(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）からの核酸を増幅させる方法であって、ＨＩＶ−１核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成り、前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの４つのオリゴヌクレオチドが
(a) 配列番号１，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに
(d) 配列番号２，４，７および８のセット
から選ばれる方法。
【請求項２】
前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの５つのオリゴヌクレオチドが
(a) 配列番号１，２，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，２，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，４，７および８のセット；
(d) 配列番号１，３，４，７および８のセット；並びに
(e) 配列番号１，２，３，４，７および８のセット
から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記５つのオリゴヌクレオチドが配列番号２，３，４，７および８である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの６つのオリゴヌクレオチドが配列番号１，２，３，４，７および８である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、テルムス・アクアティカスのポリメラーゼ、テルムス・テルモフィラスのポリメラーゼおよびテルモコッカス・リトラリスのポリメラーゼから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶ−１核酸を増幅させて検出する方法であって、
(i)  ＨＩＶ−１核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成り、前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの４つのオリゴヌクレオチドが
(a) 配列番号１，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに
(d) 配列番号２，４，７および８のセット
から選ばれ；
(ii)  前記増幅したＨＩＶ−１核酸を変性させて一本鎖核酸にし；そして
(iii) 前記増幅したＨＩＶ−１核酸の存否を検出する
ことを含んで成る方法。
【請求項７】
前記検出が、
(a) 配列番号５および９のセット；
(b) 配列番号５および10のセット；
(c) 配列番号６および９のセット；並びに
(d) 配列番号６および10のセット
から選ばれた少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使って行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出が配列番号５，６，９および10からなる４つのオリゴヌクレオチドプローブを使って行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出が酵素標識されているかまたは酵素標識することができるプローブを使って行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＩＶ−１核酸の増幅に有用な診断キットであって、
(i)  配列番号１，２，３，４，７および８からなるオリゴヌクレオチド；並びに
(ii) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を含んで成る診断キット。
【請求項１１】
配列番号５，６，９および10からなるオリゴヌクレオチドを更に含んで成る、請求項１０に記載の診断キット。
【請求項１２】
ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）の核酸を増幅させる方法であって、ＨＩＶ−２核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成り、前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの４つのオリゴヌクレオチドが
(a) 配列番号11，12，14および16のセット；
(b) 配列番号11，12，15および16のセット；
(c) 配列番号11，12，18および20のセット；
(d) 配列番号11，12，19および20のセット；
(e) 配列番号14，16，18および20のセット；
(f) 配列番号14，16，19および20のセット；
(g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに
(h) 配列番号15，16，19および20のセット
から選ばれる方法。
【請求項１３】
次のオリゴヌクレオチドペア：
(a) 配列番号5および6；
(b) 配列番号9および10；並びに
(c) 配列番号21および22
のうちの１つまたは複数を含んで成る、ＨＩＶ−１核酸及び／又はＨＩＶ−２核酸を検出するための組成物。
【請求項１４】
ＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸を同時増幅させる方法であって、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸またはＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号７および８からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１，２，３および４から選ばれた少なくとも１つのプライマーペア、並びに配列番号11, 12, 14, 15, 16, 18, 19および20から選ばれた少なくとも１つのプライマーペア、と接触させることを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増幅と検出のための方法および試験キットに関する。より詳しくは、本発明は、複数のプライマーセットを使用してＨＩＶ−１の全ての亜型（Ｍ群およびＯ群分離株を含む）とＨＩＶ−２の全ての亜型を増幅させるＰＣＲ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群（エイズ；AIDS）およびその原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の理解は日々進歩している。ヒト免疫不全ウイルスには２つの群、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が同定されている。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は遺伝学的に関連しているが、それでも別のものである。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は共に、異なる分離株間で相当な遺伝的変異性を示す。実際、ＨＩＶ−１は10の亜型（亜型Ａ〜Ｉを含むＭ群と、亜型Ｏを含むＯ群）が同定されている。様々なＨＩＶ−１分離株とＨＩＶ−２分離株の発表されたヌクレオチド配列からＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の共通配列が生成されたけれども、ＨＩＶ−１の全分離株間にまたはＨＩＶ−２の全分離株間に実在する絶対的配列保存領域を見つけることはできない。ＨＩＶ分離株間に見られる遺伝的変異性に加えて、ＨＩＶの多数のヌクレオチド領域は、それらがＨＩＶ−１ファミリーとＨＩＶ−２ファミリーの中にあるのと同じくらい高度にＨＩＶと無関連ウイルスとの間で保存される。これらの事実は、一緒になって、無関連ウイルスを誤って検出することなくＨＩＶ−１の全Ｍ群およびＯ群亜型並びにＨＩＶ−２の全亜型を効率的に検出するようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーおよびプローブをデザインすることを非常に難しくする。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
