(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取された髄液試料中のPS2Vを、固相に結合された１次抗体と反応させ、さらに２次抗体と、以下の手法：
(a)標識された前記2次抗体を反応させる、
(b)ビオチン化された前記2次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
(c)ビオチン化された前記2次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
(d)該2次抗体と反応させた後、標識され、かつ前記2次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定するPS2Vの検出方法であって、
前記1次抗体と2次抗体が、(a)１次抗体がPS2Vを特異的に認識する抗体であり、2次抗体がPS2およびPS2Vを認識する抗体であるか、または(b)１次抗体がPS2およびPS2Vを認識する抗体であり、2次抗体がPS2Vを特異的に認識する抗体であり、
前記PS2Vを特異的に認識する抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、C末端側のSer-Ser-Met-Ala-Glyのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であり、
前記PS2およびPS2Vを認識する抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、42〜58残基のGlu-Asn-Thr-Ala-Gln-Trp-Arg-Ser-Gln-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Gly-Glu-Gluのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であることを特徴とするPS2Vの検出方法。
【請求項２】
標識が放射性同位体、酵素、蛍光分子、発光分子、発色分子あるいは電気化学活性をもつ分子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者から採取された髄液試料中のPS2Vを、固相に結合され、かつPS2Vを特異的に認識する１次抗体と反応させ、さらに、PS2およびPS2Vを認識する２次抗体と、以下の手法：
(a)酵素標識され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させる、
(b)ビオチン化され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された酵素を反応させる、
(c)ビオチン化され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させた後、ビオチン化された酵素およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
(d)PS2およびPS2Vを認識する2次抗体と反応させた後、酵素標識され、かつ該２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、前記酵素の基質を加え、酵素反応によって生成した生成物を検出するPS2Vの検出方法であって、
前記PS2Vを特異的に認識する１次抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、C末端側のSer-Ser-Met-Ala-Glyのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であり、前記PS2およびPS2Vを認識する２次抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、42〜58残基のGlu-Asn-Thr-Ala-Gln-Trp-Arg-Ser-Gln-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Gly-Glu-Gluのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であることを特徴とするPS2Vの検出方法。
【請求項４】
前記酵素が、HRP、ALP、β−D−ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素またはルシフェラーゼである請求項３に記載のPS2Vの検出方法。
【請求項５】
前記酵素がＡＬＰであり、前記酵素の基質が電子供与性基をｏ位およびｐ位の少なくとも１つに有するフェノール誘導体のリン酸エステルである請求項３または請求項４に記載のPS2Vの検出方法。
【請求項６】
電子供与性基が低級アルコキシ基である請求項５記載のPS2Vの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、孤発性アルツハイマー病で認められるPS2Vを抗原抗体反応により検出する方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
背景技術
高齢化社会を迎え、痴呆患者の急激な増加は大きな社会問題となっている。アルツハイマー病（AD）は、痴呆症の一部を構成し、老年期痴呆に占める割合は、日本で約30％、欧米では過半数にも及ぶ。ADは、神経変性疾患の一つで、病理学的特徴として、（１）Aβを主要構成成分として蓄積した老人斑が神経細胞間隔に観察される、（２）神経細胞内に異常リン酸化タウが凝集し、繊維化する神経原繊維が見られる、（３）大脳の萎縮(大脳新皮質や海馬の神経細胞の脱落)が挙げられる。また、臨床的特徴として、進行性の痴呆であり、記憶障害を中心に認知機能全般の低下が起こる。
【０００３】
ADの中には、少数例の常染色体優性遺伝を示す家族性アルツハイマー病（FAD）と明らかに家族歴のない孤発性アルツハイマー病（SAD）に分類される。後者は実にAD全体の９割を占める。FADは、その原因遺伝子として、第21染色体上にアミロイド前駆蛋白質（APP）遺伝子、第14染色体上にプレセニリン-1（PS1）遺伝子、第1染色体上にプレセニリン-2（PS2）遺伝子が同定され、その発症機構が徐々に明らかになってきている。一方、ADの大部分を占めるSADについては、神経病理学的にはFADと同様な所見を示すが発症メカニズムについては、不明な点が多い。
【０００４】
ADの一般的な臨床診断には、米国で提唱されているSM-IV、NINCDS-ADRDA等の認知機能検査が使用されている。しかし、初期のADにおける極めて軽微な認知障害を、従来の認知機能検査を用いて痴呆症状であると診断を行うのは難しい。また、現在用いられているADの確定診断は、死後の脳にアミロイド蛋白の沈着（老人斑）とタウ蛋白の蓄積（神経原繊維変化）を認めることである。よって、有効な生前早期診断法はいまだ確立されておらず、ADの典型的症状（脱見識等の特有の痴呆症状）が現れたときには既に手遅れであるのが現状である。
【０００５】
