(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する活性、および、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質を、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸に作用させ、ジペプチドを合成することを特徴とするジペプチドの製造方法であって、
前記タンパク質が、コリネバクテリウム  グルタミカム、シュードモナス  プチダ、バチルス  コアギュランスのいずれかに属する微生物に由来し、
前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であり、
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上である、
ことを特徴とするジペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物を用いて、前記タンパク質を供給することを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、下記（Ａ）から（Ｆ）：
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質、
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、および
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質、
からなる群より選ばれる、特許請求の範囲第１項または第２項に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、下記（ａ）から（ｆ）：
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列表の配列番号１４に記載の塩基番号４８６〜１４９６の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列表の配列番号１４に記載の塩基番号４８６〜１４９６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３１１〜１２７９の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３１１〜１２７９の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群より選ばれるＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体により前記ＤＮＡを発現させて供給され、かつ、
前記ストリンジェントな条件が、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである、
特許請求の範囲第１項または第２項に記載のジペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ安価にジペプチドを製造する方法に関し、詳しくは、ペプチド生成酵素遺伝子、ペプチド生成酵素、および該酵素を用いたジペプチドの製造方法に関する。
背景技術
ジペプチドは、医薬品素材、機能性食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは無血清培地の成分として有用であり、Ｌ−グルタミンに比べ安定で、水溶性も高いことから輸液成分に用いられる。
ジペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便なものではなかった。例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアラニン（以下Ｚ−アラニンと称する）と保護Ｌ−グルタミンを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３４，７３９（１９６１）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３５，１９６６（１９６２））、Ｚ−アラニンと保護Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いる方法（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３７，２００（１９６４））、Ｚ−アラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開平１−９６１９４号公報）、２−置換−プロピオニルハロイドを原料として、Ｎ−（２−置換）−プロピオニルグルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開平６−２３４７１５号公報）等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、もしくは中間体の合成が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかった。酵素を用いたジペプチドの代表的製造法としては、Ｎ保護、Ｃ無保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる縮合反応（反応１）、およびＮ保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応２）が知られており、反応１の例としては、Ｚ−アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルからのＺ−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルの製造方法（特開昭５３−９２７２９号公報）、（反応２）の例としてはアセチルフェニルアラニンエチルエステルとロイシンアミドからのアセチルフェニルアラニルロイシンアミドの製造方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，１６３，５３１（１９７７））が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分を用いる方法の研究報告例は極めて少なく、Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ保護のアミン成分を用いる置換反応（反応３）の例としては特許ＷＯ  ９０／０１５５５があり、例えばアルギニンエチルエステルとロイシンアミドからのアルギニルロイシンアミドの製造方法が挙げられる。Ｎ無保護、Ｃ保護のカルボキシ成分とＮ無保護、Ｃ無保護のアミン成分を用いる置換反応（反応４）の例としては、特許ＥＰ  ２７８７８７Ａがあり、例えばチロシンエチルエステルとアラニンからのチロシルアラニンの製造方法が挙げられる。これらの方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然ながら保護基の数が最も少ない反応４の範疇に入る反応である。
しかしながら、反応４の先行例（特許ＥＰ  ２７８７８７Ａ）に使用する酵素は、カビ、植物に由来する比較的高価なｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ標品を用いており、また生産されるジペプチドも比較的疎水度の高いアミノ酸を含むものであった。反応４において、細菌および酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、また親水性の高いアラニルグルタミンやアラニルアスパラギンの製造方法についても全く知られていなかった。このような背景の下、これらペプチドの工業的安価な製造法の開発が望まれていた。
一方、プロリンイミノペプチダーゼは、Ｎ末端にプロリンを持つペプチドから、そのＮ末端プロリンを切り出す反応を触媒する酵素であり、多くの生物種においてその存在が知られている。例えば、モルモット（脳）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，６１４７−６１５４（１９８３））、ラット（脳・腎）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０，５０９−５１５（１９９０））等の高等動物、アンズ種子（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２，４１３−４２１（１９８２））等の高等植物、トルコデマ・デンテコーラ（Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．，６４，７０２−７０８（１９９６））等の口腔スピロヘータ、ペニシリウム等の糸状菌（特開平１−２１５２８８）、しいたけ等の担子菌（特開昭５８−３６３８７）、ストレプトミセズ・ブリカタス（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８４，１２５０−１２５５（１９９２））等の放線菌類、コリネバクテリウム・バリアビリス（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９０，４４９−４５６（２００１））等の細菌等で、プロリンイミノペプチダーゼの存在が知られている。
また、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子も、アースロバクター・ニコチアナ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，１９１−１９７（１９９９））、エシェリヒア・コリ（特開平２−１１３８８７）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，３５−４１（１９９６））、ハフニア・アルベイ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，４６８−４７４（１９９６））、ラクトバチルス・デブルキー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，５２７−５３５（１９９４））、バチルス・コアギュランス由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，７９１９−１９２５（１９９４））、アエロモナス・ソブリア由来（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，８１８−８２５（１９９４））、キサントモナス・キャンペストリス（特開平９−１２１８６０）、ナイセリア・コノローヘ（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，１２０３−１２１１（１９９３））、プロピオニバクテリウム・フリュデンリチー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，６４，４７３６−４７４２（１９９８））、セラチア・マルセッセンス（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，６０１−６０５（１９９７））、サーモプラズマ・アシドフィラム（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３９８，１０１−１０５（１９９６））の遺伝子のクローニング、塩基配列が報告されている。
また最近、微生物の全ゲノム解析により、多くの生物種で、プロリンイミノペプチダーゼをコードすると推測される塩基配列が報告されている。例えば、シュードモナス・アルギノーサのゲノム全塩基配列が報告され（Ｎａｔｕｒｅ，４０６，９５９（２０００））、その中でプロリンイミノペプチダーゼをコードすると推測される塩基配列が見出されている。
一方、プロリンイミノペプチダーゼにより、Ｌ−プロリンあるいはＤＬ−プロリンのエステルとαアミノ酸を反応させて含プロリンジペプチドを生成することが見出されている（特開平３−１３３９１号公報）。しかしながら、プロリンイミノペプチダーゼはＮ末端にプロリンを持つペプチドから、そのＮ末端プロリンを切り出す反応を触媒する酵素であり、この基質特異性から、プロリンエステルとアミノ酸からプロリルアミノ酸を生成させることは当然考えられることであるが、プロリンイミノペプチダーゼを用いてプロリン以外のアミノ酸エステルとアミノ酸からペプチドを合成することは全く知られていなかった。勿論、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩及びＬ−グルタミンからＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを合成することについてもこれまで全く知られていなかった。また、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３のプロリンイミノペプチダーゼ部分塩基配列が公開されていた（ＡＦ０３２９７０）が、その活性については検出も含め全く検討されていなかった。