全ての既知ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２亜型を検出する増幅方法を開発しようとする者が直面する課題の１つは、単一設定の増幅条件（例えば塩濃度、温度および増幅時間）下で一緒に使った時に適切に機能するオリゴヌクレオチドプライマーセットの開発である。プライマー−プライマー相互作用およびプライマー−プローブ相互作用の点から適合するプライマーおよび検出プローブを同定することは、更に大きな課題である。従って、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の増幅と検出の場合、理想条件より低い条件下で高度に分岐した亜型または分離株を検出する可能性を最大にする段階が今まだ必要とされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決し、そして高度に分岐したＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２分離株を増幅させて検出する必要手段を提供する。よって、本発明の目的はあらゆる既知のＨＩＶ−１亜型および／またはＨＩＶ−２亜型の検出のための方法および試験キットを提供することである。
本発明の他の目的や利点は本発明の詳細な説明から明白であろう。
【０００５】
【発明の実施の形態】
一態様では、本発明はＨＩＶ−１核酸を増幅させる方法に関する。この方法はＨＩＶ−１核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成る。前記４つのオリゴヌクレオチドは
(a) 配列番号１，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに
(d) 配列番号２，４，７および８のセット
から選ばれる。
【０００６】
別の態様では、本発明はＨＩＶ−２核酸を増幅させる方法であって、ＨＩＶ−２核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成る方法に関する。前記４つのオリゴヌクレオチドは
(a) 配列番号11，12，14および16のセット；
(b) 配列番号11，12，15および16のセット；
(c) 配列番号11，12，18および20のセット；
(d) 配列番号11，12，19および20のセット；
(e) 配列番号14，16，18および20のセット；
(f) 配列番号14，16，19および20のセット；
(g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに
(h) 配列番号15，16，19および20のセット
から選ばれる。
【０００７】
更に別の態様では、本発明はＨＩＶ−１標的核酸とＨＩＶ−２標的核酸を同時増幅させる方法に関する。いずれかのＨＩＶ核酸を含む疑いのある試料を、ＨＩＶ−１標的核酸またはＨＩＶ−２標的核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号１，２，３，４，７および８から選ばれた少なくとも１つのプライマーペア、並びに配列番号11, 12, 14, 15, 16, 18, 19および20から選ばれた少なくとも１つのプライマーペア、と接触させることを含んで成る。
【０００８】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全亜型を高感度に且つ特異的に検出することができるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の同時増幅方法の開発は、幾つかの理由により大きな課題である：(1) 個々の分離株間の核酸配列レベルでの多様性；(2) 副生成物の生成はアッセイ感度と多分特異性も低下させるだろうから、少なくとも８〜10プライマー間のプライマー−プライマー相互作用を最小にする必要があること；(3) 増幅生成物を特異的に検出する必要があること（理論的には増幅プライマーに内在するプローブとのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより達成させるだろう）；および(4) 調製した患者被検物中の阻害剤の存在と試料調製からの標的核酸の非効率的回収の両方を抑制する必要があること。本出願人はそれらの障害を克服し、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２核酸の増幅および／または検出に関する本発明に到達した。
【０００９】
本発明において、互いに適合するので組み合わせてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の配列決定された全分離株を検出することのできる複合同時増幅アッセイの構成要素となることができる、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のためのプライマーセットを開発した。本発明の方法を使えば、当業者らは高い信頼性でＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両標的核酸を高感度に且つ特異的に増幅および検出することができる。この増幅と検出は、試料調製、増幅および／または検出に問題があると偽陰性結果を示す内部陽性対照（ＩＰＣ）の存在下で且つ多重化方式で実施することができる。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２核酸を増幅させる方法に関する。様々に組み合わせて用いると、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の全ての既知分離株からの標的核酸を高感度に且つ特異的に増幅せしめるオリゴヌクレオチドプライマーセットが同定された。本発明に従ってＨＩＶ−１標的核酸を増幅せしめるためには、次のオリゴヌクレオチドからプライマーセットが選ばれる：
【００１１】
0004339427.tif 000002
【００１２】
0004339427.tif 000003
【００１３】
本発明の方法では、ＨＩＶ核酸を含む疑いのある生物学的試料を、少なくとも４つのオリゴヌクレオチドを含んで成るプライマーセットと接触させることにより、ＨＩＶ−１標的核酸を増幅させる。本発明での使用に適当であるプライマーセットとしては、
(a) 配列番号１，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに
(d) 配列番号２，４，７および８のセット
が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１４】
それらのプライマーセットの４つのオリゴヌクレオチドは、単独でまたは別のＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２プライマーと組み合わせて使用してもよい。例えば、配列番号２のオリゴヌクレオチドを上記プライマーセット(a) または(b) と共に使用することができる。好ましいプライマーセットは、
