(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからのルミネセンス発光を検出するための装置であって、前記装置は感光性の検出器手段（７４）、光源（７６）、および光ファイババンドルを含み、前記バンドルを構成するファイバ（３０，４４）の幾つかは残りのものから分離されてサンプルの直接照明のために前記光源（７６）からの光を伝えるようにその光源へ延びており、前記バンドルの他のファイバ（３２，３８，４６，４８）はサンプルから放射された光を集めて感光性の検出器手段（７４）への光路を提供し、これらの集光ファイバは複数のグループに分けられ、集光ファイバの複数のグループは前記検出器手段（７４）の異なる領域へ光を伝えるように配置されており、これによってサンプルから前記検出器手段への並列の光路を提供し、波長選択フィルタ（５４，５６）が前記光路の各々中に設けられて、選択された波長の光のみが前記検出器手段の対応する領域に届くことを許容し、前記バンドル中のファイバは六方対称のパターンで配置されており、サンプルに面する前記バンドルの端面においてサンプル照明ファイバの各々が６本の集光ファイバ（３２，３８，４６，４８）の輪で囲まれており、これら６本のファイバは集光ファイバのそれぞれのグループに属するファイバが前記輪のまわりに順次配置されたものであり、こうしてサンプル照射ファイバおよび集光ファイバはサンプルに面する前記ファイババンドルの端面において均一に分布させられている、装置。
【請求項２】
前記検出器手段（７４）は、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ、冷却ＣＣＤアレイ、高感度ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）アレイまたはフォトダイオードアレイもしくはＰＭＴアレイを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記波長選択フィルタ（５４，５６）が干渉フィルタである、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記バンドル内の３分の１のファイバ（３０，４４）はサンプルに光を伝え、別の３分の１のファイバ（３２，４６）は放射された光を集光して第１の波長選択フィルタを（５４）介して検出器手段（７４）の第１の領域にその光を伝え、ファイバの残余の３分の１（３８，４８）は放射された光を集光して第２の波長選択フィルタ（５６）を介してその光を検出器手段（７４）の第２の領域に伝える、請求項１から３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
９６本のファイババンドルを用いて９６個のウェルのルミネセンス発光の特性を一度に調査することにより、９６の整数倍のウェルを含むウェルプレートが調
べられるように構成され、９６本のファイババンドルからの集光ファイバの２つのグループは各々が９６本のファイババンドルである２つの集合にまとめられ、これら２つの集合の各々は２つの波長選択フィルタ（５４，５６）の１つに提供され、これらフィルタの各々は他方とは異なる波長フィルタ特性を有し、フィルタの下流にある光ファイバのさらなる２つのバンドルは、２つのフィルタによって透過された光を集光して検出器手段（７４）の２つの別々の領域に伝送する、請求項１から４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記ファイバの集合は各フィルタ（５４，５６）の面を最適に利用するようにそれぞれ対応するフィルタに配置される、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
検出器手段（７４）が非円形のアスペクト比を有し、波長選択フィルタ（５４，５６）から検出器手段に繋がるファイバ（６４，６６，７０）が検出器手段の面を最適に占めるように再配置されている、請求項１から６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
検出器手段（７４）が概略正方形であって、フィルタ（５４，５６）から繋がるファイバは検出器手段に対応する正方形を一緒に形成する２つの矩形のアレイ（６０，６２）に再配置されている、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
ウェルプレート内のウェルに与えられる光ファイババンドルの各々は４５本のゲルマニウムでドープされたシリカクラッドのシリカファイバから構成され、これらファイバの各々は直径が１００−２００ミクロンの範囲であって、これらファイバの１５本が励起サブバンドルとして分離されかつ９６本のバンドルの各々からの同様の１５本の励起サブバンドルと組合され、９６本の励起サブバンドルは励起放射線源（７６）に延在し、９６本のバンドルの各々からの残余の３０本のファイバは各々が１５本のファイバからなる２つのサブバンドルに分割され、各々が１５本のファイバからなる合計１９２本の放射サブバンドルが作成され、これら放射サブバンドルのうちの９６本は第１の干渉フィルタ（５４）の入力において別々の位置に繋がり、他方の９６本は第１のフィルタによって伝送された光とは異なる波長の光を透過する第２の干渉フィルタ（５６）の入力において別々の位置に繋がり、これらフィルタの下流の２つのバンドルの各々は９６本のサブバンドルを含み、これらサブバンドルの各々はフィルタの入力における１９２本の放射サブバンドルの１つと１対１対応に基づいて配置され、１９２本の下流のサブバンドルは検出器と同じアスペクト比を有するアレイに合体されている、請求項５に記載の装置。
【請求項１０】
ブロックフィルタ（８０，８２）が前記検出器手段（７４）への光の経路内に設けられ、ブロックフィルタは、発生したルミネセンス発光のためにサンプルにより放射された光に対応する波長の光を透過しながら、波長が異なる不所望の光を大幅に減衰することを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
