(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、２、６、７、９〜１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドの一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、総アミノ酸残基数が２０以下であり、血管新生作用を有するペプチドを有効成分として含む血管新生剤。
【請求項２】
前記ペプチドの総アミノ酸残基数が６〜１０である請求項１記載の血管新生剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１、２、６、７、９〜１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１記載の血管新生剤。
【請求項４】
キャリアに結合された形態にある請求項１ないし３のいずれか１項に記載の血管新生剤。
【請求項５】
前記キャリアがタンパク質である請求項４記載の血管新生剤。
【請求項６】
前記キャリアタンパク質が、細胞接着性タンパク質である請求項５記載の血管新生剤。
【請求項７】
前記細胞接着性タンパク質がコラーゲン又はその部分加水分解物である請求項６記載の血管新生剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のペプチド又はキャリアに結合されたペプチドの血管新生剤製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管を新生させる作用を有する血管新生剤に関する。本発明の血管新生剤は虚血性疾患の治療のみならず人工骨等の生体代用材料を用いた臓器の再生・修復にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在日本人の死因として、心筋梗塞、脳梗塞など血管の閉塞に起因する虚血のためにおこる疾患がかなり多数を占めている。また、死因とならないまでも閉塞性大動脈硬化症のように下肢の切断を余儀なくされ、QOL（生活の質）の損なわれる疾患も見られる。これらの虚血性疾患に対しては、新たに血管を形成することによる血管新生療法に大きな期待が寄せられている。従来より、骨補填材またインプラント材として、アパタイトやチタン等が用いられている。これらの従来の生体材料は、周囲の軟・硬組織との親和性が良くないために本来の機能が十分発揮できない場合が多い。
【０００３】
周囲の軟・硬組織との親和性を良好にするために、生体接着機能性分子ペプチドを用いることが提案されている。例えば、生体硬組織の組成・結晶性に類似した炭酸アパタイトと、生体接着機能性分子ペプチドの１つであるコラーゲンとを混合した複合体を代用骨として用いることが提案されている（K. Nokihara et al., The Japanese Peptide Society, Osaka, 373-376, 2001., Development of Biomimetic Materials: Novel Composite Material Carrying Immobilized Functional Peptides; M. Okazaki et al., Dentistry in Japan, 37, 95-100, 2001, A New Concept of CO3 apatite-Collagen Composites with Adhesion Motif as Biomaterials.)。この複合体は生体親和性が良好であり、バイオミメティックな代用骨として有望である。
【０００４】
もし、このような生体材料表面，内面に血管が新生されれば、移植生体材料の表面，内面の細胞へ術後早期に豊富な血液により栄養、酸素が十分に供給され、細胞の機能を発揮するのに最適の環境が形成され、その結果、生体と良好な生着性が得られるため好都合である。
【０００５】
一方、副作用を含む安全性、代謝性等で大きな利点を有するペプチドはデザインが容易であり高効率な合成法や検定法が確立されている。加えてアミノ酸誘導体はコンビナトリアルケミカルライブラリー構築の都合よいビルディングユニットであり、固相合成法によって短時間で構造の最適化が可能である。従って、もし、血管新生作用を有する比較的分子量の小さいペプチドが存在すれば、これを合成し、単独投与あるいは生体材料に結合することにより、生体材料が接する周囲の軟・硬組織との親和性をより良好にすることができ有利である。しかしながら、顕著な血管新生作用を有する低分子のペプチド、あるいはペプチドミメティックな有機化合物はほとんど知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、血管新生作用を有するペプチドを見出し、それを有効成分として含む、ヒトの治療等の臨床使用が可能な新規な血管新生剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定のアミノ酸配列からなるペプチドが、血管新生作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、２、６、７、９〜１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドの一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、総アミノ酸残基数が２０以下であり、血管新生作用を有するペプチドを有効成分として含む血管新生剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、強い血管新生作用を有するペプチドが見出され、それを有効成分として含む新規な血管新生剤が初めて提供された。