(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
ａ）配列番号：２をコードするか；
ｂ）受託番号９７６３６を有するＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるｃＤＮＡによりコードされるｐ１０１調節サブユニットアミノ酸配列をコードするか；
ｃ）配列番号：１２をコードするか；
ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ），（ｂ），（ｃ）、配列番号：１または配列番号：１１のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイゼーションするか；または
ｅ）（ａ），（ｂ）または（ｃ）の核酸配列において１もしくは数個の核酸の置換、欠失もしくは付加を有する、
ヌクレオチド配列を含み、かつ、該核酸分子がｐ１０１遺伝子産物をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、前記（ａ），（ｂ）または（ｃ）の核酸配列において１もしくは数個の核酸の置換、欠失もしくは付加を有する、ヌクレオチド配列の核酸配列であり、かつ、該核酸分子がｐ１０１遺伝子産物をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭＥＤＴＡ中のハイブリダイゼーション工程および６８℃での０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄工程を包含する高度のストリンジェント条件下で（ａ），（ｂ）、（ｃ）、配列番号：１もしくは配列番号：１１のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイゼーションし、かつ、該核酸分子がｐ１０１遺伝子産物をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が、配列番号：２をコードするか、または配列番号：２のアミノ酸配列をコードし、ここで４８３位の該セリンアミノ酸残基がグリシンアミノ酸残基に置換されたものである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が配列番号：１２をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号：２のアミノ酸残基１〜１６０、配列番号：２のアミノ酸残基１６１〜２６３、配列番号：２のアミノ酸残基１〜７３２、配列番号：２のアミノ酸残基７３３〜８７７、配列番号：２のアミノ酸残基１６１〜８７７、配列番号：２からアミノ酸残基１６１〜２６３を欠失させたもの、配列番号：２のアミノ酸残基１〜８７７、配列番号：１２のアミノ酸残基１〜１６０、配列番号：１２のアミノ酸残基１６１〜２６３、配列番号：１２のアミノ酸残基１〜７３５、配列番号：１２のアミノ酸残基７３６〜８８０および配列番号：１２のアミノ酸残基１〜８８０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
異種ポリペプチドに融合された請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記異種ポリペプチドがＧｌｕタグまたはｍｙｃエピトープタグである、請求項７に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチドベクター。
【請求項１０】
宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現をコントロールするヌクレオチド調節配列と作動可能に連結した請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含有する発現ベクター。
【請求項１１】
前記調節配列が、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、バキュロウイルスのプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のコントロール領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母a−接合因子のプロモーターから成る群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が非ヒト動物の一部である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、請求項１１に記載のベクターを含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞がＳｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、またはＵ９３７細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
天然の遺伝子配列を含む単離された細胞であって、該天然の遺伝子配列は、（ｉ）該天然の遺伝子配列が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸配列をコードする、または（ｉｉ）Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋ遺伝子産物のｐ１０１サブユニットの天然の配列からの発現を阻害または抑制するように該天然の配列が破壊されている、細胞。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋの単離されたｐ１０１調節サブユニットであって、該ヌクレオチド配列は、以下：
ａ）配列番号：２をコードするか；
ｂ）受託番号９７６３６を有するＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるｃＤＮＡによりコードされるｐ１０１調節サブユニットアミノ酸配列をコードするか；
ｃ）配列番号：１２をコードするか；
ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ），（ｂ），（ｃ）、配列番号：１または配列番号：１１のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイゼーションするか；または
ｅ）（ａ），（ｂ）または（ｃ）の核酸配列において１もしくは数個の核酸の置換、欠失もしくは付加を有する、
ヌクレオチド配列を含み、かつ、該核酸分子がｐ１０１遺伝子産物をコードする、単離された、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニット。
【請求項１８】
配列番号：２を含むか、または配列番号：２のアミノ酸配列において、ここで４８３位の該セリンアミノ酸残基がグリシンアミノ酸残基に置換されたものを含む、請求項１７に記載の単離された、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニット。
【請求項１９】
配列番号：１２のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の単離された、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニット。
【請求項２０】
配列番号：２のアミノ酸残基１〜１６０、配列番号：２のアミノ酸残基１６１〜２６３、配列番号：２のアミノ酸残基１〜７３２、配列番号：２のアミノ酸残基７３３〜８７７、配列番号：２のアミノ酸残基１６１〜８７７、配列番号：２からアミノ酸残基１６１〜２６３を欠失させたもの、配列番号：２のアミノ酸残基１〜８７７、配列番号：１２のアミノ酸残基１〜１６０、配列番号：１２のアミノ酸残基１６１〜２６３、配列番号：１２のアミノ酸残基１〜７３５、配列番号：１２のアミノ酸残基７３６〜８８０および配列番号：１２のアミノ酸残基１〜８８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２１】
異種ポリペプチドに融合した請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有するキメラタンパク質。
【請求項２２】
前記異種ポリペプチドがＧｌｕタグまたはｍｙｃエピトープタグである、請求項２１に記載のキメラタンパク質。
【請求項２３】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニットに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項２４】
哺乳動物のゲノムの中に含有されるＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋ遺伝子変異のｐ１０１調節サブユニットを検出することを包含する、哺乳動物における炎症性応答の障害のためのデータを収集する方法であって、
ここで該Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋ遺伝子の野生型ｐ１０１調節サブユニットは、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現し、そしてここでＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋ遺伝子変異のｐ１０１調節サブユニットの検出は、炎症性応答の障害の指標である、方法。
【請求項２５】
炎症性応答の障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットをコードする核酸分子を発現する請求項１２に記載の培養宿主細胞に化合物を接触させる工程；および
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットをコードする核酸分子の発現パターンにおける変化、または該培養細胞によって発現されたＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットの活性もしくは量における変化を、該化合物の不存在下でのＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットの発現パターンもしくは活性との比較で検出する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記タンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節性サブユニットをコードする核酸分子の発現が、ｐ１０１遺伝子のｍＲＮＡ転写体を測定することによって検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｐ１０１核酸の発現が、ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質の活性もしくは量を測定することによって検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
炎症性応答の障害の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニットをコードする核酸を発現する請求項１２に記載の培養細胞に化合物を接触させる工程；
（ｉ）ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生の変化；
（ｉｉ）細胞接着の変化；または
（ｉｉｉ）Ｏ2の生成の変化を、
該化合物の不存在下での該宿主細胞による
（ｉ）ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生；
（ｉｉ）細胞接着；または
（ｉｉｉ）Ｏ2の生成とそれぞれ対比して
検出する工程を包含する、
方法。
【請求項２９】
アニオン交換ＨＰＬＣを使用を使用して、前記宿主細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3のレベルをアッセイする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸配列を含む請求項９〜１１に記載のベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、さらに、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１２０触媒サブユニットをコードする核酸分子を含み、該核酸分子は、以下：
ａ）配列番号：４をコードするか；
ｂ）受託番号９７６３７を有するＡＴＣＣに寄託されたｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１２０のｃＤＮＡクローンの中に含有されるｃＤＮＡによりコードされるｐ１２０触媒サブユニットのアミノ酸配列をコードするか；
ｃ）配列番号：１４をコードするか；あるいは
ｄ）ストリンジェント条件下で、（ａ），（ｂ），（ｃ）、配列番号：３または配列番号：１３のヌクレオチド配列によってコードされるｐ１２０サブユニットの最後の２８アミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイゼーションするか；または
ｅ）（ａ），（ｂ）または（ｃ）の核酸配列において１もしくは数個の核酸の置換、欠失もしくは付加を有する、
ヌクレオチド配列を含み、かつ、該核酸分子がｐ１２０遺伝子産物をコードする、ヌクレオチド配列を有する、宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞は非ヒト哺乳動物の一部である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ｐ１０１遺伝子産物を発現する能力を有する宿主細胞を作製する方法であって、該方法は、
請求項９〜１１のいずれか一項のベクターを該宿主細胞に導入する工程：および
該ｐ１０１遺伝子産物の発現について該宿主細胞をスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
ｐ１０１ポリペプチドを生産する方法であって、該方法は、
請求項１２または請求項３０に記載の宿主細胞を提供する工程；および
該ｐ１０１ポリペプチドをコードするｐ１０１ヌクレオチド配列および必要に応じて該細胞中のｐ１２０ヌクレオチド配列を発現する条件下で該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
ｐ１０１ポリペプチドを生産する方法であって、
請求項１２に記載の宿主細胞を提供する工程；および
該ｐ１０１ポリペプチドをコードするｐ１０１ヌクレオチド配列を発現する条件下で該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞または前記培養の培地から前記ｐ１０１ポリペプチドおよび必要に応じてｐ１２０ポリペプチドを回収する工程をさらに包含する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、ｐＧＥＸベクターを含み、前記ｐ１０１ポリペプチドの回収が、ＧＳＴ部分から前記ｐ１０１ポリペプチドを放出させる工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニットをコードする、単離された核酸分子であって、該核酸分子は、受託番号９７６３６を有するＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるｃＤＮＡを含む、核酸分子。
【請求項３８】
配列番号：２または配列番号：１２に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋのｐ１０１調節サブユニット。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は、細胞のシグナル伝達経路に関係する造血系列の細胞から単離された、新規なＧタンパク質調節ホスホイノシチド３ＯＨ−キナーゼ酵素、および疾患の治療および診断におけるこれらの新規な酵素の使用に関する。
２．発明の背景
ホスホイノシチド３ＯＨ−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、細胞のホスホイノシチドの少なくとも１つのを３−リン酸化することができる酵素の大きいファミリーである（Whitman et al.、1988、Nature 332:644-646;Augaer et al.、1989、Cell 57:167-175）。３−リン酸化ホスホイノシチドはすべての高等真核細胞の中に見出される。増大する証拠は、細胞のシグナル伝達における新規かつ重要な第２メッセンジャー系の一部分として、ＰＩ３Ｋおよびこの酵素の脂質産物、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート（以後「ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3」）を関係づける。この新規なＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3をベースとするシグナリング系の成分は、ホスホイノシチドＣ（ＰＩＣ）がＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2を加水分解して構造的に独特な第２メッセンジャーのイノシトール（１，４，５）−トリホスフェート（Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ3）およびジアシルグリセロールを解放する、イノシトールリン脂質をベースとする従来特徴づけられたシグナリング経路に対して独立であるように見える。
選択された細胞外アゴニストおよび成長因子は、細胞内ＰＩ３Ｋ活性を刺激し、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の急速な一時的細胞内蓄積を引き起こす。驚くべきことには、種々の異なる型の細胞表面のレセプター、例えば、レセプターのチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリー非レセプターのチロシンキナーゼとアソシエートしたレセプター、サイトカイン成長因子、およびＧタンパク質共役レセプターの刺激のすべてはＰＩ３Ｋファミリーのメンバーを活性化するであろう。（Stephens et al.、1993、Biochemica et Biophysica Acta、1179:27-75、において概観されている）。例えば、活性化したとき、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の蓄積を増加するチロシンキナーゼのレセプターは、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプターファミリーのメンバー、ＣＳＦ−１レセプター、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、およびＮＧＦレセプターである。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の蓄積を刺激するｓｒｃファミリーの非レセプターのチロシンキナーゼとアソシエートしたレセプターは、Ｉｌ−２レセプター、Ｉｌ−３レセプター、ｍＩｇＭレセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ２レセプター、およびＣＤ３／Ｔ細胞レセプターである。さらに、サイトカインＩｌ−４レセプター、ＡＴＰレセプター、およびｆＭＬＰレセプターのすべてはＰＩ３Ｋの活性を刺激し、引き続くＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を蓄積させる。したがって、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3は極めて多様なシグナリング経路における第２メッセンジャーであるように見える。
ＰＩ３Ｋの活性およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生がこれらの多様なレセプターのシグナル伝達の生理学的に関係する経路であるという命題の支持は、なかでも、実験の証拠の２つの異なる系統から誘びかれる：真菌の代謝物質によるＰＩ３Ｋ活性の阻害および直接的タンパク質のアソシエーションの観察。真菌の代謝物質であるワートマンニンは、ＰＩ３Ｋの触媒ドメインに共有結合させることによってＰＩ３Ｋ活性を不可逆的に阻害する。ワートマンニンによりＰＩ３Ｋ活性の阻害は、細胞外因子に対する引き続く細胞の応答を排除する。例えば、好中球はＰＩ３Ｋを刺激しかっＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を合成することによってケモカインｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）に対して応答する。この合成は侵入性微生物の好中球破壊に関係するレスピラトリーバーストの活性化と相関する。ワートマンニンにより好中球の処理は、ｆＭＬＰ誘発レスピラトリーバーストの応答を防止する。Thelen et al.、1994、PNAS USA 91:4960-4964。事実、ワートマンニンを使用するこれらの実験、ならびに他の実験の証拠は、造血系列の細胞、特に好中球、単球、および他の型の白血球におけるＰＩ３Ｋ活性が急性および慢性の炎症に関連する多数の非記憶性免疫応答に関係することを示す。
ＰＩ３Ｋ酵素は、いくつかのレセプターチロシンキナーゼの活性化された形態と直接的に相互作用し、そしてそれらを使用して同時精製することができる。精製したとき、レセプターチロシンキナーゼとアソシエートしたＰＩ３Ｋは、触媒サブユニットと、アダプター（または調節）サブユニットとを含んでなる１７０〜２００ｋＤのヘテロダイマーから成ることが見出された（Otsu et al.、1991、Cell 65:90-104、Pons et al.、1995、Mol.Cell.Biol.15:4453-4465、Inukai et al.、1996、J.Biol.Chem.271:5317-5320）。
触媒サブユニットの２つの異なる相同体ｐ１１０αおよびｐ１１０βは記載され、そしてクローニングされた。触媒サブユニットは、ワートマンニンと不可逆的に結合し、高度に関係する調節サブユニットの小さいファミリーの１つまたは他のメンバー、ｐ５５α、ｐ５５ＰＩＫ、ｐ８５αおよびｐ８５βと密接にアソシエートして、１７０〜２００ｋＤのヘテロダイマーを形成する。既知の調節サブユニットは、２つのＳＨ２ドメインを含む、タンパク質：タンパク質相互作用ドメインの大きい集合を含有する（Cantley et al.、1991、Cell 64:281-302）。
ＳＨ２の存在は活性化されたレセプターチロシンキナーゼに対するＰＩ３Ｋの結合および刺激の原因となると考えられる。活性化されたレセプターは、５５〜８７ｋＤのＰＩ３Ｋアダプターの中に見出されるＳＨ２ドメインが好む局所的コンセンサス配列内の主要なチロシン残基において、リン酸化される（Songyang et al.、1993、Cell 72:767-778）。いったんＰＩ３Ｋヘテロダイマーが結合すると、それはＰＩ３Ｋの触媒サブユニットを直接的に活性化し（しかし、この作用はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて比較的小さい、Carpenter et al.、1993、J.Biol.Chem.268:9478-9483、Backer et al.、1992、EMBO J.11:3469-3479）そして細胞質ゾルのＰＩ３Ｋをそのリン脂質の基質源に転位させる。これらの因子の組合わせは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3産生における動揺に導く。明らかなように、ＰＩ３Ｋのこれらのイソ型（ｐ１００α／ｐ１１０β／ｐ５５α、ｐ５５ＰＩＫ）は、ＰＩ−ＰＬＣｓのτファミリーがレセプター感受性チロシンキナーゼにより調節されるのと非常に似た方法において、レセプター調節チロシンキナーゼの下流のデディケイテッド（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）シグナルトランスデューサーとして機能するために構造的に適合されるように思われる（LeeおよびRhee、1995、Curr.Biol.7:193-189）。
しかしながら、ＰＩ３Ｋｓのｐ１１０／ｐ８５サブファミリーは、ヘテロトリマーのＣＴＰアーゼを利用してそれらのシグナルを伝達する細胞表面のレセプターの活性化の結果として起こることができるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生に関係すると思われない（例えば、ｆＭＬＰ、ＰＡＦ、ＡＴＰ、およびトロンビン）。これらの型の細胞表面のレセプターは、活性が免疫系の炎症性応答に関係する造血起源の細胞において主として記載されてきている。最近の証拠は、約２２０ｋＤの自然の、相対的分子量を有するＵ９３７細胞および好中球の中に、ワートマンニン感受性ＰＩ３Ｋのクロマトグラフィー的に独特な形態が存在することを示唆した（Stephens et al.、1994、Cell 77:83-93）。このＰＩ３Ｋ活性はＧβγサブユニットにより特異的に刺激されることができるが、Ｇα−ＧＴＰサブユニットにより活性されない。同様なＰＩ３Ｋ活性は、また、骨肉腫細胞系統において記載されてきている（Morris et al.、1995、Mol.Pharm.48:532-539）。また、血小板ハＧβγ感受性ＰＩ３Ｋを含有するが、これがｐ８５／ｐ１１０ＰＩ３Ｋファミリーのメンバーであるかどうかは不明瞭である（Thomason et al.、1994、J.Biol.Chem.269:16525-16528）。この程度に特性決定されたＧβγ感受性ＰＩ３ＫはＡＴＰ、ｆＭＬＰおよびその他のようなアゴニストに応答してＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生に関係するように思われた。
最近、Stoyanov et al.（1995）は、ヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーからの、ｐ１１０γと呼ぶ、ワートマンニン感受性ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2−選択的ＰＩ３Ｋのクローニングおよび発現を発表した。潜在的ＰＩ３Ｋの触媒中心ならびにＰｔｄＩｎｓ４−キナーゼの触媒中心をターゲッティングするように設計されたプライマーを使用するＰＣＲにより、ｐ１１０γは増幅された。それは、例えば、ｐ８５アダプターファミリーの１メンバーのためのアミノ末端の結合ドメインを欠如するので、それはｐ１１０αおよびｐ１１０βと明瞭に区別される。ｐ１１０γは、Ｇα−ＧＴＰおよびＧβγ−サブユニットの双方に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるその感受性および骨髄由来細胞におけるその発現に基づいて、ヘテロトリマーのＧＴＰアーゼ結合レセプターから下流のＰＩ３Ｋ活性であると推測された。それにもかかわらず、この仮説は、Ｇβγ応答性ＰＩ３ＫがＧα−ＧＴＰサブユニットにより刺激されないこと、およびそれが約２２０ｋＤの非常に低い分子量を有することを示した、初期の生化学的証拠に関して、いくつかの未解決の問題を残した。
ｐ１１０γに対するＧβγサブユニットの作用は、推定上のＮＨ2−末端のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを介して仲介されることが示唆された。しかしながら、増加する数のＧβγ調節エフェクターの記載とともに、増大する証拠はＰＨドメインが広く使用されるＧβγ結合ドメインを表わさないことを示唆する。いくつかのエフェクターのＧβγ活性化または阻害を特異的にブロックするＧβγ−活性化アデニレートシクラーゼ（ＡＣｓ２および４）の中にのみ見出されるドメインの配列に基づく、比較的小さいペプチドのパネルを使用する、最近の研究において、Ｇβγサブユニットが広く使用されるエフェクター活性化ドメインを含有することを信じさせる、いくつかの根拠が存在しうることが示唆された。さらに、このエフェクター活性化ドメインと相互作用する異なるエフェクターにおける領域は、有意な配列の類似性を示す。それゆえ、これらのペプチドの研究により強調されるＡＣ２におけるドメイン内のモチーフ（Ｇｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）は、また、Ｇβγサブユニットによる調節に既に関係づけられたカリウムチャンネルおよびβ−ＡＲＫｓの領域において出現する（Chen et al.、1995、Science 268:1166-1169）。しかしながら、このモチーフはＧβγサブユニットにより調節されることが知られているすべてのタンパク質において複製されず、結局、配列の分析はタンパク質がＧβγサブユニットにより調節されるかどうかを結局予測することができる。Ｇタンパク質結合レセプターを通してシグナルを伝達する細胞のアゴニストによりＰＩ３Ｋ活性が活性化されるメカニズムの同定は、欠如している。炎症性応答に関係する好中球のレスピラトリーバーストを活性化するアゴニストの大部分は、レセプターチロシンキナーゼよりもＧタンパク質共役レセプターに結合するであろうすることに注意することは重要である。したがって、ＰＩ３Ｋがこれらの型のケモカインに応答して調節されるメカニズムは、チロシンキナーゼを通してシグナルを伝達する成長因子による調節と非常に異なるようである。本発明は、トリマーのＧタンパク質のβγサブユニットにより活性化されるＰＩ３Ｋの新規な、特異的な形態の同定、精製、およびクローニングにより、この問題を解決することに関する。
３．発明の要約
本発明は、トリマーのＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋ、すなわち、Ｇタンパク質結合レセプターの活性化に応答して第２メッセンジャーＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を蓄積する新規なタンパク質、の発見、同定、精製、およびクローニングに関する。この新規なＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋは、触媒サブユニット、ｐ１２０、および調節サブユニット、ｐ１０１から構成されている。ｐ１２０触媒サブユニットは、ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γと部分的アミノ酸配列の相同性を共有する。ｐ１０１、他方において、従来入手可能な他の配列に対する同定可能な相同性をもたない、完全に新規なタンパク質である。ｐ１０１調節サブユニットの非存在において、活性化Ｇタンパク質サブユニットはｐ１２０触媒サブユニットによる触媒活性の適度な刺激を誘発する。しかしながら、ｐ１０１サブユニットの存在において、触媒サブユニットのＰＩ３Ｋ活性は活性化Ｇタンパク質により１００倍以上刺激される。
ブタｐ１０１およびｐ１２０およびヒトｐ１０１およびｐ１２０の双方をコードするｃＤＮＡはクローニングおよび配列決定され、そして本明細書において記載する。ブタｐ１０１およびｐ１２０ｃＤＮＡは、それぞれ、約８７７アミノ酸および約１１０２アミノ酸のタンパク質（第１図および第４図）をコードするが、ヒトｐ１０１およびｐ１２０ｃＤＮＡは、それぞれ、約８８０および約１１０２アミノ酸のタンパク質（第１１図および第１３図）をコードする。ｐ１２０タンパク質のアミノ酸配列は他の既知のＰＩ３Ｋ触媒サブユニットのアミノ酸配列に対して相同であるが、本明細書において記載するｐ１２０ｃＤＮＡは既知のＰＩ３Ｋ触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡと、例えば、カルボキシル末端において（アミノ酸残基１０７５−１１０２）異なる。
ｐ１０１転写物は主として造血系列の細胞において見出される。ｐ１２０、および他のＰＩ３Ｋ触媒サブユニットのタンパク質は、かなり広い組織および細胞の型の分布を有するように思われる。顕著には、トリマーのＧタンパク質感受性ＰＩ３Ｋ活性の存在は、制限された数の造血系列の細胞（例えば、好中球、血小板、およびその他）においてのみ見出された。したがって、トリマーのＧタンパク質結合レセプターの刺激に応答してＰＩ３Ｋ酵素を活性化する能力は、主としてｐ１０１サブユニットの存在に依存して出現する。
本発明は下記のヌクレオチド、このようなヌクレオチドを発現する宿主細胞、およびこのようなヌクレオチドの発現産物を包含する：（ａ）ブタｐ１０１およびｐ１２０およびヒトｐ１０１およびｐ１２０を包含する、哺乳動物ｐ１０１およびｐ１２０タンパク質をコードするヌクレオチド、およびブタおよびヒトの遺伝子産物を包含する、ｐ１０１およびｐ１２０遺伝子産物；（ｂ）その機能ドメインに相当するｐ１０１およびｐ１２０の部分をコードするヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド産物、これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：例えば、ｐ１０１Ｇβγ相互作用ドメイン、または触媒サブユニットとアソシエートするドメイン、または約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１４、４１５−５６５、５６６−７０６、７０７−８３２、および／または８３３−８７７のブタｐ１０１からのアミノ酸残基、または約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１６、４１７−５６７、５６８−７０９、７１０−８３５、および／または８３６−８８０のヒトｐ１０１のアミノ酸残基をコードするｐ１０１ヌクレオチド、およびｐ１２０膜結合ドメイン、または調節サブユニットドメイン、または約１７３−３０２および３１０−３１５をコードするｐ１２０ヌクレオチド；（ｃ）ドメインの１つのすべてまたは一部分が欠失または変更されているｐ１０１およびｐ１２０の突然変異体をコードするヌクレオチド、およびこのようなヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド産物、これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｇタンパク質相互作用ドメイン、または触媒サブユニットとアソシエートするドメイン、または約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１４、４１５−５６５、５６６−７０６、７０７−８３２、および／または８３３−８７７のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドが欠失されているｐ１０１の突然変異体、および膜結合ドメイン、または調節サブユニットドメイン、または約１７３−３０２および３１０−３１５のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドが欠失されているｐ１２０の突然変異体；（ｄ）ｐ１０１タンパク質またはそのドメイン（例えば、Ｇβγ相互作用ドメイン、または触媒サブユニットとアソシエートするドメイン、または約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１４、４１５−５６５、５６６−７０６、７０７−８３２、および／または８３３−８７７のアミノ酸残基により記載されるドメイン）の１つ（他のポリペプチドに融合された）を含有するか、あるいはｐ１２０タンパク質またはそのドメイン（例えば、膜結合ドメイン、または調節サブユニットドメイン、または約１７３−３０２および３１０−３１５のアミノ酸残基）の１つ（他のポリペプチドに融合された）を含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド。
本発明は、また、小さい分子、大きい分子を包含する、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋのアゴニストおよびアンタゴニスト、自然ｐ１０１と競合する突然変異ｐ１０１タンパク質、および抗体、ならびにｐ１０１遺伝子の発現を阻害するために（例えば、アンチセンスおよびリボザイム分子、および遺伝子または調節配列置換構築物）あるいはｐ１０１遺伝子の発現を増強するために（例えば、ｐ１０１遺伝子を強いプロモーター系の制御下に配置する発現構築物）使用できるヌクレオチド配列、およびｐ１０１トランスジーンを発現するトランスジェニック細胞および動物またはｐ１０１を発現しない「ノックアウト」を包含する。
さらに、本発明は、炎症を包含する、免疫障害の診断的評価、型別および予後の方法および組成物、およびこのような症状に対する素因を有する被検者を同定する方法および組成物を包含する。例えば、本発明のｐ１０１核酸分子は、診断のハイブリダイゼーションプローブとして、あるいはｐ１０１遺伝子の突然変異、アレレ変異型およびｐ１０１遺伝子における調節的欠陥を同定する診断のＰＣＲ分析のプライマーとして、使用することができる。本発明は、さらに、このような方法を実施するための診断キットを提供する。
さらに、本発明は、また、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋ遺伝子の発現および／またはｐ１０１および／またはｐ１２０遺伝子産物の活性を調節する、すなわち、それらのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、化合物を同定するために、ｐ１０１遺伝子産物および／またはｐ１２０遺伝子産物を使用する方法に関する。このような化合物は免疫系の障害をコントロールするための薬剤として、特に、炎症性障害、例えば、関節炎、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ぜん息、アレルギー、再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、および癌の治療のための治療剤として、使用することができる。
