(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式５（式中、Ｂ１は核酸塩基、Ｒ１３はＴＦＡ、Ｒ１４は水酸基の保護基を示す）で表されるホスホン酸ヌクレオチドと下記構造式６（式中、Ｂ２は核酸塩基、Ｒ１５はＴＢＤＭＳを示す）で表されるヌクレオシドを反応させ、得られた下記構造式７（式中、Ｂ１は核酸塩基、Ｒ１６はＴＦＡ、Ｒ１７は水酸基の保護基、Ｒ１８はＴＢＤＭＳを示す）で表されるジヌクレオチドを光学分割することを特徴とする、下記構造式８（式中、Ｐ＊は光学活性なリン原子、Ｂ１、Ｂ２は核酸塩基、Ｒ１６はアミノ基の保護基であり、Ｒ１７は水酸基の保護基であり、Ｒ１８はリン酸基、ホスホロアミダイト基、を示す）で表され、そのリン原子上の立体が光学活性なホスホン酸ジエステル結合を持つジヌクレオチドの製造法。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性なホスホン酸ジエステル結合を持つＤＮＡプローブ及びその製造法に関するものである。本発明により得られるオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の同定、抽出さらには標的遺伝子の発現の調節に使用され、遺伝子工学、臨床診断、治療等の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
標的核酸の検出及び定量には、標的核酸がその中の特定核酸配列、即ち特定の核酸塩基配列と相補的な配列を有する核酸プローブと相補結合を形成する性質が利用されている。また、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイドなどのインターカレーター性色素は、二本鎖核酸と結合すると顕著な蛍光増感を示すことが知られている。
【０００３】
本出願人は、これらの性質を利用して、特定の核酸核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカレーター性色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの相補結合部分にインターカレーションするものであることを特徴とする特定核酸配列の検出法を発明した（特開平８−２１１０５０号公報参照）。
【０００４】
上記発明により、標的核酸の検出方法において、相補結合に関与しなかった余剰プローブを分離する工程等を必要とせずに、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の相補結合体の定量を可能とし、特定の核酸配列からなる核酸を均一系で簡便な一段階の操作により検出し得る標識核酸プローブ等を提供することができた。
【０００５】
プローブ核酸の標識方法については、限定的ではないが、標的核酸との相補結合形成に影響を与えないアミノアルキルホスホン酸をリンカーとして、プローブの中央部分にインターカレーターを標識することにより、標的核酸の配列の一塩基置換の検出も可能となった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
インターヌクレオチド結合のホスホン酸ジエステル結合には、そのリン原子上にキラル中心が存在する。即ち、オリゴヌクレオチドの中央部分に１カ所ホスホン酸が導入されたＤＮＡプローブには、絶対配置が、Ｒ体Ｓ体の二つの立体異性体が存在することになる。
【０００７】
遺伝子薬剤として広く研究されているアンチセンスＤＮＡとして用いられるメチルホスホン酸においては、その絶対配置により、相補鎖との結合安定性（Ｔｍ）、コンホメーション、核酸分解酵素に対する反応性などが異なることが知られている。
【０００８】
そこで本発明の目的は、アミノアルキルホスホン酸をリンカーとして、その核酸配列の中央部分にインターカレーターを標識した核酸プローブにおいて、リン原子上の立体構造の異なる核酸プローブを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる目的を実現すべく鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、光学活性なＤＮＡプローブ及びその製造法であって、その核酸プローブが核酸配列の中央部分にキラルなアミノアルキルホスホン酸をリンカーとしてインターカレーターで標識されたＤＮＡプローブである。  また本発明は、光学活性なＤＮＡプローブを製造するための前駆体である光学活性なホスホン酸ジヌクレオシド及びその製造法である。本発明者らは、ラセミ体として得られるホスホン酸ジヌクレオチドの保護基の種類により両立体異性体間のＲｆ値に差異があることを見出だした。これにより、両立体異性体の光学分割を容易にし、光学活性なホスホン酸ジヌクレオチドの製造法を確立したのである。
【００１０】
