(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0004352613.tif 000005
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、水素原子または低級アルキルを、Ｘはハロゲン原子、シアノまたは水素原子を、Ｙはハロゲン原子、トリフルオロメチルまたは水素原子を、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンを示す。〕で表されるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生促進剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘはハロゲン原子、Ｙはハロゲン原子または水素原子、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する請求項１記載の血管新生促進剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表されるピリダジノン化合物が、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンである請求項１または２記載の血管新生促進剤。
【請求項４】
一般式（Ｉ）
【化２】
0004352613.tif 000006
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、水素原子または低級アルキルを、Ｘはハロゲン原子、シアノまたは水素原子を、Ｙはハロゲン原子、トリフルオロメチルまたは水素原子を、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンを示す。〕で表されるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩、および医薬上許容される担体を含有する血管新生促進用医薬組成物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘはハロゲン原子、Ｙはハロゲン原子または水素原子、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩、および医薬上許容される担体を含有する請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表されるピリダジノン化合物が、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンである請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の医薬組成物、および該医薬組成物を血管新生促進の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した、該医薬組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【請求項８】
一般式（Ｉ）
【化３】
0004352613.tif 000007
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、水素原子または低級アルキルを、Ｘはハロゲン原子、シアノまたは水素原子を、Ｙはハロゲン原子、トリフルオロメチルまたは水素原子を、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンを示す。〕で表されるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する塩基性線維芽細胞増殖因子の血管新生作用増強剤。
【請求項９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘはハロゲン原子、Ｙはハロゲン原子または水素原子、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する請求項８記載の作用増強剤。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で表されるピリダジノン化合物が、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンである請求項８または９記載の作用増強剤。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）
【化４】
0004352613.tif 000008
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、水素原子または低級アルキルを、Ｘはハロゲン原子、シアノまたは水素原子を、Ｙはハロゲン原子、トリフルオロメチルまたは水素原子を、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンを示す。〕で表されるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩、および医薬上許容される担体を含有する塩基性線維芽細胞増殖因子の血管新生作用増強用医薬組成物。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘはハロゲン原子、Ｙはハロゲン原子または水素原子、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩、および医薬上許容される担体を含有する請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）で表されるピリダジノン化合物が、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンである請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物、および該医薬組成物を塩基性線維芽細胞増殖因子の血管新生作用増強の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した、該医薬組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、特定のピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生促進剤及び血管新生作用増強剤に関する。
