(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にしたとき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなる、下記の実用面での優良性能を発揮するａ／α型２倍体冷凍生地耐性及び高糖生地耐性実用パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３９）。
（ａ）廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が速いこと、収量が多いこと）。
（ｂ）パン酵母を培地より分離する際の効率。
（ｃ）パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率。
（ｄ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持されること。
（ｅ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間の間軟化しにくいこと。
（ｆ）廃糖蜜の色が吸着しにくく白いこと。
【請求項２】
２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にしたとき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなる、下記の実用面での優良性能を発揮するａ／α型２倍体冷凍生地耐性及び高糖生地耐性実用パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４０）。
（ａ）廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が速いこと、収量が多いこと）。
（ｂ）パン酵母を培地より分離する際の効率。
（ｃ）パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率。
（ｄ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持されること。
（ｅ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間の間軟化しにくいこと。
（ｆ）廃糖蜜の色が吸着しにくく白いこと。
【請求項３】
２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にしたとき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなるａ／α型２倍体酵母を大量培養してなる、下記の実用面での優良性能を発揮する冷凍生地耐性及び高糖生地耐性実用パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３９）。
（ａ）廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が速いこと、収量が多いこと）。
（ｂ）パン酵母を培地より分離する際の効率。
（ｃ）パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率。
（ｄ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持されること。
（ｅ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間の間軟化しにくいこと。
（ｆ）廃糖蜜の色が吸着しにくく白いこと。
【請求項４】
２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にしたとき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなるａ／α型２倍体酵母を大量培養してなる、下記の実用面での優良性能を発揮する冷凍生地耐性及び高糖生地耐性実用パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３２８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４０）。
（ａ）廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が速いこと、収量が多いこと）。
（ｂ）パン酵母を培地より分離する際の効率。
（ｃ）パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率。
（ｄ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持されること。
（ｅ）製品の２〜３週間の冷蔵保存期間の間軟化しにくいこと。
（ｆ）廃糖蜜の色が吸着しにくく白いこと。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、きわめてすぐれた冷凍生地耐性実用パン酵母および高糖生地耐性実用パン酵母に関するものである。従来にも冷凍生地耐性のパン酵母あるいは、高糖生地耐性のパン酵母は作られているが、本発明の冷凍生地耐性実用パン酵母および高糖生地耐性実用パン酵母は格段にすぐれたものである。本発明の冷凍生地耐性実用パン酵母を用いてパン生地を作り、これを前発酵して、凍結したものは、２週間以上の長期冷凍貯蔵にも耐え、すぐれたパンを製造することができるのである。この長期冷凍貯蔵した冷凍パン生地を、解凍して、焼成したとき、従来の冷凍生地用酵母を用いたパンと同等か、それ以上に優れたパンが得られる。即ち、種々優れた性質を有する実用パン酵母で冷凍生地耐性を有していないものに対してＡＴＨ１遺伝子を不活化するだけで、通常の市販冷凍耐性酵母と同等もしくはそれ以上の冷凍生地耐性を、また同時に高糖生地耐性を付与することが可能となるのである。従って、通常冷凍生地には糖濃度の比較的高いものが用いられることを考え併せて、本発明の冷凍生地耐性／高糖生地耐性実用パン酵母は冷凍パン生地業界に益するところきわめて大である。
