(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) マイコバクテリウム・フレイ（M. phlei）細胞壁上に複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ-DNAおよび薬学的に許容されるキャリアを含む組成物、並びに、
(b) 化学療法剤
を含むガン細胞を有する動物またはヒトのガン細胞の成長を抑制する医薬であって、前記組成物および化学療法剤はガン細胞の成長を阻害するように抗ガン協働作用を示す、医薬。
【請求項２】
前記抗ガン協働作用が相乗作用である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記組成物が、ガン細胞における細胞周期停止を誘導するか、ガンの細胞の増殖を抑制するか、ガン細胞のアポトーシス誘導をするか、又はガン細胞の細胞周期を同調させる、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記ガン細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞である、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
前記ガン細胞が１つ又は複数の化学療法剤に耐性を示す、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記化学療法剤が前記組成物投与の前、後、または同時に投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
前記化学療法剤がDNA架橋剤、DNA脱重合化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、トポイソメラーゼ抑制剤またはチューブリン固定化剤である、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
前記化学療法剤がマイトマイシン-C、5-フルオロウラシル、またはシスプラチンである、請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
(a)マイコバクテリウム・フレイ(M. phlei)-DNAおよび薬学的に許容されるキャリアを含む組成物、並びに、
(b)化学療法剤
を含む、ガン細胞を有する動物体内またはヒト体内のガン細胞の成長を抑制する医薬であって、前記組成物および化学療法剤はガン細胞の成長を阻害するように抗ガン協働作用を示す、医薬。
【請求項１０】
前記抗ガン協働作用が相乗作用である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記組成物がガン細胞の細胞周期停止を誘導するか、ガン細胞の増殖を阻害するか、ガン細胞のアポトーシスを誘導するか、又はガン細胞の細胞周期を同調させる、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
前記ガン細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１３】
前記ガン細胞が１つ又は複数の化学療法剤に対する耐性を持つ、請求項９に記載の医薬。
【請求項１４】
前記化学療法剤が前記組成物投与の前、後、又は同時に投与される、請求項９に記載の医薬。
【請求項１５】
前記化学療法剤がDNA架橋剤、DNA脱重合剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、トポイソメラーゼ抑制剤またはチューブリン固定化剤である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１６】
前記化学療法剤がミトマイシン-C、5-フルオロウラシル、またはシスプラチンである、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／１１１，０１９号（１９９８年１２月４日提出）および米国特許仮出願第６０／１２７，３２０号（１９９９年４月１日提出）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacteriu phlei）（M.phlei）−ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁上に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡ（ＭＣＣ）および化学療法剤を含む組成物および方法であって、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣはガンを治療するのに、ならびにガンに及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強するのに有効である組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ガンは、過剰増殖、細胞死の不全またはそれら２つの組合せに起因する異型細胞の異所性最終蓄積である。
【０００４】
増殖は細胞周期を通しての細胞の進行の頂点であり、全細胞ＤＮＡの複製および１細胞の２細胞への分裂を特徴とする。細胞分裂に関しては、哺乳類細胞は、細胞周期と呼ばれる組織化された一連の制御化事象を通過する。細胞周期進行中の一事象の開始は、前の事象が首尾よく完了することによっている。細胞周期は５つの主要段階に分けられる。これらはＧｏ、Ｇ1、Ｓ、Ｇ2およびＭである。Ｇｏ期中は、細胞は休止している。身体中のほとんどの細胞は、いずれの時でも、この段階にある。Ｇ1期中は、細胞は、分裂するためのシグナルに応答して、ＤＮＡ合成に必要なＲＮＡおよびタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ、初期Ｓ期；ＳＭ、中期Ｓ期；およびＳＬ、後期Ｓ期）中は、細胞はそれらのＤＮＡを複製する。Ｓ期終了時に、各細胞はその元のＤＮＡ含量の２倍のＤＮＡを含有するが、しかし依然として１枚の外部細胞膜により境界されている。Ｇ2期中は、タンパク質が、細胞分裂に備えて作り上げられる。有糸分裂（Ｍ）期中は、細胞が２つの娘細胞に分裂する。
【０００５】
細胞周期進行の変化はすべてのガンで起こり、そして遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異またはＤＮＡ損傷チェックポイントの撤廃に起因し、化学療法剤による治療に対する細胞応答を変調し得る（Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8:903, 1997）。
【０００６】
細胞死は、細胞溶解過程を開始し、アポトーシスを促す免疫媒介物質により、そして細胞死に至る経路を直接開始するアポトーシス誘導物質からもたらされる。アポトーシスは、核クロマチンの凝縮、細胞収縮、核崩壊、形質膜小胞化および膜境界アポトーシス小体の形成を含む特有の形態的変化を特徴とする能動的細胞死過程である（Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980）。アポトーシスの分子的特質は、内在性エンドヌクレアーゼの活性化の結果としての細胞の核ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム長断片への分解である（Wyllie A. Nature 284:555, 1981）。
【０００７】
