(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドであって、前記ＳＭＧ−１活性が、ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をリン酸化する活性である、前記ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【請求項８】
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと、（２）ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なＳＱモチーフを含むその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと、（３）試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドと前記ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なＳＱモチーフを含むその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと前記試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なＳＱモチーフを含むその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドがリン酸化されたか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと（２）試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドと前記試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、前記ポリペプチドが自己リン酸化されたか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＭＧ−１に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物には、プロモーター部位は正常の遺伝子と同じにもかかわらず、遺伝子の本来の翻訳領域の途中のコドンがストップコドンに変異したナンセンス変異ｍＲＮＡを認識して、特異的に分解する機構として、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ；ＮＭＤ）が存在する。この機構に関与している遺伝子として、酵母から３つの遺伝子（ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、及びＵＰＦ３）が、そして、線虫から７つの遺伝子（ＳＭＧ−１〜ＳＭＧ−７）が報告されている。これらの遺伝子の変異体生物では、ナンセンス変異ｍＲＮＡの特異的な分解が抑制されることも報告されている。なお、酵母ＵＰＦ１タンパク質と線虫ＳＭＧ−２タンパク質とは、高いアミノ酸配列の相同性を有している。また、酵母ＵＰＦ１遺伝子と高い塩基配列の相同性を有するヒト遺伝子及びマウス遺伝子として、Ｒｅｎｔ１／ＨＵＰＦ１が単離され、この遺伝子は、ＵＰＦ−１変異体酵母において、ＵＰＦ−１の機能を相補することが示されている（以下、Ｒｅｎｔ１／ＨＵＰＦ１を、単に「ヒトＵＰＦ１」と称する）。また、８４４位アルギニンをシステインに変異させた変異型ヒトＵＰＦ１タンパク質を動物細胞内で発現させると、ナンセンス変異ｍＲＮＡの特異的な分解の抑制がみられる。なお、これらの遺伝子の変異体は致死性でないので、生存に必須の遺伝子ではないと考えられる。
【０００３】
ＵＰＦ１／ＳＭＧ−２タンパク質は、Ｚｎフィンガーモチーフ及びＲＮＡヘリカーゼ様の構造をもち、ｍＲＮＡの分解を担う複合体のユニットとして働いていると考えられている。また、その他の遺伝子は、この酵素の活性や局在等の調節を行なっていると考えられている。線虫では、ＳＭＧ−２タンパク質がリン酸化を受けていること、そして、ＳＭＧ−１、ＳＭＧ−３、又はＳＭＧ−４の各遺伝子の変異体の線虫では、ＳＭＧ−２タンパク質のリン酸化が起きないことが報告されている。また、線虫ＳＭＧ−１のｃＤＮＡの塩基配列が報告されており、ＳＭＧ−１タンパク質は、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ；ＰＩＫＫ）と呼ばれる一群のセリン／スレオニンキナーゼのファミリーで保存されているキナーゼドメインと高い相同性を有するキナーゼドメインを有しており、ＰＩＫＫファミリーと考えられる。また、ショウジョウバエのゲノム遺伝子の塩基配列からショウジョウバエＳＭＧ−１と考えられる配列が報告されている。しかし、ヒトを含め、哺乳類のＳＭＧ−１遺伝子の塩基配列及びそれがコードするＳＭＧ−１タンパク質のアミノ酸配列は明らかにされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、新規のフォスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩＫ）−関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）の取得を目的に、鋭意探求したところ、新規のヒトＳＭＧ−１タンパク質及びそれをコードするＤＮＡを取得した。しかも、本発明者は、前記ヒトＳＭＧ−１が自己リン酸化及びＵＰＦ１／ＳＭＧ−２をリン酸化する活性を有すること、そして、ＵＰＦ１／ＳＭＧ−２、ＵＰＦ２、及びＵＰＦ３と共に免疫沈降することから、ＮＭＤの引き金を引く、いわゆる、サーベイランス複合体の構成員であることを始めて示すと同時に、ＳＭＧ−１の点変異体を用いて実際に哺乳類細胞でＳＭＧ−１がＮＭＤに必須であることを証明した。更には、ヒトＳＭＧ−１を阻害することにより、ＮＭＤを抑制可能であることを新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、新規のフォスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩＫ）−関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）、及びそれをコードする新規のポリヌクレオチドを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
また、本発明は、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
また、本発明は、前記発現ベクターでトランスフェクションされた細胞に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドに結合する抗体又はその断片に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物に関する。
また、本発明は、（１）前記ポリペプチドと、（２）Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと、（３）試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドと前記Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと前記試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドがリン酸化されたか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、（１）前記ポリペプチドと（２）試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドと前記試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、前記ポリペプチドが自己リン酸化されたか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の抑制剤に関する。
また、本発明は、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼの阻害剤を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の抑制剤に関する。また、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた、前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス変異により早期転写終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤に関する。
また、本発明は、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼの阻害剤を有効成分として含有する、ナンセンス変異により早期転写終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤に関する。
また、本発明は、（１）フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼの阻害剤、又はＳＭＧ−１活性欠損体と、（２）アミノグリコシド系抗生物質とを有効成分として含有する、ナンセンス抑制剤に関する。
また、本発明は、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼの阻害剤、又はＳＭＧ−１活性欠損体を有効成分として含有する、ナンセンス抑制剤に関する。
また、本発明は、（１）前記ポリペプチド、（２）前記ポリペプチドのＳＭＧ−１活性を促進する物質、又は（３）前記ポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の促進剤に関する。
また、本発明は、被検対象から採取した、早期転写終止コドンによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞を、ＳＭＧ−１活性阻害物質の存在下で培養する工程、及び
前記工程で得られた前記試験細胞における前記遺伝子に由来するポリペプチドの分子量を分析する工程
を含む、前記遺伝子におけるナンセンス変異点を同定する方法に関する。
更に、本発明は、被検対象から採取した、早期転写終止コドンによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞少なくとも２つを、ＳＭＧ−１活性阻害物質の存在下及び不在下で、それぞれ培養する工程、及び
前記工程で得られた各試験細胞における前記遺伝子に由来するｍＲＮＡ量の差異の有無を検出する工程
を含む、ナンセンス変異を有する遺伝子の検出方法に関する。
【０００６】
本明細書において「ＳＭＧ−１活性」とは、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２［Ｓｕｎ，Ｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１０００９−１００１４（１９９８）；及びＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ａ．ら，Ｒｎａ，６，１２２６−１２３５（２０００）］をリン酸化する活性を意味する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者は、３６５７個のアミノ酸残基からなる新規ＰＩＫＫ、すなわち、ヒトＳＭＧ−１を見出した。そのアミノ酸配列は、配列番号２で表わされる配列における第１番〜第３６５７番のアミノ酸からなる配列で示される。更に、本発明者は、この新規タンパク質の第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸残基からなるＣ末端側部分断片、あるいは、第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸残基からなるＣ末端側部分断片も、充分なＳＭＧ−１活性を有することを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
【０００８】
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；並びに
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
【０００９】
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、
（１ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド；
（１ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＳＭＧ−１活性を示す融合ポリペプチド；
（１ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＳＭＧ−１活性を示す融合ポリペプチド；
（１ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド；並びに
（１ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＳＭＧ−１活性を示す融合ポリペプチド
などが含まれる。
【００１０】
本明細書において、試験対象であるポリペプチドが「ＳＭＧ−１活性を示す」か否かを判定する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、前記の試験ポリペプチドと、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２（例えば、ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２）、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドとを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドがリン酸化されたか否かを分析することにより、確認することができ、具体的には、例えば、後述の実施例９（１）に記載の方法で確認することができる。
【００１１】
前記ポリペプチド（１ａ）、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド」は、ＳＭＧ−１活性を示す、３５５１個のアミノ酸残基からなる新規タンパク質である。前記ポリペプチド（１ａ）は、前記ポリペプチド（１ｃ）、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の部分ポリペプチドに相当する。
前記ポリペプチド（１ｃ）は、分子量約４３０ｋＤａの新規タンパク質であり、後述する実施例において「ｐ４３０」と称するタンパク質である。
また、前記ポリペプチド（１ｅ）、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド」は、ＳＭＧ−１活性を示す、３５２９個のアミノ酸残基からなる新規タンパク質であり、前記ポリペプチド（１ｃ）の部分ポリペプチドに相当する。前記ポリペプチド（１ｅ）は、分子量約４００ｋＤａの新規タンパク質であり、後述する実施例において「ｐ４００」と称するタンパク質である。
【００１２】
本発明のポリペプチドにおける前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００１３】
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
【００１４】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、サル、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体としては、後述の実施例５に示すように、サルの分子量４００ｋＤａ又は４３０ｋＤａの各天然ポリペプチド、ラットの分子量４００ｋＤａ又は４３０ｋＤａの各天然ポリペプチド、あるいは、マウスの分子量４００ｋＤａ又は４３０ｋＤａの各天然ポリペプチドを挙げることができる。
更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。
【００１５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における第７１２番目〜第１１３０１番目の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することが可能である。
【００１６】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例９（１）に記載の方法により、ＳＭＧ−１活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００１７】
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例９（１）に記載の方法により、ＳＭＧ−１活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００１８】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上（より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＳＭＧ−１活性を示すポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）により得られた値を意味する。
【００１９】
更に、本発明のポリペプチドには、哺乳動物細胞又はその破砕物（例えば、細胞溶解物）と、ＳＭＧ−１（好ましくは哺乳動物ＳＭＧ−１、より好ましくはヒトＳＭＧ−１）に特異的に反応する抗体とを接触させることにより免疫複合体（例えば、免疫沈降物）を生成させ、前記抗体を除去することにより前記免疫複合体から分離して得られるポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドとしては、例えば、ヒト、サル、ラット、又はマウスの分子量４００ｋＤａ又は４３０ｋＤａの各天然ポリペプチドを挙げることができる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第７１２番目〜第１１３０１番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができ、
（ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６４６番目〜第１１３０１番目の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチド［本発明の前記ポリペプチド（１ａ）をコードする］、あるいは、
（ii）配列番号１で表される塩基配列における第３２８番目〜第１１３０１番目の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチド［本発明の前記ポリペプチド（１ｃ）をコードする］、又は
（iii）配列番号１で表される塩基配列における第７１２番目〜第１１３０１番目の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチド［本発明の前記ポリペプチド（１ｅ）をコードする］
が好ましい。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
【００２２】
前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
【００２３】
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
【００２４】
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００２５】
