(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物に由来する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
微生物が、アンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）である請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ｄ）から（ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ：
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ｇ）から（ｈ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｇ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ：
（ｈ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項８】
請求項５のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項６のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
【請求項１０】
組換えプラスミドがエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）から取得可能なｐＦＡ００１である請求項７〜９のいずれかに記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１２】
宿主微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から選ばれた微生物である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１である請求項１１又は１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
形質転換体がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）である請求項１１〜１３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物中にギ酸脱水素酵素を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ギ酸脱水素酵素活性を有する新規なポリペプチド、その遺伝子、及び、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたギ酸脱水素酵素の製造方法に関するものである。
背景技術
ギ酸脱水素酵素（酵素番号［ＥＣ１．２．１．２］）は、ギ酸と酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ）より、二酸化炭素と還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）を生成する反応を触媒することから、ＮＡＤＨ依存型の酵素反応における補酵素再生に利用でき、この場合、安価なギ酸を利用できること、副産物が二酸化炭素であり系内に蓄積しないことなどの利点をもつ有用な酵素である。さらに、ギ酸、ＮＡＤに対するＫｍ値が小さい酵素は低基質濃度で有効に作用し、また、ギ酸の特異的な微量定量へも利用可能である等、産業上有用な酵素である。
ギ酸脱水素酵素は、高等植物、メタノール資化性酵母、細菌等においてその存在が知られている。酵素が精製され性質が調べられているものとしては、高等植物であるエンドウ豆由来の酵素（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７７，８４５，１９７５）や、メタノール資化性酵母であるキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６２，１５１，１９７６）、キャンディダ・メチリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈｙｌｉｃａ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１５２，６５７，１９８５）、キャンディダ・メタノリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．４８，１３９，１９８７）、クロイッケラ・スピーシーズ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ  ｓｐ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３８，１１１，１９７４）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｖｏｌ．４７，２５４７，１９８３）、リポマイセス・メタノシルビエンシス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｔｈａｎｏｓｉｌｖｉｅｎｓｉｓ：特開昭６０−２４１８８７号公報）などに由来する酵素を挙げることができるが、これらの酵素はいずれも、比活性が低い、ギ酸あるいはＮＡＤに対するＫｍ値が大きい、あるいは作用ｐＨ域が狭いなどから工業的な利用には問題を有していた。
細菌由来で精製されて性質が明らかにされている酵素もいくつか存在するが、それぞれ工業上の利用には問題点を有している。例えば、シュードモナス・スピーシーズ  １０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９９，５６９，１９７９参照）、及び、シュードモナス・オキザラティカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．８３，４８５，１９７８）由来の酵素は、比活性は比較的高いが、安定剤非存在下では不安定である。モラキセラ・スピーシーズ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７０，３１８９，１９８８，特開昭６３−３１３５８０号公報）由来の酵素は、比活性が低くギ酸に対するＫｍ値が大きい。ハイホマイクロビウム・スピーシーズ（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．：特開２０００−７８９７０号公報、１９９９年農芸化学会大会発表、１９９９年農芸化学会大会講演要旨２３４ページ）由来の酵素は、比活性が低く作用ｐＨ域が狭い。また、パラコッカス・スピーシーズ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．；特開平３−６１４８１号公報参照）はギ酸に対するＫｍ値が大きい。
なお、細菌由来のギ酸脱水素酵素としては、ＮＡＤを電子受容体としないもの（酵素番号［ＥＣ１．２．２．１］）、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５０，６６９３，１９７５）、クロストリジウム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５９，３７５，１９８４）、クロストリジウム・サーモアセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５９，１８２６，１９８３）などに由来する酵素も知られているが、これらは補酵素ＮＡＤＨの再生目的には利用できない。
