(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列
1) GGTCCTGGTG CTCCTCGTGG AGTTCGGATC CGGGG、
2) GGTCGAGGCT AGCTAGCGAG CGGTAGTCTA GAACCTTAGG CGTGGTGAGG、
3) GGACCTTAAG GGCACAACTG AGGAAATGGA GGTAGG、
4) GGTSCTGGTS CCCYACGGTC GACSCTAGCG TAGGAAACSC CGGCTAGG、
5) GGTGGACCST ACSAGGKTTA CYKGGAWYCS AGGYCCAMST GG、
6) GGCTGGRTYC CSAGSTYCAC CGKGGGRGGR CAAMAATGGG GG、
7) GGTGTGTACA CACATTGGCG GTGGATGAGG TCGG、
8) GGGGCGCAGT TAGGTGTGAG GTGTGAGGTC ACGTGGGCTC GG、及び
9) GGATGATATC CTCATGGCAG GGAATGGTGC GGGCTCCAGG
からなる群から選んだオリゴヌクレオチドからなる、カテプシンＧ阻害アプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のカテプシンＧ阻害アプタマーを少なくとも１つ含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カテプシンＧ阻害オリゴヌクレオチド及びそれを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カテプシンＧは、キモトリプシンと同様のセリンプロテアーゼであり、多形核白血球（ＰＭＮ）のアズール顆粒中に主に存在する。前記酵素は、ＰＭＮ脱顆粒の間に放出され、血小板凝集を刺激し、血管壁のプロテオグリカン、糖タンパク質、及びコラーゲンを加水分解する。更に、血液中を循環する細胞、特には白血球を活性化する。更に重要な点は、カテプシンＧが、凝固因子（例えば、ファクターＶ）の活性化、並びにヒト血小板糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ及びＩＩｂ／ＩＩＩａのタンパク質分解活性化に関与していることである。カテプシンＧの血小板刺激作用は、トロンビンのそれと似ているが、別個の機構（受容体）によりもたらされる点でそれとは異なる。加えて、カテプシンＧ放出は、細胞壁及び他の組織にダメージを与えることができる。
【０００３】
加えて、カテプシンＧに関して更に多くの効果が公知であり、従って、要約すれば、カテプシンＧが、ＰＭＮの脱顆粒の間に放出され、生物学的に重要なタンパク質を分解し、そして、炎症及び虚血の発生の間の組織ダメージに寄与することを指摘することができる。カテプシンＧの効果に関する従来の発見は、カテプシンの阻害が、炎症発生及び前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）症状の治療及び予防に適するという仮説を導く。
【０００４】
公知のカテプシンＧアンタゴニストは、タンパク質エグリンＢ及びＣ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，第２版，Ｃｈｅｍｉｅ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ出版，１９９３年）であるが、医薬として経口的に使用することができず、免疫学的合併症の重大なリスクを伴う。更に、阻害剤（例えば、ヘパリン）が選択的でなく、しかも、他の酵素（例えば、トロンビン）を阻害する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、カテプシンＧ阻害剤及びそれを含有する医薬組成物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、下記配列
1) GGTCCTGGTG CTCCTCGTGG AGTTCGGATC CGGGG、
2) GGTCGAGGCT AGCTAGCGAG CGGTAGTCTA GAACCTTAGG CGTGGTGAGG、
3) GGACCTTAAG GGCACAACTG AGGAAATGGA GGTAGG、
