(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（I）を有する化合物：
X17[M6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]・YH2O    （I）
（上記式中、Xは陽イオン、MはMn、Co、及びZnから成る群から選択される同一又は二種以上の金属元素、Yは０〜５０の整数）を有効成分として含有する抗生物質耐性黄色ブドウ球菌増殖抑制剤である薬剤。
【請求項２】
一般式（I）において、M6がMn6である、請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
一般式（I）において、M6がCo6である、請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
一般式（I）において、M6がZn6である、請求項１記載の薬剤。
【請求項５】
一般式（I）において、M6がMn３Co３である、請求項１記載の薬剤。
【請求項６】
一般式（I）において、XがH＋、Na＋、Ｋ＋、Li＋、NH4＋、CH3NH3＋、及び（CH3）2NH2＋、から成る群から選択される同一又は二種以上の陽イオンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
XがNa＋である、請求項６記載の薬剤。
【請求項８】
一般式（I）において、Yが４５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
抗生物質耐性黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１０】
細胞壁合成酵素PBP2’活性阻害剤である、請求項９記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗生物質（例えば、メチシリン）耐性黄色ブドウ球菌に対する優れた増殖抑制活性を示すと共に、毒性が低く、且つ、β―ラクタム系抗生物質との併用による相乗効果が見られる、新規な砒素含有ポリタングステン酸,並びに、該化合物を利用する各種薬剤及び治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
［黄色ブドウ球菌とβ−ラクタム項抗生物質］
ブドウ球菌はグラム陽性、カタラーゼ陽性、通性嫌気性の直径0.5〜1.5μmの球菌でブドウの房状の配列をとり、人や動物の皮膚、粘膜などの常在菌である。ブドウ球菌の細胞の内圧は浸透圧にして約20気圧であり・高い内圧による細胞破裂を防ぐために堅固な細胞壁が保持されている。そして、細胞内では代謝がさかんに行われており、たいへん増殖力が高い。
【０００３】
病原性の強い菌にしばしばみられる生化学的性質としてコアグラーゼ産生性とマンニット分解性があり、両反応が陽性の菌は病原性が強く黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)と分類されている。黄色ブドウ球菌は主として皮膚の化膿性感染症をおこす菌として古くから知られている。そこで、けがなどで皮膚に傷がつくと感染をおこし、溶血毒、ロイコシジン、コアグラーゼ、プロテアーゼ、DNase、TSST-1などの菌体外毒素をつくって、化膿性疾患や食中毒、毒素性ショック症候群をおこす。
【０００４】
ペニシリン系およびセフェム系（セファロスポリン誘導体）はその分子中にβ―ラクタム環と呼ばれる化学構造を有するのでβ―ラクタム抗生物質と総称される（図１)。β―ラクタム抗生物質は細胞壁の合成を阻害して細菌を殺してしまう作用をもっている。選択毒性が高く、各種のグラム陽性菌や陰性菌に幅広い抗菌活性を示すため、臨床的にも広く使用されている。
【０００５】
黄色ブドウ球菌は内圧が高いため、細胞質膜の外側に細胞全体を覆うように細胞壁が存在する。菌が生きて増殖していくためには、この細胞壁を絶えず合成していかなければならない。細胞壁は三次元の鎖の組み合わせで出来ている。一次元目の鎖は2種類の糖(GlcNAc:N-acetylglucosamine,MurNAc-pentapeptide: N-acetylmuramyl pentapeptide)が交互に並んでおり、二次元目の鎖はアミノ酸4個(L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala)から成るテトラペプチド鎖であり、そして、三次元目の鎖はグリシンが5つ連なったペンタグリシンである。細胞壁形成は次のように成される。細胞質内で作り出されたムレインモノマー前駆体(MMP:Murein Monomer Precursor)が、細胞膜を通過する間にムレインモノマー(MM:Murein Monomer)となって細胞膜の外に輸送される(図２)。その時、MMの糖の部分 (GlcNAcとMurNAc-pentapeptide)はTG(transglycosylase)とペニシリン結合タンパク質(PBP:Penicillin Binding Protein)によって連結される。