(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビルナウイルスゲノムのＶＰ５遺伝子における変異の結果、天然のＶＰ５タンパク質を製造することができないビルナウイルス変異体であって、前記変異が、
（ｉ）ＶＰ５遺伝子の開始コドンの少なくとも２個のヌクレオチドの置換；および
（ｉｉ）ＶＰ５遺伝子のヌクレオチド１−３０にわたる５’末端の３個のリーディングフレームの各々に終結コドン；
を含み、当該ビルナウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であることを特徴とする、ビルナウイルス変異体。
【請求項２】
変異が病原性の現場のウィルスのゲノム中にあることを特徴とする、請求項１に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項３】
変異がワクチン株のゲノム中にあることを特徴とする、請求項１に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項４】
前記ワクチン株がＤ７８株であることを特徴とする請求項３に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列からなるＶＰ５遺伝子の開始コドンがＧＡＡに変異し、開始コドンを基準にして第１０位と１７位のヌクレオチドＡがＴに変異していることを特徴とする請求項１〜４に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のビルナウイルス変異体および薬剤的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、鳥類のビルナウイルス感染に対するワクチン。
【請求項７】
ＶＰ５遺伝子に変異を導入し、その結果、ビルナウイルスがＶＰ５タンパク質を製造することができなくなる工程を含む、鳥類に対するビルナウイルスの病原性を弱毒化する方法であって、当該ビルナウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
変異が置換であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
変異が病原性の現場のウィルスのゲノム中にあることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
変異がＶＰ５遺伝子の開始コドンの少なくとも２個のヌクレオチドの置換を含むことを特徴とする、請求項７〜９に記載の方法。
【請求項１１】
変異がＶＰ５遺伝子のヌクレオチド１−３０にわたる５’末端中で更に１個以上の終結コドンを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
変異が３個のリーディングフレームの各々において終結コドンを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３に示される塩基配列からなるＶＰ５遺伝子の開始コドンがＧＡＡに変異し、開始コドンを基準にして第１０位と１７位のヌクレオチドＡがＴに変異していることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビルナウイルス（birnavirus）変異体、この変異体を含むワクチン、動物のビルナウイルス感染を測定する方法およびこの方法を行うためのテストキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Infectious Bursal Disease Virus，ＩＢＤＶ）および伝染性膵臓壊死ウイルス（Infectious Pancreatic Necrosis Virus，ＩＰＮＶ）は、ビルナウイルスファミリーのメンバーである。このファミリーのウイルスは、非常に類似したゲノム構成および同様の複製サイクルを有する。これらのウイルスのゲノムは、２セグメント（ＡおよびＢ）の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡから成る。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解によって開裂して成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を生成するポリタンパク質をコードする(Hudson, P.J. ら、Nucleic Acids Res., 14, 5001-50012, 1986; Dobos P., Annual review of fish diseases 5, 25-54, 1995)。ＶＰ２およびＶＰ３は、ビリオンの主な構造タンパク質である。ＶＰ２は、ビルナウイルスの主な宿主保護免疫原であり、中和抗体の誘導に寄与する抗原領域を含む。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の前駆体ポリタンパク質の処理に関与する、ウイルスによってコードされるプロテアーゼであると考えられる。大きい方のセグメントＡはまた、そのポリタンパク質遺伝子の前、および部分的に重複して、第二のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）も有する。この第二のオープンリーディングフレームは、ＩＢＤＶ感染細胞に存在する、機能が未知のタンパク質ＶＰ５をコードする(Mundt, E.ら、J. Gen. Virol., 76, 437-443, 1995)。
【０００３】
小さい方のセグメントＢは、ポリメラーゼおよびキャップ形成酵素活性を有する90 kDaの多機能タンパク質であるＶＰ１をコードする(Spies, U.ら、Virus Res., 8, 127-140, 1987および Spies, U.ら、J. Gen. Virol., 71, 977-981, 1990; Duncan R. ら、Virology 181, 541-552, 1991)。
【０００４】
ＩＢＤＶの場合、２個の血清型（血清型１および２）が存在する。２個の血清型は、ウイルス中和（ＶＮ）検定によって区別することができる。さらに、血清型１のサブタイプが単離されている。血清型１のこれらのいわゆる「バリアント」ウイルスは、交差中和検定(Diseases of Poultry, 第９版、1991, Wolfe Publishing Ltd, ISBN 0 7234 1706 7, Chapter 28, P.D. Lukert および Y.M. Saif, 648-663)、モノクローナル抗体のパネル(Snyder, D.B. ら、Arch. Virol., 127, 89-101, 1992)またはＲＴ−ＰＣＲ(Jackwood, D.J., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and infectious anaemia, Rauischholzhausen, ドイツ、155-161, 1994)によって同定できる。ＩＢＤＶの血清型１のこれらのサブタイプのいくつかは文献に記載されており、例えば、古典的、変異−Ｅ、ＧＬＳ、RS593 および DS326株(Van Loon,ら、Proceedings of the Intenational symposium on infectious bursal disease and chicken infectiouos anaemia, Rauischholzhausen,ドイツ、179-187, 1994)が挙げられる。
【０００５】
伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）は、ガンボロ（Gumboro）病とも言われ、ニワトリの急性高伝染性ウイルス感染であり、リンパ系組織をその主要標的とし、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択的向性を有する。感染しやすい群れの罹患率は高く、体重が急激に減少し、死亡率は中程度である。ニワトリの防御機構に必須であるファブリキウス嚢が破壊するため、その病気から回復したニワトリは、免疫欠乏を有する可能性がある。ＩＢＤウイルスは、３週齢より若いニワトリに重い免疫抑制を引き起し、３月齢までのニワトリにファブリキウス嚢の損傷を誘起する。
【０００６】
長年、その病気は、弱毒化したＩＢＤＶ生ワクチンで前処置しておいたニワトリに不活化ワクチンを適用することにより、繁殖のために飼育している群れに高レベルの抗体を誘導することによって予防することができた。こうして、ＩＢＤによって引き起こされる経済的損失を最小限に保っている。ワクチン接種した繁殖群のニワトリの母から受け継いだ抗体は、ＩＢＤＶによる早期感染を予防し、免疫抑制に係る問題を少なくする。さらに、弱毒化生ワクチンは、母からの抗体が減少した後の商業用のニワトリ群においても十分使用されている。
【０００７】
最近、ＩＢＤＶの非常に病原性の強い株が、ヨーロッパで死亡率の高い病気の大発生を引き起こした。現在のワクチン接種プログラムでは、ニワトリを十分保護することができなかった。ワクチン予防の失敗は、主に、現場の病原性の強いウイルスによる誘発（免疫誘発、challenge）の前に、鳥類を生ワクチンによって感染させることができなかったことによる。
【０００８】
