(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼに対する特異的結合性を測定することを特徴とする中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質結合蛋白の検出法。
【請求項２】
哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼが、哺乳類脳細胞のＰ２画分由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ又は哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼのリコンビナントプロテインジスルフィドイソメラーゼである請求項１記載の検出法。
【請求項３】
結合蛋白が、少なくともビスフェノールＡが結合する結合蛋白である請求項１又は２記載の検出法。
【請求項４】
哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼに対する結合性を測定することを特徴とする中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質のスクリーニング法。
【請求項５】
哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼが、哺乳類脳細胞のＰ２画分由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ又は哺乳類脳細胞由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼのリコンビナントプロテインジスルフィドイソメラーゼである請求項４記載のスクリーニング法。
【請求項６】
結合蛋白が、少なくともビスフェノールＡが結合する結合蛋白である請求項４又は５記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、中枢神経系に作用する内分泌かく乱化学物質の結合蛋白の検出法及び当該結合蛋白を利用する中枢神経系に作用する内分泌かく乱化学物質のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
内分泌かく乱化学物質は、いわゆる環境ホルモンとよばれる物質であり、動物の体内で営まれている正常なホルモンの作用に影響を与える化学物質である。かかる物質としては、ＰＣＢ、ビスフェノールＡ、フタル酸エステル、アジピン酸エステル等の工業用化学物質、ＤＤＴ、ジコホール、アミトロール等の農薬、カドミウム、水銀、鉛等の重金属、ダイオキシン、ベンゾピレン等が知られている。
【０００３】
この内分泌かく乱化学物質の動物への影響としては、雌の雄性化、雄の雌性化、個体数の減少等の生殖系への影響が顕著であり、細胞の核内における作用であると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら内分泌かく乱化学物質の中枢神経系に対する作用については未だ明確にされてはおらず、その解明が切望されている。
従って、本発明の目的は内分泌かく乱化学物質の中枢神経系への作用を解明するための新たな手段を開発することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、内分泌かく乱化学物質の中枢神経系への影響を検討してきたところ、ビスフェノールＡに代表される内分泌かく乱化学物質に胎児期に曝露された動物の脳内アミンが有意に減少し、内分泌かく乱化学物質が中枢神経系に影響を及ぼすことが明らかとなった。そしてさらに検討したところ、脳細胞のＰ２画分には、内分泌かく乱化学物質が特異的に結合する結合蛋白が存在し、当該結合蛋白はプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であり、当該ＰＤＩに対する結合性を測定すれば、中枢神経に作用する内分泌かく乱化学物質がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）に対する特異的結合性を測定することを特徴とする中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質結合蛋白の検出法を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、プロテインジスルフィドイソメラーゼに対する結合性を測定することを特徴とする中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質のスクリーニング法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者は、内分泌かく乱化学物質の代表例としてビスフェノールＡを選択し、脳内アミンの含量に対する影響を検討した。その結果、ビスフェノールＡを摂取したマウス（胎児期又は幼児期）は、脳内アミン、特にドパミンの含量が顕著に低下していた。また、脳組織内のドパミンｍＲＮＡを定量したところ、ドパミンの前駆体であるチロシン水酸化酵素ｍＲＮＡ及びドパミン結合蛋白Ｄ４ｍＲＮＡが顕著に増加していた。従って、内分泌かく乱化学物質が、中枢神経系に作用していると考えられた。
