(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためにｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーであって、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はペプチド核酸を主骨格として含み、この主骨格中にｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対のＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、膵臓ＲＮａｓｅ、Ｓ１ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼおよびアカパンヌクレアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能な酵素切断部位を有するリンカー。
【請求項２】
前記酵素切断部位が、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  ＡまたはＲＮａｓｅ  Ｉによって切断可能である請求項１記載のリンカー。
【請求項３】
前記酵素切断部位がリボＧである請求項１または２記載のリンカー。
【請求項４】
前記酵素切断部位がピリミジン塩基である請求項１または２記載のリンカー。
【請求項５】
前記酵素切断部位がＲＮＡである請求項１または２記載のリンカー。
【請求項６】
前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミン（ビオチンが結合されているデオキシチミン）、アミノ修飾デオキシチミン、カルボキシ修飾デオキシチミン又はチオール−デオキシチミンである請求項１記載のリンカー。
【請求項７】
前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミンである請求項６記載のリンカー。
【請求項８】
１０〜６０ｍｅｒの長さを有する請求項１〜７のいずれかに記載のリンカー。
【請求項９】
ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物が請求項１〜８のいずれかに記載のリンカーで連結されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項１０】
請求項９に記載のｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体が、請求項１〜８のいずれかに記載のリンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項１１】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項１０に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項１２】
請求項１０に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を複数含むｍＲＮＡチップ。
【請求項１３】
請求項１２記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ。
【請求項１４】
請求項１０に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ。
【請求項１５】
請求項１２記載のｍＲＮＡチップ又は請求項１４記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体又はｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためのリンカー及びそのリンカーを用いて作製したｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体又はｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体に関する。また本発明は、上記連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット等にも関する。
【背景技術】  最近のゲノム科学の領域においては、遺伝子配列を明らかにするという「構造解析」から遺伝子の発現産物による「機能解析」へと研究テーマがシフトしている。遺伝子の機能を具現するのは、基本的に、タンパク質などの発現産物だからである。ゆえに、遺伝子の機能解析にはタンパク質の解析が必須となる。タンパク質の機能解析は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通して行われている。
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２（１９９１））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１３１５−１３１７（１９８５））、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法（Ｒｅｖｚｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３，１７２（１９８６））、ＤＮａｓｅＩフットプリント法（Ｃａｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，５，３１５７（１９７８））、メチル化緩衝法等が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）（非特許文献１）；Ｔａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０８，３０９（２００１）（非特許文献２）等参照）を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている（ＷＯ０１／０１６６００号公報（特許文献１）参照）。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＶ）法はランダムな配列を有する莫大なペプチドあるいはタンパク質のライブラリ中から特定の分子（タンパク質に限らない）に特異的に結合するペプチド、等を選択するタンパク質の進化工学における有力な手法であるが、ｍＲＮＡにピューロマイシンを連結する「リンカー」が高価で非効率であることが実用化の大きな障害になっている。実用的なリンカーは、（１）リンカーとｍＲＮＡとの連結効率（ライゲーション）が良いこと（２）翻訳系から直ちに精製でき、逆転写ＤＮＡプライマーを持ち、速やかにＤＮＡ化できること（３）ＤＮＡ化したＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質連結体の精製が容易なこと等の条件が重要である。特に上記（２）の逆転写を効率的に進めるためにはビオチン修飾したリンカーを用いて翻訳後、速やかにｍＲＮＡ−タンパク質連結体を無細胞翻訳系から精製することが重要である。
しかしながら、上記３つの条件を同時に満たすリンカー未だ知られておらず、そのようなリンカー及びそのようなリンカーを用いて作製されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体の開発が望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、次に示すような、リンカー、そのリンカーを用いて作製したｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット等を提供する。
