(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（III）：
0004376971.tif 000051
｛式中、
−  複素環Ａは、芳香族又は非芳香族であり（後者の場合には、この複素環の窒素原子は、二重結合により４ａ位の炭素に結合していると解される）；
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、
・水素、又は
・ハロゲン原子、又は
・Ｒ3とＲ4が、上述の異なる原子を表さないとき、Ｒ3はＲ4と共同して、Ｃ3及びＣ4と共に、５〜６個の炭素原子を含む、芳香族又は脂肪族環、ここで適宜、この環は、ハロゲンにより置換されている、を形成するか、又は
・Ｒ3とＲ4が、上述の異なる原子を表さないとき、Ｒ3はＲ4と共同して、下記式：
0004376971.tif 000052
（式中、Ｒaは、水素原子である）で示されるインドール基を形成し；
−  Ｙは、ＯＨ又は−ＮＨ2基を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はペルクロラートの基を表し、そして式（III）の複素環Ａの窒素は、第四級型であって、一方では共有結合により１１位の炭素に結合し、かつ他方ではイオン結合により上記のＸに結合する｝
で示されるベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体の、ムコビシドーシスの治療、又は、気管支若しくは消化管に対する閉塞の治療、又は細胞毒性薬の拒絶の予防のための医薬の調製のための使用。
【請求項２】
以下の一般式（IIIａ）：
0004376971.tif 000053
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、
−  Ｙは、−ＯＨ又は−ＮＨ2基を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10の１つは、ハロゲン原子を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表す］で示される誘導体の、請求項１記載の使用。
【請求項３】
式（IIIａ）
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、
−  Ｙは、−ＯＨ基を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、水素原子又はハロゲン原子を表す］の化合物の、請求項２記載の使用。
【請求項４】
下記式：
0004376971.tif 000054
0004376971.tif 000055
0004376971.tif 000056
0004376971.tif 000057
から選択される一般式（IIIａ）のベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体の、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
以下の一般式（IIIｂ）：
0004376971.tif 000058
［式中、Ｒa、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、請求項１と同義である］で示される誘導体の、請求項１記載の使用。
【請求項６】
式（IIIｂ）
［式中、
−  Ｒaは、水素原子を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、そしてＲ1とＲ2を有する２つの炭素の間に二重結合は存在せず、
−  Ｒ5は、水素原子を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10の１つは、ハロゲン原子を表し、
−  Ｙは、−ＮＨ2を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表す］
の誘導体の、請求項５記載の使用。
【請求項７】
下記式：
0004376971.tif 000059
［化合物Ｇ：Ｒ7＝Ｃｌ、Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｈ：Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｉ：Ｒ8＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｊ：Ｒ9＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｋ：Ｒ10＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｈ、
化合物Ｌ：Ｒ9＝Ｂｒ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ］から選択される一般式（IIIｂ）の誘導体の、請求項１記載の使用。
【請求項８】
活性成分として、少なくとも１つの以下の一般式（III）：
0004376971.tif 000060
｛式中、
−  複素環Ａは、芳香族又は非芳香族であり（後者の場合には、この複素環の窒素原子は、二重結合により４ａ位の炭素に結合していると解される）；
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、
・水素、又は
・ハロゲン原子、又は
・Ｒ3とＲ4が、上述の異なる原子を表さないとき、Ｒ3はＲ4と共同して、Ｃ3及びＣ4と共に、５〜６個の炭素原子を含む、芳香族又は脂肪族環、ここで適宜、この環は、ハロゲンにより置換されている、を形成するか、又は
・Ｒ3とＲ4が、上述の異なる原子を表さないとき、Ｒ3はＲ4と共同して、下記式：
0004376971.tif 000061
（式中、Ｒaは、水素原子である）で示されるインドール基を形成し；
−  Ｙは、−ＯＨ又は−ＮＨ2基を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基を表し、そして式（III）の複素環Ａの窒素は、第四級型であって、一方では共有結合により１１位の炭素に結合し、かつ他方ではイオン結合により上記のＸに結合する｝
で示される誘導体を、生理学に許容しうる賦形剤との組合せで含有することを特徴とする、ムコビシドーシスの治療、又は気管支若しくは消化管に対する閉塞の治療、又は細胞毒性薬の拒絶の予防のための医薬組成物。
【請求項９】
活性成分として、少なくとも１つの請求項１〜７のいずれか１項記載の式（III）の誘導体を含有することを特徴とする、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口経路により投与することができる形態、又は非経口経路により投与することができる形態、又は更に気道によるエーロゾルの形態で提供されることを特徴とする、請求項８または９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
活性成分の量が、活性成分の１日用量で、１回以上の投薬において０．１mg/kg〜５mg/kgである量であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
以下の一般式（III）：
0004376971.tif 000062
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、請求項１と同義である（但し、下記式：
0004376971.tif 000063
0004376971.tif 000064
で示される化合物は除く）］で示されるベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体。
【請求項１３】
以下の一般式（IIIａ）：
0004376971.tif 000065
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、
−  Ｙは、−ＯＨ又は−ＮＨ2基を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10の１つは、ハロゲン原子を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表す］で示される、請求項１２記載の誘導体。
【請求項１４】
式（IIIａ）
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、
−  Ｙは、−ＯＨ基を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、水素原子又はハロゲン原子を表す］で示される請求項１３記載の誘導体。
【請求項１５】
下記式：
0004376971.tif 000066
0004376971.tif 000067
0004376971.tif 000068
0004376971.tif 000069
から選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の一般式（IIIａ）のベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体。
【請求項１６】
以下の一般式（IIIｂ）：
0004376971.tif 000070
［式中、Ｒa、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、請求項１２と同義である］で示される、請求項１２記載の誘導体。
【請求項１７】
式（IIIｂ）
［式中、
−  Ｒaは、水素原子を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、そしてＲ1とＲ2を有する２つの炭素の間に二重結合は存在せず、
−  Ｒ5は、水素原子を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10の１つは、ハロゲン原子を表し、
−  Ｙは、−ＮＨ2を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、又はアニオン型のペルクロラートの基ＣｌＯ4-を表す］で示される、請求項１６記載の誘導体。
【請求項１８】
下記式：
0004376971.tif 000071
［化合物Ｇ：Ｒ7＝Ｃｌ、Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｈ：Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｉ：Ｒ8＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｊ：Ｒ9＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｋ：Ｒ10＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｈ、
化合物Ｌ：Ｒ9＝Ｂｒ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ］から選択される一般式（IIIｂ）で示される請求項１６または１７記載の誘導体。
【請求項１９】
請求項１２記載の誘導体の製造方法であって、以下の工程：
−  式（Ａ）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、請求項１と同義である］の誘導体の、フェニルリチウム又はリチウムジイソプロピルアミドによる、エーテル又はＴＨＦ中での処理〔これにより、以下の反応図：
0004376971.tif 000072
に従い、式（Ｂ）（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、請求項１と同義である）の誘導体が得られる〕、
−  前段階で得られた式（Ｂ）の誘導体の、式（Ｃ）［式中、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10及びＸは、請求項１と同義である］の誘導体との縮合〔これにより、以下の反応図：
0004376971.tif 000073
に従い、式（Ｄ）（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10及びＸは、請求項１と同義である）の誘導体が得られる〕、
−  Ｈ2Ｏの添加による式（Ｄ）の化合物の処理（これにより、以下の式（Ｅ）：
0004376971.tif 000074
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10、及びＸは、請求項１と同義であり、そしてＹは、−ＮＨ2を表す］で示される誘導体が得られる）、
−  適宜、上述の式（Ｅ）［式中、Ｙは、ＮＨ2を表す］の化合物の加水分解（これにより、以下の式（Ｆ）：
0004376971.tif 000075
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、請求項１と同義である］で示される化合物が得られる）、
−  上述の式（Ｅ）又は（Ｆ）の化合物の２００℃での加熱（これにより、それぞれ以下の式（Ｇ）又は（Ｈ）：
0004376971.tif 000076
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、請求項１と同義である］で示される化合物が得られる）、
−適宜、上述の（Ｇ）又は（Ｈ）の化合物の水素化（これにより、以下の式（Ｉ）：
0004376971.tif 000077
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である］で示される化合物が得られる）を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＣＦＴＲチャネルアクチベーター化合物、これらを含む医薬組成物、及び嚢胞性線維症のような病態の治療に関連するこれらの用途に関する。
上皮細胞では、水及び電解質の輸送はイオンＫ+、Ｎａ+及びＣｌ-に対する膜の透過性の上昇に結びついている。これらの運動は、イオンチャネル、すなわち、イオンの受動拡散を可能とする膜の内に組み込まれた特殊化タンパク質の活性に連動している。分子電気生理学の技術（パッチクランプ法）により、イオンチャネルの開放と閉鎖の単位レベルでの記録が可能になり、そして経上皮イオン輸送、これらの調節及びこれらの病的調節不全の研究が可能になる。
