(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質
【請求項８】
配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１２】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質
【請求項１４】
配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１８】
配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
以下の（ａ）又は（ｂ）の染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２０】
配列番号７，９，１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号７，９，１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項７，９，１３，１５，１９，２０又は２１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質。
【請求項２５】
請求項５，６，１１，１２，２３又は２４記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項５，６，１１，１２，２３又は２４記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項２７】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２６記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、分裂酵母シゾザッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）に由来するＲｅｃ８コヒ−シンのプロテクタータンパク質Ｓｇｏ１（シュゴシン）や、染色体分配制御活性を有するそのホモログやパラログ、並びにそれらをコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】  真核生物においては、細胞周期がＳ期の間に姉妹染色分体の接着が確立され、Ｇ２期全体を通してＭ期まで保持される。有糸分裂の間、この接着は染色体の全長に沿って破壊され、姉妹染色分体が細胞の反対側へ分配することを可能にし（均等分裂）、各娘細胞が各染色体のコピ−を１つ受け取ることを確実にしている。対照的に、減数分裂は１回のＤＮＡ複製に続く２回の染色体分離からなり、それによって１個のディプロイド生殖細胞から４個のハプロイド配偶子が形成される。減数第一分裂の間、相同染色体（ホモログ）は再結合するためにペアになり、一方のホモログから生成される姉妹染色分体が、他方のホモログから生成される姉妹染色分体に共有結合的に接着する、キアズマを形成する。したがって、ホモログが減数第一分裂で分離するためには、姉妹染色分体の接着は染色体腕部に沿って解離され、キアズマを解離しなくてはならない。しかし、姉妹染色分体の接着は減数第二分裂までセントロメアで保持され、有糸分裂で行うのと同様に姉妹染色分体が分離する場合に、残留した動原体性の接着を利用する。それ故、減数分裂では姉妹染色分体の接着が２段階で解離されることが必要とされる。しかし、減数第一分裂の間のみ、及びセントロメアにおいてのみ、動原体性の接着を保護するための分子機構は、未だ解決されていない（例えば、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３５，６７３−７４５（２００１）参照）。【０００３】  姉妹染色分体の接着の分子的特性と、分裂後期の開始時において姉妹染色分体の接着を解離する機構とに関する重要な手掛かりがある（例えば、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３５，６７３−７４５（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２，２９７−３０１（２０００）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １３，Ｒ１０４−１４（２００３）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７，７５３−７７（２００１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６，３９９−４１４（２００２）参照）。様々な真核生物において、姉妹染色分体の接着は、Ｓｃｃ１（分裂酵母シゾザッカロミセス・ポンベのＲａｄ２１）を含む多サブユニットコヒ−シン複合体に依存している。分裂後期促進複合体（ＡＰＣ）依存性のセキュリンの分解、Ｃｕｔ２／Ｐｄｓ１によって、Ｃｕｔ１／Ｅｓｐ１エンドペプチタ−ゼ（セパラーゼ）を解離することが可能となり、順にＲａｄ２１／Ｓｃｃ１を切断し、姉妹染色分体の接着を解離する。減数分裂の間、コヒ−シンサブユニットＲａｄ２１／Ｓｃｃ１は減数分裂における対応物であるＲｅｃ８によって置換される（例えば、Ｃｅｌｌ  ９８，９１−１０３（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，３５１５−３５２８（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  ４００，４６１−４（１９９９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，１３４９−６０（２００１）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６０，６５７−７０（２００３）参照）。Ｒｅｃ８複合体は減数第一分裂後にセントロメアにのみ存在し、Ｒｅｃ８を枯渇させることによって動原体性の接着が破壊されることから、セントロメアにおけるＲｅｃ８の存在によって、減数第一分裂全体を通して、接着の持続性が与えられると考えられてきた（例えば、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，Ｅ１２���−７（１９９９）参照）。染色体の腕部に沿ったＲｅｃ８は第一分裂後期にセパラーゼによって切断されるが、動原体性Ｒｅｃ８は特異的に第二分裂中期まで保護されることが、いくつかの証拠により示されている（例えば、Ｃｅｌｌ  １０３，３８７−９８（２０００）、Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３）参照）。出芽酵母ＳＰＯ１３は動原体性Ｒｅｃ８の保護に関係しているが（例えば、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６，１６５９−７１（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６，１６７２−８１（２００２）参照）、ＳＰＯ１３は動原体性ではなく、間接的に機能すると考えられる。ショウジョウバエＭＥＩ−Ｓ３３２はセントロメアに存在するタンパク質であり、減数第一分裂の間に動原体性の接着が持続するために必要であり、且つ減数分裂における動原体性の接着のプロテクター候補としての特性を有するが、このような保護の詳細については今のところ解明されていない（例えば、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７，７５３−７７（２００１）、Ｃｅｌｌ  ８３，２４７−２５６（１９９５）参照）。いくつかの生命体においてゲノムシーケンスプロジェクトが完成したにもかかわらず、これらのタンパク質のホモログは出現していないため、保護に関する一般的な見解を形成することができない。同時に、分裂酵母の研究は、動原体性Ｒｅｃ８複合体をリクルートし、減数第一分裂中に動原体性の接着を確実にする、動原体周囲のヘテロクロマチンの重要性に焦点を当てている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，１１５２−５（２００３）参照）。しかし、減数第一分裂において、動原体周囲のヘテロクロマチンだけでは、減数第二分裂に対して、Ｒｅｃ８の特異的な保護を与えることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  ヒトを含めたほとんどの真核生物は、ゲノムの混合を伴う進化的に優れた有性生殖によって子孫を増やしている。染色体を半数にする減数分裂は、有性生殖機構の中核をなす。体細胞分裂では、姉妹染色分体の二つの動原体は反対極から伸びたスピンドル微小管によってとらえられ、腕部と動原体の接着が同時に解除されることにより姉妹染色分体が両極に均等に分配される（均等分裂）。これに対し減数第一分裂では、姉妹染色分体の動原体は同一極から伸びたスピンドル微小管によってとらえられ、動原体の接着が保持されたまま同一極へ分配される（還元分裂）。続く減数第二分裂ではじめて姉妹染色分体の動原体部分の接着が解除されてそれぞれ二極に分かれ、結果として四つのハプロイドの配偶子が正確に作られる。減数分裂特有の還元分裂は、酵母からヒトにいたるほとんどの真核生物に保存された染色体分配様式であるが、その分子レベルの制御機構は長い間謎であった。本発明者は、分裂酵母を用いて、減数分裂特有の染色体接着因子コヒーシンが、この制御において本質的な役割を果たしていることを示してきた（Ｎａｔｕｒｅ  ４００，４６１−４（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，１１５２−５（２００３）及びＮａｔｕｒｅ  ４０９，３５９−３６３（２００１））。本発明の課題は、コヒーシンと協調して減数第一分裂における姉妹動原体の同一方向性及び接着の維持を保証する因子として、分裂酵母シゾザッカロミセス・ポンベに由来する減数分裂特異的な新規動原体タンパク質Ｓｇｏ１（シュゴシン）や、染色体分配制御活性を有するそのホモログやパラログ、並びにそれらをコードするＤＮＡを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  減数分裂には、ハプロイド配偶子を生成する２段階の特殊な核分裂が含まれている。これを達成するために、姉妹染色分体の接着は、初めに第一分裂後期に染色体腕部から、次に第二分裂後期にセントロメアから、段階的な方法で解離されなければならない。特に、減数第一分裂において動原体性の接着を保護する因子については、これまで解明されないままであった。本発明者らは、分裂後期にＲｅｃ８を保護するタンパク質を解明するために、Ｒｅｃ８と共発現する場合、有糸分裂の成長を抑制し、分裂後期における姉妹染色分体の分離を妨げる遺伝子を、分裂酵母遺伝子中にスクリ−ニングした。このアプロ−チにより、分裂酵母におけるＲｅｃ８コヒ−シンのプロテクターである、第一分裂後期において動原体性のＲｅｃ８を分解から保護（守護）する減数分裂特異タンパク質を見い出し、Ｓｇｏ１（シュゴシン；守護神に由来）と命名した。そして、有糸分裂の染色体分離において、シュゴシンが重要な役割を果たすことも見い出した。続いて、出芽酵母のＳｇｏ１ホモログ及び分裂酵母の有糸分裂パラログＳｇｏ２を見い出した。Ｓｇｏ１とショウジョウバエＭＥＩ−Ｓ３３２との間のマージナルな類似性を同定し、他の真核生物におけるＳｇｏ１ホモログも見い出した。また、配列から予測した動物細胞のシュゴシン類似タンパク質が、機能的にも酵母のシュゴシンと保存性があることも見い出した。本発明はこれら知見に基づき完成するに至ったものである。【０００６】