前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ  Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
【００２６】
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
【００２７】
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ii）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（iii）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、又は（iv）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法を採用することができる。
【００２８】
前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
【００２９】
前記（ii）のＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３０】
前記（iii）の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３１】
前記（iv）のセレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３２】
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
【００３３】
前記（３）の化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
【００３４】
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
【００３５】
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
【００３６】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞又は導入対象細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の発現ベクターには、本発明の組換えポリペプチドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現ベクターとが含まれる。
【００３７】
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
【００３８】
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、又はヒト由来細胞である２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，３７９−３８７，１９８７）等を挙げることができる。
【００３９】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有しているものも使用することができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
【００４０】
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとしてＳＶ４０複製起点を有しているものを使用すれば、細胞内で自律増殖が可能である。更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
【００４１】
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥTM６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
【００４２】
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生するトランスフェクションされた細胞を得ることができる。
【００４３】
遺伝子治療のベクターとしては、一般的に使用されているベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等）を用いることができる。
【００４４】
本発明の細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
【００４５】
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞内に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、本発明のポリペプチドを含む細胞抽出液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
【００４７】
本発明のポリペプチドを用いると、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御（例えば、阻害又は促進）する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を阻害する物質（例えば、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より具体的には、例えば、ウォートマンニン又はカフェイン）は、ＮＭＤを抑制することが可能であるので、ナンセンス変異により早期転写終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ：ＰＴＣ）を生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用であり、本発明のポリペプチドそれ自体を、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を阻害する物質、あるいは、特定遺伝子のナンセンス変異による病態の治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして使用することができる。ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態としては、特に限定されるものではないが、例えば、遺伝性疾患（例えば、デセンヌ型筋ジストロフィー症）、あるいは、体細胞変異によって生じる癌などを挙げることができる。重要な点は、ゲノムの変異によって生じる全ての疾患の中で、「ナンセンス変異によりＰＴＣを生じる」場合のほとんどがこれに当てはまるという点である。
【００４８】
ゲノムの変異により生ずる疾患の１／４は、特定遺伝子の途中に終止コドンが存在するため、前記遺伝子が本来コードする全長ポリペプチドからなるタンパク質が発現されないばかりでなく、ＮＭＤ機構の存在により、前記遺伝子が本来コードする全長ポリペプチドのＮ末端側部分断片からなるタンパク質断片も、ほとんど発現されないことが、その原因とされている。しかし、遺伝子の途中に終止コドンが存在したとしても、遺伝子の種類又は終止コドンの位置によっては、タンパク質断片の状態でも、全長ポリペプチドと同程度の、あるいは、最小限必要な活性を有する場合も少なくない。この場合、ＮＭＤ機構を抑制することができれば、有効な活性を有するタンパク質断片の発現が可能となるため、特定遺伝子の途中に終止コドンが存在するために生じる病態、すなわち、特定遺伝子のナンセンス変異による病態の少なくとも一部を解消することができることが理論的に予測されている。しかし、従来、ＮＭＤを特異的に抑制する手法は、全く知られていない。
本発明のスクリーニング方法により選択された物質の内、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を阻害する物質は、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性の阻害を通じて、ＮＭＤを特異的に抑制することができ、従って、特定遺伝子のナンセンス変異によるあらゆる病態について、少なくとも一部について遺伝子変異を解消することができるという全く新しいタイプの治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。
【００４９】
一方、本発明のスクリーニング方法により選択された物質の内、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を促進する物質は、ＮＭＤを促進することができるので、ＮＭＤの促進剤の有効成分として、あるいは、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法としては、ＳＭＧ−１活性の程度を評価する方法の違いに基づいて、
（Ａ）（１）本発明のポリペプチドと、（２）Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２（例えば、ヒトＵｐｆ１／ＳＭＧ−２）、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと、（３）試験物質とを接触させる工程、及び
本発明のポリペプチドとＵｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドと試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチドがリン酸化されたか否かを分析する工程
を含む方法（以下、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２型スクリーニング方法と称する）；及び
（Ｂ）（１）本発明のポリペプチドと（２）試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドと前記試験物質とを接触させた状態で、リン酸化反応を実施し、前記ポリペプチドが自己リン酸化されたか否かを分析する工程
を含む方法（以下、自己リン酸化型スクリーニング方法と称する）
を挙げることができる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００５２】
本発明のＵｐｆ１／ＳＭＧ−２型スクリーニング方法（以下、「Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２、若しくはリン酸化可能なその部分断片、又はそれらを含む融合ポリペプチド」として、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２を用いる場合を例にとって、本発明のＵｐｆ１／ＳＭＧ−２型スクリーニング方法を説明する）においては、試験ポリペプチドとＵｐｆ１／ＳＭＧ−２とを接触させる代わりに、本発明のポリペプチドとＵｐｆ１／ＳＭＧ−２と試験物質とを接触させること以外は、先述のＳＭＧ−１活性の判定方法と同様にして実施することができる。すなわち、本発明のポリペプチドとＵｐｆ１／ＳＭＧ−２と試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下においてリン酸化反応を実施し、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２がリン酸化されたか否かを分析することにより、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御（例えば、阻害又は促進）する物質であるか否かを判定することができる。例えば、試験物質の存在下において、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２がリン酸化されないか、あるいは、前記リン酸化の程度が減少する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を阻害する物質であると判定することができる。一方、試験物質の存在下において、試験物質不在下の場合と比較して、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化の程度が増加する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を促進する物質であると判定することができる。
【００５３】
ＳＭＧ−１活性は、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化の有無又は程度により判定することができるだけでなく、例えば、後述の実施例６（２）、実施例７（３）、又は実施例９（１）に示すように、本発明のポリペプチドそれ自体の自己リン酸化の有無又は程度によっても判定することができる。
本発明の自己リン酸化型スクリーニング方法では、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下においてリン酸化反応を実施し、前記ポリペプチドが自己リン酸化されたか否かを分析することにより、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を制御（例えば、阻害又は促進）する物質であるか否かを判定することができる。例えば、試験物質の存在下において、本発明のポリペプチドがリン酸化されないか、あるいは、前記リン酸化の程度が減少する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を阻害する物質であると判定することができる。一方、試験物質の存在下において、試験物質不在下の場合と比較して、本発明のポリペプチドのリン酸化の程度が増加する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧ−１活性を促進する物質であると判定することができる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧ−１活性を阻害する物質（例えば、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より具体的には、例えば、ウォートマンニン又はカフェイン）は、ＮＭＤを抑制することが可能であり、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。前記ＳＭＧ−１活性阻害物質（以下、単に、ＳＭＧ−１阻害物質と称することがある）は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＮＭＤを抑制することが必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］、あるいは、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。
本発明のＮＭＤ抑制剤、あるいは、本発明のナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）を含み、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含むことができる。
本発明のＮＭＤ抑制用医薬組成物、あるいは、本発明のナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防用医薬組成物は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む。
【００５５】
ところで、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療方法の１つとして、「ナンセンス抑制」を利用することが試みられている。「ナンセンス抑制」とは、ＰＴＣを有する遺伝子であっても、ＰＴＣの読み飛ばし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）により、全長タンパク質が産生される現象を意味する。いくつかのアミノグリコシド系抗生物質がノンセンス抑制を引き起こすことが公知であり、これを嚢胞性線維症又は筋ジストロフィー症などの重篤な遺伝性疾患に利用して症状の改善を図る試みが始まっている［Ｃｌａｎｃｙ，Ｊ．Ｐ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６３（７），１６８３−１６９２（２００１）又はＷａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｒ．ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４９（６），７０６−７１１（２００１）］。しかし、ＰＴＣを有する遺伝子から転写されるｍＲＮＡはＮＭＤにより排除されるため、ｍＲＮＡ自体の量が少なく、その効果は余り芳しくなかった。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧ−１阻害物質（例えば、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より具体的には、例えば、ウォートマンニン又はカフェイン）は、ＮＭＤを抑制する作用を有する。従って、このようなＳＭＧ−１阻害物質とアミノグリコシド系抗生物質とを併用すると、ＰＴＣを有する遺伝子であっても、ＮＭＤの抑制によりｍＲＮＡ量を増加させることができ、ＰＴＣの読み飛ばし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）による全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。
また、後述の実施例８（２）又は実施例８（３）に示すように、ＳＭＧ−１活性欠損体［例えば、実施例８（３）で用いた６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）］が細胞内で過剰に発現すると、ＳＭＧ−１活性欠損体不在の場合と比較して、ＰＴＣを有する遺伝子由来のｍＲＮＡ量が増加する。また、実施例１３（１）及び実施例１３（２）に示すように、ＳＭＧ−１の阻害剤を細胞に与えると、ＰＴＣを有する遺伝子由来のｍＲＮＡ量が増加する。従って、ＳＭＧ−１阻害物質又はＳＭＧ−１活性欠損体と、アミノグリコシド系抗生物質とを併用することにより、ＰＴＣを有する遺伝子であっても、ＮＭＤの抑制によりｍＲＮＡ量を増加させることができ、ＰＴＣの読み飛ばし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）による全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。
【００５７】
このように、ＳＭＧ−１阻害物質又はＳＭＧ−１活性欠損体と、アミノグリコシド系抗生物質とは、それら単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ナンセンス抑制が必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に、有効量で投与することにより、ナンセンス抑制に基づく、全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。
本発明のナンセンス抑制剤は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）又はＳＭＧ−１活性欠損体と、有効成分であるアミノグリコシド系抗生物質とを含み、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含むことができる。
本発明のナンセンス抑制用医薬組成物は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）又はＳＭＧ−１活性欠損体と、有効成分であるアミノグリコシド系抗生物質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む。
【００５８】
本発明のナンセンス抑制用医薬組成物で用いることのできるアミノグリコシド系抗生物質は、それ単独でナンセンス抑制作用を有するアミノグリコシド系抗生物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ゲンタマイシン又はＧ４１８を挙げることができる。
