(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）
【化１】
0004240729.tif 000011
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。また、Ｒ1は水素原子もしくはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体を有効成分とする臨床検査用微粒子分散剤。
【請求項２】
ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物が、Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体２０〜９８ｍｏｌ％と、Ｂ成分の疎水性単量体２〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物である請求項１記載の臨床検査用微粒子分散剤。
【請求項３】
Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体が、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートであり、Ｂ成分の疎水性単量体が下記の式（２）
【化２】
0004240729.tif 000012
｛ただし、式中、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−からなる群より選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3、（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇ、ｈは１〜２４、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5、−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝
で表される疎水性単量体である請求項１または２記載の臨床検査用微粒子分散剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の臨床検査用微粒子分散剤と、生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させてなる検査用微粒子を含有することを特徴とする微粒子含有臨床検査試薬。
【請求項５】
検査用微粒子が、微粒子ラテックスまたは磁性微粒子である請求項４に記載の微粒子含有臨床検査試薬。
【請求項６】
臨床検査用の水中分散微粒子と、前記の請求項１〜３のいずれか１項に記載の臨床検査用微粒子分散剤の分散溶液とを接触させて、微粒子に前記の式（１）で表される単量体に基づく構成成分を含有する重合体と、生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させてなることを特徴とする臨床検査試薬の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の臨床検査用微粒子分散剤と生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させた微粒子と、前記の生体関連物質とを接触させて複合体を形成させ、分離し、さらにその複合体から、前記の生体関連物質を分離して精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査の分野において微粒子を使用する際の分散剤、それを用いた検査試薬、検査方法、試薬の製造方法、生体関連物質の分離精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野では、高感度に抗原量を測定する検査方法としてポリスチレン等のラテックスの凝集反応による検査が行われている。ラテックス表面に抗原（または抗体）を物理的あるいは化学的に担持（感作）させ、検出対象である前記の抗原に対する抗体（または前記の抗体に対する抗原）との免疫反応によりラテックスが凝集する際に変化する濁度、粒径分布等を検出し、被測定物質量を評価する方法である。
【０００３】
このようなラテックス試薬は、年々自動化及び高感度化が進められている。自動化を行うためには、自動分析機内でラテックス試薬が経時的に凝集したり、ラインやセルに吸着することのないように分散安定化させる必要がある。高感度化を行うためには、検体が入る前はラテックスの分散性が高く、検体導入後の免疫反応による凝集は速やかに起こる必要があり、免疫反応を阻害せずに分散安定化させることがやはり必要となる。
【０００４】
また、ラテックス試薬を調製する際には、ラテックスに抗原（または抗体）を結合させた後に遠心沈殿処理を行い、ラテックスを一度凝集させ未担持（未感作）の抗原（または抗体）や不純物を上澄みと一緒に取り除く操作を行う。この精製処理の際に、ラテックスが凝集し完全に再分散することができないことがあり、測定の再現性や感度が低下することになる。
【０００５】
このような場合には、ラテックスを調製する際に使用する界面活性剤や重合可能な親水性単量体を利用することで表面の電荷を制御し再分散性を上げる方法が一般的に行われる。しかしながら、このような表面電荷を制御する方法では、結合させるべき抗原（または抗体）を結合させることが困難となったり、免疫反応による凝集を阻害することがあるため、結合させる抗原（または抗体）の種類に応じて複雑で煩雑な調整が必要となる。
【０００６】
その他に臨床検査の分野では、磁性微粒子を使用する検査方法がある。この方法では通常、表面に抗体を結合させた磁性微粒子を使用して、以下の方法に準じて検査を行う。
（１）抗体（または抗原）を担持させた磁性微粒子（磁性微粒子−抗体、とする）の入った反応容器に抗原（被検出物質となる（または抗体）の入った検体を導入し免疫反応を起こさせる（磁性微粒子−抗体−抗原、とする）。
