(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、かつ（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。
【請求項２】
（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ又はアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。
【請求項３】
（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの細胞内の活性、並びに、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はアスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。
【請求項４】
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼの細胞内の活性が増強されている請求項３記載の細菌。
【請求項５】
アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼがエシェリヒア属細菌由来であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼが、存在する場合にはエシェリヒア属細菌由来であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素がエシェリヒア属細菌又はブレビバクテリウム属細菌由来であり、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼがブレビバクテリウム属細菌由来である請求項３又は４記載の細菌。
【請求項６】
細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、前記酵素の遺伝子を有するプラスミドの導入により増強されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７】
細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、染色体上での前記酵素の遺伝子のコピー数を増大させることにより増強されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８】
細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、染色体上の前記酵素の遺伝子のプロモーター配列を改変することにより増強されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項９】
ジヒドロピコリン酸合成酵素及びアスパルトキナーゼの細胞内の活性が、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素、及び、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することにより増強され、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により増強されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジンの製造法、及びこの製造法に用いる微生物に関するものである。
背景技術
従来、発酵法によりＬ−リジンを製造する場合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その多くはＳ−２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属している。また、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる等、アミノ酸の生産を増加させる種々の技術が開示されている。
例えば、エシェリヒア属細菌については、特開昭５６−１８５９６号公報、米国特許第４，３４６，１７０号およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，ｐ２２７−２３１（１９８２）においてジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性を増強した株を用いたＬ−リジンの製造法が示されている。また、コリネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳを導入したエシェリヒア属細菌を用いたＬ−リジンの製造法が、大韓民国特許公告９２−８３８２号に示されている。さらに、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ、ジヒドロジピコリン酸レダクターセをコードするＤＮＡ、及び、コリネ型細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドにより形質転換した株を用いたＬ−リジンの製造法が国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に示されている。
ブレビバクテリウム属細菌については、細胞内のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの活性の増強によりＬ−リジン生産性が改善されることが国際公開第ＷＯ  ９５／１１９８５号に示されている。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ単独の活性を増強した株を用いたＬ−リジンの製造法及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ単独の活性を増強した株を用いたＬ−リジンの製造法がそれぞれ特開昭６０−８７７８８及び特公平６−１０２０２８に示されている。
発酵法による工業的なアミノ酸の製造においては、大量生産が行われるため、たとえ数％の収率の向上であっても、工業的価値は大きく、従って、収率の向上が、その程度の大小にかかわらず望まれている。
発明の開示
本発明は、従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ−リジンの製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の性質を持つエシェリヒア属細菌において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強したとき、及び、この酵素に加えて特定の酵素又は酵素群の活性を増強したときに、その細菌によるＬ−リジンの生産が改善されることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
第１の態様として、（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、かつ（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌、
第２の態様として、（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ又はアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌、及び、
第３の態様として、（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの細胞内の活性、並びに、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はアスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌を提供する（以下、上記の三つの態様の細菌をまとめて「本発明細菌」ともいう）。
本発明細菌においては、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることが好ましい。
本発明細菌においては、また、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼがエシェリヒア属細菌由来であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼが、存在する場合にはエシェリヒア属細菌由来であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素がエシェリヒア属細菌又はブレビバクテリウム属細菌由来であり、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼがブレビバクテリウム属細菌由来であることが好ましい。
本発明細菌においては、細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、下記のいずれか又はそれらの組み合わせにより増強されていることが好ましい。
（１）酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入すること。
（２）染色体上での酵素の遺伝子のコピー数を増大させること。
（３）染色体上の酵素の遺伝子のプロモーター配列を改変すること。
さらに、本発明細菌においては、ジヒドロピコリン酸合成酵素及びアスパルトキナーゼの細胞内の活性が、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素、及び、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することにより増強され、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により増強されていることが好ましい。
本発明は、また、本発明細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法（以下、「本発明製造法」ともいう）を提供する。
発明を実施するための最良の形態
＜１＞本発明細菌
