(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖ヒト血管内皮細胞で発現するエンドグリンおよび増殖マウス内皮細胞で発現するエンドグリンに対して検出可能な結合特異性を有するモノクローナル抗体またはその断片であって、増殖マウス内皮細胞で発現するエンドグリンに対する結合特異性が、増殖ヒト血管内皮細胞で発現するエンドグリンに対する結合特異性よりも低いことを特徴とするモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２】
前記断片が、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ’およびＦｄからなる群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体の断片。
【請求項３】
前記抗体が、ヒトエンドグリンおよびマウスエンドグリンの両者に対する抗エンドグリン結合特異性を有するマウスの可変領域と、ヒトの不変領域とを含むキメラ抗体であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトエンドグリンおよびマウスエンドグリンの両者に対する抗エンドグリン結合特異性を有するマウスの超可変領域と、ヒト免疫グロブリンの不変領域配列および可変領域配列とを含むヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項５】
哺乳動物宿主における血管新生関連疾患の抗血管新生療法のための組成物であって、血管新生阻害剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される物質に結合された請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片から形成された、治療的有効量の免疫複合体を含有することを特徴とする組成物。
【請求項６】
血管新生阻害剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される物質に結合された請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片から形成された免疫複合体の使用であって、哺乳類宿主における腫瘍の抗血管新生療法のための医薬組成物を製造するための使用。
【請求項７】
哺乳動物における血管新生関連疾患の抗血管新生療法のための二部分からなる医薬を製造するための、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片の使用であって、前記医薬が、順次投与するための
（ａ）非複合形態の、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片を含む組成物、および
（ｂ）血管新生阻害剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される物質に結合された請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体またはその断片によって形成された、治療的有効量の免疫複合体を含む組成物
を含んでなることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国公衆衛生総局より付与された補助金CA 19304の下に政府のサポートを得てなされた。政府は本発明の一部権利を有する。
〔発明の分野〕
本発明は、ヒトにおける特定疾患の抗血管新生のための組成物および方法に関する。より詳しくは、本発明は、抗エンドグリン（endogline）モノクローナル抗体の産生、並びに前記抗エンドグリンモノクローナル抗体を含む免疫性複合剤の投与を含むヒトにおける血管新生を伴う癌および他の病理学的状態の治療方法に関する。
〔発明の背景〕
１．エンドグリン（endogline）
エンドグリンは、増殖血管内皮細胞に高レベルで発現するホモ二量体膜糖タンパク質である（Burrowsら，1995,Clin.Cancer Res.1:1623-1634）。よって、エンドグリンは主に、活発な血管新生を受けている内皮細胞に対する増殖関連マーカーである。しかしながら、エンドグリンは正常組織の血管内皮によっても若干発現する（Burrowsら，上掲;Wangら，1993,Int.J.Cancer 54:363-370）。最近、ヒトエンドグリンがトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に特異的に結合することが認められ、エンドグリンの推定アミノ酸配列はＴＧＦ−β受容体の１種であるβ−グリカンと高い相同性を示した。
マウスエンドグリンは、約１８０キロダルトン（ｋＤ）の分子サイズを有する二量体としてキャラクタライゼーションされた。ヒトエンドグリンは１６０ｋＤの小さい方の形態および１７０ｋＤの大きい方の形態の２つの形態で存在し、これら２つの形態の違いはタンパク質の細胞質部分にある。エンドグリンは細胞外領域、疎水性貫膜領域および細胞質テールを有する。ヒトエンドグリンとマウスエンドグリンのヌクレオチド配列の比較によって、約７１〜７２％が同一であることが明らかになった（St.Jacquesら，1994,Endocrinol.134:2645-2657;Geら，1994,Gene 158:2645-2657）。しかしながら、エンドグリンの貫膜領域および細胞質領域をコードするヒトおよびマウスの配列では、９３〜９５％が同一である。従って、細胞外領域をコードするヒトおよびマウスの配列の同一性はかなり低い。
２．エンドグリンに対するモノクローナル抗体
幾つかの抗エンドグリンモノクローナル抗体（“ＭＡｂ”）が、当該技術において報告されている。ＭＡｂ  ＳＮ６は、マウスをヒト白血病細胞の細胞膜を用いて免疫化して作製した抗体である（HarutaおよびSeon,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.83:7898-7902）。この抗体は、ヒトエンドグリンを認識するマウスＭＡｂである。ＭＡｂ  ４４Ｇ４は、マウスをヒト前Ｂ白血病細胞の全細胞懸濁液を用いて免疫化して作製した抗体である（GougosおよびLetarte,1988,J.Immunol.141:1925-1933;1990,J.Biol.Chem.265:8361-8364）。この抗体は、ヒトエンドグリンを認識するマウスＭＡｂである。ＭＡｂ  ＭＪ７／１８は、ラットを炎症状態のマウス皮膚を用いて免疫化して作製した抗体である（GeおよびButcher,1994,上掲）。この抗体は、マウスエンドグリンを認識するＭＡｂである。ＭＡｂ  Ｔｅｃ−１１は、マウスをヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて免疫化して作製した抗体である（Burrowsら，1995,Clin.Cancer Res.1:1623-1634）。この抗体は、反応性がヒトエンドグリンに限定されたマウスＭＡｂである。
抗エンドグリン抗体および当該技術において公知の各種染色法を用いることにより、エンドグリンは、
（ａ）非−Ｔ細胞性（非−Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄組織球性白血病のようなヒト白血病に由来するヒト腫瘍細胞、および血管肉腫、乳癌、盲腸癌、結腸癌、ホジキンリンパ種、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、骨肉腫、卵巣癌、耳下腺腫瘍、咽頭癌、Ｓ字結腸癌を含めたヒト固形腫瘍に由来する腫瘍関連血管系、
（ｂ）胎盤、副腎およびリンパ球様組織に由来するヒト血管系、並びに
（ｃ）腸、胃、心臓および生殖組織に由来するマウスストロマ細胞
中に含まれる内皮細胞において中〜高レベルで発現されることが分かった。
リンパ節、扁桃、脾、胸腺、腎、肺および肝に由来する各種正常成人組織片においては、エンドグリンに対して内皮細胞が弱くしか染色されないことが観察された。しかしながら、エンドグリン上の別々のエピトープに対する異なる抗エンドグリン抗体は腫瘍血管系に対して同じ特異性を示した（Burrowsら，1995,上掲）。
血管内皮細胞でのエンドグリンの発現が増加することは、血管新生を含めた病理学的状態においても報告されている。前記血管新生関連疾患には、多くの種類のヒト固形腫瘍、関節リウマチ、胃潰瘍および慢性炎症性皮膚病巣（例えば、乾癬、皮膚炎；Westphalら，1993,J.Invest.Dermatol.100:27-34）が含まれる。
３．血管新生
