(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）由来のジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素遺伝子で形質転換された大腸菌または該大腸菌により産生された同酵素を、ジヒドロキシアセトンに作用させることを特徴とする、ジヒドロキシアセトン-3-リン酸を製造する方法であって、
該ジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素遺伝子の塩基配列は、配列番号：１で示されるか、または、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードするものである、前記方法。
【請求項２】
酵素反応が補酵素ATPの再生条件下において行われる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素を利用してジヒドロキシアセトン-３-リン酸を製造する方法に関する。
背景技術
ジヒドロキシアセトン-３-リン酸はフラクトース1,6-二リン酸アルドラーゼの基質であり、種々のアルデヒドとのアルドール縮合反応により立体選択的に各種の糖質を合成する反応に利用されている。こうした糖質は医薬品およびその中間体として産業上幅広く利用されうる。しかし、上記反応においては高価なジヒドロキシアセトン-３-リン酸を過剰に使用する必要があり、結果として製品は高価なものにならざるを得ない。
例えば、ジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造法としては、ピリジン中ジヒドロキシアセトン二量体をオキシ塩化リン（POCl3）で直接化学的にリン酸化する方法（Tetrahedron Lett., 28, 1641（1987））が報告されているが、この製造法は繁雑であり、安価に高濃度のジヒドロキシアセトン-３-リン酸を製造する方法とはいえない。
また、酵素を用いるジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造法も報告されている。すなわち、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ（PK）を用いてATPを再生し、この条件下、固定化グリセロールキナーゼ（GK）によりジヒドロキシアセトンからジヒドロキシアセトン-３-リン酸を合成する方法（J.Org.Chem., 48, 3199（1983）, J.Am.Chem.Soc., 107, 7019（1985））、同方法においてホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ（PK）の代わりに酢酸キナーゼ（AK）とアセチルリン酸を用いる方法（J.Am.Chem.Soc., 107, 7019（1985））などの報告である。しかし、このグリセロールキナーゼを用いる方法では、高度に精製された酵素を使用する必要があり、安価に高濃度のジヒドロキシアセトン-３-リン酸を製造することはできない。
また、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（以下「DHAK」と略称することがある）を用いて、ジヒドロキシアセトンからジヒドロキシアセトン-３-リン酸を製造することも理論的には可能である（特公平4-29349号公報、特公平4-22560号公報）。特に、酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のジヒドロキシアセトンキナーゼは、ジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造に適した酵素である（特公平4-29349号公報）。しかし、同酵素を有する酵母シゾサッカロミセス・ポンベの菌体抽出液中には混在酵素、例えばホスファターゼやトリオース-３-リン酸イソメラーゼなどが存在し、生成したジヒドロキシアセトン-３-リン酸を分解することから、高度の精製が必要であり、実用化には至っていない。
このような、酵素を用いたジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造法を、実用可能なものとするためには、酵素または酵素を含む生体触媒の反応性が高くまた安価かつ容易に調製できること、さらに使用する酵素または生体触媒の純度が高く生成物であるジヒドロキシアセトン-３-リン酸を分解しないことが求められる。しかし、このような条件を満たす効率のよい酵素または酵素を含む生体触媒を利用したジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造方法は、未だ開発されていない。
発明の開示
本発明は、効率のよいジヒドロキシアセトン-３-リン酸の製造方法を提供することを課題とする。
本発明者はこうした背景において、実用に耐えうる酵素触媒を得る目的で、ジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子のクローニングおよび該遺伝子の効率的発現を試みた。その結果、同酵素を微生物宿主内にて過剰発現させることに成功し、さらに該宿主の菌体自体または該宿主により産生される同酵素を、基質であるジヒドロキシアセトンに作用させて、高濃度のジヒドロキシアセトン-３-リン酸を製造しうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）ジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素遺伝子で形質転換された細菌または該細菌により産生された同酵素を、ジヒドロキシアセトンに作用させることを特徴とする、ジヒドロキシアセトン-3-リン酸を製造する方法、
