(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均重合度が７００以下、平均粒子径が１０．３μｍ以下であり、コロイド状セルロース成分を４０質量％以上含有し、ジエチルエーテル可溶物含有率が１質量％未満の水不溶性天然セルロース系物質を、セルラーゼの存在下で酵素分解することを含むセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記セルラーゼの活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が０．３５以下である請求項１に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記ジエチルエーテル可溶物が、リグニンである請求項１または２のいずれか一項に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記水不溶性天然セルロース系物質が、セルロースＩ型結晶を含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系材料を酵素分解し、セロオリゴ糖を得る方法に関する。特に、本発明は、平均重合度、平均粒子径、コロイド状セルロース成分含有率、ジエチルエーテル可溶物含有率を特定の範囲に制御した水不溶性天然セルロース系物質を基質とし、β−グルコシダーゼ活性と結晶セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）を特定の範囲に制御したセルラーゼを用いて酵素分解することで、短時間にセルロース分解率を高め、セロオリゴ糖を選択的に高収率で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、及びセロヘキサオースの総称であり、グルコピラノース単位が１〜６個、β−１，４結合した少糖類である。
近年、セロオリゴ糖は、他のオリゴ糖と同様に、その生理機能が明らかになりつつあり、機能性食品の新素材として期待されている（非特許文献１）。
セロオリゴ糖は、その重合体であるセルロースを酵素で加水分解することで得られるが、天然に存在するセルロースは、水に難溶性であり、結晶性が高いために、セルラーゼによる酵素分解を受け難いことが課題であった。
さらに、セルロースの酵素分解反応では、分解生成物として得られたセロオリゴ糖が、セルラーゼ中の一成分であるβグルコシダーゼにより、さらにグルコース単位へ分解され、セロオリゴ糖の収率が低下することも課題であった（非特許文献２）。
上記の課題に絡み、従来、セルロース酵素分解時のセロオリゴ糖の収率向上を目的として多くの試みがなされてきた。
【０００３】
特定のセルロースを使用したセロオリゴ糖の製造方法としては以下のものが挙げられる。
特許文献１には、非結晶性セルロースを多く含むセルロース原料を用い、セルラーゼによる加水分解反応をリグニンの存在下で行わせるとともに、加水分解反応により生成されるセロオリゴ糖のうち少なくともセロビオースを随時反応液から採取するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。
特許文献２には天然リグノセルロースを含む原料を蒸解して蒸解後に乾燥を経ず得られるウェットパルプを、セルラーゼにより部分加水分解してセロオリゴ糖のうち少なくともセロビオースを採取するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。これらの製造方法は、セルラーゼに含まれるセロオリゴ糖分解酵素であるβ−グルコシダーゼをリグニンに吸着させ、β−グルコシダーゼの作用を抑止させることで、セロオリゴ糖のグルコースへの分解を抑制し、セロオリゴ糖の反応選択率を高められるものである。しかしながら、これらの製造方法では、得られる糖化液に多量のリグニンが含まれるため、結果としてセロオリゴ糖の収量が低くなる。また、高純度のセロオリゴ糖を得るには、糖化液からの脱リグニン処理が必要となるため精製工程が複雑となる問題があった。
【０００４】
特許文献３には、１−２０質量％のリグニンを含有するリグノセルロースをセルラーゼ及び白色腐朽菌等のリグニン分解菌とともに反応することで、セロオリゴ糖の１種であるセロビオースを製造する方法が記載されている。この方法では、セルロースの脱リグニン処理を経ずに、セルラーゼの基質に対する作用を高めることができるが、その分解生成物にはセロビオース以外にリグニン分解物が混入するため、上記と同様にセロオリゴ糖の収量が低くなる。また、高純度のセロビオースを得るには、リグニン分解物の除去工程が必要となり、精製工程が複雑となる問題があった。
特許文献４には、セルロースをアミンオキシド、塩化リチウム／Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、銅アンモニア、ビスコース等の溶剤に溶解したセルロース溶液中にセルラーゼを添加した後、得られた溶液からセルラーゼ含有再生セルロースを得、次いで該再生セルロースを緩衝液存在下で、セルロース中に包含されたセルラーゼに酵素反応を行わせてセロオリゴ糖を産生させるセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。かかる方法では、セルラーゼに精製等の特別な前処理を施す必要はなく、セロオリゴ糖の収率が向上するが、セルロースを溶解再生させる工程が必要であり、工程が煩雑になる問題があった。また、セルロース溶解に用いるアミンオキシド、塩化リチウム／Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、銅アンモニア、ビスコース等の化学物質が少なからずセルラーゼに作用し、セルロース分解反応に影響を及ぼす問題があった。
【０００５】
特許文献５には、保水度が２３０ないし２８０％であり、かつ濾水度が５５０ないし６４０ｍｌの晒スラッシュパルプを原料とするセロビオースの製造方法が記載されている。ここでいうスラッシュパルプとは、蒸解・漂白処理後の未乾燥パルプのことであり、これを原料とすることで確かにセロビオースの生成量が向上するが、未乾燥スラッシュパルプは、保水度が高いが故に、酵素分解時の基質濃度が制限されるため、セロオリゴ糖の生産性が悪くなる問題があった。
特許文献６には、セルロースを含有する材料からセルロース成分を超臨界又は亜臨界水で可溶化した後、処理液にセルラーゼ製剤を添加し、セルロース及びセルロースの部分分解物である高重合度セロオリゴ糖をセルラーゼ製剤により加水分解することによって、グルコース及び／又はセロオリゴ糖を得る方法が記載されている。この方法によると、セロビオース、セロトリオース等のセロオリゴ糖の生成量、収率ともに向上するが、超臨界、亜臨界水処理に要する、耐圧・耐酸設備等の設備上の安全性、加圧・加熱をする上での安全性等のセルロース前処理の安全性が問題となる課題があった。
【０００６】
特許文献７には、セルラーゼ反応基質として、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の値が１０％〜８０％であり、かつ保水度が２００％〜１０００％であるパルプを用いるセロオリゴ糖の製造方法、及びそのパルプにフィブリル化処理、メカノケミカル処理、化学的処理のいずれか一つ又は複数の処理を施すセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。かかる方法によると、セロビオースの生成量、セルロースの分解率が向上するが、セルロースとして保水度の高い繊維状のパルプを使用するため、フィブリル化処理、メカノケミカル処理、化学処理等の前処理、及びそれに続く酵素分解、オリゴ糖の精製等の各製造工程で、つまりを生じる、基質濃度が制限される等の、セロオリゴ糖の生産性が悪くなる問題があり、本発明の如く、平均重合度、平均粒子径、コロイド状成分含有率等を高度に制御し、酵素分解を含む各工程での処理性を高めたものとは本質的に異なるものである。
【０００７】
また、特定のセルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することで、セロオリゴ糖の収率を向上させる方法としては、以下の特許文献８−１１が挙げられる。
特許文献８には、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。この方法によると、セルロース系物質の酵素分解による分解生成物として、セロビオース、セロトリオースのみからなるセロオリゴ糖が得られる。しかしながら、セロビブリオ属微生物が生産する酵素は結晶性のセルロースには作用しにくく、反応時間を短縮し、収率を向上するためには基質として非晶質セルロースが必要であり、工程が複雑になる問題があった。
特許文献９には、セルロースをセルラーゼで分解し、セロオリゴ糖を生成させる方法において、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。かかる方法によると、セルロースの酵素分解により、グルコースを低減し、セロオリゴ糖が６０％以上の分解生成物を得ることができる。しかしながら、該方法では、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを除去する工程が必要となり、セロオリゴ糖製造工程が複雑になる問題があった。また、このセルラーゼ精製工程では、未処理セルラーゼに対し、７５〜１０００倍の陽イオン交換樹脂が必要となるため、セルラーゼ処理量が制限され、セロオリゴ糖の生産性が充分ではなく、セルラーゼ精製コスト、陽イオン交換樹脂の分離精製剤コストが高くなる問題があった。
【０００８】
特許文献１０には、セルロースエステル若しくはセルロースエーテルエステルのいずれか、又は両方とセルラーゼとを溶解し、一定時間保温した後、ｐＨを変化させ、不溶化した固形画分と溶液とを分離することによりセルラーゼ中に含有されるβ−グルコシダーゼを選択的に除去するセルラーゼ精製方法、またこのβ−グルコシダーゼを除去されたセルラーゼとセルロースとを水性媒体中に添加して懸濁液とし、該懸濁液を一定時間保温して、該懸濁液中にセロビオースを生成せしめ、該セロビオースを採取するセロビオースの製造方法が記載されている。