本発明の血管新生剤は、人工骨等の生体代用材料を用いた臓器の再生・修復や、生活習慣病として大きな部分を占める心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の治療にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
下記実施例で具体的に示されるように、本願発明者らは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヘプタペプチドが血管新生作用を有することを見出した。従って、本発明の血管新生剤の好ましい一例では、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヘプタペプチドを有効成分として含む。
【００１１】
一般に、生理活性を有するペプチドにおいて、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個〜３個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個若しくは２個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、便宜的に「修飾ペプチド」と呼ぶことがある）であって血管新生作用を有するペプチドも本発明の範囲に含まれる。なお、ここで、「修飾ペプチド」に含まれるアミノ酸は、天然のタンパク質を構成するアミノ酸に限定されるものではなく、天然のアミノ酸を化学修飾（例えば、アミノ酸の側鎖にニトロ基やハロゲンを導入する等）して得られるアミノ酸も包含される。また、Ｄ型アミノ酸であってもよい。下記実施例で具体的に確認されたように、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の１アミノ酸を欠失したアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと何ら遜色のない血管新生効果を発揮するものであり、本発明の好ましい形態である。下記実施例で具体的に記載するように、配列番号１の４番目のチロシンをアラニンに置換したペプチド（配列番号８）では血管新生作用が失われたので、４番目のチロシン残基は重要であると考えられ、その側鎖の化学構造が大幅に変更されるような置換はしない方が好ましい。もっとも、天然のＬ型のＴｙｒでなくてもＤ型あるいはチロシンの側鎖のフェノールリングにハロゲンやニトロ基を入れたものなどが通常Ｔｙｒの置換体としてメディシナルケミストリーで分子設計され、より強い効果や同等の効果を発揮する場合がしばしばあることが知られている。また、側鎖に芳香環を有する他のアミノ酸（例えばフェニルアラニンなど）でも同等の効果を発揮するであろうと考えられ、下記実施例に具体的に記載するように、４番目のチロシンをフェニルアラニンで置換したペプチドは、より優れた効果を発揮することが確認された。従って、修飾ペプチドのうち、好ましいものとして、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が置換し、若しくは一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、４番目のアミノ酸残基がチロシン残基又は側鎖に芳香環を有するアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンである血管新生作用を有するペプチドを挙げることができる。なお、ここで、「側鎖に芳香環を有するアミノ酸」は必ずしも天然のタンパク質を構成するアミノ酸に限定されるものではなく、上記のようにチロシン又はフェニルアラニンの芳香環にニトロ基、ハロゲン、炭素数１〜５のアルキル基及び炭素数１〜５のアシル基から成る群より選ばれる少なくとも１種の置換基を結合させたチロシン又はフェニルアラニン誘導体も包含される。置換基が存在する場合、芳香環、好ましくはベンゼン環上に置換する置換基の数は、１〜５個であり、１〜３個が好ましい。また、「芳香環」は好ましくはベンゼン環又はベンゼン環を含むナフタレン環のような縮合環（複素環でもよい)であり、特に好ましくはベンゼン環である。
【００１２】
