(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターの制御下にあるras癌遺伝子に特異的な細胞内単鎖抗体をコードする遺伝子を含んでなる核酸であって、ここで該単鎖抗体は、抗体の重−鎖可変領域の結合部位にペプチドリンカーを介して連結する抗体の軽−鎖可変領域の結合部位を有しており、細胞内単鎖抗体は、ras癌遺伝子として現れる細胞の形質転換の阻害によって検出されるものとして哺乳類細胞中で機能的であり、そして配列番号１の配列１−２８４までまたは配列番号２の配列１−２８４までに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成る、上記核酸。
２．核酸。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２に記載の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
哺乳類細胞中で機能的なプロモーターの制御下にあり、該プロモーターがCMV、SV40、Ela、MLP、LTRまたはビリンから選択されることを特徴とする、請求項１ないし２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４】
ベクターに組み込まれていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよびHSVウイルスから選択され、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の核酸をゲノムに含んで成ることを特徴とする、欠陥組換えウイルス。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸、あるいは請求項６に記載の１つの組換えウイルスを含んで成る、医薬組成物。
【請求項８】
組換えウイルスがアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−随伴ウイルスから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１０4から１０14pfu/mlの間で含んで成ることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌の治療を目的とした医薬組成物の製造のための、請求項１に記載の核酸の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は核酸配列、それを含むベクターおよびその治療的使用、特に遺伝子治療に関する。より詳細には本発明は細胞内結合タンパク質（IBP）をコードする遺伝子を含んで成る核酸配列、およびその遺伝子治療における使用に関し、適当な場合には適切な発現ベクターに組み込まれている。
遺伝子治療とは、不全症または異常（突然変異、異型発現等）を、悪化した細胞または器官に遺伝情報を導入することによって矯正することから成る。この遺伝情報は器官から摘出した細胞中にインビトロで導入され、その後モディファイされた細胞が体内に戻されるか、あるいは直接インビボで適当な組織に導入することができる。これとの関連で、様々なトランスフェクション法および遺伝子転移法が文献に記載されている（RoemerおよびFriedman、Eur.J.Biochem.208（1992）221を参照にされたい）。現在まで、従来技術において遺伝子治療のために提案された研究法は、遺伝子疾患に関与する活性ポリペプチド（ホルモン、成長因子等）をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、またはワクチン生産のための抗原性ペプチドの転移から成る。本発明は遺伝子治療への新たな取り組みに関し、それは標的細胞（または組織）中で、細胞成分と相互反応できる、すなわち細胞機能を妨害できる細胞内ペプチドを転移および発現することから成る。本発明は特に、細胞内部分に留まり、そして特定の細胞機能を制御できる修飾抗体をインビボで発現することができるという実証に基づく。本発明は遺伝子治療に使用するために、そのような細胞抗体をコードするＤＮＡ配列をベクター中（特にウイルスベクター）にクローン化することができるという実証にも基づいている。
ヒトの治療で抗体を使用して、一般的に循環する生物複合体および／または細胞表面に局在するものを除去する免疫系により引き起こされる一連の出来事を発生させることにより、それらを標的にし、そして中和することが可能になる。しかし癌または例えばウイルスによる疾患を含む多くの場合で、この取り組みは悪化した細胞の調節解除（以下、統制解除ということもある）の原因である抗原が、注入した抗体に接近できないので成功していない。そこで本発明は抗体または治療薬を、エピトープへの結合により統制解除の減少および／または破壊が連続的および細胞内的に生成されるようにすることから成る、特に有利な治療的取り組みを可能にする。
抗体の組換え的発現の可能性はすでに、文献に記載されている。すなわち欧州特許出願公開第88,994号明細書は、抗体の重−または軽−鎖可変領域のインビトロ発現および精製を記載している。同様に米国特許第4,946,778号明細書は、リンカーを介して連結した抗体の重−および軽−鎖可変領域から成る修飾抗体をコードするＤＮＡ配列のインビトロ発現を記載している。しかし、この特許に記載される抗体は不活性であり、かつ一般的に不溶性の封入体状態で合成される。したがって抗体は活性を回復するためには、精製され、そして次に化学的処理（変性、リナチュレーション等）に供されなければならない。本発明は直接インビボで活性な細胞内抗体の発現のために、そのようなＤＮＡ配列を使用する可能性を実証する。したがって本発明は、特にヒトの遺伝子治療のために、細胞内抗体をコードするそのようなＤＮＡの使用の可能性を、それらの発現を哺乳類細胞中で可能にする領域の制御下で実証する。それ故にこの新たな取り組みは、典型的なワクチン化法によっては接近できない細胞成分を標的にすることを可能にする。さらに、本取り組みは免疫反応の発生が関与せず、しかし細胞内で作用するものである。
したがって本発明の第一の主題は、細胞内結合タンパク質（IBP）の発現を哺乳類細胞中で可能にする制御領域下の、細胞内結合タンパク質（IBP）コードする遺伝子を含んで成る核酸配列にある。
また本発明は上記の核酸配列を含むベクターに関する。より詳細には本発明のベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、HSVウイルス等のようなウイルス起源である。