カスパーゼは、アポトーシスの実行段階における重要な酵素として関連づけられている。カスパーゼファミリーは、少なくとも１４の関連システインアスパルタンプロテアーゼで構成される。カスパーゼはすべて、保存されたＱＡＣＸＧ（ここで、ＸはＲ、ＱまたはＧである）（配列番号１）ペンタペプチド活性部位モチーフを含有する（Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997）。多数のカスパーゼは、特定のアスパルテート切断部位での切断後に活性化される不活性プロ酵素として（Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997）、あるいは活性化に調節分子との会合（association）を要する不活性酵素として（Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999）、合成される。開始剤プロカスパーゼの活性化は、細胞死カスケードの引き金となる下流エフェクターカスパーゼを活性化する（Pan et al. J. Biol. Chem. 273:5841, 1998; Earnshaw W. Nature 397:387, 1999）。
【０００８】
現在用いられるほとんどの化学療法剤は、非特異的細胞毒性である。これらの化学療法剤の多くは毒性副作用を有し、患者の生活の質を弱らせ、しばしば危うくする。さらに、ガン細胞による化学療法剤の輸送および代謝の変化は、ガン細胞による化学療法剤に対する耐性の発現を引き起こす。
【０００９】
したがって、ガン細胞における細胞周期停止を誘導し、ガン細胞の増殖を阻害し、ガン細胞中にアポトーシスを誘導し、そしてガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する新規の組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。さらに、このような組成物は、調製するのが簡単でかつ相対的に安価である必要があり、それらの活性は長時間にわたって治療的に安定であるべきであり、そしてそれらは反復投与時にも最小毒性を伴う用量レジメンで有効である必要がある。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）（M.phlei）−ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁上に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡ（ＭＣＣ）、化学療法剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物および方法であって、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣはガン細胞における細胞周期停止を誘導し、ガン細胞の増殖を阻害し、ガン細胞中にアポトーシスを誘導し、そしてガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することによりこれらの要求を満たす。さらに、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣは、調製するのが簡単でかつ相対的に安価であり、それらの活性は調製物の間で再現可能であり、長時間にわたって治療的に安定であり、反復投与時でも最小毒性を伴う用量レジメンで有効である。
【００１１】
ＭＣＣを調製するために、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）は液体培地中で増殖させられて、集菌される。マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）は破砕され、破砕マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）の固体成分が遠心沈降により収集される。固体成分は除タンパク質化され、除脂質化されて、洗浄される。試薬はすべて、ＭＣＣ調製中のＤＮＡの保存を増強するために選択される。Ｍ−ＤＮＡはＭＣＣから、または直接マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）から調製される。ここでも、試薬はすべて、Ｍ−ＤＮＡ調製中のＤＮＡの保存を増強するために選択される。
【００１２】
Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤またはＭＣＣ＋化学療法剤を含む組成物が、ガンを有する動物（ヒトを含む）に、動物のガンを治療するのに有効な量で投与される。ガン細胞における細胞周期停止を誘導し、ガン細胞の増殖を阻害し、ガン細胞中にアポトーシスを誘導し、そしてガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強するＭ−ＤＮＡの、およびＭＣＣの予期しなかった驚くべき能力は、医療業界における長年の痛切な実現されていない要求に対処し、ヒトを含めた動物に重要な利益を提供する。
【００１３】
本発明の別の目的は、ガン細胞における細胞周期停止を誘導する組成物および方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、ガン細胞の増殖を阻害する組成物および方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、ガン細胞の細胞周期を同調させることにより、ガン細胞に及ぼす化学療法剤の作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ガン細胞の増殖に及ぼす化学療法剤の作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを治療する場合に化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを排除するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを排除する場合に化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞における細胞周期停止を誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞の増殖を阻害する組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞における細胞周期停止に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞の増殖に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞にアポトーシスを誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、悪性メラノーマ細胞中のカスパーゼを活性化する組成物および方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物における悪性メラノーマを治療するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物における悪性メラノーマを治療する場合に化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物における悪性メラノーマを排除するのに有効な組成物および方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