(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるキチナーゼ：
ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、キチナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質。
【請求項２】
下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるキチナーゼ：
ａ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されていることを特徴とする蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、且つ、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されており、且つ、キチナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｃ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、且つ、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されており、且つ、キチナーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項３】
下記に記載のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ。
【請求項４】
下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡ；
ｂ）ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡを含み、かつ、キチナーゼ活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質であるキチナーゼ。
【請求項６】
形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡによりコードされる蛋白質であるキチナーゼ。
【請求項７】
請求項３または請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項８】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項７に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）である請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１２】
下記１）乃至２）を含む、キチナーゼの製造方法：
１）下記のａ）またはｂ）に記載の細胞を、キチナーゼを産生する条件下で培養する工程；
ａ）請求項９乃至請求項１１のいずれか一つに記載の宿主細胞；
ｂ）請求項１、請求項２、請求項５および請求項６のいずれか一つに記載のキチナーゼを産生する細胞；
２）１）の培養産物からキチナーゼを分離・精製する工程。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により製造されるキチナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）の少なくとも１種の培養物から分離精製されるキトサン分解酵素に関する。また、該キトサン分解酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入された組換えプラスミド、該組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞、該キトサン分解酵素の製造方法、該キトサン分解酵素を用いた低分子キトサン及びその塩の製造方法、該方法により製造される低分子キトサン及びその塩、および該低分子キトサン及びその塩を含む医薬組成物並びに食品、該キトサン分解酵素を用いた試料の製造方法、該方法により製造される試料等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）は天然に非常に多く存在する多糖であり、主としてカニ・エビ等の甲殻類およびイカ軟甲から工業的規模で抽出され生産されている。キトサン（β−１，４−ポリグルコサミン）は、キチンを濃アルカリ水で処理することにより得られる、アミノ基を有する高分子多糖であり、さまざまな生理活性を有することが知られている（非特許文献１参照。）。なかでも、キトサンは天然物由来物質としては強力な抗菌作用を有し、かつ安全性が合成抗菌剤と比較して非常に高い（非特許文献２参照。）ことが知られている。特に、メチシリンセフェム耐性黄色ブドウ球菌（methichilin  resistants  aureus）(以下、「MRSA」と記す)を含むスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）（非特許文献３乃至非特許文献８参照）、エシェリキア・コリ（Escherichia  coli）（非特許文献９参照）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas  aeruginosa）（非特許文献１０および非特許文献１１参照）等の細菌に対して効果があることが知られている。
【０００３】
カニ・エビ等の甲殻類やイカ軟甲から抽出されたキチンを濃アルカリ処理することによって製造されたキトサンは分子量１００万以上の高分子多糖であり、酸性条件では水に溶けるが、中性あるいはアルカリ性の条件では水に溶けない。そして、水に溶けない状態ではキトサンの生理活性は十分に発揮できない。また、甲殻類を含む食品材料を加工する際、これら高分子多糖が原因で非常に粘度が高い状態になってしまい、その後の処理に手間がかかるという問題もあった。
【０００４】
そこで、水に対する溶解性を増すために、高分子キトサンの誘導体化（非特許文献１２）あるいは、高分子キトサンが有する生理活性を損わずに低分子化するといった試みがなされている。
【０００５】
誘導体化を行うと、天然物とは異なる構造となる可能性があるので天然型のキトサンとは異なる性質を有するようになったり、使用に際しては安全性試験データ等が必要になる場合がある。更に誘導体化反応に使用した有機溶媒の除去、処理が生産コストを引き上げるという問題もある。
【０００６】
そこで、水に対する溶解性を上げるためには誘導体化する方法ではなく、低分子化が望ましいと考えられている。キトサンが有する抗菌活性は、分子量が１００万以上の高分子キトサンだけではなく分子量が1万以上の低分子キトサンでも発揮されることが知られている（非特許文献１３）。
【０００７】
一方、分子量１万以下のキトサンには、皮膚刺激性等の副作用があることが報告されており（特許文献１）、分子量1万以上の低分子キトサンの製造方法が検討されている。
【０００８】
低分子キトサンの製造方法としては、化学的あるいは酵素的手法による高分子キトサンの加水分解が検討されてきた。低分子キトサンの化学的製造方法としては、過酢酸等の酸化剤で処理する方法（特許文献２および特許文献３）、超音波処理する方法（非特許文献１４）等が挙げられる。しかし、酸化剤で処理する方法では分子量５００−３０，０００のキトサンが大量に生成することが知られており、分子量１万以上のキトサンの割合は定かではない。また、超音波で処理する方法では装置の大型化が困難であり、大量製造に不向きであると考えられる。低分子キトサンの酵素的製造方法としてはキトサナーゼを用いる方法（特許文献４および特許文献５）、キチナーゼを用いる方法（非特許文献１５）などが挙げられる。
【０００９】
また、細菌由来のキチナーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（非特許文献１６参照）、サイトファーガ（Cytophaga）属、アクロモバクター・ヒテロプティカム(Acromobacter  hyteropticum：被特許文献１７参照)、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属及びミクロコッカス・コルポゲネス（Micrococcus  colpogenes）（非特許文献１７参照）の生産するキチナーゼ並びに、アルテロモナス・エスピー（Alteromonas  sp.）の生産するキチナーゼＡ（GenBank  Accession  No.D13762）等が知られている。放線菌の生産するキチナーゼとしては、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）属及びアクチノミセス（Actinomyces）属の生産するキチナーゼが知られている（非特許文献１８)。糸状菌の生産するキチナーゼとしては、アスペルギルス（Aspergillus）属、リゾプス（Rhizopus）属、タラロミセス（Talaromyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属及びペニシリウム（Penicillium）属の生産するキチナーゼが知られている。アスペルギルス属の生産する酵素としては、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus  nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）、アスペルギルス・カンディドス（Aspergillus  candidus：非特許文献１９参照）及びアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus  fumigatus）の生産するキチナーゼが知られている。酵母の生産する酵素としては、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces  cerevisiae）の生産するキチナーゼを例示することができ、好適にはサッカロミセス・セレヴィシエの生産するキチナーゼ（GenBank  Accession  No.M74070）及びORF  D9481.7（GenBank  Accession  No.U28373）である。
【００１０】
このように、多くの生物由来のキチナーゼが知られているが、代表的な発酵食品である、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）およびアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）がキチナーゼを生産するとの報告はない。また、同様に味噌やしょうゆ日本酒等の生産に使用されているアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae)に関しては、キチナーゼをコードすると考えられる遺伝子について学会発表があったとの報告（非特許文献２０参照）があるものの、その遺伝子がコードする蛋白質の生物活性については報告されておらず、げんざいまでに公共のデータベースなどにおいてそのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は確認されていない。
【００１１】
一方、キトサナーゼを用いて低分子キトサンを製造する方法は、常に同じ分子量の低分子キトサンを得るための反応制御が煩雑であるという問題点もあった。
【００１２】
【特許文献１】
特開2000−169327号公報
【特許文献２】
特許第3076212号公報
【特許文献３】
特開平5-65368号公報
【特許文献４】
特許第2763112号公報
【特許文献５】
特開平11-322809号公報
【非特許文献１】
「キチン・キトサンハンドブック」、1995年、技報堂、p.302-376
【非特許文献２】
「キチン・キトサンの活用法」、1998年、財界特別増刊第46巻28号、p.106-111
【非特許文献３】
「加工技術」1998年、33巻、p.512-515
【非特許文献４】
「名城大学農学部学術報告」1998年、34巻、p.25-34
【非特許文献５】
「繊維科学」1993年、35巻、p.37-39
【非特許文献６】
「大阪府立公衆衛生研究所研究報告薬事指導編No.29」、1995年、p.7-12
【非特許文献７】
「加工技術」1997年、32巻、p.339-343
【非特許文献８】
「加工技術」1998年、33巻、p.530-532
【非特許文献９】
トクラら（Tokura,  S  et  al.）「マクロモレキュラー・シンポジア（Macromolecular  Symposia）」1997年、120巻、p.1-9
【非特許文献１０】
ロークら（Loke,  WK  et  al.）「ジャーナル・オブ・バイオメディシナル・マテリアルズ・リサーチ（Journal  of  Biomedicinal  Materials  Research）」2000年、53巻、p.8-17
【非特許文献１１】
キムら（Kim,  H.  J.  et  al.）「ジャーナル・オブ・バイオマテリアルズ・サイエンス、ポリマー・エディション（Journal  of  Biomaterials  Science,  Polymer  Edition」1999年、10巻、p.543-56
【非特許文献１２】
「キチン・キトサンの活用法」財界特別増刊第４６巻２８号、1998年、p.78-81
【非特許文献１３】
「日本農芸化学会誌74巻大会講演要旨集」講演番号２E183α、2000年
【非特許文献１４】
「キチン・キトサン研究」1999年、5巻、p.75-79
【非特許文献１５】
「日本農芸化学会誌74巻大会公演要旨集」講演番号２F313α、2000年
【非特許文献１６】
ヴェルドカンプ（Veldkamp,  H.）「ネイチャー（Nature）」1952年、169巻、p.500
【非特許文献１７】
キャンプベルら（Campbell,  Jr.,  L.L.  et  al.）「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Journal  of   General  Microbiology）」1951年、5巻、p.894
【非特許文献１８】
中神照太ら「工技院醗酵研究所報告」1966年、30巻、p.19
【非特許文献１９】
シェリフら（Sherif,  A.  A.,  et  al.）「（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied  Microbiology  and  Biotechnology）」1991年、35巻、p.228
【非特許文献２０】
「キチン・キトサン研究」2002年、第8巻、第2号、p.238-239
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、中性条件下でも水に可溶であり、抗菌作用を有する低分子キトサンを効率よく生産する方法について鋭意検討を行ったところ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株由来のキチナーゼあるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８株由来のキチナーゼあるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来のキチナーゼを精製し、該キチナーゼをコードするｃＤＮＡをクローニングし、該キチナーゼを用いた酵素反応により、カニ・エビ由来の高分子キトサンから分子量１万以上の低分子非誘導体のキトサンを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明により、非誘導体の低分子キトサンを、１万以上の分子量分布を有する状態で供給できることが可能となる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）  アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）の少なくとも１種の培養物から分離精製されるキトサン分解酵素、
（２）  アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）がアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株であり、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８株であり、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）がアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株である（１）記載のキトサン分解酵素、
（３）  配列表の配列番号１乃至３の部分アミノ酸配列を有することを特徴とする、（１）または（２）に記載のキトサン分解酵素、
（４）  以下の性質を示す（１）乃至（３）のいずれか１つに記載のキトサン分解酵素：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す；
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５乃至４．５を示す；
３）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する；
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）４５℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ５乃至ｐＨ９．５のｐＨ条件下で安定である、
（５）  下記のａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるキトサン分解酵素：
ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、キトサン分解活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質、
（６）  下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載の蛋白質であるキトサン分解酵素：
ａ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されていることを特徴とする蛋白質；
ｂ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、一つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加したアミノ酸配列からなり、且つ、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されており、且つ、キトサン分解活性を有することを特徴とする蛋白質；
ｃ）配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、且つ、Ｎ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル化されており、且つ、キトサン分解活性を有することを特徴とする蛋白質、
（７）  下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ；
ｅ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
（８）  下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡ：
ａ）形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡ；
ｂ）ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡの有するヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡを含み、かつ、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするＤＮＡ、
（９）  （７）または（８）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質であるキトサン分解酵素。
（１０）  形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡによりコードされる蛋白質であるキトサン分解酵素、
（１１）  下記のａ）乃至ｂ）に示される活性を有することを特徴とする、（５）、（６）、（９）または（１０）に記載のキトサン分解酵素；
ａ）３０％アセチル化キトサン（粘度１００〜３００ｃｐｓ）を、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５、０℃乃至８０℃の条件にて加水分解する活性；
ｂ）グリコールキチンを、ｐＨ４．０乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する活性、
（１２）  （７）または（８）に記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド、
（１３）  発現ベクターであることを特徴とする、（１２）に記載の組換えプラスミド、
（１４）  （１２）または（１３）に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞、
（１５）  原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、（１４）に記載の宿主細胞、
（１６）  形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）である（１４）記載の宿主細胞、
（１７）  下記１）乃至２）を含む、キトサン分解酵素の製造方法：
１）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載の細胞を、キトサン分解酵素を産生する条件下で培養する工程；
ａ）アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）；
ｂ）アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）；
ｃ）アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）；
ｄ）（１４）乃至（１６）のいずれか一つに記載の宿主細胞；
ｅ）（５）、（６）、（９）乃至（１１）のいずれか一つに記載のキトサン分解酵素を産生する細胞；
２）１）の培養産物からキトサン分解酵素を分離・精製する工程。
（１８）  アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）がアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株であり、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）がアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８株であり、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）がアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株である（１７）記載の方法、
（１９）  （１７）または（１８）に記載の方法により製造されるキトサン分解酵素、
（２０）  以下の工程１）および２）を含む低分子キトサンの製造方法：
１）アセチル化度が１０％乃至３０％のアセチル化キトサン水溶液に（１）乃至（６）、（９）乃至（１１）および（１９）のいずれか一つに記載のキトサン分解酵素を添加する；
２）ｐＨ３乃至１２、１０℃乃至６０℃の条件で１０分以上酵素反応を行なう、
（２１）  （２０）に記載の方法により製造される低分子キトサン又はその塩、
（２２）  分子量が４万〜２５万でアセチル化度が１０％である（２１）記載の低分子キトサン又はその塩、
（２３）  分子量が１万〜１１万でアセチル化度が２０％である（２１）記載の低分子キトサン又はその塩、
（２４）  分子量が１万〜７万でアセチル化度が３０％である（２１）記載の低分子キトサン又はその塩、
（２５）  （２１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の低分子キトサン又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物、
