(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、
（ａ）３５から４５ｍＭの濃度のカリウムイオン、８０から１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオン、２から１０ｍＭの濃度のマグネシウムイオンおよび０．０１から０．１ｍＭの濃度のカルシウムイオンからなる群より選択された１以上の電解質；
（ｂ）循環系からの脱出を制限するのに十分に大きいサイズを有し、且つ血漿圧に等しいコロイド浸透圧を維持するのに効果的であり、且つヒト血清アルブミン、多糖およびコロイド状デンプンからなる群より選択された高分子膨張剤；
（ｃ）生理学的および低温の条件下で効果的な生物学的ｐＨ緩衝液；
（ｄ）栄養学的に有効な量の少なくとも１の単糖；
（ｅ）非透過性であり、且つヒドロキシラジカルのスカベンジに有効な量のマンニトール；
（ｆ）細胞膜に対して非透過性であり、且つ低温暴露の間の細胞膨張を抑制するのに効果的な非透過性アニオンであり、ラクトビオネート、グルコネート、シトレートおよびグリセロホスフェートからなる群より選択された少なくとも１である非透過性アニオン；
（ｇ）ＡＴＰの再生に効果的な基質であり、アデノシン、フルクトース、リボースおよびアデニンからなる群より選択された少なくとも１である基質、ならびに
（ｈ）アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤；
を含有する細胞非含有溶液組成物。
【請求項２】
更にグルタチオンを含有する請求項１記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物。
【請求項３】
請求項１記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、当該アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤がフリーラジカルの細胞レベルを減少する薬剤を含む細胞非含有溶液組成物。
【請求項４】
請求項３記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、当該フリーラジカルの細胞レベルを減少する少なくとも１の薬剤がビタミンＥおよびＥＤＴＡからなる群より選択される１を含む細胞非含有溶液組成物。
【請求項５】
請求項１記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、前記低温保存が１０℃から０℃の間で行われる細胞非含有溶液組成物。
【請求項６】
請求項５記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、前記アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する薬剤が１以上のカスパーゼプロテアーゼのインヒビターを含む細胞非含有溶液組成物。
【請求項７】
請求項１記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、前記低温保存が、凍結の始まる温度から−１９６℃までの間の温度の低温保存である細胞非含有溶液組成物。
【請求項８】
請求項７記載の動物またはヒト臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物であって、当該アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する薬剤が１以上のカスパーゼプロテアーゼのインヒビターを含む細胞非含有溶液組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の低温保存のための細胞非含有溶液組成物を使用する低温での動物またはヒト臓器、組織または細胞の保存方法であって、
（ａ）アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤を含む低温保存のための細胞非含有溶液組成物と細胞を混合すること；および
（ｂ）１０℃から０℃の間の温度まで細胞を冷やすこと；
を具備する方法。
【請求項１０】
請求項９記載の低温で動物またはヒト臓器、組織または細胞を保存する方法であって、前記アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤が一酸化窒素産生の上流モジュレータを含む方法。
【請求項１１】
請求項９記載の低温で動物またはヒト臓器、組織または細胞を保存する方法であって、アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤がフリーラジカルの細胞レベルを減少する薬剤を含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の低温保存のための細胞非含有溶液組成物を使用する低温で動物またはヒト臓器、組織または細胞を保存する方法であって、
（ａ）アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤を有する低温保存のための細胞非含有溶液組成物と細胞を混合すること；
（ｂ）凍結が始まる温度から−１９６℃の間の温度まで細胞を冷やすこと；
を具備する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の低温で動物またはヒト臓器、組織または細胞を保存する方法であって、前記アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤が一酸化窒素産生の上流モジュレータを含有する方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の低温で動物またはヒト臓器、組織または細胞を保存する方法であって、当該アポトーシスで誘導される細胞死を阻害する少なくとも１の薬剤がフリーラジカルの細胞レベルを減少する薬剤を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
１．発明の分野
本発明は保存細胞におけるアポトーシスの誘導を制御する冷蔵保存組成物と凍結保存組成物に関連している。特に、本発明は、遺伝子調節細胞死（アポトーシス）の誘導を制御する薬剤を含む細胞内型低温管理及び保存用培地組成物を使用する、低温下における細胞、組織、臓器を維持する方法に関連する。更に本発明は、保存細胞におけるアポトーシスの誘導を制御する試薬が含まれる細胞内型の低温管理および保存用組成物を用いての細胞を低温保存する方法に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
２．関連分野の説明
臓器、組織、細胞を保存するのに有用な非血液含有溶液は当該分野で周知である。例えば、移植のための組織および臓器を維持する血液代替物はブレトン(Breton)へのＵ.Ｓ.特許Ｎｏ．４，９２０，０４４や、ベルザー(Belzer)へのU.S.特許Ｎｏ．４，８７９，２８３、Ｎｏ．４，７９８，８２４に開示されている。セガル(Segall)らへのＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，９２３，４２２は移植処置への使用のための摘出臓器の低温保存に有用な4つの血液代替溶液を開示している。一般的に、通常の保存溶液中に4℃でヒト組織を冷蔵保存した場合は、保存し始めてから最初の数日以内に組織サンプルを取り囲んでいる培地中に集合している細胞デブリスを生ずる。多くの細胞は４℃では数日後に収縮し、微小形態の損傷を示す。これらの細胞、組織は結果として冷蔵保存後には生存していない。
【０００３】
低温保存溶液は、臓器、組織、細胞の輸送と保存のために開発された。細胞はこれらの溶液中に浸され、４℃、若しくはそれに近い温度で維持され、そこで長期低温の状態のまま維持される。遺伝子工学で作成された組織の飛躍的進歩数により、低温保存を用いずに、短期間、４℃で組織の低温保存するための溶液の開発に対する科学的興味が増大した。ビアスパン(VIASPANTM)[ウイスコンシン(UW)大学溶液とも呼ばれている]、ユーロ‐コリンズ(EURO-COLLINS)のような低温保存溶液、凍結保存溶液、および臓器保存用(1)に使用されてきた他の溶液は、いまもなお細胞および組織を低温の状態で維持する能力を実験され続けている。
【０００４】
