(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子組換え技術によるヒトトロンビンの製造方法：
１)ニワトリβ−アクチンプロモーターの下流に、プロトロンビンのプレプロリーダー配列をその上流に付加したヒトプレトロンビンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより形質転換された動物細胞からなる形質転換体を培養し、培養液中にヒトプレトロンビンを生成蓄積せしめこれを採取する工程、
２)１）の工程で採取・回収されたヒトプレトロンビン含有溶液を、エカリンを作用させて活性化してヒトトロンビンに変換させる工程、
３)２）の活性化工程を経た反応液より、純化されたヒトトロンビンを得る精製工程。
【請求項２】
発現ベクターが、さらに遺伝子増幅遺伝子を有し、さらに形質転換体の培養を遺伝子増幅条件下に実施する請求項１ 記載のヒトトロンビンの製造方法。
【請求項３】
遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子である請求項２記載のヒトトロンビンの製造方法。
【請求項４】
プレプロリーダー配列をその上流に付加したヒトプレトロンビンをコードする遺伝子が、配列番号１１に記載の塩基配列で示される遺伝子断片である請求項１から３のいずれかに記載のヒトトロンビンの製造方法。
【請求項５】
形質転換体がチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ２１細胞、２９３細胞またはＣＯＳ細胞より選択される動物細胞である、請求項１から４のいずれかに記載のヒトトロンビンの製造方法。
【請求項６】
ヒトプレトロンビンの活性化に使用されるエカリンが遺伝子組換え技術を用いて調製されたものである、請求項１記載のヒトトロンビンの製造方法。
【請求項７】
ヒトトロンビンの精製工程が、ヒルジンペプチドとの親和性クロマトグラフィーを実施することより構成される請求項１記載のヒトトロンビンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、医療用医薬品の分野に属し、詳細には止血剤として使用され得るトロンビンに関する。さらに詳細には、遺伝子組換え技術を駆使して調製される遺伝子組換えトロンビン及びその製造方法に関する。
背景技術
トロンビンは止血血栓の形成や創傷治癒などの生命の維持進展に不可欠な作用を有するトリプシン様セリンプロテアーゼである。トロンビンにはメイゾトロンビン、α−トロンビン、β−トロンビン、γ−トロンビンが存在するが生理的にはα−トロンビンが重要である。トロンビンの前駆体であるプロトロンビンはビタミンＫ依存的に肝細胞で生合成され、その血中濃度は１００−１５０μｇ／ｍｌである。ビタミンＫ依存性凝固因子はＮ末にＧｌａを含む領域（Ｇｌａドメイン）を有し、Ｃａ２＋イオンを介してリン脂質と結合する性質を有する。このＧｌａドメインがＣａ２＋と結合するとタンパク全体の高次構造の変化が起こり、補助因子と相互作用する重要な機能を発現することがわかっている。
プロトロンビンは細胞膜リン脂質上でのＦＸａ−ＦＶａ複合体により活性化反応を受け、プロトロンビンのＡｒｇ３２０−ＩＬｅ３２１結合が限定分解を受け、Ｇｌａドメインやクリングルドメインをもったメゾトロンビンが形成される。次いでＡｒｇ２７１−Ｔｈｒ２７２結合が限定分解されα−トロンビンが生成され細胞膜から遊離し、多くの血漿タンパクや種々の細胞膜のトロンビン受容体を限定分解して多様な生理活性を示す。α−トロンビンはＡ鎖とＢ鎖からなる２本鎖分子であるが、酵素活性に重要なＢ鎖がさらに自己消化されるとβ−トロンビン、γ−トロンビンとなりフィブリノーゲンや血小板の活性化能を失う。
生成されたトロンビンの多くはフィブリン血栓に結合して局所におけるより大きな血栓の形成に関わる。α−トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換させる酵素であるとともに、ＦＸＩＩＩを活性化してフィブリンを架橋結合させる引き金でもある。さらに、それぞれＦＩＸやＦＸａの補助因子であるＦＶＩＩＩやＦＶを活性化して凝固を進行させる凝固促進機能をもつ。このように、トロンビンは止血作用においては重要な役割を果たすことから止血剤としては極めて有用なタンパクである。
一方、トロンビンは血管内皮細胞上のトロンボモジュリンと結合するとその基質特異性が変化して、プロテインＣを活性化することにより抗凝固を促進するようになる。このトロンビンの酵素活性を利用して、抗凝固剤である活性化プロテインＣをつくるためのプロセスエンザイムとしても利用されている有用なタンパクである。さらに、α−トロンビンは強力に血小板を凝集、活性化させるほか、マイトジェン作用も有する。このようにα−トロンビンは多彩な生理作用を有することから、種々の研究分野の試薬としても利用されており、今後もその利用度は一層増加していくものと考えられる。
このような機能を有するトロンビンは止血剤、プロセスエンザイム、研究用試薬としてこれまで広く利用されている。例えば、上部消化管出血に対しては血液由来のトロンビンが内視鏡的に出血患部に散布されたり、経口的に投与されて止血効果が認めれている。さらに、組織の接着剤として使用されているフィブリン糊には、フィブリノーゲンやＦＸＩＩＩ因子とともに血液由来のトロンビンが含まれている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
しかしながら、これらのトロンビンはヒト血液またはウシ血液から分離されたトロンビンであるため、それらの原料となる血液中に由来する因子で、ヒトに悪影響を及ぼすと考えられる様々な危険因子が含まれている。例えば、ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＥＶ，ＴＴＶなどの肝炎を引き起こすウイルス、ＨＩＶなどの免疫不全症を引き起こすウイルス、ＣＪＤなどを引き起こす異常プリオンなどが含まれる危険性が存在する。事実、これらの危険因子が混入した血液製剤による薬害は大きな社会問題となった。更にこれらヒトまたはウシ由来の血液は生体材料であることから、常に安定に供給される保証はない。このことは、特に医薬品としては極めて重要で深刻な問題であり、早急に解決すべき課題と考えられる。
また、従来の方法はトロンビンの前駆体であるプロトロンビンを血液由来のＦＸａで活性化してトロンビンをつくる方法であるため、この活性化の過程で血液由来の酵素ＦＸａを使用している。トロンビンの前駆体を組換え技術でつくっても、その活性化酵素に血液由来のＦＸａを使っては、血液成分から危険性を逃れることは出来ない。更にＦＸａを組換え技術でつくるためには、その前駆体であるＸを組換え技術でつくり、それをＦＩＸａで活性化しなければならない。そのＦＩＸａを組換え技術でつくるには、その前駆体であるＩＸを組換え技術でつくり、それを活性化しなければならない。このように凝固反応のカスケード反応に関わる上流の酵素まで遡って組換え技術で作製しなければ、血液由来の危険性を排除したトロンビンは得ることが出来ない。
これら従来のトロンビンおよびその活性化酵素の原料となる血液に由来する危険性と限界とを考慮すれば、より安全で安定な供給が可能な原料や方法が期待される。そのような背景を下に、これまでに微生物や動物細胞を宿主としたトロンビンの発現が報告されている。