発明の開示
本発明は、安価に入手可能な出発原料と安価に供給できる酵素源（微生物の培養物、微生物菌体、菌体処理物等）を用いて、工業的に有利かつ簡便な経路でジペプチドを製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、プロリンイミノペプチダーゼが、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからペプチドを生成する能力を有することを見出した。また、該酵素についてその遺伝子をクローニング・発現するとともに、精製組換え酵素を用いてペプチド生成の広い基質特異性を明らかとすることにより、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質。
〔２〕  下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質。
〔３〕  下記（Ｅ）または（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質。
〔４〕  下記（ａ）または、（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔５〕  下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号１４に記載の塩基番号４８６〜１４９６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号１４に記載の塩基番号４８６〜１４９６の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔６〕  下記（ｅ）または（ｆ）に示すＤＮＡ。
（ｅ）配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３１１〜１２７９の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３１１〜１２７９の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔７〕  前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である、上記〔４〕から〔６〕のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
〔８〕  上記〔４〕から〔７〕のいずれか一項に記載のＤＮＡが組み込まれた組換えＤＮＡ。
〔９〕  上記〔４〕から〔７〕のいずれか一項に記載のＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能に導入された形質転換細胞。
〔１０〕  上記〔９〕に記載の形質転換細胞を培地で培養し、培地中および／または形質転換細胞中に、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、ジペプチド生成酵素の製造方法。
〔１１〕  上記〔９〕に記載の形質転換細胞が生成する、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有するタンパク質を用いて、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを製造することを特徴とする、ジペプチドの製造方法。
〔１２〕  前記Ｌ−アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α、β−ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１１〕に記載のジペプチドの製造法。
〔１３〕  前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ―ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１１〕または〔１２〕に記載のジペプチドの製造法。
〔１４〕  プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するたんぱく質を、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸に作用させ、ジペプチドを合成することを特徴とするジペプチドの製造法。
〔１５〕  前記プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質が、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属のいずれかに属する微生物に由来することを特徴とする、上記〔１４〕に記載のジペプチドの製造法。
〔１６〕  前記プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質が、コリネバクテリウム  グルタミカム、シュードモナス  プチダ、バチルス  コアギュランスのいずれかに由来することを特徴とする、前記〔１４〕に記載のジペプチドの製造法。
〔１７〕  前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α、β−ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１４〕から〔１６〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造法。
〔１８〕  前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１４〕から〔１７〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造法。
〔１９〕  コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはバチルス属に属し、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物を用いて、アミノ酸エステルとアミノ酸とからジペプチドを製造することを特徴とするジペプチドの製造方法。
〔２０〕  前記アミノ酸エステルが、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α、β−ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン−γ−エステルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１９〕に記載のペプチドの製造法。
〔２１〕  前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ―ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１９〕に記載のペプチドの製造法。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する新規なタンパク質、これをコードするＤＮＡを提供し、さらにこれらを利用したジペプチドの製造方法を提供するものである。本発明のジペプチドの製造方法における反応は下記反応式のように表される。下記化学式に例示されるように、本明細書において「ジペプチド」とは、ペプチド結合を１つ有するペプチドポリマーのことをいう。
0004239819.tif 000002
（Ｒは置換または無置換の炭化水素鎖、Ｒ１はアミノ酸エステルの側鎖、Ｒ２はアミノ酸の側鎖を表す）
アミノ酸エステルは、安価に入手可能な化合物である。アミノ酸エステルと無保護アミノ酸を出発原料として、細菌、酵母などを酵素源として水溶液中で反応せしめる本発明の方法は、従来にはない新しいジペプチドの製造方法であり、医薬品素材、機能性食品として有用なジペプチドをより安価に提供することを可能とするものである。
以下、本発明について、
〔Ｉ〕Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
〔ＩＩ〕ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔ＩＩＩ〕ペプチド生成酵素の性質
〔ＩＶ〕ジペプチドの製造方法
の順に詳細に説明する。
〔Ｉ〕Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物
本発明に使用する微生物としては、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物としては、バチルス属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属に属する微生物などを挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
バチルス  ズブチリス  ＡＴＣＣ  ６６３３
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
バチルス  コアギュランス  ＥＫ０１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，７９１９−７９２５（１９９２））
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）
コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ  １３２８６
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
シュードモナス  プチダ  ＡＪ−２４０２  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）
シュードモナス  プチダ  ＡＴＣＣ１２６３３
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）
シュードモナス  プチダ  ＡＪ２０４８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）
上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＦＥＲＭ番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託され、受託番号が付与された微生物である。シュードモナス  プチダＡＪ−２４０２株は、２００１年１０月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、ＡＪ−２４０２はＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４４の受託番号が付与され、さらに２００２年７月１日に国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１が付与されている。尚、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１（ＡＪ−２４０２）は、以下の分類実験により、上述のシュードモナス  プチダであることが同定された。また、シュードモナス  プチダ  ＡＪ２０４８株は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３の受託番号が付与されている。