本発明細菌は、（１）ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、かつ（２）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているエシェリヒア属細菌であって、さらに、以下の酵素の細胞内の活性が増強されている細菌である。
（１）アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、
（２）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及び、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（以下、「トランスヒドロゲナーゼ」ともいう）もしくはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、又は、
（３）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びトランスヒドロゲナーゼ、並びに、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼもしくはアスパルターゼ。
本発明細菌は、好ましくは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼの細胞内の活性がさらに増強されているエシェリヒア属細菌である。
本発明細菌は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることが好ましい。
本明細書において、「細胞内の活性が増強される」とは、野生株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株）又は親株（本発明において特定された組み合わせの酵素の全ての細胞内の活性が増強されていない株）に比べて、細胞内の酵素活性が上昇していることを意味し、野生株又は親株が有していない酵素活性を有することも包含する。なお、上記の各々の酵素の活性の測定法は公知であり、細胞内の活性の増強は、当業者であれば容易に確認できる。
細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
先ず、酵素の発現量を上昇させる手段が挙げられる。
酵素の発現量を増す手段としては、具体的には、以下の手段が挙げられる。
（１）酵素の遺伝子を有するプラスミドの導入
プラスミドとしては、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターを用いることができる。導入の方法は公知のものでよい。すなわち、このベクターに該遺伝子を挿入し、このベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。このベクターはマルチコピー型のプラスミドであることが好ましい。
各遺伝子は、同一のプラスミドに保持されていてもよいし、別々のプラスミドに保持されていてもよい。また、遺伝子の一部が同一のプラスミドに保持されていてもよい。複数のプラスミドを用いた場合には、これらのプラスミドが共に安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するプラスミドを用いることが好ましい。尚、各遺伝子の導入の順序は問わない。
（２）染色体上での酵素の遺伝子のコピー数の増大
Ｍｕファージ等を用いて染色体ＤＮＡ上のＤＮＡを増幅することによりコピー数を増加させることができる。
染色体ＤＮＡ上のＤＮＡは、エシェリヒア属細菌が本来的に有するものであってもよいし、トランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，４１７（１９８３））、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．（１９７２））を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んだものであってもよい。
（３）酵素の遺伝子のプロモーター配列の改変
プロモーター配列を改変し、遺伝子の転写量を増加させ、これにより発現量を上昇させることができる。たとえばプロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化をおこない下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃ，ｔｒｃ，ＰＬその他のエシェリヒア属細菌において機能するプロモーターを新たに導入してもよい。あるいは、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーター配列は、染色体上の酵素の遺伝子のもの及びプラスミド上の酵素の遺伝子のもののいずれでもよいが、染色体上の酵素の遺伝子のものであることが好ましい。染色体ＤＮＡへのプロモーター等の遺伝子の導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
上記の酵素の遺伝子の由来は特に限定されず、エシェリヒア属細菌において、遺伝子が発現可能であり、そして遺伝子産物が機能可能である限り、種々の由来のものを用いることができる。
以下に、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−リジン生合成系遺伝子及びトランスヒドロゲナーゼ遺伝子、並びにブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムのジヒドロジピコリン酸合成酵素及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の取得法を例示する。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）は、この遺伝子を有するプラスミドｐＳ２（Ｓａｂｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３１，２７９（１９８４））、あるいはｐＴ２から得ることができる。ｐＳ２をＡａｔＩＩとＡｆｌＩＩで切断することにより、ｐｐｃを有するＤＮＡ断片が得られる。また、ｐＴ２をＳｍａＩとＳｃａＩで切断することによってもｐｐｃを有するＤＮＡ断片を得ることができる。ｐＴ２を保持するＥ．ｃｏｌｉ  Ｆ１５株（ＡＪ１２８７３）は、１９９３年７月１５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１３７５２の受託番号のもとで寄託され、１９９４年７月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７３２の受託番号が付与されている。
アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）は、既知のｌｙｓＣの塩基配列（Ｃａｓｓａｎ，Ｍ．，Ｐａｒｓｏｔ，Ｃ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｐａｔｔｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０５２（１９８６））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号５及び６）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）は、この遺伝子を有するプラスミドｐＡＤ２０（Ｈａｚｉｚａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１，３７９（１９８２））から得られる。ｐＡＤ２０をＡｓｅＩとＣｌａＩで切断すると、ａｓｄを有するＤＮＡ断片が得られる。
ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（ｄａｐＡ）は、既知のｄａｐＡの塩基配列（Ｒｉｃｈａｕｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２９７（１９８６））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号１及び２）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）は、既知のｄａｐＢの塩基配列（Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１４８２９（１９８４））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号９及び１０）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺伝子（ｄａｐＤ）は、既知のｄａｐＤの塩基配列（Ｒｉｃｈａｕｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１４８２４（１９８４））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号１５及び１６）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（ｄａｐＥ）は、既知のｄａｐＥの塩基配列（Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５２６５（１９９２））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号１７及び１８）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
アスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）は、既知のａｓｐＡの塩基配列（Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７（２），５４７−５５７（１９８６））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、本明細書配列表の配列番号５及び６）を用いたＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｎｔＡＢ）は、既知のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（Ｄ．Ｍ．Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，６４７−６５３（１９８６））に基づいて調製することができる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、トランスヒドロゲナーゼは２つのサブユニットからなり、各々ｐｎｔＡ、ｐｎｔＢによってコードされている（前掲、Ｄ．Ｍ．Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）ので、その双方を調製する（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１１９８５号参照）。
