(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列における１９３位のイソロイシンに相当するアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、野生型酵素に比して耐熱性が向上した変異α−アミラーゼ。
【請求項２】
さらに１８１位のアルギニン及び１８２位のグリシンに相当するアミノ酸が欠失したものである請求項１記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項３】
他のアミノ酸が、アスパラギン酸である請求項１又は２記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の変異α−アミラーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターで形質転換又は染色体相同組換えされた形質転換細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列における１９３位のイソロイシンに相当するアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、野生型酵素に比して耐熱性が向上した変異α−アミラーゼ。
【請求項９】
さらに１８１位のアルギニン及び１８２位のグリシンに相当するアミノ酸が欠失したものである請求項８記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１０】
他のアミノ酸が、アスパラギン酸である請求項８又は９記載の変異α−アミラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルカリ側に至適pHを有し、かつ優れた熱安定性を有し、特に洗剤用酵素として有用な変異α−アミラーゼ及びその遺伝子並びに該変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−アミラーゼ［ＥＣ３．２．１．１］は、衣料や食器等の澱粉汚れや、糊剤の除去に有効であることが知られているが、洗剤においては、洗浄水がアルカリとなるため、アルカリ側に至適pHを有するものが好ましい。
その例として、好アルカリ性Bacillus sp. KSM-AP1378（FERM BP-3048）の生産する、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリ液化型α−アミラーゼが知られており（WO94/26881）、洗浄剤用として極めて有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、衣料や食器の洗浄は、１０〜５０℃で行われるのが一般的であり、洗剤に配合するα−アミラーゼは、室温〜５０℃で熱安定性に優れていることが好ましいが、上記アルカリ液化型α−アミラーゼは、耐熱性がやや低かった。
【０００４】
α−アミラーゼの耐熱性を向上させる方法として、特定位置のアミノ酸を欠失又は他のアミノ酸に置換する方法があり、例えば１３３位のヒスチジンをチロシンに置換したBacillus licheniformis由来のα−アミラーゼが知られている（J. Biol. Chem., 15481-15488, 1990）。
【０００５】
しかし、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼでは、１３３位に相当する位置にヒスチジンは存在せず、かかる方法を用いることはできなかった。このため配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの優れた特性を維持しつつ、耐熱性に優れたα−アミラーゼが求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、これまで全く注目されなかった１９３位のイソロイシンに着目した。そして該α−アミラーゼの１９３位のイソロイシンを欠失又は他のアミノ酸に置換することにより、該α−アミラーゼの有する優れた特性を維持しながら、耐熱性が向上することを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列における１９３位のイソロイシンに相当するアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異α−アミラーゼを提供するものである。
本発明はまた、かかる変異α−アミラーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
本発明はまた、かかる遺伝子を含有する組換えベクターを提供するものである。
本発明はまた、かかる組換えベクターで形質転換又は染色体相同組換えされた形質転換細胞を提供するものである。
本発明はまた、かかる変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の変異α−アミラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号１に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有する液化型アルカリα−アミラーゼ（以下、「配列番号１等で示されるα−アミラーゼ」という。）を欠失又は他のアミノ酸に置換して得られるものである。配列番号１で示される液化型アルカリα−アミラーゼとしては、例えば本発明者らが先に報告したWO94/26881記載の、Bacillus sp. KSM-AP1378(FERM BP-3048）から得られる野生型液化型α−アミラーゼが挙げられる。同一性は７０％以上であることが必要であり、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。なお同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 227, 1435(1985)）により計算される。また配列番号１に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するα−アミラーゼとしては、例えばWO95/26397記載のNCIB 12512、NCIB 12513由来のα−アミラーゼ等がある。