特許文献１１には、キトサンが可溶となるようにｐＨを調整してなる水性媒体中に、上記キトサンとセルラーゼを溶解し、一定時間保温した後、ｐＨを変化させ、不溶化した固形画分と溶液とを分離することによりセルラーゼ中に含有されるβ−グルコシダーゼを選択的に除去するセルラーゼの精製方法、またこのβ−グルコシダーゼを除去されたセルラーゼとセルロースとを水性媒体中に添加して懸濁液とし、該懸濁液を一定時間保温して、該懸濁液中にセロビオースを生成せしめ、該セロビオースを採取するセロビオースの製造方法が記載されている。これらの方法によると、セルラーゼをセルロース誘導体又はキトサンで吸着分離処理し、セルロース誘導体又はキトサンに吸着させた状態でセルロースと接触させることで、セロビオース収率が向上する。しかしながら、この方法ではセルラーゼの精製処理が必要となるため、製造工程が複雑になり、セルラーゼ精製に使用するセルロース誘導体、キトサンが高価なためコスト高になる課題があった。また、セルラーゼをセルロース誘導体又はキトサンとともにセルロース酵素分解に用いるため、分解反応液から、それらを取り除く工程が必要になる問題があった。
従来、水不溶性天然セルロース系物質に前処理を施し、その平均重合度、平均粒子径、コロイド状セルロース成分含有率、及びジエチルエーテル可溶物含有率を特定の範囲に制御したセルロース系物質を基質とし、β−グルコシダーゼ活性と結晶セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）を特定の範囲に制御したセルラーゼで酵素分解することで、短時間にセルロース分解率を高め、セロオリゴ糖を選択的に高収率で生産する方法は知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５，Ｎｏ  ２，９１−９７（１９９８）
【非特許文献２】「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行，９７−１０４（１９８７）
【特許文献１】特開平５−３１７０７３号公報
【特許文献２】特開平７−１８４６７８号公報
【特許文献３】特開平８−８９２７４号公報
【特許文献４】特開平８−３０８５８９号公報
【特許文献５】特開平９−１０７０８７号公報
【特許文献６】特開２００１−９５５９４号公報
【特許文献７】特開２００５−６８１４０号公報
【特許文献８】特開平０１−２５６３９４号公報
【特許文献９】特開平０５−１１５２９３号公報
【特許文献１０】特開平０５−２２７９５７号公報
【特許文献１１】特開平０５−２２７９５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、水不溶性の天然セルロース系物質を原料とし、特定のセルラーゼ存在下で酵素分解することで、短時間でセルロース分解率を高め、セロオリゴ糖を選択的に、高収率で生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、前記課題を解決するため水不溶性の天然セルロース系物質を原料とし、平均重合度、平均粒子径、コロイド状セルロース成分、及びジエチルエーテル可溶物含有率を特定範囲に制御し、特定の活性を有するセルラーゼを用いて酵素分解することで、短時間でセルロース分解率を高め、セロオリゴ糖を選択的に、高収率で得ることを見出し、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
（１）平均重合度が７００以下、平均粒子径が１０．３μｍ以下であり、コロイド状セルロース成分を４０質量％以上含有し、ジエチルエーテル可溶物含有率が１質量％未満の水不溶性天然セルロース系物質を、セルラーゼの存在下で酵素分解することを含むセロオリゴ糖の製造方法。
（２）前記セルラーゼの活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が０．３５以下である（１）に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
（３）前記ジエチルエーテル可溶物が、リグニンである（１）または（２）に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
（４）前記水不溶性天然セルロース系物質が、セルロースＩ型結晶を含有する（１）〜（３）のいずれか一項に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の、水不溶性の天然セルロース系物質の酵素分解によりセロオリゴ糖を製造する方法により、短い反応時間でセルロース分解率を高め、セロオリゴ糖を選択的に、高収率で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明について、特にその好ましい態様を中心に、以下具体的に説明する。
本発明で使用する天然セルロース系物質は、セルロースを含有する天然由来の水不溶性繊維質物質である。その由来は、植物性でも動物性でもよく、それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられ、原料としてこれらのうち１種の天然セルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
本発明に使用するセルロース系物質は、天然セルロース系物質である必要がある。天然セルロースと再生セルロースは、その結晶形で区別できる。本発明の天然セルロース系物質は、セルロースＩ型結晶を含有し、その含有率は１％以上である必要がある。より好ましいセルロースＩ型結晶の含有率は５０％以上である。ここでいうセルロースＩ型の結晶型とは、粉末広角Ｘ線回折法（理学電機（株）製、商品名  ロータフレックスＲＵ−３００）により得られるＸ線回折パターンで判別できるものであり、その含有率は、Ｘ線回折により得られた回折像の総ピーク面積に占める、セルロースＩ型結晶のピーク面積の百分率で表されるものである。粉末広角Ｘ線回折測定に供するセルロース系物質が乾燥状態であれば公知の方法で粉末化し測定に用いればよく、湿潤状態であれば、公知の方法で乾燥後、粉末化し測定に用いることができる。セルロースＩ型結晶の含有率が高い程、天然に近いセルロース系物質を酵素分解に使用することになり、セルロースの再生処理等の人工的な化学処理工程が簡略化されることになるため好ましい。その上限は特に制限されないが、現在知られている天然セルロースの組成から９９％未満である。
本発明で使用する天然セルロース系物質は水不溶性であり、ここでいう水不溶性とは、天然セルロース系物質中に９０質量％以上の水不溶性成分を含有することである。この水不溶性成分とは、２５℃の純水にセルロース系物質を分散させ、限外ろ過（分画分子量１００００）により、水可溶性成分を除去した後、水不溶性残さを定量することにより得られる。
【００１４】
本発明で使用する水不溶性天然セルロース系物質の平均重合度は７００以下である。ここでいう平均重合度は、「第１４改正日本薬局方」（廣川書店発行）の結晶セルロース確認試験（３）に規定される銅エチレンジアミン溶液による還元比粘度法により測定できる。平均重合度が７００以下であると、セルロース系物質が攪拌、粉砕、摩砕等の物理処理を受けやすくなるため、そのコロイド状成分量を容易に制御できる。また、水不溶性天然セルロース系物質の平均重合度を上記範囲に制御することで、セルロース系物質中の繊維質が多孔質化するため、酵素分解時の酵素−基質接触確率が増大し、セルロース分解速度が向上する。好ましくは、平均重合度は５００以下、さらに好ましくは、４００以下である。平均重合度は、小さいほどコロイド状成分量の制御、分解速度制御が容易になるため、下限は特に制限されないが、簡便な操作で得られる平均重合度の範囲としては１０を超えることが好ましい。
【００１５】
本発明で使用する水不溶性天然セルロース系物質の平均粒子径は、１００μｍ以下である。ここでいう平均粒子径とは、セルロース系物質を、０．２質量％濃度で水懸濁液とし、高剪断ホモジナイザー（日本精機（株）製  商品名  エクセルオートホモジナイザーＥＤ−７  処理条件  回転数５０００ｒｐｍ  ３分間）で分散させ、そのｐＨを７．５−８．５に調整した後、遠心分離（久保田商事（株）製  商品名  ６９３０型遠心分離器  処理条件  遠心力２０００Ｇ  ５分間）し、遠心後の上澄み成分と、沈降成分に分画し、それぞれの重量比を測定する。次にそれらの成分について水を媒体として、レーザー回折法（堀場製作所（株）製、商品名  ＬＡ−９１０、超音波処理１分）により得られた各成分の体積頻度粒度分布に上澄み成分と沈降成分の重量比を掛け、合成した体積頻度粒度分布における積算５０％粒子径のことである。平均粒子径が１００μｍ以下であると、セルロースを酵素分解する際に、セルロースとセルラーゼの接触面積（アクセシビリティー）が増大するため、セロオリゴ糖の生成速度、収率が向上するため好ましい。より好ましくは、平均粒子径は５０μｍ以下であり、特に好ましくは３０μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下である。平均粒子径は小さいほど、セロオリゴ糖の生成速度、生成選択率、収率が向上するため、下限は特に制限されないが、簡便な操作で得られる平均粒子径の範囲としては０．０１μｍ以上である。
【００１６】
本発明で使用する水不溶性天然セルロース系物質は、コロイド状セルロース成分を１０質量％以上含有する必要がある。ここでいうコロイド状セルロース成分とは、天然セルロース系物質を、０．２質量％濃度で水懸濁液とし、高剪断ホモジナイザー（日本精機（株）製  商品名  エクセルオートホモジナイザーＥＤ−７  処理条件  回転数５０００ｒｐｍ  ３分間）で分散させ、そのｐＨを７．５−８．５に調整した後、遠心分離（久保田商事（株）製  商品名  ６９３０型遠心分離器  処理条件  遠心力２０００Ｇ  ５分間）し、遠心後の上澄みに残存するセルロース固形分の質量百分率のことである。コロイド状セルロース成分の含有量が１０質量％以上であると、セロオリゴ糖の生成速度、生成選択率、収率が向上する。コロイド状セルロース成分の含有量は、より好ましくは、１５質量％以上であり、特に好ましくは、４０質量％以上である。このコロイド状セルロース成分量は、セルロース系物質の平均粒子径と独立して、酵素分解性に作用する因子である。コロイド状セルロース成分量と、セロオリゴ糖の生成速度、選択率、及び収率向上へのメカニズムは明確ではないが、コロイド状セルロース成分が増加することにより、基質となるセルロースが懸濁安定化し、酵素と基質が均一に接触することで、上記の酵素分解性を向上させていると考えられる。コロイド状セルロース成分含有量は、多ければ多いほど、酵素分解性を向上できるため、その上限は特に制限されないが、簡便な前処理により達成される範囲としては、９９．９質量％以下である。