（２）ジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素がシゾサッカロミセス（Shizosaccharomyces）属酵母由来のものである、（１）記載の方法、
（３）ジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素がシゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）由来のものである、（１）記載の方法、
（４）細菌が大腸菌である、（１）記載の方法、
（５）酵素反応が補酵素ATPの再生条件下において行われる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、に関する。
本発明において使用されるジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子の由来は限定されないが、好ましくはシゾサッカロミセス属の酵母、より好ましくはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、より好ましくはシゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354のジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子を利用することが好ましい。シゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354由来のジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号：1に、該塩基配列から推定されるジヒドロキシアセトンキナーゼのアミノ酸配列を配列番号：2にそれぞれ示す。
本発明の方法において、酵素触媒としては、ジヒドロキシアセトンキナーゼを過剰発現する、ジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子で形質転換された微生物を直接使用することができる。なお、本明細書において、過剰発現とは、天然の状態よりも発現レベルが高いことを指し、通常、発現産物をコードする遺伝子を発現するユニットを、宿主内にマルチコピー導入することによって、発現産物を過剰発現する形質転換体を製造することができる。本発明に用いられる宿主細菌の種類に特に制限はないが、例えばEschrichia属に属する細菌、特にEschrichia coli K-12由来の菌が、多様な宿主−ベクター系が利用できる点で好ましい。ジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、例えば、大腸菌の場合はpUC118またはpUC119（Methods in Enzymology,153,3（1987））などが好適に用いられる。宿主への遺伝子導入は、当業者によく知られた方法（例えば「Methods in Enzymology,68,299（1979）」記載の方法）によって行うことができる。例えば、ジヒドロキシアセトンキナーゼを過剰発現する大腸菌は、以下のようにして調製することができる。シゾサッカロミセス・ポンベで報告されているゲノム解析のデータベースを利用しプライマーを設計する。常法によりシゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354から分離したDNAを鋳型に用い、同プライマーによりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により目的遺伝子を増幅する。得られたPCR産物を適当なベクターに連結しクローニングする。遺伝子が挿入されたベクターを大腸菌の適当な株に形質転換し、この形質転換体を薬剤耐性マーカーおよび挿入断片の有無により選択する。こうした遺伝子クローン株のDHAK生産性を活性測定法により検定する。
また、該菌体により産生された酵素を菌体から、単離して使用することもできる。単離する際は必ずしも酵素を精製する必要はなく、粗精製物も精製物と同様に利用できる。増殖した菌体からジヒドロキシアセトンキナーゼを採取するには、本酵素が菌体内に存在するため、先ず菌体から酵素の抽出を行う。すなわち培養物をろ過または遠心分離して菌体を集め、アルミナ、ダイノミル、超音波処理などの機械的方法により破砕し可溶性酵素として抽出する。または、アセトンなどの有機溶媒処理などによって細胞膜を破壊し、減圧乾燥させた菌体粉末を酵素含有触媒としても使用できる。以上のように得られた培養物から、ろ過または遠心分離によって固形物を除き粗酵素液を得、さらに濃縮、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法により部分精製されたジヒドロキシアセトンキナーゼを使用することもできる。
