(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下流に連結された目的遺伝子の発現を、或るアミノ酸の細胞内の濃度に依存して調節する発現調節配列であって、該発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌において、前記プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度が前記アミノ酸の細胞内の濃度の上昇により低下し、それによって目的遺伝子の発現が上昇することを特徴とする、発現調節配列であって、
前記発現調節配列は、アミノ酸を含むリーダーペプチドをコードする領域及びρ非依存性ターミネーターを含み、リーダーペプチドの翻訳が、前記アミノ酸の飢餓の場合に途中において前記アミノ酸のコドンで停止したときに、該発現調節配列の転写産物においてρ非依存性ターミネーターの対合構造の形成が生じることにより、前記転写が外発現調節配列内で停止する頻度が上昇し、
前記発現調節配列はまた、アテニュエーター配列に由来し、隣接するセグメントと互いに対合構造を形成しうる５個のセグメントを含み、該発現調節配列の転写産物において、両端以外のセグメントは、その隣接する２つのセグメントのいずれか一方と対合構造を形成したときには他方のセグメントと対合構造を形成せず、上流の端の第１セグメントは、リーダーペプチドを翻訳するリボソームが相互作用する領域の前記アミノ酸のコドンと重複し、リーダーペプチドの翻訳途中においては、第１セグメントに隣接する第２セグメントが第２セグメントに隣接する第３セグメントと対合構造を形成し、第３セグメントに隣接する第４セグメントと第４セグメントに隣接する第５セグメントとが形成する対合構造がρ非依存性ターミネーターの対合構造である、発現調節配列。
【請求項２】
各々のセグメント又はその一部と、隣接するセグメント又はその一部の配列は、逆方向反復配列を構成する請求項１に記載の発現調節配列。
【請求項３】
ρ非依存性ターミネーターが、エシェリヒア属、サルモネラ属又はセラチア属の細菌で機能し得るものである請求項１又は２に記載の発現調節配列。
【請求項４】
ρ非依存性ターミネーターが、エシェリヒア属細菌で機能し得るものである請求項３に記載の発現調節配列。
【請求項５】
上流側から順に５つのセグメントａｎ１〜ａｎ５を含み、セグメントａｎ１及びａｎ２は、それぞれエシェリヒア・コリのトリプトファンオペロンのアテニュエーターｔ１及びｔ２の配列に由来し、セグメントａｎ４とａｎ５は、それぞれ、エシェリヒア・コリのヒスチジンオペロンのアテニュエーターｈ５及びｈ６の配列に由来し、セグメントａｎ３は前記トリプトファンオペロンのアテニュエーターの配列ｔ３及びヒスチジンオペロンのアテニュエーターの配列ｈ４の組み合わせに由来する請求項３又は４に記載の発現調節配列。
【請求項６】
リーダーペプチドがトリプトファンを２残基以上含むものに改変されている請求項５に記載の発現調節配列。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌を培地に培養するステップと、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸の細胞内の濃度を変化させて、前記目的遺伝子の発現を調節するステップを含む、目的遺伝子の発現調節方法。
【請求項８】
目的物質を産生する能力を有する細菌を培地中に培養し、該目的物質を生成させ、該目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法であって、該細菌が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された前記目的物質の産生に関与する遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持し、且つ、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸の細胞内の濃度が変化することにより、前記遺伝子の発現が調節されることを特徴とする製造法。
【請求項９】
前記アミノ酸の細胞内の濃度が、前記細菌による前記アミノ酸の合成または分解によって変化する請求項８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物工業に関する。より詳しくは、微生物細胞内の遺伝子発現を調節するための新規なアプローチの開発に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クローニングされた遺伝子の発現を、比較的単純かつ安価な化学物質を用いて誘導することは、細菌、特にエシェリヒア・コリの組換え体を利用する生物工学的プロセスにとって、非常に興味深いことである。天然のＬ−アミノ酸は、そのような誘導物質として可能性のある有力な候補であると思われる。しかし、本発明者らが知る限り、トリプトファナーゼ遺伝子の調節領域が、トリプトファンを培地に添加することにより誘導される自然界に存在する唯一のシステムである（Landick R., Turnbough C.L., Yanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Second Edition, F.C.Neidhardt - Editor in Chief), (1996), pp. 1263-1286）。一方、細胞内のアミノ酸量が多くなると調節される遺伝子の発現量を減少させるシステムがいくつか存在している（特に、ｔｒｐオペロンリプレッサー−オペレーター（Platt, T. "Regulation of gene expression in the tryptophan operon of Escherichia coli"/ In: "The Operon" (Miller, J.H., Reznikoff, W.S. - Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory (1978), pp. 263-302.）、アミノ酸オペロン転写減衰（Landick R., Turnbough C.L., Yanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Second Edition, F.C.Neidhardt - Editor in Chief), (1996), pp. 1263-1286））。
【０００３】
アミノ酸オペロンの転写減衰の分子メカニズムは、オペロンの最初の構造遺伝子の上流にその遺伝子が位置する「リーダー」ペプチドの翻訳に依存して、いわゆる「アテニュエーター」領域における２通りのｍＲＮＡの二次構造形成が起こり得ることに基づく。リーダーペプチド遺伝子のコード領域は、センスアミノ酸のコドン（対応するオペロンのタンパク質産物により生合成されるアミノ酸のコドン。ｔｒｐオペロンにあってはＴｒｐコドン、ｈｉｓオペロンにあってはＨｉｓコドン、ｔｈｒオペロンにあってはＴｈｒ及びＩｌｅコドン、等）に富んでいる。
【０００４】
このよく知られた転写制御の詳細を、エシェリヒア・コリのｔｒｐ、ｈｉｓ両オペロンを例として図１に示す。図１に示されるように、２通りのｍＲＮＡの二次構造形成が、それぞれ対応するＤＮＡ断片の転写において形成される。すなわち、ｔｒｐ−リーダーにおいては、ヘアピンt1:t2及びt3:t4、又はもう一方の形態であるt2:t3が形成され得る。同様に、ｈｉｓ−リーダーにおいては、h1:h2、h3:h4及びh5:h6、又はh2:h3及びh4:h5が形成され得る。ヘアピンt3:t4及びh5:h6は、典型的なρ非依存性の転写ターミネータであるために、転写の延長の間にそれらが形成されると、対応するオペロンのアテニュエーター領域で転写が終結し、オペロンの構造遺伝子の発現が妨げられる。
【０００５】
