(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−アミノ酪酸産生能を有し、かつ、菌体が免疫賦活活性を有するラクトバチルス属に属するラクトバチルスｓｐ．Ｙ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９３１７）である乳酸菌。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌を培地に接種し、培養を行うことを特徴とする免疫賦活活性を有する乳酸菌菌体及びγ−アミノ酪酸を含有する培養物の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載した方法で得ることができる乳酸菌菌体を含有する免疫賦活活性が高められた食品。
【請求項４】
請求項２に記載した方法で得ることができる乳酸菌培養物を含有するγ−アミノ酪酸含量が高められた食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ-アミノ酪酸（GABA）及び免疫賦活活性物質を高濃度に産生する新規乳酸菌、さらにGABA及び免疫賦活活性物質の生産性の高い乳酸菌培養物の製造方法に関する。
また、本発明はこの乳酸菌培養物を利用した免疫賦活活性が高く、血圧上昇を抑制する等の健康志向の高い食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界に広く分布しているアミノ酸の一種であるγ-アミノ酪酸（以下、GABAという）は、他の多くのアミノ酸とは異なり、非タンパク質構成アミノ酸であるが、血圧降下作用、利尿作用、精神安定作用等の生理的に重要な機能を有している。GABAは食品として体内に摂取されるだけでなく、生体内において、L-グルタミン酸からの脱炭酸により生合成される。また、塩分の過剰摂取に対して尿へのナトリウムイオンの排出を促進したり、血圧降下作用を示したりするなど、重要な生体調節作用に寄与していることが知られている。しかしながら、GABAが含まれている食品は、少数の野菜や茶、米など種類が限定されており、また、GABAを含んでいる食品でもその含有量は少なく、GABAは有効な成分であるにもかかわらず食品として摂取される機会が少ない。
【０００３】
そこで人為的にGABAの摂取量を多くする方法として、大腸菌等の工業微生
物によりGABAを生産し、それを食品に添加することも考えられる。しかしながら、工業微生物により生産されたGABAを食品に用いるには安全性の面で問題がある。微生物により生産されたGABAを食品に用いる場合は、安全かつ大量に生産できる菌の選定が重要となってくる。
【０００４】
GABA含量を高めた食品素材としては、例えば、L-グルタミン酸を含む魚醤油等にラクトバシラス・プランタラム（特許文献１）を添加して発酵させた食品、茶の生葉を嫌気処理したギャバロン茶（非特許文献１）、米胚芽を水に浸漬して内在性酵素を活性化させた食品素材（特許文献２）や発芽玄米（特許文献３）などがあげられる。いずれも、その原材料中に存在するグルタミン酸を基質とし、かつ原材料中の内在性酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素を活性化させることにより、GABA濃度を高めている。これらのGABA含有食品はラットやヒトによる実験で、血圧降下作用や尿へのナトリウムイオンの排出促進作用を有していることが確認されている。また、昔から血圧降下作用が顕著であるとして薬膳料理などに用いられてきた紅麹の主要な有効成分がGABAであることも最近明らかにされている。
【０００５】
しかし、これらの食品製造には長期間の発酵が必要であるためにGABA含有食品は生産性が低いという欠点がある。その他の微生物として、麹菌（特許文献４）や酵母を作用させてGABAを生産させる方法もあるが、GABAへの変換率が低いという欠点がある。したがって、短時間でかつ高率にL-グルタミン酸ナトリウムやL-グルタミン酸からGABAを産生する微生物やその微生物を利用した高GABA含有食品の提供が望まれている。
【０００６】