【０００９】
欠失又は他のアミノ酸への置換のうち、他のアミノ酸に置換することが好ましく、アスパラギン酸に置換することがより好ましい。これにより耐熱性が向上する。さらに、１８１位のアルギニン及び１８２位のグリシンに相当するアミノ酸が欠失したものが特に好ましい。これにより耐熱性がさらに向上し、また通常洗剤に含まれるキレート剤に対する耐性も向上する。
【００１０】
本発明の変異α−アミラーゼは、例えば配列番号１等で示されるα−アミラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して、変異α−アミラーゼをコードする遺伝子を得、次いでこれを含有する組換えベクター、好ましくはプラスミドを作成し、該ベクターを用いて宿主を形質転換するか、染色体相同組換えにより形質転換体を得、これを培養することによって製造される。部位特異的変異の方法としては一般的に行なわれている方法であればいずれも採用できるが、例えばTakara社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan Super Express Km Kit 等を用いて行なうことができる。
本発明の変異α−アミラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列番号２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。
【００１１】
なお配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有する他のアミノ酸配列を、一文字表記で図１及び図２に示した。
【００１２】
かくして得られる本発明変異α−アミラーゼは、熱に対する安定性が向上し、洗浄剤組成物、澱粉液化、糖化用組成物、繊維糊抜き剤等として有用である。
ここで本発明の洗浄剤組成物には、本発明変異α−アミラーゼ以外に、さらに、枝切り酵素（例えばプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼなど）、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼからなる群より選ばれる１種以上の酵素を配合することができる。
また、洗浄剤組成物に通常配合される界面活性剤、キレート剤、アルカリ剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を配合することができる。
【００１３】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明変異α−アミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を配合し、常法に従い製造できる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、粉末、顆粒等にすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００１４】
また、本発明の変異α−アミラーゼを用いた澱粉液化・糖化用組成物は、本発明の変異α−アミラーゼ以外に必要に応じてさらにグルコアミラーゼ、マルターゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼからなる群より選ばれる１種以上の酵素を配合して得ることができる。該組成物を用いて常法に従い澱粉を液化・糖化することができる。
【００１５】
また本発明の変異α−アミラーゼを用いた繊維糊抜き剤は、本発明の変異α−アミラーゼ以外に、さらに必要に応じてプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ等を配合して得ることができる。該糊抜き剤は、常法に従い使用できる。
【００１６】
【実施例】
各酵素のアミラーゼ活性及び蛋白量は以下に示す方法で測定した。
アミラーゼ活性測定は、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で測定した。すなわち、５０mM Tris-HCl 緩衝液（pH８．５）中に可溶性澱粉を溶解した反応液を用い、４０℃で１５分間の反応を行なった後、生成した還元糖をＤＮＳ法で定量することによって測定した。酵素の力価は１分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準として、Bio-Rad 社のProtein Assay Kit を用いて定量した。
【００１７】
実施例１  液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子の調製
特開平８−３３６３９２号公報の実施例に従い、バチルス  エスピー KSM-AP1378 株（FERM BP-3048）から、配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子を調製した。
【００１８】
実施例２  液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子への変異導入
Takara社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kit を用い、変異導入用鋳型プラスミドとしてｐＫＦ１９ＬＡＭＹを用いた。
本プラスミドは、変異用プラスミドベクターｐＫＦ１９ｋのSmaＩ部位に、我々が独自に開発した発現プロモーター領域ＳＰ６４及びBacillus sp. KSM-AP1378 株（FERM BP-3048）由来の配列番号２に示す塩基配列を有するα−アミラーゼ遺伝子（約２．１kb）を導入したものである（図３）（Ikawa et al., Biosci. Biotech. Biochem., 62, 1720-1725, 1998）。
また、変異導入プライマーとして配列番号３に示すものを用いた。（配列表フリーテキスト：配列番号２の配列８１２〜８３８において、８２４〜８２６のata をgat に置換したものである。）配列番号３の塩基配列は、アニールする対象の鋳型配列の１９３位のイソロイシンをコードするＡＴＡの位置を、ＡＴＡからＧＡＴへ入れ替えたものであり、これを用いて、イソロイシンをアスパラギン酸に置換した。これをＩ１９３Ｄと略記する。
