(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２７０のＸａａがグルタメートであるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓの野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列からなるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓの変異ルシフェラーゼタンパク質であって、該変異タンパク質は配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２７０がグルタメート以外のアミノ酸であって、ＡＴＰに対するミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）が対応する野生型の配列を有するタンパク質に比べて減少していることを特徴とするＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓの変異ルシフェラーゼタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２７０に相当するアミノ酸残基がＸであるように、アミノ酸配列：Ｆ（１）ＸＥ（２）ＦＬを有することを特徴とし、配列中の（１）がＤ又はＥであり、（２）がＴ又はＬであり、且つ、Ｘがグルタメート以外のアミノ酸残基である、アミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸残基Ｘがリシンであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２１５に相当するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸である請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２１５に相当するアミノ酸残基が、イソロイシン、ロイシン、又はバリンである、アミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基３５４に相当するアミノ酸残基が、グルタメート以外のアミノ酸である、アミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基３５４に相当するアミノ酸残基が、リシン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、又はヒスチジンである請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
アミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを有するタンパク質であって、Ｘはグルタメート以外のアミノ酸であって、Ｘは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基３５４に相当する請求項６または７に記載のタンパク質。
【請求項９】
アミノ酸残基Ｘがリシンである請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列中のＸａａがリシンである、配列番号２で記述されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
配列番号１で記述されるヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のＤＮＡであって、配列中の８１１から８１３までの３つの塩基Ｎがグルタメート以外のアミノ酸をコードするコドンを形成するＤＮＡ。
【請求項１３】
前記コドンがリシンをコードする請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするｌｕｃ遺伝子を含むベクター。
【請求項１５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の２７０位のグルタメートをコードするコドンを別のアミノ酸に改変するための部位特異的突然変異誘発によって、野生型又は組換えｌｕｃ遺伝子を含むベクターを処理することによって得られる請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記別のアミノ酸がリシンである請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
発光試薬中に含まれる請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質を含むことを特徴とするＡＴＰ測定による検定を行うためのテストキット。
【請求項１８】
ルシフェラーゼが請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質であることを特徴とする、ＡＴＰ量に関係した量の光を発生させるためにルシフェリンとルシフェラーゼを使用してＡＴＰを測定する検定方法。
【請求項１９】
前記検定を３０℃から７０℃までの温度で行う請求項１８に記載の検定方法。
【請求項２０】
前記検定を３７℃から６０℃までの温度で行う請求項１８に記載の検定方法。
【請求項２１】
前記検定を４０℃から５０℃までの温度で行う請求項１８に記載の検定方法。
【請求項２２】
配列番号２で記述されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列中のＸａａがアルギニン、グルタミン及びアラニンから選択されるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有する新規のタンパク質と、このタンパク質の発現をコードするＤＮＡ及びベクターとに係わる。特に、本発明は、野生型及び改変野生型の既存の自然及び組換えルシフェラーゼに比較して、より低い基質ＡＴＰに対するＫmを有するルシフェラーゼを提供する。
ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ2+及び分子酸素の存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、その結果として発光を生じさせる。この反応は、約０．８８の量子収率を有し（ＤｅＬｕｃａ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９７８）とＳｅｌｉｇｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）を参照されたい）、この発光特性は、ＡＴＰレベルを測定する発光測定検定において使用されている。
ルシフェラーゼはホタルの体から直接得ることも、この酵素をコードする組換えＤＮＡ構築物を含む微生物からの発現によって得ることも可能である。この酵素を得ることが可能な、又は、この酵素をコードするＤＮＡを得ることが可能な重要な種は、日本のＧＥＮＪＩ及びＨＥＩＫＥホタルであるＬｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａとＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ、東ヨーロッパのホタルであるＬｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、北アメリカのホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）とツチボタル、及び、ヨーロッパのツチボタルであるＬａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａである。
野生型及び組換え型のルシフェラーゼの熱安定性は、約３０℃を越える温度、特に３５℃を越える温度に露出される時に極めて迅速にその活性を失うような熱安定性であり、このために、高い外界温度で使用する場合にはこの酵素の欠損が生じる。日本ホタルのルシフェラーゼをその２１７位で突然変異させてイソロイシン残基によってトレオニン残基を置き換えることによって、この酵素を熱安定化することが可能であり（Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，ｐ．１３７９５−１３７９９）、そのｐＨ安定性と比活性も増大される。
同時係属中の特許出願ＧＢ  ９４０５７５０．２は、特に、５０℃以上の温度において比較的熱安定であるルシフェラーゼを提供するために、使用可能なＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓの熱安定性を２１７位における改変によって増大させることが可能なアミノ酸置換を開示している。
本発明は、ルシフェラーゼ酵素を、比較的低いレベルにおけるアデノシン三リン酸の検出に基づく検定で使用するのに適したものにする、ルシフェラーゼ酵素の特性の強化に係わる。この強化は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのミカエリス−メンテン定数（Ｋm）が、野生型配列を有する対応するルシフェラーゼに比較して低減するように、この酵素のアミノ酸配列内の２７０位に相当する位置においてアミノ酸を改変することによって実現される。これは、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓにおけるアミノ酸２７２に相当する。これは、Ｌａｍｐｒｉｓ  Ｎｏｃｔｉｌｕｃａにおけるアミノ酸２７０にも相当する。
本発明は、更に、野生型ルシフェラーゼの発光波長とは異なった波長の発光を伴うＤ−ルシフェリンの酸化を生じさせる能力を特徴とするルシフェラーゼを提供し、従って、放出光の波長が存在する特定の標識材料に特徴的である結合測定法において、特異的標識としてこのルシフェラーゼを使用することを可能にし、又は、このルシフェラーゼをコードするＤＮＡを、遺伝子操作細胞もしくはこうした細胞から誘導された細胞のリポーターＤＮＡとして使用することを可能にする。
従って、本発明の第１の側面では、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２７０、並びに、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２７２に相当するアミノ酸残基がグルタメート以外のアミノ酸であることを特徴とする、ルシフェラーゼ活性を有し且つＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓのアミノ酸配列に対して６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質が提供される。このタンパク質が保存アミノ酸配列Ｆ（１）ＸＥ（２）ＦＬを有することを特徴とすることが好ましく、前式中で（１）がＤ又はＥであり、（２）がＴ又はＬであり、Ｘがグルタメート以外のアミノ酸であり、Ｆ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｔの各々が、単一文字アミノ酸コードによって与えられるような対応するアミノ酸に関連する。
現時点までに確定している好ましいアミノ酸Ｘは、リシン、その類似体、又は、その修飾物である。他の好ましいアミノ酸は、アルギニン、グルタミン、及び、アラニンを含む。
本発明の更に好ましい実施様態では、本発明のタンパク質が、更に、疎水性アミノ酸、好ましくはイソロイシン、ロイシン、バリン、又は、これらの類似体に改変された、Ｌｕｃｉｏｌａホタルルシフェラーゼのアミノ酸２１７又はＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸２１５に相当する位置のアミノ酸を有し、及び／又は、グルタミン酸以外のアミノ酸、特に、リシン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、又は、これらの類似体もしくは修飾物に改変された、Ｌｕｃｉｏｌａ  ホタルルシフェラーゼのアミノ酸３５６又はＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸３５４に相当する位置のアミノ酸を有する。