【００１７】
本発明で使用する水不溶性天然セルロース系物質のジエチルエーテル可溶物含有率は、１質量％未満である。ここでいうジエチルエーテル可溶物含有率は、セルロース系物質中のリグニン、リグニン分解物等のジエチルエーテルに可溶の不純物のことであり、「第１４改正日本薬局方」（廣川書店発行）の結晶セルロース純度試験（２）に規定されるジエチルエーテル可溶物の定量法により測定できる。リグニン含有率が１質量％未満の高純度セルロースを用いることで、酵素分解により得られるセロオリゴ糖の純度がより向上する。また、セロオリゴ糖の純度が向上すると、結果として生成収率も向上し、酵素分解後のセロオリゴ糖の精製、セルラーゼの回収が容易になる。より好ましくは、ジエチルエーテル可溶物含有率は０．５質量％以下であり、さらに好ましくは０．３質量％以下である。このジエチルエーテル可溶物含有率は少ないほど、上述のセロオリゴ糖の純度が向上するため、その下限は特に制限されないが、簡便な前処理で達成されるリグニン含有率の範囲は０．０００５質量％以上である。
【００１８】
天然セルロース系物質の平均重合度、平均粒子径、コロイド状セルロース成分含有率、及びジエチルエーテル可溶物含有率が、本発明の範囲を満たすための好ましい処理方法としては、以下のものが挙げられる。
平均重合度、及びジエチルエーテル可溶物含有率を制御する方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、一例としては、加水分解処理が挙げられる。また、この加水分解処理により、セルロース繊維質内部の非晶質セルロース及びヘミセルロース、リグニン等の不純物が取り除かれ、繊維質内部が多孔質化し、酵素分解時に繊維内部までセルラーゼが浸透しやすくなり、セルロースの分解速度、セロオリゴ糖収率がともに向上するため好ましい。
また、加水分解されたセルロース系物質は、繊維質内部が多孔質化しているため、それをさらに公知の方法で処理する場合に、機械処理を受けやすくなり、セルロース系物質の平均粒子径、コロイド状成分含有率の制御が容易になるため好ましい。
【００１９】
加水分解の方法は、特に制限されないが、一例としては、酸加水分解、アルカリ酸化分解、熱水分解、スチームエクスプロージョン、マイクロ波分解等が挙げられる。これらの方法は、いずれか単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。上記のうち酸加水分解を行う場合には、セルロース系物質を水系媒体に分散させた状態で、プロトン酸、カルボン酸、ルイス酸、ヘテロポリ酸等を適量加え、攪拌させながら、加温することにより、容易に平均重合度を制御できる。この際の温度、圧力、時間等の反応条件は、セルロース種、セルロース濃度、酸種、酸濃度により異なるが、目的とする平均重合度が達成されるよう適宜調整されるものである。例えば、上述の酸加水分解反応条件としては、１質量％以下の鉱酸水溶液を使用し、１００℃以上、加圧下で、１０分以上セルロースを処理することで、酸等の触媒成分がセルロース繊維内部まで浸透し、加水分解が促進され、使用する触媒成分量が少なくなるので好ましい。
【００２０】
平均粒子径、コロイド状セルロース成分含有量を制御する方法も、公知の方法であれば特に制限されないが、一例としては、摩砕、粉砕、篩を使用した分級、サイクロン、遠心分離機を用いた遠心分離等が挙げられ、それらは単独で使用しても、２種以上を組み合わせた方法でもよい。また、上述の処理は、湿式でも、乾式でもよく、それぞれ湿式で得られたもの同士を酵素分解前に混合しても、それぞれ乾式で得られたもの同士を酵素分解前に混合しても、湿式又は乾式で得られたものを組み合わせてもよい。
例えば、湿式でセルロースを処理する場合は、１〜９９％のセルロース系物質と媒体を含むセルロース分散体に、公知の摩砕、粉砕等を施すことにより、セルロース系物質の平均粒子径又はコロイド状セルロース成分含有量を容易に調整することができる。ここで使用される媒体も、特に制限はないが、例えば、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、２−メチルブチルアルコール、ベンジルアルコールなどのアルコール類、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類が挙げられる。特に、有機溶剤は、医薬品、食品及びそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
【００２１】
摩砕方法としては、ポータブルミキサー、立体ミキサー、側面ミキサーなどの一方向回転式、多軸回転式、往復反転式、上下移動式、回転及び上下移動式、管路式等の攪拌翼を使用する摩砕方法、ラインミキサー等の噴流式攪拌摩砕方法、高剪断ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー等を使用する摩砕方法、ニーダーを使用した回転押し出し式の摩砕方法、ロールミル、ボールミル、振動ボールミル、ビーズミル等の圧密と剪断を組み合わせた摩砕方法等のいずれの方法を使用してもよく、それらを組み合わせた方法でもよい。
粉砕方法としては、スクリーンミル、ハンマーミル等のスクリーン式粉砕方法、フラッシュミル等の翼回転剪断スクリーン式粉砕方法、ジェットミル等の気流式粉砕方法、ロールミル、ボールミル、振動ボールミル、ビーズミル等の圧密と剪断を組み合わせた粉砕方法、翼攪拌式粉砕方法等のいずれの方法を使用してもよく、それらを組み合わせた方法でもよい。
【００２２】
本発明のセルラーゼとは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本発明でいうセルラーゼに含まれる。セルラーゼ酵素源としては、例えば、セルラーゼ生産性生菌体そのもの又はその培養上清液、セルラーゼ生産性生菌が生産する酵素を精製したもの、精製酵素を賦形剤、安定化剤等の添加剤とともに製剤化したもの等が挙げられる。セルラーゼ製剤品を使用し酵素分解を行う場合、製剤に添加される添加剤にも特に制限はなく、その剤形は、粉末、顆粒、液体等いずれでもよい。
セルラーゼの起源についても、特に制限はなく、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される微生物が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の微生物由来の酵素に限らず、新規に発見された微生物由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００２３】
本発明で使用するセルラーゼは、β−グルコシダーゼ活性と結晶セルロース分解活性の活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が０．７以下であることが好ましい。ここでいう活性比は、セルラーゼのセルロース分解能（結晶セルロース分解活性）に対する、セロオリゴ糖の分解能（β−グルコシダーゼ活性）の比で表される。該活性比が小さければ小さいほど、セルロース分解能が高く、オリゴ糖分解能が低く、オリゴ糖の生産性が向上するため好ましい。活性比は、０．５以下がより好ましく、０．４以下がさらに好ましく、０．３５以下が特に好ましく、０．３０以下が最も好ましい。活性比は、小さければ小さいほど、セロオリゴ糖の収率が向上するため、その下限は特に制限されないが、容易に達成させる活性比の範囲としては０．０１以上である。
【００２４】
ここでいう、β−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖の一種であるセロビオースを基質とし、セルラーゼを水性媒体中で作用させた場合に、セロビオースからグルコースを生成する酵素活性のことであり、反応液１ｍＬ中に１分間に生成するグルコースのモル数（μｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ．）で測定され、Ｕ（ユニット）／ｍＬという単位で表される。このβ−グルコシダーゼ活性は、セロビオース２質量％（Ａｌｄｒｉｃｈ製  特級グレード）と、セルラーゼをｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させ、密栓状態で、５５℃水浴中で１時間反応後の反応液中のグルコース濃度を定量することで測定できる。
【００２５】
また、ここでいう、結晶セルロース分解活性とは、結晶セルロースを基質とし、セルラーゼを水性媒体中で作用させた場合に、セロビオース、セロトリオース等のセロオリゴ糖と、グルコースを生成する酵素活性のことであり、反応液１ｍＬ中に１分間に生成するセロオリゴ糖及びグルコースの総モル数（μｍｏｌ／ｍＬ＊ｍｉｎ．）で測定され、Ｕ（ユニット）／ｍＬという単位で表される。この結晶セルロース分解活性は、上述のβ−グルコシダーゼ活性測定法で、セロビオースの代わりに結晶セルロース５質量％（旭化成ケミカルズ製  商品名  セオラスＰＨ−１０１を水分６０％として、三英製作所製  商品名  万能攪拌混合機でフック羽根により、９０分間、１２６ｒｐｍで混練攪拌したもの）を用いて、同様に酵素分解し、反応液中のセロオリゴ糖、グルコース等の分解生成糖総量を定量することで測定できる。
上述の各種活性測定法において、反応液中のセロオリゴ糖、及びグルコースは、高速液体クロマトグラフィー（カラム：島津製作所製  商品名Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０、高速液体クロマトグラフィー：島津製作所製  商品名ＳＣＬ−１０Ａ型、移動層：アセトニトリル／水＝７５／２５（容積比）循環量：１ｍＬ／ｍｉｎ．試料液：１０μＬ）により定量できる。
【００２６】
β−グルコシダーゼ活性と結晶セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が、本発明の範囲を満たすセルラーゼを得る方法としては、以下のものが挙げられる。
