(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpP、fabＦのうちの１または２以上を大腸菌に導入して形質転換し、この形質転換大腸菌を炭素源存在下で増殖させ、この増殖した大腸菌からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpPおよびfabＦを大腸菌に導入して形質転換し、この形質転換大腸菌を炭素源存在下で増殖させ、この増殖した大腸菌からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項３】
微生物が大腸菌である請求項１または２の製造方法。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpP、fabＦのうちの１または２以上を大腸菌に導入することによって作出された形質転換大腸菌。
【請求項５】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpPおよびfabＦを大腸菌に導入することによって作出された形質転換大腸菌。
【請求項６】
微生物が大腸菌である請求項４または５の形質転換大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法と、このポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を大量に産生する遺伝子組換え生物に関するものである。さらに詳しくは、この出願は、代替プラスチック等として有用な高純度のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を簡便かつ大量に、しかも安価に製造する方法と、この方法に用いる新規生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以下、「Ｐ（３ＨＡ）」と記載することがある）は、３−ヒドロキシアルカン酸の２以上がエステル結合等により重合した化合物の総称であり、例えば、ポリ−３−ヒドロキシブタン酸、ポリ−３−ヒドロキシヘキサン酸等がある。
【０００３】
このＰ（３ＨＡ）は、近年、代替プラスチック等への利用が有望視されているが、化学合成による製造はコスト高となるため、バイオリアクター等による遺伝子工学的製造方法が検討されている。
この遺伝子工学的方法によるＰ（３ＨＡ）の製造では、Ｐ（３ＨＡ）を蓄積しない大腸菌等の宿主生物に他の生物由来のＰ（３ＨＡ）重合酵素の遺伝子を導入して宿主生物を形質転換し、この形質転換体をグルコース等の炭素源を含む培地で培養する方法が試みられてきた。大腸菌等のＰ（３ＨＡ）非蓄積生物は、その重合酵素を産生しないためにＰ（３ＨＡ）を蓄積しないと考えられるからである。
【０００４】
しかしながら、Ｐ（３ＨＡ）非蓄積生物に重合酵素遺伝子を導入しただけではその形質転換体におけるＰ（３ＨＡ）蓄積能を増大させることはできないことから、大腸菌等におけるＰ（３ＨＡ）の非蓄積性は、その生物がＰ（３ＨＡ）重合酵素を産生しないことだけではなく、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素の基質となる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの産生能が極めて低いことによるものであると推測されている。そこで、Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子とともに、３−ヒドロキシアシルＣｏＡの産生を促進するための脂肪酸合成酵素遺伝子を宿主生物に導入することが試みが報告されている（Ｗilliams 等：Protein Expr. Purif. 7:203-211, 1996）。この従来方法では、ラット由来の脂肪酸合成酵素の変異遺伝子と、Ａlcaligenes eutrophus由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子とを昆虫（Ｓpodoptera frugiperda）細胞に導入し、昆虫細胞用培地で３日間培養した結果、培地１リットル当たり600 mgの乾燥細胞、１mgのポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を得ることに成功している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、Ｗilliams 等の従来方法では、得られるＰ（３ＨＡ）は、乾燥細胞重量当たり0.17％と極めて少量であり、工業的規模での大量製造には適さない。また、宿主生物が昆虫細胞であるため、培養に特別な技術を必要とするといった問題点も存在した。
【０００６】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来方法の問題点を解消し、高純度のＰ（３ＨＡ）を簡便かつ大量に、しかも安価に製造することのできる新しいＰ（３ＨＡ）製造方法を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、この製造方法に用いる遺伝子組換え生物を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、第１に、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpP、fabＦのうちの１または２以上を大腸菌に導入して形質転換し、この形質転換大腸菌を炭素源存在下で増殖させ、この増殖した大腸菌からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法を、第２に、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpPおよびfabＦを大腸菌に導入して形質転換し、この形質転換大腸菌を炭素源存在下で増殖させ、この増殖した大腸菌からポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を単離・精製するポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法を、第３に、微生物が大腸菌である前記第１または２の製造方法を提供する。
【０００８】
またこの出願は、第４には、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpP、fabＦのうちの１または２以上を大腸菌に導入することによって作出された形質転換大腸菌を、第５には、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子fabH、fabＤ、fabＧ、acpPおよびfabＦを大腸菌に導入することによって作出された形質転換大腸菌を、第６には、微生物が大腸菌である前記第４または第５の形質転換大腸菌を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明の方法に使用するＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子は、各種のＰ（３ＨＡ）蓄積生物に由来する遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子としては例えば、Ａeromonas caviae 由来のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子 phaＣAC（Fukui et al., J. Bacteriol. 179:4821-4830, 1997 ）、Ａlcaligenes eutrophus由来のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子 phbＣＡe （Peoples et al., J. Biol. Chem.262:15298-15303, 1989 ）、Pseudomonas aeruginosa由来の重合酵素遺伝子 phaＣ１Ｐa （Timm et al., Eur. J. Biochem. 209:15-30, 1992 ）等である。
