(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）血液の血清および／または血漿からウィルスまたは細菌を含む液体画分を得る工程、
（ｂ）液体画分中に標的核酸を溶出するためにウィルスまたは細菌を溶解する工程、
（ｃ）細菌またはウィルスの標的核酸をハイブリッド形成によって捕獲するために、特定の配列のウィルスまたは細菌の標的核酸に対して実質上相補的である核酸プローブを比重１.１から２.５を有する粒子に化学的に結合することによって得られる、核酸プローブを有する粒子を（ｂ）の工程で得られた溶解物に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた系からウィルスまたは細菌の標的核酸を捕捉した粒子を回収する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収した、標的核酸を捕捉した粒子を、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、直接ポリメラーゼ増幅反応または逆転写ポリメラーゼ増幅反応に付し次いで増幅された核酸を検出する工程
よりなる方法であり、前記工程（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の前、或いは途中で、蛋白質変性剤を添加することを特徴とする方法。
【請求項２】
比重１．１から２．５を有する粒子の平均粒子径が０．１μｍ以上３μｍ以下である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸プローブを固定化された微粒子を用いて核酸とヌクレアーゼが共存する検体から核酸を分離する方法を用いて検体中の核酸を検出するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、血清、血漿中に浮遊しているウィルスまたは細菌を検出するには、次のような方法によっていた。まず全血液を低速遠心にかけ、血球成分を沈澱させ、上清の血清または血漿を回収する。次いで回収された血清または血漿に高濃度グアンチュームチオシアネート溶液（ＧＴＣ）と微量のＳＨ基酸化防止剤を加えると、ウィルス殻、細菌膜が破壊されると同時に、遊離されるウィルスまたは細菌の核酸の分解が抑えられる（Sambrook他著、“Molecular Cloning 2nd Ed.” Sec7., Cold Spring Harbor Press, New York, USA）。
血清中には大量の蛋白質、脂質、糖、および他の分子が含まれるので、前分離処理なしでは血清中の標的遺伝子を検出することはできない。そこで、通常、クロロホルム／フェノールまたはイソプロピルアルコール等の有機溶媒を使って、さらに、これらの溶媒中の蛋白質と核酸の溶解度の違いを利用して、血清中の核酸と蛋白質の分離を行ってから、標的遺伝子を核酸プローブ法またはポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ法）により検出していた。
【０００３】
前記有機溶媒を使用する核酸と蛋白質の分離法は、血清中に存在する全ての核酸と全ての蛋白質を分離する方法であるので、分離された核酸中には検出の対象である標的核酸以外の核酸が大量に含まれている。もし所定量の検査対象の検体中に標的核酸が数分子ないし数十分子しか含まれない場合、標的遺伝子検出のバックグランドが大きくなり、このため標的核酸が検出できないことがある。バックグラウンドを小さくするために、一つの方法として検査対象の検体に使う血清または血漿の量を減らすこともできるが、この方法には結果的に検査感度を低下させてしまうという問題点がある。加えて、この溶媒を使用した分離方法の操作は煩雑であるために、大量の臨床検体の日常的な処理に対しては不向きであった。
【０００４】
上記の問題点を解決するために提案されたもう一つ方法は、核酸を蛋白質と分離するために、有機溶媒の代わりにイオン交換樹脂またはガラスビーズを使用し、さらに異なる核酸と蛋白質間の荷電度の違いを利用することから成る。この方法は、通常の水溶液中に混在する核酸と蛋白質の分離には有効であるが、血清または血漿中に核酸とヌクレアーゼが共存する場合、特に標的遺伝子が、例えばＨＩＶまたはＨＣＶ中のＲＮＡであるとき、検体中に大量に含まれるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）の活性を妨げるために、少なくとも約２Ｍ／ｌのＧＴＣ溶液を検体の血清に添加する必要があるが、それには、検体中の電荷イオンが塩によって中和されてしまうという効果があるので、そのような場合において、この方法は効果がなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明によって提示される課題とは、生物学的液体から誘導された検体から、特に検体中に核酸とヌクレアーゼが共存する場合において、標的核酸を特異的に分離し、上記の問題点のない、上記のような検体中からウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
一つの局面によれば、本発明は血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）血液の血清および／または血漿からウィルスまたは細菌を含む液体画分を得る工程、
（ｂ）液体画分中に標的核酸を溶出するためにウィルスまたは細菌を溶解する工程、
（ｃ）細菌またはウィルスの標的核酸をハイブリッド形成によって捕獲するために、特定の配列のウィルスまたは細菌の標的核酸に対して実質上相補的である核酸プローブを比重１.１から２.５を有する粒子に化学的に結合することによって得られる、核酸プローブを有する粒子を（ｂ）の工程で得られた溶解物に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた系からウィルスまたは細菌の標的核酸を捕捉した粒子を回収する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収した、標的核酸を捕捉した粒子を、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、直接ポリメラーゼ増幅反応または逆転写ポリメラーゼ増幅反応に付し次いで増幅された核酸を検出する工程
よりなる方法であり、前記工程（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の前、或いは途中で、蛋白質変性剤を添加することを特徴とする方法である。