（１）ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためのリンカーであって、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を主骨格として含み、この主骨格中にｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有するリンカー。
（２）前記切断部位が、酵素切断部位である上記（１）記載のリンカー。
（３）前記酵素切断部位が、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  ＡまたはＲＮａｓｅ  Ｉによって切断可能である上記（２）記載のリンカー。
（４）前記酵素切断部位がリボＧである上記（２）記載のリンカー。
（５）前記酵素切断部位がピリミジン塩基である上記（２）記載のリンカー。
（６）前記酵素切断部位がＲＮＡである上記（２）記載のリンカー。
（７）前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミン（ビオチンが結合されているデオキシチミン）、アミノ修飾デオキシチミン、カルボキシ修飾デオキシチミン又はチオール−デオキシチミンである上記（１）記載のリンカー。
（８）前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミンある上記（７）記載のリンカー。
（９）１０〜６０ｍｅｒの長さを有する上記（１）〜（８）のいずれかに記載のリンカー。
（１０）ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物が上記（１）〜（９）記載のリンカーで連結されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
（１１）上記（１０）に記載のｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体が、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のリンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
（１２）前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、上記（９）に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
（１３）上記（１１）に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を複数含むｍＲＮＡチップ。
（１４）上記（１３）記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ。
（１５）上記（１１）に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ。
（１６）上記（１３）記載のｍＲＮＡチップ又は上記（１５）記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含む診断キット。
本発明のリンカーは、合成効率が良く安価に作製できるという利点がある。また、本発明の好ましい態様におけるリンカーは、従来のリンカーと比較して短く設計することが可能であるため、ｍＲＮＡとのライゲーション効率が良いという利点もある。また、本発明のリンカーを用いて作製したｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体は、固相に結合したｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相から取り外す際の効率も向上している。さらに、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法を実施した場合は、得られるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体の精製が容易であるという利点もある。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のリンカーも用いて作製したｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法を実施する場合を説明する図である。図中、１はｍＲＮＡ、２はピューロマイシン、３はリンカー、３ａは固相結合部位、３ｂは切断部位、４はｍＲＮＡ−ＰＭ連結体、５はタンパク質、そして、６はストレプトアビジン磁性体ビーズを示す。
図２は、実施例で用いたＳＢＰリンカーとＬＢＰリンカーを用いた場合のライゲーションについて説明する図である。
図３は、実施例で得られた反応物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
図４、実施例で用いたＳＢＰリンカーとＬＢＰリンカーにおける固相結合部位の切断について説明する図である。
図５は、実施例において、固相結合部位を切除した後の反応物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
図６は、実施例において、ＲＮａｓｅＨによる処理後の反応産物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
１．ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体作製用リンカー
本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためにｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーに関する。本発明において、「リンカー」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法において用いられるｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体又はｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製する際に、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーのことをいう。ここで、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体のことを「ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体」、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体のことを「ｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体」、そしてｍＲＮＡ−ＰＭ連結体又はｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体のことを「ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体」ともいう。このリンカーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのＡサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために、ｍＲＮＡとピューロマイシンの間に挿入される。また、このようなリンカーに固相結合部位を設けることによって、ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相に結合させることができ、種々の反応を効率良く行なうことができる。