本発明の第２の側面では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが提供され、第３の側面では、本発明のタンパク質を発現させることが可能であるような形でｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼをコードする遺伝子）を含むベクター（特に、プラスミド）が提供される。こうした形は、微生物宿主細胞の中に取り込まれる時にそのタンパク質が（場合によっては、適切な誘導物質の添加によって）必要に応じて容易に発現させられることが可能であるように本発明のタンパク質の発現を制御することが可能なＤＮＡを上記ベクターが含むような形である。
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓに関するｌｕｃ遺伝子が公知であり、標準的な分子生物学的方法で単離可能である。これは、更に、Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａに関しても同様である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子は、ＰｒｏｍｅｇａからプラスミドｐＧＥＭ−ｌｕｃとして市販入手可能である。従って、本発明のＤＮＡの生産のための開始材料を得るための慣用方法と起源は、（ｉ）自然発生ホタルゲノムＤＮＡの使用、及び、例えばＰＣＲを使用することによるこのＤＮＡからのｌｕｃ遺伝子の増幅、（ｉｉ）ｐＧＥＭプラスミド、並びに、（ｉｉｉ）Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏのｐＧＬｆ３７プラスミドである。ルシフェラーゼ活性、即ち、発光を伴ってルシフェリンを酸化する活性を有するタンパク質をコードする更に別の遺伝子も、ＤＮＡを得るための、及び、最終的には遺伝子発現によって本発明のタンパク質を得るための開始材料の適切な起源であろう。
本発明のＤＮＡを生産するための野生型又は他のｌｕｃ遺伝子ＤＮＡの操作に使用するのに適したベクターは、天然グルタメートを別のアミノ酸に改変する際に本発明のＤＮＡがその中に含まれることが可能なあらゆるベクターである。例えばヒドロキシルアミンのような物質を使用して化学的に誘導する突然変異誘発の場合には、こうしたベクターはあまり重要ではなく、突然変異誘発処理の前と後に遺伝子の容易な操作を可能にする数多くの適切なベクターを、当業者は見い出すだろう。そのｌｕｃ遺伝子をグルタメートにおいて特異的に突然変異させることが好ましい場合も考えられ、従って、この場合には、部位特異的な突然変異誘発操作が必要とされるだろう。こうした操作をベクター内において極めて容易に行うことが可能であり、こうした操作は当業者にとって公知だろう。
野生型及び公知タイプのｌｕｃ遺伝子と本発明のｌｕｃ遺伝子とを発現させるための適切なベクターは、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）、及び、ｐＴ７−７を含む。ｐＫＫ２２３−３とｐＤＲ５４０は、イソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在によって発現が誘導されることを可能にする、ラクトースリプレッサーの制御下にあるｔａｃプロモーターを有する。ｐＴ７−７は、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによる制御を可能にし、従って、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞内での非常に高レベルの遺伝子発現のための基礎を与える。こうしたベクターの中で、ｌｕｃ遺伝子を挿入する場合に最も高レベルの発現を示すことが確認されているベクターは、ｐＴ７−７ベクターである。
ｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０の中に挿入されたｌｕｃ遺伝子からのルシフェラーゼの発現が、野生型Ｎ末端配列ルシフェラーゼの発現を生じさせると同時に、ｐＴ７−７の中に挿入されたｌｕｃ遺伝子からの発現が、別のＮ末端アミノ酸Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑを有する融合タンパク質の合成をもたらす。ｌｕｃ遺伝子を含む個々のベクター（構築物ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６、及び、ｐＰＷ３０４と呼ぶ）内のｌｕｃ遺伝子のリボソーム結合部位と出発コドンを、実施例の表１に示す。後述するｐＷ６０１ａは、ユニークＸｈｏ  Ｉ部位ｐＰＷ１１６を除去することによって得られる。
本発明の第３の側面は、本発明のタンパク質を発現させることが可能な細胞、この細胞を用いるこうしたタンパク質を生産するための方法及び本発明のタンパク質を含むテストキット及び試薬を提供する。当業者には公知であるように、そのルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とするルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を使用してＡＴＰを測定する検定方法も提供される。本発明のルシフェラーゼ調製物は、対応する野生型及び組換えルシフェラーゼに比較してＫmが低く、更に、好ましい二重改変及び三重改変ルシフェラーゼ（即ち、２１５、２７０もしくは３５４位において改変されたＰｈｏｔｉｎｕｓ、２１７、２７２もしくは３５６位において改変されたＬｕｃｉｏｌａ、又は、２１５、２７０もしくは３５４位で改変されたＬ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）は、３０℃から７０℃までにおいて、特に３７℃から６０℃までにおいて、とりわけ４０℃から５０℃までにおいて、比較的高い熱安定性特性を有する。従って、本発明は、本発明人等による他の同時期の研究と以前の研究との熱安定性強化策が使用されることを妨げないものとして、確立されている。