シュードモナス  プチダ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性あり、コロニー形態は円形、全縁滑らか、凸状、光沢あり、クリーム色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、運動性を有する無胞子桿菌であり、シュードモナスに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの産生陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陽性、ウレアーゼ陰性、エスクリン加水分解陰性、ゼラチン加水分解陰性、β―ガラクトシダーゼ陰性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陰性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陽性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陰性、マルトース資化陰性、グルコン酸カリウム資化陽性、ｎ−カプリン酸陽性、アジピン酸資化陰性、ｄｌ−リンゴ酸資化陽性、クエン酸ナトリウム資化陽性、酢酸フェニル資化陽性、オキシダーゼ陽性、Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｂ寒天培地での蛍光色素生産陽性、ショ糖からのレバン産生陽性、ソルビトールの資化微弱という生理学的性質よりシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）と同定された。
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
〔ＩＩ〕ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの単離等
〔ＩＩ―１〕ＤＮＡの単離
本発明者らは上記の微生物から、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを合成する活性を有するタンパク質をコードする本発明のＤＮＡを単離し、配列を特定した。配列表の配列番号４に記載の塩基番号５７〜１２９５の塩基配列からなるＤＮＡは、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から単離された。また、配列表の配列番号１４に記載の塩基番号４８６〜１４９６の塩基配列からなるＤＮＡは、シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３株から単離された。さらに、配列表の配列番号１６に記載の塩基番号３１１〜１２７９の塩基配列からなるＤＮＡは、シュードモナス  プチダ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株から単離された。なお、本明細書において「配列番号４に記載の塩基配列」、「配列番号１４に記載の塩基配列」、「配列番号１６に記載の塩基配列」とは、特に断らない限りＣＤＳ部分を指す。
ＤＮＡを単離する一例を示すと、はじめに、精製されたペプチド生成酵素のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２（１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたペプチド生成酵素についてのＮ末端、あるいは、リジルエンドペプチダーゼ等の処理により得られたペプチドの約１０から３０残基のアミノ酸配列を決定し、明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９（１９８１）に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法で染色体ＤＮＡからペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを増幅することができる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡは、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長をコリネバクテリウム  グルタミカム、シュードモナス  プチダ、バチルス  スブチリスなどの各菌株の染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
あるいは、遺伝子の塩基配列の一部が既知である場合には、その既知配列を有するＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を染色体遺伝子ライブラリーから単離することができる。
さらに、遺伝子の塩基配列が既知配列と相同性を有する場合には、その既知配列を有するＤＮＡをプローブとして用いて、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡ全長を染色体遺伝子ライブラリーから単離することができる。
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。このようにしてコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株、シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３株、シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株から単離された、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを、それぞれ配列表配列番号４、１４、１６に示す。
本発明で用い得るＤＮＡは、配列表配列番号４、１４、１６で特定されるＤＮＡのみではない。例えば、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から単離された配列表配列番号４のＤＮＡについて以下説明すると、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株の染色体ＤＮＡから単離されたペプチド生成酵素をコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ペプチド生成酵素をコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Ｍｅｔｈｏｄ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４（１９８７）に記載されている部位特異的変異導入法がある。
また、配列表配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いることができるＤＮＡである。
さらに、配列表の配列番号４に記載のＣＤＳからなるＤＮＡに基づいて調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。プローブは、例えば配列番号４に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするＤＮＡをつり上げ、目的とするＤＮＡを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ペプチド生成酵素の活性については既に上記にて説明したとおりである。ただし、配列表の配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡがコードするペプチド生成酵素と実質的に同一のタンパク質も本発明で用いることができる。したがって、「配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡも本発明において用いることができる。ここで「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ペプチド生成酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、ペプチド生成酵素の活性については、既に説明した通りである。ただし、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、より好ましくは５０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
上記のように、本発明のＤＮＡとして、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から単離したＤＮＡ、シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３株から単離したＤＮＡ、シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株から単離したＤＮＡなどのほか、これらと実質的に同一のＤＮＡも提供される。すなわち、本発明が提供するＤＮＡとしては次のようなものが挙げられる。
（ｉ）配列表の配列番号４、１４または１６に記載のＣＤＳからなるＤＮＡ。
（ｉｉ）配列表の配列番号４、１４または１６に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉｖ）配列表の配列番号５、１５または１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｖ）配列表の配列番号５、１５または１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔ＩＩ−２〕形質転換体の作製
次に、ペプチド生成酵素活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。組換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理括性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
本発明の方法で用いることができる形質転換体としては、例えば下記（ＡＡ）、（ＢＢ）または（ＣＣ）などのタンパク質を発現することができる形質転換体が好適なものとして挙げられる。
（ＡＡ）配列表の配列番号５、１５または１７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ＢＢ）配列表の配列番号５、１５または１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成活性を有するタンパク質。
（ＣＣ）配列表の配列番号４、１６または１８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号４、１６または１８の塩基配列に基づいて調製されるプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する反応を触媒するペプチド生成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでコードされるタンパク質。
上記（ＡＡ）〜（ＣＣ）のペプチド生成活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記〔ＩＩ−１〕の欄に示した（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）のＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）のＤＮＡを宿主細胞で発現可能な組換えＤＮＡ、具体的には発現ベクターなどに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
また、上記（ＢＢ）に示されるような変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法などが挙げられる。
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌などの腸内細菌、好ましくは大腸菌（エシェリヒア  コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が用いられる。大腸菌などの腸内細菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてペプチド生成酵素を製造する方法の一形態を説明する。
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡ、トランスポゾンＤＮＡのベクターも利用できる。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えばエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡとして、配列表配列番号４に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド生成酵素が生産される。また、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１４に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド生成酵素が生産される。また、ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１６に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するペプチド生成酵素が生産される。