(a) 配列番号１，２，３，７および８のセット；
(b) 配列番号１，２，４，７および８のセット；
(c) 配列番号２，３，４，７および８のセット；
(d) 配列番号１，３，４，７および８のセット；並びに
(e) 配列番号１，２，３，４，７および８のセット
である。
【００１５】
より好ましいのは、配列番号２，３，４，７および８に相当するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである。それらのプライマーセットのうちのいずれも、Ｍ群およびＯ群を含む全ての既知ＨＩＶ−１亜型からの核酸を増幅させるのに用いることができる。
【００１６】
プライマーセットに加えて、生物学的試料は、該試料中に存在する任意のＨＩＶ−１核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのようなＰＣＲ試薬とも接触させられる。
【００１７】
本発明に従ってＨＩＶ−２標的核酸を増幅せしめるためには、次のオリゴヌクレオチドからプライマーセットが選ばれる：
0004339427.tif 000004
【００１８】
0004339427.tif 000005
【００１９】
0004339427.tif 000006
【００２０】
本発明の方法では、ＨＩＶ−２核酸を含む疑いのある生物学的試料を、少なくとも４つのオリゴヌクレオチドを含んで成るプライマーセットと接触させることにより、ＨＩＶ−２標的核酸を増幅させる。本発明での使用に適当であるプライマーセットとしては、
(a) 配列番号11，12，14および16のセット；
(b) 配列番号11，12，15および16のセット；
(c) 配列番号11，12，18および20のセット；
(d) 配列番号11，12，19および20のセット；
(e) 配列番号14，16，18および20のセット；
(f) 配列番号14，16，19および20のセット；
(g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに
(h) 配列番号15，16，19および20のセット
が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２１】
好ましいのは、配列番号11, 12, 14および16に相当するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである。それらのプライマーセットのいずれも、全ての既知ＨＩＶ−２亜型からの核酸を増幅させるために用いることができる。
【００２２】
プライマーセットに加えて、生物学的試料は、該試料中に存在する任意のＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのようなＰＣＲ試薬とも接触させられる。
【００２３】
ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方を増幅せしめるためには、生物学的試料を本発明のＨＩＶ−１プライマーセットと一緒に本発明のＨＩＶ−２プライマーセットと接触させる。好ましくは、生物学的試料を配列番号２，３，４，７，８，11，12，14および16に相当するオリゴヌクレオチドと接触させる。そのようなプライマーセットの使用により、試料中に存在するどんな既知ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２亜型の標的核酸でも増幅させることができる。
【００２４】
本発明の方法は、ある場合には、配列番号２，３および４を含むプライマーセットのように、共通プローブ領域と重なる標的核酸配列を増幅させるために、３つ以上のプライマーを使用する。これは増幅システムの系統（strain）感受性と強固さを最大にする。この新規特徴は、アッセイ方法の系統感受性を増大させ、且つ増幅システムの感受性と強固さを増大させるという結果において各々が別々の利益、例えば大きな増幅効率および分離株間の高い配列相同性を与えるようなプライマーの組合せを考慮に入れる。
【００２５】
本発明の１または複数のプライマーセットを使ってＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２標的が増幅されれば、増幅させたＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２標的核酸に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプローブを使って、増幅させたＨＩＶ標的の存否を検出することができる。当業者は、使用したプライマーセットに応じて、増幅させたＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２標的核酸を検出するのに適するオリゴヌクレオチドプローブを容易に同定することができよう。本発明での使用に適当なオリゴヌクレオチドプローブとしては、非限定的に、次のオリゴヌクレオチドが挙げられる：
【００２６】
0004339427.tif 000007
【００２７】
0004339427.tif 000008
【００２８】
0004339427.tif 000009
【００２９】
0004339427.tif 000010
【００３０】
好ましくは、増幅させたＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２標的は、配列番号５，６，９および10に相当するプローブと、次の組合せ：配列番号13と17、または13, 21および22、または17, 21および22のいずれかとを使って検出する。
【００３１】
本発明は、プライマー領域に比較して低度の配列保存を有する領域について探査する時は、全ての既知分離株を検出するために複数の重複したプローブを使用する。これにより、一般的には増幅生成物の配列特異的検出に必要であるような高度に保存され且つ高度に特異的なプローブ領域によって隔たれていない領域において増幅プライマーをデザインすることが可能である。ある状況では、例えばＨＩＶ−１の場合、全ての既知分離株を高感度で検出するために複数のプローブが必要である。
【００３２】
ＰＣＲを使った核酸の増幅と検出のための一般原理および条件は非常に良く知られており、その詳細は米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）をはじめとする多数の文献中に提供されている。よって、上記技術の教示とその中に与えられる特別の教示を参照すれば、当業者はＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の既知の全亜型を検出するために本発明を実施するのは何ら難しくないはずである。
【００３３】
「生物学的試料」という語は、検出することのできる核酸を含有する細胞もしくはウイルス物質、毛髪、体液または細胞成分を限定的でなく包含する。
「オリゴヌクレオチド」という語は、１または複数のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子、例えばプライマー、プローブ、および検出しようとする核酸断片のことを言う。
【００３４】
「プライマー」という語は、天然に存在するにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖（すなわち鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導されるような条件（そのような条件には、別のＰＣＲ試薬の存在、並びに適当な温度およびｐＨが含まれる）下に置いた時に合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドのことである。
【００３５】
