(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．９７２３１として寄託されているプラスミドｐＦＬＴ４−Ｌによりコードされるアミノ酸配列を含んでなる精製および単離ポリペプチドであって、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の細胞外ドメインと結合する、精製および単離ポリペプチド。
【請求項２】
Ｆｌｔ４の細胞外ドメインと結合する精製および単離ポリペプチドであって、前記結合を可能にするのに有効な、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．９７２３１として寄託されているプラスミドｐＦＬＴ４−Ｌによりコードされるアミノ酸配列の連続部分を含んでなり、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）のシステインモチーフを含むプラスミドｐＦＬＴ４−Ｌによりコードされるアミノ酸配列のカルボニル末端部分を欠いている、精製および単離ポリペプチド。
【請求項３】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合する精製および単離ポリペプチドであって、前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３のアミノ酸配列の連続部分を含むアミノ酸配列を含んでなり、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）の１以上のシステインモチーフを有する配列番号３３のいずれかの部分を欠いている、精製および単離ポリペプチド。
【請求項４】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合する精製および単離ポリペプチドであって、前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３のアミノ酸配列の一部分を含んでなるものであり、残基２２７を越えた配列番号３３のカルボキシル末端残基を少なくとも欠いている、精製および単離ポリペプチド。
【請求項５】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合する精製ポリペプチドであって、以下の工程；
（ａ）宿主細胞における核酸を発現させ、ここで該核酸は前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３のアミノ酸配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、
（ｂ）前記宿主細胞または該宿主細胞の成長培地に由来するヒトＦｌｔ４の細胞外ドメインに結合するポリペプチドを精製し、ここで前記ポリペプチドはバルビアニ環３タンパク質のシステインモチーフを特徴とする配列番号３３の少なくともカルボキシル末端部位を欠いていること
を含んでなる方法により生成される、精製ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部分が配列番号３３の１６１−２１１残基を含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部分が配列番号３３の１３１−２１１残基を含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部が配列番号３３の１０３−２２７残基を含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部分が配列番号３３の３２−２２７残基を含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部分が配列番号３３の３０−１６２残基間のアミノ酸をアミノ末端残基として有し、かつ、配列番号３３の２１０−２２８残基間のアミノ酸をカルボキシル末端残基として有する連続部分である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３３のアミノ酸配列の前記一部分が配列番号３３の１０２−１３２残基間のアミノ酸をアミノ末端残基として有し、かつ、配列番号３３の２１０−２２８残基間のアミノ酸をカルボキシル末端残基として有する連続部分である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の細胞外ドメインと結合する精製および単離ポリペプチドであって、前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３の一部分を含んでなり、かつ、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約２３ｋＤの見掛け分子量を有する、精製および単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３３のアミノ酸配列の一部分からなるアミノ酸配列を有する、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１４】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４ＥＣ）の細胞外ドメインと結合する精製および単離ポリペプチドであって、以下のハイブリッド形成条件；
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭ  Ｎａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８を含むハイブリッド形成溶液中、４２℃でのハイブリッド形成および５５℃での０．２×ＳＳＣによる洗浄
において配列番号３２の３５２−１６１１ヌクレオチドに相補的な非コード鎖とハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含んでなり、
かつ、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）のいずれかのシステインモチーフを欠いている、精製および単離ポリペプチド。
【請求項１５】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４ＥＣ）の細胞外ドメインと結合する精製および単離した哺乳動物ポリペプチドであって、
このポリペプチドはヒトＦｌｔ４に結合するのに十分である哺乳動物Ｆｌｔ４リガンド前駆体ポリペプチドの連続部分を含んでなり、
ここで該哺乳動物Ｆｌｔ４リガンド前駆体ポリペプチドは以下のハイブリッド形成条件；
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭ  Ｎａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８を含むハイブリッド形成溶液中、４２℃でのハイブリッド形成および５５℃での０．２×ＳＳＣによる洗浄
において配列番号３２の３５２−１６１１ヌクレオチドに相補的な非コード鎖とハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含んでなり、
前記連続部分がヒト脈官内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト血小板由来成長因子ＡおよびＢ（ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ）、ヒト胎盤成長因子（ＰｌＧＦ−１）、ヒト脈官内皮成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）において保存されている８つのシステイン残基を含んでなり、
バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）の１以上のシステインモチーフを有する哺乳動物Ｆｌｔ４リガンド前駆体ポリペプチドのいずれかの部分を欠いている、精製および単離した哺乳動物ポリペプチド。
【請求項１６】
還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約２３ｋＤの見掛け分子量を有する、請求項２〜８、１１、および１４〜１５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１７】
還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３２ｋＤの見掛け分子量を有する、請求項２〜１０および１４〜１５のいずれか一項に記載の精製および単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載のヒトポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｆｌｔ４を発現する宿主細胞において、該Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を刺激することができる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
Ｋｄｒレセプターチロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ−２）の細胞外ドメインと結合することができる精製および単離ポリペプチドであって、該結合を可能にするのに有効な配列番号３３の一部分を含んでなるアミノ酸配列を有する、精製および単離ポリペプチド。
【請求項２１】
検出可能なラベルをさらに含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
薬学上許容される希釈物、アジュバント、賦形剤およびキャリアからなる群から選択される少なくとも一つの成分中に請求項１〜２１のいずれか一項に記載されたポリペプチドを含んでなる、組成物。
【請求項２３】
第二ポリペプチドに連結された第一ポリペプチドを含んでなる精製タンパク質であって、前記第一ポリペプチドおよび前記第二ポリペプチドの少くとも１つが請求項１〜２１のいずれか一項に記載されたポリペプチドであり、前記タンパク質がＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと結合することができる、精製タンパク質。
【請求項２４】
薬学上許容される希釈物、アジュバント、賦形剤およびキャリアからなる群から選択される少なくとも一つの成分中に請求項２３に記載されたタンパク質を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、精製および単離核酸。
【請求項２６】
配列番号３２のヌクレオチド３５２-１６０８のヌクレオチド配列を有している、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．９７２３１として寄託されているプラスミドｐＦＬＴ４-ＬのＶＥＧＦ-Ｃコードインサートを含んでなる、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２８】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼに結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離核酸であって、前記ポリペプチドが前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３に示されたアミノ酸配列の一部分を含んでなるアミノ酸配列を有し、前記核酸がバルビアニ環３タンパク質のシステインモチーフを有する配列番号３３に示されたアミノ酸配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている、精製および単離核酸。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが約１２０アミノ酸を含んでなる、請求項２８に記載の精製および単離核酸。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸１０３−２２２を含んでなる、請求項２８に記載の精製および単離核酸。
【請求項３１】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼに結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離核酸であって、前記ポリペプチドが前記結合を可能にするのに有効な配列番号３３に示されたアミノ酸配列の連続部分を含んでなるアミノ酸配列を有し、前記核酸が残基２２７を越えた配列番号３３で示されたアミノ酸配列のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている、精製および単離核酸。
【請求項３２】
前記核酸が配列番号３３のアミノ酸３２−１０２をコードするヌクレオチド配列を欠いている、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記核酸がコード配列に作動可能に連結された発現コントロール配列をさらに含んでなる、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３４】
発現コントロール配列に作動可能に連結された請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸を含んでなるベクターであって、該発現構築物が残基２２７を越えた配列番号３３で示されたアミノ酸配列のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている、ベクター。
【請求項３５】
請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸を含んでなるベクターであって、バルビアニ環３タンパク質のシステインモチーフを有する配列番号３３に示されたアミノ酸配列の部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている、ベクター。
【請求項３６】
請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の核酸または請求項３４もしくは３５に記載の発現構築物もしくはベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、
前記ポリヌクレオチドが以下のハイブリッド形成条件；
（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt’s溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有の溶液中４２℃で２０時間かけてハイブリッド形成させ、
（ｂ）フィルターを、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含んでなる洗浄溶液を用いて、室温で３０分間にわたり２回洗浄し、６５℃で３０分間にわたり２回洗浄すること
において配列番号３２に相補的な非コード鎖を含んでなるＤＮＡとハイブリッド形成する鎖を含んでなり、
前記宿主細胞が前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現し、
前記ポリペプチドがヒト脈官内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、およびヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）において保存されている８つのシステイン残基により決定されるドメインを含んでなり、
前記ポリペプチドがバルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）の１以上のシステインモチーフを有するいずれかのドメインを欠いており、
前記ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合する、宿主細胞。
【請求項３８】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、
前記ポリヌクレオチドが以下のハイブリッド形成条件；
（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt’s溶液、０．１％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有の溶液中４２℃で２０時間かけてハイブリッド形成させ、
（ｂ）フィルターを、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含んでなる洗浄溶液を用いて、室温で３０分間にわたり２回洗浄し、６５℃で３０分間にわたり２回洗浄すること
において配列番号３２に相補的な非コード鎖を含んでなるＤＮＡとハイブリッド形成する鎖を含んでなり、
前記宿主細胞が前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを発現および分泌し、
前記ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合し、かつ、還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより約２３ｋＤまたは約３２ｋＤの分子量を有している、宿主細胞。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドによりコードされたヒトＦｌｔ４リガンドタンパク質を発現する、請求項３７または３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
配列番号３３に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、
前記宿主細胞が前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４ＥＣ）の細胞外ドメインに結合するのに十分な配列番号３３の連続部分を含んでなり、
前記連続部分がヒト脈官内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、およびヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）において保存されている８つのシステイン残基を含んでなり、
前記ポリペプチドがバルビアニ環３タンパク質の１以上のシステインモチーフを有する配列番号３３いずれかの部分を欠いており、
前記ポリペプチドがＦｌｔ４ＥＣと結合する、宿主細胞。
【請求項４１】
ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．９７２３１として寄託されているプラスミドｐＦＬＴ４-Ｌのインサートを含むポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞であって、該宿主細胞が前記インサートによりコードされたポリペプチドを発現および分泌し、
前記分泌ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼに結合し、かつ、ヒト脈官内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、およびヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）において保存されている８つのシステイン残基により決定されるドメインを含んでなり、
前記分泌ポリペプチドがバルビアニ環３タンパク質の１以上のシステインモチーフを有するいずれかのドメインを欠いている、宿主細胞。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドを発現し、かつ、ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合することができるヒトタンパク質を生成し、該タンパク質が還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより約２３ｋＤの分子量を有する、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドを発現し、かつ、ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインと結合することができるヒトタンパク質を生成し、該タンパク質が還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより約３２ｋＤの分子量を有する、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
配列番号３３に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、
前記宿主細胞が前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４ＥＣ）の細胞外ドメインに結合するのに十分な配列番号３３の連続部分を含んでなり、
前記連続部分がヒト脈官内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト血小板由来成長因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、およびヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）において保存されている８つのシステイン残基を含んでなり、
前記ポリペプチドが１０３の位置までの配列番号３３のいずれかの部分を欠いており、かつ、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）の１以上のシステインモチーフを有する配列番号３３いずれかの部分を欠いており、さらに
前記ポリペプチドが還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより約２３ｋＤの分子量を有し、かつ、Ｆｌｔ４ＥＣと結合する、宿主細胞。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターであり、該発現ベクターが前記ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された発現コントロール配列を含んでなる、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記ポリペプチドを分泌する、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の真核宿主細胞。
【請求項４７】
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合するポリペプチドを生成する方法であって、以下の工程；
（ａ）細胞が核酸によりコードされたポリヌクレオチドを発現する条件下で、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の核酸を用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を成長させ、
（ｂ）前記宿主細胞または該宿主細胞の成長培地から前記ポリペプチドを精製し、該ポリペプチドがＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合すること
を含んでなる、方法。
【請求項４８】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合することおよびＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化を刺激することが可能であるポリペプチドの製造方法であって、以下の工程；
ポリヌクレオチドでコードされたポリペプチドの宿主細胞における発現を可能にする条件下で請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の宿主細胞を成長させ、
前記宿主細胞または該宿主細胞の成長培地から前記ポリペプチドを単離し、ここで、前記ポリペプチドがヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合し、かつ、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼのリン酸化を刺激すること
を含んでなる、方法。
【請求項４９】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の細胞外ドメイン（ＥＣ）に結合するポリペプチドの製造方法であって、以下の工程；
宿主細胞がポリヌクレオチドでコードされたポリペプチドを発現し、かつ、分泌する条件下で、配列番号３３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を成長させ、
前記宿主細胞の成長培地由来のＦｌｔ４ＥＣに結合するポリペプチドを単離し、ここで、前記ポリペプチドが還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより約２３ｋＤの分子量を有し、かつ、Ｆｌｔ４ＥＣに結合するのに有効な配列番号３３の一部分を含んでなるアミノ酸配列を有すること
を含んでなる、方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが該ポリペプチドの精製を促進するペプチドタグをさらに含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
マウスポリペプチドである、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼに結合する精製ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号４１に記載のアミノ酸配列または前記結合を可能にするのに有効な前記配列の一部分を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項５３】
請求項５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなり、かつ、薬学上許容される希釈物、アジュバント、賦形剤およびキャリアからなる群から選択される少なくとも一つの成分をさらに含んでなる、組成物。
【請求項５４】
請求項５１または５２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、精製および単離核酸。
【請求項５５】
請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含んでなる、組成物。
【請求項５６】
配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する、精製抗体。
【請求項５７】
モノクローナル抗体である、請求項５６に記載の抗体。
【請求項５８】
以下の工程；
請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなる組成物を用いて哺乳動物に免疫し、
該免疫後、前記哺乳動物から抗血清を得て、該抗血清が前記ポリペプチドに結合する抗体を含んでなること
を含んでなる方法により生産される、ポリクローナル抗血清。
【請求項５９】
生物組織サンプルにおいて内皮細胞を検出するための方法であって、以下の工程；
ポリペプチドが内皮細胞と結合する条件下で、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドに、内皮細胞を含んでなる生物組織サンプルを暴し、さらに
前記生物組織中で内皮細胞に結合された前記ポリペプチドを検出して、それにより前記内皮細胞を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項６０】
前記生物組織を洗浄する工程を更に含み、該洗浄工程が前記暴露工程後でかつ前記検出工程前に行われる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
哺乳動物内皮細胞の成長を調節するための方法であって、哺乳動物内皮細胞の成長を調節するために有効な量の請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドと哺乳動物内皮細胞とをin vitroにて接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項６２】
哺乳動物内皮細胞の成長を調節する薬剤の製造における、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６３】
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの活性を調節する薬剤の製造における、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６４】
リンパ内皮の成長を調節する薬剤の製造における、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６５】
外科的介入によるリンパ管の喪失または損傷、浮腫、リンパ管の形成不全、リンパ閉塞、および象皮病からなる群から選択される疾病または状態を治療する薬剤の製造における、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６６】
リンパ内皮の成長を調節する薬剤の製造における、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の核酸の使用。
【請求項６７】
生物組織サンプルにおいて内皮細胞を検出するために使用される、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの活性を調節するために使用される、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
リンパ内皮の成長を調節するために使用される、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
外科的介入によるリンパ管の喪失または損傷、浮腫、リンパ管の形成不全、リンパ閉塞、および象皮病からなる群から選択される疾病または状態を治療するために使用される、請求項１〜２１および５０〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
前記第二ポリペプチドが配列番号３３におけるアミノ酸残基２２８−４１９に対応するアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の精製タンパク質。
【請求項７２】
前記第一ポリペプチドが請求項９または１７に記載のポリペプチドである、請求項２３または７１に記載の精製タンパク質。
【請求項７３】
薬学上許容される希釈物、アジュバント、賦形剤およびキャリアからなる群から選択される少なくとも一つの成分とともに、請求項２３、７１、および７２のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる、医薬組成物。
【請求項７４】
哺乳動物内皮細胞の成長を調節する薬剤の製造における、請求項２３、７１、および７２のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項７５】
哺乳動物内皮細胞の成長を調整するために使用される、請求項２３、７１、および７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に遺伝子工学の分野、更に詳しくは内皮細胞の成長因子および成長因子遺伝子に関する。
発明の背景
発育成長、成熟組織の改造および再生と、固形腫瘍成長とは、血管形成を伴うときだけ生じることができる。血管芽細胞および造血前駆細胞は中胚葉から分化して、卵黄嚢の血島と胚の一次脈管系を形成する。これらの初期（in situ）分化内皮細胞からの血管の発育は、脈管形成と称される。主な胚血管は脈管形成から起きると考えられるが、残りの脈管樹の形成は既存管からの脈管発芽の結果として生じると思われ、そのプロセスは血管形成と称される。Risau et al.,Devel.Biol.,125:441-450（1988）
内皮細胞は数タイプの機能的および形態的に異なる脈管を生じさせる。器官が分化して、それら特定の機能を発揮し始めたとき、内皮細胞の表現型不均一性は増加する。血管形成刺激時に、内皮細胞は細胞周期に再入し、移動して、細胞周期から出て、その後それらの組織環境と機能的に適合した新たな脈管を形成するように再び分化する。血管形成をうける内皮細胞は下にある基底膜を分解し、移動して、脈管周囲支質中に突出する毛細管芽を形成する。Ausprunk et al.,Microvasc.Rev.,14:51-65（1977）。組織発育および再生中の血管形成は、内皮細胞増殖、移動、分化および生存のきちんとコントロールされたプロセスに依存している。内皮細胞調節系の機能不全は、多くの疾患の主要な特徴である。最も重要なことに、腫瘍成長および転移は血管形成依存性であることが示された。Folkman et al.,J.Biol.Chem.,267:10931-10934（1992）
細胞増殖および分化を調節する主要シグナルはポリペプチド成長因子およびそれらの貫膜レセプターにより媒介され、その多くはチロシンキナーゼである。チロシンキナーゼインサート内の自己リン酸化ペプチドと、活性化レセプターのカルボキシル末端配列は、応答細胞における遺伝子発現の再調整のためのシグナル導入に関与するキナーゼ基質により通常認識される。レセプターチロシンキナーゼのいくつかのファミリーが特徴付けられた。Van der Geer et al.,Ann.Rev.Cell Biol.,10:251-337（1994）。血管形成刺激を導入する主要な成長因子およびレセプターは、図１に概略で示されている。
