(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エライジン酸（５’）−ゲムシタビンエステル。
【請求項２】
エライジン酸（Ｎ4）−ゲムシタビンアミド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む医薬用組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の化合物を含む抗がん剤。
【請求項５】
請求項４に記載の抗がん剤を製造するための、エライジン酸（５’）−ゲムシタビンエステルまたはエライジン酸（Ｎ4）−ゲムシタビンアミドの使用。
【請求項６】
ゲムシタビンと、式ＦａＸ（式中、Ｆａはエライドイル基であり、Ｘは脱離基である）とを反応させることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）の長鎖の飽和およびモノ不飽和脂肪酸誘導体、およびそれらを含む薬理学的組成物に関するものである。ゲムシタビンは下記の一般式を示す：
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ゲムシタビンは生体外（in  vitro）や生体内（in  vivo）試験の両方における腫瘍性の病気の治療に対して効果を示すヌクレオシド類似体である（新しい抗がん剤、Weissら、がん化学療法および１９９６年、生物機能修飾物質（ＢＲＭ）、年報１６、Pinedo、Longo、Chabner編。Elsevier  Science  Ｂ．Ｖ．、腫瘍学のセミナーの別冊、Vol.２２、No. ４、Suppl. １１、１９９５年、Yarbro編。ゲムシタビン  ヒドロクロライド：前臨床試験の現状）。また、有効な効果がゲムシタビンの臨床研究でも見られた。これらの研究において、ゲムシタビンの臨床と副作用とは、投薬スケジュールに高く依存している（腫瘍学セミナー、Vol.２２、No. ４、Suppl. １１、１９９５年、ｐｐ４２−４６）。
ゲムシタビンは、デオキシシチジンキナーゼによりその活性形態、すなわちゲムシタビンの三りん酸塩（dFdCTP）に細胞内で活性化される。これと平行して、ゲムシタビンは、デオキシシチジンデアミナーゼにより不活化され、対応するウラシル誘導体になる（不活性）。
最近本発明者らはゲムシタビンの脂肪酸誘導体が薬物速度論および組織分布を全く変えることを見出した。とくにこれは、細網内皮系（ＲＥＳ）、肺、膵臓、腸、食道、子宮、卵巣、黒色腫、および乳房の悪性疾病の場合である。
本発明の化合物は、一般式Ｉに示される式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が全て水素ではないという条件で、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して水素、Ｃ18またはＣ20の飽和およびモノ不飽和アシル基から選択される。
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ゲムシタビンは５’および３’ヒドロキシル基およびＮ4アミノ基の３つの誘導可能な官能基を有する。各々の基は、エステルまたはアミド誘導体に選択的に変換され得、さらに二付加物（ジエステルまたはエステルアミド）および三付加物も形成できる。二付加物と三付加物の場合は、アシル置換基は必ずしも同じでなくてもよい。
現下、本発明のモノアシル誘導体は、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうち２つが水素であるものが好ましい。アシル基のモノ置換基は糖部位の３’−Ｏと５’−Ｏの位置であるのがとくに好ましく、５’−Ｏ置換が最も好ましい。
モノ不飽和アシル基の二重結合はシスまたはトランス立体配置のいずれでもよいが、しかしながら治療上の効果は用いられた立体配置によって異なる。
また、モノ不飽和アシル基の二重結合の位置は活性に影響すると思われる。一般的に、ω−９位置に不飽和基を有するエステルまたはアミドを用いることが好ましい。ω−系の命名法では、モノ不飽和脂肪酸の二重結合の位置ωは、末端メチル基から数え、例えば、エイコサン酸（Ｃ20：１ω−９）は、鎖中に２０の炭素原子を有し、１つの二重結合が鎖のメチル末端から数えて９および１０の炭素の間に形成されている。