プライマーは、最大の増幅効率のために好ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含むことができる。それはＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成を開始させるのに十分な程長くなければならない。各プライマーの正確なサイズは、意図する使用目的、プライマーの濃度および配列、標的配列の複雑さ、反応温度、並びにプライマーの起源に依存して異なるだろう。本発明で使用するプライマーは通常12〜60ヌクレオチドであり、好ましくは16〜40ヌクレオチドを有するだろう。より好ましくは、各プライマーは18〜35ヌクレオチドを有する。
【００３６】
本発明に有用なプライマーは、既知の技術と装置、例えばABI DNA 合成装置（Applied Biosystemsから入手可能）またはBiosearch 8600シリーズもしくは8800シリーズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc,から入手可能）を使って調製することができる。この装置を使う手順は周知であり、例えば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載されている。生物学的源から単離された天然に存在するプライマーも有用であるかもしれない（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。一般に少なくとも２つのプライマーのセットが各々の標的核酸に使われる。よって、複数の標的核酸を同時に増幅させるためにプライマーの複数セットを用いることができる。
【００３７】
本明細書中で用いる時、「プローブ」とは標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅された標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
本発明では、配列特異的プライマーおよびプローブが提供される。例えば、５′末端か３′末端のいずれかへのヌクレオチドの付加により（前記ヌクレオチドは標的配列に相補的であるかまたは非相補的である）、追加の配列特異的プライマーおよびプローブを調製できることは当業者に明白であろう。そのような組成物は本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明において使われるプライマーおよび／またはプローブは、所望により標識することができる。当該技術分野で既知の方法を使って、プライマーおよび／またはプローブを特異的結合リガンド（例えばビオチン）、酵素（例えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリホスファターゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色素原、蛍光助剤、燐光成分またはフェリチンで標識することができる。好ましくは標識は特異的結合リガンドである。より好ましくは標識はビオチンもしくはその誘導体、ストレプトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンである。
【００４０】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに不可欠であると考えられる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸のためのプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ補因子、および１または複数のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸（dNTP's）のことである。ＰＣＲに使われる他の任意の試薬および材料については後述する。それらの試薬は個別に、試験キットの一部分として、または試験装置の試薬室の中に、提供することができる。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型の複合体においてプライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であるが、この付加は鋳型依存方式である。一般に、伸長生成物の合成は、新しく合成された鎖の５′から３′方向において、合成が終結するまで進行する。有用なＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ、逆転写酵素、および当業界で既知の他のものが挙げられる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはそれが熱に安定であることを意味する耐熱性であり、そして高い温度で、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に使われる高温において優先的に活性である。より詳しくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載のポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温において実質的に不活性でない。そのような温度は多数の反応条件、例えばｐＨ、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃度および当業界で既知の他の条件によって異なるだろう。
【００４２】
多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが技術の現状において報告されており、それらとしては、米国特許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818 号（Gelfand 他）明細書中に詳述されたものが挙げられる。特に有用なポリメラーゼは様々なテルムス菌種、例えばテルムス・アクアティカス（Thermus  aquaticus）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）から得られるものである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼは、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、テルモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年７月27日公開）に記載のものをはじめとする様々な生物源から得られる。幾つかの有用な耐熱性ポリメラーゼが市販されており、例えばPerkin ElmerからAmpliTaq（商標）, Tth およびUlTma （商標）、StratageneからPfu 、並びにNew England Biolabs からVentおよびDeep-Vent が市販されている。生物体から天然ポリメラーゼを単離する技術、および組換え技術を用いて遺伝子操作された酵素を生産する技術も多数知られている。
【００４３】
ＤＮＡポリメラーゼ補因子とは、酵素の活性がそれに依存する非タンパク質化合物のことである。よって、補因子が存在しなければ酵素は触媒的に不活性である。多数の物質が既知の補因子であり、例えばその非限定例として、マンガンおよびマグネシウムの塩、例えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩が挙げられる。塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが好ましい。
【００４４】
