(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつシアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子を喪失した微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がシアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子を喪失した微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつシアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子を喪失した微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項４】
［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、シアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子を喪失した微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がシアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子を喪失した微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【請求項６】
ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源が、グルコースまたはフラクトースであることを特徴とする、請求項３〜５記載の製造法。
【請求項７】
微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である請求項１〜６記載の製造法。
【請求項８】
エシェリヒア属に属する微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリNAN8-71（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０８）株である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１〜８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を用いたＮ−アセチルノイラミン酸の製造法に関する。
【０００２】
背景技術
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法としては、抽出法、分解法、酵素を用いた方法、および微生物を用いた方法等が知られている。
抽出法としては、ウミツバメの巣などから抽出する方法［Carbohydr. Res., 56, 423 (1977)］等が知られている。
分解法としては、大腸菌などが生産するＮ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるコロミン酸を分解する方法［J. Biochem., 82, 1425 (1977)］等が知られている。
【０００３】
酵素を利用した方法としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いる方法［J. Am. Chem. Soc., 110, 6481 (1988)、J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988)］、アルカリ条件下でＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる方法［Enzyme Microbiol. Technol., 20, 393 (1997)、米国特許第5,665,574号］、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを用いる方法［Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991)、Carbohydr. Res., 306, 575 (1998)］、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、ホスホエノールピルビン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを用いる方法［特開平１０−４９６１、Glycobiology, 7, 697 (1997)］等が知られている。
【０００４】
微生物を用いる方法としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物を利用した方法(特開2001-136982)が知られている。
しかしながら、微生物を利用した方法以外の上記のＮ−アセチルノイラミン酸の製造法はいずれも操作が煩雑であったり、高価な原料を必要としたり、原料からの転換効率が不十分である。
【０００５】
微生物を利用した方法についても、更なるＮ−アセチルノイラミン酸の安価で効率的な製造法の開発が望まれている。
【０００６】
発明の開示
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価でより効率的な製造法を提供することを目的とする。
本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
【０００７】
（１）  Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を培地に培養し、該培地中にＮ−アセチルノイラミン酸を蓄積生成させ、該培地中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【０００８】
（２）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、およびＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【０００９】
（３）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体が、Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである上記（２）の製造法。
（４）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１０】
（５）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１１】
（６）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１２】
（７）  ［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１３】
（８）  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１４】
（９）  ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源が、グルコースまたはフラクトースであることを特徴とする、上記（６）〜（８）の製造法。
（１０）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物が、シアル酸アルドラーゼ活性が喪失または野生株より低下している微生物である上記（１）〜（９）の製造法。
【００１５】
（１１）  微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（１０）の製造法。
（１２）  エシェリヒア属に属する微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリNAN8-71（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０８）株である上記（１１）の製造法。
【００１６】
（１３）  培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１）〜（１２）の製造法。
【００１７】
（１４）  Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下しているエシェリヒア・コリNAN8-71（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０８）株。
【００１８】
本発明の製造法に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されず、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物より取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物より取得することもできる。
【００１９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、例えば該微生物としては、微生物の細胞表層等に存在する糖鎖の構成成分にＮ−アセチルノイラミン酸を含むことが知られている微生物［例えばAdv. Microbiol. Pysiol., 35, 135-246(1993)］をあげることができる。該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００２０】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００２１】
本発明の製造法に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸の生合成に関わる酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物が好ましい。
具体的には、遺伝子組換え手法によりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子などから選ばれる遺伝子のうち、１以上の遺伝子の発現が増強された微生物をあげることができる。
