薬剤の製造のための、１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート又は１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネートの使用。
【請求項６】
慢性神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、デイビッド  エイチ．ファーブ（David H．Farb）により提出された、「３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート：培養ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘導電流の負の調節剤」と題する１９９５年７月２４日に出願された米国特許暫定出願第６０／００１，４３９号を優先権主張し、その恩典を主張する、デイビッド  エイチ．ファーブにより提出された、「３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート：培養ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘導電流の負の調節剤」と題する１９９５年７月２６日に出願された米国特許出願第０８／５０７，７５７号の一部継続出願である、デイビッド  エイチ．ファーブにより提出された、「ＮＭＤＡレセプター活性の抑制およびグルタメート媒介シナプス活性の調節」と題する１９９５年１１月１５日に出願された米国特許出願第０８／５５９，４４２号明細書の一部継続出願であり、全関連出願のすべての教示が、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
背景技術
Ｌ−グルタミン酸は、脊椎動物の中枢神経系において主要な興奮性ニューロトランスミッターであると考えられており、少なくとも３つの主要な薬理学的に異なるクラスのグルタミン酸ゲートイオンチャンネル：Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）およびカイネートレセプターを活性化することが知られている。これらの３つの変力性レセプターは、それらの選択的アゴニストに従って命名されている。
【０００３】
ＮＭＤＡレセプターは、正常の脳機能ならびにてんかんおよび脳の虚血等の病理生理学的状態における重要性により特に魅力的な注目を有する(Rothman，S．M．とOlney，J．W.，Trends Neurosci.，10: 299-302(1987))。ＮＭＤＡレセプターは、長期相乗作用の誘導(Collingridge，G．L．とBliss，T．V．P.，Trends Neurosci.，10: 288-293(1987))、学習と記憶に提唱される根本的なメカニズム(Madison，D．V．ら、Annu．Rev．Neurosci.，14: 379-397(1991))、虚血細胞死、てんかんおよび他の神経学的障害(Simon，R．P．ら、Science，226: 850-852(1984); Choi，D．W.，J．Neurosci．10: 2493-2501（1990）、例えば、低酸素神経障害(Simon，R.ら、Science，226: 850-852(1984))、精神分裂症(Carlsson，M．ら、Trends Neurosci.，13: 272-276(1990); Watchel，H．ら、Trends Pharmacol．Sci.，11:219-220(1990))および促進毒性(excitotoxicity)(Onley，J.ら、Brain Res.，221:207-210(1981))に必須であるようである。ＮＭＤＡレセプターの完全なチャンネルは、Ｎａ+、Ｋ+およびＣａ2+に対して透過的である。従って、ＮＭＤＡレセプター活性化は、神経細胞における細胞内Ｃａ2+を増加させ、このプロセスは、グルタミン酸誘導性神経毒性(Madison，D．V．ら、Annu．Rev．Neurosci.，14: 379-397(1991))を惹起させると考えられる。
【０００４】
従って、ＮＭＤＡレセプター活性の抑制は、グルタミン酸誘導性神経毒性を含む種々の障害に対する防御に有用である。
【０００５】
発明の概要
本発明は、神経細胞（例えば、海馬ニューロン、脊椎細胞）をプレグネノロンサルフェート（ＰＳ）の誘導体の有効量（例えば、１〜５００μＭ）と接触させることを含む、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）グルタメートレセプター介在イオンチャンネル活性（ＮＭＤＡレセプター活性）の抑制方法に関する。ＮＭＤＡレセプター活性を抑制するプレグネノロンサルフェートの誘導体は、Ａ環に少なくとも１つの二重結合を有するＰＳ誘導体、Ａ環が全て不飽和であるＰＳ、Ｃ５−Ｃ６位の二重結合が還元されているＰＳ誘導体、Ｃ３位、Ｃ５位、Ｃ６位、Ｃ７位、Ｃ１１位、Ｃ１７位、Ｃ２０位及び／又はＣ２１位の部分が修飾されているＰＳを含む。本明細書で定義されるように、ＰＳ誘導体は、ＰＳ単独に対するこれらの修飾又はこれらを組み合わせを含む。さらに、それは、他の位置（例えば、Ｃ１０、Ｃ１３、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１９）で修飾を単独で又は組み合わせて有し、ＮＭＤＡレセプター活性の抑制剤であるＰＳ誘導体に関する。Ｂ環、Ｃ環又はＤ環において１以上の二重結合が存在するＰＳ誘導体；Ａ環、Ｂ環、Ｃ環及び／又はＤ環において１個以上の炭素原子の欠失が存在するＰＳ誘導体；及び／又は、例えば、Ｃ１９とＣ３、Ｃ１９とＣ５及び／又はＣ１９とＣ６を架橋する１個以上の炭素原子が付加されたＰＳ誘導体等の他のＰＳ誘導体を予想することは、合理的である。ＰＳ誘導体は、少なくとも１つの位置でＰＳとは異なる。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート（５β３αＳ）、３β−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート（５β３βＳ）、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オンサルフェート（５α３αＳ）、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オンヘミスクシネート（５β３αＨＳ）、５α３αＨＳ、５β３βＨＳ、１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート（１７βＥ（３）ＨＳ）、１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネート（１７βＥ（１７）ＨＳ）、１７βＥ（３，１７）ジＨＳ、１７βエストラジオール、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェート、及びアンドロステロンサルフェートからなる群より選ばれるプレグネノロンサルフェートの誘導体の有効量と神経細胞を接触させることを含む、ＮＭＤＡグルタメートレセプター介在イオンチャンネル活性の抑制方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、５β３αＳ、５β３βＳ，５α３αＳ、５β３αＨＳ、５α３αＨＳ、５β３βＨＳ、１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート（１７βＥ（３）ＨＳ）、１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネート（１７βＥ（１７）ＨＳ）、１７βＥ（３，１７）ジＨＳ、１７βエストラジオール、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェート、及びアンドロステロンサルフェートからなる群より選ばれるプレグネノロンサルフェートの誘導体とニューロンを接触させることを含む、ニューロン（例えば、海馬ニューロン、脊椎細胞）におけるＮＭＤＡレセプターの活性化に関連する毒性効果の抑制方法に関する。
【０００８】
従って、神経細胞膜を通過してＮＭＤＡレセプターを選択的に抑制する能力は、促進毒性、てんかん、脳の虚血および脳溢血等の種々のグルタミン酸誘導状態における薬理学的介在のための手段を提供する。
【０００９】
また、本発明は、プレグネノロンサルフェート又はプレグネノロンサルフェートの誘導体と神経細胞を接触させることを含む、興奮性グルタメート介在シナプス活性の調節又は改変（例えば、強化；抑制）方法に関する。１つの態様において、本発明は、プレグネノロンサルフェート又はプレグネノロンサルフェートの誘導体（例えば、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート）と神経細胞を接触させることを含む、興奮性グルタメート介在シナプス活性を強化させる方法に関する。別の態様において、本発明は、プレグネノロンサルフェートの誘導体（例えば、５β３αＳ）と神経細胞を接触させることを含む、興奮性グルタメート介在シナプス活性の抑制方法に関する。
【００１０】
興奮性グルタメート介在シナプス活性の調節能力は、神経障害痛、薬物禁断症状／依存症、てんかん、慢性神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ、ハンチントン病）、筋萎縮性側索硬化症及び不安障害等の種々のグルタメート介在シナプス活性における薬理学的介在のための手段を提供する。従って、本発明は、プレグネノロンサルフェートの誘導体の有効量を個体に投与することにより、個体（例えば、ヒト）におけるＬ−グルタミン酸誘導ＮＭＤＡレセプター活性化に関連する疾患又は状態の治療方法にも関する。該疾患又は状態は、神経障害痛、薬物禁断症状／依存症、てんかん、緑内障、慢性神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症、不安障害、脳細胞死、脳虚血、脳卒中、脳、脊椎、末梢神経節若しくは腸神経系に対する外傷を含む。
【００１１】
本明細書で記載される化合物は、抗痙攣剤、鎮静薬若しくは催眠薬として又は筋肉弛緩剤として使用することも可能である。
【００１２】
また、本発明は、グルタメート介在シナプス活性を調節するための薬剤又は化合物の同定方法に関する。例えば、ニューロンを、興奮性グルタメート介在シナプス活性を調節（強化又は抑制）する本明細書に記載のステロイドと接触させ、該ステロイドのそのレセプターへのアフィニティーを確定する。評価対象の化合物を添加し、ステロイドの結合部位に対する競合能力を評価する。
【００１３】
【図面の簡単な説明】
図１は、プレグネノロンサルフェート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート（５β３αＳ）、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンサルフェート（５β３βＳ）、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オンサルフェート（５α３αＳ）、５β３αヘミスクシネート、１７β−エストラジオールヘミスクシネート、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェートおよびアンドロステロンサルフェートを示す図である。
図２は、−７０ｍＶの固定した電圧で、ＮＭＤＡ、カイニン酸塩およびＡＭＰＡにより誘導された電流における１００μＭの５β３αＳの効果のトレースを示す；各トレース上の水平な棒は、薬剤適用期間を示す。
図３は、５β３αＳによるＮＭＤＡ応答の抑制に対する濃度応答曲線を示す、５β３αＳのモル濃度対抑制％のグラフである（４〜８回の実験の平均）。
図４は、５β３αＳ、５β３αヘミスクシネートおよび１７β−エストラジオールヘミスクシネートがＮＭＤＡ応答を抑制することを実証する、電気生理学により測定されたＮＭＤＡ応答の抑制％の棒グラフである。
図５は、ＮＭＤＡ促進毒性の抑制％の棒グラフである（慢性期間および短期期間）。
図６Ａ〜６Ｄは、ステロイドを注射されたマウスにおいて観察される行動特性の棒グラフである。
図７は、マウスにおけるＮＭＤＡ（２００ｍｇ／ｋｇ）誘導された発作および死亡についての、腹腔内（ｉ．ｐ．）におけるプレグナノロンヘミスクシネートおよび関連する化合物の効果を実証するデータのヒストグラムである。
図８は、マウスにおけるＮＭＤＡ誘導された発作および死亡についての、神経作用性ステロイドの静脈内（ｉ．Ｖ．）投与の効果を実証するデータのヒストグラムである。
図９Ａは、中脳動脈（ＭＣＡ）閉塞直後に投与された５β−プレグナン−３α−オール−２０−オンヘミスクシネートの神経保護効果を実証するデータのヒストグラムである。
図９Ｂは、ＭＣＡ閉塞の３０分後に投与された５β−プレグナン−３α−オール−２０−オンヘミスクシネートの神経保護効果を実証するデータのヒストグラムである。
図１０Ａは、マウスにおけるホルマリン痛についての５β−プレグナン−３α−オール−２０−オンヘミスクシネート（１５ｍｇ／ｋｇ）の初期段階の効果を実証するデータのヒストグラムである。
