(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１層の滅菌架橋粘膜下コラーゲンを含んだコラーゲンチューブを含み、
該滅菌架橋粘膜下コラーゲンは、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、脂質、非コラーゲン質タンパク質及び核酸を５乾燥重量％未満の割合で有しており、実質的に細胞及び細胞破片は含んでいないことを特徴とする生体再造形可能補綴。
【請求項２】
小腸の粘膜下コラーゲンの少なくとも１層を含むコラーゲンチューブの生産方法であって、
（ａ）粘膜下コラーゲンをマンドレルの回りにおよびそれ自体にわたり完全の１回転させて２層粘膜下コラーゲンチューブを形成させ；
（ｂ）該チューブをマンドレルの上で乾燥し；
（ｃ）該チューブを架橋剤と接触させてコラーゲンを架橋させ；
（ｄ）該チューブをすすぐことによって該架橋剤を除去し；
（ｅ）マンドレル上で架橋チューブを乾燥し；
次いで、
（ｆ）該チューブからマンドレルを取り出す；
ことを特徴とし、
前記粘膜下コラーゲンは、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、脂質、非コラーゲン質タンパク質及び核酸を５乾燥重量％未満の割合で有しており、実質的に細胞及び細胞破片は含んでいないことを特徴とする方法。
【請求項３】
さらに、（ｇ）コラーゲンチューブを過酢酸と接触させてコラーゲンチューブを滅菌する工程を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組織工学の分野にある。本発明は動物源に由来する洗浄された組織物質から調製された生物工学作成移植片補綴に指向される。本発明の生物工学作成移植片補綴は、加工された組織マトリックスの細胞適合性、強度および生体再造形性を保持する方法を用いて調製される。生物工学作成移植片補綴は移植、修復にまたは哺乳動物宿主における用途で使用される。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
組織工学の分野は、正常および病理学的哺乳動物組織において構造および機能の関係を理解するために工学の方法をライフサイエンスの原理と組み合わせる。組織工学の目標は組織機能を回復、維持および改良するための生物学的代替の開発および最終的適用である。
【０００３】
コラーゲンは身体における主要な構造蛋白質であって、全身体蛋白質のほぼ３分の１を構成する。それは、皮膚、腱、骨および歯の有機物質のほとんどを含み、ほとんどの他の身体構造において繊維状封入体として起こる。コラーゲンの特性のいくつかはその高い引張強度；部分的には螺旋構造による可能な抗原決定基のマスキングによるその低い抗原性；およびその低い展延性、半透性および可溶性である。さらに、コラーゲンは細胞接着のための天然物質である。これらの特性および他の特性はコラーゲンを、移植可能な生物学的代替物および生体再造形可能補綴の組織工学および製造のために適した物質とする。
【０００４】
外植哺乳動物組織からコラーゲン質組織および組織構造を得る方法および組織から補綴を構築する方法は、外科的修復のためまたは組織もしくは器官置換のために広く調査されてきた。哺乳動物組織を置換または修復するのに首尾よく用いることができる補綴を開発するのは研究者の継続的目標である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
腸粘膜下組織のごとき生物学的に由来するコラーゲン質材料は組織修復または置換で用いるために多くの研究者によって提案されてきた。生体補綴適用のためのラミネートを形成するのに用いることができる腸コラーゲン（ＩＣＬ）の単一無細胞層を生成させるための近位ブタ空腸の機械的および化学的加工方法が開示されている。該加工は天然コラーゲン構造を維持しつつ細胞および細胞夾雑物を除去する。加工された組織マトリックスの得られたシートは、所望の仕様を持つ多層積層構築体を製造するのに使用される。本発明者らは、軟組織修復のための積層パッチの効果ならびに血管移植片用の支持体としてのチューブ化ＩＣＬの使用を調べた。この材料は必要な物理的支持体を提供し、周囲の天然組織に一体化し、宿主細胞が侵入するようになることができる。イン・ビボでの再造形は機械的一体化を許さない。弾性率、縫合保持およびＵＴＳのごときインプラントの保有かつ機能的特性は、ＩＣＬ層の数および架橋条件を変化させることによって具体的要件に対して操作することができる重要なパラメーターである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、哺乳動物宿主に移植されると、修復、増加または置換身体部分または組織構造として働くことができ、宿主細胞による再造形と同時におこる制御された生分解を受けるであろう組織作成補綴に指向される。