(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
その光源から出射された光を直線偏光にする偏光子と、
その偏光子から出射された直線偏光を波長分散する１枚の回折格子と、
その回折格子で分散された光を変調し、その変調した光の左円偏光と右円偏光を交互に生成可能な変調手段と、
その変調手段で変調された光の光路上に配置されたフローセルと、
光検知部に前記フローセルの光を受光する光検知手段と、
前記光検知手段の出力から、円二色性を示す信号を検出する円二色性検出手段と、
前記光検知手段の出力から、前記フローセルにある試料の総量を示す信号を検出する総量検出手段を備え、
前記円二色性検出手段の出力と前記総量検出手段の出力から、前記試料の光学異性体の存在率を示す出力ができる信号処理手段を備えたＨＰＬＣ用円二色性検出器。
【請求項２】
光源と、
その光源から出射された光を直線偏光にする偏光子と、
その偏光子から出射された直線偏光を波長分散する１枚の回折格子と、
その回折格子で分散された光を変調し、その変調した光の左円偏光と右円偏光を交互に生成可能な変調手段と、
その変調手段で変調された光の光路上に配置されたフローセルと、
光検知部に前記フローセルの光を受光する光検知手段と、
前記光検知手段の出力から、円二色性を示す信号を検出する円二色性検出手段と、
前記光検知手段の出力から、前記フローセルにある試料の総量を示す信号を検出する総量検出手段を備え、
前記円二色性検出手段の出力と前記総量検出手段の出力から、前記試料の光学異性体の存在率を示す出力ができる信号処理手段を備えたＨＰＬＣ用円二色性検出器であって、
前記信号処理手段の出力は、少なくとも前記総量検出手段の出力に基づく値が所定の基準を超えた場合にのみ出力されるようにしたことを特徴とするＨＰＬＣ用円二色性検出器。
【請求項３】
前記総量検出手段の出力の変化が所定基準より大きくなったときをピークの開始点とし、その後、前記総量検出手段の出力の変化が所定基準より小さくなったらピークの終了点として、前記ピークの開始点と前記ピークの終了点を基にベースラインを求める機能と、
その求めたベースラインに基づいて、前記総量検出手段の出力を補正する機能を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載のＨＰＬＣ用円二色性検出器。
【請求項４】
前記光源は、可視領域以外の一部の放射強度が他の領域に比べて相対的に大きい光源であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＨＰＬＣ用円二色性検出器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＰＬＣ用円二色性検出器に関するもので、より具体的には光学異性体の存在率をリアルタイムに測定するための装置の改良に関する。
【０００２】
【発明の背景】
一般に、医薬品に用いる有機化合物は、有機合成によって得られるが、得られた有機化合物中にどれくらい光学異性体が存在するのか等を調べる必要があるので、従来はその化合物を光学分割して測定してきた。
【０００３】
よく知られているように、光学異性体の分離分析を行う際に有効な手法としてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）がある。そして、光学分割を行う方法はキラルな移動相または固定相を用いて、それぞれの光学異性体を立体構造の差を基に分割した後に検出器で検出し、得られた信号を波形処理することで面積比などを求めることで行われる。しかし、光学分割可能なＨＰＬＣ用のカラムは立体構造の差が少ない光学異性体を分離しなくてはならない特殊性から高価であることに加えて、このようなカラムによる試料の分離に要する時間が長いという問題がある。
【０００４】
これに対し、ｇ−ｆａｃｔｏｒにより評価・分析する手法が提案されている。このｇ−ｆａｃｔｏｒは、試料から出射された光に基づいて、円二色性（ＣＤ）信号と光吸収信号（吸光度）を求め、ＣＤ信号を光吸収信号で除算したものである。つまり、ｇ−ｆａｃｔｏｒは、同時にＵＶ吸収と円二色性を測定して試料中の光学異性体の存在率を求めるときに用いられている値であり、求められたｇ−ｆａｃｔｏｒを検量線に対応させると光学異性体の存在率が求まるようになっている。
【０００５】
このように、使用する検出器を、光学活性な物質の円二色性を利用するようにすると、光学分割可能なＨＰＬＣ用のカラムを使わずに済む。これは、物質が示す光吸収が右円偏光と左円偏光に対して異なる現象を利用すると、通常のＨＰＬＣ用のカラムで試料を溶出しても、その試料の右円偏光の吸収力と左円偏光の吸収力の差に基づいて、光学異性体の存在率が調べられるからである。
【０００６】
ところで、このような方法で試料中に含まれる光学異性体の存在率を測定するためには、カラムから溶出された試料をフローセル中に導き、リアルタイムで測定していく。すると、セル中の試料の含量が変化していくことになるので、セル中の試料の円二色性とＵＶ吸収力の両方をできるだけ同時に測定していかなくてはならない。
【０００７】
このような技術的要求を満たす測定器として、特開昭５３―１１６８８４号公報に開示された発明が提案されている。この発明は、光源，モノクロメータ，偏光子，変調器，試料槽及び検出器からなる円二色性分散測定用光学系を有する。そして、それぞれ独立の電気系を用意して、切り換えスイッチによって光吸収信号と円二色性分散信号を切り換えながら測定をするものである。
【０００８】
理屈上では、ピークの溶出時間よりも充分高速にスイッチ切替を繰返せば紫外可視光（ＵＶ）の吸収と円二色性の同時測定は可能となるが、現実的には切替時の過渡現象中は信号が正確には測定できないので、ＨＰＬＣの様に（最も早い場合には）数秒でピークが溶出してしまう状況にはとても適用出来ない。
【０００９】
また、その他の先行技術としては、例えば特開昭５４−５６４８４号公報に開示されたｇ−ｆａｃｔｏｒ測定装置がある。係る装置は、白色光源、単色計、偏光子、集光系、円偏光変調器、試料槽、光電変換素子、信号処理系及び記録計からなる円二色測定装置を前提とする。そして、上記の偏光子に替えて偏光ビームスプリッターを配置して一方の光路は円二色性測定系とし、他方を標準光束として光電変換して得られる各信号のうち、円二色性測定系における交流信号と直流信号の比を求める回路と、円二色性測定系における直流信号と標準光束による直流信号との比の逆数を対数変換する回路と、さらにこの両者の比を求める回路を設けることにより、ｇ−ｆａｃｔｏｒを求めるようになっている。
【００１０】
光吸収測定用の光路と、円二色性測定用の光路に分かれているためＨＰＬＣに適用すると２つのフローセルを直列に接続するしかない。そうすると下流側のフローセルではピークが上流側よりも広がるし、更に時間差も発生する。どちらの現象もデータ処理で補正するのは不可能ではないが溶媒の種類や流量が変われば補正もやり直す必要があり実用的ではない。
【００１１】
また、仮に２種類の信号を同時に取得する装置があったとしても、さらに問題がある。すなわち、図１は、試料の紫外可視光の吸光度信号（ＵＶ信号）と円二色性（ＣＤ）を測定し、さらにそこから、所定の演算によりｇ−ｆａｃｔｏｒを計算した結果をプロットしたものである。
【００１２】
同図に示すように、ｇ−ｆａｃｔｏｒは、試料の左右円偏光に対する吸収強度の差、つまり円二色性信号（ＣＤ信号）を、ＵＶの吸収強度で割り算して求められている。従って、同図中のｔ１〜ｔ２区間に示すように、試料の溶出が少なくＵＶ吸収が極端に少なかった場合、分母が０に近くなるので、ＣＤ信号の変化に対するｇ−ｆａｃｔｏｒの変化量が大きくなる。そして、ＣＤ信号側わずかに＋になった時にはｇ−ｆａｃｔｏｒは大きな正値をとり、逆にＣＤ信号側わずかに−になった時にはｇ−ｆａｃｔｏｒは大きな負値をとる。よって、ＣＤ信号が僅かに±に振れるだけで、その時のｇ−ｆａｃｔｏｒは正負に非常に大きく変化してしまう。