上皮細胞の生理学に関連する多くの病態の中で、関与するタンパク質が塩化物チャネルのＣＦＴＲチャネル（「嚢胞性線維症経膜コンダクタンス調節物質（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）」を意味する）である範囲で、嚢胞性線維症もイオンチャネルの病理と見なされる。ムコビシドーシス（Mucoviscidosis）、すなわちアングロサクソン語で嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカサス人種で最も普通の劣性常染色体遺伝子病である。米国及びヨーロッパ諸国の大部分では、ＣＦ遺伝子の保因者の出現率は、１／２０〜１／３０である。嚢胞性線維症は、ヒト臓器の外分泌腺に影響を与える。ＣＦＴＲタンパク質の主要な発現部位は、膵臓外分泌腺、肺、汗腺、腸及び心臓組織である。この疾患に払われる配慮が、正常上皮細胞の分泌機構の理解に非常に重要であった。腸、膵臓又は肺の外分泌腺の上皮細胞は、これらの臓器への塩と水の輸送を制御している。嚢胞性線維症の場合には、ＣＦ遺伝子の突然変異がＣＦＴＲチャネルの性質と機能を変化させる。そして電解質の輸送が異常になって、慢性肺閉塞性障害、膵不全、細菌性肺症状、異常濃縮汗分泌（abnormally concentrated sudoriparous secretion）及び男性不妊症に至る。分泌不全は、細胞の頂端膜に位置する塩化物イオンに対する選択的イオンチャネル（ＣＦＴＲチャネル）の機能性、及びサイクリックＡＭＰ経路により制御される活性に関連している。
タンパク質ＣＦＴＲは、５つのフィールド（Riordan et al.,1989）、それぞれ６つのアルファーらせん（それぞれ２１〜２２アミノ酸を含む、１〜１２と番号付けされたもの）を有する２つの膜貫通セグメント、２つのヌクレオチド結合フィールド（ＮＢＦ１及び２）及び大きな親水性調節フィールド（フィールドＲ）に分割される、分子量１７０kDの１，４８０アミノ酸の糖タンパク質である。タンパク質ＣＦＴＲは、その分子構造から、膜輸送体（ＡＴＰ結合カセット（ATP-binding cassette）を意味するＡＢＣ）のファミリーに属する。
ＡＢＣ輸送体は、進化において高度に保存されている膜タンパク質のファミリーを構成する。これらは、細胞膜を通る種々の基質の移動に関係する。しかし、原核生物では幾つかの輸送体／基質の対が明らかにされているのに、この情報は真核細胞では少ない。哺乳動物では、ＡＢＳ輸送体の大部分は病理に関連している。嚢胞性線維症に関係するタンパク質ＣＦＴＲ、抗腫瘍性細胞毒性薬の拒絶に関係する糖タンパク質Ｐ（ＭＤＲ：多剤耐性）、及びマクロファージによるアポトーシス体のエンドサイトーシスにおいて本質的な役割を演じることが最近報告されたタンパク質ＡＢＣ１に言及することができる。ＣＦＴＲは、経上皮塩化物の輸送及び粘膜区画の水分補給を制御し、その一方でＭＤＲのアイソフォームの１つは、ホスファチジルコリンの移動に関係している。２×６個の膜貫通セグメント構造を有するこれらの３つのＡＢＣタンパク質は、ヌクレオチドを結合して加水分解する２つのフィールド（ＮＢＦ）と調節フィールドを有する。ＣＦＴＲの調節が特に研究されている。
２つの複雑なプロセスが、ＣＦＴＲチャネルの活性を制御する：キナーゼタンパク質によるフィールドＲのリン酸化及び２つのＮＢＦフィールドへのＡＴＰの結合（及び恐らく加水分解）。ＣＦＴＲチャネルの脱リン酸化は、その閉鎖までのチャネルの活性の消失を引き起こす（Tabcharani et al.,1991,Becq et al.,1993a,Becq et al.,1994）。更に、ＣＦＴＲチャネルは、チャネルの活性とリン酸化の状態を制御する膜ホスファターゼに結合している（Becq et al.,1993b,Becq et al.,1994）。
タンパク質ＣＦＴＲをコードする遺伝子は、分子クローニングにより単離され、染色体７上で同定された（Kerem et al.,1989,Riordan et al.,1989）。遺伝子の同定及びその嚢胞性線維症への関わりは、ＣＦ患者に由来するＣＦ遺伝子のコード領域（エキソン１０）内の３つの塩基対の欠失の位置により確認された。この突然変異は、ＮＢＦ１内のタンパク質の５０８位のフェニルアラニンの欠失（ΔＦ５０８）に対応する。この突然変異の出現頻度は、遺伝子解析で平均７０％である（Tsui & Buchwald,1991）。突然変異遺伝子（ΔＦ５０８）の転写により産生する異常タンパク質が、侵された上皮細胞の塩化物の輸送においてもはやその機能を確保することができないため、この突然変異の結果は劇的である。ｃＡＭＰによる外分泌腺の上皮細胞の刺激後、塩化物の流動が存在しないことは、ＣＦ遺伝子の異常、そして特に突然変異（ΔＦ５０８）の存在を証明する主要な特徴である。今までにＣＦ遺伝子上に３００以上の突然変異が同定されている。最高密度の突然変異は、２つのヌクレオチド結合フィールドで見い出される。突然変異（ΔＦ５０８）は、７０％の症例で見い出され、そして５０％の患者はこの突然変異についてホモ接合である。７つの他の顕著な突然変異は、１％を超える発生率で存在する。突然変異Ｇ５５１Ｄは、アスパラギン酸（Ｄ）によるタンパク質の５５１位のグリシン残基（Ｇ）の置換に対応する。この突然変異を有する患者は、膵不全及び重篤な肺障害を伴う重篤な病態を呈する（Cutting et al.,1990）。この突然変異を観察する発生率は、あるＣＦ集団では３〜５％に達する。ΔＦ５０８欠失とは対照的に、突然変異Ｇ５５１Ｄを含むタンパク質ＣＦＴＲは、成熟しており、膜に組み込まれる（Gregory et al.,1991）。しかし、この突然変異は膜の不透過性を引き起こし、ｃＡＭＰ経路の刺激はこの変異体の発現に関係するチャネルを開放しない（Gregory et al.,1991,Becq et al.,1994）。
Ｒ１１７Ｈ、Ｒ３３４Ｗ及びＲ３４７Ｐのような他の突然変異は、順に０．８、０．４及び０．５％の低い発生率で出現し、そしてあまり重篤でない病態に関係している（Sheppard et al.,1993）。これら３つの変異体の発現は、膜内への挿入と調和した、成熟したグリコシル化型のタンパク質を発生させる。
しかし、この３つの変異体は、チャネルの開放によりＡＭＰ経路の刺激に応答することができる。流動の大きさ、単位コンダクタンス及び３つの変異体のそれぞれに関係するチャネルの開放の確率は、正常ＣＦＴＲチャネルに対して修飾されている（Sheppard et al.,1993,Becq et al.,1994）。しかし、キナーゼ／ホスファターゼによる調節は、変異体Ｇ５５１Ｄ及びΔＦ５０８を含むこれらの種々の変異体については正常であるようである（Becq et al.,1994）。
そしてこれらの観察は、Ｇ５５１Ｄ及びΔＦ５０８を含む多数のＣＦＴＲ変異体を薬理学的に活性化することが可能であることを示す。嚢胞性線維症に侵された上皮細胞の膜内ではタンパク質ΔＦ５０８の指令の欠乏にも関わらず、幾つかのチームは、このタンパク質が膜内で機能的に存在しうることを証明した（Dalemans et al.,1991,Drumm et al.,1991,Becq et al.,1994）。したがって治療の成功の機会を最適化するためのＣＦＴＲチャネル開放のための方策を開発すること、またこれが必要でない場合（ΔＦ５０８以外の突然変異）に遺伝子治療を置換することも必要かつ非常に重要であると考えられる。
嚢胞性線維症の遺伝学及びタンパク質ＣＦＴＲの生物学と生化学における進歩にも関わらず、ＣＦＴＲチャネルのオープナーの薬理学はさほど発展していない。現在３つのファミリーの分子が、ＣＦＴＲチャネルのアクチベーター又はオープナーとしてのこれらの性質について提唱されている：フェニルイミダゾチアゾール（レバミゾール及びブロモテトラミゾール）、ベンズイミダゾロン（ＮＳ００４）及びキサンチン（ＩＢＭＸ、テオフィリン…）。
１）フェニルイミダゾチアゾール（レバミゾール及びブロモテトラミゾール）
最近レバミゾールとブロモテトラミゾールは、膜ホスファターゼを阻害することにより、ＣＦＴＲチャネルの活性及びリン酸化のレベルの制御が可能であることが証明された（Becq et al.,1994）。これらの化合物は、用量依存的にＣＦＴＲチャネルを開放し（Becq et al.,1996）、疾患の出所で突然変異を有するＣＦＴＲチャネルに作用する（Becq et al.,1994）。これらのアクチベーターの作用の様式は未だ判然としない。これらの分子は、ｃＡＭＰ又は細胞内カルシウムの従来の経路により作用するものではない。ブロモテトラミゾールファミリーの化合物は既に治療に使用されており（Grem,1990）、そしてレバミゾールはある種の肺治療に使用されている（Van Eygen et al.,1976,Dils,1979）。後者の性質は、臨床試験を開始するためのある種の利点を示している。しかし、これらの分子は全ての細胞で作用できるとは考えられない。腸細胞は応答が悪く、アフリカツメガエル卵母細胞では発現後ＣＦＴＲの開放を開始させることができない。更には、突然変異Ｇ５５１Ｄ／Ｇ５５１Ｄを有するトランスジェニックマウスモデルでは、ブロモテトラミゾールは期待されるアクチベーター効果を持たない。したがってこれらの分子の効果は限定されていると考えられる。
２）ベンズイミダゾロン（ＮＳ００４）
Gribkoff et al.,1994は、最近ＮＳ００４（イミダゾール核から誘導される化合物（ベンズイミダゾロン））が、レバミゾールと同様にある条件下では（ＣＦＴＲがリン酸化されていないならば）チャネルを開放することができることを証明した。しかし、ベンズイミダゾロンはまた、多くのカリウムチャネルのアクチベーターでもあり（Olesen et al.,1994）、その結果ＣＦＴＲにさほど特異的ではない。
３）キサンチン（ＩＢＭＸ、テオフィリン…）
ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）のようなキサンチンはＣＦＴＲアクチベーターである。その作用機構は、未だほとんど知られておらず、幾つかの可能性が存在する。細胞内ホスホジエステラーゼ（ｃＡＭＰの分解酵素）を阻害することにより、キサンチンはｃＡＭＰのレベルを上昇させることができ、このためＣＦＴＲを活性化することができる。ＣＦＴＲのヌクレオチド結合フィールド（ＮＢＦ）へのキサンチンの結合のような、他の可能性が現在提唱されている。
本発明の目的は、今までに報告されているＣＦＴＲチャネルアクチベーターよりもＣＦＴＲに対して特異的な、ＣＦＴＲチャネルアクチベーター化合物を提供することである。
これに関連して、本発明の目的は、ヒト又は動物の上皮細胞における、特に塩化物の経膜イオン流の障害に関係する病理の治療のための新しい医薬を提供することである。
本発明の目的は、更に特定して、嚢胞性線維症の治療、細胞毒性薬（特に抗腫瘍薬）の拒絶の予防、又は気管支若しくは消化管（特に膵臓又は腸）の閉塞の予防若しくは治療に関して使用することができる新しい医薬、あるいは心臓血管疾患の治療に関しても使用することができる新しい医薬を提供することである。
本発明の別の目的は、本発明の化合物及び医薬組成物の製造方法を提供することである。
本発明の主題は、以下の一般式（Ｉ）：
0004376971.tif 000002
［式中、
−  複素環Ａは、芳香族又は非芳香族であり（後者の場合には、この複素環の窒素原子は、二重結合により４ａ位の炭素に結合していると解される）；
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、
・水素、又は臭素若しくはフッ素原子、又は
・ハロゲン原子、特に塩素原子、又は
・約１〜約１０個の炭素原子を含む、直鎖若しくは分岐鎖の、アルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基｛これらの基は、適宜、特にハロゲン、及び／又はヒドロキシル、及び／又はアミン（第一級、第二級又は第三級）、及び／又は環に約５〜約１０個の炭素原子を含む、芳香族及び／若しくは脂肪族環〔これらの環は、これら自体、適宜、特にハロゲン、及び／又はヒドロキシル、及び／又はアミン（第一級、第二級又は第三級）、及び／又はアルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）により置換されている〕により置換されている｝、又は
・環に約５〜約１０個の炭素原子を含む、芳香族若しくは脂肪族環〔これらの環は、これら自体、適宜、特にハロゲン、及び／又はヒドロキシル、及び／又はアミン（第一級、第二級又は第三級）、及び／又はアルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）により置換されている〕、又は
・ＯＲa基〔Ｒaは、水素原子、又は直鎖若しくは分岐鎖の、アルキル、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）、又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの環は、上記と同義である）を表す〕、又は
・ＮＲbＲc基〔Ｒb及びＲcは、相互に独立に、直鎖若しくは分岐鎖の、アルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）、又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの環は、上記と同義である）を表す〕を表すか、あるいは
・  Ｒ1とＲ2、又はＲ3とＲ4、及び／又はＲ4とＲ5、及び／又はＲ7とＲ8、及び／又はＲ8とＲ9、及び／又はＲ9とＲ10が、上述の異なる原子又は基又は環を表さないとき、Ｒ1はＲ2と共同して、又はＲ2はＲ3と共同して、及び／又はＲ3はＲ4と共同して、及び／又はＲ4はＲ5と共同して、及び／又はＲ7はＲ8と共同して、及び／又はＲ8はＲ9と共同して、及び／又はＲ9はＲ10と共同して、順にＣ1及びＣ2と共に、又はＣ2及びＣ3と共に、又はＣ3及びＣ4と共に、又はＣ4、Ｃ4a及びＣ5と共に、又はＣ7及びＣ8と共に、又はＣ8及びＣ9と共に、又はＣ9及びＣ10と共に、５〜１０個の炭素原子を含む、芳香族又は脂肪族環〔適宜、この環は、特にハロゲン、及び／又はアルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基、及び／又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの基又は環は、上記と同義である）により置換されている〕を形成するか、又は
