(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）Ｍ２−４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５）を培養して得られる蛋白質分解活性を示す酵素液であって、ｐＨ７における６０〜６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１００％の残存活性を示す高耐熱性ペプチダーゼ活性を備えることを特徴とする酵素液。
【請求項２】
前記高耐熱性ペプチダーゼ活性が高耐熱性アミノペプチダーゼ活性であることを特徴とする請求項１に記載の酵素液。
【請求項３】
前記酵素液が更にプロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性とを併せ備えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の酵素液。
【請求項４】
前記酵素液が、下記１）〜４）の少なくとも１の特性を示すことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の酵素液。
１）蛋白質のペプチド鎖における少なくとも１０種類以上のアミノ酸の結合部位を切断するペプチド分解部位特異性を示す。
２）酸カゼイン１ｇ当たりプロテアーゼ活性で２００単位の前記酵素液を添加して１７時間の分解を行うことにより、分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸を前記酸カゼインに対して５０重量％以上生成すると言う蛋白質低分子化能力を示す。
３）上記２）の蛋白質低分子化能力が、４５°Ｃ及び６０°Ｃの温度条件での分解において同等に発現される。
４）大豆の難分解性蛋白質に対して、所定の作用条件において５０％以上の可溶化率を示す。
【請求項５】
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）Ｍ２−４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５）を培養し、培養物から請求項１〜請求項４のいずれかに記載の酵素液を取得することを特徴とする酵素液の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の酵素液の製造方法により得られた酵素液から酵素蛋白質を分離して得られることを特徴とする酵素剤。
【請求項７】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の酵素液あるいは請求項６に記載の酵素剤を有効成分として含み、難分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製造，チーズの製造のいずれかの用途に用いることを特徴とする蛋白質分解酵素剤。
【請求項８】
バチルス・ズブチリスＭ２−４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５）であることを特徴とする蛋白質分解酵素生産菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規に得られた酵素液とその製造方法、酵素液から得られる酵素剤、これらの酵素液あるいは酵素剤を有効成分として含む蛋白質分解酵素剤、及び蛋白質分解酵素生産菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種の蛋白質をペプチドあるいはアミノ酸に分解する技術は、例えば医療用の経腸栄養剤や食品素材としての栄養補給剤の調製，大豆蛋白等に含まれる難分解性蛋白質の分解効率を高めることによる食品利用効率の向上，原料蛋白質からのアミノ酸調味料の製造，ふくらみの増強されたパンの製造等、極めて多様な産業分野において広範囲に利用されている。
【０００３】
蛋白質を分解するに当たり、塩酸等を用いる化学的分解方法は、効率が良いとは言え、分解条件が過酷であるために好ましくない副産物を生成する懸念もあり、特に食品，調味料や栄養素材等の人体に関連する産業分野においては、蛋白質をマイルドな条件で分解できる酵素分解方法が好ましく利用されている（例えば特公平７−５３１０６号公報，特開平１１−７５７６５号公報等）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで従来、このような目的で工業的に利用する蛋白質分解酵素は、主として各種の細菌やカビを利用して生産しているが、一般的に、細菌から取得された蛋白質分解酵素とカビから取得された蛋白質分解酵素とは互いに一長一短があると言われており、工業的に利用する蛋白質分解酵素として充分に満足できる活性や安定性を備えた蛋白質分解酵素は必ずしも得られていない。