（２）磁力により前記の磁性微粒子を凝集させ、検体液を分離した後、磁力を落として分散状態とする。
（３）抗原と結合する酵素標識抗体液（酵素標識抗体）を容器に導入し、免疫反応を起こさせ、磁性微粒子−抗体−抗原−酵素標識抗体の複合体を形成させる。
（４）磁力により磁性微粒子を凝集させ、酵素標識抗体液と分離させ未反応の酵素標識抗体を取り除いた後、磁力を落として分散状態とする。
（５）酵素標識抗体の基質液を導入し、酵素反応により生じた物質の量を測定することにより、抗原量を評価する。
【０００７】
このような手順で行われる検査において、凝集させた磁性微粒子の再分散性が劣ると免疫反応の効率に悪影響をおよぼす。通常は、界面活性剤等を使用して磁性微粒子の再分散性を向上させる方法が行われるが、磁性微粒子に結合している抗体を変性させ活性を落としたり、残留した界面活性剤が抗原との免疫反応を阻害することがあるため、結合させる抗体や検体の種類に応じて複雑で煩雑な調整が必要となる。
【０００８】
臨床検査の分野においては、磁性微粒子を使用するのは単に検査をする場合だけではなく、磁性微粒子表面に結合させた抗体と免疫反応する抗原を分離精製する目的にも使用される。この場合には、例えば、磁性微粒子−抗体−抗原の複合体を磁力で凝集させ不純物を液とともに取り除いた後、再分散させｐＨの変化等により抗原を遊離回収させる方法が行われる。この時、磁性微粒子−抗体−抗原の複合体の再分散性が低いと抗原の回収率が低下するし、再分散性を向上させるために界面活性剤を添加すると抗体や抗原の変性が起こる恐れがある。
【０００９】
同様な操作により、細胞、細菌、ＤＮＡ、酵素等についても、それぞれに対して特異的結合部位を担持する磁性微粒子を用いた分離精製が行われている。しかし、このような分離精製の場合には、上記と同様な理由から高い再分散性を有する磁性微粒子が望まれている。
【００１０】
一方、ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体非活性化、生体物質非吸着性等の生体適合性に優れ、また防汚性、保湿性等の優れた性質を有することが知られており、それぞれの機能を生かした生体関連材料の開発を目的とした重合体の合成およびその用途に関する研究開発が活発に行われている。
【００１１】
その中でも特開平７−５１７７号公報、特開平７−８３９２３号公報、特開平１０−１１４８００号公報には、ホスホリルコリン基含有重合体が容器等へのタンパク質の吸着を抑制することができることを利用して、高精度の臨床検査が行える技術が開示されている。
【００１２】
特に特開平１０−１１４８００号公報には、ラテックス状、微粒子状の固相に対してもタンパク質の非特異的吸着を抑制することが開示されている。
しかしながら、このような臨床検査用微粒子に対して免疫反応を阻害せずに臨床検査用微粒子の分散性を向上させる効果があることについては知られていない。
【００１３】
また、特開平１０−１０９０２９号公報には、ホスホリルコリン基含有重合体を利用して水に溶解あるいは分散させるのが困難なものを可溶化できる技術が開示されている。しかしながら、微粒子を利用する臨床検査の分野において、ホスホリルコリン基含有重合体を利用して、免疫反応を阻害せずに臨床検査用微粒子を分散させる効果及び凝集した臨床検査用微粒子を再分散させる効果については知られていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、臨床検査試薬を調整する過程及び検査に使用する過程において凝集させた臨床検査用微粒子に対し、結合させている抗体や抗原等の活性を低下させることなく分散性を向上させ、さらに凝集状態からの再分散性を向上させる分散剤を提供することにある。
また、本発明の第２の目的は、前記の分散剤を用いて担持させた、臨床検査用微粒子を使用する再現性が高く高感度で自動分析機に適した検査試薬を提供することにある。
また、本発明の第３の目的は、前記の分散剤を用いて担持させた、臨床検査用微粒子を使用する検査試薬の製造方法を提供することにある。
また、本発明の第４の目的は、前記の分散剤を用いて担持させた、臨床検査用微粒子を使用する臨床検査方法を提供することにある。
またさらに、本発明の第５の目的は、前記の分散剤を用いて担持させた、臨床検査用微粒子を使用する生体関連物質の回収率を向上させる分離精製方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の問題点に鑑み、鋭意検討した結果、特定のホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合して得られる重合体を、臨床検査用微粒子に処理すると、前記の問題点を解決することの知見を得て、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の〔１〕〜〔７〕のとおりである。
【００１６】
〔１〕  下記の式（１）
【００１７】
【化３】
0004240729.tif 000002
【００１８】
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。また、Ｒ1は水素原子もしくはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数である。｝で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体を有効成分とする臨床検査用微粒子分散剤。
【００１９】
〔２〕  ホスホリルコリン類似基含有単量体を含む単量体組成物が、Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体（Ａ）２０〜９８ｍｏｌ％とＢ成分の疎水性単量体（Ｂ）２〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物である前記〔１〕の臨床検査用微粒子分散剤。
【００２０】
〔３〕  Ａ成分のホスホリルコリン類似基含有単量体が、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートであり、Ｂ成分の疎水性単量体が下記の式（２）
