(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含み、さらに血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能を阻害する物質を含む複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項２】
前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能を阻害する物質が、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤である請求項１に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項３】
前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤が、マレイミド誘導体、ハロゲン化アルキル及びその誘導体、ジスルフィド化合物からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項４】
前記マレイミド誘導体が、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−パラ−フェニレンジマレイミド、ヘキサメチレンビスマレイミドビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項５】
前記ハロゲン化アルキルおよびその誘導体が、モノクロロ酢酸およびそのアミド、モノヨード酢酸およびそのアミド、モノブロモ酢酸およびそのアミド、α−ヨードプロピオン酸、β−ブロモエチルアミン、モノクロロ酢酸、クロロアセトフェノンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項６】
前記ジスルフィド化合物が、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）及びジチオピリジンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項７】
前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤が、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリル酸エチル、アクロレイン、無水マレイン酸、ビニルスルホン、エチレンイミン、エチレンオキシド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、ｐ−クロロ第二水銀デニルスルホン酸、グリシン、グリシルグリシン、グリシルメチルエステル、カダベリンおよびグリシンアミドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【請求項８】
さらに、組織トロンボプラスチン又はホロ化組織因子を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合因子血液凝固能測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は臨床検査における血液凝固能測定に用いられる血漿由来組成物および複合因子血液凝固能測定試薬に関する。さらに詳しくは、これら組成物および試薬の安定化手段、および該安定化手段が導入された組成物および試薬に関する。
【０００２】
背景技術
ヒトまたは動物の血漿成分、少なくとも血液凝固因子であるフィブリノゲンおよび第Ｖ因子を含む組成物は、凍結乾燥処理、凍結融解処理、または冷蔵あるいは室温で１日以上放置することにより不溶性の沈殿が生じるため、これら成分を含む組成物を安定に調製し製造することは困難であった。
【０００３】
血液凝固能を測定するための複合因子血液凝固能測定試薬は、ヒトまたは動物由来の組織トロンボプラスチン、血液凝固第Ｖ因子およびフィブリノゲンを含有させている（Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｓｃａｄ．，ｓｕｐｐｌ．，１９４，１９４７）。このような試薬は、とりわけ凍結乾燥処理、凍結融解処理、または冷蔵あるいは室温で１日以上放置することにより不溶性の沈殿を生じるため、安定に調製し製造することが困難であった。また、試薬を血液凝固能測定に使用する時、用時調製した後の安定性もよくないため、安定な測定結果を得ることができないといった問題があった。
【０００４】
発明の開示
本発明の目的は、ヒトまたは動物の血漿成分、少なくとも血液凝固因子であるフィブリノゲンおよび第Ｖ因子を含む組成物を安定に調製できる手段を提供することであり、調製した組成物の安定化を図り、凍結乾燥処理、凍結融解処理、または冷蔵あるいは室温で１日以上の放置等を行っても安定な組成物を提供することである。さらに、試薬使用時における用時調製後の安定性が優れた組成物を提供することである。