【０００７】
本発明の方法は、長時間を必要とせず、容易に実行に移せて、よって臨床検査センターや病院における大量の検体の日常的な処理に十分適切である技術を使用して、生物学的液体検体または生物学的液体から誘導された検体からウィルスまたは細菌の標的核酸を特異的に、かつ効率的に分離することを可能とする。その分離方法を利用することにより、特にＨＩＶ−ＲＮＡおよびＨＣＶ−ＲＮＡの検体において、非常に高感度な標的核酸の検出が可能となる。
本発明の方法が適用され得る検体は、
【０００８】
血清および／または血漿（以下、これらを「血清等」という）である。
そのような血清等は、ヒトまたは動物の全血液から低速の遠心分離を利用して血球成分を分離することによって容易に調製することができる。通常の免疫検査によって調製される血清をそのまま用いることもできる。血清等には、もし適当であるならば、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、あるいはＥＤＴＡのような抗血液凝固剤が含まれていてもよい。
本発明において分離される核酸が宿主中に含まれる場合には、核酸を溶出するために、すなわち液体画分中に核酸を溶出するために、該宿主の外殻または膜を溶解または破壊することが必要である。かくして本発明の方法には、ウィルス殻または細菌膜を破砕する方法を要する。
【０００９】
ウィルス殻または細菌膜を破砕する方法としては、通常に用いられるいかなる適当な物理的、電気的または化学的な方法が使用できる。そのような破砕方法の例としては、超音波破砕法、電気ショック法、浸透圧差を利用する方法、界面活性剤を利用する方法等が挙げられる。
ウィルス殻または細菌膜を破砕するための特に適当なものとして、“PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications”（M.A. Innis et. Al., 1990, Academic Press, NY, USA）に記載の方法がある。
本発明の方法によって分離されるべきウィルスまたは細菌の標的核酸はＲＮＡおよび／またはＤＮＡでもよい。本発明の方法は、標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡあるいはＨＣＶ−ＲＮＡのようなＲＮＡである場合に特に好適である。
【００１０】
本発明において、ウィルスまたは細菌から遊離される核酸が検体中のヌクレアーゼにより分解されることを妨げるために、蛋白質変性剤によって検体のヌクレアーゼ活性が抑えられる。
ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の活性を抑える当該技術分野における様々な方法が知られている。好適な方法の一例としては、例えばMolecular Cloning（前期に引用）に記載されているグアニチュームチオシアネート（ＧＴＣ）のような蛋白質変性剤を用いる方法が挙げられる。グアニチュームチオシアネートは、通常ＳＨ基含有酸化防止剤を含有する。
【００１１】
本発明が適応される血清等のＧＴＣの濃度は、約０.１〜５モル／ｌ、好ましくは約０.２〜４.５モル／ｌである。もしこの濃度が約０.１モル／ｌより少ないと、濃度が低すぎて所定のＲＮａｓｅ活性を抑えることができない。一方、約５モル／ｌより多い場合には、ＧＴＣにおいて溶液が飽和状態となり、そのような飽和溶液の実際の使用は困難となる。
ＳＨ基含有酸化防止剤の例としては、ジチオトレイトール、メルカプト酢酸、メルカプトエタノールが挙げられる。血清等中のＳＨ基含有酸化防止剤の濃度は、好ましくは約０.１〜３００ミリモル／ｌ、より好ましくは約１〜１００ｍミリモル／ｌである。もしその濃度が約０.１ミリモル／ｌより少ないと、濃度が低すぎてＲＮａｓｅ活性を抑えることができない。
【００１２】
本発明において、蛋白質変性剤は、本発明の方法における（ａ）〜（ｄ）のどの工程の前、或いは途中で添加されてもよいが、通常、その変性剤はウィルスまたは細菌の標的核酸の液体画分中への溶出の直前あるいは直後に添加されるのが好ましい。
本発明において使用する核酸プローブを担持させる粒子としては、有機高分子粒子、無機粒子、またはこれらの複合体のいずれでもよい。
本発明において使用する核酸プローブを担持させる粒子の比重は、約１.１〜約２.５、好ましくは約１.２〜約２.０である。もしその比重が約１.１より小さくなると、粒子を遠心分離により沈澱させられなくなる。また、もしその比重が約２.５より大きくなると、標的核酸の捕捉反応の間の短い時間内にも粒子が沈澱してしまい、効率的に標的核酸を回収することができない。
【００１３】
粒子を形成するために使用可能な有機高分子の例としては、一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するコモノマーを他のコモノマーと共重合することによって得られた重合体を挙げることができる。そのような一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するモノマーとしては、例えばモノフルオロフェニル（メタ）アクリレート、トリクロロフェニル（メタ）アクリレート、モノブロモフェニル（メタ）アクリレート、トリブロモフェニル（メタ）アクリレート、モノイオドフェニル（メタ）アクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルアクリレート、２,４,６−トリブロモフェニルメタクリレート、α−クロロフェニルアクリレートおよびα−クロロフェニルメタクリレートが挙げられる。
【００１４】
他のコモノマーの例としては、芳香族ビニル化合物、α,β−不飽和カルボン酸およびそのエステル類とアミド類、α,β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、スチレン、クロロスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、および臭化ビニルのような低級脂肪酸ビニルエステル化合物が挙げられる。
【００１５】
一つ以上のハロゲン原子を分子中に有するモノマーは、通常室温で水溶性の固体である。従って、これらは前記したコモノマーと一緒に水性媒体中に微分散させてエマルジョンを形成させ、次いで目的とする粒子を得るために、乳化重合、懸濁重合、シード重合、溶液沈澱重合、分散重合等に掛けることが好ましい。
【００１６】
