(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法：
（a）固相支持体上に固定化された複数の異なる化合物を含むコード化又はアドレス化可能な化合物ライブラリーを調製する段階であって、固相支持体が独自の検出可能な標識でコード化されているビーズである段階、
（b）単一反応槽において、化合物・融合物の複合体形成が起こりうる条件で、該異なる固定化化合物を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要素と同時に接触させる段階、
（c）非結合の蛋白質・核酸融合物から化合物・融合物の固定化複合体を単離する段階、および
（d）化合物と融合物中の蛋白質との相互作用を指標として、該化合物・融合物の複合体を検出する段階。
【請求項２】
蛋白質・核酸融合物が蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッド分子に融合した蛋白質である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
複合化された蛋白質・核酸融合物の化合物が、ビーズと結合した独自の検出可能な標識で同定される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
検出可能な標識がペプチド標識、核酸標識、化学標識、蛍光標識、若しくはラジオ・フリーケンシー・タグである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
化合物・融合物の複合体、若しくはその構成要素が、固相支持体から遊離されることにより回収される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛋白質・核酸融合物を固相支持体から回収する段階、および該蛋白質を同定する段階をさらに含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
蛋白質が蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列から同定される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
化合物が低分子化合物である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法：
（a）固相支持体上に固定化された複数の異なる化合物を含むコード化又はアドレス化可能な化合物ライブラリーを調製する段階であって、固相支持体が独自の検出可能な標識でコード化されているビーズである段階、
（b）蛋白質・核酸融合物ライブラリーが該化合物と結合可能な条件下で該蛋白質・核酸融合物ライブラリーと該異なる固定化化合物のライブラリーとを同時に接触させる段階、
（c）該蛋白質・核酸融合物中の蛋白質と該化合物ライブラリーの化合物との相互作用を指標として、結合した蛋白質・核酸融合物を検出する段階。
【請求項１０】
蛋白質・核酸融合物が、蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッド分子に融合した蛋白質である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
蛋白質・核酸融合物が検出可能な標識を施され、相互作用が該検出可能な標識の該固相支持体への結合により検出される、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
結合した蛋白質・核酸融合物が固相支持体から遊離されることにより回収される、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
蛋白質・核酸融合物を固相支持体から回収する段階、および該蛋白質を同定する段階をさらに含む、請求項9〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質が該蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列から同定される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
化合物が低分子化合物である、請求項9〜14のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は概して核酸・蛋白質融合物に関するスクリーニング法を特徴とする。
【０００２】