図１０Ｂは、マウスにおけるホルマリン痛についての５β−プレグナン−３α−オール−２０−オンヘミスクシネート（１５ｍｇ／ｋｇ）の後期段階の効果を実証するデータのヒストグラムである。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、プレグネノロンサルフェート（ＰＳ）の誘導体、ＮＭＤＡレセプター活性の増強剤がＮＭＤＡレセプター活性を抑制するという発見に基づいている。次に、抑制は、増強とは異なる部位および／または機構を通じて働く。ＮＭＤＡレセプター活性を抑制するプレグネノロンサルフェートの誘導体としては、Ａ環が少なくとも１つの二重結合を含むＰＳ誘導体；Ａ環が十分に不飽和であるＰＳ；Ｃ５−Ｃ６位の二重結合が還元されているＰＳ誘導体；ならびにＣ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１１、Ｃ１７、Ｃ２０および／またはＣ２１位が修飾されているＰＳがあげられる。本明細書において定義されるように、ＰＳ誘導体としては、単独またはそれらの組み合わせでのＰＳに対するこれらの修飾体があげられる。さらに、本発明は、他の部位（例えば、Ｃ１０、Ｃ１３、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１９等）での単独または組み合わせでの修飾を有し、ＮＭＤＡレセプター活性の抑制剤であるＰＳ誘導体に関する。Ｂ、ＣまたはＤ環に１以上の二重結合があるＰＳ誘導体；Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤ環で１以上の炭素原子の欠失があるＰＳ誘導体；および／または例えば、Ｃ１９とＣ３、Ｃ１９とＣ５および／またはＣ１９とＣ６等の１以上の炭素原子架橋が加えられているＰＳ誘導体等の他のＰＳ誘導体を期待することは合理的である。ＰＳ誘導体は、少なくとも１つの部位でＰＳとは異なる。ＰＳ誘導体の例としては、５β３αＳ、５β３βＳ、５α３αＳ、５β３αＨＳ、５α３αＨＳ、５β３βＨＳ、１７β−エストラジオール−３−ヘミスクシネート（１７βＥ（３）ＨＳ）、１７β−エストラジオール−１７−ヘミスクシネート（１７βＥ（１７）ＨＳ）、１７βＥ（３，１７）ｄｉＨＳ、１７βエストラジオール、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェートおよびアンドロステロンサルフェート等があげられる。
【００１５】
本発明の方法においては、プレグネノロンサルフェートの誘導体は、神経細胞と接触させる。神経細胞としては、中枢神経系由来の神経細胞（例えば、脊髄細胞、海馬細胞等）等があげられる。さらに、ＮＭＤＡレセプターを有するグリア細胞等の神経系のいかなる細胞であっても、本明細書に記載されているように、自然にＰＳ誘導体の期待される標識となるであろう。
【００１６】
本発明の方法において、十分量のプレグネノロンサルフェート誘導体を個体（例えば、ヒト等）に投与して、ＮＭＤＡレセプター活性を抑制する（つまり、効果的な量）。好ましくは、プレグネノロンサルフェート誘導体の濃度は、約１〜５００μＭである。より好ましい範囲は、約５０〜約２５０μＭである。
【００１７】
本明細書に用いられる、「ＮＭＤＡレセプター活性の抑制」という用語は、ＮＭＤＡレセプター活性の効果の一部抑制または全抑制を含む（例えば、興奮毒性等）。
【００１８】
本明細書に記載のプレグネノロンサルフェートの誘導体に加え、当業者であれば、これらのプレグネノロンサルフェート誘導体の他の修飾体もＮＭＤＡレセプター媒介イオンチャンネル活性を抑制するのに有用であることを、高い程度の確実性で予測できる。これらの修飾は、Ａ環、Ｃ５−Ｃ６二重結合、Ｃ３、Ｃ１０、Ｃ１１またはＣ１３位に加えていてもよく、または（好ましくは）独立していてもよい。当業者であれば、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０および／またはＣ２１位等の他の部位に修飾を有するプレグネノロンサルフェート誘導体がＮＭＤＡレセプター活性の抑制剤であることを認識する。さらに、いくつかの修飾は、ＮＭＤＡレセプターについての抑制効果を増加させることができ、結果として、これらの誘導体の濃度を減少させることが必要である。例えば、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェートの極性ＯＨ基は、脂肪族または芳香族アルコール、チオールもしくはアミンで置換してもよい。別法として、１１ヒドロキシ酸素原子は、脂肪族または芳香族アルコール、チオールもしくはアミンへのエーテル結合に参加してもよい。
【００１９】
かかる誘導体としては、例えば、ステロイド骨格の３位のサルフェートがアルキルサルフェートにより置換されている誘導体等があげられる。アルキルサルフェートとしては、例えば、メチル、エチル、ブチルおよびプロピルサルフェート等があげられる。
【００２０】
別法として、ステロイド骨格の３位のサルフェートがホスフェート、メチルチオホスホノチオエートまたはサルファメートで置換されているステロイドサルフェート誘導体を用いてもよい。サルファメートの例においては、親のステロイドへの結合は、炭素３位のヒドロキシル基に対して置換されたアミノ基を通じてである。
【００２１】
別法として、ステロイド骨格の３位のサルフェートがスルホネートで置換されているステロイドサルフェート誘導体を用いてもよい。これらとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびジメチルスルホネート等があげられる。
【００２２】
別法として、親のステロイド骨格の３位のサルフェートが、エーテル、チオエーテル、窒素原子または炭素−炭素結合を介してステロイド骨格に結合しているアルキルまたはアリールサルフェートにより置換され、該サルフェートが、アルキルまたはアリール基によりステロイドから分離される誘導体を用いてもよい。別法として、ステロイド骨格の３位のアルキルサルフェートが、アルキルまたはアリールホスフェート、メチルチオホスホノチオエート、スルホネートまたはサルファメートで置換されている誘導体を用いてもよい。例えば、１以上のサルフェートまたはスルホネート基を１７β−エストラジオール安息香酸塩、またはプレグネノロン安息香酸の安息香酸部分に付加してもよい。
【００２３】
誘導体の第３の有用なクラスは、エステル結合により親のステロイド骨格に結合した３位のサルフェートの位置にジカルボン酸を有する。ジカルボン酸としては、アルキルおよびアリールジカルボン酸塩等があげられる。アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル等があげられ、アリールジカルボン酸塩としては、オルト、パラおよびメタ安息香酸塩等があげられる。例えば、１以上のカルボン酸塩基は、１７β−エストラジオール安息香酸塩またはプレグネノロン安息香酸塩の安息香酸塩部分に付加してもよい。
【００２４】
誘導体の第４の有用なクラスは、親のステロイド（つまり、プレグネノロンサルフェート）の３位のサルフェートの位置の糖の例えば、カルボン酸塩、サルフェート、ホスフェート、スルホネートまたはメチルチオホスホノチオエート誘導体により導入された１以上の負電荷を有する。これらとしては、例えば、プレグネノロン−３−Ｄ（もしくはＬ）−グルコシドウロネートまたはプレグネノロン−３−Ｄ（もしくはＬ）−ホスホグルコシドウロネート等があげられる。前記議論した修飾体の具体例としては、３α−ヒドロキシ−１６−イミノ−５β−１７−アザ−アンドロスタン−１１−オンまたは３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−１１，２０−ジオンヘミスクシネート等があげられる。
【００２５】
本発明に用いることのできる化合物の他の具体例としては、以下のものがあげられる：プレグネノロンホスフェート、プレグネノロンホルメート、プレグネノロンヘミオキサレート、プレグネノロンヘミマロネート、プレグネノロンヘミグルタレート、２０−オキソプレグン−５−エン−３β−イルカルボキシメチルエーテル、（カルボン酸誘導体を活性化するカルボキシアルキルエーテル対を含む）、３α−ヒドロキシプレグン−５−エン−２０−オンサルフェート、３−ヒドロキシ−１９−ノルプレグナ−１，３，５（１０）−トリエン−２０−オン、３−ヒドロキシ−１９−ノルプレグナ−１，３，５（１０），６，８−ペンタエン−２０−オン、１７α−イソプレグネノロンサルフェート、１７−アセトキシプレグネノロンサルフェート、２１−ヒドロキシプレグネノロンサルフェート、２０β−アセトキシ−３β−ヒドロキシプレグン−５−エン−サルフェート、プレグネノロンサルフェート  ２０−エチレンケタール、プレグネノロンサルフェート  ２０−カルボキシメチルオキシム、２０−デオキシプレグネノロンサルフェート、２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシプレグネノロンサルフェート、１７−プロピルオキシプレグネノロンサルフェート、１７−ブチルオキシプレグネノロンサルフェート、ＰＳの２１−チオールエステル、ピリジニウム、イミダゾリウム、６−メチルプレグネノロンサルフェート、６，１６α−ジメチルプレグネノロンサルフェート、３β−ヒドロキシ−６−メチルプレグナ−５，１６−ジエン−２０−オンサルフェート、３β−ヒドロキシ−６，１６−ジメチルプレグナ−５，１６−ジエン−２０−オンサルフェート、３β−ヒドロキシプレグナ−５，１６−ジエン−２０−オンサルフェート、ジオスゲニンサルフェート、３β−ヒドロキシアンドロスト−５−エン−１７β−カルボン酸メチルエステルサルフェート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンホルメート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンヘミオキサレート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンヘミマロネート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンヘミスクシネート、３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オンヘミグルタレート、エストラジオール−３−ホルメート、エストラジオール−３−ヘミオキサレート、エストラジオール−３−ヘミマロネート、エストラジオール−３−ヘミスクシネート、エストラジオール−３−ヘミグルタレート（活性化合物の対応するカルボキシ、アルキル、エーテルを含む）、エストラジオール−１７−メチルエーテル、エストラジオール−１７−ホルメート、エストラジオール−１７−ヘミオキサレート、エストラジオール−１７−ヘミマロネート、エストラジオール−１７−ヘミスクシネート、エストラジオール−１７−ヘミグルタレート、エストラジオール−３−メチルエーテル、１７−デオキシエストロンおよび１７β０ヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−イルカルボキシメチルエーテル。
【００２６】
ニューロステロイドプレグネノロンサルフェートは、ＮＭＤＡレセプターで正のアロステリズムのモジュレーターとして作用し、ニワトリの脊髄ニューロンのカイネート、ＡＭＰＡ、グリシン、およびγ−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）の応答を抑制する（ウー，エフ．エス．〔Ｗｕ，Ｆ．Ｓ．〕ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４０：３３３−３３６（１９９１））。５β３αＳ（図１）などの特別のプレグネノロンサルフェートの誘導体が、ＮＭＤＡレセプターが誘導した電流を抑制することは、驚くべきことであった。
【００２７】
ＮＭＤＡレセプターは、グリシン、Ｍｇ2+、およびポリアミン（ランソム，アール．ダブリュー．（Ｒａｎｓｏｍ，Ｒ．Ｗ．）およびステック，エヌ．エル．（Ｓｔｅｃ，Ｎ．Ｌ．），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５１−８３０−８３６（１９８８））に対するものを含む、幾つかの薬理学的に明確なサイトを介して調節に供される（モナグム，ディー．ティ．（Ｍｏｎａｇｈｕｍ，Ｄ．Ｔ．）ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９：３６５−４０２（１９８９）；ウォング，イー．エイチ．エフ．（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｈ．Ｆ．）およびケンプ，ジェイ．エイ．（Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，８１：４０１−５２５（１９９１））。そのうえ、解離性麻酔薬ジゾシルピン（ＭＫ−８０１）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、およびケタミンのすべてが、電圧に依存し、使用に依存するイオンチャネル活性の遮断をつくる（フックトナー，ジェイ．イー（Ｈｕｃｋｔｔｎｅｒ），Ｊ．Ｅ．）およびビーン，ビー．ピー（Ｂｅａｎ，Ｂ．Ｐ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：１３０７−１３１１（１９８８）；レルマ，ジェイ．（Ｒｅｒｍａ，Ｊ．）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１２３：１８７−１９１（１９９１））。