かくして本発明の補綴は、置換組織として用いると二重の特性を有する。まず、それは代替身体部分として機能し、第２に、代替身体部分として依然として機能しつつ、それは宿主細胞の内方成長のための再造形鋳型として機能する。これを行うためには、本発明の補綴材料は、それ自体またもう１つの加工された組織マトリックスに結合されて患者に対する移植のための補綴を形成することができる哺乳動物由来コラーゲン質組織から開発された加工組織マトリックスである。
【０００７】
本発明は、洗浄された組織材料から組織作成補綴を作成する方法に指向され、ここに、該方法は補綴の生体再造形性を維持しつつ層を一緒に結合するのに接着剤、縫合またはステープルを必要としない。用語「加工組織マトリックス」および「加工組織材料」は動物源、好ましくは哺乳動物から獲得され、随伴組織から機械的に清浄され、細胞、細胞夾雑物から化学的に清浄され、非コラーゲン質細胞外マトリックス成分が実質的になくされた天然の通常の細胞組織を意味する。加工組織マトリックスは、非コラーゲン質成分が実質的になくて、その天然マトリックス構造、強度および形状の多くを維持する。本発明の生体作成移植片を構成するための好ましい組成物は、限定されるものではないが、腸、大腿筋膜、心膜、硬膜、およびコラーゲン質組織マトリックスを含む他の平坦または平面構造組織を含めたコラーゲンを含む動物組織である。これらの組織マトリックスの平面構造はそれらが本発明の生体作成移植片を調製するように容易に清浄、操作および組み立てることができるようにする。同一の平坦シート構造およびマトリックス組成を持つ他の適当なコラーゲン質組織源は他の動物源において当業者によって同定され得る。
【０００８】
本発明の生体作成移植片を調製するためのより好ましい組成物は小腸の粘膜下膜に由来する腸コラーゲンである。小腸についての適当な源はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヤギまたはウマのごとき哺乳動物生物であるが、ブタの小腸は好ましい源である。
【０００９】
本発明の補綴を調製するための最も好ましい組成物は、ブタ小腸の粘膜下膜に由来する加工腸コラーゲン層である。加工腸コラーゲン層を得るには、ブタの小腸を収集し、伴う腸管膜組織を腸から大いに切開する。粘膜下膜は、好ましくは、対向ローラーの間で原料腸材料を機械的に圧搾して筋肉層（筋肉膜）および粘膜（粘膜）を除去することによって小腸の他の層から分離しまたは脱ラミネートする。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾する。後記する実施例においては、Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いてブタ小腸から粘膜下膜を機械的に収集し、次いで、化学的に清浄して清浄組織マトリックスを得る。この機械的かつ化学的に清浄された腸コラーゲン層を本明細書中では「ＩＣＬ」と言う。
【００１０】
加工されたＩＣＬは実質的に無細胞テロペプチドコラーゲン（約９３乾燥重量％）であり、約５乾燥重量％未満の糖蛋白質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲン質蛋白質およびＤＮＡおよびＲＮＡのごとき核酸を含み、細胞および細胞夾雑物は実質的にない。加工ＩＣＬはそのマトリックス構造およびその強度の多くを保持する。重要なことには、組織マトリックスの成体再造形性は部分的には清浄プロセスによって保持される。というのは、それはコラーゲンの生体再造形性に悪影響を与えるであろう結合洗剤残渣がないからである。加えて、コラーゲン分子はそのテロペプチド領域を保持した。というのは該組織は洗剤プロセスの間に酵素での処理を受けないからである。
【００１１】
補綴デバイスのコラーゲン層は、ＩＣＬの２以上の層のごとき同一コラーゲン材料、またはＩＣＬの１以上の層および大腿筋膜の１以上の層のごとき異なるコラーゲン材料に由来するものでよい。
【００１２】
加工組織マトリックスは生物工学形成移植片補綴の製造に先立って物理的または化学的に処理または改質することができる。シェーピング、延伸および緩和によるコンディショニング、または洗浄組織マトリックスの穴あけのごとき物理的修飾ならびに結合成長因子、選択された細胞外マトリックス成分、遺伝物質、および生体再造形に影響するであろう他の剤のごとき化学的修飾を行うことができ、身体部分の修復を処理し、改質しまたは置き換える。
