(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＭＰのＮＨ2末端α−アミノ基を電子吸引基で修飾し、メタロプロテイナーゼとの結合性を実質的に消失しているＴＩＭＰ修飾体。
【請求項２】
ＴＩＭＰ修飾体がＴＩＭＰ−２修飾体である、請求項１に記載のＴＩＭＰ修飾体。
【請求項３】
前記電子吸引基がカルバミル基である、請求項１または２に記載のＴＩＭＰ修飾体。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＴＩＭＰ修飾体を加えることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害する方法。
【請求項５】
前記ＴＩＭＰ修飾体がＴＩＭＰ−２修飾体であり、前記複合体がＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２およびゼラチナーゼＡを含む複合体である、請求項４に記載の阻害方法。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＴＩＭＰ修飾体を含む、薬学的に受容可能な担体と共に含む医薬用組成物。
【請求項７】
癌の転移抑制または血管新生抑制のために用いる請求項６に記載の医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メタロプロテイナーゼの組織性阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）（以下、「ＴＩＭＰ」と言う）の新規修飾体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
転移は、悪性の癌の特徴であり、患者の生命を最も脅かす病態であり、この転移を抑えることが癌治療の重要な目的の一つである。しかしながら、この転移を完全に抑える治療法はなく、外科手術、放射線治療や化学療法を行いつつ、いわゆる対処療法的に治療を施しているのが現状である。しかしながら、近年、転移のメカニズムが徐々に明らかになりつつあり、癌の転移能力の反映として、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）（以下、「ＥＣＭ」と言う）の分解系が注目されている。
【０００３】
より詳細には、癌細胞は原発部位で増殖を開始し、その一部の細胞は周りの細胞との接着を断ち、腫瘍組織より逸脱できるようになる。しかしながら、腫瘍組織は密なＥＣＭに囲まれており、物理的な運動による破壊だけでなく、それらを酵素分解しなければそこから離脱することはできない。転移性癌細胞は、この障壁となっているＥＣＭを分解する酵素を産生しながら組織の中を移動しはじめる。さらに遠隔移動するため、癌細胞は強固なＥＣＭで構成される血管壁を破り、血流に入る。その後、転移先の血管壁内膜に接着し、そして血管外へ脱出するために、再び血管壁ＥＣＭを酵素分解し、さらに周辺ＥＣＭを分解しながら組織中に浸潤する（細胞工学  Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．４  １９９８，ｐ．５２３−５３３）。
【０００４】
このような一連の過程のなかで、ＥＣＭの分解は、癌細胞の転移を研究、診断等する上で、最も重要であると考えられている。マトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、「ＭＭＰ」と言う）（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｃｒａｂｂｅ，Ｔ．，Ａｎｇａｌ，Ｓ．および  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，２００−２０７）は、ＥＣＭの成分を分解する、一群の亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。ＭＭＰは、形態形成、血管形成、組織修復および腫瘍浸潤などの生理学的および病理学的条件下の組織再構築において本質的な役割を果たしている（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．Ｐ．ら，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，２００−２０７  同上；  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １４，４５５−４６３；  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ，Ｓ．，および  Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，５４１−５７３）。大部分のＭＭＰはチモーゲンとして分泌され、そしてセリンプロテアーゼまたは若干の活性ＭＭＰによって活性化される。
【０００５】
ＭＭＰは現在までに、約２０種類発見されており、それぞれ特徴的な基質特異性を保持しており、各種コラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンなどを分解する。ＭＭＰはその基質特異性、存在形態により大別されている。例えば、ＭＭＰ−２および−９は、ゼラチンを基質とするため、ゼラチナーゼ群として、各々ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢとも呼ばれている。また、ＭＭＰ−１４ないし−１７は、膜結合型であり、ＭＴ−ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ−ＭＭＰ）群と呼ばれる。ＭＭＰ−１４ないし−１７は、各々ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰおよびＭＴ４−ＭＭＰとも呼ばれる。以上の他、コラゲナーゼ群（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３およびＭＭＰ−１８）、ストロムライシン群（ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１０）なども存在する。
【０００６】
活性化されたＭＭＰの活性は、メタロプロテイナーゼの組織性阻害剤（以下、「ＴＩＭＰ」という）として知られる一群の内因性特異的阻害剤によって調節される。ＴＩＭＰはこれまでに４種類同定されており、ＭＴ−ＭＭＰ以外のＭＭＰはそれら４種類のＴＩＭＰにより効率よく阻害される。ＭＴ−ＭＭＰについては選択性があり、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−３には効率よく阻害される一方、ＴＩＭＰ−１によってはほとんど阻害されない。ＴＩＭＰは基本的にＮ末端領域とＣ末端領域の構造を有する。ＭＭＰの阻害活性はＴＩＭＰのＮ末端領域にあり、Ｃ末端領域を有しないような組換えＴＩＭＰでもＭＭＰを阻害できる。
ＴＩＭＰのＭＭＰ阻害活性機構についての知見
ＴＩＭＰによるＭＭＰの阻害活性の機構については、これまでの研究により仮説が考えられている。例えば、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１については以下に記載するようにいくらか知見が得られている。
【０００７】
ＭＭＰ系列の中で、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）は、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンに対するそれらの強い活性のために、基底膜を越えた腫瘍細胞の浸潤において特に重要である（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６，１−７；  Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．，Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６５７９−６５８７；  Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１７２１３−１７２２１）。ＭＭＰの他のチモーゲンとは異なり、プロゼラチナーゼＡは、セリンプロテアーゼまたは可溶性ＭＭＰによって活性化されることはないが、癌細胞および線維芽細胞の表面上でＭＭＰ様活性によって活性化されると報告された（Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｃ．Ｍ．，および  Ｓｏｄｅｋ，Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２１１４１−２１１５１；  Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｔ．，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｉ．Ｍ．，Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，および  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，６１８４−６１９１；  Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｖ．，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｌｏｃｏｍｂｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｊ．，および  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０７９，２４２−２４６；Ａｚｚａｍ，Ｈ．Ｓ．  および  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｗ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，４５４０−４５４４）。