本発明のリンカーは、１本鎖ＤＮＡ及び／又はペプチド核酸を主骨格として含み、この主骨格中にｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有することを特徴とする。なお、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はＤＮＡやＲＮＡとは異なり、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているＤＮＡ類似構造の化合物である。本発明のリンカーは、全体として、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するように設計する。本発明のリンカーは、１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡを主骨格として含むものであり、上記リンカーの機能を果たす限り、１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡの部分以外に、それ以外の骨格部分を有することもできる。本発明のリンカー中で、１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡ以外の部分としては、例えば、ＲＮＡ鎖、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを選択することができる。これらの直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。なお、本明細書で、「１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡを主骨格として含む」とは、例えば、リンカーの骨格全長に対して、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上が１本鎖ＤＮＡ及び／又はＰＮＡで構成されていることをいう。なお、ＤＮＡとＰＮＡの両者を主骨格中に含む場合は、その比率は特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ：ＰＮＡ＝１：９〜９：１の範囲が例示される。
本発明のリンカーは、その主骨格中にｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相部位に結合するための固相結合部位を有する。この固相結合部位としては、例えば、ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体をリンカーを介して固相に結合させるための部位であり、例えば、ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相に結合させる化合物、結合基などを結合し得る塩基、あるいは、ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相に結合させる化合物、結合基などが結合した塩基である。より具体的には、固相結合部位としては、ビオチンを結合し得る塩基（例えば、デオキシチミン（ｄＴ））もしくはビオチンが結合した塩基（例えば、ビオチン−デオキシチミン（Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ））、アミノ基によって修飾された塩基（例えば、アミノ修飾デオキシチミン（例、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６−ｄＴ：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製）、カルボキシ基によって修飾された塩基（例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄＴ））、チオール基によって就職された塩基（たとえば、チオール修飾デオキシチミン（４−Ｔｈｉｏ−ｄＴ））等が挙げられる。本発明の好ましい態様では、固相結合部位はビオチン−デオキシチミンである。そして、このような固相結合部位を介し、ビオチンとアビジンの親和性を利用して、ビオチンが連結されたｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体をアビジンが固定された固相に結合させることができる。なお、上記固相結合部として、カルボキル基やアミノ基が結合した塩基が選択された場合は、固相とｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体をエステル結合やアミド結合で結合させることができる。
本発明のリンカーは、必要に応じて、ｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相から取り外すために、前記固相結合部位を挟む位置に一対の切断部位を設ける。このような切断部位は、特にこれに限定されないが、例えば、酵素切断部位である。本発明の好ましい態様においては、前記切断部位は酵素切断部位であり、例えば、リボＧ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）である。固相に結合されたｍＲＮＡ−ＰＭ−（ＰＲＴ）連結体を固相から取り外す際は、上記切断部位を切断する酵素等で切断する。ここで用いられる酵素としては、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、膵臓ＲＮａｓｅ、Ｓ１ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンヌクレアーゼなどを用いることができる。本発明では、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉ及び膵臓ＲＮａｓｅが好ましく、特にＲＮａｓｅＴ１が好ましい。酵素切断部位は、使用する酵素の種類によって適宜選択することができる。
本発明のリンカーは、種々の反応工程での反応性、得られるＤＮＡ／タンパク質複合体の精製効率などを考慮して、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは１５〜３０ｍｅｒの長さを有する。なお、本発明のリンカーは、公知の化学合成の手法を用いて作成することができる。
２．固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体
本発明は、上記リンカーを用いてｍＲＮＡとピューロマイシンとを連結させてなるｍＲＮＡ−ＰＭ連結体にも関する。