【０００２】
【従来の技術】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの冷凍耐性に関連し、トレハロースの蓄積を遺伝子操作によって達成しようとする技術は、Ｈｅｌｍｕｔ  Ｈｏｌｚｅｒら（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ大学）により発表された（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，Ｖｏｌ．２６８，Ｎｏ．７（１９９３））。また、実用菌株でこの技術が応用され、『冷凍生地耐性実用パン酵母』（特願平８−２９７８８６号）として特許出願されている。この発表および特許出願は酵母のＮＴＨ１（中性トレハラーゼ遺伝子）に関与するものである。
【０００３】
その後同様の試みがＡＴＨ１（酸性トレハラーゼ遺伝子）に関しても行なわれた。当該遺伝子は、Ｍｏｍｏｃａ  Ｄｅｓｔｒｕｅｌｌｅら（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ大学）によってクローニングされその遺伝子の解析がなされた（Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．１１，（１９９５））。また、当該遺伝子の破壊株は格段にトレハロースの蓄積量が向上することにより、パン酵母の実用面での有用性（冷凍耐性・乾燥耐性）がＪｏｈｎ  Ｋｉｍら（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ大学）により示唆された（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．５（１９９６））。しかし、これらの研究は実験室株を用いて行われたものであり、実用パン酵母においてこのＡＴＨ１遺伝子破壊が実際に有用性を持つことは実施されていない。換言すれば、この研究は実際の製パン工業において確認されたものではなく、現時点では工業上の利用性は全く確認されていないのである。
【０００４】
ここで特に注意すべきは、実験室株と実用パン酵母ではその様相が大きく異なることである。たとえば、高野ら（農水省、食総研）の報告（日本食品工学会大会（１９９７））あるいは『冷凍生地耐性実用パン酵母』（特願平８−２９７８８６号）に記載されている様に、ＮＴＨ１遺伝子の破壊効果は、実験室株と実用パン酵母菌株において大きく異なっており、当然ＡＴＨ１遺伝子の破壊の及ぼす効果も実験室株と実用パン酵母菌株において大きく異なることが予測され、実験室株で奏された効果はむしろ実用パン酵母では奏されないことが予測される。
また、ＮＴＨ１遺伝子にコードされている中性トレハラーゼは、細胞質中にありその働きは、明確になっているが、ＡＴＨ１遺伝子にコードされる酸性トレハラーゼは、液胞中に存在し、その働きは推測の域をでておらず、この点からしても、両者は同一に論じることができず、ＡＴＨ１の遺伝子破壊が、実用菌株においてＮＴＨ１の遺伝子破壊が及ぼしたのと同等の効果を及ぼすか否かは全く未知のものであるといわざるを得ない。
【０００５】
従来の掛け合わせによる育種法では、実用パン酵母に特定の性能を付与する際、優れた性能を犠牲にすることが多かった。
【０００６】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを実用パン酵母として用いるためには、種としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることの他に、種々の実用面での要素が必要である。例えば、１．工業的に培養が可能であるためには、現在パン酵母を工業的に培養する際一般的に用いられている廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が早いこと、収量が多いこと）、パン酵母を培地より分離する際の効率、パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率（この行程にはデハイドレーターという特殊な機器が用いられる）。２．製品としては、長期間（２〜３週間程度）の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持されること、この間軟化しにくいこと、廃糖蜜の色が吸着しにくく白いこと等が基本的に必要な事項で、この他に、各種の製パン方法に適合した性能が要求される。
【０００７】
このため、これらの選抜をされていない実験室株がそのまま実用パン酵母として用いることのできる可能性はほとんどない。また、これらの要素は通常１つの遺伝子により支配されていることはまれで、複数個の遺伝子により規定されていることが一般的で、しかも実用パン酵母の性能と遺伝子との関連を結び付けるような研究例は極めて少ない。
【０００８】