【００１３】
そして、上記のようにさらに、ｇ−ｆａｃｔｏｒの振幅が大きく、しかも、正負への振れが大きいとともに、測定結果が見にくくなり、光学分離能力が低いカラムを用いて簡単な光学分離を行い、Ｒ―体の試料とＳ−体の試料を分取するのが困難となる。
【００１４】
よって測定結果をモニタしながらカラムから溶出された試料を分取しようとした場合、Ｒ−体とＳ−体がはっきり分離される場所では試料を問題無く分取できるものの、両者が完全分離されずにやや混ざり合って溶出されてきてしまう部分がある場合には、この部分の試料の円二色性は異性体同士で相殺されるため、ｇ−ｆａｃｔｏｒはゼロ付近の値を取ることになる。すると、溶出される試料の分離状態をモニタしても、カラムが試料を完全分離がＲ−体もＳ−体も殆どなかった為にｇ−ｆａｃｔｏｒが乱れているのか、不完全分離されたＲ−体、Ｓ−体の円二色性がたまたま相殺されてｇ−ｆａｃｔｏｒが乱れているのかと言うことの違いを、表示されるグラフからでは判断しにくくなるという問題がある。
【００１５】
本発明は、上記した背景に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、上記した問題を解決し、同時に円二色性信号と試料の総量信号を取得することができ、さらに、その取得した信号に基づいて求める光学異性体の存在率（ｇ−ｆａｃｔｏｒ）を精度よく測定でき、その存在率を用いたＲ―体の試料とＳ−体の試料を分取も容易にできるＨＰＬＣ用円二色性検出器を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記した目的を達成するために、本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器では、光源と、その光源から出射された光を直線偏光にする偏光子と、その偏光子から出射された直線偏光を波長分散する１枚の回折格子と、その回折格子で分散された光を変調し、その変調した光の左円偏光と右円偏光を交互に生成可能な変調手段と、その変調手段で変調された光の光路上に配置されたフローセルと、光検知部に前記フローセルの光を受光する光検知手段と、前記光検知手段の出力から、円二色性を示す信号を検出する円二色性検出手段と、前記光検知手段の出力から、前記フローセルにある試料の総量を示す信号（実施の形態では「ＵＶ吸収信号（全体の吸収信号）」に対応する）を検出する総量検出手段を備え、前記円二色性検出手段の出力と前記総量検出手段の出力から、前記試料の光学異性体の存在率（実施の形態では、「ｇ−ｆａｃｔｏｒ」に対応する）を示す出力ができる信号処理手段を備えて構成した（請求項１）。
【００１７】
この発明によれば、同一の光検知手段の出力に基づいて円二色性を示す信号と、試料の総量を示す信号とが算出できるので、それら両信号を同時に取得できる。その結果、光学異性体の存在率を示すｇ−ｆａｃｔｏｒを精度よく求めることができる。
【００１８】
また、光源と、その光源から出射された光を直線偏光にする偏光子と、その偏光子から出射された直線偏光を波長分散する１枚の回折格子と、その回折格子で分散された光を変調し、その変調した光の左円偏光と右円偏光を交互に生成可能な変調手段と、その変調手段で変調された光の光路上に配置されたフローセルと、光検知部に前記フローセルの光を受光する光検知手段と、前記光検知手段の出力から、円二色性を示す信号を検出する円二色性検出手段と、前記光検知手段の出力から、前記フローセルにある試料の総量を示す信号を検出する総量検出手段を備え、前記円二色性検出手段の出力と前記総量検出手段の出力から、前記試料の光学異性体の存在率を示す出力ができる信号処理手段を備えたＨＰＬＣ用円二色性検出器において、前記信号処理手段の出力は、少なくとも前記総量検出手段の出力に基づく値が所定の基準を超えた場合にのみ出力されるように構成するとよい（請求項２）。ここで、「総量検出手段の出力に基づく値」とは、係る出力そのままの値でも良いし、その出力から求められる値や、ｇ−ｆａｃｔｏｒのようにその出力と他のデータとにより求められる値等各種の値を含む。そして、「所定の基準」も、単純にある値としきい値の大小を比較するものに限らず、変化率などの他の評価値に変換後に比較するようにしてももちろん良い。さらに、「所定の基準を超えたときのみ出力する」とは、所定の基準を満たさない場合には、信号処理自体もしないようにしてもよいし、信号処理（演算処理）は実行するものの、最終的に出力しない（０とする）ものでも良い。
【００１９】
フローセル中に試料が供給されない場合には、総量を示す信号が０またはきわめて小さい値となる。一方、試料が供給されている場合には、存在率に関係なく総量を示す信号は一定の値をとる。よって係る総量を示す信号をサーチし、それが所定の基準をこえたときのみ存在率を出力することにより、見やすい出力となる。
【００２０】
そしてユーザーにとっては、フローセル中に光学異性体が同量含まれている場合と、単にフローセル中に試料がほとんど含まれていない場合の区別が信号処理手段の出力からはっきりする。そして、この違いは、総量検出手段の出力が所定基準の大きさを超えた時にしか信号処理手段から出力がされないことで区別がつく。
【００２１】
前記光学異性体の存在率を示す出力としては、例えば前記総量検出手段の出力の大きさと前記円二色性検出手段の出力の大きさから求まるように構成することができる。このように構成すると、信号処理手段の出力を、円二色性検出手段の出力の大きさと総量検出手段の出力の大きさの比（割り算処理）で求めることができるので、信号処理手段の出力は光学異性体の存在率の分かりやすい出力となる。もちろん、フローセル中に光学異性体が同量含まれている場合と、単にフローセル中に試料がほとんど含まれていない場合の区別はよりはっきりするようになる。もちろん、これ以外の手法をとることもできる。
【００２２】
上記した請求項１または請求項２の発明を前提とし、前記総量検出手段の出力の変化が所定基準より大きくなったときをピークの開始点とし、その後、前記総量検出手段の出力の変化が所定基準より小さくなったらピークの終了点として、前記ピークの開始点と前記ピークの終了点を基にベースラインを求める機能と、その求めたベースラインに基づいて、前記総量検出手段の出力を補正する機能を備えるとなおよい（請求項３）。
【００２３】
前記光源は、可視領域以外の一部の放射強度が他の領域に比べて相対的に大きい光源でとすることができる（請求項４）。この可視領域以外の一部とは、例えば、紫外領域とすることができる。
【００２５】
このように構成すると、フローセル中に溶出される溶媒組成比が時間とともに変化し、試料の総量（実施の形態では「ＵＶ信号」）のベースラインが変化したとしても、そのベースラインの位置を検出し、そのベースラインに基づいて真の総量を求めることにより、最終的に求める光学異性体の存在率も上記ベースラインの変動の影響を受けず、真の値を算出することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態を説明する。本形態のＨＰＬＣ用円二色性検出器は、所定の光源からの光をＨＰＬＣ用のカラムから溶出した試料に照射し紫外可視光の吸収具合を、吸光度信号（ＵＶ吸収信号）や円二色性信号（ＣＤ信号）としてそれぞれ同時に検出し、その検出情報から試料中の異性体の存在率を求められるようになっている。
【００２７】
