(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項７】
請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シロアリ共生原生動物由来のセルラーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは、グルコースがβ−１,４−グリコシド結合でつながった高分子多糖である。従って、これを加水分解すればグルコースが得られ、グルコースの供給源としてセルロースを有効に利用することができる。しかし、セルロースは難分解性の物質であり、セルロース系バイオマスの活用は実用にまでは至っていない。このセルロースを効率よく加水分解し、そこからエネルギーを取り出すための一連の反応を司るのがセルラーゼである。従って、セルラーゼの特性を解明したり、セルラーゼを効率よく生産することは、セルロース資源の有効活用に関わる技術の根幹をなすものといい得ることができ、従来から、微生物由来のセルラーゼ遺伝子の単離が行われている。例えば、特開平８−５６６６３号公報には、セルラーゼ遺伝子をフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）株から単離し、セルラーゼ遺伝子を宿主である微生物に導入し、発現させることによって目的とするセルラーゼを得ることが、特開２０００−２１００８１号公報には、バチルス（Bacillus）属由来の耐熱性アルカリセルラーゼ遺伝子が、それぞれ記載されている。
【０００３】
他方、木材などのセルロースをエネルギー源にしているシロアリはセルロース分解酵素（セルラーゼ）を消化管にもっており、また、イエシロアリなどの一部のシロアリの後腸内には原生動物が共生しており、シロアリは原生動物なしでは生きていくことができないことから、原生動物がセルロースの分解に大きな役割を果たしていると考えられている。この共生原生動物は単離培養が非常に難しく、原生動物由来のセルラーゼの単離は今まで成功していない。一方、共生原生動物由来のセルラーゼ遺伝子については、既知のセルラーゼと相同性の高い配列は取得されているが、実際に活性のあるセルラーゼとして機能しているかはわかっていない。
【０００４】
なお、ヤマトシロアリ又はタカサゴシロアリ等シロアリ自身のセルラーゼ及び該セルラーゼの遺伝子は特開平１１−４６７６４号公報に開示されており、該公報には、その酵素化学的性質として、昆虫の唾腺又は腸で作られ、餌として取り込まれたセルロースを分解する、分子量が４万〜５万、熱安定性が〜６０℃、至適ｐＨが５．０〜６．０、カルボキシメチルセルロースに対する比活性が７０〜１３００ユニット／ｍｇであることが記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
シロアリと原生動物の共生系は、自然界において最も効率的にセルロースを利用している系の１つである。その共生系の根幹をなすのが共生原生動物であるが、共生原生動物から活性のあるタンパク質を生産することが可能なセルラーゼ遺伝子はこれまでに取り出されていなかった。本発明の課題は、培養が不可能なシロアリの共生原生動物からセルラーゼ遺伝子を取り出し、さらにその遺伝子を用いて遺伝子工学的手法によりセルラーゼを製造する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、イエシロアリ２５０匹の後腸の内容物からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリ−を構築し、セルラーゼ活性をもとにスクリーニングを行い、セルラーゼ活性を有する組換え体を取得し、さらに取得された遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された形質転換体からセルラーゼ活性を有する新規組換えタンパク質が得られることを見い出し、その酵素化学的性質を決定し、また、スクリーニングにより得られた新規セルラーゼ遺伝子が原生動物に由来することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２）や、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質（請求項５）に関する。
【０００８】
また本発明は、請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体（請求項７）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項９）や、請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１０）や、請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項１１）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであればどのようなものでもよく、ここで、上記セルラーゼ活性を有するタンパク質とは、セルロースを加水分解する活性、詳しくは、セルロースの非結晶領域のβ-１，４-グリコシド結合を切断する活性を定性的に有するタンパク質をいう。
【００１０】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規のセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明に包含される。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１１】
これら本発明のＤＮＡは、本発明に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えば原生動物のケカムリ（Spirotrichonympha leidyi）等のゲノム遺伝子から、ＰＣＲ又はＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションなど公知の方法により調製することができる。その他、化学合成によっても調製することができる。また、これら本発明のＤＮＡから、セルラーゼ活性を有する人工変異タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ、すなわち、塩基配列レベルやアミノ酸配列レベルでの本発明の人工変異ＤＮＡを得るには、公知の突然変異手段を用いればよく、例えば市販の突然変異誘発キットを用いると変異を容易に導入することができる。さらに、アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Met）が欠失しているものなども、アミノ酸配列の変異によるタンパク質に含まれる。
【００１２】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、これら本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１３】
本発明の融合タンパク質としては、本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したセルラーゼ活性を有するタンパク質等の精製や、セルラーゼ活性を有するタンパク質等に対する抗体の定量用などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１４】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のタンパク質、融合タンパク質等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、セルラーゼの特性やその産生機構を明らかにする上で有用である。
【００１５】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質又はエピトープを含むその断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１６】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１７】