物における悪性メラノーマを排除する場合に化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを治療する場合に放射線の作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、ヒトを含めた動物におけるガンを排除する場合に放射線の作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、ガン細胞の細胞周期を同調させることによりガン細胞に及ぼす放射線療法の作用を増強する組成物および方法を提供することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、大量に調製され得る組成物を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、調製するのが比較的安価である組成物を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、調製物の間で再現可能な活性を有する組成物を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、長時間にわたって安定である組成物を提供することである。
【００４０】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および利点は、以下の開示実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を検討すれば明らかになるであろう。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacteriu phlei）（M.phlei）−ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡ（ＭＣＣ）、化学療法剤および製薬上許容可能な担体を含む組成物および方法であって、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣはガン細胞における細胞周期停止を誘導し、ガン細胞の増殖を阻害し、ガン細胞中にアポトーシスを誘導し、そしてガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強する組成物および方法である。Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣは調製するのが簡単でかつ相対的に安価であり、それらの活性は調製物の間で再現可能であり、長時間にわたって治療的に安定であり、反復投与時でも最小毒性を伴う用量レジメンで有効である。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「Ｍ−ＤＮＡ」はマイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）から直接的に単離されたＤＮＡ、およびマイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）から調製されたＭＣＣから単離されたＤＮＡを含む。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「ＭＣＣ」とは、除タンパク質化、除脂質化マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁上に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡである。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「化学療法剤」とは、ヒトを含めた動物におけるガンを治療する場合に用いるための、ある国または合衆国政府の取締り機関により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認められた薬局方に列挙されたあらゆる作用物質である。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「抗腫瘍性」とは、ガン細胞の発生、成熟、増殖および拡張の防止に関する。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「増強する」とは、付加的であるより大きい共働作用の程度に関する。
【００４７】
本明細書中で用いる場合、「共働作用」とは、２つまたはそれ以上の化学療法剤の協調作用に関する。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「強化する」とは、２つまたはそれ以上の化学療法剤の付加的作用に関する。
【００４９】
Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣの治療的有効性を増大するための方法としては、Ｍ−ＤＮＡの刺激配列または確認を化学的に補足しまたは生物工学的に増幅すること、ならびにＭ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤およびＭＣＣ＋化学療法剤を天然または合成担体と複合体化することが挙げられるが、これらに限定されない。任意に、免疫学的作用物質および受容体結合作用物質を含めた、しかしこれらに限定されない作用物質は、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣに含まれ得る。
【００５０】
Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤およびＭＣＣ＋化学療法剤は、製薬上許容可能な担体中で投与され、担体の例としては、液体担体および固体担体が挙げられるが、これらに限定されない。液体担体は、水性担体、非水性担体またはその両方であり、それらの例としては、水性懸濁液、油乳濁液、油中水型（water in oil）乳濁液、水中油中水型（water-in-oil-in-water）乳濁液、部位特異的乳濁液、長時間滞留乳濁液、粘着性乳濁液、ミクロ乳濁液、ナノ乳濁液およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。固体担体は、生物学的担体、化学的担体またはその両方であり、それらの例としては、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、およびＭ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤またはＭＣＣ＋化学療法剤の持続性放出を可能にする生分解性または非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このようなポリマーは、送達が必要とされる場所の付近に埋め込まれ得る。ポリマーおよびそれらの用途は、例えばBrem et al., J. Neurosurg. 74:441-446(1991)に記載されている。
【００５１】
好ましい水性担体としては、ＤＮａｓｅ非含有水、ＤＮａｓｅ非含有食塩水およびＤＮａｓｅ非含有の生理学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性担体としては、鉱油または中性油（これらに限定されない）が挙げられ、それらの例としては、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。この場合、油はポリ不飽和および飽和脂肪酸の適切な混合物を含有する。例としては、ダイズ油、キャノーラ油、ヤシ油、オリーブ油およびミグリオールが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、脂肪酸炭素数は、１２〜２２であり、そして脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。任意に、荷電脂質またはリン脂質は中性油中に懸濁され得る。
