(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度に精製された形態であり、抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持された卵生産鳥類の卵から通常以上のレベルで得られた抗炎症性組成物であって、前記組成物が、
（１）卵生産鳥類が生産した卵の卵白および卵黄中に存在しており、
（２）１００℃で少なくとも３０分間、熱安定性であり、
（３）中性ｐＨで負のイオン電荷を有し、
（４）ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の条件で酸および塩基に耐性であり、
（５）経口的に活性であり、および、
（６）分子量が３，０００ダルトン未満である、
ことを特徴とする抗炎症性組成物。
【請求項２】
対象の炎症を予防し、治療し、または減少させるための医薬を製造する方法における請求項１に記載の抗炎症性組成物の使用。
【請求項３】
抗炎症性組成物の有効量が５μｇから３００ｍｇの範囲である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
対象の白血球の移動を阻止するための医薬を製造する方法における請求項１に記載の抗炎症性組成物の使用。
【請求項５】
抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持された卵生産鳥類の卵から通常以上のレベルで得られた抗炎症性組成物を高度に精製する方法であって、
（１）全卵、卵黄または卵白から水溶性画分を単離するステップと、
（２）水溶性画分から３，０００ダルトン未満の透過液を分離するステップと、および、
（３）前記３，０００ダルトン未満の透過液を分画して、生物学的に活性な画分を回収するステップと、
を含む方法。
【請求項６】
前記分画ステップがさらに、前記３，０００ダルトン未満の透過液の逆相高圧液体クロマトグラフィを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（１）の前に全卵または卵黄を脱脂することをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（２）の前記３，０００ダルトン未満の透過液を凍結乾燥することをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項９】
分離するステップが、分子量カットオフが３，０００ダルトンのフィルタで水溶性画分を限外濾過することをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
卵生産鳥類を、抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持する請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
高度免疫状態を抗原ワクチン、遺伝ワクチンまたは生物工学ワクチンで誘導する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝ワクチンが本質的にネークドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、ＤＮＡ発現ライブラリ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ−タンパク質結合体およびＤＮＡリポソーム結合体およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの抗原コードＤＮＡ構築物を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原ワクチンが細菌、ウィルス、原生動物、真菌および細胞の抗原からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（１）全卵、卵黄または卵白から水溶性画分を単離するステップと、
（２）水溶性画分から３，０００ダルトン未満の透過液を分離するステップと、および、
（３）前記３，０００ダルトン未満の透過液を分画して、生物学的に活性な画分を回収するステップと、
を含む方法で製造される高度に精製された形態であり、抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持された卵生産鳥類の卵から通常以上のレベルで得られた抗炎症性組成物。
【請求項１５】
卵生産鳥類を、抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持する請求項１４に記載の抗炎症性組成物。
【請求項１６】
高度免疫状態を抗原ワクチン、遺伝ワクチンまたは生物工学ワクチンで誘導する請求項１４に記載の抗炎症性組成物。
【請求項１７】
遺伝ワクチンが本質的にネークドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、ＤＮＡ発現ライブラリ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ−タンパク質結合体およびＤＮＡリポソーム結合体およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの抗原コードＤＮＡ構築物を含む請求項１６に記載の抗炎症性組成物。
【請求項１８】
抗原ワクチンが細菌、ウィルス、原生動物、真菌および細胞の抗原ならびにそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含む請求項１６に記載の抗炎症性組成物。
【請求項１９】
対象の炎症を予防し、治療し、または減少させるための医薬を製造する方法における請求項１４に記載の抗炎症性組成物の使用。
【請求項２０】
抗炎症性組成物の有効量が５μｇから３００ｍｇの範囲である請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
対象の白血球の移動を阻止するための医薬を製造する方法における請求項１４に記載の抗炎症性組成物の使用。
【請求項２２】
（１）抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持された卵生産鳥類が生産した卵から水溶性画分を単離するステップと、および、
（２）３０，０００ダルトン未満の透過液を分画して、生物学的に活性な画分を回収する、分離ステップと、
を含む方法で製造される、実質的に精製された形態であり、高度免疫状態に維持された卵生産鳥類の卵から通常以上のレベルで得られた抗炎症性組成物。
【請求項２３】
ステップ（２）の後に、３０，０００ダルトン未満の濾液をイオン交換クロマトグラフィにかけることをさらに含む請求項２２に記載の抗炎症性組成物。
【請求項２４】
分離ステップが、分子量カットオフが３０，０００ダルトンのフィルタで水溶性画分を限外濾過することをさらに含む請求項２３に記載の抗炎症性組成物。
【請求項２５】
前記３０，０００ダルトンの透過液からエンドトキシンを除去することをさらに含む請求項２２の抗炎症性組成物。
【請求項２６】
卵生産鳥類を、抗原または抗原混合物で６ケ月以上にわたり２週間間隔でブースター投与することにより高度免疫状態に維持する請求項２５に記載の抗炎症性組成物。
【請求項２７】
卵生産鳥類を抗原ワクチン、遺伝ワクチンまたは生物工学ワクチンで高度免疫する請求項２６に記載の抗炎症性組成物。
【請求項２８】
抗原ワクチンが細菌、ウィルス、原生動物、真菌および細胞の抗原からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含む請求項２７に記載の抗炎症性組成物。
【請求項２９】
遺伝ワクチンが本質的にネークドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、ＤＮＡ発現ライブラリ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ−タンパク質結合体およびＤＮＡリポソーム結合体およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの抗原コードＤＮＡ構築物を含む請求項２７に記載の抗炎症性組成物。
【請求項３０】
ステップ（１）の前に卵を脱脂することをさらに含む請求項２２に記載の抗炎症性組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、天然の食品中で生成される抗炎症性組成物に関する。本発明は特に、卵の炎症性組成物、実質的に高度に精製された形でのその製造法、および炎症治療へのその使用法に関する。
炎症は、ドーランド医学大辞典に、「組織の傷害や破壊により誘導される、傷害の原因と傷害組織双方を破壊、希薄化または隔離するような局所的保護反応」と定義されている。炎症は微小血管系の開窓、血液成分の間質空間への漏出、白血球の炎症組織への移動を特徴とする。肉眼レベルでは、通常、紅斑、浮腫、痛覚過敏（圧痛）および疼痛といった一般的な臨床徴候を伴う。
この複雑な反応の間、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、種々の走化性組成物、ブラジキニン、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンなどの化学的伝達物質が局所的に遊離される。貪食細胞がその領域内に移動し、細胞のリソソーム膜が破壊されて、分解酵素が放出される可能性がある。これらの事象がすべて、炎症反応に寄与する可能性がある。
関節リウマチ患者での炎症にはおそらく、白血球を誘引する走化性および化学活性化組成物の局所での放出を引き起こす抗原と抗体補体の組み合わせと関係している。白血球は抗原―抗体と補体の複合体を貪食し、また、そのリソソームに含まれる多数の酵素を放出する。これらのリソソーム酵素は次に軟骨およびその他の組織の傷害を引き起こし、炎症をより重症にする。細胞媒介性免疫反応も関与する可能性がある。細胞機能の重要な細胞内レギュレータであるプロスタグランジンもこの過程で放出される。
