(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物のライブラリーにおいて興味ある性状を持っている化合物を同定する方法であって、前記化合物は、CO2H,OH,SH,NH2,NHR（RはC1-C9の直鎖アルキル基である）,CH2Cl,CH2BrおよびCHN2よりなる群から選択された少なくとも１のタイプの第一の官能基を表面に持つ固相担体に結合しており、N反応工程で構成される独自の反応系列によって生成され、Nが少なくとも２から１００の整数であり、そこで各化合物が独自に同一か異なった構成要素から調製され、
a）前記固相担体の１群をMバッチに分割すること、ここでMは少なくとも２から５０の整数であり、
b）固相担体との結合を形成するために、構成要素と固相担体のMバッチのそれぞれとを反応させ、
c）工程b）の前に、それとも同時に、または工程b）の後に0.001から0.5モル当量の光学探索で区別可能なフルオロホア標識を各バッチへ付加し、
d）工程b）及びc）の後にすべてのMバッチを一体にし、
e）a）からd）の工程をN-1回反復すること、またはa）からd）の工程をN-2回反復した後にa）からc）の工程を一度実施して、化合物のライブラリーを形成すること、
f）ライブラリーの化合物のいずれかが興味ある性状を持つことを示すことができる分析法を実施すること、
g）興味ある性状を持っている化合物を含む固相担体を他の固相担体から単離せず、且つ興味ある性状を持っている化合物を含む固相担体からいずれの標識も解離せずに、その結合したフルオロホア標識のそれぞれの相対量を測定するためにそれぞれの固相担体のスペクトル蛍光データを収集すること、
h）化合物の独自の反応系列で結合したN構成要素を測定するため、工程g）で測定されるフルオロホア標識のそれぞれの相対量を比較することによって収集されたスペクトル蛍光データを分析または解読し、それによって、興味のある性状を持っている化合物を同定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
固相担体がビーズを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程e）がa）からd）の工程をN-1回反復して化合物のライブラリーを形成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程e）がa）からd）の工程をN-1回反復した後にa）からc）の工程を一度実施して化合物のライブラリーを形成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的標的分子と化合物のライブラリーを接触させた後にMバッチをさらに一体にすることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フルオロホア標識のそれぞれが共有結合によって固相担体に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フルオロホア標識が固相担体に直接的に、または固相担体に結合している構成要素に結合を形成することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
フルオロホア標識は以下の化学名を有する化合物：
3-（ε-カルボキシペンチル）-3’-エチル-オキサカルボシアニン-6,6’-ジスルホン酸、
1-（ε-カルボキシペンチル）-1’-エチル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5’-ジスルホン酸、
1-（ε-カルボキシペンチル）-1’-エチル-3,3,3’,3’-テトラメチル-3H-ベンズ（ゼ）インドカルボシアニン-5,5’,7,7’-テトラスルホン酸、
1-（ε-カルボキシペンチル）-1’-エチル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5’-ジスルホン酸、
から成る群から選択される染料であり、スクシンイミジル、スルフォスクシンイミジル、p-ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、HOBtおよびN-ヒドロキシピペリジルから成る群から選択された活性エステルとして活性化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
フルオロホア標識は以下の化学名を有する化合物：
6-（（4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸、
6-（（4,4-ジフルオロ-5-フェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸、
6-（（4,4-ジフルオロ-1,3-ジメチル-5-（4-メトキシフェニル）-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-2-プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸、
6-（（（4-（4,4-ジフルオロ-5-（2-チエニル）-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサン酸、
6-（（（4,4-ジフルオロ-5-（2-チエニル）-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-イル）スチルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸、及び
6-（（（4,4-ジフルオロ-5-（2-ピロリル）-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-イル）スチルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸、
から成る群から選択される染料であり、スクシンイミジル、スルフォスクシンイミジル、p-ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、HOBtおよびN-ヒドロキシピペリジルから成る群から選択された活性エステルとして活性化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
フルオロホア標識は以下の化学構造を有する化合物：
0004302780.tif 000012
から成る群から選択される染料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇ）工程が多重色蛍光イメージ化またはスペクトルイメージ化分析を使用して実施されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
多重色蛍光イメージ化を分光分析とともに使用して解読することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Mが少なくとも２から２５までの整数であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記フルオロホア標識が、放射波長によって光学的に区別可能であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記フルオロホア標識が、フルオロホア標識の相対量比率を調整することによって放射強度によって光学的に区別可能であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
比率が、１：１、２：１、３：１、又は４：１であることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記フルオロホア標識が、励起状態寿命によって光学的に区別可能であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記フルオロホア標識が、放射波長、励起状態寿命、及び放射強度によって光学的に区別可能であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記興味ある性状を持っている化合物がオリゴヌクレオチド又は核酸を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記興味ある性状を持っている化合物がオリゴペプチド又はタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記興味ある性状を持っている化合物がリガンドを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
Nが少なくとも４から１２までの整数であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ビーズを平面基質上で解読することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項２４】
