(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、
ｂ）このように処理したサンプルを、固体担体に結合されているＰｒＰｓｃとの第一の結合性成分と接触させ、
ｃ）固体担体に結合した第一の結合性成分をサンプルから分離し、そして第一の結合性成分に結合したサンプル由来のＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）を検出するものとし、ここで、
ｄ）第一の結合性成分はグリコサミノグリカン、フィブロネクチン、リポプロテインＡおよびコンゴレッドからなる群から選択されることを特徴とする、
サンプル中のＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）のインビトロ検出方法。
【請求項２】
検出（ｃ）のためにＰｒＰｓｃ−特異的モノクローナル抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）からの担体が検出（ｃ）のために標識された状態で存在し、そして、サンプルから分離したのち、特異的な抗ＰｒＰｓｃ−抗体である第二の結合性成分との結合により、標識を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸またはケラトン硫酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第一の結合性成分が人工的に製造されたスルホン化グリコサミノグリカンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルがヒトもしくは動物の身体または植物に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが血液サンプル、組織サンプル、体液、尿、乳汁、髄液または唾液である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが溶解された血栓性材料である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが土壌サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固体担体として微小担体（ビーズ）を使用することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
検出に使用される抗体を、ユウロピウムを含む１０〜１００ｎｍの直径を有するナノビーズにカップリングさせ、そして第一の結合性成分に結合したサンプル由来のＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）を遅延蛍光により検出することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第一の結合性成分とのＰｒＰｓｃの結合を、第二の結合性成分と結合したユウロピウム含有ナノビーズの遅延蛍光により検出することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
固体担体としてマイクロタイタープレートを使用することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
固体担体として焼結ガラスフィルターを使用することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
固体担体に結合させた第一の結合性成分を少なくとも含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）の検出方法を実施するための診断用キットであり、以下の、
（１）固体担体に結合されている第一の結合成分であって、該第一の結合成分はグルコサミノグルカン、フィブロネクチン、リポプロテインＡおよびコンゴレッドからなる群から選択される結合成分、および
（２）プロテイナーゼＫ、
を含む、診断用キット。
【請求項１６】
ＰｒＰｓｃ に対して特異的な抗体、ならびに場合により該特異的抗体に向けられた第二抗体をさらに含む、請求項１５に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に高速ＢＳＥ試験に関連するプリオン検出のためのリガンドの使用に関する。本発明はさらに、プリオンの結合およびその後の検出に適する物質を開示する。
【０００２】
プリオンは、とりわけニューロンの表面で検出される正常な細胞性タンパク質（ＰｒＰｃ）である。この正常な細胞性タンパク質がその異常なイソ型（ＰｒＰｓｃ）に変異することにより、新たな性質を有する病原性形態が形成される。正常形態とは異なり、こうして生成した形態は水に不溶性であり、そしてプロテアーゼによって分解することができない。いわゆる「タンパク質のみ」の仮説によれば、病理学的および正常なプリオンの同時発生は、正常分子がその立体配置を変化させて病理学的形態をとらせることになる。この過程は、これらのタンパク質の脳内蓄積に導き、そして最終的には、ヒツジでは回旋症（Trader disease）（スクレイピー）、畜牛ではウシスポンジ状脳症（ＢＳＥ）、およびヒトではクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む脳症になる。