なおさらに、本発明は、炎症性障害、例えば、関節炎、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ぜん息、アレルギー、再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、および癌を治療する方法および組成物を包含する。このような方法および組成物は、ｐ１０１遺伝子の発現のレベルおよび／またはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の活性のレベルを調節することができる。
本発明は、特に、単離された好中球中のＧタンパク質刺激ＰＩ３Ｋ活性の驚くべき発見に基づく：ｐ１０１サブユニットおよびｐ１２０サブユニットから構成されたヘテロダイマーのＰＩ３Ｋタンパク質としての、この活性の精製および特性決定；ブタ好中球ｍＲＮＡ、ヒト単球ｍＲＮＡ、およびヒト白血球ｍＲＮＡから製造されたライブラリーからのｐ１０１ｃＤＮＡの同定およびクローニング；ブタ好中球ｍＲＮＡおよびヒト白血球ｍＲＮＡから製造されたライブラリーからのｐ１２０ｃＤＮＡの同定およびクローニング；新規な配列の特性決定；および昆虫細胞、Ｕ９３７細胞、およびＣｏｓ−７細胞における単離された組換え的に発現されたｐ１０１およびｐ１２０タンパク質の研究。
３．１  定義
本発明において使用するとき、下記の用語は、単数または複数で使用されるかどうかにかかわらず、示した意味を有する：
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋ：活性が活性化されたトリマーのＧタンパク質、例えば、Ｇβγサブユニットおよび／またはＧα−ＧＴＰサブユニットにより刺激されるＰＩ３Ｋ酵素を意味する。
ｐ１０１：また、アダプターサブユニットとして知られている、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋの調節サブユニットを意味する。ｐ１０１は、ｐ１０１に対して相同性であるか、あるいはｐ１２０に結合しかつトリマーのＧタンパク質の活性化に応答してＰＩ３Ｋ触媒活性を刺激する分子を包含する。Ｎ−末端のＧｌｕタグ（詳しくは、ＭＥＥＥＥＦＭＰＭＰＭＥＦ）を有するｐ１０１融合タンパク質を本明細書において（ＥＥ）１０１融合タンパク質と呼ぶが、Ｎ−末端のｍｙｃエピトープタグを有するｐ１０１融合タンパク質を本明細書においてｍｙｃ１０１融合タンパク質と呼ぶ。
ｐ１０１ヌクレオチドまたはコーディング配列：ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質、ｐ１０１タンパク質のポリペプチドまたはペプチドのフラグメント、またはｐ１０１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。ｐ１０１ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ（例えば、ｐ１０１遺伝子）またはｃＤＮＡを含むＤＮＡ、あるいはＲＮＡを包含する。
ｐ１２０：Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットを意味する。ｐ１２０タンパク質のポリペプチドまたはペプチドのフラグメントは、ｐ１２０ポリペプチドまたはｐ１２０ペプチドと呼ぶ。無関係のタンパク質へのｐ１２０、あるいはｐ１２０ポリペプチドまたはペプチドの融合タンパク質の融合は、本明細書においてｐ１２０融合タンパク質と呼ぶ。（ＥＥ）１２０融合タンパク質は、Ｎ−末端のＧｌｕタグＭＥＥＥＥＦＭＰＭＥＦＳＳを有する。ｐ１２０の機能的同等物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高いアフィニティーでｐ１０１調節サブユニットに結合するＰＩ３Ｋ触媒サブユニットのタンパク質を意味する。ｐ１２０の他の機能的同等物は、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋの相同触媒サブユニット、例えば、ｐ１１７である。
ｐ１２０ヌクレオチドまたはコーディング配列：ｐ１２０触媒サブユニットのタンパク質、ｐ１２０タンパク質のポリペプチドまたはペプチドのフラグメント、またはｐ１２０融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。ｐ１２０ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ（例えば、ｐ１２０遺伝子）またはｃＤＮＡを含むＤＮＡ、あるいはＲＮＡを包含する。
４．図面の説明
第１Ａ図．第１Ｂ図、第１Ｃ図および第１Ｄ図。ブタｐ１０１アダプターサブユニットのヌクレオチド配列。（配列番号：１）
第２図。推定されたブタｐ１０１アミノ酸配列。（配列番号：２）タンパク質の配列決定により同定されたトリプシンのペプチドは実線で下線が引かれている。
第３Ａ図．第３Ｂ図および第３Ｃ図。ブタｐ１２０触媒サブユニットのヌクレオチド配列．（配列番号：３）
第４図．推定されたブタｐ１２０触媒サブユニットの酸配列。（配列番号：４）タンパク質の配列決定により同定されたトリプシンのペプチドは実線で下線が引かれている。ｐ１１０γの発表されたアミノ酸配列からのダイバージェンスの領域は、破線で強調されている。
第５図．好中球細胞質ゾル中のＧβγ感受性ＰＩ３Ｋは、ｐ８５／ｐ１１０ＰＩ３Ｋｓに対して顕著である。Ｑ−セファローズのクロマトグラフィーのプロフィルから誘導された画分の各々のアリコートを、ウェスタンブロットにかけ、αｐ８５αまたはαｐ８５βでプローブし、ＨＲＰ結合第２抗体で可視化する（第５図の上のパネル）か、あるいは１００ｎＭの［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンとインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％のアクリルアミド）により分割し、フルオログラフにかけた（第５図の下のパネル）。Ｇβγ感受性ＰＩ３Ｋ活性は画分２０〜２４において溶離された。
第６図．最終のミニＱカラム精製後のピークＢはＧβγ感受性ＰＩ３Ｋ活性を含有する。ピークＢ活性の最終の精製生成物を、ミニＱカラムからの単離後、活性化Ｇβγサブユニット（βγ）、チロシンリン酸化ペプチド（ＹＰ−ペプチド）、ワートマンニン、および／またはＧαi−ＧＤＰサブユニット（αi−ＧＤＰ）の存在および非存在において分析した。
第７図．Ｓｆ９細胞細胞において組換え的に発現された遊離ｐ１２０およびｐ１０１／ｐ１２０ＰＩ３Ｋの薬理学的および調節の性質。アッセイは下記の成分含有した：７ｎＭのｐ１０１／ｐ１２０または３６ｎＭのｐ１２０単独（最終濃度）これらを種々の試薬とインキュベートした；１０ｍＭのＮａＦおよび３０μＭのＡｌＣｌ3（Ａ／Ｆ）；１μＭのＧβγサブユニット（βγ）；２μＭのＧα−ＧＤＰ；１００ｎＭのワートマンニン（Ｗ）または５０μＭのチロシンリン酸化ペプチド（ＰＹ）、合計１５分（０℃）後［γ32Ｐ］−ＡＴＰの添加によりアッセイを開始した；［32Ｐ］−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の中への［32Ｐ］の組込みを定量した。示されたデータは平均である（ｎ＝２）。
第８図．ｐ１０１はＵ９３７細胞においてＧβγ刺激ＰＩ３Ｋ活性に関係づけることができる。示すように、Ｕ９３７細胞を一時的に（ＥＥ）１２０または（ＥＥ）１０１をコードする哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトし、ｍｙｃ１０１、ｍｙｃ１２０、または無関係の対照ｍｙｃ融合タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターと組み合わせて共トランスフェクトした。合計４０μｇのベクターＤＮＡを使用した。本明細書中の実施例においていっそう完全に説明するように、共トランスフェクション後、細胞を溶解し、前清浄し、α−（ＥＥ）モノクローナル抗体に共有交差結合したプロテインＧで免疫沈降させた。生ずる免疫沈降物を洗浄し、Ｇβγ活性化（１μＭ、最終濃度）ＰＩ３Ｋ活性をアッセイした。Ｇβγを使用するか、または使用しないで、無関係の（ＥＥ）タッグドタンパク質でトランスフェクトした細胞からの免疫沈降物において検出されたＰＩ３Ｋ活性を示したデータから減じた（これらは、それぞれ、Ｇβγ非存在および存在における、１８９６ｄｐｍおよび２８６２ｄｐｍの平均であった）。［35Ｓ］−メチオニンで標識化した平行のトランスフェクション物は、それらを共トランスフェクトしたとき（データは示されていない）より４０％だけ低下した免疫沈降物における［35Ｓ］−ｐ１０１および［35Ｓ］−ｐ１２０の量を示した。
第９図．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧβγによるｐ１０１／ｐ１２０の調節。示すように、Ｇβγサブユニット（「β1γ1」）、ｐ１０１（「１０１」）、および／またはｐ１２０（「１２０」）をコードする哺乳動物発現ベクターでＣｏｓ−７細胞をトランスフェクトした。４８時間の一時的発現後、各トランスフェクションからの細胞をウェスタンブロットして「相対的発現」を測定するか、あるいはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3蓄積についてアッセイした（陰影をつけたバー）。ウェスタンブロッティングのために、試料をα−（ｍｙｃ）モノクローナル抗体でプローブして、種々の（ｍｙｃ）タッグド製造の発現を定量した。すべての４つの主要なベクターの存在において得られた発現に関して結果を記載する；（ｍｙｃ）−ｐ１２０および（ｍｙｃ）−ｐ１０１の絶対レベルは非常に類似し、そして（ｍｙｃ）−γ2のそれよりも約１０×大きかった。細胞の平行のバッチを［32Ｐ］−Ｐｉで標識化した；９０分後、脂質を抽出し、脱アシル化し、水溶性ヘッドグループをアニオン交換ＨＰＬＣにより分割し、液体シンチレーション計数により定量した。示したデータは平均（ｎ＝２）＋／−範囲である。［32Ｐ］−ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3についてのデータは、無関係のＤＮＡ対照（９７２±４１ｄｐｍ）より大きい。
第１０Ａ図および第１０Ｂ図．ヒトｐ１０１アダプターサブユニットのヌクレオチド配列。（配列番号：１１）
第１１図。推定されたヒトｐ１０１アミノ酸配列。（配列番号：１２）
第１２Ａ図および第１２Ｂ図。ヒトｐ１２０触媒サブユニットのヌクレオチド配列。（配列番号：１３）
第１３図。推定されたヒトｐ１２０触媒サブユニットの配列。（配列番号：１４）。
５．発明の詳細な説明
本発明は、トリマーのＧタンパク質のβγサブユニットにより活性化されるＰＩ３Ｋの特定の形態の同定、精製、およびクローニングに関する。ｐ１０１は、ここにおいて最初に記載され、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋの新規なサブユニットである。また、ｐ１２０、トリマーのＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋの同定、クローニング、および正しい配列を本明細書において記載する。
ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトールを３ｄ位置においてリン酸化して細胞内シグナリング分子ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を発生する酵素である。ＰＩ３Ｋは種々の細胞の型においてチロシンキナーゼのレセプターで刺激するとき誘導されるすることが示されたが、トリマーのＧタンパク質結合レセプターにより活性化されるＰＩ３Ｋは、制限された数の造血系列由来の細胞、例えば、血小板、単球、および白血球においてのみ検出された。興味あることには、これらの細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の蓄積は、急性および慢性の炎症に関係する多数の免疫応答に関係づけられる。例えば、好中球は、なかでも、微生物により感染に応答して解放されるケモカインｆＭＬＰにより活性化される。このアゴニストは百日咳トキシン感受性Ｇタンパク質共役レセプターに結合し、好中球レスピラトリーバーストを活性化し、スーパーオキシドの産生および細胞障害性を生ずる。レスピラトリーバーストの応答はＰＩ３Ｋ活性の急速かつ一時的細胞内増加と相関する。
好中球の研究において、ＰＩ３Ｋの触媒成分を選択的に阻害するワートマンニンはスーパーオキシドの産生の停止を引き起こすことが証明される。このレスピラトリーバーストを活性化するアゴニストの大部分はＧタンパク質結合レセプターに結合するので、Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋ活性は、その阻害が炎症の破壊的細胞作用を減少する、優性エフェクター経路の候補を表す。しかしながら、ワートマンニンは、他の細胞の経路に関係するもの、例えば、成長因子を包含する、すべてのＰＩ３Ｋ触媒活性を阻害するので、この経路の臨床的に適当なインヒビターではない。
Ｇタンパク質調節ＰＩ３Ｋは２つのサブユニット：触媒サブユニット（ｐ１１０γ、Ｐ１１７またはｐ１２０）；およびｐ１０１調節サブユニットから構成されているという発見を本明細書において報告する。活性化トリマーのＧタンパク質からのＧβγサブユニットの解放を刺激する細胞表面のレセプターに対する応答するＰＩ３Ｋの能力は、ｐ１０１調節サブユニットの存在に大きく依存する。触媒サブユニットはＧβγサブユニットの存在におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＩ３Ｋ活性の小さい刺激（ほぼ１．７倍）を示すが、ｐ１０１タンパク質の添加はＰＩ３ＫのＧβγの刺激を１００倍増加するであろう。ｐ１０１の中和、ｐ１０１の除去、またはその結合相手へのｐ１０１の結合の妨害は、活性化Ｇβγサブユニットに応答して大きく増加したレベルの細胞内シグナルＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を発生する細胞の能力を奪う。したがって、骨髄由来の細胞中のｐ１０１サブユニットの制限された分布は、この応答の細胞型特異性における重要な因子であるように思われる。さらに、ｐ１０１は他の同定された配列との有意な相同性を含有しない。この発見はｐ１０１、およびｐ１０１／ｐ１２０複合体、選択した標的が最小の非特異的作用でＧタンパク質活性化ＰＩ３Ｋを阻害し、活性化するか、あるいは調節するようにさせる。
本発明は、また、造血系列の細胞の活性化障害の治療における、ｐ１０１およびｐ１２０ヌクレオチド、ｐ１０１およびｐ１２０タンパク質およびペプチド、ならびにｐ１０１およびｐ１２０に対する抗体（これらは、例えば、ｐ１０１またはｐ１２０のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる）、Ｇタンパク質活性化ＰＩ３Ｋの活性または発現を阻害するアンタゴニスト、またはＧタンパク質活性化ＰＩ３Ｋ活性化するか、あるいはその発現を増加するアゴニストの使用を包含し、前記障害は動物、例えば、ヒトにおける急性および慢性の炎症を包含するが、これらの限定されない。例えば、Ｇβγ活性化ＰＩ３Ｋのアンタゴニストは、慢性関節リウマチを包含する関節炎、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ぜん息および他の肺の症状、アレルギー、再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管の疾患、アルツハイマー病、および癌、およびその他の炎症性障害の治療において有用であろう。さらに、ｐ１０１ヌクレオチドおよびｐ１０１調節サブユニット、ならびにｐ１２０ヌクレオチドおよびｐ１２０触媒サブユニットは、Ｇタンパク質活性化ＰＩ３Ｋを包含する造血系列細胞の活性化の障害の治療において有効な化合物の同定のために有用である。
さらに、本発明は、造血系列細胞の活性化の障害の診断におけるｐ１０１およびｐ１２０ヌクレオチド、ｐ１０１およびｐ１２０タンパク質およびペプチド、ならびにｐ１０１およびｐ１２０に対する抗体の使用を包含する。患者におけるｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットの異常、あるいはＧタンパク質活性化ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路における異常の診断は、また、適切な治療または治療的養生法の案出を促進するであろう。
特に、下記の細分した節に記載する本発明は、ｐ１０１調節サブユニット、ｐ１０１調節サブユニットの機能的ドメインに相当するポリペプチドまたはペプチド（例えば、触媒サブユニットアソシエーションドメイン、または活性化Ｇタンパク質と相互作用するドメイン）、突然変異した、トランケートまたは欠失したｐ１０１調節サブユニット（例えば、１またはそれより多くの機能的ドメインまたはその一部分が欠失したｐ１０１調節サブユニット）、ｐ１０１調節サブユニット融合タンパク質（例えば、無関係のタンパク質またはペプチド、例えば、エピトープタグ、すなわち、ｍｙｃエピトープに融合した、ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１０１調節サブユニットの機能的ドメイン）、このような産物をコードするヌクレオチド配列、およびこのようなｐ１０１調節サブユニットの産物を産生できる宿主細胞の発現系を包含する。
さらに、本発明は、ｐ１２０触媒サブユニットのタンパク質、ポリペプチド、ｐ１２０サブユニットの機能的ドメイン（例えば、触媒ドメイン）、突然変異した、トランケートまたは欠失したｐ１２０サブユニットのタンパク質、このような産物をコードするヌクレオチド配列、およびこのようなｐ１２０触媒サブユニットの産物を産生できる宿主細胞の発現系を包含する。
本発明は、また、抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントを包含する）、Ｇタンパク質活性化ＰＩ３Ｋのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現を阻害する（転写因子インヒビター、アンチセンスおよびリボザイム分子、あるいは遺伝子または調節配列の置換構築物）か、あるいはｐ１０１調節サブユニットの発現を促進する（例えば、ｐ１０１コーディング配列が発現コントロール因子、例えば、プロモーター、プロモーター／エンハンサー、およびその他）化合物またはヌクレオチド構築物を包含する。また、本発明は、ｐ１０１調節サブユニット（またはその突然変異体）を発現するように、あるいは動物の内因性ｐ１０１調節サブユニットの発現を阻害または「ノックアウト」するように遺伝子操作された宿主細胞および動物に関する。
さらに、本発明は、特に、ｐ１２０および他のＰＩ３Ｋ触媒サブユニットのタンパク質、例えば、ｐ１１７およびｐ１１０γを包含する、ｐ１０１調節サブユニットとそれらの結合相手とのアソシエーションを妨害するアンタゴニスト、ならびにＧβγサブユニットを包含する、活性化されたトリマーのＧタンパク質のタンパク質に関する。
ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質またはペプチド、ｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質、ｐ１０１ヌクレオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、免疫障害の診断のための突然変異のｐ１０１調節サブユニットまたは不適切に発現されたｐ１０１調節サブユニットの検出に有用である。ｐ１０１およびｐ１２０サブユニットのタンパク質またはペプチド、ｐ１０１およびｐ１２０サブユニットの融合タンパク質、ｐ１０１およびｐ１２０のヌクレオチド配列、宿主細胞の発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニストおよび遺伝子操作された細胞および動物は、このような免疫障害の治療において有効な薬剤のスクリーニングのために使用することができる。操作された宿主細胞および／または動物の使用は、このような系がｐ１０１調節サブユニットに結合する化合物の同定を可能とするばかりでなく、かつまた活性化されたｐ１０１調節サブユニットにより伝達されたシグナル、詳しくは、細胞内シグナリング分子ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の産生に影響を与える化合物を同定できるという利点を提供することができる。
最後に、ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質の産物および融合タンパク質の産物、抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントを包含する）、アンタゴニストまたはアゴニスト（ｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路における下流の標的に作用することができる、シグナル伝達を調節する化合物を包含する）を、このような疾患の治療に使用することができる。例えば、機能的ｐ１０１調節サブユニット、突然変異のｐ１０１調節サブユニットをコードするヌクレオチド構築物、ならびにアンチセンスおよびリボザイム分子を造血系列細胞の活性化の障害の治療におけるｐ１０１調節サブユニットの発現および／または活性の調節のための「遺伝子治療」のアプローチにおいて使用することができる。したがって、本発明は、また、造血系列細胞の活性化の障害を治療する医薬処方物および方法を包含する。
本発明は、一部分、ブタ好中球中の新規なＰＩ３Ｋ酵素の驚くべき発見に基づく。他のＰＩ３Ｋタンパク質と同様に、これらの酵素はＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2基質を３−リン酸化し、そして１００ｎＭのワートマンニンにより完全に阻害された。しかしながら、従来記載されたＰＩ３Ｋｐ８５／ｐ１０１タンパク質複合体と異なり、ＰＩ３Ｋ活性はＧβγサブユニットとのインキュベーションにより１００倍以上刺激された。Ｇα−ＧＤＰサブユニットはこのＧβγ活性化を阻害することができた。さらに、ＰＩ３Ｋ活性はリン酸化チロシンペプチドにより刺激されなかった。精製したとき、２つの独特なヘテロダイマーのタンパク質複合体が同定された：ｐ１１７／ｐ１０１複合体およびｐ１２０／ｐ１０１複合体。ペプチドの配列決定により、ｐ１０１タンパク質は各複合体において同一であることが明らかになった。ｐ１２０およびｐ１１７タンパク質は、アミノ末端を除外して相同であった（下記の実施例を参照のこと）。次いで、ペプチド配列をベースとするデジェネレイトプローブを使用して、ブタｐ１０１およびｐ１２０ｃＤＮＡをクローニングして、ブタ好中球ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの発現ライブラリーをスクリーニングした。ブタｃＤＮＡ由来のプローブを使用して、ヒトｐ１０１およびｐ１２０をクローニングして、ヒト単球および白血球のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ブタおよびヒトのサブユニットの配列の分析により、ｐ１２０は前にクローニングされたＰＩ３Ｋ触媒サブユニットと相同であることが明らかにされたが（それらは極端のカルボキシル末端において有意に異なる）、ｐ１０１タンパク質はデータベース中のいずれの配列とも無関係である。
ｐ１０１およびｐ１２０のブタおよびヒトの相同体のアミノ酸配列を比較すると、２つの種の間の高い保存度が明らかになる。２つの哺乳動物種の間のこの高い保存度は、同様な程度の保存が一般に哺乳動物種の間に多分存在することを示唆する。ブタ配列を使用してそれらのヒト相同体をクローニングしたのと同一の方法において、当業者は開示されたヒトおよび／またはブタ配列およびこの明細書に記載されている方法を使用して、他の哺乳動物種からｐ１０１およびｐ１２０相同体をクローニングすることができる。
昆虫細胞中でｐ１０１および／またはｐ１２０融合タンパク質を発現する本明細書において記載する実験により、ｐ１０１はｐ１２０と１：１モルの化学量論において緊密に結合することが証明された。遊離の精製されたｐ１２０はＰＩ３Ｋ活性を示し、このＰＩ３Ｋ活性はＧαサブユニットおよびチロシンリン酸化ペプチドの存在に対して不感受性であり、そしてＧβγサブユニットにより軽度にのみ刺激された。しかしながら、ｐ１０１に結合したとき、ｐ１２０のＰＩ３Ｋ活性はＧβγサブユニットの存在により１００倍刺激された。ｐ１０１が昆虫細胞中で単独に発現されたとき、ｐ１０１はＰＩ３Ｋ活性を示さなかった。
ｐ１０１がヒトＵ９３７細胞中でタッグド融合タンパク質として発現されたとき、興味ある結果が生じた。この組換え的に発現されたブタｐ１０１を融合タンパク質タグを介して免疫沈降させたとき、これらの免疫沈降物はＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋ活性を含有した。ｐ１２０とｐ１０１との共発現は、免疫沈降させることができるＰＩ３Ｋ活性の量をわずかに減少させた。これらの結果が示すように、ブタｐ１０１調節サブユニットに結合することができかつそれにより活性化されうるＰＩ３Ｋ触媒サブユニットをヒトＵ９３７細胞は含有した。これらの結果が証明するように、それらの高度に保存されたアミノ酸配列と一緒に、異なる哺乳動物種からの相同体は互いに機能的にかつ構造的に類似する。
さらに、活性化Ｇタンパク質に応答してＰＩ３Ｋ活性を通常刺激しないＣｏｓ−７細胞において、ｐ１０１、ｐ１２０および／またはＧβγサブユニットをコードする構築物を使用して、一時的トランスフェクションを実施した。ｐ１２０を発現する構築物のトランスフェクションは、ｐ１０１の存在において共発現させたとき、Ｇβγサブユニット依存的方法で、細胞のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3レベルのみを有意に増加した。
下記の細分した節において、本発明の種々の面をより詳細に説明する。
５．１  ｐ１０１およびｐ１２０遺伝子
ブタｐ１０１調節サブユニットのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）および推定されたアミノ酸配列（配列番号：２）を、それぞれ、第１図および第２図に示す。相対的に共通のアレレの変動がオープンリーディングフレーム中のアミノ酸残基４８３において起こる；この位置において、セリンをグリシンで置換することができる。
ヒトｐ１０１調節サブユニットのｃＤＮＡ配列（配列番号：１１）および推定されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を、それぞれ、第１０図および第１１図に示す。
ヒトサブユニットの最初の７３６アミノ酸に相当する、ブタｐ１０１調節サブユニットの最初の７３３アミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、触媒サブユニットに結合するために十分であると考えられる。しかしながら、１４５カルボキシル末端のアミノ酸がないと、このｐ１２０に結合したトランケートｐ１０１はＧβγサブユニットに応答してＰＩ３Ｋ活性を刺激しないであろう。したがって、触媒サブユニットにアソシエートするドメインは最初の７３２アミノ酸（ヒトについて７３５）内に含有されると考えられ、そしてカルボキシル末端のアミノ酸７３３−８７７（ヒトについて７３６−８８０）はＧβγサブユニットに対する応答に関係づけることがでた。
ブタｐ１０１の他のドメインは、約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１４、４１５−５６５、５６６−７０６、７０７−８３２、および／または８３３−８７７のアミノ酸残基により記載される。ヒトｐ１０１の対応するドメインは、約１−１６０、８０−１２０、１６１−２６３、２６４−４１６、４１７−５６７、５６８−７０９、７１０−８３５、および／または８３６−８８０のアミノ酸残基により記載される。約１６１−２６３のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列は、プレクストリン相同（「ＰＨ」）ドメイン（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＳ５０００３）を定める。ＰＨドメインは、Ｇβγサブユニット（Touhara et al.、1994、J.Biol.Chem.269:10217）および膜リン脂質（Shaw、1996、Bioessays 18:35-46を参照のこと）へのタンパク質の結合に関係することができる。したがって、ｐ１０１のＰＨドメインはこれらの事象の双方に関係することができる。
ｐ１０１のアミノ酸１−１６０をコードするヌクレオチド配列は、ｐ１２０触媒サブユニットへの結合に関係することができる。ｐ１０１タンパク質のこの調節を二次構造について分析するとき、それは自己含有の交互するα−らせん／β−シート構造を有すると予測される。この構造内に「ＷＷドメイン」に対する相同性が見出される（Staub et al.、1996、Structure 4:495-499およびTIBS 21:161-163）。このＷＷドメインは、ｐ１２０タンパク質のＮ−末端内に見出されるプロリンに富んだドメインに結合することができる（残基３１０−３１５）。したがって、ｐ１０１のＷＷドメインは、調節サブユニットと触媒サブユニットとの間の相互作用に関係することができる。
ブタｐ１２０のｃＤＮＡ配列（配列番号：３）および推定されたアミノ酸配列（配列番号：４）は、それぞれ、第３図および第４図に示されている。ヒトｐ１２０のｃＤＮＡ配列（配列番号：１３）および推定されたアミノ酸配列（配列番号：１４）は、それぞれ、第１２図および第１３図に示されている。クリプティックトロンビン切断部位は、最初のほぼ４０アミノ酸残基後に存在する。これらのほぼ４０アミノ末端残基を欠如するトランケートｐ１２０タンパク質はなおｐ１０１に結合することができるが、ＰＩ３Ｋ活性はほぼ２０〜３０％だけ減少する。換言すると、約アミノ酸残基４１から残基１１０２までの配列番号：４（ブタｐ１２０の推定されたアミノ酸配列）の区画のアミノ酸配列を有するタンパク質は、全長のｐ１２０の機能を保持する。ブタおよびヒトｐ１２０の間の配列の高度の相同性に基づいて、約アミノ酸残基４１から残基１１０２までの配列番号：１４（ヒトｐ１２０の推定されたアミノ酸配列）の区画のアミノ酸配列を有するタンパク質は、また、全長のｐ１２０の機能を保持するであろう。ｐ１２０タンパク質はＳｔｏｙａｎｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）が報告した従来クローニングされたｐ１１０γに対して高度に相同性であったが、ｐ１２０の極端のＣ−末端はアミノ酸残基１０７５において報告されたｐ１１０γタンパク質と異なる；したがって、ｐ１２０の最後の２８アミノ酸残基は相同性タンパク質の報告の中に発表されてきていない。前述したように、ｐ１２０の残基３１０−３１５を含むプロリンに富んだ領域をコードするヌクレオチドは、ｐ１２０およびｐ１０１に関係することができる。さらに、ｐ１２０の約１７３−３０２のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドは、ｐ１０１／ｐ１２０複合体の膜結合および／またはＧβγサブユニットの相互作用のための候補であることができる、弱いＰＨドメインを定める。
下記の実施例に提示されたデータは、ｐ１２０ｃＤＮＡがＧβγ活性化ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットをコードすることを証明する。ｐ１０１ｃＤＮＡは、ｐ１２０サブユニットに結合する新規な調節サブユニットのタンパク質をコードする。このヘテロダイマーは、トリマーのＧタンパク質結合レセプターの活性化に応答して、ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2を３−リン酸化する。
本発明のｐ１０１ヌクレオチド配列は下記のヌクレオチド配列を含む：（ａ）第１図または第１０図に示すか、あるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ATCC）に受け入れ番号９７６３６で寄託された、ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるＤＮＡ配列；（ｂ）第２図または第１１図に示すアミノ酸配列、あるいはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１によりコードされるｐ１０１調節サブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）第１図または第１０図に示すか、あるいはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるＤＮＡ配列の補体に、高度にストリンジェントな条件、例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中の６５℃におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中の６８℃における洗浄（Ausubel F.M.et al.編、1989、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.I、Green Publishing Associates,Inc.、およびJohn Wiley & So ns,Inc.、New York、p.2.10.3）下に、ハイブリダイゼーションし、そして機能的に同等の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）第１図または第１０図に示すか、あるいはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１の中に含有されるアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の補体に、低いストリンジェントの条件、例えば、適度にストリンジェントな条件、例えば、０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中の４２℃における洗浄（Ausubel et al.、1989、上掲）にハイブリダイゼーションし、しかも機能的に同等のｐ１０１遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列。ｐ１０１調節サブユニットの機能的同等物は、他の種の中に存在する天然に存在するｐ１０１調節サブユニット、および天然に存在するか、あるいは操作されているかどうかにかかわらず、ｐ１０１の機能的活性の少なくともあるもの（すなわち、ｐ１２０またはｐ１１７への結合、Ｇβγサブユニットに応答した触媒活性の刺激、および／またはＧβγサブユニットとの相互作用）を保持する突然変異のｐ１０１調節サブユニットを包含する。本発明は、また、配列（ａ）〜（ｄ）のデジェネレイト変異型を包含する。
本発明は、また、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を包含し、これらは前節のヌクレオチド配列（ａ）〜（ｄ）にハイブリダイゼーションし、したがってそれらの配列の補体である。このようなハイブリダイゼーション条件は、前述したように、高度にストリンジェントまたはそれより低いストリンジェントであることができる。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合、高度にストリンジェントな条件は、例えば、６×ＳＳＣ／０．０５％のピロリン酸ナトリウム中の３７℃（１４塩基のオリゴについて）、４８℃（１７塩基のオリゴについて）、５５℃（２０塩基のオリゴについて）における洗浄を意味することができる。これらの核酸分子は、例えば、ｐ１０１遺伝子の調節において有用なｐ１０１アンチセンス分子をコードするか、あるいはｐ１０１アンチセンス分子として作用することができる（ｐ１０１遺伝子の核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーのためにおよび／またはとして）。ｐ１０１遺伝子の調節に関すると、このような技術は、例えば、炎症性免疫応答を調節するために使用することができる。さらに、このような配列は、また、ｐ１０１遺伝子の調節に有用な、リボザイムおよび／または三重らせん配列の一部分として使用することができる。なおさらに、このような分子は診断法の成分として使用することができ、この診断法により、炎症性応答、例えば、関節炎を引き起こす原因となる、特定のｐ１０１アレレの存在を検出することができる。
前述のｐ１０１ヌクレオチド配列に加えて、同一種の中に存在する全長のｐ１０１ｃＤＮＡまたは遺伝子配列、あるいは他の種の中に存在するｐ１０１遺伝子の相同体を、不都合な実験を使用しないで、この分野においてよく知られている分子生物学的技術により、同定しかつ容易に単離することができる。本明細書において記載する実験の証拠は、ｐ１０１タンパク質が異なる哺乳動物種において保存されることを示す。例えば、ブタｐ１０１ｃＤＮＡ配列を使用して、ヒトｐ１０１を単球および白血球のライブラリーからクローニングし、そしてヒトおよびブタの推定されたアミノ酸配列は高度に保存されることが見出された。ブタｐ１０１をＵ９３７細胞中で発現させたとき、ブタｐ１０１は触媒サブユニットのヒト相同体に結合したことを示す実験により、２つの相同体の構造的および機能的類似性が証明される。さらに、タンパク質のチロシンキナーゼ調節ＰＩ３Ｋのファミリーのメンバー、例えば、ｐ１１０／ｐ８５ＰＩ３Ｋも異なる哺乳動物種間において保存される。したがって、トリマーのＧタンパク質調節ＰＩ３Ｋを含有することが知られているか、あるいは推測される種々の哺乳動物細胞、特に造血由来の細胞、より特に血小板、単球、白血球、卵母細胞、および好中球から、ｐ１０１およびｐ１２０の相同体を単離することができる。
