(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節解除されたシステイン代謝を有し、野生型菌株に比べて増大したＯ−アセチル−Ｌ−セリンの内因性生産を有する微生物の菌株における直接発酵による非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の製造方法において、発酵の間、次の群：
−  一般式（１）：
Ｈ−Ｓ−Ｒ1                （１）
［式中Ｒ1は一価の置換または非置換の最高１５個のＣ原子を有するアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはヘテロアリール基を意味する］のチオール；
−  一般式（２）または（３）：
【化１】
0004240864.tif 000009
［式中ＸおよびＹは同じかまたは異なり、ＣＲ4またはＮを意味し、Ｒ4は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ3-、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、Ｃ1〜Ｃ5アルキルカルボニル基またはＲ1を意味し、Ｒ1は式（１）につき記述した意味を有しおよび
Ｒ2およびＲ3は同じかまたは異なりおよびＲ4を意味するか
または式（３）中のＣ1およびＣ2は、置換基Ｒ2およびＲ3の代わりに橋［−ＣＲ5Ｒ6−］a（ａは１、２、３または４に等しい）により環に結合されており、
Ｒ5およびＲ6は同じかまたは異なりおよびＲ4を意味し、１個以上の非隣接基［−ＣＲ5Ｒ6−］は酸素、硫黄または、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基で置換されたもしくは置換されていないイミノ基により代えられていてもよくおよび２個の隣接基［−ＣＲ5Ｒ6−］は基［−Ｒ5＝ＣＲ6−］によるかまたは基［−ＣＲ5＝Ｎ−］により代えられていてもよい］のアゾールならびにそのエステル、エーテルまたは塩、
−  一般式（４）または（５）：
【化２】
0004240864.tif 000010
［式中Ｘ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は既述した意味を有し、
および式（５）中のＣ1およびＣ2は置換基Ｒ2およびＲ3の代わりに式（３）につき定義したような橋により環に結合されていてもよい］のイソオキサゾリノンならびにそのエステル、エーテルまたは塩
から選択された求核化合物を、これが微生物の菌株による非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の生産を生じるような量で発酵バッチに配量することを特徴とする非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
発酵の終わりに、非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸を発酵バッチから自体公知の方法を用いて分離することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物の菌株として大腸菌の菌株を使用することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
発酵槽中での微生物の菌株の培養を連続培養として、回分培養としてまたは流加培養として行うことを特徴とする請求項１または３記載の方法。
【請求項５】
Ｃ源および求核化合物を発酵の間連続的に配量することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
求核化合物の配量を発酵の開始から６〜８時間後に開始し、発酵の終了まで継続することを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
添加される求核化合物の量は発酵培養液の初期体積１リットルあたり１０〜１０００ミリモルの範囲内で変動することを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ｃ源として糖、糖アルコールまたは有機酸を使用することを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｃ源の配量を、発酵槽中のグルコース含量が０．１〜５０ｇ／ｌの範囲内に保持されることを保証する形で行なうことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ源としてアンモニア、アンモニウム塩またはタンパク質加水分解産物を使用することを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
発酵培養液のｐＨ値が４〜１０の範囲内にあり、インキュベーション温度が１５〜４５℃であることを特徴とする請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
好気性成長条件下に実施することを特徴とする請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸を、発酵バッチから濾過または遠心分離によりバイオマスを分離した後に、培養上澄みから抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿または結晶化を用いて単離することを特徴とする請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸が一般式（６）：
【化３】
0004240864.tif 000011
［式中Ｚは式（７）〜（１３）
【化４】
0004240864.tif 000012