また、本発明のナンセンス抑制用医薬組成物で用いることのできるＳＭＧ−１活性欠損体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１２９番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧ−１活性（すなわち、Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２をリン酸化する活性）を示さないポリペプチドであって、しかも、ＰＴＣを有する遺伝子を含む細胞内で過剰に発現させた場合に、それが不在の場合と比較して、前記遺伝子由来のｍＲＮＡ量を増加させることができるポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３３１番目のアスパラギン酸（Ｄ）に相当するアスパラギン酸が、アラニン（Ａ）に置換されているポリペプチドを挙げることができる。
【００５９】
ナンセンス抑制に関して、更に、酵母では、３種のｕｐｆ遺伝子が効率的な翻訳停止に関連することが知られており、これらの遺伝子のいずれかの変異が、ナンセンス抑制を生じさせることも公知である［Ｗａｎｇ，Ｗ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０（４），８８０−８９０（２００１）］。また、線虫におけるいくつかの観察から、ナンセンス抑制の割合がｓｍｇ遺伝子欠失体において高まることも知られている［Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９，５９４３−５９５１（１９９９）］。これらの酵母又は線虫における公知事実は、ｓｍｇ遺伝子が、翻訳停止の厳密性を保証するのに重要であることを示しており、哺乳動物では、ＳＭＧ／ＵＰＦ各タンパク質（ヒトＳＭＧ−１を含む）が同様の機能を有するものと考えられる。従って、本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧ−１阻害物質は、それ単独でも（すなわち、アミノグリコシド系抗生物質と併用することなく）、ＰＴＣを有する遺伝子であっても、ＮＭＤの抑制によりｍＲＮＡ量を増加させることができ、ＰＴＣの読み飛ばし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）による全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。この場合、ＳＭＧ−１阻害物質は、２種類の異なる機序（すなわち、ｍＲＮＡレベルを増加させるＮＭＤ阻害、及び読み飛ばしによる全長タンパク質の合成を導く翻訳停止の抑制）によって、全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。
【００６０】
このように、ＳＭＧ−１阻害物質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ナンセンス抑制が必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に、有効量で投与することにより、ナンセンス抑制に基づく、全長タンパク質の産生を効率的に行なうことができる。
本発明のナンセンス抑制剤は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）を含み、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含むことができる。
本発明のナンセンス抑制用医薬組成物は、有効成分であるＳＭＧ−１阻害物質（好ましくはフォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より好ましくはウォートマンニン又はカフェイン）と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧ−１活性を促進する物質（ＳＭＧ−１活性促進物質；以下、単にＳＭＧ−１促進物質と称することがある）は、ＮＭＤを促進することが可能であり、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。また、後述の実施例８（２）又は実施例８（３）に示すように、本発明のポリペプチド［例えば、実施例８（３）で用いた６Ｈ−ｈＳＭＧ−１］をコードするポリヌクレオチドを細胞内へ導入し、前記ポリペプチドを細胞内で過剰に発現させると、ＮＭＤを促進させる（すなわち、ＰＴＣを有する遺伝子由来のｍＲＮＡ量を更に減少させる）ことができる。
【００６２】
このように、ＳＭＧ−１促進物質、又は本発明のポリペプチド、若しくはそれをコードするポリヌクレオチドは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＮＭＤを促進することが必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］、あるいは、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。
本発明のＮＭＤ促進剤は、有効成分であるＳＭＧ−１促進物質、又は本発明のポリペプチド、若しくはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含むことができる。
本発明のＮＭＤ促進用医薬組成物は、有効成分であるＳＭＧ−１促進物質、又は本発明のポリペプチド、若しくはそれをコードするポリヌクレオチドと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００６４】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００６６】
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
【００６７】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００６８】
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
【００６９】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
【００７０】
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
【００７１】
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
【００７２】
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
【００７３】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されている限り、特に限定されるものではなく、それ自体公知の方法により、作製することができる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドを含有してなる組換えベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、又はニワトリ等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）において、染色体上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）；又はＣｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化するか、あるいは、任意の配列と置換した変異クローンを作製する［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）］。胚性幹細胞の変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法又は集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞とからなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体との掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上に存在する本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に任意の変異を有する個体を得ることができ、更に、その個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入ったホモ個体の中から、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制された個体としてノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００７４】
また、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の任意の位置へ変異を導入することにより、ノックアウト非ヒト動物を作製することも可能である。例えば、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳領域中へ、塩基を置換、欠失、及び／又は挿入等させて変異を導入することにより、その遺伝子産物の活性を改変させることも可能である。
また、その発現制御領域への同様な変異を導入することにより、例えば、発現の程度、時期、及び／又は組織特異性等を改変させることも可能である。更に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、及び／又は発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモーターを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例［Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７  １９９６）］や、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）］が知られている。
【００７５】
従って、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子についても、このように任意の時期や組織で発現を制御することができ、また、任意の挿入、欠失、及び／又は置換をその翻訳領域や発現制御領域に有するノックアウト非ヒト動物を作製することができる。ノックアウト非ヒト動物は、任意の時期、任意の程度、及び／又は任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。このように、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。
【００７６】
更には、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子とは異なる遺伝子に起因する疾患のモデル動物を樹立するのに用いることもできる。例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の１つであるＳＭＧ−１ノックアウトマウスと、種々の系統の（見かけ上の）正常マウスとを掛け合わせる。後者の正常マウスが、ＰＴＣを有する変異遺伝子を含む場合、前記掛け合わせにより得られたマウス（例えば、相同染色体の双方にＳＭＧ−１変異が入ったホモ個体、あるいは、相同染色体の一方にＳＭＧ−１変異が入ったヘテロ個体）では、ＮＭＤが抑制されるため、前記変異遺伝子に由来するｍＲＮＡが増加する。その結果、或る変異遺伝子については、隠れていた症状が表面化し、何らかの疾患が生じることがあり、新たな疾患モデルマウスを樹立することができる。
【００７７】
本発明による、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子におけるナンセンス変異点を同定する方法は、
被検対象から採取した、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞を、ＳＭＧ−１活性阻害物質の存在下で培養する工程、及び前記工程で得られた前記試験細胞における前記遺伝子に由来するポリペプチドの分子量を分析する工程
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、後述の実施例１３（２）に示す方法に準じて、実施することができる。
本発明のナンセンス変異点同定方法によれば、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する可能性がある遺伝子、あるいは、ＰＴＣによるナンセンス変異を有することが知られている遺伝子において、どの位置に、ＰＴＣによるナンセンス変異が存在するかを同定することができる。
【００７８】
本発明のナンセンス変異点同定方法における培養工程では、被検対象から採取した、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞を、ＳＭＧ−１活性阻害物質（例えば、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より具体的には、例えば、ウォートマンニン又はカフェイン）の存在下で培養する。例えば、後述の実施例１３（２）では、試験細胞として、ｐ５３遺伝子にＰＴＣを有する培養細胞２種類を使用した。より具体的には、ｐ５３遺伝子（アミノ酸残基数＝３９３）の第１９６番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する肺腺癌セルラインＣａｌｕ６、及びｐ５３遺伝子の第２９８番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する小細胞肺癌腫セルラインＮ４１７を使用した。
本発明のナンセンス変異点同定方法では、コントロールとして、ＰＴＣを有しない正常遺伝子を含む細胞を用いることが好ましく、例えば、実施例１３（２）では、ＰＴＣを含まない正常ｐ５３遺伝子を有する培養細胞Ａ５４９を使用した。なお、このようなコントロールを用いない場合には、例えば、ＰＴＣを有しない正常遺伝子に由来するポリペプチドの分子量を予め決定しておくことが必要である。
【００７９】
本発明のナンセンス変異点同定方法における分析工程では、前記培養工程で得られた試験細胞における分析対象遺伝子に由来するポリペプチドの分子量を分析する。ポリペプチドの分子量の分析方法としては、公知の分析方法、例えば、ウエスタンブロット法を挙げることができる。例えば、実施例１３（２）を例にとると、図３１に示すように、ｐ５３遺伝子の第２９８番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する培養細胞Ｎ４１７では、前記遺伝子に由来するポリペプチドの分子量は約４０ｋＤａであり、ＰＴＣを含まない正常ｐ５３遺伝子を有する培養細胞Ａ５４９（コントロール）では、前記遺伝子に由来するポリペプチドの分子量は約５３ｋＤａであった。従って、これらの分子量の比較から、ｐ５３遺伝子の５’末端から約４０／５３の位置にＰＴＣが存在すると決定することができ、この値は、全コドン３９３個の内、第２９８番目のコドンがＰＴＣである事実と一致する。
【００８０】
本発明による、ナンセンス変異を有する遺伝子の検出方法は、
被検対象から採取した、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞少なくとも２つを、ＳＭＧ−１活性阻害物質の存在下及び不在下で、それぞれ培養する工程、及び
前記工程で得られた各試験細胞における前記遺伝子に由来するｍＲＮＡ量の差異の有無を検出する工程
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、後述の実施例１３（２）に示す方法に準じて、実施することができる。
本発明のナンセンス変異含有遺伝子検出方法によれば、ＰＴＣの有無が全く知られていない遺伝子であっても、その遺伝子にＰＴＣによるナンセンス変異が存在するか否かを検出することができる。
【００８１】
本発明のナンセンス変異含有遺伝子検出方法における培養工程では、被検対象から採取した、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子を含む可能性のある試験細胞少なくとも２つを、ＳＭＧ−１活性阻害物質（例えば、フォスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ阻害剤、より具体的には、例えば、ウォートマンニン又はカフェイン）の存在下及び不在下で、それぞれ培養する。例えば、後述の実施例１３（２）では、試験細胞として、ｐ５３遺伝子にＰＴＣを有する培養細胞２種類を使用した。より具体的には、ｐ５３遺伝子（アミノ酸残基数＝３９３）の第１９６番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する肺腺癌セルラインＣａｌｕ６、及びｐ５３遺伝子の第２９８番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する小細胞肺癌腫セルラインＮ４１７を使用した。なお、実施例１３（２）では、比較用として、ＰＴＣを含まない正常ｐ５３遺伝子を有する培養細胞Ａ５４９を使用した。
【００８２】
本発明のナンセンス変異含有遺伝子検出方法における分析工程では、前記培養工程で得られた各試験細胞における前記遺伝子に由来するｍＲＮＡ量の差異の有無を検出する。ｍＲＮＡ量の差異の有無の検出方法としては、公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット法を挙げることができる。例えば、実施例１３（２）を例にとると、図３１又は図３２に示すように、ｐ５３遺伝子の第２９８番目のコドンにおけるＰＴＣを含有する培養細胞Ｎ４１７では、ＳＭＧ−１活性阻害物質存在下の場合と比較して、ＳＭＧ−１活性阻害物質の不在下ではｍＲＮＡの量が減少し、ｍＲＮＡ量に差異が生じた。一方、図３１に示すように、ＰＴＣを含まない正常ｐ５３遺伝子を有する培養細胞Ａ５４９（比較用）では、ＳＭＧ−１活性阻害物質存在下の場合と比較して、ＳＭＧ−１活性阻害物質の不在下でもｍＲＮＡの量は変化せず、ｍＲＮＡ量に差異は生じなかった。
このように、ＳＭＧ−１活性阻害物質存在下の場合と比較して、ＳＭＧ−１活性阻害物質の不在下でｍＲＮＡの量が減少し、ｍＲＮＡ量に差異が生じた場合には、ＰＴＣによるナンセンス変異を有する遺伝子であると判定することができ、一方、ＳＭＧ−１活性阻害物質の存在下及び不在下でｍＲＮＡ量に差異が生じない場合には、ＰＴＣによるナンセンス変異を有しない遺伝子であると判定することができる。
【００８３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ヒトＳＭＧ−１（ｈＳＭＧ−１）ｃＤＮＡのクローニング》
本発明者は、ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１［Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，４，３０７（１９９７）；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＢ００７８８１］のコードするアミノ酸配列のＮ末端は、ＰＩＫＫファミリーで保存されているキナーゼドメインに特徴的なアミノ酸配列と相同性があり、また、そのＣ末端は、ＰＩＫＫファミリーで保存されているＦＡＴドメイン［Ｂｏｓｏｔｔｉら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２５，２２５（２０００）］に特徴的なアミノ酸配列と相同性があることを発見した。従って、ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１は、新規なＰＩＫＫファミリーのｃＤＮＡと考えられたが、その塩基配列には、終止コドン及び３’非翻訳領域は存在するものの、開始コドンと特定することができる配列はなく、不完全長ｃＤＮＡであると考えられた。そこで、ｃＤＮＡ全長の塩基配列を明らかにするために、クローンＫＩＡＡ０４２１よりも更に５’側のｃＤＮＡクローンの取得を試みた。