その細胞のＤＮＡ中のＤＮＡ配列、又は、細胞中に含まれるプラスミドのようなベクター中のＤＮＡ配列を使用して異種タンパク質を発現させることが可能な細胞を、本発明のタンパク質を発現させるために使用することが可能である。こうした細胞の中で典型的な細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のような酵母細胞と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞のような細菌細胞であると考えられるが、当業者は、タンパク質発現の目的に適した他の数多くの宿主生物を見い出すことだろう。
本発明のタンパク質を、自然ルシフェラーゼ及び公知の組換えルシフェラーゼに類似した構造のタンパク質として発現させることが可能であり、又は、他のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、もしくは、他の化学種（例えば、上記のＡ−Ｒ−Ｉ−Ｏ配列）を有するこうしたタンパク質の融合体又は複合体として発現させることが可能である。
宿主の中には特定のコドン優先性を有するものがあり、例えば、細菌が酵母とは異なったコドンを使用する場合があり、従って、こうした宿主におけるより有利な発現を生じさせる所与のアミノ酸に関与する縮重コドンを与えるために、その宿主に取り込まれたＤＮＡを有利に改変することが可能であることが当業者に理解されるだろう。当然のことながら、こうした縮重コドンは本発明のＤＮＡの範囲内に含まれる。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）は、適した宿主の１つであり、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でその染色体の中に安定的に統合されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを有し、従って、ｐＴ７−７誘導構築物に対して適合性がある。
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ菌株は、ＢＬ２１と同様に、ｌｏｎプロテアーゼとｏｍｐＴ外膜プロテアーゼとに欠けている。こうした欠乏は、Ｅ．ｃｏｌｉ中における外来タンパク質の発現と蓄積の安定化を促進することが可能である。上記の３つの発現構築物の各々を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の粗抽出物の検定は、最高レベルのルシフェラーゼ発現が、構築物ｐＰＷ３０４を含む細胞から得られることを示した（表２を参照されたい）。下記の実施例で使用するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞のような他の適切な細胞系統を、当業者は容易に見い出すだろう。
以下では、下記の非限定的な実施例、図面、表及び配列表を参照しながら、本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞を単なる例示の形で説明する。本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞を考慮することによって、当業者は、これらのいずれかを組み込んだ更に別のタンパク質、タンパク質複合体、ＤＮＡ、ベクター及び細胞、並びに、検定及びテストキットを容易に見い出すだろう。
図面
図１は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３から誘導されるプラスミドｐＰＷ２０４の制限地図を示す。
図２は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から誘導されるプラスミドｐＰＷ１１６の制限地図を示す。
図３は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７から誘導されるプラスミドｐＰＷ３０４の制限地図を示す。
図４は、ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位が除去されたｐＧＥＭ−ｌｕｃからのＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントとから誘導された、プラスミドｐＰＷ６０１ａの制限地図を示す。
図５は、下記実施例で説明する通りに所与の温度に１６分間インキュベートした、組換え野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、本発明のＫm改変ルシフェラーゼ、同時係属中のＧＢ  ９４０５７５０．２に開示されている熱安定性３５４リシン突然変異体、及び、本発明のＫm／３５４リシン二重突然変異体の熱不活性化のグラフを示す。
図６は、Ｔａｂｏｒ後のｐＴ７−７の制限地図を示す。
配列表
本明細書の末尾に示した配列表は、次のようなＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号：１は、８１１から８１３までのＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ野生型コドンが突然変異している本発明のルシフェラーゼをコードするＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。リシンに関しては８１１の塩基だけがＡに突然変異している。この配列は、１０６３から１０６５までの、熱安定性をもたらすための位置も示す。