また、ｐｎｔＡＢを含むプラスミドから得ることができる。ｐｎｔＡＢを含むプラスミドとしては、国際公開第ＷＯ  ９５／１１９８５号に記載のプラスミドｐＭＷ：：ＴＨＹが挙げられる。同プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＣ１０６１株のｐｎｔＡ及びｐｎｔＢを含む３．０ｋのＤＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＭＷ１１８のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ断片を連結することにより得られた組換えプラスミドである。ｐＭＷ：：ＴＨＹを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、ＡＪ１２９２９株と命名され、１９９３年１０月４日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−００４６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３８９０として寄託され、１９９４年９月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７９８の受託番号が付与されている。
ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムのジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（ｄａｐＡ）は、既知のｄａｐＡの塩基配列（Ｂｏｎａｓｓｉｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ａ．Ｒ．，１８（２１），６４２１（１９９０））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、本明細書配列表の配列番号３及び４）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムのジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）は、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のｄｄｈの既知の塩基配列（Ｉｓｈｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，３９１７（１９８７））をもとに作成した２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号１１及び１２）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することによって得られる。
また、細胞内の活性を増強する手段として、酵素の比活性を上昇させる手段が挙げられる。この手段は、酵素の発現量を上昇させる手段と組み合わせてもよい。
酵素の比活性を上昇させる手段としては、比活性が上昇する変異を導入した酵素を保持させること、酵素がフィードバック阻害を受ける場合、フィードバック阻害を解除した酵素を保持させることなどが挙げられる。
フィードバック阻害が解除された酵素としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤＤＰＳ）及びＬ−リジンフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼ（ＡＫ）が挙げられる。
「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された」とは、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味し、完全に解除されている必要はない。また、エシェリヒア属細菌の他の生物由来の酵素も、それがその生物の野生型のものであるか変異型のものであるかに拘わらず、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害の程度がエシェリヒア属細菌由来の野生型酵素よりも低ければ、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された酵素に包含される。従って、ブレビバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳのように、本来的にＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素も包含される。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害の程度は、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号の実施例１及び２に記載の方法など公知の方法によって評価することができる。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＤＤＰＳ（非感受性ＤＤＰＳ）及びＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫ（非感受性ＡＫ）としては、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号及び特開平１０−１１３１８３に記載されたものが挙げられる。
すなわち、非感受性ＤＤＰＳの例としては、野生型ＤＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。野生型ＤＤＰＳとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＤＰＳが挙げられる。ＤＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異の例としては、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号４に示されるＤＤＰＳのアミノ酸配列中、ＤＤＰＳのＮ−末端から
▲１▼８１番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはバリン残基）に置換させる変異、
▲２▼１１８番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、
▲３▼８１番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはバリン残基）に置換させかつ１１８番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、
が挙げられる。種や株の間で、活性に影響を与えない相違がアミノ酸配列にあり得ることはよく知られており、上記特定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は当業者であれば容易に認識できる。
非感受性ＤＤＰＳの他の例としては、コリネ型細菌（例えばブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム）由来のＤＤＰＳ（Ｃｒｅｍｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３４，３２２１−３２２９（１９８８））が挙げられる。
非感受性ＤＤＰＳを保持させる方法としては、非感受性ＤＤＰＳをコードするＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することが挙げられる。
非感受性ＤＤＰＳをコードするＤＮＡの例としては、野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＤＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。
以下、エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳを例にとって非感受性ＤＤＰＳをコードするＤＮＡ（非感受性ＤＤＰＳ遺伝子）の取得方法について説明するが、他の生物由来のＤＤＰＳについても同様である。また、他の生物由来の野生型ＤＤＰＳが非感受性ＤＤＰＳであれば、それをコードするＤＮＡをそのまま用いることができる。
野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとしては、エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするものであれば特に制限されないが、具体的には国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さらに具体的には同配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２７２〜１１４７で表される配列が挙げられる。これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、非感受性ＤＤＰＳをコードするＤＮＡである。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持するＤＤＰＳのアミノ酸配列がわずかに相異することが予想されるが、このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも非感受性ＤＤＰＳ遺伝子に含まれる。