ＰＣＲに更に必要であるのは、２以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えばdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびdUTPのうちの２以上である。好ましくは４種の一般的三リン酸（dATP, dCTP, dGTPおよびdTTP）が一緒に使用される。
【００４５】
本明細書中に記載のＰＣＲ試薬は、標的核酸の増幅を提供するのに適当な濃度で供給されそしてＰＣＲに使われる。増幅に必要であるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、補因子およびデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸の最小量並びに各々の最適範囲は当業界で周知である。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は通常少なくとも約0.5 単位／100 μL 溶液であり、約２〜約25単位／100 μL 溶液が好ましく、約７〜約20単位／100 μL 溶液がより好ましい。与えられた増幅システムには他の量が有用なことがある。「１単位」は、本明細書中では74℃で30分間の間に伸長核酸鎖の中に10ナノモルの全ヌクレオチド（dNTPs ）を取り込むのに必要とされる酵素活性の量として定義される。増幅に用いる各プライマーの最小量は少なくとも約0.075 マイクロモル濃度であり、約0.1 〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、他の量も当業界で公知である。補因子は通常約２〜約15ミリモル濃度の量で存在する。各dNTPの量は通常約0.25〜約3.5 ミリモル濃度である。
【００４６】
ＰＣＲ試薬は、任意の適当な緩衝剤（多数が当業界で既知である）を使って、約７〜約９の範囲内のｐＨを有する緩衝溶液中に、個別にもしくは種々に組み合わせてまたは全部一緒に供給することができる。
【００４７】
ＰＣＲにおいて使用できる他の試薬としては、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体が挙げられる。抗体は増幅前に前記ポリメラーゼを抑制するために使用することができる。本発明に有用な抗体は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、約50℃より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、そして高い温度で失活する抗体である。有用な抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片が挙げられる。好ましくは抗体はモノクローナルである。本発明において有用な抗体は、既知の方法、例えばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988)に記載された方法を使って調製することができる。
【００４８】
代表的なモノクローナル抗体は米国特許第5,338,671 号明細書（Scalice 他）に記載されている。常用の手順と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（Rockville, MD ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系HB 11126または11127 のいずれかを含む出発材料を使って、当業者は２つのモノクローナル抗体を容易に得ることができる。モノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜約500 ：１の量で存在する。
【００４９】
増幅された核酸は多数の既知の方法、例えば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載の方法で検出することができる。例えば、増幅された核酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、または標識プローブを用いる非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出技術を使って検出することができる。あるいは、適当に標識されたプライマーを使って増幅を行い、その標識の検出手順および検出装置を使って、増幅されたプライマー伸長生成物を検出することができる。
【００５０】
好ましい態様では、増幅された標的核酸は、検出用に標識されており且つ増幅された標的と直接的または間接的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを使って検出される。該プローブは可溶性であっても固体支持体に取り付けられてもよい。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅させるのに使われるプライマーのうちの１つまたは複数が、例えば特異的結合成分によって標識される。標識プライマーが中に取り込まれている生じたプライマー伸長生成物を、プローブを使って捕捉することができる。該プローブにハイブリダイズした増幅標的の検出は、当業界で周知である適当な検出装置および手順を使って標識付プローブの存在または増幅された標識付標的の存在を検出することにより行うことができる。標識によっては、検出装置を使わずに目で見ることができるものもある。
【００５１】
より好ましい態様では、標的核酸を増幅させるのに用いるプライマーの１つまたは複数がビオチンにより標識され、増幅されたビオチン化標的核酸が固体支持体に取り付けられたプローブにハイブリダイズせしめられる。次いで、それらを酸化剤（例えば過酸化水素）および適当な色素形成性組成物の存在下でストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させることにより、結合した標識が検出される。例えば、有用な色素形成試薬として、テトラメチルベンジジンおよびその誘導体、並びにロイコ色素、例えば米国特許第4,089,747 号明細書（Bruschi ）に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素が挙げられる。
【００５２】
本明細書中で時間に関して用いる時、「約」という語は時間限界の±10％を表し、そして温度に関して用いる時、「約」という語は±５℃を表す。
下記の実施例は本発明の幾つかの態様を例示するために与えられるのであって、本発明を限定するものであると解釈してはならない。
【００５３】
【実施例】
材料と方法：
テルムス・アクアティカス（Thermus  aquaticus）からの組換えＤＮＡポリメラーゼは既知の手順、例えば欧州特許公開EP-A-0 482 714に記載されたものを使って調製し、これは約250,000 単位／mgタンパク質の活性を有した。
【００５４】
下記の実施例で使用するプライマーおよびプローブは、既知の出発材料と手順を用いて、Applied Biosystems Model 380B 、標準ホスホロアミダイト化学を用いる３カラムＤＮＡ合成装置、およびＡＢＩ１μモルスケール・ファーストサイクルプロトコールを使って調製した。ヌクレオシド−３′−ホスホロアミダイトおよびヌクレオシド誘導化細孔制御ガラス支持体はApplied Biosystemsから入手した。プライマーは上記に示した配列を有した。米国特許第4,962,029 号明細書に記載の２つのテトラエチレングリコールスペーサーに続いて１つの市販のデュポン社製ビオチンホスホロアミダイトにより、それらの５′末端を機能性にした。米国特許第4,914,210 号明細書に記載の２つのテトラエチレングルコールスペーサーに続いて１つのアミノジオール連結基によりプローブの３′末端を機能性にした。全ての精製は核酸精製カラムに続いて逆相HPLC技術を使って実施した。デオキシリボヌクレオチド（dNTPs ）はSigma Chemical Co.から入手した。