配列番号：２は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ野生型アミノ酸２７０グルタメートがグルタメート以外の残基Ｘａａに改変されている、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３は、２７０位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるための、ｐＰＷ６０１ａのＳＤＭ突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号：４は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ野生型アミノ酸２７０グルタメートがリシンに改変され且つアミノ酸３５４がリシンに改変されている、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５は、３５４位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるためのｐＰＷ６０１ａのＳＤＭ突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。
実施例
実施例１：  本発明のＤＮＡを含むプラスミドの生産
プラスミドｐＫＫ２２３−３とプラスミドｐＤＲ５４０をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した。ｐＤＲ５４０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ，ＵＫからも入手可能である。ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡから入手した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ）を、ｐＴ７−７誘導プラスミドからのルシフェラーゼの発現のために使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９（４）をクローニング実験の全てにおいてｐＤＲ５４０誘導プラスミドからのルシフェラーゼの発現のために使用した。
プラスミドｐＴ７−７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ＩＩ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．２．１のＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい）を、Ｓｔａｎ  Ｔａｂｏｒ，Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ  ０２１１５から入手し、このプラスミドは（図６に示すように）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ１０と、ｐＴ７−５のＰｖｕＩＩ部位とＣｌａＩ部位との間に挿入されたＴ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７  ｂｐ２２８５７からｂｐ２２９７２まで）のための翻訳開始部位とを含む。（５′末端の充填後の）融合タンパク質の作成のためのユニーク制限部位は、Ｆｒａｍｅ  ０：ＥｃｏＲ１、Ｆｒａｍｅ  １：ＮｄｃＩ，ＳｍａＩ、ＣａｌＩ、Ｆｒａｍｅ  ２：ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩである。その当初のポリリンカーのＳａｃＩ部位を欠失によって除去し、追加のＸｂａＩ部位を出発コドンの上流に与える。
図面の説明に述べているように、各々に、標準的な制限エンドヌクレアーゼとライゲーション法とを使用してＰｒｏｍｅｇａ  ｐＧＥＭ−ｌｕｃから誘導したｌｕｃ遺伝子を挿入することによって、ｐＰＷ２０４をｐＫＫ２２３−３から誘導し、ｐＰＷ１１６をｐＤＲ５４０から誘導し、ｐＰＷ３０４をｐＴ７−７から誘導し、一方、ｐＤＲ５４０と、このプラスミドのポリリンカー内のユニークＸｈｏ  Ｉ部位を除去することによって誘導されるようなｐＰＷ６０１ａとの中に、ｐＧＥＭ−ｌｕｃから誘導したｌｕｃ遺伝子と、ＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントとをクローニングすることによって、ｐＰＷ６０１を生産した。ｐＰＷ６０１ａは、ルシフェラーゼアミノ酸３５４改変のためのＳＤＭ手順を単純化する、Ａｖａ  Ｉに関するユニーク認識部位を含む。
ｐＰＷ３０４の生産のために、ｐＴ７−７をＥｃｏＲＩで消化し、末端をクレノウフラグメントを使用して充填し、その産物をＳａｌＩで消化し、そのＤＮＡをゲル精製する。ｐＧＥＭ−ｌｕｃをＢａｍ  ＨＩで消化し、生産されたオーバーハングをＭＢＮで消化し、その産物をＳａｌＩで消化し、生産された１Ｋｂフラグメントを精製し、ライゲーションして精製ｐＴ７−７  ＤＮＡを得る。