すなわち本発明は、（１）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（２）配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、（３）配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（４）前記（２）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（５）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質に関する。
【０００７】
また本発明は、（７）（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（８）配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、（９）配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（１０）前記（４）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（１１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（１２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質に関する。
【０００８】
本発明はまた、（１３）（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（１４）配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、（１５）配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（１６）前記（６）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（１７）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（１８）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質に関する。
【０００９】
本発明はまた、（１９）（ａ）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質又は（ｂ）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（２０）配列番号７，９，１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（２１）配列番号７，９，１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列又はその相補的配列の全部を含み、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（２２）前記（７），（９），（１３），（１５），（１９），（２０）又は（２１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（２３）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質や、（２４）配列番号８，１０，１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質に関する。
【００１０】  さらに本発明は、（２５）前記（５），（６），（１１），（１２），（２３）又は（２４）記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、（２６）前記（５），（６），（１１），（１２），（２３）又は（２４）記載のタンパク質に特異的に結合する抗体や、（２７）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２６記載の抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のＳｇｏ１とＲｅｃ８との共発現によって、姉妹染色分体は有糸分裂中に分離しないことを示す図である。ａ．内因性プロモータ（ｒａｄ２１＋又はｒｅｃ８＋のための構成性染色質プロモータ、及びＳｇｏ１＋のためのチアミン抑制プロモータＰｎｍｔ１）によって示された遺伝子を発現するｃｅｎ２−ＧＦＰ株を、チアミン枯渇プレート上にストリークした。ｂ．チアミン枯渇の後、３０℃で１５時間培養された、Ｐａｄｈ１−ｒｅｃ８＋Ｐｎｍｔ１−ｓｇｏ１＋細胞の標本。中核結合細胞においてｃｅｎ２−ＧＦＰの不分離（アスタリスク）が認められる。ｃ．ｃｅｎ２−ＧＦＰの不分離をカウントした（ｎ＞１００）。ｄ．Ｐａｄｈ１−ｒｅｃ８＋−ＧＦＰ株を、Ｐｎｍｔ１−ｓｇｏ１＋を用いて、又は用いずに（ｂ）と同様に培養した。間期及び分裂後期における細胞の標本を示す。
【図２】切断不可能なＲｅｃ８の発現によって、有糸分裂において姉妹染色分体の分離が生じることを示す図である。プラスミドｐＲＥＰ４１−ｒｅｃ８−ＲＤＲＤ（切断不可能なＲｅｃ８（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３））を発現する）は、ｃｅｎ２−ＧＦＰ細胞株（＋Ｒｅｃ８−ＲＤＲＤ）の染色体に取り込まれ、細胞をチアミン存在下又は非存在下でプレートにストリークした。コントロールとして、宿主系細胞（−Ｒｅｃ８−ＲＤＲＤ）を同様に培養した。Ｒｅｃ８−ＲＤＲＤがチアミンを含まないプレートでのみ発現することに留意。チアミン枯渇の後、培養液中３０℃で１５時間培養された細胞の標本。
【図３】本発明のＳｇｏ１はＲｅｃ８を保護するために必要とされ、それによって減数第一分裂後期にセントロメアにおいて接着が起こることを示す図である。ａ．ｃｅｎ２−ＧＦＰでマークされたホモログの１つについて、野生型及びｓｇｏ１Δ細胞における減数分裂中の分離を観察した（ｎ＞１７０）。ｃｅｎ２−ＧＦＰ正常の分離パタ−ンが図示されている（左）。ｓｇｏ１Δ細胞の標本が示されている（右）。ｂ．減数第一分裂（ｍｅｓ１Δ抑止）後の姉妹ｃｅｎ２−ＧＦＰドットの分離が、ｓｇｏ１Δ細胞で明らかである。ｃ．第一分裂後期の後期（ｎ＞３０）、及び第二分裂前中期（ｎ＞１００）に示された細胞で、Ｒｅｃ８−ＧＦＰシグナルを観察し、細胞が示す動原体性Ｒｅｃ８−ＧＦＰの頻度をカウントした。ＣＦＰ−Ａｔｂ２（α−２チューブリン）を発現させることにより、スピンドルを可視化した（Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１，８３６−４５（２００１））。ｄ．抗ＧＦＰ抗体を用いたＣｈＩＰアッセイを使用して、減数第一分裂（ｍｅｉ４Δ抑止）の前に、抑止された細胞で指示された染色体のサイト全体におけるＲｅｃ８−ＧＦＰレベルを測定した。下のパネルはシゾサッカロミセス・ポンベ染色体１が模式的に示されており、プライマー（ｃｎｔ、ｉｍｒ，ｄｇ，ｄｈ，ｌｙｓ１，ｍｅｓ１）を使用した。
【図４】本発明のＳｇｏ１は、減数第一分裂中に、動原体周囲領域に局在することを示す図である。ａ．ディプロイドｐａｔ１−１１４／ｐａｔ１−１１４細胞株（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３））の同調的減数分裂をサンプリングし、減数核分裂をＤＡＰ１染色によってモニターし、抗Ｓｇｏ１抗体を用いたウエスタンブロット法により、Ｓｇｏ１のタンパク質レベルを検出した。ｂ．減数細胞内の指示されたステ−ジにおいて、Ｓｇｏ１（緑色）はチューブリン（赤色）及びＤＡＰ１（４’６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）（青色）で対比染色した。ｃ．ｍｉｓ６＋−ＣＦＰを共発現するｓｇｏ１＋−ＧＦＰ細胞を蛍光顕微鏡下で調べた。Ｓｇｏ１−ＧＦＰ（緑色）及びＭｉｓ６−ＣＦＰ（赤色）を重ねた。ｄ．抗ＧＦＰ抗体によるＣｈＩＰアッセイを用いて、第一分裂中期に抑止された細胞の示された染色体のサイト全体における、Ｓｇｏ１−ＧＦＰレベルを測定した。ｍａｔ（接合型遺伝子座におけるヘテロクロマチン領域）及びＴＡＳ（テロメア会合シーケンス）における追加的なプライマーと同時に、図２ｄと同様のプライマーを使用した。ｅ．ＣＦＰ−Ａｔｂ２を発現してスピンドル（赤色）を可視化する示された細胞において、第一分裂中期にＳｇｏ１−ＧＦＰ（緑色）を検出した。ｆ．増殖細胞においてＲｅｃ８−ＨＡがＳｇｏ１−ＦＬＡＧを伴って又は伴わずに発現し、抽出物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。ｇ．減数分裂におけるシュゴシンの作用のモデル。第一分裂後期の開始時に、シュゴシンはセパラーゼによる切断から動原体性Ｒｅｃ８複合体を保護し、それにより減数第二分裂まで動原体性の接着を保存する。シュゴシンは第一分裂後期の間にＡＰＣ依存的に分解する。
【図５】ハプロイドｐａｔ１−１１４細胞株（ｗｔ）、及びｃｕｔ１−２０６又はＰｒａｄ２１−ｓｌｐ１細胞の同調培養におけるＳｇｏ１とＲｅｃ８の発現量の経時変化を示す図である。ｓｌｐ１プロモータがｒａｄ２１と置換されたＰｒａｄ２１−ｓｌｐ１細胞は、ｓｌｐ１＋（ＡＰＣ活性化のために要求される分裂酵母ＣＤＣ２０ホモログ（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７，７４２−５０（１９９７））の発現が減数分裂の間抑制される。減数核分裂をＤＡＰ１染色によりモニターし、Ｓｇｏ１、Ｒｅｃ８及びチューブリン（コントロール）のタンパク質レベルを、それぞれ抗Ｓｇｏ１抗体、抗Ｒｅｃ８抗体及び抗チューブリン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング法で測定した。ｃｕｔ１−２０６細胞が正常な動原体と共にＳｇｏ１の分解を起こすが、Ｒｅｃ８の分解は遅れた。Ｐｒａｄ２１−ｓｌｐ１細胞はＲｅｃ８と同様にＳｇｏ１の分解の遅れを示した。矢印はセパラーゼＣｕｔ１によるＲｅｃ８の切断生成物を示している。
【図６】ｓｇｏ１＋が異所的に発現することにより、ｃｕｔ１−２０６変異体の成長が抑制されることを示す図である。染色体ｓｇｏ１＋プロモータをＰｎｍｔ１又はＰｎｍｔ４１（Ｐｎｍｔ１の弱いバ−ジョン）と交換し、ｃｕｔ１−２０６温度感受性細胞の有糸分裂の成長における影響を調べた。示された細胞を、チアミン非存在下プレートにストリークし、２８℃で３日間培養した。Ｐｎｍｔ１によってＳｇｏ１をある程度発現するｃｕｔ１−２０６細胞は、許容温度であっても有糸分裂の成長を停止したが、ｃｕｔ１＋細胞は正常に成長した。