【００８４】
ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１のｃＤＮＡ断片をプローブとして、ヒト細胞株ＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）からクローンＣを単離した。同様に、ＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリー［Ｃｈａｍｂｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１４），５３１０−５３１４］からクローンｙａｍａ９（Ｙ９）を、ヒト肝臓ライブラリー（クローンテック社）からクローンｌｉｖｅｒ３３（Ｌｉｖ３３）を、そして、ヒト筋肉ライブラリー（クローンテック社）からクローンｍｕｓｃｌｅ２９（ｍｕｓ２９）をそれぞれ単離し、更に、それ以外にも種々のクローンを単離し、各々の塩基配列を決定した。
【００８５】
続いて、配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせを使用し、ヒト細胞株ＨｅＬａの総ＲＮＡを用いる逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、クローンｇａｐ１を取得した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、市販のキット（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄｓ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用し、４２℃で３０分間のＲＴ反応を実施した後、９５℃（３分間）で熱変性を行ない、９５℃（１分間）と５４℃（１分間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを３２回繰り返し、最後に７２℃（７分間）の伸張反応を行なうことによりＰＣＲを実施した。
また、配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせを使用し、ヒト細胞株ＨｅＬａの総ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ法により、クローンｇａｐ２を取得した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、クローンｇａｐ１を取得する際の前記ＲＴ−ＰＣＲと同じ条件で実施した。
これらのクローンの塩基配列をつなげてみたが、まだ開始コドンと特定することができる配列はなく、不完全長なｃＤＮＡの塩基配列しか得られなかった。
【００８６】
そこで、得られた塩基配列と一致する配列を有するＥＳＴを、塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から検索したところ、ヒトＥＳＴクローンＡＩ００５５１３［リサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）社］が見出された。このＥＳＴの塩基配列には、フレーム中に開始コドンＡＴＧが存在したため、ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１とその上流領域とからなる全長ｃＤＮＡの開始コドンを含む領域のＥＳＴと推定した。
このヒトＥＳＴクローンＡＩ００５５１３の塩基配列を決めることによって、ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１とその上流領域とからなるｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。その塩基配列は、配列表の配列番号１で表される塩基配列であり、塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）で検索したところ、この塩基配列は新規であった。
【００８７】
得られた各ｃＤＮＡクローンと、それから得られた新規塩基配列及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との関係を、図１に示す。前記各ｃＤＮＡクローンから得られたＫＩＡＡ０４２１とその上流領域とからなるｃＤＮＡの長さは、約１３ｋｂであり、３６５７アミノ酸からなるタンパク質をコードする約１１ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していた。前記ＯＲＦでコードされるタンパク質の推定分子量は約４３０ｋＤａであり、後述の実施例５（１）で検出した内在性分子（ｐ４３０）の概算分子量と一致した。
【００８８】
ＯＲＦがコードするアミノ酸配列（配列番号２で表されるアミノ酸配列）について相同性検索をしたところ、ＰＩＫＫファミリーであるＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）／ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）／ＲＡＦＴ１（ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ＦＫＢＰ−ｔａｒｇｅｔ  １）、ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ）、ＡＴＲ（ＡＴＭ−  ａｎｄ  Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ）／ＦＲＡＰ１、及びＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ−ＰＫ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）等と相同性があった。ヒトＳＭＧ−１と公知タンパク質とを比較した結果を図２に示す。
【００８９】
図２において、推定されるＰＩＫＫ関連ドメインを、黒色の四角形で示す。ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン結合領域（ＦＲＢ）及びその相同性領域（ＦＲＢＨ）を濃灰色で示し、そして、ＲＡＤ３相同性領域を明灰色で示す。ＣＲ１〜ＣＲ６は、線虫ＳＭＧ１（ＣｅＳＭＧ１）と相同性の高い領域を意味し、「１０００ａ．ａ．」はアミノ酸１０００残基の長さを示す。また、相同性の数値は、ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ  ｖｅｒ２．５．１（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ社）による。ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号は、ＦＲＡＰがＬ３４０７５であり、ＡＴＭがＵ３３８４１であり、ＡＴＲがＵ７６３０８であり、ＤＮＡ−ＰＫｃｓがＵ３４９９４である。
【００９０】
ヒトＳＭＧ−１において、前記ＣＲ１は、第５５７番目〜第７２７番目のアミノ酸からなる領域であり、以下、同様に、前記ＣＲ２は第９１１番目〜第１０５１番目のアミノ酸からなる領域、前記ＣＲ３は第１５６０番目〜第１７５６番目のアミノ酸からなる領域、前記ＣＲ４は第１７８５番目〜第２１０７番目のアミノ酸からなる領域、前記ＣＲ５は第２１４１番目〜第２４２２番目のアミノ酸からなる領域、そして、前記ＣＲ６は第３６０２番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる領域である。
また、ヒトＳＭＧ−１における第２１３０番目〜第２１３６番目のアミノ酸からなる領域は、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）として機能しうるアミノ酸配列である。
【００９１】
また、得られた新規配列とこれらのＰＩＫＫファミリー分子について、アミノ酸配列に基づき分子系統樹を作成したところ、異常ＲＮＡの分解に関与する遺伝子であるショウジョウバエＳＭＧ−１及び線虫ＳＭＧ−１と最も近い分子であり、ヒトｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１とその上流領域とからなるｃＤＮＡは、ヒトのＳＭＧ−１をコードするものと推定された。なお、ヒトＳＭＧ−１には、ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲ／ＲＡＦＴ１のＦＫＢＰ１２／ラパマイシン結合部位と相同性を有する配列ＦＲＢＨ（ＦＫＢＰ１２／ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）が存在し、また、他のＰＩＫＫファミリーと異なり、キナーゼドメインとＦＡＴドメインとの間に約１２００アミノ酸の長い配列が挿入されていた。
【００９２】
【実施例２】
《ノーザンブロット法による各種ヒトセルラインにおけるヒトＳＭＧ−１のｍＲＮＡの検出》
ヒト細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ［Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２１，１６６（１９７８）］、ＨＬ−６０（ＣＣＬ−２４０）、Ｕ９３７［Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１７，５６５（１９７６）］、ＨｅｐＧ２（ＨＢ−８０６５）、ＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）、ＰＣ３、Ａ４９８、及び５８７３Ｔから、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｕｉｃｋ  ＰｒｅｐＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出キット；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて、キット付属のマニュアルに従い、総ＲＮＡを調製した。以下のブロッティング及びハイブリダイズは、文献［Ｓｕｇｉｙａｍａ，ＪＢＣ，２７５，１０９５−１１０４，（２０００）］に従って実施した。すなわち、各ＲＮＡを電気泳動した後、ポリアミド膜（Ｈｙｂｏｎｄ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に転写した。ヒトＳＭＧ−１のｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１の５’側断片（配列番号１で表される塩基配列における第６２５５番目〜第７０４８番目の塩基からなる配列に相当）を、マルチプライムＤＮＡ標識システム（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて、付属のマニュアルに従い、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（２２０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて標識した。ＲＮＡを転写したポリアミド膜に、標識したｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ［１．６７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び１．６７ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］−０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、６０℃での洗浄操作（３０分間）を３回繰り返し、シグナルをオートラジオグラフィーで検出した。
【００９３】
ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｕ９３７、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、及びＰＣ３について、オートラジオグラフィーの結果を図３に示す。図３において、「２８Ｓ」及び「１８Ｓ」は、２８ＳリボソームＲＮＡ及び１８ＳリボソームＲＮＡの泳動位置をそれぞれ示す。図３に示すように、矢印で示す２本のヒトＳＭＧ−１のｍＲＮＡのバンドが検出された。また、データは示していないが、残る全てのヒト細胞株（Ａ５４９及び２９３Ｔ）で、同様の２本のバンドが検出された。従って、ヒトＳＭＧ−１遺伝子からは２種類の長さのｍＲＮＡが転写されると考えられた。
【００９４】
【実施例３】
《蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＦＩＳＨ）法によるヒト染色体のマッピング》
ＦＩＳＨマッピングは、文献［Ｉｚｕｍｉら，ＪＣＢ，１４３，９５−１０６（１９９８）］に従って実施した。すなわち、ヒト血液より単離したリンパ球を、１０％仔ウシ血清とフィトヘマグルチニンとを加えた培地ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、３７℃で６８〜７２時間培養した。細胞周期を同調させて培養したリンパ球に、０．１８ｍｇ／ｍＬブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；シグマ・アルドリッチ社）を添加して細胞に取り込ませた。無血清培地で３回洗浄した後、２．５ｍｇ／ｍＬチミジン（シグマ・アルドリッチ社）を含むＭＥＭを用いて、３７℃で６時間再培養した。細胞を回収し、低浸透圧処理、固定化、及び風乾による標準的な方法により、スライドを作成した。
【００９５】
ＦＩＳＨのプローブとして、ヒトＳＭＧ−１のｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０４２１（全長）を、ビオチン化ｄＡＴＰ及びバイオニック標識キット（ＢｉｏＮｉｃｋ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフ・テクノロジーズ社）を用いて、１５℃で１時間の反応により、ビオチン化した［Ｈｅｎｇ  ＨＨら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９５０９−９５１３（１９９２）］。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション及びその検出は、文献［Ｈｅｎｇ  ＨＨら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，９５０９（１９９２）；Ｈｅｎｇ  ＨＨ及びＴｓｕｉ  ＬＣ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，１０２，３２５（１９９３）］の方法に従った。簡単に述べると、スライドを５５℃で１時間熱し、リボヌクレアーゼ処理をした後、スライドを７０％ホルムアルデヒドを含む２×ＳＳＣ［３３．３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び３３．３ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］を用いて、７０℃で２分間処理して染色体を変性させ、エタノールで脱水した。プローブを変性染色体のスライド上に載せ、終夜でプローブとハイブリダイゼーションした後、スライドを洗浄し、検出系に供した。第１６番染色体上にシグナルが見られ、ヒトＳＭＧ−１遺伝子は第１６番染色体（１６ｐ１２）上にあることが判明した。
【００９６】
【実施例４】
《ヒトＳＭＧ−１に対する抗体の作製》
抗ヒトＳＭＧ−１抗血清Ｐ１、抗血清Ｃ３、抗血清Ｌ１、抗血清Ｌ２、抗血清Ｎ１、及び抗血清Ｎ２を、以下に示す免疫原をアジュバントと共に用いて、ウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）を免疫することにより作製した。前記アジュバントとして、抗血清ＬＴ及び抗血清ＮＴでは、タイター・マックス・ゴールド（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ；ＣｙｔＲｘ社）を使用し、抗血清ＬＴ及び抗血清ＮＴ以外の抗血清では、フロイントアジュバント（和光純薬工業）を使用した。
【００９７】
抗血清Ｐ１は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）と結合させた、ヒトＳＭＧ−１のＣ末端に相当する１５アミノ酸ペプチドを免疫源とした。前記ペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＣＤＮＬＡＱＬＹＥＧＷＴＡＷＶ）、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第３６４４番目〜第３６５７番目のアミノ酸残基からなる配列のＮ末端に、システイン残基を付加した配列を有する。
抗血清Ｃ３の作製のため、まず、クローンＫＩＡＡ０４２１のヒトＳＭＧ−１のｃＤＮＡの１．４ｋｂのＭｓｃＩ−ＭｓｃＩ断片（配列番号１で表される塩基配列における第７６４１番目〜第９１８６番目の塩基からなる配列に相当し、キナーゼ挿入領域のＣ末端側半分をカバーする）を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）との融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）のＳｍａＩ部位に挿入したプラスミドで、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、ヒトＳＭＧ−１のＣ末断片［ヒトＳＭＧ−１のアミノ酸配列（配列番号２で表されるアミノ酸配列）における第３０７６番目〜第３５４２番目のアミノ酸残基からなる配列に相当］をＧＳＴとの融合タンパク質（分子量＝約７０ｋＤａ）として発現させた。大腸菌内で生産された融合タンパク質は、不溶性の封入体を形成した。精製した封入体を１×ＳＤＳサンプルバッファー［１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、６％β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、１０％グリセロール、及び０．０１％ブロモフェノールブルー］で溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した後、７０ｋＤａのタンパク質のバンドをゲルから切り出して、細かく砕き、免疫源として使用した。
【００９８】
抗血清Ｃ３の作製の場合と同様に、抗血清Ｌ１及び抗血清Ｌ２の作製のため、クローンＬｉｖｅｒ３３の約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片（配列番号１で表される塩基配列における第２９１７番目〜第３５０５番目の塩基からなる配列に相当）を切り出し、ＧＳＴとの融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−１（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に挿入したプラスミドで、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、ヒトＳＭＧ−１の断片（配列番号２で表されるアミノ酸配列の第８６４番目〜第１０５９番目のアミノ酸残基からなる配列に相当）をＧＳＴとの融合タンパク質（分子量＝約５０ｋＤａ）として発現させた。大腸菌内で生産されたこの融合タンパク質も不溶性だったので、抗血清Ｃ３の免疫源の調製の場合と同様にして、免疫源を調製した。
【００９９】