細胞/組織の保存用のための低温保存溶液を最大限に利用することの重要性は誇張ではない。パヘルニックら(Pahernik et al)は、生物的人工肝臓を開発するための肝細胞を大容量で保存するための施設の重要性に言及している。低温保存溶液はしばしば細胞機能を大きく損なうことから、このグループは低温保存に代わる刺激性の弱い溶液として冷蔵保存溶液に目を向けている。フィッシャーら(Fisher et al)はビアスパン(VIASPANTM)、ユーロ‐コリンズ(EURO-COLLINS)、サックス(Sacks)＋プロスタサイクリン(Prostacyclin)およびＶ-７について組織切片の低温保存能力を試験した。組織切片の保存のためにこれら冷蔵保存溶液を５℃または０℃の範囲内の温度で使用することは、効果的に組織断片の輸送/保存寿命を増加し、それによって化粧品並びに医薬品の試験に使用された動物数は減少した。タイラーら(Taylor et al.)により開発された別の低温溶液は、4℃で1週間以上に渡って遺伝子工学で作成されたヒト表皮を保護することが示された(5)。マットテック(Mat Tek)株式会社(Ashland,MA)により生産されたこの生物学的人工皮膚は、4℃の細胞内様低温血液代替溶液、ハイポサーモゾルTM中で1週間保存した後に37℃に戻しても分化を維持した。単一細胞の冷蔵保存も幾つかのグループによって検討された。例えば、正常ヒト表皮ケラチノサイトは、正常の培養液中では24時間のみであったのと比較しても、ハイポサーモゾルＴＭ中で４℃で1週間を超える期間、維持することが可能である(10)。同様の結果が以下のＥＰＩＤＥＲＭＴＭの低温保存（製品の安全性試験で使用される遺伝子工学で作成されたヒト表皮）においても得られた。
【０００５】
ＵＷ溶液のような低温保存溶液は、心臓(11-13)、肝臓(1-16)、肺臓(17-19)、腎臓(20)および小腸(21)の保存に用いられた。それらの方法は近年毒性学のインビトロ試験の分野で広がっている。フィッシャーら(Fisher et al.)は、動物代替として使用された生肝細胞切片並びに生腎細胞切片を低温保存溶液中で保存することの重要性を示した。クックら(Cook et al.)はハイポサーモゾルＴＭが５℃または０℃の範囲内の温度で遺伝子工学で産生されたヒト表皮の低温保存に使用可能であることを示した。この観察は、ハイポサーモゾルTMが動物実験の代用として使用された生物的人工ヒト皮膚の貯蔵寿命を延ばすことが出来たという点で重要である。あるいは、ハイポサーモゾルTMまたは別の溶液は臨床においては移植手術前においてヒト表皮を保管するために使用できる。一方で、生物学的人工肝は現在でも使用状態にはないが、それにも関わらず、肝組織工学技術のために肝細胞バンクが重要であることをパヘルニックら(Pahernik)は指摘している。しかしながら、最近の低温保存溶液の効果は、低温保存中の細胞死を助長する遺伝子に調節される事象を含む細胞プロセスによって制限されている。
【０００６】
約5℃から0℃での細胞および組織の低温保存は短期間に適しているのに対して、細胞の長期保存においては冷凍開始と液体窒素(-196℃)の温度の間での低温保存を必要とする。低温保存、すなわち液体窒素の温度またはその温度の近くにおいて多くの細胞株を含む生物の維持は、生物医学的研究を支持するために必要な決定的な方法論である。保存における試験方法の開発はまず第一に細胞内氷形成と化学的浸透圧による冷凍誘発細胞死［それは細胞膜破壊を引き起こし、その結果壊死を生ずるためである(43)］を克服することが中心である。従って、多くの研究者は、標準細胞培養液のような細胞外様担体溶液を含む、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはグリセロールのような低温保護剤中に細胞系を低温保存している。この戦略は、まず始めに以下のウシ精子(44)の部分保存において詳述された。その結果、多くの研究者は赤血球(45)、白血球(41)、生殖細胞および受精卵(34)、ならびに心臓弁(32)を含む単一組織を低温保存し、わずかな成功を得た。
【０００７】
低温保存に対する伝統的な取り組み方は、等張若しくは低張液の何れかに含まれる凍結保護剤のモル濃度に浸透することを追加することに依存している。この取り組みは、まれにイオンバランス、緩衝能力または低温ストレスの結果を回避するのに必要であると考えられるその他の因子を考慮するものである。この状況は、緩慢な冷凍（〜1℃/min）期間中における細胞は、細胞内の内容物が、保存試験計画の液体窒素（ＬＮ2）が急冷する段階においてガラス質に変化するまで低温状態のままであるという事実の見地において問題であろう。解凍後の細胞の生存率は、伝統的な方法論（即ち、５％から１０％ＤＭＳＯを希釈した培養液中に細胞を冷凍しているような方法）では低い。凍結細胞個体群における解凍後の細胞の生存率が約30％になることは、伝統的な試験方法を用いたときに共通することである。解凍後の細胞の生存率の損失が非常に高いのは、凍結時に生じる結晶形成若しくは脱水によると考えられている。
【０００８】
研究者の多くは解凍の数時間以内に染色排除法を用いて生存率を定量しているが、長期間の生存率はわずかである(3,27)。例えば、トリパンブルー染色排除アッセーを使用し定量したヒト肝細胞は-80℃で24時間保存ではおおよそ67％の生存率となったが、-80℃で14日間保存後では49％となった(29)。更に最近では、アダムスら(Adams et al.)(26)は肝細胞の保存結果が胎児ウシ血清とＤＭＳＯで強化した担体溶液としてビアスパン(VIASPANTM)（細胞内様低温保存溶液）の使用により改良されることを示した。
【０００９】
ナグルら(Nagle et al.)(40)は、分子に基づいた細胞死の機構は低温保存に関連していることと、その細胞死はこれまで唯一取り扱われ知られている冷蔵誘発細胞障害により説明することが出来ないことを示唆する事実を証明した。パークス(Parks)(42)は保存過程の間に細胞が経験した低温への暴露の程度が、低温保存の成功に影響している大きな要因でありそうなことに注目した。最近、アポトーシスによる細胞死は低温の暴露の結果として心筋細胞に生じることが報告された(39)。アポトーシスまたはプログラムド細胞死は、正常の発生過程(37)や、細胞ストレス(30)の結果として生じる遺伝子活性化事象である。ホリスターら(Hollister et al.)(36)は、アポトーシスは-75℃以下の氷点下の温度に暴露したヒト前立腺癌細胞株(PC3)において細胞死の重要な構成要素であることを示した。これらのデータは、アポトーシスは低温保存の失敗における十分可能な関与因子であると指摘した。
【００１０】
細胞死はアポトーシス若しくは壊死(概要は24を参照されたい)により生じるかもしれない。壊死若しくは病理学的細胞死は細胞膨張の結果、細胞膜の完全性が欠損することにより特徴づけられ、且つ多くの病理学的動因により生じる。壊死を生じている細胞のＤＮＡはランダムな形式で切断される。ゆえに、壊死を受けた細胞からのＤＮＡは、ゲル電気泳動法にかけたとき継続的なスメアを示す。アポトーシスは遺伝子により活性化され、且つ縮んでいる細胞、正常な細胞膜およびアポトーシス形体の形成により特徴づけられる。アポトーシスを受けた細胞のＤＮＡは非ランダム形式に切断され、ゲル電気泳動法においてラダー様パターンを形成する。通常の保存溶液に１-２日以上の期間に亘り低温状態で保存した多くの細胞の主な細胞死の様式はアポトーシスではなく、ネクローシスであるようである。短期間の低温保存とアポトーシスの間の相関関係は明らかではない。
【００１１】
アポトーシスを調節している詳細な細胞機序は完全には知られていない。しかしながら、アポトーシスの経路の多くの部分は日に日に明らかにされている。イオン環境の変化は、アポトーシス様の核の変質過程に関連するエンドヌクレアーゼの活性化若しくは阻害が必要であるかもしれない。例えば、Ｚｎ＋＋の生理学的濃度は、ＤＮＡフラグメンテーションとアポトーシスを阻害することが知られている。ＲＮＡ合成を阻害するアクチノマイシン、または蛋白合成を阻害するシクロヘキサミドのような大きな分子の合成の阻害剤とある一定の細胞のＴｒｅａＴＭｅｎｔはアポトーシスを惹起する。アポトーシス過程の完了は、遺伝子調節細胞死、特に細胞周期調節が関与した遺伝子産物の促進または抑制に関連した種々の遺伝子産物の調節された発現に依存しているようである。例えば、細胞死阻害作用物Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬの過剰発現は、チトクロームＣの放出を妨げる。チトクロームＣは、カスパーゼ［アポトーシスに関連する変化の原因である切断基質として知られるプロテアーゼ群である］を活性化すると考えられている。Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバー、のレベルが促進されると、シトクロムＣ放出と、続く、細胞のアポトーシスが促進される。早期反応遺伝子ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの特異的な調節は、それらの発現を取り巻く環境に依存して、細胞増殖または細胞死の何れかを促進することが可能である。従って、プログラム細胞死は、細胞事象の複雑な経路に影響を与える。
【００１２】