現在、国際的には数種類の抗痴呆薬が流通しており、日本においても1999年よりドネペジルが臨床で用いられている。これらの薬剤は、早期の症例に対して有効な場合が多く、ADを早期に発見できれば治療効果が期待できるため、ADの早期治療を行う上で有効な診断マーカーの開発が切望されている。
【０００６】
これまでに、PS2遺伝子の5番目のエキソンを欠失したスプライシング変種（PS2V）のmRNAがSAD患者脳の約70%と高頻度に発現していることが報告されている（J. Neurochem., Vol.72, No.6, 1999, 2498-2505）。このPS2VのmRNAは、PS2のN末端のアミノ酸残基119残基（Met1-Leu119）に5つのアミノ酸（Ser-Ser-Met-Ala-Gly）が付加された124アミノ酸からなる蛋白質をコードする。
また、SAD患者脳海馬CA1領域の標本を用いて免疫組織学的にPS2Vを検索した結果、100%の発現が確認された(J.Biol Chem,2001 Jan 19; 276(3) :2108-2114)。
【０００７】
In vitro解析により（１）PS2Vを強制発現させたヒト神経細胞腫SK-N-SH細胞ではストレス応答蛋白質GRP78の発現が抑制されているために、小胞体（ER）ストレスに対し感受性が増していること、（２）GRP78の発現抑制はPS2VがIre1蛋白質（ERストレスセンサー）のリン酸化を阻害し、ERストレス応答を不活性化するためであると考えられたこと、（３）PS2V発現細胞ではAβ1-40、Aβ1-42共に産生が亢進していたことが認められている。この3点から、SADにおいては、PS2Vの発現が引き金となり、神経細胞死やAβの産生亢進を引き起こしている可能性がある。
【０００８】
したがって、PS2Vの発現がAD発症に重要な役割を果たしていることから、PS2Vの高感度検出はADの早期発見につながると考えられる。
PS2Vの検出方法としては、PS2VのmRNAを検出する方法とPS2Vを検出する方法が挙げられる。早期診断に際しては、患者の脳切片を採取することは不可能である。従って、採取が比較的容易な患者の髄液、血液、血清あるいは尿等の体液を用いて検査を行うことが必要である。しかし、髄液や血清中のmRNAの保持時間は極めて短く、速やかに分解されてしまうので、mRNAによる診断は困難である。一方、PS2VはmRNAと比べて髄液や血清中の保持時間は長く、診断方法に用いるのに適すると考えられる。ただし、髄液あるいは血清等中のPS2Vの量は非常にわずかであるので、高感度にPS2Vを検出する方法が必要である。
【０００９】
なお、神経細胞の培養系において、酸化ストレス負荷やβ−アミロイド刺激などにより、異常なPS2遺伝子のスプライシング変種を発現誘導することによるPS2Vの製造法は特開２０００−３７１９２号に既に開示されているが、PS2Vの高感度検出を行った方法はいまだ見出されていない。
【００１０】
また、従来より酵素免疫測定法や核酸検出法において、アルカリホスファターゼ(以下ALP)が標識分子としてしばしば用いられる。このALPはリン酸エステル体である基質を加水分解するので、得られた生成物を定量することにより、ALPで標識された目的とする生体関連分子の定量を行うことができる。
【００１１】
ALPによる加水分解生成物の定量方法の相違により、加水分解生成物の検出方法は吸光検出、化学発光検出、蛍光検出および電気化学的検出の４種類に分類される。
ALPの基質として、ｐ−メトキシフェニルリン酸等を用いて、電気化学的に検出する方法が、Analytica Chemica Acta 393 (1999) 95-102等の文献に、既に報告されている。しかし、これらの基質を用いてPS2Vの高感度検出を行った方法はいまだ見出されていない。
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、早期診断に利用可能なPS2Vの高感度検出法およびその方法に用いる標識酵素の基質を見出すことが所望されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の開示
本発明によれば、患者から採取された体液試料中のPS2Vを、固相に結合された１次抗体と反応させ、さらに２次抗体と、以下の手法：
(a)標識された前記2次抗体を反応させる、
(b)ビオチン化された前記2次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
(c)ビオチン化された前記2次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
(d)該2次抗体と反応させた後、標識され、かつ前記2次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定するPS2Vの検出方法であって、
前記1次抗体と2次抗体が、(a)１次抗体がPS2Vを特異的に認識する抗体であり、2次抗体がPS2およびPS2Vを認識する抗体であるか、または(b)１次抗体がPS2およびPS2Vを認識する抗体であり、2次抗体がPS2Vを特異的に認識する抗体であり、
前記PS2Vを特異的に認識する抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、C末端側のSer-Ser-Met-Ala-Glyのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であり、
前記PS2およびPS2Vを認識する抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、42〜58残基のGlu-Asn-Thr-Ala-Gln-Trp-Arg-Ser-Gln-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Gly-Glu-Gluのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であることを特徴とするPS2Vの検出方法が提供される。
【００１５】
とくに標識が酵素の場合、患者から採取された体液試料中のPS2Vを、固相に結合され、かつPS2Vを特異的に認識する１次抗体と反応させ、
PS2およびPS2Vを認識する２次抗体と、以下の手法：
(a)酵素標識され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させる、
(b)ビオチン化され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された酵素を反応させる、
(c)ビオチン化され、かつPS2およびPS2Vを認識する2次抗体を反応させた後、ビオチン化された酵素およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
(d)PS2およびPS2Vを認識する2次抗体と反応させた後、酵素標識され、かつ該２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、前記酵素の基質を加え、酵素反応によって生成した生成物を検出するPS2Vの検出方法であって、
