(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム中に分散させた、水に対する溶解度が０．０１％（ｗ/v）より高くない有効成分を含む水性医薬組成物の製法であり、下記：
ａ）この有効成分を２０から３０℃の間の温度で脂質に分散させ；
ｂ）水相にこの分散液を懸濁させ；
ｃ）この懸濁液を周辺温度で０から４８時間ねかせ；
ｄ）３０〜７５℃まで１０〜４０分加熱し；
ｅ）−２００℃から−１５０℃で凍結させ；
ｆ）段階ｄ）およびｅ）を少なくとも２回、多くて７回繰返し、次いで段階ｄ）を１回行い；
ｇ）直径５００〜１０００nmの孔のフィルター膜でろ過し；
ｈ）直径５０〜４００nmの孔の膜で押出成形し；同時に
ｉ）トラップされなかった有効成分を除去する
の段階を含む、方法。
【請求項２】
水相が０．０５％〜０．９％（ｗ/v）の塩化ナトリウム水溶液からなる、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
使用した脂質の量が、水の各重量部に対して０．０１〜０．４重量部の間である、請求の範囲第１項または２項に記載の方法。
【請求項４】
使用した有効成分の量が、脂質の各重量部に対して０．０１〜０．３重量部の間である、請求の範囲第１項ないし３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
圧縮空気、窒素、ヘリウムおよびアルゴンを含む群から選択される押出ガスを段階ｈ）で使用する、上記請求の範囲第１項ないし４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
押出ガスが５００から５５００kＰaの圧力を持つ、請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｈ）が２０から７５℃の間の温度で実施される、上記請求の範囲第１項ないし６項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階ｈ）の温度が４０から６５℃の間である、請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
段階ｈ）を少なくとも２回、多くて８回繰返す、上記請求の範囲第１項ないし７項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、水に高度に不溶性の有効成分を含む水性医薬組成物に関する。特に、有効成分をリポソーム中に分散させた医薬組成物に関する。
製薬分野では新規リポソーム製剤の発見のために、非常に多くの研究が実施されている。しかしながら、特に有効成分が水に高度に不溶性である場合に多くの問題が生じてきた。特に、水に対する溶解度＜０．０１％（ｗ/v）のものである。
実際、水に対する溶解度の低い有効成分を含むリポソームを製造するのに使用される現今の技術は：
ａ）有効成分と、選定しておいたリン脂質とを適切な有機溶媒、例えば、クロロホルムに溶かし；
ｂ）この溶媒を減圧蒸発させて、有効成分/リン脂質膜を作り；
ｃ）第２の有機溶媒、例えば、テルブチルアルコールを添加し；
ｄ）得られた溶液を液体窒素温度で凍結させ；
ｅ）その凍結溶液を凍結乾燥させ；
ｆ）凍結乾燥溶液を緩衝溶液で水和して、多重ラメラリポソーム（ＭＬＶ）の懸濁液を得て；そして
ｇ）この懸濁液を超音波処理して、より小さいリポソーム（ＳＵＶ）の懸濁液を得る、ことを含む。
この方法の一例は、A. Sharma et al. “Pharmaceutical Research”, 2（6）, 889-896（1994）に記載されている。
しかしながら、この技術には、非常に面倒であるという不利点があり、かつリポソーム中に痕跡量の有機溶媒を残存させる。
にもかかわらず、この著者らは、ＭＬＶリポソームの様々な調製技術、例えば、乾燥脂質膜の水和（手で振盪する）、凍結解凍および、その後リポソームのサイズを小さくする（ＭＬＶ→ＳＵＶ）（後処理）ための押出成形や超音波処理などの様々な技術を研究したと言い、そして、上記詳述した段階ａ）からｇ）を含む方法が最も良好であることが示されたと結論している（上記引例、８９０頁、右欄、５１-５７行）。しかしながら、この著者らは、第１のＭＬＶリポソーム調製技術とリポソームサイズを小さくできる第２の技術とをどのようにして互いに組合せたか示していない。
WO-A-96 40064、EP-A-0 578 629、DE-A-4 038 075およびDE-A-4 430 593は、水に不溶性の有効成分をリポソーム中に分散させた医薬組成物を開示している。このような有効成分はシクロスポリン-Ａ、メラトニンおよびそれぞれタキソールである。