本発明において使用するのに好適な粒子の平均粒子径は、そのような微粒子は遠心分離等の簡便な操作で回収できるので、好ましくは約０.０５μｍ以上、より好ましくは約０.１μｍ以上である。一方、各粒子の単位体積当りの表面積を大きくし、その粒子がハイブリダイゼーションの適当な条件下で効率よく標的核酸を捕捉できるためには、その平均粒子径は、好ましくは約５μｍ以下、より好ましくは約３μｍ以下である。さらに、本発明において使用する粒子は、水性媒体中で使用されるために、不水溶性でなければならない。
本発明において使用するのに好適な無機粒子としては、例えばガラスビーズ、金属または金属酸化物の粒子を挙げることができる。
好適な複合粒子としては、例えば有機高分子で表面被覆された無機コア粒子、あるいは有機高分子中に分散された複数個の無機粒子が挙げられる。
【００１７】
本発明において、少なくとも一つの常磁性体あるいは超常磁性体を含有する粒子（以下、「磁性粒子」という）を使用することもできる。次いで磁性粒子の分離は、遠心分離のほか、磁石の利用によっても、便利に、且つ迅速に実現できる。超常磁性体の例としては、鉄、酸化鉄（Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ3Ｏ4）、窒化鉄、ニッケル、酸化ニッケルの超微粒子、およびこれらの金属および化合物のいずれかを含有する粒子が挙げられる。
このような磁性粒子は、例えば特開昭６１−１９１０３号公報に記述されている方法によって調整できる。
このように調製された磁性粒子は有機高分子で表面被覆されることが望ましい。これは、例えば磁性粒子を揮発性の有機溶媒に溶解させたモノマーと開始剤からなる液に添加し、脱溶媒と共にモノマーを磁性粒子の内に含浸させた後に、界面活性剤の入った水溶液中に磁性粒子を分散させ、粒子中に含まれるモノマーを加熱重合することにより都合よく実現される。このように表面被覆された粒子を核酸プローブと結合させやすくするために、表面被覆に使用されたモノマーの一部またはすべては、好ましくはカルボキシル基を側鎖にもつモノマーである。
【００１８】
本発明に用いる粒子の表面におけるカルボキシル基量は、好ましくはドライ粒子の質量当り約０.０１〜０.８ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは約０.０２〜０.５ｍｅｑ／ｇである。カルボキシル基量が約０.０１ｍｅｑ／ｇ以下になると、核酸プローブの固定化における粒子の効率が著しく低下し、また、核酸プローブが固定された粒子の安定性も低下する。このような粒子は、一粒子あたり数分子ないし数十分子の標的核酸の捕捉を行うという本発明の目標にとっては好ましくない。しかしながら、その一方では、カルボキシル基量が約０.８ｍｅｑ／ｇ以上になると、実質的にこのような粒子を調製することは容易ではない。粒子表面のカルボキシル基量の範囲は、本発明の用途および粒子調製のコストとのバランスを考慮して選択される。
【００１９】
本発明に用いる粒子の表面にカルボキシル基を導入する手段としては、前述のように重合または表面被覆する工程において、適量のカルボキシル基を有するモノマーを添加することにより達成できる。
少なくとも本発明に用いる粒子の表面は、前述したように、有機高分子材料で被覆されることが望ましい。そのような有機高分子材料には、例えばスチレン、ジビニルベンゼン、（メタ）アクリル酸、ハロゲン化ビニル化合物、およびそれらの派生化合物が含まれる。また、このように表面被覆された粒子を核酸プローブと化学的に結合させやすくするために、粒子表面にカルボキシル基を導入することが望ましい。
【００２０】
本発明において使用する核酸プローブは、固定化部位とハイブリッド形成部位により構成される。
核酸プローブ中のハイブリッド形成部位の配列は、標的核酸の特定の配列と実質的に相補的である配列を含んでいる。本発明において特に好適である検体である血清等には、通常、大過剰な望ましくない核酸、蛋白質、脂質、糖、および他の分子が、例えば標的核酸の数千倍〜数百万倍の濃度で含まれているので、標的核酸を特異的に、迅速に、且つ効率的に抽出、分離および検出するために、核酸プローブ中のハイブリッド形成部位の配列は、少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでいることが望ましい。一方、ハイブリッド形成部位の配列中のヌクレオチド数の上限は特に制限されないが、通常１００個以下、好ましくは８０個以下である。この上限は、ヌクレオチドの合成における経済面および効率を考慮して選択される。
【００２１】
本発明において使用する核酸プローブの固定化部位の配列は、第１級アミノ基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含有する。その配列は、通常１〜２０個、好ましくは３〜１５個のヌクレオチドから構成される。
核酸プローブの固定化部位の配列中の第１級アミノ基を有するヌクレオチドとしては、例えばデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）が挙げられるが、担体粒子表面に存在するカルボキシル基との反応性が高いという点で、ｄＡおよびｄＣが好ましい。第１級アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、一種類のヌクレオチドで構成されていてもよいし、２種類以上のヌクレオチドで構成されていてもよいが、ハイブリッド形成の相手となる標的核酸中の特定の配列以外の配列と偶然に相補的な配列の発生を避けるために、１種類のヌクレオチド、特にｄＡまたはｄＣ、で構成されることが望ましい。本発明で使用される核酸プローブが標的核酸の検出工程における酵素反応に影響を与えないために、粒子と核酸プローブとの接合部位がプローブの配列の３’末端の塩基であることが好ましい。さらに、３’末端の塩基を化学修飾することによって、その意図する効果がさらに増大するかもしれない。この化学修飾には、例えばアルキル基、アミノ基、ニトロ基等の官能基を３’末端の塩基に導入する方法がある。
【００２２】
［核酸プローブ粒子の調製］
本発明において使用する核酸プローブを担体粒子へ固定する法として、例えば特開平７−７５５９９号公報および特開平６−３３５３８０号公報に記述されている方法が適用される。
簡潔に述べれば、核酸プローブ１当量分と核酸プローブのハイブリッド形成部位と相補的であるＤＮＡ１当量分とをアニーリング緩衝液中で混合し、８０℃で５分間加熱した後、徐々に室温に戻し、２本鎖のＤＮＡを形成する。この２本鎖のＤＮＡをヒドロキシアパタイトカラムに通して精製した後に、脱水縮合剤と共に担体粒子の分散に添加し、加熱することによって、核酸プローブの固定化部位の配列中の第１級アミノ基がアミド結合により粒子表面に存在するカルボキシル基に固定される。
