(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表１に記載された塩基配列を有するＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼをコードする遺伝子。
【請求項２】
配列表１に記載された塩基配列を有する遺伝子によってコードされる配列表１に記載されたペプチド配列を有するＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ。
【請求項３】
（１）２Ｍの食塩濃度下での加水分解反応における活性が最大活性の５０％以上であり、（２）反応の最適温度が４０〜５０℃である配列表１に記載されたペプチド配列を有するＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼを有するラクトバチルス  ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＩＦＯ−３８０９の菌体及び／又は菌体抽出物を含有する蛋白質加水分解酵素製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ（Ｘ−Ｐｒｏｌｙｌ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、以下Ｘ−ＰＤＡＰと略す）、該Ｘ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子、該Ｘ−ＰＤＡＰを有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の菌体および／または菌体残滓を含有する蛋白質加水分解酵素に関する。この酵素による蛋白質の加水分解物は、調味料及び調味料原料として利用される。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質の加水分解は、従来高濃度の塩酸存在下に加熱することにより行われており、この方法により多くの蛋白質から調味料及び調味料原料、食品素材が製造されている。しかしながら、これらの食品を取り扱う業界では、消費者の天然物志向の拡大に伴い、化学薬品である塩酸を使用しない方法が望まれるようになりつつある。塩酸加水分解法に代わる方法として、蛋白質分解酵素を用いる加水分解法が考えられるが、酵素のコストが塩酸に比べて高価であること、また、塩酸を用いて加水分解した場合と同程度に加水分解率を高めることは困難であったことから、実用化された例は少ない。
【０００３】
酵素による加水分解で蛋白質の加水分解率が低い原因の一つとして、蛋白質中のプロリン残基及びヒドロキシプロリン残基の存在があげられる。プロリン及びヒドロキシプロリンは環状α−イミノ酸であり、他のアミノ酸とは異なる立体構造を持つ。蛋白質またはペプチド中のプロリン残基及びヒドロキシプロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペプチド結合は、通常の蛋白質分解酵素による加水分解を受けにくい。一方、プロリン特異的ペプチダーゼはペプチド中のプロリン残基部分を特異的に加水分解する酵素であり、Ｘ−ＰＤＡＰ（別名プロリンジペプチダーゼ）の他、プロリルオリゴペプチダーゼ（別名プロリルエンドペプチダーゼ）等、多数の酵素が知られている。本発明者らは、このようなプロリン特異的ペプチダーゼを用いることにより、蛋白質が高度に加水分解できることを既に見出し、特開平７−１１５９６９号公報、特開平８−２６６２７６号公報、特開平９−０００１６４号公報にその詳細を開示した。
【０００４】
食品加工のために酵素を用いる場合には、反応中の微生物繁殖を抑制するために高い食塩濃度下で反応を行うことが多い。しかしながら、これらの酵素は、高濃度の食塩が存在した場合にはその活性が大幅に低下し、食品加工用途として工業的に使用する際の問題点となっていた。中でも、蛋白質の高度加水分解に特に重要であると考えられるＸ−ＰＤＡＰについては、何種類かの微生物由来酵素がこれまでに報告されているが、それら酵素が高い食塩濃度下でも活性を示すか否かについては、これまで全く開示されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高濃度の食塩存在下でも高い活性を示すＸ−ＰＤＡＰを見出し、該酵素を用いた蛋白質の加水分解プロセスを確立するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、以下Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓと略す）ＩＦＯ−３８０９が高濃度の食塩に対する耐性が強いＸ−ＰＤＡＰを生産すること、及び該Ｘ−ＰＤＡＰを用いた蛋白質の加水分解において高い加水分解効率が達成できることを見出し、さらに、該Ｘ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子を単離し、その構造を調べることにより、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、食塩に対する強い耐性度を持つ新規Ｘ−ＰＤＡＰ、該Ｘ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子、及び該Ｘ−ＰＤＡＰを有するラクトバチルス属細菌の菌体および／または菌体抽出物を含有する蛋白質加水分解酵素製剤に関する。
【０００７】
本発明のＸ−ＰＤＡＰは以下の特徴を有する。
（１）２Ｍの食塩濃度下での加水分解反応における活性が最大活性の５０％以上である。
（２）反応の最適温度が４０〜５０℃、望ましくは４５〜５０℃である。