そして、この糖鎖のアミノ酸(L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)から成るペンタペプチドと別の糖鎖のグリシン鎖がPBPによって連結される際、ペンタペプチドの先端のD一アラニンが切り離され、ペンタグリシンの端と結合する(図３)。この過程は架橋と言われ、そのためPBPは架橋酵素とも言われる。PBPはD一アラニルーD一アラニンを認識し、ペンタグリシンと連結させる役割を果たしている。ところが、D一アラニルーD一アラニンの2つのアミノ酸構造とβ―ラクタム抗生物質はとても類似した構造をしている。そのため、β―ラクタム抗生物質が入ってくるとPBPは誤ってβ―ラクタム抗生物質と結合してしまい、細胞壁の合成が阻害される。細胞壁が合成されなくなると、高い内圧により細菌は破裂してしまう。これがβ―ラクタム抗生物質の作用機構である。
【０００６】
［メチシリン耐性黄色ブドウ球菌］
１９４１年のβ―ラクタム抗生物質であるペニシリンGの実用化以来、黄色ブドウ球菌による感染症はしばらく克服されていたが、１９５０年頃にはペニシリンを分解するペニシリナーゼという酵素を産出する黄色ブドウ球菌が蔓延し、その効果は低下していった。1960年には、ペニシリナーゼによって分解されない化学構造をもった半合成ペニシリンであるメチシリンが開発された。しかしながら、その翌年にはメチシリンの開発国であるイギリスで、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA:Methicillin-Resistant Staphy1ococcus Aureus)が世界で初めて発見され、その後30年以上の間、170種以上開発された抗生物質の全てに耐性化してきた。日本でMRSAが問題とされるようになったのは1980年代の初頭からである。その後1992年から1993年にかけてのMRSAのサーベイランス結果では、臨床分離された黄色ブドウ球菌の約60%がMRSAであると報告され、１０年余りの間に急速に全国の病院に蔓延していったことが示されている。MRSAは唯一バンコマイシン(糖ペプチド型抗菌薬)のみ耐性化しなかったが、１９９６年に世界で初めて日本で、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA:Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus)が臨床から検出され、新たな院内感染への危機感が高まっている。VRSA株はバンコマイシンの阻害から逃れるための新たな因子を獲得したというよりも、細胞壁の合成量を増強して肥厚した細胞壁にバンコマイシンをトラップして消費し、バンコマイシンが細胞壁に到達するのを防ぎ、生育阻害から免れていることが明らかとなっている。
【０００７】
基本的には、ペニシリンをはじめとするβ―ラクタム抗生物質は、細胞壁合成酵素であるPBP(Penicillin Binding Protein)に結合し、細胞壁の網目構造の完成を妨げ溶菌させる。ペニシリンやアンピシリンは、黄色ブドウ球菌が産出するβ―ラクタマーゼにより不活性化されるが、メチシリンは分解されないため、PBPによる細胞壁の合成を阻害することが出来る。ところが、MRSAは本来所有している4種類のPBP(PBP1〜4)以外に、β―ラクタム抗生物質に対して低親和性である分子量約78kDaのPBP2'と呼ばれる細胞壁合成酵素をもっており、MRSAの耐性の本質はこのことによって説明される（Y.,Utsui and T. Yokota, Antimicrob. Agents Chemother., 28, 397 (1985)）。しかしながら、MRSAの耐性レベルは必ずしもPBP2'量と相関しているわけではない。PBP2'以外にも耐性の原因となっている因子がいくつかあり、fem(factor essential for the expression of methicillin resistant)遺伝子(femA,B等)やSigma因子などのいくつか報告されているが確定的なことはまだ明らかにされていない。
【０００８】
PBP2'は本来黄色ブドウ球菌には存在しない外来性の遺伝子mecAによりコードされている。macA遺伝子の上流には逆方向に2つの遺伝子群mecI (レプレッサータンパクMecIをコード)とmecR1(シグナル伝達タンパクMecRlをコード)が存在する。β―ラクタム抗生物質との結合により活性化されたMecRlは、mecAのプロモーターに結合して転写を制御しているMecIに働き、MecIによる制御を解除させると考えられている。すなわちPBP2'は薬剤存在下で誘導産生されるペニシリン結合タンパク質であり、これにより薬剤耐性となる。しかしながら、現在臨床から分離されるほとんどのMRSA株においてmecI遺伝子が欠如しており、mecIを保有しているpreMRSAはほとんどみることはない。そこで調査検討の結果、mecA遺伝子の転写にはペニシリナーゼプラスミド上のbla調節遺伝子(blaR1とbla1)が関与していることが報告されている。このbla調節遺伝子によってPBP2'量が左右されるばかりか、基質特異性の広いblaR1が関与することによってほとんどのβ―ラクタム抗生物質を感知し、PBP2'を誘導発現して耐性化している。これを誘導型と言い、常にPBP2'を産出しているものを構成型と言う。