なお、遺伝子工学的な手法については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの文献に記載された手法に準拠して実施することができる。
〔ＩＩＩ〕ペプチド生成酵素の性質
つぎに、上記微生物のうち、例として、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株から精製されたペプチド生成酵素の性質について説明する。
Ｌ−アラニンエステルとＬ−グルタミンとを原料（基質）とする場合を例に取ると、当該ペプチド生成酵素は、Ｌ−アラニンエステルとＬ−グルタミンとを基質としＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する活性を有する。また、Ｌ−アラニンアミドとＬ−グルタミンとを原料とする場合を例に取ると、当該ペプチド生成酵素は、Ｌ−アラニンエステルとＬ−アスパラギンとを基質としＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンを生成する活性を有する。
作用としては、Ｌ−アラニンエステルと、Ｌ−アスパラギンまたはＬ−グルタミンとを原料とする場合を例に取ると、当該ペプチド生成酵素は、Ｌ−アラニンエステル１分子とＬ−グルタミン１分子からＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン１分子とアルコール１分子を生成、Ｌ−アラニンエステル１分子とＬ−アスパラギン１分子からＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギン１分子とアルコール１分子を生成する。
至適ｐＨは６．０から１０．０付近にあり、至適温度は３０から５０℃付近にある。サブユニットの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって４２，０００〜４６，０００と算出される。
〔ＩＶ〕ジペプチドの製造方法
本発明のジペプチドの製造方法は、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを合成する活性を有する酵素または当該酵素含有物を用いてジペプチドを製造する方法である。具体的には、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該微生物の菌体処理物、または、該微生物に由来するペプチド生成酵素を用いて、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを製造するものである。なお、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する限り、上記または下記表１などに例示した微生物に由来するプロリンイミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質を用いることもできる。
上記微生物の産生するペプチド生成酵素は、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸を基質としてジペプチドを生成する活性を有するものである。
上記微生物の産生するペプチド生成酵素をＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸に作用せしめる方法としては、上記微生物を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養終了後の培養液あるいは微生物培養物から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液に再懸濁したものにＬ−アミノ酸エステル−アミノ酸を添加して反応させてもよい。あるいは、ポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル法等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができる。
また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体を用いてもよい。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
さらに、当該微生物菌体処理物からペプチド生成酵素を回収し、粗酵素液として使用してもよいし、必要に応じて、酵素を精製して用いてもよい。培養物からの精製法としては通常の酵素精製法をもちいることができる。具体的には遠心分離等によって菌体を集め、超音波処理、ガラスビーズ、ダイノミルなどの機械的方法によって菌体を破砕し、細胞片等の固形物を遠心分離によって除き、粗酵素を得て、超遠心分離分画、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を行うことによって上述のペプチド生成酵素が精製される。
なお、「微生物に由来するペプチド生成酵素」とは、当該微生物菌体処理物から上記精製工程を経て得られた酵素のみならず、当該酵素の遺伝子を異種または同種の宿主において発現させることによる、いわゆる遺伝子工学的手法によって生産された酵素をも含む。
すなわち、Ｌ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸とからジペプチドを生成する活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、金属酵素阻害剤、例えばエチレンジアミンン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤などを添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから１００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭである。
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄菌体を用いる場合は反応液１リットル当たり１〜５００ｇである。
Ｌ−アミノ酸エステルとしては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてＬ−アミノ酸とジペプチドを生成できるＬ−アミノ酸エステルであればいかなるものも使用でき、例えば、Ｌ−アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。また、天然型のアミノ酸に対応したＬ−アミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するＬ−アミノ酸エステルも使用可能である。本発明において、Ｌ−アミノ酸エステルとして好ましくは、Ｌ−アミノ酸エステルは、Ｌ−アラニンエステル、グリシンエステル、Ｌ−バリンエステル、Ｌ−イソロイシンエステル、Ｌ−メチオニンエステル、Ｌ−フェニルアラニンエステル、Ｌ−セリンエステル、Ｌ−スレオニンエステル、Ｌ−グルタミンエステル、Ｌ−チロシンエステル、Ｌ−アルギニンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α−エステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エステル、Ｌ−ロイシンエステル、Ｌ−アスパラギンエステル、Ｌ−リジンエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α、β−ジメチルエステル、Ｌ−グルタミン−γ−エステルなどを用いることができる。
Ｌ−アミノ酸としては、当該ペプチド生成酵素の基質特異性においてＬ−アミノ酸エステルとジペプチドを形成するものであれば特に限定なく公知のものを使用できる。本発明においては、Ｌ−アミノ酸として好ましくは、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ―ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸など、特に好ましくは、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンなどを用いることができる。
出発原料であるＬ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、Ｌ−アミノ酸エステルに対してＬ−アミノ酸を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、必要ならば、例えば基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加する事ができる。
反応温度は３〜７０℃、好ましくは５〜５０℃であり、反応ｐＨはｐＨ２〜１２好ましくはｐＨ３〜１１である。かくして２〜４８時間程度反応を行うことにより、反応混合物中にジペプチドが生成蓄積する。生成されたジペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
実施例
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるＬ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンまたはＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（カラム：ＧＬサイエンス社製  ＩｎｅｒｔｓｉＬ  ＯＤＳ−２、溶離液：リン酸水溶液（ｐＨ２．２、５．０ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム溶液／メタノール＝１００／１５、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）により行った。
（実施例１）  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成に対するＥＤＴＡの添加効果
１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸一カリウム  １ｇ、リン酸二カリウム  ３ｇ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した。これに同組成を含む斜面寒天培地（寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養したシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１００ｍＭ  １Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。菌体懸濁液１ｍＬを、ＥＤＴＡ無添加、もしくはＥＤＴＡ２０ｍＭを含み、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬ（基質溶液）にそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、３０℃にて１時間反応をおこなった。この結果、ＥＤＴＡ無添加区では４．９ｍＭ，ＥＤＴＡ添加区では１０．１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが生成した。
尚、これらの反応系において、菌体懸濁液の代わりに１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを基質溶液１ｍＬに添加した添加した条件（菌体無添加区）、および基質溶液の替わりに、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩とグルタミンを含まない、ＥＤＴＡ無添加あるいは２０ｍＭＥＤＴＡを含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを菌体懸濁液に添加した条件（基質無添加区）では、いずれの場合もＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成は見られなかった。
（実施例２）  基質としてのアミノ酸エステル