【００２８】
実施例１に記載されているように、５β３αＳは、ＭＫ−８０１などのオープンチャネルブロッカーとは異なる、電圧およびアゴニストに依存しない非競合性のメカニズムにより、ＮＭＤＡにより誘導された応答を抑制する。さらに、アンドロステロンサルフェートは、ＮＭＤＡにより誘導された応答を抑制する（表１を見よ）。
【００２９】
天然に由来の５β３αの硫酸エステル化されたフォームである、５β３αＳは、全細胞電圧クランプ記録によって測定したとき、ＮＭＤＡおよび非ＮＭＤＡレセプターを介在した応答の双方を抑制する。１００μｍの５β３αＳは、迅速にそして可逆的に、６６％により３０μｍのＮＭＤＡ、３７％により５０μＭのカイネート、および２９％により２５μＭのＡＭＰＡに対する応答を抑制する。６０μＭの硫酸エステル化されていない５β３αの適用は、ＮＭＤＡにおいて何らの重要な効果を生じず、サルフェート残基がＮＭＤＡ応答において５β３αＳの効果に対して重要であることを示す。ＮＭＤＡ応答における５β３αＳの効果は、濃度依存性；ＥＣ50が６２μＭであることである。５β３αＳは、ＮＭＤＡ  ＥＣ50に殆ど影響を与えずに最大ＮＭＤＡ応答を減少させ、５β３αＳによりＮＭＤＡ応答の拮抗作用が競合しないことを示す。ＮＭＤＡレスポンスの５β３αＳ抑制がアゴニストでも電圧依存性でもないという事実は、５β３αＳがオープンチャネルブロッカーとして作用しないことを示す。
【００３０】
ＮＭＤＡ応答において強い抑制効果を呈する５β３αＳの能力に基づいて、ＮＭＤＡ応答における５β３αＳの作用のメカニズムは、さらに研究された。実施例１に記載されているように、５β３αＳによるＮＭＤＡレスポンスの抑制は、グリシンの最大濃度（１０μＭ）の添加によって減少されず、５β３αＳは、グリシンの認識部位を介して作用しないことを示す。ＮＭＤＡおよび非ＮＭＤＡレセプターにおける５β３αＳの抑制作用は、グルタメートレセプターが誘発する発作および促進毒性（excitotoxic）細胞死の抑制の基礎を与える。
【００３１】
実施例２には、５β３βＳを用いたＮＭＤＡ応答におけるプレグネノロンサルフェート誘導体の抑制効果のさらなる特徴が記載されている。実施例２におけるデータは、ＮＭＤＡ応答の抑制が他の既知のＮＭＤＡレセプターの認識部位（例えば、ＮＭＤＡ（またはグルタメート）グリシン、ポリアミン、アラキドン酸およびレドックス認識部位）とは別個の特定の部位で起こることを示す。負に帯電した有機分子である、５β３βＳなどのＮＭＤＡレセプターの負のモジュレーターの作用部位もまた、亜鉛が２価の陽イオンであるので、ＮＭＤＡレセプターの亜鉛認識部位とは異なるようである。さらに、実施例２におけるデータは、ＮＭＤＡ応答の正のモジュレーター（例えば、プレグネノロンサルフェート）および負のモジュレーター（例えば、５β３βＳ、５β３αＳ）が異なる部位および／または経路を介して作用することによってそれぞれの効果が生じることを示す。その結果は、ＮＭＤＡレセプターにおいて新規な細胞外のステロイド抑制部位の存在に対する強力なサポートを与える。
【００３２】
実施例３には、ＮＭＤＡレセプター活性の抑制に対して電気生理学によって調べられた、さらなるプレグネノロンサルフェート誘導体が記載されている。さらに、実施例４に記載されているように、ＮＭＤＡレセプター活性を抑制するプレグネノロンサルフェート誘導体は、また持続性のあるＮＭＤＡレセプター活性に関連する促進毒性から保護する。
【００３３】
脳卒中、低酸素神経損傷（hypoxia neuronal damage）および虚血に関連して、細胞の死は、Ｌ−グルタメートによるＮＭＤＡレセプターの活性化に関連した効果に起因するものと考えられる。それゆえ、Ｌ−グルタメートが誘導したＮＭＤＡ−レセプター活性を妨げることにより、細胞の死を防ぐことが可能である。本発明は、Ａ環が少なくとも１つの二重結合を含み；Ａ環が充分に不飽和化されているＰＳ；Ｃ５−Ｃ６位にある二重結合が還元され、ＰＳにある残基がＣ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１１、Ｃ１７、Ｃ２０および／またはＣ２１位、およびそれらの組合せにあるＰＳ誘導体であって、該誘導体が神経細胞におけるＮＭＤＡレセプターの活性化の効果を抑制するのに充分な濃度で存在している、プレグネノロンサルフェートからなる群より選ばれたプレグネノロンサルフェートの誘導体と、神経細胞を接触させることを含む、ＮＭＤＡレセプターのＬ−グルタメート活性化に起因する神経細胞死を減少させる方法に関する。ここで定義するように、ＰＳ誘導体は、ＰＳ単独に対するこれらの修飾物またはそれらの組合せを含む。本発明は、さらに、他の位置（例えば、Ｃ１０、Ｃ１３、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ１９）に単独でまたは組合せて修飾物を有し、ＮＭＤＡレセプター活性の抑制剤であるＰＳ誘導体に関する。環Ｂ、ＣまたはＤにある１またはそれ以上の二重結合があるＰＳ誘導体；Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤ環において１またはそれ以上の炭素原子が除去されているＰＳ誘導体、および／または１またはそれ以上の炭素原子、例えば、Ｃ１９とＣ３、Ｃ１９とＣ５および／またはＣ１９とＣ６が架橋されているＰＳ誘導体などの他のＰＳ誘導体を添加することを期待することは、道理的である。該ＰＳ誘導体は、少なくとも１つの部位でＰＳとは異なる。
【００３４】
ここに記載されている研究は、他のＮＭＤＡ−誘導電流の非競合性妨害のメカニズムを表すのみならず、ＮＭＤＡレセプター活性に対するステロイドの構造上の要件を理解するための原理を与える。ここに記載されている結果は、特別のプレグネノロンサルフェートの誘導体または類似物が興奮性アミノ酸レセプターの広範囲のスペクトルのアンタゴニストの新規なクラスを表わすことを示す。これらのサルフェートステロイドは、抗痙攣性または抗促進毒性治療剤として用いることができる。
【００３５】
さらにここに記載されているように、グルタメートを介在させたシナプスの応答におけるステロイドの効果が研究されている。実施例５に記載されているように、外因的に適用されたＮＭＤＡ（米国特許第５，２１２，１６７号明細書を見よ）に対するＮＭＤＡ応答を強化するプレグネノロンサルフェート（ＰＳ）は、ラットの海馬のニューロンの培養物で自発的に興奮性シナプス後部の電流（ＥＰＳＣｓ）を強化する。外因的に適用されたＮＭＤＡに対するＮＭＤＡの応答を抑制する５β３αＳ化合物は、ラットの海馬のニューロンの培養物で自発的なＥＰＳＣｓを抑制する。全細胞記録法を用いたとき、細胞は、−７０ｍＶで電圧固定された。薬剤溶液を７−バレルのピペットから圧力射出により、１つのニューロンに適用した。ＰＳによるＥＰＳＣの相乗作用は、５．６μＭのＥＣ50および１９８．２％の最大相乗作用で、濃度に依存する。ＰＳの類似物である、１１−ケトＰＳは、ＥＰＳＣｓに効果がなく、ＥＰＳＣｓにおけるＰＳの効果が特異的であることを示唆した。ＮＭＤＡレセプターによって介在されたＥＰＳＣｓが特定のＮＭＤＡレセプターアンタゴニストＡＰＶ（４０μＭ）で妨害されるとき、１００μＭのＰＳによるＥＰＳＣｓの相乗作用は、減少する。逆に、非ＮＭＤＡグルタメートレセプターによって介在されたＥＰＳＣｓが特定の非ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストＤＮＱＸ（１０μＭ）で妨害されるとき、１００μＭのＰＳは、より大きなＥＰＳＣｓの相乗作用（４５３％）を生じる。これらの結果は、ＰＳが初期にＮＭＤＡレセプターによって介在されたＥＰＳＣｓを強化することを示す。ＥＰＳＣｓにおけるＰＳの効果は、外因的に適用されたＮＭＤＡによって誘引された応答におけるＰＳのそれらと一致する。これらの観察は、ＰＳなどのニューロステロイドがＣＮＳにおける興奮性シナプスの伝達に直接、ニューロモデュレータの影響を与える。
【００３６】
本発明は、また、神経細胞をプレグネノロンサルフェートまたはプレグネノロンサルフェートの誘導体と接触させることを含む興奮性グルタメート介在シナプス活性を調節または改質（例えば、強化、抑制）する方法に関する。１つの実施態様において、本発明は、神経細胞をプレグネノロンサルフェートまたはプレグネノロンサルフェートの誘導体（例えば、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート）と接触させることを含む、興奮性グルタメート介在シナプス活性を強化する方法に関する。もう１つの態様において、本発明は、神経細胞をプレグネノロンサルフェート（例えば、５β３αＳ）の誘導体と接触させることを含む興奮性グルタメート介在シナプス活性を抑制する方法に関する。
【００３７】
ここに記載されているように、インビボの実験がまた行なわれ、そのことは、（ここで定義されている）ＮＭＤＡレセプター活性を抑制するプレグネノロンサルフェート誘導体が興奮性アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタメート）が誘導したＮＭＤＡレセプター活性化に関連する病気の治療に対して重要な効果を有することを示す。興奮性グルタメート介在シナプス活性を調節する能力は、神経痛、薬物の禁断症状／依存症、癲癇、緑内障、慢性神経変性病（パーキンソン病、アルツハイマー病、エイズ（ＡＩＤＳ）、ハンチントン舞踏病）、筋萎縮性側索硬化症、頭部、脊髄、末梢神経節または腸壁神経系に対する外傷、不安障害などの種々のグルタメートが介在した臨床的症候群における薬理学的な研究に対する手段を提供する。ここに記載されている化合物は、また抗痙攣剤、鎮静剤または催眠剤としてまたは筋弛緩剤として用いることができる。したがって、本発明は、また、有効量のプレグネノロンサルフェートの誘導体を宿主に投与することを含む、宿主（例えば、哺乳類、特にヒト）における、神経痛、薬物の禁断症状／依存症、癲癇、緑内障、慢性神経変性病、筋萎縮性側索硬化症、不安障害、脳細胞死、脳虚血、脳卒中からなる群より選ばれた、Ｌ−グルタメートが誘導するＮＭＤＡレセプター活性化に関連する病気を治療する方法に関する。ここに記載された化合物は、また鎮痙剤、鎮静剤または催眠剤としてまたは筋弛緩剤として用いることができる。
【００３８】
プレグネノロンサルフェートの誘導体（プレグネノロンサルフェート誘導体）の有効量は、宿主に投与したときに、ＮＭＤＡレセプター活性（Ｌ−グルタメートが誘導されたＮＭＤＡレセプター活性）の効果的な抑制を生じる量である。したがって、プレグネノロンサルフェート誘導体の有効量の投与は、病状の改善または除去となる。宿主に投与されるプレグネノロンサルフェート誘導体の量は、用いられるプレグネノロンサルフェート誘導体、宿主の大きさ、年齢、体重、健康状態（general health）、性別、宿主の食事、および投与時期、Ｌ−グルタメートが誘導するＮＭＤＡレセプター活性化に関連する病気の期間または特に質を含む、種々の要因によって変わるであろう。例えば、投与量は、１ｎｍ〜５００μＭ、特に、１００ｎｍ〜１００μＭおよび５００ｎｍ〜５０μＭの範囲に及ぶ。確定した投与量の範囲の調整および処置は、当業者の能力の範囲内で充分である。
【００３９】
プレグネノロンサルフェート誘導体は、種々の方法で宿主に投与することができる。投与の経路には、皮内、経皮、（例えば、徐放性ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻内の経路が含まれる。他の便利な投与経路、例えば、注入、ボーラス注射、または上皮または鼻腔を介する吸収を用いることができる。さらに、脳または脊髄のクモ膜下の空間に移植されたポンプを用いて脳脊髄液を介して直接連続的にまたは長期間（慢性的に）治療をすることができる。そのような移植には、充分な量（治療量）のステロイドを過剰に生産し、分泌するように作られたステロイドの外部源または細胞を含めることができる。さらに、プレグネノロンサルフェート誘導体は、生物学的作用剤の他の化合物（例えば、薬理学的に許容されうる界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤および／またはビヒクル）とともに投与することができる。
【００４０】
さらに、本発明は、グルタメート介在シナプス活性を調節する剤または化合物を同定する方法に関する。例えば、ニューロンは、興奮性のグルタメート介在シナプス活性を調節（強化または抑制）する、ここに記載されたステロイドと接触し、ステロイドのそのレセプター（ＮＭＤＡ）に対する親和性が確立する。評価される化合物は、添加され、ステロイドの結合部位と競い合う能力が評価される。
