(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における体液性免疫応答を阻害するための薬学的組成物の調製のための、リンホトキシン−βレセプター（LT-β-R）遮断剤の使用であって、該LT-β-R遮断剤は、リガンド結合ドメインを有する可溶性LT-β-Rを含み、LT-βとそのレセプターとの間の相互作用を阻害する、使用。
【請求項２】
前記薬学的組成物が、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記動物が哺乳動物である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記LT-β-R遮断剤が、配列番号１を含むリガンド結合ドメインを有する可溶性リンホトキシンβ−Ｒまたはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記LT-β-R遮断剤が、１つ以上の異種タンパク質ドメインをさらに含む可溶性LT-β-Rを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記異種タンパク質ドメインが、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンからなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
可溶性リンホトキシンβ−Ｒは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記LT-β-R遮断剤が、１つ以上の異種タンパク質ドメインをさらに含む可溶性LT-β-Rを含む請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
前記異種タンパク質ドメインが、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンからなる群より選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
可溶性リンホトキシンβ−Ｒは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
抗体により媒介される自己免疫障害を処置するための、請求項１〜１１のいずれか１項において定義される薬学的組成物。
【請求項１３】
前記抗体により媒介される自己免疫障害は、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自発性血小板減少症紫斑病（ITP）、全身性狼瘡赤斑病（SLE）、ウエグネル肉芽腫症、多発性動脈炎結節および急進行性鎌状糸球体腎炎からなる群より選択される、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記抗体により媒介される自己免疫障害は、慢性炎症疾患である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記慢性炎症疾患は、シャガス病またはグレーブ病である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、リンホトキシン-βレセプターシグナルを遮断する「リンホトキシン-βレセプター遮断剤」を含む組成物および方法に関する。リンホトキシン-βレセプター遮断剤は、免疫学的疾患の治療（より詳細には、抗体媒介性免疫応答の阻害、アドレシンの発現および細胞の振り分け（trafficking）の調節、ならびに濾胞性樹状細胞の分化の誘導）に有用である。この発明は、リンホトキシン-βレセプター細胞外ドメインの可溶性形態、およびリンホトキシン-βレセプター遮断剤として作用するリンホトキシン-βレセプターまたはそのリガンド（表面リンホトキシン）に対する抗体に関する。
発明の背景
獲得免疫には、抗原を排除しようとする共通の目的達成のために共同して働き得る間、種々の効果を有する異なった関与物によって媒介される２つの手段がある。獲得免疫応答の一つの手段である体液性免疫は、主としてＢ細胞および循環性抗体により媒介される。細胞性または細胞媒介性免疫といわれる他の手段は、他の細胞に影響を及ぼすサイトカインを合成および産生するＴ細胞により媒介される。
ほとんどの抗原に対する応答におけるＢ細胞の活性化および分化は、（1）Ｂ細胞が、抗原特異レセプター、膜Igを通して、抗原シグナルを受信すること、および（2）Ｂ細胞が、活性化Ｔ細胞から接触依存性および独立したシグナルを受信することを必要とする。接触依存性同時刺激性シグナルは、活性化Ｔヘルパー細胞上に発現されるCD40リガンドに対するＢ細胞上のCD40レセプターの連結により生じる。（Lamanら、Crit. Rev. Immunol., 16, 59-108頁（1996）；Van KootenおよびBanchereau, Adv. Immunol., 61, 1-77頁（1996））。接触独立性シグナルは、活性化Ｔ細胞により合成および産生されるサイトカインにより媒介される。これらの接触依存性シグナルおよび独立性シグナルは共同して、（１）抗原の二次暴露におけるより迅速な応答を媒介する準備がなされた（poise）メモリーＢ細胞、または（２）抗体分泌血漿細胞、のいずれかへ分化するようにＢ細胞を駆動する。血漿細胞は、Ｂ細胞の最終分化段階であり、抗体を合成および分泌する。
Ｔヘルパー細胞（「Th」）は、免疫系においていくつかの重要な役割を果たす。免疫チャレンジの発生時にTh細胞により産生されるサイトカインは、どの免疫エフェクター経路が続いて活性化されるかに影響を及ぼすことが示されている。Th細胞は、その抗原特異レセプターと、MHCクラスII分子と共同してプロセスされる外来抗原の表面ペプチドフラグメントを提示する抗原提示細胞（APC）との相互作用により活性化される。活性化Th細胞は、次いで、適切な免疫エフェクター機構を活性化するサイトカイン（リンホカイン）を分泌する。
Th細胞は、そのサイトカイン分泌パターンに基づいて３つのサブグループTh0、Th1、およびTh2に分類され得る。（Fitchら、Ann. Rev. Immunol.,11, 29-48頁、（1993））。マウスにおいて、刺激されていない「ナイーブ」Ｔヘルパー細胞は、IL-2を生産する。Th細胞の短期間刺激は、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、およびIL-10を含む広範なサイトカインを生産するTh0前駆細胞を誘導する。慢性的に刺激されたTh0細胞は、Th1またはTh2のいずれかの細胞型に分化し得、その結果サイトカイン発現パターンが変化する。特定のサイトカイン、例えばIL-3、GM-CSF、およびTNFは、Th1およびTh2細胞の両方により放出される。他のサイトカインは、１つのTh細胞サブグループによってのみ生産される。（Romagnaniら, Ann. Rev. Immunol., 12, 227-57頁、（1994））。Th1細胞は、マクロファージおよび細胞性免疫と関連する炎症応答、ならびに細胞内感染に対する抵抗性を活性化するLTα、IL-2、およびIFN-γを産生する。
Th2細胞は、好酸球および肥満細胞産生を増加し、Ｂ細胞の十分な拡大および成熟を促進するサイトカインIL-4、IL-5、IL-6、およびIL-10を産生する。（Howardら，「Ｔ細胞由来サイトカインとそのレセプター」Fundamental Immunology, 第三版, Raven Press, New York（1993））。Th2細胞はまた、Ｂ細胞メモリー、体細胞性変異および従って親和性成熟の生成、ならびに新たな免疫グロブリンイソ型転換の制御に関与する。例えば、Th2サイトカインIL-4転換は、Ｂ細胞を活性化してIgG1イソ型にするが、一方他のイソ型を抑制する。IL-4はまた、I型感作性過度反応においてIgEの過剰生産を刺激する。Th-2サイトカインIL-5は、粘膜免疫において重要であるIgAイソ型を誘導する。
リンパ節（LN）、脾臓、および粘膜性リンパ組織のような、二次リンパ組織は、異物の捕捉および濃縮に高度に有効であり、ＴおよびＢ細胞の抗原駆動活性化および分化の主要部位である。これらは、これらの組織における細胞の多様性および器官に依存し、T/B細胞相互作用、胚中心（GC）形成、親和性成熟、免疫ブロブリンクラススイッチおよび細胞振り分けのような、体液性免疫応答の多くの局面のための枠組みを提供する。（Klein, J., Immunology, John Wileyおよびsons,（1982））。末梢リンパ組織の発達、構造維持、および機能に関わる分子機構は、完全には理解されていない。
二次リンパ組織の一般構造は、哺乳動物の種間で著しく異なり、多様性を呈するが、これらの二次リンパ組織の微細構造は、以下のような特定の特徴を共有する：例えば、（1）抗原接触可能性、（2）抗原とリンパ球との継続的な接触を確保する構造的特徴、（3）Ｂ細胞により取り囲まれるＴ細胞リッチ領域、（4）Ｂ細胞リッチ濾胞、（5）帯域型部位、（6）特異的内皮細胞、および（7）抗体生産部位、より詳しくは以下に説明される。
二次リンパ組織は、全身において抗原に対して接触可能である。例えば、抗原は、正弦血液提供を通して脾臓に接触し、リンパ輸入管を通してLNに接触し、そして特異的な上皮を経て粘膜リンパ組織へ輸送される。
様々な種における二次リンパ組織はまた、小胞樹状細胞（FDC）、および指状突起細胞のような特定の構造的特徴を共有し、その構造は組織のリンパ球リッチ領域において抗原の継続的存在を確保する。
別の共通の特徴は、Ｂ細胞に取り囲まれるＴ細胞リッチ領域の存在である。Ｔ細胞リッチ領域は、例えば、多数の再循環するＴ細胞およびIDCを含み、次いでＴ細胞およびＢ細胞のアクセサリー細胞として機能する、脾臓の白色髄における動脈周囲リンパ鞘、およびLNの傍皮質を含む。
その上、リンパ組織は代表的には、脾臓の白色髄およびLNの傍皮質にＢ細胞リッチ一次濾胞および二次濾胞を有する。このようなリンパ組織における二次濾胞はまた、胚中心（GC）と呼ばれ、抗原を捕捉しそして提示するための高密度のFDCネットワークを有する。
帯域型領域はまた、マウス脾臓において規定された組織学的領域であり、ヒト二次リンパ器官中でより拡散した部位として留意されている。これらの領域は主として、帯域マクロファージ（MZM）、金属親和性マクロファージ（MM）、帯域Ｂ細胞、および網状細胞を含むが、またＴ細胞および樹状細胞も含み得る。（Kraal. Int. Rev. Cytol. 132, 31-74頁（1992））。帯域への動脈流の開孔は、抗原を、これらの細胞に直接的に接触させ、この部位での抗原に対する細胞反応を促進する。（Kraal, Int. Rev. Cytol. 132, 31-74頁（1992））。MZMの存在はまた、脾臓白色髄におけるＢ細胞の最適な振り分けに必要とされる。（Kraal, 1992, Kraalら, Immunology, 68, 227-232頁（1989））。
代表的には、血液リンパ球は、特異化した内皮（例えば、LNの小静脈内皮層（高内皮性小静脈-HEV）、および帯域様構造内の脾臓血液シヌソイドの内皮層）を通過することにより、二次リンパ組織に侵入する。この内皮は、二次リンパ組織への細胞の振り分けにおいて機能する、接着分子およびアドレシンを発現する。例えば、末梢LNアドレシン（PNAd）は、粘膜リンパ組織（腸間膜LN、パイエル板、および固有板（lamina）のような組織を含む）へのリンパ球の振り分けに関与する、粘膜LNアドレシン、MAdCAM-1とは異なる。
全てのアドレシンが明らかに定義されているわけではなく、例えば、脾臓へのリンパ球ホーミングに関与するアドレシンはまだ定義されずにいる。これらのアドレシンの生理学的役割は、免疫応答への抗原特異リンパ球の適切な集合の動員の増強を含み、これに引き続く身体中への免疫応答の播種を含む。
最後に、抗体産生血漿細胞である血漿細胞は、抗原によって先祖Ｂ細胞が活性化される異なった場所で検出される。例えば、脾臓赤色髄内の血漿細胞により産生される抗体は、主としてＴ細胞領域におけるＢ細胞の活性化から生じ、LN髄質内の血漿細胞は、同じ節のＴ細胞領域で活性化されたＢ細胞に由来する。同様に、骨髄内の血漿細胞により産生される抗体は、脾臓およびリンパ節において活性化されたＢ細胞の誘導体であり、そして腸の固有板内の血漿細胞は、主として腸間膜LN内または腸に関与するリンパ組織において活性化されたＢ細胞に由来する。
例えば、ICM MacLennan, 「二次リンパ組織の構造および機能」Clinical Aspects of Immunology第５版、P.J. Lachman, Sir D.K. Peters, F.S. Rosen, M.J. Walport編, Blackwell Scientific Publications 13-30頁（1993）を参照のこと。
一般的には、T依存性抗原に対する体液性免疫応答の基礎となる細胞/組織学的事象は以下の通りである。Toellnerら, J. Exp. Med., 183, 2303-2312頁（1996）：
誘導期において、ナイーブＢ細胞およびＴ細胞は、抗原が身体に侵入した直後の日に、免疫応答へ活性化および動員される。脾臓において、例えば、二次応答のための免疫後12時間以内に、メモリーＢ細胞は、帯域において血液担体抗原に遭遇し、そしてＴ細胞領域に行くために帯域を離れる。Ｂ細胞は、24時間以内にＴ細胞領域で検出され得る。免疫グロブリンスイッチ転写物は、二次抗原暴露の12時間以内に検出される得、従ってＴ-Ｂ細胞相互作用がすでに起こったことが示唆される。次いで、Ｂ細胞は、射出領域および赤色髄へ移動し、ここで、増殖してＢ細胞芽球の焦点を形成し、そして血漿細胞中へ分化する。Ｂ細胞はまた、IDCリッチＴ細胞領域において増殖し続ける。免疫後４日以内、およびGC内での増殖後、Ｂメモリー細胞生産が開始される。一次応答では、免疫後10日目までにはよく発達したGCが判然とし、14日目に最大サイズに達する。
Ｔ細胞領域におけるＴ細胞増殖は免疫後48〜72時間で明らかとなり、７日目で最大になる。このＴ細胞増殖は、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞活性化に寄与する。Ｔ細胞領域における増殖レベルは、GCが形成される場合減少する。Ｔ細胞増殖はまた、暗領域（dark zone）において、中心細胞（Ｂ細胞）がIDClから抗原を受け取り、明領域（light zone）においてＴ細胞への抗原を提示するGC内で起こる。
Ｔ細胞依存性抗原は、帯域Ｂ細胞を活性化し得、新しく生産されたナイーブＢ細胞および再循環するリンパ球は、アドレシンおよび接着分子により二次リンパ器官内に誘引され、保持される。ナイーブＢ細胞は、例えば、活性化Ｂ細胞と同様に、Ｔ細胞帯へ移動するのと同様の動力学を示す。
Ｔ細胞依存性応答の確立期
Ｔ細胞依存性応答の確立期は、二次リンパ器官の小胞子体におけるメモリーＢ細胞の継続した活性化により維持される。この段階ではナイーブＢ細胞の動員はほとんどなく、応答は主としてFDC上に保持される抗原により誘導される。GCは、最適なメモリー生成、イソ型転換、体細胞変異、および従って免疫グロブリンの親和性成熟に必要とされる。