コンビナトリアル・ケミストリー等の新しい合成法による、若しくは天然化合物として薬学的に集積されてきた低分子化合物の膨大なコレクションに関して、スクリーニング法は、蛋白質とこのような低分子化合物との間の結合相互作用を同定するための効率のよい方法であると考えられる（TIBTECH, vol. 13, p. 115, 1995）。しかしながら、多くのスクリーニング法では、広範なスクリーニングが要求され、これが重要な問題となる。つまり、このような手法では、スクリーニングの材料をいつでもすぐに供給できることが最も重要な課題となるのである。異なる標的蛋白質に関する低分子化合物ライブラリーのスクリーニングには、十分な量の化合物を必要とする。また、規模の大きな化合物ライブラリー（例えば、化合物の種類に関して106 若しくはそれ以上の多様性を有するもの）のスクリーニングには、多量のリコンビナント蛋白質が必要となる。また、スクリーニングを迅速にかつ低コストで実施できるかという別の課題もある。 異なる標的蛋白質に関する低分子化合物ライブラリーのスクリーニングは、これを連続的に実施するのは一般的に時間のかかるものである。
【０００３】
最近、所望の性質に着目して、多様な蛋白質の混合物から特定の蛋白質を単離する方法についての報告があった（Szostak 等、 Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, January 14, 1998； U.S.S.N. 09/247,190, February 9, 1999；及び Roberts と Szostak、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）。 これは、各々の蛋白質をそれをコードしているRNAと共有結合で結合した蛋白質・RNA融合分子を用いることによって実施する方法である。この蛋白質・RNA融合法は、蛋白質・蛋白質相互作用に基づくcDNAライブラリーのスクリーニング及び新規の遺伝子のクローニングに利用できる（例えば、Szostak 等 Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, January 14, 1998； 及び U.S.S.N. 09/247,190, February 9, 1999を参照）。
【０００４】
発明の概要
本発明の目的は、低分子化合物を蛋白質・核酸融合物（例えば、蛋白質・RNA融合物）のライブラリーで平行してスクリーニングすることにより、蛋白質・化合物結合相互作用（および特に蛋白質・低分子相互作用）を効率よく同定することであり、それにより低分子・蛋白質の対に関するカタログを提供することである。
【０００５】
従って、第一の局面において、本発明は、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法ｋを特徴とし、この方法は以下の段階を含む：すなわち、（a）化合物ライブラリーの各要素が固相支持体に固定されている化合物ライブラリーを調製する段階；（b）単一反応槽において、化合物・融合物の複合体が形成される条件下で、固定化化合物ライブラリーの各要素を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要素と接触させる段階；（c）化合物・融合物の固定化複合体を単離する段階；および（d）融合物中の蛋白質が化合物と相互作用することの指標として、化合物・融合物の複合体を検出する段階。
【０００６】
好ましい態様において、蛋白質・核酸融合物は、蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッドに融合した蛋白質のいずれかであり；固相支持体はビーズであり；各ビーズは、検出可能な単一の標識と共にコードされており；蛋白質・核酸融合物の複合体中の化合物は、ビーズに結合した該検出可能な単一の標識で同定され；該検出可能な標識は、ペプチド標識、核酸標識、化学的標識、蛍光標識、若しくはラジオ・フリーケンシー・タグであり；固相支持体はチップであり且つ化合物ライブラリーはチップ上にアドレス化可能なアレイとして固定され；蛋白質・核酸融合物ライブラリーの各要素は、検出可能な標識が施され；化合物・融合物複合体若しくはその構成要素は、固相支持体から遊離させることにより回収され；本法は、さらに固相支持体からの蛋白質・核酸融合物の回収、及び蛋白質の同定を含み；蛋白質の同定は、蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列によって決定され；且つ、化合物は低分子である。
【０００７】
関連する局面において、本発明は、化合物・蛋白質相互作用を検出する方法を特徴とし、この方法は以下の工程を含む：すなわち、（a）固相支持体上に固定された化合物を調製し、（b）固定化化合物を蛋白質・核酸融合物が化合物と結合する条件下で蛋白質・核酸融合物ライブラリーと接触させ、（c）蛋白質・核酸融合物中の蛋白質が化合物と相互作用することの指標として、結合した蛋白質・核酸融合物を検出する。
【０００８】
好ましい態様において、該蛋白質・核酸融合物は、蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、若しくはDNA・RNAハイブリッドに融合した蛋白質のいずれかであり、該蛋白質・核酸融合物は、検出可能な標識を施され、該相互作用は、検出可能な標識と固相支持体との結合を指標とするものである。結合した蛋白質・核酸融合物は、固相支持体から遊離させて回収する。本法は、さらに固相支持体からの蛋白質・核酸融合物の回収、及び蛋白質の同定を含む。蛋白質の同定は、蛋白質・核酸融合物の核酸部分の配列によって成される。固相支持体は、 カラム、スライドガラス、チップ、若しくはビーズである。また、該化合物は低分子の化合物である。