関係する種におけるｐ１０１の相同体の同定は、薬剤の発見を目的とするヒトにいっそう密接に関係する動物モデル系を開発するために有用である。例えば、問題の微生物から誘導される好中球ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの発現ライブラリーを、その種から誘導された標識化触媒サブユニット、例えば、ｐ１２０、ｐ１１７、またはｐ１１０γの触媒サブユニットの融合タンパク質を使用して、スクリーニングすることができる。また、本明細書において記載するヌクレオチドをハイブリダイゼーションまたは増幅のプローブとして使用するハイブリダイゼーションにより、このようなｃＤＮＡライブラリー、または問題の微生物から誘導されたゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。さらに、ｐ１０１遺伝子産物の１またはそれより多いドメインに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝子座における遺伝子を、また、同様な技術により同定することができる。ｃＤＮＡライブラリーの場合において、このようなスクリーニング技術は、同一であるか、あるいは異なる種におけるオールタネイトにスプライスされた転写物から誘導されたクローンを同定することができる。
スクリーニングは、二重反復試験のフィルターを使用する、フィルターハイブリダイゼーションによることができる。標識化プローブは、それぞれ、第１図および第１０図に示す、ヒトまたはブタのｐ１０１ヌクレオチド配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含有することができる。標識化配列を誘導した微生物の型と異なる微生物からｃＤＮＡライブラリーを誘導するとき、使用するハイブリダイゼーション洗浄条件はより低いストリンジェンシイであるべきである。例えば、ブタおよび／またはヒトのｐ１０１プローブを使用する、哺乳動物ｐ１０１相同体のクローニングに関すると、ハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃において一夜チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）の緩衝液（７％のＳＤＳ、２５０ｍＭのＮａＨＰＯ4、２μＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）中で実施することができる。２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを６５℃において使用し、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを６５℃において使用して、洗浄を実施することができる。
低いストリンジェンシイの条件は当業者によく知られており、そしてライブラリーおよび標識化配列を誘導する特定の微生物に依存して予測可能に変化するであろう。このような条件に関する手引きについては、例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y.;およびAusbel et al.、1989、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing AssociatesおよびWiley Interscince、N.Y.。
また、標識化ｐ１０１ヌクレオチドのプローブを、再び、適当にストリンジェントの条件下に、使用して、問題の微生物から誘導されたゲノムのライブラリーをスクリーニングすることができる。ヒトゲノムのクローンの同定および特性決定は、ヒトの患者における造血系列細胞の活性化の障害を処理するための診断試験および臨床プロトコールを設計するために助けとなる。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する領域から誘導された配列を使用して、診断に使用できるエクソン、イントロン、スプライス部位（例えば、スプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）内の突然変異を検出する増幅アッセイにおいて使用するためのプライマーを設計することができる。
さらに、本明細書において開示するｐ１０１遺伝子産物内のアミノ酸配列をベースとして設計した２つのデジェネレイトオリゴヌクレオチドのプライマーのプールを使用して、ＰＣＲを実施することによって、問題の微生物の核酸からｐ１０１遺伝子相同体を単離することができる。この反応の鋳型は、例えば、ｐ１０１遺伝子アレレを発現することが知られているか、あるいは推測されるヒトまたは非ヒトの細胞系統または細胞型、例えば、好中球から製造されたｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡであることができる。
ＰＣＲ生成物をサブクローニングし、配列決定して、増幅された配列がｐ１０１遺伝子の配列を表すことを保証することができる。次いで、種々の方法により、ＰＣＲフラグメントを使用して全長のｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、増幅されたフラグメントを標識化し、ｃＤＮＡライブラリー、例えば、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。また、ゲノムのライブラリーのスクリーニングにより、標識化フラグメントを使用してゲノムのクローンを単離することができる。
また、ＰＣＲ技術を利用して全長のｃＤＮＡ配列を単離することができる。例えば、標準的手法に従い、適当な細胞源（すなわち、ｐ１０１遺伝子を発現することが知られているか、あるいは推測される細胞源、例えば、好中球または他の型の白血球）からＲＮＡを単離することができる。第１鎖の合成のプライミングのための増幅されたフラグメントのほとんどの５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、逆転写反応をＲＮＡについて実施することができる。次いで、生ずるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準的末端トランスフェラーゼ反応によりグアニンで「テイル（ｔａｉｌ）」し、ＲＮアーゼＨを使用してハイブリッドを設計し、次いで第２鎖合成をポリ−Ｃプライマーでプライムすることができる。こうして、増幅されたフラグメントから上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離することができる。使用できるクローニング戦略については、例えば、Sambrook et al.、1989、上掲、を参照のこと。
ｐ１０１遺伝子配列を追加的に使用して、突然変異ｐ１０１遺伝子アレレを単離することができる。造血系列細胞の活性化の障害、例えば、炎症の症状に寄与する遺伝子型を有することが知られているか、あるいは提案されている個体から、このような突然変異のアレレを単離することができる。次いで、突然変異のアレレおよび突然変異のアレレ産物を後述する治療および診断系において利用することができる。さらに、このようなｐ１０１遺伝子配列を使用して、造血系列細胞の活性化に影響を与えることができるｐ１０１遺伝子調節（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー）の欠陥を検出することができる。
突然変異ｐ１０１遺伝子のｃＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ（当業者によく知られている技術）により、単離することができる。この場合において、突然変異ｐ１０１アレレを有すると推定される個体において発現されることが知られているか、あるいは推測される細胞から単離されたｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせ、そしてこの新しい鎖を逆転写酵素で延長することによって、第１ｃＤＮＡ鎖を合成することができる。次いで、正常の遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの第２鎖を合成する。これらの２つのプライマーを使用して、生成物をＰＣＲにより増幅し、適当なベクターの中にクローニングし、当業者によく知られている方法によりＤＮＡ配列の分析に付す。突然変異ｐ１０１アレレのＤＮＡ配列を正常ｐ１０１アレレのそれと比較することによって、突然変異ｐ１０１遺伝子産物の機能の喪失または変更の原因となる１またはそれより多い突然変異体を確認することができる。
また、突然変異ｐ１０１アレレを有することが推測されるか、あるいは知られている個体から得られたＤＮＡを使用して、ゲノムのライブラリーを構築することができるか、あるいは突然変異ｐ１０１アレレを発現することが知られているか、あるいは推測されている細胞の型からのＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。次いで、正常ｐ１０１遺伝子またはその適当なフラグメントを標識化し、このようなライブラリー中の対応する突然変異ｐ１０１アレレを同定するプローブとして使用することができる。次いで、突然変異ｐ１０１遺伝子配列を含有するクローンを精製し、当業者によく知られている方法に従い配列の分析に付すことができる。
さらに、例えば、このような突然変異アレレを有することが推測されるか、あるいは知られている個体において突然変異ｐ１０１アレレを発現することが知られているか、あるいは推測された細胞の型から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築することができる。この方法において、推定上の突然変異の細胞の型により作られた遺伝子産物を発現させ、そして、節５．３において、後述するように、正常ｐ１０１遺伝子産物に対して発生した抗体と組み合わせて標準的抗体スクリーニング技術を使用して、スクリーニングすることができる。（スクリーニング技術について、例えば、下記の文献を参照のこと：Harlow、E.およびLane、編、1998、″Antibodies:A Laboratory Manual″、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor。）さらに、標識化融合タンパク質、例えば、（ＥＥ）１２０またはｍｙｃ１２０融合タンパク質でスクリーニングすることによって、スクリーニングを達成することができる。ｐ１０１突然変異が変更された機能をもつ発現された遺伝子産物を生ずる（例えば、ミスセンスまたはフレームシフトの突然変異の結果として）場合、ｐ１０１調節サブユニットに対する抗体のポリクローナルの組は突然変異ｐ１０１調節サブユニットの遺伝子産物と交差反応するようである。このような標識化抗体とのそれらの反応により検出されたライブラリークローンを、当業者によく知られている方法方法に従い、精製し、配列の分析に付すことができる。
本発明は、また、突然変異ｐ１０１調節サブユニット、ｐ１０１調節サブユニットのペプチドフラグメント、トランケートｐ１０１調節サブユニット、およびｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：下記の節５．２に記載する突然変異ｐ１０１調節サブユニットをコードするヌクレオチド配列；ｐ１０１調節サブユニットの触媒結合、またはＧβγサブユニット結合ドメインまたはこれらのドメインの一部分に相当するポリペプチドまたはペプチド；ドメインの１つまたは２つが欠失されているトランケートｐ１０１調節サブユニット、またはトランケート、非機能的ｐ１０１調節サブユニット。融合タンパク質をコードするヌクレオチドは下記のものを包含することができるが、これらに限定されない：全長のｐ１０１調節サブユニット、トランケートｐ１０１調節サブユニット、または無関係のタンパク質またはペプチド、例えば、生ずる融合タンパク質の精製または検出を促進するエピトープタグ、に融合したｐ１０１調節サブユニットのペプチドフラグメント；またはマーカーとして使用できる酵素、蛍光性タンパク質、発光タンパク質。
本発明は、また、下記のものを包含する：（ａ）前述のｐ１０１調節サブユニットのコーディング配列および／またはそれらの補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するＤＮＡベクター；（ｂ）コーディング配列の発現を検出する調節因子と操作的にアソシエートした前述のｐ１０１調節サブユニットのコーディング配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞中のコーディング配列の発現を検出する調節因子と操作的にアソシエートした前述のｐ１０１調節サブユニットのコーディング配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞。本発明において使用するとき、調節因子は下記のものを包含するが、これらに限定されない：誘導可能なおよび非誘導可能なプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を推進しかつ調節することが当業者に知られている他の因子。このような調節因子は下記のものを包含するが、これらに限定されない：バキュロウイルスのプロモーター、サイトメガロウイルスのｈＣＭＶの前初期遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期のプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、主要なオペレーターおよびファージＡの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のコントロール領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモーター。
最後に、本発明は、また、この触媒サブユニットの新しく記載したカルボキシル末端を含むｐ１２０サブユニットのタンパク質をコードするヌクレオチド、ｐ１２０サブユニットのタンパク質の欠失変異型、これらのヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションしかつ、受け入れ番号９７６３７でＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１２０を包含する、機能的に同等の産物をコードするヌクレオチド、ｐ１２０のアレレ変異型（例えば、突然変異アレレまたは天然に存在するアレレ、例えば、アミノ酸残基４８３におけるアレレ変異型）、および本発明のｐ１０１ヌクレオチドについて前述したように単離された異なる微生物からの同等のｐ１２０ヌクレオチドを包含する。さらに、本発明は、ｐ１２０の組換え体産生のための発現ベクターおよび宿主細胞を包含する。
５．２  ｐ１０１およびｐ１２０のタンパク質およびポリペプチド
ｐ１０１調節サブユニットおよびｐ１２０触媒サブユニット、ポリペプチドおよびペプチドのフラグメント、ｐ１０１調節サブユニットおよび／またはｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質およびｐ１２０触媒サブユニットおよび／またはｐ１２０触媒サブユニットの融合タンパク質の突然変異、トランケートまたは欠失の形態を、種々の用途のために製することができ、このような用途は下記のものを包含するが、これらに限定されない：抗体の発生、診断アッセイにおける試薬として、造血系列細胞の活性化の調節に関係する他の細胞の遺伝子産物の同定、造血系列細胞の活性化の障害の治療において使用できる化合物のスクリーニングのアッセイにおける試薬として、およびＧβγ活性化ＰＩ３Ｋに関係する造血系列細胞の活性化の障害の治療において有用な製剤学的試薬として。
第２図および第１１図は、それぞれ、ブタおよびヒトのｐ１０１調節サブユニットのタンパク質のアミノ酸配列を示す。第４図および第１３図は、それぞれ、ブタおよびヒトのｐ１２０触媒サブユニット第４図上の破線は、ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γの発表された配列と異なるｐ１２０の領域を強調する。
ｐ１０１調節サブユニットの配列は、翻訳開始部位と一致するＤＮＡ配列の関係においてメチオニンで開始する。ブタおよびヒトの双方のヒト逆方向反復塩基配列の予測された分子量は９７ｋＤである。
本発明のｐ１０１調節サブユニットのアミノ酸配列は、第２図（配列番号：２）または第４図（配列番号：１２）に示すアミノ酸配列、またはＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１０１によりコードされるアミノ酸配列を包含する。さらに、他の種のｐ１０１調節サブユニットは本発明に包含される。事実、前述のｐ１０１ヌクレオチド配列によりコードされるｐ１０１調節サブユニットのタンパク質は本発明の範囲内である。
本発明のｐ１２０調節サブユニットのアミノ酸配列は、ＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ３ｍｙｃｐ１２０を包含する。本発明は、また、他の種のｐ１２０触媒サブユニット、および前の節に前述したｐ１２０ヌクレオチド配列によりコードされるｐ１２０タンパク質を包含する。
本発明は、また、多数の基準の任意のものにより判定して、前述のヌクレオチド配列によりコードされるｐ１０１調節サブユニットに機能的に同等であるタンパク質を包含し、これらの基準は下記のものを包含するが、これらに限定されない：触媒サブユニットに結合する能力、触媒サブユニットに対する結合アフィニティー、活性化トリマーのＧタンパク質に応答して触媒サブユニットのＰＩ３Ｋ活性を刺激する能力、トリマーのＧタンパク質の活性化に対する触媒サブユニットの結合および応答の生ずる生物学的効果、例えば、シグナル伝達、細胞の代謝の変化（例えば、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の発生）またはｐ１０１調節サブユニットの同等物が適当な細胞の型の中に存在するときの表現型の変化（例えば、好中球におけるスーパーオキシドのバースト）。このような機能的同等物のｐ１０１調節サブユニットのタンパク質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：前述のｐ１０１ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換、しかし、これらはサイレント変化を生じ、こうして機能的に同等の遺伝子産物を産生する。アミノ酸の置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の特質における類似性に基づいてなすことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する；極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する；正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを包含する；そして負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。同様に、本発明は、また、前述のｐ１２０タンパク質の機能的同等物を包含する。
ランダム突然変異体をｐ１０１ＤＮＡに対して作り（当業者によく知られているランダム変異誘発技術を使用して）そして生ずる突然変異ｐ１０１調節サブユニットを活性について試験することができるが、ｐ１０１コーディング配列の部位特異的突然変異体を操作して（当業者によく知られている部位特異的突然変異誘発技術を使用して）突然変異ｐ１０１調節サブユニットさせることができ、これらの突然変異ｐ１０１調節サブユニットは、増加した機能、例えば、触媒サブユニットに対するより高い結合アフィニティー、および／またはより大きいシグナリング能力を有するか、あるいは減少した機能、例えば、触媒サブユニットに対するより低い結合アフィニティー、および／または減少したシグナル伝達能力を有する。
例えば、ブタｐ１０１アミノ酸配列をヒトｐ１０１調節サブユニットのアミノ酸と整列させることができる。例えば、１またはそれより多いアミノ酸残基の欠失または挿入によるか、あるいは１またはそれより多いアミノ酸残基の置換により、可変残基が変更されるが、種間の同一性の領域が維持されるように、突然変異ｐ１０１調節サブユニットを操作することができる。機能、例えば、触媒サブユニットの結合アフィニティーまたは活性化Ｇタンパク質の伝達能力または双方を保持する突然変異ｐ１０１調節サブユニットを産生するように、可変位置における保存的変更を操作することができる。機能、例えば、触媒サブユニットの結合アフィニティーまたはシグナル伝達能力または双方を変更するために、可変位置において非保存的変化を操作することができる。また、機能の変更を望む場合、保存された領域の欠失または非保存的変更を操作することができる。当業者は、本明細書において記載する技術を使用して、このような突然変異体または欠失されたｐ１０１調節サブユニットをこれらの機能の変更について容易に試験することができる。
ｐ１０１コーディング配列に対する他の突然変異体を作って、選択した宿主細胞における発現、大規模化、およびその他によりよく適したｐ１０１調節サブユニットを発生させることができる。例えば、三文字暗号を修飾して、宿主細胞の翻訳メカニズムの優先的コドンの使用にいっそう密接に順応させることができる。
ｐ１０１調節サブユニットの１またはそれより多いドメイン（またはドメインの一部分）（例えば、ｐ１２０結合ドメイン、Ｇタンパク質の相互作用ドメイン、または約１−１５０、１５１−３００、３０１−４５０、４５１−６００、６０１−７３２（ブタ）または６０１−７３５（ヒト）、および７３３−８７７（ブタ）または７３６−８８１（ヒト）のアミノ酸残基により定められるドメイン）に相当するペプチド、トランケートまたは欠失されたｐ１０１調節サブユニット（例えば、前述のドメインの１またはそれより多くの部分が欠失されているｐ１０１調節サブユニット）ならびに全長のｐ１０１調節サブユニット、ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質またはトランケートｐ１０１調節サブユニットが無関係のタンパク質に融合されている融合タンパク質は、また、本発明の範囲内であり、そしてこの節および上の節に開示されているｐ１０１ヌクレオチドおよびｐ１０１調節サブユニットのアミノ酸に基づいて設計することができる。このような融合タンパク質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：エピトープタグ（例えば、下記の実施例において例示されているような）；またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、または発光タンパク質に対する融合物。
ｐ１０１調節サブユニットのポリペプチドおよびペプチドを化学的に合成することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Creighton、1983、Proteins:Structures and Molecular Principles、W.H.Freeman & Co.、N.Y.）が、ｐ１０１遺伝子配列および／またはコーディング配列を含有する核酸を発現する、この分野においてよく知られている技術を使用して、組換えＤＮＡ技術により、ｐ１０１調節サブユニットから誘導された大きいポリペプチドおよび全長のｐ１０１調節サブユニットそれ自体を好都合に製造することができる。前述のｐ１０１ヌクレオチド配列および適当な転写および翻訳のコントロールシグナルを含有する発現ベクターを構築するために、このような方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えを包含する。例えば、下記の文献に記載されている技術を参照のこと：Sambrook et al.、1989、上掲、およびAusubel et al.、1989、上掲。また、ｐ１０１ヌクレオチド配列をコードできるＲＮＡを、例えば、合成装置により、化学的に合成することができる。例えば、下記の文献に記載されている技術を参照のこと：″Oligonucleotide Synthesis″、Gait、M.J.編、IRL Press、Oxford、これはその全体において引用することによって本明細書の一部とされる。
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、本発明のｐ１０１ヌクレオチド配列を発現させることができる。ｐ１０１調節サブユニットのペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体である場合、ペプチドまたはポリペプチドは、培養物から、すなわち、ｐ１０１調節サブユニットのペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合において宿主細胞から、およびｐ１０１調節サブユニットのペプチドまたはポリペプチドが細胞により分泌される場合において培地から、回収することができる。しかしながら、ｐ１０１調節サブユニットの構造的および機能的特性を保持することばかりでなく、かつまた、例えば、薬剤のスクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価することが重要である状況において、このような操作された宿主細胞それら自体を使用することができる。
本発明の目的のために使用できる発現系は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ｐ１０１ヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された微生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌（E.coli）、バシラス・サチリス（B.subtilis）；ｐ１０１ヌクレオチド配列を含有する組換え酵母の発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；ｐ１０１配列を含有する組換えウイルスの発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルスの発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させたか、あるいはｐ１０１調節サブユニットを含有する組換えプラスミドの発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を収容する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、Ｕ９３７）。
細菌系において、発現されるｐ１０１遺伝子産物に意図する用途に依存して、多数の発現ベクターを好都合に選択することができる。例えば、ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質の医薬組成物を製造するために、あるいはｐ１０１調節サブユニットのタンパク質に対する抗体を発生するために、大量のこのようなタンパク質を製造すべきとき、例えば、高いレベルの精製容易な融合タンパク質の産物の発現を指令するベクターが望ましいことがある。このようなベクターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：大腸菌（E.coli）の発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al.、1983、EMBO J.2:1791）、ここで融合タンパク質が産生されるように、ｐ１０１コーディング配列を個々にｌａｃＺとインフレームでベクターの中に結合することができる；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye、1985、Nucleic Acids Res.13:3101-3109;Van Heeke & Schuster、1989、J.Biol.Chem.264:5503-5509）；およびその他。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることができる。挿入された配列が比較的小さいポリペプチド（２５ｋＤより小さい）をコードする場合、このような融合タンパク質は一般に可溶性であり、そしてグルタチオンビーズへの吸着および引き続く遊離増殖の存在下の溶離により、溶解した細胞から容易に精製することができる。クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から解放させることができるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように、ｐＧＥＸベクターを設計することができる。また、生ずる融合タンパク質が不溶性であり、そして宿主細胞中で封入体を形成する場合、当業者によく知られている技術により、封入体を精製し、そして組換えタンパク質を可溶化することができる。
昆虫系において、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用することができる。（例えば、下記の文献を参照のこと：Smith et al.、1983、J.Virol.46:584;Smith、米国特許第4,215,051号）。後述する特定の態様において、６×ＨＩＳ−タッグドｐ１２０構築物、または（ＥＥ）−タッグドｐ１０１構築物を発現するバキュロウイルスのベクターで、Ｓｆ９昆虫細胞を感染させる。
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスをベースとする発現系を利用することができる。下記においていっそう完全に説明する特定の態様は、ＣＭＶプロモーターを使用してタッグドｐ１０１またはｐ１２０ｃＤＮＡ配列を発現して、Ｕ９３７細胞またはＣｏｓ−７細胞中で組換えタンパク質を一時的に発現させる。また、この分野においてよく知られているロタウイルスのベクター系を使用して、宿主細胞の中に組換え発現構築物を挿入することができる。例えば、造血細胞を形質導入のためのロタウイルスのベクター系は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／０９４００号およびＷＯ９４／２９４３８号明細書に記載されている。
アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、問題のｐ１０１ヌクレオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスのゲノムの中に挿入することができる。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の中への挿入は、生存できかつ感染した宿主中でｐ１０１遺伝子産物を発現できる組換えウイルスが生ずるであろう。例えば、下記の文献を参照のこと：Logan & Shenk、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655-3659）。また、挿入されたｐ１０１ヌクレオチド配列の効率よい翻訳のために、特定の開始シグナルが要求されることがある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を包含する。それ自身の開始コドンおよび隣接するｃＤＮＡ配列を含む、全体のｐ１０１遺伝子またはｃＤＮＡが適当な発現ベクターの中に挿入される場合、追加の翻訳コントロールシグナルは不必要であることがある。しかしながら、ｐ１０１コーディング配列の一部分のみが挿入される場合、多分、ＡＴＧ開始コドンを含む、外性翻訳コントロールシグナルを準備しなくてはならない。さらに、開始コドンを所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調させて、全体のインサートの翻訳を保証しなくてはならない。これらの外性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の双方の種々の起源であることができる。適当な転写エンハンサー因子、転写ターミネーター、およびその他を含めることによって、発現効率を増強することができる（Bittner et al.、1987、Methods in Enzymol.153:516-544を参照のこと）。
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートするか、あるいは所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞系統を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要であろう。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特徴および特定のメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実するために適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的で、主要な転写物の適切なプロセシングのための細胞の装置を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞系統は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、およびＵ９３７細胞。
組換えタンパク質の長期間の、高い収率の生産のために、安定なウェルのプレートが好ましい。例えば、前述のｐ１０１配列を安定に発現する細胞系統を操作することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、適当な発現コントロール因子（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、およびその他）、および選択可能なマーカーによりコントロールされたＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを細胞の染色体の中に組込み、増殖してフォーカスを形成できるようにし、引き続いてフォーカスをクローニングし、細胞系統に拡張させることができる。ｐ１０１遺伝子産物を発現する細胞系統を操作するために、この方法を好都合に使用することができる。このような操作された細胞系統は、ｐ１０１遺伝子産物の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用である。
多数の選択系を使用することができ、このような選択系は下記のものを包含するが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Wigler et al.、1977、Cell 11:223）、ハイポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski、1962、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al.、1980、Cell 22:817）遺伝子を、それぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞において使用することができる。また、抗代謝物耐性を下記の遺伝子の選択基準として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を付与する（Wigler et al.、、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3576）；O’Hare et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Mulligan & Berg、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Colbere-Garapin et al.、1981、J.Mol.Biol.150:1）；およびｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する耐性を付与する（Santerre et al.、1984、Gene 30:147）。
ｐ１０１遺伝子産物は、また、トランスジェニック動物において発現させることができる。任意の種の動物を使用してｐ１０１トランスジェニック動物を発生させることができ、これらの動物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、微小ブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー。
ｐ１０１トランスジーンを動物の中に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を生産するために、この分野において知られている任意の技術を使用することができる。このような技術下記のものを包含するが、これらに限定されない：前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ、Ｐ．Ｃ．およびＷａｎｇｎｅｒ、Ｔ．Ｅ．、１９８９、米国特許第４，８７３，１９１号）；胚芽系統の中へのロタウイルス仲介遺伝子転移（Van der Putten et al.、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152）；胚幹細胞における遺伝子のターゲッティング（Thompson et al.、1989、Cell 56:313-321）；胚のエレクトロポレーション（Lo、1983、Mol.Cell.Biol.3:1803-1814）；および精子仲介遺伝子転移（Lavitrano et al.、1989、Cell 57:717-723）；およびその他。このような技術の概観については、下記の文献を参照のこと：Gordon、1989、Transgenic Animals,Intl.Rev.Cytol.115:171-229、これはその全体において引用することによって本明細書の一部とされる。
