(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞マーカーであるネスチン、ビメンチン及びムサシ-1を発現し、5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジン存在下で培養すると5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジンを細胞内に取り込む細胞の調製方法であって、ヒト羊膜から羊膜間葉細胞層を取得し、次いで該ヒト羊膜間葉細胞層から前記細胞を分離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト羊膜から分離された、新規な神経幹細胞に関する。本発明の細胞は、神経細胞により生産される物質の供給源として有用であり、また、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
多能性幹細胞は、種々の組織を構成するように分化し得る未分化の細胞であり、再生医学や組織工学の分野で重要なものである。幹細胞としては、従来、骨髄から得られる骨髄幹細胞や、臍帯血幹細胞が知られているが、これらは安定供給に難がある。また、今年になって、ヒト胎盤から多量の多能性幹細胞が採取可能であることが発表された。しかし、胎盤は、母体由来であるので、胎盤由来の幹細胞から分化した細胞を移植する場合には、拒絶反応を防止するために適合性を調べる必要があり、適合性のない患者に対しては移植ができないという問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない神経幹細胞を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト羊膜の間葉細胞層に神経幹細胞が存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、神経幹細胞マーカーであるネスチン、ビメンチン及びムサシ-1を発現し、5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジン存在下で培養すると5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジンを細胞内に取り込む細胞の調製方法であって、ヒト羊膜から羊膜間葉細胞層を取得し、次いで該ヒト羊膜間葉細胞層から上記細胞を分離することを含む方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の細胞は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されるものである。間葉細胞層は、絨毛膜層と羊膜上皮細胞層との間に位置する。羊膜は、胎児由来の組織であるが、母体由来の胎盤に付着した状態で採取することができ、しかも、子宮内壁の全体を被覆する大きな組織であるので、大量に採取することができる。さらに、胎盤やそれに付着している羊膜は、医療廃棄物として処理されるものであるので、採取に倫理上の問題も生じない。
【０００７】
本発明の細胞は、ヒト羊膜の羊膜上皮細胞層＋間葉細胞層を絨毛膜層から剥離し、これをトリプシン処理して羊膜上皮細胞を除去し、蛋白分解酵素処理することにより分離することができる。ここで、蛋白分解酵素処理の好ましい例としては、パパイン、コラゲナーゼ、中性プロテアーゼ(neutral protease))及びDNase混合液で処理することを挙げることができるが（下記実施例参照）、これに限定されるものではない。
【０００８】
本発明の細胞は、ネスチン(nestin)、ビメンチン(vimentin)及びムサシ-1を発現していることが免疫組織染色により確認されるものである。ネスチン及びビメンチンは、神経幹細胞マーカーであり、これらを発現している細胞は、多能性を有する神経幹細胞であると判定できることがこの分野において認められている（Ana Villa et al., Experimental Neurology 161, 67-84(2000))。従って、本発明の細胞は多能性を有する神経幹細胞である。さらに、本発明の細胞は、5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジン(5BrdU)存在下で培養すると5BrdUの取り込みが検出され、分裂期にあることがわかる。5BrdUを用いて細胞の増殖状態を調べることはよく行われており、市販の5BrdU測定用キットを用いて容易に行うことができる。また、本発明の細胞を、海馬細胞培養用の添加物であるB-27(Brewer, G.J. et al., (1993) J. Neuroscience Res. 35, 567)を含む培養液で培養すると、ネスチンが陰性となり、ビメンチンの発現もほとんど消失し、神経細胞への分化が認められる。なお、B-27は、ビオチン、L-カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、D(+)-ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチニルアセテート、セレニウム、T3(トリオド-1-チロネイン)、DL-α-トコフェロール、DL-α-トコフェロールアセテート、ウシアルブミン、カタラーゼ、インシュリン、スーパーオキサイドディスムターゼ及びトランスフェリンから成る、海馬細胞培養用の添加物であり、米国Invitrogen社より市販されている。また、本発明の細胞を、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び上皮増殖因子(EGF)等の分裂促進剤を含む培養液中で浮遊培養すると、細胞スフェアーが形成され、このスフェアーの一部を採取して同様に浮遊培養すると、再びスフェアーが形成される（二次スフェアー）。従って、本発明の細胞は、未分化状態で培養が可能であり、自己複製性を有している。
