(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の過程（ａ）〜（ｃ）を含む、反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具備するアッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を測定するための方法：
（ａ）アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬とも評価できる程度には反応しない標識を反応室内へ供給し、
（ｂ）診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーンにおいて、標識から発生するシグナルを検出し、
（ｃ）アッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を、
（i）シグナル量の変化速度および
（ii）シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定する。
【請求項２】
シグナルを利用することによってアッセイ測定を補正する過程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識を結合対メンバーに結合させる請求項１記載の方法。
【請求項４】
シグナル量の変化速度の導関数を決定する請求項１記載の方法。
【請求項５】
変化速度がシグナル量の負の変化速度である請求項１記載の方法。
【請求項６】
シグナルの絶対量が平均化される請求項１記載の方法。
【請求項７】
結合対メンバーが結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項８】
アッセイ試薬が結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から選択される請求項１記載の方法。
【請求項９】
標識が染料、蛍光発生性染料、化学発光性染料、赤外線発生性染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生性分子並びに酵素から成る分子群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
下記の構成要素（ａ）〜（ｃ）を具備する、アッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を測定するための装置：
（ａ）標識が供給される反応室および少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置、
（ｂ）診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において、標識から発生するシグナルを検出するための光学的要素、および
（ｃ）アッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を、
（i）シグナル量の変化速度および
（ii）シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定するためのシグナルプロセッサー
但し、標識はアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しない。
【請求項１１】
下記の構成要素（Ｉ）及び（ＩＩ）を具備するアッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を測定するためのキット：
（Ｉ）下記を具備する装置：
（i）標識が供給される反応室および少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置、
（ii）診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において、標識から発生するシグナルを検出するための光学的要素、および
（iii）アッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を、
（a）シグナル量の変化速度および
（b）シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定するためのシグナルプロセッサー、
但し、標識はアッセイ装置内でのいずれのアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しない、および
（ＩＩ）前記装置および／またはキットに関する情報を提供するテキストおよび／または図表素材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
この発明は部分的には、アッセイ、好ましくはイムノアッセイの実施と監視における器機（instrument）とアッセイ装置（device）間の光通信用独立アッセイコントロール（ＩＡＣ）の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
複雑な試料中の分析物を迅速かつ簡単に測定するための信頼できる方法の開発は増々重要になっている。例えば、病院の救急部門における看護検査（care testing）の要点は未熟練の技師が複雑な化学的および免疫化学的アッセイをおこなうことによって患者の状態を迅速に確定することである。この検査は通常は、臨床化学者として訓練を受けていない救急病室の技師または看護婦によっておこなわれる。血液試料を病院の検査室へ移送しておこなっている現在のプラクティスは、検査結果が３０分以内に要求される場合には不適当である。従って、問題は、アッセイ結果が短時間内に要求されるにもかかわらず、病院の救急部門において利用できる検査のための方法、職員および装置がこの要求に適合していないという点にある。簡単な方法で迅速に結果を得るための別の方策は医師のオフィスや患者の家庭における検査および屋外における汚物や汚染物の検査に要求されている。
【０００３】
このように、簡単で迅速におこなうことができて信頼性のあるイムノアッセイ系に対する要求は満たされたいない。イムノアツセイ系における信頼性は分析物の正確な測定にとっては重要である。救急病室内においては、医師による患者の診断と処置はアッセイ結果に応じておこなわれる。家庭内においては、アッセイの結果は、例えば、治療薬の投与量と投与回数を決定するのに役立つ。屋外における汚物や汚染物の検査においては、検査結果は汚染物を除去するために必要な改修や土地の掘削の程度を確定するのに利用できる。
【０００４】
アッセイコントロールに関する従来の文献には、アッセイ装置における評価を必要とするパラメーターは明確には規定されていない。例えば、多くの刊行物においては、非特異的結合の効果を決定するコントロールの例が単に開示されているに過ぎない。これらの刊行物のうちの一部のものは主として非特異的結合の制御法に関するものであり、また、別の刊行物は非特異的結合の制御手段を組み込んだ装置を関するものである。これらに関しては、次の米国特許の各明細書を例示することができる：第４，５３３，６２９号、第４，５４０．６５９号、第４，８４３，０００号、第４，８４９，３３８号、第５，３４２，７５９号、第４，６４９，１２１号、第４，５５８，０１３号、第４，５４１，９８７号、第４，４７２，３５３号および第４，０９９，８８６号。
【０００５】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題およびその解決方法）
この明細書に記載の発明は、アッセイ装置内における独立アッセイコントロール（ＩＡＣ）の新規な使用に関する技術を提供するためになされたものである。ＩＡＣの結果はアッセイ結果によっては一般的には左右されないが、１つのＩＡＣからの結果は別のＩＡＣからの結果に依存していてもよい。例えば、１つのＩＡＣにおける測定の変化は別のＩＡＣにおける測定の変化に対して、両方のＩＡＣが相互に依存する場合には、比例してもよい。
【０００６】
ここで用いる「ＩＡＣ」という用語は、あるアッセイ測定に依存しないいずれかのコントロール測定に関するものである。一部のＩＡＣは相互に独立していてもよく、別のＩＡＣは相互に依存していてもよい。例えば、ＩＡＣが相互に独立の場合には、第１ＩＡＣ測定の変化は発生してもよいが、第２ＩＡＣ測定の変化は発生しなくてもよい。別の例においては、ＩＡＣが相互に依存する場合には、第１ＩＡＣ測定の変化は第３ＩＡＣ測定における見合った変化と関連づけることができてもよい。
【０００７】
１もしくは複数のＩＡＣをいったん測定すれば、該ＩＡＣ測定はアッセイ測定を補正するのに利用できる。これらのＩＡＣによれば、アッセイ条件が変化しても、アッセイ検出系から正確な結果が得られることが保証される。本発明によるいずれのＩＡＣもアッセイ測定の補正に利用することができる。１つのＩＡＣを利用してアッセイの結果を補正してもよく、また、複数のＩＡＣを利用してアッセイの結果を補正してもよい。
【０００８】
流速を決定するためのＩＡＣ
ここで用いる「流速（rate of flow）」という用語は、液状溶液がアッセイ装置内を通過するときの速度に関する。流速は単位時間あたりの距離によって測定することができる。あるいは、流速は任意の単位または流速の平均値からの偏差値として表示できる。流速の平均値は、異なるアッセイ装置を用いる複数回の実験によって決定することができる。
【０００９】
ここで用いる「アッセイ装置（assay device）」という用語は、室（chamber）内を通る液体の流れを可能にするいずれかの適体な構造体に関する。例えば、アッセイ装置の少なくともいくつかの室は毛細管作用によって液体を流動させることができるチューブであってもよい。アッセイ装置は、例えば、プロピレン、ポリプロピレンおよびプラスチックスを含むいずれの種類の材料から構成されていてもよい。アッセイ装置はここに記載の装置（apparatus）に取り付けてもよい。本発明は部分的にはここで規定されるＩＡＣを実施し得るいずれのアッセイ装置にも関する。例えば、第２の結合対メンバー（ＭＢＰ）がアッセイ装置内の診断用レーンの固体相と結合することをＩＡＣ法が必要とするならば、本発明の１つの観点は、診断用レーン内の固体相と結合した第２ＭＢＰを含むアッセイ装置によって特徴づけられる。
【００１０】
従って、第１の観点においては、本発明は、アッセイ装置内を通過する溶液の流速を決定するための方法によって特徴づけられる。このアッセイ装置は反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具有する。この方法は次の過程を含む。
過程（ａ）：第１の結合対メンバー（ＭＢＰ）を反応室内へ供給し、固体相に結合した第２の結合対メンバーを診断用レーン内へ供給する。第１ＭＢＰは標識を含み、また、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しない。しかしながら、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。
過程（ｂ）：診断用レーン内においてシグナルを検出する。この場合、シグナルは標識から発生する。
過程（ｃ）：診断用レーンを経て反応室からアッセイ装置を通る液体の流速を、診断用レーン内のシグナル量から決定する。
【００１１】
ここで用いる「反応室（reaction chamber）」という用語は、診断用レーンまたは診断用ゾーンに到達する前の液体と接触するアッセイ装置の構成部分に関する。反応室はアッセイ装置と同一の領域内に形成されていてもよく、あるいは、アッセイ装置とは分離した構成要素として存在していてもよい。例えば、試料と外添試薬は反応室として利用できる試験管内で混合することができる。この試験管内の内容物の一部もしくは全体はアッセイ装置内へ導入することができる。液体、生物学的試料および試薬は反応室内へ直接添加してもよい。
【００１２】
ここで用いる「診断用レーン（diagnostic lane）」という用語は、ＩＡＣ成分やアッセイ成分を含む成分を保有するアッセイ装置の構成部分に関する。診断用レーンはシグナルの光学的測定を可能にする領域のように簡単であってもよい。あるいは、診断用レーンは、標識を含む分子および結合作用が検出できるようなアッセイ過程の結果として標識を含む分子に対して特異的結合親和性を有する成分を含んでいてもよい。毛細管を具有する装置の場合には、診断用レーンは一次元的に並列配置された毛細管または一次元的に直列配置された毛細管を具有することができる。
【００１３】
ここで用いる「結合対メンバー（member of a binding pair）（ＭＢＰ）」という用語は、特異的結合作用によって他の分子もしくは分子集塊とコンプレックスを形成するいずれかの分子もしくは分子集塊に関する。ＭＢＰとしては抗体およびこれらの対応するＭＢＰ並びにレセプターおよびこれらの対応するＭＢＰが例示される。ＭＢＰは、例えば、タンパク質、ポリペプチドおよび／または低分子から構成されていてもよい。
【００１４】
ここで用いる「評価できる程度には結合しない」という表現は、ＭＢＰと他のアッセイ試薬との間の相互作用および／または相互作用の欠如がシグナルの検出を著しく妨害しないことに関する。
【００１５】
ここで用いる「アッセイ試薬」という用語は、分析物の存在もしくは存在量を測定するために使用されるアッセイ装置内へ導入される液体へ外添される分子またはアッセイ装置内に存在するいずれかの分子に関する。例えば、アッセイ装置の製造時に該装置の特定の部分に１種もしくは複数種のアッセイ試薬を導入してもよい。この種のアッセイ試薬は、生物学的液体中の１種もしくは複数種の成分とコンプレックスを形成してアッセイ結果をもたらすような機能を果してもよい。別の例においては、アッセイ試薬を生物学的液体に外添して該液体中の１種もしくは複数種の分子とコンプレッスを形成させてもよい。分析物としてはシクロスポリンｈＣＧ、ＣＫＭＧ、トロポニンおよびミオグロビンが例示される。
【００１６】
ここで用いる「供給する」という用語は、アッセイ試薬、被検試料またはその他の種類の分子混合物をアッセイ装置内に置くことに関する。アッセイ試薬は、例えば、ピペットを用いてアッセイ試薬含有溶液を反応室内へ移送させることによってアッセイ装置の反応室内へ供給することができる。別の例においては、アッセイ試薬またはその他の種類の分子は、これらを診断用レーンの固体相に結合させることによって該診断レーン内へ供給してもよい。これらの分子を固体状支持体に結合させる方法は当業者には周知であるが、ここではさらに説明する。
【００１７】
ここで用いる「被検試料」という用語はアッセイ装置内に置いた溶液に関する。この溶液は、例えば生物の器官またはその被検物から抽出することができる。別の例においては、被検試料は生体外で調製した後、アッセイ装置内へ移してもよい。また被検試料はこれらの例を併用した試料として存在させてもよい。
【００１８】
ここで用いる「特異的結合親和性」という用語は、第１分子と第３分子との間で形成されるコンプレックスの場合に比べて、第１分子がより高い確率で第２分子とコンプレックスを形成する現像に関する。この例においては、第１分子は第２分子に対して特異的結合親和性を有する。
【００１９】
ここで用いる「標識（label）」という用語は、ＭＢＰもしくは試薬に直接的もしくは間接的に結合させる分子に関する。標識は共有結合または引力、例えば、疎水性力、イオン力もしくは水素結合力によってＭＢＰもしくは試薬に結合してもよい。標識は以下に説明するシグナルを発生してもよい。
【００２０】
ここで用いる「シグナル」という用語は、検出可能なパラメーターに関する。このようなパラメーターとしては次のものが例示される：光学的もしくは電気的もしくは磁気的なパラメーターの流れ、蛍光放射、赤外線放射、化学発光、紫外線放射、光放射およびこれらのいずれかの吸収。例えば、シグナルはアッセイ装置の診断用レーンに沿った距離に対する強度として表示してもよい。さらに、シグナルは時間に対する強度として表示してもよい。また、「シグナル」は検出可能な物理的パラメーターの欠如に関するものであってもよい。本発明は複数のシグナルおよび複数種のシグナルを同時に測定できる方法、装置およびキットを教示する。
【００２１】
ここで用いる「量（amount）」という用語は、感度の特定レベル内における物理的パラメーターの強度の増加、減少および／または維持に関する。シグナル量は任意の単位で表示することができる。例えば、シグナルの増加が１０単位で増加し、シグナルの測定感度が１単位の範囲内にあるならば、シグナル量の増加を検出することができる。
【００２２】
好ましい態様においては、第１ＭＢＰ、第２ＭＢＰおよびその他の試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。
【００２３】
ここで用いる「結合タンパク質（binding protein）」という用語は、１または複数の分子に対して特異的結合親和性を有するタンパク質に関する。結合タンパク質は、例えば、細胞から抽出されたタンパク質であってもよく、あるいはこの種のタンパク質の一部であってもよい。結合タンパク質は当業者には周知の方法を用いて生体外で合成してもよい。結合タンパク質は多重結合領域および／または多重結合タンパク質を含む分子であってもよい。結合性タンパク質は、例えば、タンパク質、ポリペプチドおよび有機分子に対して特異的結合、親和性を有していてもよい。結合タンパク質としては膜レセプター、非膜レセプターおよび抗体が例示される。
【００２４】
ここで用いる「抗体」という用語は、アミノ酸類似性および／または生物分子の免疫グロブリン群に対する構造的類似性を有する分子に関する。抗体は患者または動物から採取される免疫グロブリンとして存在していてもよい。あるいは、抗体は免疫グロブリンの部分として存在していてもよい。このような部分の一部のものは「抗体フラグメント」と呼ぶことができる。好ましくは、抗体フラグメントは免疫グロブリンの超可変領域の全部もしくは一部分を含む。抗体は、例えば、適当に免疫化された動物から採取してもよく、あるいはバクテリアの体内での組換え発現法によって合成してもよい。
【００２５】
ここで用いる「有機分子」は、炭素原子、窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子の間に共有結合を有する分子に関する。有機分子は一酸化炭素のようなサイズの小さい分子からポリマーのような複雑なサイズの大きい分子までの分子から選択することができる。有機分子はグリコシド分子に関する分子であってもよい。有機分子に対して特異的結合親和性を有する結合タンパク質と抗体の例は当業者には周知である。
【００２６】
いずれのＩＡＣやアッセイ試薬および／またはＭＢＰは液体や液体類似物に溶解していてもよく、あるいは液体等に懸濁した状態で存在していてもよい。あるいは、ＩＡＣやアッセイ試薬および／またはＭＢＰは固体状支持体もしくは固体相に結合していてもよい。
【００２７】
ここで用いる「固体状支持体」および「固体相」という用語は、非液状物に関する。固体状支持体はアッセイ装置と一体的に形成させてもよい。例えば、固体状支持体はアッセイ装置内の毛細管の一部または膜であってもよい。あるいは、固体状支持体はアッセイ装置内を流動する小径ビーズであってもよい。試薬は共有結合および／または非共有結合性引力、例えば、水素結合相互作用、疎水性引力もしくはイオン力によって固体状支持体もしくは固体相に結合していてもよい。
【００２８】
好ましい態様においては、標識は染料、蛍光発光性染料、化学発光性染料、赤外線放射性染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生分子および酵素から成る分子群から選択される。
【００２９】
ここで用いる「染料」という用語は、可視光、紫外光、赤外光、蛍光由来光、化学発光由来光および／またはその他の光学的に検出可能なパラメーターを検出可能に放出もしくは吸収する分子に関する。
また、ここで用いる「コロイド状ゾル」という用語は、固体、ゲルまたは液体として存在する部分的に分散された分子集塊に関する。
【００３０】
別の観点においては、本発明は溶液の流速を決定するための装置によって特徴づけられる。この装置は（ａ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置、（ｂ）光学的要素および（ｃ）シグナルプロセッサーを具備する。流速は、第１の結合対メンバー（ＭＢＰ）を反応室へ供給すると共に固体相に結合した第２のＭＢＰを診断用レーンへ供給することによって決定することができる。第１ＭＢＰは標識を含む。第１ＭＢＰと第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しないが、両者は相互に特異的結合親和性を有する。光学的要素は標識から発生するシグナルを検出する。シグナルプロセッサーは、診断用レーンを経て反応室からアッセイ装置を通る液体の流速を診断レーン内のシグナル量に基づいて決定する。
【００３１】
ここで用いる「光学的要素（optical component）」という用語は、アッセイシグナルが通過する装置の構成要素に関する。例えば、光学的要素は、蛍光シグナルを通過させてシグナルプロセッサーまで導くことによって該蛍光シグナル
部分的に電気的シグナルに変換させてもよい。光学的要素は装置内の他の構成要素と協働してアッセイシグナルを他のシグナルに変換してもよい。光学的要素は本発明による装置と一体化されていない独立の装置として存在していてもよく、あるいは本発明によるアッセイ装置と一体化されていてもよい。
【００３２】
ここで用いる「シグナルプロセッサー（signal processor）」という用語は、アッセイシグナルを部分的に改変する装置の構成要素に関する。例えば、シグナルプロセッサーは装置の光学的要素と共働して蛍光シグナルを電気的シグナルに変換してもよい。他の例においては、シグナルプロセッサーは後述するように、アッセイシグナルを調整してもよい。さらに別の例においては、シグナルプロセッサーは、アッセイ装置内における１または複数のＩＡＣ測定を利用することによってアッセイ測定を補正してもよい。シグナルプロセッサーは本発明の目的に対してはプロセッサー（co-processor）と呼んでもよい。プロセッサーとコプロセッサーは後述するように、媒体キャリヤー（media carrier）と共働してもよい。
【００３３】
さらに別の観点においては、本発明は溶液の流速を決定するためのキットによって特徴づけられる。キットは（ａ）食品医薬品局によって認可された少なくとも１種の標識および一式の使用説明書並びに（ｂ）(ｉ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを有するアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサーを備えた装置を具有する。流速は第１の結合対メンバー（ＭＢＰ）を反応室へ供給すると共に固体相に結合した第２のＭＢＰを診断用レーンへ供給することによって決定することができる。第１ＭＢＰは標識を含む。第１ＭＢＰと第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれの試薬に対しても評価できる程度には結合しないが、両者は相互に特異的結合親和性を有する。光学的要素は標識から発生するシグナルを検出することができる。シグナルプロセッサーは、診断用レーンを経て反応室からアッセイ装置を通る液体の流速を診断用レーン内におけるシグナル量に基づいて決定することができる。
【００３４】
ここで用いる「食品医薬品局から認可された標識」という用語は、米国の食品医薬品局または他の国における類似の部局によって認可されている標識に関する。さらにこの用語は、米国の食品医薬品局または他の国における類似の部局によって特定の化合物もしくは装置が認可されていることを必要とする標識に関する。
【００３５】
ここで用いる「一式の使用説明書」という用語は、本発明による方法、装置および／またはキットの使用者を補助するためのテキストおよび／または図表に関する。例えば、一式の使用説明書は段階的にセットになった使用説明書の形態であってもよく、あるいは本発明による装置および／またはアッセイ装置を保有するボックスの外壁上にテキストとして存在していてもよい。
【００３６】
環境条件を決定するためのＩＡＣ
ここで用いる「環境条件」という用語はアッセイ装置内における物理的パラメーターに関する。例えば、ＩＡＣは分子が液体および／または接近する液体の前部に溶解する速度を支配する試薬の拡散特性の効果を決定してもよい。一般に、反応室とアッセイ装置内のＩＡＣ試薬の近似性は標識の非特異的結合、流動力学、培養時間、反応混合物の均一性、並びに血液のヘマトクリット値およびアッセイ血液中の異好性抗体の割合を含む試料マトリックスに関連する機能を限定する。本発明によるＩＡＣは、アッセイ装置および／またはアッセイ装置へ導入される液体の物理的特性の変化に基づくアッセイ測定の補正に利用することができる。
【００３７】
従って、別の観点においては、本発明は、反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置内のアッセイ中の環境条件を決定する方法によって特徴づけられる。反応室は、標識を含む第１ＭＢＰと親和性タッグを含む第２ＭＢＰを、被検試料と溶液を生成する態様で保有する。診断用レーンは親和性タッグに対して特異的結合親和性を有する親和性タッグパートナー（ＡＴＰ）を保有する。第１ＭＢＰ、第２ＭＢＰ、ＡＴＰおよび親和性タッグはアッセイ装置内のいずれのＩＡＣもしくはアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。この方法は次の過程（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）標識から発生するシグナルを診断用レーン内において、ＡＴＰが存在する位置で検出し、次いで（ｂ）診断用レーン内のシグナル量に関連するアッセイ中のアッセイ装置内の環境条件を決定する。
【００３８】
ここで用いる「親和性タッグ（affinity tag）」という用語は、試薬および／またはＭＢＰに結合した分子であって、ＡＴＰに対して特異的結合親和性を有する分子に関する。親和性タッグは共有結合または前述の引力によって試薬および／またはＭＢＰに結合することができる。親和性タッグは試薬またはＭＢＰの合成後または合成中に該試薬またはＭＢＰに結合することができる。親和性タッグは、例えば、有機分子、タンパク質、グリコシル残基またはポリペプチドであってもよい。
【００３９】