セルラーゼを生産する菌としては、（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比が０．５以下であるセルラーゼを生産する菌株を用いることが好ましく、活性比が上述の範囲を満たせばいずれの菌株でも用いることができる。また、菌株の人工変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理など、若しくは自然発生による変異株、又は遺伝子操作、若しくは細胞融合による変異株でも、（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比が０．５以下であるセルラーゼを生産する菌株であればいずれも本発明に用いることができる。この（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比は、０．３５以下が好ましく、より好ましくは、０．２以下である。活性比は、小さければ小さいほど、セロオリゴ糖の収率が向上するため、その下限は特に制限されないが、容易に達成させる活性比の範囲としては０．０１以上である。
【００２７】
この温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性、及び結晶セルロース分解活性は、下記の方法で測定される。
（１）結晶セルロース分解活性
５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁した５質量％結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名  セオラスＰＨ−１０１を水分６０％として、三英製作所製  商品名  万能攪拌混合機でフック羽根により、９０分間、１２６ｒｐｍで混練攪拌したもの）の基質液０．４ｍｌに適当に希釈した酵素液を０．１ｍｌ添加し、４０℃水浴中で４時間反応後、９５℃、１０分間加熱して反応を停止させ、反応液中のグルコース濃度をＨＰＬＣ法で定量する。１分間に遊離するグルコース及びセロオリゴ糖の総量が１μｍｏｌｅである酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２８】
（２）β−グルコシダーゼ活性
５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した２．５質量％セロビオース（Ａｌｄｒｉｃｈ製  特級グレード）の基質液０．４ｍｌに酵素液を０．１ｍｌ添加し、４０℃水浴中で４時間反応後、１００℃  １０分間加熱し反応を停止し、反応液中のグルコース濃度をＨＰＬＣ法で定量する。１分間に１μｍｏｌｅのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
上述の各種活性測定法において、反応液中のセロオリゴ糖、及びグルコースは、上述の高速液体クロマトグラフィーにより定量できる。
【００２９】
ここで使用する代表的な菌株としては、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９株が挙げられる。
また、（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）比が低い菌株は、例えば次の方法で得られる。セルラーゼ生産能を有する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤の使用など、公知の変異誘導処理し、それらの菌株から（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）比が低い菌株を選ぶ。変異誘導処理に用いる微生物としては、例えば、親株としてＴｒｉｃｈｏｄｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を用い、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で２８℃、３〜１０日間培養する。生成した胞子を生理的食塩水に１０５〜１０８個／ｍＬになるよう懸濁し、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）で変異処理を施す（１００〜５００μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、２８℃、５〜２４時間）。（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）比が低い菌株の選択は、この変異誘発処理胞子の懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、グルコースを炭素源として培養し、培養物の酵素活性を公知の方法で測定することで達成される。例えば、各変異処理菌株の培養物を用いて、セロビオース又は結晶セルロースを基質として酵素分解し、生成した還元糖を定量してもよく、公知の発色基質を使用し培養物と酵素反応させることで定性的に目的の菌株を選択してもよい。
【００３０】
セルラーゼ生産菌株を培養し、培養上清液からセルラーゼを取得することができる。培地に使用される炭素源としては、セルロースパウダー、セロビオース、濾紙、一般紙類、オガクズ、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー粕、澱粉、ラクトース等が使用される。窒素源としては、硫安、硝安などの無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物等の有機窒素含有物が使用される。無機塩類としては、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｆｅ２Ｃｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ３・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ等が使用される。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地が使用される。培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、前記培地を使用して、生産菌株の生育可能な温度、生育可能なｐＨ付近で制御する。次いで、培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上清液を得る。この上清液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
また、さらに（温度４０℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比を低く抑える培養方法として、例えば培養中、培養液のｐＨをｐＨ３．５未満かつセルラーゼ生産菌の生育可能なｐＨ以上に制御する方法が挙げられる。具体的には、上記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９株又はその変異株をポテトデキストロース寒天斜面で２５〜３５℃、３〜１０日間培養し、培養懸濁及び溶解させ、セルロースを炭素源とする培地を５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注し、オートクレーブ滅菌した培地に植菌し、２８℃で２〜４日間前培養を行う。さらに同じ組成の培地３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、オートクレーブ殺菌した培地に、前培養液を移植し、温度２８℃、攪拌２００〜４００ｒｐｍ、通気０．３〜１ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨ又はアンモニア水で、ｐＨ２〜３．５、好ましくは２．５〜３．０に制御する。４〜７日間培養を行った後、培養液を遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上清液を得る。この上清液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
以上のようにして得られた酵素粗精製液は、さらに通常の蛋白精製法、硫安分画、溶媒による沈殿分画、カラムクロマト等による精製を行ってもよい。
また、セルラーゼを市販酵素から得る場合は、通常の蛋白精製方法である硫安分画、溶媒による沈殿分画、カラムクロマト等による精製を行い（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）比が０．７以下である画分を得る。
【００３１】
以下に本発明のセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
本発明のセロオリゴ糖の製造方法は、本発明の天然セルロース系物質を、セルラーゼの存在下で酵素分解する方法であり、ここで使用するセルラーゼは、β−グルコシダーゼ活性と結晶セルロース分解活性の活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が０．７以下であることが好ましい。さらに、本発明で得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、公知の方法で精製及び／又は乾燥される。
酵素分解方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質として本発明のセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明のセルラーゼを添加し、攪拌又は振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。また、この圧力、温度、及びｐＨについても、上記同様、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、上述のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９株又はその変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、常圧で、酢酸又はリン酸緩衝液中で、温度５０−６０℃、ｐＨ３．０−５．５の範囲で行うことが好ましい。
【００３２】
