(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異をホモで有し、
RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードしており、
RECQL4がヘリカーゼ活性を喪失しており、かつ、
ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す、マウス。
【請求項２】
RECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失している、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
RECQL4遺伝子のエキソン１３が配列番号３に記載の配列を有する、請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
RECQL4遺伝子のエキソン１３へ変異をホモで導入することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウスの作製方法。
【請求項５】
作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
RECQL4遺伝子のエキソン１３が配列番号３に記載の配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
RECQL4遺伝子のエキソン１３への変異導入をジーンターゲッティングによって行う、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物、特にマウス及びその作製方法に関する。より具体的には、RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異を有し、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ロスモンドは、多形皮膚萎縮症(ポイキロデルマ、poikiloderma)と若年性の白内障を特徴とする疾患を、トムソンは多形皮膚萎縮症と遺伝性の骨形成異常を特徴とする疾患を報告したが（Rothmund, A. (1868) Uber cataracten in verbindung mit einer eigenthumlichen hautdegeneration. Arch. Klin. Exp. Ophthal., 4, 159-182.、Thomson, M.S. (1936) Poikiloderma congenitale. Br. J. Dermatol., 48, 221-234）、後に、ロスモンド・トムソン症候群として病名が統一された。即ち、ロスモンド・トムソン症候群（以下ＲＴＳと略記）は、成長障害、多形皮膚萎縮症, 脱毛、白内障、骨形成異常、骨肉腫の発がん頻度が高いという徴候を示す常染色体劣性遺伝病である（Ichikawa, K., Noda, T. and Furuichi, Y. (2002) Preparation of the gene targeted knockout mice for human premature aging diseases, Werner syndrome, and Rothmund-Thomson syndrome caused by the mutation of DNA helicases. Nippon Yakurigaku Zasshi., 119, 219-226.、Vennos, E.M. and James, W.D. (1995) Rothmund-Thomson syndrome. Dermatol. Clin., 13, 143-150.、Vennos, E.M., Collins, M. and James, W.D. (1992) Rothmund-Thomson syndrome: review of the world literature. J. Am. Acad. Dermatol., 27, 750-762）。
【０００３】
これらの症状はまたＲＴＳが早期老化症候群であることを示唆する。代表的な早期老化症候群として、ウェルナー症候群とブルーム症候群が知られ、それぞれ、WRN遺伝子とBLM遺伝子の突然変異が原因であることが知られている（Mohaghegh, P. and Hickson, I.D. (2001) DNA helicase deficiencies associated with cancer predisposition and premature ageing disorders. Hum. Mol. Genet.,
10, 741-746.）。
これらの遺伝子はRecQヘリケース遺伝子（RecQ helicase）ファミリーに属している。この同じファミリーに属しているRECQL4遺伝子については、多くのＲＴＳ患者で突然変異が見つかっている。突然変異は、RECQL4タンパク質分子の中でとくにヘリケース活性をもつ部分に集中している（図１の矢印部分）。そこで、RECQL4遺伝子のヘリケース活性部分の変異がＲＴＳの原因なのかを確認し、ＲＴＳ患者のマウスモデルを作る目的で、RECQL4遺伝子を破壊したマウス個体の作製が試みられていた。しかし、RECQL4遺伝子の２２個のエキソンの中でエキソン５〜８をノックアウトしたマウスは胎生３．５〜６．５日に死亡し、作製には成功していなかった（Ichikawa, K., Noda, T. and Furuichi, Y. (2002) Preparation of the gene targeted knockout mice for human premature aging diseases, Werner syndrome, and Rothmund-Thomson syndrome caused by the mutation of DNA helicases. Nippon Yakurigaku Zasshi., 119, 219-226）。
【非特許文献１】