しかしながら、それら従来の方法では、例えば、大腸菌では発現されたトロンビンはインクルーションボディという凝集体を形成してしまい回収が困難である。つまり、凝集体を可溶化させ、それを機能的なタンパクとして再構成（リフォールディング）させる効率は極めて低く、産業上のメリットはない（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６３−１６９，１９９５）。又、ハムスターの培養細胞を利用した発現系では、トロンビンの発現量が低いため実用的ではない（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐ．ｐｕｒｉｆ．，１０，２１４−２２５，１９９７）。しかも、いずれの場合も発現されたトロンビンは前駆体であるため、その活性化にはＦＸａなどの活性化酵素を利用しなければならないが、それらの活性化酵素は組換え酵素ではないため血液成分の排除は未だ実現されていない。このように従来の技術では安全なヒトトロンビンを安定にしかも経済的なコストで供給することは困難であった。
（その解決方法）
そこで、本願発明者は上述の諸問題を鑑み鋭意検討した結果、安全で経済的なヒトトロンビンの製造方法をもたらす本願発明を完成することに成功した。つまり、ヒトトロンビン前駆体遺伝子やその活性化酵素遺伝子を強力なプロモーターであるベータアクチンプロモーター下流に結合させたプラスミドを構築し、それら遺伝子を動物細胞に導入してそれぞれの高発現系を組み立てることによって、従来技術では達成出来なかった大量かつ安定なトロンビンとその活性化酵素の供給し、それらを組み合わせることによって従来にはない安全で大量の活性化したトロンビンを供給することに成功した。
発明を実施するための最良の形態
前述のようにプロトロンビンはＧｌａドメイン、クリングルドメイン、セリンプロテアーゼドメインから成り、そのＧｌａ、クリングルドメインでは翻訳後の修飾が起こり、これがタンパク産生の律速となる可能性がある。又、トロンビンが生物学的活性を発揮するには、Ａ鎖、Ｂ鎖から成るα−トロンビンが最小サイズの活性化体であることから、このＡ−Ｂ鎖から成る一本鎖タンパクであるプレトロンビン−２（以下、プレトロンビンと称することがある）をコードする遺伝子を発現に用いた。このプレトロンビン遺伝子を用いることでｍＲＮＡサイズがプロトロンビンの場合より小さくなることから、プロトロンビンよりも効率的な転写・翻訳が期待できる。
具体的には、ヒト肝臓から分離されたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、プロトロンビン遺伝子の配列をもとに設計したプライマーを利用して、ＰＣＲ法によりプロトロンビン遺伝子を増幅した。更にその増幅されたプロトロンビン遺伝子を鋳型にして、目的とするプレトロンビン−２遺伝子を増幅した。動物細胞を宿主とした高発現ベクターとしては、特段の制約はないが、最適実施態様として本願発明者等が既有するニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ（特開平３−１６８０８７）を更に改良したベクターに、上記プレトロンビン遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。ここで用いるリーダー配列等は本来のトロンビン遺伝子やそれ以外の遺伝子由来の配列を利用することも可能である。構築された発現プラスミドを動物細胞に導入した結果、従来の報告にはない高い発現量を示す動物細胞を得ることが可能となった。ここで用いる宿主としての動物細胞としては、ハムスター由来、マウス由来、ヒト由来等の培養細胞を広く利用することができ、好適にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ２１細胞、２９３細胞またはＣＯＳ細胞等が例示される。
更に、本願発明者等はトロンビンの活性化酵素として従来から使用されているＦＸａを同様の機能を有するエカリンに換え、しかも好適にはそのエカリンを組換えエカリンとして、上記プレトロンビンと同様に我々の高発現系でつくることに成功した。
エカリンはＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓより単離精製された（Ｔ．Ｍｏｒｉｔａ等：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３，５５９−５７０，１９７８）蛇毒由来のプロテアーゼで、プロトロンビンを特異的に活性化することが知られている。エカリンをコードするｃＤＮＡはＳ．Ｎｉｓｈｉｄａ等によりクローニングされ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１７７１−１７７８，１９９５）その構造が明らかとなった。このエカリンは糖タンパク質で、成熟型は総アミノ酸残基数４２６、Ｚｎ２＋キレートのほか、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎドメインやＣｙｓ−ｒｉｃｈドメインを含み、ＲＶＶ−Ｘ（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍ  Ｘアクチベーター）のＨ鎖との間に６１％の相同配列を持つモザイク構造からなる金属プロテアーゼである。また、その酵素活性はＥＤＴＡで失活し、アンチトロンビンＩＩＩで阻害を受けないことから、ＦＸａとは全く異なる酵素である。同じようにＦＸａと同様の作用を示す活性化酵素はエカリン以外にも利用することは可能であると考えられる。
エカリンはその前駆体がトリプシンやプラスミン等のプロテアーゼによって活性化された後に、トロンビンを活性化する作用を発揮する。従って、トロンビンの活性化にはエカリン前駆体からトリプシン等の活性化反応が必要とされているが、我々の今回の技術によってトリプシン等を用いることなく組換えエカリンの精製過程でこの活性化も可能とした。
具体的には、プレトロンビンの場合と同様にエカリン遺伝子をＰＣＲ法により増幅して、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ由来の発現ベクターに結合したプラスミドを構築した。それらのプラスミドを導入された動物細胞は目的のエカリンを充分量発現することが可能であった。ここで用いる動物細胞としては、トロンビンの場合と同様に、ハムスター由来、マウス由来、ヒト由来等の培養細胞を広く利用することが可能である。
得られた培養上清をイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過方法により精製した結果、トリプシン等の活性化酵素を用いることなく、エカリンは活性化したタンパクとして分離されることが可能となった。つまり、動物細胞で発現されたエカリンは、本願発明者等の工夫によって精製と活性化の両過程を同時に行うことが可能となった。エカリン以外の活性化酵素の場合でも、その工夫によって同様の技術と成果が可能と考えられる。
このようにして得られた組換えエカリンを利用して、上記の組換えプレトロンビンを基質として活性化した後、トロンビンに特異的に反応することが知られているヒルジンペプチドとの親和性クロマトグラフィー、好適にはヒルジンペプチドを固定化したカラムクロマトグラフィーによって組換えα−トロンビンを高純度に精製することができる。トロンビンの精製法としては、その他種々のクロマトグラフィーを組合せた方法も可能である。
精製された組換えα−トロンビンを血液由来の天然型α−トロンビンと比較した結果、両者は同様の性質を示すことから、本願発明者が作製した組換えα−トロンビンは天然に存在するα−トロンビンに極めて近いタンパクと言うことが出来る。
以上の如く、トロンビンとエカリンの双方の前駆体だけを組換え技術で作製することによって、その他の酵素を必要とせずに活性化されたヒトトロンビンを製造することに成功した。
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。なお、以下に示す調製例及び実施例では、特に断りのない限り、ファルマシア、バイオラッド、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製の試薬を使用した。
実施例１
（発現プラスミドの構築）
