(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンに置換されたアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３２４番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３３７番目のセリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
さらに、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２４０番目のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項２に記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
さらに、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３４４番目のリジンがグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項２に記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
さらに、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３５３番目のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項２に記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
さらに、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の４１０番目のリジンがメチオニンに置換されたアミノ酸配列を有する請求項２に記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンに、２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、２４０番目のアスパラギンがセリンに、３２４番目のアスパラギン酸がグリシンに、３５３番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とするグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０記載の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養し、変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生成させ、該変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比較して、液状安定性の向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び該変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）は、動植物から微生物まで広く存在し、臨床検査薬用酵素としてクレアチニンキナーゼ、グルコース、ＡＴＰ等の測定に使用されている。これらの用途としてロイコノストック(Leuconostoc)属細菌（特公平５−８７２３４号公報、特公平５−５０３２２１号公報）や酵母等の微生物から採取されたものが主に用いられているが、従来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは安定性が不足しており、特に補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）共存下での液状保存安定性が悪いことが知られており、その改良が望まれている。
【０００３】
そのための方法として、例えば、特公昭６３−４３０７９号公報、特公平３−９９５号公報、特開平９−３１３１７４号公報等において、耐熱性のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用する方法が報告されている。また、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ自体を安定化する方法として特開平７−５９５６６号公報等にはヒドロキシルアミン類やアルデヒド類を共存させる方法、特開平９−６５８７７号公報においては二価性架橋試薬にて化学修飾する方法なども報告されている。しかしながら、これらの方法ではいずれも十分な安定性が得られていないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
臨床検査用試薬として用いるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、溶液状態における保存時の安定性に優れたものが望まれている。本発明は野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸に変異を導入することにより安定性を改良した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び該変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、臨床検査の用途として適した液状における安定性に優れたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides) ＡＴＣＣ１２２９１のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を基に、野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列に変異を導入することにより、液状における安定性が向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを造成することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入あるいは置換することにより変異させたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状における安定性が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入あるいは置換により変異させたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状安定性が変異前のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比べて向上していることを特徴とする。本発明の変異を導入する前の野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばロイコノストック属細菌由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【０００８】
上記変異の方法としては、公知の方法に従って行うことが可能である。例えば、付加による蛋白質の機能の改変する方法としては、Nature Biotechnology第１７巻、第５８〜６１頁（１９９９年）に記載されている。また、欠失による方法については、Biochem.Biophys.Res.Commun. 第２４８巻、第２号、第３７２〜３７７頁、挿入による方法については、FEBS Lett.第４４２巻、第２４１〜２４５頁（１９９９年）、置換による方法については、Nucleic Acids Research第２６巻、第２号、第６８１〜６８３頁（１９９８年）にそれぞれ記載されている。
【０００９】
本発明ではその一例として、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides) ＡＴＣＣ１２２９１株由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた。野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの性質は下記の通りであり、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
作用：Ｄ−グルコース−６−リン酸とＮＡＤ又はＮＡＤＰに作用して、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸と還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰを生成する
至適温度：約５０〜５５℃
至適ｐＨ：７．８
熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ８．０，３０分間）
ｐＨ安定性：約５．０〜１０．０（３０℃，１７時間）
グルコース−６−リン酸に対するＫｍ値（補酵素としてＮＡＤを用いた場合）：約０．１ｍＭ
ＮＡＤに対するＫｍ値：約０．１ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース−６−リン酸に高い特異性を示す
分子量：約５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１０】
