(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列の決定方法であって、標的配列を含有しているであろうサンプルをこの標的配列へハイブリッド可能な標識遺伝子プローブと接触させて、標的配列および標識遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成する方法であり、更に
（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない標識遺伝子プローブの、場合により余分となる分の標識と結合するレセプターであって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、化学的修飾抗体、および化学的修飾抗体断片からなる群から選ばれるものを添加し、それにより前記場合により余分となる分の標識に起因するシグナルを選択的に消失させ、その結果非ハイブリッド形成標識遺伝子プローブによる干渉作用を減少させ、そしてそれにより当該標的配列の決定方法の感度および特異性が決定的に改善され、次いで
（ｂ）目的に適した方法を用いて、標識に起因するシグナルを定量的に検出する
工程を含んでなる方法。
【請求項２】
場合により余分なハイブリッドを形成していない遺伝子プローブの標識が、選択試薬とのインキュベートにより部分的に不活化される工程を更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択試薬とのインキュベートが最初に行われ、その後レセプターの添加が行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標識が蛍光、りん光、化学発光、生物発光または電圧発光の可能な基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識がアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド、ルミノール、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステルあるいはオキサミドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標識が酵素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、標識に対するレセプターで非ハイブリッド形成遺伝子プローブのシグナルを変化させることに基づく、等質遺伝子プローブ試験に関する。
背景技術
遺伝子プローブアッセイは、様々な態様で文献に既に記載されている。より多く用いられる態様はハイブリッド形成保護アッセイ(Clin.Chem.35/8,1989,1588-1594) 、キッシングプローブ技術(Nachr.Chem.Tech.Lab.37/7,1989,698) およびエネルギートランスファー原理である。
【０００２】
先行技術による遺伝子プローブアッセイの極めて一般的な原理は図１で表されている：第一工程において、標的配列および標識された遺伝子プローブは互いにハイブリッド形成され、そこから２配列に十分な相同性があれば二本鎖構造体が得られる。しかしながら、たいてい、遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖部分も残る。第二工程では選択的加水分解が行われ、そこでは選択された条件のために、本質的に一本鎖遺伝子プローブの標識が攻撃されて、二本鎖構造体の標識が親水性攻撃から主として保護される。そして、第三工程では、本質的に二本鎖構造体中で結合された標識により生じるシグナルが測定される。
【０００３】
上記方法の欠点は、選択試薬との処理（工程２）にもかかわらず、完全標識を有した一本鎖遺伝子プローブの残留物が残っていて、それが測定に障害をきたしてしまうことである。
【０００４】
【発明の概要】
したがって、本発明は核酸配列の決定方法（“遺伝子プローブアッセイ”）の提供を目的としており、非ハイブリッド形成遺伝子プローブは先行技術による方法よりも小さな程度で望ましくないシグナル形成に関与しているだけである。特に、目標とした改良で、改善された均一試験操作を可能にしている。均一試験操作は、核酸ハイブリッド形成とシグナル検出との物理的分離工程がないことにより基本的に特徴付けられる。このような方法において、先行技術によれば、非ハイブリッド形成標識遺伝子プローブによる特に深刻な干渉作用が考慮に入れられねばならない。
【０００５】
その目的は、標識と結合して、結合の結果として標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減弱（“消失”）させることができるレセプターを本発明による方法で用いることにより意外にも達成された。したがって、下記本発明による方法によれば、非ハイブリッド形成標識遺伝子プローブによる干渉作用を減少させて、それにより試験系の感度および特異性を決定的に改善することが有意に可能である。
【０００６】
【発明の具体的説明】
このように、本発明は、標的配列を含有しているであろうサンプルがこの標的配列の決定に適した遺伝子プローブと接触されて、標的配列および遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成する方法であって、
（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない遺伝子プローブの場合により余分となる部分の標識と結合するレセプターを添加し、それにより標識に起因するシグナルを定性的および／または定量的に変化させ、次いで
（ｂ）目的に適した方法を用いて標識に起因するシグナルを定性的または定量的に検出する
工程を含んでなる核酸配列（すなわち、標的配列）の決定方法に関する。
【０００７】
本発明は、更に、場合により余分な非ハイブリッド形成遺伝子プローブの標識が選択試薬とのインキュベートにより部分的に不活化される追加の工程を含む方法に関する。
【０００８】
本発明の好ましい態様では、前記の選択試薬とのインキュベートが最初に行われ、その後レセプターの添加が行われる。
【０００９】
