(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）乃至（３）からなる群から選択されるポリペプチド：
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；、
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド；
および
（３）前記（１）または（２）のポリペプチドにおいてアミノ酸配列中１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
下記（１）乃至（３）からなる群から選択される一つのポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
および
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項６】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項６に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求項５若しくは請求項６に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１０】
下記の工程（ｉ）または（ｉｉ）を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するまたは増強する化合物の同定方法。
（ｉ）  請求項１記載のポリペプチドとその基質を共遺伝子発現させる系に、被検化合物を加える工程；および、脱ユビキチン化活性を測定する工程。
（ｉｉ）請求項２乃至４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを導入されてなる形質転換体と被検化合物とを接触させる工程；および、脱ユビキチン化活性を測定する工程。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するまたは増強する化合物の同定方法であって、被検化合物と該ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドと被検化合物とを接触させ、次いで、被検化合物と該ポリペプチドとの相互作用により生じるシグナルの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物が該ポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害または促進するかどうかを決定することを特徴とする方法。
【請求項１２】
下記の工程（ｉ）または（ｉｉ）を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
（ｉ）  請求項１記載のポリペプチドとその基質を共遺伝子発現させる系に、被検化合物を加える工程；および、脱ユビキチン化活性を測定する工程。
（ｉｉ）請求項２乃至４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを導入されてなる形質転換体と被検化合物とを接触させる工程；および、脱ユビキチン化活性を測定する工程。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、下記工程（１）または（２）を含む方法。
（１）該ポリペプチドとその基質とを用い、該ポリペプチドの脱ユビキチン化作用を、基質からのユビキチンの解離を検出することにより測定する工程。
（２）該ポリヌクレオチドとその基質とを共発現させた遺伝子共発現系を用い、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの脱ユビキチン化作用を、該ポリペプチドによる基質からのユビキチンの解離を検出することにより測定する工程。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、下記いずれかの方法により該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドを測定することを含む方法：ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティング、およびハイブリダイゼーション法。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項２乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項５または請求項６に記載の組換えベクター、請求項７に記載の形質転換体、および請求項９に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、脱ユビキチン化活性を有する新規なプロテアーゼ（以下、ＵＳＰと略称することもある）およびそれをコードする遺伝子に関するものである。さらに詳しくは、新規ＵＳＰのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ポリペプチドまたは該ペプチドに対する抗体、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、該ポリペプチドの拮抗剤、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ポリペプチドまたは該ペプチドの製造方法、該ポリペプチドまたは該ペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物の同定方法、該ポリペプチドまたは該ペプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法、並びに該同定方法または該測定方法に使用する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ユビキチン（以下Ｕｂと略称することもある）は７６個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖であり、そのアミノ酸配列は酵母からヒトまで高度に保存されている。Ｕｂの生体内での役割は様々であり、発癌（非特許文献１〜４）、細胞周期（非特許文献５〜７）、ウイルス感染（非特許文献８）、および神経変性疾患（非特許文献９〜１１）等の多くの生体反応に関与している。
【０００３】
Ｕｂの最も重要な機能は、２６Ｓプロテアソームでの蛋白分解におけるシグナルとしての働きである。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）といった一連のユビキチン化酵素によって、Ｕｂは標的蛋白質にイソペプチド結合し、ポリユビキチン鎖を形成する。そのポリユビキチン鎖が分解シグナルとしてプロテアソームに認識されることにより、ユビキチン化された蛋白質は分解される。
【０００４】
一方、ユビキチン化された蛋白質からＵｂが解離する脱ユビキチン化反応を触媒する脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の存在が報告されている。ＤＵＢは、その構造から大きく２つのファミリーに分類されている（非特許文献１２〜１４）。１つはユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（ＵＣＨ）と呼ばれるもので、分子量２０ｋＤａから３０ｋＤａのものが多く、異種間で一次構造が保存されている。ＵＣＨは主にＵｂのＣ末端に低分子が結合している場合にＵｂを解離する。もう一つはユビキチン特異プロテアーゼ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＵＳＰ、ＵＢＰ、あるいはＵＣＨ＿タイプＩＩ）と呼ばれるもので、その分子量は４０ｋＤａから１５０ｋＤａと様々であり、異種間でのアミノ酸配列の共通性が少ない。ＵＳＰはその活性ドメインとしてシステイン（Ｃｙｓ）ドメイン（Ｃｙｓ  ｂｏｘ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）ドメイン（Ｈｉｓ  ｂｏｘ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）ドメインを持ち、Ｃｙｓドメイン内に存在するシステイン残基を活性部位とするシステインプロテアーゼである。また、ＵＳＰのＮ末端側配列が基質認識に関与するという報告（非特許文献１５）がある。ＵＳＰはＵｂのＣ末端に高分子が結合している場合にＵｂを解離する。
【０００５】
ＵＳＰの生体内での機能は大きく３つに分けることができる。その１は、リボゾーム蛋白融合ユビキチンやペプチド結合型ポリユビキチン鎖といった前駆体ＵｂからＵｂを生成する機能である。これにはＵＳＰの１つであるＵｂ−ＣＥＰ５２等が関与している。その２は、イソペプチド結合をしたユビキチン化蛋白質からＵｂを解離する機能であり、蛋白質のユビキチン化を抑制することにより蛋白質の分解を抑制する。その３は、プロテアソームにより分解された後のイソペプチド結合型ポリユビキチン鎖を解体する機能であり、例えば、ＵＳＰ５として知られているイソペプチダーゼＴがこの機能を有している（非特許文献１６）。
【０００６】
ＵｂおよびＵＳＰ等から構成されるユビキチンシステムの機能の１つは、生体内で生じた異常蛋白質の除去、および転写因子やシグナル伝達因子等の分解による量的調節等であり（非特許文献１７）、ＵＳＰの機能障害はこのシステムの異常をきたす。ＵＳＰの異常と発癌や神経変性疾患との関連が示唆されている（非特許文献１７〜１９）。例えば、アルツハイマー病やパーキンソン病で観察される蛋白質凝集体の多くが抗ユビキチン抗体に反応することが報告されている（非特許文献１７）。また、ＵＳＰは染色体構造の維持にも関与しており、ユビキチン化されたヒストンの脱ユビキチン化が染色体凝集に重要であることが知られているし（非特許文献２０）、ＵＳＰファミリーの１つであるＵＳＰ１６がＨ２Ａを脱ユビキチン化することが報告されている（非特許文献２１）。さらに、ユビキチン経路が筋萎縮症と関連していることについても報告されている（非特許文献２２）。
【０００７】
【非特許文献１】
「フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」，１９９７年，第４２０巻，ｐ．２５−
【非特許文献２】
「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」，１９９３年，第８巻，ｐ．２３０７−
【非特許文献３】
「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」，１９９５年，第１０巻，ｐ．２１７９−
【非特許文献４】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，１９９３年，第３６６巻，ｐ．３１３−
【非特許文献５】
