(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を含む試料をプレカラムに吸着させる工程、セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸をプレカラムから溶出させる工程、及び溶出したセロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸を回収する工程からなる、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法において、プレカラムが逆相カラムであり、吸着させる工程における吸着液がｐＨ５．０以下で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含んだ溶液であり、また溶出させる工程における溶出液が前記吸着液に比べｐＨが１．０以上高い溶液であり、かつ塩基性物質用イオンペア試薬が含まれない溶液であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の精製法において、プレカラムからセロトニンおよび５−ヒドロキシインドール酢酸を溶出する溶出液に、有機溶媒が含まれることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により精製したセロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を分離カラムに導入し分離する工程、及び分離した各成分を検出または測定する工程からなることを特徴とする、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の測定方法。
【請求項４】
請求項３に記載の測定方法において、分離カラムとして逆相カラムを用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の測定方法において、プレカラムからの溶出液と分離カラムからの溶離液とが同じ組成であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織抽出液、血清、血漿、尿などの試料中に含まれるセロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セロトニン（以下５ＨＴ）、及び５−ヒドロキシインドール酢酸（以下５ＨＩＡＡ）の同時測定方法としては、液体クロマトグラフを用いた方法が知られている。分離カラムとして逆相カラムを用い、分離カラムの試料による汚れを防ぐために、同じ逆相ゲルのプレカラムを分離カラムの前に配し、試料分析中にモーターバルブを用いて分析カラム流路からはずし自動洗浄する方法（ＭＡＲＬＩＥＳＫＯＥＬら Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４９５（１９８９） ｐ２６３）がある。この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡばかりでなく、バニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、ドーパミン、トリプトファンも同時に測定できる。
【０００３】
また、プレカラムおよび分離カラムとしてどちらも逆相カラムを用い、プレカラムに吸着させる吸着液及び溶出させる溶出液を同じ組成とし、カラムスイッチングによる方法（ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯＬＺＥＲら Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）ｐ２６２）がある。この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡばかりでなく、ノルエピネフリン、ジヒドロキシフェニル酢酸、エピネフリン、ノルメタネフリン、ホモバニリン酸、メタネフリン、ドーパミンも同時に測定できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
トリプトファン代謝物の中で、５ＨＴおよび５ＨＩＡＡはさまざまな疾患との関連で特に重要であり、これら２つの物質を簡便に試料中の不純物質の影響なく測定出来る方法が望まれている。ここでいう不純物質には、さまざまな疾患の治療のために投与された薬物なども含まれる。
【０００５】
これまで知られている方法は、５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを含めて複数の代謝物を同時に測定するものである。ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯＬＺＥＲらの方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）ｐ２６２）は、カラムスイッチングを用いるものの、プレカラムおよび分離カラムどちらも逆相カラムで、プレカラムに吸着させる吸着液及び溶出させる溶出液を同じ組成としており、プレカラムで除去されない不純物質が、分離カラムでも不純物質として問題にになる可能性が高い。
【０００６】
また、５ＨＴ、５ＨＩＡＡを含めて多くの成分を同時に測定するためには、プレカラムにおいて５ＨＴ、５ＨＩＡＡを含めて多くの成分を吸着した後、溶出し、分離カラムに導入すればよい。このため、５ＨＴ、５ＨＩＡＡの測定に影響を及ぼす不純物質が分離カラムに導入される可能性も高い。
【０００７】