多重色蛍光イメージ化を分光分析とともに使用して光学探索を実施することを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ビーズを平面ビーズ・アレイに配置して解読を実施することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項２６】
多重色蛍光イメージ化を分光分析とともに使用して光学探索を実施することを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ビーズが、ポリスチレン、ポリエチレン、セルロース、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、シリカ、及びガラスから成る群から選択される物質で構成されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項２８】
工程ｃ）の標識が発色団標識を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記フルオロホア標識が、２進コード、拡大した色別２進コード、又は簡単な色別コードを構成することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
前記興味がある性状が受容体へ化合物の結合する親和性である場合、分析法は結合に対する物理的な応答を
a）固相担体に結合した少なくとも１の化合物に結合した標識した受容体が得られるように、標識した受容体の溶液を化合物のライブラリーに最初に混合すること；
k）固相担体から溶液を取り除くこと；
l）実質上非結合の標識された受容体を排除するため固相担体を洗浄すること；
ｍ）その結合親和性を測定するために、結合した標識された受容体の物理的応答を測定すること；
によって測定することによって実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記受容体が蛍光染料、有色の染料、放射性アイソトープまたは酵素によって標識されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記物理的応答が蛍光放射、光の吸収または放射能活性であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記構成要素が、
0004302780.tif 000013
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は独自にメチル、エチル、直鎖または分枝C3-C9、フェニル、ベンゾイル、シアノ、ニトロ、ハロ、ホルミル、アセチル、および直鎖または分枝C3-C9アシルであり；a、b、c、d、およびeは独自に0、1、2、または3であり；X、Y、およびZは独自にNH、O、S、S（=O）、CO、（CO）O、O（CO）、NH（C=O）、または（C=O）NHであり；Wは独自にN、O、またはSである］からなる群から独自に選択された構造を持つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
分析法は溶液を通して拡散を可能にして、受容体に結合している間に固相担体から化合物を脱離することによって実施されて、前記受容体がそれぞれの固相担体の近接に配置されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３５】
a）ビーズの静的平面アレイまたは動的平面アレイを形成すること；及び
b）各ビーズの蛍光イメージを得ること；
によって、スペクトル蛍光データが収集されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項３６】
ビーズの平面アレイがサンドイッチ・フローセルの平面の壁に隣接して形成され、光制御動電法によって制御されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ビーズアレイのスペクトル蛍光データが、電極と電解質溶液との界面のビーズの空間的にコード化されたアレイを最初に形成することにより収集され、
a）電極と電解質溶液を備えること；
c）多重タイプの粒子を備えることであって、それぞれのタイプは複数の貯蔵器の１つに化学的または物理的に区別可能な粒子の特性に従って貯蔵され、各貯蔵器は前記電解質溶液に懸濁された複数の似た粒子を含むこと；
d）mxn格子配置の様式で前記貯蔵器を備えること；
e）貯蔵器の前記mxn格子に対応するmxnコンパートメントを定義するため前記電極をパターン化すること；
f）前記mxn貯蔵器から前記対応するmxnコンパートメントにmxn小滴を堆積させることであって、それぞれの前記小滴は１つの前記貯蔵器から由来して１つの前記mxnコンパートメントに閉じ込められるままになり、前記小滴それぞれが少なくとも１つの粒子を含むこと；
g）それぞれの前記小滴に同時に接触するため、先端電極を前記小滴上に配置すること；
h）前記先端電極と前記mxn小滴の間に電場を発生すること；
i）それぞれの前記mxnコンパートメントのビーズ・アレイを形成するために前記電場を使用して、各ビーズ・アレイが１つの前記mxn小滴の一つへ空間的限定されたままになること；
j）所定の光パターンで前記パターン化された電極で前記mxnコンパートメントを照射し、前記所定の光パターンとmxnコンパートメントのパターンに従って前記ビーズ・アレイの配置を維持すること；
k）１つの対応するmxnコンパートメントにそれぞれの前記mxnビーズ・アレイを維持している間、前記先端電極を前記電極により近く配置し、それによって前記mxn小滴を連続した液相に融合すること；
を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項３８】
前記コンパートメントが親水性であり、前記電極表面の残りは疎水性であることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般的に分析化学の分野に関するものである。
本発明は特に、多重試薬とセンサーの無作為配列（combinatorial）ライブラリー合成、超高スループット・スクリーニング、診断分析法への応用で、多重化合物を提示し調べる非常に平行なモードに関するものである。本発明は、コロイド性のビーズのような収集キャリヤー粒子を標識するためにいくつかの色別コードを導入する。加えて、本発明は多重色蛍光イメージ化と個々のビーズの分光分析によって、ビーズまたは収集ビーズをインシトゥ探索するための方法と装置について記載し、ビーズ固定された化合物の化学的同定を確かめる。簡単および拡大した簡単な色別コードと２進法および拡大した２進法色別コードによるビーズのコード化は、ビーズ・サイズとか形態またはビーズ・コアに埋め込まれた分極度などの他の物理化学的性状を測定することによって、拡大される。
発明の背景
１.固相化学ライブラリー
製薬および農業バイオテクノロジーのような関連産業における先導発見の出現パラダイムは、固相法「無作為配列」合成の新方法による新規な合成化合物ライブラリーの組み立てである。無作為配列化学とは液相またはビーズ状樹脂「ビーズ」の形の固相担体で多重化合物または混合化合物の平行合成またはテストのための１セットの戦略について言及する。一般に、N個の反応工程各々でM個の前駆体を使用する無作為配列合成は、M＾N個の化合物を作り出す。例えば、それぞれ４つのオリゴヌクレオチド前駆体を使用した無作為配列合成は、N個の工程で4＾N個のオリゴヌクレオチドを生産する;同様に、それぞれ20のアミノ酸前駆体を使ったN個の工程の無作為配列合成は、20＾N個のオリゴペプチドを生産する。
1.1-1 ビーズ/1化合物化学ライブラリー
非常に大きい化学ライブラリーを造り出すのに適当な無作為配列合成を実施するのは、ビーズ状樹脂「ビーズ」の形態の固相担体に依存し、「分割、連結および再結合」（DCR）戦略（図１）で反応工程をコード化し、この方法は、また、「樹脂分割」合成と呼ばれる。生成した「１ビーズ/1化合物」化学ライブラリーは、10＾6から10＾8数までの化合物を含む。これらのライブラリーは、さまざまな化学的且つ生化学な分析法を実施することによってスクリーンされ、陽性の反応を引き出す個々の化合物が同定される。直接分析によってそのような化合物の化学同定がなされる。
直接的分析の２つの方法は、マイクロ配列決定と質量分析である。両方法は興味がある化合物を表示する合成ビーズの物理的単離を必要とし、ともに数十から数百ピコモルというかなりの量の化合物に基づくオフライン化学分析を必要とする。オリゴペプチドとオリゴヌクレオチドのライブラリーに制限されるマイクロ配列決定は、立体異性体を区別しない。質量分析は等質量の前駆体、例えばDとLアミノ酸またはロイシンとイソロイシンを区別することができない。サンプルと試薬の必要な容量を減少させて、スループットを高めるために小型化された環境における、化合物ライブラリーの高いスループット・スクリーニングを実施するのがますます望ましい中でさえ、かなりの量の化合物の直接化学分析という必要条件は、それぞれの化合物のピコモル量の回収を確実にするために、大きいビーズ樹脂（典型的なビーズ直径は130μm）の使用を必要とする。