から選択された一価の基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、ＸおよびＹは既に式（１）〜（５）につき記述した意味を有する］のＬ−立体配置のアミノ酸、ならびにそのエステル、エーテルまたは塩であることを特徴とする請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
群１，２，３，４−テトラゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（１４）、１，２，３，４−テトラゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（１５）、１，２，３−トリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（１６）、１，２，３−トリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（１７）
【化５】
0004240864.tif 000013
［式中Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は請求項１記載の意味を有する］から選択された、そのエステル、エーテルまたは塩を含む化合物。
【請求項１６】
式
【化６】
0004240864.tif 000014
［式中Ｒ7は以下の意味を有する：ピロリル基、ピラゾリル基、テトラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、フラニル基、ピリジニル基、ピラジニル基、ベンズイミダゾリル基、ベンゾトリアゾリル基及びプリニル基］のＳ−ヘテロアリール−Ｌ−システイン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の直接発酵による非タンパク質原性（nicht-proteinogen）Ｌ−アミノ酸の製造方法ならびに該方法により得られるＬ−アミノ酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非タンパク質原性アミノ酸は、自然界にタンパク質生合成の構成単位として使用されず、これにより２０種のタンパク性アミノ酸から明確に限定しうるアミノ酸である。とくに、β−置換Ｌ−アラニン誘導体である。
【０００３】
非タンパク質原性アミノ酸は、たとえば薬学および農学作用物質の製造のための重要な化合物である。これらは、一種の分子擬態における作用物質としてまたは作用物質の部分として天然アミノ酸の構造を模造し、これによりたとえば受容体相互作用において天然の反応のモジュレーションを惹起することができる。さらに、これらのアミノ酸は全く一般的に合成構成単位としての“キラルプール（chiral pool）”の範囲内のキラル化合物として使用することができる。
【０００４】
鏡像異性体濃厚形の非タンパク質原性アミノ酸の従来の製造方法は、たいてい費用がかかり、さらにたいてい特定の化合物への到達しか許さない合成を基礎とする。少数の方法だけが、出発物質の簡単な交換により種々の化合物の製造を可能にする。
【０００５】
たいていの場合、それ自体たいてい既にキラル構成単位から出発するかまたはラセミ分割を惹起する化学合成が問題である。
【０００６】
選択的に、幾つかの酵素的方法も記載されている。それで、トランスアミナーゼを用いα−ケト酸からアミノ供与体としてのＬ−グルタミン酸で種々の非タンパク質原性アミノ酸を製造することができる。他の方法は、カルバモイラーゼと組合せてヒダントイナーゼを利用する。しかし、酵素的方法は同様に費用がかかる、それというのも相当する酵素を準備しなければならずおよびこれら酵素は触媒として制限された寿命しか有しないからである（Ｒｅｈｍ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６年；６巻、５０５〜５６０ページ）。
【０００７】
それに対して、微生物の直接発酵による非タンパク質原性アミノ酸のの製造方法はとくに簡単かつ有利である。しかし、このような方法は、生産された非タンパク質原性アミノ酸が天然のアミノ酸の代謝と干渉し、それで成長を阻止する危険を内包する。従来、このテーマの範囲内ではＤ−アミノ酸の直接発酵方法が公知である（ＷＯ９８／１４６０２号）。この出願は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子およびＬ−アミノデアミナーゼ遺伝子が組入れられている組替え微生物を用いるＤ−アミノ酸の製造を記載する。さらに、斉藤等（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９７年、２０巻：４７〜５３ページ）は、大腸菌中に植物性遺伝子の発現による植物性非タンパク質原性アミノ酸Ｌ−ピラゾリルアラニンの生産を記載した。しかし収率は、商業製品には＜１ｇ／ｌと低すぎ、費用は記載された出発物質としてのＬ−セリン使用の場合非常に高い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、直接発酵による一連の非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の能率的製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この課題は、調節解除されたシステイン代謝（deregulierten Cystein−Stoffwechsel）を有する自体公知の微生物の菌株を自体公知の方法で発酵させ、発酵の間求核化合物を、該化合物が微生物の菌株による非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸を生産するような量で発酵バッチに配量することを特徴とすることにより解決される。
【００１０】
とくに、発酵の終わりに非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸は、その都度の発酵バッチから自体公知の方法を用いて分離される。