4) GGTSCTGGTS CCCYACGGTC GACSCTAGCG TAGGAAACSC CGGCTAGG、
5) GGTGGACCST ACSAGGKTTA CYKGGAWYCS AGGYCCAMST GG、
6) GGCTGGRTYC CSAGSTYCAC CGKGGGRGGR CAAMAATGGG GG、
7) GGTGTGTACA CACATTGGCG GTGGATGAGG TCGG、
8) GGGGCGCAGT TAGGTGTGAG GTGTGAGGTC ACGTGGGCTC GG、及び
9) GGATGATATC CTCATGGCAG GGAATGGTGC GGGCTCCAGG
からなる群から選んだオリゴヌクレオチドからなる、カテプシンＧ阻害アプタマー（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｇ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒ）によって解決される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
オリゴヌクレオチドの固定された要素としてのＧペア（Ｇ−ｐａｉｒｓ）を検討することによって、コンセンサス配列を確認した。調製実施例に記載のオリゴヌクレオチドプールを調製した後に、選ばれたプライマー配列を５’及び３’末端に有するオリゴヌクレオチドの共通する構造的要素として、Ｇペアを見出した。これは、オリゴヌクレオチドの一次構造の単純な比較によって見出された。Ｇペアは、三次構造の最適なエネルギー構造をもたらし、前記構造は、エネルギーの点において、適当なワトソン−クリック塩基対よりも顕著に有利である。前記の固定された点を基準として、「支持要素」の間の塩基の数を確認することができた。これに関連して、Ｎａｔｕｒｅ，第３５５巻（１９９２年），第５６４頁〜第５６６頁に開示されている。この点に関して、アプタマーを、いくつかの例外を除いて、関係するコンセンサス配列によって表わされる２つのグループに分けることができる。見つかったコンセンサス配列の例外は、指摘されたループの１つの先端の延長部分の点で、コンセンサス配列により表わされるアプタマーと異なる。表１から明らかなように、これは、カテプシンＧ阻害剤としてのオリゴヌクレオチドの機能に影響を与えない。その理由により、コンセンサス配列の確認において前記配列を考慮にいれなかった。従って、コンセンサス配列は、最小の長さで最高の効果を与える配列を表わす。コンセンサス配列は、阻害剤としての作用と配列の長さとを考慮した最適な配列として確認された。
【０００８】
また、前記配列は、より長いオリゴヌクレオチド（例えば、９０ヌクレオチド）の成分としても有効である。
【０００９】
本発明のアプタマーは、純粋なカテプシンＧに関して強力な阻害を示す。洗浄したヒト血小板の凝集のカテプシンＧ−誘発性刺激は、カテプシンＧアプタマーの濃度に依存して阻害される。また、本発明のアプタマーは、ＰＭＮからのＯ2 ラジカルのｆＭＬＰ−刺激性放出も阻害する。
【００１０】
胃腸管において、本発明のアプタマー又はオリゴヌクレオチドの変性は期待されないので、経口投与することが可能な医薬組成物として提供される。
更に、本発明のアプタマーは、特に、好中性顆粒球が活性化される病気の治療用医薬組成物として提供される。前記病気又は病的症状には、炎症及び前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）症状が含まれる。具体的に指摘すれば、喘息、気管支炎、骨及び関節病、並びにリュウマチ症状である。他に挙げると、血管内凝固障害の治療及び予防、特には、敗血症ショック及び関連疾患に関連する、血栓症並びに動脈及び静脈血管症（ｖａｓｏｐａｔｈｉｅｓ）（血小板のＰＭＮ誘発性活性化、血漿の凝集系、及び血管ダメージを含む）である。
前記病気は、特には、心筋梗塞、末梢血管閉塞、並びに静脈系の炎症性及び血栓性疾患、並びに虚血性心筋のカテプシンＧ依存性組織破壊に起因する再潅流ダメージである。最後に、本発明のアプタマーは、アルツハイマー症の進行の予防及び阻害用に提供される。
【００１１】
本発明のアプタマーの好適態様を以下に説明するが、それらはすべて、所望の作用を有する。アプタマー１〜アプタマー１１は、先に特定した第１のコンセンサス配列に含まれ、そして、アプタマー１２〜アプタマー１５は、先に特定した第２のコンセンサス配列に含まれる。