多数の細胞保存溶液の低温保存効果は、極めて多くのアッセイを使用して試験されている。そのようなアッセイは、酵素合成(2)、カリウム含有量(3)、トリパンブルー排除(7)、ニューロン生育および髄鞘形成(8)、収縮(11)、ＡＴＰ含有量(13)、および超微細構造(17)を含む。前に指摘された通り(10)、これらのアッセイは、生存能アッセイまたは機能性アッセイの何れかであると見なされる。従って、小腸においてカッツ(Katz)らにより使用された当該マルトース耐性試験は、機能性アッセイと見なすことが可能であり；それに対してロドリゲス(Rodriguez)らにより使用されたトリパンブルーは厳密には生存能アッセイである。ここで報告する一連の試験で使用されたアラマーブルーＴＭアッセイは、生存能アッセイであり、組織特異的な様式において被検細胞が機能しているか否かを示すものではない。前に記載された他の殆どの生存能アッセイまたは機能性アッセイとは分け合うことのない、アラマーブルーＴＭアッセイが寄与する重要な点の１つは、非毒性のインジケーターとして、連日繰り返して使用できるというアラマーブルーＴＭの能力である。これは、ヒト皮膚細胞等の幾つかの低温貯蔵された組織に対しては、決定的に重要であることが知られている。
【００１３】
細胞、組織および臓器の低温保存は、生体臨床医学的研究のために使用する細胞株の貯蔵、法医学的なサンプルの保存、医学的サンプル(例えば、生検材料および体外受精のためのサンプル等)の貯蔵、並びに移植のための細胞、組織および臓器の管理に重要である。例えば、膵臓島細胞の保存は、今後の臨床細胞移植のために決定的に重要である。コルバットおよびピペリーアズ(Korbutt and Pipeleers)は、膵臓β細胞がビアスパンＴＭにおける４℃での９６時間の保存期間に亘って生存可能であることを示している(6)。他のグループは、肝細胞懸濁液がＵＷ溶液中において保存できることを示している(7)。レビ(Levi)らは、損傷を受けた神経を治療するための材料源としての今後の神経バンクを考えて、神経細胞のための低温保存溶液の候補としてUW溶液を試験している(8)。また、胆管上皮細胞も、低温保存溶液において試験されている(9)。更には、培養において増殖する単離されたヒト皮膚細胞は、ハイポサーモゾルＴＭにおいて非常に良好に保存されることも示されている(CMS,Rockville,MD)(10)。
【００１４】
これらの多くの研究は、低温保存溶液の低温貯蔵効果を増進する多様な添加物を試験したが、しかしながら、そのような保存溶液における長期の保存に続いて細胞がどのように死ぬかの観点で行われたものではない。多様な添加物が、低温貯蔵用溶液に対して添加され、それらの有益な添加物としての可能性が試験された。ロドリゲスらは、ＵＷ溶液に対するグルタチオンの添加が、肝細胞の保存に有益であることを示している(7)。ロプヒン(Lopukhin)らは、ＵＷ溶液への2,3ブタンジオンモノオキシムの添加が保存された心臓の貯蔵寿命を増加したことを示している(11)。しかしながら、グリシンは、ＵＷ溶液に添加された場合に有益ではないことが明らかである(14)。しかしながら、詳細な利益の１つは、抗酸化剤の添加である。例えば、ラザロイド(Lazaroids)は、ＵＷ溶液の低温保存効果を増加することが示されている(15、21)。グルタチオンは、ビアスパンＴＭに添加された場合に、肺の保存を増進することが示されている(19)。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
冷蔵保存および冷凍保存技術の両者を使用した従来の研究は、低温保存からの完全な回復を妨害する障壁が、各細胞個体群に存在することを示す。臨床適応、基礎研究および製品安全性試験において有用な工学技術で設計された組織の出現が、低温保存条件に供される細胞および工学技術で設計された多層組織の両方の生存能を保証するような改良された冷蔵保存および凍結保存技術の必要性を大きなものにした(38)。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は動物またはヒトの臓器、組織または細胞の低温保存のための細胞非含有溶液組成物に関し、前記細胞非含有溶液は、
（ａ）３５から４５ｍＭの濃度のカリウムイオン、８０から１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオン、２から１０ｍＭの濃度のマグネシウムイオンおよび０．０１から０．１ｍＭの濃度のカルシウムイオンからなる群より選択された１以上の電解質；
（ｂ）循環系からの脱出を制限するのに十分に大きいサイズを有し、且つ血漿圧に等しいコロイド浸透圧を維持するのに効果的であり、且つヒト血清アルブミン、多糖およびコロイド状デンプンからなる群より選択された高分子膨張剤；
（ｃ）生理学的および低温の条件下で効果的な生物学的ｐＨ緩衝液；
（ｄ）栄養学に有効な量の少なくとも１の単糖；
（ｅ）非透過性であり、且つヒドロキシラジカルのスカベンジに有効な量のマンニトール；
（ｆ）細胞膜に対して非透過性であり、且つ低温暴露の間の細胞腫脹を抑制するのに効果的な非透過性アニオン［前記非透過性イオンは、ラクトビオネート、グルコネート、シトレートおよびグリセロホスフェートからなる群より選択された少なくとも１である］；
（ｇ）ＡＴＰの再生に効果的な基質［前記基質は、アデノシン、フルクトース、リボースおよびアデニンからなる群より選択された少なくとも１である］；
（ｈ）アポトーシスで誘導される細胞死を調節する少なくとも１の薬剤；
（ｉ）一酸化窒素シンターゼ活性を調節する少なくとも１の薬剤；並びに
（ｊ）フリーラジカルの細胞レベルを調節する少なくとも１の薬剤；
を含有する。
【００１７】
また、本発明は、動物またはヒト臓器、組織または細胞を約５℃から０℃の間で低温保存するための細胞非含有溶液組成物［ここで、アポトーシス細胞死を調節する少なくとも１の薬剤がビタミンＥおよびＥＤＴＡからなる群より選択される少なくとも１の薬剤である］を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、動物またはヒト臓器、組織または細胞を約５℃から０℃の間で低温保存するための細胞非含有溶液組成物［ここで、アポトーシス細胞死を調節する少なくとも１の薬剤がアポトーシスを調節する薬剤を含む］に関する。
【００１９】
本発明は更に、動物またはヒト臓器、組織または細胞を、凍結が開始する温度から約−１９６℃までの間で低温で低温保存するための細胞非含有溶液組成物［ここで、アポトーシス細胞死を調節する少なくとも１の薬剤がアポトーシスを調節する薬剤を含む］に関する。
【００２０】
また、本発明は、動物またはヒト臓器を低温保存するための細胞非含有溶液組成物［アポトーシスを調節する前記薬剤が、カスパーゼプロテアーゼのインヒビターを含むことを特徴とする］に関する。
【００２１】
加えて、本発明は、動物またはヒト臓器、組織または細胞を低温で保存する方法に関し、前記方法は、
（ａ）アポトーシスで誘導される細胞死を調節する少なくとも１の薬剤を含む低温保存のための細胞非含有組成物と細胞を混合すること；および
（ｂ）約１０℃から０℃の間に細胞を冷やすこと
を具備する。
【００２２】
また、本発明は、動物またはヒト臓器、組織または細胞を低温で保存する方法に関し、前記方法は、
（ａ）アポトーシスで誘導される細胞死を調節する少なくとも１の薬剤を有する低温保存のための細胞非含有組成物と細胞を混合すること；
（ｂ）凍結が始まる温度から−１９６℃までの温度の間に細胞を冷やすこと；を具備する。
【００２３】
定義として、アポトーシス細胞死を調節する薬剤は、典型的にアポトーシスインヒビターと称される。フリーラジカルの細胞レベルを調節する薬剤は、一般的に、フリーラジカルスカベンジャーとして知られる。一酸化窒素シンターゼ活性を調節する薬剤は、本質的に、一酸化窒素産生の上流モジュレータである。
【００２４】
【発明の実施の形態】
発明の詳細な説明
好ましい態様である発明は、動物またはヒト臓器、組織若しくは細胞の低温保存のための細胞フリー溶液組成物の改良に関する。ハイポサーモゾルＴＭは以下を含む細胞フリー溶液である：
（ａ）３５から４５ｍＭの濃度のカリウムイオン、８０から１２０ｍＭの濃度のナトリウムイオン、２から１０ｍＭの濃度のマグネシウムイオンおよび０．０１から０．１ｍＭの濃度のカルシウムイオンからなる群より選択された１以上の電解質；
（ｂ）循環系からの脱出を制限するのに十分に大きいサイズを有し、且つ血漿の圧に等しいコロイド浸透圧を維持するのに効果的であり、且つヒト血清アルブミン、多糖およびコロイド状デンプンからなる群より選択された高分子膨張剤；
（ｃ）生理学的および低温の条件下で効果的な生物学的ｐＨ緩衝液；
（ｄ）栄養学に有効な量の少なくとも１の単糖；
（ｅ）非透過性であり、且つヒドロキシラジカルのスカベンジに有効な量のマンニトール；
（ｆ）細胞膜に対して非透過性であり、且つ低温暴露の間の細胞腫脹を抑制するのに効果的な非透過性アニオン［前記非透過性イオンは、ラクトビオネート、グルコネート、シトレートおよびグリセロホスフェートからなる群より選択された少なくとも１である］；
（ｇ）ＡＴＰの再生に効果的な基質［前記基質は、アデノシン、フルクトース、リボースおよびアデニンからなる群より選択された少なくとも１である］ならびに
（ｈ）グルタチオン。
【００２５】
