(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンプリートアジュヴァントをニワトリに接種し、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンが付加した卵黄抗体を得ることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制卵黄抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにその使用方法に関し、更に詳細には、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患によるＩｇＥ抗体産生を抑制する糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにそれを用いての自己免疫疾患とアレルギー疾患との治療ならびに予防などに使用する使用方法に関するものである。
背景技術
生体には、細菌やウイルス、あるいは様々な異物（抗原）が侵入すると、免疫細胞が抗原を認識して、抗体を産生し抗原の侵入を防御する免疫反応による防御システムが備わっている。この免疫細胞は自己と非自己とを識別し、自己抗原に対しては免疫寛容（トレランス）が作用して免疫反応を抑制するのに対して、非自己抗原に対しては免疫反応を誘導する。つまり、一般には、同一個体内では、自己抗原に対する免疫寛容のバランスは制御されているが、この免疫寛容のバランスが一旦破綻してしまうと、自己抗原に対しても自己抗体（イムノグロブリン）が産生され、自己組織などの自己抗原に対しても攻撃するという問題が起こってくる。こうした現象を自己免疫反応といい、この自己免疫反応により種々の自己免疫疾患が引き起こされる。
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答が原因となって起こる疾患であり、その成因については不明な点が多い。また、その症例は多岐に亘っていて、主たる疾患例としては、例えば、甲状腺の自己免疫疾患、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、自己免疫性血液疾患（自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血等）などが知られている。
これら疾患に対する治療法としては、例えば、上述した重篤な症状をもたらすＳＬＥなどに対しては免疫抑制療法が施されている。また、症状として代謝異常を引き起こすものについては欠損している代謝酵素、ホルモンなどを投与することが行われている。しかしながら、こうした治療は対処療法にすぎず、根本的な自己免疫疾患の治療が図れていないのが現状である。
上述したように、免疫反応は、生体が生存するためには不可欠で有益な反応であるが、この免疫反応が生体に対して不都合をもたらすことがあり、このような不利益になる免疫反応が自己免疫疾患と言われている。抗体は、その分子構造の違いからいくつかのクラスに分けられるが、アレルギー反応を起こす抗体は主にＩｇＥ抗体である。
一般にアトピーといわれるのはＩｇＥ抗体が関与するアレルギー反応をいい、このＩｇＥ抗体が関与するアレルギー反応は、肥満細胞と結合しているＩｇＥ抗体に抗原が再結合して、肥満細胞に連鎖反応が起こり化学伝達物質が放出されて組織障害を起こすタイプであり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などの一般的アレルギー疾患の大部分がこのアレルギー反応で起こるものである。
アレルギー疾患の予防には環境から抗原を除去するのが重要であるが、環境から抗原を完全に除去することは至難である。また、アレルギー疾患治療薬としてよく使用されるのは、抗ヒスタミン薬、β−交感神経刺激剤、テオフィリン製剤、ステロイド剤などである。一般に、アレルギー疾患の治療は長い期間を要し、医薬品の長期服用による副作用も懸念される。
したがって、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際に産生するＩｇＥ抗体を抑制する抗体産生抑制物質そのものを開発することは、自己免疫疾患やアレルギー疾患の原因物質の産生を抑制することから、自己免疫疾患やアレルギー疾患を原因から絶つことができ、極めて有用であり、かかる抗体産生抑制物質の開発が強く要望され続けている。
発明の開示
この発明者は、このような観点から、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際に産生するＩｇＥ抗体を抑制する抗体産生抑制物質について鋭意研究をした結果、アジュヴァント単独又は混合して産卵動物に接種することにより得られた卵黄抗体がノーマル卵黄抗体よりガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンがより多く付加されていることを見出した。さらには、この糖付加卵黄抗体が免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、ＩｇＥ抗体の産生を抑制することを見出して、この発明を完成するに至った。
したがって、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することを目的としている。また、好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質が、自己の臓器または自己の臓器が生産した物質に対する自己抗体の過剰産生を抑制する物質であることからなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。別の好ましい態様としては、過剰自己抗体産生抑制物質が、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用および／またはアレルギー疾患に関与するイムノグロブリン、特にＩｇＥ抗体の産生を抑制する作用を有している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。なお、本明細書において、単に糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体のいずれか１方を使用する場合があるが、いずれの場合にもその用語に限定する意図は一切なく、特段の定めがない限り、いずれの意味をも有する意図で使用しているものと理解さるべきである。また、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体ならびに糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体として使用している含有および付加ならびにこれらと関連とする用語にしても、糖類もしくは糖鎖と卵黄抗体との共存状態を限定する意図で一切使用しているものではなく、あらゆる併存状態、例えば結合などの状態を包含する意図で使用しているものと理解さるべきである。
