(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニールサイクラーゼ溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ)から誘導されるポリペプチドであって、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能であり、かつ下記のものより選択されることを特徴とするポリペプチド：
ａ）百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前記配列に対応する配列の９１０位又は９１３位と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖を含む切詰められたＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質であって、９８０位から９８５位のアミノ酸の間に、脂肪酸の付加による配列の変性を受けている切詰められた蛋白質；
b)百日咳菌, パラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌のＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と同等の、もしくは類似する３次元構造を有している配列であって、(i)上記ａ）に定義されるアミノ酸の連続および(ii)百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列のアミノ酸385〜400, 385〜450もしくは385〜500の連続からなる配列か又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌におけるその対応する配列を含んでいる16〜500アミノ酸の連続を含み、前記二つの連続(i)および(ii)はＡＣ−Ｈｌｙとは異なる蛋白質から誘導される抗原配列を介して連結されている配列、
c）百日咳菌, パラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌のＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と同等の、もしくは類似する３次元構造を有している配列であって、(i)上記ａ）に定義されるアミノ酸の連続および(ii)百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列のアミノ酸385〜400, 385〜450もしくは385〜500の連続からなる配列か又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌におけるその対応する配列を含んでいる16〜500アミノ酸の連続を含み、前記二つの連続(i)および(ii)は互いに隣接するか、または百日咳菌, パラ百日 咳菌もしくは気管支敗血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ内で上記で定義した二つの連続の間に天然に存在するアミノ酸の連続を介して連結されている配列（但し、得られるアミノ酸配列はボルデテラ属菌のＡＣ−Ｈｌｙ配列と比べて切詰められている）。
【請求項２】
百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と同等の、もしくは類似する３次元構造を有するポリペプチドの形態にあり、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポチペプチド配列の９１０位又は９１３位のいずれか一方と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖を含むことを特徴とする請求項１記載のポリペプチドであって、加えて、該ポリペプチドが９８０位のアミノ酸と９８５位のアミノ酸との間に、脂肪酸の付加による変性を受けているポリペプチド。
【請求項３】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の３８５位のアミノ酸と最終Ｃ−末端アミノ酸との間のアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対応するパラ百日咳もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成されることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは９８０位のアミノ酸と９８５位のアミノ酸との間に、脂肪酸の付加による変性を受けているポリペプチド。
【請求項４】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の８２７位ないし８８７位のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列に相当する、ΔＣｌａと呼ばれるポリペプチド断片の欠失により変性されたＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列であることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドであって、得られる配列が９８０位のアミノ酸と９８５位のアミノ酸の間に、脂肪酸の付加による変性を受けている請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の３８５位ないし８２７位のアミノ酸鎖又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列に相当する、ΔＨと呼ばれるポリペプチド断片の欠失により変性されたＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列であることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドであって、得られた配列が９８０位のアミノ酸と９８５位のアミノ酸との間に、脂肪酸の付加による変性を受けている請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
脂肪酸の付加による変性が９８３位のアミノ酸である請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
脂肪酸の付加による変性がパルミトイル化であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
百日咳菌に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチド、及びパラ百日咳菌に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有することを特徴とするポリペプチド組成物。
【請求項９】
気管支敗血症菌に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドをさらに含有することを特徴とする請求項８記載のポリペプチド組成物。
【請求項１０】
パラ百日咳菌に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチド及び気管支敗血症菌に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有することを特徴とするポリペプチド組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドの１以上を含有することを特徴とする免疫組成物。
【請求項１３】
百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来するｖｒｇ遺伝子の発現産物を含む細菌抽出物を更に含有することを特徴とする請求項１２記載の免疫組成物。
【請求項１４】
ＦＨＡ(糸状赤血球凝集素:filamentous  hemaglunin)、ＡＧＧ類（凝集原:agglutinogens）もしくはＰＲＮ（ペルタクチン：pertactin）及びＰＴＸ（百日咳毒素：pertussis  toxin）から選択される、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来する１以上のアドヘシンもしくは毒素を、更に含有することを特徴とする請求項１３記載の免疫組成物。
【請求項１５】
ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミノ酸配列及び、ｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質が得られる百日咳菌の株が、Ｉ−１４８５としてＣＮＣＭに寄託されているＨＡＶ株であることを特徴とする請求項１３ないし１４のいずれか１項に記載の免疫組成物。
【請求項１６】
ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミノ酸配列及びｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質が得られるパラ百日咳菌の株が、Ｉ−１４９８としてＣＮＣＭに寄託されている第１号株であることを特徴とする請求項１３ないし１４のいずれか１項に記載の免疫組成物。
【請求項１７】
ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミノ酸配列及びｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質が得られる気管支敗血症菌の株が、Ｉ−８５８としてＣＮＣＭに寄託されている９.７３Ｓ株であることを特徴とする請求項１３ないし１４のいずれか１項に記載の免疫組成物。
【請求項１８】
活性成分として請求項１２ないし１７のいずれか１項に記載の免疫組成物を、薬学的に許容し得るビヒクルと共に含有することを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１９】
更にアジュバントを含有する請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ、パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及び気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識するモノクローナル抗体の製造方法であって、
−  非ヒト動物を、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のペプチドで免疫する工程、
−  免疫した動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成する工程、
−  該ハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培養する工程、
−  百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、
を包含する方法。
【請求項２１】
免疫工程がペプチドの繰返し投与によって行われる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の方法を用いて得られるモノクローナル抗体。
【請求項２３】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミノ酸鎖を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２４】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸のポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２５】
百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８８位ないし１７０５位のアミノ酸のポリペプチド又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８９位ないし１７０６位のアミノ酸のポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２６】
Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３としてＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマＥ１７−２１によって産生される、請求項２３ないし２５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項２７】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２８】
活性成分として、請求項２２ないし２７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌に感染したホストの免疫療法において医薬生成物として用いられる、請求項２２ないし２７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３０】
Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２１であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３１】
ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物からの生物学的流体サンプルを請求項２２ないし２７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させ、及びサンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合に、該モノクロ−ナルもしくはポリクローナル抗体とボルデテラ属の細菌との免疫学的反応を検出することを特徴とする方法。
【請求項３２】
ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物からの生物学的流体サンプルを請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させ、該ポリペプチドと被検サンプル中に存在する抗体との免疫学的反応を検出することを特徴とする方法。
【請求項３３】
活性成分として、請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は、ボルデテラ属菌由来のアデニールサイクラーゼ−溶血素のエピトープを含むアミノ酸配列に関する。アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ）は、ボルデテラ感染症候群に関与する毒素の１つである。ＡＣ−Ｈｌｙは、アデニールサイクラーゼ活性及び溶血素活性を有する二機能性蛋白質である。これは細菌によって分泌される。その構造遺伝子はクローン化され、かつ配列決定されている（Glaser P. et al., 1988, Molec. Microb. 2, 19-20 ）。この蛋白質は、“毒素中の繰返し”に対応する“ＲＴＸ”と名付けられた毒素群の一員であり、大腸菌（Escherichia coli）及びActinobacillus pleuropneumoniae に由来する溶血素並びにPasteurella haemolytica 及びActinobacillus actinomycetemcomitansに由来するロイコトキシン（leucotoxins ）との相同性を示すという事実がある。この蛋白質は、ＰＴＸ（百日咳毒素）と同様に、マクロファージのような真核細胞内に浸透し、カルモジュリンで活性化し、大量のｃＡＭＰを合成し、かつ細胞の機能を破壊することが可能である（Coote J. 1992, FEMS Microbiol. Rev. 88: 137-162 ）。
【０００２】
本発明者らは、この配列内において、ボルデテラ属菌、特には百日咳菌（B. pertussis）及び／又はパラ百日咳菌（B. parapertussis）及び／又は気管支敗血症菌（B. bronchiseptica ）による感染に対する防御抗体の形成を誘発する能力を有する様々なドメインを同定している。
【０００３】
したがって、本発明が目的とするものには、例えば免疫療法に利用可能な免疫組成物又は防御ワクチンの組成に組み入れることが可能なアミノ酸配列が、これらのアミノ酸配列を指向する抗体の他にある。免疫療法及び血清療法は、特に、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に感染した幼児に適しているという点で小児に利用可能である。本発明は、ヒトの医療又は獣医学における用途を提示する。
【０００４】
本発明が目的とするものは、アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ）のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸配列であって、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能であり、かつ下記鎖より選択されることを特徴とするアミノ酸配列である：
ａ）百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前記配列に対応する配列の９１０位、好ましくは９１３位と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸鎖を含む配列であって、大凡９８０位から大凡９８５位のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列；
ｂ）６ないし５００個のアミノ酸を有する鎖を含む配列であって、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前記配列に対応する配列の３８５ないし４００位のアミノ酸を含む配列；
ｃ）前記ａ）及びｂ）に定義されるアミノ酸鎖を含む配列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ内で上記ａ）及びｂ）に定義される鎖の間に天然に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるいはＡＣ−Ｈｌｙとは異なる蛋白質から誘導される抗原性配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対応ＡＣ−Ｈｌｙポリペプチド配列と同等の、もしくは類似する３次元構造を有する配列。
【０００５】
“ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列”という表現は、本発明の枠内において、それらのアミノ酸が、それらの性質もしくはそれらの結合の状態の観点からＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列に等しいか、あるいはＡＣ−Ｈｌｙの免疫学的特性が保全されるような方式でそれらの幾つかが置換され、欠失し、もしくは付加されている配列を意味するものと理解される。特に、ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列から誘導される配列は、ボルデテラ属、特には百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に感染した患者において形成される抗体によって認識される。
【０００６】
本発明のアミノ酸配列が、患者もしくは動物の免疫の後に、ボルデテラ感染に対する防御免疫を誘発することが可能である場合には、ＡＣ−Ｈｌｙの構造又は配座が保全され、本発明のアミノ酸配列がＡＣ−Ｈｌｙと等価もしくは類似する構造を有することが、本発明の枠内において考慮される。
【０００７】
本発明による配列は、ボルデテラ属菌から精製されるＡＣ−Ｈｌｙの蛋白分解により得ることができる。好ましくは、この配列は化学合成又は遺伝子工学手法により得られる。
【０００８】
例えば、遺伝子工学により本発明によるアミノ酸配列を製造するには、ＣｙａＡ遺伝子断片を担持するプラスミドが用いられる。
【０００９】
例としてではあるが、化学合成はアプライド・バイオシステム（Applied Biosystem ）型の自動機器において行うことができる。また、Betsou F et al., 1993, Infect. Immun., 61: 3583-3589の技術を用いることも可能である。
【００１０】
このようにして、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５ないし４００位のアミノ酸鎖、もしくは３８５ないし５００位のアミノ酸鎖にさえ相当するペプチド、又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの対応鎖に相当するペプチドを調製することが可能である。百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列は、そのヌクレオチド配列と共に、Glaser et al., 1988, Molec. Microb. 2-19-30 に記載されており、図７〜９に示されている。気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は図１０〜１３に示されている。
【００１１】
パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド配列は、パラ百日咳菌株、例えば、Ｉ−１４９８として１９９４年１２月２日にＣＮＣＭに寄託された第１号株、からのＤＮＡより通常の技術によって得ることができる。
【００１２】
本発明によるアミノ酸配列を百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＣｙａＡ遺伝子のＤＮＡから遺伝子工学により作製し、かつそれが百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの９８３位のアミノ酸又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの対応アミノ酸を有する場合には、この配列を、確実に、前述の株に由来するＣｙａＣ遺伝子をも発現する細胞性ホストにおいて産生させるように注意を払う。ＣｙａＣ遺伝子の発現は、残基９８３を含むアミノ酸配列の保全に必要な脂肪酸の付加による変性を可能にする。脂肪酸の付加は、例えば、パルミトイル化である。
【００１３】
ＣｙａＡ及びＣｙａＣ遺伝子を利用するために用いられる株は、例えば、Ｉ−１４８５として１９９４年１０月１９日にＣＮＣＭに寄託された百日咳菌ＨＡＶ、パラ百日咳菌Ｉ−１４９８及びＩ−８５８として１９８９年５月１２日にＣＮＣＭに寄託された気管支敗血症菌９７３Ｓである。
【００１４】
さらに、百日咳菌及び気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド配列が、それぞれ、図７〜９及び図１０〜１３に示されている。
【００１５】
ＣｙａＡ遺伝子を活性化するＣｙａＣ遺伝子のヌクレオチド配列は、Barry E. M. らの刊行物（Journal of Bacteriology, Jan. 1991, p. 720-726）に記述されている。
【００１６】
本発明の枠内において有利な配列は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域と名付けられた領域に相当する配列である（図１を参照）。
【００１７】
ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列に関して非相同の抗原性配列が存在する場合には、その配列は細菌性、ウイルス性もしくは寄生生物性の病原生物に由来する配列、特に、その配列に対する、例えば防御抗体の形成が求められる配列であればよい。
【００１８】
“百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体”という表現は、これらの細菌によって誘発される致死及び亜致死感染を防御する抗体、すなわち、この疾患及び感染を防御する抗体を意味するものと理解される。
【００１９】
前述の感染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能な本発明によるアミノ酸配列は、ボルデテラ属菌の病原性に関与する因子と関連があり、ホストにおける細菌の存続に対する防御を誘発する能力を有するポリペプチド製剤又は細菌抽出物の形態で用いられることが有利である。