【０００８】
Ｓａｔｏ  ら（Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．，および  Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，６１−６５）は、細胞表面上のプロゼラチナーゼＡの活性化因子としてＭＴ−ＭＭＰと称される新規の膜型ＭＭＰを確認した。プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化には、２段階の過程が含まれ、最初に、プロゼラチナーゼＡのＡｓｎ−３７とＬｅｕ−３８との間のペプチド結合におけるＭＴ−ＭＭＰで触媒された切断が、チモーゲンを中間型に変換し、そして次に、Ａｓｎ−８０−Ｔｙｒ−８１結合の自己触媒的切断が、その中間型を成熟型に変換する（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４０３３−１４０３９）。いくつかの研究は、双方の段階が細胞表面上への（プロ）ゼラチナーゼＡの結合によって大きく促進されるので、細胞表面上の（プロ）ゼラチナーゼＡの受容体がその活性化に重要であるということを示唆している。ゼラチナーゼＡのカルボキシ末端のヘモペキシン様ドメインは、細胞表面との相互作用に不可欠であると報告されている（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４０３３−１４０３９；  Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５３３１−５３３８）。
【０００９】
また、最近の研究（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｉｌｌｅｔｔｉ，Ｓ．，ｖｏｎ  Ｓｃｈａｌｓｃｈａ，Ｔ．Ｌ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，および  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ９２，３９１−４００；  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｉｔｏｈ，Ｍ．，Ａｋｉｚａｗａ，Ｔ．，および  Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，２５３５−２５３８；  Ｐｅｉ，Ｄ．Ｑ．，および  Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９１３５−９１４０；  Ｗｉｌｌ，Ｈ．，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．，および  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１７１１９−１７２１３；  Ｌｉｃｈｔｅ，Ａ．，Ｋｏｌｋｅｎｂｒｏｃｋ，Ｈ．，および  Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，Ｈ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９７，２７７−２８２）は、ＭＴ−ＭＭＰの膜貫通領域を欠いた変異体が、プロゼラチナーゼＡをその中間型へと変換するが、成熟型へはほとんど変換しないことを示唆している。部位特異的変異導入技術によって活性部位残基を置換した変異プロゼラチナーゼＡの細胞性プロセッシングは、その変異体の成熟型を産生しないということも報告されている（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｒａｂｂｅ，Ｔ．，Ｃｏｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｖ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｊ．，および  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０４７９−３０４８５；  Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｉｍａｉ，Ｋ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，および  Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８５，２３８−２４０）。
【００１０】
これらの研究は、中間型ゼラチナーゼＡの成熟型への変換のために細胞に結合したゼラチナーゼＡの活性が重要であることを示唆している。
一方、ＴＩＭＰとＭＭＰとの複合体の結晶構造についても研究がなされている。
【００１１】
ＴＩＭＰ−１とストロムライシンとの間に形成された複合体の結晶構造は、ＴＩＭＰ−１のＮＨ2末端のＣｙｓ−１の遊離α−アミノ基およびカルボニル酸素がストロムライシンの触媒亜鉛原子を配位しており、したがって、阻害作用に関与していることを示唆する（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ，Ｆ．Ｘ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｋ．，Ｂｅｔｚ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｎｅｒ，Ａ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｂｒｅｗ，Ｋ．，Ｂｏｕｒｅｎｋｏｖ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｒｔｕｎｉｋ，Ｈ．，および  Ｂｏｄｅ，Ｗ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，７７−８１）。ごく最近、ＴＩＭＰ−２とＭＴ１−ＭＭＰの触媒ドメインとの間に形成された複合体の結晶構造も確認された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｔａｌａｎ，Ｃ．，Ｂｏｄｅ，Ｗ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｔｕｒｋ，Ｄ．，Ｃａｌｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｃｈｔｅ，Ａ．，Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，Ｈ．，および  Ｍａｓｋｏｓ，Ｋ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，５２３８−５２４８）。しかしながら、一方、２種類のＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体の結晶構造は、ＴＩＭＰが、対応するＭＭＰと広範囲に接触していることも示すというデータもある。
【００１２】
また、従来、ジエチルピロカーボネートを用いるＴＩＭＰ−１の化学修飾は、阻害活性を消滅させると報告されてきた。修飾される残基は、ＴＩＭＰ−１のＨｉｓ−９５、Ｈｉｓ−１４４およびＨｉｓ−１６４であり、Ｈｉｓ−９５の修飾は、活性の低下に関与していると考えられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎｇａｌ，Ｓ．，および  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２０３，１４７−１５４）。しかしながら、部位特異的変異導入による研究は、Ｈｉｓ−９５のグルタミンへの置換が、ＴＩＭＰ−１の阻害活性に影響を与えないことを示した（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎｇａｌ，Ｓ．，および  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２０３，１４７−１５４）。さらに、Ｈ９５Ｑ変異体は、ジエチルピロカーボネート処理に対してなお感受性である。これまでのところ、ＴＩＭＰ−１活性に対するジエチルピロカーボネートの作用については説明されていない。
【００１３】