【００２１】
【化４】
0004240729.tif 000003
【００２２】
｛ただし、式中、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−からなる群より選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3、（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇ、ｈは１〜２４、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5、−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝
で表される疎水性単量体である前記〔１〕または〔２〕の臨床検査用微粒子分散剤。
【００２３】
〔４〕  検査用微粒子に、前記の臨床検査用微粒子分散剤と、生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させてなる微粒子を含有することを特徴とする微粒子含有臨床検査試薬。
【００２４】
〔５〕  検査用微粒子が、微粒子ラテックスまたは磁性微粒子である前記〔４〕の微粒子含有臨床検査試薬。
【００２５】
〔６〕  臨床検査用の水中分散微粒子と、前記の臨床検査用微粒子分散剤の分散溶液とを接触させて、微粒子に前記の式（１）で表される単量体に基づく構成成分を含有する重合体、及び生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位を担持させてなることを特徴とする臨床検査試薬の製造方法。
【００２６】
〔７〕  前記の臨床検査用微粒子分散剤と、生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させた微粒子と、前記の生体関連物質とを接触させて複合体を形成させ、分離し、さらにその複合体から、前記の生体関連物質を分離して精製する方法。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の臨床検査用微粒子分散剤は、特定のホスホリルコリン類似基含有単量体（以下、ＰＣ単量体と略す）を含む単量体組成物を重合してなる重合体（以下ＰＣ重合体と略す）を主成分とするものである。ＰＣ単量体を含む単量体組成物は、ＰＣ単量体のみでもよいし、その他に重合可能な他の重合性単量体を含んでいてもよい。
具体的には、さらに、前記のＰＣ重合体は、Ａ成分としてＰＣ単量体２０〜９８ｍｏｌ％とＢ成分として疎水性単量体２〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合してなる重合体を好ましく挙げることができる。より好ましくは、Ａ成分としてＰＣ単量体４０〜８０ｍｏｌ％とＢ成分として疎水性単量体２０〜６０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物である。
【００２８】
Ｂ成分の疎水性単量体が２ｍｏｌ％未満では十分に微粒子の表面の疎水性成分に対する親和性を持たせることができず、８０ｍｏｌ％より多いとホスホリルコリン類似基（ＰＣ基と略す）の効果を発揮させるのが困難であるので好ましくない。
【００２９】
またさらに、前記のＰＣ重合体は、Ａ成分としてＰＣ単量体２０〜８８ｍｏｌ％と、Ｂ成分として疎水性単量体２〜４０ｍｏｌ％およびＣ成分として親水性単量体１０〜７０ｍｏｌ％の単量体組成物を重合してなる重合体を好ましく挙げることができる。より好ましくは、Ａ成分としてＰＣ単量体４０〜７０ｍｏｌ％と、Ｂ成分として疎水性単量体５〜３０ｍｏｌ％およびＣ成分として親水性単量体２０〜５０ｍｏｌ％の単量体組成物である。
【００３０】
Ａ成分のＰＣ単量体が２０ｍｏｌ％未満では、ＰＣ基の効果を発揮させるのが困難であるので好ましくなく、Ｂ成分の疎水性単量体が２ｍｏｌ％未満、Ｃ成分の親水性単量体１０ｍｏｌ％未満では、微粒子表面の親水性成分に対する親和性を持たせることができず好ましくない。
Ａ成分のＰＣ単量体が８８ｍｏｌ％より多くなると、微粒子への親和性が小さくなるので好ましくなく、Ｂ成分の疎水性単量体が４０ｍｏｌ％より多いと親水性の付与が少なくなり、Ｃ成分の親水性単量体７０ｍｏｌ％より多いと非特異吸着が増加するので好ましくない。
【００３１】
ここで、前記のＰＣ単量体は、下記の式（１）
【００３２】
【化５】
0004240729.tif 000004
【００３３】
｛ただし、式中、Ｘは２価の有機残基を示し、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基を示し、Ｚは水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。また、Ｒ1は水素原子もしくはメチル基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｍは０または１を示す。ｎは１〜４の整数。｝
で表される。
【００３４】
式（１）中のＸの２価の有機残基としては、例えば、
−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−等が挙げられる。
【００３５】
式（１）中のＹは、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基であり、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等の基が挙げられる。
【００３６】
式（１）中のＺは、水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−基を示す。
ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す。
ここで、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。