繊維芽細胞成長因子も血管形成の調節に関与することが知られている。それらは培養された内皮細胞に分裂促進性および走化性であることが示された。繊維芽細胞成長因子はコラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターのようなプロテアーゼの生産も刺激して、内皮細胞による管形成を誘導する。Saksela et al.,Ann.Rev.Cell Biol.,4:93-126（1988）。繊維芽細胞成長因子には２つの一般的クラス、ＦＧＦ-１およびＦＧＦ-２があり、双方とも慣例的なシグナルペプチドを欠いている。双方のタイプはヘパリンに親和性を有しており、ＦＧＦ-２は内皮下細胞外マトリックスにあるヘパリン硫酸プロテオグリカンと結合して、そこからそれが損傷後に放出される。ヘパリン、変性および分解から保護して、ＦＧＦを二量化することにより、血管形成ＦＧＦによる内皮細胞増殖の刺激を強化している。培養された内皮細胞はＦＧＦ-１レセプターを発現するが、他の高親和性繊維芽細胞成長因子レセプターは有意なレベルで発現されない。
レセプターチロシンキナーゼについて他のリガンドの中では、血小板由来成長因子ＰＤＧＦ-ＢＢがニワトリ漿尿膜で弱い血管形成性であることが示された。Risau et al.,Growth Factors,7:261-266（1992）。形質転換成長因子α（ＴＧＦα）はいくつかの腫瘍細胞タイプおよびマクロファージにより分泌される血管形成因子である。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、即ちｃ-ｍｅｔプロトがん遺伝子コードレセプターのリガンドも強い血管形成性である。
最近の証拠では、内皮細胞成長、分化およびある分化機能の刺激に主に関与する内皮細胞特異性成長因子およびレセプターがあることを示している。これらのうちで最も良く研究されたのは、ＰＤＧＦファミリーのメンバーである脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。脈管内皮成長因子はジスルフィド連結２３ｋＤサブユニットのダイマー糖タンパク質である。ＶＥＧＦの他に報告された効果には、細胞内カルシウムの移動、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-１合成の誘導、内皮細胞でヘキソース輸送の刺激と、in vitroで単球遊走の促進がある。異なるｍＲＮＡスプライス変異体によりコードされた４つのＶＥＧＦイソ型は、内皮細胞で分裂促進を等しく刺激できるらしい。しかしながら、各イソ型は、ＶＥＧＦに対する低親和性レセプターとしてふるまう細胞表面プロテオグリカンに異なる親和性を有している。ＶＥＧＦの１２１および１６５アミノ酸イソ型（ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５）は可溶形で分泌されるが、１８９および２０６アミノ酸残基のイソ型は細胞表面に結合のままであり、ヘパリンに強い親和性を有している。ＶＥＧＦは内皮細胞に対するその分裂促進活性に基づいていくつかの供給源から初めて精製されたが、微細脈管透過性を誘導するその能力により脈管透過性因子（ＶＰＦ）とも称されている。
ＶＥＧＦ発現のパターンは、正常脈管系の発育および維持と腫瘍血管形成におけるその関与を示唆している。マウス発育中に、性交後（ｐ．ｃ．）全７．５日の内胚葉はＶＥＧＦを発現して、脳室神経外胚葉は毛細管内成長段階でＶＥＧＦを生産する。Breier et al.,Development,114:521-523（1992）参照。ウズラ発育の２日目に、卵黄嚢と全胚の脈管形成領域はＶＥＧＦの発現を示す。加えて、成熟マウスで有窓内皮に隣接する上皮細胞は永続的ＶＥＧＦ発現を示し、この特定の内皮表現型および機能の維持における役割を示唆している。
ＶＥＧＦの２つの高親和性レセプターが特徴付けられた。これらはＶＥＧＦＲ-１／Ｆｌｔ-１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ-１）およびＶＥＧＦＲ-２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ-１（キナーゼインサートドメイン保有レセプター／肝臓胎児キナーゼ-１）である。それらのレセプターはＰＤＧＦレセプターファミリーに分類されているが、それらはそれらの細胞外ドメインに５つではなく７つの免疫グロブリン様ループを有していて（図１参照）、それらはこのファミリーで通常観察されるよりも長いキナーゼインサートを有している。ＶＥＧＦレセプターの発現は脈管内皮細胞で主に生じるが、一部は造血始原細胞、単球およびメラノーマ細胞に存在している。内皮細胞だけがＶＥＧＦに応答して増殖することが報告され、異なる供給源からの内皮細胞は異なる応答を示す。このため、ＶＥＧＦＲ-１およびＶＥＧＦＲ-２で媒介されるシグナルは細胞型特異性であるらしい。ＶＥＧＦ関連胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、高い親和性でＶＥＧＦＲ-１と結合することが最近示された。ＰｌＧＦはＶＥＧＦの成長因子活性を高めることができたが、それはそれ自体では内皮細胞を刺激しなかった。天然ＶＥＧＦ／ＰｌＧＥヘテロダイマーは、内皮細胞に対してＶＥＧＦホモダイマーとほぼ同じくらい強いマイトジェンであった。Cao et al.,J.Biol.Chem.,271:3154-62（1996）
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ-３）は、ＶＥＧＦＲ-１およびＶＥＧＦＲ-２遺伝子の産物と構造的によく関連している。この類似性にもかかわらず、Ｆｌｔ４の成熟形は、それがタンパク質分解により細胞外ドメインで２つのジスルフィド連結ポリペプチドに開裂されるという点で、ＶＥＧＦレセプターと異なる。Pajusola et al.,Cancer Res.,52:5738-5743（1992）。
４．５および５．８ｋｂ  Ｆｌｔ４  ｍＲＮＡは、別な３′エクソンの使用のためにそれらのＣ末端で異なるポリペプチドをコードしている。ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦのイソ型はＦｌｔ４と特異的結合性を示さないか、またはその自己リン酸化を誘導しない。
Ｆｌｔ４の発現はＶＥＧＦＲ-１またはＶＥＧＦＲ-２の発現よりも制限されることが明らかとなっている。Ｆｌｔ４の発現は、頭間葉の血管芽細胞、主静脈と、胚外で８．５日ｐ．ｃ．マウス胚の尿膜において、in situハイブリッド形成で最初に検出できるようになる。１２．５日ｐ．ｃ．胚では、Ｆｌｔ４シグナルは静脈および推定リンパ内皮を発育させる際に観察されるが、動脈内皮ではネガティブのようである。発育の後期段階中に、Ｆｌｔ４  ｍＲＮＡは発育中のリンパ管に限定されるようになる。リンパ内皮と一部の高い内皮細静脈は成人組織でＦｌｔ４  ｍＲＮＡを発現して、発現の増加はリンパ洞、転移リンパ節およびリンパ管腫で生じる。これらの結果はリンパ管の静脈源の理論を支持している。
シグナル導入に必須の内因性チロシンキナーゼ活性を有する５種の内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼ、即ちＦｌｔ-１（ＶＥＧＦＲ-１）、ＫＤＲ／Ｆｌｋ-１（ＶＥＧＦＲ-２）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ-２が、これまで記載されてきた。マウス胚でＦｌｔ-１、Ｆｌｋ-１、ＴｉｅおよびＴｅｋを不活化させる標的変異は、分子レベルにおいて脈管形成と血管形成でそれらの本質的および特異的な役割を示した。ＶＥＧＦＲ-１およびＶＥＧＦＲ-２は高親和性（各々Ｋｄ１６ｐＭおよび７６０ｐＭ）でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦＲ-１は関連胎盤成長因子とも結合する（ＰｌＧＦ；Ｋｄ約２００ｐＭ）。ＴｅｋのリガンドはＰＣＴ特許公開ＷＯ９６／１１２６９に報告されている。
発明の概要
本発明は、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ-３）についての、ＶＥＧＦ-Ｃと称されるリガンドを提供する。このため、本発明ではＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと結合することができる、精製および単離されたポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のＦｌｔ４リガンドは、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼを発現する宿主細胞で、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化を刺激することができる。本発明の好ましいリガンドは哺乳動物ポリペプチドである。高度に好ましいリガンドはヒトポリペプチドである。以下で詳細に説明されるように、互いにまたは他のポリペプチドに連結された本発明のポリペプチドを含んでなるダイマーおよびマルチマーは、本発明のリガンドとして特に考えられる。
一態様において、ＦＬＴ４リガンドポリペプチドは、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、約２３ｋＤの分子量を有している。例えば、本発明には、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．ＣＲＬ１４３５を有する細胞系、ＰＣ-３前立腺がん細胞系のならし培地から精製可能である、約２３ｋＤの１種以上のポリペプチドから構成されるリガンドがある。このＰＣ-３細胞由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列決定では、そのリガンドポリペプチドが配列番号１３に示されたアミノ末端アミノ酸配列を含んでなることを明らかにした。Ｆｌｔ４リガンドを含むならし培地は、それ自体が本発明の一面である。本発明は、Ｆｌｔ４リガンドを生産するＰＣ-３前立腺がん細胞系の新たな用途も提供する。好ましい態様において、リガンドはＰＣ-３細胞培地から直接精製および単離される。
高度に好ましい態様において、リガンドポリペプチドは、ヒトＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合する、配列番号３３に示されたアミノ酸配列の断片を含んでなる。例示される断片には、配列番号３３に示された残基約１１２〜残基約２１３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；配列番号３３の残基約１０４〜残基約２２７のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；および配列番号３３の残基約１１２〜残基約２２７のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドがある。他の例示断片には、以下で更に詳細に記載されるような、下記残基：３１-２１３、３１-２２７、３２-２２７、１０３-２１７、１０３-２２５、１０４-２１３、１１３-２１３、１０３-２２７、１１３-２２７、１３１-２１１、１６１-２１１、１０３-２２５、２２７-４１９、２２８-４１９、３１-４１９および１-４１９にわたる配列番号３３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドがある。
本発明はＦｌｔ４リガンドの１種以上のポリペプチド前駆体も提供するが、１つのこのような前駆体（“プレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃ”と称される）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示された完全アミノ酸配列（アミノ酸残基１〜４１９）を含んでなる。このため、本発明には配列番号３３に示された残基１〜４１９のアミノ酸配列を有する精製および単離ポリペプチドを含む。本発明によるリガンド前駆体は、適切な宿主細胞で発現されたときに、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合するポリペプチドを開裂により作製する。推定１０２アミノ酸リーダー（プレプロ）ペプチドが、配列番号３３に示されたアミノ酸配列で特定された。このため、関連面において、本発明には配列番号３３に示された残基１０３〜４１９のアミノ酸配列を有する精製および単離ポリペプチドを含む。
一態様において、発現されたＦｌｔ４リガンドポリペプチド前駆体は、約２３ｋＤ  Ｆｌｔ４リガンドポリペプチドを生産するように、発現に際してタンパク質分解で開裂される。このため、配列番号３３に示された前駆ポリペプチドの開裂産物であって、還元条件下で約２３ｋＤの分子量を有するＦｌｔ４リガンドポリペプチドが提供される。
分子量約２９および３２ｋＤのポリペプチドからなる推定ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体またはスプライス変異体も、本発明の一面とみなされる。
もう１つの態様において、発現されたＦｌｔ４リガンドポリペプチド前駆体は、約２１ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを生産するように、発現に際してタンパク質分解で開裂される。配列分析では、観察された２１ｋＤ形が２３ｋＤ形のアミノ末端からおよそ９アミノ酸下流にアミノ末端を有することを示し、別の開裂部位が存在することを示唆している。
前記から、本発明の一面には配列番号３３に示された残基１〜４１９のアミノ酸配列を有する精製および単離ポリペプチドの断片を含み、その断片がＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合できることは明らかであろう。好ましい態様には、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより調べたところ、約２１／２３ｋＤおよび２９／３２ｋＤの見掛け分子量を有する断片がある。
証拠によれば、Ｆｌｔ４リガンド活性を留める上で必須のアミノ酸が配列番号３３のアミノ酸約１０３／１１２-２２６／２２７内に含まれていて、成熟天然Ｆｌｔ４リガンドを生じるカルボキシ末端タンパク質分解開裂が配列番号３３のアミノ酸２２６-２２７の大体の位置で起きることを示唆している。したがって、好ましいＦｌｔ４リガンドは配列番号３３のアミノ酸約１０３-２２７を含んでいる。
ここに記載されたＶＥＧＦ-Ｃ変異分析では、Ｃ末端を画定する自然プロセッシング開裂により生産された配列番号３３のアミノ酸１０３-２２７にわたる天然ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドが存在していて、Ｆｌｔ４リガンドとして生物活性であることを示している。配列番号３３の残基１０４-２１３からなるポリペプチド断片は、ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めていることが示された。追加変異分析では、配列番号３３のアミノ酸１１３-２１３のみのポリペプチドがＦｌｔ４リガンド活性を留めていることを示している。したがって、好ましいポリペプチドは配列番号３３のアミノ酸残基約１０３-２２７、１０４-２１３または１１３-２１３にわたる配列を含んでいる。
更に、ポリペプチドのＶＥＧＦファミリーのメンバーの配列比較では、もっと小さな断片が生物活性を留めていて、このように小さな断片も本発明の一面とみなされるという指摘を与えている。特に、ポリペプチドのＶＥＧＦファミリーの８つの高度に保存されたシステイン残基は配列番号３３の残基１３１〜残基２１１の領域を画定し（図１０＆３１参照）、したがって残基約１３１〜残基約２１１にわたるポリペプチドはＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めていると予想される。事実、進化的保存ＲＣＸＸＣＣモチーフを留めた残基約１６１-２１１を含んでなるポリペプチドはＶＥＧＦ-Ｃ活性を留めていると思われ、したがって本発明の一面とみなされる。ＶＥＧＦ-Ｃにある保存システイン残基の一部は、様々な天然ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのホモおよびヘテロダイマーを作る鎖間ジスルフィド結合に関与している。先の考察以外にも、鎖間ジスルフィド結合を欠くＶＥＧＦ-ＣポリペプチドがＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めているという証拠が存在している。その結果、本発明の物質および方法には、鎖間ジスルフィド結合の存在または不在にかかわらず、ＶＥＧＦ-Ｃの少くとも１つの生物活性を留めている、すべてのＶＥＧＦ-Ｃ断片を含む。本発明には互いにまたは他のポリペプチドに連結されたこのような断片を含んでなるマルチマー（ダイマーを含む）も含む。断片連結は、ポリペプチド鎖の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）または非共有結合（例えば、水素結合、安定または誘導双極子-双極子相互作用による結合、疎水性または親水性相互作用による結合、これら結合メカニズムの組合せなど）による。
更にもう１つの関連面において、本発明にはＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃの前駆体およびＶＥＧＦ-Ｃの断片を含めた、前記ポリペプチドの変異体およびアナログを含む。本発明で考えられる変異体には、当業者に認識されているような保存的置換によるか、あるいはＶＥＧＦ-Ｃの少くとも１つの生物活性の保留に適合するアミノ酸残基の付加または欠失により、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体およびＶＥＧＦ-Ｃ断片のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有した精製および単離ポリペプチドがある。
本発明で考えられるアナログには、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体またはＶＥＧＦ-Ｃ断片でみられる修飾とは異なるが、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体またはＶＥＧＦ-Ｃ断片の少くとも１つの生物活性の保留に適合する修飾を１以上のアミノ酸残基に有したポリペプチドがある。例えば、本発明の範囲内のアナログにはグリコシル化変異体および複合体（標識、毒素などのような化合物への前記ポリペプチドの付着）がある。
本発明では、本発明のポリペプチドをコードする精製および単離ポリヌクレオチド（即ち、核酸）、例えばＶＥＧＦ-Ｃ前駆体、ＶＥＧＦ-Ｃまたはそれらの生物活性断片もしくは変異体をコードするｃＤＮＡまたは対応ゲノムＤＮＡも提供する。本発明の好ましい核酸は、配列番号３３のアミノ酸残基１〜４１９またはその前記断片の１つをコードするＤＮＡを含んでいる。遺伝コードの縮重のために、多数のこのようなコード配列が可能であり、各々が配列番号３３に示されたアミノ酸配列またはその断片のコードを共通して有している。本発明には、ＶＥＧＦ-Ｃの少くとも１つの生物活性を留めたポリペプチドをコードする、これらポリヌクレオチドのアナログ、またはこれらポリヌクレオチドのいずれか１つの誘導体も包含している。本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドには、ＶＥＧＦ-Ｃの生物活性の少くとも１つを留めたＶＥＧＦ-Ｃの断片またはＶＥＧＦ-Ｃ断片のアナログについてのコード配列を含んでなる、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドがある。遺伝コードの縮合によって、本発明のポリペプチドをコードする、異なるポリヌクレオチドが、本発明の範囲内にある。一態様において、本発明では、当業者により理解されるように、コードされたポリペプチド間で保存的アミノ酸差異を生じるような、ＶＥＧＦ-Ｃ断片をコードするポリヌクレオチドとは異なる配列を有したポリヌクレオチドを考えている。
本発明による好ましいポリヌクレオチドは、配列番号３２に示されたヌクレオチド３５２-１６１１のヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ配列を含んでなる。本発明による他のポリヌクレオチドは、例えばヒト以外の哺乳動物、鳥類（例えば、鳥ウズラ）およびその他からのＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドをコードしている。本発明の更に他のポリヌクレオチドには、ＶＥＧＦ-Ｃ断片のコード配列と、ＶＥＧＦ-Ｃの一部または全部をコードするＤＮＡの対立遺伝子変異体がある。
本発明には、標準厳密ハイブリッド形成条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドを更に含む。例示されるストリンジェントハイブリッド形成条件は下記のとおりである：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ６．８中４２℃でハイブリッド形成、０．２×ＳＳＣ中５５℃で洗浄。これら条件の変化はハイブリッド形成される配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含有率に基づき生じることが、当業者により理解されている。当業界の定型的標準が適切なハイブリッド形成条件を調べるために適している。Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Second ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）SS 9.47-9.51参照。ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃ断片またはＶＥＧＦ-Ｃアナログをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成できるこれらのポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ-Ｃの他の（非ヒト）哺乳動物形をコードするポリヌクレオチドを同定、精製および単離するための核酸プローブとして有用である。しかも、これらのポリヌクレオチドは下記のような本発明のスクリーニング法に有用である。
本発明の好ましい核酸プローブは、配列番号３２の少くとも約１６の連続ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる。更に好ましくは、これらの核酸プローブは配列番号３２の配列でみられる少くとも約２０のヌクレオチドを有する。これらの核酸をプローブとして用いる場合には、その核酸は配列番号３２に示された配列の一部と特異的にハイブリッド形成することが好ましい。特異的ハイブリッド形成とは、標準厳密ハイブリッド形成条件下におけるハイブリッド形成としてここでは規定される。他の哺乳動物ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子を特異的に同定および単離するために、核酸プローブはＶＥＧＦ-Ｃに関連した遺伝子とハイブリッド形成しない（例えば、ヒトＶＥＧＦまたはヒトＶＥＧＦ-Ｂ遺伝子とハイブリッド形成しない）ように選択されることが好ましい。
このため、本発明には、ポリヌクレオチドがＶＥＧＦ-Ｃをコードする遺伝子、例えばヒト遺伝子と特異的にハイブリッド形成できる、少くとも約１６のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを包含している。ハイブリッド形成の特異性は、本発明のポリヌクレオチドが、例えばＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ-Ｂをコードする核酸へのそのポリヌクレオチドのハイブリッド形成をサポートしないハイブリッド形成条件下で、ＶＥＧＦ-Ｃをコードする核酸とハイブリッド形成できることを確かにしている。一態様において、少くとも約１６のヌクレオチドと、好ましくは少くとも約２０のヌクレオチドのポリヌクレオチドが、配列番号３２でみられる連続ヌクレオチド配列として、または配列番号３２に示されたヌクレオチド配列の補足として選択される。
本発明の追加面には、本発明の核酸を含んだベクターと、本発明の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞がある。本発明の好ましいベクターは、そのベクターで形質転換またはトランスフェクトされた適切な宿主細胞がＦｌｔ４リガンドを発現できるように、本発明の核酸が適切なプロモーターおよび他のコントロール配列と作動的に連結されている発現ベクターである。本発明の好ましいベクターは、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．９７２３１を有するプラスミドｐＦＬＴ４-Ｌである。このようなベクターおよび宿主細胞は、ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを組換え生産させる上で有用である。
本発明には、本発明のポリペプチドの製造方法を更に含む。好ましい方法において、本発明の核酸またはベクターは宿主細胞で発現され、本発明のポリペプチドは宿主細胞または宿主細胞の増殖培地から精製される。
関連態様において、本発明には、（ａ）本発明の核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、（ｂ）核酸を発現させるために宿主細胞を培養し、（ｃ）宿主細胞または宿主細胞の増殖培地からＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合できるポリペプチドを精製する工程からなる、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合できるポリペプチドの製造方法を含む。
本発明には、本発明の方法により生産されたＦｌｔ４の精製および単離ポリペプチドリガンドも含むと考えられる。１つの好ましい態様において、本発明には他のヒトポリペプチドを実質的に含まないヒトＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドまたはその生物活性断片がある。
もう１つの面において、本発明には本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドマルチマーと特異的な反応性である抗体を含む。モノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体が、当業界の標準技術に従い、本発明のポリペプチドに対して作られる。このような抗体は、血管形成、脈管形成、リンパ管およびそれらの病状、創傷治癒、あるいはある腫瘍細胞、造血または白血病細胞をモニターするために、診断適用で用いられる。抗体は、Ｆｌｔ４レセプターの活性化からリガンドを阻止するために用いてもよい。
本発明によるリガンドは検出可能なレベルで標識して、それらの対応レセプターをin situで同定するために用いてもよい。標識されたＦｌｔ４リガンドおよび抗Ｆｌｔ４リガンド抗体は、リンパ管、高内皮細静脈およびそれらの病状と、組織化学組織切片で発現されたＦｌｔ４レセプターの検出に、造影剤として用いてもよい。リガンドまたは抗体は、造影のために適切な超磁性、常磁性、電子密度、エコー源または放射性物質と共有または非共有結合させてもよい。ビオチンおよびアビジンのような他の非放射性標識も用いてよい。
本発明の関連面は、特定細胞、例えば内皮細胞の検出のための方法である。これらの細胞はin vivoまたはex vivo生物組織サンプルでみられる。検出の方法は、ポリペプチドが細胞と結合する条件下で、Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと結合できる本発明によるポリペプチドに、例えば内皮細胞を含めた生物組織を暴し、場合により生物組織を洗浄し、生物組織中でその細胞に結合されたポリペプチドを検出して、それによりその細胞を検出する工程からなる。
本発明は、請求項に記載されたリガンドの診断および臨床適用も提供する。好ましい態様において、Ｆｌｔ４リガンドまたは前駆体は、例えば創傷治癒中に血管形成を加速させるか、またはリンパ管の内皮機能を促進させるために用いられる。ＶＥＧＦ-Ｃの有用性は、組織移植、眼疾患、動脈狭窄周辺側枝管の形成と、梗塞後に損傷組織中への、血管形成のインデュサーとして示唆されている。本発明によるポリペプチドは、適切な薬学上許容されるビヒクル、例えば薬学上許容される希釈物、アジュバント、賦形剤またはキャリアを用いて、いずれか適切な手法で投与される。ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドは、検出可能に標識されたＶＥＧＦ-Ｃを用いる結合アッセイまたはキットで、活性レセプターまたはリガンドの存在について生検物質をアッセイすることにより、将来の転移リスクを定量するために用いてもよい。本発明によるＦｌｔ４リガンドは、例えば臓器移植患者でリンパ管の再成長または透過性を促進させるために用いてもよい。加えて、Ｆｌｔ４リガンドはがん（例えば乳がん）の治療で外科的介入後に腋窩リンパ管の喪失を補うために用いられる。本発明によるリガンドは、炎症、浮腫、リンパ管の形成不全、リンパ閉塞、象皮病およびミルロイ病を治療または予防するために用いてもよい。最後に、Ｆｌｔ４リガンドは、リンパ球生産および成熟を刺激させるか、組織およびリンパ管間のリンパ球の出入りを促進または阻害させるか、あるいは胸腺への出入りに影響を与えるために用いられる。
本発明には、哺乳動物の内皮細胞障害についてスクリーニングする方法を含む。その方法は、対象から内皮細胞のサンプルを用意して、内皮細胞のサンプルを請求項４に記載されたポリペプチドと接触させ、細胞の増殖速度を調べ、増殖速度を障害と相関させることを含む。好ましい態様において、内皮細胞はリンパ内皮細胞である。もう１つの好ましい態様において、哺乳動物はヒトであり、内皮細胞はヒト細胞である。更にもう１つの好ましい態様において、障害は管障害、例えば手術によるリンパ管の喪失または閉塞による現存リンパ管の機能の減少のようなリンパ管障害である。もう１つの態様において、内皮細胞はin vitroでポリペプチドと接触される。その方法で調べられる増殖速度は、当業界で知られるいくつかの技術のうちいずれか１つにより調べられる、単位時間当たりの細胞分裂速度である。増殖速度と障害との相関には、例えばポリペプチドが下記のようにＦｌｔ４リガンド活性を有しているか、またはこのような活性のインヒビターであるかといった、ポジティブまたはネガティブな相関がある。
Ｆｌｔ４リガンドのインヒビターは、内皮細胞増殖、リンパ管腫および転移がんを抑制するために用いてもよい。例えば、このようなインヒビターは転移成長または拡散を阻止させるか、あるいは内皮細胞発現および成長の他の面を抑制するために用いられる。インヒビターには抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、Ｆｌｔ４レセプターを遮断するポリペプチドがあり、それらすべてが本発明の面とみなされる。
もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物内皮細胞の成長を調節するために有効な量の本発明によるポリペプチドに哺乳動物内皮細胞を曝す工程を含む、哺乳動物で内皮細胞の成長を調節するための方法を提供する。一態様において、成長の調節はＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼを発現する宿主細胞でＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化を刺激できるポリペプチドを用いることにより行われる。内皮細胞の成長を調節することで、本発明では内皮細胞関連障害の調節を考えている。本発明により考えられる内皮細胞障害には、リンパ管の物理的喪失（例えば、腋窩リンパ組織の外科的切除）、リンパ管閉塞（例えば、象皮病）およびリンパ管腫があるが、それらに限定されない。好ましい態様において、対象、即ち内皮細胞はヒトである。内皮細胞はin vitroまたはin vivoで用意され、それらは組織移植片に含まれている。ポリペプチドの有効量とは、当業者により理解されるように、（細胞倍加時間のミクロまたはマクロ視覚化および評価、あるいは核酸合成アッセイにより調べられるような）細胞成長速度で再現可能な変化を達成させるために必要であると実験的に調べられたポリペプチドの量として、ここでは規定される。
本発明は、請求項に記載された核酸（即ち、ポリヌクレオチド）を内皮細胞障害のスクリーニングに用いるための方法も提供する。好ましい態様において、本発明は、対象から内皮細胞核酸のサンプルを用意して、ＶＥＧＦ-Ｃをコードする遺伝子とハイブリッド形成できる（好ましくは、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡとハイブリッド形成できる）本発明のポリヌクレオチドと内皮細胞核酸のサンプルを接触させ、内皮細胞核酸とポリヌクレオチドとのハイブリッド形成レベルを調べ、ハイブリッド形成レベルを障害と相関させる工程からなる、哺乳動物で内皮細胞障害をスクリーニングするための方法を提供する。好ましい哺乳動物、即ち内皮細胞核酸源はヒトである。ポリヌクレオチドでスクリーニングする方法により考えられる障害には、前記リンパ管障害および低酸素症のような管障害があるが、それらに限定されない。