図２は、本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器を構成する光学系装置１を示した概略図である。同図に示すように、光学系装置１は、光源２から出る光を回折格子３で分光し、分光された所定波長の光をＰＥＭ２６にて変調して左右の円偏光を生成し、図外のカラムから溶出しフローセル５に流入された試料に照射させる。そして、フローセル５を通過した光を後段のＵＶ・ＣＤ検出装置６の光検知器たるフォトダイオード２９に入力させるようになっている。
【００２８】
この光学系装置１について詳述すると、まず、光源２は、紫外部に強い輻射強度をもつＨｇＸｅランプまたはＨｇランプを用いている。係るランプを用いたのは以下の理由からである。一般に従来の円二色性検出器は正確な円二色性スペクトル測定を目的として作られているため、光源には放射エネルギーレベルが図３に示すように紫外部で比較的フラットなＸｅランプが使用されてきた。
【００２９】
一方、本形態では、円二色性信号を可能な限り強い信号として取り出すことを目的としたため、ＨｇランプやＨｇＸｅランプを光源として使用した。ＨｇＸｅランプの放射強度特性は、例えば図３に示すようになっており、全体として強度が大きいものの、所定の波長において強いＨｇの輝線スぺクトルが出現する。従って、これまでこれらのＨｇＸｅランプ等は、円二色性スペクトル測定の場合には、その強い輝線の波長の影響を受け、スペクトルが乱れてしまうという障害があるので、実際に使用されておらず、また、使用しようという考えすらなかった。
【００３０】
しかし、本形態ではスペクトルバンド幅を輝線スペクトルよりも十分大きくするので輝線スペクトルの影響はあまりない。そして、ＨｇＸｅランプは紫外領域に特に強いエネルギー分布を示すため、回折格子を使用した場合に問題となる長波長側の成分が散乱により迷光として紫外領域の設定波長領域に現れる量を相対的に小さくすることができる。つまり、後述するように１枚の回折格子３を用いた光学系でも、迷光の影響は可及的に抑制できる。
【００３１】
なお、このことはＨｇＸｅランプに限ることはなく、Ｈｇランプでもよい。また、重水素ランプのように、紫外部での絶対的な放射量は小さくても、紫外部以外の長波長側領域での放射量がさらに小さいと、迷光の影響は可及的に抑制される。つまり、本発明でいうところの紫外部で強い放射強度をもつランプとは、絶対量が大きいのはもちろんであるが、それ以外の波長領域（長波長側）における放射強度に比べて相対的に大きい場合も含む。
【００３２】
また、重水素ランプのように絶対的な放射強度が小さくても、本実施の形態では１枚の回折格子３にて分散光学系が形成されるため、従来のダブルモノクロメータなどに比べて光学系内での損失が少なく、フローセル５に照射される際の光強度は比較的強くできる。
【００３３】
そして、上記の光源２から出た光は、レンズＬ１で平行光にされ、偏光子９に照射されるようにしている。偏光子９は、石英のローションプリズムを使用している。この石英のローションプリズムは、透過波長範囲が１６０〜１０００ｎｍと広いが、常光と異常光間の変位角が１°〜２°と小さい。従って、偏光子９を光源２に近い位置において異常光と常光が完全に分離する様に配置する。
【００３４】
そして、レンズＬ１を通過した平行光が偏光子９を通過することにより、直線偏光が出射される。この時、常光と異常光に分離されるが、そのうちの一方が最終的に回折格子３で波長分散された後、フローセル５に照射されるようにしている。なお、係る照射される光が、常光か異常光かは、各光学部品の相対的な位置関係に基づいて決定される。
【００３５】
さらに、本形態では偏光子９を光軸周りに回転可能とし、その透過容易軸、つまり、偏光子９から出射される直線偏光の角度を調整可能としている。具体的には、光源２から回折格子３に至る光路の途中に、取り付け板１０を配置する。この取り付け板１０には、その光路に貫通孔１０ａを設け軸受け１１を構成する。そして、偏光子９を両端開口に筒状にしたホルダ１２に装着し、そのホルダ１２を軸受け１１に回転自在に取り付ける。
【００３６】
また、ホルダ１２の光源１０側の端部（図中上端）には、第１ギヤ１３が取り付けられている。もちろん、第１ギヤ１３の中央にも貫通孔が設けられ、光源２からの光が通過できるようにしている。
【００３７】
一方、取り付け板１０には、上記の光路から離れた位置に貫通孔１０ｂを設け、その貫通孔１０ｂ内にベアリング１５を装着する。このベアリング１５に回転軸１６を挿入し、回転軸１６の一端近傍をベアリング１５により回転自在に保持させる。
【００３８】
そして、回転軸の一端に第２ギヤ１７を取り付け、この第２ギヤ１７と第１ギヤ１３を連結する。また、回転軸１６の他端は、ベースプレート１８に設けたベアリング１９内を貫通させるとともに、その端部に第１プーリ２０が取り付けられる。そして、この第１プーリ２０が、ベルト２１を介してモータ２２の出力軸に装着された第２プーリ２３と連結される。
【００３９】
これにより、モータ２２が回転すると、ベルト２１を介して回転力が回転軸１６に伝達されるので、それに追従して第２ギヤ１７さらには第１ギヤ１３が回転し、偏光子９も光軸周りに回転する。
【００４０】
従って、モータ２２により回転角度制御ができ、任意の角度で停止することのできるものを用いると、偏光子９を回転させ、偏光面の調整が簡単になる。そして、この回転させる際の回転範囲は、±４５゜程度とし、精度は±１゜程度で十分調節可能である。
【００４１】
なお、この偏光子９を通過した光は、回折格子３で波長分散された後、ＰＥＭ２６に入射し、そこを通過することにより位相変調されて交互に右円偏光と左円偏光になる。そして、ＰＥＭ２６から出射された円偏光が、レンズＬ２により集光されフローセル５に照射され、そのフローセル５内を通過した光が、ＵＶ・ＣＤ検出装置６の受光部分であるフォトダイオード２９に入力される。
【００４２】
すると、フローセル５内を流れる試料の円二色性から右円偏光と左円偏光の吸収特性が異なるので、フォトダイオード２９に受光される光強度が変わる。従って、フォトダイオード２９から出力される電気信号に基づいて、ＵＶ・ＣＤ検出装置６にあるＣＰＵ回路３０（図中外）に取り込まれ計算される。
【００４３】
さらに本形態では、レンズＬ１と偏光子９の間にソレノイド３１で開閉するシャッター３２を設けている。このシャッター３２により、光源２からの光を遮光可能としている。
【００４４】
つぎに、上記した光学系装置１の動作原理について説明する。まず、フローセル５にＨ２Ｏ等の円二色性を持たない溶液を流した状態でモータ２２を動作させて偏光子９を回転させる。
【００４５】
この時、フォトダイオード２９の出力を監視し、円二色性がゼロとなる位置でモータ２２の回転を停止する。この停止したときは、円二色性を持たない試料について検出結果が、「円二色性が無い」であるので、偏光子の初期配置が完了したことになる。
【００４６】
ちなみに、フローセル５内の内壁における反射や、窓板等の偏光特性によって、たとえ円二色性を有しない試料を用いて測定しても、「円二色性が有る」というような測定結果が得られることがある。つまり、右円偏光と左円偏光の位相がずれて出力に差が出る場合である。このように、光学系の偏光特性に基づくための円二色性の信号出力（出力差）が存在すると、測定精度の低下を招くので、できるだけゼロに近づける補正を行いたい。そこで、回折格子３より光源２側に設置した偏光子９を回転させることにより、補正ができる。
【００４７】
すなわち、回折格子３の持つ偏光特性を積極的に利用し、偏光子９を通過した直線偏光を回折格子３で波長分散する際に、その直線偏光の対称性を崩す。そして、この対称性を崩したことに合わせて右円偏光と左円偏光の位相を意図的にずらすようにする。この位相のずれ量は、直線偏光が回折格子３に照射される際の角度位置により異なるので、直線偏光の偏光方向を回転させて回折格子３で波長分散する際に生じる位相のずれ量を、光学系の偏光特性から生じる右円偏光と左円偏光との位相差を逆にすることにより相殺させ、上記のように補正する。