ワクチン接種以外の予防手段による病気の撲滅は、ウイルスが広く蔓延しているし、現在投与されている弱毒化もしくは不活化ＩＢＤＶ生ワクチンでは、特定の動物が現場のＩＢＤＶウイルスに感染しているかどうか、またはその動物がＩＢＤＶワクチンの接種を受けたかどうかを調べることができないため、実行の可能性はない。ＩＢＤＶに対する撲滅制御プログラムの開始を可能にするためには、ＩＢＤＶワクチン接種した動物と現場のウイルスに感染した動物とを区別して、現場のビルレントウイルスの蔓延を減少させるための適切な手段（例えば感染群の除外）を行うことができるような可能性が存在することが強く望まれている。例えば、血清学的に同定可能なマーカーの導入は、ＩＢＤＶの必須でない（糖）タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、感染した宿主動物での抗体の産生は依然として生じるようにすることにより達成できる。アウエスキー（Aujeszky）病に対するマーカーワクチンおよびそれに伴う診断テストは、この病気の制御において実際に有効であることが証明されている。動物の他のウイルス感染病に対するそのような制御プログラムは開発中であるが、本発明以前には、ＩＢＤＶ制御プログラムに適するであろうＩＢＤＶワクチン株をベースとするワクチンは記載されていない。この主な理由は、そのようなＩＢＤＶマーカーワクチンの開発に対する必要条件が満たされなかったということである。ゲノムＩＢＤＶ配列の許容位置または領域、すなわち感染および複製に必要な機能などのＩＢＤＶの必須機能を壊すことなく変異の挿入に使用できる位置または領域はまだ確認されていない。さらに、ＩＢＤＶゲノムのそのような必須でない領域は、野生型ＩＢＤＶに感染した動物の主な血清学的応答を誘起する（糖）タンパク質をコードすべきであり、そのような領域は以前には確認されていない。
【０００９】
本発明は、予期しなかったことに、変異を行うことができるビルナウイルスのセグメントＡ内の必須でない遺伝子を見いだした。得られるビルナウイルス変異体は、その遺伝子の天然の（本来の、native）発現産物を産生しない。さらに、このビルナウイルス変異体は、野生型ビルナウイルスに感染した動物とこのビルナウイルス変異体をベースとしたワクチンで免疫感作した動物との間の血清学的区別を行うことができるマーカーワクチンウイルスとして使用できる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビルナウイルスゲノムのＶＰ５遺伝子における変異の結果として天然のＶＰ５タンパク質を産生することができないビルナウイルス変異体を提供する。
【００１１】
好ましくは、ビルナウイルス変異体がＩＢＤＶ変異体またはＩＰＮＶ変異体であり、ＩＢＤＶ変異体が最も好ましく、特に血清型１のＩＢＤウイルス由来のＩＢＤＶ変異体が本発明によって提供される。
【００１２】
本発明は、天然のＶＰ５タンパク質を産生することができないＩＢＤＶ変異体が、依然として細胞を感染させ、これらの細胞でin vitro複製することができることを見いだした。本発明に係るＩＢＤＶ変異体は細胞培養において複製可能であることを例証する（実施例２）。ＶＰ５-ＩＢＤＶは、ＶＰ５+親ウイルスと比較して、ニワトリの胚細胞における複製の遅延を示すが、ウイルスの最終的な収量は同じである。すなわち、約107.5TCID50/mlである（実施例１）。さらに、ＩＢＤＶ変異体は、家禽を感染させ、感染した宿主動物で in vivo複製することができることを例証する。すなわち、ＶＰ５タンパク質をコードする遺伝子が必須でない遺伝子であるという証拠を示す。実施例３は、ＶＰ５-ＩＢＤＶがＩＢＤＶ変異体に感染した動物の臓器から再単離でき、ＩＢＤＶ変異体が感染動物での保護免疫応答を誘導することを示す。
【００１３】
さらに、家禽での正常な抗−ＩＢＤＶ免疫応答の一部がＶＰ５領域に向けられていることを本明細書で証明した。これは、ＶＰ５タンパク質が非構造ウイルスタンパク質である(Mundtら、J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) と考えられていて、動物におけるウイルス性病原体に対する免疫応答は、通常は、ウイルスの構造（糖）タンパク質に対して惹起されるので、かなり驚くべきことである。これらの発見が、本発明に係るＩＢＤＶ変異体および他のビルナウイルス変異体をマーカーワクチンに適するワクチン候補にしている。そのようなマーカーワクチンは、動物が野生型ビルナウイルス、例えばＩＢＤＶ、またはワクチンウイルスに感染しているかどうかを決定するための可能性を提供する。
【００１４】
さらに、ＶＰ５タンパク質は、ビルナウイルス、特にＩＢＤＶの病原性の発現に関与し、また、ウイルス変異体の天然ＶＰ５タンパク質産生不能によりウイルスが弱毒化されることが見いだされた。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
「天然のＶＰ５タンパク質を産生することができない」とは、ビルナウイルス変異体が、血清学的テストによって天然のＶＰ５タンパク質と区別することができるポリペプチドを産生し、またはＶＰ５タンパク質を全く産生しないことを意味する。例えば、前者の場合、ビルナウイルス変異体は、１以上の免疫原エピトープに欠ける天然のビルナウイルスＶＰ５タンパク質断片のみを産生する。
【００１６】
好ましくは、本発明に係るビルナウイルス変異体は、宿主細胞の感染時にＶＰ５タンパク質を産生しない。
【００１７】
上記したように、ビルナウイルスのゲノム構成は十分確立されている。ＩＢＤＶおよびＩＰＮＶゲノムは、大きいセグメントＡおよび小さいセグメントＢを含む。ＩＢＤＶのセグメントＡは、約110 kDa のポリタンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）をコードする大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＶＰ５タンパク質をコードする遺伝子は、そのポリタンパク質をコードするＯＲＦの前にあり、部分的に重複するビルナウイルスゲノムのセグメントＡ上の小さいＯＲＦとして、公知文献で同定され、本明細書に規定する(Baylissら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1990; Spies ら、J. Gen. Virol. 71, 977-981, 1990; Havarstein L.S. ら、J. Gen. Virology 71, 299-308, 1990; Dobos ら、1995、前出; 本明細書の図１〜３および配列番号１〜７）。ＶＰ５遺伝子に導入される変異は、ポリタンパク質の発現を妨げないような変異である。
【００１８】
配列番号１は、ＩＢＤＶＰ２株のセグメントＢの全長ｃＤＮＡヌクレオチド配列およびセグメントＢによってコードされるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列を含む（配列番号２も参照）。配列番号３および５は、各々、ＩＢＤＶＤ７８株のセグメントＡの全長ｃＤＮＡ配列ならびにＶＰ５タンパク質およびポリタンパク質のコード領域を示す。配列番号３および４は、Ｄ７８ＶＰ５タンパク質のアミノ酸配列も示す。配列番号５および６は、Ｄ７８のポリタンパク質ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３のアミノ酸配列を示す。配列番号７は、ＶＰ５コード領域に導入された変異を含む、Ｄ７８株のセグメントＡの５’−端を示す。配列番号８は、Ｄ７８株のセグメントＢのヌクレオチド配列およびＤ７８ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。両セグメントのゲノム構成は、図１にも示す。
【００１９】
ＶＰ５をコードするＯＲＦは、今まで発表されたセグメントＡの配列全てにおいて保存されている。ＩＢＤＶ  ＯＲＦは145 個のアミノ酸をコードし、分子量の計算値は16.5 kDaとなる。本明細書で使用するＩＢＤＶＤ７８株のＶＰ５タンパク質をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列は、配列番号３および４に示す。個々のＩＢＤＶ単離物の間には天然の変異が存在する可能性がある。これらの天然の変異は、これらのウイルスのゲノムの小さい相違から生じる。多くのＩＢＤＶ単離物についてのＶＰ５遺伝子のヌクレオチド配列を含むセグメントＡのヌクレオチド配列は、公知文献に記載されている(Vakharia ら、Avian Diseases 36, 736-742, 1992; Bayliss ら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1314, 1990; Hudsonら、Nuc. Acid Res. 14, 5001-5012, 1986; Schnitzlerら、J. Gen. Virol. 47, 1563-1571, 1993; Kibenge ら、J. Gen. Virol. 71, 569-577, 1990および Virology 184, 437-440, 1991; Mundt ら、Virology 209, 10-18, 1995; Lana ら、Virus Genes 6, 247-259, 1992; Vakhariaら、Virus Res. 31, 265-273, 1994; Brown ら、Virus Res. 40, 1-15, 1996)。血清型ＩのＩＢＤＶ株由来のＶＰ５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３および４に示すＶＰ５アミノ酸配列と少なくとも95％の相同性を示すが、血清型IIのＶＰ５配列と配列番号３および４に示すアミノ酸配列との間の相同性は、少なくとも75％である。従って、本発明に係る好ましいＩＢＤＶ変異体は、変異が、本明細書に示すＶＰ５アミノ酸配列とのアミノ酸配列レベルに関する相同性が少なくとも75％、特に少なくとも95 %であるようにＶＰ５遺伝子に導入されたＩＢＤＶ変異体である。