【００１１】
意外にも、調節解除されたシステイン代謝を有する微生物菌株の発酵の場合に、硫化物の代わりに一連の他の求核化合物が非常に能率的にアミノ酸代謝に関与し、相応する反応生成物は培養液中へ分離されることが判明した。その際、有利にグルコースを廉価な炭素源として使用することができる。
【００１２】
従って、本発明により発酵の間求核化合物を配量することにより、非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸が形成される。それ故、とくにアミノ酸代謝に関与する求核化合物は発酵の間に添加される。
【００１３】
好ましくは、群：
【００１４】
【化６】
0004240864.tif 000002
【００１５】
から選択された基を包含する求核化合物が添加される。
【００１６】
とくに好ましくは、発酵バッチに次の群：
−  一般式（１）
Ｈ−Ｓ−Ｒ１                （１）
［式中Ｒ１は一価の置換または非置換のアルキル基、アルコキシ基、アリール基または最高１５個のＣ原子を有するヘテロアリール基を意味する］のチオール；
−  一般式（２）または（３）：
【００１７】
【化７】
0004240864.tif 000003
【００１８】
［式中ＸおよびＹは同じかまたは異なりおよびＣＲ４またはＮを意味し、Ｒ４は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２ー、−ＳＨ、−ＳＯ３ー、−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルカルボニル−またはＲ１を意味し、Ｒ１は式（１）につき記述した意味を有しおよび
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なりおよびＲ４を意味するかまたは式（３）中のＣ１およびＣ２は置換基Ｒ２およびＲ３の代わりに橋［−ＣＲ５Ｒ６−］ａ（ａは１，２，３または４に等しい）により環に結合しており、
Ｒ５およびＲ６は同じかまたは異なりおよびＲ4を意味しおよび
１個以上の非隣接基［−ＣＲ５Ｒ６−］は酸素、硫黄または場合によりＣ１〜Ｃ５アルキル基で置換されたイミノ基によって代えられていてもよくおよび
２個の隣接基［−ＣＲ５Ｒ６−］は基［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］によるかまたは基［−ＣＲ５＝Ｎ−］によって代えられていてもよい］のアゾールならびにそのエステル、エーテルまたは塩；
−式（４）または（５）：
【００１９】
【化８】
0004240864.tif 000004
【００２０】
［式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は既述した意味を有し、式（５）中のＣ１およびＣ２は置換基Ｒ２およびＲ３の代わりに、式（３）につき定義されたような橋により環に結合されていてもよい］のイソオキサゾリノンならびにそのエステル、エーテルまたは塩；
から選択された求核化合物が添加される。
【００２１】
チオールの例は、群２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メルカプトコハク酸、メルカプト焦性ブドウ酸、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリン、チオフェノール、４−フルオロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、ｐ−チオクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、２−チオフェンチオール、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジン、２−チオシトシン、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾオキサゾール、６−メルカプトプリンから選択された化合物である。
【００２２】
アゾールの例は、群１，２−ピラゾール、３−メチルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−ジメチルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミノピラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾール−３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、インダゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾール−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、５−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピリミジン、８−アザグアニン、８−アザアデニンから選択された化合物である。
【００２３】
イソオキサゾリノンの例は、群イソオキサゾリン−２−オン、４−メチルイソオキサゾリン−２−オン、５−メチルイソオキサゾリン−２−オン、４，５−ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−オキサジアゾリジン−３，５−ジオンから選択された化合物である。
【００２４】
本発明による方法において使用することのできる、調節解除されたシステイン代謝を有する微生物の菌株は技術水準から公知である。該微生物は、野生型菌株に比べて増大したＯ−アセチル−Ｌ−セリン（Ｌ−セリンの直接生合成前駆物質）の内因性生産により優れている。微生物中に、システイン生合成の最終段階において公知のようにＯ−アセチル−セリンスルフヒドリラーゼの活性によりＯ−アセチル−Ｌ−セリンのアセチル官能基がチオール官能基と交換され、それによりＬ−システインが形成される。この反応型は、アミノ酸のβ−炭素原子において官能基の交換が行われるのでβ−置換と呼称される。