「アニュアル  レビュー  オブ  バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９８年，第６７巻，ｐ．４２５−
【非特許文献６】
「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９６年，第９３巻，ｐ．３２７５−
【非特許文献７】
「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９７年，第２７２巻，ｐ．５１−
【非特許文献８】
「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，１９９７年，第１６巻，ｐ．１５１９−
【非特許文献９】
「トレンズ  イン  ニューロサイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，１９９８年，第２１巻，ｐ．５１６−
【非特許文献１０】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，１９９８年，第３９５巻，ｐ．４５１−４５２
【非特許文献１１】
「ネイチャー  ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９８年，第２３巻，ｐ．４７−
【非特許文献１２】
「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９９年，第２６６巻，ｐ．６３３−
【非特許文献１３】
「ファセブ  ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，１９９７年，第１１巻，ｐ．１２４５−
【非特許文献１４】
「クリティカル  レビューズ  イン  バイオケミストリーアンド  モレキュラー  バイオロジー（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９８年，第３３巻，ｐ．３３７−
【非特許文献１５】
「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２００１年，第２７６巻，ｐ．２０３５７−２０３６３
【非特許文献１６】
「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９５年，第３４巻，ｐ．１４５３５−
【非特許文献１７】
鈴木俊顕，志村秀樹，服部信孝，「ユビキチンと神経変性疾患」，「実験医学」，２０００年，第１８巻，ｐ．１４７８−１４８２
【非特許文献１８】
鈴木俊顕，「脱ユビキチン化酵素の多彩な作用」，「実験医学」，２００１年，第１９巻，ｐ．１９３−
【非特許文献１９】
阿南正，中尾光善，「ユビキチン病の分子機構」，「蛋白質・核酸・酵素」，１９９９年，第４４巻，ｐ．７７６−
【非特許文献２０】
「バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）」，１９９２年，第１４巻，ｐ．９−
【非特許文献２１】
「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミーオブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９９年，第９６巻，ｐ．２８２８−
【非特許文献２２】
「カレント  オピニオン  イン  クリニカル  ニュートリション  アンド  メタボリック  ケア（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ＩｎＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｅ）」，２００１年，第４巻，ｐ．１８３−１９０
【非特許文献２３】
「かずさＤＮＡ研究所ＤＮＡ配列解析分析情報データベース，ヒュージ（ＨＵＧＥ）」，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ＞
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
生体内には多くのＵＳＰが存在しており、それぞれ異なる基質特異性や生理機能を有していると考えられる。従って、ＵＳＰの異常に起因する疾患、例えば発癌や神経変性疾患等の解明、並びにそれらの防止、治療および診断を可能とする上では、数多くの新たなＵＳＰを発見し利用することが必要である。
【０００９】
本発明が解決しようとする課題の一つは、新規なＵＳＰを見いだし、生体内における該ＵＳＰの制御を可能にすることである。より具体的には、新規な特性をもつＵＳＰを提供することであり、それに伴い有用性がある新規ＵＳＰ由来のポリペプチドまたはペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド、および該ポリペプチドまたは該ペプチドに対する抗体を提供することである。さらに、新規ＵＳＰの発現および／またはその生理活性の阻害剤、拮抗剤または促進剤等の同定を行うことであり、同定された化合物を提供することである。また、上記ポリペプチドまたは上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記抗体、および上記化合物を利用した医薬組成物、並びに上記ポリペプチドまたは上記ペプチドまたは上記ポリヌクレオチドの測定方法を提供することである。さらにまた、上記ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学手法による新規ＵＳＰ由来のポリペプチドまたはペプチドの製造法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、新規特性を有するＵＳＰ遺伝子およびその蛋白質を得ることに成功した。より具体的には、かずさＤＮＡ研究所ヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、新規プロテアーゼ候補遺伝子としてｃＤＮＡクローンを抽出し、大腸菌を用いた遺伝子発現系で発現させて該遺伝子がコードする蛋白質を得た。さらに、得られた蛋白質が脱ユビキチン化活性を示すこと、またＮ末端側第１番目から第５２１番目の連続する５２１個のアミノ酸残基を欠失した当該蛋白質は脱ユビキチン化活性を示さないことを確認し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）下記の群より選ばれるポリペプチド；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド、
および
▲４▼前記▲１▼から▲３▼のいずれか１のポリペプチドにおいてアミノ酸配列中１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド、
（２）下記の群より選ばれるポリペプチドであって、脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
▲４▼前記▲１▼から▲３▼のいずれか１のポリペプチドにおいてアミノ酸配列中１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有するポリペプチド、
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも約５個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド、
（４）下記の群より選ばれるポリペプチド；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ前記（１）または前記（２）のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチド、
および
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）のポリペプチドにおいて、アミノ酸配列中１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有し、かつ前記（１）または前記（２）のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチド、
（５）下記の群より選ばれるポリペプチドであって、前記（１）または前記（２）のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチド；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
および
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）のポリペプチドにおいて、アミノ酸配列中１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入といった変異を有するポリペプチド、
（６）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５個の連続するアミノ酸配列を有し、かつ前記（１）または前記（２）のポリペプチドの脱ユビキチン化活性を阻害するペプチド、
（７）前記（１）若しくは前記（２）のポリペプチド、または前記（３）のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（８）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（９）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、（１０）前記（７）から前記（９）のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
（１１）前記（４）若しくは前記（５）のポリペプチド、または前記（６）のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（１２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（１３）前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１４）組換えベクターが発現組換えベクターである前記（１３）の組換えベクター、
（１５）前記（１３）または前記（１４）の組換えベクターを導入されてなる形質転換体、
（１６）前記（１）、前記（２）、前記（４）若しくは前記（５）のポリペプチド、または前記（３）若しくは前記（６）のペプチドの製造方法であって、前記（１４）の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または前記（１３）若しくは前記（１４）の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む方法、
（１７）前記（１）、前記（２）、前記（４）若しくは前記（５）のポリペプチド、または前記（３）若しくは前記（６）のペプチドを免疫学的に認識する抗体、