【００２２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子としては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子[J. Bacteriol., 177, 312 (1995)] 、ナイセリア・メニンギティディス由来の遺伝子[Mol. Microbiol., 14, 141 (1994)]、キャンピロバクター・ジェジュニ由来の遺伝子[Mol. Microbiol., 35, 1120 (2000)]等をあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子としては、ブタ由来のａｇｅ遺伝子(USP5,795,767)、シネコシスティス属に属する微生物由来のｓｌｒ１９７５(WO 00/47730)等をあげることができる。
【００２３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物としては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリNM522/pYP18(FERM BP-7283、特開2001-136982)などをあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼの活性を遺伝子組換え技術により増強した微生物としては、ブタ由来のａｇｅ遺伝子、またはシネコシスティス属に属する微生物由来のｓｌｒ１９７５遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリXL1-Blue/pEPI1 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)]、エシェリヒア・コリNM522/pYP16(FERM BP-7282、特開2001-136982)などをあげることができる。
【００２４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、通常用いられる変異誘起処理を親株に施した後、Ｎ−アセチルノイラミン酸を単一の炭素源あるいは窒素源とした寒天平板培地上に塗布し、生育できない株、または該変異誘起処理に供した親株と比較して生育が遅延する株を選択することにより取得することができる。親株としては、野生型株およびＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下している変異株などをあげることができる。
【００２５】
本発明において、野生型株とは、自然集団中でその微生物が属する種において、最も高頻度にみられる型の微生物のことをいい、親株とは、上記変異誘起処理で得られるＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物に対して、その変異誘起処理に供した株、または遺伝子組換え技術などを用いた形質転換に供した株のことをいう。
【００２６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の具体的な取得方法としては、親株である微生物に通常の変異誘起処理方法（ア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細胞を緩衝液で適当に希釈し、Ｎ−アセチルノイラミン酸を単一の炭素源あるいは窒素源とした寒天平板培地上に塗布し、該変異誘起処理に供した親株と比較して生育が遅延するあるいは生育できない株を、目的とする変異株として選択する方法をあげることができる。
【００２７】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、公知の染色体上での相同組換えを利用した変異の導入または遺伝子破壊法（モレキュラー・クローニング第３版あるいはア・ショート・コース・イン・バクテリアル・ジェネティクス）により取得することができる。公知のＮ−アセチルノイラミン酸分解酵素としては、シアル酸アルドラーゼが知られており、該酵素をコードする遺伝子も同定されている。
大腸菌のシアル酸アルドラーゼとしては、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡとしては配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡが知られている。
【００２８】
染色体上での相同組換えを利用した変異の導入または遺伝子破壊法により、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得する具体的な方法としては、λファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現する微生物を利用する方法をあげることができる［Gene, 246, 321-320 (2000)、Proc. Nat. Acad. Sci., 97, 6640-6645 (2000)］。
【００２９】
例えば、微生物として大腸菌を用いる場合、Ｒｅｄ組換え系を発現している大腸菌であるEscherichia coli ＫＭ２２株［J. Bacteriol., 180, 2063(1998)］、またはＫＭ２２株が保有するλＲｅｄ組換え系に関与する遺伝子で形質転換または形質導入された大腸菌を、
（１）薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（２）大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、および
（３）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
などを用いて形質転換することにより、シアル酸アルドラーゼ活性を喪失した大腸菌を取得することができる。
【００３０】
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。微生物に大腸菌を用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
【００３１】
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、Bacillus属に属する微生物由来のsacB遺伝子［Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366（1993）］、およびEscherichia属に属する微生物由来のrpsL遺伝子［Genomics, 72, 99-104(2001)］等をあげることができる。
【００３２】
上記直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、大腸菌の染色体ＤＮＡ上において配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは５００ｂｐ〜５ｋｂｐ程度が好ましく、５００ｂｐ〜２ｋｂｐ程度がより好ましく、１ｋｂｐ程度がさらに好ましい。
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
【００３３】
上記（１）〜（３）の直鎖ＤＮＡを用いて、シアル酸アルドラーゼ活性を喪失した大腸菌を取得する具体的な方法としては、
方法１：上記（１）の直鎖ＤＮＡを大腸菌に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法、
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（２）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除する方法、および
方法３：
［１］上記（３）の直鎖ＤＮＡを大腸菌に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡの両端の外側に位置するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法
などをあげることができる。
【００３４】
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
【００３５】
上記方法２および３は、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法である。
【００３６】
上記したＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性を喪失した微生物を取得法は、染色体ＤＮＡ上のシアル酸分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を完全に除去する方法であるが、上記方法で用いられる上記（１）、（３）の直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号４で表されるＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡの代わりに、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側および３’末端側のＤＮＡを含むＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡを用いることによっても、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性を喪失した大腸菌を取得することができる。
【００３７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が野生型株より低下した微生物の例としては、エシェリヒア・コリNAN8-71株があげられる。エシェリヒア・コリNAN8-71株は、平成１４年２月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７９０８として寄託されている。
【００３８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
【００３９】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００４０】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００４１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、例えば、Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産することができる微生物をあげることができる。