【０００３】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧＳ）は細胞表面につながれた線状ヘテロ多糖であり、そして細胞の接着および移行に重要な役割を果たす。これらの分子によりプリオンが細胞内に挿入されることも可能である。
【０００４】
ペントサン（ポリ−ｂ−キシロース−2,3−ジスルホン酸；ペントサンポリスルホン酸）は、多スルホン化ポリグリコシド（分子量４,０００〜１２,０００ダルトン）である。この分子はプリオンの蓄積を阻害すると思われる。他のスルホン化ＧＡＧＳ、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸と比較して、この物質がプリオンの産生を最も強く阻害することが示されている。この阻害の原因は、おそらくプリオンと直接に結合するためである [B. Caughey および G. Raymond, Journal of Virology, Feb. 1993, p. 643-650; B. Caughey ら, Journal of Virology, Apr. 1994, p. 2135-2141; D. Sawitzky, Med. Microbiol. Immunol. (1996) 184: 155-161; R. Gabizon ら, Journal of cellular Physiology 157: 319−325 (1993); Show-Ling Shyng ら, Journal of biological Chemistry, 1995 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.; C. Farquhar ら, The Lancet, Vol. 353, January 9, 1999]。
【０００５】
両方の変異体ＰｒＰｃおよびＰｒＰｓｃを認識するＰｒＰ−特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体が既に製造されている。市販のモノクローナル抗体により二つの変異体を直接に区別することができ、こうして疾病を検出することができる。
【０００６】
これは従来、ＰｒＰｃのみを分解しＰｒＰｓｃを分解しないプロテイナーゼＫを、検査すべきサンプルと混合することによって行われてきた。両方のタンパク質は電気泳動法により分離され、そして病理学的形態は抗体で検出される。この試験の感度および特異性は高いけれど、この試験における陽性結果は検査に使用されたプリオンの全量に依存するので、全てのＢＳＥ症例を検出することはできない。しかしながら、一般的に疾病の最終段階中に初めて充分に高い全体的量が脳組織に存在するので、標準的方法による相当する検査は、従来は死亡した生物からの組織についてしか行うことができなかった [R. Meyer, Dt. Aerzteblatt 97, Vol. 49, 08.12.2000, A-3314 頁]。さらに、電気泳動法に基づくこの試験は時間がかかり費用がかさむ。
【０００７】
最近、有機溶剤および特別なクロマトグラフィーにより、病原体をヒツジおよびシカの血液中でも追跡することができ、そしてウェスタンブロット試験により検出することができるようになった [M. Schmerr ら, Journal of Chromatography A, 853 (1999) 207214]。しかしながら、このような試験は著しく時間がかかり費用がかさみ、そしてルーチン試験として実際に実行するのは困難である。
【０００８】
最近 Adriano Aguzzi らにより、ＰｒＰｓｃがプラスミノゲンに特異的に結合することが記載された [M. B. Fischer ら, NATURE, Vol. 408, 23. November 2000]。この結合に基づく試験は提示されなかった。
【０００９】
このように、これらの疾病に特異的な実験用マーカーをこれまでに見出すことができず、そして原則として患者の死後または動物を殺した後でのみ診断が可能であった [S. B. Prusiner, PNAS USA, Vol. 95, pp. 13363−13383, Nov. 1998; A. L. Horwich および S. Weissman. Cell, Vol. 89, 499−510, May 1977]。
【００１０】
DE 197 30 132 A1 および WO 00/29850 には、サンプル中のＢＳＥ病原体のインビトロ検出方法が記載されているが、本発明に係る方法とは異なり、この検出法は直接に固定化抗体により実施される。グリコサミノグリカンの使用は記載されていない。
【００１１】