【００１１】
あるいは、これらの公知遺伝子をプローブとして、任意生物種のゲノムＤＮＡから単離したＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子を用いることもできる。
これらのＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子は、微生物用の発現ベクターに組み込み、この組換えベクターを定法に従って大腸菌等の微生物に導入することによって形質転換微生物を作出することができる。発現ベクターは、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーター等を有する公知の微生物用発現ベクター（例えば、大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム）などを用いることができる。また、この出願の発明者らが新たに構築したプラスミドベクターｐＪＲＤＴrc１（図１）を用いることもできる。このｐＪＲＤＴｒｃ１は、図１に示したように、市販のｐＴrc99ＡとｐＪＲＤ215 とを組み合わせて構築した新規ベクターであり、そのマルチクローニングサイトに前記のＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子 phaＣAC等を確実に連結することができる。  この発明の方法に使用する脂肪酸合成酵素遺伝子は、真核生物や微生物由来の公知の遺伝子である。例えば、大腸菌Ｅscherichia coli 由来の脂肪酸合成酵素遺伝子 fab（Battner et al., Science 277:1453-1474, 1997 ）、Bacillus subtilis 由来の脂肪酸合成酵素遺伝子 fab（Kunst et al., Nature 390:249-256, 1997）等であり、これらを単独もしくは複数組み合わせて使用することができる。
【００１２】
このような脂肪酸合成酵素遺伝子（群）は、前記Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子と同様に、公知の微生物用発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入することができる。
以上のとおりに構築したＰ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子発現ベクターおよび脂肪酸合成酵素発現ベクターは、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法により同一の宿主微生物に導入する。そして、発現ベクター中の耐性遺伝子による薬剤耐性等を用いて両遺伝子により形質転換した微生物を単離することができる。
【００１３】
このようにして作出した形質転換微生物を、炭素源存在下で、必要に応じて遺伝子の発現誘導処置を施すなどして増殖させることにより、微生物体内にＰ（３ＨＡ）を蓄積させることができる。炭素源は、グルコースやフラクトース等の糖類、または脂肪酸類を制限なく用いることができる。
蓄積されたＰ（３ＨＡ）は公知の方法により単離・精製することができる。例えば、大腸菌の場合には、培養液から遠心分離等により菌体を集め、これを凍結乾燥し、乾燥菌体を酸−メタノール分解し、分解物からクロロホルム抽出によってＰ（３ＨＡ）を単離することができる。そして、各種クロマトグラフィー等により精製することができる。
【００１４】
以下、実施例を示し、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
実施例１
Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子（Ａeromonas caviae ＦＡ440 株由来の phaＣAC遺伝子）をｐＪＲＤＴrc１に組み込み、Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子発現ベクターを構築した（図１）。一方、Ｅscherichia coli ＨＢ101 株由来の脂肪酸合成酵素遺伝子 fabＨ、fabＤ、fabＧ、acpＰおよびfabＦ遺伝子群を連続してｐＵＣ118 にクローニングし、このクローンから図２に示したように、fabＨを含む断片、fabＤを含む断片、および全遺伝子群を含む断片を切り出し、各々をｐＢluescriptII ＫＳ(+) に組み込んで脂肪酸合成酵素遺伝子発現ベクター（それぞれ、ｐＸbＨ1.0 、ｐＥＥv1.6、ｐＸｂＳac5.0 ）を構築した。
【００１６】
Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子発現ベクターと脂肪酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み合わせてＥscherichia coli ＨＢ101 株に同時に導入し、形質転換大腸菌を得た。
これらの形質転換菌をＬＢ（Ｌuria−Ｂertani）培地で30℃で12時間培養した後、遺伝子発現誘導剤としてＩＰＴＧ（Ｉsopropyl−β−Ｄ(-) −thiogalactopyranoside ）を最終濃度１mMになるように添加して４時間培養した。次いで、グルコース（最終濃度10 g／リットル）を添加し、さらに24時間培養した。
【００１７】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、凍結乾燥し、乾燥菌体を酸−エタノール分解し、クロロホルム抽出した後、ガスクロマトグラフィーでＰ（３ＨＡ）の収量およびその組成比を検出した。
なお、比較対照として、 phaＣAC遺伝子のみを導入した遺伝子組換え大腸菌についても同様に培養し、Ｐ（３ＨＡ）の有無を調べた。
【００１８】
結果は表１に示したとおりである。Ｐ（３ＨＡ）重合酵素遺伝子と脂肪酸合成酵素遺伝子群とを導入した形質転換菌からは、モノマーユニットがＲ−３−ヒドロキシブタン酸：100 ％の３ＨＢホモポリマーが得られたのに対し、比較対象として試験した phaＣAC遺伝子のみを導入した形質転換菌からはポリ−３−ヒドロキシアルカン酸は検出されなかった。また、３ＨＢの収率は、 fabＨ、fabＤ、fabＧ、acpＰおよびfabＦ遺伝子群を全て導入した菌が乾燥菌体重量当たり10.3％と最も高く、次いで、fabＨ（6.3 ％）、fabＤ（4.6 ％）であった。
【００１９】
【表１】
0004258577.tif 000002
【００２０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、Ｐ（３ＨＡ）の遺伝子工学的手法による製造方法と、この製造方法に用いる遺伝子組換え生物が提供される。これらの発明によって、高純度のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明に用いることのできるｐＪＲＤＴrc１の構成を示した模式図である。
【図２】実施例で構築した脂肪酸合成酵素遺伝子発現ベクターの挿入遺伝子の関係を示した模式図である。
【図１】
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【図２】
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