【００５５】
幾つかの実験では、ホスホロチオエート含有プライマーを使用した。３′−ヒドロキシル基に関して末位と末位から二番目にホスホロチオエート結合を有するホスホロチオエート含有プライマーは、米国特許第5,003,087 号明細書および技術公報添付カタログNo. 40-4036-xx, Glen Research, Sterling, Virginia 中にも記載された方法に従ってＨ−ホスフェート化学により調製した。
【００５６】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液は、リン酸塩緩衝化食塩溶液（24 mM リン酸ナトリウムおよび75 mM 塩化ナトリウム）中に市販の（Sigma Chemical Co.）ストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体、カゼイン（0.5 ％）およびメルチオレート（0.5 ％）を含んで成る溶液を使用した。接合体安定剤として10 mM の４′−ヒドロキシアセトアニリドを使用した。
【００５７】
内部陽性対照（ＩＰＣ）標的は次のようにして調製した。ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成により一本鎖合成標的としてＩＰＣ配列を調製した。次いでそれを５′制限部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使って増幅させ、pBluescript II KS(-)プラスミドベクター中に指向性クローニングした。プラスミドを含むＥ．コリの大規模培養物を以前に記載された通りにアンピシリン選択条件下で増殖させた（Sambrook他, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press 1989 ）。続いて販売業者からの適当な試薬を使ってそして販売業者の手順に従って、プラスミドＤＮＡをQiagenカラム上で精製した。得られた精製プラスミドをＴＥ緩衝液（10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0 ）中に再懸濁し、濃度を分光光度測定した（Sambrook他, 1989）。続いてプラスミドを制限酵素ScaIで消化して、完全な標的配列を維持したままでプラスミドを直鎖状にした。全ての標的の系列希釈は、10mg／mlの音波処理済の子牛胸腺ＤＮＡ（Sigma ）を含むＴＥ緩衝液において行った。
【００５８】
ロイコ色素分散液は、アガロース（0.5 ％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（250 μモル濃度）、ジエチレントリアミン五酢酸（100 μモル濃度）、３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）、ポリビニルピロリドン（112 ミリモル濃度）、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物（10ミリモル濃度）および過酸化水素（H2O2）（8.82ミリモル濃度）を含んだ。
【００５９】
洗浄溶液（pH 7.4）は、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物緩衝剤（25ミリモル濃度）中に塩化ナトリウム（373 ミリモル濃度）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（2.5 ミリモル濃度）、デシル硫酸ナトリウム（38ミリモル濃度）およびエチルセリチオサリチル酸ナトリウム塩（25マイクロモル濃度）を含んだ。
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物（75μL ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10〜18ミリモル濃度、pH 8）、EDTA（０〜0.75ミリモル濃度）、塩化カリウム（50ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（４ミリモル濃度）、dATP, dCTP, dGTPおよびdTTP（各0.3 mM）、記載のプライマー（別記しないかぎり各0.4 マイクロモル濃度）、IV型ゼラチン（100 mg／ml）、Taq ポリメラーゼ（16単位／100 μL ）およびグリセロール（9.5 ％）を含有した。50倍モル過剰（ポリメラーゼに対して）のTP1-12.2と５倍過剰のTP4-9.2 を使用した。
【００６１】
捕捉試薬を作製するために、常用の乳化重合技術を使って、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比95：５〜98：２、平均直径１μｍ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μｍ）にプローブを共有結合で取り付けた。前記粒子の水中懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（0.1 モル濃度、pH 6）で洗浄し、次いで固形分約10％になるように懸濁した。緩衝剤（0.1 モル濃度）中に固形分3.33％に希釈された洗浄済粒子の試料（3.3 ml）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（84mg／ml水、2.1 ml）およびプローブ（44.44 OD／mlナノ純水、983 μL ）と混合した。生じた懸濁液を断続的に混合しながら湯浴中50℃で約２時間加熱した後、遠心分離した。（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル濃度）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.01モル濃度、pH 8）で粒子を３回洗浄し、そして固形分４％になるようにその中に再懸濁した。
【００６２】
緩衝剤で固形分0.25％に希釈したらすぐに、捕捉試薬（１〜２μL ）を、SURECELL（商標）使い捨て試験装置〔Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.から入手可能；これは米国特許第4,948,561 号明細書（HincKley他）に詳細に記載されている〕中の試験ウエルの微孔質膜（LOPRODYNE （商標）ポリアミド膜、平均ポアサイズ 1.2μｍ、Pall Corp.から）の限定領域に適用し乾燥させた。他の試薬と材料は、商業源から入手したか、または容易に入手可能な出発材料と常用手順を使って調製した。
【００６３】
実験：
プライマーの選択：
本出願人らは、ＨＩＶ−１の高度保存配列領域を同定することによりＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のためのＰＣＲ増幅システムの開発に着手した。次の基準を使って保存領域に対するプライマーをデザインした：(1) 小さい生成物ほど高い効率で増幅し、有効ポリメラーゼ濃度、アニール／伸長時間または調製される試料の平均サイズの減少に対する感受性が低いので、生成物の長さは200 ヌクレオチドを越えてはならない；(2) プライマーセットは増幅生成物の特異的検出のためにそれらの間に機能的なプローブ領域を持たなければならない；(3) プライマーの３′末端付近の不正対合（ミスマッチ）は、５′末端付近の不正対合よりもはるかに好ましくない；(4) それらのプライマーは３′末端安定性、長さ、ＧＣ含量および別の可能なプライマーやプローブとの相互作用に関する確立されたプライマー開発基準を満たさなければならない。