他の（非ヒト）ＶＥＧＦ-Ｃ形をコードする精製および単離ポリヌクレオチドも、それでコードされるポリペプチド、および非ヒトＶＥＧＦ-Ｃ変異体と特異的に免疫反応性である抗体のように、本発明の面である。ＶＥＧＦ-Ｃの好ましい非ヒト形は、鳥および哺乳動物種を含めた他の脊椎動物種に由来する形である。哺乳動物形が高度に好ましい。このため、本発明には、精製および単離哺乳動物ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドと、このようなポリペプチドをコードする精製および単離ポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明には配列番号４１の残基１〜４１５のアミノ酸配列を有する精製および単離ポリペプチドを含み、その配列は推定マウスＶＥＧＦ-Ｃ前駆体に相当する。推定マウスＶＥＧＦ-Ｃ前駆体は、ヒトプレプロポリペプチドのプロセッシングと類似した手法で成熟マウスＶＥＧＦ-Ｃにプロセッシングされると考えられる。このため、関連面において、本発明にはＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ（例えば、ヒトまたはマウスＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼ）と特異的に結合できる精製および単離ポリペプチドがあり、そのポリペプチドは配列番号４１の残基１〜４１５のアミノ酸配列を有する精製および単離ポリペプチドの断片を含んでなり、その断片はＦｌｔ４レセプターチロシンキナーゼと特異的に結合することができる。本発明には、前記ポリペプチドのマルチマーと、前記ポリペプチドをコードする精製および単離核酸、例えば配列番号４０に示された配列の全部または一部を含んでなる核酸も更に含む。
もう１つの態様において、本発明には精製および単離ウズラＶＥＧＦ-Ｃポリペプチド、その生物活性断片およびマルチマーと、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがある。
更にもう１つの態様において、本発明には、ＶＥＧＦ-Ｃが天然宿主細胞で発現されるような条件下において、このような細胞でＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子またはもう１つの作動的に連結されたタンパク質コード遺伝子の発現を促進できる、ＶＥＧＦ-Ｃプロモーターを含んでなるＤＮＡがある。
【図面の簡単な説明】
図１は脈管形成および血管形成に関与する主要内皮細胞レセプターチロシンキナーゼおよび成長因子を概略で表している。免疫グロブリン様ドメイン（ＩＧＨ）、表皮成長因子ホモロジードメイン（ＥＧＦＨ）、フィブロネクチンIII型ドメイン（ＦＮ III）、貫膜（ＴＭ）および傍膜（ＪＭ）ドメイン、チロシンキナーゼ（ＴＫ１、ＴＫ２）ドメイン、キナーゼインサートドメイン（ＫＩ）とカルボキシ末端ドメイン（ＣＴ）を含めた、主要構造ドメインが表されている。
図２はｐＬＴＲＦｌｔ４ｌ発現ベクターの構築について概略で表している。
図３は分泌される可溶性Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆｌｔ４ＥＣ）をコードするバキュロウイルスベクターの構築について概略で表している。
図４はＰＣ-３細胞培養物からのならし培地によるＦｌｔ４自己リン酸化の刺激の結果を示している。
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＰＣ-３ならし培地で刺激されるＦｌｔ４トランスフェクト細胞の主要チロシルリン酸化ポリペプチドが１２５ｋＤ  Ｆｌｔ４ポリペプチド（ＶＥＧＦＲ-３）であり、しかもＦｌｔ４刺激活性がヘパリン-セファロースに吸着されないことを示している。
図６はＰＣ-３ならし培地から単離されたＦｌｔ４リガンド活性のウエスタン免疫ブロット分析を示している。
図７は濃縮ＰＣ-３ならし培地から単離されたＦｌｔ４リガンド（ＶＥＧＦ-Ｃ）のアフィニティ精製からのクロマトグラフィーフラクションのゲル電気泳動の結果を示している。
図８は、類似性を示すために並べられた、ヒト、マウスおよびウズラＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのアミノ酸配列を表している。３種すべてで保存された残基は太字で表されている。
図９はＦｌｔ４リガンド、ＶＥＧＦ-Ｃのクローニングおよび構造を概略で表している。ＶＥＧＦ相同領域（暗陰影ボックス）、アミノおよびカルボキシル末端プロペプチド（各々、明陰影および非陰影ボックス）と、推定シグナル配列（ｓｓ）が、５′および３′非翻訳（ｕｔ）核酸領域間に表されている。シグナル配列とアミノおよびカルボキシル末端プロペプチドの開裂部位は、三角で示されている。
図１０はＰＤＧＦ-Ａ、-Ｂ、ＰｌＧＦ-１、ＶＥＧＦ-Ｂ１６７、ＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ４リガンド（ＶＥＧＦ-Ｃ）の推定アミノ酸配列の比較を示している。
図１１はヒトＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のエクソン-イントロン構成を表している。７つのエクソンはオープンボックスとして表され、エクソンサイズは塩基対で表されている。イントロンはラインで表され、イントロンサイズ（塩基対）はライン上に表されている。推定２．４ｋｂマウスｍＲＮＡの５′および３′非翻訳配列は陰影ボックスとして表されている。ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子を特徴付けるために用いられるゲノムクローンの位置は、遺伝子の地図の下に表されている。
図１２は２種のヒト腫瘍細胞系と脳組織でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃ（“ＥＬＴ４-Ｌ”で示される）をコードする遺伝子のノーザンブロット分析を示している。
図１３Ａは、パルスチェイス実験後に単離されて、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによる電気泳動に付された組換えＶＥＧＦ-Ｃを示すオートラジオグラフである。
図１３Ｂは、組換えＶＥＧＦ-Ｃ形が非還元条件下でジスルフィド連結されていることを示す、ポリアクリルアミドゲルの写真である。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＶＥＧＦ-ＣがＶＥＧＦＲ-２（ＫＤＲ）の自己リン酸化を刺激するが、ＰＤＧＦＲ-βリン酸化に効果を有しないことを示す、ウエスタンブロットを表している。
図１５Ａは、ＶＥＧＦ-Ｃが三次元コラーゲンゲルアッセイで内皮細胞移動を刺激することを示している。
図１６Ａは成人組織におけるＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡの発現を示している。
図１６Ｂは選択されたヒト胎児組織におけるＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃの発現を示している。
図１７はヒトおよびマウスＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のゲノム構造を表している。エクソン-イントロンジャンクションの配列がエクソンおよびイントロン鎖長と一緒に表されている。イントロン配列は小文字で表されている。ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡで観察されるオープンリーディングフレームのヌクレオチドは、（ジャンクションでコードされるコドンに相当する）３つの大文字として示されている。
図１８はＶＥＧＦ-Ｃの主要形を含めたＶＥＧＦ-Ｃプロセッシングの概略を示している。
図１９は、ＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（ＶＥＧＦ-Ｃ）と偽トランスフェクト細胞（Ｍ）が放射性アミノ酸でパルス標識されて、様々な時間にわたり追跡された、パルスチェイス免疫沈降実験からのオートラジオグラムを表している。
図２０はＫ１４-ＶＥＧＦ-Ｃベクター構築物（vector construct）の概略地図である。
図２１Ａ-Ｃは、トランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞により生産される様々な形の組換えＶＥＧＦ-Ｃの電気泳動分別を表している。図２１Ｂは、偽（Ｍ）トランスフェクト細胞、野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞、およびＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２ＳをコードするｃＤＮＡ変異体でトランスフェクトされた細胞から生産されたポリペプチドの、非還元条件下における電気泳動分別を表している。図２１Ｂで特定されたバンドの各々は切り出されて、還元条件下で別々な列で電気泳動分別された。ｗｔ  ＶＥＧＦ-Ｃに相当するバンドの分別は図２１Ａに表され、Ｒ１０２Ｓ変異体に相当するバンドの分別は図２１Ｃに表されている。
図２２Ａ-Ｂは、非還元ゲル電気泳動で現されるような、野生型および変異組換えＶＥＧＦ-Ｃの形およびサイズを表している。図２２Ａは培地中に分泌されたＶＥＧＦ-Ｃ形を示し、図２２Ｂは細胞に保留されたＶＥＧＦ-Ｃ形を示している。偽（Ｍ）トランスフェクト細胞はコントロールとして使った。
図２３Ａ-Ｂは、抗血清８８２および抗血清９０５を用いた免疫沈降標識ＶＥＧＦ-Ｃ形のパターンの比較を表している。隣接する列は、還元およびアルキル化に付された（＋印の列）または付されなかった（−印の列）免疫沈降物を含んでいる。
図２４Ａ-Ｂは、所定時間にわたりインターロイキン-１（ＩＬ-１）および／またはデキサメタゾン（ＤＥＸ）の存在または不在下で増殖された細胞から単離された全ＲＮＡのノーザンブロットを表している。図２４Ｂでは、ノーザンブロットが、ｂｐ５７-６３８をカバーするＶＥＧＦ  ５８１ｂｐ  ｃＤＮＡ（Genbank受託Ｎｏ．Ｘ１５９９７）と、ヒトＶＥＧＦ-Ｂ１６７ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１／３８２、Genbank受託Ｎｏ．Ｕ４８８００）からの放射性ＤＮＡでプロービングされた。図２４Ａでは、ノーザンブロットが、ヒト全鎖長ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ（Genbank受託Ｎｏ．Ｘ９４２１６）からの放射性ＤＮＡでプロービングされた。１８Ｓおよび２８Ｓ-ｒＲＮＡマーカー
図２５は、示されたような様々な時間にわたりメタノールで誘導後に、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ、ベクター単独でトランスフェクトされた、あるいは偽（Ｍ）トランスフェクトされたP.pastoris培養物におけるＶＥＧＦ-Ｃ発現を示している。培地約１０μｌが、ゲル電気泳動と、その後でウエスタンブロット、および抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗血清での検出により分析された。
図２６は、ＶＥＧＦＲ-３（Ｆｌｔ４）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞とＶＥＧＦＲ-２（ＫＤＲ）を発現するＰＡＥ細胞が、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ保有ベクター（＋）、インサートを欠くベクター（−）でトランスフェクトされたPichia酵母からの５×濃縮培地で刺激されたか、または陽性コントロールバナデートで刺激された、ウエスタンブロットの結果を表している。刺激された細胞は溶解され、ＶＥＧＦＲ特異性抗体で免疫沈降され、免疫沈降物はブロットされて、抗ホスホチロシン抗体でプロービングされた。
図２７Ａ-Ｂは宿主２９３ＥＢＮＡ細胞により分泌（図２７Ａ）または保留（図２７Ｂ）されたヒトＶＥＧＦ-Ｃ（ｗｔ）およびＶＥＧＦ-Ｃ変異体のゲル電気泳動図を表している。偽（Ｍ）トランスフェクト細胞はコントロールとして使った。分子量マーカーはキロドルロン（ｋＤ）で左に示されている。
図２８Ａ-Ｂは、野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ-Ｃと３種のＶＥＧＦ-Ｃポリペプチド変異体により自己リン酸化物に刺激されたＶＥＧＦＲのウエスタンブロットを示している。細胞溶解物（ＶＥＧＦＲ-３の場合ＮＩＨ３Ｔ３およびＶＥＧＦＲ-２の場合ＰＡＥ）はレセプター特異性抗血清に付されて、レセプターは免疫沈降された。次いで免疫沈降物はゲル分別され、ウエスタン分析のためにブロットされた。ウエスタンブロットは抗ホスホチロシン抗体でプロービングされた。
図２９Ａ-Ｄは、Ｋ１４-ＶＥＧＦ-Ｃトランスジェニックおよびコントロールマウス同腹子組織のヘマトキシリン-エオシン染色切片の顕微鏡写真である。示された部分は、表示されているように、背面皮膚および口吻からのものである。白矢印は赤血球を欠いたラクナの内皮裏端を示している。
図３０は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ１６７およびＶＥＧＦ-Ｃプローブのプールとハイブリッド形成された、列記した組織からのポリアデニル化ＲＮＡのノーザンブロットを表している。推定転写物サイズはキロ塩基（ｋｂ）で右に示されている。
図３１はヒトおよびマウスＶＥＧＦ-Ｃアミノ酸配列の比較を表している。マウスＶＥＧＦ-Ｃのアミノ酸配列は上の列に示され、ヒト配列との違いがその下に記されている。配列は図９に示された領域を表すためにラベルされた。矢印はシグナルペプチダーゼの推定開裂部位を示し、ＢＲ３ＰモチーフとＣＲ／ＳＣモチーフはボックスで示され、保存システイン残基は配列上に太字で記されている。アルギニン残基１５８も太字で記されている。ナンバリングはマウスＶＥＧＦ-Ｃ残基に関する。
図３２は様々な３５Ｓ標識培地から免疫沈降またはアフィニティ精製されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ分別サンプルを表している。左パネルにおいて、ベクターのみを含むＢｏｓｃ２３細胞からのコントロール培地、ヒトＶＥＧＦ-Ｃを発現する細胞からの培地、およびマウスＶＥＧＦ-Ｃを発現する細胞からの培地ガ、独立して、セファロースにカップリングされたヒトＶＥＧＦＲ-３細胞外ドメインとの沈降に付された。右パネルでは、同様のならし培地が抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗体との沈降に付された。ｍｗｍ：分子量マーカー；ｍ-マウス；ｈ-ヒト；α-抗
図３３は、ＶＥＧＦ-Ｃ誘導レセプター自己リン酸化の尺度として、ＶＥＧＦ-Ｃ保有溶解物（またはベクターコントロール）との接触により刺激された、示されたようなＶＥＧＦＲ-３またはＶＥＧＦＲ-２を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞から作られた溶解物からのゲル分別免疫沈降物のウエスタンブロットを示している。ウエスタンブロットは、示されたように、抗ホスホチロシン（α-ＰＴｙｒ）または抗レセプター抗血清（抗ＶＥＧＦＲ-３および抗ＶＥＧＦＲ-２）でプロービングさせた。コントロールとして、レセプター自己リン酸化がペルバナデート処理により誘導された（ＶＯ４）。矢印および数値はチロシルリン酸化レセプターポリペプチドバンドの見掛け分子量に関する。ｂＶＥＧＦ：ヒトバキュロウイルスＶＥＧＦ-Ｃタンパク質；Ｃ-ＦＧＥＶｍ：アンチセンス方向でベクター中にクローニングされたマウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを保有する細胞からの溶解物。
図３４Ａ-Ｄは、１２．５日マウス胚の副矢状切片でＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡの発現を現すin situハイブリッド形成の顕微鏡写真を表している。図３４Ａ：ＶＥＧＦ-Ｃプローブ；ｊ-頸静脈、ｍｎ-後腎、ｍ-腸間膜（矢じり）、ｖｃ-椎間血管、ｌｕ-肺臓（矢じり）。図３４Ｂ：ＶＥＧＦ-Ｂプローブ；ｈ-心臓、鼻咽頭部分（矢じり）。図３４Ｃ：コントロールとして働くＶＥＧＦ-Ｃセンス鎖プローブ。図３４Ｄ：図３４Ｃに示された同視野の明視野顕微鏡写真。
図３５Ａ-Ｈはマウス胚の切片を表していて、頸静脈および腸間膜部分でＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦＲ-３発現の比較を行っている。図３５Ａおよび３５Ｃは、頸部（矢じり）の大きな嚢様構造周囲にある間葉でＶＥＧＦ-Ｃ転写物の発現を示している。図３５Ｂおよび３５Ｄは、頸静脈嚢でＶＥＧＦＲ-３転写物の発現を示している。図３５Ｅおよび３５Ｇでは、１４．５日ｐ．ｃ．胚の腸間膜部分と腸周囲にもＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡ分布を示している。図３５Ｆおよび３５Ｈでは、１４．５日胚の腸間膜部分と、腸部分、発育中のリンパ管および細静脈にも、ＶＥＧＦＲ-３  ｍＲＮＡを示している。
図３６Ａ-Ｄは１６日ｐ．ｃ．マウス胚の頭部のＦＬＴ４およびＶＥＧＦ-Ｃin situハイブリッド形成を示した顕微鏡写真を表している。Ｆｌｔ４ブローブとハイブリッド形成した頭部の切片（図３６Ａ）は、発育中の口吻、鼻構造および目を示している。もっと尾部側に位置する切片は、ＶＥＧＦ-Ｃプローブとのハイブリッド形成を示している（図３６Ｂ）。上部で両側にある丸い構造は、発育中の臼歯を表している。中線の両側にある上（背面）部分には、発育中の甲介の尾部がみられる。これらの構造は、高倍率暗視野（図３６Ｃ）および明視野（図３６Ｄ）顕微鏡観察でも示されている。
発明の詳細な説明
新規脈管内皮成長因子の単離と、ヒト前立腺がん細胞系ＰＣ-３から作製されたｃＤＮＡライブラリーからの、この新規成長因子をコードするＤＮＡのクローニングとが、本明細書に記載されている。単離されたｃＤＮＡは、タンパク質分解でプロセッシングされて、細胞培地に分泌されたタンパク質をコードしている。ＶＥＧＦ-Ｃと称される分泌タンパク質はＦｌｔ４の細胞外ドメインと結合して、Ｆｌｔ４およびＶＥＧＦＲ-２のチロシン自己リン酸化を誘導する。ＶＥＧＦ-Ｃはコラーゲンゲルで内皮細胞の移動も刺激する。
ここに報告されたデータでは、ＶＥＧＦ-Ｃがそれより大きな前駆体として発現されて、これが開裂されてリガンドを生じることを示している。一部の場合における同時発現領域は、リガンド遺伝子のＲＮＡの別なスプライシングに起因している。このような同時発現領域は、リガンドを得るために用いられる具体的発現系の関数であろう。当業者であれば、タンパク質の組換え生産において、追加配列がタンパク質を発現させるために用いられる具体的な組換え構築物に応じて機能性ポリペプチドと一緒に発現されて、その後で望ましいリガンドを得るために除去されることを理解している。一部の場合には、内在／天然リガンドのある残基を欠いた組換えリガンドが作られる。更に、タンパク質の機能を変えない保存的置換もタンパク質で行ってよいことは周知である。したがって、このような変更も本発明の範囲内であると考えられる。更に、ＶＥＧＦがシグナル配列の分泌と付随的放出後にその非プロセッシング形でそのレセプターを刺激させる場合と同様に、１種以上のＶＥＧＦ-Ｃ前駆体（配列番号３３の残基３２〜残基４１９の完全アミノ酸配列を有する最大推定天然分泌ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体）が更にいかなるプロセッシングもなしにＦｌｔ４リガンドを刺激できると予想されている。
ここに報告された結果は、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）がＶＥＧＦ-Ｃのシグナルを伝えることを示している。この結論は、組換えＦｌｔ４ＥＣ（Ｆｌｔ４細胞外ドメイン）タンパク質へのＶＥＧＦ-Ｃの特異的結合と、ＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト細胞からの培地によるＶＥＧＦＲ-３自己リン酸化の誘導に基づいている。逆に、ＶＥＧＦだけでなくＰｌＧＦも、ＶＥＧＦＲ-３との特異的結合を示さなかったか、またはその自己リン酸化を誘導しなかった。
以下で更に詳細に示されているように、推定プレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃは４６，８８３の推定分子質量を有し、推定プレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃプロセッシング中間体は約３２ｋＤの観察分子量を有し、ならし培地から単離された成熟ＶＥＧＦ-Ｃは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより調べたところ約２３ｋＤの分子量を有している。精製および組換えＶＥＧＦ-Ｃの観察分子質量と、ＶＥＧＦ-Ｃオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるプレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃの推定分子質量との違いの主な部分は、プレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端領域における配列のタンパク質分解除去に起因している。しかしながら、推定１０２アミノ酸リーダー配列のタンパク質分解開裂が、４６，８８３の推定分子質量と約２３ｋＤの観察質量との全くの違いの説明になるとは思われず、その理由は配列番号３３のアミノ酸１０３-４１９からなるポリペプチドの推定分子量が３５，８８１ｋＤだからである。証拠によれば、分子量で観察される違いの一部がＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のアミノおよびカルボキシル双方の末端領域におけるアミノ酸残基のタンパク質分解除去に起因することを示している。ＰＤＧＦの構造の研究（Heldin et al.,Growth Factors,8:245-52（1993））からの類推によれば、ＶＥＧＦ-Ｃによるレセプター結合および活性化に重要な領域が、ＶＥＧＦ-Ｃタンパク質の分泌形（即ち、推定プレプロリーダー配列と一部のカルボキシ末端配列を欠いた形）でみられるアミノ酸残基１０４-２１３内に含まれていることを示唆している。ＶＥＧＦＲ-３と結合する２３ｋＤポリペプチドは、ＶＥＧＦ相同性ドメインを表しているらしい。生合成後に、ナセントＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドは推定ＶＥＧＦ-Ｃアミノ酸配列で同定された３つの推定Ｎ連結グリコシル化部位でグリコシル化されることがある。Ｎ連結グリコシル化のような修飾を含むポリペプチドは、本発明の面としてみなされる。
このファミリーの他のリガンドと比較してＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドの鎖長を増加させるカルボキシル末端アミノ酸配列は、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）配列を暗示するシステイン残基のスペーシングのパターンを示している（Dignam et al.,Gene,88:133-40（1990）;Paulsson et al.,J.Mol.Biol.,211:331-49（1990））。ＶＥＧＦ-Ｃのこの新規なＣ末端シルクタンパク質様構造モチーフは、上記考察に基づいて生合成後に少くとも部分的に開裂された独立ドメインに折り畳まれることがある。面白いことに、ＢＲ３Ｐタイプの少くとも１つのシステインモチーフはＶＥＧＦのカルボキシル末端にもみられる。我々の実験において、推定前駆体および開裂リガンドの双方が細胞培地で検出されており、細胞プロテアーゼによる開裂を示唆した。ＶＥＧＦ-Ｃ単離物のアミノ末端およびカルボキシ末端配列の決定から、タンパク質分解プロセッシング部位の特定を行える。プロ-ＶＥＧＦ-Ｃ分子の異なる部分に対する抗体の作製によれば、前駆体-産物関係および比率、それらの細胞分布と、プロセッシングおよび分泌の動態の正確な決定を行える。
ＶＥＧＦ-Ｃは鎖内および間ジスルフィド結合の形成に関与する８つのシステイン残基の保存パターンを有していて、ＰＤＧＦに類似した逆平行ダイマー生物活性分子を作る。鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステイン残基の変異分析では、ＰＤＧＦと違って、ＶＥＧＦダイマーが生物活性を維持するためにこれらの共有結合相互作用で一緒に保たれる必要があることを示した。ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチド鎖のジスルフィド連結は非還元条件下におけるＶＥＧＦ-Ｃの分析で明らかだったが、組換えタンパク質にもポリペプチド間のジスルフィド結合を欠いたリガンド活性ＶＥＧＦ-Ｃ形を含んでいた。
ＶＥＧＦとＶＥＧＦ-Ｃとを区別するＶＥＧＦＲ-３は、ＶＥＧＦＲ-１およびＶＥＧＦＲ-２と構造的に密接に関連している。Finnerty et al.,Oncogene,8:2293-98（1993）;Galland et al.,Oncogene,8:1233-40（1993）;Pajusola et al.,Cancer Res.,52:5738-43（1992）。ＶＥＧＦＲ-３のほかに、ＶＥＧＦＲ-２チロシンキナーゼもＶＥＧＦ-Ｃに応答して活性化される。ＶＥＧＦＲ-２媒介シグナルは、その形態上で顕著な変化、アクチン再編成、およびこのレセプターを過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の膜ラフリング（ruffling）を起こす。これらの細胞において、ＶＥＧＦＲ-２はリガンド誘導走化性および分裂促進性も媒介した。Waltenberger et al.,J.Biol.Chem.,269:26988-95（1994）。同様に、レセプターキメラＣＳＦ-１Ｒ／ＶＥＧＦＲ-３は、ブタ大動脈内皮細胞ではなく、ＮＩＨ３Ｈ３繊維芽細胞で異所発現されたときに、分裂促進性であった（Pajusola et al.,1994）。このような結果と一致して、ＶＥＧＦＲ-２  ｍＲＮＡを発現するが、ＶＥＧＦＲ-１またはＶＥＧＦＲ-３  ｍＲＮＡをほとんどまたは全く発現しないウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞は、ＶＥＧＦ-Ｃで刺激されたときに高い移動性を示した。コラーゲンゲル中ＢＣＥ細胞培養物の光学顕微鏡観察では、ＶＥＧＦ-Ｃがこれら細胞の増殖を刺激することも示唆した。このため、データでは、ＶＥＧＦリガンドおよびレセプターがそれらのシグナリングで大きな特異性を示して、これが細胞型依存性であることを明らかにしている。
ＶＥＧＦＲ-３の発現パターン（Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,92:3566-70（1995））は、ＶＥＧＦ-Ｃが胚形成中に静脈およびリンパ脈管系の形成で機能することを示唆している。ここで示された成熟組織におけるＶＥＧＦ-Ｃの構成性発現では、ＶＥＧＦＲ-３が発現されるリンパおよびある静脈内皮の分化機能の維持にもこの遺伝子産物が関与していることを更に示唆している（Kaipainen et al.,1995）。リンパ毛細管はしっかり形成された基底層を有しておらず、シルク様ＢＲ３Ｐモチーフが組織でＶＥＧＦ-Ｃの有用性を調節できる超分子構造を作るのに関与しているという面白い可能性が残されている。しかしながら、ここで示されたように、ＶＥＧＦ-Ｃは、成熟組織にはそれほど豊富でないが、胚組織の脈管芽および分岐管の増殖内皮細胞に豊富であるＶＥＧＦＲ-２も活性化する。Millauer et al.,Nature,367:576-78（1993）。これらのデータは、ＶＥＧＦＲ-２が脈管形成および血管形成の主要レギュレーターであることを示唆した。このため、ＶＥＧＦ-Ｃは、リンパ内皮でユニークな効果と、おそらくいくつかのタイプの内皮の浸透性を調節するのと血管形成とでＶＥＧＦと共有される、より重複性のある機能とを有している。ＶＥＧＦ-ＣはＶＥＧＦＲ-２を刺激して、内皮移動を促進することから、ＶＥＧＦ-Ｃは創傷治癒、組織移植、眼疾患と、動脈狭窄周辺および梗塞後損傷組織中への副行管の形成に際して、血管およびリンパ管の管形成のインデューサーとして有用である。
一緒にすると、これらの結果は脈管内皮でシグナリングの複雑さの増加を示している。それらは、器官が分化してそれらの特定機能を発揮し始めたときに、内皮細胞の表現型不均一性がいくつかのタイプの機能的および形態的に異なる脈管で増加する、という考え方を補強している。しかしながら、適切な血管形成刺激による刺激で、内皮細胞は細胞周期に再入し、移動して、細胞周期から出て、その後それらの組織環境と機能的に適合した新しい脈管を形成するように再び分化する。組織発育および再生に伴う血管形成のこのプロセスは、内皮細胞増殖、移動、分化および生存についてポジティブおよびネガティブなシグナル間できちんとコントロールされたバランスに依存している。
血管形成を促進する既に同定された成長因子には、繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子／散乱因子、ＰＤＧＦおよびＴＨＧ-αがある（例えば、Folkman,Nature Med.,1:27-31（1995）;Friesel et al.,FASEB J.,9:919-25（1995）;Mustonen et al.,J.Cell.Biol.,129:895-98（1995）参照）。しかしながら、ＶＥＧＦは内皮細胞に比較的特異的な唯一の成長因子であった。このため、新たに同定された因子ＶＥＧＦ-Ｂ（Olofsson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:2578-81（1996））およびＶＥＧＦ-Ｃは、脈管形成、血管形成、透過性とおそらく他の内皮機能に関与している内皮細胞にとり特異的で重複した陽性シグナルの複雑さについて我々の理解を高めている。ノーザンブロットを用いた発現研究では心臓および骨格筋で豊富なＶＥＧＦ-Ｃ発現を示し、胎盤、卵巣、小腸、甲状腺、腎臓、前立腺、脾臓、精巣および大腸のような他の組織もこの遺伝子を発現している。ＰｌＧＦは胎盤で主に発現されるが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃの発現パターンは多くの組織で重複していて、ＶＥＧＦファミリーのメンバーがヘテロダイマーを形成し、それらの生理学的機能を発揮するように相互作用することを示唆している。
マウスゲノムでＶＥＧＦレセプター座の不活化をもたらす標的変異誘発は、ＶＥＧＦＲ-１が脈管内皮を形成する内皮細胞の適正な編成に必要であるが、ＶＥＧＦＲ-２が内皮および造血細胞双方の生成に必要であることを示した。これは、ＶＥＧＦファミリーの４遺伝子が脈管形成異常または心血管疾患を招く変異の標的になりうることを示唆している。
下記例は本発明の好ましい態様を表しており、そこでは本発明によるＦｌｔ４リガンドおよびリガンドコード核酸の単離、特徴と機能が示されている。
例１
ｐＬＴＲＦｌｔ４ｌ発現ベクターの作製
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼの長鎖形をコードするＬＴＲ-Ｆｌｔ４ｌベクターの構築は、図２に概略で示されている。全鎖長Ｆｌｔ４ｓ（Ｆｌｔ４短鎖形）ｃＤＮＡ（Genbank受託Ｎｏ．Ｘ６８２０３、配列番号３６）は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Pajusola et al.,Cancer Res.,52:5738-43（1992）に報告された、Ｆｌｔ４ｓの塩基対５６-２５３４を含むＳ２．５断片をｐＳＰ７３ベクター（Promega,Madison,WI）のＥｃｏＲＩ部位に最初にサブクローニングすることによりアセンブリーした。
Ｆｌｔ４  ｃＤＮＡのスクリーニングに用いられるｃＤＮＡライブラリーは最端５′タンパク質コード配列を含んでいないため、逆ＰＣＲを最初の１２アミノ酸残基（ＭＱＲＧＡＡＬＣＬＲＬＷ）に相当するＦｌｔ４の５′末端の増幅に用いた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをヒトＨＥＬ赤白血病細胞から単離し、二本鎖ｃＤＮＡはAmersham ｃＤＮＡ Synthesis System Plusキット（Amersham Corp.,Buckinghamshire,U.K.）と、クローンＳ２．５の５′末端の１９５ｂｐ下流に位置する遺伝子特異性プライマー：５′-ＴＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴ-３′（配列番号１）を用いて合成した。二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端をブラント化し、ｃＤＮＡをCentricon １００フィルター（Amicon Inc.,Beverly,MA）による濾過で精製した。ブラント末端ｃＤＮＡの環化は全容量１５０μｌ中で連結により行った。反応混合物は標準連結緩衝液、５％ＰＥＧ-８０００、１ｍＭ  ＤＴＴおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）８Ｕを含有していた。連結は１６℃で１６時間行った。この反応混合物１５μｌを、ＳａｃＩおよびＰｓｔＩ制限部位を導入するＦｌｔ４特異性プライマー１００ｎｇおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）１単位を含有した標準ＰＣＲ反応液（全容量１００μｌ）で用いた。２ラウンドのＰＣＲを、１ラウンド当たり３３サイクルを用いて行った（９５℃で１分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング、および７２℃で４分間の伸長）。ＰＣＲ混合物をＳａｃＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で連続処理し、MagicＰＣＲPrep（Promega）で精製後に、ＤＮＡ断片を配列決定のためにｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター（Promega）中にサブクローニングした。その配列は、受託Ｎｏ．Ｘ６８２０３としてGenbank Databaseに寄託されたＦｌｔ４ｓ  ｃＤＮＡクローンの５′末端に相当した。