【００２０】
本発明の枠内での有利なアミノ酸配列は、百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と等価の、もしくは類似する３次元構造を有するポリペプチドの形態にあり、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡９００位、特には９１０位、と大凡最終Ｃ−末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖を含むことを特徴とする配列であって、加えて、この配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間に、特には９８３位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列である。
【００２１】
このアミノ酸配列は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域を含む。
【００２２】
本発明による別の好ましいアミノ酸配列は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡最終Ｃ−末端アミノ酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成されることを特徴とする配列であって、この配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間に、特には９８３位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列である。
【００２３】
また、本発明が目的とするものは、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡４００位のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成される、前述の定義の範囲内のアミノ酸でもある。
【００２４】
このアミノ酸配列は、好都合なことに、百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌の型のボルデテラ属菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発し得るエピトープを有している。
【００２５】
本発明の別の態様によると、アミノ酸配列は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡５００位のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成されることを特徴とする。
【００２６】
３８５位ないし４００位又は３８５位ないし５００位のアミノ酸を有するこの配列は、それがボルデテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙにおいてとる構造と等価もしくは類似の構造で存在することが有利である。
【００２７】
また、本発明が目的とするものには、それが細菌、特には百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌から精製された配列であろうと、あるいは組換え蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから得られた配列であろうと、ボルデテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの配列からポリペプチド断片を欠失させることにより得られるアミノ酸配列でもある。
【００２８】
このようにして得られるアミノ酸配列は、図１に示されるΔＣｌａ断片の欠失により変性されたＡＣ−Ｈｌｙ鎖に相当する、ΔＣｌａと呼ばれる配列であって、前記ΔＣｌａ断片が百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の８２７位ないし８８７位のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に相当する配列であり、得られる配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位のアミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変性を受けているものであることが有利である。
【００２９】
本発明によるアミノ酸配列を形成するために、別の断片を欠失させることもできる；これは、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の３８５位ないし８２７位のアミノ酸鎖又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に相当するポリペプチド断片ΔＨであり、得られた配列は大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変性を受けている。
【００３０】
また、本発明が目的とするものは、大凡１０００位から１６００位のアミノ酸残基の間に、ボルデテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの“繰返し領域”を形成するアミノ酸配列でもある。気管支敗血症菌に由来する繰返し領域は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙと比較して繰返しが１つ少ない。これに関連して、本発明は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１５５２位ないし１５９２位のアミノ酸を含む配列に関する。
【００３１】
また、本発明は、前述のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にも関する。
【００３２】
気管支敗血症菌に由来するＣｙａＡ、ＣｙａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤを、大腸菌Ｋ１２ＸＬ１に組込まれたプラスミドｐＦＢＤ２にクローン化し、Ｉ−１６０１として１９９５年６月２１日にＣＮＣＭに寄託した。
【００３３】
このプラスミドｐＦＢＤ２は、ＣｙａＡ、ＣｙａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤ遺伝子を担持する気管支敗血症菌由来の８ｋｂ断片をＢａｍＨＩ部位に挿入することにより得られる。
【００３４】
さらに、本発明が目的とするものは、本発明による様々な型のボルデテラ属菌に由来する配列を含むポリペプチド組成物でもある。例えば、有利なポリペプチド組成物は、前に定義される百日咳菌由来の配列、又は他の配列、又はパラ百日咳菌に由来するこれらの配列の幾つかを含む。
【００３５】
本発明の別のポリペプチド組成物は、これらに加えて、気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を含む。
【００３６】
本発明の別の態様によると、ポリペプチド配列は、前に定義されるパラ百日咳菌に由来する１以上の配列及び気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を含むことを特徴とする。
【００３７】
また、本発明が目的とするものは、先行頁に定義される１以上の配列を含むことを特徴とする免疫組成物でもある。
【００３８】
ボルデテラ属菌による感染に対する防御、特にホストにおける細菌の残存に対する防御に有利であるために、本発明のアミノ酸配列を含む免疫組成物は、それに加えて、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来するｖｒｇ遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の一部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホストに免疫応答を誘発するに十分なだけ含有することを特徴としてもよい。
【００３９】
様々なアドヘシン（adhesins）及び毒素に加えて、ボルデテラ属菌はそれらの毒性に関与する因子の発現の調節によって特徴付けられる。換言すると、ボルデテラ属菌は相変異及び調節を受ける。
【００４０】
ボルデテラ属菌は、それらの環境に応じて、“無毒性”、すなわち、呼吸器感染のネズミモデルにおいて致死性、炎症反応及び肺の病変を引き起こすことができなくなり得る。これらは、相調節又は相変異のいずれかを受ける。相変異は１０-3ないし１０-6の範囲の頻度で観察され、実際には可逆的である。これは、前述の毒素及びアドヘシンの発現の停止と、未だによく特徴付けられていない他の因子の発現を生じる結果となる（第Ｉ相“毒性”細菌の第IV相“無毒性”細菌への変化）。第Ｉ相及び第IV相細菌は、Lacey B. 1960, J. Hyg, 58: 57-93に記述されている。表現型の上では相変異に類似する相調節は完全に可逆的であり、環境変化（培養培地の組成、温度等）の間のアドヘシン及び毒素の合成停止を生じる。
【００４１】
ボルデテラ属において観察される相変異及び相調節は、２つの調節遺伝子、ｂｖｇＡ及びｂｖｇＳの制御の下にある（Arico B et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6671-6675 ）。
【００４２】
ｂｖｇＳ遺伝子は外部環境に対して感受性の蛋白質をコードする。この蛋白質は、リン酸化により、ｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を制御する。このｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる蛋白質は、一方では、前述の毒性因子をコードする遺伝子（“ｖｉｒ活性化遺伝子”に対応してｖａｇ）の転写の正活性化因子であり（Uhl M. A. and Miller J, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1163-1167）、他方では、特定遺伝子の転写の抑制因子である（Beattie D. T. et al., J. of Bacteriology, Jan. 93, p. 159-527 ）。発現が抑制される遺伝子は“ｖｉｒ抑制遺伝子”に対応してｖｒｇと呼ばれ、未だにほとんど特徴付けられていない。しかしながら、百日咳菌に由来するｖｒｇ６遺伝子が、ホストにおける細菌の残存に関して役割があるタンパク質をコードすることが示されている（Beatties D. et al., 1992, Infect. Imm. 60: 571-577）。気管支敗血症菌では、ｖｒｇ遺伝子によってコードされる２つの蛋白質が特徴付けられている：これらは、鞭毛型の蛋白質である（第Ｉ相気管支敗血症菌は、鞭毛は合成しないがアドヘシン及び毒素は合成する非運動性細菌であり、第IV相気管支敗血症菌は鞭毛を合成する運動性細菌である）。
【００４３】
免疫組成物のおける、ｖｒｇ遺伝子の発現産生物を含む細菌抽出物の存在は、ワクチン投与した被検体において感染後に得られる体液性及び／又は細胞性免疫応答を増強することを可能とし、かつ細菌の残存に対する防御にも寄与する。
【００４４】
上で問題にされた、“ｖｒｇ細菌抽出物”と名付けられる細菌抽出物は、第IV相細菌、すなわちｖａｇ遺伝子を発現しない細菌、の外膜の成分をＬＰＳ内毒素を含めて全て含んでいる。しかしながら、この内毒素は、除去もしくは解毒することが可能である。
【００４５】
この抽出物は、懸濁液の形で存在してもよい。
【００４６】
本発明の実施に用いられる“ｖｒｇ”細菌抽出物は、好ましくは、“尿素抽出物”と呼ばれる抽出物である。
【００４７】
“尿素抽出物”は、細菌の表面に発現し、５Ｍ尿素と共にインキュベーションした後に細菌から分離される蛋白質の混合物を含んでなる。“ｖｒｇ”尿素抽出物は、未だ特徴付けられていない幾つかの蛋白質、鞭毛及びＬＰＳを含有している。
【００４８】
尿素抽出物を用いることにより、抽出物中に含まれる蛋白質から得られる純粋な形のワクチンと比較して安価なワクチンを製造することが可能となる。
【００４９】
加えて、本発明者らは、用いられた尿素抽出物がＴ型細胞免疫応答（リンパ球増殖）を誘発し、したがって現在まで用いられている細胞性ワクチンと同様に振る舞うことを観察している。
