(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン・デイミナーゼ活性（シトルリンが０．１ピコモル／細菌タンパク質ｍｇ／分以上で表される）を有する、生物学的に純粋な、ドイツ微生物・細胞培養保存機構に受託番号ＤＳＭ１１９８８で寄託されたラクトバチルス・ブレビスＣＤ２株。
【請求項２】
請求項１の菌株および希釈剤または担体を含む組成物。
【請求項３】
経腸、局所、経直腸、経鼻または非経口投与に適する、請求項２の組成物。
【請求項４】
請求項１の菌株および経腸投与で許容される希釈剤または担体を含む、経腸投与可能組成物。
【請求項５】
菌株が凍結乾燥または音波処理されている、請求項２−４のいずれかの組成物。
【請求項６】
菌株の濃度が組成物１ｇにつき１ｘ１０１ＣＦＵから１ｘ１０１３ＣＦＵである、請求項２−５のいずれかの組成物。
【請求項７】
以下の成分の少なくとも１つをさらに含む、請求項２−６のいずれかの組成物：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブキネリ、ラクトバチルス・カセイ、ラクトバチルス・カテナホルム、ラクトバチルス・セルビオスス、ラクトバチルス・クリスパツス、ラクトバチルス・クルバツス、ラクトバチルス・デルブルエキイ、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・レイキマニイ、ラクトバチルス・ミヌツス、ラクトバチルス・プラタルム、ラクトバチルス・ロゴサエ、ラクトバチルス・サルビリウス、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス、ビフィドバクテリウム・アングラツム、ビフィドバクテリウム・ビフィヅム、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム、ビフィドバクテリウム・デンチウム、ビフィドバクテリウム・エリクソニイ、ビフィドバクテリウム・インファチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・プランタルム、ビフィドバクテリウム・プソイドカテヌラツム、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム、スプレプトコッカス・ラクチス、スプレプトコッカス・ラフィノラクチス、スプレプトコッカス・テルモフィルス、アカデミノコッカス・フェルメンタ、シトファーガ・フェルメンタンス、ロドフェラックス・フェルメンタンス、セルロモナス・フェルメンタンス、またはジモモナス・モビリス；アルギニン・デイミナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、または他の酵素：コルチゾン、抗炎症剤、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、免疫剤、内分泌剤、血管系剤、麻酔剤、または血管拡張剤；成長因子、サイトカイン、セラミド、ビタミン、ミネラル、脂質、アミノ酸、または炭水化物；経腸用製剤；栄養補助剤、プレバイオティック補助剤、またはプロバイオティック補助剤；または、医薬または健康食で許容される賦形剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、アポトーシスを誘発しおよび／または炎症反応を低下するために、アルギニン・デイミナーゼに富む細菌を使用すること、および該細菌を含有する医薬組成物または健康食組成物に関する。本発明はまた、アルギニン・デイミナーゼに高度に富むラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis) 株に関する。
【０００２】
（背景技術）
生物体における細胞数の均衡は、構成細胞の増殖、分化および死の割合を調整することで制御されている（Collins, M. K. L. et al. A. Trends Biochem. Sci. 18:307, 1993)。胚形成、変態、ホルモン依存性組織萎縮、組織の正常な交替における細胞死は、「計画された細胞死」といわれる。「アポトーシス」で起きる過程の多くの部分は、核の凝縮および分節、細胞質の凝縮および断片化、染色体ＤＮＡのヌクレオソーム単位への断片化を特徴とする（Schwartz. L. M. et al. Immunol. Today 14:582, 1993)。アポトーシスは脊椎動物の発育においてよく起きるが、その際、細胞は、内在性の細胞自殺予定を抑制するのに必要な細胞外生存信号を受けない。生存因子は、異なる型（パラクリン機序）または同じ型（オートクリン機序）の周辺細胞によりつくられる。アポトーシスが胚の発育時に特に起きるのは、細胞の部分的集団が殺されるような複合臓器においてである。例えば、多くのニューロンが発育中の脳に動き、丁度、自動活性Ｔリンパ細胞が胸腺内部で消失するようにである。大人でアポトーシスが特に組織で起きると、その組織は、ホルモンの離脱後または骨髄の造血細胞のサイトカイン依存性膨張後に乳房および前立腺のホルモン依存性細胞での可逆的膨張の対象となる。
