(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロリン酸オキシダーゼに０．０１〜１Ｍのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）またはその塩を共存させ、ｐＨ６〜７に調整することを特徴とし、さらに以下の（１）〜（７）の成分を含有する中性脂肪測定用液状試薬中での、グリセロリン酸オキシダーゼの３５℃７日間保存後の残存酵素活性を、加温処理していないものと比較して７５％以上に安定化させる方法。
（１）マグネシウムイオン
（２）アデノシン３リン酸またはその塩
（３）色原体
（４）フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩
（５）グリセロールキナーゼ
（６）アスコルビン酸オキシダーゼ
（７）カタラーゼ
【請求項２】
グリセロリン酸オキシダーゼに０．０１〜１Ｍのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）またはその塩を共存させ、ｐＨ６〜７に調整することを特徴とし、さらに以下の（１）〜（７）の成分を含有する中性脂肪測定用液状試薬組成物であって、グリセロリン酸オキシダーゼの３５℃７日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して７５％以上に安定化されている中性脂肪測定用液状試薬組成物。
（１）マグネシウムイオン
（２）アデノシン３リン酸またはその塩
（３）色原体
（４）フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩
（５）グリセロールキナーゼ
（６）アスコルビン酸オキシダーゼ
（７）カタラーゼ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、Ｌ-α-グリセロリン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸と過酸化水素を生成するＬ-α-グリセロリン酸オキシダーゼ（以下ＧＰＯと略す）は診断用試薬として使用され重要視されている。しかし、ＧＰＯは不安定であり特にＧＰＯ低濃度水溶液において不安定である。また、ＧＰＯを含有する組成物は凍結乾燥する場合、その間あるいは凍結乾燥後の活性が低下するものであった。
【０００３】
これに対し、安定化剤としてフラビン含有物質、糖類、アルブミン、アミノ酸からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物を添加することで効果があることが示されている（特公昭６１−２３９９５）。また、安定化剤として酸性アミノ酸例えばグルタミン酸、アスパラギン酸を添加することで効果があることが示されている（特開昭５８−８６０８３）。また、飽和ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、不飽和ジカルボン酸、カルボニルカルボン酸、またはトリカルボン酸またはそれらの水溶性塩類からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物を添加することで効果があるとの報告もある（特公平４−４６５５８）。しかしながら、これらの組成物では凍結乾燥時の安定性に効果はみられるが、液状状態における安定性には尚問題が残る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これに対し近年、診断用試薬では液状状態で長期間安定である液状試薬が主流になり、益々液状安定性に対する要求が強くなっている。このことから、本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するＧＰＯを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、ＧＰＯにピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩＰＥＳと略す）またはその塩を共存させることにより、ＧＰＯを液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ＧＰＯにＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させることを特徴とするグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法。
（２）ｐＨ６〜７．５に調製された（１）のＧＰＯの安定化方法。
（３）ＰＩＰＥＳまたはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度で用いられる（１）のＧＰＯの安定化方法。
（４）ＧＰＯにＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させることを特徴とするＧＰＯの安定化組成物。
（５）ｐＨ６〜７．５に調製された（４）のＧＰＯの安定化組成物。
（６）ＰＩＰＥＳまたはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度で用いられる（４）のＧＰＯの安定化組成物。
（７）中性脂肪測定試薬で用いられる（４）のグリセロリン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、３５℃７日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、７５％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【０００８】
本発明の一実施態様として、ＧＰＯにＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させることを特徴とするＧＰＯの安定化方法がある。
【０００９】
本発明に使用されるＰＩＰＥＳとしては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩やアンモニウム塩の形で用いてもよい。ＧＰＯを含む溶液中の濃度としては特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜１Ｍ、さらに好ましくは０．０２５〜０．４Ｍの範囲で使用される。また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。ＰＩＰＥＳもＧＯＯＤ緩衝液として単独で用いられるが、これらその他の緩衝液と併用して用いることもできる。該緩衝液のｐＨ調整範囲は特に限定されないが、好ましくは６〜７．５さらに好ましくは６〜６．５の範囲で調整されるのが望ましい。
【００１０】
本発明に用いられるＧＰＯとはＥＣ１．１．３．２１に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ-α-グリセロリン酸＋Ｏ2→ジヒドロキシアセトンリン酸＋Ｈ2Ｏ2
上記酵素はペディオコッカス属、アエロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。
ＧＰＯを含む溶液中のＧＰＯの濃度は、酵素の起源によっても異なり、通常０．１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられるが、本発明は５Ｕ／ｍＬ以下の低濃度においても効果を発揮することができる。
【００１１】
本発明において、ＧＰＯ溶液には、さらに防腐剤、界面活性剤などをＧＰＯの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。
【００１２】
また、従来公知のＧＰＯ安定化剤も併用して用いることができる。従来公知のＧＰＯ安定化剤としては例えばフラビン含有物質、糖類、アルブミン等が挙げられる。
また、該ＧＰＯ溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。該診断用試薬としては、トリグリセライド測定試薬、マグネシウム測定試薬が挙げられる。
【００１３】
トリグリセライド測定試薬としては、一般にＧＰＯの他、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体が含有される。マグネシウム測定試薬としては、一般にはＧＰＯの他、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、ペルオキシダーゼ、色原体、キレート剤が含有される。
【００１４】
本発明における上記安定化剤を含むＧＰＯ組成物は水溶液であっても、凍結乾燥したものであってもよい。
【００１５】
ＧＰＯの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈反応液〉
２００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５
６００ｍＭ  グリセロリン酸
１．４ｍＭ  ４-アミノアンチピリン
１．０ｍＭ  ＴＯＯＳ
１１Ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ
〈測定条件〉
（１）上記反応液２．５ｍＬをキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３０℃に制御された分光光度計で５５５ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間あたりの吸光度変化を求める。
（３）盲検は反応液に酵素溶液の代わりに精製水を０．１ｍＬ加えて上記同様の操作を行い１分間あたりの吸光度変化を求める。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３１１）５Ｕ／ｍＬを含む下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液を変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００１８】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
各種緩衝剤    濃度、ｐＨは表に記載
ＭｇＣｌ２    １ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩    １ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩    ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１）  ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製）  ２００Ｕ／ｍＬ
ＧＰＯ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１）  ５Ｕ／ｍＬ
【００１９】
結果  表１に示す。緩衝剤としてＰＩＰＥＳを用いた試薬でのＧＰＯ残存活性は、その他の緩衝剤を用いた場合に比較し安定であった。
【００２０】
実施例２：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３１１）５Ｕ／ｍＬを含む実施例▲１▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液をＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．７５）とし濃度を０、２５、５０、１００、２００、４００ｍＭに変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２１】
【表１】
0004284384.tif 000002
【００２２】
結果  表１に示す。ＰＩＰＥＳ濃度が高いほどＧＰＯ安定性は良好であったが、低濃度でも他の緩衝剤より良好な安定性が得られた。
【００２３】
実施例３：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３１１）５Ｕ／ｍＬを含む実施例▲１▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液を５０ｍＭＰＩＰＥＳとし、ｐＨを６．０、６．２５、６．５、７．０、７．５、８．０に変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２４】
【表２】
0004284384.tif 000003
【００２５】
結果  表２に示す。特にｐＨ６〜７．５で良好な安定性が得られた。
【００２６】
【発明の効果】
本発明においては、ＧＰＯを含有する組成物中にＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させることにより、従来よりも液状状態で長期間安定な組成物が得られる。