【００３７】
また、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、２−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、２−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、２−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシデシル基等が挙げられる。
【００３８】
ＰＣ単量体としては、具体的には例えば、
２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリシクロヘキシルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリフェニルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００３９】
２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメタノールアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００４０】
２−（ビニルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンゾイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（スチリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００４１】
２−（アクリロイルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
【００４２】
エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート等を挙げることができる。
【００４３】
この中でも２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートが好ましく、さらに２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（＝２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリンともいう、以下、ＭＰＣと略す）が入手性等の点でより好ましい。
【００４４】
ＰＣ単量体を重合する際には、前記のＰＣ単量体の１種を単独で、もしくは２種以上を混合物として用いることができる。
【００４５】
ＰＣ単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示された公知の方法等に準じて製造することができる。
【００４６】
ＰＣ単量体と共重合するＢ成分の疎水性単量体は、式（２）
【００４７】
【化６】
0004240729.tif 000005
【００４８】
｛ただし、式中、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−からなる群より選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3、−（（ＣＨ2）ｐ−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇ、ｈは１〜２４、ｐは３〜５の整数を示し、ここで、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5、−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。｝
で表される。
【００４９】
Ｂ成分の疎水性単量体としては、具体的には例えば、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の直鎖または分岐アルキル（メタ）アクリレート；シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の環状アルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙られる。これらの１種または２種以上が用いられる。
【００５０】
Ｃ成分の親水性単量体は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、ホスホン酸基、スルホン酸基、アミド基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ塩基、トリアルキルホスホニウム塩基およびポリオキシエチレン基からなる群より選ばれる親水性基を有する単量体である。
さらに、具体的には例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基含有（メタ）アクリレート；アクリル酸、メタクリル酸（ＭＡｃ）等のカルボン酸；スチレンスルホン酸、（メタ）アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体；（メタ）アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の含窒素単量体；ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの１種または２種以上が用いられる。
【００５１】
ＰＣ重合体は、前記Ａ成分のＰＣ単量体とＢ成分の疎水性単量体との単量体組成物、あるいは、前記Ａ成分のＰＣ単量体とＢ成分の疎水性単量体およびＣ成分の親水性単量体との単量体組成物を重合したものであればよく、通常のラジカル共重合により製造することができる。
【００５２】
本発明のＰＣ重合体の分子量は、重量平均で、５，０００〜５，０００，０００の範囲がよく、さらに望ましくは１００，０００〜２，０００，０００の範囲である。