このようなリンパ球応答の付与は、身体内を、種々の経路（例えば、抗体は血液を介して脾臓を離れ、リンパ輸出管を経てLNを出る）によって循環し得る抗体の産生を生じる。抗体は従って、侵入病原体に遭遇して直接結合する。この認識事象は、免疫エフェクター機構のカスケード（補体カスケードの活性化、および病原体からの宿主の保護を媒介する細胞性反応の活性化を含む）を開始する。
抗体はまた、過敏症応答-過去に遭遇した抗原との接触により引き起こされる不適切または不釣り合いな免疫応答-のようなある病理的応答において、役割を果たす。過敏症には認知されている４つの型がある。
1型「即時性過敏反応」は、アレルゲン誘導によるTh2細胞活性化およびTh2サイトカイン放出を含む。Th2サイトカインIL-4は、Ｂ細胞を刺激してIgEを産生するためのイソ型転換を受け、これは次いで、肥満細胞を活性化して、湿疹、喘息、および鼻炎を起こすような急性炎症反応を産生する。
II型およびIII型過敏反応は、細胞表面抗原もしくは特異的な組織抗原（II型）、または循環免疫複合体（III型）を形成するための可溶性血清抗原に対するIgG抗体およびIgM抗体により引き起こされる。
IV型「遅延型過敏反応（DTH）」は、Th1細胞媒介応答であり、Th1細胞の移入によりマウス内に移入され得るが、血清単独では移入され得ない。この特徴は、IV型DTHを、他の３つの型の過敏反応（これは、細胞を含まない血清中に移入され得る抗体によって主として生起される体液性免疫応答を必要とする）から区別する。（Roittら, Immunology, 19.1-22.12頁（Mosby-Year Book Europe Ltd., 第三版1993））。
病理学的体液性免疫応答は、多数の器官特異的、および全身性自己免疫状態（全身性エリテマトーデス、ヴエゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、（PAN）、急性進行性半月体形成糸球体腎炎、および突発性血小板減少性紫斑病、ならびにグレーヴス病およびシャガス病のような慢性炎症性疾患）と関連する。体液性免疫応答はまた、組織移植および移植臓器拒絶に寄与し得る。
現在に至るまでのこれらの様々な免疫学的状態の処置には、一般的に、免疫調節剤および免疫抑制剤を使用した。現在使用される３種の一般的な薬剤は、ステロイド、シクロホスファミド、およびアザチオプリンである。
ステロイドは、活性化マクロファージを抑制し、および多くの病原性Ｔ細胞効果を逆転するように抗原提示細胞活性を抑制する、多形質発現性抗炎症剤である。シクロホスファミドは、アルキル化剤であり、DNA複写およびDNA修復を抑制することにより細胞死を媒介する。アザチオプリンは、抗増殖剤であり、DNA合成を抑制する。これらの非特異性免疫抑制剤は、一般的に、それらの毒性（例：腎毒性および肝毒性）を増加し、および副作用を引き起こす高用量で必要とされる。従って、これらは長期療法には不適切である。
従って、従来の処置により引き起こされる問題を克服する、さらなる薬剤および治療の必要性は、未だ満たされていない。
発明の要旨
本発明は、リンホトキシン-βレセプター遮断剤を使用して、リンホトキシン-βレセプター（LT-β-R）シグナル伝達を阻害することにより、免疫学的疾患を処置するための薬学的組成物物および方法を提供することにより、上記に言及される問題を解決する。より詳細には、LT-β-R遮断剤を含む組成物および方法は、抗体媒介免疫応答を阻害し、アドレシン発現レベルおよび細胞輸送を調節し、濾胞性樹状細胞の分化に影響を及ぼし、そして例えば、全身性エリテマトーデスおよび突発性血小板減少性紫斑病のような病理的状態を生じる二次リンパ様組織および同様のリンパ様構造の構造的組織化を改変するために有用である。さらに、特定の実施態様において、本願発明は、免疫複合体とＢ細胞との会合を改変するために有用である。より明確には、本発明の方法は、細胞上の抗原の提示または沈着を予防するか、あるいは細胞上に既に存在する抗原を本質的に溶解または除去する。
他の実施態様において、LT-β-R遮断剤は、可溶性リンホトキシン-β-R、LT-β-Rに対して指向される抗体、および表面LTリガンドに対して指向される抗体からなる群から選択される。
１つの実施態様において、LT-β-R遮断剤として作用するリンホトキシン-βレセプタ-細胞外ドメインの可溶性形態が提供される。この実施態様の好ましい組成物および方法は、免疫グロブリン定常重鎖ドメインに融合されるLT-β-R細胞外リガンド結合ドメインを有する組換えリンホトキシン-βレセプタ-融合タンパク質を含む。より好ましくは、LT-β-Rリガンド結合ドメインは、ヒトIgG Fcドメインに融合されている。
本発明の別の実施態様において、LT-β-R遮断剤として作用する抗体が提供される。この実施態様の好ましい組成物および方法は、リンホトキシン-βレセプターに対して指向される１つ以上の抗体を含む。より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。この実施態様の他の好ましい組成物および方法は、表面リンホトキシンに対して指向される１つ以上の抗体を含む。より好ましくは、抗体は、リンホトキシン-βに対して指向されるモノクローナル抗体である。好ましい抗体は、抗ヒトBT-β-R mAb BDA8および抗ヒトLT-β mAb B9である。
さらに他の実施態様において、本願発明は、治療的に有効な量のLT-β-R遮断剤を有する薬学的組成物を投与することにより、動物における体液性免疫応答を改変する方法に関する。特定の他の実施態様において、薬学的組成物は、約１日〜約14日間、LT-β-R陽性細胞を被覆するに十分な量で投与される。特定の実施態様において、薬学的組成物は、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む。
他の実施態様において、本発明の方法は、上記のLT-β-R遮断剤を使用し、TNF-Rシグナル伝達阻害することなく、LT-β-Rシグナルを阻害する。哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルスの処置、予防、または排除の方法はまた、本願発明に含まれ、LT-β-Rの遮断剤を、単独あるいは薬学的キャリア、アジュバント、またはHIVもしくはAIDSの症状の処置もしくは寛解に有用であるとして当業者に既知の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
さらに、本発明は、移植分野（すなわち、移植片拒絶）における処置の方法に関する。明確には、特定の実施態様は、CD40経路の遮断剤およびLT経路の遮断剤の同時投与に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、リガンド結合ドメインをコードするヒトLTβレセプターの細胞外部分の配列である。
図２は、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Ig融合タンパク質、および抗原の複数注射を受けたマウスの脾臓の免疫組織化学的分析である。
図３は、LTβ-R-Ig処理およびMR-1（抗CD40リガンド抗体）処理マウスの脾臓からの胚中心の非存在、ならびにMR-1処理、LTβ-R-Ig未処理マウスの脾臓中の濾胞性樹状細胞の存在を示す免疫組織化学的分析である。融合タンパク質およびSRBC抗原を、図２に記載される方法で投与した。
図４は、子宮内で、かつ生後継続的にLTβ-R-Ig処理されたマウスのLNにおけるアドレシン発現が改変されることを示す、免疫組織化学的分析である。
図５は、子宮内、かつ生後継続的にLTβ-R-Ig処理されたマウス（図４と同様）の腸間膜LNにおけるリンパ球位置およびマクロファージマーカーの発現の免疫組織化学的分析である。
図６は、マウスのLTβ-R-Ig処理がSRBCに対する免疫応答を阻害することを示す免疫組織化学的分析である。
図７は、FDC上に捕捉される免疫複合体の提示である。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される発明が十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。
本明細書中に使用される用語「免疫グロブリン応答」または「体液性応答」とは、動物の外来抗原に対する免疫学的応答をいい、それによって動物は外来抗原に対して抗体を産生する。Ｔヘルパー細胞のTh2クラスは、高親和性抗体の効率的な産生に重要である。
本明細書中に使用される用語「胚中心」とは、抗原免疫化後に形成するＢ細胞濾胞をいう。この組織学的部位の形は、最適メモリー生成、イソ型転換、体細胞過剰変異、およびこれによる抗体応答の親和性成熟と相関する。
「帯域」または「帯域型領域」は、主に、帯域マクロファージ（MZM）、金属親和性（metallophilic）マクロファージ（MM）、帯域Ｂ細胞、および網状細胞、ならびにまたＴ細胞および樹状細胞を含む、二次リンパ様組織の組織学的に記載される区画をいう。動脈血流は周縁洞に開き、従って抗原は、これらの細胞に直接接近し、この部位にて抗原に対する細胞反応を促進する。
本明細書中に使用される用語「アドレシン」とは、二次リンパ様器官へのリンパ球のホーミングに関与する分子をいう。このような分子は、内皮細胞上で、特にリンパ節内の高度の内皮細静脈で発現される。脾臓アドレシンは、規定されない。MAdCAM-1は粘膜アドレシンであり；PNAdは末梢アドレシンである。
本明細書中に使用される用語「Ｔヘルパー（Th）細胞」とは、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を補助し、そしてＢ細胞と共同して抗体産生を刺激するＴ細胞の機能的サブクラスをいう。ヘルパーＴ細胞は、II型MHC分子と会合して抗原を認識し、接触依存性および接触独立性（サイトカイン）シグナルをエフェクター細胞に提供する。
本明細書中に使用される用語「サイトカイン」とは、細胞間のシグナル伝達を媒介する分子をいう。「リンホカイン」は、リンパ球により放出されるサイトカインである。
用語「Th2」とは、LTα、インターフェロン-γ、およびIL-2（および他のサイトカイン）を産生し、そして攻撃に対する細胞性応答（すなわち非免疫グロブリン応答）と関連する炎症反応を誘導するＴヘルパー細胞のサブクラスをいう。
用語「Th2」とは、IL-4、IL-5、IL-6、およびIL-10のようなサイトカインを産生し、免疫攻撃に対する免疫グロブリン（体液性）応答と関連する、Ｔヘルパー細胞のサブクラスをいう。
用語抗体の「Fcドメイン」とは、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含むが、抗原結合部位を欠く分子の一部をいう。この用語はまた、IgMまたは他の抗体イソ型の等価領域を含むことが意味される。
用語「抗LTβレセプター抗体」とは、少なくとも１つのLTβレセプターのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいう。
用語「抗LT抗体」とは、LTα、LTβ、またはLTα/β複合体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいう。
用語「LTβシグナル伝達」とは、LTβ-R経路と関連する分子反応、およびそれにより生じる続く分子反応をいう。
用語「LTβ-R遮断剤」とは、LTβ-Rに結合するリガンド、細胞表面LTβ-RクラスタリングまたはLTβ-Rシグナルを減少させ得、または細胞内でLTβ-Rシグナルが解読される方法に影響を及ぼし得る薬剤をいう。
リガンド-レセプター結合の工程に作用するLTβ-R遮断剤は、LTβ-RへのLTリガンド結合を少なくとも20％阻害し得る。LTβ-R遮断剤の例は、可溶性LTβ-R-Fc分子、ならびに抗LTα、抗LTβ、抗LTα/β、および抗LTβ-R Absを含む。好ましくは、抗体は、LTαの分泌形態と交差反応をしない。
用語「LTβ-R生物学的活性」とは：（1）可溶性または表面LTβ-R分子との可溶性または表面LTリガンド結合について競合するLTβ-R分子またはその誘導体の能力；あるいは、（2）免疫調節応答または細胞傷害性活性を刺激する能力のような、天然LTβ活性をいう。
用語「LTリガンド」とは、LTβレセプターに特異的に結合し得る、LTα/βヘテロマー複合体またはその誘導体をいう。
用語「LTβ-Rリガンド結合ドメイン」とは、LTリガンドの特異的認識およびLTリガンドとの相互作用に関与するLTβ-Rの部分（単数または複数）をいう。
用語「表面LT」および「表面LT複合体」とは、LTα、および細胞表面上に提示される、変異体、１またはそれ以上のサブユニットの改変およびキメラ形態を含む膜結合LTβサブユニットを含む複合体をいう。「表面LTリガンド」とは、LTβレセプターに特異的に結合し得る表面LT複合体またはその誘導体をいう。
用語「被験体」とは、動物、動物由来の１つ以上の細胞をいう。好ましくは、動物は哺乳動物である。細胞は、任意の形態であり得、組織中に保持される細胞、細胞クラスター、不死化細胞、トランスフェクト細胞、または形質転換された細胞、および物理的または表現型的に改変された動物由来の細胞を含むがこれらに限定されない。
リンホトキシンβ：TNFファミリーのメンバー
腫瘍壊死因子（TNF）関連のサイトカインは、宿主防御および免疫調節の多面的媒介物質の広いファミリーとして知られてきた。このファミリーのメンバーは、細胞−細胞接触を通して局所的に作用する膜結合体形態で、または遠隔の標的に作用し得る分泌性タンパク質として存在する。TNF関連レセプターの並列のファミリーは、これらのサイトカインと反応し、細胞死、細胞増殖、組織分化、および炎症誘発性応答を含む種々の経路を誘発する。
TNF、リンホトキシンα（LTα、またはTNFβと呼称される）およびリンホトキシンβ（LTβ）は、リガンドのTNFファミリーのメンバーであり、これはまたFas、CD27、CD30、CD40、OX-40、および4-1BBレセプターに対するリガンドを含む。（Smithら, Cell, 76, 959-62頁（1994））。TNF、LTα、LTβ、およびFasを含むTNFファミリーのいくつかのメンバーによるシグナル伝達は、壊死またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）による腫瘍細胞死を誘導し得る。非腫瘍化細胞において、TNFおよび多くのTNFファミリーリガンドレセプター相互作用は、免疫系発達、および様々な免疫攻撃に対する応答に影響を及ぼす。
ほとんどの膜関連LTα/β複合体（「表面LT」）は、LTα1/β2化学量論を有する。（Browningら, Cell, 72, 847-56頁（1993）；Browningら, J. Immunol., 154, 33-46頁（1995））。表面LTリガンドは、高親和性でTNF-Rと結合せず、そしてTNF-Rシグナル伝達を活性化しない。しかし、LTβレセプター（LTβ-R）は、これらの表面リンホトキシン複合体と高親和性で結合する（Croweら, Science, 264, 707-10頁（1994））。