アルツス反応は、抗原がその抗原に対する抗体と複合体を形成する皮下の部位で、免疫複合体の形成によりもたらされる炎症反応である。好中球は、皮下注射部位で形成される免疫グロブリン複合体のＦｃ部分と結合し、その注射部位で消化酵素を放出し、可視的な急性の炎症を引き起こす。従って、この反応は主として好中球が媒介するものであり、この反応の進展に影響する物質はこれらの細胞に対する作用を介して作用している。
ある物質が血管から炎症部位への好中球の移動を阻止するにはいくつかの経路がある。１つの可能な経路は、血管壁の内皮細胞の内層への炎症細胞の可逆的な付着または「貼着」である辺縁化を阻止することである。この付着は、白血球細胞や血管内層の「ベルクロ」として作用するインテグリン分子と付着の質と量により精密に調節されている。正常な状態では、約５０％の好中球が可逆的に付着するが、急性炎症反応の間には、付着はより強力になり、好中球移動プロセスの重要なステップである。プロスタグランジンは走化性反応に直接関与していないように思われるが、アラキドン酸の別の代謝産物であるロイコトリエンは非常に強力な走化性物質である。
炎症反応とは、上記定義のように炎症を特徴とするすべての反応である。医学分野では、炎症反応が種々の疾患や損傷に伴って生じる身体的な不快（すなわち、疼痛は機能損失）の多くを引き起こすことはよく知られている。従って、炎症反応による身体的な不快を低下させる薬理学的物質を投与することが医学的に一般的に実践されている。これらの特性を有する物質は抗炎症剤と分類されている。抗炎症剤は広範囲の障害の治療に使用されており、同じ薬剤が異なる疾患の治療に使用されることも多い。抗炎症剤による治療は疾患に対するものではなく、症状（すなわち、炎症）に対するものであることが非常に多い。
抗炎症剤、鎮痛剤および解熱剤は、多くの場合化学的に無関係であるが、ある種の治療作用および副作用を共有する異なる種類の化合物群である。コルチコステロイドは最も広く使用されている炎症治療用の化合物群である。蛋白質分解酵素が抗炎症作用を有すると考えられている別の化合物群である。直接的または間接的に副腎皮質にステロイドを生成、分泌させるホルモンがもう１種類の抗炎症性化合物である。
残念ながら、天然および合成のコルチコステロイド製剤は、血圧上昇、塩および水の貯留、腎損傷、カリウムおよびカルシウム排泄の増加などの多くの重篤な副作用を引き起こす。また、コルチコステロイドは感染の徴候を隠し、感染性微生物の播種を促進する可能性がある。これらのホルモンの妊婦への使用は安全ではないと考えられており、コルチコステロイドの長期療法では胃の機能昂進および／または胃潰瘍が随伴したことがある。コルチコステロイド療法により、糖尿病が悪化し、インシュリンの増量が必要となる可能性があり、また精神障害を生じる可能性もある。間接的に内因性コルチコステロイドの産生を増加させるホルモン性抗炎症剤は有害な副作用について同じ可能性を有する。
多数の非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）について記載されている。その中で最も広く使用されているのはサリチレートである。アセチルサリチル酸すなわちアスピリンは最も広く処方されている解熱鎮痛消炎剤である。ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤の例はPhysician’s Desk Referenceに記載されている。
ＮＳＡＩＤは合成の生化学的化合物であり、高投与量では広範な望ましくない副作用のために毒性となりうる。例えば、サリチレートはこの種の化合物による中毒の特徴である重篤な酸―塩基バランス障害を引き起こす。サリチレートは直接的、間接的に呼吸を刺激する。毒性投与量のサリチレートは中枢性呼吸麻痺および血管運動抑制に伴う循環虚脱を引き起こす。サリチレートを服用すると、心窩部不快感、悪心、嘔吐が起こる可能性がある。サリチレートにより誘発された胃出血はよく知られている。サリチレートは肝障害を起こし、凝固時間を延長する可能性がある。従って、アスピリンは、重篤な肝障害の患者ではアスピリンを避けるべきであり、サリチレートにより血小板止血が阻止されて、出血が起こる可能性があるため、低トロンビン血症、ビタミンＫ欠乏症、血友病の患者で避けるべきである。サリチレート中毒は一般的であり、アメリカでは毎年１００００例を超える重篤なサリチレート中毒が認められ、その一部は死亡し、また小児で多く発生している。GoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of The rapeutics第７版、１９８５年参照のこと。
従って、現在非常に多くの抗炎症剤が入手できるにも関わらず、安全で、効果的な、副作用や有害作用のない抗炎症剤がいまだに必要とされている。
抗炎症作用を有する天然食品が得られれば、簡単に投与でき、容易に入手でき、安全な治療用組成物が提供される。
関連技術
種々の治療効果を有するミルクが報告されている。米国特許第４３２４７８２号は、齲歯阻止作用を有するStreptococcus mutansに対する抗体を含有するミルクを開示している。このミルクは、S.mutans抗原で二段階でウシを免疫して得られる。米国特許第４２８４６２３号は抗炎症特性のあるミルクを開示している。米国特許第４８７９１１０号は降圧特性を有するミルクを開示している。米国特許第３１２８２３０号は、ウシに抗原混合物を接種して得られるグロブリンのα、βおよびγ−成分を含むミルクを開示している。米国特許第３３７６１９８号、カナダ特許第５８７８４９号、英国特許第１２１１８７６号も抗体含有ミルクを記載している。米国特許第４８９７２６５号および米国特許第４６３６３８４号（再発行第３３４０３号）は、多価細菌抗原を注射して高度免疫状態に維持したウシからの抗体含有ミルクを動物に与えることによって血中脂質濃度を低下させる方法を開示している。
ニワトリ（Gallus domesticus）、シチメンチョウおよびアヒルなどの鳥類の種々の属で、トリの疾患を引き起こす抗原およびその他の抗原に対する抗体が血液中および卵中で産生される。例えば、LeBacq-Verheyden他（Immunology 27:683（1974））およびLeslie, G. A.他（J. Med. 130:1337（1969））はニワトリの免疫グロブリンを定量分析した。Polson, A他（Immunological Communication 9:495-514（1980））は、数種のタンパク質および天然のタンパク質混合物に対し雌鶏を免疫し、その卵の卵黄中でＩｇＹ抗体を検出した。Fertel, R他（Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028-1033（1981））は雌鶏をプロスタグランジンに対して免疫し、その卵の卵黄中で抗体を検出した。Jensenius他（Journal of Immunological Methods 46:63-68（1981））は免疫診断に使用する卵黄ＩｇＧを単離する方法を提供している。Polson他（Immunological Communications 9:475-493（1980））は、種々の植物ウィルスで免疫した雌鶏の卵黄から単離した抗体を記載している。
米国特許第４３５７２７２号は、高度免疫した雌鶏由来の卵の卵黄からの抗体の単離について述べている。高度免疫は、植物ウィルス由来の抗原、ヒトＩｇＧ、破傷風抗毒素、ヘビ抗毒素、およびSeramebaを反復注射して誘導した。米国特許第４５５００１９号は、分子量または粒子重量が少なくとも３００００の免疫原で高度免疫して雌鶏で誘導した抗体の卵黄からの単離を開示している。ニワトリを高度免疫するために使用した抗原は植物ウィルス、ヒト免疫グロブリン、破傷風毒素およびヘビ毒から選択した。
さらに、フィールドスタディおよび比較感染試験により、腸管毒性大腸菌（E.coli）に対する抗体卵黄凍結乾燥物および免疫全卵凍結乾燥物の保護作用が示された（Wiedermann他、J. Vet. Med. B. 38:283-291（1991））。Ｋ９９線毛保有腸管毒産生大腸菌由来の加熱死滅抗原をワクチン接種した雌鶏から作製した卵黄粉末の経口投与により、ウシの新生児を大腸菌による下痢から保護した（Ikemori他、Am. J. Vet. Res. 53:2005-2008（1992））。
ロタウィルスに感染したマウスに抗ロタウィルスＩｇＹを投与すると完全な保護が得られることも示されている（Ebina他、Microbiol. Immunol. 34:617-629（1990））。さらに、抗エドワードシエラ・タルダ抗体を含有する卵黄は日本ウナギのエドワードシエラ症の予防に効果があることが見いだされた（Gutierrez、J. Fish Disease 16:113-122（1993））。
米国特許第４７４８０１８号は、対応の抗原で免疫してあるトリの卵から得た精製抗体を非経口的に投与することを含む、この卵を摂取したことのある哺乳類の受動免疫法を開示している。米国特許第４７４８０１８号に開示の発明は、卵抗体の投与を非経口的だけでなく、任意の適切な経路で実施できるように米国特許第４７４８０１８号に開示の概念を拡張したものである。
米国特許出願第０８／６８８５７６号はDCV-Biologicsに譲渡されたものであり、高度免疫した卵および／またはミルクまたはその画分を対象に投与することにより、慢性胃腸障害または非ステロイド系抗炎症剤による（ＮＳＡＩＤによる）胃腸障害を予防し、それに対処し、または減少させる方法を開示している。
米国特許第５２１５７４６号には、特異的な細菌抗原に対して免疫したニワトリからの卵が哺乳類で抗動脈硬化作用を有することを開示した。
S.mutansに対する抗体を含有する卵は、S.mutansで免疫したニワトリから得られ（Otake他、J.Dental Research 70:162-166（1991））、齲歯の進行を妨げた。
しかし、これらの参考文献のいずれも、炎症を予防し、または減少させるために動物に投与できる組成物および／または因子を卵が産生できることは開示も示唆もしていない。これらの参考文献のいずれも、トリの処理によりこのような組成物および／または因子を生成できるという合理的な期待を提供する方法は開示も示唆もしていない。これらの参考文献のいずれも、所望の治療効果が得られる卵の炎症性成分の同定は示唆も開示もしていない。