【００２０】
好ましくは、本発明に係るＩＢＤＶ変異体が、その分野で現在使用されているような、古典的または変異（例えば、変異ＥまたはＧＬＳ）ＩＢＤＶワクチン株から誘導される。そのような適切なＩＢＤＶ株としては、市販のワクチンに存在するＩＢＤＶワクチン株：Ｄ７８、ＰＢＧ９８、ＬＺ２２８Ｅ、８９−０３（Intervet International B.V.), Bursine 2 (Fort Dodge Animal Health)およびＳ７０６（Rhone Merieux ）が挙げられる。
【００２１】
本発明に係る特に好ましいＩＢＤＶ変異体は、配列番号３および４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＶＰ５遺伝子を含むＤ７８株から誘導される。
【００２２】
あるいは、本発明に係るウイルス変異体の親ビルナウイルス株が、現場のビルレントビルナウイルス株である。本明細書では、ＶＰ５タンパク質が、伝染力に関連する因子であり、ビルナウイルスにおける天然のＶＰ５タンパク質の不在により、ウイルスの弱毒形が生じることを示す。
【００２３】
好ましくは、本発明は、ＶＰ５遺伝子のポリタンパク質をコードする大きいＯＲＦと重複しない部分における変異の結果として、天然のＶＰ５タンパク質を産生することができないビルナウイルス変異体を提供する。
【００２４】
特に、本発明に係るビルナウイルス変異体は、ヌクレオチド１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０にわたるＶＰ５遺伝子の５’−端に変異を含む。最も好ましくは、ＶＰ５遺伝子のヌクレオチド１〜３に変異を有するビルナウイルス変異体である。
【００２５】
変異は、天然のＶＰ５タンパク質を産生する天然のビルナウイルスのゲノムのこの領域に存在する遺伝情報に関するＶＰ５遺伝子における遺伝情報の変化であると理解される。変異は、例えば、核酸の置換、欠失、挿入もしくは逆位またはそれらの組み合わせである。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様では、変異が１以上のヌクレオチドの置換であるビルナウイルス変異体を提供する。特に、核酸の置換を開始コドンに導入し、その結果、新しいコドンがメチオニンとは異なるアミノ酸をコードするか、終結コドンを表し、好ましくは、核酸の置換が、開始コドンのヌクレオチドの少なくとも２個を含む。
【００２７】
本発明に係るさらに別のビルナウイルス変異体は、開始コドンとは異なるコドンに、望ましくは上記した開始コドンにおける置換の他に、１以上のヌクレオチドの置換を含み、その結果、１以上の終結コドン、好ましくは、上記で定義したＶＰ５遺伝子の５’−端を生じる。好ましくは、ビルナウイルス変異体が、３個のリーディングフレームの各々におけるＶＰ５遺伝子のこの領域に終結コドンを含む。
【００２８】
そのような好ましいビルナウイルス変異体は、ＶＰ５遺伝子の開始コドン、第四および第六コドンに変異を有し、その結果、好ましくは配列番号７および図３に示す変異コドンを生じるＩＢＤＶ変異体であってもよい。
【００２９】
あるいは、変異が欠失であるビルナウイルス変異体が提供される。特に、欠失は、20未満、10未満または５未満のヌクレオチドを含む。好ましくは、欠失が、３で割り切れないヌクレオチド総数を含み、その結果、リーディングフレームのシフトが生じる。
【００３０】
好ましくは、欠失がＶＰ５遺伝子の開始コドンの１以上のヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明の別の実施態様では、変異がビルナウイルスゲノムにおける異種核酸配列の挿入を含むビルナウイルス変異体が提供される。異種核酸配列は、特定のウイルス種の特定の挿入部位に通常は存在しない核酸配列である。
【００３２】
ビルナウイルスゲノムに挿入できる異種核酸配列は、ポリペプチドをコードするか、非コード配列である核酸断片である。核酸断片は、例えばウイルス、真核生物、原核生物または合成源などあらゆる源から誘導することができ、ＶＰ５遺伝子の発現の妨害に適するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
ＶＰ５発現の妨害に適するオリゴヌクレオチドは、第二の異種核酸配列の挿入に有用な１以上の適切な制限酵素開裂部位の他に、可能なリーディングフレームの各々の両方向に３個の翻訳終結コドンを含むことができる。そのような非コード異種核酸配列の長さおよびヌクレオチド配列は決定的ではないが、好ましくは、８〜５０個のヌクレオチドである。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様では、特定のビルナウイルスによる感染に対するワクチンの調製だけでなく、他の家禽または魚の感染病に対するワクチンの調製にも使用できるビルナウイルス変異体が提供される。例えば、そのようなＩＢＤＶ変異体をベースとするベクターワクチンは、免疫感作した宿主の感染細胞内でのこれらの鳥類病原体の抗原の発現により、他のトリ病原体に対する免疫感作の可能性を提供する。本発明に係るそのようなＩＢＤＶベクターは、本明細書で定義するように、ＶＰ５遺伝子にＩＢＤＶに対して異種のポリペプチドをコードする異種核酸配列を挿入することによって得ることができる。
【００３５】
異種核酸配列は、ニューカッスル（Newcastle）病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、マレク（Marek）病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、サルネネラ種(Salmonella spp.) 、大腸菌(E. coli) およびアイメリア種(Eimeria spp.)などの鳥類病原体の抗原をコードすることができる。
【００３６】
さらに、本発明に係るＩＢＤＶ変異体は、ＶＰ５遺伝子における変異の他に、ＶＰ２遺伝子における変異を含み、この遺伝子は、２以上の抗原型のＩＢＤＶ（例えば、古典的、バリアント−Ｅおよび／またはＧＬＳ）の中和エピトープを含むキメラタンパク質を発現する。好ましくは、そのような変異体は、変異ＧＬＳ株および古典的株の関係する保護ＶＰ２エピトープを含む。特に、変異したＶＰ２遺伝子は、Ｂ６９エピトープをコードする核酸配列断片を含むＧＬＳ  ＶＰ２遺伝子である。そのような変異したＶＰ２遺伝子の構築は、Snyderら、Avian Diseases 38, 701-707, 1994に記載されている。
【００３７】
さらに、薬剤または診断用途用ポリペプチド、特にリンホカイン、インターフェロンまたはサイトカインなどの免疫調節剤をコードする核酸配列をＶＰ５遺伝子に挿入することができる。異種核酸配列は、大腸菌β−ガラクトシダーゼまたは大腸菌β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーをコードすることもできる。
【００３８】
ビルナウイルス変異体、特に本発明に係るＩＢＤＶ変異体の構築は、ＩＢＤＶに対して最近確立された感染性ｃＲＮＡ系によって達成できる(Mundtおよび Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996)。この逆遺伝子系は、ＩＢＤウイルスのＲＮＡゲノム、特にＶＰ５遺伝子への変異導入の可能性の道を開いている。この逆遺伝子系における最も重要な工程は、ＩＢＤウイルスのセグメントＡおよびＢの全長ｃＤＮＡクローンを提供することである。セグメントＡまたはＢを含むｃＤＮＡ構築体は、これらの両セグメントの５’−および３’−端のヌクレオチドを含めて、Mundt および Vakharia (1996 、前出) に記載の方法に従って作製できる。さらに、これらの構築体は、セグメントのどちらかに機能を発揮するように連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。プロモターは、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼに対するプロモーターであり、Ｔ７プロモーターが好ましい。変異は、この目的に対して当技術分野で一般に公知の方法によってＶＰ５遺伝子に導入することができる。特に、変異は、部位特異的変異誘発によって導入される。
【００３９】
例えば、第一工程では、少なくともＶＰ５遺伝子の実質的な部分を含むｃＤＮＡ断片が提供される。次の工程では、適切なプライマー対を設計し、ＶＰ５配列を含む断片とハイブリダイズさせる。５’−プライマーは、ＶＰ５配列に相補的な配列の他に、所望の変異、例えばＡＴＧ開始コドンをＡＧＧ（アルギニン）コドンに変える変異を有するヌクレオチドを含む。さらに、５’−プライマーには、完全な５’−端非コード配列の修復を可能にする適切な制限酵素開裂部位を表す上流ヌクレオチド配列を付与する。続いて、変異した新しい断片をＰＣＲによって増幅し、その新しい断片を、適切な制限酵素を使用して天然の核酸配列と置き換えることにより、出発配列に導入する。次の工程で、セグメントＡおよびＢのプラスセンス転写産物が、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼにより in vitro で生成し、その後、合成転写産物を、通常のＲＮＡ精製法を使用して精製する。本発明に係る組換えＩＢＤＶ変異体が、所望ならばトランスフェクションを高める組成物（リポフェクチンなど）の存在下で、ＩＢＤＶゲノムの両セグメントの合成ＲＮＡ転写産物により適切な細胞（例えば、ＶＥＲＯ細胞、ＱＭ−７細胞またはＣＥＣ細胞）をトランスフェクションした後に得られる。最後に、組換えＩＢＤＶを、形質転換した細胞の上清から採取する。