ＢＭＨ  ７１−１８  ｍｕｔ  Ｓ細胞へのプラスミドの形質転換を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２−８９を使用して行った。ｐＰＷ６０１クローンの生産のために、収集した細胞と、突然変異プラスミドと親プラスミドを含む精製混合プラスミドプールとを与え、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞内への形質転換の前にＡｖａ  Ｉによる二次制限消化を行った。これらの細胞を選択培地（ＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍＬアンピシリン）上で平板培養し、クローンを、そのプラスミドＤＮＡを精製して所期の改変に関して分析することによってスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解を使用して精製した（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ  ＆  Ｄｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，ｐ１５１３）。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた場合に、構築物ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６、及び、ｐＰＷ３０４の各々から得られるルシフェラーゼの相対的発現レベルは、０．１：０．５：１．０である。細胞を３７℃のＬＢ中で０．３のＯＤ  ６００に増殖させ、その後で、ＩＰＴＧで誘導し、増殖を４時間続けさせた後で粗抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
0004342608.tif 000002
初期定常期に収集した後で、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ  ８．０）（緩衝液Ａ）中に再懸濁させたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞上で、ルシフェラーゼの部分精製を行った。ＭＳＥ  ｓｏｎｉｐｒｅｐ（増幅１４μ）内での破壊によって細胞を破壊し、そのライゼートを３００００ｘｇで１時間遠心した。その後で、硫酸アンモニウムを使用して粗抽出物の上清液を分画し、３５％飽和から５５％飽和の間で沈殿した画分がルシフェラーゼ活性を含み、この画分を緩衝液Ａ中に溶解し、０．４ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ｂ）５００ｍＬに対して一晩透析した。
沈殿させ透析したその酵素をＭｏｎｏ  Ｑ（ＨＲ１０／１０）陰イオン交換カラムにかけ、緩衝液Ｂ中の０−２００ｍＭ  ＮａＣｌ直線勾配（流量４ｍＬ／分、画分２ｍＬ）で酵素を溶離させることによって、ルシフェラーゼの完全精製を行った。ルシフェラーゼ活性を含むピーク画分を５０％グリセロール（ｖ／ｖ）にし、−２０℃で保存した。
ホタルルシフェラーゼ（結晶性懸濁液から調製、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｌ９００９）、コエンザイムＡ、及び、ＡＴＰを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。甲虫ルシフェリンカリウム塩をＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手した。細胞抽出物をＰｒｏｍｅｇａ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１０１に記載の通りに調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養のアリコートを、細胞培養溶解試薬（２５ｍＭトリス−リン酸塩、ｐＨ７．８、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム）中で室温で１０分間溶解し、２分間１６０００ｇで遠心し、その後で、検定で使用するまで氷上に保存した。
コロニーをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、そのフィルターを室温の１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中の０．５ｍＭ  ルシフェリンで浸漬し（Ｗｏｏｄ及びＤｅＬｕｃａ，（１９８７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６１，ｐ５０１−５０７）、コロニーが放出するバイオルミネセンスの測定によって細胞系のルシフェラーゼ活性を検定した。検定緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ  ＤＴＴ、０．２７ｍＭ  コエンザイムＡ、０．４７ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、０．５３ｍＭ  ＡＴＰ、及び、試料１μＬから５μＬを含む２０ｍＭ  トリシン（ｐＨ７．８））１００μＬを使用して、２１℃でインビトロでルシフェラーゼ検定を行った。検定用反応混液の最終ｐＨは７．８であり、光測定をＢｉｏＯｒｂｉｔ  １２５０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、又は、ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  ＲＳ  ｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してマイクロタイタープレート内で行った。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，ｐ２４８−２５４の方法によって、ＢＳＡを標準として使用してタンパク質を決定した。ＤＮＡの非特異的化学突然変異を生じさせるために、Ｋｉｒｏｎｄｅ他（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９，ｐ４２１−４２６の方法によって、０．１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中の０．８Ｍヒドロキシルアミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して、６５℃で２時間、ｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドを処理した。