【０００３】
アポトーシスの過程で細胞におきる変異については、広く研究され発表されている（Cohen, J. J. et al. Lab. Cli. Med. 124:761, 1994)。アポトーシスは壊死と明かに相違する。壊死は、細胞の損傷によって細胞死が起きる際の変異である。壊死では、損傷を受けた細胞が膨張し破裂して、細胞内容物を放出する。この内容物は、組織の他の細胞にとって毒であり、炎症応答の引き金となる。これに対し、アポトーシス体の食作用は、非常に速く細胞外空間に細胞内容物の拡散を生じせしめない。もしそうでなければ、壊死に典型的な末梢域での炎症が生じるであろう。
【０００４】
最近の研究結果によると、細胞生存の変化が多くのヒト疾患、例えば、癌、ウイルス感染、自己免疫疾患、自律神経障害、エイズなどの病因に関係している（Thompson. C. B. Science 267:1456, 1995)。アポトーシスを特異的に変えるのを目的とする処置は、これらの疾患のいくつかの自然的進行に変化を及ぼす可能性がある。化学療法剤および放射線照射のいずれも腫瘍細胞の死を誘導する。これは一義的にＤＮＡに障害を与え細胞自殺を起こすからである。さらに、多くの腫瘍はいくつかの生理的細胞死の制御系を保存している。この系は腫瘍発生の元の細胞に特徴的である。例えば、前立腺癌および乳癌は、それぞれアンドロゲンおよびエストロゲンに依存性である。従って、前立腺癌の治療における抗アンドロゲン療法または乳癌におけるタモキシフェンなどの抗エストロゲン処置によるエストロゲン除去は、広く認められている基本的な処置方法である。これらの処置は腫瘍細胞にアポトーシスを起す。処置がなければ、腫瘍はそれぞれアンドロゲンまたはエストロゲンに依存して生存する。さらに、リンパ様白血病の患者にみられるグルココルチコイドの作用は、好都合にアポトーシスの誘発に関与し得る。癌の化学療法に使用される他の物質、例えば、シクロホスファミド、メトトレキセート、エトポシド、シスプラチンも腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する（Thatte, U. et al. Apoptosis Drugs 54:511, 1997)。
【０００５】
以前の研究によると、食物や健康食品／医薬品中の乳酸菌が腸での一時的増殖を起し、好都合の効果をもたらす。腸内移行間の生存および上皮への接着は、宿主の免疫応答を変えるために重要とみられる（Schiffrin, E. J. et al. Am. J. Clin. Nutr. 66:515S, 1997)。乳酸菌の可能な有益作用には、腸感染に対する保護、ＩｇＡ分泌の促進、腸癌腫の成長阻害、およびＩｇＡ、Ｔ細胞、マクロファージの活性の強化がある（Perdigon, G. et al. J. Dairy Sci. 78:1597, 1995)。インビトロで乳酸菌が発揮する能力は、αＴＮＦ、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１０のヒト単核細胞上での産生の刺激であって、刺激物としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を使用したときよりも産生が大きく、宿主の非特異的免疫に対する強化作用が確認された（Miettinen, M. et al. Infect. Immun. 64:5403, 1996)。インビボで乳酸菌が発揮する能力は、調理された食物中の変異誘発性物質の吸収である。ヒトに乳酸菌を投与すると、油揚げ食品の摂取後に変異誘発性物質の分泌が低下し、腸癌の危険性が減じる（lidbeck, A. et al. Eur. J. Cancer Prev. 1:341, 1992)。
【０００６】
ビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ビフィヅム（Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis)、ラクトバチルス・アシドフィルス (Lactobacillus acidophilus)またはラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei)含有の発酵乳について、乳房腫瘍細胞ＭＣＦ７の成長に対して試験したところ、発酵乳の種類により程度は異なるが、腫瘍細胞の成長の阻害が認められた。抗増殖作用は、発酵乳の細菌の存在、乳自体またはその分留に相関し得ない。仮説としては，乳の発酵または乳中のなんらかの成分の微生物変換における乳酸菌から新たにつくられた化合物が生物活性型となって存在することである（Biffi, A. et al. Nutr. Cancer 28:93, 1997)。
【０００７】