【００４２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体としては、微生物が有する酵素活性によりＮ−アセチルノイラミン酸に変換される前駆体であればいずれでもよく、好ましくはＮ−アセチルマンノサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンなどをあげることができる。
Ｎ−アセチルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸を生産することができる微生物としては、例えばＮ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物をあげることができる。
【００４３】
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物は、遺伝子組換え技術によりそれら酵素のいずれか一方、または両方の活性を増強した微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素活性およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性のいずれか一方、または両方が強い微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子のいずれか一方または両方を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることがでる。また該微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子とＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を別々に含有する２つの組換え体ＤＮＡを有する微生物であってもよい。
【００４４】
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡとしては、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18［エシェリヒア・コリNM522/pYP18(FERM BP-7283、特開2001-136982)より調製］、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1［エシェリヒア・コリXL1-Blue/pEPI1 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)より調製]、またはpYP16［エシェリヒア・コリNM522/pYP16(FERM BP-7282、特開2001-136982)より調製］をあげることができる。
【００４５】
上記したＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００４６】
また、上記したＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリNAN8-71(FERM BP-7908)などを親株に用い、上記したＮ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡおよびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの一方、または両方の組換え体ＤＮＡを導入することによってもＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００４７】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００４８】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００４９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性が変異手法または遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
【００５０】
該微生物として、具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物をあげることができる。
Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物としては、エシェリヒア・コリNM522/pYP18(FERM BP-7283)などをあげることができる。
【００５１】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
【００５２】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００５３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００５４】
具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性が増強されたエシェリヒア・コリNM522/pYP18(FERM BP-7283)などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００５５】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリNAN8-71(FERM BP-7908)などを親株として用い、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18を導入することによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
【００５６】
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００５７】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００５８】
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性が変異手法および遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入して得られる微生物をあげることができる。
【００５９】
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物としては、具体的にはエシェリヒア・コリXL1-Blue/pEPI1、およびエシェリヒア・コリNM522/pYP16(FERM BP-7282)などをあげることができる。
【００６０】
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
【００６１】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００６２】
Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００６３】
具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性が増強されたエシェリヒア・コリXL1-Blue/pEPI1またはエシェリヒア・コリNM522/pYP16(FERM BP-7282)などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００６４】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリNAN8-71(FERM BP-7908)などを親株として用い、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1、またはpYP16を導入することによりＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
【００６５】
本発明に用いられるホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００６６】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００６７】
ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、好ましくはホスホエノールピルビン酸を生産する能力が変異手法および遺伝子組換え技術などにより増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、具体的には、エシェリヒア・コリW1485lip2株［Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164(1994)］などをあげることができる。
【００６８】
本発明に用いられるホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば、特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００６９】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００７０】
ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００７１】
具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強されたエシェリヒア・コリ W1485lip2株などを親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００７２】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
【００７３】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００７４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性が増強された微生物が好ましい。
【００７５】
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができる。
【００７６】
