(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・チューリンギエンシス単離株PS86Q3(NRRL B-18765)から得られる抗線虫性毒素86Q3(a)またはその抗線虫性断片を、線虫に接触させる段階を含む、線虫を制御する方法。
【請求項２】
毒素が、86Q3(a)である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
毒素が、植物によって産生され、植物中に存在する、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は、1995年10月6日に提出された同時係属中の出願番号第08/540,104号の一部継続出願である。
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）は副芽胞（parasporal）結晶タンパク質封入体により特徴づけられるグラム陽性の芽胞形成性細菌である。これらの封入体はしばしば顕微鏡下で特有の形態をとる結晶として観察される。これらのタンパク質は害虫に対して非常に毒性であることがあり、それらの毒性活性には特異性があり得る。これまでにいくつかのB.t.毒素遺伝子の単離、および配列の決定がなされ、組換えDNAを基にしたB.t.産物が生産され実用化されている。それに加えて、遺伝子操作技術を用いて、これらのB.t.エンドトキシンを農業環境へ運び込む新しいアプローチが開発されつつあり、エンドトキシン遺伝子を用いて遺伝的に改変し昆虫耐性を付与した植物への使用、およびB.t.エンドトキシンの輸送担体として使用するための安定化した完全な微生物細胞に対する使用が含まれる。したがって、B.t.エンドトキシン単離遺伝子は、商業的に価値あるものになりつつある。
過去１０年の間、B.t.殺虫剤の商業的使用は主として鱗翅目昆虫（イモムシ）に属する害虫の狭い範囲に限られていた。鱗翅目害虫への商業的な殺虫剤としては、長年にわたってB.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）の芽胞および結晶の調製物が用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クルスタキ（kurstaki）HD-1は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を有する、結晶性δ-エンドトキシンを産生する。
しかしながら、近年研究者達はもっと広い害虫に対して特異性を持つB.t.殺虫剤を発見した。例えば、B.t.の他の種、即ちイスラエレンシス（israelensis）およびモリソニ（morrisoni）（tenebrionis、B.t．M-7、B.t．san diegoとしても知られる）はそれぞれ、双翅目および鞘翅目に属する昆虫を制御するために商業的に用いられている(Gaetner，1989)。さらにCouch，1980およびBeegle，1978、Kriegら，1983にはバチルス・チューリンギエンシス変種テネブリオニス（tenebrionis）が鞘翅目の２種の甲虫に対して有効であることを報告している。これらはコロラドポテトビートルのレプティノターサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスティカ・アルニ（Agelastica alni）である。
近年、B.t．の新しい亜種が同定され、活性のあるδ-エンドトキシンタンパク質の遺伝子が単離された
0004359653.tif 000002
0004359653.tif 000003
およびWhiteleyはB.t.結晶タンパク質遺伝子を４つの主なクラスに分類した。このクラスはCryI(鱗翅目昆虫特異的)、CryII(鱗翅目昆虫および双翅目昆虫特異的)、CryIII(鞘翅目昆虫特異的)、CryIV(双翅目昆虫特異的)である。その他の害虫に対して特異的に毒性を持つ株の発見も報告されている(Feitelsonら，1992)。CryVを線虫特異的な毒素遺伝子のクラスとして定義することも提唱されている。
公表された文献の中で、B.t．の結晶タンパク質遺伝子をクローン化し、大腸菌で発現させたものが記載されている(SchnepfおよびWhiteley，1981)。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号は共に大腸菌内でのB.t.の結晶タンパク質の発現について開示している。米国特許第4,990,332号、第5,039,523号、第5,126,133号、第5,164,180号、および第5,169,629号は鱗翅目昆虫に対して有効なB.t.毒素の開示に関するものである。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号は様々な環境で鞘翅目害虫の制御に使用できるB.チューリンギエンシス株テネブリオニスについて開示している。米国特許第4,918,006号は双翅目昆虫に効果を持つB.t.毒素の開示である。米国特許第5,151,363号および第4,948,734号は線虫に対して有効なB.t.のある単離株について開示している。その他の米国特許の中で線虫に対する効果を開示しているものには、第5,093,120号、第5,236,843号、第5,262,399号、第5,270,448号、第5,281,530号、第5,322,932号、第5,350,577号、第5,426,049号、第5,439,881号がある。精力的な研究と資本投入の結果、新しい単離B.t.株およびB.t.単離株の新しい用法に関するその他の特許が発行されている。その概要はFeitelsonら，1992を参照のこと。しかしながら、新しいB.t.株および既知のB.t.株の新しい用法の発見は未だ経験的で予測できない技術のままである。
好ましくない生物を制御するために化学物質を常時用いると、化学物質に耐性のある株を選択してしまうことがある。化学物質耐性は経済的に重要な昆虫の多くの種で発生し、ヒツジ、ヤギ、およびウマの線虫でも発生してきた。化学物質耐性の発生により、異なる作用機序を持つ新しい制御物質を常に検索することが必要となる。本発明は特に、線虫または鞘翅目害虫に対して有効なB.t.毒素を同定するための材料および方法に関する。鞘翅目害虫の中で特に関心がもたれるのは、トウモロコシルートワームである。
