(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス リケニホルミス由来のα-アミラーゼに対応する前駆体アミノ酸配列からアミノ酸残基の置換によって修飾されたアミノ酸配列を含んでなる改良されたα-アミラーゼであって、該置換が
M15T／A33S／H133Y／N188S／A209V；
M15T／D28N／A33S／H133Y／N188S／A209V；
M15T／A52S／H133Y／N188S／A209V／L230F；
M15T／S85D／H133Y／N188S／A209V；
M15T／N96Q／H133Y／N188S／A209V／I479T；
M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V；
M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／A379S；
M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／G433D；
M15T／H133Y／N188S／A209V／A379S；又は
M15T／H133Y／N188S／A209V／A210S／T322A／A379S
を含み、
該改良されたα-アミラーゼが前駆体アミノ酸配列に対応するタンパク質と比較して安定性が変化している、改良されたα-アミラーゼ。
【請求項２】
置換：M15T／H133Y／S148N／N188S／A209Vを含む、請求の範囲第１項に記載の改良されたα-アミラーゼ。
【請求項３】
置換：M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／A379Sを含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の改良されたα-アミラーゼ。
【請求項４】
置換：M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／G433Dを含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載の改良されたα-アミラーゼ。
【請求項５】
（a）デンプン水溶液を調製する工程；及び
（b）前記デンプン水溶液を、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のα-アミラーゼと接触させる工程
を包含するデンプンの液化方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、改良されたタンパク質、特に、低安定性の相同体又は近縁タンパク質から残基を補充することによって、安定特性が変化した酵素に関する。詳細には、本発明は、B.リケニホルミス（B.licheniformis）中の残基とは異なる、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）及び／又はB.アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）中の対応する残基から少なくとも１つが補充された、B.リケニホルミスから誘導された新規な変異体α-アミラーゼに関する。得られたα-アミラーゼは、逆境下において改良された安定性を示す。
発明の背景
タンパク質の安定性を改良する方法は、実際にタンパク質の有用性を高める目的で広範に使用されてきた。このような技術は、しばしばタンパク質工学及び部位特異的な変異誘発性を利用して、アミノ酸の特性及び／又はタンパク質の構造に基づき、特に関連性を現し、或いは実験的証拠によって関連性が示される特定のアミノ酸残基を単離及び選択することを含む。例えば、Estellらの米国特許第4,760,025号は、酸化に対して不安定な酵素を修飾して、特に酸化に対して敏感な残基、すなわち、メチオニン、リジン、トリプトファン及びシステイン等の残基を変えることで安定性を高めることを提案している。Kothsらの米国特許第4,752,585号は、治療的タンパク質の酸化安定性を、クロラミンＴ酸化に対して敏感な各メチオニル残基について保存的アミノ酸置換を施すことで改良することについて提案している。Barrらの米国特許第4,732,973号は、酸化安定性アミノ酸を有するヒトα1-アンチトリプシンから活性部位メチオニンを置換することを提案している。
さらに提案された技術は、進化的に近接する酵素に対するタンパク質の相同性モデリングを含み、タンパク質工学の基礎となっている。SiezenらのProtein Engineering,Vol.4,no.7,pp.719-737（1991）は、より安定な酵素の特徴を標的に取り込み或いは複製することで、工業的プロセスで用いられるプロテアーゼの特性を改良する方法について開示している。
それにもかかわらず、相同性モデリングを基礎とするタンパク質工学で高い成功とみなされるためには、かなり高程度の相同性（70％以上）が要求される。さらに、相同性が30％以下となる場合、そのようなモデリングは成功とはならないと報告された（例えば、Machiusら，J.Mol.Biol.,vol.246,p.547（1995）参照）。
産業的に特に興味があり、また本発明を例証するためにここで用いたα-アミラーゼ（α-1,4-グルカン-4-グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1）は、安定性及び／又は活性が高められることが要望されている。α-アミラーゼは、デンプン中の内部α-1,4-グルコシド結合を、ほとんどランダムに加水分解し、低分子量のマルト-デキストリンを生成する。α-アミラーゼが、かなり商業的価値があり、デンプン加工の初期段階（液化）；アルコール製造；洗剤基質中の洗浄剤として；及びデンプン糊抜きのために織物産業で使用される。α-アミラーゼは、バシラス及びアスペルギルスを含む広範の細菌、真菌及び植物源から製造され、最も商業的なアミラーゼは、バシラス リケニホルミス、バシラス アミロリクエファシエンス、バシラス サブチリス、又はバシラス ステアロサーモフィラスのような細菌源から製造され、デンプン加工産業で用いられている。最近、市販されている好ましい酵素は、少なくとも中性及び弱アルカリのpHにおいて熱安定性及び性能がよいため、バシラス リケニホルミス由来の酵素である。バシラス アミロリクエファシエンス、バシラス サブチリス及びバシラス ステアロサーモフィラスのような近縁種から誘導されるアミラーゼは、多くの条件下でかなり安定性が低いと考えられている。