【００４８】
換言すると、偏光子９を透過した光は、右円偏光と左円偏光の位相が一致した（ずれが零）光である。この光を僅かに偏光特性をもつ回折格子Ｇを通すと位相のズレが現れる。ＰＥＭ２６を透過する前に左右円偏光間の位相がずれているため、ＰＥＭ変調角が「最初の位相のズレ角±ＰＥＭ変調角」となる。これにより変調位相角の異なる左右楕円偏光となる。フローセル５内で生じる反射及び窓板の偏光特性がこの変調位相の異なる楕円偏光を変調位相角の等しい楕円偏光または円偏光に戻すように作用することで偽円二色性が完全に除去されるものと考えられる。
【００４９】
さらに、補正すべき偽円二色性に基づく出力信号を正確に測定しＣＰＵに呼び込むため、本形態では、レンズＬ１と偏光子９の間にシャッター３２を挿入して光を遮断した状態での出力信号を読み込み、その出力信号のベースラインを求める。次いでシャッター３２を開いた状態で測定し、その出力信号が上記のベースラインと同じになる様に偏光子９を回転する。
【００５０】
なお、偏光子９をモータ２２で回転するようにしているが、手動で回転させるようにしてもよい。また、直線偏光の偏光方向と回折格子３の相対角度が変更できればよいので、本形態のように偏光子９を回転させるのではなく、回折格子３をその法線方向を中心として回転させるようにしてもよい。但し、偏光子９を回転させる方が機構並びに制御が簡単で好ましい。
【００５１】
図４は、上記した光学系装置１の後段に接続され、その光学系装置１から出力される光を受光して得られる信号（ＣＤ信号やＵＶ吸収信号（吸光度）が混在している）に対して信号処理を得るＵＶ・ＣＤ検出装置６のうち、ＣＤ信号とＵＶ信号を得るための信号処理回路４７の部分を主に示している。
【００５２】
同図に示すように、光源２から出た光はレンズＬ１で集光され透過軸が回転可能な偏光子９に進む。偏光子９を透過した光は回折格子３に入射し、そこにおいて回折された光のうち決められた波長の光だけ次のＰＥＭ２６に向かう。ＰＥＭ２６で位相変調された光はフローセル５を透過しフォトダイオード２９に進む。このフローセル５までが光学系装置１である。
【００５３】
そして、ＵＶ・ＣＤ検出装置６の入力部となるフォトダイオード２９で光信号は電気信号に変換され、後段のＵＶ・ＣＤ検出装置６に至る。なお、回折格子３は、モータ３５の出力を受けて回転し、測定中はある設定された波長の光がフォトダイオード２９に入るように作動する。すなわち、フォトダイオード２９には、波長を固定した状態での時間変化に伴う出力変化を検出するようになる。
【００５４】
このフォトダイオード２９から出力される信号は、第１アンプ３６で増設された後第１差動アンプ３７の入力と第１サンプルホルド回路３８に与えられる。サンプルホルド回路３８では直線偏光の変調時間に同期する信号がサンプルホルドされ、この第１サンプルホルド回路３８の出力は、積分回路３９に与えられ、ここで積分される。この積分回路３９の出力Ｖｄが、フォトダイオード２９から出力される検出信号のうち、直線偏光時の信号つまり後に詳述するＵＶ吸収信号に対応するものである。そしてこの積分回路３９の出力が、上記差動アンプ３７の入力に与えられる。
【００５５】
これにより、第１差動アンプ３７の出力は、直流信号を除去した交流信号（ＰＥＭ変調周波数）となる。この交流信号は第２アンプ４０で約百倍以上に増幅され次の第２サンプルホルド回路４１に与えられるとともに第３サンプルホルド回路４２にも与えられる。
【００５６】
そして、これらサンプルホルド回路４１，４２では、右円偏光と左円偏光の変調時間に同期する信号がサンプルホルドされ、第２差動アンプ４３にて両サンプルホルド回路４１，４２の出力の差、つまり、右円偏光と左円偏光の差信号ＶＤＩＦＦが第２作動アンプ４３で得られる。この差信号ＶＤＩＦＦと、積分回路３９の出力がインタフェース４４を介してＣＰＵ３０に与えられる。
【００５７】
なお、ＣＰＵ３０では差信号ＶＤＩＦＦを、積分回路３９の出力である直流信号Ｖｄで割り算し、係数を掛ける演算を行いＣＤ信号を算出する。それと同時に、直流信号ＶｄをＣＰＵ３０でＬＯＧ変換してＵＶ吸収信号も算出する。なおこれらの算出結果はインタフェース４４でＤ／Ａ変換され、出力端子４６に出力される。なお、この直流信号Ｖｄは、同期信号の周期（約２０μｓｅｃ）に比べればゆっくりとした変化となり、係る意味で直流信号と称しているが、厳密に時間的に一定ではない。
【００５８】
このＶｄはＰＥＭ変調の位相差零の位置に同期してサンプルホルドされた信号であるので正確には直線偏光の強度でありそのＬＯＧ変換されたものは、直線偏光の吸収を算出することになるので、普通の分光器による吸収信号と同じように利用できる。これにより本実施の形態ではＣＤ信号と同時にＵＶ吸収信号の測定が可能である。
【００５９】
ＵＶ吸収信号の取り込まれる同期信号は第１同期パルス発生器（ＳＰ１）の出力によって第１サンプルホルド回路３８の同期信号として供給され、右円偏光の同期信号は第２同期パルス発生器（ＳＰ２）の出力によって第２サンプルホルド回路４１に同期信号として供給され、左円偏光の同期信号は第３同期パルス発生器（ＳＰ３）の出力によって第３サンプルホルド回路４２の同期信号として供給される。
【００６０】
さらに本実施の形態では同期信号のパルス周期は約２０μｓｅｃでパルス幅は約６００ｎｓｅｃが使用されている。各サンプルホルド回路は、６００ｎｓｅｃの間に信号値を取り込むようになっている。
【００６１】
図５〜図７には、ＵＶ・ＣＤ検出装置６中の各サンプルホルドがどのようなタイミングで行われるかを具体的に示してある。図５に示されている波形は、フォトダイオード２９に入力された光が電気信号に変換された様子を示している。つまり、最大電圧をＶ１とし最低電圧をＶ２とする交流信号であり、その交流信号に直流電圧Ｖｄが重畳された電圧波形となっている。
【００６２】
ＰＥＭ２６の変調角は、ＰＥＭドライバ２６ａにより制御されている。したがって、ＰＥＭ２６を通過した光の偏光状態が、右円偏光，左円偏光並びに直線偏光がどれになっているかは、ＰＥＭドライバ２６ａがわかる。したがって、そのＰＥＭドライバ２６ａからの制御信号に基づいて、直線偏光となるタイミングで第１同期パルス発生器（ＳＰ１）から直線偏光の同期信号が出力され、右円偏光となるタイミングで第２同期パルス発生器（ＳＰ２）から右円偏光の同期信号が出力され、左円偏光となるタイミングで第３同期パルス発生器（ＳＰ３）から左円偏光の同期信号が出力される。この各同期信号が発生した時に各サンプルホルド回路に入力された電圧値が保持される。
【００６３】
したがって、ＵＶ・ＣＤ検出装置６における各地点Ａ〜Ｄの出力波形は、図６，図７のようになる。すなわち、図６（ａ）は、右円偏光の同期信号が第２サンプルホルド回路４１に与えられることで、電圧Ｖ１が右円偏光信号としてサンプルホルドされた様子が示してある。つまり、この図は図４中Ｂ点における信号波形である。
【００６４】
また、図６（ｂ）は、左円偏光の同期信号が第３サンプルホルド回路４２に与えられることで、電圧Ｖ２が左円偏光信号としてサンプルホルドされた様子が示してある。つまり、この図は図４中Ｃ点における信号波形である。
【００６５】
そして、図７（ａ）は、第１サンプルホルド回路３８でサンプルホルドされたＵＶ吸収信号を示している。つまり、この図は図４中Ａ点における信号波形である。さらに、図７（ｂ）は、第２差動アンプ４３で得られる右円偏光と左円偏光の差信号ＶＤＩＦＦ、すなわち円二色性信号を示している。つまり、この図は図４中Ｄ点における信号波形である。
【００６６】
このように、ＰＥＭ（光変調器）２６の駆動回路であるＰＥＭドライバ２６ａの出力に基づいて、フォトダイオード（光検知器）２９の出力信号から、左右の円偏光時及び直線偏光時のタイミングで信号を取り出すことができる。そして、その様に取り出した左右円偏光時の信号差からＣＤ信号を取り出し、直線偏光時の信号がＵＶ信号を取り出すことができる。そして、これらの各信号は、単一の光検出器で受光した信号に基づいて算出するものであり、ＣＤ信号とＵＶ信号を簡易かつ正確に同時に取り出すことができる。