実験室株とは異なり、実用パン酵母は、高次倍数体であることが多く、また胞子形成をしにくいため、実験室株で通常行われていた古典的な育種法を基にした掛け合わせ／胞子分離による育種法を用いることさえ非常に困難であり、優良な実用パン酵母の選別には、もっぱら長年実用的に用いられてきた菌株の自然突然変異株の選抜あるいは自然界からのスクリーニングに頼っていた。古典的な育種法がパン酵母にはじめて適用されたのは、郡家らによるレアーメイティング法の開発（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７０（１９７２））以降で、応用例は１９８２年出願の特許公報『サッカロマイセス・スペシーズＦＤ６１２』（特公平１−１６１５５号）に初めて記載された。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、先に述べたようにパン酵母に要求される１つの性能は多数の遺伝子により支配されているため、良好なパン酵母の性能を持つ菌株に、古典的な育種法で特定の性能を付与する際、せっかく保持していた優良形質を欠落させてしまう場合が多かった。例えば、良好なパン風味を生成するパン酵母に、冷凍耐性あるいは、高糖生地耐性を付与するため掛け合わせ／胞子分離により育種した際、この良好なパン風味を生成する能力が劣ってしまう場合が多く、この子孫のなかから非常に多くの菌株をスクリーニングし、比較的優良なパン風味を生成する株を選抜することが必要になる。本発明の課題は、優良な性能をそのままに、冷凍生地耐性あるいは高糖生地耐性をパン酵母菌株に付与することにある。
【００１０】
また、遺伝子操作には通常１倍体菌株を用いるが、現在日本国内で用いられているパン酵母はほとんどが２倍体である。これは、１倍体に比して、２倍体以上の株は粒径が大きく増殖能にも優れているため先に述べた実用的に必要な条件により合致しやすいからである。このギャップを埋めるために開発したのが、『冷凍生地耐性実用パン酵母』（特願平８−２９７８８６号）記載の菌株群である。この菌株は、適切な組み合わせで交雑し２倍体としたときに、種々の優良性能を発揮するようにあらかじめ試験されたものである。
【００１１】
従来のＡＴＨ１遺伝子（酸性トレハラーゼ遺伝子）破壊操作でトレハロースの増加はみられても、最終的に美味なパンを作ることのできる冷凍生地耐性実用パン酵母が未だ得られておらず、本発明ではこの冷凍生地耐性実用パン酵母を造成し、更にすぐれた冷凍パン生地及びこれを解凍、発酵、焼成した冷凍生地からのパンを製造することを目的としている。
【００１２】
一方、通常実用パン酵母の生地膨張力は、糖濃度が対小麦粉あたり５％を超えると低下することが知られているが、実際に用いられている製パンの配合では、糖濃度が４０％以上に達するものもある。糖濃度の高い生地（高糖生地）中での発酵力の低下が少ない酵母をここでは高糖生地耐性酵母と呼ぶ。高糖生地耐性の実用パン酵母は存在するが、その指標となるべき菌体内物質等の解析は成されておらず、又、行われていても、実際の製パン性能と関係付けられた研究例は無い。本発明では、ＡＴＨ１遺伝子を破壊して、菌体内のトレハロース含量を上昇させることにより、細胞内浸透圧を上げ積極的に高糖生地耐性実用パン酵母を造成し、すぐれた高糖生地からのパン（菓子パン等）を製造することも目的としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
ＡＴＨ１遺伝子破壊によって冷凍耐性酵母は造成できても、美味なパンを製造することのできる冷凍生地耐性実用パン酵母あるいは高糖生地耐性実用パン酵母が得られていないところから、本発明者らは、種々優れた性能を有する実用パン酵母で冷凍生地耐性あるいは高糖生地耐性を有していないものに対して、種々優れた性能はそのままで、市販冷凍耐性酵母と同等もしくはそれ以上の冷凍生地耐性／高糖生地耐性を付与するために、出発酵母株から最終の冷凍生地からのパンあるいは高糖生地からのパンまでを詳細に分析し、多くの実験を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母に関するものである。また、本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑してなる２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性／高糖生地耐性実用パン酵母に関するものである。
【００１５】
この交雑に用いる１倍体酵母は、少なくとも１つはＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を用いなければならないが、非遺伝子破壊酵母を併せて用いることもできる。更に、本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなる遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑してなる２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性／高糖生地耐性実用パン酵母を用いて▲１▼パン生地を作り、これを前発酵し、次いで冷凍してなる冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン生地にし、必要に応じて、この冷凍パン生地を、解凍し、発酵し、焼成して▲２▼あるいは、高糖生地を作りこれを直接、発酵、焼成して美味なパンを得るものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
１．（２倍体にした時実用パン酵母となる１倍体の選抜、マーカーの付与）
