(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）又はＮＣＳが高分子化合物と結合した高分子型ＮＣＳ誘導体を有効成分とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
高分子化合物がスチレン−マレイン酸共重合体である請求項１記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
高分子型ＮＣＳ誘導体がジノスタチンスチマラマーである請求項１記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う疾患又は病態の治療剤である請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
経皮的冠動脈形成術後の血管再狭窄に対する治療剤である請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
経皮的冠動脈形成術(percutaneous transluminal coronary angioplastry:PTCA)は、現在では薬物治療、手術治療(coronary artery bypass grafting:CABG)と共に虚血性心疾患に対する治療の主流をなすに至っており、PTCAに用いられるデバイスも、通常のバルーンに加え、ステント、方向性アテレクトミー(directinal coronary atherectomy:DCA)、ロータブレータなどのニューデバイスが誕生し、PTCAの成績が向上している（非特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、PTCAの成功後の血管再狭窄率が高いことが知られており、この再狭窄又は再閉塞は依然として大きな問題とされている。PTCA又はステントの血管内留置を行った場合、特に線維性内膜肥厚により高度の再狭窄を示す症例においては、血管内皮細胞が剥離され、それにより平滑筋細胞の増殖が起こり、再閉塞の原因となると考えられている。
【０００４】
同様に、血管平滑筋細胞の増殖が関与している疾患又は病態は各種知られており、例えば、冠動脈硬化症においては、硬化は冠状動脈の主幹部に起こり、組織学的には粥状硬化を主体とし、これに細胞、組織内皮肥厚、更に泡沫細胞や内膜膠原繊維の水腫性、脂肪性膨化などが加わったものとされている。
【０００５】
一方、ネオカルチノスタチン(neocarzinostatin:NCS)は、ストレプトミセス・カルチノスタチカス・バリアントF-41クロヤ(Streptmyces carzinostaticus var.F-41・Kuroya)の培養物中に産生される、クロモフォアとアポプロテインとからなる推定分子量１０７００のタンパク質性抗癌物質であり、これを有効成分とする医薬は既に認可されている（非特許文献２参照）。また、NCS１分子に、部分ブチルエステル化したスチレン−マレイン酸共重合体２分子を結合させて得られる平均分子量約１５０００のNCS誘導体であるジノスタチンスチマラマー(zinostatinstimalamar)（特許文献１参照）を有効成分とする医薬は、肝細胞癌を適応として認可されている（非特許文献３参照）。更に、ジノスタチンスチマラマーは、固形癌において高い浸透性及び局所留保性効果(Enhanced Permeation and Retention Effect:EPR効果)を有することが知られている（特許文献２及び非特許文献４参照）。すなわち、従来の抗癌剤は、低分子型のために、投与後直ちに全身へ拡散・分布し、しかも全身への分布によって副作用が発現するのに対し、ジノスタチンスチマラマーは、長期間に渡り所望の病変部に滞留し、薬理効果を発揮する。
【０００６】
しかし、これまで、NCS及びジノスタチンスチマラマーが血管平滑筋細胞に対して増殖抑制効果を有することは知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１−２１７０００号公報
【特許文献２】
特開２００１−７２６０６号公報
【非特許文献１】
石原正治他,「経皮的冠動脈形成術(PTCA) 循環器疾患最新の治療2002-2003」,株式会社南江堂, 2002年2月20日,85-90頁
【非特許文献２】
「抗腫瘍性抗生物質 ネオカルチノスタチン」, 医療薬日本医薬品集2003年版,株式会社じほう,平成14年10月25日,1527頁
【非特許文献３】
「ネオカルチノスタチン誘導体抗がん剤 ジノスタチンスチマラマー」,医療薬日本医薬品集2003年版,株式会社じほう,平成14年10月25日,926頁
【非特許文献４】
Maeda,H.et al.,"Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs,including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANCS.",J.Control Release ,74(2001)47-61