このため投与薬物などの不純物質の影響を受けにくい５ＨＴおよび／又は５ＨＩＡＡの精製及び測定方法の確立が望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述した課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を含む試料をプレカラムに吸着させる工程、セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸をプレカラムから溶出させる工程、及び溶出したセロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸を回収する工程からなる、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法において、プレカラムが逆相カラムであり、吸着工程における吸着液がｐＨ５．０以下で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含んだ溶液であり、また溶出工程における溶出液が前記吸着液に比べｐＨが１．０以上高い溶液であることを特徴とする方法である。
【０００９】
また本発明は、上述の方法により精製したセロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を分離カラムに導入し分離する工程、及び分離した各成分を検出または測定する工程からなることを特徴とする、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
プレカラムとして用いられる逆相カラムは、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎水基として、エーテル基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などを導入したゲルを充填したカラムが挙げられる。また、ゲル自体が疎水性を有する場合については、疎水基を導入しなくともよい。
【００１１】
プレカラムに５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを吸着させる吸着液については、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ２．０から４．０である。さらに、設定したｐＨに緩衝能のあるクエン酸、グリシン、酢酸など物質を加えることが望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程度がよい。
【００１２】
そして、加える塩基性物質用イオンペア試薬としては、５ＨＴなどの塩基性物質と逆相カラムであるプレカラム中のゲルの疎水表面との相互作用を強める性質を有する試薬であれば特に限定されない。通常、その物質はマイナスチャージを有する分子構造と疎水性を有する分子構造とがつながった分子構造を取る。例えば、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸溶液、１−プロパンスルホン酸ナトリウム、１−ブタンスルホン酸ナトリウム、１−ペンタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−ノナンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ウンデカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−トリデカンスルホン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウムなどがあげられる。
【００１３】
実際に溶液中で塩基性物質用イオンペア試薬の性質を有する分子は、それぞれ、過塩素酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、１−プロパンスルホン酸イオン、１−ブタンスルホン酸イオン、１−ペンタンスルホン酸イオン、１−ヘキサンスルホン酸イオン、１−ヘプタンスルホン酸イオン、１−オクタンスルホン酸イオン、１−ノナンスルホン酸イオン、１−デカンスルホン酸イオン、１−ウンデカンスルホン酸イオン、１−ドデカンスルホン酸イオン、１−トリデカンスルホン酸イオン、ドデシルスルホン酸イオン、２−ナフタレンスルホン酸イオンであるので、これらのイオンを含む試薬であれば良い。例えば、過塩素酸イオンを含む試薬としては、過塩素酸ナトリウム以外に過塩素酸溶液があげられる。
【００１４】
イオンペア試薬の濃度は、イオンペア試薬により異なるが、例えば過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸であれば１０から１００ｍＭ、望ましくは３０〜７０ｍＭ程度がよい。また、試料中の５ＨＴおよび５ＨＩＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢酸などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリウムなどを加えてもよい。
【００１５】
プレカラムから５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを溶出するための溶出液としては、少なくとも吸着液に比べｐＨを１．０以上高くする必要があるが、好ましくはｐＨ５．０から７．０である。設定したｐＨに緩衝能のあるクエン酸、酢酸、リン酸などの物質を加えることが望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程度がよい。また５ＨＴを速やかに溶出するために、溶出液には塩基性物質用イオンペアを含まない方が好ましく、更にエタノール、メタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒を加えることが望ましい。加える有機溶媒濃度は、その種類により異なるがアセトニトリルであれば１．０から１０％加えるとよい。また、試料中の５ＨＴおよび５ＨＩＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢酸などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリウムなどを加えてもよい。