前記PS2Vを特異的に認識する１次抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、C末端側のSer-Ser-Met-Ala-Glyのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であり、
前記PS2およびPS2Vを認識する２次抗体が、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、42〜58残基のGlu-Asn-Thr-Ala-Gln-Trp-Arg-Ser-Gln-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Gly-Glu-Gluのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体であることを特徴とするPS2Vの検出方法が好適に使用される。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による化学発光測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
図２は、くも膜下出血患者、水頭症患者及び孤発性アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のPS2Vを測定した本発明による結果を示した図である。
【００１９】
図３は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による吸光度測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
図４は、本発明による電気化学的検出において用いるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの構成を示した図である。
図５は、本発明によるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの検出器の構成を示す図である。
【００２０】
図６は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原量依存性、３回平均値）。
図７は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原０をバックグラウンドとして差し引いた値）。
【００２１】
図８は、rGST-PS2Vを試料として競合法による吸光度測定を行った本発明による実施例３の結果を示した図である。
図９は、rGST-PS2Vを試料として競合法による電気化学検出を行った本発明による実施例４の結果を示した図である。
【００２２】
発明を実施するための最良の形態
本発明で検出の対象とするPS2V（配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）は、プレセニリン-2のエキソン5を欠くスプライシング変種に由来するポリペプチドであって、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示した配列のアミノ酸配列を有するか又はこのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸の付加、欠失又は置換は、通常１〜約20個、好ましくは１〜約10個、より好ましくは１〜約5個である。このようなポリペプチドは、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列と通常約80％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有する。配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１は、PS2VのmRNAに対応するcDNAの配列である。
【００２３】
正常のPS2遺伝子のcDNAの配列は配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示したもので、エキソン5を欠く（エキソン4とエキソン6の接合した）スプラインシング変種（PS2V）遺伝子のcDNAの配列は配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４において示される。配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の塩基配列において、エキソン４とエキソン６の接合部位は、705番目と706番目の塩基配列の間に存在する。配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の塩基配列において、359番目から724番目の領域に相当する。なお、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜４までの配列は、特開2000-37192に開示されている。
【００２４】
本発明で使用する試料としては、髄液や血清等の体液試料を用いることが好ましい。
【００２５】
PS2Vを特異的に認識する抗体とは、PS2を認識しないがPS2Vを認識する抗体であり、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、C末端側のSer-Ser-Met-Ala-Glyのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体である。
PS2およびPS2Vを認識する抗体とは、PS2とPS2Vとで共通するアミノ酸配列を認識する抗体であり、例えば、PS2のアミノ酸配列の42〜58残基目を認識する抗体が挙げられる。
【００２６】
これらの抗体は、Ser-Ser-Met-Ala-Glyを含むペプチドやPS2のアミノ酸配列の42〜58残基目を含むペプチドを調製し、これらのペプチドを常法に従って、ウサギ等に一定期間免疫後得られる血清から入手することができる。
また、これらの抗体は、非特異反応抑制のために、F(ab')2またはFab'フラグメントとして使用することが好ましい。
【００２７】
なお、抗体への標識には、放射性同位体（125I）、酵素、蛍光及び発光分子(フルオロセインなどの色素、GFPなどの蛍光蛋白,希土類錯体、有機EL素子材料など)、発色分子(光活性黄色タンパク質：PYPなど)、電気化学活性をもつ分子(フェロセンなど)などが使用できる。
例えば、抗体を酵素標識するには、抗体に直接酵素で標識した酵素標識抗体を使用してもよい。または抗体をビオチン化し、ついでビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）の特異結合を利用して、アビジン（あるいはストレプトアビジン）化された酵素を結合させてもよい。もしくはビオチン化した抗体にアビジン（あるいはストレプトアビジン）とビオチン化された酵素を作用させてもよい。または、未標識の抗体と反応させた後、この抗体を認識する酵素標識された抗体を使用してもよい。
【００２８】