そこで、本発明者は、中枢神経作用性にかかわる内分泌かく乱化学物質の結合蛋白を脳細胞から検出すべく検討したところ、脳細胞のＰ２画分にあること、さらには当該結合蛋白はプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であることを見出した。従来、ＰＤＩは哺乳類の肝臓、甲状腺、脳、胃、膵臓、小腸などの細胞膜に存在し、翻訳直後の蛋白質のＳＳ結合の形成を触媒することにより、分泌蛋白や膜蛋白の３次構造の安定化や、活性発現に極めて重要な酵素である。しかし、内分泌かく乱化学物質の結合蛋白として作用することについては全く知られていない。
【０００９】
本発明の検出法及びスクリーニング法においてはＰＤＩを用いる。ここでＰＤＩとしては、動物組織等から得られたものでもよいし、遺伝子組み換えにより得られたものでもよいが、特に哺乳類脳細胞のＰ２画分由来のもの、リコンビナントＰＤＩが好ましい。また哺乳類脳のＰ２画分由来のＰＤＩを用いることもできる。
ここで哺乳類としては、ラット、マウス、サル、イヌ、ブタ、ヒト等が挙げられるが、ラット、マウスが好ましい。また脳細胞としては、全脳のホモジネートをそのまま用いてもよいし、解剖学的に分画した脳（例えば、大脳皮質、海馬など）を用いてもよい。Ｐ２画分は、例えば全脳にバッファーを加えてホモジナイズし、ホモジネートを遠心分離（１５００×ｇ）して得た上澄をさらに遠心分離（１７０００×ｇ）を２回して沈澱として得られる。このＰ２画分をそのまま用いてもよいし、さらに精製して用いることもできる。
【００１０】
当該ＰＤＩに対する特異的結合性を測定すれば、中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質結合蛋白が検出できる。
【００１１】
ＰＤＩに対する特異的結合性は、例えばＰＤＩに標識した検体と過剰の非標識検体を加えてインキュベートし、標識ビスフェノールＡの全結合量と非特異的結合量の差から特異的結合量を測定し、当該測定値のスキャッチャード  プロット(Schatchard plot)から解離定数（Kd）及び結合数（Bmax）を測定することにより確認することができる。検体としてビスフェノールＡを用いた場合のＰ２画分のＢｍａｘは２２６２fmol／mg蛋白であり、Kdは１０３nMであり、Ｐ２画分には少なくともビスフェノールＡに特異的に結合する結合蛋白が存在することがわかる。また、検体としてビスフェノールＡを用いた場合のリコンビナントＰＤＩのＢｍａｘは４０４５fmol／mg蛋白であり、Kdは１０１nMであった。これらの結果から、Ｐ２画分に存在する、中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質結合蛋白は、ＰＤＩであることが判明した。また、ＰＤＩ及びＰ２画分のいずれにも内分泌かく乱化学物質であるフタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジエチル、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシルが結合することが判明している。
【００１２】
本発明の内分泌かく乱化学物質のスクリーニング法は、被検化学物質の上記結合蛋白に対する結合性を測定することにより行なわれる。当該結合蛋白に対する結合性は、例えば競合法により測定できる。競合法は、例えば標識ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）と被検化学物質との競合により、被検化学物質の結合性を測定できる。より具体的には、ＰＤＩと3Ｈ−ＢＰＡを結合バッファー中４℃９０分反応させフリー（Ｆ）とバウンド（Ｂ）を分離し、ＰＤＩに対する結合量を算出する。同様の実験を被検化学物質を加えて行い、同様に結合量を算出する。被検化学物質添加によって3Ｈ−ＢＰＡのＰＤＩに対する結合量の低下を指標に、被検化学物質の中枢神経系への作用の強さとする。
【００１３】
ここでビスフェノールＡの標識は、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉ等の放射性同位元素を用いることができるが、3Ｈが特に好ましい。
【００１４】
なお、標識に用いる化合物としては、ビスフェノールＡのほか、中枢神経作用性分泌かく乱化学物質として確認された化合物も用いることができる。
【００１５】
当該スクリーニング法により、被検化学物質が上記結合蛋白に結合性を有することがわかれば、その被検化学物質は中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質である可能性が示唆される。
【００１６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１７】
参考例１
マウスにビスフェノールＡ（ＢＰＡ）を胎児期及び幼児期に曝露させ、脳内アミン含量の変化を測定した。
ｄｄｙ系マウスにＢＰＡを２μｇ／ｇ食摂、０．５mg／ｇ食摂、２mg／ｇ食摂又は８mg／ｇ食摂の割合で、▲１▼交配前３週間（雄及び雌の両方）、▲２▼妊娠期間（胎児期）、▲３▼授受期間（雌親及び仔）、及び▲４▼離乳後３週間（仔）に与えた。仔マウスを３週齢及び６週齢でと殺し、脳を採取し脳内アミン量をＨＰＬＣで定量した。