最初の１２アミノ酸残基をコードする配列は、ＨＥＬ細胞から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡの逆転写ＰＣＲを用いて増幅されたＳｐｈＩ切断ＰＣＲ断片を連結させることにより、発現構築物に加えた。フォワードプライマーは下記配列：５′-ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣ  ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧ  ＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧ  ＣＧＣＴＧＴＧＣＣＴ  ＧＣＧＡＣＴＧＴＧＧ  ＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧ  ＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡ-３′（配列番号２）（ＳｐｈＩ部位は下線部分、翻訳開始コドンは太字で記載）を有していた。翻訳開始コドンは最適Kozakコンセンサス配列のすぐ下流にある（Kozak,Nucl.Acids Res.,15:8125-8148（1987））。リバースプライマーは下記配列：５′-ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＣＧＧＴ  ＣＡＴＣＣ-３′（配列番号３）（ＳｐｈＩ部位は下線部分）を有し、Ｓ２．５断片の５′末端に相当して、Ｓ２．５プラスミドのユニークＳｐｈＩ断片を置き換える。得られたベクターをＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断し、オリゴヌクレオチド５′-ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣ  ＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡ  ＡＣ-３′（配列番号４）（フォワードプライマー、ＥｃｏＲＩ部位は下線部分）および５′-ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧ  ＡＴＣＣＴＡＣＣＴＧ  ＡＡＧＣＣＧＣＴＴＴ  ＣＴＴ-３′（配列番号５）（リバースプライマー、ＣｌａＩ部位は下線部分）を用いて、Pajusola et al.,Cancer Res.,52:5738-43（1992）の図１に示されたＦｌｔ４ｓの３′末端をコードする０．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片（Genbank Ｘ６８２０３配列の塩基対３７８９-４４１６）から増幅された１３８ｂｐ  ＰＣＲ断片に連結させた。コードドメインは１．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片（Genbank Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ６８２０３にみられる配列の塩基対２５３５-３７８９）の連結により完成させた。完全ＤＮＡは、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Makela et al.,Gene,118:293-294（1992）に報告されたｐＬＴＲポリ発現ベクター（Genbank受託Ｎｏ．Ｘ６０２８０、配列番号３７）に、そのＨｉｎｄ III-ＡｃｃＩ（ブラント化）制限部位を用いて、Ｈｉｎｄ III-ＣｌａＩ（ブラント化）断片（このＣｌａＩはコード配列の３′末端を構築するために用いられる３′プライマーにも含まれていた）としてサブクローニングした。
Ｆｌｔ４の長鎖形（Ｆｌｔ４ｌ）は、下記のように短鎖形の３′末端を置き換えることにより作製した：Ｆｌｔ４ｌ  ｃＤＮＡの３′領域は、リバースおよびフォワードプライマーとして遺伝子特異性オリゴヌクレオチド（配列番号７、下記参照）およびｐＧＥＭ３Ｚベクター特異性（ＳＰ６プロモーター）オリゴヌクレオチド５′-ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡ-３′（配列番号６）を各々用いてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲの鋳型は、Genbank Ｘ６８２０３配列のヌクレオチド３７８９にあるＥｃｏＲＩ部位の下流に伸びる４９５ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片を含んだＦｌｔ４ｌ  ｃＤＮＡクローンであった（このＥｃｏＲＩ部位の下流配列はGenbank受託Ｎｏ．Ｓ６６４０７を有するＦｌｔ４長鎖形３′配列として寄託されている（配列番号３８））。遺伝子特異性オリゴヌクレオチドはコード領域の末端後に正しく位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、下記配列：５′-ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴ-３′（配列番号７）を有している。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＬＴＲＦｌｔ４ｓベクター断片にフレーム内で移して、そこから塩基対２５３５でＥｃｏＲＩ部位の下流にあるコード配列（配列Ｘ６８２０３参照）をＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ切断により除去した。得られたクローンはｐＬＴＲＦｌｔ４ｌと命名した。再び、コードドメインは、得られた構築物中に逆に１．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片（配列Ｘ６８２０３の塩基対２５３５-３７８９）の連結により完成させた。
例２
Ｆｌｔ４ｌトランスフェクト細胞の作製および分析
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（６０％集密）は、ＤＯＴＡＰリポソームベーストランスフェクション試薬（Boehringer-Mannheim,Mannheim,Germany）を用いて、ｐＬＴＲＦｌｔ４ｌ構築物５μｇおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＶ２ｎｅｏベクター（Southern et al.,J.Mol.Appl.Genet.,1:327（1982））０．２５μｇで同時トランスフェクトさせた。トランスフェクションの１日後に、細胞を０．５mg/mlゲネチシン（GIBCO,Grand Island,N.Y.）含有の選択培地中に移した。ゲネチシン耐性細胞のコロニーを単離し、Ｆｌｔ４タンパク質の発現について分析した。細胞を３．３％ＳＤＳ  １２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８含有の煮沸溶解緩衝液中で溶解させた。サンプルのタンパク質濃度はＢＣＡ法（Pierce,Rockford IL）により測定した。各溶解物からのタンパク質約５０μｇを、６％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）と、Ｆｌｔ４のカルボキシル末端に対する抗血清を用いた免疫ブロットにより、Ｆｌｔ４の存在について分析した。ウエスタンブロットのシグナルはＥＣＬ法（Amersham）を用いて表した。
抗Ｆｌｔ４抗血清の生産のため、短鎖形の４０カルボキシ末端アミノ酸残基：ＮＨ２-ＰＭＴＰＴＴＹＫＧ  ＳＶＤＮＱＴＤＳＧＭ  ＶＬＡＳＥＥＦＥＱＩＥＳＲＨＲＱＥＳＧＦＲ-ＣＯＯＨ（配列番号８）をコードするＦｌｔ４  ｃＤＮＡ断片を、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼコード領域とフレーム内でｐＧＥＸ-１λＴ細菌発現ベクター（Pharmacia-LKB,Inc.,Uppsala,Sweden）中に６５７ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした。得られたＧＳＴ-Ｆｌｔ４ｓ融合タンパク質をE.coliで生産させ、グルタチオン-セファロース４Ｂカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製されたタンパク質を凍結乾燥し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、Freund’sアジュバントと混合して、当業界で標準の方法を用いて隔週間隔でウサギの免疫に用いた（Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988））。抗血清は、トランスフェクト細胞からＦｌｔ４の免疫沈降のため、４回目の追加免疫後に用いた。Ｆｌｔ４を発現する細胞クローンもリガンド刺激分析のために用いた。
例３
Ｆｌｔ４ＥＣバキュロウイルスベクターの構築とその産物の発現および精製
Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（ＥＣ）バキュロウイルスベクターの構築は、図３に概略で示されている。Ｆｌｔ４コードｃＤＮＡは長鎖形および短鎖形の双方で作製したが、各々はモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲプロモーターのコントロール下でベクターに組み込まれている。Ｆｌｔ４レセプターの短鎖形のヌクレオチド配列は受託Ｎｏ．Ｘ６８２０３としてGenbankデータベースから入手でき、長鎖形ｃＤＮＡの特異的３′セグメントはGenbank受託Ｎｏ．Ｓ６６４０７で入手できる。
Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（ＥＣ）をコードするｃＤＮＡセグメントの末端は下記のように修飾した：Ｆｌｔ４  ｃＤＮＡ（Genbank受託Ｎｏ．Ｘ６８２０３）細胞外ドメイン配列の３′末端はプライマー１１１６（５′-ＣＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＴ-３′；配列番号９、ＳａｌＩ部位は下線部分）およびプライマー１３１５（５′-ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＣＣＴＣ-３′；配列番号１０、ＢａｍＨＩ部位は下線部分）を用いて増幅させた。プライマー１３１５の５′末端にある配列は、Ｆｌｔ４コード領域と相補的でない。プライマー１３１５のこの領域と相補的な配列の検分では、５′から３′への順序で、停止コドン、６連続ヒスチジンコドン（Ｎｉ-ＮＴＡカラム,Qiagen,Hilden,Germanyを用いた、コードされたポリペプチドのその後のクロマトグラフィー精製のため）と、付加されたＢａｍＨＩ部位を示す。増幅された断片をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断し、図３に示されたＬＴＲＦｌｔ４ベクターでユニークＳａｌＩ-ＢａｍＨＩ断片と置き換えるために用いた。置換されたＳａｌＩ-ＢａｍＨＩ断片は、Ｆｌｔ４貫膜および細胞質ドメインをコードしている。結果は修飾ＬＴＲＦｌｔ４ベクターであった。
Ｆｌｔ４シグナル配列コード領域なしの５′末端は、プライマー１３３５（５′-ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣ-３′；配列番号１１；そのプライマーは付加されたＨｉｎｄ III（ＡＡＧＣＴＴ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）制限部位を含んでいて、下線が付されている）を用いてＰＣＲにより増幅させた。Ｆｌｔ４シグナル配列をコードする領域を増幅させるために用いられた第二プライマーは、プライマー１３３２  ５′-ＧＴＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＣＡ-３′（配列番号１２であった。増幅された断片をＨｉｎｄ IIIおよびＳｐｈＩで切断した（Ｈｉｎｄ III部位（ＡＡＧＣＴＴ）はプライマー１３３５で下線部分であり、ＳｐｈＩ部位はＦｌｔ４  ｃＤＮＡの増幅領域内にある）。得られたＨｉｎｄ III-ＳｐｈＩ断片は、すぐ上に記載された修飾ＬＴＲＦｌｔ４ベクターでＨｉｎｄ III-ＳｐｈＩ断片と置き換えるために用いた（Ｈｉｎｄ  III部位はベクターのｐＬＴＲポリ部分内でＦｌｔ４インサートの５′ジャンクションにあり、ＳｐｈＩ部位はＦｌｔ４  ｃＤＮＡにある）。次いで得られたＦｌｔ４ＥＣインサートは、引用することにより本明細書の開示の一部とされるTessier et al.,Gene,98:177-183（1991）に記載されたｐＶＴＢａｃプラスミドで、ＢａｍＨＩ部位中にＢａｍＨＩ断片として連結させた。そのインサートの相対向きは、ベクターのシグナル配列コード部分のオープンリーディングフレームがＦｌｔ４コード領域配列に隣接してそれとフレーム内にあるような部分配列決定により確認した。Ｆｌｔ４ＥＣ構築物は、リポフェクション（lipofection）によりＳＦ-９細胞中にバキュロウイルスゲノムＤＮＡと一緒にトランスフェクトさせた。組換えウイルスは、当業界で標準の方法を用いて、精製し、増幅させて、High-Five細胞（Invitrogen,San Diego,CA）の感染のために用いた。Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆｌｔ４ＥＣ）は、組換えＦｌｔ４細胞外ドメインのＣＯＯＨ末端でコードされた６×Ｈｉｓタグの結合および溶出のために、製造業者の説明（Qiagen）に従いＮｉ-ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて、感染High-Five細胞の培地から精製した。
例４
ならし培地からＦｌｔ４リガンドの単離
本発明によるヒトＦｌｔ４リガンドは、７％子牛胎児血清（ＦＣＳ）含有のHam’s Ｆ-１２ Nutrient混合物（GIBCO）中でＰＣ-３前立腺がん細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４３５）によりならされた培地から単離した。細胞を供給業者の説明に従い増殖させた。ならし培地を作製するために、集密ＰＣ-３細胞を牛胎児血清（ＦＢＳ）の不在下でHam’s Ｆ-１２ Nutrient混合物（GIBCO）中で７日間培養させた。次いで培地を１０，０００ｇで２０分間の遠心により清澄化させた。次いで培地は、ｐＬＴＲＦｌｔ４ｌベクターを用いて、Ｆｌｔ４コードｃＤＮＡでトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞への暴露により、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を誘導するその能力を調べるために、スクリーニングした。レセプター刺激実験のため、サブ集密ＮＩＨ３Ｔ３細胞を０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有の無血清ＤＭＥＭ培地（GIBCO）で一夜飢餓させた。細胞をならし培地で５分間刺激し、１００μＭバナデート含有の冷ＰＢＳで２回洗浄し、レセプター免疫沈降分析用のＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％Nonidet Ｐ４０（ＢＤＨ,Poole,England）、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｕ/ml Aprotinin（Boehringer-Mannheim）、１ｍＭバナデート）中で溶解させた。溶解物を１５，０００×ｇで２０分間遠心させた。上澄を例２に記載されたＦｌｔ４  Ｃ末端に対する抗血清３μｌと共に氷上で２時間インキュベートした。引用することにより本明細書の開示の一部とされるPajusola et al.,Oncogene,8: 2931-2937（1993）も参照。
抗Ｆｌｔ４抗血清の存在下で２時間のインキュベート後にタンパク質Ａ-セファロース（Pharmacia）を加え、インキュベートを回転させながら４５分間続けた。免疫沈降物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析前に、免疫沈降緩衝液で３回および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５で２回洗浄した。ポリペプチドをニトロセルロースに移して、Ｆｌｔ４-またはホスホチロシン特異性抗血清を用いたウエスタンブロットとＥＣＬ法（Amersham Corp.）により分析した。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（抗ＰＴｙｒ；ＰＹ２０）はTransduction Laboratories（Lexington,Kentucky）から購入した。一部の場合には、フィルターをストリッピング後に第二抗体で再染色した。フィルターのストリッピングは、場合により撹拌しながら、１００ｍＭ  ２-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ６．７中５０℃で３０分間行った。
図４に示されたように、ＰＣ-３ならし培地（ＰＣ-３ＣＭ）は、Ｆｌｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞が培地の図示調製物で処理され、溶解されて、溶解物がＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよび抗ＰＴｙｒ抗体を用いた染色で追跡される抗Ｆｌｔ４抗血清と免疫沈降されたときに、１２５ｋＤポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激した。得られたバンドは、未濃縮ＰＣ-３ならし培地による刺激で弱くリン酸化された（列２）。１２５ｋＤバンドは、ペルバナデート処理細胞からの成熟Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化プロセッシング形と同時移動した（図４の列２および７の比較；図５Ａも参照）。同時移動は、図５Ａ（右側のパネル）にも示されたように、抗Ｆｌｔ４抗体での再染色で確認した。１２５ｋＤポリペプチドが抗ホスホチロシン抗体と反応性のならし培地の非特異的成分ではないことを示すために、ならし培地１５μｌをＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上にブロットし、ブロットを抗ＰＴｙｒ抗体で染色した。シグナルは得られなかった（図５Ｂ）。しかも、未ならし培地は図４の列１に示されたようにＦｌｔ４リン酸化を刺激しなかった。
図５Ｃは、未トランスフェクト（列４および５）、ＦＧＦＲ-４トランスフェクト（列８および９）およびＦｌｔ４トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞（列１〜３、６および７）でＰＣ-３ＣＭ刺激（＋）の効果の比較を示している。これらの結果は、未トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞だけでなく、ＦＧＦＲ-４でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞も、ＰＣ-３からのならし培地による刺激で約１２５ｋＤのタンパク質のチロシンリン酸化を示さなかったことを表している。ヘパリン-セファロースＣＬ-６Ｂ（Pharmacia）で前処理されたＰＣ-３ＣＭによる室温で２時間にわたる刺激の分析（列３）では、Ｆｌｔ４リガンドがヘパリンと結合しないことを示した。
図４の列３に示されているように、ＰＣ-３ならし培地がCentricon-１０濃縮器（Amicon）を用いて４倍に濃縮されたときに、刺激活性は著しく増加した。図４の列４では、ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ-４ＢにカップリングされたＦｌｔ４細胞外ドメイン（Pharmacia；Ｆｌｔ４ＥＣドメイン約１ｍｇ／セファロース樹脂ｍｌ）５０μｌで濃縮ＰＣ-３ならし培地の前処理がＦｌｔ４チロシンリン酸化を完全に消失させたことを示している。非置換セファロースＣＬ-４Ｂでならし培地の同様な前処理では、図４の列５に示されたように、刺激活性に影響を与えなかった。しかも、分子量１０，０００以下のタンパク質を含有する、濃縮後に得られたフローは、図４の列６に示されたように、Ｆｌｔ４リン酸化を刺激しなかった。
もう１つの実験において、ＬＴＲＦｌｔ４ｌを発現する形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞でＦｌｔ４自己リン酸化の比較は、未ならし培地、Ｆｌｔ４リガンドを発現するＰＣ-３細胞からの培地、またはＶＥＧＦ１６５  ５０ng/mlもしくはＰｌＧＦ-１  ５０ng/mlを含有した未ならし培地を用いて行った。細胞を溶解させ、抗Ｆｌｔ４抗血清を用いて免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。Ｆｌｔ４リガンドを発現するＰＣ-３ならし培地（列Ｆｌｔ４-Ｌ）だけがＦｌｔ４自己リン酸化を刺激した。
前記データは、Ｆｌｔ４の細胞外ドメインと結合してこのレセプターを活性化させるリガンドをＰＣ-３細胞が生産することを示している。
例５
Ｆｌｔ４リガンドの精製
例４で特徴付けられたようなヒトＰＣ-３細胞により発現されたリガンドは、アフィニティクロマトグラフィーで組換え生産Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆｌｔ４ＥＣ）を用いて精製および単離した。
全部で８ｌからなる無血清ならし培地の２回収集物を、ＰＣ-３細胞の集密層を含有した５００個の集密１５ｃｍ径培養皿から集めた。ならし培地を１０，０００×ｇで遠心により清澄化させ、製造業者の説明に従い１０ｋＤカットオフOmega限外濾過膜装備のUltrasette Tangential Flow Device（Filtron,ｍNorthborough,MA）を用いて８０倍濃縮した。組換えＦｌｔ４細胞外ドメインを組換えバキュロウイルス細胞系で発現させ、Ｎｉ-アガロース（Qiagenから得たＮｉ-ＮＴＡアフィニティカラム）でアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製された細胞外ドメインを５mg/mlの濃度でＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ-４Ｂにカップリングさせ、リガンドアフィニティクロマトグラフィー用のアフィニティマトリックスとして用いた。
濃縮ならし培地をローリングチューブ中室温で３時間にわたり組換えＦｌｔ４細胞外ドメインセファロースアフィニティマトリックス２ｍｌと共にインキュベートした。その後のすべての精製工程は＋４℃であった。次いでアフィニティマトリックスを内径１５ｍｍのカラムに移して、ＰＢＳ１００ｍｌおよび１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．８）５０ｍｌで連続洗浄した。結合物質を１００ｍＭグリシンＨＣｌで段階的に溶出させると、連続した６ｍｌ溶出液は４．０、２．４および１．９のｐＨを有していた。溶出液のいくつかの２ｍｌフラクションを１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌ含有チューブに集めた。各フラクションを直ちに混合し、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析した。各７５μｌずつを、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を刺激するそれらの能力について分析した。リガンドアフィニティクロマトグラフィー前および後における濃縮ならし培地と、洗浄中にＦｌｔ４細胞外ドメインセファロースマトリックスから放出された物質の１５倍濃縮フラクション１００μｌずつも、Ｆｌｔ４チロシンリン酸化を刺激するそれらの能力について分析した。
図６の列３に示されたように、濃縮ならし培地は、Ｆｌｔ４を過剰生産するトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞で、Ｆｌｔ４の顕著なチロシンリン酸化を誘導した。この活性は、培地が上記Ｆｌｔ４セファロースアフィニティマトリックスに曝された後に採取されたならし培地で観察されなかった（図６の列４）。特異的に結合したＦｌｔ４刺激物質は、ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．８）およびｐＨ４．０（図６の各々列５〜７）で洗浄後にアフィニティマトリックスに留まっていて、それはｐＨ２．４で最初の２つの２ｍｌずつに溶出した（列８および９）。溶出緩衝液のｐＨのそれ以上の低下は、追加Ｆｌｔ４刺激物質の放出を起こさなかった（図６の列１１）。図６の列１はＦｌｔ４発現細胞が未ならし培地で処理されたコントロールを表し、列２は１０ｋＤ分子量以下のポリペプチドを含有したならし培地の限外濾過物フラクションによるＦｌｔ４発現細胞の処理後の結果を表している。
少量ずつのクロマトグラフィーフラクションをSpeedVac濃縮器（Savant,Farmingdale,N.Y.）で濃縮し、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥと、その後で当業界の標準技術でゲルの銀染色に付した。図７で示されたように、約２３ｋＤの分子量（還元条件）を有する主要ポリペプチドは、Ｆｌｔ４刺激活性を含むフラクションで検出した（図６の列８および９に相当する）。そのポリペプチドは他のクロマトグラフィーフラクションでみられなかった。他方、これらのバンドと、３２ｋＤ移動度を有する非常に弱いバンドのほかに、２つの活性フラクションで検出されたすべての他の成分も、出発物質と、それらの濃縮後に他の洗浄および溶出工程で少量分布していた。同様の結果は３回の独立したアフィニティ精製で得られ、２３ｋＤポリペプチドがＦｌｔ４と特異的に結合して、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を誘導することを示した。
２３ｋＤポリペプチドを含むフラクションを合わせ、SpeedVac濃縮器で乾燥させ、１２．５％ゲルでＳＤＳ-ＰＡＧＥに付した。次いでそのゲルからのタンパク質をImmobilon-Ｐ（ＰＶＤＦ）トランスファー膜（Millipore,Marlborough,MA）にエレクトロブロットし、クマシーブルーＲ-２５０でブロットの染色により視覚化させた。染色された２３ｋＤバンドのみを含む領域をブロットから切り出し、Prosite Protein Sequencing System（Applied Biosystems,Foster City,CA）でＮ末端アミノ酸配列分析に付した。データは610A Data Analysis System（Applied Biosystems）を用いて分析した。分析ではＮＨ２-ＸＥＥＴＩＫＦＡＡＡＨＹＮＴＥＩＬＫ-ＣＯＯＨ（配列番号１３）の単一Ｎ末端配列を明らかにした。
例６
真核生物発現ベクターでＰＣ-３細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築
ヒトポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）（タイプIII,Collaborative Biomedical Products,Becton-Dickinson Labware,Bedford,MA）セルロースアフィニティクロマトグラフィー（Sambrook et al.,1989）を用いて、単一工程方法により、集密ＰＣ-３細胞の５つの１５ｃｍ径皿から単離した。収量は７０μｇであった。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ６μｇを、キットに入れられた説明書に従い哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩおよびInvitrogenのLibrarianキットでオリゴ（ｄＴ）プライム化ｃＤＮＡライブラリーを作るために用いた。そのライブラリーは、平均インサートサイズ１．８ｋｂの約１０６の独立した組換体を含有しているとみられた。
例７
Ｆｌｔ４リガンドアミノ末端をコードするユニークヌクレオチド配列の増幅
縮重オリゴヌクレオチドは単離されたヒトＦｌｔ４リガンドのＮ末端アミノ酸配列に基づきデザインし、ＰＣ-３  ｃＤＮＡライブラリーからのＦｌｔ４リガンドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーとして用いた。例７および８に記載された全体的計画は図９に概略で表されていて、そこでは異なるプライマーが矢印で記された。
ＰＣＲは、増幅ＰＣ-３  ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ１μｇと、等割合で存在する４８センス鎖プライマー〔そのプライマー配列は、アミノ酸残基２-６（ＥＥＴＩＫ、配列番号１５）をコードする、配列５′-ＧＣＡＧＡＲＧＡＲＡＣＮＡＴＨＡＡ-３′（配列番号１４）（ＲはＡまたはＧであり、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＨはＡ、ＣまたはＴである）から集合的になる〕および等割合で存在する３８４アンチセンス鎖プライマー〔そのアンチセンス鎖プライマーは、アミノ酸残基１４-１８（ＴＥＩＬＫ、配列番号１７）に相当する、配列５′-ＧＣＡＹＴＴＮＡＲＤＡＴＹＴＣＮＧＴ-３′（配列番号１６）（ＹはＣまたはＴであり、ＤはＡ、ＧまたはＴである）から集合的になる〕の混合物とを用いて行った。３つの余分なヌクレオチド（ＧＣＡ）は、アニーリング安定性を増加させるために、各プライマーの５′末端に加えた。２回の連続ＰＣＲランは、製造業者により供給される緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．８、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％Triton-Ｘ１００）中７２℃の伸長温度で、反応当たり１Ｕの熱安定ＤＮＡポリメラーゼDynaZyme（Ｆ-５００Ｌ、Finnzymes,Espoo,Finland）を用いて行った。１回目ＰＣＲランは、４３サイクルで行った。最初の３サイクルは３３℃のアニーリング温度で２分間ランし、残りのサイクルは４２℃で１分間ランした。
予想サイズ（５７ｂｐ）の弱いバンドを含むゲルの領域をゲルから切り出し、溶出させた。溶出された物質は、上記された同様のプライマー対を４２℃で１分間用いて、３０サイクルかけて再増幅させた。増幅された断片はＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐＣＲIIベクター（Invitrogen）中にクローニングさせ、Sangerの放射性ジデオキシヌクレオチド配列決定法を用いて配列決定した。６つのクローン分析したところ、６つすべてのクローンは予想ペプチド（Ｆｌｔ４リガンド前駆体のアミノ酸残基１０４-１２０）をコードする配列を含んでいた。コドン６の第三ヌクレオチドからコドン１３の第三ヌクレオチドまでの領域（伸長領域）にわたるヌクレオチド配列は６つすべてのクローンで同一：５′-ＡＴＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣ-３′（配列番号１８）であり、このためＦｌｔ４リガンドのアミノ末端の一部をコードするユニーク配列からの増幅産物を表していた。
例８
Ｆｌｔ４リガンドをコードするｃＤＮＡの５′末端の増幅
単離されたヒトＦｌｔ４リガンドのＮ末端をコードするユニークヌクレオチド配列に基づき、２対のネステッド（nested）プライマーを、上記ＰＣ-３  ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ１μｇから対応ｃＤＮＡの完全５′末端を２回のネステッドＰＣＲ反応で増幅させるためにデザインした。最初に、増幅は、アミノ酸残基９-１５（ＡＡＨＹＮＴＥ、配列番号２０）に相当するアンチセンス鎖プライマーである配列５′-ＴＣＮＧＴＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧ-３′（配列番号１９）から集合的になる４プライマーと、ライブラリーの構築に用いられるｐｃＤＮＡＩベクターのＴ７ＲＮＡプロモーターに相当するセンス鎖プライマー５′-ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ-３′（配列番号２１）との等混合物で行った。“タッチダウン”ＰＣＲは、引用することにより本明細書の開示の一部とされるDon et al.,Nucl.Acids Res.,19:4008（1991）に開示されたように用いた。最初の２サイクルのアニーリング温度は６２℃であり、その後アニーリング温度は５３℃の最終温度に達するまで１℃ずつ１サイクルおきに低下させ、その温度のとき更に１６サイクルを行った。アニーリング時間は１分間であり、各サイクルの伸長は７２℃で１分間行った。マルチ増幅ＤＮＡ断片を初回反応で得た。初回増幅の産物（水中１：１００希釈液１μｌ）は、Ｆｌｔ４リガンドのアミノ酸残基６-１３（ＫＦＡＡＡＨＹＮ、配列番号２３）をコードするアンチセンス鎖プライマー（５′-ＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＴ-３′；配列番号２２）と、ｐｃＤＮＡＩベクターのヌクレオチド２１７９-２１９９に相当するセンス鎖プライマー（５′-ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣ-３′（配列番号２４）からなる１対のネステッドプライマーを用いて、第二増幅反応に用いた。これらセンスおよびアンチセンスプライマーの配列は、初回ＰＣＲに用いられた対応プライマーの３′末端と重複していた。“タッチダウン”ＰＣＲは、アニーリング温度を７２℃から６６℃に下げて、６６℃で更に１８サイクル続けることにより行った。アニーリング時間は１分間であり、各サイクルの伸長は７２℃で２分間行った。約２２０ｂｐの１つの主要産物と、約２７０ｂｐ、１５０ｂｐおよび１００ｂｐの３つの副産物を得た。
約２２０ｂｐの増幅断片をアガロースゲルから切り出し、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐＣＲIIベクター中にクローニングさせて、配列決定した。３つの組換えクローンを分析したところ、それらは配列５′-ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣ-３′（配列番号２５）を含んでいた。配列の始めはｐｃＤＮＡＩベクターを表し、下線配列はｃＤＮＡインサートの５′末端の増幅産物を表す。