本発明は、すべてのそれらの細胞の中にｐ１０１トランスジーンを有するトランスジェニック動物、ならびにそれらの細胞のすべてではなく、一部分の中にトランスジーンを有する動物、すなわち、モザイク動物を提供する。トランスジーンは単一のトランスジーンとして、またはコンカテマーで、例えば、頭−頭の直列または頭−尾の直列で組込むことができる。また、トランスジーンは、例えば、Lasko et al.の教示に従い、特定の細胞の型の中に選択的に導入し、活性化することができる（Lasko、M.et al.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236）。このような細胞の型特異的活性化に要求される調節配列は問題の特定の細胞の型に依存し、そして当業者にとって明らかであろう。ｐ１０１遺伝子を内因性ｐ１０１遺伝子の染色体部位の中に組込むことを望むとき、遺伝子のターゲッティングは好ましい。簡単に述べると、染色体配列との相同組換えを介して、内因性ｐ１０１遺伝子のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列の中に組込み、かつその機能を崩壊する目的で、内因性ｐ１０１遺伝子に対して相同性のいくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターを設計する。このようにして、非機能的配列を内因性ｐ１０１遺伝子の中に挿入することによって、内因性ｐ１０１遺伝子の発現を排除することもできる。また、例えば、Gu et al.の教示に従うことによって、トランスジーンを特定の細胞の型の中に導入し、こうしてその細胞の型のみにおいて内因性ｐ１０１遺伝子を不活性化することができる（Gu et al.、1994、Science 265:103-106）。このような細胞の型特異的不活性化に要求される調節配列は問題の特定の細胞の型に依存し、そして当業者にとって明らかであろう。
いったんトランスジェニック動物が発生すると、組換えｐ１０１遺伝子の発現を標準的技術によりアッセイすることができる。初期のスクリーニングをサザンブロット分析またはＰＣＲ技術により達成して動物組織を分析して、トランスジーンの組込みが起こったかどうかをアッセイすることができる。トランスジェニック動物の組織中のトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルを、また、下記の技術を包含するが、これらに限定されない技術により評価することができる：アミンから得られた細胞の型の試料のノザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、およびＲＴ−ＰＣＲ。また、ｐ１０１遺伝子発現組織の試料を、後述するように、ｐ１０１トランスジーン産物に対して特異的な抗体により免疫細胞化学的に評価することができる。
５．３  ｐ１０１およびｐ１２０タンパク質に対する抗体
ｐ１０１調節サブユニットの１またはそれより多いエピトープ、またはｐ１０１調節サブユニットの保存された変異型のエピトープ、またはｐ１０１調節サブユニットのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体は、また、本発明に包含される。また、ｐ１２０タンパク質の１またはそれより多いエピトープ、特に新しいカルボキシル末端を認識する抗体は本発明に包含される。このような抗体は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および前述の任意のエピトープ結合フラグメント。
本発明の抗体は、例えば、生物学的試料中のｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０の検出において使用することができ、したがって、患者を異常な量のこれらのタンパク質について試験することができる診断または予後の技術の一部分として利用することができる。また、節５．５において後述するように、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の発現および／または活性に対する化合物の作用を評価するために、このような抗体を、例えば、化合物スクリーニングスキームと組み合わせて利用することができる。さらに、節５．６において後述するように、このような抗体を遺伝子治療技術と組み合わせて使用して、例えば、患者の中への導入前に、正常のおよび／または操作されたｐ１０１調節サブユニットを発現する細胞を評価することができる。さらに、このような抗体は異常なｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０活性を阻害する方法として使用することができる。したがって、このような抗体は炎症性障害の治療方法の一部分として使用することができる。
抗体の産生のために、ｐ１０１調節サブユニット、ｐ１０１調節サブユニットのペプチド、トランケートｐ１０１調節サブユニットのポリペプチド、ｐ１０１調節サブユニットの機能的同等物またはｐ１０１調節サブユニットの突然変異体の注射により、種々の宿主動物を免疫化することができる。さらに、ｐ１２０触媒サブユニットまたはｐ１２０サブユニットのペプチドの注射により、宿主動物を免疫化することができる。このような宿主動物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ウサギ、マウス、およびラット、およびその他。宿主種に依存して種々のアジュバントを使用して免疫応答を増加することができ、このようなアジュバントは下記のものを包含するが、これらに限定されない：フロインド（完全および不完全）アジュバント、無機質ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性剤、例えば、リゾレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なアジュバント、例えば、ＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から誘導された抗体分子の異種集団である。
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均質集団であり、培養における連続的細胞系統による抗体分子の産生を提供する任意の技術により得ることができる。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＫｏｈｌｅｒおよびMilsteinのハイブリドーマ技術（1975、Nature 256:495-497;および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al.、1983、Immunology Today 4:72;Cole et al.、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、pp.77-96）。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを包含する免疫グロブリンのクラスからのものであることができる。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。高い力価のｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ産生は、これを現在好ましい産生方法とする。
さらに、適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適当な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライスすることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Neuberger et al.、1984、Nature、312:604-608;Takeda et al.、1985、Nature、314:452-454）を使用することができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導された分子、例えば、ブタｍＡｂおよびヒト免疫グロブリン一定領域から誘導された可変領域を有する分子である。
また、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号；Bird、1988、Science 242:423-426;Huston et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;およびWard et al.、1989、Nature 334:544-546）は、ｐ１０１遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するように適合させることができる。Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖のフラグメントをアミノ酸架橋により結合し、一本鎖ポリペプチド生成することによって、一本鎖抗体は形成される。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを既知の技術により発生させることができる。例えば、このようなフラグメントは下記のものを包含するが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により産生することができるＦ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジサルファイド架橋を還元することによって発生させることができるＦａｂフラグメント。また、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huse et al.、1989、Science、246:1275-1281）所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速かつ容易な同定を可能とすることができる。
引き続いて、当業者によく知られている技術に従い、ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットに対して抗体を利用して、それぞれ、ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０サブユニットを「模擬」する抗イディオタイプ抗体を発生させることができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Greenspan & Bona、1993、FASEB J 7（5）:437-444;およびNissinoff、.1991、J.Immunol.147（8）:2429-2438）。例えば、ｐ１０１調節サブユニットに結合しかつｐ１０１調節サブユニットへの触媒サブユニットの結合を完全に阻害する抗体を使用して、ｐ１０１調節サブユニットを「模擬」し、したがって、触媒サブユニットに結合しかつそれを中和する抗イディオタイプを発生させることができる。このような中和性抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを治療的養生法において使用して、触媒サブユニットを中和しかつ炎症を減少することができる。
５．４  造血細胞活性化障害の診断
炎症性障害を包含する、造血系列細胞の活性化の障害の診断的および予後的評価、およびこのような障害の素因を有する被検者の同定のために、種々の方法を使用することができる。
このような方法は、例えば、試薬、例えば、前述のｐ１０１またはｐ１２０ヌクレオチド配列、および節５．３に記載されているような、ｐ１０１調節サブユニットおよびｐ１２０の抗体を利用することができる。詳しくは、このような試薬は、例えば、下記の目的に使用することができる：（１）ｐ１０１またはｐ１２０の突然変異体の存在の検出、あるいは非造血系列細胞の活性化の障害の状態に関して高いか、あるいは低いｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡの発現の検出；（２）非造血系列細胞の活性化の障害の状態に関して高いか、あるいは低いｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の発生量の検出；および（３）ｐ１０１調節サブユニットおよびｐ１２０触媒サブユニットにより仲介されるシグナル伝達経路の混乱または異常の検出。
本明細書において記載する方法は、例えば、少なくとも１つの特異的ｐ１０１またはｐ１２０ヌクレオチド配列、あるいは本明細書において記載するｐ１０１またはｐ１２０調節サブユニットの抗体試薬（これは、例えば、臨床的設定において好都合に使用することができる）を含んでなる前もって包装された診断キットを利用して、造血系列細胞の活性化の障害の異常を示す患者を診断することによって、実施することができる。
ｐ１０１またはｐ１２０突然変異の検出のために、任意の有核細胞をゲノムの核酸のための出発源として使用することができる。ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現、あるいはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の検出のために、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子を発現する細胞の型または組織、例えば、好中球細胞を利用することができる。
核酸をベースとする検出技術を節５．４．１において後述する。ペプチドの検出技術を節５．４．２において後述する。
５．４．１  ｐ１０１遺伝子および転写物の検出
多数の技術を利用するによる、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子内の突然変異を検出できる。有核細胞からの核酸をこのようなアッセイ技術の出発点として使用し、そして当業者によく知られている標準的核酸製造法に従い単離することができる。
点突然変異、挿入、欠失および染色体の再配列を包含する、遺伝子構造を含む異常を検出する生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて、ＤＮＡを使用することができる。このようなアッセイは下記のものを包含するが、これらに限定されない：サザン分析、一本鎖コンフォメーション多形分析（ＳＳＣＰ）、およびＰＣＲ分析。
ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子特異的突然変異を検出するこのような診断法は、例えば、下記の工程を含むことができる：試料から得られた、例えば、患者の試料または他の適当な細胞源から誘導された、組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはそれらのデジェネレイト変異型を包含する核酸を、前述したような、組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはそれらのデジェネレイト変異型を包含する１またはそれより多い標識化核酸試薬と、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子内の相補的配列に対するこれらの試薬の特異的アニーリングに好適な条件下に、接触させる。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、すべての非アニーリング核酸を核酸分子のハイブリッドから除去される。このような分子が存在する場合、ハイブリッド化された核酸の存在を次いで検出する。このような検出スキームを使用して、問題の細胞の型または組織からの核酸を、例えば、固体状支持体、例えば、膜、または表面、例えば、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズに固定化することができる。この場合において、インキュベーション後、前述のの型の非アニーリングの標識化核酸試薬は容易に除去される。残留する、アニーリングされ、標識化されたｐ１０１またはｐ１２０核酸試薬の検出は、当業者によく知られている標準的技術に従い達成される。核酸試薬がそれらに対してアニールしたｐ１０１またはｐ１２０配列を、正常遺伝子配列から期待されるアニーリングパターンと比較して、遺伝子の突然変異が存在するかどうかを決定することができる。
患者の試料または他の適当な細胞源中の、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断方法は、これらの増幅、例えば、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ．Ｂ．、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されている実験の態様）による増幅、引き続く当業者によく知られている技術に従う増幅された分子の検出を含むことができる。生ずる増幅された配列を、増幅される核酸がｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の正常のコピーのみを含有する場合、期待される配列と比較して、遺伝子の突然変異が存在するかどうかを決定することができる。
また、よく知られた遺伝子型別技術を実施して、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の突然変異を有する個体を同定することができる。このような技術は、例えば、使用する特定の制限酵素のための認識部位の１つにおける配列の変動を含む、制限フラグメントの長さの多形（ＲＦＬＰｓ）の使用を包含する。
また、ｐ１０１またはｐ１２０の転写を検出し、そして測定することによって、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現レベルをアッセイすることができる。例えば、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子を発現することが知られているか、あるいは推測される細胞の型または組織、例えば、造血系列細胞、特に骨髄細胞および血小板からのＲＮＡを、前述したようなハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術に従い、単離し、そして試験することができる。単離された細胞は細胞培養物または患者から誘導することができる。培養から取った細胞の分析は、細胞をベースとする遺伝子治療技術の一部分として使用すべき細胞の評価において、あるいはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現に対する化合物の作用を試験するために、必要な工程であろう。このような分析は、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現の活性化または不活性化を包含する、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現パターンの定性的面または定量的面の双方を明らかにすることができる。
５．４．２  ｐ１０１遺伝子産物の検出
節５．３において前述した、野生型または突然変異のｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物または保存された変異型またはそれらのフラグメントに対して向けられた抗体を、また、本明細書において記載するように、造血系列細胞の活性化の障害の診断剤および予後剤として使用することができる。このような診断方法は、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現レベルの異常、あるいはｐ１０１調節サブユニットの構造および／または一時的、組織、細胞、または細胞下の位置の異常を検出するために使用することができ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、バイオプシー組織について実施することができる。
分析すべき組織または細胞の型は、一般に、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子を発現する細胞、例えば、炎症性組織を浸潤した好中球細胞を含有することが知られているか、あるいは推測されるものを包含するであろう。本発明において使用するタンパク質の単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅが記載するような方法であることができる（Harlow、E.およびLane、D.、1988、″Antibodies:A Laboratory Manual″,Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）、これはその全体において引用することによって本明細書の一部とされる。単離された細胞は細胞培養または患者から誘導することができる。培養から取った細胞の分析は、細胞をベースとする遺伝子治療技術の一部分として使用すべき細胞の評価において、あるいはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現に対する化合物の作用を試験するために、必要な工程であろう。
例えば、本発明において有用な抗体、または抗体のフラグメント、例えば、、節５．３において前述したものを使用して、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物あるいは保存された変異型またはそれらのフラグメントの存在を定性的または定量的に検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡、フロー・サイトメトリー、または蛍光測定的検出と組み合わせて蛍光標識化抗体（この節の下を参照のこと）を使用する免疫蛍光技術により、達成することができる。
さらに、本発明において有用な抗体（またはそれらのフラグメント）または融合または結合タンパク質は、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法または非イムノアッセイにおけるように、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物または保存変異型またはそれらのペプチドフラグメントのｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、あるいは触媒サブユニットの結合（標識化触媒サブユニットの融合タンパク質の場合において）のために、組織学的に使用することができる。
ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的試料を取り出し、そしてそれに本発明の標識化抗体またはＧタンパク質を適用することによって達成することができる。抗体（またはフラグメント）または融合タンパク質は、好ましくは標識化抗体（またはフラグメント）を生物学的試料上にオーバーレイすることによって適用される。このような手法の使用により、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物、または保存された変異型またはペプチドフラグメントの存在ばかりでなく、かつまた検査した組織のその分布を決定することが可能である。本発明を使用して、広範な種類の組織学的方法（例えば、染色法）を修飾してこのようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成することができる。
ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物、または保存された変異型またはそれらのペプチドフラグメントについてのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、典型的には、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物、または保存された変異型またはそれらのペプチドフラグメントを同定することができる検出可能に標識化された抗体の存在において、試料、例えば、生物学的流体、組織抽出物、新しく収穫した細胞、または細胞培養においてインキュベートした細胞のライゼイトをインキュベートし、そして結合した抗体を多数のこの分野においてよく知られている技術の任意の技術により検出することからなる。
生物学的試料を、固相の支持体または担体、例えば、ニトロセルロース、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化できる他の固体状支持体と接触させることができる。次いで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、次いで検出可能に標識化されたｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０サブユニットの抗体または融合タンパク質で処理することができる。次いで固体状支持体を緩衝液で２回目に洗浄して、非結合の抗体または融合タンパク質を除去することができる。次いで、固体状支持体上に結合した標識の量を慣用の手段により検出することができる。
「固相の支持体または担体」は、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体を包含することを意図する。よく知られた支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン，デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび改質されたセルロース、ポリアクリルアミド、班糲岩、および磁鉄鉱を包含する。担体の特質は本発明の目的に対してある程度まで可溶性であるか、あるいは不溶性であることができる。結合した分子が抗原または抗体に結合できるかぎり、支持体材料は事実上任意の可能な構造的コンフォメーションを有することができる。したがって、支持体のコンフォメーションは、ビーズにおけるように球形、試験管の内表面におけるように円筒形、またはロッドの外表面であることができる。また、表面は平らであり、例えば、シート、試験ストリップ、およびその他であることができる。好ましい支持体はポリスチレンのビーズを包含する。当業者は抗体または抗原を結合するために適当な多数の他の担体を知るか、あるいは日常的実験によりそれを確認することができるであろう。
ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０サブユニットの抗体または融合タンパク質の所定のロットの結合活性を、よく知られている方法により測定することができる。当業者は、日常的実験により各測定のための操作的および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
抗体に関すると、抗体を検出可能に標識化できる方法の１つは抗体を酵素に結合し、そして酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用することである（Voller、″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）″,1978、Diagnostic Horizons 2:1-7、Microbiological Associates Quarterly Publication、ウォーカーズヴィレ、マリイランド州）；Voller et al.、1978、J.Clin.Pathol.31:507-520;Butler、1981、Meth.Enzymol.73:482-523;Maggio（編）、1980、Enzyme Immunoassay、CRC Press、ボカ・レイトン、フロリダ州；Ishikawa et al.（編）、1981、Enzyme Immunoassay、Kgau Shoin、東京）。抗体に結合する酵素は、分光光度測定、蛍光測定によるか、あるいは視的手段により検出できる化学的部分を生成するような方法において、適当な基質、好ましくは色素形成基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識化するために使用できる酵素は下記のものを包含するが、これらに限定されない：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタヒロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸塩、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリネステラーゼ。酵素のための色素形成基質を使用する比色法により、検出を達成することができる。また、同様に製造した標準との比較において基質の酵素の反応の程度を視的に比較することによって、検出を達成することができる。
検出は、また、種々の他のイムノアッセイを使用して達成することができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識化することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用してｐ１０１調節サブユニットを検出することが可能である（例えば、下記の文献を参照のこと：Weintraub、B.、Principle of Radioimmunoassays、Seventh Training Coures on Radioligand Assay Techniques、The Endocrine Society、March、1986、これは引用することによって本明細書の一部とされる）。ガンマカウンターまたはシンチレーションカウターの使用のような手段によるか、あるいはオートラジオグラフィーにより、放射性アイソトープを検出することができる。
また、抗体を蛍光化合物で標識化することが可能である。蛍光的に標識化された抗体を適切な波長の光に暴露するとき、その存在を蛍光のために検出することができる。最も普通に使用される蛍光標識化化合物の例は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびフルオレスカミンである。
また、蛍光放射金属、例えば、152Ｅｕ、またはランタノイド系列の他の金属を使用して、抗体を検出可能に標識化することができる。このような金属キレート化基、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはジエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して、これらの金属を抗体に取付けることができる。
また、抗体を化学発光化合物に結合することによって、抗体を検出可能に標識化することができる。次いで、化学反応の過程の間に発生するルミネセンスの存在を検出することによって、化学発光タッグド抗体の存在は決定される。特に有用な化学発光標識化化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗体を標識化することができる。生物発光は、触媒のタンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学的系において見出される型の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在の検出により決定される。標識化の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
５．５  Ｇタンパク質活性化ＰＩ３Ｋの発現または活性をモジュレートする化合物についてのスクリーニングアッセイ
ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットと相互作用する（に結合する）化合物、ｐ１０１調節サブユニットおよび／またはｐ１２０触媒サブユニットと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用する（に結合する）化合物、ｐ１２０触媒サブユニットとの相互作用またはＧタンパク質刺激ＰＩ３Ｋ仲介シグナル伝達に関係する他の細胞内タンパク質との相互作用を妨害する化合物、およびｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の活性をモジュレートする（すなわち、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現レベルをモジュレートする）か、あるいはｐ１０１またはｐ１２０のレベルをモジュレートする化合物を同定するために、下記のアッセイを設計する。ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター配列）に結合しかつｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現をモジュレートすることができる化合物を化合物を同定するアッセイを、さらに利用することができる。例えば、Platt、K.A.、1994、J.Biol.Chem.269:28558-28562（これはその全体において引用することによって本明細書の一部とされる）を参照のこと。
本発明に従いスクリーニングすることができる化合物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットに結合しかつ自然リガンドによりトリガーされた活性を模擬する（すなわち、アゴニスト）か、あるいは自然リガンドによりトリガーされた活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）ペプチド、抗体およびそれらのフラグメント、プロスタグランジン、脂質および他の有機化合物；ならびにｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニット（またはその一部分）を模擬し、そして自然リガンドに結合しかつそれを「中和」するペプチド、抗体またはそれらのフラグメント、および他の有機化合物。
このような化合物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ペプチド、例えば、可溶性ペプチド、ランダムペプチドのライブラリーを包含するが、これらに限定されない（例えば、下記の文献を参照のこと：Lam、K.S.et al.、1991、Nature 354:82-84;Houghten、R.et al.、1991、Nature 354:84-86）、およびＤ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸配列、ホスホペプチドから作られた組合わせの化学由来分子のライブラリーペプチド（ランダムまたは部分的にデジェネレイトの、定方向ホスホペプチドのライブラリーを包含するが、これらに限定されない：例えば、Songyang、Z.et al.、1993、Cell 72:767-778を参照のこと）；抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖の抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂ発現ライブラリーのフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメントを包含するが、これらに限定されない）；および小さい有機または無機の分子。
本発明に従いスクリーニングすることができる他の化合物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：適当な細胞（例えば、好中球において）に入りかつｐ１０１またはｐ１２０遺伝子またはｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路に関係する他の遺伝子の発現に影響を与える（例えば、遺伝子の発現に関係する調節領域または転写因子と相互作用することによって）ことができる小さい有機分子；または、例えば、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットに対するｐ１０１の結合またはｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路に関係するいくつかの他の細胞内因子、例えば、Ｇβγに対するｐ１０１の結合を阻害または増強することによって、ｐ１０１調節サブユニットの活性に影響を与えるこのような化合物。
コンピューターのモデリングおよびサーチング技術は、ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットの発現または活性をモジュレートすることができる、化合物の同定、または既に同定された化合物の改良を可能とする。このような化合物または組成物が同定されると、活性の部位または領域が同定される。このような活性部位は、典型的には、結合相手部位、例えば、ｐ１０１の調節サブユニットそれ自体とのｐ１２０触媒サブユニットの相互作用ドメインであることができる。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関係する化合物または組成物とその自然のリガンドとの複合体から研究から、この分野において知られている方法により同定することができる。後者の場合において、化合的またはＸ線の結晶学的方法を使用して、因子上のどこに複合化リガンドが存在するかを見出すことによって、活性部位を見出すことができる。