【００２３】
ここで言う脱水縮合剤とは、例えば１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド類、そしてＮ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒドロキノリン等も含有する水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、これらに加えて、油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。
粒子の使用量は、通常核酸プローブ１ミリモル当り、約０.１〜５００ｇ、好ましくは約５〜５０ｇである。核酸プローブの粒子への固定化は、約ｐＨ３〜１１程度の水性媒体中、４〜７０℃において、５分から一夜の間で実行されればよい。
【００２４】
次に、この粒子に固定化された核酸プローブ中のハイブリッド形成部位に結合した相補的な配列を離脱させることによって、本発明において使用する核酸プローブを有する粒子が得られる。上記のこの際、前記の相補的な配列の離脱は、熱またはアルカリ変性により達成されることができ、その後このように離脱された相補的な配列は、遠心分離、濾過等の手段によって除去することができる。
標的核酸の捕捉を実現するために、核酸プローブを有する粒子が、前記に示す方法において処理された生物学的液体、特に血清等の検体に、核酸プローブと標的核酸の特定の配列との間においてハイブリッド形成を可能とする条件下において添加される。
【００２５】
本発明において、ハイブリッド形成の条件は、標的核酸の形態および特定の配列によって異なるが、一般的に塩濃度が０.２モル〜１０モル、温度が１０℃〜７０℃、時間が１０分〜１００分であるように選択される。
本発明により分離される標的核酸がウィルスまたは細菌のゲノムから誘導される場合、標的核酸を含むゲノムの高次三次元構造を破壊するために、核酸プローブを有する粒子を加える前または加えてから反応系全体を約５０℃〜約７５℃で一度加熱することが望ましい。ゲノムはウィルスまたは細菌のゲノムでもよいし、または検体が収集され、そして標的核酸が注入されるヒトまたは動物のゲノムであってもよい。
【００２６】
ハイブリッド形成反応中は、界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を、系の核酸プローブ粒子の安定性および分散性を維持するために、ハイブリッド形成反応系に加えられることが望ましい。例えば、ノニオン性界面活性剤の約０.１重量％〜２０重量％が系に加えられてもよい。適当なノニオン性界面活性剤の例には、TRITON(r) X シリーズ、TWEEN(r) シリーズ、BRIJ(r) シリーズ（全てシグマ社製）が含まれる。それらのノニオン性界面活性剤のいずれも上記の濃度において系に加えられてもよい。
また、それらの界面活性剤と同様な分子構造を有する反応性モノマーのいずれも重合時に粒子に加えられることによって、界面活性剤を粒子表面に予め含有させていてもよい。
【００２７】
本発明の方法による粒子によって捕捉された標的核酸は、もし必要であれば、熱やアルカリにより粒子から分離することができる。
【００２８】
本発明の方法により捕捉された標的核酸の検出は、
【００２９】
血清等の検体中に存在する標的核酸が極く微量であるので、例えばポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ）または逆転写ポリメラーゼ増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）のような核酸増幅法を利用し、増幅された核酸を検出することで行われる。
そのような核酸増幅法において、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、標的核酸を捕捉した粒子を直接ポリメラーゼ増幅反応系に加えることが適切である。
検体中の他の成分と標的核酸との先立って行われた特定の分離処理のため、その核酸増幅反応は、検体中に存在し得るいかなる反応抑制剤からも影響を受けない。特に血清等に対して、ＰＣＲ法或いはＲＴ−ＰＣＲ法は血清成分由来の反応抑制剤の影響を受けず、通常の溶液系反応で検出される時のものと同等の感度において標的核酸の検出を可能とする。
【００３０】
増幅された核酸の検出は、当該技術分野において知られているいかなる検出方法、特に紫外線下においてビジュアル化する方法、或いはラベル化された核酸プローブとのハイブリッド形成反応を利用する方法のいずれによっても実施できる。特に簡単に利用できる方法は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色し、紫外線下において増幅産物を検出することから構成される。この方法において、核酸プローブ粒子を増幅反応産物と共にゲルに加えてもよい。また、もし必要であれば、予め増幅領域に対応するプローブが固定されたウェルを有するプレートを使用することも可能である。そのようなプレートを使用する場合、増幅産物のある領域がウェルに固定化されているプローブとハイブリッドを形成しやすく、増幅産物のその他の領域に対応するもう一つのラベル化されたプローブが使用されれば、前記同様の方法で増幅産物を検出できる。
【００３１】
さらなる局面によると、本発明は上記の核酸プローブを有する粒子からなる、生物学的液体検体中または生物学的液体から誘導された検体中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出するためのキットと標的核酸を検出する方法に関するものである。さらに、そのキットは適切に、標的核酸を増幅する方法、特にＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ法による増幅による方法を包括する。
本発明を以下の実施例に基づき具体的に説明する。
【００３２】
【実施例】
実施例１
ポリマー粒子の生成
１） 高比重ポリマー粒子
スチレン５０ｇ、２,４,６−トリブロムフェニルメタクリレート４５ｇ、メタクリル酸５ｇ、過硫酸カリウム１ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１ｇ、水１０００ｇを窒素雰囲気下に７０℃で１０時間乳化重合することで、粒子径約０.３μｍ、粒子比重約１.４を有するカルボキシル基変性された高比重ポリマー粒子を得た。
２）磁性ポリマー粒子
スチレン５０ｇ、メタクリル酸５ｇ、ジビニルベンゼン３ｇ、油性の磁性流体（松本油脂（株）ＭＡ２００）３０ｇ、ベンゾイルペルオキシド３ｇを均一に混合し、次いでこれをラウリル硫酸ナトリウム５ｇを含む水溶液１０００ｍｌ中に分散し、７０℃で１０時間の重合を行った。
