(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリプルラナーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のアルカリプルラナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号３若しくは配列番号４に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する請求項２記載のアルカリプルラナーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養する請求項１記載のアルカリプルラナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗剤用酵素として有用なアルカリプルラナーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プルラナーゼは、澱粉、グリコーゲン、アミロペクチンあるいはプルラン分子中に存在するα−１，６グルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオースを生成する澱粉分解酵素の一種であり、エンド型アミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコースやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖を生産することができるので、澱粉製造工業において注目されている酵素である。
【０００３】
一方、プルラナーゼは、食器や繊維に付着した澱粉を分解除去できることから洗剤酵素として利用する試みもあり、本発明者らは、プルナラーゼをアミラーゼと共に食器用又は衣料用洗浄剤に配合することにより、澱粉汚れに対する洗浄力が飛躍的に向上することを見出している（特開平２−１３２１９３号公報）。
【０００４】
しかしながら、自然界において見出されているプルラナーゼは、殆どが中性ないし酸性領域において最大の酵素活性を示すものであり、洗浄剤組成物の必要条件であるアルカリ性領域で最大の酵素活性を有する、所謂アルカリプルラナーゼは、これまでに、中村と堀越により報告された酵素（Biochim.Biophys.Acta,397,188(1975)，特公昭５３−２７７８６号公報）と、荒らによって報告されているバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-AP1876株由来の酵素（特開平３−８７１７６号公報）が知られているに過ぎない。
従って、界面活性剤の存在下でも十分な酵素活性を示し、洗剤用酵素として有用性の高いアルカリプルラナーゼが求められている。
【０００５】
本発明の目的は、アルカリ領域で作用し、界面活性剤の存在下においても十分な酵素活性を示すアルカリプルラナーゼ、及びそれをコードする遺伝子、並びに遺伝子工学的手法により該アルカリプルラナーゼを効率よく大量生産するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素の中から、アルカリ領域で作用するアルカリプルラナーゼを見出すと共に、該アルカリプルラナーゼをコードする遺伝子のクローニング、遺伝子組換えによる生産技術の確立に成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリプルラナーゼ、該アルカリプルラナーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
【０００８】
更に本発明は、上記のアルカリプルラナーゼ遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体及びこれらを用いたアルカリプルラナーゼの製造法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプルラナーゼは、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、アルカリプルラナーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特に制限されないが、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有していることが好ましい。また、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加又は欠失していてもよい。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０９番から１０２８番目に相当するものであるが、斯かるアミノ酸をコードするＤＮＡ断片（配列番号４）を発現プラスミドベクターｐＨＳＰ６４（Sumitomo，N. et al., Biosci, Biotech, Biochem. 59, 2172-1995, 1995）に連結し枯草菌(Bacillus subtilis)によって発現させると、配列番号１に示されるアミノ酸を有するアルカリプルラナーゼと同様の酵素活性を有するアルカリプルラナーゼが得られる。
【００１０】
また、本発明アルカリプルラナーゼ遺伝子は、アルカリプルラナーゼ活性を損なわない限り配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列又はその前記変異体をコードするものであればよいが、それぞれ、配列番号３又は配列番号４で示される塩基発列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
【００１１】
本発明アルカリプルラナーゼのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列は、これまでに知られているプルラナーゼとは異なる独自のアミノ酸配列及び塩基配列を有しており、また後述するようにその酵素学的性質も、荒らが報告した酵素（特開平３−８７１７６号公報）を始め、従来のプルラナーゼとは異なる新規な酵素である。