【０００５】
即ち、細菌由来の蛋白質分解酵素は通常、耐熱性に優れるが、蛋白質をアミノ酸にまで分解するペプチダーゼ活性もしくは蛋白質低分子化能力が低い点が指摘されている。従って、その分解生成物には高分子量のペプチドが多く含まれることとなり、食品素材や調味料等として苦味が強かったり、栄養素材としては腸からの吸収速度が遅い等と言う不具合がある。又、細菌由来の蛋白質分解酵素が耐熱性に優れるとは言え、例えば６０°Ｃ程度の高温度域でペプチダーゼ活性を維持する高耐熱性のものは殆ど報告されていない。
【０００６】
一方、カビ由来の蛋白質分解酵素は通常、ペプチダーゼ活性，ペプチド結合に対する分解特異性の広さ，蛋白質の低分子化能力等の面で優れているが、耐熱性（例えば、５０°Ｃもしくはそれ以上の中〜高温度域での蛋白質分解能力）が劣るために、比較的低温度域で蛋白質分解工程を行うことを余儀無くされて、雑菌の繁殖を許し易かった。
【０００７】
このように、従来、中〜高温度以上の温度域で失活しない熱安定性と、優れた蛋白質低分子化能力とを併せ持つ蛋白質分解酵素が提供されていなかった。
【０００８】
更に、蛋白質原料として有力な大豆等には難分解性蛋白質が含まれており、これを有効に分解するためには蛋白質のペプチド結合に対する分解特異性の広さがキー・ポイントになると考えられるが、上記のような熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを備えたもとで、かかる難分解性蛋白質に対して有効な分解能力を示すものが提供されていなかった。
【０００９】
そこで本発明は、中〜高温度以上の温度域での熱安定性と優れた蛋白質低分子化能力とを併せ持ち、更に好ましくは難分解性蛋白質を有効に分解することができる酵素的な蛋白質分解手段を提供することを、解決すべき課題とする。
【００１０】
本願発明者は、モンゴル地方の伝統食品である「饅頭（マントウ）」の生地より分離したバチルス属の細菌を培養して得られる酵素液が、このような酵素活性を示すことを見出し、本願発明を完成した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、バチルス属の細菌を培養して得られる蛋白質分解活性を示す酵素液であって、ｐＨ７における６０〜６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１００％の残存活性を示す高耐熱性ペプチダーゼ活性を備える、酵素液である。
【００１２】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る酵素液が、更にプロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性とを併せ備えることである。
【００１３】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る酵素液が、下記１）〜４）の少なくとも１の特性を示すことである。
【００１４】
１）蛋白質のペプチド鎖における少なくとも１０種類以上のアミノ酸の結合部位を切断するペプチド分解部位特異性を示す。
【００１５】
２）酸カゼイン１ｇ当たりプロテアーゼ活性で２００単位の前記酵素液を添加して１７時間の分解を行うことにより、分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸を前記酸カゼインに対して５０重量％以上生成すると言う蛋白質低分子化能力を示す。
【００１６】
３）上記２）の蛋白質低分子化能力が、４５°Ｃ及び６０°Ｃの温度条件での分解において同等に発現される。
【００１７】
４）大豆の難分解性蛋白質に対して、所定の作用条件において５０％以上の可溶化率を示す。
【００１８】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明に係る酵素液が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５号として国際寄託されているバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）Ｍ２−４株を培養して得られるものであることである。
【００１９】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、バチルス属の細菌を培養し、培養物から第１発明〜第４発明のいずれかに係る酵素液を取得する、酵素液の製造方法である。
【００２０】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、第５発明に係る酵素液の製造方法により得られた酵素液から酵素蛋白質を分離して得られる、酵素剤である。