ブロックフィルタ（８０，８２）は、波長選択フィルタ（５４，５６）の前方で、波長選択フィルタとサンプルから干渉フィルタに光を伝送する光ファイバの終端との間または波長選択フィルタと検出器手段（７４）との間にある、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
蛍光がフルオレセインによって発生し、ブロックフィルタ（８０，８２）がショットのフィルタ、ＯＧ５１５型である、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
ブロックフィルタ（８０，８２）が角度コリメーティング装置（７６）と組合せて用いられる、請求項１０から１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
角度コリメーティング装置（７６）が、約５−１０ｍｍの厚みである溶融光ファイバプレートを含み、前記光ファイバプレートは検出器手段（７４）の前方に取付けられる、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
角度コリメーティング装置（７６）が約０．３０の低い開口値のグラスファイバから作製される、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
グリンレンズを用いて、波長選択フィルタ（５４，５６）を通過する光の焦点を合わせる、請求項１から１５のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
この発明は、画像化のための方法および装置に関し、特定的には、サンプルが紫外光のような励起放射線で照射されるタイプ、またはサンプルが好適な化学ルミネセントまたは生物ルミネセントの手段によって活性化されるタイプであって、サンプル内のたとえば蛍光により生じる放射光について調べられる、ルミネセンス発光サンプルのイメージングに関する。この発明は、多数のサンプルが光を放射し、それらを同時に調べる必要がある多重経路（または多重チャネル）のシステムに特に関する。
【０００２】
【発明の背景】
ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９８／０１７４４では、光ファイババンドルの分析サンプルの近くにある方の終端の回りに取付けられた環状のスリーブを介して励起放射線が分析サンプルに与えられる蛍光分析画像システムが説明されている。そのファイバは励起放射線によって生じた蛍光による放射光を集める。環状の放射線源を用いると、分析物の反応場所における最も均一なかつ十分な強さの照射がもたらされないことが認められている。この発明の目的は、ファイバの集光効率を低下させずに、各々の分析物の反応場所の提示領域にわたり、励起照射の均一性および強度を向上させることである。
【０００３】
サンプルが非常に薄いセルの層であるか、または薄いゲルもしくは薄膜の上に含まれるところでは、反応場所にわたって均一性を達成するのはさらに困難であることが認められた。
【０００４】
各々の反応場所の面積が小さくなるにつれ、上述の問題はさらに大きくなる。多数のウェルを有するプレート、多数の位置に置かれる薄膜もしくはゲルもしくはウェハまたはシリコンチップもしくは同様の物質などのサンプルを支持する装置の中にあるサンプルすなわち反応場所が多くなればなるほど、この問題は起こりやすくなる。
【０００５】
この発明は、十分な励起放射線を必要に応じて分析に導入することが可能であり、ＷＯ  ９８／０１７４４に記載の従来のイメージングシステムで一般的には十分な９６穴のウェルプレート内のような反応場所および高フォーマットの多数のサンプルプレート内に存在するようなより小さな反応場所から放射光を集光することができる、改良された照射システムおよび集光システムを提供するものである。
【０００６】
この発明はいずれのルミネセンス発光を生じる分析にも適用が可能である。
蛍光、化学ルミネセンス発光および生物ルミネセンス発光、ならびに／またはこれらのプロセスの組合せを含む光を放射するルミネセンス発光のプロセスは、生医学的および化学的分析の測定に用いることができる。これらのプロセスのための励起および放射の波長は、用いられる蛍光のおよび／またはルミネセンス発光の分子か部分に特有のものである。用いられる波長の範囲はスペクトルの紫外、可視、赤および赤外部分である。典型的な励起の範囲は２６０−８００ｎｍであり、典型的な放射の範囲は３２０−１１００ｎｍである。
【０００７】
この出願では、測定されるルミネセンス発光のプロセスは、蛍光、化学ルミネセンス発光および生物ルミネセンス発光を含む。
【０００８】
通常の蛍光では、蛍光分子または蛍光体は外部放射線によって励起され、光エネルギを吸収しかつより長い波長で光を再発光する。
【０００９】
蛍光はほとんど瞬時に、またはその事象が時間遅延蛍光と呼ばれるように、後ほど起こってもよい。
【００１０】
蛍光または化学ルミネセンス発光エネルギ転送として一般的には公知であることを含む別のルミネセンス発光のプロセスでは、エネルギは、ドナー分子または部分からアクセプタ分子または部分へ非放射性メカニズムを介して転送される。このメカニズムは、たとえば共鳴を介してまたは原子と分子の間の電子の転送を介して発生し得る。そのようなルミネセンス発光のドナー分子およびアクセプタ分子は、蛍光もしくは化学ルミネセンスまたは生物ルミネセンスであってもよい。ドナー分子またはアクセプタ分子は一般的に異なり、１つ以上の分子のタイプがプロセスのドナー段階またはアクセプタ段階のいずれかに用いられてもよい。
【００１１】
ドナー分子は、蛍光の場合は励起光を介して、または化学ルミネセンス発光もしくは生物ルミネセンス発光の場合は化学的に活性化されてもよい。蛍光の活性化の場合は、ドナーの励起とアクセプタの放射との間にマイクロ秒からミリ秒の範囲でわずかに遅延があり得る。
【００１２】
エネルギ転送は非常に短い距離（典型的には１０ｎｍ）にわたってしか発生せず、したがってドナー分子およびアクセプタ分子は非常に密に近接している必要がある。これは、ドナー分子およびアクセプタ分子を直接結合（たとえば共有結合）または生化学的ブリッジ（たとえばペプチド結合）による２つの分子の連結によって達成できる。代替的に、分子は非常に密に近接（たとえばマイクロプレートまたはビーズ）するように、被覆されまたは固体相に結合されてもよい。さらに、ドナーからのエネルギ転送は、たとえば流体の中で拡散してアクセプタ分子と相互作用するような、一重項酸素または何らかの励起された化学遊離基などの反応性中間物質を介してもよい。