このように、ＴＩＭＰのＭＭＰの阻害活性機構について、ＴＩＭＰがＭＭＰと複合体を形成することが知られており、そして、当該複合体の形成にはＴＩＭＰのＮ末端領域が関与していると推定されていた。しかしながら、その詳細は不明であり、またこのような機構の解明から癌の転移を有効に抑制する方法も得られていなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なＴＩＭＰ修飾体を提供することを目的とする。本発明のＴＩＭＰ修飾体は、ＴＩＭＰのＮＨ2末端α-アミノ基を電子吸引基で修飾し、メタロプロテイナーゼとの結合性を実質的に消失していることを特徴とする。
【００１５】
本発明のＴＩＭＰ修飾体は、好ましくは、ＴＩＭＰ−２修飾体である。
本発明において、好ましくは、前記電子吸引基はカルバミル基である。
本発明は、また、前記ＴＩＭＰ修飾体を加えることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害する方法を提供する。
【００１６】
本発明の阻害方法において、好ましくは、前記ＴＩＭＰ修飾体はＴＩＭＰ２修飾体であり、前記複合体はＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２およびゼラチナーゼＡを含む複合体である。
【００１７】
本発明は、さらに、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＴＩＭＰ修飾体を含む、薬学的に受容可能な担体と共に含む医薬用組成物を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明の医薬用組成物は、好ましくは、癌の転移抑制または血管新生抑制のために用いられる。
【００１９】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、ＴＩＭＰのＭＭＰの阻害活性機構を解明し、癌の浸潤・転移および血管内皮細胞の浸潤によって引き起こされる血管新生等の諸現象を有効に抑制するために鋭意研究につとめた結果、本発明を想到した。以下、より詳細に説明する。
【００２０】
本発明者らは、ＴＩＭＰのうち、ＴＩＭＰ−２につき以下のような仮説に基づき研究を行った。ＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端の反応性部位は、ＭＴ−ＭＭＰの活性部位に結合してプロテアーゼ−阻害剤複合体を形成し、一方、ＴＩＭＰ−２のＣＯＯＨ末端部分は、ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメインに対して親和性を有する。したがって、ＭＴ−ＭＭＰとＴＩＭＰ−２との間に形成された複合体は、プロゼラチナーゼＡの受容体として作用するという仮説が立てられる。この仮説は、ＭＴ−ＭＭＰの過発現が細胞表面上でのゼラチナーゼＡの蓄積を引き起こすという知見によって支持されると考えられる（Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．，および  Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，６１−６５）。
【００２１】
ＴＩＭＰ−２は、プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化における二機能調節因子である。Ｓｔｒｏｎｇｉｎら（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５３３１−５３３８）は、少量のＴＩＭＰ−２が、ＭＴ−ＭＭＰ含有細胞膜によるプロゼラチナーゼＡの活性を促進するが、過剰のＴＩＭＰ−２はＭＴ−ＭＭＰ活性を強く阻害することを示した。これは、ＴＩＭＰ−２のＭＴ−ＭＭＰに対する結合がプロゼラチナーゼＡに受容体を与える反面、ＭＴ−ＭＭＰの触媒活性は阻害するためであると説明されうる。
【００２２】
本発明者は、ヒト癌細胞系におけるゼラチナーゼＡ、ＴＩＭＰ−２および３種類のＭＴ−ＭＭＰの発現レベルを検討し、そしてプロゼラチナーゼＡの活性化が、培地中に分泌されたＴＩＭＰ−２のレベルとのみ強い逆の相関関係を有することを発見した。これにより、ＴＩＭＰ−２はプロゼラチナーゼＡの活性化の重要な調節因子であることが示唆された（Ｓｈｏｆｕｄａ，Ｋ．，Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｈａｓｈｉ，Ａ．，Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｓ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，Ｍｉｋｉ，Ｋ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，および  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）１２４，４６２−４７０）
また、前述したＴＩＭＰとＭＭＰとの複合体の結晶構造のデータによれば、
ＴＩＭＰ−１もＴＩＭＰ−２もＮＨ2末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基およびカルボニル酸素が、プロテアーゼの触媒亜鉛と相互作用していると推定され、よって、ＴＩＭＰのＮＨ2末端のＣｙｓ−１による触媒亜鉛原子のキレート化は、ＭＭＰ活性の阻害に共通の機序であると考えられる。
【００２３】
上述のような仮説に基づき、本発明者はＴＩＭＰ−２において、ＭＭＰとの結合に関与していると予測されるＮＨ2末端部位を修飾したＴＩＭＰ−２修飾体を製造した。そして、プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に対するＴＩＭＰ−２修飾体の作用について検討した。その結果、シアネートイオンでＴＩＭＰ−２を処理したところ、マトリライシンまたはゼラチナーゼＡに対する阻害活性の低下をもたらすことを見出した。ＴＩＭＰ−２修飾体の構造的および機能的分析により、阻害活性の低下はＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端Ｃｙｓ−１のα−アミノ基のカルバミル化によることが示された（実施例）。
【００２４】
従って、本発明はＴＩＭＰのＭＭＰとの結合に関与するＮＨ2末端を修飾し、ＭＭＰとの結合性を実質的に消失しているＴＩＭＰ修飾体を提供する。
既に記載したように、ＴＩＭＰは既に４つの型が発見されており、ＴＩＭＰ−１ないしＴＩＭＰ−４と命名されている。それらのアミノ酸配列を各々配列表の配列番号１ないし４に示す。いずれの型も前駆体として産生され、後にシグナル配列が切断されて成熟体となる。シグナル配列の切断は、いずれの型もアラニンとシステインの間で起こる。即ち、ＴＩＭＰ−１では、アミノ酸残基番号で第２３番目と第２４番目の間が、ＴＩＭＰ−２では第２６番目と第２７番目の間が、ＴＩＭＰ−３では第２３番目と第２４番目の間が、そして、ＴＩＭＰ−４では第２９番目と第３０番目の間が切断される。よって、成熟体はいずれもＮ末端がシステイン残基となる。
【００２５】
ＴＩＭＰは、Ｔ９８Ｇヒトグリア芽腫細胞、ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫細胞系の馴化培地等の材料より、公知の方法（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．，Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，および  Ｕｍｅｄａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４３８７−１４３９３；ならびにＣｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．，Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６５７９−６５８７）を用いて精製することができる。または、本明細書の配列表に記載されているように、アミノ酸配列も公知であり、遺伝子工学的手法により産生させることもできる。遺伝子工学的手法によるタンパク質の産生は当業者に熟知されており、当業者は本明細書に基づいて、ＴＩＭＰを得ることが可能である。
【００２６】
本発明のＴＩＭＰ修飾体は、好ましくは、ＴＩＭＰ−２の修飾体である。しかしながら、本発明のＴＩＭＰ修飾体は特定の型のＴＩＭＰに限定されず、ＴＩＭＰ−１等他の修飾体も含まれる、配列表の配列番号Ｎｏ．１ないしＮｏ．４に記載されたアミノ酸配列からも、特にＮＨ2末端領域の配列は相同性が高いことがわかる。さらに、前述したように、ＭＭＰとの結合体は、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２のいずれもＮＨ2末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基およびカルボニル酸素が、プロテアーゼの触媒亜鉛と相互作用していると推定され、よって、ＴＩＭＰのＮＨ2末端のＣｙｓ−１による触媒亜鉛原子のキレート化は、ＭＭＰ活性の阻害に共通の機序であると考えられる。よって、いずれのＴＩＭＰにおいても共通してＮＨ2末端を修飾することにより、ＭＭＰとの結合性を実質的に消失すると考えられる。
【００２７】
本発明においては、上述したように、成熟ＴＩＭＰの遊離ＮＨ2末端を修飾する。修飾は、電子吸引性の基であれば既知のものを用いることができる。例えば、限定されるわけではないが、カルバミル基、アセチル基、アミジノ基、トリニトロフェニル基等である。カルバミル基が好ましい。