【００４１】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、該実施例が限定されることを意図していない。
【００４２】
実施例１  ３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オン  サルフェート（５β３αＳ）及びアルドステロンサルフェートはＮＭＤＡ誘導性応答を抑制する
材料と方法
細胞培養。  分離された脊髄ニューロンの培養を、既報（Farb，D.H.ら、J.Cell Biol.、80:651-661(1979)）に従って行った。簡単には、２．４ｍＭのグルタミン、１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化ウマ血清、５％（ｖ／ｖ）のヒヨコ胚抽出物及び抗生物質を補充したイーグルの最少必須培地が入った、コラーゲンで被覆した３５ｍｍ組織培養用ディッシュ上で、７日目のヒヨコ胚から分離した細胞を培養した。５％のＣＯ2、９５％の空気、３７℃の加湿環境にて培養を続けた。培養開始時から３６時間後にサイタラビン（Cytarabine）（１μＭ）を培地に加えて、非神経性の細胞の増殖を抑制した。一日後、２０．５ｍＭグルコース、１９ｍＭのＫＣｌ、及び２．５％のヒヨコ胚抽出物を補充した同様の培地で、この培地を置換した。新鮮な培地を週に２回加えた。培養から２〜４週以内の培養ニューロンを実験に使用した。
【００４３】
電気生理学。  倒立位相差顕微鏡のステージ上での３５ｍｍ組織培養用ディッシュ中で実験を行った。パッチクランプテクニック（Hamill,O.P．ら、Pfagers Arch．、891:85-100(1981)）での全細胞の変化により、全細胞の電流を記録した。パッチ電極は先端に約２μＭの開口部を有するものであり、そして以下の（ｍＭで）：１４０  ＣｓＣｌ、１１  ＥＧＴＡ、及び１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨはＣｓＯＨで７．２に調整した）から構成される細胞内溶液を使用した場合、３〜８ＭΩの抵抗を有するものであった。高濃度のグリシンを用いた実験においては、細胞内溶液を塩化物の低い（１０ｍＭ）ピペット溶液に置換した。この溶液は以下の（ｍＭで）：１４０  グルコン酸カリウム、１０  ＫＣｌ、８  グルコン酸ナトリウム、１１  ＥＧＴＡ、及び１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨはＫＯＨで７．２に調整した）を含んでいた。高ＮＭＤＡ濃度でのＮＭＤＡ−誘導性の電流の顕著な衰弱を防ぐために、４ｍＭのＡＴＰカリウムを細胞内溶液に含めた。電解層溶液は以下の（ｍＭで）：１５０  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、１  ＣａＣｌ2、１０  ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨを７．２に調整した）を含むものであった。はっきりしたＮＭＤＡ応答を得るためには、グリシンを添加しないことが必要なことから、ＮＭＤＡを含む溶液にはグリシンを加えなかった。そして、最高濃度（１０μＭ）のグリシンは、ＮＭＤＡ応答の５β３αＳによる抑制には影響を与えなかった。全ての実験は室温（２３〜２５℃）で実施した。
【００４４】
記録には、Axopatch 1B パッチクランプ装置（Axon Instruments，Burlingame，CA）を用いた。一連の抵抗値が１０ＭΩを越える細胞を除去した。部分的に補正を行った後、一連の抵抗値は３．５〜６ＭΩの間であった。保持電位は、他に注意がない限り、−７０ｍＶで維持した。８極ベッセルフィルター（−３ｄＢ）を用いて、電流を１ＫＨｚでフィルターに付し、そしてオンラインデータ捕捉システム（pClamp、Axon Instruments）を用いてディジタル化（４０ｍｓ／ポイント）した。
【００４５】
プレッシャーイジェクション（１５ｐｓｉ）により、薬剤溶液を７バレルピペットから一つのニューロンに添加した。７バレル圧力ピペットを神経細胞体から約５０μＭに配置した。これらの条件下で、標的ニューロンの周囲の溶液を圧力ピペット中の薬剤溶液に迅速かつ効率良く、１０％未満の希釈にて置換した（Choi,D.W．ら、Nature(Lond.)269:342-344(1977)；Chan,C.Y．ら、Life Sci.，83:2061-2069(1983)；Chan,C.Y.及びFarb，D.H.、J.Neurosci.,5:2365-2373(1985)）。ＡＭＰＡハイドロブロマイド（Research Biochemicals）及びステロイド類（Steraloids）を除く全ての薬剤をＳｉｇｍａから得た。ステロイド類のストック溶液を、終濃度が０．５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド中で調製した。ジメチルスルホキシドにより起こり得る、関連するアゴニスト誘導性の電流への影響を未然に防ぐために、ＮＭＤＡ、カイネート、ＡＭＰＡ、及び外部バッファー（圧力ピペット中）を含めた全ての他の薬剤溶液にも、０．５％ジメチルスルホキシドを含ませた。
【００４６】
ステロイドによるアミノ酸応答の調節の程度、百分率での変化を〔（Ｉ’／Ｉ）−１〕×１００％で示し、ここで、Ｉは、同じ細胞についてのステロイドの添加前とステロイドの流出後から得られるコントロール応答の平均であり、Ｉ’はステロイドが存在した状態でのアゴニスト−誘導性電流を示す。結果はすべて平均±標準誤差で示した；スチューデント  ｔ  検定を用いて群の統計的な比較を行った。
【００４７】
結果
パッチクランプテクニックによる全細胞の変化により、ＮＭＤＡ、カイネート、及びＡＭＰＡによって導かれた電流を、ヒヨコ脊髄ニューロンの一次培養物中で記録した。カイネート及びＡＭＰＡ−誘導性電流を抑制している間、プレグネノロンサルフェートがＮＭＤＡ−誘導性全細胞電流を増強することは既に知られていた（Wu,F.S．ら、Mol.Pharmacol．40:333-336(1991)）。驚くべきことには、５β３αＳは反対の調節効果、即ちＮＭＤＡ応答の抑制を生じさせた。−７０ｍＶの保持電位でのＮＭＤＡ、カイネート、及びＡＭＰＡにより誘導された電流における１００μＭの５β３αＳの効果を図２に示す。５β３αＳをＮＭＤＡと同時に加えた場合、３０μＭのＮＭＤＡに対する応答は抑制された（６６．１±２．７％、ｎ＝５）。抑制の開始と回復は急激であり、そして、３〜４分間の洗浄後の５β３αＳの抑制効果は全く可逆的なものであった。１００μＭの５β３αＳも、急激にかつ可逆的に、２５μＭのＡＭＰＡ−（２９．０±３．１％、ｎ＝４）及び５０μＭカイネート−（３７．４＋／−４．７％、ｎ＝４）誘導性電流を抑制した。５β３αＳ単独の適用はいかなる直接的な応答をも与えなかった。
【００４８】
結果を表１に示す（値は平均＋／−標準偏差；細胞数を括弧内に示す）。表１に示したように、アルドステロンサルフェートは、ＮＭＤＡ誘導化応答も抑制した。しかしながら、すべての硫酸エステル化ステロイドがＮＭＤＡ応答を抑制するのではない。デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡＳ）のみが、わずかにＮＭＤＡ応答を強めた（２８．８±８．８％強度、ｎ＝４）。５０μＭ非硫酸エステル化５β３α（外部緩衝液にその最大溶解度を示している）を使用しても３０μＭ  ＮＭＤＡ誘導化電流（３．６±８．４％強度、ｎ＝４）に対して有意な効果を生じず、サルフェート部分がＮＭＤＡ応答において５β３αＳの効果に重要であることを示している。
【００４９】
ＮＭＤＡレセプターに関する５β３αＳの能力および効能を定量的に評価するため、プールしたデータを用いて５β３αＳによる３０μＭ  ＮＭＤＡ応答の抑制について濃度応答曲線を構成した。図３に示すように、５β３αＳは、３０μＭ  ＮＭＤＡにより誘導された電流の濃度依存遮断を生じ、カーブフィット分析は、６２．１μＭのＥＣ50および１０１．１％の最大抑制を表した。
【００５０】
５β３αＳによる抑制のメカニズムを調査するために、プールしたデータを用いて５０μＭ５β３αＳ存在下および非存在下でＮＭＤＡに関する濃度応答曲線を構成した。ＮＭＤＡにより誘導される最大電流に関して細胞対細胞の変異性を回避するために、すべての応答を１００μＭ  ＮＭＤＡにより誘導されるピーク電流に標準化した。５β３αＳは、ＮＭＤＡ  ＥＣ50に対してほとんど効果がないようにＮＭＤＡ最大応答を著しく減少した。（５β３αＳの非存在化で、ＥＣ50＝１５５．６μＭ、Ｉmax＝２．５６、およびｎH＝１．０１）。５β３αＳの存在下で、ＥＣ50＝１０５．７μＭ、Ｉmax＝１．１０およびｎH＝１．４６。ＮＭＤＡ  ＥＣ50値は、培養ニワトリ運動神経ニューロンについて報告されているＥＣ50に近似している（O’Brien，R.J．and Fishbach，G.D.，J．Neurosci.，6:3257-3283（1986））。この結果は、ＮＭＤＡ応答において５β３αＳの作用が本質的に非競合的であり、５β３αＳがＮＭＤＡ認識部位とは異なる部位を通じて作用することを提示している。
【００５１】
ＭＫ−８０１等の非競合的ＮＭＤＡアンタゴニストは使用および電圧依存方式でイオンチャンネルに作用するので（Hucttner，J.E．and Bean，B.P.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:1307-1311(1988)）、ＮＭＤＡ誘導電流についての５β３αＳ効果の電圧依存性を調べた。＋５０ｍＶで１００μＭ  ５β３αＳにより生じる平均抑制（６２．０±２．８％、ｎ＝５）は、−７０ｍＶ（６３．２±２．７％、ｎ＝５）でのものと有意な違いはなかった（ｐ＞０．０５、対（paired）ｔ検定）。この結果は、ＮＭＤＡ応答の５β３αＳによる遮断が電圧非依存性であることを示している。使用依存はこれらの実験の時間枠では観察されなかった；ＮＭＤＡの存在下で５β３αＳを最初に使用すると、直ちにピークと安定な応答の両方の遮断が引き出され、５β３αＳの洗浄後ＮＭＤＡ応答の回復は急速であった。
【００５２】
ＮＭＤＡレセプターの応答はグリシンにより正に調節され、グリシンはレセプター機能に関して絶対に必要である（Johnson，J.W．and Ascher，P.，Nature（Lond.）325:529-531（1987））。７−クロロキヌレニン酸等のいくつかのＮＭＤＡ応答のインヒビターは、ＮＭＤＡレセプターのグリシン部位をブロックすることにより作用する（Wong，E.H.F．and Kemp，J.A.，Annu．Rev．Pharmacol．Toxicol.，81:401-525(1991)）。５β３αＳが競合的アンタゴニストとしてグリシン認識部位に作用するかどうかを決定するために、飽和濃度（１０μＭ）のグリシン存在下でＮＭＤＡ応答に対する５β３αＳの効果を調べた。５０μＭ  ５β３αＳでもグリシンを添加した３０μＭ  ＮＭＤＡにより誘導される電流を減少した。さらに、５β３αＳによる平均抑制（５１．３±３．５％、ｎ＝４）は、グリシン非存在下でのもの（４９．１±３．４％、ｎ＝４）と有意に異ならなかった（ｐ＞０．５、非対（unpaired）ｔ検定）。この結果はＮＭＤＡ誘導電流における５β３αＳの効果がグリシン認識部位により介在されないという見解と一致する。
【００５３】
考察
ステロイドの高親油性特性および燐脂質が高い特異性をもってステロイドと結合することができるという証拠（Majewska，M.D.，Biochem．Pharmacol．35:3781-3788（1987））が、５β３αＳの効果がＮＭＤＡレセプター蛋白質周辺の膜脂質と相互作用により介在するという可能性を高める。しかしながら、われわれは他のプレグネノロンサルフェートアナログであるＤＨＥＡＳが、ＮＭＤＡ応答を１９７％まで増強するプレグネノロンサルフェートの効果と比較してＮＭＤＡ応答についてわずか少量の効果（２８．８％強度）しか有していないことを示している（Wu，F.S.，et al.，Mol．Pharmacol．40:333-336(1991)）。この発見は、５β３αＳによるＮＭＤＡ誘導電流のアンタゴニズムが特異的な効果であることを立証している。
【００５４】
５β３αＳがそのブロックする作用を発揮することができる多くのポテンシャル部位があり、１）ＮＭＤＡ結合部位での競合抑制、２）ＮＭＤＡレセプター関連チャンネルの遮断、もしくは３）異なる部位での非競合抑制またはアロステリック調節を含む。
【００５５】
まず、ＮＭＤＡ結合部位について５β３αＳの競合は観察された結果を説明することができない。その結果は、ＮＭＤＡ誘導電流の５β３αＳによるアンタゴニズムがＮＭＤＡの濃度を増加していくことにより弱められないことを示している。
【００５６】
次に、５β３αＳ等のマイナスに帯電した分子によるカチオンチャンネルの遮断は、理論的な分野において似ていないように考えられる。クローン化ＮＭＤＡレセプターは、イオンチャンネルにつながるよう関連づけて考えられ、マイナスに帯電したアミノ酸残基が側面に位置する推定の第２膜貫通ドメインを有している（Moriyoshi，K.，et al.，Nature 354:31-37（1991））。これは硫酸エステル化分子のチャンネル内への侵入を防ぐ。電圧の欠落および使用依存は、また、この化合物と内部チャンネル壁との相互作用が似ていないことを提示している。