【００１３】
ドナー分子とアクセプタ分子の間でエネルギ転送が発生しないところでは、ドナー分子自体が、活性化されると、ドナー分子自体の特徴である放射波長を備えた光としてエネルギを直接解放する。エネルギ転送が発生すると、放射波長はアクセプタ分子の特性を示す。ドナー分子とアクセプタ分子が異なるところでは、アクセプタ分子からの光放射はドナー分子の特徴である放射に対し、より長いまたはより短い波長であり得る。
【００１４】
化合物または作用剤の存在または活性を測定するために生医学的または化学的分析で用いられると、これらのルミネセンス発光のプロセスはそのような化合物または作用剤の存在または活性を示すものとして用いられ得る。ドナー分子またはアクセプタ分子からの光放射の増加または減少は、分析される未知の化合物を示すものとして用いられてもよい。たとえば、未知の化合物はエネルギ転送プロセスと直接または間接に相互作用して、たとえばドナー分子とアクセプタ分子の間のブリッジを破壊したりさもなければ転送プロセスを止めてしまうこともあり得る。この結果、ドナー分子およびアクセプタ分子の光放射の相対的な強度が変化し、その変化は、たとえば各々の分子の特徴である２つまたはそれ以上の波長で測定により検出される。したがって用いられる分子の特徴であるさまざまな対の波長を含むレシオメトリックな測定が適し得る。
【００１５】
【先行技術の説明】
ＥＰ  ０５８０３６２  Ａ１では、密閉されたサンプル保持部７の下で終端するファイバの一部がサンプルに励起放射線を伝え、他のファイバが蛍光放射線を検出器に伝える、蛍光検出装置が説明されている。３頁および４頁には、蛍光が弱い場合の好ましい配置が説明されており、その中では励起ファイバはサンプルに与えられたバンドルの中央部にまとめられ、蛍光放射線を受取りかつ伝えるためのファイバは中央部の励起ファイバコアのまわりに環状に設けられる。
【００１６】
励起放射線ファイバをサンプルの中央領域に集中させ、中央のコアの環状の部分から弱く放射された蛍光を集めれば、サンプル（または反応場所）によってファイバに向かって反射または屈折する不所望な励起放射線の多くは検出器に繋がるファイバによって集光されることはないと考えられていた。
【００１７】
しかしながら、これにより反応場所の中央部に事実上無効の領域ができてしまい、そこでは励起による産物および集光はどの点でも（集光するファイバの環状の配置のために）非常に低いかまたはゼロであり、反応場所の大きな中央部分から発出する背景ノイズと本物の信号を区別することができなくなってしまうことがわかった。
【００１８】
この発明がこの問題を克服しようとする理由は、信頼性が高くかつ正確な分析評価のためには、ウェルプレート全体にわたり１つのウェルと別のウェルとの間に応答の均一性が存在することが必要であるだけでなく、各々の分析物の反応場所の領域にわたり、応答に高度な均一性があることが非常に重要であるからである。そのためには、後者が多数の隣接した小さな領域に分割されると考え得るならば、これら小さな領域の各々に入射する励起の産物およびそれらからの集光は、分析物の領域全体にわたり実質的に同じでなければならない。
【００１９】
【発明の概要】
この発明に従うと、サンプル内のルミネセンス発光を検出するための装置が提供され、サンプルによって放射された光が集光されて光ファイババンドルにより感光性の検出器手段へ伝送され、光ファイババンドルの断面積はサンプルの面積に対応し、かつファイバの一端は、サンプルを直接照射しかつそこから放射される光を集光するために、サンプルに近接しながらサンプルとは間隔をあけて設けられ、バンドルを構成するファイバのうち選択されたファイバは残余のファイバと分離され、かつ光源に延在してサンプルを直接照射するために光を伝え、バンドルの他のファイバはルミネセンス発光によりサンプルから放射された光を集光し、かつ感光性の検出器手段への光の経路を提供し、集光するファイバは複数のグループに分割されて検出器手段の異なる領域に光を伝え、それによりサンプルから検出器への並列した光の経路を提供し、波長選択フィルタは前記光の経路の各々の中に設けられ、各々の光の経路と関連づけられた検出器手段の領域に選択された波長の光しか到達させず、バンドル内のファイバは対称のパターンに配置され、それによりサンプルに与えられたバンドルの終端面ではサンプルを照射する各々のファイバは集光する６本のファイバの輪に囲まれ、そのファイバは輪のまわりに前記集光するファイバのそれぞれのグループに属するファイバを連続的に構成し、サンプルを照射するファイバおよび集光するファイバは、サンプルに与えられたファイババンドルの領域にわたり均一に分布する。
【００２０】
検出器は、ＣＣＤアレイ、冷却ＣＣＤカメラ、高感度ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）アレイ、またはフォトダイオードアレイもしくはＰＭＴアレイ、または同様の装置を含んでもよい。
【００２２】
好ましくは、このフィルタは干渉フィルタである。
【００２４】
好ましい配置例では、バンドル内の３分の１のファイバは、サンプルに放射光を伝えることができ、別の３分の１のファイバは放射された光を集光し、第１の波長選択フィルタを介して感光性の検出器の第１の領域にその光を伝え、ファイバの残余の３分の１は放射された光を集光し、第２の波長選択フィルタを介して検出器の第２の領域に伝える。
【００２６】
ファイババンドルの領域の周辺の領域を除いて、各々の放射を集光するファイバは、放射を集光するファイバを互いに分離しながら横切る３つの輪の各々の一部となり、互いのすぐ近くにある、光を伝える３本のファイバの上に集中する。
【００２７】
サンプルに与えられたバンドルの終端にわたり光を伝えるファイバを均一に分布させ、かつ放射を集光するファイバを同様に均一に分布することにより、サンプルに伝送された光が、刺激／励起されて、光を放射できるサンプル内の場所を貫通できる可能性が高くなり、かつそのような刺激または励起に応答して放射された光が非常に少量であっても放射を集光するファイバによって集光され、感光性の検出器に伝えられる可能性も高くなる。
