(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳毒素産生に欠陥がある百日咳菌(Bordetella pertussis)菌株であって、百日咳毒素をコードする遺伝子が除去されたことにより、百日咳毒素を産生せず、百日咳（Bordetella pertussis）繊維状赤血球凝集素(FHA)および当該百日咳FHAに対する異種タンパク質を含むハイブリッドタンパク質を発現する百日咳菌(Bordetella pertussis)菌株。
【請求項２】
異種タンパク質が上部または下部気道の疾病により発現され易いタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
異種タンパク質が粘膜感染によって病原体に発現され易いタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
異種タンパク質が全身感染によって病原体に発現され易いタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項５】
コレクシオン・ナショナル・ド・クルチュール・ド・ミクロオルガニスムス・ド・アンスティテュ・パストゥール(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur(CNCM))に1996年10月８日に番号I-1770で寄託された菌株であることを特徴とする、請求項１に記載の菌株BPNX。
【請求項６】
ａ）百日咳（Bordetella pertussis）繊維状赤血球凝集素(FHA)および当該百日咳FHAに対する異種タンパク質を含むハイブリッドタンパク質をコードする組換えＤＮＡをBordetella pertussis株のゲノムに導入する工程；及び
ｂ）工程ａ）により得られたハイブリッドタンパク質を発現するBordetella pertussis株のゲノムからBordetella pertussis毒素をコードする遺伝子を除去する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の菌株を得る方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の菌株又は請求項６に記載の方法により得られた菌株を含む薬剤またはワクチン。
【請求項８】
薬理学的有効量の請求項１〜５のいずれか１つに記載の又は請求項６に記載の方法により得られた菌株および必要に応じて１種以上の薬学的相溶性賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項９】
上部または下部気道疾患を治療する薬剤またはワクチンを製造するための、請求項１〜５のいずれか１つに記載の又は請求項６に記載の方法により得られた菌株の使用。
【請求項１０】
粘膜感染を治療する薬剤またはワクチンを製造するための、請求項１〜５のいずれか１つに記載の又は請求項６に記載の方法により得られた菌株の使用。
【請求項１１】
全身感染を治療する薬剤またはワクチンを製造するための、請求項１〜５のいずれか１つに記載の又は請求項６に記載の方法により得られた菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、毒素産生に欠陥があり、ハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ属(Bordetella)株に関する。
それは、少なくとも１種の異種タンパク質およびFHA(繊維状赤血球凝集素)タンパク質の少なくとも一部を含むリポソームにも関する。
それは、特にワクチンとしての、その免疫予防的および／または治療的な使用にも関する。
本発明の他の目的は、免疫応答を刺激するためのFHAの使用である。
百日咳(pertussis)は、その最も関連ある媒体がグラム陰性細菌Bordetella pertussis(百日咳菌)であり、世界中で流行している感染症である。５千万件以上の症例が、毎年報告され、推定死亡数は年に500 000件であり、殆ど幼児である。死亡率は、例えば、開発途上国で高く、それらの国ではワクチン接種は十分でなく、百日咳は幼児死亡率の主要な原因の１つとなっている。化学的または熱的に不活化されたB. pertussisからなる細胞性ワクチンの出現は、百日咳発生の顕著な減少を導いた。しかしながら、それらの使用に関連する制限が、最近２０年間に出現した。こうして、様々な報告が、百日咳に対する細胞性ワクチン投与と幾つかの重篤な副作用との間の関連性の仮説を押し進めた。
さらに、最大防御を得るために様々なワクチン用量を投与する必要性、異なるバッチのワクチンの有効性の多様性、および後期再ワクチン接種しないワクチン後免疫の持続期間中のワクチン後免疫の減弱による成人における疾病の再発は、細胞性ワクチンの開発をもたらした多くの不都合である。しかしながら、一般に、細胞性ワクチンよりもより有効で、より安全で、より免疫原性であると明示されている、それらの新世代ワクチンを含む防御抗原は、いまだ明確に明示されておらず、複数回の注射が今でも必要とされる。さらに、子供の防御との血清学的相関関係は、いまだ決定されていない。最後に、これらのワクチンの産生コストは、以前のものより高価であることが見い出され、それは最も必要としている開発途上国にとって重要な問題となっている。
他方、B. pertussisによる自然感染は長期防御をもたらすが、ワクチン接種で誘導されたものは、限定された時間を有することが示された(Bass, J.W.ら、1987 Pediatr. Infect. Dis. J. 6:141-144; Jenkinson, D. 1988, Br. Med. J. 296:612-614)。この差異の理由は明らかでなく、それぞれの症例に関連する免疫化メカニズムに関連する知識の欠如を示す。可能性のある説明の１つは、非経口的免疫後に得られるものと比較して、感染後の気道での免疫学的記憶のより優れた誘導に基づいている。さらに、防御免疫に重要な役割を果たし得たTh1-タイプ細胞応答性Tは、自然感染で誘導されるが、細胞性ワクチンによる免疫化は、かなり強い応答性Th2を示す(Mills, K.H.G.ら、1983, J. Med. Microbiol. 39:163-164)。最後に、感染は、血清および分泌物においてB. pertussis抗原に対するIgA産生を刺激するが、これらの抗体は、ワクチン接種された個体において頻繁には検出されない(Shahin, R.ら、1992, J.E.Ciardiら編Genetically Engineered Vaccines, Plenum Press N.Y.)。