【００５０】
対照的に、排他的な無細胞組成物は、感染に際してその反応が起こるにもかかわらず、Ｔ応答を誘発することはないと考えられている。
【００５１】
ｖｒｇ尿素抽出物は、第IV相細菌から別々に調製される。適当である場合には、この第IV相細菌を、細菌がｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白質のみを発現するようにｂｖｇＳ遺伝子が変異を受けている細菌に置き換える。
【００５２】
これらの抽出物の調製は、実験の部に詳細に記述されている。
【００５３】
このように、本発明は、好ましくは、百日咳菌に由来するｖａｇ尿素抽出物及び百日咳菌に由来するｖｒｇ尿素抽出物の両者を含有する免疫組成物に関する。これらの抽出物の調製に適する百日咳菌株は、本発明の枠内にあり、かつＩ−１４８５として１９９４年１０月１９日にＣＮＣＭ（パリのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes ）に寄託されているＨＡＶ株である。ＨＡＶ株は第Ｉ相株であるため、ｖａｇ尿素抽出物の調製に直接用いることが可能である。
【００５４】
他方、ｖｒｇ尿素抽出物は第IV相株から得られる。この第IV相株は、第Ｉ相株から、百日咳菌ｖｒｇ遺伝子のみの発現が得られるように、例えば、細菌に由来するｂｖｇＳ遺伝子を変異させることにより、あるいは、硫酸マグネシウムのみを含有する培地中で第Ｉ相株を培養することにより、誘導される。
【００５５】
同様にして、免疫組成物が投与されるホストにおける免疫応答を改善することが適当である場合には、後者は、それらに加えて、ＦＨＡ、ＡＧＧ類もしくはＰＲＮ及びＰＴＸ又はこれらの蛋白質の一部から選択される、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する１以上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出物が投与されるホストにおける免疫応答を誘発するに十分なだけ含有する。
【００５６】
ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミノ酸配列及び、適当であるならば、ｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質は、Ｉ−１４８５としてＣＮＣＭに寄託されているＨＡＶ株から得ることが有利である。
【００５７】
同様に、本発明の枠内において用いられるパラ百日咳菌に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−１４９８としてＣＮＣＭに寄託されている第１号株から得られる。
【００５８】
さらに、本発明の枠内において用いられる気管支敗血症菌株に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−８５８としてＣＮＣＭに寄託されている９７３５株から得ることができる。
【００５９】
様々なボルデテラ属菌株に対して上に与えられる参照符号は、これらの蛋白質の配列を利用する機会を与え、適当である場合には、化学合成によりこの配列を再現し、あるいは、ボルデテラ属菌に由来する蛋白質の蛋白分解により本発明のアミノ酸配列を得、あるいは、これらの株のＤＮＡの利用機会を与え、それにより遺伝子工学手法によって本発明のアミノ酸配列の生成を可能とするために示されている。
【００６０】
また、本発明が目的とするものは、活性成分として上に定義される免疫組成物を、薬学的に許容し得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に含有するワクチン組成物でもある。
【００６１】
また、本発明は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ、パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及び気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識するモノクローナル抗体の調製方法であって、
−  動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合には、この免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工程、
−  免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成する工程、
−  このハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培養する工程、
−  百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、
を包含する方法に関する。
【００６２】
上記方法は、免疫に百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙに特異的な抗原を用いることにより、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ並びにパラ百日咳菌及び気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの両者を認識するモノクローナル抗体を得ることを有利に可能とする。加えて、このようなモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌型のボルデテラ属菌によるヒトもしくは動物ホストの感染に関する防御能力を有利に有している。したがって、上記方法を用いて得られるモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属菌の１以上の株に感染した患者又は動物の治療に用いることができる。
【００６３】
一般に、本発明が目的とするものは、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミノ酸配列を認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。
【００６４】
これに関連して、本発明は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５−４００位アミノ酸配列を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体であって、Ｉ−１７３４として１９９６年６月１９日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＢ５−４によって産生されるモノクローナル抗体に関する。
【００６５】
別の有利なモノクローナル抗体が、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸の配列に対して、Ｉ−１７３３として１９９６年６月１９日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２１によって産生される。
【００６６】
また、本発明が目的とするものは、上述のあらゆるアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体でもある。ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端配列に特異的なモノクローナル抗体は、本発明の有利な抗体のうちの１つである。特別な抗体は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸、特には百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８８位ないし１７０５位のアミノ酸又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８９位ないし１７０６位のアミノ酸を含む対応鎖から誘導される配列に対するものである。これらのモノクローナル抗体は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの大凡３８５位ないし４００位のアミノ酸配列に含まれるエピトープに対して得られるモノクローナル抗体について上述したものと類似の方法により調製することができる。
【００６７】
本発明の抗体は、例えば、抗体機能のないヒト免疫グロブリンの超可変部分を、上述の手法により得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変領域と置換することにより、ヒト化することが可能である。
【００６８】
抗体のヒト化を可能にする手法は、例えば、Waldmann T.,June 1991, Science, vol. 252, p.1657-1662 ；Winter G. et al., 1993, Immunology Today, vol. 14, No. 6, p. 243-246；Carter et al., May 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285-4289；Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immunology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2875 に記述されている。
【００６９】
また、本発明が目的とするものは、動物を上述の定義に相当するアミノ酸配列で免疫し、免疫に用いた配列を認識し得る形成抗体を回収することにより得られるポリクローナル血清でもある。
【００７０】
適当であるならば、この免疫には、アミノ酸配列と共に、アジュバントの投与が含まれる。
【００７１】
本発明の特定の態様によると、免疫は、１以上のアミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙの様々な抗原を含む免疫組成物で行われる。
【００７２】
また、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を活性成分として含有する医薬組成物にも関する。
【００７３】
これらの抗体、特に、３８５位ないし４００位のアミノ酸を含む配列に対する抗体及び／又はＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質のＣ−末端部分に対する抗体は、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌に感染したホストに対する免疫療法における医薬品として用いることができる。
【００７４】
例えば、Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２１によって産生されるモノクローナル抗体が用いられる。
【００７５】
本発明による抗体は、採取されたボルデテラ属菌株の分析手段として用いることもできる。したがって、ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の３５８位ないし４００位のアミノ酸配列又はＣ−末端配列に対するモノクローナル抗体は、百日咳菌株の分析に適している。
【００７６】
ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物からの生物学的流体サンプルを上に定義されるモノクローナル抗体又は上に定義されるポリクローナル血清と接触させ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合には、前記モノクローナルもしくはポリクローナル抗体とボルデテラ属の細菌との免疫学的反応を検出することを特徴とする方法も、本発明の枠内にある。
【００７７】
ボルデテラ属の細菌、特に百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌による感染の検出は、被検サンプルを上述の定義に相当するアミノ酸配列と接触させ、次いで前記アミノ酸配列と被検サンプル中に存在する抗体との免疫学的反応を検出することにより、患者もしくは動物からの生物学的流体サンプルについて行うこともできる。
【００７８】
また、本発明は、上述のヌクレオチド配列を活性成分として含有する医薬組成物にも関する。
【００７９】