また本発明は、ヒトまたは動物体の外科的および／または治療的処置を目的とする医薬組成物の調製のための、これらの核酸配列またはこれらベクターの使用関する。また、ベクター、上記のような特にウイルスベクター、または核酸配列を含んで成る医薬組成物に関する。
本発明の目的に関して、細胞内結合タンパク質（IBP）という用語は、発現される細胞成分を認識でき、この成分と選択的に、そしてこの成分に対する親和性で相互作用できる任意のタンパク質またはタンパク質断片を表す。この相互作用は共有または非共有化学的相互作用であってよい。細胞成分（タンパク質、脂質、アミノ酸、mRNA、tRNA、rRNA、DNA等）との相互作用は、該成分が含まれる細胞の機能に対して作用することができ、したがってこの機構を制御（刺激、低下、抑制）することができる。
本発明のIBPは、好ましくは抗体または抗体に匹敵する結合特性を有するものに由来する分子から成る。特に、それらは抗原に対して中和効果を有するインビボ相互作用を可能にする、十分な選択性および親和性を持つタンパク質である。これらの分子はそれらの特性および位置から、今後、細胞内抗体と命名する。
抗体、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子は、分泌タンパク質の状態で天然に合成される（主にＢリンパ球により）。したがってそれらは、活性（非自己抗原の認識および結合）を発揮する細胞外部（循環系）に放出される。抗体の特異性および親和性に影響を与えずに、細胞内抗体をコードする修飾遺伝子をインビボで発現させることができると実証された。細胞内抗体をコードする本発明の核酸配列は、それ故に抗体が分泌しないように遺伝子修飾された抗体を含んで成る。特に抗体遺伝子は一般的に、その分泌の原因である配列の欠失または突然変異により修飾される。本発明のIBPは、特に抗原結合ドメインを持つ抗体断片（例えばFabまたはF（ab）’2断片）のような抗体断片から成る。しかし、この種の細胞内抗体には、これらの断片の重−および軽−鎖領域をそれぞれコードする幾つかの遺伝子を含んで成る核酸配列の発現が関与し、そしてまたこれらの鎖がインビボで正しく集成することが関与する。このため、本発明の内容に使用できる細胞内抗体の特に有利な形態は、抗体の重−鎖可変領域の結合部位に対応するペプチドにペプチドリンカーを介して結合した抗体の軽−鎖可変領域の結合部位に対応するペプチドから成る。この種の細胞内抗体の使用は、ScFvと呼ばれているが、それらが単一遺伝子により発現されているので有利である。そのような本発明の修飾抗体をコードする核酸配列の構築を実施例で説明する。
さらに本発明の細胞内抗体をコードする核酸配列は、安定化し、かつ／または多機能性細胞内抗体のために、かつ／または大きさを減少した抗体のために、かつ／または１つ以上の細胞内区分に局在することを促進させる目的で、化学的、酵素的または遺伝的に修飾されることもできる。したがって、本発明の核酸配列は核局在ペプチド（nuclear localization peptides:NLS）をコードする配列を含んで成ることもできる。特に、本発明の配列をSV40ウイルスのNLSをコードする配列（このペプチド配列は以下の通り;MPKKKRK:Kalderonら、Cell,39（1984）499）と融合させることができる。
上述のように、本発明の核酸配列は遺伝子またはIBPをコードする遺伝子を哺乳類細胞中で発現することができる配列を含んで成る。したがって一般的にIBP遺伝子は、発現が想定される哺乳類細胞中で機能する転写および翻訳プロモーター領域の制御下に置かれる。これらは該細胞に関してホモロガスな配列であることができ、すなわち該細胞中での遺伝子発現の天然の原因である配列である。それらは異なる起源の配列であってもよく、すなわち他の種類の細胞中のタンパク質発現の原因の配列、天然条件下で抗体発現の原因である配列、ウイルスの発現配列、例えば本発明の配列が組み込まれているベクターに存在する配列、または合成もしくは半合成配列でよい。
ヒトへの使用に関して、多くの機能性プロモーターが文献に記載されており、例えばそれらはCMV、SV40、Ela、MLP、LTR等、ウイルスプロモーターである。例えば、ビリン遺伝子のプロモーターのような細胞性プロモーターは、それらが特定の組織発現を可能にするので（ビリンの場合は腸に限定されている）、有用である。
さらに発現配列も、例えば特定の種類のベクターまたは細胞中で発現するように、大きさを減少させるように、転写プロモーター活性を上昇させるように、誘導性プロモーターを作成するように、調節レベルを改良するように、あるいはその調節の性質を変えるように適合させるために修飾されることができる。そのような修飾は例えば、インビトロ突然変異誘発法により、さらなる制御要素または合成配列の導入により、あるいは新規制御要素の削除または置換により行うことができる。１種の組織中だけでIBPの発現を標的にするためには、組織−特異的プロモーターの使用が特に有利である。
さらに核酸配列が発現配列を含まないならば、後者は発現ベクター中のそのような配列の下流に組み込まれることができる。
本発明のベクターを調製するために、第一段階では作用を望む病気が関与する、または病気の原因である細胞機能が確認されなければならない。この機能に関与する適当な細胞成分が次に同定され、そして局在性、役割、性質等に基づきこの成分（抗体、誘導体等）に最も適すると思われるIBPが決定されなければならない。IBPが選択されたら、対応する核酸配列を分子生物学的手法（化学合成、クローニング、酵素的修飾等）により得、そして実施例に記載される方法により適当なベクターに挿入することができる。
本発明の別の主題は、上記の少なくとも１つの核酸配列または１つのベクターを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明の配列は、特定の細胞機能に効果を与える目的で、例えばヒトまたは動物に注射した後にIBPの細胞内発現を誘導するために使用することができる。特に、それらは国際公開第90/11,092号明細書に記載された方法により、裸のDNAの状態で注射できる。それらは複合体の状態、例えばDEAE-デキストラン（Paganoら、J.Virol.1（1967）891）と、核タンパク質（カネダら、Science 243（1989）375）と、脂質（Felgnerら、PNAS 84（1987）7413）と、リポソームの状態（Fraleyら、J.Biol.Chem.255（1980）10431）等、で投与することもできる。
本発明の好適な態様では、上記の核酸配列はベクター中に組み込まれる。そのようなベクターの使用により、結果として細胞中への移動を促進し、酵素に対する耐性を増強し、そして細胞内の安定性および発現レベルを上昇させることができる。本発明のベクターは、同様に等しくプラスミドベクターまたはウイルスベクターであることができる。しかし、ウイルスベクターを使用することが好ましい。