最近、線虫の制御に関して一般的に受け入れられた方法論は、ベンズイミダゾール薬剤およびその類似体を中心とするものであった。これらの薬剤を広範囲に使用することで線虫の集団の中に耐性が発生する例が数多くみられている(Prichardら，1980およびColes，1986)。１０万種を越える線虫が記載されている。
線虫の卵の生存率に関するB.チューリンギエンシス種のデルタエンドトキシンの効果については少数の研究報告がある。Bottjer，BoneおよびGill(1985)は、B.t.クルスタキ（kurstaki）およびB.t.イスラエレンシス（israelensis）がインビトロでは線虫トリコストロンギルス・コルブリフォルミス（Trichostrongylus colubriformis）の卵に毒性であったと報告している。さらに、B.t.のその他の２８株がさまざまな毒性に関して調べられた。IgnoffoおよびDropkin(1977)ではバチルス・チューリンギエンシス(ベータ外毒素)の温度耐性毒素が自由生活性線虫パナグレルス・レディヴィヴス（Panagrellus redivivus）  (Goodey)、植物寄生性線虫メロイドジン・インコグニア（Meloidogyne incognia）（Chitwood）、および菌捕食性線虫アフェレンチュス・アヴェナ（Aphelenchus avena）（Bastien）に対して有効であると報告されている。ベータ外毒素は一般的な細胞毒性物質で、特異性はほとんどまたは全くない。また、CiordiaおよびBizzell(1961)はB.チューリンギエンシスがある種の家畜寄生性線虫に有効であるとする予備的な報告をしている。
経済的な打撃を引き起こす甲虫は数多く存在している。トウモロコシルートワームにはディアブロティカ（Diabrotica）属(例えばD．undecimpunctata undecimpunctata、D．undecimpunctata howardii、D．longicornis、D．virgifera、およびD．balteata)にみられる種が含まれ、トウモロコシやカボチャに重大な被害を引き起こす。米国内のトウモロコシルートワームを制御するだけで、毎年約２億５千万ドルもの殺虫剤が使われている。殺虫剤を使用しても、ルートワームは毎年約７億５千万ドル分の作物の被害を引き起こし、中西部で最も深刻なトウモロコシ害虫となっている。
現在のところ、トウモロコシルートワームの被害を制御する方法は輪作および殺虫剤の使用に限られている。しかし、農地を経済的に有効利用しようとすると輪作は制限されてしまう。それに加えて、北部トウモロコシルートワームは２年休眠する（または越冬する）性質が現れたため、一部の地域では輪作ができなくなっている。
トウモロコシルートワームおよびその他の鞘翅目害虫を制御するために殺虫剤を使用することには、ほかにもいくつかの欠点がある。殺虫剤を常時使用すると、耐性を持つ昆虫を進化させてしまう。殺虫剤の使用により、土壌汚染や地表および地下の水源の汚染など、環境面の問題もしばしば引き起こされる。殺虫剤を使って作業する人間にも害を及ぼす可能性がある。
現在のところ、感受性の宿主および作物にかなりの被害をもたらす多くの線虫および鞘翅目昆虫を制御するためのより効果的な方法が必要とされている。好都合には、そのような効果的な方法は、特定の生物学的因子を用いるものであると考えられる。
線虫およびトウモロコシルートワームに対して有効なバチルス・チューリンギエンシス毒素は知られていない。有効な毒素遺伝子の単離は、経験に基づくゆっくりとした過程であった。Carozziら，1991は毒素遺伝子を同定する方法を記述した。この報告では、線虫に有効な毒素遺伝子およびトウモロコシルートワームに有効な毒素遺伝子に関わる本発見の特異的プライマーおよびプローブについては開示または示唆されていない。米国特許第5,204,237号にはB.t.毒素遺伝子の単離のための特異的および汎用プローブが記述されている。しかしながら、この特許は本発明のプローブおよびプライマーについて記述してはいない。
発明の簡単な概要
本発明は、害虫、特に植物害虫の制御に有用な材料および方法に関する。具体的には本発明は、線虫の制御に有用な新規毒素を提供する。本発明に係る単離株および毒素は、トウモロコシルートワームを含む鞘翅目害虫の制御にも用いることができる。本発明はさらに、これらの毒素をコードする核酸配列を提供する。更に本発明は抗線虫性毒素をコードする遺伝子の同定および特徴づけに有用な塩基配列を提供する。本発明はまた、抗線虫活性を有する新規のバチルス・チューリンギエンシス単離株を提供する。
一つの態様において、本発明はPCR技法における有用なプライマーであるユニークな塩基配列に関する。該プライマーにより、抗線虫活性を有する毒素をコードする遺伝子を特徴とする遺伝子断片が生じ、したがって該プライマーは、特定の毒素遺伝子の同定および単離に用いることができる。
特定の態様において、本発明は毒素をコードする遺伝子の同定に利用できる以下の塩基配列に関する：
１．塩基配列 GATCGTMTWGARTTTRTTCC（配列番号：１）を有する、V3と称される順方向プライマー
２．塩基配列 AAAGTNGATGCMTTATCWGATGA（配列番号：２）を有する、V5と称される順方向プライマー
３．塩基配列 ACACGTATAHDGTTTCTGG（配列番号：３）を有する、V7と称される順方向プライマー
４．塩基配列 TCATCWGATAAKGCATCNAC（配列番号：４）を有する、ΔV5’と称される逆方向プライマー
５．塩基配列 TGGACGDTCTTCAMKAATTTCYAAA（配列番号：５）を有する、ΔV8’と称される逆方向プライマー。
本発明の一態様においては、細菌の高度な増殖をもたらす条件の下でB.t.単離株を培養することができる。１本鎖のゲノム核酸を得るために細菌を処理した後、このＤＮＡを本発明のプライマーと接触させ、PCR増幅を行うことができる。毒素コード遺伝子の特徴的な断片がこの方法によって増幅され、それにより毒素コード遺伝子の存在を同定することができる。特に好ましい態様においては、抗線虫性B.t.毒素をコードする遺伝子の同定のために、プライマー対Ｖ７−ΔＶ８’が用いられる。