発明の概要
本発明は、卵および卵製品、特に高度免疫したトリから得た卵製品に抗炎症活性があり、これを対象、特に哺乳類に投与すると、対象の炎症を予防し、または減少させるという本発明者らの発見に基づいている。
特に、本発明は、トリの卵から得られる高度に精製された抗炎症性組成物に関する。抗炎症活性は卵黄と卵白の両方から単離された画分で認められた。
本発明はまた、１つ以上の抗原、特に細菌抗原を投与してトリを高度免疫し、高度免疫したトリから卵を採取し、その卵から非常に純粋な抗炎症性組成物を単離することを含む方法で製造される非常に純粋な抗炎症性組成物にも関する。
高度免疫プロセスによりトリの卵から非常に純粋な抗炎症性組成物が通常以上のレベルで生成される。驚くべきことに、卵黄、卵白の両者で、高度免疫化のプロセスにより抗炎症性組成物の量を増加できる。
本発明は、対象、特に哺乳類の炎症の治療法も包含し、この方法には、実質的に純粋な抗炎症性組成物または実質的に純粋な抗炎症性組成物を含む組成物を対象に投与することを含む。この態様には、抗炎症性卵の全体および／またはその画分を投与することを含む。
本発明はさらに、細静脈にリンパ球および好中球が付着するのを防ぐ（または、細静脈の内層の内皮細胞にすでに付着したリンパ球および好中球を剥がし）、リンパ球および好中球の移動を減少させて、過度の浮腫および流体の蓄積を減少させるための、抗炎症性組成物および／または高度に精製された抗炎症因子それ自身を含有する卵を使用する方法にも関する。この方法では、この組成物を使用して、炎症反応に伴う組織損傷を減少させる。
本発明は最後に、哺乳類で抗炎症活性を示す実質的に純粋な抗炎症性組成物を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＥＡＥセファロースイオン交換クロマトグラムによる分子量３００００未満の卵の炎症性組成物の分離を示すクロマトグラムである。
図２は、分子量３００００未満の卵の炎症性組成物による胸膜白血球移動の阻止を示すグラフである。
図３は、ヘキサン−エタノールで脱脂した卵黄からのエンドトキシンを含まない抗炎症性組成物によるラット胸膜白血球移動の阻止を示すグラフである。
図４は、卵黄からの分子量３００００未満の抗炎症性組成物の製造を示すフロー・チャートである。
図５は、液体卵白からの分子量３００００未満の抗炎症性組成物の製造を示すフロー・チャートである。
図６は、臨界超過ＣＯ2抽出により脱脂したＳ−１００卵の卵黄から得たエンドトキシンを含まない分子量３００００未満の抗炎症性組成物によるラット胸膜白血球の阻止を示すグラフである。
図７は、乾燥した卵黄粉末からの分子量３００００未満の抗炎症性組成物の製造を示すフロー・チャートである。
図８は、粉末卵黄からの分子量３００００未満の抗炎症性組成物の精製を示すフロー・チャートである。
図９は、粉末卵白からの分子量３００００未満の抗炎症性組成物の精製を示すフロー・チャートである。
図１０は、ＤＥＡＥ  Ｐｏｒｏｓイオン交換クロマトグラムによる分子量３００００未満の卵の炎症性組成物の分離を示すクロマトグラムである。
図１１は、卵黄および卵白からの分子量３０００未満の高度に精製された画分による白血球の移動の阻止を示すグラフである。
図１２は、高度免疫した卵黄からのＤＥＡＥピーク２の３０００ＭＷ未満および１０００ＭＷ未満の限界濾過物による白血球移動の阻止を示すグラフである。
図１３は、卵からの分子量３０００未満の高度に精製された抗炎症性組成物と抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（インドメサシンおよびアスピリン）を比較するグラフである。
図１４は、高度免疫した卵黄からの分子量３０００未満の抗炎症性組成物のＨＰＬＣ分離のクロマトグラムである。
図１５は、高度免疫した卵黄からのＤＥＡ画分のＨＰＬＣでの分離のクロマトグラムである。
発明の詳細な説明
定義
「卵製品」とは、抗炎症性卵または卵画分を含有する本明細書に記載の全ての製品を意味する。
「抗炎症性卵または卵画分」とは、本明細書に開示の抗炎症性組成物、特に本明細書に記載の方法で製造された抗炎症性組成物を含む卵または卵画分を意味する。
「抗炎症性組成物」とは、炎症プロセスを妨げるまたは抑制する組成物を意味する。
「実質的に純粋な卵の炎症性組成物」とは、少なくとも実施例３および例示の材料および数値の純度を有する抗炎症性組成物を意味する。
「高純度の卵の炎症性組成物」とは、少なくとも実施例４および例示の材料および数値の純度を有する抗炎症性組成物を意味する。
「抗炎症因子」とは、少なくとも実施例７に記載の純度の抗炎症性組成物中に存在する、炎症プロセスを妨げるまたは抑制する実質的に純粋な物質を意味する。
「組み合わせ（combinatorial）由来抗原」とは、組み合わせ合成により抗原間に分子的多様性を生じさせる新規な方法を意味する。
「生物工学的抗原」とは、遺伝子クローニング技術および抗原特性を有するタンパク質の挿入および翻訳を可能にする遺伝子再配列のプロセスを介して得られた抗原を意味する。
「遺伝ワクチン」とは、一般に組換え技術により作製され、免疫応答を引き起こしうる核酸ワクチンである。
「高度免疫した卵」とは、高度免疫状態に維持した卵生産動物から得た全卵および全卵由来の製品を意味する。
「通常以上のレベル」とは、高度免疫状態に維持していない卵生産動物の卵で認められるものより高いレベルを意味する。
「食用卵」とは、高度免疫していない卵を意味する。
「炎症」は、当業界で認められた意味で、組織の傷害や破壊により誘導される、傷害の原因と傷害組織双方を破壊、希薄化または隔離するような局所的保護反応として使用されており、標準的な一連の疼痛、発熱、発赤、腫脹、機能損失と適切ではない、調節されていない状態を特徴とする、組織学的には、浸透性および血流量の増加を伴う細動脈、毛細血管、細静脈の拡張、血漿タンパク質を含む流体の滲出、炎症巣への白血球の移動を含む事象の複雑なシリーズを含む。
「治療」とは、障害の症状および／または障害の病原を予防し、改善し、または完全に除去することを意味する。例えば、抗炎症性組成物は、ヒトおよびその他の哺乳類で炎症の症状を抑えるだけではなく、レシピエントで予想される炎症性物質の存在に対処する予防薬として作用することによっても炎症を治療する。
「投与」とは、経口、経鼻、非経口（静脈内、筋肉内または皮下）または経直腸的に対象に物質を提供するあらゆる方法を意味する。
「対象」とは、ヒトおよびその他の動物を含む、炎症反応を起こす可能性があり、炎症性障害および損傷を受けるすべての生きている動物を意味する。
発明
１つの実施形態では、本発明は、トリの卵から得た高純度の抗炎症性組成物、その単離および精製、および炎症治療のための組成物の対象への投与を含む。本発明はさらに、１つ以上の抗原、特に細菌抗原で高度免疫したトリの卵から得た高度に精製された抗炎症性組成物またはその合成の同等物を含む。高純度の抗炎症性組成物は高度免疫した卵中に、対象に抗炎症活性を提供する通常以上のレベルで存在する。
高純度の抗炎症性組成物はすべての食用卵の卵黄および卵白の水溶性画分中に見られるが、高度免疫した卵から単離すると、抗炎症性組成物は対象の炎症を治療するのに有効な通常以上のレベルで認められる。
本発明は、トリの卵から得た実質的に純粋な抗炎症性組成物、その単離および精製、および炎症治療のための対象への組成物の投与も含む。本発明はさらに、１つ以上の抗原、特に細菌抗原で高度に免疫したトリの卵から得た実質的に純粋な抗炎症性組成物またはその合成同等物を含む。実質的に純粋な抗炎症性組成物は高度免疫した卵中に、対象に抗炎症活性を提供する通常以上のレベルで存在する。
本発明の抗炎症性組成物は、抗炎症活性を提供する任意の手段で投与することができる。例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内または経口投与することができる。経口投与用の固体の剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒が含まれる。
本発明はさらに、抗炎症性組成物中に認められる実質的に純粋な抗炎症因子も含む。この因子は抗炎症性組成物について上記したものと同じ手段で対象に投与できる。
発明の詳細を下記に示す。
高度に精製した抗炎症性組成物の特徴：
高純度の抗炎症性組成物は下記の特徴を有している：
１）対象、特に哺乳類で抗炎症活性を有する。
２）トリの卵の卵白および卵黄の両者中に存在する。
３）卵黄から単離すると、卵白から単離した場合に比べ、抗炎症活性が高い。
４）分子量は約３０００ダルトン未満である。
５）蛋白質分解酵素で分解されない。
６）非タンパク質性で、非ステロイド性である。
７）一般的な条件下で、負の電荷を有する。
８）１００℃で少なくとも３０分間、熱に対し安定である。
９）経口的に活性であり、消化酵素で分解されない。
１０）酸および塩基に耐性であり、ｐＨ４からｐＨ９．０の条件で処理した後も、活性型に戻る。
分子量が３０００ダルトンであることは、３０００ダルトン以上の分子種を通過させない限外濾過膜を使用して組成物の単離および精製することから推測される。組成物は大きさが小さく、蛋白質分解酵素で分解されないことから、非タンパク質性および非ステロイド性であると決定される。さらに、組成物は経口的に活性であり、消化酵素で分解されない。（それより非常に大きなタンパク質と識別されるように）組成物は小さく安定な形であるため、消化管からの吸収が促進される。
組成物は酸および塩基に耐性で、ｐＨ９．０の条件で処理した後にも活性型に戻る。さらに、組成物は１００℃で少なくとも３０分間、熱に安定で、中性のｐＨで負の電荷を有する。
高度に精製された卵由来の抗炎症性組成物は全卵、卵黄および卵白から単離できる。卵黄から単離された抗炎症性組成物は卵白から精製された抗炎症性組成物より高い抗炎症活性を示す。
通常以上のレベルの、高度に精製された抗炎症性組成物はトリの高度免疫された全卵、卵黄および卵白から単離できる。
実質的に精製された抗炎症性組成物の特徴：
