(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコフェロール類含有液から順相液体クロマトグラフィーによりトコフェロール類を分離する方法において、固定相は比表面積（窒素吸着法）が１ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇ、細孔容積（窒素吸着法）が０．０１ｍｌ／ｇ〜３．０ｍｌ／ｇである、ポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体、又は（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子であり、移動相は比誘電率１．５〜２．５の炭化水素系有機溶媒、又は該炭化水素系有機溶媒が比誘電率４〜３８の極性有機溶媒を５０％（体積比）未満含有する混合溶媒であり、トコフェロール類含有液は、α−トコフェロール，β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールからなる群より選ばれる２種以上を含み、且つ順相液体クロマトグラフィーによりα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）およびδ−トコフェロールを分離することを特徴とする分離方法。
【請求項２】
トコトリエノール類含有液から順相液体クロマトグラフィーによりトコトリエノール類を分離する方法において、固定相として比表面積（窒素吸着法）が１ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇ、細孔容積（窒素吸着法）が０．０１ｍｌ／ｇ〜３．０ｍｌ／ｇである、ポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体、又は（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用い、且つ移動相として比誘電率１．５〜２．５の炭化水素系有機溶媒、又は該炭化水素系有機溶媒が比誘電率４〜３８の極性有機溶媒を５０％（体積比）未満含有する混合溶媒を用いることを特徴とする分離方法。
【請求項３】
トコフェロール類およびトコトリエノール類を含む溶液から順相液体クロマトグラフィーによりトコフェロール類とトコトリエノール類とを分離する方法において、固定相として比表面積（窒素吸着法）が１ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇ、細孔容積（窒素吸着法）が０．０１ｍｌ／ｇ〜３．０ｍｌ／ｇである、ポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体、又は（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用い、且つ移動相として比誘電率１．５〜２．５の炭化水素系有機溶媒、又は該炭化水素系有機溶媒が比誘電率４〜３８の極性有機溶媒を５０％（体積比）未満含有する混合溶媒を用いることを特徴とする分離方法。
【請求項４】
前記トコフェロール類は、α−トコフェロール，β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールからなる群より選ばれる２種以上を含み、且つ順相液体クロマトグラフィーによりα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）、δ−トコフェロール及びトコトリエノール類を分離することを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
多孔質有機高分子粒子がｐ−ｔ−ブトキシスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体の加水分解物からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項６】
多孔質有機高分子粒子は、比表面積（窒素吸着法）が５０ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇ、細孔容積（窒素吸着法）が０．１ｍｌ／ｇ〜３．０ｍｌ／ｇであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項７】
順相液体クロマトグラフィーにおける移動相として用いられる炭化水素系有機溶媒は、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン、トルエン、及びキシレンからなる群より選択される一種または二種以上であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項８】
順相液体クロマトグラフィーにおける移動相として、ヘキサン又はヘキサン−エタノール混合溶媒を用いることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は順相液体クロマトグラフィーを用いてトコフェロール類とトコトリエノール類を分離する方法に関するものである。詳しくは、順相液体クロマトグラフィーにより、トコフェロール類とトコトリエノール類を含有する溶液から、トコフェロール同族体を相互に分離すると同時にトコフェロール類とトコトリエノール類をも分離する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トコフェロール類およびトコトリエノール類は大豆油、菜種油、綿実油、サフラワー油、米ぬか油、トウモロコシ油、ひまわり油等の脱臭工程で副生する脱臭留出物中に含有されており、ｄ−α，ｄ−β，ｄ−γ，ｄ−δ−トコフェロールおよびｄ−α，ｄ−β，ｄ−γ，ｄ−δ−トコトリエノールの同族体が存在する。なお、天然由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは全てｄ体であるが、合成由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは通常はｄｌ体である（本明細書において特に記載しない限り、トコフェロールおよびトコトリエノールはｄ体、ｌ体およびｄ体とｌ体の混合物の何れも含むものとする）。