（１８）脱ユビキチン化活性を阻害する前記（１７）の抗体、
（１９）前記（１）若しくは前記（２）のポリペプチドと相互作用してその生理活性を阻害する若しくは増強する化合物、および／または前記（７）若しくは前記（８）のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害する若しくは促進する化合物の同定方法であって、前記（１）、前記（２）、前記（４）若しくは前記（５）のポリペプチド、前記（３）若しくは前記（６）のペプチド、前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１３）若しくは前記（１４）の組換えベクター、前記（１５）の形質転換体、および前記（１７）若しくは前記（１８）の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする方法、
（２０）前記（１）若しくは前記（２）のポリペプチドと相互作用してその生理活性を阻害する若しくは増強する化合物、および／または前記（７）若しくは前記（８）のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害する若しくは促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリペプチドの生理活性または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する方法、
（２１）前記（１９）または前記（２０）の方法で同定された化合物、
（２２）前記（１）若しくは前記（２）のポリペプチドと相互作用して脱ユビキチン化活性を阻害する若しくは増強する化合物、または前記（７）若しくは前記（８）のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害する若しくは促進する化合物、
（２３）前記（４）若しくは前記（５）のポリペプチドおよび／または前記（６）のペプチドからなる、前記（１）若しくは前記（２）のポリペプチドの拮抗剤、
（２４）前記（１）、前記（２）、前記（４）または前記（５）のポリペプチド、前記（３）または前記（６）のペプチド、前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１３）または前記（１４）の組換えベクター、前記（１５）の形質転換体、前記（１７）または前記（１８）の抗体、前記（２１）または前記（２２）の化合物、および前記（２３）の拮抗剤のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする医薬組成物、
（２５）前記（１）、前記（２）、前記（４）または前記（５）のポリペプチド、前記（３）または前記（６）のペプチド、前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１３）または前記（１４）の組換えベクター、前記（１５）の形質転換体、前記（１７）または前記（１８）の抗体、前記（２１）または前記（２２）の化合物、および前記（２３）の拮抗剤のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする神経変性疾患の防止剤および／または治療剤、
（２６）前記神経変性疾患がアルツハイマー病および／またはパーキンソン病である前記（２５）の神経変性疾患の防止剤および／または治療剤、
（２７）前記（１）、前記（２）、前記（４）または前記（５）のポリペプチド、前記（３）または前記（６）のペプチド、前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１３）または前記（１４）の組換えベクター、前記（１５）の形質転換体、前記（１７）または前記（１８）の抗体、前記（２１）または前記（２２）の化合物、および前記（２３）の拮抗剤のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする筋萎縮症の防止剤および／または治療剤、
（２８）前記（１）、前記（２）、前記（４）または前記（５）のポリペプチド、または前記（７）、前記（８）、前記（１１）若しくは前記（１２）のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法、
（２９）前記（１）、前記（２）、前記（４）または前記（５）のポリペプチド、前記（３）または前記（６）のペプチド、前記（７）から前記（１２）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１３）または前記（１４）の組換えベクター、前記（１５）の形質転換体、前記（１７）または前記（１８）の抗体、および前記（２３）の拮抗剤のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット、からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（新規ＵＳＰ）
本発明において提供するヒトＵＳＰは、ヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーから、プロテアーゼモチーフを有する遺伝子として選出したｃＤＮＡクローンｂｆ０４２７４がコードする蛋白質である。当該ＵＳＰは、上記遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを導入した大腸菌で発現させて得た。当該ＵＳＰは既知ＵＳＰとそのアミノ酸配列において、相同性の高いＣｙｓドメインおよびＨｉｓドメインを保有することを除いて、殆ど相同性を有さない新規ＵＳＰである。当該ＵＳＰ遺伝子は７７４４塩基からなり（配列表の配列番号２）、そのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）（ＯＲＦ）全長は４６７１塩基、該遺伝子の遺伝子産物は１５５６アミノ酸残基からなる（配列番号１）。以下、この遺伝子を新規ＵＳＰ遺伝子、該遺伝子の遺伝子産物を新規ＵＳＰと呼ぶ。新規ＵＳＰ遺伝子のＣ末端側５６１８塩基および新規ＵＳＰのＣ末端側９７７アミノ酸残基は、それぞれＫＩＡＡ１０５７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２８９８０）の遺伝子およびその遺伝子産物と共通である。
【００１３】
新規ＵＳＰ遺伝子は、遺伝子共発現系で人工基質と共に発現させたとき、該人工基質に作用して脱ユビキチン化活性を示した。一方、新規ＵＳＰのＮ末端から５２１アミノ酸残基欠失させたもの（ＫＩＡＡ１０５７−１）と人工基質とをインビトロまたは遺伝子共発現系において反応させたときには、脱ユビキチン化活性は観察されなかった。ＫＩＡＡ１０５７−１はＫＩＡＡ１０５７を含むものである。ＫＩＡＡ１０５７は、その塩基配列、コードするアミノ酸配列、およびＵＳＰの特徴であるＣｙｓドメインおよびＨｉｓドメインを有することが既に公開されていた（非特許文献２３）。しかし、ＫＩＡＡ１０５７として公開されているアミノ酸配列を含むＫＩＡＡ１０５７−１は脱ユビキチン化活性を示さなかった。すなわち、本発明において新規ＵＳＰを単離・同定することにより、初めて新規ＵＳＰが脱ユビキチン化活性を有することを確認でき、酵素活性を有する蛋白質を取得できた。さらに、新規ＵＳＰには基質選択性があり、人工基質を用いた検討において、アルギニンを介して蛋白質に結合したＵｂに選択的に作用することを明らかにした。既知ＵＳＰの中で、このようなＵｂに選択的に作用するものは知られていない。また、ＫＩＡＡ１０５７ｃＤＮＡが脳、骨格筋、および心臓等で、特に骨格筋で強く発現していることが公開されていることから、新規ＵＳＰ遺伝子も脳および骨格筋等で同様に発現していると考えられる。
【００１４】
（ポリペプチドまたはペプチド）
本発明に係るポリペプチドは、新規ＵＳＰ遺伝子の遺伝子産物であり、該遺伝子を大腸菌等の細胞で発現させて得られたポリペプチドである。ここで、ポリペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち、蛋白質等の長鎖ペプチドを意味し、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを単にペプチドという。本明細書においてはアミノ酸を３文字表記または１文字表記することもある。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドの１態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。別の１態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するポリペプチドである。
【００１６】
また別の１態様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、アミノ酸配列上で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するポリペプチドである。より好ましくは、配列表の配列番号１に記載のポリペプチドと同等の活性、例えば脱ユビキチン化活性を有するポリペプチドである。脱ユビキチン化活性は、例えば後述する実施例に示したように、ヒトユビキチンのＣ末端にグルタチオン＿Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をアルギニン、イソロイシン、メチオニン、またはプロリンを介して結合させたものを基質として用い、該基質からユビキチンを解離させ得るか否かを、ユビキチン解離後のＧＳＴを抗ＧＳＴ抗体によるイムノブロッティング法等の公知の方法で検出することにより測定できる。さらに好ましくは、アルギニンを介してＵｂが結合した基質に選択的に作用して脱ユビキチン化活性を示すポリペプチドである。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が利用できる。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
【００１７】
さらに、このように特定されたポリペプチドを基にして、脱ユビキチン化活性を指標にすることにより、１個以上、例えば１個乃至１００個、好ましくは１個乃至３０個、より好ましくは１個乃至２０個、さらに好ましくは１個乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供される。変異を有するペプチドまたはポリペプチドは天然に存在するものであってよく、あるいは変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加、挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えばサムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」，第２版，コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス，１９８９年、村松正實編，「ラボマニュアル遺伝子工学」，丸善株式会社，１９８８年、  エールリッヒ編，「ピーシーアール（ＰＣＲ）テクノロジー」，「ＤＮＡ増幅の原理と応用」，ストックトンプレス，１９８９年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−）を利用することができる。