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制剤、及び当該血管平滑筋細胞の増殖によって生じる疾患、例えばPTCA後の血管再狭窄や冠状動脈硬化症に代表される細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う疾患又は病態の治療剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血管平滑筋細胞増殖抑制剤について鋭意検討した結果、NCS及び高分子型NCS誘導体が優れた血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有すること、また、冠状動脈のPTCAやステント留置後の血管再狭窄等の血管平滑筋細胞増殖に起因する疾患の治療に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、NCS又はNCSが高分子化合物と結合した高分子型NCS誘導体を有効成分とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、NCS又はNCSが高分子化合物と結合した高分子型NCS誘導体を有効成分とする細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う疾患又は病態の治療剤を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるネオカルチノスタチン(NCS)は、公知の方法（特開昭５２−３２４１２号公報等）に従って製造することができ、また市販品を用いることもできる。
【００１２】
高分子型NCS誘導体は、NCSに高分子化合物を例えばアミド結合させて得られる誘導体である。高分子化合物としては、スチレン−マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸、ヒドロキシプロピル・メタアクリレートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、これらのエステル類、可溶性ゼラチン、キチン類、プルラン、デキストラン類、澱粉等が挙げられる。これらのうちで、スチレン−マレイン酸共重合体が好ましい。
【００１３】
NCS１分子に対する高分子化合物、特にスチレン−マレイン酸共重合体の結合数は、１〜３５分子であることが好ましく、２〜１５分子であることがより好ましく、２分子であることがさらに好ましい。NCS１分子にスチレン−マレイン酸共重合体２分子が結合した化合物を以下「SMANCS」という。このスチレン−マレイン酸共重合体は、部分ブチルエステル化されていることが好ましい。ブチルエステル以外のエステルとしては、マレイン酸のカルボキシル基の水素原子が、炭素数１〜４のアルカノール、アルキル基の炭素数が１もしくは２のエチレングリコールモノアルキルエーテル又はアルキル基の炭素数が１もしくは２のグリセリンジアルキルエーテルから水素原子を除いたアルコール残基によって置換されているものが好ましい。
【００１４】
SMANCSの構造は、特開昭５２−３２４１２号公報、特開昭５７−３１５５５号公報等に詳細に記載されているように、式：
[SMA]―[NCS]―[SMA]
で表される。
式中、[NCS]は、ネオカルチノスタチン残基を示し、NCSの１位のアラニン残基中の１級アミノ基及び２０位のリジン残基中の１級アミノ基からそれぞれ１個の水素原子を除いた２価のネオカルチノスタチン残基を意味する。また、[SMA]は、スチレン−マレイン酸共重合体残基を示し、スチレン残基及びマレイン酸残基又は半エステル化マレイン酸残基を構成成分とし、かつマレイン酸残基又は半エステル化マレイン酸残基の一部が、分子中の１個のカルボキシル基から水酸基が除かれて、ネオカルチノスタチン残基と結合手を有する構造となっている、１価の部分半エステル化されていてもよいスチレン−マレイン酸共重合体残基を意味する。
【００１５】
また、本発明に用いられる高分子型NCS誘導体は、特開昭５８−１５０５７号公報等の記載の方法に準じて製造できるが、市販品を使用してもよい。その平均分子量は、１００００以上、特に１００００〜３００００であることが好ましく、またそれ以下であっても生体内のアルブミン等と結合して生体内での挙動分子量が４万以上となるものであればよい。
【００１６】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、必要に応じた投与法および剤形により使用可能であり、その製剤は通常用いられている各種製剤の調製法にて、必要に応じて薬学的に許容される担体を配合して、投与法に合致した剤形を選択すればよく、投与法および剤形は特に限定されるものではない。