（２６）  外傷、床ずれまたはアトピー性皮膚炎の治療剤であることを特徴とする、（２５）記載の医薬組成物
（２７）  （２１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の低分子キトサン又はその塩を有する化粧料、
（２８）  （２１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の低分子キトサン又はその塩を有する食品、
（２９）  （２１）乃至（２４）のいずれか一つに記載の低分子キトサン又はその塩を有する水等処理剤、
（３０）  以下の工程１）および２）を含む、その液体成分中に分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含有しない試料の製造方法：
１）分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンを含む試料に（１）乃至（６）、（９）乃至（１１）および（１９）のいずれか一つに記載のキトサン分解酵素を添加する；
２）ｐＨ３乃至１２、１０℃乃至６０℃の条件で１０分間以上酵素反応を行なう、
（３１）  分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンを含有する試料が、甲殻類を含む試料であることを特徴とする、（３０）記載の方法、
（３２）  甲殻類がエビおよびカニのいずれか一つまたは両方である（３１）記載の方法、
（３３）  （３０）乃至（３２）のいずれか一つの方法により製造される、その液体成分中に分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含有しない試料，
に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は低分子キトサンを製造するために有用な糸状菌として、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）由来のキチナーゼあるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）由来のキチナーゼあるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）由来のキチナーゼ、該キチナーゼによって製造される低分子キトサン、該低分子キトサンを含む医薬組成物等に関する。
【００１８】
本発明においてキチナーゼとはキチン又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性を有する酵素をいい、キチンを加水分解するとＮ−アセチルグルコサミンとそのオリゴ糖が生成する。この「キチン又は部分アセチル化キトサンを加水分解する活性」を「キトサン分解活性」と定義する。キチンとは、部分アセチル化キトサンのうち、アセチル化の割合が高いものをいい、本発明においては、特に断りが無い限り、これらもあわせて部分アセチル化キトサンと呼ぶ。また、本発明において、キトサン分解酵素とキチナーゼはいずれも上記キトサン分解活性を有する酵素を指し、同義語として用いる。本発明のキチナーゼには、キチナーゼを生産する微生物の培養物中のキトサン分解活性を有する蛋白質が含まれる。このようなキチナーゼの例としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）由来のキチナーゼ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）由来のキチナーゼまたはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）由来のキチナーゼが挙げられる。より好適なものは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）由来のキチナーゼ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８株由来のキチナーゼまたはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来のキチナーゼであり、さらにより好適には、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）由来のキチナーゼである。
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列表の配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を全て含み、且つ、キトサン分解活性を有する蛋白質が挙げられる。該蛋白質は、各々のアミノ酸配列の順序によらず、内部アミノ酸配列としてこれらの全てを含むものであればよい。このようなキチナーゼの中で好ましいものは、配列表の配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を全て含み、且つ、Ｎ末端の配列が“Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１乃至５）”からなり、且つ、キトサン分解活性を有する蛋白質が挙げられる。より好ましいものとしては、配列表の配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を全て含み、且つ、Ｎ末端の配列がＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−からなり、且つ、Ｎ末端がアセチル化されており、且つ、キトサン分解活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００１９】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列表の配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３に示されるアミノ酸配列を全て含み、且つ、キトサン分解活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００２０】
また、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質において、一個または数個の部位に、１個または数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加した蛋白質も、キトサン分解活性を有する限り、本発明に含まれる。数個とは１０個を超えない個数を意味し、好適には５個を超えない個数をいう。置換したアミノ酸配列を有する蛋白質が、天然型蛋白質と同等の活性を有する例として、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して得られた蛋白質が、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Wang,  A.  et  al.  (1984)  Science  224,  1431-1433）。
【００２１】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げる事ができる。また、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことからなる蛋白質であっても、キトサン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００２２】
また、本発明のキチナーゼの別の例としては配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端のα−アミノ基がアセチル化されている蛋白質が挙げられる。また、このような蛋白質を含むことからなる蛋白質も、キトサン分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００２３】
本発明のキチナーゼとして好適なものは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）由来のキチナーゼ、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ１９２８８株由来のキチナーゼ、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来のキチナーゼ、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質および配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端のα−アミノ基がアセチル化されている蛋白質が挙げられるが、より好適なものは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）由来のキチナーゼおよび配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、且つＮ末端のα−アミノ基がアセチル化されている蛋白質である。
本発明において、「本発明のＤＮＡ」とは、本発明のキチナーゼをコードするＤＮＡをいう。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、現在知られる限りどのような形態をとっていても良い。
【００２４】
本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２から１４３８に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２から１４３８に示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
【００２６】
また、本発明のヌクレオチドのさらに他の例としては、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Grantham,  R.  et  al.  (1981)  Nucleic  Acids  Res.  9,  143-174）。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（site  specific  mutagenesis／Mark,  D.  F.  et  al.  (1984)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81,  5662-5666）などに従うことができる。
【００２７】
本発明のＤＮＡのまた別の例としては、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２から１４３８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。又、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２から１４３８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むことからなるＤＮＡも、キトサン分解活性を有する蛋白質をコードする領域を含む限り、本発明に含まれるものである。
【００２８】
本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを保持する形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２は、平成１４年１１月８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１-１-１  中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５が付されている。したがって、本発明のＤＮＡは、該菌株からも取得することが可能である。また、この寄託菌株の保持する組換えプラスミドに挿入されたＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、コードする蛋白質がキトサン分解活性を有する限り、本発明に含まれる。また、上記のヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡも本発明に含まれる。さらに，このようなＤＮＡによってコードされる蛋白質も本発明のキチナーゼに含まれる。
【００２９】
本発明のＤＮＡとして好適なものは、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号２４２乃至１４３８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、および、形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡであるが、最適には形質転換大腸菌  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５）により保持される組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAに挿入されているＤＮＡである。
【００３０】
また、本発明のキチナーゼには、本発明のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。また、本発明のキチナーゼにおいて、任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”335-354)、カセット変異法（岸本  利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ  組換えＤＮＡ技術  ”242-251）などに従うことができる。このように、本発明のＤＮＡを元に遺伝子工学的手法により得られる蛋白質であっても、キトサン分解活性を有する限り本発明に含まれる。このようなキチナーゼは、必ずしも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなる蛋白質であっても、該蛋白質がキトサン分解活性を示す限り本発明のキチナーゼに包含される。また、このようなキチナーゼをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００３１】
本発明に用いるキチナーゼはキチナーゼ生産菌から精製したもの、粗精製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。キチナーゼ生産菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に粉末キチン、粉末キトサン、コロイダルキチン、コロイダルキトサン等を添加して培養するのが好ましい。キチナーゼ生産菌の培養終了後に遠心分離を行ない、菌体を除いた培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
【００３２】
キチナーゼ生産菌とはキチナーゼ生産能を本質的に先天的に有する微生物をいい、キチナーゼを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等を含む。キチナーゼ生産菌の培養上清又は培養上清から精製したキチナーゼを用いる場合には菌体外にキチナーゼを分泌する菌を用いることができる。
【００３３】
本発明に用いるキチナーゼ生産菌としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）あるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）あるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）を挙げることができ、好ましくはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株あるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８あるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株を挙げることができる。キチナーゼ生産菌の培養は通常の培地を培養装置、培地を用いて行なうことができる。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択できる。液体培養の場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地の追加のないバッチ培養法や培養中に適宜培地を添加していく流加培養法を用いることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属等を添加することができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエキストラクト等を挙げることができるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、イースト・エクストラクト、マルトエクストラクト、コーンスティープリカー、ペプトン等の有機窒素が用いられるがキチナーゼ生産菌が生育する限りこれらに限定されない。また、キチナーゼ生産菌のキチナーゼの生産量を増やすために培地中に粉末キチンやコロイダルキチンを添加することもできる。これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。培養温度、ｐＨ、通気攪拌量はキチナーゼ生産に適するように適宜選択することができる。
【００３４】
本発明に用いるキチナーゼとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）あるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）あるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）由来のキチナーゼを用いることができ、好ましくはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株あるいはアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８あるいはアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来のキチナーゼを用いることができる。キチナーゼは、これらキチナーゼ生産菌自身が生産するものでもよいし、その変異体または修飾体が生産するものであってもよく、更に、これらキチナーゼ生産菌のキチナーゼをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換体から生産される組換えタンパク質であってもよい。
キチナーゼ生産菌の入手
アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株は理化学研究所  生物基盤研究部  微生物系統保存施設（ＪＣＭ：Japan  Collection  of  Microorganisms；住所  〒３５１−０１９８  日本国埼玉県和光市広沢２−１、ホームページアドレス  ＜http://www.jcm.riken.go.jp/＞）より購入することができる。
【００３５】
アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus  japonicus）ＳＡＮＫ  １９２８８株とアスペルギルス・ソジャエ（Aspergillus  sojae）ＳＡＮＫ  ２２３８８株の菌学的性質を以下に示す。
【００３６】
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株とアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株をクリックとピットの文献  (Klich,  M.  A.  and  Pitt,  J.  I.  (1988)  A  laboratory  guide  to  the  common  Aspergillus  species  and  their  teleomorphs.  CSIRO,  Division  of  Food  Processing,  North  Ryde  N.S.W.,  Austraria.)に従い、3種類の培地（CYA培地,  MEA培地,  CY20S培地）に接種して、菌学的性状を観察した。
【００３７】
色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」  (Kornerup,  A.  and  Wanscher,  J.  H.  (1978)  Methuen  handbook  of  colour(3rd.  edition).  Erye  Methuen,  London.)に従った。
【００３８】
3種類の培地（CYA培地,  MEA培地,  CY20S培地）の組成は以下の通りである。
CYA培地[ザペックイーストアガー(Czapek  Yeast  Extract  Agar)  培地](K2HPO4  1.0  g,  *ザペック濃縮液  10  ml,  イーストエキス  5  g,  シュークロース  30  g,  寒天  15  g,  蒸留水  1000  ml)
*ザペック濃縮液（NaNO3  30  g,  KCl  5  g,  MgSO4・7H2O  5  g,  FeSO4・7H2O  0.1  g,  ZnSO4・7H2O  0.1  g,  CuSO4・5H2O  0.05  g    蒸留水  100ml)
MEA培地[モルトエキスアガー(Malt  Extract  Agar)培地](モルトエキス  20  g,  ペプトン  1  g,  グルコース  20  g,  寒天  20  g,  蒸留水  1000ml)
CY20S培地[20%シュークロースザペックイーストアガー(Czapek  Yeast  Extract  Agar  with  20%  Sucrose)培地](K2HPO4  1.0  g,  *ザペック濃縮液  10  ml,  イーストエキス  5  g,  シュークロース  200  g,  寒天  15  g,  蒸留水  1000  ml)
１）  菌学的性状
a)  アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株の菌学的性状
CYA培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径45乃至60  mmである。菌糸は白色である。分生子形成は中心部で旺盛、形成部の色はオリーブブラウン（4F4）乃至黒色をを呈する。裏面の色はグレイッシュイエロー（4B4）乃至イエローイッシュホワイト（4A2）を呈する。菌核は観察されない。浸出液や可溶性色素は観察されない。CY20S培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径57乃至68  mmである。コロニーはCYA培地のコロニーに似る。裏面の色はパストラルイエロー（3A4）を呈する。MEA培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径51乃至57  mmである。分生子形成は旺盛、形成部の色は黒色である。裏面の色は無色である。37℃、１週間培養したCYA培地  のコロニーは、直径13乃至20  mmである。5℃では生育しない。
【００３９】
分生子頭は放射状、分生子柄は平滑、無色または頂部で褐色、幅4乃至11  μmである。頂のうは球形乃至楕円形、幅19乃至50  μmである。アスペルジラは単列である。フィアライドは頂のうの3/4を覆い、7乃至10  ×  3.5乃至4.5  μmである。分生子は楕円乃至球形、やや疎な棘で覆われ、直径3.5乃至4.5  ×  3.5乃至4  μmである。
【００４０】
以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックとピットの文献に記載されているアスペルギルス  ジャポニクス  バール  アキュリ−タス（Aspergillus  japonicus  var.  aculeatus  (Iizuka)  Al-Musallam）の性状とほぼ一致した。よって本菌株をアスペルギルス  ジャポニクス  バール  アキュリ−タス（Aspergillus  japonicus  var.  aculeatus  (Iizuka)  Al-Musallam）と同定した。
【００４１】