本発明においては、遺伝子操作する酵母株の選別が必須となるものである。まず、その酵母株としては１倍体酵母を選び、その酵母がａ型かα型かを知らなければならない。選んだ１倍体酵母とあらかじめ用意したα型１倍体酵母とを等量混合培養することによって数時間以内に顕微鏡で接合を確認できるものであれば、その酵母はａ型と確定できる。また、別々にａ型１倍体酵母と等量混合培養によって接合を確認できるものであればα型と確定できる。実験を目的とした場合には、この段階でマーカーを付与する次行程に移ることができるが、実用パン酵母の造成を目的とするには、以下の選抜行程が必須である。
【００１７】
ａ型又はα型の１倍体酵母は、α型又はａ型の１倍体酵母と交雑させ、ａ／α型の２倍体酵母を造成し、第１段階として段落番号（０００６）に述べた工業的に製造が可能であることを指標に大量培養試験により選抜した。更に第２段階としてここで培養した菌体が段落番号（０００６）に述べた製品としての用件を満たすことを指標に選抜した。最終的には、この２段階の選抜を受けた菌株を培養して得た菌体を用いて各種のパンを作り、すぐれたパンが出来たものから選んで遺伝子操作する１倍体酵母を決定する。
パンには、食パン、ロールパン、クロワッサン、フランスパン、菓子パンなど多くの種類があるので、すべてについて試食をして、それぞれについて１倍体酵母も同じものを用いたり、別の１倍体酵母を用いたりする。交雑する相手のａ型又はα型の１倍体酵母の選択によっても、冷凍生地からのパンの特性、あるいは高糖濃度での製パンにかなりの変化をもたらすために、遺伝子操作する１倍体酵母の選別は困難をきわめるが、冷凍生地耐性実用パン酵母あるいは高糖生地耐性実用パン酵母を造成するためにはこの工程は必須である。
【００１８】
酵母に遺伝子操作を施す際、遺伝的マーカーが必要となる。実用パン酵母にはマーカーが付与されておらず、そのまま遺伝子操作に供する場合、薬剤耐性マーカー等、酵母の遺伝子以外のマーカーを用いることも可能であるが、安全性の観点から好ましくない。セルフクローニングの範疇で遺伝子操作をするためには、この１倍体菌株に遺伝的なマーカーを付与する必要があり、この場合、酵母を薬剤等で変異させると有用な性能が同時に欠落する恐れがあり、自然突然変異体を選抜する方法が好ましい。このマーカー遺伝子として、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ＡＤＥ２等が、欠損株を容易に選抜することができ望ましい。
【００１９】
１倍体菌株に遺伝子マーカーとしてｕｒａ３（ＵＲＡ３欠損株）を付与するには、５−フルオロオロチン酸含有培地での選抜による。すなわち、１倍体菌株をＹＰＤ液体培地で培養した後、遠心分離により、菌体を生理食塩水で洗浄し、約１０8個の細胞を、５−フルオロオロチン酸を含む培地（０．７％ＹＥＡＳＴ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ）、２％グルコース、０．１％５−フルオロオロチン酸、０．０５％ウラシル、２％寒天）に塗布し、３日間３０℃で培養し、生育したコロニーを選別する。この培地で生育した菌株は、自然突然変異によりＵＲＡ３遺伝子を欠損しており、１０6〜１０7個に１個の頻度で得られる。  これらの菌株は、ウラシルを除く培地上で生育せず、ＵＲＡ３を含有するプラスミド、ＹＣｐ５０等により形質転換することにより、ウラシルを除く培地上で生育できるようになるため、ＵＲＡ３を欠損していることを確認することができる。
【００２０】
２．（酸性トレハラーゼ遺伝子のクローニング）
酸性トレハラーゼ遺伝子ＡＴＨ１のクローニングは、例えばＡＴＨ１遺伝子欠損株がトレハロースを唯一の炭素源とした培地中では生育できないことを利用すること等により、通常のショットガンクローニング法により可能である。しかし、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体の全塩基配列が既に決定されており、ＡＴＨ１の様に配列が既に解明されている様な遺伝子の取得には、ＰＣＲ法（ポリメラーゼチェーンリアクション）を用いてクローニングするのが常法となっている。また、遺伝子の不活化（破壊）操作を目的とする場合、全領域をクローニングする必要はなく、一部の領域のクローニングのみで代替することが可能である。
【００２１】
３．（ＡＴＨ１遺伝子破壊用ベクターの構築と遺伝子破壊操作）
ＡＴＨ１遺伝子の破壊は、ＡＴＨ１遺伝子が発現して酸性トレハロース分解酵素を作り、これがトレハロースを分解することを防止すれば目的を達成するので、ＡＴＨ１の全部もしくは１部を削ってしまってもよい。本発明では、ＵＲＡ３でＡＴＨ１全部を置き換えるかまたはＡＴＨ１内にＵＲＡ３を挿入することによって、実質上ＡＴＨ１を不活化させることにより遺伝子の破壊を行うのが好ましい。
【００２２】
まず、大腸菌用のベクター例えばｐＧＥＭ−Ｔに配列表の配列番号３に示されるＡＴＨ１遺伝子のアミノ酸コード領域の１部をＰＣＲ法により増幅し挿入し、次いでこのＡＴＨ１遺伝子の１部領域中に配列番号４に示すＵＲＡ３遺伝子の全領域を挿入し、得られたプラスミドを大腸菌で大量にふやして、このプラスミドからＡＴＨ１（前半）−ＵＲＡ３−ＡＴＨ１（後半）の挿入遺伝子のみを切り出し、単離したものをそのまま酢酸リチウム法によって、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母に形質転換する。１倍体酵母に導入されたＡＴＨ１（前半）−ＵＲＡ３−ＡＴＨ１（後半）は、１倍体酵母のＡＴＨ１と部位特異的組換えをおこし、ＵＲＡ３をはさんでＡＴＨ１を、前半と後半に完全に分断する。その結果、遺伝子破壊は完成し、ＡＴＨ１は実質上不活化される。ＵＲＡ３により分断されたＡＴＨ１遺伝子のアミノ酸コード領域を配列番号５に示す。
