(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）工程を含む工程に付することを特徴とする酵素活性を有するトランスグルタミナーゼの製造方法：
（ａ）当該変性した状態にある酵素を、ｐＨ値が３〜５にある水性媒体に希釈することにより酵素活性を有する状態への構造形成の中間構造を形成せしめるようにする工程；及び
（ｂ）前記構造形成の中間構造を形成した酵素を、前記水性媒体のｐＨ値を５．８〜８．５に変化させることにより、酵素活性を有する状態の高次構造を形成せしめるようにする工程。
【請求項２】
（ａ）工程において当該酵素の分子内のシステイン残基のチオール基が遊離形であり、水性媒体中、当該酵素が変性剤によって溶解した状態で希釈される請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）工程において、水性媒体が酵素活性を有する状態の高次構造を形成する促進剤を含有する請求の範囲１記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）工程後に、（ｃ）当該酵素のうち不活性な酵素を会合凝集物として分離する工程を含む請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
当該（ａ）工程において、１５℃以下の低温下で希釈され、希釈されたタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌ未満である請求の範囲２記載の方法。
【請求項６】
（ａ）工程において、水性媒体がタンパク質変性剤を含有する請求の範囲１記載の方法。
【請求項７】
前記構造形成の中間構造が、近紫外領域のＣＤスペクトルにおいて天然状態のトランスグルタミナーゼに対して３０〜７０％の分子楕円率を有する請求の範囲１記載の方法。
【請求項８】
変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを、ｐＨ値が３〜５にある水性媒体に溶解せしめ、その後当該酵素溶液をｐＨ５．８〜８．５に調整して酵素活性を有する状態にある酵素を生成せしめることを特徴とする酵素活性を有するトランスグルタミナーゼの製造方法。
【請求項９】
変性した状態にあるトランスグルタミナーゼをｐＨ値が３〜５にある水性媒体におくことにより得ることができ、以下の性質（ｄ）〜（ｇ）を示すことを特徴とするタンパク質：
（ｄ）ハイドロキサメート法によるトランスグルタミナーゼの活性測定により１５〜２５Ｕ／ｍｇの比活性を有し；
（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で３６，０００〜４０，０００の分子量を有し；
（ｆ）近紫外領域のＣＤスペクトルにおいて天然状態のトランスグルタミナーゼに対して３０〜７０％の分子楕円率を有し；及び
（ｇ）Ｈｉｓ−Ｍｅｓ、ｐＨ６．１の緩衝液システムで行う  ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において天然状態のトランスグルタミナーゼより遅い易動度を示す。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規トランスグルタミナーゼの製造方法、詳しくは変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを、酵素活性を有する状態にリフォールディングして、天然状態にあるものと実質的に同等の活性を有するトランスグルタミナーゼを製造する方法に関する。この方法により、変性した微生物トランスグルタミナーゼを、酵素活性を有する天然状態のものにリフォールディングすることができ、遺伝子組み換え技術を用いて生産した不活性な酵素タンパク質を、大量にかつ安価に高活性な酵素へ変換し、食品加工の分野で広く利用することが可能となる。
背景技術
トランスグルタミナーゼは、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、或いはゲル状化粧品等の製造や食肉の改質等、更にはこれらの分野以外でも広く利用されており、工業的に極めて有用な酵素である。
トランスグルタミナーゼ（ＥＣ  ２．３．２．１３；ＴＧａｓｅ）はタンパク質、又はポリペプチド鎖のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基と一級アミン間でのアシル転移反応を触媒する酵素であり、そのうち微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのｖａｒｉａｎｔ）の培養上清から見出されたトランスグルタミナーゼを微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）と称する。
ＭＴＧは３３１個のアミノ酸からなる分子量３８０００の単量体タンパク質である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，１１５６５−１１５７２，１９９３）。本酵素の大量生産を目的として、上記微生物の培養条件の至適化が図られたが（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２６１３−，１９８９）、この微生物は従来タンパク質の工業的生産に広く用いられてきたものではなく、生産量や生産コストの面で課題が多かった。また、本酵素は菌体外に活性な状態で分泌されるが、分子内に脱アミド反応による化学的修飾を容易に受ける配列を４カ所有するため、分泌生産が継続している間に培養液中で化学的修飾が進行し、回収された培養上清には活性が低下した酵素が混合物として蓄積された。これらの問題を解決するために、大腸菌等の微生物を用いた遺伝子組み換えＭＴＧ生産法が種々検討された（バイオサイエンスとバイオインダストリー、５２、５５４−５６１、１９９４）。
本酵素の配列そのものを大腸菌の菌体内で発現させると、その発現量は微量であったが、高発現の可能なＴ７  ｇｅｎｅ  １０由来配列の断片と融合させることにより、融合タンパク質の高発現に成功した。しかし、この融合タンパク質を限定分解して得られた本来の配列を有する酵素は、天然状態のトランスグルタミナーゼの約１／５の酵素活性しか示さず、この方法で得られた酵素の高次構造の不完全性が示唆された（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，８３０−８３５，１９９７）。また、融合タンパク質から本酵素の配列のみを切り出すには、消化酵素、或いは化学的手段による限定分解が必要であり、製造法の複雑さに加えて、生産コスト高も大きな問題となった。
以上の問題を解決するには、本酵素の配列のみを微生物で直接に高発現する技術を得ること、回収された変性状態の本酵素の高次構造を完全に再形成し、酵素活性を回復する技術（リフォールディング技術）を得ること、が必要であった。先に本出願人は、ＭＴＧを大腸菌の菌体内に発現させる際、使用コドンを宿主大腸菌用に変更し、プラスミドのコピー数を大幅に増加させることにより、それまで不可能であった本酵素配列の菌体内高発現に成功し、この内容を発明として特許を出願している（特願平１０−１８１９５１号、平成１０年６月２９日出願、特開平１１−０７５８７６号（平成１１年３月２３日公開）、その発明を以下「先の発明」という。）。
このような状況下に、優れたリフォールディング方法の開発が求められている。
発明の課題、目的
ところで、タンパク質のリフォールディング技術については、対象とするタンパク質の天然状態を検討してその適正な条件を予測することは不可能であり、実際に対象タンパク質を用いて個々の操作条件を実験的に探索する必要がある（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０，１−５９，１９９７）。先の発明（前記本出願人による特許出願）により、変性した状態にある本酵素を大量に入手可能となり、ここに初めて本酵素リフォールディング技術の検討が可能となった。
本発明の目的は、本酵素の安価な工業的製造法を構築するために、遺伝子組み換え微生物により生産されるような変性した状態で得られた本酵素のリフォールディング方法を開発し、天然状態のトランスグルタミナーゼと実質的に同等の酵素活性（即ちトランスグルタミナーゼ活性）を有するトランスグルタミナーゼを製造する方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者等は、上記課題を解決し本発明の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）工程を含む工程に付することにより酵素活性を有するトランスグルタミナーゼを効率よく製造できることを見出し本発明を完成するに到った：
（ａ）当該変性した状態にある酵素を水性媒体中、酸性下において酵素活性を有する状態への構造形成の中間構造を形成せしめるようにする工程；及び
（ｂ）前記構造形成の中間構造を形成した酵素を、水性媒体中ｐＨ値が中性領域下で酵素活性を有する状態の高次構造を形成せしめるようにする工程。
即ち、本発明は前記（ａ）及び（ｂ）工程を少なくとも含有する、特にリフォールディング工程中に含む、トランスグルタミナーゼの製造方法にある。
尚、（ａ）工程で得られる中間構造を有する酵素は、（ａ）工程のような処理工程により得られるような、トランスグルタミナーゼ酵素活性を有するが天然に存在するものと比較して実質的に低いものであり、例えば酵素活性が２０Ｕ／ｍｇ未満の酵素である。