このような非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を取得する方法の例は以下の通りである。まず、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで非感受性ＤＤＰＳを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を保持している。また、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで非感受性ＤＤＰＳを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を保持している。
野生型ＤＤＰＳを生産する微生物を変異処理し、非感受性ＤＤＰＳを生産する変異株を創成した後、該変異株から非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を取得してもよい。あるいは、野生型遺伝子が連結されている組換えＤＮＡが導入されている形質転換体を変異処理し、非感受性ＤＤＰＳを生産する変異株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれば、同ＤＮＡ上に非感受性ＤＤＰＳ遺伝子が創成される。
ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ４−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
上記野生型ＤＤＰＳ遺伝子あるいは他の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡの供与菌としては、いかなるエシェリヒア属に属する微生物を用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１２０８，ｔａｂｌｅ  １）にあげられるものが利用できる。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株や、ＭＣ１０６１株などがあげられる。ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＤＤＰＳ遺伝子を含むＤＮＡが取得できる。
非感受性ＡＫの例としては、野生型ＡＫのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。野生型ＡＫとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のアスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）が挙げられる。ＡＫＩＩＩのＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号８に示されるＡＫＩＩＩのアミノ酸配列中、ＡＫＩＩＩのＮ−末端から
（イ）３２３番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させる変異、
（ロ）３２３番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させかつ４０８番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させる変異、
（ハ）３４番目のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはシステイン残基）に置換させかつ３２３番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させる変異、
（ニ）３２５番目のロイシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはフェニルアラニン残基）に置換させる変異、
（ホ）３１８番目のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異、
（ヘ）３１８番目のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させかつ３４９番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはメチオニン残基）に置換させる変異、
（ト）３４５番目のセリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはロイシン残基）に置換させる変異、
（チ）３４７番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはメチオニン残基）に置換させる変異、
（リ）３５２番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異、
（ヌ）３５２番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させかつ３６９番目のセリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはフェニルアラニン残基）に置換させる変異、
（ル）１６４番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはリジン残基）に置換させる変異、
（ヲ）４１７番目のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させかつ４１９番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、
が挙げられる。また、３２３番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させかつ３１８番目のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異（特開平１０−１１３１８３）が挙げられる。種や株の間で、活性に影響を与えない相違がアミノ酸配列にあり得ることはよく知られており、上記特定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は当業者であれば容易に認識できる。
非感受性ＡＫの他の例としては、コリネ型細菌由来変異型ＡＫ（特開平６−６２８６６）が挙げられる。
非感受性ＡＫを保持させる方法としては、非感受性ＡＫをコードするＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することが挙げられる。
非感受性ＡＫをコードするＤＮＡの例としては、野生型ＡＫをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＡＫのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。
以下、エシェリヒア属細菌由来のＡＫＩＩＩを例にとって非感受性ＡＫをコードするＤＮＡの取得方法について説明するが、他の生物由来のＡＫについても同様である。また、他の生物由来の野生型ＡＫが非感受性ＡＫであれば、それをコードするＤＮＡをそのまま用いることができる。
野生型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡとしては、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来のＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡが挙げられ、具体的には国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらには同配列番号７に示される塩基配列のうち、塩基番号５８４〜１９３０で表される配列が挙げられる。尚、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＫＩＩＩは、ｌｙｓＣ遺伝子にコードされている。
これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡである。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫＩＩＩのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも変異型ＡＫＩＩＩ遺伝子に含まれる。例えば、後記実施例２で得られた野生型ｌｙｓＣ遺伝子の塩基配列（国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号７）は、既に発表されているＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＪＣ４１１株のｌｙｓＣの配列（Ｃａｓｓａｎ，Ｍ．，Ｐａｒｓｏｔ，Ｃ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｐａｔｔｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０５２（１９８６））と６ヶ所相違しており、そのうち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異なっている（ＪＣ４１１株のｌｙｓＣは、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載の配列番号８に示されるｌｙｓＣのアミノ酸配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残基がシステイン残基に、４０１番目のグリシン残基がアラニン残基に置き換わっている）。このＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＪＣ４１１株のｌｙｓＣと同一の配列を有するｌｙｓＣであっても、上記（イ）〜（ヲ）及び３２３番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはアスパラギン酸残基）に置換させかつ３１８番目のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基のいずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するｌｙｓＣが得られることが予想される。