【図７】動原体における有糸分裂において、本発明のＳｇｏ２は重要な役割を果たすことを示す図である。ａ．０、５又は１０μｇ／ｍｌのＴＢＺを含むＹＥＡプレートに、示された培養体の連続的に希釈物をスポットし、３０℃で３日間培養した。ｂ．指示された系列をＹＥＡプレートにストリークし、３０℃で３日間培養した。ｃ．第一分裂後期に、野生型、及びＣＦＰ−Ａｔｂ２を発現してスピンドル（赤色）を可視化するｂｕｂ１Δ細胞において、Ｓｇｏ２−ＧＦＰ（緑色）を検出した。ＤＮＡをヘキスト（青色）で染色した。分裂後期における野生型細胞についても図示した。ｄ．ｓｇｏ２＋−ＧＦＰ  ｍｉｓ６＋−ＨＡ細胞を固定し、抗ＧＦＰ抗体及び抗ＨＡ抗体で染色した。ｅ．ＣｈＩＰアッセイを用いて、分裂前中期に抑止された細胞又は非同調性細胞で、示された染色体のサイト全体においてＳｇｏ２−ＧＦＰレベルを測定した。
【図８】本発明の出芽酵母シュゴシンＳｃＳｇｏ１の解析結果を示す図である。ａ．増殖中の出芽酵母ＳｃＳＧＯ１−ＧＦＰディプロイドをメタノ−ルで固定し、ＤＡＰ１で対比染色した。ｂ．ＳｃＳＧＯ１−Ｍｙｃ  ＮＤＣ１０−ＨＡ細胞を固定し、ＤＡＰ１並びにＭｙｃ及びＨＡに対する抗体で染色した。ｃ．培養液中で減数分裂を起こすＳｃＳＧＯ１−ＧＦＰディプロイドをメタノ−ルで固定し、ＤＡＰ１で対比染色した。ｄ．０又は１５μｇ／ｍｌのベノミルを含むＹＰＤプレートに、示された培養体の連続的に希釈物をスポットした。ｅ．コロニーセクタリングアッセイにより、野生型（ｗｔ）及びＳｃｓｇｏ１Δ変異体における染色体の損失を解析した。非必須染色体フラグメントの損失は、白色コロニー中の赤色セクタ−となっている。ポジティブコントロールとしてｕｂｒ１Δ変異体を使用した（Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，９５５−９（２００１））。セクタリングコロニーの頻度を図下に示す（ｎ＞１２０）。ｆ．Ｓｃｓｇｏ１ΔテトラッドにおけるｃｅｎＶ−ＧＦＰの分離の標本。テトラッドにおける分離パタ−ンは、ほとんど下に示す３つのうちのいずれかに分類された。各個体群（ｎ＝２００）についても示した。ｇ．ＳｃＳＧＯ１−Ｍｙｃディプロイドは同調的な減数分裂に誘発され、減数第一分裂及び減数第二分裂において、２つのホモログのうち一方をマークされたｃｅｎＶ−ＧＦＰの分離について調べた。細胞は減数第一分裂ではほとんどが還元分離パタ−ンを起こしたが（９６％、ｎ＝２０７）、減数第二分裂では染色体不分離の発生率が高かった（３４％、ｎ＝３２２）。ｈ．ホモログの両方をｃｅｎＶ−ＧＦＰでマークされた細胞は減数分裂に誘発され、抗チューブリン抗体及びＤＡＰ１で対比染色された。第一分裂後期の細胞を、ｃｅｎＶ−ＧＦＰドットについて検査した。ＳｃＳＧＯ１−Ｍｙｃ細胞は姉妹染色分体のいずれかのペアで分断されたｃｅｎＶ−ＧＦＰドットを頻繁に示したが（７２％、ｎ＝１３８）、コントロール野生型細胞は示さなかった（＜２％、ｎ＝１０６）。
【図９】種々の生物における、シュゴシン類似タンパク質のアミノ末端のコイルドコイル領域、及びカルボキシル末端基本領域のシーケンスを示す図である。Ｓｇｏ１のアミノ末端領域における１次配列はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｇｏ１及びＳｇｏ２）、出芽酵母（ＳｃＳｇｏ１）及びアカパンカビ（Ｂ２３Ｇ１．０６０）に保存され、ＭＥＩ−Ｓ３３２を含む他の種のシーケンスは保存されていないが、恐らく全てがコイルドコイルモチ−フを保有している（ＣＯＩＬＳプログラム（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，１１６２−４（１９９１））による予測）。図に示す矢印、アスタリスク及び丸印参照。
【図１０】保存された領域内で生じたｓｇｏ１変異体を調べた結果を示す図である。示されたプラスミドで形質転換されたｈ＋ｓｇｏ１Δ及びｈ−ｓｇｏ１Δｃｅｎ２−ＧＦＰ細胞の双方を、ＳＰＡプレートで混合し、減数第二分裂におけるｃｅｎ２−ＧＦＰの分離についてモニターした。ｓｇｏ１を発現させるために、チアミン抑制ｎｍｔ１プロモータの弱いバ−ジョンを帯びているプラスミドｐＲＥＰ８１を使用した。プラスミドｐＲＥＰ８１−ｓｇｏ１（ｗｔ）を有するコントロール細胞は減数第二分裂において８０％近い分離を示すが、不分離のｓｇｏ１対立遺伝子を発現する細胞は、ランダムな分離（５０％分離）を示した。非保存サイト変異体２９７ＴＡを除き、テストされた変異体はいずれも、このアッセイにｓｇｏ１Δを補完しなかった。２つの独立した実験の平均が示されている（ｎ＞１００）。
【図１１】図１１（ａ）はシュゴシンファミリータンパク質の概要を示す図である。予測されたコイルドコイル（赤色）と保存された基本領域（青色）とが、Ｎ末端領域とＣ末端領域とにそれぞれ存在している。また、図１１（ｂ）はｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後で、ＨｅＬａ細胞抽出物をウェスタンブロットで分析した結果を示す図である。
【図１２】ウサギから調製したｈＳｇｏ１あるいはｈＳｇｏ２に対する抗体で、ＨｅＬａ細胞を染色し（緑色）、同時に、チューブリン抗体およびＤＡＰＩで染色し、それぞれスピンドル（赤色）および染色体ＤＮＡ（青色）で共染色した結果を示す図である。なお、細胞はパラホルムアルデヒドで固定した。
【図１３】分裂前中期および中期のＨｅＬａ細胞を、ｈＳｇｏ１あるいはｈＳｇｏ２に対する抗体で染色し（緑色）、同時にセントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ａに対する抗体（ａ，ｃ；赤色）および減数分裂前期から中期にかけて動原体内部に局在する染色体のパッセンジャータンパク質ＡｕｒｏｒａＢに対する抗体（ｂ，ｄ；赤色）、並びにＤＡＰＩ（青色）で共染色した結果を示す図である。ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれのシグナルも、染色体上のＣＥＮＰ−Ａドットに近接する場所にシグナルが見られた。このことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれもセントロメアタンパク質であることが明らかになった。また、Ｓｇｏ１とＡｕｒｏｒａ  Ｂの位置は、前中期と中期において事実上同じであったが、Ｓｇｏ２はＡｕｒｏｒａ  Ｂのちょうど外側に位置していた。このことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２はいずれも前中期から中期までに動原体内部に位置していることが明かとなった。
【図１４】ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２を標的としたＲＮＡｉ実験をそれぞれ行った結果を示す図である。４８時間後にはいずれのタンパク質の発現も有意に抑制され、その結果、分裂期（図中ｔｏｔａｌ）に停止した細胞が蓄積した。この蓄積は、スピンドルチェックポイント因子ＢｕｂＲ１をＲＮＡｉにより抑制することにより解除されたことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２はセントロメアにおいて、動原体をスピンドルが正しくとらえる過程に直接的あるいは間接的に機能していることが示唆される。
【図１５】ＨｅＬａ細胞を用いて、ｈＳｇｏ１を標的としたＲＮＡｉ実験を行い、細胞をスライドグラス状に広げ、ギムザ染色した結果を示す図である。コントロールの細胞では、姉妹染色分体が動原体部位で強く接着しているが、ｈＳｇｏ１を抑制した細胞では動原体部位の接着が弱くなって、この実験の操作によって離れやすくなっていることが判明した。
【図１６】Ｓｇｏ１及びＢｕｂ１が、有糸分裂における動原体での凝縮に必要であることを示す図である。（ａ）ｓｉＲＮＡで処理で染色体の拡張が、ギムザ染色した有糸分裂中のＨｅＬａ細胞で生じた。代表的な拡張を発生割合と共に示す。各ＲＮＡ干渉に対して、１００以上の前期及び前中期が観察された。姉妹染色分体のペアの一例の拡大図を上部に示す。（ｂ）微小管重合阻害剤（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）で４時間処理した後、染色体拡大がＲＮＡ干渉した細胞で観察された。拡大した例をその割合（ｎ＞１００）と共に示す。（ｃ）ｓｉＲＮＡで処理してから３６時間後に、Ｓｃｃ１−ｍｙｃを発現するＨｅＬａ細胞を固定した。前記細胞を抗ｍｙｃ抗体（緑色）及び抗動原体抗体（ａｎｔｉ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ−ａｎｔｉｂｏｒｙ，ＡＣＡ））（赤色）で免疫染色した。ＤＡＰＩ（青色）でＤＮＡを染色した。（ｄ）Ｓｃｃ１−ｍｙｃ染色を示す細胞の割合を示す。本細胞株において、Ｓｃｃ１−ｍｙｃを発現する細胞は、２５％にも満たなかった。スケールバーは１０μｍを示す。
【図１７】Ｂｕｂ１を標的としたＲＮＡｉ実験をそれぞれ行った結果を示す図である。（Ａ，Ｂ）Ｂｕｂ１を標的としたＲＮＡｉ実験をそれぞれ行った結果、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれのタンパク質のセントロメアへの局在が消失した。（Ｃ，Ｄ）コントロールのＢｕｂＲ１を標的としたＲＮＡｉ実験では、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれのタンパク質のセントロメアへの局在は正常であったことから、Ｂｕｂ１の結果の有意性が保証された。Ｂｕｂ１とＢｕｂＲ１は似ているが異なるタンパク質であり、ｈＳｇｏ１とｈＳｇｏ２のセントロメアへの局在はＢｕｂ１に依存するが（Ａ，Ｂ）、ＢｕｂＲ１には依存しない（Ｃ，Ｄ）ことを示している。