本発明のその他の重要な局面は、開示した塩基配列の、線虫に対する活性を有するB.t.毒素をコードする遺伝子検出用プローブとしての使用である。このプローブはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。プローブは通常少なくとも約１０塩基、より一般的には少なくとも約１８塩基を有し、約５０塩基またはそれ以上であってもよいが、このプローブを合成するのであれば、通常は約２００塩基以上とすることはない。しかし、より長いプローブも容易に利用でき、たとえば数千塩基の長さであってもよい。このプローブの配列は目的の毒素をコードする遺伝子に少なくとも実質的に相補的になるようにデザインする。プローブは、それがハイブリダイズする配列に対して完全に相補的である必要はない。プローブは当業者に公知の技術を用いて標識されていてもよい。
本発明のその他の局面は、本明細書に開示された方法および塩基配列によって同定された遺伝子および単離株を含む。こうして同定された遺伝子は、線虫に対する活性を持った毒素をコードすると考えられる。また単離株も同様に線虫に対する活性を有すると考えられる。
本発明による新規な抗線虫性B.t.単離株は、PS32B、PS49C、PS52E3、PS54G2、PS101CC3、PS178D4、PS185L2、PS197P3、PS242B6、PS242G4、PS242H10、PS242K17、PS244A2、およびPS244D1を含む。
本発明の更に他の局面は、既知のB.t.単離株および毒素からの新しい抗線虫活性の発見である。特に本明細書にはPS86Q3およびPS201T6、ならびにその毒素が線虫の制御に利用できることを示した。好ましい態様によれば、86Q3a遺伝子の産物およびその断片が線虫病の制御に用いられる。
トウモロコシルートワームに対する活性を有する毒素もまた本発明の局面である。
好ましい態様において、本明細書に開示される抗線虫性毒素をコードする遺伝子は、植物へ害虫に対する耐性を付与することを目的として植物の形質転換に利用される。このような植物の形質転換は、典型的には植物における毒素の発現を最適化する遺伝子の変更を伴う、当業者に公知の技術によって達成できる。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、本発明に係るプライマーとして有用なV3と称される塩基配列である。
配列番号：２は、本発明に係るプライマーとして有用なV5と称される塩基配列である。
配列番号：３は、本発明に係るプライマーとして有用なV7と称される塩基配列である。
配列番号：４は、本発明に係るプライマーとして有用なΔV5’と称される塩基配列である。
配列番号：５は、本発明に係るプライマーとして有用なΔV8’と称される塩基配列である。
配列番号：６は、本発明に従い用いられる１６ＳｒＲＮＡの順方向プライマーである。
配列番号：７は、本発明に従い用いられる１６ｓｒＲＮＡの逆方向プライマーである。
配列番号：８は、本発明に係る毒素１６７Ｐの塩基配列である。
配列番号：９は、毒素１６７Ｐの推定アミノ酸配列である。
発明の詳細な開示
本発明は、害虫の制御に有用な材料および方法に関する。特定の態様において、本発明は新規なバチルス・チューリンギエンシス単離株、および線虫に対する活性を有する毒素に関する。一部の毒素は鞘翅目害虫に対する活性をも備えている。更に本発明は、これらの抗線虫性毒素をコードする新規遺伝子、および有用性を備える毒素をコードするB.t.遺伝子の同定と特徴づけのための新規な方法に関する。
一態様によれば、本発明は線虫類害虫に対する活性を有するタンパク毒素をコードするバチルス・チューリンギエンシス(B.t.)遺伝子の単離および同定のための、ヌクレオチドプライマーとプローブとを含む材料および方法に関する。本明細書に開示した核酸配列は、抗線虫性活性を有する新しいB.t.株の同定にも利用することができる。更に本発明は、本明細書に開示されている材料および方法を用いて同定される遺伝子、単離株、および毒素に関する。
ＤＮＡが塩基相補性と呼ばれる基本的な性状を持っていることはよく知られている。自然界では、通常ＤＮＡは逆向き相補鎖との対の形で存在し、各鎖の塩基は反対側の鎖と対応している。一方の鎖の塩基アデニン（Ａ）は、常にもう一方の鎖の塩基チミン（Ｔ）に対応し、塩基グアニン（Ｇ）は、塩基シトシン（Ｃ）に対応する。塩基はこの法則に従い水素結合能によって２本鎖を維持する。個々の結合は比較的弱いが、多くの隣接する塩基の水素結合の総合的な作用が、塩基スタッキング効果をともなって、２本の相補鎖の安定な接合をもたらす。この結合は高いｐＨや高温といった処理によって破壊され、このような条件は２本鎖の乖離または「変性」をもたらす。ＤＮＡを、塩基が水素結合を形成する熱力学的に好ましい条件に置くと、そのＤＮＡ鎖はアニーリングまたは「ハイブリダイズ」し、もとの二重鎖ＤＮＡを再構成する。適当な条件下で実施されれば、このハイブリダイセーションを高度に特異的にすることができる。すなわち、高度に相補的な鎖だけが、安定な二重鎖構造を形成できる。ハイブリダイゼーションの特異性と反応条件の関係は良く知られている。こうしてハイブリダイゼーションは、２種のＤＮＡの塩基配列が相補的であるか否かの試験に利用される。このハイブリダイゼーションの機構に基づいて、本発明のプローブの使用により、目的のＤＮＡ配列を容易に検出し特徴づけることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列を酵素的に繰り返しプライム合成する。この方法は良く知られており、当業者がよく用いる（Mullisの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、saikiら,1985参照）。ＰＣＲは、標的配列の対向する鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって挟まれた目的のＤＮＡ断片の酵素的な合成に基づいている。プライマーは互いに３’末端が向かい合うように配向されている。鋳型の熱変性、プライマーの相補的配列へのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長というサイクルを繰り返すことによって、ＰＣＲプライマーの５’末端で規定されるセグメントが増幅される。各プライマーの伸長産物は他のプライマーの鋳型として機能するため、各サイクルで前のサイクルで生成されたＤＮＡ断片の量が本質的に倍になる。そのため、数時間のうちに数百万倍以上という指数的な特定の標的断片の蓄積をもたらす。好熱性の細菌であるThermus aquaticusから分離されたＴａｑポリメラーゼのような耐熱性のDNAポリメラーゼを利用することによって、増幅工程は完全に自動化できる。