Ichikawa, K., Noda, T. and Furuichi, Y. (2002) Preparation of the gene targeted knockout mice for human premature aging diseases, Werner syndrome, and Rothmund-Thomson syndrome caused by the mutation of DNA helicases. Nippon Yakurigaku Zasshi., 119, 219-226
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物、特にマウス及びその作製方法を提供することである。より具体的には、RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異を有し、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス及びその作製方法に関する。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウスRECQL4遺伝子(単にRecql4とも記載する)のエクソン１３のみを改変することによって、RECQL4遺伝子欠損マウスを作製し得ること、及び、作製された遺伝子欠損マウスが、ヒトのロスモンド・トムソン症候群の特徴の少なくともいくつかを示すことを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物；
（２）ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すげっ歯類動物；
（３）ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス；
（４）RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異を有し、かつ、RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードする、前記（３）に記載のマウス；
（５）RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異を有し、かつ、RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードする、RECQL4遺伝子欠損マウス；
（６）RECQL4遺伝子のエキソン１３が配列番号３に記載の配列を有する、前記（４）又は（５）に記載のマウス；
（７）RECQL4がヘリカーゼ活性を喪失している、前記（３）〜（６）のいずれか１つに記載のマウス；
（８）RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異を導入することを特徴とする、前記（３）〜（７）のいずれか１つに記載のマウスの作製方法；
（９）作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失している、前記（８）に記載の方法；
（１０）作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードする、前記（８）又は（９）に記載の方法；
（１１）RECQL4遺伝子のエキソン１３が配列番号３に記載の配列を有する、請求項（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法；及び
（１２）RECQL4遺伝子のエキソン１３への変異導入をジーンターゲッティングによって行う、前記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法
である。
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ロスモンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）の特徴を示す」とは、皮膚の異常（多形皮膚萎縮症、無色毛及び脱毛等）、低身長（体長）、骨形成障害、白内障、免疫異常、不稔及び悪性腫瘍といったヒトＲＴＳの特徴のうち１以上の特徴を示すことをいう（後述の表１を参照）。
本明細書において、「RECQL4遺伝子欠損マウス」とは、RECQL4遺伝子に変異を有し、その結果、REQCL4タンパク質が正常な機能を有しないマウス、特にREQCL4のヘリカーゼ活性が失われているマウスをいう。本発明の「RECQL4遺伝子欠損マウス」は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す。
本発明においては、RECQL4遺伝子のエキソン１３に変異が導入され、それによってRECQL4タンパク質の機能、特にヘリカーゼ活性が失われている。
マウスRECQL4のcＤＮＡ配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示した。本発明の一実施態様においては、エキソン１３は配列番号３に記載の配列を有する。配列番号３に記載のエキソン１３は、配列番号１中のヌクレオチドNo.1945-2124に相当する。
本発明の一態様では、マウスRECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失している。エキソン１３（１８０ｂｐ）は、ヘリケース活性に不可欠なアミノ酸配列をコードするエキソンである。エキソン１３は、その構成塩基数が３の倍数（１８０ｂｐ）である。したがって、エキソン１３全体が通常のスプライシングから除外されると、次のエキソン１４〜２２においてフレーム（アミノ酸配列の読み枠）が保たれて野生型Recql4と相同なタンパク質を発現するようなエキソンとなる。エキソン１４〜２２のいずれのエキソンも構成塩基数が単独では３の倍数ではないので、このようなエキソンを構成しうるエキソンとしては、エキソン１〜２２の中でエキソン１３が最もＣ末端のエキソンとなる。したがって、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスでは、そのRECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードしていることが好ましい。