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡを取得する方法の例は以下の通りである。まず、野生型ＡＫＩＩＩ遺伝子又は他の変異を有するＡＫＩＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫＩＩＩを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。また、野生型ＡＫＩＩＩ遺伝子又は他の変異を有するＡＫＩＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫＩＩＩを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。
あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。ＤＮＡを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ４−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
上記野生型ＡＫＩＩＩ遺伝子あるいは他の変異を有するＡＫＩＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡの供与菌としては、いかなるエシェリヒア属に属する微生物を用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１２０８，ｔａｂｌｅ  １）にあげられるものが利用できる。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株や、ＭＣ１０６１株などがあげられる。
本発明細菌においては、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼがエシェリヒア属細菌由来であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びアスパルターゼが、存在する場合にはエシェリヒア属細菌由来であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素がエシェリヒア属細菌又はブレビバクテリウム属細菌由来であり、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼがブレビバクテリウム属細菌由来であることが好ましい。
ブレビバクテリウム属細菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの他に、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・リリウム等が挙げられる。
また、本発明細菌においては、ジヒドロピコリン酸合成酵素及びアスパルトキナーゼの細胞内の活性が、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素、及び、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持することにより増強され、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入により増強されていることが好ましい。このような好ましい本発明細菌は、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に記載のプラスミドｐＣＡＢＤ２又はｐＣＡＢＤＥ１をエシェリヒア属細菌に導入することによって得ることができる。
＜２＞本発明製造法
上記のようにして得られる本発明細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造することができる。
本発明によるエシェリヒア属細菌の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
実施例
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
実施例１
＜１＞  種々の性質を有するエシェリヒア属細菌の作製
下記に示すプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）に導入した。
プラスミド名      保持する遺伝子
ＲＳＦ２４Ｐ      ｄａｐＡ＊
ＲＳＦＤ８０      ｄａｐＡ＊，ｌｙｓＣ＊
ｐＣＡＢ１        ｄａｐＡ＊，ｌｙｓＣ＊，ｄａｐＢ
ｐＣＡＢＤ２      ｄａｐＡ＊，ｌｙｓＣ＊，ｄａｐＢ，ｄｄｈ
ｐＣＡＢＤ（Ｂ）  Ｂｒｅｖ．ｄａｐＡ，ｌｙｓＣ＊，ｄａｐＢ，ｄｄｈ
ｐＣＡＢＤＥ１    ｄａｐＡ＊，ｌｙｓＣ＊，ｄａｐＢ，ｄａｐＤ，ｄａｐＥ
遺伝子の略号の意味は以下の通りである。
ｐｐｃ    ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
ｌｙｓＣ  ：アスパルトキナーゼＩＩＩ
ｌｙｓＣ＊：阻害解除型アスパルトキナーゼＩＩＩ
ａｓｄ    ：アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
ｄａｐＡ  ：ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
ｄａｐＡ＊：阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
Ｂｒｅｖ．ｄａｐＡ：阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム由来）
ｄａｐＢ  ：ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
ｄａｐＤ  ：テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ
ｄａｐＥ  ：スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ
ｄｄｈ    ：ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム由来）
プラスミドＲＳＦ２４Ｐ、ＲＳＦＤ８０、ｐＣＡＢ１、ｐＣＡＢＤ２及びｐＣＡＢＤＥ１は国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に記載されている。その構築の詳細は国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に記載されており、その概略は以下の通りである。
（１）ＲＳＦ２４Ｐ
既知のＥ．ｃｏｌｉのｄａｐＡの塩基配列（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，２９７（１９８６））に基づいて、ＰＣＲ法によりｄａｐＡのＳＤ配列及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む断片を増幅した。増幅断片をクローニングベクターｐＣＲ１０００に連結し、ｐＣＲ１０００中のｌａｃＺプロモーターによる転写方向に対してｄａｐＡの転写の向きが逆方向となるように連結されたプラスミドｐｄａｐＡ２を得た。ｐｄａｐＡ２をヒドロキシルアミンにより変異処理し、変異処理されたｐｄａｐＡ２をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に導入し、形質転換体からＡＥＣ耐性のあるものを選択した。さらに、選択された耐性株が有するプラスミドにコードされたＤＤＰＳのＬ−リジンによる阻害の度合いを測定し、Ｌ−リジンによる阻害が解除されたものを選択した。配列決定により、５９７番目のＣがＴに変化していることが確認されたｐｄａｐＡ２４を、ｐＶＩＣ４０のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結し、ＲＳＦ２４Ｐを得た（図１）。
ＲＳＦ２４ＰをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名され、１９９３年１０月２８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１３９３５の受託番号のもとで寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８５８の受託番号が付与されている。
（２）ＲＳＦＤ８０
既知のＥ．ｃｏｌｉのｌｙｓＣの塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０５２（１９８６））に基づいて、ＰＣＲ法によりｌｙｓＣのＳＤ配列及びＯＲＦを含む断片を増幅した。増幅断片を多コピーベクターｐＵＣ１８に連結し、ｐＵＣ１８中のｌａｃＺプロモーターによる転写方向に対してｌｙｓＣの転写の向きが逆方向となるように連結されたプラスミドｐＬＹＳＣ１を得た。ｐＬＹＳＣ１をヒドロキシルアミンにより変異処理し、変異処理されたｐＬＹＳＣ１をＥ．ｃｏｌｉ  ＧＴ３に導入し、形質転換体からＡＥＣ及びＬ−リジンに耐性のあるものを選択した。また、ｐＬＹＳＣ１をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１に導入し、菌体をヒドロキシルアミンにより変異処理し、ＡＥＣ及びＬ−リジンに耐性のあるものを選択した。さらに、選択された耐性株が有するプラスミドにコードされたＡＫのＬ−リジンによる阻害の度合い及び熱安定性を測定し、Ｌ−リジンによる阻害が解除されかつ安定性に優れたものを選択した。配列決定により、３５２番目のＣがＴに変化していることが確認されたｐＬＹＳＣ１＊８０を、ｐＨＳＧ３９９のｌａｃＺプロモーターの下流に連結し、ｐＬＬＣ＊８０を得た。ｐＬＬＣ＊８０とＲＳＦ２４Ｐとから図２に示す様にしてＲＳＦＤ８０を作製した。
ＲＳＦＤ８０をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入したものは、ＡＪ１２３９６と命名され、１９９３年１０月２８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１３９３６の受託番号のもとで寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８５９の受託番号が付与されている。
（３）ｐＣＡＢ１