【００２１】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、第１発明〜第４発明のいずれかに係る酵素液あるいは第６発明に係る酵素剤を有効成分として含み、難分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製造，チーズの製造のいずれかの用途に用いる、蛋白質分解酵素剤である。
【００２２】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）Ｍ２−４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５）である、蛋白質分解酵素生産菌である。
【００２３】
【発明の作用・効果】
（第１発明の作用・効果）
第１発明の酵素液を用いることにより、雑菌の繁殖を許さない温度条件、例えば５０°Ｃ以上、もしくは６０〜６５°Ｃに至る中〜高温度域で蛋白質分解工程を行うことが可能となり、しかもペプチダーゼ活性によって充分な蛋白質低分子化能力を期待することができる。
【００２４】
（第２発明の作用・効果）
第２発明の酵素液は、上記高耐熱性のペプチダーゼ活性に加えてプロテアーゼ活性を併せ備えるため、更に優れた蛋白質低分子化能力と、プロテアーゼ活性の一般的な特徴である反応初速度の早さとを期待することができ、蛋白質分解反応の高速度化を図ることができる。
【００２５】
更に第２発明の酵素液はコラゲナーゼ活性を併せ備えるので、例えば食肉を軟化させる際、ペプチダーゼ活性やプロテアーゼ活性による肉質の軟化と結合組織のコラーゲンの分解とが同時に進行し、食味の良い肉とすることができる。
【００２６】
（第３発明の作用・効果）
従来の蛋白質分解酵素において、そのペプチド結合分解活性は、通常は５，６種類以下、多くとも１０種類未満のアミノ酸の結合部位に対して示される程度である。しかしながら、第３発明の酵素液は、前記１）の特性として述べたように、少なくとも１０種類以上（例えば、１２種類）のアミノ酸の結合部位を切断するペプチド分解部位特異性を示すので、非常に優れた蛋白質低分子化能力が担保される。又、恐らくはこの広範囲なペプチド分解部位特異性のために、従来の蛋白質分解酵素によっては分解することが困難とされて来た大豆等の難分解性蛋白質に対して、４）の特性として述べるような有効な分解活性が発現される。
【００２７】
第３発明の酵素液は、前記２）の特性として述べたように、蛋白質原料から分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸を非常に効率良く生成することができるので、苦味のない高品質なアミノ酸素材やアミノ酸調味料を調製することができ、又、消化管からの吸収性の良好な栄養素材を調製することができる。
【００２８】
又、前記３）の特性として述べたように、上記の蛋白質低分子化能力が６０°Ｃでの分解において４５°Ｃでの分解の場合と同等に発現されるので、蛋白質低分子化工程を雑菌の繁殖を許さない温度条件で行うことができる。
【００２９】
更に第３発明の酵素液は、前記４）の特性として述べたように、大豆の難分解性蛋白質に対して、所定の作用条件において５０％以上の可溶化率を示すので、蛋白質原料として有力である大豆を、その難分解性蛋白質も含めて、有効にアミノ酸に分解することができる。
【００３０】
なお、後述のように、第１発明〜第３発明の酵素液については、カラムクロマトグラフィによって分子量の異なる複数種類の蛋白質分画を得ると共に、これらの各分画に係る蛋白質を個別に分離して酵素活性試験に供することにより、酵素液中にアミノペプチダーゼ，中性プロテアーゼ，酸性プロテアーゼ及びコラゲナーゼが含まれることを確認している。従って、第１発明又は第２発明の酵素液に係る高耐熱性ペプチダーゼ活性，プロテアーゼ活性及びコラゲナーゼ活性や、第３発明の酵素液に係る前記１）〜４）の特性が、これらの酵素の作用に基づくものであることは確実である。但し、前記１）〜４）の個々の特性に対する各酵素の関与の種類及び度合いについては、常識的に推定可能な事項を除き、未だ実験的に確認していない。
【００３１】
（第４発明及び第５発明の作用・効果）
第１発明〜第３発明の酵素液は、「ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５号」として既に国際寄託しているバチルス・ズブチリスＭ２−４株を培養することにより、その培養液として、あるいは該培養液の除菌液もしくはその濃縮液として、確実に取得することができる。
【００３２】
（第６発明の作用・効果）
第５発明の製造方法により取得した酵素液より、硫酸アンモニウム（硫安）塩析等の公知の適宜な方法で蛋白質を分離して、粗酵素粉末や、その緩衝液溶液等の剤型の酵素剤を得ることができる。これらの酵素剤は前記酵素液と同様の酵素活性及び特性を示す。
【００３３】
（第７発明の作用・効果）