【０００９】
以前までmecA遺伝子のブドウ球菌間の伝達機序は全く不明だったが、自由に移動することの出来るブドウ球菌カセット染色体(SCCmec:Staphylococcal Cassette Chromosome mec)上からブドウ球菌本体の染色体に組み込まれたり、切り出されたりすることが順天堂大学医学部細菌学教室グループにより解明された。しかしながら、実際的な菌株間での伝達機序は今もって不明である。また近年、ゲノム解読技術の進歩により黄色ブドウ球菌の全ゲノムが解読された（K. Hiramatsu et al., The Lancet, 357 (2001)）。
【００１０】
［ポリ酸］
ポリ酸は、前期遷移金属元素(Mo(VI),W(VＩ),V(VI)等)により構成されている金属酸化物クラスターで、金属原子等のO原子が通常4又は6配位した四面体(MO4)または八面体(MO6)を基本単位として、これが稜、頂点、又は面を共有し、多数縮合した構造をとっている。金属の種類、結合様式の相異により多種多様な構造を示し、それとともに物理化学的性質も変化する。代表的なポリ酸の構造として、Keggin型、β‐trivacant Keggin型、Wells-Dawson型、Anderson型などがあり、その構造を図４に示す。
【００１１】
ポリ酸はその多様な構造、酸塩基特性、多電子酸化還元特性(電気化学的・光化学的)から広く応用が検討されており、抗ウィルス、抗腫瘍、抗HIVといった生物化学分野から、触媒、蛍光体、電子素子といった分野にまで幅広く応用研究が進められている。
【００１２】
ポリ酸の生理活性に関する研究は早くから行われてきている。DNA-とRNA-ポリメラーゼ、逆転写酵素に対する阻害作用、抗ウィルス作用などが報告されている。エイズ化学療法剤の研究初期に治療薬として用いられた(NH4)17H[NaSb9W21O86]・14H2O(HPA23)は、以前からレトロウィルス(RNAウィルス)逆転写酵素の阻害剤として知られており、臨床段階では若干HIV-1の増殖阻害が認められたが、in vitroでは効果的な抗HIV-1活性を示さなかった。また、K7[PTi2W10O40]・6H2O等のケギン（Keggin）構造を有するポリ酸が、RNAウィルスであるHIV-1やDNAウィルスであるヘルペス (HSV-1、HSV-2)に対し、抗ウィルス活性を示すことが見出されている。
【００１３】
ポリモリブデン酸[Mo7O24]6-および[MMo6O24]n-(M=Ir,Pt,Co,Cr等)がMeth-Aサルコーマ、MM-46アデノカルシノーマ、B-16メラノーマ、MX-1人乳癌、Co-4人結腸癌を移植したマウスに対して固形腫瘍の増殖抑制作用を示すことが報告されている。この固形腫瘍に対して強い増殖抑制作用を示すヘプタモリブデン酸イオン[Mo7O24]6-と組み換えDNA実験でベクターとして用いられるpBR322プラスミドDNAとの混合溶液に[Mo7O24]6-のO→Mo LMCT吸収帯への紫外線光照射を行なうと、プラスミドDNAを切断させることが報告されている。
【００１４】
タングステン酸とリン酸の混合溶液を90℃に加熱後、酸性(pHl〜2)にして再び加熱し、さらに中性することにより得られるファクターTと呼ぱれる化合物が、院内感染で問題となっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)において、β―ラクタム抗生物質の抗菌力を回復させることが報告されている（Y. Tajima, Z. Nagasawa and J. Tadano, Microbilo. Immunol., 37, 695 (1993)：非特許文献１）。寒天培地中でのこの構造は不明だがポリタングステン酸が同様の方法で合成することができるためポリ酸を形成している可能性がある。そこで、様々なポリタングステン酸のMRSAにおける抗菌活性を検討した結果、特にケギン構造を有するポリタングステン酸がβ―ラクタム抗生物質の抗菌力を回復させることを本発明者等が明らかにした（N. Fukuda, T. Yamane and Y. Tajima, Biol. Pharm. Bull., 22, 463 (1999)：非特許文献２）。
【００１５】
【非特許文献１】
Y. Tajima, Z. Nagasawa and J. Tadano, Microbilo. Immunol., 37, 695 (1993)
【非特許文献２】
N. Fukuda, T. Yamane and Y. Tajima, Biol. Pharm. Bull., 22, 463 (1999)
【非特許文献３】
P.J. Domaille and W.H.Knoth, Inorg. Chem., 22, 818 (1983)
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
