(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
果汁および／またはワインからスティルベン化合物を回収する方法であって、
(a)果汁および／またはワインに酵母を接触させ、スティルベン化合物を酵母に吸着させる工程、
(b)スティルベン化合物を吸着させた酵母を菌体分離操作により、果汁および／またはワインから分離する工程、
および
(c)分離した酵母に、エタノール濃度が20〜80％(v/v)のエタノール水を接触させ、スティルベン化合物を抽出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
酵母とエタノール水の接触時間が30分〜20時間である請求項１記載の回収方法。
【請求項３】
酵母とエタノール水の接触温度が５〜30℃である請求項１記載の回収方法。
【請求項４】
スティルベン化合物がリスベラトロールである請求項１〜３のいずれかに記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はブドウやワイン等に含まれるポリフェノール、特に、フラボノールであるケルセチンやミリセチン，スティルベン化合物であるリスベラトロール等を効率良く濃縮・回収する方法および当該ポリフェノールを高濃度に含むワイン酵母を提供するものである。
【０００２】
【発明の背景】
いわゆる「フレンチパラドックス」の鍵を解くのが赤ワインであるとの報告があってから，赤ワインは「健康に良い」ということから赤ワインの消費が増大している。赤ワインは動脈硬化，心臓病，癌，痴呆症，アルツハイマー症等に効果があると報告されており、その効果を発揮する成分は含まれるポリフェノールであるといわれている。
【０００３】
ポリフェノールはベンゼン環に水酸基を複数有するものの総称であるが，その中でも、ケルセチンに代表されるフラボノール類は、抗癌作用や抗酸化作用の高い物質であると報告されている。また、同じくポリフェノールの一種のスティルベン化合物であるリスベラトロールは、悪玉コレステロールであるLDL-コレステロールの酸化阻害による動脈硬化予防効果，血小板凝集阻害による血栓症予防効果の他，抗癌作用，ファイトエストロゲンとしての作用，痴呆症やアルツハイマー症予防効果を示すことにより注目を集めている。
【０００４】
ポリフェノールを摂取する方法としては，赤ワインや赤ブドウ果汁を飲用することが知られている。しかし，健康効果の高いフラボノール類やリスベラトロールのワインあるいはブドウ果汁おける濃度は比較的低い。即ち，ブドウやワインにおけるフラボノール類含量は通常20〜50 mg/L [J. Oszmianski, C.Y. Lee, Am. J. Enol. Vitic., vol. 41, pp. 204-206 (1990), P.L. Teissedre, E.N. Frankel, A.W. Waterhouse, H. Peleg, J.B. German, J. Sci. Food Agric., vol. 70, pp. 55-61 (1996)]である。また，リスベラトロール含量は更に低く，全スティルベン化合物濃度でも白ワインで0.01〜3.02 mg/L，赤ワインで0.82〜13.43 mg/L [M. Sato, Y. Suzuki, T. Okuda, K. Yokotsuka, Biosci. Biotech. Biochem., vol. 61, pp. 1800-1805 (1997)]である。
【０００５】
【従来の技術】
フラボノールやリスベラトロールを有効な量摂取することは，ワインや果汁を大量摂取しなければならず，ワインの場合はアルコールの害が問題となり，果汁の場合は糖分の過剰摂取となる問題がある。ワインを減圧蒸留などで濃縮すれば、アルコールの害の問題は避けることができるが、これによって得られた濃縮物は有機酸量が多すぎるため飲食用には適しない。一方、果汁を濃縮しても糖分の過剰摂取の問題は解決できない。従って，これら有効なポリフェノールを選択的に高濃度化することが望まれていた。こここで，理論的には吸着樹脂を使用し，極性の比較的低い物質を吸着し，溶媒を使用し選択的に溶出することが考えられるが，樹脂塔の建設や吸着樹脂が必要であり，コストが高くなる難点がある。従来，フラボノール類やリスベラトロールをワインやブドウ果汁等から安価に，選択的濃縮・回収する方法は知られていなかった。