【００１０】
本発明の細胞はヒト羊膜由来であり、羊膜は胎児由来であり、免疫寛容を示す。すなわち免疫組織染色ではHLA Class I には陽性反応を呈し、HLA Class II の染色性はない。またFas ligand 陽性細胞が存在している。最近、羊膜組織が拒絶反応を惹起しにくい理由は、HLA Class Ib (HLA-G)の発現とFas ligand 陽性細胞の存在が拒絶抑制に貢献していると考えられている（眼科42:257-269, 2000）。従って、HLAの適合性を問題にすることなく移植することが可能である。
【００１１】
なお、下記実施例に具体的に記載するように、本発明の細胞は、βFGF（繊維芽細胞増殖因子）及び／又はEGF（上皮増殖因子）存在下での浮遊培養によりスフェアーを形成し、その一部を採って浮遊培養すると再びスフェアー（二次スフェアー）を形成するので、例えば、上記蛋白分解酵素処理により分離された細胞のうち、ネスチン及びムサシ-1が陽性である細胞を浮遊培養して二次スフェアーを形成させる等の方法により、容易に本発明の細胞を単離することが可能である。
【００１２】
本発明の細胞は、上記したB-27のような海馬細胞培養用添加物の存在下で培養することにより神経細胞に分化する。また、本発明の細胞は、NGF（神経成長因子）又はNT-3（ニュートロフィン−３)のようなサイトカインの存在下で、非コート皿上で培養することにより、希突起膠細胞又は星状細胞に分化する。従って、本発明の細胞は、このような神経細胞形成用の用途に用いることができる。分化した培養神経細胞は、神経細胞により産生されるドーパミンやコリンアセチルトランスフェラーゼ等の種々の物質の供給源として用いることができる。なお、ドーパミンはパーキンソン病患者において著しく減少することが知られている物質であり、コリンアセチルトランスフェラーゼは、アルツハイマー症患者において著しく減少することが知られている物質である。また、本発明の細胞は、免疫寛容を示すので、痴呆症等において損傷を受けている部分（例えばアルツハイマー病では海馬、脳基底核、脳線条体等）に移植することにより、神経細胞により生産されるコリンアセチルトランスフェラーゼ等の薬剤送達システム(DDS)として利用可能であり、痴呆症、パーキンソン病、代謝性神経疾患等の治療に用いることができる。また、本発明の細胞に、公知の方法（例えば特開平9-94092号公報の実施例１〜３）により所望の外来遺伝子を導入し、移植することにより、該外来遺伝子によりコードされる物質のDDSとしても利用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１４】
実施例１、比較例１
１．  細胞の分離及び培養
インフォームドコンセントを得た妊婦の出産後の胎盤より、羊膜上皮細胞層＋間葉細胞層を絨毛膜層から剥離して分離した。0.125%トリプシン溶液+1.3 mM EDTAで３７℃で１５分間処理した。これを４回繰り返し、トリプシン溶液を遠心して細胞を集め、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗った（トリプシン処理分画（比較例１））。消化されなかった組織塊をリン酸緩衝液で洗った後、混合酵素(0.01%パパイン、1 mg/mlコラゲナーゼ、0.01% DNase、0.1%中性プロテアーゼ）で３７℃、１時間振盪処理を行った。1000 rpm、１０分間遠心し、沈渣をＰＢＳに浮遊させた。２０μｍフィルターに通してから、ＰＢＳで３回洗浄した（混合酵素処理分画（実施例１））。
【００１５】
両画分を10%牛胎児血清(FBS)含有DMEM:F-12(1:1)培養液中（ヒト白血病阻害因子(hLIF, イスラエル国alomone labo社製）1000 U/ml、及び2-メルカプトエタノール(2-ME, Sigma社製）で、コラーゲンコートした培養ディッシュ上で３７℃、5% CO2インキュベーター中で初代培養した。なお、ここで用いたDMEM:F-12(1:1)培養液は、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)とハムのF-12栄養混合物(F-12)の1:1混合物で、一般的な哺乳動物細胞培養用の無血清培地として市販(米国Sigma社）されているものである。３日後、コンフルエントになってから0.125%トリプシン＋1.3 mM EDTAで処理し、２４穴のコラーゲンコートした培養ディッシュに同一培養液で２次培養し、また、B-27（Invitrogen社製B-27 Supplement (50x)を終濃度で５０倍希釈）含有DMEM:F-12(1:1)培養液に変換して培養した。そして３〜５日後に、後述の方法により免疫組織染色を行った。
【００１６】
次に、初代培養細胞を0.125%トリプシン＋1.3 mM EDTAで処理し、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(HEMA)で処理した培養皿にN2添加物(終濃度でプロゲステロン0.63μg/ml、プトレシン1611μg/ml、セレナイト0.52μg/ml、インシュリン500μg/ml、ヒトトランスフェリン10000μg/ml、Invitrogen社より市販)、２０μg/mlウシ塩基性FGF及び２０μg/ml EGF含有のDMEM:F-12(1:1)培養液で浮遊培養した。なお、培養皿は、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレートでコートした。２〜５日後に直径５０〜２００μｍのスフェアーが形成された。このスフェアーを集細胞遠心装置でカバーガラス上に標本を作製し、下記の方法により免疫染色を行った。このスフェアーを0.125%トリプシン＋1.3 mM EDTAで処理してから、再度上記の培養液で浮遊培養したところ、二次スフェアーが形成された。