既知のｄａｐＢの塩基配列（Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１４８２９（１９８４））に基づいてＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡからｄａｐＢを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をＡｓｅＩとＤｒａＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１９のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐｄａｐＢを得た。次いで、図３に示す様にしてｄａｐＢをＲＳＦＤ８０に組み込み、ｐＣＡＢ１を得た。
（４）ｐＣＡＢＤ２
コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のｄｄｈの既知の塩基配列（Ｉｓｈｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，３９１７（１９８７））に基づいてＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからｄｄｈを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＴ２２ＩとＡｖａＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１９のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐｄｄｈを得た。次いで、図４に示す様にしてｄｄｈをｐＣＡＢ１に組み込み、プラスミドｐＣＡＢＤ２を得た。
（５）ｐＣＡＢＤＥ１
既知のｄａｐＤの塩基配列（Ｒｉｃｈａｕｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１４８２４（１９８４））に基づいてＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡからｄａｐＤを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９ＩとＳａｃＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐｄａｐＤを得た。また、既知のｄａｐＥの塩基配列（Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５２６５（１９９２））に基づいてＰＣＲ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡからｄａｐＥを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片をＭｕｎＩとＢｇｌＩＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐｄａｐＥを得た。ｐｄａｐＥからｄａｐＥを切り出し、ｐｄａｐＤに挿入してｄａｐＥ及びｄａｐＤを共に有するプラスミドｐＭＷｄａｐＤＥ１を作製した。さらに、図５に示す様にして、ｐＭＷｄａｐＤＥ１からｄａｐＥ及びｄａｐＤを含む断片を切り出し、これをｐＣＡＢ１に挿入してｐＣＡＢＤＥ１を得た。
プラスミドｐＣＡＢＤ（Ｂ）は、以下のように構築した。
まず、下記の配列のプライマーを用いてｐＢＲ３２２よりＴｅｔ耐性遺伝子のプロモーター部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
0004207426.tif 000002
増幅されたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位に挿入し、ｐＵＴＥＳを得た（図１８）。
次に下記の配列のプライマーを用いてブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム  Ｙｓｒ株染色体ＤＮＡを鋳型としてＢｒｅｖ．ｄａｐＡ遺伝子を増幅した。
0004207426.tif 000003
増幅されたＢｒｅｖ．ｄａｐＡ遺伝子をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＴＥＳのＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、ｐＵＥＢＬ３を得た（図１９）。
次にｐＵＥＢＬ３をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断し、両端を平滑末端化し、Ｂｒｅｖ．ｄａｐＡを含む断片を取得した。次に国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐＣＡＢＤ２をＮｈｅＩ及びＳｐｅＩで切断後、両端を平滑末端化し、ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ及びｄｄｈを含む断片を回収後、ここに先に取得したＢｒｅｖ．ｄａｐＡを含む断片を挿入することにより、ｐＣＡＢＤ（Ｂ）を取得した（図２０）。
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）については欧州特許公開第４８８４２４号公報に詳しい記載があるが、その調製方法について簡単にふれると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静岡県三島市）よりＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を入手した。同株をストレプトマイシン含有のＬＢプレートにまき、コロニーを形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を取得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＥ８４２４株を混合して、完全培地（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ：１％  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ，０．５％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％  ＮａＣｌ）で３７℃の条件下、１５分間静置培養して接合を誘導した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＥ８４２４株は、（ＨｆｒＰＯ４５，ｔｈｉ，ｒｅｌＡ１，ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０，ｕｎｇ−１，ｎａｄＢ）の遺伝形質を有し、国立遺伝学研究所より入手できる。
その後で培養物を、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよびＬ−チロシンを含有する完全培地（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ：１％  バクトトリプトン，０．５％  イーストエキストラクト，０．５％  ＮａＣｌ，１．５％  寒天）にまき、コロニーを形成する株を選択した。この株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）株と命名した。
また、欧州特許公開第４８８４２４号公報には、Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミドｐＨＡＴｅｒｍを導入して得られる株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＨＡＴｅｒｍ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＪ  １２６６２株）と命名され、１９９１年１１月１６日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に国際寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５３が付与されている。このＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＨＡＴｅｒｍ株からプラスミドｐＨＡＴｅｒｍを脱落させることによってもＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を取得することができる。
プラスミドの脱落は常法によって行うことができる。
＜２＞  アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、ホスホエノールピルビン酸遺伝子（ｐｐｃ）、又はアスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）の導入およびＬ−リジン生産性の評価
ａｓｄを含むプラスミド及びｐｐｃを有するプラスミドとしては、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に記載されたｐａｓｄ及びｐｐｐｃを用いた。これらのプラスミドの構築については国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に詳細な記載がある。その概略は以下の通りである。
（１）ｐａｓｄ
ａｓｄは、この遺伝子を有するプラスミドｐＡＤ２０（Ｈａｚｉｚａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１，３７９（１９８２））から得た。ｐＡＤ２０をＡｓｅＩとＣｌａＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐａｓｄを得た（図８）。
（２）ｐｐｐｃ
ｐｐｃは、この遺伝子を有するプラスミドｐＴ２から得た。ｐＴ２をＳｍａＩとＳｃａＩで切断し、末端を平滑化した後、ｐＭＷ１１８のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐｐｐｃを得た（図９）。ｐＴ２を保持するＥ．ｃｏｌｉ  Ｆ１５株（ＡＪ１２８７３）は、１９９３年７月１５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１３７５２の受託番号のもとに寄託され、１９９４年７月１１日にブタベスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７３２が付与されている。