次いで、配列番号４に示す塩基配列を有する変異導入プライマーを用いて、１８１位のアルギニン及び１８２位のグリシンをコードするＡＧＡ及びＧＧＴを欠失させ、これにより両アミノ酸が欠失した変異α−アミラーゼが得られた（RG+I193D）。（配列表フリーテキスト：配列番号２の配列７７３〜８１４において、７８８〜７９３のaga ggt を欠失させたものである。）
尚、得られた変異体は塩基配列解析を行なって変異を確認した。
次いで、得られた変異体プラスミド（pKF19LAMYAA）の変異部位を含む部分を増幅し（図３）、これを高発現誘導領域SP64を含むプラスミドベクターpHSP64のSmaＩ部位に導入した（pHSPLAMYAA、図３）。
【００１９】
実施例３  熱安定性変異α−アミラーゼ（I193D 及びRG+I193D）の大量培養
変異プラスミド（pHSPLAMYAA）をB. subtilis ISW1214株（leuA metB5 hsdM1）にプロトプラスト法（Chang & Cohen, Mol. Gen. Genet., 168, 111-115, 1979）により形質転換し、適当な液体培地（コーンスティープリカー、４％；トリプトース、１％；肉エキス、１％；リン酸１カリウム、０．１％；硫酸マグネシウム０．０１％；マルトース、２％；塩化カルシウム、０．１％；テトラサイクリン、１５μｇ／ml）で３０℃で３日間、坂口フラスコ中で培養した。得られた培養上清液を硫安分画（６０％飽和）して２mM CaCl2を含むTris-HCl緩衝液pH７．５にて透析し、同緩衝液にて平衡化した陰イオン交換樹脂カラム（DEAE−トヨパール）を通過させた後、この通過溶液を陽イオン交換樹脂カラム（CM−トヨパール）に吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させた。この溶出液を限外濾過膜（アミコン社のPM−10）により濃縮し、上記緩衝液にて透析することにより、均一な精製酵素を得ることができた。
得られた、精製品は、SDS-PAGEにより単一バンドを与え、分子量は約５５kDa と決定された。
【００２０】
実施例４  熱安定性の検定
上記で得られたＩ１９３Ｄ及びＲＧ＋Ｉ１９３Ｄについて、次に示す手法で熱安定性を検定した。対照として野生型を用いた。
【００２１】
安定性実験１
あらかじめ１０mM Tris-HCl pH８．５緩衝液を５０℃にてプリインキュベートした中に、約０．２Ｕ／mlとなるよう酵素を添加後、０分、２０分、４０分、６０分にサンプリングし、上記実施例に示す方法で残存するアミラーゼ活性を測定した。それぞれのスタート時の活性を１００％として相対活性を求め、アミラーゼ残存活性とした。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
６０分後の残存活性が、野生型ではほとんどないのに対し、Ｉ１９３Ｄでは５０％以上であった。ＲＧ＋Ｉ１９３Ｄではほとんど活性が減少しなかった。
【００２４】
安定性実験２
０．１、０．５、１．０mMの塩化カルシウムを含む１０mM Tris-HCl pH８．５を予め６０℃で５分間プリインキュベートした。その中に野生型及びＲＧ＋Ｉ１９３Ｄを約０．２Ｕ／mlとなるように加え、６０℃、３０分間放置した後、残存するアミラーゼ活性を測定した。残存活性はインキュベート前の活性を１００％とし、相対活性で示した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
ＲＧ＋Ｉ１９３Ｄの熱安定性は、野生型より顕著に向上した。
【００２７】
実施例５
表３に示す配合で自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を製造した。本洗浄剤に、実施例３で得られた変異α−アミラーゼを配合することにより、優れた洗浄効果を示した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【発明の効果】
本発明の変異α−アミラーゼは、至適pHがアルカリ側にあり、かつ熱安定性が向上したものである。
かかる変異α−アミラーゼは、洗浄剤組成物、液化・糖化用組成物、繊維糊抜き剤等に配合することにより効果を発揮する。
【００３０】
【配列表】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Bacillus sp. KSM-AP1378 の生産するα−アミラーゼ（KSMAP1378）の成熟酵素アミノ酸配列（配列番号１と同じ）とその他のBacillus属細菌α−アミラーゼの成熟酵素アミノ酸配列との相同性を示す図である。NCIB 12512とNCIB 12513はWO9526397 記載のα−アミラーゼ、B. amyloはB. amyloliquefaciens、B. stearo はB. stearothermophilus、B. lichen はB. licheniformisの生産するα−アミラーゼ。下記した＊は全てのα−アミラーゼで相同性があることを示している。
【図２】  Bacillus sp. KSM-AP1378 の生産するα−アミラーゼ（KSMAP1378）の成熟酵素アミノ酸配列（配列番号１と同じ）とその他のBacillus属細菌α−アミラーゼの成熟酵素アミノ酸配列との相同性を示す図である。NCIB 12512とNCIB 12513はWO9526397 記載のα−アミラーゼ、B. amyloはB. amyloliquefaciens、B. stearo はB. stearothermophilus、B. lichen はB. licheniformisの生産するα−アミラーゼ。下記した＊は全てのα−アミラーゼで相同性があることを示している。
【図３】α−アミラーゼ遺伝子への変異導入と変異α−アミラーゼ遺伝子の枯草菌による生産の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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