さらに、発酵乳製品は免疫賦活活性を有する食品として古くから知られているが、嗜好的要素もあり利用範囲が限定されること、作用・効果が不十分な点や、製剤への配合に特殊な技術が必要なことなどの問題があった。最近においては、エンテロコッカス属の菌体または処理物を有効成分とするもの(特許文献５)、核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品（特許文献６）、カカオ豆から得られる抽出物を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献７）等があるが、その実用性はまだ明らかでない。
【０００７】
生体内の免疫システムは、生体が外界と接する境界である皮膚と粘膜で働く。そのうち粘膜は面積がはるかに広く、とりわけ腸管粘膜表面は最も広い面積を有する。腸管粘膜は多数のウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原と接触する場所であるため、それらの異物抗原から身体を守るための腸管免疫システムが働いている。この腸管免疫にて機能するものとしてIgA（Immunoglobulin A）が存在する。これは、細菌やウィルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレルギー抑制等に重要な役割を果たしている。
免疫力が低い老人や幼児あるいは体力の低下した人は、ウィルスや病原菌などの外部からの異物に対する抵抗力が低いことが知られている。したがって、これらの感染予防や治療において、IgAを高く保つ作用を有する物質、あるいはIgAの生産力を高めることができる免疫賦活剤の開発が望まれている。
【０００８】
GABA産生能を有する微生物において免疫賦活活性に関する研究報告は皆無であり、GABA産生能と免疫賦活活性の関係は全く不明である。しかし一方で、血圧降下作用、利尿作用、精神安定作用等の重要な生体調節作用に寄与しているGABAの産生能を有し、かつ細菌やウィルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレルギー抑制等の免疫機構に重要な役割を果たしているIgAの産生促進効果を有する微生物の提供は、その微生物を利用した免疫賦活剤の開発や高GABA含有食品素材の製造方法の提供に有用であり、生体への生理効果において期待される。
【０００９】
【特許文献１】
特許第2704493号公報
【特許文献２】
特許第2590423号公報
【特許文献３】
特開2000-32923号公報
【特許文献４】
特開平11-103825号公報
【特許文献５】
特開平11-92389号公報
【特許文献６】
特開2001-314172号公報
【特許文献７】
特開2000-86526号公報
【非特許文献１】
Tsushida, T. and Murai.: Agric. Biol. Chem., 51, 2865-2871, 1987
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記の現状に鑑み、免疫賦活活性物質及びγ‐アミノ酪酸（GABA）の両者を短時間で高濃度に生産することのできる新規な乳酸菌を提供すること、並びに、乳酸菌を用いた免疫賦活活性物質及びGABAを高濃度に含有する培養物の製造方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、このような培養方法を用いて免疫賦活作用及びGABA含量の高い食品を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決することを目的としてGABA産生菌を探索した。食品としての安全性の点を配慮し、食経験が豊富な醤油、魚醤、味噌、漬物、キムチ、塩辛等の発酵食品から、GABAへの変換率が高い乳酸菌株の選抜を実施した。
各種の発酵食品より分離されたGABA生産能を有する乳酸菌に対して、培地組成、ｐH、温度、時間などの培養条件を鋭意検討した。そして、得られたGABA産生能を有する乳酸菌の中から、免疫賦活活性の指標としてマウスのパイエル板細胞を用いIgA産生を促進する乳酸菌を選抜した。
その結果、GABA産生能を有し、かつ免疫賦活活性を示す新規乳酸菌株を見出し、さらに乳酸菌のGABA及び免疫賦活活性物質産生の促進因子として大豆抽出液を添加することにより、効率よくGABA及び免疫賦活活性物質の生産性を高めることができることを見いだした。
【００１２】