【００４０】
ビルナウイルスゲノムに変異を導入する方法を本明細書に記載するが、当技術分野でも一般に使用されている(Mundtおよび Vakharia, 1996 、前出; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら編、Wiley N.Y., 1995版、pages 8.5.1.-8.5.9.)。
【００４１】
ＩＢＤＶのＶＰ５  ＯＲＦがＩＢＤＶゲノムの必須でない領域であるという本発明者らによる予期せぬ発見の他に、本発明に係るＩＢＤＶ変異体が保護的免疫応答を誘導することができる、すなわち、ＩＢＤＶ変異体を含むワクチンで免疫感作した動物は、病原性誘発に対して保護されることも見いだされた。さらに、天然のＩＢＤＶに感染した動物の抗血清は、非構造ＶＰ５タンパク質に特異的な抗体を含み、これらの抗血清は、本発明に係るＩＢＤＶ変異体に感染した動物由来の抗血清と区別することができることが見いだされた。さらに、上記したＩＢＤＶ変異体は、天然のＶＰ５タンパク質を産生することができる親ＩＢＤウイルスと比較して弱毒化されていることが見いだされた。
【００４２】
従って、本発明の別の側面は、上記した特徴を有するビルナウイルス変異体を薬剤的に許容され得る担体または希釈剤とともに含む、動物をビルナウイルス感染に対して保護するのに使用されるワクチンである。特に、本発明に係るワクチンは、上記したＩＢＤＶ変異体を含む、家禽を伝染性ファブリキウス嚢病に対して保護するために使用されるワクチンである。
【００４３】
本発明に係るビルナウイルス変異体は、生きた、または不活化ウイルスとしてワクチンに混入することができる。
【００４４】
本発明に係るワクチンは、例えば市販のＩＢＤＶ生または不活化ワクチンに対して通常使用されるような常法によって調製できる。簡単に述べると、感染しやすいサブストレートに、本発明に係るＩＢＤＶ変異体を接種し、ウイルスが所望の感染力価に複製するまで増殖した後、ＩＢＤＶ含有物質を採取する。
【００４５】
ＩＢＤウイルスの複製を支持することができるどのサブストレートも本発明で使用することができ、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）もしくはニワトリ腎細胞（ＣＫ）などの一次（鳥類）細胞培養、ＶＥＲＯセルラインもしくはＢＧＭ−７０セルラインなどの哺乳類セルライン、またはＱＴ−３５、ＱＭ−７もしくはＬＭＨなどの鳥類セルラインが挙げられる。通常は、細胞をインキュベートした後、ウイルスを３〜１０日間増殖させ、その後、細胞培養上清を採取し、所望ならば、細胞壊死組織片を除去するために、濾過または遠心分離する。
【００４６】
あるいは、ＩＢＤＶ変異体を、胚含有鶏卵で増殖させる。特に、これらのＩＢＤウイルスの増殖を行うサブストレートは、ＳＰＦ胚含有卵である。胚含有卵は、例えば、少なくとも102TCID50／卵を含む、0.2 mlのＩＢＤＶ変異体を含む上清またはホモジネートを接種し、次いで37℃でインキュベートすることができる。約２〜５日後に、胚および／または膜および／またはアラントイン液を集めた後、この物質を適切にホモジネートすることにより、ＩＢＤウイルス産物を採取することができる。ホモジネートは、その後、2500 x gで10分間遠心分離し、次いで、上清をフィルター（100 μm）で濾過することができる。
【００４７】
生きたウイルスを含む本発明に係るワクチンは、懸濁物または凍結乾燥形で作り、市販することができ、さらに、そのような組成物に対して通常使用される薬剤的に許容され得る担体または希釈剤を含む。担体としては、安定剤、保存剤および緩衝剤が挙げられる。適切な安定剤としては、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、澱粉、ショ糖、デキストラン、グルタミン酸塩またはグルコースなど）、タンパク質（乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼインなど）またはその分解産物が挙げられる。適切な緩衝剤としては、例えば、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。適切な保存剤しては、チメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤としては、水、水性緩衝剤（緩衝食塩水など）、アルコールおよびポリオール（グリセロールなど）が挙げられる。
【００４８】
所望ならば、本発明に係る生ワクチンは、アジュバントを含むことができる。アジュバント活性を有する適切な化合物および組成物の例は、下記に挙げるものと同じである。
【００４９】
注射による投与、例えば本発明に係る生ワクチンの筋肉内、皮下投与が可能であるが、ワクチンは、好ましくは、ＩＢＤＶワクチン接種に対して通常使用される安価なマス投与法によって投与する。ＩＢＤＶワクチン接種の場合、これらの方法としては、飲料水および噴霧ワクチン接種が挙げられる。
【００５０】
生ワクチンの別の投与法としては、in ovo、点眼およびビーク浸漬投与が挙げられる。
【００５１】
本発明の別の側面では、不活形のビルナウイルス変異体を含むワクチンが提供される。不活化ワクチンの大きい利点は、長い期間、極めて高レベルの保護抗体が達成できることである。
【００５２】
増殖ステップ後に採取したウイルスの不活化の目的は、そのウイルスの繁殖を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段によって達成できる。化学的不活化は、ウイルスを例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体で処理することによって行うことができる。必要であれば、不活化化合物をあとで中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例えば、チオスルフェートで中和できる。物理的不活化は、好ましくは、ウイルスをエネルギーに富む照射、例えば紫外線またはγ−線にかけることにより行うことができる。所望ならば、処理後、ｐＨを約７の値に調整することができる。
【００５３】
不活化ビルナウイルス変異体を含むワクチンは、例えば、この目的に適する１以上の上記した薬剤的に許容され得る担体または希釈剤を含むことができる。
【００５４】
好ましくは、本発明に係る不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１以上の化合物を含む。この目的に適する化合物または組成物としては、水酸化、リン酸もしくは酸化アルミニウム、または、例えば鉱物油（Bayol F（登録商標）または Marcol 52（登録商標）など）もしくは植物油（ビタミンＥ酢酸塩およびサポニンなど）をベースとする油／水もしくは水／油エマルジョンが挙げられる。
【００５５】
本発明に係るワクチンは、有効量のビルナウイルス変異体、すなわち、ワクチン接種した鳥類にビルレントウイルスによる誘発に対する免疫を誘導する量の免疫感作ビルナウイルス物質を活性成分として含む。免疫は、本明細書では、ワクチン接種した後の鳥集団における、ワクチン接種していない群と比較してかなり高いレベルの保護の誘発として定義する。
【００５６】
典型的には、本発明に係る生ワクチンは、動物１匹に対して102〜109TCID50感染用量50（TCID50）の用量、好ましくは105.0〜107.0TCID50の範囲の用量で投与することができ、不活化ワクチンは、動物１匹に対して105〜109TCID50と同等の抗原量を含むと考えられる。
【００５７】
不活化ワクチンは、通常は非経口投与、例えば筋肉内または皮下投与する。
【００５８】
本発明に係るＩＢＤＶワクチンは、ニワトリにおいて有効に使用できるが、七面鳥、ホロホロチョウおよびヤマウズラなどの他の家禽もそのワクチンによって十分ワクチン接種することができる。ニワトリには、ブロイラー、生殖群および産卵群が含まれる。
【００５９】
本発明に係る生ワクチンまたは不活化ワクチンを受ける動物の年齢は、通常の生または不活化ＩＢＤＶワクチンを受ける動物の年齢と同じである。例えば、ブロイラー（母に由来する抗体−ＭＤＡを含まない）は、１日齢でワクチン接種するが、ＭＤＡのレベルが高いブロイラーは、好ましくは、２〜３週齢でワクチン接種する。ＭＤＡレベルの低い産卵群または生殖群は、１〜１０日齢でワクチン接種した後、６〜８および１６〜２０週齢で不活化ワクチンの追加接種を行うことができる。
【００６０】
本発明はまた、本発明に係るＩＢＤＶまたはＩＰＮＶ変異体の他に、各々、家禽または魚に対して感染性である他の病原体由来の１以上の免疫原を含む混合ワクチンも含む。
【００６１】
好ましくは、混合ワクチンは、さらに伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、egg drop症候群（ＥＤＳ）ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）またはレオウイルスの１以上のワクチン株を含む。
【００６２】
ビルナウイルスに対するマーカーワクチンの他に、適切な診断テストの利用可能性は、ビルナウイルス撲滅制御プログラムの適用に対する必須要件である。そのような診断テストは本明細書で提供するが、家禽におけるＩＢＤＶ感染および魚におけるＩＰＮＶ感染の測定法を含む。すなわち、上記したワクチンを接種した現場の動物を、天然のＩＢＤＶまたはＩＰＮＶに感染した動物から区別する方法を提供する。