【００１２】
0004257939.tif 000002
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−オリゴヌクレオチドの形状であることができる。配列を改変して、半減期を長くすることができる。本発明においては、例えば、２’−フルオロウラシル若しくは２’−フルオロシトシンで改変されたヌクレオチド、又は２’−アミノ−ＣＴＰ及び２’−アミノ−ＵＴＰをはじめとするヌクレオチドが、前記目的に適している。また、オリゴヌクレオチドをリン酸チオエートで安定化することもできる。
【００１４】
本発明において、アプタマーの投与に適する医薬組成物の形状は、注射可能であり、経口投与可能であり、そして、局部的に有効な製剤である。経口投与可能であり、局部的に有効な医薬組成物には、特に、錠剤、丸薬、カプセル、及び本発明のアプタマーの溶液又は懸濁液の形状のシロップ、並びに容易に広がる製剤が含まれる。前記医薬組成物の製造及び用いられるアジュバントは、当業者に公知である。
【００１５】
【実施例】
図１に、クロモジェニックス社（ドイツ、エッセン）の基質Ｓ２５４５を用いるクロモジェニックアッセイにおける、アプタマー１０によるカテプシンＧ活性の阻害を示す［Ｂｌｏｏｄ，７７，（１９９１）２３７９−２３８８］。カテプシンＧ活性は、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｎａの加水分解を参照することにより測定した。カテプシンＧの活性は、濃度に依存して阻害される。最大阻害は、３００ｎＭアプタマー濃度で６０％に達する。
【００１６】
図２に、アプタマー１０により阻害されるカテプシンＧ誘発性血小板凝集を示す［Ｂｌｏｏｄ，８１，（１９９３）２９４７−２９５７］。ここでまた、カテプシンＧ誘発性効果における濃度依存性の阻害が表れる。２００ｎＭのアプタマー濃度で９０％阻害レベルが達成される。
【００１７】
図３に、アプタマーにより阻害されるカテプシンＧ誘発性血小板凝集の濃度依存性を示す。図２で示した結果がここで実証される。加えて、トロンビン阻害アプタマーによる阻害効果がないことを示すことができる。
【００１８】
図４に、ヒト血漿でのアプタマーの安定性を示す。ヒト血漿中のプレインキュベーション（１５分間まで）中に、アプタマーの活性に重大な低下はみられない。この結果は、血漿中のヌクレアーゼに供せられているにもかかわらず、アプタマーの安定性を示す。
【００１９】
図１〜図４に示すすべてのデータは、ｎ＝３の平均値±ＳＤである。
これらの生物学的テストにより、最大阻害は約２００ｎＭカテプシンＧアプタマーですでに達成されていることが示される。阻害定数ＩＣ50は約６０〜１００ｎＭであり、これによって、Ｋｉがより低いナノモル範囲にあることが予想される。
【００２０】
更に、アプタマー１、３、５、６、７、９、１０、１１、１４、及び１５の阻害効力を決定するために、これらのアプタマーをテストした。ここでまた、このテストの根拠は、基質のＣ末端を芳香族アミノ酸に分解するカテプシンＧの活性におけるこれらのアプタマーの阻害作用であった。前記基質は、サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｎａ）であった。カテプシンＧは、純粋であると仮定した形状で使用した。本発明のアプタマーの存在下におけるカテプシンＧの活性の測定を、０．０３Ｍトリス（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、及び５ｍＭ−ＫＣｌで実施した。吸光度の変化を４０５ｎｍ（２回評価）で測定し、カテプシンＧの活性を計算した。表１に、阻害されていないコントロールサンプルの％として、阻害度を示す。
【００２１】
【表１】
0004257939.tif 000003
【００２２】
調製実施例
１．カテプシンＧ結合アプタマーの単離のためのイン・ビトロ選抜
ヒトトロンビンに結合して阻害する一本鎖ＤＮＡヌクレオチドの単離に関して、ＮＡＴＵＲＥ第３５５巻第５６４頁〜５６６頁（１９９２年）に基本的に記載され、特にＧｅｎｅ第１３７巻第２５頁〜３１頁（１９９３年）に記載されている方法によって、本発明のカテプシンＧ阻害アプタマー配列を好適に得ることができる。
【００２３】