尚、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株は、アスペルギルス  ジャポニクス  バール  アキュリ−タス  ＳＡＮＫ  １９２８８株として、平成１３年９月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１-１-１  中央第６）に国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７３６が付された。
【００４２】
b)  アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株の菌学的性状
CYA培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径46乃至52  mmである。コロニーは綿毛状である。菌糸は白色、密である。分生子形成は旺盛、形成部の色はオリーブ（2F-E7）を呈する。裏面の色はイエローイッシュホワイト（2A2）を呈する。CY20S培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径42乃至45  mmである。コロニーはCYA培地のコロニーに似る。分生子形成は旺盛、形成部の色はオリーブイエロー（3D6）乃至オリーブ（3E7）を呈する。MEA培地でのコロニーは、25℃、１週間の培養で直径43乃至47  mmである。コロニーはやや綿毛状、やや疎である。菌糸は白色、目立たない。分生子形成は旺盛、形成部の色はオリーブ（1E8）を呈する。裏面の色は無色である。37℃、１週間培養したCYA培地のコロニーは、直径52乃至56  mmである。5℃では生育しない。
【００４３】
分生子頭は放射状、分生子柄は粗面、無色、幅7乃至12  μmである。頂のうは洋なし形乃至球形、幅24乃至41  μmである。アスペルジラは単列、ときどき二列である。メトレは8乃至12  ×  4乃至8  μmである。フィアライドは10乃至11×  4.5乃至6  μmである。分生子は球形、粗面、直径5乃至6.5  μmである。
【００４４】
以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックとピットの文献に記載されているアスペルギルス  ソジャエ（Aspergillus  sojae  Sakaguchi  &  Yamada）の性状とほぼ一致した。よって本菌株をアスペルギルス  ソジャエ（Aspergillus  sojae  Sakaguchi  &  Yamada）と同定した。
【００４５】
尚、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株は、アスペルギルスソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株として、平成１３年９月１３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１-１-１  中央第６）に国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７３８が付された。
【００４６】
周知の通り、糸状菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara   ＪＣＭ  ２０６７）株、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株やアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株もその点は同じである。本発明にいうアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株やアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即ち、キチナーゼを生産するアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae  var.  sporoflavus  Ohara  ＪＣＭ  ２０６７）株に包含される。キチナーゼを生産するアスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株に包含される。キチナーゼを生産するアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株に包含される。
また、本発明のキチナーゼは、ベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事もできる。このように適当なベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００４７】
本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００４８】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia  coli）や枯草菌（Bacillus  subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００４９】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００５０】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明のキチナーゼの産生に使用することができる。
【００５１】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐTUB２２８（Ohmura,  K.  et  al.  (1984)  J.  Biochem.  95,  87-93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００５３】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman,  Y.  (1981)  Cell  23,  175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,  G.  and  Chasin,  L.  A.  (1980)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77,  4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００５４】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani,  S.  et  al.  (1981)  Mol.  Cell.  Biol.  1,  854-864）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５５】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman,  H.  and  Magnusson,  G.  (1983)  Nucleic  Acids  Res,  11,  1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham,  F.  L.  and  van  der  Eb,  A.  J.  (1973)  Virology  52,  456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann,  E.  et  al.  (1982)  EMBO  J.  1,  841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook,  J.  et  al.  (1989)  :  "Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual"  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern,  P.  J.  and  Berg,  P.  (1982)  J.  Mol.  Appl.  Genet.  1,  327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のキチナーゼを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００５６】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera  frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia  niの卵細胞由来High  Five細胞（Wickham,  T.  J.  et  al,  (1992)  Biotechnol.  Prog.  I:  391-396）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd,  I.  M.  and  V.C.  Emery  (1993)  The  use  of  baculoviruses  as  expression  vectors.  Applied  Biochemistry  and  Biotechnology  42,  137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei  Wang,  et  al.  (1998)  Biol.  Chem.,  379,  167-174)。
【００５７】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces  cerevisiaeや石油酵母Pichia  pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,  J.  L.  and  Hall,  B.  D.  (1982)  J.  Biol.  Chem.  257,  3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara,  A.  et  al.  (1983)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  80,  1-5）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew,  L.  Niles,et  al.  (1998)  Biotechnol.Appl.  Biochem.  28,  125-131)。
【００５８】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明のキチナーゼが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。培養条件としては、ＣＯ２濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【００５９】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に組換え蛋白質として産生される本発明のキチナーゼは、培養産物中から、その蛋白質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質(酵素活性など）等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックＩＩ」、1175-1259項、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行;Biochemistry,  vol.  25,  No.25,  p8274-8277  (1986);  Eur.  J.  Biochem.,  163,  p313-321  (1987)等参照）により分離、精製することができる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アッフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示できる。上記により、高収率で所望の組替え蛋白質を工業的規模で製造できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のキチナーゼを大量に製造できる。
【００６０】
以上のような方法により製造されたキチナーゼも本発明の好適な例としてあげる事ができる。
本発明に用いる低分子キトサン又はその塩は、０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解する。ここでいう水とは、蒸留水、水道水、井戸水であるとよい。さらに、低分子キトサン又はその塩は、ｐＨ１．０〜７．０の条件下で、１００ｇの水に１０ｇ以上溶解する。また、低分子キトサンは抗菌活性を有する。
【００６１】
部分アセチル化キトサンとは、キトサンのアミノ基の一部がアセチル化されているものをいい、アセチル化度が低い部分アセチル化キトサンは、キチンをアルカリで脱アセチル化することによって製造することができる。部分アセチル化キトサンのアセチル化度はアルカリ濃度、反応時間等により制御することができる。また、分子量が１００万以上のものを特に高分子部分アセチル化キトサンと呼ぶ。分子量１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンとしては、例えば、エビ・カニ由来の３０％、２０％、１０％アセチル化キトサン（商品名  キトサン７B、８B、９B（いずれも加ト吉（株）製）を用いることができるが、これらに限定されない。エビ、カニに含まれる天然のキチンは、よりアセチル化度が高い高分子部分アセチル化キトサンであり、これらも部分アセチル化キトサンとして用いることができる。
【００６２】
高分子部分アセチル化キトサンの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）を用いる高速液体クロマトグラフィー（プルランを標準物質とする）により、測定することができる（滝口ら、キチン・キトサン研究  ｐ.75-79,  1999）。
【００６３】
高分子部分アセチル化キトサンのアセチル化度は、指示薬としてトルイジンブルー溶液を用い、１／４００  Ｎポリビニル硫酸カリウム溶液でPVSKコロイド滴定を行うことにより測定することができる（Toei  K.  et  al.  Anal.  Chem.  Acta  83,  59,  1976）。この方法で測定したアセチル化度は、アセチル化されているアミノ基の％（例えば、アセチル化度が１％とは、１００個のアミノ基のうち１個がアセチル化されていることを意味する）を表す値である。
【００６４】
キトサンのアセチル化度は、1H-NMRにより得られるアセチル基の３Hとアセチル基以外の水酸基を除く７Hとの積分比からも算出することができる。
【００６５】
キチナーゼの加水分解活性は、Randle-Morgan法（Randle  C.J.M  et  al.  Biochem.  J.  GL  586-589,  1955）に従って、測定することができる。また、Schales変法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)）に従っても測定できる。
【００６６】
本発明は低分子キトサンの製造方法に関する。
【００６７】
該方法において使用されるキチナーゼは、ｐＨ４．０〜５．５、温度３７℃で１０〜３０分間の反応条件下での３０％アセチル化キトサン（粘度100〜300  cps）を基質とした場合の加水分解活性を１００％とした場合に、グリコールキチンを基質とした場合の加水分解活性が１００％より小さく、アセチル化度が１％以下のキトサン（粘度５０〜２００  cps）を基質とした場合の前記キチナーゼの加水分解活性が１５％以下である。
【００６８】
該方法における酵素の使用量及び使用濃度については、特に限定されない。
【００６９】
該方法において、キチナーゼの基質となる高分子部分アセチル化キトサンの水溶液は、０．１〜５質量％、好適には０．２５〜２質量％、さらに好適には０．５〜１質量％濃度である。該水溶液は、酸性条件下（例えば、ｐＨ１〜６）で水に溶解した溶液として用いることもできる。また、この溶液に更にアルカリ（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、苛性ソーダなど）を加えて弱酸性（例えば、ｐＨ４．０〜６．０）にした溶液として、該方法に用いる事もできる。
【００７０】
高分子部分アセチル化キトサン溶液を酸性にして水に溶解させるために使用する酸としては、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸、アクリル酸、乳酸、アミノ酸、クエン酸、サリチル酸、グルクロン酸、グリコール酸等を挙げることができるが酸性溶液を作ることができればこれらに限定されない。
【００７１】
本発明のキチナーゼを用いて低分子キトサンを製造する際の反応溶液のｐＨ範囲としては、ｐＨ３〜１２の範囲を挙げることができるが、好適にはｐＨ３〜７の範囲であり、さらに好適にはｐＨ４〜６の範囲である。該反応溶液の温度は、０℃〜７０℃であればよく、好適には１０℃〜６０℃であり、さらに好適には40〜50℃である。反応時間は10分〜7日間を挙げることができるが、好適には3時間〜5日間であり、より好適には1〜3日間である。
【００７２】
高分子部分アセチル化キトサンを様々な酸を用いて水溶液にした後に、本発明のキチナーゼによる加水分解反応をおこなうことにより、分子量１万以上、１００万未満の様々な低分子キトサン塩が生成する。塩の種類としては使用した酸に応じて塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、アクリル酸塩、乳酸塩、アミノ酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、グルクロン酸塩、グリコール酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明によって、０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解する低分子キトサン又はその塩が提供される。
【００７３】
さらに、本発明は、０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解する低分子キトサンを含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
キチナーゼの加水分解活性は、Randle-Morgan法（Randle  C.J.M  et  al.  Biochem.  J.  GL  586-589,  1955）に従って、測定することができる。また、Schales変法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)）に従っても測定できる。
【００７５】
グリコールキチンは、R.  Senzyu  and  S.  Okimatsu,  Nippon  Nogeikagaku  Kaishi,  23,  432  (1950)に記載されている方法によって製造することができる。
キチナーゼ生産菌から得られたキチナーゼの具体的な性質について以下に示すが、本発明のキチナーゼの有する性質はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７）株により生産され、精製されたキチナーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ４．５を示す。
３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する。
５）８０℃以下で３）記載の加水分解活性を発揮する。
６）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ５．５である。
７）４）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ１０．０である。
８）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐH５．５では６０℃である。
９）４５℃以下の温度で安定である。
１０）ｐＨ５乃至ｐＨ９．５のｐＨ条件下で安定である。
１１）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ５．５あるいはｐH１０．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を１００％としたときの、他の基質に対する酵素のｐＨ５．５あるいはｐH１０．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性が相対値として表１の値を示す。表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂは２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述の方法により調製する。
【００７７】
【表１】
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表１から、この酵素は、ｐH５．５においてはグリコールキチンよりもアセチル化度が１０〜３０％の部分アセチル化キトサン（キトサン９Ｂ、８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キトサン１０Ｂ）に対する加水分解活性がほとんどないことがわかる。カルボキシメチルセルロースナトリウムに対する加水分解活性はない。
１２）下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列は、N末端側から記す。
Glu-Met-Thr-Pro-Tyr-Leu-Asp-Phe-Tyr-Arg-Leu-Met-Ala-Tyr-Gln  （配列表の配列番号１）
Ile-Val-Val-Gly-Met-Pro-Ile-Tyr-Gly-Arg-Lys-Glu  （配列表の配列番号２）
Ala-Leu-Pro-Lys-Pro-Gly-Ala-Thr-Glu-Tyr-Val-Asp-Pro-Ser-Ile  [配列表の配列番号３）
アスペルギルス・ジャポニクスＳＡＮＫ  １９２８８株により生産されるキチナーゼは、粗酵素液において、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点転記泳動法にて等電点ｐＩ約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する。
４）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ４．０である。
５）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ４．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を１００％としたときの、他の基質に対する酵素のｐＨ４．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性が相対値として表２の値を示す。
【００７８】
【表２】
――――――――――――――――――――
基質                  相対活性（％）
――――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ          ８．２
キトサン  ９Ｂ        ６７．６
キトサン  ８Ｂ        ７４．４
キトサン  ７Ｂ      １００
グリコールキトサン      ８．２
グリコールキチン      ２３．３
ＣＭ−セルロース      １１．４
リケナン              ２５．３
――――――――――――――――――――
表２から、この酵素は、グリコールキチンよりもアセチル化度が１０〜３０％の部分アセチル化キトサン（キトサン９Ｂ、８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キトサン１０Ｂ）に対する加水分解活性は弱いことがわかる。
また、アスペルギルス・ジャポニクスＳＡＮＫ  １９２８８株により生産され、精製されたキチナーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点転記泳動法にて等電点ｐＩ約３．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．５乃至ｐＨ１０．５にて加水分解する。