LTβ-Rシグナル伝達は、TNF-Rシグナル伝達と同様に抗増殖効果を有し、そして腫瘍細胞に対して細胞傷害性であり得る。本出願者らの同時係属米国出願第08/378,968号において、LTβ-R活性化剤を使用してLTβ-Rを選択的に刺激するための組成物および方法が開示されている。LTβ-R活性化剤は、TNF-R誘導炎症誘発性または免疫調節経路を同時に活性化することなしに、腫瘍細胞増殖を阻害するために有用である。
最近の遺伝子標的研究は、二次リンパ様器官の発達におけるLTα/βの役割を示唆する。（Banksら, J. Immunol., 155, 1685-1693頁（1995）；De Tongiら, Science, 264, 703-706頁（1994））。実際に、LTα欠損マウスは、リンパ節（LN）およびパイヤー斑（PP）を欠損する。さらに、その脾臓は、崩壊した構造を有し、脾臓帯域の細胞上の機能的マーカーの発現は改変されている。（Banksら, 1995；De Togniら, Science, 264, 703-706頁（1994）；Matsumotoら, Science, 271, 1289-1291頁（1996）。これらの特徴は、TNFレセプターノックアウトマウスのいずれについても記載されていない。（Ericksonら, Nature, 372, 560-563頁（1994）；Pfefferら, Cell, 73, 457-467頁（1993）；Rotheら, Nature, 364, 798-802頁（1993）。本出願者らは、最近、妊娠中にヒトIgG1 Fc部分（LTβ-R-Ig）と融合させた可溶性形態のマウスLTβ-Rを注射されたマウスの子孫は、ほとんどのリンパ節を欠損し、そして崩壊した脾臓構造を示すことを示すことにより、二次リンパ様器官発達における膜LTα/β複合体の役割を定義した。（Rennertら、1996, 「表面リンホトキシンα/β複合体は末梢リンパ様器官の発達に必要とされる」J. Exp. Med., 184: 1999-2006）。別の研究において、生後３日目に発現され始める同様のLTβ-R-Ig構築物をトランスジェニックされたマウスは、LNを有することが示された。しかし、その脾臓構造は崩壊しており、そして脾臓帯域細胞のいくつかのマーカーは発現されなかった。（Ettingerら, 「可溶性LTβ-R/IgG1融合タンパク質を発現するマウスにおける、脾臓構造が崩壊されているが正常なリンパ節発達」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 13102-7）。これらの研究の結果はともに、二次リンパ様器官の発達に対する効果を媒介する膜LT機能の一時的な必要性は存在するが、脾臓構造に対する効果については存在しないことを示す。
TNF系はまた、脾臓の発達において機能する。TNF欠損マウスの脾臓帯域細胞は、マクロファージマーカー、またはMAdCAM-1を発現しない。（Alexopoulouら, 第60回Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228頁（1996）；Pasparakisら, 第60回Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239頁（1996）。）TNF-R55欠損マウスはまた、脾臓帯域において染色されるMAdCAM-1（しかしMOMA-1ではない）を欠損する。（Neumannら, J. Exp. Med., 184, 259-264頁（1996）、Matsumotoら, Science, 271, 1289-1291頁（1996）。）TNF-R75欠損マウスの脾臓に見られるようなこれらのマーカーの発現は、正常なようである。（Matsumotoら, Science, 271, 1289-1291頁（1996）。）
リンパ様組織は発育過程の一部として生じるのみならず、慢性炎症のようなある種の病理学的状況（最近、新リンパ器官形成（neolymphoorganogenesis）と命名された過程）においても出現する。（PickerおよびButcher, Annu. Rev. Immunol., 10, 561-591頁（1992）；Kratzら, J. Exp. Med., 183, 1461-1471頁（1996））このような過程は、明らかにTNFファミリーのメンバーにより影響を受ける。ラットインスリンプロモーター（RIP-LT）により駆動されるLTα遺伝子についてトランスジェニックなマウスは、組織化リンパ組織により特徴付けられるLT誘導性慢性炎症性病巣を形成する。（Kratzら, J. Exp. Med., 1183, 1461-1471頁（1996）；Picarellaら, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 10036-10040頁（1992）。）
LTα欠損マウスを使用する、Ｔ細胞依存性免疫応答の間のLT機能の評価は、GC形成のため、おそらく組織化小胞性樹状細胞（FDC）構造を維持するため、および体液性応答のためのLTの必要性を示した。（Banksら, J. Immunol., 155, 1685-1693頁（1995）；Matsumotoら, Science, 271, 1289-1291頁（1996）；Matsumotoら, Nature, 382, 462-466（1996）。）TNF-R55欠損マウスはまた、FDCを欠損し、GCを発達させることもヒツジ赤血球（SRBC）に対する至適抗体応答を発達させることもできない。このことは、TNF-R55が、これらのほとんどの応答について可溶性LTまたはTNFシグナルにより誘発され得ることを示唆する（Le Hirら, J. Exp. Med., 183, 2367-2372頁（1996）、Alexopoulouら, 第60回Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228頁（1996）；Pasparakisら, 第60回Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239頁（1996））。体液性免疫応答における表面LT/LTβ-R経路のための機能的役割は、現在まで不確定である。
レセプターのTNFファミリーのメンバーである、LTβレセプターは、表面LTリガンドと特異的に結合する。LTβ-Rは、LTヘテロマー複合体（主にLTα1/β2およびLTα2/β1）と結合するが、TNFにもLTαにも結合しない（Croweら, Science, 264, 707-10頁（1994））。LTβ-R mRNAは、ヒト脾臓、胸腺、および免疫系に関与する一般的器官において発見される。LTβ-R発現の研究は未だ開始されたばかりであるにもかかわらず、LTβ-Rの発現パターンは、LTβ-Rが末梢血のＴ細胞およびＢ細胞、ならびにＴ細胞株およびＢ細胞株において欠落していることを除いては、TNF-55について報告されているそれと同様であるようである。
細胞表面リンホトキシン（LT）複合体は、高レベルのLTを発現するCD4+Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（II-23.D7）において特徴付けられている。（Browningら, J. Immunol., 147, 1230-37頁（1991）；Androlewiczら, J. Biol. Chem., 267, 2542-47頁（1992）、どちらも本明細書中において参考として援用される。）LTβ-R、LTサブユニット、および表面LT複合体の発現および生物学的役割は、本明細書中に特に参考として援用される、C.F. Wareら、「リンホトキシン系のリガンドおよびレセプター」, Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Varlag, 175-218頁（1995）において概説されている。
LTα発現は誘導され、LTαは、主として活性化されたＴおよびＢリンパ球ならびにナチュラルキラー（NK）細胞により分泌される。Ｔヘルパー細胞の間では、LTαは、Th1細胞ではなくTh2細胞により産生されるようである。LTαはまた、メラノサイト内に検知されている。多発性硬化症患者の病巣中の小グリア細胞およびＴ細胞はまた、抗LTα抗血清で染色され得る（Selmajら, J. Clin. Invest., 87, 949-954頁（1991））。
リンホトキシンβ（p33とも呼ばれる）は、ヒトおよびマウスのＴリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、およびリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞の表面に発現される。LTβは、本明細書中に参考として援用されている、出願人らの同時係属中の、1992年１月９日にWO 92/00329として公開された国際出願PCT/US91/04588；および1994年６月23日にWO 94/13808として公開されたPCT/US93/11669における主題である。
表面LT複合体は主として、FACS分析、または抗LTα抗体もしくは可溶性LTβ-R-Ig融合タンパク質質を使用する免疫組織学により規定されるように、活性化Ｔ（ヘルパー、Th1、およびキラー細胞）およびＢリンパ球ならびにナチュラルキラー（NK）細胞により発現される。1995年７月21日に出願された出願人らの同時係属中の米国特許出願第08/505,606号において、可溶性LTβレセプターおよび抗LTβレセプター、ならびにリガンド特異的抗体を、Th1細胞により媒介される免疫学的疾患処置の治療薬として使用するための組織物および方法が開示されている。表面LTはまた、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）クローン、活性化末梢単核リンパ球（PML）、IL-2活性化末梢血リンパ球（LAK細胞）、アメリカヤマゴボウマイトジェン活性化または抗CD40活性化末梢Ｂリンパ球（PBL）、ならびにＴ細胞およびＢ細胞の直系の様々なリンパ様腫瘍について記載されている。同種異系抗原保有標的細胞の勤めは、CD8+およびCD4+CTLクローンによる表面LT発現を特異的に誘導する。
出願人らは本明細書において、表面LTのいくつかの免疫学的機能を記載し、免疫グロブリン応答の生成および特徴、小胞樹状細胞の分化状態および胚中心形成に対する効果を含む二次リンパ組織の細胞組織化の維持、ならびに細胞トラフィッキングに影響を与えるアドレシン（addressin）発現レベルにおけるLTα/β結合試薬の効果を示す。従って、出願人らは、表面LTα/βおよびLTβレセプター結合薬についての治療的適用を規定する。
しかし、本発明に至るまでは、体液性、すなわち免疫原性の応答におけるLT-β-Rシグナル伝達の影響は完全には理解されていなかった。発明者らは、初めて、LT-βまたはLT-β-RのどちらかのLT経路を遮断することにより、動物における体液性免疫応答を改変し得ることを見い出した。従って、広範囲な実施様態における請求される発明は、治療有効量の、LT経路の遮断剤、特に好ましくは、LT-β-Rブロッカーを含む薬学的組成物の投与する工程を含む、動物における体液性免疫応答を改変する方法に関する。
本発明においては任意の遮断剤が使用され得、当業者はLT-β-Rを阻害する薬剤を容易に決定し得る。例えば、そのような遮断剤は、レセプターの低分子インヒビター、可溶性リンホトキシン-β-レセプター、LT-β-Rに対する抗体、および表面LTリガンドに対する抗体を含み得る。好ましい実施様態においては、遮断剤は、表面LTリガンドと選択的に結合し得るリガンド結合ドメインを有する可溶性LT-β-Rを含み、より好ましくは、ここで可溶性LT-β-Rがヒト免疫グロブリンFCドメインを含む。
他の実施様態においては、好ましい遮断剤は、LT-β-Rに対するモノクローナル抗体を含み、好ましくは、抗ヒトLT-β-R  mAb  BDA8、および抗ヒトLT-β  mAb  B9を含む。より好ましい抗体は、A1.D5.18およびA0.D12.10、およびBB-F6を含む。ある特定の例においては、マウス表面LTリガンドに対するモノクローナル抗体を使用することが所望であり得る。
FDCによる抗原の長期間に渡る提示は、内因性または自己抗原による免疫系の継続的活性化が自己免疫疾患を永続させる自己免疫疾患において重要であるようである。FDC上に捕捉される免疫複合体を、図７に例示する。FDCからこれらの免疫複合体を除去する能力は、免疫活性化量を減少させ、そして疾患を減衰させるか、またはさらに疾患の進行を停止させるのに役立つ。他のより「古典的な」Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は未だ認識されていない体液性成分を有し得るが、異常な抗体応答に関与するこれらの自己免疫疾患は、LT経路インヒビターの明確な標的であり、それゆえ、有益に影響され得る。
同様に、移植分野においては、移植片拒絶、すなわち、宿主対移植片疾患および移植片対宿主疾患は、永続するためには抗原提示を必要とする。FDCを操作することについて本明細書に記載されるメカニズムはまた、非自己、すなわち、移植の認識に関する問題に適用され得る。
さらに、抗原の継続的提示または抗原記憶の保持は、分子模倣物により引き起こされる自己免疫疾患において役割を果たし得る。例えば、ライム病感染性因子であるBorrelia burgdorferiに対する免疫反応は、多分この細菌上の同様な（saome）抗原性エピトープが正常関節成分と相似するために関節炎様疾患を導く。FDC保持ライム細菌抗原の除去は、ライム病誘導性関節炎を改善し得る。このような治療法はまた、感染性因子と模倣して関係する他の場合に適切である。
出願人らは、驚くべきことに、LT-β-Rの遮断剤の投与が、小胞樹状細胞上の抗原の提示および/または沈着に干渉し得ることを見い出した。代表的には、Ｂ細胞は、小胞樹状細胞の表面に結合した免疫複合体として抗原を認識する。小胞樹状細胞は、特定されない期間、抗原を保持し得る。従って、FDC上に保持される抗原との定期的接触は、Ｂ細胞の記憶保持と関係し得る。従って、請求される方法は、樹状細胞上の抗原提示に依存する多くの疾患状態を含む。本発明の遮断剤の投与は、動物内への抗原の導入の前に行われ得、その場合は、遮断剤は小胞樹状細胞上の抗原の沈着の全てまたは一部を防止し、それによって、予測される免疫応答を防止または減少させる。あるいは、本発明の遮断剤は、小胞樹状細胞が抗原と会合した後の段階で動物に投与され得る。出願人らの請求される方法は、この会合を破壊し得、その結果、予測される免疫応答は減少または無効にされる。従って、本発明の治療法は、既にＢ細胞小胞体に捕捉された免疫複合体の全てもしくは一部の排除、またはＢ細胞小胞上での免疫複合体の捕捉の全てまたは一部の予防を含み得る。
これらの抗原提示小胞樹状細胞と免疫複合体との間の会合を破壊する能力は、LT-β経路に固有であるようである。例えば、抗CD40L（MR-1）は、TNFファミリーの別のメンバーであり、そしてまた小胞樹状細胞上に発現される。LT-β-R/Ig同様、MR-1は、胚細胞形成を防止することが示されているが、しかし、FDCマーカーの発現には影響を与えない。抗CD40-Lは、LT-β-Rと異なり、小胞樹状細胞上での免疫複合体捕捉を防止せず、既に小胞樹状細胞に捕捉された免疫複合体を排除し得ない。さらに、出願人らは、抗CD40-Lは、既に生成された記憶Ｂ細胞の生存/保持に影響を与えないことを示した。