ｍＲＮＡの二次構造の形成のプロセスは、ｍＲＮＡ合成のプロセスとカプリングしており、ｔｒｐアテニュエーターの場合はリーダーペプチドが翻訳されていないときに、ヘアピンt1:t2、さらにt3:t4が段階的に形成される（ヘアピンt1:t2が先に形成されるため、もう一方のt2:t3は形成されない）。同様に、対応するリーダーペプチドの翻訳が起こらないときのｈｉｓアテニュエーターｍＲＮＡの合成の場合は、ヘアピンh1:h2、h3:h4及びh5:h6が先に形成され、もう一方のh2:h3及びh4:h5の形成は妨げられる。先に述べたように、ヘアピンt3:t4及びh5:h6の形成は、対応するアテニュエーター領域での転写終結に至る。この状態は、反応液中に転写因子を全く含まない純粋なＲＮＡポリメラーゼを用いた対応するＤＮＡのインビトロ転写において、あるいは一般的なアミノ酸飢餓におけるインビボ転写において、生じ得る。
【０００６】
リーダーペプチドの翻訳においては、さらに複雑な状態が、センスアミノ酸が過剰（より正確には、対応するアミノ酸を担ったtRNAが過剰）となったとき、あるいは細菌細胞内のセンスアミノ酸が欠乏したとき、インビボで起こり得る。アテニュエーターｍＲＮＡの転写を開始したＲＮＡポリメラーゼは、ヘアピン1:2の直下に位置する領域内のポーズ(pause)部位で停止することが示されている（恐らく、前記ヘアピンの形成は必須であるが、ポーズ部位での停止にとって十分条件ではない）（Chan, C.L., Wang, D., Landick, R. "Multiple interactions stabilize a single paused transcription intermediate in which hairpin to 3' end spacing distinguishes pause and termination pathway"/ J. Mol. Biol. 268 (1997) 54-68）。リーダーペプチドのＮ末端部分を翻訳したリボゾームはＲＮＡポリメラーゼを解放し、転写の延長が継続され、そしてｍＲＮＡのもう一方のヘアピン2:3が形成され得る。それ以降の事象はセンスアミノ酸を担ったｔＲＮＡの細胞内濃度に依存する。なぜなら、その際に、リーダーペプチド遺伝子の対応するコドンは、リボゾームにより翻訳される必要があるからである。
【０００７】
センスアミノ酸飢餓の場合は、リボゾームはセンスコドンの位置で留まり、ヘアピン2:3を破壊しない。一方、ＲＮＡポリメラーゼはｍＲＮＡの下流の断片を合成し、このｍＲＮＡは原則的にはターミネーターヘアピン（ｔｒｐアテニュエーターではt3:t4、ｈｉｓアテニュエーターではh5:h6）を形成し得るが、もう一方のヘアピン（ｔｒｐアテニュエーターではt2:t3、ｈｉｓアテニュエーターではh2:h3, h4:h5）の存在のため、ターミネーターヘアピンは折り曲げられず、続いて、転写の延長、及びオペロンの構造遺伝子群のｍＲＮＡ合成が起こる。
【０００８】
センスアミノ酸が過剰な場合は、リーダーペプチドの翻訳は高い効率で起こるため、最初にヘアピン1:2を破壊したリボゾームは、さらにヘアピン2:3も破壊する。そして、リーダーペプチドの終止コドンの位置に留まる。この場合は、最終的に、ターミネーターヘアピンが形成され、アテニュエーター領域で転写の終結が起こる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、制御された遺伝子の発現を、センスアミノ酸の細胞内濃度を上昇させることによって上昇させる、原核生物の新規な人工調節システムを創製することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明らは、リーダーペプチドの転写の効率に依存したｍＲＮＡの２通りの二次構造の形成に基づく、ネイティブの調節メカニズムを活用することによって、細胞内のアミノ酸濃度に依存した新規な人工的な調節システムの創製することに成功した。新規なシステムは、センスアミノ酸の細胞内濃度が過剰の場合、ネイティブのアミノ酸オペロンのアテニュエーターのように遺伝子発現を減少させず、増加させる。それと同時に、センスアミノ酸の飢餓条件下では、新規な発現調節配列の制御下では遺伝子発現のレベルは減少する。よく知られた転写の制御であるアミノ酸オペロンの転写減衰は、この新規なシステムの原型であるが、新規なシステムは原型とは異なり、センスアミノ酸が過剰の場合、制御された遺伝子の発現レベルを減少させず、増加させる。
【００１１】
本発明は、以下の発現調節配列並びにこれを用いる発現調節方法及び製造方法を提供する。
【００１２】
（１）下流に連結された目的遺伝子の発現を、或るアミノ酸の細胞内の濃度に依存して調節する発現調節配列であって、該発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌において、前記プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度が前記アミノ酸の細胞内の濃度の上昇により低下し、それによって目的遺伝子の発現が上昇することを特徴とする、発現調節配列。
【００１３】
（２）前記アミノ酸を含むリーダーペプチドをコードする領域及びρ非依存性ターミネーターを含み、リーダーペプチドの翻訳が、前記アミノ酸の飢餓の場合に途中において前記アミノ酸のコドンで停止したときに、該発現調節配列の転写産物においてρ非依存性ターミネーターの対合構造の形成が生じることにより、前記転写が該発現調節配列内で停止する頻度が上昇する（１）記載の発現調節配列。
【００１４】
（３）隣接するセグメントと互いに対合構造を形成し得る３以上の奇数個のセグメントを含み、該発現調節配列の転写産物において、両端以外のセグメントは、その隣接する２つのセグメントのいずれか一方と対合構造を形成したときには他方のセグメントと対合構造を形成せず、上流の端の第１セグメントは、リーダーペプチドを翻訳するリボソームが相互作用する領域と少なくとも部分的に重複し、リーダーペプチドの翻訳途中においては、第１セグメントに隣接する第２セグメントが第２セグメントに隣接する第３セグメントと対合構造を形成し、下流の端のセグメントとその隣接するセグメントとが形成する対合構造がρ非依存性ターミネーターの対合構造である（２）記載の発現調節配列。
【００１５】
（４）第１セグメントが、リーダーペプチド内の前記アミノ酸のコドンと重複する（３）記載の発現調節配列。
【００１６】
（５）前記セグメントの数が５である（３）又は（４）記載の発現調節配列。
【００１７】
（６）各々のセグメント又はその一部と、隣接するセグメント又はその一部の配列は、逆方向反復配列を構成する（３）〜（５）いずれか１項に記載の発現調節配列。
【００１８】
（７）ρ非依存性ターミネーターが、エシェリヒア属、サルモネラ属またはセラチア属の細菌で機能し得るものである（２）〜（６）のいずれか一項に記載の発現調節配列。
【００１９】
（８）ρ非依存性ターミネーターが、エシェリヒア属細菌で機能し得るものである（７）記載の発現調節配列。
【００２０】
（９）上流側から順に５つのセグメントａｎ１〜ａｎ５を含み、セグメントａｎ１及びａｎ２、ならびにリーダーペプチドの領域はエシェリヒア・コリのトリプトファンオペロンのアテニュエーターの配列に由来し、セグメントａｎ４とａｎ５はエシェリヒア・コリのヒスチジンオペロンのアテニュエーターの配列に由来し、セグメントａｎ３は前記トリプトファンオペロンのアテニュエーターの配列及びヒスチジンオペロンのアテニュエーターの配列の組み合わせに由来する（７）又は（８）記載の発現調節配列。
【００２１】
（１０）リーダーペプチドがトリプトファンを２残基以上含むものに改変されている（９）記載の発現調節配列。
【００２２】
（１１）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌を培地に培養するステップと、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸の細胞内の濃度を変化させて、前記目的遺伝子の発現を調節するステップを含む、目的遺伝子の発現調節方法。
【００２３】
（１２）目的物質を産生する能力を有する細菌を培地中に培養し、該目的物質を生成させ、該目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法であって、該細菌が、（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された前記目的物質の産生に関与する遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持し、且つ、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸の細胞内の濃度が変化することにより、前記遺伝子の発現が調節されることを特徴とする製造法。