例９
Ｆｌｔ４リガンドをコードするｃＤＮＡの３′末端の増幅
２３ｋＤヒトＦｌｔ４リガンドのアミノ末端をコードするクローンの増幅５′配列に基づき、２対の非重複ネステッドプライマーを、Ｆｌｔ４リガンドコードｃＤＮＡクローンの３′部分を増幅させるためにデザインした。Ｆｌｔ４リガンドの増幅５′配列のヌクレオチド１５２-１６９（配列番号２５）に相当するセンス鎖プライマー５′-ＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣ-３′（配列番号２６）と、ｐｃＤＮＡＩベクターのヌクレオチド２３１１-２３２９に相当するアンチセンス鎖プライマー５′-ＴＣＴＡＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ-３′（配列番号２７）とを一次“タッチダウン”ＰＣＲに用いた。反応のアニーリング温度を２サイクル毎に１℃ずつ７２℃から５２℃に下げて、その温度で更に１５サイクルを行った。アニーリング時間は１分間であり、各サイクルの伸長は７２℃で３分間行った。いくつかのサイズのＤＮＡ断片を初回増幅で得た。それらの産物を水で１：２００希釈し、第二対のプライマー：５′-ＡＡＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣ-３′（配列番号２８）および５′-ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡ-３′（配列番号２９）（ｐｃＤＮＡＩベクターのヌクレオチド２２７９-２２９８に相当するアンチセンス鎖プライマー）を用いてＰＣＲで再増幅させた。１３５０ｂｐおよび５７０ｂｐのサイズを有する２つのＤＮＡ断片を得た。それらの断片をｐＣＲIIベクター中にクローニングし、クローンのインサートを配列決定した。これら断片の双方は、ＶＥＧＦ配列と相同的なアミノ酸配列をコードする配列を含むことがわかった。
例１０
Ｆｌｔ４リガンドｃＤＮＡの５′ＰＣＲ断片を用いるＰＣ-３細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒトＦｌｔ４リガンドｃＤＮＡの２１９ｂｐ５′末端断片は、上記５′ＰＣＲ断片と、プライマー５′-ＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＴ-３′（アンチセンス鎖プライマー、配列番号３０）および５′-ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣ-３′（配列番号３１）（ｐｃＤＮＡＩベクターのヌクレオチド２１７９-２１９９に相当するセンスプライマー）を用いたＰＣＲにより増幅させた。増幅産物をＥｃｏＲＩ（Boehringer Mannheim）切断に付して、ｐｃＤＮＡＩベクターから増幅されたＤＮＡ配列の一部を除去させ、Ｆｌｔ４リガンドの５′末端をコードする得られた１５３ｂｐ断片を、E.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer Mannheim）のKlenow断片を用いて〔３２Ｐ〕-ｄＣＴＰで標識した。その断片は増幅ＰＣ-３細胞ｃＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成スクリーニング用のプローブとして用いた。
ライブラリーのフィルターレプリカを、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt’s溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１mg/ml変性サケ精子ＤＮＡ含有の溶液中４２℃で２０時間かけて放射線標識プローブとハイブリッド形成させた。フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより室温で３０分間にわたり２回、その後６５℃で３０分間にわたり２回洗浄して、一夜曝した。
オートラジオグラフィーに基づき、プローブとハイブリッド形成する１０の陽性組換え細菌コロニーをライブラリーから選択した。プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーから精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断とアガロースゲル電気泳動、その後臭化エチジウム染色により分析した。１０のプラスミドクローンを各々約１．７、１．９および２．１ｋｂのインサートサイズの存在に基づき３つのグループに分けた。各グループからのプラスミドのインサートは、プライマーとしてＴ７オリゴヌクレオチドと、その後の配列決定反応用のウォーキングプライマーとを用いて配列決定した。
配列分析では、すべてのクローンが２３ｋＤヒトＦｌｔ４リガンドのＮＨ２末端配列をコードするオープンリーディングフレームを含んでいることを示した。ジデオキシ配列決定を、下流方向にウォーキングプライマーを用いて続けた。完全ヒトｃＤＮＡ配列と２ｋｂクローンからの推定アミノ酸配列は、配列番号３２および３３に各々示されている。“プレプロ”リーダー配列の推定開裂部位は、配列番号３３の残基１０２および１０３間に位置している。GenBank Databaseにある配列と比較したとき、このリーディングフレームの予想タンパク質産物は、図１０に示されたように、成長因子のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの予想アミノ酸配列と相同的であることがわかった。
ｐｃＤＮＡＩベクターに２．１ｋｂヒトｃＤＮＡクローンを含んだプラスミドｐＦＬＴ４-Ｌは、受託Ｎｏ．９７２３１として、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852に寄託した。
例１１
Ｆｌｔ４リガンドベクターのタンパク質産物によるＦｌｔ４自己リン酸化の刺激
配列番号３２および３３に示された配列（ヒトＶＥＧＦ-Ｃ、下記参照）をコードするオープンリーディングフレームを含んだプラスミドｐＦｌｔ４-Ｌの２．１ｂヒトｃＤＮＡインサートを、ＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いてｐｃＤＮＡＩベクターから切断し、プレパラティブアガロースゲルから単離して、ｐＲＥＰ７発現ベクター（Invitrogen）で対応部位に連結させた。ｐＦｌｔ４-Ｌインサートを含むｐＲＥＰ７ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション法（Sambrook et al,1989）を用いて、２９３ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）中にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、トランスフェクトされた細胞の培地を子牛胎児血清を欠くＤＭＥＭ培地に変え、３６時間インキュベートした。次いでならし培地を集め、５０００×ｇで２０分間遠心し、上澄をCentriprep １０（Amicon）を用いて５倍濃縮して、例４のようにＬＴＲＦｌｔ４ｌ（Ｆｌｔ４レセプター）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を刺激するために用いた。細胞を溶解させ、抗Ｆｌｔ４抗血清を用いて免疫沈降し、抗ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した。
トランスフェクトされた細胞の２枚の異なる皿からのならし培地は、Ｆｌｔ４レセプターのリン酸化のバックグラウンドレベルのみを与える偽トランスフェクト細胞からの培地と比較すると、Ｆｌｔ４自己リン酸化を刺激していた。濃縮ならし培地をセファロースにカップリングされたＦｌｔ４ＥＣドメインのスラリー２０μｌで前吸収させたとき、リン酸化は得られず、Ｆｌｔ４自己リン酸化に関与する活性が確かにＦｌｔ４リガンドであることを示した。そのため、これらの結果は、約２．１ｋｂインサートを有して、配列番号３２に示されたようなオープンリーディングフレームを含む発現ベクターが、トランスフェクト細胞で生物活性Ｆｌｔ４リガンド（ＶＥＧＦ-Ｃ）として発現されることを証明している。そのオープンリーディングフレームによりコードされた配列は配列番号３３に示されている。
配列番号３３の完全アミノ酸配列（残基１-４１９）からなるポリペプチドの推定分子量は４６，８８３である。配列番号３３のアミノ酸残基１０３-４１９からなるポリペプチドの推定分子量は３５，８８１である。ＰＣ-３培養物から精製されたＦｌｔ４リガンドは、還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより調べると、約２３ｋＤの観察分子量を有していた。このため、Ｆｌｔ４リガンドｍＲＮＡは前駆ポリペプチドに翻訳されて、そこから成熟リガンドがタンパク質分解開裂により誘導されているらしい。しかも、Ｆｌｔ４リガンドは、推定Ｆｌｔ４リガンドアミノ酸配列で確認できるコンセンサスと同じ３つの推定Ｎ連結グルコシル化部位でグルコシル化される（図１０で下線部分のＮ残基）。
Ｆｌｔ４リガンドサブユニットの予想分子量をこのファミリーの他のリガンドと比較して増加させるカルボキシル末端アミノ酸配列は、図９に概略で表されたように、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）配列を暗示するシステイン残基のスペーシングのパターンを示している（Dignam et al.,Gene,88:133-140（1990））。このような配列はＦｌｔ４リガンド前駆体に存在する独立的折り畳みドメインをコードしていて、例えばＦｌｔ４リガンドの分泌、溶解、安定性、細胞表面局在または活性の調節に関与している。面白いことに、ＢＲ３Ｐタイプの少くとも１つのシステインモチーフはＶＥＧＦカルボキシ末端アミノ酸配列にもみられる。
このため、Ｆｌｔ４リガンドｍＲＮＡは最初にプラスミドＦＬＴ４-ＬのｃＤＮＡインサートに相当するｍＲＮＡから前駆体に翻訳されて、そこから成熟リガンドがタンパク質分解開裂により誘導されるらしい。成熟Ｆｌｔ４リガンドポリペプチドを画定するために、ＣＯＳ細胞のような細胞でｃＤＮＡクローン（ｐｃＤＮＡＩ発現ベクターに入れられている）を最初に発現させる。ＶＥＧＦ相同的ドメインとＦｌｔ４リガンドのアミノおよびカルボキシル末端プロペプチドに対する抗体を作るために、コードされたポリペプチド、その断片またはＧＳＴ融合タンパク質のような細菌Ｆｌｔ４融合タンパク質に対する抗体を用いる。次いで、細胞の標識に放射性システインを用いるパルスチェイス分析、免疫沈降およびゲル電気泳動により、トランスフェクト細胞でＦｌｔ４リガンドの生合成およびプロセッシングを追跡する。プラスミドＦＬＴ４-ＬのｃＤＮＡインサートによりコードされる産物の３つのドメインに対する抗体を用いて、放射性または非放射性アミノ末端配列分析のための物質を単離する。成熟ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのアミノ末端配列の決定から、アミノ末端タンパク質分解プロセッシング部位の特定を行える。カルボキシル末端プロペプチドのアミノ末端配列の決定は、カルボキシル末端プロセッシング部位を決めさせる。これは、開裂を妨げる、その開裂部位に隣接したアミノ酸残基の部位特異的変異誘発により確認される。
Ｆｌｔ４リガンドは、タンパク質産物のカルボキシ末端切欠を起こす停止コドンを導入する、Ｆｌｔ４リガンド前駆体クローンの３′コード配列における漸進的３′欠失により更に特徴付けできる。このような端部切欠形の活性は、例えば、ＬＴＲＦｌｔ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のような細胞の培養物に適用されたときに端部切欠タンパク質により誘導されるＦｌｔ４自己リン酸化を研究することによりアッセイされる。関連血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、Heldin et al.,Growth Factors,8:245-252（1993））の構造の研究からの類推により、Ｆｌｔ４リガンドによるレセプター活性化に重要な領域が、推定１０２アミノ酸プレプロリーダーを欠く分泌ＶＥＧＦ-Ｃタンパク質の最初の約１８０アミノ酸残基（配列番号３３、残基１０３-２８２）内と、見掛け上最初の約１２０アミノ酸残基（配列番号３３、残基１０３-２２３）内に含まれていることを調べた。
他方、精製リガンドで観察された分子量とＦｌｔ４リガンドクローンのオープンリーディングフレームから求められた分子量との差異は、可溶性リガンドがＰＣ-３細胞にも存在する別なスプライスｍＲＮＡから作られて、そこから単離リガンドが誘導される、という事実に起因している。このような別なｃＤＮＡクローンを単離するために、寄託されたクローンのｃＤＮＡ断片、および用意された配列により作られたＰＣＲプライマーと、ＰＣ-３細胞ｃＤＮＡライブラリーから別なｃＤＮＡを単離または増幅する上で当業界で標準の技術を用いる。プラスミドＦＬＴ４-ＬのｃＤＮＡインサートの配列で用意されたプライマーを用いて、ＰＣ-３  ｍＲＮＡから直接、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲを用いて増幅させてもよい。別なｃＤＮＡ配列は得られたｃＤＮＡクローンから決定される。当業界で標準の方法を用いたヒトゲノムＤＮＡライブラリーからＦｌｔ４リガンドｍＲＮＡ転写物に相当するゲノムクローンを単離して、対応エクソンを現すこのようなクローンまたはそれらのサブクローニング断片を配列決定することもできる。次いで、別なエクソンは、後で特徴付けられるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのヘテロ二本鎖分析のような、当業界で標準のいくつかの方法により特定できる。
例１２
ヒト腫瘍細胞系でＶＥＧＦ-Ｃをコードする遺伝子の発現
Ｆｌｔ４リガンド（ＶＥＧＦ-Ｃ）に相当する転写物の発現は、ＨＴ１０８０およびＰＣ-３ヒト腫瘍細胞系から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含むノーザンブロットのハイブリッド形成により分析した。プローブは２．１ｋｂ  ｃＤＮＡクローンの放射線標識インサートであった（ｐＦｌｔ４-Ｌ／ＶＥＧＦ-Ｃ、比活性１０８〜１０９cpm/mgＤＮＡ）。ブロットは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ緩衝液、２％ＳＤＳ、１０×Denhardt’s溶液、１００mg/mlサケ精子ＤＮＡおよび１×１０６cpm/ml標識プローブを用いて、４２℃で一夜ハイブリッド形成させた。ブロットは、０．０５％ＳＤＳ含有の２×ＳＳＣ中室温で２×３０分間、その後０．１％ＳＤＳ含有の０．１×ＳＳＣ中５２℃で２×２０分間洗浄した。次いでブロットは増感スクリーンおよびKodak XARフィルムを用いて−７０℃で３日間暴露させた。双方の細胞系は、約２．４ｋｂのＦｌｔ４リガンドｍＲＮＡと、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡを発現した（図１２）。
例１３
ＶＥＧＦ-Ｃ鎖は生合成後にタンパク質分解でプロセッシングされ、ジスルフィド連結される
ＶＥＧＦ-Ｃオープンリーディングフレームから求められるような、分泌ヒトＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドの予想分子質量は４６，８８３ｋＤであり、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡが最初に前駆体に翻訳されて、そこから２１／２３ｋＤおよび２９／３２ｋＤのリガンドがタンパク質分解開裂により誘導されることを示唆している。
この可能性は、ＶＥＧＦ-Ｃを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞の代謝標識により調べた。初めに、２９３ＥＢＮＡ細胞をＶＥＧＦ-Ｃ構築物でトランスフェクトした。発現産物は、システインおよびメチオニンを欠く培地へPro-mixTMＬ-〔３５Ｓ〕in vitro細胞標識ミックス（３５Ｓ-メチオニンおよび３５Ｓ-システインを含有する；Amersham,Buckinghamshire,England）１００μCi/mlの添加により標識した。２時間後に細胞層をＰＢＳで２回洗浄し、その後培地をＤＭＥＭ-０．２％ＢＳＡに代えた。その後１、３、６、１２および２４時間のインキュベート後に培地を集め、遠心により清澄化し、濃縮し、ヒトＶＥＧＦ-Ｃを＋４℃で一夜かけてＦｌｔ４ＥＣ-セファロースのスラリー３０μｌに結合させ、その後ＰＢＳで３回洗浄、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄、アルキル化、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行った。アルキル化は、２５℃で１時間にわたり１０ｍＭ  １，４-ジチオスレイトール（Boehringer-Mannheim,Mannheim,Germany）、その後３０ｍＭヨードアセトアミド（Fluka,Buchs,Switzerland）でのサンプルの処理により行った。
これらの実験では、３２ｋＤ見掛け分子質量の推定前駆ポリペプチドが、偽（Ｍ）トランスフェクト細胞からではなく、ヒトＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターでトランスフェクトされた代謝標識細胞のならし培地からのＦｌｔ４ＥＣアフィニティマトリックスに結合されることを証明した（図１３Ａ）。２３ｋＤレセプター結合ポリペプチドの量は３時間の追跡中にＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト細胞の培地で次代に蓄積したが、その後はそうでなく（レーン２-４、データ示さず）、２３ｋＤ形がタンパク質分解プロセッシングにより作られて、それが少くとも一時的トランスフェクト細胞では不完全であることを示唆した。図１３Ａの矢印は、分泌されたＶＥＧＦ-Ｃの３２ｋＤおよび２３ｋＤポリペプチドを示す。その後の実験では、３２ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃ形が２９および３２ｋＤのポリペプチドとしてアルキル化の不在下で移動する２成分を含有していることを示した（図２１〜２３）。
関連実験において、４時間連続代謝標識後にＦｌｔ４ＥＣ-セファロースを用いて単離されたヒトＶＥＧＦ-Ｃを、非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（図１３Ｂ）。もっと高い分子質量形が非還元条件下で観察され、ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドがジスルフィド連結ダイマーおよび／またはマルチマーを形成できることを示唆した（図１３Ｂの矢印）。
例１４
ＶＥＧＦ-ＣによるＶＥＧＦＲ-２自己リン酸化の刺激
ヒトＶＥＧＦ-Ｃベクターでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞からのならし培地（ＣＭ）も、ＶＥＧＦＲ-２（Ｋｄｒ）を発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を刺激するために用いた。Pajusola et al.,Oncogene,9:3545-55（1994）;Waltenberger et al.,J.Biol.Chem.,269:26988-26995（1994）。細胞を溶解させ、ＶＥＧＦＲ-２特異性抗血清を用いて免疫沈降させた（Waltenberger et al.,1994）。
ＰＡＥ-ＫＤＲ細胞（Waltenberger et al.,1994）をHam’s Ｆ１２培地-１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ）で増殖させた。集密ＮＩＨ３Ｔ３-Ｆｌｔ４細胞またはＰＡＥ-ＫＤＲ細胞を、０．２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充されたＤＭＥＭまたはHam’s Ｆ１２培地で各々一夜飢餓状態にし、その後分析培地と共に５分間インキュベートした。刺激因子として機能性の組換えヒトＶＥＧＦ（R&D Systems）およびＰＤＧＦ-ＢＢをコントロールとして用いた。細胞を１００ｍＭナトリウムオルトバナデート含有の氷冷Ｔｒｉｓ緩衝液（ＴＢＳ）で２回洗浄し、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．１U/mlアプロチニンおよび１ｍＭナトリウムオルトバナデートを含有したＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。溶解物を音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間の遠心により清澄化させ、Ｆｌｔ４（Pajusola et al.,1993）、ＶＥＧＦＲ-２またはＰＤＧＦＲ-β（Claesson-Welsh et al.,J.Biol.Chem.,264:1742-1747（1989）;Waltenberger et al.,1994）に特異的な抗血清３〜５μｌと共に氷上で３〜６時間インキュベートした。免疫沈降物をタンパク質Ａ-セファロースに結合させ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭナトリウムオルトバナデートを含有したＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、７％ゲルを用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥに付した。ポリペプチドをウエスタンブロットによりニトロセルロースに移し、ＰＹ２０ホスホチロシン特異性モノクローナル抗体（Transduction Laboratories）またはレセプター特異性抗血清とＥＣＬ検出法（Amersham Corp.）を用いて分析した。
実験の結果は図１４Ａおよび１４Ｂに示されている。図１４Ａに示されるように、ＶＥＧＦＲ-２を発現するＰＡＥ細胞は、偽トランスフェクト２９３ＥＢＮＡ細胞からの１０または２倍濃縮培地（レーン１および２）、あるいは組換えＶＥＧＦ-Ｃを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞培養物からの２、５または１０倍濃縮培地（レーン３〜６）で刺激した。ＶＥＧＦＲ-２を特異的抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。比較のため、刺激は５０ng/mlの精製組換えＶＥＧＦを含有した非ならし培地で行った（レーン７および８）。レーン６および７はＦｌｔ４ＥＣで前処理されたＶＥＧＦ-ＣまたはＶＥＧＦ含有培地による刺激を示している。図１４Ｂに示されているように、ＰＤＧＦＲ-β発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、非ならし培地（レーン１）、偽トランスフェクト（レーン２）またはＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト（レーン３および４）細胞からの５倍濃縮ＣＭ、または５０ng/mlの組換えヒトＰＤＧＦ-ＢＢを含有した非ならし培地（レーン５）で刺激した。ＶＥＧＦ-Ｃを含有した培地も組換えＦｌｔ４ＥＣで前処理した（レーン４）。ＰＤＧＦＲ-βを特異的抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより分析し、その後ストリッピングして、ＰＤＧＦＲ-βに特異的な抗体で膜を再プロービングした。
再び図１４Ａに関して、ＶＥＧＦＲ-２のチロシンリン酸化の基礎レベルは偽トランスフェクト細胞からのＣＭにより刺激された細胞で検出した。この培地を更に濃縮しても、ＶＥＧＦＲ-２のリン酸化をやや高めただけであった（レーン１および２）。組換えＶＥＧＦ-Ｃを含有したＣＭはＶＥＧＦＲ-２のチロシン自己リン酸化を刺激し、自己リン酸化ポリペプチドバンドの強度はＶＥＧＦ-Ｃ  ＣＭの濃縮で増加した（レーン３〜５）。更に、刺激効果はＦｌｔ４ＥＣアフィニティマトリックスで培地の前処理後に弱まった（レーン１、５および６の比較）。このアッセイでＶＥＧＦ-Ｃの最大効果は、５０ng/mlの濃度で未ならし培地に加えられた組換えＶＥＧＦの効果に匹敵した（レーン８）。Ｆｌｔ４ＥＣによるＶＥＧＦを含有した培地の前処理は、ＶＥＧＦＲ-２に対するその刺激効果を弱めた（レーン７および８の比較）。これらの結果は、ＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターがＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）だけでなく、ＶＥＧＦＲ-２（Ｋｄｒ）についてのリガンドもコードしていることを示唆している。
ＶＥＧＦＲ-３およびＶＥＧＦＲ-２のチロシンリン酸化に対するＶＥＧＦ-Ｃの刺激効果がレセプター特異性であることを更に確認するために、我々は繊維芽細胞で豊富に発現されるＰＤＧＦレセプターβ（ＰＤＧＦＲ-β）のチロシンリン酸化に対するＶＥＧＦ-Ｃの効果を分析した。図１４Ｂからみられるように、ＰＤＧＦＲ-βの弱いチロシンリン酸化が、偽トランスフェクト細胞からのＣＭによるＦｌｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の刺激で検出された（レーン１および２の比較）。同様に低レベルのＰＤＧＦＲ-βリン酸化は、細胞がＦｌｔ４ＥＣで前処理してまたはしないでＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト細胞からのＣＭと共にインキュベートされたときに観察された。逆に、５０ng/mlのＰＤＧＦ-ＢＢの添加はＰＤＧＦＲ-βの顕著なチロシン自己リン酸化を誘導した（レーン５）。
例１５
ＶＥＧＦ-Ｃはコラーゲンゲルで内皮細胞移動を刺激する
ＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞培養物からのならし培地（ＣＭ）をコラーゲンゲルで作られたウェルに入れ、下記のように三次元コラーゲンゲルでウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞の移動を刺激させるために用いた。
ＢＣＥ細胞（Folkman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,76:5217-5221（1979））をPertovaara et al.,J.Biol.Chem.,269:6271-74（1994）に記載されたように培養した。コラーゲンゲルは、タイプＩコラーゲンストック溶液（１ｍＭ  ＨＣｌ中５mg/ml）を等容量の２×ＭＥＭおよび２倍容量の１０％新生牛血清含有ＭＥＭと混合して、１．２５mg/mlの最終コラーゲン濃度とすることにより調製した。組織培養プレート（５ｃｍ径）を約１ｍｍ厚層の溶液でコートし、それを３７℃で重合させた。ＢＣＥ細胞をこの層の上に接種した。移動アッセイのため、細胞を第一コラーゲン層の上に置かれたプラスチック環（１ｃｍ径）の内側に付着させた。３０分間後に、環を取り除き、未付着細胞を洗い落とした。コラーゲンの第二層と、０．７５％低融点寒天（FMC BioProducts,Rockland,ME）で固化された増殖培地（５％新生牛血清（ＮＣＳ））の層を加えた。ウェル（３ｍｍ径）を４ｍｍの距離で細胞スポットの両側ですべての層に穴をあけ、サンプルまたはコントロール培地をウェルに毎日ピペットで入れた。スポット端から移動した細胞の顕微鏡写真を、位相差光学素子装備のOlympus CK 2倒立顕微鏡で６日後にとった。移動細胞を蛍光色素ビスベンズイミド（１mg/ml、Hoechst 33258、Sigma）で核染色後にカウントした。
図１５は、培地の添加から６日後に、非トランスフェクト（コントロール）またはトランスフェクト（偽；ＶＥＧＦ-Ｃ；ＶＥＧＦ）細胞でならされた培地を含有するウェルの方に、元の付着部分から異なる距離で移動した細胞の数の比較を表している。元の付着環から移動した細胞の数は、蛍光顕微鏡で接眼レンズグリッドおよび１０×倍率を用いて、５つの隣接０．５ｍｍ×０．５ｍｍ四方でカウントした。０．５ｍｍ以上移動した細胞は、０．５ｍｍステップでグリッドを移動させることにより、同様にカウントした。実験は同様の結果で２回行い、１実験からの中間値は標準誤差棒で示されている。カラムからわかるように、ＶＥＧＦ-Ｃ含有ＣＭは、非トランスフェクトまたは偽トランスフェクト細胞でならされた培地よりも細胞移動を刺激したが、ＶＥＧＦ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの培地ほどではなかった。ウェル中へＦＧＦ２  １ｎｇの毎日の添加は、ＶＥＧＦトランスフェクト細胞からの培地による刺激と比較したとき、約２倍の細胞数を移動させた。
例１６
ＶＥＧＦ-Ｃは多数の組織で発現される
多数のヒト組織からの単離ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを含有したノーザンブロット（Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CAからのブロット）を２．１ｋｂ  ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡクローンの放射線標識インサートでブロービングした。ノーザンブロットおよびハイブリッド形成分析では、２．４ｋｂ  ＲＮＡとそれより少量の２．０ｋｂ  ｍＲＮＡが多数のヒト組織で、最も顕著には心臓、胎盤、筋肉、卵巣および小腸で発現されることを示した（図１６Ａ）。ＶＥＧＦ-Ｃ  ＲＮＡは脳、肝臓または胸腺でほとんどみられず、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は陰性のようであった。ヒト胎児組織からのＲＮＡの同様な分析（図１６Ｂ）では、ＶＥＧＦ-Ｃが腎臓および肺臓では高度に、肝臓ではそれより少ない程度で発現されるが、発現が脳では本質的に検出されないことを示している。面白いことに、ＶＥＧＦ発現はこれらの組織でＶＥＧＦ-Ｃ発現と相関しているが、ＶＥＧＦ-Ｂは分析されたすべての組織で高度に発現される。
例１７
ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子は染色体４ｑ３４に局在している
１または２つのヒト染色体を留めた２４の種間体細胞ハイブリッドのＤＮＡパネルをＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子の染色体位置決めに用いた（Bios Laboratories,Inc.,New Haven,CT）。プライマーは、体細胞ハイブリッドＤＮＡからＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子の約２５０ｂｐ断片を増幅させるためにデザインした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーおよび条件は、ＶＥＧＦ-Ｃについて５′-ＴＧＡＧＴＧＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧ-３′（フォワード）（配列番号３４）および５′-ＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＴ-３′（リバース）（配列番号３５）であった（９４℃、６０ｓ／６２℃、４５ｓ／７２℃、６０ｓ）。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動により調べ、紫外線で臭化エチジウム染色により視覚化させた。完全ＶＥＧＦ-Ｃコードドメインを表すプラスミドの〔α-３２Ｐ〕-ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡインサートを、供給業者（Bios Laboratories）により説明されるように、体細胞ハイブリッドＤＮＡのサザンブロットおよびハイブリッド形成分析でプローブとして用いた。
蛍光in situハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）用の細胞系はAmerican Type Culture Collection（Rockville,MD）から得た。Ｐ１クローン７６６０および７６６１（ＶＥＧＦ-Ｃ）からの精製ＤＮＡ（Genome Systems,Inc.,St.Louis,MO）は、ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡのサザンブロット、その後ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡとのハイブリッド形成により、陽性と確認した。次いでＰ１クローンは標準プロトコールに従いビオチン-１１-ｄＵＴＰ、ビオチン-１４-ＡＴＰ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）またはジゴキシゲニン-１１-ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany）でニックトランスレーションにより標識した。ＰＨＡ刺激末梢血リンパ球培養物は、Ｇ-バンド化を誘導するために、初期複製期に５-ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で処理した。Takahashi et al.,Human Genet.,86:14-16（1995）;Lemieux et al.,Cytogenet.Cell Genet.,59:311-12（1992）参照。ＦＩＳＨ操作は、周知の操作を用いて、２×ＳＳＣ中で５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストランで行った。例えば、Rytkonnen et al.,Cytogenet.Cell Genet.,68:61-63（1995）;Lichter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,85:9664-68（1988）参照。反復配列は、標識プローブと比較して５０倍過剰のＣｏｔ-１  ＤＮＡ（ＢＲＬ,Gaithersburg,MD）で抑制した。特異的ハイブリッド形成シグナルは、標識抗ジゴキシゲニン抗体中でハイブリッド形成スライドをインキュベートして、その後０．１mmol／ｌ  ４，６-ジアミノ-２-フェニルインドールで対比染色することにより検出した。２色実験でのプローブ検出は、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ジゴキシゲニン抗体（Sigma Chemical Co.）とTexasレッド-アビジン（Vector Laboratories,Burlingame,CA）、またはローダミン-抗ジゴキシゲニンとＦＩＴＣ-アビジン中でスライドをインキュベートすることにより行った。