抗血清Ｎ１及び抗血清Ｎ２の作製のため、クローンＡＩ００５５１３由来の約０．７ｋｂｐのＳｍａＩ−ＨｉｎｃII断片（配列番号１で表される塩基配列における第３０６番目〜第６４５番目の塩基からなる配列に相当）を、ＧＳＴとの融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に挿入した。生成された組換えタンパク質を、標準的なグルタチオンビーズ法により大腸菌から精製し、免疫源として使用した。
図４に各抗原部位を模式的に示す。図４において、線虫ＳＭＧ−１と相同性の高い領域（図２におけるＣＲ１〜ＣＲ６）を灰色又は黒色の四角形で示す。また、図４において、「ＦＲＢＨ」は、ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン結合部位と相同性を有する配列（ＦＫＢＰ１２／ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を意味し、「ＰＩＫＫ」は、フォスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩＫ）−関連キナーゼを意味し、「ＰＩＫＫ−Ｃ」は、ＰＩＫＫ触媒領域カルボキシル末端部分を意味する。また、各一文字記号「Ｎ」、「Ｌ」、「Ｃ」、及び「Ｐ」は、それぞれ、抗血清Ｎ１及び抗血清Ｎ２、抗血清Ｌ１及び抗血清Ｌ２、抗血清Ｃ３、並びに抗血清Ｐ１を作製するのに用いた各抗原部位を示す。
【０１００】
【実施例５】
《各種動物細胞又は各種動物組織におけるＳＭＧ−１タンパク質の検出》
（１）各種動物細胞溶解物におけるウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
ＨｅＬａ細胞を７％仔ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）により培養し、細胞を溶解用緩衝液Ｆ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌショ糖、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール、１ｍｍｏｌ／Ｌオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、及び２μｇ／ｍＬアプロチニン］中で超音波破砕し、細胞溶解物を調製した。
【０１０１】
同様に、ヒト、サル、マウス、及びラット由来の種々のセルラインについても、各種動物細胞溶解物を調製した。具体的には、ヒトセルラインとしては、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、２９３（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１５７３）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ：ＨＢ−８０６５）、Ｊｕｒｋａｔ［Ｓｃｈｕｎｅｉｄｅｒ，Ｕ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９，６２１−６２６（１９７７）］、Ｕ９３７［Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１７，５６５（１９７６）］、ＨＬ−６０［Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２７０，３４７（１９７７）］、及びＨＰＢ−ＡＬＬ［Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２１，１６６（１９７８）］を使用し、サルセルラインとしては、ＣＯＳ１（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５０）を使用し、マウスセルラインとしては、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５８）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２２６）、及びＣ２Ｃ１２を使用し、ラットセルラインとしては、３Ｙ１［Ｓａｍｄｉｎｅｙｅｒ，Ｓ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１，８３０（１９８１）］及びＬ６［Ｙａｆｆｅ，Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６１，４７７−４８３（１９６８）］を使用した。
【０１０２】
得られた各種動物細胞溶解物（タンパク質２０ｐｇ分に相当）を、５．５％及び１２．５％の各ゲル濃度で、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、抗血清Ｐ１、抗血清Ｃ３、抗血清Ｌ１、抗血清Ｌ２、抗血清Ｎ１、及び抗血清Ｎ２、並びにコントロール用の免疫前血清を用いて、それぞれウエスタンブロット法を実施した。
ＨｅＬａ細胞溶解物について、抗血清Ｐ１、抗血清Ｃ３、抗血清Ｌ２、及び抗血清Ｎ１を用いた場合の結果を図５に示し、各種動物細胞溶解物について、抗血清Ｐ１及び抗血清Ｃ３を用いた場合の結果を図６に示す。
図５及び図６において、記号「ＷＢ」は、ウエスタンブロット法を意味する。図５において、記号「ｐｒｅ」は、免疫前血清を意味する。図６において、「ＷＢ：Ｃ３」列又は「ＷＢ：Ｐ１」列における上側の各矢印は、ｐ４３０を示し、「ＷＢ：Ｃ３」列又は「ＷＢ：Ｐ１」列における下側の各矢印は、ｐ４００を示す。
【０１０３】
抗血清Ｎ１及び抗血清Ｎ２を除く全ての抗血清において、４００ｋＤａ及び４３０ｋＤａの２つのタンパク質のバンドを抗血清特異的に検出した。以下、分子量４００ｋＤａのＳＭＧ−１タンパク質をｐ４００と称し、分子量４３０ｋＤａのＳＭＧ−１タンパク質をｐ４３０と称することがある。また、マウス由来の２種の細胞株ＮＩＨ３Ｔ３及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２においては、４００ｋＤａ及び４３０ｋＤａの２本のバンドの他に、４６０ｋＤａのタンパク質のバンドも検出された。
一方、抗血清Ｎ１及び抗血清Ｎ２では、４３０ｋＤａのバンドしか検出されなかった。従って、４００ｋＤａのバンドは、ヒトＳＭＧ−１のＮ末端部分が欠失しているＳＭＧ−１分子と考えられる。
この仮説を検証するために、前記ｈＳＭＧ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を綿密に調査したところ、コザック（Ｋｏｚａｋ）の翻訳開始基準を満たすメチオニン（Ｍｅｔ）コドンが１２９番目の位置に存在することが明らかになった。１２９番目のＭｅｔから開始するその推定ＯＲＦは、３５２９アミノ酸からなる３９６，０４０Ｄａのタンパク質である。従って、おそらくｐ４００が、１２９位の第２のメチオニンから開始するＯＲＦの生成物であると考えられる。
【０１０４】
（２）各種動物組織由来の細胞溶解物におけるウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
ラット及びマウス由来の種々の組織において、抗血清Ｃ３を用いてウエスタンブロット法を行なった。各動物から手術によって組織を摘出し、それらを液体窒素中で急速に凍結した後、押しつぶすことにより粉末化した。１×ＳＤＳサンプルバッファー中で可溶化した後に、各組織からのタンパク質２０μｇを用いてウエスタンブロット法を実施した。
【０１０５】
結果を図７に示す。図７において、記号「ＷＢ」はウエスタンブロット法を意味し、上側の矢印はｐ４３０を示し、下側の矢印は、ｐ４００を示す。ラット組織としては、心臓（ｈｅａｒｔ）、大脳（ｃｅｒｅｂｒｕｍ）、小脳（ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、肺（ｌｕｎｇ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、骨格筋（ｓｋ．ｍｕｓｃｌｅ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）、前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ）、卵巣（ｔｅｓｔｉｓ）、及び大腸（ｏｖａｒｙ）を使用し、マウス組織としては、胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）を使用した。
全ての組織で、４００ｋＤａのタンパク質（ｐ４００）及び４３０ｋＤａのタンパク質（ｐ４３０）の２本のバンドが検出された。なお、マウス胎盤においては、４００ｋＤａ及び４３０ｋＤａの２本のバンドの他に、４６０ｋＤａのタンパク質のバンドも検出されたが、４６０ｋＤａのバンドは非特異的シグナルであった。
【０１０６】
【実施例６】
《ヒトＳＭＧ−１（ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の抗ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物）のプロテインキナーゼ活性の確認》
（１）ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の各種ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物における、ウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
前記実施例５（１）と同様にして得られたＨｅＬａ細胞溶解物について、抗血清Ｎ１、抗血清Ｌ２、及び抗血清Ｃ３並びにコントロール用の免疫前抗血清を用いて、それぞれ免疫沈降を行なった。免疫沈降は、細胞溶解物に各抗血清を添加し、４℃で２時間放置して免疫複合体を形成させた後、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を添加して更に２時間放置して免疫複合体を結合させ、遠心分離によりプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂを回収する方法で行なった。各免疫沈降物について、５．５％の各ゲル濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、抗血清Ｃ３を用いたウエスタンブロット法を行なった。
【０１０７】
結果を図８に示す。図８において、記号「ＷＢ」は、ウエスタンブロット法を意味し、記号「32Ｐ」は、後述の実施例６（２）におけるオートラジオグラフィーの結果であることを示す。また、記号「ｐｒｅ」は、免疫前血清を意味し、記号「ＩＰ」は、免疫沈降物を意味する。更に、「32Ｐ」列における上側の矢印は、ｐ４３０を示し、「32Ｐ」列における下側の矢印は、ｐ４００を示す。
図８の「ＷＢ：Ｃ３」列に示すように、抗血清Ｌ２又は抗血清Ｃ３の免疫沈降物からは、抗血清Ｃ３によって４００ｋＤａと４３０ｋＤａの二つのタンパク質バンドが検出されたのに対して、抗血清Ｎ１の免疫沈降物からは、抗血清Ｃ３によって４３０ｋＤａのタンパク質バンドのみが検出された。
【０１０８】
（２）ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の各種ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物のプロテインキナーゼ活性の確認
前記実施例６（１）で得られた各免疫沈降物を、０．２５ｍｏｌ／Ｌ−ＬｉＣｌを含む溶解用緩衝液Ｆで５回洗浄した後、１×キナーゼ反応用緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−グリセロリン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｎＣｌ２］で２回洗浄した。
洗浄後の免疫沈降物に、２×キナーゼ反応用緩衝液（すなわち、前記組成の２倍濃度のキナーゼ反応用緩衝液）２５μＬを加えた。リン酸化反応は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＡＴＰ及び３７０ｋＢｑ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を等量（２５μＬ）加えることで開始し、時々攪拌しながら、３０℃で３０分間反応させた。最終反応量を５０μＬに維持し、４×ＳＤＳサンプルバッファー２５μＬを加えて反応を終了させた。５．５％及び１２．５％の各ゲル濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、オートラジオグラフィーによりリン酸化されたタンパク質を検出した。タンパク質のリン酸化強度は、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）で測定した。
【０１０９】
結果を図８に示す。図８の「32Ｐ」列に示すように、抗血清Ｌ２又は抗血清Ｃ３の免疫沈降物において、分子量４３０ｋＤａ及び４００ｋＤａのリン酸化タンパク質が検出された。分子量４３０ｋＤａ及び４００ｋＤａの各タンパク質は、ヒトＳＭＧ−１と考えられるので、ヒトＳＭＧ−１は自己リン酸化することが判明した。
【０１１０】
【実施例７】
《ヒトＳＭＧ−１タンパク質断片の融合タンパク質及びその一アミノ酸置換体の発現》
本実施例では、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列からなるヒトＳＭＧ−１タンパク質部分断片と、配列番号８で表されるアミノ酸配列［連続するヒスチジン（Ｈｉｓ）残基６個を含む］からなるＨｉｓタグとの融合タンパク質（以下、「６Ｈ−ｈＳＭＧ−１」と称する）、及び（２）前記６Ｈ−ｈＳＭＧ−１において、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３３１番目のアスパラギン酸（Ｄ）に相当するアスパラギン酸が、アラニン（Ａ）に置換されているキナーゼ不完全置換体（以下、「６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）」と称する）をそれぞれ発現するための発現ベクターを調製した。
【０１１１】
（１）ヒトＳＭＧ−１タンパク質断片とＨｉｓタグとの融合タンパク質（６Ｈ−ｈＳＭＧ−１）発現用ベクターの構築
６Ｈ−ｈＳＭＧ−１の発現用ベクターは、以下の手順で実施した。
すなわち、ｈＳＭＧ−１のｃＤＮＡ全長の一部（配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０７番目〜第３６５７番目のアミノ酸からなる配列に相当する部分）を含む前記ｃＤＮＡクローンを、制限酵素ＨｐａＩ及びＸｈｏＩで消化した後、１１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。前記ＤＮＡ断片を、発現ベクターＳＲ６Ｈ［マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に、Ｈｉｓタグをコードする塩基配列を有する改変ＳＲＤベクター］のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ部位に導入することにより、組換えヒトＳＭＧ−１の発現用ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を得た。
【０１１２】
（２）６Ｈ−ｈＳＭＧ−１の一アミノ酸置換体［６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）］発現用ベクターの構築
続いて、前記発現用ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１と、市販のキット（カメレオンミュータジェネシスキット；ストラタジーン社）とを用いて、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）の発現用ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を得た。
【０１１３】
（３）６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）の発現とイン・ビトロプロテインキナーゼ活性の確認
２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を用いて培養した後、前記実施例７（１）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１、あるいは、前記実施例７（２）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとして、ベクターＳＲ６Ｈを用いたトランスフェクションも実施した。トランスフェクションから２日間経過後に、細胞を回収し、溶解用緩衝液Ｆを用いて、細胞を溶解した。
抗ポリヒスチジン抗体（Ｈｉｓ−Ｔａｇ；Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いること以外は、前記実施例６（１）に記載の手順に従って、前記の各細胞溶解液の免疫沈降を実施し、得られた各免疫沈降物について、前記実施例６（２）に記載の手順に従って、プロテインキナーゼ活性の測定を実施した。また、前記免疫沈降により得られた各免疫沈降物のウエスタンブロット法も実施した。
【０１１４】
結果を図９に示す。図９において、記号「ＷＢ：ａｎｔｉ−Ｈｉｓ」は、抗ポリヒスチジン抗体によるウエスタンブロット法の結果であることを示し、記号「32Ｐ」は、オートラジオグラフィーの結果であることを示す。また、記号「ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。更に、「32Ｐ」列における矢印は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を示す。
図９に示すように、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のいずれも、抗ポリヒスチジン抗体によって免疫沈降した。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３３１番目のアスパラギン酸に相当する、ｈＳＭＧ−１中のアスパラギン酸（ＡＴＲにおいて、キナーゼ活性に必須であることが公知である第２４７５番目のアスパラギン酸に相当する）が、前記キナーゼ活性に必要なことが示された。図９に示すように、免疫沈降により得られた６Ｈ−ｈＳＭＧ−１は、約４００ｋＤａの移動度を示し、固有のキナーゼ活性を有する。これらの結果は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１が、固有の自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）活性を有することを明確に示している。
【０１１５】
【実施例８】
《ＳＭＧ−１がβグロブリンｍＲＮＡのＰＴＣ依存性分解に関与していることの確認》
（１）レポーター遺伝子プラスミドの構築
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において、７種類のｓｍｇ遺伝子がＮＭＤに関与することが確認されている。我々は、ＰＩＫＫファミリーの新規メンバーが線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＭＧ−１に対して全体配列類似性を示すという予期せぬ発見をしたことにより、ｈＳＭＧ−１が哺乳動物のＮＭＤに関与するか否かを調査することにした。この目的のために、ヒトβグロブリン（ＢＧＧ）の３９番目のコドンにおけるＰＴＣが存在するか又は不在の遺伝子配列をそのＣＭＶプロモーターの下流に配置したレポーター遺伝子（図１０）を以下の手順で構築した。この構築において、前記ＣＭＶプロモーターは、上流のテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ：ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列の制御下にあり、また、プラスミドｐＴｅｔ  ＯＦＦを有するセルライン中に導入される場合には、このレポーター遺伝子からの転写は、テトラサイクリン又はその誘導体（ドキシサイクリン）の存在下において特異的に、且つ迅速に停止させられる。図１０において、エキソン（ｅｘｏｎ）は、四角形で示し、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）は、直線で示す。