【０００３】
トコフェロール類およびトコトリエノール類はビタミンＥ群としての生理活性があり、また抗酸化作用があることから薬品，化粧品，食品等において利用されている。近年になって、ビタミンＥ生理活性ではα−トコフェロールに比べて劣るが、酸化防止作用を有するβ，γ，δ−トコフェロールについて、その酸化防止効果はδ−トコフェロールが優れており、またγ−トコフェロールには排尿や肌の健康に効果があるなど、個々のトコフェロール同族体についての機能性が注目されており、これらを効率的に単離する方法が求められるようになっている。
また、トコトリエノール類についても高脂血症改善作用，アテローム性動脈硬化改善作用，抗癌作用などの機能性が見いだされており、トコフェロール類からの効率的な分離方法が求められるようになっている。
【０００４】
しかしながら、従来はトコフェロール類を精製濃縮するために分子蒸留法、イオン交換樹脂処理等の方法が用いられていたが、分子蒸留法では分離操作が困難なうえに高濃度の濃縮物を収率よく得ることは非常に難しく、またイオン交換樹脂処理法では樹脂の再生が必要で溶剤置換を行う場合に生ずる溶出薬剤の除去処理等繁雑な工程を要する欠点があり、更にこれらの方法ではトコフェロール類の各同族体の単離およびトコトリエノール類との効率的な分離が困難であった。
これらの問題点を解決するために各種方法が提案されている。その一方法は、イオン交換樹脂ではない有機高分子を用いる方法であり、例えば、特公昭６０−３７１１０号公報には粗製トコフェロールをスチレンジビニルベンゼン共重合体ポーラスポリマーを充填したカラムに供し、アルコール溶媒系にて展開溶出し精製トコフェロールを得る方法が開示されている。本方法はスチレンジビニルベンゼン共重合体ポーラスポリマーに対してアルコール溶媒系の極性が高いことから逆相クロマトグラフィー分離であるが、この方法ではα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール），δ−トコフェロールの各同族体間の分離が出来ておらず、またトコトリエノール類の分離可能性については何等言及されていない。
【０００５】
また、特許第２７５７３７２号公報には、水と相溶せず原料の重合性単量体と相溶する有機溶剤からなる希釈剤の存在下、水系懸濁重合で得られる６０重量％以上の１分子内に複数のビニル基を有する架橋性単量体を結合含有する多孔性重合体からなり、該重合体の粒子径が１０μ以上で、かつゲル水分率が３０％以上であるトコフェロール類の分離濃縮用ビーズを充填したカラムに脱臭留出物を注入した後展開溶媒を通液し、液体クロマトグラフィーによりトコフェロール類を分離濃縮する方法が開示されている。本方法では、展開溶媒として推奨され、且つ具体的に用いられたメタノールが該多孔性重合体に対して極性が高いことから逆相クロマトグラフィー分離であり、トコフェロール同族体の相互分離、即ちα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール），δ−トコフェロールの分離が出来ておらず、またトコトリエノール類の分離可能性については言及されていない。
【０００６】
一方、シリカゲル系充填剤を用いる方法も検討されており、例えば、特開平８−５９６４７号公報ではシリカゲル系充填剤を充填した擬似移動層を用いて、トコフェロール成分を分離精製する方法が開示されているが、本方法でもトコフェロールとトコトリエノールの分離可能性については言及されていない。
また、特開２００１−１２２８６９号公報においてはトコトリエノール類、トコフェロール類及びそれらの異性体類を粗初期原料から逆相液体クロマトグラフィーを用いて単離する方法が開示されているが、本方法での移動相はアルコールおよび所定量以下の水を含む溶媒が使用されており、移動相に水が入ると一般的にはトコフェロール類およびトコトリエノール類の溶解度が低下することから高濃度負荷が出来ず工業的には不利である。
【０００７】
更に、特開２００１−２６１６７１号公報にはシリカゲル、逆相Ｃ１８シリカゲルを用いて超臨界流体環境下でビタミンＥを含んでなる化合物からのビタミンＥ異性体をクロマトグラフィー単離する方法が開示されているが、本方法では超臨界流体を用いるため設備費用が高いという工業的欠点を有する。
加えて、シリカゲル系充填剤についてはシリカゲルの製造において各種金属の混入程度を制御することが難しく、これらの混入金属イオン等の影響による分離挙動の再現性の問題があり、また水分の影響による保持挙動の変動も大きく運転上の安定性にも問題がある。更にＣ１８基のごときアルキル基を導入したシリカゲル系充填剤を用いる場合にも、この導入率の制御、またアルキル基未導入部分のエンドキャップの制御が難しく分離挙動の再現性に問題がある。
以上のように、従来技術においては工業的に効率的かつ安定的な方法にてトコフェロール類とトコトリエノール類を分離することは困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、工業的に効率的かつ安定的なトコフェロール類、トコトリエノール類の分離方法、更にはトコフェロール類の各同族体とトコトリエノール類との分離方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、固定相として製造再現性に優れ、また酸・アルカリ等の化学的耐性に優れる特徴を持つ多孔質有機高分子粒子を用いた順相液体クロマトグラフィーを適用することによりトコフェロール類とトコトリエノール類の分離は勿論、トコフェロール類の各同族体間の単離も同時に効率的かつ安定的に出来ることを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は、トコフェロール類およびトコトリエノール類を含む溶液から順相液体クロマトグラフィーにより、所望のトコフェロール類、又はトコトリエノール類を分離する方法、更にはトコフェロール類の各同族体とトコトリエノール類とを分離する方法において、順相液体クロマトグラフィーの固定相として多孔質有機高分子粒子を用いることを特徴とする分離方法に存するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、順相クロマトグラフィーによりトコフェロール類およびトコトリエノール類を分離する方法に係わり、この順相クロマトグラフィーに固定相として多孔質有機高分子粒子を用いることが必須である。