更に、本発明には下記の内容が含まれる。
１．  前記（ａ）工程において、当該酵素の分子内のシステイン残基のチオール基が遊離形であり、水性媒体中、酸性下において酵素活性を有する状態への構造形成の中間構造を形成せしめる際に、当該酵素が溶解した状態で酸性下に希釈される上記方法。
システイン残基部分で２分子が結合するようなダイマーの場合、還元してチオール基を遊離形（フリー）にする方が好ましい。
２．  前記（ｂ）工程において、水性媒体が酵素活性を有する状態の高次構造を形成する促進剤を含有する上記方法。
（ｂ）工程においては、中性領域に調整する段階を含むが、この際目的とする高次構造を形成促進する促進剤を使用し、特に好ましくはｐＨ値を上昇せしめる前に添加して使用するとよい。その場合の促進剤としては、低分子量化合物が好ましく、例えば塩化カルシウム、塩化ストロンチウム等の無機塩、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等の有機酸塩、アミノ酸塩、ポリエチレングリコール等のポリオール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の有機溶媒が適宜採用される。
３．  前記（ｂ）工程後に、（ｃ）当該酵素のうち不活性な酵素を会合凝集物として分離する工程を含む上記方法。
４．  前記（ａ）工程において、当該酵素が当該水性媒体中に溶解しており、（ｂ）工程において、当該中性領域が当該（ａ）工程で得られた酵素溶液のｐＨ値を上昇せしめて中性領域とした領域である上記方法。
５．  前記（ａ）工程において、当該変性した状態にある酵素の酸性溶液を酸性下に希釈する際に、低温下、好ましくは１５℃以下で希釈され、希釈されたタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌ未満である上記方法。
希釈倍率としては５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは５０〜４００倍程度であり、複数段階に分けて希釈してもよい。また、希釈に際して下記変性剤を使用する場合、希釈前と希釈後とを変性剤の濃度で示すと尿素の場合は４〜１０Ｍ程度の濃度のものを希釈して０．０１〜０．５Ｍ程度の濃度にするのが好ましい。
（ａ）工程は低温下に行うのが好ましく、特に希釈に際して低温下に実施されるのが好ましい。例えば、１５℃以下、好ましくは３〜１０℃程度の低温下で実施することができる。
６．  前記（ａ）工程において、水性媒体がタンパク質変性剤を含有する上記方法。
出発物質のトランスグルタミナーゼは水性媒体中良く溶解している方が好ましく、その溶解補助剤としてタンパク変性剤を使用することができる。その場合のタンパク質変性剤として、尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸塩等を挙げることができる。使用する濃度としては通常タンパク質を変性するのに使用する濃度や、変性剤の種類等にもよるが、例えば尿素を変性剤として使用する場合４〜１０Ｍ程度で使用することができる。希釈する場合は、一度に希釈しても段階的に希釈してもよい。
７．  変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを、水性媒体中酸性下に溶解せしめ、その後当該酵素溶液を中性領域に調整して目的とする前記酵素活性を有する状態にある酵素を生成せしめることによりトランスグルタミナーゼを製造する方法。この場合、好ましい処理条件等については上記の記載を利用して行うことができる。
８．  前記（ａ）工程で得られる構造形成の中間構造が、近紫外領域のＣＤスペクトルにおいて天然状態のものに対して３０〜７０％の分子楕円率を有する上記方法。
９．  変性した状態にあるトランスグルタミナーゼを水性媒体中酸性下におくことにより得ることができ、以下の性質（ｄ）〜（ｇ）を示すタンパク質：
（ｄ）  ハイドロキサメート法によるトランスグルタミナーゼの活性測定により１５〜２５Ｕ／ｍｇの比活性を有し；
（ｅ）  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で３６，０００〜４０，０００の分子量を有し；
（ｆ）  近紫外領域のＣＤスペクトルにおいて天然状態のものに対して３０〜７０％の分子楕円率を有し；及び
（ｇ）  Ｈｉｓ−Ｍｅｓ、ｐＨ６．１の緩衝液システムで行うｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において天然状態のものより遅い易動度を示す。
前記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では、天然状態のものと同等の値、約３８，０００の分子量を有するのが好ましい。
尚、トランスグルタミナーゼの活性測定に使用するハイドロキサメート法については、公知方法（例えば、文献：Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，８３０−８３５，１９９７参照。）により行うことができる。
次に、本発明の好適な例を示す。
下記工程イ．及びロ．の工程を含む、変性した状態にあるトランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）から酵素活性を有する天然状態のトランスグルタミナーゼのリフォールディング方法による製造：
（イ）活性残基のシステイン残基（Ｃｙｓ）のチオール基が遊離形（フリー）である、変性、可溶化された微生物由来トランスグルタミナーゼ含有液のｐＨ値を酸性領域に調整し、好ましくは希薄な変性剤を含む酸性緩衝液に一挙に、好ましくは５０〜４００倍程度に希釈し、天然状態への構造形成の中間構造（状態）を有する本酵素を得る工程；及び
（ロ）前記構造形成の中間構造（状態）を有する本酵素含有液に直接、或いは構造形成を促進する低分子量化合物を添加した後、アルカリ液を添加してｐＨ値を中性領域、６〜７程度にまで上昇せしめ、本酵素の高次構造形成を促進、或いは当該高次構造を形成させるとともに、必要により構造形成に到らない不活性な画分を会合凝集物として分離する工程。
実施の形態
次に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。特に、組み換え大腸菌を培養して得られる変性した状態にある酵素を含む培養物から好適な例として具体的にリフォールディングをする場合を中心に説明するが、本発明はこれに限定されることはない。
本発明に使用する出発物質である被処理物は、変性した状態にあるトランスグルタミナーゼ、好ましくは微生物由来の変性トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）のように天然状態の高次構造を有さないトランスグルタミナーゼで実質的に酵素活性を示さないもの、更には最終的にトランスグルタミナーゼ活性を発揮し得る配列を有する酵素が本発明の出発物質に含まれる。
より詳細に説明すると、天然状態のトランスグルタミナーゼ配列はＮ端のアスパラギン酸残基（１番目）から始まりＣ端のプロリン残基（３３１番目）に終わる３３１個のアミノ酸で構成され、そのようなタンパク質は勿論本発明の出発物質に含まれる。その他２番目から３３１番目のアミノ酸残基を有する３３０のアミノ酸（１番目のアスパラギン酸残基が欠失している。）で構成されるタンパク質や、それらに更に、Ｎ端側及び／又はＣ端側にアミノ酸残基が１個又は複数個配列して結合するタンパク質であってトランスグルタミナーゼ活性を実質的に示さないがその高次構造の転移により当該活性を有し、又は有する可能性のあるものが含まれる。このようなタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加若しくは挿入されたアミノ酸配列であって、本発明の方法によりトランスグルタミナーゼ活性を有し、又は有する可能性のある配列を持つタンパク質は本発明の出発物質に含まれる。
本発明で用いる出発物質の代表的な例としては、微生物由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子を組み込んだ微生物、例えば組み換え大腸菌を培養して得られる変性酵素を含む培養物を挙げることができる（先の発明：前記本出願人による特許先願、後述の実施例中の製造例参照）。ここで、微生物由来のトランスグルタミナーゼ遺伝子の一部が変化し、発現されるアミノ酸配列の一部が、その１カ所又は複数カ所において欠損及び／又は置換（１個又は複数個のアミノ酸残基で）されたり、並びに／又は１個又は複数のアミノ酸で付加、挿入されたりしても、最終的にトランスグルタミナーゼ活性を発揮し得る配列であれば、本発明に使用する出発物質として使用できる。
大腸菌を生産宿主として用いた場合、微生物由来トランスグルタミナーゼの殆どは菌体中に不溶性顆粒として蓄積されるので、この顆粒を出発物質とすることができる。その場合、常法に従って回収された微生物由来トランスグルタミナーゼの不溶性顆粒を水性媒体中好ましくは可溶化せしめる。その際、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液に懸濁後、尿素、塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤を用いて可溶化するとよい。その他可溶化するための変性剤としては、チオシアン酸塩等を挙げることができる。