したがって好適な態様では、本発明はウイルスベクターに組み込まれた上記の核酸配列に関する。また本発明はゲノムに挿入された、IBPをコードする少なくとも１つの核酸配列を含んで成る。
上述のように、様々なウイルスを本発明の遺伝子のインビボ転移および発現のために使用することができる。例として、レトロウイルス（RSV、HMS、MMS等）、HSVウイルス、アデノ−随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等を挙げることができる。
有利なことには、本発明の組換えウイルスは欠陥ウイルスである。“欠陥ウイルス”という用語は、標的細胞中で複製できないウイルスを表す。一般的に、それ故に本発明との関連で使用される欠陥ウイルスのゲノムは、少なくとも感染細胞中で該ウイルスの複製に必要な配列を欠いている。これらの領域は除去（完全に、または部分的に）されているか、または非−機能的にされているか、あるいは他の配列に置き換えられることができ、そして特に本発明の核酸配列に置き換えられることができる。好ましくは欠陥ウイルスはウイルス粒子の包膜化に必要なゲノム配列をやはり保持している。
レトロウイルス由来、アデノ−随伴ウイルス由来、HSVウイルス（単純ヘルペスウイルス）由来、またはアデノウイルス由来の欠陥組換えウイルスは、すでに文献に記載されている［RoemerおよびFriedmann、Eur.J.Biochem.208（1992）211;Dobsonら、Neuron 5（1990）353;Chioccaら、New Biol.2（1990）739;ミヤノハラら、New Biol.4（1992）238;国際特許出願公開第WO91/18,088号明細書;Akliら、Nature Genetics 3（1993）224;Stratford-Perricaudetら、Human Gene Therapy 1（1990）241;欧州特許出願公開第185,573号明細書、Levreroら、Gene 101（1991）195;欧州特許出願公開第243,204号明細書）］。
本発明の核酸配列を欠陥組換えアデノウイルスに取り込んだ状態で使用することが特に有利である。
実質的にアデノウイルスの異なる血清型、構造および幾分異なる特性が存在するが、それらはヒト、特に非−免疫抑制個体に対して病原性ではない。さらにこれらのウイルスはそれが感染した細胞のゲノムに組み込まれず、そして外因ＤＮＡの大きい断片に取り込まれる。様々な血清型の中でも、本発明との関連でアデノウイルス２または５型（Ad2またはAd5）を使用することが好ましい。Ad5アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はElAおよびELB領域である。
さらに本発明の細胞内抗体をコードする小さなサイズの遺伝子により、１つ以上の標的細胞成分の様々な領域に対する細胞内抗体をコードする数種の遺伝子を、有利にも同じベクター中に同時に組み込むことができる。したがって本発明の特定の態様は、様々なエピトープに対する細胞内結合タンパク質をコードする少なくとも２つの核酸配列を含んでなるベクター、特にウイルスベクターから成る。
本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスと、とりわけ上記の核酸配列を持つプラスミドとの間の相同的組換えにより調製できる（Levreroら、Gene 101（1991）195;Graham,EMBO J.3（12）（1984）2917）。相同的組換えは、該ウイルスと該プラスミドが適当な細胞系に同時形質転換した後に起こる。使用される細胞系は、好ましくは（ｉ）該要素により形質転換できるものであり、そして（ii）欠陥ウイルスゲノムの部分を相補することができる配列を含むべきで、好ましくは組換えの危険性を回避するために組換え体の状態である。欠陥組換えアデノウイルスの調製に有用である系の例として、特にゲノム中にAd5アデノウイルスのゲノムの左-手部を組み込んで含んでいる（12％）ヒト胚腎臓系293（Graham,ら、J.Gen.Virol.36（1977）59）を挙げることができる。欠陥組換えレトロウイルスの調製に有用な系の例として、CRIP系を挙げることができる（DanosおよびMulligan、PNAS 85（1988）6460）。
組み込まれたウイルスを、次に従来の分子生物学的法により回収し、そして精製する。
本発明はそれゆえに、少なくとも１つの上記の欠陥組換えウイルスを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内等の投与目的に製剤することができる。
好ましくは医薬組成物は、注射用製剤のために医薬的に許容できる賦形剤を含む。これらは特に、無菌の等張塩溶液（リン酸一ナトリウム、または二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等、あるいはその混合物）、あるいは乾燥、特に凍結乾燥状態であることができ、さらに組成物は適切である場合には滅菌水または生理塩の添加時に注射用溶剤を形成することが可能である。
投与に使用する核酸（配列またはベクター）の投与量を、様々なパラメーター、特に使用する投与様式、問題の疾患、発現する遺伝子または望まれる治療期間により調整することができる。一般的に本発明の組換えウイルスの場合には、これらは104から1014pfu/mlの間、好ましくは106から1010pfu/mlの投与量の状態で製剤され、投与される。pfu（プラーク形成単位）という用語は、ウイルス溶液の感染力に相当し、そして適当な細胞の感染、そして一般的に48時間後の感染細胞プラーク数の測定により定められる。ウイルス溶液のpfu力価の決定法は文献によく記載されている。
また本発明の主題は、上記のような核酸配列を含んで成る組換え細胞に関する。
ベクターに適当に組み込まれた本発明の配列、およびそれを含む医薬組成物は、多くの病原の治療に使用することができる。それゆえに、それらは遺伝子の転移および発現のために、任意の種類の組織中のインビボで使用することができる。さらに治療は治療される病原に関連して標的にされることができる（特定の組織への転移は、特にベクターの選択および特定のプロモーターの選択による発現により決定できる）。
本発明の配列またはベクターは、有利にヒトまたは動物中でインビボおよび細胞内で、細胞増殖、代謝物の合成、タンパク質合成、ＤＮＡ複製および／または転写等のような多様な細胞機能に対して特異的に作用できるタンパク質の生産に使用される。したがって本発明は、多くの細胞機能不全を、種々の病原で、または病原の結果で、特に癌、ウイルス性または細菌性疾患を、より一般的には細胞性メディエーターが同定できる任意の病原を、特異的に、局在的に、そして効果的に治療することを可能とする。