【００５７】
ＮＭＤＡレセプターは、アゴニスト結合部位に加えて、グリシン認識部位を有していることが知られている（Johnson，J.W．and Ascher，P.，Nature(Lond.)325:529-531(1987)）。ＮＭＤＡ誘導電流において５β３αＳの抑制作用を飽和濃度のグリシンにより乗り越えることはできない。この実験は、ステロイドおよびグリシンが共通の部位に作用しないことを提示している。
【００５８】
以前、プレグナノロンサルフェートが正のアロステリックモジュレーターとしてＮＭＤＡレセプターに作用することを示した。驚くべきことに、プレグナノロンサルフェート構造のわずかな変化（Ｃ−５位の二重結合を３β−ヒドロキシから３α−ヒドロキシに還元する）は、正から負の方向にＮＭＤＡレセプター介在化応答の調節を変化する。興味深いことに、５β３αＳはＮＭＤＡ応答においてのみプレグネノロンサルフェートに反対の効果を生じる。それは、ＡＭＰＡおよびカイネート（ｋａｉｎａｔｅ）応答でプレグネノロンサルフェートの抑制効果に似た抑制効果を引き出す。この結果は、ステロイドによるＮＭＤＡおよび非ＮＭＤＡレセプターの調節に関して構造的な要求が異なるという証拠を提供している。ＮＭＤＡ応答における非硫酸エステル化５β３αＳの無効性は、硫酸エステル化が不活性なステロイドを活性ステロイドインヒビターに変換することを表しており、ステロイドサルフォトランスフェラーゼがＣＮＳにおいてＮＭＤＡレセプター活性を制御する重要な酵素でありえることを提示している。
【００５９】
本明細書で述べられている研究は、ＮＭＤＡ誘導電流の非競合遮断の他のメカニズムを表しているだけでなく、ＮＭＤＡレセプター活性化に関するステロイドの構造的な要求を理解するための根拠もあげている。本明細書で述べられている結果は、プレグネノロンサルフェートの特別な誘導体やアナログが興奮性のアミノ酸レセプターの新規なクラスの広いスペクトラムアンタゴニストを表していることを示している。硫酸エステル化ステロイドは、抗痙攣剤または抗促進毒性治療剤として使用できる。
【００６０】
表１．  ３０μＭ  ＮＭＤＡ誘導応答におけるステロイドの効果
【表１】
0004313435.tif 000002
【００６１】
実施例２  エピプレグナノロンサルフェート（３β−ヒドロキシ−５β−プレグナノンサルフェート、５β３βＳ）が、特定の部位の作用においてＮＭＤＡレセプター活性を抑制する
実験を実施例１で述べるように行ない、ＮＭＤＡ、カイネート、およびＡＭＰＡ応答を抑制する５β３βＳ能を決定した。
【００６２】
１００μＭ  ５β３βＳの急速的かつ可逆的な使用は、３０μＭ  ＮＭＤＡに対する応答を５９％にまで、５０μＭカイネートに対する応答を３３％にまで、そして２５μＭ  ＡＭＰＡに対する応答を４３％にまで抑制した。５β３βＳ単独では、高濃度（１００μＭ以上）でしばしば小さな外部電流を誘導した。この電流は、ＣｓＣｌ含有細胞内溶液中で観察されず、それがＫ+電流であることを示している。さらに、ＣｓＣｌ含有溶液中で、５β３βＳ（１００μＭ）は、まだＮＭＤＡ応答を阻害した。２細胞において、５β３βＳにより生じる平均阻害は４９＋／−５．０％であり、それはＫＣｌ含有細胞内溶液中で測定されたものと有意に違うものではなかった（ｐ＞０．０５、非対ｔ検定）。これは、５β３βＳ誘導外部電流がＮＭＤＡ応答の抑制を説明することができることと同じではない。
【００６３】
５β３βＳの立体異性体である５α−プレグナン−３β−オール−２０−オンサルフェート（５α３βＳ）はＮＭＤＡ誘導電流を抑制せず（１＋／−２．６％、ｎ＝６）、５β３βＳとＮＭＤＡレセプターとの相互作用が、炭素−３においてでなく炭素−５について立体特異的であることを提示している。作用のこの立体選択性は、短鎖アルコールを提案する脂質二重層の乱れ等の非選択的メカニズムを通して、５β３βＳがＮＭＤＡレセプターを抑制しそうにない（Lovinger et al.，Science，243:1721-1724（1989）が、代わりに特異的作用部位の存在を支持する。
【００６４】
５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の遮断が電圧依存性であるかどうかを決定するために、２つの異なる保持ポテンシャルにおいて３０μＭ  ＮＭＤＡにより誘導された電流に対する１００μＭ  ５β３βＳの効果を調べた。２細胞において、５β３βＳにより生じる平均抑制は−７０ｍＶおよび＋５０ｍＶで類似しており、ＮＭＤＡ応答において５β３βＳの効果が電圧依存性ではないことを示している。さらに、ＮＭＤＡ応答のブロックと５β３βＳによる遮断からの回復の両方が急速であり、ＮＭＤＡ応答の５β３βＳ抑制がアゴニスト依存性ではないことを示している。従って、５β３βＳの電圧依存作用は、実質的にフェンシクリジンまたはＮＭＤＡレセプターのＭｇ2+結合部位との相互作用を排除する。
【００６５】
ＮＭＤＡ応答の５β３βＳによる抑制をグリシン認識部位を経て介在するかどうかを決定するために、飽和濃度（１０μＭ）のグリシンの存在下で３０μＭ  ＮＭＤＡによる５β３βＳ（１００μＭ）の効果を調べた。５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制はグリシンを添加せずに測定したものと有意に違わず（ｐ＞０．０５、非対ｔ検定）、このことは５β３βＳ部位がグリシン認識部位と異なることを示している。
【００６６】
さらなる実験を行ない、サルフェート（ＰＳ）および５β３βＳが、後記のように共通の調節部位を通じて作用したかどうかを決定した。
【００６７】
細胞内ステロイドは、細胞外適用ステロイドによるＮＭＤＡ応答の調節を変化しない。
ＰＳによる強化がＮＭＤＡレセプターの細胞内部位により調節されるかどうかを試験するために、細胞内１００μＭ  ＰＳ存在下で全細胞電流測定を行なった。電極緩衝液中の含有物により細胞内的にＰＳを適用した時、平均ＮＭＤＡ応答は対照と有意に違わず、記録期間（３−５分間）の間安定なままであった。この結果は、細胞内ＰＳがＮＭＤＡのステロイド調節部位へのアクセスを得ることができないことを提示している。この結果を確認するために、ＮＭＤＡ応答を細胞の静電容量（ｐＦ）に標準化し、細胞のサイズに関して細胞対細胞の変化性を回避した。標準化電流における有意な違いはＰＳの存在下または非存在下で観察されず、このことは、ＰＳが細胞内部位でまたは関連ＮＭＤＡレセプターに作用しないことを示している。さらに、細胞内ＰＳの存在下で（１５２±２３％、ｎ＝４）細胞外適用ＰＳによるＮＭＤＡ応答の平均強化が細胞内ＰＳの非存在下のもの（１５８±２４％、ｎ＝４）と有意に違わなかった。両者はＮＭＤＡ応答を遮断し、細胞外５β３βＳによる抑制からの回復の両方が急速であり、ＭＫ−８０１およびＰＣＰに見られるような明確な使用依存性を伴わない（Halliwell，R.F.，et al.，Br．J．Pharmacol.，96:480-494（1989）；Lerma，J．et al.，Neurosci．Lett.，123: 187-189（1991））。同様に、２００μＭ  ５β３βＳの細胞内緩衝液への添加は、ＮＭＤＡ誘導電流を抑制しない。さらに、細胞外１００μＭ５β３βＳの抑制効果は、細胞内５β３βＳの存在下で（４４±４％、ｎ＝４）、細胞内５β３βＳの非存在下でのもの（４８±４％、ｎ＝４）と有意に違わなかった。
【００６８】
ステロイドによるＮＭＤＡ−Ｒ二方向調節はポリアミン部位により調節されない。
以前の報告（Sprosen，T.S.，et al.，Eur．J．Pharmacol.，179:477-478（1990）; Williams，K．et al.，Neuron，5:199-208（1990））と一致して、スペルミン（１０−２５０μＭ）は、ＮＭＤＡ誘導電流を強化している。強化は、１００μＭのスペルミン濃度で最大（１３６±３３％、ｎ＝４）である。スペルミンの濃度がさらに２５０μＭに増加すると、スペルミンはＮＭＤＡ応答を強化する効果が弱くなる（６７±２１％、ｎ＝３）。ＰＳおよびスペルミンがＮＭＤＡＲの共通の調節部位を通じて作用することを決定するために、スペルミンの最大強化濃度（１００μＭ）の存在下でＮＭＤＡ応答におけるＰＳ（１００μＭ）の効果を試験した。スペルミンの非存在下で、ＰＳ（１００μＭ）は、１５０±１４％（ｎ＝１４）まで３０μＭ  ＮＭＤＡへの応答を強化した。１００μＭスペルミンの存在下で、ＰＳはＮＭＤＡ応答を１７８±１２％（ｎ＝６）まで強化し、それはスペルミンの非存在下におけるＰＳ強化と有意に違わなかった。これらの結果は、ＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化がスペルミンによる強化に応答する部位と異なる部位により調節されることを示した。同様に、１００μＭ  ５β３βＳは、１００μＭスペルミンの存在下でＮＭＤＡ応答を５０±５％（ｎ＝５）まで抑制し、それはスペルミンの非存在下の抑制の強化と有意に違わなかった。５β３βＳのこの濃度は、そのＥＣ50に近似しているので、もし５β３βＳおよびスペルミンが共通の部位について競合すれば、５β３βＳによる抑制の割合は減少されるであろう。従って、抑制ステロイド調節部位はスペルミン調節部位とは異なる。
【００６９】
ステロイドによるＮＭＤＡ−Ｒの二方向調節は、アラキドン酸部位により調節されない。
アラキドン酸は、直接ＮＭＤＡレセプターで作用することによりＮＭＤＡ応答を強化することが示されてきた（Miller，B．et al.，Nature，355:722-725（1992））。ＰＳは、アラキドン酸に似た両親媒的特性を有しているので、ＰＳおよびアラキドン酸は同じ部位を通じて作用するかどうかを試験した。最大濃度のアラキドン酸（１０μＭ）だけが１２０±３５％（ｎ＝５）まで３０μＭ  ＮＭＤＡ応答を強化し、一方で１００μＭ  ＰＳの存在化でアラキドン酸は１５８±２２％（ｎ＝４）までＮＭＤＡ応答を強化した。逆に、１００μＭ  ＰＳは１０μＭアラキドン酸存在下で１８２±２５％（ｎ＝４）までＮＭＤＡ応答を強化し、それはアラキドン酸の非存在下での強化と有意に違わなかった。従って、ＰＳおよびアラキドン酸は、独立したメカニズムを通じてＮＭＤＡＲを強化するようである。同様に、アラキドン酸は５β３βＳの抑制の割合に影響を与えず（４９±５％、ｎ＝５）、これは抑制ステロイド部位がまた、アラキドン酸調節部位とは異なることを示している。
【００７０】
ステロイドによるＮＭＤＡ応答の二方向調節は、酸化還元部位により調節されない。
４ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、逐次「急増」のＮＭＤＡ応答があり、ＤＴＴ曝露の１８０秒後に対照のＮＭＤＡ電流が２７３±１９％（ｎ＝６）に増加する。ＰＳがＮＭＤＡレセプターの酸化還元調節部位と相互作用するかどうかを試験するために、延長したＤＴＴへの曝露の後、ＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化を測定した。約１時間の４ｍＭ  ＤＴＴへの曝露後（電解溶液中）、平均ＮＭＤＡ誘導電流は、対照の培養液（１２１±１６ｐＡ；ｎ＝２５）と比較して、有意に増加した（３２６±８２ｐＡ；ｎ＝１３）。しかしながら、１００μＭ  ＰＳによるＮＭＤＡ誘導電流の強化に有意な変化はなかった（１６５±２６％、ｎ＝４）。同様に、ＮＭＤＡ応答のＰＳ強化は、約１時間後の１０ｍＭ  ＤＴＴへの曝露の有意に変化しなかった（１６１±１２％、ｎ＝４）。追加試験として、細胞をメルカプト基アルキル化剤Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理し、ＮＭＤＡレセプターの酸化還元調節に応答する部位をアルキル化した。培養液を４ｍＭ  ＤＴＴを用いて５分間処理し、次いで４ｍＭ  ＤＴＴ＋３００μＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で２分間処理した。次いで、培養液を４回洗浄し、ＰＳにより３０μＭ  ＮＭＤＡ応答の強化を測定した。平均ＮＭＤＡ誘導電流は、対照培養液（１２１±１６ｐＡ、ｎ＝２５）に比べ、有意に増加したが（３６７±８２ｐＡ、ｎ＝２５）、しかしながらＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化は有意（ｐ＞０．１）に減少しなかった（１０３±２３％、ｎ＝４）。５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制も、ＮＥＭ処理後変化しなかった（５３±５％抑制、ｎ＝４）。
【００７１】
５β３βＳおよびＰＳは、異なる部位を通じて作用する。