近年、抗生物質が頻繁に用いられるようになったことに伴い、病原菌の薬剤耐性が大きな問題となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は院内感染の原因菌として重要である。この問題を克服するためには新しい抗菌剤の開発はもちろんのこと、現在臨床で使用されている抗生物質の抗菌効果を回復させる化合物の開発も重要である。更に、ポリタングステン酸のMRSAに対する抗菌活性メカニズムを解明することは、このようなポリ酸の新たな生理活性を見出し、その医薬分野での応用を図る上で、大いに期待される。
【００１７】
そこで、本発明者は、今までに開発されたポリ酸に比べ、より人体への毒性が低く、より高い抗MRSA効果をもち、更にβ―ラクタム抗生物質とより高い相乗効果をもつポリ酸を開発し、並びにそのメカニズムを解明することを目的とし、鋭意研究を重ねた。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
まず、様々なMRSA株に対する最小発育阻止濃度(MIC:Minimum Inhibitory Concentration)、ならびにβ―ラクタム抗生物質(オキサシリン、ペニシリンG)との相乗効果を調べ、その指標であるFractional Inhibitory  Concentration(FIC)indexを求めた。次に、毒性実験にヒト癌細胞株(MKN-1,MKN-45,MCF7)を用いてのin vitroにおけるポリ酸の細胞毒性を調べた。更に、ポリ酸が誘起する相乗効果の要因として可能性が高いMRSA中の因子(PBP2',β―ラクタマーゼ)のうち、ポリ酸によるβ―ラクタマーゼの抑制について注目し相乗効果との関連を調べた。その結果、以上の研究から得られた知見に基づき本発明を完成させた。
【００１９】
即ち、本発明は、以下の一般式（I）を有する化合物：
X17[M6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]・YH2O    （I）
（上記式中、Xは陽イオン、MはMn、Co、及びZnから成る群から選択される同一又は二種以上の金属元素、Yは０〜５０の整数）に係る。
【００２０】
本発明の化合物における好適例として、上記一般式（I）において、M6がMn6、Co6、Zn6、又はMn３Co３である化合物を挙げることが出来る。
更に好適例として、一般式（I）において、XがH＋、Na＋、Ｋ＋、Li＋、NH4＋、CH3NH3＋、及び（CH3）2NH2＋、から成る群から選択される同一又は二種以上の陽イオンであり、特に、XがNa＋である化合物を挙げることが出来る。
或いは、その他の好適例として、一般式（I）において、Yが４５である化合物を挙げることが出来る。
【００２１】
上記一般式（I）で表わされる本発明の化合物は、以下の実施例において示されるように、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して、例えば、増殖抑制作用（抗菌活性）のような優れた薬理作用を有する。従って、本発明は、該化合物を有効成分として含有する薬剤、例えば、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌増殖抑制剤にも係る。
【００２２】
更に、以下の実施例に示されるように、本発明化合物の抗生物質耐性黄色ブドウ球菌に対する優れた増殖抑制作用は、細胞壁合成酵素であるPBP2’の活性を阻害することにより発揮されていると考えられるので、本発明は、該化合物を有効成分として含有する細胞壁合成酵素PBP2’活性阻害剤にも係る。尚、本発明において、「PBP2’の活性を阻害する」とは、単にPBP2’の活性自体をを阻害することに加えて、（１）PBP2'とβ―ラクタム抗生物質の親和性を高めること、（２）PBP2'の産生を抑制すること、及び、（３）PBP2'の反応を阻害すること等の態様も含むものである。
【００２３】
又、本発明は、上記本発明化合物を投与することから成る、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌による感染症の治療方法に係る。
更に、以下の実施例に示すように、本発明化合物をβ―ラクタム抗生物質と併用することによって、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌に対して優れた相乗効果が認めれた。従って、本発明は、本発明化合物をβ―ラクタム抗生物質と併用することを特徴とする、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌による感染症の治療方法にも係る。
【００２４】
ここで、β―ラクタム抗生物質は当業者に公知の任意の物質であり、例えば、既に記載したようなペニシリン系及びセフェム系抗生物質がある。ペニシリン系抗生物質の代表的例としてはオキサシリン及びペニシリンG等を挙げることが出来る。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明化合物は、以下の実施例に従い当業者が容易に調製することが出来る。