中でもオレイン酸（Ｃ18：１ω−９cis）、エライジン酸（Ｃ18：１ω−９trans）、エイコサン酸（Ｃ20：１ω−９cis）および（Ｃ20：１ω−９trans）から誘導されたエステル、エステル−アミドおよびアミドを用いるのが好ましく、なかでもアミドおよび５’エステルが本発明の誘導体として最も好ましい。
ステアリン酸（Ｃ18：０）およびエイコサン酸（Ｃ20：０）から誘導されたゲムシタビンのエステル、エステル−アミドおよびアミドはいくつかの場合において有利に用いられる。
本発明におけるゲムシタビンの誘導体は一般的には、下記の反応式に従って調製され得る。
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式中Ｎｕ−ＹＨはゲムシタビンを表し、Ｙは糖部位の３’および／または５’位置の酸素もしくはゲムシタビンのピリミジン部位の４位置にある窒素であり、ＦａはＣ18またはＣ20のモノ不飽和脂肪酸のアシル基であり、Ｘは脱離基、例えばＣｌ、Ｂｒ、３−チアゾリジン−２−チオンもしくはＯＲ’（式中、Ｒ’はＦａ、ＣＯＣＨ3、ＣＯＥｔ、またはＣＯＣＦ3である）である。
したがって、反応はヌクレオシドのアシル化によって進む。これは適切な脂肪酸反応性誘導体、とくに酸ハライドまたは酸無水物の使用によって達成される。
一般的に、プロトンスカベンジャーが反応によって遊離される酸ＨＸの反応を止めるために必要である。従って塩基を反応混合物に添加できる。例えば、塩酸のような酸ハライドが使用されるとき、第三アミン塩基、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジンまたはＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを添加して遊離したハロゲン化水素酸に結合させることができる。他の場合では、反応で使用される溶媒はプロトンスカベンジャーとして働くことがある。
通常、アシル化反応は触媒を必要しないで進む。いくつかの場合では、反応性脂肪酸誘導体ＦａＸは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＯ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）のようなカップリング試薬によってその場で形成される。
反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはハロゲン化炭化水素、たとえばジクロロメタンのような非反応性溶媒で行われるのが好ましい。もし望むならば、上記の第三アミン塩基のいくつかを溶媒として使用することができる（ただし適切な過剰量で存在させておくことに注意する）。この場合、プロトンスカベンジャーを別に用意しておくことは必要でない。その反応は５℃と５℃の間に保持するのが好ましい。１時間〜６０時間の後、反応はほぼ完了するであろう。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および適当な溶媒相を使用して見守ることができる。ＴＬＣによって反応の完了が確認された際、生成物は有機溶媒で抽出され、適当な溶媒系によるクロマトグラフィーおよび／または再結晶化により精製され得る。１つ以上のヒドロキシル基とアミノ基がゲムシタビンに存在しているので、アシル化合物の混合物が生成される。もし必要ならば、必要とされる個々のモノおよびマルチアシル化誘導体は例えば、クロマトグラフィー、結晶化、超臨界抽出等によって分離され得る。
Ｒ1および／またはＲ2および／またはＲ3が同じアシル基である一般式Ｉのマルチ−アシル化合物を調製する際には、適当なアシル試薬を過剰に用いた上記の方法を使用するのが好ましい。
Ｒ1および／またはＲ2および／またはＲ3が異なる一般式Ｉのマルチアシル化合物を調製するためには、適当に試薬を選択し、段階的に上記の方法を行うのが好ましい。特定の反応を確実にするために適切な選択された保護基を使用することも可能である。これらの方法の選択は下記のスキーム１に示される。特定の生成物を調製するために複数の方法を任意に組み合わせることもできる。
0004352115.tif 000005
次の実施例は本発明の２種の好ましいゲムシタビン誘導体の調製を示している。
実施例１
エライジン酸５’−ゲムシタビンエステル