第１発明〜第４発明に係る酵素液や、第６発明に係る酵素剤を用いて、従来にない高耐熱ペプチダーゼ活性，優れた蛋白質低分子化能力，コラゲナーゼ活性等を示す蛋白質分解酵素剤を提供することができる。この蛋白質分解酵素剤は、難分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製造又はチーズの製造と言う用途に特に有効に利用することができる。なお、パンの製造に用いた際には、体積増加（ふくらみの増強）と言う効果を得ることができる。
【００３４】
（第８発明の作用・効果）
第８発明によって、上記各種の酵素液，酵素剤及び蛋白質分解酵素剤の有効な製造手段が提供される。
【００３５】
【発明の実施の形態】
次に、第１発明〜第８発明の実施の形態を説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、第１発明〜第８発明を一括して指している。
【００３６】
〔蛋白質分解酵素生産菌〕
本発明に係る蛋白質分解活性を有する酵素液の生産に用いる微生物は、バチルス属に属し、より好ましくはズブチリス種の細菌であって、その最も代表的なものがバチルス・ズブチリスＭ２−４株である。
【００３７】
バチルス・ズブチリスＭ２−４株は、モンゴル地方の伝統的な小麦粉自然発酵食品である饅頭（マントウ）の生地より分離された複数種類の蛋白質分解酵素生産菌の内、特に実用的に優れたものであって、同定試験の結果、末尾の表１の成育状態（栄研社製普通寒天培地による３０°Ｃ、４８時間培養時のコロニー）を示すこと、末尾の表２の菌学的形態が観察されること、及び、末尾の表３の生理的性質を示すことから、バチルス・ズブチリス（ Bacillus subtilis）と同定し、「バチルス・ズブチリスＭ２−４株」と命名したものである。本菌株は生命研菌寄  Ｐ−１７３８８号として平成１１年５月１２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（特許微生物寄託センター）に寄託され、平成１２年５月１１日にＦＥＲＭ  ＢＰ−７１５５号としてブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
【００３８】
〔酵素液〕
第１発明〜第４発明の酵素液は、バチルス属の所定の細菌、例えば上記バチルス・ズブチリスＭ２−４株を培養することにより取得することができる。そのための培養条件には特段の限定はなく、通常の栄養培地を用いて通常の条件で培養しても良く、必要に応じて特殊な培地や特殊な培養条件を採用しても良い。
【００３９】
酵素液としては、液体培地を用いて培養した場合における培地を、そのまま除菌することなく使用することもできるし、濾過や遠心分離等の手段により菌体を除菌したり固形物の排除した後の酵素液を使用することもでき、更にはこれを、限外濾過膜等を利用したマイルドな手段で濃縮した酵素液として使用することもできる。
【００４０】
〔酵素液の酵素活性〕
第１発明〜第４発明の酵素液は、ペプチダーゼ活性、より具体的にはアミノペプチダーゼ活性を示し、かつ、ｐＨ７における６０〜６５°Ｃでの１時間の熱処理に対して実質的に１００％の残存活性を示すと言う高耐熱性を備えている。
【００４１】
第２発明〜第４発明の酵素液は、上記アミノペプチダーゼ活性に加え、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性とを併せ備え、かつ、前記プロテアーゼ活性には好適ｐＨを中性域に持つ中性プロテアーゼ活性と、好適ｐＨをアルカリ性域に持つアルカリ性プロテアーゼ活性とが認められる。これらの活性については、現在の処、必ずしも高耐熱性は確認されていない。
【００４２】
〔酵素液の特性〕
第３発明又は第４発明の酵素液は、１）非常に広範囲なペプチド分解部位特異性と、２）優れた蛋白質低分子化能力と、３）難分解性蛋白質に対する有効な分解活性とを示す。なお、コラーゲンに対する分解活性も認められる。
【００４３】
上記１）の広範囲なペプチド分解部位特異性に関しては、１０種類以上、より好ましくは１２種類のアミノ酸の結合部位をカルボキシル末端において切断するペプチド分解部位特異性が認められる。このようなアミノ酸として、具体的にはロイシン，イソロイシン，フェニルアラニン，リシン，バリン，アラニン，スレオニン，グリシン，セリン，グルタミン，アスパラギン，アルギニンが挙げられる。
【００４４】
上記２）の蛋白質低分子化能力に関しては、従来の蛋白質分解酵素に比較して、同一量の蛋白質原料に対して同一条件で同一の酵素活性単位量を作用させた時、分子量１０００以下のペプチド又はアミノ酸の生成量が著しく多いことと、そのような蛋白質低分子化能力が比較的中温度域に近い４５°Ｃの温度条件でも、かなりの高温度域である６０°Ｃの温度条件でも同等に発現されることとが、非常に特徴的である。
【００４５】