それらの全ての観察は、百日咳に対する長期防御が、B. pertussisによる感染の際に自然の開口部である気道粘膜のレベルで投与された弱毒化生菌によるワクチン接種を介してより良く得られ得るという考えを導いた。以前の業績は、マウスを、B. pertussisの自然弱毒化生菌株(Vesselinova-Jenkins, C.K., 1985, Dev. Biol. Stand. 61:517-524)またはaroA菌株(Roberts, F.ら, 1990. Infect. Immun. 58:732-739)で免疫すると２回目の感染に対して防御することを示した。しかしながら、そのような菌株は、特徴付けが乏しく、ある種の毒性を保持し、或いは、高度にそれらのコロニー形成能力を失っていたという不都合を有し、従って、有効な防御免疫を誘発するには多数回の投与を必要とする。
B. pertussis毒素は、５つのサブユニット、いわゆるS1〜S5から形成されたオリゴマータンパク質である。それは、２つの大きなドメイン、いわゆるプロトマーA(S1にある)およびオリゴマーB(S2〜S5にある)に共有され得る。オリゴマーBは、標的細胞表面での毒素のそのレセプターとの相互作用に関連し、プロトマーA(またはS1)は、標的細胞に注入され、その中でADP-リボシルトランスフェラーゼ酵素活性を発現する(Tamuraら、Biochemistry 21, 5516-5522, 1962)。５個のサブユニットをコードする遺伝子はクローン化され配列決定され(LochtおよびKeith, Science 232, 1258-1264, 1986)、その結晶構造が確立された(Steinら、Structure 2, 45-47, 1994)。毒素遺伝子中の様々な突然変異が、この分子の遺伝子的不活性化に関連すると記載されている。これらの突然変異は、S1遺伝子(総説、LochtおよびAntoine, Biochimie 77, 333-340、1995を参照)および／またはオリゴマーBをコードする遺伝子(例えば、Lobetら、J. Exp. Med. 177, 79-87, 1993を参照)中に見い出され得る。毒素は、ポリクローナルまたは例えば後述する抗体1B7のようなモノクローナル抗体を用いて免疫学的活性を介して、或いは、Hewlettら(Infect. Immun. 40, 1198-1203, 1983)に記載されるように「チャイニーズハムスター卵巣」細胞上の活性のようなその生物学的活性を介して、実証され得る。
FHAは、B. pertussisによって産生され分泌される、主要な付着素である(総説、Lochtら、Mol. Microbiol., 9, 653-660, 1993を参照)。FHAの構造遺伝子、いわゆるfhaBは、クローン化され(Brown, D.R.ら、1987. Infect. Immun. 55:154-161; Relman, D.A.ら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:2637-2641; Delisse-Gathoye A.M.ら、1990, Infect. Immun. 58:2895-2905)、約367kDaの前駆体(FHAB)をコードする。成熟形態(220kDa)は、FHABのN-末端側の３分の２に対応し、いわゆる「ヘアピン内」構造を有する(Makhovら、J. Mol. Biol. 241, 110-124, 1994)。FHABのC-末端側部分は、成熟形態では存在しないけれども、それは、プロリン・リッチとして公知の様々な領域およびRGD部位のような興味ある特徴を有する。さらに、前駆体のC-末端部分は、FHA分泌に重要な役割を果たすように見える。FHAのN-末端領域の下流に、２つの繰返し領域、それぞれAおよびBが位置し、その後にタンパク質分解感受性部位およびRGD配列が続く。FHAB成熟化部位は、このRGD配列の下流約1000アミノ酸に位置する。FHAB N-末端ドメインは、この領域のフェイズ欠失がFHA生合成を全体的に阻害するように見えるので、成熟タンパク質の分泌に必須の役割を果たす。FHA分泌は、B. pertussisの外部膜のレベルで存在するマイナーなタンパク質、いわゆるFhaCに依存する。このタンパク質は、FhaBの下流に位置する遺伝子FhaCにコードされ、繊毛をコードする３個の他の遺伝子fimB、fimCおよびfimDによって、後者から分離される。FHABのN-末端部分の開裂およびその後の修飾、続いて、この領域とマイナータンパク質FHACとの間の相互作用に関連するFHA分泌メカニズムが、提案されている。
様々なFHA結合メカニズムは、B. pertussisに、多くのタイプの真核細胞への接着を可能にする。B. pertussis毒素は、細菌の気道上皮細胞との接着に関連するけれども、FHAは、そのような相互作用に主要な役割を果たす。FHAは、複合糖質と相互作用でき、炭水化物認識ドメインは、アミノ酸1141〜1279に限定されるFHA領域に同定され、該領域は、「ヘアピン」構造のバックルに対応し、1097-1099位にRGB部位を既に含む。FHAはまた、B. pertussisの非繊毛上皮細胞との接着メカニズムに関連する主要な付着素である。気管支粘膜ならびに細胞外マトリックスおよび多数の上皮細胞表面で無視できない量で存在する、ヘパリン、硫酸化グリコサミノグリカンに対するこの分子の結合活性は、これらの細胞への細菌の接着に関連する。最近の研究は、FHAのN-末端領域、恐らくアミノ酸442〜863を含む領域に位置する、特異的ヘパリン結合部位を明らかにする(Hannahら、Infect. Immun., 62, 5010-5019, 1994)。
繊毛化および非繊毛化した上皮細胞上のこの接着活性に加えて、FHAは、マクロファージおよび単球上に存在するCR3(CD11b/CD18, aMb2)と特異的に結合し得る(Relmanら、Cell, 61, 1375-1382, 1990)。FHAを介したB. pertussisのCR3とのこの結合は、いかなる酸化的異化も生じない手段により、マクロファージ中でこれらの細菌のインターナリゼーションを可能にする。