ＤＭＦ３０ｍｌにおける２’，２’−ジフルオロデオキシリボフラノシルシトシン（ゲムシタビン）（０．４２ｇ  １．６ｍｍｏｌ）の溶液に、１．６ｍｍｏｌＨＣｌ（ｇ）を含む０．８１ｍｌＤＭＦを添加し、続いてＤＭＦ３ｍｌ中のエライジン酸クロライド（０．５１ｇ  １．７ｍｍｏｌ）溶液を加えた。反応混合物を１２時間周囲温度で攪拌した。溶媒は高真空で蒸発させ、粗生成物は溶出系としてクロロホルム中の１５％メタノールでシリカゲルのカラムにおいて精製された。不純画分を再精製し、標記化合物をトータルで０．２５ｇ（３０％）得た。
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さらに、エライジン酸（３’）ゲムシタビンエステルの少量（０．０５ｇ）が不純画分から単離された。
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実施例２
エライジン酸（Ｎ4）−ゲムシタビンアミド
ピリジン５ｍｌにおける２’，２’ジフルオロデオキシリボフラノシルシトシン（ゲムシタビン）（０．３８ｇ  １．３ｍｍｏｌ）の溶液に、エライジン酸クロライド（０．５７ｇ  １．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２．５時間周囲温度で攪拌した。
溶媒は高真空で蒸発され、粗生成物は溶出系としてクロロホルム中の１５％メタノールでシリカゲルのカラムにおいて精製された。生成物を含む画分は蒸発させて、残留物を超音波槽にてエーテル／ヘキサンで処理した。結晶化した物質を乾燥させ、標記化合物を０．１ｇ（１５％）得た。
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本発明の好ましいゲムシタビン誘導体は、ゲムシタビンそれ自体よりも悪性疾病の治療に対してより高い治療上の効果を有している。このことは、一回投与と繰返し投与の２つの異なる生体内（in  vivo）モデルにより示される。一回投与治療では、誘導体の効果はゲムシタビンより優れているか、もしくは同等である。これは、アミド誘導体の場合にとくに示される。すなわちアミド誘導体は、良好な効果がゲムシタビンのちょうど２５％で得られる。
繰返し投与では、誘導体とゲムシタビンとの相違はさらに著しい。これは生存時間の増加および長期生存者に反映されている。他の著しい特徴は、高程度および中程度の繰返し投与でのゲムシタビン自体に見られる毒性である。無毒低量投与（１ｍｇ／ｋｇ）で得られる効果はよいが、それはＮ4−アミドおよび５’エステル誘導体のほうがより優れる。ゲムシタビンは約２０μＭの血しょう濃度にて至適効果を有するが、さらに高濃度の約３５μＭ超ではリン酸化メカニズムの飽和により抗がん効果を阻害する（ガンジー、ゲムシタビンにおけるゲムシタビンの細胞薬理学：臨床試験デザインおよび評価の理論、ミニシンポジウム、12.3.96、Vrije  Universiteit  Amsterdam）。
これに対して、本発明の好ましいゲムシタビン誘導体は阻害濃度（＞３５μＭ）に達することなく長時間ゲムシタビンの至適血しょうレベルの効果をもたらす。これは誘導体がリン酸化を受けるわけではなく、おそらくメカニズムの阻害物質でもないからである。
がん治療の主たる問題は治療での耐性の進化である。多剤耐性（ＭＤＲ）は他の効果的な薬剤の効かない主な原因のひとつである。本発明者らは、本発明の好適な誘導体がＭＤＲポンプをブロックし、この問題を回避することができることを見出した。
ゲムシタビンのようなヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の細胞への取り込みは、主に選択的ヌクレオシド輸送（ＮＴ）レセプターにより行われる。
このレセプターの調節／阻害が、臨床学的な薬剤耐性であると考えられる。この現象は、ＮＴ阻害剤の添加によるin  vitroで観察される。本発明者らは、本発明の好適な誘導体の細胞分裂抑制活性が、ＮＴ阻害剤の存在下でも維持されるので、本発明の誘導体がＮＴ阻害剤の存在下でも影響を受けないという、驚くべき事実を見出した。
血しょうにおけるゲムシタビンの半減期は、約１０分間であり、これは内在性酵素デオキシシチジンデアミナーゼにより、対応のウラシル誘導体に高速脱アミノ化されるからである（P.G.Johnstonら、がんクロマトグラフィーおよび免疫調節剤、年報１６、1996、１章、Pinedo  HH.M.ら編集）。
これに対して、本発明の誘導体は脱活性酵素に対する基質となりにくいので、これによって半減期が増加する。したがって、本発明の誘導体はゲムシタビンそれ自体よりも悪性腫瘍の全身治療もしくは局所治療に対してより適している。