重合後、そのポリマー混合物を市販磁石を用いた磁気沈澱精製と溶剤精製にかけることで、粒子径約０.８μｍ、磁性体含量約３０重量％、粒子比重約１.２５を有する磁性ポリマー粒子を得た。
【００３３】
実施例２
１） ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子の調製
ＨＩＶ−ＲＮＡを標的核酸とする核酸プローブは、 Science Vol.227,484-495,1985にて記載されたＨＩＶタイプ−１の配列に基づき、下記のように調整された。
オリゴヌクレオチド A(+) は以下の配列を有する。
５'-GTT TAG CAT GGT GTT TAA ATC TTG TGG GGT GGC TCC TTC CCC CCC CCC -３'前記配列において、５’末端の３８塩基分はＨＩＶ−ＲＮＡに対応し、ハイブリッド形成領域を構成するもので、３’末端の１０塩基分はプローブ粒子表面の固定反応に使用される領域であり、固定化部位を構成する。
Ａ（＋）およびその相補鎖Ａ（−）は通常の化学固相合成法で調整された。Ａ（−）の配列はＡ（＋）のハイブリッド形成領域に対し相補的であるが、３’末端の１０C塩基分に欠ける。これらのＡ（＋）およびＡ（−）は下記の実験に先立って、ＯＰＣカラム（Oligonucleotide Purification Cartridge column; Perkin Elmer）で精製された。
合成ポリヌクレオチドＡ（＋）およびＡ（−）をそれぞれ６０ｎｍｏｌ取り、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、（６０ｍＭ 塩化マグネシウム、６０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ  塩化ナトリウムよりなる、１００ｍＭ  トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８を有する）１０倍アニーリング溶液を１０μｌ加え、減菌蒸留水で１００μｌに調製した。
【００３４】
これを８０℃のウオーターバスで１０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時間５時間）。この反応によりＡ（＋）とＡ（−）が、２本鎖DNAを形成した（以下、２本鎖核酸Ａという）。
次に、ハイブリッド形成されていない１本鎖オリゴヌクレオチドを除去するため、上記で得られた反応生成物を１０ｍｌのヒドロキシアパタイト（Bio Rad社製ＡＧ５０１−Ｘ８＆ＭＳＺ５０１）を含有するカラムに通した。その後、０.１５ｍＭと０.５ｍＭのリン酸緩衝液で展開され、各画分の２６０ｎｍにおける吸光度が測定された。この方法によって、ハイブリッド形成されていない１本鎖核酸と反応生成物の２本鎖核酸が別々に分離され集められた。
２本鎖核酸の回収率は約９１％であり、回収された画分の２.５容量分のエタノールが反応生成物に加えられ、その後−７０℃で２０分間静置後、１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈澱物を回収、７０℃容量％エタノール溶液でリンスした後、（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる ）ＴＥ緩衝液に溶かして、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量され、以下の固定化反応において使用された。
【００３５】
実施例１の１）で生成された高比重ポリマー粒子の１０（ｗ／ｖ）％を含む０.０００１Ｎ塩酸懸濁液を１０００μｌ、上記で調製された２本鎖核酸プローブＡを１０ｎｍｏｌ、１−エチル−３−（Ｎ,Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドの０.５（ｗ／ｖ）％を含む０.０００１Ｎ塩酸溶液を５００μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定した恒温槽中で一晩混合することにより、２本鎖核酸Ａをアミド結合の形成を利用して１本鎖の固定化領域を介して粒子に結合させた。次に、５,０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）で２分間遠心分離にかけられ、粒子の沈澱が回収された。沈澱分は減菌蒸留水で再分散され、８０℃のウオーターバス中で加温されてから、直ちに、０℃の氷水に浸され、５分間放置後、−２０℃で５,０００ｒｐｍで３分間遠心分離され、分離した上清が除去された。この操作により核酸プローブＡ（＋）の相補鎖Ａ（−）が粒子から除去された。次に、（５００ｍＭ  塩化ナトリウム、０.１（ｗ／ｖ）％  ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸よりなる，１０ｍＭ  トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８を有する）結合用緩衝液を粒子沈殿物に１ ｍｌ添加することにより、ハイブリッド形成用担体粒子を緩衝液内に再分散させた後、５,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ハイブリッド形成用担体粒子を回収した。この操作を３回繰り返して、毎回ハイブリッド形成用担体粒子を洗浄し、最終的に担体は再度（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる ）ＴＥ緩衝液１０００ｍｌに再分散された。
【００３６】
２） ＨＩＶ−ＲＮＡの分離および検出
ａ）イソプロピルアルコール抽出法による分離
ＨＩＶ−１タイプウィルスを含有するヒト血清の検体を、正常なヒト血清を用いて１０倍ずつの希釈列を調製した。これらの希釈された血清０.３ｍｌづつに、５Ｍのグアニジニウムチオシアネート（ＧＴＣ）および１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）０.１ｍｌを加えて、７０℃で５分間放置後、イソプロピルアルコール１ｍｌを加えて、室温で５分間静置後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去してから残ったペレットを１ｍｌの減菌蒸留水中に再分散し、続いてその中の５０ｍｌを鋳型として、以下に示すようにＲＴ−ＰＣＲ反応およびNestedＰＣＲ反応により増幅した。
ｂ）本発明の粒子法による分離