４）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ５．０である。
５）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ５．０では６５℃である。
６）５０℃以下の温度で安定である。
７）ｐＨ４乃至ｐＨ９．５のｐＨ条件下で安定である。
８）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を１００％としたときの、他の基質に対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性が相対値として表３の値示す。表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂは２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述の方法により調製する。
【００７９】
【表３】
――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ          ０
キトサン９Ｂ          ５８．６
キトサン８Ｂ          ７２．４
キトサン７Ｂ        １００
グルコールキトサン      ０
グリコールキチン      ２８．３
ＣＭ−セルロース        ０
リケナン                ４．２
――――――――――――――――――
表３に示すとおり、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼはキトサン７Bに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下する。また、該精製キチナーゼはキチン加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性は無い。
９）下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列は、N末端側から記す。
His-Tyr-Pro-Thr-Asp-Ser-Trp-Asn-Asp-Val-Gly-Thr-Asn-Val-Tyr（配列表の配列番号１１）
Ala-Phe-Thr-Asn-Thr-Asp-Gly-Pro-Gly-Thr-Ala-Phe-Ser-Gly-Val（配列表の配列番号１２）
Leu-Ser-Gln-Met-Thr-Pro-Tyr-Leu-Asp-Phe-Tyr-Asn-Leu-Met-Ala-Tyr-Asp-Tyr-Ala-Gly（配列表の配列番号１３）
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株により生産されるキチナーゼは、粗酵素液において、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にてｐＩ約４．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．５乃至ｐＨ９．５にて加水分解する。
４）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ４．５である。
５）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ４．５、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を１００％としたときの、他の基質に対する酵素のｐＨ４．５、温度３７℃における１０分間の加水分解活性が相対値として表４の値を示す。
【００８０】
【表４】
――――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ            ０
キトサン９Ｂ            ６７．７
キトサン８Ｂ            ７１．６
キトサン７Ｂ          １００
グリコールキトサン        ２．９
グリコールキチン        ８１．９
ＣＭ―セルロース          ０
リケナン                １１．９
――――――――――――――――――――
表４から、この酵素は、アセチル化度が１０〜３０％の部分アセチル化キトサン（キトサン９Ｂ、８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キトサン１０Ｂ）に対する加水分解活性がほとんどないことがわかる。カルボキシメチルセルロースナトリウムに対する加水分解活性はない。
また、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株により生産され、精製されたキチナーゼは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点転記泳動法にて等電点ｐＩ約４．５を示す。
３）キトサン７Ｂを、ｐＨ３．５乃至ｐＨ９．５にて加水分解する。
４）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ５．５およびｐＨ９．０である。
５）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ５．５では６０℃、ｐＨ９．０では３５℃である。
６）ｐＨ５．５およびｐＨ９．０において、４０℃以下の温度で安定である。
７）ｐＨ４．５乃至ｐＨ１０のｐＨ条件下で安定である。
８）キトサン８Ｂに対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性を１００％としたときの、他の基質に対する酵素のｐＨ５．０、温度３７℃における１０分間の加水分解活性が相対値として表５の値を示す。表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂは２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述の方法により調製する。
【００８１】
【表５】
――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ        １４．３
キトサン９Ｂ          ７３．６
キトサン８Ｂ        １００
キトサン７Ｂ          ９７．４
グルコールキトサン      ０
グリコールキチン      ２３．８
ＣＭ−セルロース        ０
リケナン              ０
――――――――――――――――――
表５に示すとおり、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼはキトサン７Bおよび８Bに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下する。また、該精製キチナーゼはキチン加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性はない。
以上のことから、本発明のキチナーゼの有する性質としては以下のようなものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約４０，０００を示す。
２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．０乃至５．０（好適にはｐＩ３．５乃至４．５）を示す。
３）キトサン7Ｂを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．０（好適にはｐＨ３．５乃至１０．５）にて加水分解する。
４）グリコールキチンを、ｐＨ３．０乃至ｐＨ１１．５（好適にはｐＨ４乃至ｐＨ１０．５）にて加水分解する；
５）０℃乃至８０℃で３）記載の加水分解活性を発揮する；
６）５０℃以下（好適には４５℃以下）の温度で安定である；
７）ｐＨ４．０乃至ｐＨ１０（好適にはｐＨ５乃至ｐＨ９．５）のｐＨ条件下で安定である。
【００８２】
また、本発明のキチナーゼを製造する方法も本発明に含まれる。
【００８３】
アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株を初めとするキチナーゼ産生微生物を培地で培養することにより、キチナーゼを生産することができる。例えば、０．１〜５．０％マルトエクストラクト（Difco（株）製）、０．１〜１．０％イーストエキストラクト（Difco（株）製）、０．０５〜１．０％キチンあるいは０．０５〜１．０％キトサンの培地で、１６〜４５℃で１〜１５日間、１００〜２５０ｒｍｐで振とう培養する。
【００８４】
アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara  ＪＣＭ  ２０６７株、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の酵素は、次の各点が共通である。
１）弱酸性で最も高い部分アセチル化キトサン分解活性を有する。
２）３０％アセチル化キトサンに対する、ｐＨ４．０〜６．０、温度３７℃における１０〜３０分間の加水分解活性を１００％とすると、１％アセチル化キトサンに対する該活性は１５％以下である。
【００８５】
本発明によって得られるキトサン低分子キトサン及び各種塩溶液は、そのまま用いることもできるが、硫安沈殿・有機溶媒沈殿・遠心分離・凍結乾燥・限外濾過等により、濃縮することもできる。また、透析・限外濾過・ゲル濾過・カラムクロマトグラフィー等により精製と脱塩及び分子量分画をすることもできる。
【００８６】
このようにして作製した低分子キトサン塩酸塩は、水に対する溶解性に優れ、最大約10質量％濃度の溶液とすることができる。また、低分子キトサン塩酸塩の１質量％水溶液は、ｐＨ４．９〜５．６を示し、アルカリを添加した場合に沈殿物（コロイド）が析出するｐＨはｐＨ６．６〜７．４である。
【００８７】
ここで作製した低分子キトサン塩酸塩が有する生理活性を、抗菌活性を指標として調べる。抗菌活性を有するための低分子キトサン９Ｂ、８Ｂ、７Ｂ各塩酸塩の最小阻止濃度（Minimum  Inhibitory  Concentration;  MIC）を測定する。高分子キトサン塩酸塩の抗菌活性と比較すると、グラム陽性菌・陰性菌にかかわらず、低分子キトサン塩酸塩は高分子キトサン塩酸塩と同等以上の活性を有している。したがって、低分子キトサンは高分子キトサンと同等以上の優れた生理活性を有している。このことから高分子キトサンが有するとされている抗菌活性は、本発明の低分子キトサンにおいても保持されているものと考えられる。また、皮膚欠損傷動物の治癒試験においても、治癒日数の短縮効果がみられ、動物における生理活性も有している．
このように優れた生理活性を有していることから、本発明で得られる低分子キトサンまたはその塩は、例えば、創傷・褥創用外用剤、床ずれ治療薬、アトピー性皮膚炎治療薬、ニキビ治療薬等の皮膚外用剤、入浴剤、化粧料、洗顔剤、基礎化粧品、虫歯予防薬等の口腔衛生剤、液状洗口剤、歯科向けの素材、腸内細菌改善薬等の整腸剤、院内感染予防薬等の医療分野、ダイエットフード、食品保存剤、防腐剤等の食品添加物分野、動物・魚類用飼料等の分野、植物活性増強剤などの農業分野、水等処理剤、金属吸着剤、原子力廃棄物吸着剤薬剤除法剤等に本発明の低分子キトサンを使用することが考えられるが、用途は特にこれらの例に限定されるものではない。また本発明の低分子キトサンまたはその塩の有効量を動物に投与することを含む、外傷、床ずれ,アトピー性皮膚炎等の疾患の治療方法も本発明に含まれる。また、これらの疾患を治療するための本発明の低分子キトサンまたはその塩の使用も本発明に含まれるものとする。
本発明によって得られる低分子キトサン又は低分子キトサン塩の用法は目的に応じて変わるが、上述のような用途に使用するには、さまざまな形態をとり得る。以下に形態を列挙するが、特に限定されるわけではない。低分子キトサンは、固体のまま用いることができる。また、10質量％濃度の水溶液あるいは有機溶媒溶液、さらに適宜これを希釈して任意の濃度で用いることができる。希釈剤は水あるいは有機溶媒（アルコール類など）等を使用することができる。最終的にpHが6.5より酸性であれば溶液として、アルカリ性であればコロイド状化合物として使用できるが、塩の種類によっては弱アルカリ性でも溶液として使用できる。さらに、無機物あるいは有機物を共存させることにより、任意のpHで溶液として用いることができる。また、低分子キトサン溶液あるいは希釈溶液を10質量％以下の任意の濃度においてクリーム基材と混合することにより、クリーム剤として使用することができる。低分子キトサン溶液あるいは希釈溶液を、任意の厚さを有するフィルムとして使用することができる。プラスチック様の硬さを有するフィルムは、低分子キトサン溶液を、さまざまな厚さを有する枠の中で乾燥させることにより得られる。また、柔軟性を有する軟質シートは、低分子キトサン溶液に例えばグリセリン等の溶剤を任意の割合で混合して、さまざまな厚さを有する枠の中で乾燥させることにより得られる。柔軟性の度合いは、例えばグリセリン等の溶剤を加える割合で調節される。さらに、キトサンーメチルセルロ−ス複合フィルムは、低分子キトサン溶液にメチルセルロースを混合し、さまざまな厚さを有する枠の中で乾燥させることにより得られる。
【００８８】
用量は、疾患の種類、症状、患者の性別、年令、剤型、投与法に応じて変わるが、安全性が高いので、任意の量を用いることができる。生体に投与する場合には2g/kg体重以下が好ましく、それ以外の場合には、適宜調節される。
また、本発明のキチナーゼは、扱いにくい試料をより扱い易くする為にも有効に用いる事ができる。従来、甲殻類などを含む試料を、粉砕する，すり潰す、ミキサーにかけるなどの加工をした場合、粘度が非常に高くなり、扱いにくかった。これは、これら甲殻類に大量に含まれる高分子多糖（主成分は高分子部分アセチル化キトサン）が原因であった。たとえば、このような食品加工の過程に、本発明のキチナーゼを加えて反応させ、その液性成分中の高分子部分アセチル化キトサンを分解し、その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない、扱い易い試料を製造することが可能であり、キチナーゼを用いた該扱い易い試料の製造方法も本発明に含まれる。このような製造方法に用いる原材料としては、高分子部分アセチル化キトサンを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくは、甲殻類を含む試料であり，より好ましくはエビおよびカニのいずれか一つまたは両方を含む試料である。原材料とキチナーゼの反応条件としては上記のキトサン分解活性を発揮する条件を適用することができる。反応時間は１０分以上であって、試料の粘度が低い状態になる時間であれば特に限定されないが、好ましくは１０分間から１０日間程度であり、より好ましくは１日間から５日間程度である。また、このような方法によって製造された試料も本発明に含まれる。
【００８９】
「その液性成分中に高分子部分アセチル化キトサンを実質的に含まない」とは、試料に高分子部分アセチル化キトサンが含有される事によりもたらされる、高い粘性が減少または消失した状態を指し、厳密に濃度として０％であることを指さないが、好ましくは高分子部分アセチル化キトサンの含有量が２０％以下であり、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、最適には０％である。
【００９０】
【実施例】
以下に、実施例及び試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００９１】
実施例１．アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ２０６７株からのキチナーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表６の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara  ＪＣＭ  ２０６７株の菌体を接種し、２６℃にて８日間、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。
【００９２】
【表６】
培地
――――――――――――――――――――――――――――――
マルトエクストラクト      １０ｇ
イースト・エクストラクト  ５ｇ
粉末キチン                ２ｇ
あるいは  コロイダルキトサン（キミツ化学（株）製）      ２ｇ
純水で１，０００ｍｌとした。
――――――――――――――――――――――――――――――
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【００９３】
２）酵素活性測定法
キチナーゼの加水分解活性は以下のようにして測定した。
【００９４】
▲１▼部分アセチル化キトサンの加水分解反応
キトサン７Ｂ（３０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび酢酸３０μlを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。キトサン８Ｂ（２０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび酢酸５０μlを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。キトサン９Ｂ（１０％アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび酢酸５０μlを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。キトサン１０Ｂ（ほぼ完全な脱アセチル化キトサン、加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水５０ｍｌおよび酢酸９０μlを加え、粉末キトサンを完全に溶解させた。これらのキトサン水溶液１６０μlおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌの混合液に酵素液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で保温して２０分間酵素反応を行った。
【００９５】
▲２▼ランドル・モーガン法による遊離還元糖の定量
アセチルアセトン１０μｌを０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５００μｌに溶かした溶液４００μｌを酵素反応液に加えて反応を停止させた後、１００℃で２０分間保温した。氷冷後、Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノベンズアルデビド０．８ｇをエタノール３０ｍｌ及び濃塩酸３０ｍｌに溶解した混合溶液４００μｌとエタノール１２００μlを酵素反応溶液に加え、６５℃で１０分間発色反応をさせた。氷冷後、沈殿物を遠心分離し上清の５３０  ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素反応1分間当たり１μｍｏｌのグルコサミンを生成する酵素活性を1単位とした。
【００９６】
３）粗精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液５００ｍｌに、氷冷下攪拌しながら硫酸アンモニウム２８０ｇを徐々に加えた。混合溶液を一晩４℃で静置したのち、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３，０００ｍｌに対して１２時間ずつ５回透析した。これを、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）に添加し、吸着させた。１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で該カラム十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ｍｌ中に０乃至０．４Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キトサン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．２０Ｍ乃至０．３０Ｍの画分（１３５ｍｌ）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【００９７】
４）精製酵素溶液の調製
３）で得られた活性画分１３５  ｍｌを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３，０００ｍｌに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に添加し、吸着させた。該カラムを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ｍｌ中に０乃至０．１５  Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キトサン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．０５４Ｍ乃至０．０５７Ｍの画分（１０ｍｌ）に溶出された。この画分を精製酵素溶液とした。
【００９８】
５）精製酵素の分子量測定
１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Laemmli,  U.K.,  Nature,  227,  680(1970)参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．ホスホリラーゼ（phosphorylase）、分子量９４，０００：ｂ．アルブミン（albumin）、分子量６７，０００：ｃ．オバルブミン（ovalbumin）、分子量４３０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ（carbonic  anhydrase）、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・インヒビター（trypsin  inhibitor）、分子量２０，１００：ｆ．α−ラクタルブミン（α-lactalbumin）、分子量１４，４００。
これら標準タンパクの移動度から求められた検量線を図１に記載した。図１に示す通り、精製酵素は分子量約４０，０００の単一バンドを示した。
【００９９】
６）精製酵素の等電点
精製酵素を等電点電気泳動（日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ  分離精製、東京化学同人刊（1976年）」262乃至312頁参照）に供した。精製酵素の等電点は約ｐＩ４．５であった。
【０１００】
７）部分アミノ酸配列の決定
精製した酵素溶液を約１ｍｇ/ｍｌ程度まで限外濾過膜（ADVANTEC社製ULTRA  FILTER  UNIT  USY-1、分子量分画1万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液４００μｌにDenature  buffer（６M塩酸グアニジン、１０ｍM  EDTA、０．１M炭酸水素アンモニウムpH  7.8）４００μｌおよび５０ｍM  Dithiothreitol  ８μｌを加え、95℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液にDenature  buffer溶液に溶解した５０ｍM  Iodoacetoamide４０μｌを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液をSlide-A-Lyzer  Mini  Dialysis  Units  Plus  Float（PIERCE社製、分子量分画1万）で水１Lに対して透析した。得られた溶液にトリプシン（Modified、Promega社製）８μｌを加え、37℃で7時間酵素反応させた。反応液をSMART  system（Pharmacia  Biotech社製）にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
カラム：Nomura  Chemical  Develosil  300  CDS-HG-5  (1mm×150mm)
A  buffer：0.1%TFA/Water
B  buffer：0.1%TFA/Acetonitril
グラジエント：5→60%B  1%／分.