該微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を同一の組換え体ＤＮＡに含む微生物であってもよい。
該微生物として、より具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【００７７】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
【００７８】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００７９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００８０】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を宿主微生物に導入して得られる微生物などをあげることができる。
【００８１】
上記方法により得られるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００８２】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であるエシェリヒア・コリNAN8-71(FERM BP-7908)などを親株として用い、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を導入することによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびＮ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することもできる。
【００８３】
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
【００８４】
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００８５】
Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
【００８６】
具体的には、遺伝子組換え技術などにより、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリW1485lip2株に、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【００８７】
上記方法により得られるＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を取得することができる。
本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
【００８８】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００８９】
Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００９０】
Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリW1485lip2株に、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【００９１】
上記方法により得られるＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【００９２】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
【００９３】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００９４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
【００９５】
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリW1485lip2株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【００９６】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定さない。
【００９７】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【００９８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【００９９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、上記したホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリW1485lip2株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【０１００】
上記したＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【０１０１】
本発明に用いられるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であれば特に限定されない。
【０１０２】
該微生物としては、例えばエシェリヒア属、コリネバクテリウム属、またはバチルス属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリなど、コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスおよびコリネバクテリウム・グルタミクムなど、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・サチルスなどをあげることができる。
【０１０３】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物から取得することができ、また逆にＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物から取得することもできる。
【０１０４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物が好ましい。
【０１０５】
具体的には、遺伝子組換え技術などによりＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有し、かつ変異手法または遺伝子組換え技術などによりホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物をあげることができる。
【０１０６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を同一の組換え体ＤＮＡに含み、かつホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であってもよい。
該微生物として、より具体的には、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力が増強された微生物であるエシェリヒア・コリW1485lip2株に、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpYP18、およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡであるpEPI1またはpYP16を導入して得られる微生物などをあげることができる。
【０１０７】
上記方法により得られるＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物を親株として、上記した変異誘起処理または相同組換え法を用いることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を取得することができる。
【０１０８】
本発明の製造法において、遺伝子組換え微生物を利用する場合、プラスミドＤＮＡの単離、精製、組換え体ＤＮＡの作製、該組換え体ＤＮＡを用いた形質転換、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）等の遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法（モレキュラー・クローニング第３版あるいはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）に準じて行うことができる。
【０１０９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造に関与するＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン  ２−エピメラーゼ等のタンパク質を組換え手法により、微生物で発現させるためには、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した微生物に導入することにより達成することができる。
【０１１０】
微生物としては、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記微生物において自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可能で、該タンパク質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【０１１１】
微生物として細菌等の原核生物を用いる場合には、Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【０１１２】
発現ベクターとしては、例えば、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、pTrs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pGHA2 [Escherichia coli IGHA2（FERM B-400）より調製、特開昭60-221091]、pGKA2 [Escherichia coli IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091]、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、pGEX（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pETシステム（ノバジェン社製）等をあげることができる。