B. pertussisの様々な細胞タイプとの接着に対する興味により、FHAは、百日咳に対するワクチン接種のための主要な抗原と考えられている。細胞性ワクチンを、マウスまたは子供に投与すると、それらの血清中に抗FHA抗体の産生がもたらされる。さらに、18ヶ月の子供を細胞性ワクチンでワクチン接種すると、高割合で抗FHA抗体ならびに特異的細胞性応答Tを誘発する。これらの免疫学的特性は、百日咳後の回復期の人々に見られる。
しかしながら、細胞性ワクチンを受けた子供の抗FHA反応の同位体プロフィールは、百日咳に冒された個体の1つとは異なる。特異的血清免疫グロブリンＧ(IgG)の割合は類似するが、抗FHA IgA2応答は、ワクチン接種された人々でよりも病気の人々でより重要である。この差異は、鼻咽頭分泌物および唾液のレベルで、さらにより顕著であり、そこでは、抗FHA IgA割合の増加が、殆どの患者において症状の開始後の様々な週に観察される。同様に、高い抗FHA IgA割合が、B. pertussis毒性株で感染されたマウス鼻分泌物に、感染後26週までの期間に見られる。FHAに対するIgAsとIgGの両方の免疫応答はまた、精製FHAで鼻腔内ワクチン接種後に、マウスの気道で得られ得る。
BおよびT細胞の潜在的に防御性エピトープは、FHA上に局在している。従って、免疫優性の領域が、成熟FHAのC-末端領域に決定されている。それは、FHAのN-末端部分も認識する、マウスB細胞およびヒトリンパ球T CD4+によって認識される。
FHAの一部分および異種ペプチドを含む組換え融合タンパク質は、フランス特許FR 94 04661(番号2 718 750で発行)(アンスティテュ  パストゥール、アンスティテュ  パストゥール  ド  リール、アンセルム)に記載されている。この出願では、異種ポリペプチドをコードする配列を、同じリーディングフレーム中にFHA前駆体の少なくとも一部をコードする配列と融合されて含む組換えDNAを調製し、細胞培養物、特にボルデテラ脱毒素化または弱毒化培養物中で発現する。
この発明の１つの目的は、特にワクチン接種目的で、原核細胞の表面に組換えペプチドを露出させることである。組換え細胞の脱毒素化または弱毒化は、付随的に言及されるのみであり、更に実施例も特定の手順もこの可能性を例示しないことに注目すべきである。とくに、本発明は、細胞が如何に脱毒素化または弱毒化されるかを、正確に言及するものではない。
従って、従来技術の分析から、百日咳に対するワクチン接種手段は以前から公知であるが、それらは副作用を誘発することが判る。
従って、本出願人は、副作用が除去され、実行するのが容易で低コストで産生し得る、百日咳に対する、また他の病原体に対するワクチン接種手段を見い出すために努力を行なってきた。
我々は驚くべきことに、B. pertussis毒素遺伝子を除去された菌株の鼻腔内投与が、繊毛赤血球凝集素(FHA)に対する抗体の高い産生を誘発し、FHAと融合された異種抗原に対する免疫応答を刺激することが結果的に可能であることを最初に見い出した。
他方で、我々は、エピトープを有する他のペプチドを含むリポソームに組込まれたFHAが、これらのリポソームの気道粘膜との結合を改善させることを見い出した。
我々は、最後に、FHAが、一般的に免疫刺激特性を有することを見い出した。
従って、本発明は先ず、毒素産生に欠陥があり、繊毛赤血球凝集素(FHA)の少なくとも一部およびFHAに対する異種タンパク質の少なくとも一部を含むハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ株に関する。
有利には、ボルデテラ株は、不活性毒素を産生するように、毒素をコードする遺伝子の、少なくとも部分的な除去または欠失によって、或いは、突然変異によって、毒素産生に欠陥があるようにされる。そのような遺伝子は、特に、B. pertussis毒素または、そのような毒素との構造または機能類似性を有する任意のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。それはまた、ボルデテラ株により発現される溶血素/アデニルシクラーゼ毒素または皮膚壊死性毒素、または構造もしくは機能類似性を有するタンパク質をコードする遺伝子でもあり得る。
ボルデテラ株は、これらの毒素の１種または様々な種の産生に欠陥があり得る。
有利には、ハイブリッドタンパク質の一部を含む異種タンパク質は、上部または下部気道に感染すると、病原体によって発現され得るタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む。
結果として、該ハイブリッドタンパク質は、FHAタンパク質の一部およびマンソン住血吸虫のタンパク質Sm28GSTの一部を含み得る。この特定のタンパク質は、B. pertussis種の菌株に発現され得、コレクシオン・ナショナル・ド・クルチュール・ド・ミクロオルガニスムス・ド・アンスティテュ・パストゥール(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur(CNCM))に1996年10月８日に番号I-1770で寄託された、特に菌株BPNXであり得る。
本発明による菌株は、不活性毒素を産生するために、前記ハイブリッドタンパク質を発現する毒性株のゲノムから毒素の遺伝子を除去することによって、または部分的欠失または突然変異によって、得られ得る。
除去は、当業者に公知の任意の方法により、および特に毒性株を可動株と交雑し、その後、菌株により適合されたマーカーによって毒素遺伝子を消失させた細胞を選択することによって、行なわれ得る。毒性株の毒素を発現する能力のそのような損失は、毒性株と可動株のプラスミドとの間の相同組換えの二重事象から生じる。当業者は、弱毒株を得るために、AntoineおよびLochtに記載される方法(1990, Infect. Immun., 58, 1518-1526)を参照し得る。
そのように選択された、毒素産生における欠陥株の特性は、様々な技術、特にウェスタンブロットによってチェックされ得る。