【００２８】
電子吸引性の基による末端ＮＨ2の修飾は、特に限定されず、公知の方法を用いることによって行える。例えば、カルバミル基によって修飾する場合、先ず、水溶液中、ＫＮＣＯを用いて、２０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１０分から５時間、好ましくは２０分から３０分間反応させる。緩衝液としては、トリス−ＨＣｌ、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）−ナトリウム、リン酸緩衝液等を用いることができる。ｐＨは、７．０−８．５の範囲内である。次いで、ヒドロキシアミン塩酸塩等のヒドロキシルアミンの塩を添加し反応を停止させることにより、カルバミル基導入量を調節することができる。反応は、１０℃から２５℃、好ましくは２０℃から２５℃で、３０分から２時間、好ましくは６０分から２時間行う。
【００２９】
さらに、電子吸引性の基を導入された修飾ＴＩＭＰを、アフィニティーカラム等により、非修飾ＴＩＭＰと分離することができる。アフィニティーカラムの担体に固定する物質としては、各ＴＩＭＰのＮＨ2末端の反応性部位とのみと結合性を有するもの、例えば、ＴＩＭＰ−２の場合は、マトリライシン、ストロムライシン等を固定化物質として使用できる。
【００３０】
上述のようにして得られた本発明のＴＩＭＰ修飾体は、末端ＮＨ2が修飾されているため、ＭＭＰと結合することができず、よって複合体を生成できない。例えば、本明細書の実施例において、１個のカルバミル化されたα−アミノ基を有する修飾ＴＩＭＰ−２は、マトリライシンとの親和性をもたなかった。理論にしばられるわけではないが、ＴＩＭＰの末端ＮＨ2を電子吸引性の基で修飾することにより、アミノ基のＮα窒素の塩基度の減少がもたらされ、これによりＮα窒素がＭＭＰの触媒中心である亜鉛原子に配位できないようにさせ、それによってＴＩＭＰ−２の阻害活性を消滅させると考えられる（図７Ａ）。
【００３１】
一方、本発明のＴＩＭＰ修飾体はＣ末端側は修飾されていない。よって、本発明ではＴＩＭＰのＣ末端領域の関与する反応は阻害されない点をその特徴の一つとする。例えば、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２は、活性型となる前の潜在型（プロ型）ＭＭＰとも複合体を形成することが知られており、ＴＩＭＰ−１は潜在型ＭＭＰ−９と、ＴＩＭＰ−２はプロゼラチナーゼＡ（潜在型ＭＭＰ−２）と、Ｃ末端領域同士の親和性により結合することが知られている（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｗ，Ｇ．，Ｂｏｄｄｅｎ，Ｍ．Ｋ．ら：Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４，１９７−２５０（１９９３）；  Ｎａｇａｅ，Ｈ．：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８，１５１−１６０（１９９７））。即ち、ＴＩＭＰ−２は、Ｎ末端領域でＭＴ１−ＭＭＰと結合し、一方、Ｃ末端側でプロゼラチナーゼＡと結合し、三分子複合体を形成すると推測されている。プロゼラチナーゼＡが活性型のゼラチナーゼＡになるためには、当該三分子複合体を形成することが必要であるとするモデルが考えられている（図７Ｂ）。
【００３２】
本発明のＴＩＭＰ修飾体は、末端ＮＨ2を修飾されており、ＭＭＰ、例えば、ＴＩＭＰ−２の場合はＭＴ１−ＭＭＰと結合できない一方、Ｃ末端は修飾されていないので、プロゼラチナーゼＡとの結合が可能である（図５）。よって、プロゼラチナーゼＡとの結合において天然のＴＩＭＰ−２と競合する一方、ＭＴ１−ＭＭＰとは結合せず、ＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害する。従って、このようなＴＩＭＰの複合体の形成により促進される反応が、調節、抑制される。一方、ＮＨ2末端が結合するＭＭＰ自体の酵素活性機能には無関係である。例えば、本発明のＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ１−ＭＭＰの触媒活性を阻害することなく、プロゼラチナーゼＡの活性化を阻害できる（図７Ａ）。このようにＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ１−ＭＭＰのプロテアーゼ活性自体と、ＴＩＭＰと結合して複合体を形成し、プロゼラチナーゼＡの活性化を促進する機能とを区別する有用な手段である。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明のＴＩＭＰ修飾体を含む、薬学的に受容可能な担体と共に含む医薬用組成物を提供する。
本発明の医薬用組成物は、ＭＭＰが関与する癌の転移および血管新生の抑制、並びにこれらに伴う疾患を予防、治療するために有用である。具体的には、特に、胃癌、大腸癌、肺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌等の癌の転移およびそれにおける血管新生等の予防、治療に有用である。
【００３４】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、ＴＩＭＰの治療上有効な量を含む。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に、経口的または静脈内、皮下内、筋肉内等の非経口的に投与しうる。
【００３５】
経口的に投与される場合、錠剤、散剤、液状等公知の所望の形態を採用しうる。製剤化には、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、結合剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等、公知の所望の製剤化のための補助剤を使用しうる。
【００３６】
また、非経口的に投与可能なＴＩＭＰタンパク質溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行いうる。
本発明の組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／もしくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定されうる。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【００３７】
【実施例】
本願明細書に記載する実施例は、下記の「実験手順」によって行った。
実験手順
材料
用いられた材料の由来は次の通りであった。Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（大阪，日本）からの３１６７−ｖ（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−ノルバリル−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｎε−（２，４−ジニトロフェニル）−リシンアミド）；和光純薬株式会社（大阪）からのシアン酸カリウム；東京化成（東京，日本）からのｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀（ＡＰＭＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ウプサラ，スウェーデン）からのＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ；Ｂｅｃｋｍａｎ（フラートン，ＣＡ）からの  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ  ５Ｕ（２．０×１５０ｍｍ）。Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトンで処理されたウシ膵臓トリプシンは、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（フリーホールド，ＮＪ）から購入され；植物レクチンコンカナバリンＡ（ＩＶ型，実質的に炭水化物不含）は  Ｓｉｇｍａ（セント・ルイス，ＭＯ）から；ゼラチンは  Ｄｉｆｃｏ（デトロイト，ＭＩ）からであった。組換えヒトマトリライシンは、オリエンタル酵母工業株式会社製（滋賀，日本）のものを使用した。他の化学薬品は全て、分析用または商業的に入手可能なものを使用した。
タンパク質
ＴＩＭＰ−２不含およびＴＩＭＰ−２結合型のプロゼラチナーゼＡは、前に記載されたように（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．，Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，および  Ｕｍｅｄａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４３８７−１４３９３）、Ｔ９８Ｇヒトグリア芽細胞腫細胞系の馴化培地（以下、「ＣＭ」と言う）から別個に精製した。ＴＩＭＰ−２は、Ｃｏｌｌｉｅｒ  ら（Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，ＧｒａｎｔＧ．Ａ．，Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６５７９−６５８７）の方法にしたがってＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ  ＲＰ−４  逆相カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ；ラフィエット，ＩＮ）を用いて、ＴＩＭＰ−２結合プロゼラチナーゼＡから精製した。プロゼラチナーゼＡに対するウサギ抗血清は、公知の方法を用いて製造したものを使用した。