なお、高感度にPS2Vを検出する必要がある場合、標識反応時の影響による抗体活性の低下および酵素標識された抗体の非特異吸着が問題となることが多い。つまり抗体の抗原結合部位への修飾を抑制し、かつ、多量体化を防ぐことが重要である。この対策としてFab'のチオール基に酵素を導入する方法がある。具体的には抗体のアミノ基を無差別に修飾する試薬を避け、N-スクシニミジル-6-マレイミドヘキサノエートのようなヘテロ2官能性架橋剤を用い、抗体のジスルフィドを還元して得たチオール基と酵素のアミノ基の間で複合体化する。具体的には、まず、疎水性が高いFc部分を除去するためIgGをペプシン消化してF(ab')2フラグメントを回収し、ヒンジ部のジスルフィド結合を2mmol/l  2-メルカプトエチルアミン(5mmol/l EDTAを含む0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0、37℃、90分)により温和な条件で還元し、チオール基とすることによりFab'を調製する。Fab'を濃縮した後、マレイミド基を導入した酵素と反応させると酵素標識された抗体が得られる。
【００２９】
酵素としては、標識として使用される公知のものが使用でき、例えば、HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）やALP（アルカリホスファターゼ）、β-D-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等を使用することができる。基質は吸光基質や蛍光基質、そして発光基質等使用する酵素によって適宜選択される。例えば、ルミノール、o-フェニレンジアミン(OPD)、3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB)、2-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、4-ニトロフェニル-フォスフェート、4-メチルウムベリフェリル-β-D-ガラクトシド、グルコース-6-リン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等が挙げられる。酵素がＡＬＰであるとき、その基質はｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、フェニルリン酸、アミノフェニルリン酸、ナフチルリン酸、４-メチルベリフェリルフォスフェートなどを使用することができる。
【００３０】
本発明の方法においては、酵素がＡＬＰであるとき、その基質として、電子供与性基をｏ位およびｐ位の少なくとも１つに有するフェノール誘導体のリン酸エステルを用いるのが好ましい。電子供与性基としては、アルキル、エーテル、シリル、アミノ基およびそれらの誘導体等が挙げられる。好ましくは、低級アルコキシ基が挙げられる。さらには、ｐ−メトキシフェニルリン酸を用いるのがより好ましい。
【００３１】
本発明のPS2Vの検出法を、1次抗体としてPS2Vを特異的に認識する抗体を、2次抗体としてPS2またはPS2Vを認識する抗体を用い、標識として酵素を用いる場合を例に挙げて説明する。なお、1次抗体と2次抗体の組み合わせが逆の場合でも同様に測定を実施できる。
【００３２】
まず、PS2とは反応しないがPS2Vとは反応する（PS2Vを特異的に認識する）1次抗体を固相に結合させる。固相としては、試験管、96穴の反応プレート、ビーズ等が使用できる。また、固相への1次抗体の結合は従来公知の方法が実施でき、例えば物理吸着法や、グルタルアルデヒドやカルボジイミド等の架橋化剤を用いた化学結合法が挙げられる。
【００３３】
抗体を結合させた後、固相への非特異吸着を防ぐために、該固相にBSA（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、PVA(ポリビニルアルコール)、スキムミルク、ケラチン、デキストラン、ゼラチン等適当なブロッキング剤を使用してブロッキング処理を施す。
【００３４】
次に、試料中のPS2Vをこの1次抗体と反応させる。反応温度は、約４〜４０℃、好ましくは約４〜３０℃、反応時間は、約５分〜オーバーナイト、好ましくは約４０分〜６時間で行うことができる。本工程により、PS2Vのみが固相に捕捉される。
【００３５】
次にB/F分離を行った後、PS2またはPS2Vを認識する2次抗体と反応させる。反応条件は、1次抗体の反応条件と同様の条件で行うことができる。この2次抗体としては、前述のように抗体に直接酵素で標識した抗体を用いることができる。あるいはビオチン化した2次抗体を反応させた後、さらにアビジン（あるいはストレプトアビジン）化酵素を結合させて酵素標識することができる。もしくはビオチン化した2次抗体にアビジン（あるいはストレプトアビジン）とビオチン化酵素を作用させることもできる。あるいは未標識の2次抗体と反応させた後、この2次抗体を認識する酵素標識抗体を反応させて酵素標識を行うこともできる。
【００３６】
次いで、酵素の基質を加えて反応させ、酵素反応によって生成した生成物を検出する。好適な反応温度や反応時間等の反応条件は、使用する酵素や基質の組み合わせによって異なるが、例えば、酵素としてHRPを用いる場合について説明する。（１）基質にOPDを用いたとき、反応緩衝液に0.012〜0.02%の過酸化水素を含むOPD濃度0.4mg/mlの0.05M クエン酸-リン酸緩衝液(pH5.0)で１分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間、２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行い、基質液量の1/4量の3Nの塩酸もしくは３Mの硫酸で反応を停止させ、490nmの吸光度を測定する。（２）TMBを用いたとき、反応緩衝液に0.01〜0.02%の過酸化水素を含むTMB濃度0.1〜0.2mg/mlの1% DMF、0.01% Tween20入り0.1M クエン酸緩衝液(pH5.5)で１分〜２時間、好ましくは５〜３０分、２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行い、基質液量と等量の１Mのリン酸、塩酸もしくは硫酸で反応を停止させ、450nmの吸光度を測定する。（３）ルミノール基質の場合、１〜３０分、好ましくは１〜７分、２０〜３７℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行う。酵素反応によって生成した反応物は、吸光度で検出可能なものであれば分光光度計で、蛍光検出可能なものは、蛍光分光光度計で、発光物質の場合は発光光度計で、反応物が電極上で酸化されるときに生じる電流を検出する場合は電気化学検出器で検出することができる。PS2Vは酵素反応により生成した生成物の存在により検出される。より詳細には、PS2Vの量は、濃度既知のPS2Vを添加した際に得られる酵素反応生成物から作成した検量線より算出できる。
【００３７】
また、別の実施形態として、あらかじめ試料と2次抗体を混合し1時間程度反応させた後、この反応混合物を含む液を1次抗体を固定した反応プレートのウェルに添加して1次抗体と反応させ、B/F分離を行った後、上記と同様に操作を行って測定を実施することができる。
【００３８】