【図１８】マウスのシュゴシン相同遺伝子（配列２１、２３）のｃＤＮＡとＧＦＰ遺伝子を融合したクローンを、レトロウイルスベクターを用いて作製し、ヒトのＨｅＬａ細胞で発現させた結果を示す図である。いずれのＧＦＰ融合タンパク質も、分裂期にヒトの動原体タンパク質Ｂｕｂ１と共局在することがわかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明の対象となるタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質Ｓｇｏ１（シュゴシン）や、該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質Ｓｇｏ１のパラログＳｇｏ２や、該配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる染色体分配制御活性を有するタンパク質Ｓｇｏ１のサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ホモログＳｃＳｇｏ１や、該配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来の染色体分配制御活性を有するタンパク質（ＮＣ）や、該配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号１０又は１２に示されるアミノ酸配列からなるシロイヌナズナ由来の染色体分配制御活性を有するタンパク質（Ａｔ）や、該配列番号１０又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号１４又は１６に示されるアミノ酸配列からなるマウス由来の染色体分配制御活性を有するタンパク質（Ｍｍ）や、該配列番号１４又は１６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質や、配列番号１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるヒト由来の染色体分配制御活性を有するタンパク質（Ｈｓ）や、該配列番号１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記染色体分配制御活性としては、染色体分配を制御する活性であれば特に制限されないが、好ましくは生殖細胞の染色体分配及び／又は体細胞分裂の染色体分配を正しく制御する活性を、より好ましくは減数第一分裂において姉妹染色分体の動原体が離れないように保護（守護）する活性を挙げることができる。なお、本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は酵母、マウス、ヒト等に限定されるものではない。また、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質であるＳｇｏ１（シュゴシン）変異体は、ポイントミューテーション等の公知の遺伝子操作により常法により作製することができる。【００１３】  本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本発明の染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、分裂酵母シゾザッカロミセス・ポンベに由来する配列番号１又は３に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、サッカロミセス・セレビジエに由来する配列番号５に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、ノイロスポラ・クラッサに由来する配列番号７に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、シロイヌナズナに由来する配列番号９又は１１に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、マウスに由来する配列番号１３又は１５に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、ヒトに由来する配列番号１７又は１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなり、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらの配列の一部または全部を含む染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を例示することができる。【００１４】  これらＤＮＡは、そのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えば酵母、マウス、ヒト等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。また、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９等に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、酵母、マウス、ヒト等のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、目的とする染色体分配制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要���としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００１５】  本発明の融合タンパク質としては、前記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリホスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したタンパク質Ｓｇｏ１等の精製や、当該分野の研究用試薬としても有用である。【００１６】  本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記Ｓｇｏ１等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、生体内におけるＳｇｏ１等の局在を明らかにする上で有用である。【００１７】  上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。【００１８】  本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本発明のタンパク質やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、染色体分配制御因子を指標とした癌や不妊症あるいはダウン症などの染色体分配疾患の診断や治療に使用できる可能性がある。【００１９】  また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５��又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。【００２０】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】［方法］
（Ｒｅｃ８プロテクターのスクリーニング）
本発明者らは栄養細胞においてＲｅｃ８と共発現した場合のみ毒性となる遺伝子を調べた。ＧＦＰと融合したシーケンスをコードするＲｅｃ８を、チアミン抑制ｎｍｔ１＋プロモータのもとでｐＲＥＰ８２（ｕｒａ４＋マーカー）にクローニングし、ｐＲＥＰ８２−ｒｅｃ８＋−ＧＦＰを構築した。減数分裂細胞から調製されたｍＲＮＡを用いて構築したシゾサッカロミセス・ポンベｃＤＮＡライブラリー、及びｐＲＥＰ３ベクター（ｎｍｔ１＋プロモータ、ＬＥＵ２＋マーカー）（Ｙ．Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｗ．未発表）を使用した。ｐＲＥＰ８２−ｒｅｃ８＋−ＧＦＰを保有するｌｅｕ１  ｕｒａ４−Ｄ１８細胞はｃＤＮＡライブラリーでトランスフォームし、チアミン（プロモータオフ）を含む寒天プレート上に広げられ、３０℃で３０日間培養された。次に、コロニーが２枚のチアミンを含まない寒天プレート上、すなわち、一方はプラスミドｐＲＥＰ８２−ｒｅｃ８＋−ＧＦＰを欠落した細胞のみが成長することができる、ウラシル及び５’−ＦＯＡ（５’−ｆｌｕｏｒｏｏｒｔｏｉｃ  ａｃｉｄ）を含むプレート上で複製され（それによりライブラリクローンのみを発現する）、他方は５’−ＦＯＡを含まないプレート上で複製される（ｒｅｃ８＋−ＧＦＰとライブラリクローンとの共発現を可能にする）。本発明者らは、死滅した細胞を赤色染色する薬品であるＰｈｌｏｘｉｎｅ  Ｂを両寒天プレートに加え、それにより病態のコロニーに焦点を当てた。２日間の培養後、共発現寒天プレートでのみ病態を示すコロニーを取り上げ、ライブラリー由来のプラスミドを回収して解析した。【００２２】（シゾサッカロミセス・ポンベ株）
内因性ｓｇｏ１＋及びｓｇｏ２＋へのＧＦＰ又はＦＬＡＧタグ付け及び削除を、ＰＣＲベースの遺伝子ターゲティング法（Ｙｅａｓｔ  １４，９４３−９５１（１９９８））によって実施した。ＰＣＲ増幅ｓｇｏ１＋−ＦＬＡＧのＣ末端にＧＦＰを挿入することによりｓｇｏ１＋−ＦＬＡＧ−ＧＦＰが作製され、内因性ｓｇｏ１の遺伝子座に組み込まれた。さらに、ＰＣＲベースの遺伝子ターゲティング法によって、ｓｇｏ１＋の内因性プロモータをｎｍｔプロモータと置換し、Ｐｎｍｔ−ｓｇｏ１＋又はＰｎｍｔ−ｓｇｏ１＋−ＦＬＡＧ−ＧＦＰを作出した。必要に応じて、Ｓｇｏ１−ＧＦＰ又はＳｇｏ１−ＦＬＡＧにタグ付けされたタンパク質を削除した。文献（Ｎａｔｕｒｅ  ４００，４６１−４（１９９９））記載のように、減数第一分裂の前（減数第一分裂前期の後期に近接した時期）に、減数分裂細胞を抑止するためにｍｅｉ４Δ変異体を使用し、減数第一分裂後に抑止するためにｍｅｓ１Δを使用した。【００２３】（ＧＦＰでマークされた染色体の観察）
減数第一分裂におけるホモログの分離パタ−ンを観察するために、ｃｅｎ２−ＧＦＰ（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，２２８４−９６（２００３））を保持するｈ９０細胞が、減数分裂誘導培地ＳＰＡにスポットされた。姉妹染色分体の分離パタ−ンを調べるために、一方はｃｅｎ２−ＧＦＰでマークされ、他方はマークされていない異なる接合型細胞が混合され、ＳＰＡ上にスポットされた。１日間培養された後、接合体がＧＦＰについて観察された。冷却ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｉｘ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を備えた顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２、Ｚｅｉｓｓ）、及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のもとで、画像を得た。ＧＦＰシグナルの７つのＺセクションは、画像の各ピクセル位置における最大値のシグナルを取ることによって、単一の二次元の画像に変換した。【００２４】（クロマチン免疫沈降；ＣｈＩＰ）
Ｓｇｏ１を有するＣｈＩＰについては、ディプロイドｓｇｏ１＋−ＦＬＡＧ−ＧＦＰを使用した。高度に同調的な培養を達成するために、内因性ｓｌｐ１＋プロモータを減数分裂中は活性化しないｒａｄ２１＋プロモータと置換し、第一分裂中期に細胞を抑止した。細胞は、窒素枯渇培地において３０℃で１７時間培養され、６０％以下の細胞を第一分裂中期に抑止した。Ｓｇｏ２を有するＣｈＩＰについては、ｎｄａ３−ＫＭ３１１ｓｇｏ２＋−ＧＦＰ細胞を３０℃で増殖させ、その後１８℃に移行した。８時間の培養の後、ほとんどの細胞を分裂中期に抑止した。細胞は３％のパラホルムアルデヒドで１８℃で３０分間固定され、抽出物が作製された。ＤＮＡは平均サイズが４００ｂｐまでに破壊され、抽出物は、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で免疫沈降された。全細胞粗製抽出物から作製されたＤＮＡ、又は免疫沈降されたクロマチンのフラクションは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ−ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で、定量的なＰＣＲによって解析された。ＣｈＩＰフラクションにおける非特異的な結合を説明するために、各実験におけるコントロールとして抗体不含サンプルを用いた。【００２５】（抗Ｓｇｏ１抗体の作製）