構造的に似ている化合物５β３βＳおよびＰＳが同じ部位を通じて作用し、ＮＭＤＡ応答を調節するかどうかを調査するために、組み合わせた５β３βＳおよびＰＳの効果を試験した。２００μＭ  ＰＳの存在下で、２００μＭ  ５β３βＳはピークＮＭＤＡ応答を５０±４％（ｎ＝４）まで抑制し、それはＰＳ非存在下で測定した５９±３％（ｎ＝４）の抑制と有意に異ならなかった。逆に、１００μＭ  ＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化は、２００μＭ  ５β３βＳの存在下でも明らかであった。さらに、５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制についてのＩＣ50は、１２０μＭおよび１４３μＭでそれぞれ、２００μＭ  ＰＳの存在下および非存在下において同様であった。５７μＭのＰＳ  ＥＣ50をそのＫdの近似値としてＮＭＤＡ応答の強化について測定したところ（Wu，F.S．et al.，Mol．Pharmacol.，40:333-336(1991)）、競合的抑制から、ＰＳ存在下で測定された５β３βＳについてのＩＣ50が４．５係数まで増加することが予想されている。これらの結果は、５β３βＳが、ＰＳ調節部位と異なる部位を経てＮＭＤＡ応答を抑制することを示している。
【００７２】
組換えＮＭＤＡレセプターを発現する卵母細胞におけるステロイドによるＮＭＤＡ応答の調節
ＮＭＤＡレセプターのサブユニットをコードする最近のｃＤＮＡのクローニングは、ＮＭＤＡレセプターの機能調節の研究を大いに促進してきた。それは、４つのＮＲ２のサブユニット（ＮＲ２Ａ−ＮＲ２Ｄ）（モンヤーら(Monyer，H.，et al.)、Science，256:1217-1221（1992）;イシイら(Ishii，T.，et al.)、J．Biol．Chem.，268:2836-2843（1993））の１つとＮＲ１のサブユニットとの共発現（モリヨシら(Moriyoshi，K.，et al.)、Nature，354:31-37（1991））が、天然のＮＭＤＡレセプターの薬理学的性質の多くを発揮する機能的チャンネルを生ずることを示してきた。近年の研究では、これらの組換えヘテロメトリック(heterometric)チャンネルが、４つのＮＲ２のサブユニットのＮＲ１との集合体に依存するＮＭＤＡレセプターのモジュレーターに対して異なった感度を表すことを提唱している（モンヤーら(Monyer，H.，et al.)、Science，256:1217-1222（1992）;クスワデら(Kusuwade，T.，et al.)Nature，358:36-41（1992）; ラウリーら(Laurie，D.J.，et al.)、Eur．J．Pharmacol.，268:335-345（1994）; マソードら（Masood，K.，et al.）、Mol．Pharmacol.，45:324-329（1994））。
【００７３】
卵母細胞の電気生理学
ＲＮＡの調製。ｍＲＮＡは、インビトロでのＮＲ１100およびＮＲ２ＡのｃＤＮＡの転写を通して、ｍメッセージ・ｍマシーンキット（アンビオン（Ambion），TX）を用いて調製した。ＮＲ１100およびＮＲ２Ａのクローンは、Ｄｒ．ズキン（Zukin）とＤｒ．ナカニシエ(nakanishie)により供与された。
【００７４】
アフリカツメガエルの発現系。雌の卵母細胞陽性のゼノパス・ラエビス（Xenopus laevis）カエルをナスコ(Nasco)，Inc.(WI)から購入した。そのカエルを１２／１２の明−暗周期で保ち、３日ごとに刻んだ子牛のレバーの食餌を続けた。外科手術に先立って、３５−４５分間０．１５％トリカイン（Tricaine）溶液（シグマ（Sigma)，MO）中でカエルを麻酔した。小胞状の卵母細胞を含有する卵巣部分を側面の腹部の切り口を通して除去し、すぐにカルシウム−フリーＮＤ９６溶液（ｉｎ  ｍＭ）：９６  ＮａＣｌ；１  ＭｇＣｌ2；２  ＫＣｌ；５  ヘペス（Hepes）；２．５  ピルビン酸（ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整した）中に置いた。室温で２時間の０．２％コラゲナーゼII型（シグマ，MO）中のインキュベーション後、個々の脱小胞化された卵母細胞を、ＮＤ９６溶液（ｉｎ  ｍＭ）：９６  ＮａＣｌ；１  ＭｇＣｌ2；２  ＫＣｌ；１．８  ＣａＣｌ2；５  ヘペス（Hepes）；２．５  ピルビン酸（ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整した）を含有する６０×１５ｍｍのガラスのペトリ皿に移した。単離した卵母細胞を１８℃で恒温槽中で保った。次の日に、２０−４０個の選択した卵母細胞の一群（デュモント（Dumont）ステージ  ＶおよびVI）に５０ｎｌの調製したＲＮＡ溶液（卵母細胞あたり、０．５ｎｇのＮＲ１と１２ｎｇのＮＲ２Ａ  ｍＲＮＡ）を電子マイクロインジェクター（ドラモンド(drummond)，PA）を用いて注入した。注入された卵母細胞は、１８℃の恒温槽で続く４−１０日、電気生理学的実験のために用いた。
【００７５】
電子記録と薬物の適用。イオン電流記録は、アクソクランプ−２Ａ（Axoclamp-2A）増幅器（アクソンインストルメンツ（Axon Instruments），Inc.，CA）を用いて、２つの電極電圧クランプモードにおいて得られた。微電極をガラスの毛細管（ダガン（Dagan），ミネソタ）から、プログラムされた引き抜き具（サッター・インストルメント（Sutter Instrument）Co.，CA）を用いて製作し、３Ｍ  ＫＣｌ溶液で充填した。充填した微電極の抵抗は、２．５−３．５ＭΩの範囲にあった。卵母細胞を−７０ｍＶの保持電位をかけた。膜電流を５００Ｈｚでフィルターし(filtered)、１００Ｈｚの周波数でためした。薬物を重力作動性外部灌流システムを用いて適用した。データの取得および外部灌流制御はスーパースコープII（SuperScopeII）ソフトウェアパッケージ（GW  インストルメンツ（Instruments），MA）を用いて行なった。全ての実験を２２−２４℃の室温で行なった。
【００７６】
ステロイドによるアミノ酸応答の調節の程度であるパーセント変化は、（Ｉ’／Ｉ−１）×１００％（式中、ＩおよびＩ’はそれぞれステロイドの非存在下または存在下におけるアゴニスト誘導電流である）で定義した。終始、結果は平均±ＳＥＭとして表示され、統計比較群はスチューデントのｔ検定を用いて実行された。
【００７７】
ＰＳおよび５β３βＳが異なったセレプター集団に対して作用するのかどうかを調査するために、ステロイドの調節効果をＮＭＤＡＲｌ100とＮＭＤＡＲ  ２Ａサブユニットのみを発現する卵母細胞を用いて評価した。ＮＭＤＡ一投与の応答曲線は、それぞれ、６２±４μＭと１．５±０．１のＥＣ50およびヒル係数を生じた（ｎ＝４）。５β３αＳのように（パーク−チャングら(Park-Chung，M.，et al.)、Mol．Pharmacol.，46:462-465（1994））、５β３βＳは最大ＮＭＤＡ応答を低下させたが、ＮＭＤＡ  ＥＣ50（４８±４μＭ；ｎ＝４）においてはわずかな変動を引き起こしただけで、５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制は非競合的であったことを示唆している。２００μＭ  ５β３βＳが抑制し（５４±８％，ｎ＝４）、１００μＭ  ＰＳが最大ＮＭＤＡ応答（２００μＭ）程度に強化した（２９２±３４％，ｎ＝８）。５β３βＳとＰＳがＮＭＤＡ応答を調節するために、単一の部位を通して作用したかどうかを検査するために、最大濃度のＰＳの存在下における５β３βＳの効果を評価した。２００μＭ  ＰＳ（５４±５％；ｎ＝５）の存在下における２００μＭ  ５β３βＳによるピークＮＭＤＡ応答の抑制は、ＰＳ（４６±８％；ｎ＝４）の非存在下において測定されたものと、有意に異なっていなかった。そのうえ、２００μＭ  ＰＳの存在下および非存在下において、５β３βＳに対するＩＣ50（それぞれ、１２４μＭおよび１５１μＭ）において有意な変化がなかった。再び、これらの結果は５β３βＳがＰＳ調節部位とは異なった部位を経由してＮＭＤＡ応答を抑制したという見解と一致していた。
【００７８】
さらに、ニューロンを用いたのと同様に、５β３αＳは、ＮＲ１100／ＮＲ２Ａを注入した卵母細胞のＮＭＤＡ応答に対して抑制効果を有し、ＰＳと５β３αＳ間の相互作用が競合的ではなかったことは、これらの２つのステロイドが異なった部位を通して作用することを示している。
【００７９】
考察
ステロイドの作用部位
ＮＭＤＡ応答は、Ｍｇ2+（ノワクら(Nowak，L.，et al.)、Nature（Lond.），307:462-465（1984））、ＭＫ−８０１、およびフェンシクリジン（ハニー(Honey，C.R.)、NeuroSci．Lett.，61:135-139（1985））を含むＮＭＤＡＲの非競合的拮抗薬による電圧依存様式で阻害され、それらはチャンネル内の部位に結合すると考えられる。対照的に５β３βＳは電圧依存ではない。５β３βＳが帯電しているときに、電圧依存の抑制では、その結合部位への５β３βＳの接近にチャンネルへの入口を必要とするのではないかと予測される。さらに、使用依存抑制の証拠もない。なぜなら、５β３βＳの存在下におけるＮＭＤＡの適用の繰り返しによって引き起こされたピークの内部への電流が徐々に衰えないからである。電圧または使用依存の欠乏は、５β３βＳによる抑制がＭｇ2+またはＭＫ−８０１の結合部位により媒介されないことを示している。
【００８０】
以前の報告では、ＰＳが作用の可能なあらゆる部位に接近するために、膜内でまたは横切って拡散することができるかも知れないと提案している（ウォングら(Wong，M．et al.)，J．Neuroscience，12:3217-3225（1992）；ボウルビー（Bowlby，M.）、Mol．Pharmacol.，43:813-819（1993））。しかしながら、細胞内のステロイドによるＮＭＤＡ応答の平均振幅の大きな変化は観察されなかった。加えて、時間（約５ｍｉｎ．）によるＮＭＤＡ応答における緩やかな増加または減少はなく、細胞内のステロイドは、緩慢な時間のスケールでさえ、ＮＭＤＡ応答を調節しないことを示唆している。さらに、細胞外から適用したときのＰＳによる強化または５β３βＳによる抑制は、細胞内のステロイドの存在下において変化しない。これらの結果は、ＰＳおよび５β３βＳの作用部位が膜の細胞の外側と関連していることを示している。以前の報告においては、細胞外から適用したＰＳが、直接ＰＳにさらされていない細胞上の一部において、ＮＭＤＡ応答を強化した（ボウルビー（Bowlby，M.）、Mol．Pharmacol.，43:813-819（1993））。今回の結果の見解では、この発見は、ＰＳが膜の平面内で横からの拡散により作用部位に達することができるかどうかを説明した。
【００８１】
ＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化および５β３αＳによる抑制はグリシンの調節部位により媒介されないことが明らかにされてきた（ウーら(Wu，F.-S.，et al.)、Mol．Pharm.，37:597-602（1991）；ボウルビー（Bowlby，M.）、Mol．Pharmacol.，43:813-819（1992），パーク−チャングら(Park-Chung，M.，et al.)、Mol．Pharmacol.，46:146-150（1994））。同様に、５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制の割合は飽和濃度のグリシンの存在下において減少せず、抑制がグリシンの調節部位のために内在性グリシンとの競合のためではないことを示している。
【００８２】
ポリアミン、アラキドン酸および酸化還元剤に対する部位を含めて、ＮＭＤＡＲと関連する他の調節部位の多様性が提案されてきた。スペルミンまたはスペルミジンのようなポリアミンは、マイクロモル濃度で、ＮＭＤＡ応答を増加させることを示し、それらの作用部位はグリシンの部位とは異なる（ランサムら(Ransom，R.W.，et al.)、J．Neurochem.，51:830-836（1988）；ウィリアムズら(Williams，K.，et al.)、Mol．Pharmacol.，36:575-581（1989）；スプロセンら(Sprosen、T.S.，et al.)、Eur．J．Pharmacol.，179:477-478（1990）; ウィリアムズら(Williams，K，et al.)、Neuron，5:199-208（1989））。他のＮＭＤＡレセプターのモジュレーターであるアラキドン酸は、ＰＳと同様の両親媒性の性質を有しており、アラキドン酸の作用部位がＮＭＤＡレセプターの推定脂肪酸結合ドメインであると提案されている（ペトロウら(Petrou，S.，et al.)、Trends Biol．Sci.，18:12-13（1993））。加えて、チャンネルの酸化還元調節部位の縮小は、ＮＭＤＡ誘導電流を高める一方で、酸化により反対の効果が得られる（アイゼンマンら(Aizenman，E.，et al.)、Neuron，2:1257-1263（1989））。このようにして、ステロイドによるＮＭＤＡＲの正または負の調節が、これらの知られているあらゆる調節部位により媒介されているかどうかを調査した。ＰＳによるＮＭＤＡ応答の強化および５β３βＳによる抑制の両方が、高濃度のスペルミンまたはアラキドン酸の存在下において持続し、これらのステロイドの調節効果がポリアミンまたはアラキドン酸の部位のいずれにも媒介されていないことを示している。同様に、ＰＳによる強化および５β３βＳによる抑制は、続く長期のＤＴＴとのインキュベーションまたはＮＥＭを用いたアルキル化でも持続し、ステロイドが酸化還元調節部位と相互作用しないことを示している。合わせて考えると、これらの結果は新たな細胞外のステロイド調節部位の存在の強力な支えになる。
