(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩまたはＩＩ
【化１】
0004257697.tif 000008
（上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ１は、独立して、水素原子、Ｃ１−２０アルキル基またはケタールもしくはアセタール、ヒドロキシル、アルデヒド、アミノ、メルカプトおよび糖残基からなる群より選ばれる置換基１もしくは２個により置換されたＣ１−２０アルキル基を示し、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ５(ＣＨ２)ｐＲ６を示し、ここでＲ５はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ６はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ２は、独立して、水素原子またはアルキル基またはアラルキル基を示すが、但し、水素原子が全Ｒ２基の７０％以上であり、Ｒ３は、独立して、水素原子または疎水性残基を示し、ｍは、独立して、５０〜５０００の整数を示し、そしてｎは、独立して、５〜５００の整数を示す）
で表されるブロック共重合体とシスプラチンとに由来する錯体であって、シスプラチンのＰｔと該共重合体のカルボキシルアニオンの当量比（Ｐｔ／ＣＯＯ−）が０．３以上である錯体。
【請求項２】
Ｒ２が水素原子またはベンジル基であるが、但し、水素原子が全Ｒ２基の９５％以上であり、そして
Ｒ３が水素原子であるか、或いは式Ｉの場合にはＲ３がＣ８−１６アルキルカルボニル、フェニルアセチル、ジフェニルアセチルまたはピレンスルホニルであり、他方、式ＩＩの場合はＣ８−１６アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、アダマンチルまたはコレステリルである請求項１記載の錯体。
【請求項３】
共重合体が式Ｉ−ａ：
【化２】
0004257697.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは式Ｉについて定義したのと同義である）
で表されるブロック共重合体である請求項１または２に記載の錯体。
【請求項４】
Ｒ１が水素原子、Ｃ１−６アルキル基、またはケタールもしくはアセタール、ヒドロキシル、アミノおよびアルカプトからなる群より選ばれる置換基１個により置換されたＣ１−６アルキル基であり、
Ｒ２が水素原子またはベンジルであるが、但し、水素原子が全Ｒ２基の９５％以上であり、そして
Ｒ３が水素原子である請求項１〜３のいずれかに記載の錯体。
【請求項５】
水に可溶化させた場合にシスプラチン由来の分子または部分を内包する高分子ミセルを形成することができる請求項１〜４のいずれかに記載の錯体。
【請求項６】
高分子ミセルが３７℃の純水中で安定に存在し、そして生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液）中で少なくとも１５時間はミセル形態を維持することが静的光散乱の測定で認められる請求項１〜４のいずれかに記載の錯体。
【請求項７】
高分子ミセルが２０〜１００ｎｍの平均直径サイズである請求項６記載の錯体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の錯体を有効成分として含んでなる医薬製剤。
【請求項９】
制がん剤である請求項８記載の医薬製剤。
【請求項１０】
ボーラス静注するための形態にある請求項８記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリ（エチレングリコール）セグメント（以下、ＰＥＧと略記する場合あり）およびポリ（α−グルタミン酸）セグメント（以下、Ｐ（Ｇｌｕ）と略記する場合あり）を含有する共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）と略記する場合あり）とシスプラチンとの錯体ならびに該錯体を有効成分とする医薬に関する。
背景技術
シスプラチン（ｃｉｓ−Ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）；以下、ＣＤＤＰと略記する場合あり）は臨床において非常に有効な制ガン剤であるが、腎毒性などの副作用が非常に強いことが知られている。さらに、ＣＤＤＰは血中に投与されると腎糸球体濾過により迅速に体外へと排泄されるため、その血中半減期は非常に短い。そこでこのＣＤＤＰの血中半減期を長期化し、腎毒性を軽減するための多くの製剤の開発がこれまでに多くの研究者によって行われてきたが成功例は未だに無いのが現状である。