経口投与製剤としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。これらの経口投与用製剤は、製剤分野において通常用いられる添加剤を配合し、公知の方法に従って製造することができる。このような添加剤としては、例えば乳糖、マンニトール、無水リン酸水素カルシウム等の賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、でんぷん、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、動物又は植物由来の各種油脂等の滑沢剤等が用いられる。
非経口投与用製剤としては、例えば注射剤等が挙げられる。このような注射剤は公知の方法、例えばNCS又は高分子型NCS誘導体を日局注射用水に溶解することにより製造できる。当該溶解したものを容器に充填してもよく、またそれを凍結乾燥等によって固形として用時調製の製剤としてもよい。必要により塩化ナトリウム等の等張化剤、リン酸水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム等の緩衝剤等を配合してもよい。
本発明においては、注射用製剤であることが好ましく、既認可品（NCS注2000単位：SMANCS動注用4.6mg/動注用懸濁用液4.6mL）（医療薬日本医薬品集2003年版,株式会社じほう,平成14年10月25日,926頁）と同様な製剤を使用できる。
【００１７】
製剤を油性化するために、NCS又は高分子型NCS誘導体を高級脂肪酸トリグリセライド、中鎖脂肪酸トリグリセライド、同ジグリセライド、他の脂肪酸もしくはそのエステル類、大豆油、オリーブ油、綿実油、その他の植物油、油性造影剤（例えば、リピオドール）等により懸濁溶解して、又は用時溶解して用いることも好ましい。また、必要に応じて他の植物油及び鉱物油を配合することができる。
【００１８】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状等により異なるが、成人１人当たりの１日量は、０．０１ｍｇ〜０．１ｇが好ましく、０．１ｍｇ〜５ｍｇがより好ましく、病変部局所の有効成分濃度が０．５〜１０μｇ／ｍＬとなる量が好ましい。この場合、１日量を数回に分けて投与することも可能であり、必要な場合には上記の１日量を超えて投薬することも可能である。
【００１９】
血管平滑筋細胞増殖抑制剤の投与法は、病変部の冠状動脈等への血管内投与が好ましい。投与に際しては、前記の油性化した高分子型NCS誘導体からなる製剤を使用することが好ましい。当該投与により、病変部の障害された細胞・組織への製剤の浸透性が高まり、また病変部に有効成分が留保して病変部局所にて薬理効果を奏することにより、効果が１０〜１００倍程度高まることが期待される。例えば、PTCA処置後に、製剤を常法によりカテーテルにて局所投与することにより、又は予め有効成分をコーティングしたステントを血管内留置することにより、これら所望の局所投与を実施できる。更に、油性造影剤に懸濁した製剤を使用する場合には、油性造影剤が造影剤効果を併せ持つことから、常法に従う造影により、局所における薬剤の滞留又は残存量を確認できる。
【００２０】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、後記試験例に示すように、血管平滑筋細胞増殖の抑制に有効である。また、細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う各種の疾患又は病態、特にPTCA後の血管再狭窄、動脈硬化、虚血性血管傷害後の内膜肥厚、末梢動脈閉塞、結節性動脈周囲炎、移植臓器において見られる血管炎等の治療剤としても有効である。
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤において、高分子型NCS誘導体、特にSMANNCSは、その高いEPR効果から、細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う各種の疾患又は病態の治療剤に殊に好適に使用される。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
試験例１
ヒト大動脈平滑筋細胞HASMC(1.5×104/100μL/well、クラボウ(株))を９６穴マイクロプレートにて平滑筋細胞増殖用低血清培地(HuMedia-SG2、クラボウ（株）)で常法に従い培養した。試験は、NCS（（株）科薬）又は常法により製造したジノスタチンスチマラマー（日抗基ジノスタチンスチマラマー；癌と化学療法,第21巻,第6号,907頁(1994)）を被検薬剤とし、それぞれ0、1、5、10、50、100又は200μg/mL濃度の薬剤存在下で細胞を培養し、培養１日、３日及び５日後のHASMCの増殖に対する作用をMTT法（Ishiyama,M.,et al.,Talanta,44,1299(1997)）で測定することにより行った。