【００２８】
典型的には、サンプルはウェルプレートとして公知のプレート内にマトリックスに配置された小さなウェルに含まれ、少なくとも各々のウェルの一端は液体のサンプルを保持するように閉じられながら、その閉じられた一端は透明であり、窓を形成して光がサンプルを貫通し後者を励起することを可能にし、かつ蛍光またはエネルギ転送によりサンプルから放射された光がそれを通って元の方向に戻るのを防ぐ。
【００２９】
分析には何百または何千ものサンプルで発生した反応の研究がしばしば含まれ、ウェルプレートは何百または何千ものウェルのマトリックスを有して構成されるのが通常である。典型的なウェルプレートは３４５６個のウェルを含み、ウェルプレート内の３４５６個のうち９６個のウェルに対して９６本のファイババンドルを整列させる表示プレートを用いて、９６個のウェルから発生するルミネセンス発光を一度に調査し、３４５６個のウェルすべてを調べるためにウェルプレートに対して表示プレートを３６回段階的にずらすことにより、３４５６個のウェルを好都合に調べることができる。
【００３０】
円形のウェルを有する３４５６穴のウェルプレートの場合は、典型的には、各々のウェルの直径は１ｍｍである。ウェル数がより少ないウェルプレートの場合は、各々のウェルはもっと大きくてもよい。実際に、ウェルの断面はどのような形状であってもよいが、通常は円形または方形である。
【００３１】
この発明の好ましい特徴に従うと、各々の９６本のバンドルからの、２つのグループの放射を集光するファイバは各々が９６本のバンドルである２つの集合にまとめられ、２つの集合の各々は２つの波長選択干渉フィルタの１つに提供される。各波長選択フィルタは他方とは異なる波長をフィルタすることを特徴とする。フィルタの下流にある光ファイバのさらなる２つのバンドルは、２つのフィルタが伝送する光を集光しかつ検出器の２つの別々の領域に転送する。
【００３２】
ファイバの集合はフィルタ面を最適に利用するように、必要に応じて好ましくは再配置され、フィルタから検出器に繋がるファイバは検出器の活性した面を最適に占めるように必要に応じて好ましくは再配置される。
【００３３】
これには検出器のアスペクト比に一致するように、下流にあるファイバの再配置が一般的には必要となる。但し後者がフィルタのアスペクト比と異なった場合である。
【００３４】
したがって方形の検出器の場合は、干渉フィルタから引出されるファイバは、並んで配置されると検出器の方形の比に対応する方形を構成する２つの長方形のアレイに好ましくは再配置される。
【００３５】
ファイババンドルが再配置されても、９６本のウェル検査バンドルから導出された１９２本のファイババンドルと検出器に与えられた１９２本のファイババンドルの終端の間に固定した位置を維持していれば、いずれのウェルから放射された光の存在も、特定のウェルを検査するファイババンドルからのファイバの２つのグループに相関する、検出器に与えられた２つの９６本のバンドルのグループ内の２つのファイババンドルの画像に対応する検出器アレイ内のＸ、Ｙ座標の位置を調べることにより判断することができる。
【００３６】
この発明の好ましい局面に従うと、各々のウェルの場所に与えられる各々の光ファイババンドルは、その各々の直径が典型的には１００−２００ミクロンである４５本のゲルマニウムでドーピングされたシリカクラッド、シリカファイバから構成され、そのうちの１５本はサブバンドルとして分離され、他の９６本のバンドルの各々からの同様のサブバンドルと結合され、紫外光のような励起放射線源に延在する。１つまたはそれ以上のフィルタが紫外光源とサブバンドルの間に設けられてもよい。９６本のバンドルの各々からの残余の３０本のファイバは、各々が１５本のファイバである２つのサブバンドルにさらに分割される。これにより合計１９２本の放射を集光するサブバンドルとなり、そのうち９６本は第１の干渉フィルタの入力で別々の位置に繋がり、他方の９６本のバンドルは第１のフィルタとは異なる波長を伝送する第２の干渉フィルタの入力で別々の位置に繋がる。
【００３７】
干渉フィルタによって伝送された光は、フィルタの上流に配置された９６本のサブバンドルの２つの配置の各々と１対１対応に基づき配置された９６本のサブバンドルの下流にある２つのグループの一方またはもう一方に入り、下流のサブバンドルは合体して検出器と同じアスペクト比を有する１９２本のサブバンドルのアレイを形成する。
【００３８】
検出器のアスペクト比がほぼ方形であるところでは、１９２本のサブバンドルは１４個の行に好都合に配置され、第１および最後の行は１２本のサブバンドルを含み、その間の１２の行の各々は１４本のサブバンドルを含む。一般的にはアスペクト比が方形である検出器に対する表示のために、行および列のアレイは四隅が欠けた実質的には方形の領域を規定する。
【００３９】
典型的には干渉フィルタは円形であり、直径は約８０ｍｍである。
典型的にはＣＣＤカメラの方形の入力ウィンドウは、長い方の辺の長さが２７ｍｍである。
【００４０】
この発明はまた、分析サンプルから放射されたルミネセンス発光を検出する方法であって、光ファイババンドルはサンプルの面積と同じ断面積を有し、その一方の終端は後者と近接して設けられ、放射された光を集光しかつ伝送するファイバは、それを通って必要に応じて光がサンプルに伝えられるバンドル内の他のファイバの間でバンドルの断面にわたり均一に分布する。
【００４１】
この方法は、集光するファイバが同数のファイバを有する２つまたはそれ以上のサブバンドルに分割され、各々のサブバンドルが帯域の異なる対応する複数の干渉フィルタの１つに光を伝え、その結果フィルタを通った光が感光性の検出器の、異なるアドレス指定可能な領域に照射されるように配置することにより、検出された光を２つまたはそれ以上のチャネルに分割するステップと、異なるアドレス指定可能な領域からの電気的信号を比較してフィルタの一方によって伝送された光の量と他方のフィルタによって伝送された光の量との比較を行なうステップとをさらに含んでもよい。
【００４２】