しかしながら、上記文献には、凍結および解凍技術と押出成形を組合せる水性リポソーム組成物の製法はどこにも記載されていない。
意外にも、この度、凍結および解凍技術を押出成形と組合せると、有機溶媒を使用せずとも水に対する溶解度＜０．０１％（ｗ/v）の有効成分の水性リポソーム組成物を調製できることが分かった。
本明細書および後の請求の範囲では、水に対する溶解度＜０．０１％（ｗ/v）の有効成分を“水に高度に不溶性”と定義する。
従って、請求の範囲第１項に記載の医薬組成物を提供することが本発明の第１の目的である。
以下は、水に高度に不溶性である有効成分の典型的な例である：ロニダミン（溶解度：３×１０-6g/ml）、メラトニン［“practically insoluble”, G.S.Shida et al., “J. Pineal Res.”, 16, 198-201,（1994）］、シクロスポリン-Ａ［“insoluble in water”, monograph on cyclosporin-A in“Analytical Profiles of Drug Substances”, 16, 163（1987）］およびビンダリト（bindarit）（溶解度：１×１０-4g/ml）。
本発明の組成物のリポソームは、好ましくは、ホスホグリセライド、グリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド、リン脂質、ガラクトシルおよびグルコシル脂質、コレステロールおよびその誘導体、スフィンゴ脂質およびこれらの混合物を含む群から選択された成分から作られる。より好ましくは、リン脂質から作られる。
本発明のリポソーム組成物の典型的な例は、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、Ｎ-アシル-ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、非極性脂質、トリグリセライド、遊離脂肪酸、ＤＬ-α-トコフェロールを含む。
本発明の好ましいリポソーム組成物は：
成分                            ％（ｗ/v）
ホスファチジルコリン            ：８５−９７
リゾホスファチジルコリン        ：０−５
Ｎ-アシル-エタノールアミン      ：０−４
ホスファチジルエタノールアミン  ：０−１０
トリグリセライド                ：０−４
遊離脂肪酸                      ：０−３
ＤＬ-α-トコフェロール          ：０−１
を含む。
本発明の特に好ましいリポソーム組成物は：
成分                            ％（ｗ/v）
ホスファチジルコリン            ：９４
リゾホスファチジルコリン        ：３
Ｎ-アシル-エタノールアミン      ：１
ホスファチジルエタノールアミン  ：０．１
トリグリセライド                ：１
遊離脂肪酸                      ：０．７５
ＤＬ-α-トコフェロール          ：０．１５
を含む。
典型的には、本発明のリポソームのサイズは、５００nm以下である。好ましくは、５０〜２５０nmである。
請求の範囲第６項に記載した水性医薬組成物の製法を提供することが本発明の第２の目的である。
段階ｃ）の時間は、リポソームにトラップされる、水に高度に不溶性の有効成分の量によって変わる。よって、当業者ならば、２・３の簡単な定例実験を行えば各種有効成分やリポソーム組成物に適した時間が決まるため、何の困難も感じない。
水相は、好ましくは、０．０５％〜０．９％（ｗ/v）の塩化ナトリウム水溶液から作る。
典型的には、使用した脂質の量は、水溶液の各重量部に対して０．０１〜０．４重量部の間である。次に、有効成分の量は、典型的には脂質の各重量部に対して０．０１〜０．３重量部の間である。
典型的には、分散機器は、Ultraturrax（商標）型のホモジナイザーである。
典型的には、押出成形は、圧縮空気または、窒素、ヘリウムおよびアルゴンを含む群から選択される不活性ガスを押出ガスとして用いて実施する。好ましい不活性ガスはヘリウムである。押出成形段階では、その圧力は、好ましくは５００から５５００kＰaの間であり、温度は、好ましくは２０から７５℃の間であり、更に好ましくは４０から６５℃の間である。適切な押出成形器の典型的な例は、Lipex Biomembranes Thermobarrel型のもの、または５０から６００nmの孔のポリカーボネートCostar（商標）膜のフィルターの付いたEmulsiflex CC Avestin型のものである。
典型的には、段階ｈ）は、少なくとも２回、多くて８回繰返す。好ましくは６回である。