【００６７】
そして、一般に光学異性体はＵＶ吸収をもつものが多くＵＶ吸収端の位置近傍にＣＤ信号が強く現れることが多い。このためＣＤ信号を探す最初の目標はＵＶ吸収を測定してＵＶ吸収の強い波長位置でＣＤ信号を測定することが行われている。それ故本形態のように一台の装置でＵＶ吸収信号とＣＤ信号が同時に測定できることは限られた空間の有効利用の面だけでなく装置のコスト低減の面で大変効果が大きい。
【００６８】
そして、このようにＵＶ吸収信号とＣＤ信号が同時に測定できることから、このＵＶ・ＣＤ検出装置６では、光学系装置１の出力を基に試料中に含まれる光学異性体の存在率を示す出力をｇ−ｆａｃｔｏｒとして求めることができる。
【００６９】
従って、ｇ−ｆａｃｔｏｒは、ＣＤ信号をＵＶ信号で除算すれば良いので、第２差動アンプ４３の出力（ＶＤＩＦＦ）を積分回路３９の出力（ＶＤ）で割ることにより求められる。そして、本形態では、さらにＵＶ信号を監視しながら、一定期間のみ上記ｇ−ｆａｃｔｏｒの算出処理をするようにしている。そして、係る処理を行うためのＵＶ・ＣＤ検出装置６の具体的な処理回路の一例を示すと、以下のようになる。
【００７０】
図８は、主としてＵＶ・ＣＤ検出装置９のハードウエア構成の一例を示している。同図に示すように光学系装置１の出力はフォトダイオード２９で電気信号に変換された後、上記第１サンプルホルド回路３８，第２サンプルホルド回路４１，第３サンプルホルド回路４２等を含む信号処理回路系４７にて、ＵＶ吸収信号とＣＤ信号に分けて取り出される。
【００７１】
取り出された信号は、インタフェース４４（Ａ／Ｄ変換部４４ａ）によってＡ／Ｄ変換されてそれぞれデジタル信号としてＣＰＵ３０に入力される。ＣＰＵ３０は、入力された信号を基に、ｇ−ｆａｃｔｏｒを求める所定の計算処理を行い、算出された情報はインタフェース４４（Ｄ／Ａ変換部４４ｂ）によってＤ／Ａ変換されて、アナログ信号としてＵＶ・ＣＤ検出装置６の外部へ出力端子４６を経由して出力される。
【００７２】
なお、ＵＶ・ＣＤ検出装置６を操作するための信号やデータ処理のための設定値は、キーボード４８を介してＣＰＵ３０に与えられ、また、それらの入力状況はディスプレイであるＬＣＤ４９に表示され確認できるようになっている。
【００７３】
そして、ｇ−ｆａｃｔｏｒの算出・出力などの各種の処理は、ＲＯＭ３０ａに格納されたプログラムに基づき、ＣＰＵ３０が演算処理する際のワークエリアとしてＲＡＭ３０ｂを適宜用いながら実行する。
【００７４】
そして、ＣＰＵ３０で行うｇ−ｆａｃｔｏｒの演算処理は、以下のようにして求められ、リアルタイムでアナログまたはデジタル信号でＵＶ・ＣＤ検出装置６の外部に出力されるようになっている。
すなわち、ｇ−ｆａｃｔｏｒは、次式の演算で得られる。
ｇ−ｆａｃｔｏｒ＝δＡＵ／ＡＵ      …（１）
ここで、δＡＵ＝Ａ（Ｌ）−Ａ（Ｒ）  …（２）
Ａ（Ｌ）：左円偏光に対するＵＶ吸収
Ａ（Ｒ）：右円偏光に対するＵＶ吸収
ＡＵ    ：直線偏光に対するＵＶ吸収
δＡＵとＣＤ信号との関係は、下記の式（２）で定義される。ここでＣＤは偏光の楕円率を角度で表現したものである。
【００７５】
【数１】
0004278783.tif 000002
【００７６】
ＣＤ信号を使ってｇ−ｆａｃｔｏｒを表現すると、式（１），（２）から下記式（３）のようになる。
【００７７】
【数２】
0004278783.tif 000003
【００７８】
以上の計算により求められたｇ−ｆａｃｔｏｒは、インタフェース４４によりＤ／Ａ変換してアナログ信号として出力すると同時に、ＲＳ―２３２Ｃ等のデジタル信号としても出力する。
【００７９】
上記処理がｇ−ｆａｃｔｏｒを求めるための基本処理アルゴリズムである。ところで、本実施の形態では、ＵＶ吸収信号が一定の値（しきい値）以上になったときのみｇ−ｆａｃｔｏｒの計算処理を実行するようになっている。すなわち、ＣＰＵ３０は、図９に示すような処理を実行するようになっている。
【００８０】
同図に示すように、まず初期設定をする（ＳＴ１）。この初期設定は、ｇ−ｆａｃｔｏｒの計算処理を開始するしきい値を設定する。実際には、キーボード４８から与えられた数値をしきい値としてセットするようになる。そして、このしきい値の入力処理は、例えば図１０に示すようなＬＣＤ４９の表示メッセージにしたがって処理することができる。同図には、ＬＣＤ４９に示される表示の一部を示した。もちろんこれ以外の表示が出力されていても構わない。
【００８１】
同図（ａ）に示すように、「ＵＶ  ＴＨＬＥＳＨＯＬＤ」の表示は、ｇ−ｆａｃｔｏｒの計算を開始するにおいて、ＵＶ信号にどれくらいのしきい値を設けるかの設定場面の表示である。この例では、初期値して「０．０５」が設定されている。同図の０．０５の表示をキーボード４８上の[ＥＤＩＴ／ＥＮＴＥＲ]キーにより点滅させ編集を開始する。
【００８２】
同図（ｂ）に示す×．××は点滅中を意味する。この点滅中に、「数値キー」を用いてｇ−ｆａｃｔｏｒの計算を開始するに最適と思われるＵＶ信号を設定する。同図（ｃ）のように、数値キーにて入力が終了したら、再度[ＥＤＩＴ／ＥＮＴＥＲ]キーにて登録する。同図には、一例としてしきい値を０．０８ＡＵとした。
【００８３】
上記のようにして初期設定が終了したならば、実際の計測に移行する。すなわち、信号処理回路４７からは、順次リアルタイムでＵＶ信号，ＣＤ信号の元となるデータが送られてくるので、それら両信号を取得する（ＳＴ２）。そして、取得したＵＶ信号の値と初期設定でセットしたしきい値とを比較し（ＳＴ３）、ＵＶ信号の方が大きい場合にはステップ４に進み、ＵＶ信号，ＣＤ信号に基づいて上記した演算式にしたがいｇ−ｆａｃｔｏｒを算出し、ＵＶ信号がしきい値以下の場合には、ステップ５に進みｇ−ｆａｃｔｏｒを０にする。
【００８４】
そして、上記のようにして算出あるいはセットされたｇ−ｆａｃｔｏｒと、ＵＶ信号，ＣＤ信号を関連付けて格納する（ＳＴ６）。なお、両信号の格納は、ステップ２でデータを取得した際に行ってももちろん良い。そして、上記したステップ２からステップ６の処理を測定が終了するまで繰り返し実行する（ＳＴ７）。
【００８５】
そして、上記した演算処理や、算出結果等の一時記憶は、例えばＲＡＭ３０ｂを用いて実行することになる。なお、ステップ６で格納したデータは、外部モニタに出力表示されたり、プリンタ・プロッターにプリントアウトされたりしてユーザーに視覚的に理解させることができるようになる。また、取得あるいは算出した各種のデータは、別途記憶装置に記憶させることもできる。
【００８６】
さらには、ステップ６のようにＣＰＵ３０側では格納せず、順次出力し外部記憶装置に記憶させたり、表示・プリントアウトなどをするようにしてももちろん良い。
【００８７】
上記した実施の形態の装置を用いた測定結果の一例を図１１に示す。図１１は、図１に示した実験結果に対して本発明の処理を行った結果を示している。すなわち、ｇ−ｆａｃｔｏｒの演算開始のしきい値を０．１５ＡＵにセットし、取得したＵＶ信号，ＣＤ信号とそれに基づいて求めたｇ−ｆａｃｔｏｒを、記録・表示したものである。図中の横軸は試料の溶出開始時からの時間経過を示す。
【００８８】
前述したようにＣＰＵ３０の動作が行われると、フローセル５中に試料が所定量以上溶出されてからの間（１９．６＜ｔ＜２０．８）のｇ−ｆａｃｔｏｒのみがステップ４を実行して算出され、それ以外の区間はステップ５によりｇ−ｆａｃｔｏｒが０となる。
【００８９】
同図から明らかなように、このように、ＵＶ吸収信号に０．１５ＡＵのしきい値を設け、この値を超えるようなＵＶ吸収信号がＣＰＵ３０に入力された場合のみｇ−ｆａｃｔｏｒを算出するようにすると、測定結果に含まれるノイズが大幅に小さくなるのがわかる。