重合体の重量分子量が５，０００未満では十分に微粒子再分散性を発揮させるのが困難であり、重合体の重量分子量が５，０００，０００より大きいとＰＣ重合体の水性溶液の粘性が高くなりすぎ微粒子の免疫反応を阻害するおそれがあるため好ましくない。
【００５３】
本発明における臨床検査用微粒子とは、おおよそ１０ｎｍ〜１００μｍの直径の水分散性の微粒子を指し、ラテックス、リポソーム、磁性微粒子、磁性細菌、赤血球等の臨床検査に使用することのできる微粒子であればいずれでもよい。
【００５４】
本発明の微粒子再分散剤が適用できるラテックスを使用した臨床検査方法としては、いずれの方法でもよいが、ラテックス凝集反応による濁度、光散乱、粒度分布等の変化を検出する方法等が挙げられる。
【００５５】
ラテックスとしては、乳化重合で製造されたポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の微粒子が一般的であるが、どのような素材、方法で製造されたものでもよい。
【００５６】
本発明の微粒子再分散剤が適用できる磁性微粒子としては、前記従来技術で説明したような検査方法や分離精製方法で使用される磁性微粒子が一般的であるが、試薬調製、検査、分離精製の過程で一旦磁力で凝集させた後再分散させる磁性微粒子には、いずれの場合にも好適に使用できる。
【００５７】
磁性微粒子の構造としては、フェライト磁石、サマリウム−コバルト磁石、希土磁石、鉄、マンガン、コバルト、四三酸化鉄、三二酸化鉄、フェライト型ステンレス、マルテンサイト型ステンレス、アモルファス合金、シリコン鉄難磁性結晶、ニッケル、クロム等のように磁性を有する金属あるいは金属化合物の微粒子であり、必要に応じてポリマーや親油化剤で被覆したりあるいは含有させているものでもよい。
【００５８】
前記の検査用微粒子のなかでも、微粒子ラテックスまたは磁性微粒子がより好ましく挙げられる。
【００５９】
本発明の微粒子再分散剤が適用できる微粒子に結合させ得る生体関連物質と生化学的な特異的な結合部位を有する化合物としては、前記の特異的な結合部位を有していれば、いずれのものでもよいが、例えば、抗原、抗体等の免疫反応活性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸関連物質、酵素、蛍光物質、放射性物質、発光物質等の標識関連物質等が挙げられる。
【００６０】
抗原、抗体等の免疫反応活性物質としては、例えば、免疫グロブリン、血漿タンパク質、ホルモン関連物質、腫瘍関連物質、ウイルス関連物質、薬剤に対する抗体、酵素に対する抗体等が挙げられ、またこれらの物質に対する抗体も挙げられる。
【００６１】
血漿タンパク質としては、例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポタンパク質関連物質、リューマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン等が挙げられる。
【００６２】
ホルモン関連物質としては例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、チロキシン結合タンパク質（ＴＢＧ）等が挙げられる。
【００６３】
腫瘍関連物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β２−マイクログロブリン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）等が挙げられる。
【００６４】
ウイルス関連物質としては、例えば、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、抗エイズ抗体等が挙げられる。
【００６５】
薬剤に対する抗体としては、例えば、フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の抗体が挙げられる。
【００６６】
酵素としては具体的には、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、ペルオキシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシターゼ、リゾチーム等が挙げられる。
【００６７】
蛍光物質としては、例えば、フルオロセインイソチオシアネート、４−クロロ−７−ニトロベンゼンゾフラザン、４−フルオロ−７−ニトロベンゼンゾフラザン、スルホローダミン１０１酸クロライド等が挙げられる。
【００６８】
発光物質としては、例えば、１０−メチル−９−［４−｛２−（スクシンイミジルオキシカルボニル）エチル｝フェニルオキシカルボニル］アクリジニウムフルオロサルフェート等が挙げられる。
【００６９】
前記の生体関連物質のなかでも、免疫グロブリン、血漿タンパク質等がより好ましく挙げられる。
【００７０】
本発明のＰＣ重合体により臨床検査用微粒子の分散安定性を向上させる方法としては、微粒子を含有する臨床検査試薬にＰＣ重合体を０．００１〜１重量％となるように添加する方法である。
【００７１】
また、特に測定容器あるいはラインに対して吸着して凝集するような安定性の低い微粒子含有臨床検査試薬を使用する場合には、微粒子を含有する臨床検査試薬が測定容器あるいはラインに接触させる前に、前記の測定容器あるいはラインに対して、ＰＣ重合体を０．００１〜１重量％含む液を加えて、接触させる方法も有効である。
【００７２】
ＰＣ重合体が、０．００１重量％より低い濃度では微粒子分散安定化効果を十分に発揮させることができず、１重量％より高い濃度であるとＰＣ重合体が粒子表面で必要以上に残留し免疫反応を阻害する恐れがあるため好ましくない。
【００７３】
本発明のＰＣ重合体により臨床検査用微粒子の再分散性を向上させる方法としては、微粒子を凝集させる前の微粒子分散液にＰＣ重合体を０．００１〜１重量％となるように添加する方法である。
【００７４】