細菌由来のＮＡＤ依存型ギ酸脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関しては、シュードモナス・スピーシーズ  １０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１８，２０１，１９９３）、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．４４，４７９，１９９５，特開平１０−２３８９６号公報）、パイロコッカスＫＯＤ１（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＫＯＤ１：特開２０００−６９９７１号公報）、ハイホマイクロビウム・スピーシーズ（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．：特開２０００−７８９７０号公報，１９９９年農芸化学会大会発表、１９９９年農芸化学会大会講演要旨２３４ページ）由来の遺伝子について知られているが、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属由来のギ酸脱水素酵素遺伝子については知られていない。
アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌に関しては、完全菌体の状態でギ酸脱水素酵素活性があることは知られているものの（Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，３８１（１９８１））、酵素を精製、単離した報告や性質を明らかにした報告はこれまでになく、また、遺伝子の単離についても知られていない。
発明の要約
本発明は、上記のような従来知られているギ酸脱水素酵素の問題点、即ち、酵素の生産性が低い、比活性が低い、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が大きい、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が狭い、作用ｐＨの範囲が狭い等の問題を解決し、工業的に利用可能な優れた性質をあわせもつギ酸脱水素酵素及びその製造方法を提供するものである。
本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりギ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた性質を有するギ酸脱水素酵素を高生産するアンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属細菌を新たに分離した。当該微生物からギ酸脱水素酵素を単離、精製し、さらにギ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）作用：ＮＡＤを補酵素として、ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
（２）分子量：約１．０×１０６、
（３）ギ酸に対するＫｍ値：２．４ｍＭ、
（４）ＮＡＤに対するＫｍ値：０．０５７ｍＭ、
（５）作用温度の範囲：２０℃〜６０℃、至適温度４５℃〜５５℃、
（６）作用ｐＨの範囲：５．０〜１１．０、至適ｐＨ５．５〜９．５、
（７）温度安定性：５０℃以下、
（８）ｐＨ安定性：４．５〜９．５。
本発明の提供する上記酵素は、高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が小さく、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、作用ｐＨ、温度の範囲が広い工業的利用に適した性質をあわせ持つ酵素である。
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド：
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
本発明はまた、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのＤＮＡである：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ：
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｆ）配列表配列番号２に示される塩基配列と９０％以上の相同性を示す塩基配列を有し、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
本発明はまた、以下の（ｇ）から（ｉ）のいずれかのＤＮＡである：
（ｇ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ：
（ｈ）配列表配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ｉ）配列表配列番号３に示される塩基配列と９０％以上の相同性を示す塩基配列を有し、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
また、本発明は、上記のＤＮＡを含む組換えプラスミドである。
また、本発明は上記のＤＮＡまたは組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
さらに本発明は、上記のポリペプチドを生産する能力を有する微生物、または上記形質転換体を培養し、培養物中に該ポリペプチドを蓄積せしめ、これを採取することからなるギ酸脱水素酵素の製造方法でもある。
発明の詳細な開示
まず、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドは、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
（１）作用：ＮＡＤを補酵素として、ギ酸を酸化し二酸化炭素を生成する、
（２）分子量：約１．０×１０６、
（３）ギ酸に対するＫｍ値：２．４ｍＭ、
（４）ＮＡＤに対するＫｍ値：０．０５７ｍＭ、
（５）作用温度の範囲：２０℃〜６０℃、至適温度４５℃〜５５℃、
（６）作用ｐＨの範囲：５．０〜１１．０、至適ｐＨ５．５〜９．５、
（７）温度安定性：５０℃以下、
（８）ｐＨ安定性：４．５〜９．５。
本発明において、ポリペプチドのギ酸脱水素酵素活性は、ギ酸ナトリウム５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃あるいは４０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行う。
作用温度、作用ｐＨは、上記の活性測定条件の温度またはｐＨを変えて活性を測定することにより決定する。また、温度安定性は、該ポリペプチドを各温度で１０分間処理した後の残活性を測定することによって、ｐＨ安定性は、該ポリペプチドを６℃で２０時間、各ｐＨで処理した後の残活性を測定することによって決定する。また、分子量はゲルろ過クロマトグラフィー法により決定する。