Flow：50μｌ/ml
分離した分解アミノ酸のうち、B  buffer濃度１５％程度の2つのピークおよび３５％程度のピークを分取した。この3つ（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３）についてアミノ酸配列解析装置（Procise  cLC、Applied  Biosystem社製）でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をアミノ末端側から記す。
Ｎｏ．１：Glu  Met  Thr  Pro  Tyr  Leu  Asp  Phe  Tyr  Arg  Leu  Met  Ala  Tyr  Gln（配列表の配列番号１）；
Ｎｏ．２：Ile  Val  Val  Gly  Met  Pro  Ile  Tyr  Gly  Arg  Lys  Glu（配列表の配列番号２）；
Ｎｏ．３：Ala  Leu  Pro  Lys  Pro  Gly  Ala  Thr  Glu  Tyr  Val  Asp  Pro  Ser  Ile（配列表の配列番号３）。
【０１０１】
実施例２．アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株からのキチナーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表７の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株の菌体を接種し、２６℃にて８日間、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。培養終了後、４℃条件下、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１０２】
【表７】
培地
――――――――――――――――――――
マルトエクストラクト      １０ｇ
イースト・エクストラクト  ５ｇ
粉末キチン                ５ｇ
純水で１，０００ｍｌとした。
――――――――――――――――――――
２）精製酵素溶液の調製
１）で得られた粗酵素液２００ｍｌに、氷冷下攪拌しながら硫酸アンモニウム１１２ｇを徐々に加えた。混合溶液を一晩４℃で静置したのち、２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３，０００ｍｌに対して１２時間ずつ５回透析し、これを粗精製酵素画分とした。予め２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に粗精製酵素画分を添加し、吸着させた。該カラムを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ｍｌ中に０乃至０．１５  Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キトサン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．０６３Ｍ乃至０．０６６Ｍの画分（１０ｍｌ）に溶出された。この画分を精製酵素溶液とした。
【０１０３】
３）精製酵素の分子量
実施例１  ５）と同じ方法で分子量を測定した。本酵素は分子量約４０，０００の単一バンドを示した。
【０１０４】
４）精製酵素の等電点
実施例１  ６）と同じ方法で等電点を測定した。本酵素の等電点は約ｐＩ３．５であった。
【０１０５】
実施例３．アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株からのキチナーゼの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表８の組成の培地１００ｍｌが入っている５００ｍｌ容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株の菌体を接種し、２６℃にて８日間、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。培養終了後、４℃条件下、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１０６】
【表８】
培地
――――――――――――――――――――
マルトエクストラクト      １０ｇ
イースト・エクストラクト  ５ｇ
粉末キチン                ５ｇ
純水で１，０００ｍｌとした。
――――――――――――――――――――
２）精製酵素溶液の調製
１）で得られた粗酵素液２００ｍｌに、氷冷下攪拌しながら硫酸アンモニウム１１２ｇを徐々に加えた。混合溶液を一晩４℃で静置したのち、２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３，０００ｍｌに対して１２時間ずつ５回透析し、これを粗精製酵素画分とした。予め２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に粗精製酵素画分を添加し、吸着させた。該カラムを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ｍｌ中に０乃至０．１５  Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。キトサン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．０６２Ｍ乃至０．０６４Ｍの画分（１０ｍｌ）に溶出された。この画分を精製酵素溶液とした。
３）精製酵素の分子量
実施例１  ５）と同じ方法で分子量を測定した。本酵素は分子量約４０，０００の単一バンドを示した。
【０１０７】
４）精製酵素酵素の等電点
実施例１  ６）と同じ方法で等電点を測定した。本酵素の等電点は約ｐＩ４．５であった。
実施例４．  アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株由来キチナーゼを用いた低分子キトサン塩酸塩の調製
キトサン９Ｂあるいはキトサン８Ｂあるいはキトサン７Ｂ、２．０ｇを水８００ｍｌに懸濁し、濃塩酸を加えてｐＨ２．５として粉末を完全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム水でｐＨを５．０に合わせた後、水を加えて全量を１，０００  ｍｌとし、２００  ｍｌずつを５００  ｍｌ三角フラスコに移し、実施例１１）で調製した酵素液１０ｍｌを加え、４０℃で３日間８０ｒｐｍで振とうして酵素反応を行わせた。反応終了後、全ての反応液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水でｐＨ１２以上としたのち、１０，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で沈殿物を得た。回収した沈殿物を２００ｍｌの水に懸濁し、氷冷下濃塩酸を加えてｐＨ２．５として溶解し、分子量分画１０，０００の透析膜を用いて、水に対して透析を行なった。透析終了後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。低分子キトサン９Ｂ塩酸塩は、２．０  ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン８Ｂ塩酸塩が１．６  ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン７Ｂ塩酸塩が０．６  ｇの白色綿状固体として得られた。
【０１０８】
実施例５．  アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来キチナーゼを用いた低分子キトサン塩酸塩の調製
実施例４と同様の方法で低分子キトサン塩酸塩を調製した。酵素液は実施例２  １）で得られたものを用い、酵素反応はｐＨ４．０で行った。低分子キトサン９Ｂ塩酸塩は、１．３ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン８Ｂ塩酸塩が１．３ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン７Ｂ塩酸塩が０．９ｇの白色綿状固体として得られた。
【０１０９】
実施例６．  アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来キチナーゼを用いた低分子キトサン塩酸塩の調製
実施例４と同様の方法で低分子キトサン塩酸塩を調整した。但し、酵素液は実施例３で調整したものを用い、酵素反応はｐＨ４．５で行った。低分子キトサン９Ｂ塩酸塩は、２．１ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン８Ｂ塩酸塩が１．７ｇの白色綿状固体として得られた。低分子キトサン７Ｂ塩酸塩が１．０ｇの白色綿状固体として得られた。
【０１１０】
実施例７．  低分子キトサン塩酸塩のアセチル化度
実施例４〜６にて調製した低分子キトサン塩酸塩１００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、キトサナーゼ１０Ｕ（和光純薬（株）製）を加えて室温で３時間攪拌した。反応溶液を凍結乾燥し、乾燥固体をＤ2Ｏに溶かして1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
アセチル基の３Ｈとアセチル基以外の、水酸基を除く７Ｈとの積分比から、アセチル化度を算出した。結果は表９に示す。
【０１１１】
【表９】
0004204857.tif 000003
実施例８．  ゲル濾過法での分子量分画の決定
分子量マーカーとして、デキストランＴ１０（分子量１０，０００）、Ｔ４０（分子量４０，０００）、Ｔ７０（分子量７０，０００）、Ｔ１１０（分子量１１０，０００）、Ｔ２５０（分子量２５０，０００）（ファルマシア（株）製）の各１％溶液２００μｌを、あらかじめｐＨ４．５の２００ｍＭ酢酸緩衝液で膨潤させたゲル濾過材（Toyopearl  HW55  Fine）をつめたカラム（８６×２ｃｍ）に展開し、１．７５ｍｌずつに分画した。水１容に濃硫酸８容を加えた硫酸液１．８ｍｌ、カルバゾール０．２５ｇをエタノール５０ｍｌに溶かした溶液６０μｌを各々の分画液２００μｌに加え、１００℃で１０分間保温した。氷冷後４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１２】
実施例４、５、６で作製した低分子キトサン塩酸塩の各５％溶液２００μｌを、同様にして１．７５ｍｌずつに分画した。各分画２８０μｌにｐＨ６．５の４００ｍＭ  ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液１００μｌおよびキトサナーゼ１０Ｕ（和光純薬（株）製）を加えて、３７℃で１０分間酵素反応を行なった。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。分子量マーカーと各低分子キトサンについて、最大吸光度を示す分画を１００％とし同一グラフ上にプロットした(図２〜４)。図から推定した低分子キトサンの分子量を表１０にまとめた。
【０１１３】
【表１０】
0004204857.tif 000004
実施例９．アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus  oryzae)由来のキチナーゼをコードするゲノムＤＮＡの分離
９−１）アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus  oryzae)のゲノムDNAの分離アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株を培地（1%  Malt  Extract,  0.5%  Yeast  Extract）100mlにて30℃で4日間振盪培養した後、この培養液をろ過装置を用い、菌体を集菌した。続いて、この菌体を-80℃に冷却した乳鉢に入れ、液体窒素を注いだ。液体窒素を加えながら乳棒を用いて菌体が粉末状になるまで十分砕いた。粉末状の菌体約1.5gを20mlの溶菌バッファー（62.5mM  EDTA、50mM  Tris-HCl、50mM  SDS：pH8.0）に加え、穏やかに攪拌した。次に、これに10mlの9.5M  酢酸アンモニウムを添加し、さらに15mlのTE飽和フェノールを添加し穏やかに攪拌した。この溶液を高速冷却遠心機（日立製ローターNo.3）を用い、4℃,  5000rpmで5分間遠心し、上清を約25ml回収した。回収した上清に15mlのクロロホルムを添加し、穏やかに攪拌した後、4℃,  5000rpmで10分間遠心した。上清を新しいチューブに回収し、上清と等量の2-プロパノールを添加し攪拌した後、4℃,  10000rpmで10分間遠心した。沈殿を400μlのTEに溶解した後、1mlのマイクロチューブに移し、10μlの10mg/ml  リボヌクレアーゼを添加し37℃で20分処理した。次いで、40μlの3M  酢酸ナトリウム、400μl  クロロホルムを添加し攪拌し、室温で10000rpm,  5分間遠心分離した。分離した上清をマイクロチューブに回収し、1mlの100％エタノール（-20℃で冷却）を添加して穏やかに攪拌した。ガラス棒で糸状になったDNAを巻き取り、エタノールをきった後に200μlのTEに溶解させた。
９−２）アスペルギルス・オリザエ・ゲノムDNAライブラリーの作製
９−１）で得られたアスペルギルス・オリザエ・ゲノムDNA10μgを、制限酵素EcoRI（宝酒造社製）10μlを用い、50mM  Tris-HCl（pH7.5)、10mM  MgCl2、1mM  DTT及び100mM  NaClからなる溶液中で、37℃で約2時間切断処理した後、DNAを回収した。アスペルギルス・オリザエ・ゲノムDNAのEcoRI切断産物と、同じくEcoRIで切断されたベクター、pUC118  EcoRI/BAP（宝酒造社製）をRapid  DNA  Ligation  Kit（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いてライゲーションを行い、アスペルギルス・オリザエのゲノムDNAライブラリーとした。
９−３）DIG（ジゴキシゲニン）標識DNAプローブの作製
実施例１で同定した内部アミノ酸配列（配列表の配列番号２）を元に作製したミックスプライマーF21、およびF21を用いてアスペルギルス・オリザエのゲノムライブラリーから同定したオリゴプライマーPR50を合成した。
【０１１４】
F21：5'-attggcataccaacaactatcttagagc-3'  （配列表の配列番号７）
PR50：5'-taaattgacccatatcctctatgcatt-3'  （配列表の配列番号８）
この２種類のプライマーを用いて、アスペルギルス・オリザエのゲノムDNAをテンプレートとしたPCRにより、約800bpのDNAを増やした。このDNAは電気泳動により分離し、アガロースゲルから切り出した後、QIAquick  Gel  Extraction  Kit  （キアゲン社製）を用いて精製した。こうして精製したDNAをDIG  DNA  Labeling  Kit  （ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて標識した。標識の方法は以下の様に行った。まず、精製したDNAを100℃で10分間加熱し、１本鎖にした後、氷上で急冷した。次いで10μl  ヘキサヌクレオチド・ミックス(0.5M  Tris、0.1M  MgCl2、1mM  Dithioerithritol、2mg/ml  BSA；pH7.2)、10μl  ｄNTPラベリング・ミックス(1mM  dATP,  1mM  dCTP,  1mM  dGTP,  0.65mM  dTTP,  0.35mM  DIG-11-dUTP;  pH7.5)、5μl  DNAポリメラーゼ(Klenow  fragment)を加え、滅菌水で全量が100μlになるように調整した。この反応液を37℃で一晩反応させた後、10μl  0.2M  EDTA(pH8.0)を添加して反応を停止させた。次いで、10μl  4N  LiClと500μl  100%エタノール（-20℃で冷却させたもの）を加え、-70℃で30分間静置し、標識されたDNAを沈殿させた。冷却遠心機で4℃、15000rpm、10分間遠心した。エタノールを捨て、100μl  70%エタノール（-20℃で冷却したもの）を添加してペレットを洗浄した後、15000rpm、10分間遠心し、ピペットで完全にエタノールを除去した。ペレットを乾燥した後、50μl  TEに溶解し、25ml  DIG  Easy  Hyb（ロシュ・ダイアグノスティック社製）に加え、キチナーゼ遺伝子プローブとした。
９−４）キチナーゼ遺伝子を含む部分DNAライブラリーの作製
９−１）で得られたアスペルギルス・オリザエ・ゲノムDNA  20μgを制限酵素EcoRIで切断処理を行った後、精製しDNAを回収した。精製したDNAをアガロースゲルで電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにブロッティングを行った。次いで、９−３）で得られたキチナーゼ遺伝子プローブを用い、サザンハイブリダイゼーションを行った結果、キチナーゼ遺伝子を含む一本の単一のバンドが得られた。そこで、次に９−１）で得られたアスペルギルス・オリザエ・ゲノムDNA  80μgを制限酵素EcoRIで切断処理を行った後、精製しDNAを回収した。このDNAをアガロースゲルで電気泳動し、上記のサザンハイブリダイゼーションによって見られたバンドの位置と同じ位置をゲルから切り出し、DNAを抽出した。抽出したDNAをpUC118  EcoRI/BAPベクターにライゲーションを行い、キチナーゼ遺伝子を含むDNAライブラリーとした。
９−５）キチナーゼ遺伝子含有DNAのスクリーニング
９−４）で得たDNAライブラリーにより、大腸菌JM109株（宝酒造社製）を形質転換させた。寒天培地上に形質転換体コロニーを形成させ、その上に、ナイロントランスファーメンブレン（アマシャム社製）を重ねて、メンブレン上にコロニーの一部を移行させた。このメンブレンをアルカリ変性溶液（0.5M  NaOH、3.0M  NaCl）を浸したろ紙上に20分間静置し、その後中和溶液（1M  Tris-HCl  (pH7.5)）を浸したろ紙上に10分間置いた。さらに、2×SSC溶液で振盪しながら洗浄した。次に、このメンブレンをDIG  Easy  Hybでプレハイブリダイゼーションを1時間行った。その後、メンブレンを９−３）で得られたキチナーゼ遺伝子プローブと37℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、常温の2×SSCバッファーで三回洗浄し、さらに53℃に温めた２×ＳＳＣバッファーで二回洗浄した。その後、DIG  Wash  and  Block  Buffer  Set（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて検出を行った。まず、Wash  buffer  (0.1M  マレイン酸、0.15M  NaCl、0.3%  Tween  20：pH7.5)でメンブレンを順化した。次いで、このメンブレンをブロッキング溶液(0.1M  マレイン酸、0.15M  NaCl：pH7.5に10%ブロッキング試薬を含む溶液)に浸して60分間ブロッキングを行い、非特異的な結合をブロッキングした。次に、メンブレンをブロッキング溶液に抗ジゴキシゲニン抗体を10000倍希釈で加えた溶液に浸し、37℃で30分間反応させた後、Wash  Bufferで二回洗浄した。その後、Detection  buffer  (0.1M  Tris-HCl、0.1M  NaCl：pH9.5)でメンブレンを順化した。Detection  bufferにCSPD  (Chemiluminescence  substrate)を100倍希釈で加え、純化したメンブレンに滴下した後、37℃で15分間発色を安定させた。その後Lumi-Film  Chemiluminescent  Detecion  Film（コニカ社製）に感光させ、現像した。その結果、ポジティブシグナルを示すクローンを確認できた。
９−６）組換え体プラスミドDNAの抽出と配列解析
９−５）で得たポジティブシグナルを示すクローンをL-broth（和光純薬工業社製）で一晩培養し、組換え体プラスミドのDNAを抽出した。QIAprep  Spin  Miniprep  Kit  (キアゲン社製)を用い、プラスミドDNAを抽出した。次いで、抽出したDNAをこのプラスミド特有のユニバーサルプライマー、M13M4,  M13RVを用いて配列解析を行い、その結果と９−３）で得られたキチナーゼ遺伝子プローブのヌクレオチド配列とをアラインメントし、キチナーゼの配列を含むことを確認した。キチナーゼの配列を含むことが確認できたプラスミドDNAをGPS-1  Genome  Priming  System（ニューイングランド  バイオ・ラボ社製）を用いて、全体の配列を決定した。手順は、まず上記で抽出したプラスミドDNA  4μlに2μl  10×GPS  Buffer  (250mM  Tris-HCl；pH8.0、20mM  DTT、20mM  ATP、500μg/ml  BSA)、1μl  pGPS1（Transprimer-1  Donor  plasmid）、11μl  滅菌水を加え混合した後、1μl  TnsABC  Transposaseを添加し37℃で10分間結合させた。その後、1μl  Start  Solution  (300mM  magnesium  acetate)を添加し、37℃で1時間反応させた後、75℃で10分間処理することで、反応を停止した。次いで、この反応産物10μlを大腸菌JM109株に形質転換し、アンピシリンとカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。生育してきたコロニーをLB液体培地で一晩培養し、プラスミドDNAを抽出した。この抽出したプラスミドDNAをpGPS1のプライマーであるNプライマーおよびSプライマーで配列をよみ、キチナーゼをコードするゲノム配列の全配列を決定した。
実施例１０．アスペルギルス・オリザエ由来のキチナーゼをコードするｃＤＮＡの同定
１０−１）アスペルギルス・オリザエの全RNAの精製
アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus  oryzae）var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株をPotato  Dextrose培地20mlで30℃、3日間前培養した。その後、液体培地（1%  Malt  Extract、0.5%  Yeast  Extract）に1％植菌し、30℃で3日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、-80℃で冷やした乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。完全に粉末状になった菌体をRneasy  Plant  Mini  Kit  (キアゲン社製)を用いて次のように全RNAの精製を行った。まず粉末状の菌体約1gを4.5ml  RLT  buffer  (β-  Mercaptoethanol)に加え、激しく振とうし菌体を溶解させ、氷上に置いた。0.5mlずつQIAshredderスピンカラムに分注し、室温で15000rpm、2分間遠心した。通過液に0.5倍量のエタノールを添加し、ピペッティングで攪拌した。その後、675μlずつRneasy  Miniスピンカラムに分注し、室温で16000rpm、15秒間遠心した。700μlのRW1  Wash  bufferを加え、同じように室温で16000rpm、15秒間遠心した。次に500μl  RPE  Wash  bufferを添加し、室温で16000rpm、2分間遠心してRNAを洗浄した。スピンカラムをマイクロチューブにセットし、50μlのRnase  free  waterでRNAを溶出させ室温で10000rpm、1分間遠心して回収した。
１０−２）アスペルギルス・オリザエcDNAライブラリーの作製
アスペルギルス・オリザエのcDNAライブラリーは、SMART  cDNA  Library  Construction  Kit  (クロンテック社製)を用いて作製した。まず、滅菌した0.5mlチューブに１０−１）で精製した全RNA  1μgと1μl  SMART  IV  Oligonucleotide、1μl  CDS  III/3'  PCR  Primerを混合し、72℃で2分間インキュベートした。その後、氷上に2分間置き、冷却した。この冷却した試料に2μl  5×  First-Strand  Buffer、1μl  20mM  DTT、1μl  10mM  dNTP  Mixおよび1μl  Power  Script  Reverse  Transcriptaseを添加した。内容物を混合し、42℃で1時間反応させた後、氷上に置き、first-strand  DNA合成を停止させた。次いで、LD  PCRによるcDNAの増幅を行った。PCRチューブに前記のFirst-Strand  DNAを2μl添加し、さらに次の試薬を添加した：80μl  脱イオン水、10μl  10×Advantage2  PCR  Buffer、2μl  50×dNTP  Mix、2μl  5'PCR  Primer、2μl  CDS  III/3'  PCR  Primer、2μl  50×  Advantage2  Polymerase  Mix。このPCRチューブを95℃に予熱したサーマルサイクラーにセットし、95℃で20秒反応させた後、95℃で5秒、68℃で6分のサイクルを20サイクル行った。この反応液（ds  cDNAを含む）50μlを滅菌したチューブに取り、2μl  プロテアーゼKを添加して45℃で20分間インキュベートし、プロテアーゼ処理を行った後、50μlの脱イオン水を添加した。100μl  フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１）を添加し、1分間混合して14000rpmで5分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、100μl  クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。1分間混合した後、再度14000rpmで5分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、10μl  3M  酢酸ナトリウム、1.3μl  グリコーゲン及び260μl  95%エタノール（室温）を加え、直ちに室温で14000rpmで20分間遠心分離した。ピペットで上清を除去し、80%エタノール100μlでペレットを洗浄した後、ペレットを乾燥させた。ペレットを79μl  脱イオン水に溶解した。続いて、制限酵素Sfi  Iによる処理を行った。79μl  cDNA、10μl  10×  Sfi  Buffer、10μl  Sfi  Enzymeおよび1μl  100×  BSAを混合し、試験管を50℃で2時間インキュベートした。その後、2μl  1%  xylene  cyanol染色液を添加した。CHROMA  SPIN-400カラムを使い、cDNAを分子ふるいにかけた。CHROMA  SPINカラムは数回転倒混和してゲルマトリックスを懸濁させ、さらにピペットマンで懸濁した。カラムの蓋を取り、カラムが自然にドリップするように設置した。次にカラムバッファーを静かに添加し、重力で自然にドリップさせた。このバッファーのドリップが終了した後、マトリックスの上面中央にSfi  Iで分解したcDNAサンプルをアプライし、マトリックスの表面に十分吸収させた。表面から液体がなくなり、ドリップが終了したら、600μl  カラムバッファーを添加し、直ちに試験管16本に1滴ずつフラクションを収集した。このフラクションの各3μlをアガロースゲル電気泳動にかけ、ピークフラクションを判定した。cDNAを含むフラクションを収集し、1本の新しい試験管に集めた。この試験管に1/10倍量の酢酸ナトリウム（3M；pH4.8）、1.3μl  グリコーゲン、2.5倍量の95%エタノール（-20℃）を加え、軽く振って混合し、-20℃で一晩インキュベートした。室温で14000rpm、20分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを完全に乾燥させた後、7μl  脱イオン水にペレットを再懸濁した。上記のcDNA  0.5μlを1μl  λTriplEx2ベクター、0.5μl  10×  Ligation  Buffer、0.5μl  ATP、0.5μl  T4  DNA  Ligase���よび2.0μl  脱イオン水と混合し、16℃で一晩インキュベートした。次に、このライゲーションサンプルに対してλファージパッケージング反応を行った。パッケージングにはGigapack  III  Gold  Packaging  Extract（STRATAGENE社製）を用いた。Packaging  Extractが入ったマイクロチューブに上記でライゲーションしたDNAベクターを4μlμl加え、静かにピペッティングで混合した後、室温で2時間インキュベートした。2時間後、500μl  SM  bufferを加え、さらに20μlのクロロホルムを混合した後、軽く遠心分離することによりパッケージング液を調製した。次に、パッケージングしたファージを感染させるホスト細胞を培養した。E.  coli  XL1-Blueの凍結ストックをLB/tetracyclineアガープレートに植菌し、37℃で一晩培養した。生育したシングルコロニーをMgSO4とtetracyclineを含むプレートに移し、37℃で一晩培養した。生育したシングルコロニーを15mlのLB/MgSO4/マルトースブロスに植菌し、培養液のOD600が2.0になるまで37℃で培養した。培養液を5000rpmで5分間を遠心分離し、ペレットを7.5mlの10mM  MgSO4に再懸濁した。パッケージング液を1×λ希釈バッファーで希釈した後、該パッケージング液  1μlを、200μl  E.  coli  XL1-Blue懸濁液に添加し、37℃で15分間吸着させた。該反応液に、融解した2mlのLB/  MgSO4トップアガーを混合し、温めておいたLB/  MgSO4プレートに均等に広げた。室温で10分間冷やし、トップアガーを固めた後、37℃で一晩培養した。得られたプラークをSMバッファーを加えて一晩振とうして溶出させ、アスペルギルス・オリザエｃDNAライブラリーを含むファージを得た。
１０−３）キチナーゼ遺伝子含有ｃＤＮＡのスクリーニング
１０−２）で得たcDNAライブラリーを含むファージを大腸菌XL1-Blue株（クロンテック社製）に感染させた。希釈したファージ1μlを培養した200μl  XL1-Blueに添加し、37℃で10分から15分間吸着させた。2mlの融解したLB/  MgSO4トップアガーを添加し、混合し、温めておいたLB/  MgSO4プレートに注ぎ、プレートをまわしてトップアガーを均等に広げた。室温で10分間冷やし、トップアガーを固めた後、37℃で一晩インキュベートし、寒天培地上にプラークを形成させた。その上に、ナイロントランスファーメンブレン（アマシャム社製）を1分間ほど重ねて、ファージの一部をナイロンメンブレン上に移行させた。このメンブレンをろ紙上で20分間乾燥させた後、アルカリ変性溶液（0.2N  NaOH、1.5M  NaCl）を浸したろ紙上に5分間静置し、その後中和溶液（0.4M  Tris-HCl  (pH7.5)、2×SSC）を浸したろ紙上に5分間置いた。さらに、中和溶液で1分間振盪しながら洗浄した後、2×SSCでさらに5分間洗浄した。フィルターをろ紙上で1時間程乾燥させ、80℃のオーブンで2時間ベーキングを行った。その後、メンブレンをX−３で得られたDNAプローブと37℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、常温の2×SSCバッファーで三回洗浄し、さらに53℃に温めた2×SSCバッファーで二回洗浄した。その後、DIG  Wash  and  Block  Buffer  Set（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて検出を行った。まず、Wash  buffer  (0.1M  マレイン酸、0.15M  NaCl、0.3%  Tween  20；pH7.5)でメンブレンを順化した。次いで、このメンブレンをブロッキング溶液(0.1M  マレイン酸、0.15M  NaCl；pH7.5に10%ブロッキング試薬を含む溶液)に浸して60分間ブロッキングを行い、非特異的な結合をブロッキングした。次に、メンブレンをブロッキング溶液に抗ジゴキシゲニン抗体を10000倍希釈で加えた溶液に浸し、37℃で30分間反応させた後、Wash  Bufferで二回洗浄した。その後、Detection  buffer（0.1M  Tris-HCl、0.1M  NaCl；pH9.5)でメンブレンを順化した。Detection  bufferにCSPD  (Chemiluminescence  substrate)を100倍希釈で加え、純化したメンブレンに滴下した後、37℃で15分間発色を安定させた。その後Lumi-Film  Chemiluminescent  Detecion  Film（コニカ社製）に感光させ、現像し、検出した結果、ポジティブシグナルを示すクローンを検出できた。このポジティブを示すファージプラークを寒天培地ごとくり抜き、SMバッファーに溶解させた後、大腸菌BM25.8株に形質転換させ、形質転換大腸菌株  Escherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２株を得た。この菌株は平成１４年１１月８日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３５を付与された。感染したファージDNAであるλTriplEx-Chitinase-cDNAは、大腸菌BM25.8株の細胞内で環状化し、組換えプラスミドpTriplEx-Chitinase-cDNAとして存在する。得られたEscherichia  coli  BM25.8/pTriplEx-Chitinase-cDNA  ＳＡＮＫ  ７２１０２株のコロニーをLB/Ampicilinブロスで一晩培養し、組換え体プラスミドpTriplEx-Chitinase-cDNAのDNAを抽出した。QIAprep  Spin  Miniprep  Kit  (キアゲン社製)を用い、プラスミドDNAを抽出した。次いで、該プラスミドDNA  4μlに2μl  10×GPS  Buffer  (250mM  Tris-HCl；pH8.0、20mM  DTT、20mM  ATP、500μg/ml  BSA)、1μl  pGPS1  (Transprimer-1  Donor  plasmid)、11μl  滅菌水を加え混合した後、1μl  TnsABC  Transposaseを添加し37℃で10分間結合させた。���の後、1μl  Start  Solution  (300mM  magnesium  acetate)を添加し、37℃で1時間反応させた後、75℃で10分間処理することで、反応を停止した。次いで、この反応産物10μlを大腸菌JM109株に形質転換し、アンピシリンとカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。生育してきたコロニーをLB液体培地で一晩培養し、プラスミドDNAを抽出した。この抽出したプラスミドDNAをpGPS1のプライマーであるNプライマーおよびSプライマーで配列をよみ、アスペルギルス・オリザエのキチナーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した（配列表の配列番号４）。また、配列表の配列番号4に記載のヌクレオチド配列から、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ヌクレオチド番号２４２から２４４番目の“ＡＴＧ”を開始コドンとし、ヌクレオチド番号１４３６から１４３８番目の“ＴＡＧ”を終止コドンとする領域であり、コードするアミノ酸配列は配列表の配列番号５に示される配列であることが推察された。
実施例１１．アスペルギルス・オリザエ由来キチナーゼのＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例１で精製した酵素溶液を約１ｍｇ/ｍｌ程度まで限外濾過膜（ADVANTEC社製ULTRA  FILTER  UNIT  USY-1、分子量分画1万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液４００μｌにDenature  buffer（６M塩酸グアニジン、１０ｍM  EDTA、０．１M炭酸水素アンモニウムpH  7.8）４００μｌおよび５０ｍM  Dithiothreitol ８μｌを加え、95℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液にDenature  buffer溶液に溶解した５０ｍM  Iodoacetoamide４０μｌを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液をSlide-A-Lyzer  Mini  Dialysis  Units  Plus  Float（PIERCE社製、分子量分画1万）で水１Lに対して透析した。得られた溶液にトリプシン（Modified、Promega社製）８μｌを加え、37℃で7時間酵素反応させた。得られた酵素反応液をLC/MS  (Pencon/Q-Tof2)で測定した。Include  massとしてm/z  533を設定し、MS/MSスペクトルを測定した。フラグメントイオンの帰属からN末端アミノ酸はSerであること、Ｎ末端にSer-Ser-Gly-Leu-Lysというアミノ酸配列を含むこと、および、N末端にアセチル基の存在が示唆された（配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から５に記載のアミノ酸配列）。この結果を配列表の配列番号５のアミノ酸配列と照らし合わせると、アスペルギルス・オリザエが産生するキチナーゼは、そのN末端、“Met-Ser-Ser”、が翻訳後修飾をうけて、“Acetyl-Ser-Ser”の形（配列表の配列番号１４）で産生されていることが示唆された。
実施例１２．アスペルギルス・オリザエのキチナーゼ遺伝子の発現
キチナーゼORFの5'末端と3'末端にそれぞれBamHIサイトを接続させたプライマー、BamHI-cDNAおよびcDNA-BamHIを設計し，合成したた。
【０１１５】
BamHI-cDNA：5'-gaggatccatgtcttccggactaaagtcgg-3'  （配列表の配列番号９）
cDNA-BamHI：5'-ctggatccagcgaaaccggctcgcaggttg-3'  （配列表の配列番号１０）
実施例１０−３）で得られた組換えプラスミド、pTriplEx-Chitinase-cDNAを鋳型とし、プライマーとして上記のBamHI-cDNAおよびcDNA-BamHIを用いてPCRを行い、制限酵素サイトを導入したキチナーゼDNAを増幅させた。さらにpCR  2.1-TOPOベクター（インヴィトロジェン社製）に挿入し、大腸菌JM109株に形質転換させ、増幅させた。JM109株を生育させたコロニーをLb/Ampicilinブロスで一晩培養し、プラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを制限酵素BamHIで処理し、キチナーゼORFを切断した。また、この断片を連結させるベクターとして、pQE-60（キアゲン社製）をBamHIで切断し、さらにアルカリフォスファターゼで5'末端にあるリン酸基を除去する処理を行った。その後、TOPO  TA  Cloning  Kit（インヴィトロジェン社製）を用いて上記のキチナーゼORFとライゲーションを行った。該反応液を大腸菌JM109株に形質転換させ、Lb/Ampicilinアガープレートで一晩培養した。生育してきたコロニーをLb/Ampicilinブロス3mlに植菌し、振とうしながら一晩培養した。該培養液からプラスミドDNAをQIAprep  Spin  Miniprep  Kit（キアゲン社製）で抽出し、大腸菌M15[pREP4]株に形質転換した。Lb/Ampicilin、  Kanamaicinアガープレートで一晩培養し、生育してきたコロニーをLb/Ampicilin、  Kanamaicinブロス20mlに植菌し、振とうしながら37℃で一晩培養した。この培養液から2.5mlをLb/Ampicilin、  Kanamicinブロス100mlに植菌し、37℃で培養した。培養開始後1時間後から30分おきにOD600を測定し、0.6−0.7の間になるまで培養後、1mM  IPTGを加えた。IPTG添加後、18℃で培養を続け、４及び6時間後に集菌した。菌体に10ml  PBS(137mM  NaCl、8.1mM  Na2HPO4・12H2O、2.68mM  KCl、1.47mM  KH2PO4)を添加し、ヴォルテックスをかけよく懸濁した。この懸濁液をソニケーションにより、菌体を破砕した後、4℃で8000rpm、5分間遠心分離した。上清100μlを1.5mlチューブに取り、50μl変性剤（6%  SDS、24%  glycerol、12%  β−メルカプトエタノール、0.3M  Tris-HCl  (pH6.8)、0.15%  BPB）を添加し100℃で5分間処理した。この反応液を各サンプル10μlずつe-PAGEL（ATTO社製）で電気泳動した後、Simply  Blue  SafeStain（インヴィトロジェン社製）で染色、検出した。その結果、約44kDa付近に濃いバンドが見られた。
【０１１６】
6時間培養し集菌した菌体の上清中にキチナーゼが存在することは、試験例１−６）に記載のシェールズ法により確認した。
【０１１７】
4時間培養し集菌した菌体の上清は、Hisタグ精製を行った。カラムチューブにNi-NTAアガロースを詰め、0.1M  Tris-HCl  (pH8.0)約10mlで洗浄した後、上清をカラムに吸着させた。次いで、8mlの10mMイミダゾールで非特異的な結合物を洗い流した後、8mlの200mMイミダゾールでカラムに吸着している蛋白質を溶出させ、。この溶出液をe-PAGELで電気泳動した結果、単一のバンドとして現れた。また、この溶出液と実施例１で得られたアスペルギルス・オリザエの培養物から精製したキチナーゼを12.5％アクリルアミドゲルによってＳＤＳ電気泳動を行なった（図３０に示す）。溶出液に含まれる蛋白質の分子量は、アスペルギルス・オリザエ由来の精製キチナーゼよりも少し大きくなっているが、これはＨｉｓタグによるものと考えられ、溶出液に含まれるリコンビナント蛋白質がＨｉｓ融合リコンビナントキチナーゼであることが推察された。この溶出液のキトサン分解活性を試験例１−６）に記載のシェールズ法により測定したところ、２．０U/mlであり、この溶出液に含まれるリコンビナント蛋白質がキチナーゼであることが確認された。なお、１分間に１μmolのアセチルグルコサミンを生成する酵素量を１Uと定義した。
【０１１８】
本発明においてアミノ酸配列が同定されたアスペルギルス・オリザエ由来のキチナーゼは、翻訳後修飾を受ける前の３９９アミノ酸からなるもの（配列表の配列番号５）および翻訳後修飾を受けた３９８アミノ酸からなるもの（配列表の配列番号１４）である。キチナーゼ遺伝子として報告（キチン・キトサン研究  第8巻  第2号  238-239頁  2002年）されているアスペルギルス・オリザエ由来の遺伝子は４３１アミノ酸からなる蛋白質をコードするものであり、コードする蛋白質の活性も不明であるので、本発明のアスペルギルス・オリザエ由来のキチナーゼとは異なる分子であると推測される。
試験例１．アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara  ＪＣＭ  ２０６７株由来のキチナーゼの粗酵素液の諸性質
実施例１．１）で得られた粗酵素液について、活性測定を行なった。
１）加水分解活性
実施例１  ２）の方法にしたがって、還元糖の定量を行った。キトサン７Ｂを基質として測定した場合、上清中１ｍｌあたり４．２×１０-3Ｕの酵素活性を有していた。キトサン７Ｂを基質としたときの酵素活性を１００％としたときの、キトサン１０Ｂ分解活性の相対値を表１１に示す。キトサン７Ｂ分解活性を有し、キトサン１０Ｂ分解活性がほとんどないことが判明した。
【０１１９】
【表１１】
0004204857.tif 000005
２）ｐＨ活性
キトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ緩衝液１００μlの混合液に、酵素液１４０μlを加え撹拌して均一にし、３７℃で２０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１  ２）記載の方法にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．６乃至ｐＨ５．９の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ  ５．９乃至ｐＨ８．２の場合、3-（N-Morpholine）  propanesulfonic  acid（以下「ＭＯＰＳ」と記す)−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．０乃至ｐＨ１０．２の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図５に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．０付近であった。
【０１２０】
３）培養上清中の酵素の温度活性
ｐＨ５．０の条件下において、種々の温度で加水分解活性を測定した。5分間予熱した実施例1で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)１００μｌの混合液に、酵素液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例1にしたがった。最も高い活性を示した温度条件で測定された加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図６にまとめた。