本発明で用いられるｍＲＮＡは、配列未知のもの、配列既知のものの両者を含む。すなわち、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列既知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、配列既知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いる。逆に、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析する場合は、配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いることができる。ここで用いられるｍＲＮＡは、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、各種抗体又はその断片をコードするｍＲＮＡ、各種酵素をコードするｍＲＮＡ、各種遺伝子ライブラリー中のＤＮＡから転写される配列未知のｍＲＮＡ、有機合成によってランダムに合成された配列を有するＤＮＡから転写されたランダムな配列を有するｍＲＮＡなどから選択される。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体は、通常、ｍＲＮＡの３’末端に上記リンカーを介してピューロマイシン（ＰＭ）を連結したものである。ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、ｍＲＮＡにリンカーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓビリオンが生成することが知られている（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）参照）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似している、下記式（Ｉ）：
0004318721.tif 000002
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などであり、下記にその化学構造式を示す。
0004318721.tif 000003
0004318721.tif 000004
ｍＲＮＡとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをリンカーとして用いる場合は、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡリンカーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。また、リンカーとピューロマイシンを連結する場合は、通常、公知の化学的手法によって連結される。
また、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を作成するに際しては、リンカーの一部をｍＲＮＡを調製する際にｍＲＮＡの３’末端側に形成しておき、これにピューロマイシンを結合したリンカーの残部を結合することによってｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を作製することもできる。この場合は、ｍＲＮＡの３’末端側に形成したリンカーの一部中に切断部位を設けることもできる。
なお、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体には、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、リンカー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
３．固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体
本発明の別の態様によれば、上記リンカーの固相結合部を介してｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定化してなる固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が提供される。
ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。なお、本明細書では、上記ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体がビーズに固定されたものを「ｍＲＮＡビーズ」という。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体においては、ｍＲＮＡとＰＭを連結するリンカーに固相結合部位が設けられており、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する。固相結合部位は、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビース、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
４．タンパク質の固相固定化方法及びタンパク質の固相合成方法
本発明の別の態様によれば、タンパク質の固相固定化又は固相合成法であって、（ａ）上記リンカーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を調製する工程、（ｂ）該リンカーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する工程；及び（ｃ）該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体と翻訳系とを接触させることにより（例えば、該連結体に翻訳系を投入、あるいは該連結体を翻訳系に投入）、タンパク質を合成する工程を含む、タンパク質の固相固定化又は合成法が提供される。工程（ｂ）において、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固相に固定されているので、この連結体を翻訳系に投入した際に、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法の対応づけ技術を利用して、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して固相に固定化されるのである。
上記（ｃ）工程では、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ  Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ  Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  Ｕ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７  ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
ここで、図１に基づいて、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法のプロセスについて簡単に説明する。