本発明における液状安定性とは、例えば中性緩衝液中に該酵素を溶解して、熱処理した後の残存酵素活性の割合を示す。本発明の一実施態様として、２ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で５０℃、３０分熱処理した後の活性残存率が野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比べて向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。他の態様としては、２ｍＭのＥＤＴＡと２ｍＭのＮＡＤＰを含む１００ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で４０℃、１週間保存した後の活性残存率が野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比べて向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。更に他の態様としては、１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で５０℃、３０分熱処理した後の活性残存率が野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比べて向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００１１】
また、別な実施態様は血清グルコース測定試薬溶液中で４０℃、１週間保存した後の残存活性率が野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと比べて向上した変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。ここで、血清グルコース測定溶液とは、試料中のグルコースをＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下にヘキソキナーゼを作用させて、ＡＤＰ及びグルコース−６−リン酸を生成させ、次いでグルコース−６−リン酸とＮＡＤまたはＮＡＤＰにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変化を吸光度測定することにより、グルコースを測定する溶液であり、少なくともｐＨ緩衝剤、ＡＴＰ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、マグネシウムイオン、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを成分として含む溶液である。該溶液は日本臨床化学会勧告法（臨床化学  第２０巻、第４号、第１８５頁、１９９１年１２月）によりその望ましい組成が定められている。ｐＨ緩衝剤としては、基質の安定性や酵素の反応性を考慮して種類とｐＨを適宜選択すればよいが、例えば、トリス、トリスエタノールアミン、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等を通常５〜５００ｍＭの濃度で、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で使用することができる。他の成分についても、反応性や経済性を考慮して添加量を設定すればよいが、例えば、ＡＴＰは０．２〜１０ｍＭ、ＮＡＤＰは０．２〜１０ｍＭ、マグネシウムイオンは１〜２０ｍＭ、ヘキソキナーゼは０．３〜１０Ｕ／ｍｌ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは０．３〜１０Ｕ／ｍｌの範囲で使用される。
【００１２】
本発明の具体的な実施態様としては、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニン、２０７番目のチロシン、２４０番目のアスパラギン、３２４番目のアスパラギン酸、３３７番目のセリン、３４４番目のリジン、３５３番目のリジン、４１０番目のリジンからなる群より選択される箇所の一つまたは二つ以上が他のアミノ酸に置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００１３】
更に具体的な例として、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンへ、２０７番目のチロシンがフェニルアラニンへ、２４０番目のアスパラギンがセリンへ、３２４番目のアスパラギン酸がグルタミンへ、３３７番目のセリンがアラニンへ、３４４番目のリジンがグルタミンへ、３５３番目のリジンがアルギニンへ、４１０番目のリジンがメチオニンへの置換の中、一または二つ以上を含む変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００１４】
本発明の一例としては、下記の理化学的性質を有する変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
作用：Ｄ−グルコース−６−リン酸とＮＡＤ又はＮＡＤＰに作用して、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸と還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰを生成する
至適温度：約５０〜５５℃
至適ｐＨ：７．８
熱安定性：約４５℃以下（ｐＨ８．０，３０分間）
ｐＨ安定性：約４．０〜１１．０（３０℃，１７時間）
グルコース−６−リン酸に対するＫｍ値（補酵素としてＮＡＤを用いた場合）：約０．１ｍＭ
ＮＡＤに対するＫｍ値：約０．１ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース−６−リン酸に高い特異性を示す
分子量：約５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１５】
また本発明の別な一例としては、下記の理化学的性質を有する変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
作用：Ｄ−グルコース−６−リン酸とＮＡＤ又はＮＡＤＰに作用して、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸と還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰを生成する
至適温度：約５０〜５５℃
至適ｐＨ：７．８
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ８．０，３０分間）
ｐＨ安定性：約４．０〜１１．０（３０℃，１７時間）
グルコース−６−リン酸に対するＫｍ値（補酵素としてＮＡＤを用いた場合）：約０．３ｍＭ
ＮＡＤに対するＫｍ値：約０．１ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース−６−リン酸に高い特異性を示す
分子量：約５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１６】
本発明の具体的な実施態様としては、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニン、２０７番目のチロシン、２４０番目のアスパラギン、３２４番目のアスパラギン酸、３３７番目のセリン、３４４番目のリジン、３５３番目のリジン、４１０番目のリジンからなる群より選択される箇所の一つまたは二つ以上が他のアミノ酸に置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００１７】
更に具体的な例として、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンへ、２０７番目のチロシンがフェニルアラニンへ、２４０番目のアスパラギンがセリンへ、３２４番目のアスパラギン酸がグルタミンへ、３３７番目のセリンがアラニンへ、３４４番目のリジンがグルタミンへ、３５３番目のリジンがアルギニンへ、４１０番目のリジンがメチオニンへの置換のうち、一または二つ以上を含む変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１８】
更に本発明は、上記変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、及び該組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体、更に該形質転換体を培養し、変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生成させ、該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法である。ベクター、宿主細胞は一般的に当該技術分野において使用されるものが例示される。
【００１９】