【０１１３】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１１４】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡにおいて、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【０１１５】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NM522、Escherichia coli NY49、Escherichia coli GI698、Escherichia coli TB1、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【０１１６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 17, 107(1982)やMol. Gen. Genet., 168, 111(1979)に記載の方法等をあげることができる。
【０１１７】
本発明の製造法に用いられる微生物の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。
本発明の製造法に用いられる微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１１８】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
【０１１９】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸および有機酸のアンモニウム塩、およびペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【０１２０】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常 16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【０１２１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン、テトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１２２】
上記した培養方法により、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物を培地に培養し、該培地中にＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該培地中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することによりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
【０１２３】
また、Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法としては、
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆体からＮ−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、およびＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（２）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、ホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（３）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ａ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｂのいずれか一方、または両方の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ａの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｂの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルマンノサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（４）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有し、かつＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、および該微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
（５）［１］Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力、［２］Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力、および［３］ホスホエノールピルビン酸を生産する能力から選ばれる１または２つの能力を有する微生物Ｃ、［１］〜［３］から選ばれる能力のうち該微生物Ｃが有していない能力の全部を有する微生物Ｄのいずれか一方または両方の微生物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｃの培養物または該培養物の処理物および該微生物Ｄの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、および
（６）Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｅ、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物Ｆ、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物Ｇのうち、１以上の微生物がＮ−アセチルノイラミン酸の分解活性が喪失または野生型株より低下している微生物であって、該微生物Ｅの培養物または該培養物の処理物、該微生物Ｆの培養物または該培養物の処理物、および該微生物Ｇの培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびホスホエノールピルビン酸を生産する能力を有する微生物がホスホエノールピルビン酸を生産するために必要な炭素源を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取する方法、
をあげることができる。
【０１２４】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体のタンパク質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
【０１２５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において、酵素源として用いる微生物の培養物または該培養物の処理物の量は、単一の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いるときは該単一の微生物の培養物または該培養物の処理物の活性として、また複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いるときは該複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を合わせた活性として、37℃で1分間に1μmolのＮ−アセチルノイラミン酸を生成することのできる活性を1単位（U）として、0.1 mU/l〜10,000 U/l であり、好ましくは  Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において用いられる各微生物の量は、用いる各微生物について、湿菌体として1〜300g/lである。
【０１２６】
本発明で用いられるＮ−アセチルマンノサミンあるいはＮ−アセチルグルコサミンなどのＮ−アセチルノイラミン酸の前駆体は、通常1〜300g/lの濃度で用いられる。
ホスホエノールピルビン酸の生産に必要な炭素源としては、ホスホエノールピルビン酸に代謝される炭素源であればいずれも用いることができるが、好ましくはグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物等をあげることができ、より好ましくはグルコースやフラクトースなどをあげることができる。これらの炭素源は、一括して添加してもよいし、分割あるいは連続的に添加することもでき、通常10〜300g/lの濃度で用いられる。
【０１２７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
【０１２８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。
【０１２９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成反応において、必要に応じて塩化マグネシウム、塩化マンガン等を添加することができる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成反応は水性媒体中、pH 5〜10、好ましくはpH 6〜8、20〜50℃、好ましくは30℃〜40℃の条件で1〜96時間行う。
水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸の定量は公知の方法[Anal. Biochem., 189, 151 (1990)]に準じて行うことができる。
【０１３０】
培養物中または水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラミン酸の採取は、イオン交換樹脂などを用いる通常の方法［Enzyme Microbiol. Technol., 20, 393 (1997)］に準じて行うことができる
【０１３１】
本発明を実施するための最良の形態
実施例１  Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ発現株の造成