上記の希釈されたＨＩＶ−１ウィルス含有血清の０.３ｍｌづつに、５Ｍ  ＧＴＣおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含む溶液０.５ｍｌを加えて、７０℃で５分間放置後、上記で調製したＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子分散液（５重量％）１０μｌと界面活性剤Triton X-100の２０％溶液１００μｌを加えて、室温で１０分間静置後、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈澱した粒子を回収した。その粒子を０.２Ｍの塩化ナトリウム水溶液１ｍｌに再分散し、遠心洗浄し、ペレットを５０μｌの減菌蒸留水に再分散した後、そのまま上記のイソプロピルアルコール分離法によって調整された検体と同様にＲＴ−ＰＣＲ増幅反応処理およびNestedＰＣＲ増幅反応処理にかけられた。
【００３７】
ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ反応およびNestedＰＣＲ反応による増幅
ＲＴ−ＰＣＲ増幅には、Gene Amp rTth RT PCRキット（パーキンエルマー社製）が使用された。使用された試薬組成および反応条件は、キットの製造者によって提供されたマニュアルに従った。また、ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記の配列を有するものが使用された。
プライマーＳＫ１４５Ａの配列（逆転写反応兼用）：
５’−ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ−３’
プライマーＳＫ４５１Ａの配列：
５’−ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ−３’
１ｓｔ ＰＣＲの産物を５μｌを取り、２ｎｄ ＰＣＲ増幅（NestedＰＣＲ）を行った。
２ｎｄ ＰＣＲのプライマーは以下の通りである。
ＳＫ１４５：５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３’
ＳＫ４３１：５’−ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ−３’
【００３８】
なお、上記の増幅反応において、サーモーサイクラーGene Amp 9600（パーキンエルマー社製）が使用された。
ＲＴ−ＰＣＲ法およびNestedＰＣＲ法によって増幅された各反応産物を２％のアガロースゲル（Agarose 1600、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で電気泳動にかけて、エチジウムブロマイドで染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。４つの別個の検体を使用して得られた結果を表１に示した。
表１は、本発明の粒子法を用いてヒト血清とＨＩＶ−ＲＮＡとを分離する場合に、イソプロピルアルコール抽出法を用いて分離するよりも、少なくとも１００倍以上の希釈倍率においてＨＩＶ−ＲＮＡの検出が可能であることを示している。
【００３９】
【表１】
0004380807.tif 000002
【００４０】
実施例３
ＨＣＶ−ＲＮＡの検出
１）ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子の調製
実質的に実施例２の１）と同様な手順で、様々なＨＣＶ核酸プローブを調製した。その核酸プローブの配列は、岡本らの論文（Okamoto, H. et al., Japan. J. Exp. Med., Vol. 60, pp.167-177. 1990)に掲載されたＨＣ−１株の配列を参考にした。コンピューターシュミレーション（ソフト  Geuetyx、 ＳＯＣ社製）による二次構造、ＧＣ含有率、融点温度（Ｔｍ）および他のパラメーターを考慮し、以下のプローブを選定した。
【００４１】
0004380807.tif 000003
【００４２】
なお、ＤＮＡ製造に使用されるカラムのうち、 PAおよびPBには３’ＤＮＰ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ、PCおよびPDには３’−Ａｃｒｉｄｉｎｅ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ、PE、PF、PGおよびPHには３’−ＤＭＴ−Ｃ6Ａｍｉｎｏ−ＯＮ(TM) ＣＰＧ（いずれもクロンテック（株）製）を使用した。
それぞれが対応するプローブの３’末端の１０Ｃ塩基分を欠く、これらプローブの相補鎖も、上記に示される手順で調製した。
実施例２の１）に示されるように、各々の核酸プローブをその相補鎖と同当比で混ぜ合わせ、アニリングし、二本鎖核酸を形成し、精製後、使用に供した。
続いて、実施例１の２）で調製した磁性ポリマー粒子を用いて、上記のプローブPA 〜 PHの二本鎖核酸をそれぞれ磁性ポリマー粒子に化学結合させ、これらのプローブの一つを有する磁性ポリマー粒子の分散液を得るために、実施例２の１）に示されるように処理した。 このように、プローブPA 〜 PHのそれぞれについて、それらのプローブが固定された磁性ポリマー粒子の分散液を得た。
【００４３】
２）相補的オリゴヌクレオチドを捕獲および分離するためのキャパシティーに関する、ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子の評価
相補的オリゴヌクレオチドの32Ｐによる標識
プローブPA 〜 PHのそれぞれについて、（実施例２に示されるような）３’末端を欠く相補鎖オリゴヌクレオチドPA（−）〜 PH（−）を次のようにして32Ｐにより標識した。
２ｎｍｏｌのＡ（−）を含有する水溶液を１μｌ、８Ｕの酵素活性を有するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１μｌ、γ−32Ｐ−標識付きアデノシン三リン酸（１０μＣｉ／μｌ ）を５μｌ 、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液を５μｌおよび減菌水３９μｌを、２ｍｌエッペンドルフ遠心管に入れ、混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。
なお、上記で用いた１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は、次の組成を有するものである。