実施例１と同様に調製したシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株の菌体懸濁液湿菌体（１００ｇ／Ｌ）１ｍＬを、ＥＤＴＡ２０ｍＭと下記のＬ−アラニンエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、３０℃にて１時間反応をおこなった。この結果、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質した場合には、１４．９ｍＭ、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質した場合には、１１．４ｍＭ、Ｌ−アラニン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質した場合には、０．５ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンが生成した。
（実施例３）  基質としてのＬ−アミノ酸
実施例１と同様に調製した  シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株の菌体懸濁液湿菌体（１００ｇ／Ｌ）１ｍＬを、ＥＤＴＡ２０ｍＭとＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミンあるいはＬ−アスパラギン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、３０℃にて１時間反応を行った。この結果、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを基質した場合には、１２．７ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−アスパラギンを基質した場合には、４．８ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギンが生成した。
（実施例４）  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する微生物
微生物の培養には、１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸一カリウム  １ｇ、リン酸二カリウム  ３ｇ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた。これに１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇを含む斜面寒天培地（寒天  ２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１に示す細菌を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩２００ｍＭ、及びＬ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２５℃にて２時間反応をおこなった。このときのＬ―アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の生成量（ｍＭ）を表１に示す。
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（実施例５）  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成に及ぼす温度の影響
実施例４の微生物の培養法に従って調製したシュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株菌体懸濁液（１００ｇ／Ｌ）１ｍＬを、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩  ２００ｍＭ、Ｌ−グルタミン４００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬにそれぞれ添加し、全量を２ｍＬとした後、２０℃、３０℃、４０℃にてそれぞれ１時間反応をおこなった結果を表２に示した。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の生成は、シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１０１株の場合には４０℃において最も高い値を示した。
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（実施例６）  コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３２８６株からのペプチド生成酵素の精製と精製酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産
１Ｌ中にグルセロール  ５ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ペプトン  ５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩  ５ｇを含む培地５００ｍＬを５Ｌ坂口フラスコに分注し、１２０℃、２０分殺菌した。これに、上記と同じ組成の培地で２０時間培養したコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株の培養液を５％（Ｖ／Ｖ）になるように植菌し、３０℃、１２０往復／分で２０時間培養した。この培養液８Ｌから遠心分離により菌体を集めた。、以下の操作は氷上あるいは４℃にて行った。菌体を５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、０．１ｍｍ径のガラスビーズをもちいて約１０分間破砕処理を行った。ガラスビーズと菌体破砕液を分離し、２０，０００×ｇ、３０分の遠心分離にて破砕菌体片を除去し、無細胞抽出液を得た。更に２００，０００×ｇ、６０分の超遠心分離にて不溶性画分を除去し、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分に硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように添加し、２０，０００×ｇ、３０分の遠心分離によって沈殿を回収した。得られた沈殿を少量の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。この酵素液を５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムに供し、０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分を集め、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇに供し、同緩衝液で酵素を溶出させた。活性画分を集め、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行い、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰに供した。０．５〜０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分を集め、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、これを５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＭｏｎｏＱカラムに供し、０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。こうしてペプチド精製酵素を電気泳動的に均一に精製した。
本精製酵素の比活性は９．８４１Ｕｎｉｔ／ｍｇで、これらの精製過程を通じて当該ペプチド精製酵素の比活性は約２４６倍に上昇した。また、本精製酵素標品の分子量をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した結果、分子量４２，０００〜４６，０００と算出される位置に均一なバンドが検出された。尚、酵素の力価の測定は以下の通り行った。トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μｍｏｌ、Ｌ−アラニンアミド５０μｍｏｌおよび適当量の酵素液を加え、全量が１ｍｌとなるように混合し、３０℃にて６０分間反応させた後、リン酸水溶液（ｐＨ２．１）を４ｍｌ加え反応を停止した。生成したアラニンを高速液体クロマトグラフィーで定量し、１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニンを生成する酵素量を１単位とした。
この精製酵素をＥＤＴＡ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、及びＬ−グルタミン（あるいはＬ−アスパラギン）を含むホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、全量が１ｍＬになるように混合（終末濃度として、酵素添加量はアラニンアミド分解活性として２Ｕｎｉｔ、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩１００ｍＭ、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ（あるいはＬ−アスパラギン２００ｍＭ）、ホウ酸緩衝液１００ｍＭ）し、３０℃にて４時間反応させた（尚、酵素のｕｎｉｔ数はＬ−アラニンメチルエステルとＬ−グルタミンからのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生成活性ではなく、簡便なＬ−アラニンアミド分解活性で示した）。このときＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生成量は５０．２ｍＭ、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギンの生成量は４９．８ｍＭであった。
（実施例７）  コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株からのペプチド生成酵素遺伝子の単離とＥ．ｃｏｌｉでの発現
以下、コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６からのペプチド生成酵素遺伝子の単離とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現について述べる。遺伝子の単離、発現とも、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
１．決定アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
実施例１で得たコリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株由来のペプチド生成酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列表配列番号１）をもとに、配列表配列番号２、３にそれぞれ示すミックスプライマーを作製した。
２．菌体の取得
コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株をＣＭ２Ｇｌｙ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ  グリセロール、  １．０ｇ／ｄｌ  酵母エキス、１．０ｇ／ｄｌ  ペプトン、０．５ｇ／ｄｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／ｄｌ  寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４  時間培養し菌をリフレッシュした。これを５０  ｍｌのＣＭ２Ｇｌｙ液体培地を張り込んだ５００  ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振盪培養した。