【００６３】
従って、本発明は、ビルナウイルス感染を検出する方法、特に、動物サンプルのＶＰ５抗体または抗原の有無を調べる工程を含む、動物のＩＢＤＶ感染を検出する方法を提供する。動物は、現場の動物であり、特に鳥類、好ましくはニワトリである。動物から得るサンプルは、ＩＢＤＶ抗体または抗原が存在するサンプルであればいずれでもよく、例えば血液、血清または組織サンプルが挙げられ、血清サンプルが好ましい。
【００６４】
動物におけるビルナウイルス感染の好ましい測定法は、ＶＰ５タンパク質に対する抗体を検出する方法であり、
（ｉ）抗−ビルナウイルス抗体を含む疑いのあるサンプルをＶＰ５抗原とインキュベートする工程、
（ii）抗体−抗原複合体を形成させる工程、および
（iii)抗体−抗原複合体の存在を検出する工程
を含む。
【００６５】
このイムノアッセイの設計は変わり得る。例えば、イムノアッセイは、競合または直接反応をベースとしてもよい。さらに、プロトコールは固体支持体を使用してもよく、または細胞物質を使用してもよい。抗体−抗原複合体の検出は、標識抗体の使用を含むことができ、標識は、例えば、酵素、蛍光分子、化学ルミネセンス分子、放射性分子または染料分子である。
【００６６】
サンプル中のＶＰ５抗体の適切な検出法としては、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）およびウェスタンブロット分析が挙げられる。
【００６７】
ＥＬＩＳＡを例にとると、ポリスチレンマイクロ滴定プレートのウェルをＶＰ５抗原で被覆する。次に、被覆したプレートのウェルにニワトリ血清を充填し、順次希釈を行う。インキュベートした後、ニワトリ抗−ＶＰ５タンパク質血清抗体を、被覆したものと特異性が同じであるが、標識されている（例えば、ビオチンで標識）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を検出することにより測定する。標識した抗体は、ニワトリ血清中の抗−ＶＰ５抗体によって占領されていない遊離の抗原を占領する。例えば、アビジンに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、ペルオキシダーゼの量を酵素反応によって測定する。ＶＰ５に対する抗体がニワトリ血清サンプルに存在しない場合は、最大の吸光度が得られる。血清がＶＰ５に対して多くの抗体を含む場合は、低い吸光度が予想される。あるいは、ニワトリ血清とともにインキュベートした後、ＶＰ５抗原に結合した、血清中に存在する抗体の量は、抗−ニワトリコンジュゲート、次いで酵素反応を使用して直接測定できる。
【００６８】
サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ポリスチレンマイクロ滴定プレートのウェルをＶＰ５タンパク質に特異的なモノクローナル抗体で被覆することができる。次に、これらの被覆したプレートのウェルは、ＶＰ５抗原とともにインキュベートする。抗原を捕獲した後、ウェルにニワトリ血清を充填し、順次希釈を行う。次いで、上記したプロトコールを行うことができる。このテストは、被覆したモノクローナル抗体の代わりにＶＰ５に対するポリクローナル血清を使用することによっても行うことができる。
【００６９】
別の診断テスト（ウェスタンブロット分析）では、ＶＰ５抗原（含有）物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。次に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロットする。その後、膜をレーンに切り分け、それらのレーンをニワトリ血清とともにインキュベートする。サンプル中のＶＰ５抗体の存在は、抗体がＶＰ５抗原に結合したかどうかを、例えば抗−ニワトリコンジュゲート、次いで酵素反応を使用して調べることにより測定できる。ＶＰ５に対する抗体が存在する場合は、約17 kDaのバンドが確認できる。
【００７０】
ＶＰ５抗原は、ＶＰ５抗原−ＶＰ５抗体複合体の形成を可能にする物質を含むどのＶＰ５タンパク質（断片）でもよい。好ましくは、ＶＰ５抗原が通常の組換え宿主細胞またはウイルスの発現産物、例えば、大腸菌発現ＶＰ５(Mundtら、J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) またはバキュロウイルス発現タンパク質(Vakharia ら、Vaccine 12, 452-456, 1994; Vakharia ら、J. Gen Virol. 74, 1201-1206, 1993)などを含む。本発明のさらに別の実施態様によれば、上記した本発明に係る診断テストを行うのに適した診断テストキットが提供される。
【００７１】
特に、通常存在する成分の他に、免疫学的試薬としてＶＰ５抗原（所望ならば固相上に被覆）を含む診断テストキットが提供される。そのようなテストキットに通常存在する他の成分としては、ビオチンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した抗体、酵素基質、洗浄緩衝剤などが挙げられる。
【００７２】
現場の動物のテストサンプルにおけるビルナウイルスＶＰ５抗原を測定するために、ＶＰ５特異的抗体を免疫学的試薬として使用し、好ましくは、固相に固定する。テストサンプルを添加し、抗体−抗原複合体を形成させるべくインキュベートした後、標識した第二の抗体を添加してその複合体を検出することができる。
【００７３】
【実施例】
実施例１
組換えＶＰ５-ＩＢＤウイルスの構築および分析
ＩＢＤＶセグメントＡの全長ＶＰ５-クローンの構築：
ＶＰ５陰性ＩＢＤＶを構築するために、Ｄ７８株セグメントＡ(pUC19FLAD78; Mundt および Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996)の全長ｃＤＮＡの３’−端のすぐ後ろのEcoRI 部位を欠失させた。Ｔ７ポリメラーゼ結合部位および続くセグメントＡの完全な配列を含むEcoRI-KpnI断片を切り出してEcoRI-KpnI開裂ベクターpUC18 に挿入した後、そのベクター配列内のユニークなNdeIを不活化して、プラスミドpAD78/EKを得た。その後、ＶＰ５に対する開始コドンを含むゲノム領域を、各々、プライマーA1F5' およびVP5MutR 、ならびにVP5MutF およびA2R を使用して２片で増幅した（プライマーの配列および位置に対しては表１を参照）。ＰＣＲ断片を別々にクローン化し、次いで、各々のプライマー内の変異によって作ったユニークなAflII 部位によって融合した（図２参照）。Ｔ７ポリメラーゼ結合部位を含むEcoRI-NdeI断片および導入した変異を含むセグメントＡの５’−部分を切り出して、pAD78/EKにおける野生型EcoRI-NdeI断片との置換に使用し、プラスミドpAD78/VP5-を得た。導入した３個の変異のうち、一つはＶＰ５に対する開始メチオニンコドンをアルギニンコドンに変えた（図２）。
【００７４】
表１：変異体構築物の生成に使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列
【００７５】
【表１】
0004316025.tif 000002
【００７６】
a)下線部のヌクレオチドは、ウイルス特異的ヌクレオチドを示す。Ｔ７プロモーター配列は、イタリック体で示す。変異したヌクレオチドは太字であり、プライマーの方向は、センス（＋）およびアンチセンス（−）に対して示す。プライマーの位置は、血清型ＩＰ２株の発表された配列に従って示す（Mundt ら、Virology 209, 209-218, 1995)。
【００７７】
ｃＲＮＡからのウイルス回収：ＲＮＡプラスミドを in vitro 転写するために、pAD78/EK、pAD78/VP5-および pBP2 （図２）を、各々、BsrGI およびPstIによる開裂によって線状化した。線状化ＤＮＡの処理、ＲＮＡの転写および精製、ならびにトランスフエクションは、Mundt およびVakharia(1996 、前出) の記載に従って行ったが、トランスフェクションの実験については、二次ＣＥＣを使用した。トランスフェクションの３日後、ＣＰＥをＣＥＣ中に見ることができた。細胞を凍結／解凍し、700 x g で遠心分離して細胞の壊死組織片を除去し、得られた上清を0.45μm のフィルターで濾過して、−20℃で保存した。トランスフェクション実験のために、ＶＰ５を発現することができるＤ７８株のセグメントＡの全長ｃＤＮＡクローン（pAD78/EK）または発現できないクローン（pAD78/VP5-）を合成ＲＮＡに転写し、セグメントＢ全長ｃＲＮＡとともにＣＥＣに共トランスフェクションした。得られたウイルスの子孫ＩＢＤＶ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５-を、さらに解析した。
【００７８】
免疫蛍光および放射線免疫沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）によるトランスフェクション子孫の分析：ＶＰ５を、Mundt ら (J. Gen. Virol. 76, 437-443, 1995) の記載に従って、大腸菌で発現させた。ＶＰ５に対するウサギモノ特異的ポリクローナル抗血清およびマウスモノクローナル抗体を、標準的プロトコールに従って調製した。ＩＢＤＶ／ＶＰ５-感染ベロ細胞、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染ベロ細胞および非感染細胞を、各々、ウサギ抗−ＩＢＤＶ血清、ウサギ抗−ＶＰ５血清および抗−ＶＰ５ mAb DIE 7とともにインキュベートし、蛍光−結合二次抗体で染色した。抗血清およびモノクローナル抗体の両方が、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染細胞の細胞質におけるＩＢＤＶ抗原を認識した。これに対して、抗−ＩＢＤＶ血清は、ＩＢＤＶ／ＶＰ５-感染細胞におけるウイルス抗原を容易に検出したが、モノ特異的抗ＶＰ５血清もモノクローナル抗−ＶＰ５抗体も特異的反応性を示さなかった。これらの免疫学的試薬はどれも、感染していない対照とは反応しなかった。