【０００５】
RECQL4タンパク質は、ヘリケーススーパーファミリーII型（SFII）に属し、７つの保存領域を有するタンパク質である。その中で、エキソン１３はモチーフIIIをコードする。モチーフIIIのTAT(SAT)配列は、ATPの加水分解を必要とするヘリケース活性とＤＮＡへの結合にとって重要であることが仮想的ＲＮＡヘリケースのＸ線構造解析により示されている（Story, R.M., Li, H. and Abelson, J.N. (2001) Crystal structure of a DEAD box protein from the hyperthermophile Methanococcus jannaschii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98, 1465-1470）。また、マウスeIF4a（SFIIの一つ）のSAT配列の突然変異（Pause, A. and Sonenberg, N. (1992) Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF-4A. EMBO J., 11, 2643-2654.）及びマウスBlmのモチーフIIIの突然変異（Bahr, A., De Graeve, F., Kedinger, C. and Chatton, B. (1998) Point mutations causing Bloom's syndrome abolish ATPase and DNA helicase activities of the BLM protein. Oncogene, 17, 2565-2571.）によって、ヘリケース活性が欠損することが示されている。更に、E.coliのRecGヘリケースのTAT配列の突然変異がブランチ・マイグレーション（branch migration）を抑制することが示されている。これらの報告は、モチーフIIIの存在がヘリケース活性にとって不可欠であることを示している。したがって、本発明の一つの実施態様においては、エキソン１３のモチーフIIIを破壊する変異が導入されていてもよい。この場合でも、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスは、そのRECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２２に対応するアミノ酸配列をコードしていることが好ましい。
マウス以外の非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類動物を標的とする場合も、モチーフIIIが含まれるエキソンを変異導入の標的とし、かつ上述した性質を有する変異を導入することができる。
マウスとしては、一般的にモデルマウスの作製に用いられる１２９／ＳＶを使用することができる。
【０００６】
本発明において、RECQL4遺伝子への変異の導入は、いわゆる遺伝子ターゲッティングによって行うことができる。
本発明のマウスを作製するためのターゲッティングベクターとしては、例えば、
（１）ポジティブ選択マーカー、
（２）ポジティブ選択マーカーの５’側領域に存在し、RECQL4遺伝子のエキソン１〜１２又はその一部に相同な配列（Long arm）、及び、
（３）ポジティブ選択マーカーの３’側領域に存在し、RECQL4遺伝子のエキソン１４〜２０又はその一部に相同な配列（Short arm）
を有するベクターを利用することができる（図２、中段）。
Long arm及びShort armは、一般には長い方が好ましいと考えられており、例えば、５’側領域はRECQL4遺伝子のエキソン１〜１２を含み長さが4kb以上あることがより好ましいが、３’側及び５’側のいずれについても長さは本発明に本質的ではなく、このような遺伝子ターゲティングに通常利用される長さを有していればよい。また、相同組換えを生じさせる領域は、標的領域と完全に同一である必要はなく、相同組換えが生じる程度の配列類似性を有していればよい。
ポジティブ選択マーカーとしては、一般に薬剤耐性遺伝子を用いることができ、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いることができる。
ターゲッティングベクターは、相同組換えが起きたことを確認するためのネガティブ選択マーカーを更に含んでいてもよい。そのようなマーカーとしては、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子を利用することができる。
【０００７】
次に、このようなターゲッティングベクターを胚性幹細胞(ＥＳ細胞)へ導入する。導入方法は特に限定されず、このような場合に用いられる当業者に知られた一般的な方法及び条件を利用することができる。例えば、エレクトロポレーション、リポフェクチン法などが利用できる。
ターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞は、適切な条件下で培養することができる。例えば、ＥＳ細胞の培養に適し、かつ、ポジティブ選択用マーカー及びネガティブ選択用マーカーに対応した薬剤を含む培地中で培養することができる。ＥＳ細胞の培養条件及び培養方法は当業者にはよく知られたものである。必要であれば、更にＰＣＲ等により導入された遺伝子及びその位置、方向を確認することもできる。
【０００８】
得られたRECQL4遺伝子欠損ヘテロＥＳ細胞（Recql4 +/-）を、当業者によく知られた方法に従って、胚盤胞へマイクロインジェクションする。その後、偽妊娠動物への導入等により目的とする遺伝子が導入されたキメラ動物を得ることができる。得られたキメラ動物は、ＥＳ細胞由来の性質、例えば毛皮の色等を指標として導入遺伝子について選抜することができる。