【００１８】
上記のような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、生理活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これらのペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００１９】
このように、新規ＵＳＰが有する生理活性と同等の活性、例えば同等の脱ユビキチン化活性を有するポリペプチドが、本発明において提供できる。それら以外にも、活性の強度または基質特異性を変更したポリペプチドが提供できる。
【００２０】
さらに、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドも本発明の範囲に包含される。当該部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、その最小単位として５個以上のアミノ酸、好ましくは８個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸からなるものである。例えば、新規ＵＳＰが有する生理活性の最小活性単位（領域またはドメイン）からなるポリペプチドまたはペプチドも本発明において提供される。上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を有する上記ポリペプチドの活性を調節する物質として、あるいは当該生理活性を調節する物質の同定等に使用する試薬として有用である。
【００２１】
具体的には例えば、上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を有する上記ポリペプチドの拮抗物質として使用できる。例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端第１番目のアミノ酸残基から第５２１番目のアミノ酸残基までの５２１個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（配列表の配列番号３）は、この部位を欠失させると配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの脱ユビキチン化活性が消失すること、またユビキチン特異プロテアーゼ（ＵＢＰ）のＮ末端側配列が基質認識に関与するという報告（非特許文献１５）があることから、新規ＵＳＰの基質認識に関与していると考えられる。基質認識部位を有しているが酵素活性部位を持たないこのようなポリペプチドは、それが由来した酵素の拮抗剤として用いることができる。従って、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの拮抗剤として、それらの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性の阻害に使用できる。
【００２２】
新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチドは、配列表の配列番号３に記載のポリペプチドに限定されず、これらポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害できるポリペプチドであればよく、例えば、配列表の配列番号３に記載のポリペプチドとアミノ酸配列上で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害できるポリペプチドが挙げられる。さらに、例えば配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを基にして、脱ユビキチン化活性の阻害能を指標にすることにより、１個以上、例えば１個乃至１００個、好ましくは１個乃至３０個、より好ましくは１個乃至２０個、さらに好ましくは１個乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供できる。欠失、置換、付加、あるいは挿入は上記同様の手段が使用できる。
【００２３】
またさらに、新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチドの部分ペプチドであって、当該生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するポリペプチドまたはペプチドは、脱ユビキチン化活性を測定する実験系において、脱ユビキチン化活性の阻害を検討することにより得られる。該実験系としては、例えば後述する実施例に示したように、ヒトユビキチンのＣ末端にグルタチオン＿Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をアルギニン、イソロイシン、メチオニン、またはプロリンを介して結合させたものを基質として用い、該基質からユビキチンを解離させ得るか否かを、ユビキチン解離後のＧＳＴを抗ＧＳＴ抗体によるイムノブロッティング法等の公知の方法で検出する実験系を使用できる。
【００２５】
また、上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドのうち免疫学的に認識され得るペプチドは、例えばエピトープペプチドであれば、後述するように新規ＵＳＰに特異的な抗体を作製するための抗原として単独でまたはキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できる。
【００２６】
本発明の範囲には、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドに、別種の蛋白質または物質、例えばキャリア等を結合したものも包含される。例えば、本発明に係るポリペプチド等の検出または精製を容易にするために、あるいは別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別種の蛋白質またはペプチド、例えばグルタチオン＿Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、またはＦｌａｇ−ｔａｇ等が、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加されたものであってもよい。
【００２７】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖を提供する。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。好ましくは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。さらに本発明に係る配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその相補鎖、好ましくは配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、好ましくは配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」，第２版，コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス，１９８９年等に従うことができる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイゼーションするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。
【００２９】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基配列領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上の配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドまたはそれらの相補鎖を包含する。
【００３０】
これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬または標準品としても利用できる。例えば、新規ＵＳＰをコードする核酸、例えばその遺伝子またはｍＲＮＡの検出のためのプローブまたはプライマーとして、あるいは遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として利用できる。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。ここで、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの選別は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、その生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を指標にして行うことができる。公知の蛋白質発現系としては、例えば、胚芽または家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用した無細胞蛋白質発現系（「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５７年，第１７９巻，ｐ．１６０−１６１）を例示できる。
【００３１】
（組換えベクター）
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターが得られる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
【００３２】
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製される。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００３３】
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。宿主としては、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、または動物細胞等が例示できる。遺伝子の導入を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、サムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」，第２版，コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス，１９８９年等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染等が挙げられる。