分化を研究するために、浮遊培養細胞をNT-3及びNGFのようないくつかのサイトカインで処理した。すなわち、具体的には次のように行った。羊膜スフェアーを附着培養系に移し、NGF(100 ng/ml)及びNT-3(50 ng/ml)含有の無血清培地で培養した。
【００１７】
２．  免疫染色
羊膜上皮細胞層及び羊膜間葉細胞層を含む羊膜のクリオスタット断片並びに浮遊培養細胞を免疫染色した。免疫組織染色は、一次抗体として、抗ヒトネスチンポリクローナル抗体又は抗ヒトムサシ-1モノクローナル抗体を用い、二次抗体としては、抗ラッビットＩｇＧローダミン(1:100 Chemicon社製）および抗ラビットＩgG  FITC（ZYMED社製）を用いて、常法により行った。具体的には次のように行った。培養細胞または羊膜組織を4% パラホルムアルデヒドで１分間固定し、上記の一次抗体で室温２時間インキュベートした。つぎに0.3%triton X100(商品名）で希釈した二次抗体で２時間インキュベートした。免疫ブロットした細胞は、オリンパス社製IX 10蛍光顕微鏡で観察し、オリンパス社製Fluoviewレーザー走査顕微鏡を用いた共焦点画像により分析した。さらに、他の細胞マーカーであるCK19（Santa Cruz社製）、ビメンチン（PROGEN社製）、Gal C（Sigma社製）及びβ-tub-III（Sigma社製）についても、各細胞マーカーに対する市販のモノクローナル抗体を用いて上記と同様に免疫組織染色を行った。また抗Fas ligand (SANTA CRUZ社製)、抗HLA Class I (HLA-A, B, C; アンセル社製) と抗HLA Class II (HLA-DP, DQ, DR; アンセル社製) を一次抗体として用いた。
また、上記培養を5-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジン(5BrdU)（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）存在下（培地中の濃度10μM)で行い、細胞内の5BrdUを市販のキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて検出した
【００１８】
３．  結果
混合酵素処理分画から得られた本発明の細胞（実施例１）は、10% FBS含有のDMEM:F-12(1:1)培養液（hLIF及び2-ME含有）で３日間コラーゲンコート培養皿で付着培養すると、細胞の免疫染色による特徴はCK19-/ビメンチン++/ネスチン+/ムサシ-1+であった（全細胞中の約１５％)。上記のように、ネスチン及びビメンチンを発現している細胞は、神経幹細胞であることがこの分野において認められている。従って、本発明の細胞は神経幹細胞であることが明らかになった。また、5BrdU存在下での培養では、5BrdUは、陽性であり、分裂期にあることも判明した。また、B-27含有培養液で分化させるとビメンチン±/ネスチン-/ムサシ-1-/Gal C±/β-tub-III++となり、神経幹細胞マーカーが消失し、神経細胞への分化が示唆された。また、浮遊培養細胞をNT-3及びNGFのようないくつかのサイトカインで処理した結果、NGF含有培地で培養すると、GFAP陽性の細胞が増加し、アストログリア（星状細胞）への分化が示唆された。NT-3含有培地で培養すると、GFAP及びGal C陽性細胞が増加し、アストログリア及びオリゴグリア（希突起膠細胞)への分化が示唆された。
【００１９】
また、本発明の細胞をN2、ウシ塩基性FGF、EGF及び1%ヒト血清アルブミン(HAS)含有培養液中で浮遊培養すると、培養開始２〜３日後に直径50〜200μｍの羊膜スフェアーが形成され、さらにその一部を採って同様に培養すると、同様な２次スフェアーが形成された。これにより、本発明の細胞が、自己複製性を有し、FGF、EGF等の分裂促進剤の存在下で、未分化状態で培養が可能なことが明らかになった。
【００２０】
一方、トリプシン処理分画から得られた細胞（比較例１）は、10% FBS含有のDMEM:F-12(1:1)培養液で３日間コラーゲンコート培養皿で付着培養すると、細胞の免疫染色による特徴はCK19+/ビメンチン-/ネスチン-/ムサシ-1-であった。また、上記液体培養により、スフェアーは形成されなかった。これより、羊膜上皮細胞には神経幹細胞が存在しないことが明らかになった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明により、安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない神経幹細胞が初めて提供された。本発明の細胞は、胎盤と共に大量に採取することができ、倫理上の問題もなく安定供給が可能である。また、本発明の細胞は、免疫寛容性を有するので、患者に移植する際の適合性が問題にならない。よって、本発明の細胞は、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として優れた効果を発揮するものと考えられる。