・Ｒ3とＲ4が、上述の異なる原子若しくは基若しくは環を表さないとき、Ｒ3はＲ4と共同して、下記式：
0004376971.tif 000003
（式中、Ｒaは、上記と同義である）で示されるインドール基を形成し；
−  Ｙは、
・ＯＲd基〔Ｒdは、水素原子、又は直鎖若しくは分岐鎖の、アルキル、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）、又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの環は、上記と同義である）を表す〕、又は
・ＮＲeＲf基〔Ｒe及びＲfは、相互に独立に、直鎖若しくは分岐鎖の、アルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基（これらの基は、上記と同義である）、又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの環は、上記と同義である）を表す〕を表し、
・Ｒd、又はＲe及びＲfの少なくとも１つが、上述の異なる原子又は基又は環の１つを表さないとき、Ｒd、又はＲe及びＲfの少なくとも１つは、Ｒ5と共同して、又はＲ7と共同して、それぞれＣ5若しくはＣ6と共に、又はＣ6、Ｃ6a及びＣ7と共に、５〜１０個の炭素原子を含む、芳香族又は脂肪族複素環〔適宜、特にハロゲン、及び／又はアルキル、アルコキシ、カルボニル若しくはオキシカルボニル基、及び／又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの基又は環は、上記と同義である）により置換されている〕を形成すると解され；
−  ｎは、０又は１に等しく、そして
・ｎが０に等しいとき、
＊Ｘは、ハロゲン原子（特に臭素又は塩素原子）のようなアニオン型の原子、又はペルクロラートのようなアニオン型の原子の基を表し、そして式（Ｉ）の複素環Ａの窒素は、第四級型であって、一方では共有結合により１１位の炭素に結合し、かつ他方ではイオン結合により上記のＸに結合し、
＊Ｒ1とＲ10が、上述の異なる原子又は基又は環の１つを表さないとき、Ｒ1はＲ10と共同して、Ｃ1、式（Ｉ）の複素環Ａの窒素、Ｃ11、及びＣ10と共に、５〜１０個の炭素原子を含む、芳香族又は脂肪族複素環〔適宜、ハロゲン、及び／又はアルキル、カルボニル若しくはオキシカルボニル基、及び／又は芳香族若しくは脂肪族環（これらの基又は環は、上記と同義である〕により置換されている）を形成すると解され、
・ｎが１に等しいとき、Ｘは、水素原子、又はハロゲン原子、特に臭素、若しくは塩素、若しくはフッ素原子を表す］で示される誘導体の使用である。
生物（ヒト又は動物）における、経膜イオン流動障害、特に塩素、及び適宜重炭酸塩に結びついた病態（特に、肺、消化器又は心臓）の治療を目的とする医薬の調製のため、特にムコビシドーシスの治療、又は細胞毒性薬（特に抗腫瘍薬）の拒絶の予防、気管支若しくは消化管（特に膵臓又は腸）に対する閉塞の治療を目的とする医薬の調製のため。
本発明の更に特定の主題は、一般式（Ｉ）［式中、ｎ＝１であり、そして以下の一般式（II）：
0004376971.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である）で示される誘導体に対応する］の化合物の上記と同義の使用である。
したがって、本発明はまた、更に特定して以下の一般式（IIａ）：
0004376971.tif 000005
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表すか、又はＣ1及びＣ2と共同して、６個の炭素原子を含む芳香族環を形成し、
−  Ｙは、−ＯＨ又はＮＨ2基を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9若しくはＲ10の１つは、ハロゲン原子、特に臭素、塩素若しくはフッ素原子を表し、
−  Ｘは、水素原子又はハロゲン原子、特に臭素、塩素若しくはフッ素原子を表す］で示される誘導体の上記と同義の使用に関する。
本発明の範囲で有利に使用される一般式（IIａ）の化合物は、下記式：
0004376971.tif 000006
0004376971.tif 000007
0004376971.tif 000008
0004376971.tif 000009
から選択される化合物である。
更に特定して本発明はまた、以下の一般式（IIｂ）：
0004376971.tif 000010
［式中、Ｒa、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である］で示される化合物、及び特に式（IIｂ）［式中、
−  Ｒaは、水素原子を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、そしてＲ1とＲ2を有する２つの炭素の間に二重結合は存在せず、
−  Ｒ5は、水素原子を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10の１つは、ハロゲン原子、特に塩素、臭素若しくはフッ素原子を表し、
−  Ｙは、−ＮＨ2を表し、
−  Ｘは、ハロゲン原子、特に臭素、塩素若しくはフッ素原子を表す］の化合物の上記と同義の使用に関する。
本発明の範囲で有利に使用される式（IIｂ）の化合物は、下記式：
0004376971.tif 000011
［化合物Ａ：Ｒ7＝Ｃ１、Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｂ：Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｃ：Ｒ8＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｄ：Ｒ9＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｅ：Ｒ10＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｈ、
化合物Ｆ：Ｒ9＝Ｂｒ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ］から選択される化合物である。
本発明の更に特定の主題は、一般式（Ｉ）［式中、ｎ＝０であり、そして以下の一般式（III）：
0004376971.tif 000012
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である）で示されるベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体に対応する］の化合物について上記と同義の使用である。
したがって、本発明は更に特定して以下の一般式（IIIａ）：
0004376971.tif 000013
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表すか、又はＣ1及びＣ2と共同して、６個の炭素原子を含む芳香族環を形成し、
−  Ｙは、−ＯＨ又は−ＮＨ2又はＮＨＣＯＣＨ3基を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10の１つは、ハロゲン原子、特に塩素、臭素若しくはフッ素原子を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、特に臭素原子Ｂｒ-、若しくは塩素原子Ｃｌ-、又はアニオン型の原子の基、特にペルクロラートＣｌＯ4-を表す］で示される化合物の上記と同義の使用に関する。
本発明の範囲の特に好ましい化合物は、式（IIIａ）［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、
−  Ｙは、−ＯＨ基を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、特に臭素原子Ｂｒ-、若しくは塩素原子Ｃｌ-、又はアニオン型の原子の基、特にペルクロラートＣｌＯ4-を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、相互に独立に、水素原子又はハロゲン原子、特に塩素、臭素若しくはフッ素原子を表す］の化合物である。
本発明の範囲で有利に使用される一般式（IIIａ）の化合物は、下記式：
0004376971.tif 000014
0004376971.tif 000015
0004376971.tif 000016
0004376971.tif 000017
0004376971.tif 000018
0004376971.tif 000019
から選択される化合物である。
更に特定して本発明は、以下の一般式（IIIｂ）：
0004376971.tif 000020
［式中、Ｒa、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である］で示される化合物、及び特に式（IIIｂ）［式中、
−  Ｒaは、水素原子を表し、
−  Ｒ1及びＲ2は、水素原子を表し、そしてＲ1とＲ2を有する２つの炭素の間に二重結合は存在せず、
−  Ｒ5は、水素原子を表し、
−  Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、水素原子を表すか、又はＲ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10の１つは、ハロゲン原子、特に塩素、臭素若しくはフッ素原子を表し、
−  Ｙは、−ＮＨ2を表し、
−  Ｘは、アニオン型のハロゲン原子、特に臭素原子Ｂｒ-、若しくは塩素原子Ｃｌ-、又はアニオン型の原子の基、特にペルクロラートＣｌＯ4-を表す］の化合物の上記と同義の使用に関する。
本発明の範囲で有利に使用される式（IIIｂ）の化合物は、下記式：
0004376971.tif 000021
［化合物Ｇ：Ｒ7＝Ｃｌ、Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｈ：Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｉ：Ｒ8＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ9＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｊ：Ｒ9＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ、
化合物Ｋ：Ｒ10＝Ｃｌ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ9＝Ｈ、
化合物Ｌ：Ｒ9＝Ｂｒ、Ｒ7＝Ｒ8＝Ｒ10＝Ｈ］から選択される化合物である。
本発明の主題は、活性成分として、少なくとも１つの上述の一般式（Ｉ）の化合物を、生理学的に許容しうる賦形剤との組合せで含有する、任意の医薬組成物である。
本発明の更に特定の主題は、活性成分として、上述の少なくとも１つの式（II）及び更に特定して式（IIａ）の化合物、そして特に少なくとも１つの上述の化合物１〜１０、及び更になお特定して上記と同義の式（IIｂ）の化合物、そして特に少なくとも１つの上述の化合物Ａ〜Ｆを含有する、上述の任意の医薬組成物である。
本発明の更に特定の主題は、活性成分として、上述の少なくとも１つの一般式（III）及び更に特定して式（IIIａ）の化合物、そして特に少なくとも１つの上述の化合物１１〜２７、及び更になお特定して上記と同義の式（IIIｂ）、そして特に少なくとも１つの上述の化合物Ｇ〜Ｌを含有する、上述の任意の医薬組成物である。
本発明の好ましい医薬組成物は、化合物１９（ＭＰＢ−０７とも称される）を、適宜、上述の本発明の１つ（又はそれ以上）の他の化合物との組合せで含有する組成物である。
有利には、本発明の医薬組成物は、経口経路により投与することができる形態、特に錠剤若しくはカプセル剤の形態で、又は非経口経路により投与することができる形態、特に静脈内、筋肉内若しくは皮下経路により注射可能な調剤の形態で、あるいはまた気道による、特にエーロゾルの形態で肺経路による、形態で提供される。
更に有利には、本発明の医薬組成物は、活性成分の量が、活性成分の１日用量で、１回以上の投薬において約０．１mg/kg〜５mg/kg、特に約３mg/kgである量であることを特徴とする。
本発明はまた、上述の化合物２、３、９、１０、１１（又はＭＰＢ−２６）、１２又は（ＭＰＢ−５）、２２、２３及び２４を除いた、それ自体、上述の一般式（Ｉ）の化合物に関する。
更に特定して本発明の主題は、化合物２、３、９及び１０を除いた、ｎ＝１であり、かつ上述の一般式（II）の化合物に対応する、上述の一般式（Ｉ）の化合物である。
更に特定して本発明は、上述の一般式（IIａ）の化合物（その内特に上述の化合物１、４、５、６、７及び８）に関する。
更に特定して本発明はまた、上述の一般式（IIｂ）の化合物（その内特に上述の化合物Ａ〜Ｆ）に関する。
更に特定して本発明の主題は、化合物１１、１２、２２、２３及び２４を除いた、ｎ＝０であり、かつ上述の式（III）のベンゾ［ｃ］キノリジニウム誘導体に対応する、上述の一般式（Ｉ）の化合物である。
更に特定して本発明は、上述の一般式（IIIａ）の化合物（その内特に上述の化合物１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６及び２７）に関する。
更に特定して本発明はまた、上述の一般式（IIIｂ）の化合物（その内特に上述の化合物Ｇ〜Ｌ）に関する。
本発明の主題はまた、以下の工程を含むことを特徴とする、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法である：
−  式（Ａ）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、式（Ｉ）と同義である］の誘導体の、フェニルリチウム又はリチウムジイソプロピルアミドによる、有利にはエーテル又はＴＨＦ中での処理（これにより、以下の反応図：