次に、活性部位の三次元の幾何学的構造を決定する。これは完全な分子構造を決定できる既知の方法、例えば、Ｘ線結晶学により実施することができる。他方において、固相または液相のＮＭＲを使用して、ある種の分子内距離を測定することができる。任意の他の構造決定の実験的方法を使用して、部分的または完全な幾何学的構造を得ることができる。幾何学的構造は、決定された活性部位の正確度を増加することができる、天然または人工の複合化リガンドを使用して測定することができる。
不完全なまたは不十分な正確度の構造が測定される場合、コンピューターをベースとする数値的モデリングを使用して構造を完結するか、あるいはその正確度を改良する。任意の認識されたモデリング法を使用することができ、このような方法は、特定のバイオポリマー、例えば、タンパク質または核酸に対して特異的なパラメーター化モデル、分子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱的集合に基づく統計学的メカニックのモデル、または組合わせされたモデルを包含する。モデルの大部分の型について、構成成分の原子と群との間の力を表す、標準的分子力の場は必要であり、そして物理化学において知られている力の場から選択することができる。不完全なまたは低い正確度の実験的構造は、これらのモデリング法により計算された完全なかつより正確な構造に対する拘束として働くことができる。
最後に、実験的に、モデリングにより、あるいは組合わせにより、活性部位の構造が決定されると、化合物およびそれらの分子構造に関する情報を含有するデータベースをサーチすることによって、候補のモジュレート化合物を同定することができる。このようなサーチは、決定された活性部位の構造と合致しかつ活性部位を定める群と相互作用する構造を有する化合物を探索する。このようなサーチはマニュアルであることができるが、好ましくはコンピューター補助である。このサーチから見出されたこれらの化合物は、潜在的なＧタンパク質活性化ＰＩ３Ｋモジュレート化合物である。
また、これらの方法を使用して、既に知られているモジュレート化合物またはリガンドから改良されたモジュレート化合物を同定することができる。既知の化合物の組成物を修飾し、そして新しい組成物に適用される前述の実験的およびコンピューターモデリング法を使用して、修飾の構造的効果を決定することができる。次いで、変更された構造を化合物の活性部位の構造と比較して、改良された適合または相互作用が生ずるかどうかを決定する。この方法において、例えば、側面の群を変化することによって、組成物における系統的変動を急速に評価して、改良された特異性または活性の修飾されたモジュレート化合物またはリガンドを得ることができる。
モジュレートの同定に有用な、ｐ１２０触媒サブユニット、ｐ１０１調節サブユニット、および関係する伝達および転写の因子の活性部位の同定に基づく、他の実験的およびコンピューターモデリング法は当業者にとって明らかであろう。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワルサム、マサチュセッツ州）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子と互いとの相互作用の構築、変更、可視化、および挙動の分析を可能とする。
多数の文献において、特定のタンパク質との薬剤の相互作用のコンピューターのモデリングが概観されている、例えば、Rotivinen et al.、1988、Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166;Ripka、New Scientist 54-57（June 16、1988）;McKinalyおよびRossmann、1989、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:111-122;PerryおよびDavies、OSAR:Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193（Alan R.Liss,Inc.1989）;LewisおよびDean、1989、Proc.R.Soc.Lond.236:125-140および141-162;および、核酸成分のモデルリポーターに関して、Askew et al.、1989、J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090。化学物質をスクリーニングしかつグラフ的に描写する他のコンピュータープログラムは、会社、例えば、バイオデザイン・インコーポレーテッド（BioDesign,Inc.）（パサデナ、カリフォルニア州）、アレリックス・インコーポレーテッド（Allelix,Inc.（ミッシサウガ、オンタリオ州、カナダ国）、およびハイパーキューブ・インコーポレーテッド（Hypercube,Inc.）（ケンブリッジ、オンタリオ州）から入手可能である。これらは主として特定のタンパク質に対して特異的な薬剤の適用のために設計されているが、いったんＤＮＡまたはＲＮＡの領域が同定されると、それらの領域に対して特異的な薬剤の設計にそれらを適合させることができる。
結合を変更することができる化合物の設計および発生を参照して前述したが、自然の産物または合成化学物質、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質を包含する既知の化合物のライブラリー、インヒビターまたはアクチベーターである化合物をスクリーニングすることもできるであろう。
本明細書において記載するようなアッセイにより同定された化合物は、例えば、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の生物学的機能を苦心して作るとき、そして造血系列細胞の活性化の障害を改善するために有用であろう。例えば、節５．５．１〜５．５．３に記載されているのような技術により同定された化合物の有効性を試験するアッセイを、下記の節５．５．４において論ずる。
５．５．１  ｐ１０１調節サブユニットに結合する化合物についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ
ｐ１０１調節サブユニットまたはｐ１２０触媒サブユニットと相互作用する（に結合する）ことができる化合物を同定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を設計することができる。同定された化合物は、例えば、野生型および／または突然変異のｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物の活性をモジュレートするために有用であり、正常のｐ１０１調節サブユニット／触媒サブユニットの相互作用を崩壊する化合物を同定するためのスクリーンにおいて利用することができるか、あるいはそれら自体このような相互作用を崩壊することができる。
ｐ１０１調節サブユニットに結合する化合物を同定するために使用するアッセイの原理は、ｐ１０１調節サブユニットおよび被験化合物が相互作用および結合するために十分な条件下にかつ時間の間、２つの成分の反応混合物を調製し、こうして取り出すことができおよび／または反応混合物中で検出することができる複合体を形成することを包含する。使用するｐ１０１調節サブユニット種は、スクリーニングアッセイの目標に依存して変化させることができる。例えば、自然リガンドのアゴニストを探求する場合、全長のｐ１０１調節サブユニット、またはアッセイ系において利点（例えば、標識化、生ずる複合体のｒｌ、およびその他）を提供するタンパク質またはポリペプチドに融合したｐ１０１調節サブユニットを含有する融合タンパク質を利用することができる。
スクリーニングアッセイは種々の方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施する１つの方法は、ｐ１０１調節サブユニット、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質または被験化合物を固相上に固定し、そして固相上に固定されたｐ１０１調節サブユニット／被験化合物の複合体を反応の終わりにおいて検出することを含むであろう。このような方法の１つの態様において、ｐ１０１調節サブユニット反応成分を固体表面上に固定し、そして固定しない被験化合物を、直接的または間接的に、標識化することができる。この方法の他の態様において、固相上に固定されたｐ１０１調節サブユニットを標識化触媒サブユニット、例えば、ｐ１２０と複合化させる。次いで、被験化合物をｐ１０１／ｐ１２０複合体のアソシエーションを崩壊する能力についてアッセイすることができるであろう。
実際には、マイクロタイタープレートを固相として好都合に利用できる。固定された成分を非共有結合または共有結合の取付けにより固定化できる。非共有結合の取付けは、固体表面をタンパク質の溶液でコーティングし、乾燥することによって達成できる。また、固定化すべきタンパク質に対して特異的な、固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定できる。このようなは前もって調製し、貯蔵することができる。
このアッセイを実施するために、非固定化成分を固定成分を含有するコーティングされた表面に添加する。反応の完結後、形成された複合体が固体表面上に固定化されて止まるのような条件下に、未反応成分を除去する（例えば、洗浄により）。固体表面上に固定された複合体の検出は多数の方法により達成できる。前に非固定化の成分を前もって標識化する場合、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成したことを示す。前に非固定化の成分を前もって標識化しない場合、間接的標識を使用して表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば、前に非固定化の成分に対して特異的な標識化抗体を使用する（ここで、この抗体は直接的または間接的に標識化Ｉｇ抗体で標識化することができる）。
また、反応を液相中で実施することができ、反応生成物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出する；例えば、ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、または触媒サブユニットのタンパク質または融合タンパク質、または被験化合物に対して特異的な固定化抗体を使用して、溶液中で形成した複合体を固定し、そして可能な複合体の他の成分に対して特異的な標識化抗体を使用して、固定された複合体を検出する。
５．５．２  ｐ１０１またはｐ１２０タンパク質と相互作用する細胞内タンパク質のアッセイ
ｐ１０１調節サブユニットおよび／または触媒サブユニットｐ１２０と相互作用する細胞内タンパク質を同定するために、タンパク質−タンパク質の相互作用の検出に適当な任意の方法を使用できる。使用できる伝統的方法の例は、共免疫沈降、架橋、およびｐ１０１調節サブユニットと相互作用するライゼイト中のタンパク質を同定するための細胞ライゼイトおよびｐ１０１調節サブユニットから得られた細胞ライゼイトまたはタンパク質の勾配またはクロマトグラフィーのカラムを通す共精製である。これらのアッセイのために、使用するｐ１０１調節サブユニットの成分は全長のｐ１０１調節サブユニットまたはトランケートペプチドであることができる。同様に、成分はｐ１２０触媒サブユニット、またはｐ１０１調節サブユニットとｐ１２０触媒サブユニットとの複合体であることができる。いったん単離されると、このような細胞内タンパク質を同定し、次いで標準的技術と組み合わせて使用して、それと相互作用するタンパク質を同定することができる。例えば、ｐ１０１調節サブユニット、ＰＩ３Ｋ（ｐ１０１／ｐ１２０複合体）、またはｐ１２０触媒サブユニットと相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を、この分野においてよく知られている技術、例えば、エドマン分解技術により確認することができる（例えば、Creighton、1983、″Proteis:Structures and Molecular Principles″、W.H.Freeman & Co.、N.Y.、pp.34-49を参照のこと）。得られたアミノ酸配列は、このような細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列についてスクリーニングするために使用できるオリゴヌクレオチド混合物の発生のためのガイドとして使用できる。スクリーニングは、例えば、標準的ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術により達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物の発生およびスクリーニングの技術はよく知られている。（例えば、Ausubel、上掲、およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、1990、Innis、M.et al.、編、Academic Press,Inc.New Yorkを参照のこと）。
さらに、ｐ１０１調節サブユニットおよび／またはｐ１２０触媒サブユニットおよび／またはＰＩ３Ｋと相互作用する細胞内タンパク質をコードする遺伝子を同時に同定する方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、λｇｔ１１ライブラリーの抗体のプロービングのよく知られている技術に類似する方法において、標識化ｐ１０１調節サブユニットのタンパク質、またはｐ１０１調節サブユニットのポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、例えば、ｐ１０１調節サブユニットのポリペプチドまたはマーカー（例えば、酵素、フルオール、発光タンパク質、または色素）に融合されたｐ１０１調節サブユニットのポリペプチドまたはｐ１０１調節サブユニットのドメイン、またはＩｇ−Ｆｃドメインを使用して、発現、ライブラリーをプロービングすることを包含する。
ｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク質の相互作用を検出する１つの方法、２つのハイブリッド系を、例示のみの目的で非限定的に、詳細に説明する。この系の１つのバージョンは記載され（Chien et al.、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582）そしてクロンテク（Clontech）（パロ・アルト、カリフォルニア州）から商業的に入手可能である。
簡単に述べると、このような系を使用して、２つのハイブリッドをコードするプラスミドを構築する：１つのプラスミドは、ｐ１０１調節サブユニット、ｐ１０１調節サブユニットのポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質をコードするｐ１０１ヌクレオチド配列に融合された転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドから成り、そして他方のプラスミドはｃＤＮＡライブラリーの一部分としてこのプラスミドの中に組換えられた未知のタンパク質をコードするｃＤＮＡに融合された転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドから成る。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーを、その調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含有するリポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳまたはｌａｃＺ）を含有する酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の株の中に形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではリポーター遺伝子の転写を活性化することができない；ＤＮＡ結合ドメインのハイブリッドは、活性化機能を提供しないので、活性化することができず、そして活性化ドメインのハイブリッドは、アクチベーターの結合部位に局在化することができないので、活性化することができない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的アクチベータータンパク質を再構築し、そしてリポーター遺伝子の発現を生じ、この発現はリポーター遺伝子産物についてのアッセイにより検出される。
２つのハイブリッド系または関係する方法を使用して、活性化ドメインのライブラリーを「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてスクリーニングすることができる。１例として、限定されないが、ｐ１０１調節サブユニットをベイト遺伝子産物としてとして使用できる。全体のゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合される。このライブラリーおよびＤＮＡ結合ドメインに融合されたベイトｐ１０１遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドを酵母リポーター株の中に共形質転換し、そして生ずる共形質転換物をリポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、限定されないが、ベイトｐ１０１遺伝子配列、例えば、第１図に描写されている、ｐ１０１（またはｐ１０１のドメイン）のオープンリーディングフレームをベクターの中にクローニングし、こうして、それをＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳的に融合する。これらのコロニーを精製し、そしてリポーター遺伝子の発現に関係するライブラリーのプラスミドを単離する。次いでＤＮＡ配列を使用して、ライブラリーのプラスミドによりコードされるタンパク質を同定する。
この分野において日常的に実施されている方法を使用して、ベイトｐ１０１遺伝子産物と相互作用するタンパク質を検出すべき細胞系統のｃＤＮＡライブラリーを作ることができる。本明細書において記載する特定の系に従い、例えば、ｃＤＮＡフラグメントがＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合されるように、ｃＤＮＡフラグメントをベクターの中に挿入することができる。ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモーターにより推進されるｌａｃＺ遺伝子を含有する酵母株の中に、このライブラリーをベイトｐ１０１遺伝子−ＧＡＬ４融合プレートと一緒に共形質転換することができる。ベイトｐ１０１遺伝子産物と相互作用する、ＧＡＬ４翻訳活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡコードされたタンパク質は活性ＧＡＬ４タンパク質を再構築し、これによりＨＩＳ３遺伝子の発現を推進するであろう。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、ヒスチジンを欠如する半固体状寒天をベースとする培地を含有するペトリ皿上の増殖により検出可能である。次いでｃＤＮＡをこれらの株から精製し、そしてこの分野において日常的に実施されている技術に従いベイトｐ１０１遺伝子と相互作用するタンパク質を単離することができる。
５．５．３  ｐ１０１調節サブユニット／細胞内高分子の相互作用を妨害する化合物についてのアッセイ
ｐ１０１調節サブユニットと相互作用する高分子を、この説明の目的で、「結合相手」と呼ぶ。これらの結合相手はｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路に関係し、したがって、造血系列細胞の活性化の障害の調節におけるｐ１０１調節サブユニットの役割に関係するように思われる。既知の結合相手はＰＩ３Ｋキナーゼの触媒サブユニット、例えば、ｐ１２０、ｐ１１７、および多分ある種のｐ１１０タンパク質である。他の結合相手は活性化されたトリマーのＧタンパク質、例えば、Ｇβγサブユニット、および／または脂質であるように思われる。したがって、このような結合相手のｐ１０１との相互作用を妨害するか、あるいは崩壊し、ｐ１０１調節サブユニットの活性の調節において有用であることができる、したがって、ｐ１０１調節サブユニットの活性に関連する造血系列細胞の活性化の障害をコントロールする化合物を同定することが望ましい。
ｐ１０１調節サブユニットとその１またはそれより多い結合相手との間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用するアッセイ系の基本的原理は、節５．５．１および５．５．２に記載するｐ１０１調節サブユニットのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、および結合相手を含有する反応混合物を、２つを相互作用および結合させ、こうして複合体を形成するために十分な条件下にかつ時間の間、調製することを包含する。化合物を阻害活性について試験するために、反応混合物を被験化合物の存在および非存在において調製する。被験化合物は最初に反応混合物の中に含めるか、あるいはｐ１０１調節サブユニットの成分およびその結合相手の添加後のある時間において添加することができる。被験化合物を含まないか、あるいはプラシーボを含む対照反応混合物をインキュベートする。次いで、ｐ１０１調節サブユニットの成分と結合相手との間の複合体の形成を検出する。被験化合物を含有する反応混合物ではなく、対照反応混合物中の複合体の形成は、化合物がｐ１０１調節サブユニットと相互作用性結合相手との間の相互作用を妨害することを示す。さらに、被験化合物およびｐ１０１調節サブユニットのタンパク質を含有する反応混合物内の複合体の形成を、また、被験化合物および突然変異ｐ１０１調節サブユニットを含有する反応混合物内の複合体の遺伝物質と比較することができる。突然変異ｐ１０１調節サブユニットの相互作用を崩壊するが、正常のｐ１０１調節サブユニットのそれを崩壊しない化合物を同定することが望ましい場合、この比較は重要であろう。
ｐ１０１調節サブユニットおよび結合相手の相互作用を妨害する化合物についてのアッセイは、不均質または均質のフォーマットで実施することができる。不均質アッセイは、ｐ１０１調節サブユニットの成分または結合相手を固相上に固定し、そして固相に固定された複合体を反応の終わりにおいて検出することを包含する。均質アッセイにおいて、全体の反応を液相中で実施する。いずれのアプローチにおいても、反応成分の添加順序を変更して、試験する化合物に関する異なる情報を得ることができる。例えば、被験物質の存在において反応を実施することによって、すなわち、ｐ１０１調節サブユニットの成分および相互作用性結合相手の前に、あるいはそれと同時に被験物質を反応混合物に添加することによって、競合により相互作用を妨害する被験化合物を同定することができる。また、複合体が形成した後、被験化合物を反応混合物に添加することによって、前形成した複合体を崩壊する被験化合物、例えば、複合体から成分の１つを変位させるより高い結合定数を有する化合物を試験することができる。種々のフォーマットを下において簡単に説明する。
不均質アッセイ系において、ｐ１０１調節サブユニットの成分または相互作用性結合相手を固体表面上に固定するが、非固定種を、直接的または間接的に、標識化する。実際には、マイクロタイタープレートが好都合に利用される。固定された種を非共有結合炎症性応答共有結合の取付けにより固定化することができる。単に固体表面をｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物または結合相手の溶液でコーティングし、乾燥することによって、非共有結合の取付けを達成できる。また、固定すべき種に対して特異的な固定化された抗体を使用して、種を固体表面にｄｘすることができる。表面を前もって調製し、貯蔵することができる。
アッセイを実施するために、固定化された種の相手被験化合物を含むか、または含まないコーティングされた表面に暴露する。反応が完結した後、未反応の成分を除去し（例えば、洗浄により）、そして形成された複合体は固体表面上に固定化された状態に止まるであろう。固体表面上に固定された複合体の検出は多数のの方法で達成できる。非固定化種を前標識化する場合、固体表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。非固定化種が前標識化しない場合、間接的標識を使用して表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば、最初に固定化された種に対して特異的な標識化抗体を使用する（ここで抗体を直接的に標識化するか、あるいは標識化抗Ｉｇ抗体で間接的に標識化することができる）。反応成分の添加順序に依存して、複合体の形成を阻害するか、あるいは前形成した複合体を崩壊する被験化合物を検出することができる。
また、反応を液相中で被験化合物の存在または非存在において実施し、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる；例えば、結合成分の１つに対して特異的な固定化抗体を使用して、溶液中で形成した複合体を固定し、そして他の相手に対して特異的な標識化抗体を使用して固定された複合体を検出する。再び、液相への反応成分の添加順序に依存して、複合体を阻害するか、あるいは前形成した複合体を崩壊する被験化合物を同定することができる。
本発明の別の態様において、均質アッセイを使用することができる。このアプローチにおいて、ｐ１０１調節サブユニットの成分および相互作用性結合相手の前形成複合体を調製し、ここでｐ１０１調節サブユニットまたはその結合相手を標識化するが、標識化が発生するシグナルは複合体の形成のためのクエンチされる（例えば、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎによる米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと、これはこのイムノアッセイのアプローチを利用する）。前形成複合体からの種の１つと競合しかつそれを置換する試験物質の添加は、バックグラウンドの上でシグナルを発生させるであろう。このようにして、ｐ１０１調節サブユニット／細胞内結合相手の相互作用を崩壊する試験物質を同定することができる。
特定の態様において、ｐ１０１調節サブユニット融合物を固定化のために調製できる。例えば、融合ベクター、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１を使用して、その結合活性が生ずる融合タンパク質において維持されるような方法において、ｐ１０１調節サブユニットまたはペプチドフラグメント、例えば、ＣＤに相当するフラグメントをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させることができる。日常的に実施されおりそして節５．３において前述した方法に従い、相互作用性結合相手を精製し、モノクローナル抗体を発生させるために使用することができる。この抗体を放射性同位元素125Ｉで、例えば、この分野において日常的に実施されている方法により標識化することができる。不均質アッセイにおいて、例えば、ＧＳＴ−ｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに固定することができる。次いで、相互作用および結合が起こる方法において、相互作用性結合相手を被験化合物の存在または非存在において添加することができる。反応期間の終わりにおいて、非結合物質を洗浄除去し、そして標識化モノクローナル抗体を系に添加し、複合化成分に結合させることができる。グルタチオン−アガロースビーズとアソシエートして止まる放射能の量を測定することによって、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物と相互作用性結合相手との間の相互作用を検出できる。被験化合物による首尾よい阻害は、測定された活性を減少させるであろう。
また、ＧＳＴ−ｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質および相互作用性結合相手を、固体のグルタチオン−アガロースビーズの非存在において液体中で一緒に混合することができる。種を相互作用させる間または後に、被験化合物を添加することができる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加することができ、そして非結合物質を洗浄除去する。再び、標識化抗体を添加し、そしてビーズとアソシエートした放射能を測定することによって、ｐ１０１調節サブユニット／結合相手の相互作用の阻害の程度を検出することができる。
本発明の他の態様において、全長のタンパク質の１つまたは双方の代わりに、ｐ１０１調節サブユニットおよび／または相互作用性または結合相手（結合相手がタンパク質である場合において）の結合ドメインに相当するペプチドフラグメントを使用して、これらの同一技術を用いることができる。この分野において日常的に実施されている多数の方法を使用して、結合部位を同定し、単離することができる。これらの方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発、および共免疫沈降アッセイにおける結合の崩壊についてのスクリーニング。次いで、複合体中の第２種をコードする遺伝子における補償突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列の分析により、相互作用性結合に関係するタンパク質の領域に相当する突然変異が明らかになるであろう。また、１つのタンパク質を前述の方法により固体表面に固定し、タンパク質分解酵素、例えば、トリプシンで処理した、その標識化結合相手と相互作用させかつそれに結合させることができる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる短い標識化ペプチドは固体物質とアソシエートして止まることができ、これを単離し、アミノ酸の配列決定により同定することができる。また、いったん細胞内結合相手をコードする遺伝子が得られると、強い遺伝子をタンパク質のペプチドフラグメントを発現するように操作し、次いでこれを結合活性について試験し、同定または合成することができる。
例えば、限定されないが、ＧＳＴ−ｐ１０１調節サブユニットの融合タンパク質を作り、それをグルタチオン−アガロースビーズに結合させることによって、ｐ１０１遺伝子産物を前述の固体物質に固定することができる。相互作用性結合相手を放射性同位元素、例えば、35Ｓで標識化し、タンパク質分解酵素、例えば、トリプシンで切断することができる。次いで切断産物を固定ＧＳＴ−ｐ１０１融合タンパク質に添加し、結合させることができる。非結合ペプチドを洗浄除去した後、細胞内結合相手の結合ドメインを表す標識化結合物質を、よく知られている方法により、溶離し、精製し、アミノ酸配列について分析することができる。そのように同定されたペプチドを、組換えＤＮＡ技術により、合成的に製造するか、あるいは適当な促進製造に融合することができる。
５．５．４  炎症性障害を改善する化合物の同定のアッセイ
アッセイ技術、例えば、節５．５．１〜５．５．３に記載されている技術により同定された結合性化合物を包含するが、これらに限定されない化合物を、免疫系障害の症状を改善する能力について試験することができる。ｐ１０１調節サブユニットの活性に影響を与える化合物（例えば、ｐ１０１調節サブユニットに結合し、自然リガンドの結合を阻害し、そしてシグナル伝達を活性化する（アゴニスト）か、あるいは活性をブロックする（アンタゴニスト）化合物、およびｐ１０１調節サブユニットの自然リガンドに結合し、リガンドの活性を中和する化合物）；またはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の活性に影響を与える化合物（ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現に影響を与えることによって、ｐ１０１調節サブユニットの全長の形態またはトランケート形態の発現をモジュレートできるように、スプライシング事象に影響を与えるか、あるいは前記事象を妨害する分子、例えば、タンパク質または小さい有機分子）を、前述のアッセイにより、同定することができる。しかしながら、本明細書において記載するアッセイは、また、ｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達をモジュレートする化合物（例えば、下流のシグナリング事象に影響を与える化合物、例えば、ｐ１０１調節サブユニットに結合する触媒サブユニットにより発生されたＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ3シグナルの伝達に参加する活性のインヒビターまたはエンハンサー）を同定することができることに注意すべきである。ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子および／またはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子産物が関係する、ｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路における他の段階に影響を与えそして、この経路に影響を与えることによって、造血系列細胞の活性化の障害の発生に対するｐ１０１調節サブユニットの作用をモジュレートできる、このような化合物の同定および使用は、本発明の範囲内に入る。このような化合物は、造血系列細胞の活性化の障害を治療する方法の一部分として使用することができる。
本発明は、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善する、このような能力を示す化合物を同定する、細胞をベースとしかつ動物モデルをベースとするアッセイを包含する。このような細胞をベースとするアッセイ系は、また、組換え的または合成的に製造された触媒サブユニットおよび触媒サブユニットの突然変異を包含する、自然のリガンド、触媒サブユニットの純度および効力についてのアッセイの標準として使用することができる。
細胞をベースとする系を使用して、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善する作用することができる化合物を同定できる。このような細胞系は、例えば、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子を発現する、組換えまたは非組換え細胞、例えば、細胞系統を包含することができる。例えば、白血球細胞、または白血球細胞から誘導された細胞系統を使用することができる。さらに、機能的ｐ１０１／ｐ１２０ＰＩ３Ｋを発現しかつ、例えば、化学的または表現型の変化、他の宿主細胞の遺伝子の誘発、特定の細胞内メッセンジャーのレベルの変化（例えば、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3、およびその他）により測定して、自然リガンドＧβγサブユニットによる活性化に対して応答する発現宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞、Ｓｆ９細胞）を、アッセイの終点として使用することができる。
このような細胞系を利用するとき、暴露された細胞において造血系列細胞の活性化の障害の症状のこのような改善を引き出すために十分な濃度でかつ時間の間、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善する能力を示すことが推測される化合物に細胞を暴露することができる。暴露後、細胞をアッセイしてｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現の変更を測定することができ、ここで、例えば、細胞ライゼイトをｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡ転写物についてアッセイする（例えば、ノザン分析により）か、あるいは細胞中で発現されたｐ１０１またはｐ１２０タンパク質についてアッセイする；ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現を調節またはモジュレートする化合物は治療剤として価値ある候補である。また、細胞を検査して、１またはそれより多い造血系列細胞の活性化の障害様の細胞の表現型が正常のまたはより野生型の表現型に類似するように変更されたかどうか、あるいは表現型が障害の症状のより低い出現率または発病度を生成するようでであるかどうかを決定することができる。なおさらに、ｐ１０１調節サブユニットがその一部分であるシグナル伝達経路の成分の発現および／または活性、あるいはｐ１０１調節サブユニットのシグナル伝達経路それ自体の活性をアッセイすることができる。
例えば、細胞の発現後、非暴露の対照細胞から誘導されたライゼイトに比較して、細胞ライゼイトを第２メッセンジャーＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3の増加したレベルの存在についてアッセイすることができる。これらのアッセイにおいて第２メッセンジャーの産生を阻害する被験化合物の能力は、被験化合物がｐ１０１調節サブユニットの活性化により開始されるシグナル伝達を阻害することを示す。細胞ライゼイトはアニオン交換ＨＰＬＣにより容易にアッセイすることができる。また、Wymann et al.、1987、Anal.Biochem.165:371-378（その全体において引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように、セイヨウワサビペルオキシダーゼを触媒とするルミノールの酸化をモニターすることによって、スーパーオキシドの生成またはＯ2のレベルをアッセイすることができる。最後に、当業者によく知られている技術により、完全な細胞の細胞付着の変化をアッセイすることができる。