抗CD40-LとLT-β-R遮断剤との間の影響の相違の正確な根拠は知られていないが、CD40はＢ細胞に生存シグナルを提供し得ると仮説される。しかし、LT系は、小胞樹状細胞を、十分に分化しそして機能的な状態（胚中心反応ならびに記憶Ｂ細胞の生成および維持のために必要と思われる条件）に保持するために重要である。従って、CD40/CD40L経路を遮断することは、記憶Ｂ細胞の生成を防止し得るが、既に樹立された記憶Ｂ細胞プールには影響しない。他方、LT経路を遮断することは、記憶Ｂ細胞の生成および保持のみならず、既に生成された記憶Ｂ細胞の保持にも影響を与える。
LT経路の阻害のさらなる適用は、小胞樹状細胞（FDC）コンパートメントにおいてレザーバーを形成するウイルスの処置に存在する。HIVウイルスはこのような場合の良い例である。ウイルス感染に引き続き、大量の感染性ウイルスが二次リンパ器官のＢ細胞小胞体内のFDC上に存在する。（Heatheら, 1995, 「小胞樹状細胞およびヒト免疫不全症ウイルス感染性」, Nature, 377:740-4）。ウイルスは、補体または免疫グロブリンのいずれかと複合化し、そしてFcレセプターもしくは補体レセプターのいずれかまたはその両方と結合すると推定される。従って、ウイルスは、長期間にわたって抗原記憶を保持するために免疫系の正常なメカニズムを利用する。疾患の経過において、リンパ球の活発な感染は主としてこれらの部位に起きる。感染の無症候期においては、このコンパートメント内のウイルスのプールは、Ｔ細胞および単球中に含まれるプールよりも10倍を超えて大きいことが計算されている。（Cavertら, 1997, 「HIV-1感染の抗レトロウイルス治療に対するリンパ組織内の応答の動力学」, Science、276:960-4）。現在のHIV処置様式においては、ウイルス負荷を減少させ、また抵抗性変異株のエスケープを回避するために、複数の抗ウイルス剤が併用されている。この治療のもっともらしい限界は、治療の非コンプライアンスにあり、このような間隔の間、残存するウイルスは自由に変異して、抵抗性変異株を発達させ得、従って治療経過を妨害する。FDCコンパートメント内のウイルス負荷は複数薬物治療中に劇的に影響を与えるが、薬物それ自体は主としてウイルス複製機構に指向され、そしてFDC表面上の非複製可能ウイルスには指向されない。それゆえ、FDC上のウイルスレザーバーは、薬物治療の停止後に再接種物として作用し得る。さらに、FDCは中和されたウイルスを感染性形態に変換し得るため、HIV病因に対するこれらの細胞の重要性がさらに強調される。
LT経路の阻害は、FDCが細胞表面から免疫複合体を放出するのを生じ得るため、免疫複合体の形態のHIVもまた放出され得る。放出されるウイルスは処理され、そして身体から除去されるか、または感染に際して薬物治療に感受性であるかのいずれかであるべきであるので、複数治療型レジメの開始の直前に、このコンパートメント内のHIV負荷の全てを放出することが望ましい。そのような組み合わせは、残存ウイルス負荷を極めて低レベルに減少させ得、おそらく治癒をもたらす。この場合、リガンドまたはレセプターのいずれかに対するLTβ-R/Igまたはブロッキング抗体のいずれかが有用である。可能性のある処置プロトコルは、薬物治療の開始、次いで数日以内の、LT経路インヒビターを用いる１または数回の処置での任意の結合ウイルスの放出を含む。一旦ウイルス負荷が減少すると、LT指向剤によるさらなる処置は必要でない。
HIVは特によく研究されている例であるが、その他のウイルスも静止状態においてFDC上に在留または隠蔽して、大量のさらなる抗原負荷を導く免疫障害のような事象に備えて待機しており、その結果FDCからの結合ウイルスの放出およびウイルスの再出現を起こす。従って、本発明は、FDC結合ウイルスの合併症を避けるためのLT経路抑制のあらゆる手段に関する。
この発見は、樹状細胞上の抗原呈示に起因する多数の疾患、および記憶Ｂ細胞により生成される応答に関する重大な含意を有する。LTα1/β2シグナリングは、効果的に治療的に有効な抗LTb遮断モノクローナルの例として作用する。さらに、AOD12という名称の抗ヒトLTα指向性モノクローナル抗体は、LTα1/β2シグナリングをよく遮断することが可能であったが、多くの抗ヒトLTαモノクローナル抗体とは対照的に、LTα単独に対しては効果が少なかった。これらのモノクローナル抗体は、可溶性LTα1/β2リガンドでマウスを免疫することにより獲得され、独特の特異性を有するモノクローナル抗体の発見の糸口となった。さらには、LTα1/β2複合体に対して優先的に特異性を有するように指向された抗LTαモノクローナル抗体は、この形態の免疫化によってのみ見出され、LTα単独による免疫化では得られず、従って抗LTα抗体の独特な型を含むことを維持する。
実施例
材料および方法
マウス
時期を合わせた、妊娠中であるBalb/cマウスがJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入され、従来の柵保護において飼育し、制度的規定に従って取り扱われた。レセプターIgタンパク質質またはmAbsが、妊娠マウスの尾部静脈（iv）より注射された。これらのマウスの子孫および生後５週間のメスBalb/cマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEより購入）が、腹腔内（ip）経路を通して融合タンパク質を注射された。
融合タンパク質および抗体
ヒトIgG1のヒンジ、CH2およびCH3ドメインに融合した、マウスLTβ-R、ヒトTNF-55またはヒトLFA-3（マウスCD2と結合しない）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質は以下に記載されるように調製された（Forceら, J. Immunol., 155, 5280-5288頁（1995））；Millerら, J. Exp. Med., 178, 211-222頁（1993））。対照として使用された精製されたヒトIgG1は、Protos Immunoresearch（San Francisco, CA）より購入された。MR1、抗マウスCD40リガンド抗体は、Pharmingen（San Diego, CA）より購入された。
マウス金属親和性マクロファージ（MM）により発現されるマーカーに特異的な抗体（MOMA-1、ED3）、（ED3はシアロアドヘシン（sialoadhesin）を認識する）、またはマウス網状線維芽細胞（ER-TR-7）特異抗体、はSerotec（Oxon, UK）から購入した。マウスB220、CD4およびMadCAM-1（MECA 367）に特異的な抗体は、Pharmingen（San Diego, CA）から購入した。マウス周辺帯マクロファージにより発現されるマーカーに特異的な抗体（ER-TR-9）は、Dr. Reina Mebius（Vrije Universiteit, Amsterdam）により提供された。マウス小胞樹状細胞（FDC）に特異的な抗体（FDC-M1およびFDC-M2）はすでに説明されている（Maedaら, J. Immunol., 148, pp. 2340-2347（1992）。抗マウスCR1抗体（またFDCを染色する）は、Dr. Randolph J. Noelle（Dartmouth Medical School）の好意により供給された。末梢リンパ節アドレシン（PNAd）の検知は、抗体MECA 79（ATCC, Rockville, MDより購入の細胞由来の細胞培養上清）を使用した。
抗原および免疫化
マウスを、腹腔（ip）経由でSRBC（Colorado Serum Companyより購入）の10%懸濁液100μlで免疫した。これは、免疫あたり1〜5ｘ108SRBCに等価である。
免疫組織化学
脾臓およびリンパ節はOCT包埋培地（Miles, Elkhart, IN）内に凍結され、低温槽切片用にマウントされた。7-10mmの厚さの切片を、乾燥し、アセトン固定した。切片を、トリス緩衝化食塩緩衝液A（TBS-A、0.05M Tris、 0.15M NaCl、0.05% Tween-20（v/v）、0.25%ウシ血清アルブミン（BSA））で希釈した後に湿潤化ボックス中で室温で１時間インキュベートし、TBS-B（0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05% Tween-20）中で洗浄し、そして酵素反応開始前にメタノールで１分間固定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）およびアルカリホスファターゼ（AP）活性を、それぞれDAB錠剤基質キット（Sigma、St. Louis、MO）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸塩/ニトロブル-テトラゾリウム（BCIP/NBT、Sigma）で発生させた。組織切片をメタノール中で５分間固定し、ギムザ（Fluka、Buchs、Switzerland）で対比染色した。
蛍光イメージ分析
免疫蛍光染色のために、凍結切片を、アセトン固定し、風乾し、そして0.25% BSA、0.05% Tween-20および10%熱凝集ウサギ血清を含むトリス緩衝化生理食塩水中で、5μg/ml抗CD16/CD32Fc遮断（Pharmingen、San Diego CA）で事前に遮断した。切片を、以下のmAb、および検知試薬を使用して同じ緩衝液中で染色した：10μg/mlビオチン化抗B220mAb（Pharmingen）、続いて20μg/mlストレプトアビジン-FITC（Southern Biotechnology Associates、Birmingham、AL）；10μg/ml MECA367、続いて10μg/ml PE-ヤギF（ab’）2抗ラットIgG（Southern Biotechnology Associates）；MECA79の培養上清、続いて20μg/ml FITC-マウス抗ラットIgM（Pharmingen）；20μg/ml抗シアロアドヘシンmAb、続いて10μg/ml PE-ヤギF（ab’）2抗ラットIgG（Southern Biotechnology Associates）、50μg/mlビオチン化PNA（Vector Laboratories、Burlingame、CA）、続いて10μg/mlストレプトアビジン-PE（Southern Biotechnology Associates）；１：５希釈のmAb MOMA-1細胞培養物上清、続いて20μg/ml FITC-マウス抗ラットIgM（Pharmingen）。いくつかの切片を、画像重層分析を可能とするために、同時に複数のmAbで染色した。全ての切片を、50倍光学顕微鏡で観察し、Ektachrome P1600（Kodak、Rochester、NY）を使用して写真を撮るか、記載されるように（Rennertら, J. Exp. Med.（11月1996、印刷中）別々の赤および緑のイメージファイルに捕獲した。
赤血球凝集測定法
血清の連続希釈を、PBS/1%グルコース中で、96ウェルマイクロタイタープレート（Costar、Cambridge、MA）中に作製した。SRBC特異的IgM力価は、各々のウェルに25μlの10%SRBC懸濁液を添加し、プレートを加湿された37℃のインキュベーター内で１時間インキュベートすることにより決定された。SRBC特異的IgGを、血清を、20μl/ウェルの1% ２-メルカプトエタノール（v/v）（Bio-Rad、Richmond、CA）とともに37℃で30分間インキュベートし、IgMペンタマーを排除した。次いで、25μl/ウェルの10%SRBC懸濁液を添加し、その後赤血球凝集のための架橋剤としてのヤギ抗マウスIgG（Southern、Biotechnology, Birmingham、AL）10mg/ml溶液（PBS/1%グルコース中）25μl/ウェルにて添加した。力価は、赤血球凝集がはっきりと明確となった最終血清希釈の相反として決定される。
ELISAs
血漿中のレセプターIgの分析は、マウスLTβ-Rに特異的なmAb（Browningら．原稿は準備中）、LFA-3（Millerら, J. Exp. Med., 178, pp. 211-222（1993）、または捕捉のための96ウェルマイクロタイタープレート上に直接固定化したヒトIgG1のCH3ドメイン（CDG5、Biogenで調製）、および検知のためのロバ抗ヒトIgG1-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）（Jackson ImmunoResearch、West Grove PA, 1:4000希釈）を使用した。
可溶性LTβ-R分子の産生
本発明のひとつの実施様態におけるLTβ-R遮断剤は、可溶性LTβレセプター分子を含む。図１は、リガンド結合ドメインをコードするヒトLTβ-Rの細胞外部分の配列を示す。図１における配列情報および当該分野で周知の組換え型DNA技術を使用して、LTβ-Rリガンド結合ドメインをコードする機能的フラグメントをベクター内にクローン化し、適切な宿主内において発現し、可溶性LTβ-R分子を産生し得る。1995年７月21日に出願された本出願人の同時係属中の米国特許出願第08/505,606号に記載されるアッセイに従って、天然LTβレセプターとLTリガンド結合について競合し得る可溶性LTβ-R分子を、LTβ-R遮断剤として選択する。
図１に表示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む可溶性LTβレセプターは、レセプター融合タンパク質のインビボでの安定性の増加のため、または生物学的活性または局在性の調節のために、１またはそれ以上の異種タンパク質ドメイン（”融合ドメイン”）に付着され得る。
好ましくは、安定な血漿タンパク質質（典型的にはその循環において20時間を超えるの半減期を有する）は、レセプター融合タンパク質質を構築するために使用される。そのような血漿タンパク質質は以下を含むがそれに限定されるわけではない：免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質質、アポリポタンパク質質およびトランスフェリン。可溶性LTβ分子を特定の細胞または組織型に標的し得る配列はまた、特異的に局在する可溶性LTβ-R融合タンパク質質を作製するために、LTβ-Rリガンド結合ドメインに付着し得る。
LTβ-Rリガンド結合ドメインを含むLTβ-R細胞外領域（図１）の全てまたは機能部分は、ヒトIgG1重鎖のFcドメインのような免疫グロブリン定常領域に融合され得る（Browningら, J. Immunol., 154, pp. 33-46（1995））。可溶性レセプター-IgG融合タンパク質は好ましく、および一般的免疫学的試薬であり、またその構築の方法は、当該分野で公知である。（例えば、本明細書中に引用されている、米国特許第5,225,538号を参照のこと）