PCT公開番号WO 95/10603において、洗濯又は食器洗い性能を改良し、バシラス リケニホルミスα-アミラーゼ中のM197位における単一の変異とは別の変異を包含する変異体α-アミラーゼが提案されている。PCT公開番号WO 94/02597には、１以上のメチオニンがシステイン又はメチオニンを除くいずれかのアミノ酸によって置換され、酸化安定性が改良された変異体α-アミラーゼについて記載されている。PCT公開番号WO 94/18314には、１以上のメチオニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン又はチロシン残基が、非酸化性のアミノ酸によって置換された酸化安定性が改良された変異体α-アミラーゼについて記載されている。PCT公開番号WO 91/00353は、野生型バシラス リケニホルミスα-アミラーゼによるデンプンの液化に関する性能特性及び問題を、遺伝子工学によってアプローチし、特異的置換Ala-111-Thr、His-133-Tyr及び／又はThr-149-Ileを包含している。
組換え型DNAを用いて、残基がアミラーゼの触媒活性に重要であるかを調査し、及び／又は種々のアミラーゼ及び／又はグリコシラーゼの活性部位内で特定のアミノ酸を修飾することの効果を調査する研究は、多くの研究者らによって行われてきた（Vihinenら、J.Biochem.,vol.107,pp.267-272（1990）;Holmら，Protein Engineering,vol.3,pp.181-191（1990）;Takaseら，Biochemica et Biophysica Acta,vol.1120,pp.281-288（1992）;Matsuiら，Febs Letters,vol.310,pp.216-218（1992）;Matsuiら，Biochemistry,vol.33,pp.451-458（1992）;Sogaardら、J.Biol.Chem.,vol.268,pp.22480-22484（1993）;Sogaardら、Carbohydrate Polymers,vol.21,pp.137-146（1993）;Svenssonら、Plant Mol.Biol.,vol.25,pp.141-157（1994）;Svenssonら、J.Biotech.,vol.29,pp.1-37（1993））。また、研究者らは、残基が熱安定性に重要であることをも調査し（Suzukiら、J.Biol.Chem.,vol.264,pp.18933-18938（1989）;Watanabeら，Eur.J.Biochem.,vol.266,pp.277-283（1994））、あるグループは、このような方法を使用して、バシラス リケニホルミス アミラーゼ内に種々のヒスチジン残基における変異を導入し、他の同様のバシラス アミラーゼと比較すると、かなり熱的に安定なことで知られるバシラス リケニホルミス アミラーゼが過剰のヒスチジンを有しているので、ヒスチジンを置換すると酵素の安定性に効果的であると示唆した。この研究の結果、+133位におけるヒスチジン残基及び+209位におけるアラニン残基での安定化変異が同定された（Declerckら、J.Biol.Chem.,vol.265,pp.15481-15488（1990）;FR 2 665 178-A1;Joyetら、Bio/Technology,vol.10,pp.1579-1583（1992））。
このように、タンパク質工学の分野では、より安定な酵素を得るための多大な努力が為されている。そして、より安定な酵素から安定性の低い酵素への補充、ランダムな突然変異と配列のアラインメント及び相同性モデリングを含むこのような技術は、多くの成功を収めてきた。しかし、本分野では、改良された酵素の製造に有用な、さらなる技術が要望されている。
発明の概要
本発明の目的は、安定性が増したタンパク質を提供することである。
さらに、本発明の目的は、例えば、pHの安定性、アルカリ安定性、酸化安定性及び／又は熱安定性のような安定特性が変化したα-アミラーゼのようなタンパク質を提供することである。
本発明により、低安定性であるが相同性のタンパク質中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基の置換又は欠失によって、前駆体アミノ酸配列から変化したアミノ酸配列を包含する改良されたタンパク質が提供される。改良されたタンパク質は、その前駆体アミノ酸配列に対応するタンパク質と比較して安定特性が改良されていることが好ましい。また、置換又は欠失が、埋め込まれた残基では起こらないが、代わりに分子の表面の残基において起こることが好ましい。
また、好ましくは、タンパク質は酵素であり、最も好ましくは、α-アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼである。本発明の特に好ましい組成物の実施態様では、酵素はバシラス リケニホルミスから誘導されたα-アミラーゼで、低安定性であるが相同性のタンパク質は、バシラス アミロリクエファシエンス又はバシラス ステアロサーモフィラスから誘導されたアミラーゼのどちらか或いは両方を包含する。
本発明の特に好ましい実施態様においては、前駆体タンパク質はバシラス ステアロサーモフィラスから誘導されたα-アミラーゼであり、その改良されたタンパク質中の置換残基は、バシラス ステアロサーモフィラス及びバシラス アミロリクエファシエンスの両方にあるものとは異なり、１以上のA33、A52、N96、H133、S148、A209、A269、A379及びA435を含有し、好ましくは、バシラス ステアロサーモフィラス及びバシラス アミロリクエファシエンスの両方で自然に起こる次の特定の置換、すなわちA33S、A52S、N96Q、H133Y、S148N、A209V、A269K、A379S及び／又はA435Sを包含する。
本発明の方法の実施態様において、前駆体タンパク質に基づく改良されたタンパク質の製造方法は、（a）低安定性であるが相同性の酵素の配列を有する前駆体タンパク質の配列を調整し、前駆体タンパク質の配列及び低安定性であるが相同性の酵素間で異なる１以上の残基を同定する工程；（b）前駆体タンパク質中の置換のために、工程（a）で同定された残基を１以上選択する工程；及び（c）前駆体タンパク質を修飾して、工程（b）で選択された置換用残基を取り込む工程を包含する。置換は、埋め込まれた残基においてではなく、タンパク質の表面にある残基で起こることが好ましい。