【００２６】
本発明に用いられる化合物を有効成分として含有する各種薬剤を用いて治療する際の患者への投与経路は特に限定されず、経口投与若しくは非経口投与（たとえば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）のいずれでもよい。
【００２７】
本発明方法における活性成分の有効な投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤などを総合的に勘案して適宜選択することができる。投与量は、特に限定されないが、通常成人１日あたり約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは約１〜１０００ｍｇであり、より好ましくは１０〜５００ｍｇであり、これを、通例、１日１〜４回にわけて投与する。１日１回投与の場合の投与量合計が０．０１ｍｇ以下では予防治療効果が得られず、１日４回投与での投与量合計が２０００ｍｇ以上では、薬剤の血中濃度が上昇し、発疹等を引き起こすおそれがある。
【００２８】
本発明の各薬剤は、当業者に公知の任意の方法に従って製造することが出来る。その形態は投与経路等に応じて適宜選択することが出来、例えば、経口投与のための製剤としては、たとえば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、口腔内崩壊錠、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては、たとえば、注射剤、点滴剤、坐薬、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。尚、これら薬剤にはその形態等に応じて、製薬業界において通常使用されるような、当業者に公知の任意の各種補助物質を適宜含むことが出来る。又、これら薬剤中の活性成分の含有量は、その形態等にもよるが、通常、０．１〜１０重量％程度である。
【００２９】
【実施例】
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されない。
【００３０】
［ポリ酸の合成］
以下の実施例で使用するポリ酸は以下の通り調製した。尚、これらの合成に使用した試薬は、和光純薬工業(株)やSigmaの特級品または一級品を精製することなくそのまま使用した。
【００３１】
K7[PTi2W10O40]・6H20(PMl9)
既に報告されている方法（非特許文献３）を用いて以下のとおり合成した。200mlの蒸留水に60gのNa2WO4・2H2Oおよび12gのNaH2PO4・2H2Oを完全に溶解した。この溶液に撹伴しながらTiCl4を加えた。その後、この溶液を300m1ナス型フラスコに移し30分程度還流し、室温まで冷却し、析出した白色沈殿物(大部分が酸化チタン)をろ別した。このろ液にKClを60g加え、K7[PTi2W10O40]・6H20の粗結晶を得た。この結晶を150mlの蒸留水で再結晶した。結晶の同定はIRスペクトルにより行なった。
【００３２】
Na17[M6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]・45H2O(M6=Mn6,Co6,Zn6,Mn3Co3)
59.5gのNa2WO4・2H2Oと6.24gのNa2HAsO4・7H2Oを60mlの蒸留水に溶解し約80℃に加熱した。その溶液に6MHClを60ml加え、これにi) M6=Mn6;5.94gのMnC12・4H2O   ii) M6=Co6;8.73gのCo(NO3)2・6H20  iii) M6=Zn6;8.91gのZn(NO3)2・6H20  iv) M6=Mn3Co3;2.97gのMnCl2・4H20と4.37gのCo(NO3)2を溶解した水溶液30mlを加えた。さらに、濃NaOH水溶液を徐々に加え、溶液のpHを7〜8に調整した。析出した沈殿物をろ別し、ろ液を室温で放置し、粗結晶を得た。再結晶を行なうために、この粗結晶1.Ogを蒸留水30m1に溶解し、1.OgのNaC1を加えた後、懸濁液をろ別した。そのろ液を室温で一日放置し、Na17[M6(H2O)2(AsW6O026)(AsW9O34)2]・45H2O (M6=Mn6,Co6,Zn6,Mn3Co3)の結晶を得た。
尚、その他のポリ酸は既報に従い、本発明者等が合成した。
【００３３】
【実施例１】
［MRSAにおけるポリ酸の抗菌効果］
本発明に係る新規な砒素含有ポリタングステン酸化合物であるNa17[M6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]45H2O(M6=Mn6(1),Co6(2),Zn6(3),Mn3Co3(4))(これら化合物の構造を図５に示す)、これらと同じ元素から構成されているが構造の異なる（ケギン構造）ポリ酸Na10[Co2WO(H2O)3(AsW9O33)2]・nH2O(この化合物の構造を図６に示す)、既に記載したように以前本発明者等により抗菌効果があることが明らかとされたポリ酸K7[PTi2W10O40]・6H2O(PMl9)、並びに上記化合物(1),(2),(3),(4)の主原料であるNa2HAsO4・7H20とNa2WO4・2H20を用い、MRSAに対する抗菌活性をMIC及びβ―ラクタム抗生物質(オキサシリンとペニシリンG)との相乗効果を指標として検討した。