本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明はまた、上記本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡや上記発現系を含む組換えベクターの宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明の組換えタンパク質の製造方法としては、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物からセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取する方法であればどのような方法でもよく、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製する方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法を挙げることができる。また、上記アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本発明のタンパク質を得ることができる。上記本発明のタンパク質の精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
（１．ｍＲＮＡの単離）
ｍＲＮＡの単離をするために、イエシロアリ２５０匹から後腸を取り出し、その内容物をSolution U（Trager 1934, Biological Bulletin, Vol66: 182-190）に懸濁し、緩やかに遠心分離（３００ｇ、1分）することによって、原生動物分画を得た。さらに該原生動物分画に対してSolution Uで２回洗浄を行い、ＲＮＡ抽出のための原生動物分画を得た。顕鏡下、この原生動物分画には３種類の原生動物（Spirotrichonympha leidyi、Pseudotrichonympha grassi、Holomastigotoides hartmanni）の存在が認められた。ＲＮＡの単離は、ISOGEN（ニッポンジーン社）を用いて指示書に従って行い、ｍＲＮＡの精製、単離はOligotex-dT30<Super>（日本ロシュ社）を用いて指示書通りに行い、約３．９μｇのｍＲＮＡを得た。
【００２１】
（２．ｃＤＮＡライブラリーの構築）
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ｍＲＮＡを鋳型にｏｌｉｇｏ  ｄＴをプライマーとして、SuperscriptII（Gibco BRL社)による逆転写によりＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を形成し、さらに回収された第１のｃＤＮＡ鎖を鋳型として、第２のｃＤＮＡ鎖を合成した。得られた二本鎖ｃＤＮＡから、λＺＡＰII（STRATAGENE社）を用いて指示書に従いｃＤＮＡライブラリーを調製した。クローニングのためのpackaging lysateは、GIGAPAK III Glod（STRATAGENE社）を用いて常法により行った。その結果、３×１０5個の組換え体ファージを得ることができ、増幅後のタイターは、３×１０9ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００２２】
（３．発現スクリーニング）
０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む２×ＹＴ培地を用いて、該組換え体ファージを、８〜１２時間３７℃で培養して、プラークを形成させた。その後、プラークが形成しているプレートの上に０．１％コンゴレッド１０ｍｌを注ぎ染色し、さらに１Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍｌによる脱色を行った。コンゴレッドで染色した後、ハロー（ＣＭＣの分解によりコンゴーレッドで染色されない円形の部分）を与えるコロニー１１個を得た。スクリーニングでハローを与えるクローン１１の内、３つのクローンについて、λＺＡＰＩＩベクターキットに含まれているヘルパーファージEXASSIST及びE.coli SOLR菌株を用いる重複感染により、ブルースクリプト（pBluescript）ファージミドに転換した。転換されたクローンについて、ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、３クローンの塩基配列は同一であった。得られたＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、その翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２３】
（４．セルラーゼ遺伝子の起源の特定）
上記ｃＤＮＡライブラリーは、３種の原生動物の混合ｍＲＮＡから作製されたものであるので、該セルラーゼ遺伝子がどの原生動物由来のものであるか特定できない。そこで、得られたセルラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列からこのセルラーゼに特異的なプライマー、5'-CTTCAAGGTATTGTTGATAC-3'Forward（配列番号３）及び5'-TTAAGCAATGCTGATCATTA-3'Reverse（配列番号４）を設計し、マイクロキャピラリーで分画した３種類それぞれの原生動物２０〜３０個体をテンプレートとして、ＰＣＲを試みた。ＰＣＲの条件は、９４℃３０秒、５９℃４５秒、７２℃２分で３５サイクルとした。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果（図１）、３種の原生動物の内、ケカムリ(Spirotrichonympha leidyi)からのみ、ＤＮＡの増幅を確認できた。なお図１中、レーンＭはマーカー、レーン１はPseudotrichonympha grassi、レーン２はHolomastigotoides hartmanni、レーン３はSpirotrichonympha leidyi、レーン４は３種の原生動物の混合から抽出したＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲの結果のコントロールである。従って、セルラーゼ遺伝子の由来はこのケカムリであると結論できた。
【００２４】
（５．セルラーゼの大腸菌による発現と精製）
セルラーゼの発現ベクターを作製するため、セルラーゼ遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから、セルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をsalI及びsacIにより切り出し、ベクターｐＥＴ２１ｂ（Novagen社）の対応部位にクローニングした。該ベクターを用い、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））株に形質転換し、ＬＢ液体培地で３７℃、１２時間振盪培養した。大腸菌を回収後、BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen社）を用いて、指示書通りにタンパクを回収した。さらに、T7・Tag Affinity Purification Kit（Novagen社）を用いて、指示書に従い組換えタンパク質を精製した。組換えタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分子量約３６ｋＤａの単一のバンドとして検出された。さらに、この組換えタンパク質のセルラーゼ活性を、基質としてＣＭＣを用いて測定した。この組換えセルラーゼの最適ｐＨは６．０（図２）、最適温度は７０℃（図３）、Ｋｍ値は１．９ｍｇ／ｍｌ、Ｖｍａｘは１４８．２ｕｎｉｔｓ／ｍｇタンパク質（１ｕｎｉｔは、１分あたり1μＭのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量）であった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により提供されるシロアリ共生原生動物に由来する新規なセルラーゼは、単独使用又はすでに知られているセルラーゼとの併用により、効率的にセルロースを分解することができることから、洗剤、繊維加工用製剤、飼料添加剤、消化剤といった種々の産業用酵素剤として有用である。また、本発明の新規セルラーゼ及びその遺伝子は、セルラーゼの特性を解明する上で大いに役立つものと期待される。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロキャピラリーで分画した３種類それぞれの原生動物２０〜３０個体をテンプレートとして、セルラーゼ遺伝子に特異的なプライマーを使ったＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】組換えセルラーゼのＣＭＣに対する活性のｐＨによる影響を示す図である。
【図３】組換えセルラーゼのＣＭＣに対する活性の温度による影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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