尿素濃度と塩酸グアニジン濃度は、一般にタンパク質を変性するに必要なそれぞれ７〜１０Ｍ、４〜７Ｍ程度でよい。微生物由来トランスグルタミナーゼの濃度には特に制限がないが、できるだけ高濃度、例えば１０〜１００ｍｇ／ｍｌ程度にするのが以降の操作上好ましい。
このような水溶液に、例えばダイマーに見られるようなジスルフィド結合について還元をする場合には還元剤を添加するのが好ましい。その場合、その水溶液に直ちに、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭになるよう添加し、ｐＨ値を７．５に調整後、３７℃で約２時間攪拌して可溶化するとよい。
次いで、このようにして得られた微生物由来トランスグルタミナーゼの可溶化液に塩酸等の酸を適量添加してｐＨ値を、２〜７、より好ましくは３〜５、更に好ましくは３．５〜４．５程度に調整し、同じ濃度の変性剤と還元剤を含む同じ又は同程度のｐＨ値の緩衝液を用いて希釈し、濃度を、１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜８０ｍｇ／ｍｌ程度に調整する。このような酸性下での希釈操作が前記高次構造の形成を促進する上で好ましい。処理温度は低温である方が好ましく、０〜１５℃、好ましくは３〜１０℃程度で処理するとよい。
上記に得られた溶液を予め３〜１０℃に冷却しておいた５〜５０ｍＭ、好ましくは１５〜２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３〜５、好ましくは３．５〜４．５の緩衝液中に希釈して、タンパク質濃度を０．２〜４ｍｇ／ｍｌ、尿素濃度を０．０１〜０．５Ｍに調整することにより、変性酵素を構造形成の中間構造（状態）へと導くことができる。この中間状態は、溶媒環境を整え、酸性下で希釈することによって初めて効果的に観察される速度論的な中間状態であり、天然状態から平衡的に容易に導かれる状態ではない（後述の実施例１１〜１６参照。）。
変性酵素の希釈は他段階に分けて行うこともできるが、全体での希釈倍率としては、好ましくは５０〜４００倍程度であり、変性剤を使用する場合、変性剤の濃度で示すと尿素の場合４〜１０Ｍ程度のものを希釈して０．０１〜０．５Ｍ程度にするとよい。
尚、上記酸性下での希釈に際して、リフォールディングに適した前記構造形成の中間構造（中間状態）を獲得するには長時間、例えば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、より好ましくは１．５時間以上保持するのが望ましい。
このようにして形成される中間構造（状態）については、後述実施例１１〜１６に示される通り天然構造（状態）とは異なり、本発明において好ましい希釈条件を選択することにより“天然状態”のトランスグルタミナーゼを効率よく取得することができる。
中間状態の形成は、例えばＶｙｄａｃ  ２１４ＴＰ５４（４．６φｘ２５０ｍｍ、ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ  ＧＲＯＵＰ）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と、例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５  ＨＲ  １０／３０（１０φｘ３００ｍｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いる高速ゲルろ過クロマトグラフィーのそれぞれで検出される、微生物由来トランスグルタミナーゼのピークエリアを比較検討することにより確認することができる。ここで、文献（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，８３０−８３５，１９９７）に記載の方法で測定された中間状態の酵素活性は低く、例えば比活性として１０〜２０Ｕ／ｍｇ程度であり、天然状態の酵素活性（約３０Ｕ／ｍｇ）を大きく下まわる。このような酵素活性を含むもの又はその画分を本発明における（ａ）工程で得られる「構造形成の中間構造」を有する酵素に含まれる。従って、このような低い酵素活性を有するＭＴＧが生成した段階で（その採取工程を含むことなく）本発明における（ａ）工程が終了する。
上記の希釈法に代えて、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析により中間（状態）を形成することも可能であるが、希釈法に比較して酵素タンパク質の回収率や酵素活性（比活性）の低下を招くので、好ましくない。尚、前記低い酵素活性が得られれば、特に本発明においては（ａ）工程における酵素を分離する必要はなく（ｂ）工程に付すことができる。
続いて、（ｂ）工程においては前記の如くして得られたような中間状態を形成した酵素を含む溶液をｐＨ値が中性領域で処理するとよい。この場合そのような酵素の液を低温下、例えば１５℃以下、好ましくは３〜１０℃に維持したまま、ｐＨ値を上昇せしめて中性領域にすることができる。中性領域を調製する方法として好ましくは、これにアルカリ液を添加し、ｐＨ値を５．８〜８．５、好ましくは６〜７に上昇し、生じた沈殿を遠心分離して除去することにより、構造形成を完了した微生物由来トランスグルタミナーゼのみを含む上清を回収できる。従って、この方法によれば上記構造形成を成し得なかった活性を有さない酵素は会合凝集物として容易に分離できるので、極めて有利である。上記目的とする酵素活性を有する構造形成が一部でも得られた段階で（採取工程を含むことなく）本発明における（ｂ）工程は終了する。
上清の酵素活性は約３０Ｕ／ｍｇと天然状態と同等にまで高まり、各種ＨＰＬＣにおける溶出ピークプロファイル、分光学的性質、及び熱安定性は天然状態の微生物由来トランスグルタミナーゼと完全に、又は実質的に一致する。以上より、変性タンパク質から天然状態の酵素へのリフォールディングが完了したことが分かる。尚、酵素の分離、精製工程はトランスグルタミナーゼその他酵素の分離、精製方法として知られている方法を利用すれば容易に行うことができる。
また、中間状態のｐＨ値を上昇する際、予めここへ促進剤として低分子量化合物を添加しておくことにより、中間状態から天然状態への構造形成を促進することができる。例えば、０．０１〜１０ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）等の２価の金属塩は、中間状態に対して構造転移の核となる局所的な構造形成を促進し、天然状態への転移を促進すると考えられる。また、塩化カルシウム以外で塩化ストロンチウム等の無機塩を採用することができる。更に、０．１〜２Ｍの酢酸ナトリウムやプロピオン酸ナトリウム等の有機酸塩、０．１〜２Ｍのアルギニン塩酸塩等のアミノ酸塩、１０〜４０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒、１〜１０％のポリエチレングリコール等のポリオールや１〜５０ｍＭのＣＨＡＰＳ等の界面活性剤は、緩衝液の性質を変えることにより天然状態への構造転移の過程で生じる酵素の会合凝集を抑制し、本酵素タンパク質の回収率を向上するものと考えられる。
このように生成して得られたトランスグルタミナーゼは極めて高純度であり、これを分離し、単離するには特に困難は無く、酵素（トランスグルタミナーゼ）の単離方法として慣用又は知られている方法を利用して容易に行うことができる。
このように本発明において得られるトランスグルタミナーゼは天然状態にあるものと実質的に同等の活性を有し、かつ極めて高純度であるため、更に精製する必要がなく、そのまま食品等各種の分野で、天然状態のトランスグルタミナーゼと同様に使用することができる。
好適な実施の形態
以下、製造例及び実施例により本発明を具体的に説明する。
（出発物質の製造例）
微生物由来トランスグルタミナーゼをコードするＤＮＡを導入した大腸菌を２ｘＹＴ培地で培養し、微生物由来トランスグルタミナーゼを不溶性顆粒として菌体内に蓄積させたものを出発物質として使用すべく下記のように調製した。尚、この詳細な内容については前記先の発明について本出願人による特願平１０−１８１９５１号、平成１０年６月２９日出願、特開平１１−０７５８７６号公報（平成１１年３月２３日公開）（明細書等）に記載されており、この明細書等の内容が参考により本願明細書の中に組み込まれる。
ＭＴＧは、菌体内に不溶性顆粒として蓄積するので、下記のように菌体破砕液の遠心沈殿画分に含まれ、以後の実施例では、この遠心沈殿画分を顆粒として用いた。尚、この顆粒はトランスグルタミナーゼ活性は示さなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭＴＧの大量発現
〈１〉ＭＴＧ発現プラスミドｐＴＲＰＭＴＧ−０１の構築
ＭＴＧ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉや酵母のコドン使用頻度を考慮して、既に、全合成されている（特開平５−１９９８８３号公報参照）。しかしながら、この遺伝子配列は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適なものになっていなかった。即ち、３０個存在するアルギニン残基のコドンが全てマイナーコドンであるＡＧＡであった。そこで、まず、ＭＴＧ遺伝子のＮ末端から約２００塩基をＥ．ｃｏｌｉの発現に最適なように再合成することとした。