【００１３】
ＩＣＬは本発明の生体作成移植片補綴の生産用の最も好ましい出発材料であるので、後記する方法はＩＣＬを含む生体作成移植片補綴を生産するのに好ましい方法である。
【００１４】
最も好ましい具体例において、ブタ小腸の粘膜下膜は、本発明の生体作成移植片補綴のための出発物質として利用される。ブタの小腸を収集し、その随伴する組織を除去し、次いで、機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下膜から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に除去する腸清浄マシーンを用いて機械的に清浄される。機械的作用は、小腸がそれらの間で処理されると粘膜下膜からの連続層を圧縮し、該層を除く一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下膜は周囲の組織よりも比較的硬くてしっかりしており、ローラーは粘膜下組織から柔軟成分を圧搾する。マシーン清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。
【００１５】
機械的に清浄した後、化学的清浄処理を使用して、細胞およびマトリックス成分を除去し、好ましくは室温にて無菌条件下で行う。次いで、腸をルーメンの長さ方向に切断し、次いで、ほぼ１５ｃｍ2シートセクションに切断される。材料を秤量し、腸材料に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れる。国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／４９９６９（その開示をここに一体化させる）に開示された方法のごとき最も好ましい化学的清浄処理において、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加によって、アルカリ性条件下で、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のごときキレート化剤とコラーゲン質組織を接触させ、続いて、酸と接触させ、ここに該酸は塩、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する塩酸（ＨＣｌ）を含有し、続いて、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のごとき緩衝化塩溶液と接触させ、最後に水を用いるすすぎ工程を行う。
【００１６】
各処理工程は、好ましくは、回転または震盪プラットフォームを用いて行う。すすいだ後、次いで、水を各容器から除去し、ＩＣＬを滅菌吸収剤タオルを用いて過剰の水でにじませる。この時点で、ＩＣＬを−８０℃にて滅菌リン酸緩衝液中で４℃にて凍結貯蔵するか、あるいは、補綴の製造で用いるまで乾燥することができる。もし乾燥貯蔵すべきならば、ＩＣＬシートを平坦プレート、好ましくは剛直なポリカーボネートシートのごときプレートまたは膜のような表面上で平坦化させ、材料のアブルミナル側からのいずれのリンパ系タグもスカルペルを用いて除去し、雰囲気室温および湿度にて層流風土中でＩＣＬシートを乾燥させる。
【００１７】
ＩＣＬは、その意図した用途に最終的には応じて補綴の形状にて補綴として使用されるべき種々のタイプの構築体を製造するのに使用することができる平面シート構造である。本発明の補綴を形成するには、加工マトリックス材料の生体再造形性を保持する方法を用いて構築体を製造しなければならないが、また置換組織としてその性能においてその強度および構造特徴を維持することもできる。加工組織マトリックスシートは、もう１つのシートと接触するように層とされ、あるいはチューブとされ、それ自体にまかれる。接触の面積は層が接触する結合領域である。結合領域は、患者の細胞が補綴に住み着いて引き続いてそれを生体再造形して新しい組織を形成するまで移植の間および最初の治癒相において縫合および延伸に耐えることができなければならない。導管またはダクトとして使用する場合、特に全身血流の収縮期および弛緩期圧力下で血管移植片として使用する場合、結合領域はそれが含有するまたは通過する物質の圧力に耐えることができなければならない。
【００１８】