機能的LTβ-Rリガンド結合ドメインは、IgG1以外の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス由来の免疫グロブリン（Ig）Fcドメインと融合され得る。異種のIgクラスまたはサブクラスに属する抗体のFcドメインは、別種の二次エフェクター機能を活性化し得る。Fcドメインが同族Fcレセップターにより結合された時に活性化が生成する。二次エフェクター機能は、補体系活性化する能力、胎盤通過する能力、および種々の微生物タンパク質に結合する能力を含む。免疫グロブリンの異なったクラスおよびサブクラスの特性はRoittらによるImmunology、p.4-8（Mosby-Year Book Europe Ltd., 第三版、1993）に記載されている。
補体系の活性化は炎症を媒介する酵素反応のカスケードを開始する。補体系の産物は、細菌の結合、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス（食菌）、細胞毒性、フリーラジカル（遊離基）産生、および免疫複合体の可溶化を含む様々な機能を有する。
補体酵素カスケードは、抗原結合IgG1、IgG3、およびIgM抗体のFcドメインにより活性化され得る。IgG2のFcドメインは効果が少ないように思われ、またIgG4、IgA、IgDおよびIgEのFcドメインは補体の活性化には効果がない。従って、関連する二次エフェクター機能が、特定の免疫応答またはLTβ-R-Ig融合タンパク質質により治療される疾患にとって望ましいか否かに基づいて、Fcドメインを選択し得る。
LTリガンド保有標的細胞を傷害または殺傷することがが有益であるならば、LTβ-R-Ig融合タンパク質質を作るような特に活性なFcドメイン（IgG1）を選択し得る。あるいは、補体系を開始することなしに細胞にLTβR-Fc融合を標的とすることを望むのであれば、不活性IgG4 Fcドメインが選択され得る。
Fcレセプターとの結合および補体活性化を減少または排除するようなFcドメインにおける突然変異が記載されている（S. Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10, pp. 239-65（1992））。これらまたはその他の突然変異は、単独でまたは組み合わせて、LTβ-R-Ig融合タンパク質の構築に使用されるFcドメインの活性を至適にするために使用され得る。
ヒト免疫グロブリンFcドメイン（hLTβ-R-Ig）に融合するリガンド結合配列を含む可溶性ヒトLTβ-R融合タンパク質質の産生は、実施例１において記載される。実施例１に従って作製された、hLTβ-R-Fcを分泌する１つのCHO株は、”hLTβ-R-hG1 CHO#14”と呼称される。この株のサンプルは、ブダペスト条約の規定に準じて、1995年７月21日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Rockville, MD）に寄託され、ATCC受託番号CRL11965が割り当てられた。
可溶性マウスLTβ-R融合分子（LTβ-R-Ig）の産生は実施例２に記載される。実施例２に従って作製された、LTβ-R-Igを分泌するCHO株は”mLTβ;R-hG1 CHO#1.3.BB”と呼称される。この株のサンプルは、ブダペスト条約の規定に準じて、1995年７月21日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Rockville, MD）に寄託され、ATCC受託番号CRL11964が割り当てられた。
上記のATCC寄託物への公共の利用可能性に対する規制は、本出願に対する特許の付与において最終的に取除される。
レセプターIg融合タンパク質の連結部位を形成する異なったアミノ酸残基は、可溶性LTβレセプター融合タンパク質の構造、安定性およびの最終的な生物学的活性を変更し得る。選択された融合ドメインとの連結部位を修飾するために、１またはそれ以上のアミノ酸は、選択されたLTβ-RフラグメントのＣ末端に付加され得る。
LTβ-R融合タンパク質のN末端はまた、選択されたLTβ-R DNAフラグメントが組換え型発現ベクター内に挿入されるためにその5”端において切断される部位を変化させることにより、改変し得る。各々のLTβ-R融合タンパク質の安定性および活性は、日常的な実験を使用して試験および至適化され、そして本明細書中に記載されるLTβ-R遮断剤の選択のために分析され得る。
図１に表示される細胞外ドメイン内のLTβ-Rリガンド結合ドメイン配列を使用することにより、LTリガンドに対する可溶性LTβレセプターまたは融合タンパク質質の親和性を修飾するために、アミノ酸配列変異体がまた構築され得る。
本発明による可溶性LTβ-R分子は、内因性細胞表面LTβレセプターと表面LTリガンド結合について競合し得る。LTリガンド結合のための細胞表面LTβレセプターと競合し得るLTβ-Rリガンド結合ドメインを含むすべての可溶性分子は、本発明の範囲に含まれるLTβ-R遮断剤であると考えられる。
抗LTβ-R抗体の供給源
本発明の他の実施様態においては、ヒトLTβレセプター（抗LTβ-R Abs）に対する抗体は、LTβ-R遮断剤として機能する。本発明による抗LTβ-R Absは、ポリクローナルまたはモノクローナル（mAbs）であり得、そしてそのLTβ-Rシグナリングを遮断する能力、インビボバイオアベイラビリティー、安定性またはその他の所望の特性能力を至適にするために改変され得る。
ヒトLTβレセプターに対するポリクローナル抗体血清は、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスのような動物に、完全フロイントアジュバント中のヒトLTβレセプタ-Ig融合タンパク質（実施例１）を皮下注射し、それに引き続いて不完全フロイントアジュバント中のそれを腹腔内または皮下注射追加免疫による従来の方法を使用して調製される。LTβレセプターに対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清は、従来の免疫学的方法によってスクリーニングされる。
ヒトLTβレセプタ-Ig融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（mAbs）は、1995年７月21日に出願者により米国同時係属出願第08/505,606号に記載されるように調製される。マウス抗ヒトLTβR  mAb  BDA8を産生するハイブリドーマ細胞株（BD.A8.AB9）は、ブダペスト条約の規定に従って、1995年１月12日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（Rockville, MD）に寄託され、ATCC登録番号HB11798が割り当てられた。上記のATCC寄託株への公共の利用可能性におけるすべての規制は、本出願における特許の付与において変更不能に取りのぞかれる。
抗LTβ-R抗体の種々の形態はまた、標準組換え型DNA技術を用いて作製され得る（WinterおよびMilstein, Nature, 349, 293-99頁（1991））。例えば、「キメラ化」抗体は、動物抗体からの抗原結合ドメインがヒト定常ドメインと連結するように構築され得る（例：Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81, 6851-55頁（1984））。キメラ化抗体はヒト臨床処置に使用される場合に、動物抗体により惹起されることにより観察される免疫応答を減少する。
さらに、LTβ-Rを認識する、組換え型「ヒト化抗体」が合成され得る。ヒト化抗体は、特異抗原結合に応答する領域内に挿入された、主としてヒトIgG配列を含むキメラである（例えば、国際公開WO94/04679）。動物は、所望の抗原で免疫され、対応する抗体が単離され、そして特異的抗原結合に応答する可変領域配列が取り出される。次いで、動物由来抗原結合領域は、抗原結合領域が欠失されたヒト抗体遺伝子の適切な部位にクローニングされる。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異型（種間）配列の使用を最小化し、処置された被験体における免疫応答を惹起しないようである。
異なったクラスの組換え抗LTβ-R抗体の構築はまた、異なったクラスの免疫グロブリンから単離された抗LTβ-R可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（CH1、CH2、CH3）を含むキメラまたはヒト化抗体を作製することにより達成され得る。例えば、増加された抗原結合部位結合価を有する抗LTβ-R IgM抗体は、ヒトμ鎖定常領域を有するベクター内に抗原結合部位をクローニングすることにより、組換え的に産生され得る。（Arulanandamら, J.Exp.Med.,177,1439-50頁（1993）；Laneら, Eur.J.Immunol., 22,2573-78（1993）；Trauneckerら, Nature, 339,68-70頁（1989））
さらに、標準的組換え型DNA技術は、抗原結合部位の近傍におけるアミノ酸残基を変更することにより、それらの抗原に対する組換え型抗体の結合親和性を改変するために使用され得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発により増加され得る（Queenら,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,86,10029-33頁（1989）；WO94/04679）。
標的組織タイプまたは想像される特定の治療スケジュールによって、LTβ-Rに対する抗LTβ-R Absの親和性を増加または減少することが望ましくあり得る。例えば、抗LTβ-R Absが定常レベルである患者を、LT-β経路を介したシグナル能力を減少するように治療することは、半予防的処置のために有益であり得る。同様に、LTβ-Rに対する増大した親和性を有する抑制性抗LTβ-R Absは、短期の処置に有利であり得る。
抗表面LTリガンド抗体の供給源。
本発明の他の好ましい実施様態は、LTβ-R遮断剤として機能するLTリガンドに対する抗体を含む組成物および方法を含む。抗LTβ-R Abについて上記のように、LTβ-R遮断剤として機能する抗LTリガンド抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり、そしてその抗原結合特性および免疫原性を調節する日常の手順によって改変され得る。
本発明による抗LT抗体は、LTサブユニットの可溶性、変異誘発、改変およびキメラの形態を含む、２つのLTサブユニットのいずれか１つに対して別々に惹起され得る。LTサブユニットが抗原として使用される場合、好ましくは、LTβサブユニットである。LTαサブユニットが使用される場合、得られる抗LTα抗体が表面LTリガンドと結合すること、および分泌されるLTαを交差反応するか、またはTNF-R活性を調節しないことが好ましい。（出願者により1995年７月21日に共同出願された米国特許出願第08/505,606号に記載されているアッセイによる）
あるいは、１つ以上のLTサブユニットを含む、ホモマー（LTβ）またはヘテロマー（LTα/β）複合体に対する抗体が惹起され得、そしてLTβ-R遮断剤としての活性をスクリーニングされ得る。好ましくは、LTα1/β2複合体が抗原として使用される。上記に考察されたように、得られる抗LTα1/β2抗体が、分泌されるLTαと結合せず、そしてTNF-R活性を影響せずに、表面LTリガンドと結合することが好ましい。
ポリクローナル抗ヒトLTα抗体の産生は、出願者による共同出願（国際公開第WO 94/13808）において記載される。モノクローナル抗LTαおよび抗LTβ抗体もまた記載されている（Browningら, J.Immunol., 154,33-46頁（1995））。
マウス抗ヒトLTβ mAbsは、1995年７月21日に出願された出願者の共同出願による米国特許出願第08/505,606号おいて記載されている方法により調製された。マウス抗ヒトLTβ-R mAb B9を産生するハイブリドーマ細胞株（B9.C9.1）は、ブダペスト条約の規定に従って、1995年７月21日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（Rockville, MD）に寄託され、ATCC受託番号HB11962が指定された。
モノクローナルハムスター抗マウスLTα/β抗体は、1995年７月21日に出願された出願者の共同出願による米国特許出願第08/505,606号おいて説明されている方法により調製された。ハムスター抗マウスLTα/β抗体mAb BB. F6を産生するハイブリドーマ細胞株（BB. F6.1）は、ブダペスト条約の規定に従って、1995年７月21日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（Rockville, MD）に寄託され、ATCC受託番号HB11963が指定された。
上記のATCC寄託物への公共の利用可能性におけるすべての規制は、本出願における特許付与において変更不能に取り除かれる。
表面LT複合体の免疫学的機能を阻害するための可溶性LTβ-R-Igの使用。
マウスLTβ-Rの細胞外ドメインおよびヒンジ、ヒトIgG1（LTβ-R-Ig）のCH2およびCH3ドメインを含む融合タンパク質である、表面LT結合試薬の、免疫グロブリン応答の生成および特徴、濾胞樹状細胞および胚中心形成の分化過程における影響を含む二次リンパ様組織の細胞組織化の維持、ならびに細胞トラフィッキングに影響するアドレシン発現レベルに対する効果を示す。
マウスのLTβ-R-Igによる複数注射は脾臓リンパ球の組織化、および脾臓周辺帯細胞による機能マーカー発現を修正する。
脾臓構造における表面LT遮断の影響は、マウスに、１週間ごとに６回連続してLTβ-R-Ig注射をすることにより確かめられた。次いで、マウスはSRBCで免疫され、４日後にLTβ-R-Igのさらなる注射を与えられた。マウスはSRBC注射後10日めに屠殺された。凍結脾臓切片の免疫組織化学染色は、いくつかの組織学的変化を明らかにした。正常マウスの脾臓Ｂ細胞コンパートメントを含む濾胞は、LTβ-R-Ig処置後は分散しない。Ｂ細胞のかわりに、Ｔ細胞領域を取り囲む拡散されたバンドにまさに組織化され（図2B）、そして、ＴおよびＢ細胞ゾーンの間の境界は破壊されている（図2B）。対照的に、コントロールLFAー3-Ig処理マウスにおいては、脾臓Ｂ細胞濾胞は分散しており、ＴおよびＢ細胞間には明確な境界がある（図2A）。
モノクローナル抗体、ER-TR-9およびMOMA-1により認識される細胞表面マーカーの発現は、LTβ-R-Ig処理を受けたマウスの脾臓周辺帯に存在する２つの別々なマクロファージ集団が存在しない。ER-TR-9はMZM上のマーカーを染色し、（Dijkstraら, Immunol., 55,23-30頁（1985））、そしてMOMA-1は、金属親和性マクロファージ上のマーカーを染色する（KraalおよびJanse, Immunol., 58,665-669頁（1986））（それぞれ、図2D、F）。これらのマーカーは、コントロール（LFA-3-Ig）処理マウスの細胞上に発現される（図2 C,E）。マウス脾臓周辺帯におけるMOMA-1＋マクロファージの別のマーカーである、シアロアドヘシンの発現はまた、LTβ-R-Ig処理マウスにおいて存在しない（データは示さず）。