これらの特徴は、後述の実施例に記載の方法により測定した。
【０００８】
本発明のＸ−ＰＤＡＰは、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９が生産する。なお、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９は財団法人発酵研究所が保有する微生物であり、同所に依頼することにより誰でもこの菌株の分譲を受けることができる。本発明のＸ−ＰＤＡＰは、このようなＸ−ＰＤＡＰを生産する能力のある微生物を培地に接種し、一定時間培養を行うことにより製造することができる。詳しくは、該Ｘ−ＰＤＡＰを生産する能力のある微生物をＭＲＳ培地や脱脂粉乳培地、ロイコノストック培地等に接種し、３０〜４０℃で１〜３日嫌気培養することにより、該Ｘ−ＰＤＡＰが生産される。
【０００９】
本発明のＸ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子は、遺伝子工学の手法を用いて単離することができる。大腸菌等の公知の宿主−ベクター系を用い、公知の常法によりクローニングを行う。Ｘ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子を含む組換え体は、平板培地に生じたコロニーをニトロセルロースメンブランに移し、基質としてグリシル−プロリン−β−ナフチルアミド（以後、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−βＮＡと略す）を含む溶液に浸した後、ファスト・ガーネットＧＢＣ溶液を注ぎ、赤く発色したコロニー痕として検出される。このような方法により得られたＸ−ＰＤＡＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡを、ｐＵＣ１１８等のベクターに接続し、該組換え体を培養することによっても、該Ｘ−ＰＤＡＰを生産することができる。
【００１０】
本発明のＸ−ＰＤＡＰを用いて蛋白質及びペプチドを加水分解する際、必ずしも酵素を精製することは必要ではない。加水分解反応もしくは加水分解に悪影響を与える因子が混在せず、かつ、食品衛生上の問題がなければ培養液または菌体をそのまま反応に供することも可能である。なお、本発明のＸ−ＰＤＡＰを生産するＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓは、古来よりチーズ等の乳製品の製造に用いられており、食経験があることから、これより得られる酵素については食品衛生上全く問題はない。
【００１１】
本発明のＸ−ＰＤＡＰを用いた蛋白質及びペプチドを加水分解する方法も、公知のペプチダーゼを用いる反応となんら変わりはない。蛋白質を高度に加水分解する場合には、原料蛋白質を複数のプロテアーゼ及びペプチダーゼで処理することが必要であるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を個別に連続して使用するよりも、複数のプロテアーゼ及びペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤を使用する方が有利である。複数のプロテアーゼ及び公知のペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤の例としては、ノボ・ノルディスク社（ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓ、デンマーク）のフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）があげられる。該プロテアーゼ製剤はアスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来で、その中には約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約５３ｋＤの少なくとも５種のプロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれており、さらにそれ以外にも、約２７ｋＤ、約３２ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約１００ｋＤのプロテアーゼ及びペプチダーゼが含まれていることもある。このような酵素製剤と本発明のＸ−ＰＤＡＰとを、同時にまたは別々に蛋白質に作用させることにより、蛋白質の高度加水分解が達成される。
本発明のＸ−ＰＤＡＰによる加水分解は、反応液のｐＨが４〜１０、好ましくは７〜９の範囲で、反応温度は４０〜５０℃、好ましくは４５〜５０℃で行うことが必要である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。
酵素の性質は、以下の実施例に従い求められた。
（１）蛋白質量の測定
精製酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして２８０ｎｍの吸光度を島津分光光度計ＵＶ−１６０Ａを用いて測定した。蛋白質量は２８０ｎｍにおける吸光度１の蛋白質溶液１ｍｌ中に含まれる蛋白質を１単位とする吸光度単位で示した。なお、本精製酵素１．５吸光度単位が約１ｍｇの蛋白質量に相当した。
【００１３】
（２）Ｘ−ＰＤＡＰ活性の測定