マルチカラーデジタル画像分析は、中期染色体のハイブリッド形成シグナルの捕捉、表示および定量に用いた。そのシステムはPowerMac 7100／Ａｖワークステーションに接続されたＰＸＬカメラ（Photometrics Inc.,Tucson,AZ）を備えている。IPLabソフトウェアがカメラ操作、画像捕捉およびLudl Filterホイールをコントロールしている。少くとも５０の核を数えた。重なっている核と細胞の集塊は無視した。正常リンパ球中期スプレッドと間期核を含んだスライドも、ハイブリッド形成の効力および特異性についてコントロールするために各実験に含めた。
ヒトＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子の染色体局在を調べるために、規定組のヒト染色体を含むヒトげっ歯類体細胞ハイブリッドからのＤＮＡをＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡプローブとのサザンブロットおよびハイブリッド形成により分析した。異なるヒト染色体を表す、ハイブリッドパネルにおける２４ＤＮＡサンプルの中で、ヒト特異性シグナルはヒト染色体４を含むハイブリッドのみで観察された。その結果はＶＥＧＦ-Ｃ特異性プライマーを用いた体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲにより確認され、増幅されたバンドはヒト染色体４を含むＤＮＡのみから得られた。
ＶＥＧＦ-ＣのゲノムＰ１プラスミドは特異性プライマーおよびＰＣＲを用いて単離し、ＶＥＧＦ-Ｃ特異性ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロットおよびハイブリッド形成により確認した。ＶＥＧＦ-Ｃの染色体局在は中期ＦＩＳＨを用いて更に研究した。ＦＩＳＨでＶＥＧＦ-Ｃ用のＰ１プローブを用いると、４ｑ３４染色体バンドとの特異的ハイブリッド形成は４４のうち４０の中期で検出された。アスパルチルグルコサミニダーゼ（ＡＧＡ）遺伝子に特異的なコスミドプローブを用いた二重蛍光色素ハイブリッド形成では、ＶＥＧＦ-Ｃが４ｑ３４-３５染色体バンドに既にマッピングされたＡＧＡ遺伝子のすぐ近くに位置していることを示した。
ビオチン標識ＶＥＧＦ-Ｃ  Ｐ１およびジゴキシゲニン標識ＡＧＡコスミドプローブを中期染色体と同時にハイブリッド形成させた。この実験では、ＡＧＡ遺伝子がＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子よりもテロメア側に位置していることを証明した。前記例では、染色体マーカーとして、および正常または病的細胞でＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子領域の存在または不在について、本発明のポリヌクレオチドの有用性を証明している。４ｑ３４のＶＥＧＦ-Ｃ座は、脈管形成異常または心血管疾患を招く変異の候補標的である。
例１８
Ｃ６グリア芽腫細胞でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡレベルに対するグルコース濃度および低酸素の効果
Ｃ６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０７）の集密培養物を、ＤＭＥＭおよび５％子牛胎児血清＋抗生物質２．５ｍｌを含有した１０ｃｍ径組織培養プレートで増殖させた。培養物は、５％ＣＯ２を含有した正常細胞培養インキュベーターで正常酸素状態に、あるいは気密ガラス室に培養プレートを入れて炎が酸素の欠乏により消えるまで木材片を内部で燃やすことによる低酸素状態に１６時間暴した。ポリアデニル化ＲＮＡを（他の例のように）単離し、ＲＮＡ８μｇをＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃプローブの混合物と共に電気泳動およびブロットハイブリッド形成に付した（図１２参照）。その結果は、低酸素状態が低および高グルコース双方でＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現を強く誘導するが、ＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡレベルには有意の効果を有しないことを示している。低酸素細胞から単離されたＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡはゲル電気泳動でやや速くランし、もっと速い移動性の余分なバンドが上の方のｍＲＮＡバンドの下にみられる。この観察は、低酸素状態がＶＥＧＦ-Ｃ  ＲＮＡプロセッシングに影響を与えることを示唆している。この観察の１つの説明は、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡスプライシングが変わり、ＶＥＧＦ-Ｃオープンリーディングフレームに影響を与えて、別なＶＥＧＦ-Ｃタンパク質が低酸素細胞から生産されるようになったためである。このような別な形のＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦ-Ｃコードポリヌクレオチドも本発明の面としてみなされる。このデータは、生物学的サンプルが低酸素誘導形のＶＥＧＦ-Ｃおよび／またはＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡについてスクリーニングされる方法のように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについてのスクリーニングおよび診断有用性を示している。そのデータは、低酸素誘導形のＶＥＧＦ-Ｃまたは正常形のＶＥＧＦ-Ｃの抗体および／または他のインヒビターについての治療適応を更に示唆している。
例１９
ＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞からのＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのパルスチェイス標識および免疫沈降
ＰＡＭ１２６と称される下記ＶＥＧＦ-Ｃ分岐アミノ末端ペプチドを、抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗血清の生産のために合成した：
ＮＨ２-Ｅ-Ｅ-Ｔ-Ｉ-Ｋ-Ｆ-Ａ-Ａ-Ａ-Ｈ-Ｙ-Ｎ-Ｔ-Ｅ-Ｉ-Ｌ-Ｋ-ＣＯＯＨ（配列番号３９）
特に、ＰＡＭ１２６は、４つのペプチド酸（ＰＡ）鎖を２つの利用しうるリジン（Ｋ）残基に結合させた、分岐ポリリジン構造Ｋ３ＰＡ４として合成した。合成はＦｍｏｃ化学およびTentaGel S MAP RAM10樹脂ミックス（RAPP Polymere GmbH,Tubingen,Germany）を用いて４３３Ａ Peptide Synthesizer（Applied Biosystems）で行い、開裂性および樹脂結合双方のペプチドを得た。開裂性ペプチドは逆相ＨＰＬＣで精製して、樹脂結合ペプチドと一緒に免疫に用いた。合成産物の正しさは、質量スペクトル測定（Lasermatte）を用いて確認した。
ＰＡＭ１２６ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、Freund’sアジュバントと混合し、当業界で標準の方法を用いて隔週間隔でウサギの免疫に用いた（Harlow and Lane,Antibodies,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1988））。４回目追加免疫後に得られた抗血清を下記ようにパルスチェイス実験でＶＥＧＦ-Ｃの免疫沈降に用いた。
パルスチェイス分析では、ＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクター（即ち、上記のようにｐＲＥＰ７発現ベクター中に挿入されたＦＬＴ４-Ｌ  ｃＤＮＡ）でトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞を無メチオニン、無システイン、無血清ＤＭＥＭ培地中３７℃で３０分間インキュベートした。次いで培地を変えて、Pro-mixTM（Amersham）２００μＣｉを加えた。細胞層をこの標識培地で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地で０、１５、３０、６０、９０、１２０または１８０分間インキュベートした（追跡）。様々な追跡時間後に培地を集め、細胞を再びＰＢＳで２回洗浄して、免疫沈降緩衝液で溶解させた。ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドは、２３ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃ形のＮＨ２末端ペプチド（ＰＡＭ１２６）に対するＶＥＧＦ-Ｃ特異性抗血清を用いて、培地および免疫沈降による細胞溶解物の双方から分析した。免疫沈降ポリペプチドをＳＤＳ-ＰＡＧＥと、その後オートラジオグラフィーにより分析した。
図１９に関して、得られたオートラジオグラムでは、２時間標識直後（追跡時間０）に、ＶＥＧＦ-Ｃベクタートランスフェクト細胞が偽トランスフェクト細胞（Ｍ）でみられない放射性５５ｋＤポリペプチドバンドを含んでいたことを証明している。この５５ｋＤポリペプチドバンドは追跡時間の経過に従い強度が徐々に弱まり、１８０分間の追跡では細胞にもはや検出されない。３２ｋＤポリペプチドバンドもＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト細胞で観察される（偽トランスフェクト細胞では観察されない）。この３２ｋＤバンドは５５ｋＤバンドの場合に類似した動態で弱まる。同時に、３２ｋＤ（矢印）、その後２３ｋＤ（矢印）および１４ｋＤポリペプチドが増量しながら培地に出現している。
まとめると、パルスチェイス実験からのデータでは、５５ｋＤ細胞内ポリペプチドがプロＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを表していて、それが細胞から分泌されずに、むしろ最初に３２ｋＤ形にタンパク質分解で開裂されることを示している。３２ｋＤ形は分泌されて、同時にタンパク質分解により２３ｋＤおよび１４ｋＤ形に更にプロセッシングされる。特定の理論に制限されないが、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のプロセッシングは、シグナル配列の除去、ＣＯＯＨ末端ドメイン（ＢＲ３Ｐ）の除去、およびアミノ末端ポリペプチドの除去として生じて、ＴＥＥ…アミノ末端を有するＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドになると考えられる。
高分解能のとき、２３ｋＤポリペプチドバンドは密な間隔のポリペプチドダブレットとして現れ、開裂またはグリコシル化で不均一性を示唆している。
例２０
ＶＥＧＦ-ＣをコードするマウスおよびウズラｃＤＮＡクローンの単離
ＶＥＧＦ-Ｃのマウス変異体をクローニングするために、市販１２日マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（ラムダEXloxライブラリー,Novagen, カタログＮｏ．６９６３２-１）の約１×１０６バクテリオファージラムダクローンを、配列番号３２のヌクレオチド４９５-１６６１を含むヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡの放射線標識断片でスクリーニングした。１つの陽性クローンを単離した。
単離マウスｃＤＮＡクローンのインサートの１３２３ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片をｐBluescriptＳＫ＋ベクター（Stratagene）の対応部位中にサブクローニングして、配列決定した。このクローンのｃＤＮＡ配列はここで報告されたヒトＶＥＧＦ-Ｃ配列と相同的であったが、ヒトクローンに存在する約７１０ｂｐの５′末端配列はマウスクローンに存在していなかった。
更にマウスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために、マウスｃＤＮＡクローンのコード領域からの８８１ｂｐのＨｉｎｄ III-ＢｓｔＸＩ（ＨｉｎｄIII部位はｐBluescriptＳＫ＋ポリリンカーからきている）断片を放射線標識して、２つの追加マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして用いた。成熟マウス心臓ＺＡＰ II ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene、カタログＮｏ．９３６３０６）から２つの追加ｃＤＮＡクローンを同定した。３つの追加クローンもλｇｔ１１中マウス心臓５′-ストレッチ-プラスｃＤＮＡライブラリー（Clontech Laboratories,Inc.、カタログＮｏ．ＭＬ５００２ｂ）から単離した。後の３つのクローンのうち１つは、約１．９ｋｂのインサートを含むことがわかった。このｃＤＮＡクローンのインサートをｐBluescriptＳＫ＋ベクターのＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングし、このクローンの両鎖を完全に配列決定して、配列番号４０および４１に示されたヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を得た。
配列番号４１に相当するポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦ-Ｃプレプロペプチドのプロセッシングと同様にして、成熟マウスＶＥＧＦ-Ｃタンパク質にプロセッシングされると考えられる。マウスタンパク質の推定開裂部位は、ヒトＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドについて開裂部位の特定のために上記された操作を用いて特定する。
上記結果は、ＶＥＧＦ-Ｃの他の非ヒト哺乳動物変異体をコードするポリヌクレオチドを同定および単離する上で、本発明のポリヌクレオチドの有用性を証明している。このように同定および単離されたポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ-Ｃの非ヒト哺乳動物変異体に相当する組換えポリペプチドを生産するために（前記例に記載された場合と同様の操作を用いて）発現させることができる。
マウスおよびヒトＶＥＧＦ-Ｃ配列は、ウズラｃＤＮＡライブラリーからウズラＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを単離するためのプローブをデザインするために用いた。配列番号３２のヌクレオチド４９５-１６７０を含んでなるヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡの断片をＰＣＲ増幅により得て、製造業者の説明に従いａｐＣＲIIベクター（Invitrogen）中にクローニングして、増幅させた。インサートをＥｃｏＲＩ切断およびプレパラティブゲル電気泳動により単離し、その後放射性ｄＣＴＰおよびランダムプライミングを用いて標識した。次いでｐｃＤＮＡ-１ベクター（Invitrogen）でＥ-４期のウズラ胚から作られたｃＤＮＡライブラリーを、このプローブを用いてスクリーニングした。約２００，０００のコロニーをプレーティングし、フィルターレプリカを放射性プローブとハイブリッド形成させた。９つの陽性クローンを特定して、二次プレーティングした。９つのうち２つのクローンが二次スクリーニングでハイブリッド形成した。精製されたクローン（クローン１および１４）は約２．７ｋｂ  ＥｃｏＲＩインサートを有していた。双方のクローンを増幅させ、その後Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて（ベクターにアニーリングさせて）配列決定した。加えて、内部ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をベクターのＴ７プライマー側から１．９ｋｂに特定して、５′-および３′-ＳｐｈＩ断片のサブクローニングと、その後でサブクローンのＳｐｈＩ末端からの配列決定のために用いた。得られた配列は双方のクローンで同一であり、ヒトＶＥＧＦ-Ｃコード領域と高度の類似性を示した。次いでウォーキングプライマーを両方向に作り、二本鎖配列決定を、全鎖長オープンリーディングフレームを含めて、１７４３塩基対について終えた。
得られたｃＤＮＡ配列は、長鎖オープンリーディングフレームと５′未翻訳領域を含んでいる。ウズラｃＤＮＡのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、配列番号５２および５３に各々示されている。図８に示されたように、ヒト、マウスおよびトリ（ウズラ）ＶＥＧＦ-Ｃ前駆アミノ酸配列は有意の保存度を共有している。この高度のホモロジーによれば、プローブとして本発明のポリヌクレオチドを用い、ここに記載されたような標準分子生物学技術を用いて、他の種、特に脊椎動物種、更に詳しくは哺乳動物およびトリ種からのＶＥＧＦ-Ｃコード配列の単離を行える。
例２１
組換えＶＥＧＦ-ＣのＮ末端ペプチド配列分析
ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ（例１３参照）でトランスフェクトされた細胞（２９３ＥＢＮＡ）は、いくつかの形の組換えＶＥＧＦ-Ｃを分泌する（図２１Ａ、列ＩＰ）。アルキル化の不在下で、３つの主要タンパク質分解プロセッシング形のＶＥＧＦ-Ｃは、３２／２９ｋＤ（ダブレット）、２１ｋＤおよび１５ｋＤの見掛け分子質量のタンパク質としてＳＤＳ-ＰＡＧＥで移動する。２つの副ポリペプチドは、各々約６３および５２ｋＤの分子質量を示す。これらのポリペプチドのうち１つはおそらくグリコシル化および非プロセッシング形であり、他のポリペプチドはおそらくグリコシル化および部分的プロセッシングされている。
ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のタンパク質分解開裂の部位を決定するために、イムノアフィニティカラムを用いて、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞のならし培地からＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを精製した。イムノアフィニティカラムを作るために、ウサギを配列番号３３のアミノ酸１０４-１２０に相当する合成ペプチド：Ｈ２Ｎ-ＥＥＴＩＫＦＡＡＡＨＹＮＴＥＩＬＫ（例１９のＰＡＭ１２６参照）で免疫した。ＩｇＧフラクションは、タンパク質Ａ-セファロース（Pharmacia）を用いて、免疫ウサギの血清から単離した。単離されたＩｇＧフラクションは、５ｍｇ  ＩｇＧ／ｍｌセファロースの濃度で標準技術を用いてＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ-４Ｂ（Pharmacia）に共有結合させた。このイムノアフィニティマトリックスは、プロセッシングされたＶＥＧＦ-Ｃをならし培地（ＣＭ）１．２ｌから単離するために用いた。
カラムから溶出した精製物質をゲル電気泳動およびウエスタンブロットにより分析した。ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを含有するフラクションを合わせ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌに対して透析し、真空乾燥させ、Immobilon-Ｐ（ポリビニリデンジスルフィドまたはＰＶＤＦ）トランスファー膜（Millipore,Marlborough,MA）にエレクトロトランスファーさせて、Ｎ末端アミノ酸配列分析に付した。
３２ｋＤのポリペプチドバンドは２つの異なる配列：ＮＨ２-ＦＥＳＧＬＤＬＳＤＡ…およびＮＨ２-ＡＶＶＭＴＱＴＰＡＳ…（配列番号５１）を生じたが、前者はシグナルペプチドの開裂後におけるＶＥＧＦ-ＣのＮ末端部分に相当して、アミノ酸３２から始まり（配列番号３３）、後者は溶出操作中にアフィニティマトリックスの“漏出”による精製物質中に存在しているＩｇＧのκ鎖に相当する。
２９ｋＤ形のＶＥＧＦ-ＣのＮ末端ペプチド配列を得るために、ＶＥＧＦ-Ｃ変異体をコードする構築物（ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓ）を作った。特に、その構築物は分泌される前駆体のＮ末端に（即ち、配列番号３３でアミノ酸３１および３３間に）６ｘＨｉｓタグを融合させたＶＥＧＦ-Ｃ変異体をコードしていた。３２位のフェニルアラニンは、ＶＥＧＦ-Ｃの分泌中にタグ配列で生じうる開裂を妨げるために除去した。ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓ構築物をベクターとしてｐＲＥＰ７中にクローニングしたが、その構築法は下記例２８で更に詳しく記載されている。
リン酸カルシウム同時沈降技術を用いて、ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓを２９３ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトさせた。細胞を１５ｃｍ細胞培養皿（全部で２５枚）内のＤＭＥＭ／１０％子牛胎児血清中でインキュベートした。翌日、細胞は同培地を含有する新鮮培養皿（７５枚）中に再接種して、４８時間インキュベートした。次いで細胞層をＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳを欠くＤＭＥＭ培地を加えた。細胞をこの培地で４８時間インキュベートし、培地を集め、５０００×ｇで遠心により清澄化させ、例５に前記されたようにUltrasette Tangential Flow Device（Filtron,Northborough,MA）を用いて５００×濃縮した。ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓは、イミダゾール含有緩衝液を用いる天然タンパク質精製のための製造業者プロトコールとTALONTM Metal Affinity Resin（Clontech Laboratories,Inc.）を用いて、濃縮ならし培地から精製した。タンパク質は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２００ｍＭイミダゾールを含有した溶液で溶出させた。精製ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓを含有した溶出フラクションは、Antiserum ８８２（ＰＡＭ１２６ポリペプチドで免疫されたウサギ８８２からの抗血清）で免疫ブロットすることにより検出した。ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓを含有した溶出フラクションを合わせ、透析して、真空乾燥させた。図２７でみられるように、この形のＶＥＧＦ-ＣのＮ末端で６ｘＨｉｓタグの存在のために、ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓの主要ダブレットの上方の成分は３２ｋＤの野生型ＶＥＧＦ-Ｃよりもやや遅く移動し、それによりＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いた２９ｋＤバンドからＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓ３２ｋＤ変異体の分離を改善している。精製ＶＥＧＦ-Ｃ約１５μｇを還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥに付し、Immobilon-Ｐ（ＰＶＤＦ）トランスファー膜（Millipore,Inc.,arlborough,MA）にエレクトロトランスファーさせて、２９ｋＤのバンドをＮ末端アミノ酸配列分析に付した。この配列分析では、ＶＥＧＦ-Ｃのアミノ酸２２８-２３２（配列番号３３）に相当するＨ２Ｎ-ＳＬＰＡＴ…のＮ末端配列を現した。
２１ｋＤのポリペプチドバンドは、配列番号３３のアミノ酸１１２で始まるアミノ末端に相当する配列Ｈ２Ｎ-ＡＨＹＮＴＥＩＬＫＳ…を生じた。このため、トランスフェクト２９３ＥＢＮＡ細胞により生産される２１ｋＤ形のＶＥＧＦ-Ｃを作るタンパク質分解プロセッシング部位は、ＰＣ-３細胞により分泌される２３ｋＤ形のＶＥＧＦ-Ｃを作る開裂部位の９アミノ酸残基下流に見掛け上生じている。
１５ｋＤ形のＮ末端は３２ｋＤ形のＮ末端（ＮＨ２-ＦＥＳＧＬＤＬＳＤＡ…）と同一であった。１５ｋＤ形は、組換えＶＥＧＦ-ＣがＣＯＳ細胞により生産されたときに検出されなかった。これは、この形の生産が細胞系統特異性であることを示唆している。
例２２
ダイマーおよびモノマー形のＶＥＧＦ-Ｃ
ＶＥＧＦ-Ｃダイマーの組成を下記のように分析した。例１１に記載されたようにｐＲＥＰ７  ＶＥＧＦ-Ｃベクターでトランスフェクトされた細胞（２９３ＥＢＮＡ細胞）を、１００μCi/mlの最終濃度までPro-mix Ｌ-〔３５Ｓ〕標識ミックス（Amersham Corp.）で代謝標識させた。
並行して、“Ｒ１０２Ｓ”と称されるＶＥＧＦ-Ｃ変異体を作製および分析した。ＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２ＳをコードするＤＮＡを作るために、配列番号３３の１０２位にあるアルギニンコドンをセリンコドンで置き換えた。このＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２ＳコードＤＮＡをｐＲＥＰ７ベクターで２９３ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトさせ、上記のように発現させた。ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドは、抗血清８８２（配列番号３３の残基１０４-１２０に相当するポリペプチドで免疫されたウサギの免疫により得られた（前例参照））および抗血清９０５（プレプロＶＥＧＦ-Ｃリーダーの一部に相当するポリペプチド：Ｈ２Ｎ-ＥＳＧＬＤＬＳＤＡＥＰＤＡＧＥＡＴＡＹＡＳＫ（配列番号３３の残基３３-５４）で免疫されたウサギの免疫により得られた）を用いて免疫沈降させた。
各細胞培養物からの免疫沈降物を非還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥに付した（図２１Ｂ）。バンド１〜６をゲルから切り出し、２００ｍＭ  β-メルカプトエタノールを含有した１×ゲル担持緩衝液に３０分間浸漬させ、変性条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥに付した（図２１Ａおよび２１Ｃ、列１〜６）。
図２１Ａ-Ｃからみられるように、各高分子量形のＶＥＧＦ-Ｃ（図２１Ｂ、バンド１〜４）はジスルフィド結合により結合された少くとも２つのモノマーからなる（還元ゲルで、図２１Ａおよび２１Ｃ、列１〜４の比較）。バンド１〜３の主成分は３２／２９ｋＤのダブレットであり、双方のタンパク質は等モル比で存在している。２１ｋＤ形の主フラクションはモノマーとして、またはジスルフィド結合以外の手段で連結されたホモダイマーとして分泌される（図２１Ａ-Ｃのバンド６および列６）。
Ｒ１０２Ｓ変異では、配列番号３３で１００位のアスパラギン残基にＮ連結グリコシル化のための追加部位をＶＥＧＦ-Ｃで作る。この追加グリコシル化部位のグリコシル化は、図２１Ａ-Ｃおよび図２２Ａ-Ｂで確認されるように、その部位を含んだポリペプチドの見掛け分子量を増加させる。追加グリコシル化は、ＶＥＧＦ-Ｃに相当する類似一次構造のポリペプチドと比較したとき、追加グリコシル化を含んだＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２Ｓの形の移動度を低下させる。図２１Ａ-Ｃおよび図２２Ａ-Ｂでは、ｗｔＶＥＧＦ-Ｃの３２ｋＤおよび１５ｋＤ形に相当するＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２Ｓポリペプチドが増大した見掛け分子量を示して、これらポリペプチドの各々が新たに導入されたグリコシル化部位を含んでいることを現している。特に、ＶＥＧＦ-Ｃの１５ｋＤポリペプチドに相当するＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２Ｓポリペプチドは野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ-Ｃの２１ｋＤ形とゲル上で同時移動して、より大きな見掛け分子量に相当する位置へのゲル上でのシフトを反映している（図２１Ａおよび２１Ｃで列４の比較）。
関連実験では、“Ｒ２２６，２２７Ｓ”と称されるもう１つのＶＥＧＦ-Ｃ変異体を作製および分析した。ＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ２２６，２２７ＳをコードするＤＮＡを作製するために、配列番号３３の２２６および２２７位にあるアルギニンコドンを部位特異的変異誘発でセリンコドンと置き換えた。得られたＤＮＡを前記のように２９３ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトし、ＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ１０２Ｓについて記載されたのと同様の条件下で発現および分析した。ＶＥＧＦ-Ｃ-Ｒ２２６，２２７Ｓを発現する細胞からのならし培地では、３２ｋＤ形のＶＥＧＦ-Ｃが検出されなかった。これらの結果は、野生型ＶＥＧＦ-ＣのＣ末端開裂部位が配列番号３３の残基２２６および２２７に隣接していて、アルギニンからセリンへの変異により壊されることを示している。再び、そのダブレットの２９ｋ成分の移動度は未変化であった（図２２Ａ-Ｂ）。
一緒にしてみると、これらのデータは、プロセッシングされたＶＥＧＦ-Ｃの主要形が、配列番号３３のアミノ酸２２８から始まる２９ｋＤのポリペプチド（２）とジスルフィド結合により結合されたプレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃのアミノ酸３２-２２７（配列番号３３のアミノ酸３２-２２７）を含む３２ｋＤのポリペプチド（１）からなるヘテロダイマーであることを示している。これらのデータは、抗血清８８２および抗血清９０５を用いた免疫沈降標識ＶＥＧＦ-Ｃ形のパターンの比較によっても支持される。
ＶＥＧＦ-Ｃ免疫沈降がならし培地を用いて行われたとき、双方の抗血清（８８２および９０５）はＶＥＧＦ-Ｃの３種主要プロセッシング形（３２／２９ｋＤ、２１ｋＤおよび１５ｋＤ）の一部または全部を認識した。ならし培地を１０ｍＭジチオスレイトールの存在下室温で２時間のインキュベートと、その後で２５ｍＭヨードアセトアミドと室温で２０分間の追加インキュベートにより還元させたときには、いずれの抗体も２９ｋＤ成分を沈降させなかったが、抗体８８２は３２ｋＤ、２１ｋＤおよび１５ｋＤのポリペプチドをなお認識した。これらの結果は、抗血清８８２に含まれる抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド抗原の性質と一致し、そのオリゴペプチドは配列番号３３のアミノ酸残基１０４-１２０を含んでいる。他方、抗血清９０５は３２ｋＤおよび１５ｋＤポリペプチドのみを認識したが、それらは抗血清９０５を得るために免疫で用いられるオリゴペプチドの配列（配列番号３３のアミノ酸３３-５４）を含んでいる。３２ｋＤおよび１５ｋＤ形の移動シフトを考慮すると、Ｒ１０２Ｓ変異体との免疫沈降結果は類似していた（図２３Ａ-Ｂ）。抗体９０５の特異性は、未プロセッシングポリペプチドの残基３２-１０２にわたるＮ末端プロペプチドが欠けたＶＥＧＦ-ＣΔＮ変異形を認識しなかったという事実により確認される（図２３Ｂ）。
これら実験の結果は、２１ｋＤポリペプチドが（１）他の分子形とのヘテロダイマーでみられ（図２１Ａ-Ｃおよび図２２Ａ-Ｂ参照）、（２）モノマーまたはジスルフィド結合以外の結合により保持されたホモダイマーとして分泌される（図２１Ａおよび２１Ｂ、レーン６）ことも証明している。
この例に開示された実験は、いくつかの形のＶＥＧＦ-Ｃが存在していることを証明している。様々なＶＥＧＦ-Ｃモノマーが観察され、これらのモノマーはグリコシル化のレベルおよびパターンに応じて様々である。加えて、ＶＥＧＦ-Ｃはマルチマー、例えばホモダイマーまたはヘテロダイマーとして観察された。ＶＥＧＦ-Ｃのプロセッシングは図１８に概略で示されている（ジスルフィド結合は示されていない）。すべての形のＶＥＧＦ-Ｃが本発明の範囲内にある。
例２３
マウス胚のin situハイブリッド形成