なお、PS2Vの検出は、競合法を用いて行うこともできる。まず、抗原を固相に結合させる形態では、一定量のPS2Vを公知の手段によって固相に固定化する。このとき使用するPS2Vは、前述の変異ポリペプチドを含むものであれば特に制限されず、精製したPS2V、合成ペプチド、あるいは融合蛋白が使用できる。
【００３９】
次に、PS2Vを固定化した反応容器内に試料を添加し、続いてPS2Vを特異的に認識する抗体を一定量添加して固相上のPS2Vと試料由来のPS2Vとを競合させて反応を行う。このとき固相上のPS2Vと試料由来のPS2Vとの間で抗体を奪い合う。固相上のPS2Vと抗体の量は一定であるため、試料由来のPS2Vの量が多くなるほど抗体の固相上のPS2Vへの結合量は減少する。あらかじめブランク試料としてPS2Vを含まない試料を測定して固相への抗体の結合量を求めておけば、減少した結合量から試料中のPS2V量を求めることができる。反応温度、反応時間などの反応条件はサンドイッチ法と同様である。反応後、B/F分離を行って、固相に結合していないPS2Vや抗体を除去する。続いて、抗体としてあらかじめ標識した標識抗体を使用する場合は標識量を測定し、ビオチン化された抗体を使用する場合は、さらにアビジン（またはストレプトアビジン）化された標識を用いて標識を行い、あるいは、PS2Vを特異的に認識する抗体と反応させた後、これを認識する標識抗体を用いることによって標識し、標識された量を測定することによってPS2Vを検出できる。なお、標識には上記と同様のものが使用できる。
【００４０】
また、抗体を固相に結合させる形態では、PS2Vを特異的に認識する一定量の抗体を公知の手段によって固相に固定化する。また、標識したPS2Vを用意する。このとき使用するPS2Vは、前述の変異ポリペプチドを含むものであれば特に制限されず、精製したPS2V、合成ペプチド、あるいは融合蛋白が使用できる。PS2Vを標識するには、公知の蛋白の標識手段で実施できる。標識としては、上記と同様のものを使用することができる。
【００４１】
さらに、PS2Vを特異的に認識する抗体を一定量固定化した反応容器内に、標識されたPS2V一定量と、未知量のPS2Vを含む試料を添加し、標識PS2Vと試料由来のPS2Vとを競合させて、抗体を奪い合う。固相上の抗体と標識されたPS2Vの量は一定であるため、試料由来のPS2Vが多くなるほど標識PS2Vの固相上の抗体への結合量は減少する。あらかじめブランク試料としてPS2Vを含まない試料を測定して固相への標識PS2Vの結合量を求めておけば、減少した結合量から試料中のPS2V量を求めることができる。反応温度、反応時間などの反応条件はサンドイッチ法と同様である。反応後、B/F分離を行って、固相に結合していない標識PS2Vを除去する。続いて、固相に捕捉された標識PS2Vの量を測定することによってPS2Vを検出できる。
【実施例】
【００４２】
以下に、1次抗体としてPS2Vを特異的に認識する抗体を、2次抗体としてPS2またはPS2Vを認識する抗体を用いた実施例を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
1次抗体（ウサギ抗SSMAG抗体）の調製
合成ペプチドGly-Arg-Leu-Ser-Ser-Met-Ala-GlyのN末端側にシステイン残基を加え、このSH基とヘモシアニン(KLH)のアミノ基をm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて常法に従い、複合体化した（Biochemistry,18,690-697(1979)）。この複合体をウサギの背中皮内に免疫し抗血清を調製し、同ペプチドを架橋したアフィニティカラムにて精製した。なお、抗体はサワディテクノロジー株式会社に依頼して調製した。
【００４３】
2次抗体(ウサギ抗PS2N抗体：Anti PS2N Ab)の調製
合成ペプチドGlu-Asn-Thr-Ala-Gln-Trp-Arg-Ser-Gln-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Gly-Glu-Glu（PS2のアミノ酸配列の42〜58番目）のN末端側にシステイン残基を加え、このSH基とヘモシアニン(KLH)のアミノ基をm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて常法に従い、複合体化した。この複合体をウサギの背中皮内に免疫し抗血清を調製し、同ペプチドを架橋したアフィニティカラムにて精製した。なお、抗体はサワディテクノロジー株式会社に依頼して調製した。
【００４４】
2次抗体のビオチン化
Centricon YM30（Cut-off=30000Da、Amicon社製）へ上記で調製したAnti PS2N Ab 372.1μg/mlを1ml加え、4℃、4500rpm、30分間処理し、100μlへ濃縮した。PBS(-)1.5mlを添加し、同じ条件で遠心操作を行い、濃縮し、500μlになるようにPBS(-)でメスアップした。
10mlのPBS(-)で平衡化を行ったNAP-5カラム（Amersham Pharmacia Biotech社製）に上記で処理したAnti PS2N Ab溶液500μlを通し、500μlの溶出液を廃棄した後1mlの溶出液(抗体を含むフラクション)を回収した。吸光度A280を測定し（吸光係数ε＝1.4ml/mg・cm）、抗体濃度を算出した。（抗体濃度＝282.4μg/ml）
【００４５】
次に、ビオチン化試薬EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(スルフォスクシニミジル-6-（ビオチンアミド）ヘキサノエート,Pierce社製)を、ビオチン化試薬：IgG＝54mol：1.3mol＝42:1となるように抗体液にビオチン化試薬を添加し、4℃、2時間反応させた。次いで、Centricon YM30へ反応物を含む溶液を1ml加え、4℃、4500rpm、30分間処理し、100μlへ濃縮した。TBS1.5mlを添加し、同じ条件で遠心操作及び濃縮を２回実施し未反応のビオチン化試薬の除去と濃縮を行った。吸光度A280を測定し（吸光係数ε＝1.4ml/mg・cm）、抗体濃度を算出した。（抗体濃度＝378.83μg/ml）
【００４６】
遺伝子組換えGST-PS2V（ｒGST-PS2V）の調製
（１）ヒト神経細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）を、10cm径の培養皿で、10％v/vウシ胎児血清含有α−MEM培地（α−Minimum Essential Medium；ＧＩＢＣＯ社製）中、コンフルエントな状態まで、37℃で約４８時間ＣＯ2培養器で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換し、約２時間培養した。
前記培養細胞についてさらに、培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ2、５％ＣＯ2）（Coy Laboratory Products社製）に移し１６時間培養した。
【００４７】