下記実施例に具体的に記載されるように、本願発明者らは、配列番号１の第４番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドよりもさらに優れた血管新生効果を有することを見出した。なお、フェニルアラニンは、側鎖に芳香環(ベンゼン環）を有するアミノ酸である。したがって、本発明の好ましい形態として、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるペプチド又は該配列において、一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失し、若しくは前記アミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に位置する１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の一方若しくは両方の端部に他のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって血管新生作用を有するペプチドを含む血管新生剤を挙げることができる。
【００１３】
血管新生作用を有する領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中に含まれるので、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に他の任意のアミノ酸配列が付加されていてもそのペプチドは血管新生作用を発揮し得る。このことは、フィブロネクチンやラミニン等の細胞接着性ペプチドの細胞接着作用がRGDという僅か３つのアミノ酸から成る領域や、YIGSRという僅か５つのアミノ酸から成る領域等により発揮されるものであることからも類推できる。従って、血管新生活性を有する領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中に含まれるので、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくはその端部領域が欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に、長いアミノ酸配列が付加されている場合であっても、上記ペプチド又は修飾ペプチド領域が相互作用のために露出している限りは血管新生作用を発揮するものと考えられる。なお、現在では、人工ペプチドの立体構造は、その一次配列から、市販のコンピューターソフトを用いて容易に予測することができるので、サイズの大きなペプチドであっても、上記ペプチド又は修飾ペプチド領域が露出するペプチドは容易にデザインできる。
【００１４】
従って、本発明に用いられるペプチドのサイズの上限は何ら限定されるものではないが、あまりに大きいと製造が困難となり、取り扱いが不便であり、また、単位重量当たりの血管新生活性が減少すると考えられるので、ペプチドの総アミノ酸数は、通常、５〜２０、さらに好ましくは６〜１０である。例えば、配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列のいずれか一端に他のアミノ酸配列を付加したペプチドであるが、いずれも優れた血管新生活性を有することが確認されている。なお、配列番号１のみならず、配列番号２〜７及び９〜１１に記載したアミノ酸配列からなるペプチドが血管新生作用を有することは下記実施例において具体的に確認されている。
【００１５】
なお、ペプチドが血管新生作用を有するか否かは、下記実施例に具体的に示すように、ペプチド溶液を充填したマイクロセルをマウスの背部に埋め込み、埋め込んだ周囲の組織内の毛細血管の形成状況を観察することにより調べることができる。
【００１６】
上記ペプチドは、手動あるいは市販のペプチド合成機を用いる常法により容易に合成することができる。また、サイズの大きなペプチドは、常法により、遺伝子工学的に製造することができる。
【００１７】
上記ペプチドは、単独で、又は生理緩衝液中に溶解した注射液等の形態で、血管新生が望まれる組織に局所投与することができる。手術や外傷により生じた創傷等の近傍に本発明の血管新生剤を、注射や塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、血管新生が促進され、創傷の治癒が促進される。ここで、注射又は塗布若しくは噴霧等に用いるペプチド溶液中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、1〜10μｇ（マイクログラム）／mＬ程度である。また、投与量は、傷などの大きさや深さにより適宜選択できるが、傷全体がペプチド溶液で被覆される程度でよい。また、傷が治癒するまで、１日〜数日毎に１回〜数回投与することができる。また、注射液には、他の消毒剤や消炎鎮痛剤など、通常、傷の治療薬に含まれる種々の成分を含んでいてもよい。
【００１８】
また、ペプチドをキャリアに結合し、ペプチドが結合されたキャリアを生体に埋め込むことにより血管新生を促進することもできる。これはキャリアに固定化している為に必要な部位に選択的に作用させることができ、新たなDDS（ドラッグデリバリーシステム）としての可能性に富んでいる。生体材料移植部に本発明の血管新生剤を、塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、血管新生が促進され、術後の治癒が促進される。ここで、キャリアとしては、特に限定されるものではなく、代用骨や代用歯、人工臓器等に用いられる樹脂や、タンパク質等の生体高分子を挙げることができる。樹脂に上記ペプチドを結合することにより、該樹脂を生体に埋め込んだ際に、樹脂と接する周辺組織中での血管新生が促進され、樹脂の生体との親和性がより向上する。また、より好ましい態様として、タンパク質（本明細書において、特に断りがない限り「タンパク質」という語は、糖タンパク質やリンタンパク質等のタンパク質含有複合体を包含する）をキャリアとして用いるができる。