血管新生は、新血管形成につながる新しい毛細血管の形成である。血管新生は、血管基底膜および間質性マトリックスの内皮細胞媒介性の退化、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖および内皮細胞による毛細管係蹄（capollary loop）の形成を含めた一連の連続ステップを含む複雑な過程である。固形腫瘍は血管新生依存性である。すなわち、小さな固形腫瘍がかなり大きくなったら、更に増殖するために周囲の正常組織において血管新生応答を誘導することが必要である。腫瘍の新血管形成が生ずると、より迅速な増殖および局所的な侵襲が起こる。更に、血管新生が高まると、転移の危険が高まる。従って、腫瘍血管新生を抑制するための抗血管新生治療により、腫瘍増殖およびその広がりが抑制または鎮静される。
創傷治癒のような一般的な生理学的過程では、該過程が終了すれば血管新生は停止する。対照的に、腫瘍血管新生は自己制限的でない。また、或る病理学的（および非悪性）過程では、血管新生は異常に長く続く。こうした血管新生関連の疾患としては、糖尿病性網膜症、関節リウマチを含めた慢性炎症性疾患、皮膚炎や乾癬が挙げられる。抗血管新生治療は、過度の血管形成を有する血管新生関連の疾患を抑制し得るであろう。
４．抗血管新生治療およびヒト固形腫瘍の血管ターゲッティング療法
固形腫瘍の増殖が臨床的に非常に小さなサイズ（例えば、数ｍｍ3）を越えて進行するには、腫瘍血管新生として公知の過程である新しい血管の連続形成が必要である。腫瘍増殖および転移は血管新生依存性である。腫瘍は、増殖する腫瘍そのものに栄養および酸素を送給するための新しい毛細血管の成長を常に刺激していなければならない。従って、腫瘍血管新生の予防（抗血管新生治療）または腫瘍の既存血管の選択的破壊（血管ターゲッティング療法）は、固形腫瘍を予防または治療するための方法である。
新しい毛細血管の局所ネットワークは原発腫瘍が体の他の部分に転移し得るルートを提供するので、抗血管新生治療は小さな固形腫瘍の形成を予防するためまたは転移を防止するために重要である（例えば、Folkman,1995,Nature Medicine,1:27-31参照）。一方、既存の血管系を攻撃する血管ターゲッティング療法は、血管系がすでに易感染性である大きな腫瘍に対して最も有効であろう（例えば、BicknellおよびHarris,1992,Semin.Cancer Biol.3:399-407参照）。本発明のモノクローナル抗体およびその断片は、抗血管新生治療方法において、既存の腫瘍血管系または新しく形成された腫瘍新血管形成に治療化合物を送給するための手段として使用される。
５．ヒト疾患用マウスモデル
Ａ．無胸腺ヌードまたはＳＣＩＤマウスモデル
本発明を説明するために使用した後述の実施例では、以下の点を考慮することが重要である。
ヒト腫瘍異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスを使用することは、化学療法剤を評価するためのモデルとして実証されている。なぜなら、前記モデルは、化学療法薬剤で治療した患者における該薬剤の臨床的有効性を反映することが判明しており、対応する種類の臨床癌に対する活性に一致するように、腫瘍退行または腫瘍増殖の抑制のような該薬剤の抗腫瘍効果を反映しているからである（例えば、Neuwaltら，1985,Cancer Res.45:2827-2833:Ovejeraら，1978.Annals of Clin.and Lab.Science 8:50参照）。ヒト腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスも、化学療法薬剤を評価するためのモデルとして当業者に容認されている。
モノクローナル抗体は、抗ガン剤を腫瘍標的組織に選択的に送給するために使用される。この点に関して、抗エンドグリンＭＡｂはヒト腫瘍血管系をターゲッティングするために使用することができる。ヒト腫瘍異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスは、抗血管新生治療の過程における腫瘍血管系への抗体のターゲッティングを試験できるモデルである。しかしながら、マウスモデル中のヒト異種移植片のために新血管形成が（マウス）ヒト組織から生ずるという問題がある。よって、反応性がヒトエンドグリンまたはマウスエンドグリンのいずれかに限定されている従来の抗エンドグリンＭＡｂは、抗血管新生治療の臨床的有効性、薬物動態および副作用の可能性を評価する上で必要な研究を実施するためのマウスモデルで使用することはできない。
Ｂ．血管新生関連疾患用マウスモデル
本発明を説明するために使用される後述の実施例では、以下の点を考慮することが重要である。
血管新生のマウスモデルを使用することは、治療薬剤を評価するためのモデルとして容認されており、立証されている。なぜなら、前記モデルは、各疾患の特徴であり、患者における治療薬剤の有効性を予測する臨床パラメーターを反映することが判明しているからである。これらのモデルの非限定的な例には、網膜新血管形成用マウスモデル（Pierceら，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:905-909）、関節リウマチ用マウスモデル（ＭＲＬ−１ｐｒ／１ｐｒマウスモデル、Folliardら，1992,Agents Actions 36:127-135;mevマウス、Kovarikら，1994,J.Autoimmun.7:575-88）、血管肉腫用マウスモデル（Majewskiら，1994,Int.J.Cancer 57:81-85;Andradeら，1992,Int.J.Exp.Pathol.73:503-13;Sunderkotterら，1991,Am.J.Pathol.138:931-939）、皮膚炎用マウスモデル（Maguireら，1982,J.Invest.Dermatol.79:147-152）、および乾癬用マウスモデル（Blandonら，1985,Arch.Dermatol.Res.277:121-125;Naganoら，1990,Arch.Dermatol.Res.282:459-462）が含まれる。よって、反応性がヒトエンドグリンまたはマウスエンドグリンのいずれかに限定されている従来の抗エンドグリンＭＡｂは、ヒトにおける抗血管新生治療の臨床的有効性、薬物動態および副作用を評価する上で必要な研究を実施するための、各血管新生関連疾患用マウスモデルで使用することができない。
従って、ヒト腫瘍血管新生および過度の血管形成を有する他のヒト血管新生関連疾患の抗血管新生治療に使用することができ、且つヒト異種移植片−マウスモデルまたは血管新生関連疾患のマウスモデルにおいて臨床的有効性および薬物動態を評価することができる、抗エンドグリンＭＡｂが依然として求められている。
〔発明の概要〕
従って、本発明の主目的は、ヒト腫瘍血管新生の抗血管新生治療に使用できるる抗エンドグリンＭＡｂを提供することにある。
本発明の別の目的は、過度の血管形成を有するヒト血管新生関連疾患の抗血管新生治療に使用できる抗エンドグリンＭＡｂを提供することにある。
本発明の別の目的は、抗血管新生治療に使用することができ、無胸腺ヌードマウスモデルまたは血管新生関連疾患のマウスモデルで評価することができる抗エンドグリンＭＡｂを提供することにある。
本発明の別の目的は、抗エンドグリンＭＡｂを使用した、ヒト腫瘍血管新生の抗血管新生治療方法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、抗エンドグリンＭＡｂを使用する、過度の血管形成を有するヒト血管新生関連疾患の抗血管新生治療方法を提供することにある。
上記した目的は、予期せぬことにマウスエンドグリンと交差反応する、新規なヒトエンドグリン反応性抗エンドグリンＭＡｂを提供することにより達成される。本発明のＭＡｂは、ヒト腫瘍血管系の抗血管新生治療法を提供するために、抗腫瘍剤と共役させて複合剤とすることができる。本発明のＭＡｂは、過度の血管形成を有するヒト血管新生関連疾患の抗血管新生治療法を提供するために、血管新生阻害剤と共役させて複合剤とすることができる。本発明の上記および他の特徴並びに利点は、図面に関連した好ましい実施態様の説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、本発明の抗エンドグリンＭＡｂおよびリシンＡ（ＲＡ）を含有する免疫性複合剤の増殖マウス内皮細胞（ＳＶＥＣ４−１０）に対する細胞毒性活性を示すグラフである。
図１Ｂは、本発明の抗エンドグリンＭＡｂおよび脱グリコシル化リシンＡ（ｄｇＲＡ）を含有する免疫性複合剤の増殖マウス内皮細胞（ＳＶＥＣ４−１０）に対する細胞毒性活性を示すグラフである。