本発明のポリペプチドは、ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。従って、本発明のポリペプチドの起源となる微生物としては、メタノール資化性菌あるいはギ酸資化性菌等が好適であり、特に限定されないが、例えばアンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が挙げられ、なかでもアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）が好ましく、より好ましくはアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株である。
上記のアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、平成１２年１０月２０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタペスト条約に基づき寄託されている。以下に、アンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株の菌学的性質を示す。
１．形態
１）直径１μｍｘ３μｍ程度の湾曲桿菌
２）グラム染色：陰性。
運動性：なし。
４）胞子の有無：なし。
５）肉汁寒天平板培地培養でのコロニー形態：円形、全円なめらか、凸状、光沢、淡黄色
２．培養的性質
１）肉汁液体培養：懸濁
２）リトマスミルク：−
３．生理学的性質
１）カタラーゼ：＋
２）オキシダーゼ：＋
３）オルニチンデカルボキシラーセ：＋
４）アルギニンジヒドロラーゼ：−
５）ウレアーゼ：＋
６）β−ガラクトシダーゼ：±
７）澱粉加水分解：−
８）エクスリン加水分解：＋
９）ゼラチン加水分解：−
１０）Ｏ／Ｆ試験：−
１１）硝酸塩還元：−
１２）インドール産生：−
１３）ブドウ糖酸性化：−
１４）脱窒反応：＋
１５）ＭＲテスト：−
１６）ＶＰテスト：−
１７）硫化水素の生成：＋
１８）無機窒素源の利用：＋
１９）生育性ｐＨ６：＋
２０）嫌気培養：−
２１）基質資化能
ブドウ糖：−
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンノース：−
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：−
グルコン酸カリウム：−
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：−
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：−
２２）酸産生
グリセリン：＋
マンニトール：＋
リボース：＋
ソルビトール：＋
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、主炭素源としてのメタノールと窒素源、無機塩類などの栄養素を含む水性媒体が用いられる。さらに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
培養は、通常温度範囲２０℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が好ましい。また、ｐＨは５．５から９．５で培養できるが７から９が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
培養物からの分離精製は、培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。
「１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、アミノ酸を置換、挿入、欠失および／または付加することにより取得可能である。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている。
また、「ギ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
次に、本発明のＤＮＡについて説明する。本発明のＤＮＡは上記のポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２または配列番号３で示されるＤＮＡであっても良いし、配列番号２または配列番号３で示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有するＤＮＡであっても良い。また、配列番号２または配列番号３で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を示す塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
ここで、「１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素  増刊  遺伝子増幅ＰＣＲ法  ＴＡＫＫＡＪ  ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編  加藤郁之進鑑訳  ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により置換、挿入、欠失および／または付加できる程度の数の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加されてなる塩基配列を意味する。
なお、アミノ酸配列及び塩基配列の相同性は、ソフトウェアーディベロップメント（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）社製のソフトウェアーであるジェネティクス（ＧＥＮＥＴＹＸ）を用いて配列を比較することで計算できる。
本発明のＤＮＡ（ギ酸脱水素酵素遺伝子）は、前述したようなギ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
まず、ギ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたギ酸脱水素酵素のアミノ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。このアミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーと、既知のギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。
次に、ギ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体のＤＮＡは、培養された細胞をリゾチーム，界面活性剤等で溶解後、抽出されたＤＮＡをエタノールで析出し、ガラス棒へ付着させ、適当な緩衝液へ溶解させることを数回繰り返して精製することで得られる（例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２０８（１９６１）記載のＭａｒｍｕｒ法を参照）。
この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的の遺伝子の一部を取得できる。次に、目的遺伝子の全長を取得するために、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩなどの適当な制限酵素で先に得た染色体ＤＮＡを分解したものをアガロースゲル電気泳動して、ＰＣＲで得たギ酸脱水素酵素遺伝子の一部のＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼージョンを行い、ギ酸脱水素酵素遺伝子が含まれ、かつ、ギ酸脱水素酵素遺伝子内で上記制限酵素により切断されないＤＮＡ断片をゲル上で検出する。