本発明の利点は、相同性であるが安定性が異なる２つのタンパク質の調整された配列を解析するという簡単な方法によって、より安定なタンパク質を得ることができることである。
【図面の簡単な説明】
図１は、バシラス リケニホルミスα-アミラーゼからのAsn188の定方向変異誘発において有用な変異原性オリゴヌクレオチドを示す。この図及びオリゴヌクレオチドの構成を示す以下の図において、太字は、オリゴヌクレオチドによって導入された基本的な変化を示し、下線は、オリゴヌクレオチドによって導入された制限エンドヌクレアーゼ部位を示す。
図２は、変異原性オリゴヌクレオチドの鋳型のPCR処理に使用するPCRプライマーを示す。
図３は、バシラス リケニホルミス由来のα-アミラーゼについての遺伝子のDNA配列（NCIB 8061）（配列番号：33）及びGrayらのJ.Bacteriology,vol.166,pp.635-643（1986）に記載されているような、翻訳生成物の推定されるアミノ酸配列（配列番号：41）を示す。
図４は、バシラス リケニホルミス由来の成熟α-アミラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号：34）を示す。
図５は、３つのバシラスα-アミラーゼの初期構造のアラインメントを示す。バシラス リケニホルミスα-アミラーゼ（Am-Lich）（配列番号：35）は、GrayらのJ.Bacteriology,vol.166,pp.635-643（1986）に記載され；バシラス アミロリクエファシエンス（Am-Amylo）（配列番号：36）は、TakkinenらのJ.Biol.Chem.,vol.258,pp.1007-1013（1983）に記載され；バシラス ステアロサーモフィラスα-アミラーゼ（Am-Stearo）（配列番号：37）は、IharaらのJ.Biochem.,vol.98,pp.95-103（1985）に記載されている。
図６は、プラスミドpHP13を示し、CmRはクロラムフェニコール耐性を表し、EmRはエリスロマイシン耐性を表し、Rep pTA1060はプラスミドpTA1060からの複製開始点を表す。
図７は、pBLaprプラスミドを示し、BLAAはバシラス リケニホルミスα-アミラーゼ遺伝子を表し；aprEはプロンプター及びaprE遺伝子領域をコードするシグナルペプチドを表し；AmpRはpBR322からのアンピシリン耐性遺伝子を表し；CATはpC194からのクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。
図８は、バシラス リケニホルミスα-アミラーゼの遺伝子を運ぶpHP.BLプラスミドを示す。
図９は、バシラス リケニホルミスから誘導されたα-アミラーゼに対応する変異体オリゴヌクレオチドを製造するために使用するPCR法の概略を示す。
図10は、バシラス リケニホルミス（配列番号：38）、バシラス サブチリスaprE（配列番号：39）及びpBLapr中のバシラス リケニホルミス（配列番号：40）から誘導されたα-アミラーゼ中のシグナル配列−成熟タンパク質接合点を示す。
詳細な説明
「発現ベクター」は、適切な宿主中でDNAの発現に影響しうる適切な制御配列に動作可能に連結されるDNA配列を包含するDNA構造体を意味する。このような制御配列は、転写に影響するプロンプター、そのような転写を制御する作動配列、適切なmRNAリボース−結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列を含んでよい。バシラス内での発現が必要な場合は、好ましいプロンプターはバシラス サブチリスaprEプロンプターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、又は単にポテンシャルゲノム挿入断片であってもよい。ベクターは、一端適切な宿主に形質転換されると、複製し独立して宿主ゲノムとして機能し、又は、ある場合には、ゲノム自体に融合する。プラスミドは現在ベクターの形態で最も一般的に使用されるので、プラスミド及びベクターは時には相互交換可能に用いられるが、本発明は、同等の機能を与え、本技術分野では知られ、或いは知られるようになっている発現ベクターの他の形態を包含することを意図している。
「宿主菌株」又は「宿主細胞」は、本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明で有用な宿主細胞は、通常、原核の又は真核の宿主であり、本発明による特定のタンパク質の発現を達成可能ないずれの形質転換性微生物をも含む。当業者は、特定なタンパク質に使用するための、適切な宿主細胞を含む、適切な発現及び分泌機構に精通している。例えば、バシラス由来のα-アミラーゼについては適切な宿主細胞はバシラス株であるというように、特定のタンパク質が適切に誘導される同種又は同属の宿主菌株が適当である。この場合、α-アミラーゼ陰性バシラス株（欠失遺伝子）及び／又はα-アミラーゼ及びプロテアーゼ欠失バシラス株（ΔamyE、Δapr、Δnpr）は好ましく使用される。宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて形成されたベクターによって形質転換又は形質移入される。このような形質転換された宿主細胞は、タンパク質及びその変異形（変異体）をコードするベクターを複製し、又は所望のタンパク質を発現することが可能となる。
「組換えタンパク質」は、天然の又は前駆体タンパク質をコードするDNA配列が修飾され、天然の又は前駆体タンパク質と比べて、タンパク質配列内で１以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失をコードする変異体DNAを生成するタンパク質を意味する。ここで、前駆体タンパク質（又は酵素）という語は、化学反応における中間前駆体の意ではなく、モデリングされる親タンパク質を意味する。従って、修飾の限界を定めるのは前駆体であるが、実際の変化又は修飾は、その前駆体をコードするDNA内での変化にその基礎を有し、そしてDNAは形質転換され、発現され、修飾を組込んだタンパク質生成物が分泌される。