ＰＣＴ出願ＷＯ  ９８／０１７４４には、干渉フィルタが用いられて、カメラのような画像化装置に及ぶほど選択性を高めて放射光を伝送することが可能な、光放射分析のための画像システムが説明されている。
【００４３】
干渉フィルタは非常に正確なカットオフを有し、所望の波長の光を事実上１００％伝送し、かつ不所望の波長は事実上伝送しないが、干渉フィルタの伝送基準、すなわち干渉フィルタに対する波長と入射角の間の関係を満たすような十分に大きな角度でフィルタ上に受光不可能な波長の光が入射すると、突破が発生し得る。
【００４４】
サンプルから干渉フィルタに光を伝送する光ファイバを用い、かつ可能な限りファイバの終端が異質の光にあたらないようにすることにより、無関係な光線は反射または屈折された励起光に一般的には限定され、これは一般的には固定した波長である。光ファイバを介して伝送され、かつ干渉フィルタを突破できるような大きな角度を有するこのような光線は、おそらくはスキュー光線であり、干渉フィルタから発生するスキュー光線がカメラに転送されるのを低減するために、干渉フィルタとカメラとの間に角度コリメータを設けることが既に提案されている。
【００４５】
この発明の別の好ましい局面に従うと、上述の装置では、さらなる光フィルタが検出器への光の経路内、好ましくは分析サンプルと干渉フィルタの間に設けられ、このさらなる光フィルタは、サンプルによって放射された光に対応する波長の光は伝送するが、サンプルを励起するのに用いられた光と同等の波長の光はフィルタ上の放射の入射角にかかわらず、干渉フィルタに到達する前に大幅に減衰または「ブロック」されることを特徴とする。
【００４６】
さらなるフィルタは干渉フィルタのすぐ前方に、この干渉フィルタと分析サンプルから干渉フィルタの光を伝送する光ファイバの終端との間に設けられてもよい。
【００４７】
さらなるフィルタは、励起放射線、特定的にはそれがなければ干渉フィルタを介して伝送され、結果的に分析物のルミネセンス発光として検出器で発生するいずれの放射線の強さと比較しても検出器で非常に強くなり得る励起放射線のスキュー光線を取除くことを主な目的とする。
【００４８】
これらのタイプのルミネセンス発光、特にアクセプタ分子の放射の波長がドナー分子の波長よりも短いまたは長いルミネセンス発光のプロセスの検出に必要な放射フィルタの特徴が考慮されなければならない。
【００４９】
通常の蛍光を発生するフルオレセインの場合は、たとえば４８５ｎｍの励起光は、より長い波長たとえば５３０ｎｍで放射される蛍光を発生する。
【００５０】
フィルタに対してファブリ・ペロー条件を満たす角度で５３０ｎｍの帯域の干渉フィルタに現われる励起光はいずれも伝送される。たとえば４８５ｎｍの光が〜５４°で到達すると、そのようになる。光ファイバ成分の場合は、スキュー光線は伝送され、そのような角度でフィルタに入り得る。ファブリ・ペロー条件またはパンチスルーによって伝送されるいずれの光も排除するにはブロックフィルタが必要である。
【００５１】
励起光がドナー分子を活性化するのに用いられ、かつたとえば波長が４８０ｎｍであって、アクセプタ分子により放射されたたとえば５４０ｎｍの光よりも短い波長である蛍光エネルギ転送分析の場合にも、同じ状況となる。このことは、選択されて５４０ｎｍの放射光を伝送する干渉フィルタに対しファブリ・ペロー条件によってさもなければ伝送されてしまう４８０ｎｍの励起光を吸収するためにブロックフィルタが必要となることを意味する。ブロックフィルタはまた、４８０ｎｍの光のいずれのパンチスルーを排除するのにも役立つ。
【００５２】
ドナー分子の化学ルミネセンスまたは生物ルミネセンスが活性化し、したがって励起光が用いられないエネルギ転送分析の場合は、放射の波長が異なるドナー分子またはアクセプタ分子から発生する問題が依然としてあり、したがって短い波長の強さが長い波長の強さよりも著しく大きい状態である、短い波長が存在する中ではより長い波長を検出しなければならない。
【００５３】
これは、アクセプタが放射する波長がドナーが放射する波長よりも短い場合、およびエネルギ転送のプロセスの結果、アクセプタ分子によって発生した信号が著しく増幅してしまう場合、特に当てはまる。ファブリ・ペロー条件が満たされることによりまたはパンチスルーによりフィルタを介して伝送されるより短い波長のために、長い波長のための干渉フィルタによって短い波長が通過してしまうのを、ここでもまたブロックフィルタが防ぐのが好ましい。
【００５４】
この発明を実施する装置の典型的な例では、波長が４８５ｎｍである青色の励起光が、波長が約５３０ｎｍである緑色の蛍光を励起するのに用いられる。たとえば分析物を含むサンプルプレートの底部からの反射により、放射された緑色の蛍光のみを伝送すべきその下流のファイバに達するいずれの青色の光も、干渉フィルタの伝送基準を満たす十分に大きな角度の円錐状のスキュー光線としてファイバから出て、強い青色の光の輪が検出器に与えられる。
【００５５】
この発明で提案されたさらなるフィルタがなければ、この不所望の光は残余の光ファイバを介してカメラに伝えられてしまう。この青色の光の輪が既に提案されたようにカメラの前方の角度コリメーティング装置によって排除されなければ、光の輪は蛍光による低レベルの緑色の光が、もしあればそれに伝えられるカメラセンサの領域の回りのカメラを光で充満させてしまう。
【００５６】
角度コリメータはそのような輪の強度を低減するが、それがこの問題に対しての完全な解決とはならず、強いスキュー光線のあるところでは、依然としてかなりの光が充満することによりカメラでの緑色の光とノイズなどとの区別が事実上つかなくなり、分析物がたとえば蛍光により光を放射すると、蛍光による緑色の光が現われる小さな場所は、角度コリメータがあったとしても不所望の励起放射線が突破して発生する強い青色の光の輪により取囲まれかつ実質的に満たされ得る。この発明で提案されたような補足のフィルタは、干渉フィルタの前方、下流または前方と下流の両方に取付けられるとこれを著しく低減する。
【００５７】
干渉フィルタ上のスキュー光線の入射を低減するためには、干渉フィルタの前方にさらなるフィルタを設けなければならない。それは相接してもよい。
【００５８】