すなわち、本発明は、免疫賦活活性及びGABA産生能を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌に関する。このような乳酸菌としては、本発明者らが魚醤油もろみから分離した新規な乳酸菌ラクトバチルスsp.Y-3株がある。本発明者らはこの乳酸菌を独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号FERM P-19317を得た。
また、本発明は、免疫賦活活性及びGABA産生能を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌を培地に接種し、培養を行うことよりなる免疫賦活活性物質及び／またはγ-アミノ酪酸を含有する培養物の製造方法に関する。
さらに、本発明は、免疫賦活活性を有する乳酸菌を、大豆抽出液を免疫賦活活性物質の産生促進因子として含有せしめた培地で培養することよりなる、免疫賦活活性が高められた乳酸菌培養物の製造方法に関する。
さらに、本発明は、γ-アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌を、L-グルタミン酸及び／またはその塩を含有し更にγ-アミノ酪酸産生因子として大豆抽出液を含有せしめた培地で培養することよりなる、γ-アミノ酪酸含量が高められた乳酸菌培養物の製造方法に関する。
本発明においては、このような乳酸菌として、免疫賦活活性及びγ-アミノ酪酸生産能を有するラクトバチルス乳酸菌sp.Y-3（FERM P-19317）を用いるとよい。
また、本発明は上記方法によって得ることができる乳酸培養物を含有するγ-アミノ酪酸含量が高められた食品に関する。
この様な食品としては、調味料、エキス類、スープ類、飲料、麺類、菓子類、あるいはカプセルに充填した食品などを例示することができる。
【００１３】
本発明に関する免疫賦活活性及びGABA生産能を有する新規乳酸菌ラクトバチルス（Lactobacillus）sp.Y-3（FERM P-19317）の菌学的性質を調べ、その結果を表１に示した。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
また、本発明の乳酸菌ラクトバチルスsp.Y-3（FERMP-19317）の16S rDNA（16S rRNA遺伝子）の部分塩基配列を以下の方法で決定した。
乳酸菌ラクトバチルスsp.Y-3をMRS培地に植菌し、30℃で3日間培養した。ゲノムDNAの抽出にはプレップマン法（アプライドバイオシステム社）を使用した。抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRにより16S リボソームRNA遺伝子（16S rDNA）のうち5’末端側約500 bpの領域を増幅した。その後、増幅された塩基配列をシークエンスし、本菌の16S rDNA部分塩基配列を得た。PCR産物の精製、サイクルシークエンスにはマイクロシーク500 16S rDNAバクテリアシークエンスキット（アプライドバイオシステム社）を使用した。サーマルサイクラーにはジーンアンプPCR システム9600（アプライドバイオシステム社）、DNAシークエンサーにはABI プリズム377 DNA シークエンサー（アプライドバイオシステム社）を使用した。なお、ゲノムDNA抽出からサイクルシークエンスまでの基本的操作はアプライドバイオシステム社のプロトコール（P/N4308132レビュー.A）に従った。得られた16S rDNA（16S rRNA遺伝子）の部分塩基配列は配列表配列番号１に記載した。
【００１６】
得られた16S rDNAの部分塩基配列から本菌と近縁と考えられる種の相同性検索を行い、上位10株を決定した。更に、検索された上位10株と本菌の16S rDNAを用いて近隣結合法（Saitou, N. and Nei, M.:Molecular Biology and Evolution, 4, 406-425）により分子系統樹を作製し、本菌の近縁種及び帰属分類群の検討を行った。相同性検索及び系統樹の作製にはマイクロシーク マイクロバイアルアイデンティフィケーションシステム  ソフトウェアバージョン1.4.1を、相同性検索を行う際のデータベースとしてマイクロシークバクテリア500 ライブラリーバージョン0023（アプライドバイオシステム社）を使用した。作成した分子系統樹は図１に示した。