３．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、遠心分離操作により菌体を回収した。再び、この菌体を１０ｍｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。さらに、この懸濁液に、０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。このインキュベートした薄液に、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で飽和したフェノールを等量加えて除タンパクを行った。この分離した水層に対して、等量の２−プロパノールを加えて、ＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）０．５ｍｌに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、この溶液に等量の１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で飽和したフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に等量の２４：１  クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ  ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）に溶解させた。
４．カセットＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
カセットＰＣＲ法によるペプチド生成酵素をコードする遺伝子（ａａｈ）を含むＤＮＡ分子の単離・増幅には、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いた。以下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。カセットＰＣＲ法において、プライマー１（１ｓｔ  ＰＣＲ、配列表配列番号２）と２（２ｎｄ  ＰＣＲ、配列表配列番号３）をプライマーとした場合に、ＥｃｏＲ  Ｉカセットとの間で約０．５ｋｂのバンド（フラグメント１）が増幅した。この断片の塩基配列を決定することにより、フラグメント１がａａｈの一部分であることを確認した。
５．遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
次に、ａａｈの全長取得のために、フラグメント１をプローブとしてまず、サザンハイブリダイゼーションを行った。
プローブとなるＤＮＡ断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、プロトコールに準じて３７℃で２４時間インキュベートしてプローブの標識を行った。
染色体ＤＮＡ１μｇを各種制限酵素の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）にブロッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行い、５０℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。
その結果、Ｂｇｌ  ＩＩの切断物においては、約７ｋｂの位置にバンドが検出された。この７ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリー（１２０株）を作製した。以下定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎｙ  ａｎｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に転写し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをｂｕｆｆｅｒ中に浸し、４２℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述の標識プローブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒでの洗浄後、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてポジティブクローン１株を選抜した。
６．コリネバクテリウム  グルタミカム  ＡＴＣＣ１３２８６由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
選抜した形質転換体が保有するプラスミドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される方法に従って調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。ペプチド生成酵素の３０残基のＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子ａａｈであることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列を配列表配列番号４に示した。得られたＯＲＦは既知のプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来のプロリンイミノペプチダーゼ（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）と塩基配列で５７．６％の相同性を示した。なお、相同性の数値はＧｅｎｅｔｙｘを用いて得られた値である（以下、本実施例において同じ）。
７．ペプチド生成酵素遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ａａｈをＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にａａｈを連結したプラスミドｐＵＣＡＡＨを構築した。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６染色体ＤＮＡを鋳型とし、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＳａｃＩ、ＳｍａＩで処理し、ｐＵＣ１８のＳａｃＩ、ＳｍａＩ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＵＣＡＡＨと命名した。
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ｐＵＣＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉでのペプチド生成酵素の発現形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間、シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコに、この前培養液を１ｍｌシードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始２時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３時間培養を行った。
培養終了後、集菌、洗浄を行い、１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液  （ｐＨ８．０）に懸濁し、１８０Ｗ、３０分間、超音波破砕した。溶液を回収し、１２，０００ｇ×１０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
（実施例８）  ペプチド生成酵素活性測定
１．コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６由来酵素の活性
上記のようにして培養終了後、無細胞抽出液を調製し、これを酵素源としてペプチド生成酵素活性の測定を行った。ペプチド生成酵素活性の測定は、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素溶液を含む反応液を３０℃で６０分インキュベートした後、４倍容のリン酸（ｐＨ１．５）を添加することにより反応を停止させた。ＨＰＬＣにてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン量を定量することによった。酵素活性の単位として、この条件にて１分間に１μｍｏｌのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生成する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通り。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２
移動相：（リン酸水溶液（ｐＨ２．１）），２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ−１−ｏｃｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ／ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１０／１
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
その結果、ｐＵＣ１８ＡＡＨを導入した場合に、０．５４Ｕ／ｍｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩からのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成の活性が検出され、クローニングしたａａｈ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＵＣ１８のみを導入した場合には、活性は検出されなかった。
２．Ｈｉｓ−Ｔａｇペプチド生成酵素遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ａａｈをＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にＨｉｓ−Ｔａｇタンパクとしてペプチド生成酵素を発現させるプラスミドｐＱＥＡＡＨを構築した。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株染色体ＤＮＡを鋳型とし、表４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＳａｃＩ、ＳｍａＩで処理し、ｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ社）のＳａｃＩ、ＳｍａＩ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＱＥＡＡＨと命名した。
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ｐＱＥＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉでのペプチド生成酵素の発現形質転換体について、実施例８と同様の方法で活性測定したところ、５．２８Ｕ／ｍｇのペプチド生成酵素活性を示した。
３．Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製酵素の調製
ｐＱＥＡＡＨを持つＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の培養液１５０ｍｌから、上記の方法で菌体破砕し、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、その添付プロトコールに従ってＨｉｓ−ＴａｇＬ―アラニンアミドハイドロラーゼを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドを示すタンパクが２４ｍｇ取得された。その精製酵素のＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩からのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成の比活性は１４８．３Ｕ／ｍｇであり、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩に対して５０．７％であった。
４．Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製酵素を用いた基質特異性の検討
取得したペプチド生成酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン以外のペプチド合成についてＨｉｓ−Ｔａｇ精製酵素を用いて検討を行った。
（１）Ｌ−アラニンメチルエステルと他のＬ−アミノ酸からのペプチド合成