【０００５】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤が、ヒトまたは動物由来の血漿成分、特に少なくとも血液凝固因子であるフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含む組成物の安定化に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、（１）少なくともフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含み、さらに血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能を阻害する物質を含む複合因子血液凝固能測定試薬。（２）前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能を阻害する物質が、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤である前記（１）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（３）前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤が、マレイミド誘導体、ハロゲン化アルキル及びその誘導体、ジスルフィド化合物からなる群から選択される少なくとも１種である前記（２）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（４）前記マレイミド誘導体が、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−パラ−フェニレンジマレイミド、ヘキサメチレンビスマレイミドビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルからなる群から選択される少なくとも１種である前記（３）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（５）前記ハロゲン化アルキルおよびその誘導体が、モノクロロ酢酸およびそのアミド、モノヨード酢酸およびそのアミド、モノブロモ酢酸およびそのアミド、α−ヨードプロピオン酸、β−ブロモエチルアミン、モノクロロ酢酸、クロロアセトフェノンからなる群から選択される少なくとも１種である前記（３）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（６）前記ジスルフィド化合物が、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）及びジチオピリジンからなる群から選択される少なくとも１種である前記（３）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（７）前記血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤が、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリル酸エチル、アクロレイン、無水マレイン酸、ビニルスルホン、エチレンイミン、エチレンオキシド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、ｐ−クロロ第二水銀デニルスルホン酸、グリシン、グリシルグリシン、グリシルメチルエステル、カダベリンおよびグリシンアミドからなる群から選択される少なくとも１種である前記（２）に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、（８）さらに、組織トロンボプラスチン又はホロ化組織因子を含む前記（１）〜（７）のいずれか一に記載の複合因子血液凝固能測定試薬、からなる。
【０００７】
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を具体的に説明する。
【０００８】
本発明で用いられる組織トロンボプラスチンは通常、ヒト胎盤、ウシ、サルまたはウサギの脳等の組織より抽出することにより提供される。また、組織トロンボプラスチンの代わりに遺伝子組換えにより調製された組織因子アポ蛋白に適切なリン脂質を再構成させることにより調製されるホロ化組織因子を用いることもできる。
【０００９】
また、血液凝固第Ｖ因子およびフィブリノゲンは、既存の精製品を用いても良いが、例えばウシ血漿から、硫酸バリウム等の吸着剤で、少なくとも血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第Ｘ因子、および血液凝固第ＩＩ因子を吸着除去して得られる血漿を用いることが一般的に行われている。
【００１０】
上記の組織トロンボプラスチンまたはホロ化組織因子と、少なくとも血液凝固第Ｖ因子並びにフィブリノゲンを含む前記吸着処理して得られる血漿とを混合することにより、複合因子血液凝固能測定試薬が調製される。
【００１１】
このように調製される試薬には、所望によりさらに、適切な緩衝液、防腐剤、並びに血液凝固因子でもあるカルシウムイオンを適宜添加して調製することも一般的に行われている。
【００１２】
このようにして調製された組成物を凍結乾燥処理、凍結融解処理、または冷蔵あるいは室温で１日以上の放置等を行うと、不溶性の物質が生成され、調製物の安定性が著しく悪くなる。
【００１３】
本発明では、血液凝固第ＸＩＩＩ因子阻害剤の阻害有効量を添加することにより、前記少なくともフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含む血漿由来組成物、または少なくともフィブリノゲン、血液凝固第Ｖ因子、および組織トロンボプラスチン若しくはホロ化組織因子を含む複合因子血液凝固能測定試薬の安定化を図ることができることを見出した。
【００１４】