長期間、例えば、５日間以上、ハイポサーモゾルＴＭ(HTS)または皮膚培養用培地において保存された正常なヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)は、蘇生の第1日目の間、低温保存をしていないコントロールと比較して全く生存可能であるように見える。しかしながら、蘇生の４８時間後、培養細胞は、蘇生の２、３日以内には生存する細胞がなくなるまでに急激に悪化する(10)。同様な劇的なプロファイルは、工学技術により設計されたヒト表皮でも生ずる(5)。ビアスパンＴＭ(肝臓および腎臓の低温保存のために設計された商業的に入手可能な溶液)において０℃から−５℃で長期間保存されたＭＤＣＫ細胞もこのような時間依存的な悪化を示すようである(図１)。この時間依存性の死は、ＡＴＰ依存性の遺伝子活性が細胞死に必要な条件として誘導されることが必要であることを暗示するものである。
【００２６】
低温保護溶液として、ＨＴＳは、ＤＭＳＯを含有する細胞培養用培地に匹敵する(図３、９、１１、１３、１４)。ビアスパンＴＭは、低温保存用培地としては失敗であるが、ＤＭＳＯの追加で、ＤＭＳＯを含有する細胞培養用培地以上に、細胞生存をある程度まで改善する(図１１)。５％のＤＭＳＯを含有するＨＴＳ誘導物(クライオスターＴＭＣＳ５;CRYOSTORTM CS5)は、ＤＭＳＯで強化された細胞培養用培地またはビアスパンＴＭの何れに比較してもより優れた低温保存溶液である(図１１)。
【００２７】
伝統的に、低温保存の成功は、染料排出アッセイを使用して凍結の数時間以内に評価されている。しかしながら、染料排出アッセイは細胞生存能を過剰評価する傾向があることを多くの報告が明記している(33)。延長された期間に亘る低温保存に続く細胞生存についてのより正確な描写を与える評価アッセイの同定が研究された。トリパンブルー、カルセイン−ＡＭ、およびアラマーブルーＴＭの間の比較がなされ、ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯにおいて低温保存されたＭＤＣＫ細胞の解凍後生存率が評価された。トリパンブルー、カルセイン−ＡＭおよびアラマーブルーＴＭアッセイにより得られたパーセント生存率は、夫々、９５％、６５％および２８％であった(図２)。これらの観察を基に、より厳しいアッセイであるアラマーブルーＴＭを第１の評価プローブとして選択した。アラマーブルーＴＭアッセイは非毒性であり、好気的呼吸における最終的な酸化ステップを基にした代謝活性を測定する生理的なインジケーター染料である(48)。また、アラマーブルーＴＭはマルチエンドポイントアッセイであるため、長期の細胞生存および回復をモニターすることが可能である。
【００２８】
本発明の目的は、当該担体培地の変更、即ち、細胞外型(DME)と細胞内型(HTS)、を介した低温保存の増進である。細胞をＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯ中で低温保存し、ＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯ(クライオスターＴＭ)中で保存された細胞と比較した(図３)。クライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)において低温保存された細胞は、ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯにおいて低温保存された細胞に比較し、生存能は２５７％増で得られ、同時に約半分の１００％まで回復した。この生存および回復率における有意な増加(p<0.007)は、担体培地の違いの結果のようであった。この仮説を考査するために、細胞培養物を基礎ＨＴＳ(DMSO非含有)において低温保存した。ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯとＨＴＳとの比較すると、解凍後生存は、２８％と３２％で等しいものであった(P=0.145)(図３)。ＨＴＳにおいて低温保存された細胞の長期間の回復は、５日以内でコントロールの９５％までに回復するＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯの回復に類似するものであった。従って、冷蔵保存溶液ＨＴＳは更なる低温保護剤の追加を含まない低温保存培地として良好に機能するものである。
【００２９】
細胞内用溶液(HTS)の使用を介した低温保存生存の改良にもかかわらず、総合的な結果としては、未だに、有意に不十分な生存率(28%)しか得られなかった(図３)。この不十分な保存レベルは、最適化した低温保存プロトコールを使用した場合でさえも、日常的に遭遇するものである。この一般的な問題の観点から、伝統的な化学浸透性の保護戦略により方向付けられるものを超えた、細胞死の１以上の様式がほぼ全ての細胞死の原因となり得ることを、本発明は示唆した。プログラム細胞死(アポトーシス)を阻害するための標準的な低温保護の起こり得る失敗のために、浸透性ベースの保護は制限される（「キャップされる(capped)」）のかもしれない。
【００３０】
【表１】
0004376460.tif 000002
【００３１】
表１．低温保存されたＭＤＣＫ細胞の解凍後回復期間(１＆３日)。対角線上の（強調された）四角は、サンプル数と１日目の回復値の標準偏差を示す。表における凡例は、第１日および第３日のＭＤＣＫ細胞のパーセント回復率を示す。全ての他の値は、ＡＮＯＶＡにより決定された信頼限界(P-値)である。
【００３２】
従って、本発明の目的は、低温保存の失敗に関連する細胞死の様式を崩壊することにより低温保存の失敗を減少することである。１つのアプローチは、フリーラジカル保護戦略であり、ここにおいて保護因子が低温細胞保存溶液に含有され、解凍後細胞生存を増進する。α−トコフェロール(ビタミンＥ)のＨＴＳへの添加は、ベースＨＴＳにおいて低温保存された細胞よりも有利な１６２％の生存率を得られた。α−トコフェロール添加ＨＴＳは、ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯよりも有利な１８５％の生存率を与え、且つＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯ(クライオスターＴＭＣＳ５)と同様な回復率を与えた(図３)。興味深いことに、この抗酸化剤は更に長期の利益は与えることがなく、実際、ＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯと共に使用された場合には不利益となった(図３)。α-トコフェロールのクライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)への添加は、５６％の生存率を与え、これはクライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)単独で保存された細胞の全般的な７２％の生存率よりも有意に低いものである。この観察は、更に、「低温保存キャップ(cryopreservation cap)」の外側の細胞死は、細胞外の氷の形成とそれによる化学的浸透圧の混乱に無関係な他の１以上の因子が原因である可能性をサポートする。
【００３３】
加えて、α-トコフェロール(ビタミンＥ)とＥＤＴＡの両者は、低温保存剤としてハイポサーモゾルＴＭの効果を増強している。アラマーブルーＴＭ(代謝染色)およびカルセイン(膜完全性染色)の両者によって証明される通り、ハイポサーモゾルＴＭへのＥＤＴＡの添加が、０℃から５℃での溶液の冷蔵保存能力を増進したことを図４は示している。ＥＤＴＡは細胞外カルシウムイオンのキレーターとして機能するが、これは高い細胞外濃度で細胞毒性があることが知られている。従って、ＥＤＴＡは、カルシウム活性化プロテアーゼおよび／またはカルシウム活性化エンドヌクレアーゼの作用を衰退させる。ビタミンＥの有益な作用は、その抗酸化能力のためであり、それにより、低温細胞保存中の膜の損傷を防止することが可能である。或いは、ビタミンＥは、一酸化窒素の放出を阻害するかもしれない(22)。ビタミンＥはアポトーシスから細胞を保護すると報告されていることから(23)、ハイポサーモゾルＴＭにおいて長時間に亘り保存された場合に、ネクローシスまたはプログラム細胞死を経て細胞が死ぬのか否かを決定するために実験を行った。
【００３４】
細胞死は、多様なストレスに対する応答において(28)、アポトーシスまたはネクローシスを経て生じる(概要は24を参照されたい)。ホリスター(Hollister)らによる１９９８年の論文(36)は、低温保存を基礎にしていない研究において、アポトーシスが凍結暴露(-5℃から-75℃)に続き生じることを証明した。加えて、マシュー(Mathew)らは、体温低下法もアポトーシスを誘導することを証明した(個人的な情報による)。低温保存される細胞の凍結速度を制御することが多くのストレスを誘導することから、アポトーシス細胞死が低温保存の失敗の原因であるようである。
【００３５】
ネクローシスまたは病理学的な細胞死は、細胞膨張に終わる細胞膜完全性の喪失により特徴付けられ、且つ多くの病理学的な動因により引き起こされる。ネクローシス生じた細胞におけるＤＮＡは、ランダム様式に切断される。従って、ネクローシスを受ける細胞からのＤＮＡは、電気泳動ゲルにおいて連続したスメアとして現れる。アポトーシスまたはプログラム細胞死は、遺伝子で活性化され、細胞が縮むこと、正常な細胞膜およびアポトーシスボディフォーメーションにより特徴付けられる。アポトーシスを受ける細胞におけるＤＮＡは、非ランダム様式に切断され、電気泳動においてはＤＮＡ断片の２００ｂｐの周期性が示されるようなＤＮＡラダーが形成される。