本発明の新規化合物は、がんの治療だけではなく、抗ウイルス薬剤としても有用である。
生物学的
試験
ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’エライジンエステルの細胞毒性活性は、２組のげっ歯動物およびヒトの腫瘍細胞株で研究された。なおそれぞれは、ゲムシタビンに耐性または交雑耐性の親株および同系統株（サブライン）からなる。
細胞株は、ゲムシタビンに耐性であり、かつデオキシシチジンキナーゼの欠乏を有するヒト卵巣腫瘍株Ａ２７８０および同系統株（サブライン）ＡＧ６０００、およびデオキシシチジンキナーゼは変わらずに、チミジンキナーゼＩが１０倍少ないマウス結腸腫瘍株Ｃ２６Ａおよび同系統株（サブライン）Ｃ２６Ｇである。各々の化合物の細胞毒性は、７２時間連続薬剤投与に従って評価が行われた。細胞数はＳＲＢアッセイによって決定され、生育阻害パーセントは、コントロールと比較して５０％生育阻害を生じる化合物の濃度であり、μＭで与えられたＩＣ５０値として各々の腫瘍株に対して計算された。
結果
ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの細胞毒性活性と比較した、ゲムシタビンそれ自体の細胞毒性活性のＩＣ５０値（μＭ）を下記の表に示した。ゲムシタビン誘導体の活性は、試験された細胞株におけるゲムシタビンの細胞毒性活性よりさらに高かった。
表
細胞株Ｃ２６−Ａ、Ｃ２６−Ｇ、Ａ２７８０およびＡ６０００におけるＩＣ５０値（μＭ）によるゲムシタビン、ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの細胞毒性
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ＣＥＭ細胞におけるゲムシタビンおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの細胞増殖抑制活性は、ヌクレオシド輸送阻害剤であるニトロベンジルチオイノシン（ＮＢＭＰＲ）もしくはPersantine（Pyridamole）があるのとないのとで測定された。ゲムシタビンのＩＣ50値は、ゲムシタビン−５’−エライジンエステルのＩＣ50値よりも２倍高いことが下記の表からわかる。ＮＴ阻害剤を添加すると、ゲムシタビンのＩＣ50値は１０倍上昇し、一方ゲムシタビン−５’−エライジンエステルのＩＣ50値はあまり影響を受けていない（１．３〜１．５増加）。”耐性”状況では、好適な誘導体は、母体薬剤よりも１５〜２０倍の効力がある。
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ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの抗腫瘍効果を、一回および繰返し投与の両方で、２種の異なる腫瘍タイプをもつマウスで生体内（in−vivo）で調査した。
マウスの脾臓内に接種したＣｏ−２６に対するゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの効果
Balb／ｃメスマウスの脾臓に、０日目、マウス結腸がんＣｏ−２６を接種した。このモデルでは腫瘍が主に肝臓で発達する。腹腔内の治療は１日目に開始された。化合物の一回投与はゲムシタビンでの一回投与との比較において試験された。生理食塩水はコントロールとして用いられた。
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死亡した動物の平均生存時間は、試験された化合物では同様の範囲にあった。ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドは、ゲムシタビン１００ｍｇ／ｋｇと比べて２５ｍｇ／ｋｇのみの投与で５／８生存し、ゲムシタビン−５’−エライジンエステルおよびゲムシタビンより優れていた。
平行試験において、投与は１−１１日間繰り返された。
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この試験において、ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよび低量投与のゲムシタビン−５’−エライジンエステルで得られた結果は、低量投与のゲムシタビンで行われた結果より良好、もしくは同じであった。ゲムシタビン−５’−エライジンエステルの多量投与はわずかな毒性があるが、それはゲムシタビンそれ自体の多量投与よりは低かった。