ここで用いる「親和性タッグパートナー（affinity tag partner）」という用語は親和性タッグに対して特異的結合親和性を有する分子に関する。親和性タッグパートナーは固体相に結合していてもよく、あるいは溶液中で自由に拡散できる非結合状分子として存在していてもよい。親和性タッグパートナーは、例えば、有機分子、ポリペプチド、グリコシル残基またはタンパク質であってもよい。当該分野で周知の親和性タッグ／親和性タッグパートナーコンプレックスとしては、赤血球凝集素ペプチド／赤血球凝集素ペプチド抗体コンプレックスおよびアビディン／ビオチンコンプレックスが例示される。
【００４０】
好ましい態様においては、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは反応室の蓋および底部の少なくとも一方に結合する。別の好ましい態様においては、ＡＴＰは診断用レーンの固体状支持体に結合する。
【００４１】
別の観点においては、この方法は第２ＭＢＰ、および第２親和性タッグを含むＡＴＰを反応室へ供給し、診断用レーンは第２ＡＴＰを含む。第２ＡＴＰは第２親和性タッグに対して特異的結合親和性を有し、第２ＡＴＰと第２親和性タッグはアッセイ試薬に対して評価し得る程度には結合しない。
【００４２】
好ましい態様においては、第１ＭＢＰ、第２ＭＢＰおよび試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。別の態様においては、標識は染料、蛍光発生染料、化学蛍光発生染料、赤外線発生染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生分子および酵素から成る分子群から選択される。
【００４３】
別の観点においては、本発明はアッセン中のアッセイ装置内における環境条件を決定するための装置によって特徴づけられる。この装置は（ａ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを有するアッセイ装置、（ｂ）光学的要素および（ｃ）シグナルプロセッサーを具有する。反応室は被検試料と溶液を生成する態様で第１ＭＢＰと第２ＭＢＰを含む。第１ＭＢＰは標識を含み、第２ＭＢＰは親和性タッグを含む。診断用レーンは親和性タッグパートナー（ＡＴＰ）を含み、該ＡＴＰは親和性タッグに対して特異的結合親和性を有していてもよい。第１ＭＢＰ、第２ＭＢＰ、ＡＴＰおよび親和性タッグはアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しないが、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。光学的要素は標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーは、診断用レーン内のシグナル量に関連するアッセイ中のアッセイ装置内の環境条件を決定することができる。
【００４４】
さらに別の観点においては、本発明はアッセイ中のアッセイ装置内の環境条件を決定するためのキットによって特徴づけられる。キットは（ａ）食品医薬品局によって認可された少なくとも１種の標識と一式の使用説明書および（ｂ）次の構成要素（ｉ）〜（iii）を具有する装置を保有する：（ｉ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを有するアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサー。反応室は被検試料と溶液を生成する態様で第１ＭＢＰと第２ＭＢＰを含む。第１ＭＢＰは標識を含んでいてもよく、また、第２ＭＢＰは親和性タッグを含んでいてもよい。診断用レーンは親和性タッグパートナー（ＡＴＰ）を含んでいてもよく、ＡＴＰは親和性タッグに対して特異的結合親和性を有していてもよい。第１ＭＢＰ、第２ＭＢＰ、ＡＴＰおよび親和性タッグはアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しないが、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。光学的要素は標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーは、診断用レーン内のシグナル量に関連するアッセイ中のアッセイ装置内の環境条件を決定することができる。
【００４５】
アッセイの進行と完了時を決定するためのＩＡＣ
ここで用いる「進行（progress）」および「完了時（time of completion）」という用語はアッセイ装置内を通る分子の流れの監視に関する。例えば、完了時は診断用レーン内の時間および／または距離に関するシグナル強度の測定から決定することができる。読み出し（read-out）中のいずれかの点におけるシグナル量の変化速度または読み出し中のいずれかの点におけるシグナルの絶対強度によってアッセイの進行と完了時を決定することができる。これらのパラメーターについては以下においてさらに詳述する。
【００４６】
従って、別の観点においては、本発明は、反応室と少なくとも１つの診断用レーンを有するアッセイ装置内におけるアッセイの進行と完了時を測定するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）アッセイ装置内のＩＡＣまたはいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室内へ供給し、（ｂ）診断用レーン内において少なくとも１つの分離ゾーン内で標識から発生するシグナルを検出し、次いで（ｃ）アッセイ装置内のアッセイの進行と完了時を（ｉ）シグナル量の変化速度と（ii)シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定する。
【００４７】
ここで用いる「分離ゾーン（discrete zone）」という用語はアッセイ装置の領域に関する。例えば、診断用レーンが毛細管として存在するときには、該毛細管は複数の分離ゾーンを含む。シグナル強度は各々のゾーンにおいて独立して監視できる。アッセイ測定は１本の毛細管について１つのゾーン内でおこなうことができ、ＩＡＣ測定は別の毛細管または同じ毛細管の別の分離ゾーン内でおこなうことができる。これらの例は単なる例示であって、本発明を限定するものではない。
【００４８】
ここで用いる「シグナルの絶対量」という用語はアッセイ装置内のシグナルの程度に関する。この用語はシグナル強度対時間および／または距離に関連するアッセイ装置のいずれかの領域におけるシグナル強度測定に関する。領域はシグナル強度に関する１つの別々の測定を表わす。こご用いる「シグナル量の変化速度」という用語はシグナル強度の一次導関数に関する。変化速度は、シグナル強度対診断用ゾーンに沿った距離に関連する測定の１つの領域において決定することができる。さらに、変化速度はシグナル強度対時間に関連する測定の１つの領域において決定することができる。これらの例は限定的なものではなく、単なる例示的なものに過ぎない。
【００４９】
好ましい態様においては、シグナル量の変化速度の導関数が決定される。別の好ましい態様においては、シグナルの絶対量が平均化される。さらに別の好ましい態様においては、変化速度はシグナル量の負の変化速度である。
【００５０】
好ましい態様においては、標識はＭＢＰに結合される。別の好ましい態様においては、ＭＢＰと試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。さらに別の好ましい態様においては、標識は染料、蛍光発生染料、化学蛍光発生染料、赤外線発生染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生分子並びに酵素から成る分子群から選択される。
【００５１】
他の観点においては、本発明は次の構成要素を含む、アッセイ装置内でのアッセイの進行と完了時を測定するための装置によって特徴づけられる：（ａ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ｂ）光学的要素、および（ｃ）シグナルプロセッサー。標識は反応室内へ供給することができ、また、好ましくは、標識はアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。光学的要素は診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において、標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーによって、アッセイ装置内のアッセイの進行と完了時を（ｉ）シグナル量の変化速度および（ii）シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定することができる。
【００５２】
さらに別の観点においては、本発明はアッセイ装置内におけるアッセイの進行と完了時を決定するためのキットによって特徴づけられる。このキットは（ａ）食品医薬品局によって認可された少なくとも１種の標識および一式の使用説明書並びに（ｂ）(ｉ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサーを具備する装置を保有する。標識は反応室内へ供給してもよく、また、好ましくは、標識はアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。光学的要素は診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーによってアッセイ装置内におけるアッセイの進行と完了時を（ｉ）シグナル量の変化速度および（ii）シグナルの絶対量の少なくとも一方に基づいて決定することができる。
【００５３】
シグナル強度および／またはシグナル形状に基づいて異常なアッセイ結果を確認するためのＩＡＣ
ここで用いる「異常な（deviant）アッセイ結果」という用語はＩＡＣまたはアッセイに対するシグナルの平均的形状からの偏差に関する。シグナルは、例えば、強度対診断用レーン内の距離として表示することができる。このようなシグナルの形状がシグナルの平均的形状から実質上ずれるときには、アッセイ結果は異常となる。シグナルの平均的形状は、異なるアッセイ装置内におけるシグナルを複数回測定することによって決定することができる。さらに、ＩＡＣシグナルの形状が測定シグナルと異なるときには、測定シグナルは異常となる。本発明による全てのＩＡＣの場合と同様に、このＩＡＣは本発明による他のいずれかのＩＡＣまたはアッセイの併用によって監視できる。
【００５４】
従って、１つの観点においては、本発明はアッセイ装置内における異常なアッセイ結果を決定するための方法によって特徴づけられる。アッセイ装置は反応室および１または複数の診断用レーンを具有する。この方法は次の過程（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）アッセイ装置内のいずれの反応試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室内へ供給し、（ｂ）１もしくは複数の診断用レーン内の少なくとも２つの分離ゾーン内において標識から発生するアッセイシグナル（ＡＳ）と独立アッセイコントロールシグナル（ＩＡＣs）を検出し、次いで（ｃ）ＡＳの強度および／または形状をＩＡＣsの強度および／または形状と比較することによってアッセイ装置内における異常なアッセイ結果を決定する。アッセイシグナルと独立アッセイコントロールシグナルは別々の分離ゾーン内において測定することができる。分離ゾーンはアッセイ装置の１本の毛細管の内部に存在していてもよく、あるいはアッセイ装置の異なる毛細管の内部に存在していてもよい。
【００５５】
好ましい態様においては、標識はＭＢＰに結合させる。別の好ましい態様においては、ＭＢＰと他の試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。さらに別の好ましい態様においては、標識は染料、蛍光発生性染料、化学蛍光発生性染料、赤外線発生性染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生性分子並びに酵素から成る群から選択される。
【００５６】
別の観点においては、本発明はアッセイ装置内において異常なアッセイ結果を決定するための装置によって特徴づけられる。この装置は（ａ）反応室および１もしくは複数の診断用レーンを含むアッセイ装置、（ｂ）光学的要素および（ｃ）シグナルプロセッサーを具備する。標識は反応室内へ供給してもよい。好ましくは、標識はアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。光学的要素によって１もしくは複数の診断用レーン内の少なくとも２つの分離ゾーン内において標識から発生するアッセイシグナル（ＡＳ）および独立アッセイコントロールシグナル（ＩＡＣＳ）を検出してもよい。シグナルプロセッサーを用いてＡＳの形状とＩＡＣＳの形状を比較することによってアッセイ装置内における異常なアッセイ結果を決定することができる。
【００５７】
さらに別の観点においては、本発明はアッセイ装置内において異常なアッセイ結果を決定するためのキットによって特徴づけられる。このキットは（ａ）食品医薬品局によって認可された少なくとも１種の標識および一式の使用説明書並びに（ｂ）(ｉ）反応室および１もしくは複数の診断用レーンを含むアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサーを具備する装置を保有する。標識は反応室内へ供給してもよい。好ましくは、標識はアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。光学的要素によって、１もしくは複数の診断用レーン内の少なくとも２つの分離ゾーン内において標識から発生するアッセイシグナル（ＡＳ）と独立アッセイコントロールシグナル（ＩＡＣＳ）を検出してもよい。シグナルプロセッサーを用いることにより、ＡＳの形状とＩＡＣＳの形状を比較することによってアッセイ装置内の異常なアッセイ結果を決定してもよい。
【００５８】
シグナルの調整
ここで用いる「調整（smoothing）」という用語はアッセイシグナルにおける可変性の減少に関する。シグナル対ノイズ比が小さいアッセイ条件下で測定するアッセイシグナルの定量においてはその調整は特に有用である。このような条件下で特に問題となる点は、シグナル強度の増減の検出および／または定量が誤まって誘発されることである。このような条件下で測定されるシグナルを調整する本発明方法はシグナル処理の信頼性を高めることができる。この調整は本発明による他のいずれかのＩＡＣと併用して利用することができる。シグナルの調整法は当該分野においては周知であるが、以下において説明する。
【００５９】
本発明は、本発明による調整法を全体的または部分的に実施し得るコンピュータープログラム可能媒体（medium）および装置にも関する。
従って、別の観点においては、反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置内におけるバックグラウンド、ＩＡＣおよびアッセイシグナル決定を調整する方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室へ供給し、（ｂ）診断レーン内において標識から発生するシグナルを検出し、次いで（ｃ）シグナルを調整する。
【００６０】
好ましい態様においては、標識は第１ＭＢＰに結合させる。別の好ましい態様においては、第１ＭＢＰと他の試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。さらに別の好ましい態様においては、標識は染料、蛍光発生性染料、化学蛍光発生性染料、赤外線発生性染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生性分子および酵素から成る分子群から選択される。
【００６１】
他の好ましい態様においては、本発明は第２ＭＢＰを供給する過程を含む調整法に関する。第２ＭＢＰは診断用レーン内に位置し、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれのＩＡＣおよびアッセイ試薬（第１ＭＢＰを除く）に対しても評価し得る程度には結合しない。
【００６２】
別の好ましい態様においては、本発明は第２ＭＢＰを供給してこれを反応室内へ導入する過程を含む調整法に関する。第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有し、また、第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれのＩＡＣおよびアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。第２ＭＢＰは親和性タッグを含み、診断用レーンは親和性タッグパートナー（ＡＴＰ）を含み、また、ＡＴＰは親和性タッグに対して特異的結合親和性を有する。第２ＭＢＰ、ＡＴＰおよび親和性タッグはアッセイ装置内のいずれのＩＡＣおよびアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合せず、また、第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有する。
【００６３】
さらに別の好ましい態様においては、本発明は第２ＭＢＰと第１の親和性タッグパートナー（ＡＴＰ）を反応室へ供給する過程を含む調整法に関する。第１ＭＢＰと第２ＭＢＰは相互に特異的結合親和性を有し、第２ＭＢＰはアッセイ装置内のいずれのＩＡＣおよびアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しない。第２ＭＢＰは第１親和性タッグを含み、第１ＡＴＰは第１親和性タッグに対して特異的結合親和性を有し、また、第１ＡＴＰは第２親和性タッグを含む。診断用レーンは、第２親和性タッグに対して特異的結合親和性を有する第２ＡＴＰを含む。第２ＭＢＰ、第１ＡＴＰ、第２ＡＴＰ、第１親和性タッグおよび第２親和性タッグはアッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない。他の好ましい態様においては、調整法はシグナルを平均化する過程を含む。
【００６４】
別の観点においては、本発明はアッセイ装置内におけるアッセイシグナルの決定を調整するための装置によって特徴づけられる。この装置は（ａ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ｂ）光学的要素および（ｃ）シグナルプロセッサーを含んでいてもよい。アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価できる程度には結合しない標識を反応室へ供給してもよい。光学的要素によって、診断用レーン内において標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーによってシグナルを調整してもよい。
【００６５】
さらに別の観点においては、本発明はアッセイ装置内においてアッセイシグナルの決定を調整するためのキットによって特徴づけられる。このキツトは（ａ）食品医薬品局から認可を受けた少なくとも１種の標識および一式の使用説明書並びに（ｂ）(ｉ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサーを具備する装置を具有していてもよい。アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室へ供給してもよい。光学的要素によって、診断用レーン内において標識から発生するシグナルを検出してもよい。シグナルプロセッサーによってシグナルを調整してもよい。
【００６６】
検出ゾーンの位置を確認するためのＩＡＣ
ここで用いる「検出ゾーンの位置を確認する」という表現は、シグナル検出装置がアッセイ装置の適当な領域においてシグナルを検出しているかどうかを示すアッセイおよび／またはＩＡＣに関する。例えば、アッセイ装置がシグナル検出装置の不適当な位置にあるときには、本発明のこの観点によれば、異常な状況がオペレーターに警告される。同様に、検出ゾーンがアッセイ装置の不正確な位置に存在するように該アッセイ装置が不適切に製造されているときにも、この観点によれば異常な状況がオペレーターに警告される。検出ゾーンの位置を確認するためのその他の要因と方法は以下に説明する。ここで用いる「検出ゾーン」という用語はシグナルが検出できるアッセイ装置のいずれかの領域に関する。このシグナルはＩＡＣシグナル、調整されるシグナル、アッセイ測定シグナル、バッククラウンドシグナルおよびその他の検出可能なシグナルに拡張できる。
【００６７】
他の観点においては、本発明は、反応室と少なくとも１つの診断用レーンを具有するアッセイ装置内の検出ゾーンの位置を確認するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）アッセイ装置内のいずれのＩＡＣおよびアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室へ供給し、（ｂ）診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において標識から発生するシグナルを測定し、次いで（ｃ）診断用レーンの分離ゾーン内のシグナルの検出によって検出ゾーンの位置を確認する。
【００６８】
好ましい態様においては、標識はＭＢＰに結合させる。別の好ましい態様においては、ＭＢＰと他の試薬は結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチドおよび有機分子から成る群から選択される。さらに別の好ましい態様においては、標識は染料、蛍光発生性染料、化学蛍光発生性染料、赤外線発生性染料、コロイド状ゾル、電気的および／または磁気的シグナル発生性分子および酵素から成る分子群から選択される。
【００６９】
別の観点においては、本発明はアッセイ装置内の検出ゾーンの位置を確認するための装置によって特徴づけられる。この装置は（ａ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ｂ）光学的要素および（ｃ）シグナルプロセッサーを具備する。アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室へ供給することができる。診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において標識から発生するシグナルは光学的要素によって測定してもよい。検出ゾーンの位置はシグナルプロセッサーを用いることにより、診断用レーンの分離ゾーン内のシグナルを検出することによって決定することができる。
【００７０】
さらに別の観点においては、本発明はアッセイ装置内の検出ゾーンの位置を確認するためのキットによって特徴づけられる。このキットは（ａ）食品医薬品局によって認可された少なくとも１種の標識および一式の使用説明書並びに（ｂ）（ｉ）反応室と少なくとも１つの診断用レーンを含むアッセイ装置、（ii）光学的要素および（iii）シグナルプロセッサーを具備する装置を含んでいてもよい。アッセイ装置内のいずれのアッセイ試薬に対しても評価し得る程度には結合しない標識を反応室へ供給することができる。標識から発生するシグナルを、診断用レーンの少なくとも１つの分離ゾーン内において光学的要素によって測定してもよい。検出ゾーンの位置はシグナルプロセッサーを用いることにより、診断用レーンの分離ゾーン内におけるシグナルの検出によって決定することができる。
【００７１】
ＩＡＣの利用によるアッセイ測定の補正
本発明は、ここで提供されるＩＡＣの利用によるアッセイ測定の補正に有用な方法、コンピュータープログラム化可能な媒体および装置を教示する。前述のように、アッセイをおこなうオペレーターが容易に制御できないパラメーターの変化、例えば、アッセイ温度の変化、試料粘度の変化並びに化学的および生化学的組成の変化に起因してアッセイの結果はずれる。
【００７２】
本発明によるＩＡＣの測定はアッセイの測定結果の補正に利用することができるので、アッセイをおこなうオペレーターの制御範囲を越える条件変化にかかわらずに一定のアッセイ測定結果が得られる。アッセイ測定結果を補正するための数学的誘導法に関しては、単一のアッセイにおいて１、２またはそれ以上のＩＡＣを用いることによって後述する。
【００７３】
１または複数のＩＡＣ測定によってアッセイ測定を補正するためには異なる方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置を利用することができる。アッセイ測定の補正に使用する方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置の種類はアッセイの特定のパラメーターの関係によって左右される。例えば、（ｉ）ＩＡＣ測定における偏差を修正する定数（β）および（ii）アッセイ測定の平均値との間の関係によって、アッセイ測定の補正にどのような方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置を使用すればよいかを決定することができる。特に、これらの２つのパラメーターの関係が非線形の場合には特定の方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置を利用すればよい。一方、これらの２つのパラメーターの関係が線形の場合には別の方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置を利用すればよい。これらのパラメーターについては以下においてさらに詳述する。
【００７４】
ここで用いる「定数（constant)」という用語は、本発明による測定値または決定値を掛けたいずれかの定数に関する。本発明による測定値は、例えば、ＩＡＣ偏差値、または複数のアッセイ測定値の平均値であってもよい。前述のように、測定されたアッセイ結果の補正に有用な方法においては、ＩＡＣ偏差には定数を掛けるとができる。ここで利用するいくつかの定数はβおよびΓとする。βとΓは試験値ＩＡＣ値の関数にすることができる。しかしながら、以下の教示内容においては、βとΓは試験アッセイ測定値とＩＡＣ測定値に対しては特定の値において解くことができるので、定数とすることができる。βは、例えば、次の方法（ｉ）〜（iv）によって決定することができる：（ｉ）値が定数であると推定する。（ii）アッセイ測定値の偏差と対照測定値の偏差に関する線形回帰の勾配値について解く。（iii）アッセイ測定値の偏差と対照測定値の偏差から成るマトリックスに関するマトリックス関数を解く。（iv）相関係数を最大にすると共に補正されたアッセイ測定値の標準偏差と平均値の商を最小にする方程式を解く。マトリックス関数および相関係数を解くための多くの数学的手法例は当業者には周知である。これに関しては次の文献が例示される：ジョーシ（A.W.Joshi）著、「物理学におけるマトリックスとテンソル」（第２版）；トゥソコス（C.P.Tsokos）著、「確率分布：確率論の入門と応用」（１９７２年）。線形回帰分析とマトリックス関数分析を含む適用については以下に詳述する。Γは、例えば、βとアッセイ測定値の平均値に関するプロットについての線形回帰分析の勾配から決定することができる。各々のβは一組のアッセイ装置から決定してもよい。アッセイ測定値の各々の平均値は一組のアッセイ装置から決定することができる。ここでしばしば用いる下付き文字「ｉ」はアッセイ装置の別の組を示す。