そのため、現状では、ＣＤＤＰ剤を投与する前に適当な輸液を投与しておき、次いでＣＤＤＰを多量の生理食塩液またはブドウ糖−食塩液に混和し、数時間かけて点滴静注するのが一般的である。
したがって、煩雑で時間のかかる点滴静注に代わる新しい投与形態、例えばボーラス静注を可能にするような製剤の開発が強く望まれている。
このような要望に応えるべく、本発明者らは、水性媒体中でのポリ（エチレングリコール）−ポリ（α，β−アスパラギン酸）（以下、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）と略記する）とＣＤＤＰとの錯形成により得られた高分子金属錯体ミセルを提案した（例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａ；Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３９（１９９６）３５１−３５６；Ｎｉｓｈｉｙａｍａ；Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９、１５、３７７−３８３）。該高分子金属錯体ミセルは、純水中で安定なミセル構造を長期にわたり維持し、３７℃の生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液）中でＰｔ（ＩＩ）錯体を徐々に放出するが約１０時間にわたり高分子ミセル構造を維持しうるものである。すなわち、この金属錯体ミセルは、生理的環境下、例えば、血液循環中でかなり長期にわたって存在しうる点で注目すべきである。またさらに、静脈投与を行った場合に、該金属錯体ミセルは、ＣＤＤＰ単体に比べて優れた制ガン効果や腎毒性低減効果が得られることが示唆されている（例えば、片岡、ＰＨＡＲＭ  ＴＥＣＨ  ＪＡＰＡＮ  Ｖｏｌ．１６、Ｎｏ．８（２０００）１２０９−１２１９）。
しかし、可能であるなら、生理的環境下でさらに長期にわたって高分子ミセル形態を維持しうる製剤の開発に対する要望は依然として存在するであろう。したがって、本発明の目的は、上記ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）とＣＤＤＰとの高分子金属錯体ミセルよりは、生理的環境下でさらに長期にわたって高分子ミセル形態を維持しうる高分子金属錯体を提供することにある。
発明の開示
一般的に金属錯体の安定化を図ると、形成した錯体から金属が放出されなくなるか、あるいは効率よくもしくは適当の速度で放出されなくなる場合がよくある。例えば、ＣＤＤＰの塩素イオン配位子をタンパク質中のシステイン、メチオニン、ヒスチジンなどの側鎖残基（これらはカルボキシルアニオンに比べて遥かに強い求核性を有する）で交換すると、極めて安定な錯体が形成し、生理食塩水中でも、さらなる塩素イオン配位子への再交換が起こらず、ＣＤＤＰは生体内で活性を示さなくなる場合さえある。したがって、本発明者らはＣＤＤＰの塩素イオン配位子と適当に交換しうる配位子をもつキャリヤーを開発すべく検討してきた。その結果、意外にも、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）とは、ＣＤＤＰの塩素イオンと交換しうる配位子として共通のカルボキシルアニオン（−ＣＯＯ−）を側鎖にもつにもかかわらず、ポリ（エチレングリコール）セグメントとポリ（α−グルタミン酸）セグメントを含んでなるブロック共重合体とＣＤＤＰとの錯体が、本発明の目的にかなう特性を有することを、ここに見出した。
したがって、本発明によれば、下記式ＩまたはＩＩで表されるブロック共重合体とシスプラチンとに由来する錯体であって、シスプラチンのＰｔと該共重合体のカルボキシルアニオンの当量比（Ｐｔ／ＣＯＯ−）が０．３以上、好ましくは０．５以上である錯体が提供される。
0004257697.tif 000002
上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ１は、独立して、水素原子または官能基により置換されていてもよいアルキル基を示し、Ａは、独立して、ＮＨ、ＣＯ、Ｒ５（ＣＨ２）ｐＲ６を示し、ここでＲ５はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｒ６はＮＨまたはＣＯであり、そしてｐは１〜６の整数であり；Ｒ２は、独立して、水素原子またはアルキル基またはアラルキル基を示し、Ｒ３は、独立して、水素原子または疎水性の残基を示し、ｍは、独立して、５０〜５０００、好ましくは１００〜１０００の整数であり、ｎは、独立して、５〜１０００、好ましくは１０〜５００の整数である。