このＤＮＡ断片をゲルより取得した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、前にＰＣＲで得た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、かつ、酵素遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマーを合成し、これらプライマーを用いてＰＣＲを行うことで既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片が取得できる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流、Ｃ末端をコードするＤＮＡより下流と推定されるＤＮＡの塩基配列にもとづきＤＮＡプライマーを作成して、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得できる。取得したＤＮＡ断片は、分子量測定と一部の塩基配列の解析により、目的のギ酸脱水素酵素遺伝子の全長が含まれていることを確認する。
次いで、得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとＴ４  ＤＮＡリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析し、ギ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位を決定し、終止コドンまでをオープンリーディングフレームとして、この塩基配列が既知ギ酸脱水素酵素遺伝子と相同であること、コードされるタンパク質が電気泳動によるタンパク質分子量と一致することなどから目的遺伝子であることを確認する。
このようにして取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主−ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。
一例として、上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターに組み込んだ組換えプラスミドｐＦＡ００１を用いてエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）を得ることができる。
本発明で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）は平成１２年（２０００）１０月２０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタペスト条約に基づき寄託されている。
また、酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用することもできる。
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
本発明で得られた形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産は、通常の培地を用いて培養を行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地でよい。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンス・ティープ・リカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
必要に応じてメタノール、ギ酸、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトースなどの添加などの酵素誘導のための処理を行うこともできる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）アンシロバクター  アクアティカス  ＫＮＫ６０７Ｍ株の取得
本発明の、ギ酸脱水素酵素を高生産するアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株は以下のようにして分離した。各地より採取した土壌サンプルを０．９％食塩水に懸濁し、その上清を、メタノールを単一炭素源とする表１の組成の液体培地１０ｍｌに１％植菌して３０℃で好気的に振とう培養した。
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水を加えて１ＬとしてｐＨ７に調整、オートクレーブ殺菌して使用。ただし、メタノールは殺菌後に添加した。
菌の生育が認められた培養液について、６００ｎｍの吸光度で菌濃度を測定した。この培養液１．５ｍｌを遠心分離して得た菌体を、基質溶液０．５ｍｌ（０．１Ｍ  リン酸バッファー、０．５Ｍ  ギ酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮＡＤ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７）に懸濁し、３０℃で２０時間振とうして菌体反応を行った後、遠心して得た上清のＮＡＤＨの生成量を３４０ｎｍで測定した。この値を菌濃度で割った値が高いものを、ギ酸脱水素酵素高活性菌として選択した。次に、選択した菌の培養液７ｍｌを遠心分離して得た菌体を０．７ｍｌの０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁、超音波破砕、遠心分離して上清を粗酵素液として得た。粗酵素液のギ酸脱水素酵素活性の測定は、ギ酸ナトリウム  ５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。また、タンパク質の定量はＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７２，２４８，１９７６参照）により行った。次に、粗酵素液の比活性が高いものについて培養液よりモノコロニー法でギ酸脱水素酵素活性菌株を純化し、得られた純化菌株を用いて上述と同様に培養して粗酵素液を調製後、ギ酸脱水素酵素活性、タンパク質濃度を測定した。そして、各菌株の粗酵素液比活性を比較し、高比活性菌株としてアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）を得た。
（実施例２）ギ酸脱水素酵素の単離・精製
アンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株のコロニーを、表２の組成からギ酸を除いた組成の培地１０ｍｌに植菌して３０℃で３日間、好気的に振とう培養した。この培養液をフラスコあたり１００ｍｌの表２の本培養培地に培地液量の１％植菌して３０℃で４日間、好気的に振とう培養した。
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水を加えて１ＬとしてｐＨ７に調整、オートクレーブ殺菌して使用。ただし、メタノールとギ酸は殺菌後に添加した。