ハイブリッドタンパク質を発現する毒性株は、当業者に公知の技術によって得られ得、特に、上述のフランス特許出願FR-94 04 661に記載されるように得られ得、その内容は本明細書中にを参考として援用される。一方で異種ペプチドをコードする配列、他方でFHAの一部をコードする配列を含む組換えDNAは、当業者に公知の方法によって、特に、フランス特許出願FR-94 04 661の実施例Vに記載されるようにして得られ得る。この実施例は、マンソン住血吸虫の28kDaのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Sm28GST)の190-211領域の、切型FHAタンパク質との融合を生み出す。ハイブリッドタンパク質をコードする組換えDNAを選択し、その配列を当業者に公知の方法によりチェックし、その後、ボルデテラ細胞に転移する。
当業者は、恐らく、本発明の実施のために、これらの技術に関連する一般的マニュアル、特に次のマニュアル：Maniatisら、1982, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー  ニューヨーク、米国、或いはその最新の再版本を参照する。
本発明は、百日咳菌の菌株に限定されないが、任意のボルデテラ種、特にパラ百日咳菌(B. paraperutussis)または気管支敗血症菌(B. bronchiseptica)を含む特にヒトに感染性のもの、或いは、特にイヌもしくはブタに感染性の気管支敗血症またはトリに感染性のB. avium株を含む特に動物に感染性のボルデテラ種に適用される、と理解される。
その配列がハイブリッドタンパク質に含まれる異種タンパク質は、任意の抗原性タンパク質配列、特に、ボルデテラ属、赤痢菌属、ナイセリア属、ボレリア属の抗原、ジフテリア、破傷風、コレラの毒素またはトキソイド、B型肝炎、C型肝炎、ポリオウイルスまたはHIVを含むウイルス性抗原、或いは、プラスモディウム、住血吸虫またはトキソプラスマのもののような寄生虫抗原であり得る。それはまた、粘膜感染または全身感染を起こしたとき、病原体によって発現され得るタンパク質のエピトープを含み得る。
そのような菌株は、様々な病原体に対する、ヒトまたは動物のワクチン接種用に使用され得る。それらは、特に、鼻腔内に投与され得る。
さらに、本発明は、そのような菌株を含む薬剤およびワクチン、或いは、薬理学的有効量のそのような菌株、必要に応じて１種以上の薬理学的相溶性の賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
本発明の他の目的は、上部または下部気道の疾患、粘膜感染または全身感染の治療用の薬剤またはワクチンを産生するための、そのような菌株の使用を包含する。
本発明による菌株は、驚くべき活性を有することが注目される。実際、下記の実施例に示されるように、その毒素遺伝子が除去されたハイブリッドタンパク質を発現する菌株は、両方の株が鼻腔内に投与されるとき、親の毒性株で得られるよりも、十分に高い抗体産生を誘発する。例えば鼻スプレーによる鼻腔内投与は、皮膚を介した注射に関連する不純物混入の危険を除去し、さらに胃の酸性環境における経口投与されたワクチンの破壊も回避可能とする。
本発明は更に、FHAタンパク質の少なくとも一部ならびにFHAタンパク質に対する少なくとも１種の異種タンパク質を含むリポソームに関する。
そのような異種タンパク質は、上述のハイブリッドタンパク質を含むタンパク質であり得る。それは、従って、上部または下部気道の疾患が起こると発現され易いタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含み得る。そのようなリポソームは、当業者に公知の方法で、例えば、FHA、異種タンパク質および脂質を混合する工程、次に脂質フィルムを再水和する工程を含む方法により、得られ得る。それらは、所与のエピトープに対する免疫応答を刺激するための薬剤およびワクチンを産生するために、治療的用途に使用され得る。
従って、本発明は、そのようなリポソームを含む薬剤、ならびに薬理学的有効量のそのようなリポソームおよび必要に応じて薬理学的相溶性の賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
FHAのリポソーム表面との結合は、粘膜組織に対して、異種タンパク質の投与を標的化する利点を有する。従って、FHAは、２つの作用：一方で、粘膜組織に関する特別な接着特性によるリポソームの標的化作用、他方で、免疫刺激化特性を有し、異種タンパク質の抗原に対し免疫応答を増加することを可能にする。
FHAのこの第２の特性は、本発明のもう一つの目的である。
結果として、本発明は、免疫応答を刺激するための薬剤を産生するためのFHAの使用に関する。好ましくは、FHAは、抗原決定基すなわちエピトープを有する異種分子に関連し、それはその作用を可能にする。
本発明を例示するが、下記の実施例に限定されない。
図１Ａは、B. pertussis株、BPSM(PTX+, FHA+)、BPRA(PTX-, FHA+)およびBP347(PTX-, FHA-, PRN-, Fim-, AcHIy-)による、マウスOF1の肺のコロニー形成を示す。
図１Ｂは、図１Ａの菌株またはS. typhimuriumにより先に鼻腔内免疫されていたマウスの細菌BPMSによる肺のコロニー形成を示す。感染から３時間後、各群の３匹のマウスを殺し、B. pertussisの生存数を肺当り測定した。他の群のマウスを、図に示されるように、感染後１週間以上分析した。棒は、平均に対する標準偏差(SEM)を示す。
図２Ａは、健康なマウスOF1(1)の肺および菌株BPSM(2)、BPRA(3)の５×106個の細菌の鼻投与から７日後の肺を示す。
図２Ｂ〜２Ｄは、菌株BPSM(2C)、BPRA(2D)の５×106個の細菌の鼻腔内投与から14日後の肺の切片であり、コントロールは、健康なマウス(2B)に対応する。細胞コアの染色は、ヘマトキシリン処理で得られる。
図３は、マウスOF1への菌株BPSM、BPRAおよびBP347の鼻腔内投与から28日後、およびBPSMによる２回目の感染(63日目)から28日後の抗FHA IgG応答を示す。抗体割合の測定は、ELISAにより、群当り３匹のマウスで時間当りで、測定された。
図４Ａ〜４Ｄは抗FHA同位体分布の動力学を示す。３匹のマウスの時間当りの血清を、ELISA技術により、アイソタイプIgG1(4A)、IgG2a(4B)、IgG2b(4C)およびIgA(4D)の抗FHA抗体の存在について分析した。