【０００２】
背景技術
本発明における特定の下記ピリダジノン化合物は、優れた血小板凝集阻害作用、強心作用、血管拡張作用、抗ＳＲＳ−Ａ（Ｓｌｏｗ  Ｒｅａｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）作用、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害作用等を有することが知られており（特公平７−１０７０５５号公報、特開平７−２８５８６９号公報参照）、抗血小板剤等として期待される薬物である。
しかしながら、該ピリダジノン化合物が血管の新生に対してどのような作用を持つかについては報告がない。
【０００３】
発明の開示
本発明者らは、該ピリダジノン化合物が血管の新生に及ぼす影響について種々研究を重ねた結果、該ピリダジノン化合物が血管の新生を促進する作用を有すること、及び血管新生作用を有する薬物の当該作用を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次のものに関する。
一般式（Ｉ）
【０００４】
【化５】
0004352613.tif 000002
【０００５】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、水素原子または低級アルキルを、Ｘはハロゲン原子、シアノまたは水素原子を、Ｙはハロゲン原子、トリフルオロメチルまたは水素原子を、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンを示す。〕
で表されるピリダジノン化合物またはその薬理学的に許容される塩（以下、ピリダジノン化合物類という）を有効成分として含有する血管新生促進剤。
ピリダジノン化合物類を投与することを含む血管新生を促進する方法。
血管新生促進剤の製造のためのピリダジノン化合物類の使用。
ピリダジノン化合物類、および医薬上許容される担体を含有する血管新生促進用医薬組成物。
上記医薬組成物、および該医薬組成物を血管新生促進の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した、該医薬組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
ピリダジノン化合物類を有効成分として含有する血管新生作用を有する薬物の作用増強剤。
ピリダジノン化合物類を投与することを含む血管新生作用を有する薬物の作用増強方法。
血管新生作用を有する薬物の作用増強剤の製造のためのピリダジノン化合物類の使用。
ピリダジノン化合物類、および医薬上許容される担体を含有する血管新生作用を有する薬物の作用増強用医薬組成物。
上記医薬組成物、および該医薬組成物を血管新生作用を有する薬物の作用増強の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した、該医薬組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。
【０００６】
本発明におけるピリダジノン化合物としては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘはハロゲン原子、Ｙはハロゲン原子または水素原子、Ａは水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物が好ましい。
【０００７】
一般式（Ｉ）で表されるピリダジノン化合物（以下、ピリダジノン化合物（Ｉ）という）の特に好ましい例は、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３−（２Ｈ）−ピリダジノンである。
【０００８】
血管新生とは既存の血管から内皮細胞が出芽して新しい血管が形成されることで、その形成過程は複雑であるが、生体では発生成長に伴う血管新生の他、腫瘍増殖や糖尿病性網膜症をはじめとする病的血管新生などさまざまな局面で認められる重要な現象である。
【０００９】
血管新生促進剤の投与は癌患者や糖尿病性網膜症患者には病的血管新生を助長するので禁忌である。
しかしながら、血管新生促進剤は責任動脈（病気を引き起こす主因となる動脈）にとらわれることなく、側副血行路を形成する作用を有するので、責任動脈に直接的に作用する薬剤の効力を補完、増強せしめる点で有用である。
【００１０】
本明細書中で用いられている各記号について以下に説明する。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３における低級アルキルとは、炭素数１〜６であって直鎖状でも分枝鎖状でもよく、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
好ましいＲ１およびＲ２としてそれぞれ、水素原子、好ましいＲ３として、水素原子および炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。