【０１２１】
４）培養上清中の酵素の温度安定性
培養上清中の酵素を種々の温度で３０分間処理した後、その加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２００μｌに、酵素液２８０μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。実施例1で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌに加温処理した酵素液２４０μｌを加え、３７℃で２０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図７にまとめた。
【０１２２】
５）培養上清中の酵素のｐＨ安定性
培養上清４００μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍＭ緩衝液７０μｌ及び水９０μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．９乃至ｐＨ７．３の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．５乃至ｐＨ８．６の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．３乃至ｐＨ１０．４の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ１０．０乃至ｐＨ１１．４の場合、リン酸水素2ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌおよび実施例１  ２）記載の方法で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌの混合液に、加温した酵素混合液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で２０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける加水分解活性を相対値として図８にまとめた。
【０１２３】
６）培養上清中の酵素の基質選択性
次に、ｐＨ５．０における基質選択性を測定した。実施例2で調製した培養上清１０ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１，０００  ｍｌに対して１２時間ごとに３回透析したものを酵素液として用いた。０．２５％  ｗｔ／ｖの基質溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）および水１６０μｌの混合液に酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量はシェールズ法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)参照）により行った。最大活性を示す基質を用いたときの加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表１２に示す。
【０１２４】
【表１２】
――――――――――――――――――――
基質                  相対活性（％）
――――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ        １２．７
キトサン９Ｂ          ７８．９
キトサン８Ｂ          ８２．３
キトサン７Ｂ          １００
グルコールキトサン    １７．７
グルコールキチン      ５２．５
ＣＭ−セルロース        ２．２
リケナン              ３１．６
――――――――――――――――――――
試験例２．アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ
２０６７株由来の粗精製キチナーゼの諸性質
実施例１．２）で得られたアスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株由来の粗精製キチナーゼの諸性質を調べた。
１）粗精製画分中の酵素が有する加水分解活性のｐＨ活性
実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ緩衝液１００μｌの混合液に、酵素液１４０μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して２０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．３乃至ｐＨ５．９の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．９乃至ｐＨ８．５の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．２乃至ｐＨ１０．３の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図９に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．０付近であった。
【０１２５】
２）粗精製画分中の酵素が有する加水分解活性の温度活性
ｐＨ５．０の条件下において、種々の温度で加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）１００μｌの混合液に、酵素液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。最も高い活性を示した温度条件で測定された加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図１０にまとめた。
【０１２６】
３）粗精製画分中の酵素の温度安定性
粗精製画分中の酵素を種々の温度で３０分間処理した後、その加水分解活性を測定した。処理温度に保持した、４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２００μｌおよび酵素液２８０μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。実施例１で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌに加温処理した酵素液２４０μｌを加え、３７℃で２０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図１１にまとめた。
【０１２７】
４）粗精製画分中の酵素のｐＨ安定性
粗精製画分中の酵素４００μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍＭ緩衝液１４０μｌおよび水２０μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．１乃至ｐＨ６．１の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．１乃至ｐＨ８．４の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．０乃至ｐＨ１０．３の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ１０．４乃至ｐＨ１１．４の場合、リン酸水素2ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。４００ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ  5.0)  １００μｌおよび実施例1で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌ混合液に、加温した酵素混合液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で２０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図１２にまとめた。
試験例３．アスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ２０６７株由来の精製キチナーゼの諸性質
実施例１．３）で得られたアスペルギルス・オリザエ  var.  sporoflavus  Ohara    ＪＣＭ  ２０６７株由来の精製キチナーゼの諸性質を調べた。
１）精製酵素が有する加水分解活性のｐＨ活性
実施例１  ２）記載の方法によって作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ緩衝液１００μｌおよび水９０μｌの混合液に、酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して４０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１  ２）記載の方法にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．３乃至ｐＨ５．９の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．９乃至ｐＨ８．４の場合、MOPS-炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．３乃至ｐＨ１０．４の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１３に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．５付近であった。
また、０．２５％  ｗｔ／ｖのグリコールキチン溶液２４０μｌおよび４００ｍＭ緩衝液１５０μｌ及び水１３５μｌの混合液に、酵素液７５μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して３０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量はシェールズ法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)参照）により行った。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．３乃至ｐＨ６．０の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．３乃至ｐＨ７．８の場合、リン酸水素1ナトリウム-リン酸水素2ナトリウム緩衝液：ｐＨ７．３乃至ｐＨ８．７の場合、トリス・塩酸緩衝液：ｐＨ９．３乃至ｐＨ１０．４の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ１０．６乃至ｐＨ１１．５の場合、リン酸水素2ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１４に記載した。至適ｐＨはｐＨ１０付近であった。
【０１２８】
２）精製酵素が有する加水分解活性の温度活性
ｐＨ５．５の条件下において、種々の温度で精製酵素の加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した１）と同様に調製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００  ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００μｌおよび水１００μｌの混合液に、酵素液４０μｌを加え撹拌して均一にし、１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。最も高い活性を示した温度条件で測定された精製酵素の加水分解活性を１００％とし、各温度における精製酵素の加水分解活性を相対値として図１５にまとめた。図１５に示す通り、精製酵素の加水分解活性の最適温度は、ｐＨ  ５．５において６０℃であった。
【０１２９】
３）精製酵素の温度安定性
精製酵素を種々の温度で３０分間処理した後、その加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．５）  ２００μｌおよび水１８０μｌの混合液に、酵素液１００μｌを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。１）と同様に調製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌに加温処理した酵素液２４０μｌを加え、３７℃で４０分間酵素反応を行った。遊離還元糖の定量は実施例１にしたがった。無処理（０℃保温）群の精製酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における精製酵素の加水分解活性を相対値として図１６にまとめた。図１６に示す通り、精製酵素は４５℃以下で安定であった。
【０１３０】
４）精製酵素のｐＨ安定性
精製酵素１５０μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍＭ緩衝液５０μｌを添加し、３７℃にて１時間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．２乃至ｐＨ６．２の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．１乃至ｐＨ８．２の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ８．８乃至ｐＨ１０．１の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．６乃至ｐＨ１１．３の場合、リン酸水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００μｌおよび実施例1で作製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌ及び水７０μｌの混合液に、加温した酵素混合液７０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で４０分間酵素反応を行い、遊離還元糖の定量をした。無処理（０℃保温）群の精製酵素および緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における精製酵素の加水分解活性を相対値として図１７にまとめた。図１７に示す通り、精製酵素はｐＨ５乃至ｐＨ９．５で安定であった。
【０１３１】
５）精製酵素の基質特異性
精製酵素の種々の基質に対する加水分解活性を実施例5の方法にしたがって測定した。但し酵素反応は、ｐＨ５．５及びｐＨ１０．０で行なった。キトサン７Ｂに対する精製酵素の加水分解活性を１００％としたときの、他の各基質に対する精製酵素の加水分解活性を相対値として表１３に記載した。
【０１３２】
【表１３】
0004204857.tif 000006
表１１に示す通り、精製酵素はキトサン７Ｂに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下した。また、精製酵素はキチン加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性は見られなかった。
試験例４．アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来のキチナーゼ粗酵素液の諸性質
１）実施例１  ２）記載の方法にしたがって、還元糖の定量を行った。キトサン７Ｂを基質として測定した場合、上清中１ｍｌあたり３．４×１０-3Ｕの酵素活性を有していた。キトサン７Ｂを基質としたときの酵素活性を１００％としたときの、キトサン１０Ｂ分解活性の相対値を表１４に示す。
【０１３３】
【表１４】
0004204857.tif 000007
キトサン７Ｂ分解活性を有し、キトサン１０Ｂ分解活性がほとんどないことから、上清中にはキチナーゼが生産されていることが判明した。
【０１３４】
２）粗酵素液のｐＨ活性
実施例１  ２）記載の方法にしたがって調製したキトサン７Ｂ溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ緩衝液１００μｌの混合液に粗酵素液１４０μｌを加え撹拌して均一にし、３７℃で保温して２０分間酵素反応を行い、酵素反応後の遊離還元糖の定量を行なった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．７乃至ｐＨ６．０の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．０乃至ｐＨ８．５の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．３乃至ｐＨ１０．４の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１８に記載した。至適ｐＨはｐＨ４．０付近であった。
【０１３５】
３）粗酵素の基質選択性
ｐＨ４．０における基質選択性を測定した。実施例２で得られた調製した培養上清１０ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１，０００  ｍｌに対して１２時間ごとに３回透析したものを酵素液として用いた。０．２５％  ｗｔ／ｖの基質溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）および水１６０μｌの混合液に酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量はシェールズ法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)参照）により行った。最大活性を示す基質を用いたときの加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表１５に示す。
【０１３６】
【表１５】
―――――――――――――――――――――
基質                      相対活性（％）
―――――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ              ８．２
キトサン９Ｂ              ６７．６
キトサン８Ｂ              ７４．４
キトサン７Ｂ            １００
グリコールキトサン          ８．２
グリコールキチン          ２３．３
ＣＭ−セルロース          １１．４
リケナン                  ２５．３
―――――――――――――――――――――
試験例５．アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来のキチナーゼ粗酵素液の諸性質
１）加水分解活性
実施例１  ２）に記載の方法にしたがって還元糖の定量を行った。キトサン７Ｂを基質として測定した場合、上清中１ｍｌあたり２．６×１０-3Ｕの酵素活性を有していた。キトサン７Ｂを基質としたときの酵素活性を１００％としたときの、キトサン１０Ｂ分解活性の相対値を表１６に示す。
【０１３７】
【表１６】
0004204857.tif 000008
キトサン７Ｂ分解活性を有し、キトサン１０Ｂ分解活性がほとんどないことから、上清中にはキチナーゼが生産されていることが判明した。
【０１３８】
２）培養上清中の酵素のｐＨ活性
測定法は実施例６にしたがった。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．８乃至ｐＨ６．３の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．２乃至ｐＨ８．６の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ９．３乃至ｐＨ１０．４の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１９に記載した。至適ｐＨはｐＨ４．５付近であった。
【０１３９】
３）培養上清中の酵素の基質選択性
ｐＨ４．５における基質選択性を測定した。実施例４で調製した培養上清１０ｍｌを１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)１，０００ｍｌに対して１２時間ごとに３回透析したものを酵素液として用いた。０．２５％ｗｔ／ｖの基質溶液１６０μｌおよび４００ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ  4.5)および水１６０μｌの混合液に酵素液５０μｌを加え撹拌して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間酵素反応を行った。酵素反応後の遊離還元糖の定量はシェールズ法（Imoto,  T.  and  Yagashita,  K.,  Agric.  Biol.  Chem.,  35,  1154(1971)参照）により行った。最大活性を示す基質を用いたときの加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表１７に示す。
【０１４０】
【表１７】
――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ          ０
キトサン９Ｂ          ６７．７
キトサン８Ｂ          ７１．６
キトサン７Ｂ        １００
グルコールキトサン      ２．９
グリコールキチン      ８１．９
ＣＭ−セルロース        ０
リケナン              １１．９
――――――――――――――――――
試験例６．  各低分子キトサン塩酸塩の水に対する溶解性
実施例４〜６にて調製した各低分子キトサン塩酸塩１００ｍｇを水１０ｍｌに溶かし、ｐＨを測定した。この溶液に１Ｎ苛性ソーダ水を少しずつ加え、溶液が白濁してコロイドが析出するｐＨを測定した。結果を表１８に示す。
【０１４１】
【表１８】
0004204857.tif 000009
試験例７．  高分子キトサン塩酸塩の調製
キトサン９Ｂ、１ｇを２００ｍｌの水に懸濁し、濃塩酸でｐＨ２．５に合わせて、完全に溶解した。これを水に対して透析後、凍結乾燥を行い、５３７ｍｇの白色綿状固体として、高分子キトサン９Ｂ塩酸塩が得られた。高分子キトサン１０Ｂ及び８Ｂおよび７Ｂ塩酸塩も同じ方法で調製した。各高分子キトサン塩酸塩１００ｍｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、キトサナーゼ２０Ｕ（和光純薬（株）製）を加えて室温で３時間攪拌した。反応溶液を凍結乾燥し、乾燥固体をＤ2Ｏに溶かして1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