図１（ａ）中、１はｍＲＮＡ、２はピューロマイシンであり、両者はリンカー３を介して連結され、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体４を構成している。リンカー３は、固相結合部位３ａ及び切断部位３ｂを有している。なお、５はピューロマイシン２に結合したタンパク質である。図１（ｂ）及び（ｃ）中、６は固相結合部位３ａが結合しているストレプトアビジン磁性体ビーズである。図１（ｃ）〜（ｄ）中、７は逆転写によって生成したＤＮＡである。なお、図１（ｂ）〜（ｅ）において、重複する図番は省略している。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法においては、まず、図１（ａ）に示すように、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体４を無細胞翻訳系などの翻訳系に供することによって、そのｍＲＮＡに対応するタンパク質が合成される。このタンパク質は図に示されるようにピューロマイシン２に結合する。次いで、得られたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体をビーズ６に固定し（図１（ｂ））、これを逆転写反応に供することによって、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡが生成する（図１（ｃ））。ここで、ＲＮａｓｅＴＩなどの酵素によって、切断部位３ｂでリンカーを切断すると、ストレプトアビジン磁性体ビーズ６を除去することができる（図１（ｄ））。さらに、必要に応じて、ＲＮａｓｅＨで、ｍＲＮＡを分解するとタンパク質とそれをコードするＤＮＡが連結したＤＮＡ−タンパク質連結体が生成する。このようにして得られるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（複合体）、ＤＮＡ−タンパク質連結体（複合体）を種々の解析実験に供することによって、タンパク質の機能などを効率良く解析することができる。
５．ｍＲＮＡチップ及びプロテインチップ
本発明の別の態様によれば、上記した固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数含むｍＲＮＡチップ（ｍＲＮＡマイクロアレイ）が提供される。このｍＲＮＡチップは、上述したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数基板上に固定化したものである。このｍＲＮＡチップを翻訳系に投入することにより、あるいは、翻訳系をｍＲＮＡチップに投入することにより、上述のタンパク質合成がチップ上で起こり、各タンパク質が固相に結合した、いわゆるプロテインチップが作製される。
本発明のｍＲＮＡチップにおいては、機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数を、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体として固相に固定してもよいし、機能未知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数をｍＲＮＡ−ＰＭ連結体として固相に固定してもよい。例えば、疾病に関与する機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡを複数チップに固定する場合は、例えば、疾病の診断用ｍＲＮＡチップとすることができる。この場合は、ある特定の疾病の診断マーカーと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれプレートの所定の位置に固定しておく。そして、診断を行う直前にこのプレートに無細胞翻訳系を投入して、プレート上の所定の位置に所望の診断マーカーと結合するタンパク質を合成し、固定する。このようにすれば、診断の直前にプロテインチップを作製することができる。プロテインチップは、その保存上あるいは取り扱い上に問題がある。不安定なプロテインの代わりに安定なｍＲＮＡの形でチップ化したところに、本発明の特徴がある。ゆえに、ｍＲＮＡの固相固定化及びタンパク質の合成・固定化以外の技術（例えば、使用するプレートの材料・サイズ、使用するプロテインの種類・配置、プロテインチップを用いたタンパク質の機能解析方法等）は、公知のプロテインチップの技術をそのまま利用することができる（Ｋｕｋａｒ  Ｔ，Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ  Ｓ，Ｇｕ  Ｙ，Ｌｉａｎ  Ｗ，Ｍｅｇｇｉｎｓｏｎ  Ｍ，Ｓｈｅ  ＪＸ，Ｗｕ  Ｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｄ  ａｎｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３０６（１）：５０−４等参照）。なお、上記ｍＲＮＡビーズ又は上記ｍＲＮＡチップと無細胞翻訳系を含む診断キットも本発明の範囲内である。このようなｍＲＮＡチップを用いることによって、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、リガンドの探索、疾病マーカーの探索、疾病の診断、薬効評価、薬物動態の評価などに利用することができる。
６．タンパク質と分子との相互作用を解析する方法
本発明の別の態様によれば、上記したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いたタンパク質と分子との相互作用を解析する方法が提供される。この解析方法は、（ａ）−以上の固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を、翻訳系に投入し、固相上でタンパク質を合成する工程；（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程を含む。
この解析方法は、例えば、（ｉ）配列既知のタンパク質に作用する物質をスクリーニングする場合、（ｉｉ）ある特定の物質（例えば、リガンド）が結合する配列未知のタンパク質をスクリーニングする場合等に用いることができる。例えば、（ｉ）の場合は、配列既知のタンパク質（例えばオーファンレセプタータンパク質）をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を複数用意しておき（すなわち、複数のオーファンレセプタータンパク質に対応するｍＲＮＡをそれぞれ有するｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数用意）、これを翻訳系に投入する。すると、各ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のｍＲＮＡから複数のオーファンレセプタータンパク質が合成される。各オーファンレセプタータンパク質は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のピューロマイシンにＣ末端が結合することによって固定される。必要に応じて、不要な成分を洗浄除去し、これに標的物質及びバッファー等を加えて、標的物質をオーファンレセプタータンパク質に結合させることによって、結合実験を行う。（ｉｉ）の場合は、例えば、ある遺伝子ライブラリーから複数のｍＲＮＡを取得し、複数のｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を作成し、固相に固定する。以下、同様にタンパク質の合成を行い、標的物質をそのタンパク質に接触させて結合実験を行う。