【００３４】
また、形質転換体に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの作用、例えば少なくとも脱ユビキチン化活性等、あるいは宿主中で産生されたまたは宿主外に産生された該ポリペプチドまたは該ペプチドの量を指標にして行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
【００３５】
（ポリペプチドまたはペプチドの製造）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、上記ベクターまたは形質転換体を利用して上記のように遺伝子工学的技術で製造可能である。また、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、「ペプチド合成」，丸善株式会社，１９７５年や「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９９６年に記載の方法が例示できるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
【００３６】
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの精製および回収は、その生理活性、例えば少なくとも脱ユビキチン化活性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組み合わせるか、溶解度差に基づく硫安、アルコール等の分画手段によって精製回収できる。好ましくは、回収しようとするポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。
【００３７】
（抗体）
抗体は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチド、あるいはそれらの断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。新規ＵＳＰに特異的な抗体を作製するためには、ＵＳＰファミリー間の保存領域以外の新規ＵＳＰに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。抗原として用いるポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、必ずしもポリペプチドまたはペプチド、例えば配列表の配列番号１若しくは配列番号３に記載のアミノ酸配列または該配列中の連続するアミノ酸配列からなる部分配列と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に新規ＵＳＰまたはその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを、結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
【００３８】
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを、アジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等が例示される。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
【００３９】
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法により得られる。
【００４０】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作製してこれをクローン化し、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００４１】
かくして得られた上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドの、精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。例えば、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のうち、直接本発明に係る新規ＵＳＰに結合してその脱ユビキチン化活性を阻害する抗体は、ＵＳＰの異常に起因する各種疾患の解明、防止および／または治療に有用である。
【００４２】
（スクリーニング）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を組み込んだベクター、該ベクターを導入してなる形質転換体、これらを用いる蛋白質発現系、並びに該ポリペプチドまたは該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組み合わせることによって、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの活性阻害剤または活性増強剤の同定に有効な方法を提供する。また、これらは、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現阻害剤または発現促進剤の同定に有効な方法を提供する。該方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。本発明の同定方法によれば、例えば、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が可能である。
【００４３】
例えば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを用いて、被検化合物とこれらポリペプチドまたはペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でこれらポリペプチドまたはペプチドと該化合物とを接触させて、その相互作用により生じるシグナルの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を増強する化合物または阻害する化合物を同定可能である。
【００４４】
また、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと被検化合物との間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で該ポリヌクレオチドと該化合物とを接触させて、その相互作用により生じるシグナルの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該ポリヌクレオチドに結合する化合物を同定可能である
【００４５】
さらにまた、本発明に係る形質転換体を用いて、被検化合物または上記同定された化合物とを適当な条件下で接触させ、本発明に係る新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現の有無または変化を検出することにより、これらポリペプチドの発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。これらポリペプチドの発現の有無または変化の検出は、簡便には、発現されるポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を指標にして実施できる。脱ユビキチン化活性の測定は、例えば人工基質Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴの分解により生じるＧＳＴの測定により可能である。このような同定方法においては、これらポリペプチドの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害する化合物または増強する化合物も同定できる。あるいは、新規ＵＳＰの発現の有無または変化を検出するために、検出のためのシグナルまたはマーカーを使用する自体公知の系を導入し、このシグナルまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出してもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼやグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等、または検出用のタグ、例えば６×Ｈｉｓタグ等、公知のものが利用できる。これらのシグナルまたはマーカーを組み込んだベクターを作製し、該ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製すればよい。これらのシグナルまたはマーカーの検出方法は、当業者には周知のものである。
【００４６】
具体的には、例えば、後述する実施例に準じて、新規ＵＳＰと基質とを例えば大腸菌で共遺伝子発現させて該ＵＳＰの脱ユビキチン化活性を測定する実験系において、ここに被検化合物を加えることにより、該ＵＳＰの発現または生理活性を阻害する、促進する、または増強する化合物を同定できる。この実験系は、同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る化合物の同定方法はこれに限定されない。
【００４７】
（化合物）
上記方法により同定された化合物は、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの活性、例えば脱ユビキチン化活性の阻害剤、拮抗剤、または増強剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現に関する阻害剤または促進剤の候補化合物としても利用可能である。これらの候補化合物は、新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現や生理活性、例えば脱ユビキチン化活性の増加、減少または欠失等に起因する各種病的症状の防止効果および／または治療効果を期待できる。後述するように、ＵＳＰと神経変性疾患や筋萎縮症との関連が報告されていることから（非特許文献２２）、これらの疾患の防止剤および／または治療剤として使用できる。
【００４８】
（医薬組成物）
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより、医薬組成物として調製可能である。また本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、並びに新規ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現や生理活性、例えば脱ユビキチン化活性の増加、減少または欠失等に起因する各種病的症状の防止および／または治療に使用できる。すなわち本発明は、これらを単独または複数組み合わせて使用することにより、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供する。なお、製剤化に当たっては、自体公知のポリペプチド、ペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００４９】