図２Ａは、乳癌細胞（ＭＣＰ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図２Ｂは、非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０で治療後の、乳癌細胞（ＭＣＰ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図２Ｃは、免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）で治療後の、乳癌細胞（ＭＣＰ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図２Ｄは、非複合抗エンドグリンＭＡｂ（Ｋ４−２Ｃ１０）で予備治療してから免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）を投与後の、乳癌細胞（ＭＣＰ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図３Ａは、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図３Ｂは、非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０で治療後の、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図３Ｃは、免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）で治療後の、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
図３Ｄは、非複合抗エンドグリンＭＡｂ（Ｋ４−２Ｃ１０）で予備治療してから免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）を投与後の、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）からなるヒト異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける進行を示すグラフである。
〔好ましい実施態様の詳細な説明〕
定義
本明細書および請求の範囲において使用される用語「血管新生関連疾患」は、ヒトにおいて血管新生が異常に長く続いている特定の病理学的過程を意味する。前記した血管新生関連疾患には、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍および多くの種類のヒト固形腫瘍が含まれる。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「血管新生阻害剤」は、生体分子を意味し、その非限定的な例にはペプチド、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えベクター、および血管新生を阻害すべく機能する薬物が含まれる。血管新生阻害剤は当業界で公知であり、パクリタクセル、ｏ−（クロロアセチルカルボミル）フマジロール（“ＴＮＰ−４７０”または“ＡＧＭ−１４７０”）、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２，アンギオスタチン、血管新生のヒト軟骨細胞由来阻害剤（“ｈＣＨＩＡＭＰ”）、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子−４，グロ−ベーター（gro-beta）、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質（“ＩＰ１０”）、インターロイキン１２、Ｒｏ  ３１８２２０、トリシクロデカン−９−イルキサントゲン酸塩（“Ｄ６０９”）、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロミド（“ＧＰＡ  １７３４”）、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンの組み合わせ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン（genistein）、サリドマイド、ジアミノアントラキノン、ハービマイシン（harbimycin）、ウルソル酸（ursolic acid）およびオレアノール酸（oleanolic acid）のような天然および合成生体分子が含まれる。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「抗血管新生治療」は、エンドグリンが（不活発な血管系に比して）高レベルで発現している増殖血管系を標的とする治療を意味し、前記治療は血管新生（すなわち、新血管形成へとつながる新しい毛細血管の形成）および／または増殖しており病的状態に関連た既存の血管系（例えば、血管ターゲッティング療法）に向けられる。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「抗体断片」または「その断片」は、抗原結合機能を保持している、完全な抗体分子の一部または断片を意味する。すなわち、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ’およびＦｄ断片を意味する。ＭＡｂから各種断片を作製する方法は当業者に周知である。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「免疫性複合剤」は、本発明の抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片および少なくとも１つの抗腫瘍剤または少なくとも１つの血管新生阻害剤を含む複合剤を意味する。前記抗腫瘍剤は当業界で公知であり、その非限定例にはトキシン、薬物、酵素、サイトカイン、放射性核種、光力学作用物質および血管新生阻害剤が含まれる。トキシンには、リシンＡ鎖、突然変異シュードモナスエンドトキシン、ジフテリアトキソイド、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポニン、ゲロニンおよびヨウシャヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質が含まれる。薬物にはダウノルビシン（daunorubicin）およびメトトレキセートが含まれる。放射性核種には放射性金属が含まれる。サイトカインには腫瘍壊死因子が含まれる。光力学作用物質にはポルフィリンおよびその誘導体が含まれる。抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片と少なくとも１つの抗腫瘍剤との複合剤を形成する方法は、当業者に公知である（すなわち、抗体複合剤は、Ghetieら，1994,Pharmacol.Ther.63:209-34に記載されている）。前記方法の多くは、分子を結合または連結するために使用される市販されている数種のヘテロ二価試薬の１つを用いている。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「哺乳動物宿主」または「宿主」は、マウスまたはヒトを意味する。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「モノクローナル抗体」は、マウスモノクローナル抗体および該抗体から作製され、ヒトエンドグリンとマウスエンドグリン間の交差反応性エピトープに対する抗エンドグリン結合特異性が維持されているように処理された抗体分子、例えば以下の実施例から明らかなようなキメラまたは“ヒト化”抗体を意味する。本発明の例であるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ｙ４−２Ｆ１、Ｋ４−２Ｃ１０、Ｐ３−２Ｇ８およびＤ４−２Ｇ１０は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにそれぞれ、ＨＢ−１２１７１、ＨＢ−１２１７２、ＨＢ−１２１７３およびＨＢ−１２１７４のＡＴＣＣ名で寄託されている。
本明細書および請求の範囲において使用される用語「腫瘍」は、エンドグリンを（同一タイプの正常組織による発現に比して）中〜高レベルで発現する腫瘍、例えば非−Ｔ細胞性（非−Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および骨髄組織球性白血病を含めたヒト白血病、並びにエンドグリンを（同一タイプの正常組織による発現に比して）中〜高レベルで発現する周囲血管系を有するヒト固形腫瘍、例えば血管肉腫、乳癌、盲腸癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、骨肉腫、卵巣癌、耳下腺腫瘍、咽頭癌およびＳ字結腸癌を意味する。
全身治療の欠点は、治療薬が正常組織ではなく、その所期の標的、すなわち罹患組織に供給する選択的に欠けていることである。モノクローナル抗体は、より高い標的特異性で治療薬を送給し、これにより毒性を減ずるために使用されている。マウスＭＡｂまたはその断片は、ヒト疾患を治療するために使用されてきたが、その臨床効果は多くの場合並〜相当程度である（例えば、Ghetieら，1994,上掲参照）。研究によれば、たとえヒト抗マウス抗体応答が生じても、マウスモノクローナル抗体は安全基準で繰り返し投与され得る。また、ヒト抗マウス抗体応答は、マウスＭＡｂの繰り返し注入により重大な臨床問題を呈しなかった（例えば、Frondinら，1992,Cell Biophys.21:153-165参照）。