この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する上で重要である。反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、限外ろ過、逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から、生成したセロビオースを抜き出す方法でもよく、活性炭、竹、木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法でもよく、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法でもよく、セルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法でもよい。
上述の酵素分解により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
上記の方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００３３】
上記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤にも、特に制限はないが、例えば、医薬品、食品及びそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
上記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップ、溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖の一例としては、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体、固体分散体等が挙げられる。
次に、本発明の方法で得られるセロオリゴ糖について説明する。
本発明のセロオリゴ糖は、ジエチルエーテル可溶物含有率が２０００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０００ｐｐｍ以下であることがより好ましい。ここでいうジエチルエーテル可溶物含有率は、セルロース系物質中のリグニン、リグニン分解物等のジエチルエーテルに可溶の不純物含有率のことであり、「第１４改正日本薬局方」（廣川書店発行）の結晶セルロース純度試験（２）に規定されるジエチルエーテル可溶物の定量法により測定できる。ジエチルエーテル可溶物含有率が２０００ｐｐｍ以下のセロオリゴ糖は、不純物が少ないため、白色度が高く、該セロオリゴ糖を食品、化粧品、医薬品に用いる際の精製が容易になるため好ましい。特にセロオリゴ糖を医薬品等の活性成分との組成物とする際には、活性成分の分解を低減できるため好ましい。また、該セロオリゴ糖を化学変換原料として使用する際には、不純物が少ないことで、副反応が生じにくく、化学変換収率が向上するため好ましい。より好ましくは、ジエチルエーテル可溶物含有率は１０００ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは５００ｐｐｍ以下、特に好ましくは３００ｐｐｍ以下、最も好ましくは１００ｐｐｍ以下である。このジエチルエーテル可溶物含有率は少ないほど、上述の効果が得られるため、その下限は特に制限されないが、簡便な処理で達成されるリグニン含有率の範囲は０．１ｐｐｍ以上である。
【００３４】
本発明により得られるセロオリゴ糖の用途は、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品、一般工業製品等の分野で、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、及び添加剤、中間原料、発酵原料等として使用してもよい。
本発明により得られるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリン、ヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープ、野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチュー、スープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージ、ハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージ、揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソース、餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮、ジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子、プリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子、中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペースト、魚介類のペースト等のペースト類である。また、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズ、ホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の油脂加工品等がある。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料、乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳、ヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶、紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
本発明で得られるセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
また、本発明により得られるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
【実施例】
【００３５】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）
市販の針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１％、平均粒子径１７４μｍ）２ｋｇ、３Ｎ塩酸水溶液３０Ｌを低速型攪拌機（３０Ｌ反応器）に仕込み、１０５℃、３０分間攪拌しながら加水分解した。得られた酸不溶性残渣は、ヌッチェを使用してろ過し、７０Ｌの純水で４回洗浄した後、固形分４０．１％のウェットケークを得た（平均重合度２２０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、平均粒子径６９．１μｍ、コロイド状セルロース成分含有率１３．４質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）。
このウェットケークが固形分５％、タンパク濃度で０．２５％になるようＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来の市販のセルラーゼ製剤  商品名  Ｔ「アマノ」４を０．２Ｎ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解させたものを加え、全量２５ｍＬとし、５０ｍＬのガラス製バイヤル瓶に仕込んだ。このガラス製バイヤル瓶を、４８℃の恒温振とう水槽に仕込み、振とう速度９０ｒｐｍで、表１に示す所定時間反応させた。反応開始後、表１に示す所定時間で、反応液を懸濁状態で３００μＬ分注し、限外ろ過モジュール（分画分子量５０００）を使用し、酵素を取り除いた後、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所（株）製、カラム：東ソー（株）製、商品名  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＡＭＩＤＯ−８０、移動相：アセトニトリル／水＝６／４）で分析した。得られた結果を表１に示す。表中のオリゴ糖選択率は、（セロビオース濃度＋セロトリオース濃度）／全糖濃度ｘ１００（％）で算出した値である。
【００３６】
（参考例２）
参考例１と同様に市販針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１％、平均粒子径１７４μｍ）を酸加水分解し、得られたウェットケークをフロック状で、６０℃の気流式乾燥機に仕込み、１２時間乾燥した。
得られた乾燥物を家庭用ミキサーで解砕し、得られたセルロース粗砕物を、気流式粉砕機（（株）セイシン企業製、商品名  ジェットミルＳＴＪ−２００型）で粉砕し、セルロース微粉砕物を得た（平均重合度２２０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、平均粒子径１６．４μｍ、コロイド状セルロース成分含有率１７．５質量％、セルロースＩ型結晶含有率８６％）。このセルロース微粉砕物を基質として、参考例１と同様の方法で酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
参考例２は、参考例１に対し、平均重合度、ジエチルエーテル可溶物含有率が同じで、平均粒子径を小さく、コロイド状セルロース成分含有率を多くしたものである。表１から、参考例２は、参考例１に対し、基質の平均粒子径を小さくすることにより、糖濃度１０％、２０％に達するまでの反応時間が短くなり、さらにいずれの糖濃度においても、オリゴ糖選択率は向上した。
【００３７】
（実施例１）
市販広葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度１６８２、ジエチルエーテル可溶物含有率０．９％、平均粒子径９１μｍ）を参考例１と同様に酸加水分解し、得られたウェットケークに純水を添加し、セルロース濃度１０％の分散液とし、高剪断ホモジナイザー（特殊機化（株）製、商品名  ＴＫホモジナイザー）で３０分間攪拌し、セルロース分散体を得た（平均重合度１５１、ジエチルエーテル可溶物含有率０．１質量％、平均粒子径８．７μｍ、コロイド状セルロース成分含有率５５．５質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）。このセルロース分散体を基質とし、参考例１と同様の方法で酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