【００７５】
ＩＡＣ測定値の偏差を修正する定数がアッセイ測定値の平均値に対して非線形的に変化するときのＩＡＣの利用
本発明は、ＩＡＣ結果における偏差を修正する定数（β）が複数のアッセイ測定値の平均値に対して非線形的に変化するアッセイ条件下で測定されるアッセイ結果から補正アッセイ結果を決定するのに有用な方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置にも関する。補正アッセイ結果、測定アッセイ結果、ＩＡＣ結果、およびＩＡＣ結果を修正する定数の間の関係を示す数学的方程式はこれらの条件に関連して以下に定義する。
【００７６】
ＩＡＣが相互に依存することには、定数は、アッセイ結果の測定値をＩＡＣ測定値を含むマトリックス関数を解くことによって決定することができる。ＩＡＣが相互に依存しないときには、定数は、ＩＡＣ測定値の偏差とアッセイ測定値の偏差に関するプロットの線形回帰分析の勾配についての解を求めることによって決定することができる。アッセイ測定値とＩＡＣ測定値の偏差は複数のアッセイ装置を用いる測定値から決定することができる。アッセイ結果の補正のための１、２またはそれ以上のＩＡＣを用いるアッセイ装置に関しては別々の数学的方程式と対応する実験方法を決定することができる。これらの数学的方程式は以下に定義する。
【００７７】
総和、差、積および商の決定を含むここに記載の数学的方程式は当業者には周知である。さらに、線形回帰分析、マトリックス代数関数の解法およびプロットの作製は当業者には周知の技法である。ここで用いる「差」という用語は、ある量から別の量が差し引かれる数学的関数に関する。別の量から差し引かれる量はここでの差の表現法とは無関係である。例えば、「ＡとＢの間の差」という表現は、「Ｂから差し引かれたＡ」および「Ａから差し引かれたＢ」として表現することができるが、本発明の目的に対しては後者の解釈が好ましい。
【００７８】
ここで用いる「商」という用語は、ある量が別の量によって割られる数学的関数に関する。別の量によって割られる量はここでの商の表現法とは無関係である。例えば、「ＡとＢの間の商」という表現は「Ｂによって割られたＡ」および「Ａによって割られたＢ」として表現することができるが、本発明の目的に対しては前者の解釈が好ましい。
【００７９】
ここで用いる「複数測定」という用語は、アッセイ測定値を補正するのに利用してもよいアッセイおよび／またはＩＡＣの測定回数に関する。下付き文字「ｉ」は各々のアッセイ装置を示すのに利用できる。アッセイ装置の数は特定種のアッセイ測定値および特定のＩＡＣに関連して変化させることができる。本発明によって与えられる数学的関係は無限数のアッセイ装置に関するものであるが、好ましいアッセイ装置数は２〜１００００００である。例えば、ある種のアッセイ測定値が１０個のアッセイ装置において決定される場合、５番目の装置での測定値はＴi（ｉ＝５）として表される。以下に説明する別の例においては、アッセイ測定値は複数のアッセイ装置において決定することができ、アッセイ測定値の平均値も決定することができ、また、アッセイ偏差の範囲は各々のアッセイ測定値から計算された平均値を差し引くことによって計算することができ、さらに、定数はこれらのアッセイ偏差のプロットから決定することができる。下付き文字「ｉ」は各々のアッセイ装置並びに複数のアッセイ測定値およびＩＡＣ測定値を得るのに利用した各々のＩＡＣを示す。
【００８０】
別のＩＡＣは下付き文字「ｊ」で規定することができる。ここで教示する数学的操作によれば、無限数の異なるＩＡＣを利用してアッセイシグナルの補正をすることが可能となる。しかしながら、アッセイ結果を補正するためのアッセイ装置内においては、１０以下のＩＡＣを測定するのが好ましい。例えば、１つのアッセイ装置内において１０個のＩＡＣを測定するときには、各々のアッセイ装置内で測定される５番目のＩＡＣはＩＡＣj（ｊ＝５）として表される。各々の異なるＩＡＣに関する各々のＩＡＣ偏差を定数で修正することによって測定されるアッセイ結果を補正することができる。
【００８１】
ここで用いる「ＩＡＣ偏差」および「δＴＡＣ」という用語は、アッセイ装置内における各々の別のＩＡＣに対する複数のＩＡＣ測定値の平均値と該測定値自体との間の数学的差に関する。複数のＩＡＣ測定値は複数のアッセイ装置内において決定することができる。複数のＩＡＣ測定は、補正されてもよいアッセイ測定の前におこなうことができる。
【００８２】
ここで用いる「アッセイ測定偏差」および「δＴ」という用語は、複数のアッセイ測定値の平均値と該測定値自体との間の数学的差に関する。複数のアッセイ測定値は複数のアッセイ装置内において決定することができる。複数のアッセイ測定は、補正されてもよいアッセイ測定の前におこなうことができる。ここで用いる「マトリックス関数」という用語は数学基マトリックス関数または逆マトリックス関数に関する。マトリックス関数と逆マトリックス関数についてはさらに詳述する。
【００８３】
１つの観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と複数回（ｊ）測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjと複数のＩＡＣj測定値（ＩＡＣji）の平均値（ＩＡＣjave）との間の差を決定し、（ｃ）過程（ｂ）における各々の差に定数（βj）を掛けることによって積を決定し、次いで（ｄ）全てのｊ番目の積の総和を決定し、次いで（ｅ）Ｔmから該総和を差し引く。
【００８４】
好ましい態様においては、各々のβjは、各々のδＴと各々のδＩＡＣjを含むマトリックス関数によって決定される。別の好ましい態様においては、各々のβjは、複数のアッセイ結果測定値（Ｔi）とＴiの平均値（Ｔave）との間の差をＩＡＣjiとＩＡＣjaveとの間の差に対してプロットして得られるデータの線形回帰の勾配から決定することができる。
【００８５】
さらに別の好ましい態様においては、この方法は１つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正するときにおこなわれる。他の好ましい態様においては、２つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正する。当業者であれば、これらの好ましい態様を実施するために、ここで教示された方法、コンピュータープログラム化可能媒体、装置および数学的関係式を容易に採用することができる。
【００８６】
別の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と複数回(j)測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定する方法を実施するようにプロセッサーに指令するプログラムを具有するコンピュータープログラム化可能媒体によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjと複数のＩＡＣj測定値（ＩＡＣji）との間の差を決定し、（ｃ）過程（ｂ）の各々の差に定数（βj）を掛けることによって積を決定し、（ｄ）全てのｊ番目の積についての総和を決定し、次いで（ｅ）Ｔmから該総和を差し引く。
【００８７】
さらに別の観点においては、本発明は上記のパラグラフに記載の方法を実施するのに有用な装置によって特徴づけられる。本発明の好ましい態様は、測定されたアッセイ結果の補正に有用な方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置において使用するための本明細書に記載のシグナル測定とＩＡＣ測定の利用に関する。
【００８８】
ＩＡＣ測定の偏差を修正する定数がアッセイ測定値の平均値に対して線形的に変化するときのＩＡＣの利用
本発明は、ＩＡＣ結果における偏差を修正する定数（β）が複数のアッセイ測定値の平均値に対して線形的に変化するアッセイ条件下において測定されたアッセイ結果から補正されたアッセイ結果を決定するのに有用な方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置にも関する。補正されたアッセイ結果、測定されたアッセイ結果、ＩＡＣ結果およびＩＡＣ結果を修正する定数の間の関係を示す数学的方程式をこれらの条件と関連させて以下に説明する。
【００８９】
前述のように、複数のＩＡＣが相互に依存する場合には、定数はアッセイ結果の測定値とＩＡＣ測定値を含むマトリックス関数を解くことによって決定することができる。ＩＡＣが相互に依存しないときには、定数は、ＩＡＣ測定値の偏差とアッセイ測定値の偏差との関係を示すプロットの線形回帰が勾配に関する解を求めることによって決定することができる。アッセイ測定値とＩＡＣ測定値の偏差は複数のアッセイ装置を用いる測定値から決定することができる。別の数学的方程式と対応する実験法は、アッセイ結果の補正のために１、２またはそれ以上のＩＡＣを用いるアッセイ装置に対して決定することができる。これらの数学的方程式は以下に示す。
【００９０】
１つの観点においては、本発明は測定されたアッセイ結果（Ｔm）および複数（ｊ）の測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjと複数のＩＡＣj測定値（ＩＡＣji）の平均値（ＩＡＣjave）との間の差（δＩＡＣj）を決定し、（ｃ）過程（ｂ）の各々の差に定数（Γj）を掛けることによって積を決定し、（ｄ）整数１と全てのｊ番目の積との総和を決定し、次いで（ｅ）該総和とＴmとの間の商を決定する。
【００９１】
好ましい態様においては、各々のΓjは、複数のβjの決定値と複数のアッセイ結果測定値（Ｔi）の平均値（Ｔave）との関係を示すプロットの線形回帰の勾配である。別の好ましい態様においては、各々のβjは、各々のδＴと各々のδＩＡＣjを含むマトリックス関数によって決定される。さらに別の好ましい態様においては、各々のβjは、複数のアッセイ結果測定値（Ｔi）とＴiの平均値（Ｔave）との間の差およびＩＡＣjiとＩＡＣjaveとの間の差との関係を示すプロットの線形回帰の勾配から決定される。
【００９２】
好ましい態様においては、この方法は１つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正するときにおこなわれる。別の好ましい態様においては、２つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正する。当業者であれば、これらの好ましい態様を実施するためにここに教示された方法と数学的関係を容易に採用することができる。
【００９３】
別の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と複数（ｊ）の測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するための方法をプロセッサーが実施するように指命するプログラムを具有するコンピュータープログラム化可能媒体によって特徴づけられる。この方法は次の（ａ）〜（ｅ）の過程を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjと複数のＩＡＣj測定値（ＩＡＣji）の平均値（ＩＡＣjave）との間の差を決定し、（ｃ）過程（ｂ）の各々の差に定数（Γj）を掛けることによって積を決定し、（ｄ）整数１との全てのｊ番目の積との総和を決定し、次いで(ｅ)該総和とＴmとの間の商を決定する。
さらに別の観点においては、本発明は上記パラグラフに記載の方法を実施するのに有用な装置によって特徴づけられる。
【００９４】
ＩＡＣの結果における偏差を修正する定数が複数のアッセイ測定値の平均値に対して線形的に変化するときにアッセイ結果を補正するための別の方法も存在する。従って、他の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と複数（ｊ）の測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｄ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjの関数を決定し、（ｃ）整数１と各々の関数の総和を決定し、次いで（ｄ）Ｔmと該総和との間の商を決定する。
【００９５】
ここで用いる「関数」という用語は、各々のＩＡＣjと複数のＩＡＣj測定値（ＩＡＣji）の平均値（ＩＡＣjave）との間の差（δＩＡＣj）についての累乗級数展開式の形で表示できる数学的操作に関する。
好ましい態様においては、この方法は１つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正するときにおこなわれる。別の好ましい態様においては、２つのＩＡＣを利用してアッセイ結果を補正する。当業者であれば、これらの好ましい態様を実施するためにここに教示された方法と数学的関係を容易に採用することができる。
【００９６】
別の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と複数（ｊ）の測定されたコントロールアッセイ結果（ＩＡＣj）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するための方法をプロセッサーが実施するように指令するプログラムを具有するコンピュータープログラム化可能媒体によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｄ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmと各々のＩＡＣjを測定し、（ｂ）各々のＩＡＣjの関数を決定し、（ｃ）整数１と各々の関数の総和を決定し、次いで（ｄ）Ｔmと該総和との間の商を決定する。
さらに別の観点においては、本発明は上記のパラグラフに記載の方法を実施するのに有用な装置によって特徴づけられる。
【００９７】
１つのＩＡＣを測定する場合、ＩＡＣ測定値がアッセイ測定値に対して比例的に変化するときには、別の方法を利用てアッセイ測定値を補正することができる。
従って、別の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と測定された独立アッセイコントロール結果（ＩＡＣ）から補正されたアッセイ（Ｔc）を決定するための方法によって特徴づけられる。この方法は次の過程（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）アッセイ装置内においてＴmとＩＡＣを測定し、（ｂ）複数のＩＡＣ測定値（ＩＡＣi）の平均値（ＩＡＣave）とＩＡＣとの間の商を決定し、次いで（ｃ）過程（ｂ）の商にＴｍを掛けることによって積を決定する。
【００９８】
他の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と測定された独立アッセイコントロール結果（Ｔc）を決定するための方法をプロセッサーが実施するように指令するプログラムを具有するコンピュータープログラム化可能媒体によって特徴づけられる。この方法は上記のパラグラフに記載の方法と同一である。
さらに別の観点においては、本発明は、測定されたアッセイ結果（Ｔm）と測定された独立アッセイコントロール結果（ＩＡＣ）から補正されたアッセイ結果（Ｔc）を決定するのに有用な装置によって特徴づけられる。この装置は上記のパラグラフに記載の方法を実施するのに有用である。
【００９９】
前述のように、本発明の好ましい態様は、測定されたアッセイ結果を補正するのに有用な方法、コンピュータープログラム化可能媒体および装置において使用するここに記載のシグナル測定値とＩＡＣ測定値の利用に関する。
【０１００】
装置を利用することによるアッセイ測定値の補正
本発明は、装置内におけるＩＡＣの測定によってアッセイ測定値を補正する方法にも関する。ここに規定される調整する方法、装置およびキットはいずれもアッセイ測定値の補正に利用することができる。ＩＡＣと調整する方法、装置およびキットのいずれの組合せも併用もしくは単独使用することができ。例えば、シグナルの調整に有用な装置および流速の監視によってアッセイ測定値を補正するのに有用な装置は１つの装置として存在することができ、あるいはアッセイ測定値の補正に有用な１つの装置内に組み込むことができる。
【０１０１】
本発明の態様は、装置内の光学的装置によってアッセイシグナルおよび／またはＩＡＣシグナルを測定できる装置に関する。光学的装置は共係属中のブエチュラーらによる米国特許出願（発明の名称：イムノアッセイ用蛍光計、出願日：１９９７年１２月３１日、代理人の書類整理番号：２３０／００４）の明細書に記載されている。媒体キャリヤーはここに記載のコンピュータープログラム化可能媒体を含んでいてもよい。
【０１０２】
従って、本発明は次の機能（ｉ）〜（iv）を有する装置にも関する：（ｉ）アッセイ装置内においてアッセイシグナルを測定し、（ii）ここに記載の１もしくは複数のＩＡＣシグナルを測定し、（iii）該シグナルを調整し、および（iv）１もしくは複数のＩＡＣシグナルの利用によってアッセイ結果を補正する。アッセイシグナルと１もしくは複数のＩＡＣシグナルは装置の光学的要素を用いて測定することができ、また、該シグナルは装置のプロセッサーもしくはコプロセッサーによって調整することができる。プロセッサーもしくはコプロセッサーは１もしくは複数のＩＡＣシグナルに応じてアッセイ測定値を補正することができる。装置のプロセッサーもしくはコプロセッサーは１もしくは複数の媒体キャリヤーと共同して作動する。
上記の本発明の概要は制限的なものではなく、本発明の特徴と利点は好ましい態様に関する以下の詳細な説明によって明らかにする。
【０１０３】
（図面の簡単な説明）
特定の図面は本発明の特定の態様に関するシグナル測定を例示する。図１は積分されたＣＫＭＢアッセイシグナの時間依存性プロフィールを示す。図２は積分されたトロポニンＩアッセイシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図３は積分されたミオグロビンアッセイシグナルの時間依存性プロフィールを示す。
【０１０４】
別の図面は本発明によるＩＡＣの特定の態様を示す。図４は積分されたタイムゲートＩＡＣシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図５は積分された流動ＩＡＣシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図６は積分された非特異的結合ＩＡＣシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図７は調時ＩＡＣシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図８はヒトの絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に関するＩＡＣシグナルの時間依存性プロフィールを示す。図９は正規化されたｈＣＧアッセイシグナルの時間依存性プロフィールを示す。
【０１０５】
また、さらに別の図面は、本発明によるシグナル処理ＩＡＣの態様を示す。図１０はアッセイ装置の診断用レーン内における特異的時間ゾーンを示す。図１１はアッセイ装置の診断用レーン内におけるゾーンの決定と確認を示す。図１２は二方向性濾過機能の効果を示す。図１３は時間定数の関数としての濾過効果を示す。図１４は放物線状適合機能の関数としての濾過効果を示す。図１５は最大許容変化速度関数としての濾過効果を示す。図１６は拒絶ゾーンに関する濾過効果を示す。図１７は二次導関数解析に関する濾過効果を示す。これらの全ての態様においては以下において詳述する。
【０１０６】
本発明の種々の態様はコンピューターのハードウェアおよび／またはソフトウェアを用いて実施してもよく、あるいはコンピューターシステムまたは他の処理システム内で実施してもよい。コンピューターシステムの一例を図１８に示す。
【０１０７】
発明の詳細な説明
本発明は、独立アッセイコントロール（ＩＡＣ）を利用する新規方法に関する。ＩＡＣは、アッセイ装置におけるイムノアッセイの状態を明らかにするための装置と光学的な通信を行う。ＩＡＣは、アッセイ装置における特異的で独立した結合現象であるイムノアッセイの視覚化および解釈に関し、およびそれらは非特異的な結合現象に関連しうる全アッセイ装置蛍光の視覚化および解釈に関しうる。ある具体例において、ＩＡＣは、アッセイ装置におけるイムノアッセイの状態および完了時を明らかにするために用いられる。もう一つの具体例において、ＩＡＣは、アッセイシグナルのゾーンと特性を明らかにする。さらにもう一つの具体例において、ＩＡＣは、アッセイ装置における試料マトリックス差および試料流速の関数としてのアッセイシグナルの修正の目的ために、アッセイシグナルを再評価する。
【０１０８】
ＩＡＣは、アッセイ装置によって実施されるイムノアッセイである。予測不能な被検体シグナルの大きさと異なり、ＩＡＣシグナルの大きさは、製造者によって設定された所定の範囲内で予測可能である。ＩＡＣの新規特徴は、それが被検体の存在または量によって左右されないが、試料のマトリックスおよびアッセイ装置におけるイムノアッセイの進行に従属することである。被検体アッセイから独立であるＩＡＣの性質は、試料マトリックスに従属しうる被検体アッセイシグナルを較正することと共に、蛍光シグナルの形状および大きさを明確にすることによって、誤り無くイムノアッセイプロセスが行われたことを確認する使用態様を可能にする。
【０１０９】
本発明は、被検体濃度の正確で信頼性のある測定のためのＩＡＣの使用に関する。通常、被検体はイムノアッセイに関する方法を用いて測定される。イムノアッセイが非競合および競合形態で実施されること、ならびに本明細書に記載の発明の教示をこれらの形態に適用できるが、単にこれらの形態に限定されるものではないことは、当業者に理解されよう。例えば、米国特許第5,028,535号および5,089,391号は、被検体濃度の作用としてのシグナル発生に関する閾値応答を含むイムノアッセイの形態を教示し、ならびにこの方法論はＩＡＣ方法論とともに利用することができる。当該方法は、例えば、試薬の横の流れと試薬の固相への連続的な結合を含むアッセイ装置、ならびに米国特許第5,458,852号および同時係属米国特許出願出願番号08/458,276、Nowakowskiら、「リガンドレセプター法用の装置（Devices for Ligand Receptors Methods）」1995年１月27日出願、代理人整理番号214/169；米国特許出願出願番号08/065,528、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents Without Membranes）」1992年５月21日出願、代理人整理番号202/108；米国特許出願出願番号08/447,895、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents Without Membranes）」1995年５月23日出願、代理人整理番号213/224；米国特許出願出願番号08/447,981、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents Without Membranes）」1995年５月23日出願、代理人整理番号213/225；米国特許出願出願番号08/810,569、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents Without Membranes）」1997年２月28日出願、代理人整理番号224/098；米国特許出願出願番号08/828,041、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents Without Membranes）」1997年５月27日出願、代理人整理番号225/104；（すべての図、表および図面を含むこれらの特許出願のすべての記載内容も本明細書の一部を成す）に記載されている装置などを利用する。当業者は、本明細書に記載する発明の教示により、他のアッセイ装置および装置もまたこれらの新規方法を利用できることを理解するであろう。
【０１１０】
ＩＡＣを含む試薬を、イムノアッセイ装置におけるイムノアッセイ状態認識情報を与えるようにデザインする。当業者が抗体／抗原結合反応として認識するように、当該試薬を対にしてイムノアッセイの結果としての結合反応を生じさせる。ＩＡＣを含む試薬は結合タンパク質、例えば、タンパク質、ペプチド、リガンドおよびリガンド類似体に特異的に結合する抗体および結合フラグメント等であってよい。当該試薬は溶液であってもよく、固相に結合していてもよい。当該試薬を修飾して、抗体が別の抗体またはタンパク質に結合しているリガンドに結合できるようにしてもよい。アッセイプロセスの結果として、少なくとも２つのリガンドが溶液中もしくは固相上またはこれら両方で結合する。ＩＡＣの試薬のうちの少なくとも１つを、アッセイプロセスの結果として直接的または間接的に標識に結合させる。結合は、共有結合、静電的相互作用または疎水的相互作用を介して形成させることができ、当業者はこれらの技術に精通している。標識は、色素、蛍光色素、コロイドゾル、電気的および／または磁気的シグナルを発生する分子、ならびに分子を色素またはアッセイプロセスの結果として電荷を帯びる試薬へ変化させる酵素であってよい。好ましい具体例においては、標識は蛍光染色を含む。特に好ましい具体例では、上記蛍光色素を粒子に吸収させ、または結合させ、および、それらは約６７０ｎｍで励起され、７６０ｎｍで発光する。例えば、ヨーロッパ特許出願94931287.0、Buechlerら、「新規化合物を用いる粒子内の蛍光エネルギー移動および分子内エネルギー移動（Fluorescence Energy Transfer and Intramolecular energy transfer in particles using novel compouds）」1994年９月23日出願、代理人整理番号209/202；米国特許出願番号08/601,492、Buechler、「粒子内の蛍光エネルギー移動（Fluorescence Energy Transfer in Particles）」1996年２月14日出願、代理人整理番号218/224；米国特許出願番号08/274,534、Buechlerら、「粒子内の蛍光エネルギー移動（Fluorescence Energy Transfer in Particles）」1994年７月12日出願、代理人整理番号208/193；および米国特許出願番号08/311,098、Buechlerら、「新規化合物を用いる粒子内の蛍光エネルギー移動および分子内エネルギー移動（Fluorescence Energy Transfer and Intramolecular Energy Transfer in Particles Using Novel Compouds）」1994年９月23日出願、代理人整理番号209/202；（すべての図、表および図面を含むこれらの特許出願のすべての記載内容も本明細書の一部を成す）を参照。本発明にとって有用な粒子の大きさは、約２ｎｍ〜４０００ｎｍの間で様々であり、好ましくは約５０ｎｍ〜３００ｎｍである。酵素を利用して分子を標識へ変換する場合に、異好性の架橋試薬を用いて酵素と、例えば抗体との結合体を作ることができることは、当業者に明らかである。