【０００６】
一方、酵母を栄養補助食品として利用することは古くから行われているが，ポリフェノールを高濃度で含み，特にポリフェノールの中でも，フラボノール類やリスベラトロールを高濃度で含む酵母食品の報告はない。今までに詳述したように，ケルセチンに代表されるフラボノール類やスティルベン化合物であるリスベラトロールには抗癌性や動脈硬化予防効果など種々の優れた作用があるが，フラボノール類とリスベラトロールを高濃度に含む酵母は未だに開発されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ワインやブドウ果汁に存在するケルセチンなどのフラボノール類やスティルベン化合物であるリスベラトロールを，安価に選択的且つ効率良く濃縮・回収すること，および，フラボノール類やリスベラトロールを高濃度に含む酵母を開発することが，本発明の課題である。
【０００８】
【問題点を解決するための手段】
我々は，ワイン酵母の有効利用研究の過程で，ワイン発酵後の酵母菌体に含まれるポリフェノールを分析したところ，意外にも，ポリフェノール中のケルセチンやミリセチン等のフラボノール類，およびリスベラトロールやその配糖体パイシードなどのスティルベン化合物が著量含まれることを見い出した。更に鋭意研究を重ねたところ，酵母はブドウ果汁やワインに添加するだけで，フラボノール類やスティルベン化合物を選択性良く吸着できることを見い出し，本発明に到達した。
【０００９】
即ち，本発明は赤ワイン発酵後の菌体を回収し，当該菌体を得ること，および得られた菌体からエタノールなどの親水性極性溶剤を使用し，酵母に吸着したフラボノール類やスティルベン化合物を抽出し，フラボノール類やスティルベン化合物を高濃度に含む溶液，または更に高濃度化した溶液，または粉末を得ることにより実施できる。また，パン酵母等市販酵母を赤ブドウ果汁やワインに添加・インキュベートすることでも，フラボノール類やスティルベン化合物が選択的に吸着できるので，特に発酵工程を経なくても発明を実施できる。本発明は，フラボノール類やスティルベン化合物を含む果汁あるいはワインと酵母菌体を接触させることで，選択的に菌体に当該物質を吸着することを特徴とする。
【００１０】
以下に，本発明を詳細に説明する。本発明における果汁とは目的のフラボノール類やスティルベン化合物を含有するものであれば，特に果汁の種類は問わない。果汁としては，赤ブドウ果汁，りんご果汁，ブルーベリー果汁，アローニャ果汁，黒すぐり果汁等が使用できるが，好適には，赤ブドウ果汁が用いられる。
【００１１】
使用するワインについても特に種類は問わない。通常ワインはブドウを発酵したものであるが，前述したフラボノール類およびスティルベン化合物を含む果汁を発酵して得られたものであれば，全て本発明に使用できる。好適には，赤ワインが使用される。
【００１２】
果汁および／またはワインと酵母の接触方法は，ワイン醸造の発酵工程を利用することができる。また，市販の乾燥または酵母湿菌体を使用し，果汁および／またはワインに添加し，しばらく接触時間を取ることでも実施できる。市販の酵母菌体としてはパン酵母（オリエンタル酵母社）や醸造用のワイン酵母(EC1118，Lallemand社）など，入手可能な酵母菌体であれば，特に種類は問わない。果汁および／またはワインと酵母の接触条件は，発酵工程を利用する場合は，ワインの発酵条件である，10℃〜30℃，3〜20日間である。果汁および／またはワインに酵母菌体を添加する場合は，酵母と果汁および／またはワインの接触条件は0〜30℃，30分間以上で良いが，通常，5〜20℃，5時間の接触時間が好適である。
【００１３】
本発明のフラボノール類含有酵母は，赤ワイン発酵後の酵母を使用する場合，赤ワイン発酵後の酵母を遠心分離や濾過など，通常ワインの清澄化の為に行われる菌体分離操作により回収される。回収した菌体は，適宜，真空乾燥，凍結乾燥，噴霧乾燥など当該業者であれば通常行う乾燥工程にて乾燥され，乾燥粉末として得られる。市販の酵母を果汁および／またはワインに添加・接触させ，酵母にフラボノール類やリスベラトロールを吸着した場合も，赤ワイン発酵酵母の場合と同様の方法で回収，乾燥できる。