１．１．オリゴヌクレオチドプールの調製
これまで未知の酵素結合配列（アプタマー）の単離用に、互いに異なる充分量の合成オリゴヌクレオチドが必要である。このオリゴヌクレオチドプールは、次の基準、すなわち、（ａ）少なくとも１０13の異なる配列、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドはポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法により増幅される必要がある、及び（ｃ）直接的クローニングの可能性を満たす必要がある。
ヌクレオチド６０個を有する分子において、４塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔのそれぞれが各位置を占めることができる場合に、異なるオリゴヌクレオチドの要求量が達成される。
【００２４】
ＰＣＲ法による増幅の能力は、規定された配列１８塩基を、６０塩基ヌクレオチドの５’及び３’末端の両方に連結することにより得られる。制限ヌクレアーゼＥｃｏＲＩ用の、オリゴヌクレオチドの５’プライマー配列内の適当な制限交点（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）を挿入することによりなされた場合、直接的クローニングは可能であった。得られた９６塩基オリゴヌクレオチドは、示されたすべての要求を満足する。その配列を以下に示す：
5'- CGTACGGAATTCGCTAGC-----N60-----CACGTGGAGCTCGGATCC -3'
（式中、Ｎはヌクレオチドを表わす）。前記の１８塩基長のプライマー結合試薬の間に６０ヌクレオチドが存在する。前記試薬において、可能な塩基のそれぞれは、任意の位置に存在することができる。それにより、約１０13の異なる配列が提供される。このオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ法により精製される。
【００２５】
１．２．オリゴヌクレオチドのカテプシンＧとのインキュベーション
この調製工程において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを標的酵素に結合させ、結合しないオリゴヌクレオチドを、イオン交換クロマトグラフィーにより分離する。
最初の工程では、充分量のオリゴヌクレオチドプール（３００μｇ、すなわち約１０ｎｍｏｌ相当）を１００μｇカテプシンＧと一緒にインキュベートする。インキュベーション緩衝液（ｐＫ７．５）は、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＫＣｌ、及び５ｍＭ−ＭｇＣｌ2 を含有した。インキュベーションは室温で３０分間実施し、そのインキュベートの全容量は１ｍｌであった。
【００２６】
１．３．イオン交換クロマトグラフィー
続いて、前記インキュベートを１ｍｌハイトラップＳＰ−カチオン交換カラム（ファルマシア）にかけた。カラム材料を予め前記インキュベーション緩衝液でバランスさせた。更に、この工程で使用した装置は、メンブレンポンプ、分光光度計、及び記録装置である。
【００２７】
４℃で約２５分間更にインキュベートした後、結合していないＤＮＡ断片を洗浄除去した（流速１ｍｌ／分）。それに対して、ＤＮＡ断片に結合した、正に帯電したカテプシンＧは、カラム材料上に残った。カラム材料に結合したＤＮＡ／酵素複合体の溶出は、０．８Ｍ−ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）で行なった（流速０．５ｍｌ／分）。ＤＮＡを含有していると光度測定により同定された画分を集め、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に従って、公知のエタノール／アセテート沈殿にかけた。その容量のエタノールを３回加えた。−２０℃で一晩の沈殿の後、１２０００×ｇでサンプルを１時間遠心した（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ  １３）。得られたペレットを乾燥させ、滅菌水５０μｌで希釈した。以下のポリメラーゼチェーン反応はＤＮＡ溶液１５μｌで実施した。従って、１画分で３回までの増幅を実施することができた。
【００２８】