【０１１１】
本発明の重要な観点は、ＩＡＣ試薬が、お互いに分離または独立して結合体上に存在し、および被検体アッセイの実施に用いる試薬から分離または独立した結合体上に存在することである。この重大な機能は、ＩＡＣ試薬が被検体アッセイ試薬から独立であることを可能にし、当該アッセイにおける被検体の濃度が、ＩＡＣによって明らかになるアッセイの認識結果に影響を与えないようにする。さらに、ＩＡＣ結合体の分離は、様々な機能を有し、各々が互いに独立し、装置内、詳細には試薬が横の形式で移動し、標識化結合体の固相への結合が連続的な方式で生じる装置内でのイムノアッセイの状態を明らかにするコントロール開発への新規アプローチを可能にする。例えば、被検体アッセイについて異なるダイナミックレンジを必要としうるので、ＩＡＣ結合体およびアッセイ結合体は分離している。例えば、ミオグロビンについてのアッセイ装置のアッセイダイナミックレンジは０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、クレアチンキナーゼは０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、および高い感度を必要とするトロポニンは０〜１０ｎｇ／ｍｌである。これらのアッセイの各々の実質的に異なるダイナミックレンジにより、例えば、異なる粒子サイズを用いることが必要になる。ミオグロビンのような大きなダイナミックレンジのアッセイでは、小さいが多数の粒子を使用し、トロポニンにように高い感度を必要とするより短いダイナミックレンジのアッセイでは、より大きくより少数の粒子を使用する。イムノアッセイのデザインへの当該アプローチおよび様々な特異的活性を有する酵素結合体の使用も様々なダイナミックレンジのアッセイをつくることは、当業者に明らかである。したがって、被検体についてのイムノアッセイデザインの制約により、ＩＡＣおよびアッセイ結合体は、干渉を防止するために分離していなければならない。ＩＡＣの多様性およびＩＡＣとアッセイ試薬との結合の分離の必要性のもう一つの例においては、被検体イムノアッセイ、およびアッセイ試薬の横の移動によって装置内で作用するＩＡＣは、潜在的にお互いに干渉しうる。例えば、上流の結合現象は試薬の全部または一部を除去するので、診断レーン内の下流の固相への標識の結合から上流の固相ゾーンへの標識の結合は、下流の結合のシグナルに影響を与えうる。したがって、上流の結合現象は、下流の結合現象に影響し、予測不能な被検体アッセイまたはＩＡＣ結果の原因となる。本明細書に記載する新規方法は、ＩＡＣおよび被検体アッセイ試薬が、お互いの結合および固相へのアッセイ試薬の結合から分離し、かつ独立していることを提供する。換言すれば、横の流れの装置において被検体アッセイおよびＩＡＣの双方について再現可能で予測可能なシグナルが生じることを可能にする。
【０１１２】
ＩＡＣはアッセイ装置において作用し、装置と通信する。好ましい具体例において、当該装置は、アッセイ装置からの光学シグナルを測定するための手段を有し、光学シグナルを電気シグナルへ変換する移動式のバッテリー電源の蛍光計である。好ましい具体例において、当該装置は、約６７０ｎｍで発光するレーザーダイオードとシリコンフォトダイオードをそれぞれ励起源および検出器として使用する。当該装置はまた、上記ＩＡＣからの情報を利用するかどうかに関わらず、１以上の被検体の存在または濃度の測定および計算を可能にし、外部のデータシステムとのインターフェース接続を可能にする様々な慣用の保存手段も有する。好ましい装置は、「イムノアッセイ蛍光計（Immunoassay Fluorometer）」という発明の名称の同時係属米国特許出願、Beuchlerら、1997年12月31日出願、代理人整理番号230/003、および「アッセイ装置用媒体担体（Media Carrier for an Assay Device）」という発明の名称の同時係属米国特許出願、Beuchlerら、1997年12月31日出願、代理人整理番号230/004（これらの特許出願の記載内容も本明細書の一部を成す）に記載されている。光吸収化合物すなわち標識の反射率と吸光度を測定するための手段を有する装置を、本明細書に記載の発明の教示の実施において用いることもできることは、当業者はに理解されよう。
【０１１３】
好ましい具体例において、アッセイ装置は、ＩＡＣに特異的および非特異的な結合現象ならびに１以上の被検体の存在または濃度の測定のためのイムノアッセイをなす。当該イムノアッセイ装置は、ＩＡＣ用および被検体測定用の試薬を含む。通常、当該イムノアッセイ装置は、ユーザーが１以上の試料を１または複数の装置に適用するワンステップ装置であり、イムノアッセイプロセスは当該装置内で行われる。試料は、流体移動用の推進力として毛細管現象を利用し、ユーザーインターフェースを用いない横の形式で上記装置を通って流れる。この好ましい具体例において、通常、上記アッセイ装置は、アッセイプロセスの結果として蛍光標識を当該装置の非吸湿性表面へ結合させる。アッセイプロセスの結果としての様々な標識の結合が、例えば膜および紙などの吸湿性の支持体上でも起りうることは、当業者に理解されよう。好ましい具体例において、イムノアッセイプロセスの結果としての表面への標識の結合は、アッセイ装置の診断レーンの１または複数のゾーンで起りうる。通常、イムノアッセイ装置は、アッセイプロセスの試薬を入れるかまたは載せる区画室または室（chamber）および診断レーンを有する。好ましい具体例において、反応混合物の容量を定める反応室には、ＩＡＣ試薬および被検体特異的アッセイ試薬、例えば蛍光抗体結合体が入っている。吸湿性の支持体を有さないアッセイ装置では、毛細現象の推進力は、毛細管空間をつくる表面の質、および２つの表面（基部と蓋）の近接度によって定まる。したがって、反応室はＩＡＣ試薬および被検体アッセイ試薬を載せることができる２つの表面を有する。膜のような吸湿性の支持体を有するアッセイ装置では、流体の流れのための毛細現象の推進力は、通常、膜の孔の大きさによって定まる。診断レーンは、アッセイプロセスの結果として１以上の別々のゾーンに標識を結合させるアッセイ装置における手段である。
【０１１４】
好ましい具体例においては、イムノアッセイプロセスは試料のアッセイ装置への添加を含み、ここで、試料は、プラズマからの細胞の濾過もしくは細片の濾過による除去または細胞の溶解の各々の目的用のフィルターまたは網を通って流れる。試料の一部は反応室へ流入し、アッセイ試薬と結合して反応混合物を形成する。通常、当該反応混合物を一定時間（一般的に約３０秒〜約５０分）インキュベートし、反応物を実質的な平衡に至らせる。ついで、当該反応物を続けて横の形式で流し、診断レーンの固相上の１以上の別々のゾーンを通過させ、これにより、アッセイプロセスの結果として、反応混合物中の標識は当該１以上のゾーンに結合する。反応混合物の後で流れる余分の試料は、固相へ結合しなかった標識を除去する洗浄剤として作用する。当該ゾーン（単数または複数）中の固相へ結合している被検体結合体由来およびＩＡＣ結合体由来の標識の範囲と程度は、それぞれ、試料中の被検体濃度および流体力学、インキュベーション時間、反応混合物の均一性および試料マトリクスの指標となりうる。計測装置内にアッセイ装置を置き、標識の固相への結合の結果生じる光エネルギーを測定することによって、被検体濃度およびＩＡＣ強度を定量する。
【０１１５】
反応室内のＩＡＣ試薬の近接は、標識の非特異的結合、流体力学、インキュベーション時間、反応混合物の均一性およびアッセイ試料のマトリックスに関する作用を規定してモニターする。
好ましい具体例においては、非特異的結合コントロールＩＡＣを装置に入れる。この機能を非特異的結合コントロールという。非特異的結合コントロールは装置内および診断レーン上のゾーン（単数または複数）内の標識の全レパートリーを含む。診断レーン上のゾーン（単数または複数）は、特異的には標識を結合しないが非特異的結合現象を通じて標識を結合する抗体もしくは装置表面またはそれら両方を含みうる。当業者は非特異的結合現象を熟知している。したがって、非特異的結合コントロールＩＡＣは、標識の固相への非特異的結合の程度をモニターし、試料マトリックスによる問題を同定する。例えば、試料中の異好性抗体の存在は標識抗体結合体を架橋して他の抗体へ変化させ、また、この非特異的結合現象は、アッセイ装置の固相ゾーンへ結合する標識の増加の原因となりうる。
【０１１６】
好ましい具体例においては、流量コントロールＩＡＣを装置に入れる。この機能を流量コントロールという。当該流量コントロールＩＡＣは、タンパク質、抗体、リガンド、ペプチドまたはリガンド類似体が結合する標識を含み、アッセイ試薬と共に反応室の基部または蓋に置くことができる。流量コントロールＩＡＣ試薬は反応室内で試料により復元され、最終的に診断レーンの固相に結合する。固相試薬は、結合が生じるように、流量コントロール標識上の試薬と相補的である。例えば、リガンドアナログを標識に結合させ、当該リガンドアナログに対する抗体を固相に結合させる。流量コントロールＩＡＣは、最終的に診断レーンの毛細管内の反応混合物の流速を示す。流量コントロール用の好ましい試薬は抗体、リガンドまたはリガンド類似体が結合している直径５０ｎｍ〜３００ｎｍの蛍光粒子である。固相試薬は、好ましくはそれぞれリガンド、リガンド類似体または抗体である。試薬との様々な結合現象が結果として流量コントロールを定めることは、当業者に理解されよう。
【０１１７】
もう一つの好ましい具体例において、反応室内の反応混合物のインキュベーション時間は、ＩＡＣによってモニターされ、これを時間ゲートコントロールという。例えば、本具体例では、共有結合的に結合したリガンドまたはリガンド類似体を有する標識を反応室の基部に置き、標識のリガンドまたはリガンド類似体に結合する、共有結合的に結合しているタグを有する抗体を反応室の蓋に置く。標識化リガンド結合体を時間ゲートコントロール標識といい、抗体タグ結合体を時間ゲートコントロール抗体という。アッセイの結果として、試料が反応室へ流入すると、蓋および基部の試薬は試料によって復元され、蓋抗体と標識は互いに結合を開始する。ＩＡＣのこれらの２つの試薬の結合は、時間、それらの相対溶解速度およびそれらの相対拡散係数の関数である。これにより、結合の時間的要素により反応混合物のインキュベーション時間をモニターできる。したがって、この反応混合物中で形成されるものは抗体タグが結合している標識である。抗体のタグは最終的に診断レーンの固相上の抗体に結合し、標識からのシグナルの強度は反応室内の試薬のインキュベーション状態に関係する。時間ゲートコントロール用の好ましい標識は、直径５０ｎｍ〜３００ｎｍの蛍光粒子であり、抗体、リガンドまたはリガンド類似体が結合しているものである。インキュベーション中に標識に結合する好ましい相補的試薬は、抗体に相補的なリガンドまたはリガンドもしくはリガンド類似体に相補的な抗体を、それぞれ有するウシ血清アルブミンのようなタンパク質である。好ましいタグはリガンド、リガンド類似体、ペプチドなどである。溶液中および固相上の双方のリガンド、リガンド類似体、抗体およびペプチドの様々な組み合わせをつくり、時間ゲートコントロールを提供できることは、当業者に理解されるであろう。また、時間ゲートコントロール標識および時間ゲートコントロール抗体を装置内の複数の異なる位置に置くことができることも、当業者に理解されるであろう。例えば、時間ゲートコントロール抗体を、試料に加え、または反応室に入れる前に反応装置内（例えば試料内またはフィルター内のそれぞれ）に置くことができ、標識を反応室の基部および／または蓋に置くことができる。
【０１１８】
もう一つの好ましい具体例においては、リガンド類似体を有する標識およびタグ１を有する抗体１を反応室の基部に置き、タグ２を有する抗体２を蓋に置く。この好ましい具体例では、反応混合物の適合性は反応混合物の均一性に関し、基部および蓋上の試薬の相対的溶解に関連するように定められる。このコントロールを反応室コントロールという。当該試薬は反応室内で試料により復元され、試料が反応室へ流入する速度は当該試薬の相対的溶解に影響しうる。例えば、試料がゆっくりと反応室に流入する場合、反応室内への流入が速い場合と比較して、試料が前へ進むことによって、より多くの試薬が溶解する。したがって、蓋上および基部上の双方の試薬の相対的溶解は、溶解が反応室内への流入速度から独立するように最適化すべきである。しかし、実際には、この理想的な状況は常に実現可能ではない。したがって、蓋の抗体２−タグ２は、基部上の標識のリガンド類似体へ結合し、基部の抗体１−タグ１は蓋の抗体２−タグ２のタグ２に結合する。この結合配列は、反応混合物中で、蓋および基部試薬の溶解と一致する平衡に至る。基部抗体１のタグ１は最終的には診断レーンの固相上の抗体へ結合し、結果として標識が固相へ結合する。このＩＡＣの相対的シグナルは、したがって、反応室内の反応混合物の均一性に依存する。反応室コントロール用の好ましい試薬は直径５０ｎｍ〜３００ｎｍの蛍光粒子であり、抗体、リガンドまたはリガンド類似体が結合しているものである。好ましくは、溶液中および蓋上の標識を有する相補的コントロール試薬は、リガンドもしくはリガンド類似体が結合しているタンパク質またはリガンドもしくはリガンド類似体に相補的な抗体である。好ましくは、固相試薬はリガンド、リガンド類似体または抗体である。
【０１１９】
本発明の好ましい具体例はＩＡＣを利用して、アッセイ装置内のイムノアッセイの進行および終了時間を明らかにする。調時機能は、ユーザーがアッセイの進行に注意を払う必要が無い点で重要性を有する。病院の救急治療室では、例えば、看護婦が血液試料を装置に付し、当該装置を装置に挿入し、他の任務を行うために立ち去り、そして、例えば、当該装置が可聴音を出したときに当該装置のところへ戻ってきて、アッセイ結果を得ることができる。調時機能のもう一つの使用例は、アッセイシステムの未熟なオペレーターがアッセイの完了を決定できないことである。この場合、ＩＡＣが提供する調時機能は、当該装置にアッセイプロセスが完了した時を判断させる。
【０１２０】
調時機能の好ましい構成は、アッセイ完了の基準として、１以上のＩＡＣ、例えば、流量コントロールおよび／または時間ゲートコントロールのシグナル強度を用いることである。この具体例は、アッセイ装置への試料の添加によりイムノアッセイが始まるときに機能する。本発明のすべての具体例のように、試料は試薬、例えば、反応室内のアッセイ試薬およびＩＡＣ試薬を復元し、それらは実質的に結合平衡に達し、反応混合物は診断レーンを通って流れる。ＩＡＣは、診断レーンを通って横の形式で流れるので、ＩＡＣの別々のゾーン上のシグナル強度は増加する。ＩＡＣは、試料添加前に測定可能なシグナルを有するようにデザインすることもできる。これは、固相への適用前または適用時の可溶性標識のＩＡＣ溶液への添加によってなされる。反応混合物が診断レーンを通って流れる場合、ＩＡＣ中の標識は洗い出される。したがって、ＩＡＣシグナルは、アッセイプロセスの結果として生じる反応混合物によって標識が除去されるに従って減少する。すべての反応混合物が診断レーンを通って流れると、ＩＡＣ（および被検体アッセイ）の増加速度が予測可能な様式で減少する。
【０１２１】
調時機能の特に好ましい具体例においては、アッセイ装置上の１以上の別々に結合した標識の変化速度、すなわちシグナル強度の変化速度が、アッセイプロセスの完了の基準である。アッセイの完了を明らかにすることについての、診断レーン上の別々のゾーンへの標識結合の変化の絶対速度は経験的に達成される。
調時シグナル測定にとって特に好ましい装置上の位置は、診断レーンの末端である。この位置が特に好ましいのは、診断レーンの末端は最後に非結合標識が洗浄されるところだからである。したがって、診断レーンの末端に非結合標識が無くなったとき、診断レーンの始まり、すなわち反応室の最も近くにも非結合標識は存在しない。
【０１２２】
調時機能のもう一つの特に好ましい具体例では、アッセイ装置の１以上のゾーンの診断レーンにおけるすべての標識の負の速度変化が、アッセイプロセス完了の基準である。アッセイ完了についての標識の負の変化速度の調時機能による採用は、アッセイの感度の要求性に関する。すなわち、シグナルの高い変化速度は、アッセイプロセスがいまだ行われていることを示すが、アッセイの適用によっては、許容される応答についてアッセイが７５％のみ完了していることが必要とされうる。換言すれば、シグナルの負の遅い変化速度は、アッセイプロセスが完了または完了間近であることを示し、この状況は、極めて高感度で正確な結果が必要な場合に好適でありうる。シグナルの負の変化速度は、標識の洗い流しが完了に近づくにつれて、０に近づく。本発明の多くの適用においておよび実際に、負の変化速度は０でない数であってよく、この０で無い数は、標識の大多数が診断レーンから洗い出されている状況に関連する。最も厳密な意味において洗い出しが完了したときに、負の変化速度は０になる。
【０１２３】
調時機能の好ましい具体例は、１以上の別々のレーン内の１以上の絶対的シグナル強度とシグナルの負の変化速度も測定する。この具体例が重要なのは、試料が添加されなかったアッセイ装置を試料が添加されたアッセイ装置から区別するように装置をプログラムしなければならないからである。試料がアッセイ装置へ添加されない場合には、調時機能の間、装置によって測定される標識の変化速度は０であり、装置は、この結果が、アッセイは開始されなかったが、アッセイは完了したことを意味すると判断できる。さらに、装置に試料が添加され、シグナルが最大値に達した場合、すなわち、装置が診断レーンから標識を洗い出しておらず、イムノアッセイが完了していない場合も、シグナルの変化速度は０に達しうる。したがって、装置は、標識の変化速度の詳述に関わらず、さらに明確なシグナルの達成を詳述することにより、試料がアッセイ装置に添加されていないことを確かめなければならない。この明確なシグナルは一定の範囲内に予測可能である。その範囲内の最大のシグナルは、全標識測定によって得られるものであり、最小のシグナルは装置への非特異的または特異的結合によって定まる。アッセイ完了を明確にするために用いるシグナルは、標識が診断レーンに流れなかった場合に得られたシグナルより大きく、また、すべての標識が診断レーンから洗い出された場合の典型的な非特異的結合シグナルから得られる予定値より大きくなるように選択する。したがって、アッセイ装置のアッセイ完了を明確にする基準は、実験に基づいて得られる。
【０１２４】
アッセイシグナル測定のきっかけについての、シグナルの測定において観察される複雑さは、単一の装置における非特異的結合シグナルの多様性である。本明細書に記載する新規な教示内容はこの複雑さを未然に防止する。例えば、試料マトリックスの変化性および診断レーンの表面の欠陥により、バックグラウンドに対するシグナル比は潜在的に診断レーンにおける所定のレーンで望まれるものよりも高くまたは低く定められうる。その結果、被検体アッセイゾーンの測定のきっかけとなる調時機能による絶対的なシグナルの分析は、ある形式のシグナル平均化を含まなければならない。緩やかに変化する関数においてノイズを軽減させる多くの方法があることは、当業者に理解されよう。最も単純な方法の一つは、各点をその周辺のＮ点の平均と置き換えるＮ点平滑化機能を用いることである。Ｎ点平滑化を用いても、目的の速度変化が実際に起る前に、安定性基準を満たす２つの連続点が到達すると考えられる。この潜在的な間違ったきっかけの確立は、安定性基準を満たす列内の所定の数の平滑化点を要求することにより、許容されるレベルまで減少されうる。
【０１２５】
好ましい具体例において、安定性基準は、負の１次微分係数と正の２次微分係数の必要性を含む。これは、最小のシグナルではなく局所的な最大値が測定されている場合の早すぎるきっかけを防止する。これらの微分係数の基準は、すべてのシグナルが装置を通って流れた後で、装置によって上記装置を測定する場合、１次微分係数と２次微分係数はともに０、正および負の装置ノイズであり、したがって、この状態は統計学的に起り得ないものになるという、問題がある。これにより、安定性基準に至る時間が増える。典型的には、当該シグナルレベルは高い閾値よりもずっと低いので、この状態は認識可能である。好ましい具体例においては、シグナルが高い閾値の下のいくらかの部分である場合、傾斜基準を無視する。
【０１２６】
調時機能の重要な態様は、装置が正しく動作していないことを認識し、ユーザーに警告することである。所定の時間内に流れるべき試料と到達すべき安定性とを必要とするタイムアウトが含まれる。
好ましい具体例においては、プログラミング可能な使用サイクルを含む。これにより、必要な電力が減少し、バッテリーの寿命が延びる。
調時コントロール用の好ましい試薬は直径５０ｎｍ〜３００ｎｍの蛍光粒子であり、抗体、リガンドまたはリガンド類似体が結合しているものである。固相試薬は、好ましくはそれぞれリガンド、リガンド類似体または抗体である。特に好ましい調時コントロール用試薬は、アッセイ装置内の全蛍光標識を含む。
【０１２７】
本発明のもう一つの好ましい具体例においては、ＩＡＣが積分したシグナルの形を明確にする。シグナルの上昇および下降機能の勾配が、装置が被検体ゾーンを測定して被検体の濃度を決定する重要なパラメーターを定める点で、積分したシグナルの形の明確化は重要である。積分したシグナルの形は重要であり、シグナルの測定に関する機械装置、例えば、光学的構成部分（optics）または光学的構成部分周辺のアッセイ装置の移動手段などの問題、およびアッセイ装置に関する問題を明らかにできる。例えば、標識を固相へ結合させる手段、例えば抗体、を目的よりも小さいかまたは大きい面積で装置表面に適用する場合、積分したシグナルは、それぞれ、より小さいかまたは大きい値を有し、誤った結果になる。ＩＡＣは、ゾーンの積分したシグナルの正しくない形を明らかにし、ユーザーに、アッセイ結果に信頼性がないことを明らかにするエラーメッセージを与える。時間と空間にわたって測定を行うシステムでは、アッセイについての質の制御（ＱＣ）の方法として測定された挙動を用いて予想されるアッセイの挙動を利用できる。シグナルの特性によって定められたように、予期される挙動から実質的に逸脱するあらゆるアッセイを棄却し、予期される挙動に合致するアッセイを受け入れる。この新規ＱＣ工程は、アッセイの信頼性を向上させる。実際に、最も大きく適切に機能するアッセイに依存する挙動を同定しなければならない。アッセイを長時間測定する場合、時間の関数としてのシグナル応答が測定されうる。１以上の次元でアッセイを行う場合、目的の領域内の特徴的な形を探すべきである。このタイプの分析は、照合フィルター分析と類似する。
【０１２８】
好ましい具体例においては、診断レーンに沿った位置の関数としての応答が測定される。目的の各ゾーンの特徴的な形および位置ならびにゾーン間のあらゆる関係は、アッセイ装置の製造方法によって決まる。あらゆる所定のアッセイまたは装置においてアッセイが進行するときのＩＡＣゾーンで予期される最大の変化速度もまた、アッセイ装置の製造方法、当該装置およびアッセイのデザインによって定まり、予期された結果からの測定結果のあらゆる偏差は、装置の不調により説明される。通常の組み合わせの高域、低域、およびノッチフィルターを用いてデータをフィルター処理し、曲線の部分を特有の関数に合致させ、または、あらゆるタイプの新型のデジタルアルゴリズムを用いることができる。これらのタイプのフィルター処理は、誤作動のような望まない性質を除去する。このタイプのフィルター処理は、局所的な質の保証のチェックをなし、結果の正確さの改良を助ける点で、最も有益である。当該フィルタリングはアッセイのバックグラウンドに対して許容される最大のシグナルの範囲内のシグナルにのみ適用されることを確かめ、内部の質の保証のチェックとしてバックグラウンドに対する当該シグナルを利用することができる。蛍光シグナルの形を定める好ましい組成物は、流量コントロール試薬、時間ゲート試薬、反応室コントロール試薬、アッセイ試薬またはこれらの試薬の組み合わせである。
【０１２９】
本発明のもう一つの好ましい具体例においては、ＩＡＣにより、アッセイ装置の積分された蛍光のゾーンの位置が明らかになり、確認される。アッセイゾーンの位置はアッセイシグナルの正確な測定にとって極めて重要である。例えば、アッセイ装置の製造においては、標識結合用の固相試薬を別個のゾーンの装置へ適用する場合、装置上への試薬の置き違えは誤った結果の原因となりうる。もう一つの例においては、アッセイシグナル測定用光学的ブロックの下のアッセイ装置を動かすモーターの伝動装置がスリップし、装置の読み取る絶対的位置が別々のゾーンに結合した標識と一致しなくなりうる。このモデルもまた誤った結果の原因となる。ＩＡＣはこれらの潜在的な問題を明らかにし、装置は、積分したシグナルの予期しない位置に応答してエラーメッセージを与える。エラーシグナルは、ユーザーにその結果を信用すべきでないことを通知する。積分した蛍光シグナルのゾーンの位置を明らかにし、および確認する好ましい組成物は、流量コントロール試薬、時間ゲートコントロール試薬、反応室コントロール試薬またはこれらの試薬の組み合わせである。
【０１３０】