【００２５】
とくに、次の微生物の菌株のいずれかが本発明による方法において使用される：
−たとえばＷＯ９７／１５６７３号（これに関して参照により組入れられる）または中森Ｓ．等、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４巻：１６０７〜１６１１ページ（これに関して参照により組入れられる）または高木Ｈ．等、１９９９年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２巻：３２３〜３２７ページに記載されているような改変ｃｙｓＥ対立遺伝子を有する菌株、または
−たとえばＥＰ０８８５９６２Ａ１号（通し番号ＳＮ０９／０９７７５９号を有するＵＳ出願に相当（これに関して参照により組入れられる））に記載されているような排出遺伝子（Efflux-Gene）を含有する菌株、または
−ドイツ国特許出願ＤＥ１９９４９５７９号に記載されているような変更ＣｙｓＢ活性を有する菌株、または
−たとえばＷＯ９７／５６７３号または中森Ｓ．等、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４巻：１６０７〜１６１１ページに記載されているような、システイン過剰生産または減少システイン分解のためのスクリーニング法と組合された非特異的突然変異誘発法の使用下に得られる菌株。
【００２６】
このような菌株は、たとえば硫酸塩またはチオ硫酸塩のような無機硫黄源の十分な供給の場合に重要な量のＬ−システインまたはその誘導体を培養液中へ分離することにより優れている。発酵の間本発明による求核化合物の配量により、この化合物がβ−置換に関与し、これにより非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸を生産する。調節解除されたシステイン代謝を有しない微生物の菌株（たとえば通常の野生型生物）を用いると、このような手段はシステイン生合成の減衰およびそれと共に成長抑制を生じる。それに従って、非タンパク質原性アミノ酸は重要な量で生成しない。
【００２７】
本発明により使用される菌株は調節解除されたシステイン代謝およびそれと共にＯ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性濃度を有するので、非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の大量生産が可能である。同時になお、微生物の細胞成長を保証するために、Ｌ−システインの十分な生成が保証されている。
【００２８】
調節解除されたシステイン代謝を有する大腸菌種の微生物の菌株が好んで使用される。
【００２９】
好ましくは、たとえばＷＯ９７／１５６７３号またはＥＰ０８８５９６２Ａ１号（通し番号ＳＮ０９／００７７５９号に相当）またはＤＥ１９９４９５７９号に記載されたような大腸菌の菌株である。これらの特許出願に記載された方法によれば、任意の菌株中でたとえばフィードバック抵抗性ｃｙｓＥ対立遺伝子および／または排出遺伝子を有するプラスミドでの形質転換によりシステイン代謝を調節解除することができる。
【００３０】
微生物の菌株を用いる非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸の本発明による製造方法は、発酵槽中で自体公知のやり方で求核化合物の付加的添加下に実施される。
【００３１】
発酵槽中での微生物の菌株の培養は、連続培養として、バッチ培養としてまたはとくに流加培養として行われる。とくに好ましくは、Ｃ源および求核化合物は発酵の間連続的に配量される。
【００３２】
求核化合物の配量は、接種した後またはとくに成長段階後に開始する。とくに好ましくは、配量は発酵の開始から６〜８時間後に開始し、発酵の終了まで継続する。
【００３３】
添加される求核化合物の量は、その微生物に対する毒性に依存し、発酵培養液の初期体積ｌあたり１０〜１０００ｍモルの範囲内で変動する。発酵培養液の初期体積ｌあたり５０〜５００ｍモルの配量がとくに好ましい。
【００３４】
発酵のＣ源としては、とくに糖、糖アルコールまたは有機酸が使用される。とくに好ましくは、本発明による方法においてＣ源としてグルコース、ラクトースまたはグリセリンが使用される。発酵槽中の含量が発酵の間０．１〜５０ｇ／ｌの範囲内に保持されることを保証する形でのグルコースの配量が好ましい。０．５〜１０ｇ／ｌの範囲がとくに好ましい。
【００３５】
Ｎ源としては、本発明による方法においてとくにアンモニア、アンモニウム塩またはタンパク質加水分解物が使用される。
【００３６】
他の培養液添加物としては、元素リン、硫黄、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩および痕跡で（つまりμＭ濃度で）元素モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛およびニッケルの塩を添加することができる。
【００３７】
さらに、有機酸（たとえば酢酸、クエン酸）アミノ酸（たとえばイソロイシン）およびビタミン（Ｂ１、Ｂ６）を培養液に添加することができる。
【００３８】
複合栄養物源としては、たとえば酵母抽出物、トウモロコシ膨化水、大豆粉または麦芽抽出物を使用することができる。
【００３９】
発酵培養液のｐＨは、４〜１０の範囲内にある。６〜８の範囲が好ましい。６．５〜７．５のｐＨ範囲がとくに好ましい。
【００４０】
インキュベーション温度は１５〜４５℃である。３０〜３７℃の間の温度が好ましい。
【００４１】
発酵は、とくに好気性成長条件下に実施される。発酵槽中への酸素供給は、圧縮空気または純酸素で行われる。