本発明のＤＮＡ配列はＰＣＲ増幅用のプライマーとして利用することができる。ＰＣＲ増幅の実施に当たり、プライマーと鋳型との間のある程度のミスマッチは許容される。それ故、例示したプライマーの変異、欠失、および挿入（特に５’末端へのヌクレオチドの付加）は、本発明の範囲内である。あるプライマーに対する変異、欠失、および挿入は、当業者に公知の方法によって得ることができる。あるプライマー配列に生じた変異、欠失、挿入により、もとの配列に比べて効率の上昇や低下がおきるかもしれないことに留意することが重要である。効率の違いに関わらず、これらの変異体は本発明の範囲内にある。
加えて、ＰＣＲ増幅したＤＮＡはハイブリダイゼーション用プローブとして用いられる。本発明の塩基配列をプローブとして用いてB.t.ＤＮＡを分析するために、まずそのＤＮＡを二重鎖の形で得ることができる。現在ではＤＮＡを単離するためのいくつかの方法が用いられており、それは当業者にとって周知である。
本発明のプローブとしての使用に関する一つのアプローチには、まず既に開示されている塩基配列と相同なすべてのDNAセグメントを、B.t.単離株のgene bankのサザンブロット分析によって同定することが含まれる。それにより、多くの新しいB.t.単離株およびあるB.t.単離株から発現された個々のエンドトキシンの遺伝子産物の潜在的な効果を、生物学的な分析をせずに、あらかじめ知ることが可能となる。このようなプローブ分析により、多様なB.t.亜種の商業的に価値があると考えられる殺虫性エンドトキシン遺伝子を同定するための迅速な方法が提供される。
本発明に係る有用なハイブリダイゼーション法の一つとして、典型的には目的とするＤＮＡ試料の分離とその化学的な精製という最初の段階が含まれる。細菌の溶解物または細菌由来の核酸の総分画をいずれも利用することができる。細胞は、ＤＮＡ（および／またはＲＮＡ）を放出させるための公知の技術で処理することができる。ＤＮＡ試料は適当な制限酵素で切断することができる。断片はゲル中で電気泳動を通じてサイズによって分離することができ、通常アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルが用いられる。目的の断片は、断片の位置的な情報を保持できるような方法で、メンブランに固定するために転写することができる。メンブランを乾燥させ、その後平衡化させるためにハイブリダイゼーション溶液中に浸漬してプレハイブリダイズさせる。この方法でさまざまな核酸を固相に固定できる。実際の実験におけるこの技術に使用には、実験設備にかかわらず、その後の工程のためにこのＤＮＡの固定が大きな価値を持っている。
詳細なハイブリダイゼーション技術は本発明において本質的なことではない。ハイブリダイゼーション法には改良が施され、それを容易に応用することができる。
当技術分野では良く知られているとおり、プローブ分子と核酸試料とが２つの分子の間の強固な非共有結合によってハイブリダイズする場合、それはプローブと試料とが本質的に同一であることの正当な証明となりうる。プローブに検出可能な標識を施すことにより、既知の方法を用いてプローブハイブリダイゼーションが起きたか否かを確認するための手段が提供される。
プローブとして用いられる本発明のヌクレオチド断片は、通常の方法にしたがってＤＮＡ合成装置により合成することができる。プローブとしてのヌクレオチド断片の使用において、各プローブは放射性標識や非放射性標識を含む当業者に公知の適当な標識で標識される。典型的な放射性標識には、32Ｐ、35Ｓ等が含まれる。放射性同位元素で標識されるプローブは、ＤＮＡ試料に相補的な塩基配列から、ＤＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼを用いた、従来のニックトランスレーション反応によって構築することができる。次にプローブと試料とをハイブリダイゼーション緩衝液中で混合し、アニーリングするまで適当な温度に保持する。その後、メンブランを洗浄して無関係なものを除き、残った試料と結合したプローブ分子とを典型的にはオートラジオグラフィーおよび／または液体シンチレーションカウントにより検出または定量する。合成プローブの場合、プローブに用いるＤＮＡの末端を標識するためにポリヌクレオチドキナーゼやターミナルトランスフェラーゼのような酵素を利用することが最も望ましい。
非放射性標識には、例えばビオチンもしくはサイロキシンのようなリガンド、ならびに加水分解酵素もしくはペルオキシダーゼのような酵素、またはルシフェリンのようなさまざまな化学発光物質、またはフルオレセインやその誘導体のような蛍光物質が含まれる。プローブは国際公開公報第９３／１６０９４号に開示されている内因性の蛍光物質で製造することもできる。プローブは分離を容易にするために、たとえば一方には上述の放射性標識を施し、他方にはビオチン標識を施すというように、両端を違う種類の標識で標識することもできる。
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の特性、論理的にはフィルターに結合しうる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して広範に変動する。一般的に、固定したＤＮＡに対するプローブの結合の割合を増加させるために、プローブを実質的に過剰に適用する。
ハイブリダイゼーションには、いろいろな程度のストリンジェンシーを適用することができる。より厳密な条件の下では、二重鎖の形成により大きな相補性が必要となる。厳密の程度は、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、塩強度、時間等で制御することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、たとえばKellerおよびManak 1987のような当業者に公知の技術によりストリンジェントな条件下で実施する。
二重鎖の形成および安定性は実質的に、ハイブリッドを形成する２本の鎖の相補性に依存するが、上記のとおり、ある程度のミスマッチは許容される。そのため、変異、挿入、および欠失により、対象となる標的ポリヌクレオチドとの安定的なハイブリッドが形成されるのであれば、本発明の塩基配列には、開示した配列の変異（１塩基と複数の両方）挿入、および欠失、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。あるポリヌクレオチド配列における変異、挿入、および欠失は多くの方法によって得ることができ、それらは当業者に公知である。その他の方法も将来的には知られると思われる。