ＭＴＧ遺伝子を転写するプロモーターは、培地中のトリプトファンの欠乏で容易に転写が誘導されるｔｒｐプロモーターを用いることとした。マダイ・トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）遺伝子を高発現したプラスミドｐＴＴＧ２−２２（特開平６−２２５７７５号公報参照）は、ｔｒｐプロモーターを用いており、マダイＴＧ遺伝子の上流の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて異種タンパク質が高発現するようデザインされている。
ｐＴＲＰＭＴＧ−０１の構築には、図１に示したようにマダイＴＧ発現プラスミドｐＴＴＧ２−２２（特開平６−２２５７７５号公報参照）のｔｒｐプロモーター下流にあるＣｌａＩ部位から下流のＢｇｌＩＩ部位までを合成ＤＮＡ遺伝子ＣｌａＩ／ＨｐａＩ断片とｐＧＥＭ１５ＢＴＧ（特開平６−３０７７１号公報参照。）のＨｐａＩ／ＢａｍＨＩ断片（小）に置き換えることによって構築した。
合成ＤＮＡ遺伝子ＣｌａＩ／ＨｐａＩ断片は、ｐＴＴＧ２−２２のｔｒｐプロモーター下流のＣｌａＩ部位から翻訳開始コドンまでの配列とＭＴＧ遺伝子のＮ末端から２１６塩基を持つ遺伝子配列である。ＭＴＧ構造遺伝子部分に関しては、Ｅ．ｃｏｌｉの発現に最適なようにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度を参考にして塩基配列を決定した。但し、ｍＲＮＡの高次構造形成を除去するためＮ末端部分をコードする領域中の縮重コドンの３文字目をアデニン、ウラシルに富むコドンへ変換し、できるだけ同じ塩基が続かないよう配慮した。
合成ＤＮＡ遺伝子ＣｌａＩ／ＨｐａＩ断片は、末端にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを持つようにデザインした。デザインした遺伝子を＋鎖と−鎖がお互いにオーバーラップするように約４０〜５０塩基に分割し、各々の配列に相当するＤＮＡを１２本合成した（配列表配列番号２から１３）。この合成ＤＮＡの５’末端をリン酸化し、ペアになる合成ＤＮＡをアニーリング後、連結した。その後、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、目的の大きさのＤＮＡを切り出し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んだ。塩基配列を確認し、正しいものをｐＵＣＮ２１６と名付けた。このｐＵＣＮ２１６から、ＣｌａＩ／ＨｐａＩ断片（小）を切り出し、ｐＴＲＰＭＴＧ−０１の構築に用いた。
〈２〉ＭＴＧ発現プラスミドｐＴＲＰＭＴＧ−０２の構築
ｐＴＲＰＭＴＧ−０１を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は、ＭＴＧを高発現しなかったので、ＭＴＧ遺伝子のＮ末端の改変した部分以外の部分（７７７塩基）も、Ｅ．ｃｏｌｉ用に改変することとした。７７７塩基を一度に合成するのは難しいので、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度を参考にして塩基配列を決定した後、約２００塩基ずつ４つのブロック（Ｂ１，２，３，４）に分けて合成することとした。各ブロックは、末端にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを持つようにデザインした。デザインした遺伝子を＋鎖と−鎖がお互いにオーバーラップするように約４０〜５０塩基に分割し、各々の配列に相当するＤＮＡを各ブロック１０本づつ計４０本合成した（配列表配列番号１４から５３）。この合成ＤＮＡの５’末端をリン酸化し、ペアになる合成ＤＮＡをアニーリング後、連結した。その後、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、目的の大きさのＤＮＡを切り出し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んだ。塩基配列を確認し、正しいものをそれぞれｐＵＣＢ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４と名付けた。次に、図２に示すように、Ｂ１とＢ２、Ｂ３とＢ４を連結したｐＵＣＢ１−２、ｐＵＣＢ３−４を作製し、更にｐＴＲＰＭＴＧ−０１、ｐＵＣＮ２１６、ｐＵＣＢ１−２、ｐＵＣＢ３−４より、ｐＴＲＰＭＴＧ−０２を構築した。ｐＴＲＰＭＴＧ−０２上に存在する高発現ＭＴＧ遺伝子を含む塩基配列を配列表配列番号１に示す。
〈３〉ＭＴＧ発現プラスミドｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（＋）、（−）の構築
このｐＴＲＰＭＴＧ−０２を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９も、ＭＴＧを高発現しなかったので、プラスミドを多コピー化することとした。ｐＴＲＰＭＴＧ−０２のｔｒｐプロモーターを含むＥｃｏＯ１０９Ｉ断片（小）を平滑化後、多コピープラスミドであるｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位に組み込み、ｌａｃＺのプロモーターとｔｒｐプロモーターが同一のもの（ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（＋））と逆向きのもの（ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（−））を構築した。
〈４〉ＭＴＧの発現
ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（＋）、ｐＵＣ１９で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ｘＹＴ培地で、３７℃、１０時間振盪培養した（前培養）。この前培養液０．５ｍｌを１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、３７℃、２０時間振盪培養した。
培養液から、菌体を集菌し、超音波破砕した。この菌体破砕液の全画分、遠心上清画分、遠心沈殿画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を図３に示す。ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（＋）／ＪＭ１０９の菌体破砕全画分、遠心沈殿画分にＭＴＧと同一分子量を有するタンパク質の高発現が確認された。また、ウエスタンブロッテイングによって、このタンパク質がマウス抗ＭＴＧ抗体と反応することが確認された。このタンパク質の発現量は５００〜６００ｍｇ／Ｌであった。なお、生産培地には、３−β−インドールアクリル酸を加えなくとも、十分な高発現が見られた。
更に、マウス抗ＭＴＧ抗体を用いたウエスタンブロッテイングを行ったところ、遠心上清画分にはＭＴＧがわずかしか発現しておらず、発現したＭＴＧは殆ど全て不溶性タンパク質封入体となっていることが分かった。
〈５〉発現ＭＴＧのＮ末端アミノ酸の解析
発現したＭＴＧのタンパク質封入体についてＮ末端アミノ酸残基の解析を行ったところ、Ｎ末端の配列は約６０％がメチオニン残基で約４０％がフォルミルメチオニン残基であった。開始コドンに相当する（ホルミル）メチオニン残基を除去するため、以下のような工夫を行った。
〈６〉ＭＴＧのＮ末端アスパラギン酸残基の欠失
ＭＴＧのＮ末端に相当する２１６塩基を含むｐＵＣＮ２１６を鋳型として、ＰＣＲを行うことによって、アスパラギン酸残基に相当する塩基配列を欠失させた。ｐＵＣＮ２１６は、ＭＴＧのＮ末のＣｌａＩ−ＨｐａＩ断片を含む約２１６ｂｐがｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたプラスミドである。ｐＦ０１（配列表配列番号５４）、ｐＲ０１（配列表配列番号５５）はベクター中の配列を持つプライマーであり、ｐＤＥＬＤ（配列表配列番号５６）はＡｓｐ残基に相当する塩基配列を欠失させたもの、ｐＨｄ０１（配列表配列番号５７）はＣをＧに変えてＨｉｎｄＩＩＩ部位を潰したものである。ｐＦ０１、ｐＤＥＬＤはセンスプライマー、ｐＲ０１、ｐＨｄ０１はアンチセンスプライマーである。
まず、ｐＦ０１とｐＨｄ０１、ｐＤＥＬＤとｐＲ０１の組み合わせでｐＵＣＮ２１６に対して、それぞれＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。各ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿を行い、１００μＬのＨ２０に溶解した。
各ＰＣＲ産物から１μＬずつ取って混ぜ９４℃で１０分間熱変性した後、ｐＦ０１とｐＨｄ０１のプライマーの組み合わせで、ＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。
２回目のＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿したものを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ処理をし、ｐＵＣ１９サブクローニングしｐＵＣＮ２１６Ｄを得た（図４）。得られたｐＵＣＮ２１６Ｄのシークエンスを確認したところ目的通りのものであった。