マウスにおけるＰ−３８８に対するゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの効果（１回投与もしくは繰返し投与）
Ｂ６Ｄ２Ｆ１メスマウスに、マウスリンパ性白血病Ｐ３８８細胞を腹腔内移植した。治療は腹腔内への細胞の移植１日後に開始された。平均生存時間、長時間生存動物および毒性死亡は、１回投与治療、５日間の繰返し治療および１０日間の繰返し治療に従い記録された。その結果を下記の表に示した。ゲムシタビン−５’−エライジンエステルの一回投与治療は、ゲムシタビンの同様の投与と比べると測定された生存時間の延長および長時間生存動物に効力があった。
一回投与治療
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１−４日間繰返し投与治療
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ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドの活性は、１および４ｍｇ／ｋｇ両方で、長時間生存動物および延長された生存時間によって明確になった。ゲムシタビン１５ｍｇ／ｋｇで治療されたコントロールグループにおいて、全ての動物が毒性で死亡した。
１−１１日間繰返し投与治療
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１０日間治療は短時間治療に比べて抗腫瘍活性が増加した。ゲムシタビンの毒性は、４ｍｇ／ｋｇで６／６の毒性死亡であるので、ｍｇ／ｋｇをベースとしたとき高いものであった。長時間生存動物は、ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの両方で繰返し治療後に観察され、ゲムシタビン−Ｎ4−エライジンアミドおよびゲムシタビン−５’−エライジンエステルの両方ともに、平均生存時間の実質的な増加が観察された。
本発明のゲムシタビンエステルおよびアミドは全身、腸内または腸管外のいずれにも投与できる。
腸内投与の場合、本発明の活性化合物は、軟質もしくは硬質ゼラチン、カプセル、錠剤、顆粒、細粒、粉末、糖衣剤、シロップ、懸濁液、もしくは溶液として提供される。
非経口的に投与される場合、注射液もしくは注入液、懸濁液もしくは乳濁液のようなゲムシタビンエステルまたはアミドの製剤が適している。
製剤は、製剤業界において当業者によく知られているような不活性、または薬効学的に活性な添加剤を含むことができる。例えば、錠剤または顆粒は結合剤、充填材、乳化剤、キャリア物質もしくは希釈剤を含むことができる。液体製剤は、例えば無菌溶液の状態で提供できる。
カプセルは、活性成分に加え、充填材または濃縮剤を含むことができる。また、風味改善剤、さらに保存剤、安定剤、水分保持剤、乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝液、その他の添加剤のような通常用いられる物質を使用することができる。
本発明による製剤の投薬は、患者に対する条件に加え、使用の形態および使用方法に応じて変化するであろう。一般的に、平均的な成人患者の全身治療に対する一日投与量は、約０．１−１５０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、好ましくは１−４０ｍｇ／ｋｇ／日である。局所の投与の場合、例えば、外用薬薬理学的製剤を０．１−１０重量％、とくには０．５−５重量％を含むことができる。
もし望むなら、ゲムシタビンエステルもしくはアミドを含む薬理学的製剤は、トコフェロール、Ｎ−メチルトコフェミン、ブチルヒドロキシアニソール、アスコルビン酸、もしくはブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤を含むことができる。
組合せ療法、すなわち本発明のゲムシタビンエステルもしくはアミドの投与が、外科手術、放射線治療、化学療法等の他の治療と組合せる療法も可能である。例えば、脳腫瘍の好ましい治療は、全身または局所投与による本発明のゲムシタビンエステルもしくはアミドでの治療と外科手術とを組合わせることが考えられる。