実施例１は、参考例１、２と比べて、平均重合度が小さく、ジエチルエーテル可溶物含有率が高く、平均粒子径を小さく、コロイド状セルロース成分含有率を多くしたものである。表１から、実施例１は、参考例１、２に対し、さらに反応時間が短縮され、それぞれの糖濃度におけるオリゴ糖選択率も向上した。また、参考例１及び２は、糖濃度の上昇に伴いオリゴ糖選択率が低下したが、実施例１は、糖濃度が上昇してもオリゴ糖選択率は低下しなかった。
【００３８】
（実施例２）
参考例１と同様に、市販針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１質量％、平均粒子径１７４μｍ）を使用し、加水分解条件を塩酸濃度５Ｎ塩酸水溶液、１８℃、１２時間とする以外は参考例１と同様に加水分解、酸不溶性残渣を洗浄、ろ過し、ウェットケークを得た（平均重合度６９０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．７％、平均粒子径４９．８μｍ）。このウェットケークをセルロース１０％濃度の水分散体とし、超高性能分散機・湿式微粉砕機（アシザワ（株）製、商品名  パールミルＲＬ、φ２ｍｍアルミナビーズ使用、充填率８０％）を使用し、圧密・摩砕処理を施し、セルロース微粒子分散体を得た（平均重合度６９０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．７質量％、平均粒子径７．１μｍ、コロイド状セルロース成分含有率８７．５質量％、セルロースＩ型結晶含有率７７％）。このセルロース微粒子分散体を基質とし、参考例１と同様に酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
実施例２は、参考例１、２、及び実施例１と比べて、平均重合度、及びジエチルエーテル可溶物含有率が高いが、平均粒子径が小さく、コロイド状セルロース成分含有率が大きいものである。表１から、実施例２も、実施例１と、オリゴ糖選択率は同等であったが、反応速度は向上した。また、実施例２は糖濃度が上昇してもセロオリゴ糖の収率はほとんど低下しなかった。
（実施例３）
市販コットンリンター由来パルプ（平均重合度１８５３）を使用し、加水分解条件を塩酸濃度５Ｎ塩酸水溶液、１３０℃、１２時間とする以下は参考例１と同様に加水分解し、ウェットケークを得た（平均重合度４９）。このウェットケークをセルロース10％濃度の水分解体とし、超高性能分散機・湿式微粉砕機（アシザワ（株）製、商品名  パールミルＲＬ  φ２ｍｍアルミナ製ビーズ使用  充填率８０％）を使用し、圧密・摩砕処理を施し、セルロース微粒子分散体を得た（平均重合度４９、ジエチルエーテル可溶物含有率０．９質量％、平均粒子径１０．３μｍ、コロイド状セルロース含有量９４．１質量％、セルロースＩ型結晶含有率７５％）。このセルロース微粒子分散体を、参考例１と同様の方法で、酵素をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来の長瀬産業（株）製  商品名「セルレースナガセ」に替えて、酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
実施例３は、実施例２と比べて、平均重合度が小さく、ジエチルエーテル可溶物含有率が多く、平均粒子径が大きいが、コロイド状セルロース成分量は多いものである。表１から、実施例３は、実施例２に対し、反応時間は半減し、オリゴ糖選択率は向上した。
【００３９】
（比較例１）
参考例１で使用した市販針葉樹由来の溶解パルプを用い、３Ｎ塩酸水溶液中で、セルロース濃度１０％の分散液とし、常温で高剪断ホモジナイザー（特殊機化（株）製、商品名  ＴＫホモジナイザー）で６０分間攪拌し、セルロース分散体を得た（平均重合度７２３、ジエチルエーテル可溶物含有率０．９質量％、平均粒子径４９．３μｍ、コロイド状セルロース成分含有率１０．２質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）。この酸加水分解を経ないセルロース分散体を基質とし、参考例１と同様の方法で酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
比較例１は、平均粒子径、ジエチルエーテル可溶物含有率が本発明の範囲にあり、平均重合度が大きいものである。表１から、比較例１は、各実施例に対し、糖濃度１０、２０％に達するまでの反応時間が長く、酵素分解が遅かった。また、オリゴ糖選択率は、いずれの糖濃度においても、各実施例のレベルに達しなかった。
【００４０】
（比較例２）
実施例２の操作により得られたウェットケークをセルロース１０％濃度の水分散体とし、目開き４５μｍの篩を使用し、湿式分画した後、篩上に残った固形分（平均重合度６９０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．７質量％、平均粒子径１０７．３μｍ、コロイド状セルロース成分含有率５．２質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）を基質として使用し、参考例１と同様に酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
比較例２は、平均重合度、ジエチルエーテル可溶物含有率は本発明の範囲にあり、平均粒子径が大きいものである。表１から、比較例２は、各実施例に対し反応速度が遅く、オリゴ糖選択率も実施例のレベルに至らなかった。
【００４１】
（比較例３）
市販の未晒し針葉樹由来のクラフトパルプ（平均重合度１６７０、ジエチルエーテル可溶物含有率１２質量％、平均粒子径１５４μｍ）を、加水分解条件を塩酸濃度４Ｎ塩酸水溶液、３５℃、１８時間とする以外は参考例１と同様に加水分解、酸不溶性残渣を洗浄、ろ過し、ウェットケークを得た（平均重合度４９０、ジエチルエーテル可溶物含有率４．４質量％、平均粒子径４８．７μｍ、コロイド状セルロース成分含有率１２．８質量％、セルロースＩ型結晶含有率８６％）。
このウェットケークを使用し、参考例１と同様に酵素分解を行った。得られた結果を表１に示す。
比較例３は、平均重合度、平均粒子径が本発明の範囲にあり、ジエチルエーテル可溶物含有率が大きいものである。表１から、比較例３は、比較例１及び２に対し、セロオリゴ糖収率は若干向上したものの、各実施例に対しては、反応速度、オリゴ糖選択率ともに実施例のレベルには至らなかった。
【００４２】
【表１】
0004372787.tif 000002
【００４３】
（製造例１）
ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ社製）にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を接種し、３７℃で７日間培養後、その培地表面から胞子を１白金耳取り、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸１カリウム２ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、トレースエレメント１ｍＬ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍＬの精製水に溶解させたもの）、アデカノールＬＧ−１０９  １ｍＬ、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名ＰＨ−１０１）１０ｇを全量１Ｌの精製水に懸濁及び溶解させ、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注し、オートクレーブ滅菌した培地に植菌し、２８℃で３日間前培養を行った。さらに同じ培地１Ｌを仕込んだ５Ｌジャーファーメンターに前培養液を１０ｍＬ移植し、２８℃、攪拌  ４００ｒｐｍ、通気  ０．５ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨでｐＨ３に制御した。７日間培養を行った培養後の液を遠心分離し、上清を目開き０．４６μｍの精密ろ過膜で除菌し、ろ液を分画分子量１３０００の限外ろ過膜（旭化成ケミカルズ製  商品名マイクローザペンシル型モジュール  ＡＣＰ−００１３）で体積比１０倍濃縮し粗酵素を得た。
この粗酵素について、活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）を測定した結果を表２に示す。
【００４４】
（製造例２）
ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ社製）にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を接種し、３７℃で７日間培養後、その培地表面から胞子を１白金耳取り、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸１カリウム２ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、トレースエレメント１ｍＬ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍＬの精製水に溶解させたもの）、アデカノールＬＧ−１０９  １ｍＬ、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名ＰＨ−１０１）１０ｇを全量１Ｌの精製水に懸濁及び溶解させ、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注し、オートクレーブ滅菌した培地に植菌し、２８℃で３日間前培養を行った。さらに同じ培地１Ｌを仕込んだ５Ｌジャーファーメンターに前培養液を１０ｍＬ移植し、２８℃、攪拌  ４００ｒｐｍ、通気０．５ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨでｐＨ４に制御した。７日間培養を行った培養後の液を遠心分離し、上清を目開き０．４６μｍの精密ろ過膜で除菌し、ろ液を分画分子量１３０００の限外ろ過膜（旭化成ケミカルズ製  商品名マイクローザペンシル型モジュール  ＡＣＰ−００１３）で体積比１０倍濃縮し粗酵素を得た。