さらに、動物をベースとする造血系列細胞の活性化の障害の系（例えば、マウスを包含することができる）を使用して、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善することができる化合物を同定することができる。このような動物モデルは、このような障害の治療において有効であることができる薬剤、製薬、治療剤および関与剤の同定のための試験系として使用することができる。例えば、暴露された動物において造血系列細胞の活性化の障害の症状のこのような改善を引き出すために十分な濃度でかつ時間の間、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善する能力を示すことが推測される化合物に動物モデルを暴露することができる。造血系列細胞の活性化の障害、例えば、炎症に関連する障害の逆転を評価することによって、暴露に対する動物の応答をモニターすることができる。関与に関して、造血系列細胞の活性化の障害様の症状のいずれかの面を逆転する治療は、ヒトの造血系列細胞の活性化の障害の治療的関与のための候補として考慮されるであろう。試験剤の投与量は、後述するように、投与量−応答曲線を誘導することによって決定することができる。
５．６  炎症性障害を包含する、Ｇタンパク質活性化ＰＩ３Ｋの刺激に関連する障害の治療
本発明は、また、造血系列細胞の活性化を変更し、そして炎症性障害を包含する、造血系列細胞の活性化の障害を治療する方法および組成物を包含する。例えば、ｐ１０１遺伝子の発現、および／またはｐ１０１調節サブユニットの遺伝子活性を減少し、および／またはｐ１０１調節サブユニットの経路をダウンレギュレートする（例えば、ｐ１０１調節サブユニットとｐ１２０触媒サブユニットとの相互作用を妨害するか、あるいは下流のシグナリング事象を一緒にすることによって）ことによって、トリマーのＧタンパク質とアソシエートしたレセプター、例えば、サイトカインを活性化する因子に対する白血球細胞の応答を減少し、そして慢性炎症性疾患を改善することができる。逆に、Ｇタンパク質とアソシエートしたレセプターの活性化に対する白血球細胞の応答はｐ１０１調節サブユニットの活性を増加することによって増強することができる。例えば、増強は感染に対する免疫系の応答を促進する働きをすることができる。種々のアプローチを後述する。
５．６．１  ｐ１０１アダプターの発現またはｐ１０１アダプターの活性を阻害してＧタンパク質活性化ＰＩ３Ｋの活性を減少しかつ炎症を減少すること
触媒サブユニットを中和するか、あるいはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子（転写または翻訳）の発現を阻害する任意の方法を使用して、炎症性応答を減少することができる。このようなアプローチを使用して炎症性応答の障害、例えば、慢性関節リウマチを包含する関節炎、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ぜん息および他の肺の症状、アレルギー、再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管の疾患、アルツハイマー病、および癌、およびその他の炎症性障害を治療することができる。
１つの態様において、例えば、ｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害または妨害するためのアンチセンスまたはリボザイムのアプローチ；ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の転写を阻害するための三重らせんのアプローチ；またはｐ１０１またはｐ１２０遺伝子またはその内因性プロモーターを不活性化または「ノックアウト」するためのターゲッテッド相同組換えを使用して、内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現レベルを減少するために、免疫治療を設計することができる。
アンチセンスのアプローチは、ｐ１０１またはｐ１２０調節サブユニットのｍＲＮＡに対して相補的であるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計を包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的ｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨害するであろう。絶対的相補性は、好ましいが、不必要である。ＲＮＡの一部分に対して「相補的な」配列は、本発明において好ましく、ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションして、安定な二本鎖を形成できるために十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖のアンチセンス核酸の場合において、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をこうして試験することができるか、あるいは三重らせんをアッセイすることができる。ハイブリダイゼーションする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの双方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイゼーションする核酸が長いほど、それが含有できるＲＮＡとより多い塩基がミスマッチし、そしてなお安定な二本鎖（場合に応じて、または三重らせん）を形成する。当業者は、ハイブリダイゼーションした複合体の融点を決定するための標準的手法の使用により、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよびそれを含む５’非翻訳配列、に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害において最も効率よく働くべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対して相補的な配列は、その上ｍＲＮＡの翻訳の阻害するとき有効であることが最近示された。一般的に、Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照のこと。こうして、第１図および第３図に示すｐ１０１またはｐ１２０の５’−または３’−非翻訳、非コーディング領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスのアプローチにおいてを使用して、内因性ｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができるであろう。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンを含むであろう。ｍＲＮＡコーディング領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは効率が低い翻訳インヒビターであるが、本発明に従い使用できるであろう。ｐ１０１調節サブユニットのｍＲＮＡの５’−、３’−またはコーディング領域のいずれにハイブリダイゼーションするように設計しても、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。特定の面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
ターゲット配列の選択を無視して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究をまず実施して、遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量することが好ましい。これらの研究はアンチセンス遺伝子の阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的作用との間を区別する対照を利用することが好ましい。また、これらの研究はターゲットＲＮＡまたはタンパク質のレベルを内部の対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られた結果を対照オリゴヌクレオチドを使用して得られた結果と比較することが考えられる。対照オリゴヌクレオチドは被験オリゴヌクレオチドと同一の長さであること、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ターゲット配列に対する特定のハイブリダイゼーションを防止するために必要である以上に、アンチセンス配列と異ならないことが好ましい。
オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体またはそれらの修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩主鎖において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、およびその他を改良することができる。オリゴヌクレオチドは他の添付されたグループ、例えば、ペプチド（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞リポーターをターゲッティングするために）または細胞膜を横切る輸送を促進する因子（例えば、下記の文献を参照のこと：Letsinger et al.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6533-6556;Lemaitre et al.、1987、Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652;PCT公開No.WO88/09810号、1988年12月15日発行）またはハイブリダイゼーション誘発切断因子（例えば、下記の文献を参照のこと：Krol et al.、1988、Bio/Techniques 6:958-976）または内位添加因子（例えば、下記の文献を参照のこと：Zon、1988、Pharm.Res.5:539-549）を含むことができる。この目的で、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋因子、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発切断因子、およびその他に結合することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾された塩基部分を含むことができ、このような部分は下記のものを包含するが、これらに限定されない群より選択される：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ハイポキサンチン、サンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメトキシウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュートウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを包含するが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含むことができる。
他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体から成る群より選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸塩主鎖を含む。
なお他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーのオリゴヌクレオチドである。α−アノマーのオリゴヌクレオチドは、通常β−単位と反対に、鎖が互いに対して平行に走行する、相補的ＲＮＡとの特定の二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautier et al.、1987、Nucl.Acids Res.15:6625-6641）。オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al.、1987、Nucl.Acids Res.15:6131-6148）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al.、1987、FEBS Lett.215:327-330）である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、この分野において知られている標準的方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Biosearch、Applied Biosystems、およびその他から商業的に入手可能である）を使用して合成することができる。例として、ホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドは、Stein et al.、1988、Nucl.Acids Res.16:3206の方法により合成できる。メチルホスホネートのオリゴヌクレオチドは、コントロールされた孔ガラスポリマーの支持体を使用して製造することができる（Sarin et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451）。
ｐ１０１またはｐ１２０コーディング領域の配列に対して相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用できるが、転写された非翻訳領域に対して相補的なものは最も好ましい。
アンチセンス分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｐ１０１調節サブユニットを発現する細胞、例えば、造血起源の細胞、例えば、血小板、および好中球および他の白血球に送達されるべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達する多数の方法が開発された；例えば、アンチセンス分子を組織または細胞誘導部位に直接的に注入できるか、あるいは所望の細胞をターゲットするように設計された、修飾されたアンチセンス分子（例えば、ペプチドに結合されたアンチセンス分子またはターゲット細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合する抗体）を全身的に投与することができる。
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成ことはしばしば困難である。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に配置されている、組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者におけるターゲット細胞をトランスフェクトするためにこのような構築物を使用すると、内因性ｐ１０１またはｐ１２０転写物と相補的塩基対を形成する十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が生じ、これによりｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡの翻訳を防止するであろう。例えば、ベクターが細胞により吸収され、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指令するように、ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏに導入することができる。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写されることができるかぎり、エピソームに止まるか、あるいは染色体的に統合されるようになることができる。このようなベクターはこの分野において標準的である組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現のために使用されるプラスミド、ウイルス、またはこの分野において知られている他のものであることができる。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において作用することがこの分野において知られている任意のプロモーターによることができる。このようなプロモーターは誘導可能であるか、あるいは構成的であることができる。このようなプロモーターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＳＶ４０の初期のプロモーター領域（BernoistおよびChambon、1981、Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端の反復の中に含有されているプロモーター（Yamamoto et al.、1980、Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼのプロモーター（Wagner et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al.、1982、Nature 296:39-42）およびその他。任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスのベクターを使用して、組織または細胞誘導部位、例えば、骨髄の中に直接的に導入できる組換えＤＮＡ構築物を製造することができる。また、所望の組織または細胞の型を選択的に感染するウイルスのベクター（例えば、造血系列細胞を感染するウイルス）を使用することができ、この場合において、投与は他の経路（例えば、全身的）により達成することができる。
また、ｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子をを使用して、ｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡの翻訳およびｐ１０１調節サブユニットの発現を防止することができる。（例えば、下記の文献を参照のこと：ＰＣＴ国際特許ＷＯ９０／１１３６４号、１９９０年１０月４日発行；Sarver et al.、1990、Science 247:1222-1225）。ｍＲＮＡを部位特異的配列において切断するリボザイムを使用してｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用は好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、ターゲットｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域により支配される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、ターゲットｍＲＮＡが下記の２塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生はこの分野においてよく知られており、そしてHaseloffおよびGerlach、1988、Nature 334:585-591にいっそう完全に記載されている。ヒトｐ１０１またはｐ１２０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列内に数百の潜在的ハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する（第３図）。好ましくは、切断認識部位がｐ１０１またはｐ１２０ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増加しかつ非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小とするように、リボザイムを操作する。
本発明のリボザイムは、また、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ（以後、「Cech型リボザイム」）、例えば、テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena Thermophila）（ＩＶＳ、またはＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）の中に天然に存在しかつThomas Cechおよび共同者により広範に記載されたものを包含する（Zaug et al.、1984、Science 224:574-578;ZaugおよびCech、1986、Science 231:470-475;Zaug et al.、1986、Nature 324:429-433;公開国際特許出願No.WO88/04300号、University Patents Inc.;BeenおよびCech、1986、Cell 47:207-216）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは８塩基対活性部位を有し、ターゲットＲＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、次いでターゲットＲＮＡの切断が起こる。本発明は、ｐ１０１またはｐ１２０の中に存在する８塩基対の活性部位の配列をターゲットするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
アンチセンスのアプローチにおけるように、リボザイムは修飾されたオリゴヌクレオチドから構成することができ（例えば、安定性、ターゲッティング、およびその他を改良するために）そしてｐ１０１調節サブユニットをｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞、例えば、好中球に送達されるべきである。好ましい送達法は、トランスフェクトされた細胞が内因性ｐ１０１またはｐ１２０メッセージを破壊しかつ翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを産生するように、強い構成的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下にリボザイム「をコードする」ＤＮＡ構築物の使用を包含する。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒的であるので、より低い細胞内濃度が効率のために要求される。
また、ターゲッテッド相同組換えを使用して、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって、内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現を減少することができる。（例えば、下記の文献を参照のこと：Smithies et al.、1985、Nature 317:230-234;Thomas & Capecchi、1987、Cell 51:503-512;Thompson et al.、1989、Cell 5:313-321:それらの各々はその全体において引用することによって本明細書の一部とされる）。例えば、内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子（ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子のコーディング領域または調節領域）に対して相同のＤＮＡによりフランクされた、突然変異の、非機能的ｐ１０１調節サブユニット（または完全に無関係のＤＮＡ配列）を、選択可能なマーカーおよび／または消極的な選択可能なマーカーの存在または非存在下に、使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでｐ１０１調節サブユニットを発現する細胞をトランスフェクトすることができる。ターゲッテッド相同組換えによりＤＮＡ構築物を挿入すると、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子は不活性化される。このようなアプローチは農学の分野において特に適し、ここでＥＳ（胚幹）細胞に対する修飾を使用して、不活性なｐ１０１調節サブユニットを有する動物の子孫を発生させることができる（例えば、Thomas & Capecchi、1987およびThompson、1989、上掲、を参照のこと）。しかしながら、組換えＤＮＡ構築物が適当なウイルスのベクターを使用してｉｎ  ｖｉｖｏの要求される部位に直接的に投与またはターゲットされるかぎり、このアプローチはヒトにおける使用に適合させることができる。
また、ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の調節領域（すなわち、ｐ１０１またはｐ１２０のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲットして、体の中のターゲット細胞中のｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の転写を妨害する三重らせんの構造物を形成することによって、内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現を減少することができる。（一般に、下記の文献を参照のこと：Helene、C.1991、Antcancer Drug Des.、6（6）:569-84;Helene、C.et al.、1992、Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36;およびMaher、L.J.、1992、Bioassays 14（12）:807-15）。
本発明のなお他の態様において、ＰＩ３ＫのトリマーのＧタンパク質の活性化を妨害する「優性消極的」アプローチを使用して、ｐ１０１調節サブユニットの活性を減少することができる。この目的で、欠陥のあるｐ１０１調節サブユニットをコードする構築物を遺伝子治療のアプローチにおいて使用して、適当なターゲット細胞におけるｐ１０１調節サブユニットの活性を減少できる。例えば、Ｇβγ相互作用ドメインが欠失されているか、あるいは突然変異しているｐ１０１調節サブユニットの宿主細胞の発現を指令するヌクレオチド配列を、造血細胞の中に導入することができる（前述のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療法）。また、ｐ１０１の機能ドメインのみをコードするヌクレオチド配列を自然ｐ１０１／ｐ１２０の相互作用のインヒビターとして使用できるであろう。また、ターゲッテッド相同組換えを利用して、このような欠失または突然変異を被検者の骨髄中の内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の中に導入することができる。操作された細胞は非機能的リポーターを発現するであろう（すなわち、触媒サブユニットに結合できるが、Ｇタンパク質の活性化に応答して触媒活性を刺激することができない調節サブユニット）。このような操作された細胞、すなわち、好中球または他の白血球系列は、細胞外ケモカインに対するＧタンパク質結合レセプターの活性化に対して減少した応答を示し、炎症性表現型を減少させる。
５．６．２  ｐ１０１調節サブユニットの発現または免疫系の活性化を促進するための活性の回復または増加
正常のｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現レベルおよび／またはｐ１０１調節サブユニットの遺伝子産物の活性の増加に関して、ケモカインに対する免疫系の応答の減少を包含する、造血系列細胞の活性化の障害の治療のために、ｐ１０１またはｐ１２０の核酸配列を利用することができる。免疫系の機能障害の原因は欠陥のあるｐ１０１調節サブユニットであるが、治療を、例えば、遺伝子置換治療の形態で行うことができる。詳しくは、正常の機能を示すｐ１０１遺伝子産物の産生を指令する正常のｐ１０１遺伝子の１またはそれより多いコピーまたはｐ１０１遺伝子の一部分を、ベクターを使用して、ＤＮＡを細胞の中に導入する他の粒子、例えば、リポソームに加えて、患者または動物の被検体内の適当な細胞の中に挿入することができ、ここでベクターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスのベクター。
ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子は、好中球および他の白血球を包含する、造血系列細胞において発現されるので、このような遺伝子置換の治療技術はｐ１０１またはｐ１２０遺伝子配列を患者内のこれらの細胞の型に送達することができるべきである。また、ターゲッテッド相同組換えを利用して、適当な細胞の型、例えば、骨髄細胞および／または他の白血球における欠陥のある内因性ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子を補正することができる。動物において、ターゲッテッド相同組換えを使用してＥＳ細胞における欠陥を補正して、補正された特性を有する子孫を発生させることができる。
最後に、例えば、ｐ１０１調節サブユニットのカスケード中の下流のシグナリングタンパク質を活性化し、これにより欠陥のあるｐ１０１調節サブユニットをバイパスすることによって、活性化されたｐ１０１調節サブユニットにより伝達されるシグナルを刺激し、増強し、あるいは変更する、前述のアッセイにおいて同定された化合物を使用して免疫系の刺激を達成することができる。処方物および投与のモードは化合物の物理化学的性質に依存するであろう。
５．７  製剤および投与法
ｐ１０１またはｐ１２０遺伝子の発現またはｐ１０１調節サブユニットの活性、あるいはｐ１０１と触媒サブユニットを包含するが、これらに限定されないその結合相手との相互作用に影響を与える化合物を、炎症性応答の障害、例えば、慢性関節リウマチを包含する関節炎、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ぜん息および他の肺の症状、アレルギー、再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管の疾患、アルツハイマー病、および癌を包含する、造血細胞の活性化の障害を治療または改善するために治療的に有効な投与量で患者に投与することができる。治療的に有効な投与量は、造血系列細胞の活性化の障害の症状を改善するために十分な化合物の量を意味する。
５．７．１  有効投与量
例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的薬理学的手法により、このようなの毒性および治療的効能を決定することができる。毒性と治療的有効性との間の投与量の比は治療的指数であり、そしてＬＤ50／ＥＣ50の比として表すことができる。大きい治療的指数を示す化合物は好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用できるが、このような化合物を影響を受けた組織の部位にターゲットして、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小にし、これにより副作用を減少する送達系を設計するように注意すべきである。
同時培養のアッセイおよび動物の研究から得られたデータを使用して、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を定めることができる。このような化合物の投与量は、毒性がわずかであるか、あるいはまったくないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内に存在することが好ましい。投与量は、使用する投与形態および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変化させることができる。本発明の方法において使用する任意の化合物について、最初に細胞培養アッセイから治療的に有効な投与量を推定することができる。細胞培養において決定されたＩＣ50（すなわち、症状の最大抑制の１／２を達成する被験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて、投与量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な投与量をいっそう正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定できる。
５．７．２  処方物および使用
本発明による医薬組成物は、１またはそれより多い生理学上許容される担体または賦形剤を使用して慣用法において処方することができる。
こうして、化合物およびそれらの生理学上許容される塩および溶媒を、吸入または注入（口または鼻を通して）または経口、経頬、非経口または直腸の投与による投与のために処方することができる。
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの形態を取ることができ、これらは慣用手段により薬学上許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えば、前ゲル化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム澱粉）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を使用して製造される。錠剤はこの分野においてよく知られている方法により被覆することができる。経口投与のための液状調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取ることができるか、あるいは使用前に水または他の適当なベヒクルで構成するための乾燥生成物として提供することができる。このような液状調製物は、慣用手段により、薬学上許容される添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用脂肪の水素化物）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシアゴム）；非水性ベヒクル（例えば、アーモンド油、油エステル、エチルアルコールまたは植物油画分）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を使用して製造できる。また、調製物は、必要に応じて、緩衝化塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有することができる。
経口投与のための調製物は、活性化合物のコントロールされた放出を与えるように、適当な処方することができる。
経頬投与のために、組成物は慣用法で処方された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。
吸入による投与のために、本発明による化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレーの提供の形態で、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、好都合に送出される。加圧されたエーロゾルの場合において、投与単位は計量した量を送出すように弁を準備することによって決定ことができる。吸入器または注入器において使用するための、化合物の粉末状混合物および適当な粉末状基剤、例えば、ラクトースまたは澱粉を含有する、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物は、単位投与形態、例えば、保存剤を添加した、アンプルまたは多投与容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ベヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取ることができ、そして処方剤、例えば、懸濁剤、可溶化剤および／または分散剤を含有することができる。また、活性成分は、使用前に、適当なベヒクル、例えば、無菌の無発熱物質の水で構成するための粉末の形態であることができる。
化合物は、また、直腸組成物、例えば、坐剤または保持浣腸剤、例えば、慣用の坐剤基剤、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドを含有する組成物で処方することができる。
前述の処方物に加えて、化合物は、また、デポー製剤として処方することができる。このような長く作用する処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内に）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適当なポリマーまたは疎水性物質（例えば、許容される油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂を使用して、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として処方することができる。
組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１または２以上の単位投与形態を含有するできるパックまたはディスペンサーで提供することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックの箔を含み、例えば、ブリスターパックであることができる。パックまたはディスペンサーの装置は、投与のための説明書を有することができる。
下記の実施例は本発明を例示し、そして本発明の構成しかつ使用するとき当業者を補助するために提供される。実施例は、いかなる方法おいても本発明の範囲を限定することを意図しない。