【００７９】
複製中に発現されるウイルスタンパク質を分析するために、ＩＢＤＶ／ＶＰ５-（図４、レーン１〜３）およびＩＢＤＶ／ＥＫ（図４、レーン４〜６）を感染させた放射能標識したＣＥＣの溶解産物を、ウサギ抗−ＩＢＤＶ血清、ウサギ抗−ＶＰ５血清および mAb DIE 7  によって免疫沈殿させた。感染していないＣＥＣを対照として使用した（図４、レーン７〜９）。ＩＢＤＶ／ＥＫ（レーン４）およびＩＢＤＶ／ＶＰ５-（レーン１）感染ＣＥＣは、ウサギ抗−ＩＢＤＶ血清による免疫沈殿により、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を示した。ウサギ抗−ＶＰ５血清（レーン５）および mAb DIE 7（レーン６）は、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染細胞のみに由来する分子量21 kDaのＶＰ５を沈殿させた。ウサギ抗−ＶＰ５（レーン２）およびＶＰ５特異的 mAb DIE 7（レーン３）による沈殿においては、ＩＢＤＶ／ＶＰ５-感染ＣＥＣは、特異的反応性を示さなかった。感染していないＣＥＣは、特異的反応性を示さなかった（レーン７〜９）。
【００８０】
ＣＥＣにおけるＩＢＤＶ／ＶＰ５-の複製：ＩＢＤＶ／ＶＰ５-の複製をさらに詳細に分析するために、一ステップ増殖を分析した（図５）。コンフルエント二次ＣＥＣを、各々、107.2TCID50を有するＩＢＤＶ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５-で感染させた。感染細胞を5 mlの増殖培地で覆った直後に、各ウイルスの１個の感染ＣＥＣ組織プレートの上清を取り出して、−20℃で保存した（0 h p.i.）。残りの組織培養プレートはさらにインキュベートし、4h、8h、16h 、24h および48h p.i.上清を取り出して、−20℃で保存した。上清を遠心分離し、標準的方法に従って力価測定した。感染後の種々の時点でのTCID50は、ＶＰ５発現ウイルス（ＩＢＤＶ／ＥＫ）が、ＶＰ５に欠けるウイルス変異体（ＩＢＤＶ／ＶＰ５-）よりも速く複製することを示した。感染の16時間後、ＩＢＤＶ／ＥＫは、ＩＢＤＶ／ＶＰ５-よりも100 倍高いことを示した（図５）。しかし、48h p.i.では、ＩＢＤＶ／ＶＰ５-は、107.2TCID50/ml に達し、これは、ＩＢＤＶ／ＥＫ（107.45TCID50/ml ）と同じであった。
【００８１】
組換えＩＢＤＶ  ＶＰ５-−２の調製：プラスミド pAD78/VP5--2を、上記した方法と同様の方法で調製した。変異誘発したＶＰ５遺伝子の一部のヌクレオチド配列を配列番号７および図３に示す。変異を含む制限酵素断片を使用して、pAD78/EKにおける野生型EcoRI-NdeI断片と置き換えた。組換えプラスミドの調製に対するプロトコールの概略を図３に示す。pBD78 の構成も図３に示す。組換えウイルスは、上記と同様に作製したが、Ｄ７８株のセグメントＢ（配列番号８）を使用し、ＱＭ−７細胞をトランスフェクション実験に使用した。
【００８２】
実施例２
種々のＩＢＤＶ株におけるＶＰ５タンパク質の同定
種々のＩＢＤＶ株を、ＶＰ５遺伝子の発現について調べた。これは、免疫蛍光法（ＩＦＴ）を使用して行った。マイクロタイタープレートで増殖させたニワトリ胚繊維芽細胞に種々のＩＢＤＶ株を感染させた。37℃でのインキュベートの３〜５日後に細胞を70 %エタノールで固定し、次いで、各々、ポリクローナルウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｒ1928）、ポリクローナルウサギ抗ＶＰ５血清（ＲαＶＰ５）またはＶＰ５に対して特異的なモノクローナル抗体（DIE7）で処理した。種々のＩＢＤＶ株に対するポリ−またはモノクローナル抗体の結合を、蛍光標識コンジュゲート（ヤギ−抗−ウサギまたはヤギ−抗−マウス）を使用することにより可視化した。結果を表２に示す。
【００８３】
表２：種々の血清型およびサブタイプのＩＢＤＶ株の同定：ＶＰ５タンパク質の存在の測定
【００８４】
【表２】
0004316025.tif 000003
【００８５】
これらのデータから、種々の血清型およびサブタイプに属するＩＢＤＶの種々の株は、ＶＰ５遺伝子を発現すると結論付けることができる。さらに、組換えＶＰ５-ＩＢＤＶワクチン株は、現場およびワクチンウイルスと区別することができ、従って、組換えＶＰ５-ウイルスはマーカーワクチンとして使用することができる
実施例３
組換えＶＰ５+およびＶＰ５-ＩＢＤＶワクチンの、市販のＩＢＤＶ生ワクチンとの比較のための in vivoテスト
ＩＢＤＶワクチンの調製：一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を 2 × 106/ml の最終濃度で調製した。細胞は、5 ％のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地で培養した。この細胞懸濁物25 ml に、0.1 mlのＩＢＤＶ／ＥＫまたはＩＢＤＶ／ＶＰ５-ウイルス（約3.0 log 10 TCID50/mlの感染力価を有する）を添加した。37℃の高湿度インキュベーターで５日間インキュベートした後、懸濁物全体をさらに精製することなく動物実験に使用した。上清の感染力価は、107.1TCID50/ml であった。
【００８６】
動物実験：この実験では、種々のワクチン（ＶＰ５陽性株ＩＢＤＶ／ＥＫおよびＶＰ５陰性株ＩＢＤＶ／ＶＰ５-ならびに市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株 (Intervet International B.V., NL)）の効力を調べた。３週齢のＳＰＦニワトリを、処理計画に示すように処理した。
【００８７】
処理計画：
【００８８】
【表３】
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【００８９】
VP5+ ＶＰ５陽性ワクチンクローンによる嚢病（bursal disease）ワクチン接種、点眼法、用量は動物１匹につき104.6TCID50、0.1 ml
VP5- ＶＰ５陰性ワクチンクローンによる嚢病ワクチン接種、点眼法、用量は動物１匹につき105.9TCID50、0.1 ml
D78  ＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株による嚢病ワクチン接種、点眼法、１フィールド用量
ch  嚢病ウイルス Farragher F52/70株 による誘発、点眼法、用量は動物１匹につき102.0TCID50、0.1 ml
bl  血清学的実験；ＶＮ−検定／ウェスタンブロット
x  嚢（bursae）に対する組織学的実験（H.E.染色）およびＭＣＡ−８  ＥＬＩＳＡ
xl  嚢に対する組織学的実験（H.E.染色）およびＭＣＡ−８  ＥＬＩＳＡならびにファブリキウス嚢由来のウイルスの再単離
+  嚢の臨床実験および10日後の組織学的実験
ファブリキウス嚢におけるウイルスの検出：
点眼によるワクチン接種の３、７、１４および２０日後、動物を屠殺し、血液および嚢を得た。嚢中のウイルスの存在を、モノクローナル抗体８（ＭＡＢ−８）の使用による固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ＭＡＢ−８は、ＩＢＤＶに対して特異的である。データを表３に示す。
【００９０】
さらに、ワクチン接種の３および７日後、第２群の動物の嚢を、組換えＶＰ５-ウイルスの存在について調べた。その目的のために、嚢をモジネートし、ニワトリ胚繊維芽細胞上で培養した。ＶＰ５-ウイルスの存在は、ＩＢＤＶもしくはＶＰ５に対するポリクローナルウサギ血清またはＶＰ５に対するモノクローナル抗体を使用して、ＩＦＴにより測定した。調べた15の嚢のうち13（87 %）からＶＰ５-ウイルスを再単離し、同定することができた（R1928 に対して陽性であり、 RαVP5 およびDIE 7 に対して陰性である）。このことは、動物の継代後のウイルスがなおもＶＰ５-であることを示し、これは、そのウイルスが安定であって、ＶＰ５+に戻らないことを示している。さらに、種々のポリ−およびモノクローナル抗体の使用により、ＶＰ５-ワクチンウイルスを、他の全てのワクチンおよび／または現場のＩＢＤＶウイルスと区別することができる。従って、ＶＰ５-ワクチンは、マーカーワクチンとして使用できる。
【００９１】
誘発（challenge）の３日後、第１、２および３群では、ウイルスが検出されなかった（ＭＣＡ−８  ＥＬＩＳＡ）。これに対して、第４群（ワクチン接種していない対照群）の全動物は、誘発の３日後にファブリキウス嚢に誘発ウイルスを含んでいた。それらの結果は、組換えＶＰ５+でワクチン接種した動物（第１群）、組換えＶＰ５-でワクチン接種した動物（第２群）およびＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８でワクチン接種した動物（第３群）が、過酷な誘発に対して保護されたことを示している。