更に、この発明の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、マンノース、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンもしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に存在している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。
また、この発明は、免疫増進効果を有する物質（以下、免疫増進物質ともいう）を産卵動物に接種することにより糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を産生させることからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することを別の目的としている。この発明の好ましい態様として、アジュヴァントとの混合物として使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。
この発明の別の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、ＩｇＥ抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することを別の目的としている。また、この発明の別の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、マンノース、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンもしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の特に好ましい態様としては、アジュヴァントを産卵動物に接種することによって卵黄抗体にガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンが付加されたガラクトース等付加卵黄抗体を製造することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。また、この発明の別の好ましい態様としては、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画として過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。
更に、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵黄抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の抗体の過剰産生を抑制するために使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様においては、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、ＩｇＥ抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の際に生じる過剰抗体の産生を抑制することによって、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防の為に使用する使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が免疫卵、免疫卵黄もしくは免疫卵黄抗体分画としてまたは免疫卵から抽出したもしくは精製した状態で、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患のＩｇＥ抗体産生を抑制するために過剰自己抗体産生抑制物質を使用する方法を提供することである。
この発明の更なる目的、特長ならびに利点は、本明細書の下記記載と添付図面から明らかになるであろう。
発明を実施するための最良の形態
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、糖含有卵抗体または糖付加卵抗体、つまり、糖含有または糖付加卵黄抗体である。また糖類もしくは糖鎖としては、ガラクトース、マンノース、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンもしくはシアル酸が挙げられるが、ガラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミンが特に好ましい。この過剰自己抗体産生抑制物質は、特に、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患の際、ＩｇＥ抗体産生を抑制する作用があることを特徴とする。
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、免疫増進効果を有する物質（以下、免疫増進物質ともいう）を産卵動物に接種することによって製造することができる。かかる免疫増進物質は、単独もしくは他の同様な効果を有する物質と組み合わせて使用することができる。