（１）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）の構築
ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ（特開平３−１６８０８７）を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、リン酸化Ｘｈｏ  Ｉリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）を構築した。このｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）を制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｐｖ２を構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｐｖ２を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を行うことでＸｈｏ  Ｉ認識配列近傍の塩基を若干削り込んだ。ヌクレアーゼ処理の後、ｄＮＴＰ存在下、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで一本鎖部位を修飾した後、リン酸化Ｓａｌ  Ｉリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）を構築した。
（２）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒの構築
ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４ｐ，１９８１）を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−Ｂｇｎを構築した。さらにこのｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−Ｂｇｎを制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩで消化した後、リン酸化Ｂｇｌ  ＩＩリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ＢｇＢを構築した。このｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ＢｇＢを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＢａｍＨ  Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．７ｋｂｐの断片を取得した。上述のｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）を制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、この１．７ｋｂｐ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒを構築した。
（３）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏの構築
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）の発現プラスミドｐＭＣ１ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ（Ｋ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５１，５０３−５１２ｐ，１９８７）を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、リン酸化ＢａｍＨ  Ｉリンカー存在下Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用い連結環状化したｐＭＣ１ｎｅｏ−２Ｂを構築した。このｐＭＣ１ｎｅｏ−２Ｂを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により約１．１ｋｂｐの断片を取得した。上述のｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、この約１．１ｋｂｐの断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを構築した。
（４）改良型ＤＨＦＲの発現プラスミドｐＳＶ２−ｍｄｈｆｒの構築
ＤＨＦＲのｃＤＮＡをコードする発現プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒをテンプレートにして下記の様なＰＣＲ反応を行った。プライマー１及びプライマー２の組合せ、及びプライマー３及びプライマー４の組合せで１回目のＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列は以下に示した［配列番号１〜４］。
0004227012.tif 000002
５ｎｇのテンプレートとそれぞれ１００ｐｍｏｌのプライマーを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる増幅を２５サイクル行った。ＰＣＲ反応は酵素の取扱説明書に準じて行った。増幅したＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル電気泳動により精製を行った。次に、プライマー１、２で増幅したＤＮＡフラグメントとプライマー３、４で増幅したＤＮＡフラグメントを約２０ｎｇずつを混合し、これをテンプレートにしてプライマー１及びプライマー４を用いて同様のＰＣＲ反応を行った。プライマーの塩基配列は以下に示した。このＰＣＲにより、ＤＨＦＲのアミノ酸の２３番目のロイシンをアルギニンに変換する核酸変異を導入した。増幅したＤＮＡフラグメントを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動により約０．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを抽出した。このＤＮＡフラグメントとサブクローニングプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉで消化したものとをＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＵＣ−ｍＤＨＦＲを構築した。このプラスミドについてＤＮＡ塩基配列の確認を実施して、目的の変異が正確に導入されていることと他の塩基配列に誤りがないことを確認した。塩基配列を確認したプラスミドに関し、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉで再度消化し、アガロースゲル電気泳動により約０．６ｋｂｐの変異導入ＤＨＦＲ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを抽出した。前述のｐＳＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂｇｌ  ＩＩで消化した後、約３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により抽出し、これと変異型ＤＨＦＲをコードする前述のＤＮＡフラグメントとをＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｍｄｈｆｒを構築した。
（５）ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｍｄｈｆｒの構築
