(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、
開口絞りと、
前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、
前記開口絞りと共役な前記対物レンズ内の位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、
前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第１透過率変調部と、
前記第１透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第２透過率変調部とを有し、
前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きく、
前記第２透過率変調部の波長４００ｎｍにおける透過率をＴ400、
前記第２透過率変調部の波長５５０ｎｍにおける透過率をＴ550、
前記第２透過率変調部の波長７００ｎｍにおける透過率をＴ700とそれぞれしたとき、
Ｔ400＜Ｔ550＜Ｔ700
の条件を満足することを特徴とする位相差観察装置。
【請求項２】
前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きく、かつ、所定の波長領域においてほぼ直線状に増加することを特徴とする請求項１記載の位相差観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、位相差観察装置、特に生物標本などの無色透明な物体を染色すること無しに観察できる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡は、被検物体を照明系の開口位置に配した絞りによって制限された照明光で照明し、対物レンズ内に開口絞りと共役位置に位相を変換する位相膜を配して、被検物体（位相物体）によって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変えている。これにより、被検物体の位相差を像の明暗として可視化して観察することができる。この位相差顕微鏡は、１９３５年にF.Zernikeにより発明され、原理に関しては、例えば応用光学１（培風館、１９９０、鶴田匡夫、Ｐ．２５６−２５９位相差法）、又はFundamentals of Optics (4th edition, McGrawhill,1982, Jenkins & white, P.602-604, Phase contrast microscope)に記載されている。
【０００３】
図４（ａ）に示した位相差顕微鏡の構成図を用いて原理を簡単に説明する。不図示の光源からの波長λの照明光が、図下方から輪帯状の開口部を有するリング絞りＡＰを透過する。絞りＡＰは、コンデンサレンズＧｌの前側焦点位置Ｆに配置されており、被検物体Ｏを照明する光束を図４（ｂ）に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Ｏを透過した光は、対物レンズＧ２，Ｇ３によって像面Ｉに集光され像が形成される。ここで、対物レンズＧ２の後ろ側焦点位置Ｆ’には位相板ＰＨ１が設けられている。リング絞りＡＰと位相板ＰＨ１とは共役な関係となっている。そして、位相板ＰＨ１は、リング絞りＡＰの開口部と共役な形状で透過光に位相差λ／４を与える位相膜ＰＰを有している。また、位相板ＰＨ１は、透過光量を弱めるための変調膜ＮＤも有している。
【０００４】
被検物体Ｏを透過する際に、物体で回折された光束は、直接光Ｌ１と±１次の回折光Ｌ２とに分かれて位相板ＰＨ１を通過する。直接光Ｌ１と回折光Ｌ２とが位相板ＰＨ１を透過する際に、直接光Ｌ１の通過する部分に位相膜ＰＰを設け、例えば直接光Ｌ１の位相がλ／４進むように構成されている。位相がλ／４進んだ直接光Ｌｌは、位相がλ／４遅れた回折光Ｌ２と像面Ｉの位置で干渉して弱め合う。これに対して、位相物体が無い部分では回折光が生じないため、直接光Ｌｌの明るさの背景となる。これにより、物体Ｏの位相差を、像の明暗として観察できる。また、±１次の回折光Ｌ２の振幅は、ベッセル関数を用いてJ1(B)で表される。そして、位相差量に応じて変化する回折光の強度J12(B)に合わせて、位相膜ＰＰに透過光量を弱めるニュートラルデンシティ膜などの透過率変調膜が施されている。透過率変調膜により直接光Ｌ１の振幅と回折光Ｌ２の振幅とを等しくした場合に、背景光に対し位相物体が最もコントラスト良く観察することができる。
【０００５】
ニュートラルデンシティ膜の分光透過率Ｔ1は、例えば図５に示すように波長に対してほぼフラット（一定）でほぼ２５％となっている。そして、直接光Ｌ１の振幅と回折光Ｌ２の振幅とが等しい場合に、背景光に対し位相物体が最もコントラスト良く観察できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術で述べた位相差顕微鏡では、被検物体の位相差が小さい場合は、直接光Ｌ２の透過率を低くして位相差量の検出感度を高くした、いわゆる高コントラストタイプが用いられている。この時の位相板ＰＨ１上の変調膜ＮＤの透過率は１０％〜２５％程度であることが望ましい。高コントラストタイプの位相差顕微鏡の場合、微小な位相差量の物体を検出することができる反面、位相差量が大きい物体を観察すると直接光と回折光の振幅量が逆転して、コントラストの反転した像が形成されてしまう。このため、物体像の周囲に、位相差又は構造に応じた隈取り状の光の滲みが生ずる。この現象はハロー（ｈａ１ｏ）と呼ばれる。ハローが生じると良好な観察が妨げられるばかりか、さらに被検物体の構造を誤認して観察するおそれがあり問題である。