かかる免疫増進物質は、アジュヴァントと総称され、例えば、死活牛酪菌、死活牛型結核菌、死活人型結核菌、アスカリス、死活百日咳菌、カリミョウバン、クロムミョウバン、水酸化アルミニウム、エンドトキシン、Ｍｕｒａｍｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＤＰ）、トキシン類（リポポリサッカリド＝ＬＰＳを含む）、Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、Ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ等が挙げられる。また、コンプリートアジュヴァント、インコンプリートアジュヴァント、プリスタン、アジュヴァントペプチドの単独接種、更にはウシＩＩ型コラーゲンと免疫増進物質を混合したものであってもよい。また、かかる免疫増進物質と混合して使用することができる物質としては、例えば、ミネラルオイルの他に、植物由来もしくは動物由来のオイルや、界面活性剤などが挙げられる。
これらの免疫増進物質は、１種もしくは異なる種類を２種以上混合して同時にもしくは別個に産卵動物に対して接種することができる。なお、産卵動物に対して接種することが可能であれば、いずれの形態でも適用することができ、例えば、溶液、エマルジョンなどの形態で接種するのが好都合である。産卵動物に対するかかる免疫増進物質の接種は、毎週または１ヶ月ないし２ヶ月に１回程度の割合で行なうことができる。一般には、産卵動物に対する接種は、免疫増進物質の量を所定の間隔をおいて、例えば、２週間ないし４週間の間隔で注射などによって行うのが普通である。注射期間は、所定の間隔をおいて卵を採取後、卵黄成分中の糖付加卵黄抗体が、自己免疫疾患および／またはアレルギーモデル動物に対して抗体産生抑制効果を発現するまで接種を継続する。更に、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質の種類、産卵動物の種類などによって変わるが、一般には、０．０１ないし２０ｍｇ、好ましくは０．５ないし５ｍｇであるのがよい。なお、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質を、例えばフロインドの完全アジュヴァントとして接種する場合には、一般には、０．１ｍｌないし１０ｍｌ／回／羽、好ましくは０．５ｍｌないし２ｍｌ／回／羽の範囲であればよい。
この発明において、接種できる産卵動物としては、産卵動物であればいずれも利用することができるが、通常産卵動物といわれているニワトリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、エミュー、七面鳥等などの鳥類が好ましい。これら産卵動物のうち、飼育数、産卵数などの点からしても、糖付加卵黄抗体を安定してかつ安価に供給できることから、ニワトリが特に好ましい。次に、この発明に従ってアジュヴァントを接種した産卵動物は、通常の飼育場で常法に従って飼育することができる。上記のようにして飼育した産卵動物から採卵した卵は、回収して、免疫卵を免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に必要に応じて常法に従って精製分離することができる。
接種した産卵動物から採卵をする時期は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果および／またはアレルギー疾患のＩｇＥ抗体産生抑制効果を、所定の評価方法で、この発明の過剰免疫産生抑制物質が卵中に所定濃度に達していることを確認後、使用することになる。なお、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果の評価方法は、自己免疫疾患マウス（ＭＲＬ／ｌｐｒ）に一定量の糖付加卵黄抗体を経口投与し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの血清中のリウマチ因子濃度を、非経口投与群と比較して抑制効果を確認することによって行うことができる。同様に、ＩｇＥ抗体産生抑制効果の評価方法も、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス血清中のＩｇＥ抗体濃度を非経口投与群と比較してＩｇＥ抗体産生抑制効果を確認することによって行うことができる。
上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用およびアレルギー疾患のＩｇＥ抗体産生抑制作用を有している。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。この目的のために、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のようにして常法により精製分離した免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画は、必要に応じて加工して、それぞれの用途に使用することができる。なお、アレルギー疾患の治療ならびに予防のためにこの発明の過剰抗体産生抑制物質を使用する場合には、免疫卵黄抗体分画のみを使用するのがよい。また、この発明により得られた過剰抗体産生抑制物質は、例えば、必要に応じて他の物質と混合して、液状、粉状、粒状、クリーム状、コロイド状、固形状などの形態で使用することができる。また、この発明の過剰抗体産生抑制物質は、例えば、医薬品（治療薬、予防薬など）、食品（例えば機能性食品）、化粧品等に使用することができる。同様に、競走馬、家畜、ペット等の餌等に含有して使用することも可能である。この態様における特に好ましい具体的な実施例としては、食品が挙げられる。この発明に係る糖付加卵黄抗体を食品に使用する場合には、例えば成人１日卵換算量として０．１個から２個程度、好ましくは０．５個から１個程度飲用すればよい。