好ましい具体例において、本発明の補綴デバイスは加工組織マトリックスの単一の一般に矩形シートから形成されたチューブ状構築体である。加工組織マトリックスは、１つのエッジが対向エッジに適合し重複するように圧延される。重複は結合領域として働く。本明細書中で用いる「結合領域」は、層を相互にその上に置き、自己ラミネーションおよび化学的結合によって十分に一緒に保持されるように処理された同一または異なる加工組織マトリックスの２以上の層の間の接触の領域を意味する。例えば、ＩＣＬの多層シート構築体を用いて、心膜パッチまたはヘルニア修復デバイスのごとき体壁構造を修復し、チューブ状構築体を用いて、血管系または消化系管構造のごとき導管として働くチューブ状器官を修復することができ、あるいは神経再生をガイドするためのニューロン成長チューブとして使用することができる。また、それらは組織バルキングおよび増加のために移植することができる。ＩＣＬの多数の層をバルキングまたは強度表示のために構築体に一体化させることができる。移植に先立ち、層をさらにコラーゲンまたは他の細胞外マトリックス成分、ヒアルロン酸、またはヘパリン、成長因子、ペプチドまたは培養細胞で処理しまたはコートすることができる。
【００１９】
好ましい具体例において、ＩＣＬシートをチューブ状補綴に形成する。ＩＣＬチューブは種々の直径、長さおよび層の数にて製造することができ、その使用のための適用に応じて他の成分を配合することもできる。チューブ状ＩＣＬ構築体は血管移植片として用いることができる。この適用では、移植片は密な継ぎ目を形成する結合領域として作用するための少なくとも５％重複を持つ少なくとも１つの層を含み、管腔表面を好ましくはヘパリンまたは血栓を予防する剤で処理する。血栓を予防する他の手段は血管構築体を製造する分野で公知である。もう１つの血管適用において、チューブ状ＩＣＬ構築体は金属ステント上に形成されてステントのためのカバーを供する。移植すると、該ＩＣＬは、ステントのための平滑な保護被覆を供して、配置の間に宿主組織に対するさらなる損傷を妨げることによって受容者に益する。また、チューブ状ＩＣＬ補綴を用いて、胃腸管セクション、尿道、ダクト等のごとき他の通常にチューブ状の構造を修復しまたは置き換えることもできる。また、細胞外マトリックス成分、成長因子または培養細胞を充填した神経成長チューブに製造した場合、それは神経系修復で使用することもできる。
【００２０】
もう１つの好ましい血管適用において、損傷したまたは病気となった血管または自己移植血管が外部支持体を必要とする場合、チューブ状ＩＣＬ構築体は外部ステントとして使用することができる。１つのかかる適用において、静脈自己移植片は身体内に移植され、移植静脈のための外部支持体が望まれる。移植血管が十分に存在する血管系に吻合される前に、まず血管をＩＣＬチューブの管腔に通す。次いで、血管を吻合し、次いで、ＩＣＬチューブの端部を固定して構築体の位置を維持する。
【００２１】
チューブ状構築体を形成するには、形成された構築体の直径を決定するであろう直径測定でマンドレルを選択する。マンドレルは好ましくは断面が円筒または卵型であり、ガラス、ステンレス鋼または非反応性の医療グレードの組成物で作成される。マンドレルは直線、曲線、角度をつけたものであってよく、それは分岐または分岐点、あるいは多数のこれらの性質を有することができる。形成されるべきチューブ状構築体で意図した層の数は、ＩＣＬがマンドレルの回りまたはそれ自体にわたって巻かれる回数の数に対応する。ＩＣＬを巻くことができる回数の数は加工ＩＣＬシートの幅に依存する。２層チューブ状構築体では、シートの幅は少なくとも２回マンドレルの周りにシートを巻くのに十分でなければならない。該幅は、単一層構築体につき、好ましくはマンドレル周囲の約５％ないし約２０％の間だけ結合領域として働いて、結合領域として働き密な継目を形成するための重複として必要な回数およびさらなるパーセントだけマンドレルの回りにシートを巻くのに十分であるのが好ましい。同様に、マンドレルの長さは、その上で見いだすことができるチューブの長さを指令するであろう。マンドレル上で構築体を扱う容易性のために、形成される構築体ではなくマンドレルが取り扱われる場合に接触されるように、マンドレルは構築体の長さよりも長くあるべきである。
【００２２】
ＩＣＬはその天然チューブ状状態に由来する面性を有する。ＩＣＬは２つの対向表面を有する：腸ルーメンに面する粘膜表面および腸間膜および血管系のごとき、そのに付着した外部腸組織を従前有した漿膜。これらの表面は補綴の手術後性能に影響し得る特徴を有するが、増強されたデバイス性能につきてこ入れされ得ることが判明した。血管移植片におけるごとき使用のためのチューブ状構築体の形成において、材料の粘膜表面は、形成された場合に、チューブ状移植片の管腔表面であるのが好ましい。血管適用において、粘膜表面を血流に接触させることは、利点を有する。というのは、それが患者に移植された場合に、移植片の閉塞を妨げるのが好ましいいくつかの非血栓形成性特性を有するからである。他のチューブ状構築体において、構築体の層の向きは意図した用途に依存する。