0004376971.tif 000022
に従い、式（Ｂ）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、式（Ｉ）と同義である］の誘導体が得られる）、
−  前段階で得られた式（Ｂ）の誘導体の、式（Ｃ）［式中、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10及びＸは、式（Ｉ）と同義である］の誘導体との縮合（これにより、以下の反応図：
0004376971.tif 000023
に従い、式（Ｄ）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10及びＸは、式（Ｉ）と同義である］の誘導体が得られる）、
−  Ｈ2Ｏの添加による式（Ｄ）の化合物の処理（これにより、上述の式（II）［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10、及びＸは、式（Ｉ）と同義であり、そしてＹは、−ＮＨ2を表す］の誘導体に対応する、以下の式（II）：
0004376971.tif 000024
で示される誘導体が得られる）、
−  適宜、上述の式（II）の化合物の、式（Ｉ）と同義のＲe及びＲf基を含有する誘導体〔この誘導体は、上述の式（II）の化合物の６位の炭素に結合している窒素原子と、特にＲe及び／又はＲfのハロゲン化物により（必要であれば、上述の式（II）の化合物に存在し、上述のＲe及びＲf基を含有する誘導体と反応することができる他の官能基を事前に保護すべく処理しながら）反応することができる〕による処理（これにより、以下の式（II）：
0004376971.tif 000025
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、上記と同義であり、そしてＹは、式（Ｉ）と同義の−ＮＲeＲf基を表す］で示される化合物が得られる）、
−  適宜、特に４０℃で硫酸（pH３）の作用による、上述の式（II）［式中、Ｙは、ＮＨ2を表す］の化合物の加水分解（これにより、上述の式（II）［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、式（Ｉ）と同義であり、そしてＹは、−ＯＨ基を表す］の誘導体に対応する、以下の式（II）：
0004376971.tif 000026
で示される化合物が得られる）、
−  適宜、上述の式（II）［式中、Ｙは、−ＯＨ基を表す］の化合物の、式（Ｉ）と同義のＲd基を含有する誘導体〔この誘導体は、上述の式（II）の化合物の７位の炭素に結合している酸素原子と、特にＲdのハロゲン化物により（必要であれば、上述の式（II）の化合物に存在し、上述のＲd基を含有する誘導体と反応することができる他の官能基を事前に保護すべく処理しながら）反応することができる〕による処理（これにより、以下の式（II）：
0004376971.tif 000027
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、上記と同義であり、そしてＹは、式（Ｉ）と同義の−ＯＲd基を表す］で示される化合物が得られる）、
−  適宜、上述の式（II）［式中、Ｙは、−ＮＨ2又は−ＯＨを表す］の化合物の有利には２００℃での加熱（これにより、上述の式（III）［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、式（Ｉ）と同義であり、そしてＹは、−ＮＨ2又は−ＯＨ基を表す］の化合物に対応する、それぞれ以下の式（III）：
0004376971.tif 000028
で示される化合物が得られる）、
−  適宜、上述の式（III）［式中、Ｙは、−ＮＨ2基を表す］の化合物の、式（Ｉ）と同義のＲe及びＲf基を含有する誘導体〔この誘導体は、上述の式（III）の化合物の６位の炭素に結合している窒素原子と、特にＲe及び／又はＲfのハロゲン化物により（必要であれば、上述の式（III）の化合物に存在し、上述のＲe及びＲf基を含有する誘導体と反応することができる他の官能基を事前に保護すべく処理しながら）反応することができる〕による処理（これにより、以下の式（III）：
0004376971.tif 000029
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、上記と同義であり、そしてＹは、式（Ｉ）と同義の−ＮＲeＲf基を表す］で示される化合物が得られる）、
−  適宜、上述の式（III）［式中、Ｙは、−ＯＨ基を表す］の化合物の、式（Ｉ）と同義のＲd基を含有する誘導体〔この誘導体は、上述の式（III）の化合物の７位の炭素に結合している酸素原子と、特にＲdのハロゲン化物により（必要であれば、上述の式（III）の化合物に存在し、上述のＲd基を含有する誘導体と反応することができる他の官能基を事前に保護すべく処理しながら）反応することができる〕による処理（これにより、以下の式（III）：
0004376971.tif 000030
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10及びＸは、上記と同義であり、そしてＹは、式（Ｉ）と同義の−ＯＲd基を表す］で示される化合物が得られる）、
−適宜、上述の式（II）又は（III）の化合物の、特に減圧下の酸化白金の存在下での接触水素化による水素化（これにより、以下の式（II）又は（III）：
0004376971.tif 000031
［式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ｒ7〜Ｒ10、Ｘ及びＹは、上記と同義である］で示される化合物が得られる）。
上述の化合物Ａ〜Ｌは、有利には−４０℃でハルマラン（harmalane）でブチルリチウム（ＢｕＬｉ、２当量）の処理、その後に２−クロロベンゾニトリル（適宜、１つ以上の上記と同義のＲ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10基により置換されている）の付加（これにより、式Ａ〜Ｆの化合物が得られ、これを窒素下で１９５℃で加熱することにより、それぞれ化合物Ｇ〜Ｌとなる）により得られる。
本発明は、上述の化合物１〜２４の製造法の以下の詳細な説明、更にはＣＦＴＲに及ぼす幾つかのこれらの化合物の作用の試験を利用して更に明らかにされる。
Ｉ−化合物１〜２４の製造法：
ａ）１−ヒドロキシ−１−フェニル−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物１）
化合物１は、２−クロロベンゾニトリルの代わりにベンゾニトリルを使用する他は、化合物２の調製の範囲で以後に記載される方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｂ）１−ヒドロキシ−１−（２−クロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物２）
無水ＴＨＦ３０ml中のジイソプロピルアミン２．２２ｇ（０．０２２mol）を、塩化カルシウム乾燥管と窒素の供給を伴う還流冷却器を取り付けた５００ml反応器に入れた。溶液を０℃にし、次にＢｕＬｉの１．６Mヘキサン溶液１３．７５ml（０．０２２mol）を加えた。０℃で３０分間撹拌し、次に温度を−４０℃まで下げ、次いで２−メチルピリジン１．８６ｇ（０．０２mol）を加えた。−４０℃で３０分間撹拌し、次に無水ＴＨＦ２０ml中の２−クロロベンゾニトリル２．７５ｇを加えた。反応媒体を周囲温度に戻して、水２０mlを加え、次に２N  Ｈ2ＳＯ4の添加によりpHを２に調整した。１時間撹拌しながら加熱還流し、続けてクロロホルムで抽出して硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して、残渣を無水エーテル最少量に溶解し、次に塩酸塩が完全に沈殿するまで、ＨＣｌで飽和したエタノールを滴下により加えた。こうして化合物２の２．９９ｇを得た（すなわち５６％の収率）。
0004376971.tif 000032
ｃ）１−アミノ−１−（２−クロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物３）
化合物３は、Ｈ2ＳＯ4の添加による加水分解段階を経ない他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｄ）１−ヒドロキシ−１−（２−ブロモフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物４）
化合物４は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２−ベンゾベンゾニトリルを使用する他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｅ）１−ヒドロキシ−１−（２，３−ジクロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物５）
無水ＴＨＦ３０ml中のジイソプロピルアミン２．２２ｇ（０．０２２mol）を、塩化カルシウム乾燥管と窒素の供給を伴う還流冷却器を取り付けた５００ml反応器に入れた。溶液を０℃にし、次にＢｕＬｉの１．６Mヘキサン溶液１３．７５ml（０．０２２mol）を加えた。０℃で３０分間撹拌し、次に温度を−４０℃まで下げ、次いで２−メチルピリジン１．８６ｇ（０．０２mol）を加えた。−４０℃で３０分間撹拌し、次に無水ＴＨＦ２０ml中の２，３−ジクロロベンゾニトリル２．５８ｇ（０．０１５mol）を加えた。反応媒体を周囲温度に戻して、水２０mlを加え、次に２N  Ｈ2ＳＯ4の添加によりpHを２に調整した。２時間撹拌しながら加熱還流し、次に有機相を分離して硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して、残渣をシリカカラムのクロマトグラフィーに付してクロロホルムで溶出し、純粋なケトン３．１９ｇ（８０％）を得た。
0004376971.tif 000033
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）（δppm、シグナル、Ｎプロトン、属性）：８、二重項、ピリジンの６位のＨ；7.6.5、多重項、６、芳香族Ｈ；5.55、ｓ、ｂ（８０％）ビニルＨ；4.25、ｓ  ｓ２（２０％）ＣＨ2。
こうして得られた塩基は、塩酸塩に変換することができた：塩基を無水エーテルに溶解して、ＨＣｌで飽和した無水エタノールを滴下により加えた。
0004376971.tif 000034
ｆ）１−ヒドロキシ−１−（２，４−ジクロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物６）
化合物６は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，４−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｇ）１−ヒドロキシ−１−（２，５−ジクロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物７）
化合物７は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，５−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｈ）１−ヒドロキシ−１−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物８）
化合物８は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，６−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｉ）１−ヒドロキシ−１−（２−クロロフェニル）−２−（２−キノリル）エチレン（化合物９）
化合物９は、２−メチルピリジンの代わりに２−メチルキノリンを使用する他は、化合物２の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｊ）１−アミノ−１−（２−クロロフェニル）−２−（２−キノリル）エチレン（化合物１０）
化合物１０は、Ｈ2ＳＯ4の添加による加水分解段階を経ない他は、化合物９の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｋ）６−アミノベンゾ［ｃ］キノリジニウムＭＰＢ−２６（化合物１１）
無水ＴＨＦ３０ml中のジイソプロピルアミン２．２２ｇ（０．０２２mol）を、塩化カルシウム乾燥管と窒素の供給を伴う還流冷却器を取り付けた５００ml反応器に入れた。溶液を０℃にし、次にＢｕＬｉの１．６Mヘキサン溶液１３．７５ml（０．０２２mol）を加えた。０℃で３０分間撹拌し、次に温度を−４０℃まで下げ、次いで２−メチルピリジン１．８６ｇ（０．０２mol）を加えた。−４０℃で３０分間撹拌し、次に無水ＴＨＦ２０ml中の２−クロロベンゾニトリル２．７５ｇ（０．０２mol）を加えた。反応媒体を周囲温度に戻して、塩化アンモニウムの１０％溶液を加えた。有機相を分離し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を留去して、残渣を窒素流下で１５分間２００℃にした。白色の蒸気の発生を観察した後、残渣が帯褐色の塊状に凝固した。生成物を最初にアセトンで洗浄し、次にエタノールに溶解して酢酸エチルで沈殿させることにより精製した。精製は、中性アルミナカラムのクロマトグラフィーに付して酢酸エチルで溶出しても行うことができた。こうして水１molと結晶化する生成物１．７３ｇ（３５％）を得た。
0004376971.tif 000035
−質量スペクトル：ｍ／ｅ  194（Ｍ+−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ）。
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3460、3360、ＮＨ2；1660、1640、1660、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃ；760、オルト置換したベンゼン。