上記工程（ｂ）においては、工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
次いで、本解析方法によれば、工程（ｃ）において、該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。そのような測定手法としては、例えば、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））、エバネッセント場分子イメージング法Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））、蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、及び蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））等が挙げられる。
本発明の解析方法においては、必要に応じて、さらに、工程（ｃ）において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び／又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているｍＲＮＡからＤＮＡを逆転写し、得られたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、ＮＭＲ、ＩＲ、各種質量分析などによって行うことができる。なお、本発明のｍＲＮＡチップ及びプロテインチップを用いて、タンパク質−タンパク質間相互作用を解析する場合は、通常のプロテインチップ上のサンプル解析と同様に、飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いることができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
新規リンカーを用いたＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｉｏｎ（ビリオン）（ＲＮＡ／ＤＮＡ−タンパク質連結体）の合成
（１）新規リンカーと従来のリンカー合成効率の比較
１．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ用リンカー：Ｓｈｏｒｔ−Ｂｉｏｔｉｎ−ピューロマイシン・リンカー（ＳＢＰリンカー）及びＬｏｎｇ−Ｂｉｏｔｉｎ−ピューロマイシン・リンカー（ＬＢＰリンカー）の合成
まず、以下の特殊ＤＮＡ合成をＢＥＸ社から購入した。
（Ａ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、（Ｓ）は５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシン  ＣＰＧ、（Ｓｐａｃｅｒ１８）は商品名「Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８」で化学名は（１８−０−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する（すべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）。
0004318721.tif 000005
（Ｂ）Ｈｙｂｒｉ［配列番号１：５’−ＣＣ（ｒＧ）Ｃ（Ｔ−Ｂ）  Ｃ（ｒＧ）ＣＣＣ  ＣＧＣＣＧ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧ（Ｔ）ＣＣ  Ｔ−３’］
ここで、（ｒＧ）はリボＧ、（Ｔ）はＡｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ（５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、（Ｔ−Ｂ）はＢｉｏｔｉｎ−ｄＴ（５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ−５−［Ｎ−（（４−ｔ−ｂｕｔｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−ｂｉｏｔｉｎｙｌ）−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ−３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）
である（すべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製）。
（Ｃ）Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ［（５６ｍｅｒ）配列番号２；５’−ＣＣＣＧＧ  ＴＧＣＡＧ ＣＴＧＴＴ  ＴＣＡＴＣ（Ｔ−Ｂ）ＣＧＧＡ  ＡＡＣＡＧ ＣＴＧＣＡ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧＣＣＧ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧ（Ｔ）ＣＣＴ−３’］
（アンダーラインは制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す）
本発明のリンカーは（Ａ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓと（Ｂ）Ｈｙｂｒｉを以下の方法に従って架橋し精製したもので、これを「ＳＢＰリンカー」と名づける。また、比較のために（Ａ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓと（Ｂ）Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを架橋した「ＬＢＰリンカー」も合成した。以下に、合成法を示す。
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ  １０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を１μｌ加え（ｆｉｎａｌ  １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰを除いた。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌのＨｙｂｒｉまたはＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ  ２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え、室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＨｙｂｒｉまたはＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム：ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ  ＣＳＯＭＯＳＩＬ  ３７９１８−３１  １０ｘ２５０ｍｍ  Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％  ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ  尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
