(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
密封可能な容器内に試料を注入し、硫酸と過酸化水素水とを加えて容器を密封し、密封状態のままで容器内の試料溶液を撹拌しながら容器下部を所定温度に加熱するとともに容器上部を所定温度に冷却して反応させた後、反応後の試料溶液中のアンモニウムイオン量を比色定量することにより試料中の窒素を定量することを特徴とする窒素の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、窒素の定量方法に関し、詳しくは、ケルダール法に代わる新規な窒素の定量方法に関するものであって、特に、食品，医薬品等のアミノ酸やタンパク質を構成する原子である窒素を迅速かつ簡便に、しかも、複数のサンプルを同時に、再現性良く定量することができる窒素の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、タンパク質等の含窒素試料の全窒素の定量は、１８８３年にケルダールによって創案された方法を基礎として行われている。すなわち、ケルダール法では、試料（窒素含有化合物）に分解促進剤を加えて濃硫酸中で加熱し、分解と酸化還元とによって試料中の窒素を最終的に硫酸アンモニウムとして濃硫酸中に存在する状態とした後、過剰の強アルカリを加えて水蒸気蒸留し、遊離したアンモニアを一定濃度の塩酸あるいは硫酸標準液で捕集して過剰の酸をアルカリ滴定で定量するか、アンモニアをホウ酸溶液で捕集して指示薬を使用して滴定することにより定量している。
【０００３】
このようなケルダール法による窒素の定量も、少量の試料の分析を行うために種々の改良が行われており、ミクロケルダール法等と呼ばれるものが提案されている。例えば、図２に示すミクロケルダール法の装置は、蒸留フラスコ１の外側を二重ガラス壁１ａとしたものであり、水蒸気蒸留の際に熱伝導によって内容物が冷却されることを防止するようにしている。しかし、これらの装置は、前記蒸留フラスコ１を初めとして、水蒸気発生用のフラスコ２，飛沫止め３，冷却器４等の構成部品が全て硬質ガラスで製作されているため、加工・細工に熟練を要し、装置自体が高価なものとなっている。
【０００４】
さらに、これらを組合わせて行う分析操作も煩雑であり、自動化はされているものの極めて高価である。また、材質がガラスのために破損し易いという欠点もある。加えて、試料溶液を高温に加熱して分解させる過程で有毒なガスが発生するため、装置全体をドラフトチャンバー等の中に設置しなければならないなど、大きなスペースを占有するという不都合もあった。このため、多数の試料を同時に処理することが難しく、分析に長時間を要していた。
【０００５】
そこで本発明は、手軽に再現性良く窒素の定量を行うことができ、有毒ガスの発生もなく、装置価格も低廉な窒素の定量方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の窒素の定量方法は、密封可能な容器内に試料を注入し、硫酸と過酸化水素水とを加えて容器を密封し、密封状態のままで容器内の試料溶液を撹拌しながら容器下部を所定温度に加熱するとともに容器上部を所定温度に冷却して反応させた後、反応後の試料溶液中のアンモニウムイオン量を比色定量することにより試料中の窒素を定量することを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る窒素の定量方法を実施する反応装置の一形態例を示す斜視図である。この反応装置は、スクリューキャップ（ネジ蓋）や共栓スリ等の密封手段１１で密封可能なガラス製試験管等の容器１２を複数本立て位置に保持するとともに、該容器１２内に注入されている試料溶液を撹拌する撹拌手段及び容器１２の下部を加熱するためのヒーター等の加熱手段を内蔵した保持手段１３と、容器１２の上部を空冷等の冷却方式で冷却するための冷却手段１４とにより形成されている。
【０００９】
前記保持手段１３の容器保持部は、ヒーターを内蔵した金属製ブロックに容器下部を挿入可能な多数の穴を設けたものであって、撹拌手段としては、各容器１２内に投入したマグネット撹拌子を回転させるマグネチックスターラーや、容器保持部全体を振盪させる振盪装置等を用いることができる。
【００１０】
また、冷却手段１４は、底部が開口した箱状のものであって、周壁の適宜な位置には、冷却用空気を流通させるためファンが設けられている。さらに、前記加熱温度や冷却温度、容器の大きさなどの条件に応じて冷却コイルを内蔵させることもできる。