ｐＳＶ２−ｍｄｈｆｒを制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩで消化し、リン酸化Ｂｇｌ  ＩＩリンカー存在下Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｍｄｈｆｒ−ＢｇＢを構築した。このプラスミドを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉで消化し、ｍＤＨＦＲの発現カセットをコードする約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で抽出した。（１）で調製したｐＣＡＧＧＳ１（Ｓａｌ）を制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、この１．７ｋｂｐ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｍｄｈｆｒを構築した。
実施例２
（ヒトプレトロンビン−２遺伝子の調製）
ヒト肝臓ｍＲＮＡ（サワデーテクノロジー社）を鋳型に常法によりオリゴｄＴをプライマーとして逆転写酵素を用いた１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った（Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ；アマシャムファルマシア社製）。このｃＤＮＡをもとに以下のプライマーを設計しＰＣＲ反応に用いた。プライマーは以下のプロトロンビンＮ末端側に相当する遺伝子のプライマーとして５’−ＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴ（ＰＴ１；配列番号５）、Ｃ末端側に相当する遺伝子のプライマーとして５’−ＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣＴ（ＰＴ２；配列番号６）を用いた。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、本酵素の取扱い説明書に準じた方法で３０サイクルで遺伝子増幅を試みた。以下のＰＣＲ反応も同様の手技に準じた。
このプロトロンビンｃＤＮＡをもとにプレトロンビン−２の遺伝子を調製した。以下にあげた様なプライマーを合成し、プロトロンビンｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである［配列番号７〜１０］。
0004227012.tif 000003
プライマー１及び２を用いて増幅を行うことで、プロトロンビンのプレプロリーダー配列部位をコードするＤＮＡを増幅した。この際に開始コドン部位へＫｏｚａｋの共通配列が導入されるような変異を施し、さらに上流に制限酵素Ｓａｌ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉの認識部位を導入した。さらに、プライマー３及び４を用いて増幅を行うことでプロトロンビン翻訳領域のＣ末端側にあたるセリンプロテアーゼドメインをコードするプレトロンビン−２遺伝子を増幅した。この際に終止コドン下流に制限酵素Ｓａｌ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉの認識部位を導入した。プライマー２及び３はＰＣＲ反応の前にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理を行い、５’−末端をリン酸化し、ＰＣＲ反応にて遺伝子の増幅を行った。増幅されたフラグメントを１％アガロースゲル電気泳動で抽出した後、プレプロリーダー配列部位をコードするＤＮＡ及びプレトロンビン−２部位をコードするＤＮＡをほぼ当量混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合させた。この後、この混合物をテンプレートにして、プライマー１とプライマー４でＰＣＲ増幅を再度行い、増幅したＤＮＡのうちアガロースゲル電気泳動で約１．１ｋｂｐのＤＮＡを抽出することでプレプロリーダーをコードするＤＮＡ配列とプレトロンビン−２をコードするＤＮＡ配列が結合されたものを取得した。この遺伝子の末端を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉで消化した。サブクローニングプラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）を制限酵素Ｓａｃ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで消化した後、Ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅを作用させ平滑末端とし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＴＺΔＳｃＰｔを構築した。このｐＴＺΔＳｃＰｔを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、前述のプレトロンビンをコードするフラグメントとＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＴＺ．ＰＴを構築した。このプラスミドを常法によりＤＮＡ塩基配列を確認し、プロトロンビンのプレプロリーダー配列部位とプレトロンビン部位とをコードするＤＮＡが同一フレームで翻訳されることを確認した。以下、このプレプロリーダー配列を導入したプレトロンビン遺伝子をプレトロンビン構造遺伝子（配列番号１１）と呼ぶ。
実施例３
（ヒトプレトロンビン−２発現プラスミドの構築）
実施例１にあげたｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏ及びｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｍｄｈｆｒへプレトロンビン構造遺伝子を導入した。ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏ及びｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｍｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化した後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。前述のｐＴＺ．ＰＴを制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化し、プレトロンビン−２構造遺伝子をコードする約１．１ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。脱リン酸化したプラスミドとプレトロンビン−２構造遺伝子をコードする断片とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＰＴ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏとｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＰＴ．ｍｄｈｆｒを構築した。
実施例４
（動物細胞を用いたヒトプレトロンビンの発現）