ジヒドロキシアセトンキナーゼを過剰発現する大腸菌または該大腸菌から単離された酵素のジヒドロキシアセトンキナーゼ活性は、公知の方法に従って測定することができる（特公平04-29349号公報参照）。すなわち0.1Mトリエタノールアミン緩衝液（pH7.5）、2.5mM ATP、4mM MgSO4、0.2mM NADH、2.5単位グリセロール-３-リン酸脱水素酵素（G3PDH）および被検酵素液0.01mlを含む溶液１mlの25℃における340nmの吸光度の減少を分光学的に測定する（下式）。
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本明細書において、酵素活性の表示は、上記条件で1分間に1μモルのNADHを減少させる酵素量を1単位とした。
本発明の方法によるジヒドロキシアセトン-３-リン酸の生産は一般的に次のような条件で行われる。まずpHに関しては通常pH７〜８の範囲の緩衝液中で行う。使用する緩衝液は、反応を行わせるpHで緩衝能を有するものであればいずれのものも使用できるが、通常トリス塩酸塩を含む緩衝液が好適である。反応温度は、使用するジヒドロキシアセトンキナーゼが活性を有する温度範囲であればいずれでもよいが、好ましくは20〜35℃付近である。また、ジヒドロキシアセトンキナーゼは補酵素としてATPを必要とすることから、反応液には適宜ATPを添加する必要がある。しかし、ジヒドロキシアセトンキナーゼは生成するADPにより反応が阻害されることより、補酵素ATPの再生を行いつつ反応を行わせる方が望ましい。補酵素ATPの再生系としては、公知の方法のいずれも使用できるが（J.Org.Chem.48,3199（1983）, J.Am.Chem.Scc.111,627（1989））、製造コストの点からアセチルリン酸と酢酸キナーゼ（AK）を使用する系が望ましい。
以上のようにして反応した結果、生成したジヒドロキシアセトン-３-リン酸の確認は、酵素化学的手法により行うことができる。すなわち0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）、0.25mM NADH、0.6単位グリセロール-３-リン酸脱水素酵素（G3PDH）および被検液0.01mlを含む溶液3mlの30℃における340nmの吸光度の減少量を分光学的に測定し、標準化合物にて前もって作成した検量線より被検液中のジヒドロキシアセトン-３-リン酸（DHAリン酸）の濃度を測定するものである（下式）。
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また、反応生成物は、反応終了後、エタノール等の有機溶媒の添加による沈殿、あるいは塩析等により得られる。さらにカラムクロマトグラフィー、再結晶等の通常用いられる精製手段により精製できるが、そのまま次の反応に使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、pUDKベクターの構造を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ジヒドロキシアセトンキナーゼを過剰発現する大腸菌の調製
シゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354由来のDHAK遺伝子は、次の方法により取得し解析された。シゾサッカロミセス・ポンベで報告されているゲノム解析のデータベースを利用し、2種のプライマー、プライマーA（5’-GCCGGTACCAGGAGCTAAAATATGGATAAGCAC-3’／配列番号：3）およびプライマーB（5’-GCCAAGCTTAAAATTTCGTATCCAATTATTCG-3’／配列番号：4）を設計した。プライマーAには制限酵素KpnI部位と大腸菌のSD-配列を加えた。またプライマーBには制限酵素HindIII部位を加えた。常法によりシゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354株から分離したDNAを鋳型に用い、上記プライマーによりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により目的遺伝子（dhakI）を増幅した。得られたPCR産物はpT7BlueTベクターに連結しクローニングした。さらにこのベクターより目的遺伝子領域を切り出し、pUC118ベクターに連結した。得られたベクターをpUDKと命名した。
同ベクターを大腸菌JM109株に形質転換し、この形質転換体を「大腸菌JM109（pUDK）」と名付けた。この形質転換体によるジヒドロキシアセトンキナーゼの生産は、100mg/mlの抗生物質アンピシリンおよび誘導物質である0.4mMのIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を含むLB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl,pH7.0）に同菌を接種し37℃、16時間振とう培養することにより行った。図1にpUDKベクターの構造を示す。また、配列番号：1にdhakIの塩基配列を、配列番号：2に該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。本酵素は、HPLC分析により分子量145,000、SDS-ゲル電気泳動によりサブユニットの分子量63,000であった。サブユニットの分子量は推定アミノ酸配列の分子量62245とよく一致した。また、２価金属の要求性はMg2+を100％とした時、Ca2+で116％、Co2+では20％、Mn2+では12％の相対活性を示した。これらの結果より、同酵素は二量体酵素であり、クローニングされたdhakI遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベのジヒドロキシアセトンキナーゼIイソ酵素をコードしていると判明した（特公平04-29349号公報）。