以下本発明を詳細に説明する。本発明の出発物質である下記構造式１０で表わされるヌクレオシドとして、Ｒ２１がＤＭＴｒ基のものが文献に記載された方法（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、第８４巻、第４３０頁（１９６２年））によって取得可能である。また市販の当該化合物を用いてることもできる。
【００１１】
【化１３】
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【００１２】
また、下記構造式１１で表わされる化合物は、市販の２−アミノエチルホスホン酸を適当なアミノ基の保護基で保護したものを用いることができる。アミノ基の保護基は、Ｚ、ＭＺ、Ｆｍｏｃ、ＴＦＡ、Ｂｚ等一般に用いられる保護基でよいが、好ましくはＤＭＴｒ基の脱離条件と異なるものが望ましい。
【００１３】
【化１４】
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【００１４】
構造式１０で表わされる化合物と構造式１１で表わされる化合物を脱水縮合することにより、下記構造式１２で表わされる化合物が得られる。縮合に用いる縮合試薬に制限はないが、一般にリン酸エステルを形成できる試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、アルキルベンゼンスルホン酸誘導体、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド等が例示される。また反応溶媒は、アセトニトリル、ピリジンなどの生成物が溶解される極性溶媒を用いることができる。反応温度も特に制限されないが、溶媒の融点温度から沸点温度まで用いることができるが、好ましくは−１０℃から６０℃までの温度が望ましい。
【００１５】
【化１５】
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【００１６】
得られた構造式１２で表わされる化合物は、下記構造式６で表わされる５’−位水酸基が保護されていないヌクレオシドと縮合することにより、下記構造式７で表わされるホスホン酸ジヌクレオシドが得られる。構造式６で表わされる化合物の３’−位の保護基は、水酸基の保護基として用いられるＡｃ、Ｂｚ、ＴＢＤＭＳ、Ｂｎ等を用いることができるが、好ましくはＤＭＴｒ基か、アミノエチルホスホン酸のアミノ基の保護基の脱離条件とは異なるものが望ましい。
【００１７】
【化１６】
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【００１８】
【化１７】
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【００１９】
縮合に用いる縮合試薬に制限はないが、一般にリン酸エステルを形成できる試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、アルキルベンゼンスルホン酸誘導体、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド等が例示される。また反応溶媒は、アセトニトリル、ピリジン、などの生成物が溶解される極性溶媒を用いることができる。反応温度も特に制限はなく、溶媒の融点温度から沸点温度まで用いることができるが、好ましくは、−１０℃から６０℃までの温度が望ましい。
【００２０】
本化合物は、リン原子上にキラル中心が存在し、Ｒ体、Ｓ体の二つの立体異性体の混合物として得られる。両立体異性体の分割は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなど、通常の化合物の分離精製方法を用いて光学分割することができる。
【００２１】
本発明者らは、立体異性体の分割において、ホスホン酸ジエステルの３’−位の保護基の種類によって両異性体のＲｆ値に差異があることを発見した。アミノ基の保護基がＭＺ基、３’−位の保護基がＡｃの時、両異性体のＲｆ値は同一であり、両者を分割することは困難である。一方、アミノ基の保護基がＴＦＡ基、３’−位の保護基がＴＢＤＭＳ基であるとき、両異性体のＲｆ値の差は大きく、分割は容易となる。
【００２２】
分割した異性体の絶対配置は１Ｈ  ＮＭＲ、３１Ｐ  ＮＭＲ等の分析方法により決定することができる。
【００２３】
次に分割した光学活性なホスホン酸ジヌクレオチドの３’−位の保護基を脱保護する。脱保護方法は、化合物中に存在する他の保護基が脱離しない条件であることが望ましい。生成した３’−水酸基を公知の方法でリン酸化又はホスホロアミダイト化し、別途合成したＤＮＡオリゴマーの５’−末端に導入することができる。さらに、この５’−末端にホスホン酸ジヌクレオチドが導入されたＤＮＡオリゴマーからＤＮＡ鎖を伸長することにより目的の配列を持ったオリゴマーを調製することができる。ＤＮＡオリゴマーの調製は、液相法や固相法など、通常のＤＮＡオリゴマーの調製方法を用いることができる。ホスホン酸ジヌクレオチドをホスホロアミダイト化することにより、一般に市販されているＤＮＡ合成機用試薬と同等に扱うことができる。ホスホン酸ジヌクレオチドのホスホロアミダイト体を用いてＤＮＡ合成機でＤＮＡを合成し、任意のＤＮＡ配列の任意の位置にホスホン酸ジエステルを導入したＤＮＡオリゴマーを調製することができる。最終的に調製したホスホン酸オリゴマーの保護基を脱保護し、露出したホスホン酸のアミノ基とインターカレーター性色素を結合することにより、本発明の光学活性なＤＮＡプローブを調製することができる。