【００２４】
（１３）前記アミノ酸の細胞内の濃度が、前記細菌による前記アミノ酸の合成または分解によって変化する（１２）記載の製造法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
＜１＞発現調節配列
本発明の発現調節配列は、下流に連結された目的遺伝子の発現を、或るアミノ酸（センスアミノ酸）の細胞内の濃度に依存して調節する発現調節配列であって、該発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌において、前記プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度が前記アミノ酸の細胞内の濃度の上昇により低下し、それによって目的遺伝子の発現が上昇することを特徴とする。
【００２６】
センスアミノ酸は、本発明の発現調節配列を用いる細菌において、そのアミノアシルtRNAが合成され、合成されたアミノアシルtRNAがタンパク質の翻訳に使用され得るものであれば特に限定されない。好ましくは、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンである。
【００２７】
目的遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)、アミノ酸オペロン、そのタンパク質産物がアミノ酸、ヌクレオシド及びヌクレオチドの生合成に関与する遺伝子、ならびに、外来タンパク質産物をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２８】
プロモーターとしては、Ｐtacならびにその他の調節的及び構成的の原核生物プロモーターが挙げられる。
【００２９】
ＤＮＡ構造体を保持する細菌としては、エシェリヒア属、サルモネラ属及びセラチア属に属する細菌が挙げられる。
【００３０】
本発明の発現調節配列、及び、ＤＮＡ構造体の構築、並びに、このＤＮＡ構造体を保持する細菌の作製は、標準的な遺伝子組換え技術（例えば、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)、特開平２−２０７７９１号公報等参照）により行うことができる。
【００３１】
プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度がセンスアミノ酸の細胞内の濃度の上昇により低下し、それによって目的遺伝子の発現が上昇することの確認も、標準的な遺伝子組換え技術により行うことができる。センスアミノ酸の細胞内の濃度は、細胞の内外のセンスアミノ酸の濃度の関係が知られている細菌であれば、細胞内の濃度を直接に測定する必要はなく、細胞外の濃度（例えば培地中の濃度）から推定してもよい。プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度も直接に測定する必要はなく、目的遺伝子の発現の上昇を測定すればよい。目的遺伝子の発現の上昇は、目的遺伝子の遺伝子産物の量や、遺伝子産物が活性を有する場合にはその活性の測定により測定できる。
【００３２】
前記プロモーターから開始される転写の該発現調節配列内で停止する頻度が前記アミノ酸の細胞内の濃度の上昇により低下し、それによって目的遺伝子の発現が上昇することの一態様としては、センスアミノ酸の細胞内の濃度が一定レベル以下にあるときには、前記プロモーターから開始される転写は該発現調節配列内で終結し、前記アミノ酸の細胞内の濃度が前記レベルよりも高いときには転写は延長され、それによって目的遺伝子の発現が生じることが挙げられる。
【００３３】
本発明の発現調節配列は、好ましくは、センスアミノ酸を含むリーダーペプチドをコードする領域及びρ非依存性ターミネーターを含み、リーダーペプチドの翻訳が、センスアミノ酸の飢餓の場合に途中においてセンスアミノ酸のコドン（センスコドン）で停止したときに、該発現調節配列の転写産物においてρ非依存性ターミネーターの対合構造の形成が生じることにより、前記転写が該発現調節配列内で停止する頻度が上昇するものである。
【００３４】
リーダーペプチドの長さは、通常には、１４〜３２残基であり、リーダーペプチドはセンスアミノ酸残基を、全アミノ酸残基の通常１４〜５７％、好ましくは３０〜４５％含む。センスアミノ酸の割合が大きいほど、センスアミノ酸の細胞内の濃度による調節が厳密になる。センスアミノ酸残基は連続している方が好ましい。
【００３５】
ρ非依存性ターミネーターは、対合構造（ヘアピン）を形成することのできる配列を有しており、その対合構造が形成されたときに転写を終結させるものである。ρ非依存性ターミネーターは、好ましくは、エシェリヒア属、サルモネラ属又はセラチア属に属する細菌で機能し得るものである。
【００３６】
リーダーペプチドの翻訳が途中においてセンスコドンで停止したときに、該発現調節配列の転写産物においてρ非依存性ターミネーターの対合構造の形成を生じさせる手段としては、該発現調節配列が、隣接するセグメントと互いに対合構造を形成し得る３以上の奇数個のセグメントを含むようにし、該発現調節配列の転写産物において、両端以外のセグメントは、その隣接する２つのセグメントのいずれか一方と対合構造を形成したときには他方のセグメントと対合構造を形成せず、上流の端の第１セグメントは、リーダーペプチドを翻訳するリボソームが相互作用する領域と少なくとも部分的に重複し、リーダーペプチドの翻訳途中においては、第１セグメントに隣接する第２セグメントが第２セグメントに隣接する第３セグメントと対合構造を形成し、下流の端のセグメントとその隣接するセグメントとが形成する対合構造がρ非依存性ターミネーターの対合構造であるようにすることが挙げられる。
【００３７】
この態様において、必要なことは、センスアミノ酸のコドンでリボソームが停止することによって、第１セグメントと第２セグメントとの間の対合構造の形成がブロックされることにある。リボソームの大きさのため、停止したセンスアミノ酸のコドンの上流約１７ｂｐから下流約１３ｂｐまでがリボソームによりカバーされる。リボソームが相互作用する領域とは、このようなリボソームによりカバーされる領域を意味する。リーダーペプチドを翻訳するリボソームが相互作用する領域と第１セグメントが少なくとも部分的に重複していれば、センスアミノ酸のコドンでリボソームが停止することによって、第１セグメントと第２セグメントとの間の対合構造の形成がブロックされるのに十分と考えられる。例えば、センスアミノ酸のコドンがリーダーペプチドの終止コドンの直前にあり、センスアミノ酸のコドンから第１セグメントの初めまでの距離が約１３ｂｐ以内であれば、第１セグメントと第２セグメントとの間の対合構造の形成がブロックされ得る。
【００３８】
第１セグメントは、リーダーペプチド内のセンスアミノ酸のコドンと重複していることが好ましい。
【００３９】
この態様においては、センスアミノ酸の飢餓で第１セグメントがリボソームによってブロックされると、第２と第３、第４と第５、・・・のセグメント間の対合構造が形成され、最後の対合構造がターミネーターとなって転写が停止する。一方、センスアミノ酸が十分に供給され、リボソームが十分な速度で転写の進行を追いかけるようにmRNA上をストップコドンまで進み、リボソームにより第２セグメントまでブロックされると、第３と第４、・・・のセグメント間の対合構造が形成され、ターミネーターの形成が阻止される。また、転写に付随した翻訳が起こらないと、第１と第２、第３と第４、・・・のセグメント間の対合構造が形成され、ターミネーターの形成が阻止される。
【００４０】
本発明の発現調節配列においては、リーダーペプチドのＣ末端領域をコードする領域又はリーダーペプチドをコードする領域の下流（好ましくは第２セグメントから第３セグメントの領域）にRNAポリメラーゼのポーズ部位があることが好ましい。ポーズ部位が無い場合には、転写に付随した翻訳が十分に起こらないときに、目的遺伝子の発現が十分に調節されないことがある。
【００４１】
セグメントの数は例えば５である。
