(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ（１本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射することを特徴とする特定核酸配列の切断方法であって、前記インターカレーターがオキサゾールイエローである、前記切断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子本体である核酸の配列特異的な切断方法に関するものであり、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、そして未知遺伝子の探索等の分野で利用され得るものである。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学又はその応用分野においては、核酸を特定配列部位で切断することが頻繁に行われる。例えば、大腸菌等の微生物やヒト細胞や他の動物細胞等で目的のタンパクを生産するには、目的タンパクをコードする遺伝子を挿入したベクターが必要になるが、このベクターの調製にあたっては、制限酵素を用いて遺伝子たる核酸を特定配列部位で特異的に切断することが必要である。
【０００３】
このような、核酸の特定配列部位での特異的な切断には、核酸中の塩基配列を認識して塩基間の結合を切断する活性を発揮する制限酵素が用いられるのが一般的であり、既に数百種類の制限酵素が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
制限酵素を用いる場合は、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選択して使用する必要がある。しかしながら、任意の配列で核酸を切断しようとすると、既に知られた数百種類の制限酵素をもってしても十分ではない。例えば、ガンの治療法の一つとして、ガン遺伝子の発現を阻止する目的でゲノム中の目的ガン遺伝子のみを特異的に切断する方法が有望視されているが、この目的を達成するには切断されるべきガン遺伝子中の特定配列部位を特異的に切断する制限酵素が必要となるが、かかる特定配列部位を認識し切断する制限酵素が存在するとは必ずしも言えない。
【０００５】
そこで本発明の目的は、２本鎖ＤＮＡ（以下、標的核酸という）の特定核酸配列を特異的に切断する方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、任意に選択された特定核酸配列の切断を可能とすることを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本発明は、２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ（１本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射することを特徴とする特定核酸配列の切断方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
２本鎖ＤＮＡに対しては、その特定の核酸配列部位に結合し３本鎖を形成し得る核酸プローブ（１本鎖ＤＮＡ）を設計することが可能であり、設計のための塩基の選択規則も既によく知られている（伊藤隆司、蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．３、５４１〜５５０頁、１９９３年）。一方、本出願人により、１本鎖の標的核酸の特定配列部位に特異的に結合し得る核酸配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を結合し、特定核酸との相補結合により形成される２本鎖核酸部分に該蛍光色素がインターカレーションしてその蛍光特性を変化するように設計された、インターカレーター性蛍光色素結合プローブを報告している（特願平７−１８５５９９号公報、ＥＰ公開第７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７頁、１９９６年参照）。なお、本明細書においては、標的核酸とインターカレーターを結合した核酸プローブを時として切断用プローブと、切断用プローブ中の１本鎖オリゴヌクレオチド部分を単に核酸プローブと称することがある。
【０００８】
今回、本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を行う中で、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部位に特異的に結合し得る核酸配列を有する核酸プローブにインターカレーターを結合した切断用プローブを標的核酸に添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射すると、インターカレーターが標的核酸中にインターカレーションし、前記特定波長光を吸収して切断用プローブの結合部位、即ち標的核酸の前記特定核酸配列部位を切断することを見出したのである。
【０００９】
本発明で用いられるインターカレーターとしては、２本鎖ＤＮＡにインターカレーションする物質であれば特に制限はない。例えば、チアゾールオレンジやオキサゾールイエロー等のインターカレーター性蛍光色素を例示することができる。インターカレーターは、共有結合によって核酸プローブと結合すれば良いが、この際、適当な分子長のリンカーを介して結合しても良い。リンカーは、インターカレーターが標的核酸中にインターカレーションすることを妨害しない分子であれば特に制限はないが、例えば両末端に官能基を有する二官能性炭化水素等は両者を容易に結合するうえで特に好ましいリンカーである。また例えば、市販の試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）等を使用することもできる。
【００１０】
インターカレーターの核酸プローブへの結合部位は、核酸プローブの５’末端、３’末端又は中央部分のいずれであっても、この結合により切断用プローブの標的核酸の特定核酸配列部位への結合が妨害されず、かつ、結合されたインターカレーターが標的核酸中にインターカレーション可能であれば特に制限はない。
【００１１】
本発明により、標的核酸は切断用プローブが特異的に結合した部位、即ち特定核酸配列部位で切断される。このように、前記リンカーの分子長及び切断用プローブにおけるインターカレーターの結合部位は、標的核酸の切断部位を制御するうえで重要である。即ち、例えば切断用プローブの末端にインターカレーターが結合されている場合、標的核酸の特定核酸配列部位の末端からリンカーの分子長に依存して数塩基〜数十塩基の範囲内で標的核酸は切断される。
【００１２】