上記３）の難分解性蛋白質分解活性に関しては、既に大豆の難分解性蛋白質に対して高い可溶化率を示すことが確認されているが、例えば食肉の結合組織等の他種の難分解性蛋白質に対しても高い分解活性を示すことが期待できる。この特性には、上記の広範囲なペプチド分解部位特異性、とりわけ、従来の蛋白質分解酵素において余り見られないグリシン，バリン，アスパラギン等のアミノ酸の結合部位に対する分解部位特異性が関与している可能性がある。
【００４６】
〔酵素剤〕
酵素剤は、上記酵素液から適宜な手段により酵素蛋白質を分離することで調製され、酵素液に比較して高品位化できる点で有利である。酵素蛋白質の分離手段は限定されないが、硫安等を用いた塩析や、エタノールによる沈澱等の適宜な手段を任意に採用することができる。酵素剤は、酵素粉末，その緩衝液等の溶液等の任意の剤型とすることができる。
【００４７】
〔蛋白質分解酵素剤〕
蛋白質分解酵素剤とは、上記の酵素液あるいは酵素剤を有効成分として含み、各種の具体的な用途、例えば難分解性蛋白質の分解，アミノ酸調味料の製造，パンの製造，食肉の軟化，ペプチドの製造，低アレルゲン化蛋白質の製造，チーズの製造等に用いるものを言う。
【００４８】
【実施例】
〔実施例１：酵素液の調製と内容分析〕
１％のグルコース，１％のペプトン，０．３％のゼラチン，０．１％の酵母エキス，０．７％のリン酸２カリウム，０．１％のリン酸１カリウム，０．０５％のクエン酸及び０．０１％の硫酸マグネシウムから組成される培地を、５００ｍＬ（ミリリッター）容の坂口フラスコに１００ｍＬ入れて、１２０°Ｃで２０分間殺菌した後、この培地にバチルス・ズブチリスＭ２−４株を接種し、３０°Ｃで４０時間の振盪培養を行った。振盪培養の後、フラスコの培養液を遠心分離して除菌を行い、粗酵素液を得た。
【００４９】
この粗酵素液について、「ＤＥＡＥセファロースＣＬ６Ｂ」のカラムクロマトグラフィを行ったところ、図２に示すように、蛋白質を示す分子量の抽出フラクションにＡ〜Ｈの複数のピークが認められた。
【００５０】
そこで、これらの各ピークに相当するフラクションを個別に回収して各種の酵素活性試験に供したところ、ピークＢの回収液にはコラゲナーゼが、ピークＣ及びピークＤの回収液にはアルカリ性プロテアーゼが、ピークＥ及びピークＦの回収液にはアミノペプチダーゼが、ピークＧ及びピークＨの回収液には中性プロテアーゼが、それぞれ含まれることを確認した。上記の酵素活性は、それぞれ次の方法によって測定した。
【００５１】
プロテアーゼ活性：１ｍＬの０．７５％のミルクカゼイン溶液（ｐＨ７．０）に１ｍＬのフラクション回収液を加え、３７°Ｃで６０分間の反応を行った後に２ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液を添加して酵素反応を停止させる。この溶液を３７°Ｃで２５分間静置した後に濾紙で濾過する。別に調製した５ｍＬの０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液に、上記した濾液を１ｍＬ添加した後に更に１ｍＬのフォーリン試液（和光純薬製）を加えて、３７°Ｃで２０分間静置する。この液について６６０ｎｍでの吸光度を測定する。盲験として、上記操作法において、２ｍＬの０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液の添加後に１ｍＬのフラクション回収液を加える順序で反応を行う。なお、上記反応条件下での濾液中に０．１ｍｇのチロシン相当量のアミノ酸を生成させる活性を１単位とする。
【００５２】
コラゲナーゼ活性：０．４ｍＬの２．５％のコラーゲン溶液（ｐＨ７．５）に０．１ｍＬのフラクション回収液を加え、３０°Ｃで３０分間の反応を行った後に０．５ｍＬの０．１Ｍ酢酸溶液を添加する。この溶液を遠心分離して上清を取得する。この上清液０．１ｍＬに０．９ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）、０．１ｍＬの塩化スズ溶液及び２ｍＬのニンヒドリン溶液を添加して沸騰水中で２０分間加熱する。その後、水を添加して１０ｍＬとし、５７０ｎｍでの吸光度を測定する。盲験として、沸騰水中で５分間加熱処理をしたフラクション回収液を使用して、同一の測定操作を行う。なお、上記反応条件下での１分間に１マイクロモルのチロシン相当量のアミノ酸を生成させる活性を１単位とする。
【００５３】
アミノペプチダーゼ活性：０．８ｍＬのロイシン−ｐ−ニトロアニリド溶液（０．０７２％）に０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、０．２ｍＬのフラクション回収液を添加後、３７°Ｃで６０分間の反応を行う。その後に２ｍＬの０．７％塩酸／エタノール溶液を添加し、次いで２ｍＬの０．０６％ｐ−ジメチルアミノ・ケイ皮アルデヒド溶液を加え、１０分後に５４０ｎｍでの吸光度を測定する。盲験として、沸騰水中で５分間加熱処理をしたフラクション回収液を使用して、同一の測定操作を行う。なお、上記反応条件下での１分間に１マイクロモルのロイシンを生成させる活性を１単位とする。