実質的に精製された抗炎症性組成物は哺乳類で抗炎症活性を示す。実質的に精製された抗炎症性組成物は、卵黄および卵白の水溶性画分中、分子量約３００００ダルトン未満の分子を含む画分中に認められる。組成物は負の電荷を有し、９０℃に少なくとも１時間熱安定であり、図１に示す卵からの溶離プロフィールを有する。さらに、哺乳類で、卵黄から単離された抗炎症性組成物は卵白から精製された抗炎症性組成物より高い抗炎症活性を示す。
上記の方法でニワトリの卵から製造された卵の炎症性組成物の分子量は３００００ダルトン未満である。このことは、卵黄および卵白から因子を単離する最初のステップを、３００００ダルトン以上の分子量を有する種は通過させない膜を使用する限外濾過により実施したことから推察された。組成物は、卵由来の３０Ｋ限外濾過液をＤＥＡＥセファロースイオン交換カラムにかけて測定すると、一般的な条件下では負の電荷を有する。抗炎症性組成物は水ではカラムから溶離されない。溶離媒質をＮＨ４０Ａｃ溶液に変更すると、卵由来の抗炎症性組成物が溶離される。限外濾過液をＤＥＡＥセファロース・カラムにかけると、種々のタンパク質および塩が未結合画分を形成する。
卵生産動物の高度免疫：
本発明は、トリなどの卵を生産する動物を高度免疫の特異的な状態にすると、動物は非常に有益性の高い抗炎症性組成物を通常以上のレベルで有し、高い抗炎症作用を提供する卵を生産するという発見に部分的に基づいている。
高度免疫した卵製品は、任意の卵生産動物によって製造できる。動物は鳥類であるのが好ましい。鳥類の中では、家畜化したニワトリが好ましいが、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウなどのこの種の別のものも高度免疫した卵製品の好適な原料である。
このような卵生産動物を、例えば抗原を定期的にブースター投与することにより高度免疫の特異的な状態にすると、動物は、対象に投与したときに炎症の治療に有益な特性を有するであろう抗炎症性組成物を通常以上のレベルで含有する卵を生産するであろう。
トリをトリの疾患に対する一般的な免疫の間または環境因子への通常の曝露の間に種々の抗原に対して感作した場合でさえ、「食用卵」と呼ぶ正常のトリの卵はこれらの通常以上のレベルを含有しないという事実から示されるように、免疫感受性のみを誘導しても、卵中に卵の炎症性組成物の通常以上のレベルで生じさせるには不十分である。特異的な高度免疫状態でのみ、卵は所望の通常以上のレベルを有する。
この特異的な高度免疫状態では卵は抗炎症性組成物をより高濃度に含むであろうが、この状態は初回免疫後、十分大量の特異抗原または抗原混合物で定期的にブースターすることにより得られる。ブースターの好ましい投与量はトリで一次免疫を得るのに必要な投与量の５０％以上とすべきである。従って、それ以下では、トリが通常免疫状態と呼ばれる状態にあっても、トリの卵でその特性が生じない閾値ブースター投与量がある。高度免疫状態を生じ、これを維持するための要件に関する知識を有していれば、動物を高度免疫状態に維持するために、使用する卵生産動物の属や系統に応じて投与する抗原の量を変化させることは当業界の技術の範囲である。
上記のように抗炎症性組成物の濃度が上昇した場合には、それに伴って自然に抗炎症因子の量も同様に上昇すると理解されたい。
高度免疫性組成物は任意の抗原または抗原の組み合わせにより製造することができる。高度免疫は、複数の抗原に複数回曝露する、単一の抗原に複数回曝露する、または免疫原ライブラリに一回曝露することにより達成できる。ほぼすべての抗原を使用して高度免疫状態を誘導することができ、これには細菌、ウィルス、原生動物、アレルゲン、真菌または細胞物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
天然の抗原による免疫の他に、組み合わせ（combinatorial）化学により合成で得た抗原を使用して免疫することもできる。基本戦略は、種々の分子群を作製するために化学的基礎単位の複数の組み合わせを集めることである。最近、オリゴマー・ライブラリ（Fodor, S他、Science 251:767（1991）: Houghton, R他、Nature 354:82（1991）および有機低分子（Bunin, B&Ellman, J., J. Am. Chem. Soc. 114:10997（1992））の固液相組み合わせ合成のためのいくつかの方法が開発された。迅速な複数のペプチドおよびオリゴマーの合成により組み合わせによる抗原の源が得られる。さらに、別の戦略では、組み合わせ法で有機基礎単位を骨格分子に追加して、抗原性を改良することができる。
卵生産動物を高度免疫する別の様式には、遺伝ワクチンまたは生物工学的に得られた抗原の使用が含まれる。特に、（一般にプロモーター領域と抗原コード配列からなる）任意のＤＮＡ構築物が抗体の放出をトリガーする。免疫応答を産生するために投与する遺伝ワクチンは抗原コーディング・ベクター、ネークド（naked）ＤＮＡの断片、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ−タンパク質結合体、ＤＮＡ−リポソーム結合体、ＤＮＡ発現ライブラリ、およびウィルスおよび細菌ＤＮＡで構成されている。
特に、ＤＮＡは免疫調節性であると共に免疫原性であることを示す証拠がある。抗原コーディング・ベクター、ネークドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ抗原およびＤＮＡ発現ライブラリを投与すると細菌およびウィルスの生ワクチンおよび加熱死滅ワクチンを模倣することができる。ＤＮＡワクチンの利点の１つは、個々の細胞から抗原を産生、放出されるため、液性免疫応答および細胞毒性免疫応答を誘導する遊離抗原が得られることである。細胞毒性応答により有効性が増強される（Ada, G. L., Lancet 335:523-526（1990））。別の利点は、遺伝ワクチンが適切な３次元配座を有する外来タンパク質を産生できることである。
遺伝免疫化は生の／減弱させた病原体の利点を多くを有するが、感染の危険性のないワクチン製造の新しい方法である。いくつかの源からのＤＮＡで構成された発現ライブラリをワクチンとして使用して、高度免疫状態を得ることができる。
ＤＮＡ投与の方法には粒子衝撃、直接注射、リポソーム、ジェット注射（Fynan, E. F.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482（1993））が含まれるが、これらに限定されるものではない。公知または未知の免疫原をコードする核酸、プロモータ領域（特にＣＭＶカリフラワーモザイクウィルス）およびＳＶ４０細菌起源を細菌中で複製して、ＤＮＡ注射に使用するプラスミドＤＮＡを作製できる。ＤＮＡの非経口投与のいくつかの経路がニワトリで有効であるが、好ましい方法は胸筋への筋肉内注射である。ワクチンの試験を産卵トリ、好ましくはニワトリで実施する。反復免疫感作を１〜２週間間隔で６ヶ月まで実施する。
直接注射では、使用するＤＮＡの量は一般に、食塩水中に約５０〜３００μｇのＤＮＡであると好ましい。粒子衝撃では、２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を添加することにより４〜１００μｇのＤＮＡを金ビーズに共沈させるのが好ましい。このＤＮＡ被覆した粒子促進法により、皮内投与で生きている動物に反復免疫を実施できる。
卵生産動物を免疫の高い状態にし、その結果得られた高度免疫された卵または卵製品を対象に投与するのに使用する好適手順の詳細を以下に示す。
１．１つ以上の抗原を選択する。
２．一次免疫により卵生産動物で免疫応答を引き起こす。
３．高度免疫を誘導し、維持するのに適切な投与量の抗原のブースター・ワクチンを投与する。
４．高度免疫した卵の抗炎症活性レベルをテストする。
５．卵を集め、処理する。
この手順について下記により詳細に述べる。
ステップ１：任意の抗原または抗原の組み合わせを使用できる。抗原は細菌性、ウィルス性、原生動物性、真菌性、細胞性、アレルゲンまたはそれに対し卵生産動物の免疫系が応答するその他の任意の物質であってよい。このステップの重要な点は、抗原が卵生産トリで免疫状態および高度免疫状態を誘導できるだけではなく、卵の中での抗炎症性組成物の産生を誘導できるものでなければならないことである。１つの好ましいワクチンはシリーズ１００（Ｓ−１００）ワクチンと呼ばれる多価細菌抗原の混合物である。Ｓ−１００ワクチンに含まれる細菌を実施例１の表１に示す。このワクチンはすでに米国特許第５１０６６１８号および第５２１５７４６号に記載されており、これはいずれもStolle Reserach and Development社に譲渡されている。
ステップ２：ワクチンは免疫応答を誘導する任意の方法で投与できる。抗原を筋肉内注射で投与して免疫するのが好ましい。トリで注射に適した筋肉は胸筋である。投与量は好ましくは抗原ワクチン０．５〜５ｍｇである。使用できる他の投与方法には、特に、静脈内注射、腹腔内注射、座薬および経口投与が含まれる。ＤＮＡ手法を高度免疫のプロセスに使用すると、一般に１〜３００μｇといった非常に少量しか必要としない。
ワクチンが卵生産動物で免疫応答を誘導体したかは、免疫業界で公知の多くの方法で決定できる。これらの例には、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、刺激抗原に対する抗体の存在を調べるテスト、宿主からの免疫細胞の抗原応答能を評価するよう設計されたテストが含まれる。一般に、ワクチンで免疫した後の卵抗体の外観により免疫応答が示される。免疫応答を誘導するのに必要な抗原の最小量は、使用する抗原の種類および宿主として使用する卵生産動物の種類を含むワクチン接種手順に依存する。
ステップ３：高度免疫状態は、一定の時間の間隔で適当な量を繰り返しブースター投与することにより誘導および維持するのが好ましい。６ヶ月以上にわたり、２週間間隔とするのが好ましい。ブースター投与が免疫寛容を誘導しないことが不可欠である。
その他の高度免疫維持手順または手順の組み合わせを使用し、例えば、一次免疫のために筋肉内注射し、ブースター注射のために静脈内注射することもできる。別の手順には、一次免疫のためにマイクロカプセル化した液体抗原を投与するかまたは筋肉内注射し、同時に、マイクロカプセル化手段で非経口投与または経口投与することによりブースター投与することが含まれる。一次免疫と高度免疫のいくつかの組み合わせが当業界で公知である。