また、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の自己抗体の過剰産生を抑制するためまたはアレルゲン、例えば、動物性物質、植物性物質もしくは化学物質により外部から刺激されることによって自己において過剰に産生される抗体の過剰産生を抑制するために使用することができる。上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のような抗体の過剰産生を抑制する作用、特に自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用ならびにアレルギー疾患のＩｇＥ抗体産生抑制作用を有しているので、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患、特に自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質が適用できる疾患の例としては、例えば、慢性関節リウマチ並びにアレルギー症状である関節の痛み、鼻汁、くしゃみ、鼻のかゆみ、咳、喘鳴、呼吸器困難、喉頭浮腫、嗄声、チアノーゼ、紅班、紫班、そう痒、蕁麻疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、目のかゆみ、流涙、眼球結膜充血、眼臉浮腫、悪心、嘔吐、下痢、血便、腹痛、便秘、吸収不良、体重増加不良、蛋白尿、血尿、浮腫、亀頭炎、夜尿、頭痛、めまい、行動異常、貧血、血小板減少、ショック、アレルギー性緊張（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｔｅｎｓｉｏｎ）、疲労シンドローム．（ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿病などがあげられ、かかる症状の改善もしくは完治に有用である。更に、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査薬としても応用可能であり、例えば、各種の自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査に使用することができる。かかる検査としては、例えば、自己免疫疾患検査、アレルギー検査、抗膵島細胞抗体検査などが挙げられる。
以下、この発明を実施例により更に詳細に説明する。
0004207190.tif 000002
0004207190.tif 000003
上記実施例１−１および１−２の試験結果より経済的に産卵率を落とさず回収可能な上記アジュヴァント接種群の卵を以下の試験に使用した。
（実施例２）
自然発症自己免疫疾患マウスによる自己抗体産生抑制効果試験
使用マウス：
自然発症免疫疾患マウス：ＭＲＬ／ｌｐｒ（深町知博他：ＭＲＬ／ｌｐｒマウス自然発症関節炎；炎症と免疫：Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，ｐｐ．１０４−１１４，１９９４）
ブリーダー名：日本チャールスリバー製
雌雄：♂
６週令で入荷後６週間予備飼育
Ｂａｌｂ／ｃマウス
ブリーダー名：日本チャールスリバー製
雌雄：♂
８週令で入荷後６週間予備飼育
投与試験：
週令：ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは１２週令より投与試験開始
Ｂｌｂ／ｃマウスは１４週令より投与試験開始
Ｎ数：各群５匹
餌：  ＣＥ−２（日本クレア製）
給水：滅菌水道水
照度：午前７時から午後７時まで
投与量：免疫卵全成分並びにノーマル卵全成分  ３５μｌ／匹／回。
投与方法：経口ゾンデを使用して直接投与
投与回数：２〜３日間間隔
投与期間：１６日間
コントロール群（対象群）：
免疫卵の全成分投与群（Ｂａｌｂ／ｃマウスへ投与）
ノーマル卵の全成分投与群（Ｂａｌｂ／ｃマウスへ投与）
ノーマル卵の全成分投与群（ＭＲＬ／ｌｐｒマウスへ投与）
未投与群（ＭＲＬ／ｌｐｒ）
試験群
免疫卵の全成分投与群（ＭＲＬ／ｌｐｒマウスへ投与）
評価方法：
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは加齢とともに自らの血清中に自己抗体であるＩｇＧ型リウマチ因子を大量に産生するがＢａｌｂ／ｃマウスは自然発症自己免疫疾患の発症がない。
そこで、Ｂａｌｂ／ｃマウスでの免疫卵全成分投与群、ノーマル卵全成分投与群、自然発症自己免疫疾患マウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）での免疫卵全成分投与群とノーマル卵全成分投与群のＩｇＧ型リウマチ因子濃度を比較することにより効果判定が可能である。
測定方法：
試薬：ＩｇＧ型マウスリウマチ因子測定法（市川厚編：関節炎（３）ＭＲＬ／ｌマウス関節炎、炎症とアレルギー（Ｉ−２）、廣川生物薬科学実験講座１２巻、廣川書店、１９９３）に従って調製した。
操作方法：９６ウェルに固相化した抗原（ＩｇＧ型マウスリウマチ因子と反応する蛋白）ウェルに検体（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス血清を一定量希釈した液：１００μｌ／ウェル）を添加して室温で２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ／ウェルの割合で添加して室温でさらに２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、発色液（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェルの割合で添加して室温で２０分間反応させた後、反応停止液を１００μｌ／ウェルの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダー（４５０ｎｍ）で測定した。
評価結果
Ｂａｌｂ／ｃマウスへノーマル卵全成分投与群と免疫卵全成分投与群のマウス血清中のＩｇＧ型リウマチ因子濃度は変化がなかったが、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスへ投与した群の内、ノーマル卵全成分投与群と未投与群のＩｇＧ型マウスリウマチ因子濃度は上昇した。しかし、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスへ免疫卵全成分投与群はＩｇＧ型マウスリウマチ因子濃度の上昇は抑制された。（図１）（各週令のＯＤ値は平均値で表示）
（実施例３）
実施例１のアジュヴァント接種群卵のどの分画にＩｇＧ型マウスリウマチ因子濃度の上昇を抑制した成分があるのかを探索する為に、次のようにして卵を分画した。
分離精製工程：
ノーマル卵並びに免疫卵（以下、ニワトリにアジュヴァントを接種後、回収した卵を免疫卵と言う。）を割って卵黄を分離した。次いで、卵黄をデキストラン（シグマ社製；添加量：最終濃度０．１％）で吸着後、卵黄を遠心分離してその上清を回収して脱脂した。この回収した上清をゲルろ過カラムクロマトグラフィに付した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：    Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００クロマトグラフィ（アマシャム・