【００３４】
［細胞］
ペニシリン系抗生物質であるオキサシリンとペニシリンG（図７)はSigmaから購入した。菌体は表１に示す5種類を用いた。メチシリン耐性(MR)、感受性(MS)かは、細胞壁合成酵素(PBP2')の有無で区別され、該酵素を有する菌がMRSAであり、無い菌がMSSAである。
【００３５】
【表１】
0004316291.tif 000002
【００３６】
NCTC8325株はPBP2'をコードする遺伝子mecAをもたず、Penicillinaseも産生しないMSSAである。その他のATCC43300株、TK784株、MRS394-1株、SR3605株はMRSAである。さらにMRSAにおいて、β―ラクタム抗生物質存在下でmecA遺伝子からPBP2'を誘導する菌体を誘導型(Inducible)、β―ラクタム抗生物質存在有無に関わらずPBP2'を生産している菌体を構成型(Constitutive)と表現した。今回用いた菌体では、誘導型がATCC43300株とTK784株、構成型がSR3605株とMRS394-1株である。
【００３７】
［培養］
オートクレーブで121℃、15分間滅菌処理したミューラーヒントン寒天培地 (栄研化学(株))に植菌を行い、35℃のインキュベーター内で18時間培養した。
こうして培養した菌体を白金耳で採取し、オートクレーブで121℃、15分間滅菌処理したミューラーヒントン培地(MHB、Difco Lab.)に懸濁させ、6〜8時間、37℃の振盤培養器内で培養した。この懸濁液を希釈し、660nmでの吸光度が0.085〜0.1になるように調整した。この懸濁液の菌体密度は1×108CFU/mlであり、この密度から必要な菌体密度に調整した。
【００３８】
［ポリ酸又はβ―ラクタム抗生物質のMICの判定］
オートクレーブで121℃、15分間滅菌処理したミューラーヒントン培地に一定濃度になるようポリ酸又はβ―ラクタム抗生物質を溶解した。96穴プレートの各ウェルにこの溶液を90μl加え、さらに菌体密度5×105CFU/mlの懸濁液を10μl(最終的な菌体密度:5×104CFU/ml)加えた。この96穴プレートを35℃のインキュベーター内で24時間培養した。培養24時間後、肉眼的に菌体の発育の無い最低濃度を最小発育阻止濃度（MIC）とした。
【００３９】
各々のポリ酸とβ―ラクタム抗生物質のMICを表２に示した。表２からNa2WO4・2H2OとPM19以外の全ての化合物はMRSAに対するMICが1600μg/ml以下であり、Na2WO4・2H2Oと既に抗菌効果があることが知られているPMl9に比べて有意に高い抗菌力をもつことが分かった。
【００４０】
【表２】
0004316291.tif 000003
【００４１】
［ポリ酸とβ―ラクタム抗生物質によるFICの判定］
オートクレーブで121℃、15分間滅菌処理したミューラーヒントン培地に一定濃度になるようポリ酸又はβ―ラクタム抗生物質を溶かした。96穴プレートの各ウェルにこの二つの溶液をそれぞれ45μl加え、さらに菌体密度5×105CFU/mlの懸濁液を10μl(最終的な菌体密度:5×104CFU/ml)加えた。この96穴プレートを35℃のインキュベーター内で24時間培養した。24時間培養後、肉眼的に菌体の発育の無い最小濃度をFICとした。
【００４２】
ここで、FICの算出と併用効果は以下のように定義する。
FIC=(ポリ酸;最小濃度/MIC)+(β―ラクタム抗生物質;最小濃度/MIC)
FIC>1;不関、1≧FIC≧0.5・相加効果、0.5>FIC;相乗効果
【００４３】
各々のポリ酸とオキサシリン及びペニシリンGによるFIC indexを、それぞれ表３及び表４に示した。
【００４４】
【表３】
0004316291.tif 000004
【００４５】
【表４】
0004316291.tif 000005
【００４６】
表３から、MSSAであるNCTC8325に対して、全ての化合物はFIC indexが0.5以上であることから、あまり効果が無いことが分かった。一方、全てのMRSAに対して、(1),(2),(3),(4)とPMl9に相乗効果(全てのFIC indexが0.2以下)が観察され、Na10[Co2WO(H20)3(AsW9O33)2]・nH2Oと、(1),(2),(3),(4)の原料であるNa2HAsO4・7H2OとNa2WO4・2H2Oにはほとんど効果(ほとんどのFIC indexが0.5以上)が見られなかった。表４においても同様な結果が観察された。
【００４７】
このように、本発明化合物である(1),(2),(3),(4)、特に、M6=Mn6,Co6,Mn3Co3である本発明の化合物はペニシリン系β―ラクタム抗生物質との間で、MRSAに対して非常に高い相乗効果を示す一方で、MSSAに対しては有意な相乗効果を示さないことが観察された。