【００５２】
一例では、Ｍ−ＤＮＡはＤＮａｓｅ非含有滅菌水中に懸濁され、２０％出力で５分間音波処理される（Ｗ−３８５モデル音波処理機、Heat Systems-Ultrasonics Inc.）。任意に、音波処理されたＭ−ＤＮＡは、１５，０００〜３０，０００ｐｓｉで１フロースルー（flow-through）の間、微小流動化により均質化され（Ｍ−１１０Ｙモデル、Microfluidics, Newton, MA）、オートクレーブ処理蓋付き瓶に移されて、４℃で保存される。
【００５３】
一例では、ＤＮａｓｅ非含有ホスファチジルコリンが、リン脂質１グラム対トリグリセリド２０ｍｌの比率で、ＤＮａｓｅ非含有トリグリセリドダイズ油に添加され、５０〜６０℃で静かに加熱することにより溶解される。数グラムのＭＣＣが乾燥オートクレーブ処理容器に添加され、リン脂質−トリグリセリド溶液がＭＣＣ１グラム当たり２０ｍｌの濃度で添加される。懸濁液は２０℃で６０分間インキュベートされ、次にＤＮａｓｅ非含有ＰＢＳ１リットル当たりＭＣＣ懸濁液２０ｍｌの比率で、ＤＮａｓｅ非含有ＰＢＳと混合される。混合物は、２０％出力で５分間音波処理される（Ｗ−３８５モデル音波処理機、Heat Systems-Ultrasonics Inc.）。任意に、音波処理ＭＣＣ混合物は、１５，０００〜３０，０００ｐｓｉで１フロースルーの間、微小流動化により均質化され（Ｍ−１１０Ｙモデル、Microfluidics）、オートクレーブ処理蓋付き瓶に移されて、４℃で保存される。
【００５４】
化学療法剤は、音波処理または微小流動化の前、最中または後に、あるいは貯蔵の前または後に、Ｍ−ＤＮＡにまたはＭＣＣに添加され得る。さらに、ヒトを含めた動物への投与のためのデオキシリボ核酸、細菌細胞壁抽出物および化学療法剤を調製するための当業者に既知のその他の方法が用いられ得る。
【００５５】
さらに、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤およびＭＣＣ＋化学療法剤は、応答細胞に組成物を提供するために用いられる担体に関係なく、賦形剤のいずれか、すべて、または任意の組合せとともに用いられ得る。これらの例としては、酸化防止剤、緩衝剤および静菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。また、沈澱防止剤、増粘剤および安定剤も含まれ得る。安定剤としては、非イオン性およびイオン性ポリマー、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン）またはヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤およびＭＣＣ＋化学療法剤は、ガン細胞における細胞周期停止を誘導し、ガン細胞の増殖を阻害し、ガン細胞にアポトーシスを誘導し、そしてガン細胞に及ぼす化学療法剤の抗腫瘍性作用を増強するのに有効な量で、ガンを有する動物に投与される。化学療法剤は、Ｍ−ＤＮＡまたはＭＣＣの投与の前に、同時に、または後に投与され得る。用いられる化学療法剤、ならびに１回に投与されるＭ−ＤＮＡ、ＭＣＣおよび化学療法剤の量、投与回数、そして投与計画は、ガンの種類、ガンの重症度、ガンの位置およびその他の臨床的因子、例えばレシピエントのサイズ、体重および身体状態ならびに投与経路によっており、標準的臨床技術を用いて、過度の実験なしで、医療従事者により確定され得る。さらに、in vitro検定は、Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ＋化学療法剤およびＭＣＣ＋化学療法剤投与に関する最適範囲を同定するのに役立てるために、任意に用いられ得る。
【００５７】
好ましくは、投与されるＭ−ＤＮＡの量は、１回投与当たり約０．００００１〜５００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１回投与当たり約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１回投与当たり約０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、投与されるＭＣＣの量は、１回投与当たり約０．００００１〜５００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１回投与当たり約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１回投与当たり約０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、ＭＣＣのＭ−ＤＮＡ含量は、約０．００１〜９０ｍｇ／乾燥ＭＣＣ１００ｍｇ、さらに好ましくは約０．０１〜４０ｍｇ／乾燥ＭＣＣ１００ｍｇ、最も好ましくは約０．１〜３０ｍｇ／乾燥ＭＣＣ１００ｍｇである。ＭＣＣのタンパク質含量は約２０ｍｇ／乾燥ＭＣＣ１００ｍｇ未満であるべきであり、抽出可能Ｍ−ＤＮＡはＭＣＣの乾燥重量の少なくとも約４．５％であるべきである。
【００５８】
化学療法剤としては、ＤＮＡ−アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、抗代謝剤、チューブリン安定剤、チューブリン不安定剤、ホルモン拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重らせんＤＮＡ、核酸アプタマー、および分子生物学的修飾ウイルス性細菌および外毒素性作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ＤＮＡアルキル化剤としては、ニトロソ尿素、重金属剤および架橋剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗腫瘍抗生物質としてはマイトマイシン−Ｃが挙げられるが、これに限定されない。抗代謝剤としては５−フルオロウラシルおよびメトトレキセートが挙げられるが、これらに限定されない。トポイソメラーゼ阻害剤としては、ＣＰＴ−１１が挙げられるが、これに限定されない。チューブリン安定剤としてはタキソールが挙げられるが、これに限定されない。チューブリン不安定剤としてはビンクリスチンおよびビンブラスチンが挙げられるが、これらに限定されない。ホルモン拮抗剤としてはタモキシフェンが挙げられるが、これに限定されない。
【００６０】
好ましくは、１回に投与される化学療法剤の量は、約０．０００１〜１０００ｍｇ／ｍ2または約０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．５〜７０ｍｇ／ｍ2または約０．５〜７０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１〜５０ｍｇ／ｍ2または約１〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【００６１】