細胞増殖に関連する病原治療のための使用
特に有利な態様では、本発明の核酸配列は、細胞増殖に関与する活性因子に相互作用し、そして干渉することができるIBPをコードする遺伝子を含んで成る。細胞増殖には、膜レセプター（Ｇタンパク質）、癌遺伝子、酵素（プロテインキナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ等）、ヌクレオシド（ATP、AMP、GDP、GTP等）、活性化因子［グアノシン交換因子（GRF、GAP等）、転写因子等］などのような数多くの因子が関与する。そのような因子に結合し、そして中和することができる、本発明のIBPの細胞内発現で、細胞増殖の過程を制御することが可能になる。これは細胞増殖が自然の調節機構を逃れて、例えば腫瘍の発生を生じるような状況で特に有利である。多くの因子（発癌性遺伝子の産物、およびこれらの産物の影響の信号を送ることに関与する因子）は実質的に、これらの細胞増殖の統制解除現象と関連してきた。すなわち膵臓の90％の腺癌が、第１２番目のコドンが突然変異したKi-ras癌遺伝子を保有する（Almogueraら、Cell 53（1988）549）。同様に突然変異したras遺伝子の存在は、結腸の腺癌および甲状腺の癌（50％）、または肺および骨髄白血病の癌腫（30％）で検出された（Bos,J.L.Cancer Res.49（1989）4682）。他の多くの癌遺伝子がすでに同定され（myc、fos、jun、ras、myb、erb等）、その突然変異体は細胞増殖の統制解除の原因であると考えられている。
これらの細胞因子（好ましくはその発癌性状態）に結合できるIBPの発現、そしてそれゆえにその効果の低下または抑制は、癌に対する新たな治療的研究の可能性を提供する。
特に有利な態様では、本発明は癌遺伝子の発現産物を妨害する、または癌遺伝子のシグナル伝達経路（以下、発信経路ということもある）に関与する因子を妨害することができる細胞内抗体をコードする遺伝子を含んで成る核酸配列を含むベクターに関する。
標的癌遺伝子のなかでも、ras、fos、jun、myc、mybおよびerb癌遺伝子を本発明の目的のために挙げることができる。
癌遺伝子の発信経路に関与する因子の中でも、細胞内ドメイン［Gタンパク質、キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）、ホスホリラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ］、ヌクレオシド交換因子（GAP,GRF等、因子）などのレベルで標的にすることができる膜レセプターを、特に挙げることができる。
より好ましくは本発明は、癌遺伝子または癌遺伝子の発信の経路に関与する因子に対する細胞内抗体をコードする核酸配列を含むベクター、特にウイルス起源のベクターに関し、それは抗体の重−鎖可変領域の結合部位に対応するペプチドにペプチドリンカーを介して連結した抗体の軽−鎖可変領域の結合部位に対応するペプチドから成る。
より特別には、本発明はras-依存性発信経路の因子に対する細胞内抗体を発現する欠陥組換えウイルスに関する。
実施例に示すように、細胞内抗-p21（ras遺伝子の発現産物）、抗−GAPまたは抗−p53抗体の発現は、形質転換させる癌細胞の表現型を逆戻りさせることができる。
ウイルス病原治療のための使用
本発明の核酸配列は、病原ウイルス（HIV、パピローマオイルス等）の感染周期と相互反応できる細胞内抗体をコードする配列であることができる。
さらに特別には、HIVウイルスの場合には、現時点で利用できる抗ウイルス剤または進行した臨床段階の処方ではウイルスの複製を遮断することはできず、疾患の進行を遅らせることができるだけである。この主な理由の１つは、これらの抗ウイルス剤に耐性な株の出現にある。効果的なワクチン化もまた多くの障害に直面する：HIVの遺伝的多様性が、存在する様々な株に対する体液性または細胞性免疫反応を得るための安定な抗原的構造の決定を不可能にしている。ウイルスが好都合な点突然変異誘発法による選択圧に耐える抗ウイルス剤の場合には、現在までに試されたワクチン化では、HIVは免疫系を回避すると思われる。
本発明はHIV感染の治療のための新規な取り組みを構成し、それはウイルスの複製周期中にIBPの発現、特に細胞内抗体の発現によりウイルスを遮断することから成る。本発明は特にワクチン的および抗ウイルス的方法とは対照的に、ウイルスの遺伝的多様性の問題を回避することが可能である。典型的なワクチン化の場合には、主に検出される免疫反応は可変領域に対して生じる。対照的に、本発明の細胞内抗体の使用は、保存されるだけでなく、ウイルスタンパク質の機能に必須でもあるエピトープを選択することを可能にする。好ましくは細胞内抗体は、好都合な点突然変異法により、ウイルスの耐性化（withstanding）および適合化（adapting）を防ぐに十分な大きさのエピトープに対するものである。さらに、本発明の細胞内抗体をコードする小さな遺伝子は、同じ遺伝的治療ベクターで数種の領域（１つの中の、または数種のタンパク質の）を標的にすることを可能にする。
ウイルスの２つの主な調節タンパク質、tatおよびrevは、本発明の実施に一番重要な標的である。実質的に、これら２つのタンパク質はウイルス複製に必須である。さらに、tatもしくはrevメッセンジャーRNAを標的にするアンチセンスメッセンジャーRNAまたはリボザイムの発現は、ウイルス複製を妨害する。これらのタンパク質の作用機構は比較的解明されている；tatは転写トランス作用因子であり、一方revは複製周期の初期および後期の間の移行を提供する。これらの２つのタンパク質は、ウイルスメッセンジャーRNAに結合することによりそれらの活性を発揮し、そしてそれらの機能に必須であるこの結合に必要なペプチド領域は比較的範囲が定まっている。さらに、RNAに結合するそれらの結合部位（tatのためのTAR領域およびrevのためのRRE領域）の過剰発現は、ウイルス発現に関してそれらの機能を阻害する。
これらの条件下で本発明の特に有利な態様は、tatまたはrevタンパク質に対し、かつそれらの活性を中和することができる細胞内抗体をコードするDNA配列を使用することにある。有利なことには、そのような抗体はそれらのRNAへの結合の原因であるtatまたはrev領域に対している。
これらのエピトープに対する本発明の細胞内抗体は、実施例に記載されるような方法により調製することができる。特に、抗−tat抗体については、T-Bモノクローナル抗体（12）（ハイブリッドラボ:Hybridolab）から遺伝子修飾により得ることができる。