レセプターがモノクローナルまたはポリクローナル抗体、抗体断片、（化学的修飾後に抗原結合能力が十分な程度に留められているならば）化学的修飾抗体または化学的修飾抗体断片である方法も更に好ましい。
【００１０】
更に好ましい本発明による方法では、標識が蛍光、りん光、化学発光、生物発光または電圧発光の可能な基からなる。
【００１１】
本発明の特に好ましい態様において、標識はアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド、ルミノール、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステルあるいはオキサミドである。
【００１２】
標識が酵素である方法も好ましい。
標識：
適切な標識は蛍光、りん光、化学発光、生物発光または電圧発光の可能なすべての基であり、これらはその化学構造のために、この基に対するレセプターの結合が対応一本鎖結合基への結合と比較して困難になるように、例えば二本鎖中にはいり込むことで核酸二本鎖と相互作用することができる。二本鎖核酸中にはいり込んだアクリジニウムエステルおよびアクリジニウムアシルスルホンアミド基が特に適している。加えて、ルミノール、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステルまたはオキサミドも適切である。
【００１３】
発光化合物は既に様々な用途を有している。それらは酵素イムノアッセイ、発光イムノアッセイ(cf.W.P.Collins "Alternative Immunoassays",Publishers John Wiley & Sons Ltd.,Chichester,1985) およびバイオアッセイ（抗原‐抗体相互作用に基づかずに、免疫系の一部として考えられない分子間の結合親和性に基づく試験）、更に核酸ハイブリッド形成アッセイ(cf.J.A.Matthews et al."Analytical Biochemistry",151,205-209,1985)もまた指示薬として用いられている。加えて、化学発光化合物はフローインジェクション分析、液体クロマトグラフィーのポストカラム検出器、フローサーチおよび人工光源の発生に用いられる。アクリジン誘導体は更に食品および環境分析の試験方法に適している。
【００１４】
核酸ハイブリッド形成アッセイにおけるアクリジニウム標識の使用は、ＥＰ‐Ａ‐０  ２７３  １１５と、ＥＰ‐Ａ‐０  ２１２  ９５１、ＥＰ‐Ａ‐０  ２８１  ３９０、ＥＰ‐Ａ‐０  ３１０  ３１２、ＥＰ‐Ａ‐０  ３１３  ２１９およびＷＯ  ８９／０２８９６に記載されている。ＥＰ‐Ａ‐０  ４０７  ８１６では塩基ウラシルでのヌクレオチド誘導体について記載し、その一部ではスペーサーを介して化学発光化合物で標識されている。ＥＰ‐Ａ‐０  ６０２  ５２４では先行技術と比較して有利な性質のある発光標識遺伝子プローブ、特に開示された遺伝子プローブの有利な性質に基づくハイブリッド保護アッセイ原理による等質遺伝子プローブアッセイについて記載している。
抗標識抗体：
標識に対する抗体は、例えば実験動物を標識で免疫し、その後適切なシグナル対応抗体を選択することにより、常法で基本的に作製することができる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方が適しており、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が好ましい。発光原性アクリジニウム標識に対する一部の抗体は、標識と結合することにより、そのシグナル強度を減少させる性質（消失作用）を有している。このため、例えば、マウス１０匹の単一実験バッチでは、発光原性アクリジニウムアシルスルホンアミド標識に対するＭＡｂがみられるが、可能なシグナル消失性質に関して予め選択されず、望ましいシグナル消失性質を有した１つのＭＡｂがみられた。
【００１５】
高度に適切な抗体の例は細胞系ＢＷ９０‐６１４‐８‐０４から分泌されるモノクローナルマウス抗体であり、これはGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-38124 Brunswick に番号ＤＳＭＡＣＣ  ２１８４のもと寄託された。このＭＡｂは図２で示されたアクリジニウムアシルスルホンアミドに対するものである。
遺伝子プローブの作製：
適切な遺伝子プローブの作製は、当業者に原則として知られている方法を用いて行える。遺伝子プローブは比較的多数の公開文献、例えば：S.L.Beaucage and R.P.Iyer:"The Functionalization of Oligonucleotides Via Phosphoramidite Derivatives",Tetrahedron 49,1925-1963 (1993) およびJ.Goodchild:"Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of Their Synthesis  and Properties",Bioconjugate Chemistry 1,165-187 (1990) で詳細に開示されている。
【００１６】
適切な遺伝子プローブの構造は図３で例示されている。勿論、示された塩基配列はいずれか他の適切な配列と置き換えてもよい。当業者に知られる他の標識も、当業者に知られた方法で遺伝子プローブとして用いられる核酸に結合させることができる。
遺伝子プローブアッセイ：
通常、本発明による方法は先行技術で知られたすべての方法に基づいて理解することができる。本発明による遺伝子プローブ技術は、均一試験で有利に用いることができる。抗標識ＭＡｂによる強いシグナル消失のために、先行技術で知られているよりも実質上高感度の等質遺伝子プローブ試験が、比較的良好な安定性を有するものとして開発できる。本発明による等質遺伝子プローブアッセイは、簡単な取扱いと容易な自動性で更に区別される。
【００１７】