本発明はもう一つの態様として、上記錯体を有効成分とする医薬、特に、制がん剤も提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明にいう、錯体は、ＣＤＤＰ分子内の２つの塩素イオンの１つまたは両方が該ブロック共重合体のカルボキシルアニオンにより交換された、所謂、配位化合物を意味するが、必ずしもＣＤＤＰ分子のすべてが該ブロック共重合体と配位結合を形成しているものに限定されるものでない。換言すれば、ＣＤＤＰ分子の一部が配位結合以外の何等かの物理的結合によって該ブロック共重合体に担持されていてもよい。しかし、担持されているＣＤＤＰ分子のすべてが、ＣＤＤＰ分子内の２つの塩素イオンの１つまたは両方において該ブロック共重合体のカルボキシル基と配位結合しているものが好ましい。
本明細書で「・・・とシスプラチン（またはＣＤＤＰ）に由来する」とか、「シスプラチン（またはＣＤＤＰ）内包」とか、「内包されたシスプラチン（またはＣＤＤＰ）」という場合にの、「シスプラチン（またはＣＤＤＰ）」の語は、本明細書では、必ずしも下記：
0004257697.tif 000003
の構造式を有するものを意味するのでなく、該構造から、塩素イオン（Ｃｌ−）が１個または２個脱離した状態にある場合のものをも包含する意  味で使用している。
本明細書で「高分子ミセル」という場合は、当該技術分野で一般に用いられている意味を有するが、より具体的には、上記ブロック共重合体におけるＰＥＧセグメントからなるシェル（外殻）とＰ（Ａｓｐ）またはＰ（Ｇｌｕ）セグメントからなるコア（内核）とからなるコア−シェル型の構造体を意味する。本発明によれば、高分子ミセルは限定されるものでないが、典型的には水性媒体中でＣＤＤＰの共存下でブロック共重合体が自律的に多分子会合して形成されるものを意味する。
本発明で用いるブロック共重合体には、上記式ＩまたはＩＩで表されるものであって、本発明の目的に沿うものであればいかなる共重合体であってもよい。これらの共重合体は、例えば、特許第２７７７５３０号掲載公報（または米国特許第５，４４９、５１３号）に記載されているようなポリ（エチレングリコール）セグメントおよびポリ（α−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル）セグメントを含有するブロック共重合体からベンジル基の部分加水分解もしくはエステル交換後の部分加水分解によるか、あるいは実質的に完全な加水分解を行い、逆に、必要により、カルボキシル基を部分エステル化することにより製造することができる。
また、式ＩおよびＩＩにおけるＲ１が官能基により置換されていてもよいアルキル基である場合の官能基は、通常１個の適当な保護基で保護されていてもよい、ヒドロキシル基、例えば、アセタールもしくはケタール化されていてもよいアルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、糖残基等を挙げることができる。このような官能基を有していてもよいアルキル基としては炭素原子１〜２０個のアルキル基が挙げられ、好ましくは１〜６個のメチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、等の直鎖または分岐の低級アルキル基を挙げることができる。このようなＲ１基を有する式ＩまたはＩＩのブロック共重合体を製造するには、例えば，ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２、ＷＯ９６／３２４３４等に記載の方法で対応するＰＥＧセグメントを作成した後、例えばそのω末端をアミノ基に改変し、これを開始剤としてγ−ベンジルグルタメート  Ｎ−カルボン酸無水物を重合させることにより得ることができる。得られるブロック共重合体のγ−ベンジル基（Ｒ２基に相当する）は、上述したように、部分加水分解および／またはエステル交換するか、あるいは実質的に完全な加水分解により脱離し、場合によって、上述したようなアルキル基やアラルキル基（ベンジル基，フェネチル基、等）を部分的に導入してもよい。なお、「実質的に完全な加水分解」とは、少なくとも９５％、好ましくは９９％のエステル基が脱離している場合を包含する意味を有するが、本発明の目的上、１００％エステル基が脱離していることが、特に好ましい。また、部分加水分解または完全な加水分解後にアルキル基やアラルキル基が導入される場合（Ｒ２基が水素原子以外である）には、エステル基が７０％、好ましくは５０％、より好ましくは３０％まで存在することができる。