本発明に係る新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現および／またはその生理活性の減少や欠失等に起因する異常な症状の治療には、１つの方法として当該ＵＳＰ自体または当該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性を増強する化合物（増強剤）および／または当該ＵＳＰをコードする遺伝子の発現を促進する治療上有効量の化合物（促進剤）を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの活性を生成なさしめてもよい。上記ポリヌクレオチドを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用できるが、例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作製して遺伝子治療に利用すればよい。また、例えば、蛋白質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
【００５０】
本発明に係る新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現および／またはその生理活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与して新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの生理活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。例えば新規ＵＳＰの部分ポリペプチドまたはペプチドであって新規ＵＳＰの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するものを、新規ＵＳＰの拮抗剤として使用できる。具体的には、例えば配列表の配列番号３に記載のポリペプチドを医薬上許容される担体とともに対象に投与することにより、新規ＵＳＰの生理活性を阻害できる。あるいは、新規ＵＳＰの部分ポリペプチドまたはペプチドであって新規ＵＳＰの生理活性、例えば脱ユビキチン化活性を阻害するもの、例えば配列番号３に記載のポリペプチドを、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子治療により、上記のように対象中の細胞内で生成なさしめてもよい。これにより新規ＵＳＰまたは新規ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドの発現および／またはその生理活性の過剰に起因する疾患を防止および／または治療できる。該拮抗剤は、上記医薬組成物の一成分として使用することもできる。
【００５１】
さらに、発現ブロック法を用いて内在性の新規ＵＳＰまたは該ＵＳＰと同等の生理活性を有する上記ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された当該遺伝子のアンチセンス配列を使用して当該遺伝子の発現を阻害できる。これらのオリゴヌクレオチドは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成できる。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
【００５２】
投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩、フシジン酸、または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲル等の形態を利用できる。
【００５３】
必要な用量範囲は、新規ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、新規ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合物、上記拮抗剤、および上記医薬組成物の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。
【００５４】
製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗体、化合物等各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体等の製剤化方法が利用できる。
【００５５】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
【００５６】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ＰＥＧ等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００５７】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００５８】
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００５９】
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
【００６０】
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００６１】
ＵＳＰの発現や生理活性の増加、減少、または欠失等の機能障害は、ＵＳＰが係るユビキチンシステムの異常をきたし、ひいては病的症状を引き起こす。例えば、ＵＳＰの異常と発癌や神経変性疾患との関連が示唆されている（非特許文献１７〜１９）。ＵＳＰは染色体構造の維持にも関与しており、ユビキチン化されたヒストンの脱ユビキチン化が染色体凝集に重要であることが知られている （非特許文献２０）し、ＵＳＰファミリーの１つであるＵＳＰ１６がＨ２Ａを脱ユビキチン化することが報告されている（非特許文献２１）。また、アルツハイマー病やパーキンソン病で観察される蛋白質凝集体の多くが抗ユビキチン抗体に反応することからも（非特許文献１７）、神経変性疾患とＵＳＰの機能異常の関係が示唆される。また、ユビキチン経路が筋萎縮症と関連していることについても報告されている（非特許文献２２）。上記本発明に係るＵＳＰは、脳および骨格筋、殊に骨格筋での発現が比較的高く、当該ＵＳＰが神経変性疾患や筋萎縮症と関連している可能性が高い。従って、本発明は、ＵＳＰの関与する生体機能の解明、例えば発癌プロセスの解明、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解明、および筋萎縮症の解明、並びにそれらの防止剤および／または治療剤の開発、およびそれらの診断手段として用いる測定法の開発を可能とするものであり、非常に有用である。
【００６２】
（診断のための測定方法および試薬）
本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドおよびその相補鎖、並びに当該ＵＳＰおよびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、診断マーカーや試薬等として、本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物であるポリペプチド、またはこれらをコードするポリヌクレオチドを定量的にまたは定性的に測定する方法に使用できる。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。当該試薬キットは、上記同定方法および上記測定方法に使用できる。製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチドまたはペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。上記測定方法によれば、新規ＵＳＰの発現や活性の増加、減少または欠失等が関連する各種病的症状診断が可能になる。
【００６３】
本発明に係る新規ＵＳＰおよびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または生理活性の異常に起因する疾患の診断手段は、例えば当該ＵＳＰをコードしている核酸との相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在量を決定すること、および／または当該ＵＳＰについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ＵＳＰの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。詳しくは、新規ＵＳＰを診断マーカーとして検定するのである。試料中の当該ＵＳＰの検出またはその存在量の決定に用いることができる測定法は当業者に周知である。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。また、本発明に係る新規ＵＳＰをコードするポリヌクレオチドの検出法および定量法としては、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティング、およびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルで測定することができる。
【００６４】
測定される試料として、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを標識した上記ＵＳＰをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。
【００６５】
上記測定により本発明に係るＵＳＰおよび該ＵＳＰをコードするＤＮＡの変異、減少、または増加を検出することにより、当該ＵＳＰの異常に起因する疾患、例えば、癌あるいは神経変性疾患等、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の診断が可能になる。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
（新規ＵＳＰ遺伝子の単離・同定）