最初に、ｐＷ３０４内でのｌｕｃ遺伝子のヒドロキシルアミン誘導突然変異誘発を生じさせ、２７０位におけるアミノ酸グルタメートのリシンへの改変を生じさせる配列番号：１の８１１におけるＤＮＡ配列の単一塩基改変を有するプラスミド３０４  Ｇ１を得ることによって、Ｋm突然変異体を産生した。１．１ｋｂ  ＤＮＡフラグメント（ＢｓｔＥ  ＩＩ／Ｓｔｕ  Ｉ）をｐＰＷ３０４からクローニングし、ｐＰ６０１ａ内の対応するフラグメントを置き換えてｐＰＷ６０１Ｇ１を形成するために使用し、こうして、ｐＰＷ３０４によってコードされる、４つの別のアミノ酸（Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｉ−ＱからのＭは含まれない）を含まないルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を得た。
この突然変異誘発プラスミドをＧ６０  ＤＮＡグレードＮｉｃｋカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩した後に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の中に形質転換した。これから発現させたルシフェラーゼは、当初の突然変異体の低Ｋm表現型と同じ低Ｋm表現型を示した。
［α−32Ｐ］ｄＡＴＰと８Ｍ尿素（６％ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動を使用するＳａｎｇｅｒ他（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７４，５４６３−５４６７のジデオキシ鎖成長終結法によって、二本鎖ＤＮＡの配列決定を行った。更に、自動配列決定を、ＤＮＡ  ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。
ＡＴＰに関するこのルシフェラーゼのＫm値を定量するための検定を、ｃｐｍを測定するためにルミノメーターを使用し、検定緩衝液（１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３ｍＭジチオトレイトール、２７０μＭコエンザイムＡ、４７０μＭ  Ｄ−ルシフェリン、及び、６．２５μＭから４００μＭまでのＡＴＰを含む２０ｍＭ  トリシン  ｐＨ７．８）１００μＬを用いて２１℃で行った。
６０１ａ組換え野生型に関するＫm値を６６．１μＭ（標準誤差４．１）と測定し、６０１ａＫ（熱安定性突然変異体３５４リシン）に関しては６１．３（標準誤差４．７）と測定し、６０１ａＧ１（２７０リシンＫm改変）に関しては２８．７（標準誤差０．９）と測定し、このことは、２７０改変が、その酵素が最適化されるＡＴＰ濃度を半分以上にすることを示している。
ルシフェラーゼの熱安定性に対する２７０改変の影響はネガティブであり、３７℃において、野生型ではｔ1/2活性に達するのに７分を要するのとは対照的に、僅か２分後にｔ1/2活性に達するが、３０℃では、２７０の比活性は野生型より高い。
実施例２：  「二重突然変異体」２７０Ｋ：３５４Ｋ  Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの調製
２７０改変ルシフェラーゼの熱安定性の低下を補うために、部位特異的突然変異誘発を使用して、実施例１で説明した２７０リシンルシフェラーゼをコードするＤＮＡとプラスミドとの中に３５４におけるリシン改変を組み込むことによって、二重改変ルシフェラーゼを調製した。これは、ｐＰＷ６０１ａＧ１をｐＰＷ６０１ａに変換し更にＧ１Ｋに変換するために特別に設計されたオリゴヌクレオチドを使用する突然変異を含んでいた。
ＳＤＭによって３５４リシン改変を生じさせるために使用したオリゴヌクレオチドは、下線付きのＴがミスマッチであるＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧ（配列番号：５）であった。
ｐＰＷ６０１ａＥ２７０Ｋのグルタメート３５４を所期のアミノ酸に変換するために（及び、ｐＰＷ６０１ａからの２７０突然変異体の直接合成が必要である場合に）必要とされる部位特異的突然変異誘発を、必要に応じて設計したオリゴヌクレオチドを使用して、次のプロトコルによって行う。
部位特異的突然変異誘発プロトコル
選択されたプラスミドを、選択と、所期の改変のための突然変異原性オリゴヌクレオチドとによって、変性させ、アニーリングする。突然変異体ＤＮＡ鎖を合成してライゲーションし、一次制限全体を制限エンドヌクレアーゼで消化する。配列決定とＳＤＭのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ａ  ＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、ｌｕｃ遺伝子内のユニークＡｖａ  Ｉ部位、又は、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子のユニークＳｃａＩ部位を破壊するように設計した。これらの部位の存在を、突然変異誘発を受けなかったプラスミドを選択するために使用した。詳細なプロトコルは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ（ＵＳ）ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｋ１６００−１によって販売されるＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒRTM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に記載されている通りだった。
ｐＤＲ５４０から誘導したｐＰＷ６０１とクローニングしたｌｕｃ遺伝子との制限地図を図４に示す。挿入された野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｌｕｃ遺伝子を、改変されたアミノ酸配列のタンパク質を発現する、配列番号：１で示される配列に配列番号：２でＸａａとして示されている２７０位においてリシンに変換するように、部位特異的突然変異誘発を上記の通りに且つＣｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って行った。