切断用プローブを構成する核酸プローブは、標的核酸の特定核酸配列部位に対する特異性を担保するため、６〜１００ヌクレオチド、特に１０〜３０ヌクレオチドの１本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好ましい。ここで標的核酸の特定核酸配列部位とは、標的核酸中に見出される、本発明の方法により切断されるべき部位を含む塩基配列部分であり、任意に設定することができる。例えば切断されるべき標的核酸が切断されるべきではない２本鎖ＤＮＡと共存している場合には、特定核酸配列部位として標的核酸に特異的に見出される（言い換えれば他の核酸中には見出されない）塩基配列部部位を選択することが好ましい。核酸プローブの塩基配列は、標的核酸（２本鎖ＤＮＡ）中のＡ−Ｔ結合部分に対応する塩基としてＴを、Ｇ−Ｃ結合部分に対応する塩基としてＣ又は５−メチルシトシンを選択することで、安定なＰｙｒ−Ｐｕｒ−Ｐｙｒ型３本鎖を形成することができる。
【００１３】
標的核酸に切断用プローブを添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射することにより、標的核酸を特定核酸配列部位で切断することができる。標的核酸と共存させる切断用プローブの量は、予想される標的核酸の存在料と同程度とすれば十分であるが、その１０〜１００倍を使用することで、標的核酸を効率的に切断することができる。スペルミンの使用量（最終濃度）は、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ程度、特に好ましくは０．５ｍＭ程度である。
【００１４】
照射する光は、切断用プローブ中のインターカレーターが吸収する特定波長の光を含んでいれば特に制限はない。例えばインターカレーターがオキサゾールイエローである場合には、特定波長の光として４９０ｎｍの光を例示することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一例であって本発明を限定するものではない。
【００１６】
実施例１  オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドＤＳ−１、ＴＨ−１、ＴＨ−２ＴＨ−３及びＴＨ−４を市販のＤＮＡ合成装置により合成した。各オリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。
【００１７】
ＤＳ−１：５’−ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴ−３’
ＴＨ−１：５’−ＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＧＣ−３’
ＴＨ−２：５’−ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣ−３’
ＴＨ−３：５’−ＣＧＡＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＡＧ−３’
ＴＨ−４：５’−ＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧ−３’
チオール修飾オリゴヌクレオチドＰＵ−１及びＰＹ−１（核酸プローブ）は、市販の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、商品名、クロンテック社製）を用い、ＤＮＡ合成装置により常法に従って合成した。また市販の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ）部分からのトリチル基の除去は常法に従った。ＰＵ−１及びＰＹ−１の塩基配列は以下の通りである。
【００１８】
尚、各オリゴ核酸の塩基配列は、以下の通りである（＊は、５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを示す）。
【００１９】
ＰＵ−１：５’−ＨＳ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
ＰＹ−１：５’−ＨＳ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴＣ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’
実施例２  切断用核酸プローブの調製
実施例１で調製したＰＵ−１を、常法に従って高速液体クロマトグラフィーで精製した。得られたＰＵ−１含有画分にジチオスレイトール（１０μＭ、２０μＬ）を加えて溶液Ａとした。ＤＭＦ（２００μｌ）、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１０．０、３００μｌ）及び水（５００μｌ）の混合液に、文献（特願平７−１８５５９９号公報、ＥＰ公開第７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７頁、１９９６年参照）に開示したようにして調製したオキサゾールイエロー（ＹＯ（ＣＨ2）3Ｉ）を添加し、飽和させて溶液Ｂとした。
【００２０】
溶液Ａと溶液Ｂを３：１の比率で混合し、アルゴン存在下で２時間反応させた後、ゲルろ過用カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ファルマシア社製）を用いた液体クロマトグラフィーで精製した。なお溶出液としては５％アセトニトリルを含むｐＨ７．０のＴＥＡＡ緩衝液を使用した。
【００２１】
精製した画分を濃縮し、蒸留水に溶解し、常法に従い高速液体クロマトグラフィーで更に精製した後、得られた画分を減圧下で乾固しＹＯ−ＰＵ−１を得た。得られたＹＯ−ＰＵ−１の濃度は、２６０ｎｍの吸光度から決定した。
【００２２】
実施例１で調製したＰＹ−１についても上記同様の操作を行い、ＹＯ−ＰＹ−１を得た。各核酸プローブの塩基配列は、以下の通りである（＊は、５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを示す）。またこれら切断用核酸プローブ（インターカレーターを結合した核酸プローブ）の調製の様子を図１に示す。
【００２３】
ＹＯ−ＰＵ−１：５’−ＹＯ−（ＣＨ2）3−Ｓ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
ＹＯ−ＰＹ−１：５’−ＹＯ−（ＣＨ2）3−Ｓ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴＣ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’
実施例３  ２本鎖形成と蛍光の測定
ＹＯ−ＰＵ−１（３０ｐｍｏｌ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に実施例１で調製したＤＳ−１を添加し、混合液を９０℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷した。前記と同じＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測定した。結果を図２に示す。
【００２４】