【００１１】
Ｒ３における炭素数１〜４のアルキルとは、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
Ｘ、Ｙにおけるハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
好ましいＸとしてハロゲン原子、好ましいＹとしてハロゲン原子および水素原子が挙げられる。
【００１２】
Ａにおける水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜８のアルキレンとは、直鎖状でも分枝鎖状でもよく、具体的にはメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、２，２−ジメチルエチレン、２，２−ジエチルエチレン、２，２−ジ−ｎ−プロピルエチレン、ヒドロキシメチレン、１−ヒドロキシエチレン、２−ヒドロキシエチレン、３−ヒドロキシプロピレン等が挙げられる。
好ましいＡとして、水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンが挙げられる。
【００１３】
一般式（Ｉ）において、メチレン基とピリジン環の結合位置は特に限定されないが、好ましくはピリジン環の窒素原子に対して３位である。
また、Ｙはベンゼン環上のいずれの位置で置換されていてもよいが、好ましくは４位である。
特に一般式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２が水素原子、Ｒ３が水素原子または炭素数１〜４のアルキル、Ｘがハロゲン原子、Ｙがハロゲン原子または水素原子、Ａが水酸基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキレンであるピリダジノン化合物が好ましい。
【００１４】
さらに、より好ましいピリダジノン化合物（Ｉ）として、４−ブロモ−６−（３−フェニルプロポキシ）−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−クロロ−６−（３−フェニルプロポキシ）−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−クロロ−６−〔３−（４−クロロフェニル）プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−ブロモ−６−（２，２−ジメチル−３−フェニルプロポキシ）−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−クロロ−６−（２，２−ジメチル−３−フェニルプロポキシ）−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−２，２−ジメチルプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−クロロ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−２，２−ジメチルプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−クロロ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンおよび４−クロロ−６−〔３−（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシプロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３（２Ｈ）−ピリダジノンが挙げられる。
【００１５】
本発明におけるピリダジノン化合物（Ｉ）には、立体および光学異性体も包含される。
【００１６】
ピリダジノン化合物（Ｉ）は、例えば、特公平７−１０７０５５号公報、米国特許５３１４８８３号公報、欧州特許４８２２０８号公開公報、特開平７−２５２２３７号公報、米国特許５７５０５２３号公報、欧州特許７４２２１１号公開公報に開示の方法等により製造することができる。
【００１７】
ピリダジノン化合物（Ｉ）の薬理学的に許容される塩としては、例えば無機酸との塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等）、有機酸との塩（酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩等）等が挙げられる。
また、ピリダジノン化合物（Ｉ）は、公知の手段により上記の塩とすることができる。
【００１８】
ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその薬理学的に許容される塩は、それ自体単独で血管新生促進剤として用いることもできるが、血管新生作用を有する薬物と併用することにより当該薬物の作用増強剤として用いることもできる。
【００１９】
血管新生作用を有する薬物としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ｂ−ＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＣＧＦ）、表皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＰＦ）等の成長因子やヘパリン、アデノシンなどが挙げられる。
【００２０】
ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその薬理学的に許容される塩は、成長因子、その中でもｂ−ＦＧＦの血管新生作用増強剤として優れている。
【００２１】
本発明に係る作用の確認方法については特に制限はなく、公知の方法によって行える。