本発明に係るＵＳＰ遺伝子は、かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、バイオインフォーマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、新規プロテアーゼ候補遺伝子として抽出した。本遺伝子の３´末端領域の塩基配列はｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ１０５７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２８９８０）と共通の配列であった。ｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ１０５７は、９７７個のアミノ酸をコードする領域を含む５６１８ｂｐを含有するクローンであり、ＵＳＰに特徴的なモチーフであるＣｙｓドメイン（Ｃｙｓ−ｂｏｘ）（Ｇ−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（１，３）−［ＡＧＣ］−［ＮＡＳＭ］−ｘ−Ｃ−［ＦＹＷ］−［ＬＩＶＭＦＣ］−［ＮＳＴ］−［ＳＡＣＶ］−ｘ−［ＬＩＶＭＳ］−Ｑ）とＨｉｓドメイン（Ｈｉｓ−ｂｏｘ）（Ｙ−ｘ−Ｌ−ｘ−［ＳＡＧ］−［ＬＩＶＭＦＴ］−ｘ（２）−Ｈ−ｘ−Ｇ−ｘ（４，５）−Ｇ−Ｈ−Ｙ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）ドメインを有する。本発明に係る遺伝子は、Ｃｙｓドメイン内において既知の当該ドメイン配列と一致していないアミノ酸残基が１つ存在する。
【００６７】
ｃＤＮＡクローンＫＩＡＡ１０５７はそのＯＲＦ内の５′末端領域が欠失してクローニングされていると推定されたため、ＫＩＡＡ１０５７の塩基配列を基に、さらに上記データベースを検索した。その結果、ＫＩＡＡ１０５７の塩基配列を含むｃＤＮＡクローンｂｆ０４２７４を見い出した。
【００６８】
ｂｆ０４２７４は７７４４ｂｐからなるｃＤＮＡである。その塩基配列の第３８９位〜第３９１位に存在する最初のＡＴＧは、その直前にコザックのコンセンサス配列を持つことから、翻訳開始コドンと予測された。すなわち、ｂｆ０４２７４は、１５５６個のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする翻訳領域（ＣＤＳ）をその塩基配列の第３８９位〜第５０５９位に含む。ｂｆ０４２７４の塩基配列を配列表の配列番号２に、ｂｆ０４２７４がコードするアミノ酸配列を配列番号１に記載した。ＫＩＡＡ１０５７はｂｆ０４２７４の塩基配列のうち第２１２４位から第７７４１位までの塩基配列に相当し、ＫＩＡＡ１０５７の推定アミノ酸配列は、ｂｆ０４２７４がコードするアミノ酸配列の第５８０番目から第１５５６番目のアミノ酸配列に相当する。Ｃｙｓ−ｂｏｘおよびＨｉｓ−ｂｏｘは、ｂｆ０４２７４がコードするアミノ酸配列の第６２６番目〜第６４１番目および第８９０番目〜第９０７番目のアミノ酸配列に存在する。
【００６９】
【実施例２】
（新規ＵＳＰの発現）
実施例１で単離・同定した新規ＵＳＰをコードするｃＤＮＡクローンｂｆ０４２７４発現プラスミドをゲイトウェイＴＭ＿クローニング＿テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて作製した。まず、ｂｆ０４２７４クローン（ｐＢＣ  ＳＫ＋のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位に挿入）を鋳型として、アドバンテージ−ＨＦ２＿ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）あるいはＥｘｐａｎｄ＿ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ＿ＰＣＲ＿ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて推定ＣＤＳ領域（配列番号２に記載の塩基配列の第３８９位〜第５０５９位）を２段階ＰＣＲで増幅した後、ＢＰクロナーゼエンザイム（ＢＰ  ｃｌｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）を用いた組換え反応によりエントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１）に挿入し、ｐＤＯＮＲ−ｂｆ０４２７４を作製した。なお、プライマーは、１段階目のＰＣＲ用にｂｆ０４２７４−ＡｔｔＢ（配列番号５）とＰｒＤＯＮＲ１０５７（−）（配列番号６）とを、２段階目のＰＣＲ用にＡｔｔＢ１  アダプター  プライマー（配列番号７）と上記Ｐｒ−ＤＯＮＲ１０５７（−）とを使用した。次に、ｐＤＯＮＲ−ｂｆ０４２７４とＮ−末端Ｈｉｓ−タグ付加蛋白質（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現用ベクターであるｐＤＥＳＴ１７とを用いて、ＬＲクロナーゼエンザイムによる組換え反応によりＨｉｓ−タグ付加ｂｆ０４２７４発現プラスミド（ｐＨｉｓ−０４２７４）を作製した。発現プラスミドは、ＮａＣｌにより発現誘導が可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＳＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に導入した。ＣＤＳの塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンスを行なって確認した。シーケンス反応はビッグダイ＿ターミネーター＿サイクル＿シーケンシング＿ＦＳ＿レディ＿リアクション＿キット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０を用いて実施した。
【００７０】
上記作製した発現プラスミドを用いて大腸菌でｂｆ０４２７４の発現誘導を行った。ＬＢＯＮ／Ａｍｐ培地（５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含み、ＮａＣｌを含まないＬＢ培地）に１／１０量の大腸菌前培養液を接種し、３７℃にてＯＤ６００が約１．０前後になるまで培養後、ＮａＣｌを終濃度０．３Ｍになるように添加した。さらに約４〜５時間培養後、菌体を回収した。菌体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後に超音波処理し、遠心処理により上清を回収して抽出液とした。該抽出液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、抗Ｈｉｓ−タグ抗体（Ｐｅｎｔａ−ＨｉｓＴＭ抗体、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてイムノブロッティングを行った。その結果、推定アミノ酸配列から予測される分子量と同じ分子量の蛋白質（１８６．８ｋＤａ）を検出した。発現蛋白質はその多くが不溶性画分に認められ、可溶性画分への分布は少量であった。なお、検出にはＥＣＬウエスタンブロッティング検出キット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
【００７１】
【実施例３】
（ｂｆ０４２７４の脱ユビキチン化活性）
ｂｆ０４２７４がコードする蛋白質について、基質との共発現系で、その脱ユビキチン化活性を検討した。この実験系は、酵素発現用プラスミドが有するｐＢＲ３２２系のｏｒｉとコンパティビリティを示すｐ１５Ａのｏｒｉを有する基質発現用プラスミドを使用することにより、酵素と基質を同一菌体内で共発現させるものである（「アーチーブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」，２０００年，第３７９巻，ｐ．１９８−）。
【００７２】
まず、共発現用の各種基質発現プラスミドを構築した。基質は、ヒトユビキチンのＣ末端にグルタチオン＿Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を結合させた人工基質Ｕｂ−ＧＳＴを用いた。ｐＴＶ１１８Ｎ／Ｕｂ−ＧＳＴを鋳型としてＵｂ−ＧＳＴコード領域をＰＣＲにより増幅させた後、ゲートウェイＴＭ＿クローニング＿テクノロジーを用いて大腸菌発現用ベクター、ｐＤＥＳＴ１４に挿入し、ｐＤＥＳＴ１４Ｕｂ−ＧＳＴを作製した。次に、ｐＤＥＳＴ１４Ｕｂ−ＧＳＴからＴ７プロモーターおよびＵｂ−ＧＳＴコード領域を含む領域をＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ処理により切り出し、ｐ１５Ａ由来のｏｒｉを持つｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン社）のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間に組み込み、ｐＡＣＵｂ−Ｍ−ＧＳＴを作製した。これを共発現用Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ発現プラスミドとした。次に、ｐＡＣＵｂ−Ｍ−ＧＳＴをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、Ｔ７プロモーターおよびＵｂ−ＧＳＴコード領域を含む領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間に組み込み、ｐＢＳＵｂＧＳＴを作製した。さらに、ｐＢＳＵｂＧＳＴを鋳型として、クイックチェンジ  サイト−ディレクティド＿ミュータジェネシス＿キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＧＳＴのＮ末端のアミノ酸に対応するコドンをＡＴＧ（メチオニン：Ｍ）から、ＣＣＧ（プロリン：Ｐ）、ＡＴＣ（イソロイシン：Ｉ）、またはＣＧＴ（アルギニン：Ｒ）に変換したｐＢＳＵｂ−Ｐ−ＧＳＴ、ｐＢＳＵｂ−Ｉ−ＧＳＴ、またはｐＢＳＵｂ−Ｒ−ＧＳＴを作製した。コドンの変換は、シーケンシングにより確認した。以下、Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｐ−ＧＳＴ、およびＵｂ−Ｉ−ＧＳＴを総称するときは、Ｕｂ−Ｘ−ＧＳＴという。次に、各ｐＢＳＵｂ−Ｘ−ＧＳＴをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで処理し、Ｔ７プロモーターおよびＵｂ−Ｘ−ＧＳＴコード領域を含む領域をｐＡＣＹＣ１８４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ間に組み込み、各共発現用Ｕｂ−Ｘ−ＧＳＴ発現プラスミド、ｐＡＣＵｂ−Ｘ−ＧＳＴを作製した。作製した４種類のｐＡＣＵｂ−Ｘ−ＧＳＴはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＳＩに導入し、塩化カルシウム法によりコンピテントセル化した。
【００７３】