【００９０】
すなわち、ＵＶ吸収がない場合には、ｇ−ｆａｃｔｏｒを求める演算式の分母が、０或いはほぼ０となるので、ｇ−ｆａｃｔｏｒの値は正又は負の大きな値をとる。しかも、演算式の分子であるＣＤ信号の変化に対するｇ−ｆａｃｔｏｒの変化量も非常に大きいものとなる。さらに、ＵＶ吸収がない、つまり試料がほとんど供給されていない状態では、ノイズその他の要因から、ＣＤ信号は、０附近で正負に小刻みに揺れる。その結果、ｇ−ｆａｃｔｏｒは、高周波数で正負に切り替わり、しかも、振幅が大きくなる。一方、ある程度以上のＵＶ吸収があると、分母も正の所定の大きさの値となるので、ＣＤ信号の変化に対するｇ−ｆａｃｔｏｒの変化量も小さくなり、適正な測定が可能となる。
【００９１】
なお、本実施の形態では、ＵＶ信号がしきい値より大きい場合にｇ−ｆａｃｔｏｒを算出するようにしたが、本発明はこれに限ることはなく、算出自体は常時行うようにし、モニタ・プリンタなどの外部装置に出力（表示・プリントアウト等）したり、最終的に測定結果を記憶保持する際に、ＵＶ信号がしきい値未満のｇ−ｆａｃｔｏｒは無視する（０とみなす）ようにしてもよい。
【００９２】
また、算出されるｇ−ｆａｃｔｏｒの時間変化率（時間方向への差分値）を求め、その値が一定値以上大きいときには、ｇ−ｆａｃｔｏｒの出力を行わないという方法もある。この場合には、ｇ−ｆａｃｔｏｒの時間変化率を設定する手段を前述したしきい値の設定と同様な設定画面を設けて設定し、ｇ−ｆａｃｔｏｒが求まるたびに時間変化率の計算を行い、その結果とｇ−ｆａｃｔｏｒ変化率設定値とを比較することでｇ−ｆａｃｔｏｒの出力を行うかどうかを判定してもよい。
【００９３】
つぎに、本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第２の実施の形態を説明する。本実施の形態は、基本的に第１の実施の形態と同様の構成であり、異なる点は、ｇ−ｆａｃｔｏｒの算出方法である。そして、第１の実施の形態の場合には、その時点の信号だけを処理するために、ＣＰＵ３０としても低速及びまたはメモリー容量も少ないものを用いて実行可能となる。これに対し、本実施の形態では、測定開始から測定終了時までのクロマトグラム全体を記憶し、それらに対してデータ処理をする必要がある。そこで、ＣＰＵ３０として係る演算処理を可能とする高速でメモリー容量も多いものを実装するようにしても良いし、或いは、図８に示したように出力端子４６に外部のデータ処理するためのコンピュータ（パソコンやＨＰＬＣ用のデータ処理装置等）を接続し、そのコンピュータにデータ処理をさせるようにしても良い。
【００９４】
測定開始時（試料の溶出開始時）のＵＶ吸収信号の出力をゼロとすると、その後フローセルに試料がなくなったときのＵＶ吸収信号の出力も０となるはずであるが、実際には０とならないことが多々ある。
【００９５】
この原因としては、以下のようなものがある。すなわち、クロマトグラムは、ミクロ的に観察すれば必ず時間的に上下にドリフトしている。通常のクロマトグラム間演算であれば無視できるドリフトであっても、微小信号であるＣＤ信号の大きさを示す値とＵＶ吸収信号の大きさを示す値を割り算する場合には、その精度に影響を与える。
【００９６】
また、溶媒組成比を時間とともに変化させるグラジェント溶出などでは、ＵＶ吸収信号のベースラインが変化し、ある時点のＵＶ吸収信号をゼロとしても、時間とともにゼロ点はずれてしまう。
【００９７】
このような状態でｇ−ｆａｃｔｏｒをグラフ等にプロットすると、ピーク成分の寄与による部分と溶媒組成の変化による部分が加算されたＵＶ吸収信号の大きさは真のＵＶ吸収信号の大きさより大きくなり、その結果、ｇ−ｆａｃｔｏｒは小さくなってしまう。
【００９８】
一方、ＣＤ信号は、左円偏光と右円偏光の吸収の差に基づく値であるので、外気温の変化、セル内の圧力変化、溶媒組成により変化といった外的要因は相殺される。しかも、左円偏光と右円偏光に基づく信号は、厳密には同時ではないが、左右円偏光を切り替える変調周期は２０μｓｅｃ程度となり、クロマトグラムの変化は、秒オーダーであるので実質的に左右円偏光の出力は同時のものとみなせる。その結果、上記ドリフト又はベースライン変化という現象はほとんど現れない。このため、信号が外的要因によりドリフト又はベースライン変化することによる補正は、ＵＶ吸収信号のみ行うことで、所定の精度が確保できる。
【００９９】
その結果、図１２に示すように、ＵＶ吸収信号が上記要因によりドリフト又はベースライン変化したときに、算出されるｇ−ｆａｃｔｏｒは時間の経過とともに歪んでしまい真の値が得られなくなる。つまり、本来、光学分割されないカラムから溶出される試料中の異性体の存在率は一定であるので、試料の溶出中のｇ−ｆａｃｔｏｒの値も一定となる。しかし、図１２を見ると、時間経過に伴いｇ−ｆａｃｔｏｒの値も変化しており、歪んでいるのがわかる。
【０１００】
そこで、本実施の形態では、ＵＶ吸収信号のピークの裾に当たる両端をピークの開始・終了点とし、この２点間を結ぶ線をベースラインとし、ＵＶ吸収信号の大きさをベースラインを基準にした大きさとする。また、本形態ではこのようにＵＶ信号のみ補正するようにしたが、本発明はこれに限ることはなく、ＣＤ信号も補正するようにしても良い。
【０１０１】
そして、上記のように補正された後の真のＵＶ信号とＣＤ信号からｇ−ｆａｃｔｏｒを算出することになる。なお、係る算出処理は、代入する値が上記のように補正後の真のＵＶ信号となる以外は第１の実施の形態と同様であるのでその詳細な説明を省略する。次に具体例をあげつつ本形態をさらに詳述する。
【０１０２】
図１３は、ＵＶ吸収信号を波形処理することにより、ピークの開始点・終了点を正確に求め、さらに、その得られた開始点と終了点を結んだ線（ベースラインＢ）からＵＶ吸収信号の高さを求め、この大きさとＣＤ信号の大きさよりｇ−ｆａｃｔｏｒを求めた図である。
【０１０３】
同図に示すように、ＣＰＵ３０に入力されるＵＶ吸収信号を前述した波形処理を行うことで、ピークスタートＰＳやピークエンドＰＥは簡単に求まる。続いて、その２点を通過する直線をベースラインＢとして求め、ベースラインＢからのＵＶ吸収信号の高さからｇ−ｆａｃｔｏｒを求める。すると、同図中に示すように、ドリフトによる影響のないｇ−ｆａｃｔｏｒが得られるのがわかる。
【０１０４】
そして、ピークスタート並びにピークエンドの算出方法としては、例えば図１４に示すような波形処理をすることにより求めることができる。すなわち、まず最初にピークスタートＰＳを決める。この決め方は、信号の時間方向への微分値（差分値）ΔＵＶを求めることで、そのピークの傾き（信号量／時間）を算出し、その値が一定値を超えたらピークスタートＰＳとする。
【０１０５】
続いて、ピークスタートＰＳ検出後は差分量が「０」となる位置、すなわちピークトップＰＴを検出し、このピークトップＰＴ検出後は、一定の傾き以下になったらピークエンドＰＥとする方式を採ることができる。なお、同図に示すように、ピークスタートＰＳのしきい値Ｔ１とピークエンドＰＥのしきい値Ｔ２を設定することで、ピークスタート・エンドを判定するようにしてもよく、その他各種の方法が採れる。
【０１０６】
図１５は、ベースラインＢを求めた後、各時間における波形の高さ（応答量）を求める具体的な方法を示す図である。同図に示すように、ＵＶ吸収信号とＣＤ信号は、同時測定であるので、得られるＵＶ吸収信号やＣＤ信号は同一時間の信号が連続的に並んでいることになる。よって、双方の同一時間におけるベースラインＢからの高さ（応答量）を求めて、ｇ−ｆａｃｔｏｒを算出することができる。なお、本実施の形態では、ＣＤ信号については補正を行っていないので、その応答量は横軸からの高さとしている。