【００２２】
本発明の有効成分であるピリダジノン化合物（Ｉ）およびその薬理学的に許容される塩は、極めて低毒性であり、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳動物に対して、血管の新生を促進する作用及び血管新生作用を有する薬物の当該作用を増強する作用を有する。
【００２３】
ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその薬理学的に許容される塩の投与形態としては、注射剤（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内注射）、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤等による非経口投与、または錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁液剤等による経口投与を挙げることができる。
【００２４】
ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその塩は、製薬の慣用手段によって投与用に製剤化される。
【００２５】
経口投与用の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤は、賦形剤（例えば白糖、乳糖、ブドウ糖、澱粉、マンニット等）、結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば澱粉、カルボキシメチルセルロースまたはそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール等）、滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、シリカ等）、潤滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、グリセロール等）等を使用して調製される。
【００２６】
また、注射剤、エアゾール剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁液剤は、活性成分の溶剤（例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等）、界面活性剤（例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素添加ヒマシ油のポリオキシエチレンエーテル、レシチン等）、懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム塩、メチルセルロース等のセルロース誘導体、トラガント、アラビアゴム等の天然ゴム類等）、保存剤（例えばパラオキシ安息香酸のエステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等）等を使用して調製される。坐剤は、例えばポリエチレングリコール、ラノリン、ココナッツ油等を使用して調製される。
【００２７】
ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその塩の投与量は、患者の年齢、体重、症状の程度等によって適宜選択すればよく、通常、ヒト成人に対しては０．００１ｍｇ〜５ｇ／日、好ましくは０．００５〜１０００ｍｇ／日であり、これを１日１〜数回に分けて投与する。
【００２８】
ピリダジノン化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩を血管新生作用を有する薬物の作用増強剤として用いる場合、本発明におけるピリダジノン化合物と血管新生作用を有する薬物とが同時期に生体内に存在するように投与すればよい。血管新生作用を有する薬物の用法や用量は公知の範囲であれば特に制限されることはない。また、両者は一緒に製剤化してもよいし別に製剤化してもよい。別に製剤化する場合は、投与経路や用法は同じであっても異なっていてもよい。
【００２９】
実施例
以下、本発明を詳細に説明するため実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３０】
実験例１  化合物Ａの血管新生促進作用
方法：
ラットにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔し、背部正中線部を約１ｃｍ切開して尾部側約２．５ｃｍの皮下にコッヘルでエアポケットを作り、生理食塩液を吸収させた止血用ゼラチンスポンジ（スポンゼル、１０ｍｍ×１０ｍｍ×７ｍｍ；山之内製薬製）を包埋した。続いて切開部を縫合、消毒し実験動物モデルを作製した。
試薬として、常法に従って製造された化合物Ａ（４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３−（２Ｈ）−ピリダジノン塩酸塩）１００ｍｇを乳鉢内で０．５％メチルセルロース溶液１００ｍｌに懸濁したものを使用した。
また、対照として溶媒である０．５％メチルセルロース溶液を使用した。溶媒は、メチルセルロース（キシダ化学製）５ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解して得た。
試薬（化合物Ａ）および溶媒をスポンジ包埋当日から、１０ｍｌ／ｋｇの容量で１日１回、４日間ないし７日間にわたり反復経口投与した。なお、包埋当日は動物を麻酔する３０分前に投与し、スポンジの摘出は最終投与日の翌日に行った。