ａｓｐＡを有するプラスミドは以下のように構築した。
下記の配列のプライマーを用いてＥ．ｃｏｌｉのａｓｐＡ遺伝子を増幅した。
0004207426.tif 000004
次に、得られた増幅断片をｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社）のＳｍａＩ切断部位に挿入しｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡを取得した（図９）。
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）及び上記＜１＞で得られた形質転換体の各々に、ｐＭＷ１１８（対照プラスミド）、ｐａｓｄ、ｐｐｐｃ及びｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡ（比較例プラスミド）をそれぞれ導入した。得られた形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）に、ｐＭＷ１１８、ｐａｓｄ、ｐｐｐｃ又はｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡを導入したものを除いて、ｐＭＷ１１８、ｐａｓｄ、ｐｐｐｃ及びｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡのいずれかと、ＲＳＦ２４Ｐ、ＲＳＦＤ８０、ｐＣＡＢ１、ｐＣＡＢＤ２、ｐＣＡＢＤ（Ｂ）及びｐＣＡＢＤＥ１のいずれかとの２種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号に記載された方法によりＬ−リジン生産性を調べた。具体的には、以下のように行った。
培養は、５００ｍｌ坂口フラスコに下記組成の培地を２０ｍｌ入れ、培養温度３７℃、撹拌１１４〜１１６ｒｐｍの条件下で３０時間行った。
（培地組成）
グルコース                        ４０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                １ｇ／ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                １６ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                        １ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                ０．０１ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                ０．０１ｇ／ｌ
イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）２ｇ／ｌ
Ｌ−チロシン                        ０．１ｇ／ｌ
ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１１５℃で１０分オートクレーブ（グルコース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは別殺）
局方ＣａＣＯ３                ２５ｇ／ｌ（１８０℃で２日間乾熱滅菌）
抗生物質（導入するプラスミドの種類に応じストレプトマイシン２０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０ｍｇ／ｌ、またはカナマイシン２５ｍｇ／ｌ）
培養液（培養後の培地）中のＬ−リジンの定量を、旭化成（株）製バイオテックアナライザーＡＳ２１０を使用して行った。
結果を表１に示す。表中、Ｌ−リジンの量は培地ｄｌ当たりのｍｇで示す。
0004207426.tif 000005
表１から明らかなように、ａｓｄ又はｐｐｃを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、単独又はｄａｐＡ（ＲＳＦ２４Ｐ）もしくはｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ（ＲＳＦＤ８０）もしくはｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ（ｐＣＡＢ１）と共に増強した場合のＬ−リジンの生産量（蓄積量）は、ａｓｄ又はｐｐｃを増強しない場合と比較して変化ないか、あっても微弱であり、特にａｓｄでは減少する場合もある（ａｓｄでは−１８０〜２０ｍｇ／ｄｌ、ｐｐｃでは１０〜３０ｍｇ／ｄｌ）。これに比し、ｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ（ｐＣＡＢＤ２）又はｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄａｐＤ＋ｄａｐＥ（ｐＣＡＢＤＥ１）と共に増強した場合には、ａｓｄ又はｐｐｃを増強しない場合と比し顕著なＬ−リジンの生産量の上昇が認められた（ａｓｄでは７０ｍｇ／ｄｌ、ｐｐｃでは９０ｍｇ／ｄｌ）。しかし、ａｓｐＡは、ｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ（ｐＣＡＢＤ２）と共に増強した場合でも、顕著なＬ−リジンの生産量の上昇は認められなかった。さらに、エシェリヒア・コリ由来のｄａｐＡの代わりにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｄａｐＡを用いた場合（ｐＣＡＢＤ（Ｂ））でも、エシェリヒア・コリ由来のｄａｐＡを用いた場合（ｐＣＡＢＤ２）と同様な効果が得られたことから、遺伝子の由来は重要でなく、その組み合わせが重要と考えられる。
実施例２
＜１＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）と、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｎｔＡＢ）又はアスパルターゼ（ａｓｐＡ）とを有するプラスミドの構築
ｐｐｃ及びａｓｄを有するプラスミド、ｐｐｃ及びｐｎｔＡＢを有するプラスミド、並びに、ｐｐｃ及びａｓｐＡを有するプラスミドを下記の様にして構築した。
（１）ｐｐｃ及びａｓｄを有するプラスミド（ｐｐｃｄ）
国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐａｓｄをＫｐｎＩ及びＳｐｈＩで切断後、ａｓｄを含むＤＮＡ断片の両端を平滑末端化した。次に国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐｐｐｃをＸｂａＩで切断後、両端を平滑末端化し、ここに先のａｓｄ断片を挿入することでｐｐｃｄを得た（図１０）。
（２）ｐｐｃ及びｐｎｔＡＢを有するプラスミド（ｐＰＴＳ）
国際公開第ＷＯ  ９５／１１９８５号記載のｐＭＷ：：ＴＨＹをＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐｎｔＡＢを含むＤＮＡ断片を回収した。次に国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐｐｐｃをＸｂａＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ここに先のｐｎｔＡＢ断片を挿入することでｐＰＴＳを得た（図１１）。
プラスミドｐＭＷ：：ＴＨＹの構築については国際公開第ＷＯ  ９５／１１９８５号に詳細な記載がある。その概略は以下の通りである。
既知のＥ．ｃｏｌｉのｐｎｔＡ，ｐｎｔＢの塩基配列（Ｄ．Ｍ．Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，６４７−６５３（１９８６））に基づいて、ＰＣＲ法によりプロモーター活性のある領域を含めて両遺伝子を含む断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドベクターｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社）に連結し、ｐＭＷ：：ＴＨＹを得た（図８）。
ｐＭＷ１１８：：ＴＨＹをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入したものは、ＡＪ１２９２９と命名され、１９９３年１０月４日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１３８９０の受託番号のもとで寄託され、１９９４年９月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７９８の受託番号が付与されている。
（３）ｐｐｃ及びａｓｐＡを有するプラスミド（ｐＡＰＷ）
上記実施例１に記載のｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡをＳａｃＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりａｓｐＡを含むＤＮＡ断片を得た。次に国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐｐｐｃをＸｂａＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ここに先のａｓｐＡ断片を挿入することでｐＡＰＷを得た（図１２）。
＜２＞二つの遺伝子の導入並びにＬ−リジン生産性の評価
上記実施例＜１＞で得られた、ｐＣＡＢＤ２を導入した形質転換体に、ｐｐｐｃ（参照プラスミド）、ｐｐｃｄ、ｐＰＴＳ及びｐＡＰＷ（比較例プラスミド）を導入した。得られた形質転換体は、ｐｐｐｃ、ｐｐｃｄ、ｐＰＴＳ及びｐＡＰＷのいずれかと、ｐＣＡＢＤ２との２種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例１＜２＞と同様にＬ−リジン生産性を調べた。
結果を表２に示す。
0004207426.tif 000006