ＫＮＣＯを用いるＴＩＭＰ−２の化学修飾
５０μｌの１．０Ｍ  ＫＮＣＯを、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１％ＮａＮ3を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（トリス緩衝食塩水；ＴＢＳ）中に５００ピコモルのＴＩＭＰ−２を含有した２００μｌのタンパク質溶液に対して加えた。その混合物を３７℃で０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および２４０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物から得られた５０μｌの各試料を２０μｌの１．０Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ８．０）と混合し、そして２５℃で１時間インキュベートして修飾反応を終結させた。得られた反応混合物をＴＢＳに対して４℃で透析した。
化学修飾後のＴＩＭＰ−２の阻害活性の検定
種々の条件下でのＴＩＭＰ−２の修飾後、種々の濃度のＴＩＭＰ−２修飾体を、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．０１％のＢｒｉｊ３５を含有する９０μｌのＴＢＳ中のマトリライシン（３３ｎＭ）と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。それら混合物を、１０μｌの１ｍＭの３１６７ｖと一緒に加え、そして更に４０分間インキュベートした。その反応物を、１００μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えることによって終結させた。マトリライシンによって加水分解された３１６７ｖの量を、３６０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を用いて蛍光定量法によって測定した。酵素非存在下で加水分解された３１６７ｖの量を、加水分解された基質の全量から差引いた。ＴＩＭＰ−２（１５０μｇ）を、５００μｌのＴＢＳ中０．２Ｍ  ＫＮＣＯと一緒に３７℃で２５分間インキュベートした。この処理は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性の５０％減少を引き起こした。
部分カルバミル化後の活性および不活性ＴＩＭＰ−２の分離
ＫＮＣＯで処理したＴＩＭＰ−２試料を、０．２Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩と一緒に２５℃で１時間更にインキュベートした後、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2含有ＴＢＳに対して４℃で充分に透析した。活性ＴＩＭＰ−２と不活性ＴＩＭＰ−２を分離するために、マトリライシン１００μｇを５００μｌのＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂに対して結合させたマトリライシン−セファロース４Ｂカラムに対してその反応混合物を加え、そして不活性ＴＩＭＰ−２を含有する流出（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分を集めた。１０ｍＭ  ＣａＣｌ2含有ＴＢＳでカラムを洗浄後、吸着した試料（活性ＴＩＭＰ−２）を、４Ｍグアニジン塩酸塩および２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＴＢＳで溶離した。溶離後、そのカラムを、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および５０μＭ  ＺｎＣｌ2を含有するＴＢＳで、次いで１０ｍＭ  ＣａＣｌ2含有ＴＢＳで逐次的に洗浄して、固定されたマトリライシンを再生した。流出画分および溶離画分中のＴＩＭＰ−２試料を、リン酸緩衝溶液に対して別々に透析した。
ＴＩＭＰ−２修飾体によるゼラチナーゼＡ活性の阻害検定
ＴＩＭＰ−２不含型のプロゼラチナーゼＡを、前に記載されたように（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．，Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，および  Ｕｍｅｄａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４３８７−１４３９３）、１ｍＭ  ＡＰＭＡと一緒に３７℃で１時間インキュベートすることによって活性化させた。活性型ゼラチナーゼＡ（８９ｎＭ）を、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．０１％Ｂｒｉｊ３５を含有する９０μｌのＴＢＳ中の種々の濃度のＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理誘導体と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。それら混合物を、１０μｌの１ｍＭ３１６７ｖと一緒に加え、そして更に４０分間インキュベートした。１００μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えることによって反応を終結させた。加水分解された３１６７ｖの量を上記のように測定した。
マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の還元およびＳ−カルボキサミドメチル化
マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２それぞれ（１０μＭ）を、４Ｍグアニジン塩酸塩および２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＴＢＳ中１００ｍＭジチオトレイトールと一緒に５０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、それら試料を氷水の容器に移し、そして２４０ｍＭヨードアセトアミドと一緒に更にインキュベートした。２時間後、試料をＴＢＳに対して透析した。
細胞培養物並びにＣＭおよび細胞溶解産物の調製
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地およびハムのＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ；グランド・アイランド，ＮＹ）の１：１混合物、ＤＭＥ／Ｆ１２中で半密集まで増殖させた。それら細胞を血清不含ＤＭＥ／Ｆ１２で３回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ／Ｆ１２中の種々の濃度のＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−２修飾体および一定濃度のコンカナバリンＡ（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で培養を更に続けた。２４時間後、得られたＣＭを集め、遠心分離によって清澄にし、そして蒸留水に対して４℃で透析した。次に、試料を凍結乾燥させ、そして５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０％グリセロールから成る少量のドデシル硫酸ナトリウム試料採取用緩衝液中に溶解させた。これら手順により、初期ＣＭを２０倍に濃縮した。細胞溶解産物を調製するために、細胞をリン酸緩衝溶液で３回洗浄後、少量のドデシル硫酸ナトリウム試料採取用緩衝液中に溶解させた。
リガンドブロッティング分析
ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−２修飾体を、非還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上のタンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  装置（リッチモンド，ＣＡ）を用いてニトロセルロース膜上に移した。その膜を、５％脱脂乳含有ＴＢＳを用いて室温で１２時間遮断し、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−トゥイーン）で洗浄後、ＴＢＳ−トゥイーン中においてプロゼラチナーゼＡ（５μｇ／ｍｌ）と一緒に室温でインキュベートした。３時間後、膜をＴＢＳ−トゥイーンで洗浄し、そしてＴＢＳ−トゥイーンで１０００倍に希釈された抗プロゼラチナーゼＡ抗血清と一緒に３時間インキュベートした。ＴＢＳ−トゥイーンで洗浄後、膜を１０００倍希釈ビオチニル化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；バーリンゲーム，ＣＡ）とインキュベートし、ＴＢＳ−トゥイーンで洗浄後、アビジン−アルカリ性ホスフェート（Ｖｅｃｔｏｒ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。その膜を充分に洗浄後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウムを含有する反応混合物中でインキュベートして、膜上に着色生成物を生じさせた。