【００１９】
ここで、キャリアとして用いるタンパク質は、生体適合性を有するいずれのタンパク質であってもよく、とりわけ、生体組織との接合を良好にするために、細胞接着性タンパク質であることが好ましい。細胞接着性タンパク質の好ましい例として、コラーゲン（ゼラチン）、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン等並びにこれらの部分加水分解物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。なお、これらのタンパク質は、アレルゲンを除去した精製タンパク質であることが、アレルギー反応の防止の観点から好ましい。例えば、コラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンが種々市販されているが、これらは純度が低く、アレルゲンが含まれており、品質の再現性も劣るので臨床用途に適用することは好ましくない。動物由来のコラーゲンを部分加水分解し、アレルゲンを除去したゼラチンが臨床用途のために市販されているので、このような精製されたコラーゲン又はその部分加水分解物を用いることが好ましい。
【００２０】
キャリアに結合されるペプチドの量は、特に限定されず、適宜選択することができるが、通常、キャリアとペプチドの重量比率（キャリア：ペプチド）が１００：１〜１：１程度であり、好ましくは２０：１〜５：１程度である。
【００２１】
キャリアとペプチドとの結合は、共有結合によることが好ましい。結合は、例えばペプチドのＮ末端のアミノ基と、キャリア中の任意のアミノ基をグルタルアルデヒド等の結合架橋剤を用いて結合することにより容易に行うことができ、下記実施例に詳細な結合方法の一例が記載されている。また、人工臓器等の樹脂に結合する場合には、この樹脂中に、アミノ基等の、ペプチドとの結合に用いることができる基を含むモノマーを共重合させておき、当該アミノ基等とペプチドのＮ末端のアミノ基を結合することができる。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその一部のアミノ酸が置換若しくは欠失した、血管新生作用を有する修飾ペプチドの一端又は両端に、任意のアミノ酸配列からなる他のペプチドを結合したものを採用し、この任意のペプチドをキャリアとの結合に供することも好ましい。
【００２２】
ペプチドを結合したキャリアは、塗布又は噴霧する他にそのままで生体内に埋め込むことができる。キャリアとして、細胞接着性タンパク質を採用した場合には、ペプチド結合キャリアは、縫合糸、各種整形手術材料、傷口の癒着促進剤等として単独又は他の薬効成分とともに用いることができる。また、ペプチドを結合したキャリアタンパク質を、炭酸アパタイトや、本発明のペプチドを結合していない細胞接着性タンパク質等の他の材料と混合したものを代用骨等として用いることができる。この場合、代用骨等の最終の生体材料中に含まれるペプチドの量は、特に限定されないが、通常、生体材料１００ｇ当たり、0.1mg〜10mg程度である。
【００２３】
本発明に用いられるペプチドは、天然のタンパク質を構成するアミノ酸によって構成されているものであり、生体内ではペプチダーゼの作用を受けてやがてはアミノ酸に分解されるものであるので、安全性が高い。実際、下記実施例で行った、マウスを用いたin vivoの実験において、毒性は全く観察されなかった。このことは、薬効を発揮する使用量において、毒性が認められなかったことを示している。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００２５】
実施例１    ペプチドの合成
Fmoc化学による高効率固相法（K. Nokihara et al., Innovation and Perspectives in Solid-Phase Synthesis 1992, ed., R. Epton, Intercept Limited, Andover, UK, 445-448, 1992, Design and Applications of a Novel Simultaneous Multiple Solid-Phase Peptide Synthesizer; 軒原清史、有機合成化学協会誌、52, 347-358, 1994, 高効率ペプチド合成：多種品目同時自動合成とペプチドライブラリー）に基づき、ペプチド自動合成機を用いて配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヘプタペプチド（AGP(angiogenic peptideの略)と命名）を合成した。得られたペプチドを、液体クロマトグラフィー結合質量スペクトル(LCMS)システムで検定し、高純度であることを確認した（単一成分、質量理論値と一致）。
【００２６】
実施例２    三次元培養された血管内皮培養組織中での血管新生作用