変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作製する為に、野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入する方法は公知の方法により行うことができる。すなわち、該遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法、また遺伝子修復機構が欠損しているために高頻度に遺伝子に変異が生じる大腸菌を用いる方法がある。また部位特異的変異を導入する方法として合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法や市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００２０】
本発明において変異を導入する前の野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、特に限定されるものではないが、例えば配列表の配列番号２記載のロイコノストック・シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides) ＡＴＣＣ１２２９１株由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。また別の例として、該遺伝子とストリントジェントな条件、例えば×２ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）中、６５℃、１６時間においてハイブリダイズするグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２１】
作製された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ベクターに連結した状態で複製可能な宿主微生物に移入後、該形質転換体を培養し、該培養物から該変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターを分離、精製し、該ベクターから変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を採取することができる。
【００２２】
すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることにより変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うこともできる。
【００２３】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10，Lambda-gt11などが使用できる。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、pBR322,pUC19,pBluescript,pLED-M1（Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993)）などが使用できる。
【００２４】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＷ３１１０，エシェリヒア・コリーＣ６００，エシェリヒア・コリーＨＢ１０１，エシェリヒア・コリーＪＭ１０９などを用いることができる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。
【００２５】
こうして得られた形質転換体である微生物は栄養培地で培養されることにより、多量の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を同時に発現する微生物を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２６】
上記の方法により得られた変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列はサイエンス（Science, Vol.214, 1205-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読し、また変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定した。この様にして一度選択された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲにより変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収して他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２７】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス，シュークロース，ラクトース，マルトース，フラクトース，糖蜜，ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼイン加水分解物，大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの塩類，特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は、菌が発育しグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒアコリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育しグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２８】
培養物中の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従ってグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが培養液中に存在する場合は濾過，遠心分離などにより、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで該菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は界面活性剤を加えることによりグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２９】
この様にして得られた変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸アンモニウム，硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは、例えばメタノール，エタノール，アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００３０】
例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（アマシャム−ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム−ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム−ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーなどにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。尚、実施例中のアミノ酸配列の置換箇所において、置換された後のアミノ酸の種類はその一例を示したもので、これらに限定されるものではなく有効なアミノ酸を適宜選択して用いることができる。
【００３２】
実施例中、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の試薬および測定条件で行った。
＜試薬＞
試薬Ａ：５５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８；３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）
試薬Ｂ：６０ｍＭ  ＮＡＤ+水溶液
試薬Ｃ：１００ｍＭ  グルコース−６−リン酸水溶液
酵素希釈液：５５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８；０．１％  ＢＳＡを含む）
＜測定条件＞
まず、試薬Ａ２．７ｍｌ，試薬Ｂ０．１ｍｌ，試薬Ｃ０．１ｍｌを混合して反応混液を調製する。３０℃で約５分間予備加温後、反応混液に０．１ｍｌの酵素溶液を加え３０℃で反応を開始し、５分間反応させた後３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に1マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００３３】
参考例  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングと発現
ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株をLactobacilli MRS Broth（Ｄｉｆｃｏ製）２６℃にて培養した後、遠心分離により集菌し、該菌体より常法に従い染色体ＤＮＡを調製した。次に上記染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１（東洋紡績製）で部分分解し、アガロースゲル電気泳動により３〜７Ｋｂの断片を回収した。一方、pBluescript KS(+)（東洋紡績製）を制限酵素ＢａｍＨ１（東洋紡績製）で切断し、更にアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）で処理した後、上記ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）で連結した。
【００３４】
連結したＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリーＪＭ１０９を形質転換し、選択用ＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＨ７．２））に塗布し、３７℃、１８時間培養した。生育したコロニーについてＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＨ７．２））で３７℃、１６時間振とう培養し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を指標にスクリーニングを行った結果、培養液１ｍｌ当たり１．５４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す形質転換体を得た。この形質転換体のプラスミドＤＮＡを鋳型として、公知のロイコノストック・メセンテロイデスのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（特表平５−５０３２２１公報）を基に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ蛋白質をコードする遺伝子及びその上流約１００ｂｐが増幅されるような２種のプライマーにより、ＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは以下に示す反応液組成及び条件にて行った。
【００３５】
＜反応液組成＞
ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）  ５Ｕ／１００μl
１０倍濃度ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液    １０μl／１００μl
プラスミドＤＮＡ    ５０ｎｇ
ｄＡＴＰ, ｄＴＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＣＴＰ    各０．２ｍＭ
プライマー      各１００ｐＭ
＜増幅条件＞
(1)９４℃、３０秒間
(2)６０℃、２秒間
(3)７４℃、１分間  （(1)〜(3)を１サイクルとして３０サイクル実施した）
【００３６】
増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断したpBluescript KS(+)とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、これを用いてエシェリヒア・コリーＪＭ１０９を形質転換し、選択用ＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＨ７．２））に塗布し、３７℃、１８時間培養した。生育したコロニーについてＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＨ７．２））で３７℃、１６時間振とう培養し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を発現する株をスクリーニングした結果、培養液１ｍｌ当たり１５０Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す形質転換体を得た。この形質転換体より抽出したプラスミドＤＮＡをｐＧ６Ｄ６６と命名した。ｐＧ６Ｄ６６のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列はＤＮＡシーケンサー（ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer；ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ製）を用いて決定した。その塩基配列を配列表の配列番号１に、また該塩基配列から推定されるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００３７】
実施例１  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの作製
野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＧ６Ｄ６６と配列表配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に参考例と同様の方法にて塩基配列を決定して、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンに置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ１）を取得した。
【００３８】
また、ｐＧ６Ｄ６６と配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２）を取得した。
【００３９】
ｐＧ６Ｄ６６と配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の３２４番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ３）を取得した。
【００４０】
ｐＧ６Ｄ６６と配列表の配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の３３７番目のセリンがアラニンに置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ４）を取得した。
【００４１】
また、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２と配列表の配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、２４０番目のアスパラギンがセリンに各々置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ５）を取得した。
【００４２】
ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２と配列表の配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、３５３番目のリジンがアルギニンに各々置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ６）を取得した。
【００４３】
更に、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ５と配列表の配列番号３、５及び８記載の各合成オリゴヌクレオチド及びこれらと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の６６番目のフェニルアラニンがロイシンに、２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、２４０番目のアスパラギンがセリンに、３２４番目のアスパラギン酸がグリシンに、３５３番目のリジン酸がアルギニンに各々置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ７）を取得した。
【００４４】
また、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２と配列表の配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、３４４番目のリジンがグルタミンに各々置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ８）を取得した。
【００４５】
ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２と配列表の配列番号１０記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０７番目のチロシンがフェニルアラニンに、４１０番目のリジンがメチオニンに各々置換された変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ９）を取得した。
【００４６】