マイクロシークを用いた解析の結果、本菌の16S rDNA部分塩基配列は相同率81.74%でラクトバチルス  ビファメンタンス (Lactobacillus bifermentans)の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。しかし、分子系統樹では本菌の16S rDNAはラクトバチルスのクラスターに含まれるものの、単独で枝を形成した。以上の結果から本菌のラクトバチルスへの帰属が示唆され、本菌は新規な乳酸菌ラクトバチルスsp.と同定できた。更に、本菌は発酵食品から分離された有用乳酸菌であるので安全性が高いものである。
【００１７】
本菌はL-グルタミン酸を含む植物性もしくは動物性成分を発酵培地とするが、L-グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩を含有する食品素材、例えば、醤油や味噌などの発酵食品の原料も発酵培地として使用できる。このような発酵食品原料を用いることによりGABA含有量及び免疫賦活活性の高い発酵食品を得ることができる。
L-グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩の初発濃度は、0.1〜10重量%に設定することが好ましく、より好ましくは1〜5重量%の範囲である。
このような範囲内であると、グルタミン酸脱炭酸酵素によりGABAを生成させるための十分な基質を含ませることができ、かつグルタミン酸が培地中に残存することもなく好適である。
【００１８】
また、乳酸菌の培地に大豆抽出液を添加することによりGABA生産量、及び／または免疫賦活活性物質の産生を促進することができる。
大豆抽出液は、大豆に水を加えて浸漬もしくは加熱して製造することができるが、煮豆、味噌、醤油などの大豆を原料とする様々な食品加工製造において、原料大豆を蒸煮する工程の副産物として大量に排出される大豆煮汁等が利用できる。醤油業界における例として、大豆1トン当たり水2トンを加え、約１０時間浸漬した後浸漬液を排出し、蒸気を投入し127℃で４分間蒸煮すると、浸漬排水とあわせて約１トンの大豆煮汁が発生する。大豆煮汁は高濃度の有機物を含んでいるため、当業者はその処理に苦慮しているのが現状であった。しかし、この大豆煮汁を利用した培地で乳酸菌を培養すると、GABAや免疫賦活活性物質の生産量が顕著に増大したことから、大豆抽出液は免疫賦活活性物質及びGABAの両方の生産に対して有効な成分として活用することが可能になる。
大豆抽出液の添加量は、抽出液の製造方法（抽出液の濃度）にもよるが、10重量%以上に設定することが好ましく、より好ましくは50〜90重量%の範囲である。
【００１９】
本発明により高GABA含有発酵物の短期間製造および、これにより製造される高GABA含有食品が期待される。
このような製造方法により得られた食品は、GABAが高濃度に含有されているため、これを任意食品に少量添加するだけで、その食品中のGABA含有量を著しく増加させることができるという利点がある。さらに免疫賦活活性が高いという利点もある。
例えば、本発明により製造された乳酸菌培養物は、そのまま調味料やエキスとして利用したり、必要に応じて脱塩、脱臭などの精製処理を施したり、あるいは粉末化することにより、調味料、エキス類、スープ類、飲料、麺類、菓子類、カプセルに充填した食品等といった幅広い食品の配合原料として利用することもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
＜新規乳酸菌の獲得＞
各種食品から被験試料を適量サンプリングし、生理食塩水にて希釈懸濁した後、ブロムクレゾール・パープル・プレートカウント寒天培地（BCP寒天培地）に混釈培養し、これから代表的コロニーを釣菌し、更にこれをBCP寒天培地に画線し培養する操作を繰り返して乳酸菌の純粋分離を行った。
得られた分離乳酸菌を、MRS液体培地（メルク社製）に醤油を10%添加し（以