本発明の組成物の投与経路としては、経口、局所、皮下（subcutaneous）、経皮、皮下（subdermal）、筋内、腹腔内、関節内、嚢内、動脈内、静脈内、皮膚内、頭蓋内、病変内、腫瘍内、眼内、肺内、脊椎内、体腔内の位置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕およびエレクトロコーポレーション（electrocorporation）が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路によって、投与当たりの容積は、好ましくは１回投与当たり約０．００１〜５００ｍｌ、さらに好ましくは１回投与当たり約０．０１〜１００ｍｌ、最も好ましくは１回投与当たり約０．１〜５０ｍｌ／投与である。
【００６２】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために役立つが、しかしながら同時に、本発明を限定するものではない。それどころか、本発明の種々のその他の実施形態、変更形態および等価物に訴え得ると明確に理解されるべきものであり、これは、本明細書中の説明を読めば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、当業者に示唆され得る。
【００６３】
実施例１
マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）からのＭ−ＤＮＡおよびＭＣＣの調製
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ９８／００７４４号（この記載内容は、参照により本明細書中に援用する）に記載されているように、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）（菌株１１０）からＭ−ＤＮＡおよびＭＣＣを調製した。試薬はすべて、ＤＮＡの保存を強化するように選択した。別記しない限り、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣを、ＤＮａｓｅ非含有水中に、または製薬上許容可能なＤＮａｓｅ非含有緩衝液中に再懸濁し、２０％出力で５分間音波処理した（Ｗ−３８５モデル音波処理機、heat systems-Ultrasonics, Inc.）。Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣは、リムルスアメーバ様細胞溶解物ＱＣＬ−１０００キット（BioWhittaker, Walkersville, MD）を用いて測定した場合、エンドトキシンを含有していなかった。
【００６４】
ＤＮａｓｅ処理のために、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣを、２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．４、２ｍＭのＭｇＣｌ2および５０ｍＭのＫＣｌ中で２５℃で１時間、１国際単位のＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Life Technologies）で消化した。最終濃度で２．５ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加して、６５℃で１０分間加熱することにより、ＤＮａｓｅＩを活性化した。ＤＮａｓｅＩは、二本鎖および一本鎖ＤＮＡの両方を消化し、ＤＮＡのほぼ全体の分解を提供する。
【００６５】
実施例２
マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）以外の種からのマイコバクテリアＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）およびマイコバクテリア細胞壁上に保持され、複合体化されたマイコバクテリアＤＮＡ（ＢＣＣ）の調製
実施例１と同様に、マイコバクテリア種、例えばM. vaccae、M. chelonei、M.smegmatis、M.terrae、M. duvalii、M. tubeculosis、M. bovis BCG、M. avium、M. Szulgai、M. scrofulaceum、M. xenopi、M. kansaii、M. gastr、M. fortuitousおよびM. asiaticum（これらに限定されない）から、ＢＣＣおよびＢ−ＤＮＡを調製した。
【００６６】
実施例３
細胞および試薬
ヒトジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞白血病細胞（ジャーカット）、ヒト前骨髄球ＨＬ６０白血病細胞（ＨＬ−６０）、ミトザントロン耐性ヒト前骨髄球ＨＬ−６０ＭＸ１白血病細胞（ＨＬ−６０ＭＸ１）、ネズミＥＬ−４リンパ腫細胞（ＥＬ−４）およびネズミＢ−１６メラノーマ細胞を、アメリカンタイプ組織培養コレクション（ATCC Rockville, MD, USA）から入手し、ＡＴＣＣ推奨の培地中で増殖させた。別記しない限り、細胞は６ウエル平底組織培養プレート中に５×１０3細胞／ｍｌ〜１×１０6細胞／ｍｌの濃度で植え付け、３７℃で２４〜７２時間保持した。
【００６７】
マイトマイシン−Ｃ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、メトトレキセートおよびニシン精子ＤＮＡは、シグマアルドリッチカナダ（Sigma Aldrich Canada）（Oakville, Ontario, Canada）から入手した。
【００６８】
実施例４
細胞周期分析
ＣＹＣＬＥＴＥＳＴ（商標）ＰＬＵＳ ＤＮＡ市販キット（Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）を用いて、細胞周期段階を決定した。要するに、非イオン性界面活性剤中で細胞膜を溶解し、トリプシンを用いて細胞骨格および核タンパク質を除去し、ＲＮａｓｅで細胞ＲＮＡを消化して、スペルミンで核クロマチンを安定化することにより、処理細胞からの核を得た。プロピジウムイオダイドを細胞核に添加し、それらの蛍光を、電子二重線識別能力を備えたフローサイトメータ（FACSCalibur, Becton Dickinson）で分析した。細胞周期のＧ0／Ｇ1、Ｓ（ＳＥ、ＳＭ、ＳＬ）またはＧ2／Ｍ期における細胞の蓄積を、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴソフトウェア（Verity Software House Inc., Topsham, MA, USA）を用いて分析した。結果は、細胞周期の各期における細胞のパーセンテージとして表す。
【００６９】
実施例５
メトトレキセートによる細胞集団の同調
細胞集団を同調させるために、０．０４〜０．１６μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含有する組織培地中で、指数関数的に増殖中の細胞を２０時間インキュベートした。ＭＴＸ培地を除去し、細胞を大量のリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、新鮮な培地を添加して、インキュベーションを８時間継続して、実施例４と同様に細胞周期分析を実施した。
【００７０】
実施例６
ＭＣＣによる同調的に分裂中のガン細胞における細胞周期停止の誘導
ＭＴＸ培地中の０、１０および１００μｇ／ｍｌのＭＣＣを用いて、実施例５と同様に分析のために、指数関数的に増殖中のジャーカット、ＨＬ−６０、ＨＬ−６０ＭＸ１およびＥＬ−４細胞を１×１０6細胞／ｍｌで、ならびにＢ−１６細胞を３×１０5細胞／ｍｌで調製した。
【００７１】