〈７〉アスパラギン酸残基欠失プラスミドの構築
ｐＵＣＮ２１６ＤのＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｐａＩ断片（小）を、ｐＵＣＢ１−２（ＭＴＧ遣伝子のＨｐａＩ／ＢｇｌＩＩ断片がｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたプラスミド）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｐａＩ断片（大）と結合し、ｐＵＣＮＢ１−２Ｄとした。更に、ｐＵＣＮＢ１−２ＤのＣｌａＩ／ＢｇｌＩＩ断片（小）を、ＭＴＧ高発現プラスミドであるｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２（＋）のＣｌａＩ／ＢｇｌＩＩ断片（大）と結合し、アスパラギン酸残基除去ＭＴＧ発現プラスミドｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２とした（図５）。その結果、図６に示すように、アスパラギン酸残基に相当するＧＡＴが欠失したＭＴＧ遺伝子を含むプラスミドを得た。
〈８〉アスパラギン酸残基欠失ＭＴＧの発現
ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ｘＹＴ培地で、３７℃、１０時間振盪培養した（前培養）。この前培養液０．５ｍｌを１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に添加し、３７℃、２０時間振盪培養した。菌体を超音波破砕した後の破砕上清及び沈殿の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクマシー・ブリリアント・ブルー染色やマウス抗ＭＴＧ抗体を用いたウエスタン・ブロッティングの結果から、超音波破砕後沈殿即ち不溶画分にアスパラギン酸残基欠失ＭＴＧタンパク質が検出された。これは、アスパラギン酸残基欠失ＭＴＧタンパク質がタンパク質封入体として菌体内に蓄積したことを示している。
また、このタンパク質封入体についてＮ末端アミノ酸配列の解析を行ったところ、図７に示すように、Ｎ末端の配列の約９０％がセリンであった。
〈５〉と〈８〉で得られた発現ＭＴＧのＮ末端アミノ酸についての結果を比較すると、表１のようになり、ＭＴＧのＮ末端アスパラギン酸残基を欠失させることにより、発現ＭＴＧのＮ末端に付加される開始メチオニンが効率的に除去されることが分かった。
0004239412.tif 000002
（実施例１）
前記出発物質の製造例のようにして調製された顆粒（前記遠心沈殿画分）を用いて顆粒懸濁液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を調製、尿素を最終的に８Ｍになるよう添加、更に２０ｍＭ  ＤＴＴを添加した後、２０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ７．５に調整し、３７℃で２時間攪拌抽出して変性酵素液とした。変性酵素の含有量を前述の逆相ＨＰＬＣで測定した後、以降の実験に用いるまで、小分けして−８０℃に凍結保存した。
変性酵素液（酵素の濃度：約５０ｍｇ／ｍｌ）に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。この時の反応条件は、変性酵素濃度、０．２ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度、０．０４Ｍとなった。文献（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，８３０−８３５，１９９７）に記載のハイドロキサメート法により求めた反応溶液中の酵素活性（比活性）は１９．４Ｕ／ｍｇであった。５℃で撹拌を３０分間継続し、続けて４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。得られた酵素の比活性はｐＨ値上昇前の１．５倍に上昇して２９．０Ｕ／ｍｇに達し、天然状態の微生物由来トランスグルタミナーゼとほぼ一致した。変性酵素からのタンパク質回収率は５３．６％であった。
以上のリフォールディング反応条件を維持したまま、実験スケールのみを１０倍に向上し、５００ｍｌの緩衝液を用いて希釈、ｐＨ６．０に上昇後、遠心分離して上清を得た。この酵素の比活性は３３．７Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からのタンパク質回収率は４１．９％であった。この酵素液を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた精製酵素の性状を（１）逆相ＨＰＬＣ（図８参照）、（２）ＣＤスペクトル（図９参照）及び（３）示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて、天然状態の微生物由来トランスグルタミナーゼと比較したところ、両者に実質的な差異は認められなかった。
（実施例２）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を０．２ｍｇ／ｍｌに調整した。この変性酵素液の６ｍｌを、２ｍＭ  ＤＴＴを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０緩衝液に平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍカラム（１．６φｘ１５ｃｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク）に負荷し、同じ緩衝液で展開した。波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収を指標にタンパク質画分を回収した。クロマトグラフィーは室温で実施した。回収画分を５℃に３０分間以上冷却し、そのまま４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。この酵素の比活性は２３．４Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からのタンパク質回収率は３９．８％となり、実施例１で得られた酵素の比活性、タンパク質回収率の何れよりも低下した。
（実施例３）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を０．２ｍｇ／ｍｌに調整した。この変性酵素液の１ｍｌを透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｎｏ１  ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に注入し、１０００ｍｌの緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）に対して、５℃で終夜透析した。得られた透析内液に４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。この酵素の比活性は３１．１Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からのタンパク質回収率は４２．６％となり、実施例１で得られたタンパク質回収率よりも低下した。
（実施例４）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ６．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。この時の反応条件は、変性酵素濃度、０．２ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度、０．０４Ｍとなった。５℃で撹拌を３０分間継続し、遠心分離して上清を得た。上清にはタンパク質は全く検出されず、リフォールディングに供した変性酵素は全て会合凝集した。
更に、実施例１と同様に調製された変性酵素液に４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下し、ｐＨ９．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ９．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ９．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。この時のタンパク質回収率は１８．９％であったが、酵素活性は全く検出されなかった。続けて濃塩酸を滴下してｐＨ値を６．０まで下げ、遠心分離して上清を得た。上清にはタンパク質は全く検出されず、リフォールディングに供した変性酵素は全て会合凝集した。
以上の結果は実施例１の有効性と共に、希釈操作を行う際のｐＨ値は酸性に保たれなければならないことを示している。