【００１６】
５ＨＴは塩基性物質であり、疎水性は弱い。一方５ＨＩＡＡは、ｐＨが上昇すると共に酸性の電荷を増し疎水性が弱くなり、ｐＨが低下すると共に酸性の電荷が低下し疎水性が強くなる。これらの性質を利用し、プレカラムとして逆相カラムを用い、吸着液の組成を、５ＨＩＡＡを吸着させるためにｐＨ５．０以下とし、かつ５ＨＴを吸着させるために塩基性物質用イオンペア試薬を加えた組成とし、更にプレカラムに吸着された疎水性の高い不純物を溶出せずに、５ＨＩＡＡを速やかに溶出するために、溶出液のｐＨが吸着液のｐＨと比較して１．０以上高い溶液とすることにより、プレカラムから５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを含み、それ以外の成分を最小限とした分画を回収することができる。
【００１７】
以上のようにして精製された５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを含む溶液を、分離カラムに導入・分離し、分離した成分を検出又は測定することにより、５ＨＴおよび５ＨＩＡＡの測定を行うことができる。
【００１８】
分離カラムとしては、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡについて保持できるカラムであれば良い。例えば、弱い疎水性の性質を有した陽イオン交換カラムや、逆相カラムを用いることができる。分離カラムとして用いられる逆相カラムは、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎水基として、エーテル基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などを導入したゲルを充填したカラムが挙げられる。また、ゲル自体が疎水性を有する場合については、疎水基を導入しなくともよい。
【００１９】
分離カラムからの分離に使用される溶離液には特に限定はない。しかし、弱い疎水性の性質を有した陽イオン交換カラムを用いる場合は、ｐＨ５．０以下の溶離液を用いるとよい。それは５ＨＴは塩基性物質であり、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以下の溶離液を用いれば強い疎水性を有するからである。また逆相カラムを用いる場合は、溶離液のｐＨに特に限定はなくｐＨ５．０以上でも使用可能である。それは、５ＨＴは弱い疎水性の性質を有し、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以上であっても弱い疎水性の性質を有するからである。
【００２０】
さらに逆相カラムを用いる場合は、プレカラムからの溶出液と分離カラムからの溶離液に同じ液を使用することができるため、好ましいものである。その場合には、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡの分離をより良好にするために、塩基性物質用イオンペア試薬を加えてもよいが、加える濃度については、プレカラムから５ＨＴを速やかに溶出させるために、吸着液に加えた物と同じ種類の塩基性物質用イオンペア試薬を用いる場合には、吸着液に加えた濃度の半分以下、異なる種類の塩基性物質用イオンペア試薬を用いる場合には、必要最小限の濃度とすることが好ましい。これにより、分離カラムから回収される不純物を最少量とすることができる。
【００２１】
分離カラムにより分離された各成分は、検出又は測定されるが、例えば検出系としては、電気化学検出器、蛍光検出器などが挙げられる。蛍光検出器を用いる場合には、例えば５ＨＴおよび５ＨＩＡＡ自身の自然蛍光を用いる方法、ジフェニルエチレンジアミン、ベンジルアミンなどの試薬と反応後、生成された蛍光物質を測定する方法がある。
【００２２】
本発明においては、試料をプレカラムに導入し試料中の特定の成分を吸着し、溶出し、分離カラムに導入し分離し、検出・測定するわけであるが、このようなカラムスイッチング操作は、通常、コンピューター制御により自動的に指定した時間に流路が切り替えられる流路切り替えバルブにより行うことができる。本発明を実施するための装置としては、一般的に、カラムスイッチングのための流路切り替えバルブ、溶離液を流すポンプ、流す溶離液の種類を切り替えるための流路切り替えバルブ、オートサンプラー、溶離液中に溶存する気体成分を除去するデガッサーなどを有し、それらをコンピューターにより自動制御出来るものが用いられる。カラムスイッチングのための流路切り替えバルブとしては、通常６方モーターバルブが用いられる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細な説明をするが、本発明は実施例に限定するものではない。
【００２４】
実施例１