【００２３】
マンドレルには、スリーブ形態である、非反応性で、医療グレードの品質の、弾性ゴムもしくはラテックス材料のカバーリングを設けるのが好ましい。チューブ状ＩＣＬ構築体はマンドレル表面に直接形成することができるが、該スリーブは形成されたチューブをマンドレルから取り出すのを容易とし、ＩＣＬ上の残物に接着したり、それと反応したりそれを残したりしない。形成された構築体を取り出すには、スリーブは、それと共にマンドレルからの構築体を運ぶにはマンドレルの一端から引っ張ることができる。加工されたＩＣＬはスリーブに軽く接着しているの過ぎず、かつ他のＩＣＬ層により接着している故に、ＩＣＬチューブの製造は容易とされる。というのは、チューブ化構築体は、該構築体を延ばしたりまたはそれに圧力を加えたり、あるいはそれに損傷を与える危険性なくしてマンドレルから取り出すことができるからである。最も好ましい具体例において、スリーブはＫＲＡＴＯＮ8（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、非常に安定な飽和中央ブロックを持つスチレン−エチレン／ブチレン−スチレンコポリマーよりなる熱可塑性ゴムを含む。
【００２４】
説明の簡単のために、４ｍｍ直径および１０％重複を持つ２層チューブ状構築体が４ｍｍ直径を有するマンドレル上に形成されるものとする。マンドレルには、該マンドレルの長さとほぼ同等の長さであって、その上に形成されるべき構築体よりも長いＫＲＡＴＯＮ8スリーブが設けられる。ＩＣＬのシートは、幅の寸法が約２８ｍｍであって、長さの寸法が構築体の所望の長さに依存して変化し得るように整えられる。層流キャビネットの滅菌場において、次いで、ＩＣＬを以下のプロセスによってコラーゲンチューブに形成する。該ＩＣＬは１つのエッジに沿って湿らせ、スリーブ被覆マンドレルと整列させ、ＩＣＬの接着性質をてこ入れし、それをスリーブ被覆マンドレルの長さに沿って「舗装」し、所定の位置にて少なくとも１０分以上乾燥する。次いで、舗装したＩＣＬを水和させ、マンドレルの回りに巻き、次いで、１１０％重複のために、１回転＋周囲の１０％だけそれ自体の回りに巻いて、結合領域として働かせ、密な継目を供する。形成された構築体の管腔としてのＩＣＬの粘膜側を持つチューブ状構築体を得るには、ＩＣＬの粘膜側を１つのエッジに沿って湿らせ、マンドレル上に舗装し、ＩＣＬの粘膜側がマンドレルに面するように巻く。
【００２５】
単一チューブ状構築体の形成には、ＩＣＬは、構築体の周囲の約５％と等しい結合領域を供するための重複として、１回十分におよびさらなる回転の少なくとも５％だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。２層構築体では、ＩＣＬは、重複として、少なくとも２回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。２層のラップはＩＣＬ表面間１００％の結合領域を供する一方、重複のための割り増しパーセントにより不浸透性で密な継ぎ目を確保する。３層構築体では、ＩＣＬは、重複として少なくとも３回および好ましくはさらに５％ないし２０％回転だけマンドレルの回りに巻くことができなければならない。意図した適用によって要求される仕様に応じて、構築体はいずれかの数の層にて調製することができる。典型的には、チューブ状構築体は、重複の程度を変化させて、１０層以下、好ましくは２ないし６層、より好ましくは２または３層有するであろう。巻いた後、いずれの気泡、巻き、および皺をマンドレルの下方から、および層の間から延ばす。
【００２６】
ＩＣＬは、手動で、またはマンドレルの下方またはＩＣＬの層の間に生じ得る気泡または水泡または皺を張りそれを延ばすのを助ける装置の助けで圧延することができる。該装置は、マンドレルがそれがＩＣＬを巻くように回転するにつれてその長さに沿って接触できる表面を有するであろう。
【００２７】