【０００７】
一方、位相差量の大きい被検物体を観察する際は、ハローが生じにくいように直接光Ｌ１の透過率を高くした低コントラストタイプの位相差顕微鏡が用いられている。この時の位相板ＰＨ１上の透過率変調膜ＮＤの透過率は２５％〜５０％程度であることが望ましい。低コントラストタイプの顕微鏡の場合は、ハローが生じにくい代わりに、微小な位相差量の物体を観察した場合に、観察像のコントラストが低くなってしまい、良好な像の検出が困難になるという問題がある。
【０００８】
また、上記問題に加えて、白色光を用いて位相差顕微鏡観察を行う場合はさらに以下の問題が生じる。図６に示すような長さｄ、屈折率ｎ１の位相物体を観察する場合、屈折率は波長によって異なるが、通常の分散の程度であり可視光域では１〜２％の差であるため、ほぼ一定であるとみなせる。そして、位相物体中の光路長は、屈折率ｎｌ×長さｄで求めることができ、屈折率ｎ２の外部媒質中の光路長ｎ２×ｄとの差（ｎ１−ｎ２）×ｄが位相差量になる。位相差量は使用波長を単位として表されるため、同一の被検物体で生じる位相差量は光の波長にほぼ反比例する。例えば、５５０ｎｍの波長で０．１λの位相差量を有する被検物体の場合、波長４００ｎｍでは約０．１４λの位相差量になる。このため、例えば波長５５０ｎｍでハローが生じない被検物体でも波長４００ｎｍではハローが生じるという問題がある。
【０００９】
この問題を解決するために、位相板ＰＨ１上の変調膜ＮＤの透過率Ｔ1を波長によって１０％〜４０％程度の範囲で変えるという方法も考えられる。例えば、図７に示すように変調膜ＮＤの短波長側の透過率を長波長側より高くするという方法である。このような透過率にすることによって短波長側では低コントラストタイプの位相差顕微鏡として作用し、長波長側では高コントラストタイプの位相差顕微鏡として作用するので、短波長側で生じやすいハローを軽滅することができる。しかし、位相板上の変調膜ＮＤの分光透過率特性を単波長側で高い透過率に設定するという方法では、観察像の背景光の分光透過率を変えてしまうために背景に色づきが生じてしまう問題がある。例えば、図７に示すような短波長側で透過率が高い場合は、背景が青色になってしまう現象が生ずる。
【００１０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、被検物体の位相差に関わらず、背景光の色づきを低減し、良好なコントラストの像を観察できる位相差観察装置を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決する為の手段】
上記課題を解決するために、本発明は、光源と、前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、開口絞りと、前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、前記開口絞りと共役な前記対物レンズ内の位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第１透過率変調部と、前記第１透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第２透過率変調部とを有し、前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きく、
前記第２透過率変調部の波長４００ｎｍにおける透過率をＴ400、
前記第２透過率変調部の波長５５０ｎｍにおける透過率をＴ550、
前記第２透過率変調部の波長７００ｎｍにおける透過率をＴ700とそれぞれしたとき、
Ｔ400＜Ｔ550＜Ｔ700
の条件を満足することを特徴とする位相差観察装置を提供する。
【００１３】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きく、かつ、所定の波長領域においてほぼ直線状に増加することが望ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。図１（ａ）は、本発明の実施形態にかかる位相差顕微鏡の概略構成を示す図である。図１（ａ）の構成において、前述した従来技術のものと同じ構成部分については同一の符号を用いている。
【００１５】