表２から明らかなように、ａｓｄ又はｐｎｔＡＢをｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ＋ｐｐｃと共に増強した場合（ｐｐｃｄ又はｐＰＴＳ）には、顕著なＬ−リジンの生産量の上昇が認められた（ａｓｄでは８０ｍｇ／ｄｌ、ｐｎｔＡＢでは７０ｍｇ／ｄｌ）。しかし、ａｓｐＡは、ｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ＋ｐｐｃと共に増強した場合（ｐＡＰＷ）でも、顕著なＬ−リジンの生産量の上昇は認められなかった。
実施例３
＜１＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）と、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｎｔＡＢ）と、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）又はアスパルターゼ（ａｓｐＡ）遺伝子とを有するプラスミドの構築
ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｄ遺伝子を有するプラスミド、並びに、ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｐＡを有するプラスミドを下記の様にして構築した。
（１）ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｄを有するプラスミド（ｐＰＴｄ）
国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐａｓｄをＫｐｎＩ及びＳｐｈＩで切断後、ａｓｄを含むＤＮＡ断片の両端を平滑末端化した。次に上記実施例２に記載のｐＰＴＳをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、平滑末端化した後、ここに先のａｓｄ断片を挿入することでｐＰＴｄを得た（図１３）。
（２）ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｐＡを有するプラスミド（ｐＡＰＴ）
国際公開第ＷＯ９５／１１９８５号記載のｐＭＷ：：ＴＨＹをＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりｐｎｔＡＢを含むＤＮＡ断片を取得した。次に上記実施例２に記載のｐＡＰＷをＸｂａＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ここに先のｐｎｔＡＢを含む断片を挿入することによりｐＡＰＴを得た（図１４）。
＜２＞三つの遺伝子の導入並びにＬ−リジン生産性の評価
上記実施例＜１＞で得られた、ｐＣＡＢＤ２を導入した形質転換体に、ｐＰＴＳ（参照プラスミド）、ｐＰＴｄ及びｐＡＰＴを導入した。得られた形質転換体は、ｐＰＴＳ、ｐＰＴｄ及びｐＡＰＴのいずれかと、ｐＣＡＢＤ２との２種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例１＜２＞と同様にＬ−リジン生産性を調べた。
結果を表３に示す。
0004207426.tif 000007
表３から明らかなように、ａｓｄ又はａｓｐＡをｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ＋ｐｐｃ＋ｐｎｔＡＢと共に増強した場合（ｐＰＴｄ又はｐＡＰＴ）には、顕著なＬ−リジンの生産量の上昇が認められた（ａｓｄでは６０ｍｇ／ｄｌ、ａｓｐＡでは５０ｍｇ／ｄｌ）。
実施例４
＜１＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）と、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｎｔＡＢ）と、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）と、アスパルターゼ（ａｓｐＡ）遺伝子とを有するプラスミドの構築
ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ、ａｓｄ及びａｓｐＡを有するプラスミドを下記の様にして構築した。
上記実施例３に記載のｐＡＰＴをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＳｍａＩで切断することにより、ｐｐｃ、ａｓｐＡ、及びｐｎｔＡＢを含むＤＮＡ断片を取得した。次にｐＭＷ２１８（ニッポンジーン社）をＥｃｏＲＩで切断後、両端を平滑末端化し、ここに先のｐｐｃ、ａｓｐＡ、及びｐｎｔＡＢを含むＤＮＡ断片を挿入することによりｐＡＰＴＫを取得した（図１５）。
次に、国際公開第ＷＯ  ９５／１６０４２号記載のｐａｓｄをＫｐｎＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＢａｍＨＩで切断することによりａｓｄを含むＤＮＡ断片を取得した。そしてｐＳＴＶ２９をＰｓｔＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＢａｍＨＩで切断した部位に先のａｓｄ断片を挿入することによりｐＳｄを取得した（図１６）。
次に、ｐＳｄをＳｐｈＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＸｂａＩで切断することにより再度ａｓｄを含むＤＮＡ断片を取得した。そしてｐＡＰＴＫをＳａｃＩで切断後、両端を平滑末端化し、更にＸｂａＩで切断した部位に先のａｓｄ断片を断片を挿入することによりｐＫＤを取得した（図１７）。
＜２＞四つの遺伝子の導入並びにＬ−リジン生産性の評価
上記実施例＜１＞で得られた、ｐＣＡＢＤ２、ｐＣＡＢＤ（Ｂ）又はｐＣＡＢＤＥ１を導入した形質転換体に、ｐＡＰＴ（参照プラスミド１）、ｐＡＰＴＫ（参照プラスミド２）及びｐＫＤをそれぞれ導入した。得られた形質転換体は、ｐＡＰＴ、ｐＡＰＴＫ及びｐＫＤのいずれかと、ｐＣＡＢＤ２、ｐＣＡＢＤ（Ｂ）及びｐＣＡＢＤＥ１のいずれかとの２種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例１＜２＞と同様にＬ−リジン生産性を調べた。
結果を表４に示す。
0004207426.tif 000008
表４から明らかなように、ａｓｄをｄａｐＡ＋ｌｙｓＣ＋ｄａｐＢ＋ｄｄｈ＋ｐｐｃ＋ｐｎｔＡＢ＋ａｓｐＡと共に増強した場合には、顕著なＬ−リジンの生産量の上昇が認められた。この結果は、ｐＣＡＢＤ２の代わりに、ｐＣＡＢＤ（Ｂ）又はｐＣＡＢＤＥ１を用いた場合でも同様であった。
表４中、ｐＡＰＴＫはｐＡＰＴの薬剤耐性遺伝子をアンピシリンからカナマイシンに変更したものである（ベクターをｐＭＷ１１８からｐＭＷ２１８に変更したため）。ｐＫＤは、ｐＡＰＴＫにａｓｄを挿入して作成したため、ｐＫＤのコントロールとしてはｐＡＰＴよりｐＡＰＴＫの方が適切と考えられるので、ｐＡＰＴＫのデータも示した。薬剤耐性遺伝子の変更によりＬ−リジンの生産量は影響を受けないことも確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｌ−リジンの生産性の高いエシェリヒア属細菌が提供され、この細菌を用いることによりＬ−リジンを高収率で得ることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｄａｐＡ＊２４を有する、ＲＳＦ１０１０由来のプラスミドＲＳＦ２４Ｐの製造工程を示す図である。
図２は、ｄａｐＡ＊２４及びｌｙｓＣ＊８０を有するプラスミドＲＳＦＤ８０の製造工程を示す図である。
図３は、ｄａｐＡ＊２４、ｌｙｓＣ＊８０及びｄａｐＢを有するプラスミドｐＣＡＢ１の製造工程を示す図である。
図４は、ｄａｐＡ＊２４、ｌｙｓＣ＊８０、ｄａｐＢ及びｄｄｈを有するプラスミドｐＣＡＢＤ２の製造工程を示す図である。
図５は、ｄａｐＡ＊２４、ｌｙｓＣ＊８０、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ及びｄａｐＥを有するプラスミドｐＣＡＢＤＥ１の製造工程を示す図である。
図６は、ｐｐｃを有するプラスミドｐｐｐｃの構造を示す図である。
図７は、ａｓｄを有するプラスミドｐａｓｄの構造を示す図である。
図８は、ｐｎｔＡＢ（ｐｎｔＡ及びｐｎｔＢ）を有するプラスミドｐＭＷ：：ＴＨＹの製造工程を示す図である。
図９は、ａｓｐＡを有するプラスミドｐＭＷ１１８：：ａｓｐＡの製造工程を示す図である。
図１０は、ｐｐｃ及びａｓｄを有するプラスミドｐｐｃｄの製造工程を示す図である。
図１１は、ｐｐｃ及びｐｎｔＡＢを有するプラスミドｐＰＴＳの製造工程を示す図である。
図１２は、ｐｐｃ及びａｓｐＡを有するプラスミドｐＡＰＷの製造工程を示す図である。
図１３は、ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｄを有するプラスミドｐＰＴｄの製造工程を示す図である。
図１４は、ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｐＡを有するプラスミドｐＡＰＴの製造工程を示す図である。
図１５は、ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ及びａｓｐＡを有するプラスミドｐＡＰＴＫの製造工程を示す図である。
図１６は、ａｓｄを有するプラスミドｐＳｄの製造工程を示す図である。
図１７は、ｐｐｃ、ｐｎｔＡＢ、ａｓｐＡ及びａｓｄを有するプラスミドｐＫＤの製造工程を示す図である。
図１８は、ｔｅｔｐｒｏを有するプラスミドｐＵＴＥＳの製造工程を示す図である。
図１９は、ｔｅｔｐｒｏ及びその下流にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｄａｐＡを有するプラスミドｐＵＥＢＬ３の製造工程を示す図である。
図２０は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｄａｐＡ（Ｂｒｅｖ．ｄａｐＡ）、ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ及びｄｄｈを有するプラスミドｐＣＡＢＤ（Ｂ）の製造工程を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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