【００８３】
ＰＳと５β３βＳの相互作用
驚くべきことに、ＰＳと５β３βＳ間の相互作用は競合的ではなく、これは、これらのステロイドが、異なった部位を通して作用することにより、それぞれの正および負の調節効果を生じていることを示している。この結論は次の所見に基づいている：（ｉ）５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の抑制はＰＳの最大濃度程度の添加で変化しない；（ii）ＮＭＤＡ応答のＰＳによる強化は高濃度の５β３βＳの存在下でさらに明らかである；および（iii）ＰＳの存在下において５β３βＳに対するＩＣ500には有意な変化がない。おそらく、ＰＳおよび５β３βＳは異なったＮＭＤＡＲの集団に作用しないと思われ、高濃度の５β３βＳでＮＭＤＡ応答の抑制をほとんど完全に達成することができるため、５β３βＳに対しては抵抗性であるが、ＰＳに対しては感度が高いレセプターの集団の存在の証拠となる。加えて、ＰＳおよび５β３βＳによるＮＭＤＡ応答の二方向調節が、ニューロンのＮＭＤＡレセプターでのように、ＮＭＤＡＲ１100およびＮＭＤＡＲ２Ａのサブユニットのみを発現する卵母細胞において観察され、これらの二つのモジュレーター間の相互作用は競合的ではない。このように、ＮＭＤＡＲの機能を調節する能力を持つ少なく２つの異なったステロイド調節部位があるに違いない。
【００８４】
生理学的および薬理学的意義
近年、ＰＳの脳室内注入が記憶維持を高めることが立証されている（フラッドら(Flood，J.F.，et al.)、Proc．Nat’l．Acad．Sci.，89:1567-1571（1992））。ＰＳもまた受動的回避記憶機能におけるＮＭＤＡレセプターのアゴニスト誘導欠損の阻害（マシスら(Mathis，C.，et al.)、Psycopharmacol.，116:201-206（1994））およびラットにおけるディゾシルピン(dizocilpine)誘導記憶喪失を拮抗させる（チェニーら(Cheney，D.L.，et al(1995)）に効果的であることが明らかにされている。
【００８５】
５β３βＳまたは５β３αＳのような硫酸エステル化された抑制ステロイドは、促進毒性ニューロン死の防止に有用である。虚血において、グリシン（グローブスら(Globus，M.，et al.)、Neurosci．Lett.，127:39-42（1991））またはアラキドン酸（レンクローナら(Rehncrona，S.，et al.)、J．Neurochem.，38:84-93（1982））のようなＮＭＤＡレセプターのモジュレーターの放出が増加されることが明らかにされてきた。グルタメートの濃度およびＮＭＤＡレセプターの内在性のモジュレーターの増加は、ＮＭＤＡレセプターの電流を強化し、グルタメート介在促進毒性を悪化させると予測される。なぜなら、５β３βＳはグリシン、ポリアミンまたはアラキドン酸の存在下におけるＮＭＤＡ応答を抑制することができるため、これは、脳卒中、脳虚血、および低酸素症のニューロン損傷のような病態生理学的状態の際に、過度のＮＭＤＡレセプターの活性化を効果的に抑制することができる。
【００８６】
本明細書で記載したように、硫酸エステル化されたステロイドＰＳおよび５β３βＳは、ＮＭＤＡレセプターのユニークな部位で作用し、それらは別々の経路を通して正および負の調節を発揮する。これらの結果は、これらの硫酸エステル化されたステロイドがＮＭＤＡレセプターの機能的モジュレーターの新たな種類を構成するという見解を支持している。
【００８７】
実施例３  ＮＭＤＡレセプターの活性を抑制するプレグネノロンサルフェートの付加的誘導体
付加的なプレグネノロンの誘導体の電気生理学を実施例１において記載したように分析した。次の化合物：５β３αＳ、５β３αヘミスクシネート、１７β−エストラジオールヘミスクシネート、１１β−ＯＨ−プレグネノロンサルフェート、５β３βＳおよび５α３αＳの結果を表２に一覧している。図４は、ＮＭＤＡ応答の抑制率に対する電気生理学の棒グラフであり、５β３αＳ、５β３αヘミスクシネートおよび１７β−エストラジオールヘミスクシネートがＮＭＤＡ応答を抑制することを示している。
【００８８】
図４において明らかなように、５β３αヘミスクシネートによるラットの海馬細胞におけるＮＭＤＡ応答の抑制率はおよそ２０％であった。５β３αヘミスクシネートを用いて行なった６つの実験のうちの２つでは、化合物の効果はなかった。しかしながら、６つの実験のうちの４つにおいて、ラットの海馬細胞におけるＮＭＤＡ応答の抑制率がかなり大きかった。６つの実験すべての結果の平均をとって、最終結果にしたところ、全体的に低い抑制率になった。
【００８９】
表２  ＮＭＤＡ応答におけるステロイド類の効果
【表２】
0004313435.tif 000003
【００９０】
実施例４  ＮＭＤＡレセプター活性のインヒビターは、促進毒性に対して保護する
ラット海馬形成の初代神経培養物におけるＮＭＤＡ誘導細胞死を抑制するプレグネノロンサルフェートの誘導体の能力を評価するために、トリパンブルー除外を使用した。
混合した海馬組織の神経および膠培養物は、胚発生の１８日目の胎児ラットに由来し、１６〜２４日間培地中で維持した（Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇ．Ｊ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、４９４、６５−７４（１９８９））。本研究で使用した動物の世話は制度化されたガイドラインに則った。ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの子供由来の海馬組織を胎児１８日目において、ＣＯ2で殺した母親から取り除いたあと直ちに集めた。４．２ｍＭ重炭酸塩、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを補ったＣａ2+／Ｍｇ2+無しのハンクの基本塩溶液中で粉砕によって細胞を分離し、遠心分離（９００ｒｐｍ、３分）によってペレットにした。得られたペレットを２．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２６．５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％  ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび組成（２５０ｍＭビタミンＢ１２を有し、カタラーゼ、グルタチオン、およびスーパーオキシドディスムターゼを有さない）を明らかにしたＢｒｅｗｅｒｓ  Ｂ１６の改変（Ｐｉｋｅ，Ｃ．Ｊ．等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１３、１６７６−８７（１９９３））を補ったＤＭＥＭ中に懸濁し、ポリ−Ｌ−リジンでコートした２４ウェル培養皿（Ｎｕｎｃｌｏｎ）に１５，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレートし、５％  ＣＯ2／９５％空気で３７℃の加湿されたインキュベーター内で維持した。インビトロで５日後、非神経細胞分裂を２×１０-6Ｍシトシンアラビノシドに４８時間曝露することによって抑制した。細胞を継続的にＢＳＡまたはＦＢＳ無しでプレーティングに使うものと同一の培地中で維持した。
【００９１】
個々の培養ウェルの培地への薬剤溶液の添加後１６時間で、トリパンブルーを除外する細胞の能力を評価することによって生きているニューロンの数を決定した（Ｄａｗｓｏｎ，Ｖ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、６３６８−６３７１（１９９１））。処理の直前に実験用の培養物から集めた、１００μｌの条件つけた培地中の培養物に、薬剤を０．５ｍｌの最終量にするように導入した。１０μｌの添加によって０〜１００μＭの終濃度になるように、ＮＭＤＡを０〜５ｍＭの濃度のＤＭＥＭ中に溶解した。陽性対照である、ＭＫ−８０１を５μｌの添加によって１０μＭの最終濃度になるように１ｍＭの濃度のＤＭＥＭに溶解した。対照培養物を等量のＤＭＥＭ、およびＤＭＳＯの濃度（０．５％）に曝露しただけであった。プレグネノロンサルフェート誘導体の濃度は下記のようにした：１０〜１００μＭ  ５β３αＳ、１００μＭ  ５β３αヘミスクシネートおよび２００μＭ  １７β−エストラジオールヘミスクシネート。
【００９２】
薬剤への曝露後、該培地を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０．４％トリパンブルーに置き換えた。細胞死を、明るいフィールドおよび位相設定を用いた倒立位相差顕微鏡により、培養物ウェルあたり５倍高いパワーフィールドで、トリパンブルー陽性および陰性ニューロンの数を数えることによって評価した。細胞死は、各々のウェル中で数えられた細胞の全数に対するトリパンブルー陽性の数×１００の割合（パーセント細胞死）として表した。
【００９３】
結果
結果を図５に示す。５β３αＳは、短期間のＮＭＤＡ促進毒性に対して防御するが、慢性ＮＭＤＡ−誘導された細胞死に対しては効果的でない。これは、この化合物の不安定性によるものであろう。５β３αＳの場合は、慢性の曝露実験における防御を示すが、平均的に効果はない。
【００９４】
曝露のみの間に存在するとき、５β３αＳは完全にＮＭＤＡによる細胞死をブロックし、曝露後のみに存在するとき、ほとんど効果がないように考えられ、防御はＮＭＤＡレセプターに対する直接の作用を通していることを示唆する。５β３αＳの投与の間および後ならびに前、間、ならびに後は投与の間のみに対する防御に似ていることを示した。
【００９５】
５β３αヘミスクシネートおよび１７β−エストラジオールヘミスクシネートは、慢性ＮＭＤＡにより誘導された細胞死の５０および４０％、ならびにＮＭＤＡへの短期間の曝露により生じた細胞死の４６および６５％を抑制する。これらのステロイドの両方に対して、促進毒性研究における防御は、電気生理学により示されたものよりも多く見られた。
【００９６】
さらに、短期間実験のＮＭＤＡ曝露の間に存在するとき、これらの両方のステロイドは、最も効果的であった。ＮＭＤＡ傷害の間および後の両方に存在するとき、防御は幾分劣っていた。
【００９７】
実施例５  プレグネノロンサルフェートおよびその誘導体による培養ニューロンにおける自発興奮性後シナプス電流（ＥＰＳＣｓ）の調節
本明細書において述べられた調節効果が、短い持続時間の曝露の期間およびシナプスレセプターに位置するシナプス応答の調節に中継されるかどうかについてを評価した。
【００９８】
海馬ニューロンの初代培養物を、胎児１８日目のラットから調製した。培養されたニューロンをプレーティング後２〜３週間の実験に用いた。
【００９９】
自発の興奮性の後シナプス電流を、パッチクランプ技術の全細胞変異体によって記録した。ピペット溶液は、常に、ＫＣｌ  １０、ＥＧＴＡ  １１、グルコン酸ナトリウム  ３、グルコン酸カリウム  １４０およびＫＯＨでｐＨ７．２に調整されたＨＥＰＥＳ  １０（ｍＭ）を含んでいた。バッチ溶液は、ＮａＣｌ  １５０、ＫＣｌ  ４、ＣａＣｌ2  １およびＮａＯＨでｐＨ７．２に調整されたＨＥＰＥＳ  １０（ｍＭ）を含んでいた。ＮＭＤＡ誘導された電流が細胞外のＭｇ2+によるボルト数−依存のブロックに従属するため、マグネシウム塩を電解槽（ｂａｔｈ）溶液に添加しなかった。全ての記録を、Ｃｌ-平衡電位に非常に近い−７０ｍＶでクランプした細胞膜電位で作成した。したがって、ＩＰＳＣｓは観察されることを期待されず、自発の活動はＥＰＳＣｓに含まれるべきであろう。ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストＡＰＶおよび非−ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストＤＮＱＸの同時−使用による自発の行動の完全なブロックは、観察された自発の行動がグルタミン酸レセプター−仲介されることを主張する。
【０１００】
薬剤溶液を、ニューロンの細胞体から−５０μｍに位置した７−バレルピペット（チップ開口−３〜５μｍ）からの圧力放出（１５ｐｓｉ）によって、単独のニューロンへ供した。全ての実験において、ニューロンに、ステロイドまたはステロイド  プラス  アンタゴニストのいずれかの４０秒間適用をうけさせた後、外部緩衝液溶液の１０〜２０ｓパルスをうけさせた。
【０１０１】
結果
表３に示すように、ラット海馬ニューロンの培養物において、ＰＳは自発のＥＰＳＣｓを増強し、５βαＳは自発のＥＰＳＣｓを抑制した。ＰＳの類似体である１１−ケトＰＳはＥＰＳＣｓへ効果を与えなかった。１００μＭ  １１−ケトＰＳにより生じる増強パーセンテージは、１９±１５％（ｎ＝４）である。これは、ＰＳのＥＰＳＣｓにおける効果が特異的であることを示唆する。ＰＳの幾つかの代謝物の効果もＥＰＳＣｓで評価した。