医薬組成物におけるヌクレオチド配列の利用は、Donnellyらによって記述される手法（Nature M馘ecine, 1995, vol. 1, No. 6, p. 583-587）を参照して行うことができる。
【００８０】
【実施例】
材料及び方法
細菌株、プラスミド及び増殖条件：
毒性株百日咳菌１８３２３（ＡＴＣＣ９７９７）を、１５％脱繊維素ヒツジ血液を補足したボルデット・ジェンゴウ（Bordet Gengou ）寒天培地（ＢＧ）で、３６℃で７２時間培養し、再度２４時間培養した。液体培地中での副次培養を、Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（Stainer D. W. and Scholte M. J., 1971, J. Gen. Microb., 63: 211-220 ）において３６℃で２０時間、６５０ｎｍでの光学密度が１．０（ＯＤ620 ＝１．０）になるまで行った。
【００８１】
大腸菌内での組換え蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及びその切詰められた派生物の産生に用いられるプラスミドは下記刊行物に記載されている：Betsou F., P. Sebo and N. Guiso, 1993,  ＣｙａＣ−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要である（CyaC-mediated activation is important not only for toxic but also for protective activities of Bordetella pertussis adenylate cyclase-haemolysin）, Infect. Immun. 61: 3583-3589；Iwaki M., Ullmann A. and P.Sebo, 1995,  “百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素のオリゴマー化：個々に不活性化した変異体の生体外補足からの証拠”（"Oligomerization of the adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis: Evidence from in vitro complementation of individually inactive mutants" ）. 投稿済み；及びSebo P., P. Glaser, H. Sakamoto and A. Ullmann, 1991, 再構築大腸菌システムにおける百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素の高レベル合成（High level synthesis of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis in a reconstructed Escherichia coli system）, Gene 104: 19-24 。
【００８２】
これらのプラスミドは、活性化蛋白質ＣｙａＣの存在下での様々な蛋白質（図１）の生成を可能とする。それぞれのプラスミドを有する大腸菌ＸＬ−１ブルー株（Stratagene）を、３７℃で、１００μｇ／ｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地において、０．５ないし０．７の光学密度ＯＤ600 で培養し、ＡＣ−Ｈｌｙを産生させるためにＩＰＴＧ（１ｍＭ）でさらに４時間誘発した（Betsou F., P. Sebo, and N. Guiso, 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。
【００８３】
アデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞毒性活性の試験
アデニレートサイクラーゼ活性は、Ladant D., C. Brezin, I. Crenon, J. M. Alonso,及びN. Guiso（1987, 百日咳菌アデニレートサイクラーゼ：精製、特徴付け及びラジオイムノアッセイ（Bordetella pertussis adenylate cyclase: purification, characteriation and radioimmunoassay）, J. Biol. Chem. 261: 16264-16269 ）によって記述された手順に従って測定した。１ユニット（Ｕ）のアデニレートサイクラーゼ活性は、３０℃、ｐＨ８．０で１分当たりに１ナノモルのｃＡＭＰが形成されることに相当する。ＡＣ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性活性は、Bellalou J., H. Sakamoto, D. Ladant, C. Geoffroy  及び A. Ullmann の記述（1990, 百日咳菌の溶血及び毒性活性に影響を及ぼす欠失（Deletions affecting haemolytic and toxin activities of Bordetella pertussis adenylate cyclase ）, Infect. Immun. 58: 3242-3247）に従い、洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ／ｍｌ）を用いて３７℃で決定した。蛋白質濃度は、Bradfordの方法  （蛋白質−染料結合の原理を利用する、マイクログラムの蛋白質の迅速かつ高感度の定量方法（A rapid and sensitive method for the quantification of micrograms of protein, utilizing the principle of protein-dye binding）. Anal. Biochem. 72: 248-257）によって決定した。
【００８４】
アデニレートサイクラーゼ阻害の試験
１００Ｕ／ｍｌの百日咳菌に由来する精製ＡＣ−Ｈｌｙを、ｐＨ７．６の５０ｍＭトリス−ＨＣｌにおいて、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 及び０．１  ＮＰ−４０、並びに１００倍に希釈した様々な血清と共に、４℃で１８ないし２０時間インキュベートした；インキュベーション後のサンプルのアデニレートサイクラーゼ活性（ＩＡ）を測定した。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウスからの血清と共にインキュベートした後のＡＣ（アデニレートサイクラーゼ）活性（ＣＡ）を、活性１００％（換言すると阻害０％）の基準として採用した。
ＡＣ活性の阻害パーセンテージを以下のように算出した：
阻害％＝１００％−（１００％×ＩＡ／ＣＡ）
【００８５】
溶血活性阻害の試験
１ユニット（Ｕ）の毒素及び５μｌの様々な血清を、１ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中において、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１μＭウシ脳カルモジュリンと混合し、４℃で２０分間予備インキュベートした。洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ）を添加し、室温で３時間インキュベートした後に残存する溶血活性を決定した。未溶解の赤血球を２０００ｒｐｍで遠心した後にペレットの形で回収し、上清中に放出されたヘモグロビン（ＲＨ）の光学密度を５４１ｎｍで測定した。水酸化アルミニウムのみで免疫されたマウスの血清と共にインキュベートした毒素の溶血活性（ＣＨ）を、活性１００％（阻害０％）の基準として採用した。毒素なしでインキュベートしたヒツジ赤血球を非特異的溶解についての対照として用いた。溶血活性の阻害パーセンテージを以下のように算出した：
阻害％＝１００％−（１００％×ＲＨ／ＣＨ）
【００８６】
細胞毒性活性阻害の試験
１ユニット（Ｕ）の毒素及び５μｌの様々な血清を、総容量１ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８において、２ｍＭ  ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び１μＭウシ脳カルモジュリンと共に、４℃で２０分間予備インキュベートした。次いで、１０9 個の洗浄したヒツジ赤血球を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続した。毒素の活性を停止させるため、赤血球懸濁液をｐＨ５．２の５０ｍＭ沸騰酢酸ナトリウム１ｍｌに注入し、１００℃で５分間加熱した。溶血した赤血球中に形成されたｃＡＭＰの量（ＩＴ）を、標準ＥＬＩＳＡ法（Pradelles P. Grassi J. Chabardes D., Guiso N. 1989, Analytical Chemistry, 61: 447-450 ）により決定した。４℃でインキュベートした毒素を細胞毒性の陰性対照として用いた。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウスの血清と共にインキュベートした毒素の活性（ＣＴ）を活性１００％（阻害０％）と想定した。細胞毒性活性の阻害パーセンテージを以下のように算出した：
阻害％＝１００％−（１００％×ＩＴ／ＣＴ）
【００８７】
電気泳動及び免疫ブロッティング法
ファストシステム（PhastSystem ）（Pharmacia ）用の８−２５％調製済み  （ready-for-use ）ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、分離した蛋白質をポリアクリルアミドゲルからハイボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（Amersham）に電気移動（electrotransferred）させた。ブロックした後、この膜を、１０-3の希釈率で、ポリクローナル血清と共に、４℃で一晩インキュベートした。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン及び増強化学発光システム（ECL-Amersham）を用いて免疫化学検出を行った。
【００８８】
ＡＣ−Ｈｌｙの生成及び精製
Guiso N., M. Szatanik 及びM. Rocandourt によって記述される方法（1991, 細菌コロニー形成に対するボルデテラ属菌アデニレートサイクラーゼの防御活性（Protective activity of Bordetella adenylate cyclase against bacterial colonaization ）. Microb. Pathog. 11: 423-431 ）に従って、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙ、大腸菌から産生されるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（組換えＡＣ−Ｈｌｙ）及び様々な組換え切詰め蛋白質を尿素を用いて細菌から抽出し、カルモジュリン・アフィニティカラムで精製した。これらの酵素調製品を、８Ｍ尿素中に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2 と共に−２０℃で保存した。全ての調製品を、それらの純度を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。
【００８９】
能動免疫化
ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた蛋白質の精製調製品を水酸化アルミニウム（２５０μｇ／ｍｌ）に６０μｇ／ｍｌ吸着させた。能動免疫化を行うため、３ないし４週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（CERJ, St Berthevin, France）を、１５μｇの蛋白質抗原を２週間の間隔をおいて２回皮下注射することにより処置した。対照には、水酸化アルミニウムを含むバッファのみを投与した。次いで、最後の注射の１週間後に、存在する循環抗体を入手することが可能となるように、これらのマウスから血液を抜いた。第２の免疫化の２週間後に亜致死呼吸器感染が達成された。