本発明がなされるまでは、ＢＳＥ疾病を生きている生物において検出できる方法は商業的に実現されなかった。しかしながら、このことは、この疾病が現在なお不治であることからみて、そしてこの疾病に感染しているがまだ発症していないにちがいない動物（例えばウシ）から、摂取された食物を介してヒトに感染しうることが証明されていることからみて、この疾病の包括的な予防および満足すべき除去のために著しく重要なことであろう。これに関して、この疾病により生じた数十億にものぼる国民経済上の損失に言及せずにはいられない。
【００１２】
上記の欠点を克服するＢＳＥ試験に対する極めて高度な要求（これは上記のことから必然的に生じる）にもかかわらず、本発明がなされるまでは、このような試験を提供することができなかった。
【００１３】
従って上記の技術水準からみて、本発明は、ＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）を特異的に検出できる方法を提供するという課題に基づいている。この方法は、操作が簡単かつ迅速であるべきであり、そして実施が確実かつ費用効果的であるべきであり、ならびに著しく高感度の検出を可能にすべきである。さらに、この方法は、例えば生きている生物から得ることのできるＰｒＰｓｃ濃度の低いサンプルについてインビトロで実施できるべきである。
【００１４】
この課題、ならびに明示的には述べられていないが本明細書の冒頭で論じた文脈から直接に誘導または推論できる他の課題は、請求項１に記載の全ての特徴を有する方法によって解決される。本発明に係る方法の適切な変更は、請求項１を引用した従属項において保護される。
【００１５】
インビトロ方法において、
(ｉ) サンプルをプロテイナーゼＫで処理し、
(ii) このように処理したサンプルを、固体担体に結合されている結合性成分と接触させ、
(iii) 固体担体に結合した結合性成分をサンプルから分離し、そして
(iv) 結合性成分に場合により結合したサンプル由来のＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ）を検出し、ここで、
(ｖ) 結合性成分をグリコサミノグリカン、フィブロネクチンまたはリポプロテインＡからなる群から選択することによって、
サンプル中のＢＳＥ病原体の検出方法を直接には予想できない手段で提供することができ、この方法はこの検出を簡単な様式および手段で可能にする。これに関して、この方法は技術水準と比較して上記の利点を示す。
【００１６】
特にこの方法は、
・ 操作が簡単かつ迅速であり、そして
・ 実施が確実かつ費用効果的であり、
そしてこの方法は、
・ 生きている生物に由来するサンプル、例えば血液サンプル、組織サンプルまたは体液、例えば尿、乳汁、髄液もしくは唾液、ならびに
・ 土壌または植物サンプルについて実施することができる。
【００１７】
本発明により、ＢＳＥ病原体が検出される。これは、プリオンタンパク質の病理学的形態（ＰｒＰｓｃ）を意味すると理解すべきである。
【００１８】
非病理学的プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）を分解するために、プロテイナーゼＫをサンプルに加える。プロテイナーゼＫは非病理学的形態を加水分解により切断するが、プリオンタンパク質の病理学的形態を僅かな程度しか切断しないことが技術水準から知られている。しかしながら本発明を考慮すれば、上記の目的に役立つ他のプロテアーゼも本発明の範囲を逸脱することなく本発明によって利用できることは、当業者に明らかである。プロテイナーゼＫにより加水分解して切断する方法は、当業者によく知られている。特に、実験ハンドブックには一連の操作手順が含まれており、それらには使用できる緩衝系、適用すべきインキュベーション時間、ならびに満たすべき他の反応条件が詳細に記載されている。
【００１９】
プロテイナーゼＫによる非病理学的プリオンタンパク質の加水分解的分解は、例えば M. Schmerr ら, Journal of Chromatography A, 853 (1999) 207-214 に記載されている。
【００２０】
例えば、普通のトリス／ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７.４中の２５０μg／mlプロテイナーゼＫ溶液の中で３７℃においてサンプルをプロテイナーゼＫによる３０分間の分解に付することによって、ＰｒＰｃを分解することができる。
【００２１】
加水分解により切断されないプリオンタンパク質（これは本発明によれば病理学的形態のＰｒＰｓｃである）は、結合性成分によりサンプルから分離される。この結合性成分は、好ましくはグリコサミノグリカン、特に好ましくはペントサンポリリン酸である。本発明により使用できる他の好ましいグリコサミノグリカンは、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラトン硫酸またはコンゴーレッドである。本発明により同様に好ましく使用できるものは、人工的に製造されたスルホン化グリコサミノグリカンである。さらにフィブロネクチンも、結合性成分として好ましく使用することができる。さらにリポプロテインＡも、結合性成分として好ましく使用することができる。