培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．２）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心した。上清に硫安３０〜６０％飽和で塩析する沈殿を遠心で取得した。この画分を１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解、同バッファーで透析後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーを行い、同バッファーで洗浄後、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．２）で溶出して、活性のあるフラクションを集めた。これに２５％飽和となるように硫安を加えた後、ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．２）で２５〜０％飽和の硫安のグラジエントをかけて溶出した。得られた活性画分に６０％飽和となるように硫安を添加して、遠心により得た沈殿を１ｍＭのＤＴＴとＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．２）に溶解して、同バッファーで透析を行った。これを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、ギ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、酵素の純粋性が確認できた。
（実施例３）酵素の性質
実施例２で得られた精製ギ酸脱水素酵素の性質を以下のように調べた。
［比活性］
得られたギ酸脱水素酵素の活性測定はギ酸ナトリウム５００ｍＭ、ＮＡＤ  ５ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、３０℃あるいは４０℃でのＮＡＤＨの生成にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。このとき１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、タンパク質の定量は、ＢＳＡを標準タンパク質としてＬｏｗｒｙ法で行った。精製したギ酸脱水素酵素の比活性は９．５ｕ／ｍｇタンパク質（３０℃）、１７．５ｕ／ｍｇタンパク質（４０℃）であった。
［Ｋｍ値の測定］
ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値を上記比活性の測定条件下（３０℃）で調べた。なお、ギ酸のＫｍ値測定にあたってはＮＡＤ  ５ｍＭの条件下、ギ酸ナトリウム濃度を変化させて活性を測定した。ＮＡＤのＫｍ値測定にあたってはギ酸ナトリウム５００ｍＭの条件下、ＮＡＤ濃度を変化させて活性を測定した。図２に示す結果から、ギ酸に対するＫｍ値は２．４２ｍＭ、図３からＮＡＤに対するＫｍ値は０．０５７ｍＭであった。
［作用温度の範囲・至適温度］
作用温度の範囲と至適温度を上記比活性の測定条件下で調べた。３０℃での活性を１００％とした場合の各温度での相対活性を図４に示した。本酵素は検討した２０〜６０℃の範囲で５０％以上の相対活性を示し、特に４５〜５５℃の範囲で２００％以上の相対活性を示した。このことから、作用温度を２０〜６０℃、至適温度を４５〜５５℃とした。
［作用ｐＨの範囲］
作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを上記比活性の測定条件下（３０℃）で調べた。ｐＨ６．３での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの相対活性を図５に示した。本酵素はｐＨ５〜１１の範囲で３％以上の相対活性を示し、特にｐＨ５．５〜９．５の範囲で８０％以上の相対活性を示した。このことから、作用ｐＨを５〜１１、至適ｐＨは５．５〜９．５とした。
［温度安定性］
本酵素の温度安定性を、本酵素を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）中、各温度で１０分間保持した後の残活性を測定することで調べた。この結果、図６に示すように５０℃以下で８０％以上の残活性を示し、安定であった。
［ｐＨ安定性］
ｐＨ安定性については以下の方法で調べた。本酵素を、ｐＨ４．０〜５．５は０．０５Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．１〜７．９は０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．５〜９．５は０．１ＭトリスＨＣｌバッファー、ｐＨ９．７〜１１．１は０．１Ｍ炭酸バッファー中で６℃、２０時間保持した後の残活性を測定した。処理前の活性と比べ活性低下のないｐＨ６．５での残活性を１００％としてｐＨ安定性を示したのが図７である。本酵素はｐＨ４．５〜９．５の間で７０％以上の残活性を示し、比較的安定であった。
［分子量の測定］
ゲルろ過クロマトグラフィー法により分子量を決定したところ約１．０×１０６であった。
（実施例４）ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離
まず、実施例１と同様の方法でアンシロバクター  アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＫＮＫ６０７Ｍ株を培養して得た菌体をＭａｒｍｕｒ法に従い、リゾチーム，界面活性剤等で溶解後、抽出されたＤＮＡをエタノールで析出し、ガラス棒へ付着させ、適当な緩衝液へ溶解させることを数回繰り返して精製して、染色体ＤＮＡを調製した。目的のギ酸脱水素酵素遺伝子を取得するには、まず、精製されたギ酸脱水素酵素のアミノ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサーなどで決定して、このアミノ酸配列にもとづいて設計した配列表の配列番号４に示すＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１）と、既知のギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列中で相同性の高い部分の配列にもとづいて設計した配列表の配列番号５に示すＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。この結果、目的のギ酸脱水素酵素遺伝子の一部を取得した。