（実施例５）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を３０分間継続し、再びｐＨ４．０の変性酵素液（４０ｍｇ／ｍｌ）を０．２５ｍｌ、希釈注入した。この操作を更に２回繰り返し、合計４回に分割して希釈を行った結果、最終的な反応条件は、変性酵素濃度、０．７８ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度、０．１６Ｍとなった。５℃で撹拌を３０分間継続し、続けて４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。得られた酵素の比活性は３２．８Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からタンパク質回収率は５９．０％となった。希釈操作を分割することなく、１ｍｌの変性酵素液（ｐＨ４．０、４０ｍｇ／ｍｌ）を一挙に希釈注入した場合、得られた上清の比活性は同等であったが（３２．８Ｕ／ｍｇ）、タンパク質回収率は４分割して希釈した場合より３％低下して５６％となった。
（実施例６）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を３０分間継続し、ＣａＣｌ２を１ｍＭになるように添加し、再び５℃で３０分間撹拌した。この時の反応条件は、変性酵素濃度、０．２ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度、０．０４Ｍ；ＣａＣｌ２濃度、１ｍＭとなった。続けて４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。得られた酵素の比活性は３０．０Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からタンパク質回収率は６０．１％となった。対照としてＣａＣｌ２を添加しないリフォールディングを同時に行ったところ、得られた酵素の比活性は３１．７Ｕ／ｍｇと同等なものの、変性酵素液からタンパク質回収率は５１．３％と約９％の差異を示し、ｐＨ値を６．０へ上昇する前にＣａＣｌ２を添加する効果を確認できた。一方、希釈用緩衝液に予めＣａＣｌ２を１ｍＭ添加しておくと、比活性は２５．３Ｕ／ｍｇ、タンパク質回収率は５３．２％と、ｐＨ値上昇前に加えた場合より何れも低下した。
（実施例７）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を３０分間継続し、ＳｔＣｌ２を０．１ｍＭになるように添加し、再び５℃で３０分間撹拌した。この時の反応条件は、変性酵素濃度０．２ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度０．０４Ｍ；及びＳｔＣｌ２濃度０．１ｍＭとなった。続けて、４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。得られた酵素の比活性は２７．３Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からタンパク質回収率は８４．５％となり、実施例１のタンパク質回収率（５３．６％）と比較して大幅に向上した。
（実施例８）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この０．２５ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）、５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を３０分間継続し、界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を１０ｍＭになるように添加し、再び５℃で３０分間撹拌した。この時の反応条件は、変性酵素濃度０．２ｍｇ／ｍｌ；尿素濃度０．０４Ｍ；及びＣＨＡＰＳ濃度１０ｍＭとなった。続けて、４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０まで上昇し、遠心分離して上清を得た。得られた酵素の比活性は２９．３Ｕ／ｍｇ、変性酵素液からタンパク質回収率は９３．０％となり、実施例１のタンパク質回収率（５３．６％）と比較して大幅に向上した。
（実施例９）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を継続しながら、３０秒、５分、並びに０．５、１．０、１．５、２．０、３．０及び１７時間後に、それぞれ１ｍｌをサンプリングし、直ちに４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０までシフトし、遠心分離して上清を得た。得られた上清中の酵素の比活性及び変性酵素液から上清までのタンパク質回収率とサンプリングまでの時間との関係を表２に示した。この結果、希釈直後ではｐＨシフト後の比活性が低いが、サンプリングまでの時間が長くなるに従って、ｐＨシフト後の上清中の比活性が高くなり、１．５時間以上で３０Ｕ／ｍｇに達した。ｐＨ４．０の希釈により形成された中間構造（状態）がリフォールディングに適した構造状態を獲得するのに、より好ましくは１．５時間以上の時間を要することが分かった。
0004239412.tif 000003
（実施例１０）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ値を４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた各種ｐＨ値を有する希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、５．０及び５．５）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を２時間継続し、続けて４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ値を６．０までシフトし、遠心分離して上清を得た。得られた上清中の酵素の比活性及び変性酵素液から上清までのタンパク質回収率と希釈時のｐＨ値との関係を表３に示した。この結果、ｐＨ４．０及びｐＨ４．２で最も高い比活性とタンパク質回収率が得られた。
0004239412.tif 000004
（実施例１１）
実施例１と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液１４７ｍｌを、予め５℃に冷却しておいた希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．１）７３５０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。５℃で撹拌を２時間継続し、続けて４Ｍ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨを６．０までシフトし、デカンテーションと遠心分離により上清を得た。得られた上清中の酵素の比活性は３０．７Ｕ／ｍｇ、変性酵素液から上清までのタンパク質回収率は６６．５％となった。この上清を限外ろ過（ハイドロザルト、１０ｋＤａモレキュラーカットオフ；ザルトコンスライスカセット、ザルトリウス社製）によって７５０ｍｌまで濃縮し、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８）で１０倍に希釈した。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（ＣＭセファロースＦＦ、１１．３φｘ１０ｃｍ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に負荷した。同緩衝液で再平衡化後、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収を指標に０→０．３Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出されるタンパク質画分（５００ｍｌ）を回収した。クロマトグラフィーは室温で実施した。この操作により、菌体由来の非タンパク性の不純物が除去できた。
回収画分の半量（２５０ｍｌ）を、２ｍＭ  ＤＴＴを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液に平衡化されたゲル濾過カラム（セファデックスＧ−２５Ｍ、１４φｘ１５ｃｍ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク）に負荷し、同緩衝液で展開した。波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収を指標にタンパク質画分（３８０ｍｌ）を回収した。クロマトグラフィーは室温で実施した。得られたタンパク質画分の比活性は２９．４Ｕ／ｍｇ（約０．７５ｇ）であった。この画分を１．２ｍｇ／ｍｌに濃度調整し、小分けにして−８０℃に凍結保存した。以降、この保存サンプルを「精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼ」と称する。
一方、前記陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて残る半量の回収画分（２５０ｍｌ）を、２ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０緩衝液に平衡化された前述のゲルろ過カラムに負荷し、同緩衝液で展開した。波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収を指標にタンパク質画分（３８０ｍｌ）を回収した。クロマトグラフィーは室温で実施した。得られたタンパク質画分の全量を前述の限外ろ過を用いて１２２ｍｌまで濃縮した。これを、酢酸アンモニウム濃度が最終的に５０ｍＭになるよう調整し、−８０℃で凍結後、凍結乾燥を行い、約０．７５ｇのパウダーを得た。以降、このパウダーを「精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼパウダー」と称する。