合成反応は、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭ供試アミノ酸、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素溶液（０．０５Ｕ／ｍｌ）を含む反応液を２５℃で３時間インキュベートし、生成したペプチドをＨＰＬＣで定量した。その結果、Ｌ−アミノ酸としてＬ−アスパラギンを用いた場合には、２２．３４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アスパラギン、グリシンを用いた場合には、５．６６ｍＭのＬ−アラニル−グリシン、Ｌ−アラニンを用いた場合には、１０．６３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシンを用いた場合には、１３．７３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニンを用いた場合には、４８．８０ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリンを用いた場合には、１．０２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニンを用いた場合には、１６．１３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンを用いた場合には、１５．３１ｍＭのＬ−アラニル−トリプトファン、Ｌ−セリンを用いた場合には、２６．１４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニンを用いた場合には、２４．２３ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンを用いた場合には０．９６ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−チロシン、Ｌ−リジンを用いた場合には、７．９１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンを用いた場合には、２４．８７ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンを用いた場合には、２３．１６ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グルタミン酸を用いた場合には、１．１１ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン酸が生成された。
（２）他のＬ−アミノ酸メチルエステルとＬ−グルタミンからのペプチド合成
Ｌ−アラニンメチルエステル以外のアミノ酸メチルエステルを用いて反応をを行った。
合成反応は、１００ｍＭ供試アミノ酸メチルエステル、１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび酵素（０．０５Ｕ／ｍｌ）を含む反応液を２５℃で３時間インキュベートし、生成したペプチドをＨＰＬＣで定量した。その結果、Ｌ−アミノ酸メチルエステルとしてグリシンメチルエステルを用いた場合には、５２．１９ｍＭのグリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリンメチルエステルを用いた場合には、５．９４ｍＭのＬ−バリル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシンメチルエステルを用いた場合には、０．５９ｍＭのＬ−イソロイシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−メチオニンメチルエステルを用いた場合には、４．３１ｍＭのＬ−メチオニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを用いた場合には、３．６７ｍＭのＬ−フェニルアラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−セリンメチルエステルを用いた場合には、４０．４４ｍＭのＬ−セリル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−スレオニンメチルエステルを用いた場合には、３．８５ｍＭのＬ−スレオニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミンメチルエステルを用いた場合にはでは０．２３ｍＭのＬ−グルタミニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−チロシンメチルエステルを用いた場合には、１．２４ｍＭのＬ−チロシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンメチルエステルを用いた場合には、６．５２ｍＭのＬ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸−α−メチルエステルを用いた場合には８．２２ｍＭのＬ−アスパルチル−α−Ｌ−グルタミンが生成された。また、アミノ酸メチルエステルとしてＬ−ロイシンメチルエステル、あるいはＬ−アスパラギンメチルエステル、あるいはＬ−リジンメチルエステル、あるいはＬ−アスパラギン酸−β−メチルエステル、あるいはＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル、あるいはＬ−グルタミン酸−γ−メチルエステルを用いた場合にも、対応するアミノ酸とＬ−グルタミンからなるペプチドの生成が確認された（標準品が入手できなかったため、定量はしていない）。
（３）プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）活性の測定法
反応液（組成；５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  プロリン２−ナフチルアミド（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｐＮＡ））を用いて、３０℃で反応を行った。ナフチルアミドの遊離速度を４０５ｎｍの吸光度の増大で測定（ε＝９．８３）。１分間に１μｍｏｌのナフチルアミドを放出する活性を１Ｕとした。
精製酵素のプロリンイミノペプチダーゼ活性は、５．８３ｘ１０３Ｕ／ｍｇであった。
（実施例９）  シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３株プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）遺伝子の単離とＥ．ｃｏｌｉでの発現
１．プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）遺伝子部分断片の取得
実施例７の３．と同様の方法でシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３の培養菌体（５０ｍｌ培養）から、ＤＮＡを単離した。
一方、Ｇｅｎｂａｎｋに公開されているシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株のプロリンイミノペプチダーゼ部分塩基配列（ＡＦ０３２９７０）に基づいて合成ＤＮＡオリゴマー（配列番号１０：ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  Ａ、および、配列番号１１：ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＴＣ）を作製し、これらをプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により遺伝子部分断片を増幅した。
２．遺伝子ライブラリーからのプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子全長のクローニング
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子（ｐｅｐＩ）の全長取得のために、この部分断片をプローブとして用いて、まず、実施例７の５．に記載の方法と同様にしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＸｈｏＩの切断物においては、約２．８ｋｂの位置にバンドが検出された。次に、この２．８ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８のＳａｌＩ部位に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリー（１００株）を作製した。実施例と同様の方法にてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローン１株を選抜した。
３．シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列
選抜した形質転換体が保有するプラスミドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される方法に従って調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。３３７アミノ酸よりなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この遺伝子全長を取得したことを確認した。プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表配列番号１４に示した。
なお、得られたＯＲＦは既知のコリネ属細菌由来のプロリンイミノペプチダーゼと塩基配列４６．３％の相同性、シュードモナス・アルギノーサＰＡ０１のプロリンイミノペプチダーゼと８２．４％の相同性を示した。
４．プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にｐｅｐＩ遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＰＰＰＥＰＩを構築した。染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９、１１に示すオリゴヌクレオチド（配列番号９；ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  Ａ、配列番号１１；ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＣＡＴ）をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をで処理し、ｐＵＣ１８切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＵＣＰＰＰＥＰＩと命名した。
ｐＵＣＰＰＰＥＰＩを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間、シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコに、この前培養液を１ｍｌシードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始２時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３時間培養を行った。
培養終了後、集菌、洗浄を行い、１０ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１８０Ｗ、３０分間、超音波破砕した。溶液を回収し、１２，０００ｇ×１０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。その結果、ｐＵＣＰＰＰＥＰＩを導入した場合のみプロリンイミノペプチダーゼ活性（１．２１ｘ１０３Ｕ／ｍｇ）が検出され、クローニングしたｐｅｐＩ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことが確認された。
（実施例１０）  シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株のプロリンイミノペプチダーゼによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成