ｐＧ６Ｄ６６、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ１、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ３、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ４、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ５、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ６、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ７、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ８、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ９の各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００４７】
実施例２  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造
１００ｍｌのＬＢ培地を５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを１００μｌ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢで予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＧ６Ｄ６６Ｍ１）の培養液をを１ｍｌ接種し、３０℃で１８時間通気攪拌培養した。培養終了時のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、培養液１ｍｌ当たり約１０４０Ｕ／ｍｌであった。
【００４８】
上記菌体を遠心分離により集菌し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（アマシャム−ファルマシア）により脱塩し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｐｓｅ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィー、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ファルマシアバイオテク）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約７３０Ｕ／ｍｇ蛋白であった。また、この変異体をＧ６Ｄ６６Ｍ１と命名した。
【００４９】
ｐＧ６Ｄ６６、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ２、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ３、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ４、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ５、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ６、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ７、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ８、ｐＧ６Ｄ６６Ｍ９による各エシェリヒア・コリーＪＭ１０９形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。得られた精製酵素標品それぞれＧ６Ｄ６６、Ｇ６Ｄ６６Ｍ２、Ｇ６Ｄ６６Ｍ３、Ｇ６Ｄ６６Ｍ４、Ｇ６Ｄ６６Ｍ５、Ｇ６Ｄ６６Ｍ６、Ｇ６Ｄ６６Ｍ７、Ｇ６Ｄ６６Ｍ８、Ｇ６Ｄ６６Ｍ９と命名した。
【００５０】
実施例３  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性の比較（１）
実施例２で得た各種変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６Ｍ１、Ｇ６Ｄ６６Ｍ２、Ｇ６Ｄ６６Ｍ３、Ｇ６Ｄ６６Ｍ４）と野生型のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６）をそれぞれ２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で５０℃にて熱処理した時の活性残存率の経時的変化を比較した結果を図１に示す。図１から明らかなように、本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、野生型と比べて安定性が向上していることが示される。
【００５１】
実施例４  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性の比較（２）
実施例２で得た各種変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６Ｍ２、Ｇ６Ｄ６６Ｍ５、Ｇ６Ｄ６６Ｍ６、Ｇ６Ｄ６６Ｍ７）と野生型のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６）をそれぞれ２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で５２℃にて熱処理した時の活性残存率の経時的変化を比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは変異を適宜組み合わせることで、野生型と比べて安定性が相加的に向上していることが示される。
【００５２】
実施例５  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの保存安定性の比較（１）
実施例２で得た変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６Ｍ２、Ｇ６Ｄ６６Ｍ８）と野生型のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｐＧ６Ｄ６６）をそれぞれ２ｍＭ  ＥＤＴＡと２ｍＭ  ＮＡＤＰを含む１００ｍＭイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で４０℃にて保存した時の活性残存率の経時的変化を比較した結果を図３に示す。図３から明らかなように、本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは野生型と比べて補酵素ＮＡＤＰ共存下での液状保存安定性が向上していることが示される。
【００５３】
実施例６  変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと野生型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの保存安定性の比較（２）
実施例２で得た変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｄ６６Ｍ２、Ｇ６Ｄ６６Ｍ９）と野生型のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｐＧ６Ｄ６６）をそれぞれ下記のグルコース測定試薬中で３７℃にて保存した時の活性残存率の経時的変化を比較した結果を図４に示す。図４から明らかなように、本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは野生型と比べてグルコース測定試薬中での液状保存安定性が向上していることが示される。
【００５４】
トリス−塩酸緩衝液    １００ｍＭ
酢酸マグネシウム    ５ｍＭ
ＡＴＰ    １．２ｍＭ
ＮＡＤＰ    １．２ｍＭ
ヘキソキナーゼ    １０００Ｕ／ｌ（３０℃）
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ    １０００Ｕ／ｌ（３０℃）
ｐＨ７．５（２５℃）
【００５５】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を変異させて改良し、液状における安定性に優れた変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを取得できる。更に遺伝子工学的技術を用いることにより該変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを、高純度且つ大量に供給することができる。
【００５６】
【配列表】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（変異１箇所）の熱安定性を示す図である。
【図２】本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（変異を複数箇所組合せ）の熱安定性を示す図である。
【図３】本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＮＡＤＰ共存下での保存安定性を示す図である。
【図４】本発明の変異型グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのグルコース測定試薬中での保存安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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