【００２３】
４．（２倍体の作成）
ここに得られるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母は、すでにａ型かα型かは定まっており、また２倍体にしたとき実用パン酵母になるというすぐれた性質は有するもので、遺伝子破壊操作ではＡＴＨ１遺伝子のみ破壊され、その他のすぐれた性質を生む遺伝子はそのままである。本発明では２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑し、２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性／高糖生地耐性実用パン酵母を得る。
【００２４】
【実施例１】
（２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母の選別）
野性株として保存している１倍体酵母２５株について、ａ型かα型を確定し、それぞれについて２倍体にしたとき実用パン酵母となり得るかどうかを試験した結果、表１の８株を選別した。これら８株について、後述の方法でＡＴＨ１遺伝子破壊を行い、破壊前と破壊後の酸性トレハラーゼ活性を測定した。
結果は表１に示され、ＡＴＨ１遺伝子破壊株の酸性トレハラーゼ活性が有意に低下しており、ＡＴＨ１遺伝子が破壊されていることを確認した。
【００２５】
【表１】
0004278726.tif 000002
【００２６】
（ＡＴＨ１遺伝子のクローニング）
ＡＴＨ１遺伝子の部分配列をＰｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ−Ｔベクターシステムを用いてクローニングした。概要を図１に示す。
【００２７】
既知のＡＴＨ１遺伝子の塩基配列（ＹＥＡＳＴ，ＶＯＬ．１１，（１９９５））より、常法に従い、配列表の配列番号１、配列番号２に示す、各々２０塩基のプライマーを設計した。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴ０１９株より染色体ＤＮＡを抽出・精製し、このＤＮＡを鋳型とし、先に述べた配列番号１及び２で示す合成ＤＮＡをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によりＡＴＨ１遺伝子のコーティング領域中の部分配列第４８１塩基〜第１，６３０塩基間の１，１５０塩基対を増幅した。次いで常法により、増幅したＤＮＡ断片を精製した後、この断片をｐＧＥＭ−Ｔベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラスミドｐＣＩ１を得た。このプラスミドｐＣＩ１を常法に従い、大腸菌に導入し（形質転換）、増幅後精製した。次いで、この精製プラスミドに唯一存在するＡＴＨ１遺伝子部分配列上の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位で、同酵素を用いて切断し、一方、プラスミドとして公知のＹＥｐ２４のＵＲＡ３遺伝子の全長を含む１，１６６塩基対のＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断し、常法に従い精製後、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ＡＴＨ１遺伝子破壊用プラスミドｐＣＹ１を作成した。
【００２８】
（ＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体の作成）
接合型ａの１倍体酵母（野性型株）を段落番号（００１９）に示した方法でｕｒａ３とした株をＡＴＨ１遺伝子破壊用プラスミドｐＣＹ１を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断後、酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換体はウラシル要求性から、非要求性になることにより確認した。
同様に、接合型αの１倍体酵母（野性型株）を段落番号（００１９）に示した方法でｕｒａ３とした株をＡＴＨ１遺伝子破壊用プラスミドｐＣＹ１を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断後、ＡＴＨ１部分配列とＵＲＡ３を含むＤＮＡ断片を分離精製し、このＤＮＡで酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換体はウラシル要求性から、非要求性になることにより確認した。（図２）
【００２９】
（ＡＴＨ１遺伝子破壊の確認）
理論通り、当該遺伝子が破壊されていることはＰＣＲ法により確認した。
すなわち、野性型株と遺伝子破壊株より、全染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを配列番号１および配列番号２で示したプライマーを用いて、増幅し、増幅配列の長さを比較することによって確認した。結果を図２に示す。理論上野性型株では、１，１５０塩基対、遺伝子破壊株では、２，３１６塩基対のＤＮＡ断片が増幅されるが、図３に示す結果と合致しており、遺伝子破壊が確認された。
【００３０】
（ＡＴＨ１遺伝子不活化の確認）