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯｄ６）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：3.2〜4、交換可能なピーク  Ｄ2Ｏ（ＮＨ2＋Ｈ2Ｏ）；7.1、一重項、５位のＨ；7.4〜8.15、２つの塊状、芳香族５Ｈ；9.00、２Ｈ、芳香族；9.8、二重項  Ｊ＝８Hz、１位のＨ。
ｌ）６−ヒドロキシベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリドＭＰＢ−０５（化合物１２）
１−ヒドロキシ−１−（２−クロロフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物２）を炭酸ナトリウムの水溶液で中和し、この塩基をエーテルで抽出し、この溶液をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、次に溶媒を留去した。淡黄色油状物の形態の塩基１．１６ｇ（０．００５mol）を窒素下で１９５℃で１５分間加熱した。こうして得られた残渣をアセトンで洗浄し、次にエタノールに溶解して酢酸エチルの添加により沈殿させた。水１molと結晶化したクリーム白色の生成物０．７５ｇ（６０％）を得た。
0004376971.tif 000036
−質量スペクトル：ｍ／ｅ  195（Ｍ+−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ）、167（Ｍ+−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ−ＣＯ）。
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3250、ＯＨ；1640、Ｃ＝Ｎ；770、オルト置換したベンゼン。
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯｄ６）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：6.60、広い交換可能なピーク  Ｄ2Ｏ、ＨＯ；7.75、一重項、５位のＨ；7.9〜8.6、多重項、６Ｈ芳香族；9.15、二重項、Ｊ＝６．５Hz、１Ｈ；10、二重項、Ｊ＝６Hz、１位のＨ。
ｍ）６−アミノベンゾ［ｃ］キノリジニウムブロミドＭＰＢ−０１（化合物１３）：
化合物１３は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２−ブロモベンゾニトリルを使用する他は、化合物１１の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｎ）６−アミノ−１０−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリドＭＰＢ−０２（化合物１４）：
化合物１４は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，３−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物１１の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｏ）６−アミノ−９−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリド（化合物１５）：
化合物１５は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，４−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物１１の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｐ）６−アミノ−７−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリド（化合物１６）：
化合物１６は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，６−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物１１の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｑ）６−アミノ−８−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリド（化合物１７）：
化合物１７は、２−クロロベンゾニトリルの代わりに２，５−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物１１の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｒ）６−ヒドロキシベンゾ［ｃ］キノリジニウムブロミドＭＰＢ−０６（化合物１８）：
化合物１８は、化合物５の代わりに化合物４から出発して実施する他は、化合物１９の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｓ）６−ヒドロキシ−１０−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリドＭＰＢ−０７（化合物１９）：
１−ヒドロキシ−１−（２−ブロモフェニル）−２−（２−ピリジル）エチレン（化合物５）１．４０ｇ（０．００５３mol）を窒素下で２１５℃で加熱した。約１９０℃でＨＣｌの白色煙の出現を認めてから、１０分間２２０℃で加熱を続けた。生成物をクロロホルムで洗浄し、次に残渣（１．８２ｇ）を、酢酸及びアルコールで溶出するシリカカラムのクロマトグラフィーにより精製した。こうして生成物０．５８ｇ（４２％）を得た。
0004376971.tif 000037
ｔ）６−ヒドロキシ−９−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリドＭＰＢ−０８（化合物２０）：
化合物２０は、化合物５の代わりに化合物６から出発して実施する他は、化合物１９の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｕ）６−ヒドロキシ−７−クロロベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリド（化合物２１）：
化合物２１は、化合物５の代わりに化合物８から出発して実施する他は、化合物１９の調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｖ）８−アミノジベンゾ［ｃ，ｆ］キノリジニウムペルクロラート（化合物２２）：
無水ＴＨＦ３０ml中のジイソプロピルアミン２．２２ｇ（０．０２２mol）を、塩化カルシウム乾燥管と窒素の供給を伴う還流冷却器を取り付けた５００ml反応器に入れた。溶液を０℃にし、次にＢｕＬｉの１．６Mヘキサン溶液１３．７５ml（０．０２２mol）を加えた。０℃で３０分間撹拌し、次に温度を−４０℃まで下げ、次いでキナルジン２．８６ｇ（０．０２mol）を加えた。−４０℃で３０分間撹拌し、次に無水ＴＨＦ２０ml中の２−クロロベンゾニトリル２．７５ｇ（０．０２mol）を加えた。反応媒体を周囲温度に戻して、塩化アンモニウムの１０％溶液を加えた。有機相を分離し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を留去して、残渣を窒素流下で３０分間２３０℃にした。白色の塩酸蒸気の発生を観察した後、残渣が帯褐色の塊状に凝固した。生成物を最初にアセトンで洗浄し、次にエタノールに溶解して酢酸エチルで沈殿させることにより精製した。生成物を最少量の水に溶解して、沈殿が完了するまで過塩素酸の溶液を加えた。化合物を濾過して２．２０ｇ（３２％）を回収した。
0004376971.tif 000038
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3400、3280、ＮＨ2；1650、1600、1000、広いバンド、ＣｌＯ4。
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯｄ６）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：7.0、一重項、５位の１Ｈ；7.5〜8.7、多重項、芳香族１０Ｈ；9.0、一重項、２Ｈ、交換可能なＤ2Ｏ。
ｗ）６−アセトアミドベンゾ［ｃ］キノリジニウムクロリド（化合物２３）
６−アミノベンゾ［ｃ］キノリジニウム１ｇ（０．００４mol）を酢酸１０mlに溶解し、次に無水酢酸２５mlを加えた。反応媒体を２４時間還流し、次に無水酢酸及び酢酸を減圧下で留去した。
得られた生成物は青紫色であり、これを酢酸エチルで洗浄し、次にエタノールから再結晶した。クリーム白色の生成物０．９３ｇ（８５％）を得た。
−融点＝＞２８０℃
0004376971.tif 000039
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3450、ＮＨ；1700、Ｃ＝Ｏ。
ｘ）１，２，３，４−テトラヒドロ−６−アミノベンゾ［ｃ，ｆ］キノリジニウムペルクロラート（化合物２４）：
６−アミノベンゾ［ｃ］キノリジニウム塩酸塩０．５０ｇ（０．００２mol）をエタノール２０mlに溶解して、大気圧で酸化白金及び水素の存在下に置いた。数分間で水素化を行い、次に溶液を濾過し、アルコールを留去し、残渣を蒸留水１０mlにとって、過塩素酸の２５％溶液を加えると沈殿物が生成した。白色の生成物をメタノールから再結晶して、ペルクロラート０．５４ｇ（９１％）を得た。
0004376971.tif 000040
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3460、3360、ＮＨ2；1650、1600、1100、広いバンド、ＣｌＯ4。
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯｄ６）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：2.1、多重項、２位及び３位のＣＨ2；3.20、三重項、４位のＣＨ2；4.45、三重項、１位のＣＨ2；6.60、一重項、５位のＨ；7.6〜8.4、多重項、４Ｈ、芳香族；8.6、一重項、２Ｈ、交換可能なＤ2Ｏ。
II−化合物Ａ〜Ｆの製造法：
ａ）１−アミノ−１−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ａ）
ハルマラン１．８４ｇ（０．０１mol）を、窒素供給を取り付けた反応器中でＴＨＦ４０mlに可溶化し、反応媒体を−４０℃にした。ＢｕＬｉの１３．７５ml（０．０２２mol）を滴下により加えると、暗赤色になり、この溶液を３０分間撹拌した。２，６−ジクロロベンゾニトリル１．７１ｇ（０．０１mol）をＴＨＦ１５mlに可溶化し、次に滴下により加えた。−４０℃で１時間後、混合物を室温で４時間撹拌した。反応の進展は、ＴＬＣによりモニターしたが、出発物質の消失はイミンを特徴づける黄色の蛍光スポットの出現に相関していた。ＮＨ4Ｃｌの１０％溶液５mlでの加水分解により、イミンを含有するＴＨＦ相を回収することができた。この相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過して次に蒸発乾固した。生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＣＯＯＣ2Ｈ5の５％混合物で溶出するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製した。こうして化合物Ａ２．０６ｇを得た（すなわち５８％の収率）。
0004376971.tif 000041
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）：3428、3255、3134cm-1、ＮＨ；ＮＨ2；3134cm-1、Ｃ＝Ｃ−Ｈ；2932、2843cm-1、ＣＨ2。
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯｄ６）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：8.40、Ｄ2Ｏにより交換可能な一重項、３Ｈ、ＮＨ及びＮＨ2；7.20、多重項、７Ｈ、芳香族プロトン；5.00、一重項、１Ｈ、ビニルＨ；3.70、三重項、Ｊ＝６Hz、２Ｈ、ＣＨ2；3.00、三重項、Ｊ＝６Hz、２Ｈ、ＣＨ2。
ｂ）１−アミノ−１−（ｏ−クロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ｂ）
化合物Ｂは、２，６−ジクロロベンゾニトリルの代わりにオルトクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物Ａの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｃ）１−アミノ−１−（２，５−ジクロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ｃ）
化合物Ｃは、２，６−ジクロロベンゾニトリルの代わりに２，５−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物Ａの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｄ）１−アミノ−１−（２，４−ジクロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ｄ）
化合物Ｄは、２，６−ジクロロベンゾニトリルの代わりに２，４−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物Ａの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｅ）１−アミノ−１−（２，３−ジクロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ｅ）
化合物Ｅは、２，６−ジクロロベンゾニトリルの代わりに２，３−ジクロロベンゾニトリルを使用する他は、化合物Ａの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