1.2-コード化された１ビーズ/1成分化学ライブラリー
標準の１ビーズ/1化合物化学ライブラリーの重大な限界を克服することへの１つのアプローチは、化合物を同定コード化することである。これはマイクロ配列決定または質量分析直接測定に向かない化合物の同定を容易にする。１つのコード化法はペプチドとオリゴヌクレオチド同時合成を使用し、配列決定不可能な合成産物の同定を表現することを採用する（Nikolaiev et al.,″Peptide-Encoding for Structure Determination of Non-Sequenceable Polymers Within Libraries Synthesized and Tested on Solid-Phase Supports″（「固相担体で合成且つテストされたライブラリー内での配列決定不可能なポリマーの構造決定のためのペプチドコード化」）Peptides Res.6,161（1993）（この内容は参考としてここに含まれる）。２番目の、より広範囲な化学反応状態に適合する方法は、１セットの標識（tag）分子を使い、ビーズの反応履歴を記録する。
後者の方法の１つの実施法では、１セットの前合成されたクロマトグラフィーで区別可能な分子標識TI、T2、...、TMを使用し、化学的２進法コードを作成する。従来技術の中では、分子標識はそれらの独特のガス・クロマトグラフ保持時間（Still et al.,″Complex combinatorial libraries encoded with tages,（「標識でコード化された複雑な無作為配列ライブラリー」）、米国特許番号5,565,324、この内容は参考としてここに含まれる。）によって同定することができる構造的に関連した分子（図２）である。
DCR合成の各工程では、セットからのユニークな標識がそれぞれの分割されたアリコートに加えられ、そのアリコートによって行われる反応を記録する。この概念を、工程１で試薬R11、R12、とR13および工程２でR21、R22とR23を使用して９個の産物を製造する２工程合成の工程を調べることによって、例証する。２進法のアドレス01（R11）、10（R12）、と11（R13）によって第一工程の試薬がユニークに同定され、第２工程の試薬が２進法のアドレス01（R21）、10（R22）と11（R23）によってユニークに同定される。それぞれの２進法アドレスは、１セットの分子標識用語で化学的に表現される:TI（R11を表す工程１のOl）、T2（R12を表す工程１の10）およびT2TI（R13を表す工程１の11）、そして類似してT3（R21を表す工程２の01）、T4（R22を表す工程２の10）およびT4T3（R23を表す工程２の11）となる。
反応工程の順序は、単に２進法のアドレスを連結することによって、記録される。したがって、右より左へ読んで11.01は「工程２の試薬R23、工程Ｉの試薬R11」を示す。この順序の化学表現はT4T3.TIであり、この特定のセットの標識のビーズの上での存在によってビーズ固定された合成産物の化学同定が示される。この戦略は容易により大きい反応に一般化される。例えば、それぞれの反応工程で使用される７試薬を２進法のアドレス001（R11）、010（R12）、...、111（R17）でユニークに同定することができる。コード化されていない１ビーズ/1化合物方法よりも優れているが、それにもかかわらず、従来技術による標識法戦略にはまだ３つの制限がある。まず最初に興味がある個々のビーズを残りから物理的に単離しなければならない；次に分子標識を化学的または光化学的にビーズから解離しなければならないし、解離した標識を回収しなければならない。最終的には、化学分析（例えば、ガスクロマトグラフィー）を実施しなければならない。これら多数の時間労働集約的な操作は、DCR合成戦略によって獲得されるスループットの向上の多くを排除する。
1.3スクリーニングとリード化合物最適化
典型的な生物学的基質-標的相互作用の高い特異性のため、ライブラリーにおける大多数の化合物がどんな特定の標的に対しても不活性であることを示唆する。したがって、スクリーニングの作業は、ライブラリーの中で結合活性か機能分析法で活性を表示するほんのわずかな化合物を同定することである。一般の標的は核酸と同様酵素と受容体を含む。
実際には10＾4から10＾8化合物を含む合成化合物の全体のライブラリーの迅速なスクリーニングと記録を行うためには、その作業を実施可能な時間枠の中で完成するならば、系統的なスクリーニング法を必要とする。いくつかの分析法形式が、ビーズ・ベースの無作為配列ライブラリーのスクリーニングを実施するために記載されている。これには次のものが含まれる：重力で沈ませる収集されたビーズの反応、これは酵素またはフルオロホアで標識（label）された標的分子と共に視覚検出される（Lam et al.,″A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity″、Nature 354（1991）、この内容は参考としてここに含まれる）;放射性標識された標的分子を持つビーズのインキュベーションとその後のビーズのアガロース固定とオートラジオグラフィー検出（Kassarjian、Schellenberger and Turck,″Screening of Synthetic Peptide Libraries with Radio-labeled Acceptor Molecules″,Peptide Res.6,129（1993）、この内容は参考としてここに含まれる）;液相テストのためのビーズからの化合物の部分的解離（Salmonら、″Discovery of biochemically active peptides in random libraries:Solution-phase testing after staged orthogonal release from resin beads″,Proc.NatI.Acad.Sc.USA 90,11708（1993）、この内容は参考としてここに含まれる）
WO95/32425はフルオロホアで標識されたビーズの組合せ（combinational）ライブラリーをコード化する方法を使用して組合せライブラリーを調製する方法を提供する。この方法によると、最初の組合せライブラリーは、コード化された最初の登録（すなわち、合成順序の工程）を可能にするため標識したビーズに１セットの反応を行うことによって、調製される。同様の反応工程を使用して２番目の組合せライブラリーを調製するが、標識されたビーズは最初の反応順序の前に結合分離され、ビーズは２番目の反応順序の前に分類される。ソーティング・工程がそれぞれのその後のライブラリーにおける異なった登録の前に行われるのを除いて、その後のライブラリーは２番目のライブラリーのように調製される。したがって、WO95/32425は、ビーズの第一工程と物理的分離を個別的に標識し、それぞれの変更された組合せライブラリーを同定することのみを教える。
Nederlofら、Cytometry、13、839-845（1992）は以前に使用された７以上同時に検出可能なプローブの数を増加させる方法として比率標識化（ratio labeling）の使用を教える。このアプローチでは、比率標識されたプローブは使用された特定の色のみでなく色の強度の比率に基づいて同定される。蛍光比は追加コード化色として測定され、使用される。この方法では、標識の異なった比率を使用してプローブの二重標識化を必要とする。この方法は合成組合せライブラリーに特異的に意図されていない。したがって、Nederlof法の分野はインシトゥ（in situ）ハイブリッド形成による多重DNA/RNA配列の検出であり、合成化学ライブラリーのコード化の分野には関連しない。
Speiche、Ballard and Ward、Nature Genetics、12、368（1996）は、多重蛍光インシトゥハイブリッド形成を使用して複雑な染色体核型を特徴付ける方法を記載した。Nederlofのように比率二重標識化を使用する代わりに、Speicheらは光度測定の反応範囲を横切って広がったスペクトル放出ピークを持つ６の蛍光染料セットを使用して、27の組み合わせで標識したプローブを視覚化した。Speicheらは合成組合せライブラリーをコード化する方法を記載しない。
Still et al.（Proc.Nat’l Acad.Sci.、90、10922-926（1993））は、異なった電導性標識に基づく２進法コードを使用して、標識した組合せライブラリーの合成法を記載する。この方法は光開裂する分子標識の使用を必要とし、この分子標識は可変長の脂肪族炭化水素鎖を通して連接する各種置換されたアリール官能基を含み、開裂すると標識は電気化学検出を持つ毛細管ガスクロマトグラフィーで明瞭に分析できる。色別検出はこの方法で使用されない。また、この方法は、配列分析するために固相担体からの開裂を必要とする。関連する仕事では、Still et al.の米国特許5,721,099はコード化された無作為配列ライブラリーを準備する方法を記載するが、再びこの方法はコード化された反応履歴分析の前に同定標識の開裂を必要とする。対照的に、本発明はコード化された無作為配列ライブラリーの探索にインシトゥアプローチを提供し、ライブラリー・コード化の以前の方法に対する利点を有する。雑音に対してスペクトル信号を消散する種々雑多なメディアで実施される分光分析に期待される分散現象のため、フルオロホア標識の相対的に豊富な情報を精密に検出することに伴う実用的な困難をもたらす以前のアプローチから見て、本発明の成功は予期されない。本方法論は、インシトゥコード化と無作為配列ライブラリーの探索の実施の際に、これらの実用的な問題を解決する方法を初めて示す。