効果を上げるためには、さらなるフィルタは透過と減衰の間に明確なカットオフを有し、かつカットオフ点を超える波長を大きく減衰させなければならない。青色の光の波長が４８５ｎｍで、たとえば蛍光による放射の波長が５３０ｎｍである上記の例では、５１５ｎｍでカットオフを有するフィルタが適切であり、それにより約５３０ｎｍの波長は透過しながら約４８５ｎｍの波長は通さない。
【００５９】
そのような特徴を有するフィルタはショット（Schott）のフィルタ、ＯＧ５１５型である。これは約５１５ｎｍより長い波長を透過するが、５１５ｎｍを著しく下回る波長を大幅に減衰する。そのようなフィルタがブロックフィルタを構成する。
【００６０】
この発明によって提供されたさらなるフィルタの使用により既に提案されたような角度コリメータの必要性がなくなるわけではなく、好ましくはそれと組合せて用いられる。
【００６１】
角度コリメーティング装置はスキュー光線をさらに低減し、実際にはカメラの入力の前方に取付けられる約５−１０ｍｍの厚みの溶融光ファイバプレートからなる。好ましくはそれは典型的には約０．３０の比較的少ない開口値（ＮＡ）のグラスファイバから作られる。そのような装置はファイババンドルの開口値０．２２内で所望の光を伝送するが、さもなければバンドルによって伝送されてしまうスキュー光線を大幅に低減する。
【００６２】
検出器の前方（たとえばカメラの入力面のプレートの前）にプレートを挿入することにより、ファイバと検出器の間の分散またはクロストークが起こりにくくなる。
【００６３】
角度コリメーティング装置が干渉フィルタの後方に設けられることは重要である。なぜならその位置ではコリメーティング装置自体を構成する物質から蛍光が発するか否かは問題とならないためである。シリカのような非蛍光性の物質からなる溶融光ファイバプレートを得ることは困難である。
【００６４】
これまでスキュー光線について言及されてきた。これと関連して、ファイバの開口値は、ファイバにより非常に効率よく転送される光線に対して円錐角度である。理想的には、この条件はメリジオナル光線すなわちファイバの軸を含む平面に沿って伝わる光線にしか適用されない。このファイバは通常は長い円柱形と考えられる。
【００６５】
実際にはそのような光線は非常に少なく、ファイバによって伝送された光はファイバの入口面上のいずれかの点でファイバに入る、同じ円錐角度内のすべての光線であると考えられている。なぜならこれらの光線すべてもまたかなり効率よく伝送されるためである。
【００６６】
このように、スキュー光線はｓｉｎ-1ＮＡ以内の角度で入射する、ファイバの終端面上のいずれかの点で入射する光線である。そのような光線が伝送される条件を満たすのは複雑かつ困難であるが、ある状況では、ファイバによって伝送された光線の半分まではスキュー光線であり得る。
【００６７】
単一のチャネル分析システムでは、スキュー光線はさほど問題ではない。なぜなら単一のチャネルシステム内の光の経路はそれらをより効果的に取除くために高度に視準化され得るためである。問題はチャネルの間に光コリメーティングメカニズムを取入れるのに十分なスペースがない多チャネルシステムにおいてより顕著である。
【００６８】
前述の装置では、感光性の検出器は好ましくはＣＣＤ、ＩＣＣＤ、冷却ＣＣＤ、またはフォトダイオードアレイもしくはＰＭＴアレイである。どの装置が選択されても、チャネルの間のクロストークを最小限にするために、最終の画像で個別のファイババンドルを分離できるように、集中させた後優れた空間的分解能を持っていなければならない。１０−２０ミクロンの空間的な分離が好ましい。
【００６９】
検出器は適切な量子効率（ＱＥ）を有するべきである。
典型的にはＩＣＣＤは青色で１５％のＱＥを有し、赤色では数％に降下する。
【００７０】
冷却ＣＣＤはより高いＱＥを有し、赤色で約３０％に上昇する。
カメラに光を与える光システムが直径の小さなファイバ（典型的には約１００ミクロンまたはそれ未満の直径）を介してサンプルから光を集光し、かつＣＣＤカメラのような光検出器の入力にわたってこの分離を維持すると、またカメラが約１０−２０ミクロンの空間的分解能を有するところでは、サンプルからのいずれかの光が入射するＣＣＤアレイの領域を検査することにより、サンプルからカメラへ光を伝えるバンドル内の個別のファイバからの光を識別することができる。これにより、たとえばサンプル内のセルの塊からの光を、分離された個別のセルとは別に観察することができ、これは非常に有用である。
【００７１】
干渉フィルタの領域を通過する光の焦点を合わせる必要がある場合は、前述のＰＣＴ出願ＷＯ  ９８／０１７４４に説明されたようにグリンレンズまたは他の装置が用いられてもよい。
【００７２】
この発明は、異なる検出器およびグリンレンズを用いるサブウェルの画像化を組込んだシステムを含む、すべてのそのようなシステムに組込まれてもよいことを理解されたい。
【００７３】
また、この発明のさまざまな局面がウェルプレートに関連してこれまで説明されたが、この発明の各々の局面は、サンプルが薄膜またはゲルの別々の領域を占める分析システム、またはウェハもしくはシリコンチップまたは薄いガラスのスライドもしくはシートなどのサンプル支持のマトリックス内に分布する分析システムに等しく適用される。
【００７４】
この発明は添付の図面を参照して、例を用いて以下に説明される。
図１および図１Ａには、表示プレート１２の上に設けられたウェルプレート１０が示されている。この図は分解斜視図であり、図で示された間隔は実際の間隔を誇張したものである。実際には表示プレート１２はウェルプレート１０の底面に非常に近接している。
【００７５】
ウェルプレートは典型的には８つの行の１２の列に配置された９６個のウェルで構成される傾向にあったが、近年高密度のプレートが構成され、典型的な高密度プレートはたとえば９６個のウェルのプレートの３６倍のウェルを含むことができる。しかしながらプレートの面積は基本的なマトリックスと同じである。この場合の唯一の違いはウェルのサイズが減少し、それにより各々の行に沿って６個のウェルを設け、かつ元々のアレイの１個のウェルの代わりに６個のウェルを各々の列に設けることが可能となったことである。すなわち各々の行に沿った１２個のウェルの代わりに７２個のウェルが設けられ、また８つの行の代わりに４８の行が設けられている。
【００７６】