この場合、式ＩにおけるＡがＮＨを示す、式Ｉ−ａ：
0004257697.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは式Ｉについて定義したのと同義である）
で表される共重合体に対応する。
なお、式ＩまたはＩＩにおけるＡは、上記のようにＰＥＧセグメントのω末端の改変方法またはＰＥＧセグメントとＰ（Ｇｌｕ）セグメントを連結する方法によって変動しうるものであり、式Ｉ−ａで示す上記ＮＨの他に、ＣＯ、Ｒ５（ＣＨ２）ｐＲ６（ここで、Ｒ５はＯ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、そしてＲ６はＮＨまたはＣＯであり、ｐは１〜６の整数である）を示すことができる。
式ＩまたはＩＩにおけるＲ３は、水素原子または疎水性残基である。疎水性残基とは、例えば、式Ｉおよび式ＩＩの場合に、それぞれ、Ｃ８−１６アルキルカルボニルおよびＣ８−１６アルキル、フェニルアセチルおよびベンジル、ジフェニルアセチルおよびベンズヒドリル、ピレンスルホニルおよびピレニル、アダマンチル、コレステリル基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの残基は、酸クロライド法や、その他活性エステル化法によって導入できる。かような疎水性残基は、場合によって、水性媒体中での本発明に従う錯体の自己会合能を高めるのに役立ちうる。
式ＩまたはＩＩにおけるｍは５０〜５０００、好ましくは１００〜１０００の整数であり、ｎは５〜１０００、好ましくは１０〜５００の整数である。これらのｍおよびｎの数は、式ＩまたはＩＩにおけるＲ２基やＲ３基として水素原子以外の基の存否またはその存在割合によっても変動しうるが、本発明の錯体を水に可溶化させた場合に、シスプラチン由来の分子または部分を内包（またはシスプラチンを内包）する高分子ミセルを形成することができるものが好ましい。例えば、Ｒ２基がベンジル基であるが、このような疎水性の側鎖の場合、残りのカルボキシレートをＣＤＤＰと結合させればミセルが形成されるので任意の導入率をとることができる。
さらに、本発明に従う錯体は、上記高分子ミセルが３７℃の純水中で安定に存在し、そして生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液）中で少なくとも約１５時間はミセル形態を維持することが静的光散乱の測定で認められるものが好ましい。純水中で安定に存在するとは、高分子ミセルを純水中に分散または可溶化させた場合、少なくとも２日間は実質的に内包されたＣＤＤＰが高分子ミセルから水中へ放出されないことを意味する。後述する実施例に記載される錯体では、８０時間を超えてもＣＤＤＰの水中への放出は認められなかった。また、数ケ月以上にわたって安定であったものも確認されている。一方、生理食塩水中でミセル形態を維持することが静的光散乱の測定で認められるとは、一般的に静的光散乱（ＳＬＳ）の散乱光強度は高分子の見かけの重量平均分子量を反映することが知られており、従って、ＳＬＳの散乱光強度変化より高分子ミセルの見かけの分子量の変化を評価できることを基礎としたものである。例えば、一定のＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）ミセルは、３７℃の生理食塩水中において約１０時間その見かけの分子量を維持した後、ゆっくりと解離するものと推測されるが、本発明に従うＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）ミセルでは、少なくとも約１５時間は高分子ミセルの見かけの分子量を維持（すなわち、ミセル形態を維持）する。さらに、本発明に従う高分子ミセルでは、好ましくは約２０時間にわたり高分子ミセルの見かけの分子量を維持する。
さらに本発明に従う高分子ミセルは、水性媒体中での動的光散乱（ＤＬＳ）測定により得られるキュムラント粒径約１５〜約５００ｎｍ、好ましくは約２０〜約２００ｎｍであり、粒度分布の狭い単分散ミセルであることができる。
かような高分子ミセルに内包されるＣＤＤＰは、ＣＤＤＰ中のＰｔと共重合体中のカルボキシルアニオン（ＣＯＯ−）の当量比（Ｐｔ／ＣＯＯ−）が０．３以上、好ましくは０．５以上である。この値が０．３未満であるときは、一般的に水中で安定な高分子ミセルが形成できない場合がある。この値いは、高分子ミセルが安定であるかぎり、高ければ高い方がよいが、一般的には、２以下である。また、一般的に高分子ミセルは臨界会合濃度（ｃ．ａ．ｃ）を有しているが、本発明に従う、ＣＤＤＰ内包ミセルは希釈に対しても非常に安定である。