ＡＴＨ１遺伝子破壊の確認のため酸性トレハラーゼ活性の測定を行った。各菌株のＡＴＨ１遺伝子非破壊株（ＡＴＨ１：野性型株）と、ＡＴＨ１遺伝子破壊株（ａｔｈ１）とを、各々、１８φの試験管中の５ｍｌＹＰＤ培地（１％イーストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）に、１白金耳植菌し、４８時間３０℃で振とう培養した。この培養菌体を用い、常法に従い酸性トレハラーゼ活性を測定した。結果を表１に示した。各破壊株の酸性トレハラーゼ活性は、破壊前の野性型株に比して明らかに活性が低下し、その活性はほぼ０であり、ＡＴＨ１遺伝子の不活化が確認された。
【００３１】
【実施例２】
（ａ型１倍体酵母とα型１倍体酵母の交雑）
野性株とｐＣＹ１によってＡＴＨ１遺伝子破壊操作した株の組合せを表２のメイティングマトリクスに示す。
【００３２】
【表２】
0004278726.tif 000003
【００３３】
表２で最上段の株（横の株）はすべてａ型で、左端行の株（縦の株）はすべてα型であり、数字のあとにｄ−ＡがついたものはｐＣＹ１によって遺伝子破壊操作したことを示し、ｄ−Ａと付記のないものは表に示した野性型株を示している。表２における横の株と縦の株すべてを１対づつ交雑して２倍体酵母６４株を得た。（表２でＴ１０１からＴ１２８、Ａ３０１からＡ３６１は菌株番号である。）
交雑は、まず対となるａ型株とα型株を別々にＹＰＤ培地で３０℃１日間培養して増殖させ、両菌数を同程度として、両酵母を新たなＹＰＤ培地に入れ、３０℃１２時間培養し、適当量をＹＰＤ寒天培地に塗布して、１から２日間３０℃で培養した。比較的大きなコロニーを分離し、接合性を有していないことと、顕微鏡下で１倍体よりも大きくなっていることを観察することにより、２倍体となっていることを確認した。
【００３４】
【実施例３】
0004278726.tif 000004
【００３５】
＊１：２５０ｍｌのＹＰＤ培地／１Ｌ容坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で２日間培養したのち、４本分全量をそのまま種酵母として用いた。
＊２：種培養で得られた菌体を遠心分離操作によって分離し、脱イオン水により洗滌した後、その一部を使用した。
全ての菌株において市販パン酵母菌株と同等に加えた糖量に対し１２０−１４０％の収率が得られ、工業レベルでの培養が可能であり、ＡＴＨ１遺伝子の破壊により、増殖性、保存性等、実用パン酵母に必要な要素が失われていないことが確認できた。
【００３６】
（培養過程におけるトレハロース、トレハラーゼの消長）
上記段落番号（００３３）の培養条件は、一般に対数的増殖期と定常期に大きく分けることができる。前述の表２記載の６４株の内、Ｔ１１８株、Ｔ１２８株およびこれらのＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８株、Ａ３２８株の計４株について、この各時期の初期、中期、後期で、菌体をサンプリングし、各時点での、酸性トレハラーゼ活性（Ａ）、トレハロース含量（Ｂ）を測定した。結果を図４及び図５に示した。各遺伝子破壊株の酸性トレハラーゼ活性は、全ての培養時期においてほぼ０であり、ＡＴＨ１遺伝子の不活化が再確認された。
【００３７】
Ｔ１１８株及びＴ１２８株は、これをサッカロマイセス  セレビシエ  Ｔ１１８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ１１８）及びサッカロマイセス  セレビシエ  Ｔ１２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔ１２８）と命名し、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６０９６及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６０９７として国際寄託した。また、これらのＡＴＨ１遺伝子破壊株であるＡ３１８株及びＡ３２８株は、これをサッカロマイセス  セレビシエ  Ａ３１８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３１８）及びサッカロマイセス  セレビシエ  Ａ３２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３２８）と命名し、それぞれ生命研にＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３９及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４０として国際寄託した。
【００３８】
Ｔ１１８株とそのＡＴＨ１遺伝子破壊株であるＡ３１８株との比較では、先述の文献で記載されているように遺伝子破壊により明らかに終点でのトレハロース含量が増加し、破壊株では野性型株の約２倍のトレハロース含量を示した。これに対してＴ１２８株とそのＡＴＨ１遺伝子破壊株であるＡ３２８株との比較ではＡＴＨ１遺伝子破壊株では、酸性トレハラーゼ活性がほぼ０に低下しているにもかかわらず、培養終点でのトレハロース含量はほぼ野性型株と同値であった。実用パン酵母菌株の性能試験には、通常上述のような、工業的培養を模した流加培養をした菌体を用いるが、この際その菌体内トレハロース含量は乾物あたり８±２％程度となり、Ｔ１１８株は、通常の実用パン酵母菌株とはやや異なった含量を示す。また、実験室用の酵母菌株では、このような培養にほとんどの場合適していないのは前述の通りではあるが、生産効率を無視して、試験的に培養すると、トレハロース含量は２〜４％程度であり、実用菌株とは大きく異なる。表２に記載の他の実用パン酵母菌株での試験結果では、ＡＴＨ１遺伝子に関して野性型の菌株培養終点でのトレハロース含量に関してＴ１１８株の様に実験室株のそれとほぼ同値を示すものについては、ＡＴＨ１遺伝子破壊によりトレハロースの蓄積量が顕著に上昇したが、野性型株で通常の実用パン酵母に近い蓄積量を示すものは、その効果はわずかであり、この点が実験室株と実用パン酵母との相違であると考えられる。