【００１１】
次に、上記反応装置を使用して本発明方法により窒素の定量を行う手順を説明する。なお、本発明方法は、上記反応装置を使用しなくても、同様の手順で実施することが可能である。
【００１２】
まず、容器１２内に所定量の試料を入れ、分解促進剤や分解液を所定量加えて密封手段１１で容器１２を密封する。分解促進剤には、従来のケルダール法と同様のものを使用することが可能であり、例えば、硫酸カリウムと硫酸銅との９：１の混合物を混和粉砕したものを使用することができる。また、分解液には、硫酸と３０％過酸化水素水とを１：１から１：８の範囲で混合した液、好ましくは、１：２混液を用いることができ、液質を安定化させるために冷暗所で数日保存したものを用いることが好ましい。
【００１３】
次に、試料溶液が入れられた所定数の容器１２を保持手段１３にセットするとともに、その上部に冷却手段１４をセットした後、加熱手段，撹拌手段及び冷却手段１４を作動させる。これにより、容器下部の試料溶液が撹拌状態で加熱されて反応が進行し、加熱により発生した蒸気は、容器上部で冷却されて容器下部に流下する。このときの加熱温度は、適当に設定することができるが、反応速度等を考慮すると１５０℃程度が適当である。一方、容器上部の冷却は、室温の空気を十分に接触させることで行うこともできるが、冷却コイルによって室温以下、例えば０℃程度に冷却することが好ましい。また、反応時間は、試料の種類や量、反応温度等に応じて任意に設定できるが、一般的には１５分程度で十分である。なお、試料の分解が不十分なときは、密封手段１１を取除いて過酸化水素水を加えることにより分解を進めることができる。また、分解終了後は、冷却手段１４を停止させて適当な時間、例えば１０分程度加熱を継続し、試料液中の過剰な過酸化水素水を揮散させることが好ましい。
【００１４】
上記反応装置での反応が終了したら、容器１２を試験管立て等に移し、密封状態のままで室温まで冷却する。この後の操作は、基本的に、比色法により溶液中のアンモニアを定量する方法で行うことができる。すなわち、容器１２内にアルカリを加えて中和してから溶液量を所定量とした後、所定の倍率で希釈するとともに発色試薬を加え、比色計を使用して標準溶液による検量線からアンモニウムイオンの量を定量するという一連の操作で試料溶液中のアンモニア量、すなわち、試料中の窒素量を求めることができる。
【００１５】
具体的には、まず、容器１２内に適当な濃度の炭酸ナトリウム溶液を所定量注入して試料溶液を中和する。このとき、水酸化ナトリウム等の強アルカリを使用して急激に中和すると、試料溶液内のアンモニウムイオンがアンモニアとなって揮散し、測定値が低く出てしまう。また、炭酸ナトリウム溶液の量も、最初に加えた硫酸と過酸化水素水との混合液の量から中和するために必要な量を求めておき、その量を加えるようにする。これにより、試料溶液中のアンモニウムイオンを炭酸塩として液中にトラップしておくことができる。
【００１６】
次に、試料溶液の量を一定量、例えば１０ｍｌに定容した後、比色定量に備えて数段階の倍率に希釈する。そして、発色試薬との反応時にアンモニアガスの揮散することを防止するため、６４０ｎｍに吸収を持たず、マイクロプレートを犯さず、かつ、水と混ざらない有機溶媒、例えばｎ−ヘプタンを所定量滴下したマイクロプレートの各ウエルに、前記希釈液の所定量を滴下するとともに、発色試薬を加えて撹拌混合し、適当な温度、例えば室温から５０℃程度に保持して十分に反応させた後、比色計で比色定量を行う。同時に、マイクロプレートの他のウエルに適当な濃度のアンモニウム標準溶液を滴下しておき、同様にして比色定量を行うことにより、検量線を作成することができる。
【００１７】
このようにして窒素の定量を行うことにより、少量の試料でも十分に信頼性を有する定量を行うことができ、また、ガラス細工による破損しやすい高価な器具を使用することなく、さらに、ドラフトチャンバーのような大型の閉鎖型装置を必要としないので、数多くの試料に対する窒素の定量操作を効率よく迅速に行うことができる。特に、前述の反応装置を用いて試料の分解等を行うことにより、分析に要する時間を大幅に短縮することができる。また、分解温度が低温で、かつ、容器を密閉した状態で反応を行うので有毒ガスの発生もなく、アンモニアの散逸もほとんどないので、再現性も良好なものとなる。
【００１８】
【実施例】
実施例１