【００２２】
本発明によれば、この結合性成分は固体担体に結合される。
好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーの分野で当業者に知られている全ての固体担体を、固体担体としての使用に考慮することができる。特に好ましくは、いわゆるビーズ、すなわち種々の材料からの多くは球形の微小担体が本発明により使用される。
【００２３】
本発明により好ましく使用できる他の固体担体は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて広い用途が認められているカラム材料である。
さらに、本発明により好ましく使用できるものは、上記の結合性成分で被覆されたマイクロタイタープレートである。
【００２４】
特に好ましいものは、Seradyn 社, Indianapolis, USA からのユウロピウム（Ｅｕ）を含有するナノビーズである。粒子表面がカップリング反応のために空いたままであるように、そしてユウロピウム−キレートが漏出しないように、これらの粒子にはユウロピウム−キレートが「吸収」されている。ユウロピウム−キレート：トリス−(ナフチルトリフルオロブタンジオン)−Ｅｕ。これらの粒子をＵＶ光（最大３３３nm）で励起すると、６１３nmにおいて約０.５ミリ秒の持続時間（寿命）で発光する。これは大部分の発蛍光団の発光期間よりも１０,０００倍〜１００,０００倍長い。この著しく長い発光期間および大きなストークス−シフト（発光波長と励起波長との差）は、遅延蛍光に基づく試験におけるそれらの使用を可能にする。それぞれの粒子は、トリス−ナフチルトリフルオロブタンジオン（ジケトンの１種）に閉じ込められた＞３０,０００個のユウロピウム原子を含有する。大きさが１００nmの粒子の場合、いわゆる量子収量（quantum yield）は約３,０００分子のフルオレセイン（最も広く用いられる発蛍光団の１種）と同等である。これと比較して、フィコビリンタンパク質（おそらく最も強い蛍光を発する公知化合物）は、約３０分子のフルオレセインに相当する量子収量を有する。１００nmの粒子は、フィコビリンタンパク質と比較して１０倍大きな直径、および１０００倍大きな体積質量比を有するので、これらのビーズはフィコビリンタンパク質よりもモル基準で１００倍高い蛍光を有する。
【００２５】
ナノ粒子は最初に照射され（いわゆる励起波長 − ユウロピウムの場合は３４０nm）、そして４００μsの遅延（この場合）ののちに、シグナルを４００μsの長さで測定する。この遅延の結果、マトリックスからの持続時間の短い非特異的シグナルが避けられる。結果はＲＦＵ（相対蛍光単位）として記録される。測定は、遅延蛍光を測定できる標準化した蛍光計を用いて自動的に行われる。
【００２６】
本発明に係る試験系により、生きた生物に由来するサンプル、例えば血液サンプル、組織サンプルまたは体液、例えば尿、乳汁、髄液もしくは唾液において、ＢＳＥ病原体（ＰｒＰｓｃ；プリオンタンパク質の病理学的系態）の存在に関する検査が成功して行われる。
同様に、土壌および植物サンプルの検査を行うこともできる。
【００２７】
特に好ましくは、溶解した血栓性出発材料がサンプルとして使用される。このために、血液サンプルを凝固させ、こうして生成した血栓性材料を分離する。この血栓性材料をプロテイナーゼで加水分解することにより分解し、そして得られたサンプルを直接に試験に使用する。
【００２８】
結合性成分に結合したＢＳＥ病原体は、好ましくは特異的抗体試験により検出される。この試験および検出方法も当業者によく知られている。例としてはＥＬＩＳＡ法およびＲＩＡ法、ならびに凝集試験およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【００２９】
原則として、特異的な第一抗体により、場合によってはこの第一抗体に対して特異的な第二抗体の使用により検出を可能にする全ての方法を使用することができる。第一または第二抗体にカップリングさせた酵素のような増強系を含む方法は、本発明により特に好ましく使用することができる。
特異的抗体は既に記載されており、そして特に Prionics AG 社, University of Zurich, Switzerland から市販品を購入することができる。
【００３０】
結合性成分に結合したＰｒＰｓｃを検出するための本発明に係る特に好ましい系は、１０〜１００nmの直径を有するナノ粒子に共有結合された抗体を含む。このナノ粒子はユウロピウムを含有している。遅延蛍光により、これらの粒子を、従って間接的に、抗体を、またはＰｃＰｓｃもしくは第一抗体との抗体の結合を、高い感度で検出することができる。
【００３１】
さらに、前節で述べた抗体が、共有結合によるのではなくて当業者によく知られたビオチン／ストレプトアビジン系によってナノビーズに結合されていることが特に好ましく、この場合、抗体は好ましくはビオチン化された状態にある。