【００３９】
（発酵過程におけるトレハロースの消長）
３０Ｌジャー培養した菌体を、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる液発酵力測定装置に供し、菌体内のトレハロース含量を経時的に測定した。液発酵溶液（ショ糖１０％、酵母濃度２．５％）を、所定時間液発酵装置で振とうし、２０ｍｌ全量を、２００ｍｌの冷水に速やかに懸濁し遠心分離により洗浄した後、再度１００ｍｌの冷水で洗浄し、最終的に得られた菌体を５ｍｌの冷水に懸濁した後、そのトレハロース含量を測定した。その結果は、図６および図７に示される。
【００４０】
また、図８は、市販酵母を用いて段落番号（００３９）の方法で同様の測定を行った結果である。この結果、ＡＴＨ１遺伝子破壊により明らかにトレハロース保持力の上昇が認められた。これは、市販パン酵母の保持力と比しても有意な値である。この点は、実験室株においては全く認められなかった現象であり、実用パン酵母菌株に特異的な現象である。これは生地中でなく、液体中でのトレハロースの減少であるが、凍結前の生地の前発酵過程でも同等の現象が起こっていると思われるので、前発酵過程で酵母中のトレハロース含量がＡＴＨ１遺伝子破壊によって、高レベルで保持されていることを示す。トレハロースの減少量が低下した株は市販酵母に比べてトレハロース含量が高いまま前発酵が終了する。あるいは、高糖生地中での発酵が、菌体内のトレハロース含量が高いまま行われこの間菌体内の浸透圧が高レベルで推移する。
【００４１】
【実施例４】
（食パン生地、菓子パン生地配合での製パン性能）
表２における実用パン酵母２倍体のＴ１１８、Ｔ１２８株、これらのＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８、Ａ３２８株および市販パン酵母（オリエンタル酵母工業製）を用いて、下記の配合及び表３に示す製パン条件により、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる製パン試験を行った。
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
得られた結果を下記表４、表５に示した。先ず表４の結果から明らかなように、食パン配合生地での製パンは、野生型株とＡＴＨ１遺伝子破壊株双方でほぼ同値となった。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
【表５】
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【００４６】
また、表５の結果から明らかなように、菓子パン配合生地では、Ｔ１１８に比して、このＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８、Ｔ１２８株に比して、このＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３２８株の高糖生地での製パン性能（高糖生地耐性）は明らかに向上しており、このＡ３１８株、Ａ３２８株の値は、市販パン酵母の値と同等もしくはそれ以上であり、充分市場価値を有する値である。
【００４７】
【実施例５】
（冷凍生地のガス発生）
表２（メイティングマトリクス）における実用パン酵母２倍体のＴ１１８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０９６）、Ｔ１２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０９７）、これらのＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３９）、Ａ３２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０４０）を用いて、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる冷凍生地試験を行った。
【００４８】
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【００４９】
各酵母菌株を用いて上記生地配合で生地を作り、混捏後、小麦粉換算で３０ｇを分割し、３０℃で前発酵６０分後、成型し、各生地を１〜３週間冷凍貯蔵し、解凍後、３０℃で１２０分間のガス発生量をファーモグラフで測定した。その結果は図９（低糖生地配合）および図１０（高糖生地配合）に示される通りである。低糖生地配合では、ＡＴＨ１遺伝子破壊株であるＡ３１８株は、非破壊株であるＴ１１８株に対し、また、ＡＴＨ１遺伝子破壊株であるＡ３２８株は、非破壊株であるＴ１２８株に対し全ての生地で冷凍耐性の向上が認められた。よって、遺伝子破壊により冷凍耐性が付与されることが確認できた。
さらに高糖生地配合での結果（図１０）では、より以上の冷凍耐性の獲得が認められた。これは、冷凍生地耐性と高糖生地耐性双方の向上による相乗効果である。
【００５０】
【発明の効果】