【００４２】
記載した方法により発酵させる微生物は、１〜４日の発酵時間中に相応する非タンパク質原性Ｌ−アミノ酸を高い能率で培養液中へ分離する。
【００４３】
求核性物質を供給する場合、調節解除されたシステイン代謝を有する微生物は発酵の間Ｌ−立体配置で一般式（６）
【００４４】
【化９】
0004240864.tif 000005
【００４５】
［式中Ｚは式（７）〜（１３）
【００４６】
【化１０】
0004240864.tif 000006
【００４７】
から選択された一価の基でありおよびＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹは式（１）〜（５）につき既述した意味を有する］の非タンパク質原性アミノ酸ならびにそのエステル、エーテルまたは塩を分離する。
【００４８】
本発明による方法は、初めて群１，２，３，４−テトラゾリル−Ｌ−アラニンおよびその誘導体ならびに１，２，３−トリアゾリル−Ｌ−アラニンおよびその誘導体の化合物の製造を可能にする。とくに、その都度異性体形１，２，３，４−テトラゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（１４）ないしは１，２，３，４−テトラゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（１５）およびそのエステル、エーテルまたは塩を含めてその誘導体、ならびに１，２，３−トリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（１６）ないしは１，２，３−トリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（１７）
【００４９】
【化１１】
0004240864.tif 000007
【００５０】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は式（１）〜（５）につき既述した意味を有する］およびそのエステル、エーテルまたは塩を含めてその誘導体が重要である。
【００５１】
さらに、本発明による方法は、初めてＳ−ヘテロアリール−Ｌ−システイン群の化合物の製造を可能にする。これはその都度、遊離アミノ官能性ないしはカルボン酸官能性を有するアミノ酸化合物である。Ｓ−ヘテロアリール−Ｌ−システインは、Ｓ原子における基Ｒ７の置換により特徴ずけられているシステイン誘導体を意味する。その際、Ｒ７は芳香族の特性を有するヘテロアリール基を表し、単環式または二環式でありおよび環中に炭素原子の外に少なくとも１個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子の例は窒素、酸素または硫黄である。ヘテロアリール基はそれ自体基Ｒ４で置換されていてもよく、その際Ｒ４は式（２）につき記述した意味を有する。
【００５２】
【化１２】
0004240864.tif 000008
【００５３】
ヘテロアリール基の例は、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、フラニル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリルまたはプリニルである。
【００５４】
従って、本発明は記述した化合物に関する。
【００５５】
とくに好ましい化合物は次の化合物である：
−１，２，３，４−テトラゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ４＝Ｈ）、
−１，２，３，４−テトラゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ４＝Ｈ）、
−１，２，３，−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ２およびＲ３は同じで、［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］を意味し、その際Ｒ５およびＲ６はＨに等しく、Ｒ２およびＲ３は芳香族環に結合している）、
−１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ２およびＲ３は同じで、［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］を意味し、その際Ｒ５およびＲ６はＨに等しく、Ｒ２およびＲ３は芳香族環に結合している）、
−５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ２およびＲ３は異なり、［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］を意味し、その際Ｒ５およびＲ６はＲ３の場合にはＨに等しく、Ｒ２の場合にはＲ５はＨに等しく、Ｒ６は−ＣＯＯＨに等しく、およびＲ２およびＲ３は芳香族環に結合している）、
−５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニン（Ｒ２およびＲ３は異なり、［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］を意味し、その際Ｒ５およびＲ６はＲ３の場合にはＨに等しく、Ｒ２の場合にはＲ５はＨに等しく、Ｒ６は−ＣＯＯＨに等しく、およびＲ２およびＲ３は芳香族環に結合している）、
−１，２，４−トリアゾール−３−イル−Ｌ−システイン
−チアゾール−２−イル−Ｌ−システイン
−イミダゾール−２−イル−Ｌ−システイン
−チエン−２−イル−Ｌ−システイン
−ピリジン−２−イル−Ｌ−システイン
−ピリミジン−２−イル−Ｌ−システイン
−ベンゾチアゾール−２−イル−Ｌ−システイン
−ベンゾオキサゾール−２−イル−Ｌ−システイン。
【００５６】