【００３６】
浮き上がった細胞および細胞用プレートに接着した細胞ともに、低温保存された細胞を、ＤＮＡゲル電気泳動により分析するために２４および４８時間の回復期間の後に回収した。ＤＮＡゲルの実験において、低温保存の失敗に関連する幾つかの所見に気づいた(図５)。第一に、全ての低温保存溶液のバリエーションにおいて、生細胞(接着細胞)から単離されたＤＮＡは、当該ゲルの最上部で単一バンドを生じた(生存細胞のインジケーターである)(図５)。ＤＭＥ単独において低温保存された浮き上がった細胞(死細胞)からのＤＮＡは、はっきりとしたランダム切断パターン(「スメア」と称する)が現れた。ネクローシス細胞死のインジケーターであるこのパターンは、特に解凍後４８時間に見られた。ネクローシス細胞死が有力になるのは解凍後４８時間後であるが、ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯにおいて低温保存された浮き上がった細胞からのＤＮＡは、ネクローシスの予備段階である解凍後２４時間にも現れ、ＤＮＡラダーが観察された。このＤＮＡラダーは、アポトーシスの最終段階の証明である１８０塩基対のＤＮＡ断片由来物を示す。ＨＴＳおよびクライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)からの浮き上がった細胞から単離されたＤＮＡを含むレーンの実験(解凍後24および48時間)は、ネクローシス細胞のパターンの減少とアポトーシス細胞死の存在の増加を明らかにした。ＤＮＡ分析から、アポトーシスは低温保存の失敗に有意に寄与していることが結論付けられた。低温保存の失敗に対するネクローシスとアポトーシスの寄与の相対的なレベルを決定するためには更なる実験が必要である。
【００３７】
４℃で冷蔵保存に供したＭＤＣＫ細胞の死細胞であるデタッチした細胞のＤＮＡと、生細胞である接着細胞のＤＮＡを比較した更なる実験を図６に示す。死細胞のＤＮＡは、アポトーシス細胞の特徴であるＤＮＡラダーを示した(図６)。このラダーは、ＤＭＥ(図６、レーン３，４)またはハイポサーモゾルＴＭ(図６、レーン6-10)の何れにおいてもより長時間保存された細胞において現れた。しかしながら、低温においてより長時間保存された細胞(レーン9および10)は、ネクローシスの特徴(即ち、より広範なスメア)をより多く有し、且つアポトーシスの特徴は殆どなかった(即ち、ラダーがはっきりしない)ことに注目することが重要である。従って、冷蔵保存された細胞はアポトーシスおよびネクローシスの両方を被り、且つ両状態の間の移行は低温保存時間に依存することを当該データが示唆するものである。
【００３８】
アポトーシスインヒビターを用いた追加実験(図７および８)は、低温保存中の細胞死においてアポトーシスが役割を担っているという考えをサポートするものである。ＩＤＵＮアポトーシスインヒビターおよびカスパーゼ−１インヒビターＶは、両者ともインターロイキン１β変換酵素(ICE)様プロテアーゼインヒビターであるが、４℃での低温保存の間、細胞を保護した。データの中で明らかに不可解なことの１つは、ネクローシスを経て死んだ細胞が、まず始めに一連のアポトーシスを経てからネクローシス経路に入るように進行したことである。ハーシュ(Hirsch)らは、透過性移行のようなミトコンドリアの変化が、ネクローシスまたはアポトーシスに入る細胞についての決定点において重要であることを示している(25)。更に詳細には、このグループは、アポトジェニックプロテアーゼの有効性が細胞がネクローシスまたはアポトーシスに進むか否かの決定をなし得ると提案している。従って、全く明らかにネクローシスを経て死んで行くように見える細胞におけるアポトーシスインヒビターの予知不可能なレベルの効果は、今後の研究を必要とする。
【００３９】
上記の観点から、本発明の目的は、ＨＴＳに対するアポトーシスレギュレーターの添加により低温保存の間のアポトーシスによる細胞死を減少することである。カスパーゼカスケードは、エンドヌクレアーゼベースのＤＮＡ断片過程の一部分であることから(47)、カスパーゼカスケードの阻害が、アポトーシスのレベルを減少することが見出され、それにより低温保存の結果が改善されている。図９に示される通り、プロテアーゼインヒビターであるカスパーゼＩインヒビターＶのＨＴＳへの添加は、ベースＨＴＳを超える更なる保護を可能にするものである(夫々６５％対３２％の生存率)。インヒビターを加えたＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯ(クライオスター CS 5N)において細胞が低温保存された場合、ＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯに比較して解凍後２４時間の生存率が増加し、また標準ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯと比較した結果も非常に顕著なものである(夫々、８５％：７２％：２８％)。当該インヒビターのＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯにおける使用は、全般的な低温保存の結果を非低温保存コントロール細胞に対して８５％まで改善した。ＤＭＳＯありまたはなしのＨＴＳへの該インヒビターの添加は、また、当該細胞のより急速な回復を生じる。
【００４０】
低温保存がアポトーシスを誘導するメカニズムは明らかではないが、当該細胞におけるアポトーシスのメカニズムの活性化は、凍結解凍過程において体験されるストレスの直接的な結果であるように見える。考えられる１つの説明は、凍結解凍過程の間の細胞の「収縮と膨張」の結果としての細胞膜において影響する物理的圧力である。深遠なハイパーオスモラリティと合わせたこの構造的な撓みがアポトーシスの開始を生じる細胞表面にある死受容体(35)を活性する可能性がある。アポトーシスインヒビターの組み合わせを介した低温保存における改善された結果(図９)は、カスパーゼカスケードの活性化が低温保存の凍結解凍過程の間に生じることを示唆する。もう１つのアポトーシスの活性化手段の可能性は、ミトコンドリアの透過性移行ポア(MPTp)の活性化を引き起こすサイトゾルにおけるフリーラジカルの蓄積の結果としての可能性である。ＭＰＴｐの活性化は、正常な活性を混乱するミトコンドリアへのおよびミトコンドリアからのイオンの自由拡散を可能にし、それによってカスパーゼカスケードの活性化を引き起こす(35)。アポトーシス開始の考えられるこの道筋についてのサポートは、フリーラジカルスカベンジャーであるα-トコフェロールをＨＴＳに含ませることによる低温保存結果の改善により証明される(図３)。最終的に、亜死細胞およびＤＮＡ損傷への応答において、ｐ５３遺伝子が活性化され、それにより細胞においてアポトーシスメカニズムの開始が惹起される(31)。低温保存誘導アポトーシスは、１つの特定のアポトーシス誘導経路に直接的に繋がってはいないが、低温保存の失敗に寄与するアポトーシス開始因子と経路の組み合わせによるものであるのかもしれない。更なる研究が、経路と低温保存誘導アポトーシスとが親しく関係するものであるかどうかを決定するためには必要である。
【００４１】
残る問題は、ビタミンＥおよび／またはＥＤＴＡがアポトーシスの阻害を経てそれらの保護作用を生じているのかどうかということである。現時点では、この質問には容易に答えられない。ＨＴＳおよびＥＤＴＡプラスビタミンＥにおける４℃での１１日間のＭＤＣＫ細胞の冷蔵保存は、ＥＤＴＡまたはビタミンＥの何れかを単独で添加したＨＴＳよりもより高い細胞生存能を提供する(図１０)。ＨＴＳでの添加物としてのＥＤＴＡおよびビタミンＥを試験する同様の実験は、ひよこ心筋細胞で達成されている。この興奮しやすい細胞を用いたデータは、ビアスパンＴＭと同様な保護評価順位を示す。ビタミンＥの水可溶性形態、トロロックス(Trolox)による更なる実験は、ビタミンＥと同様の結果を示した(データには示さず)。従って、どのようなメカニズムであっても、ビタミンＥとＥＤＴＡはハイポサーモゾルＴＭの効果を増強し、２つの薬剤の効果は付加的であるようである。これらのデータは、細胞、哺乳類臓器および工学技術により設計された組織のための低温保存溶液の今後の改良が、低温保存中の細胞質およびゲノムの両方において生じる分子変化において注目されるべきであることを示唆する。
【００４２】