本発明で用いられる多孔質有機高分子粒子としては、液相クロマトグラフィーに使用されるものから選定することが出来るが、代表的なものとしては多孔質のポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体および（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体等があげられる。
ポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体としては、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−ｔ−ブトキシスチレン等のスチレン系単量体と架橋剤としてのジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等のポリビニルベンゼン系単量体との架橋共重合体、或いはジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等のポリビニルベンゼン系単量体の単独重合体又は２種以上からなる共重合体があげられるが、これらの中、特にスチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体が好ましい。これらの架橋（共）重合体は公知の方法により製造することができる。
【００１１】
（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体としては、（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体、並びに（メタ）アクリル酸ポリオールエステル等の単量体の（共）重合体であり、例えば（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体と（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの共重合体、或いは（メタ）アクリル酸ポリオールエステルの単独重合体又は少なくとも２種の共重合体が挙げられ、これらの架橋（共）重合体は公知の方法により製造される。
（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体としては、具体的に（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル類；（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体類が挙げられる。
【００１２】
また、（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとしては、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ブタンジオールジ（メタ）アクリレート，ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋（共）重合体等はそのままで用いることができるが、また必要に応じて更に官能基を導入して用いてもよい。導入する官能基としては、例えば、水酸基、エステル基、エーテル基、カルボニル基等の含酸素官能基、アミノ基、アミド基、ニトロ基、ニトリル基等の含窒素官能基、チオール基、スルホン基等の含硫黄官能基等が挙げられるが、中でも水酸基、エステル基、アミノ基、アミド基、ニトリル基が好ましく、水酸基、エステル基が更に好ましい。
架橋共重合体の中で好ましい具体例としては、（メタ）アクリル酸エステルと（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの架橋共重合体である（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体、ｐ−ｔ−ブトキシスチレンとジビニルベンゼンとの架橋共重合体の加水分解物等があげられ、特に好ましくは（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体があげられる。
【００１３】
多孔質有機高分子粒子が多孔性であることは順相クロマトグラフィーによる分離時の処理量を高めるために有効であり、具体的には窒素吸着法にて求められる比表面積として１ｍ2／ｇ以上、好ましくは５０ｍ2／ｇ以上、更に好ましくは１００ｍ2／ｇ以上であり、２０００ｍ2／ｇ以下である。また、細孔容積としては０．０１ｍｌ／ｇ以上、好ましくは０．１ｍｌ／ｇ以上、更に好ましくは０．２ｍｌ／ｇ以上であり、３．０ｍｌ／ｇ以下である。
多孔質有機高分子粒子の平均粒子径については１μｍから２ｍｍの範囲、好ましくは３μｍから２ｍｍの範囲、工業的に更に好ましくは４μｍから１ｍｍの範囲であり、また粒子形状は真球状であり、粒子径分布は狭いことが好ましい。
【００１４】