その結果、脳内アミン量は３週齢仔及び６週齢仔ともにＢＰＡの曝露により顕著に低下し（図１〜３）、ＢＰＡが中枢神経系に影響を及ぼすことが明らかとなった。
【００１８】
参考例２
神経細胞の機能を有するＰＣ１２細胞を用いて、ビスフェノールＡの神経細胞に及ぼす影響について検討した。
ＰＣ１２細胞を１×１０5cells／mLで１０％馬血清と５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０メジウム含有ディシュに播き、ＢＰＡを含有する培地に交換した。３７℃で５時間、炭酸ガスインキュベータ内で培養した。培地を取り除き、細胞を回収し、細胞数及びドパミン量を測定した。その結果、図４に示すように、ＢＰＡの添加量に依存してＰＣ１２細胞内のドパミン量が低下し、またＢＰＡ添加後経時的にＰＣ１２細胞内ドパミン量が低下した。
【００１９】
実施例１
（１）Ｐ２画分の調製
ラットを無麻酔下で断首し、速やかに全脳を摘出した。摘出した全脳をバッファーA（０．３２Ｍ  シュクロース／１０mMトリス塩酸（pH７．５））で２回洗浄した。全脳の湿重量を測定し、９倍容量のバッファー Aを加え、Potter型テフロン（登録商標）−ガラスホモジナイザーで、８００〜１，０００rpmで１０回上下させてホモジナイズした。ホモジネートを１，５００×ｇにて１０min遠心分離を行い、上澄Ｓ１を回収し、沈澱Ｐ１はさらに９倍容量のバッファー Aを加え、Potter型テフロン−ガラスホモジナイザーで、８００〜１，０００rpmで１０回上下させてホモジナイズした。ホモジネートを１，５００×ｇにて１０min遠心分離を行い、上澄Ｓ２を回収した。Ｓ１とＳ２を１７，０００×ｇにて２０min遠心分離を行い、沈澱Ｐ２′を得た。Ｐ２′をバッファー Aで再懸濁して１７，０００×ｇにて２０min遠心分離を行い、沈澱Ｐ２（Washed P2）を得た。Ｐ２を適当量のバッファー B（バッファー Aに終濃度 ０．１mM  ＰＭＳＦ（セリンプロテアーゼ阻害剤、α−フェニルメタンスルホニルクロリド）、および終濃度０．０５％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を添加したもの）に１０mg／mLとなる様懸濁し、使用するまで−８０℃にて保存した。
【００２０】
（２）ビスフェノールＡ結合アッセイ
▲１▼結合バッファーとして、（５０mMトリス塩酸（pH６．８）、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＣａＣｌ2及び１mM  ＭｇＣｌ2）を含むバッファーを用いた。リガンドとして3Ｈ−ＢＰＡ、ディスプレーサとしてＢＰＡを用いた。
これらを含む反応液にＰ２画分を加えることにより反応を開始し、４℃で９０分穏やかに攪拌しながらインキュベーションした。
【００２１】
▲２▼１．５mLサンプルチューブ（反応液１．０mL）で上記▲１▼の結合反応を行った後、１４，５００rpmにて１０分間遠心分離を行った。上澄をアスピレーターで除去し、１．０mLの洗浄バッファー（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＣａＣｌ2、１mM  ＭｇＣｌ2）を加えて沈澱の表面とチューブの内面を洗浄した。１４，５００rpmにて３分の遠心分離を行った。上澄の除去から１４，５００rpmの遠心分離までの操作を繰り返した。沈澱を０．１mLの０．１Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、全量を液体シンチレーター用プラスチックバイアルに移した。３．０mLの液体シンチレーションカクテルを加え、液体シンチレーターにてＤＰＭのカウントを行った。
【００２２】
得られた結果を図５及び図６に示す。図５及び図６から明らかなように、Ｐ２画分結合蛋白に対するＢＰＡのＢｍａｘは０．４９nmol／mg蛋白であり、Kdは１．１４μＭであった。
【００２３】
実施例２
（１）各種被検化合物は、５０％エタノールに溶解し、順次希釈して用いた。
（２）結合反応
実施例１と同様の反応溶液組成にて行った。ただし、3Ｈ−ＢＰＡは５００nM、ディプレーサとしてのＢＰＡを各種被検化合物に換えて行った。すなわち、１．５mＬマイクロチューブに結合バッファー１２５μＬ、１０μＭ  3Ｈ−ＢＰＡ１２．５μＬ、被検化合物溶液５０μＬ、蒸留水５０μＬ、および１０mg／mLＰ２画分１２．５μＬを加えた。４℃にて９０分間反応させた。遠沈法によりＢ／Ｆ分離を行い、液体シンチレータにて測定を行った。
3Ｈ−ＢＰＡの結合率Ｂ／Ｂ０は次式により算出した。
【００２４】
【数１】
0004284045.tif 000002
【００２５】
その結果、図７に示すように、ノニルフェノールのような内分泌かく乱化学物質が脳内ＢＰＡ結合部位に結合することが明らかになった。このことは本結合試験法が中枢神経作用を示す内分泌かく乱化学物質のスクリーニング法として有効であることを示すものである。またこの結果から求められる親和性（Ki値）を比較することにより、阻害の強さが推定できる。なお、女性ホルモンであるエストラジオール等がこの結合蛋白に結合していないことから、この結合蛋白はエストロゲン受容体とは異なる。
【００２６】
実施例３
（１）ラット脳ＰＤＩ（rbPDI）のクローニングとHis-tag融合発現