【００４２】
各セグメントの塩基配列は、隣接するセグメントと対合構造を形成できればよい。例えば、各々のセグメント又はその一部と、隣接するセグメント又はその一部の配列が、逆方向反復配列を構成するものであればよい。逆方向反復配列を構成する配列は連続していなくてもよい。すなわち途中に対合しない部分があってもよい。また、両端を除くセグメントにおいては、隣接するセグメントの一方との逆方向反復配列を構成する部分と、隣接するセグメントの他方との逆方向反復配列を構成する部分とが少なくとも部分的に重複していればよい。
【００４３】
本発明の発現調節配列の例としては、上流側から順に５つのセグメントａｎ１〜ａｎ５を含み、セグメントａｎ１及びａｎ２、ならびにリーダーペプチドをコードする領域はエシェリヒア・コリのトリプトファンオペロンのアテニュエーターの配列に由来し、セグメントａｎ４とａｎ５はエシェリヒア・コリのヒスチジンオペロンのアテニュエーターの配列に由来し、セグメントａｎ３は前記トリプトファンオペロンのアテニュエーターの配列及びヒスチジンオペロンのアテニュエーターの配列の組み合わせに由来するものが挙げられる。
【００４４】
ここで「由来する」とは、ネイティブな配列と同じまたは類似する配列を有することを意味し、取得手段を限定するものではない。すなわち、生物材料から単離したものでも化学合成されたものでもよい。類似する配列とは、ネイティブな配列と同等の対合構造を形成でき、且つ、ネイティブな配列に、１以上の塩基の置換、欠失又は挿入がされた配列である。
【００４５】
また、上記の発現調節配列の好ましい例においては、リーダーペプチドは、トリプトファンを２残基以上含むように改変されていることが好ましい。これらのトリプトファン残基は連続していることが好ましい。
【００４６】
以下、上記の発現調節配列の好ましい例を参照して本発明を説明する。以下、説明の便宜のために、この発現調節配列を人工アンチ−アテニュエーターと呼ぶ。
【００４７】
人工アンチ−アテニュエーターの生物学的特性の概略を、図１に示す。図１に示されるように、センスアミノ酸が欠乏し、リーダーペプチドの対応するコドンの位置でリボゾームが停止した場合は、アンチ−アテニュエーターのヘアピンan2:an3が維持され、典型的なρ非依存性転写ターミネータの一部であるヘアピンan4:an5が形成される。一方、センスアミノ酸が過剰の場合、リーダーペプチドの効率的な転写がアンチ−アテニュエーターのヘアピンan2:an3の破壊を招き、別のヘアピンan3:an4が形成され、ターミネーターヘアピンであるan4:an5が形成されないため、遠位（下流）の遺伝子群の転写前の終結が妨げられる。
【００４８】
人工アンチ−アテニュエーターの構造は、エシェリヒア・コリのよく知られたｔｒｐオペロン及びｈｉｓオペロンの２つのネイティブアテニュエーターに基づいて設計されている。構造遺伝子部分に２つの調節Ｔｒｐコドンを有するネイティブのｔｒｐオペロンのリーダーペプチド遺伝子（trpL）が、人工アンチ−アテニュエーターのリーダーペプチドとして用いられている。一方、ｍＲＮＡの２通りの二次構造の形成プロセスは、対応するネイティブｈｉｓアテニュエーターの領域と同様に、人工アンチ−アテニュエーターの３’−非翻訳領域で起こる。
【００４９】
基本とする２つの天然アテニュエーター（ｔｒｐ及びｈｉｓ）のコード部分、及び３’−非翻訳領域の塩基配列を、人工アンチ−アテニュエーターの対応する領域の配列と共に、図２に示す。図２に示されるように、ネイティブのｔｒｐアテニュエーター及び人工アンチ−アテニュエーターの「＋８５」（番号はリーダーペプチドのコード部分のＡＴＧのＡを＋１として記す）までの構造は一致する。従って、細胞内のＴｒｐが過剰の場合のヘアピンan2:an3の破壊だけでなく、＋６６〜＋６７の位置でのＲＮＡポリメラーゼの一時停止（ポーズ）、及び、Ｔｒｐ飢餓の場合の、リーダーペプチドを翻訳するリボゾームによるヘアピンan1:an2の破壊を伴う転写の延長も、ネイティブｔｒｐアテニュエーターの場合と同様に人工アンチ−アテニュエーターの調節領域で起こる。一方、人工アンチ−アテニュエーターの遠位部分は、第二の原型として用いたｈｉｓアテニュエーターの対応する領域とは少し異なる。
【００５０】
最小の改変は、ターミネーターヘアピンan4:an5の形成が可能な領域で行われている。それにもかかわらず、ネイティブのｈｉｓアテニュエーターと同様に、人工アンチ−アテニュエーターにおいて別のヘアピンan3:an4の形成が可能であり（この領域の二次構造はネイティブのｈｉｓアテニュエーターのh4:h5と相同性がある）、このヘアピンの形成は人工アンチ−アテニュエーターにおける転写の終結を妨げる。ネイティブのｈｉｓアテニュエーターと比較すると、人工アンチ−アテニュエーター中には、ヘアピンh3:h4を形成するＤＮＡ断片は存在せず、それにより生物学的特性の変化がもたらされる。すなわち、ρ非依存性転写ターミネーターの形成は、センスアミノ酸の細胞内濃度の上昇の場合ではなく、飢餓の場合に起こる。
【００５１】
以下、人工アンチ−アテニュエーターの特性を確認した結果を示す。
【００５２】
人工アンチ−アテニュエーターは、図３及び４に概略を示したように、標準的な遺伝子組換え技術（ネイティブtrpアテニュエーター断片のPCRによる増幅、オリゴヌクレオチドの化学合成等を含む）を用いて合成した。なお、２種類の異なるタイプの人工アンチ−アテニュエーターを取得した。第一のタイプ（アンチ−アテニュエーターＩ）では、ｔｒｐＬのネイティブのリボゾーム結合部位（RBS）をリーダーペプチドの転写開始のために用いた。第二のタイプ（人工アンチ−アテニュエーターII）では、より効率のよいＴ７ファージの遺伝子10のRBSを、リーダーペプチド遺伝子の５’−領域に挿入した。それぞれの人工アンチ−アテニュエーターは、ベクタープラスミドの高効率プロモーターPtacの下流、かつ、cat遺伝子自体のRBSを含むcat遺伝子の上流にクローン化された。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするcat遺伝子は、リポーターとして用いられ、その発現レベルから、細胞内のセンスアミノ酸（Ｔｒｐ）濃度に依存する調節因子の機能の効率に関する情報が得られる。
【００５３】
さらに、同じベクターを用いて、対照となるいくつかの組換えプラスミドを構築した。第一のプラスミドは、ネイティブのｔｒｐオペロン−ｔｒｐＬのアテニュエーターを保持する。第二のプラスミドは、潜在的な転写ターミネータである、ターミネータヘアピンan4:an5を形成するアンチ−アテニュエーターの３’末端ＤＮＡ断片を保持する。第三のプラスミドは、より長いアンチ−アテニュエーターの３’末端ＤＮＡ断片を保持する。このＤＮＡ断片は、mRNA合成において潜在的な別のヘアピンan3:an4が先に形成されるために、ターミネータヘアピンan4:an5の形成をもたらさない。
【００５４】
文献によれば、エシェリヒア・コリｔｒｐオペロンのネイティブｔｒｐＬは、他のアミノ酸オペロンのアテニュエーターと異なり、いくらか弱いアテニュエーターである（「培地中のTrpの有無は、通常にはtrpアテニュエーターのリードスルーに影響しない。リードスルーにおける１０倍の変化は、変異型細菌における極端なTrp飢餓においてか、または、Trp含有培地からTrp非含有培地に移したときに一時的に生じるだけである」[Landick R., Turnbough C.L., Yanofsky C. "Transcription attenuation"/ In: "Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology" (Second Edition, F. C. Neidhardt - Editor in Chief), (1996), p. 1263-1286]）。これはおそらくリーダーペプチドの構造遺伝子部分にセンスアミノ酸のコドンが二つ連続してあるだけのためと考えられる。人工アンチ−アテニュエーターとｔｒｐＬのリーダーペプチドのコード部分は同一であるから、新規システムの調節特性の試験には、特別なモデル系を用いる必要がある。リポーターであるCATの酵素活性の測定は、被検対照の組換えプラスミドを保持し、必要に応じてＴｒｐ飢餓状態の後にＴｒｐを添加した培地で生育させたｔｒｐ-細胞で行った。結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