異なる細胞および組織でＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡ分布を分析するために、性交後（ｐ．ｃ．）１２．５および１４．５日マウス胚の切片を作製し、標識ＶＥＧＦ-Ｃプローブを用いてin situハイブリッド形成により分析した。組織切片のin situハイブリッド形成はVastrik et al.,J.Cell Biol.,128:1197-1208（1995）に記載されたように行った。マウスＶＥＧＦ-ＣアンチセンスＲＮＡプローブは、マウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡのヌクレオチド４９９-９７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）に相当するｃＤＮＡ断片を含んだ、直鎖化ｐBluescript II ＳＫ＋プラスミド（Stratagene Inc.,La Jolla,CA）から作製した。放射線標識ＲＮＡはＴ７ポリメラーゼおよび〔３５Ｓ〕-ＵＴＰ（Amersham）を用いて合成した。マウスＶＥＧＦ-ＢアンチセンスおよびセンスＲＮＡプローブは、Olofsson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,93:2576-2581（1996）に記載されたようにマウスＶＥＧＦ-Ｂ  ｃＤＮＡインサートを含んだ直鎖化ｐＣＲIIプラスミドから同様の手法で合成した。高厳密洗浄は、３０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および４×ＳＳＣを含有した溶液中６５℃で４５分間であった。スライドを２８日間暴し、展開して、ヘマトキシリンで染色した。比較のため、同様の切片をＶＥＧＦＲ-３プローブとハイブリッド形成させ、１２．５日ｐ．ｃ．胚もＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡについてプロービングした。
図３４Ａ-Ｄは、アンチセンス（図３４Ａ）およびセンス（図３４Ｃ-Ｄ）ＶＥＧＦ-Ｃプローブでプロービングされた１２．５日ｐ．ｃ．胚切片の暗視野（図３４Ａ-Ｃ）および明視野（図３４Ｄ）顕微鏡写真を示している。図３４Ａは副矢状切片を表していて、そこではＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡが発育中の後腎（ｍｎ）周囲にある管周辺の間葉で特に顕著である。加えて、ハイブリッド形成シグナルは発育中の椎骨（ｖｃ）間、発育中の肺臓間葉（ｌｕ）、首領域および発育中の前頭で観察された。これらシグナルの特異性は隣接切片でＶＥＧＦ-Ｂ発現との比較から明らかであり（図３４Ｂ）、そこで心筋は非常に強いシグナルを与え、それより低レベルのＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡが他のいくつかの組織で検出される。双方の遺伝子は、発育中の椎骨（ｖｃ）間、発育中の肺臓（ｌｕ）および前頭で発現されるらしい。ＶＥＧＦ-Ｃセンスプローブのハイブリッド形成では、これらの構造内で特異的発現を示さなかった（図３４Ｃ）。
図３５Ａ-Ｄは、発育中の背側大動脈および主静脈が位置している１２．５日ｐ．ｃ．マウス胚の頸部領域で、ＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦＲ-３の発現パターンの比較を示している。これは、一次リンパ管がSabin,Am.J.Anat.,9:43-91（1909）のロングスタンディング（long-standing）理論に従い静脈嚢様構造から発芽してくる部分である。図３５Ａ-Ｄからみられるように、強度のＶＥＧＦ-Ｃシグナルが、ＶＥＧＦＲ-３に陽性である（図３５Ｂおよび３５Ｄ）、発育中の静脈嚢周辺の間葉で検出される（図３５Ａおよび３５Ｃ）。
腸間膜は発育中の腸に血液を供給し、発育中のリンパ管を含んでいる。発育中の１４．５日ｐ．ｃ．腸間膜はＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡに陽性であり、ある管周囲の結合組織で特に高い発現がある（図３５Ｅ-Ｈの矢じり）。図３５Ｅにおいて、このシグナルは管内で赤血球からの光の偽陽性反射から区別されねばならない。図３５Ｆに示された隣接腸間膜ＶＥＧＦＲ-３シグナルは腸間膜の小さな毛細管から派生している。（矢じり）。したがって、ＶＥＧＦ-Ｃとそのレセプターに関するｍＲＮＡの生産にはパラクリン関係があるらしい。このデータはＶＥＧＦ-Ｃが様々な組織で発現されることを示している。更に、発現のパターンは静脈およびリンパ管発育におけるＶＥＧＦ-Ｃの役割と一致している。更に、データはＶＥＧＦ-Ｃが非ヒト動物で発現されることを現している。
例２４
胎児および成熟組織でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-ＢおよびＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡ発現の分析
脳、肺臓、肝臓および腎臓からのポリアデニル化ＲＮＡ２μｇを含有したヒト胎児組織ノーザンブロット（Clontech Inc.）を下記プローブ：ＰＣＲ増幅により得られるヒト全鎖長ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡインサート（Genbank ＡＣＣ．Ｎｏ．Ｘ９４２１６）、ヒトＶＥＧＦ-Ｂ１６７ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１-３８２、Genbank ＡＣＣ．Ｎｏ．Ｕ４８８００）；塩基対５７-６３８をカバーするヒトＶＥＧＦ  ５８１ｂｐ  ｃＤＮＡ断片（Genbank ＡＣＣ．Ｎｏ．Ｘ１５９９７）のプールとハイブリッド形成させた。ブロットは当業界で標準の技術を用いて厳密条件下で洗浄した。
性交後（ｐ．ｃ．）７、１１、１５および１７日胚からのポリアデニル化ＲＮＡ２μｇを含有したマウス胚マルチ組織ノーザンブロット（Clontech Inc.）を、マウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ断片（塩基対４９９-６５６）とハイブリッド形成させた。マウス成熟組織ノーザンブロットは、ヒトＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ１６７、ＶＥＧＦ-Ｃのプローブ、およびＶＥＧＦＲ-３  ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１-５９５、Genbank受託Ｎｏ．Ｘ６８２０３）とハイブリッド形成させた。
成熟マウス組織において、２．４ｋｂおよび２．０ｋｂ双方のｍＲＮＡシグナルが約４：１比でＶＥＧＦ-Ｃプローブで観察された。最も顕著なシグナルは肺臓および心臓ＲＮＡから得られ、腎臓、肝臓、脳および骨格筋はそれより低いレベルを有して、脾臓および精巣はほとんど目に見えないレベルを有していた。ヒト組織の場合のように、成熟マウスでのＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現は肺臓および心臓ＲＮＡで最も豊富であったが、他のサンプルではＶＥＧＦ-Ｃ発現で同調調節をそれほど示さなかった。骨格筋および心臓組織は、Olofsson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,93:2576-2581（1996）で既に報告されたように、成熟マウスから最高のＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡレベルを与えた。ＶＥＧＦＲ-３発現との比較では、ＶＥＧＦ-Ｃが発現される組織が、その同族レセプターチロシンキナーゼについてのｍＲＮＡも含んでいるが、成熟肝臓ではＶＥＧＦＲ-３  ｍＲＮＡが不釣合いに豊富であることを示した。
胚発育中におけるＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡの調節をもっと良く洞察するために、様々な妊娠期（７、１１、１５および１７日ｐ．ｃ．）のマウス胚から単離されたポリアデニル化ＲＮＡをマウスＶＥＧＦ-Ｃプローブとハイブリッド形成させた。これらの分析では、２．４ｋｂ  ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡの量が妊娠期間中ずっと比較的一定であることを示した。
例２５
培養中のヒト繊維芽細胞で血清、インターロイキン-１およびデキサメタゾンによるＶＥＧＦファミリーメンバーについてのｍＲＮＡの調節
ヒトＩＭＲ-９０繊維芽細胞を、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有したＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞を８０％集密まで増殖させ、その後ＤＭＥＭ中０．５％ＦＣＳで４８時間飢餓させた。その後、増殖培地は図２４Ａ-Ｂに示されたように、１０ng/mlインターロイキン-１（ＩＬ-１）含有または非含有、および１ｍＭデキサメタゾン含有または非含有で、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに変えた。培養プレートを示された時間にわたりこれらを添加してインキュベートし、全細胞ＲＮＡをTRIZOLキット（GIBCO-BRL）を用いて単離した。各サンプルから全ＲＮＡ約２０μｇをSambrook et al.,supra（1989）に記載されたように１．５％ホルムアルデヒド-アガロースゲルで電気泳動させた。ゲルは、ヒトＶＥＧＦクローンからの放射線標識インサートＤＮＡ（５７-６３８をカバーする５８１ｂｐ  ｃＤＮＡ、Genbank ＡＣＣ．Ｎｏ．１５９９７）およびヒトＶＥＧＦ-Ｂ１６７ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１-３８２、Genbank ＡＣＣ．Ｎｏ．Ｕ４８８００）とのノーザンブロットおよびハイブリッド形成に用いた（図２５Ｂ）。次いで、ノーザンブロットをＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡプラスミドからの放射線標識インサートでプロービングした（図２４Ａ）。プライマーは、当業者により理解されるように、ランダムプライマーの酵素伸長反応を伴う標準技術を用いて標識した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡバンドの移動度は、トランスファー前に臭化エチジウム染色ＲＮＡのＵＶ写真撮影に基づき示されている。
図２４Ａ-Ｂでみられるように、非常に低レベルのＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦが飢餓ＩＭＲ-９０細胞と１時間の刺激後の細胞により発現されている。逆に、豊富なＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡシグナルがこれらの条件下で見える。４時間の血清刺激後に、ＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの強い誘導があり、これはＩＬ-１処理サンプルで更に増大する。ＩＬ-１の効果はデキサメタゾンの存在下で弱まるようである。類似した増強パターンは８時間サンプルで維持されるが、全シグナルの徐々の下方調節が２４時間および４８時間サンプルで双方のＲＮＡについて生じる。逆に、ＶＥＧＦ-Ｂ  ｍＲＮＡレベルは一定のままであり、このためその期間中ずっと顕著な安定性を示す。その結果は、様々な障害を治療するための方法にＶＥＧＦ-Ｃおよびその断片、そのアンタゴニストと、抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗体を用いるための、指針となる努力にとり有用である。
例２６
組換えマウスＶＥＧＦ-Ｃの発現および分析
マウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを組換えタンパク質として発現させ、分泌されたタンパク質をそのレセプター結合性質について分析した。ヒトＶＥＧＦＲ-３細胞外ドメインへのマウスＶＥＧＦ-Ｃの結合は、レトロウイルス発現ベクター中のマウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＢｏｓｃ２３細胞からの培地を用いることにより研究した。
１．８ｋｂマウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを、ＳＶ４０初期プロモーター領域を含むレトロウイルス発現ベクターｐBabe-puro中にＥｃｏＲＩ断片としてクローニングさせ（Morgenstern et al.,Nucl.Acids Res.,18:3587-3595（1990））、リン酸カルシウム沈降法によりＢｏｓｃ２３パッケージング細胞系中にトランスフェクトした（Pearet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,90:8392-8396（1994））。比較のため、Ｂｏｓｃ２３細胞はｐＲＥＰ７発現ベクター中の前記ヒトＶＥＧＦ-Ｃ構築物でもトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は代謝標識前に４８時間培養した。細胞をシステインおよびメチオニンを欠くＤＭＥＭ培地に変え、４５分間のプレインキュベートおよび培地変更後に、Pro-mix Ｌ-〔３５Ｓ〕in vitro細胞標識ミックス（Amersham Corp.）を同培地中で約１２０μCi/mlの最終濃度まで加えた。６時間のインキュベート後、培地を集め、遠心により清澄化させた。
免疫沈降のため、エンプティベクターまたはマウスもしくはヒト組換えＶＥＧＦ-Ｃで各々トランスフェクトされた代謝標識Ｂｏｓｃ２３細胞からの培地１ｍｌずつを、成人ＶＥＧＦ-ＣのＮ末端１７アミノ酸オリゴヌクレオチド（Ｈ２Ｎ-ＥＥＴＩＫＦＡＡＡＨＹＮＴＥＩＬＫ）（配列番号３３、残基１０４-１２０）に対するウサギポリクローナル抗血清２μｌと共に氷上で一夜インキュベートした。その後、サンプルを穏やかに撹拌しながら４℃で４０分間にわたりタンパク質Ａ-セファロースと共にインキュベートした。次いでセファロースバンドを免疫沈降緩衝液で２回および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４で４回洗浄した。サンプルをLaemmli緩衝液中で煮沸させ、１２．５％ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分析した。
トランスフェクトおよび代謝標識された細胞の培地からのＶＥＧＦ-Ｃの免疫沈降では、１２．５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで約３０〜３２×１０３Ｍｒ（ダブレット）および２２-２３×１０３Ｍｒのバンドを現した。これらのバンドは、図３２に示されたように、非トランスフェクトまたは偽トランスフェクト細胞からのサンプルで検出されなかった（即ち、“ベクター”と記された列）。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦ-Ｃに対する抗体が対応マウスリガンドを認識することを示している。
レセプター結合実験のため、代謝標識Ｂｏｓｃ２３細胞からの培地１ｍｌずつを、セファロースに共有結合されたＶＥＧＦＲ-３細胞外ドメインと共に４℃で４時間にわたり穏やかに混合しながらインキュベートした（例３参照）。セファロースビーズを氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で４回洗浄し、サンプルをJoukov et al.,EMBO J.,15:290-298（1996）に記載されたようにゲル電気泳動で分析した。
図３２からみられるように、同様の約３０〜３２×１０３Ｍｒダブレットおよび２２〜２３×１０３Ｍｒポリペプチドバンドを、免疫沈降アッセイと比較されるように、レセプター結合アッセイで得た。このため、マウスＶＥＧＦ-ＣはヒトＶＥＧＦＲ-３と結合する。マウスＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドのやや速い移動性は、配列分析で観察された４つのアミノ酸残基差異に起因しているのかもしれない（残基Ｈ８８-Ｅ９１、図３１）。
ＶＥＧＦＲ-３自己リン酸化を誘導するマウス組換えＶＥＧＦ-Ｃの能力も調べた。ＶＥＧＦＲ-３レセプター刺激実験のため、サブ集密ＮＩＨ３Ｔ３-Ｆｌｔ４細胞（Pajusola et al.,Oncogene,9:3545-3555（1994））を０．２％ＢＳＡ含有の無血清培地で一夜飢餓させた。一般的には、細胞をＶＥＧＦ-Ｃベクタートランスフェクト細胞からのならし培地で５分間刺激し、２００μＭバナデート含有の冷ＰＢＳで３回洗浄し、免疫沈降分析のためＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。溶解物を１６０００×ｇで２５分間遠心し、得られた上澄を特異的抗血清と共に氷上で２時間インキュベートし、その後タンパク質Ａ-セファロースを用いた免疫沈降と７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥでの分析に付した。ポリペプチドをニトロセルロースに移して、Pajusola et al.,Oncogene,9:3545-3555（1994）に記載されたように、抗ホスホチロシン（Transduction Laboratories）および抗レセプター抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。フィルターストリッピングは１００ｍＭ  ２-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ６．７中５０℃で３０分間にわたり時々撹拌しながら行った。実験の結果は図３３に示されている。その結果は、マウスＶＥＧＦ-Ｃを含む培地がヒトバキュロウイルスＶＥＧＦ-Ｃまたはチロシルホスファターゼインヒビターペルバナデートと同程度までＶＥＧＦＲ-３の自己リン酸化を刺激することを証明している。
ＶＥＧＦＲ-２刺激は、０．２％ＢＳＡ含有の無血清培地で一夜飢餓状態にされたサブ集密ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞発現Ｋｄｒ（ＶＥＧＦＲ-２）（ＰＡＥ-ＶＥＧＦＲ-２）（Waltenberger et al.,J.Biol.Chem.,269:26988-95（1994））で研究した。刺激は前記のように行って、溶解物を得た。レセプター免疫沈降のため、ＶＥＧＦＲ-２の特異的抗血清（Waltenberger et al.,J.Biol.Chem.,269:26988-95（1994））を用いた。免疫沈降物を７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥでＶＥＧＦＲ-３について記載されたように分析し、その後抗ホスホチロシン抗体でウエスタンブロットに付し、フィルターをストリッピングして、それを抗ＶＥＧＦＲ-２抗体（Santa Cruz）で再プロービングした。
マウスＶＥＧＦ-ＣはＶＥＧＦＲ-３自己リン酸化の強いインデューサーであるらしく、そのレセプターの１９５×１０３Ｍｒ前駆体およびタンパク質分解開裂１２５×１０３Ｍｒチロシンキナーゼポリペプチド（Pajusola et al.,Oncogene,9:3545-3555（1994））がリン酸化される。ＶＥＧＦＲ-２刺激は最初に組換えＶＥＧＦ-Ｃを発現する細胞からの未濃縮培地で試みたが、免疫ブロット分析ではいかなるレセプター自己リン酸化も現さなかった。
マウス組換えＶＥＧＦ-ＣもヒトＶＥＧＦ-Ｃで観察されるようなＶＥＧＦＲ-２自己リン酸化を誘導できるかどうかを更に調べるために、ＶＥＧＦＲ-２を発現するＰＡＥ細胞をマウスＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターでトランスフェクトされた培養物からの１０倍濃縮培地で刺激し、自己リン酸化を分析した。比較のため、ヒト組換えＶＥＧＦ-Ｃを含有する１０倍濃縮培地（Joukov et al.,（1996））、ヒトＶＥＧＦ-Ｃバキュロウイルス感染昆虫細胞からの未濃縮培地、またはペルバナデート（チロシルホスファターゼインヒビター）で処理された細胞を用いた。図３３からみられるように、ヒトバキュロウイルスＶＥＧＦ-Ｃとペルバナデート処理に応答して、ＶＥＧＦＲ-２は顕著にリン酸化されたが、ヒトおよびマウス組換えＶＥＧＦ-Ｃは自己リン酸化の弱いおよびかすかに検出しうる増強を各々示した。アンチセンス方向にクローニングされたエンプティベクターまたはＶＥＧＦ-Ｃでトランスフェクトされた細胞培養物からの培地は、ＶＥＧＦＲ-２の自己リン酸化を誘導しなかった。したがって、マウスＶＥＧＦ-ＣはＶＥＧＦＲ-３と結合して、ＶＥＧＦＲ-２の活性化に必要な場合よりもかなり低い濃度でこのレセプターを活性化させる。それにもかかわらず、本発明には、ＶＥＧＦ-ＣとＶＥＧＦＲ-３との相互作用に加えて、ＶＥＧＦ-ＣとＶＥＧＦＲ-２との相互作用も利用するために、本発明の物質を用いる方法も包含している。
例２７
Pichia酵母で発現されるＶＥＧＦ-Ｃ  Ｅ１０４-Ｓ２１３断片は、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ-２）の自己リン酸化を刺激する
（１）推定成熟ＶＥＧＦ-Ｃアミノ末端Ｈ２Ｎ-Ｅ（１０４）ＥＴＩＫ（配列番号３３、残基１０４以下）の残基をコードする配列が酵母ＰＨＯ１シグナル配列（Invitrogen Pichia Expression Kit、カタログ＃Ｋ１７１０-０１）とフレーム内で融合されて、（２）停止コドンがアミノ酸２１３後（Ｈ２Ｎ-…ＲＣＭＳ；即ち配列番号３２のコドン２１３後）に導入された、ヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡの端部切欠形を構築した。次いで得られた端部切欠形ｃＤＮＡ構築物をPichia pastoris発現ベクターｐＨＩＬ-Ｓ１（Invitrogen）中に挿入した。クローニングのため、ＶＥＧＦ-Ｃコード配列の内部ＢｇｌII部位を、コードされたポリペプチド配列の変更なしに変異させた。
次いでこのＶＥＧＦ-Ｃ発現ベクターをPichia細胞中にトランスフェクトさせ、陽性クローンをウエスタンブロットにより培地中でＶＥＧＦ-Ｃタンパク質の発現についてスクリーニングすることにより特定した。１つの陽性クローンを５０ｍｌ培養物中で増殖させ、０〜６０時間の様々な期間にわたりメタノールで誘導させた。培地約１０μｌを、前記のようにゲル電気泳動と、その後ウエスタンブロットおよび抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗血清での検出により分析した。図２５でみられるように、約２４ｋＤポリペプチド（グリコシル化によるバンド拡散に注目）は組換えＶＥＧＦ-Ｃ構築物でトランスフェクトされた細胞の培地に蓄積するが、偽トランスフェクト細胞またはベクター単独でトランスフェクトされた細胞の培地では蓄積しない。
組換えＶＥＧＦ-Ｃタンパク質を含有した培地をCentricon ３０ｋＤカットオフ限外濾過により濃縮させ、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ-２）を発現するブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を刺激するために用いた。刺激された細胞を溶解し、ＶＥＧＦＲ特異性抗血清を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体、化学発光およびフルオログラフィーを用いてウエスタンブロットにより分析した。ＶＥＧＦＲの最大自己リン酸化についての陽性コントロールとして、１０分間にわたる細胞のバナデート（ＶＯ４）処理を用いた。図２６で示された結果からみられるように、組換えＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドを分泌するPichia培養物からの培地は、１９５ｋＤおよび１２５ｋＤのＦｌｔ４ｌポリペプチドと約２００ｋＤのＫＤＲポリペプチド双方の自己リン酸化を誘導する。他方、バナデートは、レセプターとおそらく同時沈降する他のバンドに加えて、レセプターバンドの相当なチロシルリン酸化を誘導する。
これらの結果は、アミノ酸残基１０４Ｅ-２１３Ｓ（配列番号３３、残基１０４-２１３）からなるＶＥＧＦ-ＣのＶＥＧＦ相同性ドメインが酵母で組換え生産できて、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ-２）の自己リン酸化を刺激できることを証明している。Ｆｌｔ４またはＫＤＲ自己リン酸化を刺激できる、ここに記載された断片のような組換えＶＥＧＦ-Ｃ断片は、本発明の面としてみなされ、これらの断片を用いる方法も本発明の範囲内にある。
例２８
ＶＥＧＦ-Ｃの別々にプロセッシングされた形の性質
下記オリゴヌクレオチドは、１組のＶＥＧＦ-Ｃ変異体を作るために用いた：５′-ＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧ-３′（配列番号４２）、ＶＥＧＦ-Ｃ  Ｒ１０２Ｓ（１０２位でアルギニンがセリンに変異（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３））を作製するために用いられる；
５′-ＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＴＴＧＡＧ-３′（配列番号４３）、ＶＥＧＦ-Ｃ  Ｒ１０２Ｇ（１０２位でアルギニンがグリシンに変異（配列番号３３））を作製するために用いられる；
５′-ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＣＣ-３′（配列番号４４）、ＶＥＧＦ-Ｃ  ΔＮ（アミノ酸３２-１０２に相当するＮ末端プロペプチドの欠失（配列番号３３））を作製するために用いられる；
５′-ＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡ-３′（配列番号４５）、ＶＥＧＦ-Ｃ  Ｒ２２６，２２７Ｓ（２２６および２２７位でアルギニンコドンがセリンに変異（配列番号３３））を作製するために用いられる；
５′-ＧＧＧＣＴＣＣＧＣＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＴＣＣＧＧＡＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＣＣ-３′（配列番号４６）、ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓ（この構築物は分泌される前駆体のＮ末端に６ｘＨｉｓタグを融合させたポリペプチドをコードしている（配列番号３３のアミノ酸３２））を作製するために用いられる。
前記ＶＥＧＦ-Ｃ変異体構築物の一部は、追加構築物を得るために更に修飾した。例えば、ｐＡＬＴＥＲ（Promega）中のＶＥＧＦ-Ｃ  Ｒ１０２Ｇとオリゴヌクレオチド５′-ＧＴＡＴＴＡＴＡＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＧ-３′（配列番号４７）を用いてＶＥＧＦ-Ｃ  ４Ｇを作ったが、これは４つの点変異を有するポリペプチド：Ｒ１０２Ｇ、Ａ１１０Ｇ、Ａ１１１ＧおよびＡ１１２Ｇ（１１０-１１２位でアラニンがグリセリンに変異（配列番号３３））をコードしている。これら４つの変異は、ＰＣ-３で発現されて、２９３ＥＢＮＡ細胞で組換え発現されたＶＥＧＦ-Ｃの予想開裂部位と隣接している。
もう１つの構築物はＶＥＧＦ-Ｃ  ΔＮおよびオリゴヌクレオチド５′-ＧＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧ-３′（配列番号４８）を用いて作り、ＶＥＧＦ-Ｃ  ΔＮΔＣＨｉｓを得た。この構築物は欠失Ｎ末端プロペプチド（アミノ酸３２-１０２）；欠失Ｃ末端プロペプチド（配列番号３３のアミノ酸２２６-４１９）；およびＣ末端付加６ｘＨｉｓタグを有するポリペプチドをコードしている。
すべての構築物を更にＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩで切断し、ＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩ切断ｐＲＥＰ７ベクター中にサブクローニングして、２９３ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトするために用いた。トランスフェクトから４８時間後に、その細胞を前記のようにPro-mixTMで代謝標識するか、または無血清培地で２日間飢餓させた。次いで培地を集め、次の実験に用いた。図２７Ａ-Ｂからみられるように、野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓおよびＶＥＧＦ-Ｃ  ΔＮΔＣＨｉｓは２９３ＥＢＮＡ細胞で同様のレベルまで発現された。それと同時に、ＶＥＧＦ-Ｃ  ４Ｇポリペプチドの発現は、おそらく翻訳産物のコンホメーション変化と安定性減少のせいで著しく低下した。しかしながら、上記すべてのＶＥＧＦ-Ｃ変異体がその細胞から分泌された（図２７Ａおよび２７Ｂ比較）。トランスフェクトおよび飢餓された細胞からのならし培地を５倍濃縮して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現されたＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ-３）およびＰＡＥ細胞で発現されたＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ-２）のチロシンリン酸化を刺激するそれらの能力を調べるために用いた。
図２８Ａ-Ｂでは、野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ-Ｃと３種すべての変異ポリペプチドがＶＥＧＦＲ-３のチロシンリン酸化を刺激することを示している。最も顕著な刺激は短鎖成熟ＶＥＧＦ-Ｃ  ΔＮΔＣＨｉｓによる。この変異体とＶＥＧＦ-Ｃ  ＮＨｉｓはＶＥＧＦＲ-２のチロシンリン酸化も刺激した。このため、分泌された組換えＶＥＧＦ-Ｃの主成分が３２／２９ｋＤのダイマーであるという事実にもかかわらず、ＶＥＧＦＲ-３およびＶＥＧＦＲ-２へのその結合に関与するＶＥＧＦ-Ｃの活性部分はＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のアミノ酸１０２および２２６（配列番号３３）間に位置している。ここに記載されたようなアッセイを用いた、これらＶＥＧＦ-Ｃタンパク質および変異体の結合性質と生物活性の分析および比較は、観察される主要３２／２９ｋＤおよび２１-２３ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃプロセッシング形の重要性に関するデータを与えてくれる。そのデータでは、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のアミノ酸残基１０３-２２５（配列番号３３）をコードする構築物が、ＶＥＧＦＲ-３およびＶＥＧＦＲ-２双方にとり機能性である組換えリガンドを作れることを示している。
これと前記の例からのデータは、ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドの多数の断片が生物活性を留めていることを証明している。Ｃ末端を画定する自然プロセッシング開裂により作られる配列番号３３のアミノ酸１０３-２２６（または１０３-２２７）にわたる天然ＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドは、活性であることが示された。例２７では、配列番号３３の残基１０４-２１３の断片が生物活性を留めていることを証明している。
加えて、例２１からのデータは、配列番号３３の１１２位にそのアミノ末端を有するＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドが活性を留めていることを証明している。追加実験では、配列番号３３の残基１-１１２を欠く断片が生物活性を留めていることを示した。
関連実験において、停止コドンを配列番号３３の２１４位でリジンの代わりに用いた（配列番号３２、ヌクレオチド９９１-９９３）。得られた組換えポリペプチドはなおＦｌｔ４自己リン酸化を誘導でき、配列番号３３のアミノ酸残基１１３-２１３にわたるポリペプチドが生物活性であることを示した。
ポリペプチドのＶＥＧＦファミリーのメンバーの配列比較では、配列番号３３に示されたポリペプチドのもっと小さな断片でも生物活性を留めているという指摘を与える。特に、ポリペプチドのＶＥＧＦファミリーの８つの高度に保存されたシステイン残基は進化的に重要な配列番号３３の残基１３１-２１１からの領域（図３１参照）を画定しており、したがって残基約１３１から残基約２１１にわたるポリペプチドはＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めていると予想される。事実、保存モチーフＲＣＸＸＣＣを留めたポリペプチド（例えば、配列番号３３の残基約１６１-残基約２１１を含んでなるポリペプチド）は、ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めていると考えられる。これら断片の自然コンホメーションを維持するためには、カルボキシ末端に約１〜２の追加アミノ酸とアミノ末端に１〜２またはそれ以上のアミノ酸を留めていることが好ましい。
前記考察にもかかわらず、保存システインを欠いたもっと小さな断片および／または断片変異体がＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を留めている証拠は存在する。その結果、本発明の物質および方法には、システイン残基の保存組のメンバーの存在または不在にかかわらず、ＶＥＧＦ-Ｃの少くとも１つの生物活性を留めたすべてのＶＥＧＦ-Ｃ断片および変異体を含む。
例２９
トランスジェニックマウスでヒトＫ１４ケラチンプロモーター下にあるヒトＶＥＧＦ-Ｃの発現は、皮膚でリンパ管の豊かな成長を誘導する
Ｆｌｔ４レセプターチロシンキナーゼは、リンパ管の内皮で比較的特異的に発現される。Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,92:3566-3570（1995）。更に、ＶＥＧＦ-Ｃ成長因子はＦｌｔ４レセプターを刺激し、血管のＫＤＲレセプターに対する活性はそれほど示さない（Joukov et al.,EMBO J.,15:290-298（1996）；例２６参照）。