前記のように培養した細胞を回収し、生理的リン酸緩衝液（PBS：Phosphate buffered Saline）で洗浄した。これを、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）700μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液から、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製は、ＲＮＡ調製用キット（商品名：RNeasy total RNAキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
【００４８】
（２）PS2VのcDNAの調製
前記で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、１μｇ）を鋳型とし、オリゴｄＴプライマー（50 pmole）、ランダムオリゴヌクレオチド（5 pmole）及びリバーストランスクリプターゼ（Promega社製、Moloney leukaemia virus reverse transcriptase）（200単位）を含む緩衝液（0.05M Tris-HCl,pH8.3, 0.075M KCl,0.003M MgCl2, DTT, 0.0002M deoxynucleotides）0.05ml中、４２℃で１時間反応させて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００４９】
（３）ベクターの調製
PS2V遺伝子の5'と3'末端に、ベクターｐGEX-4T-1（Amersham Pharmacia Biotech）のマルチクローニングサイトに組み込め、インフレームとなるようにプライマー(配列は以下の通り。センスプライマー：5'-GAA TTC ATG CTC ACA TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAA G-3' （配列SEQ ID No.5）およびアンチセンスプライマー：5'-CTC GAG TCA ACC AGC CAT GGA TGA AAG CTG TCC ATT CTT C-3' （配列SEQ ID No.6）)を設計し、上記で得た一本鎖DNAを用いてPCR(変性反応９５℃、３０秒、伸長反応７２℃で１分、アニーリング５５℃で３０秒の条件（サイクル数；３０サイクル）で行った。)を行って遺伝子断片を調製、単離し、これを制限酵素EcoRI及びXhoIで切り出した。また、ｐGEX-4T-1についても同様にEcoRI及びXhoI部位を切断した。
【００５０】
次に、単離したPS2V遺伝子断片を精製し、上記で処理したｐGEX-4T-1を混合し、ライゲーションを行って、ｐGEX-4T-1のマルチクローニングサイトにPS2V遺伝子を導入した。DNAシーケンサで正しい配列であることを確かめ、ｐGEX-4T-1/PS2Vプラスミドとした。ライゲーションはライゲーションキット（商品名：DNA Ligation Kit Ver.2、TaKaRa社製）を用いて行った。
【００５１】
（４）rGST−PS2Vの発現
上記で調製したrGST−PS2V発現ベクターをJM109コンピテントセル（大腸菌）にトランスフォーメーションしてLB培地プレートに添加し、培養した。出てきたコロニーに正しくベクターが導入されていることをPCRで確認した。
次に、コロニーを100μg/mlのアンピシリンナトリウム入りの液体のLB培地に加え、オーバーナイトで培養した。
【００５２】
上記オーバーナイト培養液2mlを200mlのLB培地に加え、37℃、2時間後に最終濃度0.1mMになるようにIPTG（イソプロピル−β−D-チオガラクトピラノシド）を加えて融合蛋白の発現誘導を行った。
2時間後に菌体を回収した。50mlの培養液に対し、4℃、8000rpm、10分間遠心後、沈渣を回収した。沈渣に最終濃度1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む3mlのPBSに懸濁させ、懸濁液を氷冷し、ソニケータで菌体を破壊し、遠心後（4℃、15000rpm、10分）、上清を回収した。
【００５３】
次いで、回収した上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（Amersham Pharmacia Biotech製）カラムに通した。50mM Tris−HCl(pH7.4)で洗浄した後、10mM還元型グルタチオン溶液でrGST-PS2Vを溶出させた。回収した各フラクションの吸光度を測定し、A280の大きなフラクションの電気泳動を行い、rGST-PS2Vの存在を確認した。透析によりグルタチオンを除去した後、Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories製)を用いて蛋白濃度を測定してrGST-PS2Vの標品とした。
【００５４】
実施例１  サンドイッチ法によるrGST-PS2Vの測定（HRPおよびルミノールを用いる方法）
（１）固相への1次抗体の固定
96穴プレート（Cliniplate,  Labsystems社製）に上記で調製した1次抗体を1pmol／ウェル添加し、37℃、1時間放置した。0.5%w/v Block Ace(大日本製薬株式会社製)を含むTBS-T（50mM Tris-HCl 150mM NaCl 0.05%w/v Tween 20(pH7.4)） 0.32ml／ウェルで3回洗浄し、25%w/v Block Aceを含むTBS（50mM Tris-HCl 150mM NaCl(pH7.4)）溶液300μl／ウェルを加え、37℃で1時間放置してブロッキングを行った。
【００５５】
（２）rGST-PS2Vの化学発光測定
上記で調製したプレートに、rGST-PS2Vを０〜31pmol含む正常血清溶液を50μl/ウェル添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、0.5%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄し、B/F分離を行った。
次に上記で調製したビオチン化2次抗体を0.3pmol／ウェル添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、0.5%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄した後、ストレプトアビジン−HRP（Zymed Laboratories製）の5000倍希釈0.5%w/v Block Ace含有TBS-T溶液を50μl/ウェルを添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、0.5%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄した。
次に、発光基質であるルミノール（Super Signal ELISA Pico, Pierce製）を80μl/ウェル添加し、30℃、5分反応させた。酵素反応開始より5分経過した時点で10秒間の積算発光量を求めた。発光量の測定には、Labsystems Luminoskan(大日本製薬株式会社)を用いた。図１に示したようにamol(10-18mol)オーダーの検出感度が得られた。