0004352650.tif 000002
【００５６】
表１から明らかなように、CAT活性のレベルは、ｔｒｐＬのコード部分を含まないプラスミドを保持する細胞へのＴｒｐの添加に依存しない。さらに、ｍＲＮＡの２通りの二次構造形成のプロセスに依存して得られるCAT活性レベルの理論的な差異は、「ターミネータ」及び「アンチターミネータ」ヘアピンをコードする対照プラスミドで得られた結果に基づいて評価することができる。アンチターミネータ構造が形成された場合、人工アンチ−アテニュエーターの３’部分におけるρ非依存性転写終結に比べて、２０倍高い転写が起こり得る。
【００５７】
予想されたように、測定されたCAT活性レベルは、ネイティブｔｒｐアテニュエーターを含むプラスミドを用いた場合に高く、Ｔｒｐ飢餓の場合は、プラスミド保持細菌へＴｒｐを添加した後よりも、レベルは上昇した。具体的にはCAT活性は17ユニットであり、最大レベル（60ユニット）には及ばなかった。これは、第一には、細菌の生育中のＴｒｐ飢餓によっては、ｔｒｐＬのリードスルー転写の最大効率は保証されないことによる。第二に、cat遺伝子自体のRBSの直ぐ上流に位置するcat遺伝子の５’非翻訳領域は、ネイティブtrpLを用いた場合と他の被検構築物を用いた場合では異なり、従って、CATの転写開始の効率が異なるからである。
【００５８】
目的の結果は、人工アンチ−アテニュエーターを含むプラスミドで得られた。表１からわかるように、どちらのプラスミドを保持する菌株においても、プラスミド保持細菌にＴｒｐを添加した後は、CAT活性の上昇が見られた。さらに、ファージT7遺伝子10の高効率RBSをリーダーペプチドの翻訳開始のために用いた場合、CAT蓄積のレベルは理論的最大値に匹敵した（60ユニットに対して51ユニット）。後者は、かなり強力なプロモーターPtac（ｔｒｐオペロンのネイティブプロモーターよりも強い）からの人工アンチ−アテニュエーターの転写の場合、ｍＲＮＡの２通りの二次構造形成の分子機構の実現に必要な転写と翻訳の完全な共役（典型的には原核細胞アミノ酸オペロンにおけるネイティブアテニュエーション転写）には、リーダーペプチドのRBSの改良が必要であるという事実によって説明される。
【００５９】
上記で得られた結果に基づいて、以下の結論が得られる。
１．２通りのｍＲＮＡの二次構造形成のプロセスは、転写の調節に利用することができる。人工「ｈｉｓ様」末端構造を利用することによって、発現レベルは２０倍異なる。
【００６０】
２．得られた人工「アンチ−アテニュエーター」システムは機能的に活性である。
2.1.  ネイティブｔｒｐリーダーペプチドのコード部分は、細胞内のＴｒｐ濃度に依存して、mRNAの二次構造の折り畳みのプロセスを促進する。
2.2.  Ｔｒｐ過剰における最良の「アクチベータ」効果は、最適化したリーダーペプチドの翻訳開始（trpLのネイティブRBSの代わりにT7ファージのS10 RBSを用いる）と組み合わせて、転写にPtacプロモーターを用いた場合に見られる。
【００６１】
３．開発されたシステムは、より効率的に誘導可能な調節要素を構築する基礎として用いられるものであると考えられる。このシステムは、アンチ−アテニュエーター領域のリーダーペプチド部分の構造遺伝子部分にあるセンスアミノ酸（Ｔｒｐ）のコドンの数を増加させ、培地に過剰量のＴｒｐを添加することによって、より効率的に誘導され得る。
【００６２】
＜２＞目的遺伝子の発現調節方法
本発明の発現調節方法は、本発明の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された目的遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持する細菌を培地に培養するステップと、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸（センスアミノ酸）の細胞内の濃度を変化させて、前記目的遺伝子の発現を調節するステップを含む、目的遺伝子の発現調節方法である。
【００６３】
ＤＮＡ構造体及びそれを保持する細菌は、発現調節配列に関して説明した通りでよい。
【００６４】
培養の条件は、細菌が生存できる条件であれば特に制限されず、細菌に合わせて適宜選択される。
【００６５】
センスアミノ酸の細胞内の濃度を変化させる方法としては、細菌を培養する培地中のセンスアミノ酸濃度を変化させる方法、細胞内におけるセンスアミノ酸の合成量又は分解量を変化させる方法などが挙げられる。目的遺伝子の発現の変化は、遺伝子産物の量や、遺伝子産物が活性を有する場合にはその活性レベルの測定により測定できる。
【００６６】
＜３＞目的物質の製造法
本発明の製造法は、さらに、目的物質を産生する能力を有する細菌を培地中に培養し、該目的物質を生成させ、該目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法であって、該細菌が、本発明の発現調節配列、該発現調節配列の上流に連結されたプロモーター、及び、該発現調節配列の下流に連結された前記目的物質の産生に関与する遺伝子を含むＤＮＡ構造体を保持し、且つ、該発現調節配列による発現の調節が依存するアミノ酸（センスアミノ酸）の細胞内の濃度が変化することにより、前記遺伝子の発現が調節されることを特徴とする製造法である。
【００６７】
目的物質としては、CATその他の原核生物酵素、外来タンパク質産物、アミノ酸、ヌクレオシド及びヌクレオチド、ビタミン、ならびにその他の生物活性物質が挙げられる。
【００６８】
目的物質を産生する能力を有する細菌としては、エシェリヒア属、サルモネラ属及びセラチア属に属する細菌が挙げられる。
【００６９】
培養の条件は、目的物質を産生する能力を有する細菌が目的物質を産生できる条件であれば特に制限されず、細菌に合わせて適宜選択される。
【００７０】
通常には、好気的条件下で１０〜１５時間実施し、培養温度は２８〜３７℃に、培養中ｐＨは６．６〜７．４に制御する。尚、ｐＨ調整には無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００７１】
培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。
【００７２】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、シュークロースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００７３】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００７４】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００７５】
菌体や培養液などの培養物からの目的物質の採取は、通常には、イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００７６】
ＤＮＡ構造体は、目的遺伝子として、目的物質の産生に関与する遺伝子を用いることの他は、発現調節配列に関して説明した通りでよい。目的物質の産生に関与する遺伝子としては、目的物質の生合成遺伝子、目的物質の生合成に使われる中間体等の関連物質及びエネルギーの産生遺伝子、それらの調節遺伝子等が挙げられ、具体的には、Ｌ−トリプトファン生合成遺伝子、Ｌ−セリン生合成遺伝子（特には、Ｌ−トリプトファン生合成に用いる）、putAB遺伝子、H+-ATPase遺伝子が挙げられる。
【００７７】
特に、Ｌ−トリプトファンの生産菌において、センスアミノ酸をＬ−トリプトファンとして、かつ、目的遺伝子をＬ−セリン生合成系の遺伝子として当該遺伝子を本発明の発現調節配列の下流に連結する場合には、Ｌ−トリプトファンの細胞内蓄積量が増加に向かうときにＬ−セリン生合成系の遺伝子の発現が上昇することになる。Ｌ−トリプトファンの細胞内蓄積量が増加に向かうときとは、Ｌ−トリプトファンの生合成の基質の一つであるＬ−セリンが不足に向かうときでもあるので、Ｌ−セリンが不足に向かうときに限ってＬ−セリン生合成系の遺伝子の発現を上昇させることができる。一方、Ｌ−トリプトファンの生産菌において、Ｌ−セリン生合成系の遺伝子を常時高発現にすることはできない。高濃度のＬ−セリンは細胞の生育にとって有害であるためである。従って、Ｌ−トリプトファンの生産菌においてＬ−セリン生合成系の遺伝子の発現を上昇させたい場合に、本発明の発現調節配列は非常に有効であることが理解できる。