これらの結果から、本発明化合物の抗生物質耐性黄色ブドウ球菌に対する優れた増殖抑制作用は、（１）ポリ酸によるPBP2'とβ―ラクタム抗生物質の親和性の向上、（２）ポリ酸によるPBP2'の産生抑制、又は（３）ポリ酸によるPBP2'の反応阻害、等の機序によって、細胞壁合成酵素であるPBP2’の活性を阻害することにより発揮されていると考えられる。又、ATCC43300株とTK784株はβ―ラクタマーゼを産生することから、ポリ酸がβ―ラクタマーゼ活性を抑制している可能性も考えられる。
【００４８】
【実施例２】
［ヒト癌細胞株に対するポリ酸の毒性］
感染症治療薬として人体への投与を考えた場合、人体に対して強い毒性をもつポリ酸(POT)は治療薬として不適当であると考えられる。そこで、人体に対するポリ酸の毒性を探索するために、本発明の化合物を含む各種ポリ酸のヒト細胞毒性試験（小山秀基、細胞ラボマニュアル、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社（１９９９））を行なった。
【００４９】
［測定法］
細胞毒性試験における生細胞数の測定法として、比色法であるMTS法を用いた。CellTiter96（登録商標）Aqueous One Solution Reagentにはテトラゾリウム化合物 [MTS:3-(4,5dimethylthiazo1-2-y1)-5-(3-car boxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt]と電子輸送試薬(PES:phenazine ethosu1fate)が含まれている。MTSテトラゾリウム化合物は細胞によって生物的に還元され、細胞培養液に可溶な発色性のホルマザン産物へと変換される (図８)。この変換は、代謝活性がある細胞のデヒドロゲナーゼによって産生されるNADPHまたはNADHによって行なわれると考えられている。ホルマザン産物量は490nmの吸光度として測定され、その値は培養液に含まれる生細胞数と比例関係にある。
【００５０】
［試薬・培地］
5一fluorouracil(5-FU)はSigmaから購入した。
RPMIl640 Medium(Sigma Aldrich)500ml中に、50℃で非働化したウシ胎児血清(FBS:Fetal Bovine Serum, Termo Trace)50mlと(100×)硫酸カナマイシン(インビトロジェン)5mlを加えて、RPMIl640培地を調製した。
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS,大日本製薬株式会社)5粒を超純水500m1に溶解した。その後、オートクレープで121℃、15分滅菌処理し、PBS溶液を調製した。
PBS溶液50m1に(10×)トリプシンーEDTA(インビトロジェン)5mlを加えてトリプシンーEDTA溶液の調製した。
【００５１】
［細胞株］
本研究で使用したヒト胃癌細胞株MKN-1とMKN-45は理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター細胞開発銀行から購入し、ヒト乳癌細胞株MCF-7は関谷剛男先生(三菱化学生命科学研究所副所長兼トランスレイショナル研究部長)から分与して頂いた。
【００５２】
［細胞の融解と培養］
液体窒素中で保存されていた細胞の入ったアンプルを37℃の温水で溶かした。この細胞懸濁液全量をRPMIl640培地5mlに懸濁させ、遠心分離(1000rpm,3分間25℃)を行い、上清を除去した。得られた細胞のペレットに少量の培地を加えて懸濁させ、8mlの培地を加えてふた付き100×20mmディッシュ(FALCON)で培養した。このディッシュを37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベータ内に入れ、培養した。
【００５３】
［細胞の計数］
ディッシュから培地をアスピレーターで除去し、PBS溶液で1回細胞を洗浄した後、トリプシンーEDTA溶液1mlで細胞をディッシュ面から遊離させた。そして、RPMIl640培地2mlを加えよく懸濁した後、エッペンドルチューブにこの細胞懸濁液を移し、0.4%トリパンブルー溶液を等量加えた。この混合溶液をBurker-Turk型血球計算版(測定体積;縦:1mm横:1mm深さ:0.1 mmエルマ)に注入し、CK40培養顕微鏡(100倍、OLYMPUS)で染色の見られない生細胞数を計測した。測定された細胞数に20000倍した数から細胞密度(cells/ml)を求めた。
【００５４】
［細胞の継代］
ふた付き100×20mmディッシュにRPMIl640培地8mlを加え、細胞懸濁液を細胞密度が1×105cells/m1になるように調製した。このディッシュを37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベータ内に入れ、3〜4日間培養した。細胞が常に対数増殖期にあるよう継代し続けた。
【００５５】
［ヒト癌細胞に対するポリ酸の毒性試験］