【００５６】
SAD患者脳脊髄液の測定
SAD患者4例、くも膜下出血患者1例及び水頭症患者2例の脳脊髄液を試料とし、上記と同様にして、PS2Vの測定を行った。結果を図２に示す。他の症例に比較して高値を示し、SAD診断の指標になり得ることが確認できた。
【００５７】
rGST-PS2Vの吸光度測定
96穴プレート（ELISA Plate,  IWAKI製）に上記で調製した1次抗体を3pmol／ウェル添加した以外は上記と同様の操作を行って抗原抗体反応を行った。酵素反応は、基質としてTMB（KPL製）を100μl／ウェル添加し、30℃、15分間反応させた。酵素反応開始より15分後１M H3PO4 100μl／ウェル添加し、VERSAmax tuneable microplate reader(Molecular Devices製)を用いて450nmと650nmにおける吸光度の間でバックグラウンド補正を行い、450nmで吸光度測定を行った。吸光度の平均値を図３に示す。化学発光法と同様にamolオーダーの検出感度が得られた。
【００５８】
実施例２  サンドイッチ法によるrGST-PS2Vの測定（ALPおよびpMPP（ｐ−メトキシフェニルリン酸）を用いる方法）
（１）固相への1次抗体の固定
96穴プレート（Cliniplate,  Labsystems社製）に上記で調製したウサギSSMAG抗体（1次抗体）を6.25×10-11mol／ウェル添加し、37℃、1時間放置した。0.1%w/v BSA(SIGMA製A6003)を含むTBS-T（50mM Tris-HCl 150mM NaCl 0.05%w/v Tween 20(pH7.4)） 300μl／ウェルで3回洗浄し、3%w/v BSAを含むTBS-T溶液305μl／ウェルを加え、37℃で1時間放置してブロッキングを行った。
【００５９】
（２）rGST-PS2Vの電気化学検出による測定
上記で調製したプレートに、rGST-PS2Vを1×10-17〜1×10-12mol含む正常血清溶液を50μl/ウェル添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、0.1%w/v BSAを含むTBS-T 300μl／ウェルで3回洗浄し、B/F分離を行った。
次に上記で調製したビオチン化2次抗体（ウサギ抗PS2N抗体）を3.12×10-13mol／ウェル添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、3% w/v BSA(SIGMA製A6003)を含むTBS（50mM Tris-HCl 150mM NaCl(pH7.4)）溶液305μl／ウェルを加え、37℃で1時間放置してブロッキングを行い、0.1%w/v BSAを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄した後、ストレプトアビジン−ALP（DAKO製）の5000倍希釈0.5%w/v Block Ace含有TBS-T溶液を50μl/ウェルを添加し、37℃、1時間反応させた。反応後、0.1%w/v BSAを含むTBS-T 300μl／ウェルで3回洗浄した。
【００６０】
次に、基質である0.5M CB-Buffer中10mMのｐMPP（Analytica Chimica Acta 393 (1999) 95-102に記載の方法に従い製造した、田辺R&D製）を90μl/ウェル添加し、さらに0.1M Mg(ClO4)2を20μl、0.5M CB-Buffer （pH9.5）10μlおよびRO水を60μl添加し、37℃、30分反応させた。その後、45μlの0.6M EDTA-3Na溶液（NaOHにてpH9.5に調製）を0℃で添加して酵素反応を停止させた。また酵素反応停止後、各ウェルの酵素反応停止液を別のプレート(ELISA Plate,  IWAKI製)に移し変えた。
【００６１】
次いで、ALPによるｐMPPの加水分解された生成物、ｐ−メトキシフェノールを検出した。検出には、フロー式電気化学アンペロメトリック検出システム(Flow Injection Analysis-Electro Chemical-Amperometric Detection System :以下FIA-EC-DT)を用いた。そのFIA-EC-DTの構成図を図4に示す。
FIA-EC-DTは、デガッサ(:Vacuum Degasser LC-27A),ポンプ(:MICRO LC PUMP LC-100),インジェクトバルブ(Reodine製  77251), ODSカラム(YMC-Pack-ODS-AM,AM3C7AM12S05-L502WT No.02070458(W)),ショートカラム(YMC セミミクロガードカートリッジカラム2×10 AM12S05-0102CC),電極検出部で構成される。
【００６２】
FIA-EC-DT流路内には、45%v/vまたは50%v/vメタノールを含む0.1Mのリン酸緩衝液を溶出液として流す。デガッサ(:Vacuum Degasser LC-27A)は、溶出液の気泡を除去し、ポンプ(:MICRO LC PUMP LC-100)は溶出液を250μl/minで電極検出部まで送液する。この送液状態で、インジェクトバルブ(Reodine製  77251)からサンプルを注入する。本発明におけるFIA-EC-DT流路への測定試料のサンプル量は20μlとなるように設定した。
【００６３】
インジェクトバルブと電極検出部の間には、測定試料に混入する蛋白成分が電極検出部に到達することで電極表面の汚れを防止するために、ショートカラムを配置した。またショートカラムにより、緩衝液由来のノイズ電流と検出成分の電流を検出器に到達する時間で分離する
【００６４】
電極検出器の構成を図5に示す。電気化学検出では一般に、検出対象物質の酸化還元電位を供給し、酸化還元反応に伴う酸化還元電流を取り込む作用電極、また作用電極（ＷＥ）の酸化還元電位を設定する時に基準となる参照電極、また酸化還元反応の時に余剰の酸化還元電流が参照電極（ＲＥ）に流れないようにするためのカウンター電極（ＣＥ）が必要である。良く用いられる電気化学検出系では各電極を1つずつ構成する3電極系、作用電極を2つ,他の電極を各1つずつもつ4電極系がある。本システムFIA-EC-DTの電極検出部には3電極系を使用しており、参照電極にはAg/AgCl電極(BAS RE-3V)、カウンター電極には流路一体型電極、作用電極にはグラッシーカーボン電極(BAS 003456)を使用した。また電気化学測定器はBAS社のALS832aを使用した。
【００６５】
検出物質は、基質の加水分解反応生成物であるp-メトキシフェノールである。あらかじめｐ−メトキシフェノール（和光純薬工業株式会社084-01282(特級品)をそのまま使用）を0.1M リン酸緩衝液(pH6.92)により1nM〜1μMまで系列希釈液を作製し、各サンプルをFIA-EC-DTにインジェクトし、酸化電流値のピークを求めて電気化学検出し、検量線を作成した。検出条件は、作用電極電位（酸化電位）が０．５５V vs Ａｇ／ＡｇＣｌ、インジェクトから電極検出部までの出現時間が９０秒である。