この粗酵素について、活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）を測定した結果を表２に示す。
【００４５】
（製造例３）
市販のセルラーゼ（合同酒精製  商品名ＧＯＤＯ−ＴＣＤ）を５００ｍｇ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）に溶解し、陰イオン交換カラム（アマシャム製  商品名ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）に導入し、カラム内を５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）と、１モル％の塩化ナトリウムを溶解させた５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）をリニアグラジエント法により流通させることで、市販酵素から、分画サンプルを得た。得られたすべての画分に対しβ−グルコシダーゼ活性、及び結晶セルロース分解活性を測定し、活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が０．５以下の画分を合わせた。得られたセロビオース画分を分画分子量１００００の限外ろ過モジュール（ミリポア製  商品名アミコンウルトラ−１５セントリフューガルフィルター）で体積比５倍まで濃縮し、精製酵素を得た（精製酵素中のタンパク質濃度は１５．４ｍｇ／ｍＬ）。
この精製酵素について、活性比（温度５５℃におけるβ−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）を測定した結果を表２に示す。
【００４６】
（実施例４）
市販針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１％、平均粒子径１７４μｍ）２ｋｇを使用し、低速型攪拌機（３０Ｌ反応器）に仕込み、加水分解条件を、３Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、３０分間として加水分解し、酸不溶性残渣を洗浄、ろ過し、ウェットケークを得た。得られたウェットケークをフロック状にし、６０℃のオーブン中で１２時間通気乾燥させた。乾燥物に精製水を加え、水分６０％としてミキサー（三英製作所製  商品名  万能攪拌混合機、フック羽根、９０分間、１２６ｒｐｍ）で摩砕し、摩砕セルロースを得た（平均重合度２２０、平均粒子径９．１μｍ、コロイド状セルロース成分量６６．１質量％、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、セルロースＩ型結晶含有率７８％）。
この摩砕セルロース５質量％を、製造例１で得られた粗酵素の５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）に懸濁溶解させ、全量２５ｍＬとし、ガラス製バイヤル瓶に仕込んだ。このガラス製バイヤル瓶を、５５℃の恒温振とう水槽に仕込み、振とう速度９０ｒｐｍで反応させた。反応開始後所定時間で、反応液を懸濁状態で３００μＬ分注し、限外ろ過モジュール（分画分子量１００００）を使用し、酵素、未分解セルロースを取り除いた後、高速液体クロマトグラフィーで糖濃度を分析した。得られた結果を表２に示す。
反応液中のセロオリゴ糖、グルコースの定量は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：島津製作所製  商品名Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０、高速液体クロマトグラフィー：島津製作所製  商品名ＳＣＬ−１０Ａ型、移動層：アセトニトリル／水＝７５／２５（容積比）循環量：１ｍＬ／ｍｉｎ．試料液：１０μＬ）で行った。
表中の反応時間は、仕込みセルロース量に対し、セロオリゴ糖、グルコースの総生成糖量の比が２０質量％に到達するのに要した反応時間のことである。また、オリゴ糖選択率は（セロビオース濃度＋セロトリオース濃度）／全糖濃度ｘ１００（％）で算出した値で示されている。
【００４７】
（実施例５）
市販針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１％、平均粒子径１７４μｍ）を使用し、加水分解条件を塩酸濃度５Ｎ塩酸水溶液、１８℃、１２時間として、参考例１と同様に加水分解し、酸不溶性残渣を洗浄、ろ過し、ウェットケークを得た（平均重合度６９０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．７質量％、平均粒子径４９．８μｍ）。このウェットケークをセルロース１０％濃度の水分散体とし、超高性能分散機・湿式微粉砕機（アシザワ（株）製、商品名  パールミルＲＬ  φ２ｍｍアルミナビーズ使用  充填率８０％）を使用し、圧密・摩砕処理を施し、セルロース微粒子分散体を得た（平均重合度６９０、ジエチルエーテル可溶物含有率０．７質量％、平均粒子径７．１μｍ、コロイド状成分含有率８７．５質量％、セルロースＩ型結晶含有率７７％）。また、得られたウェットケークを実施例４と同様に酵素分解し、得られた結果を表２に示す。
実施例５は実施例４に対して、平均粒子径が小さく、コロイド成分量が多いセルロースを酵素分解したものであり、反応時間が短縮され、オリゴ糖選択率も向上した。
【００４８】
（実施例６）
実施例４で得られたウェットケーク状セルロースを用いて、製造例３で得られた精製酵素を用いて、参考例１と同様に酵素分解した。得られた結果を表２に示す。
実施例６は、実施例４に対し、活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が小さいものに酵素を代えたものである。酵素を変えることで、反応時間は延びたが、選択率は向上した。
（参考例３）
市販の針葉樹由来の溶解パルプ（平均重合度７８１、ジエチルエーテル可溶物含有率１．１質量％、平均粒子径１７４μｍ）を、１０５℃、３０分間攪拌しながら加水分解し、得られた酸不溶性残渣は、ヌッチェを使用してろ過し、７０Ｌの純水で４回洗浄した後、固形分４０．１％のウェットケークを得た（平均重合度２２０、平均粒子径６９．１μｍ、コロイド状成分含有率１３．４質量％、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）。このウェットケーク状セルロースを用いて、製造例３で得られた精製酵素を用いて、実施例４と同様に酵素分解した。得られた結果を表２に示す。
参考例３は、実施例４に対し、活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が小さいものに酵素を代え、さらに平均粒子径が大きく、コロイド成分量が少ないセルロースを使用したものである。酵素、基質を変えることで、反応時間は延びたが、選択率は向上した。
（実施例７）
実施例４で得られたウェットケーク状セルロースを用い、製造例２で得られた酵素を用いて、実施例４と同様に酵素分解した。得られた結果を表２に示す。
実施例７は、実施例４に対し、活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶セルロース分解活性）が大きいものに酵素を代えたものである。酵素を変えることで、反応時間は同等であるが、選択率は低下した。
【００４９】
（比較例４）
実施例４〜６で使用した市販パルプ（平均重合度７８１）を用い、加水分解を経ずに、純水を添加し（固形分４０質量％）、実施例４と同様に摩砕処理を施し、ウェットケークを得た（平均重合度７８１、平均粒子径４９．３μｍ、コロイド状セルロース成分量１０．２質量％、ジエチルエーテル可溶物含有率０．９質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）。これを用い、実施例４と同様に酵素分解した。得られた結果を表２に示す。
比較例４は、セルロースの平均重合度が本発明の範囲になく、平均粒子径、コロイド状セルロース成分含有量が本発明の範囲を満たすものであり、各実施例に対し、反応時間が長く、セロオリゴ糖選択率も低い。
【００５０】
（比較例５）
実施例４の操作により得られたウェットケークをセルロース１０％濃度の水分散体とし、目開き４５μｍの篩を使用し、湿式分画した後、篩上に残った固形分（平均重合度２２０、平均粒子径１０３．４μｍ、コロイド状成分含有率９．７質量％、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、セルロースＩ型結晶含有率８５％）を基質として使用し、実施例４と同様に酵素分解を行った。得られた結果を表２に示す。
比較例５は、平均重合度、ジエチルエーテル可溶物含有率は本発明の範囲にあり、平均粒子径が大きく、コロイド状成分含有率が小さいものである。比較例５は、各実施例に対し反応速度が遅く、セロオリゴ糖選択率も実施例のレベルに至らなかった。
【００５１】
【表２】
0004372787.tif 000003
【００５２】
（参考例４）
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で２８℃、７日間培養した。生成した胞子を１００ｍＭ  リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）２ｍｌに１０６個／ｍＬになるよう懸濁し、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を２４μｌ添加し、２８℃、１６時間振とうし、変異処理を施した。この胞子懸濁液から遠心分離により胞子を集め、１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）でよく洗浄し、平板あたり１００〜３００胞子になるように希釈し、グルコース１ｇ、酵母エキス１ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｍｇ、トリトンＸ−１００、トレースエレメント１ｍＬ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍＬの精製水に溶解させたもの）、寒天２０ｇを１Ｌの水に溶解又は懸濁させた後、オートクレーブ滅菌し、さらにメンブレンフィルターでろ過滅菌し、２８℃で５日間培養した培養液の、β−グルコシダーゼ活性及び結晶セルロース分解活性を測定し、変異株Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＧＬ−１を選択した。この変異株は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、ブダペスト条約の下、２００５年４月１５日に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３２３を受けている。