接着分子および粘膜アドレシンMAdCAM-1と結合する抗体MECA-367は、本来はパイエル板の内皮細胞、腸間膜リンパ節、腸管粘膜および固有板について記載された（Briskinら, Nature, 363, 461-464頁（1993）；Nakacheら, Nature, 337, 179-181頁（1989））。MAdCAM-1発現はまた、脾臓周辺帯（周辺洞に開孔する小末端細動脈の内皮細胞上に発現されるようである）および胚中心内の網状網目構造（Kraalら, Am. J. Pathol., 147,763-771頁（1995））（図2G）に対して記載された。LTβ-R-Ig処理マウスよりの切片のMECA 367染色は、MAdCAM-1発現が脾臓において失われていることを示す（図2H）。
同様に、周辺帯における網状線維芽細胞の集合を示す（図2I）、ER-TR-7抗体による染色（Van Vlietら, Cytochem., 34,883-890頁（1986））は、異常に分布し、そしてLFA-3-Ig処理マウスよりもLTβ-R-Ig処理マウスの白色髄において強い（図2J）。LTβ-R-Ig処理マウス非免疫マウスにおける染色のパターンは同一であったので、LTβ-R-Ig処理マウスにおいて観察された変化は、抗原刺激に依存しなかった（データは示さず）。
切断および濾胞樹状細胞における胚中心形成はLTβ-R-Ig処理マウスの脾臓においては検知されない。
LTβ-R-Igのマウスへの複数注射がSRBCに対する免疫応答に対して影響するかどうかを組織学レベルで決定するために、抗原プライミングの応答における胚中心（GC）形成および濾胞樹状細胞（FDC）分布の分析が行われた。図２で記載されるように、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Igで複数回にわたり前処理されたマウスの凍結脾臓切片は、GCを示すために、ピーナッツ凝集素（PNA）で染色され、GC形成に必要とされる細胞成分であるFDC検知のためにFDC-M1抗体で染色された。（SchrieverおよびNadler, Adv. Immunol., 51,243-284頁（1992））；Tewら, Immunol. Rev., 117, 185-211頁（1990）。CD-40-CD40リガンド相互作用もまたGC形成に重要であることが示されている（Foyら, J.Exp.Med., 180,157-163頁（1994））。従って、比較のために、一群のマウスは、抗マウスCD40リガンド抗体である、MR-1で処理され、次いで前述によるGC形成抑制のための注射プロトコルで処理された（Hanら, J. Immunol., 155. 556-567頁（1995））。SRBC抗原投与の10日後、対照LFA-3-Igタンパク質処理によるマウスは、脾臓中に多数のPNA鮮明なGCを発生した（図3A）。LTβ-R-Ig、またはMR1処理マウスの脾臓においてはGCは検知されなかった（それぞれ図3  B,C）。しかし、MR1およびLTβ-R-Igの効果は、２つのさらなる観察により区別され得る。GC内（図3D）のFDC（FDC-M1）についての染色は、LTβ-R-Ig処理マウスの脾臓において存在しない（図3E）が、MR1処理によるマウスの脾臓中にはなお存在する（図3F）。同様な観察がFDC-M2抗体を用いて、株FDCについてなされた（データは示さず）。従って、LTβ-R-Ig処理は脾臓におけるFDCの表現型変化を生じ、そしてGCを形成しない。
GC染色に加えて、PNAはまた、正常マウス脾臓の周辺帯を染色する。このような染色はまた、LFA-3-Ig処理（図3A）およびMR-1処理マウス（図3C）においても表示されるが、LTβ-R-Ig処理マウス脾臓には存在しない（図3B）。
MR1処理マウス脾臓における唾液腺接着の発現（MOMA-1、ER-TR-9、ER-TR-7およびMAdCAM1）はまた正常であることが示されている（データは示さず）。このことはさらに、CD40およびLTβ-Rシグナルの妨害の分子的効果を区別する。
脾臓リンパ球組織化および周辺帯細胞マーカー発現のLTβ-R-Ig誘導による修正の動力学
脾臓におけるリンパ球組織化および周辺帯細胞マーカー発現に影響を及ぼすために必要とされるLTβ-R-Ig注射の回数が分析された。表１に示されるようにマウスは、１回または複数回、LTβ-R-Igを腹腔内に注射された。次いで、いくつかのマウスはまた、LTβ-R-Ig注射の最終日にSRBCで免疫された。ＢおよびＴ細胞上におけるB220およびCD4発現が、それぞれPNA（GC用）とMECA367（MAdCAM-1用）で染色され、MOMA-1、ER-TR-9、およびFDC-M1が処理マウスの凍結脾臓切片において評価された。金属親和性マクロファージ、周辺帯マクロファージ、MAdCAM-1、GC、およびFDCの染色消失の力学が識別のために表示される。
１週間後のMadCAM-1染色を排除するためには、LTβ-R-Igの１回の注射で十分である。１週毎のLTβ-R-Ig注射を３回接種後、GCsおよびFDCsの染色は検知されず、そしてT/Bリンパ球コンパートメントは破壊される。金属親和性マクロファージの染色を消失するためには、最低４回のLTβ-R-Ig注射が必要とされる。６回のLTβ-R-Ig注射は、ER-TR-9抗体を持つ周辺帯マクロファージ染色を完全には除去しない。（図2Dにまた表示される）
LTβ-R-Ig単一注射後のMOMA-1、MAdCAM-1、FDC-M1、FDC-M2およびCR1染色の敏速な阻害のより詳細な分析が、抗原の非存在下において行われた（表2）。
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LTβ-R-Igの単回腹腔内静脈注入を受けたBalb/cマウスを、注入後14日間毎日屠殺し、それらの脾臓を取り出し、凍結した。凍結脾臓切片を、MOMA-1、抗MAdCAM-1（MECA-367）、およびFDC特異試薬（FDC-M1、FDC-M2、および抗CR1抗体）を用いて染色した。LTβ-R-Ig注入の一日後に、抗MAdCAM-1 FDC-M1、およびFDC-M2試薬での染色は、非常に減少された（表２）。表１に記載されている結果と比較した、この実験でのFDC-M1染色のより迅速な阻害は、免疫された動物でより強いFDC-M1染色強度に原因し得る。CR1に対する染色は、14日目でさえ検出可能であり、このことは、FDCはLTβ-R-Igによる処理の３日後まで存在するが、FDC-M1およびFDC-M2によって検出されるマーカーの発現が消滅されたことを示す。従って、LTβ-R-Ig処理が、FDC表現型を変化させた。最終的に、MOMA-1染色は減少されたが、14日目にまだ検出された。
複数回LTβ-R-Ig処理はLNでのアドレシン（addressin）発現を阻害する。
本発明者らは、妊娠14日および17日目に、200μgのレセプター-Igタンパク質質を静脈内注入された、調節妊娠Balb/cマウスの子孫のLNでの、アドレシン発現を調査した。出産後、その子孫を、処理しないか、または100μgのLTβ-R-Ig、TNF-R55-IgまたはLFA-3-Igを、一週間に一度腹腔内に注入した。融合タンパク質質レベルは、ELISAによって測定されるように、生涯を通して10μg/mlまたはそれを超えて存在した（データは示されていない）。MECA367およびMECA79による免疫組織化学染色は、MAdCAM-1および末梢LNアドレシンが、生涯を通してLTβ-R-Ig処理されたマウスからの腸間膜LNに全く存在しないことを示した（図4A、B）。これらのマウスからの仙骨LNもまた、全アドレシン発現を欠如し、頚部および腸骨LNは、末梢リンパ腺（PNAd）染色を示さなかった（データは示されていない）。子宮のみに処理された動物において、発現が通常レベルに回復したので、アドレシン発現の下降調節は可逆的であった（図4G、H）。生涯を通して、100μg／週のTNF-R55-IgまたはLFA-3-Igで処理されたマウスで、LNでのアドレシン発現は、非処理マウスと同程度に存在した（図4C、D、E、F）。
Bリンパ球設置およびマクロファージマーカー発現はLTβ-R-Ig処理マウスのLNで変化される。
LN被膜下洞（脾臓周縁ゾーンに類似する）でのマクロファージ集団でマーカーに結合する抗体を、上記図４に記載されているように、LTβ-R-Ig、TNF-R55-Ig、またはLFA-3-Igを用いて、妊娠中および出産後継続的に処理されたマウスから得たLNの、免疫組織化学分析を実施するために使用した。蛍光画像を、画像分析ソフトを使用して分析した。シアロアドヘシン発現は、可溶性LTβ-R-Igによって処理されたマウスLNで減少されたが（図5B）、TNF-R55-IgまたはLFA-3-IgマウスのLNでは減少されなかった（図5E、H）ことを示す。被膜下洞のマクロファージ上でのMOMA-1発現はまだ、LTβ-R-Igで処理されたマウスのLNで検出された（図5C）。
LNにおけるリンパ球組織での連続LTβ-R-Ig処理の効果もまた評価した。LN切片を、B細胞マーカーB220およびT細胞マーカーCD4に対して特異的なmAbsで染色した。画像分析を、TおよびB細胞ゾーンの重複領域を同定するために使用した。LTβ-R-Igによる処理は、B細胞がT細胞領域の外側縁での拡散バンドに存在するように、B細胞小胞の溶解を生じた（図5A）。それらの小胞構造の溶解にもかかわらず、B細胞はLNのT細胞領域に存在せず、それどころか、通常はリンパ球に占有されない領域に出現した。TおよびB細胞染色の非常に類似したパターンが、生涯を通して100μg／週のTNF-R55-Igで処理されたマウスには認められたが、LFA-3-Ig処理マウスには認められなかった（図5D）。再度B細胞小胞は崩壊され、そしてB細胞は、通常リンパ球を含有することが認められないLN領域に存在した。B細胞のT細胞との重複は、認められなかった。
マウスのLTβ-R-Ig処理はIgMおよびIgG抗体応答を阻害する。
LTβ-R-Igによって複数回処理されたマウスのSRBC感作後の脾臓GC形成の欠如（図3でのように）は、これらのマウスの体液性免疫応答の変化を示唆した。これを直接テストするために、成体マウスに、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Igを毎週一度で６回注入し、SRBCで感作した。マウスを、免疫後の7日および14日目に採血し、血清中のSRBC特異IgMおよびIgGの存在を、赤血球凝集反応アッセイによって分析した。SRBC免疫の7日後、IgM力価は正常であったが、IgG応答は、ヒトIgまたはPBSによって処理されたマウスに比較して、LTβ-R-Ig処理マウスで非常に減少された。（図6A）。免疫の14日後に、SRBC特異IgGはまだ、LTβ-R-Ig処理マウスからの血清中に検出されないが、これらのマウスでのSRBC特異IgM力価もまた、ヒトIgまたはPBS処理マウスに比較して、半分を超えて減少される（図6A）。
SRBC感作の10日後、GCは、LTβ-R-Igで一度または二度処理されたマウス脾臓に検出されるが、しかし、多数のGCは、コントロールに比較して非常に減少される（表１）。マウスが、LTβ-R-Igの２回注入を受けたときには、最初の注入はSRBC感作の一週前であり、第二注入はSRBC注入と同じ日であり、7日および14日目のSRBCに対するIgMおよびIgG応答の阻害（図6B）は、マウスが複数回のLTβ-R-Ig注入を受けたときに検出されるのと同じである（図6A）。免疫30日後、SRBC特異IgGは検出されず、IgMレベルは、コントロールに比較して80%を超えて減少される（図6B）。従って、これらのLTβ-R-Ig処理プロトコールは、IgG応答の完全阻害、およびコントロールに比較して縮少／減少されたIgM応答を生じた。
マウスが、SRBC感作と同じ日にLTβ-R-Igの単回注入を受けたときに、7日目のSRBCに対するIgGおよびIgM応答レベルは、コントロール群と同程度であった（図6C）。しかし、免疫の24日後、IgMおよびIgG力価は、両方とも30%減少される。SRBC感作の34日後、SRBC特異IgMの力価は、コントロール群に比較して50%減少され、SRBC特異IgGは検出され得なかった（図6C）。これらのデータは、このLTβ-R-Ig処理プロトコールが、進行中のIgMおよびIgG両応答レベルの顕著な縮少／減少をもたらすことを示し、それは、LTβ-R-Ig処理が、すでに開始されている体液性応答を阻害し得るということである。
抗体媒介疾患
多数の器官特異および多機構自己免疫症状は、病理学的抗体応答を包含する。このような症状は以下のものを包含する：胃筋無力症、自己免疫溶血性貧血、シャガス病、グレーブ（Grave）病、自発性血小板減少症紫斑病（ITP）、全身性狼瘡赤斑病（SLE）、ウエグネル肉芽腫症、多発性動脈炎結節および急進行性鎌状糸球体腎炎。（Benjaminiら、Immunology,A Short Course, Wiley-Liss, New York第三編（1996））。
SLEの病因学は明かではないが、認められる病理症状に応答可能な免疫学的機構については、かなり知られている。未知理由につては、SLE患者は、身体の核成分に対する抗体（未変性二本鎖DNAに対する抗核抗体（ANA））を産生する。臨床的に、これらの抗体の存在は、SLEでの腎臓関連病理症状に関連する。これらの抗体は、明白に正常組織の衰弱に由来するDNAと複合体化し、任意の免疫凝集疾患でのように、このような複合体は、細動脈壁および関節腔で、糸球体の基礎メンバーに対して捕捉された蓄積物を形成する。これらの複合体は、補足カスケードを活性化し、顆粒球を誘引する。次の炎症反応が、タンパク質尿および血尿に導く腎臓損傷をもたらす、糸球体腎炎として特徴づけられる。
狼瘡腎炎は、10年間マウスモデルで研究されてきた。最近、マウスCD40リガンドに対して特異的な試薬の治療的効果が、このようなモデルにおいて評価された（Mohanら、J. Imuunol., 154, pp.1470-1480（1995））。インビボで病原性抗体の産生を誘引する細胞の導入による狼瘡の加速は、CD40/CD40リガンド相互作用を阻害するモノクローナル抗体の投与によって阻害されることが示された。さらに、抗CD40リガンド抗体による狼瘡マウスの簡単な処理が、その抗体が全身から排除された後も長く、自発性疾患に対して持続的に有利な効果を有した。その実験は、病原性B細胞が、治療後9ヶ月でさえも抗体を産生し得ないことを実証し、そのことは、長期間治療効果をもたらす、自己免疫メモリーB細胞の増殖の遅れが存在することを示唆する。本発明者らは、インビボにおいてLTα/β／LTβ-R相互作用を阻害する試薬が、抗体応答の発生を阻害し、FDC表現型およびB細胞メモリーの最適発生に関連する胚中心の形成を変化することを示したので、本発明のLTα/β／LTβ-R阻害試薬は、SLEの治療または予防に有用である。