これら多孔質有機高分子粒子は上記の多孔質特性を満たす限り市販品から適宜選定することができる。スチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体の具体的製品例としては、ダイヤイオン  ＨＰ２０、ＨＰ２０Ｓ、ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２１、セパビーズ  ＳＰ２０ＳＳ、ＳＰ２０ＤＦ、ＳＰ２０７、ＳＰ７０、ＳＰ７００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ１０Ｍ、ＣＨＰ５Ｃ、ＣＨＰ２０Ｐ、ＣＨＰ２０Ａ、ＣＨＰ２０Ｙ、ＣＨＰ５５Ａ、ＣＨＰ５５Ｙ等（以上、三菱化学(株)製；商品名）；アンバーライト  ＸＡＤ２（スペルコ社製；商品名）、アンバーライト  ＸＡＤ４、ＸＡＤ８、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ１６００、ＸＡＤ２０００、ＸＡＤ２０１０、アンバークロム  ＣＧ−１６１、ＣＧ−３００、ＣＧ−１０００等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）、ダウエックス  Ｌ２８５、Ｌ３２３、Ｌ４９３、Ｖ４９３、Ｖ５０２等（以上、ダウ・ケミカル社製；商品名）、ＰＬＲＰ−Ｓ等（ポリマーラボラトリー社製；商品名）、ＰＲＰ−１、ＰＲＰ−３等（ハミルトン社製；商品名）、ＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ等（アマシャムファルマシアバイオテク社製；商品名）等が挙げられる。
【００１５】
（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体としては、ダイヤイオン  ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等、ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ２ＭＧＭ、ＣＨＰ２ＭＧ、ＣＨＰ２ＭＧＦ、ＣＨＰ２ＭＧＡ、ＣＨＰ２ＭＧＹ等、セパビーズ  ＦＰ−ＨＧ等（以上三菱化学社製；商品名）、アンバーライト  ＸＡＤ７、ＸＡＤ７ＨＰ、アンバークロム  ＣＧ−７１等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）等があげられる。
【００１６】
本発明において用いられる順相液体クロマトグラフィーとは、固定相に対して極性の低い移動相を通液し、試料を負荷、分離する方法である。移動相としては、固定相より低極性の有機溶媒が使用され、通常比誘電率が2.5〜1.5の有機溶媒から選ばれる。具体的には、ｎ−ペンタン（比誘電率1.844）、ｎ−ヘキサン（比誘電率1.890）、ｎ−ヘプタン（比誘電率1.924）、ｎ−オクタン（比誘電率1.948）、イソオクタン（比誘電率1.943）、シクロヘキサン（比誘電率2.052）等の飽和脂肪族系炭化水素、およびトルエン（比誘電率2.24）、キシレン（比誘電率2.266）等の芳香族系炭化水素からなる群より選択される一種または二種以上の炭化水素系有機溶媒が挙げられる。これらの有機溶媒は必要に応じて、少量の極性有機溶媒を含んでいても良い。
【００１７】
添加し得る極性有機溶媒としては、通常比誘電率が4〜38の有機溶媒から選ばれ、具体的にはメタノール（比誘電率33.1）、エタノール（比誘電率23.8）、ｎ−プロパノール（比誘電率22.2）、２−プロパノール（比誘電率18.3）等の炭素数１から６の脂肪族アルコール類；酢酸エチル（比誘電率6.02）、酢酸プロピル（比誘電率6.002）等のアルキル鎖の炭素数が１から６の酢酸アルキルエステル類；クロロホルム（比誘電率4.9）、ジクロロメタン（比誘電率9.1）等の塩素系有機化合物類；アセトン（比誘電率20.7）、メチルエチルケトン（比誘電率18.51）等のアルキルケトン類；ジエチルエーテル（比誘電率4.197）、ジイソプロピルエーテル（比誘電率4.49）、テトラヒドロフラン（比誘電率7.58）等のアルキルエーテル類およびアセトニトリル（比誘電率37.5）等からなる群から任意に選択された一種又は二種以上の有機溶媒が挙げられる。炭化水素系有機溶媒とこれらの極性有機溶媒との混合溶媒を用いると溶離位置の調整が容易になり好適である。これらの中でも食品用途を考慮すると食品添加物として使用可能であるヘキサン、又はヘキサン−エタノール混合溶媒が好ましい。
炭化水素系有機溶媒が含有し得る極性有機溶媒の量は、固定相の極性度、有機溶媒の種類、比誘電率等によっても異なり画一的決められないが、通常５０％（体積比）未満、好ましくは４０％（体積比）以下、更に好ましくは２０％（体積比）以下である。
【００１８】
本発明の特徴は、トコフェロール類とトコトリエノール類を効率的に分離することが可能であるということに在る。通常、使用されているシリカゲルを固定相とする順相液体クロマトグラフィーによってトコフェロール類とトコトリエノール類を含有する溶液の分離を行った場合、α−トコフェロールとα−トコトリエノール；（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）と（β−トコトリエノール＋γ−トコトリエノール）；δ−トコフェロールとδ−トコトリエノールそれぞれの保持が近接しているため、例えばα−トコフェロールとβ−トコフェロールの間にα−トコトリエノールが溶離する、また（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）とδ−トコフェロールの間に（β−トコトリエノール＋γ−トコトリエノール）が溶離する場合がある。その為、このような保持挙動を示すシリカゲル系充填剤を用いる場合には、トコフェロール類とトコトリエノール類を分離するためには各成分を細かく分取する必要があり工業的に効率的ではない。一方、本発明においてはトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が大きく離れていることからトコフェロール類とトコトリエノール類との分離が容易であり、工業的に極めて有利といえる。
【００１９】
更に、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用い、ヘキサン−エタノール混合溶媒等を移動相とした場合には、トコフェロール同族体の相互分離、即ちα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）およびδ−トコフェロールを分離し、かつトコトリエノール類をも分離することが可能であり好ましい。