実施例３にあげたプレトロンビン発現プラスミドを用いてＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５５５−５６６ｐ，１９８６、以下ＣＨＯ）細胞及びＳＰ２／０  Ａｇ１４（Ｍ．Ｓｈｕｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１６，２６９−２７０ｐ，１９７８、以下ＳＰ２／０）細胞を形質転換した。ＣＨＯ細胞に関して、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＰＴ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを、ＳＰ２／０細胞に関してｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＰＴ．ｍｄｈｆｒを用いた。ＣＨＯ細胞はリン酸カルシウム法変法（Ｃ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５−２７５２ｐ，１９８７）で、ＳＰ２／０細胞はＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法で形質転換を行った。
形質転換に用いた発現プラスミドは制限酵素Ｐｖｕ  Ｉで消化することであらかじめ線状化した。
また、ここでのプレトロンビンの定量は抗ヒト−トロンビン抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。
（１）ＣＨＯ細胞を用いた産生能評価
ＣＨＯ細胞は以下のようにして形質転換から形質転換体の選択を行った。
形質転換の前日に細胞を１０ｃｍディッシュに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ディッシュの細胞密度で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用い播種した。３７℃で一夜培養の後、２０μｇ／ｍＬの線状化した発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＰＴ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを用い形質転換を行った。３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、ダルベッコＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、１０％透析ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、出現した形質転換体をプールし産生能の評価を行った。
形質転換細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地で播種し、一夜培養した。翌日培地を、血清を含まないＹＭＭ培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含ＭＥＭアルファ培地）に交換した。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で７日〜１０日間培養後、上清中のプレトロンビン濃度を測定した。上清中に２０μｇ／ｍＬのプレトロンビンが確認できた。この細胞を１００ｎｍｏｌ／Ｌのメトトレキセート（ＭＴＸ、和光純薬工業製）・１０％透析ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い、３〜４日間おきに培地交換を行いながら約１４日間培養を行った。その後、細胞を希釈継代し、５００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸ・１０％透析ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地に培地交換してさらに約１４日間培養を行うことで遺伝子増幅を行った。得られた細胞をプールした後、同じ培地で９６ｗｅｌｌプレートに０．５個／ｗｅｌｌの濃度で２００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種することで限界希釈によるクローニングを行った。得られたクローンをクローン毎に産生能評価を行った。各クローンを２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種し、一夜培養した。翌日培地を、ＹＭＭ培地に交換した。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で７日〜１０日間培養後、上清中のプレトロンビン濃度を測定した。得られたクローンのうち、クローン＃１０は上清中に９０μｇ／ｍＬのプレトロンビン−２を、クローン＃７２は１１０μｇ／ｍＬのプレトロンビン−２を発現していた。
（２）ＳＰ２／０細胞を用いた産生能評価
ＳＰ２／０細胞は以下のようにして形質転換体から形質転換体の選択を行った。
ＳＰ２／０細胞を冷却したダルベッコＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）０．８ｍＬに懸濁した１０７個の細胞をＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用キュベット（電極幅０．４ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に入れた。前述の線状化した発現プラスミド４０μｇを加えピペットで混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、０．２２ｋｖ、９７５μＦで１回パルスを加えた。キュベットを氷上１０分間冷却した後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地で約５，０００個／５０μＬとなるように希釈し、９６ｗｅｌｌプレート５枚に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した。翌日１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加しさらに一夜培養した。翌日１０％透析ＦＣＳ及び１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは２００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。１０日〜１４日間培養の後、出現した形質転換体をｗｅｌｌ毎に産生能評価を行った。細胞を約４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で２％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種し、２４時間培養後、上清中のプレトロンビン−２濃度と細胞密度を測定し、単位細胞あたり単位時間あたりのプレトロンビン産生能で評価した。各形質転換体は２〜１０μｇ／ｄａｙ／１０６ｃｅｌｌｓの産生能を持っていた。
これらの細胞のうち産生能が高かったものを選び、１０％透析ＦＣＳ及び１μｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地で約１４日間培養を行った。
得られたＭＴＸ耐性細胞について、ＹＭＭ培地を用い無血清培地への順応化を行った。ＹＭＭ培地に透析ＦＣＳを２％添加し増殖を確認した後、添加する血清濃度を０．５％−０．１％と低下させながら培養を行った。細胞の増殖性が良好であることを確認した後、血清を全く含まないＹＭＭ培地で培養を行い、増殖を確認したうえで、ＹＭＭ培地を用い上述の方法で産生能評価を行った。得られた形質転換体のうち＃３２は１５μｇ／ｄａｙ／１０６ｃｅｌｌｓの産生能を持っていた。この＃３２についてＹＭＭ培地を用い３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度でディッシュに播種し、約７日間培養を行い、上清中に発現したプレトロンビン濃度を測定した。＃３２は約１５０μｇ／ｍＬのプレトロンビンを上清中に発現していた。