Ｋmの測定を実施例１で説明した通りに行い、一方、熱不活性化の研究を溶解緩衝液（２５ｍＭトリス−リン酸、ｐＨ  ７．８、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、及び、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で３７℃で粗抽出物を使用して行い、様々な時点で、酵素のアリコートを取り出し、上記の通りに検定した（５３０μＭ  ＡＴＰを使用）。残留活性を時間経過に応じてプロットした。
この例の二重改変である６０１Ｇ１Ｋに関するＫm値が、２５．２μＭ（標準誤差１．５）であることを見い出し、この値も、対応する３５４リシン突然変異体と野生型ルシフェラーゼのＫm値の１／２よりも小さかった。
連続加熱時にルシフェラーゼの活性がその初期値の５０％に減少するのに要する時間であるｔ1/2値が、次の値であることが判明した。
60la  （組換え野生型）    7．0分後にｔ1/2に達した。
60laGl（270Ｋm改変）    1．75分後にｔ1/2に達した。
60laK （354熱安定性改変）35分よりも長い時間が経過した後にｔ1/2に達した。
60laGlK （270＋354改変）  10．5分後にｔ1/2に達した。
上記データは、Ｋm値と共に次のリスト（他のデータに加えて）に含まれる。
0004342608.tif 000003
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ  ＯＦ  ＳＴＡＴＥ  ＦＯＲ  ＤＥＦＥＮＣＥ
（ｉｉ）発明の名称：ルシフェラーゼ
（ｉｉｉ）配列数：５
（ｉｖ）通信住所：
（Ａ）受信人：ＴＨＥ  ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ  ＯＦ  ＳＴＡＴＥ  ＦＯＲ  ＤＥＦＥＮＣＥ
（Ｂ）通り：ＷＨＩＴＥＨＡＬＬ
（Ｃ）市：ＬＯＮＤＯＮ
（Ｄ）州：ＬＯＮＤＯＮ
（Ｅ）国：英国（ＧＢ）
（Ｆ）ＺＩＰ：ＳＷ１Ａ  ２ＨＢ
（ｖ）コンピュータ読み取り可能形式：
（Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＃１．３０
（ｖｉ）現在出願データ：
（Ａ）出願番号：ＷＯ
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特質：
（Ａ）配列の長さ：１７２２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：４．．１６５３
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
（Ｂ）存在位置：ｒｅｐｌａｃｅ（８１１．．８１３，″″）
（ｘｉ）配列：配列番号：１
0004342608.tif 000004
0004342608.tif 000005
0004342608.tif 000006
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特質：
（Ａ）配列の長さ：５５０
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ
（Ｂ）存在位置：２７０
（ｘｉ）配列：配列番号：２
0004342608.tif 000007
0004342608.tif 000008
0004342608.tif 000009
0004342608.tif 000010
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特質：
（Ａ）配列の長さ：３０
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
（Ｂ）存在位置：ｒｅｐｌａｃｅ（１０，″″）
（ｘｉ）配列：配列番号：３
0004342608.tif 000011
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特質：
（Ａ）配列の長さ：５５０
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ
（Ｂ）存在位置：３５４
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ
（Ｂ）存在位置：２７０
（ｘｉ）配列：配列番号：４
0004342608.tif 000012
0004342608.tif 000013
0004342608.tif 000014
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（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特質：
（Ａ）配列の長さ：２２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物：Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ＿ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
（Ｂ）存在位置：ｒｅｐｌａｃｅ（１０，″″）
（ｘｉ）配列：配列番号：５
0004342608.tif 000016
【図１】
0004342608.tif 000017
【図２】
0004342608.tif 000018
【図３】
0004342608.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図６】
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