もう一つの好ましい具体例においては、試料マトリックスの相違、外部および内部の混乱、インキュベーション時間の変化、アッセイ装置の試料流速の作用としてのアッセイシグナル補正目的のため、ＩＡＣにより、被検体のアッセイシグナルを再評価する。例えば、血液、溶血血液、血漿、血清および尿などにおいてみられるような粘性または不均一な試料において直接実施するイムノアッセイの開発においては、流速、結合効率および結合干渉などに遭遇する。これらの遭遇の結果、事実上、各試料は相違し、この相違はアッセイ結果の異常性の原因となりうる。例えば、溶血全血試料におけるイムノアッセイの実施においては、当該試料の粘性は血液試料の赤血球容積率に依存して異なる。試料粘性の増加は、アッセイ装置の毛細管内での試料流体の流れをより遅くする。毛細管内の流速が低下し、流体が結合ゾーンを通過する際に結合反応が起るにつれて、試料はより長い時間結合部位近辺にとどまるので、固相への結合速度は増加する。このモデルは、結果として予想よりも大きなアッセイシグナルを生じ、被検体濃度の計算は誤りになる。さらに、試料の粘性が増加するにつれて、拡散速度が低下する。拡散速度の低下は平衡結合への到達に要する時間を増加させる。装置が分析物を測定するときに平衡になるようにイムノアッセイをデザインし、アッセイが平衡に至らなかった場合、アッセイの結果は誤りとなりうる。もう一つの例においては、例えば、患者の血液に異好性抗体が存在するときに観察されるように、イムノアッセイの結合反応物に結合し、または何らかの方法で影響を与える構成成分を試料が含む場合、イムノアッセイプロセスを台無しにする可能性があり、アッセイ結果は誤りとなりうる。本具体例におけるＩＡＣの役割は、ＩＡＣの変化に基づくアッセイシグナルの補正である。さらに、特に固相への非特異的結合成分が異常である場合、ＩＡＣは結果として、ユーザーにエラーメッセージを報告できる。アッセイシグナルの補正の目的のためにアッセイシグナルを再評価する好ましい試薬の構成は、非特異的結合コントロール試薬、流量コントロール試薬、時間ゲートコントロール試薬、反応室コントロール試薬またはこれらの試薬の組み合わせである。
【０１３１】
さらに本発明のもう一つの好ましい具体例においては、ＩＡＣの平均値からの偏差を用いてアッセイを補正し、同一のまたは異なる試料を使用する別々のアッセイ装置におけるアッセイ結果の不正確さを改善する。例えば、血液試料の赤血球容積率の変化は、当該試料の粘性に影響を与え、その結果、横の流れの装置における流れの性質に影響を与える。この具体例は、ＩＡＣの平均シグナル強度および当該平均からの偏差の程度の推定に関連する。本発明の特徴は、ＩＡＣの予測値からの偏差を利用して、値をアッセイ結果へ返還する方法を教示することである。
本発明のもう一つの好ましい具体例においては、少なくとも２つの同一のＩＡＣシグナルの比の平均値からの偏差を用いて、予測可能なイムノアッセイが実施され、高い確率の範囲内でイムノアッセイの結果が信頼できることが確認される。
【０１３２】
本発明のさらにもう一つの好ましい具体例においては、複数のＩＡＣの平均値からの偏差を用いて、アッセイを補正し、同じか、または異なる試料を用いる異なるアッセイ装置におけるアッセイ結果の不正確さを改善できる。好ましい具体例においては、ＩＡＣの偏差は他のＩＡＣの偏差によって影響を受けてもよい。例えば、１つは主に装置の流速に感受性であり、また１つは装置のインキュベーション時間に感受性である、２つのＩＡＣが装置に存在してもよい。この具体例は、各ＩＡＣの結果が他方の結果によって影響を受ける場合にも、同時に両方のコントロールを利用する方法を教示する。この教示は線形代数学の原理による。
【０１３３】
原則的に、アッセイシステムは、試料の不均一性、物質の干渉などの多くの因子によって乱される可能性があり、またアッセイに影響する各変動についてＩＡＣを開発することが好ましい。この理想的な場合では、当該ＩＡＣは独立である、または直交であるといわれる。より一般的には、当該ＩＡＣは、相互に依存していてもよいが、それらは相違するので、それらは変動に対して別個に異なるパラメーターで応答すると考えられ、その結果一次独立であるといわれる。この仮定が正しくない場合、当該コントロールは同じ情報を与える。線形代数学の関係において、このことは、当該コントロールが、アッセイに影響するそのパラメーターについての基底を形成することを意味する。例えば、診断レーンにおける流速の変化は、流量コントロールと同様に時間ゲートコントロールの値にも影響を与えうる。当該コントロールは従属であるが、その２つの組み合わせは流速および時間ゲート時間の固有の作図を与え、したがって両コントロールを用いて当該結果を正規化する。
【０１３４】
ＩＡＣシグナルによるアッセイシグナルの正規化の特に好ましい具体例は、アッセイの変化性の原因を同定する必要が無く、またはＩＡＣは起りうる各変動について存在することを教示する。例えば、上記の場合において、流量と時間ゲート時間は２つの重要な変数である。しかし、これらは実際に他のパラメーターに感受性でありうるコントロールに与えられる標識にすぎない。この好ましい具体例においてＩＡＣを利用するために、アッセイ結果に影響を与えるｎ個のパラメーターおよびこれらのパラメーターについての一次独立性のコントロールがあると仮定する。与えられた試料について、多くのアッセイの平均は、コントロール（Ｃave）およびアッセイ（Ｔave）について平均値の期待値を定める。アッセイ結果に影響を与える、あるパラメータ、Ｐの具体例において、測定コントロール値（Ｃm）は期待コントロール値と当該パラメーターの変動に比例する項の和に等しく、以下のように記載される：
Ｃm＝Ｃave＋αδＰ                                  式ｊ１
したがって、試験の測定値は以下のように記載できる：
Ｔm＝Ｔave＋β’δＰ                                式ｊ２
【０１３５】
以下の解析においては、αおよびβ’はδＰの関数ではないと仮定する。これは、δＰが小さい場合に有効な仮定である。αおよびβ’はＰ値に関数従属性を有しうる。以下は、Ｐに関して関数の型を与える様々な値のＰ近傍の小さな変動に適応できる。当該パラメーターの変動が小さい場合、αおよびβ’は、当該パラメーターに関する試験およびコントロールの微分係数を表す定数である（ｄＣ／ｄＰおよびｄＴ／ｄＰ）。これらの式はより単純に書くことができ：
δＣ＝αδＰ                                          式ｊ３
δＴ＝β’δＰ                                        式ｊ４
および、結合させると以下の形になる：
δＴ＝（β’／α）δＣ＝βδＣ                        式ｊ５
これより、βが得られ、これは実験に基づいて容易になされる。当該パラメーターについて、さらなる同定および解釈の必要はない。ｎ個のパラメーター、Ｐ、およびｎ個のコントロール、Ｃがある好ましい具体例では、以下の同様の式が書かれる：
δＣ＝αδＰ                                          式ｊ６
ここで、コントロール（δＣ）の変動およびパラメーター（δＰ）の変動はともにベクトルであり、一方、偏導関数（∂Ｃk／∂Ｐj）はｎ×ｎ行列（α）をつくる。各コントロールが純粋に１個のパラメーター関数である場合、α行列は対角である。コントロールが一次独立である場合、αの逆（行列）が存在する。
δＴ＝β’δＰ                                        式ｊ７
また、偏導関数（∂Ｔ／∂Ｐj）はｎ次元ベクトル（β’）をつくる。線形代数学から：
δＰ＝α-1δＣ                                        式ｊ８
と書くことができ、これより：
δＴ＝β’α-1δＣ＝βδＣ                            式ｊ９
と書くこともできる。式ｊ５に類似することを特記する。また、さらにαについて解く必要はなく、その代わりに実験に基づいてβを決定できる。本明細書に記載の発明の教示は、変化しているパラメーターについて同定し、または解く必要がないことを示す。式ｊ５およびｊ９を用いてアッセイ結果を補正し、およびβを決定することができる。アッセイ結果（Ｔm）を補正するために用いる場合、アッセイ結果の変動（δＴ）を測定アッセイ結果（Ｔm）と補正アッセイ結果（Ｔc）との間の差分として表現できる。補正アッセイ結果を決定するために、式ｊ９を：
Ｔc＝Ｔm−βδＣ                                    式ｊ９ａ
として表現することができる。
【０１３６】
βjを決定する多くの方法が存在するが、上記方法は上記の教示に影響を与えない。例えば、一つの方法は推量することである。これは時間がかかりうるが、コンピューターアルゴリズムがｎパラメーター空間を効率良く探索し、βjの最適値を発見することは、当業者に理解されよう。コントロールが互いに独立の場合、δＣｊに対するδＴの傾きから各βjが得られる。複雑だが、より一般的なアプローチにおいては、各βjは、コントロールの変動とアッセイの変動との間の相関を最大化し、アッセイ変動率の標準偏差を最小化することにより得られる。簡単で非常に一般的な方法を以下に記載する。このアプローチから得られるいくつかの重要で特別な場合の結果を含む。
【０１３７】
ＩＡＣの無作為変動を含む統計学的に有意な数のアッセイを実施することにより、実験に基づいてβ（βk）のｎ個の要素を決定できる。当該結果を平均して、テスト期待値（Ｔave）および各ＩＡＣについての期待値（Ｃk ave）を定める。各アッセイについて、試験の変動（δＴj）およびＩＡＣ（δＣki）の変動を容易に決定できる。式ｊ９を用いて、全装置を合計し（ｉによって表す）、ｎ個のＩＡＣのそれぞれについて書くことができる：
Σi（δＴiδＣki）＝Σi｛Σj（βjＴiδＣij）Ｃki｝
＝Σj（βjΣi｛δＣijδＣki｝）    式ｊ１０
式１０は、ｎ個の未知数（βの要素）を有するｎ個の式（ｎ個のＩＡＣについて）の系を定義する。式１０の形を単純化するために、対称行列Ｋを以下のように定義する：
Ｋjk＝Σi｛δＣijδＣki｝＝Ｋkj                      式ｊ１１
式ｊ１１を用いて、式ｊ１０を単純化して以下の２式で表す：
Σi（δＴiδＣi）＝Ｋβ                              式ｊ１２
β＝Ｋ-1Σi（δＴiδＣi）                            式ｊ１３
式ｊ１３は式ｊ１２で表す式の系の解を定義する。ｎ×ｎ行列の逆行列を得る方法は、線形代数学のあらゆる教科書に見出すことができる。例えば、「物理学における行列およびテンソル（Matrixes and Tensors in Physics）」（第２版）、A. W. Joshi、４７ページを参照。
【０１３８】
ＫjkがＩＡＣの変動によって表されるランダム分布の共分散であることは、当業者に理解されよう。２個のランダム変数の共分散の論文については、例えば、「確率分布：確率理論概論と応用（Probability Distributions: An Introduction to Probability Theory with Applications）」, 1972, C. P. Tsokos、367ページを参照。２個のランダム変数が独立の場合、共分散は０である。したがって、独立のコントロールについて、Ｋjk＝ｋjδjkすなわちＫは対角行列である。この特別の場合について、Ｋの逆（行列）は自明であり、式ｊ１３を以下のように書くことができる：
βj＝Σi（δＣijδＴi）／Σi（δＣij）2              式ｊ１４
当業者は、これを０切片の直線に適合する最小自乗法からの式として理解するであろう。換言すれば、コントロールが独立の場合、δＣjに対するδＴの傾き（すなわち∂Ｔ／∂Ｃj）はβjである。
【０１３９】
上記の教示において、試験（被検体アッセイ）の変動に対するコントロールの変動に関する行列（β）が、固有の試験値について得られるが、βは試験値の関数ではないと仮定した。試験値（Ｔ）へのβの関数の従属は、様々な試験値で上記のようにβを得ることにより実験に基づいて決定できる。
好ましい具体例において、βは被検体アッセイの大きさに比例して見出される。すなわち：
βj＝ΓjＴave                                        式ｊ１５
式ｊ１５を用いて、式ｊ９を：
Ｔm＝Ｔave＋ΣjβjδＣj＝Ｔave（１＋ΣjΓjδＣj）    式ｊ１６
または、
Ｔave＝Ｔm／（１＋ΣjΓjδＣj）                      式ｊ１７
式ｊ１７と１７．５（実施例１７参照）とは同一の式であることを特記する。１以上のＩＡＣが存在する場合（独立であるか従属であるかに関わらず）、式ｊ１７を用いてアッセイ結果を正規化でき、ここでコントロール変動に対する関係は、試験またはアッセイ結果の大きさに比例する。
１個のみのコントロールがある好ましい具体例では、式１５はそのままで、Γは１／Ｃaveに等しく、式ｊ１７は以下に変化する：
Ｔave＝Ｔm／（１＋（Ｃm−Ｃave）／Ｃave）
＝ＴmＣave／Ｃm                                式ｊ１８
【０１４０】
これは、試験（アッセイ）値がコントロール（ＩＡＣ）値に比例する単純な場合である。すなわち、コントロール値における２つのうちの１つの因子の変化は、コントロール（ＩＡＣ）における２つのうちの１つの因子の変化の結果を与える。これは、検体のアッセイにも影響を与える変動に対して独立に応答するＩＡＣである。ここで、アッセイおよびＩＡＣが比例して変化する場合、このタイプの正規化を用いることは、当業者に理解されよう。
上記の式において、ノイズがないシステムの理想化した場合を示す。ランダムノイズ項の付加が上記の方法に影響を与えないことは、当業者に理解されよう。このことは、ランダムノイズ（δＮ）が、定義より、平均が０の独立変数である事実から現われる。上記のように、独立変数の共分散も０なので、ランダムノイズおよびその他の変数を含むすべての項は０である。唯一残存する項はδＮ2である。ランダムノイズは他の変動に比べて小さくなけらばならないので（さもなければコントロール補正を適用する理由がない）、δＮ2は無視できる。換言すれば、上記の技法は、試験における変動を支配するパラメーターの変動がコントロールにおける支配的な変動であることを要する。コントロール変動と試験変動との間の相関関係の計算により、この条件について試験を行える。
【０１４１】
実施例
以下の実施例は、本発明のＩＡＣの具体例である。これらの実施例は、説明的な目的のみのためのものであり、いかなる方法でも本発明を制限しない。
実施例１：ウシ血清アルブミン結合体を含む蛍光エネルギー伝達ラテックス（FETL-BSA）および抗体結合体を含む蛍光エネルギー伝達ラテックス（FETL-AB）の調製
蛍光エネルギー伝達ラテックスを、米国特許出願 No. 08/409,298、1995年３月23日出願、に記載されているように、シリコンフタロシアニン  ビス（ジ−メチルヘキシル−ビニルシリルオキシド）およびシリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン］ジフタロシアニン  ビス（ジ−メチルヘキシルビニルシリルオキシド）を、それぞれドナーおよびアクセプター染色剤として、１モルのアクセプターに対して４モルのドナーの比で用いて調製した。ラテックス粒子は直径約２３０ｎｍであり、インターフェーシャル  ダイナミクス  コーポレーション（Interfacial Dynamics Corporation）から購入した。当業者にとって標準の技術を用いて、ＦＥＴＬ粒子にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または様々な抗体を吸収させた。別法として、異種２機能の架橋試薬を用い、また当業者にとって標準の技術も用いて、ＢＳＡまたは抗体を当該粒子に共有結合させた（ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰ、ピアス  ケミカル  カンパニー（Pierce Chemical Co.）より入手）。これらの方法はピアス  ケミカル  カンパニー（Pierce Chemical Co.）カタログ、1994年、T166頁およびT192頁、「均一ラテックス粒子（Uniform Latex Particles）」、セラディン  インコーポレーテッド（Seradyn Inc.）、第31-40頁および「微粒子試薬最適化（Microparticle Reagent Optimization）」、セラディン  インコーポレーテッド（Seradyn Inc.）、第91-97頁に記載されている。エッペンドルフ遠心分離機、５４１５Ｃ型の最高速度での遠心分離によって、非結合ＢＳＡをFETL-BSAから精製した。その結果得られた粒子を、１０ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭホウ酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝溶液ｐＨ７．０中で、固形物濃度約２％（ｗ／ｖ）で復元した。
【０１４２】
この形式で調製する抗体ＦＥＴＬ結合体は、流量コントロールＩＡＣ用に用いる抗−ダンシル−ＦＥＴＬ、それぞれトロポニンＩ、ＣＫＭＢおよびミオグロビン測定のためのイムノアッセイに用いる抗−トロポニンＩ、抗−ＣＫＭＢ、抗−ミオグロビンＦＥＴＬ、抗−ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）ＦＥＴＬ結合体を包含する。ここに挙げた特異的な検体抗体の対は本発明の範囲を限定せず、本発明の例として用いられるものであることは、当業者に理解されよう。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、例えば、「抗体：実験マニュアル」、Ed HarlowおよびDavid Lane、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1988）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク  に記載されているような標準技術によって調製した。調製され、心臓病マーカーアッセイについて選択される組換え抗体を、「抗体技術：実践方法（Antibody Engineering: A Practical Approach）」(Borrebaeck, C.編）、1995、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（Oxford University Press）、オックスフォード；J. Immunol. 149、3914-3920（1992）および米国特許出願96/05476（その記載内容も本明細書の一部を成す）に記載されている様々な方法によりマウスから得た遺伝情報から調製した。
【０１４３】
実施例２：心臓病マーカーアッセイ用の流量コントロールＦＥＴＬ結合体の調製
実施例１に従って調製したFETL-BSA溶液（１％固形物、ｗ／ｖ、２２０ｎｍ粒子で１１ｍｌ）に、撹拌しながらアスコルビン酸およびエチレンジアミン四酢酸を添加し、それぞれ最終濃度を２０ｍＭおよび０．１ｍＭにした。撹拌しながらＳＭＣＣ（６０ｍＭアセトニトリル溶液  ３．８μｌ）を添加し、当該溶液を室温で２時間インキュベートした。０．５Ｍタウリン溶液０．４５ｍｌの添加により、反応を停止させた。当該溶液をゲル濾過カラムにかけ、FETL-BSAマレイミド２３．１ｍｌを溶出させた。デカペプチドチオール溶液（４．７ｍＭ溶液１９μｌ）を添加し、当該溶液を室温で５０分間インキュベートした。デカペプチドチオールは実施例４に記載するように加水分解によって調製した。当該溶液をゲル濾過カラムにかけ、エッペンドルフ遠心分離機の最高速度で２０分間、溶出FETL-BSA−デカペプチドを遠心分離した。ＦＥＴＬ結合体のペレットを再懸濁し、リン酸緩衝溶液中（ｐＨ７．０）で固形物最終濃度２％（ｗ／ｖ）にした。
【０１４４】
実施例３：心臓病マーカーアッセイ用の時間ゲートコントロールＦＥＴＬ結合体の調製
実施例１に従って調製したFETL-BSA溶液（１％固形物、ｗ／ｖ、２２０ｎｍ粒子で１１ｍｌ）に、撹拌しながらアスコルビン酸およびエチレンジアミン四酢酸を添加し、それぞれ最終濃度を２０ｍＭおよび０．１ｍＭにした。撹拌しながらＳＭＣＣ（６０ｍＭアセトニトリル溶液１７μｌ）を添加し、当該溶液を室温で２時間インキュベートした。０．５Ｍタウリン溶液０．８２ｍｌの添加により、反応を停止させた。当該溶液をゲル濾過カラムにかけ、FETL-BSA−マレイミド１６．９ｍｌを溶出させた。米国特許第5,089,391号、実施例４に記載のようにして、モルヒネ−HCTLを合成し、加水分解して、対応チオール誘導体にした（該記載内容も本明細書の一部を成す）。モルヒネチオール（１６．３ｍＭ溶液０．５２ｍｌ）を添加し、当該溶液を室温で３時間インキュベートした。Ｎ−エチルマレイミドの添加により反応を停止させ、最終濃度を２ｍＭにした。当該溶液をゲル濾過カラムにかけ、溶出FETL-BSA-モルヒネをエッペンドルフ遠心分離機の最高速度で２０分間、遠心分離しした。ＦＥＴＬ結合体のペレットを再懸濁し、リン酸緩衝溶液中（ｐＨ７．０）で固形物最終濃度４％（ｗ／ｖ）にした。
【０１４５】
実施例４：心臓病マーカーアッセイ用時間ゲートコントロール抗体結合体の調製  ５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液中に１０ｍｇ／ｍｌの抗−モルヒネ抗体３６Ｅ１０を含む溶液１．０ｍｌに対し、２ｍｇ／ｍｌＳＭＣＣ（ピアス  ケミカル  カンパニー製）（Pierce Chemical Co.）アセトニトリル溶液０．０２２ｍｌを添加した。当該溶液を室温で３時間撹拌した。ついで、ゲル濾過カラム上で当該溶液を精製し、回収した溶出タンパク質は２．４ｍｇ／ｍｌで３．４ｍｌであった。この、抗体−マレイミドからなるタンパク質画分に対してデカペプチドチオール０．１２ｍｌを添加した（デカペプチドチオールの合成はこの例を参照）。当該溶液を室温で３時間撹拌し、つづいて５０ｍＭリン酸カリウムに対して一晩透析した。抗−モルヒネ抗体デカペプチド結合体からなる回収タンパク質は、２．８ｍｇ／ｍｌで３．２ｍｌであった。
【０１４６】
アセチルチオプロピオン酸の合成
３−メルカプトプロピオン酸（７ｍｌ、０．０８モル）およびイミダゾール（５．４ｇ、０．０８モル）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、７００ｍｌ）撹拌溶液に対し、アルゴン下で、１−アセチルイミダゾール（９．６ｇ、０．０８７モル）のＴＨＦ溶液（１００ｍｌ）を１５分間にわたって滴下により添加した。当該溶液をさらに室温で３時間撹拌し、その後減圧してＴＨＦを除去した。残分を氷冷水（１８ｍｌ）で処理し、その結果得られた溶液を氷冷濃塩酸（１４．５ｍｌ）でｐＨ１．５〜２まで酸性化した。当該混合物を水で抽出（２×５０ｍｌ）し、硫酸マグネシウム上で蒸発させて乾燥させた。残った粗精製の黄色の油状固体生産物（１０．５ｇ）をクロロフォルム−ヘキサンから再結晶化し、融点が４４〜４５℃の白色固体としてアセチルチオプロピオン酸４．８ｇ（収率４１％）を得た。
【０１４７】
デカペプチドチオール合成
デカペプチドチオールプロピオンアミド（デカペプチドチオール）をデカペプチドアセチルチオプロピオンアミド（デカペプチドＡＴＰ）の加水分解によって合成した。デカペプチドＡＴＰは、デカペプチド、YPYDVPDYAS（カイロン  ミモトープス  ペプチド  システムズ（Chiron Mimotopes Peptido Systems）社（サンディエゴ、カリフォルニア）製）およびアセチルチオプロピオン酸から合成した。このように、当該デカペプチドをアルゴン下で丸底フラスコ中で乾燥ＤＭＦ（５．４ｍｌ）に、緩やかに撹拌して溶解した（０．３ｇ）。イミダゾール（０．０２ｇ）を撹拌溶液へ添加した。別個に、丸底フラスコ中でアセチルチオプロピオン酸（０．０４１ｇ）を、撹拌して、０．５５ｍｌ乾燥ＤＭＦに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール(アルドリッチ  ケミカル  カンパニー（Aldrich Chemical Co.)（ミルウォーキー、ウィスコンシン）製)を撹拌溶液に添加した。フラスコをアルゴン下で密封し、室温で少なくとも３０分間撹拌した。当該溶液をデカペプチド溶液に添加し、反応混合物を室温で少なくとも６時間撹拌した後、減圧して溶媒を除去した。フラスコ内の残分を各回１０ｍｌのジエチルエーテルを用いて２回破砕し、当該エーテルをデカントした。塩化メチレン（２０ｍｌ）を当該残分に添加し、固形物をフラスコからかき集めて、精密にフリット処理したブフナー漏斗を用いて濾過した。当該固形物をさらに２０ｍｌの塩化メチレンで洗浄し、当該ブフナー漏斗を減圧下で乾燥した。
デカペプチドＡＴＰのチオアセチル基を７０％ＤＭＦに溶解することによって加水分解し、２０ｍＭ溶液をつくった。激しく混合しながら１Ｎ水酸化カリウム溶液を添加し、最終濃度０．２Ｎにした。当該溶液を室温で５分間インキュベートした後に、０．５Ｍリン酸カリウム、０．１Ｍホウ酸および１Ｍ塩酸を含む溶液を添加して、上記溶液をｐＨ７に中性化した。デカペプチドチオール誘導体のチオール濃度を、当該溶液１０μｌを０．２５ｍＭ  ５，５’ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、アルドリッチ  ケミカル  カンパニー（Aldrich Chemical Co.）（ミルウォーキー、ウィスコンシン）製）および０．２Ｍホウ酸カリウムを含有する溶液、ｐＨ８．０、９９０μｌへ希釈することによって確定した。ｍＭ単位のチオール濃度はＡ412（100/13.76）に等しかった。
【０１４８】
実施例５：固相抗体、アビジンおよびダンシルラテックス結合体の調製
直径約１３０ｎｍの粒子に抗体またはウシ血清アルブミンを吸収させることにより、固相抗体ラテックスを調製した。これらのタンパク質をラテックス粒子へ吸収させる方法は、当業者に周知であり、「均一ラテックス粒子（Uniform Latex Particles）」、セラディン  インコーポレーテッド（Seradyn Inc.）、第31-32頁および「微粒子試薬最適化（Microparticle Reagent Optimization）」、セラディン  インコーポレーテッド（Seradyn Inc.）、第91-97頁に見出すことができる。
上記で引用した参考文献に記載されているように、アビジン（ピアス  ケミカル  カンパニー（Pierce Chemical Co）製）をラテックス粒子へ吸収させることにより、シクロスポリンアッセイにＩＡＣとして用いるアビジンラテックスを調製した。
実施例３に従って、ウシ血清アルブミンラテックスをＳＭＣＣに反応させることにより、心臓病アッセイ用の流量コントロール固相として用いるダンシルラテックスを調製した。その結果得られるラテックスＢＳＡ−マレイミドをダンシルチオールと反応させた。ダンシルチオールは、トリブチルホスフィン（アルドリッチ  ケミカル  カンパニー（Aldrich Chemical Co.）製）を用いるジダンシル−システインの還元によって調製した。その結果得られるダンシルＢＳＡラテックス結合体をゲル濾過カラム上で精製し、溶出固形物をエッペンドルフ遠心分離機の最高速度で２０分間、遠心分離した。