実施例５
（プレトロンビン産生細胞の大量培養）
実施例４に示した、無血清培地に順応化したプレトロンビン産生細胞＃３２をスピナーフラスコ培養した。細胞を拡張の後、ＹＭＭ培地を用い２５０ｍＬスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ社製）に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２５０ｍＬ培養した。細胞が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える密度で細胞を１Ｌスピナーフラスコに拡張培養した。さらにこの細胞の増殖を確認した後、細胞を１Ｌスピナーフラスコ５本に拡張した。細胞を約７日間培養した後、上清に発現したプレトロンビン濃度を測定した。約１００μｇ／ｍＬのプレトロンビン−２の発現が確認できた。
実施例６
（蛇毒エカリンｃＤＮＡの調製）
エカリンｃＤＮＡは文献（Ｓ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１７７１−１７７８ｐ，１９９５）に報告されている配列のものをテンプレートに用い、ＰＣＲを用いて両端に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉの認識部位を導入した。この遺伝子を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、ｐＵＣ１８にサブクローニングしたｐＵＣ．ＥＣを構築した。このプラスミドを常法によりエカリンｃＤＮＡ部分のＤＮＡ塩基配列を確認した、開始コドンから終止コドンまでが文献通りの配列を持ったエカリンｃＤＮＡを取得できた（配列番号１２）。
実施例７
（エカリン発現プラスミドの構築）
実施例１にあげたｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏへエカリンｃＤＮＡを導入した。ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化した後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。前述のｐＵＣ．ＥＣを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化し、エカリンｃＤＮＡをコードする約１．８ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。脱リン酸化したプラスミドとエカリンｃＤＮＡをコードする断片とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを構築した。
実施例８
（動物細胞を用いたエカリンの発現）
実施例７にあげたエカリン発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを用いてＣＨＯ細胞及びＳＰ２／０細胞を形質転換した。エカリンの定量は、プロトロンビンのトロンビンへの変換活性を、市販の蛇毒由来エカリン（Ｓｉｇｍａ社製）を標準品に用いて行った。発現量は活性単位（Ｕ／ｍＬ）で表した。
（１）ＣＨＯ細胞を用いた産生能評価
ＣＨＯ細胞は以下のようにして形質転換から形質転換体の選択を行った。
形質転換の前日に細胞を１０ｃｍディッシュに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ディッシュの細胞密度で１０％ウシ胎児血清を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地を用い播種した。３７℃で一夜培養の後、２０μｇ／ｍＬの線状化した発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを用い形質転換を行った。３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、ダルベッコＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、１０％透析ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地に培地交換した。３〜４日間毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、出現した形質転換体をプールし産生能の評価を行った。
形質転換細胞を２×１０５ｅｌｌｓ／ｍＬの密度で１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地で播種し、一夜培養した。翌日培地を、血清を含まないＹＭＭ培地に交換した。３５℃、５％ＣＯ２培養装置で約１４日間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。上清中に１０Ｕ／ｍＬのエカリンが確認できた。
（２）ＳＰ２／０細胞を用いた産生能評価
ＳＰ２／０細胞は以下のようにして形質転換体から形質転換体の選択を行った。
ＳＰ２／０細胞を冷却したダルベッコＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）０．８ｍＬに懸濁した１０７個の細胞をＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用キュベット（電極幅０．４ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に入れた。前述の線状化した発現プラスミド４０μｇを加えピペットで混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、０．２２ｋｖ、９７５μＦで１回パルスを加えた。キュベットを氷上１０分間冷却した後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地で約５，０００個／５０μＬとなるように希釈し、９６ｗｅｌｌプレート５枚に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した。翌日１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加しさらに一夜培養した。翌日１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及び１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。１０日〜１４日間培養の後、出現した形質転換体をｗｅｌｌ毎に産生能評価を行った。細胞を約３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及び２％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種した、約１４日間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。各形質転換体は２〜１０Ｕ／ｍＬのエカリンを発現していた。この中で産生能が高かった形質転換体を、同じ培地を用いて９６ｗｅｌｌプレートに０．５個／ｗｅｌｌの濃度で２００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種することで限界希釈によるクローニングを行った。得られたクローンについてクローン毎に産生能評価を行った。各クローンを３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種し、一夜培養した。翌日培地を、２％透析ＦＣＳを含むＹＭＭ培地に交換した。３５℃、５％ＣＯ２培養装置で約１４日間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。得られたクローンのうち、クローン＃１Ｈ−８は上清中に１５Ｕ／ｍＬのエカリンを発現していた。