【００５４】
又、上記各ピークに相当する回収液の内、ピークＥ及びピークＦの回収液については、分画分子量３０００のＵＦ膜（アミコン社製のミニタンプレート）を用いて濃縮を行い、アミノペプチダーゼの熱安定性を評価した。その結果、図３に示すように、ｐＨ７における４０〜６５°Ｃの各温度域での１時間の熱処理に対して、いずれもほぼ１００％の残存活性を示すと言う高耐熱性を確認した。
【００５５】
〔実施例２：濃縮酵素液の調製〕
実施例１と同じ組成の培地を各１００ｍＬ入れた２０本の坂口フラスコに、それぞれバチルス・ズブチリスＭ２−４株を接種して、実施例１と同じ条件で振盪培養し、次いで遠心分離により除菌して粗酵素液を得た後、これらの粗酵素液を一緒にした（合計量約１９００ｍＬ）。この粗酵素液において、中性プロテアーゼ活性は１１．０ｕ／ｍＬ、アルカリ性プロテアーゼ活性は１２．１ｕ／ｍＬ、コラゲナーゼ活性は４．４ｕ／ｍＬ、アミノペプチダーゼ活性は０．４８ｕ／ｍＬであった。
【００５６】
次に、上記の粗酵素液約１９００ｍＬをアミコン社製のミニタンプレート（分画分子量３０００）の膜を用いて濃縮し、濃縮酵素液約９０ｍＬを得た。この濃縮酵素液において、中性プロテアーゼ活性は１６６ｕ／ｍＬ、アルカリ性プロテアーゼ活性は１８０ｕ／ｍＬ、コラゲナーゼ活性は６６．４ｕ／ｍＬ、アミノペプチダーゼ活性は５．９ｕ／ｍＬであった。
【００５７】
〔実施例３：酵素剤の調製〕
実施例１と同じ組成の培地２０Ｌを用いて、３０Ｌ容のジャーファーメンターにて、３０°Ｃ、回転数２５０ｒｐｍ、通気量２０Ｌ／分の条件でバチルス・ズブチリスＭ２−４株を４０時間培養した。
【００５８】
培養後、遠心分離により１８Ｌの除菌液を得て、これを旭化成（株）製のＵＦ膜（分画分子量１３０００）で９００ｍＬに濃縮した。この濃縮液を硫安０．８飽和で塩析を行い、生成した沈澱を凍結乾燥して、７５ｇの粗酵素粉末からなる酵素剤を得た。
【００５９】
この酵素剤の酵素活性は、中性プロテアーゼ活性が１９９２ｕ／ｍＬ、アルカリ性プロテアーゼ活性が２２００ｕ／ｍＬ、コラゲナーゼ活性が７９０ｕ／ｍＬ、アミノペプチダーゼ活性が７１ｕ／ｍＬであった。
【００６０】
〔実施例４：蛋白質低分子化能力〕
ｐＨ７の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製した酵素剤、及び、比較対照としてのバチルス・ズブチリス起源の中性プロテアーゼである「プロテアーゼＮ」と、バチルス・ズブチリス起源のアルカリ性プロテアーゼである「プロレザー」（いずれも天野製薬（株）製）を、酸カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロテアーゼ活性で２００単位添加となるように添加し、４５°Ｃで１７時間分解反応を行って、反応物の分子量分布を測定した。
【００６１】
この測定はゲル濾過法で行い、 Amarciam 社製のＦＰＬＣシステムにより、分析カラムは Amarciam 社製の「スーパーロース１２」を用いた。又、分子量の標準物質として、血清アルブミン（分子量６７０００），キモトリプシノーゲン（分子量２５０００），チトクロームＣ（分子量１２３００），トリプシンインヒビター（分子量６５００）及びバシトラシン（分子量１４５０）を使用した。
【００６２】
実施例に係る酵素剤についての測定結果を図４（ａ）に、プロレザーについての測定結果を図４（ｂ）に、プロテアーゼＮについての測定結果を図４（ｃ）にそれぞれ示す。
【００６３】
図４（ｂ）及び図４（ｃ）より明らかなように、プロレザー及びプロテアーゼＮによる分解ペプチドには、分子量が１０００超〜１００００の高分子量ペプチドが多く、分子量１０００以下の低分子量ペプチドが少なかった。そして、高分子量ペプチド（Ｘ）の低分子量ペプチド（Ｙ）に対する量比Ｘ／Ｙは、いずれも約４以上であった。
【００６４】
一方、図４（ａ）より分かるように、実施例に係る酵素剤による分解ペプチドでは、分子量１０００以下の低分子量ペプチドが大半を占め、高分子量ペプチド（Ｘ）の低分子量ペプチド（Ｙ）に対する量比Ｘ／Ｙは０．７以下であって、図４（ｂ）及び図４（ｃ）の結果とは顕著な差異を示した。
【００６５】
分子量１０００以下の低分子量ペプチドは、消化管からの吸収速度が早く、医療用の経腸栄養剤や食品素材たる栄養補給剤として有効であると言われており、実施例に係る酵素剤を用いて得られたペプチドは、このような目的に適う。
【００６６】
〔実施例５：高温度域での蛋白質低分子化能力〕