公知の方法を以下に示すが、これに限定されるものではない：
（１）既知の配列に変異、挿入、または欠失を施した人工的な配列を化学的にまたは他の方法で合成し；
（２）新しい配列、または変異、挿入、もしくは欠失したプローブ配列をハイブリダイゼーションにより得るために、本発明の塩基配列をプローブとして用い；そして
（３）インビトロまたはインビボテスト配列を、変異、挿入もしくは欠失させる。
あるプローブから作製される変異、欠失、挿入を有する変異体では、もとの配列に比べて効率の上昇または低下がおきるかもしれないことは重要である。効率の違いに関わらず、これらの変異体は本発明の範囲内にある。
そのため、開示した塩基配列の変異、挿入、および欠失変異体は、当業者に周知の方法により容易に調製することができる。これらの変異体は、変異体がプローブとの実質的な配列相同性を有する限り、本発明のプローブ配列として同様に用いることができる。本明細書で用いられる実質的な配列相同性とは、変異体がもとのプローブと十分に同じように機能しうる相同性を意味する。好ましくはこの相同性は５０％以上、より好ましくはこの相同性が７５％以上、最も好ましくはこの相同性は９０％以上である。意図する能力を達成するための変異体に求められる相同性の程度は、利用したい配列に依存する。変異、挿入、および欠失を有する、配列の機能が改変された変異体、または方法論的な利点が提供されるようせっけされた変異体を得ることは当業者にとっては容易である。
タンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡの塩基配列によって決定することは周知のことである。遺伝子コードの縮重のため、すなわち１つ以上のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）がタンパク質を構成するほとんどのアミノ酸に対して利用され、異なる塩基配列が特定のアミノ酸をコードすることが可能である。そのため、遺伝子コードは次のように表すことができる。
0004359653.tif 000004
説明：３文字の各デオキシヌクレオチドトリプレットは、ｍＲＮＡのトリヌクレオチドに相当し、左が５’末端、右が３’末端となるように記載されている。本明細書において記載されたすべてのＤＮＡ配列は、チミンをウラシルに読み替えてｍＲＮＡに相当する鎖の配列である。文字は、デオキシヌクレオチド配列を構成するプリンまたはピリミジン塩基を表す。
A=アデニン
G=グアニン
C=シトシン
T=チミン
X=YがAまたはGである場合、TまたはC
X=YがCまたはTである場合、C
Y=XがCである場合、A、G、C、またはT
Y=XがTである場合、AまたはG
W=ZがAまたはGである場合、CまたはA
W=ZがCまたはTである場合、C
Z=WがCである場合、A、G、C、またはT
Z=WがAである場合、AまたはG
QR=SがA、G、C、もしくはTGである場合、TC;
またはQR=SがTまたはCである場合、AG
J=AまたはG
K=TまたはC
L=A、T、C、またはG
M=A、C、またはT
上記により、B.t.毒素のアミノ酸配列は、タンパク質の同じアミノ酸配列をコードする等価な塩基配列によってコードすることができるということが示される。したがって本発明は、各々全てがあるタンパク質またはその変異体をコードする様々なポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするプローブを含む。加えて、タンパク質の二次構造を変化させないのであれば、アミノ酸を置き換えても同一の構造と機能を有するタンパク質が構築されることが示されている(Kaiser,E.T.,Kezdy,F.J.［1984］Science 223:249-255)。
本発明に係る有用な５種類のcryV特異的プライマーの配列および長さを表１に示す。
0004359653.tif 000005
以下に示すのは、本発明に係る有用な単離株の特徴を表す表である。
0004359653.tif 000006
0004359653.tif 000007
表２に記載したとおり、本発明に係る有用なB.t.単離株は、「Agricultual Research Service Patent Culture Collection(NRRL)、Northern Regional Research Center（1815 North University Street，Peoria，IIIinois 61604，USA）」に永久寄託されており利用可能である。
本特許出願を目的として寄託された培養物は、37CFR1.14および35U.S.C.122に基づいて米国特許商標局長官によって本特許出願が継続中であると認定される期間においては、培養物の入手が保証されるという条件の下で寄託されている。本特許出願の対応外国出願、またはその継続出願が提出された場合にも、外国特許法による要求にしたがい、寄託物の入手は可能である。ただし寄託物の入手は、官庁の審査によって許可された本出願の特許権を犠牲にして本発明を実施する権限を与えるものではないことを理解すべきである。
更にこれら本発明の培養寄託物は、微生物寄託のためのブダペスト条約（the Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms）の規定に基づいて保存され、公的に入手可能となっている。すなわち寄託物は、寄託物の最新の試料分譲請求の後少なくとも５年間、そしていずれにせよ寄託の日から少なくとも３０年間、または培養物を開示した特許の権利が残存している間は、生存しコンタミネーションのない状態を維持するのに必要なすべての管理がなされる。分譲要求に対して寄託物の状態のために寄託機関が試料の分譲ができないとき、寄託者は寄託物を置き換える義務があることを承認されている。本発明の培養寄託物の公的な分譲に対する全ての制限は、それを開示した特許が認可された後であっても有効である。