【０１１６】
レポーター遺伝子プラスミドｐＴＲＥ  ＢＧＧ  ＷＴ（すなわち、ＢＧＧの３９番目のコドンにおけるＰＴＣが不在）を作成するために、ヒトβグロブリン遺伝子断片を、ヒト遺伝子ライブラリー（クローンテック社）からＰＣＲによって増幅し、そして、ｐＴＲＥベクター（クローンテック社）に挿入した。また、コドン３９におけるヒトβグロブリン遺伝子のナンセンス変異を標準的な手順により誘発して、レポーター遺伝子プラスミドｐＴＲＥ  ＢＧＧ  ＰＴＣ（すなわち、ＢＧＧの３９番目のコドンにおけるＰＴＣが存在）を生成した。
【０１１７】
（２）レポーターｍＲＮＡ蓄積量のノーザンブロット法による評価
前記実施例８（１）で調製したレポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴ又はレポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを、内部標準としてのＣＡＴプラスミドと一緒に、細胞株ＨｅＬａ  Ｔｅｔ−ＯＦＦ（クローンテック社）又は細胞株ＭＥＦＴｅｔ−ＯＦＦ（クローンテック社）中に同時にトランスフェクトさせ、そして、ドキシサイクリン不在下でインキュベートした後に、前記ＢＧＧのｍＲＮＡの蓄積をノーザンブロット法によって評価した。
具体的には、トランスフェクション用試薬として、細胞株ＨｅＬａ  Ｔｅｔ−ＯＦＦの場合にはポリフェクチン（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、細胞株ＭＥＦ  Ｔｅｔ−ＯＦＦの場合にはエフェクチン（ｅｆｆｅｃｔｉｎ）（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。トランスフェクションして２４時間経過後に、１０ｃｍ皿６個に再び細胞を蒔き、ドキシサイクリン不在下で更に２４時間培養した。ドキシサイクリン５０ｎｇ／ｍＬを添加することにより前記レポーターからの転写を停止させてから、０時間、０．５時間、１時間、又は３時間の時点で細胞を回収し、そして、総ＲＮＡを単離した。等量（２μｇ）の各細胞からのＢＧＧｍＲＮＡ及びＣＡＴｍＲＮＡの存在量を、ＢＧＧプローブ及びＣＡＴプローブをそれぞれ用いるノーザンブロット法によって評価した。
【０１１８】
結果を図１１に示す。図１１において、記号「ＷＴ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴを用いた場合の結果を意味し、記号「３９ＰＴＣ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを用いた場合の結果を意味する。また、記号「ＢＧ」は、ＢＧＧプローブにより得られた結果を意味し、記号「ＣＡＴ」は、ＣＡＴプローブにより得られた結果を意味する。
図１１に示すように、どちらの細胞株においても、ＢＧＧ−ＷＴ（すなわち、ＰＴＣを含まないＢＧＧ）のｍＲＮＡの蓄積は、ＢＧＧ−３９ＰＴＣ（すなわち、３９位にＰＴＣを含むＢＧＧ）の蓄積よりも豊富であった。
【０１１９】
（３）６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のレポーターｍＲＮＡ蓄積に与える影響の確認
トランスフェクションの際に、更に、前記実施例７（１）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１、あるいは、前記実施例７（２）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のいずれかを同時にトランスフェクションさせること以外は、前記実施例８（２）の操作を繰り返した。
ＨｅＬａ  Ｔｅｔ−ＯＦＦ細胞におけるＢＧＧ−３９ＰＴＣに関する結果を図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３において、記号「ｖｅｃｔｏｒ」又は「ｖｅｃ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」又は「ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」又は「ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。また、記号「ＢＧ」は、ＢＧＧプローブにより得られた結果を意味し、記号「ＣＡＴ」は、ＣＡＴプローブにより得られた結果を意味する。更に、記号「３９ＰＴＣ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを用いた場合の結果を意味する。
６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）が過剰に発現すると、ＢＧＧ−３９ＰＴＣ転写生成物の蓄積が増幅されることになるのに対して、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１が過剰に発現すると、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を導入した場合と比較して、ＢＧＧ−３９ＰＴＣをコードする安定状態量のｍＲＮＡが減少することになる。これらの結果は、ｈＳＭＧ−１及びその固有のプロテインキナーゼ活性がＢＧＧのｍＲＮＡのＰＴＣ依存性崩壊に関連することを支持する強力な証拠を提供している。
【０１２０】
次に、前記の考えを更に確認するために、ＢＧＧ  ＷＴ又はＢＧＧ−３９ＰＴＣのｍＲＮＡ種の半減期における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１又は６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）の過剰な発現の影響を試験した。ドキシサイクリンを培養器に添加することによって前記ＢＧＧレポーターのどちらの転写も停止し、そして、規定の時間（０時間、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、及び３時間）が経過した後に細胞を収穫してＢＧＧのｍＲＮＡの量を測定した。
【０１２１】
結果を図１４〜図１７に示す。図１４〜図１７において、記号「ＢＧＧ  ＷＴ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴを用いた場合の結果を意味し、記号「ＢＧＧ  ＰＴＣ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを用いた場合の結果を意味する。また、記号「ｖｅｃｔｏｒ」又は「ｖｅｃ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」又は「ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」又は「ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。更に、記号「Ｄｏｘ．」は、ドキシサイクリンを意味し、記号「ＢＧ」は、ＢＧＧを意味し、記号「１８Ｓ」は、１８ＳリボソームＲＮＡを意味する。
ＢＧＧ  ＷＴの半減期は、既に報告されているように、非常に長いように見え［Ｓｕｎ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１０００９−１００１４（１９９８）］、また、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１又は６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のいずれの発現によっても影響されていない。一方、ＢＧＧ−３９ＰＴＣの半減期は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１の過剰な発現によって大きく短縮され、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）の過剰な発現によって長くなる。これらの結果を前記の結果と組み合わせると、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１がＰＴＣ依存性のＢＧＧｍＲＮＡの崩壊に関連していることが明確に示されている。更に、これらの結果は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１の前記キナーゼ活性が、哺乳動物のＮＭＤにおいて重要な役割を果たしていることも示している。
【０１２２】
【実施例９】
《イン・ビトロにおける６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるｈＵＰＦ１／ＳＭＧ−２のリン酸化》
Ｐｅｒｌｉｃｋによる実験［Ｐｅｒｌｉｃｋ，Ｈ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１０９２８−１０９３２（１９９６）］は、ｈＵｐｆ１（酵母Ｕｐｆ１のヒト相同体）を同定し、そして、そのヘリカーゼドメインの点突然変異を用いることによって、Ｓｕｎらは、ｈＵｐｆ１が哺乳動物のＮＭＤに関連していることを示した［Ｓｕｎ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１０００９−１００１４（１９９８）］。より近年においては、Ａｎｄｅｒｓｏｎが、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＭＧ−２タンパク質がＵｐｆ１の線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における相同体であることを確認している［Ｐａｇｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９，５９４３−５９５１（１９９９）］。ＳＭＧ−２は、リン酸化タンパク質であり、そして、非常に重要なことに、その他の６種類のｓｍｇ遺伝子は、ＳＭＧ−２のリン酸化状態におけるそれらの突然変異の影響に基づいて２つの群に分類することができる。ｓｍｇ−１、ｓｍｇ−２、及びｓｍｇ−３突然変異体においては、リン酸化形態のＳＭＧ−２は検出されなかった。ｓｍｇ−５、ｓｍｇ−６、及びｓｍｇ−７突然変異体においては、リン酸化したＳＭＧ−２が高レベルで蓄積された。
【０１２３】
（１）全長ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質の６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化の確認
ｈＳＭＧ−１がｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を直接リン酸化する可能性を試験するために、ＨＡタグを付加したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２（以下、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２と称する）を２９３Ｔ細胞中で発現させ、そして、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を精製した。
具体的には、まず、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を発現させるための発現ベクターは、以下の手順で作成した。すなわち、ＳＲベクター［Ｈｉｒａｉ，Ｓ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２，６４１−６５０（１９９６）］を改変して、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）及びその上流にＨＡタグを挿入することにより、ベクターＳＲＨＡＩを得た。得られたベクターＳＲＨＡＩのＭＣＳに、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の全長をコードするｃＤＮＡを挿入することにより、発現ベクターＳＲＨＡＩ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を得た。より具体的には、ベクターＳＲＨＡＩを制限酵素ＢｇｌIIで切断後、平滑末端化したものに、ｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ０２２１を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢｌｐＩで切断後、平滑末端化したものを挿入した。
【０１２４】
得られた発現ベクターＳＲＨＡＩ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２で、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に細胞を回収し、溶解用緩衝液Ｆ中に溶解した。抗ＨＡアフィニティビーズ（ロッシュ社）を溶解物に加えた。１時間後に、そのビーズを溶解用緩衝液Ｆにより３回洗浄し、そして、洗浄緩衝液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］で３回洗浄した。得られた洗浄物を、ＨＡペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）１ｍｇ／ｍＬを含む洗浄緩衝液中で３７℃で処理することにより、結合タンパク質を溶離した。次に、１０％グリセロール及び１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴを含む１×ＰＢＳに対して透析することにより、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を得た。
【０１２５】
一方、前記実施例７（１）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１、あるいは、前記実施例７（２）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）でトランスフェクトしたｃＤＮＡトランスフェクト２９３Ｔ細胞から、前記実施例７（３）に記載の手順に従って、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）もそれぞれ精製した。
リン酸化反応は、基質として、前記実施例９（１）で調製したＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を２×キナーゼ反応用緩衝液に加えること以外は、前記実施例６（２）に記載の手順に従って実施した。
【０１２６】
結果を図１８に示す。図１８において、記号「ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。記号「ａｎｔｉ−Ｈｉｓ」は、抗ポリヒスチジン抗体によるウエスタンブロット法の結果であることを意味し、記号「32Ｐ」は、オートラジオグラフィーの結果であることを意味し、記号「ＣＢＢ」は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色による結果であることを意味する。
図１８に示すように、精製した６Ｈ−ｈＳＭＧ−１は、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をリン酸化しており、このことは、少なくとも精製物を用いた系において、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２がｈＳＭＧ−１の直接基質となることを示唆している。ＰＩＫＫファミリーに属するキナーゼは、ＳＱ又はＴＱモチーフ［Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３７５３８−３７５４３（１９９９）］中のセリン又はトレオニン残基をリン酸化する。興味深いことに、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２は、そのＣ末端領域に、ＳＱモチーフの繰り返しを含有する［Ｐａｇｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９，５９４３−５９５１（１９９９）］。ｈＳＭＧ−１がＰＩＫＫファミリーに属するキナーゼをコードすることと併せて考えると、このことは、ＳＱモチーフがｈＳＭＧ−１の標的であることを示唆している。
【０１２７】
（２）ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分断片の融合タンパク質における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化の確認（１）
前記仮説を確認するために、断片化したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を含むマルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｉｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）融合タンパク質シリーズを構築し、それらを精製した。
具体的には、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をコードするｃＤＮＡを含むＳＲＨＡＩ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２［前記実施例９（１）で調製したもの］から、それぞれ切り出した３種類のｃＤＮＡ断片、すなわち、Ｎ末端側部分断片をコードするｃＤＮＡ断片（１．４ｋｂｐ，ＢｇＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片，ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の第１番目〜第４６２番目のアミノ酸からなる配列に相当）、中間領域の部分断片をコードするｃＤＮＡ断片（１．０ｋｂｐ，Ｅｃｏ４７ＩＨ−Ｅｃｏ４７ＩＩ断片，ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の第４６３番目〜第８００番目のアミノ酸からなる配列に相当）、及びＣ末端側部分断片をコードするｃＤＮＡ断片（１．４ｋｂｐ，Ｅｃｏ４７ｌｌＩ−ＢｓｔＺ１７Ｉ断片，ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の第８０１番目〜第１１１８番目のアミノ酸からなる配列に相当）を、ｐＭａＩ−ｃ２ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中に挿入して、それぞれ、発現ベクターｐＭＢＰ−ｈＳＭＧ−２  Ｎ、発現ベクターｐＭＢＰ−ｈＳＭＧ−２  Ｍ、及び発現ベクターｐＭＢＰ−ｈＳＭＧ−２  Ｃを得た。
【０１２８】
得られたこれらのＭＢＰ融合タンパク質は、いずれも大腸菌内で非常に難溶性であったので、組換えタンパク質は、以下の通りに封入体から精製した。すなわち、回収した細胞を、２μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌベンズアミジンを加えた超音波破砕緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ、及び１％トリトンＸ−１００］中に懸濁し、そして、超音波破砕した。１００００×ｇで遠心して得られた沈殿物（封入体が多い）を洗浄溶液（０．５％トリトンＸ−１００及び１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ）中で５回洗浄した。洗浄後の沈殿物を変性緩衝液［８ｍｏｌ／Ｌ尿素、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ］中に懸濁し、そして室温で１時間放置した。１００００×ｇで遠心して得られた上清を、尿素４ｍｏｌ／Ｌを含む変性緩衝液で１時間透析し、続いて、尿素２ｍｏｌ／Ｌを含む変性緩衝液で１時間透析し、そして、超音波破砕緩衝液で一晩、透析処理した。この処理で再構造化（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）したＭＢＰ融合タンパク質を回収し、アミローズ樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、添付のマニュアルに従って、各ＭＢＰ融合タンパク質、すなわち、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＮ末端側部分断片、中間領域の部分断片、又はＣ末端側部分断片とＭＢＰとの融合タンパク質を精製した。