腫瘍自体に対するターゲッティング療法とは異なり、腫瘍血管系に対するターゲッティング療法は幾つかの利点を有する。第１に、免疫性複合剤を静注すると、腫瘍抗原が飽和されるよりも非常に迅速に腫瘍血管系が飽和され得る。このため、治療法に必要な免疫性複合剤の量は少なくてすみ、非特異的副作用の可能性が減る。第２に、相当数の腫瘍細胞の生死は少数の毛細管係蹄に依存している。よって、毛細管係蹄を最小限に破壊するだけで、腫瘍細胞は有意にかつ格段に死滅する。更に、上記したように、抗エンドグリンＭＡｂ複合剤は、多種多様の腫瘍および過剰の血管形成を有する他の病理学的状態に対して選択的に使用され得る。抗エンドグリンＭＡＢにより抗血管新生治療は腫瘍血管系に標的されるが、当業者は十分理解しているように、送給された抗腫瘍剤が更に該腫瘍剤と接触している腫瘍細胞に対して直接作用し得る。
本発明の１実施態様は、ヒトエンドグリンおよびマウスエンドグリン間の交差反応性エピトープに対する結合特異性、マウスエンドグリンに比して強いヒトエンドグリンとの免疫反応性、および特定腫瘍血管系および血管新生の特徴である増殖血管内皮細胞に限定される選択的免疫反応性により特徴づけられる、新規種類のマウスＭＡｂに関する。よって、反応性がヒトエンドグリンまたはマウスエンドグリンのいずれかに限定される従来の抗エンドグリンＭＡｂとは異なり、本発明の抗エンドグリンＭＡｂは、ヒトにおける抗血管新生治療の臨床的有効性、薬物動態および潜在的副作用を評価するために必要な研究を実施するために、無胸腺ヌードマウスモデルまたは血管新生関連疾患の他のマウスモデルで使用することができる。今までに、４個の抗エンドグリンＭＡｂ、すなわちＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０、Ｄ４−２Ｇ１０、Ｙ４−２Ｆ１およびＰ３−２Ｇ８が開発された。本発明による新規抗エンドグリンＭＡｂの特定の例は、ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０である。
本発明の別の実施態様は、本発明の抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片を使用する抗血管新生治療方法に関する。この実施態様では、抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片を少なくとも１つの抗腫瘍剤に結合させることにより免疫性複合剤を形成し、得られた免疫性複合剤は特定腫瘍血管系および血管新生の特徴である増殖血管内皮細胞に限定される選択的免疫反応性を維持している。免疫性複合剤を、抗血管新生治療を試験するために適切なマウスモードに投与するが、その投与は標的血管系の位置に依存する。臨床的有効性および薬物動態のようなパラメーターを適切なマウスモードにおいて評価したら、抗血管新生治療をヒト治療にスケールアップすることができる。ＭＡｂを含有する治療薬剤をマウスモデルからヒトにスケールアップするための生理学的基礎は当業者に公知である（例えば、参考文献として本明細書に援用されるBaxterら，1995,Cancer Res.55:4611-4622参照）。
実施例１
交差反応性抗エンドグリンＭＡｂの作製
本発明当時、従来報告された抗エンドグリンＭＡｂは、細胞膜または白血病細胞、炎症状態の皮膚およびヒトの臍静脈内皮細胞の全細胞上清を含むエンドグリン含有粗組成物を用いてマウスを免疫化することにより作製した。こうして作製された抗エンドグリンＭＡｂは、ヒトエンドグリンまたはマウスエンドグリンのいずれかに対して特異的であると報告された。対照的に、本発明の交差反応性抗エンドグリンＭＡｂは、精製ヒトエンドグリン（“ｈＥＤＧ”）を用いてマウスを免疫化することにより作製した。
ｈＥＤＧを、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞から精製した。細胞膜糖タンパク質を、文献記載（参考文献として本明細書に援用される、HarutaおよびSeon,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7898-7902）の界面活性剤抽出およびレクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した。単離した糖タンパク質を、予め０．５％タウロコレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  ＮａＮ3および０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した、抗エンドグリンＭＡｂ  ＳＮ６（HarutaおよびSeon,1986,上掲）を含有するイムノアフィニティーカラムにかけた。結合した物質を、０．５％タウロコレート、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  ＮａＮ3を含有する５０ｍＭジエチルアミン−ＨＣｌ（ｐＨ１１．３）（“アルカリ緩衝液”）を用いて溶離させた。溶離した物質を再びイムノアフィニティーカラムにかけ、結合した物質を更に０．０１％シトクロム−ｃ（１２．４ｋＤ輸送タンパク質）を含有するアルカリ緩衝液を用いて溶離させ、中和した。溶離した物質を濃縮した。この精製方法は、４〜６℃で行った。ｈＥＤＧの精製は、ＭＡｂ  ＳＮ６を用いて固相ラジオイムノアッセイによりモニターし、銀染色法を用いてゲル電気泳動により確認した。得られたｈＥＤＧ組成物は、非還元状態で１７０ｋＤ、還元状態で９２ｋＤの単一主要成分を含んでいた。
第１の免疫化プロトコルでは、２匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを単離したｈＥＤＧを用いて免疫化した。簡単に説明すると、０．５％タウロコレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１４μｇ  シトクロム−ｃを含有する１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ中にｈＥＤＧ組成物１０μｇを含有する抗原溶液を等容量のアジュバントと混合した後、各マウスの数ヶ所の部位に皮下注射した。更に、サリン１００μｌ中の１×１０9個の百日咳菌を別の部位に注射した。アジュバント中の抗原溶液を用いて２回投与して追加免疫化した。ｈＥＤＧ組成物８μｇを含有する抗原溶液４０μｌとサリン２００μｌの混合物を腹腔内投与して最終免疫化した。最終免疫化から４日後に、脾臓を取り出し、Ｐ３／ＮＳ１−１／Ａｇ４−１（ＮＳ−１）マウスミエローマ細胞と融合した。細胞融合、ハイブリドーマスクリーニングおよび免疫グロブリンのクラス決定は、文献記載（HarutaおよびSeon,1986,上掲）の通り実施した。第２の免疫化プロトコルでは、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを第２の実験において上記した単離ｈＥＤＧを用いて免疫化した。ただし、百日咳菌は投与しなかった。上記した免疫化方法により作製した１１個のハイブリドーマは、それぞれ異なる抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂを産生した。これらのＭＡｂを更にキャラクタライゼーションした。
実施例２
抗エンドグリンＭＡｂのキャラクタライゼーション
本実施例では、実施例１の方法により作製した１１個の抗ヒトエンドグリン抗体のうちの４個の抗体の結合特異性を説明する。４個のＭＡｂ、すなわちＫ４−２Ｃ１０、Ｄ４−２Ｇ１０、Ｙ４−２Ｆ１およびＰ３−２Ｇ８は、ヒト細胞で発現させたエンドグリンと反応し、マウス細胞で発現させたエンドグリンと交差反応することが判明した。この交差反応性は、（ａ）今までに報告されていなかったことと、（ｂ）エンドグリンの（抗体に接する）細胞外領域をコードするマウスおよびヒトの配列の同一性は、貫膜領域および細胞質領域をコードする配列に比して著しく劣ることから、予期せぬ結果である。ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０、Ｙ４−２Ｆ１およびＰ３−２Ｇ８は実施例１に記載した第１の免疫化プロトコルを用いて作製し、Ｄ４−２Ｇ１０は第２の免疫化プロトコルを用いて作製した。
上記した４個のＭＡｂの各々の免疫反応性の特異性を、該ＭＡｂを、細胞ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および文献記載（HarutaおよびSeon,1986,上掲）の方法を用いるｈＥＤＧの免疫沈降法を用いて各種造血細胞系に対して試験して更にキャラクタライゼーションした。簡単に説明すると、各ハイブリドーマおよび２×１０5個の造血細胞の培養液の１：９希釈物２０μｌをＲＩＡにより試験した。アッセイには、マウスプラスマ細胞ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをコントロールとして含めた。結果を表１に示す。（＋）は免疫反応性が検出されたこと、（−）は免疫反応性が検出されなかったことを表す。