図５Ａおよび５Ｂは、B. pertussis抗原に対する血清応答IgG2Aの動力学を示す。３匹のマウスの時間当りの血清を、ELISA技術により、抗BP347(5A)および抗BPSM(5B)抗体の存在について分析した。
図６は、B. pertussisの菌株BPSM(PTX+)、BPRA(PTX-)およびBPDS1(S1-, オリゴマーB+)投与後の、抗FHA血清応答の動力学を示す。抗体割合を、ELISAにより、群当たり３匹のマウスで時間当りで決定した。
図７は、PTXのS1サブユニットに対するモノクローナル抗体1B7を用いた、非組換え菌株BPSM(PTX+)(ウェル4)およびBPRA(PTX-)(ウェル1)、およびタンパク質FHA-Sm28GSTを発現する組換え菌株BPGR60(PXT+)(ウェル3)およびBPNX(PXT-)(ウェル2)の培養物の上清のウェスタンブロットによる分析を示す。ウェル5は、分子量マーカーに対応する。
図８は、組換え菌株B. pertussis BPGR60(PTX+)およびBPNX(PTX-)のマウスOF1への鼻腔内投与後の抗Sm28GST IgG血清応答の動力学を示す。
図９は、(Sm28GSTのみをウェル6及び13で、Sm28GSTを３種の異なる投与量のFHA、60μg/ml(ウェル3および10)、6μg/ml(ウェル4および11)、0,6μg/ml(ウェル5および12)での、様々なリポソーム調製物の免疫転移(イムノプロット)であり、ニトロセルロース上SDS-PAGEゲルの転移後に分析する。ウェル1および8は、リポソームに含まれないSm28GSTに対応する。ウェル2および9は、リポソームに含まれないFHAに対応する。ウェル7は、分子量マーカーの１つに対応する。
ウェル1〜6は、FHA特異的抗体により明示され、ウェル8〜13は、Sm28GST特異的抗体(190-211)によって明示された。二量体化したSm28GSTは、リン脂質の存在下に異なる移動をした。FHAの存在は、リポソームに組込まれたSm28GSTの量を変化させなかった。
図１０Ａおよび１０Ｂは、抗Sm28GSTおよび抗FHA IgG(H+L)血清応答をそれぞれ示す(血清プール1/40 ABTS中１時間明示)。D1およびD14に、２回の鼻腔内滴下を行なった。血清を、D-1およびD27に分析し、D28に行なったB. pertussisで感染後D36およびD43に分析した。
図１１Ａおよび１１Ｂは、抗Sm28GSTおよび抗FHA IgA血清応答をそれぞれ示す(血清プール1/40 OPD中明示)。DlおよびD14に、２回の鼻腔内滴下を行なった。血清を、D-1およびD27に分析し、D28に行なったB. pertussisで感染後D36およびD43に分析した。
実施例１
１以上の病原性因子の産生に欠陥がある異なる株で予め免疫されたB. pertussisによる感染に対する保護
B. pertussis BPSMの野生株(Menozzi, F.D.ら、1994, Infect. Immunol., 62, 769-778)をBPSMの第２感染に対する保護についてのリファレンスとして使用した。pertussis毒素(PTX)の産生に欠陥があるBPRA株(Antoine R.ら, 1990, Infect. Immun., 58, 1518-1526)の効率は、ゲノムにトランスポゾンＴｈ５が挿入されてＰＴＸ、アデニル酸シクラーゼ毒素(Ac-Hly)、フィムブリエ(fimbriae)、ペルタクチン(pertactine)及びＦＨＡ(Weiss, A.A. ら, 1983, Infect. Immun., 42, 33-41)のような病原性因子の発現できなくなった株BP347と比較された。Salmonella typhimurium aroA株(Hoiset, S.K.ら, 1981, Nature 291: 238-241)は、グラム陰性菌による感染コントロールとして１群のマウスに鼻腔内投与された。滅菌ＰＢＳの懸濁液中の５×106のB. pertussis細菌（ヒツジ脱線維素血を含む固体ボルデジャングー(BG)培地；Bordet, J. 及びGengou, O., 1906, Ann. Institut Pasteur（Paris), 20: 731-741)中の培養物のこすり落とした細胞）をペントバルビタール麻酔下ＯＦ１マウス（非純系種、４週齢の雌マウス）に鼻孔あたり２５μｌの量を点鼻注入した。液体ＬＢ培地中で３７℃終夜培養からの細菌S. typhimuriumを６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物を滅菌ＰＢＳに２×１０3細菌／ｍｌの濃度で再懸濁した。マウスは次いで５０μｌの細菌溶液を滴下注入された。３匹のマウスの肺を注入３時間後、次いで７、１４、２１、２８及び３５日後に取った。肺を５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中でホモジナイズし、細菌を１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍｌのナリジクス酸を含む固体ＢＧ培地（ＢＧＳＮ）中にすりつぶした残渣を撒いた後３〜４日目にカウントした。単純化のために、”マウスＸ”を”Ｘ−免役されたマウス”として用いた。
最初の期間において、B. pertussisの異なる弱毒化株がマウスの気道にコロニー形成する能力をチェックした。図１Ａに示されるように、滴下注入後最初の７日間はマウスの肺で細菌ＢＰＲＡの数が増加し、次いで野生株ＢＰＳＭと同様に引き続く４週間減少したが、その除去動力学はより速い。病原性因子の産生に欠陥があるBP347株は、最初の週に増加することができず、免疫１４日後肺中に細菌は見出されなかった。最後に、経口感染後に胃腸管にコロニー形成した微生物であるS. typhimuriumは、気道粘膜にコロニー形成できないので速やかに除去された。コントロールマウスの群は、鼻腔内に滅菌ＰＢＳを５０μｌ受けた。