アセチル基の３Ｈとアセチル基以外の、水酸基を除く７Ｈとの積分比から、アセチル化度を算出した。結果を表１９に示す。
【０１４２】
【表１９】
0004204857.tif 000010
試験例８．低分子キトサンの抗菌活性
被検菌としてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）  209P  JC-1株及びシュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas  aeruginosa）  PAO1株を被検菌とし、試験例７で作製した高分子キトサン塩酸塩並びに実施例４、実施例５および実施例６にて各種アスペルギルス族由来のキチナーゼを用いて調製した低分子キトサン塩酸塩のＭＩＣを測定した。結果は表１８に示した。
【０１４３】
使用培地
Mueller  Hinton  Broth（Difco（株）製）を用い、いずれもｐＨ６．５に調整した。
【０１４４】
試料菌液の調製
試験に使用する菌を上記培地で一晩培養し、菌数が２×１０6になるように同培地で希釈した。
検体の調製
各低分子キトサン塩酸塩２０ｍｇを蒸留滅菌水に溶かし、１０ｍｌとした。
【０１４５】
試験方法
あらかじめ蒸留滅菌水を希釈液とし、検体溶液の倍数希釈系列を作製しておき、これに上記培地５０μｌ及び試験菌液５０μｌを加え、３７℃で１８時間培養し、ＭＩＣを判定した。結果は表２０に示した。
【０１４６】
【表２０】
0004204857.tif 000011
試験例９．アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの諸性質
実施例２．２）で得られたアスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの諸性質を調べた。
【０１４７】
１）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性のｐＨ活性
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性のｐＨ活性を、試験例３  １）に記載の方法により測定した。最も活性が高かったｐH条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐHにおける酵素の加水分解活性を相対値として図２０に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．０付近であった。
【０１４８】
２）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性の温度活性
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性の温度活性を、試験例３  ２）に記載の方法により測定した。最も活性が高かった温度条件での加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図２１にまとめた。至適温度はｐＨ５．０において６５℃であった。
【０１４９】
３）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性を、試験例３  ３）に記載の方法により測定した。無処置（０℃保温）群の該精製キチナーゼおよび緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図２２にまとめた。該精製キチナーゼは５０℃以下で安定であった。
【０１５０】
４）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性を、試験例３  ４）に記載の方法により測定した。無処置（０℃保温）群の該精製キチナーゼおよび緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図２３にまとめた。該精製キチナーゼはｐＨ４乃至ｐＨ９．５で安定であった。
【０１５１】
５）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの基質特異性
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの基質特異性を、試験例３  ５）に記載の方法により測定した。キトサン７Bに対する、ｐＨ５．０、３７℃、１０分間の条件における該精製キチナーゼの加水分解活性を１００％としたときの、他の各基質に対する該精製キチナーゼの加水分解活性を相対値として表２１に示した。
【０１５２】
【表２１】
――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ          ０
キトサン９Ｂ          ５８．６
キトサン８Ｂ          ７２．４
キトサン７Ｂ        １００
グルコールキトサン      ０
グリコールキチン      ２８．３
ＣＭ−セルロース        ０
リケナン                ４．２
――――――――――――――――――
表２１に示すとおり、アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼはキトサン７Bに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下した。また、該精製キチナーゼはキチン加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性は見られなかった。
【０１５３】
６）アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの部分アミノ酸配列の決定
アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ  １９２８８株由来の精製キチナーゼの部分アミノ酸配列の決定を、実施例１．７）記載の方法でおこなった。分離した分解アミノ酸のうち、B  buffer濃度２８％程度、３０％程度、３５％程度の３つのピークを分取した。この3つについてアミノ酸配列解析装置（Procise  cLC、Applied  Biosystem社製）で配列を解析した。結果をN末端側から記す。
His-Tyr-Pro-Thr-Asp-Ser-Trp-Asn-Asp-Val-Gly-Thr-Asn-Val-Tyr（配列表の配列番号１１）
Ala-Phe-Thr-Asn-Thr-Asp-Gly-Pro-Gly-Thr-Ala-Phe-Ser-Gly-Val（配列表の配列番号１２）
Leu-Ser-Gln-Met-Thr-Pro-Tyr-Leu-Asp-Phe-Tyr-Asn-Leu-Met-Ala-Tyr-Asp-Tyr-Ala-Gly（配列表の配列番号１３）
試験例１０．アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの諸性質
実施例３．２）で得られたアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの諸性質を調べた。
【０１５４】
１）アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性のｐＨ活性
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性のｐＨ活性を、試験例３．１）に記載の方法により測定した。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図２４に記載した。至適ｐＨはｐＨ５．５およびｐＨ９．０付近であった。
【０１５５】
２）アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼが有する加水分解活性の温度活性
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ジャポニクス由来のキチナーゼと異なり、至適ｐＨが２点存在する（試験例１０  １）参照）ため、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの温度活性はこの２点のｐＨにおいて、試験例３  ２）に記載の方法により測定した。最も活性が高かった温度条件での加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図２５（ｐＨ５．５における温度活性）および図２６（ｐＨ９．０における温度活性）にまとめた。至適温度はｐＨ５．５において６０℃、ｐＨ９．０において３５℃であった。
【０１５６】
３）アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ジャポニクス由来のキチナーゼと異なり、至適ｐＨが２点存在する（試験例１０  １）参照）ため、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性はこの２点のｐＨにおいて、試験例３．３）に記載の方法により測定した。無処置（０℃保温）群の該精製キチナーゼおよび緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図２７（ｐＨ５．５における温度安定性）および図２８（ｐＨ９．０における温度安定性）にまとめた。該精製キチナーゼはいずれのｐＨにおいても４０℃以下で安定であった。
【０１５７】
４）アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性を試験例３．４）に記載の方法により測定した。無処置（０℃保温）群の該精製キチナーゼおよび緩衝液の混合液が有する加水分解活性を１００％とし、各ｐHにおける酵素の加水分解活性を相対値として図２９にまとめた。該精製キチナーゼはｐＨ４．５乃至ｐＨ１０で安定であった。
【０１５８】
５）アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの基質特異性
アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼの基質特異性を試験例３．５）に記載の方法により測定した。キトサン８Ｂに対する、ｐＨ５．０、３７℃、１０分間の条件における該精製キチナーゼの加水分解活性を１００％としたときの、他の各基質に対する該精製キチナーゼの加水分解活性を相対値として表２２に示した。
【０１５９】
【表２２】
――――――――――――――――――
基質                相対活性（％）
――――――――――――――――――
キトサン１０Ｂ        １４．３
キトサン９Ｂ          ７３．６
キトサン８Ｂ        １００
キトサン７Ｂ          ９７．４
グルコールキトサン      ０
グリコールキチン      ２３．８
ＣＭ−セルロース        ０
リケナン              ０
――――――――――――――――――
表２２に示すとおり、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ  ２２３８８株由来の精製キチナーゼはキトサン７Bおよび８Bに対して最も加水分解活性が高く、アセチル化度が小さくなるにつれて加水分解活性は低下した。また、該精製キチナーゼはキチン加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性は見られなかった。
製剤例１．5％キトサン軟膏製剤の作製
プロピレングリコール3.0g、パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃に加温し、実施例４にて調製した低分子キトサン９Ｂ塩酸塩5.0gを加えて溶解し、低分子キトサン９Ｂ溶液とした。ステアリン酸3.0g、セタール1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリン酸ポリオキシル40  2.5gを70℃にて加温溶解後、同温度で上記の低分子キトサン９Ｂ溶液を加え、精製水をくわえて全量を100gとし、混合乳化した。乳化後攪拌しながら室温まで冷却し、白色の５％低分子キトサン９B塩酸塩クリーム（5％キトサン軟膏と呼ぶ）を100g得た。
試験例１０．５％キトサン軟膏の外傷治癒試験
ラット皮膚欠損傷モデルでの5％キトサン軟膏の有効性を予知する目的で外傷治癒試験を行なった。
１）試験材料
被験物質としては、製剤例１で調製した5％キトサン軟膏を用いた。対照薬としては、ユーパスタ軟膏（1００ｇ中に精製白糖７０ｇ、ポピドンヨード３ｇを含有、添加物としてポリエチレングリコール、濃グリセリン、ポリオキシエチレン[１６０]ポリオキシプロピレン[３０]グリコール、プルラン、ヨウ化カリウムを含有、製造番号  BA1S、興和株式会社製）を使用した。試験に用いる動物としては、６週齢のSprague-Dawley（SD）系雄性ラット（日本エスエルシー株式会社）を購入して使用した。動物は平均温度23℃、平均湿度55％の環境制御飼育装置（日本クレア株式会社）で固形飼料（マウス・ラット飼育用FR-2、株式会社船橋農場）および水道水を与え、照明時間7時−１９時の条件下で6日間馴化飼育管理を行い実験に用いた。
２）実験方法
７週齢のSD系雄性ラット（体重157.6g乃至235.9g）を1群５匹で６群用いた。ラットの背部被毛を電気バリカンで除毛した後、EBAエバクリーム（東京田辺製薬株式会社製）を塗布し、１５分後に洗浄して脱毛した。背部脱毛部位を７０％エタノールで消毒後、ペントバルビタール・ナトリウム（40mg/kg，i.p.）麻酔下に円形ポンチ（内径15mm）を用いて背部正中線で対称の打ち抜き創を2個所作製した。欠損傷作製24時間後に無処置群、基剤群、被験物質群および対照薬群に各群5匹で群分けし、その後被験物質および対照薬を欠損傷部2箇所に、約0.1g/部位、一日２回、１０日間塗布した。ラットは実験期間中、個別ケージで飼育した。効果の判定はノギスを用いて欠損傷部の長径と短径を測定した。
【０１６０】
治療過程における面積変化は、（測定日の長径×短径／欠損傷作製後の長径×短径）×100の式で面積比（％）を求め、面積比から治療面積（5-15日目）を、完治率は面積比が5％以下を完治例とし治療日数を算出し、表２３に示した。実験結果は平均値±標準偏差で表した。無処理群の13.7±1.3日に対して、5％キトサン軟膏群は12.6±1.9日と治療日数を短縮した。対照薬群では13.6±0.4日と治療日数の改善はみられなかった。
【０１６１】
【表２３】
ラット皮膚欠損傷モデルの治療日数
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
被験物質                        治療日数
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
無処置                          13.7±1.3
５％キトサン                    12.6±1.9
対照薬                          13.6±0.4
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
【０１６２】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明のキチナーゼを用いる事により、分子量１万以上で、中性条件でも可溶な、本発明の低分子キトサン製造することができる。更に本発明の低分子キトサンは優れた抗菌性および外傷治癒効果を示し、本発明の低分子キトサンを有効成分として含有する医薬組成物は、外傷、床ずれ、アトピー性皮膚炎などの治療剤として有用である。また、本発明のキチナーゼを用いて、高分子アセチル化キトサンを含有することにより高い粘度を示す試料を原料として、粘度の低い扱い易い試料を製造することができる。このような試料の製造方法は食品加工の過程で有用である。
【０１６３】
【配列表フリーワード】
配列番号６：キチナーゼ遺伝子プローブ
配列番号７：ＰＣＲプライマー  F21
配列番号８：ＰＣＲプライマー  PR50
配列番号９：ＰＣＲプライマー  BamHI-cDNA
配列番号１０：ＰＣＲプライマー  cDNA-BamHI
【０１６４】
【配列表】
0004204857.tif 000012
0004204857.tif 000013
0004204857.tif 000014
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0004204857.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼの分子量
【図２】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来のキチナーゼを用いて作製した低分子キトサンの分子量分布
【図３】アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来のキチナーゼを用いて作製した低分子キトサンの分子量分布
【図４】アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株の培養上清中のキチナーゼを用いて作製した低分子キトサンの分子量分布
【図５】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７株培養上清中のキチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図６】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７株培養上清中のキチナーゼの活性と温度との関係
【図７】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７株培養上清中のキチナーゼの温度安定性
【図８】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７株培養上清中のキチナーゼのｐＨ安定性
【図９】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の粗精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図１０】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の粗精製キチナーゼの活性と温度との関係
【図１１】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の粗精製キチナーゼのｐＨ安定性
【図１２】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の粗精製キチナーゼの温度安定性
【図１３】キトサン７Ｂを反応基質としたときのアスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図１４】グリコールキチンを反応基質としたときのアスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図１５】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係
【図１６】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼの温度安定性
【図１７】アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性
【図１８】アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株培養上清中のキチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図１９】アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株の培養上清中のキチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図２０】グリコールキチンを反応基質としたときのアスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図２１】アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係
【図２２】アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性
【図２３】アスペルギルス・ジャポニクス  ＳＡＮＫ１９２８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性
【図２４】グリコールキチンを反応基質としたときのアスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼの活性とｐＨとの関係
【図２５】ｐＨ５．５の条件における、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係
【図２６】ｐＨ９．０の条件における、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼの活性と温度との関係
【図２７】ｐＨ５．５の条件における、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性
【図２８】ｐＨ９．０の条件における、アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼの温度安定性
【図２９】アスペルギルス・ソジャエ  ＳＡＮＫ２２３８８株由来の精製キチナーゼのｐＨ安定性
【図３０】キチナーゼのＳＤＳ電気泳動図（12％アクリルアミドゲル、ＣＢＢ染色、レーンＭ：マーカー、レーン１：Ｈｉｓ融合リコンビナントキチナーゼ、レーン２：アスペルギルス・オリザエ var. sporoflavus Ohara ＪＣＭ２０６７由来の精製キチナーゼ）
【図１】
0004204857.tif 000025
【図２】
0004204857.tif 000026
【図３】
0004204857.tif 000027
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004204857.tif 000031
【図８】
0004204857.tif 000032
【図９】
0004204857.tif 000033
【図１０】
0004204857.tif 000034
【図１１】
0004204857.tif 000035
【図１２】
0004204857.tif 000036
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0004204857.tif 000040
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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