本発明のＰＣ重合体により臨床検査用微粒子の再分散性を向上させる別の方法としては、凝集させた微粒子を再分散させる直前にＰＣ重合体を０．００１〜１重量％となるように添加する方法である。
【００７５】
ＰＣ重合体が、０．００１重量％より低い濃度では微粒子再分散性を十分に発揮させることができず、ＰＣ重合体が１重量％より高い濃度であるとＰＣ重合体が粒子表面で必要以上に残留し免疫反応を阻害する恐れがあるため好ましくない。
【００７６】
微粒子を再分散させる前の凝集させる方法としては、いずれの方法でもよいが、ポリスチレンラテックスのように媒体と比重のわずかに異なる微粒子の場合には遠心沈殿法が適当であり、磁性微粒子の場合には磁力により凝集させる方法が適当である。
【００７７】
本発明の微粒子含有臨床検査試薬は、前記の臨床検査用微粒子分散剤と検査用微粒子とを接触させて、前記の微粒子に担持させてなる微粒子を含有することを特徴とする微粒子含有臨床検査試薬である。特に臨床検査用微粒子には、例えば、前記に記載の抗原、抗体等の免疫反応活性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸関連物質、酵素、蛍光物質、放射性物質、発光物質等の標識関連物質等あるいはこれらの関連物質の生物学的特異的な結合部位を担持したものが好ましく挙げられる。
より好ましくは、抗原−抗体反応を用いる抗原（または抗体）を担持させたものが挙げられる。
【００７８】
本発明の臨床検査試薬の製造方法は、前記のように臨床検査用の水中分散微粒子と、前記に記載の臨床検査用微粒子分散剤水溶液とを接触させて、微粒子に前記の式（１）で表される単量体に基づく構成成分を含有する重合体を担持させた微粒子を作成する、容易な臨床検査試薬の製造方法である。
【００７９】
また、本発明の生体関連物質を分離精製する方法は、前記の臨床検査用微粒子分散剤と、生体関連物質に生化学的に特異的に結合する部位とを担持させた微粒子を用いる方法で、前記の微粒子と、さらに前記の生体関連物質とを接触させて複合体を形成させ、分離し、さらにその複合体から、前記の生体関連物質を分離して精製する方法である。
微粒子が磁性微粒子の場合にも、生体関連物質としては、前記のものが使用でき、前記と同様な操作により、細胞、細菌、ＤＮＡ、酵素等についても、それぞれに対して特異的結合部位を有する物質を磁性微粒子に担体させて、同様に複合体の形成させ、それを分離し、さらにその複合体から前記の生体関連物質を分離して精製する方法である。
このような分離精製の場合には、前記と同様な理由から高い再分散性を有する磁性微粒子がより好ましく挙げられる。
【００８０】
本発明の臨床検査用微粒子分散剤には、本発明の効果を損なわない範囲において、界面活性剤、溶剤、防腐剤等の他の成分を添加してもよい。
【００８１】
【発明の効果】
第１の発明の臨床検査用微粒子分散剤は、臨床検査試薬を調整する過程及び検査に使用する過程において凝集させた検査用微粒子に対し、結合させている抗体や抗原等の活性を落とすことなく分散性を向上させ、さらに凝集状態からの再分散性を向上させる分散剤である。
また、第２の発明の検査試薬は、前記の分散剤を用いて、担持させた臨床検査用微粒子を使用する再現性が高く高感度で自動分析機に適した検査試薬である。
また、第３の発明の検査試薬の製造方法は、前記の分散剤を、微粒子に担持させた臨床検査用微粒子を使用する簡単な検査試薬の製造方法である。
また、第４の発明の臨床検査方法は、前記の分散剤を用いて、担持させた臨床検査用微粒子を使用する臨床検査方法で容易に実施することができる。
またさらに、第５の発明の生体関連物質の分離精製方法は、前記の分散剤を用いて、生体関連物質｛例えば抗体（または抗原）｝を担持させた臨床検査用微粒子を使用するので容易に回収率よく生体関連物質の分離精製することができる方法である。
【００８２】
【実施例】
以下、実施例に基づいてさらに詳しく説明する。
次に用いたポリマーの重量平均分子量の分析方法を示す。
＜重量平均分子量の測定＞
リン酸バッファー（ｐＨ７．４、２０ｍＭ）を溶離液としたゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ポリエチレングリコール標準、ＵＶ（２１０ｎｍ）及び屈折率を用いて検出した。
【００８３】
合成例１；ポリマー１（Ｐ−１）の合成
ＭＰＣ；３５．７ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）；４．３ｇ（単量体組成モル比、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０）をエタノール；１６０ｇに溶解し４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル；０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３リットルのジエチルエーテル中にかき混ぜながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って、粉末２９．６ｇを得た。得られた共重合体は、ＧＰＣにより評価した重量平均分子量で１５３，０００であった。これをポリマー１（Ｐ−１）とする。
【００８４】
合成例２；ポリマー２（Ｐ−２）の合成
前記の合成例１のポリマー１に準じて単量体の種類、組成比（モル組成比ＭＰＣ０．５−ＢＭＡ０．２−ＭＡｃ０．３）、溶媒種を変え、合成例１と同様の操作により、重合体ポリマー２（Ｐ−２）を得た。得られた共重合体のポリマーは、前記と同様にして測定した結果、重量平均分子量で３５４，０００であった。
【００８５】
【表１】
0004240729.tif 000006
【００８６】
注；表中に用いた略号は次のとおりである。
ＭＰＣ；２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
ＢＭＡ；ｎ−ブチルメタクリレート、
ＭＡｃ；メタクリル酸
【００８７】
実施例１