本発明の改良されたタンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を包含する。前駆体タンパク質は、天然のタンパク質又は組換えタンパク質であってもよい。改良されたタンパク質のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失又は挿入された前駆体タンパク質のアミノ酸配列から誘導される。このような修飾は、一般的に、前駆体タンパク質自体を操作するのではなく、前駆体タンパク質のアミノ酸配列をコードする前駆体DNA配列を操作する。このような前駆体DNA配列を操作する適切な方法は、本明細書で開示し、また参照文献として取込まれている米国特許第4,760,025号及び第5,185,258号に一般に所有されている方法を含む。
本発明によって、タンパク質は以下のように修飾される。タンパク質は、配列が異なる相同性タンパク質に関連づけられる。例えば、周知の配列アラインメント技術によって、２つの関連するタンパク質の配列を調整してその２つのタンパク質が異なる位置のみならず、保存された（すなわち同一の）位置を決定することができる。本発明の実験で、驚くべきことにまた予想外に、標的タンパク質を低安定性のタンパク質に対して関連づけ、その標的タンパク質内での修飾のために、低安定性のタンパク質とは異なる特定の残基を同定し選択することによって、安定性が有利に改良されることが見いだされた。その２つのタンパク質は、比較的活性又は機能的で、本質的に相同性であることが必要である。比較的活性なので、そのタンパク質は同様の生物的活性、機能、触媒活性又は特定のタンパク質を分類するために通常使用される他の基準を有しているべきである。「本質的に相同性」とは、タンパク質が、保存された、すなわち同一のアミノ酸について有意水準を有し、それらの配列が意味があるように整列可能で、主構造、機能、又は触媒部位が限定されうることを意味する。好ましくは、その２つのタンパク質の配列は、少なくとも60％、さらに好ましくは、65％、最も好ましくは80％同一である。
本発明の改良されたタンパク質は、他の条件下ではもう安定性が改良されているいずれの環境設定においても、前駆体タンパク質の少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも90％の安定性を有する。従って、高温下で前駆体酵素の少なくとも50％の安定性を有するが、酸化条件下でも安定性が改良されている改良タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。特に好ましい実施態様においては、改良されたタンパク質の安定性は、酸化剤が存在し高温下での前駆体タンパク質について改良される。
好ましい実施態様においては、タンパク質は酵素を含む。酵素は、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ又はリガーゼの５つの主要酵素ののいずれでもよい。本発明の恩恵を受ける酵素の特異的な例としては、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコアミラーゼ、エステラーゼ、ラクターゼ、ポリガラクトロナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リグニナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、又は近接かつ低安定性の相同体が存在する酵素のいずれをも包含する。
本発明の方法及び組成物の例としてα-アミラーゼについて示す。ここで、「α-アミラーゼ」とは、例えば、デンプン、アミロペクチン又はアミロースポリマー中のα（1-4）グリコシダーゼ結合を切断或いは加水分解する酵素活性を意味する。α-アミラーゼは、天然のα-アミラーゼと共に組換えα-アミラーゼを含む。本発明において好ましいα-アミラーゼは、バシラス種、特にバシラス リケニホルミス、バシラス アミロリクエファシエンス又はバシラス ステアロサーモフィラス、並びにアスペルギルス（すなわち、A.aryzea及びA.niger）から誘導されるような真菌のα-アミラーゼである。従って、本発明のα-アミラーゼは、前駆体α-アミラーゼから誘導される。前駆体α-アミラーゼは、α-アミラーゼを生成しうるいずれの起源によっても生成される。α-アミラーゼの好適な起源は、菌類、細菌、植物又は動物を含む原核生物又は真核生物である。前駆体α-アミラーゼは、好ましくはバシラス；さらに好ましくはバシラス リケニホルミス、バシラス アミロリクエファシエンス又はバシラス ステアロサーモフィラス；最も好ましくは、バシラス リケニホルミスから誘導される前駆体α-アミラーゼによって生成されることである。
相同性は、現在までに、植物、哺乳類、及び細菌までに及んで配列決定されたほとんどすべてのエンド−アミラーゼの間で見いだされている（Nakajimaら，Appl.Microbiol.Biotecnol.,vol.23,pp.335-360（1986）;Rogers,Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.128,pp.470-476（1985）;Janecek,Eur.J.Biochem.,vol.224,pp.519-524（1994））。図５に示されるように、特定のバシラス アミラーゼにおいては、特に相同性の高い４つの領域がある。ここで、下線部分は相同性が高い領域を示している。また、配列のアラインメントは、バシラス エンド−アミラーゼ間の関係の地図で示されている（Fengら，J.Molec.Evol.,vol.35,pp.351-360（1987））。Holmら，Protein Engineering,vol.3,No.3,pp.181-191（1990）によって決定されたように、バシラス ステアロサーモフィラスとバシラス アミロリクエファシエンス アミラーゼとの間の相対配列の相同性は約66％であり、バシラス リケニホルミスとバシラス アミロリクエファシエンス アミラーゼとの間の相対配列の相同性は約81％である。