【００２０】
本発明において行われる順相液体クロマトグラフィー分離を実施する装置については、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置、中圧液体クロマトグラフィー装置、低圧液体クロマトグラフィー装置等、公知の装置が使用できる。
また、本発明において行われる順相液体クロマトグラフィー分離においては、単カラム法、多段カラム法および複数のカラムを循環接続させ、移動相通液、試料添加および分離成分抜き出しを各カラム間に設けたバルブを介して行ういわゆる擬似移動床（擬似移動層，Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  ＢｅｄまたはＳＭＢ）法および改良型擬似移動床（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ  ＢｅｄまたはＩＳＭＢ）法等が可能である。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明の具体的態様を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
送液ポンプ、オートサンプルインジェクタ、カラムオーブン、紫外吸収検出器、データ処理装置を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用い、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体であるＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ２ＭＧ（三菱化学社製）を多孔質有機高分子粒子として用いた。この粒子を内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したカラムを使用し、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９８／２（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．０ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。
【００２３】
試料としてｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、及びｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）の各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各１０μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて２０μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００２４】
各試料についての保持比（ｋ’）は以下の式により算出した。
【数１】
ｋ’＝[(各試料の溶離容量)−(四塩化炭素の溶離容量)]／［（四塩化炭素の溶離容量）］
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表１に示す。表１より本実施例ではトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が離れていることからトコフェロール類およびトコトリエノール類を含む溶液からのトコフェロール類とトコトリエノール類との分離が容易であることが分かる。
【００２５】
【表１】
0004316185.tif 000002
【００２６】
実施例２
試料としてオリザトコトリエノール−３０Ｇ（オリザ油化製）を用いた以外は、実施例１と同一条件にて順相クロマトグラフィー分離を行った。オリザトコトリエノール−３０Ｇはイネ種子由来であり、ｄ−α−トコフェロール，ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−α−トコトリエノール，ｄ−γ−トコトリエノールを主成分として含む。試料としては、５０ｍｇのオリザトコトリエノール−３０Ｇを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて５μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムの溶出曲線を図１に示す。
図１中、ピーク１はｄ−α−トコフェロール、ピーク２は（ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロール）、ピーク３はｄ−δ−トコフェロール、ピーク４はｄ−トコトリエノール類を表す。
実施例１の結果との対比によりｄ−α−トコフェロール，（ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロール）およびｄ−δ−トコフェロールを分離し、かつｄ−トコトリエノール類を分離していることが分かる。
【００２７】
実施例３
送液ポンプ、オートサンプルインジェクタ、カラムオーブン、紫外吸収検出器、データ処理装置を備えたＨＰＬＣ装置を用い、スチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体であるｐ−ｔ−ブトキシスチレン／ジビニルベンゼン＝１５／８５（重量比）架橋共重合体（粒子径：５０〜１５０μｍ、比表面積（窒素吸着法による）：６１６ｍ2／ｇ、細孔容積：１．２２ｍｌ／ｇ、最頻度半径：８１オングストローム）のｔ−ブトキシ基を常法にてアルカリ加水分解することにより水酸基に変換した多孔質有機高分子粒子を固定相として用いた。この粒子を内径１０ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したカラムを使用し、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９９／１（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速２．４ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。