【００１４】
本発明に使用する酵母の果汁および／またはワインに対する添加量は特に限定されないが，果汁および／またはワインに対し，0.1〜10%(w/v)が使用できる。ワイン発酵酵母の場合は，酒母として添加する酵母量は極めて少量であるが，発酵中に酵母が増殖するので，その酵母量は通常約0.5%(w/v)である。
【００１５】
果汁および／またはワインと接触し，フラボノール類やスティルベン化合物を吸着した回収酵母から，目的のフラボノール類やスティルベン化合物は溶媒にて抽出できる。使用する溶媒は酵母菌体からフラボノール類やスティルベン化合物を抽出できるアセトン，メタノール，あるいはエタノールなどの溶媒であれば，特に限定されないが，フラボノール類やスティルベン化合物を含む抽出物を，飲料など人体に対して使用することを考慮すれば，エタノールが好適に使用される。
【００１６】
酵母菌体からのフラボノール類やスティルベン化合物の抽出は，通常行われる方法でよく、特に限定はされない。例えば、エタノール水を酵母菌体に接触させることで行うことが出来る。その各種条件は、フラボノール類やスティルベン化合物が効率よく抽出されるものであれば良いが、エタノール濃度10%以上、酵母との接触時間10分間以上、抽出温度は0〜60℃の範囲が望ましい。特に望ましくは、エタノール濃度が20〜80%(v/v)、酵母との接触時間30分間から20時間、が好適条件である。また、抽出時の温度も操作の容易さからは5〜30℃が選択される。
【００１７】
以下，実施例を示し，本発明を更に具体的に説明するが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実験例１：ワインの発酵工程を利用した実施例
赤ブドウ濃縮マスト（スペイン産）を4倍に希釈し，糖濃度20.2%の果汁100 Lを用意し，これに市販酵母(Uvaferm CM, Danster Ferment AG社製）を1000 ppm添加し，20℃にて発酵した。12日間の発酵で糖を完全に消費し，発酵が終了したので，遠心(7000 rpm, 15分間）し，菌体を分離し湿菌体を得た。湿菌体の収得量は2600 gであった。本湿菌体を凍結乾燥した後，乾燥酵母菌体を0.3 g分取し，60%(v/v)エタノール30 mLを添加，20℃，20時間スターラーにて撹拌し，酵母に吸着したポリフェノール成分を抽出した。得られた抽出液は遠心(3000 rpm，10分間）し，上清を得，0.45μmの膜濾過し，濾液についてフォーリン・チオカルト法にて，総ポリフェノールを没食子換算にて求めた。その結果，赤ワイン乾燥酵母には3.54%(w/w)のポリフェノールが含まれていた。通常の赤ワインには，総ポリフェノールが0.1〜0.35%が含まれるので，赤ワイン酵母の総ポリフェノール量はワインの濃度の10倍以上ということが判明した。
【００１９】
更に、上述の濾液につき，高速液体クロマト(HPLC)にて，スティルベン化合物およびフラボノール類の分析を行った。HPLCの詳細な条件は文献 [M. Sato, Y. Suzuki, T. Okuda, K. Yokotsuka, Biosci. Biotech. Biochem., vol. 61, pp. 1800-1805 (1997)]に示した条件と同一である。分析結果を表1に示す。
【００２０】
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【表１】
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【００２１】
表1より，上記方法で得られた乾燥酵母には、リスベラトロールが122.4 mg/kg，総スティルベン化合物が234.9 mg/kgが含まれていた。この時に得られたワインには総スティルベン化合物が3.1 mg/Lが含まれていたので、ワインのおよそ80倍のスティルベン化合物が含まれていたことになる。特にリスベラトロールについてはワインのおよそ400倍の濃度で含まれていた。一方、フラボノール類に関しては、ケルセチン-3-グルコシド、ケルセチン、ミリセチン、ルチンおよびケンフェロールの総量を総フラボノール濃度とすると、1498.7 mg/kg含まれていた。この時に得られたワインには総フラボノール濃度として25.0 mg/Lが含まれていたことから、総フラボノール濃度もワインのおよそ６０倍であることが判明した。中でも、ケルセチンについてはおよそ２５０倍、ミリセチンについてはおよそ２００倍の濃度であった。