【００７８】
上記ＤＮＡ構造体を保持し、目的物質を産生する能力を有する細菌は、目的物質を産生する能力を有する細菌に、上記ＤＮＡ構造体を保持させてもよいし、上記ＤＮＡ構造体を保持する細菌に、目的物質を産生する能力を付与してもよい。上記ＤＮＡ構造体を保持させることは、標準的な遺伝子組換え技術により行うことができる。また、目的物質を産生する能力の付与は、公知の方法により行うことができる。例えば、目的物質がCATの場合には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入する方法が挙げられる。
【００７９】
センスアミノ酸の細胞内の濃度を変化させる方法としては、細菌を培養する培地中のセンスアミノ酸濃度を変化させる方法、細胞内におけるセンスアミノ酸の合成量又は分解量を変化させる方法などが挙げられる。細胞内におけるセンスアミノ酸の合成量又は分解量を変化させる方法は、目的物質の製造を、目的物質製造の中間体等の製造と連携させることができる点で好ましい。目的遺伝子の発現の変化は、遺伝子産物の量や、遺伝子産物が活性を有する場合にはその活性レベルの測定により測定できる。
【００８０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００８１】
【実施例１】
ネイティブアテニュエーター、人工アンチアテニュエーター及びそれらの断片を保持する組換えプラスミドの構築
1. ベクタープラスミドpML-Ptac-ter_thrL-catの構築
ColE1様レプリコン、選択マーカーとしてのApR遺伝子、tacプロモーター （Ptac）(Russel D.R., Bennett G., Gene 20 (1982) 231)、E. coliのthrオペロンのリーダーペプチドの合成ρ非依存性転写ターミネーター（ter_thrL）、及び、Ptacの下流のcat遺伝子の構造遺伝子部分を保持するプラスミドベクターpML-Ptac-ter_thrL-catを以下の様にして構築した。その後の実験では、Ptacから転写される遺伝子catをレポーターとして用いた。
【００８２】
1.1.  pML-pp-vectorの構築
pML-pp-vectorの構築のための前駆体として二つのプラスミドを用いた。第１のプラスミドは、プラスミドpML24(Trukhan et al., Biotechnologiya (in Russian) 4, No. 3 (1988) 325-334)であった。第２のプラスミドは、市販(MBI "Fermentas", Lithuania)のベクターpUC57(GenBank/EMBL アクセッション番号Y14837)であった。標準的な遺伝子操作技術 (Sambrook et al., "Molecular cloning. Laboratory manual".(1989) Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)に基づいて行ったpML-pp-vectorの構築のスキームを図４に示す。
【００８３】
1.2. プラスミドpML-pp-vectorへの化学的に合成したter_thrLの挿入
E. coliのthrオペロンリーダーペプチドの合成ρ非依存性転写ターミネーターを、下記の二つの化学合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより構築した。
【００８４】
I - 5'-ctagaaagcttaacacagaaaaaagcccgcacctgacagtgcgggctttttttttcgaccactgcagga-3'（配列番号４）
II - 5'-gatccctgcagtggtcgaaaaaaaaagcccgcactgtcaggtgcgggcttttttctgtgttaagcttta-3'（配列番号５）
【００８５】
化学合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより、XbaI及びBamHI処理により得られるような一本鎖の付着末端を有する二本鎖DNAフラグメントが構築される。
【００８６】
このフラグメントをT4ポリヌクレオチドキナーゼで常法によりリン酸化し、XbaI及びBamHIで切断したプラスミドpML-pp-vectorにクローニングした。制限酵素分析及び挿入フラグメントのDNA配列決定により目的プラスミドの構造を確認した。
【００８７】
1.3. Ptacの分子クローニング
ハイブリッドプロモーターPtacの分子クローニングのためにPCRによるDNA増幅を行った。下記の二つのオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。
【００８８】
III - 5'-gcttaggtaccctccccatccccctgttgaca-3'（配列番号６）
IV - 5'-ctgtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgca-3'（配列番号７）
【００８９】
また、Ptacプロモーターを保持する市販のプラスミドpDR540(Pharmacia, Sweden)をPCRの鋳型として用いた。
【００９０】
これらのオリゴヌクレオチドは、図６に示すようにプロモーターの上流(III)及び下流(IV)の配列を有する。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは、分子クローニングの便宜のために、制限酵素（KpnI及びXbaI）により認識される配列を有する（図６）。
【００９１】
増幅したDNA断片をKpnI及びXbaIで処理した後、同じ制限酵素で切断した、上記1.2で得たベクタープラスミドにクローニングした。選択された組換えプラスミドをpML-Ptac→ter_thrL→catと名付けた。
【００９２】
2. ネイティブ及び人工の転写転写調節要素を有するプラスミドの構築
上記のプラスミドpML-Ptac→ter_thrL→catを、全ての目的のプラスミドの作成のためにベクターとして使用した。さらに、下記の一群のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。
【００９３】
olig1: 5'-cagagctctagaagttcacgtaaaaagggtatcgac-3'（配列番号８）
olig2: 5'-gtatcgcatatgaaagcaattttcgtactgaaagg-3'（配列番号９）
olig3: 5'-gtctgagatctagtatctgattgctttacgcatggtg-3'（配列番号１０）
olig4: 5'-atcataggatcctaattttgttcaaaaaaaagcccgctcatt-3'（配列番号１１）
olig5: 5'-cgactgtctagaacggtacagaaagcccccggcagat-3'（配列番号１２）
cat3': 5'-agctcaccgtctttcattgccatacgg-3'（配列番号１３）
cr5': 5'- acatgcggtaccgatcccgcgaaattaatacg-3'（配列番号１４）
【００９４】
これらのオリゴヌクレオチドは、下記のPCRによるDNA増幅のためのプライマーとして使用した。下記の他の群のオリゴヌクレオチドを、新規な人工アンチアテニュエーターの3'末端部分の再構築の工程（下記参照）に直接使用した。
【００９５】
olig6: 5'-cagagctctagaagatctgcccgactgcgtacaacggtacagaaagcccccggcagatcacctgc-3'（配列番号１５）
olig7: 5'-cgggggcttttttattgcgcggttgataacgggatccagcgta-3'（配列番号１６）
olig8: 5'-tacgctggatcccgttatcaaccgcgcaataaaaaagcccccggcaggtgatctgccgggggctt-3'（配列番号１７）