野生株(５×１０6の細菌BPSM／50μｌのＰＢＳ)の第２の鼻腔内感染は、異なる細菌株でマウスの鼻免疫３５日後に行う。ＰＢＳコントロールマウス及びS. typhimuriumマウスは、同様なコロニー形成曲線を示す（図１Ｂ）。BPSM及びBPRA動物において、細菌の数はBPSMによる第二感染後速やかに減少する。７日後、BPRAマウスの肺に存在する細菌の量は、ＰＢＳマウスの３００倍小さく、BPSMマウスで観察されたのと同様である。これに対し、感染後の最初の週では、BPSM細菌はＰＢＳマウスの肺と同様にBP347マウスの肺にコロニー形成するように見える。しかしながら、１週間後、BP347動物はＰＢＳ群と比較して約１００倍細菌数の減少を示す。第２感染の２１日後、BPSMマウスの肺に細菌は検出されないが、PBSマウスに比較しBPRAマウスでは約１３０倍、BP347マウスでは１２倍の減少が観察される。感染の４週間後、BPRAマウスではほぼ完全な細菌の除去に達するが、BP347マウスでは幾らかの残りがある。
これらの結果は、PTX産生に欠陥があるBPRA株のみがインビボで野生株と類似の挙動を示し、２つの株の一方による初回感染(prime infection)は、野生株による呼吸粘膜の効率的なコロニー形成に対する保護を示す。
実施例２
pertussis毒素の産生に欠陥があるB. pertussis株の鼻腔内投与により誘発された肺レベルの炎症の組織学的分析
マウスを野生株BPSM又はBPRA（PTX-）株から５×１０6の細菌（実施例１に記載されたのと同じ免疫プロトコール）で免役する。設与された細菌の数は、鼻腔内投与の３時間後に肺を取り、肺をすりつぶした残渣を撒いた後で細菌をカウントすることによりチェックする。投与の７日後、直接観察は、BPRAマウスのものと比較して、幾分小さいだけの出血性領域が存在し、コントロールマウスと同一容量の、BPSMマウスのより大きく出血性の肺を示す（図２Ａ）。
細胞浸潤の強さを分析するために、B. pertussis株のいずれかの投与の１４日後に肺を取る。肺を取って直ぐに４℃で４％パラホルムアルデヒド中終夜固定する。洗浄後、該臓器を濃度を増加させる連続的エタノール（メルク）浴で脱水し、次いで４℃で２４時間１−ブタノール（メルク）と接触させ、パラフィン侵入を改善する。次いで、含有物を５６℃で４〜５時間パラフィン侵入(Paraplast Lancer)を行う。６μｍの厚さのラメラの切片をミクロトームで作製する。該作製前に、切片をトルエン（メルク）で脱パラフィンし、再水和する。濃度を減少したアルコール浴で行われる切片の再水和は、緩衝液浴ＴＢＳ(Tris HCl 10mM, NaCl 150mM, pH7.4)で終了する。細胞コアの染色は、１０分間ヘマトキシリンに接触し、次いで１０分間生水でラメラをリンスすることにより行う。切片の写真は、×１０の対物レンズを用いてなされる。細胞浸潤は、BPSM及びBPRAの両方のマウスで肺レベルで観察され、健康なマウスの肺は陰性コントロールとして使用される（図２Ｂ）。しかしながら、細胞浸潤はBPRAマウスについてはわずかで上気道の周辺に限られているが（図２Ｄ）、BPSMマウスについては塊状であり、肺胞に到達しているようにみえる（図２Ｃ）。
これらの観察は、ＰＴＸ産生に欠陥があるBPRA株は、BPSM野生株の鼻投与によるよりも肺レベルにおけるより弱い炎症反応を誘発することを示す。
実施例３
各種細菌株の鼻腔内投与後の抗FHA血清免疫応答の分析
トータル抗FHA IgG応答の力価は、B. pertussis株（BPSM、BPRA、BP347）の鼻腔内投与の２８日後、及び、BPSMでの第２感染の１ヶ月後（実施例１の記載と同じプロトコール）にマウス血清で測定される。マウスはレトロオービタル叢(retroorbital plexus)のレベルで針刺により出血され、血清をELISA技術による分析まで−２０℃保存される。
２８−６３日の期間中、抗FHA IgG応答の力価は、異なるB. pertussis株で免役された各マウス群で２倍であった（図３）。
興味深いことに、BPRAマウスは、BPSMマウスで観察されたものよりも４倍優れた抗FHA応答を示し、該相違は免疫２８日後又はBPSMでの第２感染後に観察された。これらの結果はELISAテストがBPSMまたはBPRA株から精製されたFHAに対して有効であるとき一様に見出される。
BPSM及びBPRAマウスの抗FHA血清応答の相違が量的及び／又は質的のみであるのかを決定するために、抗FHA応答のプロフィールをELISAにより行った。
特異的応答動力学の分析は、鼻腔内投与の１４日後にIgG1（図４Ａ）、IgG2a（図４Ｂ）及びIgG2b（図４Ｃ）がBPRAマウスの血清中に存在し、一方IgG2a及びIgG2bはBPSMマウスで免疫１ヶ月後においてのみ検出されることを示す。これら２群のマウスにおいて、BPSMにより第二感染は抗FHA IgG2a及びIgG2b応答の増加を誘発した。他方、特異的IgG1応答の大きな増加がBPRAマウスで観察されるが、小さな一時的産生がBPSMマウスで第２感染の１週間後に検出される。この感染の１ヶ月後、IgG1及びIgG2bの割合の減少は、BPRAマウスの血清で検出されるが、IgG2aの割合は安定したままである。抗FHA IgA血清応答の分析は、BPSMによる第２感染の１週間後BPSMマウス血清の特異的IgAの高産生を示す（図４Ｄ）。１週間後、そのような血清IgAレベルはBPRAマウスで到達し、７日後にBP347マウス及びS. typhimuriumマウスの血清で抗FHA IgAを検出する。
抗FHAイソタイプ応答についてのこれらの分布動力学は、BPSM(PTX+)マウスで見出されたものと比較してBPRA(PTX1)マウスの血清におけるより速くより高い特異的な血清応答を実証する。
それらの結果を説明することができる仮説の１つは、BPRA株により表面で発現され及び／又は分泌されたFHA量はBPSM野性株により産生されるものよりも優れているということであろう。抗FHAラットポリクローナル抗体を用いたイムノブロット分析は、１ｇ／ｌの2,6-O-ジメチル-β-シクロデキストリン(Imaizumi, A.ら, 1983, Infect.Immun. 41: 1138-1143)を含むスタイナー−スコルト(Stainer-Scholte)培地(Stainer, D.W. 及びScholte, M.J. 1971, J. Gen. Microbiol. 63: 211-220)中での各種B. pertussis株の液体培養物からの培養上清及び細胞ライゼートに効果があった。この研究は、BPRA及びBPSM株により産生されるFHAの量が類似する証拠を与えるものである。