６．実施例：ブタＧβγ活性化ＰＩ３Ｋ活性の精製および特性決定
６．１  材料および方法
６．１．１  ＰＩ３Ｋのアッセイ
Ｓｆ９誘導またはブタの好中球の細胞質ゾル誘導ＰＩ３Ｋの精製されたアリコートを、氷冷０．１２ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１％のベタイン、０．０２％ｗ／ｖのツイーン２０、ｐＨ７．４、０℃中で適当な程度に希釈し、次いで５μｌのアリコートをアッセイまで氷上で貯蔵した。ＰＩ３ＫアッセイをＵ９３７細胞からの免疫沈降物（下記の実施例を参照のこと）について実施した場合、ＰＩ３Ｋを１０μｌの上記において定義した氷冷緩衝液中のパックしたプロテインＧセファローズビーズ上に固定化した。Ｇβγおよび／またはＧα（ＧＤＰ結合または活性化）を含むか、または含まない３０μｌのリン脂質の混合物を５μｌの画分、または１０μｌのビーズに添加し、混合した。氷上で１０分後、５〜１０μｌの最後の洗浄緩衝液を、３．５ｍＭの程度のアッセイ体積においてＭｇＣｌ2で最終濃度に補充し、添加し、混合した。６分後、５μｌの［32γＰ］−ＡＴＰ（典型的には１０μＣｉ／アッセイ、Amersham、PB10168）および３．５ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する最後の洗浄緩衝液を添加し（５０μｌの最終アッセイ体積に）管を混合し、３０℃の水浴に移した。アッセイを１５分後５００μｌのクロロホルム：メタノール：Ｈ2Ｏ（２９：５４：１３．１、ｖ／ｖ／ｖ）でクエンチした。１μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１０３μｌの２．４ＨＣｌおよび４３４μｌのクロロホルムを引き続く添加して、２相の「フロチ（Ｆｌｏｃｈ）」溶媒分布を発生させた。混合および遠心後、下相を取り出し、４２４μｌの新鮮な「上相」（メタノール：１ＭのＨＣｌ：クロロホルム；４８：４７：３、ｖ／ｖ／ｖ）を含有する清浄な管に移した。混合および遠心後、下相を新鮮な管取り出し（ブタ好中球ＰＩ３Ｋの精製の間、［32Ｐ］−脂質産物をこの時点においてガイガーカウンターで定量した）、真空下に乾燥し、脱アシル化し、ＰＥＩ（０．６ＭのＨＣｌを含む；PtdIns（3,4,5）P3は0.47のRfを有する）（Stephens et al．、1994、Cell 77:83-93）上のＴＬＣにより分割した。ある実験において、乾燥した脂質をクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中に再溶解し、カリウムオキシレート含浸ＴＬＣプレートに適用し、クロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：Ｈ2Ｏ（４０：１５：１３：１２：８、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；Ｔｒａｙｎｏｒ−Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８）の混合物中に分割した。
脂質／Ｇタンパク質のサブユニットの混合物を下記のようにして調製した：ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2（これはフロチ（Ｆｌｏｃｈ）ホスホイノシチド画分から２サイクルの固定化ネオマイシンのクロマトグラフィーにより製造した）およびＰｔｄＥｔｎ（Ｓｉｇｍａ）を真空下に乾燥した（それぞれ、５０μＭおよび０．５ｍＭの最終濃度を与えるために十分な）。ある実験において、ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2と同様に製造した）および／またはＰｔｄＩｎｓ（Ｓｉｇｍａ）を含めた。乾燥した脂質を浴−超音波処理して（室温において）０．１％のナトリウムコレートを補充した最終洗浄緩衝液（上記）の中に入れた。氷上で冷却後、この分散した脂質貯蔵液の一部分を合計１μｌ／アッセイのＧβγ貯蔵緩衝液（１％のコレート；５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、４℃、０．１ＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＤＴＴ；０．５ｍＭのＥＤＴＡ）、活性Ｇβγ、または等しい体積の貯蔵緩衝液中の３〜７ｍｇ／ｍｌから沸騰したＧβγの混合物と混合した。ある実験において、１μｌはＧαサブユニットまたはそれらの貯蔵緩衝液を含み、この場合においてＧβγをＧαサブユニット（ＧＤＰ結合または活参性化；下を参照）と氷上で１０分間プレミックスした。
Ｇαサブユニット（Ｇα：ｏ、ｉ、ｉ2およびｉ3の等モル混合物；前述したように製造し、そして１０μＭのＧＤＰを補充したＧβγサブユニットと同一の緩衝液中で貯蔵した）を氷上で１０ｍＭのＮａＦ、３０μＭのＡｌＣｌ3（Ａ／Ｆ）と１０分間インキュベートすることによって活性化した；これらのサブユニットを希釈したアッセイはＡ／Ｆをまた含有した。
ａ）タンパク質の精製
ブタの血液（４２バッチ）を２１の容器中で抗凝固剤の中に直接集めた。収集の４０分以内に、血液／抗凝固剤を等張生理食塩水中の３％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、３６０ｋＤ）と混合した（４．２の血液混合物：０．８のＰＶＰ）。３５分の放置（２５の容器中で）後、赤血球は適切に沈降してサイホンによる上清の取り出しを可能とし、１リットルの容器中で遠心（８分、１０００×ｇ）。ほぼ２８リットルのこの一次上清が回収された。最終の蓄積した体積が２リットルの遠心ボトルの中に含有されるように、沈降した細胞をハンク生理食塩水の中に再懸濁させた。細胞を遠心（８分、１０００×ｇ）により沈降させた。上清を吸引し、細胞ペレットを７０ｍｌの氷冷Ｈ2Ｏの添加により低張的ショックさせた（赤血球を含有する残留物を溶解するために）。２５〜３０秒間混合した後、７７ｍｌの１０×ハンク生理食塩水（カルシウムを含まない）を添加した。ハンク生理食塩水で１回洗浄した後、細胞を１つの遠心管の中に一緒にし、沈降させ、５００ｍｌの氷冷した４０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５、４℃；０．１２ＭのＮａＣｌ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2の中に再懸濁させた。ジイソプロピルフルオロリン酸塩を添加し（最終濃度０．５ｍＭ）、氷上で５分後、細胞を沈降させ（ほぼ８０〜９０ｍｌのパックした体積）そして３００ｍｌの氷冷した４０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５；０．１ＭのＮａＣｌ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2；１ｍＭのＥＧＴＡ；０．２ｍＭのＥＤＴＡおよびアンチプロテアーゼＩの中に再懸濁させた。細胞懸濁液を超音波処理し（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｂｅソニケーター、設定９．２５、４×１５秒、１分の混合、氷上、各バースト１の間）次いで遠心して（２０００×ｇ、１０分）非破壊細胞および核（無傷で残留する細胞の５％より少ない）を沈降させた。上清を遠心（１００，０００×ｇ、６０分、４℃）そして上清をデカントし、プールし、ＥＤＴＡ、ベタインおよびＤＴＴ（それぞれ、５ｍＭ、１％および１ｍＭの最終濃度）と混合し、最後に液体窒素中で凍結させ、−８０℃において貯蔵した。この方法において調製した細胞質ゾルの画分は典型的には８〜９ｍｇ／ｌのタンパク質濃度（約２．５ｇのタンパク質／調製）を有した。いったん７５０リットルの血液（１８〜４２調製、９×１０12細胞、４０ｇのタンパク質）からの細胞質ゾルが集められ、−８０℃において貯蔵したとき、それらを５時間の間隔で分離した３つのバッチで融解した。この時点以後において、すべての手順を２〜４℃において実施した。
新しく融解した細胞質ゾルをツイーン−２０（０．０５％、ｗ／ｖ、最終濃度）で補充し、遠心し（２０，０００×ｇ、３０分間、２℃）濾過し（５μｍの硝酸セルロース、４．５ｃｍの直径；Ｗｈａｔｍａｎ）ほぼ２．５×に緩衝液（下を参照）で２００μＳの最終導電度（４℃）に希釈し、次いで緩衝液Ｋと平衡化したファーストフローＱセファロースの８００ｍｌ（５ｃｍの直径）のカラム上に負荷した（１２．５ｍｌ／分、蠕動ポンプ）。希釈した細胞質ゾルの合計の体積はほぼ１５．５リットルであった。いったん負荷すると、カラムを１リットルの緩衝液Ｋで洗浄し、次いで４．５リットルの直線の勾配の緩衝液Ｋ中の０．１〜０．６ＭのＮａＣｌで８ｍｌ／分において溶離した。５０の１ｍｌの画分が集められた。細胞溶出液の導電度および吸収（２８０ｎｍにおける）を連続的に（およびすべての引き続く工程において）モニターした。緩衝液Ｋは下記の組成を有した：４０ｍＭのＴＲＩＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のベタイン；０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、５ｍＭのβ−グリセロホスフェートｐＨ７．５、４℃、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび４μｇ／ｍｌの各アンチペイン、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチンＡおよびアプロチニンおよび０．１ｍＭのＰＭＳＦ（「アンチプロテアーゼＩＩ」）。この溶液、ならびに下記の溶液を０．２μｍで濾過した。
いったん関係する画分がＰＩ３Ｋアッセイにより同定されると、それらをプールし、直ちにセファデックス−Ｇ２５−微細のカラム（５ｃｍの直径）［１８リットル緩衝液Ｌ（最後の２リットルのみはアンチプロテアーゼＩＩを含む）と前平衡化した］負荷（１０ｍｌ／分）した（緩衝液Ｌは下記の成分を含有した：５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、２０ｍＭのＫＣｌ、０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、１％のベタイン、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．０、４℃、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール＋アンチプロテアーゼＩＩ）。１リットルの緩衝液Ｍ（５ｍＭのβ−グリセロホスフェート；１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、４℃、０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、１％のベタイン、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）と１０ｍｌ／分の流速で平衡化し、次いで試料の負荷直前に１００ｍｌの緩衝液Ｎ（０．１ｍＭのＥＤＴＡおよびアンチプロテアーゼＩから構成された）と平衡化した８０ｍｌのヒドロキシルアパタイト（２．６ｃｍの直径；Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ−セラミック、ＢｉｏＲａｄ）上に、Ｑセファロースからの脱塩プールを直ちに負荷した。負荷後、カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｎで洗浄し、１００ｍｌの緩衝液Ｎ中の０．０５〜０．３５Ｍのリン酸カリウムの直線の勾配で溶離した。２５ｍｌの画分を集め、Ｇβγ刺激ＰＩ３Ｋ活性についてアッセイした。
関係する画分をプールし（典型的には合計１００ｍｌ）、緩衝液Ｏで３×に希釈し（２５０μＳの導電度に、４℃）、そしてヘパリン・セファロースＨＲ［１．６ｃｍの直径；１５０ｍｌの緩衝液Ｏ（下を参照、２ｍｌ／分）で前平衡化した］上に負荷した（１．１ｍｌ／分）。負荷後、カラムを緩衝液Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄し、１４０ｍｌの緩衝液Ｏ中の０．１〜０．７ＭのＫＣｌの直線の勾配で溶離し（流速１ｍｌ／分）、溶出液を５ｍｌの画分で集めた。緩衝液Ｏは次の通りであった：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖ／ツイーン−２０、１．０％のベタイン、１ｍＭのβ−グリセロホスフェートｐＨ７．２、４℃、１５ＭＭのβ−メルカプトエタノール＋アンチプロテアーゼＩＩ。
Ｇβγ刺激ＰＩ３Ｋ活性は、ヘパリン・セファロースＨＲから２つのピーク（ピークＡおよびＢと表示する）で溶離された。ＡおよびＢの双方を、カラムの同一の組合わせを順次に使用してさらに精製した。ピークＡは１５ｍｌ（０．４ＭのＫＣｌ）であり、緩衝液Ｐ（下を参照）中で（２００μＳ、４℃の最終導電度に）８×に希釈し、ピークＢは１５ｍｌ（０．６ＭのＫＣｌ）であり、緩衝液Ｐ中で（２００μＳ、４℃の最終導電度に）１０×に希釈した。希釈直後に、２０ｍｌの緩衝液Ｐと前平衡化したモノＱ５／５ＨＲカラム上に１ｍｌ／分で負荷した。負荷後、カラムを５ｍｌの緩衝液Ｐで洗浄した。溶出液を０．５ｍｌの画分で集めた。緩衝液Ｐは下記の成分を含有した：１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖ／ツイーン−２０、１．０％のベタイン、１ｍＭのβ−グリセロホスフェートｐＨ７．１、４℃、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール＋アンチプロテアーゼＩＩ。
モノＱ（Ａ）および（Ｂ）からの関係する画分を独立にプールし（双方は３ｍｌの合計の体積を有した）限外濾過ユニット（緩衝液Ｐで前洗浄した５０ｋＤのカットオフ）で０．８ｍｌに濃縮し、遠心し（１０，０００×ｇ、１０分間、０℃）そして緩衝液Ｑ（下を参照；アンチプロテアーゼＩＩを含まない２リットル、次いでアンチプロテアーゼＩＩを含む１５０ｍｌ）で前平衡化した高性能サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｖ７２ｍｌ、Ｖ1１７２ｍｌ）上に直接的に負荷し（０．２５ｍｌ／分）、Ｖ直前に１．５ｍｌの画分が集められた。緩衝液Ｑは下記の成分を含有した：０．１７ＭのＫＣｌ、１％のベタイン、０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのリン酸カリウム、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．９、４℃、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール。
ＡおよびＢからの関係する画分を独立にプールし（双方は６ｍｌの合計の体積を有した）緩衝液Ｒで２４ｍｌに希釈し（最終導電度２５０μＳ、４℃）そしてアクリルをベースとするカチオン交換ＨＰＬＣカラム（２．５ｍｌの体積、ＢｉｏＲａｄ）上に負荷し（０．８ｍｌ／分）、２５ｍｌの緩衝液Ｒ中のＫＣｌの直線の勾配（０．１〜０．６Ｍ）で溶離した。緩衝液Ｒは下記の成分を含有した：１％のベタイン、０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、４℃、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール＋アンチプロテアーゼＩＩ。
関係する画分をプールし（（Ａ）について３ｍｌ、（Ｂ）について２ｍｌ）、緩衝液Ｓで７×に希釈し（最終導電度１８０μＳ、４℃）そしてミニＱカラム（０．２４ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＳｍａｒｔTMシステムで操作される）上に負荷した（０．１５ｍｌ／分）。カラムを１ｍｌの緩衝液Ｓで洗浄し、緩衝液Ｓ中のＮａＣｌの直線の勾配（０．１〜０．５ＭのＮａＣｌ）で０．１ｍｌ／分において溶離した。溶出液を７５μｌの画分で集めた。緩衝液Ｓは下記の成分を含有した：１％のベタイン、０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．７、４℃、１ｍＭのＤＴＴ（アンチプロテアーゼを含有しない）。
精製を通じたタンパク質濃度を４つの方法で推定した：（ａ）タンパク質に結合する色素を使用する（ＢｉｏＲａｄ；これはライゼイト、細胞質ゾルおよびＱセファロースの画分についてのみ使用した）；（ｂ）吸収２８０ｎｍのピーク面積の積分（これは色素結合アッセイを使用して目盛定めした）；（ｃ）フィルター上のタンパク質をポンセウ（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓで染色し、同様に固定化した標準の定められたアリコートの染色強度と比較した）；および（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、クーマッシーＲ２５０で染色したタンパク質を、同一ゲル上の既知濃度のタンパク質のアリコートと比較した。
ＰＩ３Ｋの最終調製物（または第１段階の精製された物質）を、１００ｎＭの［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニン（１７．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、特注）とインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、クーマッシーブルーで染色し、そして写真撮影した。次いで［3Ｈ］をフルオログラフィーにより検出した。
６．２  結果
ブタ好中球のイオン交換クロマトグラフィーによる分析は、それがＵ９３７細胞および骨肉腫細胞について既に記載された性質に類似するＧβγ活性化ＰＩ３Ｋ活性を含有することを示した。プローブとして［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンを使用すると、見掛けの大きさ１１７ｋＤおよび１２０ｋＤのタンパク質のダブレットが同定され、前記タンパク質はＧβγ活性化ＰＩ３Ｋ活性を含有する画分の中に溶離され、そして、さらに、それらはｐ１１０αおよび／またはｐ１１０βが結合した［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンのレベルの２〜４％であった（第５図参照）。Ｇβγ活性化ＰＩ３Ｋ活性のこのピークをさらに精製した（すべての図面および表は究極的に配列決定されたＰＩ３Ｋの調製物の精製を詳細に示す）。この手順の間に、それは２つのピーク（ＡおよびＢ）に分割し、これらの双方は２２０ｋＤの明らかな、自然の、相対的分子量を表示した。クーマッシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより評価して、いったん本質的に純粋なであると、双方活性は２つのタンパク質とともに共移動した：（Ａ）１１７ｋＤ（これは特異的に［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンに結合し、したがって触媒サブユニットであると仮定された）および１０１ｋＤのタンパク質；および（Ｂ）１２０ｋＤ（これも［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンに結合した）および１０１ｋＤのタンパク質。この結果が示すように、ＰＩ３Ｋ活性はそれらの自然状態のｐ１１７／ｐ１０１およびｐ１２０／ｐ１０１ヘテロダイマーであった。それらの最終形態ＰＩ３ＫＡおよびＢにおいて、活性の５．５％の全体の回収率で好中球ライゼイト（血液から１，０００，０００，０００×）からほぼ１８０，０００×および３８０，０００×が精製された。各工程を通したタンパク質およびＰＩ３Ｋ活性の回収を表１に記載する。
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これらの濃縮度は、ｐ８５／ｐ１１０ファミリーのメンバーと比較した、これらのタンパク質により結合された［3Ｈ］−１７−ヒドロキシ−ワートマンニンの物質と一致した。したがって、これらのタンパク質のすべては低い存在量であると考慮される。
ＰＩ３ＫＡおよびＢの精製された調製物は、それらの脂質キナーゼ活性に基づいて区別されなかった。双方の調製物は、（ａ）Ｇα−ＧＤＰ感受性の方法で、Ｇβγサブユニットにより１００×以上活性化された、（ｂ）１００ｎＭのワートマンニンにより完全に阻害された（アッセイにおいて５μＭのＡＴＰを使用した）、（ｃ）Ｇβγの存在または非存在において、ｐ８５／ｐ１１０ファミリーのＰＩ３Ｋを５倍活性化するチロシンリン酸化ペプチドに対して不感受性であった（第６図参照）、そして（ｄ）ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2を３−リン酸化することができた（産物の同一性は、順次の脱アシル化および脱グリセル化、引き続く内部の［3Ｈ］標識化標準を使用する［32Ｐ］標識化水溶性産物のアニオン交換ＨＰＬＣ分析により確立された）。さらに、ＰＩ３ＫＡおよびＢの精製された調製物は、リン酸塩ドナーとしてＡＴＰのγ−リン酸塩を使用して、後者の下を参照）について最低の見掛けのＫｍを示した（それぞれ、ＡおよびＢについて８および１０μＭ）（結果は示されていない）。
７．実施例：ブタＧβγ活性化ＰＩ３ＫＡおよびＢのペプチドの配列決定
この実施例において、双方のブタＰＩ３Ｋタンパク質をアミノ酸の配列決定により分析した。４０ｇの細胞質ゾルタンパク質から精製されたＰＩ３ＫＡおよびＢをニトロセルロース上にウェスタンブロットし、ポンセウ（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓで染色し、すべての４つのサブユニットに相当するバンドを切除し、トリプシンで処理し、そして内部のアミノ酸配列の分析のためにプロセシングした。
７．１  材料および方法
ペプチドの発生およびペプチドの配列決定。配列決定のためのタンパク質のアリコートをニトロセルロース（０．４５μｍの孔大きさＢＡ８５；Schleicher and Schuell）上にウェスタンブロットした（湿ったブロッター）。転移緩衝液は１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＴＲＩＳおよび１０％ｖ／ｖのメタノールを含有した。アセンブリングの前に、ゲル／フィルターのサンドイッチの（−）側上の最終転移ユニットワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ．１濾紙、およびゲル（１ｍｍの厚さ）を、０．０００５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含有する転移緩衝液中でソーキングした。転移は固定された３５Ｖにおいて１６時間であった（０．２５〜０．３５アンペア、５℃）。フィルターを１％の酢酸中の０．１％のポンセウＳで１分間染色し、次いで１％の酢酸中で１分間脱染した。ゲル上に負荷されたタンパク質のほぼ８５〜９０％がフィルターで回収された。問題のバンドをニトロセルロースから切除し、そして記載されているように（Tempst et al.、1990、Electrophoresis 11:537-552）、変更を加えて（Lui et al.、1996）内部のアミノ酸配列分析のためにプロセシングした。簡単に述べると、２５μｌの１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（１％のZwittergent 3-16を補充した）中の０．５μｇのトリプシン（Promega、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質分解切断を３７℃において２時間実施した。生ずるペプチドを、それぞれ、０．１％のβ−メルカプトエタノール（ＢｉｏＲａｄ、リッチモンド、カリフォルニア州）および０．３％の４−ビニルピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ミルウォーキー、ウイスコンシン州）で還元しかつＳ−アルキル化し、そして逆相ＨＰＬＣで分画した。酵素のブランクをニトロセルロースの等しい大きさのストリップ上で実施した。
ＨＰＬＣの溶媒およびシステムの立体配置は記載された通りであった（Elicone et al.、1994）が、ただし２．１ｍｍの２１４ＴＰ５４Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Separation Group、ヘスペリア、カリフォルニア州）カラムを１００μｌ／分の流速において勾配溶離で使用した。Ｔｒｐを含有するペプチドの同定を２９７および２７７ｎｍにおける吸収のマニュアル比の分析により実施し、アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）（フォスター・シティー、カリフォルニア州）１０００Ｓ型ジオダレイ（diodarray）検出器（Erdjument-Bromage et al.、1994）を使用して実時間でモニターした。画分を手により集め、実験の間、氷上に保持し、次いで分析の前に−７０℃において貯蔵した。
自動化エドマン分解法およびマトリック補助レーザー脱着イオン化時間のフライト（matric-assited laser-desorption ionization time-of-flight）（MALDI-TOF）質量分析の組合わせにより、精製されたペプチドを分析した；質量促進ポスト化学的配列決定ルーチン（mass-aided post-chemical sequencing routines）を包含する、この組合わせたアプローチについての詳細な説明はどこかで見出すことができる（Geromanos et al.、1994、Techniques in Protein Chemistry V 143-150;Elicone et al.、1994、J.Chromatogr.676:121-137;Erdjument-Bromage et al.、1994、Protein Sci.3:2435-2446）。貯蔵後、カラムの画分に純粋なＴＰＡを補充した（最終濃度を１０％とする）後、配列決定装置のディスクおよび質量分析装置のターゲット上に負荷した。ボイエイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）ＲＰ型ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ計装（Ｖｅｓｔｅｃ／ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、フラミンガム、マサチュセッツ州）により直線のモードで、３３７ｎｍのアウトプット窒素レーザー、１．３ｍのフライト管およびα−シアノー４−ヒドロキシシンナム酸（前もって調製した溶液、Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｃｉ．、レノ、ネバダ州）をマトリックスとして使用して、質量分析（２％のアリコートについて）を実施した。３０ｋＶのイオン加速電圧（７０％におけるグリッド電圧、０．１％におけるガイドワイヤ電圧）および−２．０ｋＶの倍率器の電圧を使用した。ＴＤＳ５２０テクトロニクス（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）（バベルトン、オレゴン州）ディジタル化オッシロスコープを使用して、特定の最大値の最適な偏向から判定して、レーザーの影響および捕捉数を調節した。ＧＲＡＭＳ（Ｇａｌａｃｉｃ  Ｉｎｄ．、サレム、ニューハンプシャイヤー州）データ分析ソフトウェアを使用してタイム・オブ・フライトのファイルから、Ｍｚ（質量／電荷）スペクトルを発生させた。すべての試料を２回分析し、記載されているように（Geromanos et al.、1994）２つのカリブラント（calibrants）（２５フェムトモルのＡＰＩＤおよびＰ８９３０の各々）の存在および非存在において、すべての試料を２回分析した。アプライド・バイオシステムス（ＡＢ）からの４７７Ａ計装を使用して、化学的配列決定（試料の９５％について）実施した。ＰＴＨＣ１８（２／１×２２０ｍｍ；５ミクロンの粒度）カラム（ＡＢ）を装備した「オンライン」１２０ＡＨＰＬＣシステム（ＡＢ）を使用して、段階的に遊離したＰＴＨ−アミノ酸を同定した。記載されているように（Erdjument-Bromage et al.、1994、Protein Sci.30:2435-2446:Tempst et al.、1994、Methods Companion Meth.Enzymol.6:284-261）、酸計装および手順をフェムトモルのレベルのフェニルチヒダントインアミノ酸分析について最適化した。
ＰｒｏＣｏｍｐバージョン１．２ソフトウェア（入手先：P.C.Andrews博士、University of Michigan、アン・アーバー、ミシガン州）を使用して、同定された残基（推定されたものを包含する）からペプチドの平均アイソトープ質量を合計した。
バブラハム研究所（Babraham Institute）における微量化学設備により、ＰＤＧＦβＲ中のチロシン７４０および７５１を取り囲む配列をベースとする二重のチロシンリン酸化ペプチド（１８残基）を調製した。
７．２  結果
ペプチドの配列のデータは、これらのタンパク質の間の関係に関するいくつかの問題を直ちに解決した。ＰＩ３ＫＡおよびＢの双方から誘導されたｐ１０１が同定され、さらに、セリンがグリシンで置換されるような比較的普通のアレレ−変異型がＯＲＦ中の４８３において同定された（第４図においてマークされている）。ｐ１１７およびｐ１２０は事実上同一のトリプシンのＨＰＬＣプロフィル表示し、そしてｐ１１７からのアミノ末端のブロックされたペプチドを除外した、双方の種から配列決定されたすべての明らかに普通のペプチドが同定された（下を参照）。次いでペプチドの配列の情報を使用して、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を取出すための設計した。
８．実施例：ブタｐ１２０およびｐ１０１をコードするｃＤＮＡのクローニング
ブタｐ１２０からのペプチドおよびブタｐ１０１からのペプチドの配列をベースとする、デジェネレイトオリゴヌクレオチドのプローブを使用して、オリゴ−ｄＴプライムド、増幅されたｃＤＮＡライブラリー（ブタ好中球のポリ−Ａ選択ＲＮＡから作られた）をスクリーニングした。ｐ１０１およびｐ１２０の双方のタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび特性決定を後述する。
８．１  材料および方法
０．７ｍｇの全体のＲＮＡを４．２×１０9のブタ好中球から調製した（Chomczynski & Sacchi、1987、Anal.Biochemistry 162:156-159）。このＲＮＡをストラタジーン（Stratagene）（カリフォルニア州サンディエゴ）により使用してポリＡ−選択ｍＲＮＡを製造し、これからλＺＡＰＩＩ中でオリゴｄＴ−およびランダム−プライムドｃＤＮＡライブラリーを調製した（それぞれ、ほぼ５．４×１０-6および３．２×１０6一次ｐ．ｆ．ｕ．）。増幅されたライブラリーをほぼ２×１０6のもとの組換え体から構築しそして標準的手順により、これらを使用してｐ１２０およびｐ１０１ｃＤＮＡをスクリーニングした。
オリゴｄＴ−プライムドライブラリーから誘導された２．５×１０6プラークを、ｐ１２０からのペプチド配列をベースとする［32Ｐ］−標識化オリゴでスクリーニングした［ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＣＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴＩＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧ］（配列番号：５）。１２の陽性のクローンが同定され、ブルースクリプト（BluescriptTM）をベースとするプラスミドとして単離され、そして双方の鎖を配列決定した（ＡＢＩ自動化配列決定設備を使用した、バブラハム研究所）。これらのプラスミドのインサートは１系列のオーバーラップするクローンを表し、２つのクローンはｐ１１７／ｐ１２０トリプシンの消化物から誘導されたペプチド配列のすべてをコードする全長のＯＲＦを定めた（第４図）。
オリゴｄＴ−プライムドライブラリーから誘導された０．９×１０6プラークを、ｐ１０１からのペプチド配列をベースとする［32Ｐ］−標識化オリゴでスクリーニングした［ＧＣＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＩＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ］（配列番号：６）。１つの陽性のクローンが同定され、これを単離しそして配列決定した。このクローン（Ｄ１１）の５’末端はトリプシンのペプチドの１つの配列の一部分を表し、こうしてそれは部分的クローンとして同定された。オリゴｏＴ−プライムドライブラリーからのさらに０．６×１０10プラークを、Ｄ１１から誘導された［32Ｐ］−標識化Ｃｌａ−１制限フラグメントを使用してスクリーニングした。６６の陽性のクローンが同定され、それらのうちの４９を単離し、いくつかを部分的に配列決定した。これらは１系列のオーバーラップするクローンを表し、それらのすべてはＤ１１配列を含有したが、それらのすべてはＤ１１それ自体よりも小さかった。次いでランダム−プライムドライブラリーからの３．５×１０6プラークを、Ｄ１１からの［32Ｐ］−標識化Ａｐａ−１制限フラグメントを使用して走査した。９８の陽性のクローンが同定された。ＰＣＲに基づくアプローチによりブルースクリプト（BluescriptTM）ベクターに対して設計されたプライマー（「前方」および「逆」プライマー）および内部のＤ１１配列を使用して、これらのクローンを再スクリーニングした（一次プラークの単離物の段階において）。これにより、ｐ１０１配列をコードする最長の潜在的Ｎ−末端のエクステンションを同定（向きに対して独立）することができた。最長のＰＣＲ−フラグメントを与える３つのリットルのを単離し、配列決定した。これらはオーバーラップするクローンを表し、これらはＤ１１と一緒にｐ１０１トリプシン消化物から誘導されたペプチド配列のすべてをコードする全長のＯＲＦを定めた（第１図および第２図）。
８．２  結果
２つのクローンは、ｐ１１７／ｐ１２０トリプシンのペプチドのすべてをコードする全長のＯＲＦを定めた。アミノ末端ブロックドｐ１２０誘導ペプチドの測定された質量と、３つのメチオニンの各々における開始翻訳の結果として、誘導されるアミノ末端のペプチドの理論的質量との間の正確な合致に基づいて、これらの潜在的開始メチオニンのうちで、中央のメチオニンが活性として同定された（Stoyanov et al.、1995、Science 269:690-693の仮定と対照的である）。それ自体、ｐ１２０は１２６ｋＤの理論的大きさを有する。ｐ１１７から製造されたアミノ末端ブロックドペプチドと、ｐ１２０のアミノ末端の関係する領域との質量の比較は、正確な合致を示さない（通常のアミノ末端のブロックを可能とする）。それゆえ、ｐ１１７はｐ１２０のタンパク質分解的に、または翻訳後に修飾された形態であるように思われず、また、ｐ１２０メッセージ内の第２翻訳開始底の使用から生ずると思われない。しかしながら、ｐ１１７をコードするＯＲＦを有するｃＤＮＡは単離されなかった。
ｐ１２０を定めるタンパク質およびＤＮＡ配列を使用して、同様な構造についてのデータベースをサーチした。すべての前にクローニングされたＰＩ３Ｋとの類似性が同定された。しかしながら、種の差を許すと、配列はｐ１１０γ（Stoyanov et al.、1995）とほぼ同一であった。我々の配列とＳｔｏｙａｎｏｖｅｔｌとの間の唯一の不一致は、極端のＣＯＯＨ末端において見出される。一次構造のみに基づいて、ｐ１２０におけるＣＯＯＨ末端のプレクストリン相同ドメインの同定は確証することができなかった。
オリゴ−ｄＴおよびランダム−プライムド、ブタ好中球誘導ｃＤＮＡライブラリーから誘導された、いくつかのオーバーラップするフラグメントを利用することによって、ｐ１０１から誘導されたペプチド配列のすべてをコードする全長のＯＲＦは定められた。ｐ１０１誘導、アミノ末端ブロックドペプチドが同定された；その質量は、記載されたＯＲＦ中の予測された開始により定められた最初の１２残基のアミノ末端アシル化バージョンについて予測された質量に正確に等しかった。ｐ１０１の予測された相対分子量は９７ｋＤである。タンパク質およびＤＮＡ配列のデータベースを同様な構造または細分構造についてサーチしたが、有意な合致は同定されなかった。
９．実施例：ヒトｐ１２０およびｐ１０１をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトｃＤＮＡライブラリーをそれらのヒト相同体についてスクリーニングするために、ブタｐ１０１およびｐ１２０ｃＤＮＡ配列から誘導された放射性標識化ＰＣＲ生成物は首尾よく使用された。ヒトｐ１０１またはｐ１２０をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび特性決定を後述する。
９．１  ヒトｐ１０１