初期構造に対して相同性を達成するために、前駆体α-アミラーゼのアミノ酸配列を直接バシラス リケニホルミスα-アミラーゼの初期配列と比較し、特に配列が既知の全てのα-アミラーゼについて不変であることが知られている一組の残基と比較する（例えば、図７参照）。ブタの膵臓のα-アミラーゼ（Buissonら，EMBO Journal,vol.6,pp.3909-3916（1987）;Qianら，Biochemistry,vol.33,pp.6284-6294（1994）;Larsonら，J.Mol.Biol.,vol.235,pp.1560-1584（1994））；アスペルギルス オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のTaka-アミラーゼA（Matsuuraら，J.Biochem.（Tokyo）,vol.95,pp.697-702（1984））；及びA.ニガー（A.Niger）由来の酸α-アミラーゼ（Boelら，Biochemistry,vol.29,pp.6244-6249（1990））、前述の２つの構造と同様のオオムギα-アミラーゼ（Valleeら，J.Mol.Biol.,vol.236,pp.368-371（1994）;Kadziolaら，J.Mol.Biol.,vol.239,pp.104-121（1994））について報告されている結晶構造の三次構造解析によって同等の残基を決定することもできる。いくつかの予備試験が開示されてるが（Suzukiら，J.Biochem.,vol.108,pp.379-381（1990）;Leeら，Arch.Biochem.Biophys,vol.291,pp.255-257（1991）;Changら，J.Mol.Biol.,vol.229,pp.235-238（1993）;Mizunoら，J.Mol.Biol.,vol.234,pp.1282-1283（1993））、バシラス リケニホルミスα-アミラーゼの構造が開示されているだけである（Machiusら，J.Mol.Biol.,vol.246,pp.545-549（1995））。しかしながら、ある研究者らは、グルカナーゼ間の一般的な超−二次構造について（MacGregorら，Biochem.J.,vol.259,pp.145-152（1989））及びα-アミラーゼ及び他のデンプン−代謝酵素内での（Jaspersenら，J.Prot.Chem.,vol.12,pp.791-805（1993）;MacGregor,Starke,vol.45,pp.232-237（1993））；及びα-アミラーゼに対する同様の超−二次構造を有する酵素間の配列の類似性（Janecek,FEBS Letters,vol.316,pp.23-26（1993）;Janecekら,J.Prot.Chem.,vol.12,pp.509-191（1993））について予測している。バシラス ステアロサーモフィラス酵素の構造は、Taka−アミラーゼＡの構造上でモデル化されている（Holmら，Protein Engineering,vol.3,pp.181-191（1990））。図７に示される４つの高保存領域は、バシラス リケニホルミスの数体系でHis+105;Arg+229;Asp+231;His+235;Glu+261及びAsp+328を含む、活性部位の部分と考えられる多くの残基を包含している（Matsuuraら，J.Biochem.（Tokyo）,vol.95,pp.697-702（1984）:Buissonら，EMBO Journal,vol.6,pp.3909-3916（1987）;Vihinenら，J.Biochem.,vol.107,pp.267-272（1990））。細菌性アミラーゼハイブリッド酵素の結晶構造は、PCT公開番号WO96/23874に開示されている。
上述したように、バシラス リケニホルミス、バシラス ステアロサーモフィラス、バシラス アミロリクエファシエンス及びバシラス サブチリス由来のα-アミラーゼは、すべてかなり高い相同性を持っている。しかし、工業上のデンプン液化条件、例えば、高温（90℃以上）、低pH（pH4-6）及び低カルシウムの下では、バシラス リケニホルミスから誘導されたα-アミラーゼが最も許容される性能を示すことが知られている。それにもかかわらず、バシラス リケニホルミスα-アミラーゼでさえ、より安定な所望の代替物を製造する液化条件下では望ましくない不安定性に影響を受けやすい。そこで、液化工程での使用において望ましい特性をこの酵素に導入する目的で、バシラス リケニホルミス誘導分子について多くの研究がなされてきた。バシラス リケニホルミス由来のα-アミラーゼの配列を、バシラス ステアロサーモフィラス又はバシラス アミロリクエファシエンス由来のα-アミラーゼに対して整列させることによって、相同体間で異なる残基を同定することができる。そこで、本発明に従い、B.リケニホルミス由来のα-アミラーゼ中での置換のために、B.リケニホルミス由来のα-アミラーゼと比較してB.ステアロサーモフィラス又はB.アミロリクエファシエンス由来のα-アミラーゼ中の残基が異なる位置を選択する。その置換された残基は、B.ステアロサーモフィラス又はB.アミロリクエファシエンス由来のα-アミラーゼに存在する残基と実質的に同一であることが好ましい。さらに好ましくは、置換された残基は、同一の残基がB.ステアロサーモフィラス及びB.アミロリクエファシエンス由来の両方のα-アミラーゼに存在するような位置に対応していることである。
ここで、バシラス リケニホルミス中での置換のために特定された残基は、バシラス アミロリクエファシエンス及び／又はバシラス ステアロサーモフィラス中の対応する位置にある残基とは異なり、特にA33、A52、S85、N96、H133、S148、A209、A269、A379及びA435である。これらの残基について特に好ましい置換は、バシラス アミロリクエファシエンス及びバシラス ステアロサーモフィラスの両方に存在する置換から選択され、A33S、A52S、N96Q、H133Y、S148N、A209V、A269K、A379S及び／又はA435Sに対応している。また、バシラス アミロリクエファシエンスからのみ補充されるA85D変異も安定性の利益があることが発見された。上述の残基は、性能が有利になるように他の修飾と組み合わせて変形してもよい。本発明の最も好ましい実施態様においては、上述の残基は、M15、N188及び／又はM197のいずれにも対応する残基における、特にバシラス リケニホルミス中のM15T、N188S及び／又はM197Tにおける変異と組み合わされる。本発明に従い、バシラス リケニホルミス中のM15T／H133Y／N188S／A209Vに対応する変異体と組み合わせて同定された修飾のいずれも、特に安定特性を改良する。