ファルマシア社製）
バッファ：  １０ｍＭリン酸バッファ：ｐＨ７．２；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
フローレート：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
波長：        ２５４ｎｍ、２８０ｎｍ
測定機器：    ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャム・ファルマシア社製）
ゲルろ過カラムクロマトグラフィから免疫卵の分画−１、−２、−３および−４を回収した。
ゲルろ過カラムクロマトグラフィの測定結果は図２に示すとおりである。
（実施例４）
実施例３で得られた免疫卵の分画−１、−２、−３および−４を自然発症自己免疫疾患マウスによる自己抗体産生抑制効果試験をした。
使用マウス：
自然発症免疫疾患マウス：ＭＲＬ／ｌｐｒ（深町知博他：ＭＲＬ／ｌｐｒマウス自然発症関節炎；炎症と免疫：Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，ｐｐ．１０４−１１４，１９９４）
８週令で入荷後、１週間予備飼育した。
ブリーダー名：日本エスエルシー製
雌雄：メス
投与試験：
週令：９週令より投与試験開始
Ｎ数：各群７匹
餌：  ＣＥ−２（日本クレア製）
給水：滅菌水道水
照度：午前７時から午後７時まで
投与量：免疫卵並びにノーマル卵の全卵成分  ３５μｌ／匹／回。
各卵分画    全卵換算の７０μｌ相当量／匹／回。
投与方法：経口ゾンデを使用して直接投与
投与回数：３回／週
投与期間：８週間
コントロール群（対象群）：滅菌水道水を投与。
評価方法：
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスが加齢とともに自らの血清中に自己抗体であるＩｇＧ型リウマチ因子を大量に産生すると同時に手足関節の膨らみが観察できた。したがって、免疫卵全成分並びに各分画をＭＲＬ／ｌｐｒマウスに経口投与して、投与されたＭＲＬ／ｌｐｒマウス血清中のＩｇＧ型リウマチ因子濃度を比較することにより、免疫卵中のどの分画に免疫疾患に伴なう過剰抗体産生抑制物質が含有されているかを判定する事が可能である。
測定方法：
試薬：ＩｇＧ型マウスリウマチ因子測定法（市川厚編：関節炎（３）ＭＲＬ／ｌマウス関節炎、炎症とアレルギー（Ｉ−２）、廣川生物薬科学実験講座１２巻、廣川書店、１９９３）に従って調製した。
操作方法：９６ウェルに固相化した抗原（ＩｇＧ型マウスリウマチ因子と反応する蛋白）ウェルに検体（ＭＲＬ／ｌｐｒマウスから採血した血清を一定量希釈した液：１００μｌ／ウェル）を添加して室温で２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ／ウェルの割合で添加して室温でさらに２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、発色液（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェルの割合で添加して室温で２０分間反応させた後、反応停止液を１００μｌ／ウェルの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダー（４５０ｎｍ）で測定した。
評価結果
コントロール群（対照群）と、免疫卵分画−３と免疫卵分画−４とをそれぞれ投与した免疫卵分画投与群のＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、飼育加齢と共に、ＩｇＧ型リウマチ因子濃度が上昇した。これに対して、免疫卵分画−１投与群のＭＲＬ／ｌｐｒマウスのＩｇＧ型リウマチ因子濃度は上昇しないので、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された。また、免疫卵分画−２投与群のＭＲＬ／ｌｐｒマウスのＩｇＧ型リウマチ因子濃度は、僅かに上昇した後、減少し、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された。更に、免疫卵全体も、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスのＩｇＧ型リウマチ因子濃度は、対象群に比較して低く、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用を有していると言える（図３）。
したがって、実施例１の処理をした免疫卵全成分の内、免疫卵黄を脱脂した免疫卵分画−１並びに−２に自己免疫疾患である関節リウマチの治療並びに予防効果がある成分が含有されている事が証明された。
0004207190.tif 000004
上記の結果から、コントロール投与群のＭＲＬ／ｌｐｒマウス１５週令のＩｇＥ抗体濃度は１６１．１ｎｇ／ｍｌであって加齢とともに上昇したが、免疫卵分画−１投与群のＭＲＬ／ｌｐｒマウス１５週令のＩｇＥ抗体濃度は感度以下の０．４０６ｎｇ／ｍｌであった。この結果から、免疫卵分画−１はＭＲＬ／ｌｐｒマウスのＩｇＥ抗体産生を抑制したことを確認した。従って、免疫卵黄を脱脂した免疫卵分画−１はアレルギー疾患の治療並びに予防に効果があることが証明された。
（実施例６）
免疫卵分画−１の成分を分析する為に、つぎに、この免疫卵分画−１を２回目のゲルろ過カラムクロマトグラフィによって処理した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：      Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５クロマトグラフィ（アマシャム・フ
ァルマシア社製）
バッファ：    １０ｍＭリン酸バッファ；ｐＨ７．２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
フローレート：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
波長：        ２５４ｎｍ、２８０ｎｍ