表１は、ＭＣＣが、１０および１００μｇ／ｍｌの両方で、同調的に分裂中のジャーカット、ＨＬ−６０、ＨＬ−６０ＭＸ１、ＥＬ−４およびＢ−１６ガン細胞における細胞周期のＳＬ＋Ｇ2Ｍ期で停止を誘導したことを示す。ＳＬ＋Ｇ2Ｍ期における細胞の蓄積には、細胞周期のＧ0／Ｇ1＋ＳＥ期におけるまたはＧ0／Ｇ1＋ＳＥおよびＳＭ期における細胞の低減を伴った。
【００７２】
【表１】
0004380922.tif 000002
【００７３】
これらのデータは、ＭＣＣが、非定型多化学療法剤耐性を示す、同調的に分裂中のガン細胞、例えばＨＬ−６０ＭＸ１ガン細胞における停止を誘導し、トポイソメラーゼＩＩ触媒性活性を変化させ、およびトポイソメラーゼＩＩαおよびβタンパク質レベルを低減させたことを実証する（Harker et al. Cancer Res 49:4542-4549, 1989）。
【００７４】
実施例７
同調的に分裂中のジャーカット白血病細胞における、ＭＣＣおよびＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣによる細胞周期停止の誘導
ＭＴＸ培地中の０および１０μｇ／ｍｌのＭＣＣ、ならびに１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣを用いて、実施例５と同様に分析のために、指数関数的に増殖中のジャーカット白血病細胞を１×１０6細胞／ｍｌで調製した。
【００７５】
表２は、ＭＣＣが、同調化ジャーカット細胞における細胞周期のＳＬ＋Ｇ2Ｍ期で停止を誘導したことを示す。ＳＬ＋Ｇ2Ｍ期における細胞の蓄積には、細胞周期のＧ0／Ｇ1＋ＳＥ期における、またはＧ0／Ｇ1＋ＳＥおよびＳＭ期における細胞の低減を伴った。表２は、ＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣは同調的に分裂中のジャーカット細胞における細胞周期停止を誘導しなかったことも示す。
【００７６】
【表２】
0004380922.tif 000003
【００７７】
ＭＣＣはマイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡであり、ＤＮａｓｅＩはＭＣＣのＭ−ＤＮＡを消化する。したがって、ＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣが同調的に分裂中のジャーカット白血病細胞において停止を誘導しなかったことは、分裂中ガン細胞における細胞周期停止のＭＣＣ誘導に関するＭ−ＤＮＡの重要性を実証する。
【００７８】
実施例８
ＭＣＣによるガン細胞における細胞周期停止の誘導
ＭＴＸの非存在下で、かつ０、１０および１００μｇ／ｍｌのＭＣＣの存在下で、実施例５と同様に分析のために、指数関数的に増殖中のジャーカット、ＨＬ−６０、ＨＬ−６０ＭＸ１およびＥＬ−４細胞を１×１０6細胞／ｍｌで、ならびにＢ−１６細胞を３×１０5細胞／ｍｌで調製した。
【００７９】
表３は、ＭＣＣが、１０および１００μｇ／ｍｌの両方で、非同調的に分裂中のジャーカット、ＨＬ−６０、ＨＬ−６０ＭＸ１、ＥＬ−４およびＢ−１６ガン細胞における細胞周期のＳＬ＋Ｇ2Ｍ期で停止を誘導したことを示す。ＳＬ＋Ｇ2Ｍ期における細胞の蓄積には、細胞周期のＧ0／Ｇ1＋ＳＥ期におけるまたはＧ0／Ｇ1＋ＳＥおよびＳＭ期における細胞の低減を伴った。
【００８０】
【表３】
0004380922.tif 000004
【００８１】
ＭＣＣは、非定型多化学療法剤耐性を示す、非同調的に分裂中のガン細胞、例えばＨＬ−６０ＭＸ１細胞における停止を誘導し、トポイソメラーゼＩＩ触媒性活性を変化させ、およびトポイソメラーゼＩＩαおよびβタンパク質レベルを低減させた（Harker et al. Cancer Res 49:4542-4549, 1989）。
【００８２】
実施例９
Ｍ−ＤＮＡ、ＭＣＣおよびＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣによるジャーカット白血病細胞における細胞周期停止の誘導
ＭＴＸの非存在下で、かつ２００μｇ／ｍｌのＭ−ＤＮＡ、１０μｇ／ｍｌのＭＣＣおよび１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣの存在下で、実施例５と同様に分析のために、指数関数的に増殖中のジャーカット白血病細胞を１×１０6細胞／ｍｌで調製した。
【００８３】
表４は、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣがともに、非同調的に分裂中のジャーカット細胞における細胞周期のＳＬ＋Ｇ2Ｍ期で停止を誘導したことを示す。ＳＬ＋Ｇ2Ｍ期における細胞の蓄積には、細胞周期のＧO／Ｇ1＋ＳＥおよびＳＭ期における細胞の低減を伴った。表３も、ＤＮａｓｅＩ処理後、ＭＣＣが非同調的に分裂中のジャーカット細胞における細胞周期停止をほとんど誘導しなかったことを示す。
【００８４】
【表４】
0004380922.tif 000005
【００８５】
Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣは、非同調的に分裂中のジャーカット細胞における細胞周期停止を誘導した。ＭＣＣは、マイコバクテリウム・フレイ（M.phlei）細胞壁上に保持され、複合体化されたＭ−ＤＮＡであり、ＤＮａｓｅＩは、ＭＣＣのＭ−ＤＮＡを消化する。したがって、ＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣが非同調的に分裂中のジャーカット細胞において停止をほとんど誘導しなかったことも、分裂中のガン細胞における細胞周期停止のＭＣＣ誘導に関するＭ−ＤＮＡの重要性を実証する。
【００８６】
実施例１０
ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ、音波処理されたＭ−ＤＮＡおよびニシン精子ＤＮＡによるＢ−１６メラノーマ細胞増殖の阻害
ＭＴＸの非存在下で、かつ１〜１００μｇ／ｍｌのＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡまたはＷ−３８モデル超音波処理機（HeatSystems-Ultrasonics, Inc.）中、氷上で２０分間音波処理されオリゴヌクレオチド長を低減させたＭ−ＤＮＡ、およびニシン精子ＤＮＡの存在下で、実施例５と同様に分析のために、指数関数的に増殖中のＢ−１６メラノーマ細胞を３×１０5細胞／ｍｌで調製した。
【００８７】
図６に示したように、１μｇ／ｍｌで、ＭＣＣは約２５％、Ｍ−ＤＮＡは約５％、音波処理されたＭ−ＤＮＡは約１０％およびニシン精子ＤＮＡは０％、増殖を阻害した。１０μｇ／ｍｌでは、ＭＣＣは約５０％、Ｍ−ＤＮＡは約３０％、音波処理されたＭ−ＤＮＡは約２５％およびニシン精子ＤＮＡは０％、増殖を阻害した。１００μｇ／ｍｌでは、ＭＣＣは約８０％、Ｍ−ＤＮＡおよび音波処理されたＭ−ＤＮＡは約５０％ならびにニシン精子ＤＮＡは約５％、増殖を阻害した。
【００８８】
ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡおよび音波処理されたＭ−ＤＮＡは各々、非同調的に分裂中のＢ−１６メラノーマ細胞の増殖を阻害したが、一方、ニシン精子ＤＮＡは非同調的に分裂中のＢ−１６メラノーマ細胞の増殖を阻害しなかった。
【００８９】
実施例１１
化学療法剤±ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞増殖の阻害