【００１２】
本発明のアルカリプルラナーゼは、自然界から分離した微生物、例えば神奈川県横浜市の土壌より分離され、微工研条寄第３０４９号（FERM BP-3049）として寄託されたBacillus sp. KSM-AP1876株やそれらの変異体を培養し、得られた培養物から採取することにより得ることができるが、該アルカリプルラナーゼをコードする遺伝子を取得し、これを用いて組み換えベクターを作製し、該組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物からアルカリプルラナーゼを採取する方法によれば、大量生産することができる。
【００１３】
本発明のアルカリプルラナーゼ遺伝子は、アルカリプルラナーゼ産生菌、例えば上記のBacillus sp. KSM-AP1876株等から、例えば適当な制限酵素による染色体ＤＮＡの全分解又は部分分解で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込み、大腸菌や枯草菌等に導入し発現させるショットガン法や、適当なプライマーを合成してＰＣＲ法を用いることによりクローニングすることができる。
ここで、染色体ＤＮＡは、供与菌株から、例えばＭａｒｍｕｒの方法（J.,J.Mol.Biol.,3,208(1961)）や斉藤と三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963)）或いは他の類似な方法を用いて取得すればよく、また制限酵素は、当該遺伝子を分断しないものであれば、いかなるものでも使用できる。
また、ＰＣＲ法を用いる場合は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を基にして活性発現必須領域の５′末端の上流及び３′末端の下流位置に相当する配列のプライマーを合成し、アルカリプルラナーゼ生産菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行えばアルカリプルラナーゼ遺伝子を取得できる。
【００１４】
遺伝子の断片を含む組み換えベクターの作製に用いられる宿主・ベクター系としては、宿主菌株が本発明のアルカリプルラナーゼ遺伝子を発現させることができ、組換えＤＮＡが宿主菌中で複製可能であり、且つ組み込んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、いかなるものも使用することができる。例えば、大腸菌(Esherichia coli)Ｋ−１２系統株を宿主とするＥＫ系や枯草菌（Bacillus subtilis）のMarburg系統株を宿主とするＢＭ系等が挙げられる。ここで、宿主菌株は、ＥＫ系では、例えばＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＢＭ系では、例えばＢＤ１７０株、ＭＩ１１２株、ＩＳＷ１２１４株等が挙げられ、ベクターとしては、ＥＫ系では、例えばｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫやｐＵＣ１８等、またＢM系では、例えばｐＵＢ１１０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、更にこれらを使用して構築したベクターも使用できる。
本発明の遺伝子を含む組換えＤＮＡの好適な例として、プラスミドｐＡＰ１００（図１）等が挙げられる。本プラスミドは本発明の遺伝子５．０ｋｂｐを含む断片とｐＨＹ３００ＰＬＫの一部からなる１０．１ｋｂｐの組換えプラスミドである。また、組換えＤＮＡを含有する組換え微生物の好適な例としては、E.coliＨＢ１０１（ｐＡＰ１００）株が挙げられる。
【００１５】
組換えＤＮＡによる宿主菌株の形質転換の方法は、例えば、ＥＫ系宿主菌株の場合、塩化カルシウム法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、またＢＭ系宿主菌株の場合には、プロトプラスト法（Chang,C.and Cohen.S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1978)）等を用いることができる。
【００１６】
組換え微生物の選択は、形質転換操作が施された菌体をプルラン又はレッドプルランを含む寒天プレートにレプリカ法等によって移植して培養した後、集落を出現させ、プルラン寒天プレート上でハローを形成することのできるコロニーを検出することにより行うことができる。得られた組換え微生物が保持する組換えＤＮＡは、通常のプラスミド調製法あるいはファージＤＮＡ調製法（Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory,New York,(1982)）を用いて抽出でき、更に各種制限酵素による切断パターンを電気泳動法等によって解析することによって、組換えＤＮＡがベクターＤＮＡとアルカリプルラナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が結合したものであることを確認できる。
【００１７】
形質転換体の培養は、微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えば良く、得られた培養液から、一般に知られている酵素の採取及び精製方法に準じた方法により、アルカリプルラナーゼを得ることができる。
【００１８】
かくして得られた本発明のアルカリプルラナーゼは、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を有し、その酵素学的性質は以下に示す通り、最適反応ｐＨが８．５〜９．５であるという特徴を有する。
【００１９】
＜酵素学的性質＞
（１）作用