選抜された動物と遺伝子導入していない動物とを交配して子孫動物（Ｆ１動物）を得る。ＥＳ細胞由来の性質、例えば毛皮の色を指標にして生殖細胞に導入遺伝子を有する動物を更に選抜することができる。必要であれば、更に得られた動物の一部、例えば尾部からＤＮＡを取得し、ＰＣＲによって導入遺伝子の有無を確認することもできる。このようにして得られたRECQL4遺伝子欠損ヘテロ動物（Recql4 +/-）同士を交配してRECQL4遺伝子欠損ホモ動物（Recql4 -/-）、例えばRECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失している変異動物を得ることができる。
【０００９】
得られた本発明のRECQL4遺伝子欠損動物（Recql4 -/-）を、野生型動物（Recql4 +/+）を対照として、その性質を調べることができる。例えば、動物の外観観察、皮膚の状態観察、悪性腫瘍の発生頻度の計測、Recql4の転写産物量の測定、組織標本観察、細胞学解析等を行うことができる。転写産物量は、例えばトータルＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって定量することができる。組織標本観察は、常法に従って、ホルマリン等で固定し、パラフィン包埋した切片を用いて行うことができる。細胞学的解析は、組織から細胞を単離し、例えば、種々の刺激、特に放射線、又は紫外線に対する感受性を測定することによって行うことができる。更に、一定期間後の動物の体重、体長、体高等を指標に動物の成育能を測定することもできる。
本発明のRECQL4遺伝子欠損動物（Recql4 -/-）、特にマウスでは、顕著な脱毛、びらん性の出血を伴う病変が見られる。また、上皮、真皮、皮下組織の形成が不良となる。本発明のRECQL4遺伝子欠損動物、特にマウスでは、骨組織の形成、特に、骨梁形成が不良となる。また、本発明のRECQL4遺伝子欠損動物、特にマウスでは生長も遅延し、生後１０週において正常固体の約１／３程の大きさしかない。また、このようなマウスから採種した細胞は増殖速度が野生型の２／３程度に低下する。さらに、本発明のRECQL4遺伝子欠損動物、特にマウスは小腸上皮の絨毛の大きさ及び数が正常固体に比べて減少する。
表１は、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスのこれらの特徴、及びその他の特徴とヒトのＲＴＳの症状を比較した結果である。このことは、本発明のRECQL4遺伝子欠損動物、特にマウスがヒトのロスモンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）のモデルとして利用し得ることを示す。本明細書において、「ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す」とは、下記の表においてＲＴＳの特徴として示される１以上の特徴を示すことをいう。
【００１０】
【表１】
表１．本発明のRECQL4欠損動物の特徴とヒトのＲＴＳの症状の比較
0004217782.tif 000002
a：一部のＲＴＳ患者の細胞はＸ線及び紫外線に感受性だが、そうでない患者もいる。
b：２〜８週齡のマウス（n=23）について得られたデータ。
c：Ｔ細胞が僅かしか見られない。
d：組織学的検査によればRecql4遺伝子欠損マウスの精子形成は正常であったが、Recql4遺伝子欠損マウスをC57BL/6マウス又は同腹仔と交配した場合には新生仔は生まれなかった（オスn=5、メスn=4）。
e：MEFについてのデータ。
【００１１】
【実施例】
実施例１
ターゲッティングベクターの構築
ターゲッティングベクターは、ポジティブ選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子及びネガティブ選択マーカーとしてのチミジンカイネース遺伝子（相同組換えが起こらなかった場合、そのままゲノムに取り込まれて、細胞をガンアシクロビルに対して致死感受性にする遺伝子）を含むNTBluntベクターへ、Long arm及びShort armを挿入することにより構築した。
NTBluntベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子（PGKNeo）を有するpKJ1ベクター（NAR, vol19, no. 20 5755-5761, 1991. McBurney MW et. al.）を制限酵素EcoRI, BglIIで切り出し、得られたPGKNeopAを、制限酵素EcoRI及びBamHIで切断したpBluescriptIIへ挿入し、更にチミジンカイネース遺伝子（HSV-TK）を常法に従い挿入することにより作製した。
Long arm（ポジティブ選択マーカーの５’側領域）は、マウスＥＳ細胞のRecql4遺伝子のエキソン１からエキソン１２を含む４．３ｋｂのゲノムＤＮＡ（ＥＳ細胞株Ｒ１から通常のフェノールクロロホルム抽出により調製）を鋳型に、次のプライマーを用いたＰＣＲにより作製した。
mQ4-1(+)30     5’-CTTTTGCACGGCTGCACGGGCGACGGCCAG-3’  （配列番号４）
mQ4-Co1(-)30   5’-CAGCTATGCCAAGGTGCTGAGCCACATCTC-3’  （配列番号５）
Short arm（ポジティブ選択マーカーの３’側領域）は、マウスＥＳ細胞のRecql4遺伝子のエキソン１４からエキソン２０を含む1.9kbのゲノムＤＮＡ（ＥＳ細胞株Ｒ１から通常のフェノールクロロホルム抽出により調製）を鋳型に、次のプライマーを用いたＰＣＲにより作製した。
mQ4-6(+)30   5’-TTGAGCTCAGCGGGTCAGCCAACATCCCTG-3’  （配列番号６）
mQ4-9(-)30   5’-TGCTCTAAACAGGGTCCACAACTGGGAAAG-3’  （配列番号７）
ポリメラーゼとしてKODplus (TOYOBO)を用い、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。
NTBluntベクターへの制限酵素HpaIの認識部位にShort armを、制限酵素SwaIの認識部位にLong armを常法により挿入した。ターゲティングベクターの作製の基礎になったベクターNTBluntを図３に示す。
【００１２】
Recql4遺伝子のジーンターゲティング