２．リンカー合成効率の比較
上記の方法により合成した結果、（１）ＳＢＰリンカー、（２）ＬＢＰリンカーのどちらも等量の５ｎｍｏｌのＨｙｂｒｉ，Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｏｏｐから出発して合成した。しかし、最終的に得られたリンカーの量は（１）ＳＢＰリンカー４４９．２ｐｍｏｌ（２）ＬＢＰリンカー１９８ｐｍｏｌで、ＳＢＰリンカーはＬＢＰリンカーと比較してほぼ２倍程度の収率で得られた。これは、ＨｙｂｒｉがＢｉｏｔｉｎ−Ｌｏｏｐの約半分程度の分子量であるために反応性が良いことが理由であると考えられる。また、ＨＰＬＣの精製の際に、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｏｏｐは長いため反応産物はいくつかの２次構造を取ると思われる。このため、ＬＢＰリンカーの場合は精製効率が悪いと思われる。
（２）ライゲーション効率の比較
モデルｍＲＮＡとして転写因子Ｏｃｔ−１のＰＯＵ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（３４０ｍｅｒ）とアルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）（１．１２ｋ  ｍｅｒ）を用いて、（図２）に示したような２種類のリンカーの連結効率を比較した。図２中、矢印は連結すべき箇所を示している。
１．Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション酵素反応
ライゲーション反応はｍＲＮＡ１０ｐｍｏｌに対しリンカー１５ｐｍｏｌを加え２０μｌのＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１ｍＭ  ＡＴＰ）で行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、７０℃で５分間ヒートブロックで温めた後、１０分間室温で冷やし氷上に置いた。ここに１μｌのＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μｌ；Ｔａｋａｒａ），１．５μｌのＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（４０Ｕ／μｌ；Ｔａｋａｒａ）と２μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ／μｌ；Ａｍｂｉｏｎ）を加え２５℃で１０分から３０分インキュベーションした。
２．ライゲーション反応の結果
上記に従って反応した産物は、６５℃、８Ｍ  Ｕｒｅａの５％変性アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。その結果を図３に示す。
図３中、レーン１はＰｏｕのｍＲＮＡ、レーン４はＡＬＲのｍＲＮＡである。レーン２、５はＳＢＰリンカーを使ってライゲーション反応を行ったもの、レーン３，６はＬＢＰリンカーを用いてライゲーション反応を行ったものである。なお、図３中、矢印はｍＲＮＡまたはリンカーが連結していないｍＲＮＡの位置を示し、＊はリンカーが連結された位置を示す。
図３から分かるとおり、ＳＢＰリンカーを用いた場合の連結効率は９５％以上である。一方、ＬＢＰリンカーを用いた場合は８０％以下で、反応時間を２時間以上に延ばしてもこの結果は変わらなかった。したがって、ＳＢＰリンカーは反応時間を１０分という従来の１０分の１の時間で従来のリンカー以上の連結効率を得ることができた。
（３）ビオチン部分の切断効率
図４に示すように、ビオチン部分の切断において、ＳＢＰリンカーとＬＢＰリンカーでは使用する酵素が異なる。
１．ＲＮａｓｅＴ１による切断（ＳＢＰリンカーの場合）
１０ｐｍｏｌのＳＢＰリンカーとｍＲＮＡのライゲーションを行なった後、２０μｌの逆転写用バッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭ  ＫＣｌ；１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１μｌ加え５０℃、３０分反応させＤＮＡ化した。次にそのままＲＮａｓｅ  Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ）を１００Ｕ加え、３７℃で１０分反応させた。
２．制限酵素ＰｖｕＩＩによる切断（ＬＢＰリンカーの場合）
１０ｐｍｏｌのＬＢＰリンカーとｍＲＮＡのライゲーションを行なった後、２０μｌの逆転写用バッファー中で逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１μｌ加え５０℃、３０分反応させＤＮＡ化した。ここに２４ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）で３７℃、２時間反応させた。
３．切断反応の結果
上記のような反応を行なった後、得られた反応物を５％の８Ｍ  Ｕｒｅａアクリルアミドゲル電気泳動を６５℃恒温下で行った結果を、図５に示す。図５中、＊印は分解された産物のバンドを示し、矢印は分解されなかった産物のバンドである。
図５に示されるように、ＳＢＰリンカーはほとんど分解されているが、ＬＢＰリンカーは２時間の反応後も分解されない反応物があることが分かった。
（４）ＳＢＰリンカーとＬＢＰリンカーのＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｉｏｎ（ＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質結合体）合成効率の比較
ＳＢＰリンカーとＬＢＰリンカーをＰｏｕのｍＲＮＡに連結し、図１に示したようなスキームでそれぞれの場合のＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質結合体を得た。ただし、ＬＢＰリンカーの場合、図中のＲＮａｓｅ  Ｔ１の部分については、上記（３）「ビオチン部分の切断効率」に記載した方法で制限酵素のＰｖｕＩＩで切断した。また、最終産物（ＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質結合体）の確認は逆転写後、このままでは元のｍＲＮＡに比べ分子量が２倍以上になって電気泳動で確認できないため、ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡ部分を分解し、ＤＮＡ−タンパク質結合体にして確認した。
１．ｍＲＮＡのリンカーＤＮＡへの連結
１０ｐｍｏｌのＰｏｕ−ｍＲＮＡと１５ｐｍｏｌのリンカーは、上述の（２）ライゲーション反応の比較の「１．Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション酵素反応」に基づいて連結を行った。
２．ｍＲＮＡ−ＤＮＡリンカーの精製と沈殿
次に、未連結のＤＮＡリンカーを除くために、ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いて添付のプロトコールに従い精製した。回収したｍＲＮＡ−ＤＮＡリンカー（３０−５０μｌ）は、共沈剤Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ  Ｐｌｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍ）によって添付のプロトコールに従いエタノール沈殿した。これを４−１０μｌのＤＥＰＣ水に溶解し翻訳用テンプレートとした。