特異的な細胞内型溶液、即ち、ハイポサーモゾルＴＭ、の低温保存用液およびＤＭＳＯのための担体溶液の両方としての使用は、解凍後の細胞生存能を顕著に増加する。ハイポサーモゾルＴＭの使用は、凍結解凍過程に当該細胞が曝露されるイオン依存的ストレスを減少すると考えられる。加えて、低温保存後に観察される該細胞死は、損傷および続く凍結誘導外傷性ネクローシスに関連する物理的な凍結解凍を厳密には制限するものでない。最初の時点では、アポトーシスは低温保存の失敗と関連すると示されている。本発明の低温保存中のアポトーシスインヒビターの使用は、低温保存の成功例を増加する。更に、冷蔵保存溶液としてのＨＴＳのパフォーマンスを改善する薬剤であるα−トコフェロールの添加もまた、ＨＴＳの低温保存能力を改善する。最後に、低温保存の結果における最高の改善は、クライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)とアポトーシス経路を混乱するカスパーゼインヒビター(クライオスターTMCS5N)との組み合わせての使用により達成される。従って、発明のハイポサーモゾルＴＭ組成物、クライオスターＴＭＣＳ５Ｎは、低温保存により誘導されるアポトーシスの開始を阻害するために設計することにより調製される第１の保存溶液である。
【００４３】
加えて、ＨＴＳ(DMSO非含有）は、低温保護剤として使用されることから、当該保存溶液は、現在では多少のプロトコールにより必要とされる、適用前にＤＭＳＯを取り除くためのマルチステップウォッシュ処理の排除を介して、臨床的組織工学技術適用に特に有用である。更に、分子学および／または物理学を基礎とした低温保存の失敗を解決するための今後の研究が、「低温保存キャップ」の制限を克服するために必要である。
【００４４】
本発明は、０℃−５℃で冷蔵保存することとおよび冷凍保存することとの両方によって、種々の臓器、組織および細胞を保存することにおいて使用することが想像される。これに限られるものではないが、肺、肝、心臓、腎、腸、目および皮膚を含む臓器を、レシピエント患者に移植する前に、本発明に従って冷蔵保存することが可能である。本発明に従って、骨髄等の組織、並びに赤血球および白血球等の細胞を長期間冷凍保存することが可能である。例えば、法医学および病理学的記録のための組織を、生存率の顕著な損失なく、低温保存することが可能である。治療的および研究的興味のための細胞株を、本発明に従って、短期または長期に低温保存することが可能である。詳細な利益の１つは、体外受精等の生殖処置のための生殖体または胚を長期間低温保存するために適用されることである。本発明の改変は、完全な多細胞臓器の長期保存に適用されてもよい。保存に加えて、アポトーシスを制御するこの方法は、液体窒素で貯蔵することを具備する従来の方法によって低温保存される細胞および組織を救助するために使用される。
【００４５】
本発明を更に以下の非限定的な例の手段により説明する。
【００４６】
例
方法
MDCK細胞培養。マディン・ダービー・ケーナイン腎(MDCK)細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection,Rockville,MD)から入手した。ストック培養物は、３７℃／９５％エア５％ＣＯ２で、ファルコンＴフラスコ内で維持し、１０％胎児ウシ血清および１％ペニシリン／１％ストレプトマイシン(GIBCO-BRL Laboratories,Grand Island,NY)を含有するダルベッコ改変イーグル(DME)培地(4500mg グルコース/リットル)で培養した。細胞は、約１×１０５／ｃｍ２の密度でファルコン２４ウェルプレートに播種した。全細胞は低温実験に使用される時にはコンフルエントであった。
【００４７】
低温保存および蛍光アッセイ。当該細胞培養用培地をＭＤＣＫ培養物から除去し、該細胞をハンクス平衡化塩溶液を用いて洗浄し、この培地を、夫々に室温まで予加温したハイポサーモゾル（登録商標）、ビタミンＥまたはＥＤＴＡを用いて改変したハイポサーモゾル(登録商標)、またはビアスパンＴＭ(VIASPAN)の何れかと置換した。当該低温培地は胎児ウシ血清を含有しなかった。次に当該プレートを４℃に１から１１日の範囲の期間に亘り維持した。続いて、これらの期間の終わりに、プレートを４℃の培地で洗浄し、１０％の胎児ウシ血清を含有する培地中で段階的に３７℃まで暖めた。細胞を３７℃で２４時間維持して回復させた。この期間の最後に、細胞培養プレートを既に記載された通りに(5,10)、１時間３７℃で、毒性のない代謝インジケーターであるアラマーブルーＴＭ(ALAMAR BLUETM,Westlake,OH)を用いてアッセイした。アラマーブルーＴＭは、フェノールレッドを含まないＨＢＳＳ中で１：２０に希釈し、培地を除いた後に０．５ｍＬを各細胞培養ウェルに添加した。その蛍光形態へのアラマーブルーＴＭの代謝依存的転換をサイトフルオロ２３５０(CytoFluor2350,Millipore Corporation,Bedford,MA)またはサイトフルオロII(CytoFluor II,PerSeptive Biosystems,Cambridge,MA)を使用し、５３０ｎｍ励起／５９０ｎｍ蛍光フィルタセットを用いてモニターした。該アッセイの後、続いてアラマーブルーＴＭ溶液を取り除き、１０％胎児ウシ血清を添加した培地の１．０ｍＬで置き換えた。毎日または２日に１度、アラマーブルーＴＭを用いて同様な方法により再度アッセイした。このアラマーブルーＴＭ処理は殆どの場合において４から７日間に亘って繰り返した。
【００４８】
カルセイン-ＡＭ(Calcein-AM)は、モレキュラー・プローブズ・オブ・ユージーン(Molecular Probes of Eugene,OR)から入手し、膜完全性染色として使用した。カルセインのストックバイアルを１ｍｇカルセイン−ＡＭ／ｍＬＤＭＳＯ(シグマ)に溶解した。このストック溶液をＨＢＳＳ(GIBCO)と１／１００で混合し、７日間の４℃で低温保存されたＭＤＣＫ細胞と１時間のインキュベーションを行った。次に、当該細胞をハンクス平衡化塩溶液で洗浄し、サイトフルオロ２３５０またはサイトフルオロＩＩを使用して４８５ｎｍ励起／５３０ｎｍ蛍光フィルタセットを用いて、インサイチュウで該染料の保持を分析した。蛍光ユニットが大きい程、より多くの染料が当該細胞によって保持されると見なされた。
【００４９】
低温保存溶液。ハイポサーモゾル(登録商標)は、クライオメディカル・サイエンシーズ(Cryomedical Sciences,Rockville,MD)の許可を得て、当研究室で調製した。この溶液の完全な処方は公開されている(4)。ＥＤＴＡはシグマから入手した。ビタミンＥ(α-トコフェロール)およびＥＤＴＡは、シグマ・ケミカル・Ｃｏ．(Sigma Chemical Co.)から入手した。アポトーシスプロテアーゼパンインヒビターＩＤＵＮ−１５２９とＩＤＵＮ−１９６５は、ＩＤＵＮファーマシューティカルズ(IDUN pharmaceuticals,San Diego CA)から入手した。アポトーシスプロテアーゼインヒビターであるカスパーゼ-１インヒビターＶ(Caspase-1 Inhibitor V)はカルバイオケム(CalBiochem,La Jolla,CA)から入手した。全てのストックプロテアーゼインヒビターはＤＭＳＯに溶解し、次いでハイポサーモゾルＴＭに希釈した。ビタミンＥは、ハイポサーモゾルＴＭに添加する前にＤＭＳＯ(シグマ)に溶解した。ビアスパン(登録商標)は、Ｄｒ．アン・ロビコード(Anne Robichaud,Dupont Merck Pharmaceutical Company,Wilmington,DE.)により快く寄贈頂いた。デュポン-メルクとの協定に従い、ビアスパンＴＭはここに記述した実験のためにどのような変更(例えば、ＥＤＴＡまたはビタミンＥの添加等)も加えなかった。全ての実験は少なくとも３回は繰り返した。
【００５０】
ＤＮＡゲル電気泳動。ＭＤＣＫ細胞は、７５ｃｍ２Ｔフラスコ(Cornin Inc.,Corning,NY)中でコンフルエントな状態で、ハイポサーモゾルＴＭまたはＤＭＥの何れかにおいて、４℃で１から６日間、低温保存した。次に、細胞培養物を３７℃にし、培地を上述の通りに置換した。当該細胞は、３７℃で細胞培養用培地中で再生した。次に、−７０℃で保存するために、この再生期間を通して剥離した細胞を、濯ぎ、ＳＴＥ緩衝液(8%のショ糖、50mMのTris-HCl、50mMのEDTA、ｐH8.0)の０．５ｍLに再懸濁した。接着細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離し、同様に保存した。
【００５１】
これらの細胞を解凍し、１．６ｍＬのマイクロフュージチューブで５００×ｇでペレットにした後、それらを消化緩衝液{100mMのNaCl、10mMのTris-HCl、25mMのEDTA(pH8.0)、10%のSDS}に再懸濁し、２６ゲージの皮下用注射針を装着した１．０ｍＬの注射筒を用いて破壊した。異なったフェノール−クロロホルム抽出液を用いてたんぱく質を沈殿した。得られた水相に対して３Ｍの酢酸ナトリウムと１００％の氷冷エタノールの添加に続き、−２０℃で全核酸を沈殿した。乾燥核酸ペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ(pH8.0)−０．１％ドデシル硫酸ナトリウムに再懸濁した。ＲＮＡは、１００μｇ／ｍＬの最終濃度でのＲＮａｓｅＡ(シグマ)の添加を経て変性し、続いて、少なくとも３０分間３７℃でインキュベートした。界面にデブリスがなくなるまで、フェノール−クロロホルム抽出を行った。ＤＮＡは前述した通りに沈殿し、ＴＥ{10mMのTris-HCl(pH8.0)、1mMのEDTA}に再懸濁した。