機能を容易に阻害できるHIV複製において、細胞内抗体の他の重要なタンパク質は、ヌクレオキャプシドタンパク質NCP7である。実質的に、このタンパク質は逆転写（初期）、組換えおよび後期ではあるが重要な期である包膜化において、重要な役割を果たす。この多機能性は、これが酵素的に活性な構造的役割を有するという事実により説明される。これはウイルス核酸の複合化を可能にすると考えられるハイブリダーゼとして記載された：逆転写中のRNA/DNAおよびDNA/DNA、ならびに包膜化中のRNA/RNAおよびRNA/tRNA-1ys3。NCP7は感染性ウイルスの生産に必須であると思われる。
NCP7に対する細胞内抗体の遺伝子治療による細胞質発現は、ウイルスRNAの二量化および包膜化において機能を阻害し、本発明の別の特定な態様を構成する。
このタンパク質の中和化エピトープに対する、本発明の細胞内抗体は、実施例に記載された方法により調製できる。
別のウイルス成分も本発明の遺伝子治療の物質を形成することができ、そして特にそれらは、CD4分子結合部位（例えば、エンベロップグリコプロテイン（gp120/41））、エンベロップ多量化領域、gp120/gp41開裂部位、プロテアーゼ、インテグラーゼ、およびより一般的には、任意のウイルスタンパク質である。これらのドメインはエンベロップが自然な状態では一般的には接近することができない。このために、それらは免疫原性が弱く、そしてこれらを使用するワクチン化は不可能である。本発明はこれらのウイルス成分を標的にすることを可能とし、したがってさらに大きな治療的可能性をもつ。さらに上述のように、本発明の細胞内抗体をコードする小さなサイズの遺伝子は、１つ以上のこれらの標的の様々な領域に対する数種の細胞内抗体を、同時に同じベクター内で発現することができる。
本発明の核酸配列は、代謝物の合成に、タンパク質合成に、あるいはDNA複製および/または転写に関与する因子の活性と相互反応し、そして妨害できるIBPをコードする配列でもあることができる。
本発明の以下の実施例により、より完全に記載され、これらは説明を目的とするものであり、制限することを意図していない。
図面の説明
第１図：（Ａ）ScFv-rasの制限地図。（Ｂ）ScFv-Gapの制限地図。（Ｃ）rasまたはHer2癌遺伝子の形質転換力に対する、本発明の細胞内抗体の一時的発現の中和効果。Py=対照細胞；ScFv＝プラスミドpsv2.ScFv.ras単独で形質転換した細胞、VAL=Ha-ras Val12発癌性rasを発現するベクターでトランセクトした細胞；VAL+ScFv＝プラスミドpsv2.ScFv.rasおよびHa-ras Val12で同時トランセクトした細胞；HER2＝発癌性Her2を発現するベクターでトランセクトした細胞；HER2+ScFv＝プラスミドpsv2.ScFv.rasおよびHer2で同時トランセクトした細胞。
一般的な分子生物学技法
分子生物学で伝統的に使用されている手法、例えばプラスミドDNAの調製用抽出、塩化セシウム勾配中でのプラスミドDNAの遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDNA断片の精製、フェノールまたはフェノール／クロロホルムでのタンパク質抽出、塩媒質中のDNAのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌の形質転換等は、当業者には周知であり、文献に詳細に記載されている［Maniatisら、“モレキュラークローニング  ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）”コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1982；Ausubel F.M.ら、（編集）、“分子生物学の現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）”、ジョンウィリー アンド サン（John Wiley & Sons、ニューヨーク、1987］。
プラスミドpBR322およびpUC型、ならびにM13ファージ群は、市販のものである（ベセスダリサーチラボラトリーズ：Bethesda Research Laboratories）。
ライゲーションについては、DNA断片をそれらの大きさによりアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、そしてフェノールまたはフェノール/クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファージT4 DNAリガーゼ（バイオラボズ:Biolabs）の存在下で、供給元の推薦に従いインキューベーションすることがてきる。
5’突出末端を埋めることは、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（バイオラボズ）のクレノー断片で、供給元の推薦にしたがい行うことができる。3’突出末端の破壊は、ファージT4 DNAポリメラーゼ（バイオラボズ）の存在下で製造元の推薦に従い使用して行う。5’突出末端の破壊はS1ヌクレアーゼにより制御処理することにより行う。
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロの突然変異誘発法は、Taylorらにより開発された方法［Nucleic Acids Res.13（1985）8749-8764］に従い、アマシャム（Amesham）により販売されているキットを使用して行うことができる。
酵素的なDNA断片の増幅は、いわゆるPCR［Polymerase-catalyzed Chain Reaction、Saili R.K.ら、Science 230（1985）1350-1354;Mullis K.B.およびFaloona F.A.Meth.Enzym.155（1987）335-350］法により、“DNA thermal cycler”（パーキン エルマー シータス:Perkin Elmer Cetus）を使用し、製造元の仕様に従い行うことができる。
核酸配列の確認は、Sangerらにより開発された方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74（1977）5463-5467］により、アマシャムにより販売されているキットを使用して行うことができる。
実施例１：細胞内抗-ras抗体をコードするDNA配列のクローニングおよび発現