包埋４日及び７日後、動物に過量のペントバルビタールを静注して安楽死させた後に、背部を切開して埋め込んだスポンジから周囲組織を剥離し、スポンジ表面を写真撮影した。その後、摘出したスポンジを０．１Ｍアンモニア水２ｍｌ中に入れて、４時間放置してスポンジ内のヘモグロビンを抽出した。抽出液１００μｌをとり、アッセイキット（ヘモグロビンＢ−テストワコー；和光純薬製）を用いてヘモグロビンを定量し、血管新生の指標とした。なお、スポンジ内ヘモグロビン量は次に示す式にて算出した。
スポンジ内ヘモグロビン量（ｍｇ／スポンジ）
＝抽出液１００μｌ中ヘモグロビン量（ｍｇ）×２０（抽出液全量２ｍｌ）
得られたデータは、平均±標準誤差で表した。血管新生作用の評価は、薬物を４日間および７日間投与した動物において、それぞれの溶媒群を対照とし、対応のないｔ検定を実施し、有意差を検討した。なお、危険率が５％未満のものを有意差ありとした。
結果：
１．写真所見
試薬（化合物Ａ）投与群、溶媒投与群のいずれにおいても、試験開始４日後および７日後において経過日数に伴ったスポンジ表面の新生血管の増加が見られたが、試験開始７日後では溶媒投与群（図１）に比べ、試薬（化合物Ａ）投与群（図２）に多くの新生血管が確認された。
２．スポンジ内ヘモグロビン量
結果を表１および図３に示す。スポンジ内ヘモグロビン量は、試薬（化合物Ａ）投与群、溶媒投与群、いずれにおいても試験開始４日後および７日後において経過日数に伴なったヘモグロビン量の増加が見られたが、試験開始７日後では、溶媒投与群に比べ、試薬（化合物Ａ）投与群に有意な増加がみられた。
【００３１】
【表１】
0004352613.tif 000003
【００３２】
実験例２  化合物Ａのｂ−ＦＧＦの血管新生作用の増強作用
方法：
実験例１と同様に実験動物モデルを作製した。
試薬として、常法に従って製造された化合物Ａ（４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３−（２Ｈ）−ピリダジノン塩酸塩）５０ｍｇを乳鉢内で０．５％メチルセルロース溶液１００ｍｌに懸濁したものを使用した。
溶媒の０．５％メチルセルロース溶液は、メチルセルロース（キシダ化学製）５ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解して得た。
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）生理食塩液は、ＢＳＡ（シグマ製）０．１ｇを生理食塩液１００ｍｌに溶解したものを使用した。
ｂ−ＦＧＦ溶液は、組換えｂ−ＦＧＦ（ＢＴＩ製）２０μｇを０．１％ＢＳＡ生理食塩液２ｍｌに溶解したものを使用した。
止血用ゼラチンスポンジは、実験例１と同じものを使用した。
試験群を３群にわけ、第１群には、０．１％ＢＳＡ生理食塩液１００μｌを湿潤させたスポンジを包埋した。第２群、第３群には、ｂ−ＦＧＦ溶液１００μｌを湿潤させたスポンジ（１μｇｂ−ＦＧＦ／スポンジ）を包埋した。
第１群、第２群には溶媒を、第３群には試薬（化合物Ａ）をスポンジ包埋当日から、１０ｍｌ／ｋｇの容量で１日２回、４日間にわたり反復経口投与した。
なお、いずれの試験群も、包埋当日は夕方の投与より開始した（１回投与）。薬物の投与時間は１回目の投与を午前９時前後、２回目の投与を午後７時前後とした。また、薬物の効果を考慮してスポンジ摘出の当日は薬物を投与しなかった（合計７回投与）。
包埋４日後、動物に過量のペントバルビタールを静注して安楽死させた後に、背部を切開して埋め込んだスポンジから周囲組織を剥離し、スポンジ表面を写真撮影した。その後、摘出したスポンジから、実験例１と同様の方法にてスポンジ内ヘモグロビン量を算出した。
得られたデータは平均±標準誤差で表した。血管新生作用の評価は、Ｔｕｋｅｙ法による多重比較検定を行い、有意性を検討した。なお、危険率が５％未満のものを有意差ありとした。
結果：
１．写真所見
結果を図４、図５および図６に示す。試験開始４日後において、第１群（０．１％ＢＳＡ生理食塩液群）に比して、第２群（ｂ−ＦＧＦ単独投与群）でより多くの新生血管が肉眼的に確認され、第３群（ｂ−ＦＧＦと試薬（化合物Ａ）５ｍｇ／ｋｇ併用投与群）では第２群よりも、さらに多くの新生血管がみられた。
２．スポンジ内ヘモグロビン量
結果を表２および図７に示す。スポンジ内ヘモグロビン量については、第１群（０．１％ＢＳＡ生理食塩液群）および第２群（ｂ−ＦＧＦ単独投与群）に比べて、第３群（ｂ−ＦＧＦと試薬（化合物Ａ）５ｍｇ／ｋｇ併用投与群）では有意なヘモグロビン量の増加が見られた。
【００３３】
【表２】
0004352613.tif 000004
【００３４】
実験例３  化合物Ａの血管新生促進作用に関する用量相関性の検討
方法：
実験例１と同様に実験動物モデルを作製した。
常法に従って製造された化合物Ａ（４−ブロモ−６−〔３−（４−クロロフェニル）プロポキシ〕−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−３−（２Ｈ）−ピリダジノン塩酸塩）３５ｍｇを乳鉢内で０．５％メチルセルロース溶液７０ｍｌに懸濁したものを使用し、５ｍｇ／ｋｇ投与試薬とした。
また、この懸濁液を溶媒である０．５％メチルセルロース溶液で２倍希釈、５倍希釈したものを調製し、各々、投与用量を１０ｍｌ／ｋｇとして２．５ｍｇ／ｋｇ投与試薬、１ｍｇ／ｋｇ投与試薬とした。また、対照として溶媒である０．５％メチルセルロース溶液を使用した。溶媒は、メチルセルロース（キシダ化学製）５ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解して得た。
各試薬（化合物Ａ）および溶媒をスポンジ包埋当日から、１０ｍｌ／ｋｇの容量で１日２回、４日間にわたり計７回反復経口投与し、最終投与日の翌日にスポンジを摘出し、摘出したスポンジから実験例１と同様の方法にてスポンジ内ヘモグロビン量を算出した。
なお、各群とも例数は８〜９であり、得られたデータは平均±標準誤差で表した。血管新生作用の評価は溶媒投与群を対照としたＤｕｎｎｅｔｔ検定を行い、有意差を検討した。危険率５％未満のものを有意差ありとした。