【００９０】
マウスの鼻腔内感染
前掲の記載に従って百日咳菌をボルデット・ジェンゴウＢＧ培地で４８時間培養し、細菌を１％カザミノ酸に再懸濁した。この細菌懸濁液５０μｌを鼻腔内注入することにより亜致死量を投与した。暴露の１時間後（“第０日”で示される時点）及び第０日後の異なる日（各ステージの間に６匹のマウス）に、頚部脱臼により感染マウスを殺した。切除により肺を採取し、組織破砕器を用いて塩中にホモジナイズした。均質肺調製品の希釈物をＢＧ培地にサンプリングし、３６℃で３日間インキュベートした後にコロニー形成単位（ｃｆｕ）の計数を行った。全ての実験は少なくとも２回行い、一貫性のある結果を得た。
【００９１】
免疫血清の調製
感染マウスから血清を得るため、Guiso N. Rocancourt, M. Szatanik及びJ. M. Alonsoによって記述された手法（1989, ボルデテラ属菌アデニレートサイクラーゼは毒性関連因子及び防御抗原である（Bordetella adenylate cyclase is a virulence associated factor and a protective antigen）, Molec. Pathog. 7: 373-380 ）に従い、１０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週齢）を２×１０5 毒性百日咳菌を鼻腔内投与することにより感染させた。感染の１４日後又はこれらの１４日に続く異なる指定日に、これらのマウスの血液を抜いた。
【００９２】
ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた派生物に対するマウスポリクローナル血清を、考慮される抗原の各々でのマウスへの第２の注入の１週間後に採取した。
【００９３】
感染患者の血清を、百日咳菌に感染した１０名の選ばれた非ワクチン投与の小児からのポリクローナル免疫血清を混合することにより調製した。これらの小児は、彼らの体内に母親の抗体が存在するのを排除するために８月齢を越えたものであり、かつ彼らの病歴を確実なものとするために２歳未満であった。
【００９４】
結果
ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質及びその切詰められた変種の免疫学的特性
百日咳菌からＣｙａＣ蛋白質を介して生じるＡＣ−Ｈｌｙの変性はその防御活性に必須のものであることが過去に示されている（Betsou et al.,  ＣｙａＣ−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要である, Infect. Immun. 61: 3583-3589) 。したがって、この変性自体がその直鎖状形態における防御エピトープの形成に寄与するのかどうか、あるいは、この変性が防御エピトープの表出に必要な変性である毒素における構造的な変性を誘発するのかどうかを決定することが重要である。このため、多数の切詰められた蛋白質の免疫学的特性及び防御特性を調べた；問題となる切詰められた蛋白質を図１に模式的に示す。
【００９５】
これらの蛋白質は、変性部位を有する構築物のＣｙａＣによる脂肪酸鎖でのアシル化が可能となるように、ＣｙａＣ蛋白質の存在下において、プラスミドｐＣＡＣＴ又はｐＤＩＡを用いて、大腸菌内で生成した。図２（Ａ）に示されるように、全ての蛋白質から精製された調製品は、期待される分子量に相当する主要ポリペプチドを含んでいた。これらの蛋白質を、様々な血清によるそれらの認識を確かめるため、ウェスタン・ブロット試験でチェックした。図２（Ｂ）に示されるように、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して生成された血清はｒ−ＡＣ−Ｈｌｙを認識し、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから派生した全ての切詰められた形態の他に、百日咳菌から精製されたＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質をも認識した。図２（Ａ）によると、蛋白質の全長を含む精製ポリペプチド調製品、換言すると、ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ並びに切詰められたポリペプチドΔＣｌａ及びΔＣ２１７の調製品もまた、精製蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して得られたポリクローナル血清によって認識される幾つかの断片を有していた（図２（Ｂ））。ＡＣ−Ｈｌｙのアデニレートサイクラーゼ・ドメインに対して特異的に調製されたモノクローナル抗体（図２）もまた、ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣｌａ及びΔＣ２１７のこれらの断片を認識した。これは、これらの断片が、Ｃ−末端部分が切詰められ、カルモジュリン−寒天でＡＣ−Ｈｌｙと共に精製されるＡＣドメインを有する蛋白分解断片であることを示している。しかしながら、このモノクローナル抗体は、残基３８５ないし８２８及び１４８９ないし１７０６をそれぞれ欠いている蛋白質ΔＨ又はΔＨＲ２は認識しなかったが、蛋白質ΔＣ１３０７は認識した。特にこれらの観察を用いて、本発明者らは、３８５位ないし４００位のアミノ酸の間に位置する分子領域がエピトープの形成に関与していることを確証した。
【００９６】
極めて顕著に、しかも抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清で起こり得ることとは対照的に、感染した小児から得られ、混合物の形態で用いられる血清は、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣドメインを認識せず（ΔＣ１３０７；ライン７）、ＡＣ−Ｈｌｙの２１７末端残基を欠く蛋白質（ΔＣ２１７；ライン６）も、最後の２１７残基は有するものの疎水性領域は欠いている（これは、変性を受けており、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域の主要部分である）蛋白質（ΔＨＲ２；ライン３）も認識しなかった。しかしながら、これらのヒト血清は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（図２（Ｄ）、ライン１及び２）及び変性を受け、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域（最後の９００残基）を有する２つの切詰められた蛋白質（図２（Ｄ）、ライン４及び５）を認識した。百日咳菌１８３２３（参照株）で感染させ、感染後迅速に（第１４日）に採取したマウス血清でも同様の認識パターン（図２（Ｆ））が得られた。感染から長期間経過した後（第３５日）に採取された血清は、依然としてＡＣドメイン（図２（Ｆ）、ライン７）及び最後の２１７残基のみを欠く蛋白質ΔＣ２１７（図２（Ｆ）、ライン６）を認識しなかったものの、蛋白質ΔＨＲ２（図２（Ｆ）、ライン３）に存在するＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分を認識した。これらの結果は、百日咳菌での感染後に合成される抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域を含むＣ−末端領域（最後の９００残基）に優先的に向けられたものであることを強く示唆している。さらに、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ２１７も、最後の２１７残基を有するタンパク質ΔＨＲ２も、免疫及びネズミ血清では認識されなかった。これは、これらのポリクローナル血清が、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域の特定の構造であって、２つの非重複欠失のいずれによっても破棄される構造を認識することを示唆している。
【００９７】
感染患者又はマウスからの血清が、蛋白質の全長に亘って伸びるポリペプチド（ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣｌａ及びΔＨ）のみを認識し、それらの蛋白分解断片を認識しなかったことに注目することが重要である。これに加えて、これらの血清が、ＡＣドメインを含み、それらのＣ−末端部分で開裂している蛋白分解生成物を認識しない（上記図２（Ｃ）を参照）ことは、これらの血清によって認識されるためにはＡＣ−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域（最後の９００残基）が無傷でなければならないことを示している。
【００９８】
ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた派生体に対する血清によるアデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞毒性活性の阻害
百日咳菌に感染したマウスからの血清、又は百日咳菌に感染したヒト患者からの血清、あるいは精製された切詰め蛋白質で免疫することにより得られる、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙの様々な切詰め形態に対するポリクローナル抗体が、毒素の活性の１つを特異的に阻害し得るかどうかを調べた。これらの実験に先立って対照が必要であったため、完全なｒ−ＡＣ−Ｈｌｙをこれらの試験の被覆抗原として用いて、様々な血清のＥＬＩＳＡ力価を決定した。これらの力価は、抗−ΔＣ１３０７血清を用いて得られる力価を除いて類似していた。この抗−ΔＣ１３０７血清は、他の血清と同様にウェスタン・ブロットにおいてはＡＣ−Ｈｌｙを認識したが、ＥＬＩＳＡにおいてはＡＣ−Ｈｌｙを認識しなかった。図３に示されるように、アデニレートサイクラーゼ活性は、マウスを精製ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた派生蛋白質で免疫した後に得られる血清の全てで阻害された。しかしながら、感染マウス又は感染ヒト患者からの血清で、同様の条件下において、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣ活性を阻害したものはなかった。これは、これらの血清が、ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分（最後の９００残基）を優先的に指向するが、ＡＣドメインは指向しない抗体を含むことを示すウェスタン・ブロット分析によって得られた結果（上記参照）と一致する。実際、蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性が、感染小児からの血清と、より弱くではあるが、感染マウスからの血清とによって阻害された。しかしながら、百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２で免疫することにより得られる抗血清を用いて、溶血活性の強い阻害が観察された（図４）。この阻害は、恐らく、ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分に対する特異的抗体の存在によるものである。実際、そのような抗体を欠く、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣドメインに対する抗−ΔＣ１３０７血清は、ＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。あらゆる点で有利な様式において、最後の２１７残基のみを欠く蛋白質ΔＣ２１７に対する血清は、測定し得るレベルではＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。これは、最後の２１７残基が、中和抗体の標的であるか、もしくはＡＣ−Ｈｌｙの別の部分に対する中和抗体の合成に都合の良い構造の形成に関与しているかのいずれかであることを示している。総合すると、これらの結果は、さらに加えて、感染後に合成される抗体は主としてＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端ヘモリシン部分を指向するものであって、この蛋白質の溶血活性を中和することは可能であるが、そのＮ−末端アデニレートサイクラーゼ・ドメインの酵素活性を中和するものではないことを示している。図５に示されるように、無傷のＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた蛋白質ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２に対して得られる血清で、ＡＣ−Ｈｌｙの細胞毒性の有意の阻害が観察されている。これらの蛋白質は全て、ＡＣドメイン及び最後の２１７残基の両者を有している。また、これらの抗血清は、ＡＣ及び溶血活性をも中和した。反対に、溶血活性のみ（例えば、感染マウスまたは患者からの血清）又はＡＣ活性のみ（抗−ΔＣ１３０６及び抗−ΔＣ２１７血清）のいずれかを阻害する２種の血清は、ＡＣ−Ｈｌｙの細胞毒性活性を阻害しなかった。したがって、その細胞毒性活性を中和するためには、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣドメイン及び最後の２１７残基に対する抗体の存在を必要とする可能性があるように思われる。