例えば、同図に示すように、ｔ１〜ｔ７のそれぞれの時間のＵＶ吸収信号やＣＤ信号の応答量を求め、この応答量をそれぞれ以下のように定義する。
【０１０７】
【表１】
0004278783.tif 000004
【０１０８】
それぞれの時間でのｇ−ｆａｃｔｏｒの値は、第１の実施の形態と同様にして、ＵＶ吸収信号やＣＤ信号の応答量を基に以下のように表される。
【０１０９】
【数３】
0004278783.tif 000005
【０１１０】
この求めた値をグラフ等にプロットすることによりベースラインによる補正後のｇ−ｆａｃｔｏｒを求めることができる。なお、上記したＵＶ吸収信号の応答量やＣＤ信号の応答量の求め方の別な方法としては、例えば、双方の同一時間における各ベースラインからの高さをそれぞれ所定時間内で積分し、その積分量をそれぞれの応答量としてもよい。つまり、面積比によってもｇ−ｆａｃｔｏｒを求めることができる。
【０１１１】
以下に、本実施の形態の装置を用いて行った試料の分析例を示す。試料にはＣＤ特性を持つｆｌａｖａｎｏｎｅを用い、そのｇ−ｆａｃｔｏｒを求めることによりＲ−体，Ｓ−体の割合（存在比）を求めた。図１６は、分析条件を示している。
【０１１２】
図１７，図１８には、既知のｆｌａｖａｎｏｎｅの割合（存在比）を分析したクロマトグラムを示した。どの図中にも試料のＵＶ吸収信号とＣＤ信号の両方の信号を示してある。
【０１１３】
図１７（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）には、ｆｌａｖａｎｏｎｅのＲ−体／Ｓ−体の割合を１００／０，８０／２０，６０／４０，５０／５０とした試料の測定結果がこの順番で示している。また、図１８（ａ），（ｂ），（ｃ）には、Ｒ−体／Ｓ−体の割合を４０／６０，２０／８０，０／１００とした試料の測定結果が順番に示してある。なお、試料はｆｌａｖａｎｏｎｅのＲ−体，Ｓ−体のそれぞれの純品を用意し、それらを計量して混合し作成したものであり、試料の総量は全て同じである。
【０１１４】
図１７（ａ）〜（ｄ）に示すように、Ｒ−体／Ｓ−体の混合の割合が１００／０から５０／５０になるようにＲ−体の割合が減ってくると、ＣＤ信号のピークは小さくなっていくのがわかる。特に、Ｒ−体／Ｓ−体の試料が等量となる５０／５０の試料においては、ＣＤ信号のピークが完全に消滅している。
【０１１５】
さらに、図１８（ａ）〜（ｃ）に示されているように、Ｓ−体が占める割合の方がＲ−体の割合よりも増えてくると、ＣＤ信号のピークはＲ−体の割合が多かった時と対称的なピークを示すようになっている。もちろん、全ての測定において、ＵＶ吸収信号のピーク位置及び高さは同じである。
【０１１６】
図１９は、各種の既知のＲ−体／Ｓ−体の混合したｆｌａｖａｎｏｎｅ試料のピークトップ付近のｇ−ｆａｃｔｏｒを求めた結果である。この結果は、すでに述べた、ＵＶ吸収信号をベースラインを用いて補正する処理方法により求めている。
【０１１７】
前述したように、ＣＤ信号の波形は、Ｒ−体／Ｓ−体の混合が等量の場合を境に、Ｒ−体の占める割合が多い時とＳ−体の占める割合が多い時の様子が対称となることから、ｇ−ｆａｃｔｏｒのグラフの形状もＲ−体／Ｓ−体の混合が等量の場合を境に対称的な形状となっているのが解かる。
【０１１８】
図２０は、上記した既知のｆｌａｖａｎｏｎｅの割合（存在比）を分析したクロマトグラムを基に作成したｇ−ｆａｃｔｏｒの検量線である。この検量線は、横軸に割合、縦軸にｇ−ｆａｃｔｏｒの大きさを示したものである。そして、未知の試料のｇ−ｆａｃｔｏｒが求まれば、この検量線を参照することにより、その試料中の光学異性体の存在率を求めることができるようになる。
【０１１９】
以下に、未知の試料の光学異性体の存在率を具体的に求めた例を説明する。図２１は、Ｒ−体／Ｓ−体の存在比が１／９９の試料と５１／４９の試料と、４種類の存在比未知試料ＵＮＫ１〜ＵＮＫ４を測定した結果を示している。
【０１２０】
同図に示すように、存在比１／９９の試料のｇ−ｆａｃｔｏｒを測定し、図２０の検量線より求めた存在比は０．９２／９９．０８であった。（図中では、ｇ−ｆａｃｔｏｒ（−）（＋）と書いた列を参照）また、同じ試料を光学分割カラムを使用してＲ−体／Ｓ−体を分離した後、ピーク面積を求めて存在比を求めた結果が１．９８／９８．０２であった。（図中では、ＵＶ−１５７０（−）（＋）と書いた列を参照）
【０１２１】
同様に、５１／４９の試料では、ｇ−ｆａｃｔｏｒにより求めた値が５１．０８／４８．９２であり、光学分割カラムを使用して測定した場合が５１．７５／４８．２５であった。この結果からわかるように、ＵＶ吸収信号のベースラインを補正してｇ−ｆａｃｔｏｒを求めて光学異性体の存在率を調べるほうが、光学分割カラムを用いて光学異性体の存在率を調べるよりも精度よく分析しているといえる。
【０１２２】
従って、未知試料ＵＮＫ１〜ＵＮＫ４を測定した結果も、ｇ−ｆａｃｔｏｒを測定し光学異性体の存在率を調べる場合と、光学分割カラムを用いて光学異性体の存在率を調べる場合で測定結果が異なっているが、ｇ−ｆａｃｔｏｒを求めて光学異性体の存在率を調べた結果の方が信頼性が高いといえる。
【０１２３】
図２２，図２３にＲ−体とＳ−体の存在比が、９９／１の試料を分析したクロマトグラムを示す。図２２は、光学分割カラムを用いＲ−体とＳ−体を分離した時のクロマトグラムであり、図２３は、通常のカラムで試料を溶出しｇ−ｆａｃｔｏｒを求めた場合のクロマトグラムである。
【０１２４】
図２２に示すように、Ｒ−体とＳ−体が完全分離できていると、Ｒ−体の偏光性を示す信号とは別にＳ−体の偏光性を示す信号がグラフ上で確認できる程度正側と負側に示されているのがわかる。
【０１２５】
一方、図２３に示すように、Ｒ−体とＳ−体が一緒に溶出してしまい不分離の場合には、ＣＤ信号は、片側（この場合は正側）にしか現れない。このような場合でも、ｇ−ｆａｃｔｏｒを測定し、存在率を求めることができる。なお、同図（ｂ）中１番目のピークは、試料のピークではなく、試料を溶かした溶媒のピークである。
【０１２６】
図２４に、光学分割の完全でないカラムを用いて試料を溶出し、リアルタイムでｇ−ｆａｃｔｏｒを求めた様子を示した。同図には、ＵＶ吸収信号やＣＤ信号も併せて示している。
【０１２７】
同図に示すように、ＵＶ吸収信号のピーク頂上に付近にＣＤ信号の正負のピークができている。ＣＤ信号のピークの各頂上付近では、試料が光学的に高純度で分離されていることを示しているので、この位置で溶出されてきた試料を他と区別して分取すると高純度なＲ−体またはＳ−体の試料が得られる。
【０１２８】
一方、このカラムでは基本的に完全な光学分離はできないのでＲ−体とＳ−体の試料が混ざって溶出される領域がある。すなわち、Ｒ−体とＳ−体のそれぞれのＵＶ吸収信号のピークの裾が重なる付近であり、特にＣＤ信号がゼロの場所ではＲ−体とＳ−体の試料が等量溶出されている場所である。そして、高純度にＲ−体またはＳ−体の試料が溶出されている領域では、ｇ−ｆａｃｔｏｒは＋あるいは−で一定値を示し、純度が低下してＲ−体とＳ−体が混ざり合うとともにｇ−ｆａｃｔｏｒはゼロに近づく。
【０１２９】
そこで、不完全な光学分割時に高純度なＲ−体またはＳ−体の試料を分取するのであれば、ｇ−ｆａｃｔｏｒをリアルタイムでモニタし、ｇ−ｆａｃｔｏｒが＋あるいは−のどちらか一方を示す試料だけを分取すれば、高純度な試料が得られる。
【０１３０】
この場合、ベースライン付近でｇ−ｆａｃｔｏｒが大きく変化すると見にくくなり、分取時のモニタとして利用できなくなる。一方、本発明の様にＵＶ吸収信号にしきい値を設け、一定値以上の大きさの信号があった時のみｇ−ｆａｃｔｏｒが表示されるようにすると、正負に大きく揺れることもなく、ｇ−ｆａｃｔｏの利用がし易くなる。
【０１３１】