【００６６】
同検出条件下で、酵素反応を停止させた本実施例のサンプルをＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴにインジェクトし、酸化電流値のピークを求めた。その結果を図６および７に示す。
図６および７の結果から、1×10-17mol〜1×10-12mol(10amol〜1pmol)の範囲内で３回測定の同時再現性（変動率）10％以下のrGST-PS2V量依存性が確認された。またrGST-PS2V 0molのシグナルレベルをバックグラウンド電流として、各rGST-PS2V分子数における電流値からバックグラウンド電流を引いて(0補正)、rGST-PS2V依存性を確認すると1×10-17mol〜1×10-12mol(10amol〜1pmol)の範囲でも直線性が良好であることが示された。これにより、基質pMPPを用いたALPの電気化学検出をSandwich-ELISAに適用した場合、例えばrGST-PS2Vの蛋白でもamolオーダーの検出能を有することができることが示された。
【００６７】
実施例３  競合法によるrGST-PS2Vの測定
（１）固相へのrGST-PS2Vの固定
96穴プレート（Cliniplate,  Labsystems社製）に上記で調製したrGST-PS2V 1.45μg/mlTBS溶液を50μl／ウェル添加し、室温で2時間放置した。0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄し、25%w/v Block Aceを含む50mM Tris-HCl 150mM NaCl溶液300μl／ウェルを加え、37℃で1時間放置してブロッキングを行った。
【００６８】
（２）rGST-PS2Vの測定
上記で調製したプレートに、rGST-PS2Vを０〜31pmol含む正常血清溶液を25μl/ウェル添加し、続いて上記で調製したウサギ抗SSMAG抗体（PS2Vを特異的に認識する抗体）0.03μg/mlを25μl/ウェル添加し、37℃で1時間反応させた。0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄した後、抗ウサギIgG-HRP（DAKO社製）1000倍希釈TBS-T溶液（0.1%w/v Block Ace含有）50μl添加し、37℃で1時間反応させた。
【００６９】
0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 0.32ml／ウェルで3回洗浄した後、発光基質であるルミノール（Super Signal ELISA Pico, Pierce製）を80μl/ウェル添加し、30℃で5分反応させた。酵素反応開始より5分経過した時点で10秒間の積算発光量を求めた。発光量の測定には、Labsystems Luminoskanを用いた。結果を図８に示す。競合法でも測定できることが確認された。
【００７０】
実施例４  競合法によるrGST-PS2Vの測定
（１）固相へのrGST-PS2Vの固定
96穴プレート（Cliniplate,  Labsystems社製）に上記で調製したrGST-PS2V 1.45μg/mlTBS溶液を50μl／ウェル添加し、室温で1時間放置した。0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 300μl／ウェルで3回洗浄し、25%w/v Block Aceを含む50mM Tris-HCl 150mM NaCl溶液305μl／ウェルを加え、37℃で1時間放置してブロッキングを行った。
【００７１】
（２）rGST-PS2Vの電気化学検出による測定
上記で調製したプレートに、rGST-PS2Vを0〜1mol含む正常血清溶液を25μl/ウェル添加し、続いて上記で調製したウサギ抗SSMAG抗体（１次抗体）0.1mg/mlを25μl/ウェル添加し、37℃で1時間反応させた。0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 300μl／ウェルで3回洗浄した後、抗ウサギIgG-ALP（２次抗体）（DAKO社製）4000倍希釈TBS-T溶液（0.1%w/v Block Ace含有）50μl添加し、37℃で1時間反応させた。
【００７２】
0.1%w/v Block Aceを含むTBS-T 300μl／ウェルで1回洗浄した後、基質であるｐMPP（田辺R&D製）の1mmol/lの溶液を100μl/ウェル添加し、37℃で30分反応させた。その後、45μlの0.6M EDTA-3Na溶液（NaOHにてpH9.5に調製）を0℃で添加して酵素反応を停止させた。実施例２と同様にして、電気化学検出によりrGST-PS2Vの量を測定した。
図９に測定した結果を示す。試料中の抗原rGST-PS2V量が30fmolより変化が認められ、30fmolの検出感度の競合アッセイを組むことができると考えられる。
【００７３】
産業上の利用の可能性
本発明によれば、体液試料を用いてPS2Vを高感度に検出することができるので、孤発性アルツハイマー病の早期診断に有用な検査データを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による化学発光測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
【図２】図２は、くも膜下出血患者、水頭症患者及び孤発性アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のPS2Vを測定した本発明による結果を示した図である。
【図３】図３は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による吸光度測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
【図４】図４は、本発明による電気化学的検出において用いるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの構成を示した図である。
【図５】図５は、本発明によるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの検出器の構成を示す図である。
【図６】図６は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原量依存性、３回平均値）。
【図７】図７は、rGST-PS2Vを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原０をバックグラウンドとして差し引いた値）。
【図８】図８は、rGST-PS2Vを試料として競合法による吸光度測定を行った本発明による実施例３の結果を示した図である。
【図９】図９は、rGST-PS2Vを試料として競合法による電気化学検出を行った本発明による実施例４の結果を示した図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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