バシラス リケニホルミス中のM15T／A33S／H133Y／N188S／A209V；M15T／D28N／A33S／H133Y／N188S／A209V；M15T／A52S／H133Y／N188S／A209V；M15T／A52S／H133Y／N188S／A209V／L230F；M15T／S85D／H133Y／N188S／A209V；M15T／N96Q／H133Y／N188S／A209V；M15T／N96Q／H133Y／N188S／A209B／I479T；M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V；M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／A379S；M15T／H133Y／S148N／N188S／A209V／G433D；M15T／H133Y／N188S／A209V／A379S；M15T／H133Y／N188S／A209V／A210S／T322A／A379Sに対応する修飾は、特に好ましく、本発明を実施する最良の形態を示す。
本発明の改良されたタンパク質は、タンパク質が一般的に使用され、かつ安定性の改良が望まれる種々の用途に特に有用なタンパク質を製造する改良された性能特性を示す。例えば、α-アミラーゼを含む本発明の酵素は、改良された熱安定性、改良されたpH安定性及び／又は改良れた酸化安定性を示す。熱安定性が高められているので、それらを取り入れた製品の貯蔵寿命の長期化及び／又は高温下での用途に有用である。酸化安定性が高められ、又は性能が改良されているので、特に洗浄製品に望ましく、そのような洗浄製品に使用される漂白剤、パーボレート、パーカーボネート又は過酸の存在下での酵素の貯蔵寿命を長期化するために望ましい。本発明のα-アミラーゼは、デンプン加工において、特に酸化安定性及び熱安定性が極めて重要なデンプンの液化において有用である。
本発明の他の実施態様は、本発明のタンパク質をコードするDNA及びそのようなDNAを含む発現ベクターを含む。DNA配列は、周知の方法に従い、適切な発現ベクター内の発現制御配列に可動的に連結し、その発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換させて発現される。本発明のDNA配列の発現においては、広範囲の宿主／発現ベクターの組合せを使用することができる。例えば、有用な発現ベクターとしては、この目的のために使用できる公知のプラスミド及びファージのような染色体性、非染色体性及び合成DNA配列がある。さらに、広範囲の発現制御配列のいずれをも、これらベクターに通常使用される。例えば、バシラス由来のα-アミラーゼについては、出願人らは、バシラス形質転換体のための好ましい発現制御配列は、バシラス サブチリスから誘導されたaprEシグナルペプチドであることを発見した。
また、広範囲の宿主細胞を本発明のDNA配列の発現に使用することができる。これら宿主は、大腸菌、緑膿菌、バシラス、ストレプトマイシン、種々の菌類、酵母菌及び動物細胞系のような周知の原核性及び真核性宿主を含む。宿主が本発明のタンパク質を細胞外で発現して、精製及び下流処理を容易にすることが好ましい。本発明の改良されたタンパク質の発現及び精製は、このような処理を行う場合に技術的に認知された方法で効果的に行うことができる。
以下は、実施例として説明するものであり、請求の範囲を制限するものと解してはならない。ここで使用する略語、特にアミノ酸の３文字又は１文字表記については、Dale,J.W.,Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley & Sons,（1989）Appendix Bに記載されている。
実施例
実施例１
プラスミドpHP.BLの作製
図３に示すα-アミラーゼ遺伝子は、バシラス リケニホルミスNCIB8061からクローン化した（Grayら，J.Bacteriology,vol.166,pp.635-643（1986））。シグナル配列の最後の３つの残基をコードする1.72kb Pstl-Sstl断片、成熟タンパク質全体及び終結領域をM13mp18にサブクローン化した。Bcll及びSstl間に、バシラス アミロリクエファシエンス サブチリシン転写ターミネーターを包含するように設計された以下の形態の合成オリゴヌクレオチドカセットを用いて合成ターミネーターを加えた（Wellsら，Nucleic Acid Reserch,vol.11,pp.7911-7925（1983））。
0004253041.tif 000002
バシラス リケニホルミスα-アミラーゼの遺伝子を運ぶpBLaprプラスミドを作製した。図７に示すように、pBLaprは、pBR322からのアンピシリン耐性遺伝子及びpC194からのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む6.1kbプラスミド、aprEプロンプター及びバシラス リケニホルミスα-アミラーゼ（「BLAA」）についてコードする遺伝子を包含する。aprEプロンプターは、そのプロンプターについてコードする660塩基対のHindIII-Pstl断片及びバシラス サブチリスのアルカリ性プロテアーゼのシグナル配列から作製した。Pstl部位を除去し、aprE/BLAA接合部に近接してSfil部位を加えた。BLAA遺伝子は、上述の1720塩基対のPstl-Sstl断片を包含する。ここで記載した実験においては、pBLaprは、成熟アミラーゼ遺伝子についてのコード配列の開始部である5’末端に隣接するSfil部位で作製した。特に、pBLapr構造の5’末端は、EcoRI-Sstll断片上でpBLaprからM13BM20（Boehringer Mannheim）にサブクローン化して、下記の変異原性オリゴヌクレオチドのためのコーディング鎖の鋳型を得た。
0004253041.tif 000003
このプライマーはSfil部位（下線で示される）を導入し、この特異的な制限部位の存在によって、形を正してスクリーニングされるようにすることができる。EcoRI-Sstll断片を戻してpBLaprベクターにサブクローニングして、Sfil部位を含むプラスミドの異形を得た。