【０００９】
本明細書において用いられる「ライブラリー」とは、少なくとも2分子（例えば、化合物若しくは蛋白質・核酸融合物等の分子）から成る集合体を意味する。化合物ライブラリーは、好ましくは、少なくとも102若しくは103の要素を含み、より好ましくは、少なくとも104、105、若しくは106の要素を含む。蛋白質・核酸ライブラリー（例えば、蛋白質・RNAライブラリー）は、好ましくは、少なくとも102、若しくは103の要素を含み、より好ましくは、少なくとも104、105、若しくは106の要素を含み、最も好ましくは、少なくとも1010、若しくは1012の要素を含む。
【００１０】
「DNA・RNAハイブリッド」とは、相補的RNA鎖とハイブリダイズしたDNA鎖を意味する。通常、DNA鎖は、RNA分子の逆転写によって生ずる。
【００１１】
「アドレス化可能なアレイ」とは、その対象物の同定が知られているか、若しくは容易に決定できる、固相表面上に固定された対象物の固着パターンを意味する。
【００１２】
「低分子」とは、その分子量が、10,000ダルトン以下の化合物、好ましくは1000ダルトン以下の化合物、最も好ましくは500ダルトン以下の化合物を意味する。
【００１３】
本発明により、多くの利点が提供される。例えば、本法により、スクリーニングするのに必要な材料の量が減少する。標準的なスクリーニングでは、各化合物は空間的に分離された槽の中の単一の蛋白質を用いてスクリーニングが成されるため、かなりの量の蛋白質と低分子化合物が必要である。しかしながら、結合相互作用を調べるための低分子化合物による蛋白質・核酸融合分子ライブラリーのスクリーニングは、同一反応槽にて平行して実施することができる。さらに、標的蛋白質をクローン化、過剰発現、若しくは単離する必要はなく、蛋白質・核酸融合分子としてスクリーニングを行い、それをコードする核酸によって同定を行う。さらには、本小型化スクリーニング法により材料コストがさらに低減されうる。このようなコストの低減は、本法によって容易となり、また低分子と融合物との複合体の同定に関する検出方法の選択によってのみ制限される。
【００１４】
さらに、本発明は化合物のスクリーニングの実施に要する時間に関して利点を有する。特に、本明細書に記載の方法は、標的蛋白質のライブラリーを、リガンドを含みうるライブラリーで平行してスクリーニングすることにより、リガンド（例えば、低分子リガンド）の同定に要する時間を短縮することができる。標準的なスクリーニング法、つまり連続的に異なった蛋白質に対する結合についてスクリーニングする低分子化合物ライブラリーのスクリーニングとは対照的に、本法では、単一アッセイにおいて低分子化合物を蛋白質・核酸融合物ライブラリーでスクリーニングすることができる。従って、本発明では、蛋白質ライブラリーの各要素へ結合する低分子化合物ライブラリーの各要素のスクリーニングを非常に高効率に実施することができる。
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００１６】
詳細な説明
本発明の方法は、化合物を蛋白質・核酸融合物のライブラリー（例えば、蛋白質・RNA融合物）でスクリーニングし、それにより化合物・蛋白質対のカタログが得られることにより、蛋白質・化合物（および、好ましくは、蛋白質・低分子化合物）の結合相互作用の効率的な同定を容易にする。必要に応じて、化合物ライブラリーを、単一のスクリーニングにおいて、蛋白質・核酸融合物のライブラリーに対してスクリーニングしてもよい。好ましい態様において、スクリーニング及び/若しくは結果判定の簡素化のために、化合物または該融合物のいずれかが固相支持体（例えば、ビーズ、チップ、スライドガラス、若しくはカラム）上に固定される。さらに、化合物・蛋白質対の同定を容易にする目的で、化合物（または、固定化の行われる固相支持体）を特定の化合物または化合物ファミリーに特徴的であるような検出可能な標識を用いて標識してもよい。
【００１７】
スクリーニングの好ましい標的は低分子であるが、本発明の方法でスクリーニングされる化合物はいかなるものであってもよい。
【００１８】
本発明の上記及びその他の局面を、以下にさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を説明する目的で示されるものであって、これらのみに限定されるものではない。
【００１９】
スクリーニング・アッセイ法
上記のように、蛋白質・核酸融合物（例えば、 蛋白質・RNA融合物）に対する化合物のスクリーニングは、多くの異なる様式で実施することができる。一つの特定の様式を図1に示している。この方法では、単一化合物がカラム、若しくはその他の固相の表面に、多様な標準的方法のうちのいずれかを用いて固定化される。次に非特異的結合を低減させるために、固相に結合した低分子化合物を、BSA若しくは他の不活性蛋白質を含むスクリーニング用緩衝液でインキュベートする。次に、緩衝液を除去し、化合物を表出している固相を蛋白質・核酸融合物ライブラリーの溶液と共にインキュベートした後、非特異的に結合した融合分子を除去するためにスクリーニング用緩衝液で洗浄する。その後、特異的に結合した蛋白質・核酸融合物を溶出する（例えば、結合していない低分子化合物を含む緩衝液で親和性溶出を行う）。溶出した融合分子の核酸（例えば、RNA）部分を「識別」することによって、低分子化合物に結合した蛋白質が同定される。かかる「識別」は後述のような方法で行われる。