この実施例では、Y13-259モノクローナル抗体の特性を再生する、細胞内結合タンパク質をコードする核酸配列のクローニングおよび発現を記載する。Y13-259抗体はRasタンパク質に対し（ATCC CRL 1742を参照にされたい）（J.Virol.43,294-304,1982）、そして細胞に注入されときに発癌性Rasタンパク質の機能に対する中和抗体である［Smithら、（1986）Nature、320、540-543;Kungら、Exp.Cell.Res.（1986）162,363-371］。
１．１  DNA配列の調製
細胞内抗体（ScFv断片）をコードするDNA配列を、米国特許第4,946,778号明細書の記載に従い調製した。この配列を次に哺乳類細胞中で機能するプロモーターの制御下に置いた。
ポリ（A）RNAを、Y13-259抗体を分泌しているハイブリドーマの細胞カルチャーから、Chirguin S.H.らにより記載された方法［Biochemistry 18,5294（1979）］に従い単離する。これらのRNAを、ランダムヘキサヌクレオチドを使用して、逆転写反応に使用する。得られたcDNAは２つのPCR反応:
−１つはネズミVH領域に特異的なプライマーを持つ、Y13-259の重-鎖可変領域（VH）を増幅する目的、
−第二はネズミ配列由来を10個のプライマー混合物を使用して、VL断片を得ることを可能にする、
の鋳型として役立つ。
340bpおよび325bpの2つの断片をこれにより得て、そして次にリンカー（これはVH cDNAをVLの5’末端に正しく配置させることができる）により集成した。このリンカーは（Gly）4Ser単位の3つの反復から成る15アミノ酸をコードする［Orlandi,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3833-3837（1979）］。細胞内抗体の配列を配列番号１（28-270残基）に示す。この配列は、VH-VL融合体を平行して集成させ、抗原に対して正しい親和性を提供できるように十分な自由度を与える。
VH-リンカー-VL融合核酸配列は、次に細胞内抗体（ScFv断片）をM13ファージの表面に発現できるファジェミド中に挿入される（第１Ａ図）。この発現は、正しく抗原を認識する細胞内抗体の同定および選択を容易に可能とする。
１．２  修飾細胞内抗体の機能評価
発癌性Rasの効果と拮抗する能力を試験するために、修飾細胞内抗-Ras抗体（VH-リンカー-VL）をコードするDNA配列は、制限によりファジェミドから単離され、そして次にSV40のエンハンサー-初期プロモーターシステム（Schweighofferら、Science,256,825-827,1992）の制御下にベクターsv2に挿入する。これにより得られたプラスミドをpsv2.ScFv.rasと命名する。機能評価は幾つかの試験により行った：
ａ）哺乳類細胞中での一時的トランスフェクション
哺乳類細胞中での一時的トランスフェクションによる評価のために、プラスミドpsv2.ScFv.rasをSchweighofferらに記載された手法［Science,256,825-827,（1992）］により、Ha-ras Val 12遺伝子の発現を可能にするベクターとコートランスフェクションした。実験中の発信経路の活性化状態は、Ras（RRE）の作用に対してトランスに反応するヌクレオチド要素を含むプロモーターの制御下に置かれたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）レポーター遺伝子（これもまたコートランスフェクションされた）から得た酵素活性を測定することにより記録され：これらのRRE要素はポリオーマTKハイブリッドプロモーター−エンハンサー（Wasylykら、EMBO,J.7,2475,1988）から成った。
得られた結果を第１Ｃ図に表す。得られたCAT活性の分析は、Y13-259抗体から調製した修飾細胞内抗体が発癌性Rasの活性を拮抗する能力を実証している。
チロシンキナーゼ活性、HER2（ヒト上皮増殖因子II型）癌遺伝子を与える癌遺伝子の発現を可能にするプラスミドとコートランスフェクションしたプラスミドpsv2.ScFv.rasも、“CAT”プラスミド試験（第１図）に関してその活性を遮断する。
ｂ）形質転換した細胞の焦点（foci）の形成：
癌細胞は形質転換の焦点を形成する性質を有し、そして特にNIH 3T3繊維芽細胞は発癌性Rasを発現する（Barlatら、Oncogene（1993）,B,215-218）。
NIH 3T3細胞を、10％のウシ胎児血清を含むダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）中で37℃で、5％のCO2の湿潤環境中で、予備試験のように培養する。これらの細胞を次に発癌性Ras:Ha-ras val12、プラスミドpsv2.ScFv.ras（上記ａを参照）、および10-倍過剰のネオマイシン耐性遺伝子で、カチオン性脂質トランスフェクション法（Schweighofferら、Science,256,825-827,1992）によりコートランスフェクションする。同量のDNAをそれぞれの皿でトランスフェクトした。
トランスフェクションの24時間後、各々の100mmのペトリ皿から生じたトランスフェクトした細胞を、１対10の割合で分割し、1mlの培地あたり0.4mg濃度のG418（ギブコ:GIBCO/BRL）が存在する同じ培地中で培養する。トランスフェクトした1μgのDNAあたり、得られた形質転換の焦点数は培養14日後に計数した。
得られた結果を以下の表に表す。それらは４回の別個の実験の平均を表す。
0004384260.tif 000002
得られた結果は、細胞内抗-ras抗体が発癌性ras遺伝子の形質転換力を大変減少させることを示している。
さらにａ）から得られた結果から、Y13-159抗体のScFv断片の発現は、細胞内Rasタンパク質の活性化を促進するHER1、HER2のような他の癌遺伝子による形質転換も防ぐはずである。
当業者は本出願に記載された結果を基に、他の細胞成分に対する細胞内抗体（ScFv断片のような）をコードする核酸配列で本発明を再現することができると理解するであろう。これらは細胞成分に対する既知の抗体から、あるいは中和する抗原を同定し、この抗原または後者の好適なエピトープによる免疫化、そして次に得られた抗体、そのmRNAまたはハイブリドーマのいずれかから調製できる。細胞の形質転換過程に関与する他の成分は、このようにして標的にすることができる。例えば、細胞内抗−ras結合抗体をコードする他のDNA配列は、同じ方法によりM38、M8、M70、M90およびM30（ATCC HB 9158）ハイブリドーマから調製することができ、そらの抗体はそれぞれHa-Rasタンパク質の1-23、24-69、90-106、107-130および131-152残基に対する。さらに上記のように、様々な細胞内抗体をコードする数種の配列を持つベクターは、卓越した中和活性を与えるために有利に調製されることができる。