他方、理論によって拘束されるものでないが、該ＣＤＤＰ内包ミセルは、生理条件に近い３７℃の生理食塩中において、Ｐｔ（ＩＩ）錯体の配位子交換（−ＣＯＯ−→Ｃｌ−）を伴ないながら、ＣＤＤＰを徐々に放出し、上述のように約１５時間を経過した後に、ミセル形態が崩壊する。なお、かようなＣＤＤＰ内包ミセルは、シェル（外殻）が、フレキシブルで親水性のＰＥＧセグメントが数十本から数百本まで密集していて、コア（内核）との界面からブラシ状に生えた構造をとっていることが推測される。しかも、主としてメゾスコピックなサイズ範囲（２０〜１００ｎｍ程度）であることから、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞に代表される細網内皮系（ＲＥＳ）による非特異的な取り込みを回避でき、加えて、腎糸球体による濾過を回避できるので、該ＣＤＤＰ内包ミセルは約１５時間を超えてミセル形態で血流中を循環しうるものと推測される。その後、短時間で遊離または実質的に遊離のＣＤＤＰを、腫瘍部位で放出しうる。さらに、かようなＣＤＤＰ内包ミセルは、上述の片岡、ＰＨＡＲＭ  ＴＥＣＨ  ＪＡＰＡＮ  Ｖｏｌ．１６、Ｎｏ．８（２０００）１２０９〜１２１９に記載されているＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）と同様に腎毒性等の毒性が低い。
したがって、本発明に従う錯体、より具体的にはＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）ミセルは、ＣＤＤＰ単体が本来有している抗腫瘍活性を新しい投与形態において発揮しうる。こうして、本発明によれば、上記本発明に従う錯体を有効成分とする制がん剤が提供される。かような制がん剤は、場合により、該ＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）ミセルそれ自体、または、必要により賦形剤、例えば、グルコース、マンノース、オリゴ−またはポリエチレングリコール等の安定剤などとともに凍結乾燥形態で保存していたものを、例えば、薬物の初期濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるような希釈剤、例えば減菌等張水溶液として、通常、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにボーラス静注することができる。
また、本発明に従う、ＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）ミセルは、上述のＮｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，に記載されるＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）のそれと、同様に調製することができる。
以下、本発明をさらに具体例を挙げながら説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
本例では、上述のＮｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）とともに、本発明のＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）のＣＤＤＰ内包高分子ミセルの製造例が示される。本発明で使用するブロック共重合体は、例えば、次の構造式で表される。
0004257697.tif 000005
水中にシスプラチン（ＣＤＤＰ）を溶解させた（５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この溶液にポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））およびポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ））（以下、実施例においてブロック共重合体の表記は（ＰＥＧの分子量×１０−３）−（ポリアミノ酸の重合度）とする：例えば、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）５−３５は、ＰＥＧの分子量が約５０００でＰ（Ｇｌｕ）の重合度が約３５であることを意味する。）を溶解させ（［ＣＤＤＰ］／［ＡｓｐまたはＧｌｕ］＝１．０）、３７℃で７２時間反応させた。得られた溶液を限外濾過（分画分子量：１００，０００）を繰り返すことにより精製した。