【００２４】
インターカレーター色素にアミノ基と直接結合できる官能基を有しているものを用いることにより、アミノ基とインターカレーター色素を容易に結合することができる。さらに、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）やＮ−Ｓｕｃｃｉｍｉｎｉｄｙｌ−６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＥＭＣＳ）等の両末端に官能基を有する二官能性試薬をホスホン酸アミノ基に結合し、これを介してインターカレーター性色素を結合すれようにすれば、インターカレーター性色素が有する官能基の種類を任意に選択することができる。
【００２５】
インターカレーター性色素としては、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジなどの二本鎖核酸とインターカレートして顕著な蛍光増感を示すことが知られている化合物であれば制限なく用いることができる。好ましくは、検出の容易さの観点からインターカレーションによりその蛍光強度が著しく増加するものが特に良い。このようなインターカレーター性色素として、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエローを例示することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明を限定するものではない。
【００２７】
実施例１
図１の通り、化合物１と化合物２を表１の比率にて混合し、ピリジンに溶解した溶液に、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル（ＴＰＳ−Ｃｌ）とテトラゾールのピリジン溶液を滴下した。反応液を４０℃４時間撹拌した後、５０％ピリジン水溶液を加え、ｐＨを７．０付近に調整した。反応液を酢酸エチルと飽和食塩水で分液し、有機層を乾燥後減圧下溶媒を濃縮した。得られた濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物３を得た。収量及び収率は表１の通りである。
【００２８】
【表１】
0004305966.tif 000007
【００２９】
実施例２
図２の通り、化合物３と化合物４を１：１のモル比で混合し、ピリジンに溶解した。縮合試薬（塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル（ＴＰＳ−Ｃｌ）、トリイソプロピルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾール（ＴＰＳ−Ｎｔｒｉａｚｏｌｅ）、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド（ＢＯＰ−Ｃｌ）を加え、４０℃で反応を継続した。表２に示した反応時間の後、５０％ピリジン水溶液を加え、ｐＨを７．０付近に調整した。反応液を酢酸エチルと飽和食塩水で分液し、有機層を乾燥後減圧下溶媒を濃縮した。得られた濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物５- Ｓ及び化合物５- Ｒ（図６参照）を得た。収量及び収率は表２の通りである。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
図３に、図２中の化合物５（Ｒ＋Ｓ）（Ｂ１＝Ｔ、Ｂ２＝ＣＢｚ、Ｒ１＝ＭＺ、Ｒ２＝Ａｃ）の５００  ＭＨｚ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）のチャートを示した。また図４に、図２中の化合物５- Ｓ（Ｂ１＝Ｔ、Ｂ２＝ＣＢｚ、Ｒ１＝ＴＦＡ、Ｒ２＝ＴＢＤＭＳ）及び化合物５−Ｒ（Ｂ１＝Ｔ、Ｂ２＝ＣＢｚ、Ｒ１＝ＴＦＡ、Ｒ２＝ＴＢＤＭＳ）の５００  ＭＨｚ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）のチャートを示した。また図５に、図２中の化合物５−Ｓ（Ｂ１＝ＡＢｚ、Ｂ２＝ＡＢｚ、Ｒ１＝ＴＦＡ、Ｒ２＝ＴＢＤＭＳ）及び化合物５- Ｒ（Ｂ１＝ＡＢｚ、Ｂ２＝ＡＢｚ、Ｒ１＝ＴＦＡ、Ｒ２＝ＴＢＤＭＳ）の５００  ＭＨｚ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）のチャートを示した。
【００３２】