II--多重薬剤モニターと診断学
診断パネルは、多重の化学を表示し、多重薬剤の存在に備えて未知の解決策をスクリーンする。例えば、血液型特異性は、パネルでの配置がそれらの抗原特異性を反映する表面結合した抗体のパネルに未知の血液サンプルをスポットすることによって、決定される。パネルのいずれかの特異的なパッチと抗原結合すると、抗原の化学同定を明らかにして、その血液型を増強する。空間的コード化されたパネルまたはアレイに多重診断プローブを表示する同じ概念の別の現実化は、チェッカー盤パターン内の平面基質において既知の位置に配置された多数の候補マッチング鎖の１つとのDNAハイブリッド形成測定によって行われる変異のスクリーニングである。これは異なったプローブを含む小滴を分配することによって行われる場合もあるし、または異なった構成のオリゴヌクレオチド鎖のインシトゥ合成に係る場合もある。
空間的コード化は、化学的同定を保持する、パネルまたはアレイ製作過程、添加時間及び費用に依存する。チェッカー盤使用のフィールドの数が増加するに従って、必要なアレイを作るチャレンジも増加する。さらに、通常、プローブは平面基質の表面へ付着固定され、空間的コード化計画の保全を維持しなければならない。実際には、この分析法形式は問題が多い場合がある：サンプル蓄積が遅く、プローブへのアクセスが制限される場合がある。
III-多重色蛍光演出の現在の応用
本発明は多重色蛍光イメージ化と分光分析を使用して、ビーズ・ベースの無作為配列ライブラリーのインシトゥ探索および逆応答の方法および装置を記載する。DNA塩基配列決定と染色体ペインティングへの多重色蛍光分光学の最近の応用により、蛍光強度比測定などの従来の応用で遭遇する必要条件を超える感度と波長選択性を必要となる。
DNA塩基配列決定の状況の中で、４色蛍光の迅速検出のためのさまざまな配置が記載されている。これらには次のものが関係している：それぞれの放出波長専用光電子増倍管検知器を持ち、これに対応するセットのビーム・スプリッターが光路にあり、空間的に別個なビームを発生するもの；複合記録モードで要求波長セットを選択する単一検出器および回転式フィルター歯車；またはプリズムまたは波長に応じて多重フルオロホアから発する光を分割する回折格子に依存する分散的配置、これではチャージ・カップルド・デバイス（CCD）の最近の進歩を利用して、スペクトルを長方形のCCDアレイ線統合に記録する。（Kargeret al.,″Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillary electrophesis″、Nucl.Acids Res.19、4955（1991）、その内容は参考としてここに含まれる。）
発明の概要
本発明はビーズまたは同等な物（「ビーズ」）の群の構成物を独自に標識し、ビーズの化学的同定を保持し、その結果、ビーズに結合した化合物同定を保持する目的のためにいくつかの色別コードを構成する方法を提供する。これらの色別コードは１セットの区別可能な波長、励起状態寿命と強度レベルを持つコード化フルオロホアに基づき、後者は染料の量を調整することによって制御される。特に、本発明は卓越した、ビーズ・ベースの化学のセットのコード化とインシトゥでの探索のための方法と装置を記載する。
２進法と拡張した２進法の色別コードは、大きなコード能を提供し、ここで例証考察されたように、無作為配列化学ライブラリーの分割-連結-再結合（DCR）合成戦略で遭遇する多段階反応履歴をコード化するための一般的な戦略を供する。
簡単および拡張した簡単な色別コードは、多重薬剤診断および環境試験および他の生化学分析法を含む生化学分析における多重標的またはプローブを表示するパネルの典型である卓越した化学のより小さなセットをコード化する効率的な戦略を提供する。
すべての色別コードは、形とサイズや分極度などのビーズ・コアと関連する他の適当な物理化学的パラメーターなどのビーズの区別可能な特徴を変えることによって、増大させることができる。
どんな特異的なビーズに固定された化合物の同定も、ここに記載されたように個々のビーズの色別コードを光学的に読むことによって、インシトゥで決定される。これによって物理的分離およびオフライン化学分析の必要なく、ビーズに固定された化合物の同定を確実にする。
本発明のコード化戦略は、これまでに記載されたビーズ・ベースの無作為配列合成とスクリーニングのすべての形式と適合する。小型化およびスクリーニングと解読オペレーションの自動化を可能にする利点を持った好ましい実施方法は、平面電極表面に隣接して形成され、維持され、操作される平面ビーズ・アレイに依存する。
【図面の簡単な説明】
上記の簡潔な説明で考察された発明の他の目的、特徴および利点が、実施態様の以下の詳細な説明と共に受け取られると、より明確に理解されるが、これら実施態様は例解に役立つものとしてのみ理解され、添付の図面はその実施態様の一態様を反映し、その中で
図１は「分割-カップル-再結合」無作為配列合成を例示する；
図２は化学標識（「バーコード」）で個々の合成ビーズを標識することを例示する；
また、そのような標識に使用される分子構造例を示し：異なった標識はnとArを変えることによって作られる；
図３はフルオロホアまたは発色団標識（F）を合成ビーズに配置する２つの代替の方法を例示する；
図４はフルオロホアY、B、G、とRを使用した２進法色別コード化を例示する。この例は工程１で試薬R11、R12、R13、とR14を使用し、工程２で試薬R21、R22、R23、とR24（表Iを参照）を使用して無作為配列ペプチド合成で造り出されたコード化されたビーズ群を列挙する；
図５はスペクトル特性が図面を伴う表にまとめられた市販の蛍光染料のCyDye群の放射スペクトルを例示する（Amersham LIFE SCIENCE,Catalog of Multicolor Fluorescent Reagents/多重色蛍光試薬のカタログ,1995,その内容は参考としてここに含まれる）；
図６は簡単な色別コードSCC（l=1、m=5）に従ってコード化された無作為ビーズ・アレイを例示する；
図７は分散光学に基づく統合分光分析での多重色蛍光顕微鏡像を示す;
図８は多重色蛍光イメージ化と分光法のいくつかの幾何形状を例示する。
図９はその表面にヒドロキシ官能基を持つ固相担体の例を例示し、これはリンカーによって修飾され、このリンカーは本発明に従ってMmt保護基の脱保護とその後の蛍光染料の活性化エステルとの反応を伴う多段階の過程で形成される。
好ましい実施態様の詳細な説明
色別コードの実施
本発明の色別コード化戦略は、そのビーズ上の化合物の化学同定を独自にコード化するために、１セットのフルオロホア（より一般には発色団）を各ビーズに配置する方法を提供する。特に、DCR無作為配列合成の間のそれぞれのカップリング工程の間、１つ以上のフルオロホアが各ビーズに取り付けられる。解読はインシトゥ光学探索による興味あるビーズにおけるフルオロホアの相対量の測定に基づく。
２つの方法でフルオロホアを加えることができる。最初の方法では、フルオロホアは直接初期の化合物のわずかな部分に加えられ、その結果、初期の化合物（図3A）のその部分のそれ以上の合成を停止する。２番目の方法では、標識は初期の化合物以外の予定された反応位置に共有結合で付加され、前駆体が標識によって停止されないことを確かめる（Fig.3B）。最初の方法と２番目の方法の殆どの実施では、各ビーズに加えられるフルオロホアの量xは初期の化合物に関して殆ど化学量論的で、xは典型的にはビーズ上の初期の化合物の0.001から0.1モル等量範囲である。３つの要素がxの選択を支配する。まず最初に、ビーズの上の標識の密度は、物質的に合成とその後のスクリーニング分析法を妨害してはいけない。２番目に、ビーズの上の標識の密度は十分低いままで残存し、蛍光エネルギー転移による複雑化を避けなければならない。３番目に、標識された部位はここで考察したように信号検出と区別の必要条件を満たす十分な数が存在しなければならない。
色別コード化戦略を実施するために、本発明はフルオロホアの３つの性状を利用し、フルオロホア標識のアルファベット、すなわち、放射波長、励起状態寿命および放射強度を構成する。フルオロホアの相対量（例えば、x、2x、3x等）を調節することにより制御されて、ｍFで区別可能な放射極大及び／または励起状態寿命を持つ利用できるフルオロホアの数を表示し、ｍIで区別可能な強度レベルの数を表示し、フルオロホア標識のアルファベットのサイズはm=mF*mIである。標識されたビーズの表面は、異なったフルオロホアの複合性を表示する（図４を参照）。これらの多重色ビーズのインシトゥ光学探索は、ここで考察例示されたように、フルオロホアの相対量が測定され、色別コードを解読するための放射スペクトルを記録するのに用いられる。