（実施例１２）
実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼパウダーを用い、構造形成の中間構造（状態）の物理化学的性質を調べた。このパウダーを１ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液に溶解し、尿素、ＤＴＴ及びリン酸ナトリウムを、最終的にそれぞれ８Ｍ、２０ｍＭ及び２０ｍＭになるよう添加し、ｐＨ値を７．５に調整した。これを３７℃で２時間インキュベートし、ここへ濃塩酸を滴下してｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。以降の実験に用いるまで小分けして−８０℃に凍結保存した。この変性酵素液を融解後、この溶液０．２ｍｌを希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。その後のｎｅａｒＵＶスペクトルを経時的に測定した。測定には、ＪａｓｃｏＪ−７１５ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒを使用し、キュベットはｎｅａｒＵＶ領域では１ｃｍパスのものを、ｆａｒＵＶ領域は０．１ｃｍパスのものを使用した。測定は室温で行い、波長スキャン率は１０ｎｍ／ｍｉｎで行った。得られたデータは、アミノ酸１モル当たりのＣＤ（円偏光二色性）シグナルに変換した。図１０にｎｅａｒＵＶのＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを示す。０〜１０ｍｉｎは、１回のスキャンのデータ、１０〜６０ｍｉｎは５回のスキャンの平均データ、６０〜１６０ｍｉｎと１７０〜２７０ｍｉｎは、１０回のスキャンの平均データである。この結果より、希釈直後には殆ど高次構造を形成しておらず、その後ゆっくりと構造形成が進行することが分かった。６０〜１６０ｍｉｎと１７０〜２７０ｍｉｎがほぼ同じスペクトルを示すことから、ｎｅａｒＵＶ−ＣＤで観察される高次構造形成は、遅くとも１６０ｍｉｎまでに終了していることが分かった。希釈後２６時間（ｈ）経過しても６０〜１６０ｍｉｎで形成された構造からなんら変化することはなかった。
同時に、実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼに尿素と酢酸ナトリウムを添加し、最終的に０．１６Ｍ尿素と２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２に調整し、２４時間静置して同緩衝液中で十分に安定な構造を形成させた後、同様にＣＤスペクトルを測定して天然状態のそれと比較した。その結果を図１１に示した。０．１６Ｍ尿素、ｐＨ４．２中にあっても、本酵素は天然構造（状態）を失うことはなかった。一方、変性状態から希釈することにより形成された構造状態（希釈後２６時間）は、同じ緩衝液中にある本酵素の構造状態（天然状態）とは明らかに異なり、変性→希釈操作（リフォールディング）で形成された構造状態が天然状態とは異なる“中間状態”にあり、しかも希釈後に状態が徐々に変化していることが分かった。
以上から、近紫外領域、特に２６０〜２９０ｎｍのＣＤスペクトルにおいて中間状態の分子楕円率は天然状態のものに対して３０〜７０％を示すことが分かった。）
（実施例１３）
実施例１２と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌを、希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。希釈後の構造状態の変化過程を調べるため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０を用いたゲル濾過分析を行った。緩衝液には、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０を用い、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎで行った。希釈後のサンプル１００μｇを経時的（２、１０、３０、６０、１００、１６０及び２６０分、並びに１日）に分析した。希釈直後（２分）では、天然構造（状態）にある本酵素のピーク溶出時間より約４分早くピークが検出されたが、希釈後の時間経過と共に溶出時間が変化し、構造状態（分子の大きさや形）が希釈後に変化し続けていることが分かった。
一方、実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼを０．１６Ｍ尿素と２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で２４時間透析し、希釈用緩衝液中で十分に安定な構造を形成させた後、同様に分析した（図１２参照。）。ピークの溶出時間は天然状態から変化せず、本酵素は０．１６Ｍ尿素、ｐＨ４．０中にあっても天然状態を失うことはなかった。希釈により形成された構造は、十分に時間が経過するとそのピーク溶出時間が天然構造と一致するものの、ピーク形状が依然として明確に異なった。これらの結果より、希釈により形成される中間状態は経時的にその構造状態を変化させ、最終的にも天然状態と同様の構造には到らず、構造形成の中間状態に留まることが分かった。
（実施例１４）
実施例１２と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を１５ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌを、希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。この溶液を２８０ｎｍで励起し、Ｔｒｐ蛍光のλｍａｘを経時的（３０秒並びに０．５、１、１．５及び２時間）に測定した。希釈直後（３０秒）より、経時的にλｍａｘのブルーシフト（３５１．５→３４４ｎｍ）が観察され、構造が徐々にコンパクト化していく（構造形成が進行する）過程が示された。また、希釈後十分な時間を経過しても、λｍａｘは天然状態のもの（３４０．０ｎｍ）とは一致せず、希釈により形成された構造状態が明らかに天然状態とは異なることを示した。
一方、実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼを０．１６Ｍ尿素と２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で２４時間透析し、希釈用緩衝液中で十分に安定な構造を形成させた後、同様にＴｒｐ蛍光のλｍａｘを測定したところ、λｍａｘは天然状態と変わることなく、本酵素は０．１６Ｍ尿素、ｐＨ４．０中にあっても天然構造（状態）を維持することが分かった（表４参照。）。これらの結果から、希釈により形成される中間状態は経時的にその構造状態を変化させ、最終的にも天然状態と同様の構造には到らず、構造形成の中間状態に留まることが分かった。
0004239412.tif 000005
（実施例１５）
実施例１２と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を１５ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌとＡＮＳ（８−アニリノナフタレン−１−スルフォン酸、最終濃度２０μＭ）を、希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化した。その後のＡＮＳ蛍光強度を励起波長４００ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍで経時的（１分並びに０．５、１、１．５及び２時間）に測定し、結果を表５に示した。この結果、希釈直後（１分）から２時間まで、経時的な蛍光強度の低下（１３８７→９７４）が観察され、タンパク質表面に露出した疎水性領域が徐々に消失していく過程が示された。しかし、希釈後に十分な時間が経過しても、ＡＮＳ蛍光強度は天然状態の蛍光強度にまで低下せず、希釈により形成された構造状態が明らかに天然状態とは異なることを示した。
一方、実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼを０．１６Ｍ尿素と２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２で２４時間透析し、希釈用緩衝液中で十分に安定な構造を形成させた後、同様にＡＮＳ蛍光強度を測定したところ、蛍光強度は天然状態と比較して若干上昇するものの、その変化は極わずかであり（５６→１６２）、本酵素は０．１６Ｍ尿素、ｐＨ４．２中にあっても天然状態を維持することが分かった。これらの結果から、希釈により形成される中間状態は経時的にその構造状態を変化させ、最終的にも天然状態と同様の構造には到らず、構造形成の中間状態に留まることが分かった。
0004239412.tif 000006
（実施例１６）