平均粒径１９７ｎｍのポリスチレン製ラテックス溶液｛ジェイエスアール（株）社製｝１．０ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）に純水４ｍＬを加え軽くかき混ぜた後、ポリマー１を０．０１ｇ加え（ポリマー１濃度０．２％）かき混ぜて溶解させた。その後、６００００回転１時間で遠心分離し、上澄み液を捨て、ポリマー１を０．０１ｇ溶解させた純水５ｍＬを加え超音波照射を行い再分散させた。この遠心分離操作をさらに４回繰り返して最終的にラテックス分散液５ｍＬを得た。
ＣＯＵＬＴＥＲ社製のサブミクロン粒度分布計Ｎ４ＳＤ型を使用して、初期及び５回の遠心分離後のラテックスの粒径（Ｄ）、標準偏差（ＳＤ）およびＣＶ値｛（ＳＤ／Ｄ）×１００％｝を求めた。結果を表２に示す。
【００８８】
比較例１
平均粒径１９７ｎｍのポリスチレン製ラテックス溶液｛ジェイエスアール（株）社製｝１．０ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）に純水４ｍＬを加え軽くかき混ぜた。その後、６００００回転１時間で遠心分離し、上澄み液を捨て、純水５ｍＬを加え超音波照射を行い再分散させた。この遠心分離操作をさらに４回繰り返して最終的にラテックス分散液５ｍＬを得た。そのラテックスを用いて、実施例１と同様にして数値を求めた。結果を表２に示す。
【００８９】
【表２】
0004240729.tif 000007
【００９０】
実施例２
平均粒径１９７ｎｍのポリスチレン製ラテックス溶液｛ジェイエスアール（株）社製｝１．０ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）に２０ｍｇ／ｍＬのヤギ抗（マウスＩｇＧ）抗体溶液１．０ｍＬ（リン酸緩衝液）を添加して、室温にて２時間かき混ぜた。かき混ぜた後、２０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（リン酸緩衝液）を添加して、室温で２時間かき混ぜた。
かき混ぜ終了後、ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液１．０ｍＬ加え軽く更にかき混ぜた。その後、４００００回転、１時間の遠心分離を行った。遠心分離終了後、上清を除去した。その後、ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液３ｍＬ加え１分間の超音波照射で再分散させた。遠心分離による洗浄操作を４回繰り返して、最終的にポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液を添加して、２ｍｇ／ｍＬのラテックス懸濁液を調製した。測定は自動分析機器７０７０｛（株）日立製作所社製｝で行った。
＜試薬と条件＞
第１試薬（Ｒ１）；ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液２００μＬ、
第３試薬（Ｒ３）；先に調製した２ｍｇ／ｍｌのラテックス懸濁液５０μＬ、
検体；マウス血清（３種類の検体で同一検体を５回測定）３μＬ。
＜条件＞
測定形式；２ポイントエンドの１０分間反応、
キャリブレーション；スプライン、
測定ポイント；１８−３１、
測定波長は、７００−３４０ｎｍである。
結果を表３に示す。
【００９１】
実施例３
実施例２で用いたポリマー１の代わりにポリマー２を用いた以外は実施例２と同様に行った。結果を表３に示す。
【００９２】
比較例２
実施例２のポリマー１の代わりにウシ血清アルブミンを用いた以外は実施例２と同様に行った。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
0004240729.tif 000008
【００９４】
実施例４
下記の（１−１）〜（１−５）の操作手順で、ポリマー１を微粒子再分散剤として使用し抗体を結合させた磁性Ｆｅ微粒子分散液を作成し、抗原の測定を行った。
（１−１）粒径２．５μｍのＦｅ微粒子（ポリサイエンス社製、球状強磁性鉄粉）５．０ｍｇにγ−アミノプロピルトリエトキシシラン１．０ｍＬを加え、１分間の超音波照射で再分散させた後、室温で１０分間インキュベートさせた。
（１−２）磁石で容器の底にＦｅ微粒子を凝集させながら溶媒を除去し、磁力を解除した後、ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液１．０ｍＬを加え軽くかき混ぜて洗浄した。
（１−３）（１−２）の洗浄操作を２回繰り返した後、２．５％グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液５ｍＬを加え１分間の超音波照射で再分散させ、室温で１時間インキュベートを行った。
（１−４）（１−２）の操作を３回繰り返し余分なグルタルアルデヒドを取り除いた後、抗（マウスＩｇＧ）抗体の１．０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液１．０ｍＬを加え、室温で１時間インキュベートした。
（１−５）（１−２）の操作を３回繰り返した後、ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液１．０ｍＬを添加し、抗体固定化磁性Ｆｅ微粒子１ｍＬ（磁性微粒子濃度；５ｍｇ／ｍＬ）を得た。
上の操作により得られた抗体固定化磁性Ｆｅ微粒子を使用して下記の（２−１）〜（２−５）の手順で抗原の測定を行った。
（２−１）抗体固定化磁性Ｆｅ微粒子分散液１００μＬづつを３本のガラス試験管（直径：１２ｍｍ、長さ：７５ｍｍ）に入れ、磁石で試験管の底に磁性Ｆｅ微粒子を凝集させ分散媒を取り除いた。
（２−２）各容器に０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬの３種類の濃度のマウスＩｇＧ溶液をそれぞれ５００μＬづつ加えて、１分間超音波をかけた後、室温で１時間インキュベートを行って抗原−抗体反応をさせた。
（２−３）磁石で容器の底に前記のＦｅ微粒子を凝集させながら溶媒を除去し、磁力を解除してポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液１．０ｍＬを加え軽くかき混ぜて洗浄した。