ｓｇｏ１＋ＯＲＦはシゾサッカロミセス・ポンベｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増幅物であり、組換えタンパク質ＧＳＴ−Ｓｇｏ１及びＨｉｓ−Ｓｇｏ１を作製するために、プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びｐＥＴ−１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にそれぞれ挿入された。文献（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３））記載の通り、ＧＳＴ−Ｓｇｏ１はウサギを免疫化するために使用され、産生された抗体はＨｉｓ−Ｓｇｏ１によって精製した。また、ヒトのシュゴシン相同遺伝子（配列番号１７、１９）のコードするタンパク質（配列番号１８，２０；それぞれｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２とする）の解析を行う目的で、ｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２の一部を大腸菌に発現させ、そのタンパク質をウサギに注射することによりｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２に対する抗体を作製した。【００２６】（免疫染色）
内因性Ｓｇｏ１を染色するために、ＭＭ−Ｎで５時間培養された野生型ディプロイド細胞を、３０℃で４０分間３％のホルムアルデヒドで固定し、文献（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３））記載の方法によって染色した。Ｓｇｏ２−ＧＦＰ及びＭｉｓ６−ＨＡを染色するために、対数的に成長している細胞を使用した。１：５０でウサギ抗Ｓｇｏ１抗体及び１：１００でＡｌｅｘａ４８８結合の抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＳｇｏ１を検出した。１：２００でマウス抗チューブリン抗体ＴＡＴ−１（Ｋｅｉｔｈ  Ｇｕｌｌ氏から供与）、及び１：２０００でＣｙ３タグ付け抗マウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いてチューブリンを検出した。ＤＮＡを可視化するために、細胞をＤＡＰＩで対比染色した。１：５０でマウス抗ＧＦＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ）、及び１：１００のＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ結合抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＳｇｏ２−ＧＦＰを検出した。１：５０でウサギ抗ＨＡ抗体Ｙ−１１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、及び１：１００でＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギ抗体を用いてＭｉｓ６−ＨＡを検出した。ＤＮＡを可視化するために、細胞をＤＡＰＩで対比染色した。また同様に、ウサギ抗ｈＳｇｏ１抗体及びウサギ抗ｈＳｇｏ２抗体を用いて免疫染色を行った。【００２７】（共免疫沈降）
Ｐａｄｈ−ｒｅｃ８＋−３ＨＡ  Ｐｎｍｔ４１−ｓｇｏ１＋−ＦＬＡＧ−ＧＦＰ株細胞及び、コントロールとしてのＰａｄｈ−ｒｅｃ８＋−３ＨＡ株細胞を、３０℃で１５時間チアミンを用いずに培養し、収集し、抽出物を作製した。クロマチン結合タンパク質を遊離させるために、ＤＮａｓｅ１で抽出物を処理した。遠心分離によって抽出物を清澄化した後、Ｓｇｏ１−ＦＬＡＧ−ＧＦＰタンパク質を、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）で免疫沈降した。抗ＨＡ抗体Ｙ−１１及び抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２によって、それぞれＲｅｃ８−３ＨＡ及びＳｇｏ１−ＦＬＡＧ−ＧＦＰを検出した。【００２８】（出芽酵母の解析）
すべての供試株は、染色体ロスアッセイに関するものを除き、ＳＫ１（Ｃｅｌｌ  ９８，９１−１０３（１９９９））の派生物であった。染色体ロスアッセイを文献（Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，９５５−９（２００１））記載の通り実施した。ＰＣＲ生成カセット（Ｙｅａｓｔ  １４，９５３−９６１（１９９８））を使用して、ＳｃＳＧＯ１遺伝子を削除、又はエピト−プデータグを付けた。正確な遺伝子タ−ゲットをＰＣＲによってチェックした。染色体Ｖをマ−キングしたＵＲＡ３−ＧＦＰドット（ｃｅｎＶ−ＧＦＰ）については前述されている（Ｃｅｌｌ  ９８，９１−１０３（１９９９））。文献（Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ４，５３５−４８（２００３））記載の通り、３０℃でディプロイド細胞を培養することにより、胞子形成が誘引された。インサイチュ蛍光免疫法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を文献（Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ４，５３５−４８（２００３））記載の通り実施した。【００２９】（細胞の培養）
１０％のウシ胎子血清と０．０３％のＬ−グルタミンとを加えたＤＭＥＭ培地で、ＨｅＬａ細胞を培養した。Ｓｃｃ１−ｍｙｃを発現するＨｅＬａ細胞株を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び１００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ（Ｗａｋｏ社製）で培養した。ｓμｇ／ｍｌのＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いたインキュベーションを４８時間行うことにより、Ｓｃｃ１−ｍｙｃの発現を誘導した。【００３０】（抗ヒトＳｇｏ抗体の作製）
ヒトＳｇｏ１のＮ末端アミノ酸配列に関する情報がデータベース上で得られなかったことから、本発明者らは、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ：ＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧ（配列番号３８）のクローニング部位を認識するプライマーと、Ｑ９ＢＶＡ８のアミノ酸配列中の第２３７〜２４２番に対応するＤＮＡ配列：ＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧ（配列番号３９）を認識するプライマーとを用いてｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）から増やしたｃＤＮＡ断片をクローニングした。かかるシークエンシングにより、Ｓｇｏ１のｍＲＮＡは５２７個のアミノ酸を有するタンパク質をコードすることがわかった。Ｓｇｏ１に対するポリクロナール抗体を得るために、Ｓｇｏ１の第１０９〜４９１番目のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ断片を増やし、ＧＳＴ−Ｓｇｏ１とＨｉｓ−Ｓｇｏ１とを作製するためにプラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の読み枠中にそれぞれ挿入し、続けてウサギ（ＱＩＡＧＥＮ）を免疫処理した（生産者マニュアルの指示に従って行う）。ＣＮＢｒ活性を有するセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上で、Ｈｉｓ−Ｓｇｏ１をアフィニティー精製した。Ｓｇｏ２に対する抗体は、ＧＳＴ−Ｓｇｏ２（第３３１〜６３１番のアミノ酸）で育成して、上記と同様の方法によりＨｉｓ−Ｓｇｏ２を用いて精製した。【００３１】（免疫蛍光顕微鏡検査及び染色体拡大）
抗ヒトＳｇｏ１抗体（１：１０００）、抗ヒトＳｇｏ２抗血清（１：１００００）、抗Ｂｕｂ１（１：１０００；ＭＢＬ社製）、抗ＢｕｂＲ１（１：１０００；ＭＢＬ社製）、抗ＣＥＮＰ−Ａ（１：１０００；ＭＢＬ社製）、抗ＡｕｒｏｒａＢ  ＡＩＭ−１（１：１０００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及び抗微小管ＤＭ１Ａ（１：１０００；Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、上記方法により免疫蛍光染色を行った。Ｓｃｃ１−ｍｙｃの免疫染色は、抗ｍｙｃ  ＣＭ−１００（１：１０００；Ｇｒａｍｓｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びＡＣＡ（１：１０００、Ｄｒ．Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ  Ｔａｋａｓａｋｉから提供を受ける）を用いて、上記方法により行った。２次抗体としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ抗体（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、Ｃｙ３共役抗マウス抗体（１：１０００；ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）、及びＣｙ３共役ロバ抗ヒト抗体（１：１０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ社製）を用いた。３μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２又は０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを用いて対比染色した。映像は、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ又はＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いて撮影した。【００３２】（染色体拡大）