本発明による方法の好ましい変法は図４で概略的に示されている：第一工程において、標的配列および標識遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成され、そこから二配列に十分な相同性があれば二本鎖構造体が得られる。ところが、たいてい、遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖部分も残る。第二工程では、一本鎖遺伝子プローブの標識と結合して、結合の結果として標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減弱（消失）させることができるレセプター、例えば抗体が用いられる。第三工程では、二本鎖構造体中で結合された標識により生じるシグナルがその後でほぼ排他的に測定されるが、その理由はハイブリッド形成遺伝子プローブの標識がレセプターと結合できないかまたは非ハイブリッド形成遺伝子プローブの標識よりもレセプターとよく結合できないからである。公知方法と比較して、この方法では、一本鎖遺伝子プローブによる測定されるシグナルに対する（望ましくない）関与をより一層小さくできるという利点を有している。
【００１８】
上記方法は、第一ハイブリッド形成工程後に、上記のように、選択試薬との処理で一本鎖遺伝子プローブの選択的加水分解を行い、その後に標識に対するレセプターを用いることで、更に改善することができる。その後の測定では、一本鎖遺伝子プローブの標識の事前の二重の排除により、未結合標識により事実上もはや障害をうけない（図５参照）。
【００１９】
更に好ましい変法は、ハイブリッド形成保護アッセイ（前記参照）に基づいており、本発明によれば、これらの未結合遺伝子プローブが測定されるシグナルの障害を起こさないように、一本鎖遺伝子プローブの標識と結合できるレセプターの添加により、別な工程で遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖部分の標識を検出上変化、例えば消失させることからなる。
【００２０】
本発明による方法で用いられるレセプターは、既に上記されたように、標識に対するシグナル消失モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００２１】
【実施例】
下記例は本発明を更に説明するためであり、それをいずれかに限定するためではない。
【００２２】
例１：発光原性アクリジニウムアシルスルホンアミド標識に対するモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製のため、ＢＡＬＢ‐ｃマウスに、完全Freund'sアジュバントに乳化されたアクリジニウムアシルスルホンアミド‐ＢＳＡ複合体１０μｇを皮下または腹腔内注射した。アクリジニウムアシルスルホンアミド‐ＢＳＡ複合体は、当業者に知られる方法により、ＢＳＡとのＮ‐（４‐メトキシフェニル）‐Ｎ‐〔４‐（２‐スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキサミドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテート（図２）の反応により製造できる。アジュバントなしに４〜５回の追加免疫を４週間毎に続けた。融合前の最後の４日間は、マウスに静脈内ブースター注射（１０μｇ／日）を行った。
【００２３】
ハイブリドーマの産生のため、免疫動物を頸部脱臼により殺した。脾臓を無菌的に摘出し、無血清Dulbecco's修正Eagle's 培地（ＤＭＥＭ）で脾臓細胞の個別懸濁物を得るために細断した。細胞を遠心（５分間；１８００ｒｐｍ）により集め、ＤＭＥＭで１回洗浄した。全細胞数はTrypan Blue 排除技術を用いて血球計カウントにより調べた。マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）を無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、遠心（１０分間；１０００ｒｐｍ）により集め、上記のようにカウントした。
【００２４】
約１０８脾臓細胞をマウスの２×１０７ＳＰ２／０ミエローマ細胞と混合した。１０００ｒｐｍで１０分間の遠心後、上澄を除去し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、Merck 、５０％）１ｍｌをペレット含有容器に加えた。次いでペレットをライトタッピング(light tapping) しながら再懸濁し、３７℃で１分間インキュベートした。
【００２５】
無血清ＤＭＥＭ１０ｍｌをライトタッピングしながら滴下し、混合液を２〜４分間インキュベートした、次いで融合された細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた細胞ペレットを２０％胎児牛血清（ＦＣＳ）およびＨＡＴ（ヒポキサンチン０．１μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭ）を含有したＤＭＥＭに懸濁し、約５×１０４〜１０６細胞／ウェルの濃度を用いて２４ウェルの培養プレート（Nunc）上で培養した。２〜３週間後、個別の細胞コロニーを個々のウェルから取出し、新たな培養プレートのウェルで培養した。
【００２６】
培養上澄をＥＩＡ技術により抗原特異的抗体について試験した。アクリジニウムアシルスルホンアミド‐ＢＳＡ（３μg/ml）でコートされた微量滴定プレートの各ウェルを上澄１００μＬで満たし、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗マウスペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）複合体１００μＬを室温で更に１時間かけて加えた。基質と共に３０分間インキュベート後、４９２ｎｍでの発色をBehring-ELISA プロセッサー（ＢＥＰ）で読み取った。適切な抗原特異性を有した抗体を産生するハイブリドーマを選択し、個別細胞マニピュレーターを用いてクローニングした。多量のモノクローナル抗体の作製のために、クローンを集団培養で複製した。その後の個別モノクローナル抗体の精製は、プロテインＡクロマトグラフィーにより行った。
【００２７】
例２：遺伝子プローブの作製（図３）
オリゴヌクレオチドの合成はＥＰ‐Ａ‐０  ６０２  ５２４、ｐ．４９、例１４ｂ）で記載されている。アクリジニウムアシルスルホンアミドとのカップリングは、例えば上記欧州特許出願で記載された公知方法により行った。