【００３２】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、担体が検出のために標識された状態、特にＥｕ標識の形態にあり（Ｅｕ−ナノビーズ）、そして、サンプルから分離したのちに、第二の結合性成分、特に特異的な抗ＰｒＰｓｃ−抗体との結合によって、相当する検出法、特に遅延蛍光により相当する標識を検出することである。
【００３３】
本発明に特有なことは、本発明に係る検出方法の個々の構成要素が当業者に公知であることである。しかしながら、これら個々の段階の組み合わせが、このような当業者の強い要求に対して、極めて驚くほど好ましい手段で簡単な解決策を与える方法に導くことは、決して予期することができなかった。
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例が限定的であるとは決して理解してはならない。
【００３４】
実施例１
微小担体とのペントサンの結合
担体として、Toyopearl HW55（Toyo Soda Manufacturing Co. Ltd. から市販されている架橋ポリアクリレートゲル、５０〜１００μmの粒径を有する）を用いた。
１０mlのゲルに６mlの飽和ＮａＯＨ水溶液および１５mlのエピクロルヒドリンを加え、反応混合物を撹拌下に５０℃で２時間インキュベートした。ゲル中にエポキシ基を導入するためにゲルを順次にアルコールおよび水で洗浄した。得られたエポキシ活性化ゲルに２０mlの濃アンモニア水を加え、ゲル中にアミノ基を導入するために反応混合物を５０℃で２時間撹拌した。
【００３５】
３mlのこうして得られたアミノ基含有活性化ゲルを、２００mgのペントサンポリ硫酸を含有する１０mlの水溶液（ｐＨ４.５）に加えた。得られた反応混合物に２００mgの 1−エチル−3−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドを加え、反応混合物のｐＨ値を４.５に調節し、得られた反応混合物を４℃で２４時間振盪した。反応が終了したのち、得られた反応混合物を順次に２Ｍ ＮａＣｌ水溶液、０.５Ｍ ＮａＣｌ水溶液および水で洗浄し、こうしてペントサンポリリン酸が固定化された目的のゲルを得た。
【００３６】
実施例２
プリオン含有試験サンプルを常法によりプロテイナーゼＫで処理して、正常プリオンタンパク質ＰｒＰｃを除去した。
このために、サンプルを５０μg／mlのプロテイナーゼＫ(Boehringer)の濃度に調節し、３７℃で１時間インキュベートした。この酵素的分解の詳細な条件は上記の Schmerr らに記載されている。
例えば下記のプロトコールを用いることができる：
５０μlの１mg／mlプロテイナーゼＫ (Sigma, Cat. No. 82456) を１mlのサンプルにピペットで加える。
３７℃で３０分間インキュベートする。
１００μlの４ｍＭ Pefabloc SC PLUS (Roche; Cat. No. 1 873 601) を加える。
次いで室温で５分間インキュベートする。
【００３７】
上澄み液を、実施例１からのペントサンポリリン酸で被覆したビーズと混合した。１ｍＭの亜鉛の存在が結合を促進させることを見出した。
Hettich−テーブル遠心分離器で遠心することによりビーズを沈降させ、試験サンプルから分離する。
次いでビーズをプリオンに対する特異的抗体 (Prionics AG, University of Zurich, 8057 Zurich, Switzerland) と共にインキュベートし、第二抗体によりＥＬＩＳＡ法で試験する。陽性の試験バッチはリガンド複合体への第二抗体の付加の増大を特徴としており、これは次に第二抗体に結合した酵素による無色物質の変換によって測定することができる。
感染した動物の血液中のＢＳＥ病原体を驚くほど簡単な手段で検出することができた。
【００３８】
実施例３
ＥＬＩＳＡ試験の代わりに、凝集試験を行った。
同様にこのようにして、ＢＳＥ病原体を驚くほど簡単な手段で検出することができた。
【００３９】
実施例４
ＥＬＩＳＡ試験の代わりに、第二抗体で標識したビーズをフローサイトメトリーにより検出した。
同様にこのようにして、ＢＳＥ病原体を驚くほど簡単な手段で検出することができた。
プリオンを検出するためのこの操作法は全く新規であり、かつ実行可能である。この方法により、ヒト、動物および植物に由来する血液サンプル、組織サンプル、体液（例えば尿、乳汁、液、唾液等）を試験することができる。土壌試料も汚染について試験することができる。
【００４０】
実施例５
抗体をナノビーズ (FluoroMaxTM 蛍光性微小粒子, Seradyn, Indianapolis, USA) に共有結合させるため、粒子表面上のカルボキシル基とタンパク質分子（抗体）との確実かつ強固な結合を確保するために、これらの粒子をカルボジイミドおよびヒドロキシスクシンイミドで処理する。こうして抗体はナノ粒子に安定的に結合されたままである（複合体のより長い耐久性）。抗体は、その後の処理（異なる反応緩衝液）においてビーズから分離することができない。
【００４１】
実施例６
抗体−ユウロピウム−ナノビーズ複合体によるペントサンポリリン酸とのＰｒＰｓｃの結合の検出