【００９２】
表３：ワクチン接種または誘発後の異なる時点（日数）でのファブリキウス嚢におけるＭＣＡ−８  ＥＬＩＳＡによる個々のウイルス検出データ
【００９３】
【表４】
0004316025.tif 000005
【００９４】
ファブリキウス嚢における病変の検出：
種々のＩＢＤＶ（組換え）ワクチンまたは誘発ウイルスにより誘起される病変の顕微鏡による平均得点を表４に示す。
【００９５】
誘発前は、組換えＶＰ５+ＩＢＤＶワクチンでワクチン接種した（第１群）またはＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８でワクチン接種した（第３群）動物の嚢の病変は小〜中程度であった。誘発の３日後に、慢性の病変のみがファブリキウス嚢で確認された。これは、第１および３群の動物が誘発に対して保護されたことを示す。さらに、誘発の１０日後には、非常に小さい病変（ 0〜20％のリンパ球の消耗）のみがＶＰ５+組換えＩＢＤＶワクチンまたは NobilisワクチンＤ７８でワクチン接種した動物の嚢で確認された。これに対して、ワクチン接種または誘発を行わなかった動物は、誘発の１０日後に重い病変を示した。言い換えると、ＶＰ５+組換えＩＢＤＶワクチンまたは NobilisワクチンＤ７８でワクチン接種した第１および３群の全動物（100％)が、過酷な誘発に対して保護された。
【００９６】
組換えＶＰ５-ＩＢＤＶワクチンによるワクチン接種の３、７、１４および２０日後、ならびに誘発の３および１０日後に、第２群の動物は、嚢の病変をほとんど示さなかった（ 0〜20 %のリンパ球の消耗）。ＶＰ５-組換えＩＢＤＶワクチンを接種した第２群の全動物を第１または３群の動物（組換えＶＰ５+または市販のワクチンを接種）と比較すると、組換えＶＰ５-ワクチンは、病変の誘起が小さく、従って、この実験でテストしたワクチンよりも安全で刺激が少ない。
【００９７】
誘発の３日後、第４群のワクチン接種しなかった全動物は、嚢に急性の重い病変を示した（全リンパ球の消耗、得点 5.0）。誘発の１０日後には、全動物（17匹中17匹）が全リンパ球の消耗を示した。これは、これらの動物が、過酷な誘発に対して保護されなかったことを示す。誘発後に死亡した動物は、全部がファブリキウス嚢に重い病変を示した。対照の第４群は、過酷な誘発に対して保護されず、これは、テスト条件が最適であったことを示すとの結論を下した。
【００９８】
表４：ワクチン接種または誘発後の種々の時点（日数）での嚢の病変の平均得点：病変の平均得点は、次のように計算する。すなわち、ある一定の日に、群毎に動物の全ての病変の得点を加える。この数値を次いで、その日にその群で調べた動物の総数で割る。個々の得点は１〜５の範囲である。得点０＝リンパ球の消耗なし、得点１＝リンパ球の消耗が 0〜20％、得点２＝20〜40 %、得点３＝40〜60％、得点４＝60〜80％および得点５＝80〜100％（全リンパ球の消耗）
【００９９】
【表５】
0004316025.tif 000006
【０１００】
血清学的応答：
動物の血清学的応答を、血清による古典的伝染性嚢病ウイルス株の中和能をウイルス中和（ＶＮ）検定で測定することにより求めた。血清は、ワクチン接種の３、７、１４および２０日後に調べた。中和力価の平均を表５に示す。
【０１０１】
結果は、第１群のニワトリに適用した組換えＩＢＤＶワクチンＶＰ５+が、ワクチン接種の２０日後に良好で高い血清学的応答を誘起したことを示している。これは、市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株を接種したニワトリ（第３群）の血清学的応答に匹敵する。第２群のニワトリに適用した組換えＩＢＤＶワクチンＶＰ５-も、良好な血清学的応答を誘起した。ワクチン接種の２０日後に9.4 log 2 の力価が確認された。組換えＶＰ５-ＩＢＤＶワクチンによって誘起される血清学的応答は、組換えＩＢＤＶ  ＶＰ５+ワクチンまたは市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株によって誘起される血清学的応答と比較して遅かった。
【０１０２】
ワクチン接種しなかった第４群は、ＩＢＤＶに対する血清学的応答を示さなかった。
【０１０３】
表５：ワクチン接種後の異なる時点（日数）での第１〜４群のＩＢＤＶ−ＶＮ平均力価（希釈度の log 2として表す）
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
抗血清間の血清学的差異の認識：
ＶＰ５に対する血清学的応答を、ウェスタンブロット分析を使用することにより調べた。この目的のために、ＶＰ５タンパク質を大腸菌またはバキュロ発現系で発現させた。発現したタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した。次に、タンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロットした。その後、膜をレーンに切り分け、それらのレーンをウサギ抗−ＶＰ５血清、ＶＰ５+組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清、ＶＰ５-組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清またはＳＰＦニワトリ由来の陰性血清とともにインキュベートした。データを表６にまとめる。表６から分かるように、ＶＰ５-血清は、ＶＰ５に対する血清学的応答を誘起しない。これに対して、ウサギ抗−ＶＰ５血清およびＶＰ５+組換えワクチンに対して特異的なニワトリ血清は、ＶＰ５タンパク質を認識し、従って、ＶＰ５に対する血清学的応答を誘起する。これは、ニワトリ血清が、動物がＶＰ５タンパク質を発現するウイルス（例えば、現場のウイルス）またはＶＰ５-組換えワクチンに動物がさらされたかどうかを調べるために使用できることを示している。
【０１０６】
表６：ウェスタンブロット分析：ＶＰ５+またはＶＰ５-組換えワクチンを接種した動物由来の血清ならびにＳＰＦニワトリ血清および抗ＶＰ５−ウサギ血清のＶＰ５−タンパク質との反応を調べた。
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
死亡率および臨床上の徴候：
ＶＰ５+ＩＢＤＶワクチンを接種した動物（第１群）、組換えＶＰ５-ＩＢＤＶワクチンを接種した動物（第２群）または市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株を接種した動物（第３群）はいずれも、誘発後、死亡しなかったし、あるいは、伝染性嚢病の臨床上の徴候を示さなかった。これは、それらの動物が、過酷な誘発に対して保護されたことを示す。ワクチン接種していない対照群の動物は全て、過酷な誘発に対して保護されなかった。
【０１０９】
実施例４
組換えＶＰ５-−２ワクチンの in vivoテスト
ＩＢＤＶワクチンの調製：一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を、2 × 106/ml の最終濃度で調製した。細胞は、5％のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地で培養した。この細胞懸濁物の15 ml に、0.1 mlのＩＢＤＶ／ＶＰ５-−２（D78/D78/VP5-）ウイルスを添加した。高湿度のインキュベーター（37℃）で６日間インキュベートした後、上清を力価測定した。上清の感染力価は、108.2TCID50/ml であった。第二の動物実験に対しては、上清を希釈して、ワクチン用量を 105.5TCID50／動物とし、第一の動物実験の場合は、上清を希釈して、104.0TCID50／動物または105.0TCID50／卵とした。
【０１１０】
第一の動物実験：ワクチンの効果を、14日齢での誘発ウイルスの投与によって得られる血清学的応答および誘発耐性を測定することにより評価した。ワクチン（105.0TCID50／卵または104.0TCID50／動物のD78/D78/VP5-）は、 in ovo または１日齢では筋肉内に投与した。誘発の３および10日後の嚢の病変を顕微鏡により調べた。誘発に対する保護を測定し、14日齢での血清学的応答をＶＮ−検定によって測定した。
【０１１１】
１．誘発の３および10日後の嚢の病変の顕微鏡による平均得点
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
２．誘発後の保護
【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
３．ＩＢＤＶに対する血清学的応答
【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
結論：
１．D78/D78/VP5-株は、かなり弱毒化されたＩＢＤ−ウイルスである。
【０１１８】
２．そのウイルス株は非常にマイルドである。
【０１１９】
３．そのウイルスは、血清学的応答を誘起することができる。
【０１２０】
４．そのウイルスは、保護を誘起することができる。
【０１２１】
５．そのウイルス株は、１日齢のＳＰＦニワトリに筋肉内注射によって投与することができ、18日齢の胚含有ＳＰＦ卵には in ovo で投与することができる。
【０１２２】