実施例１で合成したAGPの存在下でラットの血管内皮細胞を三次元培養した。この操作は具体的には次のようにして行った。細胞はtransformed rat lung endothelial cells (TRLEC細胞 )を用いた。10μg/mlの濃度のペプチド溶液混和コラーゲンI 層 中にTRLEC細胞を播種し、14日間の炭酸ガスインキュベータ−中で培養した。コントロールは因子(-)と従来より血管新生因子として知られているタンパク質VEGF(+)で行った。
【００２７】
14日後に培養細胞を顕微鏡で観察したところ、コントロールはまったく管腔を形成しなかった。AGPとVEGFは管腔を形成し、この管腔を囲包する細胞同士が接着されていた。さらに、倍率７０００倍で電子顕微鏡で管腔部分を観察したところ、管腔の内壁にマイクロビライ（微細細胞突起）が複数個形成されていることが認められた。さらに、倍率１５０００倍で、管腔を取り囲む血管内皮細胞同士の接合部分を観察したところ、内皮細胞同士が堅固に結合されている領域、すなわち、タイトジャンクション（密着結合）が認められた。これらの所見は内皮細胞が極性を獲得して、管腔を形成したことを示す。なお、極性というのは細胞が頭と尻尾のような機能分担する部分をもつ性質で、内皮細胞を通常培養していても極性はなく、したがって管腔も作らないので、このペプチドで誘導されたことを示している。管腔形成長さは有意にAGPの方がVEGFより優れていた。これらの結果から、AGPには血管内皮培養細胞から構成される組織中に、細胞同士を接着させてそれらの間に管腔を形成する作用（生体内では、この管腔が血管になる）があることが確認された。
【００２８】
実施例３、比較例１      DASアッセイによるin vivoでの血管新生作用
細胞培養液として用いられるDMEM（ダルベッコ修飾イーグル培地）中に10μg/mlの濃度のプチドを溶解した溶液を得た。直径0.45 mmの円筒の上下をMilliporeフィルター（商品名）で塞いで構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋め込んだ後、マイクロセル内に上記AGP等のペプチド溶液やVEGF溶液をインジェクションした。また、対照として、ペプチドを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）単独もインジェクションした（比較例１）。５日後に、マイクロセル周辺の組織の様子を顕微鏡で観察した。
【００２９】
その結果、AGP溶液をインジェクションしたマイクロセルに接していた組織では、枝分かれした毛細血管が多数形成されていた。一方、ＰＢＳのみを投与した比較例１（コントロール）では、このような毛細血管の生成は全く認められなかった。この結果をマグニチュードで示すとAGPでは５（マグニチュード５を以下、「Ｍ５」のように表記する）、コントロールではＭ０、比較のために用いた既知の血管新生タンパク質VEGFではＭ３であった。なお、マグニチュードは、スパイラル化した血管新生数であり、M0が0本、M1が1-10本、M2が11-20本、M3が21-30本、M4が31-40本、M5が41-50本、M6が51本以上であることを示す。従って、マグニチュードＭが大きいほど血管新生作用が大きい。上記結果から、AGPのin vivoにおける強い（顕著な）血管新生作用が確認された。
【００３０】
実施例４、参考例５〜７、実施例８〜９、比較例２
AGPを構成する７個のアミノ酸のうちの１個をアラニンに置換した、合計７種類のヘプタペプチド（配列番号２〜８）を実施例１と同様にして合成した。各ヘプタペプチドについて、実施例３に記載したDASアッセイによりマウス体内における血管新生作用を調べた。
【００３１】
その結果、配列番号１の４番目のチロシンをアラニンに置換したペプチド（配列番号８、比較例２）では、比較例１と同様、スパイラル化した血管新生作用が全く認められなかったが、他のペプチド（配列番号２〜７：実施例４、参考例５〜７、実施例８〜９）では、AGPと同等又はそれ以上の新生血管が形成されており、明らかな血管新生作用が認められた。血管新生能をマグニチュードMで表記すると、コントロール（ペプチドなし）(M0)、 AGP(M5)、AGP1(M5)、AGP2(M3)、AGP3(M2)、AGP4(M0)、AGP5(M3)、AGP6(M4)、AGP7(M6)であった。なお、ここで、AGP1は１位をAlaで置換したもの、以下同様でAGP7は７位をAla  置換したものであり、括弧内は上記した血管新生マグニチュードを示す。上記結果から、AGPのうち、少なくともＮ末端とＣ末端は、血管新生作用にとって必要ではないことが明らかになった。従って、AGPのＮ末端又はＣ末端を、キャリアとの結合部位として利用しても血管新生作用が損なわれないことが明らかになった。
【００３２】
実施例１０    ペプチドのキャリアタンパク質への結合
キャリアタンパク質として、動物由来コラーゲンを部分加水分解し、アレルゲンの部分を除去したゼラチンであるFreAlagin ADタイプ（宮城化学工業株式会社製、分子量2000〜20000）を用いた。FreAlagin ADタイプは、臨床での使用が認められているものである。
【００３３】