このクローン＃１Ｈ−８について、ＹＭＭ培地を用い無血清培地への順応化を行った。ＹＭＭ培地に透析ＦＣＳを２％添加し増殖を確認した後、添加する血清濃度を０．５％−０．１％と低下させながら培養を行った。細胞の増殖性が良好であることを確認した後、血清を全く含まないＹＭＭ培地で培養を行い、増殖を確認したうえで、ＹＭＭ培地を用い上述の方法で産生能評価を行った。無血清培地に順応化したクローン＃１Ｈ−８は２０Ｕ／ｍＬの産生能を持っていた。
実施例９
（エカリン産生細胞の大量培養）
実施例８に示した、無血清培地に順応化したエカリン産生細胞＃１Ｈ−８をスピナーフラスコを用いて浮遊培養した。細胞を拡張の後、ＹＭＭ培地を用い２５０ｍＬスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ社）に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２５０ｍＬ培養した。細胞が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える密度で細胞を１Ｌスピナーフラスコに拡張培養した。さらにこの細胞の増殖を確認した後、細胞を１Ｌスピナーフラスコ５本に拡張した。細胞を約７日間培養した後、上清に発現したエカリン濃度を測定した。約１８Ｕ／ｍＬのエカリンの発現が確認できた。
実施例１０
（ヒルジンペプチド固定化カラムの作製）
ヒルジンはヒルより単離されたトロンビンの特異的なインヒビターである。このヒルジンのアミノ酸配列から配列番号１３に示すペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕをペプチド合成機（アプライド社）を用いて合成した。このペプチド１０ｍｇをチッソ社製のホルミルセルロファイン１ｍｌに対して、添付文書の記載に従ってカップリングを行った。
実施例１１
（エカリン部分ペプチドに対する抗体の作製）
エカリンのｃＤＮＡのアミノ酸配列をホップとウッドの方法（Ｔ．Ｐ，Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．７８  ３８２４−３８２８，１９８１）に従って親水性及び疎水性の領域を明らかにした後、親水性の高い領域について配列表の配列番号１４に示すＬｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの配列を持つペプチドをペプチド合成機（アプライド社製）を用いて合成した。このペプチド５００μｇをフロイントの完全アジュバント存在下０日目、１４日目及び２８日目にフロイント不完全アジュバント存在下、ウサギの皮内に接種することで、エカリンペプチドに対するポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体がエカリンを認識するかどうかをウエスタンブロット法により確認した。天然のエカリンを２−メルカプトエタノール非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭ  Ｎ−サイクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１１）に５分間浸し、あらかじめ１００％メタノールおよびトランスファーバッファーの順に浸しておいたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｖｉｌｏｎ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上に重ね、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて１６０ｍＡ、１６時間転写を行った。この膜を５％スキムミルクを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）でマスキングの後、ＴＢＳＴで５００倍希釈した合成ペプチド投与ウサギの血清を室温で１時間インキュベーション後ＴＢＳＴで膜を洗浄した。次にこの膜を２０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）と室温で１時間反応させ、洗浄後コニカイムノステイニンＨＲＰ１０００（コニカ株式会社）キットを用いて染色を行った。その結果、この合成ペプチドを免役して得られた血清は、エカリンに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例１２
（組換えトロンビンの精製）
（１）陽イオン交換クロマトグラフィー
プレトロンビン−２産生ＳＰ２／０細胞の培養上清２０００ｍｌを、１Ｍクエン酸でｐＨ６．０に合わせ０．４５μｍフィルター濾過したものを試料とした。この試料を２０ｍＭクエン酸＋０．０５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８（ｐＨ６．０）のバッファーで平衡化したＳＰトヨパール５５０Ｃ（２０ｍｌ：東ソー）カラムに２ｍｌ／ｍｉｎ．の流速でアプライした。１００ｍｌの上記バッファーでカラムを洗浄後、５０ｍＭから１０００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）２１０ｍｌの塩濃度勾配で２ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で溶出を行った。フラクションの一部を用いて、シグマ社の抗トロンビン抗体を用いたウエスタンブロットによりトロンビン溶出画分を同定、プール後，０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに対して４℃で１６時間透析した。
（２）トロンビンの活性化
透析したＳＰトヨパール５５０Ｃプールフラクション４０ｍｌに１Ｍベンズアミジンを２５ｍｌ加え、さらに精製組換えエカリンを最終濃度６．５Ｕ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１６時間反応させた。
（３）ヒルジンペプチド固定化カラムを用いた精製
（２）で得られたエカリン処理後の反応液を実施例１０の方法で作製したヒルジンペプチドを固定化したゲル１０ｍｌに対して、１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。試料のアプライ後に０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファー５０ｍｌで洗浄後１Ｍチオシアン酸カリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファー５０ｍｌで溶出を行った。以上のステップを経ることで、最終活性収率４０％で高純度のα−トロンビンを得た。
これらの精製ステップで得られたフラクションについて２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブリリアントブルー染色を行った結果を図１に示す。
実施例１３
（エカリンの精製）
１）陽イオン交換クロマトグラフィー