ゼラチンザイモグラフィー
ザイモグラフィーは、Ｍｉｙａｚａｋｉら（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｙ．，Ｕｍｅｎｉｓｈｉ，Ｆ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，およびＵｍｅｄａ，Ｍ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，７７５８−７７６４）に記載されたように、ゼラチン１ｍｇ／ｍｌを含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。
アミノ末端配列分析
試料を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７Ａ  気相シークエンサーで分析した。フェニルチオヒダントイン誘導体を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １２０Ａ  ＰＴＨ  分析器を用いてオンラインシステムで検出した。
質量分析
ＴＩＭＰ−２のトリプシンペプチド（１０ピコモル／μｌ）を、等容量のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸１０ｍｇを、０．１％トリフルオロ酢酸含有５０％アセトニトリル１ｍｌ中に溶解させた）と一緒に混合した。試料／マトリックス溶液を、飛翔質量分析（ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）のマトリックス介助レーザー脱離イオン化時間のために試料プレート上に滴下した後、周囲条件下で乾燥させた。質量スペクトルは、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（商標）ＳＴＲ  システム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；フレーミンハム，ＭＡ）で得られた。
実施例
阻害活性に対するＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理の効果
ＴＩＭＰ−１とストロムライシンとの間に形成される複合体の最近確認された結晶構造は、ＴＩＭＰ−１のＮＨ2末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基が、ストロムライシンの活性部位の触媒亜鉛原子に対して結合し、したがって、ＴＩＭＰ−１の阻害作用において本質的な役割を果たすことを示唆している（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ，Ｆ．Ｘ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｋ．，Ｂｅｔｚ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｎｅｒ，Ａ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｂｒｅｗ，Ｋ．，Ｂｏｕｒｅｎｋｏｖ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｒｔｕｎｉｋ，Ｈ．，および  Ｂｏｄｅ，Ｗ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，７７−８１）。ＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端部分の構造はＴＩＭＰ−１のそれと相同であるので、ＴＩＭＰ−２のＣｙｓ−１のα−アミノ基は、ＴＩＭＰ−１のそれに対応して、ＴＩＭＰ−２の阻害作用に重要でありうる。この可能性を検討するために、本発明者は、種々の条件下においてＴＩＭＰ−２をＫＮＣＯで処理することによってＣｙｓ−１のα−アミノ基をカルバミル化することを試みた。そしてＴＩＭＰ−２修飾体を、３１６７ｖのマトリライシンに触媒された加水分解を阻害するそれらの能力について調べた。図１Ａで示されるように、ＴＩＭＰ−２とＫＮＣＯとのインキュベーションは、阻害のＩＣ50値の増加をもたらした。このＩＣ50は、マトリライシンの活性の５０％阻害を与えるＴＩＭＰ−２修飾体の濃度を示している。ＫＮＣＯとのインキュベーション時間に対するＩＣ50の逆の値をプロットした場合、１／ＩＣ50値は、ＫＮＣＯとのインキュベーション時間の増加に伴って減少し、そして１／ＩＣ50値の５０％減少は、インキュベーション時間が２５分である場合に観察された（図１Ｂ）。ＴＩＭＰ−２の阻害活性は、ＫＮＣＯとの４時間のインキュベーション後に消滅した。
ＴＩＭＰ−２の部分修飾後の活性および不活性画分の分離
「実験手順」で記載されたように、ＴＩＭＰ−２を０．２Ｍ  ＫＮＣＯを用いて３７℃で２５分間処理した。この修飾は、ＴＩＭＰ−２の５０％阻害活性の減少をもたらした（図１）。次に、部分修飾されたＴＩＭＰ−２を、マトリライシン−セファロース４Ｂカラムで分離した。分離後、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分はほぼ同量のタンパク質を含有し（データは示されていない）、分離前の修飾ＴＩＭＰ−２の約５０％は、マトリライシンに対してほとんど親和性がなかったことが示唆された。マトリライシン結合画分および天然ＴＩＭＰ−２は、３１６７ｖのマトリライシンに触媒された加水分解を阻害する同様の能力を示した（図２Ａ）。対照的に、マトリライシン非結合画分は、阻害活性がなかった。マトリライシン非結合画分は、ＡＰＭＡ活性ゼラチナーゼＡに対しても不活性であった（図２Ｂ）。これらデータは、ＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯでの処理が、ＴＩＭＰ−２の末端ＮＨ2の修飾をもたらし、したがって、プロテアーゼ阻害複合体の形成を妨げるという知見と一致する。
ＴＩＭＰ−２の阻害活性の減少に関与する修飾部位の決定
阻害活性の減少に関与する修飾部位を決定するために、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中の試料を還元し且つＳ−カルボキサミドメチル化した後、トリプシン消化を施し、その後、消化物を逆相ＨＰＬＣによって分離した。２種類の溶離プロフィール間で認められる違いは、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分それぞれからのＢ−２０およびＵ−２１のピークだけであった（図３ＡおよびＢ）。それらペプチドの質量分析（図４ＡおよびＢ）は、Ｂ−２０およびＵ−２１の分子質量がそれぞれ、２３４５．２２および２３８８．２６であることを示した。測定された分子質量に基づき、Ｂ−２０は、ヒトＴＩＭＰ−２の残基１ないし２０に該当するペプチドとされる。もう一方で、Ｂ−２０とＵ−２１との間の分子質量の差はカルバミル付加物の質量に相当し、Ｕ−２１は、１個のカルバミル化アミノ基を有するＴＩＭＰ−２の残基１ないし２０に該当するペプチドであることが示唆される。
【００３８】
更に、Ｂ−２０についてのＮＨ2末端配列分析においてＴＩＭＰ−２の残基１ないし１９に該当する配列が決定されたが、第１番目、第３番目および第１３番目の残基は、Ｓ−カルボキサミドメチルシステインのフェニルチオヒダントイン誘導体として検出された。一方、Ｕ−２１のＮＨ2末端配列分析において、アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体は検出されなかった。これらの結果は、Ｂ−２０およびＵ−２１が、残基１ないし２０に該当するＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端部分から誘導されたペプチドであること、およびＵ−２１のＣｙｓ−１のα−アミノ基はカルバミル化されていることを示している。
これらの結果は、ＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基のカルバミル化が、ＴＩＭＰ−２の失活をもたらすということも示唆している。
プロゼラチナーゼＡ結合能力に対するＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理の効果