プルランのα−１，６グルコシド結合を加水分解して、マルトトリオースを生成する。また、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲンのα−１，６グルコシド結合を加水分解する。
（２）最適反応ｐＨ
ｐＨ８．５〜９．５である。
（３）安定ｐＨ
ｐＨ７〜１０の範囲で極めて安定である。
（４）最適反応温度
５０〜５５℃で作用する。
（５）耐熱性
５０℃までは安定である（トリス・塩酸１０mM（ｐH8.5）緩衝液中、５０℃、３０分間処理で８５％以上の活性を保持する）。
（６）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による野生型の推定分子量は、１２０，０００〜１３０，０００である。
【００２０】
従って、本発明のアルカリプルラナーゼは、界面活性剤の存在下においても優れた酵素活性を示し、洗剤用酵素、例えば衣料用洗剤、食器用洗剤等の酵素として液体、粉末、顆粒等の形態で使用することができる。
【００２１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。尚、本実施例中の濃度は何れも重量％を示す。
【００２２】
実施例1
アルカリプルラナーゼを生産するBacillus sp. KSM−AP1876株を５mLのＡ培地（バクトペプトン ２．８％、酵母エキス  ０．０５％、魚肉エキス０．５％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ  ０．０２％、炭酸ナトリウム  １．０％）に接種し、３０℃で２４時間振盪培養を行った後、この１mLを１００mLの同培地に接種して３０℃で更に１２時間振盪培養した。この後、遠心分離によて菌体を集め、斉藤と三浦の方法に従って約１mgの染色体ＤＮＡを得た。
【００２３】
実施例２
実施例１で得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によってアルカリプルラナーゼ遺伝子の一部の取得を試みた。増幅に使用したプライマーＤＮＡは既知の酸性あるいは中性プルラナーゼのアミノ酸共通配列からデザインした。プライマー１の配列は5'-TATAATTGGGGT(A)TATGATCCT(A)C-3'（配列番号５）であり、Y-N-W-G-Y-D-P-Hからなるアミノ酸配列を元にデザインしたものである。プライマー２の配列は5'-ACCCATCATATCAAAT(A)CT(G)AAAA(T)CC -3'（配列番号６）であり、G-F-R-F-D-M-M-Gからなるアミノ酸配列を元にデザインしたものである。Ｐｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃  １分、４５℃  １分、６０℃  １分を３０サイクル）を行った結果、約３７０ｂｐからなるＰＣＲ増幅断片が取得された。約３７０ｂｐ−ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定し、さらにその決定した配列をもとにしてプライマーをデザインし、約３７０ｂｐ−ＰＣＲ増幅断片の５′側および３′側への遺伝子の延長部分の増幅を試みた。デザインしたプライマー配列はプライマー３が5'-TGCCCGTTAGAGCGAAATAACTTTG -3'（配列番号７）で、プライマー４が5'-CTGATGGTACGCCAAGAACAAGCTT -3'（配列番号８）である。鋳型としてＰｓｔＩあるいはＳａｃIで切断したＫＳＭ−AP1876株の染色体ＤＮＡを分子内結合した環状ＤＮＡ群を用い、ＰＣＲキット（アプライド バイオシステム社製）によって逆ＰＣＲ法（Triglia,T.et al.,Nucleic Acids Res.,16,81(1988)）で（９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ ５分を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返す）ＤＮＡ増幅を行った。ＰｓｔＩを用いて調製した鋳型を用いた場合約６ｋｂｐのＤＮＡ断片が、また、ＳａｃＩを用いて調製した鋳型を用いた場合約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これら増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列をダイレクトシークエンス法で決めたところ、アルカリプルラナーゼ遺伝子とその上流および下流領域をコードする約５ｋｂの配列が検出された。続いて、プライマー５（5'-CATTTTTAGCAGGTTAGTAAGTC -3'（配列番号９））、プライマー６（5' -CGGTACCCTTGTTGAACGGACAGC -3'（配列番号１０））を用いて、さらに実施例１で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、アルカリプルラナーゼ遺伝子を含む約５ｋｂｐＤＮＡ断片を再びＰＣＲで増幅した後、その５ｋｂｐＤＮＡ断片の全長の塩基配列をダイレクトシークエンス法で再確認し、配列の決定に至った。
【００２４】
実施例３
実施例２で得られた配列を元にBacillus sp.KSM-AP1876株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー５（5'-CATTTTTAGCAGGTTAGTAAGTC -3'（配列番号１１））、プライマー６（5'-CGGTACCCTTGTTGAACGGACAGC -3'（配列番号１２））を用いて、アルカリプルラナーゼをコードする遺伝子約５ｋｂをＰＣＲ法で増幅した。制限酵素ＳｍａＩで切断したベクタープラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫとＰＣＲ増幅断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行って組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミド混合物による形質転換処理を行ったＥ．ｃｏｌｉ懸濁液を７．５μｇ  ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ、１．５％寒天（和光純薬社製）〕に塗抹し３７℃で２４時間培養した。更に、出現した形質転換コロニー上に、０．２％プルラン、０．８％レッドプルラン（Kanno,M.and Tomiura,E.,Agric.Biol.Chem.,49,1529(1985)）、１mg／mLリゾチーム、グリシン−ＮａＣｌ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０）を含む０．８％寒天を重層し、３７℃にて５時間反応させた。この結果、レッドプルランの分解によってコロニー周辺に透明なハローを形成した株１株が得られ、これをアルカリプルラナーゼ生産組換え微生物として分離した。