【００５３】
（参考例５）
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９及び参考例４で取得した変異株ＧＬ−１株の各菌株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２５℃、７日間培養して胞子を十分形成させた。その１白金耳をポリペプトン１．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、ツイーン８０（半井化学薬品（株）製）１．０ｍｌ、微量元素液（Ｈ３ＢＯ４  ６ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ１００ｍｇＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解及び懸濁した液）１．０ｍｌ、酒石酸７．５ｇを水１Ｌに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名ＰＨ−１０１）１ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した培地に接種して、２８℃、５日間振盪培養した。５日目に培養液を遠心分離し、その上清について温度４０℃でセルラーゼ活性及びβ−グルコシダーゼ活性を測定した。その結果を表３に示す。
【００５４】
（参考例６）
ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ社製）にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を接種し、３７℃で７日間培養を行った。その培地表面から胞子を１白金耳取り、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸１カリウム２ｇ、硫酸アンモニウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、塩化カルシウム０．３ｇ、トレースエレメント１ｍＬ（硼酸６ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物２６ｍｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン４水和物８ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物２００ｍｇを全量１００ｍＬの精製水に溶解させたもの）、アデカノールＬＧ−１０９  １ｍＬを全量１Ｌの精製水に懸濁及び溶解させ、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注し、各フラスコに結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名ＰＨ−１０１）１ｇ添加後、オートクレーブ滅菌した培地に植菌し、２８℃で３日間前培養を行った。さらに同じ培地３Ｌを仕込んだ５Ｌジャーファーメンターに前培養液を３０ｍＬ移植し、２８℃、攪拌  ４００ｒｐｍ、通気０．５ｖｖｍで培養を行い、培養中ＮａＯＨ水溶液でｐＨの下限をｐＨ３．０に制御した。５日間培養を行った培養後の液を遠心分離し、上清を粗酵素として得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性及びβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表４に示す。
【００５５】
（参考例７）
参考例６と同様の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を培養する際、培養中ＮａＯＨでｐＨの下限をｐＨ２．５に制御し、粗酵素液を得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性及びβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表４に示す。
（比較例６）
参考例６と同様の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＮＢＲＣ３１３２９を培養する際、培養中ＮａＯＨでｐＨの下限をｐＨ３．５又は４又は５に制御し、粗酵素液を得た。得られた酵素液の結晶性セルラーゼ分解活性及びβ−グルコシダーゼ活性を前述の方法で測定した。培養中のｐＨ経時変化を図１に、活性測定結果を表４に示す。
【００５６】
（参考例８）
参考例６と同様の方法で参考例４で得たＧＬ−１株を培養した。培養を行う際、培養中ＮａＯＨでｐＨの下限をｐＨ３又はｐＨ４に制御し、粗酵素液を得た。培養中のｐＨ経時変化を図２に示す。
（参考例９）
結晶セルロース５質量％（旭化成ケミカルズ製  商品名  セオラスＰＨ−１０１を水分６０％として、三英製作所製、商品名  万能攪拌混合機でフック羽根により、９０分間、１２６ｒｐｍで混練攪拌したもの）８ｍｌに、参考例６及び参考例８で得たセルラーゼ粗酵素液を２ｍｌ添加し、５５℃攪拌条件下で加水分解を行った。２ｈｒ、４ｈｒ、６ｈｒ、及び８ｈｒ反応後、９５℃で１５分間加熱し、酵素反応を停止し、遠心分離により上清液を得、前述のＨＰＬＣ法によりセロオリゴ糖及びグルコースの濃度を測定した。結果を図３に示す。
（比較例７）
参考例９と同様の方法で結晶性セルロースを酵素分解する際、比較例６で得たセルラーゼを粗酵素液として使用した。結果を図３に示す。
【００５７】
【表３】
0004372787.tif 000004
【００５８】
【表４】
0004372787.tif 000005
【００５９】
（実施例８）
市販の結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製  商品名ＰＨ−１０１）を、固形分１０質量％の水分散体として、ビーズミルで湿式摩砕（アシザワファインテック製  商品名パールミルＲＬ５  ベッセルサイズ５Ｌ  粉砕メディア：φ１ｍｍのジルコニアビーズ  回転数：１８００ｒｐｍ  ベッセル内滞留時間７０分）して得た摩砕セルロース水分散体（平均重合度２２０、平均粒子径０．７μｍ、コロイド状セルロース含有率５４質量％、ジエチルエーテル可溶物含有率０．０３質量％、セルロースＩ型結晶含有率７５％）の１００ｍＬに、参考例８においてｐＨ３で培養した上清を限外ろ過（分画分子量１３０００）により体積比で５倍濃縮して得られた粗酵素液の２００ｍＬを加え、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液で全量５００ｍＬとして、１Ｌ容のガラス製セパラブルフラスコで、商品名３−１モーターで内部攪拌しながら、５５℃温浴中で反応を行った。反応開始後を２時間で、反応液を懸濁状態で３００μＬ分注し、限外ろ過モジュール（分画分子量１００００）を使用し、酵素、及び未分解セルロースを取り除いた後、高速液体クロマトグラフィーで糖濃度を分析、反応液中に残存するセルロース残さを定量した。結果から、反応時間２時間において、セルロース分解率は８２％、オリゴ糖選択率は８１％であった。
【００６０】
（実施例９）
実施例８で得られた摩砕セルロース水分散体を使用し、実施例８と同じフラスコに、分画分子量１３０００のポリアクリロニトリル製の中空限外ろ過モジュール（旭化成ケミカルズ製  商品名マイクローザＡＣＰ−００１３）をセットした反応槽を用いて、実施例８と同様の条件で反応しながら、０．１ＭＰａ、毎時４Ｌの循環流量で限外ろ過モジュールに反応液を流通させながら、２時間反応を行った。限外ろ過により得られた透過液中の糖濃度を測定し、反応液中に残存するセルロース残さを定量した。
結果より、セルロース分解率は９５質量％、オリゴ糖選択率は８５％であった。
（実施例１０）
反応液中のセルロース濃度を２．５質量％とした以外は、実施例９と同じ装置を用いて酵素分解を行った。酵素分解中、透過液中の分析により、セルロース分解率を測定し、常に反応液中のセルロース濃度を２．５質量％に保つよう、摩砕セルロース水分散体を追加しながら、２４時間反応を行った。実施例９と同様に透過液中の糖濃度を測定し、反応液中に残存するセルロース残さを定量した。
結果より、セルロース分解率は９８質量％、オリゴ糖選択率は９２％であった。
（実施例１１）
実施例１０で得られたセロオリゴ糖水溶液イオン交換樹脂（三菱化学製  商品名ダイヤイオンＷＡ３０及びＳＫ１Ｂ）で脱酢酸した後、６０℃で８時間乾燥し、乳鉢で粉砕し、セロオリゴ糖粉末を得た。このセロオリゴ糖粉末を用いて、「第１４改正日本薬局方」（廣川書店発行）の結晶セルロース純度試験（２）に規定されるジエチルエーテル可溶物の定量法で測定したジエチルエーテル可溶物含有率は、２００ｐｐｍであった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の方法により、得られるセロオリゴ糖は、通常の食品素材に加え、機能性食品素材、医薬品及びその他化学品の中間体合成材料等の化学変換原料、発酵原料として食品、医薬品、一般工業製品分野で好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例１３及び１４並びに比較例６における培養中のｐＨ経時変化を示すグラフである。
【図２】実施例１５における培養中のｐＨ経時変化を示すグラフである。
【図３】実施例１６及び比較例７における結晶セルロース分解の生成物の濃度変化を示すグラフである。グラフ中の「反応液中の分解物蓄積量（％）」は、反応液中のグルコース、セロオリゴ糖の総計の濃度であり、セロビオース純度は、反応液中の分解物蓄積量に対するセロオリゴ糖の割合（百分率）である。変異株を用いること、培養液中のｐＨを低くすることで、分解物蓄積量当たりのセロビオース純度が向上した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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