ＭＭＰ阻害活性に加えて、ＴＩＭＰ−２は、プロゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメインと相互作用する能力も有する。ＴＩＭＰ−２のカルバミル化がプロゼラチナーゼＡ結合能力に影響を与えるかどうか調べるために、ＫＮＣＯで処理されたＴＩＭＰ−２のマトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分並びに天然ＴＩＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力について、「実験手順」で記載のリガンドブロッティング分析を用いて試験した。図５で示されるように、天然ＴＩＭＰ−２並びにマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯ処理されたＴＩＭＰ−２およびマトリライシン結合画分中のそれは、プロゼラチナーゼＡと結合する同様の能力を有し、ＴＩＭＰ−２のカルバミル化が、プロゼラチナーゼＡとの相互作用にほとんど影響しないことが示唆された。
プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に対するＴＩＭＰ−２修飾体および天然ＴＩＭＰ−２の効果
ＭＴ−ＭＭＰとＴＩＭＰ−２との間に形成された複合体は、プロゼラチナーゼＡの受容体として作用し、そしてその三分子複合体の形成は、プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に不可欠であるという仮説が立てられた（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４０３３−１４０３９；  Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５３３１−５３３８；  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｏｋａｄａ，Ａ．，Ｏｈｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｉｍａｉ，Ｋ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，および  Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１６０９８−１６１０３）。カルバミル化されたＴＩＭＰ−２のマトリライシン非結合画分は、ＭＭＰの活性部位と相互作用する反応性部位を失っているが、プロゼラチナーゼＡ結合部位を保持しているので、ＴＩＭＰ−２修飾体は、プロゼラチナーゼＡの限られた数のＴＩＭＰ−２結合部位に関して競合することによってその三分子複合体の形成を妨げることができると考えられる。この可能性を検討するために、種々の濃度の修飾型および非修飾型のＴＩＭＰ−２並びに天然ＴＩＭＰ−２を、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１０８０細胞のＣＭに対して加え、そして細胞溶解産物中の様々な種類の内因性ゼラチナーゼＡおよびＣＭ中のそれらを、ゼラチンザイモグラフィーによって分析した。図６Ａで示されるように、細胞に結合した成熟型のゼラチナーゼＡは、マトリライシン非結合画分中の不活性のＴＩＭＰ−２修飾体の濃度の増加に伴って徐々に減少した。細胞溶解産物中のプロゼラチナーゼＡおよびプロゼラチナーゼＢは、ＴＩＭＰ−２修飾体によって影響されなかった。これら検出されたチモーゲンは、細胞から分泌される前のタンパク質でありうる。ＣＭ中では、ゼラチナーゼＡの中間型はＴＩＭＰ−２修飾体の存在下、顕著に減少しなかったものの、成熟型はＴＩＭＰ−２修飾体の濃度が３６ｎＭまたはそれ以上まで増加するに伴いほとんど消滅した。一方、プロゼラチナーゼＡの量はＴＩＭＰ−２の濃度の増加に伴って増加した（図６Ｂ）。これは、内因性プロゼラチナーゼＡの中間型への変換は部分的に阻害されたが、中間型の成熟型への変換は、高濃度のＴＩＭＰ−２修飾体の存在下において強く阻害されたことを示唆した。ＣＭ中の成熟型ゼラチナーゼＡの消失は、細胞結合成熟型の減少と平行していた。したがって、中間型の成熟型への変換は、細胞に結合した活性ゼラチナーゼＡに依存しうる。もう一方において、マトリライシン結合画分中の活性ＴＩＭＰ−２を濃度を変化させながらＨＴ１０８０細胞の培養物中に加えた場合、細胞結合成熟型のゼラチナーゼＡは、４．５ｎＭの活性ＴＩＭＰ−２で僅かに増加した後、更に高濃度では急激に減少した（図６Ａ）。ＣＭ中のゼラチナーゼＡの成熟型および中間型両方が消失したが、プロゼラチナーゼＡは、活性ＴＩＭＰ−２の濃度の増加に伴って増加した。よって、プロゼラチナーゼＡ���ＭＴ−ＭＭＰによるプロセシングは、活性ＴＩＭＰ−２の存在下で阻害されたことが示唆された。ＣＭ中のゼラチナーゼＡの成熟型および中間型の消失は、細胞結合成熟型の減少とも平行していた。活性ＴＩＭＰ−２によるプロゼラチナーゼＡのプロセッシングの阻害は、細胞結合プロゼラチナーゼＡの量の増加を伴わなかったので、細胞結合チモーゲンは、高濃度のＴＩＭＰ−２存在下、細胞表面から遊離すると考えられる。
【００３９】
細胞結合ゼラチナーゼＡに対する作用およびプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に対するマトリライシン結合画分中の活性ＴＩＭＰ−２の作用は、天然ＴＩＭＰ−２の作用とほぼ同様であった（データは示されていない）。
以上の実施例において、ＴＩＭＰ−２修飾体を、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１０８０細胞の培地に対して加えた場合、内因性プロゼラチナーゼＡの中間型への変換は部分的に阻害され、その中間型の成熟型への変換は強く阻害された。本発明のＴＩＭＰ−２修飾体は、細胞表面上での活性型ゼラチナーゼＡの蓄積をも妨げた。理論に縛られるわけではないが、本発明者は、ＴＩＭＰ−２修飾体によるゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメインの占有が、ゼラチナーゼＡを細胞表面上に保持できないようにさせ、それによってゼラチナーゼＡの中間型からその成熟型への自己触媒的変換を妨げると推測している。
【００４０】
本発明者は、ゼラチナーゼＡの中間型の成熟型への変換がゼラチナーゼＡの細胞に結合した活性に依存しているので、ＴＩＭＰ−２修飾体による細胞に結合した活性型ゼラチナーゼＡの喪失は、成熟型の生産の阻害を引き起こすということも考えている。実際、高濃度のＴＩＭＰ−２修飾体の存在下において、ＣＭ中の成熟型ゼラチナーゼＡの消失は、細胞に結合した活性ゼラチナーゼＡの減少と平行していた（図６）。
【００４１】
ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成の重要性を考えると、ＴＩＭＰ−２によるプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化の阻害は、二つの別の方法で説明できると考えられる。一つの解釈は、過剰のＴＩＭＰ−２が、ＭＴ−ＭＭＰの活性部位および（プロ）ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメイン中のＴＩＭＰ−２結合部位両方を占有し、それによって三分子複合体の形成を妨げるということである（図７Ｂ）。もう一つの解釈は、ＴＩＭＰ−２がＭＴ−ＭＭＰの触媒活性を阻害し、それによってプロゼラチナーゼＡのタンパク質分解過程を阻害するということである。
【００４２】
本発明者は、天然ＴＩＭＰ−２もＴＩＭＰ−２修飾体も、細胞結合プロゼラチナーゼＡを増加させることなく、細胞表面上での活性ゼラチナーゼＡの蓄積を防止しうることを発見した。これらデータは、三分子複合体の形成の防止が、ＴＩＭＰ−２によるプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化の阻害の原因となることを示唆している。
【００４３】
過剰天然ＴＩＭＰ−２は、ゼラチナーゼＡの中間型の生産を阻害したが、ＴＩＭＰ−２修飾体は阻害しなかった。したがって、ＴＩＭＰ−２によるＭＴ−ＭＭＰの触媒活性の阻害は、プロゼラチナーゼＡのプロセッシングの阻害の原因となるということも考えられる。ＣＭ中の成熟型および中間型ゼラチナーゼＡの消失並びに細胞に結合した活性ゼラチナーゼＡの減少は、同様の濃度の非修飾ＴＩＭＰ−２で認められたので（図６）、三分子複合体の形成の防止およびＭＴ−ＭＭＰ活性の阻害は、臨界的濃度のＴＩＭＰ−２存在下、同時に起こりうる（図７Ｂ）。それら機序の両方が、ＴＩＭＰ−２がプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化の調節因子になり得る要因であると考えられる。
【００４４】
図面の詳細な説明
図１は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性に対するＫＮＣＯの効果を示す。ＴＩＭＰ−２（２μＭ）を、ＴＢＳ中０．２Ｍ  ＫＮＣＯと一緒に３７℃で０分間（●）、３０分間（○）、６０分間（▲）、１２０分間（△）および２４０分間（ｘ）インキュベートした。インキュベーション後、それぞれの試料をヒドロキシルアミン塩酸塩で処理し、そして「実験手順」で記載されたようにＴＢＳに対して透析した。パネルＡでは、マトリライシン（３０ｎＭ）を、種々の濃度のＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯで処理された誘導体の存在下において０．１ｍＭの３１６７ｖと一緒に３７℃で４０分間インキュベートした。反応混合物は全て、ＴＢＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．０１％Ｂｒｉｊ３５を含有した。マトリライシンによって加水分解された３１６７ｖの量を１００％として、各濃度のＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理誘導体の存在下でマトリライシンによって加水分解された３１６７ｖの相対量を縦座標で示す。パネルＢでは、ＫＮＣＯとのインキュベーション時間に対するパネルＡで得られたＩＣ50の逆の値をプロットしている。ＩＣ50は、マトリライシンの活性の５０％阻害を与えるＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理誘導体の濃度を示す。