２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑することによって２倍体以上の倍数体のすぐれた冷凍生地耐性／高糖生地耐性実用パン酵母を得ることができた。
本発明の冷凍生地耐性実用パン酵母は培養時にトレハロースの蓄積が高く、生成したトレハロースの減少が少なく、パン生地は長期間の冷凍貯蔵によく耐えることができる。また、細胞内の浸透圧が高く、高糖濃度に耐え、高糖生地をよく発酵できる。
【００５１】
【配列表】
配列番号１及び２は、ＰＣＲ用プライマーを示し、それぞれプライマー１及びプライマー２を示す。配列番号３は、ＡＴＨ１遺伝子のアミノ酸コード領域を示し、配列番号４は、ＵＲＡ３遺伝子の全領域を示す。配列番号５は、ＵＲＡ３遺伝子により分断されたＡＴＨ１遺伝子のアミノ酸コード領域を示す。
下記表６〜２５に、配列番号１〜５に示される各配列を示す。
【００５２】
【表６】
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【００５３】
【表７】
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【００５４】
【表８】
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【００５５】
【表９】
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【００５６】
【表１０】
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【００５７】
【表１１】
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【００５８】
【表１２】
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【００５９】
【表１３】
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【００６０】
【表１４】
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【００６１】
【表１５】
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【００６２】
【表１６】
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【００６３】
【表１７】
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【００６４】
【表１８】
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【００６５】
【表１９】
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【００６６】
【表２０】
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【００６７】
【表２１】
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【００６８】
【表２２】
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【００６９】
【表２３】
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【００７０】
【表２４】
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【００７１】
【表２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＨ１遺伝子破壊用ベクターの構築図である。
【図２】ＡＴＨ１遺伝子破壊の概念図である。
【図３】ＡＴＨ１遺伝子破壊を確認した図であり、レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２、４、６、８は、それぞれ菌株７、２１、１８、１９より調整したＤＮＡのＰＣＲ産物を示し、レーン３、５、７、９は、それぞれ菌株７ｄＡ、２１ｄＡ、１８ｄＡ、１９ｄＡより調整したＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
【図４】Ｔ１１８株、Ａ３１８株での酸性トレハラーゼ活性及び菌体内トレハロース含量の消長をそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【図５】Ｔ１２８株、Ａ３２８株での酸性トレハラーゼ活性及び菌体内トレハロース含量の消長をそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【図６】Ｔ１１８株、Ａ３１８株での発酵過程におけるトレハロースの消長を示す。
【図７】Ｔ１２８株、Ａ３２８株での発酵過程におけるトレハロースの消長を示す。
【図８】市販酵母での発酵過程におけるトレハロースの消長を示す。
【図９】各酵母を前発酵６０分後、低糖生地を１〜３週間冷凍貯蔵し、解凍後３０℃でその１２０分間のガス発生量をファーモグラフで測定した図である。
【図１０】上記低糖生地に代えて高糖生地を用いた場合のガス発生量をファーモグラフで測定した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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