本発明の単離株、毒素、および遺伝子を用いた、線虫または鞘翅目昆虫の制御は、当業者に公知のさまざまな方法によって達成される。これらの方法は、たとえば、B.t.単離株の害虫（またはその生息地域）への適用、組換え微生物の害虫（またはその生息地域）への適用、および本発明に係る抗線虫性毒素をコードする遺伝子による植物の形質転換を含む。組換え微生物とは、たとえばB.t.、大腸菌、またはシュードモナス属（Pseudomonas）である。形質転換は、当業者にとって標準的な方法により成される。形質転換に必要な材料は本明細書に開示してあり、または当業者であれば容易に入手できる。たとえば、１６７Ｐ毒素をコードする遺伝子は、配列番号：８として本明細書に記載されている。１６７Ｐ毒素の推定アミノ酸配列は配列番号：９として記載されている。ＰＳ１６７Ｐ単離株の開示は、８０ＪＪ１遺伝子のクローニングについて開示した国際公開公報第９４／１６０７９号に見ることができる。ＰＳ８６Ｑ３に見出された８６Ｑ３（ａ）として知られる抗線虫性毒素は、国際公開公報第９２／２０８０２号に開示された遺伝子によってコードされている。同様に米国特許第５，４８９，４３２号は、本発明に係る抗線虫性毒素をコードする２０１Ｔ６遺伝子を開示している。抗線虫性毒素をコードする遺伝子を有するB.t.単離株もまた、本明細書に記載したとおり既に寄託されている。
以下は、本発明の実行形態を示す実施例である。これらの実施例は、制限につながるものではない。別途注記しない限り、全てのパーセンテージは重量で、また溶液状の混合物の割合については体積で表す。
実施例１−本発明に係る有用なB.t.単離株の培養
B.t.単離株またはその突然変異体の二次培養は以下のペプトン、グルコース、塩からなる培地に植えついで行うことができる。
バクトペプトン  7.5 g/l
グルコース  1.0 g/l
KH2PO4  3.4 g/l
K2HPO4  4.35 g/l
塩溶液  5.0 ml/l
CaCl2溶液  5.0 ml/l
pH 7.2
塩溶液（100ml）
MgSO4・7H2O  2.46 g
MnSO4・H2O  0.04 g
ZnSO4・7H2O  0.28 g
FeSO4・7H2O  0.40 g
CaCl2溶液（100ml）
CaCl2・2H2O  3.66 g
塩溶液およびCaCl2溶液は濾過滅菌し、接種する際にオートクレーブし調製した培地に加える。フラスコは30℃、200 rpmの回転振とう機で64時間培養する。
上記の手順は当技術分野において周知の手順により、大きな発酵槽へ容易に拡大することができる。
上記発酵槽で得られたB.t.芽胞および／または結晶は、当技術分野において周知の手順により単離することができる。一つのよく用いられる手順は、回収した発酵槽の培地を遠心分離などの分離技術に供するものである。
実施例２−線虫の生物検定
C.エレガンス（elegans）の卵は妊娠した成虫の両性固体から回収し、孵化させた後、B.t.を基にした材料を給餌してL1からL2の幼生の集団へ育て、３日間の生物検定を行う。孵化したL1幼虫はバクテリアの餌がなければ15℃で成長も死にもせず２週間以上生存可能である。C.エレガンス（elegans）は毒性のないB.t.芽胞（および結晶）の餌に素早く適応してしまうが、通常のバクテリアの餌である大腸菌に比べると成長は遅い。
この生物検定は、24穴マイクロタイタートレイに入れた300μlの生物検定容量の中に、約100個体のL1またはL2 C.エレガンス（elegans）幼虫を、以下のバクテリア細胞を４つの分量(1，5，10，25 μlの洗浄した生物量)と共に加えることによって確認した。
B.t.PS17  既知の抗線虫性単離株
B.t.PS80JJ1  既知の抗線虫性単離株
B.t.PS167P  既知の抗線虫性単離株
B.t.HD-73  陰性対照株
大腸菌 MC1061株  通常のC.エレガンスの餌
バクテリア無し
３つの抗線虫性単離株と培養した場合すべての線虫は室温で３日後には死滅したが、HD-73 またはMC1061と共にすると完全に成長し成虫になった。５日後にはMC1061の高い分量においては、完全に成長した成虫と共にL2の子孫が観察された。このときHD-73においては完全に成長した成虫だけが生じた。
従って、３つの既知の抗線虫性単離株は全て、検査した内最も低い分量でも、全ての線虫を死滅させたが、毒性のないB.t.株では、検査した内最も高い分量でも子孫に干渉することなく完全な集団増殖が可能であった。
実施例３−ＰＣＲのための細胞ＤＮＡの単離および調製
ＤＮＡは、Spizizenの寒天培地または当技術分野において知られている他の最小寒天培地で約16時間培養した細胞から調製できる。Spizizenのカザミノ酸寒天培地には23.2 g/l Spizizenの最小塩[(NH4)2SO4，120g; K2HPO4，840g; KH2PO4，360g; クエン酸ナトリウム，60g; MgSO4・7H2O，12g; 全1392g]; 1.0 g/l ビタミン不含カザミノ酸; 15.0 g/l ディフコ寒天が含まれる。寒天培地調製時には、混合物を30分間オートクレーブした後、滅菌した50%グルコース溶液を最終濃度0.5%(1/100容) となるよう加える。約16時間細胞を培養した後、約1 cm2分の細胞を寒天から掻き取り、300 μlの10 mM Tris-HCl(pH 8.0)-1 mM EDTAに懸濁する。
プロテイナーゼＫを50μg/ml加えて55℃で15分間インキュベートする。核酸分解活性のない他の適当なプロテアーゼを用いてもよい。その後試料を15分間沸騰水で湯煎しプロテイナーゼを失活させＤＮＡを変性させた。また、このとき不要な成分が沈殿する。その後、試料をエッペンドルフ微量遠心機で室温、14,000 xgで５分間遠心し、細胞片を除く。粗精製ＤＮＡを含む上清を新しいチューブに移し、ＰＣＲ反応まで-20℃で凍結させた。
実施例４−ＰＣＲ増幅
同時増幅ＰＣＲの条件は以下の通りである。
0004359653.tif 000008
試料は前もって94℃、３分間加熱し、氷上で素早く冷却した。0.5 μlのTaqポリメラーゼ(5 units/ml)を加えた後、50 μlのライトミネラルオイルを重層した。サイクル条件は{94℃、１分;  42℃、2分；72℃、3分−5秒/サイクル}を30サイクル繰り返し、ゲル分析まで4℃または-20℃に保持した。
スクリーニングのための各ＰＣＲ反応には内部陽性対照も含めた。即ち、16S rRNA遺伝子の順方向および逆方向のプライマーで、配列中のヌクレオチドの位置が1188〜1370に相当する182 bpの断片がＰＣＲによって増幅される(Ash．C.ら.[1991]Lett．Appl．Microbiol．13: 202〜206)。この長さは、cryV-特異的プライマー対から予測されるいかなる断片よりも短い。２つのrRNAプライマーは、以下の通りである。