ユウロピウム−ナノ粒子を Seradyn, Indianapolis, USA から購入した。粒子表面がカップリング反応のために空いたままであるように、そしてユウロピウム−キレートが漏出しないように、これらの粒子にはユウロピウム−キレートが「吸収」されている。ユウロピウム−キレート：トリス−(ナフチルトリフルオロブタンジオン)−Ｅｕ。これらの粒子をＵＶ光（最大３３３nm）で励起すると、６１３nmにおいて約０.５ミリ秒の持続時間で発光する。これは大部分の発蛍光団の発光期間よりも１０,０００倍〜１００,０００倍長い。この著しく長い発光期間および大きなストークス−シフト（発光波長と励起波長との差）は、遅延蛍光に基づく試験におけるそれらの使用を可能にする。それぞれの粒子は、トリス−ナフチルトリフルオロブタンジオン（ジケトンの１種）に閉じ込められた＞３０,０００個のユウロピウム原子を含有する。大きさが１００nmの粒子の場合、いわゆる量子収量は約３,０００分子のフルオレセイン（最も広く用いられる発蛍光団の１種）と同等である。これと比較して、フィコビリンタンパク質（おそらく最も強い蛍光を発する公知化合物）は、約３０分子のフルオレセインに相当する量子収量を有する。１００nmの粒子は、フィコビリンタンパク質と比較して１０倍大きな直径、および１０００倍大きな体積質量比を有するので、これらのビーズはモル基準で、フィコビリンタンパク質よりも１００倍高い蛍光を有する。
【００４２】
ナノ粒子は最初に照射され（いわゆる励起波長 − ユウロピウムの場合は３４０nm）、そして４００μsの遅延（この場合）ののちに、シグナルを４００μsの長さで測定する。この遅延の結果、マトリックスからの持続時間の短い非特異的シグナルが避けられる。結果はＲＦＵ（相対蛍光単位）として記録される。測定は、遅延蛍光を測定できる標準化した蛍光計を用いて自動的に行われる。
この系は、数ある中で Ci, Y. ら, J. Immun. Meth., 179, 233-241, 1995 ならびに Souka ら, Clin. Chem., 47:3, 561-568 に記載されている。
類似の系（Ｅｕ−ナノビーズ複合体）については、前立腺−特異的抗原に対して７.３×１０5分子／mlの検出限界が報告されている（プリオンタンパク質の場合、これは約３６.３fgに相当するであろう）。これまでに記載された時間検出法では、５０pgのプリオンタンパク質を検出することができる (Barnard, G. ら, Luminescence, 15:6, 357-362, 2000)。
【００４３】
実施例７
ビオチン／ストレプトアビジン系による担体との抗体カップリング
複合または固定化されたストレプト（アビジン）に関連するいわゆる２段階技術に、ビオチンを用いる。ストレプト（アビジン）とのビオチンの結合は極めて急速かつ安定である。抗体をビオチン化する種々の技術が記載されている。さらに、キットも種々の会社から相当するプロトコールで入手することができる。
通常はビオチンをタンパク質（例えばリジン）の一級アミンにより複合させ、こうして１分子のタンパク質当たり３〜６分子のビオチンを結合させる。一例として、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce)を使用することができる。抗体からの複合しなかったビオチンの分離は遠心マイクロ濃縮器 NanosepTM (Pall)で行うことができる。ビオチン化段階は過剰のアビジンとのいわゆるＨＡＢＡ反応（ＨＡＢＡ−2−(4'−ヒドロキシアゾベンゼン)−安息香酸）により測光法で決定する。
【００４４】
ストレプトアビジンによるナノ粒子の被覆を Haermae ら, Clin. Chem., 47:3; 561-568 (2001) により行う。ビーズを NanosepTM 遠心マイクロ濃縮器によりＰＢＳ、ｐＨ７.０で前洗浄することによって、超音波プローブを含む同じ緩衝液に再懸濁させる。次いで１０ｍＭ N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N'−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）(Pierce)および N−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）(Sigma)によるカルボキシル基の活性化を３０分間行う。２回の洗浄工程（上記のとおり、ただし炭酸塩緩衝液、ｐＨ９.０を使用）ののち、１５μmのストレプトアビジンを加え、ビーズを１時間インキュベートする。最後にナノ粒子を２ｍＭトリス−ＨＣｌ(Sigma)、ｐＨ７.０で５回洗浄し、４℃で保存する。
【００４５】
実施例８
フィブロネクチンによるユウロピウム−ナノビーズとのＰｒＰｓｃの結合（実施例７参照）
この場合、フィブロネクチン分子の立体配座への影響ができるだけ少ない方法の使用が特に重要であることを見出した。
サンプルからの（ナノ）ビーズの分離は遠心分離および／またはいわゆる遠心濃縮器（マイクロフィルター）の使用により行うことができる。フィブロネクチンとＰｒＰｓｃとの結合強度に応じて、両方のＰｒＰ形態のできるだけ高い分離を得るために、ビーズ−ＰｒＰｓｃ複合体を洗浄することができる。