【００２２】
実施例２：果汁やワインに酵母を添加、撹拌した実施例
果汁やワインに市販乾燥酵母を添加し，フラボノール化合物やスティルベン化合物を選択的に吸着・濃縮可能かどうかを検討した。実施例1で使用した濃縮赤ブドウ果汁を4倍希釈したブドウ果汁100 mLに，乾燥酵母(EC1118，Lallemand社製）を1 g添加し，5℃もしくは20℃で，5時間または20時間撹拌した。また，同様に、実施例1で得られた赤ワイン100 mLに，ブドウ果汁と乾燥酵母を1 g添加し，ブドウ果汁撹拌した。各条件で撹拌後，酵母を遠心分離(7000 rpm，15分間）し，蒸留水20 mLで1回洗浄した。酵母は凍結乾燥器にて乾燥した。各条件での乾燥菌体回収量を表2に示す。得られた乾燥酵母菌体を0.3 g分取し，60%(v/v)エタノール30 mLを添加，20℃，20時間スターラーにて撹拌し，酵母に吸着したポリフェノール成分を抽出した。得られた抽出液は遠心(3000 rpm，10分間）し，上清をHPLC分析した。分析したスティルベン化合物およびフラボノール化合物に関し，表３に5℃におけるブドウ果汁への酵母添加によるポリフェノールの吸着結果，表４に20℃におけるブドウ果汁への酵母添加によるポリフェノールの吸着結果，表５に5℃におけるワインへの酵母添加によるポリフェノールの吸着結果，表６に20℃におけるワインへの酵母添加によるポリフェノールの吸着結果を示す。
【００２３】
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【表２】
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【００２４】
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【表３】
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【００２５】
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【表４】
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【００２６】
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【表５】
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【００２７】
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【表６】
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表2より，酵母と果汁あるいはワインとの接触温度が20℃の場合，5℃と比べ，回収菌体量が若干多くなっているが，これは接触中に酵母が僅かに増殖したためと考えられる。この傾向は果汁での20℃，20時間接触の場合に顕著であった。
【００２８】
表３，表４から，元の果汁に含まれるスティルベン化合物中，主要物質であるトランス-リスベラトロールの菌体への回収率（吸着割合）は70〜80%であり，極めて選択的に酵母に吸着，回収されていることが分かる。また，フラボノール化合物中，主要物質であるケルセチンおよびミリセチンの菌体での回収率は90%以上と極めて高く，極めて選択的に効率良く菌体に吸着され，エタノールで溶出されることが判明した。表３，表４から，吸着反応時間は5℃では5時間でも20時間でも殆ど差がなく，接触時間は5時間で既に充分であることが判明した。また，20℃では酵母へのスティルベン化合物およびフラボノール化合物の吸着量は5℃より若干少なく，特に反応時間が長くなると少なくなることが分かった。これは，酵母が発酵してしまうと為と考えられた。即ち，果汁から酵母にスティルベン化合物およびフラボノール化合物を吸着させる場合，5℃付近の低温で反応することが良く，20℃で吸着反応を行う場合は，5時間程度の短時間の方が望ましいことが判明した。