下YM培地という）、更にグルタミン酸ナトリウムを５％添加して調製した培地に接種して、初発pH5.5、30℃にて７日間培養した。ついで、上記培地中のGABAとグルタミン酸の量を、アミノ酸分析システム（ヒュ−レッドパッカード社1100シリーズ）を用いてオルトフタルアルデヒド法により定量した。その結果、表２に示すように数種のGABA生産性分離乳酸菌の中で、分離したY-3株が顕著に培地中のグルタミン酸をGABAに変換していることがわかった。同時に、菌体を遠心分離により集菌・洗浄した後凍結乾燥した試料を用いて下記の方法で免疫賦活活性を測定したところ、Y-3株のみに活性が認められた。なお、Y-3株の菌学的性質は表１に、またその16SrDNAの部分塩基配列は配列表配列番号１に示した。
【００２２】
＜免疫賦活活性の測定方法＞
BALB/cマウス雄性７週齢（日本クレア株式会社）よりパイエル板組織を取り出し、20%FBS（ウシ胎児血清）を含むRPMI-1690培地（ギブコ社製）に浸し、組織を押しつぶし、ナイロンメッシュを通して単細胞浮遊液とした。これを180×gで2分間遠心分離して上清を除き、20%FBSを含むRPMI培地に1×107個/mlになるように懸濁した。
IgA産生誘導剤として上記培養菌体の凍結乾燥物を200μg/ml添加した96穴平底プレートに、上記懸濁液を100μlずつ添加し、37℃、5%CO2の存在下で３日間培養し、培養液を700×gで10分間遠心分離し、上清のIgAをELISA法により測定した。
なお、陽性対照としてLPS（リポポリサッカライド、和光純薬工業製）を用いた。また、パイエル板細胞に何も加えずに培養した対照群の値を１としたときの比活性で評価した。各種発酵食品から分離した乳酸菌のGABA産生能と免疫賦活活性を表２に示した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
【実施例２】
＜大豆煮汁によるGABA産生量及び免疫賦活活性の増大＞
次に、GABA産生能が最も高く免疫賦活活性が認められた実施例１のY-3株について、GABA産生の促進因子の検索を行った。
食品として用いうる培地を中心に検討した結果、YM培地に大豆煮汁を添加した大豆煮汁培地（大豆煮汁を25〜90%添加、ｐH5.7）を用いることにより、免疫賦活活性物質及びGABA産生の促進が認められた。ここで、大豆煮汁25%はMRS培地粉末52.2g、醤油100ml、大豆煮汁250ml及び水650mlを混合したもの、また、大豆煮汁90%はMRS培地粉末52.2g、醤油100ml、大豆煮汁900ml及び水0mlを混合したものである。これらの培地500mlをメディウム瓶に入れ、種菌を105/mlになるよう接種し、密栓して30℃で７日間静置培養した。結果を図２及び表３に示した。図２はY-3株を用い、培地にグルタミン酸5%を添加して培養した結果を示したものであり、大豆煮汁の添加量に比例してグルタミン酸からGABAへの変換率が上昇した。また、表３に示したとおり、A-1、B-5、C-7株等のGABA産生においても大豆煮汁の有用性が示された。
なお、ここで用いた大豆煮汁は以下のようにして調製した。大豆を２倍量の水に１２時間浸漬し、浸漬液を排出して浸漬大豆を得た。その後、連続的に蒸気により127℃で４分間蒸煮して、排出される液を採取して大豆煮汁とした。この大豆煮汁はブリックス濃度3.7、総窒素0.07%であった。さらにこれをろ過及び遠心分離（12,000×g,15分）処理して清澄にした。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
＜免疫賦活活性の測定方法＞
また、大豆煮汁培地によって培養したY-3株の菌体を実施例１と同様に処理して免疫賦活活性を測定した。大豆煮汁を添加したYM培地で培養を行ったところ無添加のYM培地で培養するよりも、IgA産生能が上昇した。すなわち、大豆煮汁を添加することにより、本菌株に強い免疫賦活活性が得られることが判明した。結果は表４に示した。
【００２７】
【表４】
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【００２８】
【実施例３】
＜大豆煮汁によるGABA産生酵素：グルタミン酸脱炭酸酵素活性の増強＞
大豆煮汁のGABA産生促進効果を明らかにするため、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）についてその活性を測定した。
グルタミン酸脱炭酸酵素の調製及び測定はおおむね早川らの方法（生物工学, 75, 239-244, 1997）に従った。