図２から、切断用プローブがＤＳ−１と特異的に結合することが分かる。
【００２５】
実施例４  ３本鎖形成と蛍光の測定
実施例１で調製したＴＨ−１及びＴＨ−２をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に添加し、混合液を９０℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）を形成させた。形成させた標的核酸とＹＯ−ＰＹ−１を、Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（２５ｍＭ、ｐＨ５．１）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン（０．５ｍＭ）を含む緩衝液（１００μｌ）に添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。前記と同じＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測定した。比較のため、スペルミンを含まない緩衝液を用いて前記同様の操作を行った。結果を図３に示す。
【００２６】
図３から、切断用プローブが標的核酸と特異的に３本鎖を形成し、スペルミンの共存がその形成に効果的であることが分かる。また、切断用プローブのインターカレーターとして、インターカレーター性蛍光色素を用いた場合は、３本鎖の形成により蛍光増感を示すことも確認された。
【００２７】
実施例５  標的核酸の切断
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（３２Ｐで標識したＡＴＰ）を用いて、実施例１で調製したＴＨ−３又はＴＨ−４の５’末端を標識した。標識した鎖と未標識の相補鎖を混合後、混合液を９０℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）を形成した。
【００２８】
形成した標的核酸（４ｍＭ、約１００Ｋ  ｃｐｍの標識した鎖を含む）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ５．８）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン（０．５ｍＭ）及び１０当量又は１００当量のＹＯ−ＰＹ−１を含む緩衝液（１ｍｌ）に添加し、２０℃で３０分間インキュベートし、同温度で可視光を１時間照射した。
【００２９】
混合液にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、減圧して乾燥した。２０Ｋ
ｃｐｍの標識鎖を含むサンプルを１２％の変性ポリアクリルアミドゲルを用い２０００Ｖにて３時間電気泳動し、泳動後、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行なった。結果を図４〜６に示す。
【００３０】
図中の矢印は、標的核酸の切断部位を示すものである。このように、切断用プローブを用いた標的核酸の切断は部位特異的であり、核酸プローブの塩基配列を選択することで標的核酸中の任意の部位（特定核酸配列部位）を切断可能であることが分かる。
【００３１】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部位（任意の配列からなる部位）を特異的に切断する方法が提供される。この方法は、従来の制限酵素を用いる切断法では対応し得なかった配列部位に対しても適用可能であるため、有用遺伝子のクローニングへの利用、未知遺伝子の探索等の分野での利用はもとより、今後期待されている遺伝子診断や遺伝子治療の分野においても有効な方法である。
【００３２】
特に本発明では、標的となる２本鎖ＤＮＡを含む試料に切断用プローブを添加し、スペルミンの共存下で特定波長の光を例えば１時間程度照射するだけで切断が可能であるから、迅速性と簡便性に対する一般的な要求に応えることが可能であり、熟練を要する操作が存在しないために操作者の相違により異なる結果が得られるということもない。加えて、本発明では特定波長の光を照射することによってはじめて２本鎖ＤＮＡを切断し得るものであるから、標的核酸と切断用プローブとが共存する状況のもとであっても切断の時期を自由に選択することが可能である。例えば、切断用プローブが標的核酸の存在する細胞等に移動するのを確認したうえで光を照射すれば、標的核酸を効率的に切断することが可能となるため、遺伝子治療での利用も期待できる。しかも、このように切断の時期を自由に選択することができれば、切断されるべきではないが、特定核酸配列部位又はそれと類似した配列部位を有する２本鎖ＤＮＡがダメージを受けることを避けるための工夫も可能となる。
【００３３】
本発明で切断用プローブとして用いるインターカレーターを結合した核酸プローブは、標的核酸と相補結合を形成するとインターカレーターの蛍光強度が増加等するという特質をも有していることから、例えば、まず切断用プローブを標的核酸が存在する組織の細胞等に導入し、該細胞からの蛍光の有無をもとに切断プローブと標的核酸の結合を確認し、そのうえで本発明における切断に好適な特定波長の光を照射する、等の操作を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＹＯ−ＰＹ−１の調製操作を説明するための図である。
【図２】図２は、相補鎖ＤＳ−１と２本鎖を形成した場合のＹＯ−ＰＵ−１の蛍光の増大を示すための図である。
【図３】図３は、ＴＨ−１及びＴＨ−２により形成される２本鎖ＤＮＡと３本鎖を形成した場合のＹＯ−ＰＹ−１の蛍光の増大を示すための図である。図中、Ａはスペルミンが存在するとき、Ｂスペルミンが存在しないときの結果である。
【図４】図４は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及びＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動パターンであり、標識されたＴＨ−４を含む２本鎖ＤＮＡの切断を示すものである。
【図５】図５は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及びＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動パターンであり、標識されたＴＨ−３を含む２本鎖ＤＮＡの切断を示すものである。
【図６】図６は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及びＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す図であり、切断箇所を示すヒストグラムを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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