ラット（６週齢，オス）より全脳を摘出し、ＩＳＯＧＥＮ(QIAGEN)を用いてｍＲＮＡを調製した。
ＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを調製し、ラット肝臓ＰＤＩの遺伝子情報をもとに設計したプライマーを２つ組み合わせとして用いてＰＣＲを行った。
【００２７】
組み合わせＡ（全長PDI前半）
センス: 5'- ggg ggg atc ctc cga cat gct gag ccg tgc -3'
アンチセンス:5'- agc gat gac gat att ctc at -3'
組み合わせＢ（全長PDI後半）
センス:5'- acc tga tga gcc agg aac tg -3'
アンチセンス:5'- ccc tcg aga gat ctg gct tct gca cta c -3'
【００２８】
組み合わせＡで増幅されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩにより制限酵素消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋(TOYOBO)に組み込んだ。このプラスミドをコンピテント細胞(DH5α COMPITENT high, TOYOBO)に導入し、形質転換させた。アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーの出現を確認した。アルカリ法によりプラスミド調製し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより制限酵素消化した。これに組み合わせＢで増幅されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにより制限酵素消化し、組み込んだ。このプラスミドをコンピテント細胞に導入し、形質転換させた。
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーの出現を確認した。アルカリ法によりプラスミド調製し、ＳａｃＩとＫｐｎＩにより制限酵素消化した。ｒｂＰＤＩ全長を含むＤＮＡ断片を、ｐＱＥ−８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に組み込んだ。このプラスミドをコンピテント細胞に導入し、形質転換させた。アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーを確認した。アルカリ法によりプラスミド調製し、全長のシーケンシングを行い、ｒｂＰＤＩの全長が含まれていることを確認した。
【００２９】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＰＤＩの精製法
上記の方法によって得られたクローンのグリセロールストックから２×ＹＴ培地に植菌し、一晩培養した。翌日、１０mLの培養液を５００mLの培養液に植菌し、ＯＤ600＝６．０に達するまで振騰培養を行った。培養液にＩＰＴＧを１mg／mLとなるように加え、さらに４時間振騰培養を行った。
遠心分離により細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁して遠心分離により洗浄菌体を得た。５０mLのリシスバッファー（６mM NaH2PO4,３００mM NaCl, １０mMイミダゾール，０．５％プロテアーゼインヒビターカクテル,１mg／mLライソザイム，pH８．０）で懸濁し、氷上に３０分間置いた。氷中にて５分間の超音波処理を行った後、シュクロースモノラウレートを０．５％となる様に加え、スターラーを用いて４℃にて６０分間、穏やかに攪拌した。遠心分離（５００００×ｇ，３０min，４℃）により得られた上澄を可溶性画分とし、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（１．０mL,QIAGEN）にアプライした。５mLのバッファー１（リシスバッファー＋０．１％シュクロースモノラウレート＋０．５％プロテアーゼインインヒビター＋１０mMイミダゾール）でカラムを洗浄した後、５mLのバッファー２（リシスバッファー＋０．１％シュクロースモノラウレート＋０．５％プロテアーゼインヒビター＋２０mMイミダゾール）を流した。溶出画分を回収し、５mLのバッファー３（リシスバッファー＋０．１％シュクロースモノラウレート＋０．５％プロテアーゼインヒビター＋５０mMイミダゾール）を流した。溶出画分を回収し、３mLのバッファー４（リシスバッファー＋０．１％シュクロースモノラウレート＋０．５％プロテアーゼインヒビター＋１００mMイミダゾール）を流した。溶出画分を回収し、３mLのバッフアー５（リシスバッファー＋０．１％シュクロースモノラウレート＋０．５％プロテアーゼインヒビター＋２５０mMイミダゾール）を流した。それぞれの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、必要な画分を集めて５０mMリン酸ナトリウムバッファー（pH８．０）に対して、４℃にて一晩透析を行った。得られた最終サンプルをＨｉｓ−ｔａｇ融合ＰＤＩ精製標品とした。
【００３０】
実施例４
実施例３で得られたリコンビナントラットＰＤＩ及び実施例１で得られたＰ２画分を用いてスキャッチャード解析を行った。