有糸分裂中のＨｅＬａ細胞を有糸分裂シェイクオフ（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｈａｋｅ−ｏｆｆ）により回収し、３３０ｎＭのノコダゾールで０から４時間インキュベーションした。染色体拡大を上記方法で行った。【００３３】（免疫ブロット法）
ＨｅＬａ細胞をサンプル緩衝液を用いて煮沸して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移し、続けてＴＢＳＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ，ｐＨ７．４，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で５％のスキムミルク（Ｎａｃａｌａｉ社製）でブロッキングした。抗Ｓｇｏ１抗体（１：１０００）、抗Ｓｇｏ２抗体（１：１０００）、抗Ｂｕｂ１抗体（１：５００）及び抗チューブリン抗体（１：３０００）を加えた０．１％のスキムミルクＴＢＳＴ中で、抗体のインキュベーションを行った。ブロットは、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で作製された。【００３４】（ＲＮＡｉ）
ｈＳｇｏ１ＲＮＡ又はｈＳｇｏ２ＲＮＡ上に、ｓｉＲＮＡターゲット配列として、ｈＳｇｏ１：ＡＡＧＵＣＵＡＣＵＧＡＵＡＡＵＧＵＣＵＵＡＴＴ（配列番号４０）とｈＳｇｏ２：ＡＡＧＣＡＣＵＡＣＣＡＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＴＴ（配列番号４１）及びヒトＳｇｏ１：ＧＵＧＡＧＣＣＵＣＵＧＵＧＡＡＵＣＡＡＴＴ（配列番号４２）とヒトＳｇｏ２：ＧＣＵＣＵＣＡＵＧＡＡＣＡＡＵＡＡＣＵＴＴ（配列番号４３）をそれぞれ選択した。また、他のｓｉＲＮＡターゲット配列であるＢｕｂ１ＲＮＡ上にｓｉＲＮＡターゲット配列としてＧＡＧＵＧＡＵＣＡＣＧＡＵＵＵＣＵＡＡＴＴ（配列番号４４）を、スピンドルチェックポイント因子ＢｕｂＲ１ＲＮＡ上に、ｓｉＲＮＡターゲット配列を２箇所ＡＡＣＧＧＧＣＡＵＵＵＧＡＡＵＡＵＧＡＡＡ（配列番号４５；ＪＣＳ，１１７，１５７７−１５８９（２００４）参照）を選択した。これらの配列を二本鎖として合成し、オリゴフェクタミン（インビトロジェン社）を用いて細胞へ導入した。また同様に、ＨＩＶベクターの作製に当たっては、ＨｅＬａ細胞に対して、ＨＩＶプラスミドベクター、ｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ発現プラスミド）、ｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（第３世代パッケージングプラスミド）及びｐＲＳＶ  Ｒｅｖ（Ｒｅｖ発現プラスミド）を、リン酸カルシウム法により、トランスフェクションを行い、４８時間後の培養上清を回収後、濃縮してウイルスベクターとして用いた。
【実施例２】
【００３５】［結果］
（分裂酵母におけるシュゴシンＳｇｏ１の同定）
有糸分裂コヒ−シンＲａｄ２１／Ｓｃｃ１を減数分裂バ−ジョンであるＲｅｃ８と置換することは、減数第一分裂後期を通して動原体性姉妹染色分体の接着を保護するための必須条件である（Ｃｅｌｌ  １０３，１１５５−６８（２０００）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３，３９６５−７３（２００３））。しかし、有糸分裂中に異所的にＲｅｃ８を発現させた場合、Ｒｅｃ８はセントロメアに広く局在したが、姉妹染色分体が反対側に分離するにつれて分裂後期には消滅した（図１ｃ、ｄ）。さらに、有糸分裂中に、切断不可能なＲｅｃ８が異所的に発現した結果（Ｒｅｃ８は減数分裂中に、セパラーゼＣｕｔ１により切断されることに留意（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３）））、姉妹染色分体の分離が不能となった（図２参照）。したがって、減数第一分裂中の状況とはコントロール的に、動原体性Ｒｅｃ８は有糸分裂中にセパラーゼによって切断され、結果的に姉妹染色分体が分離する。これらの観察から、本発明者らはＲｅｃ８の減数第一分裂特異性動原体プロテクターを仮定するに至った。この因子を発見するために、本発明者らは、Ｒｅｃ８と共発現した場合にのみ有糸分裂成長中に毒性を発生する遺伝子を調査した。このスクリーニングによって新規遺伝子ｓｇｏ１＋（ＯＲＦ：ＳＰＢＰ３５Ｇ２．０３Ｃ）を見い出した。Ｒａｄ２１と共発現した場合、Ｓｇｏ１は成長に関してほとんど影響を及ぼさないため、Ｓｇｏ１による成長の妨害はＲｅｃ８に大きく依存している（図１ａ）。セントロメア会合緑色蛍光タンパク質マーカー（ｃｅｎ２−ＧＦＰ）が高頻度で中核細胞（図１ｂ、ｃ参照）の同じ側に分離されるため、ｒｅｃ８＋とｓｇｏ１＋との共発現の結果、核分裂がブロックされる（ｂｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）頻度が高まる。分裂後期にＳｇｏ１がＲｅｃ８を分解から保護する可能性をテストするために、Ｓｇｏ１発現に関連してＲｅｃ８の局在を調べ、構成性染色質ａｄｈ１プロモータの制御下で、そのカルボキシル末端にＧＦＰデータグ付けしたＲｅｃ８を発現させ、チアミン抑制ｎｍｔ１プロモータを用いてＳｇｏ１を誘導した。その結果、Ｓｇｏ１が共発現した場合にのみ、分裂後期を通してＲｅｃ８−ＧＦＰシグナルが持続することを見い出した（図１ｄ）。Ｓｇｏ１が減数分裂においてのみ発現することから、（ＤＮＡマイクロアレイデータ（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２，１４３−７（２００２））、下記参照）、上述の結果によって、Ｓｇｏ１が減数分裂の間はＲｅｃ８のプロテクターであることがわかった。【００３６】（Ｓｇｏ１は減数第一分裂における動原体性の接着を保護する）
減数分裂中のＲｅｃ８の保護に関して、Ｓｇｏ１が本当に必要であるかを調べるために、ｓｇｏ１＋をコードするＯＲＦ全体を除去し、表現型を調査した。ｓｇｏ１＋は減数分裂特異遺伝子であるという概念に一致して、ｓｇｏ１Δ細胞は生育可能であり正常な増殖的成長を示した。ｓｇｏ１Δ細胞の減数分裂の染色体分離を調べるために、接合体の２つのホモログのうち一方についてのみ、セントロメア関連シーケンスをＧＦＰ（ｃｅｎ２−ＧＦＰ）でマークし、減数第一分裂の間、ＧＦＰドットの分離をモニターした。姉妹染色分体ペアが、各接合体の同じ側へ概ね一緒に移動したことから、減数第一分裂はｓｇｏ１Δにおいて正常に出現することがわかった。したがって、単極性接着は損なわれていなかった（図３ａ）。さらに、両染色体におけるｃｅｎ２−ＧＦＰをマークすることにより、減数第一分裂でホモログが正確な染色体の分離を行ったと判定した（データは示さず）。しかし、減数第二分裂においては、姉妹染色分体ペアは適切に分離せず、５０％以下の細胞において染色体不分離を起こした（図３ａ）。この値は減数第二分裂におけるランダムな染色体分離と一致している。【００３７】  動原体性の接着を調べるために、ｍｅｓ１Δ突然変異を経て減数第二分裂の前に抑止された接合体における両ホモログをマークしたｃｅｎ２−ＧＦＰを観察した。上記結果を裏付けるかのように、分割されたｃｅｎ２−ＧＦＰシグナルが二分染色体核にいきわたり、ｓｇｏ１Δ細胞はセントロメアの早期分裂を示すことが多い（図３ｂ）。最終的に、セントロメアにおけるＲｅｃ８の保護がＳｇｏ１に依存しているかについて、第一分裂後期の後期及び第二分裂前中期のＲｅｃ８−ＧＦＰを観察することにより調べた。野生型細胞においてはＲｅｃ８シグナルが動原体性であることが顕著であるのに対し、ｓｇｏ１Δ細胞のこれらのステ−ジにおいては、セントロメアからＲｅｃ８シグナルの多くが消失した（図３ｃ）。ｓｇｏ１Δ細胞のすべての表現型は、ヘテロクロマチン欠損のシゾサッカロミセス・ポンベを連想させるが、ここでＲｅｃ８の動原体周囲領域への局在は減少し、動原体性の接着は減数第一分裂の間に失われ、減数第二分裂におけるランダムな分裂を導く（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，１１５２−５（２００３））。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを用いて、減数第一分裂の前に抑止された細胞のＲｅｃ８によるクロマチン結合を調べた。ヘテロクロマチン欠損細胞とは全く対照的に、Ｒｅｃ８の局在は他のすべてのテスト領域と同様、動原体周囲領域のｓｇｏ１Δ細胞においても損なわれていなかった。これらの結果は、減数第一分裂後の動原体性Ｒｅｃ８の消失が、セントロメアへのＲｅｃ８局在における初期の欠損によって生じるのではなく、むしろ減数第一分裂における動原体性Ｒｅｃ８の保存における欠損によって生じることを示唆する。上述の結果によって、Ｃｕｔ１セパラーゼが第一分裂後期の開始時に活性化し、染色体性Ｒｅｃ８のほとんどを切断し、動原体性Ｒｅｃ８のみを残すことを示している（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，５６４３−５３（２００３））。これらの結果は、減数第一分裂期を通してセパラーゼによる切断からコヒ−シンＲｅｃ８を保護することにより、動原体性の接着を保護する上でＳｇｏ１が必須の役割を果たしていることを示している。【００３８】（Ｓｇｏ１は減数第一分裂中にセントロメアに局在する）
Ｓｇｏ１タンパク質を検出するために、Ｓｇｏ１特異的抗体を作製し、ウエスタンブロット法によりＳｇｏ１が専ら減数第一分裂期に発現することを示した（図４ａ）。減数分裂の様々なステ−ジにある細胞に対して免疫蛍光顕微鏡検査法を実施し、Ｓｇｏ１が第一分裂前期の終期に出現し、いくつかのドットとして第一分裂中期までに十分に局在することが明らかになった（図４ｂ）。これらのドットはＭｉｓ６動原体タンパク質（Ｃｅｌｌ  ９０，１３１−１４３（１９９７））と共存し、Ｓｇｏ１がセントロメア会合タンパク質であることを示している（図４ｃ）。第一分裂後期の開始時に、Ｓｇｏ１シグナルが劇的に減少する。第一分裂中期に抑止されたＡＰＣ枯渇細胞のセントロメアにおいては、Ｓｇｏ１は分解されていないが、セパラーゼ欠損細胞においては正常な分解が起きていることを見い出し（図５）、第一分裂後期におけるＳｇｏ１の分解が、セパラーゼを介してというよりも、ＡＰＣによってより直接的にレギュレイトされていることを示した。第一分裂後期の初期のセントロメアにおいて残留Ｓｇｏ１シグナルを検知することができたが、それらは第一分裂後期の終期までには完全に消失した（図４ｂ）。これは、セパラーゼが十分に活性化した場合、第一分裂後期の開始時にかなりの量のＳｇｏ１が必要とされることを示している。しかし、第一分裂後期が進行するにつれて、必要とされるＳｇｏ１は少量になっていくと考えられる。この考え方は、セパラーゼ活性が素早くダウンレギュレートされる場合、あるいは第一分裂後期の間に染色体へのアクセスが妨げられる場合に論証可能である。Ｓｇｏ１は減数第二分裂では全く出現せず（図４ｂ）、Ｓｇｏ１は、減数第一分裂においてのみＲｅｃ８を保護するために必要であるという考え方と一致する。