下記の実施例は、本発明の例示であって、いかにしても本発明を限定するものではない。
実施例１
Ultraturrax（商標）型ホモジナイザーを使って、メラトニン１００mgをリン脂質１gに３０℃で１０分間分散させた。その後直ちに、そのホモジナイザーによりこの分散液を０．９％（ｗ/v）塩化ナトリウム水溶液１０mlに懸濁させ、次いで、水浴中、５５℃で２０分間加熱した。
こうして得られた懸濁液を下記の冷却および加熱サイクルにかけた：
−液体窒素中１分間冷却
−リン脂質が完全に流体になるまで５５℃に加熱。
このサイクルを６回繰り返した。
懸濁液をLipex Biomembrane装置の０．６μmフィルターに２回通した。
こうして、“大きな多重ラメラ小胞”（ＭＬＶ）懸濁液を得、これを、０．１μmポリカーボネートCostar（商標）フィルター付きLipex Biomembranes Extruder Thermobarrel型の１０ml押出成形器を用い、５５℃で、押出ガスとしてヘリウムを用い、１０００から４８００ｋＰａの間の圧力で、６サイクルの連続押出成形にかけた。
上記のように操作して、３バッチの生成物（ＬＭ/１８６、ＬＭ/１８８およびＬＭ/１９０）を調製した。
下記の試験をこれらのバッチにて実施した：
*水性リポソーム組成物中のメラトニン量（ＨＰＬＣ分析）；
*リポソームサイズ；
*リポソームにトラップされたメラトニン量。
下記の表は、測定したパラメーターとその意義を示す：
0004299369.tif 000002
得られたデータは表１であり、これは以下のことを示す：
−水性リポソーム製剤中で得られたメラトニンの濃度の３バッチの平均値は、８．０５×１０-3g/mlであった；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、９３nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、８０．５μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
0004299369.tif 000003
ＨＰＬＣ分析用に下記の手順を使用した：
−固相：逆相ＰＫＢ−１００（２５０×４．６mm；５μm Supelco）のカラム；
−移動相：水：アセトニトリル８０：２０（v/v）；
−検出：ＵＶ２５４nm。
２台の装置を用いてリポソームの平均サイズを分析する：
１）DELSA 440 Coulter、
２）NICOMP Submicron粒子サイズモデル３７０。
手順は次の通りである：
ａ）装置１）で実施する試験の場合、リポソーム懸濁液１mlを０．９％（ｗ/v）の塩化ナトリウム水溶液１０mlで希釈した；
ｂ）装置２）で実施する試験の場合、溶液ａ）０．５mlを０．９％（ｗ/v）の塩化ナトリウム水溶液１０mlに希釈した。
実施例２
リン脂質１gとメラトニン１００mgの代わりにリン脂質２gとロニダミン５０mgを使用して、上記実施例１に記載のように行う。
こうして、３バッチの生成物（ＬＭ/１９５、ＧＮ/１ＬおよびＧＮ/２Ｌ）を調製した。得られたデータは表２であり、これは以下のことを示す：
−水性組成物中のロニダミン濃度は、初期溶解度値３×１０-6g/mlから３バッチの平均値、３．８３×１０-3g/mlまで及んだ；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、７９．６nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、１９．２μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
0004299369.tif 000004
実施例３
リン脂質１gとメラトニン１００mgの代わりにリン脂質２gとメラトニン２００mgを使用して、上記実施例１に記載のように行う。
こうして、３バッチの生成物（ＧＮ/１Ｍ、ＧＮ/２ＭおよびＧＮ/３Ｍ）を調製した。得られたデータは表３であり、これは以下のことを示す：
−水性リポソーム製剤中のメラトニン濃度の３バッチの平均値は、１３．５×１０-3g/mlであった；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、９２．６nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、６７．６μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
0004299369.tif 000005
実施例４
０．１μmよりはむしろ０．２μmのポリカーボネート膜で押出成形を実施する以外は、上記実施例２に記載のように行う。
こうして、３バッチの生成物（ＧＮ/３Ｌ、ＧＮ/４ＬおよびＧＮ/５Ｌ）を調製した。