いくつかの病原性感染因子に対する正常免疫応答もまた、過剰になり得、医療問題を生じる、自己抗体応答を誘引する。１つの実験は、シャガス病で、慢性Trypanosoma cruzi感染を有するヒトおよび実験動物に進行する、炎症性心筋病である。ヒトシャガス病心筋病の発病に関連する機構の中に、心臓特異自己免疫応答の誘導が、最近実質的な実験支持を得た。最近の研究（Tibbettsら、J. Immunol., 152, pp.1493-1499（1994））は、心臓抗原特異抗体は、心臓疾患を有するT. Cruzi感染C57B1/6マウスで産生されることを決定した。T. CruziのBrazil株による感染では、C57B1/6マウスは、慢性感染ヒトで認められるのと組織学的に同様である心筋病を進行する。これらのマウスからの抗血清は、３つの心臓抗体と反応するが、一方、心筋病を進行しないT. CruziのGuayas株に感染したC57B1/6マウスは、このような抗体を産生しなかった。これらのデータは、これらの抗体が、心筋病のマーカーに特異であることを示す。従って、自己抗体によって媒介される損傷を阻害するためのLTβ-R阻害剤の能力は、このようなゲッ歯類モデルで評価され得る。
特定の感染性疾患の結果として、またはその他の未知の理由によって生じた、自己抗体による細胞崩壊の別の例は、特発性血小板減少症（ITP）である。この状態では、血小板に対して指向する抗体は、出血に導き得る血小板破壊（補体あるいはFcまたはC3bレセプターを有する食細胞による）をもたらす。本発明のLT-β-R遮断剤のような、インビボでこのような抗体媒介自己免疫反応を阻害する（抗体生成を阻害する）治療薬は、同様にこれらの自己免疫疾患を処置または予防するために有用である。
いくつかの病原性感染因子に対する正常免疫応答はまた、過剰になって、それ自身医療問題となり得る、過敏性反応を惹起する。I型過敏性の最も広く認められる例は、アレルギー反応である。これらは、マスト細胞および好塩基球上のレセプターにFc部分を介して結合し、アナフィラキシーを媒介する薬理学的活性因子の放出を開始させる、IgE抗体によって媒介される。ITPおよびグッドパスチュア症候群は、ときには、IgMまたはIgG抗体が、細胞表面上で抗原に結合し、補体カスケードを活性化するときに生じる、II型反応であると考えられる。次に、顆粒球は活性化部位に誘引され、顆粒からの溶解酵素の放出による損傷が細胞の破壊を生じる。リウマチ性関節炎は、正常IgGのFc部分に結合する抗原（この場合は、リウマトイド因子であるIgM自己抗体）の免疫複合体によって媒介されるIII型過敏性反応から生じると考えられる。これらの免疫複合体は、関節の炎症およびこの疾患に特徴的な損傷を引き起こすことに関与する。これらの病理症状は、一部、抗体によって媒介されるので、本発明のLT-β-R遮断剤のような抗体の生成を阻害する治療薬は、同様にこれらの疾患の治療または予防に有用である。
LTβ-R遮断剤を用いる処置
本発明の組成物は、目的の特定の臨床状態を処置するために有効な用量で投与される。所定の適用についての好ましい薬学的処方物および治療的に効率的な用量レジメの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の範囲、および患者の処置に対する寛容性を考慮して、当業者の十分範囲内である。
約1mg／kgの可溶性LTβ-Rの用量が、処置用量を最適にするのに適した開始点であると期待される。
治療的に有効な用量の決定もまた、1〜14日間に標的細胞（遮断剤に依存したLTβ-RまたはLTリガンドポジティブ細胞）を被覆するのに要求されるLTβ-R遮断剤の濃度を測定する、インビトロ実験を実施することによって評価され得る。1995年7月21日出願の同時係属の米国特許出願番号第08/505,606号出願に以前記載されたレセプター-リガンド結合アッセイが、細胞被覆反応をモニターするのに用いられ得る。LTβ-RまたはLTリガンド-ポジティブ細胞は、活性化リンパ球集団からFACSを用いて分離され得る。このようなインビトロ結合アッセイの結果に基づいて、適切なLTβ-R遮断剤濃度の範囲が、動物でテストするために選択され得る。
本発明の可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abの投与は、抗体または複合体の単離および精製形態、それらの塩または薬学的に受容可能な誘導体を含み、単独または組み合わせて、免疫抑制活性を示す因子の従来から受容されている任意の投与様式によって、完了され得る。
これらの治療法に使用される薬学的組成物はまた、種々の形態であり得る。これらには、例えば、錠剤、ピル、粉末、液体溶液または懸濁液、座薬、および、注射可能および注入可能溶液のような、固体、半固体、および液体投与形態が包含される。好ましい形態は、投与および治療適用の意図される様式に依存する。投与様式は、経口、非経口、皮下、静脈内、病巣内、または局所投与を包含し得る。
本発明の可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子と共にまたはこれを含まずに、滅菌等張処方剤に配され得る。処方剤は、好ましくは液体であり、または凍結乾燥粉末であり得る。例えば、本発明の可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abは、5.0mg/mlクエン酸一水和物、2.7mg/mlクエン酸三ナトリウム、41mg/mlマンニトール、1mg/mlグリシン、および1mg/mlポリソルベート20を含有する処方緩衝液を用いて希釈され得る。この溶液は凍結乾燥され、冷蔵庫で貯蔵され、投与前に注入用滅菌水（USP）で再構成され得る。
組成物はまた、好ましくは当該分野で周知である従来の薬学的に受容可能なキャリアを含有する（例えば、Remigton’s Pharmaceutical Sciences, 第16編、1980, Mac Publishing Companyを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアは、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物のような、その他の医療薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤などを包含し得る。組成物は、好ましくは単位用量の形態であり、通常は日に１回以上投与される。
本発明の薬学的組成物はまた、罹患組織または血流内、近く、さもなければ連絡して配置される、マイクロスフェア、リポソーム、その他の微粒子送達システムまたは持続放出処方剤を用いて、投与され得る。持続放出キャリアの適切な例は、座薬またはマイクロカプセルのような成形品の形態の半透性ポリマーマトリックスを包含する。移植可能またはマイクロカプセル持続放出マトリックスは、ポリ乳酸（米国特許第3,773,319号、欧州特許第58,481号）、L-グルタミン酸およびエチル-L-グルタミン酸コポリマー（Sidmanら、Biopolymers, 22, 547〜56頁（1985））；ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）またはエチレンビニル酢酸（Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15, 167〜277頁（1981）; Langer, Chem. Tech., 12, 98〜105頁（1982））を包含する。
本発明の可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abを含有するリポソームは、単独または組み合わせで、周知方法によって調製され得る（例えば、DE第3,218,121号；Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 3688〜92頁（1985）; Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4030〜34頁（1980）; 米国特許第4,485,045号および第4,544,545号を参照のこと）。通常リポソームは、脂質含量が約30mol%コレストロールを超える、小さな（約200〜800オングストローム）単ラメラ型である。コレステロールの割合は、可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Ab放出の最適速度を制御するように選択される。
本発明の可溶性LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abはまた、他のLTβ-R遮断剤、免疫抑制剤、またはLTβ-R遮断活性を調節するサイトカインを含有するリポソームに付着され得る。LTβ-R分子、抗LTリガンド、および抗LTβ-R Abのリポソームへの付着は、標的される送達のためにトキシンまたは化学療法剤の抗体への結合カップリングに広く使用されてきたヘテロ二官能性架橋剤のような、任意の公知の架橋剤によって完了され得る。リポソームへの結合体化もまた、炭水化物指向性架橋試薬4-（4-マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（MPBH）を用いて完了され得る（Duzgunesら、J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77（1992））。
LTβ-R遮断剤を含む治療組成物の利点
本発明のLTβ-R遮断剤は、免疫エフェクター機構を選択的に阻害し得る。抗体媒介免疫の阻害は、FDC機能に影響を及ぼすことによって、GC形成の調節を含む複数の機構によって阻害される。抗体および細胞媒介免疫はともに、一部、アドレシンの発現を調節することによって、従って、リンパ球輸送に影響を及ぼすことによって、阻害される。従って、LTβ-R遮断剤は、抗体の活性、またはアドレシンの異常発現により悪化される状態を処置するのに有用である。このような免疫媒介応答を選択的に阻害する能力は、種々の自己免疫および慢性炎症状態を含む異常を処置するために有用である。上記に考察されているように、このような病理学的免疫媒介状態の処置は、一般的に、種々広範囲の細胞型および免疫学的応答に多面的効果を有する免疫調節剤および免疫抑制剤を使用する。これらの非特異的免疫抑制剤は、有害な副作用を引き起こす高度かつ頻繁な細胞毒性用量で、一般的に要求される。
病理学的免疫学的応答を改善するために抗体応対を阻害する試薬の能力は、マウスループス腎炎の最近の研究で支持されている。より最近の研究で、CD40/CD40L経路を遮断する抗体の投与は、インビボでの病原性抗体の産生を誘導する細胞の転移の際に生じるループス腎炎の加速を阻害し、そして抗体が系から排除されたずっと後に、自発性疾患に対して持続的に有利な効果を有することが示された。これらのデータは、本発明のLTβ-R遮断剤が、抗体応答の発生を導くプロセスを阻害することによって、組織移植片および器官移植の細胞拒絶を抑制するのに有用であることを示す。
本発明の組成物および方法のLTβ-R遮断剤は、処置される状態、障害または疾患に依存して改変され、所望のレベルのLTβ-Rシグナリングが得られ得る。LTβ-Rシグナリングの絶対レベルは、それらのそれぞれの分子標的に対するLTβ-R遮断剤の濃度および親和性を操作することにより微調整され得ることが予想される。
例えば、本発明の１つの実施態様では、可溶性LTβ-R分子を含む組成物が被験体に投与される。可溶性LTβレセプターは、表面LTリガンドを結合することについて、細胞表面LTβレセプターと効果的に競合し得る。表面LTリガンドと競合する能力は、可溶性LTβ-R分子および細胞表面LTβ-R分子の相対濃度、ならびにリガンド結合に対するそれらの相対親和性に依存する。
変異体可溶性LTβ-Rの表面LTリガンドとの結合親和性を増大または低減させるような変異を有する可溶性LTβ-R分子は、当業者に周知の標準的な組換えDNA技術を用いて作製され得る。多数の部位特異的変異またはランダム変異は、日常的な実験および本明細書に記載の技術を用いてLTβ-R遮断剤として作用するそれらの能力について試験され得る。
同様に、本発明の別の実施態様では、LTβレセプターまたは１つ以上のLTリガンドサブユニットのいずれかに対して惹起された抗体が、LTβ-R遮断剤として機能する。これらの抗体がLTβレセプターシグナリングを遮断する能力は、変異、化学的改変により、または被験体に送達された抗体の有効濃度または活性を変動し得るその他の方法により改変され得る。
LTβ-Rシグナリングを完全に阻害することなく、それを少なくする能力は、過剰であるかまたは異常である抗体または細胞介在応答を阻害しながら正常免疫機能を支持するLTβ-Rシグナリングの低減されたレベルを確立または維持するために重要であり得る。
マウスにおけるLTα遺伝子の破壊は、異常末梢リンパ系器官の発達に至る（De Tongiら、Science、264、703〜707（1994））。このようなマウスは、リンパ節を欠き、そしてそれらの脾臓は、小胞中のＴ細胞に富む領域とＢ細胞に富む領域との間の通常明瞭な分界を欠いていた。本発明者らは、この表現型が表面LT誘導LTβ-Rシグナリングの損失と関連していると考える。なぜなら、TNF-R活性を調整することによっては同様の表現型が観察されなかったからである。従って、LTβ-R経路を選択的にまたは部分的に遮断する能力は、LTβ-R経路のシグナリングによる誤発現または過剰発現に伴う慢性炎症から生じるリンパ系様構造の異常発達を処置することにおいて有用であり得る。
抗体は、病的因子に対する免疫応答の重要なメディエーターである。従って、抗体応答の絶対的な阻害は、特定の状況においては所望され得ない。例えば、抗体は、pneumococcusおよびhemophilusのような細胞外細菌による感染に対する抵抗性を仲介するために必要である。
LTβ-Rシグナリングを遮断することにより生成される抗体のレベルに影響する能力は、本発明のLTβ-R遮断剤を用いる処置によって達成され得る有益な結果を最大にすることにおいて重要であり得る。
本発明の治療方法は、LT-β経路に全面的にまたは一部依存する応答を選択的に阻害することを含む。請求項に記載された発明のこの特異的な治療用使用は、当業者に明らかなように、阻害されるプロセスまたは促進される医療的に所望されるプロセスのいずれかの、関係する病因学的機構に依存する。従って、本発明の方法は、種々の実施態様において、治療的に有効な量の遮断剤LT-β-R、またはLT-βを投与することを包含する。これらの方法で用いられるタンパク質質は、完全長タンパク質質、このタンパク質質のフラグメントであるか、または融合フラグメントのいずれかであり得る。他の実施態様では、本発明の方法は、可溶性リンホトキシン-βレセプターのような、可溶性フラグメントの投与を包含する。他の好適な実施態様では、請求項に記載の発明は、LT-β-R、またはLT-βに対する抗体の投与に関する。本発明の遮断剤は、医療的に所望される効果を奏する治療的に有効な量の第２の化合物と同時に投与され得る。