これを利用しかつ９６個の開口部を有する表示プレートのインデックス付けを単純化するために、後者は、９６穴のウェルプレートの元々の９６個のウェルの各々にその位置が対応しながら３４５６穴のウェルプレート内のウェルとサイズが等しい開口部を備えて形成される。これはすなわち、表示プレート１２を、９６個の開口部（１４）の１番目はウェルプレート内の位置６０で３４５６個のウェルの１番目と一致し、表示プレート内の第２の開口部１８は第１の行に沿った７番目のウェル２０と並び、以下も同様となるように並べることにより、３４５６個のウェルのうち９６個を同時に検査することができることを意味する。
【００７７】
開口部１６と２２（１６に隣接する第１の行の中の次のウェル）の間の距離に等しい距離分表示プレート１２を移動させると、表示プレート１２の中の９６個の開口部すべてがウェルプレート１０内の９６個のウェルの新たな一組と並ぶ。表示プレートをウェル１６、２２および２０を含む行に平行に連続して６回のステップで移動させ、各々のステップごとにその行に垂直な６つの位置に移動させ、各々の場合各々の移動は第１の列に垂直なウェルプレート内の隣接するウェルの間の距離（すなわちウェル１６とウェル２４の間の距離）に対応することにより、３４５６個のウェルのすべてが表示プレートとウェルプレートの間の３６回の相関した移動により調べられる。
【００７８】
実際にはウェルプレートは表示プレートに対して移動される。
表示プレート１２内の１４のような開口部の各々は、４５本の個別のファイバから構成されるファイババンドルの終端としての役割を果たす。２つの開口部で終端するファイバが図示のみの目的で示され、一方は２６、他方は２８で示されている。
【００７９】
４５本のファイバの各々のバンドルは３つの１５本のグループから構成され、３０のような１つのグループは励起光源に延在し、３２のような１つのグループは開口部２６と並んだウェルから表示ディスク３６内の開口部３４に蛍光を伝える。第３の１５本のファイバのグループ３８は第２の表示ディスク４２内の別の開口部４０に延在して、蛍光を別の開口部４０に伝える。
【００８０】
開口２８へおよび２８から繋がる図示された他のバンドルを構成する１５本のファイバの３つのグループはそれぞれ参照番号４４、４６および４８で示され、４４のグループの場合、これらのファイバは励起光源から２つの表示ディスク３６および４２内の他の開口部５０および５２にそれぞれ延在する。
【００８１】
後者の各々は各々のディスクの円形の領域にわたり規則的に配置された９６個の開口部を含み、類似のディスク３６′および４２′はディスク３６および４２と一列に並べられる。好適な光フィルタディスク５４および５６は、ディスク３６と３６′の間およびディスク４２と４２′の間に挟まれる。
【００８２】
２つのディスク３６、３６′（４２、４２′）の開口部は１対１対応に基づいて並べられ、ファイバはディスク３６′内の３４′のような並んだ開口部の各々から一般的には５８で示された出力プレート内の直線で囲まれたマトリックス内に配置された９６個の開口部の２つのグループの中にある独自の開口部に繋がる。そのような第１のマトリックスは６０で、かつ第２のマトリックスは６２で示され、開口部３４′および５０′からの６４のようなファイバはマトリックス領域６０内の開口部３４"および５０"に繋がり、ディスク４２′内の開口部４０′および５２′からのファイバ６８および７０はマトリックス６２内の４０"および５２"のような開口部に繋がる。
【００８３】
２つのマトリックス６０および６２は、カメラ７４内の７２で図示された入力ウィンドウの方形のアスペクト比とほぼ一致する、一般的には方形の外形をともに形成する。
【００８４】
励起光源は参照番号７６で示され、それと３０および４４のような１５本のファイバの９６個のグループの間にフィルタ７８が設けられる。３４および５０ならびに４０および５２のような、プレート３６および４２の各々の上の開口部の配置は図２に示される。開口部のうち２つが３４および３６で任意に示される。
【００８５】
２つのマトリックス６０および６２内の９６本のファイバの終端の２つのグループの配置は図３に示される。典型的にはカメラは一般的に方形のアスペクト比を有し、２つのマトリックス６０および６２を構成する１９２個の開口部の配置は利用可能な一般的には方形の外形を最大限に利用している。
【００８６】
この発明の特に好ましい特徴に従うと、たとえば１６のような各々の表示プレートの開口部でファイババンドルを構成する１５本のファイバの３つのグループが図４に示される。黒丸で示されたファイバの終端は励起バンドル３０のファイバに対応し、白丸で示されたファイバはフィルタ５４を含む第１のフィルタ経路に繋がるファイババンドル３２内のファイバの終端に対応し、影付きの丸で示されたファイバは第２のフィルタ５６を含む別の波長選択経路に繋がるバンドル３８内のファイバに対応する。
【００８７】
図４に示されたファイバの各々の直径は典型的には約１００−２００ミクロンであり、典型的にはドープドシリカクラッディングから形成された屈折率の低いクラッディングを有する純シリカコアを含む。典型的にはゲルマニウムがドーパントとして用いられるが、他の材料が用いられてもよい。その結果形成されるファイバは約０．２２の開口値を有する。好ましくはファイバはクラッディングのまわりに被覆も含む。被覆はポリアミドまたはクラッディングの表面のメタライゼーションにより得られるような薄い層状の物質であってもよい。
【００８８】
コア、クラッディングおよびいずれの被覆のための材料も、背景の照明として現われる不所望の光の発生を最小限にするために蛍光を発する傾向が低いことが望ましい。波長が類似しているため、および／または単に放射された光および背景の光が相関して増幅するために、アレイによって放射された光と不所望の光を区別することが困難または不可能となり得るからである。
【００８９】
上述に規定されたファイバは幅広い波長（紫外、可視および赤外を超える波長を含む）を受入れることができ、かつ低レベルの背景ルミネセンス発光しか生じないことが実験で示された。
【００９０】
クラッディング材料に異なるドーパントおよび／または特定のドーパントの特性を選択することにより、開口値を増加させることができる。
【００９１】