免疫抑制エレメントとして作用するであろうＰＴＸの潜在的な免疫制御活性は、BPRA(PTX-)マウスで得られたものと比較してBPSM(PTX+)マウスの抗FHA応答の弱い強度の起源であり得る。BP347及びBPSM細菌のトータル抗原に対し、トータルIgG応答よりもより感受性であるIgG2a応答の研究は、各群のマウスの血清について行われた。トータル抗原を調製するために、細菌をＢＧＳボックス上ですじを付け、次いで４８時間培養後、再度0.5mM PMSF及び1mM EDTAを含むPBS中２．５×１０9細菌／ｍｌの濃度で懸濁した。次いで細胞懸濁液をフレンチプレス(French press)を２回連続して通すことにより溶解する。BP347株の抗原に対する抗体の割合（抗BP347抗体）は、BPSM及びBPRAマウスの血清と類似するが（図５Ａ）、おそらく抗FHA IgG2aの割合にリンクしたBPRAマウスのより高い応答と抗BPSM応答のレベルに関しわずかな相違に気付かれる（図５Ｂ）。さらに、抗BP347抗体のレベルはBPSM及びBPRAマウスの血清において連続的に減少するが、抗BPSM IgG2a応答は少なくともBPSMによる第２感染の２８日後まで上昇を続け、すなわち、抗FHA IgG2a応答と並行する。
実施例４
抗FHA血清応答に関するPTXの酵素活性により果たされる役割の研究
PTXは、いわゆるS1〜S5の５サブユニットを含むオリゴマー蛋白質である。このホロ毒素は、Ａ−Ｂ型構造を有し、ＡはＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ及びＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ酵素活性を発現するサブユニットS1に相当する(Kataka T.ら, 1983, Arch. Biochem. Biophys., 224: 290-298)。この蛋白質は毒素が細菌により分泌されるときジスルフィド架橋を形成する２つのシステインを有する。これらのシステインのうちの一方(cys-41)は、酵素のNAD結合部位の近傍に局在し(Locht, C.ら, 1990, J.Biol.Chem. 265: 4552-4559)及びB. pertussis S1サブユニットの安定に必須である。抗FHA応答に関するPTX酵素活性により演じられる役割を決定するために、１群のマウスは、S1のcys-41残基が欠失した(Antoine R.ら, 1990, Infect.Immun. 58: 1518-1526)、染色体に組み込まれた毒素をコードする遺伝子を含み、BPRA(pPT2)またはBPDS1と呼ばれるB. pertussis株の５×１０6細菌を受けた。サブユニットS1はそのような株の培養上清中には検出できないが、標的細胞との結合を許容する成分であるオリゴマーＢは集合され分泌され得る。マウス気道でのコロニー形成及び投与後１４日に肺レベルで観察される細胞浸潤についてのBPDS1株の能力は、BPRA株の１つと同じである。BPDS1株の鼻腔内投与(５×１０6細菌／５０μｌ  ＰＢＳ)後の抗FHA血清応答の動力学は、２ヶ月にわたり分析された。BPDS1マウスについて観察された抗FHA IgG抗体の割合は、BPRAマウスの１つと類似し、BPSMマウスの血清で検出されたものよりも高い（図６）。
これらの結果は、ＰＴＸ酵素活性がB. pertussisの主要な付着素であるFHAに対する血清応答の減少に関与することを示す。
実施例５
S. mansoniの修飾蛋白質Sm28GSTを発現するB. pertussis毒素(BPNX)の産生に欠陥がある組換え株の染色体構築
弱毒化された組換え株の鼻腔内投与後に、PTXをコードする遺伝子の染色体欠失とFHAと融合した異種の抗原に対する血清抗体応答の増加の相関関係を証明するために、B. pertussisの弱毒化された組換え株を構築した。モデル異種抗原は、Schistosoma mansoniの28kDaのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(Sm28GST)である(Balloul, J.M.ら, 1987, Nature(London), 326: 149-153)。
FHA(Renault-Mongenie, G.ら, 1996, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93: 7944-7949)と融合したS. mansoniの修飾蛋白質Sm28GSTを発現するB. pertussisの毒性株BPGR60(SmR、GenS、NaIR)のゲノム由来のPTX遺伝子を除くために、この後者を可動株E. coli: S17-1(pRIT13295)(SmS、GenR、NaIS)を含む固体ＢＧ培地上で交雑し、プラスミドpRIT13295はPTX遺伝子の５’および３’フランキング領域を有する(Antoine, Locht, 1990, Infect. Immun., 58, 1518-1526)。相同の２重組換え事象がこの遺伝子のフランキング領域のレベルで起こる。複合体形成後、両方の組換え事象を経験した細菌は既述のように選択培地上で選択される(Antoine及びLocht, 1990, Infect.Immun., 58, 1518-1526)。
融合蛋白質FHA-Sm28GSTの抗原性の保存及びBPNX弱毒化組換え株のPTX発現能力の欠如を、１０％ゲル上のSDS-PAGEによる培養上清由来の蛋白質画分及び細胞と結合したものの分離後ウェスタン−ブロットによりチェックする。融合蛋白質の識別は、FHAに対するラットのポリクローナル抗体及びSm28GSTのペプチド190-211に対するラットのポリクローナル抗体を用いて行う。毒素は、S1(Satoら, Infect.Immun., 46, 422-428, 1984)に対するマウス1B7のモノクローナル抗体によりBPSM及びBPGR60株の培養上清において同定されるが、BPRA及びBPNX株の上清には検出されない（図７）。
BPNX株はNoI-1770の下にCNCMに１９９６年１０月８日に寄託された。
実施例６
組換え株BPNXの免疫原性
マウスOF1中の組換え株BPNXのコロニー形成がチェックされ（実施例１のBPRA株について既に記載されているように）、B. pertussis野生株の１種と同じ肺に対するコロニー形成動力学を示す。