１．４．イオン交換クロマトグラフィー
プライマー5'- CGTACGGAATTCGCTAGC -3'（配列番号１７）及びプライマー5'- CACGTGGAGCTCGGATCC -3'（配列番号１８）で、ポリメラーゼチェーン反応を実施した。溶出したＤＮＡの最大増幅の条件は、一連のテストで予め決定した。ＭｇＣｌ2 至適濃度は２ｍＭであり、プライマー至適濃度は１．５μＭであった。それに加えて、ポリメラーゼ、緩衝液、及びＭｇＣｌ2 溶液を含むプリメザイム（ＰＲＩＭＥＺＹＭＥ）キット（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を使用した。それぞれ、変性温度は９４℃で、プライマーのハイブリダイゼーションの温度は４２℃で、そして、伸長の温度は７２℃（１分）であった。ポリメラーゼ１Ｕの使用で、最大収率を得るのに充分であった。前記サイクルを４０回実施した。これらの反応の生成物を、アガロースゲル電気泳動法により分析し、ＤＮＡ伸長標準品との比較により定量した。続いて、それを沈殿させ、滅菌水に溶かし、熱変性（９５℃）により一本鎖形状に変化させた。これがサイクルの最後であり、続いて、ＤＮＡをもう一度、前記インキュベーションに移した。
【００２９】
１．５．カラム材料へ非特異的に結合するＤＮＡ配列の豊富化の回避
カラム材料へ結合する配列の豊富化を防ぐために、最後の３サイクルにおける工程を改良した。ＤＮＡをカテプシンＧとプレインキュベートせずに、前記酵素をクロマトグラフィーカラムに直接充填した。予めスイッチした更なるカラムを単にカチオン交換材料で充填し、続くＤＮＡの装填（流速０．３ｍｌ／分）によりそれらの断片のみがカテプシンに結合する（最初のカラムのカラム材料とは非特異的に反応しない）ことができるようにした。
【００３０】
１．６．最後のサイクルの後のＰＣＲ生成物のクローニング及び配列決定
最後のサイクルの後、得られたＰＣＲ生成物をクレノーポリメラーゼで完全にし、リン酸化を行ない、その混合物をＥｃｏＲＩ制限消化にかけた。続いて、ベクターｐＵＣ１８への直接クローニングを行なった。その後、配列決定した挿入物内の配列ホモロジーを検索した。得られた配列をコンピュータープログラム（Ｈｕｓａｒ，ＥＭＢＬ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ハイデルベルグ）により評価した。
【００３１】
【配列表】
【００３２】
0004257939.tif 000004
【００３３】
0004257939.tif 000005
【００３４】
0004257939.tif 000006
【００３５】
0004257939.tif 000007
【００３６】
0004257939.tif 000008
【００３７】
0004257939.tif 000009
【００３８】
0004257939.tif 000010
【００３９】
0004257939.tif 000011
【００４０】
0004257939.tif 000012
【００４１】
0004257939.tif 000013
【００４２】
0004257939.tif 000014
【００４３】
0004257939.tif 000015
【００４４】
0004257939.tif 000016
【００４５】
0004257939.tif 000017
【００４６】
0004257939.tif 000018
【００４７】
0004257939.tif 000019
【００４８】
0004257939.tif 000020
【００４９】
0004257939.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】アプタマー１０によるカテプシンＧ活性の阻害を示すグラフである。
【図２】光透過の増大によって、アプタマー１０により阻害されるカテプシンＧ誘発性血小板凝集を説明するグラフである。
【図３】カテプシンＧ阻害アプタマーによる、ヒト血小板のカテプシンＧ誘発性凝集の阻害を示すグラフである。
【図４】ヒト血漿中でのＤＮＡ−及びＲＮＡ−アプタマーの安定性を示すグラフである。
【図１】
0004257939.tif 000022
【図２】
0004257939.tif 000023
【図３】
0004257939.tif 000024
【図４】
0004257939.tif 000025