MTT法による測定は、各サンプルの穴にMTT溶液を添加し、２時間培養後にミトコンドリア活性（生細胞活性能）の指標となるOD450/650nmの吸光度を測定することにより行い、この吸光度を細胞増殖の指標とした。結果を図１(NCS添加)及び２（ジノスタチンスチマラマー添加）に示す。図１及び２において、縦軸はミトコンドリア活性(D450/650nm)を、横軸は培養後の測定日を示し、図中の曲線は、−黒塗りひし形−：NCSの非添加群又はジノスタチンスチマラマー（ジノスタチンスチマラマーを「SMANCS」と表示する。）の非添加群、−黒塗り四角−：NCS又はSMANCS 1μg/mL添加群、−黒塗り三角−：NCS又はSMANCS 5μg/mL添加群、−ばつ印−：NCS又はSMANCS 10μg/mL添加群、−星印−：NCS又はSMANCS 50μg/mL添加群、−黒塗り丸−：NCS又はSMANCS 100μg/mL添加群、−縦線−：NCS又はSMANCS 200μg/mL添加群を示す。
【００２３】
図１及び２より、NCS又はジノスタチンスチマラマー非添加の対照群では、１日、３日及び５日後において細胞の増殖が認められたが、NCS又はジノスタチンスチマラマー添加群では、添加濃度の増加と培養日数の経過に伴い細胞増殖の顕著な抑制が認められた。
【００２４】
上記抑制の程度を図３（１日後）、４（３日後）及び５（５日後）に示す。図中、縦軸は上記対照群におけるミトコンドリア活性（OD450/650nm）を１００％とした時の試験群におけるミトコンドリア活性を百分率で表した増殖率（％ Growth to control）を、横軸は各試験群を示し、図中の黒バーはNCS添加群を、白バーはジノスタチンスチマラマー添加群を示す。細胞増殖抑制の程度は、NCSとジノスタチンスチマラマーとでほぼ同程度の傾向を示し、培養３日後で既に10μg/mLの濃度でほぼ完全に増殖を抑制し、５日後では5μg/mLの濃度で完全に増殖を抑制した。
【００２５】
試験例２
低濃度のNCS又はジノスタチンスチマラマーを使用する以外は試験例１と同様にしてHASMCの増殖抑制を測定した。結果を図６（NCS添加）及び７（ジノスタチンスチマラマー添加）に示す。図中の曲線は、−黒塗りひし形−：NCSの非添加群又はジノスタチンスチマラマーの非添加群、−黒塗り四角−：NCS又はSMANCS 10ng/mL添加群、−黒塗り三角−：NCS又はSMANCS 50ng/mL添加群、−ばつ印−：NCS又はSMANCS 100ng/mL添加群、−星印−：NCS又はSMANCS 500ng/mL添加群、−黒塗り丸−：NCS又はSMANCS 1000ng/mL添加群、−縦線−：NCS又はSMANC 2000ng/mL添加群を示す。
【００２６】
図６及び７より、NCS及びジノスタチンスチマラマーは、何れも約500ng/mLの添加濃度までは平滑筋細胞増殖抑制効果が認められた。
【００２７】
試験例３
前記に従い５日間培養してコンフルエント(confluent)に達したHASMCを平滑筋細胞増殖用低血清培地で6×105/mLに調製し、その100μLを96穴プレート（平底）に播いて培養を開始した。培養１日後に、所定濃度の薬剤を100μLずつ添加して更に１日培養した後、生細胞数をMTT法に従い測定した。結果を図８に示す。図中の黒バーはNCS添加群を、白バーはジノスタチンスチマラマー添加群を示す。
【００２８】
NCS及びジノスタチンスチマラマーは、ヒト血管平滑筋細胞がコンフルエントな状態ではその増殖抑制作用はほとんど認められず、正常組織と対比して増殖性の平滑筋細胞に高い増殖抑制作用を示すと推察された。
【００２９】
【発明の効果】
NCS又はジノスタチンスチマラマーに代表される高分子型NCS誘導体は、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有し、冠状動脈のPTCAやステント留置後の再狭窄の治療剤の他、細胞増殖性血管病変又は血管壁肥厚を伴う疾患又は病態の治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  HASMCに対するNCSの細胞増殖抑制を示す図である。
【図２】  HASMCに対するSMANCSの細胞増殖抑制を示す図である。
【図３】１日培養後のHASMC増殖に対するNCS又はSMANCSの効果を示す図である。
【図４】３日培養後のHASMC増殖に対するNCS又はSMANCSの効果を示す図である。
【図５】５日培養後のHASMC増殖に対するNCS又はSMANCSの効果を示す図である。
【図６】  HASMCに対する低濃度NCSの細胞増殖抑制を示す図である。
【図７】  HASMCに対する低濃度SMANCSの細胞増殖抑制を示す図である。
【図８】コンフルエント状態のHASMCに対する低濃度SMANCSの細胞増殖抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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