以下、これら血漿由来組成物、または複合因子血液凝固能測定試薬の安定化手段について、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤を例に挙げて説明するが、本発明の安定化手段は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能を阻害できる物質を用いれば達成できるものであり、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤に限定されるものではない。ここに血液凝固第ＸＩＩＩ因子の生物学的機能とは、トランスグルタミナーゼ作用によりフィブリンに架橋形成し、フィブリンを安定化させる等の機能をいう。
【００１５】
血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤としては以下が例示される。特に好ましい阻害剤は、マレイミド誘導体であり、具体例としてはＮ−エチルマレイミドが例示される。
【００１６】
（阻害剤の例示）
マレイミド誘導体；Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−パラ−フェニレンジマレイミド、ヘキサメチレンビスマレイミドビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテル等、
ハロゲン化アルキルおよびその誘導体；モノクロロ酢酸およびそのアミド、モノヨード酢酸およびそのアミド、モノブロモ酢酸およびそのアミド、α−ヨードプロピオン酸、β−ブロモエチルアミン、モノクロロ酢酸、クロロアセトフェノン等、
ジスルフィド化合物；５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ジチオピリジン等、
その他；アクリロニトリル、アクリルアミド、アクリル酸エチル、アクロレイン、無水マレイン酸、ビニルスルホン、エチレンイミン、エチレンオキシド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、ｐ−クロロ第二水銀デニルスルホン酸、グリシン、グリシルグリシン、グリシルメチルエステル、カダベリンおよびグリシンアミド等。
【００１７】
これらの阻害剤は、単独または２種以上を組み合わせて用いることもできる。用いる阻害剤の添加量は、含有される血液凝固第ＸＩＩＩ因子の量と、各々の阻害剤の阻害有効量とを考慮して、適切な添加量に設定すれば良い。濃度として設定する場合は、凍結乾燥前の液状混合物において、例えばＮ−エチルマレイミドの場合には、０．１ｍＭから１０ｍＭが適当であり、より好ましくは１ｍＭから２ｍＭである。しかし添加量は、容易な実験的繰り返しにより、調製時、保存時、および測定時に不溶性の沈殿物を生じない濃度に適宜決定すればよく、上記数値に必ずしも限定されるものではない。
【００１８】
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）
（組織トロンボプラスチンの調製）
組織トロンボプラスチンの調製原料としては、新鮮または凍結融解したウシまたはウサギまたはサルの脳を用い、これらを十分に水洗いして凝血混などを除去した。脳組織にアセトンを加えてワーリングブレンダーでホモジナイズして調製された脱脂状のアセトン粉末、あるいは、脳組織を生理的食塩水に加えてワーリングブレンダーでホモジナイズして、数回の遠心とホモジナイズの操作を繰り返して調製された脳組織体を生理的食塩水に懸濁させ、４８℃の振とう式恒温抽出装置に約３０分間かけ、ついでこれを遠心分離した上清を組織トロンボプラスチン液として得た。この方法は、続生化学実験講座８ 血液下、４９７ページ、東京化学同人に記載の方法に従った。
【００２０】
あるいは、ホロ化組織因子を、組換え組織因子に適切なリン脂質を再構成させることにより調製した。組換えウサギまたはウシ組織因子０．２μｇと、予め調製しておいたホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン（混合比７：３）からなるリポソーム０．２ｍｇとを、０．２％デオキシコール酸を含むＨｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬに混合し、３７℃で１時間インキュベート後、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌで２４時間透析し、組換え再構成組織因子を得た。この方法は、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２２，Ｐ１７７，１９９３に記載の方法に従った。
【００２１】
（実施例２）
（少なくともフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含む血漿由来組成物／吸着処理血漿の調製）
ウシ血漿１００ｍＬに２０Ｗ／Ｖ％の硫酸バリウムを加えて、室温で３０分間混和し、ゆっくり撹拌した。その後、硫酸バリウムを５，０００×ｇで遠心して除去し、得られた上清に血液凝固第ＸＩＩＩ因子阻害剤として１ｍＭのＮ−エチルマレイミドを添加混合することにより吸着処理血漿、すなわち、少なくとも血液凝固第Ｖ因子およびフィブリノゲンを含む組成物を調製した。なお、比較対照として１ｍＭのＮ−エチルマレイミドを含まない吸着処理血漿を調製して用いた。
【００２２】
（実施例３）
（複合因子血液凝固能測定試薬の調製）
上記実施例１で調製した凍結融解ウシ脳由来の組織トロンボプラスチンの１容と実施例２で調製した吸着処理血漿の１容とに、さらに２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍＭ乳酸カルシウムを加えた溶液の１容とを混合して複合因子血液凝固能測定試薬とした。対照として、上記実施例２で示した１ｍＭのＮ−エチルマレイミドを含まない吸着処理血漿を用いて複合因子血液凝固能測定試薬を調製した。