光源ＬＳからの波長λの照明光が、図下方からリング状の開口部を有するリング絞りＡＰを透過する。絞りＡＰは、コンデンサレンズＧｌの前側焦点位置Ｆに配置されており、開口絞りとして被検物体Ｏを照明する光束を図１（ｂ）に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Ｏを透過した光は、対物レンズＧ２，Ｇ３によって像面Ｉに集光され像が形成される。ここで、対物レンズＧ２の後ろ側焦点位置Ｆ’には位相板ＰＨが設けられている。位相板ＰＨのうち、透過率変調部Ａとリング絞りＡＰとは共役な関係となっている。また、透過率変調部Ａは、リング絞りＡＰの開口部と相似な形状であり、かつ透過光に位相差λ／４を与える位相膜ＰＰを有している。また、位相板ＰＨは光量を弱める変調膜ＮＤも有している。
【００１６】
位相板ＰＨの構成を図２を用いてさらに詳しく説明する。透過率変調部Ａは、リング絞りＡＰの開口部に対して所定倍率の相似形状である。所定倍率として、コンデンサレンズＧ１と対物レンズＧ２との合成倍率、即ち、絞りＡＰがレンズＧ１とＧ２とによりリレーされる倍率であることが望ましい。さらに好ましくは、位相板ＰＨの位置調整の容易性等を考慮して、リング絞りＡＰの開口部に対応するリレー倍率で定まる幅よりやや広めであることが望ましい。そして、透過率変調部Ａの外周及び内周の周囲部分には、透過率変調部Ｂが透過率変調部Ａを取り囲むように設けられている。透過率変調部Ｂの幅は、透過率変調部Ａと同一又は若干広い程度であることが望ましいが、これに限られるものではない。透過率変調部Ａ、Ｂはいずれも輪帯形状である。
【００１７】
透過率変調部Ａの透過率ＴＡは、波長４００ｎｍ〜７００ｎｍまでの可視光域全体で２５％に設定されている。また、透過率変調部Ｂの透過率は、波長４００ｎｍにおける透過率ＴＢ400は３０％、波長５５０ｎｍにおける透過率ＴＢ550は４０％、波長７００ｎｍにおける透過率ＴＢ700は５０％とそれぞれなるようにニュートラルデンシティ膜などを使用して調整されている。また、図からも明らかなように、波長４００ｎｍ、５５０ｎｍ、７００ｎｍの間の波長領域における透過率は、ＴＢ400とＴＢ550とＴＢ700とを通るほぼ直線状に変化している。さらに、位相板ＰＨの最外周部分及び中心部分付近Ｃは、透過率変調を行なっていない、透過率ＴＣが１００％の部分である。
【００１８】
次に、本実施形態の位相板ＰＨを用いた場合の、位相差観察の原理について説明する。物体の構造によって生じる回折光Ｌ２の回折角θは、使用波長をλ、媒質の屈折率をｎ、物体構造の周期をｄとしたとき、次式で表される。
【００１９】
θ＝ｓｉｎ-1｛０．６１λ／（ｎ・ｄ）｝
ただし、０≦θ≦π／４である。
【００２０】
一般に、生物標本では、位相差量は物体の構造の大きさにほぼ比例するので、位相差量の大きい物体では、構造も大きい、即ち、上式でｄが大きいという特徴が存在する。このとき、ｎ、λが定数ならばθが小さくなる。
【００２１】
また、回折光Ｌ２と直接光Ｌ１との距離Ｐ（図１参照）は次式で表すことができる。
【００２２】
Ｐ＝ｆ２・ｓｉｎθ
ここで、ｆ２は対物レンズＧ２の焦点距離、θは回折角をそれぞれ表している。
【００２３】
位相差量の大きい物体（構造の大きな物体）を観察する場合は、回折角θは小さいので、直接光Ｌ１と回折光Ｌ２との距離Ｐが小さくなり、直接光Ｌ１は透過率変調部Ａ、±１次の回折光Ｌ２は透過率変調部Ｂをそれぞれ通過する。透過率変調部Ｂの分光透過率は図３で示したように、短波長側で低く、長波長側で高いので、低コントラストタイプの構成と同様の効果となる。即ち、被検物体によって生じる位相差量の波長による違いを、長波長側よりも短波長側でより低コントラストタイプに作用させることでコントラストの調整を良好に行うことが出来る。
【００２４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、電気的なコントラスト変調装置を用いることなく、きわめて単純な構成で、位相差量の大きい構造物でもハローの少ない観察ができ、位相差量の小さい構造物も高いコントラストで観察できる。また、短波長側で顕著に発生するハローを背景光の色づきなしに軽減することができため、被検物体の位相差量の大小にかかわらず、白色光による照明で、検知能力に優れた位相差顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態にかかる位相差観察装置の概略構成を示す図である。
【図２】位相板の構成を示す図である。
【図３】位相板の分光透過率を示す図である。
【図４】従来の位相差顕微鏡の構成を示す図である。
【図５】従来の位相差顕微鏡の位相板の分光透過率を示す図である。
【図６】位相物体の構造を示す図である。
【図７】従来の位相差顕微鏡の位相板の分光透過率を示す他の図である。
【符号の説明】
Ａ，Ｂ，Ｃ  透過率変調部
ＰＰ  位相膜
ＮＤ  ニュートラルデンシティ膜
ＰＨ，ＰＨ１  位相板
ＡＰ  開口絞り
Ｇ１  照明系レンズ
Ｇ２，Ｇ３  対物レンズ
Ｏ  被検物体
Ｉ  観察像（像面）
Ｌ１  直接光
Ｌ２  回折光
ＬＳ  光源
【図１】
0004370636.tif 000002
【図２】
0004370636.tif 000003
【図３】
0004370636.tif 000004
【図４】
0004370636.tif 000005
【図５】
0004370636.tif 000006
【図６】
0004370636.tif 000007
【図７】
0004370636.tif 000008