各ｐＡＣＵｂ−Ｘ−ＧＳＴをそれぞれ保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＳＩコンピテントセルに、実施例２で作製したプラスミドｐＨｉｓ−０４２７４を遺伝子導入した。このとき、一部のコンピテントセルには、ｐＨｉｓ−０４２７４の代わりに、陽性コントロールとして既知ユビキチン特異プロテアーゼ１５（以下、ＵＳＰ１５と略称する）ｃＤＮＡ（ＫＩＡＡ０５２９クローン）を鋳型として実施例２に記載の方法で作製したＨｉｓ−タグ付加ＵＳＰ１５発現プラスミド（ｐＨｉｓ−ＵＳＰ１５）、または陰性コントロールとしてＨｉｓ−タグ付加ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現プラスミド（ｐＨｉｓ−Ｌｕｃ）をそれぞれ遺伝子導入した。該遺伝子導入されたコンピテントセルを、５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢＯＮ（ＮａＣｌを含まないＬＢ培地）プレート上にて培養し、各種共発現株を選択して得た。なお、ｐＨｉｓ−ＵＳＰ１５の作製において、ＫＩＡＡ０５２９はＵＳＰ１５のＮ末端３アミノ酸残基（ＭＡＥ）が欠失していたため、ベイカーらの方法に従い（「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，１９９９年，第５９巻，ｐ．２６４−）、この３アミノ酸残基に対応するコドンをプライマー内に設計し、完全なＣＤＳとした。また、ｐＨｉｓ−Ｌｕｃは、ｐＧＬ３−Ｌｕｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を鋳型として、実施例２と同様にゲートウェイＴＭ＿クローニング＿テクノロジーを用いて作製した。
【００７４】
上記各種共発現株を５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢＯＮ培地中でＯＤ６００が約０．５〜１．２になるまで３７℃にて培養後、ＮａＣｌを終濃度０．３Ｍになるように添加した。さらに約４または５時間培養後、菌体を回収した。該菌体を培養液の１／１０量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６／５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に懸濁後、超音波処理により破壊し、遠心処理により上清を回収して大腸菌抽出液を調製した。該抽出液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体として抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）、２次抗体としてホースラディシュ＿パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヤギ抗体（Ａｌｐｈａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いてイムノブロッティングを行い、Ｕｂ−Ｘ−ＧＳＴおよび遊離したＧＳＴを検出した。なお、検出はＥＣＬウエスタンブロッティング検出キットを使用した。
【００７５】
その結果、図１に示すように、プラスミドｐＨｉｓ−０４２７４とＵｂ−Ｒ−ＧＳＴとを共発現させた大腸菌から調製した抽出液では、Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴ以外に、Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴからＵｂが加水分解されて生じたＧＳＴが検出された。しかし、Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｐ−ＧＳＴ、またはＵｂ−Ｉ−ＧＳＴとの共発現系では、ＧＳＴが検出されなかった。一方、陽性コントロールであるＵＳＰ１５を、ｂｆ０４２７４の代わりに基質と共発現させたときには上記４種類の基質のいずれに対しても脱ユビキチン化活性が認められたが、陰性コントロールであるルシフェラーゼでは認められなかった。
【００７６】
このようにプラスミドｐＨｉｓ−０４２７４により発現された蛋白質は、Ｕｂがアルギニン（Ｒ）残基を介して蛋白質に結合している人工基質に対して基質選択性を示した。既知ＵＳＰについて同様に基質選択性を検討したが、Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴに対する基質選択性を示すものは、本発明に係る新規ＵＳＰのみであった。Ｕｂ−ＧＳＴは、Ｕｂが蛋白質（ＧＳＴ）とペプチド結合していることから、前駆体Ｕｂモデルと考えられる。ｂｆ−０４２７４がコードする蛋白質は、Ｕｂ−ＧＳＴを基質としてＵｂを解離するため、生体内において前駆体ＵｂからのＵｂ生成に関与している可能性がある。
【００７７】
【実施例４】
（ｂｆ−０４２７４がコードする蛋白質の酵素活性部位の特定）
ＵＳＰはシステインプロテアーゼの１つであり、Ｃｙｓ−ｂｏｘ内に存在するシステイン残基が活性部位であると考えられている。そこで、ｂｆ０４２７４がコードする蛋白質の推定活性残基である第６３４番目のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体（ｂｆ０４２７４Ｃ６３４Ｓ）を作製した。まず、第６３４番目のシステインをクイックチェンジ＿サイト−ディレクティド＿ミュータジェネシス＿キットを用いてセリンに置換した。使用したプライマーは、第６３４番目のシステインのコドンであるＴＧＴがセリンのコドンであるＴＣＴに置換するように設計した（配列番号８）。変異の導入をシーケンシングにて確認し、Ｈｉｓ−タグ付加ｂｆ０４２７４Ｃ６３４Ｓ発現プラスミド、ｐＨｉｓ−０４２７４Ｍｕｔを得た。シーケンス反応はＣｙ５＿サーモシーケナーゼ＿ダイ＿サーミネーター＿キット（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｄｙｅ  Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ）を用い、泳動および解析はロング＿リード＿タワー（Ｌｏｎｇ  Ｒｅａｄ  Ｔｏｗｅｒ）（いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて実施した。
【００７８】
ｐＨｉｓ−０４２７４Ｍｕｔ、実施例２または実施例３で作製したｐＨｉｓ−０４２７４、ｐＨｉｓ−ＵＳＰ１５、あるいはｐＨｉｓ−Ｌｕｃをそれぞれ、実施例３と同様にｐＡＣＵｂ−Ｒ−ＧＳＴと共に大腸菌で共発現させた。その結果、図２に示すように、ｂｆ０４２７４を発現させたときに認められたＵｂ−Ｒ−ＧＳＴに対する脱ユビキチン化活性が、ｂｆ０４２７４Ｃ６３４Ｓにおいては消失していることが判明した。すなわち、ｂｆ０４２７４がコードする蛋白質は、第６３４番目のシステイン残基を活性部位とするシステインプロテアーゼであることが確認された。
【００７９】
【実施例５】
（ＫＩＡＡ１０５７−１がコードする遺伝子産物の脱ユビキチン化活性の検討）ｂｆ０４２７４のＮ末端側を５２１アミノ酸残基（配列番号３）欠失させたポリペプチドをコードするＫＩＡＡ１０５７−１を含むプラスミドを実施例２と同様の方法で作製し、実施例３と同様の方法で基質と共に大腸菌で共発現させてその脱ユビキチン化活性を検討した。その結果、ＫＩＡＡ１０５７−１は、ＵＳＰファミリーの特徴であるＣｙｓ−ＢｏｘおよびＨｉｓ−Ｂｏｘを保有しているが、４種類の人工基質それぞれとの共発現系において、脱ユビキチン化活性を示さなかった（図３）。
以上の結果から、ｂｆ０４２７４がコードする蛋白質のＮ末端側には、文献（非特許文献１５）に記載されたＵＳＰと同様に、基質の認識に関与する部位が存在すると考えられる。
【００８０】
【発明の効果】
かずさＤＮＡ研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベースから、バイオインフォーマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、新規プロテアーゼ候補遺伝子としてｂｆ０４２７４を抽出し、本遺伝子の遺伝子産物がユビキチン化蛋白質を脱ユビキチン化するユビキチン特異プロテアーゼ（ＵＳＰ）の１つであることを見い出した。さらに、本発明に係るＵＳＰは、Ｎ末端から５２１アミノ酸残基を欠失させると脱ユビキチン化活性が消失することを見い出した。
本発明は、ＵＳＰの関与する生体機能の解明、例えば、発癌プロセスの解明、筋萎縮症、および神経変性疾患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解明、並びにそれらの防止、治療、および診断を可能にするものであり、非常に有用である。
【００８１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５：プライマーとして用いるために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：プライマーとして用いるために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：プライマーとして用いるために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマーとして用いるために設計されたオリゴヌクレオチド。
【００８２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｂｆ０４２７４の脱ユビキチン化活性が、ｂｆ０４２７４と人工基質（Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｉ−ＧＳＴ、またはＵｂ−Ｐ−ＧＳＴ）とを共に大腸菌で発現させた共発現系で認められたことを示す図である。図中、ＵＳＰ１５およびルシフェラーゼは、それぞれ脱ユビキチン化活性の陽性コントロールおよび陰性コントロールである。レーン左側の数値は分子量を示す。
【図２】  ｂｆ０４２７４の推定酵素活性部位である、Ｎ末端から第６３４番目のシステイン（Ｃ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換すると（ｂｆ０４２７４Ｃ６３４Ｓ）、その脱ユビキチン化活性が消失したことを示す図である。図中、ＵＳＰ１５およびルシフェラーゼは、それぞれ脱ユビキチン化活性の陽性コントロールおよび陰性コントロールである。レーン左側の数値は分子量を示す。
【図３】  ｂｆ０４２７４のＮ末端から５２１アミノ酸残基を欠失させたＫＩＡＡ１０５７−１の脱ユビキチン化活性が、ＫＩＡＡ１０５７−１と人工基質（Ｕｂ−Ｒ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｍ−ＧＳＴ、Ｕｂ−Ｉ−ＧＳＴ、またはＵｂ−Ｐ−ＧＳＴ）とを共に大腸菌で発現させた共発現系で認められたことを示す図である。図中、ＵＳＰ１５およびルシフェラーゼは、それぞれ脱ユビキチン化活性の陽性コントロールおよび陰性コントロールである。レーン左側の数値は分子量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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