５×１０6細菌／株BPNXの50μｌ鼻腔内投与されたマウスで得られたIgG抗Sm28GST血清応答の強度は、BPGR60株の投与後に得られたものと比較される。B. pertussis組換株を用いた免疫の２ヶ月後、PBS中２０μｇの組換え抗原（大腸菌により産生されたrSm28GST）の鼻腔内投与によりマウスの再評価が行われる。血清免疫応答の動力学は、各時期に３〜５マウスの群で効果がある。
Sm28GSTに特異的な血清応答は、毒性組換株BPGR60の鼻投与後には得られないが、抗Sm28GST IgGは弱毒化組換え株BPNXの投与１４日後に既に検出され、その産生は投与後３５日持続的に増加する（図８）。免疫の２ヶ月後、この抗Sm28GST血清抗体の割合のわずかな減少が、BPNXマウスについて観察されたが、そのような応答はBPGR60マウスでは検出されない。rSm28GSTを用いた再ワクチン接種後の数週間に、抗Sm28GST抗体の産生はBPGR60マウスでは証明されるが、BPNXマウスで得られたものよりも弱いままである。
従って、これらの結果はPTXをコードする遺伝子の染色体欠失とFHAと融合した異種抗原に対する血清抗体応答の増加の相関関係を示す。細菌の量は類似しているが、B. pertussisの弱毒化組換え株の１回のみの鼻腔内投与はFHAと融合した異種抗原の特異的血清応答を誘発するが、毒性組換え株については再ワクチン接種が必要であった。
実施例７
表面にFHAを有する関心のある抗原を含むリポソームの産生
使用される抗原は、28kDaの蛋白質であるS. mansoniのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であり、それは成虫の数を減少させ、これら虫の繁殖能力を減少させることにより哺乳動物の防御免疫を誘発する。Sm28GSTモデルは、そのようなリポソームを改良するために関心のある抗原として使用された。
原理は、リポソーム表面で各種細胞タイプと結合する少なくとも３つの活性を有し、その結果リポソームがそれらを介して粘膜に付着するB. pertussisの主要な付着素であるFHAを結合することである。得られた結果は、Sm28GSTを含むリポソーム表面でのFHAの存在がSm28GSTの特異的血清応答の量的効果を誘発することを示す。そのような効果はリポソーム表面におけるB. pertussis付着素の存在が誘導原部位に到達する粒子数を増加させる結果となるという事実による。他方、特異的血清応答のホモジナイゼーションがそのようなリポソームSm28GST/FHAの投与後に観察される。
乾燥調製物の水和により形成される９／１比のリポソームDPPC/DMPG(ジパルミトイルホスファチジルコリン：ジミリストイルホスファチジルグリセロール)(Phillips, N.ら, 1996, Vaccine, 14: 898-904)が使用された。FHAは、ヘパリンカラムを通すことによりB. pertussis（BPRA株）の培養上清から精製された。観察される性質は該調製物中のエンドトキシンの存在によるものではないことがチェックされた。ヒト集団において観察できる最も代表的なものである遺伝的不均一性のマウスOF1（異系交配）が使用された。
Sm28GSTを含むリポソームDPPC/DMPGのマウスOF1への投与はSm28GSTの特異的な漿液性で分泌性の免疫応答を導いた。
リポソーム表面でのFHAの使用による免疫応答の改良された効果を観察するために、リポソームSm28GSTを用いた免疫応答を得るためのサブリミット条件が決定された。注入当たり動物当たり２μＭの量のホスホリピッドについて異なる用量のSm28GST(5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml)を用いて製造されたリポソームの１５日間隔の点鼻注入は、1mg/mlの量は弱いが検出可能な免疫応答を与えることを示した。
表面におけるFHAの存在を得ることを許容するリポソームの製造条件もまた決定された。FHAはリポソーム内に容易に挿入させ得る疎水性配列を有する。しかしながら、既に製造されたリポソームSm28GSTへのFHAの添加は満足のいく結果をもたらさなかった。一方、FHAがSm28GST溶液に加えられてリピッドフィルムを再水和し、リポソームを製造すると、混合リポソームが製造できた。FHA及びSm28GSTのリポソーム表面における存在がFHAに対するポリクローナル抗体又はSm28GSTに対するポリクローナル抗体を用いることにより視覚化された。
実施例８
FHA量による免疫応答の増加
マウスOF1を１５日間隔で２回の滴下注入により免役した(約１５匹の動物を含む５群)。コントロール群はPBSで免役し、１群は1mg/mlのSm28GSTを用いて製造されたリポソームで免役された。他の３群は、1mg/mlのSm28GST及び０．６μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ及び６０μｇ／ｍｌのFHAを用いて製造されたリポソームを含んでいた。リポソームに組み込まれたSm28GSTの量は、最初の溶液の任意の量のFHAの存在下又は非存在下で技術的な分解能限界に等しいことが12%ゲルを用いたSDS-PAGEによるリポソーム調製物の分離後、ウェスタン−ブロットによりチェックされた。蛋白質認識は、FHAに対するラットのポリクローナル抗体及びSm28GSTのペプチド190-211に対するラットのポリクローナル抗体を用いて行う（図９）。
マウスは最後の注入後２週間に出血させた。血清プールの分析は、使用されたFHAの量に直接依存する抗Sm28GST IgG(H+L)応答の増加を証明した（図１０）。抗FHA IgG(H+L)応答は最も高い用量のFHAを含む群でのみ検出された（図１０）。
個々の血清の分析は、高用量のFHAを含む群で応答のホモジナイゼーションを示した（表）。得られたイソタイプの分析は、混合応答（IgG1, IgG2a及びIgG2bの存在）を証明した。得られた曲線は、Sm28GST及びFHAについて曲線IgG(H+L)と同じプロフィールを有する。混合応答はまた、Sm28GSTのみを含むリポソームについて得られた。応答分極効果は観察されなかった。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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