アッセイチューブに緩衝液（３００μＬ）、トレーサー（3H-BPA）溶液（１００μＬ）、ＰＤＩ蛋白あるいはＰ２画分（５００μＬ）を添加した。更に、特異的結合（Ｂ０）測定として１０％エタノール水溶液（１００μＬ）を、非特異的結合（ＮＳＢ）測定として置換物質（ＢＰＡ）溶液（１００μＬ）をそれぞれ加えて撹拌した後、氷水中で２時間インキュベートした。インキュベート後、０．３％ポリエチレンイミン処理した濾紙を用いて濾過し、洗浄(５０mM Trisを３mLで３回)した。濾紙を放射能測定用のバイアルビンに移し、液体シンチレーター５ｍＬを加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を２分間測定した。
【００３１】
図８にＰＤＩ蛋白に対するＢＰＡの結合飽和曲線を、図９にＰＤＩ蛋白に対するＢＰＡ特異的結合量のスキャッチャードプロットを示す。また、図１０にＰ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡの結合飽和曲線を、図１１にＰ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡ特異的結合量のスキャッチャードプロットを示す。
【００３２】
図８及び９よりＰＤＩ蛋白におけるKd値は１０１nM、Ｂｍａｘ値は４０４５fmol／mg蛋白であった。一方、Ｐ２画分の結合蛋白におけるKd値は１０３nM、Ｂｍａｘ値は２２６２fmol／mg蛋白であった。またこれらのＨｉｌｌ係数は、ＰＤＩ蛋白において０．９７、Ｐ２画分において１．００を示し、結合蛋白の相互作用はなく、3Ｈ-ＢＰＡの結合を捉えていることが確認された。
【００３３】
実施例１で得られたKd及びＢｍａｘは3Ｈ−ＢＰＡのＰＤＩに対する低親和性結合部位を示すと考えられるため、実施例４ではキャリアフリーかつ3Ｈ−ＢＰＡの量を少なくしてスキャッチャードプロットを行なった。実施例４で得られたKd及びＢｍａｘは3Ｈ−ＢＰＡのＰＤＩに対する高親和性結合部位と考えられる。
【００３４】
実施例５
実施例３で得られたリコンビナントＰＤＩ及び実施例１で得られたＰ２画分を用いて、結合阻害実験を行った。
アッセイチューブに緩衝液（３００μL）、トレーサー（3Ｈ-ＢＰＡ）溶液（１００μL）、ＰＤＩ蛋白あるいはＰ２画分（５００μL）を添加した。更に，特異的結合（Ｂ０）測定として１０％エタノール水溶液（１００μL）を、非特異的結合（ＮＳＢ）測定として置換物質（ＢＰＡ）溶液（１００μL）を、試験物質の結合測定として各種化合物の試験物質溶液（１００μL）をそれぞれ加えて撹拌した後，氷水中で２時間インキュベートした。インキュベート後、０．３％ポリエチレンイミン処理した濾紙を用いて濾過し、洗浄（５０mM  Ｔｒｉｓ３mLで３回）した。濾紙を放射能測定用のバイアルビンに移し、液体シンチレーター５mLを加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を２分間測定した。
【００３５】
その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
0004284045.tif 000003
【００３７】
表１から明らかなように、内分泌かく乱化学物質として環境省が指定した物質は、ＰＤＩ及びＰ２画分に対して3Ｈ-ＢＰＡの結合を強く阻害し、これらの結合蛋白に結合する物質であることが判明した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質の結合蛋白が検出され、当該結合蛋白に対する結合性を測定することにより種々の中枢神経作用性内分泌かく乱化学物質のスクリーニングが可能となった。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＰＡ曝露仔マウスの脳内ドパミン量を示す図である。
【図２】ＢＰＡ曝露仔マウスの脳内ノルエピネフリン量を示す図である。
【図３】ＢＰＡ曝露仔マウスの脳内セロトニン量を示す図である。
【図４】ＢＰＡ曝露ＰＣ１２細胞内の曝露ＢＰＡ量とドパミン量の関係を示す図である。
【図５】Ｐ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡの結合飽和曲線を示す図である。
【図６】Ｐ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡ特異的結合量のスキャッチャードプロットを示す図である。
【図７】3Ｈ−ＢＰＡと各種被検化合物との競合結合試験結果を示す図である。
【図８】ＰＤＩ蛋白に対するＢＰＡの結合飽和曲線を示す図である。
【図９】ＰＤＩ蛋白に対するＢＰＡ特異的結合量のスキャッチャードプロットを示す図である。
【図１０】Ｐ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡの結合飽和曲線を示す図である。
【図１１】Ｐ２画分の結合蛋白に対するＢＰＡ特異的結合量のスキャッチャードプロットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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