0004318752.tif 000002
本発明の抗エンドグリンＭＡｂについての表１の結果、およびコントロールの抗エンドグリンＭＡｂ  ＳＮ６についての以前の測定結果に示すように、試験した未熟Ｂ−系統白血病細胞系（ＫＭ−３、ＲＥＨ、ＮＡＬＭ−１、ＮＡＬＭ−６およびＮＡＬＭ−１６）および試験した骨髄組織球性細胞系（ＭＬ−２、ＨＬ−６０およびＵ９３７）に対する免疫反応性が立証された。しかしながら、成熟Ｂ−系統白血病−リンパ腫細胞系（ＢＡＬＭ−１、ＢＡＬＭ−２、ＢＡＬＭ−３、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｕ６９８ＭおよびＳＵ−ＤＨＬ−４）およびＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系（ＣＣＲＦ−ＳＢ、ＲＰＭＩ  １７８８およびＲＰＭＩ  ８０５７）とは反応しなかった。免疫沈降法アッセイから、４個の本発明の抗エンドグリンＭＡｂはすべて、コントロールの抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂ  ＳＮ６と同様に、非還元状態では１７０ｋＤ成分を沈降させ、また還元状態では９２ｋＤ成分を沈降させることが判明した。
実施例１のプロトコルを用いて作製した１１個の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂおよび抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂ  ＳＮ６の、細胞表面でエンドグリンを発現する増殖ＳＶＥＣ４−１０マウス内皮細胞に対する免疫反応性をＲＩＡを用いて試験した。Ｋ４−２Ｃ１０、Ｄ４−２Ｇ１０、Ｙ４−２Ｆ１およびＰ３−２Ｇ８の４個のＭＡｂのみが、マウス内皮細胞で発現させたエンドグリンと結合特異性を有することが発明した（ＭＡｂ  ＳＮ６、すなわちコントロール抗体よりも結合は標準偏差で少なくとも１高い）。上記した４個のＭＡｂのマウスＳＶＥＣ４−１０細胞に対する交差反応性とＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０およびＤ４−２Ｇ１０の増殖ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する免疫反応性を、ＲＩＡで、表２に示すように各種インキュベーション時間（２時間、４時間、８時間、２４時間および３２時間）で比較した。コントロールは、各種特異性のイソタイプ適合ＩｇＧである。
0004318752.tif 000003
各試験は３回実施し、示した値（カウント／分）は３回の平均±標準偏差である。
４個のＭＡｂの各々の免疫反応性の特異性を、該ＭＡｂを数種のヒト悪性組織を組織化学染色法で用いて更にキャラクタライゼーションした。組織には胸、結腸、腎臓、肺およびリンパ節の悪性組織を含めた。組織を凍結させた後、風乾し、アセトンで固定し、当業界の標準的方法に従って染色した。悪性組織を４個のＭＡｂの各々で免疫組織化学的に染色すると、これらＭＡｂは、試験した悪性組織のすべてに関連した血管内皮と強く反応することが判明したが、コントロールのＩｇＧでは各組織における染色が認められなかった。
要するに、本発明の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂは、ＨＵＶＥＣおよび悪性腫瘍血管系で立証されたように、増殖ヒト血管内皮細胞により発現するエンドグリンに対して強い免疫反応性を示した。免疫反応性は、悪性腫瘍組織の血管系に対してであって、腫瘍細胞それ自体に対するものではないことに特に留意されたい。本発明の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂは増殖マウス内皮細胞で発現したエンドグリンとも有意に反応したが、その程度はＨＵＶＥＣで発現したエンドグリンに対する免疫反応性に比して低かった。エンドグリンは主に活発な血管新生を受けている内皮細胞に対する増殖関連マーカーであるので、本発明の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂは、ヒト疾患のヒトおよびマウスの両方において腫瘍血管系または他の血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対して抗血管新生治療を選択的に標的するために使用され得る。
抗血管新生治療のための潜在的に新規な薬剤は、該薬剤をヒト患者を含めた臨床試験に使用する前に動物モデルにおいてその安全性および有効性を評価しなければならない。この点に関し、本発明の抗ヒトエンドグリンＭＡｂの、確認されたマウス内皮細胞との交差反応性は、これらＭＡｂおよび該ＭＡｂを用いて調製された免疫性複合剤の安全性および有効性を評価するために非常に重要である。
実施例３
本実施例では、腫瘍血管系および他の血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対する治療（“抗血管新生治療”と総称する）を目的とする、本発明方法の第１実施態様を説明する。本発明の抗エンドグリンＭＡｂは主に、本発明の抗血管新生治療法に使用される。この実施態様では、本発明の抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片を用いて免疫性複合剤が調製される。免疫性複合剤を調製する際に、抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片を少なくとも１つの抗腫瘍剤、例えば血管新生阻害剤と結合させる。その後、免疫性複合剤を適切なマウスモデルで使用して、抗血管新生治療を試験してから、ヒトにおける抗血管新生治療にスケールアップする。
免疫性複合剤は静注（ｉ．ｖ．）以外のルートで投与され得るが、好ましい実施態様は、免疫性複合剤のｉ．ｖ．投与である。これは、血管新生を含む増殖血管系が治療の標的であり、従って免疫性複合剤をｉ．ｖ．投与すると、他の投与ルートを使用した場合に比して非常に素早く標的血管系が飽和されるからである。更するに、静注ルートによれば、特定組織を更にターゲッティングすることができる。この実施態様の変形例では、カテーテルを使用して標的血管新生の場所に免疫性複合剤を誘導することができる。例えば、腫瘍血管新生が抗血管新生治療の標的である場合、腫瘍が肝臓中に存在する場合には、免疫性複合剤をカテーテルを用いて肝臓の門脈に送給するることができる。この変形例では、免疫性複合剤が全身に余り分布されないので、抗血管新生治療による副作用を更に抑えることができる。
１．免疫性複合剤の調製
この第１実施態様を例示するために、免疫性複合剤を、本発明の４個の抗エンドグリンＭＡｂの各々を用いて調製した。免疫性複合剤は、ＭＡｂのＩｇＧ分子にインビボ安定ジスルフィドリンカーを誘導するヘテロ二価試薬（ＳＭＰＴ）を用いて、リシンＡ鎖（“ＲＡ”）または脱グリコシル化リシンＡ鎖（“ｄｇＲＡ”）に結合させた（例えば、Thropeら，1987,Cancer Res.47:5924-5931参照）、ＭＡｂ、即ち、Ｋ４−２Ｃ１０、Ｄ４−２Ｇ１０、Ｙ４−２Ｆ１およびＰ３−２Ｇ８の１個を含む。次いで、ＲＡまたはｄｇＲＡを混合し、修飾ＭＡｂとインキュベートした。得られたＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤またはＭＡｂ−ＲＡ複合剤を、それぞれ非結合ｄｇＲＡまたはＲＡから分離し、更に精製した。コントロールの免疫性複合剤を、ＩｇＧ成分をイソタイプ適合コントロールＩｇＧ（ＭＯＰＣ  １９５変異体）とした以外は同様にして調製した。
２．免疫性複合剤のインビトロ細胞毒性活性