実験は組織でＶＥＧＦ-Ｃ過剰発現の特異的効果を分析するためにトランスジェニックマウスで行った。ヒトＫ１４ケラチンプロモーターは単層偏平上皮の基底細胞で活性であり（Vassar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,86:1563-1567（1989））、組換えＶＥＧＦ-Ｃトランスジーンで発現コントロール要素として用いた。Ｋ１４ケラチンプロモーターを含むベクターは、Vassar et al.,Genes Dev.,5:714-727（1991）およびNelson et al.,J.Cell Biol.,97:244-251（1983）に記載されている。
組換えＶＥＧＦ-Ｃトランスジーンはヒト全鎖長ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ（GenBank Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ９４２１６）を用いて構築した。この配列をＸｈｏＩ／ＮｏｔＩでｐＣＩ-ｎｅｏベクター（Promega）から切り出し、オープンリーディングフレームおよび停止コドン（配列番号３２のヌクレオチド３５２-１６１１）を含んで得られる２０２７塩基対断片を単離した。次いで単離された断片はＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片を用いて末端補充反応に付した。次いでブラント化断片をＫ１４ベクターの同様に開いたＢａｍＨＩ制限部位に連結させた。得られた構築物はｐＣＩ-ｎｅｏベクターのポリリンカーに由来するＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。このＥｃｏＲＩ部位は、後で受精マウス卵母細胞中に注入させるＤＮＡ断片の切り出しを易しくするために、標準技術（ＥｃｏＲＩによる組換え中間体の部分切断後にKlenow媒介補充反応）を用いて除去した。Ｋ１４-ＶＥＧＦ-Ｃと称される得られたクローンは、図２０に示されている。
Ｋ１４プロモーター、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡおよびＫ１４ポリアデニル化シグナルを含んだクローンＫ１４  ＶＥＧＦ-ＣからのＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIII断片を単離し、ＦＶＢ-ＮＩＨマウス系の受精卵母細胞中に注入させた。注入された接合体を偽妊娠Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２Ｊハイブリッドマウスの卵管に移植した。得られた創始マウスは、プライマー５′-ＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧ-３′（配列番号４９）および５′-ＡＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＧ-３′（配列番号５０）を用いて、尾部ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によりトランスジーンの存在について分析した。加えて、尾部ＤＮＡは、ＥｃｏＲＶ切断と、その後でマウス中に注入されたＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIII断片を用いてサザンブロットに付した。３週齢に分析された仔８匹のうち２匹は陽性であって、それらの各ゲノムにトランスジーンの約４０〜５０コピーおよび４〜６コピーを有していた。
高コピー数トランスジーンのマウスは小さく、その同腹子よりも遅く発育して、食に難を有していた（即ち、乳離れしていない）。更に精査すると、腫脹した赤い口吻を示して、毛が乏しかった。特別液体食を与えたが、摂取後に上部気道および消化管の浮腫を起こし、呼吸困難を生じた。このマウスは出生から８週後に死に、組織学、免疫組織化学とin situハイブリッド形成のために直ちに処理した。
組織検査では、同腹子の皮膚と比較してみると、Ｋ１４-ＶＥＧＦ-Ｃトランスジェニックマウスの背側真皮は萎縮していて、結合組織は赤血球を欠く大きなラクナに置き換わっていたが、薄い内皮層で覆われていることを示した（図２９Ａ-Ｄの白矢印）。これらの膨張管様構造はヒトリンパ管腫でみられるものと似ていた。皮膚付属器および毛包の数は減少していた。口吻領域では、増加した数の管もみられた。したがって、基底表皮におけるＶＥＧＦ-Ｃ過剰発現は、大きな管ラクナを含めて、下層皮膚で伸びる管構造の成長を促進させることができる。これらラクナ周辺の内皮細胞はin situハイブリッド形成で豊富なＦｌｔ４  ｍＲＮＡを含んでいた（方法について例２３および３０参照）。管形態では、ＶＥＧＦ-Ｃがリンパ管の特徴を有する管の成長を刺激することを示している。他のＫ１４-ＶＥＧＦ-Ｃトランスジェニックマウスも類似した皮膚組織病状を有していた。
前記in vivoデータでは、（ｉ）ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を有するＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドおよびポリペプチド変異体と、（ii）（例えば、ＶＥＧＦ-Ｃと結合するか、またはＶＥＧＦ-Ｃ／レセプター相互作用を妨げることにより）ＶＥＧＦ-Ｃ活性を阻害する抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗体およびＶＥＧＦ-Ｃアンタゴニストの双方について有用性を示している。例えば、そのデータは、リンパ組織の成長が望まれる患者（例えば、リンパ組織が切除されて、そのためリンパ管ドレナージが処置され、腫脹を起こした、乳がんまたは他の手術後の患者；または象皮病にかかった患者）でＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドの治療有用性を示している。デールは、リンパ組織の成長阻害が望まれる症状について抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗体物質およびＶＥＧＦ-Ｃアンタゴニストの治療有用性を示している（例えば、象皮病の治療）。したがって、ＶＥＧＦ-ＣおよびＶＥＧＦ-Ｃ変異体およびアンタゴニストを投与する方法も、本発明の方法および物質として考えられる。
例３０
発育中のマウスにおけるＶＥＧＦ-ＣおよびＦｌｔ４の発現
受精後１６日妊娠マウスからの胚を準備し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンに包埋して、６μｍで切片にした。切片をシラン処理顕微鏡スライド上におき、キシレンで処理し、再水和させ、４％ＰＦＡで２０分間かけて固定し、プロテイナーゼＫ（７mg/ml;Merck,Darmstadt,Germany）により室温で５分間処理し、再び４％ＰＦＡで固定し、無水酢酸で処理し、エタノール濃度を増加させた溶液で脱水し、乾燥させて、in situハイブリッド形成に用いた。
切片のin situハイブリッド形成は記載されたように行った（Vastrik et al.,J.Cell.Biol.,128:1197-1208（1995））。マウスＶＥＧＦ-ＣアンチセンスＲＮＡプローブを直鎖化ｐBluescript II ＳＫ＋プラスミド（Stratagene Inc.）から作製したが、それはマウスＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡのヌクレオチド４９９-９７９に相当する断片を含んでいて、そこでは非コード領域およびＢＲ３ＰリピートがエキソヌクレアーゼIII処理により除去されていた。その断片をｐBluescript II ＳＫ＋のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII部位中にクローニングした。放射線標識ＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび〔３５Ｓ〕-ＵＴＰ（Amersham,Little Chalfont,UK）を用いて合成した。約２百万ｃｐｍのＶＥＧＦ-Ｃプローブをスライド１枚当たりに適用した。一夜ハイブリッド形成後、スライドを最初に２×ＳＳＣおよび２０〜３０ｍＭ  ＤＤＴで１時間にわたり５０℃で洗浄した。６５℃で３０分間にわたる４×ＳＳＣ、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５０％脱イオンホルムアミドでの高厳密洗浄による処理と、その後３７℃で３０分間のＲＮアーゼＡ処理（２０μg/ml）を続けた。高厳密洗浄を４５分間繰り返した。最後に、スライドを脱水させ、室温で３０分間乾燥させた。スライドを写真撮影用エマルジョン中に浸して、４週間暴露させた。スライドはKodak D-16現像液を用いて現像し、ヘマトキシリンで対比染色し、Permount（FisherChemical）とのせた。
Ｆｌｔ４配列のin situハイブリッド形成のため、公開された配列（Finnerty et al.,Oncogene,8:2293-98（1993））のｂｐ１-１９２をカバーするマウスＦｌｔ４  ｃＤＮＡ断片を用いて、上記プロトコールを続けたが、下記例外がある。約１百万ｃｐｍのＦｌｔ４プローブを各スライドに適用した。ハイブリッド形成後の厳密洗浄は、１×ＳＳＣおよび３０ｍＭ  ＤＴＴで１０５分間行った。
図は暗視野顕微鏡観察（図３６Ａ-Ｃ）および明視野顕微鏡観察（図３６Ｄ）でハイブリッド形成切片の顕微鏡写真を示している。写真撮影に用いられた倍率は図３６Ａ-Ｂで４×、図３６Ｃ-Ｄで１０×であった。示された横断面は頭部領域からのであり、ＶＥＧＦ-ＣおよびＦＬＴ４について示された部分は約１４切片離れていて、Ｆｌｔ４は胚で頭部側に位置している。図３６Ａ（Ｆｌｔ４プローブ）において、発育中の鼻咽腔は上部後方部分で中線にあり、図３６Ａの前方部分には出現中のフィブリサル（fibrissal）嚢をもつ口吻があり、中線には形成中の鼻腔がある。双方の側では、網膜色素が暗視野顕微鏡観察で偽陽性シグナルを出している。最も顕著なＦｌｔ４ハイブリッド形成構造は発育中のリンパおよび静脈内皮に相当するらしい。叢様内皮脈管構造が発育中の鼻咽腔粘膜の周辺にあることに注目せよ。図３６Ｂにおいて、最も顕著なシグナルは発育中の鼻甲介の後方部分から得られ、高倍率では（図３６Ｃ-Ｄ）ゆるい結合組織／形成中の軟骨周辺の内皮を示している。この構造はＶＥＧＦ-Ｃについて強いin situハイブリッド形成シグナルを出している。図３６Ｂでも、もっと弱いハイブリッド形成部分が口吻あたりにみられるが、このシグナルは外観上かなり似ている。このため、ＶＥＧＦ-Ｃの発現は発育中の鼻甲介で著しく高い。
甲介は、上皮細胞により出される粘液と温かい吸入空気の供給源として鼻生理上重要な、豊かな脈管叢で囲まれている。ＶＥＧＦ-Ｃは粘膜で甲介静脈叢の形成にとり重要であって、鼻粘液の分泌に必要な管の透過性も調節していることが示唆された。おそらく、ＶＥＧＦ-Ｃおよびその誘導体とアンタゴニストは、甲介組織および粘膜のトルゴールと、ひいては上部気道の径と、出される粘液の量および質の調節に用いられる。これらの因子は上部気道の炎症（アレルギーを含む）および感染症にとり大きな臨床的意義を有している。したがって、本発明には、鼻構造を含めた上部気道に影響を与える炎症および感染症を診断および治療する方法における、ＶＥＧＦ-Ｃ、Ｆｌｔ４およびそれらの誘導体を含めた本発明の物質の用途もある。
例３１
ヒトＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のエクソン-イントロン構成の特徴
ヒトＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のエクソン１、２および３をカバーする２つのゲノムＤＮＡクローンは、プローブとしてＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ断片を用いて、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。特に、バクテリオファージＥＭＢＬ-３ラムダのヒトゲノムライブラリー（Clontech）は、ヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡのヌクレオチド６２９-７４６（配列番号３２）に相当するＰＣＲ生成断片を用いてスクリーニングした。“ラムダ３”と称される１つの陽性クローンを特定し、インサートをｐＢＳＫIIベクター（Stratagene）中に１４ｋｂ  ＸｈｏＩ断片としてサブクローニングした。ゲノムライブラリーは、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡの５′-非コード領域からの標識１３０ｂｐ  ＮｏｔＩ-ＳａｃＩ断片でもスクリーニングした（ＮｏｔＩ部位はクローニングベクターのポリリンカーにあり、ＳａｃＩ部位は配列番号３２のヌクレオチド９２-９７に相当する）。“ラムダ５”および“ラムダ８”と称される２つの陽性クローンを得た。制限地図分析では、クローンラムダ３がエクソン２および３を含むが、クローンラムダ５がエクソン１と推定プロモーター領域を含んでいることを示した。
エクソン４、５、６および７を含む３つのゲノム断片をゲノムＶＥＧＦ-ＣＰ１プラスミドクローンからサブクローニングした。特に、ゲノムＰ１プラスミドクローン７６６０（Paavonen et al.,Circulation,93:1079-1082（1996））から精製されたＤＮＡを用いた。Ｐ１インサートＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をｐＢＳＫ IIベクター中に連結した。ヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ相同性配列を含むクローン７６６０のサブクローンは、プローブとして全鎖長ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを用いて、コロニーハイブリッド形成により同定した。残りのエクソン４〜７を含む３つの異なるゲノム断片を同定および単離した。
ゲノム構成を調べるために、クローンは制限エンドヌクレアーゼ開裂を用いてマッピングした。しかも、コード領域およびエクソン-イントロンジャンクションを部分的に配列決定した。この分析の結果は図１１および１７に表されている。すべてのイントロン-エクソン境界の配列（図１７、配列番号５７-６８）はコンセンサススプライシングシグナルと同じであった（Mount,Nucl.Acids Res.,10:459-472（1982））。エクソン５および６間のイントロンの鎖長は、ヌクレオチド配列決定により直接決定したところ、３０１ｂｐであるとわかった。エクソン２および３間のイントロンの鎖長は、制限マッピングおよびサザンハイブリッド形成により調べたところ、約１．６ｋｐであるとわかった。他のイントロンの各々は鎖長が１０ｋｂを超えていた。
同様の分析をマウスゲノムＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子について行った。マウスＶＥＧＦ-Ｃエクソン-イントロン境界の配列は、図１７と配列番号６９-８０に表されている。
制限マッピングおよび配列決定データでは、シグナル配列とＮ末端プロペプチドの第一残基がエクソン１によりコードされていることを示した。第二エクソンは、Ｎ末端プロペプチドのカルボキシ末端部分とＶＥＧＦホモロジードメインのアミノ末端とをコードしている。ＶＥＧＦホモロジードメインの最も保存された配列は、エクソン３（６つの保存システイン残基を含む）および４（２つのｃｙｓ残基を含む）に分布している。残りのエクソンは、タイプＣ-６Ｘ-Ｃ-１０Ｘ-ＣＲＣのシステインに富むモチーフ（エクソン５および７）と、シルクタンパク質に典型的なタイプＣ-６Ｘ-Ｂ-３Ｘ-Ｃ-Ｃ-Ｃの５倍反復モチーフとをコードしている。
ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子プロモーターを更に特徴付けるために、ラムダ５クローンを更に分析した。単一および二重切断とサザンハイブリッド形成との組合せを用いたこのクローンの制限マッピングでは、それが（１）推定開始ＡＴＧコドンの上流にある約５ｋｂ領域、（２）エクソン１、および（３）ＶＥＧＦ-Ｃのイントロン１の部分を含むことを示した。
エクソン１と５′および３′フランキング配列を含むクローンラムダ５の３．７ｋｂ  ＸｂａＩ断片をサブクローニングして、更に分析した。既に報告されたように、主要ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡバンドは約２．４ｋｂの位置で移動する。１２５７ｂｐのＶＥＧＦ-Ｃコード配列および３９１ｂｐ  ３′非コード配列＋約５０〜２００ｂｐのポリＡ配列から計算すると、ｍＲＮＡ開始部位は翻訳開始コドンの約５５０〜７００ｂｐ上流に位置している。
ヒトＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のプロモーターを更に特徴付けるために、翻訳開始部位の上流約１．４ｋｂを含むゲノムクローンを単離し、５′非コードｃＤＮＡ配列および推定プロモーター領域を配列決定した。得られた配列は配列番号５４に示されている。ＶＥＧＦ遺伝子で観察された場合と同様に、ＶＥＧＦ-ＣプロモーターはＧおよびＣ残基に豊み、コンセンサスＴＡＴＡおよびＣＣＡＡＴ配列を欠いている。代わりに、それはＴＡＴＡなし遺伝子の転写を開始できる偏在性核タンパク質、Ｓｐ１について、多くの推定結合部位を有している。Pugh and Tjian,Genes and Dev.,5:105-119（1991）参照。加えて、ＶＥＧＦ-Ｃ翻訳開始部位より上流の配列はＡＰ-２因子の頻出コンセンサス結合部位を含むことがわかった。これは、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼおよびタンパク質キナーゼＣが、ＡＰ-２転写因子のアクチベーターとして（Curran and Franza,Cell,55:395-397（1988））、ＶＥＧＦ-Ｃ転写調節を媒介することを示唆している。
ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子は心臓、胎盤、卵巣および小腸のような成人組織で豊富に発現され、様々な因子により誘導される。実際に、ＮＦｋＢおよびＧＡＴＡのような組織特異性遺伝子発現のレギュレーターについていくつか可能な結合部位がＶＥＧＦ-Ｃプロモーターの遠位部分に位置している。例えば、ＮＦｋＢは内皮細胞で組織因子の発現を調節することが知られている。しかも、ＧＡＴＡファミリーの転写因子は細胞型特異性遺伝子発現を調節すると考えられている。
ＶＥＧＦとは異なり、ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子は低酸素誘導性因子ＨＩＦ-１の結合部位を含んでいない（Levy et al.,J.Biol.Chem.,270:13333-13340（1995））。この発見は、ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡが低酸素により調節されるならば、そのメカニズムはｍＲＮＡ安定性の調節に主に基づくことを示唆している。これに関して、多くの研究では、ＶＥＧＦ遺伝子の低酸素誘導についての主要コントロールポイントがｍＲＮＡの定常状態レベルの調節であることを示した。Levy et al.,J.Biol.Chem.,271:2746-2753（1996）参照。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ安定および減衰の相対速度は、ｍＲＮＡ安定性を調節することが証明された、３′未翻訳領域（ＵＴＲ）で特異的配列モチーフの存在により調べられると思われる（Chen and Shyu,Mol.Cell Biol.,14:8471-8482（1994））。ＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子の３′-ＵＴＲも配列番号３２の１８７３-１８７８位にこのタイプの推定モチーフ（ＴＴＡＴＴＴ）を含んでいる。
例３２
ＶＥＧＦ-Ｃスプライス変異体の同定
例１６に報告されたように、主要２．４ｋｂ  ＶＥＧＦ-Ｃ  ｍＲＮＡとそれより少量の２．０ｋｂ  ｍＲＮＡが観察できる。これらＲＮＡの起源を明らかにするために、いくつかの追加ＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡを単離して特徴付けた。ラムダｇｔ１１ベクターでＨＴ１０８０細胞からのヒト繊維肉腫ｃＤＮＡライブラリー（Clontech，製品＃ＨＬ１０４８ｂ）を、例１０に記載されたように、プローブとして１５３ｂｐ  ヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡ断片を用いてスクリーニングした。Joukov et al.,EMBO J.,15:290-298（1996）参照。９つの陽性クローンを選別し、オリゴヌクレオチド５′-ＣＡＣＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧ-３′（配列番号５５）および５′-ＡＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＡＧ-３′（配列番号５６）を用いてＰＣＲ増幅により分析した。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド４９５-１６６１に相当するＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡの一部を増幅させるために選択した。ＰＣＲは５５℃のアニーリング温度と２５サイクルを用いて行った。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動に付した。分析された９つのうち５つのクローンは１１４７塩基対の予想鎖長のＰＣＲ断片を生じたが、１つはそれよりやや短かった。短い方の断片と予想鎖長の断片の１つをｐＣＲＴＭIIベクター（Invitrogen）中にクローニングして、配列決定により分析した。その配列では、短いＰＣＲ断片が配列番号３２のヌクレオチド９０４-１０５５に相当する１５３塩基対の欠失を有することを明らかにした。これらの欠失塩基は、図１７に概略で示された、ヒトおよびマウスＶＥＧＦ-Ｃ遺伝子のエクソン４に相当する。エクソン４の欠失は、全鎖長ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のＣ末端切欠を生じるフレームシフトを起こして、全鎖長タンパク質を発現するために用いられるフレームとは異なるフレームで１５のアミノ酸残基がエクソン５から翻訳される。このため、得られた端部切欠ポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列は--Ｌｅｕ（１８１）-Ｓｅｒ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ｈｉｓ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ（１９９）（配列番号８１）である。このスプライス変異体によりコードされるＶＥＧＦ-Ｃ変異体は、ＶＥＧＦ-Ｃ前駆体のＣ末端開裂部位を含まない。このため、保存エクソン４を欠く別な推定スプライスＤＮＡ形がＨＴ-１０８０繊維肉腫細胞で同定されたが、この形はＶＥＧＦ-Ｃのアンタゴニストである１９９アミノ酸残基のタンパク質をコードしていると予想される。
例３３
ＶＥＧＦ-Ｃはin vitroで異なる細胞培養物で同様にプロセッシングされる
ＶＥＧＦ-Ｃが異なる細胞タイプで同様にプロセッシングされるかどうかを調べるために、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＣＯＳ-１細胞およびＨＴ-１０８０細胞を野生型ヒトＶＥＧＦ-Ｃ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし、例２２に記載されたようにPro-MixTMで標識した。培養物からのならし培地を集め、抗血清８８２（例２１に記載されている；配列番号３３のアミノ酸１０４-１２０に相当するペプチドを認識する）を用いて免疫沈降に付した。免疫沈降ポリペプチドをＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。試験されたすべての細胞系から観察される分泌組換えＶＥＧＦ-Ｃの主要形は２９／３２ｋＤダブレットである。これら２つのポリペプチドは、例２２に記載されたように、ジスルフィド結合で互いに結合される。約２１ｋＤのそれほど顕著でないバンドも培地で検出した。しかも、６３ｋＤａの非プロセッシングＶＥＧＦ-Ｃ前駆体が観察された。この形はＣＯＳ-１細胞でより顕著であり、ＣＯＳ-１細胞でＶＥＧＦ-Ｃのタンパク質分解プロセッシングが２９３ＥＢＮＡ細胞の場合ほど効率的でないことを示唆した。（非トランスフェクト細胞に）内在するＶＥＧＦ-Ｃはこれらの実験条件下においてＨＴ-１０８０細胞で検出不能であったが、ＰＣ-３細胞のならし培地では容易に検出された。ＰＣ-３細胞および２９３ＥＢＮＡ細胞におけるサブユニットポリペプチドサイズおよび比率の分析では著しく類似した結果を現し、最も顕著な形は２９／３２ｋＤのダブレットであり、それほど顕著でない形は２１ｋＤポリペプチドであった。２９３ＥＢＮＡ細胞により生産された２１ｋＤ形はウエスタンブロットで８８２抗体により認識されなかったが、同抗体が免疫沈降に用いられたときには認識される（前記例のデータ参照）。例２１に報告されたように、２９３ＥＢＮＡ細胞における３２ｋＤ形の開裂は、ＰＣ-３細胞における開裂部位（残基１０２および１０３間）より下流である、アミノ酸残基１１１および１１２間（配列番号３３）で生じる。したがって、２９３ＥＢＮＡ細胞で生産された２１ｋＤ形は、抗血清８８２を作製するために用いられた完全Ｎ末端ペプチドを含んでいないのである。
関連実験において、ＰＣ-３細胞をならし培地の単離前に様々な時間（１〜８日間）にわたり無血清培地で培養した。ならし培地はCentricon装置（Amicon,Bevery,USA）を用いて濃縮し、抗血清８８２を用いてウエスタンブロット分析に付した。１日間の培養後に、顕著な３２ｋＤバンドを検出した。増量しながら、２１-２３ｋＤ形が４日間および８日間培養物からのならし培地で検出された。例５といくつかその後の例で２３ｋＤポリペプチドと単純に称される、このポリペプチドバンドの拡散性質は、ほとんどが不均一で様々な量のグリコシル化のせいらしい。これらの結果は、最初に細胞が３２ｋＤポリペプチドを分泌して、これが更に培地でプロセッシングまたは開裂されて２１-２３ｋＤ形を生じることを示している。そのため、このポリペプチドバンドのわずかな不均一性が、ＰＣ-３および２９３ＥＢＮＡ細胞培養物でアミノ末端について得られるような、様々なグリコシル化度とプロセッシング開裂部位のわずかな不均一性から生じてくる。カルボキシル末端開裂部位も様々であり、可能な開裂部位の例は残基２２５-２２６、２２６-２２７および２２７-２２８と残基２１６-２１７である。一緒にすると、これらのデータは、分泌された細胞プロテアーゼが３２ｋＤポリペプチドからＶＥＧＦ-Ｃの２１-２３ｋＤ形の生成に関与している可能性を示唆している。このようなプロテアーゼは、ＶＥＧＦ-Ｃの生産中に溶液でＶＥＧＦ-Ｃ前駆タンパク質を開裂させるためにin vitroで用いられるか、または生物活性ＶＥＧＦ-Ｃを放出させるために細胞培養物およびin vivoで用いられる。
例３４
ＶＥＧＦＲ-３およびＶＥＧＦＲ-２の細胞外ドメインによるＶＥＧＦ-Ｃ形の差異的結合
２つの並行実験において、２９３ＥＢＮＡ細胞を、組換え野生型ＶＥＧＦ-Ｃをコードする構築物またはＶＥＧＦ-Ｃ  ＤＮＤＣＨｉｓをコードする構築物（例２８）でトランスフェクトし、トランスフェクトから約４８時間後に、前記例に記載されたようにPro-MixTMで代謝標識した。培地を偽トランスフェクトおよびトランスフェクト細胞から集めて、レセプター結合分析に用いた。
レセプター結合は、約０．２μｇの（ａ）免疫グロブリン配列に融合されたＶＥＧＦＲ-３細胞外ドメインを含んでなる融合タンパク質（ＶＥＧＦＲ-３-Ｉｇ）または（ｂ）アルカリホスファターゼ配列に融合されたＶＥＧＦＲ-２細胞外ドメインを含んでなる融合タンパク質（ＶＥＧＦＲ-２-ＡＰ；Cao et al.,J.Biol.Chem.,271:3154-62（1996））を含有した結合緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０２％ Tween２０、１μg/mlヘパリン）で行った。コントロールとして、同量ずつの２９３ＥＢＮＡならし培地を２μｌの抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗血清（ＶＥＧＦ-Ｃ  ＩＰ）と混合した。
室温で２時間のインキュベート後に、抗ＶＥＧＦ-Ｃ抗体およびＶＥＧＦＲ-３-Ｉｇタンパク質をタンパク質Ａ-セファロース（ＰＡＳ）に吸着させ、ＶＥＧＦＲ-２-ＡＰを抗ＡＰモノクローナル抗体（Medix Biotech,Genzyme Diagnostics,San Carlos,CA,USA）およびタンパク質Ｇ-セファロースを用いて免疫沈降させた。ＶＥＧＦＲ-３-ＩｇまたはＶＥＧＦＲ-２-ＡＰに結合されたＶＥＧＦ-Ｃを含む複合体を結合緩衝液で３回、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、ＶＥＧＦ-Ｃ免疫沈降物をＲＩＰＡ緩衝液で３回および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、還元および非還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。コントロールとして、同培地は生じうる非特異的吸着について抑制するために抗ＡＰとタンパク質Ｇ-セファロース（ＰＧＳ）またはＰＡＳで沈降させた。
これらの実験では、ＶＥＧＦＲ-３が組換えＶＥＧＦ-Ｃの３２／２９ｋＤおよび２１-２３ｋＤ形双方と結合するが、ＶＥＧＦＲ-２がならし培地からの２１-２３ｋＤ成分と優先的に結合することを明らかにした。加えて、少量の６３ｋＤおよび５２ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃ形がＶＥＧＦＲ-３と結合して観察された。非還元条件下の追加分析では、レセプターと結合した２１-２３ｋＤ  ＶＥＧＦ-Ｃの大きな割合が鎖間ジスルフィド結合を含んでいないことを示している。これらの発見は、ＶＥＧＦ-ＣがＶＥＧＦＲ-２と結合するという結果を補強している。このデータは、ＶＥＧＦＲ-３のみに活性であるか、あるいはＶＥＧＦＲ-３およびＶＥＧＦＲ-２の双方に活性である、ＶＥＧＦ-Ｃの組換え形について有用性を示唆している。他方、これらの結果は、例２８の結果と一緒になって、３２／２９ｋＤダイマーがＶＥＧＦＲ-３と結合しても、それを活性化しない、という可能性を排除していない。ＶＥＧＦＲ-３を活性化する３２／２９ｋＤダイマーの特徴は、Ｎ-Ｈｉｓ  ＶＥＧＦ-Ｃトランスフェクト細胞からのならし培地が、たとえそのポリペプチドの発現の方がかなり高いとしても、ＶＥＧＦ-Ｃ  ＤＮＤＣＨｉｓトランスフェクト細胞からの培地ほどＶＥＧＦＲ-３の顕著なチロシンリン酸化を誘導しなかった、という発見を説明している（図２７および２８参照）。ＶＥＧＦ-Ｃレセプターと結合するが、そのレセプターを活性化しない、安定なＶＥＧＦ-Ｃポリペプチド変異体は、ＶＥＧＦ-Ｃアンタゴニストとして有用である。
生物学的物質の寄託：プラスミドＦＬＴ４-Ｌは、ブダペスト条約の規定に従いAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）,12301 Parklawn Dr.,Rockville MD 20952（ＵＳＡ）に寄託した。寄託日は１９９５年７月２４日であり、ＡＴＣＣ受託番号．９７２３１である。
本発明は特定の態様に関して記載されてきたが、変更および修正が当業者により加えうることが理解される。したがって、請求の範囲でみられるような限定のみが本発明になされるべきである。
配列表
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配列の型:核酸
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配列:SEQ ID NO:81:
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【図１】
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【図２】
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0004324709.tif 000109
【図３】
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【図４】
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【図５】
0004324709.tif 000112
【図６】
0004324709.tif 000113
【図７】
0004324709.tif 000114
【図８】
0004324709.tif 000115
【図９】
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【図１０】
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0004324709.tif 000118
0004324709.tif 000119
【図１１】
0004324709.tif 000120
【図１２】
0004324709.tif 000121
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
0004324709.tif 000142
【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
0004324709.tif 000157
【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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