悪性メラノーマは、最も化学療法難治性のガンの１つであり、多くの化学療法剤はこの疾患の予後を緩和するとは思われない。メラノーマ由来細胞株もほとんどの化学療法剤に対してかなりの耐性を示し、このことは、内在性細胞性耐性の存在を示唆する。この耐性は、例えば、Ｐ−糖タンパク質、グルタチオン／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ系多化学療法剤耐性関連タンパク質、突然変異化Ｎ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２およびｐ５３ガン遺伝子ならびにトポイソメラーゼＩＩ酵素を含めたメカニズム（これらに限定されない）により媒介され得る（Serrone et al. Melanoma Res. 9:51, 1999）。
【００９０】
ＭＣＣの非存在下および存在下で、化学療法剤マイトマイシン−Ｃ、５−フルオロウラシルおよびシスプラチンを用いて、Ｂ−１６メラノーマ細胞を、３×１０5細胞／ｍｌで、７２時間インキュベートした。ジメチルチアゾール−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元を用いて、細胞増殖を測定した（Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65:55-63, 1983）。７２時間後、培地中の２０μｌのＭＴＴを各ウエルに添加し、３時間インキュベートした。次に培地を各ウエルから吸引し、１００μｌの酸性化イソプロピルアルコールを各試料に添加し、還元化ＭＴＴを混合により可溶化した。ＥＬＩＳＡマイクロプレート読取機を用いて、５７０ｎｍの波長で、反応生成物の吸光度を測定した。
【００９１】
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、０．０１〜１００μｇ／ｍｌのマイトマイシン−Ｃとともに、１〜１００μｇ／ｍｌのＭＣＣとともに、および０．０１〜１０μｇ／ｍｌのマイトマイシン−Ｃ＋１μｇ／ｍｌのＭＣＣとともにインキュベートした。マイトマイシン−Ｃは、ストレプトミセス属caespitosusにより産生される抗腫瘍抗生物質であり、これはＤＮＡを架橋し、ＤＮＡを脱重合化し、そしてフリーラジカルを生成する。
【００９２】
図２は、Ｂ−１６に関して、マイトマイシン−Ｃが０．１μｇ／ｍｌで約５％、１μｇ／ｍｌで約１０％、ならびに１０および１００μｇ／ｍｌで１００％、増殖を阻害したが、一方、ＭＣＣは１μｇ／ｍｌで約２５％、１０μｇ／ｍｌで約５０％および１００μｇ／ｍｌで約８０％、増殖を阻害したことを示す。図２は、１μｇ／ｍｌのＭＣＣの存在下で、マイトマイシン−Ｃが、０．１μｇ／ｍｌで約４０％、１μｇ／ｍｌで約６５％および１００μｇ／ｍｌで１００％、増殖を阻害したことも示す。これらのデータは、ＭＭＣが、ガン細胞の増殖に及ぼすマイトマイシン−Ｃの抗腫瘍性作用を増強することを示す。
【００９３】
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルとともに、１〜１００μｇ／ｍｌのＭＣＣとともに、および０．０１〜１０μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシル＋１μｇ／ｍｌのＭＣＣとともにインキュベートした。５−フルオロウラシルは抗代謝物質であり、これはＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨げる。
【００９４】
図３は、Ｂ−１６に関して、５−フルオロウラシルが０．０１μｇ／ｍｌで約８％、０．１μｇ／ｍｌで約５０％、１μｇ／ｍｌで約９０％、ならびに１０および１００μｇ／ｍｌで１００％、増殖を阻害したが、一方、ＭＣＣは１μｇ／ｍｌで約２５％、１０μｇ／ｍｌで約５０％および１００μｇ／ｍｌで約８０％、増殖を阻害したことを示す。図３は、１μｇ／ｍｌのＭＣＣの存在下で、５−フルオロウラシルが、０．０１μｇ／ｍｌで約７５％、０．１μｇ／ｍｌで約８５％、１μｇ／ｍｌで約９０％および１０μｇ／ｍｌで１００％、増殖を阻害したことも示す。これらのデータは、ＭＣＣが、ガン細胞の増殖に及ぼす５−フルオロウラシルの抗腫瘍性作用を増強することを示す。
【００９５】
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、０．０１〜１００μｇ／ｍｌのシスプラチンとともに、１〜１００μｇ／ｍｌのＭＣＣとともに、および０．０１〜１０μｇ／ｍｌのシスプラチン＋１μｇ／ｍｌのＭＣＣとともにインキュベートした。シスプラチンはＤＮＡを架橋し、ＤＮＡ前駆体を阻害するアルキル化剤である。
【００９６】
図４は、Ｂ−１６に関して、シスプラチンが０．０１μｇ／ｍｌで０％、０．１μｇ／ｍｌで約８％、１μｇ／ｍｌで約６２％、１０μｇ／ｍｌで約９０％および１００μｇ／ｍｌで１００％、増殖を阻害したが、一方、ＭＣＣは１μｇ／ｍｌで約２５％、１０μｇ／ｍｌで約５０％および１００μｇ／ｍｌで約８０％、増殖を阻害したことを示す。図４は、１μｇ／ｍｌのＭＣＣの存在下で、シスプラチンが、０．０１μｇ／ｍｌで約４０％、０．１μｇ／ｍｌで約５０％、１μｇ／ｍｌで約７０％および１０μｇ／ｍｌで９０％、増殖を阻害したことも示す。これらのデータは、ＭＣＣが、ガン細胞の増殖に及ぼすシスプラチンの抗腫瘍性作用を強化することを示す。
【００９７】
表５は、１μｇ／ｍｌのＭＣＣの非存在下または存在下で、Ｂ−１６メラノーマ細胞分裂の５０％阻害に要するマイトマイシン−Ｃ、５−フルオロウラシルおよびシスプラチンの濃度を示す。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
表５は、１０〜１００μｇ／ｍｌでのＭＣＣ（ＩＣ50＝１０μｇ／ｍｌ）による、ならびに０．１〜１０μｇ／ｍｌでのマイトマイシン−Ｃ、５−フルオロウラシルおよびシスプラチン（それぞれＩＣ50＝２．２、０．１２および０．６μｇ／ｍｌ）によるＢ−１６細胞メラノーマ増殖の用量依存性阻害を示す。表５は、１μｇ／ｍｌのＭＣＣがＢ−１６メラノーマ細胞増殖のマイトマイシン−Ｃ（ＩＣ50＝０．１２μｇ／ｍｌ）および５−フルオロウラシル（ＩＣ50＝０．００５μｇ／ｍｌ）による阻害を増強し、そして１μｇ／ｍｌのＭＣＣがＢ−１６メラノーマ増殖のシスプラチン（ＩＣ50＝０．１６μｇ／ｍｌ）による阻害を強化したことも示す。
【０１００】
これらのデータは、ＭＣＣがガン細胞増殖を阻害するだけでなく、ガン細胞増殖に及ぼすマイトマイシン−Ｃおよび５−フルオロウラシルの抗腫瘍性作用を増強し、そしてガン細胞増殖に及ぼすシスプラチンの抗腫瘍性作用を強化することを示す。
【０１０１】
実施例１２
ＭＣＣおよびＭ−ＤＮＡによるＢ−１６メラノーマ細胞におけるアポトーシスの誘導
細胞ＤＮＡのヌクレオソーム大の断片への断片化は、アポトーシス進行中の細胞の特徴である（Newell et al. Nature 357:286-289, 1990）。ＤＮＡ断片化を評価するために、Ｂ−１６細胞を０．５ｍｌの低張溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、ｐＨ７．５）で溶解した。溶解物を１３，０００ｇで１０分間遠心分離し、断片化ＤＮＡを含有する上清を５０％イソプロパノールおよび０．５ＭのＮａＣｌ中で−２０℃で一夜、沈澱させた。沈殿物を遠心分離により収集し、０．７％アガロースゲル中で１００Ｖで３時間の電気泳動により分析した。
【０１０２】