ｆ）１−アミノ−１−（４−ブロモ−２−クロロフェニル）−２−［１−（３，４−ジヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリル）］エチレン（化合物Ｆ）
化合物Ｆは、２，６−ジクロロベンゾニトリルの代わりに２−クロロ−４−ブロモベンゾニトリルを使用する他は、化合物Ａの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
III−化合物Ｇ〜Ｌの製造法：
キノリジニウムＧ〜Ｌへの化合物Ａ〜Ｆの環化。
ａ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−１−クロロ−ベンゾ−［ｎ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｇ）
精製したエナミンＡを窒素下で加熱した：この生成物は、約１５０℃で融解し、次に１９５℃で白色煙が出現して生成物が凝固した。この温度で加熱を１０分間維持した。ＴＬＣを用いて以下を観察した：ＣＨ2Ｃｌ2中シリカ上で０．３のＲｆを有するイミンの黄色の蛍光スポットの消失、及びアルコール中アルミナ上で０．１のＲｆを有する環化生成物の黄緑色の蛍光スポットの出現。生成物を、アセトンでの洗浄、次にアルコールからの再結晶、又はクロマトグラフィー：アルミナ−アルコールにより精製した。
こうして得られた生成物は、明褐色であり１７％の収率であった。
0004376971.tif 000042
1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ＣＦ3ＣＯＯＤ）（δppm、シグナル、ｎプロトン、属性）：8.10〜6.20、塊状、１１Ｈ、芳香族プロトン＋ＮＨ＋ＮＨ2；3.90、分離が不充分な三重項、２Ｈ、６位のＣＨ2；3.00、分離が不充分な三重項、２Ｈ、７位のＣＨ2。
−赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ）（νcm-1、属性）全て同一の吸収を示す：3458、3371cm-1、ＮＨ；ＮＨ2；3073cm-1、Ｃ＝Ｃ−Ｈ；1638cm-1、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｃ。
ｂ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−ベンゾ−［ｆ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｈ）
化合物Ｈは、化合物Ａの代わりに化合物Ｂを使用する他は、化合物Ｇの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
得られた生成物は、からし黄色であり５６％の収率であった。
0004376971.tif 000043
ｃ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−２−クロロ−ベンゾ−［ｌ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｉ）
化合物Ｉは、化合物Ａの代わりに化合物Ｃを使用する他は、化合物Ｇの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
得られた生成物は、明褐色であり７％の収率であった。
0004376971.tif 000044
ｄ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−３−クロロ−ベンゾ−［ｌ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｊ）
化合物Ｊは、化合物Ａの代わりに化合物Ｄを使用する他は、化合物Ｇの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
得られた生成物は、明褐色であり５２％の収率であった。
0004376971.tif 000045
ｅ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−４−クロロ−ベンゾ−［ｌ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｋ）
化合物Ｋは、化合物Ａの代わりに化合物Ｅを使用する他は、化合物Ｇの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
得られた生成物は、明褐色であり６％の収率であった。
0004376971.tif 000046
ｆ）１４−アミノ−６，７−ジヒドロ−１２Ｈ−３−ブロモ−ベンゾ−［ｌ］インドロ［２，３−ａ］キノリジニウムクロリド（化合物Ｌ）
化合物Ｌは、化合物Ａの代わりに化合物Ｆを使用する他は、化合物Ｇの調製の範囲で上述の方法と同一の任意の操作法により調製した。
得られた生成物は、からし黄色であり１２％の収率であった。
0004376971.tif 000047
IV−ＣＦＴＲに及ぼす本発明の化合物の作用の検討：
Ａ）方法
ａ）ヒト上皮細胞及び組換えＣＨＯ細胞の培養：
本試験のために幾つかの型の細胞を使用する：腸細胞系統Ｔ８４、Ｃａｃｏ−２及びＨＴ２９。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞は、正常又は突然変異ＣＦＴＲｃＤＮＡ（Chang et al.,1993）の組み込みを伴うか、又は伴わない（対照細胞）ベクターｐＮＵＴ（Tabcharani et al.,1991）によりトランスフェクションした。細胞をこの特異的培地で保持し、次にスライドガラス上に低密度で接種し、３７℃（５％  ＣＯ2）でパッチクランプ法の実験まで培養する。細胞の生存培地は、ウシ胎児血清（７％）及び抗生物質：５０IU/mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシン及びメトトレキサート（１００μM〜２００μM）を含むαＭＥＭからなる。
ｂ）分子電気生理学の技術又はパッチクランプ法の原理：
細胞の電気活性は、膜貫通孔の存在と機能、イオンチャネルにより制御される。イオンチャネルは、タンパク質であり、そのコンホメーション状態は、種々の因子に応じて修飾することができる：経膜電場、リガンドの結合又は転写後の生化学反応。イオンチャネルを通過する電流は、１０億分の１アンペアの桁である（ピカ−アンペア、１pA＝１０-12Ａ）。これは、分子電気生理学の技術（更に普通にはパッチクランプ法と呼ばれる）により測定することができる。
細胞内微小電極により経膜電流を測定する従来法では、熱力学的基本ノイズは、単一のイオンチャネルを通過する電流よりも少なくとも１００倍高い。このような条件下では、チャネル内の流動はこのノイズにより遮蔽され、その変化は平均電流と共に上昇する。ゲッティンゲンのマックスプランク研究所のErwin NeherとBert Sackman（Hamill et al.,1981を参照のこと）は、このノイズの解析により、イオンチャネルを通過する電流を概算することが可能であることを証明した。熱力学的基本ノイズは、膜の面積に比例する。これを限定することにより、基本ノイズはチャネルを通過する電流よりも低くなる。
パッチクランプ法は、これら２名の研究者とその同僚により行われた観察から誘導される：膜表面に適用するガラスマイクロピペットを、ピペットと膜の間に確立する電気抵抗がギガオーム値（１Gohm＝１０9ohm）に達するようにそこに付着させる。オームの法則により、電流強度Ｉ（アンペア）と適用される電位Ｕ（ボルト）に対して電気抵抗（Ｒ）が与えられ（式１）、そしてチャネルの単位コンダクタンスｇ（単位：ピコジーメンス、ps）が求められる（式２）。
（式１）  Ｕ＝Ｒ・Ｉ
（式２）  ｇ＝１／Ｒ
ピペットのガラスと膜のリン脂質の間の相互作用力により、漏れ電流を低下させることができる（イオンチャネルを通過する電流の測定に本質的な段階）。こうして得られた立体配置は、「細胞付着」という用語で呼ばれる。細胞付着立体配置から出発してピペットを引き出すことにより、膜の断片（パッチ）が引き裂かれて、ピペットの末端に固定されたままになる。こうして得られた立体配置は、膜の細胞内表面が浴中にあるため「裏返し」と呼ぶ。膜の細胞外表面は、ピペットに含まれる溶液に接触するが、細胞内部分は、実験チャンバーの灌流媒体と接触している。電子的集成体により、浴の参照電極（Ｖｒｅｆ）とピペット（Ｖｐ）の間の電位差（Ｖｒｅｆ−Ｖｐ）の適用（クランプ）及び発生電流Ｉの測定が可能になる。膜の両側でイオン組成が同一であれば（対称性媒体）、電流強度Ｉは膜に適用される電位差に正比例する。ポイントＩ（Ｖ）は、一般に直線（その勾配と位置が、チャネルの単位コンダクタンス（ｇ）と電流の逆電位（Ｅｒｅｖ）を規定する）に沿って分布する。逆電位では、膜を通る電荷の流動はゼロである。逆電位は、ネルンスト式（式３）［ここで、Ｅは、考慮されるイオンのネルンスト電位を表し、Ｃは、細胞外（Ｃｏ）及び細胞内（Ｃｉ）区画のイオン濃度を表す］により規定される。
（式３）  Ｅ＝ＲＴ／ｚＦ  ＬｏｇＣｏ／Ｃｉ
細胞付着立体配置において、電極の電位が膜の電位に加えられるが、これは約−６０mVである。全ての細胞において、カリウム（Ｋ+）と塩素（Ｃｌ-）イオンの濃度は、それぞれ約１５０mM及び１０mMである。１５０mM  ＫＣｌを含有するピペットにより、Ｋ+（ＥK）及びＣｌ-（ＥCl）イオンのネルンスト電位は、それぞれゼロ及び−５０mVに近づく。したがって塩素電流の逆転は、静止電位付近で、すなわち膜への電位の適用なし（Ｖｐ＝０mV）で得られる。他方で、カリウム電流の逆転は、膜の電位をうち消すことで、５０〜６０mVで脱分極することにより得られる。この例は、チャネルのイオン性を評価するために使用される方策を例示している。この方法により収集される情報は、チャネルのコンダクタンスの種々の状態の間の転移を伝える電流のゆらぎ（ミリ秒の桁、ms）により表される。
ｃ）培養上皮細胞の検討に適用されるパッチクランプ法
パッチクランプ法の実験は、コンフルエントな細胞で行われる。ガラススライド（細胞支持体）の断片を、位相差照明（オリンパス（Olympus）ＩＭＴ２）を取り付けた倒立顕微鏡のプラテン上の実験チャンバー（容量６００μl又は１ml）におく。細胞付着及び裏返しの立体配置を用いる（Hamill et al.,1981）。本実験は、室温（２０〜２２℃）で行われる。電流は、２〜５kHzの低域フィルター（６ポールベッセルフィルター）を伴うＬＩＳＴ  ＥＰＣ７増幅器（ダルムシュタット、ドイツ）（３kHzのフィルター）で増幅して、４４kHzでディジタル化（１６ビット）後ＤＡＴ（ディジタルオーディオテープ）で記録する。次にデータをＯｌｉｖｅｔｔｉＭ２８ＰＣコンピュータに移す。ピペットは直径１mmのガラス管〔クラーク電気医学装置（Clarke Electromedical Instrument）〕から水平ドロワー〔フラミング／ブラウン（Flaming/Brown）型、モデルＰ−８７、サッター研究所（Sutter.Inst.Co.）、米国〕により２又は３段階で作られる。１５０mMのＮａＣｌの溶液を充填したピペットは、４〜１２MΩの間の抵抗を有する。電位は、パッチ電極の電位と浴の電位の間の差として表される。細胞付着立体配置では、これらは細胞の静止電位に対する電位の変化を表す。拡散電位は、ゼロ電流（チャネルが閉鎖しているとき）に対応する電極の電位から評価される。これらは、浴と参照電極の間の接続を確立し（アース）、ピペットと同じ溶液を含有する寒天橋を使用して最小化する。電流の逆電位及びチャネルの単位コンダクタンスは、線形回帰により電流−電圧比（Ｉ／Ｖ）から得られる。電流−電圧比を求めるために、イオン電流振幅を振幅ヒストグラムから測定する。振幅ヒストグラムは、そのピークが、電極に存在するチャネルの開放及び閉鎖状態に対応する、２つ以上のガウス分布の和として示される。これらのヒストグラムから以下を求めることが可能である：Ｎ、パッチに存在するチャネルの総数；ｎ、同時に開放しているチャネルの数（ｎ＝０、１、２…Ｎ）；Ｐｏ、チャネルの開放の確率；及びＩ、チャネルの電流の平均強度。存在するチャネルが同じ型であり、かつ相互に独立に開放及び閉鎖すると仮定されるならば、ｎ個のチャネルが同時に開放している確率は、二項分布（式４）により与えられ、ここから個々の確率Ｐｏが導き出される（式５）。
（式４）  Ｐ（ｎ）＝（Ｎ！／ｎ！（Ｎ−ｎ）Ｐｏn．（１−Ｐｏ）N-n
（式５）  Ｐｏ＝Ｐ（ｎ）／Ｎ
本試験はＣｌ-チャネルのみに関するため、流出電流は、細胞の細胞内媒体又は灌流媒体へピペットから流出するＣｌ-イオンの運動として解釈されるべきである。Ｃｌ-イオンに関するアニオンＸ-の相対透過性ＰX／ＰClは、裏返し立体配置のチャネルのイオン選択性を評価するために使用される。ゴールドマン−ホジキン−キャッツ（Goldman-Hodgkin-Katz）式（式６）は、実験的に得られた逆電位（Ｅｒｅｖ）と存在するアニオンの各濃度の関数として透過性の比を関連づける。
（式６）  Ｅｒｅｖ＝−ＲＴ／Ｆ  Ｉｎ（［Ｃｌ-］e＋ＰX／ＰCl［Ｘ-］e／［Ｃｌ-］i＋ＰX／ＰCl［Ｘ-］i）
ｉ及びｅ：細胞内及び細胞外イオン濃度。Ｒ、Ｔ及びＦは、これらの通常の意味を有する。
パッチ電極を充填するために、生理食塩水の組成は以下の通りである（mM）：１５０  ＮａＣｌ、２  ＭｇＣｌ2、１０  ＴＥＳ（pH７．４）。細胞の灌流浴は、以下を含有する（mM）：１４５  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、２  ＭｇＣｌ2、０．５  ＣａＣｌ2、１０  ＴＥＳ（pH７．４）。
ｄ）ウシングチャンバーのショートサーキット電流の測定