３．ＩＶＶ形成（翻訳とｍＲＮＡ−タンパク質連結）
翻訳に使用される全ての試薬は撹拌して遠心後、氷上に置いた。２５μｌスケールの反応は次のような順番で混合して反応させた。
０．６２５μｌの？  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと０．６２５μｌの？  ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを混合し１．２５μｌの１Ｍ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅを加えた。ここに２μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を加えた。さらに１７μのＲｅｔｉｃ  ｌｙｓａｔｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）を注意深く加え丁寧にピペッテイングして泡が出ないようにした。この混合液を上記の２．で調整したテンプレートに加えた。そして再び泡がでないように丁寧に混合した。次に３０°Ｃ、２０分反応させた。ここに３μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２と７μｌの３Ｍ  ＫＣｌを加え３７℃で２ｈインキュベーションした。
４．ｍＲＮＡ−タンパク質連結体のストレプトアビジンビーズ（ＳｔＡＶビーズ）への固定
ビオチン−ストレプトアビジンの結合を利用してｍＲＮＡ−タンパク質連結体を無細胞翻訳系から精製した。上記３で形成されたｍＲＮＡ−タンパク質連結体をまず、Ｍａｇｎｏｔｅｘ−ＳＡ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔａｋａｒａ社）２０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブにとり、マグネットスタンドに１分間靜置した後上清捨てた。次に２００μｌの１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、次にｍＲＮＡ−タンパク質連結体と同体積の２×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、ここに洗浄したＭａｇｎｏｔｅｘ−ＳＡ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓを加えた。サスペンドしたｐａｒｔｉｃｌｅｓを室温で１５分間ゆっくりローテーションした。結合反応の後、ｐａｒｔｉｃｌｅｓを２回ほど１０倍量の１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、１回０．０１％  ＢＳＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄した。
５．逆転写反応
固定化したｍＲＮＡ−タンパク質連結体のｍＲＮＡをＤＮＡ化して安定化するために以下のように行った。
４μｌ  ５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；３７５ｍＭ  ＫＣｌ；１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に１μｌ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌ  ＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、３μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）、１μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、洗浄したｍＲＮＡ−タンパク質連結体付のビーズを加えて最終体積が２０μｌになるようにし、５０°Ｃで反応させた。この際、チューブをローテーションさせてビーズが沈殿しないように留意した。
６．ＳｔＡＶビーズからのＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質連結体の切り出し
ＳＢＰリンカー、ＬＢＰリンカーのそれぞれについて上記（３）「ビオチン部分の切断効率」に記載の方法に従って切断反応を行った。反応時間終了後、マグネットスタンドを用いてビーズを壁に吸着させ、切り離されたＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質連結体を含む上清を回収した。
７．ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ部分の分解反応
上記６で得られた上清に１μｌのＲＮａｓｅＨ（Ａｍｂｉｏｎ社）を加え４０℃、２０分反応させた。反応物は、６％アクリルアミドゲルの８Ｍ  尿素ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果を図６に示す。図６中、レーン１，２はＳＢＰリンカー、レーン３，４はＬＢＰリンカーでそれぞれＩＶＶ反応を行った結果である。レーン１，３の「Ａ」はｍＲＮＡ−タンパク質連結体で「Ｂ」はｍＲＮＡとリンカーの結合体の位置で；レーン２，４における「Ｃ」の位置はｃＤＮＡ−タンパク質連結体を示す。
図６に示される結果から分かるように、ＳＢＰリンカー、ＬＢＰリンカーに連結したｍＲＮＡの量は等量であるが、レーン１と３を比べると全体的にレーン１のバンドが濃い（つまり量が多い）。これはＳＢＰリンカーの方がリンカーとの連結反応時間も短く効率も良いため、ＲＮＡの分解が少なくてすむためと考えられる。また、レーン２，４を比べるとＣの位置のｃＤＮＡ−タンパク質連結体のバンドがＬＢＰリンカーに比べＳＢＰリンカーの方が２倍ほど濃い。これは最終的なＤＮＡ／ＲＮＡ−たんぱく質連結体がＳＢＰリンカーはＬＢＰリンカーの２倍得られたことを意味する。ＳＢＰリンカーはＬＢＰリンカーに比べ短い時間で完全に切り離すことができること、及び全体の行程を半分の時間以下で行うことができたためＲＮＡの分解も少ないこと等の理由により、最終的な収量が２倍以上になったと考えられる。さらに、リンカー自体の合成単価も半分以下にすることができたので、従来のものに比べ全体で４倍以上の効率化を達成することができたと考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、合成効率が良く安価に作製できるｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体作製用リンカーを提供でいる。また、本発明の好ましい態様におけるリンカーは、従来のリンカーと比較して短く設計することが可能であり、ｍＲＮＡとのライゲーション効率が良くかつ迅速で精製効率が良いという利点もある。このことにより、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ技術の実施の促進につながり、ＤＮＡ及びタンパク質の機能解析及び機能タンパク質の取得を目指す進化分子工学における発展が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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