【００４６】
原則的な操作は次のとおりであった：
１．  フィブロネクチンをナノビーズ（ユウロピウム−ナノビーズ）とカップリングさせる。
２．  サンプルをフィブロネクチン−ナノビーズと共にインキュベートする。ＰｒＰの病理学的形態（ＰｒＰｓｃ）はフィブロネクチンに付着するが、正常形態（ＰｒＰｃ）は付着しない − 反応混合物に溶解したままである。
３．  次いでフィブロネクチン−ナノビーズをサンプルから遠心により分離し、反応緩衝液に再懸濁させる。
４．  再懸濁したフィブロネクチン−ナノビーズをモノクローナル抗体（ＰｒＰに対する）で被覆したマイクロタイタープレート上でインキュベートする（複合体ＭｏＡｋ−ＰｒＰｓｃ−フィブロネクチン−ナノビーズの形成）。
５．  洗浄工程ののち、蛍光を測定し（時間分解法）、ＰｒＰｓｃの濃度を決定する。
【００４７】
詳細な指示は次のとおりである：
・ ヒトＦＮ (FIBRONECTIN−ロット：000832. 会社：BD Biosciences. ＭＷ：440 kDa) または別のフィブロネクチン組み換え体
・ １mg／ml ＦＮ：ボトル１本分の１mgのＦＮを室温にし、１mlの無菌蒸留Ｈ2Ｏで３０分間溶解する。
・ ０.５mlの１％ＭＰ(Seradyn, FLUORO−MAX FLUORESCENT PARTICLES Part No. 1347-0350)を０.５mlの５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳ（モルホリノエタンスルホン酸, Sigma−製品 No. M8250）および Nanosep 300 kDa カットオフ（Pall Life Siences; 製品 No. OD300C33）で２回、１４,０００ｇで５分間洗浄する。
・ 最終洗浄工程ののち、０.５mlの５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳに再懸濁させ、２.０mlエッペンドルフ試験管に移し、５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳを１.０mlまで充填する。
【００４８】
予備活性化：
ａ）  ＥＤＡＣ（カルボジイミド − 会社 Pierce, Cat. No. 22980）：０.６モル過剰：
０.５mlの１％ＭＰ＝５ＭＰ；ＭＰの酸含有量 meq／ｇ ＝ μmol／mg；
ｂ）  （酸含有量、μmol／mg）（５mg ＭＰ）（望ましい比率）＝ μmol ＥＤＡＣ必要量：0.1566×５×0.6 ＝ 0.4698μmol ＥＤＡＣ必要量
ｃ）  （μmol ＥＤＡＣ必要量）／（５２μmol／ml）＝ １ml当たりの ml ＥＤＡＣストック溶液
反応： 0.4698／52 ＝ 0.009ml ＥＤＡＣストック溶液
ｄ）  ＥＤＡＣストック溶液：蒸留水中１０mg／ml、使用の直前に調製する。
ｅ）  洗浄したＭＰに下記の順序でピペットで加える：
・ ２３０μl ＮＨＳストック溶液（蒸留水中 50mg／ml N−ヒドロキシスクシンイミド, Sigma, Cat. No. H7377）
・ ９μl ＥＤＡＣストック溶液
・ ＲＴ（室温）で連続的に混合しながら３０分間インキュベートする。
・ ＭＰを５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳおよび Nanosep で３．のように２回洗浄する。
・ 最終洗浄工程ＬＷＶののち、０.５mlの５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳに再懸濁させ、２.０mlエッペンドルフ試験管に移す。
・ ２．からの０.５mlのＦＮ溶液を加え、充分に混合する。
・ ＲＴで連続的に混合しながら２時間インキュベートする。
・ ＭＰを５０ｍＭ ｐＨ６.１ ＭＥＳおよび Nanosep で３．のように２回洗浄する。
・ ＬＷＶののち、０.５mlのＭＮＴＡ (25 mM MOPSO, Sigma, Cat. No. M8389, pH 7.4; 100 mM NaCl, Sigma, Cat. No. 71378; 0.1％ Tween 20, Sigma, Cat. No. 27, 434-8; 0.1％ NaN3, Sigma, Cat. No. 71290) に再懸濁させる。
・ ４℃で保存する。
【００４９】
マイクロタイタープレートの被覆：
・ プレート (Nunc, Fluoro−Nunc モジュール F16 Maxi−Sorp, Cat. No. 47515) を被覆する：
・ ６Ｈ４（モノクローナル抗体, Prionics）：８μl／ml、９６ウェル − Bic/Carb 緩衝液 ｐＨ９.４ (Pierce, Cat. No. 28382) で希釈し、５０μl／ウェルをピペットで加える。
・ ３７℃で３時間インキュベートする。
【００５０】
非特異的結合部位のブロック：