図１に装置の構成を示した。装置はＨＬＣ−７２５ＣＡＩＩ東ソー（株）製の配管系を変更し用いた。６方モーターバルブは１個用いた。プレカラム（Ｃ１）、分離カラム（Ｃ２）は、それぞれＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ（サイズ３．２ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍｍ）、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ（サイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１２０ｍｍ）どちらも東ソー（株）製を用いた。ポンプはすべてレシプロ型ポンプで、流速はポンプ１，２，３，４（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４）それぞれ１．０ｍｌ／ｍｉｎ，０．７ｍｌ／ｍｉｎ，０．２５ｍｌ／ｍｉｎ，０．２５ｍｌ／ｍｉｎとした。デガッサ（Ｄ）は、オンライン真空脱気式を用い、吸着液（Ｅ１），洗浄液（Ｅ２），溶出・溶離液（Ｅ３）、反応液１，２（Ｒ１，Ｒ２）のすべてをポンプの前に脱気するようにした。オートサンプラー（ＡＳ）は、ループを５００μＬとした。リアクター（ＲＥ）はテフロン配管０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍとし、設定温度は９０℃とした。蛍光検出器（ＦＳ）は、光源にキセノンランプを用い、励起波長３４０から３６０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ以上とした。
【００２５】
吸着液（Ｅ１）の組成は１０ｍＭグリシン、５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム ｐＨ３．０とし、洗浄液（Ｅ２）はカテコールアミン測定用試薬溶離液ＢＩＩ（東ソー株式会社製）を、溶出液及び溶離液としてはいずれも溶出・溶離液（Ｅ３）を用い、その組成は１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム、２％アセトニトリルｐＨ５．５とした。また５ＨＴ及び５ＨＩＡＡの検出のために用いられる反応液１（Ｒ１）は５０％アセトニトリル、４０ｍＭベンジルアミンとし、反応液２（Ｒ２）は、５０％アセトニトリル、５ｍＭ四ほう酸ナトリウム、６ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ１０．０とした。
測定中の６方モーターバルブ、３方電磁弁の切り替えタイミングは、６方モーターバルブ１（Ｍ１）：ＯＮ１．９ｍｉｎ−ＯＦＦ１２．０ｍｉｎ、３方電磁弁１（Ｓ１）：ＯＮ１２．０ｍｉｎ−ＯＦＦ１７．０ｍｉｎ、３方電磁弁２（Ｓ２）：ＯＮ２９．０ｍｉｎ−ＯＦＦ３０．５ｍｉｎ、とし、測定サイクルは３５．５ｍｉｎとした。
【００２６】
標準試料は、イオン交換水１Ｌに０．１９ｇアスコルビン酸、０．３８ｇエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、３４ｍＬ  ６０％過塩素酸溶液を加えて均一にした希釈液を用い、５ＨＴ（シグマ製）、５ＨＩＡＡ（シグマ製）それぞれ１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるよう調製した。血漿は、同じ希釈液で２０倍に希釈し、遠心分離後の上清を試料として用いた。尿は、同じ希釈液で５００倍希釈し、そのまま試料として用いた。試料注入量は５００μＬとした。
【００２７】
血漿は、患者血漿４検体、健常人血漿１検体を用いた。尿は患者尿２検体、健常人尿１検体を用いた。
【００２８】
測定結果を、図２から１０に示した。図２は標準試料の測定結果であり、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピークが確認された。図３〜６はそれぞれ患者血漿１〜４、図７は健常人血漿の測定結果である。血漿試料では、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピークが確認された。図８，９はそれぞれ患者尿１，２、図１０は健常人尿の測定結果である。尿試料では、５ＨＩＡＡのみが確認され、５ＨＴは感度以下であった。以上のように、すべての試料において良好な測定結果が得られた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、試料中の不純物質の影響を受けにくいセロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製及び測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で使用した測定装置の概要図である。
【図２】実施例１の標準試料の測定結果を示す図である。
【図３】実施例１の患者血漿１の測定結果を示す図である。
【図４】実施例１の患者血漿２の測定結果を示す図である。
【図５】実施例１の患者血漿３の測定結果を示す図である。
【図６】実施例１の患者血漿４の測定結果を示す図である。
【図７】実施例１の健常人血漿の測定結果を示す図である。
【図８】実施例１の患者尿１の測定結果を示す図である。
【図９】実施例１の患者尿２の測定結果を示す図である。
【図１０】実施例１の健常人尿の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
Ｅ１  吸着液
Ｅ２  洗浄液
Ｅ３  溶出・溶離液
Ｒ１  反応液１
Ｒ２  反応液２
Ｄ  デガッサー
Ｓ１  ３方電磁弁１
Ｓ２  ３方電磁弁２
Ｐ１  ポンプ１
Ｐ２  ポンプ２
Ｐ３  ポンプ３
Ｐ４  ポンプ４
ＲＥ  リアクター
ＦＳ  蛍光検出器
ＡＳ  オートサンプラー
Ｃ１  プレカラム
Ｃ２  分離カラム
Ｍ１  ６方モーターバルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004258072.tif 000009
【図９】
0004258072.tif 000010
【図１０】
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