次に、目的遺伝子の全長を取得するために、制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩで先に得た染色体ＤＮＡを分解したものをアガロースゲル電気泳動して、ＰＣＲで得たギ酸脱水素酵素遺伝子の一部のＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果、用いた制限酵素でギ酸脱水素酵素遺伝子が切断されず、かつ、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が小さいのは、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで分解した場合に検出されたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むバンドであった。これらのＤＮＡ断片をゲルより取得した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得た、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ分解物由来のＤＮＡを鋳型に、前にＰＣＲで得た部分ギ酸脱水素酵素遺伝子の酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、酵素遺伝子の外側方向へ向けた配列表の配列番号６及び７に示すＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３、Ｐｒｉｍｅｒ−４）を合成し、インバースＰＣＲを行った。これにより、既に取得した酵素の部分遺伝子にはなかったさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、配列表配列番号８に示す酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流と推定される塩基配列に制限酵素ＳｐｈＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５）と、配列表配列番号９に示すＣ末端をコードするＤＮＡより下流と推定される塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−６）を用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでギ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片（配列表配列番号２）を取得した。得られたＤＮＡ断片の分子量と一部の塩基配列の解析から、ギ酸脱水素酵素遺伝子の全長（配列表配列番号３）が含まれていることを確認した。
（実施例５）ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドの作成と遺伝子の解析
実施例４で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣ１９とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドｐＦＡ００１を取得した。なお、図中のＦＤＨ遺伝子とは、本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。
取得したプラスミドｐＦＡ００１を用いて、ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩの切断部位にはさまれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。この結果、精製したギ酸脱水素酵素を用いて決定したＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位を決定し、終止コドンまでをオープンリーディングフレームとして、この塩基配列が既知ギ酸脱水素酵素遺伝子と相同であること、コードされるタンパク質が電気泳動によるタンパク質分子量と一致することを確認した。このようにして得られた、ギ酸脱水素酵素遺伝子全長を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列表配列番号２に、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列表配列番号３に、塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号１に示した。
（実施例６）ギ酸脱水素酵素の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例５で得られたプラスミドｐＦＡ００１とエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株のコンピテントセルを混合することで形質転換を行い、表３に示す寒天培地にプレーティングして、ギ酸脱水素酵素の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体をコロニーとして取得した。
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脱イオン水を加えて１ＬとしてｐＨ７に調製、オートクレーブして殺菌。ただし、アンピシリンは殺菌後に添加した。
得られた形質転換体のコロニーを、表４に示す液体培地１０ｍｌに植菌後、３７℃で２０時間、振とうして好気的に培養した。
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脱イオン水を加えて１ＬとしてｐＨ７に調製。オートクレーブして殺菌。ただし、アンピシリンは殺菌後に添加した。
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＦＤＨ酵素液を取得した。得られた酵素液０．１ｍｌを、１Ｍギ酸Ｎａ（０．１Ｍリン酸バッファー中でｐＨ７）１．５ｍｌ、０．１Ｍ  ＮＡＤ  ０．１５ｍｌ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）１．２５ｍｌと混合して，３０℃で３４０ｎｍの吸光度変化をみたところ、ＮＡＤＨの生成による吸光度の増加が認められ、形質転換体にギ酸脱水素酵素活性があることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明は、上述の構成よりなるので、高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値が小さく、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、作用ｐＨ、温度の範囲が広い工業的利用に適したギ酸脱水素酵素とその製造方法を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＡ００１の制限酵素地図を示す。
図２は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素のギ酸に対するＫｍ値を示すグラフである。
図３は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素のＮＡＤに対するＫｍ値を示すグラフである。
図４は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素の作用温度の範囲と至適温度を示すグラフである。
図５は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素の作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを示すグラフである。
図６は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素の温度安定性を示すグラフである。
図７は、本発明の１態様であるギ酸脱水素酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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