エカリン産生ＳＰ２／０細胞の培養上清２０００ｍｌを２倍量の水で希釈後、１Ｍクエン酸でｐＨ５．０に合わせ０．４５μｍフィルター濾過したものを試料とした。この試料を２０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）バッファーで平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（２０ｍｌ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムに４ｍｌ／ｍｉｎ．の流速でかけた。１５０ｍｌの上記バッファーでカラムを洗浄後、０ｍＭから１０００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）２１０ｍｌの塩濃度勾配で４ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で溶出を行った。フラクションの一部を用いて、実施例１１で得られた抗エカリン抗体を用いたウエスタンブロットによりエカリン溶出画分を同定、プール後，５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．０）バッファーに対して透析した。
２）陽イオン交換クロマトグラフィー
１）の陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた透析産物を、５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で平衡化した硫酸セルロファイン（２ｍｌ：生化学工業株式会社）カラムに０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速でアプライした。１４ｍｌの上記バッファーでカラムを洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．０）２０ｍｌの塩濃度勾配で０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で溶出を行った。フラクションの一部を用いて、実施例１１で得られた抗エカリン抗体を用いたウエスタンブロットによりエカリン溶出画分を同定後、プールした。
３）ゲル濾過
２）に示したクロマトグラフィーで得られた組換えエカリンを含むフラクションを、１００ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）バッファーで平衡化したゲル濾過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で分画を行った。分子量のスタンダードとしてＢｉｏ  Ｒａｄのゲル濾過用のマーカーを用いた。各フラクションのプロトロンビン活性化能を測定したところ、分子量８０，０００付近の画分に活性のピークが認められた（図３）。得られた精製エカリンを２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にクーマシーブリリアントブルーで染色したパターンを示す（図２）。
以上述べた３ステップの精製により、最終活性収率１３％で、比活性で培養上清と比べて１２，０００倍の組換えエカリンを得た。
実施例１４
（組換えα−トロンビンの酵素化学的性質）
実施例１２に示した方法で得られた精製組換えα−トロンビンについて、その酵素化学的性質について、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換活性、トロンボモジュリンとの解離常数、トロンボモジュリン存在下、非存在下でのプロテインＣの活性化およびアンチトロンビンＩＩＩによる活性阻害について測定を行った。陽性コントロールとして、プラズマ由来の精製α−トロンビン（ヘマトロジックインスティチュート社から購入）を用いた。その結果、精製組換えα−トロンビンは表１に示すようにそれぞれの酵素化学的パラメータにおいて、プラズマ由来の精製α−トロンビンと同等の値を示した。
0004227012.tif 000004
なお、上記実施例で実施したトロンビン及びエカリンの活性測定は各々下記の記載に拠った。
１）トロンビンの活性測定
トロンビンの活性は以下の方法で測定した。
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μｌ、０．１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μｌ加え、３７℃で３分間インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α−トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０３１２５μｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μｌ添加し攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後０．１Ｍクエン酸溶液を８００μｌ加えて反応を停止した。反応液２００μｌを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
２）エカリンの活性測定
エカリンの活性は以下の方法で測定した。
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８バッファー（バッファー▲１▼）６０μｌを加え、更に０．０１％トリプシンを２μｌ添加して攪拌混合後、３７℃で１０分間インキュベートした。試料は濃度に応じてバッファー▲１▼で希釈を行った。その反応液に、０．４ｍｇ／ｍｌのプロトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入）を１０μｌ添加し３７℃で５分間反応させ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを１０μｌとテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ）を１００μｌ添加し攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後０．１Ｍクエン酸溶液を８００μｌ加えて反応を停止した。反応液２００μｌを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。エカリンの活性を定量するために、シグマ社から市販されている蛇毒由来のエカリンをバッファー▲１▼で希釈し２５ｍＵ／ｍｌ、１２．５、６．２５、３．１２５ｍＵ／ｍｌを調製した。このスタンダード溶液を試料の代わりに２０μｌ加え（トリプシン溶液は加えない）、プロトロンビンを加える以降の操作は、上記と同様に行った。
（従来技術より有効な効果）
これまで報告されている組換えトロンビンの発現量は約２５μｇ／ｍｌであるが、今回、本願発明によって構築されたトロンビンの発現系は、約１５０μｇ／ｍｌという、従来の発現量を大きく上回る優れた発現系である。しかも、本願発明者等は活性化酵素としても組換えエカリンをつくることに成功したことによって、ヒトトロンビンの製造方法として、血液由来の成分を排除した安全で優れた方法を確立した。このように本発明によって、従来技術では達成できなかった血液由来成分の関与を極力排除した安全かつ低コストのヒトトロンビンを大量に供給することが可能となり、本発明の医療及び研究分野への貢献は極めて大きいものと考える。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１  プレトロンビン−２産生ＳＰ２／０培養上清からのプレトロンビン−２の精製各ステップにおけるフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク染色を行ったものである。
図２  エカリン産生ＳＰ２／０培養上清からエカリンの精製を行い、最終ステップのゲルろ過におけるフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク染色を行ったものである。
【図１】
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【図２】
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