【０１２９】
リン酸化反応は、基質として、前記の各ＭＢＰ融合タンパク質を２×キナーゼ反応用緩衝液に加えること、そして、ｈＳＭＧ−１として、前記実施例７（３）に記載の手順に従って調製した６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を使用すること以外は、前記実施例６（２）に記載の手順に従って実施した。
結果を図１９及び図２０に示す。図２０において、記号「ＣＢＢ」は、ＣＢＢ染色による結果であることを意味し、記号「32Ｐ」は、オートラジオグラフィーの結果であることを意味する。また、オートラジオグラムの下に示す各数字は、ｐＭＢＰ−ｈＳＭＧ−２  ＣとＭＢＰとの融合タンパク質におけるオートラジオグラムの強度を１００とした場合の相対値である。
図２０に示すように、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＣ末端側断片及びＮ末端側断片は、それぞれ、ｈＳＭＧ−１の良好な基質としての役割を果たした。ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＣ末端側断片がリン酸化された結果は、Ｐａｇｅらの前記報告（すなわち、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２は、そのＣ末端領域に、ＳＱモチーフの繰り返しを含有する）を考えると、ＳＱモチーフをリン酸化していることを予測させる。また、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＮ末端側断片がリン酸化された結果から、Ｎ末端領域にも複数のＳＱモチーフが存在しており、その部位がリン酸化された可能性が考えられる。
【０１３０】
（３）ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分断片の融合タンパク質における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化の確認（２）
次に、前記の点をより明確にするために、ＧＳＴ融合タンパク質の別のシリーズを製造した。ここでは、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２における各ＳＱ又はＴＱ推定モチーフとその周囲の１２アミノ酸残基とからなる各１４ｍｅｒペプチドを、ＧＳＴの下流に融合した融合タンパク質を製造した。
具体的には、Ｔ２８（すなわち、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２における第２８番目のトレオニン）、Ｔ３２５（すなわち、第３２５番目のトレオニン）、Ｓ４７４（すなわち、第４７４番目のセリン）、Ｓ６８１（すなわち、第６８１番目のセリン）、Ｓ１０７８（すなわち、第１０７８番目のセリン）、又はＳ１０９６（すなわち、第１０９６番目のセリン）を含む１４ｍｅｒペプチドをそれぞれコードする各ＤＮＡ、あるいは、ｐ５３タンパク質におけるＳ１５（ｐ５３タンパク質における第１５番目のセリン）を含む１４ｍｅｒペプチド（コントロール）をコードするＤＮＡを、それぞれ、ベクターｐＧＥＸ  ６Ｐ（アマシャムファルマシアバイオテック社）中に挿入することにより、各発現ベクターを調製し、前記発現ベクターでトランスフォームした大腸菌から、標準的グルタチオンビーズ法によりＧＳＴ融合タンパク質を精製した。
【０１３１】
各１４ｍｅｒペプチドのアミノ酸配列を図２１に示す。図２１において、記号「Ｔ２８」は、Ｔ２８を含む１４ｍｅｒペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質における１４ｍｅｒペプチド部分のアミノ酸配列を意味し、以下、同様に、記号「Ｔ３２５」、記号「Ｓ４７４」、記号「Ｓ６８１」、記号「Ｓ１０７８」、及び記号「Ｓ１０９６」は、それぞれ、Ｔ３２５、Ｓ４７４、Ｓ６８１、Ｓ１０７８、及びＳ１０９６を含む各１４ｍｅｒペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質における１４ｍｅｒペプチド部分のアミノ酸配列を意味し、記号「ｐ５３  Ｓ１５」は、ｐ５３タンパク質におけるＳ１５を含む１４ｍｅｒペプチド（コントロール）とＧＳＴとの融合タンパク質における１４ｍｅｒペプチド部分のアミノ酸配列を意味する。
【０１３２】
リン酸化反応は、基質として、前記の各ＧＳＴ融合タンパク質を２×キナーゼ反応用緩衝液に加えること、そして、ｈＳＭＧ−１として、前記実施例７（３）に記載の手順に従って調製した６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を使用すること以外は、前記実施例６（２）に記載の手順に従って実施した。
結果を図２２に示す。図２２において、記号「Ｔ２８」は、Ｔ２８を含む１４ｍｅｒペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質を意味し、以下、同様に、記号「Ｔ３２５」、記号「Ｓ４７４」、記号「Ｓ６８１」、記号「Ｓ１０７８」、及び記号「Ｓ１０９６」は、それぞれ、Ｔ３２５、Ｓ４７４、Ｓ６８１、Ｓ１０７８、及びＳ１０９６を含む各１４ｍｅｒペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質を意味し、記号「ｐ５３  Ｓ１５」は、ｐ５３タンパク質におけるＳ１５を含む１４ｍｅｒペプチド（コントロール）とＧＳＴとの融合タンパク質を意味する。記号「Ｓ１０７８Ａ」は、前記「Ｓ１０７８」において、第１０７８番目のセリンをアラニンに置換した点変異体を意味する。また、記号「ＣＢＢ」は、ＣＢＢ染色による結果であることを意味し、記号「32Ｐ」は、オートラジオグラフィーの結果であることを意味する。また、オートラジオグラムの下に示す各数字は、ｐ５３タンパク質におけるＳ１５を含む１４ｍｅｒペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質（ｐ５３  Ｓ１５）におけるオートラジオグラムの強度を１００とした場合の相対値である。
【０１３３】
図２２に示すように、ｐ５３タンパク質中のＳＱモチーフをコードするコントロール構築物は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によってリン酸化された。更に、Ｓ１０７８を含むＧＳＴ融合タンパク質、あるいは、Ｓ１０９６を含むＧＳＴ融合タンパク質［以下、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質（Ｓ１０９６）と称する］は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によって能率的にリン酸化された。これらの結果は、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１は、少なくともイン・ビトロにおいては、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＳＱモチーフであるＳ１０７８及びＳ１０９６におけるセリン残基をリン酸化することを確立している。
【０１３４】
【実施例１０】
《細胞内でのＳＭＧ−１によるｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２リン酸化の確認》
前記実施例９で得られた結果（すなわち、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１がｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をイン・ビトロでリン酸化するという結果）を、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｓｍｇ遺伝子における結果と併せて考えると、ｈＳＭＧ−１はイン・ビボでもｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をリン酸化し、そして、このリン酸化はＮＭＤにおいて本質的な役割を果たすという或る興味ある可能性が持ち上がる。この可能性を評価するための第一段階として、次に、イン・ビボにおけるｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を試験した。
【０１３５】
種々濃度のオカダ酸（ＯＡ；カルビオケム社）でＨｅＬａ細胞を４．５時間処理した後、細胞を回収し、１×ＳＤＳサンプルバッファー中に溶解した。６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、抗ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いるウエスタンブロット法によって、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の移動度シフト（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ）を決定した。
結果を図２３に示す。ホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸（ＯＡ）でＨｅＬａ細胞を処理すると、結果として、上方にシフトしたｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のバンドが現れる。図２３において、シフトしたバンドの位置に記号「＊」を付した。また、図２３における記号「ａｎｔｉ−ｈＵＰＦ１／ＳＭＧ−２」は、抗ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いるウエスタンブロット法により得られた結果であることを意味する。
【０１３６】
ＯＡが誘発するｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の上方シフトが、リン酸化によって発生することを示すため、免疫精製したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２をアルカリホスファターゼで処理し、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるその移動度を以下の通りに試験した。
すなわち、５０ｎｍｏｌ／Ｌオカダ酸存在下又は不在下（すなわち、培地のみ）で４．５時間処理したＨｅＬａ細胞を回収し、そして、１μｍｏｌ／Ｌミクロシスチン（ｍｙｃｒｏｃｙｓｔｉｎ）ＬＲ（カルビオケム社）及び１０ｎｍｏｌ／Ｌオカダ酸を含有する溶解用緩衝液Ｆ中に溶解し、続いて、抗ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２血清を用いて免疫沈降した。なお、ミクロシスチン及びオカダ酸を溶解用緩衝液Ｆに添加した理由は、一度リン酸化されたタンパク質が免疫沈降の操作の際に脱リン酸化されるのを防ぐためである。
溶解用緩衝液Ｆ及び脱リン酸化緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）及び１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ2］中で洗浄した後、その免疫沈降物を脱リン酸化緩衝液５０μＬで懸濁した。仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ；宝酒造）を０ユニット（すなわち、非添加）又は６０ユニット添加して、反応を開始した。３７℃で１時間インキュベートした後に、ＳＤＳサンプルバッファーを加えることで反応を停止した。６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、続いて、抗Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いたウエスタンブロット法によりｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の移動度シフトを決定した。
【０１３７】
結果を図２４に示す。図２４において、記号「ＯＡ」は、オカダ酸処理した細胞に由来する免疫沈降物を用いた場合の結果を意味し、記号「ｍｅｄｉｕｍ」は、オカダ酸不在下の細胞に由来する免疫沈降物を用いた場合の結果を意味する。また、記号「ａｎｔｉ−ｈＵＰＦ１／ＳＭＧ−２」は、抗ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いるウエスタンブロット法により得られた結果であることを意味する。更に、記号「ｈＵＰＦ１−Ｐ」は、リン酸化されたｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味し、記号「ｈＵＰＦ１」は、リン酸化されていないｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味する。
上方に移動したバンドは、免疫沈降物をホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理した場合に消え、このことは、ＯＡ処理により発生するｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の前記上方シフトが、リン酸化であることを示している。
【０１３８】
次に、過剰に発現したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の分析のため、前記実施例９（１）で調製したＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２発現用ベクターＳＲＨＡＩ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２と、前記実施例７（１）で調製した発現ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１又はベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）とで、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。５０ｎｍｏｌ／Ｌオカダ酸の存在下又は不在下で、細胞を４時間培養した。細胞を回収し、そして、１×ＳＤＳサンプルバッファー中に溶解した。抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５；ベーリンガー社）を用いるウエスタンブロット法により、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の移動度シフトを決定した。
【０１３９】
結果を図２５に示す。図２５において、記号「ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。また、記号「ａｎｔｉ−ＨＡ」は、抗ＨＡ抗体によるウエスタンブロット法の結果であることを意味する。更に、記号「ＨＡ  ｈＵＰＦ１−Ｐ」は、リン酸化されたＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味し、記号「ＨＡ  ｈＵＰＦ１」は、リン酸化されていないＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味する。図２５において、シフトしたＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の位置に記号「＊」を付した。
ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）のみの場合と同様に、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を過剰に発現させた場合には、外因性のＨＡタグ付加ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＯＡ誘発上方シフトは、観察されなかった。しかし、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１が過剰に発現すると、ＨＡタグ付加ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＯＡ誘発上方シフトが大きく増幅された。
【０１４０】
【実施例１１】
《６Ｈ−ｈＳＭＧ−１のプロテインキナーゼ活性を指標とした阻害剤の同定》
ＰＩＫＫファミリーにおける過去の研究により、キナーゼのこのファミリーにおいて作用する阻害剤が同定されている。同定された阻害剤としては、例えば、ウォートマンニン［Ｓａｒｋａｒｉａ，Ｓ．Ｎ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８，４３７５−４３８２（１９９８）］及びカフェイン［Ｓａｒｋａｒｉａ，Ｓ．Ｎ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，４３７５−４３８２（１９９９）］を挙げることができる。次に、哺乳動物のＮＭＤにおけるｈＳＭＧ−１の役割を評価するため、そして、細胞を薬理学的に操作することによるＮＭＤの特異的な阻害の潜在的な戦略を評価するために、内因性基質として、前記実施例９（３）で調製したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質（Ｓ１０９６）［すなわち、第１０９６番目のセリン（Ｓ１０９６）を含む１４ｍｅｒペプチドを、ＧＳＴの下流に融合した融合タンパク質］を用いることにより、ｈＳＭＧ−１のキナーゼ活性におけるこれらの阻害剤の効果を評価した。
具体的には、前記実施例７（３）に記載の手順に従って、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を調製した。図２６及び図２７に示す種々の濃度のウォートマンニン又はカフェインの存在下で、基質として、前記実施例９（３）で調製したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質（Ｓ１０９６）を用いて、イン・ビトロキナーゼアッセイを実施した。すなわち、リン酸化は、前記ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質（Ｓ１０９６）とウォートマンニン又はカフェインとを２×キナーゼ反応用緩衝液に加えること、そして、ｈＳＭＧ−１として、前記実施例７（３）に記載の手順に従って調製した６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を使用すること以外は、前記実施例６（２）に記載の手順に従って実施した。
【０１４１】
ウォートマンニンを用いた場合の結果を図２６に、カフェインを用いた場合の結果を図２７にそれぞれ示す。図２６及び図２７に示すように、ウォートマンニン及びカフェインの両方とも、それぞれ、約６０ｎｍｏｌ／Ｌ及びＯ．３ｍｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値で、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１のキナーゼ活性を阻害した。一方、精製した組換えＦＫＢＰ１２の存在下において、ラパマイシンは、ｈＳＭＧ−１を阻害しなかった（データ記載せず）。
【０１４２】
【実施例１２】