アラニル−プロリン−ｐ−ニトロアニリド（以後、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡと略す）５ｍＭ濃度のエタノール溶液に、その１．５倍容の５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて基質溶液とした（終濃度２ｍＭ）。酵素液は１ｍＭのジチオトレイトール及び０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、その５００ｕｌに基質溶液１００ｕｌを加えて、３７℃で５〜１５分間反応させた。反応液に１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）３００ｕｌを添加して反応を停止させ、８０００×ｇで１分間遠心分離を行うことにより不溶物を除去し、遊離パラニトロアニリンに由来する４１０ｎｍの吸光度を測定した。酵素１単位はＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質とした場合に３７℃、１分間の反応で１ｕモルのパラニトロアニリンを遊離させる酵素量とした。なお、パラニトロアニリンの分子吸光係数は９４８０Ｍ−１・ｃｍ−１とした。
（３）最適温度
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、各種温度で１０分間酵素反応を行い、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを加水分解する活性を比較した。
【００１４】
【実施例１】
Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）３リットルを含む５リットル容のジャーファーメンターに接種し、３７℃で１６時間嫌気培養した。培養液から遠心分離で菌体を回収し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄後、培養液量の１／２０量の同緩衝液に懸濁し、この粗酵素液を蛋白質加水分解酵素製剤とした。
粗酵素液の活性に及ぼす食塩濃度の影響を測定した。表１に結果を示したとおり、本発明のＸ−ＰＤＡＰは、食塩濃度が２Ｍの場合でも最大活性の８９％の活性を示した。
本酵素の最適作用温度は４５℃であった（表２）。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
【実施例２】
実施例１と全く同様の操作により、約１５０ｍｌの粗酵素液を取得した。これを蛋白質加水分解酵素製剤とし、ゼラチンの加水分解試験を行った。
ゼラチンの３６％水溶液を５０ｍｌずつ２個の容器にとり、両方の容器に食塩１２ｇと、ノボ・ノルディスク社製のアルカラーゼ０．１６ｇ、フレーバーザイム１．１２ｇを加え、片方の容器には上記粗酵素液２０ｍｌを加えた後、両方の容器ともに１００ｍｌにメスアップした。５０℃で７２時間反応させた後、８５℃で１５分間加熱することにより酵素を失活させ、それぞれのサンプルにつき、ホルモール態窒素含有量と、ケルダール窒素含有量を測定し、これらの比より加水分解率を計算した。その結果、粗酵素液を加えた反応系は、加えない反応系に比べて約３％高い加水分解率を示し、Ｘ−ＰＤＡＰの加水分解に及ぼす効果が確認された（表３）。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
【実施例３】
（１）Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９染色体ＤＮＡの調製
Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９をＭＲＳ培地２０ｍｌに接種し、一晩培養した。遠心分離で集菌し、得られた菌体を２ｍｌのＳＴＭＥ（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭトリス−マリエイト緩衝液、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）に懸濁し、Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ（１ｍｇ／ｍｌ）１００ｕｌとＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）２０ｕｌを加え、３７℃で１５分反応を行った。トリス−ＳＤＳ（０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、ｐＨ９．０）３ｍｌとＰｒｏｎａｓｅ  Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）５０ｕｌを加え、３７℃で１５分、６５℃で１５分反応を行った後、ＴＥ飽和フェノール５ｍｌとクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４：１）０．５ｍｌを加え、室温で軽く左右に振り均一なエマルジョンとした。遠心分離（１００００ｒｐｍ、５分、２０℃）して上清を取り、フェノール抽出を繰り返した後、エタノール２倍量を加え、沈殿するＤＮＡを滅菌したガラス棒に巻き取った。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５ｍｌに溶解し、ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）１００ｕｌを加え、３７℃で３０分反応を行った。エタノール沈殿を再度繰り返した後、ガラス棒に巻き取ったＤＮＡをエッペンチューブに取り、７０％エタノール１ｍｌを加え、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２分、４℃）し、上清を取り除いた後、真空乾燥した。これをＴＥ緩衝液２００ｕｌに溶解し、染色体ＤＮＡサンプルとした。
【００２０】
（２）染色体ＤＮＡライブラリーの作成