ターゲッティングベクターに用いたマウスＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞Ｒ１株（Nagy, A博士より入手。連絡先：Division of Molecular and Developmental Biology, Samuel Lumenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, ON, Canada）（Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W. and Roder, J.C. (1993) Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 8424-8428.）であった。
ターゲッティングベクター３０μｇを、Ｒ１細胞２×１０7個と共にキュベット（電極間４ｍｍ）（BioRad）に加え、GenePulserII (BioRad)を用いたエレクトロポレーション（電圧：２５０Ｖ、容量：９５０μＦ）によりマウスＥＳ細胞へ導入した。
得られたターゲッティングベクター導入ＥＳ細胞を、Nagyらの文献（Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Sep 15;90(18):8424-8. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.; Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder JC. Division of Molecular and Developmental Biology, Samuel Lumenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, ON, Canada.）にしたがい、選択薬剤Ｇ４１８（ポジティブ選択用；ネオマイシン誘導体）及びガンアシクロビル（ネガティブ選択用）を含む培地中で培養した。
双方の選択薬剤に耐性を示す細胞のクローンを培養し、常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、制限酵素XbaIで消化し、アガロースゲル電気泳動に付し、ナイロンメンブレンへ転写した。次いで、Recql4遺伝子のエキソン２１と２２を含むゲノム領域０．６ｋｂの ＤＮＡ断片からなるプローブ
【００１３】
5'-GGACACTCAGGGTCCAAAACCTGGGCAGACTCAGGTAAGTGCCACACCTCTGAGGATAGTTCTTAAAGCTTGGGACAGTGACATGGCCCCATTCAACCCTGACCCCACAGTTCAATCCCTGCTTGGCTCAAGGTTTCCTTGGCTGCTCCGGGTGTGATTTTACATGACAGATGCTATGGTAGCTCAGATGAGGTTACATGCTATCCTCCCACAGCTTCAGGACTGGGAGGACCAAATACGCCGGGATGTCCGCCAGCTCCTGTCCCTGAGGCCAGAAGAAAGGTTTTCAGGAAGGGCTGTGGCCCGCATCTTCCATGGCATTGGTGAGGGCCACGGGGTTGCCTGGTGCCAGCGGGGGATGGGTATTAGAGCCAGCTGAGTCCTCAGGCCTGTGTTTCTGCTCCACCCTAGCGAGTCCATGCTACCCAGCCCAGGTGTATGGGCTGGACCGGCGCTTCTGGAGGAAGTACCTACACCTGGACTTTCATGCCCTGATGCACCTAGCTACAGAAGAGCTCCTGCTGAGAGGCCGATGACCACCTTACATGGGAGGGTGCCACATGATTGAGGCATGAGGCAAGCC-3'  (584 bp)（配列番号８）
【００１４】
を蛍光ラベルしたもの（図２の「３’プローブ」）を用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った（Wurst, W. and Joyner, A.L. (1993) Gene targeting: A Practical Approach. IRL press, Oxford.）。結果を図４に示す。
野生型マウス（Recql4+/+）（すなわち、２本の染色体のいずれにおいてもRecQL4のエキソン１３が欠損していない遺伝子）のＥＳ細胞クローンは８ｋｂのバンドを与えた。一方、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）、すなわちターゲッティングにより１本の染色体のRecQL4のエキソン１３が欠損したマウスのＥＳ細胞クローンは６ｋｂ及び８ｋｂのバンドを与えた。RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）、すなわち２本の染色体のいずれにおいてもRecQL4のエキソン１３が欠損したマウスのＥＳ細胞クローンは６ｋｂのバンドのみを与えた。RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）のＥＳ細胞クローンを更なる工程に用いた。
【００１５】
RECQL4遺伝子のエキソン１３欠損マウスの作製
Recql4+/-のＥＳ細胞クローンを、C57BL/6JNrs妊娠マウス（黒眼、黒色毛、独立法人放射線医学総合研究所で維持されているストレイン）の卵管切除によって得たブラストシスト（桑実胚）へ、マイクロインジェクター（ナリシゲ）およびピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック）を用いて注入した。この胚を精管結紮した雄と交配させた偽妊娠の代理母マウスの胎内に導入しキメラマウスを作製した。
作製したキメラマウスの中から、Recql4+/-のＥＳ細胞が示す毛皮の色（アグチ）が８０％以上含まれるオスのマウスを選択した。
選択したオスのマウスとC57BL/6のメスのマウスとを交配して、エキソン１３が欠損したRecQL4アレル遺伝子（Recql4-）が生殖系列へ導入されたＦ１マウスを作製した。
Ｆ１マウス個体の遺伝子型の識別は、尾の一部を切除してＤＮＡを抽出し、Recql4遺伝子に対するプライマーを用いたＰＣＲにより行った。使用したプライマーは以下の通りである。