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、３×１０5細胞／ｍｌで、１μｇ／ｍｌのＭ−ＤＮＡ（図６、レーン１）とともに、ならびに１００μｇ／ｍｌ（レーン２）、１０μｇ／ｍｌ（レーン３）および１μｇ／ｍｌ（レーン４）のＭＣＣとともに、７２時間インキュベートした。Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣ処理Ｂ−１６メラノーマ細胞は、有意のＤＮＡ断片化を示したが、一方、非処理Ｂ−１６メラノーマ細胞（図６、レーン５）は、ＤＮＡ断片化を示さなかった。１２３ｂｐＤＮＡラダー（Gibco Life Science）を用いて、ヌクレオソーム大のＤＮＡ断片の分子量を測定した（図６、レーンＬ）。これらのデータは、Ｍ−ＤＮＡおよびＭＣＣがＢ−１６メラノーマ細胞においてアポトーシスを誘導することを示す。
【０１０３】
実施例１３
ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞におけるカスパーゼ−１の活性化
インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ／カスパーゼ−１）は、アポトーシスに必要なカスパーゼカスケードの逐次活性化に関与するシステインプロテアーゼである。ＩＣＥ／カスパーゼ−１は、種々の前アポトーシス刺激により迅速かつ一過性に活性化される。ＭＣＣがＩＣＥ／カスパーゼ−１を直接活性化し得るか否かを確定するために、ＩＣＥ／カスパーゼ−１活性に及ぼすＭＣＣの作用を、Ｂ−１６メラノーマ細胞で分析した。
【０１０４】
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、３×１０5細胞／ｍｌで、１ｍｌの容積で６ウエル組織培養プレート中に入れて、１〜１００μｇ／ｍｌのＭＣＣとともに３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％の３−［３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０％のグリセロール中で溶解し、１１，０００ｇで１０分間遠心分離した。蛍光原性合成基質Ｚ−ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ［ＯＭｅ］−７−アミノ−４−メチルクマリン「Calbiochem #6 88225」を用いて、上清中のＩＣＥ／カスパーゼ−１活性を測定した。４００ｎｍの励起波長および５０５ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。
【０１０５】
図７に示したように、ＭＣＣを用いたＢ−１６メラノーマ細胞のインキュベーションは、ＩＣＥ／カスパーゼ−１活性の有意の用量依存性増大を生じたが、一方、ＭＣＣを用いないＢ−１６メラノーマ細胞のインキュベーションは、ＩＣＥ／カスパーゼ−１活性の変化を生じなかった。
【０１０６】
実施例１４
悪性メラノーマ細胞に及ぼすＭＣＣの細胞毒性作用
細胞毒性は、細胞膜一体性の損失および細胞質酵素、例えばＬＤＨ（これに限定されない）の放出により特性化される（Phillips et al. Vaccine 14:898-904）。
【０１０７】
ＭＣＣの細胞毒性を評価するために、Ｂ−１６メラノーマ細胞を１００μｇ／ｍｌのＭＣＣとともに、または総ＬＤＨ放出に関する対照としての溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％トリトンＸ−１００、ｐＨ７．５）とともに４８時間インキュベートした（Fillon et al. Biochim. Biophys Acta 1329:345-356, 1997）。市販検定（Sigma-Aldrich）により、ＬＤＨを測定した。
【０１０８】
図８に示したように、ＭＣＣはＢ−１６メラノーマ細胞に対して細胞毒性でなかった。これらのデータは、ＭＣＣが細胞の膜を破砕することにより作用するのではなく、ＭＣＣがアポトーシスを誘導するためにＢ−１６メラノーマ細胞に直接作用することを実証する。
【０１０９】
実施例１５
マウスにおけるＢ−１６メラノーマに及ぼすＭ−ＤＮＡ、ＭＣＣおよびＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣの作用
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、２０匹の雄ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植し、１０日間増殖させる。マウスを４群に分けて、各マウスの腫瘍塊を測定する。０日目に、第１群マウスには生理食塩水を投与し、第２群マウスにはＭＣＣを投与し、第３群マウスにはＭ−ＤＮＡを投与し、そして第４群マウスにはＤＮａｓｅＩ処理ＭＣＣを投与する。処置の４週間後に、マウスを屠殺して、腫瘍塊を測定する。第２群および第３群マウスは、第１群および第４群マウスより腫瘍塊が小さかった。
【０１１０】
実施例１６
マウスにおけるＢ−１６メラノーマに及ぼすマイトマイシン−Ｃと組合せたＭ−ＤＮＡおよびＭＣＣの作用
Ｂ−１６メラノーマ細胞を、３０匹の雄ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植し、１０日間増殖させる。マウスを６群に分けて、各マウスの腫瘍塊を測定する。０日目に、第１群マウスには生理食塩水を投与し、第２群マウスにはＭ−ＤＮＡを投与し、第３群マウスにはＭＣＣを投与し、第４群マウスにはマイトマイシン−Ｃを投与し、第５群マウスにはＭ−ＤＮＡおよびマイトマイシン−Ｃを投与し、そして第６群マウスにはＭＣＣおよびマイトマイシン−Ｃを投与する。処置の４週間後に、マウスを屠殺して、腫瘍塊および転移数を測定する。第１群マウスは最大量の腫瘍塊を有する。第４群マウスは、第１群マウスより小さい腫瘍塊を有する。第２群および第３群マウスは、第４群マウスより小さい腫瘍塊を有する。第５群および第６群マウスは、最も小さい腫瘍塊を有する。
【０１１１】
もちろん、前記は本発明の好ましい実施態様にのみ関するものであり、添付の特許請求の範囲に記載したような本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明において多数の変更形態または代替形態が成され得ると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＭＣＣ、Ｍ−ＤＮＡ、音波処理されたＭ−ＤＮＡおよびニシン精子ＤＮＡによるＢ−１６メラノーマ細胞分裂の阻害。
【図２】  マイトマイシン−Ｃ、ＭＣＣおよびマイトマイシンＣ＋ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞分裂の阻害。
【図３】  ５−フルオロウラシル、ＭＣＣおよび５−フルオロウラシル＋ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞分裂の阻害。
【図４】  シスプラチン、ＭＣＣおよびシスプラチン＋ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞分裂の阻害。
【図５】  Ｂ−１６メラノーマ細胞のＳ期評価（Ａ）およびＭＣＣによる処理後のＢ−１６メラノーマ細胞のＳ期評価（Ｂ）。
【図６】  ＭＣＣおよびＭ−ＤＮＡによるＢ−１６メラノーマ細胞におけるアポトーシスの誘導。
【図７】  ＭＣＣによるＢ−１６メラノーマ細胞におけるカスパーゼ−１活性の誘導。
【図８】  ＭＣＣの細胞毒性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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