各種ＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤、ＭＡｂ−ＲＡ複合剤およびコントロール複合剤のインビトロ細胞毒性活性をＭａｙら（1990,J.Immunol.144:3637-3642）の改変方法により評価した。簡単に説明すると、増殖ＳＶＥＣ４−１０マウス内皮細胞またはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、平底の９６ウェル微量滴定プレートのウェルに２．５×１０4細胞／ウェルの割合で導入した。各種量のＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤、ＭＡｂ−ＲＡ複合剤、コントロール複合剤または培地（追加のコントロール）をウェルに添加した。次いで、プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で４８時間インキュベートした。ウェル中に含まれる細胞に１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジンを１８時間パルスし、細胞を半自動式細胞収集装置を用いてガラス繊維フィルター上に集めた。放射能をシンチレーションカウンターを用いて測定し、結果を培地のみで処理した細胞が取込んだ［3Ｈ］チミジンのパーセンテージとして表した。図１Ａは、ＭＡｂ−ＲＡ複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ＲＡ：●；Ｙ４−２Ｆ１−ＲＡ：▲；Ｐ３−２Ｇ８−ＲＡ：■）の増殖マウス内皮細胞に対する細胞毒性は、コントロール−ＲＡ複合剤（Ｘ）の細胞毒性に比して有意に高いことを示した。同様に、図１Ｂは、ＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ：●；Ｄ４−２Ｇ１０−ｄｇＲＡ：○）の増殖マウス内皮細胞に対する細胞毒性は、コントロール−ｄｇＲＡ複合剤の細胞毒性に比して有意に高いことを示した。濃度が２５ｎＭより高いとき、コントロール複合剤は弱くかつ非特異的細胞毒性効果しか示さなかった。上記した濃度での非特異性細胞毒性効果は、以前にも報告されている（例えば、Seon,1984,Cancer Res.44:259-264参照）。しかしながら、コントロール複合剤の非特異性細胞毒性効果はインビボでは有意でないことが判明した。ＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤およびコントロール複合剤のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞に対する有意な細胞毒性は認められなかった。
３．免疫性複合剤を用いる抗血管新生治療
ＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤であるＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲａを使用して本発明方法による抗新生血管治療を例示する。インビボでの腫瘍治療においてｉ．ｖ．投与したときに、ｄｇＲＡ含有複合剤はＲＡ含有複合剤よりもより有効であると思われるので（例えば、Fultonら，1988,Cancer Res.48:2626-2631参照）、ＭＡｂ−ｄｇＲＡ複合剤を例示の目的で選択した。
Ａ．  免疫性複合剤をヒト疾患用マウスモデルに投与する前に、最大耐量を調べなければならない。このために、Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤のＬＤ50値をFultonら（1988,上掲）の方法の改変法を用いて測定した。簡単に説明すると、１群４匹のＢＡＬＢ−ｃマウス（１７週令）にＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤を０．０２５、０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｇの量腹腔内投与した。注射前にマウスの体重を測定し、その後毎日罹患率および死亡率を２週間に亘り観察した。死亡率対注射量をプロットして、５０％が死亡する用量を測定することによりＬＤ50値を求めた。マウスにおけるＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤のＬＤ50値は１６．４μｇ／ｇ−体重であった。
Ｂ．  ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を含むヒト腫瘍異種移植片を有するＳＣＩＤマウスが、Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤を投与することからなる抗血管新生治療を評価するためのモデルであった。このモデルでは、ヒト固形腫瘍としてヒト乳癌を使用した。このモデルを作製するために、ＭＣＦ−７細胞をＳＣＩＤマウスに移植した。事前の用量依存滴定実験で、８×１０6細胞／マウスの用量を皮下接種したＳＣＩＤマウスすべてで皮下腫瘍を生じた。従って、８×１０6細胞を本発明の抗血管新生治療で治療するマウスにおいて皮下腫瘍を形成するために使用される用量とした。腫瘍の増殖を毎日モニターした。
Ｃ．  第１および第２の実施態様において、Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤の投与を含む抗血管新生治療をＳＣＩＤマウス−ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおいて試験した。２組の治療プロトコルを実施した。第１の治療プロトコルにおいて、８×１０6ＭＣＦ−７細胞／マウスを皮下接種した８匹のＳＣＩＤマウスからなる第１群に対しては治療を施さなかった（コントロール）。８×１０6ＭＣＦ−７細胞／マウスを皮下接種した８匹のＳＣＩＤマウスからなる第２群に対しては、１７μｇ／０．２ｍｌの非複合（遊離）ＭＡＢ  Ｋ４−２Ｃ１０をｉ．ｖ．投与して治療を施した。８×１０6ＭＣＦ−７細胞／マウスを皮下接種した８匹のＳＣＩＤマウスからなる第３群に対しては、２０μｇ／０．２ｍｌのＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤をｉ．ｖ．投与して治療を施した。８×１０6ＭＣＦ−７細胞／マウスを皮下接種した８匹のＳＣＩＤマウスからなる第４群に対しては、腫瘍接種してから３、５および７日後に７５μｇの非複合（遊離）ＭＡＢ  Ｋ４−２Ｃ１０を投与してから２０μｇ／０．２ｍｌのＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤をｉ．ｖ．投与して治療を施した。第４群のマウスを予備治療するために非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０を、腫瘍接種してから２時間後に投与した。マウスの尾静脈に注射する前に、非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０の滅菌溶液およびＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤の滅菌溶液をマウス血清アルブミンを含有する滅菌ＰＢＳで希釈した（最終濃度０．０５％）。この治療プロトコルの免疫性複合剤の総用量（３×２０μｇ）はＬＤ50の２２％に相当した。
治療に際して、マウスの腫瘍サイズおよび致死率は毎日、体重は１週間に２回測定した。腫瘍容量は、以下の式に従って換算した。
Ｖ＝長さ×（幅）2×π／σ
４群すべてのマウスにおいて、腫瘍接種から１〜２週間後に触知可能な腫瘍が現れ始めた。しかしながら、免疫性複合剤治療を受けた群と免疫性複合剤治療を受けていない群との間で腫瘍増殖に著しい違いがあった。図２Ａに示すように、未処理のマウスすべては、マウスを追跡している間腫瘍は増殖し続けた。図２Ｂに示すように、非複合ＭＡＢ  Ｋ４−２Ｃ１０のみでは腫瘍増殖の抑制には余り有効でなかった。一方、図２Ｃおよび２Ｄに示すように、免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）で治療したマウスの群では腫瘍が有意に退行した。免疫性複合剤のみで治療した８匹のマウス（第３群）すべてで腫瘍は完全に退行し、マウスを追跡している間（１２５日間）腫瘍は退行し続けた。上記した結果に基づいて、抗血管新生治療を効果的に実施するための第１実施態様は、免疫性複合剤のみを投与することを含む。非複合ＭＡｂで予め処理してから免疫性複合剤で治療した８匹のマウス（第４群）のうち、７匹において腫瘍は完全に退行し、マウスを追跡している間（腫瘍接種してから１２５日間）腫瘍は退行し続けた。上記した結果に基づいて、抗血管新生治療を効果的に実施するための第２実施態様は、非複合ＭＡｂを投与してから免疫性複合剤を投与することを含む。スチューデントｔ−検定およびフィッシャー精密検定によりデーターを統計分析した。各テストにおいて、免疫性複合剤治療群（第３群および第４群）とコントロール群（第１群）との差は統計上有意であった（ｐ＜０．００１）。
これらの結果は、本発明の抗エンドグリンＭＡｂを含み抗腫瘍剤に結合させた免疫性複合剤を用いる抗血管新生治療は、ヒト疾患用マウスモデルにおいて発揮される治癒的抗腫瘍効果の点で非常に有効であることを示す。本発明の第１または第２実施態様による抗血管新生治療は、治療したＳＣＩＤマウスにおいてヒト固形腫瘍の完全退行を誘導する点で有効であった。