図６に、化合物５−Ｓ及び５−Ｒの構造を詳細に示す。表２に示したように化合物５において、その水酸基及びアミノ基の保護基（Ｒ１、Ｒ２）の種類によって、Ｒ体、Ｓ体両体の両立体特異体の薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）における移動度（Ｒｆ）が異なり、Ｒ１＝ＴＦＡ、Ｒ２＝ＴＢＤＭＳのとき、両特異体の分割が容易となることが分かる。なおＴＬＣは、市販の装置（Ｍｅｒｋ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０Ｆ２５４ＨＰＴＬＣｐｌａｔｅ）を使用し、クロロホルムとメタノールを９５：５に混合した展開溶媒を使用して行った。
【００３３】
実施例３
図７及び図８の通り、化合物５- Ｓまたは化合物５- ＲをＴＨＦに溶解し、０．１ＭテトラブチルアンモミウムフルオライドのＴＨＦ溶液を滴下した。反応液を２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮乾固した。残さをクロロホルムと飽和食塩水で分液し、有機層を乾燥後、減圧下濃縮乾固した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物６- Ｓ及び化合物６- Ｒを得た。収量及び収率は表３の通りである。
【００３４】
【表３】
0004305966.tif 000009
【００３５】
実施例４
図９の通り、化合物７を文献に記載された方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１４巻、第７３９１頁）に従ってホスホロアミダイト化し、化合物８を合成した。化合物８は単離せずにＤＮＡ合成機を用いたＤＮＡオリゴマー合成に供した。
【００３６】
実施例５
図１０の通り、化合物９を実施例４の方法に従ってホスホロアミダイト化し、化合物１０を合成した。化合物１０は単離せずにDNA 合成機を用いたDNA オリゴマー合成に供した。
【００３７】
実施例６
実施例４で合成した化合物８（図９参照）とアデノシン３’−ホスホロアミダイトを原料として、市販のＤＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で以下の塩基配列を有するＤＮＡオリゴマーＡ−１３Ｓ（配列中の「＊」にＳ体のホスホン酸ジエステル結合を有する）を合成した。
【００３８】
Ａ−１３Ｓ：（５’）ＡＡＡＡＡ＊ＡＡＡＡＡＡＡＡ（３’）
実施例７
実施例５で合成した化合物１０（図１０参照）とアデノシン３’−ホスホロアミダイトを原料として、市販のＤＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で以下の塩基配列を有するＤＮＡオリゴマーＡ１３−Ｒ  （配列中の「＊」にＲ体のホスホン酸ジエステル結合を有する）を合成した。
【００３９】
Ａ−１３Ｒ：（５’）ＡＡＡＡＡ＊ＡＡＡＡＡＡＡＡ（３’）
実施例８
ＤＮＡオリゴマーＡ−１３Ｓを原料として、特開平８−２１１０５０号公報に記載された方法に従い、図１１に示すDNA プローブＹＯＡ−１３Ｓを得た。図１２には、精製したＹＯＡ−１３ＳのＨＰＬＣチャートを示した。
【００４０】
実施例９
ＤＮＡオリゴマーＡ−１３Ｒを原料として、特開平８−２１１０５０号公報に記載された方法に従い、図１３に示すDNA プローブＹＯＡ−１３Ｒを得た。図１４には、精製したＹＯＡ−１３ＲのＨＰＬＣチャートを示した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノアルキルホスホン酸をリンカーとして、その核酸配列の中央部分にインターカレーターを標識した核酸プローブを得ることが可能になる。特に、今回初めて得られた知見に基づけば、Ｒｆ値の差異を利用して、リン原子上の立体構造の異なる核酸プローブを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１の操作を示すための図である。
【図２】図２は実施例２の操作を示すための図である。
【図３】図３は化合物５のＮＭＲチャートである。
【図４】図４は、化合物５−Ｓ及び５−ＲのＮＭＲチャートである。
【図５】図５は化合物５−Ｓ及び５−ＲのＮＭＲチャートである。
【図６】図６は化合物５−Ｓ及び５−Ｒの詳細を示す図である。
【図７】図７は実施例３の操作を示すための図である。
【図８】図８は実施例３の操作を示すための図である。
【図９】図９は実施例４の操作を示すための図である。
【図１０】図１０は実施例５の操作を示すための図である。
【図１１】図１１は実施例８で得られた本発明のＤＮＡプローブを示す図である。
【図１２】図１２は実施例８で得られた本発明のＤＮＡプローブのＨＰＬＣチャートである。
【図１３】図１３は実施例９で得られた本発明のＤＮＡプローブを示す図である。
【図１４】図１４は実施例９で得られた本発明のＤＮＡプローブのＨＰＬＣチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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