0004359653.tif 000009
0004359653.tif 000010
実施例５−オリゴヌクレオチドプライマーを用いた新規の殺虫遺伝子のクローニング
新しいB.t.株の抗線虫性毒素遺伝子は、それらのＤＮＡから、配列番号：４まらは配列番号：５のオリゴヌクレオチドを逆方向プライマーとして、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３のオリゴヌクレオチドを順方向プライマーとして用いて、実施例４に示したような標準的なＰＣＲを行うことにより得ることができる。逆方向プライマーに配列番号：４を、順方向プライマーに配列番号：１を使うと、予想されるＰＣＲ断片はおよそ200から1000 bpになる。逆方向プライマーに配列番号：５を、順方向プライマーに配列番号：１を使うと、予想される断片はおよそ300から1500 bpになる。逆方向プライマーに配列番号：５を、順方向プライマーに配列番号：２を使うと、予想されるＰＣＲ断片はおよそ400から800 bpになる。逆方向プライマーに配列番号：５を、順方向プライマーに配列番号：３を使うと、予想されるＰＣＲ断片はおよそ200から650 bpになる。エンドトキシン遺伝子の全長をクローン化するために、ここに示した長さを持つ増幅されたＤＮＡ断片を放射性標識してプローブとして用いることができる。
実施例６−線虫および鞘翅目昆虫に有効な毒素をコードする遺伝子をB.t.単離株からスクリーニングする
上記のＰＣＲによって大量のB.t.株をスクリーニングした。これらの株のうちいくつかは「cryV陽性」と同定された。好ましい様態において、「cryV陽性」とはV7-ΔV8’のプライマー対（配列番号：３および５）を使ったＰＣＲ増幅でおよそ315〜325 bpの断片を生じる株を指す。最も好ましくは、この断片は約320 bpである。それら１１の株から得られた塩基対断片のおおよその長さは以下の通りであった。
0004359653.tif 000011
実施例７−生物検定の結果
線虫に対する効果の生物検定は実施例３に示した手順で行った。V7-ΔV8’プライマー対を用いたＰＣＲを本明細書で示した手順で行い、多くの単離株の生物検定を行った。V7-ΔV8’プライマー対を使ったＰＣＲで約320 bpの断片が生じた場合、その単離株はcryV陽性と判断した。このプライマー対を用いたＰＣＲで他の長さの断片が生じた場合は、その単離株は「cryV非正常」とした。断片が全く生じなかった場合、その単離株は「cryV陰性」とした。これらの生物検定およびＰＣＲ実験の結果を表７に示す。線虫に対する効果はＰＣＲプロフィールにおける「cryV陽性」と非常に強い相関があることがわかった。ＰＣＲにおいてcryV非正常またはcryV陰性でも、線虫に対する効果は除去されないことに留意されたい。これは、cryV毒素以外にも、線虫に対して効果のある抗線虫性毒素が存在するためである。
0004359653.tif 000012
0004359653.tif 000013
特定の毒素を発現する組換え宿主を作成し、抗線虫活性を評価するために上記と同様に生物検定を行った。これらの検定の結果は表８に示す。
0004359653.tif 000014
実施例８−植物への毒素遺伝子の挿入
本発明の一つの局面は、鞘翅目昆虫および／または線虫の害虫に対して有効な毒素をコードする遺伝子で植物を形質転換させることである。形質転換された植物は、鞘翅目昆虫および／または線虫による攻撃に対して耐性となる。
本明細書に開示したような殺虫性の毒素をコードする遺伝子は、植物の選択性マーカー遺伝子と結合させ植物体内で最適な発現をするように改変し、当技術分野において周知の種々の技術を使って植物細胞のゲノムへ挿入することができる。本発明に従えば被子植物、裸子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含むいかなる植物も使用することができ得る。好ましい植物としては、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、ジャガイモ、アルファルファ、トウモロコシ、イネ、およびコムギが含まれる。形質転換法そのものは本発明にとって重要ではなく、形質転換因子、リポソーム融合、マイクロインジェクション、遺伝子銃、化学物質（PEGまたは塩化カルシウム）によるＤＮＡの取り込み、またはエレクトロポレーションなどの、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはA.リゾゲネス（rhizogenes）を用いるT-DNAによる形質転換、ならびにその他の可能な方法が使用できる。既知の方法の完全な詳細に関する参考文献があり、特にHolstersら，1978; Frommら，1985; Horschら，1985; Herrera-Estrellaら，1983; Crosswayら，1986; Lin，1966; およびSteinkiss & Stabel，1983がある。
形質転換において植物で選択できるマーカーを用いることにより、形質転換した細胞を、挿入したＤＮＡを持たない細胞から選択することができる。植物細胞で使用できるマーカーには様々なものがあるが、一般的には殺生物剤または抗生物質に対する耐性を付与するもので、カナマイシン、G418、ハイグロマイシン、およびフォスフィノトリシンが含まれるが、これに限ったものではない。視覚的マーカーとしては、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、B-peruタンパク質、緑色蛍光タンパク質（GFP）、およびルシフェラーゼが含まれるが、これに限らない。形質転換の後、ＤＮＡが挿入された細胞は決められた培地中での増殖によって選択され、耐性または視覚化によってマーカーの発現が検定される。ＤＮＡが挿入された細胞は植物体へと再生させることができる。安定的に形質転換された植物体が得られる限り、再生に使用する方法は植物組織や形質転換方法によって異なってもよく、本発明にとって重要ではない。しかしながら、例えば懸濁した細胞を形質転換に用いる場合、形質転換細胞は、カルスを形成するよう誘導し、そこからシュートを形成させることができ、それを適当な栄養培地に移して植物体を再生させてもよい。または、胚軸組織または胚などの外植片を形質転換させ、適当な培地でシュート形成させ、根および完全な植物体を形成させることができる。いかなる再生法を用いても、結果として安定的に形質転換された植物が得られ、無性的にも有性的にも形質転換した特性が子孫に伝わることになり、目的を達成するようその特性をより好都合な生殖質に移すため、必要に応じて形質転換植物を非形質転換植物とかけあわせることができる。