２進法色別コード
このコードの１つの表現は、すべてがmI=1でmFフルオロホアを使用する２進法の色別コード（BCC）である。このBCCは異なった化合物を2＾mFまでコード化する。このBCCでは、mIフルオロホアは励起状態寿命、放射極大または両方において異なる場合もある。便宜をはかって、以下の特異的な例はそれらの放射極大（「色」）においてのみ異なるフルオロホアを使用する。それぞれ１セットN=4試薬を使用して、２段階反応工程での16個の産物の無作為配列合成は以下の通りにコード化される:
0004302780.tif 000002
４個の試薬の２進法の表現は工程１の試薬に対してR1（00）、R12（01）、R13（10）とR14（11）で、工程２の試薬は、R21（00）、R22（01）、R23（10）およびR24（l1）である。前と同様、反応工程の順序は連結された２進法コードに対応していて、例では、すべての4＾2=16の可能な順序が４つのビット列によって表現される。その結果、順序:「工程２の試薬R23、工程１の試薬R14」は、列10.11（右から左へ読む）で表現される。４つのフルオロホアのアルファベットを使用して、色を前と同様R、G、B、およびYによって表示し、４ビット列を表すために割り当てられ（Y、B、G、R）、2＾4の可能な列（右から左へ読む）は、表Iと図４で表示されるようにBCC（m=4）でコード化される。
色別コードの２番目の表現は、相対量の異なり、その結果各工程で強度の異なるmFフルオロホアを使用する２進法の色別コードである。結果として起こる拡張した２進法色別コード（XBCC）が、2＾（mF*mI）の異なった化合物をコード化する。例えば、４つのビット列を表すのに２つの異なった色だけのアルファベット（2G、2R、G、R）を使用して、2＾4の可能な列（右から左へ読む）は表IIで列挙されるようにXBCC（mF=2、mI=2）でコード化される。この例では、非回旋化はそれぞれの２つの放射バンドに対して４つの異なった強度レベルの区別を必要とする。N工程が係る場合、拡張した２進法の色別コードXBCC（mF、mI）で区別される強度レベルの数はN*mIくらい高くなる場合もある。達成できる強度区別は結局、個々のビーズの分光分析で達成できるシグナル−雑音比によって制限される。
0004302780.tif 000003
もう１つの例は第１工程で７試薬、最後の各２工程で６試薬を使用した無作為配列合成で作成された産物の色別コード化を記載する。試薬は２進法のアドレスR1（001）、R2（010）、R3（011）...、R7（111）によって表示される；記法の簡略化のために、異なった工程で使用される試薬（R）の上付き文字を省略する。
mF=4（前と同様に表示される色）およびmI=2とする。８文字アルファベット（2Y、2B、2G、2R、Y、B、O、R）に基き、表IIIで例解される以下のXBCCは、この合成で作られた7*6*6=252合成産物をコード化するために工夫され得る。XBCCの構築が３つのビット列のすべての可能な連結によって作成された8＾3=512=2＾9配列の完全なセットを表すために９つのビット列を必要とする一方、事実上、この例で必要とされる252の配列は、この例で示されたような置換をすることによって2∧8の可能な８ビット列で収容できる。このようにして反応順序「工程３の試薬６、工程２の試薬１、工程１の試薬３」は以下のように（右から左へ読む）XBCC（mF=4、mI=2）によって表される：R6.Rl.R3=2X2B.N.G=2G2RY.N.G、その結果、GGGRRYに対応する。
0004302780.tif 000004
簡単な色別コード
多重工程無作為配列合成で反応履歴をコード化する複雑な作業と比べて、多くの応用は限られたセットの化学的のみの区別を必要とする。この目的のために、簡単な色別コード（SCC）を構築することができる。対応する２進法の色別コードのコード化容量には匹敵しないが、興味がある化学的識別が１個の診断プローブのビーズへのカップリングのように単一反応工程で作成される多くの例では、これらの色別コードは全く適当である。そのような限られた化学的複雑さの例は、多重薬剤のモニターと診断学と同様のセンシング応用を含む。
２進法の色別コードのように、簡単な色別コードの構築は、利用可能なフルオロホアの区別可能な波長、寿命および強度を利用する。合計ｍフルオロホアに基づくSSCの一般的な変形は、同量のIフルオロホアを使用して構築され、1≦1≦mであるそれぞれ興味がある異なった化学種をコード化する。このコードでは、色別の可能な組み合わせセットがmの貯蔵、S_R（1、m）−（m-1-l）!/l!（m-l）!、からの置換によって取られたｌのサイズのサンプルの可能な配列数、S_r（1、m）、に同等である。置換は各列において１色の多重例を可能にする。
例えば、４種類の異なったフルオロホア（m=4）が利用可能で、3（l=3）つの組み合わせが同じ相対量で各異なった興味のある化学種に対し使用された場合、一般化されたSCCは合計20の異なった配列を提供する。これらは４色アルファベットにおける色をR、G、BおよびYによって表示して、表IVに記載されている。したがって、SCC（l=3、m=4）は担体ビーズと最大20の異なった抗体をカップリングする単一工程で産生する産物を独自にコード化する；それぞれ20の反応容器は表IVに記載されたセットに応じて３つのフルオロホアの混合物を受け入れる。いくつかの既知のフルオロホアの存在は、同時計数法を実施する基礎を提供し、弱い信号を検出しモニターし、分析感度を高める。
0004302780.tif 000005
フルオロホアの相対量を変えて、アルファベットにおける各フルオロホア種に対して１セットの区別可能な強度レベルを作成することにより、拡張した簡単な色別コード（XSCC）を構築することができる。XBCCのように、XSCCはアルファベットにおけるそれぞれのmFフルオロホア種に対するmI強度レベルの制御を可能にする。
SCCとXSCCの特別なケースであるl=1の場合は、実現するのが特に容易である；この場合、ただ単一なフルオロホアが興味のある各化学種をマークする。
一層の増進
以前にここで考察したすべての色別コードを、ビーズの物理化学的パラメーターを変えることによって、さらに増大することができる。例えば、コード化された配列の数は、各々１セットのビーズに取り付けられる。ビーズの個々の形状、平均サイズ、分極能または他の物理化学的性状が十分異なり区別可能である。Sの異なったセットのビーズを使用して、XBCC（m）で表されるコード化された配列の数は、S*2∧mに増加する。
BCCとXBCCは、各ビーズにカップルされたフルオロホアの相対量に関して化合物の同定をコード化する。従って、同じ相対量となるので、フルオロホア標識の列のすべての順列が同等である。しかしながら、標識化が化合物停止（図3Aを参照）に至る色別コードの実施が、また、異なった色別標識が各ビーズ加えられた順序の記録を保持することが我々の注意を引いた。その結果、標識化合物の分子量の分析によって、標識化が起こった順序が明らかになる。
拡張２進法色別コードの化学的実現
化学的色別コードの実現は、最少限度重なっている吸収と放射スペクトルを持つ化学的に活性化されたフルオロホアのセット（「アルファベット」）に依存する。我々はここで拡張２進法色別コードのケースについて考察する；他のコードは類似の様式で実現されうる。本発明に従って、色別コードの実施は特異的な群のフルオロホアを通してここで例解されるが、この方法は特有のスペクトル特性がここで記載される標識のアルファベットを構築するのに役立つ他のフルオロホアと発色団による実施にも同等に適している。６色の適当なアルファベットの例は、図５で記載されているインドシアニン染料のCyDye（TM）群によって提供される。
この例の合成工程は以下の通りである（標準のFmoc主要鎖保護化学を使用して（AthertonおよびSheppard、”Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach”「固相ペプチド合成：実践アプローチ」IRL Press at Oxford University Press,Oxford,1989,その内容は参考としてここに含まれる））。
0004302780.tif 000006
この手順は異なった染料の間の蛍光エネルギー転移を避ける。まず、ここに記載されるようにどんなアミノ酸配列の標識化も不活性化するので、その配列を停止する。この結果、単一の染料だけがどんな配列にも組み入れられて、配列内エネルギー転移は避けられる。２番目に、樹脂表面（上記工程３を参照）に固定される染料の低密度のため、標識されたアミノ酸配列の間の側部の距離が列間蛍光エネルギー転移に関係するフォースター半径を実質的に超えることを確実にする。これは固相合成における、良く知られた現象である「疑似希釈」の発現である。
表Vの手順の実施可能性は、標準組み合わせ合成ビーズ樹脂を標識することによって、示された。（NovaSyn TG amino resin,NovaBiochem、”Combinatorial Chemistry”Catalog,San Diego,CA,1997,この内容は参考としてここに含まれる）。特異的に、我々は、個々の染料とCyDyeシリーズの多重染料を使用してXSCC（l=1,mF=1,mI=5）と同様SCC（l=1、m=6）を組み立てて、色が蛍光顕微鏡で0.0001モル比の低さで区別可能であることを示した。さらに、我々は、この染料カップリング化学が表Vで指定される蛋白質合成と適合性があることを示した。