ヒト単球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州；ｍＲＮＡ源：Ｕ９３７細胞系統、ＰＭＡで５０ｎｇ／ｍｌにおいて３．５日間処理した）を、ブタｐ１０１ｃＤＮＡ配列のｂｐ８８７−１２８７に相当する放射性標識化ＰＣＲ生成物でスクリーニングした。ヒトｃＤＮＡライブラリーを含有するλｇｔ１１ファージを、Clontech Lambda Library Protocol Handbookに記載されているように、プレートし、ナイロンフィルターに移した。フィルターを１分間オートクレーブ処理することによって、フィルターに結合したＤＮＡを変性し、次いでフィルターを４２℃において２時間５０％のホルムアルデヒド、５×デンハルト、５×ＳＳＣ、０．０５ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．０５ＭのＮａＰＯ4、ｐＨ６．８、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムおよび１％のＳＤＳ中で前インキュベートした。放射性標識化ｐｒｃｐを５分間の沸騰により変性し、氷上で１５分間冷却し、次いでハイブリダイゼーション緩衝液中のフィルターに１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの最終濃度に添加した。ハイブリダイゼーションを４２℃において一定に撹拌しながら一夜進行させた。次いでフィルターを１回２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で室温において２０分間洗浄し、次いで２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で４２℃において２０分間洗浄し、最後に０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で４２℃において２０分間洗浄した。オートラジオグラフィー後、Clontech Library Handbookに従い陽性のクローンの回りおよびそれを含む区域を取り上げ、ファージをファージ希釈緩衝液の中に溶離することによって、陽性のクローンを単離した。次いで単一のファージのプラークの単離を可能とする密度において、ファージを再プレートし、一夜増殖させ、ナイロンフィルターに移した。フィルターを前述と同一の放射性ＰＣＲプローブとハイブリダイゼーションさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。単一の、純粋な、陽性のファージのプラークを取り上げ、ファージをファージ希釈緩衝液の中に溶離し、次いで再プレートしてコンフルエントの菌叢を得た。プラーク精製ファージ菌叢をファージ緩衝液の中に溶離し、ラムダファージＤＮＡをClontech Library Protocol Handbook中のプロトコールに従い単離した。
精製されたラムダＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル上で分離し、ＥｃｏＲＩＤＮＡインサートを単離し、そしてＥｃｏＲＩ線状化ブルースクリプトＫＳ＋の中に再クローニングした。次いで、これらのＤＮＡインサートを含有するブルースクリプトのプラスミドを配列決定した。独立に単離されたｃＤＮＡクローンのうちの５つは、ヌクレオチド１１３７とヌクレオチド３０２１における停止コドンとの間にブタｐ１０１ｃＤＮＡ配列に対して相同性の配列を含有した。ブタｐ１０１配列に関して、単離されたヒトクローンは追加の５４４ｂｐの３’非翻訳配列を含有した。
ブタ配列は５’末端において非常にＧＣに富んでいるので、オリゴ−ｄＴプライムドライブラリーの中に全長のクローンが見出される確率は低い。したがって、ＧＣに富んだ５′末端を含有するクローンを見出す確率を増加するようにオリゴｄＴプライムドおよびランダムプライムドの双方であるライブラリーを使用することを、我々は決定した。前述の同一のブタｐ１０１配列の放射性標識化ＰＣＲ生成物および同一の方法を使用して、我々はヒト白血球５’−ストレッチ・プラス（Stretch Plus）ｃＤＮＡライブラリー（Clonech:ｍＲＮＡ源：正常の末梢血白血球）および単離されたいくつかのクローンをスクリーニングし、それらの１つはヒトｐ１０１配列の５’末端を含有した。このクローンはコーディング配列からほぼ３００ｂｐ上流およびコーディング配列の最初の１６１２ｂを含んだ。次いで、白血球クローンの５’末端（開始コドンから７７ｂｐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位から位置１２６２におけるＳａｃＩ部位まで）を単球クローン（ＳａｃＩ部位から停止コドンから３０５ｂｐ下流の位置３０１４におけるＸｂａＩ部位まで）と融合することによって、ヒトｐ１０１配列の全体のコーディング領域を含有する全長のｃＤＮＡクローンを構築した。全長のｃＤＮＡクローンの全体の配列を決定し、そしてコードされたアミノ酸配列を推定した。
この全長のクローンを２つの異なるライブラリーからの２つの異なるクローンから誘導したので、白血球中のｐ１０１クローンの３’末端の存在を確認した。５つの異なる組のＰＣＲプライマーを使用して、単球ライブラリーからクローニングされたｐ１０１の３’末端が単球および白血球の双方のライブラリーの中に存在することを我々は証明した。
９．２  ヒトｐ１２０
ヒトｐ１０１のクローニングについて前述したプロトコールに従い、白血球ｃＤＮＡライブラリー（Clontech;ｍＲＮＡ源：正常の末梢血白血球）をｂｐ８７５−１３１５のブタ配列の放射性標識化ＰＣＲフラグメントでスクリーニングすることによって、ブタｐ１２０のヒト相同体をクローニングした。Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．が報告したブタ配列中のｂｐ６−２４１４に相当する、ヒトｐ１２０の５’末端を含有する２つのクローンを、我々は独立に単離した。ヒト配列はｂｐ２４０８にＥｃｏＲＩ部位を含有し、そしてｃＤＮＡライブラリーはＥｃｏＲＩリンカーで構築されたので、全長のヒト配列は２つの別々のクローンの中に含有されなくてはならず、１つは５’ＥｃｏＲＩフラグメントを含有し、他方は３’ＥｃｏＲＩフラグメントを含有した。したがって、ライブラリーを前述と同一の条件下にブタｐ１２０配列の３’末端（ｂｐ２８０１−３３９５）からの放射性標識化ＰＣＲフラグメントで再スクリーニングした。位置２４０８（ヒト配列）から位置５１２８におけるポリＡテイルの開始までの配列の３’末端を含有する２つのクローンを、我々は独立に単離した。５’および３’ＥｃｏＲＩフラグメントを含有する２つのファージのＤＮＡインサートを単離し、そしてＥｃｏＲＩ部位において融合して、ヒトｐ１２０相同体の全体のコーディング領域（８４−３３９０）を含有する全長のｃＤＮＡクローンを得た。全長のｃＤＮＡクローンの全体の配列を決定し、そしてコードされたアミノ酸配列を推定した。
１０．実施例：昆虫細胞におけるブタｐ１２０およびｐ１０１の発現
全体のアミノ末端、６×ＨＩＳ−タッグドｐ１２０（ｐＡｃＨＬＴｐ１２０）ｃＤＮＡまたはアミノ末端、（ＥＥ）−タッグドｐ１０１ｃＤＮＡ（ｐＡｃＯ−Ｇ１）ｐ１０１）を収容する、組換え、クローナル、バキュロウイルス（ｒｂｖ）を調製し、昆虫（Ｓｆ９）細胞中の上記タンパク質の産生を推進するために使用した。
１０．１  材料および方法
１０．１．  発現ベクターの構築
Ｎ−末端ＰＣＲおよび適当な制限部位を使用すると、ブタｐ１２０およびｐ１０１のＯＲＦを操作して、それらを種々の発現ベクターの中にインフレームで挿入できる形態にすることができた。各場合において、Ｎ−末端タグの後にコードされた最初のアミノ酸は開始メチオニンであった。ｐ１２０ｃＤＮＡの３’非翻訳領域を完全に使用し、そしてｐ１０１ｃＤＮＡのそれをＢａｍＨＩ部位においてトランケートした（ヌクレオチド１９２、第１図）。Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス誘導発現に使用したベクターは、ｐＡｃＨＬＴ（これはＮ−末端６×Ｈｉｓ−タグ、次いでトロンビン切断部位、Phrminogen;p120ORFがXhoI-EcoRI部位の中に挿入された）およびｐＡｃＯ−Ｇ１（これはＮ−末端「ＥＥ−タグ」、ONYX、Phrminogen;p101ORFがXhoI-NotI部位の中に挿入された）であった。使用前に、すべてのベクターをＮ−末端配列決定した。
１０．１．２  Ｓｆ９細胞のトランスフェクションおよび組換えタンパク質の産生
Ｓｆ９細胞をスピンナーフラスコ内で１１％のＨＩ−ＦＢＳを含むＴＮＭ  ＦＨ中で増殖させ、そして０．２〜２×１０6細胞／ｍｌに維持した。Ｓｆ９細胞をInsectinTM（Invitrogen）および線状化バキュロ−ゴールドＤＮＡ（Pharminogen）および関係するバキュロウイルス転移ベクターで推奨されるように（Invitrogen）トランスフェクトした。生ずる組換えバキュロウイルスをプラーク精製し、増幅して高い力価のウイルス系統を産生した。最適の（タンパク質の産生のために）希釈物を各力価の系統について決定した。ｐＡｃＯ−Ｇ１ｐ１０１ウイルスを付着性Ｓｆ９細胞に２．２日間２７℃において感染させた；ｐＡｃＨＬＴｐ１２０ウイルスをスピンナー培養物（通常）中で１．９日間２７℃において感染させた。細胞を氷冷０．４１％のＫＣｌ；２．６６％のスクロース；２０ｍＭのＭｇＣｌ2；８ＭｇＣｌ2ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．２、２５℃、の中に収獲し；１ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフェート（氷上で５分）で処理し、収獲溶液中で１回洗浄した。細胞の遠心的にパックされたアリコートを液体Ｎ2中で凍結させ、−８０℃において貯蔵した。
１０．１．３  Ｓｆ９誘導タンパク質の精製
金属イオンキレート化カラム（Talon、Clontech）を使用して、ブタｐ１２０を精製した。細胞ペレットを融解して０．１０ＭのＨＣｌ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４℃；１０ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４℃；１ｍＭのＭｇＣｌ2およびアンチプロテアーゼＩ（上を参照）の中に１リットルの感染したＳｆ９細胞培養物／５０ｍｌの超音波処理結合の比で導入し、プローブ超音波処理し（氷上で４×１５秒のバースト）、そして遠心した（１２０，０００×ｇ、４０分間、４℃）。上清を取り出し、プールした（管の上部における曇った上清を別々に取り出し、０．４５μＭを低いタンパク質結合性のフィルターで濾過し、次いで残りとともにプールした）。細胞質ゾルの画分にツイーン−２０およびベタイン（それぞれ、０．０５％ｗ／ｖ、および１％）を補充し、次いでこれを同等の緩衝液中の平衡化したＴａｌｏｎ樹脂上にポンプ輸送した（１．２ｍｌの樹脂／１リットルのもとの感染したＳｆ９培養物、２０ｃｍ／時の直線流速）。この工程およびすべての引き続く工程を４℃において実施した。カラムを順次に２０カラム体積の下記の各々で洗浄（同一の流れ）した：緩衝液Ａ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４℃；１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４℃；０．１５ＭのＮａＣｌ；１％のベタイン；０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０；緩衝液Ｂ、１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００；０．１５ＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４℃；１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、４℃；１％のベタイン；０．０５％のツイーン−２０；緩衝液Ｃ、０．１５ＭのＨＣｌ；５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１、４℃；１％のベタイン；０．０５％ｗ／ｖのツイーン−２０；緩衝液Ｄ、０．０５ＭのＮａＣｌ；３０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、４℃；１％のベタイン；０．０２％ｗ／ｖのツイーン−２０；１０％ｖ／ｖのエチレングリコール；１ｍＭのＭｇＣｌ2；次いで８カラム体積の緩衝液Ｅ、１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）を補充した緩衝液Ｄから構成された。緩衝液Ｅで洗浄する間、２ｍｌの画分を集めた。最後に、前に使用した流れの１／２において、７０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５；最終濃度）を補充した緩衝液Ｄから構成された緩衝液Ｆでカラムを洗浄した。典型的には、１ｍｌの画分を集めた。経験的に、画分を２８０ｎｍの吸収のトレース（連続的に記録した）に基づいてプールし、直ちに１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＥＧＴＡ（最終濃度）で補充した。典型的には、このプロセスはＳｆ９培養物の１リットル当たり４ｍｇのｐ１２０を産生した。この方法において調製されたｐ１２０は通常９０％より高い純度を有した。１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＥＧＴＡ（最終濃度）で補充した緩衝液Ｄから構成された緩衝液Ｇ中で平衡化したＧ−２５スーパーファインの１５ｍｌの細胞を介して、ｐ１２０の最終プールを脱塩した。ある実験において「ｐ１２０ブランク」調製物を正常のｐ１２０に対して正確に平行して調製したが、ただし出発する細胞は野生型バキュロウイルスで感染させたか、あるいは非感染であった。これらの「ブランク」調製物から誘導された最終画分は、事実上タンパク質を含有しなかったので、「平行体積」でプールした。
ｐ１２０の６×ＨＩＳタグはトロンビン切断認識モチーフを含有した。トロンビンを使用する注意した滴定および６％のポリアクリルアミドＳＤＳ−ゲルを使用する分析は、トロンビンに対して同様な感受性を有する２つの２つの部位を明らかにし、双方はアミノ末端に密接していた（αＣＯＯＨ−末端の抗体は２回切断のｐ１２０をなお免疫沈降させた）。１つの部位はタグに操作される部位のために期待される位置に存在した；他の部位はアミノ末端からほぼ４０残基の中に存在した（好適なトロンビン認識配列を含まない領域の中に）。最適化された条件（２Ｕ／ｍｌのトロンビン；０．２ｍｇ／ｍｌのｐ１２０；４時間、４℃、１ｍＭのＥＧＴＡおよび１ｍＭのＭｇＣｌ2）下に、１５％の非切断ｐ１２０、真性のアミノ末端トロンビン部位において切断された５０％、および追加のほぼ４０残基が切断された３５％を含有する、トロンビン切断ｐ１２０の調製物を発生させることが可能であった。これらの実験において、１００ｎＭのＮ−アセチルＤ−Ｐｈｅ−２−アミド−５グアニジノブタンボロン酸；効力のあるトロンビンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）の添加により、トロンビンの作用を停止させた。この研究を通して、部分的に切断された調製物を完全に非切断のｐ１２０と平行して使用した。下記の事実が明らかであった：（Ａ）すべての３つのｐ１２０は非常に類似するアフィニティーでｐ１０１に結合した、（Ｂ）ｐ１２０混合物に結合したｐ１０１は、非切断ｐ１２０に結合したｐ１０１と同様な程度に、Ｇβγにより活性化された、そして（Ｃ）非切断のｐ１２０および部分的に切断されたｐ１２０の双方は、ｐ１０１の非存在において、Ｇβγに対して事実上不感受性であった（しかしながら、完全なトロンビン切断物は全体のｐ１２０触媒活性を２０〜３０％だけ減少させる傾向があり、そしてｐ１０１の非存在においてＧβγによる１．７倍の見掛けの活性化を約２．５倍に増加する）。
ブタ（ＥＥ）−ｐ１０１を下記のようにしてＳｆ９細胞の凍結ペレットから精製した。２リットルの感染したＳｆ９培養物からの細胞を超音波処理して５０ｍｌの０．１２ＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ2；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃；１ｍＭのＥＧＴＡ＋アンチプロテアーゼＩ（前述したように）の中に入れた。遠心（１２０，０００×ｇ、４℃、４０分）後、上清を取り出し（前述したように）、１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００，０．４％のナトリウムコレート、０．４ＭのＮａＣｌ（最終濃度）で補充し、２ｍｌのα−（ｍｙｃ）無関係のモノクローナル抗体に共有交差結合したパックされたプロテインＧセファロース（等しい体積の溶液で洗浄した）と混合した。４℃において３０分間混合した後、ビーズを沈降させ、上清を取り出し、１ｍｌのα−（ＥＥ）モノクローナル抗体に共有交差結合したプロテインＧセファロース（等しい体積の溶液で洗浄した）と混合した。４℃において２時間混合した後、Ｕ９３７細胞α−（ＥＥ）免疫沈降について後述するようにビーズを洗浄したが、ただし（ａ）洗浄は２０ｍｌの遠心管中であり、そして（ｂ）最後に緩衝液Ｇと１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００とから構成された緩衝液Ｈで３回洗浄した。ある実験において使用した「ｐ１０１ブランク」（ｐ１０１Ｃ）調製物を正確に前述したように野生型バキュロウイルスで感染した細胞または非感染の細胞から調製した。
組換えバキュロウイルスの双方の形態でＳｆ９細胞を共感染させることによってｉｎ  ｖｉｖｏで形成されたｐ１０１／ｐ１２０ヘテロダイマーを（ＥＥ）−ｐ１０１について記載したように精製したが、ただし免疫沈降物を緩衝液Ｉ、１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００；０．１５ＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃；１ｍＭのＥＧＴＡで４回洗浄し；０．４ＭのＮａＣｌ（最終濃度）を補充した緩衝液Ｉから構成された緩衝液Ｊで２回洗浄し、次いで緩衝液Ｇで３回洗浄した後、１ベッド体積の１５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）の緩衝液Ｇ中の（ＥＥ）−ペプチドで溶離した。（ＥＥ）−ペプチド、アミノ末端アセチル化ＥＹＭＰＴＤは、α−（ＥＥ）モノクローナル抗体に対して非常に高いアフィニティーを有する。ビーズを（ＥＥ）−ペプチドと氷上で４０分間インキュベートした後、上清を取り出した。溶離されたタンパク質のアリコートを希釈し、ＰＩ３Ｋ活性についてアッセイする（上を参照）か、あるいはＳＤＳ試料緩衝液と直接的に混合した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え実験において、１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００を補充した緩衝液Ｇ（ここで緩衝液Ｈに等しい）中のｐ１２０調製物をなおプロテインＧマトリックスに結合している（ＥＥ）−ｐ１０１（１０：１モル比のタンパク質）と混合し、２時間混合し（転倒、４℃）次いでｐ１０１／ｐ１２０−ＰＩ３Ｋの精製について記載したように（ＥＥ）−ペプチドで溶離し、下記の実施例におけるようにｉｎ  ｖｉｖｏで再構築した。
１０．２  結果
タグを利用する単一工程の精製は、クーマッシー染色により評価して、精製されたタンパク質調製物を生じた；それらの見掛けの大きさは期待値と一致した。さらに、双方はウェスタンブロットにおいて特定のＣＯＯＨ末端特異的および内部の配列特異的、抗ペプチド、ウサギポリクローナル血清８（示されていない）により正しく認識され、それらの真性を示す。
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、双方タンパク質を独立に精製し、混合し（単離のために使用したプロテインＧマトリックスとまだアソシエートしたｐ１０１と）次いでよく洗浄した後、（ＥＥ）−ペプチドで溶離したとき、あるいは（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｓｆ９細胞を双方の形態のｒｂｖおよびタンパク質で共感染させ、ｐ１０１タグを介して精製したとき、ｐ１２０は緊密に、１：１モルの化学量論において、ｐ１０１に結合した（データは示されていない）。
遊離の精製されたｐ１２０は、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2選択的、ワートマンニン感受性ＰＩ３Ｋであった。Ｇβγは遊離ｐ１２０ＰＩ３Ｋ活性に対して小さい、２モードの作用を有した。ＧＤＰに結合したＧαのｏ、ｉ1、ｉ2およびｉ3の等モル混合物（２μＭの最終の合計の濃度）は、フッ化アルミニウムの存在において、遊離ｐ１２０ＰＩ３Ｋ活性に対して有意な作用をもたなかった（これはＧαの調製物であり、１．５倍モル過剰で添加したとき、ＰＩ３Ｋに対するＧβγの作用を完全に阻害することができた）。ｐ８５／ｐ１１０−ＰＩ３Ｋファミリーのメンバーを活性化することができるチロシンリン酸化ペプチドは、また、ｐ１２０ＰＩ３Ｋ活性に対して検出可能な作用をもたなかった。ｐ１０１に結合したとき（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて）、ｐ１２０のＰＩ３Ｋ活性はＧβγサブユニットにより１００倍より大きく活性化されることができた。チロシンリン酸化ペプチドおよびＧα−ＧＤＰ／フッ化アルミニウムは、Ｇβγ活性化された、または基底の、ｐ１０１／ｐ１２０ＰＩ３Ｋ活性に対して作用をもたなかった。Ｇβγの非存在において、ｐ１０１／ｐ１２０複合体中のｐ１２０の比活性は、遊離ｐ１２０の比活性より低いが、Ｇβγの存在において、５０倍より大きく増加する（第７図参照）。
ブタ好中球誘導ＰＩ３Ｋ（Ｂ）およびＳｆ９誘導ｐ１０１／ｐ１２０ヘテロダイマーの特異的触媒活性を、同一の、Ｇβγ刺激された、アッセイ条件下に、比較すると、Ｓｆ９誘導物質はタンパク質の１ｍｇ当たり２倍より高い活性を有することが示された。この結果は４日の精製のプロトコールを介する循環好中球から誘導されたＰＩ３Ｋ調製物の同様な「エイジ・アット・アッセイ（ａｇｅ  ａｔ  ａｓｓａｙ）」と一致せず、そして大量の組換えＰＩ３Ｋは正しくフォルドされること、そして決定的な翻訳後の修飾が所定位置に存在するにちがいないことを補充した。
１１．実施例：哺乳動物細胞におけるブタｐ１０１およびｐ１２０の発現
ブタｐ１０１およびｐ１２０のアミノ末端エピトープ−タッグド形態（（ｍｙｃ）または（ＥＥ））の一時的発現を可能とする、哺乳動物の発現ベクターのファミリーを構築した。この実施例において、哺乳動物細胞から精製された組換えｐ１０１およびｐ１２０融合タンパク質の産生，および引き続くそれらの性質の分析を記載する。
１１．１  材料および方法
１１．１．１  細胞培養
Ｕ９３７細胞をＲＰＭＩ  １６４０および１０％ｖ／ｖの熱不活性化（ＨＩ）−ＦＢＳ中で増殖させ、２日毎に４倍に希釈した。Ｃｏｓ−７細胞をＤＭＥＭおよび１０％のＨＩ−ＦＢＳ中で増殖させた。
１１．１．２  発現ベクターの構築
Ｎ−末端ＰＣＲおよび適当な制限部位を使用すると、ブタｐ１２０およびｐ１０１ＯＲＦを操作して、それらを種々の発現ベクターの中にインフレームで挿入できる形態にすることができた（各場合において、Ｎ−末端のタグの後にコードされる最初のアミノ酸は開始メチオニンであった。ｐ１２０ｃＤＮＡの３’非翻訳領域は完全であり、そしてｐ１０１ｃＤＮＡのそれはＢａｍＨＩ部位（ヌクレオチド１９２、第１図）においてトランケートされた。哺乳動物細胞におけるサイトメガロウイルス誘導（ＣＭＶ）の発現のための使用されたベクターは、（Ａ）ｐＣＭＶ（ＥＥ）（それぞれ、ｐ１０１またはｐ１２０の発現のためにＮ−末端のＭＥＥＥＥＦＭＰＭＰＭＥＦ（配列番号：７）またはＭＥＥＥＥＦＭＰＭＥＦＳＳ（配列番号：８）「ＥＥ−タグ」をコードする）および（Ｂ）ｐＣＭＶ（ｍｙｃ）（それぞれ、ｐ１０１またはｐ１２０の発現のためにＮ−末端のＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＥＦ（配列番号：９）またはＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＥＦＳＳ（配列番号：１０）「ｍｙｃ−タグ」をコードする）。使用前に、すべてのベクターをＮ−末端で配列決定した。
１１．１．３  Ｕ９３７のトランスフェクションのプロトコール
指数的に増殖するＵ９３７細胞（１２時間前に希釈した）をＰＢＳで２回洗浄し、下記の成分を含有する無菌のエレクトロポレーション媒質（ＥＭ）の中に再懸濁させた：３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１２ＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４６ｍＭのＫＨ2ＰＯ4および５ｍＭのＭｇＣｌ2、室温。円形プラスミドＤＮＡを１×ＥＭ中で細胞に添加して、１．４×１０7細胞および４０μｇの全体のＤＮＡ（通常、発現プラスミドおよび同一プロモーターで４０μｇまでにされ、そして同様にタグされたが、無関係のタンパク質を発現する）を含有する０．５ｍｌの最終体積を生成し、そしてクベット（０．４ｃｍのギャップ、ＢｉｏＲａｄ）に移した。室温において開始から１５分後、細胞をエレクトロポレートし（２８０Ｖおよび９６０μＦにおいて１パルス、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅのパルサーを使用した；時間定数は典型的にはｍｓｅｃであった）次いで氷上にさらに８分間配置した後、５ｍｌのＲＰＭＩ、１０％のＨＩ−ＦＢＳの中に希釈した。５分間放置した後、死んだ細胞を一緒にかたまりにさせ、細胞を３５ｍｌのＲＰＭＩ、１０％のＨＩ−ＦＢＳ（ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充されている）で希釈し、次いでＴＰＡおよびＺｎＣｌ2（それらの双方はＵ９３７細胞においてＣＭＶからの発現を実質的に増幅する）を、例えば、５×１０-8および２０μＭの最終濃度に添加した。細胞を［35Ｓ］−メチオニン（トランス−ラベル、ＩＣＮ）で標識化すべき場合、エレクトロポレーション後のＲＰＭＩはメチオニンおよびロイシンを含有せず、２ｍＭのＮａＨＣＯ3および２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０％の透析したＨＩ−ＦＢＳを含有し、細胞を１０ｍｌの最終体積において２０μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］−メチオニン／ロイシン（多分ＴＰＡおよびＺｎＣｌ2、前述したように）とともに再懸濁させた。１２時間（［35Ｓ］の存在または非存在下に）後、細胞の懸濁液をジイソプロピルフルオロホスフェート（１ｍＭの最終濃度）と混合し、次いで遠心し、ＰＢＳで１回洗浄し、免疫沈降のために溶解した。下記のようにして、（ＥＥ）−エピトープタッグドタンパク質をＵ９３７細胞ライゼイトから免疫沈降させた。１エレクトロポレーションからの細胞を下記の成分を含有する１．２５ｍｌの溶解緩衝液の中に溶解して入れた：１％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、４℃；１ｍＭのＥＧＴＡ；１ｍＭのＭｇＣｌ2；０．１５ｍのＮａＣｌおよび０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのアンチペイン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡおよび１０μｇ／ｍｌのベスタチン（以前においてアンチプロテアーゼＩとして知られていた）。ライゼイトを遠心した（１２，０００ｒｐｍ、０℃、１５分）。生ずる懸濁液を取り出し、４ＭのＮａＣｌ（０．１ｍｌ）、２０％のナトリウムコレート（２５μｌ）およびプロテインＧセファロース（４０μｌのパックされた体積）（無関係の、アイソトープ合致の、マウスモノクローナル抗体に共有結合された、ほぼ５〜１０ｍｇ／ｍｌのセファロース）と混合した。上清を２０分間転倒混合し、次いでビーズを沈降させ、プロテインＧセファロースビーズ（１０μｌ、パ��クされた）（α−（ＥＥ）マウスモノクローナル抗体に共有架橋された、ほぼ５〜１０ｍｇ／ｍｌのセファロース）を含む管に上清を移した。４℃において２時間混合した後、免疫沈降物を下記の緩衝液で洗浄した：５×１．０％ｗ／ｖのトリトン−Ｘ１００；０．４％のコレート；０．００４％のＳＤＳ；０．４ＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＧＴＡ；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０℃；１×０．５ＭのＬｉＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、４℃；２×０．１２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０℃。最後の緩衝液を１ｍＭのＤＴＴで補充した（最後の洗浄緩衝液）。免疫沈降物を［35Ｓ］−メチオニン標識化細胞から調製する場合、最後の洗浄を省略し、ビーズをＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰させた。そうでなければ、試料を後述するようにＰＩ３Ｋ活性についてアッセイした。
１１．１．４．  Ｃｏｓ−７細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの３時間前に、指数的に増殖するＣｏｓ−７細胞を約５０〜７０％のコンフルエンスにおいてトリプシン処理／再プレートした。トランスフェクションのときにおいて、細胞を再びトリプシン処理し、ＤＭＥＭ  １０％のＦＢＳの中に希釈し、計数し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＥＭ（１×１０7クベット）の中に再懸濁させ、円形プラスミドＤＮＡ（合計４０μｇ／クベット、１０μｇのＥＸＶ−（ＥＥ）−β1、１０μｇのＥＸＶ−（（ｍｙｃ）−τ2、１０μｇのｐＣＭＶ−（ｍｙｃ）−ｐ１２０または１０〜４０μｇの無関係の哺乳動物発現ベクターの組合わせから構成された）と混合して、最終体積を５００μｌにし、次いでエレクトロポレーションのカバー（０．４ｃｍのギャップ、ＢｉｏＲａｄ）に移した。室温において１０分後、細胞をエレクトロポレートし（２５０Ｖ、９６０μＦ）、氷上に８分間配置し、次いでＤＭＥＭ１０％のＦＢＳの中に希釈した。凝集した細胞をかたまりにさせ、廃棄した後、細胞をアリコートで６ｃｍの皿（各クベットから４）に移した。
４８時間後、各処理からの４つの皿を１ｍＭのＮａＨＣＯ3および０．２％の無脂肪酸ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝化ＤＭＥＭの中に洗浄して入れた。１０時間後、２つの複製皿をウェスタンブロットのために収獲した（１°検出試薬としてα−（ｍｙｃ）モノクローナル抗体、２°検出系としてα−マウス−ＨＲＰおよびＥＣＬおよび比重走査による定量を使用した）。２つの皿を無リン酸塩、ＤＭＥＭおよび１ｍＭの０．２％の無脂肪酸ＢＳＡの中に洗浄して入れ、次いでさらに９０分間３７℃において３００μＣｉの［32Ｐ］−Ｐｉ／皿（４ｍｌ中）とともにインキュベートした。培地を吸引し、１ｍｌの氷冷１ＭのＨＣｌを添加した。細胞をこすり取り、取り出し、皿を１．３３ｍｌのメタノールで洗浄した。ＨＣｌおよびメタノールを２．６６ｍｌのクロロホルムでプールし（「フォルチ（Ｆｏｌｃｈ）」２相、溶媒分布を生じさせるため）混合し、遠心した。下相を取り出し、１．９５ｍｌの新鮮な上相（上を参照）（０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのテトラブチルアンモニウムサルフェートを含有する）と混合した。混合および遠心後、下相を取り出し、乾燥し、脱アシル化し、アニオン交換ＨＰＬＣにより分析のために調製した（Stephens et al.、1991、Nature.Lond.351:33-39、その開示はその全体において引用することによって本明細書の一部とされる）。
１１．２  結果
Ｕ９３７細胞において一時的に発現させると、（ＥＥ）−ｐ１０１および（ＥＥ）−ｐ１２０を［35Ｓ］−メチオニン標識化細胞からほぼ等しい量において特異的に免疫沈降物させることができた（メチオニンのそれらの相対的補足を可能とする：それぞれ、８：２５、データは示されていない）。ストリンジェントで洗浄したα−（ＥＥ）ｐ１０１免疫沈降物はワートマンニン感受性、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2感受性、Ｇβγ感受性のＰＩ３Ｋ活性を含有し、このＰＩ３Ｋ活性活性は、免疫沈降のための無関係のモノクローナル抗体を使用するか、あるいは［35Ｓ］−メチオニンにより判定して、（ＥＥ）−ｐ１０１と同様なレベルに発現される、（ＥＥ）−タッグド無関係のタンパク質をコードするｃＤＮＡを使用する対照において、存在しなかった。
Ｇβγにより活性化は、２倍モル過剰のＧα−ＧＤＰとのインキュベーションによりブロックされた。さらに、これらのｐ１０１免疫沈降物中のＰＩ３Ｋ活性はＧα−ＧＤＰ／フッ化アルミニウムに対して不感受性であった。（ＥＥ）−ｐ１０１との（ｍｙｃ）−ｐ１２０の共トランスフェクションは、α−（ＥＥ）免疫沈降物において特異的に回収されたＰＩ３Ｋ活性を増加しなかった。事実、多分（ＥＥ）−ｐ１０１の発現は（ｍｙｃ）−ｐ１２０発現ベクターの存在において相対的より低いために、それは減少した。対照的に、（ＥＥ）−ｐ１２０α−（ＥＥ）免疫沈降物でトランスフェクトした細胞は、Ｇβγの存在または非存在において検出可能なＰＩ３Ｋ活性をめったに含有しなかった。（ＥＥ）−ｐ１０１トランスフェクト細胞からのα−（ＥＥ）免疫沈降物の中に（ＥＥ）−ｐ１０１が存在したので、これらの細胞は匹敵するモルの［35Ｓ］−メチオニン標識化ｐ１２０を含有した。（ｍｙｃ）−ｐ１０１により共トランスフェクションは、（ＥＥ）−ｐ１２０の発現の低下にかかわらず、回収することができるＧβγτ−刺激ＰＩ３Ｋ活性を、特異的に、実質的に増加させた（［35Ｓ］−メチオニンの標識化により判定して）（第８図参照）。このデータが示すように、Ｕ９３７細胞（ヒト）は一時的に発現したｐ１０１（ブタ）に結合できる内因性ＰＩ３Ｋ触媒を含有する。免疫沈降物の中に存在するｐ１２０のすべてはｐ１０１に結合するので、その内因性触媒サブユニットは、ｐ１０１（ブタ）結合したとき、Ｇβγにより実質的な調節を表示する。
対照的に、（ＥＥ）−ｐ１２０トランスフェクト細胞からのα−（ＥＥ）免疫沈降物において、ｐ１２０の大部分はｐ１０１とアソシエートせず、それゆえ相対的不活性である（ｐ１０１に結合したものに比較して、およびＧβγの存在において）。しかしながら、このＰＩ３Ｋ活性は、Ｇβγの存在においてアッセイするとき、（ｍｙｃ）−ｐ１０１との共トランスフェクションにより実質的に増幅される。これらのデータについての別の説明は−−ｐ１０１の存在において発現されないかぎり、ｐ１２０は「変性される」ことである（可溶性でありかつ免疫沈降物されることができるが）−−独立にＳｆ９精製され、誘導されたタンパク質を使用して得られたデータにかんがみるて起こり得ないが。
ｐ１０１／ｐ１２０ＰＩ３ＫがＧβγで活性化され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3を産生することができるかどうかを試験するために、（ｍｙｃ）−γ2、（ＥＥ）−β1、（ｍｙｃ）−ｐ１０１および（ｍｙｃ）−ｐ１２０の種々の組合わせをＣｏｓ−７細胞において一時的に発現させ、そしトランスフェクション後４８時間に細胞における［35Ｐ］−ホスホイノシチドのレベルに対するそれらの作用を測定した（第９図参照）。ｐ１２０のみはｐ１０１の存在においてβ1γ2依存的方法でＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ3およびＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ2を有意に増加させた。結果のこのパターンは、組合わせで導入するとき、異なるｃＤＮＡの相対的発現の変化により説明することができないであろう（第９図参照）。
１２．クローンの寄託
下記の微生物またはクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国マリイランド州ロックビレに、示したデータに基づいて寄託され、そして下記の受け入れ番号を割り当てられた：
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本発明は本明細書において記載した特定の態様により範囲を限定されず、前記態様は本発明の個々の面の単一の例示であり、そして機能的に同等の方法および成分は本発明の範囲内に入る。事実、本発明の種々の変更は、本明細書において示しかつ記載したものに加えて、前記説明および添付図面から当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更は添付された請求の範囲内に入ることを意図する。
【図１Ａ】
0004240537.tif 000004
【図１Ｂ】
0004240537.tif 000005
【図１Ｃ】
0004240537.tif 000006
【図１Ｄ】
0004240537.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
0004240537.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0004240537.tif 000011
【図４】
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【図５】
0004240537.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0004240537.tif 000018
【図１０Ｂ】
0004240537.tif 000019
【図１１】
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【図１２Ａ】
0004240537.tif 000021
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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