FreAlagin AD （キャリアタンパク質）100 mgを2.5 mL のMilliQ水に溶解した。AGP 1.20-1.32 mgを0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.0) 1 mL に溶解し,キャリア蛋白質に氷冷下で加えた。グルタルアルデヒド(25%溶液を0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.0)で10倍に希釈し、0.15 mLを得られた混合物に滴下（4℃）、反応混合物を4℃で3〜4 時間攪拌した。これにより、AGPのＮ末端のアミノ基と、キャリアタンパク質のアミノ基が共有結合された。
【００３４】
完全な結合の確認は薄層クロマトグラフィー（TLC）で原料消失にて行った。反応混合物は５％酢酸を溶出液としG10カラム（ファルマシア社製）で脱塩した。主ピークを凍結乾燥しほぼ定量的に結合物を得た。
【００３５】
実施例１１    AGP結合ゼラチンの三次元培養された血管内皮培養組織中での血管新生作用
実施例１０で合成したAGP結合ゼラチンの存在下でラットの血管内皮細胞を三次元培養した。この操作は具体的には次のようにして行った。細胞はtransformed rat lung endothelial cells (TRLEC細胞)を用いた。ペプチドAGP結合ゼラチン（コンジュゲート）とコラーゲンタイプIを1：10の割合で混和し、10μg(マイクログラム)/mlの濃度にしたコンジュゲート・コラーゲン混和溶液混和層中にTRLEC細胞を播種し、14日間の炭酸ガスインキュベータ−中で培養した。コントロールは因子(-)で他は従来より血管新生因子として知られているタンパク質VEGF(+)を用いた。
【００３６】
14日後に顕微鏡で観察したところ、コントロールはまったく管腔を形成しなかった。AGPコンジュゲートとVEGFとは管腔を形成し、この管腔を囲包する細胞同士が接着されていた。さらに、倍率７０００倍で電子顕微鏡で管腔部分を観察したところ、管腔の内壁にマイクロビライ（微細細胞突起）が複数個形成されていることが認められた。さらに、倍率１５０００倍で、管腔を取り囲む血管内皮細胞同士の接合部分を観察したところ、内皮細胞同士が堅固に結合されている領域、すなわち、タイトジャンクションが認められた。管腔形成長さは有意にAGPコンジュゲートの方がVEGFより優れていた。これらの結果から、AGPコンジュゲートには血管内皮培養細胞から構成される組織中に、細胞同士を接着させてそれらの間に管腔を形成する作用（生体内では、この管腔が血管になる）があることが確認された。
【００３７】
実施例１１、比較例３      DASアッセイによるin vivoでの血管新生作用
100μg/mlの濃度のAGPコンジュゲート（実施例１０で作製）をコラーゲンIに1：10の割合で溶解し、10μg/mlの濃度のプチド結合ゼラチンコラーゲン混和溶液を得た。直径0.45 mmの円筒の上下をMilliporeフィルター（商品名）で塞いで構成されるマイクロセルをマウスの背部に埋め込んだ後、マイクロセル内に上記AGPコンジュゲートとVEGF溶液とをインジェクションした。また、対照として、ペプチドを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）単独もインジェクションした（比較例３）。５日後に、マイクロセル周辺の組織の様子を顕微鏡で観察した。
【００３８】
その結果、AGPコンジュゲート・コラーゲン混和溶液をインジェクションしたマイクロセルに接していた組織では、スパイラル化した毛細血管が多数形成されていた。一方、ＰＢＳのみを投与した比較例３では、このようなスパイラル化した血管の形成は全く認められなかった。血管新生マグニチュードは、対照はＭ０、AGPはＭ５、VEGFはＭ３であった。この結果から、AGPコンジュゲートのin vivoにおける血管新生作用が確認された。
【００３９】
実施例１２〜１５、参考例１６〜２１、比較例４〜７
配列番号９ないし２２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、実施例３と同様にしてDASアッセイを行った。結果を下記表１に示す。
【００４０】
【表１】
0004338516.tif 000002
注    実施例１８(配列番号１５)のｙはDアミノ酸でTyrのD体を意味する。
【００４１】
以上の結果から、配列番号９〜１１で示すアミノ酸配列からなるペプチドが非常に優れた血管新生活性を有し、とりわけ、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるペプチドが特に優れた血管新生活性を有することが明らかになった。また、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に他のアミノ酸配列を付加したペプチドも優れた血管新生活性を有することが明らかになった。
【００４２】
産業上の利用可能性
本発明の血管新生剤は、強い血管新生作用を有し、人工骨等の生体代用材料や人工臓器の体内埋め込み及び臓器の修復に有用である。また、生活習慣病として大きな部分を占める心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性大動脈硬化症などの虚血性疾患の治療にも有用である。
【配列表】
0004338516000001.app