プラスミドpHP13（Haimaら，Mol.Gen.Genet.,vol.209,pp.335-342（1987））（図６）は、制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化し、得られたベクターをポリアクリアミドゲルで精製し、溶出した。プラスミドpBLaprは、HindIII、Asp718で消化し、Asp718、EcoRIと共に分離インキュベーションしてゲル精製した。２つのバンド、HindIII-Asp718（1203塩基対）及びAsp718-EcoRI（1253塩基対）をゲル精製し、ゲルから溶出し、３−ウェイ結合により、ベクターに結合させて、α-アミラーゼの発現で使用するプラスミドpHP.BLを得た（図８）。
実施例２
アスパラギン188の置換を含むα-アミラーゼをコードするプラスミドの作製
それぞれ天然のアミノ酸を有するAsn188（「N188」）の置換についてコードする一連の変異原性プライマーを合成し、図１に示した（配列番号：1-22）。これらの変化についてコードするα-アミラーゼ遺伝子の変異は、図９に概略を示した方法に従い、図２に示すPCRプライマー（配列番号：23-32）を用いて、PCRによって行った。
工程（1）：変異原性プライマーをPCRプライマー、PCR A+及びPCR B-の鋳型として使用し、伸長された（61塩基対）二本鎖DNAを得た。それぞれ、188位で異なったアミノ酸置換を含み、N188M以外は全て異なった制限部位を含んでいた。初めに、PCRプライマーを35℃で５分間アニールし、次いで１分間75℃で、taqポリメラーゼによってDNAを伸長した。そして、二本鎖DNAを95℃で１分間融解し、アニールし、伸長工程を行った。融解、アニーリング及び伸長を、全体で30サイクル続けた。
工程（2）：188位のDNA上流と下流は、分離PCR反応で作った。鋳型はpBLapr、PCRプライマーは、上流DNAについてはLAAfs5（配列番号：27）及びPCR A-（配列番号：24）、下流DNAについてはPCR B+（配列番号：25）及びPCR Cla-Sall（配列番号：28）である。DNAを95℃で１分間融解し、45℃で３分間アニールし、68℃で３分間伸長した。上流部分は、290塩基対、下流部分は、498塩基対であった。この方法は、pfuポリメラーゼを用いて18サイクル繰り返した。同じPCR手順を工程（3）及び（4）で使用した。
工程（3）：工程（2）で記載したDNAの上流部分を工程（1）で記載した二本鎖変異原性プライマーに連結した。プライマーLAAfs5（配列番号：27）及びPCR B-（配列番号：26）を使用した。プライマーの設計の結果として、２種のDNAを付加させるこれらの鋳型の間に24塩基対の重複部分ができる。
工程（4）：工程（2）で記載したDNAの下流部分と工程（3）の生成物とを連結させて最終生成物を得た。２つのPCR生成物間の24塩基対の重複部分によって連結される。プライマーは、LAAfs5（配列番号：27）及びPCR Clal-Sall（配列番号：28）を使用した。
工程（5）：特異的な制限部位、Asp718及びBssHllを、それぞれ188部位の上流及び下流に配置した。最終的なPCR生成物をAsp718及びBssHllで消化して、333塩基対の断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、pHP.BLベクターにサブクローン化してpHP.N188Xを得た。
変異は、ジデオキシ配列決定法により確認した（Sangerら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,vol.74,pp.5463-5467（1977））。
DNA配列及び図３で用いられる数体系を参照すると、+188アミノ酸の位置をコードするコドンは、塩基対812-814である。PCRプライマーA+及びA-は、塩基対784-807に対応する。PCRプライマーB+及びB-は、塩基対821-844に対応する。PCRプライマーLAAfs5の5’末端は、塩基対518に対応する。PCRプライマーPCR Clal-Sallの5’末端は、塩基対1317に対応する。Asp718部位は、塩基対724に対応する。BssHll部位は、塩基対1053に対応する。
実施例３
M15及びN188における変異をコードするプラスミドの作製
米国特許出願番号第08/194,664（PCT公開番号WO 94/18314）に従い、アミノ酸15においてメチオニンと置換されたスレオニンを有するpBLaprプラスミドを作製した。このプラスミド（pBLaprM15T）をSfil及びAsp718で消化し、477塩基対断片をpHP.BLにサブクローン化してpHP.M15Tを得た。上述の実施例１と同様な方法で、pHP.M15TをAsp718及びBssHllで消化し、ゲル精製し、ゲルから溶出した。そして、Asp718からBssHllを含む333塩基対断片及びpHP.N188Sからの断片をpHP.M15Tにサブクローン化してプラスミドpHP.M15T/N188Sを得た。同様に、プラスミドpBLaprM15L及びpHP.N188Yで開始してプラスミドpHP.M15L/N188Yを作製した。
実施例４
プラスミドのバシラス サブチリスへの形質転換、変異体α-アミラーゼの発現及び精製
実施例1-3で記載したプラスミドによる形質転換後、バシラス サブチリス内にα-アミラーゼが発現した。pHP13は、E.coli及びバシラス サブチリス内で複製可能なプラスミドである。E.ｃoli株MM294を用いて、異なる変異体を包含するプラスミドを作製し、そのプラスミドを単離して、Anagnostopoulosら，J.Bacter.,vol.81,pp.741-746（1961）に記載されているように、バシラス サブチリスに形質転換させた。バシラス株は、２つのプロテアーゼ（Δapr、Δnpr）（例えば、Ferrariら，米国特許第5,264,366号参照）及びアミラーゼ（ΔamyE）（例えば、Stahlら，J.Bacter.,vol.158,pp.411-418（1984））のために欠失された。M15L/N188Yを発現するバシラス株は、デンプン分解活性の増加を示す不溶性デンプンを１％含む寒天平板上でM15Lを発現する菌株よりも大きいクリアリングゾーンを形成することがわかった。形質転換後、sacU（Hy）変異（Hennerら，J.Bacter.,vol.170,pp.296-300（1988））を、PBS-1媒介形質導入によって導入した（Hoch,J.Bact.,vol.154,pp.1513-1515（1983））。