【００４４】
組成：
０.５Ｍ／ｌ トリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７.６
０.１Ｍ／ｌ 塩化マグネシウム
５０ｍＭ／ｌ ジチオスレイトール
１ｍＭ／ｌ スペルミジン
１ｍＭ／ｌ エチレンジアミン四酢酸
次に、反応混合物からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼをフェノール抽出法（see Sambrook at al.,“Molecular Cloning” reference cited above, P458）によって除去した後、反応混合物を（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる）ＴＥ緩衝液と均衡を保つセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）を有する１ｍｌのカラム通じてゲル濾過に供した。
ゲル濾過により溶出され分割された１００μｌずつの各画分を順に摂取し、各画分の放射線量をチェレンコフーカウント法によって測定して、カラムを通過した画分を判別し集めた。その結果、32Ｐによって標識された２つのオリゴヌクレオチドのそれぞれを有するＴＥ緩衝液２００μｌが得られた。これらは、各々が１μｌ当り４００,０００ｃｐｍのカウントの放射線量を有する溶液であった。
【００４５】
上記１）下において調整された核酸プローブPAを有する磁性ポリマー粒子の１０（ｗ／ｖ）％分散液（１００ｐｍｏｌｅプローブ核酸含有）の１００μｌを８本のエンペドルフチューブにそれぞれ入れた。標的核酸として、上記で調整された32Ｐによって標識された（約４００,０００ｃｐｍのチェレンコフカウントを有し、１０ｐｍｏｌに相当する）PA（−）を１μｌ、および上記１）下において調整された１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０ｐｍｏｌの未標識のＡ（−）をそれぞれ、８本のエペンドルフチューブのそれぞれに加えた。減菌蒸留水を加えて全体の容量を１８０μｌとし、各チューブのチェレンコフカウントを測って、それらの値をカウント１とした。
上記のように調製した８本のエペンドルフチューブすべてを８０℃のウォーターバスに入れ、１０分間加熱後、直ちに氷水に入れ、５分間静置後に、５Ｍ塩化ナトリウム２０μｌを各チューブに加えて、次いで４０℃のウォーターバスで５分間加熱し、ハイブリット形成体を調製した。次に、結合した核酸と遊離している核酸とを分離するために、各チューブに市販磁石を１分間あて、未反応の標的核酸を含む上清を除去し、沈澱物を結合用緩衝液で２回洗浄し、最終的に（１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液および１ｍＭ EDTA、ｐＨ８.０よりなる ）ＴＥ緩衝液に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、チュレンコフカウントを測定した。それらの値をそれぞれのチューブのカウント２とした。
【００４６】
次に、各検体を磁気分離して、沈澱物を減菌蒸留水１００μｌ中に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、６５℃のウォーターバス中で１０分間静置後、直ちに氷水により冷却した。５分後、１０,０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄し、上清を除去した後、沈澱物を減菌蒸留水に再分散し、全体の容量を１００μｌとし、チュレンコフカウントを測定した。それらの値をそれぞれのチューブのカウント３とした。
標的核酸の捕獲率（［捕獲核酸量］／［標的核酸量］×１００％）および捕獲した核酸の分離率（［分離核酸量］／［捕獲核酸量］×１００％）を以下の表２にまとめた。
他の核酸プローブPBからPHまでについても、同様な手順で処理および評価を行い、それらの結果も以下の表２にまとめた。
表２は、商用検定に適応する時間内および条件下において、相補的なオリゴヌクレオチドの９０％以上を捕獲する、および捕獲されたオリゴヌクレオチドの９０％以上を分離するためのＨＣＶ核酸プローブを有する考察される個々のポリマー粒子のキャパシティーを示している。それらの検定結果は、それらの粒子を用いた商用検定において、高いパーセンテージのＨＣＶ−ＲＮＡの捕獲および分離が見込めるということを証明している。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
３） ＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子によるＨＣＶ−ＲＮＡの抽出および検出
上記で調整されたＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡが分離された。抽出実験は、遠心分離操作の代わりに市販磁石を、粒子を含有する懸濁液に１分間当てることを除いて、実施例２の２）のｂ）に示される手順で実行される。簡潔に述べると、ＨＣＶ−ＲＮＡを含有するヒト血漿３００μｌに、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ ＡｍｐｌｉｃｏｎTM ＨＣＶキット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＵＳＡ）６００μｌを加え、室温にて１０分間静置後、１０重量％のＨＣＶ核酸プローブを有する磁性ポリマー粒子を含む懸濁液１０μｌおよびハイブリ緩衝液（３０％ Triton X-100溶液）３００μｌを入れ、そのまま６０℃で１０分間、２５℃で１０分間静置し、磁気分離後、０.４Ｍの塩化ナトリウム溶液１ｍｌで分離された粒子を洗浄し、再分散後、再度磁気分離を行ってから、沈澱分に上記キットの検体希釈剤を加えて、希釈剤中に再分散させた。該分散液はそのままＰＣＲの鋳型として使用された。なお、ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、上記キットの操作方法に示される手順で行われた。
【００４９】
核酸プローブPAからPHまでを有する磁性ポリマー粒子を用いて得られた実験結果を以下の表３にまとめた。該実験結果は、プローブPB、PE、およびPFを有する粒子は、少なくとも５つのＨＣＶウィルスを有するサンプルのすべてからＨＣＶウィルスの検出を可能にするということを証明している。該粒子は、本発明によるＨＣＶ−ＲＮＡの分離および検出に特に有益である。
【００５０】
【表３】