【００２０】
また、複数の化合物のスクリーニングを複数の蛋白質・核酸融合物に対して同時に行ってもよい。このようなタイプのスクリーニングを異なる二通りの様式で行った例が、図2及び3に示されている。 これらの様式では、コード化された（アドレス化可能な）低分子化合物ライブラリーがビーズ、若しくはチップ等その他の表面上に固定化されている。次に非特異的結合を低減するために、固相結合化ライブラリーを、BSA若しくは他の不活性蛋白質を含むスクリーニング用緩衝液でインキュベートする。次に、緩衝液を除き、低分子化合物ライブラリーを融合物ライブラリーと共にインキュベートする。その後、非特異的に結合した融合分子を除去するためにスクリーニング用緩衝液で洗浄する。低分子に特異的に結合した蛋白質・核酸融合分子を検出する、若しくは、ビーズが用いられている場合には、分別し回収する。識別コード（またはタグ若しくはアドレス）を用いて、低分子化合物を同定し、さらに結合した融合分子の核酸部分の識別によって蛋白質の同定を（後述のように）行う。
【００２１】
異なる遺伝子型、及び異なる表現型の蛋白質・核酸融合分子が、同一の低分子化合物に結合する場合がある。それゆえ、必要に応じて、融合分子の結合画分を集め、増幅し、よりストリンジェントな条件（例えば、蛋白質・核酸融合物の濃度がより低い条件）下で、同定されたリガンドと共に再びインキュベートする。所望のリガンド親和性を有する受容体の単離（例えば、最も親和性の高い受容体の選択）が可能な限り、何回この工程を繰り返し実施してもよい。
【００２２】
さらに、同定後、固相に結合した化合物と融合分子との結合相互作用を、標準的な結合測定法で、結合していないリガンド若しくは結合していない蛋白質を化合物・融合物複合体に加えて確認を行うか、若しくは分析することができる。
【００２３】
本発明のスクリーニングは、未知の化合物・蛋白質相互作用の同定に利用でき、若しくは相互作用（例えば、リガンドと受容体間）に関する一般的情報が取得可能な環境下で実施することができる。後者の場合、偏りのあるライブラリーをスクリーニングに用いてもよい。このようなライブラリーには、特定のクラスの化合物（若しくは蛋白質）または単一化合物（若しくは蛋白質）の修飾物が含まれる。通常、このような偏りをもたらす要素は、リガンドの標的受容体に対する平均的な親和性を増加させ、リガンドを一方向に配向させる傾向を有する（例えば、Chen等、JACS (1993) vol. 115, p. 12591-12592参照）。この種の方法は、例えば、受容体の標的部位に結合するリガンドの同定を容易にする。
【００２４】
蛋白質・核酸融合物の調製
上記のように 本法は蛋白質・RNA融合物、蛋白質・DNA融合物、及び蛋白質とハイブリッドDNA・RNA分子との融合物を含むいかなる蛋白質・核酸融合物集団にも適用可能である。
【００２５】
本明細書に記載の方法に使用される蛋白質・RNA融合分子のランダムなライブラリーは、例えば、Szostak 等（Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, 1月14日, 1998、およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）、RobertsとSzostak（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）、若しくはKuimelis等 (Addressable Protein Arrays, U.S.S.N. 60/080,686, 4月3日, 1998、およびU.S.S.N.09/282,734, 3月31日, 1999)等の文献に記載の方法で調製できる。 また、細胞性のRNA・蛋白質融合分子のライブラリーは、mRNA、若しくは3'-非翻訳領域を欠いたcDNAから、例えば、Lipovsek等の方法 （Methods for Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. 60/096,818, 8月17日, 1998）及びHammond等の方法（Methods for Producing Nucleic Acids Lacking 3'-Untranslated Regions and Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. , 8月17日, 1999）で調製できる。
【００２６】