【００３９】  本発明者らは、Ｒｅｃ８の動原体周囲領域における局在が、減数第一分裂全体を通して動原体性の接着が持続するために、特に重要であることを既に報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，１１５２−５（２００３））している。Ｓｇｏ１がＲｅｃ８の動原体性プロテクターである場合には、そこに局在することもまた予測された。この可能性をテストするために、ＣｈＩＰアッセイを用い、Ｒｅｃ８の局在をより正確に描写した。Ｓｇｏ１は実際にセントロメアシーケンスに沿って、中心核領域よりはむしろ、動原体周囲のヘテロクロマチン領域と会合している（図４ｄ）。免疫沈降実験によって、インビボでＳｇｏ１がＲｅｃ８複合体と相互に作用していることが示されるように（図４ｆ）、保護は密接な相互作用を通じて実行される。同時に、これらの結果は、Ｓｇｏ１は動原体周囲領域に残留し、第一分裂後期において、セパラーゼによる切断から動原体性Ｒｅｃ８を保護するために作用することを示している（図４ｄ）。Ｒｅｃ８の局在はＳｇｏ１に依存しておらず、逆もまた同様であることを見い出した（図３ｄ、図示せず）。実際には、Ｒｅｃ８とＳｇｏ１とはむしろ独立して動原体周囲領域に産生されるが、局在に関しては、Ｒｅｃ８はヘテロクロマチンに依存し、Ｓｇｏ１はＢｕｂ１キナ−ゼに依存している（図４ｅ）。対照的に、Ｓｇｏ１とＲｅｃ８はそれぞれ、ｓｗｉΔ６（ヘテロクロマチン欠損）及びｂｕｂ１Δ細胞に��るセントロメアに局在している（図４ｅ）。このように独立して局在することにより、染色体腕部領域に沿うことなく、セントロメアのみでＲｅｃ８を保護することが確実となる。【００４０】  また、シュゴシンがセパラーゼの作用からＲｅｃ８を物理的にシ−ルドし、これを相殺することを示す。この点において、Ｓｇｏ１の強い過剰発現が、Ｒｅｃ８が発現していない場合であっても、有糸分裂の成長を中程度に妨害し（図示せず）、ｃｕｔ１対立遺伝子に対して許容的な温度である場合であっても、Ｓｇｏ１が穏やかに発現することによりｃｕｔ１変異体を殺す（図６）ことが見い出された。【００４１】（Ｓｇｏ２は分裂酵母における有糸分裂Ｓｇｏ１パラログである）
従来の遺伝子データベースのブラスト検索によって、本発明者らは、サッカロミセス・セレビジエ及びノイロスポラ・クラッサからＳｇｏ１類似のタンパク質を見い出し、Ｓｇｏ１が保存されたタンパク質であることを示した（下記参照）。また、同検索において、本発明者らがＳｇｏ２と名付けたシゾサッカロミセス・ポンベＳｇｏ１パラログを見い出した（ＯＲＦ：ＳＰＡＣＩ５Ａ１０．１５）。ｓｇｏ２＋遺伝子を分裂させ、ｓｇｏ２Δ細胞が生存可能であるが、スピンドル不安定化剤チアベンダゾ−ル（ＴＢＺ）に対して感受性を示すことを見い出した（図７ａ）。ｓｇｏ１Δ細胞がその種の欠陥を全く示さないことから、この表現型は注目に値する。その細胞分配について調べるために、内因性ｓｇｏ２＋遺伝子にＧＦＰデータグを付けた。増殖細胞において、Ｓｇｏ２−ＧＦＰは２つ又は３つのドットとして核内で観察された（図７ｄ）。しかし、Ｓｇｏ２−ＧＦＰはセントロメアタンパク質Ｍｉｓ６と有糸分裂中期において共存し、分裂後期の間に消失する（図７ｃ、ｄ）。ＣｈＩＰアッセイは、Ｓｇｏ２クロマチン会合が有糸分裂細胞の同調ポピュレーションにのみ検出可能であり、クロマチン会合は動原体周囲領域に局在していることを示した（図７ｅ）。この局在を強化し、ヘテロクロマチン欠損ｓｗｉ６Δ突然変異体と結合した場合、ｓｇｏ２の削除は染色体の分離に劇的な欠陥を与えるが、これ自体は動原体の機能をわずかに損なうものである（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，１４２９−３１（１９９５））（図７ｂ）。これらの結果は、有糸分裂における染色体の分離を確実にするために、Ｓｇｏ２が動原体性ヘテロクロマチン因子と協働していることを示している。さらに、減数第一分裂におけるホモログの染色体不分離において、ｓｇｏ２Δ細胞がある程度増加（〜１５％）したことを見い出し、適切な減数第一分裂を促進させるためには、Ｓｇｏ２もまた重要であることを示した。しかし、ｓｇｏ１Δは減数第一分裂において明らかな欠陥引き起こさず（図３ａ）、また減数分裂におけるｓｇｏ２Δの欠陥を強化しないことから、Ｓｇｏ２の役割はＳｇｏ１の役割と重複してはいない。【００４２】（Ｂｕｂ１に制御されるシュゴシンの局在）
分裂酵母ｂｕｂ１変異体において、減数第一分裂以降は動原体性Ｒｅｃ８を検出できないことから、保存されたセントロメア会合キナ−ゼＢｕｂ１は、減数分裂の間Ｒｅｃ８を保護する際に機能すると考えられている。（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，５２２−６（２００１）、図３ｃ）。ｂｕｂ１変異体は減数第一分裂の染色体分離において多面的に影響を及ぼしているが、Ｓｇｏ１の機能はＢｕｂ１活性によって標的とされうると考えられる。この問題を解明するために、減数分裂が起こっているｂｕｂ１Δ細胞において、Ｓｇｏ１−ＧＦＰシグナルを調べた。明らかに、ｂｕｂ１Δ細胞は正確な動原体性Ｓｇｏ１−ＧＦＰシグナルをほぼ完全に欠いており、代わりに核内に拡散した蛍光を示した（図４ｅ）。キナ−ゼ活性を消滅させるｂｕｂ１−Ｋ７６２Ｒ点突然変異を用いて、同様の結果を得た（Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，１０７５−８７（２００３））。Ｓｇｏ１タンパク質の実質的なレベルは、減数分裂ｂｕｂ１Δ細胞においてウエスタンブロット解析によって検出されるが（図示せず）、Ｂｕｂ１はＳｇｏ１タンパク質の安定性に影響を及ぼさない。したがって、Ｂｕｂ１のキナ−ゼ活性はＳｇｏ１をセントロメアに取り込むために必要となり、ｂｕｂ１Δ細胞における動原体の保護に見られる欠損は、Ｓｇｏ１の局在が損なわれることにより説明することができる。【００４３】  並行した実験において、セントロメアにおける有糸分裂Ｓｇｏ２の局在は、ｂｕｂ１変異体において同様に妨害されることを見い出した（図７ｃ）。Ｂｕｂ１機能を失うことによって、動原体の機能が弱まると指摘されてきた（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３，１７７５−８７（１９９８））。この点に関して、ｂｕｂ１−Ｋ７６２Ｒ変異体は、動原体周囲でのヘテロクロマチン形成における役割を通じて、同様に動原体機能をわずかに損なう突然変異であるｓｗｉ６Δに対して共致死性を示す。ｓｇｏ２Δが同様にｓｗｉ６Δに対して共致死性を示し（図７ｂ）、有糸分裂において重大な染色体分離ミスを示すことを見い出した（図示せず）。ｓｇｏ２Δｂｕｂ１Δ二重変異体が、成長又はＴＢＺ感受性について累積的欠陥をまったく示さなかったことから（図７ａ）、これらの遺伝子解析により、有糸分裂における染色体の分裂を確実にするための、Ｓｇｏ２とＢｕｂ１とのタンデム機能を確認した。これらの全てを考慮すると、以上の結果は、セントロメアにＳｇｏ１及びＳｇｏ２をそれぞれ減数分裂及び有糸分裂において取り込むことが、Ｂｕｂ１キナ−ゼの重要な機能であることを示している。【００４４】（出芽酵母Ｓｇｏ１ホモログの特性）
本発明者らは、出芽酵母における、これまで解析されたことのない一つのＳｇｏ１ホモログであるＳｃＳｇｏ１（ＯＲＦ：ＹＯＲ０７３Ｗ）を同定した。内因性ＳｃＳＧＯ１にＧＦＰタグを付けることによって、ＳｃＳｇｏ１の細胞内の局在について調べた。ＳｃＳｇｏ１−ＧＦＰは増殖細胞において主として単一ドットとして検出されたが、これはポピュレーションのうち限定されたサブセットでのみ検出された（図８ａ）。ＳｃＳｇｏ１−ＧＦＰはＧ１／Ｓ期（すなわち細胞内に芽がない場合、又は細胞内の芽が小さい場合）では検出されないが、Ｇ２／Ｍ期（芽が大きく、単一核を有する細胞）ではドットとして出現し、分裂後期（芽が大きく、核を伸ばしている細胞）では消滅する（図８ａ）。ドットはＮｄｃ１０動原体タンパク質と共局在している（図８ｂ）。減数分裂の間、ＳｃＳｇｏ１−ＧＦＰは第一分裂中期にのみ動原体で検出されるが、第一分裂後期及び減数第二分裂においては全く検出されない（図８ｃ）。したがって、ＳｃＳｇｏ１局在パタ−ンは減数分裂におけるＳｐＳｇｏ１、及び有糸分裂におけるＳｐＳｇｏ２のパタ−ンに酷似している。【００４５】  ＳｃＳｇｏ１の機能を調べるために、ＳｃＳＧＯ１遺伝子を分裂させた。Ｓｃｓｇｏ１Δ細胞は生存可能ではあるが、成長が遅く、スピンドル不安定化剤ベノミルに対する感受性を示し（図８ｄ）、動原体機能を損なう恐れがあることを示した。また、コロニーセクタリングアッセイを用いて、Ｓｃｓｇｏ１Δ細胞と野生型細胞とでクロモソ−ム損失率を比較した。４０％のＳｃｓｇｏ１Δコロニーが赤色セクタ−（クロモソ−ムの損失を示す）を含んでいたが、野生型コロニーでは２％未満であった（図８ｅ）。有糸分裂の染色体分離を確実にするために、ＳｃＳｇｏ１が動原体において重大な役割を果たしていると結論付けた。Ｓｃｓｇｏ１Δ細胞は減数分裂開始の際に、多くの細胞が減数分裂状態で単一の核に抑止されているという重大な欠陥を示した。しかし、リ−クした減数分裂のテトラニュークリエート生成物のうち、ｃｅｎＶ−ＧＦＰの分配パタ−ンは、減数第二分裂におけるランダムな分離を除き、減数第一分裂における適切な分離と一致している（図８ｆ）。また、カルボキシル末端において染色体ＳｃＳＧＯ１に１３Ｍｙｃタグを付けることは、それ自体は有糸分裂の成長又は減数第一分裂で検出可能な欠陥を引き起こさないが、減数第二分裂における分離を損ねる結果となる（３４％の染色体不分離が６８％のランダム分離を示す）ことを見い出した（図８ｇ）。さらに、ＳｃＳＧＯ１−Ｍｙｃ細胞は減数第一分裂後期の後期において姉妹セントロメアの分離を頻繁に示し（（図８ｈ）、動原体性の接着が適切に保護されていないことを示した。同時に、これらの結果は、減数第一分裂全体を通して動原体性の接着を保護する上でＳｃＳｇｏ１が重要な役割を果たしており、それにより分裂酵母Ｓｇｏ１と同様に減数第二分裂を確実にしているとの考えを支持する。【００４６】（真核生物でのシュゴシンの保存）