第２の治療プロトコルには、１群あたり６〜８匹の８×１０6ＭＣＦ−７乳癌細胞／マウスを皮下接種したＳＣＩＤマウスからなる４群を含めた。第１プロトコルの方法を使用して、第１群は未処理とした（コントロール）。第２群は、腫瘍接種してから３、４および５日後に非複合（遊離）ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０をｉ．ｖ．投与して治療した。第３群は、腫瘍接種してから３、４および５日後にＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤をｉ．ｖ．投与して治療した。第４群は、（腫瘍接種してから１日目に）５０μｇの非複合（遊離）ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０をｉ．ｖ．投与後腫瘍接種してから３、４および５日後にＫ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤をｉ．ｖ．投与して治療した。第１の治療プロトコルの方法およびパラメーターを用いてマウスを評価した。
図３Ａに示すように、１匹を除いて第１群（未処理）の８匹のマウスすべてにおいて、マウスを追跡している間、腫瘍は増殖し続けた。図３Ｂに示すように、非複合ＭＡＢ  Ｋ４−２Ｃ１０のみでは腫瘍増殖の抑制には余り有効でなかった。一方、図３Ｃおよび３Ｄに示すように、免疫性複合剤（Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤）で治療したマウスの群では腫瘍が有意に退行した。免疫性複合剤のみで治療した８匹のマウス（第３群）のうち７匹（８７．５％）において、腫瘍は完全に退行し、マウスを追跡している間（腫瘍接種してから１０５日間）、腫瘍は退行し続けた。図３Ｄに示すように、非複合抗エンドグリンＭＡｂで予備治療してから免疫性複合剤で治療した６匹のマウス（第４群）のうち、５匹において腫瘍は完全に退行し、マウスを追跡している間（腫瘍接種してから１０５日間）、腫瘍は退行し続けた。第２の治療プロトコルの結果は、第１の治療プロトコルの結果とかなり一致している。すなわち、抗エンドグリンＭＡｂ複合剤を用いる抗血管新生治療は、ヒト固形腫瘍の継続的な完全退行を誘導する点で有効である。
免疫性複合剤のインビボ抗腫瘍効果がかなり高いことは、以下の理由で予期せぬ結果である。第１に、ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０はマウス内皮細胞と非常に弱くしか反応せず、Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ複合剤は非常に弱くしかマウス内皮細胞に対して細胞毒性を示さなかった（増殖ヒト内皮細胞に比して）。更に、ｉ．ｖ．投与した免疫性複合剤の量は比較的少量（ＬＤ50用量の２２％に相当する）であった。一般的な腫瘍細胞ターゲッティング療法では、少量の薬剤をｉ．ｖ．投与したときに、たとえ非常に強い抗腫瘍イムノトキシンであっても強いインビボ抗腫瘍効果がまれに生じた。本発明では、免疫性複合剤は腫瘍それ自体を標的するのではなく、血管系を選択的に標的する。しかしながら、腫瘍血管新生に対して標的剤を使用する今までに報告されている試み（Folkman,1955,上掲;Siposら，1994,Ann.NY Acad.Sci.732:263-272;Hawkins,1995,Curr.Opin.Oncol.7:90-93に検討されている）とは異なり、本発明の免疫性複合剤においては、抗ヒトエンドグリンＭＡｂを使用すると治癒的抗腫瘍効果を発揮し得ると考えられる。
実施例４
実施例３では、腫瘍血管新生または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対して治療薬を標的するための、本発明方法の第１および第２実施態様を説明した。第１実施態様の方法を使用して抗腫瘍剤に結合させた本発明の抗エンドグリンＭＡｂを含む免疫性複合剤は、腫瘍新血管形成の増殖内皮細胞と選択的に反応し、既存の腫瘍付随血管を破壊することにより腫瘍血管新生が発展するのを防止して、腫瘍血管形成を破壊することが立証された（例えば、図２Ｃおよび３Ｃ参照）。実施例３では、抗血管新生治療のための本発明による方法の第２実施態様も説明している。
第２実施態様によれば、本発明の抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片を使用し、免疫性複合剤を形成するときにそれを少なくとも１つの抗腫瘍剤または血管新生阻害剤に結合させて調製した免疫性複合剤を使用している。しかしながら、この抗血管新生治療の第２実施態様では、腫瘍を持っている宿主または血管新生関連疾患により過度の血管形成を有する宿主を予め本発明の非複合抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）2）で治療する。免疫性複合剤を投与する前に予備治療する理由は、エンドグリン上の免疫性複合剤と同じエピトープを認識する非複合抗エンドグリンＭＡｂで予備治療すると、免疫性複合剤の標的血管形成に対する選択性が更に高まるからである。例えば、正常で不活発血管系内の内皮細胞の交替速度は非常に遅い。対照的に、腫瘍新血管形成または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成で見られる内皮細胞は、少しの血管新生の間に急速に増殖する（例えば、Folkmanら，1992,J.Biol.Chem.267:10931-10934参照）。従って。宿主を非複合抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片で予備治療すると、正常な（病的状態にない）組織内の不活発内皮細胞上の弱い結合部位をマスク（プレコート）し得、血管新生で見られる増殖内皮細胞上の新たに生じた多くの結合部位はその後投与される免疫性複合剤による結合のために利用される。免疫性複合剤の投与前にプレコートされている正常組織は、投与された免疫性複合剤が正常組織に弱く反応するために起こるであろう免疫性複合剤の望ましくない副作用を受け難くなり得る。更に、全身投与された免疫性複合剤が標的血管系によって有効に送給されるので、プレコートステップにより、免疫性複合剤の抗血管新生効果が高められ得る。図２Ｄおよび３Ｄに示すように、宿主に対してプレコート量の非複合抗エンドグリンＭＡｂを投与後、免疫性複合剤を全身投与することにより、血管系（腫瘍起因性の新血管形成または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成）を効果的にターゲッティングすることができる。こうしてに、プレコートステップとして患者に非複合抗エンドグリンＭＡｂをｉ．ｖ．投与後、抗エンドグリン免疫性複合剤をｉ．ｖ．投与することは、新しく且つ有効な抗血管新生治療方法である。
実施例５
実施例３および実施例４では、腫瘍血管形成または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対して治療薬をターゲッティングする本発明による方法の２つの実施態様を、ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植片モデルを用いて詳細に説明した。ヒト血管新生関連疾患の別のマウスモデルを使用して、本発明の抗エンドグリンＭＡｂおよびその使用方法を用いた抗血管新生治療を立証する。免疫性複合剤Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡの抗血管新生活性を、インビボ血管新生のアッセイ法である背部気嚢法（例えば、Asanoら，1995,Cancer Res.55:5296-5301参照）により試験した。簡単に説明すると、１×１０7個のＨＴ１０８０ヒト腫瘍細胞をＰＢＳに懸濁させてからプラスチックチャンバー（直径１４ｍｍ）に入れ、チャンバーの各端部をセルロース膜フィルター（孔径０．４５μｍ）でシールした。こうして作製したチャンバーを数匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの各々の背部気嚢に移植した。第１群のインプラントを有するマウスは、血管新生のポジティブコントロールとして治療しなかった。第２群のインプラントを有するマウスは、チャンバーを移植してから２時間、２４時間および４８時間後に、非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０（１７μｇ／０．２ｍｌ）をｉ．ｖ．投与して治療した。第３群のインプラントを有するマウスは、チャンバーを移植してから２時間、２４時間および４８時間後に、複合剤Ｋ４−２Ｃ１０−ｄｇＲＡ（２０μｇ／０．２ｍｌ）をｉ．ｖ．投与して治療した。第４群のインプラントを有するマウスには、血管新生のネガティブコントロールとしてＰＢＳ（腫瘍細胞を含まない）のみを含有するチャンバーを移植し、治療しなかった。４日目に、各群のマウスを、皮下領域の新血管（血管新生）について調べた。マウスを免疫性複合剤で治療した場合には血管新生が有意に抑制されたのに対して、非複合ＭＡｂ  Ｋ４−２Ｃ１０で治療したマウスでは、血管新生は余り抑制されなかった。これらの結果からも、抗エンドグリン免疫性複合剤の投与が新規且つ有効な抗血管新生治療法であることが裏付けられる。