とくに、生成物はバイオマスを分離した後公知方法（たとえば濾過、遠心分離）を用いて培養上澄みから単離される。このようなアミノ酸の単離方法は、当業者に同様に公知である。該方法はたとえば抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、結晶化を包含する。
【００５７】
次の例は本発明のさらなる説明に役立つ。例の実施のために使用した菌株大腸菌（Escherichia coli）  Ｗ３１１０／ｐＡ−ＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、ブダベスト条約によりＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｄ−３８１４２  ブラウンシュバイク）において番号ＤＳＭ１３４９５で寄託された。
【００５８】
【実施例】
例１：生産菌株の前培養
発酵の前培養として、付加的にテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培養液（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出液５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）２０ｍｌに、菌株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（ＥＰ０８８５９６２号、通し番号ＳＮ０９／０９７７５９を有するＵＳ出願に相当（これに関して参照により組入れられた））を接種し、振盪装置中で３０℃および１５０ｒｐｍでインキュベートした。７時間後全バッチを、グルコース５ｇ／ｌ；ビタミンＢ１０．５ｍｇ／ｌおよびテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌで補足したＳＭ１培養液（Ｋ２ＨＰＯ４１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．００２ｇ／ｌ；クエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ；ＮａＣｌ０．１ｇ／ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ０．１５ｇ／；Ｎａ３ＢＯ３２．５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ０．７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ０．２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ１．６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．３ｇ／ｌからなる微量元素溶液１ｍｌ／ｌ）１００ｍｌ中に移した。さらなるインキュベーションを、３０℃で１５０ｒｐｍで１７時間行った。
【００５９】
例２：Ｓ−［２，３−ジヒドロキシ−４−メルカプトブチル］−Ｌ−システインの発酵による製造
発酵槽として、２ｌの最大培養体積を有するＢｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（メルズンゲン、ドイツ国）のビオスタット（Biostat）Ｍ装置を使用した。例１に記載した前培養（約３の６００ｎｍにおける光学密度）で、発酵培養液（グルコース１５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母抽出液５ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．０７５ｇ／ｌ；クエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏｇ／ｌおよび微量元素溶液上記参照１ｍｌ／ｌ、ビタミンＢ１５ｍｇ／ｌおよびテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌ，２５％のアンモニアでｐＨ７．０に調節）９００ｍｌを有する発酵槽を接種した。発酵の間、３２℃の温度を調節し、ｐＨ値を２５％のアンモニアの配量により７．０の値に不変に保持した。培養に滅菌圧縮空気を１．５ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎで通気し、２００ｒｐｍの撹拌機回転数で撹拌した。酸素飽和度が５０％の値に低下した後、酸素飽和度５０％を維持するために（ｐＯ２ゾンデを用いて決定、９００ｒｐｍで１００％飽和に校正）、回転数を制御装置により１２００ｒｐｍの値にまで高めた。
【００６０】
８時間後、１Ｍのジチオトレイトール溶液の配量を２ｍモル／ｈの速度で行った。発酵槽中の含量が最初の１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌに低下したら直ちに、グルコースを原溶液から供給した。グルコースの供給は、８〜１４ｍｌ／ｈの速度で行われ、その際グルコースの濃度は０．５〜１０ｇ／ｌの間に一定不変に保持した。グルコースの決定は、ＹＳＩ社（イエロー  スプリングス、オハイオ、ＵＳＡ）のグルコース分析計を用いて実施した。
【００６１】
発酵時間は４８時間であった。この時間後、試料を取り出し、細胞を遠心分離により培養液から分離した。生じる培養上澄みを、ＬＵＮＡ  ５μＣ１８（２）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、アシャフェンブルグ、ドイツ国）での逆相ＨＰＬＣにより展開した。溶離剤として、希リン酸（濃リン酸０．１ｍｌ／ｌ）を、０．５ｍｌ／ｍｉｎの速度で使用した。Ｓ−メルカプトジヒドロキシブチルーＬ−システインは８６．７分の保持時間で溶離する。収率は２．５ｇ／ｌであった。
【００６２】