olig9: 5'-tctgtaccgttgtacgcagtcgggcagatcttctagagctctg-3'（配列番号１８）
【００９６】
2.1. プラスミドpML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-catの構築
このプラスミドは、pML-Ptac→ter_thrL→catを基に、プロモーターとcat遺伝子の構造部分との間のter_thrLの代わりに、化学的に合成したオリゴヌクレオチド（olig6, olig7, olig8及びolig9）から作成された二本鎖DNAフラグメントの挿入によって構築した（図７）。このために、先ず650 ngのolig7及び650 ngのolig9をT4ポリヌクレオチドキナーゼ("MBI Fermentas", Lithuania)により推奨のプロトコルに従ってリン酸化し、30μlの"Y+/Tango"緩衝液("MBI Fermentas", Lithuania)中の430 ngのolig6及び650 ngのリン酸化olig9と、430 ngのolig8及び650 ngのリン酸化olig7の二つの混合物を100℃に５分間加熱し、次いで75℃で５分間アニールさせた。次いで、5ユニットのT4 DNAリガーゼ("MBI Fermentas", Lithuania)及び0.5μM ATPを加え、22℃で４時間インキュベートし、４℃で一晩インキュベートした。混合物を68℃で10分間加熱し、ゲル電気泳動に付した。Low-Melting-Point Agarose法により、明確なＤＮＡバンドが単離された。得られた二本鎖DNA断片(長さ108 bp)を、XbaI("MBI Fermentas", Lithuania)で、製造者の推奨するように処理した。360 ngのこのフラグメントを、E. coli(dam-)株から調製され、XbaIで切断した50 ngのベクターpML-Ptac→ter_thrL→catに連結した。全ての場合において、ベクタープラスミドpML-Ptac→ter_thrL→cat及びそれに基づいて得られた組換えプラスミドを制限酵素XbaIにより切断しなければならないときには、これらのプラスミド中のXbaI制限部位は、DamによるDNA修飾の標的であるGATC配列と重複するため、プラスミドDNAは、E. coli (dam-)株から調製しなくてはならない。E. coli (dam+)株から精製されたプラスミドDNAはXbaIで切断できない。連結は、3ユニットのT4 DNAリガーゼで４℃において一晩行った。得られた混合物をBamHI("MBI Fermentas", Lithuania)で標準プロトコルに従って処理した。最終工程で、このDNA混合物を60μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液中に希釈し、5ユニットのT4 DNAリガーゼで一晩４℃において処理した。得られた混合物でHB101株を形質転換し、所望の構築物に関してコロニーをスクリーニングした。この様にしてプラスミドpML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-catを得た。その構造は、制限分析及びSangerの標準的な方法によるDNA配列決定により確認した。得られたプラスミドは、翻訳されたときにアンチターミネーターヘアピンan3:an4を形成するDNAフラグメントを有すると考えられる（ターミネーターヘアピンan4:an5は、an3:an4が先に合成されるので形成されない）。
【００９７】
2.2.プラスミドpML-Ptac-an4:an5-catの構築
上記のプラスミドpML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-catは、次の組換えDNAの構築のための前駆体とした。このプラスミドを、新規調節領域の最終(an4:an5)ヘアピンをコードするフラグメントのPCRによるDNA増幅のテンプレートとした。このPCRのために、olig5及びcat3'をプライマーとして用いた（図７）。Olig5は、ヘアピンan4:an5をコードする先にクローニングされたフラグメントの部分の最初に相当し、さらに、5'末端の近くにXbaIによる認識されるヌクレオチドを有していた（図７）。後cat3'は、cat遺伝子のコード部分の断片（catのATG開始コドンのAを+1としたとき、+219〜+245位）に相当する（図７）。PCRにより得られた二本鎖DNAを、XbaIで処理し、同制限酵素で切断したベクタープラスミドpML-Ptac→ter_thrL→catと連結した。次いで、BamHIで処理し、生成物をT4 DNAリガーゼで再環状化した。この様にして、pML-Ptac-an4:an5-catと名付けた目的のプラスミドが得られた。
【００９８】
2.3. プラスミドpML-Ptac-trpL-catの構築
Ptacプロモーターの転写調節下にE. coli trpオペロンリーダーペプチドのネイティブな遺伝子（trpL遺伝子）を保持するプラスミドの構築のために、全ゲノム配列が決定されているE. coli MG1655株由来の染色体DNAをPCRのテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドolig1及びolig4は、trpL遺伝子の5'-及び3'-末端部分に相当しており（図８）、DNA増幅のプライマーとして使用された。図８から明らかなように、これらのプライマーはさらに、次の操作の便宜のために、隣接する（olig1及びolig4においてそれぞれ）XbaI及びBamHI認識部位を有する。長さ175 bpの二本鎖DNA断片をXbaI及びBamHIで処理し、同制限酵素で切断したベクタープラスミドpML-Ptac→ter_thrL→catにクローニングした。ベクタープラスミドにおいて、ter_thrLの代わりにネイティブのtrpL遺伝子を有する、得られたプラスミドをpML-Ptac-trpL-catと名付けた。
【００９９】
2.4.プラスミドpML-Ptac-anti_att-I-catの構築
上記のプラスミドpML-Ptac-trpL-catを、次の組換えDNAの作成のためのPCRにおいてテンプレートとして使用した。この操作においては、上述のオリゴヌクレオチドolig1及びolig3をプライマーとして使用した。Olig3はネイティブなtrpL遺伝子の中央部分に相当し、さらに、その5'末端にBglII認識部位を有する（図８）。PCRによるDNA増幅後、得られた長さ133 bpの二本鎖フラグメントをXbaIで処理し、同制限酵素で切断したプラスミドpML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-catと連結した。次いで、生成物をBglIIで加水分解し、T4 DNAリガーゼで再環状化した。Ptacプロモーターとcat遺伝子の構造部分との間に人工アンチアテニュエーターを有する得られたプラスミドをpML-Ptac-anti_att-I-catと名付けた。
【０１００】
2.5. プラスミドpML-Ptac-anti_att-II-catの構築
E. coli trpオペロンのネイティブなリーダーペプチドのコード部分の上流にファージT7遺伝子10の高効率リボゾーム結合部位(RBS)を有する人工アンチアテニュエーターを有する組換えプラスミドの構築を以下の様に行った。先ず、二本鎖DNAフラグメントを、olig2及びolig3をプライマーとし、プラスミドpML-Ptac-trpL-catのDNAを鋳型として用いるPCRにより得た（図８）。これにより、NdeIの制限部位が、リーダーペプチドのATG開始コドンの上流に再構築された（ATGコドンのヌクレオチドは、NdeIにより認識される配列CATATGの一部である）。得られたDNAフラグメントをNdeIで切断し、NdeIで処理した市販のベクタープラスミドpET-22b(+) ("Novagen", USA)と連結した。プラスミドpET-22b(+)は、XbaIとNdeIの制限部位の間にT7 遺伝子10のRBSを有する。この連結産物を、構築の次の工程においてPCRの鋳型として用いた。新規オリゴヌクレオチドcr5'（図９）及び上記olig3をこのPCRのプライマーとして用いた。得られた長さ210 bpの二本鎖DNAフラグメントを、XbaI及びBglIIで処理し、pML-Ptac-anti_att-I-catの構築において確立されたプロトコルに従ってプラスミドpML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-catにクローニングした。この様にして、pML-Ptac-anti_att-II-catと名付けた、trpリーダーペプチド遺伝子の5'-非翻訳領域にファージT7遺伝子10のRBSを有する人工アンチアテニュエーターを有する新規プラスミドが得られた。人工転写調節要素を有する全てのプラスミドの構造は、制限分析及び標準のSangarの方法による配列決定により確認した。