［実施例２］  大腸菌JM109（pUDK）およびシゾサッカロミセス・ポンベの粗酵素液の酵素活性の比較
0.4mMのIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を含むLB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl,pH7.0）に大腸菌JM109（pUDK）菌を接種し37℃、16時間振とう培養した。培養液から遠心分離にて菌体を集め、緩衝液に再懸濁した後超音波にて破砕した。再度遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。また、特公平04-29349号公報記載の方法に従いシゾサッカロミセス・ポンベIFO 0354株を培養し、菌体を酸化アルミナにて破砕して同様の粗酵素液を得た。表１に両菌株のジヒドロキシアセトンキナーゼ活性および混在酵素の活性（単位/dl培養液）を示す。
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上記の表から明らかなように、大腸菌JM109（pUDK）では、ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性が高く混在酵素の活性が低い。一方、S.ポンベではジヒドロキシアセトンキナーゼ活性が低く混在酵素の活性が高い。また、100mM DHA 10mM MgSO4、４mM ATP、100mMアセチルリン酸（AcOP）、６単位のAK（ユニチカ（株）製）、６単位のDHAKおよび0.1Mのトリス-HCI緩衝液（pH7.3）を含む10mlの反応液を25℃にて10〜15時間反応し、大腸菌JM109（pUDK）とS.ポンベの粗酵素によるジヒドロキシアセトン-３-リン酸の生産性を比較したところ、両者には有意な差異がみられた。実験結果を表２に示す。
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［実施例３］  大腸菌JM109（pUDK）の粗酵素液による生産
50mM DHA、10mM MgSO4、60mM ATP、6単位のジヒドロキシアセトンキナーゼ粗酵素液および0.1Mのトリス-HCl緩衝液（pH7.3）を含む10mlの反応液を25℃にて10〜20時間反応したところ、20mMのDHAリン酸（ジヒドロキシアセトン-３-リン酸モノナトリウム塩として3.8mg/ml）が生成した。
［実施例４］  ATP再生系存在下における大腸菌JM109（pUDK）の粗酵素液による生産
100mM DHA、10mM MgSO4、4mM ATP、100mMアセチルリン酸（AcOP）、6単位のAK（ユニチカ（株）製）、6単位のジヒドロキシアセトンキナーゼ粗酵素液および0.1Mのトリス-HCl緩衝液（pH7.3）を含む10mlの反応液を25℃にて10〜15時間反応したところ、70mMのDHAリン酸（ジヒドロキシアセトン-３-リン酸モノナトリウム塩として13.3mg/ml）が生成した。
［実施例５］  ATP再生系存在下における大腸菌JM109（pUDK）による生産
6単位のジヒドロキシアセトンキナーゼ活性を含む大腸菌JM109（pUDK）のアセトン処理菌体を使用して実施例2と同様の反応を行ったところ、73mMのDHAリン酸（ジヒドロキシアセトン-３-リン酸モノナトリウム塩として13.9mg/ml）が生成した。
［実施例６］
200mM DHA、10mM MgSO4、4mM ATP、250mMアセチルリン酸（AcOP）、24単位のAK（ユニチカ（株）製）、24単位のジヒドロキシアセトンキナーゼ粗酵素液および0.1Mのトリス-HCl緩衝液（pH7.3）を含む10mlの反応液を25℃にてpHを調整しながら15〜20時間反応したところ、140mMのDHAリン酸（ジヒドロキシアセトン-３-リン酸モノナトリウム塩として26.6mg/ml）が生成した。本反応の経時変化を表3に示す。
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本反応液を活性炭で処理し、ろ過した。ろ液に0.08gの酢酸バリウムを添加し、沈殿したリン酸バリウムをろ過により除去した。ろ液を減圧下3mlにまで濃縮し、この溶液に5倍容量の冷エタノールを加え、生成した沈殿をろ別後、減圧乾燥し、ジヒドロキシアセトン-3-リン酸モノナトリウム塩180mgを得た。
産業上の利用の可能性
本発明により、ジヒドロキシアセトンキナーゼ酵素触媒反応を利用して高濃度のジヒドロキシアセトン-３-リン酸を効率よく製造する方法が提供された。
配列表
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【図１】
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