【００４５】
図２は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の阻害活性を示す。ＫＮＣＯでの処理後、部分修飾されたＴＩＭＰ−２を、「実験手順」で記載されたようにマトリライシン−セファロース４Ｂカラムを用いて分離した。マトリライシン（３０ｎＭ，パネルＡ）およびＡＰＭＡ活性化ゼラチナーゼＡ（８０ｎＭ，パネルＢ）をそれぞれ、マトリライシン結合（●）およびマトリライシン非結合（○）画分中の種々の濃度のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の存在下において、０．１ｍＭの３１６７ｖと一緒に３７℃で４０分間インキュベートした。反応混合物は全て、ＴＢＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．０１％Ｂｒｉｊ３５を含有した。酵素によって加水分解された３１６７ｖの量を１００％として、各濃度のＫＮＣＯ処理型ＴＩＭＰ−２の存在下で酵素によって加水分解された３１６７ｖの相対量を縦座標で示す。
【００４６】
図３は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２のトリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。マトリライシン結合（パネルＡ）およびマトリライシン非結合（パネルＢ）画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２をそれぞれ、「実験手順」で記載されたように還元し且つＳ−カルボキサミドメチル化した後、１：１００（ｗ／ｗ）の酵素対基質比のトリプシンを用いて３７℃で２４時間消化した。消化物を  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ  ５Ｕカラム（２．０×１５０ｍｍ）に加え、そして０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの直線勾配を用いて０．５ｍｌ／分の流速で溶離した。カラム溶出液を２０６ｎｍで監視したが（実線）、破線はカラム基材中のアセトニトリルの百分率を示す。
【００４７】
図４は、Ｂ２０およびＵ−２１の質量スペクトルを示す。ＯＤＳカラムから得られたピークＢ−２０（パネルＡ）およびＵ−２１（パネルＢ）を、マトリックス溶液として１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸／５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を用いて、マトリックス介助レーザー脱離イオン化時間の飛翔質量分析に供した。
【００４８】
図５は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力を示す。マトリライシン非結合画分（Ｎ末端修飾されたＴＩＭＰ−２）およびマトリライシン結合画分（非修飾ＴＩＭＰ−２）中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２並びに天然ＴＩＭＰ−２の指定量を、「実験手順」で記載されたようにリガンドブロッティング分析に供した。縦座標は、ｋＤａの分子寸法を示す。
【００４９】
図６は、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１０８０細胞の溶解産物およびＣＭ中でのプロゼラチナーゼＡのプロセッシングに対するＮ末端修飾および非修飾ＴＩＭＰ−２の効果を示す。ＨＴ１０８０細胞を、血清不含培地中において、マトリライシン非結合画分（Ｎ末端修飾ＴＩＭＰ−２）およびマトリライシン結合画分（非修飾ＴＩＭＰ−２）中の指定された濃度のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２並びに一定濃度（１００μｇ／ｍｌ）のコンカナバリンＡと一緒にインキュベートした。細胞溶解物（パネルＡ）およびＣＭ（パネルＢ）を、インキュベートされた細胞から調製し、そして「実験手順」で記載されたようにゼラチンザイモグラフィーに供した。くさび形は、６６ｋＤａのプロゼラチナーゼＡ（上段）、５９ｋＤａの中間型（中段）および５７ｋＤａの成熟型（下段）のゼラチン分解バンドを示す。９０ｋＤａの矢印は、プロゼラチナーゼＢのゼラチン分解バンドを示す。縦座標、ｋＤａでの分子寸法。
【００５０】
図７は、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成に対するＴＩＭＰ−２修飾体および天然ＴＩＭＰ−２の阻害作用についての仮説モデルを示す。
【００５１】
パネルＡにおいて、ＴＩＭＰ−２修飾体は、（プロ）ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメインに関して競合することにより、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成を阻害する。ＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ−ＭＭＰの活性部位と相互作用できない。パネルＢにおいて、過剰量の天然ＴＩＭＰ−２は、ＭＴ−ＭＭＰの活性部位および（プロ）ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメイン両方を占有することによって三分子複合体の形成を阻害する。図中、Ｈ2Ｎは、ＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基を、Ｈ2ＮＣＯＮＨは、ＴＩＭＰ−２のＮＨ2末端のＣｙｓ−１がカルバミル化されたα−アミノ基を、そして、Ｚｎ2+は、メタロプロテイナーゼの触媒亜鉛原子を示す。
【００５２】
【効果】
本発明者は、ＴＩＭＰによるＭＭＰの活性化機構を解明し、ＴＩＭＰ修飾体によりＴＩＭＰの複合体の形成により促進される反応を調節、抑制することが可能となった。一方、ＮＨ2末端が結合するＭＭＰ自体の酵素活性機能は影響を受けない。例えば、本発明のＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ１−ＭＭＰの触媒活性を阻害することなく、プロゼラチナーゼＡの活性化を阻害できる（図７Ａ）。
【００５３】
癌の転移の研究において、ＭＭＰ活性を直接阻害する金属酵素阻害剤が数多く研究・試験されている。例えば、ＢＥ−１６６２７Ｂ、Ｓ１−２７等である。しかしながら、これらのＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ活性を広範囲に阻害してしまうため、種々の副作用が指摘されている。
【００５４】
また、ＴＩＭＰを含む複合体の生成を阻害するためには、例えば、天然ＴＩＭＰを過剰に投与する方法も考えられる（図７Ｂ）。しかしながら、この方法は、臨界量まではむしろ複合体の生成を促進する可能性がある。また、過剰量のＴＩＭＰによりＭＭＰ活性自体が阻害される可能性がある。
【００５５】
これらに対し、本発明のＴＩＭＰ修飾体は、このようにＭＭＰ自体の酵素活性を阻害せず、ＴＩＭＰの型により特異的に潜在型ＭＭＰの活性化を阻害できる。よって、上述のような副作用等の問題も生ぜず、また試験用の試薬としても有用である。
【００５６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性に対するＫＮＣＯの効果を示す。
【図２】図２は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の阻害活性を示す。
【図３】図３は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２のトリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。
【図４】図４は、Ｂ２０およびＵ−２１の質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力を示す。
【図６】図６は、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１０８０細胞の溶解産物およびＣＭ中でのプロゼラチナーゼＡのプロセッシングに対するＮ末端修飾および非修飾ＴＩＭＰ−２の効果を示す。
【図７】図７は、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成に対するＴＩＭＰ−２修飾体および天然ＴＩＭＰ０−２の阻害作用についての仮説モデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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