【００６４】
初めに、次の11のプライマーを試験用に選択した：
0004339427.tif 000011
【００６５】
これらのプライマーの多くは、プライマーの５′末端、３′末端または両末端のところの配列を除いて別のプライマー１つまたは２つと同じである。配列番号１と23は、ＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲ領域の１つの正プライマー領域であり、一方配列番号24と２は別のＬＴＲ正プライマー領域である。配列番号25, ３および26は１つのＬＴＲ逆プライマー領域を表し、一方配列番号４は第二の領域を表す。配列番号７はＨＩＶ−１ゲノムのＰＯＬ領域に対してデザインした唯一の正プライマーであり、一方配列番号27と８は配列番号７と相補することができる逆プライマーである。
【００６６】
これらのプライマーを、PE9600サーモサイクラー上で40サイクルに渡るＰＣＲによって反応液75 ml あたりＨＩＶ−１標的０コピーまたは15コピーを増幅させ、次いでゲル電気泳動を使って検出することにより試験した。ＨＩＶ−１標的ＤＮＡは次のようにして調製した。宿主染色体中に組み込まれたポリメラーゼ欠損ＨＩＶゲノムの単一コピーを含む８Ｅ５細胞（Folks T.M.他, J. Exp. Med. 164:280, 1986）を、10％ウシ胎児血清を含む90％RPMI培地中で増殖させた。典型的なＳＤＳ、プロテイナーゼＫ消化に続くフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって、2.5 ×109 細胞／１Ｌ培養物からＤＮＡを調製した。得られた抽出物を塩化セシウム上でバンド沈降せしめ、透析し、抽出し、エタノール沈澱し、そして分析用に10 mM Tris／1 mM EDTA (pH 8.0)中に再懸濁した。Ａ260 での光学濃度測定によりＤＮＡ含量を計算した。全ての反応は反応液75μL あたり３mgの子牛胸腺ＤＮＡを添加すること以外は上述した通りに実施した。16通りの可能なＬＴＲ組合せと２通りの可能なＰＯＬ組合せの各々について複製反応を実施した。ゲル結果を第１表に示す。68℃のアニール／伸長温度でのＨＩＶ−１標的を含まない対照反応は、配列番号23／４の組合せについて検出可能な副生成物バンドを示した。このため、この組合せはあまり好ましくないプライマーセットである。この副生成物の他には、いずれのアニール／伸長温度でも検出可能な副生成物は本質的に全く観察されなかった。
【００６７】
選ばれたプライマーを、２つのアニール／伸長温度においてゲルバンド強度の点から更に比較した。配列番号１または23を含む組合せ間にはゲルバンド強度にほとんど差がなかった。配列番号24と２は、異なる逆プライマーと組み合わせた時に互いに同等に機能した。３つの重複する逆プライマーのうち、配列番号３と26は、特に70℃のアニール／伸長温度を使った時に、配列番号25よりも良好に機能した。配列番号４を含む全ての組合せが両アニール／伸長温度で良好に増幅させた。配列番号27は配列番号８に比べて非常に貧弱にしか機能しなかった（共に配列番号１と組み合わせた時）。従って、配列番号27に関してはこれ以上試験を行わなかった。
【００６８】
【表１】
0004339427.tif 000012
【００６９】
次の実験は、配列番号７／８プライマーセットと個々の全ての可能なＬＴＲプライマーセットとの同時増幅反応であった。この同時増幅は内部陽性対照（ＩＰＣ）の存在下で実施した。増幅は、米国特許第5,089,233 号明細書に記載された自動ＰＣＲプロセッサーである、Johnson & Johnson Clinical DiagnosticsのＰＣＲアナライザーを使って実施した。次の３種類の温度プロフィールを使って、40サイクルに渡りＨＩＶ標的を増幅させた。
【００７０】
(1)  95 ℃で15秒間の変性および68℃で30秒間のアニール／伸長；
(2)  95 ℃で15秒間の変性および66℃で30秒間のアニール／伸長；並びに
(3)  96 ℃で５秒間の変性および68℃で40秒間のアニール／伸長。
増幅生成物は上述した通りに検出した。
【００７１】
プロフィール１は従来技術の条件と見なし、第二のプロフィールはどのプライマー組合せが副生成物を形成する傾向があるかを決定するために使用し、そして第三のプロフィールは合計循環時間を増大させることなく（アニール／伸長時間を増加することによって）増幅をより強固にする試みであった。全ての反応は、反応液75μL あたりＨＩＶ標的とＩＰＣ標的各々10コピーを使って実施した。
第三の増幅プロフィールを使った時、特により長い（＞150 ヌクレオチド）生成物を生じるプライマーセットの場合、増幅はより強固であった。この結果は、配列番号23, 24および４がいずれも副生成物を形成する傾向があることも証明した。従って配列番号23と24を外した。その後の実験は配列番号１，２および３を使って実施した。
【００７２】
次に、２つのＨＩＶ−１同時増幅システム（配列番号１／３または２／３と配列番号７／８との同時増幅）の絶対感度を試験した。反応は40または45サイクル実施した（96℃で５秒；ＩＰＣ標的およびプライマーの存在下または非存在下のいずれかで68℃で40秒）。10, 5, 2.5, 1, 0.5および０のＨＩＶ標的レベルを全ての試験条件に対して二重反復で実験した。
【００７３】
配列番号２／３を含むシステムは増幅中に生成する副生成物が少なく（特に45サイクルの場合）、両システムとも2.5 コピーほどの少量のＨＩＶ−１標的を一貫して検出できるようであった。ＩＰＣの存在下では、配列番号１／３同時増幅システムは、１コピーでは４複製物のうちの２つ、そして0.5 コピーでは４複製物のうちの１つにおいてＨＩＶ生成物（一方または両方）を増幅させた。同じ条件下で、配列番号２／３同時増幅システムは、１コピーでは４複製物のうちの３つ、そして0.5 コピーでは４複製物のうちの４つでＨＩＶ生成物（ＨＩＶ−１もしくは２またはその両方）を増幅させた。この実験で行った標的配列を１つも含まない対照反応は全て外観上陰性であった。
【００７４】
ＨＩＶ−１について要約したのと同じ基準に従って、ＨＩＶ−２プライマーを試験用に選んだ。ＨＩＶ−２プライマーをデザインする時に考慮した１つの追加の基準は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方のプライマー候補との起こり得る相互作用を最小にすることであった。試験したＨＩＶ−２プライマーの最初のセットを下記に列挙する：
【００７５】
0004339427.tif 000013
【００７６】
ＨＩＶ−２  ＤＮＡを調製するために、ＨＩＶ−２のHut78 NIH-Z 株に感染した10E8細胞を、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫで処理し、次いでフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱し、得られた抽出物を分析用に10 mM Tris／1 mM EDTA pH 8.0中に再懸濁した。
【００７７】
個々のＨＩＶ−２プライマーを、次の２つの異なる増幅プロフィール：
(1) 68℃のアニール／伸長温度で40サイクル；および
(2) 62℃のアニール／伸長温度で５サイクル