【０１０２】
細胞培養で維持し、プレーティング後１０〜２１日間にアッセイした胎児ラット海馬ニューロンのほとんどは、Ｍｇ2+無しの細胞外溶液中で自発の興奮性の後シナプス電位（ＥＰＳＣｓ）を示す。内因性のニューロステロイド、プレグネノロンサルフェートは、電圧−クランプしたラット海馬ニューロンの初代培養物中でＥＰＳＣｓを可逆的に増強する。ＥＰＳＣｓの効果は、１１．９μＭのＥＣ50および２２３％の最大増強を有し、投与−依存的である。ＮＭＤＡレセプターによって仲介されたＥＰＳＣｓが特異的なＮＭＤＡレセプターアンタゴニストであるＡＰＶでブロックされるとき、ＰＳによるＥＰＳＣｓの増強は減らされた。逆に、非−ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターによって仲介されたＥＰＳＣｓが特異的な非−ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストであるＤＮＱＸでブロックされるとき、ＰＳはＥＳＣｓのより大きな増強を生じる。これらの結果は、ＰＳが、ＮＭＤＡレセプターによって仲介されたＥＰＳＣｓを最初に増強することを示す。ＥＰＳＣｓへのＰＳの効果は、外因的に供されたＮＭＤＡによって誘導された応答へのＰＳの効果に一致する。これらの観察は、ＰＳなどのニューロステロイドは、ＣＮＳ中で興奮性のシナプス伝達への直接神経調節の効果を持つというさらなる証拠を提供する。これは、ニューロステロイドによる興奮性のシナプス電位の調節の最初の証明である。
【０１０３】
表３
ＥＰＳＣｓにおけるステロイド類の効果。保持電位は−７０ｍＶである。
ステロイド類を方法に記載のように供した。値は、有意±ＳＥＭである。
細胞数は括弧内に示した。
【表３】
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【０１０４】
実施例６  硫酸エステル化およびスクシニル化されたステロイドの行動効果
行動効果を試験するために、ＰＳ、５β３αＳ、５β３αＨＳ、βＥ2（１７）ＨＳまたはβＥ2（３）ＨＳ（ＤＭＳＯ中７ｍｇ／ｍｌ）をマウスに２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射で投与した（薬剤群あたり５匹の動物）。行動の評価を、注入後３０分間、運動性効果応答、感覚運動性応答、体位、筋肉緊張力、平衡、ＣＮＳ興奮、および自律神経系機能（Ｉｒｗｉｎ，Ｒ．Ｐ．等、ＮｅｕｒｏＳｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１４１、３０−４４（１９６８））の包括的な観察評価を用いてした。５β３αＨＳ処理した動物は、事実上全ての筋肉緊張力を失ったが、穏やかな程度で、それらのはっとする驚き、ピナ（ｐｉｎａ）および角膜反射運動を取り戻した。反射運動を正すことの欠失の潜伏（ｌａｔｅｎｃｙ）は、２．５±０．５分であり、反射運動を正すことを取り戻すことの潜伏（ｌａｔｅｎｃｙ）は８３±１１分であった。開始（ｏｎｓｅｔ）の速さは、５β３αＨＳが直ちに血液脳関門に近づくことを主張する。ＰＳをうける動物は、運動の活性のスコアを減らした１つを除いて影響しなかった。５β３αＳ、βＥ2（１７）ＨＳおよびβＥ2（３）ＨＳ処理したマウスは、非常に僅かな行動障害を示した。図６Ａ〜６Ｄを参照せよ。
【０１０５】
実施例７  ＮＭＤＡ誘導された痙攣および死
５β３αＨＳ（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）は、マウスをＮＭＤＡ誘導された死から守る。試験されたステロイドのどれもがＮＭＤＡ−誘導された痙攣への潜伏を変えなかった。しかしながら、５β３αＨＳをうけた動物の１００％が、ＤＭＳＯに対して５０％  ５β３αＳおよびＥ2（３）ＨＳに対して７５％ならびにＥ2（１７）ＨＳに対して５０％であることと比較して、１００ｍｇ／ｋｇ  ＮＭＤＡチャレンジで生き残った。
【０１０６】
実施例８  インビボでの神経保護
５β３αＨＳは、行動アッセイにおいて最も活性であり、ステロイドサルフェートよりもさらに直ちに血液／脳関門を通ることを示した。したがって、５β３αＨＳをインビボでの可能性のある神経保護剤として試験するために選んだ。後述するように、５β３αＳは痙攣の開始への潜伏を増やし、２００ｍｇ／ｋｇ  ＮＭＤＡの静脈内注入をしたあとのラットの死亡率を減らす。５β３αＨＳの静脈内注入を虚血の開始後５分で開始したとき、病巣（ｆｏｃａｌ）虚血のラット中脳動脈閉塞モデル（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｋ．およびＳｉｍｏｎ，Ｒ．Ｐ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ、３０、１６９−１７４（１９８９））において、皮質性の梗塞体積を著しく減少した。ビヒクル処理したラット（ｎ＝９）に比べて、５β３αＨＳ処理したラット（ｎ＝１０）は、皮質性の梗塞体積で４７＋／−１０％減少および皮質下の梗塞体積で２６＋／−６％の減少を示した。５β３αＨＳの静脈注入を虚血の開始後３０分まで遅らせたとき、皮質性の梗塞体積も著しく減少させた。
【０１０７】
試薬および方法
ホルマリンカギ爪のある足（ｐａｗ）リック（ｌｉｃｋ）鎮痛薬試験
２０〜２５ｇの体重の雄のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）をホルマリン試験に使用した。ＤＭＳＯに溶解させた試験化合物またはビヒクルで、マウスへ腹腔内に注射した。５分後、２０μｌの１％ホルマリンをそれぞれのマウスの後ろの足に注射した。注射したカギ爪のある足をなめること（ｌｉｃｋｉｎｇ）にかかる時を２５分間モニターした。早い段階の応答は０〜５分の間であり、遅い段階の応答は５〜２５分の間の応答として定義された。
【０１０８】
マウスにおけるＮＭＤＡ−誘導された痙攣試験
２０〜２５ｇの体重の雄のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）をＮＭＤＡ−誘導された痙攣試験に使用した。ＤＭＳＯに溶解させた試験化合物またはビヒクルで、マウスへ腹腔内に注射した。ＮＭＤＡ（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を試験化合物の静脈内注射後２分または試験化合物の腹腔内注射後２０分後のいずれかに注射した。マウスは緊張性の痙攣および３０分の限度時間の死亡を観察された。３０分を越えても痙攣または死亡を経験しないマウスを、３０分の潜伏を持つとしてスコアした。
【０１０９】
ラットにおける中脳動脈閉塞脳虚血試験
雄のＷｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ）を使用した。酸素でバランスをとった７０％窒素中３％ハロタンで麻酔を誘導した。ラットに挿管し、３０％酸素および７０％窒素の混合物中２％ハロタンを人工的に通気した。フィードバックコントロールユニットにつないだ直腸のプローブを有するウォーミングパッドで手術中体温を３７．５℃に維持した。両方の共通の頸動脈（ＣＣＡ）を単離し、ゆるいシルク結紮をそれぞれの動脈の周りに施した。鉛直方向の皮膚切開を左眼窩および耳道の間につくった。標準食塩水洗浄下、頬骨の後部を取り除き、小さい開口（２．０／２．５ｍｍ）は、背にくちばしがあるように（ｄｏｒｓｏｒｏｓｔｒａｌｌｙ）卵形の孔を開けた。硬膜を微小の外科用のフックであけ、内部の頸動脈および中央の脳の動脈の分岐を露出させるように、脳を小さいスパチュラで穏やかに牽縮した。同じ側のＣＣＡの恒久的な結紮後、中脳動脈（ＭＣＡ）をその起始から嗅索へ凝固させた。反対側に起こるＣＣＡを２時間の期間で閉塞した。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中、５％ＤＭＳＯ、１０％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させた試験化合物のボラス（ｂｏｌｕｓ）静脈注入（ｌｍｌ）を、ＭＣＡ閉塞後直ちにまたはＭＣＡ閉塞後３０分のいずれかで行なった。同じビヒクル中の該試験剤の静脈注入をボラス注入後直ぐに開始した。ＭＣＡ閉塞後２２時間後、ラットを安楽死させ、脳を２ｍｍスライスに切りわけ、テトラゾリウムレッド（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物）で染色した。脳のダメージを受けた領域を、ＮＩＨイメージプログラムを用いたイメージアナライザー用いて評価し、皮質および皮質下の梗塞の体積をひとつづきの領域の組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって推定した。
【０１１０】
結果および考察
図７に示すように、プレグネノロンヘミスクシネートは、２００ｍｇ／ｋｇのＮＭＤＡによって誘導された緊張性痙攣を、投与依存的に抑制した。高い用量で、プレグナノロンは完全にＮＭＤＡによって誘導された該痙攣を、３０分の最大時間限界の試験の終わりまでブロックすることができた。ビヒクル処理した群において、ＮＭＤＡは、７分未満の平均潜伏で全ての動物において緊張性痙攣を誘導した。
【０１１１】
プレグナノロンヘミスクシネートは、２００ｍｇ／ｋｇのＮＭＤＡによって誘導された死亡率を投与依存的に抑制した。高い用量で、プレグナノロンは完全にＮＭＤＡによって誘導された死亡率を、３０分の最大時間限界の試験の終わりまでブロックすることができた。ビヒクル処理した群において、ＮＭＤＡは、約７分平均の有意な潜伏で全ての動物において死亡を誘導した。
【０１１２】
図８に示すように、プレグナノロンサルフェート、１７β−エストラジオール  ３−ヘミスクシネート、１７β−エストラジオールおよび１７−ヘミスクシネートはＮＭＤＡによって誘導された痙攣および死亡率をブロックすることに効果的であった。
【０１１３】
プレグナノロンヘミスクシネートは、ＭＣＡＯ脳虚血モデルにおいて著しい神経保護を産みだした。皮質および皮質下の脳の領域の梗塞の体積は、脳の虚血後直ちに処理することによって著しく減少した。皮質脳領域の梗塞体積は、処理を脳の虚血後３０分遅らせたときでさえ、著しく減少した（図９Ａおよび９Ｂを参照せよ）。病巣の脳の虚血は、中脳動脈の近位の凝固によって雄のラットの左半球に誘導された。ついで、同側の共通の頸動脈を恒久的に閉塞し、対側の共通の頸動脈を２時間閉塞した。虚血開始後５分で、６．９ｍｇ／ｋｇ  ５β３αＨＳの静脈導入する投与でラットを注射し、ついで、６．９ｍｇ／ｋｇ／ｈで５β３αＨＳの静脈注入を行なった。この投与において、わずかな鎮静または鎮静が無いことを観察した。対照ラットを賦形剤で処理した。５β３αＨＳの注入を、さらに２０時間つづけ、ラットを屠殺したとき、それらの脳をスライスし、２，３，５  トリフェニルテトラゾリウムＣｌ活性染色で染色した。
【０１１４】
マウスでホルマリン誘導した足なめ試験で、プレグナノロンヘミスクシネートを試験した。この試験において、マウスは、２段階応答を示した。早い段階はカギ爪のある足へのホルマリンの注入によって誘導された急性症状に関連し、応答のない期間があり、ついで、より慢性症状に関連することが信じられているなめる応答の遅い段階が行なわれた。プレグナノロンは、早い応答には効果がなかったが、遅い段階の応答をブロックすることに効果的であり、プレグナノロンが慢性症状の治療に効果的であろうことを示唆した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１１５】
本発明の化合物は、ＮＭＤＡレセプターにおけるグルタミン酸の効果と拮抗することを示していた。またこれらの化合物は、ＮＭＤＡレセプターに対する効果を含む興奮性のアミノ酸の効果に関連する痙攣、慢性症状および脳卒中の治療に著しい効果を持つことを示していた。このように、これらの化合物は、興奮性のアミノ酸によって誘導される神経毒性の治療に有効である。本発明の化合物の神経保護効果は、緑内障、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＡＩＤＳ痴呆症、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経縮重症状に対する保護を提供するであろう。さらに、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストは生理学的依存性の進行またはモルフィンなどのオピオイドの繰り返し投与の抑制をすることが示されている。このように、本発明の化合物は、オピオイドの鎮痛効果への抵抗性ならびにオピオイド剤誤用の生理学的依存性を抑制することに有効であろう。
【０１１６】
均等物
当業者であれば、単なる日常的な実験手法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、下記クレームに記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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