【０１３２】
0.2μgのpYP18（特開2000-136982）を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキット（フナコシ社製）によりエシェリヒア・コリ由来のＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む 1.1 kbのＤＮＡ断片を回収した。次に0.1μgのpTrS32 [Escherichia coli JM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調製]を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に4.2 kbのＤＮＡ断片を回収した。
【０１３３】
該1.1 kbおよび4.2 kbの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（10 g/l バクトトリプトン（Difco社製）、10 g/l 酵母エキス、5 g/l 塩化ナトリウム、15g/l 寒天）に塗布後、30℃で一晩培養した。
【０１３４】
生育してきた形質転換体のコロニーから前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子発現プラスミドであるpLT1を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
【０１３５】
次に0.2μgのpYP16（特開2000-136982）を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンIIキットを用いてシネコシスティス属に属する微生物由来のＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を含む1.2 kbのＤＮＡ断片を回収した。次に0.1μgのpTrS32を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に4.2 kbのＤＮＡ断片を回収した。
【０１３６】
該1.2 kbおよび4.2 kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子発現プラスミドであるpNE12を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
【０１３７】
配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、pLT1プラスミドＤＮＡを鋳型として以下の方法によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、0.1μgのpLT1プラスミドＤＮＡ、各0.5μmol/lの上記プライマーＤＮＡ、2.5 unitsのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、4μlのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各200μmol/lのdeoxy NTPを含む反応液40μlを用い、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間を1工程とする反応を30回繰り返すことにより行い、約1.1 kbのＰＣＲ産物を取得した。
【０１３８】
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを該反応液に添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
【０１３９】
該ＤＮＡの沈殿を20μl のＴＥ[10 mmol/l Tris-HCl、1 mmol/l EDTA (pH8.0)]に溶解した。5μlの該溶解液を用い、該ＤＮＡを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットを用いてＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子を含む 1.1 kbのＤＮＡ断片を回収した。
【０１４０】
0.2μgのpNE12を制限酵素BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に5.4 kbのＤＮＡ断片を回収した。
該1.1 kbおよび5.4 kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【０１４１】
生育してきた形質転換体のコロニーからプラスミドを抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼを発現するプラスミドであるpLT4を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）
実施例２ Ｎ−アセチルノイラミン酸分解活性低下株の取得
【０１４２】
Escherichiacoli HN0074株(FERM BP-4425)を、30 mlのＬＢ培地（10 g/l バクトトリプトン（Difco社製）、10 g/l 酵母エキス、5 g/l 塩化ナトリウム）が入った 300 ml容の三角フラスコに植菌し、28℃で5時間振盪培養した。培養液を4℃で3,000rpmにて10分間遠心分離して対数増殖期の細胞を回収した。該細胞をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン 0.1 mg/mlを含有するＴＭ緩衝液[6.1 g/l トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、5.8 g/l マレイン酸、0.1 g/l  硫酸マグネシウム・七水和物、1 g/l  硫酸アンモニウム、0.5 g/l  クエン酸ナトリウム、pH 6.0]に懸濁し、37℃で30分間変異処理を行った。変異処理を行った細胞を遠心分離により集めて洗浄した後、滅菌水に懸濁した。該懸濁液を1.5%の寒天を含有するＭ９最少培地[3 g/l  グルコース、6g/l リン酸水素二ナトリウム、3g/l リン酸二水素カリウム、5g/l 塩化ナトリウム、1g/l 塩化アンモニウム、0.24g/l 硫酸マグネシウム・七水和物、4mg/l ビタミンB1]および該寒天含有Ｍ９最小培地に含まれるグルコースの代わりに0.75 g/lのＮ−アセチルノイラミン酸を含む培地からなる平板培地上に塗布し、37℃で2日間培養し、グルコースを含む培地で良好に生育し、Ｎ−アセチルノイラミン酸を含む培地で生育が遅延または生育できない株を選択し、Escherichiacoli NAN8-71株を取得した。
【０１４３】
Escherichia coliHN0074株およびNAN8-71株を30 mlのＭ９最少培地が入った300 ml容の三角フラスコに植菌し、37℃で7時間振盪培養した。培養液を4℃で10,000rpmにて10分間遠心分離して菌体を回収した。
120 g/lのEscherichia coli HN0074株またはNAN8-71株の湿菌体、20g/lのＮ−アセチルノイラミン酸 、4 g/lのナイミーンS-215、10 ml/lのキシレンからなる0.1 mlの反応液を用いて、32℃で2時間、振盪下で反応を行った。反応生成物をＨＰＬＣにて分析した結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸の残存率は、親株のHN0074株が85%であるのに対して、NAN8-71株では98%であった。
実施例３  Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産
【０１４４】
実施例1で得られたプラスミドpLT4を用いてEscherichia coliNAN8-71株を形質転換し、得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養することによりEscherichia coli NAN8-71/pLT4株を取得した。
【０１４５】
Escherichia coliNAN8-71/pLT4株を50μg/mlのアンピシリンを含む150mlのＬＢ培地の入った 1Ｌ容のバッフル付き三角フラスコに接種し、30℃で 220 rpmの条件で17時間培養した。次に150 mlの該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む3 LのＭ９培地 [5 g/l グルコース、6 g/l リン酸水素二ナトリウム、KH2PO43 g/l リン酸二水素カリウム、5 g/l 塩化ナトリウム、1 g/l 塩化アンモニウム、2.4 g/l 硫酸マグネシウム・七水和物、10 mg/l 硫酸マンガン・一水和物、200 mg/l 硫酸鉄・七水和物、8 mg/l ビタミンB1、5 g/l ペプトン(極東製薬社製)]が入った5 L容の培養槽に接種し、600 rpm、通気量3L/分の条件で 30℃で6.5時間培養を行った。培養中、28％アンモニア水を用いて培養液のpHを7.0に維持した。培養終了後、培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【０１４６】
200 g/lのEscherichia coli NAN8-71/pLT4株湿菌体、90 g/lのＮ−アセチルグルコサミン、50 g/lのグルコース、4 g/lのナイミーンS-215、10 ml/lのキシレンからなる30 mlの反応液を200 ml容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（900 rpm）しながら、32℃で24時間反応を行った。反応中、2 mol/lの水酸化ナトリウム溶液を用いて、該反応液のpHを7.2に維持し、必要に応じてグルコースを添加した。
【０１４７】
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにて分析し、反応液中に35g/lのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積していることを確認した。同様の培養および反応をEscherichiacoli HN0074/pLT4株湿菌体を用いて行った場合のＮ−アセチルノイラミン酸の蓄積量は12 g/lであった。
産業上の利用可能性
【０１４８】
本発明により、Ｎ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