に続いて68℃のアニール／伸長温度で35サイクルを用いて、配列番号１，２，３，26，４，７および８のＨＩＶ−１プライマーと共に使った場合の副生成物を形成する能力についてスクリーニングした。二番目のプロフィールは、標的の不正対合の影響を最小にする条件下でどのプライマーセットが副生成物形成を最小にできるかを決定する試験のために選んだ。条件１を使った時に配列番号７および８と共に強い副生成物を形成したどのプライマーも即座に捨てた。何故なら、それらのプライマーは同時増幅アッセイに最小にしか必要でないからである。この基準のために捨てたのは配列番号30および31のただ２つのプライマーであった。プライマーの残りを、様々な基準に基づいて狭めていった。ＨＩＶ−１プライマーと配列番号20により形成される副生成物が非常に低レベルであったために配列番号34よりも配列番号20を選んだ。配列番号11と12は副生成物をあまり生じず、更に確立された基準にも良く適合するために、配列番号28と29よりも配列番号11と12を選んだ。配列番号32と33は、増幅条件２の下で配列番号20または34のいずれかと併用した時に比較的貧弱な増幅であったために捨てた。残ったＨＩＶ−２プライマーセット（配列番号11／12、14／16、15／16、18／20および19／20）は全て、次のプライマー：配列番号２，３，７および８（各々0.4 μＭ）、IPC-F1（0.2 μＭ）およびIPC-R1（0.2 μＭ）を含む系において、反応あたり10コピーのＨＩＶ−２標的レベルで非常に良好に増幅させ且つ良く見えるゲルバンドを与える。上記の増幅条件１を使用した時のそれらの増幅システムによる副生成物形成はいずれも非常に少ない。増幅条件２を使用した時には有意な副生成物形成があるが、しかし特定の生成物がゲル上にまだ非常に良く検出可能である。
【００７８】
プローブ選択：
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のような多分岐のゲノムを扱う時には、２つのプライマーを使った各領域の増幅および１つのオリゴヌクレオチドプローブを使った各領域の検出を可能にするのに十分なほどに保存されている３つの領域を同定することはしばしば困難である。生成物の長さを最小にする必要があるシステムでは、プローブ特異性が損なわれ得る程度にまでプロービングの緊縮性を減らさない限り、この問題は作業を不可能にする程度にまで悪化する。この問題を避けるために、本出願人は、アッセイ特異性を傷つけることなく、全ての既知配列変異体の検出を可能にするために多重プローブを使用するシステムを開発した。
【００７９】
配列番号２と３により形成される生成物を探査するために、プローブは長さがわずか34ヌクレオイドの領域にはまらなければならない。この領域中の最も保存された配列は配列番号５のプローブの配列である。
0004339427.tif 000014
この配列はＨＩＶ−１分離株の大部分に高度に保存されており、該プローブと分離株配列のこの領域との間には１個以下のヌクレオチドの相違しかない。しかしながら、この領域には２〜５個の変異を有する幾つかの分岐配列がある。将来それらの配列から更に分岐した配列を検出する能力を最大にするために、配列番号６の追加のプローブをデザインした。
0004339427.tif 000015
【００８０】
ＨＩＶ−１  ＰＯＬの場合、遭遇する変異の最大数および苛酷性を最小にするように使用する両プローブを変更した。これを達成するために、デザインした両プローブはいずれの既知分離株配列とも等しくない。２つのプローブを使うことにより、任意の既知分離株に対して遭遇する変異の最大数を５から３に減らした。加えて、残りの変異の大部分はプローブの片側末端の付近に置かれ、かくしてハイブリダイゼーションした時のそれらの影響が小さくなる。ＨＩＶ−１  ＰＯＬプローブの配列を下記に示す：
0004339427.tif 000016
【００８１】
記載した上記状況は、２つのプローブを使用するＨＩＶ−２  ＰＯＬシステム用に選ばれた配列についても同様である。しかしながら、この状況は、２つのプローブに相補的な領域は重複しているけれども位置が同一でないという点で幾らか異なっている。これは、ＨＩＶ−２の２つの亜型間で配列が非常に異なるので必要な熱安定性を獲得するためにプローブの位置を変更しなればならないという事実のためである。この２つのプローブを使うと、全ての既知ＨＩＶ−２配列は亜型特異的ＨＩＶ−２プローブに比較して多くて２個のヌクレオチド相違を有する。２つのＨＩＶ−２  ＰＯＬプローブ配列を下記に示す：
0004339427.tif 000017
【００８２】
上述した同時増幅システムを、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２試料に対して試験した。比色検出に用いる検出プローブは下記のものであった：
0004339427.tif 000018
【００８３】
0004339427.tif 000019
【００８４】
始原型Ｍ群およびＯ群分離株を含む５種類の培養増幅したＨＩＶ−１分離株を試験した。試験した同時増幅システムは全て、配列番号７／８プライマーセット、内部陽性対照プライマーセット、並びに次の４つのＨＩＶ−１  ＬＴＲプライマーセットのうちの１つ：配列番号１／３、１／４、２／３および２／４を含んだ。ＨＩＶ−１特異的プライマーセットはいずれも試験した全ての分離株を検出した。標的ＤＮＡの系列希釈は、配列番号２／３および２／４プライマーセットが最も感受性のＬＴＲプライマーセットであることを証明した。配列番号２／４プライマーセットは多分岐のＯ群分離株に対して最も感受性であるように見えた。
【００８５】
２種類の培養増幅したＨＩＶ−２分離株も試験して様々なＨＩＶ−２プライマーセットの性能を評価した。どの反応も配列番号11／12プライマーセット、並びに次の４つのＬＴＲ−またはＰＯＬ−特異的ＨＩＶ−２プライマーセットのうちの１つ：配列番号18／20、19／20、14／16および15／16を含んだ。全てのプライマーセットが、試験した高い方の標的レベルで両標的の増幅をもたらした。ＨＩＶ−２標的の系列希釈はＬＴＲプライマーセットが最も感受性であることを示唆した。
【００８６】
15の培養増幅したＨＩＶ−１Ｏ群分離株、ＨＩＶ−１に感染したアフリカ人患者からの17の凍結した患者細胞ペレット（高レベルの配列非相同性を含むであろう）、および12の培養増幅したＨＩＶ−２分離株を試験することにより、様々な同時増幅システムの系統感受性を更に評価した。15のＯ群分離株は全て配列番号７／８プライマーセットと配列番号１／４，２／３および２／４のＬＴＲプライマーセットにより検出された。しかしながら、３つの分離株が配列番号１／３プライマーセットにより見落とされた。ＬＴＲシステムの場合、数個のＯ群分離株は２つのＬＴＲプローブのうちの１つ（Ｏ群とＵ分離株に最も相同であり且つチンパンジーウイルスHIV1-CPZgab に最も相同であるプローブ）だけに陽性であった。これらの結果は、単一の標的に対して２つの検出プローブを使用することにより観察される改善を証明した。上述のアフリカ人患者細胞ペレットの場合には、３つのＨＩＶ−１システム（配列番号２／３、２／４および７／８）全てが陽性であたが、しかし配列番号２／３システムがこの実験で最高の感受性のシステムであるらしく、試験した標的ＤＮＡの最高レベルでも２つの複製物のうち１つしか検出しなかったので配列番号７／８セットは最低の感受性であるように見えた。
【００８７】
12の培養増幅したＨＩＶ−２分離株のうちの１つは、試験した全てのプライマーセットに対して陰性であった。この試料はラボで用いる対照プライマーセットでも陰性であり、このことは、試料中にＨＩＶ−２  ＤＮＡが全く存在していなかった可能性があることを示す（幾つかのＨＩＶ−２分離株は十分に培養しないことは周知である）。他の11分離株はＥＮＶプライマーセットおよび両ＬＴＲプライマーセットを用いた時に陽性であった。対照的に、配列番号18／20および19／20セットはそれぞれ11の分離株のうち２つおよび11の分離株のうち１つを見落とした。
【００８８】
【配列表】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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