【００２８】
試料として、ｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、ｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各８０μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１００μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００２９】
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表２に示す。表２より本実施例でもトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が離れていることが分かる。本実施例では実施例１に比べて各試料の保持比が小さいが、このような場合でも擬似移動床および改良型擬似移動床法等を採用することによりトコトリエノール類およびトコフェロール類を含む原料からの工業的に効率的なトコフェロール類とトコトリエノール類の分離が可能である。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
比較例１
実施例１と同一のＨＰＬＣ装置および同一の固定相を充填した同一サイズのカラムを用い、移動相として固定相より極性の高いイソプロパノールを用いた逆相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速０．５ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。試料として５０ｍｇのオリザトコトリエノール−３０Ｇを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１０μｌを注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムの溶出曲線を図２に示す。実施例１と比較すると、クロマトグラムは２つのブロードなピークが重なっており、ｄ−トコフェロール類とｄ−トコトリエノール類の分離が不充分であることが分かる。
【００３２】
比較例２
実施例１と同一のＨＰＬＣ装置を用い、固定相としてシリカゲル充填カラムであるＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ−Ｓｉ（粒子径５μｍ；カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ＡＬＴＥＸ社製）を用い、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９９／１（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．０ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。試料としてｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、およびｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）の各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各５μｌを注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００３３】
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１０μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表３に示す。表３より明らかなように、各試料の保持比はｄｌ−α−トコフェロール→ｄｌ−α−トコトリエノール→ｄｌ−β−トコフェロール→ｄｌ−γ−トコフェロール→ｄｌ−β−トコトリエノール→ｄｌ−γ−トコトリエノール→ｄｌ−δ−トコフェロール→ｄｌ−δ−トコトリエノールの順で大きくなることから、トコトリエノール類およびトコフェロール類を含む原料からトコフェロール類とトコトリエノール類を分離するためには各成分を細かく分取する必要が生じ、工業的には効率的でないことが判る。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
【発明の効果】
従来技術ではトコフェロール類とトコトリエノール類を工業的に分離することが困難であったが、本発明方法にれば、工業的に効率的かつ安定的な方法にてトコフェロール類の各同族体の分離はもとより、トコトリエノール類との分離をも可能にするので、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例２におけるオリザトコトリエノール−３０Ｇの順相クロマトグラフィーによる溶出曲線を示す。
【図２】  比較例１におけるオリザトコトリエノール−３０Ｇの逆相クロマトグラフィーによる溶出曲線を示す。
【符号の説明】
１  ｄ−α−トコフェロールのピーク
２  ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロールのピーク
３  ｄ−δ−トコフェロールのピーク
４  ｄ−トコトリエノール類のピーク
【図１】
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【図２】
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