mQ4-5 (+) 30     5'-CTCGTGGTCTCGCCTCTCCTGTCACTCATG-3'  （配列番号９）
mQ4-6(-)30       5'-GCCCACCATGGACAGGCAGGTGCGGAGGAG-3'  （配列番号１０）
pgkNeo5'-1(-)30  5'-CTTGGGAAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAG-3'  （配列番号１１）
遺伝子型を確認したRECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4 +/-）同士、あるいは、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4 +/-）とC57BL/6との交配により、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）を作製した。
【００１６】
Recql4遺伝子転写産物の配列決定による欠失部位の確認
野生型マウス（Recql4+/+）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）のそれぞれについて、１４．５日胎児からはプライマリーの胎生線維芽細胞（ＭＥＦ）、成熟個体からは脳、心臓、胸腺、腎臓及び精巣から常法にしたがいトータルＲＮＡを調製した。調製したトータルＲＮＡに対し、下記のプライマー（図２の矢頭）を用い、Recql4遺伝子転写産物についてのＲＴ−ＰＣＲを行った。
mQ4-5(+)30  5'-CTCGTGGTCTCGCCTCTCCTGTCACTCATG-3'  （配列番号１２）
mQ4-8(-)30  5'-CAGCTGGGCACTGCCGCCAAGGCAATGCAG-3'  （配列番号１３）
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）のＭＥＦ及び精巣から得られた変異ＰＣＲ増幅産物（転写産物）は、対応する野生型マウス（Recql4+/+）のＰＣＲ増幅産物（転写産物）と比較して短かかった。
変異ＰＣＲ増幅産物を、pGEM-T Eazy（プロメガ）へ常法によりクローニングし、下記のプライマーを用いて塩基配列を決定した。
5'-CTGCCTCTCTCAGTGGTCAC-3'  （配列番号１４）
5'-GACAGGCAGGTGCGGAGGAG-3'  （配列番号１５）
配列決定したRECQL4遺伝子ホモ欠損マウスのＰＣＲ増幅産物の配列と野生型マウスのＰＣＲ増幅産物の配列とを比較したところ、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）のＰＣＲ増幅産物では、エキソン１３を構成する配列（１８０塩基）が完全に欠失していることが明らかになった（図５）。このことは、上述のターゲッティング方法により得られたマウスにおいて、
（１）RECQL4遺伝子のエキソン１３全体が欠失していること、及び
（２）スプライシングの結果、エキソン１２の３’末端とエキソン１４の５’末端とが正常に結合していること（すなわち、エキソン１４以降に対応するアミノ酸配列は野生型の対応するアミノ酸配列と同じである）
を示している。
【００１７】
試験例１
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）におけるエキソン１３欠失転写産物の発現量の評価
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）における変異Recql4転写産物（エキソン１３欠失転写産物）の量と、野生型マウス（Recql4+/+）における正常Recql4転写産物の量とを定量的ＰＣＲにより比較した。
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスのトータルＲＮＡ  １μｇより合成されたcＤＮＡを基準として、野生型マウスの精巣のトータルＲＮＡより合成されたcＤＮＡの希釈系列を作製した（RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスを１として野生型マウス０〜０．１）。作製した野生型マウスのｃＤＮＡの各希釈系列とRECQL4遺伝子ホモ欠損マウスのcＤＮＡとの混合物を鋳型として、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスで欠失しているエキソン１３を挟む下記のプライマーのセット
5'-CTCGTGGTCTCGCCTCTCCTGTCACTCATG-3'（配列番号１６）
5'-CAGCTGGGCACTGCCGCCAAGGCAATGCAG-3'（配列番号１７）
でＰＣＲを行った。結果を図６に示す。尚、示されている各混合物の混合比は、それぞれ同一のcＤＮＡサンプルを鋳型としてGapdh遺伝子に特異的なプライマーセットによるＲＴ−ＰＣＲを行ったデータをもとに補正された値である。図６より、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスにおける変異転写産物の発現量は野生型マウスの野生型転写産物の発現量の１〜２％であることが明らかになった。
【００１８】
試験例２
成長遅延
（１）生存率による評価
作製した 頭のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）うち、約４０％は生まれた直後に死亡した。生存した個体のうち、８０％は生後２日以内に死亡し、９５％の個体は生後２週間以内に死亡した。しかし、残りの５％は生後２週間以降も生存していた。
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の胎生致死率を観察するため、帝王切開によって得られた胎児の遺伝子型を調べた。その結果、野生型マウス（Recql4+/+）：RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）：RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）＝１９：４３：１４であり、メンデルの法則にほぼ従った分布を示した。したがって、胎生期の死亡はRecql4遺伝子の変異によるものではないと考えられる。