固相ラテックス溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、固形物濃度１％（ｗ／ｖ）に復元した。
この方法で調製した固相を心臓病アッセイの時間ゲートコントロールに利用した。これは、抗−デカペプチド抗体結合体ラテックスを含み、心臓病アッセイ流量コントロール用ではダンシルＢＳＡ結合体ラテックスを、心臓病アッセイ非特異的結合コントロール用では抗−ベンゾジアザピン抗体結合体ラテックスを、トロポニンＩアッセイ用では抗−トロポニン抗体結合体ラテックスを、ＣＫＭＢアッセイ用では抗ＣＫＭＢ抗体結合体ラテックスを、およびミオグロビンアッセイ用では抗ミオグロビン結合体ラテックスをそれぞれ含んだ。サイクロスポリンアッセイ用に用いた固相は、時間ゲートおよび流量コントロール用アビジン結合体ラテックスならびにシクロスポリンアッセイ用抗−フェンシクリジン抗体結合体ラテックスを含んだ。
【０１４９】
実施例６：ＦＥＴＬ−シクロスポリンの調製
実施例１に従って調製したFETL-BSA（１％固形物、ｗ／ｖ、２２０ｎｍ粒子、２５ｍｌ）を、２．５ｍｌジメチルホルムアミド添加後、シクロスポリン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ノバルティス（Novartis）社（ベイサル、スイス  ）製）０．２２ｍｇと反応させた。当該反応物を、シクロスポリン−Ｈ−ヒドロキシスクシンイミド添加後に、室温で３０分間撹拌した。０．５Ｍタウリン溶液１．１ｍｌの添加により、反応を停止させた。当該混合物をゲル濾過カラムにかけた。FETL−シクロスポリンを含む溶出物をエッペンドルフ遠心分離機の最高速度で２０分間、遠心分離した。ペレットを、１０ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７．０）１０．５ｍｌで復元し、固形物最終濃度２．２％、ｗ／ｖにした。
【０１５０】
実施例７：ＦＥＴＬ−デカペプチド結合体（シクロスポリンアッセイ用）ＩＡＣ標識
実施例１に従って調製したFETL-BSA溶液（１％固形物、ｗ／ｖ、２２０ｎｍ粒子で、１５ｍｌ）に、撹拌しながら、ＳＭＣＣ（２ｍｇ／ｍｌアセトニトリル溶液２５μｌ）を添加した。当該溶液を室温で２時間インキュベートした。０．５Ｍトルエン溶液０．６ｍｌの添加により、反応を停止させた。当該溶液をゲル濾過カラムにかけ、FETL-BSA-マレイミド２３．１ｍｌを溶出させた。デカペプチドチオール溶液（４．７ｍＭ溶液１９μｌ；デカペプチドチオールの調製については、実施例４を参照）を添加し、当該溶液を室温で５０分間インキュベートした。溶液をゲル濾過カラムにかけ、溶出FETL-BSA-マレイミドをエッペンドルフ遠心分離機の最高速度で２０分間、遠心分離した。ＦＥＴＬ結合体のペレットを再懸濁し、リン酸緩衝溶液中（ｐＨ７．０）で固形物最終濃度２％（ｗ／ｖ）にした。
【０１５１】
実施例８：抗−シクロスポリンフェンシクリジン抗体および抗−デカペプチドビオチン抗体結合体
シクロスポリンおよびデカペプチドに対するモノクローナル抗体を、それぞれシクロスポリンアッセイおよびシクロスポリンアッセイのＩＡＣに用いた。これらの抗体結合体をアッセイ装置の蓋に置き、蓋抗体と称する。抗シクロスポリン抗体をフェンシクリジンチオールと反応させ、抗デカペプチド抗体をビオチンと反応させた。
したがって、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７）中の抗シクロスポリン抗体（１０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｌ、ノバルティス（Novartis）製）に、撹拌しながら、アセトニトリル中の２ｍｇ／ｍｌ  ＳＭＣＣ  ２２μｌを添加した。当該溶液を室温で３時間撹拌した。当該溶液を、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７）で平衡化したゲル濾過カラムに付した。抗シクロスポリンマレイミドを回収し、フェンシクリジンチオールと反応させた。フェンシクリジンＡＴＰの加水分解により、フェンシクリジンチオールを調製した。それぞれ米国特許第5,331,109号の実施例４および５に従って、フェンシクリジンＡＴＰおよびフェンシクリジンチオールを合成した。フェンシクリジンチオール溶液（１８ｍＭ、９０μｌ）を、撹拌しながら、抗シクロスポリンマレイミドに添加した。当該溶液を室温で２．５時間撹拌した。フェンシクリジン抗体を、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７）で平衡化したゲル濾過カラムにかけた。抗デカペプチドビオチン結合体を４．２ｍｇ／ｍｌで１ｍｌ溶出させた。溶出タンパク質を１．２ｍｇ／ｍｌで、４ｍｌに分取して回収した。
抗デカプペチド抗体溶液（１０ｍｇ／ｍｌで０．５ｍｌ）に対して、２ｍｇ／ｍｌビオチン−Ｎヒドロキシスクシンイミド（Piece Chemical Co.）を０．１ｍｌ添加した。当該タンパク質溶液を、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７）で平衡化したゲル濾過カラムに添加した。抗デカペプチドビオチン結合体を、４．２ｍｇ／ｍｌで１ｍｌ溶出させた。
【０１５２】
実施例９：シクロスポリンアッセイ用独立アッセイコントロールの調製
シクロスポリンアッセイ用ＩＡＣは、FETLシクロスポリン結合体とともに反応室のアッセイ装置の基部へ添加したFETLデカペプチド結合体（実施例７）、抗シクロスポリンビオチン結合体とともにアッセイ装置の蓋に添加した抗デカペプチドビオチン結合体（実施例８）および診断レーンの装置の固相へ適用したアビジン結合体ラテックス（実施例５）を含んだ。
FETLデカペプチド結合体およびFETLシクロスポリン結合体の固体濃度は、反応混合物中、０．０４％（ｗ／ｖ）であった。抗デカペプチドビオチン抗体結合体および抗シクロスポリンビオチン抗体結合体は、反応混合物中、０．３μｇ／ｍｌであった。それぞれ、反応混合物中のIAC FETLおよび抗体結合体の濃度を別個または一緒に上昇または低下させることにより、ＩＡＣの絶対シグナルを調製できることは当業者に理解されよう。
【０１５３】
実施例１０：アッセイ装置の調製および説明
米国特許第5,458,852号に記載のアッセイ装置を本実施例に用いる。しかし、多くのアッセイ装置および形式を、本明細書に記載の試薬の適用および本発明の教示の実施に利用できることは、当業者に理解されよう。例えば、米国特許第4,200,690号、第4,391,904号、第4,435,504号、第4,857,453号、第4,963,468号、第5,073,484号、第5,096,837号および第5,654,162号に記載の膜が組み込まれているアッセイ装置を適用して（これらの記載内容も本明細書の一部を成す）、本明細書に記載の発明の教示を利用してもよい。FETL−抗体およびFETL−リガンドの組成物を、最終アッセイ固形物濃度が約０．２％〜０．４％（ｗ／ｖ）になるように、基部の反応室に添加する。時間ゲートコントロールを約５μｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度まで当該反応室領域の蓋に適用する。固相抗体ラテックスを、約２ｍｍ×３ｍｍのゾーンの診断レーンへ適用する。フィルターを用いて、血漿から赤血球を、および一般的には、試料から細片を除去するアッセイの場合、1996年８月26日出願の米国特許出願出願番号08/704,804（その記載内容も本明細書の一部を成す）の記載のように、当該装置とフィルターを構成する。全血液を溶解させるための溶解メッシュが組み込まれているアッセイの場合、「アッセイ装置において使用する為の溶解室（A lysis Chamber for Use in an Assay Device）」なる名称の米国特許出願、Buechlerら、1997年10月２日出願、代理人整理番号225/062（すべての図、表および図面を含むこれらのすべての記載内容も本明細書の一部を成す）に記載させているように当該装置および溶解メッシュを構成する。当該時間ゲートを米国特許第5,458,852号の記載のように装置および機能に適用する。当業者が理解するように、超音波溶接によってアッセイ装置の蓋を取り付ける。
【０１５４】
毛細管装置におけるフィルター、溶解チャンバー、反応室、時間ゲートおよび診断レーンが本発明の実施に必須ではないこともまた、当業者に理解されよう。さらに、試験管内で反応混合物をつくり、インキュベートし、および膜または毛細管に適用して、膜または毛細管内の反応混合物の流れが横の形式になるようにする。反応混合物中の標識および膜または毛細管の固相上の試薬の結合反応は、固相への反応混合物の添加後に起る。結合ゾーンからの非結合標識の洗浄は、界面活性剤を含有する緩衝剤の添加により行うことができる。
通常、これらの例に用いるアッセイ装置は各々時間ゲートコントロールおよび流量コントロールを含む。いくつかの場合では、時間ゲートコントロールおよび流量コントロールＩＡＣを試薬の一組によって実施できる。すなわち、時間ゲートコントロールもまた、流量コントロールとして機能しうる。
【０１５５】
心臓病マーカー用イムノアッセイ装置は、本明細書に記載するように、各々が別個の時間ゲートコントロールおよび流量コントロールを含み、これらのＩＡＣは相互に独立である。時間ゲートコントロール用ＩＡＣ抗体（抗モルヒネ抗体デカペプチド結合体）を、アッセイのダイナミックレンジに関して調整し、反応混合物中、約０．１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの範囲、および好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度で蓋に適用する。標識化結合体を反応室に適用し、固相捕捉試薬をアッセイ装置の診断レーンに適用する。IAC FETL結合体の濃度は、流量コントロール用では０．０６％固形物（ｗ／ｖ）、および時間ゲートコントロールでは０．１２％（ｗ／ｖ）であった。それぞれ、反応混合物中のIAC FETLおよび抗体結合体の濃度を別個または一緒に上昇または低下させることにより、ＩＡＣの絶対シグナルを高くまたは低く調製できることは当業者に理解されよう。
【０１５６】
試料が反応室内の試薬を復元して反応混合物を形成するアッセイプロセスの間に、抗モルヒネ抗体デカペプチド結合体はFETLモルヒネ結合体に結合する。時間ゲートは、インキュベーション中に時間ゲートコントロール抗体が時間ゲートコントロール標識に結合して被検体がその各々のＦＥＴＬ抗体結合体に結合することおよびインキュベーション後に反応混合物が診断レーンを通って流れることを可能にする。反応混合物中の標識は各々のゾーン中の固相に結合する。したがって、FETLモルヒネ抗モルヒネ抗体デカペプチド結合複合体は時間ゲートコントロールＩＡＣを明らかにする固定化抗デカペプチド抗体に結合し、ＦＥＴＬダンシル結合体は流量コントロールＩＡＣを明らかにする固定化抗ダンシル抗体に結合し、全ＦＥＴＬ結合体は抗体ゾーンへの非特異的結合を明らかにする固定化抗ベンゾジアザピンに結合し、ＦＥＴＬ抗ＣＫＭＢ抗体結合体はＣＫＭＢ存在下で固定化抗ＣＫＭＢ抗体に結合し、ＦＥＴＬ抗トロポニンＩ抗体結合体はトロポニンＩ存在下で固定化抗トロポニンＩ抗体に結合し、およびＦＥＴＬ抗ミオグロビン抗体結合体はミオグロビン存在下で固定化抗ミオグロビン抗体に結合する。ＩＡＣはイムノアッセイの完了の状態の関連し、診断レーンの固相への非特異的結合に関する情報に関連する装置と通信するように機能する。
【０１５７】
シクロスポリン用イムノアッセイ装置は、シクロスポリンの測定用に実施される競合的イムノアッセイと類似して機能するＩＡＣを含む。シクロスポリンアッセイ装置は心臓マーカー装置用に記載したような別個の流量コントロールも含む。ＩＡＣ抗体（抗−デカペプチドビオチン）を、アッセイのダイナミックレンジに関して調整した濃度で抗シクロスポリン抗体とともに蓋に適用する。標識結合体を反応室に適用し、固相捕捉試薬をアッセイ装置の診断レーンに適用した。反応室内で試料が試薬を復元するアッセイプロセスの間に、抗シクロスポリンＰＣＰ結合体および抗デカペプチドビオチン結合体は、それぞれＦＥＴＬシクロスポリン結合体およびＦＥＴＬデカペプチド結合体に結合する。リガンド、例えばこの場合デカペプチドを溶解チャンバー内のメッシュに添加し、試料が反応室に入る前に試料で復元してもよい。リガンドは被検体として機能するので、ＩＡＣはシクロスポリン用の競合的イムノアッセイと同様に機能する。時間ゲートは、インキュベーション後に反応混合物が診断レーンを通って流れるのを可能にする。ＦＥＴＬシクロスポリン抗シクロスポリン抗体フェンシクリジン結合体は、シクロスポリンアッセイを規定する固定化抗フェンシクリジン抗体に結合し、抗デカペプチドビオチン結合体はＩＡＣを規定する固定化アビジンに結合する。ＩＡＣはイムノアッセイの完了の状態に関連し、診断レーンの固相への非特異的結合に関する情報に関連する装置と通信するように機能する。
【０１５８】
実施例１１：イムノアッセイの実施
数滴の試料（例えばシクロスポリンアッセイでは試料溶解用装置へ全血約７０μｌ、フィルターが組み込まれている装置については全血または血漿約１８０μｌ）を実施例６に記載のようにして組み立てたアッセイ装置に添加した。当該アッセイ装置を、試料添加後直ちに、または３０分までの任意の時間に装置内に置く。例えば、「イムノアッセイ蛍光計（Immunoassay Fluorometer）」なる名称の同時係属米国特許出願、Buechlerら、1997年12月31日、代理人整理番号230/003、および「アッセイ装置用媒体担体（Media Carrier for an Assay Device）」なる名称の同時係属米国特許出願、Buechlerら、1997年12月31日、代理人整理番号230/004を参照。当業者が実施できるいくつかの単純な命令は装置によって指示され、装置は捕捉ゾーンおよび調時機能のために利用するゾーンの分析のために光学ブロックの下のアッセイ装置を作動させる。装置が、装置のイムノアッセイが完了したことを判断した後、分析した被検体の濃度を示す結果が画面上に現れる。
【０１５９】
実施例１２：診断レーン内の特異的な捕捉ゾーン位置をＩＡＣを用いて規定する方法
診断レーンを３つの型の領域、すなわち、ベースラインゾーン、捕捉ゾーン、および捕捉ゾーン端に分けることができる。図１０はこれらの領域を説明する。これらの領域の同定は、実施例１３に記載するように、各領域に別々のフィルターを適用することを可能にする。実施例１４に記載するように、軌跡をバリデーションする方法として、これらの領域の各々の大きさおよび位置を用いる。ノイズに対する既知の高シグナルの比を有する２点を、位置決めゾーンとして用いる。図１０に示すように、このアッセイにおいては２のコントロールゾーンがある。図１０は、ＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビンを添加した（spiked)血液を分析した心臓病パネル装置の蛍光スキャンを表す。各位置決めゾーンの端部を見つけることができ、しかも位置決めゾーン間に適切な間隔がある場合には、すべてのゾーン間の間隔は固相適用プロセスによって一定に固定されるので、他のゾーンの予想位置が決まる。したがって、位置決めゾーンの端を用いて、すべての他のゾーンの予想位置を明らかにすることができる。この方法は、測定システムまたは固相適用システムによる位置決めの不確実性を取り除く。
【０１６０】
捕捉ゾーン端は、バックグラウンドからのその鋭い立ち上がりによって同定される。ゾーンの近似平均シグナル高さを用いて、平均シグナル高さの２５、５０、および７５％である閾値高さを定める。図１１を参照。シグナルが閾値と交わる点を閾値交差の位置と定義する。５０％閾値についての左側と右側の交差が最大値の半分の全幅を定義することは当業者に理解されよう。これを通常曲線の幅として用いる。ノイズの存在は、閾値交差の決定に誤差を生じさせうる。当該決定におけるノイズの影響を最小にするために、各閾値交差の位置を、高から低および低から高の両方向での端の探索によって見つける。閾値交差の位置が探索方向によって左右されない場合は高い信頼性を有し、探索方向に依存する交差よりも好ましい。ノイズによって影響されない明確な端については、各閾値交差の位置は探索方向によって左右されず、移動の位置の予想範囲内である。以下の基準によって閾値交差の信頼性を等級付けする。
１）閾値交差が存在しない。
２）閾値交差が存在する。
３）閾値交差が非方向依存性である。
４）閾値交差が移動の位置の予想範囲内である。
５）閾値交差が移動の位置の予想範囲内かつ非方向依存性である。
【０１６１】
最も高い信頼性を有する閾値交差は、その端の特性を定める。捕捉ゾーンの特性は、最も低い特性の端によって定められる。最も高い信頼性を有する閾値交差の位置を用いて、捕捉ゾーン端上の点を定め、当該捕捉ゾーン端の残余を、この点周辺の単調領域として定義する。シグナル中のノイズは単調領域を早期に終わらせうるので、隣の２点がまた単調である捕捉ゾーン端内に、１つの非単調点が含まれることが許容される。
したがって、各捕捉ゾーンの端が見つけられた場合、軌跡を３つの型の領域に分けることができる。これらの各領域を、慣用のデジタルフィルターによって別々に処理する。当該端の定義については、迅速に変化する単調領域である。これらの領域をフィルター処理する必要は無いので、それらは不変のままにされる。実施例１３は、ベースラインゾーンおよび捕捉ゾーンに適用するフィルター処理を詳細に説明する。
【０１６２】
図１０において、捕捉ゾーン（ＣＺ）はシグナルが予想される領域である。この例では、最初の２つの捕捉ゾーンは明確なシグナルを有する。これらのゾーンはコントロールゾーンであり、位置決定ゾーンとして用いる。この装置の捕捉ゾーンは同じ幅であり、等間隔である。ベースラインゾーン（ＢＬ）は捕捉ゾーン間の領域である。捕捉ゾーン端はベースラインシグナルから高くなっている捕捉ゾーンシグナルへの移行部である。
図１１において、６ゾーンについて約７５％、５０％、および２５％閾値を示す。これらのゾーンの高さを拡大縮小し、すべて同一グラフ上にプロットできるようにする。第３のゾーンはノイズが多く、すべての閾値交差の位置は探索方向に依存している。さらに、２５％閾値は、捕捉ゾーンの左手側には見出されない。第４の捕捉ゾーンは右手端にスパイク（spike）を有する。その２５％および５０％交差は探索方向に依存する。その他の捕捉ゾーンは明確な端を有し、すべての閾値交差の位置は探索方向に依存しない。
【０１６３】
実施例１３：診断レーンの蛍光測定を調整する方法およびＩＡＣを用いて捕捉ゾーンシグナルを規定する方法
この実施例は、実施例１２で論じた３つのタイプのゾーンに関連して、フィルターアルゴリズムの使用を説明する。各ゾーンは独特の性格を有するので、各ゾーンに適用するフィルタリングは異なる。実施例１２に記載したように、捕捉ゾーン端は急に変化する単調領域なので、これらのゾーンにはフィルタリングは適用しない。
ベースラインゾーンは平坦であることが求められるので、これらの領域には低域フィルターを適用する。通常、フィルターは時間の関数としてシグナルに作用するが、蛍光シグナルは診断レーンに沿った位置の関数である。このコントロール性を用いて、各ゾーンに両方向でフィルターをかけ、２つの結果を結合させた。この結合は、最大、最小および平均を含む多くの形式をとりうる。結合低域フィルターの結果は、フィルター処理ベースラインを形成する。シグナル中のノイズはベースラインのスパイクに左右されることが認められる。したがって、ベースラインゾーン内に観察される最小値はベースラインを表す。このことが、結合フィルターについての左手および右手フィルターの最小値の使用を決定付ける。図１２はこの２方向フィルター処理の結果を示す。フィルターは、増加および減少シグナルについて別々の時定数を有してもよい。選択（ダウン＝０）はフィルターがベースラインに迅速にもどることを可能にする。図１３は様々な時定数の効果を示す。フィルターは、変化の最大許容率を含んでもよい。これは、誤作動による減衰の増加の結果を生じる大きな誤作動への応答を制限する。図１５は、この効果を示す。
【０１６４】
捕捉ゾーンシグナルは特徴的な形状を有し、この形状に近似する関数に適合する。放物線は真だが未知である捕捉ゾーンの関数形に極めて近似する。当該放物線は最小自乗法によって得られる。図１４はいくつかの特徴的な捕捉ゾーンと放物線適合の結果を示す。
捕捉ゾーン周辺のベースラインゾーンを用いて、捕捉ゾーンにおけるベースラインシグナルを定めることができる。これは、線形補間法によってなされる。捕捉ゾーンシグナルとベースラインとの間の相違は特異的結合由来のシグナルである。このシグナルを捕捉ゾーンにわたって合計し、およびこのシグナルが捕捉ゾーンの結果である。捕捉ゾーン微分に関する詳細については、例えば、米国出願出願番号08/065,528、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents without Membranes）」、1993年５月19日出願、代理人整理番号202/108；米国出願出願番号08/828,041、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents without Membranes）」、1997年３月27日出願、代理人整理番号225/104；および米国出願出願番号08/902,775、Buechler、「膜を有さない試薬の調整された移動のための診断装置（Diagnostic Devices and Apparatus for the Controlled Movement of Reagents without Membranes）」、1997年７月30日出願、代理人整理番号227/087；（すべての図、表および図面を含むこれらの特許出願のすべての記載内容も本明細書の一部を成す）を参照。
もとのシグナルとフィルター処理シグナルとの間のＲＭＳ偏差を用いて、ベースラインゾーンおよび捕捉ゾーンの双方におけるノイズを明らかにする。ゾーンのノイズに対するシグナルを、捕捉ゾーン結果のゾーンノイズに対する比として定義する。
【０１６５】
目的のシグナルから区別できる誤作動またはその他の特徴をフィルター処理の前に除去できることは、当業者に理解されよう。これらの特徴を見つける方法の一つは、幅および縦横比のような基準を用いて許容される形状の範囲を定め、ついで、軌跡において、候補を用いる対比を行うことにより形状を確認することである。別法は、軌跡の微分における特徴を調査することである。図１５に示すように、これらのプレフィルター（pre-filter）は特徴的なノイズ源を有効に除去できる。
図１２においては、それぞれ異なるフィルターを適用して、軌跡の区画が３回プロットされている。ＬＨフィルターは、フィルターを左から右へ動かして適用した場合の結果である。ＲＨフィルターは、フィルターを右から左へ動かして適用した場合の結果である。シグナルが増加する（アップ＝１ｍｍ）場合、適用するフィルターは低域フィルターであり、減少するシグナル（ダウン＝０ｍｍ）を濾過しない。結合軌跡は、ＲＨおよびＬＨフィルターの最小値である。
【０１６６】
図１３においては、異なるフィルターを適用して、軌跡の区画が２回プロットされている。第１のフィルターは（ダウン＝０、アップ＝１ｍｍ）の効果を示す。第２のフィルターは（アップ＝ダウン＝１ｍｍ）の効果を示す。主なノイズ源はベースラインシグナルの頂点のスパイクである。非対称フィルターの使用は、優先的に最も低い点を選択する。
図１４においては、捕捉ゾーンの特徴的形状とこれらに対応する放物線適合度（fit）を示す。これらのゾーンの高さを拡大縮小して、すべて同一グラフ上にプロットできるようにする。
図１５においては、例は、３つの異なるフィルターを適用した誤作動を示す。第１のフィルターは、許容される変化率に制限の無い、図１２の結合フィルターである。第２のフィルターも結合フィルターであるが、この場合許容される変化率の最大値がある。第３の軌跡は、誤作動フィルターの効果を示す。
【０１６７】
実施例１４：欠陥のある装置または試料に基づくアッセイデータのＩＡＣを用いる棄却方法
軌跡もしくはトレースＱＣアルゴリズムは、アッセイ結果が確かであるかどうかを決定しなければならない。各捕捉ゾーンを確認することは、捕捉ゾーン幅および位置、捕捉ゾーン端幅および特性ならびに捕捉ゾーンＳ／ＮおよびベースラインＳ／Ｎを包含する数個の基準を用いてなされる。受容可能および受容不能基準を構成するものを定めることは容易だが、受容と棄却カットオフとの間に中間の領域が残る。疑わしいアッセイの最終結果を決定するためには、一連の複合規則またはあいまい理論が必要である。デジタルフィルターにより、ベースライン以外の捕捉ゾーンを別個に処理した。このフィルターは、捕捉ゾーン端の正確な決定に依存する。したがって、捕捉ゾーンが軌跡ＱＣを満たさない場合、その端が不正確に同定されたと考えられ、その捕捉ゾーンをベースラインゾーンと同様にフィルター処理する。
【０１６８】
まず、悪い捕捉ゾーンを棄却し、ついで良い捕捉ゾーンを受容し、ついであらゆる疑わしい捕捉ゾーンを決定することにより、軌跡を確認する。これらの３段階を以下の方法で実施する。捕捉ゾーンの幅、捕捉ゾーンの位置、捕捉ゾーンのＳ／Ｎ比をすべて棄却基準と比較する。これらの４つの試験のいずれかを満たさない場合、その捕捉ゾーンは受容できない、すなわち、それは軌跡ＱＣを満たさない。残った捕捉ゾーンについて、捕捉ゾーンのＳ／Ｎおよび端の質を受容可能基準と比較する。捕捉ゾーンがこれらの２つの試験を通過する場合、捕捉ゾーンは軌跡ＱＣに合格する。棄却基準は通過するが受容可能基準は満たさない場合、その点は疑わしい。２次的な基準を用いて疑わしい捕捉ゾーンを解決する。２次的な基準は、捕捉ゾーン幅および捕捉ゾーン端幅の両方が受容可能限度内にあることを要求する。シグナルが小さい場合、しばしば誤ってスパイクが端として同定されるので、捕捉ゾーン端幅は重要である。この端の幅は、一般的には、真の捕捉ゾーン幅よりも狭い。
【０１６９】
軌跡ＱＣを満たさない捕捉ゾーンは、完全なシグナルから予想される特性を現さず、したがって、ベースラインゾーンと同様に処理しなければならない。棄却捕捉ゾーンの端を無視し、捕捉ゾーンおよび２つの周囲のベースラインゾーンにベースラインゾーンを適用する。この新たにフィルター処理されたシグナルは再び積分されて新しい捕捉ゾーン結果を与える。システムノイズによって設定されるノイズ閾値より大きいあらゆる結果は、受容できる捕捉ゾーンを与えるはずである。軌跡ＱＣを満たさない捕捉ゾーンに由来する結果は解釈することができず、棄却しなければならない。したがって、その捕捉ゾーンは質の保証を満たさず、そのゾーンに由来する結果は報告されない。軌跡ＱＣを満たさない捕捉ゾーン由来の結果がノイズ閾値未満の場合、予想シグナルはシステムノイズによって制限されると考えられ、その結果は報告される。図１６はベースラインフィルターによってフィルター処理された棄却ゾーンを示す。一つの捕捉ゾーンはノイズ閾値より大きく、一つはノイズ閾値未満である。