このような蛋白質・RNA融合物の標識には、任意の標準的な標識方法、及び任意の検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、及び化学発光標識を含む）を利用できる。必要に応じて、放射性標識されたアミノ酸（例えば、35S、若しくは14C標識アミノ酸）の存在下で、または放射性標識したヌクレオチド（例えば、35S若しくは32P標識したヌクレオチド）の存在下で融合物若しくは融合物の構成要素を生成させることにより、融合物を放射性標識してもよい。また、融合分子を蛍光標識してもよい。一つの具体例として、DNAリンカー（例えば、RobertsとSzostakの文献のdA27dCdCPリンカー（Proc. Natl. Acad. Sci. U27 (1997) vol. 94, p. 12297-12302））をフルオレセイン・フォスフォールアミダイト・マーカー（Glen Research  製、Sterling、VA）で修飾し、このリンカーを用いて蛍光性の蛋白質・RNA融合物を合成する。さらにまた別法として、RobertsとSzostakの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302;およびSelection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, 1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）に従い調製した蛋白質・RNA融合物、またはLipovsek等の方法（Methods for Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. 60/096,818, 8月17日, 1998）またはHammond等の方法（Methods for Producing Nucleic Acids Lacking 3'-Untranslated Regions and Optimizing Cellular RNA-Protein Fusion Formation, U.S.S.N. , 8月17日, 1999）に従い調製した細胞性RNA・蛋白質融合物を、蛍光標識したオリゴヌクレオチドに対する融合物と塩基対形成させる（例えば、蛍光性ポリ-dTオリゴヌクレオチドをdA27dCdCPリンカーと塩基対形成させる）ことにより標識する。
【００２７】
また、蛋白質・DNA融合物も同様の方法で標識できる。かかる蛋白質・DNA融合物は、例えば、Lohse等（DNA-Protein Fusions and Uses Thereof, U.S.S.N. 60/110,549, 12月2日, 1998）が報告している方法で生成させてもよい。さらにまた別法として、上記の標識方法を蛋白質の融合物のDNA・RNAハイブリッド部分（すなわち、各々の一方の鎖）に対して用いてもよい。かかるハイブリッド融合物は、例えば、標準的な方法を用いてRNA・蛋白質融合物を逆転写の工程で処理し生成させる。
【００２８】
化合物の調製
本発明のスクリーニング方法の実施については、いかなる化合物ライブラリーであっても利用可能である。かかるライブラリーは、天然由来のものでもよく、また合成的（若しくは、半合成的）抽出物、若しくは当技術分野における公知の方法で得られた化学的ライブラリーでもよい。 薬剤研究開発の分野における当業者であれば、本発明のスクリーニング法にとって化合物の正確な由来は重要な問題ではないことが理解されると思われる。天然化合物源の例としては、次のようなものが挙げられるが、これらのみに限定されるわけではない：すなわち、植物、真菌、原核生物、若しくは動物、ならびに既存の化合物の修飾物。これらには限定されないが、例えば糖質、脂質、ペプチド、及び核酸を基とする化合物を含む任意の化合物のランダム合成若しくは指向的（directed）合成（例えば、半合成、若しくは全合成）で生成させるための多くの方法が利用可能である。合成化合物ライブラリーは、市販のものを入手することもでき、また当技術分野で公知の方法により生産してもよい。さらに、必要に応じて、ライブラリー、若しくは化合物は標準的な化学的、物理学的、若しくは生化学的方法で容易に修飾が可能である。
【００２９】
本発明の特定の方法において、化合物の相互作用は、検出可能な標識若しくは「タグ」が、化合物若しくはその結合している固相支持体（例えば、ビーズ）のいずれかに結合した結果として同定される。低分子化合物のコード化ライブラリーは、例えば、Combs等（JACS (1996) vol. 118, p. 287-288）の文献による方法で、ビーズ上に調製できる。さらに、コード化法には複数のものが利用可能であり、これらには、ペプチド及び核酸のコード（Kerr等、JACS (1993) vol. 115, p. 2529-2531;およびBrenner & Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) vol. 89, p. 5381-5383）、化学的タグ(Ohlmeyer等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) vol. 90, p. 109222-10926;およびMaclean等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 2805-2810); 蛍光体のタグ (Yamashita & Weinstock (SmithKline Beecham Corporation), W095/32425 (1995);およびSebestyen等、Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 22nd 1992 (1993), p. 63-64)、及びラジオ・フリーケンシー・タグ(Nicolaou等、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1995) vol. 34, p. 2289-2291; 及びMoran等、JACS (1995) vol. 117, p. 10787-10788)等が含まれる。