・ ２００μlの洗浄緩衝液 (５mM Trizma pH 7.8, Sigma, Cat. No. 93349; 150mM NaCl; 0.05％ Tween 20) で１回洗浄する。
・ １００μlのブロック緩衝液 (50mM Trizma pH 7.8, Sigma, Cat. No. 93349; 150 mM NaCl; ２％ ウシ血清アルブミン, Immucore, Cat. No. 004410; ２ゼラチン, Sigma, Cat. No. G7765; 0.05% Tween 20; 0.05％ NaN3) を各キャビティにピペットで加える。
・ 室温で１時間振盪する − ４５０rpm。
・ 上澄み液を吸引分離する。
【００５１】
抗原−ＭＰ−ＦＮのインキュベーション：
・ ＭＰ−ＦＮ １：７４２をＰＢＳ− Tween 20 ２％ (PBS, Pierce, Cat. No. 28374; Tween 20 ２％) で希釈する。
・ エッペンドルフ試験管中で５０μlのプロテイナーゼＫで処理したサンプルをインキュベートし、５０μlの希釈ＭＰ−ＦＮをピペットで加え、ＲＴで連続的に撹拌しながら２時間インキュベートする。
・ Nanosep で１４,０００ｇにおいて２分間遠心する。
・ 濾液を捨て、ＭＰ−ＦＮを１００μlのＰＢＳ− Tween 20 ２％に再懸濁させる。
・ サンプル当たり３０μlを正確にキャビティ底に入れる。
・ ３７℃で４５０rpmにおいて２時間インキュベートする。
・ ３００μlのＰＢＳ− Tween 20 ２％で２回洗浄する。
【００５２】
測定（遅延蛍光）：
・ 装置：Tecan GENios, program XFluor4：１０フラッシュ、遅延４００μs、積分：４００μs。
【００５３】
実施例９
フィブロネクチンをビーズ（ポリスチレンビーズ）とカップリングさせる：
プロテイナーゼＫ処理サンプルおよび未処理サンプルをフィブロネクチン−ナノビーズと共にインキュベートする。
次いでサンプルをフィブロネクチンと共にインキュベートする。
次いでフィブロネクチンビーズを洗浄し、反応緩衝液に再懸濁させる。
再懸濁したビーズをモノクローナル蛍光標識抗体（ＰｒＰに対する）と共にインキュベートする。
インキュベーションののち、蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定する。
【００５４】
実施例１０
フィブロネクチンで被覆したマイクロタイタープレートでのＰｒＰｓｃの結合
１．  マイクロタイタープレートをフィブロネクチンで被覆（塗布）する。
２．  サンプルをマイクロタイタープレートでインキュベートする。ＰｒＰの病理学的形態（ＰｒＰｓｃ）はフィブロネクチンに付着するが、正常形態（ＰｒＰｃ）は付着しない − 反応混合物に溶解したままである。
３．  洗浄工程ののち、モノクローナル抗体（ＰｒＰに対する）とカップリングさせたユウロピウム−ナノビーズをマイクロタイタープレートにピペットで加え、インキュベートする。
４．  洗浄工程ののち、蛍光を測定し（時間分解法）、ＰｒＰｓｃの濃度を決定する。
【００５５】
詳細な手順は例えば下記のように行われる：
プレート (Nunc. Fluoro−Nunc モジュール F16 Maxi−Sorp, Cat. No. 47515) の被覆：
・ ＦＮをＰＢＳ(Pierce, Cat. No. 28374)ｐＨ７.２で２.５μg／mlに希釈し、５０μl／ウェルをピペットで加える。
・ ＲＴで１時間インキュベートする。
・ 吸引分離する。
・ プレートを注意深く３００μlの蒸留水で３回洗浄する。
【００５６】
抗原のインキュベーション：
・ ３０μlのプロテイナーゼＫ処理サンプルをキャビティにピペットで加える。
・ ＲＴ − ４５０rpmで１.５時間インキュベートする
【００５７】
ＭＰ−３Ｆ４のインキュベーション：
・ ２００μlのＰＢＳ−Tween 20 ２％で１回洗浄する。
・ ＭＰをＰＢＳ− Tween 20 ２％で１：２９６に希釈する。
・ 希釈物を充分に混合する。
・ ３０μlを正確にキャビティ底にピペットで入れる。
・ ３０℃で４時間インキュベートする − ４５０rpmで振盪。
・ ２００μlのＰＢＳ−Tween 20 ２％で２回洗浄する。
【００５８】
測定：
・ 装置：Tecan GENios, program XFluor4：１０フラッシュ、遅延４００μs、積分：４００μs。
【００５９】
実施例１１
リポプロテインＡによるユウロピウム−ナノビーズとのＰｒＰｓｃの結合
操作法については実施例９を参照（フィブロネクチンの代わりにリポプロテインＡを用いた。アポリポプロテインＡを用いることもできる）。
【００６０】
実施例１２
リポプロテインＡで被覆したポリスチレンビーズとのＰｒＰｓｃの結合
操作法については実施例１０を参照（フィブロネクチンの代わりにリポプロテインＡを用いた。アポリポプロテインＡを用いることもできる）。
【００６１】
実施例１３
リポプロテインＡで被覆したマイクロタイタープレートでのＰｒＰｓｃの結合
操作法については実施例１１を参照（フィブロネクチンの代わりにリポプロテインＡを用いた。アポリポプロテインＡを用いることもできる）。