測定機器：    ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャム・ファルマシア社製）
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収して、イオン交換カラムクロマトグラフィによって処理した。イオン交換カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：      Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓクロマトグラフィ（アマシャム・ファルマ
シア社製）
バッファＡ：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０
バッファＢ：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．３Ｍ  ＮａＣｌ
バッファＡ→バッファＢ：  Ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
フローレート：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
波長：        ２５４ｎｍ、２８０ｎｍ
測定機器：    ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャム・ファルマシア社製）
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られた免疫卵分画−１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図４に示す通りである。同様に、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたノーマル卵分画−１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図５に示す通りである。
次に、上記イオン交換カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収した。さらに、回収したメインピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験によって処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験条件は次のとおりである。
電気泳動装置：  テフコ社製ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動装置
電気泳動条件：  １８ｍＡ定電流，６０分
サンプル量  ：  非還元処理  １μｇ／ｌａｎｅ
染色条件
銀染色：  ２Ｄ−銀染色試薬ＩＩ（第一化学薬品製）
試験結果：
ノーマル卵黄（脱脂）ならびに免疫卵黄（脱脂）を、上記のようにゲルろ過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行うことによって精製分離した結果、卵黄抗体の分子量に相当する１８万の部分にバンドが１本確認された。（図６）
図６において、レーン２はＨｙＥ  Ｆ−１（ＧＧＩ）（ゲルろ過カラムクロマトグラフィを２回、イオン交換クロマトグラフィを１回行なって精製した免疫卵分画−１を示す。レーン３はＮＥ  Ｆ−１（ＧＧＩ）ゲルろ過クロマトグラフィを２回、イオン交換カラムカラムクロマトグラフィを１回行なって精製したノーマル卵分画−１を示す。レーン４はＨｙＥ  Ｆ−１（ＧＧ）（ゲルろ過クロマトグラフィを２回のみ精製した免疫卵分画−１）を示す。レーン５はＮＥ  Ｆ−１（ＧＧ）（ゲルろ過カラムクロマトグラフィを２回のみ精製したノーマル卵分画−１）を示す。
次に、免疫卵、免疫卵黄、免疫卵黄を脱脂後ゲルろ過クロマトグラフィ２回・イオン交換カラムカラムクロマトグラフィ１回精製した試料、ノーマル卵、ノーマル卵黄、ノーマル卵黄を脱脂後ゲルろ過クロマトグラフィ２回・イオン交換カラムカラムクロマトグラフィ１回精製した試料をイムノドット試験によって判定した。
イムノドット作業工程
Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇメンブレン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）（１μｌ／Ｄｏｔ）を風乾した後、室温で１時間ブロッティング（１０％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ／１０ｍＭ  ＰＢＳ）した。ブロッティングした後、３回洗浄をして抗ニワトリＩｇＹヤギ血清（ロットＩＣ−００３：ＳＹＣ社製）を１０ｍＭ  ＰＢＳで３０００倍希釈して、室温で１時間反応した。反応後、洗浄液で３回洗浄し、抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰＯ標識（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１０ｍＭ  ＰＢＳで５０００倍希釈液を加えて室温で１時間更に反応した。洗浄液で３回更に洗浄して、発色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて発色して判定した。
試験結果：
上記の試験結果から、免疫卵黄（脱脂）並びにノーマル卵黄（脱脂）をゲルろ過カラムクロマトグラフィ２回とイオン交換カラムクロマトグラフィ１回精製した試料、卵黄成分、全卵とは、抗原抗体反応はするが、ＰＢＳとは反応していないことが判明した。
また、ゲルろ過カラム２回とイオン交換カラム１回を通して精製分離した試料は図６並びに図７からノーマル卵黄抗体と免疫卵黄抗体であることが確認された。
（実施例７）
免疫卵並びにノーマル卵を卵黄分離して脱脂した後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回精製して回収した免疫卵黄抗体並びにノーマル卵黄抗体との相違点を検討した。
免疫卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＮＡＧＡと言う）量と、ノーマル卵由来卵黄抗体に結合したガラクトース・ＮＡＧＡ量を比較した。
測定方法：