動的光散乱（ＤＬＳ）測定より、粒径測定（キュムラント解析を行った結果を表１に示す。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０及び５−７９からはそれぞれ粒径２２．１ｎｍ及び２２．５ｎｍの単分散な粒子の形成が確認され、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）５−３５、５−７０及び１２−７０からはそれぞれ粒径１１４ｎｍ、２９．７ｎｍ及び３５．２ｎｍの単分散な粒子の形成が確認された（図１参照）。これに対し、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）１２−２９からは粒子の形成は全く確認されなかった。すなわち高分子ミセル内核を構成するポリアミノ酸構造をアスパラギン酸（Ａｓｐ）からより疎水的なグルタミン酸（Ｇｌｕ）にすることで高分子ミセルの粒子径は増大し、さらにＡｓｐからは調製困難である分子量が１２，０００のＰＥＧを含む共重合体よりなる高分子ミセルの調製が可能となる。
0004257697.tif 000006
実施例２
３７℃の生理食塩水中における実施例１で得られたＣＤＤＰを内包する高分子ミセルからのＣＤＤＰのリリース挙動を透析法（透析膜の分画分子量：１，０００）により評価した。分画分子量が１，０００の透析膜を用いて５０倍の生理食塩水に対し透析を行い、所定時間後に外液中に含まれる白金（Ｐｔ）量をフレームレス原子吸光により定量した。ミセルを構成するアミノ酸の構造をＡｓｐからＧｌｕにすることで高分子ミセルからのＣＤＤＰのリリース速度は大きく抑制されることが確認された（図２参照）。また、水中においてはミセルからのＣＤＤＰのリリースは認められなかった。
実施例３
３７℃の生理食塩水中における実施例１で得られた高分子ミセルの粒子としての安定性評価を静的光散乱（ＳＬＳ）の相対散乱光強度変化により評価した。一般的に、ＳＬＳの散乱光強度は粒子の見かけの重量平均分子量を反映することが知られている。３７℃の生理食塩水中においてミセルは非線形的な解離挙動を示し、ある一定時間その見かけの分子量を維持した後ゆっくりと解離することが確認された。また、ミセルとしてその見かけの分子量が維持される時間はミセル内核のアミノ酸の構造がＡｓｐからＧｌｕとなることで約１０時間から約３０時間へと大幅に長期化されることが確認された（図３参照）。
実施例４
ルイス肺ガンを下腹部皮下に移植したＣ５７ＢＬ６／Ｎマウス（ｎ＝４、雄、６週齢）に対し、フリーのＣＤＤＰおよびＣＤＤＰ内包ミセルを尾静脈より投与した時の血漿中白金濃度および主要臓器への白金の集積の時間変化を評価した結果を図４に示す。図中、○：フリーのＣＤＤＰ；△：ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０；▲：ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５；■：同１２−７０である。
血漿中白金濃度の時間変化（図４（Ａ））において、ＣＤＤＰ内包ミセルはフリーのＣＤＤＰと比較して大幅に長期化された血中滞留性を有することが確認された。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセル投与群において、血漿中白金濃度は投与後４時間まで高い値（４５％投与量／ｍＬ）が維持され、その後速やかに減少し、２４時間後には１．５％投与量／ｍＬに達した。これに対し、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５および同１２−７０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセル投与群では、血漿中白金濃度は投与後８時間まで高い値（それぞれ５７および３４％投与量／ｍＬ）が維持され、その後緩やかに減少し、２４時間後における値はそれぞれ１１および５．１％投与量／ｍＬであった。これらの結果は、３７℃の生理食塩水中で観察されたミセル内核のアミノ酸の構造がＡｓｐからＧｌｕとなることで著しく遅延される時間に対し非線形なミセルの崩壊挙動（図３）に矛盾しないと考えられる。従って、ミセル内核のアミノ酸の構造がＡｓｐからＧｌｕとなることでＣＤＤＰ内包ミセルの血漿中滞留時間が大幅に長期化された。