【００２８】
例３：抗標識ＭＡｂなしのE.coli検出に関する等質遺伝子プローブ試験
標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリスチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺伝子プローブ５０μｌ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけてハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテトラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。この後、チューブを５分間冷却させる。測定は、発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分析器試薬１（０．１Ｍ  ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）および分析器試薬２（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）の各場合に３００μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サンプルである。
【００２９】
陽性および陰性標準間で明確なシグナル差異を調べる（表参照）。
【００３０】
例４：抗標識ＭＡｂを用いたE.coli検出に関する等質遺伝子プローブ試験
標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリスチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけてハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテトラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。この後、チューブを５分間冷却させる。
【００３１】
次いで抗標識ＭＡｂ溶液（１０μg/mlのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Triton X-100）５０μＬをＲＴで１分間インキュベートする。測定は、発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分析器試薬１（０．１Ｍ  ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）および分析器試薬２（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）の各場合に３００μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サンプルである。
【００３２】
先のハイブリッド形成保護アッセイ（例３）と比較して、陽性および陰性標準間のシグナル差異は抗標識ＭＡｂの添加で明らかに改善されている（表参照）。固相として磁気粒子を用いた異種態様だけで可能になるシグナル差異が得られる（ＥＰ‐Ａ‐０  ６０２  ５２４、ｐ．５０〜５１、例１７参照）。
【００３３】
例５：非特異的ＭＡｂを用いたE.coli検出に関する等質遺伝子プローブ試験（コントロール実験）
標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリスチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけてハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテトラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。この後、チューブを５分間冷却させる。
【００３４】
次いで抗ＴＳＨ  ＭＡｂ溶液（Medix のＴＳＨ  ＭＡｂ  １μｇ、バッチ  Ｎｏ．：ＳＰＨＹ０５２／ｍｌのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Triton X-100）５０μＬをＲＴで５分間インキュベートする。測定は、発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分析器試薬１（０．１Ｍ  ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）および分析器試薬２（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）の各場合に３００μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サンプルである。
【００３５】
陽性および陰性標準間のシグナル差異は、予想どおり、例３に相当する（表参照）。
【００３６】
【表１】
0004286334.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】従来知られた遺伝子プローブアッセイの一般原理の説明図である。
【図２】ＢＳＡと反応させることでアクリジニウムアシルスルホンアミド−ＢＳＡが得られる、Ｎ‐（４‐メトキシフェニル）‐Ｎ‐〔４‐（２‐スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキサミドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテートの化学構造式である。
【図３】本発明の好ましい態様による遺伝子プローブを表す図である。
【図４】本発明による方法の原理を模式的に説明する図である。
【図５】本発明による好ましい変法の原理を模式的に説明する図である。
【図１】
0004286334.tif 000003
【図２】
0004286334.tif 000004
【図３】
0004286334.tif 000005
【図４】
0004286334.tif 000006
【図５】
0004286334.tif 000007