透過性底部を有するチャンバーでの上皮、特に消化器上皮（ＨＴ２９系統及びその種々のクローン、Ｔ８４又はＣａｃｏ２系統）の培養の利点は、細胞生物学の研究において広く証明されている。この方法では、底部が穿孔（孔の直径（０．４５〜３μmの間）と分布は慎重に測定される）したポリスチレンの膜から作られたカップの内側で細胞を培養する。これにより補足マトリックスの添加なしに細胞の付着が可能になる。屈折率が水の屈折率に近い媒体中ではこれは透明であり、細胞層の目視検査が可能になる。しかし限界はある。膜厚の薄さは流体の保持を限定するが、ゲロソーム（gelosomes）のような高分子又は複合体のトラップを構成する可能性を除外することはできない。表面積５cm2のこのカップを６ウェルプレートに入れる。そこでの細胞の付着及び培養は、従来法で行われる。接種の２週間後、細胞は不浸透性単層を形成する。この不浸透性は、電気抵抗の発生、又は２つの粘液性及び漿液性区画の間の高分子の非拡散により証明される。培養は、２つの区画に同一の培地を維持しながら約１０日間安定である。透過性底部を伴うチャンバーでの上皮のこの培養は、上皮を通る荷電又は非荷電分子の分泌及び通過の性質及び調節を研究するのにかなり有用である。経上皮輸送は、クランプした接合点のいずれかの側の２つの先端部又は底側部フィールドに存在する透過酵素の性質に依存する。荷電分子の通過により顕われる上皮の性質は、経上皮電位又はショートサーキット電流の測定から容易に導き出すことができる。分子が中性であるとき、これらの運動を追跡するのに標識分子が使用される。
ｅ）測定法の原理
概略、上皮輸送は、細胞輸送と接合点を通る選択的拡散の均衡である。細胞輸送は、それぞれ細胞の先端部ポール及び底部ポールに位置する特異的な透過酵素の対の活性（Ｎａ+及びＮａ+／Ｋ+  ＡＴＰアーゼチャネル、Ｃｌ-チャネル及びＮａ+／Ｋ+／Ｃｌ-共輸送体、Ｎａ／グルコース共輸送体及び拡散性グルコース輸送体…）に由来する。輸送体上皮が不浸透性であるとき、クランプした接合点は、媒体に対して異なる電位を有する２つの部分の膜に分離する。単純な電気的類推を使用することができ、そしてそれぞれ電位Ｖｍ（粘液性）及びＶｓ（漿液性）を有する回路素子と考えることができる。これら直列の２つの膜は、こうして、代数和Ｖｍ＋Ｖｓである電位Ｖｔを有する。使用される組織では、Ｖｔは標準的条件下で−５mVに達する。上皮の特質を決定するために、３つの型の測定法を使用することができる。
開回路による測定
細胞層の各側に存在する電位の差を測定する。一定の時間に、パラメーター化が可能な電流ｉ（μA）を回路に送りこみ、これが回路の抵抗に比例する電位差ΔＶを変化させる。
ショートサーキット電流による測定
存在する電位に代数的に加える電位差を作るために、組織の抵抗を使用する調整可能な電流ｉを回路に導入する。電流がＩｓｃ（ショートサーキット電流）を有するとき、Ｖｔはゼロであり；Ｉｓｃ×Ｒｔ−Ｅｔ＝０又はＩｓｃ＝Ｅｔ／Ｒｔである。Ｖｍ−Ｖｓ＝０かつＶｍ＝Ｖｓの条件下で、２つの粘液性及び漿液性膜は同じ電位である。抵抗を求めるために、所定の電位差を回路に適用して抵抗を測定し、生じる電流Ｉｓｃの偏差を評価する。
加電圧による測定
これは、ショートサーキット電流による測定の特別な例であり、ここではゼロ電位を与えるために上皮に適用される。これらの条件下では、膜の各々の電位を知ることなく、経上皮電位が固定される。このために、電位差を積み上げ、抵抗の測定に使用される電流の代数和を延長する。ショートサーキット電流には短時間を選択し、そして積み上げ電位差には長時間を選択する。所定の抵抗について、電位差は最大電流を送達する装置の能力に依存するが（１００μA；５００ohmについて電位差は５０mVである）、また生じる電位差（ＩＶ）を測定する能力にも依存することは明らかである。
これらの測定を実施するために、カップを修飾ウシングチャンバーにマウントする。我々は、強度／電圧曲線をプロットすることができるパルス発生器に結合した「電流−電圧クランプ」（ＷＰＩ）制御ユニットを使用する。集めたシグナルをディジタル化（MacLab）して、マッキントッシュアップルコンピュータでチャートソフトウェアを使用して処理する。
ｆ）試験上皮の性質
ＨＴ２９細胞により形成される上皮を最初に使用する。粘液性区画の基本培地（対称性生理食塩水培地、刺激物質は存在しない）へのグルコースの添加は、抵抗に影響することなく経上皮電位及びショートサーキット電流の上昇を引き起こす。上皮は、粘液性側のＮａ依存性グルコース輸送体を利用するグルコース吸収物質、及び疑いなく漿液性側の拡散輸送体として機能する。グルコースを伴うナトリウムの輸送は、電位差（これは、フロリジンにより阻害することができる）を引き起こし、一方グルコースの全流量は、粘液性又は漿液性区画に入れる放射標識グルコース類似体により測定される。
ｃＡＭＰのレベルを上昇させる作因の培地への添加は、グルコースと無関係なＶｔ及びＩｓｃの上昇を誘導する。これは、Ｃｌ-の経上皮輸送（漿液性側から粘液性側へ）の確立に関係していると考えられ、漿液性側の底側部塩化物輸送体及び粘液性側の塩化物チャネルに関連する。このＣｌ-の輸送は、同じ方向の水の輸送に関係している。ｃＡＭＰレベルの上昇後の、細胞内Ｃａ2+のレベルの上昇を引き起こす作因の適用は、疑いなくＣａ2+の粘液性から漿液性への通過及び新しいＣｌ-の漿液性から粘液性への通過に関係している、Ｖｔ及びＩｓｃの新しい上昇を引き起こす。
ｇ）培養上皮細胞の研究に適用される放射活性トレーサーの流動の測定
この方法により、ヨウ化物の流出の速度論をモニターすることができる。細胞は、継代後１／１０に希釈して１２ウェルプレートで培養する。３日目に、試験薬剤を必要な濃度に媒体Ｂ（３７℃）に溶解する。ウェルを媒体ＢのＮａＯＨ、０．１％グルコース１mlで２回洗浄し、次に補充溶液１mlにより３０分間置換する。
ヨウ化物の流出の速度論は、補充溶液を除去して、ウェルを媒体Ｂの１．５mlで３回洗浄後に求める。このために、媒体Ｂの１mlをウェルに１分間放置して、新鮮媒体Ｂの１mlにより置換するため溶血管に集める。最初の１分を対照とし、試験すべき生成物を２分目から加える。この操作を１０分にわたって繰り返し、次に細胞をＮａＯＨ  ０．１N  ＳＤＳ  ０．１％の１mlで剥離する。各ウェルの内容物を、２５分間撹拌後溶血管に集めて、管をガンマ計数管で２分間計数する。
Ｂ）結果
本試験は、上述のベンゾキノリジニウムファミリーの分子に関する。これらをＣＦＴＲチャネルを活性化するその能力について試験する。ＣＦＴＲチャネルのオープナーとしての分子のスクリーニングは、放射活性ヨウ化物の流出及び経膜塩化物電流に及ぼすこれらの作用を測定することにより行った（Becq et al.,1993a）。これらのデータは、細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベル及び種々の実験状況でのその変動の測定により補足した。
３細胞モデルを使用して、ベンゾキノリジニウムによるＣＦＴＲ活性化の作用を評価した：ＣＦＴＲをコードするＲＮＡ（このＲＮＡは以降ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲと呼ばれる）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞；安定にタンパク質ＣＦＴＲを発現する組換えＣＨＯ細胞、及びタンパク質ＣＦＴＲを構成性に発現するＨＴ２９系統のヒト結腸細胞。ＣＦＴＲチャネルは、細胞内ｃＡＭＰのレベルにより刺激されるキナーゼＡタンパク質により主として調節されるため、対照実験では、細胞膜を通過することができるｃＡＭＰの誘導体、及び細胞でのｃＡＭＰの合成を導く酵素アデニル酸シクラーゼのフォルスコリン（forskoline）アクチベーターを使用した。図１は、５００μM  ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰ（サイクリック８−（４−クロロフェニルチオ）−アデノシン３’，５’−一リン酸）（細胞の膜を通過するｃＡＭＰの類似体）により得られるこのような活性化を示す。ヨウ化物の流出により測定されるＣＦＴＲチャネルの活性化は、ヨウ化物の流出の大きさ（ｔ＝０時点の細胞含量の％で表現される）及びヨウ化物の流出の速度（原点での曲線の勾配）の上昇を誘導する。
ＣＦＴＲチャネルの活性について試験分子の効力を評価できるようにする対照実験は、以下の通りである：
１）アフリカツメガエル卵母細胞：以下における放射活性ヨウ化物の流出及び経膜塩化物電流：
−  ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲ（図１ＢではＣＦＴＲと標識）を注入した卵母細胞；
−  ｃＡＭＰ経路のアクチベーター（ｃ−ｃｔｐ−ＡＭＰ、フォルスコリン）の存在下での同じ卵母細胞；
−  ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲの代わりに水（図１Ｂでは「水」と標識）を注入した卵母細胞；
−  ｃＡＭＰ経路の上述のアクチベーターの存在下の同じ卵母細胞。
２）ＣＨＯ細胞：以下における放射活性ヨウ化物の流出：
−  上述のアクチベーターの存在下又は非存在下のタンパク質ＣＦＴＲ（図２ＢではＣＨＯ−ＣＦＴＲ（−）と標識）でトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞；
−  上述のアクチベーターの存在下又は非存在下のＣＦＴＲ鎖（図２ＢではＣＨＯ−ＣＦＴＲ（＋）と標識）でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞。
３）ＨＴ２９細胞：以下における放射活性ヨウ化物の流出：
−  アクチベーターの非存在下のＨＴ２９細胞（図３ではベースと標識）；
−  上述のアクチベーターの存在下の細胞（図３ではｃＡＭＰと標識）。
細胞内カルシウムのレベルの上昇により活性化される塩化物チャネルの存在を、カルシウムイオノホアＡ２３１８７の存在下で試験した。ｃＡＭＰのアクチベーター、Ａ２３１８７及びベンゾキノリジニウムの作用を、これら種々の実験条件下で（標識付したベースを必要に応じて対照と見なす）、放射活性ヨウ化物の流出を促進するこれらの能力、及び経膜塩化物電流を上昇させるこれらの能力により評価した。
図２Ａ及び２Ｂは、ＣＦＴＲを発現する組換えＣＨＯ細胞中での５００μMｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰによるＣＦＴＲ活性化を示す。対照ＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）細胞では、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰは作用しない。ＨＴ２９細胞では、５００μMｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰの存在下でヨウ化物流動の大きさの上昇が示されるため、ＣＦＴＲチャネルはｃＡＭＰにより刺激することができる（図３Ａ及びＢ）。
ＣＨＯ細胞においてＣＦＴＲチャネル活性化に及ぼすベンゾキノリジニウムの作用
図４は、ＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）及びＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）細胞におけるヨウ化物の流出に及ぼす誘導体ＭＰＢ−０７（５００μM）の作用を示す。ＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）細胞におけるヨウ化物の流出の活性化は、強度と速度においてＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）細胞でフォルスコリン（５μM）（ｃＡＭＰのアクチベーター）により誘導されるそれらに匹敵する（図５）。ＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）及びＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）細胞におけるヨウ化物の流出に及ぼす誘導体ＭＰＢ−０７の作用に関する結果は、それぞれ図６及び７のヒストグラムに要約される。ＭＰＢ−０７（５００μM）は、また、フォルスコリン（５μM）がＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）細胞上に引き起こすヨウ化物の流出をも有効に刺激する（図７）。これらの同じ細胞で、Ａ２３１８７（１０μM）は作用しない。ＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）細胞では、フォルスコリン（５μM）、Ａ２３１８７（１０μM）（別々に又は一緒に加えられて）及びＭＰＢ−０７（５００μM）は、ヨウ化物の流出のベースレベルを有意に修飾しない（図６）。
ＨＴ２９細胞においてＣＦＴＲチャネル活性化に及ぼすベンゾキノリジニウムの作用
組換えＣＨＯ細胞におけるヨウ化物の流出に及ぼすＭＰＢ−０７の作用は、ＨＴ２９上皮細胞において再現される。５００μMｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰ（図８Ａ）又は５００μM  ＭＰＢ−０７（図８Ｂ）の適用により、ベースレベル（アクチベーターなし）に対して上昇する、同様な速度と大きさでヨウ化物の流出を誘導する（図９）。
アフリカツメガエル卵母細胞において発現するＣＦＴＲチャネル活性化に及ぼすベンゾキノリジニウムの作用
ＭＰＢ−０７（５００μM）は、アフリカツメガエル卵母細胞においてヨウ化物の流出を刺激する。この活性化（図１０Ａ）は、５００μM  ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰの適用（図１０Ｂ）により得られる活性化に匹敵し、刺激（ｃＡＭＰ及びＭＰＢ−０７）及び非刺激（ベース）非注入卵母細胞（図１１、水）、並びに刺激されないがＣＦＴＲを発現する卵母細胞（図１０Ａ、流出標識ベースＣＦＴＲ）において測定される流出とは有意に異なる（図１１）。
ベンゾキノリジニウムの構造−機能検討及びＣＦＴＲ開放との相関
本検討は、ベンゾキノリジニウム核の１６個の誘導体で行った。
表１及び２は、ＣＦＴＲチャネルアクチベーターとしてここで試験されるベンゾキノリジニウムの化合物の化学構造を示す。
表１及び２は、組換えＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）細胞で試験される種々の化合物の存在下で測定される流出に関する結果を示す。基本化合物のフェナントレン（表２）は、ＣＦＴＲチャネルを活性化しない。２種のシリーズの分子を試験した：ＮＨ2シリーズ（表１、ＭＰＢ−２６、ＭＰＢ−０１〜０４；表２：ＭＰＢ−２４）及びＯＨシリーズ（表１、ＭＰＢ−０５〜０８、ＭＰＢ−２７、２９、３０及び３２；表２：ＭＰＢ−２５）。ＣＦＴＲチャネル活性化の百分率は、対応する表に与えられる。これらは、ＯＨシリーズが１５〜１１０％の百分率でＣＦＴＲを活性化することを示している。ＮＨ2シリーズは、それほど活性ではない（１０〜３０％）。