腫瘍への白金の集積（図４（Ｂ））において、ＣＤＤＰ内包ミセルはフリーのＣＤＤＰと比較して効果的に腫瘍に集積することが確認された。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセル投与群において、腫瘍中白金濃度は高い血漿中白金濃度が認められた投与４時間後までは効果的に増大したが、その後頭打ちとなり投与２４時間後における値はフリーのＣＤＤＰの値の４．８倍であった。これに対し、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５および同１２−７０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセル投与群では、血漿中白金濃度は投与後８時間まで効果的に増大し、投与２４時間後における値はそれぞれフリーのＣＤＤＰの値の２０および１５倍であった。このようにミセル内核のアミノ酸の構造がＡｓｐからＧｌｕとなることでＣＤＤＰ内包ミセルの腫瘍集積性が大幅に向上された。
腎臓への白金の集積（図４（Ｃ））において、ＣＤＤＰ内包ミセルはフリーのＣＤＤＰに認められる投与直後（〜１５ｍｉｎ）の高い集積を効果的に抑制した。文献的にある閾値以上のＣＤＤＰの集積は腎毒性を引き起こすと報告されており、ＣＤＤＰ内包ミセルは投与直後の腎臓への高い集積を回避することにより、腎毒性を効果的に抑制することが期待される。ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）から形成されたＣＤＤＰ内包ミセルはＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）から形成されたミセルと比較して長期化された血中滞留性と高い腫瘍集積性を示した（図４（Ａ）と（Ｂ））にも拘わらず、ＣＤＤＰの副作用臓器である腎臓に対しては同程度の集積性しか有していないことが確認された。
肝臓および脾臓への白金の集積（図４（Ｄ）および（Ｅ））において、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセルは血漿中白金濃度が急激に減少した投与８時間後に肝臓および脾臓に対し急激な高い集積を示したが、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）から形成されたミセルは肝臓および脾臓に対しそのような急激な集積は示さず、特に同１２−３５から形成されたミセルにおいては白金の肝臓への集積が効果的に抑制されることが確認された。
図４のフリーのＣＤＤＰおよびＣＤＤＰ内包ミセルの組織中白金濃度−時間曲線から曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、腫瘍に対する各臓器のＡＵＣの比を求めた結果を表２に示す。フリーのＣＤＤＰは腎臓ＡＵＣ／腫瘍ＡＵＣおよび肝臓ＡＵＣ／腫瘍ＡＵＣにおいて１以上の値を示し、腎臓および肝臓に対し腫瘍より高い特異性を有するものと思われる。一方、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０から形成されたＣＤＤＰ内包ミセルは肝臓ＡＵＣ／腫瘍ＡＵＣおよ脾臓ＡＵＣ／腫瘍ＡＵＣにおいて１以上の値を示し、肝臓および脾臓に対し腫瘍より高い特異性を有するものと思われる。これに対して、ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５から形成されたミセルはすべての組織ＡＵＣ／腫瘍ＡＵＣにおいて１以下の値を示し、腫瘍に対し高い特異性を有するものとみなせる。
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実施例５
ルイス肺ガンを下腹部皮下に移植したＣ５７ＢＬ６／Ｎマウス（ｎ＝４、雄、６週齢）に対し、フリーのＣＤＤＰもしくはＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５から形成されたＣＤＤＰ内包ミセルを尾静脈より一回投与した時のＣＤＤＰ換算投与量に対するマウスの抗腫瘍効果および体重変化を評価した結果をそれぞれ図５（Ａ）および（Ｂ）に示す（▲：フリーＣＤＤＰ；■：ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５から形成されたミセル）。図５では、０日目に対する腫瘍体積変化および体重変化の相対値の経過日数積分（薬物処理から１７日まで）を算出し、その値の無処理群に対する薬物処理群の比をそれぞれ抗腫瘍効果および体重変化として表した。