実施例６
実施例３および４では、腫瘍血管新生または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対して治療薬をターゲッティングするための、本発明による方法の２つの実施態様を、ヒト疾患のマウスモデルを用いて説明した。いずれの実施態様の方法を用いても、抗腫瘍剤に結合して本発明の抗エンドグリンＭＡｂを含有する免疫性複合剤は、標的とされる血管系の増殖内皮細胞と選択的に反応し、破壊して、関連の血管新生が発展するのを防止することを立証した。更に、非複合抗エンドグリンＭＡｂでプレコートした後、免疫性複合剤を投与することも有効な抗血管新生治療法である。
当業者は十分理解しているように、第１または第２実施態様の抗血管新生治療をヒトに対して臨床応用するためには、最適化しなければならない。ＭＡｂを含有する治療薬をマウスモデルからヒトにスケールアップするための生理学的基礎は、当業者には周知である（例えば、Baxterら，1995,上掲参照）。例えば、非複合抗エンドグリンＭＡｂで予備治療してから免疫性複合剤を投与するための最適タイミングおよび非複合抗エンドグリンＭＡｂ／免疫性複合剤の最適モル比は、腫瘍新血管形成または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成のための治療を受ける個々の患者に対して決定されなければならない。最適タイミングは、各種要因、例えば投与される本発明の抗エンドグリンＭＡｂまたはその断片の薬物動態により左右される。また、ヒト内皮細胞表面上のヒトエンドグリンに結合するＭＡｂまたはその断片の細胞内取り込み／抜け落ち率も要因である。患者を自己または同種抗エンドグリンＭＡｂで治療すると、本発明方法の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂ免疫性複合剤の臨床応用の安全性および有効性を高めることができる。
本発明の抗血管新生治療の別の実施態様では、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、皮膚炎または乾癬のような血管新生関連疾患を有するヒト患者を本発明の免疫性複合剤を複数回投与する治療プロトコルにより治療する。免疫性複合剤は、少なくとも１つの血管新生阻害剤または少なくとも１つの抗腫瘍剤に結合して本発明の抗ヒトエンドグリンＭＡｂまたはその断片を含む。免疫性複合剤が更に、医薬的に許容され得る担体を含んでいてもよい。別の実施態様では、ヒト患者を非複合抗エンドグリンＭＡｂ（またはその断片）で予備治療後本発明の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂ（その断片）免疫性複合剤を投与する。非複合抗エンドグリンＭＡｂ（その断片）が更に、医薬的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
本発明による抗血管新生の別の実施態様では、腫瘍、例えば非−Ｔ細胞性（非−Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄組織球性白血病を含めたヒト白血病、または血管肉腫、乳癌、盲腸癌、結腸癌、ホジキンリンパ種、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、骨肉腫、卵巣癌、耳下腺腫瘍、咽頭癌およびＳ字結腸癌を含む固形腫瘍をもったヒト患者を、本発明の免疫性複合剤を複数回投与する治療プロトコルで治療する。免疫性複合剤は、少なくと１つの血管新生阻害剤または少なくとも１つの抗腫瘍剤に結合した、本発明の抗ヒトエンドグリンＭＡｂまたはその断片を含む。免疫性複合剤が更に、医薬的に許容され得る担体を含んでいてもよい。別の実施態様では、ヒト患者を非複合抗エンドグリンＭＡｂ（またはその断片）で予備治療した後に、本発明の抗ｈＥＤＧ  ＭＡｂ（その断片）複合剤を投与する。非複合抗エンドグリンＭＡｂ（その断片）は更に、医薬的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
当業者は十分理解しているように、使用する血管新生阻害剤または抗腫瘍剤に依存して、治療プロトコルが別のステップを必要とする場合もある。例えば、投与される免疫性複合剤が光感作物質（多くはポルフィリン）と複合剤形成して抗ｈＥＤＧ（その断片）を含む場合には、標的領域に光を照射する別のステップを必要とする。
実施例７
実施例３〜５では、抗エンドグリン免疫性複合剤の投与を、抗エンドグリンＭＡｂを腫瘍血管系または血管新生関連疾患に存在する過度の血管形成に対して治療薬をターゲッティングするために使用するための、新規且つ有効な抗血管新生治療法として立証した。本発明方法による抗血管新生治療の有効性を説明するために使用したモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体であるが、当業者には十分理解されるように、前記マウスＭＡｂは、当業界で一般的な方法（例えば、参考文献として本明細書に援用されるAdair,1992,Immunological Reviews 130:6-37に記載されている）を用いて修飾（“処理”）され得る。
例えば、マウスモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体の一部を均等のヒト配列で置換することによりヒト化することができる。１つの実施態様では、キメラ抗体が構築される。キメラ抗体の構築は現在直接的な手段であり（Adair,1992,上掲，p.13）、キメラ抗体は、ヒト不変領域にマウス可変領域を結合することにより作製される。更には、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体の高頻度可変領域をヒト不変領域およびヒト可変領域の一部に当業界で公知の幾つかの方法の１つを用いて結合することにより作製される。治療に使用され得るキメラ抗体（マウス−ヒト）の構築方法は公知である（例えば、参考文献として本明細書に援用されるMorrisonら，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-6855;Larrickら，1991,Hum.Antibod.Hybridomas 2:172-189参照）。従って、本発明の１つの実施態様では、当業界で公知の方法を使用して、本発明の抗エンドグリンＭＡｂのマウス可変領域をヒト不変領域に結合して、抗エンドグリンＭＡｂと同一の特異性を有するキメラ抗エンドグリン抗体を作製している。一般に、キメラ抗体を作製するようにしてマウスＭＡｂをヒト化すると、ヒト抗マウス抗体応答の発生が限定される。また、ヒト化抗体は通常、前記抗体を含有する免疫性複合剤の半減期を、マウス抗体を含有する免疫性複合剤の半減期に比して長くすることにより薬物動態を変化させている。
キメラＭＡｂは、抗体可変領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング、すでにヒト不変領域をコードするＤＮＡを含有する適当な発現ベクターの使用、組換えベクターを作製するための前記ベクターへのマウスＭＡｂ可変領域のＤＮＡの挿入、および生じたキメラ抗体の組換えベクターを含む発現系による発現を含む標準的な方法の組み合わせによっても構築することができる（例えば、参考文献として本明細書に援用される、Daughertyら，1991,Nucl.Acids Res.19:2471-2476;Maedaら，1991,「ヒト抗体およびハイブリドーマ（Human Antibodies and Hybridomas）」2:124-134）。可変領域および不変領域遺伝子が縦列に存在する１つの発現ベクターを使用することができる。或いは、マウス可変領域をコードするＤＮＡを１つの発現ベクターに挿入し、ヒト不変領域をコードするＤＮＡを第２の発現ベクターに挿入後、第１および第２発現ベクターの両方を使用してトランスフェクションすることができる。抗体または抗体断片を産生するための当業界で公知の発現系には、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＮＳＯまたはＣＨＯのような細胞系）、ファージ発現ライブラリー、大腸菌および酵母が含まれる（Adair,1992,上掲）。
上記した記載から、上記した方法および組成物を、本発明の趣旨および範囲を逸脱せずに種々変更することができることは当業者には自明である。よって、本発明には、本発明の趣旨および必須要件を逸脱しない他の特定態様も含まれる。従って、本明細書の実施態様および実施例は、すべての点で非限定的例示と見做され、請求の範囲の同等の範囲内の変更すべてが本発明に包含されるものと理解されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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