例３：Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１ＭのＮａチオフェノール懸濁液の配量を２ｍモル／ｈの速度で行った。Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い８８分の保持時間で溶離する。収率は２．１ｇ／ｌであった。
【００６３】
例４：１，２−ピラゾリル−Ｌ−アラニンの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１Ｍの１，２−ピラゾール溶液の配量を４ｍモル／ｈの速度で行った。１，２−ピラゾリル−Ｌ−アラニンは、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い８．４分の保持時間で溶離する。収率は６．１ｇ／ｌであった。
【００６４】
例５：１，２，４−トリアゾリル−Ｌ−アラニンの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１Ｍの１，２，４−トリアゾール溶液の配量を４ｍモル／ｈの速度で行った。１，２，４−トリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニンは、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い５．８分の保持時間で溶離する。収率は４．６ｇ／ｌであった。
【００６５】
例６：１，２，３，４−テトラゾリル−Ｌ−アラニンの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１Ｍの１，２，３，４−テトラゾール溶液の配量を４ｍモル／ｈの速度で行った。発酵の際に、双方の異性体１，２，３，４−テトラゾール−１−イル−Ｌ−アラニンおよび１，２，３，４−テトラゾール−２−イル−Ｌ−アラニンが生じる。これらは、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い５．４分ないしは５．７分の保持時間で溶離する。収率は、双方の異性体の合計として３．９ｇ／ｌであった。
【００６６】
例７：５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾリル−Ｌ−アラニンの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、０．５ＭのＮａＯＨ中の１Ｍの１，２，３−ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸の懸濁液の配量を４ｍモル／ｈの速度で行った。
【００６７】
発酵の際に、すべて３つの異性体５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｌ−アラニン、５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニンおよび５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−３−イル−Ｌ−アラニンが生じ、その際主生成物は５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニンである。これを、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い６７．５分の保持時間で溶離する。収率は５．２ｇ／ｌであった。
【００６８】
例８：１，２，４−オキサジアゾリジン−２，５−ジオニル−Ｌ−アラニン（＝キスカル酸（Quisqualinsauere））の発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、ジメチルスルホキシド中の１，２，４−オキサジアゾリジン−２，５−ジオンの２Ｍ溶液の配量を２ｍモル／ｈの速度で行った。
【００６９】
キスカリン酸を、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い５．６分の保持時間で溶離する。収率は２．２ｇ／ｌであった。
【００７０】
例９：発酵槽濁液からの１，２−ピラゾリル−Ｌ−アラニンの単離
差し当たり、発酵槽濁液０．６ｌの５０００ｇでの遠心分離により細胞を分離した。上澄みを、脱色のため活性炭１０ｇを加え、室温で２時間撹拌し、引き続き濾過した。得られた溶液を２ＭのＮａＯＨで６．０のｐＨ値に調節し、カチオン交換カラム  アンバージェット（Amberjet）１２００／Ｈ＋（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｓ．Ａ．、チャウニー、フランス国；ゲル層２５０ｍｌ）上に加え、結合した物質を１ＭのＮａＣｌで溶離した。溶離画分を合し（５００ｍｌ）２ＭのＮａＯＨで６．０のｐＨ値に調節し、１００ｍｌに濃縮した。試料を、４℃で１６時間貯蔵した。生じる結晶を濾過により得、エタノール５０ｍｌで洗浄し、引き続き乾燥した。
【００７１】
例１０：Ｓ−チアゾール−２−イル−Ｌ−システインの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１Ｍの２−メルカプトチアゾール溶液の配量を２ｍモル／ｈの速度で行った。Ｓ−チアゾール−２−イルーＬ−システインを、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い３３．７分の保持時間で溶離した。収率は６．１ｇ／ｌであった。
【００７２】
例１１：Ｓ−１，２，４−トリアゾール−３−イル−Ｌ−システインの発酵による製造
細菌を、例１および２に記載したように培養した。８時間後、１Ｍの３−メルカプトトリアゾール溶液の配量を２ｍモル／ｈの速度で行った。Ｓ−チアゾール−２−イル−Ｌ−システインを、例２に記載したＨＰＬＣ法を用い８．２分の保持時間で溶離した。収率は５．５ｇ／ｌであった。