【００９９】
様々な組換えＡＣ−Ｈｌｙ構築物の防御活性
防御活性を得るために必要なＡＣ−Ｈｌｙのエピトープを突き止めるために、ネズミ呼吸器モデルを用いて、様々な精製された切詰め蛋白質の防御活性を試験した。複数群のマウスを、水酸化アルミニウム単独（対照）、または水酸化アルミニウムに吸着させた精製切詰め蛋白質で２回免疫した後、これらのマウスを、鼻腔内経路を介して、亜致死用量の毒性百日咳菌１８３２３株と接触させた。このモデルは、マウスの呼吸器系における細菌の吸着、コロニー形成、生存及び増殖の能力を反映する。図６に示されるように、細菌は感染の６日後に対照マウスの肺内で急速に増殖した後、肺から除去され始める。百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙまたはｒ−ＡＣ−Ｈｌｙで免疫したマウスの肺においては細菌の増殖は観察されず、３日後に細菌の数が増加し始めた（図６）。以前の観察（Betsou F., Sebo and N. Guiso, 1993, ＣｙａＣ−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要である, Infect. Immun. 61: 3583-3589）と一致して、百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙの防御効力はｒ−ＡＣ−Ｈｌｙよりも高かった。ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙによって誘発される防御に類似する防御が蛋白質ΔＣｌａでも得られた。これは、残基８２７ないし８８７の蛋白質ΔＣｌａにおける欠失部分が、防御免疫の誘発に必須ではないことを示唆している。残基３８５ないし８２８が失われている蛋白質ΔＨは、ΔＣｌａよりは弱い防御活性を示す。ＡＣ−Ｈｌｙのヘモリシン部分全体を欠く蛋白質ΔＣ１３０７では防御は誘発されなかった。より有利な様式において、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ２１７及び最後の２１７残基を有するタンパク質ΔＨＲ２は、防御の誘発を可能にすることができなかった。したがって、防御活性は、感染患者もしくは感染マウスからの血清による個々の構築物の認識パターンと相関する。
【０１００】
検討
ＡＣ−Ｈｌｙに対する抗体は、通常、感染小児の血清中に存在し（Arciniaga J. L., E. L. Hewlett, F. D. Johnson, A. Deforest, S. G. F. Wassilak, I. M. Onorato, C. R. Manclark and D. L. Burns, 1991, J. Infect. Dis. 163: 135-142；及びGuiso N., E. Grimprel, I. Anjak and P. B馮u 1993, Eur. J. Clin. Microbiol. and Infect. Dis. In Press）、ＡＣ−Ｈｌｙでの免疫化がボルデテラ属菌によるコロニー形成からマウスを防御することが過去に示されている（Khelef, N., H. Sakamoto and N. Guiso, 1992, Microb. Pathog. 12: 227-235 ）。一組の切詰められた形態の組換えＡＣ−Ｈｌｙを生成させることにより、ＡＣ−Ｈｌｙのワクチン投与による防御免疫の誘導におけるこの蛋白質の様々なドメインの重要性の研究を行うことが可能となっている。上に提示される結果は、百日咳菌に感染した後に合成される抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体が、主に、ＡＣ−Ｈｌｙの変性ドメイン及び繰返しドメイン（約８００残基）を指向することを示している。実際、損なわれていないこれらの領域を有する切詰められた形態のＡＣ−Ｈｌｙのみがウェスタン・ブロットにおいて感染マウス及び患者の血清によって認識され、これらの蛋白質のみがマウスにおける防御を誘発する能力を示すものであった。これは、少なくともマウスの場合において、同一もしくは重複するエピトープの比較的限定された組が、感染被験者による抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体の合成の誘発及びＡＣ−Ｈｌｙのワクチン投与の後に得られる防御抗体の合成の誘発の両者に有利であることを示している。従来報告されている実験は、９８３位リシン残基のレベルでのＣｙａＣ遺伝子発現の産生物による蛋白質の変性部位に対して、末梢位置にあるＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を除去することで、感染マウス及び患者の血清によるこの蛋白質（ΔＣ２１７）の認識が無効となり、その防御活性もが無効となったことを示している。しかしながら、これは、この蛋白質ΔＣ２１７が蛋白質ＣｙａＣの存在下において産生された場合には脂肪酸鎖のレベルでアシル化されているので、蛋白質ΔＣ２１７の変性の欠如によるものではなかった。さらに、この２１７残基それ自体は、それらが変性部位（リシン９８３）及び繰返し領域の大部分を欠く蛋白質ΔＨＲ２中に存在する場合には、血清によって認識されず、いかなる防御活性をも示さなかった。
【０１０１】
これは、最後の２１７残基及び変性領域の両者がＡＣ−Ｈｌｙの防御活性に重要であるという結論に繋がった。このように、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域と最後の２１７残基との相互作用がＡＣ−Ｈｌｙの防御エピトープの形成または活性に必要である。驚いたことに、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ２１７も、変性領域及び繰返しの大部分を欠くが最後の２１７残基は有する蛋白質ΔＨＲ２も、感染患者及び／又はマウスのポリクローナル血清（新鮮な血清）によっては認識されなかった。この抗血清は、蛋白質ΔＣ２１７及びΔＨＲ２に存在する繰返し領域の区切りの点（breakpoint）に位置する単一のエピトープ又はエピトープの小群に対する狭い特異性を有する可能性がある（１４８９位プロリン）。しかしながら、この可能性は、混合ポリクローナル抗血清ではそれほど確かであるようには見えない。加えて、感染したヒト患者及びマウスの血清は、様々な蛋白質の完全長ポリペプチドのほとんどを感染したが、これらの調製品中に存在する、抗−ＡＣモノクローナル抗体によっては認識される開裂Ｃ−末端蛋白分解断片は認識しなかった。これらをまとめると、これらの結果は、ＡＣ−Ｈｌｙ上での防御エピトープの形成及び感染被験者の血清によるＡＣ−Ｈｌｙの認識に、ＡＣ−Ｈｌｙの変性及び繰返し領域が存在する場合にのみ形成される特定の構造の存在が必要とされることを示唆している。この構造の形成にＡＣ−Ｈｌｙの翻訳後のアシル化による９８３位リシン残基での脂肪酸鎖の変性が必要であり、それがＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分の除去によって無効となる可能性が考えられる。これに関して、ＡＣ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性活性の両者が、非変性分泌シグナルを含むＡＣ−Ｈｌｙの最後の７５残基が除去された場合に失われ、孔（pores ）（４及び２９）の形成活性に直接関与しないことは重要である。これらの観察は、これらに加えて、ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端領域の最後の部分がＡＣ−Ｈｌｙ全体の構造において必要不可欠な役割を果たしているという仮定を支持する。
【０１０２】
ＡＣ−Ｈｌｙの主要防御エピトープがＡＣ部分に位置する可能性があることは既に示唆されている（Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik and J. M. Alonso, 1989, Molec. Pathog. 7: 373-380 及びGuiso, N. M. Szatanik and M. Rocancourt, 1991, Microb. Pathog. 11: 423-431）。ここに提示される結果は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性及び繰返し領域に亘るＡＣ−Ｈｌｙ断片の混入が、当該技術分野の従来の状況において記述される調製品中に存在するＡＣドメイン断片に関連する防御活性の生成の要因である可能性を示している。それでもやはり、少量のこれらの混入の防御活性を生じる能力には疑わしいものがある。別の解釈は、特定に条件下において、３８５位ないし４５０位又は５００位アミノ酸の領域もＡＣ−Ｈｌｙの防御活性において役割を果たし得るというものである。ＡＣ−Ｈｌｙのこの領域の構造は、最後の２１７アミノ酸残基の非存在下、又はアシル化の非存在下において、変性させることが可能である。４０−５０ｋＤａのＮ−末端部分の構造及び免疫系への呈示は、この構造が開裂している場合、百日咳菌培養上清におけるＡＣ−Ｈｌｙ分子の残りの部分に関する防御を誘発することが可能である。この仮定に対する説明の１つは、３８５位から４００位アミノ酸の間に位置する分子の一部に対するモノクローナル抗体が防御抗体であるというものである。
【０１０３】
また、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから得られる切詰められた蛋白質の生体内における防御活性と、毒性活性を中和し得る抗体の合成を誘発する生体外におけるその活性との間に相関が存在するかどうかも調べた。そのような相関は確立されなかった。防御活性を有する蛋白質の全てが中和抗体の合成を誘発したが、全く防御しない蛋白質ΔＨＲ２が強力な中和抗体応答を誘発した。これは、ＡＣ−Ｈｌｙの毒性活性に関する中和抗体の存在が、百日咳菌の感染に対する防御の誘発の信頼できる基準ではないことを示唆している。
【０１０４】
疎水性ドメインの一部を欠く蛋白質ΔＣｌａが防御活性を示すことに留意することがより重要である。この組換え蛋白質は、残留する細胞毒性活性を示さないため、百日咳に対する無細胞ワクチンに含める含有物の良い候補である。
【０１０５】
ｖｒｇ尿素抽出物の調製
同じ３つの第IV相細菌種、すなわち、もはやいかなるｖａｇ遺伝子をも発現しないがｖｒｇ遺伝子は発現する細菌からｖｒｇ尿素抽出物を調製する。これらの遺伝子の産生物は、気管支敗血症菌の鞭毛を除いて、未だによく特徴付けられていない。ｖｒｇ尿素抽出物はｖａｇ尿素抽出物と同様に調製する。
【０１０６】
培養培地の説明
0004302784.tif 000002
ｐＨを７．４に調整
−加熱
−１２０℃で１５分間オートクレーブ処理
−４℃で保存
使用時：
ボルデット・ジェンゴウを１５％ないし２０％ヒツジもしくはウマ血液で富化させる。管を溶融し、５４℃で溶融状態を維持する。各管に、無菌的な方式で、２．５ｍｌのヒツジ血液を添加する。管の内容物を無菌ペトリ皿に注ぐ。
注：
鼻咽頭サンプルからの百日咳菌の同定については、新たな皿を用いる（最大４℃で７日間）。
【０１０７】
ＣＳＭ寒天培地
１０倍濃縮溶液２リットルを調製するため：
グルタミン酸水素ナトリウム
（参照プロラボ（Prolabo ）番号２７８７２．２９８）．．．１０７ｇ