分泌されたアミラーゼを、以下に示すように、ルーチン的にバシラス サブチリス培養から回収した。すなわち、培養上清を20％の飽和硫酸アンモニウムに調整し、４℃で１時間撹拌した。遠心分離の後、得られた上清を70％の飽和硫酸アンモニウムに調整し、４℃で１時間撹拌した。その上清を遠心分離後、得られたペレットを50mM酢酸ナトリウム、5mM塩化カルシウムに再溶解し、無菌ろ過した。
実施例５
α-アミラーゼの活性測定アッセイ
可溶性基質アッセイ：速度アッセイは、Magazyme（Aust.）Pty.Ltd.によって供給される終点検定キットを基に発展した。基質（p-ニトロフェニル マルトヘプタオシド（maltoheptaoside）、BPNPG7）のバイアルを無菌の水10mlに溶解し、アッセイ緩衝液（50mMマレイン酸塩緩衝液、pH6.7、5mM塩化カルシウム、0.002％トウィーン20）内で1:4に希釈した。アッセイは、25℃で、キュベット中、790μlの基質に10μlのアミラーゼを添加して行った。加水分解の速度は、75秒後の、410nmにおける吸収の変化の速度として測定した。アッセイは、0.2吸収単位／分の割合まで直線だった。
α-アミラーゼタンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミン標準物質を用いたBradford,Anal.Biochem.,vol.72,p.248（1976）に基づく標準Bio-Radアッセイ（Bio-Rad Laboratories）を使用して測定した。
デンプン加水分解アッセイ：デンプン上でのα-アミラーゼ活性は、デンプンがヨウ素によって青色錯体を形成し、デンプンが加水分解されて短いデキストリン分子になると、その色が消失するというデンプン能に基づくアッセイにより測定した。α-アミラーゼ活性は、デンプンのデキストリン化の一定の段階を示す色の変化を起こすために必要な消化時間に関して定義した
使用した試薬は以下の通りである：
リン酸緩衝液−リン酸二水素カリウム（340g）及び水酸化ナトリウム（25.3g）を水に溶解して〜２リットルに希釈した。緩衝液を室温まで冷却し、pHを6.2±0.1に調整した。緩衝液をメスフラスコ内で２リットルに希釈した。
デンプン基質−10グラム（乾燥物質）の可溶性リントナー（lintner）デンプンを50mlの水で縣濁させ、〜300mlの熱湯中で洗浄した。縣濁液を再び沸騰させコンスタントに撹拌しながら５分間煮沸した。そのデンプン溶液をコンスタントに撹拌しながら室温まで冷却し、125mlのリン酸緩衝液を加えた。その溶液を水で500mlに希釈した。デンプン基質は毎日新鮮なものを作った。
貯蔵ヨウ素溶液−ヨウ素の結晶（5.5g）及びヨウ化カリウム（11.0g）を水に溶解し、体積を測定して250mlに希釈した。溶液は毎日新鮮なものを作った。
希釈ヨウ素溶液−ヨウ化カリウム（20g）及び2mlの貯蔵ヨウ素溶液を水に溶解し、体積をを測定して500mlに希釈した。溶液は毎日新鮮なものを作った。
酵素希釈溶液−塩化カルシウム（11.1g）を４リットルの水に溶解した。全ての試薬について使用する水は蒸留又は脱イオン化した。
α-アミラーゼの試料は、酵素希釈溶液で10-15LU/ml（以下に定義されるように）に希釈した。多くの市販のα-アミラーゼ調製については、好適な希釈は2000ホールド（fold）であることがわかった。５ミリリットルアリコートの希釈ヨウ素溶液を13×100mmの試験管に分配し、10mlのデンプン基質を23×200mmの試験管に入れた。全ての試験管を30℃のウォーターバスに入れた。特殊なα-アミラーゼカラーディスクを備えたHellligeコンパレーター（カタログ番号620-s5）を使用して測定した。５ミリリットルの希釈された酵素（これも30℃で）をデンプン基質と混合して時間の測定を開始した。適切な間隔で、例えば、反応の初期では１分間隔で、その後は15秒間隔で、1mlアリコートの酵素−基質混合物を希釈ヨウ素溶液が入っている試験管に移した。デンプンヨウ素溶液を混合し、13mmの精確な角管に移し、Hellligeコンパレーター内の標準α-アミラーゼカラーディスクの色と比較した。終了点に近づいたときは、試料は0.25秒間隔で取った。
試料の色とカラーディスクの色が一致するまでに要した時間を記録し、以下の式に従って、活性（liquefons／グラム又はml）を計算した。
LU/ml又はLU/g＝
ここで、LU＝liquefon単位
Ｖ＝酵素の量（5ml又はグラム）
ｔ＝デキストリン化時間（分）
Ｄ＝希釈因子：希釈された酵素のml又はｇで除した希釈量
実施例６
熱安定性のために加えられた変異体アルファ-アミラーゼの調製及び試験
バシラス ステアロサーモフィラスとバシラス アミロリクエファシエンスの両方で対応する残基が同定された（M15T/H133Y/N1885/A209Vと組み合わせたA33S、A52S、N96Q、S148N、A379S）５カ所の１以上において置換されている変異体α-アミラーゼを調製し、M15T/H133Y/N1885/A209V置換のみを含む変異体と比較した。さらに、バシラス アミロリクエファシエンスからの補充を示す変異S85D。この変異は、所望の変異に効果的な適切なPCRプライマーを供給することを除き、実施例1-4で示した手順に従い、調製した。
種々の変異体についての熱的不活性化速度は、以下の方法に従って測定した。アミラーゼ貯蔵溶液を20mMの酢酸アンモニウム、4mMのCaCl2、pH6.5中に、広範囲にわたって透析させた。安定性の測定のため、このストックを、野生型アミラーゼの速い不活性化を引き起こすように設計された溶液（50mM酢酸アンモニウム、5mM CaCl2、0.02％トウィーン及びpH4.9又は4.8）中で>50ホールドに希釈して最終的な濃度を30〜50μg/mlにした。６つの100μlアリコートをエッペンドルフ管に入れ、82℃又は83℃のウォーターバスに入れた。エッペンドルフ管を一定の時間をおいて取り出し、30秒〜５分ごとに測定して氷上に置いて不活性化を終わらせた。残基の活性を実施例５に記載の可溶性基質を用いてアッセイした。活性の自然対数をインキュベーション時間に対してプロットし、その直線の傾きから不活性化の速度定数を求めた。半減期は、ln（2）を速度定数で割って計算した。種々の変異体の結果を表1-4に示す。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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