実施例２：細胞内抗-GAP抗体をコードするDNA配列のクローニングおよび発現
この実施例では、GAPタンパク質に対するモノクローナル抗体の特性を再生する、細胞内結合タンパク質をコードする核酸配列のクローニングおよび発現を記載する。
GAPタンパク質（GTPase Activating Protein）は、ras-依存性発信経路に関与している。これは触媒的にrasタンパク質と相互作用し、そして正常なp21タンパク質についてインビトロで測定したとき、GTPの加水分解速度を100-から200-倍にする。様々な研究により、このタンパク質の1044アミノ酸残基の触媒的ドメインはカルボキシ末端領域（702-1044残基）に位置し、そしてこの領域がGAPタンパク質とrasタンパク質との相互作用の原因であると示された（国際特許出願公開第WO91/02,749号明細書を参照にされたい）。
今、GAPタンパク質のいわゆる“SH3”ドメインに対するモノクローナル抗体が、アフリカツメガエルの卵中の発癌性Rasタンパク質の機能を中和することが示された（Duchesneら、Science,259,525-528,1993）。
１．１に記載した方法により、この抗体（配列番号２、11-250残基、第１Ｂ図）に対応する細胞内抗体（ScFv断片）をコードするDNA配列を合成することが可能である。そのような配列はベクター中に組み込まれ、腫瘍細胞中の発癌性ras遺伝子の形質転換力を抑制することができる。
さらに、出願人はこの抗体により認識されるエピトープをより正確に同定した。これらのエピトープは次に人工的に合成され、そして本発明を実施するために使用することができる新規中和抗体を生成するために使用できる。
ａ）より正確な同定：
同定は“エピトープスキャンニング”法により行った。この方法は、上記抗体が5-15アミノ酸のペプチドと反応できるという原理に基づく。その結果、一連のエピトープの同定は完全に重複する5-15アミノ酸のペプチドの組（問題の抗原の完全な配列に相当する）を調製することにより得られる。この方法はGAPの“SH3”ドメインの機能的エピトープを決定するために使用した。このために、このドメイン全体を連続的な重複により、それぞれ別のアミノ酸のデカペプチドを合成することにより調査した。
−重複ペプチドの合成
第１図の断片全体を網羅する35ペプチドを化学的に合成した。合成は２つの別個の支持体で、Fmoc/t-ブチル固相法（ケンブリッジ リサーチ バイオケミカルズ キット:Cambridge Research Biochemicals kit）により二連で行った。
−機能的エピトープの検出
Ac200抗体により認識される機能的エピトープは、ELISA試験によりペルオキシダーゼ-結合ウサギ抗-マウス抗体で視覚化した。この酵素に使用する発色性基質は、アミノビス（3-エチルベンゾチアゾジンスルホネート）（ABTS）である。
得られた結果はこの抗体により認識されるエピトープが以下のものであることを示している：
−PVEDRRRVRAI
−EISF
−EDGWM
これらのエピトープは当業者の従来技術により使用され、rasの効果を中和する抗体を生成できる。これらの抗体またはそれを生産するハイブリドーマを、上記の方法により本発明の核酸配列およびベクターを生成するために使用する。
実施例３：Ki-Ras（2Aおよび2B）の超可変部位由来のペプチドで免疫化したマウスの脾臓から抽出したmRNAからの細胞内抗-Ki-ras抗体をコードする核酸配列の調製
この実施例は、本発明の細胞内抗体（ScFv断片のような）をコードする核酸配列を、中和する抗原の同定し、この抗原による、または後者の好適なエピトープにより免疫化し、そして次に得られた抗体、そのmRNAまたはハイブリドーマからの核酸配列を調製して調製することを記載する。
この実施例は、所望の抗原またはエピトープに対する抗体が利用できないときでも、そのような抗原またはエピトープに本発明を応用できる可能性を実証する。
この実施例で標的にする抗原は、Ki-rasタンパク質である。より正確には、免疫化に使用する抗原は、Ki-Ras 2Aおよび2Bタンパク質の以下の末端に相当する25および24アミノ酸のペプチドである：
−ペプチド2A：QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
−ペプチド2B：KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM
免疫学の伝統的手法により、これらのペプチドをマウスに免疫化した後、脾臓を摘出し、そしてcDNAをmRNAから調製する。可変領域をコードするこのcDNAを次にクローン化し、そして使用したマウスの全範囲に対応するScFv断片を発現するファージライブラリーを形成する。ペプチド2Aおよび2Bを認識する細胞内抗体（ScFv断片）を次に同定し、そしてカラムおよびマイクロタイトレーションプレートアフィニティー試験に基づく選択の連続的工程により同定および単離する。
これらのScFv断片を次に実施例１に記載した手法により機能的に試験する。
この実施例で開発した戦略は、有利にもKi-ras癌遺伝子に特異的な細胞内抗体を選択することを可能とし、それ故にこれは他のRas原−癌遺伝子に影響しないだろう。そのようなツールの選択性は、細胞性であるだけでなく（Ras-形質転換細胞中の形質導入経路の分離の結果のような）、分子性でもある。
実施例４：細胞内抗−（突然変異p53）抗体をコードする核酸配列の調製
この実施例では突然変異p53タンパク質に対する細胞内抗体（ScFvのような）をコードする核酸配列の調製を記載する。これらの細胞内抗体は、該突然変異p53タンパク質に対する様々なモノクローナル抗体から得る。
p53タンパク質をコードする遺伝子は、大変多くの腫瘍細胞中で変化する（Caron de FromentelおよびSoussi,Gene,4,1-15,1992）。突然変異p53タンパク質は野生−型p53と同じコンフォメーションを持たない（LaneおよびBenchimol,Gene Dev.4,1-8,1990）。このコンフォメーションの変化はモノクローナル抗体により検出できる（MilnerおよびCook,Virology.154,21-30,1986;Milner,Nature,310,143-145,1984）。
pAB240抗体はp53タンパク質の突然変異体を認識する。
突然変異p53に特異的な抗体のScFv断片の細胞内発現、またはこのような突然変異p53タンパク質と特異的に相互反応するタンパク質の発現は、突然変異p53を有する腫瘍に有益な効果を誘導する。
実施例５：細胞内抗−パピローマウイルス抗体をコードするDNA配列のクローニングおよび発現