ｐＨ７の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製した酵素剤と、比較対照としてのアスパーギルス・オリゼー（ Aspergillus oryzae ）起源の中性プロテアーゼである「プロテアーゼＡ」（天野製薬（株）製）とを、酸カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロテアーゼ活性で２００単位添加となるように添加し、４５°Ｃ及び６０°Ｃでそれぞれ１７時間分解反応を行って、反応物の分子量分布を測定した。測定法は実施例４と同様である。
【００６７】
実施例に係る酵素剤について、４５°Ｃにおける分解の場合の測定結果を図５（ａ）に、同６０°Ｃにおける分解の場合の測定結果を図５（ｂ）に、プロテアーゼＡについて、４５°Ｃにおける分解の場合の測定結果を図５（ｃ）に、同６０°Ｃにおける分解の場合の測定結果を図５（ｄ）に、それぞれ示す。
【００６８】
プロテアーゼＡによる分解ペプチドには、図５（ｃ）より明らかなように、４５°Ｃにおける分解の場合にも実施例４と同様に高分子量ペプチドが多い傾向が認められるが、図５（ｄ）に見られるように、６０°Ｃにおける分解の場合にはこの傾向が一層顕著になり、高温度域におけるプロテアーゼＡのかなりの活性低下が推測される。
【００６９】
一方、図５（ａ）及び図５（ｂ）より分かるように、実施例に係る酵素剤による分解ペプチドでは、６０°Ｃにおける分解の場合にも、４５°Ｃにおける分解の場合とほぼ同等に、分子量１０００以下の低分子量ペプチドが大半を占めており、優れた低分子化能力と同時に高耐熱性が裏付けられた。
【００７０】
従って、実施例に係る酵素剤を用いて工業的スケールでペプチドを製造する際、雑菌の繁殖による微生物汚染を生じ得る５０°Ｃ以下での分解操作を回避して、５５°Ｃ以上（例えば、６０°Ｃ）での工程管理が可能となるため、大きな工業的利点が得られる。
【００７１】
〔実施例６：難分解性蛋白質の分解〕
市販の分離大豆蛋白質である不二製油（株）製の「ニューフジプロＲ」１００ｇを１０００ｍＬの水に溶解し、前記「プロレザー」及び「プロテアーゼＡ」各１ｇを添加して、５０°Ｃで１７時間の分解反応を行った。その後、分解液を遠心分離して上記プロテアーゼ剤で分解できなかった沈澱物を分離、乾燥して、水に不溶の２５ｇの難分解性物質を取得した。
【００７２】
この難分解性物質についてケルダール法で蛋白質の定量を行った処、原料蛋白質に対して２０重量％の蛋白質が含まれていた。上記乾燥した難分解性物質５ｇを１００ｍＬの水に懸濁し、前記実施例１で得た粗酵素液６ｍＬを添加して、５０°Ｃで１７時間の分解反応を行った。
【００７３】
又、比較対照として、上記と同様に調製した難分解性物質の懸濁液の各１００ｍＬに対して、それぞれプロレザー０．１ｇを添加したものと、プロテアーゼＡ０．１ｇを添加したものとを準備し、上記と同条件で分解反応を行った。
【００７４】
これらの各例につき、分解反応終了後に遠心分離を行って、上清液の蛋白量をケルダール法で定量し、難分解性蛋白質の可溶化率を算出した。その結果、プロレザーによる分解例では５％、プロテアーゼＡによる分解例では４％の可溶化率であったのに対し、実施例に係る粗酵素液による分解例では、７０％の可溶化率であった。
【００７５】
従って、実施例に係る粗酵素液を用いることにより、難分解性蛋白質を含む蛋白質原料を用いるペプチドもしくはアミノ酸の製造において、難分解性蛋白質を有効に資化し、ペプチドの収率を向上させ、廃棄物量を低減させることができると言う工業的メリットが得られる。
【００７６】
〔実施例７：ペプチド分解部位特異性〕
ｐＨ７の１％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製した酵素剤と、比較対照としてのプロレザー及びプロテアーゼＮとを、適宜な同一単位量添加して分解反応を行い、その後、各例の分解反応液に酵母カルボキシペプチダーゼＹを添加して遊離アミノ酸を分析することにより、分解されたペプチドのカルボキシル末端を推定した。
【００７７】
その結果、図１の該当欄において上向きの矢印で示すように、プロテアーゼＮはロイシン，フェニルアラニン及びスレオニンの３種のアミノ酸のカルボキシル側を切断し、プロレザーはロイシン，フェニルアラニン，リシン，アラニン，セリン及びグルタミンの６種のアミノ酸のカルボキシル側を切断するのに対して、実施例に係る「Ｍ２−４」と表記する酵素剤は、ロイシン，イソロイシン，フェニルアラニン，リシン，バリン，アラニン，スレオニン，グリシン，セリン，グルタミン，アスパラギン，アルギニンの１２種のアミノ酸のカルボキシル側を切断すると言う、非常に広範囲にわたるペプチド分解部位特異性を示す事が分かった。
【００７８】
本発明の酵素液や酵素剤が発現する優れた蛋白質低分子化能力や、難分解性蛋白質に対する分解力には、上記の広範囲にわたるペプチド分解部位特異性が関係しているものと考えられる。
【００７９】