【０１７０】
ベースラインゾーンは装置の質の保証の重要な部分である。不適当な試料量は高いベースラインまたはベースラインの傾きの原因となる。さらに、実施例１２に記載したように、結果の計算の前に捕捉ゾーンシグナルからベースラインを差し引く。したがって、正確な結果には、ベースラインシグナルが予想通り挙動する事が必要とされる。
レベルが閾値レベル未満であることまたは捕捉ゾーン近傍の大きさと比べて小さいことを確認することにより、ベースラインの確実性を確認できる。ベースラインゾーンの傾斜が閾値レベル未満であることまたは捕捉ゾーン近傍の大きさと比べて小さいことを確認することによって、確実性を確認することもできる。最終的な確実性の確認は、ベースラインゾーンの２次微分係数（屈折）が閾値以下であることまたは捕捉ゾーン近傍の大きさと比べて小さいことを確認することである。図１７はこれらの試験を示す。捕捉ゾーンでのベースラインの大きさ（ＢＬ0）、傾斜（ＢＬ1）および２次微分係数を計算する。これらの値の各々を、式１４．１に示す対応する閾値レベル（Ｔｈx）と、傾斜値（ｍｘ）と捕捉ゾーン結果（ＣＺＲ）との積との和と比較する。
Ｂｌx＞Ｔｈx＋ｍxＣＺＲ                                  式ｊ１
システムノイズによって設定された閾値レベルは、捕捉ゾーンシグナルがない場合の最大受容可能値を表す。傾斜値（ｍx）は大きな捕捉ゾーンシグナルについて受容可能Ｓ／Ｎを定める。ベースラインが質の保証を満たさない場合、すなわち式１４．１が任意のＸについて真である場合、対応する捕捉ゾーンに由来する結果は報告されない。捕捉ゾーンのうちのいくつかはコントロールゾーンであり、各コントロールゾーン結果をその最小および最大許容値と比較する。あらゆるコントロールゾーン結果が受容可能範囲の外側にある場合、試験全体を棄却する。
【０１７１】
図１６では、２つの捕捉ゾーンを図示する。第１のゾーンはノイズが多く、よく定義された端を有さない。第２のゾーンはとても広いので、その端が許容範囲内に無かった。軌跡ＱＣアルゴリズムにより、これらのゾーンのこれらの端は受容できない。端無しで、これらのゾーンをベースラインと同様にフィルター処理する。この広いゾーンはノイズ閾値より大きい結果を有するので、ゾーン結果は報告されない。このノイズの多いスポットはノイズ閾値未満の結果を有し、棄却される。
図１７では、３つの軌跡がプロットされており、それぞれがベースラインの問題を有する。良いベースラインは約１００および平坦（図１０参照）である。高いベースライン軌跡は１０，０００よりも大きく、勾配の問題を現す。傾いているベースラインは望ましいものよりも高いが、受容可能限度内である。しかし、その傾斜は小さなシグナルの分析を困難にし、これらの結果は棄却される。高い２次微分係数は明確な屈折のシグナルになる。この屈折の近くの小さなシグナルに由来する結果は信頼できず、その結果棄却される。
【０１７２】
実施例１５：ＩＡＣを用いるイムノアッセイ完了の検出方法
この例では、装置によるイムノアッセイ完了の検出のためのＩＡＣを用いるいくつかの方法を説明する。好ましい方法を、スパイクならびに調時アルゴリズムによって調整した数個のイムノアッセイ装置および装置を用いる回収実験によって説明する。いつイムノアッセイ装置を装置に挿入したかに関わらずアッセイ完了を検出するためには、論じたどの計画を用いてもよい。ほとんどの場合、アッセイ完了はアッセイシグナルが定常状態に達したときであると定義される。いくつかの場合では（実施例１６参照）、アッセイ完了はアッセイシグナルが定常状態に達する前に起りうる。定常状態は定めた限度未満のシグナルの変化速度の絶対値として定義される。好ましい具体例においては、調時シグナルの定常状態を、絶対値が定めた限度未満である負の変化速度として定義する。
【０１７３】
アッセイおよびＩＡＣシグナルの時間特性
アッセイ装置の診断レーン上のアッセイおよびＩＡＣ検出ゾーン由来の蛍光シグナルの時間特性を決定し、アッセイ完了を検出する調時アルゴリズムに用いる基準を定義した。その調時アルゴリズムはアッセイ完了を明らかにするための、数学的関数を用いる一組のソフトウエア命令である。イムノアッセイ装置（実施例１０）は、ＣＫＭＢ、トロポニンＩ、ミオグロビン、流量コントロール、時間ゲートコントロールおよび非特異的結合コントロール（心臓病パネル装置）用検出ゾーンを用いて作成した。ＣＫＭＢ（Genzyme社製；10 ng/ml）、トロポニンＩ（Bio-tech International社（Seattle, WA）製；４ng/ml）およびミオグロビン（Scripps Laboratories社（San Diego, CA）製；40 ng/ml）を添加した（実施例１１）ヒトヘパリン化全血を心臓病パネル装置に付し、１分間以内に当該装置を装置内に挿入した。毎分、診断レーンをスキャンする（レーンの位置の関数として蛍光を測定する）ように装置をプログラムした。その結果得られたデータを分析のためにコンピューターに移した。バックグラウンドシグナル（検出ゾーン間で測定）を差し引いて（実施例１２〜１４）、検出ゾーンにわたり蛍光を積算することにより、アッセイおよびコントロール結果を定量した。結果として得られた、ＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビン検出ゾーンからの積算シグナルを用いて、予め定めた較正曲線から、これら各々の被検体の濃度を計算した。さらに、最後の検出ゾーンのゾーン（調時ゾーン）下流からの蛍光シグナル（調時シグナル）を定量した。調時ゾーンに固定化された結合タンパク質は無いので、調時シグナルは非結合（非洗浄）ＦＥＴＬおよび非特異的結合ＦＥＴＬからの蛍光の合計である。
積算したアッセイシグナル、コントロールシグナルおよび調時シグナルの時間特性を図１〜７に示す。通常、時間特性はすべてのシグナルがほぼ同時（１０分から１５分の間）に定常状態に達することを示す。図４のデータを用いて、以下に、アッセイ完了決定のためのＩＡＣ使用のいくつかの具体例を説明する。
【０１７４】
ＩＡＣシグナル値の測定により検出するアッセイ完了
この具体例では、一部または全部のＩＡＣシグナルが定められた受容窓内にあるときに、アッセイ完了が起ったことを明らかにする。多くの場合、受容窓はＩＡＣシグナルの定常状態値を一括する。例えば、図１〜７に示す場合では、受容窓は以下のように定義できる：積算流量コントロールシグナルでは２６と２７との間、積算時間ゲートコントロールシグナルでは３４０と３５０との間および調時シグナルでは１と３の間。すべてのＩＡＣがこれらの受容窓内にある時間のみが、アッセイ（ＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビン）が定常状態になった後である。したがって、受容窓の方法を用いて、ＩＡＣシグナルと同時またはその前にアッセイシグナルが定常状態に至る長さのアッセイ装置の単一の測定（１回のみで）により、定常状態（アッセイ完了）を検出できる。装置へ挿入したときにイムノアッセイが完了している装置を、診断レーンの単一のスキャンのみで、アッセイ完了と読み取りの両方についてチェックできる。したがって、装置への挿入後できるだけ迅速に上記装置の測定を行う。受容窓の方法の欠点は、当該窓が様々な装置および／または様々な血液試料でのシグナルの正常な変化（標準偏差）に適応するのに十分な幅でなければならないことである。受容窓は、実質的に受容基準を満たす装置の少なくとも９５％について、数個（２以上）の標準偏差の幅でなければならない。幅が広すぎる受容窓は、アッセイシグナルの早すぎる（定常状態に達する前の）測定を導きうる。したがって、この方法は、ＩＡＣシグナルの変動係数（Ｃ．Ｖ．）が十分に小さい場合、またはＩＡＣシグナルの変動（Ｃ．Ｖ．ｓ）がアッセイシグナルの変動によく相関している場合、およびコントロールシグナルを用いてアッセイシグナルを正規化する場合に有効である（実施例１６、１８、１９、２０および２１）。受容窓の方法は、ＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルが定常状態に達する前にアッセイ完了が起るように定められている場合、例えば、アッセイ完了がアッセイシグナルの時間特性において固定時に起こるように定められている場合にも適用できる。定常状態に達する前にアッセイを読み取る場合ならびにＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルが時間に相関する場合、受容窓の方法は、固定時にアッセイシグナルを読み取ることにより得られるものよりも正確なアッセイ結果を導きうる。アッセイシグナルおよびＩＡＣシグナルの時間特性は互いに相関するが、異なるアッセイ装置間で変化する場合、より正確な結果を得ることができる。
【０１７５】
ＩＡＣシグナルの変化率の決定によって検出されるアッセイ完了
本具体例においては、コントロール、アッセイおよび／または調時シグナルのの一部または全部を少なくとも２回測定し、定常状態がシグナルの最大許容変化率について定めた限度内に達しているかどうかを決定する。図４は、コントロールおよび調時シグナルが定常状態である場合、アッセイが定常状態であることを示す。アッセイ完了は、コントロール、アッセイおよび／または調時シグナルの一部または全部が定常状態であるときであるように定める。本例に記載のアッセイ装置のものを包含する多くのアッセイの構成について、調時シグナルの負の変化率の測定はアッセイ完了検出の精密な手段を提供する。調時シグナルのみの測定は、装置が調時サイクル間の診断レーン全体のスキャンを必要としないために、電力消費および装置の機械的磨耗を抑えることができるという利点を有する。いくつかのアッセイの構成については、調時シグナルのみでは十分な情報を提供できず、または、アッセイが定常状態に達したかどうかを決定するのに十分な機能が得られない。これらの場合、アッセイ完了の正確な検出を得るためには、調時シグナルの測定に加えて、コントロールおよび／またはアッセイ調時シグナルの一部または全部の変化速度の決定が必要とされうる。
【０１７６】
イムノアッセイ装置のアッセイ完了検出のための調時シグナルの使用
アッセイ完了（定常状態）の決定のための調時シグナルの使用を説明するために、ＣＫＭＢ（８ng/ml）、トロポニンＩ（1.3 ng/ml）およびミオグロビン（110 ng/ml）を添加したヒト全血を用いて、６個の心臓病パネル装置を作成した。血液添加１分間以内に当該装置を装置へ挿入し、アッセイ測定のすべての他のコントロールをソフトウエア具有装置の支配下に置くことによって、ソフトウエア具有装置を開始させた（実施例１１）。
調時シグナルゾーンが測定位置において光学ブロックの下にあるように、装置によってアッセイ装置の位置を定めた。当該装置は１０秒ごとに調時シグナルを測定した（各調時シグナル測定を時間点と称する）。調時シグナル時間特性を滑らかにする（ランダムノイズの影響を減少させる）ために、調時アルゴリズムソフトウエアによって、３個の連続する時間点からなる窓内のすべての時間点を平均し、時間点平均を得た。当該窓を一度に１個の時間点前進させることにより、一連の部分的に重なる時間点平均を計算した。定常状態は、３個の連続する時間点平均が相互に３％以内で一致するときであると定義した。定常状態についてのこの基準が調時シグナル（図７）の時間特性における３つの別々の位置（時間）で満たされうることは、当業者に理解されよう。基準が満たされうる第１の時間は、調時ゾーンに蛍光がないときのタイムゲートが壊れる前で、装置を計器に挿入した直後である。基準が満たされうる第２の時間は、調時シグナルが最大値に達し、上昇から下降へ移行するときである。基準が満たされうる第３の時間は、調時シグナルが負の変化率を含み、最終的な定常状態値に下降したときである。この第３の時間のみが定常状態のアッセイであり、測定の準備が整っている。最良の態様では、最初の２つの時間での装置の早すぎる読み取りを避けるために、調時アルゴリズムは、アッセイ装置を読み取る前に数個のさらなる満たすべき基準を必要とする。これらは、（ｉ）調時シグナル値が、調時ゾーンに蛍光標識が無い装置について予想されるレベルより大きいが、調時シグナル時間特性（受容窓は０．７および２００調時シグナル蛍光単位の間の調時シグナルであった（図７））によって予想される最大値より小さかったこと；（ii）調時シグナルの１次微分係数が負であったこと、および（iii）調時シグナルの２次微分係数が正であったこと、である。これらの基準は、この場合において、定常状態が真に達成された後にのみ生じる調時シグナル時間特性の値および曲率（形状）を定める。したがって、これらの基準による定常状態の検出には、装置または装置を使用する者が、試料が装置に付された時間または装置が計測装置に挿入された時間を知ることを必要とせず、および、特に、あらゆる特定の時間に装置を計測装置に挿入する人員を必要としないということは当業者に理解されよう。
【０１７７】
いったん、前の段落で論じたすべての調時基準が満たされると、計測装置はアッセイシグナルを読み取り、データを処理し、蓄積している較正情報を用いて、血液試料中のＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビンの濃度を決定した。ついで、測定濃度をＬＣＤディスプレーに表示した。装置によって読み取られたときにアッセイが定常状態に達していたことを示すために、最初の読み取りの約１１分後に装置を再び計測装置に挿入し、２回目の読み取りを行った。
その結果を表１５．１に示す。全アッセイ時間を、血液試料の装置への添加と、装置を読み取ったＬＣＤディスプレー上の測定被検体濃度の表示との間の時間として定義した。当該濃度の表示は、定常状態に至ったと装置が結論を下した約１分後に起った。この１分は、装置をスキャンし、濃度を計算し、および結果を表示するために必要とされた。したがって、装置は、定常状態に達したとこを結論付けるために、調時データ取得の約１分間を必要とした。６個のアッセイ装置で測定したＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビンの濃度の平均値および変動係数（Ｃ．Ｖ．）を表１５．２に示す。その平均濃度および濃度Ｃ．Ｖ．ｓは、装置の第１（約１５分）および第２（約２６分）の読み取りと同じであった。これらの結果は、装置の第１の読み取りが定常状態に達していたことを示す。
【０１７８】
【表１】
0004370053.tif 000002
【０１７９】
【表２】
0004370053.tif 000003
【０１８０】
実施例１６  アッセイ完了までの時間を短縮するためのＩＡＣの使用
本実施例は、正規化されたシグナルが元のシグナルより先に定常状態に達するようにイムノアッセイシグナルを正規化するためのＩＡＣの使用を説明する。従って、正規化されたシグナルは、正規化されていないシグナルよりも速くアッセイの完了と被検体濃度の定量を達成する手段を提供する。
ヒトの絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、２つのフローコントロール(高シグナルを有するもの、低シグナルを有するもの)および非特異的結合コントロールのための検出ゾーンを有するイムノアッセイ装置を作成した。１００ｍＩＵのｈＣＧを加えたヒトの血清を装置に添加した。各検出ゾーンからの蛍光を部分改造した蛍光光度計を用いて時間の関数として測定した。蛍光光度計は、実施例１５に開示されている測定に用いられる器機と実質的に同一の光学的成分を有した。
【０１８１】
ＩＡＣおよびｈＣＧ検出ゾーンからの絶対蛍光シグナルを図８に示す。血清試料を装置に添加した後約１５分で、ＩＡＣおよびｈＣＧアッセイシグナルは全て定常状態に達した。ほとんどの場合において、アッセイの完了は、アッセイシグナルが定常状態に達した時であると定義する。それゆえ本実施例においては、１５分後に測定されたアッセイシグナルを予め決定した検量線と比較し、血清試料中のｈＣＧの濃度を得る。装置への血清試料の添加からｈＣＧ濃度の表示までの全アッセイは、１５分よりもわずかに長くかかることになろう。
ＩＡＣシグナルのいずれかを用いてアッセイシグナルを正規化することにより(その方法は次の段落に記載する)、正規化されたシグナルが定常状態に達するまでの時間が劇的に短くなる。正規化シグナル(図９)は約８分で定常状態に達する。正規化シグナルの定常状態値は、正規化されていないシグナルの定常状態値と同一であった。ゆえに、該正規化法は、最終の濃度値を得るのに８分よりわずかに長くかかり、かつ検量線を変更しないアッセイをもたらす。
【０１８２】
方程式１７．５(実施例１７)を用いて、アッセイシグナルを各ＩＡＣに対して正規化した。関数ｆ(方程式１７．４)は、各時間における最終的な定常状態値からのアッセイシグナルの偏差(方程式１７．２；Ａｖｅ(アッセイ)t=∞は本実施例の単一装置から決定した)を各時間における最終的な定常状態値からのＩＡＣシグナルの偏差(方程式１７．１；Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞は本実施例の単一装置から決定した)の関数としてプロットすることにより決定した。得られた曲線をシグマプロットの曲線のあてはめ手順(ジャンデル  サイエンティフィック  バージョン２．０１)を用いて放物関数(parabolic function)と適合させた。その結果、関数ｆは該あてはめにより与えられる係数を有する二次べき級数であった。
【０１８３】
実施例１７：  一つのＩＡＣを用いるアッセイシグナルの正規化のための方程式
本実施例は単一のＩＡＣを用いてアッセイシグナルを正規化するのに用いられる方程式を示す。これらの方程式を定常状態にあるアッセイシグナルとＩＡＣシグナル、および時間と共に変化しているアッセイシグナルとＩＡＣシグナルの両方に適用する。ここで詳説する概念を拡大して２またはそれ以上のＩＡＣの一次結合(linear combination)に適用し、例えば流速と培養時間の両方をモニターする多数のＩＡＣに対してアッセイシグナルを正規化することができる。
【０１８４】
該正規化法は、ＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルの、その各々の平均定常値からの偏差を利用する。平均定常状態値は、正規化を行うアッセイ法およびアッセイ装置と同一のアッセイ法およびアッセイ装置を用いて経験的に測定される。当業者には、これが様々な試料、例えば５人から１００人の個人からの血液を用いて最もよく成し遂げられることがわかるだろう。更に、試料の多様性は、個人からの試料をプールすることにより、例えば血漿、血清または尿プールを作ることにより得ることができる。ＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルの平均を規定するために用いる試料または試料プールが多様であると、正規化手順がテストされる全試料に適用される確率が高まる。だから、複数の測定が平均定常状態シグナルの正確な値を得るためになされるべきである。偏差を次のように定義する：
Δ(ＩＡＣ)i,t＝｛(ＩＡＣ)i,t−Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞｝／Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞
方程式１７．１
Δ(アッセイ)i,t＝｛(アッセイ)i,t−Ａｖｅ(アッセイ)t=∞｝／Ａｖｅ(アッセイ)t=∞                                                  方程式１７．２
式中、Δ(ＩＡＣ)i,tおよび(アッセイ)i,tはそれぞれｉ番目のイムノアッセイ装置に関する時間ｔにおけるＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルの偏差であり、(ＩＡＣ)i,tおよび(アッセイ)i,tはそれぞれ、ｉ番目のイムノアッセイ装置に関する時間ｔにおけるＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルであり、およびＡｖｅ(ＩＡＣ)t=∞およびＡＶｅ(アッセイ)t=∞は、各定常状態(ｔ＝∞)シグナルを十分な数の装置に関して平均化することによりそれぞれ決定される定常状態にある平均したＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルである。平均化に含まれる装置の数は１であってもよく、必要とされる正確さおよび測定の精度に依存する。当業者には、平均化に必要とされる装置の数をどのように決定するかがわかるであろう。
方程式１７．２の代数再配列によって次の方程式を得る。：
Ａｖｅ(アッセイ)t=∞＝｛(アッセイ)i,t｝／｛１＋Δ(アッセイ)i,t｝
方程式１７．３
【０１８５】
平均の定常状態シグナルはアッセイのための較正情報(calibration information)を引き出すのに用いられるため、一般に、いずれの正規化スキームにおいてもその目的は、いずれかの時間ｔにおけるｉ番目の装置のアッセイシグナル(すなわち(アッセイ)i,t)を正規化し、平均の定常状態シグナル(すなわちＡｖｅ(アッセイ)t=∞)を得ることである。試料内の被検体の濃度および期待される平均の定常状態アッセイシグナルが未知であるため、偏差Δ(アッセイ)i,tは一般的には未知である。しかしながら、偏差Δ(アッセイ)i,tは偏差Δ(ＩＡＣ)i,tから計算することができる。ＩＡＣシグナルは被検体の濃度とは無関係であるので、ＩＡＣシグナルに関する期待値は、平均の定常状態値と同一である。それゆえ、ｉアッセイ装置の各々に関して、Δ(ＩＡＣ)i,tはＩＡＣシグナル、(ＩＡＣ)i,tおよび方程式１を用いて予め決定された平均の定常状態ＩＡＣシグナル、Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞から計算することができる。ＩＡＣおよびアッセイは、それらのシグナルが時間および／またはｉ装置全てに相関するように設定する。ＩＡＣとアッセイが相関する場合、定義によりこれらの偏差間には関係が存在する。すなわちΔ(アッセイ)i,tはΔ(ＩＡＣ)i,tの関数ｆである。
Δ(アッセイ)i,t＝ｆ(Δ(ＩＡＣ)i,t)                      方程式１７．４
方程式１７．４を方程式１７．３へ代入し、ｉ番目の装置からの正規化アッセイシグナル、norm(アッセイ)iをＡｖｅ(アッセイ)t=∞と等しいとして、
Norm.(アッセイ)i,t＝｛(アッセイ)i,t｝／｛１＋ｆ(Δ(ＩＡＣ)i,t)｝
方程式１７．５を導く。
【０１８６】
アッセイおよびＩＡＣの偏差に関連する関数ｆが分かれば、方程式１７．５を用いて、多くの装置で平均をとった平均の定常状態値と同一になるようにアッセイシグナルを正規化することができる。実施例を本明細書中に示すが(実施例１６、１８−２１)、その中でｆは一次または二次べき級数のどちらかであり、方程式１７．５(または方程式１７．７)を用いてアッセイ完了までの時間を短縮し(実施例１６)、可変な時間ゲート時間の効果を正規化し(実施例１９)、および様々な被検体の測定の正確さと精度を改善する (実施例１８、２０および２１)。当業者にはｆが多くの関数であり得ることが認識されるであろう。特にｆは、テイラー級数を規定するための基準に従うＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルの偏差間のいずれの関数関係も利用できるような、テイラー級数展開式(Taylor series expansion)であり得る。
方程式１７．４の特殊なケースは、アッセイシグナルとＩＡＣシグナルの偏差が等しいケースである。：
Δ(アッセイ)i,t＝Δ(ＩＡＣ)i,t                          方程式１７．６
この特別なケースにおいて、方程式１７．５は単純な比に約分される。：
Norm(アッセイ)i,t＝｛(アッセイ)i,t／(ＩＡＣ)i,t｝・Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞                                                            方程式１７．７
【０１８７】
実施例１８：  幾人かの異なる個人からの血漿試料間での被検体の測定の再現性を改善するためのＩＡＣの使用
血漿、血清または全血試料中の被検体のイムノアッセイは、たとえ全試料が同一の濃度の被検体を含んだとしても、イムノアッセイの結果が異なる個人からの試料間で変化するマトリックス効果のために問題がある可能性がある。マトリックス効果の原因は多く、イムノアッセイそのものの性格に依存する。一般に、試料の物理的特性(粘度、光学濃度など)および化学的特性(アッセイを妨げる物質)の違いがマトリックス効果に寄与する。マトリックス効果の影響を減じる一つの方法は、ＩＡＣを用いてイムノアッセイを正規化することである。適切に使用するために、マトリックス効果に関連するＩＡＣおよび被検体アッセイの変化は関連していなければならない、すなわち、被検体アッセイの偏差は、関数(実施例１７の方程式１７．４)により、ＩＡＣの偏差と関連していなければならない。本実施例では、時間ゲートコントロールＩＡＣを用いて、幾人かの異なる個人からの血漿試料間での、心臓パネル装置(実施例１５)上でのＣＫＭＢの測定の再現性を正規化して改善する。
【０１８８】
心臓パネル装置(実施例１５)を、２０ｎｇ／ｍｌのＣＫＭＢを添加した異なる個人からの血漿を用いて作動させた。各試料を８つの装置上に流し、結果の平均をとった。無作為に選ばれた９人の個人からの結果を用いて時間ゲートコントロールＩＡＣとＣＫＭＢアッセイの間の関数関係を決定した。偏差Δ(ＩＡＣ)iおよびΔ(アッセイ)iを、方程式１７．１および１７．２からそれぞれ計算した。全測定を定常状態(ｔ＝∞)にて行ったので、下付き文字ｔ＝時間は記載しなかった。下付き文字ｉはｉ番目の血漿試料、すなわち、ｉ番目の個人(ｉ＝１から９)からの血漿試料を意味する。Ａｖｅ(ＩＡＣ)およびＡｖｅ(アッセイ)の値を、それぞれ９つの血漿試料について平均をとった平均のＩＡＣシグナルおよびアッセイシグナルと定義した。それゆえ、各値、Δ(ＩＡＣ)iまたはΔ(アッセイ)iはそれぞれ、全９つの血漿試料で平均を取った平均の時間ゲートコントロールまたはＣＫＭＢアッセイシグナルからの時間ゲートコントロールまたはＣＫＭＢアッセイシグナルのｉ番目の血漿試料に関する偏差を表す。得られたデータ対(Δ(ＩＡＣ)i、Δ(アッセイ)iをプロットし、シグマプロットの曲線のあてはめ手順(ジャンダル  サイエンティフィック)を用いて直線と適合させた。こうして得られた２つの偏差間の関数関係は