実施例１２と同様に調製された変性酵素液に濃塩酸を滴下し、ｐＨ４．０に調整した。これを８Ｍ尿素と２０ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈し、変性酵素濃度を４０ｍｇ／ｍｌに調整した。この溶液０．２ｍｌを、希釈用緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）１０ｍｌに希釈注入し、直ちに撹拌均一化し、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを行った。泳動は、市販のＮｕＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ７％ゲル（Ｎｏｖｅｘ社）を用い、Ｈｉｓ−Ｍｅｓ、ｐＨ６．１の緩衝液システムで行った。図１３にその結果を示す。希釈後の本酵素は天然状態とは明らかに異なる易動度を示し、希釈により形成された構造状態が天然状態とは異なることを示した。
同時に、実施例１１で得られた精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼに尿素と酢酸ナトリウム水溶液を加え、最終的に０．１６Ｍ尿素と２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０に調整し、同様にｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ったところ、溶媒組成変化の前後で易動度に変化なく、本酵素は０．１６Ｍ尿素、ｐＨ４．２中にあっても天然状態を維持することが分かった。
実施例１１〜１６に示した結果から、（１）水性媒体中、酸性下において変性剤の希釈により形成される構造状態が複雑な混合物であり、（２）その状態は経時的に変化し、（３）最終的にも天然構造とは異なる“中間状態”に留まることを示している。更に、実施例９と１０は（４）希釈条件を適切に設定して好ましい中間状態を誘導することにより、天然状態への回収率向上が可能であることを示している。
発明の効果
本発明で使用される前記リフォールディング法によれば遺伝子組み換え微生物により生産されるような変性した状態で得られた本酵素を、天然状態のトランスグルタミナーゼと実質的に同等の酵素活性、即ちトランスグルタミナーゼ活性を有するトランスグルタミナーゼを工業的に、しかも極めて高純度に製造することができ、故に更に精製する必要もなくそのまま食品等各種の分野で広く天然状態のトランスグルタミナーゼと同様に使用することが可能である。
特に、酸性溶液中における希釈、好ましくはｐＨ値をほぼ一定にした状態での希釈処理及びその後の中性領域への調整により、変性した状態にあるトランスグルタミナーゼから、前記構造形成の中間構造を経てその目的とする高次構造形成を効率よく促進し目的とする酵素活性を有する酵素を製造することができる。
前記構造形成の中間構造を有する中間体も提供する。
【配列表】
0004239412.tif 000007
0004239412.tif 000008
0004239412.tif 000009
0004239412.tif 000010
0004239412.tif 000011
0004239412.tif 000012
0004239412.tif 000013
0004239412.tif 000014
0004239412.tif 000015
0004239412.tif 000016
0004239412.tif 000017
0004239412.tif 000018
0004239412.tif 000019
0004239412.tif 000020
0004239412.tif 000021
0004239412.tif 000022
0004239412.tif 000023
0004239412.tif 000024
0004239412.tif 000025
0004239412.tif 000026
0004239412.tif 000027
0004239412.tif 000028
0004239412.tif 000029
0004239412.tif 000030
0004239412.tif 000031
【図面の簡単な説明】
［図１］ＭＴＧ発現プラスミドｐＴＲＰＭＴＧ−０１の構築図である。
［図２］ＭＴＧ発現プラスミドｐＴＲＰＭＴＧ−０２の構築図である。
［図３］ＭＴＧが発現したことを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の展開図である。
１．ＭＴＧ（４μｇ）
２．ｐＵＣ１９／ＪＭ１０９の菌体破砕全画分（ネガコン）
３．ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ−０２／ＪＭ１０９の菌体破砕全画分
４．第３レーンの遠心上清画分
５．第３レーンの遠心沈殿画分
［図４］プラスミドｐＵＣＮ２１６Ｄの構築図である。
［図５］ＭＴＧ発現プラスミドｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２の構築図である。
［図６］アスパラギン酸残基に相当するＧＡＴが欠失したことを示す図である。
［図７］Ｎ末端アミノ酸がセリンであることを示す図である。
［図８］天然状態のトランスグルタミナーゼ（天然型）と遺伝子組み換えＭＴＧから得られたもの（遺伝子組み換え型）の逆相ＨＰＬＣを示す図である。
１：遺伝子組み換え型  ；  ２：天然型
各々、即ち天然型、遺伝子組み換え型のトランスグルタミナーゼ、それぞれ８μｇを以下の条件による逆相ＨＰＬＣに供した。
カラム：Ｖｙｄａｃ  ２１４ＴＰ５４１０
溶離液：Ａ：  ０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）
Ｂ：  ０．１％ＴＦＡ、８０％アセトニトリル
溶出プログラム：１ｍｌ／分
0004239412.tif 000032
［図９］トランスグルタミナーゼの天然状態のもの（天然型）及び遺伝子組み換えＭＴＧから得られたものの（遺伝子組み換え型）ＣＤスペクトルを示す図である。
ＡＶＩＶモデル６２ＡＤＳ（ＨＡＲＴ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製）と１ｍｍセルを用い、２０℃で実施例１中の４検体のＣＤスペクトルを測定した。図中の検体番号１〜４は下記の通りである。
0004239412.tif 000033
［図１０］実施例１２で得られた遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼの天然型、及び構造形成途中の中間構造（状態）のＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを示す図である。
１．希釈後０−１０ｍｉｎ；
２．希釈後１０−６０ｍｉｎ；
３．希釈後６０−１６０ｍｉｎ；
４．希釈後１７０−２７０ｍｉｎ；及び
５．精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼ。
［図１１］実施例１２で得られた遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼの天然型、及び構造形成途中の中間状態のＣＤスペクトルを示す図である。
１．精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼ；
２．精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼをｐＨ４．２、０．１６Ｍ尿素に調整したもの；及び
３．変性状態から希釈後、２６時間経過したもの。
［図１２］実施例１３で得られた遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼの天然型、及び構造形成途中の中間構造（状態）についてゲル濾過分析のクロマトグラムを示す図である。
［図１３］実施例１６で得られた遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼの天然型、及び構造形成途中の中間状態についてＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥの結果を示す図である。
１．精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼ；
２．変性状態から希釈後、２６時間経過したもの；
３．精製遺伝子組み換え型トランスグルタミナーゼをｐＨ４．２、０．１６Ｍ尿素に調整したもの；及び
４．３に同じ。
【図１】
0004239412.tif 000034
【図２】
0004239412.tif 000035
【図３】
0004239412.tif 000036
【図４】
0004239412.tif 000037
【図５】
0004239412.tif 000038
【図６】
0004239412.tif 000039
【図７】
0004239412.tif 000040
【図８】
0004239412.tif 000041
【図９】
0004239412.tif 000042
【図１０】
0004239412.tif 000043
【図１１】
0004239412.tif 000044
【図１２】
0004239412.tif 000045
【図１３】
0004239412.tif 000046