このような標識は、上記の参考文献に記載の方法で識別できる。
【００３０】
また、アドレス化可能な化合物ライブラリー（例えば、低分子化合物）は、チップ表面等の固相表面上に調製される。化合物のチップ表面上への固定化には様々な方法があり、いずれもが利用可能である。好ましい方法としては、フォトリソグラフィー（Affymetrix社、Santa Clara, CA）、機械的ミクロスポッティング（Schena等、Science (1995) vol. 270, p. 467-470; Synteni, Fremont, CA）及びインク射出法（Incyte Pharmaceuticals社、Palo Alto, CA；及びProtogene社, Palo Alto, CA）が挙げられる。
【００３１】
化合物・融合物の相互作用の同定
化合物（例えば、コード化化合物）と蛋白質・核酸融合物との相互作用を同定するために、化合物もしくは融合物に結合された標識の検出手段、または必要に応じて、化合物・融合物対を単離し、それらの同定若しくは「アドレス」の決定手段が提供される任意の方法を利用してもよい。
【００３２】
一つの特定の例においては、化合物・蛋白質対（例えば、低分子・蛋白質対）は、ビーズ上で単離され同定される。ビーズに結合した標識を検出するために、好ましくは、ビーズ樹脂をプレート上に広げた後、例えば、蛍光標識、若しくは放射性標識を走査する（例えば、ホスフォールイメージャーを利用して放射性標識を検出する）。ビーズ上の低分子に結合する蛋白質・核酸融合分子は、ビーズを物理的に分類することにより単離できる。また、蛍光標識した融合分子に結合したビーズは、蛍光活性化セルソータ（FACS）で分別してもよい。選別されたビーズはそれぞれ個々に空間的に分離される（例えば、96穴マイクロタイタープレートのウェルに分別する）。RNA・蛋白質融合物の場合には、個々のビーズに結合した分子は、RNA部分の逆転写により同定でき、続いてRoberts ＆ Szostak（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）及びSzostak 等 （Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, 1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）の記載に従ってDNAの配列を決定できる。個々のビーズ上の化合物（例えば、低分子化合物）をコードするタグは上記のようにして識別できる。
【００３３】
また、チップ表面上のリガンド・受容体対はチップ表面上の放射活性若しくは蛍光を走査することにより検出できる。チップ上で相互作用している対のアドレスを知ることによって、その化合物（例えば、低分子化合物）を同定できる。アドレスの取得可能なマイクロコレクター、若しくはその他の任意の標準的な方法（例えば、Kuimelis等、Addressable Protein Arrays, U.S.S.N. 60/080,686, 4月3日, 1998,およびU.S.S.N.09/282,734, 3月31日, 1999）を用いて、チップ表面から融合分子を得ることができる。回収された融合分子は、上記のように融合物の核酸部分の特徴を調べることで同定可能である。
【００３４】
ビーズ形式を用いた化合物のスクリーニング
上述のように、化合物をビーズ固相支持体に固定化し、化合物と相互作用可能な蛋白質・核酸融合物、具体的にはRNA・蛋白質融合物のスクリーニングに用いることができる。この方法に関する一つの実際例では、ヒト肝臓のcDNAライブラリー（Maxim Biotech製、South San Francisco, CA）からジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子をクローン化する。この構築物は、C末端にDYKDDDDK-ASAペプチドタグ（配列番号： 1）を有するDHFR遺伝子の全長を含む。DHFRのRNA・蛋白質融合物の調製は、DHFR コーディング領域の配列をPCRで増幅し、RobertsとSzostak（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302）及びSzostak等（Selection of Proteins Using RNA-Protein Fusions, U.S.S.N. 09/007,005, 1月14日, 1998,およびU.S.S.N.09/247,190, 2月9日, 1999）の文献に記載の方法で融合物を形成させて行う。