このサイズのファイバを用いることは、一般的に円形の断面のアレイにバンドルされると、バンドルの外径は約１．７ｍｍになることを意味する。
【００９２】
ファイババンドルの円形の領域全体にわたり励起ファイバの終端を確実に均一に分布させ、かつ等しく均一に残余のスペースにわたり２つの異なる波長選択経路に繋がるファイバを均一に配置することにより確実に励起光からの照射を強めるためには、図４に示されたファイバの特定の配置には相当の利点があることが認められ、それにより各々のウェルに最適な励起／集光が特徴として得られる。
【００９３】
非常に細いファイババンドルが表示プレート１２ならびに表示ディスク３６および４２の各々の間に必要であるが、ディスク３６′および５２′から出力プレート５８へ繋がるファイバは、ファイババンドルで構成される必要はなく単一のファイバであってもよい。したがってたとえば６４は細いファイババンドルまたは単一のファイバであってもよく、各々の場合典型的には外側の直径は２ｍｍである。
【００９４】
薄いプレート状の角度コリメーティング装置７６は、ファイバの終端３４"、５０"などのマトリックスアレイとカメラ７４の入力ウィンドウの間に設けられてもよい。
【００９５】
フィルタ５４および５６は典型的には干渉フィルタであり、好ましくは異なる波長が選択できるように交換可能である。
【００９６】
図示された例はウェルプレートの例であるが、サンプルは多数のウェルを有するプレート、多数の位置に置かれる薄膜もしくはゲルまたはウェハもしくはシリコンチップまたは同様の物質のような、他のいずれの支持装置の中に含まれてもよいことを理解されたい。
【００９７】
図１に示されたように表示プレートの面積は、表示プレート内の検査用の開口部に対してサンプルの率が高いウェルプレートの面積よりも大幅に小さくなり得る。検査用の開口部の配置、間隔および数がサンプルのグループと並ぶのに好適であって、かつ一方が他方と相関してずらして、異なる位置付けを得ることができれば、サンプルの支持および表示プレートのアスペクト比およびサイズはかなり異なってもよい。
【００９８】
図１に破線で示されたように、スキュー光線をブロックするためにさらなるフィルタ８０、８２が組込まれてもよい。その目的についてはこの後に詳述する。
【００９９】
［干渉フィルタ］
ここで参照されるように、干渉フィルタは、伝送された光の中で建設的および相殺的干渉を発生する、屈折率が異なる多数の誘電性物質の薄い層を含んでもよい。そのようなフィルタは特定の帯域のみを伝送するように設計されてもよく（帯域フィルタ）、また特定の波長で非常に明確なカットオンまたはカットオフを与えかつエッジフィルタをもたらすように作られてもよい。
【０１００】
そのような装置および補助的なブロッキング構造に金属層が組入れられてもよい。広帯域干渉フィルタは通常金属層を含む。
【０１０１】
狭帯域干渉フィルタは、第１次で動作するファブリ・ペロー干渉計と考えられてもよい。
【０１０２】
［ブロックフィルタと干渉フィルタの組合せの例］
［例１］
フルオレセイン−緑色の蛍光分析
フルオレセインのピーク励起波長は４８５ｎｍであり、ピーク放射は５１８−５２３ｎｍの範囲にある。
【０１０３】
ピーク伝送帯域が５２５−５３０ｎｍである干渉フィルタが選択され、この発明に従うと、ショットのＯＧ５１５フィルタのような５１５ｎｍより短い波長を減衰するブロックフィルタが選択される。
【０１０４】
［例２］
クマリン−青色の蛍光分析
クマリンのピーク励起波長は４００ｎｍであり、ピーク放射波長は４５５−４６０ｎｍの範囲にある。
【０１０５】
ピーク伝送波長が４６０ｎｍである干渉フィルタが選択され、この発明に従うと、ショットのＢＧ４５５のような４５５ｎｍより短い波長を減衰するブロックフィルタが選択される。
【０１０６】
［例３］
Ｃｙ５−赤色の蛍光分析
Ｃｙ５のピーク励起波長は６４９ｎｍであり、ピーク放射は６７０ｎｍである。
【０１０７】
ピーク伝送波長が６８０ｎｍである干渉フィルタが選択され、この発明に従うと、ショットのＲＧ６６５のような６６５ｎｍより短い波長を減衰するブロックフィルタが選択される。
【０１０８】
［エネルギ転送分析の例］
放射を刺激するのに励起放射は必要ではない。
【０１０９】
生物ルミネセンス酵素であるルシフェラーゼがドナー部分の１つの例である。アクセプタ部分はウミシイタケ（Renilla）から得られるような緑色の蛍光タンパク質である。
【０１１０】
この場合ドナーの放射波長は４８０ｎｍであり、アクセプタの放射波長は５２０ｎｍである。
【０１１１】
ピーク伝送波長が５３０ｎｍである干渉フィルタが用いられると、ブロックフィルタは、ショットのＯＧ５１５のようにカットオフ波長が５１５ｎｍであることが好ましい。
【０１１２】
ドナーとアクセプタの間でエネルギ転送が起こるところでは、測定されるべき放射光は５２０ｎｍでのアクセプタ放射である。
【０１１３】
エネルギ転送が起こらないときはアクセプタからの放射はほとんどまたは全くないが、ドナーは、上の例では４８０ｎｍである特徴的な放射波長で、光としてのエネルギを失う。
【０１１４】
実際には、５２０ｎｍと４８０ｎｍの両者とも別個にモニタされ、波長の相対的な比率が測定される。
【０１１５】
エネルギ転送のプロセスは１００％の効率で進行するわけではないため、ドナーの成分はその特徴とする４８０ｎｍの波長で光を放射し続け、アクセプタの放射は背景となるドナーの放射に対して測定されなければならない。上の例のような５２０ｎｍの放射波長は、背景となる４８０ｎｍでのドナーの放射に対して測定されなければならない。
【０１１６】
生物ルミネセンス発光および化学ルミネセンス発光の分析のようなエネルギ転送分析の例は、１９８８年に英国チチェスターのエリスハーウッド社（Ellis Harwood Ltd）により出版されたＡ．Ｋ．キャンベル（A. K. Campbell）著の「化学ルミネセンス発光：生物学および医学における原則および適用」（“Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine”）に見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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