（２−４）（２−３）の洗浄操作を２回行った後、磁石で前記のＦｅ微粒子を凝集させ分散媒を除去し、９−〔（６，６−ジメチル−３−イソプロピル−２，４，５−トリオキサシクロヘキシノ）カルボニル〕アントラセン標識抗（マウスＩｇＧ）抗体（以下、トリオキサン標識抗体と略す）溶液溶液（濃度；３３０ｎｇ／ｍＬ）を５００μＬ加えて室温で１時間インキュベートを行った。
（なお、９−〔（６，６−ジメチル−３−イソプロピル−２，４，５−トリオキサシクロヘキシノ）カルボニル〕アントラセンは特開平６−２２８１２９号記載の方法により合成し、Ｎ−ヒドロシキスクシンイミド及び、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてアントラセン標識抗体を調製した。）
（２−５）（２−３）の洗浄操作を２回行った後、磁石で前記のＦｅ微粒子を凝集させ分散媒を除去し、ジメチルホルムアミド２００μＬ加え、１０Ｎ水酸化ナトリウム液２００μＬをトリガーとして加え化学発光させた。発光量はＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ  ＲＥＡＤＥＲ  ＢＬＲ−２０１（アロカ社製）を用いて、１分間までの積算発光カウントを測定した。測定結果を表４に示す。
【００９５】
実施例５
実施例４のポリマー１を溶解させたリン酸緩衝液の代わりに、ポリマー２を溶解させたリン酸緩衝液を用いた以外は実施例４と同様に行い、１分間までの積算発光カウントを測定した。測定結果を表４に示す。
【００９６】
比較例３
実施例４のポリマー１を溶解させたリン酸緩衝液の代わりに、ウシ血清アルブミンを添加したリン酸緩衝液を用いた以外は実施例４と同様に行い、１分間までの積算発光カウントを測定した。測定結果を表４に示す。
【００９７】
【表４】
0004240729.tif 000009
【００９８】
実施例６
実施例４の（１−１）〜（１−５）の操作手順で作成した抗体を担持させた磁性Ｆｅ微粒子を、１００μＬづつ３本の試験管（直径；１２ｍｍ、長さ；７５ｍｍ）に入れ、磁石で試験管の底に前記の磁性Ｆｅ微粒子を凝集させ分散媒を取り除いた。これにマウス血清５００μＬづつを加えて、１分間超音波をかけた後、室温で１時間インキュベートを行って、抗原−抗体反応をさせた。次いで、磁石で容器の底に前記のＦｅ微粒子を凝集させながら溶媒を除去し、磁力を解除して、ポリマー１を０．１％溶解させたリン酸緩衝液１．０ｍｌを加えて軽くかき混ぜて洗浄した。この洗浄操作を２回行った後に、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００μＬを加えて１分間超音波をかけた後、室温で１時間インキュベートを行って結合した抗原（マウスＩｇＧ）を遊離させた。次いで、磁石で試験管の底に前記の磁性Ｆｅ微粒子を凝集させた後に、上清を４００μＬ回収した。この上清に含まれるマウスＩｇＧ濃度を以下の方法で測定した。
＜マウスＩｇＧの測定＞
１０μＬ／ｍｇのヤギ抗（マウスＩｇＧ）抗体｛和光純薬工業（株）社製｝溶液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）をポリスチレン製９６穴タイタープレート（イムノプレート、Ｆ９６、マキシソープ、Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬ／ウエルで加え、４℃、一晩インキュベートして物理的に吸着させた後に、生理的リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）で４回洗浄を行った。次いで、５％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を添加したＰＢＳを３００μＬ／ウエルで加え、４℃、一晩インキュベートした後に、ＢＳＡ溶液を除去し、抗体吸着固相を調製した。
次いで、先の上清をＰＢＳで１００倍希釈したものを１００μＬ／ウエルで加え、２５℃、２時間インキュベートし、続いてＰＢＳで４回洗浄した。次いでパーオキシダーゼ標識−抗（マウス抗体）抗体｛和光純薬工業（株）社製｝溶液をＰＢＳで１００００倍希釈して、１００μＬ／ウエルで加え、２５℃、２時間インキュベートし、続いてＰＢＳで４回洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ発色キットＴ｛住友ベークライト（株）社製｝で各ウエルを室温で、１０分間発色させた後に、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（マイクロプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）を用いて、各ウエルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。既知量のＩｇＧを含む溶液を用いて検量線を作成し、それを用いて先の上清中のマウスＩｇＧ濃度を求めた。１検体について８回測定した。結果を表５に示す。
【００９９】
実施例７
実施例６で用いたポリマー１の代わりにポリマー２を用いた以外は、実施例６と同様にして行い、マウスＩｇＧ濃度を求めた。結果を表５に示す。
【０１００】
比較例４
実施例６で用いたポリマー１の代わりにウシ血清アルブミンを用いた以外は、実施例６と同様にして行い、マウスＩｇＧ濃度を求めた。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
0004240729.tif 000010
【０１０２】
なおここでは、回収率（％）は、比較例４を基準として実施例６および７で検出したマウスＩｇＧ量を％で表示した。
【０１０３】
以上の結果より、比較例１〜３に対して、実施例１〜５の場合には、高い精度の結果が得られ、検査方法として優れていることがわかる。また、比較例４に比べて実施例６および７が回収率が高く、優れていることがわかる。