この実施例ではヒトパピローマウイルス（HPV）のタンパク質に対する細胞内抗体（ScFv断片）をコードするDNA配列のクローニングおよび発現を記載する。
標的とするウイルスタンパク質はE6タンパク質である。このタンパク質はHPV16および18ウイルスにより生成され、これは女性の子宮癌の原因の90％を占め、そして前癌性の上皮病変中で同定された（Riouら、Lancet 355（1990）117）。E6遺伝子産物は、HPV-陽性細胞中で野生-型p53、抗−癌遺伝子の量を強く減少させることにより腫瘍の形成を導く（Wredeら、Mol.Carcinog.4（1991）171）。別の腫瘍では、p53は様々なメカニズムによって抑制される：突然変異（実施例４を参照にされたい）またはMDM2のようなタンパク質との組み合わせ。
E6タンパク質の配列は文献に記載された（Hawley-Nelsonら、EMBO J.8（1989）3905;Mungerら、J.Virol.63（1989）4417）。このタンパク質の特定領域は、“エピトープスキャンニング”（実施例２を参照にされたい）により同定でき、そして次に実施例３に記載された手法によりマウスを免疫化するために使用できる。ヒト パピローマウイルス（HPV）のE6タンパク質に対する細胞内抗体（ScFv断片）をコードするDNA配列を、次に上記の方法により調製する。この配列の機能性をインビボ発現の後に、
−E6を発現する細胞中の野生−型p53レベルの上昇、
−HPV-形質転換細胞の形態学的復帰、
−p53のトランス活性化に対するE6の効果の遮断、および
−ヒト  ケラチン生成細胞および繊維芽細胞のE6による形質転換の阻害、
を測定することにより示す。
実施例６：tat、revおよびNCP7タンパク質の活性領域由来のペプチドで免疫化したマウスの脾臓から摘出したmRNA由来の細胞内抗−HIV抗体をコードする核酸配列の調製
この実施例では本発明の細胞内抗体（ScFv断片）をコードする核酸配列の調製を、中和する抗原を同定し、この抗原または後者の好適なエピトープによる免疫化し、そして次に得られた抗体、そのmRNAまたはハイブリドーマからの核酸配列を調製することにより記載する。
さらにこの実施例は、たとえ所望の抗原またはエピトープに対するモノクローナル抗体が従来技術に記載されてなくても、該抗原またはエピトープに本発明を応用できる可能性を示す。
この実施例で標的にする抗原は、HIVウイルスのtat、revおよびNCP7タンパク質である。より正確には免疫化に使用する抗原は、以下の6、9および16アミノ酸であり、それらはこれらタンパク質のmRNA（tatおよびrevの場合）との結合、またはRNAの二量化（NCP7の場合）の原因となる領域に相当する：
−tatペプチド：RKKRRQRRR
−revペプチド：RQARRNRRRRWRERQR
−NC7ペプチド：RAPRKK
免疫学の従来の技術により、これらのペプチドでマウスを免疫化した後、脾臓を摘出し、そしてcDNAをmRNAから調製する。次に可変領域をコードするcDNAをクローン化し、使用したマウスの全範囲に対応するScFv断片を発現するファージライブラリーを形成する。tat、revおよびNCP7ペプチドを認識する細胞内抗体（ScFv断片）を次に同定し、そしてカラムおよびマイクロタイトレーションプレートアフィニティー試験の連続工程により同定し、そして単離する。
次にこれらのScFv断片を、HIVウイルスの複製周期を遮断するそれらの能力について機能的に試験する。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名前：ローヌ−プーラン  ローラー  エス．エー．
（Ｂ）通り：アロン通り  Ｒ．２０
（Ｃ）市：アントニー
（Ｄ）国：仏国
（Ｅ）郵便番号：９２０１６５
（ii）発明の名称：核酸配列、それを含むベクター、医薬組成物および治療的使用。
（iii）配列の数：２
（iv）コンピーター読み取り先：
（Ａ）媒体型：テープ
（Ｂ）コンピーター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換型
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア；パテントイン  リリース  #1.0、
#1.25バージョン（EPO）
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ−センス：無し
（ix）特性：
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．８７０
（ix）特性：
（Ａ）名前／キー：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）位置：４４２．．４８６
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“リンカー”
（ix）特性
（Ａ）名前／キー：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）位置：８２．．８１０
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＳｃＦｖ抗−Ｒａｓ”
（xi）配列の記載：配列番号１：
0004384260.tif 000003
0004384260.tif 000004
0004384260.tif 000005
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８１０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）コンフィグレーション：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ−センス：無し
（ix）特性：
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．８１０
（ix）特性：
（Ａ）名前／キー：ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）位置：３１．．７５３
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ＳｃＦｖ抗−ＧＡＰ”
（xi）配列の記載：配列番号２：
0004384260.tif 000006
0004384260.tif 000007
0004384260.tif 000008
【図１Ａ】
0004384260.tif 000009
【図１Ｂ】
0004384260.tif 000010
【図１Ｃ】
0004384260.tif 000011