Δ(アッセイ)i＝０．３０□Δ(ＩＡＣ)i                    方程式１８．１
であった。
それゆえ、正規化方程式(方程式１７．５)は
Norm(アッセイ)i＝｛(アッセイ)i／｛１＋０．３０・Δ(ＩＡＣ)i｝
方程式１８．２となる。
【０１８９】
被検体測定の再現性に対する正規化の効果を証明するために、４人の個人からの血漿試料に２０ｎｇ／ｍｌのＣＫＭＢを加え、心臓パネル装置上に流した(１つの血漿試料につき８装置からの結果を平均した)。得られた正規化されていない時間ゲートコントロールシグナルと測定されたＣＫＭＢシグナルを表１８．１に示す。測定されたＣＫＭＢシグナルを、方程式１８．２を用いて正規化した。時間ゲートコントロールシグナル偏差Δ(ＩＡＣ)iを、時間ゲートコントロールシグナルを４つの血漿試料について平均をとることによりＡｖｅ(ＩＡＣ)の値を決定する方程式１７．１を用いて計算した。正規化されたＣＫＭＢシグナルを表１８．１に示す。４つの血漿試料について平均をとった、正規化されていない平均のＣＫＭＢシグナルと正規化された平均のＣＫＭＢシグナルは同一である。しかしながら、４つの血漿試料間で計算されたＣ．Ｖ．は、正規化されたＣＫＭＢシグナルに関して劇的に低い。このように、ＣＫＭＢシグナルを正規化するための時間ゲートコントロールＩＡＣの使用は、マトリックス効果を正規化することにより、異なる血漿ドナー間での再現性を劇的に改善した。
【０１９０】
【表３】
0004370053.tif 000004
【０１９１】
実施例１９  抗体試薬を含む試料の培養時間の変動に関するイムノアッセイを修正するためのＩＡＣの使用
イムノアッセイの不正確さまたはエラーの一つの潜在的な原因は、抗体試薬を含む試料を適切な時間(通常は結合平衡が得られるまでの時間)培養するのを間違うことである。他方、いくつかのケースでは、アッセイ完了時間を短くするために培養時間をわざわざ短くすることが望ましい場合もある。どちらの場合においても、アッセイシグナルの培養時間に伴う変動に相関するように培養時間と共に変動するシグナルを示すＩＡＣを、アッセイシグナルを正規化するために使用することができる。正規化されたアッセイシグナルは、抗体試薬を含む試料の培養時間とは実質的に無関係となる。こうして、正規化によりアッセイの精度および正確さが改善され、かつアッセイの時間を短くすることが可能となる。
【０１９２】
抗体試薬を有する試料の培養時間の変動に関するアッセイシグナルを修正するためのＩＡＣの使用を説明するために、一時待機時間(時間ゲート時間)を０から４分で変化させることができる時間ゲートを用いて心臓パネル装置を作成した。ＣＫＭＢ(終濃度５ｎｇ／ｍｌ)、トロポニンＩ(終濃度５ｎｇ／ｍｌ)およびミオグロビン(終濃度５０ｎｇ／ｍｌ)を添加したヒトの全血を装置上に流した。時間ゲート時間を０．０分、１分または４分に合わせた。３０の装置を各時間ゲート時間で作動させた。各時間ゲート時間で作動させた装置に関して得られた平均の時間ゲートコントロールシグナルおよびアッセイシグナルを表１９．１に示す。
【０１９３】
時間ゲートコントロールシグナルおよびアッセイシグナルは全て、時間ゲート時間と全て相関している。すなわち、これらのシグナルは０．０分の時間ゲート時間においては、より長い時間ゲート時間におけるよりも低い。時間ゲートコントロールは、反応室中で抗モルフィン抗体がＦＥＴＬ−モルフィンに結合してシグナル発生性コンプレックスを形成することに関わる。この反応の速度は、時間ゲート時間が１分未満である場合、反応が完了しないほど十分遅いものである。同様に、ＦＥＴＬ上において、ＣＫＭＢ，トロポニンＩおよびミオグロビンがそれらの各抗体に結合してシグナル発生性コンプレックスを形成する速度は、時間ゲート時間が１分未満である場合、これらの反応が完了しないほど十分遅いものである。ＩＡＣシグナルを用いて全時間ゲート時間に渡る被検体アッセイシグナルの最良の正規化を得るためには、ＩＡＣシグナル発生性コンプレックスの形成に関連する結合速度は、被検体アッセイシグナル発生性コンプレックスの形成に関連する結合速度とできる限り類似しているべきである。
表１９．１の被検体アッセイシグナルは実施例１７の方法を用いてＩＡＣシグナルで正規化した。正規化方程式は次の通りであった。：
Norm（アッセイ)t＝｛(アッセイ)t｝／｛１＋ｍ□Δ(ＩＡＣ)t｝
方程式１９．１
【０１９４】
下付き文字ｔは、本実施例中の時間ゲート時間を意味する。個々の装置に関しては分析しなかったので、下付き文字ｉを記載しなかった。偏差Δ(ＩＡＣ)tおよびΔ(アッセイ)tは、Ａｖｅ(ＩＡＣ)t=∞およびＡｖｅ(アッセイ)t=∞を１分および４分の時間ゲート時間に関する値の平均から計算した方程式１７．１および１７．２を用いてそれぞれ決定した。方程式１２の傾きは、データ対(Δ(ＩＡＣ)t、Δ(アッセイ)t)をプロットし、シグマプロットの曲線のあてはめ手順を用いて得られた線に適合させることにより決定した。傾きは次の通りである。：
ＣＫＭＢ：ｍ＝１．０
トロポニンＩ：ｍ＝０．４３
ミオグロビン：ｍ＝０．３４
正規化されたアッセイシグナルを表１９．１に示す。正規化は、１分または４分の時間ゲートに関して得られた最終の平衡値と類似するように０分の時間ゲートに関して得られたシグナルを有意に修正する。こうして、正規化により、時間ゲート時間の不正確さが要因である場合にアッセイの精度をよりよくすることが可能となり、また、時間ゲートの必要性を排除することによりアッセイ時間をより早くすることも可能となる。
【０１９５】
【表４】
0004370053.tif 000005
【０１９６】
実施例２０：  シクロスポリンアッセイにおけるアッセイの精度と正確さを改善するためのＩＡＣの使用
本実施例は、アッセイの精度(Ｃ．Ｖ．)および正確さを改善するための、全血を用いて作動させたシクロスポリンイムノアッセイ装置からのアッセイシグナルを正規化するためのＩＡＣの使用を説明する。次の３つの点を扱う：(ｉ)一人の血液ドナーからの試料中でのシクロスポリン測定の精度；(ii)４人の異なる血液ドナーからの血液中でのシクロスポリン測定の正確さ；(iii)同一の血液ドナーからの異なるヘマトクリット値の血液中でのシクロスポリン測定の正確さと精度。
４人の異なる血液ドナーからの全血にシクロスポリン(ＣＳ)を、最終全濃度が０ｎｇ／ｍｌＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌＣＳまたは８００ｎｇ／ｍｌＣＳになるように添加した。添加された各血液試料を、シクロスポリンおよびＩＡＣのための検出ゾーンを有する約１８のイムノアッセイ装置(実施例１０および１１)上に流した。アッセイ装置を計測器に挿入し、血液を加えてから約２０分後に計測した。
【０１９７】
５０ｎｇ／ｍｌまでＣＳを添加した血液ドナー試料を用いて作動させた各装置からの積分したアッセイシグナルおよびＩＡＣシグナルを表２０．１に示す。次の方程式を用いてアッセイシグナルおよびＩＡＣシグナルから計算した正規化されたアッセイシグナルも表に示す。：
正規化アッセイシグナル＝(アッセイシグナル/IACシグナル)×１０００
方程式２０．１
正規化されたアッセイシグナルのＣ．Ｖ．は、正規化されていないアッセイシグナルのＣ．Ｖ．よりも有意に低い。
添加された全シクロスポリン濃度におけるシクロスポリン測定の結果を、表２０．２にまとめる。個々の試料(すなわち、個々のドナーからの血液中の各シクロスポリン濃度)に関して、この表は、試料を用いて作動させた１８装置について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化されたアッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。さらにこの表は、４人のドナーからの血液試料について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化されたアッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．(ドナー間のＣ．Ｖ．)を示す。データは、テストされた各ドナーおよび各シクロスポリン濃度に関して、正規化されたアッセイシグナルのＣ．Ｖ．が正規化されていないシグナルのＣ．Ｖ．よりも少ないことを示す。さらに、正規化されたシグナルのドナー間のＣ．Ｖ．は、正規化されていないシグナルのドナー間のＣ．Ｖ．よりも有意に少ない。ゆえに、データは、ＩＡＣシグナルを用いたアッセイシグナルの正規化が一試料(血液ドナー)内でのシクロスポリン測定の精度を有意に改善すること、および正規化がシクロスポリン測定におけるマトリックス(異なる血液ドナーの試料)の効果を減じるか、若しくは排除することを示す。
【０１９８】
シクロスポリン測定の正確さおよび精度に対する正規化の効果を、様々なヘマトクリット値の血液試料についても調査した。一人の血液ドナーからの血液のヘマトクリットは、血液を遠心分離して、同一ドナーからの血漿を適当に除去するか、または添加することにより３レベルに調整した。３つのヘマトクリットを、３つのシクロスポリン濃度：０ｎｇ／ｍｌＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌＣＳおよび４００ｎｇ／ｍｌＣＳにおいてテストした(低＝２９％、中＝３７％および高＝４５％)。結果を表２０．３に示す。個々の試料(すなわち、各ヘマトクリット値の血液における各シクロスポリン濃度)に関して、この表は、試料を用いて作動させた１８装置について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化されたアッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。さらにこの表は、低、中および高ヘマトクリット試料について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化されたアッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。データは、テストされた各ヘマトクリットおよび各シクロスポリン濃度に関して、正規化されたアッセイシグナルのＣ．Ｖ．が正規化されていないシグナルのＣ．Ｖ．よりも少ないことを示す。さらに、低、中および高ヘマトクリット試料からのシグナルを平均することにより計算されるＣ．Ｖ．は、アッセイシグナルの正規化により有意に低下する。それゆえ、データはＩＡＣシグナルを用いたアッセイシグナルの正規化が一試料(ヘマトクリット)内でのシクロスポリン測定の精度を有意に改善すること、および正規化が、テストされたヘマトクリットの範囲に渡るヘマトクリットのシクロスポリン測定への効果を実質的に排除することを示す。
総じて、本実施例で提示されているデータの全ては、ＩＡＣシグナルを用いたアッセイシグナルの正規化がシクロスポリン測定の精度および正確さを有意に改善することを示す。
【０１９９】
【表５】
0004370053.tif 000006
【０２００】
添加された全シクロスポリン濃度におけるシクロスポリン測定の結果を表２０．２にまとめる。それぞれの個々の試料（すなわち、それぞれの個々のドナーからの血液中の各シクロスポリン濃度）に関して、この表は、試料を用いて作動された１８装置について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化アッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。さらにこの表は、４人のドナーからの血液試料について平均をとったＩＡＣシグナルおよび正規化されたアッセイシグナル（ドナー間のＣ．Ｖ．）の平均およびＣ．Ｖ．を示す。データは、正規化されたアッセイシグナルのＣ．Ｖ．がテストされた各ドナーおよび各シクロスポリン濃度に関する正規化されていないシグナルのＣ．Ｖ．よりも少ないことを示す。さらに、正規化されたシグナルのドナー間のＣ．Ｖ．は正規化されていないシグナルのドナー間のＣ．Ｖ．よりも有意に低い。それゆえ、データはＩＡＣシグナルを用いたアッセイシグナルの正規化が一試料（血液ドナー）内のシクロスポリン測定の精度を有意に改善すること、および正規化がシクロスポリン測定へのマトリックス（異なる血液ドナー試料）の効果を減じるか、若しくは排除することを示す。
【０２０１】
【表６】
0004370053.tif 000007
【０２０２】
シクロスポリン測定の正確さと精度への正規化の効果を、様々なヘマトクリット値の血液試料についても調査した。一人の血液ドナーからの血液のヘマトクリットを、血液を遠心分離して同一のドナーからの血漿を適当に除去するか、または添加することにより３つのレベルに調整した。３つのシクロスポリン濃度：０ｎｇ／ｍｌＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌＣＳおよび４００ｎｇ／ＣＳにおいて、３つのヘマトクリットをテストした（低＝２９％、中＝３７％および高＝４５％）。結果を表２０．３に示す。個々の試料（すなわち、各ヘマトクリット値での血液中の各シクロスポリン濃度）に関して、この表は、試料を用いて作動した１８装置について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび正規化アッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。さらにこの表は、低、中、および高ヘマトクリット試料について平均をとったアッセイシグナル、ＩＡＣシグナルおよび、正規化アッセイシグナルの平均およびＣ．Ｖ．を示す。データは、正規化されたアッセイシグナルのＣ．Ｖ．が、テストされた各ヘマトクリットおよび各シクロスポリン濃度に関する正規化されていないシグナルのＣ．Ｖ．より少ないことを示す。さらに、低、中および高ヘマトクリット試料からのシグナルを平均することにより計算されたＣ．Ｖ．は、アッセイシグナルの正規化により有意に低くなる。データはそれゆえ、ＩＡＣシグナルを有するアッセイシグナルの正規化が一試料（ヘマトクリット）中でのシクロスポリン測定の精度を有意に改善すること、および正規化がテストされたヘマトクリットの範囲にわたってシクロスポリン測定へのヘマトクリットの効果を実質的に排除することを示す。
総じて、本実施例で提示されたデータの全ては、ＩＡＣシグナルを用いたアッセイシグナルの正規化がシクロスポリン測定の精度と正確さを有意に改善することを示す。
【０２０３】
【表７】
0004370053.tif 000008
【０２０４】
実施例２１  ＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビンに関するアッセイの精度を改善するためのＩＡＣの使用
ＣＫＭＢ(５ｎｇ／ｍｌ)、トロポニンＩ(２ｎｇ／ｍｌ)およびミオグロビン(７０ｎｇ／ｍｌ)を添加したヒトの血漿を、心臓パネルイムノアッセイ装置(２３装置)上でこれらの被検体に関してアッセイし、前記実施例に記載のごとく計測器中で読んだ。各イムノアッセイ装置中で測定されたＣＫＭＢ、トロポニンＩおよびミオグロビンに関するアッセイシグナルを表２１．１に示す。フローコントロールシグナルおよびアッセイシグナルから方程式１７．７(実施例１７)を用いて計算した正規化されたアッセイシグナルも表に示す。正規化されたシグナルのＣ．Ｖ．は、正規化されていないシグナルのＣ．Ｖ．よりも有意に低い。これより、データは、ＩＡＣフローコントロールを用いたアッセイシグナルの正規化がＣＫＭＢ、トロポニンおよびミオグロビンアッセイの精度を改善することを示す。
【０２０５】
【表８】
0004370053.tif 000009
【０２０６】
前に記載した発明の様々な態様は、ハードウエア、ソフトウエアまたはそれらの組み合わせを用いて実施してもよく、また、コンピュータシステムまたは他の処理システム中で実施してもよい。実際、一態様においては、これらのエレメントはそれに関して記載された相関性(functionality)を実行することができるコンピュータシステムを用いて実施する。コンピュータシステムの一例７０２を図１８に示す。コンピュータシステム７０２は、プロセッサー７０４のような１またはそれ以上のプロセッサーを含む。プロセッサー７０４はコミュニケーションバス７０６に連結される。様々なソフトウェアの態様を、この例のコンピュータシステムに関して記載する。この記載を読んだ後は、当業者には、他のコンピュータシステムおよび／またはコンピュータアーキテクチャーを用いて本発明を実施する方法が明らかになるであろう。
【０２０７】
コンピュータシステム７０２は、主記憶装置７０８、好ましくは等速読出し記憶装置(ＲＡＭ)をも含み、二次記憶装置７１０を含むこともできる。二次記憶装置７１０は例えば、ハードディスクドライブ７１２および／またはフロッピーディスクドライブ、磁気タイプドライブ、光学ディスクドライブなどによって代表される着脱式記憶ドライブ７１４を含むことができる。着脱式記憶ドライブ７１４は、よく知られる方法で着脱式記憶媒体７１８から読み取る、および／または着脱式記憶媒体７１８へ記録する。着脱式記憶媒体７１８は、フロッピーディスク、磁気テープおよび光学ディスクなどによって代表され、着脱式記憶媒体７１４により読みとられるか、または記録される。理解されるように、着脱式記憶媒体７１８には、内部にコンピュータソフトウェアおよび／またはデータが記憶された、コンピュータ利用可能な記憶媒体が含まれる。
【０２０８】
別の態様においては、二次記憶装置７１０は、コンピュータプログラムまたはその他の命令をコンピュータシステム７０２にロードさせる他の類似の手段を含んでいてもよい。そのような手段は例えば、着脱式記憶ユニット７２２およびインターフェース７２０を含むことができる。その例として、(ビデオゲーム装置に見られるような)プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース、(ＥＰＲＯＭ、またはＰＲＯＭのような)着脱式記憶装置チップおよび連想ソケット、およびその他の着脱式記憶ユニット７２２並びにソフトウェアおよびデータを着脱式記憶ユニット７１８からコンピュータシステム７０２に移動させるインターフェース７２０を含むことができる。
【０２０９】
コンピュータシステム７０２は、コミュニケーションインターフェース７２４を含むこともできる。コミュニケーションインターフェース７２４はソフトウェアおよびデータをコンピュータシステム７０２と外部の装置の間で移動させる。コミュニケーションインターフェース７２４の例には、モデム、(イーサネットカードのような)ネットワーク接続器、コミュニケーションポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどを含むことができる。コミュニケーションインターフェース７２４経由で運ばれたソフトウェアおよびデータは、コミュニケーションインターフェース７２４により受信されることができる電子的シグナル、電磁気的シグナル、光学的シグナルまたはその他のシグナルの形態になっている。これらのシグナルはチャンネル７２８経由で、コミュニケーションインターフェースに提供される。このチャンネル７２８はシグナルを運搬し、無線媒体、ワイヤーまたはケーブル、光ファイバー、またはその他の通信媒体を用いて実施に供することができる。チャンネルのいくつかの例には、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンク、ネットワークインターフェースおよび他のコミュニケーションチャンネルを含むことができる。
【０２１０】
本明細書中、「コンピュータプログラム媒体」および「コンピュータに利用できる媒体」という用語は、一般に、着脱式記憶装置７１８、ハードディスクドライブ７１２にインストールされたハードディスクおよびチャンネル７２８上のシグナルのような媒体を意味するのに用いられる。これらのコンピュータプログラム製品は、コンピュータシステム７０２にソフトウェアを提供するための手段である。
コンピュータプログラム(コンピュータ制御論理とも呼ばれる)は、主記憶装置および／または二次記憶装置７１０に記憶される。コンピュータプログラムは、コミュニケーションインターフェース７２４経由で受信することもできる。そのようなコンピュータプログラムが命令を実行すると、コンピュータシステム７０２は本明細書中に論じられている本発明の特徴を実行するのを可能にする。特に、コンピュータプログラムが命令を実行すると、プロセッサー７０４は本発明の特徴を実施するのを可能にする。従って、そのようなコンピュータプログラムはコンピュータシステム７０２のコントローラーに相当する。
【０２１１】
エレメントをソフトウェアを用いて実施する一態様において、ソフトウェアは、コンピュータプログラム製品に記憶させ、かつ、着脱式記憶ドライブ７１４、ハードドライブ７１２またはコミュニケーションインターフェース７２４を用いてコンピュータシステム７０２にロードしてもよい。制御論理(ソフトウェア)がプロセッサー７０４により命令を実行すると、プロセッサ７０４によって本明細書中に記載されるような発明の作用が実行される。
他の態様においては、エレメントは、例えば特定用途向けＩＣ(ＡＳＩＣ)のようなハードウェアコンポーネントを用いてハードウェア内で主に実施する。この明細書中に記載する作用を実施するためのハードウェア状機器の実施は当業者には明らかであろう。しかし、さらに他の態様においては、エレメントはハードウェアとソフトウェアの両方の組み合わせを用いて実施する。
【０２１２】
本発明は当業者が実施して使用することができるように詳細に記載して例示したが、本発明の目的および範囲からはずれることのない様々な他の方法、変更および改善が明らかであろう。
本発明の対象を実行して記載した目的および利益並びに本発明の固有の目的および利益を達成するように本発明を適合させることは当業者には容易に理解される。上述した本発明の方法、装置、コンピュータプログラム可能な媒体、アッセイ装置、およびキットは好ましい態様の代表例であり、具体例であり、本発明の範囲を制限するものではない。これらの変更およびその他の使用法は当業者には明らかであろう。これらの変更態様も本発明の技術的思想に包含され、請求項の範囲により規定される。
様々な置き換えおよび変更を、本発明の範囲および技術的思想から外れることなく本明細書に開示されている発明に対して行ってもよいことは当業者には容易に理解されるであろう。
【０２１３】
本明細書中に記載される全ての特許および刊行物は、本発明の属する分野の当業者のレベルを示すものである。全ての特許および刊行物は、特許および刊行物に関して特別に具体的に指定した範囲内において、本明細書の一部を成すものである。
【０２１４】
本明細書中に適当なものとして例示的に記載されている発明は、本明細書中に特に開示されていない１または複数のエレメントあるいは１または複数の限定がない態様で実施してもよい。ゆえに、例えば、本明細書中の各例において、「含む」、「実質的に〜から成る」および「〜から成る」のいずれの用語も他の２つの用語のどちらかで置きかえてもよい。用いられている用語および表現は説明のための用語(terms of description)として用いられ、限定のための用語ではない。そのような用語および表現の使用においては、記載された特徴と均等のものまたはその一部を除外されるものではなく、様々な変更が権利請求されている本発明の範囲内で可能である。ゆえに、本発明は好ましい態様および図表的特徴により特に開示したが、明細書中に開示された概念の変更および修正は当業者により成されてもよく、そのような変更および修正は請求の範囲により規定されるような本発明の範囲内に包含される。
【０２１５】
さらに、本発明の特徴または観点をマーカッシュグループにより記載する場合、発明はそれにより、マーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループのいずれかによって記載されることが当業者には理解されるであろう。例えば、Ｘが臭素、塩素およびヨウ素からなる群から選択されるように記載される場合、Ｘが臭素である請求項およびＸが臭素および塩素である請求項が少なくとも記載される。
他の態様は特許請求の範囲の中に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＫＭＢアッセイにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図２】  トリポニンＩアッセイにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図３】  ミオグロビンアッセイにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図４】  タイムゲートコントロールにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図５】  フローコントロールにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図６】  非特異的結合コントロールにおける積分化蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図７】  調時シグナルに関する蛍光の経時変化を示すグラフである。
【図８】  ｈＣＧに関する蛍光シグナルの経時変化を示すグラフである。
【図９】  ｈＣＧに関する正規化蛍光シグナルの経時変化を示すグラフである。
【図１０】  診断用レーン内における特異的時間ゾーンに関する位置と蛍光性シグナルの関係を示すグラフである。
【図１１】  診断用レーン内におけるゾーンの決定と確認に関する位置と蛍光性シグナルの関係を示すグラフである。
【図１２】  二次方向性濾過機能の効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１３】  時間定数の関数としての濾過効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１４】  放物線状適合機能の関数としての濾過効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１５】  最大許容変化速度関数としての濾過効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１６】  拒絶ゾーンにおける濾過効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１７】  二次導関数解析による濾過効果に関する位置と蛍光性シグナルとの関係を示すグラフである。
【図１８】  本発明の種々の態様に利用してもよいコンピューターシステムの一例を示すブロック図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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