ステップ４：卵の抗炎症活性レベルを検査することが必要である。これは高度免疫卵または高度免疫卵由来の製品の炎症に対する効果を検査する臨床評価および前臨床評価により実施できる。ラットで化学的に誘導した炎症が抗炎症剤の標準的アッセイ法である（実施例６ａ，ｂ，ｃ参照）。
ステップ５：このステップには抗炎症性組成物を含有する卵の採取および処理を含む。卵は慣用法で採取できる。抗炎症性組成物を単離、精製するための方法を下記に示す。
単離および精製：
卵の炎症性組成物の単離および精製は全卵、卵黄または卵白を使用して実施できる。好ましい方法の例は次の通りである：
１．卵から水溶性画分を調製する。
２．水溶性画分を限外濾過する。
３．画分を逆相高速液体クロマトグラフィで分離する。
４．分離した画分を抗炎症活性についてバイオアッセイする。
この方法を以下にさらに詳細に説明する：
ステップ１：
抗炎症性組成物は全卵、卵黄または卵白から単離できる。好ましい実施形態では、組成物をこの方法で卵白から単離する。特に好ましい実施形態では、組成物は卵黄から単離する。全卵または卵黄から当業者に公知の方法で脂質部分を除去する。例えば、噴霧乾燥させた卵黄の場合には、溶媒（プロパン、ブタンまたはヘキサンまたは二成分溶媒）、超臨界ＣＯ2、酵素等を使用して脱脂を実施できる。液体卵黄の場合には、Lee（米国特許第５３６７０５４号）が開示したカプリル酸分離法（ＣＡＰＳ）により脱脂を実施できる。卵白の場合には脂質を除去する必要はないので、液体または粉末状の卵白は慣用法で、下記実施例に記載のように、加熱または直接溶解する。次に、全卵、卵黄または卵白を液体または粉末の形状にすると好ましく、さらに処理して水溶性画分を得る。（実施例参照）
ステップ２：
全卵、卵黄または卵白から得られた水溶性画分を、分子量３０００のカットオフ膜を備えた限外濾過システムを使用する限外濾過にかける。限外濾過プロセスにより分子量３０００ダルトン未満の分子から分子量３０００ダルトンを超える分子を分ける。一度濾過して得られた限外濾過液は分子量３０００ダルトン未満の分子を含有している。次に、限外濾過液を凍結乾燥させ、重量を測定し、バイオアッセイ・テスト用に調製する。具体的に開示した実施形態では、好ましい限外濾過はAmicon RA1000（３ＫＭＷＣＯ）およびＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィで実施する。しかし、同等の手法および物質を使用して、本明細書に記載の情報および当業者の入手できる知識により、組成物を単離できると理解されたい。
ステップ３：
分子量３０００ダルトン未満の限外濾過液からの画分を、例えば、逆相高圧液体クロマトグラフィにより分離し、高純度の抗炎症性組成物を単離することができる。別のまたは追加の戦略としては、限外濾過液中の卵の炎症性組成物を、陰イオン交換ＥＤＡＥセファロースクロマトグラフィでさらに特性化できる。このような分離法は当業者によく知られている。
ステップ４：
組成物の抗炎症活性は、抗炎症活性を測定する任意のバイオアッセイでテストできる。一部の例には、特に、白血球移動阻止、ラット前肢浮腫テスト、アジュバント誘発関節炎、コラーゲン誘発関節炎および生存中の検鏡が含まれる。卵の抗炎症性組成物と公知のアスピリンおよびインドメサシンなどの抗炎症剤との比較もできる。最後に、慢性関節リウマチ、変形性関節疾患、傷害で誘発された関節炎を使用して抗炎症活性を測定することもできる。
高純度の卵の炎症性組成物の抗炎症作用はバイオアッセイで測定できる。好ましいバイオアッセイは、Vinegar他、「Some Quantitative Characteristics of Carrageenan Induced Pleurisy in the Rat」、Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 143:711-714（1973）、Ammendola, G.他「Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy」、Agents and Actions 5:250-255（1975）、Vinegar, R.他、「Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation」、Fed. Proc. 35:2447-2456（1976）に記載の胸膜白血病移動阻止アッセイである（実施例７，７ａ、７ｂ、７ｃおよび９、および図３、５および６参照）。
白血球移動阻止アッセイは一般に次のように実施する：
抗炎症性組成物を含有するサンプルをｍｌ％カラゲナン溶液で人工的に炎症を起こした雌の成熟ラットに投与し、次に、対照ラットでの胸水中の白血球数と比較した処理ラットでの胸水中の白血球数の減少により（自動画像分析手法を使用し）、サンプルの抗炎症効果を測定した。
また、実質的に純粋な抗炎症性組成物の抗炎症作用を、ラットのフットパッド（footpad）にカラゲナンを注射して生じさせた浮腫でテストできる（Winter, C. A., Risley, G. A. Nuss, A. W.、「Garrageenan-Induced Edema in the Hind Raw of the Rat as an Assay for Anti-Inflammatory Drugs」、Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3:544（1967））。
その他の種々のテストも使用できる。（Wetnick, A. S.およびSabin, C、「The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats」、Jap. J. Pharm. 22:741（1972））。
治療のための対象への投与
本発明はまた、対象の炎症を治療する方法にも関し、この方法は、対象に本発明の卵、卵製品および／または抗炎症性組成物を投与することを含む。
本発明の抗炎症性組成物は抗炎症活性を提供する任意の手段で投与できる。例えば、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内または経口投与できる。
経口投与は、特にカプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒を含む固体の剤形で実施するのが好ましい。固体の剤形では、抗炎症性組成物は少なくとも１つの、蔗糖、乳糖またはデンプンなどの不活性希釈剤と混合されている。このような剤形は、通常の実施の場合と同様に、不活性希釈剤以外の別の物質も含むことができる。カプセル、錠剤、丸剤の場合、これらの剤形には緩衝剤、ｐＨ感受性ポリマー、または任意のその他の食品および医薬品業界でカプセル封入剤として一般的に使用されている徐放用カプセル化剤も含むことができる。錠剤および丸薬は腸溶錠として製造することもできる。
経口投与用の抗炎症性組成物の液体の剤形には、製薬業界で一般に使用される不活性希釈剤を含有する、製薬上許容されるエマルジョン、縣濁液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。不活性希釈剤の他に、組成物には湿潤剤、乳化剤、縣濁液および甘味料も含むことができる。
非経口投与用の抗炎症性組成物の製剤には、滅菌した水性または非水性溶液、縣濁液またはエマルジョンが含まれる。非水性溶媒またはベヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。
有効成分の投与量は変化させてよい。しかし、有効成分の量は好適な剤形が得られるようなものである必要がある。選択された剤形は所望の治療効果、投与経路および治療期間に依存するものと理解されたい。
抗炎症性組成物を含有する卵それ自体を食品製品に入れて卵製品を形成するのが好ましい。食品製品に入れるため卵を製造する１つの好ましい方法は卵を乾燥させて卵粉末とするものである。卵の乾燥には種々の方法が公知であるが、噴霧乾燥が好ましい。わずか華氏１４０度（６０℃）の温度を使用するのが好ましい。乾燥工程の間、サンプルの水分含量をモニターして、任意の所望の堅さを有する最終品を得る。乾燥した卵粉末は飲料、タンパク質補助剤および任意のその他の栄養、運動関連製品に使用できる。さらに、卵粉末をケーキミックス、バー、キャンディ、クッキー用粉末等に使用できる。卵加工のその他の例には、オムレツ、柔らかいまたは固いゆで卵を作ることや、卵を焼くことを含み、所望であれば、卵を生食することもできる。
投与量および投与頻度は、副作用の可能性を考慮に入れて、患者の年齢および一般的な健康状態に依存しよう。投与はまた、他の併用薬や投与する薬剤に対する患者の忍容性にも依存しよう。
イオン交換ステップ後の製剤を保存する好ましい方法は、凍結乾燥粉末としてである。最初の精製ステップで採取した濾液を使用時まで冷蔵保存することができる。精製により得られた抗炎症組成物の活性は前記ラット胸膜白血球移動テストを使用して測定する。
本発明の卵、卵製品および／または抗炎症性組成物の投与により治療できる炎症性状態の例には、急性および亜急性滑液嚢炎、急性非特異的腱炎、全身性紅斑性狼瘡、全身性皮膚筋炎、急性リウマチ性心炎、水疱性皮膚炎、ヘルペス（herpeteformis）、重篤な紅斑、多形性剥脱性皮膚炎、肝硬変、季節性通年性鼻炎、気管支喘息、異所性皮膚炎、血清疾患、角膜炎、虹彩炎（opthalmicusiritis）、びまん性ウレイチス（ureitis）、声帯炎、ベリリウム中毒、溶血性貧血、乳腺炎、乳突炎、接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、乾せん性関節炎、強直性脊椎炎、急性尿酸塩関節炎、帯状疱疹、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、任意のその他の変形性関節疾患および任意のその他の関連する自己免疫疾患が含まれる。また、単離精製した卵製品はアレルゲンなどの潜在的な炎症物質に曝露された個体の治療にも使用できる。