多くの微生物は、炭素、窒素およびエネルギーの源としてアルギニンを利用する。アルギニン・デイミナーゼは、アルギニンを水の存在下にシトルリンとアンモニアに変換する。この酵素過程において、種々の病原性または病原可能性の細菌、例えば、プソイドモナス菌（Pseudomonas sp)、バチルス菌（Bacillus sp)、ある種の型のマイコプラズマが関与する。発表されたところによると、この系は口腔環境に役割を演じる。すなわち、歯垢中のｐＨが４以下に低下した際、酸性に抵抗力のある細菌による糖分解の際、酸耐性の低い生物を保護する（Curran. T. M. Appl. Environ. Microbio. 61:4494, 1995)。
【０００８】
マイコプラズマから得られるアルギニン・デイミナーゼについて、癌の治療に使用する研究がなされた（Takaku, H. et al. Jpn. J. Cancer Res. 1:840, 1995)。マイコプラズマは、細菌に似た微生物であり、細菌と同様に細胞膜を欠き、ゲノムサイズが大腸菌の１／６である。しかし、マイコプラズマは、ヒト、動物、植物の病原となり、さらに、細胞膜を欠くので扱うのが容易でない。マイクロプラズマから得られる酵素アルギニン・デイミナーゼについて精製がなされた（McGarrity, J. G. et al. US-A-5 372 942)。なお、マイコプラズマほ免疫原として働き、インビボでの使用で好ましくない作用を示す。アルギニン・デイミナーゼを有する他の微生物（例えば、プソイドモナス菌（Pseudomonas sp)やバチルス菌（Bacillus sp)）は、その病原性および発熱原性のために使用できない。
【０００９】
驚くべきことに本発明者の発見によると、いくつかの細菌、特にいくつかのグラム陽性菌、また乳酸菌のいくつかの株、特にラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis)やラクトバチルス・フェルメンタム（Lactobacillus fermentum)がアルギニン・デイミナーゼに富み、アポトーシスを誘発し得るので、アポトーシスの不十分や欠落または炎症を特徴とする臨床症状の予防または治療に使用できる。このうち特に、ＣＤ２というラクトバチルス・ブレビスの株はアルギニン・デイミナーゼに富み、これをドイツ微生物・細胞培養保存機構（Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Brunswick, Germany)に受託番号ＤＳＭ１１９８８で寄託した。
【００１０】
上記の細菌は、アポトーシスを誘発できるアルギニン・デイミナーゼを驚くべきに示し、そのままで、または適当な増殖後または音波破壊後に使用できる。本発明において、問題の細菌は生存しているか音波破壊されている。その濃度範囲は、期待する効果および細菌含有のアルギニン・デイミナーゼ量に従って、組成物１ｇにつき１ｘ１０1ＣＦＵから１ｘ１０13ＣＦＵである。同じ細菌株を用いて、酸化窒素（ＮＯ）に起因する炎症反応を減少または消滅せしめることができる。酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）がＬ−アルギニンから合成するＮＯは、多数の生物作用についての細菌内および細菌間の伝導体である。ＮＯの合成レベルが変ると、多数の他の生理病理的症状、例えば、高血圧症、腎不全、敗血病性ショック、低酸素による血管拡張、くも膜下出血による血管痙攣、血管梗塞における神経破壊などの神経分解症状、慢性炎症病態、アナフィラキシーおよび免疫不全が起きる。アルギニン・デイミナーゼは、アルギニンをシトルリンとＮＨ3とに酸化窒素の産生なしで変え、もって、抗炎症および治療的すなわち医療的作用を有するようになる。例えば、患者の代謝および／または栄養状態などにおいて腸管の吸収不良や膵液不足に対する作用である。非限定的な例で言及される作用は、血液および尿における酒石酸塩および／またはリン酸塩のレベルを低下する作用であり得る。
【００１１】
アルギニン・デイミナーゼに富む細菌を用いて処置し得る疾患および障害の非限定的な例は、次の通りである。一般的に腫瘍、特に結腸直腸癌、肝癌、グリオーマ、神経芽細胞腫、扁平細胞口腔癌腫、リンパ腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、胸膜・腹膜癌、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、甲状腺などの自己免疫疾患、急性および／または慢性の炎症過程を特徴とする疾患、腸管炎症、胃炎、十二指腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、肺炎、胸膜炎、アデノウイルス感染、バキュロウイルス感染、ウイルスによる一般的感染、中枢系および／または末梢系の急性および／または慢性の炎症性および／または変性過程を特徴とする疾患、膵炎、心筋内膜炎、虚血性障害（心筋、網膜、脳、腎での）、尿石症、腎石灰症、高シュウ酸症、高リン酸症、門脈高血圧などの全身性および／または局所的な動脈および静脈における神経変性、膣症や膣炎、直腸出血性炎症、前立腺炎、副鼻腔炎、耳炎、結膜炎、歯肉炎、歯周症、アナフラキシー症状、免疫欠損症。