【００２９】
表５，表６から，赤ワインに含まれるスティルベン化合物中，主要物質であるトランス-リスベラトロールの菌体への回収率（吸着割合）は43〜60%であり，選択的に酵母に吸着，回収されていることが分かる。また，フラボノール化合物中，主要物質であるケルセチンはほぼ全て菌体に吸着され，エタノールで溶出されることが判明した。表５，表６から，吸着反応時間は5℃の場合，5時間でも20時間でも殆ど差がなく，接触時間は5時間で既に充分であることが判明した。また，20℃の場合は，20時間の反応より5時間の方が吸着量が若干多い傾向であった。吸着量は20℃より5℃の方が多く，赤ワインに酵母を添加し，スティルベン化合物およびフラボノール化合物を吸着させる場合，5℃付近の低温で反応することが良く，反応時間は5〜20時間でほぼ同様であることが判明した。5℃，5時間ワインと接触した乾燥酵母の総フェノール含量は1.4%であり，20℃，5時間ワインと接触した乾燥酵母の総フェノール含量は1.3%であった。
【００３０】
実施例３
赤ワイン酵母からスティルベン化合物およびフラボノール化合物を抽出する目的で，抽出に用いるエタノール水のエタノール濃度を検討した。実施例1で得られた乾燥赤ワイン酵母を0.3 g宛秤量し，0〜99.5%濃度のエタノール水を添加し，総量を30 mLとし，20℃，20時間スターラーにて撹拌後，遠心分離器にて上清を得，0.45μmの膜濾過後，実施例1と同様のHPLC条件にて，スティルベン化合物およびフラボノール化合物の抽出量を測定した。結果を表７に示す。
【００３１】
表７の抽出量は菌体1%溶液として求めたので，菌体1 kg当りに換算して示した。表７より，抽出エタノール濃度は60%(v/v)が最大の抽出効率を示した。80%エタノール水は高い抽出率を示すが，99.5%のエタノールでは全く抽出されなかった。表７から，菌体からの抽出エタノール水としては，40〜80%エタノール水が好適に使用できることが判明した。
【００３２】
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【表７】
0004244086.tif 000015
実施例４
赤ワイン発酵終了時に得られる遠心分離菌体に直接エタノールを添加し，スティルベン化合物およびフラボノール化合物の抽出液を得るため，実施例１で得られた湿菌体300 mLに95.5%のアルコールを種々の量添加し，実用的な抽出条件を検討した。アルコール添加後，20℃で一夜撹拌し，遠心後，上清をHPLC分析し，得られる抽出液のスティルベン化合物およびフラボノール化合物の濃度を調べた。結果を表８に示す。
【００３３】
0004244086.tif 000016
【表８】
0004244086.tif 000017
【００３４】
表８より，発酵後得られる湿菌体にエタノールを添加し，スティルベン化合物およびフラボノール化合物の抽出液を得るためには，アルコール濃度が41%の時が最も濃厚な抽出液が得られた。このときのスティルベン化合物およびフラボノール化合物の総濃度は，ワインの濃度の7.7倍であった。しかし，総抽出スティルベン化合物およびフラボノール化合物の総量ではエタノール濃度が59.1%であり，実施例3の結果を再現した。以上，赤ワイン発酵後，ワイン製造工程で得られる菌体にエタノールを添加することで，容易にスティルベン化合物およびフラボノール化合物濃度の高い溶液の得られることが示された。更に高濃度の溶液を得るためには，減圧濃縮などの濃縮工程で，高濃度溶液が調製できる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により，抗酸化性が高く，抗癌性，動脈硬化予防効果，血栓症予防効果の高い，スティルベン化合物およびフラボノール化合物がブドウ果汁やワインから容易に選択的に抽出することが可能になり，従来，廃棄物として捨てられていた赤ワイン発酵終了後の菌体からも，スティルベン化合物およびフラボノール化合物が効率良く回収できることが示された。得られる酵母菌体は健康補助食品として使用できるほか，抽出液は種々のアルコール飲料や化粧品など広い応用が期待される。