ＯＨシリーズでは、効力は以下の通りである：
ＭＰＢ−０５、０８、２５、３２＜３０＜２９＜０６＜２７、０７
検討した全ての化合物から、６位のＯＨ基の存在が、ＣＦＴＲチャネルを活性化する能力に関して決定因子であると考えられる：
・  ６位にＯＨを有する９化合物：４５％  ＣＦＴＲチャネル活性化
・  ６位にＮＨ2を有する６化合物：１３％  ＣＦＴＲチャネル活性化。
細胞内ｃＡＭＰに及ぼすベンゾキノリジニウムの作用
図１２は、５μMフォルスコリン（ｃＡＭＰの合成の酵素：アデニル酸シクラーゼのアクチベーター）、１０μMロリプラム（ｃＡＭＰ分解の酵素：IV型ホスホジエステラーゼのインヒビター）及び５００μM  ＭＰＢ−０７の存在下で５分後に測定される、組換えＣＨＯ細胞における細胞ｃＡＭＰのレベルを示す。化合物ＭＰＢ−０７及びロリプラムの存在下では、ｃＡＭＰの同じレベルに達するが、ＭＰＢ−０７のみがＣＦＴＲチャネル活性化を誘導する。ｃＡＭＰに及ぼすフォルスコリンの作用は、約４倍であり、このことは、この作用が純粋にｃＡＭＰに依存することを示唆している。ロリプラムは、ヨウ化物の流動及びパッチクランプ法により測定されるＣＦＴＲアクチベーターとしての作用がない。これらの結果は、化合物ＭＰＢ−０７が、細胞ｃＡＭＰ経路とは独立した経路によりＣＦＴＲチャネルを刺激することを示している。
Ｃ）結論
これらの結果は、化合物ＭＰＢ−０７及びベンゾキノリジニウムファミリーの幾つかのメンバーが、ｃＡＭＰ又は細胞内カルシウムとは独立した経路によりＣＦＴＲチャネルの開放を刺激することを示している。したがってこれらの分子は、ＣＦＴＲチャネルアクチベーターの新しいファミリーを代表する。
図面の凡例
−  図１：アフリカツメガエル卵母細胞における放射活性ヨウ化物の流出に及ぼすｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰの作用；
・  図１Ａ：時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）の曲線：黒四角により表される点を通る曲線は、ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入した卵母細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ベースＣＦＴＲと称される曲線）；白四角により表される点を通る曲線は、ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入し、かつｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化した卵母細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ＣＦＴＲ＋ｃＡＭＰと称される曲線）；
・  図１Ｂ：ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化していない卵母細胞（黒で示される）及びｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化した卵母細胞（白で示される）における125Ｉの流出のヒストグラム：ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したか又はしていなく、かつ水を注入した卵母細胞は、左側に示される（「水」と標識）；ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したか又はしていなく、かつｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入した卵母細胞は、右側に示される（「ＣＦＴＲ」と標識）；ｎは、実験の数を表す。
−  図２：ＣＨＯ細胞における放射活性ヨウ化物の流出に及ぼすｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰの作用；
・  図２Ａ：時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）の曲線：黒三角により表される点を通る曲線は、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化していないＣＨＯ細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ベースと称される曲線）；白三角により表される点を通る曲線は、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したＣＨＯ細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ｃＡＭＰと称される曲線）；
・  図２Ｂ：ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化していないＣＨＯ細胞における125Ｉの流出のヒストグラム（白で示される）；ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したか又はしていなく、かつＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞は、左側に示される（ＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）と標識）；ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したか又はしていなく、かつＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞は、右側に示される（ＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）と標識）；ｎは、実験の数を表す。
−  図３：ＨＴ２９細胞における放射活性ヨウ化物の流出に及ぼすｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰの作用；
・  図３Ａ：時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）の曲線：黒四角により表される点を通る曲線は、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化していないＨＴ２９細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ベースと称される曲線）；白四角により表される点を通る曲線は、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したＨＴ２９細胞において時間の関数として測定される125Ｉの流出に対応する（ｃＡＭＰと称される曲線）；
・  図３Ｂ：ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化していないＨＴ２９細胞（黒）及びｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したＨＴ２９細胞（白）における125Ｉの流出のヒストグラム。
−  図４：ＣＨＯ細胞における時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）に及ぼす誘導体ＭＰＢ−０７（５００μM）の作用：白丸により表される点を通る曲線は、ＭＰＢ−０７により活性化し、かつＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ＭＰＢ−０７（ＣＦＴＲ＋）と称される曲線）；黒丸により表される点を通る曲線は、ＭＰＢ−０７により活性化しているが、ＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ＭＰＢ−０７（ＣＦＴＲ−）と称される曲線）。
−  図５：ＣＨＯ細胞における時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）に及ぼす「フォルスコリン」（５００μM）の作用：白三角により表される点を通る曲線は、フォルスコリンにより活性化し、かつＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（フォルスコリンＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）と称される曲線）；黒三角により表される点を通る曲線は、フォルスコリンにより活性化していなく、かつＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ベースＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）と称される曲線）。
−  図６：ＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションしていなく（ＣＨＯ（ＣＦＴＲ−）と称される）、かつ
・  活性化していない（ベース）、
・  フォルスコリンにより活性化した（フォルスコリン）、
・  Ａ２３１８７により活性化した（Ａ２３１８７）、
・  Ａ２３１８７及びフォルスコリンにより活性化した（Ａ２３１８７＋ｆｓｋ）、
・  ＭＰＢ−０７により活性化した（ＭＰＢ−０７）、
ＣＨＯ細胞における125Ｉの流出のヒストグラム。
ｎは、実験の数を表す。
−  図７：ＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションし（ＣＨＯ（ＣＦＴＲ＋）と称される）、かつ
・  活性化していない（ベース）、
・  フォルスコリンにより活性化した（フォルスコリン）、
・  ＭＰＢ−０７により活性化した（ＭＰＢ−０７）、
・  Ａ２３１８７により活性化した（Ａ２３１８７）、
ＣＨＯ細胞における125Ｉの流出のヒストグラム。
ｎは、実験の数を表す。
−  図８：ＨＴ２９細胞における時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）に及ぼすｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰ（５００μM）及びＭＰＢ−０７（５００μM）の作用の比較：
・  図８Ａ：黒四角により表される点を通る曲線は、活性化していないＨＴ２９細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ベースと称される曲線）；白四角により表される点を通る曲線は、ｃ−ｃｐｔ−ＡＭＰにより活性化したＨＴ２９細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ｃＡＭＰと称される曲線）。
・  図８Ｂ：白四角により表される点を通る曲線は、活性化していないＨＴ２９細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ベースと称される曲線）；黒四角により表される点を通る曲線は、ＭＰＢ−０７により活性化したＨＴ２９細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ＭＰＢ−０７と称される曲線）。
−  図９：活性化していない（ベース）、ｃ−ｃｔｐ−ＡＭＰにより活性化した（ｃＡＭＰ）及びＭＰＢ−０７により活性化した（ＭＰＢ−０７）ＨＴ２９細胞における125Ｉの流出のヒストグラム：ｎは、実験の数を表す。
−  図１０：アフリカツメガエル卵母細胞における時間（横軸上、分）の関数としての125Ｉの流出（縦軸上、％）に及ぼすｃ−ｃｔｐ−ＡＭＰ（５００μM）の作用の比較：
・  図１０Ａ：白丸により表される点を通る曲線は、水を注入した卵母細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ベースの水と称される曲線）；黒四角により表される点を通る曲線は、ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入した卵母細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ベースＣＦＴＲと称される曲線）；白四角により表される点を通る曲線は、ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入し、かつｃ−ｃｔｐ−ＡＭＰで活性化した卵母細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ＣＦＴＲ＋ｃＡＭＰと称される曲線）；
・  図１０Ｂ：白四角により表される点を通る曲線は、ｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入し、かつＭＰＢ−０７で活性化した卵母細胞における時間の関数としての125Ｉの流出の測定に対応する（ＭＰＢ−０７と称される曲線）。
−  図１１：活性化していない（ベース）か、又はｃ−ｃｔｐ−ＡＭＰにより活性化した（ｃＡＭＰ）か、又はＭＰＢ−０７により活性化した（ＭＰＢ−０７）アフリカツメガエル卵母細胞における125Ｉの流出のヒストグラム、これらの卵母細胞は、水を注入した（左側の「水」と標識）か、又はｃＲＮＡ−ＣＦＴＲを注入した（右側の「ＣＦＴＲ」と標識）；ｎは、実験の数を表す。
−  図１２：ＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションし、かつ活性化していない（ベース）か、又はフォルスコリンにより活性化した（フォルスコリン）か、又はロリプラムにより活性化した（ロリプラム）か、又はＭＰＢ−０７により活性化した（ＭＰＢ−０７）、ＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ（タンパク質１mg当たりのnmolで測定）のレベルを表すヒストグラム。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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