第二の動物実験：ワクチンの効果を、ガンボロワクチン投与の21日後に誘発ウイルスを投与することによって得られるＩＢＤＶに対する血清学的応答および誘発耐性を測定することにより評価した。ワクチン（105.5TCID50／動物のD78/D78/VP5-）は、14日齢のＳＰＦニワトリに筋肉内投与した。ワクチン接種の３、７、１４および２０日後ならびに誘発の３日後に、嚢、脾臓、胸腺、肝臓、十二指腸、膵臓、ceacal tonsilsおよび harderian腺の病変を顕微鏡で調べた。誘発の10日後に、嚢の病変を顕微鏡で調べた。血清をＶＮ−検定でテストし、誘発後の死亡率を記録した。
【０１２３】
１．誘発後の死亡率（％）：
【０１２４】
【表１１】
0004316025.tif 000012
【０１２５】
２．誘発の前後のワクチン接種群の顕微鏡による病変の調査：
【０１２６】
【表１２】
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【０１２７】
ＮＤ＝調査していない
３．ワクチン接種後の血清学的応答
【０１２８】
【表１３】
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【０１２９】
結論
１．D78/D78/VP5-株は、かなり弱毒化されたＩＢＤ−ウイルスである。
【０１３０】
２．そのウイルス株は非常にマイルドであり、臓器の病変を誘起しない。
【０１３１】
３．そのウイルスは、血清学的応答を誘起することができる。
【０１３２】
４．そのウイルスは、保護を誘起することができる。
【０１３３】
【配列表】
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【０１３４】
【化１】
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【０１３５】
【化２】
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【０１３６】
【化３】
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【０１３７】
【化４】
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【０１３８】
【化５】
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【０１３９】
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【０１４０】
【化６】
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【０１４１】
【化７】
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【０１４２】
【化８】
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【０１４３】
【化９】
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【０１４４】
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【０１４５】
【化１０】
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【０１４６】
【化１１】
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【０１４７】
【化１２】
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【０１４８】
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【０１４９】
【化１３】
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【０１５０】
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【０１５１】
【化１４】
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【０１５２】
【化１５】
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【０１５３】
【化１６】
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【０１５４】
【化１７】
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【０１５５】
【化１８】
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【０１５６】
【化１９】
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【０１５７】
【化２０】
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【０１５８】
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【０１５９】
【化２１】
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【０１６０】
【化２２】
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【０１６１】
【化２３】
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【０１６２】
【化２４】
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【０１６３】
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【０１６４】
【化２５】
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【０１６５】
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【０１６６】
【化２６】
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【０１６７】
【化２７】
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【０１６８】
【化２８】
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【０１６９】
【化２９】
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【０１７０】
【化３０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＢＤＶのセグメントＡおよびセグメントＢのゲノム構成。数字は、セグメント上の開始、末端およびコード領域のヌクレオチドの位置を示す。
【図２】ＩＢＤＶ／ＶＰ５-を調製するためのゲノムｃＤＮＡの構築。プラスミド pAD78/EK は、ポリタンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）およびＶＰ５をコードする完全なＤ７８セグメントＡ  ｃＤＮＡを含む。プラスミド pBP2 は、ＶＰ１をコードする完全株Ｐ２セグメントＢを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5-に導入して、ＶＰ５に対するメチオニン開始コドンをアルギニンに変え、人工の Afl II 開裂部位を作った。組換えプラスミドを、下線を引いた制限酵素で線状化し、次いでＴ７ポリメラーゼ転写を行った。
【図３】ＩＢＤＶ／ＶＰ５-−２を調製するためのゲノムｃＤＮＡの構築。プラスミド pAD78/EK は、ポリタンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）およびＶＰ５をコードする完全なＤ７８セグメントＡ  ｃＤＮＡを含む。プラスミド pBD78は、ＶＰ１をコードする完全Ｄ７８株セグメントＢを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5-に導入して、ＶＰ５に対するメチオニン開始コドンをグルタミン酸に変え、人工の BstBI開裂部位を作った。さらに変異をアルギニンおよびグルタミンコドンに導入した。組換えプラスミドを、下線を引いた制限酵素で線状化し、次いでＴ７ポリメラーゼ転写を行った。
【図４】組換えＩＢＤＶ感染ＣＥＣ細胞由来のタンパク質の放射線免疫沈殿。ＩＢＤＶ／ＶＰ５-感染ＣＥＣ細胞（レーン１〜３）、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染ＣＥＣ細胞（レーン４〜６）および未感染の対照のウサギ抗−ＩＢＤＶ血清（レーン１、４、７）、ウサギ抗−ＶＰ５血清（レーン２、５、８）および mAb DIE7 （レーン３、６、９）による免疫沈殿を行った。分子量マーカー（Ｍ）の位置を示す。ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰ５の位置に印を付ける。
【図５】ＩＢＤＶ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５-の複製動力学。上清の感染力価（縦軸）を、指示した時間に測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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