Ｌ−プロリン
（参照メルク（Merck ）番号７４３４）．．．．．．．．．．２．４ｇ
ＮａＣｌ
（参照プロラボ番号２７８１０．２９５）．．．．．．．．．２５ｇ
Ｈ2 ＰＯ4 
（参照プロラボ番号２６９２６．２９８）．．．．．．．．．．５ｇ
ＫＣｌ
（参照プロラボ番号２６７５９．２９１）．．．．．．．．．．２ｇ
ＭｇＣｌ2 
（参照プロラボ番号２５１０８．２９５）．．．．．．．．．．１ｇ
トリス−塩基
（参照メルク番号８３８２．２５００）．．．．．．．．．１５．２ｇ
カザミノ酸
（参照ディフコ（Difco ）番号０２８８−０１−２）．．．．．．５ｇ
ＣａＣｌ2 の１％熱分解水溶液
（参照プロラボ番号２２３１７．２９７）．．．．．．．．．２０ｍｌ
熱分解水                                全量．．．．．．１リットル
これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。塩酸でｐＨを７．４に調整する。最終容量まで満たし、−２０℃で保存する。
【０１０８】
−使用時に：
−１０倍濃縮溶液１００ｍｌ
−熱分解水９００ｍｌ
−（２，６−Ｏ−ジメチル）シクロデキストリン、参照アルドリッチ（Aldrich ）番号５１１６６−７１−３、１ｇ
−２０ｍｌの小分画に分けてガラス管に分配される、バクト寒天（Bacto agar）、参照ディフコ番号０１４０−０１、１５ｇ
を混合する。
【０１０９】
無菌化し、無菌の補足物を添加する。
【０１１０】
−補足物溶液：
−１０倍に濃縮された補足物溶液１ｍｌ
−グルタチオン、参照メルク番号４０９０、１００ｍｇ
−熱分解水９ｍｌ
を混合する。
【０１１１】
この溶液を０．２２μｍミレックス（Millex）フィルターで濾過する。この溶液２００μｌを培地２０ｍｌを収容する１管に添加する。
ステイナー（Stainer ）培養培地
Ａ．基礎培地
１０倍濃縮溶液２リットルを調製するため：
グルタミン酸水素ナトリウム
（参照プロラボ番号２７８７２．２９８）．．．．．．．２０４．０ｇ
Ｌ−プロリン
（参照メルク番号７４３４）．．．．．．．．．．．．．．．４．８ｇ
ＮａＣｌ
（参照プロラボ番号２７８１０．２９５）．．．．．．．．５０．０ｇ
Ｈ2 ＰＯ4 
（参照プロラボ番号２６９２６．２９８）．．．．．．．．１０．０ｇ
ＫＣｌ
（参照プロラボ番号２６７５９．２９１）．．．．．．．．．４．０ｇ
ＭｇＣｌ2 
（参照プロラボ番号２５１０８．２９５）．．．．．．．．．２．０ｇ
トリス−塩基
（参照メルク番号８３８２．２５００）．．．．．．．．．３０．５ｇ
ＣａＣｌ2 の１％熱分解水溶液
（参照プロラボ番号２２３１７．２９７）．．．．．．．．．４０ｍｌ
熱分解水                                全量．．．．．．２リットル
これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。塩酸を用いてｐＨを７．６に調整する。最終容量まで満たし、この濃縮溶液を分配する。これは、−２０℃で、数週間保存することが可能である。
【０１１２】
使用時に、この培地を希釈し、１２０℃で１５分間無菌化した後、濾過により無菌化した補足物を添加する。
Ｂ．補足物溶液
１０倍濃縮溶液２００ｍｌを調製するため：
−  Ｌ−システイン
（参照プロラボ番号２３２６０．１８４）．．．．．．．．．．８ｇ
−  濃ＨＣｌ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｍｌ
を溶解する。この調製品に予め溶解した下記混合物を注ぐ。
【０１１３】
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
（参照プロラボ番号２４２４４．２３２）．．．．．．．．．．．２ｇ
Ｌ（＋）アスコルビン酸
（参照プロラボ番号２０１５５．２３７）．．．．．．．．．．．４ｇ
ニコチン酸
（参照メルク番号６８１７）．．．．．．．．．．．．．．．０．８ｇ
熱分解水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１２０ｍｌ
熱分解水で２００ｍｌとし、この溶液を１、２、３もしくは４ｍｌの小分画に分配して−２０℃で凍結させる。
【０１１４】
使用時に、この溶液を熱分解水で１０倍に希釈して、希釈補足物：
グルタチオン（参照メルク番号４０９０）．．．．１００ｍｇ／１０ｍｌ
を添加し、この溶液を濾過（単一使用０．２２μｍミレックスフィルター）により無菌化して、無菌溶液１ｍｌを無菌基礎培地１００ｍｌに添加する。
２．１．２．ｖｒｇ尿素抽出物の調製
−  細菌懸濁液を、５０００ｇで３０分間、４℃で遠心する。
【０１１５】
−  細菌ペレットを、この細菌ペレットの湿潤重量の５倍に等しい容量でＰＢＳバッファ中に調製された５Ｍ尿素（先に記述されている）に再懸濁する。
【０１１６】
−  ４℃で１時間攪拌したままにした後、４０，０００ｇで４０分間、４℃で遠心する。
【０１１７】
−  使用時まで、上清を−８０℃で保存する。
２．１．３．ｖｒｇ尿素抽出物の不活性化
−  Ｇ２５カラムを通過させることによって尿素を除去した後、３００μｇ／ｍｌの蛋白質濃縮物が得られるようにｖｒｇ尿素抽出物をＰＢＳで希釈する。
【０１１８】
−  ０．０５％の最終濃度が得られるような容量の２．５％グルタルアルデヒドを滴下により添加する。
【０１１９】
−  規則的に攪拌しながら室温で２時間放置する。
【０１２０】
−  ライシンを添加することにより反応を停止させる（最終濃度０．０２Ｍ）。
【０１２１】
−  室温で２時間後、ＰＢＳ中に調製した水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ）に、４℃で一晩、攪拌しながら、尿素抽出物を吸着させる。これにより、１０ないし２０μｇ／注射の量での動物の免疫化のためのワクチンの準備が整う（先に記述されている）。
【図面の簡単な説明】
【図１】使用される、ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた蛋白質の模式図。プラスミドの構造及び対応する切詰められた蛋白質の生成は、以前の刊行物であるSebo P. et al., 1991, Gene, 104: 19-24及びSebo P. et al., 1993, Mol. Microb. 9: 999-1009に記述されている。“Ｍｒ”欄の数字は、それらの推定アミノ酸配列から算出される毒素の相対分子量を示す。プラスミドの名称において記号Δに続く数字は、ｃｙａＡの読取り枠から欠失した部分の最初と最後のアミノ酸の番号である。記号ΔＣに続く数字は失われたＣ−末端残基を表す。ｃｙａＡ対立遺伝子は、プラスミドｐＣＡＣＴ３に存在するものと同様に、ｌａｃＺ遺伝子の転写及び翻訳の開始シグナルの制御の下にｃｙａＣ遺伝子と同時発現する（Betsou F. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。ΔＣ１３０７は、適合プラスミドｐＰＳ４Ｃを介して発現するｃｙａＣ遺伝子の存在下において、ｐＤＩＡ５２４０（ｐＡＣＴΔＣ１３０７）から生成した（Betsou F. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589及びSebo P. et al., 1991, Gene, 104: 19-24）。
【図２】百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の電気泳動を表す写真。２００ｎｇの精製百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙを８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、蛋白質をクーマシー・ブルーで染色し（Ａ）、あるいは、ハイボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（ＨＹＢＯＮＤ  Ｃ−Ｓｕｐｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移して、ワクチン接種２２日後の２０匹のマウスからの混合抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清（Ｂ）、又は百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙに特異的なモノクローナル抗体（Ｃ）、又は感染した小児（培養によって確認された感染）からの血清混合物（Ｄ）、又は百日咳菌１８３２３に感染したマウスから感染の２週間後に採取した血清（Ｅ）、又は百日咳菌に感染したマウスから感染の２ヶ月後に採取した血清（Ｆ）と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を用いて免疫検出を行った。ライン１：百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン２：ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン３：ΔＨＲ２；ライン４：ΔＨ；ライン５：ΔＣｌａ；ライン６：ΔＣ２１７；ライン７：ΔＣ１３０７；数字は分子量マーカーを示す。
【図３】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及び小児からの血清による、アデニレートサイクラーゼ活性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図４】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及び小児からの血清による、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図５】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及び小児からの血清による、細胞毒性活性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図６】ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及びその切詰められた蛋白質の防御活性。３ないし４週齢のマウスを、水酸化アルミニウムに吸着させた１５μｇのｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（△−△）、ΔＣｌａ（黒三角−黒三角）、ΔＣ１３０７（黒丸−黒丸）、もしくはΔＨＲ２（［］−［］）、ΔＣ２１７（黒四角−黒四角）、ΔＨ（□−□）又は百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙ（○−○）で、あるいは対照としての水酸化アルミニウムのみを含有するバッファ（□−［］）で、２週間の間隔で２回免疫した。これらを、２週間後に、鼻腔内経路により１０5 ＣＦＵの百日咳菌１８３２３に感染させる。曲線は、ポイント毎の６匹のマウスについての標準幾何偏差（横線）を示す。
【図７】百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙをコードする遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
【図８】図７に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の続き。
【図９】図７に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の続き。
【図１０】気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙをコードする遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
【図１１】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
【図１２】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
【図１３】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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