融合物はオリゴdTセルロース親和性クロマトグラフィー（Edmonds等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1971) vol. 68:1336）で精製し、スーパースクリプトII（Superscript II）逆転写酵素を用いて製造元の説明書に従い逆転写を行う。10μLの1X 緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、1 M NaCl, 1 mg/ml BSA、0.1 mg/ml剪断DNA、1％ v/v Triton X-100）に溶かしたDHFR融合物（100 fmol）を500μLのエッペンドルフチューブ中で、10μLの予め平衡化したメトトレキセート-アガロース （Kaufmanの方法、Methods Enzymol. (1974) vol. 34:272-81）と混合した。このスラリーを30分間周囲温度で5分毎にかき混ぜながらインキュベートした。その後このスラリーを、3000 rpmで1分間エッペンドルフチューブで微量遠心機に供した。液体を除き、メトトレキセート-アガロースを500μL の1X 緩衝液で3回洗浄した。メトトレキセート-アガロースに50μL の30μM メトトレキセートを加え37℃で30分間インキュベートすることにより、融合物を溶出した。
【００３５】
この相互作用アッセイ法の結果を図4に示している。この図では、翻訳過程で融合物に取り込まれた35S-メチオニン標識を測定することにより、全融合分子の何％が相互作用したかをモニターしたものである。この図に示されているように、第3回目の洗浄液には有意な量の融合分子は含まれていなかった。さらに、マトリックス中に含まれる融合物全量のうち、86％がビーズを充填したカラムを素通りし、残りの14％がメトトレキセートで効率よく溶出された。
【００３６】
用途
本法は、化合物・蛋白質結合相互作用に関する小型若しくは大型のライブラリーをスクリーニングするための効率の良い手段を提供する。さらに、本法は、ある化合物に対する、若しくは化合物のライブラリーに対する蛋白質・核酸融合物をスクリーニングするのに利用され得る。
【００３７】
単一化合物に対する融合分子ライブラリーをスクリーニングするための商業的用途に関しては、特段の制限はなく、以下のような用途が含まれる：すなわち、融合分子のランダムプールからの所望の低分子に結合する蛋白質の同定、細胞性mRNA・蛋白質融合分子のプール（または、DNA・蛋白質融合物若しくはハイブリッド融合体の誘導体のプール）から細胞性標的物質を単離することにより、所与の薬剤の作用機序を明らかにすること、さらに細胞性mRNA-蛋白質（または、DNA・蛋白質若しくはハイブリッド・蛋白質）融合分子のプールから大多数若しくは全標的蛋白質を単離することにより、所与の薬剤の副作用プロフィールを明らかにし、それによって副作用を低減させた改良型薬剤が得られる。
【００３８】
コード化された（アドレス化可能な）化合物ライブラリーに対する融合分子ライブラリーのスクリーニングの用途には、これらに制限されないが、新規の鉛化合物（例えば、リガンド若しくは酵素阻害剤）を得るために行う低分子化合物ライブラリーの核酸・蛋白質（例えば、細胞性mRNA・蛋白質）融合分子ライブラリーによるスクリーニング、潜在的な標的物質（例えば、受容体若しくは酵素）を調べるために行う核酸・蛋白質（例えば、細胞性mRNA・蛋白質）融合分子ライブラリーの低分子化合物ライブラリーによるスクリーニング、及び蛋白質ライブラリーの要素と低分子化合物ライブラリーの要素との結合相互作用のマッピング等が挙げられ、それによりリガンド・蛋白質対に関するカタログが提供される。
【００３９】
本明細書において言及されたすべての特許および文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
その他の態様は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  固相支持体に固定化された化合物の蛋白質・核酸融合物のライブラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示した図である。
【図２】  ビーズに固定化された化合物ライブラリーの蛋白質・核酸融合物ライブラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示した図である。
【図３】  マイクロチップ上に固定化されたアドレス化可能な化合物アレイの蛋白質・核酸融合物ライブラリーによるスクリーニング法の例を模式的に示した図である。
【図４】  ビーズ固相支持体上のRNA・蛋白質融合物に対する化合物の結合を示したグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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