【０１０１】
【実施例２】
ネイティブtrpL、人工アンチアテニュエーター及びそれらの断片を含む組換えプラスミドを保持する株におけるCatタンパク質の蓄積量の検出
前記（実施例１参照）のプラスミドpML-Ptac-an4:an5-cat、pML-Ptac-an3:an4(an4:an5)-cat、pML-Ptac-trpL-cat、pML-Ptac-anti_att-I-cat及びpML-Ptac-anti_att-II-catを、E. coli TG1株（supE, hsd, thi, D(lac-proAB), F'[traD36, proAB+, lacIQ, lacZΔM15]）及びE. coli B7248株（trpB-:Tn10, StrR）に、アンピシリン（100μg/ml）を添加した培地でのプラスミド保持細胞の選択を含む標準的な実験プロトコール（Sambrook et al., "Molecular cloning. Laboratory manual".(1989) Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って導入した。得られた細胞培養物を、液体培地を入れた試験管で、十分に通気して３７℃にて培養した。培地は、TG1に由来するプラスミド保持株については、アンピシリンを添加したＬ培地を、E. coli B7248を基に構築された株については、アンピシリン（100μg/ml）、チアミン（5μg/ml）及びトリプトファン（10μg/ml）を添加した最少M9培地を用いた。B7248由来一晩培養物を同じ培地で５０倍に希釈し、培養を600 nmの光学密度が１（OD600=1）になるまで続けた。各培養物を二つに分け、その一方にトリプトファン（200μg/ml）を加えた。培養を１時間続けた後、菌体を遠心分離により回収し、生理的食塩水で洗浄し、初期容量の10分の１の容量のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理し、４℃で破片を遠心分離により回収した。上清のタンパク質濃度を、Bio-RadクマシーR250試薬を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性は、従来の方法（Schottel JL, Sninsky JJ, Cohen SN "Effects of alterations in the translation control region on bacterial gene expression: use of cat gene constructs transcribed from the lac promoter as a model system." Gene, 28 (1984) 177-193）により測定した。これらの実験において、5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)すなわちエルマン試薬(Sigma)を特異的試薬として用いた。得られた結果を上記の表１に示す。
【０１０２】
SDS-PAGE（0.1%SDS-12.5%PAAG電気泳動）を、E. coli TG1由来プラスミド保持株において蓄積されたCATを可視化するために行った。各株を上記のようにして培養した。各培養物を二つに分けた。培養物にIPTG（最終濃度で0.4 mMまで）を加え、２時間培養した。菌体を回収し、SDSサンプルローディングバッファー（60 mM Tris-HCl pH6.8/2.3% SDS/10% グリセロール/5% β-メルカプトエタノール）に再懸濁し、15分間沸騰させた。得られた懸濁液の10〜20μlをサンプルとして、PAAGにロードし、電気泳動をLaemmliにより記載された方法（Laemmli V.K.// "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature 227 (1970) 680-685）に従って行った。ゲルを分離されたタンパク質を検出するためにクマシーブルーで染色した。得られたゲルのパターンを図３に示す。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明によれば、制御された遺伝子の発現を、センスアミノ酸の細胞内濃度を上昇させることによって上昇させる発現調節配列が提供される。本発明の発現調節方法によれば、センスアミノ酸の細胞内の濃度を上昇させることにより、目的遺伝子の発現を上昇することができる。本発明の製造方法によれば、センスアミノ酸の細胞内の濃度を上昇させることにより目的物質の製造量を上昇させることができ、これにより目的物質の製造を効率よく行うことができる。
【０１０４】
【配列表】
0004352650.tif 000003
0004352650.tif 000004
0004352650.tif 000005
0004352650.tif 000006
0004352650.tif 000007
0004352650.tif 000008
0004352650.tif 000009
0004352650.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】  ネイティブアテニュエーター及び本発明の発現調節配列（人工アンチ−アテニュエーター）の構造及び機能の説明図である。
【図２】  ネイティブアテニュエーター及び人工アンチ−アテニュエーターの詳細な構造を示す。Ａ及びＢは、それぞれ、リーダーペプチド中のセンスコドンで停止している（Ａ）及びストップコドンで終結している（Ｂ）リボゾームによりブロックされているmRNAの部分の推定「下流」境界を示す。Ｃは、E. coli RNAポリメラーゼによるDNA転写のポーズ部位を示す。
【図３】  人工アンチ−アテニュエーターの構築の概略的スキームを示す。○中に×の印は、ネイティブ配列と比較したときのヌクレオチドの変化箇所を示す。BI: BamHI, Bg: BglII, NI: NdeI, XI; XbaI, XI*; XbaI(dam-)。
【図４】  図３に示す構築に用いるプライマーolig1〜olig9の配置、及び、図３に示す構築に用いるクローニング用ベクターVの構造を示す。
【図５】  実施例１におけるプラスミドの構築のスキームを示す。
【図６】  プラスミドpDR540由来のPtacプロモーターの構造を示す。網掛けされた部分は、PCRのための上流(III)及び下流(IV)のプライマーの配列を示す。
【図７】  化学的に合成されたan3:an4(an4:an5)断片の構造及びその断片のクローニングベクターへの挿入の方法を示す。
【図８】  E. coliのtrpオペロンのネイティブなアテニュエータ領域の構造を示す。太文字の斜体はリーダーペプチドを示す。
【図９】  バクテリオファージT7の遺伝子10(gene 10)のRBSとtrpオペロンのリーダー領域との融合体を含む中間構築物の構造を示す。太文字の斜体はリーダーペプチドを示す。
【図１】
0004352650.tif 000011
【図２】
0004352650.tif 000012
【図３】
0004352650.tif 000013
【図４】
0004352650.tif 000014
【図５】
0004352650.tif 000015
【図６】
0004352650.tif 000016
【図７】
0004352650.tif 000017
【図８】
0004352650.tif 000018
【図９】
0004352650.tif 000019