YM培地及びYM培地に大豆煮汁を90％を添加した培地（図3の大豆煮汁+YM培地）を用い、それぞれにグルタミン酸ナトリウムを1％添加し、初発pH5.7、30℃、０〜６日間培養した。1日ごとに培養液30mlを遠心分離（8000×g、10分）し、得られた菌体を10mlの20mMリン酸緩衝液（0.1mMピリドキサルリン酸、0.1mMメルカプトエタノールを含む、pH 7.0）に懸濁した。
続いて、超音波破砕機（クボタ、UP 50H）により菌体を破砕後、遠心分離
（20,000×g、10分）により上清を回収し、グルタミン酸脱炭酸酵素の粗酵素液とした。基質溶液（20mM グルタミン酸ナトリウム、pH 4.6）1.3ml、4M 硫酸アンモニウム0.1ml及び酵素液0.1mlを混合し、30℃で120分間反応を行った。
5分間煮沸して反応を停止させた後、産生したGABAを測定した。上記条件で、1分間に1μmolのGABAを産生する酵素量を1単位（U）とした。大豆煮汁の添加により、グルタミン酸脱炭酸酵素の活性が上昇することが明らかとなった。結果は図３に示した。
【００２９】
【実施例４】
（乳酸菌培養物の製造）
培地として、実施例２と同様にして調製した大豆煮汁17L、醤油2L、グルコース1kg、L-グルタミン酸ナトリウム（一水和物）1kgを混合溶解しｐH5.7に調整した培地を、攪拌機のついた50kl密閉式培養器に入れ、95℃  １０分間加熱した。冷却後、ラクトバチラスsp.Y-3株を、およそ105/mlになるように添加し、30℃で緩やかに撹拌しながら培養した。培養７日後に、別途殺菌したL-グルタミン酸ナトリウム（一水和物）1kgを無菌的に添加し、更に５日間培養を続けた後95℃５分間殺菌し、5.5%のGABAを含有する乳酸菌培養物を得た。L-グルタミン酸ナトリウムからGABAへの変換率はほぼ100%であった。
【００３０】
【実施例５】
（粉末食品の製造）
実施例４で得た乳酸菌培養物10Lにデキストリン1.8kgを加えてスプレードライしたところ、約3kgの粉末が得られた。この粉末のGABA含量は15%であった。この粉末の免疫賦活活性を実施例１と同様にして測定したところ、粉末濃度0.2 mg/mlのときIgA産生量は無添加区に対する比活性として1.5と高い値を示した。
本粉末50%、結晶セルロース50%を十分混合し、その混合物100mgずつをゼラチンカプセルに充填した。本カプセルを１日2〜4カプセルを継続して摂取すると、血圧降下作用や免疫機能の向上が期待できる。
【００３１】
【実施例６】
（飲料の製造）
実施例４で得た乳酸培養物100mlを豆乳10Lに添加し、殺菌後、100mlずつペット容器に充填した。この豆乳１本を継続的に飲用することにより、血圧降下作用や免疫機能向上などの健康維持が期待できる。
【００３２】
【実施例７】
（乳酸菌培養物の製造）
ふた付きの培養瓶に市販の牛乳を1L、グルタミン酸ナトリウム（一水和物）２g、ブドウ糖20gを入れて溶解後、95℃で10分間加熱後急冷した。これに、予め培養したY-3株を1×107/mlになるように加えてふたをし、緩やかに撹拌後25℃で１2時間静置して発酵させヨーグルトを調製した。このヨーグルトはpH4.5であり、GABA0.１%を含んだ穏やかな酸味のあるものであった。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明によれば、短期間に効率よく高含量のGABAを生産し、かつ免疫賦活活性を有する乳酸菌及びその培養方法を提供することができる。しかも、本発明の乳酸菌およびその培養方法を用いて得られた食品は、安全であり、これを摂取することにより免疫賦活活性の向上、高血圧症の改善などの高い薬理効果が期待される。
【００３４】
【配列表】
0004313615.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクトバチルスsp.Y-3(FERM P-19317)の分子系統樹を示す。
【図２】大豆煮汁の添加量とGABA変換率との関係を示す。
【図３】大豆煮汁添加におけるグルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）活性の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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