本発明の方法はアミノ酸またはペプチド無作為配列ライブラリーの色別コード化を実現するのに使用され、その例は表VIに要約されている。適当なレポーター系はN末端アミノ酸配列Ntes-YGGFLのペプチド・エピトープに対して向けられる抗-β-エンドルフィンモノクローナル抗体（mAb）で、ここでYはチロシンを表示し；一次抗-β-エンドルフィンmAbの標的への結合はカスケード・ブルー標識された二次抗マウス抗体によって検出される（励起396nm、放射410nm）。
0004302780.tif 000007
本発明の方法はペプチドとペプチド前駆体を参考にして例解されているが、この方法はDCR無作為配列合成を通して造り出されたいかなる他の化学前駆体と化合物クラスでも同等に適用される（Calbiochem-NovaBiochem,”Solid Phase Organic Chemistry Handbook”,San Diego,CA,1997,この内容は参考としてここに含まれる）。
公開された方法によって準備される化合物は高血圧、炎症および無痛覚症の治療における治療薬剤として潜在的な用途を持っている。例えば、公開された方法によって選択されたエンケファリン・類似体は鎮痛薬として役に立つ。また、筋弛緩薬として役に立つベンゾジアゼピン系などの有機化合物は公開された方法によって選択されうる。
多重薬剤の診断学と環虜モニタリング
本発明の方法によって、同時に多重試薬または病原体をプローブする診断分析法とテストの新規な実施が可能になる。すべての従来技術における、診断パネルの空間的なコード化と対照的に、それぞれのカラーコードによって区別可能な多重ビーズ・タイプの無作為アセンブリを混ぜて、平行に扱うことができる。例えば、ビーズ・ベースの免疫診断分析法形式を実施するためにここで記載されるように色別コード化を利用することができ、特異的なビーズ固定された抗体の多重性を表示でき、各タイプは特異的色別コードに割り当てられ周囲の薬剤の多重性をモニターする。
多重薬剤診断分析法の好ましい実施では化学的にコード化されたビーズの無作為アレイを使用する（図６）。例えば、血液型の測定には単に５つの異なったビーズ・タイプだけが必要で、これはSCC（l=1、m=5）によって容易に扱われる作業である。診断テストと環境モニター装置のこの実現によって、スペクトル読み取りに依存した、小型化、多重テストの統合および自動化された操縦が容易になる。
インシトゥ探索および色別コード化されたビーズの解読
図７における光学配列によって２つの不可欠な能力の統合が提供される：個々のビーズの蛍光顕微鏡のイメージ化と多重色蛍光分析法。後者はビーズ表面に存在する数個のフルオロホアの相対量を測定するのに役立つ。
高開口数（H.A.=0.7）（702）の顕微鏡対物レンズの使用は、空間分解能と同様に収集効率を最大にするのに役立つ。図７の主要な追加部品は以下の通りである：励起迷光を拒絶する長いパス・フィルター（704）、視野レンズ（708）によって結像のためにビームを分離する二色性ビーム・スプリッター（706）、回折格子モノクロメータ（712）のスリット開口に光を（レンズ710で）集中させることを通して行い、または、代わりに（非提示）、回折格子モノクロメータに連結された光ファイバの入り口瞳孔でも行う分光分析、多重色スペクトルはCCDアレイ（714）によって記録される。無限修正された光学部分は、実施の利便性を提供する。
簡単な長いパス・フィルタが単一の波長で供給された励起迷光を拒絶するのにDNA塩基シークエンシング適用で使われている一方、干渉フィルタを設計して、ここで考察されたフルオロホアのCyDye群の特異的な放射波長で多重で狭い（10nm）パスーバンドを提供するようにできる。同様の制作技法は二色性鏡に適用されうる。これらの考慮は特に反射顕微鏡法に特有であるエピ蛍光幾何学に関連している。
個々の色別コード化されたビーズまたは収集された色別コード化されたビーズよりスペクトル情報を記録する適当な機器の現実化では、フローサイトメトリー解析と多重スペクトル・イメージ化がある。後者は図７で考察されるように顕微鏡か他のイメージ装置の視野の個々か多重ビーズからのスペクトル情報の収集を可能にする。
多重スペクトル・イメージ化に適当な方法は次のものを含む：多重波長の重ね合わせによる入射と放射光およびイルミネーションの異なった波長の多重送信とこれに続く回折格子またはプリズム（図７を参照）による分散的イメージ化または放射光干渉分析。
最初の方法は合った光学パス・バンド適合体を使用して容易に実現化される；これらはフィルター歯車に取り付けられて、顕微鏡の入射と放射光の通路に配置される。２つのフィルタ歯車の同調回転によって、合致した組の励起および放射フィルタ（また、反射幾何学は適当な二色性鏡を必要とする）が光路に挿入される、それによってフィルタ/鏡の組み合わせで選択されたそれぞれの異なった波長で繰り返しているシリーズのイメージを産生する。例えば、この原理はKairos Scientific（Santa Clara,CA）によって開発されたFluorescence Imaging MicroSpectrophotometer（蛍光イメージ化マイクロ分光光度計）で実現されている。
２番目の方法では、イルミネーションのための異なった波長は多重パス・バンド・フィルタ/鏡の組み合わせによって産生される；プリズムは出力経路に挿入される。この配置によって、顕微鏡の視野の長方形の部分に位置する多重ビーズの同時分光分析が、容易になる。この部分の中のビーズから放射された光は、プリズムの入口スリットにイメージ化されて、そのスペクトル・構成要素に分解される。この原理はLightForm（Belle Meade、NJ）によって開発されたPARISS Imaging Spectrometer付属器で実現されている。３番目の方法では、視野の全体からの光は干渉法で分析され：出力経路の薄膜ビームスプリッターによって、２つの（一貫性した）光線が発生され、その光線が鏡によって反射され再結合される。ビームスプリッターが回転すると、パス長の小さな違いが２つ光線間に導入され、この２ビームが再結合されるときに干渉縞となる。これらの縞が顕微鏡の視野から放出される光の中に含まれた全体のスペクトル情報を含んでいる（Garini et al.、Bioimaging 4、65-72（1996））。すなわち、ビームスプリッターが回転すると、連続スペクトルが視野中のあらゆる部位に対して生成され、データの立体的な表現となる。この原理はApplied Spectral Imaging（Carlsbad,CA）によって開発され、市販のSpectraCubeシステムにて実現化されている。最初の方法と対照的に、重なっている放射バンドのスペクトル分類を容易にして、２番目と３番目の方法は連続スペクトルを発生させる。
図８における配置によって、図8Aと8Bで各々例解されるように伝達と拒絶顕微鏡法で入射と放射光収集を空間的に切り離すことによってそれぞれ迷光を拒絶する際に追加的柔軟性が提供される。さらに、出力光経路の特別に設計された多重パス・バンド干渉フィルタの使用は、再びオプションである。
多重色蛍光検出システム感度に対する要求は、選択されたビーズ上に存在することが予想されるそれぞれの色のフルオロホアの数から派生する。半径Rで表面積A=4πR∧2のビーズは、N=A/a分子の分子領域aまたはN*=xNフルオロホアまで収容する。a=30Aと0.0l<x<0.lで、10μmの直径を持つビーズは
0004302780.tif 000008
フルオロホアを運べる。比較として、１モル%の蛍光アナログを含むリン脂質で構成され空気水界面へ閉じ込められた単分子膜の中の10μm直径の小さい円形の領域でのイメージ化は、同じぐらいの数のフルオロホアに基づき、容易にシリコン強化した標的（SIT）カメラ技術を使用して、達成される。水溶液中のビーズの屈折性状は、さらに全体のシステムの光収集効率を高める。
インシトゥ探索と色別コード化されたビーズ・アレイの解読
本発明がビーズの色別コード化の方法論を提供し、インシトゥ探索と色別コード化されたビーズ解読および多重色蛍光イメージ化と分光分析色によるビーズ収集のための方法と装置を記載する。この方法はここで考察されるようにこれまで記載されたすべてのビーズ分析法形式と適合する。
本発明の方法と装置に基づいたビーズ分析法の特に効率的な実現化を提供する好ましい形式は、平面のビーズ・アレイに関係する。この形式によってDNAまたはRNAハイブリッド形成と酵素活性、受容体-リガンド結合、抗体抗原認識の非常に平行なスクリーニングなどが容易になる。その結果、100μm直径を持つビーズが接近して詰められたアレイによって、1cm∧2だけの領域に10∧4ほどのビーズを保持することができ、単一のパスで10∧4化合物/cm∧2までの試験が可能である。化学同定の瞬時決定により、反復のスクリーニングの効率的な実施が可能になり、そこでそれぞれのビーズ・タイプの多重コピーが調べられ、プラスな分析点を産生する化合物の統計的に強力なランキングが確立される。その上、平面のビーズ・アレイ形式における、本発明の実施は自動化に適している。自動化されたオペレーションは平面ビーズ・アレイの準備に続いてアレイ蛍光イメージ化が行われ、分光分析とオンライン解読にかけられるビーズを見つけることである。単一のフルオロホアを検出するレベルで示される蛍光の本質的な検出感度は、合成ビーズのサイズを実質的に減少させるのを可能にする。これによって、その必要な量の合成化合物とスクリーニングの間に消費される試薬の量を減少させる付随の利益をもって、封じられたシステムの中での小型化と抑制が容易になる。