得られたデータは表４であり、これは、ロニダミンを２０mgから５０mgに、リン脂質量を１ないし２gに増やし、０．１μm膜の代わりに０．２μmで押出成形することにより、水性組成物中のロニダミン濃度の顕著な増加が実施例２において得られた。実際、平均値４．４７×１０-3g/mlがロニダミン濃度について得られた。
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実施例５
Ultraturrax（商標）型ホモジナイザーを使って、シクロスポリン-Ａ ２０mgをリン脂質１gに３０℃で１０分間分散させた。その後直ちに、そのホモジナイザーによりこの分散液を０．９％（ｗ/v）塩化ナトリウム水溶液に懸濁させ、次いで、水浴中、６５℃で２０分間加熱した。
こうして得られた懸濁液を下記の冷却および加熱サイクルにかけた：
−液体窒素中１分間冷却
−リン脂質が完全に流体になるまで６５℃に加熱。
このサイクルを６回繰り返した。
懸濁液をLipex Biomembrane装置の０．６μmフィルターに２回通した。
こうして、“大きな多重ラメラ小胞”（ＭＬＶ）懸濁液を得、これを、０．１μmポリカーボネートCostar（商標）フィルター付きLipex Biomembranes Extruder Thermobarrel型の１０ml押出成形器を用い、６５℃で、押出ガスとしてヘリウムを用い、１０００から４８００ｋＰａの間の圧力で、６サイクルの連続押出成形にかけた。
このようにして、３バッチの生成物（ＬＭ/４１６Ａ、ＬＭ/４１６ＢおよびＬＭ/４１６Ｃ）を調製した。
得られたデータは表５であり、これは以下のことを示す：
−水性リポソーム製剤中のシクロスポリン-Ａの濃度の３バッチの平均値は、０．９６×１０-3g/mlであった；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、１０３nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、９．６μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
0004299369.tif 000007
実施例６
リン脂質１gとメラトニン１００mgの代わりにリン脂質２gとビンダリト５０mgを使用して、上記実施例１に記載のように行う。
こうして、３バッチの生成物（ＬＭ/３５６、ＬＭ/３５７およびＬＭ/３５８）を調製した。
得られたデータは表６であり、これは以下のことを示す：
−水性リポソーム組成物中のビンダリト濃度は、初期溶解度値１×１０-4g/mlから３バッチの平均値、４mg/mlまで及んだ；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、１０８．３nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、２０．２μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
0004299369.tif 000008
実施例７
Ultraturrax（商標）型ホモジナイザーを使って、シクロスポリン-Ａ ３０mgをリン脂質２gに３０℃で１０分間分散させた。その後直ちに、そのホモジナイザーによりこの分散液を０．９％（ｗ/v）塩化ナトリウム水溶液に懸濁させ、周辺温度で２４時間放置した。次いで、水浴中、６５℃で２０分間加熱した。
こうして得られた懸濁液を下記の冷却および加熱サイクルにかけた：
−液体窒素中１分間冷却
−リン脂質が完全に流体になるまで６５℃に加熱。
このサイクルを６回繰り返した。
懸濁液をLipex Biomembrane装置の０．６μmフィルターに２回通した。
こうして、“大きな多重ラメラ小胞”（ＭＬＶ）懸濁液を得、これを、０．１μmポリカーボネートCostar（商標）フィルター付き１０mlLipex Biomembranes Extruder Thermobarrel型の押出成形器を用い、６５℃で、押出ガスとしてヘリウムを用い、１０００から４８００ｋＰａの間の圧力で、６サイクルの連続押出成形にかけた。
このようにして、３バッチの生成物（ＬＭ/４２２ａ、ＬＭ/４２２ｂおよびＬＭ/４２２ｃ）を調製した。
得られたデータは表７であり、これは以下のことを示す：
−水性リポソーム製剤中のシクロスポリン-Ａの濃度の３バッチの平均値は、３mg/mlであった；
−３バッチのリポソームの平均サイズは、１１９．５nmであった；
−トラップ量の３バッチの平均値は、１５μg/mgであった；
−各製剤は、リポソーム凝固現象をなんら示さなかった。
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