結果：
結果を図８に示す。溶媒投与群に比べて、２．５ｍｇ／ｋｇ投与群、５ｍｇ／ｋｇ投与群では、有意なヘモグロビン量の増加が見られた。
５ｍｇ／ｋｇ投与群では有意差はあるものの、やや作用が減弱する傾向を示した。これは、ラットにおける化合物Ａの５ｍｇ／ｋｇという用量は血管拡張作用に基づく降圧作用を示す用量であるので、降圧作用による血流量の減少に起因するものと考えられた。
このことから、化合物Ａは、降圧作用を実質的に示さない用量において優れた血管新生促進作用を発揮することが明らかになった。
【００３５】
実験例４  毒性
化合物Ａの急性毒性（ＬＤ５０）は、ラット、イヌへの経口投与において２ｇ／ｋｇ以上であり、極めて低毒性であることが判明した。
上記実験結果から、ピリダジノン化合物（Ｉ）およびその塩は、優れた血管新生促進作用及び血管新生作用を有する薬物の当該作用に対する増強作用を有し、かつ低毒性であることがわかる。
【００３６】
実施例１（錠剤）
下記成分を常法により混合した後、１錠中に５０ｍｇの活性成分を含有する糖衣錠とした。
化合物Ａ                                      １０ｇ
乳糖                                          ２０ｇ
澱粉                                            ５ｇ
ステアリン酸マグネシウム                    ０．１ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム            ７ｇ
合計                          ４２．１ｇ
【００３７】
実施例２（カプセル剤）
下記成分を常法により混合した後、ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に５０ｍｇの活性成分を含有するカプセル剤とした。
化合物Ａ                                  １０ｇ
乳糖                                      ２０ｇ
微結晶セルロース                          １０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                    １ｇ
合計                          ４１ｇ
【００３８】
実施例３（軟膏）
下記成分を常法により混合し、１重量％軟膏とした。
化合物Ａ                          １ｇ
オリーブ油                      ２０ｇ
白色ワセリン                    ７９ｇ
合計                    １００ｇ
【００３９】
実施例４（エアゾール懸濁液）
下記成分（Ａ）を混合し、得られた混合液をバルブを備えた容器に仕込み、噴射剤（Ｂ）を２０℃で約２．４６〜２．８１ｍｇ／ｃｍ２ゲージ圧までバルブノズルから圧入し、エアゾール懸濁液とした。
（Ａ）化合物Ａ                                      ０．２５重量％
ミリスチン酸イソプロピル                      ０．１０重量％
エタノール                                  ２６．４０重量％
（Ｂ）１，２−ジクロロテトラフルオロエタンと
１−クロロペンタフルオロエタンの
６０−４０重量％                            ７３．２５重量％
【００４０】
産業上の利用可能性
本発明におけるピリダジノン化合物（Ｉ）およびその薬理学的に許容される塩は、血管新生促進作用及び血管新生作用を有する薬物の当該作用を増強する作用を有しており、血管新生促進剤及び血管新生作用増強剤として有用である。よって、創傷治癒の促進、皮膚移植後の着生促進、四肢切断の再縫合術後の治癒促進、発毛促進など血管新生過程が重要な役割を担う種々の疾患の治癒促進に効果を有する。
【００４１】
本出願は日本で出願された平成９年特許願第２３２６４４号を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ラットスポンジモデル溶媒投与群における、試験開始７日後の新生血管を示す写真である。
【図２】  図２は、ラットスポンジモデル化合物Ａ投与群における、試験開始７日後の新生血管を示す写真である。
【図３】  図３は、ラットスポンジモデルにおけるスポンジ内ヘモグロビン量を示し、化合物Ａの血管新生促進作用を示す。
【図４】  図４は、ラットスポンジモデル第１群（ＢＳＡ生理食塩液投与群）における、試験開始４日後の新生血管を示す写真である。
【図５】  図５は、ラットスポンジモデル第２群（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）単独投与群）における、試験開始４日後の新生血管を示す写真である。
【図６】  図６は、ラットスポンジモデル第３群（ｂ−ＦＧＦと化合物Ａの併用投与群）における、試験開始４日後の新生血管を示す写真である。
【図７】  図７は、ラットスポンジモデルにおけるスポンジ内ヘモグロビン量を示し、ｂ−ＦＧＦの血管新生作用が化合物Ａにより増強されることを示す。
【図８】  図８は、ラットスポンジモデルにおける化合物Ａの血管新生促進作用に関する用量相関性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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