小麦粉（中力粉）中のタンパク質量を求める実験を行った。分解促進剤には、硫酸カリウムと硫酸銅との９：１混合物を十分に混和粉砕したものを用い、分解液には、硫酸と３０％過酸化水素水との１：２混液を冷暗所で２日間保存したものを用いた。また、中和溶液には、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を使用した。比色用の発色試薬には、フェノール１ｇとニトロプルッシドナトリウム５ｍｇとを純水に溶解して１００ｍｌとしたフェノールニトロプルッシドナトリウム溶液と、次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度１０％）１０／Ｃｍｌ（Ｃは有効塩素濃度％）と水酸化ナトリウム１．５ｇとを純水に溶解して１００ｍｌとした次亜塩素酸ナトリウム溶液とを使用した。さらに、測定時のアンモニアの揮散するための有機溶媒としてｎ−ヘプタンを用意した。
【００１９】
まず、試料２０ｍｇを１０ｍｌ標線入りネジ蓋試験管に採り、分解促進剤２００ｍｇと分解液３００μＬとを加えてネジ蓋を装着し、撹拌して試料と混液とをよく混合させた。この試験管を前述のような反応装置にセットし、試験管下部の加熱温度を１５０℃に、上部の冷却温度を０℃にそれぞれ設定し、振盪しながら１５分間反応を行った。
【００２０】
試験管を試験管立てに移して室温まで冷却した後、ネジ蓋を取って１Ｍ炭酸ナトリウム溶液１．７ｍＬを加えて中和した。なお、この炭酸ナトリウム溶液量は、あらかじめ中和に必要な量を求めておいたものである。次に純水を加えて溶液量を１０ｍｌに定容し、さらにこの試料溶液を分取して５倍、２５倍、５０倍にそれぞれ希釈した。
【００２１】
９６穴マイクロプレートの各ウエルに、ｎ−ヘプタン５０μＬを滴下し、その上に前記５倍希釈液、２５倍希釈液、５０倍希釈液をそれぞれ１００μＬ滴下した。さらに、フェノールニトロプルッシドナトリウム溶液５０μＬと、次亜塩素酸ナトリウム溶液５０μＬとを滴下し、撹拌混合して５０℃で３０分間保持し、十分に反応させた。反応後、マイクロプレートリーダー（東ソー製：ＭＰＲ−Ａ４ｉ、フィルター：６４０ｎｍ）を用いてトリプルケートで比色定量を行った。
【００２２】
また、アンモニウムイオンの標準溶液として、２ｍＭ塩化アンモニウム標準溶液を希釈し、０．５ｍＭ，０．４ｍＭ，０．３ｍＭ，０．２ｍＭ，０．１ｍＭ，０．０５ｍＭの各標準溶液を調整し、試料溶液と同じマイクロプレートを用いて比色定量を行い、これにより得られた検量線に基づいて各試料のアンモニウムイオン量を求め、さらにこのアンモニウムイオン量から各試料のタンパク質量を求めた。
【００２３】
同じ操作を５回繰返すとともに、通常行われているミクロケルダール法（従来法）によってタンパク質量を求めて両者を比較した。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0004204675.tif 000002
【００２５】
実施例２
きな粉のタンパク質量を、実施例１と同じ操作を行って求めた。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
0004204675.tif 000003
【００２７】
実施例３
鶏による玄米及び小麦の見かけの消化率を求めた。５週令の鶏５羽に１週間玄米又は小麦を与え、それぞれの糞を回収して６０℃で５時間乾燥後、乳鉢を用いて粉砕し、均一に混合して試料とした。各試料２０ｍｇについて実施例１と同じ操作を行い、タンパク質量を求めて消化率を算出した。その結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
0004204675.tif 000004
【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、窒素の定量を効率よく迅速に行うことができ、一度に多種類の試料の処理、定量を行うことが可能である。さらに、少量の試料で再現性良く定量を行うことができ、スペース効率にも優れ、エネルギー効率にも優れている。したがって、食品や医薬品等における窒素の定量を極めて経済的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の反応装置の一形態例を示す斜視図である。
【図２】  ミクロケルダール法の装置の一例を示す正面図である。
【符号の説明】
１１…、１２…容器、１３…保持手段、１４…冷却手段
【図１】
0004204675.tif 000005
【図２】
0004204675.tif 000006