各卵黄抗体３μｇ／ｍｌを０．１Ｍ炭酸バッファ、ｐＨ９．５に溶解した溶液を１００μｌ／ウェルの割合で９６ウェル（ヌンク社製）の各ウェルに添加して、２５℃で２時間コーテイングした。コーティング後、３回洗浄液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．２；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、各ウェルにコーティング液（２５％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ；１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．２；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を２５０μｌ／ウェルの割合で添加し、２５℃で２時間コーテイングした。次いで、洗浄液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．２；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、反応液（Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＲＣＡ１２０＊；＊ＲＣＡ１２０：ガラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミン残基特異結合レクチン）を１００μｌ／ウェルの割合で各ウェルに添加し、２５℃で１時間反応させた。次に、各ウェルにＡｖｉｄｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＨＲＰを１００μｌ／ウェルの割合で添加し、２５℃で１時間反応させた。反応後、各ウェルを洗浄液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．２；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。洗浄後、発色液（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェルの割合で添加して室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１ＭＨ２ＳＯ４）を１００μｌ／ウェルの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダーで吸光度（４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）を測定した。
測定結果：
上記のようにしてノーマル卵と免疫卵の各３個より精製した卵黄抗体結合ガラクトース・ＮＡＧＡ量を測定した結果、ノーマル卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・ＮＡＧＡ量のＡｂｓ．値（吸光度）を１００％としたときに、免疫卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・ＮＡＧＡ量は１５４％であったことが判明した。
この測定結果より、ノーマル卵と比較して、アジュヴァント接種により卵黄抗体結合ガラクトース・ＮＡＧＡ量が１．５倍も付加されたことが判る（図８）。
発明の効果
この発明によって、アジュヴァントを接種して得た糖付加卵黄抗体は、関節リウマチ疾患の自己抗体（イムノグロブリン）並びにアレルギー疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、喘息等）のＩｇＥ抗体産生を抑制することが判明した。このことから、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに／もしくは予防に有効である。従って、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防に対して効果を付与する飲食品、医薬品，化粧品、飼料等の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は自己免疫疾患モデルマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）に免疫卵全成分、ノーマル卵全成分の投与実験、マウスＩｇＧ型リウマチ因子濃度の経時変化を示すグラフである。
図２は、ゲルろ過カラムクロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００クロマトグラフィ）での免疫卵分画−１、−２、−３、−４の分画パターンを示すパターン図である。
図３は、自己免疫疾患モデルマウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）に免疫卵全成分、免疫卵分画−１、−２、−３、−４を投与した免疫卵投与実験、マウスＩｇＧ型リウマチ因子濃度の経時変化を示すグラフである。
図４は、イオン交換カラムクロマトグラフィ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓクロマトグラフィ）で免疫卵分画−１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
図５は、イオン交換カラムクロマトグラフィ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓクロマトグラフィ）でノーマル卵分画−１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
図６は、ノーマル卵分画−１と免疫卵分画−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験結果を示す電気泳動図である。
図７は、イムノドット試験結果を示す写真である。
図８は、免疫卵由来卵黄抗体（ＩｇＹ）結合ガラクトース等量とノーマル卵由来卵黄抗体（ＩｇＹ）結合ガラクトース等量の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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