本明細書に記載した実施例および様態は例示のみを目的とするものであり、その内容から様々な改変または変更が当業者には示唆されるが、それらは本出願の精神および権限ならびに添付の請求の範囲に含まれるものであることを理解されるべきである。
0004359653.tif 000015
0004359653.tif 000016
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人の情報：
名称：  MYCOGEN CORPORATION
街路名：  5501 Oberlin Drive
市名：  San Diego
州名：  California
国名：  US
郵便番号：  92121
電話番号：  (619)453-8030  ファックス：(619)453-6991
テレックス：
（ii）発明の名称：  抗線虫性バチルス・チューリンギエンシス
（Bacillus thuringiensis）遺伝子、毒素、および単離株の同定およびその利用
（iii）配列数：  9
（iv）文書通信情報：
（A）宛名：  Saliwanchik & Saliwanchik
（B）街路名：  2421 N.W．41st Street，Suite A-1
（C）市名：  Gainesville
（D）州名：  Florida
（E）国名：  USA
（F）郵便番号：  32606
（v）コンピューター読み取りフォーム：
（A）メディア形式：  Floppy disk
（B）コンピューター：  IBM PC compatible
（C）運転システム：  PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア  PatentIn
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：  US
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）親出願データ：
（A）出願番号：  US 08/540,104
（B）出願日：  06-OCT-1995
（C）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（A）氏名：  Saliwanchik，David R.
（B）登録番号：  31,794
（C）参照／明細書番号：  MA94.C1
（ix）電気通信情報：
（A）電話番号：  (352)375-8100
（B）ファックス：  (352)372-5800
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  20塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：１
0004359653.tif 000017
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  23塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0004359653.tif 000018
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  20塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0004359653.tif 000019
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  20塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004359653.tif 000020
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0004359653.tif 000021
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  19塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0004359653.tif 000022
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  17塩基
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（synthetic）
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0004359653.tif 000023
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  3504塩基対
（B）配列の型：  核酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  DNA（genomic）
（vi）起源：
（C）個体・単離クローン名：167P
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0004359653.tif 000024
0004359653.tif 000025
0004359653.tif 000026
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：  1168アミノ酸
（B）配列の型：  アミノ酸
（C）鎖の数：  一本鎖
（D）トポロジー：  直鎖状
（ii）配列の種類：  ペプチド
（vi）起源：
（C）個体・単離クローン名：167p
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0004359653.tif 000027
0004359653.tif 000028
0004359653.tif 000029
0004359653.tif 000030
0004359653.tif 000031
0004359653.tif 000032