《ＳＭＧ−１阻害剤がｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を細胞内で抑制することの確認》
また、前記の２種のｈＳＭＧ−１阻害剤の効果は、ＨｅＬａ細胞中における内因性ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化においても試験することができる。
図２８に示す種々の濃度のウォートマンニン、カフェイン、又はラパマイシンの存在下又は不在下で、ＨｅＬａ細胞を３０分間、前処理した。続いて、各薬剤の存在下で、５０ｎｍｏｌ／Ｌオカダ酸の存在下又は不在下で、前記細胞を４．５時間処理した。細胞溶解物を調製し、抗Ｕｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いるウエスタンブロット法により分析した。
結果を図２８に示す。図２８において、記号「ａｎｔｉ−ｈＵＰＦ１／ＳＭＧ−２」は、抗ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２抗体を用いるウエスタンブロット法により得られた結果であることを意味する。また、記号「ｃｏｎｔ．」、記号「ｗｏｒｔ．」、記号「ｃａｆｆ．」、及び記号「ｒａｐ．」は、それぞれ、コントロール（すなわち、ウォートマンニン、カフェイン、及びラパマイシンの不在下）の結果、ウォートマンニン存在下の結果、カフェイン存在下の結果、及びラパマイシン存在下の結果であることを示す。更に、記号「ｈＵＰＦ１−Ｐ」は、リン酸化されたｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味し、記号「ｈＵＰＦ１」は、リン酸化されていないｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味する。
図２８に示すように、ウォートマンニン及びカフェインは、両方とも、ＨｅＬａ細胞中のｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の上方シフトを阻害するが、ラパマイシンは阻害しなかった。このことは、精製した系における結果（すなわち、前記実施例１１の結果）と一致している。
【０１４３】
【実施例１３】
《ＳＭＧ−１阻害剤による内因性のＰＴＣｍＲＮＡの安定化》
（１）ＳＭＧ−１阻害剤による内因性のＰＴＣ含有ＢＧＧ遺伝子産物の安定化》ｈＳＭＧ−１が哺乳動物のＮＭＤにおいて重要な役割を果たすならば、これらのｈＳＭＧ−１阻害剤は、ＮＭＤを阻害するはずである。このことを試験するために、最初に、前記実施例８（１）で調製したレポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴ又はレポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを利用するレポーターＢＧＧ系を適用した。
具体的には、レポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴ又はレポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを、ＭＥＦ−Ｔｅｔ  ＯＦＦ細胞にトランスフェクションし、そして、８枚の皿に再び蒔いた。５０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下で、図２９に示す種々濃度のカフェイン（ｃａｆｆ．）、ウォートマンニン（ｗｏｒｔ．）、ラパマイシン（ｒａｐ．）、又はシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で細胞を４．５時間処理した。
【０１４４】
ＢＧＧプローブを用いるノーザンブロット法により総ＲＮＡを分析した結果を図２９に示す。図２９において、記号「ＢＧ  ＷＴ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−ＷＴを用いた場合の結果を意味し、記号「ＢＧ  ＰＴＣ」は、レポータープラスミドＢＧＧ−３９ＰＴＣを用いた場合の結果を意味し、記号「ＧＡＰＤＨ」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡをプローブとした場合の結果を意味する。また、記号「ｃｏｎｔ．」、記号「ｃａｆｆ．」、記号「ｗｏｒｔ．」、記号「ｒａｐ．」、及び記号「ＣＨＸ」は、それぞれ、コントロール（すなわち、ウォートマンニン、カフェイン、ラパマイシン、及びシクロヘキサミドの不在下）の結果、カフェイン存在下の結果、ウォートマンニン存在下の結果、ラパマイシン存在下の結果、及びシクロヘキサミド存在下の結果であることを示す。
図２９に示すように、タンパク質合成阻害剤であるＣＨＸは、ＮＭＤを阻害し、そして、ＢＧＧ−３９ＰＴＣｍＲＮＡ（ＢＧＧ  ＷＴではなく）が蓄積され、このことは、これまでの観察と一致している。重要なことに、前記ｈＳＭＧ−１阻害剤、すなわち、カフェイン及びウォートマンニンは、結果として、ＢＧＧ  ３９ＰＴＣを蓄積した。このことにより、ｈＳＭＧ−１が哺乳動物のＮＭＤに関連することを支持する薬理学的証拠が得られた。
【０１４５】
（２）ＳＭＧ−１阻害剤による内因性のＰＴＣｐ５３遺伝子産物の安定化》
ＮＭＤは、ＰＴＣｍＲＮＡから生じる潜在的毒性タンパク質が蓄積することから細胞を助けるが、ＮＭＤは、しばしば、前記突然変異によって発生する障害化表現型を部分的に救済することができる活性が残っている断片化タンパク質をコードするｍＲＮＡを、消滅させる。従って、少なくとも、ＰＴＣ変異のいくつかの場合においては、ＮＭＤを特異的に阻害することにより、前記遺伝障害を救済するための新規治療方法を提供することができる。
次に、前記方法の可能性を評価するための最初の工程として、前記の断片化タンパク質の合成を特異的に救済するｈＳＭＧ−１阻害剤の能力を試験した。前記可能性を評価するための系のモデルとしては、前記突然変異を有するセルラインを得ることが可能なので、ｐ５３遺伝子を選択した。ＰＴＣを有する２種のセルライン、すなわち、第１９６番目のコドンにおけるＰＴＣを含有するＣａｌｕ６（肺腺癌セルライン）、及び第２９８番目のコドンにおけるＰＴＣを含有するＮ４１７（小細胞肺癌腫セルライン）を選択した［Ｌｅｈｍａｎ  ＴＡ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，４０９０−４０９６（１９９１）；Ｂｏｄｎｅｒ  ＳＭ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７，７４３−７４９（１９９２）］。ｐ５３遺伝子の構造並びにセルラインＣａｌｕ６及びＮ４１７中のＰＴＣ変異を、図３０に模式的に示す。図３０において、エキソン（ｅｘｏｎ）を四角形で示す。
【０１４６】
Ｃａｌｕ６、Ｎ４１７、及びコントロールとしてのＡ５４９細胞［肺腺癌セルライン；Ｌｅｈｍａｎ  ＴＡ，ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，４０９０−４０９６（１９９１）］を、２μｍｏｌ／Ｌウォートマンニン（ｗｏｒｔ．）若しくは５０μｇ／ｍＬシクロヘキサミド（ＣＨＸ）の存在下又は不在下（ｃｏｎｔ．）で、４．５時間処理した後、細胞を回収した。調製した細胞溶解物及び総ＲＮＡを、それぞれ、ｐ５３プローブを用いるノーザンブロット法及び抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１；カルビオケム社）を用いるウエスタンブロット法によって分析した。アクチン染色を示すＣＢＢイメージも表示する。
【０１４７】
Ｎ４１７及びＡ５４９細胞における結果を図３１に示す。図３１において、記号「ｃｏｎｔ．」、記号「ｗｏｒｔ．」、及び記号「ＣＨＸ」は、それぞれ、コントロールの結果、ウォートマンニン存在下の結果、及びシクロヘキサミド存在下の結果であることを示す。
Ｎ４１７細胞をウォートマンニンで処理した結果、ｐ５３  ２９８ＰＴＣ  ｍＲＮＡも、前記断片化ｐ５３タンパク質も増加したが、コントロールのＡ５４９細胞においては前記ｍＲＮＡもタンパク質も増加しなかった。
【０１４８】
更に、種々濃度のウォートマンニン、シクロヘキサミド、又はカフェインで４．５時間処理した場合の結果を、図３２に示す。図３２において、記号「ＣＨＸ」は、シクロヘキサミド存在下の結果であることを示す。前記の断片化ｐ５３における増加は、ｃａｌｕ６細胞を増加量のウォートマンニンで処理した場合にも観察された。
【０１４９】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドによれば、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
【０１５０】
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号８の配列で表される塩基配列は、６個のヒスチジン残基を含有するＨｉｓタグ配列である。
【０１５１】
【配列表】
0004299990.tif 000002
0004299990.tif 000003
0004299990.tif 000004
0004299990.tif 000005
0004299990.tif 000006
0004299990.tif 000007
0004299990.tif 000008
0004299990.tif 000009
0004299990.tif 000010
0004299990.tif 000011
0004299990.tif 000012
0004299990.tif 000013
0004299990.tif 000014
0004299990.tif 000015
0004299990.tif 000016
0004299990.tif 000017
0004299990.tif 000018
0004299990.tif 000019
0004299990.tif 000020
0004299990.tif 000021
0004299990.tif 000022
0004299990.tif 000023
0004299990.tif 000024
0004299990.tif 000025
0004299990.tif 000026
0004299990.tif 000027
0004299990.tif 000028
0004299990.tif 000029
0004299990.tif 000030
0004299990.tif 000031
0004299990.tif 000032
0004299990.tif 000033
0004299990.tif 000034
0004299990.tif 000035
0004299990.tif 000036
0004299990.tif 000037
0004299990.tif 000038
0004299990.tif 000039
0004299990.tif 000040
0004299990.tif 000041
0004299990.tif 000042
0004299990.tif 000043
0004299990.tif 000044
0004299990.tif 000045
0004299990.tif 000046
0004299990.tif 000047
0004299990.tif 000048
0004299990.tif 000049
0004299990.tif 000050
0004299990.tif 000051
0004299990.tif 000052
0004299990.tif 000053
0004299990.tif 000054
0004299990.tif 000055
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた各ｃＤＮＡクローンと、それから得られた新規塩基配列及びオープンリーディングフレームとの関係を示す説明図である。
【図２】本発明のヒトＳＭＧ−１と公知タンパク質とを比較した結果を示す説明図である。
【図３】各種ヒトセルラインにおけるヒトＳＭＧ−１のｍＲＮＡを検出するオートラジオグラフィーの結果を示す、図面に代わる写真である。
【図４】ヒトＳＭＧ−１に対する抗体を作製するのに用いた各抗原部位を示す説明図である。
【図５】ＨｅＬａ細胞溶解物について、ウエスタンブロット法を実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】各種動物細胞溶解物について、ウエスタンブロット法を実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図７】各種動物組織由来の細胞溶解物について、ウエスタンブロット法を実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図８】ＨｅＬａ細胞溶解物由来の免疫沈降物について、ウエスタンブロット法を実施した結果と、プロテインキナーゼ活性を確認した結果とを示す、図面に代わる写真である。
【図９】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）の発現と、イン・ビトロプロテインキナーゼ活性の確認とを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１０】レポーター遺伝子プラスミドの構造を模式的に示す説明図である。
【図１１】レポーターｍＲＮＡ蓄積量をノーザンブロット法により評価した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１２】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のレポーターｍＲＮＡ蓄積に与える影響を確認した結果の代表例を示す、図面に代わる写真である。
【図１３】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のレポーターｍＲＮＡ蓄積に与える影響を確認した結果を、統計処理した結果を示す、グラフである。
【図１４】レポーターｍＲＮＡとしてＢＧＧ−ＷＴを用いた場合の、ドキシサイクリン存在下における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のレポーターｍＲＮＡ蓄積に与える影響を確認した結果の代表例を示す、図面に代わる写真である。
【図１５】図１４に示す結果をグラフ化した結果を、統計処理した結果を示す、グラフである。
【図１６】レポーターｍＲＮＡとしてＢＧＧ−３９ＰＴＣを用いた場合の、ドキシサイクリン存在下における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１及び６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）のレポーターｍＲＮＡ蓄積に与える影響を確認した結果の代表例を示す、図面に代わる写真である。
【図１７】図１４に示す結果をグラフ化した結果を、統計処理した結果を示す、グラフである。
【図１８】全長ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２融合タンパク質の６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１９】実施例９（２）で使用したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分断片の構造を模式的に示す、説明図である。
【図２０】ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分断片の融合タンパク質における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２１】実施例９（３）で使用したｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分ペプチドの構造を模式的に示す、説明図である。
【図２２】ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２部分ペプチドの融合タンパク質における６Ｈ−ｈＳＭＧ−１によるリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２３】イン・ビボにおいて、オカダ酸存在下でのｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２４】アルカリホスファターゼを用いて、イン・ビボにおけるｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２５】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１又は６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を過剰発現した場合の、ＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２６】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１のキナーゼ活性における、ウォートマンニンの阻害効果を示す、グラフである。
【図２７】６Ｈ−ｈＳＭＧ−１のキナーゼ活性における、カフェインの阻害効果を示す、グラフである。
【図２８】ＳＭＧ−１阻害剤が、ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のリン酸化を細胞内で抑制することを確認した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２９】ＳＭＧ−１阻害剤により、内因性のＰＴＣ含有ＢＧＧ遺伝子産物が安定化されることを示す、図面に代わる写真である。
【図３０】ｐ５３遺伝子の構造並びにセルラインｃａｌｕ６及びＮ４１７中のＰＴＣ変異を模式的に示す、説明図である。
【図３１】ＳＭＧ−１阻害剤（ウォートマンニン）により、内因性のＰＴＣｐ５３遺伝子産物が安定化されることを示す、図面に代わる写真である。
【図３２】種々濃度のＳＭＧ−１阻害剤（ウォートマンニン又はカフェイン）により、内因性のＰＴＣｐ５３遺伝子産物が安定化されることを示す、図面に代わる写真である。
【図１】
0004299990.tif 000056
【図２】
0004299990.tif 000057
【図３】
0004299990.tif 000058
【図４】
0004299990.tif 000059
【図５】
0004299990.tif 000060
【図６】
0004299990.tif 000061
【図７】
0004299990.tif 000062
【図８】
0004299990.tif 000063
【図９】
0004299990.tif 000064
【図１０】
0004299990.tif 000065
【図１１】
0004299990.tif 000066
【図１２】
0004299990.tif 000067
【図１３】
0004299990.tif 000068
【図１４】
0004299990.tif 000069
【図１５】
0004299990.tif 000070
【図１６】
0004299990.tif 000071
【図１７】
0004299990.tif 000072
【図１８】
0004299990.tif 000073
【図１９】
0004299990.tif 000074
【図２０】
0004299990.tif 000075
【図２１】
0004299990.tif 000076
【図２２】
0004299990.tif 000077
【図２３】
0004299990.tif 000078
【図２４】
0004299990.tif 000079
【図２５】
0004299990.tif 000080
【図２６】
0004299990.tif 000081
【図２７】
0004299990.tif 000082
【図２８】
0004299990.tif 000083
【図２９】
0004299990.tif 000084
【図３０】
0004299990.tif 000085
【図３１】
0004299990.tif 000086
【図３２】
0004299990.tif 000087