【００１２】
アルギニン・デイミナーゼに富むこれらの微生物は、個別にまたは他の乳酸菌と組み合せて使用できる。その乳酸菌は、例えば、次の通りである。ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブキネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・カセイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・カテナホルム(Lactobacillus catenaforme)、ラクトバチルス・セルビオスス(Lactobacillus cellobiosus)、ラクトバチルス・クリスパツス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・クルバツス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・デルブルエキイ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・レイキマニイ(Lactobacillus leichmanii)、ラクトバチルス・ミヌツス(Lactobacillus minutus)、ラクトバチルス・プラタルム(Lactobacillus platarum)、ラクトバチルス・ロゴサエ(Lactobacillus rogosae)、ラクトバチルス・サルビリウス(Lactobacillus salivarius)、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アングラツム(Bifidobacterium angulatum)、ビフィドバクテリウム・ビフィヅム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム(Bifidobacterium catenulatum)、ビフィドバクテリウム・デンチウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・エリクソニイ(Bifidobacterium eriksonii)、ビフィドバクテリウム・インファチス(Bifidobacterium infatis)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・プランタルム(Bifidobacterium plantarum)、ビフィドバクテリウム・プソイドカテヌラツム(Bifidobacterium pseudo-catenulatum)、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム(Bifidobacterium pseudolongum)、スプレプトコッカス・ラクチス(Streptococcus lactis)、スプレプトコッカス・ラフィノラクチス(Streptococcus raffinolactis)、スプレプトコッカス・テルモフィルス(Streptococcus thermophilus)、アカデミノコッカス・フェルメンタ(Acadaminococcus fermenta)、シトファーガ・フェルメンタンス(Cytophaga fermentans)、ロドフェラックス・フェルメンタンス(Rhodoferax fermentans)、セルロモナス・フェルメンタンス(Cellulomonas fermentans)、ジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)。
【００１３】
さらに、本発明において、この細菌は、アルギニン・デイミナーゼやスフィンゴミエリナーゼなどの酵素とともに、また、コルチゾン、抗炎症剤、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、免疫剤、内分泌剤、血管系剤、麻酔剤、血管拡張剤、成長因子、サイトキニン、セラミド、ビタミン、ミネラル、脂質、アミノ酸、炭水化物、経腸または食品的プレビオまたはプロビオ補助剤とともに、また、医薬品または食品／健康食の分野で普通に用いられる賦形剤とともに使用できる。好ましい投与形態は経口であるが、これに限定されず、局所的、経直腸、経鼻または経皮の投与も可能である。従って、本発明の投与剤形としては、丸薬、錠剤、カプセル、顆粒、座剤、乳化剤、懸濁剤、貼付剤、クリーム、軟膏、噴霧剤、点眼剤、うがい剤、歯科用剤がある。
【００１４】
非限定的な表示の下記実施例は、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
種々の細胞系におけるアポトーシスの導入
用いた細胞
１．正常
ＰＢＬ（ヒト末梢血液リンパ球）
ＨＳ２７（正常ヒト線維芽細胞）
ＨａＣａＴ（不死化正常ヒト角化細胞）