【００２５】
実施例４
実施例３で得られた組換え微生物を、１５μg ／mLテトラサイクリンを含む５mLのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一夜培養した後、これを５００mLのＬＢ培地に移植し、更に２４時間振盪培養した。この培養液より遠心分離によって菌体を集め、常法（Maniatis, T.et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)）に従って、組換えプラスミド約５００μg を調製した。得られた組換えプラスミドの制限酵素切断地図を作製したところ、図１に示した約５ｋｂ断片が含まれていることが明らかになり、これをプラスミドｐＡＰ１００と命名した。また、ｐＡＰ１００によって形質転換されたE.coliＨＢ１０１株をＨＢ１０１（ｐＡＰ１００）株と命名した。
【００２６】
実施例５
４５mLのＬＢ培地（テトラサイクリンを含む）で一晩培養したＨＢ１０１（ｐＡＰ１００）株の培養液１mLを１００mLのＬＢ培地（テトラサイクリンを含む）に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養後、遠心分離によって集めた菌体をトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁し、超音波による破砕を行った。破砕後、遠心分離によって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液とした。対照として、ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２）株についても同様に無細胞抽出液を調製し、これらの抽出液中のプルラナーゼ活性を測定した。尚、プルラナーゼ活性は、４０mMグリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０）とプルラン（終濃度０．２５％）を含む反応液中で、４０℃、３０分間の反応を行った後、生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（3,5-dinitrosalicylic acid（ＤＮＳ））法にて定量することによって測定し、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
【００２７】
この結果、ＨＢ１０１（ｐＡＰ１００）株の無細胞抽出液にはプルラナーゼ活性が認められた。更に、生産されたプルラナーゼの作用至適ｐＨを測定した結果、図２に示したように、本酵素におけるプルラナーゼ活性は約ｐＨ８．５〜９．５に最適作用ｐＨを有するアルカリプルラナーゼであることが明らかとなった。尚、酵素活性の測定には、ブリットン−ロビンソン緩衝液（H.T.S.Britton, G.Welford, J.Chem.Soc.,1848(1937）)を用いた。
【００２８】
実施例６
また、ｐＡＰ１００によって形質転換されたB.  subtilis ISW1214株を１０0mLのＢ培地（バクトペプトン  ２．８％、酵母エキス  ０．０５％、魚肉エキス０．５％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ  ０．０２％、炭酸ナトリウム  １．０％、テトラサイクリン  ７．５μｇ／mL）に接種して３０℃で更に３日間振盪培養した後、遠心分離してアルカリプルラナーゼの粗酵素液を得た。粗酵素液に対しＤＥＡＥ−セルロースによる吸着、セファロース−α−サイクロデキストリン アフィニティーカラム処理、セファクリルＳ−２００カラム処理の順での精製過程を経て、電気泳動的に均一な酵素標品を得た。本酵素のプルラナーゼ活性の作用至適ｐＨを実施例５と同様に測定した結果、最適ｐＨは８．５〜９．５であった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のアルカリプルラナーゼは、最適反応ｐＨを８．５〜９．５に有し、アルカリ性領域において最大活性を有することから衣料用又は食器用洗剤酵素等として有用である。また、本発明のアルカリプルラナーゼ遺伝子を用いることにより、当該アルカリプルラナーゼを単一且つ大量に生産することが可能となる。
【００３０】
【配列表】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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0004372986.tif 000016
【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アルカリプルラナーゼ遺伝子(Bacillus sp. KSM-AP1876株由来)のを含有したプラスミド(ｐＡＰ１００)の制限酵素地図を示す図である。
【図２】図２は、アルカリプルラナーゼのｐＨプロファイルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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