ブラスト検索の結果、Ｓｇｏ１類似のタンパク質が３種のみ同定されたが、これらは全て菌類で、シゾサッカロミセス・ポンベＳｇｏ２、サッカロミセス・セレビジエＳｃＳｇｏ１、及びノイロスポラ・クラッサＢ２３Ｇ１．０６０であった。これらのタンパク質に２つの保存領域を見い出したことから、ＢＬＯＣＫ  ＭＡＫＥＲ及びＭＡＳＴプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６，３０９−１２（１９９８）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４，４８−５４（１９９８））を使用して、２ブロックシーケンス条件下で関連性のあるタンパク質を検索した。このアプロ−チは、ハエ、ムシ、植物、マウス及びヒトを含む様々な真核生物からいくつかのタンパク質候補を抽出した（図９のそれぞれショウジョウバエＤｍ、Ｃｅ、シロイヌナズナＡｔ、マウスＭｍ及びヒトＨｓ；配列番号２１〜３７参照）。特に、このリストはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＥＩ−Ｓ３３２を含んでおり、これは以前に減数分裂における動原体性の接着を保存するために必要なタンパク質として特徴付けられたものである（Ｃｅｌｌ  ８３，２４７−２５６（１９９５））が、類似性のスコアはマージナルである（Ｅ値＝１０）。リスト中、他の全てのタンパク質はカルボキシル末端基本領域において類似性のショートストレッチを示すが、それらすべてが推定コイルドコイルを含むことを除いては、第１ブロックの主なシーケンスは保存されていない。これら２つのブロック間のスペースとシーケンスはタンパク質間で分岐する。これらのブロックはＭＥＩ−Ｓ３３２機能にとって重要であると以前に確認されている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，３８４３−３８５６（１９９８））ため、Ｓｇｏ１の保存された領域の重要性について調査を行った。これらの類似性ブロック内で、いくつかのアミノ酸をそれぞれにアラニンに変化させ、インビボで変異体タンパク質の機能を調べた（図１０）。ＭＥＩ−Ｓ３３２機能のために重要であるとして知られる保存された３つのアミノ酸もまた、Ｓｇｏ１の機能のために必要であることを見い出した（ＭＥＩ−Ｓ３３２における１３Ｎ、３４Ｖ及び３６８Ｓ；Ｓｇｏ１における２９Ｎ、５０１及び２９４Ｓ）（図９の矢印部分）。さらに、第２ブロック内の他の保存されたアミノ酸（Ｓｇｏ１の２９３Ｐ、２９６Ｒ、２９８Ｋ、２９９Ｌ及び３００Ｒ）も、すべてＳｇｏ１機能にとって必要であり（図９アスタリスク）、ここで保存されていない残基２９７Ｔは、機能を損なうことなくアラニンに変化させることができる（図９丸印）。これらの結果は、シゾサッカロミセス・ポンベＳｇｏ１と様々な真核生物における他のタンパク質との間に見られるマージナルな構造的類似性が重要であることを示している。植物及び哺乳類は２つのシュゴシンに類似したタンパク質を有しており、シュゴシンの機能は分裂酵母におけるように、有糸分裂と減数分裂を完成させるために分岐した可能性がある。【００４７】（ヒトのシュゴシン相同遺伝子のコードするタンパク質は分裂期に動原体に特異的に局在する）
本発明者らはヒトＳｇｏタンパク質であると考えられるＳｇｏ１及びＳｇｏ２をデータベース上で見い出しているが、ヒト以外の種における公知のＳｇｏタンパク質との全体的な配列相同性はわずかなものであった（図１１ａ）。そこで、前記データベース上で見い出したタンパク質が実際にヒトＳｇｏのホモログであるか否かを調べるために、本発明者らは前記タンパク質の局在性を調べた。かかる目的のために、本発明者らはバクテリアで産生された組換えタンパク質に対するウサギポリクロナール抗体を培養した。得られたＳｇｏ１抗体は、ＨｅＬａ細胞抽出物で〜７０ｋＤのバンド（推定分子量は６０ｋＤ）を検知し、また、Ｓｇｏ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡで細胞を処理した場合、かかるシグナルが大幅に減少した（図１１ｂ）。同様に、Ｓｇｏ２抗体は、〜１２０ｋＤのバンド（推定分子量は１４５０ｋＤ）を検知し、Ｓｇｏ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞から得た抽出物では減少していた（図１１ｂ）。かかるデータは、Ｓｇｏ１とＳｇｏ２との両方が、増殖したＨｅＬａ細胞において少なくとも発現していることを示している。次に、ヒトＳｇｏのホモログであることが推定されたヒトのシュゴシン相同遺伝子（配列番号１７、１９）のコードするタンパク質（配列番号１８，２０；それぞれｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２）の解析を行う目的で、ｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２の一部を大腸菌に発現させ、そのタンパク質をウサギに注射することによりｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２に対する抗体を作製し、かかる抗体を用いて、ＨｅＬａ細胞を染色し、同時に、チューブリン抗体およびＤＡＰＩで染色し、それぞれスピンドルおよび染色体ＤＮＡで共染色して、増殖細胞でともに内在性のｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２タンパク質の発現を調べた。結果を図１２に示す。図１２からわかるように、分裂期の前中期（ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ）から中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）にかけて、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれのシグナルも、染色体上にドット状に見られた。この免疫染色の結果により、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２のいずれのタンパク質も、分裂期に動原体に特異的に局在することを確認した。また、分裂前中期および中期のＨｅＬａ細胞を、ｈＳｇｏ１あるいはｈＳｇｏ２に対する抗体で染色し、同時にセントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ａに対する抗体及びＤＡＰＩで共染色して、ｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２タンパク質の発現を調べた。結果を図１３に示す。図１３からわかるように、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれのシグナルも、染色体上のＣＥＮＰ−Ａドットに近接する場所にシグナルが見られた。このことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２いずれもセントロメアタンパク質であることが明らかになった。さらに、この可能性を調べるため減数分裂前期から中期にかけて動原体内部に局在していいることが知られている染色体のパッセンジャータンパク質である、Ａｕｒｏｒａ  Ｂを染色した。Ｓｇｏ１とＡｕｒｏｒａ  Ｂの位置は、前中期と中期において事実上同じであったが、Ｓｇｏ２はＡｕｒｏｒａ  Ｂのちょうど外側に位置していた（図１３）。このことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２はいずれも前中期から中期までに動原体内部に位置していることわかる。右側に姉妹キネトコアの代表図を拡大したものを示��。スケールバーは１０μｍである。【００４８】（ヒトのシュゴシン相同遺伝子のコードするタンパク質は分裂期に動原体に特異的に局在し、染色体分配を進行させる上で重要な役割をしている）
ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２を標的としたＲＮＡｉ実験をそれぞれ行った。結果を図１４に示す。その結果、４８時間後にはいずれのタンパク質の発現も有意に抑制され、図１４に示されるように、分裂期（図中ｔｏｔａｌ）に停止した細胞が蓄積した。このことから、いずれのタンパク質も分裂期に動原体に局在し、染色体分配を進行させる上で重要な役割をしていることが強く示唆された。この蓄積は、後述するように、スピンドルチェックポイント因子Ｂｕｂ１をＲＮＡｉにより抑制することにより解除されたことから、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２はセントロメアにおいて、動原体をスピンドルが正しくとらえる過程に直接的あるいは間接的に機能していることが示唆される。【００４９】  また、ＨｅＬａ細胞を用いて、ｈＳｇｏ１を標的としたＲＮＡｉ実験を行った細胞をスライドグラス状に広げ、ギムザ染色した。結果を図１５に示す。ＲＮＡｉを行っていないコントロールの細胞では、分裂前期の姉妹染色分体が動原体部位で強く接着しているが、ＲＮＡｉを行ったｈＳｇｏ１の発現を抑制した細胞では動原体部位の接着が弱くなって、離れやすくなっていることが判明した。このことから、増殖細胞の分裂期にｈＳｇｏ１は、染色体の動原体部位の強い接着を維持するのに重要な役割を持つことが示された。すなわち、Ｓｇｏ１タンパク質がＲＮＡｉ実験によりノックダウンされた有糸分裂細胞を集めて、染色体構造を直接観察するために染色体を拡大させた。コントロールとなる細胞では姉妹染色分体は腕部領域に沿って分離した動原体での一次性の収縮が観察された（図１６ａ  ｉ）。驚くべきことに、Ｓｇｏ１がない細胞では、姉妹染色分体がしばしば染色体長の全体に沿って分離した（図１６ａ  ｉｉｉ）。姉妹染色分体が密に接近しているサンプルは、姉妹染色分体が一次性の収縮を示さなかった（図１６ａ  ｉｖ）が、このことは動原体結合が選択的に失われたことを示している。ノコダゾール処理を行うと、紡錘体チェックポイントを活性化し、これにより前中期に細胞サイクルを拘束している。Ｍ期におけるこのような長期的拘束は、染色体の腕部領域からの結合性を完全に分離する。このために姉妹染色分体が動原体でのみ結合しており、「Ｘ型」染色体を形成する（図１６ｂ、コントロール）。予想通り、ノコダゾール処理を行うと、Ｓｇｏ１  ＲＮＡｉ干渉細胞において染色体長に沿った姉妹染色体分体が完全に分離した（〜９７％）（図１６ｃ、ｄ）。このことより、増殖細胞の分裂期にｈＳｇｏ１は染色体の動原体部位の強い接着を維持するのに重要な役割を持つことが示された。【００５０】  Ｂｕｂ１を標的としたＲＮＡｉ実験をそれぞれ行った。結果を図１７に示す。その結果、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２のいずれのタンパク質のセントロメアへの局在が消失した。この結果は、本発明者らが酵母で見つけた、「シュゴシンのセントロメアへの局在がＢｕｂ１キナーゼに依存している」という結論が、高等生物にも保存されていることを意味する。【００５１】  次に、マウスのシュゴシン相同遺伝子（配列番号２１、２３）のｃＤＮＡとＧＦＰ遺伝子を融合したクローンを、レトロウイルスベクターを用いて作製し、ヒトのＨｅＬａ細胞で発現させた。結果を図１８に示す。その結果、いずれ���ＧＦＰ融合タンパク質も、分裂期にヒトの動原体タンパク質Ｂｕｂ１と共局在することがわかった。【００５２】  以上のｈＳｇｏ１，ｈＳｇｏ２についての解析やマウスのシュゴシン相同遺伝子を用いた解析結果から、配列から予測した動物細胞のシュゴシン類似タンパク質が、機能的にも酵母のシュゴシンと保存性があることが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】  本発明のシュゴシンは真核細胞に広く保存された染色体分配制御因子で、染色体分配における機構解明の他、体細胞分裂では癌の誘発機構、また減数分裂では不妊症あるいはダウン症などの染色体分配疾患などの研究に、有利に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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