（２）体重による評価
野生型マウス（Recql4+/+）、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の１９日目の胎児における体重はそれぞれ、１．４８±０．１７ｇ、１．５１±０．２１ｇ及び０．８６±０．１２ｇであった。したがって、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの体重は野生型マウスの約６０％であった（図７）。
RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの成長遅延はその後も持続し、生後１０週間後では、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの体重は野生型マウスの体重の約１／３であった（図８）。
（３）細胞増殖による評価
野生型マウス（Recql4+/+）、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の各個体からＭＥＦを単離し、その細胞増殖を調べた。
ＭＥＦの単離は、１４．５日胚の頭部と内臓を除去し、組織を細かく破砕し、トリプシン処理により行った。培地は、Dulbecco's modified Eagle's medium（シグマ）に１０％胎児牛血清、５０μＵ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５８μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加したものを用いた。培養は１０mmのシャーレ中、３７℃、ＣＯ2濃度５％に管理したインキュベーターにて行った。細胞培養は、１０5個の細胞を６０mmのシャーレ２枚ずつに播種し、毎日培地を代えて行った。細胞の計数は、２４時間毎にコールターカウンター（ベックマン＝コールター）によって行った。結果を図９に示す。野生型マウス（Recql4+/+）及びRECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）由来のＭＥＦと比較して、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）由来のＭＥＦは有意に低い増殖能力を示した。
以上の結果より、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）は、野生型マウス（Recql4+/+）と比較して成長遅延を示すことが明らかになった。成長遅延は、ヒトＲＴＳの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトＲＴＳのモデル動物として利用可能である。
【００１９】
試験例３
皮膚の異常
（１）外観による評価
ほとんどのRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）が何らかの皮膚の異常を示した。生後は目立たなかったが、生後６週までに頸部、背部、前足の付け根から側腹部にかけて脱毛があった。更に尻や腹部に毛の脱色を示した個体もあった。脱毛部位が個体表面の２０％に達する個体も存在した。
生後２〜３月後には、脱毛部位にびらん性の出血をともなう病変が観察された。これらの病変はかさぶたを作って治癒に向かったが、再び発毛を見るには至らなかった。本病変は、皮膚が脆弱でありかつ物理的接触の機会が多い部分（例えばオスでは陰茎）で多く観察された。
皮膚の乾燥は尾部において最も顕著であり、生後３〜４ヶ月の個体の６０％で観察された。
（２）組織学的評価
組織学的評価を行うために、マウス組織を、１０％の緩衝フォルマリンによって固定し、パラフィン包埋して切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。顕微鏡写真は、ECLIPS TE300（ニコン）により倍率40×、100×及び400×で撮影した。
野生型マウスと比較して、変異マウスの皮膚は、上皮、真皮、および皮下組織の低形成を示した。
以上の結果より、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）は、野生型マウス（Recql4+/+）と比較して、皮膚の異常を示すことが明らかになった。皮膚の異常は、ヒトＲＴＳの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトＲＴＳのモデル動物として利用可能である。
【００２０】
試験例４
他組織の低形成
骨組織、小腸上皮及びリンパ組織の顕微鏡写真を試験例３と同様の方法により撮影した。
野生型マウスと比較して、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）では骨形成層における骨梁形成の減少が見られた。
更に、小腸上皮の絨毛の大きさと数の減少も明らかであった。クリプト及び結合組織における細胞分裂像も少なかった。これは、RECQL4遺伝子のエキソン１３の欠損が、増殖の盛んな腸上皮に特に影響を及ぼすことを示唆している。
リンパ系の組織を観察したところ、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の胸腺は、野生型マウスと比較して顕著に小さかった。
更に胸腺細胞の数も、野生型マウスと比較して有意に小さかった（新生仔マウスについて野生型マウスは１×１０7（ｎ＝１）、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスは０．６〜５×１０5（ｎ＝２）；成体マウスについて野生型マウスは２．０×１０7（ｎ＝１）、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスは１．３×１０7（ｎ＝１））。