有効量：
対象への高度免疫した卵または卵製品の投与に関し、対象に投与すべき高度免疫した卵または卵製品の好ましい投与量の範囲は対象の体重１ｋｇ当たり１グラムから４０グラムであると決定されており、下記実施例に詳述する。
高度に精製した抗炎症性組成物自体に関しては、高度免疫した卵の全卵、卵黄および卵白から精製単離した高度に精製した組成物の好ましい投与量の範囲は抗炎症性組成物１μｇから４００ｍｇと決定されている。
抗炎症因子：
抗炎症性組成物を単離精製した後、活性画分をさらに精製し、構造および活性の両者について検討し、より特異的で活性の高い抗炎症性化合物の特性を決定することができる。特に、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、抗炎症活性を示す単一の非常に純粋なピークを同定した。この単一の非常に純粋なピークは基本的化学構造を有する単一化合物を表すと考えられている。この化合物には卵の「抗炎症因子」と名付けた。
これまで本発明について一般的に述べてきたが、説明のためだけに本明細書に示し、特記しない限り、限定の意図は持たない具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明しよう。
実施例
実施例１
Ｓ−１００ワクチンの製造
米国特許第５２１５７４６号に開示され、表１に示す細菌（American Type Culture Colletionから入手した）を含有する「シリーズ１００」または「Ｓ−１００」として知られている多価ワクチンを１５ｍｌの溶媒で再構成し、３７℃で一晩インキュベートした。良好な増殖が得られた後、細菌縣濁液の約半分を使用し、１リットルのブロスに接種し、３７℃でインキュベートした。残りの縣濁液を滅菌したグリコール管に移し、−２０℃で６ヶ月まで保存した。
良好な増殖が培養中に可視的に認められた後、細菌を遠心分離により採取した。細菌ペレットを滅菌食塩溶液に再縣濁させ、細菌サンプルを３回遠心にかけて、細胞を洗った。３回目の洗浄の後、得られたペレットを少量の二度蒸留した水に再縣濁させた。
培地を含まない細菌縣濁液を８０℃の水浴中のガラスフラスコに一晩おくことにより、熱殺菌した。ブロス培養の生存率を、少量の熱殺菌した細菌を使用してテストした。ワクチンに使用するには細菌が死滅していなければならないので、ブロスに熱殺菌した細菌を接種し、３７℃で５日間インキュベートし、毎日増殖についてチェックした。
熱殺菌した細菌を乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥した細菌を滅菌食塩水と混合し、濃度２．２×１０8細菌細胞／ｍｌ食塩水（６６０ｎｍで光学密度１．０）とした。
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実施例２
高度免疫卵の抗炎症作用
この実施例は、実施例１に記載のような高度免疫卵の、高度免疫卵を含む食餌を摂取しているイヌのカラゲナンで誘発した皮膚浮腫に対する抗炎症作用を示す。これらの結果は、高度免疫卵が炎症を減少させることを示している。炎症に対する作用は、非ステロイド系抗炎症剤イブプロフェンのこの試験におけるＥＤ５０の投与量である１０ｍｇ／ｋｇで得られる抗炎症作用と同等であった。
２０匹のイーグル・ビーグル犬（各５匹の４群）に市販のラムと米のドッグフードの基礎食（３５０ｍｇ）を与えた。表２に示すように、１群各５匹としたイヌの２つの群（１群および２群）には約１００日のコンディショニング期間中基礎食のみを与えた。さらに、２群のイヌには、炎症を起こすためにカラゲナンでチャレンジする前に、炎症非ステロイド系抗炎症剤イブプロフェンを投与した。この同じ期間に、残りの２つの群（３群および４群）には基礎食と共に高度免疫卵（ＨＩＥ）を与えた。３群には高度免疫卵を３．５ｇ、４群には高度免疫卵３５ｇを食餌に添加した。コンディショニング食投与が終了した時点で、イヌに２％カラゲナンを皮内注射してチャレンジし、炎症反応を誘導した。
チャレンジの方法は次の通りである。各日に、チャレンジおよびテストするために、各群から１匹のイヌを無作為に選択した。全群にすべてのイヌをテストするまで、この手順を毎日５日間繰り返した。チャレンジを実施する１５分前に、２群のイヌにイブプロフェンを１０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。全てのイヌを静注により麻酔し、左側部（約６×８インチ）を剃毛した。剃毛した部分に３つのマークを２列つけ、１〜６の番号を付けた。マーク１に、陰性対照として０．１ｍｌの食塩水を皮内注射した。マーク２から６には、カラゲナン２％溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。試験期間中、同じ人が注射した。この濃度のカラゲナンを皮内注射すると、動物の１００％で測定可能な腫脹が生じ、この腫脹はイブプロフェンを１０ｍｇ／ｋｇで減少することが予め測定された。カラゲナンの最後の注射が終了した時点で、マイクロメータを使用して各腫脹を測定し、数を記録した。麻酔したイヌは回復させ、６時間後に、再度測定し、記録した。炎症反応の大きさの平均は各群について測定した。
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これらの結果は、高度免疫卵（３．５グラム＋基礎食および３５グラム＋基礎食）を与えた動物では腫脹が有意に減少したことを示し、経口摂取したときの高度免疫卵の予防作用を示唆している。さらに、これらの結果は、高度免疫卵の抗炎症活性が抗炎症剤イブプロフェンで認められる作用と同等であったことを示している。投与群と対照群の間には、ｐ＜０．０５の有意差が認められた。
実施例３
高度免疫したトリの卵からの＜３００００ダルトンの卵の炎症性組成物の単離
ステップ１：卵からの水溶性濾液の調製
液体卵黄、液体卵白、卵黄粉末を処理して水溶性画分を得た。液体の卵黄は、Lee（米国特許第５３６７０５４号）が開示したカプリル酸分離法（ＣＡＰＳ）により脱脂できる。液体卵白はこれらの実施例に記載の特定の時間加熱した。卵黄分は、これらの実施例に記載のように二成分溶媒、超臨界ＣＯ2、または酵素で脱脂できる。
ステップ２：水溶性画分の限外濾過
らせん状に巻いた３０Ｋ  ＭＸＣＯ限外濾過膜を有するAmicon DC10L限外濾過システムで水溶性画分を濃縮した。限外濾過カートリッジの膜の表面積は１０ｆｔ２で、再循環流量１０．４Ｌ／分およびフラックス流量２．３Ｌ／分、入口圧４０ｐｓｉ、出口圧３３ｐｓｉ（トランスメンブレン圧７ｐｓｉ）付近で実施した。
ステップ３：イオン交換クロマトグラフィ
水溶性画分をＤＣ１０Ｌ限外濾過にかけて得られた濾液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィで再度処理しいた。この手順では、ＤＥＡＥ−セファロース・ファスト・フロー・ゲル（Pharmacia）を３×１５ｃｍのガラスカラムに充填し、二度蒸留したｐＨ７．０の滅菌水で平衡化した。
０．２ミクロンのフィルタで予め濾過した濾液（＜３００００ダルトン＞）５００ｍｌを、２回蒸留したｐＨ７．０の滅菌水５００ｍｌで流量１０ｍｌ／分で洗ったカラムにかけた。卵の炎症性組成物を含有すると思われる結合画分を０．１５Ｍ  ＮＨ４０Ａｃ２５０ｍｌで溶離した。画分を集め、LKB Uvicord2138モニターを使用し、２８０ｎｍでモニターし、光学密度は接続したレコーダにプリントアウトされた。エンドトキシンを含まない実質的に純粋な卵の抗炎症性画分の溶離プロフィールを図１に示す。卵の炎症性組成物画分はその後の処理のために凍結乾燥した。
液体卵黄および液体卵白からの分子量＜３００００ダルトンの卵の炎症性組成物の調製
２リットルの高度免疫卵の卵黄を、Lee（米国特許第５３６７０５４号）が開示したカプリル酸相分離法（ＣＡＰＳ）で脱脂した。簡単に述べると、Ｓ−１００卵の卵黄を１％０．０２Ｍアセテート中に１％のカプリル酸および０．０６Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ５．０の緩衝溶液で１５倍に希釈した。濾過により水相を凝結相から分離し、０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整した。２リットルの保持液（retentate）が残るまで、水相を限外濾過した。限外濾過液をＤＥＡＥセファロースカラムにかけた。ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィ後、２リットルの卵黄から４６．６ｇの卵黄由来抗炎症性組成物が得られた（図４参照）。
高度免疫卵の卵白１リットルを３リットルの脱イオン水で希釈した。混合物を１時間、９０℃に加熱し、冷却し、遠心した。上清を４０ミクロンの濾紙で濾過し、約６４ｍｌの濃縮物が得られるまで限外濾過した。限外濾過液５００ｍｌをＤＥＡＥセファロース・カラムにかけた。卵白１リットルから、ＤＥＡＥセファロース・カラムクロマトグラフィ後に、４．４ｇの抗炎症組成物が得られた（図５参照）。
卵黄粉末からの分子量＜３００００ダルトンの卵の炎症性組成物の調製
３つの手順を使用して、卵黄粉末を脱脂し、次いで、脱脂した卵黄粉末から卵の炎症性組成物を単離した（図７）。
手順１：二相溶媒抽出
高度免疫卵の卵黄粉末を、無水エタノールとヘキサンからなる混合物と合わせ、卵黄から脂質を除去し、次に、卵の炎症性組成物画分を水性分離した。簡単に述べると、高度免疫卵の卵黄粉末４００ｇを二相溶媒（無水エタノール２５％とヘキサン７５％またはイソプロパノール２５％とヘキサン７５％）２リットルと合わせ、混合した。溶媒上清を除去し、さらに２回溶媒で抽出して、合計３回脂質抽出そ行った。最後の分離を容易にするてまに、最後の抽出混合物を遠心した。脱脂した卵黄物質を乾燥させ、４０００ｍｌの脱イオン水と合わせ、０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７に合わせた。次に、Amicon DC10L限外濾過システムで５００ｍｌまで濃縮した。