それぞれの細胞懸濁液を細胞密度4×104cells/mlになるように希釈した。96穴プレート(Nunc)のウェルにこの細胞懸濁液を90μl(細胞密度3.6×105cells/well)加え、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベータ内で24時間培養した。24時間培養後、各々のウェルに一定濃度のポリ酸溶液を10μl加え、再び37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベータ内で72時間培養した。72時間培養後、各々のウェルの培地をアスピレーターで除去し、RPMI1640培地で1回洗浄後、各々のウェルにRPMIl640培地l00μlとCellTiter96(登録商標)Aqueous One Solution 20μlを加え、37℃、5%CO2雰囲気下で2時間インキュベートした。2時間後、IMMUNO-MINI NJ-2300  96穴プレートリーダー(Nunc)により、各々のウェルに対して波長490mmにおける吸光度(A490)を測定した(バックグラウンドはRPMIl640培地100μlとCellTiter96（登録商標）Aqueous One Solution 20μlの混合溶液を用いた)。得られた吸光度から生細胞数を比色定量し、50%生育阻止濃度(IC50: 50%Inhibition Concentration)を求めた。各ポリ酸濃度につき6検体解析を行い、平均値を求めた。
【００５６】
［IC50値の算出］
50={ポリ酸濃度(Xμg/ml)の吸光度(A490)/ポリ酸非存在下の吸光度(A490)}×100の式に従いIC50値Xを求めた。
【００５７】
各ヒト癌細胞株(MKN-1,MKN-45,MCF7)における種々のポリ酸のIC50値を表５に示した。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
5-FUをコントロールに用いて細胞毒性試験を行い、他の参考文献と比較した結果、文献値とほぼ等しいIC50値が得られたことを確認した。
表５から、ヒト癌細胞株に対するポリ酸の毒性がわかった。ほとんどのポリ酸やその原料化合物において、化合物濃度1000μg/mlでの細胞生育阻止率がほぼ100%であることから、IC50>100μg/mlのポリ酸は毒性が低いと見なし、これ以上詳細には求めなかった。
【００６０】
その結果、ほとんどのポリモリブデン酸は細胞毒性が低く、ほとんどのポリバナジウム酸は細胞毒性が高いことが分かった。
砒素含有ポリタングステン酸の毒性も強さは様々であった。本発明化合物であるNa17[Co6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]・45H2OとNa17[Mn6(H2O)2(AsW6O26)(AsW9O34)2]・45H2OのIC50はいずれも細胞についても100μg/mlより高く、本発明の化合物の毒性は低いことが確認された。一方、これに対して、同じ構成元素を有するNa10[Co2WO(H2O)3(AsW9O33)2]・nH2Oはこれらに比べて毒性が高いことが明らかとなった。この原因として、構造、砒素の価数、及び、ポリ酸の溶液中の安定性等における違いが考えられる。
尚、それぞれの細胞株においてポリ酸の毒性が異なるのは、細胞株の金属に対する代謝機能や細胞増殖速度などに関与している可能性があると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】
以上の実施例から、本発明化合物である一般式（Ｉ）を有する砒素含有ポリタングステン酸は抗生物質耐性黄色ブドウ球菌等のMRSAに対して優れた抗菌力があり、且つ、ヒト癌細胞株に対しては毒性が低く、更にβ―ラクタム抗生物質との併用により高い相乗効果を示すため、有効な抗MRSA薬としての可能性があることが確認された。
今後さらなる研究により、本発明化合物が有する様々な生理活性を活かした新規薬剤や抗菌製品が開発される可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペニシリン系（上）およびセフェム系（下）抗生物質の構造を示す。
【図２】細胞膜を通過する間にムレインモノマー前駆体からムレインモノマーが合成される様子を示す。
【図３】黄色ブドウ球菌の細胞壁形成の過程を示す。
【図４】代表的なポリ酸の構造であるKeggin型（ａ）、Trivacant Keggin型（ｂ）、Wells-Dawson型（ｃ）、Decatungstate型（ｄ）及びAnderson型（ｅ）の構造を示す。
【図５】本発明の化合物の構造を示す。
【図６】ポリ酸Na10[Co2WO(H20)3(AsW9O33)2]・nH2Oのケギン構造を示す。
【図７】ペニシリン系抗生物質であるオキサシリンとペニシリンGの構造を示す。
【図８】MTSテトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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