【００５２】
変性したＤＮＡと正常なＤＮＡを、標準的なアガロースゲル電気泳動を使用して可視化した。ＤＮＡは、１．５％アガロースゲル上で９０ＶでＴＡＥ緩衝液{40mMのTris-アセテート、2mMのEDTA(pH8.0)}中で分離した。
【００５３】
データ分析
蛍光ユニットは、実験コントロールを基にしてパーセント生存率に変換した。標準偏差の算出を行い、統計学的な有意差はＡＮＯＶＡを使用して決定した(表１)。
【００５４】
例Ｉ
ＭＤＣＫ細胞を２４ウェルプレートでコンフルエントになるまで培養した。次に、培地を注ぎ出し、ハイポサーモゾルＴＭ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを追加したハイポサーモゾルＴＭ、１ｍＭのビタミンＥを追加したハイポサーモゾルＴＭ、ビアスパンＴＭまたはＤＭＥの何れかをウェルに添加した。ＭＤＣＫ細胞を次に４℃で７日間保存し、３７℃で４日間与えて再生した。これらの４日間の夫々の日において(低温から移動した直後、即ち「０」日、も同様に)、培地を注ぎ出し、当該細胞を１時間３７℃でアラマーブルーＴＭ中でインキュベートした。各ウェルの相対的な蛍光レベルをサイトフルオロを使用して定量した。次に、当該細胞におけるアラマーブルーＴＭ溶液を注ぎ出し、当該ウェルに胎児ウシ血清を含有するＤＭＥで満たし、当該プレートを３７℃のインキュベーター内に２４時間戻した。この時期の終わりに、他のアラマーブルーＴＭアッセイを実施した。表１に記述したデータは、ビタミンＥまたはＥＤＴＡを含むハイポサーモゾルＴＭ中で低温保存した細胞が、改変なしのハイポサーモゾルＴＭまたはビアスパンＴＭの何れかにおいて保存された細胞に比較してより高い蛍光レベルを有していたことを示している。
【００５５】
例ＩＩ
アラマーブルーＴＭが本当に生存率を反映しているかどうかを試験するために、膜完全性染色を同様に使用した。ＭＤＣＫ細胞を、ハイポサーモゾルＴＭ、ビタミンＥを追加されたハイポサーモゾルＴＭ、ＥＤＴＡを追加されたハイポサーモゾルＴＭ、またはＤＭＥの何れかにおいて４℃で７日間維持した。低温から３７℃に細胞を移動した直後に、当該細胞をアラマーブルーＴＭで１時間インキュベートし、サイトフルオロを使用して蛍光量を定量した。続いて、全アラマーブルーＴＭを細胞から洗い去り、膜完全性染料、即ち、カルセイン-ＡＭ、を３７℃で１時間添加した。取り込まれなかった染料は細胞から洗い去り、ハンクス平衡化塩溶液に取り替えて、得られた蛍光細胞をサイトフルオロで分析した。得られたデータは図４に示す。アラマーブルーＴＭの蛍光レベルはカルセインの蛍光レベルに類似することに注意されたい。
【００５６】
例ＩＩＩ
ビタミンＥおよびＥＤＴＡを試験し、これらの追加が更なる作用を有するか否かを決定した。ビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭ、ＥＤＴＡ含有ハイポサーモゾルＴＭ、ビタミンＥおよびＥＤＴＡの両方を含有するハイポサーモゾルＴＭ、ベースのハイポサーモゾルＴＭ中で、ＭＤＣＫ細胞を１１日間に亘って低温保存した。これらの種々の溶液をビアスパンＴＭまたはＤＭＥ中で保存した細胞と比較した。最高成績の溶液はビタミンＥとＥＤＴＡを共に含有するハイポサーモゾルＴＭであることに注目されたい（図３）。
【００５７】
例ＩＶ
ＤＭＥ中で１または２日間保存されたＭＤＣＫ細胞を、３７℃で３日間与えて再生した。低温保存の結果として、多くの細胞は基層からデタッチされ、これを回収した。それらのＤＮＡを単離し、ＤＮＡゲル上で特徴付けした(図６、レーン３および４)。また、１日の低温保存後に基層に対して付着され維持された細胞も回収し、それらのＤＮＡを単離し、ＤＮＡゲル上で特徴付けした(図６、レーン２)。(１および２日の低温保存後の付着細胞からのＤＮＡも同様に処理したが、１日間の低温において保存された細胞からのＤＮＡのみ、ここで代表して示した)。レーン３および４のＤＮＡはラダー様外見を有するが、これに対して付着細胞からのＤＮＡ(レーン２)は正常に見え、正常なゲノムＤＮＡを示す高分子量のバンドを示す。
【００５８】
例Ｖ
同様なプロトコールを、ハイポサーモゾルＴＭ中で１、２、４、５および６日間(図６、レーン6-10)保存し、３７℃で３日間与えて再生したＭＤＣＫ細胞について実施した。１日間保存した培養物において付着が維持された細胞のＤＮＡ(レーン５)は、２から６日間の低温保存後に付着していた細胞(データは示さず)と同様なシングルバンドのように見えた。しかしながら、剥がれた細胞は、ラダー様の全ての２００塩基が現れるバンドを有するアポトーシス性の周期を示した。また、これらのレーンの最上部には、接着した細胞から単離された正常なＤＮＡにおいてははっきりとは認められなかったスメアがあった。当該プレートの４℃での保存が長くなればなる程、デタッチした細胞の数がより多くなった(データは示さず)。図４における各レーンには同量のＤＮＡをロードしたので、この観察は該ゲルにおいては見られない。低温保存のより早い時期ではよりはっきりとしたラダー様が示され(レーン6-8)、より遅い保存期間ではＤＮＡスメアがひどい(レーン9-10)ことに注目されたい。
【００５９】
例ＶＩ
低温保存に暴露されたための細胞死においてアポトーシスが関連する可能性は、ハイポサーモゾルＴＭへのアポトーシスプロテアーゼインヒビターの添加により試験できた。アポトーシス特異的プロテアーゼパンインヒビターであるＩＤＵＮ−１５２９およびＩＤＵＮ−１９６５をハイポサーモゾルＴＭに添加し、当該細胞を６時間、低温保存した。回復期間においては何れのプロテアーゼインヒビターも添加しなかった。ＩＤＵＮ−１５２９(100μM)とＩＤＵＮ−１０６５(100μM)の両者とも、この期間のＭＤＣＫ細胞を保護できた(図５)。更なるアポトーシス特異的プロテアーゼインヒビター、カスパーゼ−１インヒビターＶも同様に試験した。図６のデータは、カスパーゼ−１インヒビターＶの添加が、濃度依存的にハイポサーモゾルＴＭの低温保存能力を改善することを示す。
【００６０】
例ＶＩＩ
実験は、前立腺癌細胞株であるＰＣ−３をインビトロモデルとして使用するように設計し、細胞死の基本的な分子的機序における温度の影響を試験した。コンフルエントのＰＣ−３培養物を３７℃から−８０度の温度に暴露し、２日間を与えて回復させた。死亡および生存細胞を単離し、アガロースゲル電気泳動を使用してＤＮＡ断片化についてアッセイした。−５℃以上の温度に曝した細胞は、非ランダムＤＮＡ断片化(アポトーシス細胞死の特徴)を示した；ところが、−１５℃より低温に曝した細胞では、ランダムＤＮＡ断片化によって明らかである通り、主にネクローシスを経て死に至った。次に、細胞生存能について、非侵略的な代謝インジケーターであるアラマーブルーＴＭを用いて低温暴露後にアッセイを行った。著しく、アポトーシスインヒビターであるＩＤＮ−１５２９(これは−１０℃以下への暴露に続くアポトーシスのＤＮＡラダーリングを完全に阻害した)は、また、−１０から−７５℃までの範囲の温度に暴露した培養物における細胞死を部分的に阻害した。この阻害は、死の主な原因がネクローシスであるらしい温度でさえも生じた。概略すると、(1)ＰＣ−３細胞は、アポトーシスまたはネクローシスの何れかによって死に至り、死の様式は、ｔｒｅａＴＭｅｎｔ温度により決定されることと、(2)アポトーシスインヒビターは、全くネクローシスであるような処理のＰＣ−３細胞の細胞死でさえも阻害するということが結論付けられる。
【００６１】
例ＶＩＩＩ
液体窒素中(約-196℃)の低温保存からの解凍後２４時間のＭＤＣＫ細胞株のパーセント生存率を示す標本実験を図１２に示す。「培地」：コントロール細胞は、で３７℃で、ダルベッコ最小必須培地(DME)、「細胞外様の(extracellular)」培地、において試験細胞が供された凍結から解凍までの同じ期間に亘って維持された；ＤＭＥ：未知の低温保存機能を有するＤＭＥ培養用培地において凍結および解凍された細胞；ＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯ：低温保存剤としてＤＭＳＯを使用した標準的な従来の条件下で凍結および解凍された細胞；ＤＭＥ＋１０％ＤＭＳＯ：更なるＤＭＳＯ低温保存剤を含有する標準的な条件下で凍結および解凍された細胞；ビアスパンＴＭ：腎臓、肝臓および膵臓凍結保存(約0-5℃)に使用される商業的に入手可能な「細胞内様の(intracellular)」臓器維持溶液において凍結および解凍された細胞；ＨＴＳ：高濃度の公知の低温保護剤を使用せずに、標準的な培地＋ＤＭＳＯと同様の低温保存効果を提供する、細胞、組織および臓器の冷保存のために設計された細胞内様(intracellular)培地であるハイポサーモゾルＴＭ中で凍結および解凍された細胞；クライオスターＴＭＣＳ５(HTS+5%DMSO)：ハイポサーモゾルＴＭプラス５％ＤＭＳＯにおいて凍結および解凍された細胞、ここで、ＤＭＳＯはＨＴＳ単独よりも細胞生存能を改善した(統計学的に有意差あり)；クライオスターＴＭＣＳ１０(HTS+10%DMSO)：ハイポサーモゾルＴＭプラス１０％ＤＭＳＯにおいて凍結および解凍された細胞、ここでＤＭＳＯは、思いがけなくＨＴＳ単独よりも細胞生存能を改善した(統計学的に有意差あり)；ＨＴＳ＋１ｍＭコレステロール：ハイポサーモゾルＴＭプラス１ｍＭコレステロールにおいて凍結および解凍された細胞、ここで、コレステロールは、膜安定化剤であり、ＨＴＳ低温保護レベルを低下する；ＨＴＳ＋５ｍＭビタミンＥ：ハイポサーモゾルＴＭおよび５ｍＭビタミンＥにおいて凍結および解凍された細胞、ここで、ビタミンＥは細胞膜安定化剤であり、ＨＴＳ低温保護レベルを増進する。