限外濾過液中の卵の炎症性組成物（＜３００００ダルトン＞）をＤＥＡＥセファロース・クロマトグラフィでさらに単離し、卵の炎症性組成物をその後の処理のために凍結乾燥した。ＤＥＡＥクロマトグラフィ後、限外濾過液から０．４５ｇの抗炎症性組成物が回収され、この活性を調べた（図３）。
手順２：超臨界ＣＯ2抽出
乾燥した高度免疫卵の卵黄を超臨界状態に置き、卵黄から脂質の一部を除去した後、卵由来の抗炎症性組成物を水性分離した。要約すると、乾燥した免疫卵卵黄粉末約４００ｇをAutoclabe Engineers（登録商標）ＳＣＥユニット内に置き、３２．２℃、〜５４００ｐｓｉで２０時間、静的ＣＯ2抽出を実施した。部分脱脂卵黄を４０００ｍｌの脱イオン水で均質化し、１００００ｒｐｍで３０分間遠心した。水性上清を分離し、Amicon DC10L限外濾過システムで５００ｍｌまで濃縮した。透過液中の卵の炎症性組成物（＜３００００ダルトン＞）をＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィでさらに単離した。
卵の炎症性組成物画分をその後の処理のために凍結乾燥させ、ＤＥＡＥクロマトグラフィ後、限外濾過液から１．８６ｇの卵の炎症性組成物が得られた。図６は、超臨界ＣＯ2抽出、限外濾過およびＤＥＡＥクロマトグラフィで脱脂した後の実質的に純粋な組成物のバイオアッセイ活性を示している。
手順３：酵素処理抽出
高度免疫卵の卵黄粉末を乳酸バッファ中のNewlase Fからなる混合物と共にインキュベートし、卵黄から脂質を分離した後、抗炎症性組成物画分を水性分離した。簡単に述べると、乾燥させたＳ−１００卵の卵黄粉末３００ｇを０．０５Ｍ乳酸バッファ（ｐＨ４．０）６リットルおよびNewlase F（Sigma #P-5027）２７ｇと混合し、均質化した。混合物を５０℃で１時間インキュベートし、次に、底部の水相を濾過した。得られた水相を０．５Ｍ  ＮａＯＨで中和し、３リットルの透過液が集められるまで、Amicon DC10L（３０Ｋ  ＭＷＣＯ）で濃縮した。透過液２７６ｍｌをＤＥＡＥセファロースカラムにかけた。ＤＥＡＥクロマトグラフィ後、３００００ＭＷの透過液の抗炎症活性を分析した。
＜３００００ダルトンの卵の炎症性組成物単離物の発熱物質の除去およびエンドトキシン含量
発熱物質の除去
卵の炎症性組成物単離物の発熱物質を除去し、抗炎症性組成物活性を模倣するエンドトキシンを除去した。簡単に述べると、卵の抗炎症粉末６０ｍｇを滅菌生理食塩水１５ｍｌに溶解した。混合物を3K MWCO Centriplus Concentrators（Amicon）で超遠心して、発熱物質を除去した。Centriplis Concentratorsは予め、層流下で無菌手法を使用するＰｙｒｏＣＬＥＡＮ（AlerCHECK. Inc.）で発熱物質を除去した。エンドトキシンは、当業界で利用できる標準手順で除去することもでき、分子量分離に基づく必要はない。
分析
確認のために、発熱物質を除去した卵の炎症性組成物のエンドトキシン含量を腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量した。簡単に述べると、生理食塩水で希釈した卵の炎症性組成物のアリコートを、１０％ウシ胎児血清を加えたRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）培地中で増殖させたＪ７７４マクロファージを含有するプレートに加えた。３７℃で４時間インキュベートした後、上清を、抗ＴＮＦモノクローナル抗体でコーティングし、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックしたプレートに加えた。プレートを室温で一晩インキュベートした後、ビオチニル化した抗体とストレプトアビジン・ペルオキシダーゼを加えた。発色のために、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質をプレートに入れた。プレート・ウェルの内容物の吸光度を４５０ｎｍで読みとった。卵由来の抗炎症性サンプル中のＴＮＦ濃度を、標準曲線から内挿により測定した。発熱物質除去後の卵の炎症性組成物単離物のＴＮＦ含量は無視できる程度であった（表３参照）。
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白血球移動に対する＜３００００ダルトンのエンドトキシンを含まない抗炎症性組成物の作用
実質的に純粋な＜３００００ダルトンの卵の炎症性組成物の各投与量における抗炎症作用を、対照ラットと比較して、実質的に純粋な卵の炎症性組成物で処理したラットでの胸水中の白血球数の減少により測定した（表４、図２参照）。図２および表４は、実質的に純粋な高度免疫した卵の卵黄画分および卵白画分の作用を、通常の食用卵から得られた作用と比較している。実質的に純粋な高度免疫した抗炎症性組成物は全ての投与量で、胸水中に移動する白血球数を減少させた。卵黄からの実質的に純粋な組成物を２ｍｇ与えた対象で最も大きな効果が認められた。
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卵の炎症性組成物の特性化
上記方法で調製した実質的に純粋な卵の炎症性組成物の分子量は３００００ダルトン未満であることが判った。このことは、卵黄および卵白から組成物を単離する最初のステップを、分子量＞３００００ダルトンの種を通過させない膜を使用する限外濾過で実施したことから推量された。
この組成物は一般的条件下では負の電荷を有し、そのゲルのｐＫａ値は９．５である。これは卵の限外濾過液をＤＥＡＥセファロースイオン交換カラムにかけることにより測定した。抗炎症性組成物は水ではカラムから溶離されなかった。溶離媒質をＮＨ4ＯＡｃ溶液またはｐＨが９．５を超える任意の塩溶液またはバッファに変更すると、卵の炎症性組成物が溶離された。限外濾過液をＤＥＡＥカラムにかけると、種々のタンパク質および塩が未結合画分（ピーク１，図１）を構成した。カラムをＮＨ4ＯＡｃ溶液（ピーク２）、次にＮａＣｌ溶液（ピーク３）で洗ったとき、ピークが記録された。ピーク２から単離した画分はラットのアッセイで抗炎症活性を示した。ピーク３はほとんど活性を示さなかった。卵白由来の抗炎症性組成物は９０で１時間、熱に安定であった。
さらに、卵の炎症性組成物を卵黄および卵白から単離することができる。卵黄由来の卵の炎症性組成物は卵白由来の卵の炎症性組成物より高い活性を示す（図２、表４）。
実施例４
卵から高度に精製された抗炎症性組成物を調製する好ましい方法
以下の実施例は、トリの卵から高純粋の、分子量が最も少なく、非凝集型の抗炎症性組成物を得るための（大量精製に好適な）方法を示す。高度免疫した卵および対照の食用卵の全卵を割り、卵黄から卵白を分離し、この両者を噴霧乾燥させた。高度免疫した卵は実施例１に記載のようにして得た。卵白粉末を別に処理して、限外濾過用の水性画分を得た。
精製ステップはすべて、細菌および発熱物質の混入を最小に抑えるように実施した。溶液の調製には滅菌水を使用し、すべてのガラス器具は発熱物質を除去した。さらに、溶液は濾過滅菌した。
実施例４ａ
卵黄からの卵の炎症性組成物の調製
溶媒抽出
乾燥した卵黄をプロパンまたはブタンによる液体溶媒抽出にかけて、抗炎症性組成物を含有する水性卵黄画分から脂質を分離した。簡単に述べると、乾燥した卵黄粉末５００ｇをカラムにかけ、液体プロパン溶媒４リットルを加えた。溶媒上清および抽出された脂質を除去した。さらに溶媒抽出を６回実施し、合計６回脂質抽出を行った。
限外濾過
乾燥した脱脂卵黄４００ｇを滅菌蒸留水４リットルで希釈し、Virtis（handishear）で均質化した。卵黄混合物を２４ＲＰＭで遠心するか、未溶解の卵黄粒子が沈殿するまで冷蔵放置した。得られた水性画分を、３０００ＭＷカットオフ螺旋巻き膜を備えたAmicon RA1000限外濾過システムを使用して限外濾過した。ポンプ速度は入口圧２０ｐｓｉ、出口圧１５ｐｓｉに維持した。分子量＜３０００の透過液を０．４５μｍの滅菌した使い捨てNalgeneフィルタを使用して濾過滅菌し、保存、バイオアッセイ検査またはさらに精製するために凍結乾燥または乾燥させた。図８は精製プロセスのフロー・チャートを示す。
卵黄からの３０００ダルトン以下の分子種は分子量の低い、非凝集型の抗炎症性組成物を含有している。出発物質４００ｇから約１２ｇの抗炎症性組成物が得られ、収率は全体の３％であった。この３Ｋ画分の抗炎症活性をバイオアッセイで調べると、高いレベルの活性が認められた（実施例６ａ）。
実施例４ｂ
卵白粉末からの卵の炎症性活性の調製
実施例１に記載のような高度免疫した卵および対照の食用卵の両者から単離した卵白４ｇを脱イオン水１リットルで希釈した。混合物を均質化し、４０μｍフィルタで濾過し、３Ｋ  ＭＷＣお限外濾過システムで限外濾過した（図９）。卵白粉末４００ｇから、８．６ｇすなわち２．１５％の抗炎症性組成物が回収された。この物質はラットの白血球の傷害誘導部位への移動を阻止する活性がバイオアッセイで示された（実施例６ａ）。
この実施例は、高度免疫卵と対照の食用卵の両方の卵黄物質からの活性のある抗炎症性組成物の調製を示している。
実施例５
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ
卵の炎症性組成物を陰イオン交換ＤＥＡＥクロマトグラフィでもさらに特性化した。この実施例は、抗炎症性組成物が中性ｐＨでは負の電荷を有することを示した。
卵白および卵黄物質の両者からの１０Ｋ限外濾過は、実施例４ａに記載したものと同じ方法で、但し、３０００ＭＷ膜の代わりに１００００ＭＷ膜を使用して得た。
ＤＥＡＥ―Ｐｏｒｏｓ５０カラム（１０／５０ｍｍ）を二度蒸留した発熱物質を含まないｐＨ７．０の滅菌水（Sigma）で平衡化した。限外濾過液（＜１００００ＭＷ）１０ｍｇを二度蒸留した発熱物質を含まない滅菌水１００ｍｌに溶解し、ＢｉｏＣａｄ７００（Perseptives Biosystems）上のＤＥＡＥ  Ｐｏｒｏカラムにかけた。流量１０ｍｌ／分で、この物質をカラムにかけた。カラムに結合しない物質の最初の溶離液を蒸留水で除去した。集めた。酢酸アンモニウムの直線勾配（０％−１００％）を使用して、カラムに結合した物質を溶離し、画分の２８０ｎｍおよび２５４ｎｍでの紫外線吸収をモニターして、Avantecフラクションコレクタで１０ｍｌの画分を集めた。
ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を使用して、カラムに結合した残りの物質を除去した。２８０ｎｍおよび２５４ｎｍでの吸光度が元のレベルに戻るまで、カラムを蒸留水で洗った。
図１０は典型的なクロマトグラムを示している。矢印は活性のある抗炎症性画分（ピーク２）を示している。ＮＨ4酢酸塩による典型的な溶離プロフィールを、矢尻に示した溶離バッファの変化と共に示している。溶出液を０．４５μｍの滅菌フィルタで濾過滅菌し、凍結乾燥により乾固し、重さを測定した。各ピークをバイオアッセイした結果、活性を有するピークはピーク２に認められることが判った（実施例６ｂ）。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィで単離した画分は、抗炎症性組成物が負の電荷を有することを示した。
実施例６
抗炎症活性アッセイ
食用卵および高度免疫卵の卵黄および卵白の実質的に精製された画分の盲検試験で抗炎症活性を測定した。このテスト・アッセイでは、ラットの細動脈から胸腔内の傷害誘導部位への白血球の移動の阻止を測定した。
体重１２０ｇ〜１５０ｇの雌のラット（Charles River、ＭＡ）の胸腔に生理食塩水中の１％カラゲナン（刺激原）２ｍｌを注射して、胸腔内内への白血球の移動を誘導した。次に、ラットに生理食塩水中の選択した濃度の各テスト画分０．５ｍｌを腹腔内（ＩＰ）注射した。各濃度を２匹のラットに注射した。食塩水の注射を対照として使用した。注射４時間後、動物福祉法に適合した方法を使用して動物を屠殺した。胸水を取り出し、評価のために白血球を固定した。胸水５０μｌを対応の標識スライドガラスに載せ、サイトスピン（cytospin）に載せた。サイトスピン・サイクル終了後、スライドグラスにｃｙｔｏｐｒｅｐ固定液（Fisher Scientific Co.アトランタ）を噴霧視、ヘマトキシリンで染色した。各スライドグラスの５つの代表的な領域を評価し、Bioscan Optimas画像分析プログラムで白血球数を計測した。５つのすべての測定値の平均を各ラットの総平均白血球数に使用した。各サンプル濃度について、対照の食塩水の注射と比較して阻止率を計算した。
実施例６ａ
高度免疫卵および食用卵の卵白および卵黄由来の抗炎症活性の比較
実施例４に記載のように食用卵および高度免疫卵からの噴霧乾燥した脱脂卵黄および卵白から精製した画分の抗炎症活性を調べた。実施例４および５に記載のように、限外濾過後に、食用卵の卵白、高度免疫卵の卵黄および卵白からの３０００ＭＷ未満の透過液を得た。実施例６に記載のように、各サンプルについて２匹のラットに食塩水または試験画分１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇまたは２０ｍｇを腹腔内（ＩＰ）注射し、評価した。
図１１は高度免疫したニワトリからの分子量３０００未満の高度に精製した卵黄画分が１ｍｇ／ラットの投与量で白血球の移動を６５％阻止したことを示している。また、同じ投与量で、これらの高度免疫卵の卵黄画分（１ｍｇ／ラットで６５％阻止）は高度免疫卵の卵白から得られた画分（３８％）より高い活性を示した。対照の卵白はより低い抗炎症活性（１ｍｇ／ラットで２５％の阻止率）を示した。すべての雌鶏はワクチン接種を受けており、環境内の微生物およびアレルゲンの存在で免疫されているため、高度免疫していない卵の画分も抗炎症活性を有している。しかし、驚くべきことに、高度免疫のプロセスにより、卵黄および卵白の両者で抗炎症性組成物の濃度が上昇した。卵の成分は一般に脂質の多い卵黄と卵白とに区分されているので、抗炎症活性が卵黄および卵白の両者からの３０００ＭＷ未満の画分で認められたことは驚くべきことである。
この実施例は、分子量３０００ダルトン未満の抗炎症性組成物が卵黄および卵白に認められ、高度免疫卵の画分では対照の食用卵より非常の高い有効な量で認められることを示している。事実、高度免疫卵では、高純度の抗炎症性組成物が炎症の治療に有効な量認められる。
実施例６ｂ
白血球の移動に対する負に荷電したＤＥＡＥ画分の作用
抗炎症に関するバイオアッセイの後、高度免疫卵の卵黄からＮＨ４０Ａｃで溶離された負に荷電されたＤＥＡＥのピーク２、３Ｋおよび１０Ｋの限外濾過液の活性を調べた。各サンプルについて示した投与量でテストした。
図１２は、高度免疫したニワトリの卵からのＮＨ４０Ａｃで溶離された負に荷電されたＤＥＡＥのピーク２、３Ｋおよび１０Ｋの限外濾過液は、対照の食塩水と比べ高い抗炎症活性を示すことを示している。
実施例６ｃ
抗炎症剤との比較
抗炎症剤インドメサシンおよびアスピリンを卵由来の３Ｋ限外濾過液と白血球移動の阻止に関してin vivoで比較した。このアッセイでは、インドメサシン、アスピリンおよび高度免疫卵からの３Ｋの卵の炎症性組成物を１０００μｇ、１００μｇ、１０μｇ、１μｇの投与量で腹腔内注射した。
図１３は、３Ｋの限外濾過液およびアスピリンが同程度の抗炎症活性を示したことを示している。インドメサシンによる白血球移動の阻止のレベルは低い投与量（１から１００μｇ／ラット）で低下するようであった。
この実施例は卵の炎症性組成物が白血球移動アッセイで、公知の抗炎症剤と同等の作用を有することを示している。
実施例７
逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による抗炎症因子の精製
実質的に純粋な、卵黄からの３Ｋおよび１０Ｋ未満のＤＥＡＥ画分および卵白からの３０ＫのＤＥＡＥ画分をWaters C8対称逆相カラム（３．９×２５０ｍｍ）で分離した。７１７プラス自動サンプラおよび９９６光ダイオードアレイ検出器を備えたWaters2010型ＨＰＬＣで、移動相として１０％〜８０％メタノールとＨ2Ｏの直線勾配を使用した。凍結乾燥したサンプルを二度蒸留した滅菌水１００から２００ｍｌで希釈した。カラムを２ｍｌ／分の流量で溶離し、流出液ダイオードアレイ・データを２００ｎｍ〜３５０ｎｍの全ての波長について蓄積した。
図１４は、３Ｋの透過液の分離のＭＡＸプロット・クロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、高度に精製した卵の炎症性組成物が得られる分子量３Ｋ未満の２つの主なピークを示している。図１５は、実施例５に概説したようにＤＥＡＥイオン交換カラムで分離した１０Ｋの透過液からの組成物の分離を示している。３Ｋの限外濾過液で認められるものと同様の２つのピークが得られた。これらの結果は、抗炎症活性を示す（実施例７）３Ｋ未満とＤＥＡＥの両方の画分が高度に精製された負に荷電された成分を得るのに使用できることを示している。
３Ｋの卵黄画分からの組成物を分析した結果、１分から２分に溶出される最初の一連のピークと１０分から２０分後に溶出される３つのピークとが存在することが示された。この実施例は、抗炎症性組成物が３０００ＭＷ未満であり、この方法により比較的純粋なピークに分離できることを示している。
分離用ＨＰＬＣ
限外濾過後に抗炎症因子を大量に得るためには、分離用ＨＰＬＣカラムで高度に精製された、分子量３０００未完の組成物を分離するステップが好ましい。従って、５．０８×２０ｃｍのカラムにZorbax C8充填材を充填し、カラムを流す毎に、３０００ＭＷ未満の限外濾過液４ｇを精製した。０．０５％ＴＦＡを含有する水とメタノールの８０：２０の混合物を移動相として使用し、流量を９０ｍｌ／分とすることにより、透過液を高度に精製された組成物に分離し、これを集め、凍結乾燥させた。次に、集めたピークを分析用Ｃ８カラムで再テストした。上記の方法を使用して、分析用ＨＰＬＣで大量の超純粋なピークを得て、これをバイオアッセイ活性、元素組成、化学構造について分析した。質量分析、元素分析、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用してこの因子の構造を決定中である。
実施例８
卵の炎症性組成物の物理特性
この実施例は熱安定性、酸および塩基中および蛋白質分解酵素処理での変化を示している。
３０００ＭＷ未満の限外濾過液４ｍｇを滅菌水で希釈し、１００℃に３０分間おいた。３Ｋ未満の限外濾過液のサンプルを酸ＨＣｌ（ｐＨ２．０）、中性（ｐＨ７．４）および塩基ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）に３０分間おいてから、中和した。３Ｋの画分は１単位のプロナーゼ酵素でも１時間処理した。全サンプルは濾過滅菌し、凍結乾燥し、重量を測定し、生物活性を調べた。
処理画分（高温、ｐＨの変化、プロナーゼ消化）のバイオアッセイ活性を未処理対照および食塩水を注射した動物と比較すると、驚くべきことに、これらの処理に対し安定であることが示される。大きさが小さい（３０００ＭＷ未満）ことに加え、高温、ｐＨの変化、プロナーゼ処理に安定であることから、抗炎症性組成物がタンパク質ではないことが示唆された。
高純度の抗炎症性組成物が次の特性を有することが明らかになった。分子量は３０００ダルトン未満である。この特性は、３０００ダルトンを超える分子種を透過させない限外濾過膜を単離精製プロセスで使用する組成物の単離精製から推量された。組成物は大きさが小さく、タンパク質を分解する酵素で分解されないことから、非タンパク質で非ステロイド系物質であることと決定される。さらに、組成物は経口的に活性で、消化酵素で分解されない。組成物が小さく（これより非常に大きなタンパク質とは識別される）、安定なことから、消化管からの吸収が促進される。
組成物は酸および塩基に耐性で、ｐＨ９．０の条件で処理した後でさえ、活性型に戻る。さらに、組成物は１００Ｃに少なくとも３０分間熱安定であり、中性ｐＨで負に荷電される。
卵の炎症性組成物は全卵、卵黄および卵白から単離できる。卵黄から単離された抗炎症性組成物は卵白から精製された抗炎症性組成物より高い抗炎症活性を示す。
高度免疫した卵の全卵、卵黄および卵白から通常以上のレベルの抗炎症性組成物が単離できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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