また、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の胸腺ではリンパ濾胞の皮質と髄質の区別が不明瞭であった。更に、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）では、白質層（white pulp）の大きさと数が野生型マウスと比較して顕著に少なかった。
以上の結果より、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）は、骨形成障害、小腸上皮の異常及びリンパ組織の異常を示すことが明らかになった。骨形成障害は、ヒトＲＴＳの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトＲＴＳのモデル動物として利用可能である。
【発明の効果】
本発明により、従来、致死性が高いと考えられていた、RECQL4遺伝子欠損ホモ動物（Recql4-/-）、特にRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）及びその作製方法が提供される。本発明のマウスは、生長遅延、皮膚の異常、骨形成不良を含む、ヒトＲＴＳの特徴を多く示し、ヒトＲＴＳのモデル動物として利用可能である。
【配列表】
0004217782.tif 000003
0004217782.tif 000004
0004217782.tif 000005
0004217782.tif 000006
0004217782.tif 000007
0004217782.tif 000008
0004217782.tif 000009
0004217782.tif 000010
0004217782.tif 000011
0004217782.tif 000012
0004217782.tif 000013
0004217782.tif 000014
0004217782.tif 000015
0004217782.tif 000016
0004217782.tif 000017
0004217782.tif 000018
0004217782.tif 000019
0004217782.tif 000020
0004217782.tif 000021
0004217782.tif 000022
0004217782.tif 000023
0004217782.tif 000024
0004217782.tif 000025
0004217782.tif 000026
0004217782.tif 000027
0004217782.tif 000028
0004217782.tif 000029
0004217782.tif 000030
0004217782.tif 000031
0004217782.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＲＴＳ患者で報告されているRECQL4遺伝子の突然変異の位置を示す図である。図中の矢印が突然変異の位置を示す。矩形は一つのエキソンに相当する。影付きの矩形は RecQヘリケースドメインを示す。
【図２】図２は、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の作製スキームを示す。上段は野生型マウスのRECQL4遺伝子の構造を示す。中断は、遺伝子ターゲティングベクターの構造を示す。下段は遺伝子ターゲッティングによる相同組み換え後のRECQL4遺伝子の構造を示す。ＴＫはチミジンカイネース遺伝子を示し、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を示す。矢印は転写の方向を示す。
Ｘ印は制限酵素 XbaIの認識配列の部位を示す。
「３’プローブ」は、サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブの領域を示す。
矢頭はＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを示す。
【図３】図３は、RECQL4遺伝子のエキソン１３を破壊させるための、遺伝子ターゲティングベクターの作製の基礎になったベクターNTBluntを示す。
【図４】図４は、野生型マウス（Recql4+/+）、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の個体の尾の一部から抽出したDNAの、Recql4遺伝子の3'プローブによるサザンブロットの結果を示す。
【図５】図５は、遺伝子ターゲッティング前後の、マウスのRECQL4遺伝子の転写産物より作製したcDNAの塩基配列を示す。
【図６】図６は、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）におけるエキソン１３欠失転写産物についての定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図７】図７は、野生型マウス（Recql4+/+）、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の１９日目における外観を示す。
【図８】図８は、野生型マウス（Recql4+/+）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の生後１０週間後における外観を示す。
【図９】図９は、野生型マウス（Recql4+/+）、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス（Recql4+/-）及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス（Recql4-/-）の各個体に由来するＭＥＦの細胞増殖を示す。
【図１】
0004217782.tif 000033
【図２】
0004217782.tif 000034
【図３】
0004217782.tif 000035
【図４】
0004217782.tif 000036
【図５】
0004217782.tif 000037
【図６】
0004217782.tif 000038
【図７】
0004217782.tif 000039
【図８】
0004217782.tif 000040
【図９】
0004217782.tif 000041