１．シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株におけるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性の検出
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３をＬ培地で３０℃一晩液体培養し、菌体を得た。取得した菌体を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡにけん濁し、酵素液とした。なお、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性は、以下の酵素活性測定法により行った。終濃度０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、及び１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミンとなる反応溶液にて３０℃にて酵素反応を行い、反応に伴い生じるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンをＨＰＬＣにより定量した。一分間に１μｍｏｌのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生じる活性を１Ｕとした。
培養液１ｍｌあたり０．０５１ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性が検出された。
２．プロリンイミノペプチダーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成
上記無細胞抽出液を用いて、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性を測定した。その結果、ｐＵＣＰＰＰＥＰＩを導入した場合には７．８８Ｕ／ｍｇのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性が検出され、クローニングしたｐｅｐＩ遺伝子がＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成酵素の遺伝子であることが確認された。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高蓄積は２５ｍＭであった。
（実施例１１）  シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）遺伝子の単離とＥ．ｃｏｌｉでの発現
１．プロリンイミノペプチダーゼ（ｐｅｐＩ）遺伝子部の取得
シュードモナス  プチダ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子（ｐｅｐＩ）取得のために、実施例１と同様の方法でシュードモナス  プチダ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株の培養菌体（５０ｍｌ培養）から、ＤＮＡを単離した。
一方、実施例９で増幅したシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株のｐｅｐＩ遺伝子部分断片をプローブとして用いて、まず、実施例９の５．同様の方法でサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＰｓｔＩの切断物においては、約６．５ｋｂの位置にバンドが検出された。
次に、この６．５ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部位に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリー（２００株）を作製した。実施例と同様の方法にてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローン２株を選抜した。
２．シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列
選抜した形質転換体が保有するプラスミドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される方法に従って調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。３２３アミノ酸よりなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この遺伝子全長を取得したことを確認した。プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表配列番号１６に示した。得られたＯＲＦはシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子と塩基配列で８３％、アミノ酸配列で８５％の相同性を示した。
３．プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでの発現
ｐｅｐＩ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にｐｅｐＩ遺伝子を連結したプラスミドを構築した。染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２、１３に示すオリゴヌクレオチド（配列番号１２；ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＧＣＧ  ＣＡＡ  ＴＧ、配列番号１３；ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧ）をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をで処理し、ｐＵＣ１８切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＵＣＰＧＰＥＰＩと命名した。
ｐＵＣＰＧＰＥＰＩを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を実施例８と同様の方法で無細胞抽出液を作成し、プロリンイミノペプチダーゼ活性を測定したところ活性（３．４８ｘ１０１Ｕ／ｍｇ）が検出され、クローニングしたｐｅｐＩ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことが確認された。
（実施例１２）  シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株のプロリンイミノペプチダーゼによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成
１．シュードモナスプチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性の検出
シュードモナスプチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株を実施例１０と同様に培養し酵素活性を測定した。培養液１ｍｌあたり０．０５４ＵのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性が検出された。
２．Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成酵素活性の検出
ｐＵＣＰＧＰＥＰＩを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体無細胞抽出液を用いて、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性を測定した。その結果、ｐＵＣＰＧＰＥＰＩを導入した場合には０．４７０Ｕ／ｍｇのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性が検出され、クローニングしたｐｅｐＩ遺伝子がＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成酵素の遺伝子であることが確認された。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高蓄積は３０ｍＭであった。
（実施例１３）  バチルス・コアギュランスＥＫ０１株のプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する酵素によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成
東洋紡より市販されているバチルス・コアギュランスＥＫ０１株の精製酵素（３．９３ｘ１０５Ｕ／ｍｇ）をもちいて、実施例１０に開示されている方法でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性を測定した。その結果、５２．０Ｕ／ｍｇの活性が検出され、このプロリンイミノペプチダーゼがＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成活性を有する酵素であることが確認された。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高蓄積は１８ｍＭであった。
（実施例１４）  取得酵素の活性に対する阻害剤の影響
取得したプロリンイミノペプチダーゼに対する阻害剤の影響を調べた。０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、１５０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭ阻害剤となる反応溶液にて３０℃にて３０分間酵素反応を行い、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成を測定した。バチルス  コアギュランスＥＫ０１、シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３株、シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３株については、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）を１ｍＭ添加すると、酵素活性はほぼ完全に阻害された。また、１ｍＭのＩＡＡ（ヨードアセトアミド）添加によって、活性がある程度減少した。一方、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフロリド）添加時には活性に影響はなかった。コリネバクテリウム  グルタミカムＡＴＣＣ１３２８６株については、調べたどの阻害剤でも活性は影響を受けなかった。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のペプチド生成酵素のＮ末端アミノ酸配列
配列番号２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のペプチド生成酵素のコードシーケンス
配列番号５：コリネバクテリウム  グルタミカム由来のペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３由来のペプチド生成酵素のコードシーケンス
配列番号１５：シュードモナス  プチダＡＴＣＣ１２６３３由来のペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号１６：シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３由来のペプチド生成酵素のコードシーケンス
配列番号１７：シュードモナス  プチダＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２３由来のペプチド生成酵素のアミノ酸配列
産業上の利用の可能性
本発明のジペプチドの製造方法により、複雑な合成方法を経ることなく、安価に入手可能なＬ−アミノ酸エステルとＬ−アミノ酸を用いてジペプチドを製造することができ、医薬品素材、機能性食品等として有用なジペプチドの製造コストダウンが可能となる。また、本発明のジペプチドの製造方法によれば、様々な種類のアミノ酸エステルおよびアミノ酸を原料として、種々のタイプのジペプチドを生成することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、阻害剤を添加したときのジペプチド合成活性を示した図である。
【図１】
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