【００６２】
本発明は、詳細に且つその明らかな態様について記述されいるが、当該記述分野において通常の技術を有する者には、種々の変更や改良が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされることは明らかであろう。
【００６３】
ここに引用される全ての引用文献は、参照されることによりここに組み込まれる。
【００６４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＤＭＥ、ビアスパンＴＭ、ハイポサーモゾルＴＭ、ＥＤＴＡ含有ハイポサーモゾルＴＭ、またはビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭにおけるマディン・ダービー・ケーナイン腎(MDCK)細胞の7日間の冷蔵保存の効果。ＭＤＣＫ細胞は、２４ウェルプレートにおいてコンフルエントまで増殖させ、上記の５溶液の１つにおいて４℃での低温保存に供した。７日の最後に、細胞を４℃から３７℃に移動し、更なる４日間維持した。細胞生存能はこれらの各日において評価した。冷蔵保存溶液の効果はビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭ＞ＥＤＴＡ含有ハイポサーモゾルＴＭ＞ハイポサーモゾルＴＭ＞ビアスパンＴＭ＞ＤＭＥであったことに注目されたい。
【図２】  種々の評価アッセイを使用したＭＤＣＫ細胞の低温保存(-196℃)の結果であるパーセント生存率の比較。
【図３】  低温保護剤の添加ありおよびなしの、細胞外様(DME)および細胞内様(HTS)担体溶液の両方におけるＭＤＣＫ細胞の低温保存の解凍蘇生の５日後の比較結果。標準偏差および統計学的有意差を表１に示した。注：クライオスターＣＳ５ＴＭはＨＴＳ＋５％ＤＭＳＯである。
【図４】  ＤＭＥ、ハイポサーモゾルＴＭ、ＥＤＴＡ含有ハイポサーモゾルＴＭ、またはビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭにおけるＭＤＣＫ細胞の７日間の冷蔵保存の影響−細胞膜完全性および生存能のアッセイ。ＭＤＣＫ細胞は、２４ウェルプレートにおいてコンフルエントまで増殖させ、ＤＭＥ、ハイポサーモゾルＴＭ、ＥＤＴＡ含有ハイポサーモゾルＴＭ、またはビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭにおいて４℃で７日間の低温保存に供した。当該低温からの移動の直後に細胞をアラマーブルーＴＭとカルセイン−ＡＭとでアッセイした。蛍光レベルはビタミンＥを添加したハイポサーモゾルＴＭ中で保存させた細胞において最も高いものだったことに注目されたい。これはこの溶液が生存能(アラマーブルーＴＭ)および細胞膜の完全性(カルセイン−ＡＭ)を最もよく保護し得ることを示す。
【図５】  低温保存(-196℃)したＭＤＣＫ細胞の解凍後の２４および４８時間のＤＮＡゲル電気泳動。レーン１、７および１３は、ＨｉｎｄＩＩＩでのλＤＮＡ切片(23.1、9.4、6.5、4.3、2.3、2.0および0.5Kb)を含み、それに対してレーン２、８および１４は単離された生存する接着ＭＤＣＫ細胞からの正常なゲノムＤＮＡを含む。レーン３−６および９−１２は、死んで浮かび上がった細胞から単離されたＤＮＡを示す。レーン３および９はＤＭＥ中で保存された細胞からのＤＮＡを含み、レーン４および１０はＤＭＥ＋５％ＤＭＳＯで保存された細胞からのＤＮＡを含み、レーン５および１１はハイポサーモゾルＴＭで保存された細胞からのＤＮＡを含み、レーン６および１２はクライオスターＣＳ５ＴＭで保存された細胞からのＤＮＡを含む。
【図６】  ＤＭＥまたはハイポサーモゾルＴＭにおいて低温保存されたＭＤＣＫ細胞から単離されたＤＮＡのゲル電気泳動。ＭＤＣＫ細胞は以下の通りに、ＤＭＥまたはハイポサーモゾルＴＭの何れかにおいて種々の時間に亘り４℃で低温保存された：レーン１−分子量マーカー；レーン２−ＤＭＥにおける１日の低温保存後の接着細胞；レーン３−ＤＭＥにおける１日の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン４−ＤＭＥにおける２日間の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン５−ハイポサーモゾルＴＭにおける１日の低温保存後の接着細胞；レーン６−ハイポサーモゾルＴＭにおける１日の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン７−ハイポサーモゾルＴＭにおける２日の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン８−ハイポサーモゾルＴＭにおける４日の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン９−ハイポサーモゾルＴＭにおける５日の低温保存後の浮き上がった細胞；レーン１０−ハイポサーモゾルＴＭにおける６日の低温保存後の浮き上がった細胞。
【図７】  ＤＭＥ、ハイポサーモゾルＴＭ、ＩＤＵＮ−１５２９含有ハイポサーモゾルＴＭ(HTS+AI-1、100μM)、およびＩＤＵＮ−１９６５含有ハイポサーモゾルＴＭ(HTS+AI-2、100μM)におけるＭＤＣＫ細胞の6日間の冷蔵保存の影響。ＭＤＣＫ細胞は24ウェルプレート中でコンフルエントまで増殖させ、上記の４の溶液の１において４℃で低温保存に供した。6日目の終わりに細胞を４℃から３７℃にし、５日間追加培養した。細胞の生存率は毎日定量した。両阻害剤はハイポサーモゾルＴＭにおける冷蔵保存力を改良したことをに注目されたい。
【図８】  ハイポサーモゾルＴＭおよび記述した濃度のカスパーゼ−１インヒビターＶ(AI V)を含有するハイポサーモゾルＴＭにおけるＤＭＣＫ細胞の７日間の冷蔵保存の影響。ＭＤＣＫ細胞は２４ウェルプレートにおいてコンフルエントまで培養し、５つのインヒビター溶液の１を含むハイポサーモゾルＴＭまたはインヒビターを含まないハイポサーモゾルＴＭにおいて低温保存に供した。７日目の終わりに、細胞を４℃から３７℃に移し、３日間追加培養した。細胞の生存能はこれらの毎日において評価した。このインヒビターは濃度依存的にハイポサーモゾルＴＭの低温保存能を改善したことに注目されたい。
【図９】  細胞内様溶液：ハイポサーモゾルＴＭ(HTS)、HTS+アポトーシスインヒビター(カスパーゼIインヒビターV)、クライオスターＣＳ５ＴＭおよびクライオスターＣＳ５ＮＴＭ(クライオスターＣＳ５ＴＭ＋カスパーゼＩインヒビターＶ)における低温保存されたＭＤＣＫ細胞の解凍回復５日後の比較。標準偏差および統計学的有意差を表１に示す。
【図１０】  ＤＭＥ、ビアスパンＴＭ、ハイポサーモゾルＴＭ、ハイポサーモゾルＴＭとビタミンＥ、ハイポサーモゾルＴＭとＥＤＴＡ、ＥＤＴＡおよびビタミンＥ含有ハイポサーモゾルＴＭにおけるＭＤＣＫ細胞の冷蔵保存１１日間の影響。ＭＤＣＫ細胞は、２４ウェルプレートにおいてコンフルエントまで培養し、４℃で１１日間低温保存し、それに続いて、３７℃で毎日アッセイした。効果の順位はＴＨＳ＋ビタミンＥおよびＥＤＴＡ＞ＨＴＳ＋ビタミンＥ＞ＴＳ＋ＥＤＴＡ＞ＨＴＳ＞ビアスパンＴＭ＞ＤＭＥであったことに注目されたい。データはビタミンＥとＥＤＴＡの効果は、付加的であることを示している。
【図１１】  低温保護剤添加ありおよびなしの種々の細胞内様担体溶液(HTSおよびビアスパンＴＭ)において低温保存(-196℃)されたＭＤＣＫ細胞の解凍回復５日後の比較。標準偏差および統計学的有意差を表１において報告する。
【図１２】  液体窒素(約-196℃)における２４時間の低温保存からの解凍２４時間のＭＤＣＫ細胞株のパーセント生存率を示すサンプル実験。
【図１３】  表記濃度のＤＭＳＯ含有および非含有ＤＭＥ並びにＨＴＳ、種々の培地での低温保存、並びに非凍結コントロールの間での影響の比較。凡例は図１２に記載する通りである。
【図１４】  図１３に記載のグループの詳細。ここで、細胞は液体窒素において１−７日間凍結し(グループ当たりの持続期間は重要ではない)、１−５日の凍結後回復期間を測定した。傾斜は時間当たりの細胞回復を示す。当該回復過程は、ＨＴＳを低温保護培地として使用した場合、またはＤＭＳＯを担体培地として使用した場合に促進される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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