染色体ＤＮＡはＳａｕ３ＡＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、７〜１０ｋｂの断片をゲルから抽出した。これをＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１１８とＴ４−ＤＮＡリガーゼにて連結して得られたプラスミドを用いて、エシェリシア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以後Ｅ．ｃｏｌｉと略す）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体は１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アガー１５ｇ／Ｌ）上で選択した。
【００２１】
（３）Ｘ−ＰＤＡＰ活性によるスクリーニング
形質転換体のコロニーをニトロセルロースメンブランに移した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌにＧｌｙ−Ｐｒｏ−βＮＡ１ｍｇを溶解した液に浸した。３７℃で３０分間静置した後、ファスト・ガーネットＧＢＣ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、赤く発色したコロニー痕を確認し、対応するＬＢ寒天培地のコロニーをピックアップした後、同様の操作をもう一度繰り返し純化した。
【００２２】
（４）制限酵素地図の作成
得られた形質転換体をアンピシリン１００ｕｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＩＤ  ＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドｐＹＪ１００を抽出した。得られたプラスミドｐＹＪ１００を数種類の制限酵素で切断し、制限酵素地図を作成した（図１）。ｐＹＪ１００はｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位に約７ｋｂの染色体ＤＮＡ断片が挿入されていた。なお、ｐＹＪ１００を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２４として寄託されている。
【００２３】
（５）Ｘ−ＰＤＡＰ遺伝子領域の決定
プラスミドｐＹＪ１００の制限酵素地図から適当な制限酵素切断部位を利用してプラスミドを縮小化した。縮小化されたプラスミドｐＹＪ１００ΔＳａｌＩ、ｐＹＪ１００ΔＨｉｎｄＩＩＩ、ｐＹＪ１００ΔＳａｃＩについてＸ−ＰＤＡＰ活性を測定したところ、ΔＳａｌＩ、ΔＨｉｎｄＩＩＩは活性が消失したのに対し、ΔＳａｃＩはＸ−ＰＤＡＰ活性を保持していた。このことから、Ｘ−ＰＤＡＰをコードする部分は約３．０ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片上に存在することが判明した（図２）。
【００２４】
（６）塩基配列の決定
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製）を用いｐＹＪ１００の段階的欠損株を作成した。これをテンプレートとしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＤｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で解析し、塩基配列を決定した。ラクトバチルス  ヘルベティカスＩＦＯ−３８０９のＸ−ＰＤＡＰ構造遺伝子は２４０９ｂｐの塩基からなり、８０３個のアミノ酸からなる蛋白質（分子量９０８４７）をコードすることが明らかになった。
【００２５】
ｐＹＪ１００を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃、１８時間培養した。遠心分離により菌体を回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、培養液の１／２０量の同緩衝液に懸濁した。得られた粗酵素液についてＸ−ＰＤＡＰ活性を測定した。この組換え体は培養液１ｍｌ当たり０．３単位のＸ−ＰＤＡＰを生産した。一方、同様に培養したＬ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＩＦＯ−３８０９のＸ−ＰＤＡＰ活性は、培養液当たり０．０３単位であった。
また、粗酵素液の活性に及ぼす食塩濃度の影響を測定した。得られた粗酵素液は、食塩濃度が２Ｍの場合でも最大活性の９０％の活性を示した。
また、得られた粗酵素液の最適作用温度は４５℃であった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により食塩に対する耐性度が高い新規Ｘ−ＰＤＡＰが見出され、これを用いることにより、高食塩濃度の条件下でも、蛋白質を高度に加水分解出来るようになった。また、該Ｘ−ＰＤＡＰの遺伝子を単離したことにより、遺伝子工学の技術を用いて該Ｘ−ＰＤＡＰを大量に生産できるようになった。
【００２７】
【配列表】
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【００２８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＹＪ１００の制限酵素地図である。
【図２】ｐＹＪ１００の染色体ＤＮＡ断片挿入部分におけるＸ−ＰＤＡＰをコードする部分を示すものである。
【図１】
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【図２】
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