配列表
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD
<120> Process for producing of N-acetylneuraminic acid
<130> 11455WO1
<140>
<141>
<150> JP 2002-53696
<151> 2002-02-28
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 1
ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgat                                   29
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 2
tttggatcct cattattccc cctgattttt gaa                              33
<210> 3
<211> 267
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 3
Met Ala Thr Asn Leu Arg Gly Val Met Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe
1               5                  10                  15
Asp Gln Gln Gln Ala Leu Asp Lys Ala Ser Leu Arg Arg Leu Val Gln
20                  25                  30
Phe Asn Ile Gln Gln Gly Ile Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr
35                  40                  45
Gly Glu Ala Phe Val Gln Ser Leu Ser Glu Arg Glu Gln Val Leu Glu
50                  55                  60
Ile Val Ala Glu Glu Ala Lys Gly Lys Ile Lys Leu Ile Ala His Val
65                  70                  75                  80
Gly Cys Val Ser Thr Ala Glu Ser Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ala Lys
85                  90                  95
Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Val Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Pro
100                 105                 110
Phe Ser Phe Glu Glu His Cys Asp His Tyr Arg Ala Ile Ile Asp Ser
115                 120                 125
Ala Asp Gly Leu Pro Met Val Val Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Ser Gly
130                 135                 140
Val Lys Leu Thr Leu Asp Gln Ile Asn Thr Leu Val Thr Leu Pro Gly
145                 150                 155                 160
Val Gly Ala Leu Lys Gln Thr Ser Gly Asp Leu Tyr Gln Met Glu Gln
165                 170                 175
Ile Arg Arg Glu His Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Gly Tyr Asp Glu
180                 185                 190
Ile Phe Ala Ser Gly Leu Leu Ala Gly Ala Asp Gly Gly Ile Gly Ser
195                 200                 205
Thr Tyr Asn Ile Met Gly Trp Arg Tyr Gln Gly Ile Val Lys Ala Leu
210                 215                 220
Lys Glu Gly Asp Ile Gln Thr Ala Gln Lys Leu Gln Thr Glu Cys Asn
225                 230                 235                 240
Lys Val Ile Asp Leu Leu Ile Lys Thr Gly Val Phe Arg Gly Leu Lys
245                 250                 255
Thr Val Leu His Tyr Met Asp Val Val Ser Val Pro Leu Cys Arg Lys
260                 265                 270
Pro Phe Gly Pro Val Asp Glu Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Lys Ala Leu
275                 280                 285
Ala Gln Gln Leu Met Gln Glu Arg Gly
290                 295
<210> 4
<211> 891
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
atg gca acg aat tta cgt ggc gta atg gct gca ctc ctg act cct ttt   48
Met Ala Thr Asn Leu Arg Gly Val Met Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe
1               5                  10                  15
gac caa caa caa gca ctg gat aaa gcg agt ctg cgt cgc ctg gtt cag   96
Asp Gln Gln Gln Ala Leu Asp Lys Ala Ser Leu Arg Arg Leu Val Gln
20                  25                  30
ttc aat att cag cag ggc atc gac ggt tta tac gtg ggt ggt tcg acc   144
Phe Asn Ile Gln Gln Gly Ile Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr
35                  40                  45
ggc gag gcc ttt gta caa agc ctt tcc gag cgt gaa cag gta ctg gaa   192
Gly Glu Ala Phe Val Gln Ser Leu Ser Glu Arg Glu Gln Val Leu Glu
50                  55                  60
atc gtc gcc gaa gag gcg aaa ggt aag att aaa ctc atc gcc cac gtc   240
Ile Val Ala Glu Glu Ala Lys Gly Lys Ile Lys Leu Ile Ala His Val
65                  70                  75                  80
ggt tgc gtc agc acc gcc gaa agc caa caa ctt gcg gca tcg gct aaa   288
Gly Cys Val Ser Thr Ala Glu Ser Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ala Lys
85                  90                  95
cgt tat ggc ttc gat gcc gtc tcc gcc gtc acg ccg ttc tac tat cct   336
Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Val Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Pro
100                 105                 110
【図面の簡単な説明】
第１図はＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子およびＮ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドpLT4の造成工程を示す。
また、図中の符号の意味は、以下に示す通りである。
Ａｍｐr：アンピシリン耐性遺伝子
ＰＬ：ＰＬプロモーター
Ｐtrp×2：トリプトファンタンデムプロモーター
ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素遺伝子
ｓｌｒ１９７５：Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ遺伝子
【図１】
0004318549.tif 000002