【００２３】
（実施例４）
（各種阻害剤の効果）
Ｎ−エチルマレイミドを含まない以外は実施例２と同様に操作して吸着処理血漿を調製した。そして吸着処理血漿１容とさらに、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍＭ乳酸カルシウムを加えた溶液１容とを混合し、表１に示す物質を各濃度になるように添加し、ＸＩＩＩ因子の阻害率および１０℃で２４時間保存後の不溶物の生成度合いを判定した。結果を表１に示した。その結果、チオール基と反応しうる物質でＸＩＩＩ因子を阻害することにより、不溶性物質の生成を防止できることが明らかとなった。
【００２４】
0004370071.tif 000002
【００２５】
（実施例５）
（阻害剤の濃度調整）
Ｎ−エチルマレイミドの濃度を変化させた以外は実施例２と同様に操作して吸着処理血漿を調製した。そして吸着処理血漿１容と１０ｍＭ乳酸カルシウムを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）１容とを混合し、１０℃で２４時間保存後および−２０℃での凍結融解直後の不溶物の生成度合いを目視で判定した。結果を表２に示した。その結果、Ｎ−エチルマレイミドは０．１ｍＭ濃度の添加量でも不溶性物質の生成を抑制することが判ったが、より効果的な添加量は１ｍＭ〜１０ｍＭであった。
【００２６】
0004370071.tif 000003
【００２７】
（実施例６）
（少なくともフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含む血漿由来組成物／吸着処理血漿への阻害剤の添加による保存効果）
本発明の効果を調べるため、実施例２で調製した３例の吸着処理血漿１容と１０ｍＭ乳酸カルシウムを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）１容とを混合し、１０℃で２４時間保存後と−２０℃での凍結融解直後の不溶物の生成度合いを目視で判定した。結果を表３に示した。この結果、Ｎ−エチルマレイミドを吸着処理血漿に加えたものは、何れも１０℃保存または凍結融解処理後も、不溶性物質の生成が認められないのに対して、Ｎ−エチルマレイミドを添加しないものは、全例１０℃保存または凍結融解処理後に不溶性物質の生成が認められ、Ｎ−エチルマレイミドの添加により不溶性物質の生成が防止できることが判った。
【００２８】
0004370071.tif 000004
【００２９】
（実施例７）
（複合因子血液凝固能測定試薬における安定化効果）
本発明の効果をさらに調べるため、Ｎ−エチルマレイミドの濃度を１ｍＭ、１．５ｍＭおよび２ｍＭと変化させて調製した吸着処理血漿を用いて、実施例４と同様の方法で複合因子血液凝固能測定試薬を調製し、その効果を確認した。その結果を表４に示した。
【００３０】
Ｎ−エチルマレイミドを添加しない試薬では１日目において不溶性物質の生成が認められるのに対して、Ｎ−エチルマレイミドを１ｍＭ、１．５ｍＭまたは２ｍＭ添加した試薬では何れも不溶性物質の生成は認められなかった。従って、複合因子血液凝固能測定試薬においても、Ｎ−エチルマレイミドの添加により不溶性物質の生成が防止でき、試薬の安定化が可能であることが判った。
【００３１】
0004370071.tif 000005
【００３２】
（実施例８）
（測定性能に及ぼす阻害剤の効果）
実施例７で調製した各試薬の性能を確かめるために、血液凝固分析装置コアグレックス７００（国際試薬株式会社製）を用いて、市販のコントロール血漿を測定して血液凝固時間を得て、試薬の性能を評価した。調製した各試薬を１０℃で各日数保存した後の試薬を用いて測定したコントロール血漿の血液凝固活性を求めることにより、調製した試薬の性能と安定性を調べた。その結果を表５に示した。その結果、ＮＥＭを添加しても血液凝固時間は変化しなかった。
【００３３】
Ｎ−エチルマレイミドを添加しない試薬では１日目〜４日目において経時的に血液凝固活性の低下が認められるのに対して、Ｎ−エチルマレイミドを１ｍＭ、１．５ｍＭまたは２ｍＭ添加した試薬では何れも血液凝固活性の低下は認められなかった。従って、複合因子血液凝固能測定試薬の性能においても、Ｎ−エチルマレイミドの添加により試薬性能の低下が防止でき、試薬の安定化が可能であることが判った。
【００３４】
0004370071.tif 000006
【００３５】
（実施例９）
（その他の阻害剤の効果）
阻害剤として、モノクロロアミド、アクリルアミド、グリシンアミド、およびジチオピリジンとＮ−エチルマレイミドとの１：１混合物をその他の代表例として、実施例５〜８を繰り返し実施した。結果は、Ｎ−エチルマレイミドと同等若しくは若干劣る程度であり、発明の目的である安定化効果は確認された。
【００３６】
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の阻害剤を阻害効果が得られる有効量添加することによる、ヒトまたは動物由来の血漿成分、少なくとも血液凝固因子であるフィブリノゲンおよび血液凝固第Ｖ因子を含む組成物を安定化する手段を提供する。この安定化手段を導入することにより、調製時、保存時および測定時に安定な、この組成物並びに少なくとも組織トロンボプラスチン、血液凝固第Ｖ因子およびフィブリノゲンを含む複合因子血液凝固能測定試薬を提供することができる。