0004380807.tif 000005
【００５１】
実施例４
ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子は、上記において使用されたポリマー粒子の代わりに、粒径が約０.５μｍで、表面積１ｎｍ2当り５個のカルボキシル基を有する、比重が約１.０５のポリスチレンラテックスが使用されたこと以外は、実施例２の１）において記述されるように調整された。簡潔に述べると、核酸プローブは２本鎖核酸に変換されるように、上記に示されるように処理された後に、粒子に化学的に固定化され、最終的に核酸プローブの相補鎖を熱処理により除去し、ＨＩＶ核酸プローブを有するポリマー粒子の分散液が得られた。
手順は実施例２の２）のｂ）の方法と同様であるが、上記において得られたポリマー粒子を使用した。しかしながら、ＨＩＶ−ＲＮＡの捕捉およびＰＣＲ反応による検出を行ったが、０.３ｍｌの血清検体と０.５Ｍ／ｌのＧＴＣおよび１０ｍＭ／ｌのＤＴＴを含有する溶液０.６ｍｌ加えた系において、５０００ｒｐｍ×３分間では粒子の回収ができず、該系をさらに過酷な条件下、１５０００ｒｐｍ×１５分において遠心分離したときでさえ、粒子は遠心管の下部に行かず、血清／ＧＴＣ／ＤＴＴ混合液の上部に集まり、粒子相と溶液相の２相に分かれたが、その境界面が不明瞭で、回収後、粒子相の容量は約０.３ｍｌとなった。これを、実施例２の２）のｃ）において示されるようなＲＴ−ＰＣＲ反応系およびＰＣＲ反応系で処理したが、ＨＩＶ−ＲＮＡに対応する増幅された核酸は検出できなかった。
上記の例は、ポリマー粒子の比重の重要性を特に示している。比重約1.05を有するポリマー粒子を用いても、低速遠心では粒子を沈殿させることはできない。
【００５２】
実施例５
実施例４で回収された遠心管上部にある粒子相０.３ｍｌに、減菌蒸留水を１５０Ｍｌずつ加えて、再度１５０００ｒｐｍ×１０分で遠心分離を行った。この操作を５回繰り返したところ、０.３ｍｌの粒子相溶液への０.７５ｍｌの減菌蒸留水の添加に対応して、系の遠心分離によって粒子をペレットとして回収することができた。このときの系はＧＴＣ／ＤＴＴ溶液を２.５倍希釈したものからなっていた。
回収された粒子のペレットを実施例２の２）のｃ）に示されるように、 ＲＴ−ＰＣＲ反応系およびＰＣＲ反応系で処理したが、以下の表４に示されるように、ＨＩＶ−ＲＮＡに対応する増幅された核酸は検出できなかった。
コントロールとして、 ＧＴＣ／ＤＴＴの非希釈系、ＧＴＣ／ＤＴＴ系の０.５、１.０、１.５、２.０、２.５倍希釈した溶液が調整され、血清に添加された。これらは実施例２の１）のａ）に示されるようなイソプロピルアルコール抽出方法に従って処理および評価された。その結果も表４に示す。
【００５３】
表４は、０.５ｍＭ／ｌのＧＴＣを含有するＧＴＣ／ＤＴＴ溶液を少なくとも１.０倍以上希釈した場合、検体の一つに、増幅産物の減少が見られることを示している。この減少は、おそらく血清検体中に存在するリボヌクレアーゼによるＨＩＶ−ＲＮＡの分解によるものと思われる。
前述の部分において詳細に示される本発明によると、特定の核酸プローブを有する粒子を使用して、生物学的液体の検体から誘導される検体に含有されるウィルスまたは細菌の標的核酸を容易に分離できる。特異的に、本発明による粒子を用いる標的核酸の捕捉は、高感度で簡便に、且つ短時間で済む。加えて、本発明の方法によると、捕捉された標的核酸を粒子から解離することなく、単に標的核酸を捕捉した粒子をポリメラーゼ増幅反応系に加えることによって捕捉された標的核酸を容易に検出できる。このように、本発明の方法は臨床検査センターや病院の検査において有利に利用できる。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
以下、本発明並びにその好ましい実施態様についてまとめて説明する。
１.血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）血液の血清および／または血漿からウィルスまたは細菌を含む液体画分を得る工程、
（ｂ）液体画分中に標的核酸を溶出するためにウィルスまたは細菌を溶解する工程、
（ｃ）細菌またはウィルスの標的核酸をハイブリッド形成によって捕獲するために、特定の配列のウィルスまたは細菌の標的核酸に対して実質上相補的である核酸プローブを比重１.１から２.５を有する粒子に化学的に結合することによって得られる、核酸プローブを有する粒子を（ｂ）の工程で得られた溶解物に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において得られた系からウィルスまたは細菌の標的核酸を捕捉した粒子を回収する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収した、標的核酸を捕捉した粒子を、予め粒子から標的核酸を溶出させることなしに、直接ポリメラーゼ増幅反応または逆転写ポリメラーゼ増幅反応に付しついて増幅された核酸を検出する工程
よりなる方法であり、前記工程（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の前、或いは途中で、蛋白質変性剤を添加することを特徴とする方法。
２.核酸プローブを有する粒子の担体粒子が、その表面上にカルボキシル基を有する水不溶性のポリマー粒子である、前記１の方法。
３.核酸プローブを有する粒子が磁性粒子である、前記１および２の方法。
４.核酸プローブを有する粒子の平均サイズが約０.０５〜５μｍ、好ましくは約０.１〜３μｍである、前記１〜３のいずれかの方法。
５.検体が血清等である、前記１〜４のいずれかの方法。
【００５６】
６.蛋白質変性剤が約０.１〜５モル／ｌ、好ましくは約０.２〜４.５Ｍモル／ｌの濃度で使用されるグアニチュームチオキシアネート（ＧＴＣ）である、前記５の方法。
７.標的核酸がＲＮＡである、前記１〜６のいずれかの方法。
８.標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡまたはＨＣＶ−ＲＮＡである、前記７の方法。
【００５７】
９.前記１〜４のいずれでも定義される粒子からなる、血液の血清および／または血漿中のウィルスまたは細菌の標的核酸を検出するためのキット。
１０.さらに標的核酸を増幅するための方法を含む、前記９のキット。
１１．ＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法によって標的核酸が増幅する方法を含む、前記１０のキット。
１２．標的核酸がＨＩＶ−ＲＮＡまたはＨＣＶ−ＲＮＡである、前記９〜１１のいずれかのキット。