〔実施例８：アミノ酸調味料の製造〕
ｐＨ７の１０％酸カゼイン溶液に対して、実施例３で調製した酵素剤と、比較対照としてのプロレザー及びプロテアーゼＡを、それぞれ酸カゼイン１ｇ当たりｐＨ７のプロテアーゼ活性で２００単位添加となるように添加し、５５°Ｃでそれぞれ１７時間分解反応を行った後、遠心分離した上清についてアミノ酸分析及び呈味の官能評価を行った。
【００８０】
プロレザーによる分解例では、上清液における遊離アミノ酸の生成量が１５％で、苦味があり、旨味に欠けていた。プロテアーゼＡによる分解例では、上清液における遊離アミノ酸の生成量が３６％であったが、やや苦味があり、やはり旨味に欠けていた。一方、実施例に係る酵素剤による分解例では、上清液における遊離アミノ酸の生成量が４６％に達し、呈味性に優れていた。
【００８１】
〔実施例９：中華饅頭の製造〕
１００ｇの強力粉と１００ｇの薄力粉に、１０ｇの砂糖及び１ｇの食塩を添加混合し、これに３０°Ｃの温湯を１０５ｍＬ添加して、良く混合した。この混合物に、実施例１で調製した酵素液及び市販のパン酵母（オリエンタル酵母工業（株）製）を４ｇ添加して、３０°Ｃで４時間の１次発酵後に、２０ｇずつに分割・成形を行い、３０°Ｃで４時間の２次発酵を行った。その後、沸騰湯浴上で６分間蒸して、中華饅頭とした。
【００８２】
対照として、上記混合物に上記市販のパン酵母（オリエンタル酵母工業（株）製）のみを４ｇ添加して、同様の方法にて中華饅頭を調製した。
【００８３】
調製した実施例及び対照に係る中華饅頭の体積を測定した処、実施例に係る酵素液添加の中華饅頭は、対照に係る酵素液無添加の中華饅頭に比較して、約１５％の体積増加が認められた。
【００８４】
〔実施例１０：パンの製造〕
１００ｇの小麦粉、５０ｇの砂糖、２０ｇの食塩、４０ｇのショートニング及び３０ｇの市販パン酵母（オリエンタル酵母工業（株）製）を混合し、それに水６９０ｍＬと実施例１で調製した酵素液５０ｍＬを添加して、２７〜２９°Ｃで混合を行った。そして３０分間の１次発酵後に４５０ｇに分割し、３０分間の２次発酵を行った。これを食パンケースに入れ、２３０°Ｃで２５分間の焼成を行った。
【００８５】
対照として、上記酵素液無添加のものを、上記と同様の方法で１次発酵，２次発酵及び焼成した。
【００８６】
調製した実施例及び対照に係るパンの体積を測定した処、実施例に係る酵素液添加のパンは、対照に係る酵素液無添加のパンに比較して、約１０％の体積増加が認められた。
【００８７】
〔実施例１１：酵母エキスへの利用〕
市販の乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業製）１００ｇに水を加えて１Ｌとした。これを２モルの塩酸溶液にてｐＨ７に調整した後、９０°Ｃで３０分間加熱を行った。この溶液に溶菌酵素「ＹＬ−１５」（天野製薬製）を１ｇ添加して、攪拌しつつ５０°Ｃで１６時間の反応を行った。その後、９０°Ｃで２０分間加熱を行うことにより、酵母菌体を溶菌してエキスを抽出した。抽出液の遠心分離を行い、上清液を凍結乾燥して７０ｇの酵母エキス粉末を得た。本粉末中の蛋白質の含有量は３５％であった。
【００８８】
得られた酵母エキス粉末７ｇを１００ｍＬの水に溶解すると共に２モルの塩酸溶液にてｐＨ７に調整した溶液を用いて、本発明の酵素剤による遊離アミノ酸の生成率を、前記プロテアーゼＮ「アマノ」を対照として比較した。上記酵母エキス溶液に所定単位の酵素剤を添加した後、５０°Ｃで１７時間反応させ、９０°Ｃで２０分間加熱を行った。得られた酵素処理溶液についてアミノ酸分析を行い、遊離アミノ酸生成率を算出した。なお、酵素剤の添加量は酵母エキス粉末１ｇ当たりのプロテアーゼ活性として表示した。
【００８９】
本発明の酵素剤と対照酵素剤であるプロテアーゼＮ「アマノ」との比較結果を末尾の表４に示した。表４より明らかなように、本発明の酵素剤による処理群は遊離アミノ酸の生成率が高く、かつ呈味性に優れ、苦味がなく酵母エキスとして優れた特色を有していた。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
【表２】
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【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】酵素のペプチド分解部位特異性を示す一覧図である。
【図２】実施例に係るクロマトグラフ図である。
【図３】酵素の熱安定性を示すグラフ図である。
【図４】分解反応物の分子量分布を示すグラフ図である。
【図５】分解反応物の分子量分布を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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