２．腫瘍性
Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ白血病）
Ｐ８１５（ネズミ肥満細胞）
Ｊ７４４（ネズミ腫瘍マクロファージ）
【００１５】
細胞の培養を血清（１０％）を有する適当な培地で３７℃（５％ＣＯ2）で１８−７２時間、ラクトバチルス・ブレビスのリン酸緩衝音波処理液の存在または不存在で行った（細胞懸濁液の最終濃度：１００ｍｌ／１０ｍｌ）。インキュベーション処理後、細胞数を数え、生存能を染料トリパンブルーの排出を基に測定した。細菌で処理した細胞でのアポトーシス死の導入能を下記に基づき定めた。
【００１６】
ヘマトキシリン／エオジンでの染色後、光学顕微鏡による形態
蛍光顕微鏡および細胞蛍光光度法により検出されるアクリジンオレンジ／臭化エチジウムでの染色
ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によるはしご状ＤＮＡの検出
【００１７】
【表１】
表１
0004253439.tif 000002
【００１８】
上記の結果から明かなように、本発明の音波処理細菌での１４−１８時間処理は、腫瘍細胞に有意なレベルでのアポトーシスの導入をもたらし、一方、正常な細胞系にはなんらの作用を与えない。
【００１９】
実施例２
細菌株におけるアルギニン・デイミナーゼの存在の証明
いくつかの細菌株におけるアルギニン・デイミナーゼの活性を、放射標識アルギニンのシトルリンおよびＮＨ3への転換を基として調べた。アルギニンの転換に働く他の酵素（酸化窒素シンターゼおよびアルギナーゼ）を特異的に阻害し得る阻害剤（Ｌ−Ｎ−ニトロアルギニンメチルエステルＨＣｌおよびＬ−バリン）の存在よって、他の酵素ではなくアルギニン・デイミナーゼに基づく酵素活性が測定できた。さらに、アルギニン・デイミナーゼ（ホルマミジン）の特異的阻害剤を用いて、結果が正しいことが確認された。
【００２０】
【表２】
表２：アルギニン・デイミナーゼの活性（分当り生産された放射活性シトルリンのピコモル（ｐmol）／細菌タンパク質ｍｇとして表す）
0004253439.tif 000003
【００２１】
本発明の目的に有用と考えられる細胞株は、シトルリンが０．１ピコモル／タンパク質ｍｇ／分以上の値を有する。
酸化窒素シンターゼ（Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｌ−ニトロモノメチルアルギニン）またはアルギナーゼ（Ｌ−バリン）の阻害剤の存在はアルギニンのシトルリンへの転換についてなんら影響を与えないので、種々の細菌で観測されるシトルリンのアルギニン・デイミナーゼへの生成に関与が可能となる。さらに、継続的な酸化窒素シンターゼの活性に不可欠なカルシウムおよびカルモジュリンの分析系の欠如が、アルギニン転換の細菌の役割に対する活性をまったく修飾しなかったから、さらに後者に関与する酵素がアルギニン・デイミナーゼであることが確認される。
【００２２】
下記する結果から明かなように、問題の細菌で認められるアルギニン・デイミナーゼの活性は、継続性酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の活性および誘発性ＮＯＳの活性の両方を完全に阻害し得た。その存在が種々の形態の酸化窒素の基質（アルギニン）を奪うことに関与するからであろう。この目的に、インビトロで大腸菌のリポポリサッカライド（１００ｍｇ／ｍｌ）およびインターフェロン（１００Ｕ／ｍｌ）のそれぞれで刺激されたラット小脳抽出物およびラットマクロファージを、継続性ＮＯＳおよび誘発性ＮＯＳについての正の対照として用いた。
【００２３】
【表３】
表３：継続性および誘発性の酸化窒素シンターゼならびにアルギニン・デイミナーゼの活性
0004253439.tif 000004
【００２４】
明かなのは、すべての細菌が本発明の目的に有意の程度にアルギニン・デイミナーゼについての酵素活性を有するわけでないこと（表２）、およびここに挙げられた株による継続性ＮＯＳおよび誘発性ＮＯＳ両方の阻害が、両型のＮＯＳの特異的阻害剤の存在下での高いシトルリンの持続的存在でもって確認されたこと(表３）である。
【００２５】
実施例３
パウチ炎、回腸レザボアの非特異的炎症の患者４人を処置した。この疾患は潰瘍性大腸炎について回腸肛門吻合により長期間しばしば複合する。パウチ炎が炎症性ＮＯ仲介障害の結果であると、最近いわれている。対象者、すべてボランティアの処置は、２か月間、L. brevis CD2 の凍結乾燥製剤で、５ｘ１０10ＣＦＵ／ｇｒの濃度で、経口で、６ｇ／日の用量で行った。処置の前後に生検サンプルをパウチの粘膜から採取し、均質化し、放射標識アルギニンのシトルリンへの転換の解析によりシトルリン量を調べた。
【００２６】
【表４】
表４：パウチ炎患者の腸生検サンプルにおける誘発酸化窒素シンターゼ活性に対するＣＤ２での処置の効果
0004253439.tif 000005
【００２７】
ＣＤ２での処置は、誘発性酸化窒素シンターゼの活性レベルを有意に低下した。