平面ビーズ・アレイを形成する１つの方法は、懸濁液からビーズが重力によって沈むことに依存して、（静的な）層のビーズかビーズ集団を平面基質上に配置することである。２番目の方法は平面表面に隣接して形成され、外部制御の下、インシトゥで操作される動的平面ビーズ・アレイを使う、例えばLight-controlled Eletrokinetic Assembly of Particles near Surfaces（表面近くの粒子の光線制御電気運動組立）（LEAPS）。LEAPSは水溶液中にシグナルで動的平面ビーズ・アレイを形成して、平面電極表面の指定地域でそれらを配置維持する能力を提供する技術で、この技術は1997年4月24日に出願されたPCT出願で同時に申請中で詳しく説明され、その題名は1996年4月25日に出版された米国暫定出願番号60/016、642に基づいて「Light Controlled Electrokinetic Assembly Particles near Surfaces」（表面近くの粒子の光線制御電気運動アセンブリ）でありここに参考として組み込まれている。
平面の動的ビーズ・アレイは、小型化され、抑制された環境における、自動化スクリーニング分析法の実現に追加利点を提供する。合成プールからのビーズの懸濁液は平面ビーズ・アレイがセルの平面壁に隣接して形成される「サンドイッチ」フローセルに積み込まれる;スクリーニング分析法は平面アレイ形式で実施され、時間がかかりエラーの多い工程である物理的分離を必要なく先導化合物を同定し;予定された分析法の完成に続いて、ビーズ・アレイは分解されて、ビーズの懸濁液は次のサイクルにフローセルを準備するため放出される。この例では、10の重複、（すなわち、同じタイプと色別コードのビーズの10部のコピーの存在）は一度にまだ1000個の化合物のスクリーニングを容易にするが、どんな薬理動態特性記載の質をもかなり高める。小型化の利点は小さい合成ビーズの使用によって高められる。化学的に、そして物理的によく明示された、必要なサイズ範囲（10μm直径）のビーズは多くの市販元から手に入る。それらは、LEAPSによって容易に操縦され、高密度の動的平面ビーズ・アレイを形成する。これは、スクリーニング分析法が多くのサンプルに非常に平行な形式で実施されることを確実にして、続いて潜在的な先導化合物の反復の高いスクリーニングと強力な薬理動態特性記載の基礎を提供する。
本発明はつぎの実験詳細からよりよく理解される。しかしながら、当業者は考察された特異的方法と結果がその後の特許請求の範囲で記載されるように単に発明の例示であることを容易に理解するであろう。
実施例１
1.色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア
a.色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェアの調製
（1）Cy2（ex=489nm、em=506nm）-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：50mgのNovaSyn TGアミノ・ミクロスフェア（NovaBiochem;130μ直径、15μmolアミン）は25℃で10mlのDMF中で30分間平衡化された。上清は濾過で取り除かれて、100μl DMF、1μl TEAおよび15μlの1mM Cy2-両官能基化NHS-エステル（Amersham;15nmol）はDMFに加えられた。反応混合物が25℃で１時間振盪され、2μl（20μmole）のn-ブチルアミンを加え、反応混合物は25℃でさらに30分間振盪された。上清が取り除かれ、ミクロスフェアは5mlのDMFで２度洗浄され、5mlのクロロホルムで２度すすがれて、真空で乾燥された。
（2）Cy3（ex=550nm,em=570nm）-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。平行反応で15μlの0.001、0.01、0.1、および1mMのCy3-単官能基化NHS-エステル（Amersham;0.15、1.5、および15nmol）が使用されて、n-ブチルアミン・工程は省略された。
（3）Cy3.5（ex=581nm、em=596nm）-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。15μlの1mMのCy3.5-単官能基化NHS-エステル（Amersham;15nmol）が使用されて、n-ブチルアミン・工程は省略された。
（4）Cy5（ex=649nm,em=670nm）-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。15μlの1mMのCy5-単官能基化NHS-エステル（Amersham;15nmol）が使用されて、n-ブチルアミン・工程は省略された。
（5）Cy5.5（ex=675nm,em=694nm）−色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。15μlの1mMのCy5.5-単官能基化NHS-エステル（Amersham;15nmol）が使用されて、n-ブチルアミン・工程は省略された。
（6）Cy7（ex=743nm、em=767nm）−色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。15μlの1mMのCy7-両官能基化NHS-エステル（Amersham;15nmol）が使用された。
（7）Cy3/Cy5-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア：
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。Cy3-単官能基化NHS-エステルおよびCy5-単官能基化NHS-エステルの両方が加えられ（15μlの1mMのストックそれぞれを加えた）、n-ブチルアミン・工程は省略された。
（8）Cy2/Cy3/Cy5/Cy7-色別コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェア:
次を除いてこの調製は（1）と同一であった。Cy2-両官能基化NHS-エステル、Cy3-単官能基化NHS-エステル、Cy5-単官能基化NHS-エステルおよびCy7-両官能基化NHS-エステルが加えられた（15μlの1mMのストックをそれぞれを加える）。
b.固相ペプチド合成状態でのCy3-コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェアの安定性。
Cy3-コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェアが、１サイクルの固相ペプチド合成にかけられた。100μlのDMF中で50mgのミクロスフェアと5mgのFmoc（Lys）Boc-OBT（94mgのFmoc（Lys）Boc-OH（NovaBiochem;0.2mmol）、48mgのDCC（Aldrich;0.22mmol）および27mgのHOBT（Aldrich;0.2mmol）を2mlのDMF中25℃で０．５時間反応させ、25℃で2000xgで５分間遠心分離し調製し、100μlの上清を使用した）を25℃で０．５時間振盪した。ミクロスフェアが濾過され、DMF中20%ピペリジン100μlに25℃で15分間懸濁し、5mlのCHCl3で２度洗浄後乾燥した。Cy3-コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェアのUV/VIS吸収と蛍光特性は不変であった。
c.色別コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェアの光学的性質
光学的性質が検査されたミクロスフェアは次のものを含む：
Cy3（ex=550nm,em=570nm）-色別コード化された４つの異なった強度レベルを持つPEG-ポリスチレン・ミクロスフェアであって、上記のa-（2）で記載されたようにビーズを0.001、0.01、0.1、および1mMのCy3と反応させて調製され、それぞれb3-000l,b3-00l,b3-01、およびb3-lと表示されるもの、;群として、すべてのCy3-コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェアはb3-xと表示される。
Cy5（ex=649nm,em=670nm）-色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェア、これらは上記の（2）に記載されたようにビーズをlmM Cy5と反応させて調製され、b5-lと表示される；