また、正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｎマウス（ｎ＝４、雌、６週齢）に対し、薬物を尾静脈から一回投与し、６日後の血漿中の尿素窒素（ＢＵＮ）値を評価した。ＢＵＮ値の上昇は腎毒性の指標になることが一般的に知られている。このＢＵＮ値に関しても無処理群に対する薬物処理群の比を算出し、ＣＤＤＰ換算投与量に対する相対ＢＵＮ値を図５（Ｃ）に示した。その結果、フリーのＣＤＤＰにおいては投与量依存的に抗腫瘍効果の増大、体重の減少およびＢＵＮ値の上昇が確認された（１２ｍｇ／ｋｇで処理したマウスの３匹中１匹が毒性死）のに対し、ＣＤＤＰ内包ミセルにおいては大幅な体重減少とＢＵＮ値の上昇無しに高い抗腫瘍効果が得られる薬物投与量域（１１〜２５ｍｇ／ｋｇ）が確認された。このような高分子ミセル化によるＣＤＤＰの有効治療域の拡大は、実施例４において示されたミセル化によるＣＤＤＰの腫瘍への選択的な集積によりもたらされたものと考えられる。
産業上の利用可能性
本発明に従うＣＤＤＰ内包ミセルは時間制御された崩壊挙動を示す新しいタイプのＣＤＤＰ製剤であり、固形ガンに対し効果的に集積し、非常に高い制ガン効果を示す一方、ＣＤＤＰ投与の際、最も大きな問題となる腎毒性を顕著に軽減する。さらに、高分子ミセル化により難溶性のＣＤＤＰの水への溶解性が飛躍的に高まり、ＣＤＤＰ投与の際、患者のＱＯＬ上好ましくないと考えられるハイドレーションを行わず、簡便に投与できることが可能になる。このようにＣＤＤＰ内包ミセルは臨床上多くの利点を有すると考えられる。したがって、医療業および医薬製造業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で調製した本発明に従う各種ＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定による分散度を表すグラフである。
図２は、本発明に従うＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）高分子ミセルと比較のＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の高分子ミセルからの生理的食塩水中へのＣＤＤＰ（Ｐｔ）放出挙動を示すグラフである。図中、△：ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０；□：同５−８０；●：ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）５−３５；▲：同１２−３５；■：同１２−７０である。
図３は、本発明に従うＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）高分子ミセルと比較のＣＤＤＰ内包ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）高分子ミセルの生理食塩水中での安定性を評価するための経時的な静的光散乱（ＳＬＳ）の相対散乱光強度変化を表すグラフである。図中の記号は、図２に同じ。
図４は、実施例４に従う、フリーのＣＤＤＰおよびＣＤＤＰ内包ミセルを尾静脈より投与した時の血漿中白金濃度変化（４（Ａ））および主要臓器への白金の集積の時間変化（４（Ｂ）〜（Ｅ））を評価した結果をそれぞれ示すグラフである。図中、●：フリーのＣＤＤＰ；△：ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）５−４０；▲：ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５；■：同１２−７０である。
図５は、実施例５に従う、フリーのＣＤＤＰもしくはＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５から形成されたＣＤＤＰ内包ミセルを尾静脈より一回投与した時のＣＤＤＰ換算投与量に対するマウスの抗腫瘍効果（５（Ａ））、体重変化（５（Ｂ））および相対ＢＵＮ値変化（５（Ｃ））を評価した結果をそれぞれ示すグラフである（▲：フリーＣＤＤＰ；■：ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｕ）１２−３５から形成されたミセル）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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