図２５には、光学分割可能なカラムでＲ−体とＬ−体の試料を分離した時のｇ−ｆａｃｔｏｒを示している。このように完全分離できるタイプでもｇ−ｆａｃｔｏｒを精度良く求めることができる。
【０１３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器では、請求項１のような構成にすることで、同時に円二色性信号と試料の総量信号を取得することができ、高精度な測定ができる。さらに本発明では左円偏光と右円偏光の間に生じる直線偏光のタイミングをとらえてＵＶ測定を行っているので、１つのセルで測定できる。
【０１３３】
また、請求項２のように構成すると、試料が所定量以上フローセル中に溶出されてこないと、検出手段は検出結果を出力しないので、特に、フローセル中に光学異性体が同量含まれている場合と、単にフローセル中に試料がほとんど含まれていない場合の区別がはっきりし、光学異性体の存在率を示す測定結果が見やすくなる。つまり、試料が溶出されていない区間での存在率の大きな変動がない。さらに、取得した２つの信号に基づいて求める光学異性体の存在率（ｇ−ｆａｃｔｏｒ）を精度よく測定でき、その存在率を用いたＲ―体の試料とＳ−体の試料を分取も容易にできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来のＨＰＬＣ用円二色性検出器の出力を示す図である。
【図２】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態にある光学系部分の構成を示した断面図である。
【図３】  ランプの波長に対する放射特性を示すグラフである。
【図４】    本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態の構成を示したアナログ処理系のブロック回路図である。
【図５】  受光部からの信号と、同期信号との関係を示した図である。
【図６】  （ａ）は本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態にある受光部に入力される信号から右偏光時のタイミングでＳ／Ｈした信号を示した波形図である。
（ｂ）は本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態にある受光部に入力される信号から左偏光時のタイミングでＳ／Ｈした信号を示した波形図である。
【図７】  （ａ）は本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態にある受光部に入力される信号からＵＶ吸収時のタイミングでＳ／Ｈした信号を示した波形図である。
（ｂ）は本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態にある受光部に入力される信号のうちＣＤ信号を示した波形図である。
【図８】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態で行われる信号の処理過程を説明するためのブロック回路図である。
【図９】  ｇ−ｆａｃｔｏｒを処理するためのフローチャートである。
【図１０】  （ａ）は、初期設定画面の一例を示す図（その１）である。
（ｂ）は、初期設定画面の一例を示す図（その２）である。
（ｃ）は、初期設定画面の一例を示す図（その３）である。
【図１１】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第１の実施の形態からの出力を示す図である。
【図１２】  ＵＶ信号のベースラインが変化した場合における補正前のｇ−ｆａｃｔｏｒを示す図である。
【図１３】  ＵＶ信号のベースラインが変化した場合における補正後のｇ−ｆａｃｔｏｒを示す図である。
【図１４】  ＵＶ信号のベースラインを求めるためピークスタートとピークエンドを検出するアルゴリズムを説明する図である。
【図１５】  ＵＶ信号のベースラインが変化した場合における補正後のｇ−ｆａｃｔｏｒの算出アルゴリズムを説明する図である。
【図１６】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第２の実施の形態が測定する試料の測定条件を示した図である。
【図１７】  （ａ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が１００／０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
（ｂ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が８０／２０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
（ｃ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が６０／４０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
（ｄ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が５０／５０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
【図１８】  （ａ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が４０／６０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
（ｂ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が２０／８０の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
（ｃ）はＲ−体，Ｓ−体の存在比が０／１００の時のＣＤ信号とＵＶ信号を示す図である。
【図１９】  図１７，図１８に示す各存在比におけるピークトップ付近を拡大してｇ−ｆａｃｔｏｒを並びて示した図である。
【図２０】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第２の実施の形態の出力に適用する検量線である。
【図２１】  存在比が未知の試料に対し、本発明と従来方法でそれぞれ存在比を求めた実験結果である。
【図２２】  光学分離カラムが溶出する試料のクロマトグラムである。
【図２３】  非光学分離カラムが溶出する試料のクロマトグラムである。
【図２４】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第２の実施の形態が非光学分離カラムが溶出する試料を分析したときの出力を示す図である。
【図２５】  本発明に係るＨＰＬＣ用円二色性検出器の第２の実施の形態が光学分離カラムが溶出する試料を分析したときの出力を示す図である。
【符号の説明】
２  光源
６  ＵＶ・ＣＤ検出装置（光検知部，信号処理手段，総量検出手段，円二色性検出手段）
２６  ＰＥＭ（変調手段）
２９  フォトダイオード（光検知部）
３０  ＣＰＵ（信号処理手段）
３８  第１サンプルホルド回路（総量検出手段）
３９  積分回路（総量検出手段）
４１  第２サンプルホルド回路（円二色性検出手段）
４２  第３サンプルホルド回路（円二色性検出手段）
４３  第２差動アンプ（円二色性検出手段）
４７  信号処理回路系（総量検出手段，円二色性検出手段）
５１  パーソナルコンピュータ（信号処理手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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