Cy3/Cy5-色別コード化PEG-ポリスチレン・ミクロスフェア、これらは上記セクションa-（2）に記載されたように、ビーズをlmM Cy3/Cy5と反応させて調製され、b35-1と表示される。
乾燥させたミクロスフェアのアリコートはDMFに懸濁され、シリコン５ウエハに分散された;DMFは温和な加熱によって蒸発させられた。その後の観測はすべて空気中で行われた。
（1）蛍光イメージ化
観測はエピ蛍光を備えるZeiss UEM顕微鏡で行われた;Cy3とCy5のために設計された励起フィルタ/２色性鏡/発行フィルタの組み合わせ（Chroma Technologies、Brattleboro、VT）は100Wハロゲンイルミネーター並びにl0X、25Xおよび40X倍率対物レンズの組み合わせで使用された。画像は任意に、SITカメラ（Cohu、San Diego、CA）で記録された。
すべてのミクロスフェアは粒子径の5%以下に対応する高い強度の明るい周辺「リング」を表示したが、これは各粒子で標識が主として内部よりむしろ表面に結合していることを示唆している。タイプb3-0001の最も薄暗い粒子でさえ、25X/0.45NA対物レンズとSITカメラを使用して容易に観察可能であった。予想された因子の10以下ではあるが、b3-000lタイプのミクロスフェアは、b3-00lタイプのミクロスフェアよりも薄暗かった。この現象は研究課題として残っているが、蛍光消光を示すかもしれない。どのCy3コード化ミクロスフェアのセットも個々の粒子の色の違いを示した：いくつかの粒子がオレンジに見えて、他のものは黄色に見え、タイプb5-1のものは明るい赤に見えた。
（2）蛍光スペクトル
色別コード化されたミクロスフェアのインシトゥ探索実施可能性を示すため、個々の色別コード化されたPEG-ポリスチレン・ミクロスフェアからの蛍光スペクトルがPARISSTMイメージ化分光計（LightForm、Belle Meade、NJによってプロトタイプが供給された）によって記録されたが、この装置は50μm幅の入口スリット、曲がったプリズム、チップにおいて統合可能な室温CCDアレイを備えている。この装置はZeiss UEM顕微鏡のカメラ・ポートに取り付けられた。この配置では、投影スリットの長い寸法に沿って並べられる多重ビーズをイメージ化し、スペクトル分析することができる。大体の波長補正だけが実施された。
蛍光強度を波長の関数として表示するスペクトルが、Cy3-およびCy5-コード化ミクロスフェアについて別々に得られ、以下のスペクトル特性を示した：
b3-x:スペクトルは、すべてのタイプの粒子で得られた；次のような特異的特性を含んでいた：
0004302780.tif 000009
スムージングにする独特なスペクトル特性が明らかになった;b3-l:S/N>10;
b5-l:非常に明確なスペクトルが記録され、すべてが高波長に向かって少し歪曲していた;b35-1:フィルタ歯車操縦をシミュレートするために適切なフィルタを切り換えて、どちらの標識でも非常に明確なスペクトルが記録された。この濃度では、スペクトル（b3-0lとb3-00lに使用されるものより10倍短い統合時間で、回取される）は、識別し得る雑音を全く示さなかった。
2.色別コード化されたマクロポーラス（大多孔性）・ポリスチレン・ミクロスフェア
a.色別コード化されたマクロポーラス・ポリスチレンミクロスフェアの調整
50mgのAmino-Biolinker-PM1-l000のアミノ・オリゴエチレン・グリコールで官能基化しているマクロポーラス・ポリスチレン・ミクロスフェア（Solid Phase Sciences;35μ直径、7μmolアミン）は25℃で20分間2mlのDMF中で平衡化された。上清は濾過で取り除かれて、100μlのDMF、1μlのTEA、および70μlの1mM Cy3-単官能基化NHS-エステル（Amersham;70μmol）が加えられた。25℃で１時間振盪後、上清が濾過で取り除かれて、ミクロスフェアは5mlのDMFで２度洗浄され、5mlのCHCI3で２度洗浄され、真空で乾燥された。
b.色別コード化されたマクロポーラス・ポリスチレン・ミクロスフェアの光学的性状
実施例１に記載された配置を使用して目視検査して、蛍光強度にビーズ間でかなりの差があることが明らかになった。
3.色別コード化固体ガラスミクロスフェア（「薄膜（pelicular）ミクロスフェア」）
a.色別コード化薄膜ミクロスフェアの調整
（1）エポキシドが官能基化している薄膜ミクロスフェア：
4gの固形ソーダライム・ガラス・ミクロスフェア（Duke Scientific;40±3μ直径;4.8x107ミクロスフェア）、7mlキシレン、2.34mlの3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Aldrich;1mmol）および0.117mlのジイソプロピルエチルアミン（Aldrich;0.7mmol）は、18時間80℃で振盪された。ミクロスフェアは室温に冷やしてから濾過されて、40mlのメタノールで洗浄され、40mlのジエチルエーテルによって洗浄されて、真空中で乾燥された。
（2）MMT-NH PEGが官能基化している薄膜ミクロスフェア:
（1）で得られたミクロスフェアは200mgのモノ-MMT-1,13-トリオキソデカジアミン［0.4mmol;7gのMMT-Cl（Aldrich;23mmol）と11.3mlの4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン（Aldrich;51mmol）を150mlの1:1:1メチレンクロリド:ピリジン:アセトニトリル中25℃で18時間混合し、次いでシリカ・ゲル・クロマトグラフィーで付加物を単離して調製された］の6mlのキシレン溶液に懸濁された。約10mgの水素化ナトリウム（Aldrich;0.4mmol）が加えられ、乾燥チューブ下で40℃18時間、この懸濁液が振盪された。
次に、ミクロスフェアは濾過され、連続して20mlのメタノール、10mlの水、20mlのメタノール、および20mlのクロロホルムで洗浄されて、真空乾燥された。乾燥したミクロスフェアは10mlのテトラヒドロフラン中、5%の無水酢酸、5%の2,6-ルチジン、8%のN-メチルイミダゾールと１時間25℃での振盪反応でキャップされ、連続して2x5mlメタノール、2x5mlクロロホルム、および2x5mlジエチルエーテルで洗浄され、真空乾燥された。
（3）H2N-PEGが官能基化している薄膜ミクロスフェア：
（2）で得られたミクロスフェアは、25℃でCH2CI2中の3%TFA 1mlにより０．５時間振盪しながら処理された。
放出されたモノメトキシ・トリチル陽イオン（∈478=3.47x104 M-1cm-1）の定量に基づいて、H2N-PEGの装填密度は以下の通りであった：
ミクロスフェアあたり15fmolのH2N-PEG
ミクロスフェアあたり1.1x1010分子のH2N-PEG
Å2あたり0.022分子のH2N-PEG
ソーダ・ライム・ガラスのÅ2あたり、利用可能なシラノール基を
0004302780.tif 000010
と仮定すると、移植効率は
0004302780.tif 000011
であった。
（4）色別コード化されたPEGが官能基化している薄膜ミクロスフェア：
20mgのH2N-PEG-官能基化された薄膜のミクロスフェア（4.2nmolアミン）に97μlのDMF、2μlのTEA、および0.8μlの1mM Cy3-単官能基化されたNHS-エステル（Amersham;0.8nmol）が加えられ、得られた懸濁液は25℃で18時間振盪された。次に、ミクロスフェアは濾過され、連続して5mlのDMF、5mlのメタノール、5mlのクロロホルム、および5mlのジエチルエーテルによって洗浄され、真空乾燥された。
消費されたCy3-単官能基化されたNHS-エステル（∈552=l.5x105 M-1cm-1）の定量に基づくと、Cy3密度の装填は以下の通りであった：
ミクロスフェアあたり1fmolのCy3
ミクロスフェアあたり6x108分子のCy3
Å2あたり0.001分子のCy3
利用可能なH2N-PEG分子あたり0.07分子のCy3
b.Cy3-コード化された、PEGが官能基化されている薄膜ミクロスフェアの光学的性状：
実施例１で記載された配置を使用した目視検査によって、ミクロスフェアが一様に蛍光を発することが分かった。
【図１】
0004302780.tif 000014
【図２Ａ】
0004302780.tif 000015
【図２Ｂ】
0004302780.tif 000016
【図２Ｃ】
0004302780.tif 000017
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
0004302780.tif 000023
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
0004302780.tif 000026
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
0004302780.tif 000031