例えば、AIDSおよび/またはHIVの処置のための特定の方法では、当該分野で公知のさらなる抗ウイルス剤の同時投与を所望し得る。例えば、AZT、またはプロテアーゼインヒビターである。特に好ましいのは、本発明の遮断剤、より好ましくはLT-β-R/IgG融合タンパク質質の、AIDS「カクテル」療法と組み合わせた投与であり得る。これらの薬剤「カクテル」は、患者系中のウイルス量を低減するための複数薬物の患者への投与を含む。
本発明の組成物は、キャリアビヒクル中に調製されるなど、標準的な慣行に従って処方され得る。用語、薬学的に受容可能なキャリアは、患者に対して本発明の遮断剤の投与を容易にし得る、１つ以上の有機または無機成分（天然または合成の）をいう。適切なキャリアは当業者に公知である。
本発明の任意の組成物は、医療的に受容可能である任意の方法で投与され得る。これは、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜内などのような非経口経路、および経口、鼻、眼、直腸または局所による注入を含み得る。持続放出投与もまた、本発明に特に含まれ、例えば、デポー注入またはインプラントのような手段である。局在化送達もまた望ましい。投与の様式は当業者により容易に規定される。
請求の範囲に記載された発明で有用な、LT経路の遮断剤は、本明細書の請求項に記載の抗体である可溶性LT-β-Rの機能的誘導体を含むことが意図される。機能的誘導体は、分子のフラグメント、改変体、アナログまたは化学的誘導体を含む。本発明の任意の抗原のような、分子のフラグメントとは、分子の任意のポリペプチドサブセットをいうことを意味する。このような分子の改変体は、全体分子、またはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する天然に存在する分子をいうことを意味する。分子のアナログは、全体分子またそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然分子をいう。
本発明の遮断剤の改変体は、天然に存在する剤と、アミノ酸配列において、または配列を含まない様式で、またはその両方で異なる。アミノ酸配列における改変体は、天然に存在する分子中の１つ以上のアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然アミノ酸で置換されるときに生成される。特に好ましい改変体は、天然に存在するタンパク質質、または天然に存在するタンパク質質の生物学的に活性なフラグメントを含み、その配列は、野生型配列と、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって異なる。そのような置換は、当業者に周知であり、そして代表的には、遮断剤の二次構造および疎水性性質に対して最小の影響を有する。
他の実施態様では、より保存的でないアミノ酸置換を有する改変体がまた、所望の誘導体を、例えば、荷電、立体配座および他の生物学的性質における変化を引き起こすことにより生じ得る。このような置換は、例えば、疎水性残基に対する親水性残基の置換、他の残基に対するシステインまたはプロリンの置換、大きな側鎖を有する残基に対する小残基を有する残基の置換、または正味負荷電を有する残基に対する正味正荷電を有する残基の置換を含む。所定の置換の結果が、確実に予見され得ない場合、この誘導体は、本明細書に開示された方法に従って容易にアッセイされ、所望の特徴の存在または非存在を決定し得る。
本発明の範囲内の改変体は、本発明の遮断剤と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質質およびペプチドを含む。より好ましくは、配列相同性は、少なくとも90％、または少なくとも95％である。相同性を決定する目的には、比較配列の長さは、一般に、少なくとも８アミノ酸残基、通常少なくとも20アミノ酸残基である。本発明の範囲内の改変体はまた、1）遮断剤の配列に対して少なくとも40％相同であるアミノ酸配列を有し、そしてまた2）本発明の遮断剤の配列と最適アラインメントに配置された後、本発明の遮断剤のシステインと並んだ少なくとも80％のそのシステイン残基を有する、任意の遮断剤を含む。
本発明はまた、リガンドおよび抗体を含む、本発明の遮断剤に特異的に結合する剤である。
以下は、本発明の可溶性LTβレセプター、抗LTリガンドおよび抗LTβ-R抗体、ならびにそれらを特徴付けるために用いられる方法を例示する実施例である。これらの実施例は、制限するものとして解釈されるべきではない：実施例は、例示の目的で含まれ、そして本発明は、請求項のみによって制限される。
実施例１
免疫グロブリンFc融合タンパク質質としての可溶性ヒトLTβレセプターの調製
体細胞ハイブリッド由来のヒト12p転写配列のライブラリー（Baensら、Genomics、16、214〜18頁（1993））から単離されたヒトcDNAクローンの配列を、GenBankに登録し、そして後にヒトLTβ-Rをコードする配列であると同定された。この完全長ヒトLTβ-R cDNAクローンの配列は、1992年以来GenBank登録L04270として入手可能である。
LTβ-Rのトランスメンブレン領域までの細胞外ドメイン（図１）は、５’および３’末端上の、それぞれNotIおよびSalI制限酵素部位を取り込んだプライマー（Browningら、J.Immunol.、154、33〜46頁（1995））を用いて、cDNAクローンからPCRにより増幅した。この増幅した産物を、NotIおよびSalIで切断し、精製し、そしてNotIで線状化したベクターpMDR901中に、ヒトIgG1のFc領域をコードするSalI-NotIフラグメントとともに連結した。得られたベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および別のプロモーターにより駆動されるLTβR-Ig融合タンパク質質を含んでいた。
このベクターを、CHO dhfr-細胞中にエレクトロポーレションし、そしてメトトレキサート耐性クローンを、標準的手順により単離した。LTβ-R-Igは培地中に分泌され、そしてELISAアッセイを用いてレセプター融合タンパク質質の最高レベルを産生する細胞株を選択した。高生産性細胞株を多数まで増殖させ、そして調整培地を回収した。精製LTβレセプター融合タンパク質質を、ProteinＡ Sepharose Fast Flowアフィニティークロマトグラフィー（Pharmacia）により単離した。
実施例２
免疫グロブリン融合タンパク質質としての可溶性マウスLTβレセプターの調製
マウスLTβ-Rの完全cDNAクローンを、２つの部分cDNA単離物からの５’NotI/ApaLIおよび３’ApaLI/NotIフラグメントをpCDNA3（InVitrogen、San Diego、CA）のNotI部位中に連結することにより調製した。このcDNAクローンの配列は、GenBank登録U29173としてアクセス可能である。GenBank登録L38423中に見いだされるマウスLTβ-Rの別の配列登録と比較した場合コード配列の差異はなかった。
可溶性マウスLTβ-R/ヒトIgG1融合タンパク質質は、テンプレートおよびプライマーとして、５’AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC３’および５’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG３’を用い、完全長mLTβ-R cDNAクローンのPCR増幅により調製した。増幅された産物を精製し、そしてNotIおよびSalIで切断し、そしてSalI/NotIヒトIgG1 Fcフラグメントとともに、NotIで線状化しかつホスファターゼ処理したSAB132中に連結しJLB122を形成した。安定発現のために、マウスLTβ-R-Igフラグメントを含むNotIカセットをpMDR901のNotI部位中に移してPSH001を形成し、そしてこのベクターを、記載のように（Browningら、J. Immunol.、154、33〜46頁（1995））CHO細胞中にトランスフェクトした。マウスLTβ-R-Igを分泌する細胞クローンを、ELISA分析により同定した。精製されたレセプター融合タンパク質質は、CHO細胞上清から、Protein A Sepharose Fast Flowクロマトグラフィー（Pharmacia）により単離し、そして以下の実施例で利用した。
実施例３
LTβ-R-Igを用いたマウスの複数注射後の脾臓の免疫組織学的分析
１週間に１回、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Ig（100μg ip）の注射を６回受けた４〜５週齢マウスを、そして第６回目の融合タンパク質質注射の日にSRBCで免疫した。次いでマウスは、SRBCを用いた抗原投与後４日目に、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Igのさらなる注射を受けた。動物を、SRBCを用いた抗原投与後10日目に屠殺し、そして器官を構造の分析のために回収した。図２の左のカラムは、LFA-3-Igで処理した動物（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）、そして右のカラムは、LTβ-R-Igで処置した動物（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）からの脾臓セクションを表す。アセトン固定した凍結脾臓セクションを、ビオチン化抗マウスB220標識および抗マウスCD4抗体（ＡおよびＢ）、次いでアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（青紫、濃染色）および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ラットIg（淡い褐色染色）のそれぞれ対応する第２番目の染色で二重染色した。別のセットの凍結セクションを、ER-TR-9（MZMを検出するため、ＣおよびＤ）、MOMA-1（好金属親和性マクロファージを検出するため、ＥおよびＦ）、MECA-367（MAdCAM-1に特異的、ＧおよびＨ）、およびER-TR-7（網状線維芽細胞を染色するため、ＩおよびＪ）抗体、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ラットIgで第２番目の染色により（褐色染色）染色した。これらの写真は、最少６匹の動物からのセクションの代表的な染色である。倍率10倍。
実施例４
GC形成およびFDC染色に対するLGβ-R-Igおよび抗-CD40リガンドの影響
動物を、実施例３に記載のように、LTβ-R-IgまたはLFA-3-Igで処置した。別の群の動物を、MR1（抗マウスCD40リガンド、250μg/注射、腹腔内）で、SRBCを０日目に受けて−１日目、１日目および３日目に処置し、そして10日目に屠殺した。LFA-3-Ig（図３の左のカラム、ＡおよびＤ）、またはLTβ-R-Ig（中央のカラム、ＢおよびＥ）、またはMR1（右のカラム、ＣおよびＦ）で処理した動物のアセトン固定脾臓セクションを、ビオチン標識ピーナッツ血球凝集素（PNA、上の列、Ａ、ＢおよびＣ）で、またはFDC-M1（下の列、Ｄ、ＥおよびＦ）で、次いで第２番目の染色として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ラットIgでそれぞれ染色した（褐色染色）。周縁ゾーンのPNA染色は、ＡおよびＣにおいて矢印で示される。GC形成は、Ａにおいて白の星印で示される。FDCの染色は、ＤおよびＦにおいて黒の矢印で示される。これらの写真は、少なくとも４匹の動物からのセクションの代表的な染色である。倍率10倍。
実施例５
子宮内および出生後連続的にLTβ-R-Igで処置されたマウスのLNにおけるアドレシン発現
これらの実験は、妊娠14日および17日に200μgのレセプターIgタンパク質質をiv注射し、時間を合わせた妊娠Balb/cマウスの子孫を用いた。出生後、子孫は、100μgのLTβ-R-Ig、TNF-R55-Ig、またはLFA-3-Igで１週間に一度ip注射された。融合タンパク質質レベルは、ELISAにより測定したとき、生涯を通じて10μg/mlまたはそれを超えたままであった（データは示さず）。図４：パネルＡ、Ｂ、Ｇ、Ｈ、LTβ-R-Igで処置されたマウスからのリンパ節の染色。パネルＣ、Ｄ、LFA-3-Igで処置されたマウスからのリンパ節の染色。パネルＥ、Ｆ、TNF-R55-Igで処置されたマウスからのリンパ節の染色。パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇは、粘膜アドレシンMAdCAM-1を検出するための抗体MECA367で染色した腸間膜リンパ節である。パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、末梢LNアドレシン（PNAd）に特異的な抗体MECA79で染色した末梢（上腕）リンパ節である。パネルＧ、Ｈは、子宮内でのみLTβ-R-Igに曝された６週齢マウスからのリンパ節である。すべての画像は50倍の倍率である。
実施例６
子宮内および出生後連続的にLTβ-R-Igで処置されたマウスのLNにおけるリンパ球の位置決めおよびマクロファージの発現
マウスは、子宮内および出生後連続的に、実施例５について記載されたように、LTβ-R-Ig、TNF-R55-Ig、またはLFA-3-Igで処置された。次いでLN切片を、マクロファージにより発現されたマーカーに特異的な抗体で、またはＢ細胞マーカーB220およびＴ細胞マーカーCD4に特異的なmAbで染色した。画像分析を、Ｔ細胞ゾーンおよびＢ細胞ゾーンの重複の領域を同定するために用いた。図５：パネルＡ、Ｄ、Ｇは、それぞれLTβ-R-Ig、LFA-3-Ig、またはTNF-R55-Igで処置されたマウスからのLNのB220/CD4染色である。蛍光画像は画像分析ソフトウェアを用いて分析した。パネルＢ、Ｅ、Ｈは、シアロアドヘシンに対する染色であり、そしてパネルＣ、Ｆ、Ｉは、MOMA-1に対する染色である。
実施例７
SRBCに応答性の抗体に対するLTβ-R-Ig処置の影響
Balb/cマウスは、以下のように、LTβ-R-Ig、ヒトIgまたはPBSのいずれかを注射された：図６Ａ：図２、実施例３で記載されたように、６回の注射を受けた。動物は、SRBC免疫化の後、７日（黒の棒）および14日（縞の棒）飼育された。６Ｂ：動物は、−７日および０日に融合タンパク質質を受けた。SRBCは、０日目に投与され、そして動物を、７日（黒の棒）、14日（縞の棒）および30日（白の棒）飼育した。６Ｃ：動物は、０日に一度、SRBC免疫化と同時に融合タンパク質質を受けた。血液は、７日（黒の棒）、14日（縞の棒）および34日（灰色の棒）に収集した。
SRBC特異的IgMおよびIgGの力価は、血球凝集アッセイ中で血清を分析することにより測定した。力価は、血球凝集が検出される最後の血清希釈の逆数として規定され、そして対数の底を２とするスケールで表される（１＝血清の希釈1/15）。結果は、１群あたり４匹の異なる動物の平均と標準偏差で表される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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