次いで、スリーブ被覆マンドレル上に巻いた配置である間に、それを脱水することによって、巻いたＩＣＬの層を一緒に結合する。理論に拘束されるつもりはないが、脱水は、マトリックス中の繊維の間の空間から水を除去すると、コラーゲン繊維のごとき細胞外マトリックス成分を一緒に層に入れる。脱水は空気中、真空中、またはアセトンまたはエチルアルコールもしくはイソプロピルアルコールのごときアルコールによって行うことができる。脱水は室内湿度、通常は約１０％Ｒｈないし約２０％Ｒｈ以下；または約１０重量％ないし２０重量％水分まで行うことができる。脱水は、雰囲気室温、ほぼ２０℃および室内湿度にて、少なくとも約１時間ないし２４時間まで、ＩＣＬ層を層流キャビネットの気流まで入れるような角度にマンドレルを置くことによって容易に行うことができる。この時点において、次いで、巻かれた脱水ＩＣＬ構築体をスリーブを介してマンドレルから引き離し、あるいはさらに加工のために放置することができる。構築体は、それを再脱水剤を含有する室温容器に移すことによって、少なくとも約１０ないし約１５分間水性溶液、好ましくは水中で再脱水して、層を分離または脱ラミネートすることなくそれを再脱水することができる。
【００２８】
次いで、構築体を、架橋剤、好ましくはＩＣＬ材料の生体再造形性を保持する化学架橋剤と接触させることによってそれを一緒に架橋する。前記したごとく、脱水は、ラップのそれらの層を一緒に架橋するために隣接ＩＣＬ層の細胞外マトリックス成分を一緒にして、成分間に化学結合を形成し、かくして、層を一緒に結合させる。別法として、少なくとも約１０ないし約１５分間脱水剤を含有する室温容器にそれを移して、それを分離または脱ラミネートすることなく層を再脱するすることにより水性溶液、好ましくは水と接触させることによる架橋の前に構築体を再脱水することができる。結合された補綴デバイスを架橋することは、デバイスに強度および持続性を供して取り扱い特性を改良する。リボースおよび糖、酸化剤および脱水加熱（ＤＨＴ）方法のごとき種々のタイプの架橋剤が当該分野で知られている。好ましい架橋剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。もう１つの好ましい方法において、Ｓｔａｒｏｓ，  Ｊ．  Ｖ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１，  ３９５０−３９５５，１９８２によって記載されているごとく、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＥＤＣ架橋剤に添加する。化学架橋剤に加えて、フィブリン−ベースの膠のごとき他の手段またはポリウレタン、酢酸ビニルまたはポリエポキシのごとき医療グレードの接着剤によって層を一緒に結合することができる。最も好ましい方法において、ＥＤＣを、好ましくは約０．１ｍＭないし約１００ｍＭの間、より好ましくは約１．０ｍＭないし約１０ｍＭの間、最も好ましくは約１．０ｍＭの濃度にて水に可溶化させる。水以外に、リン酸緩衝化セーラインまたは（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）緩衝液を用いてＥＤＣを溶解させることができる。加えて、他の剤をアセトンのごとき溶液に添加することができるか、あるいはアルコールを水中に９９％まで添加して架橋をより均一かつ効果的にすることができる。ＥＤＣ架橋溶液は、ＥＤＣが経時的にその活性を失うので使用直前に調製する。架橋剤をＩＣＬに接触させるためには、水和し結合したＩＣＬ構築体を狭いパンのごとき容器に移し、架橋剤を温和に該パンにデカントして、ＩＣＬ層が被覆されかつ自由浮遊し、ＩＣＬ構築体の層の下方およびその中に気泡が存在しないことを確実とする。パンを覆い、ＩＣＬの層を約４ないし約２４±２時間の間架橋させ、しかる後、架橋溶液をデカントし、捨てる。
【００２９】
それをすすぎ剤と接触させることによって構築体をすすいで、残存する架橋剤を除去する。好ましいすすぎ剤は水または他の水性溶液である。好ましくは、化学的結合した構築体を等容量の滅菌水と各すすぎにつき約５分間３回接触させることによって十分なすすぎが達成される。もし構築体がマンドレルから取り出されていなければ、それを、マンドレルからスリーブを引くことによってこの時点で取り出すことができる。次いで、構築体を乾燥させ、乾燥すれば、単にそれを自由端の１つだけ引くことによって、構築体の管腔からスリーブを取り出すことができる。
【００３０】
構築体を血管移植片として使用する具体例において、形成されたチューブの管腔にヘパリンを適用することによって構築体を非血栓形成性とする。ヘパリンは種々のよく知られた技術によって補綴に適用することができる。説明のため、ヘパリンは以下の３つの方法で補綴に適用することができるとする。まず、垂直に管腔を充填し、または補綴を溶液中に浸漬し、次いで、それを風乾することによって、ベンザルコニウムヘパリン（ＢＡ−Ｈｅｐ）イソプロピルアルコール溶液を補綴に適用する。この手法はコラーゲンをイオン結合したＢＡ−Ｈｅｐ複合体で処理する。第２に、ＥＤＣを用いて、ヘパリンを活性化し、次いで、ヘパリンをコラーゲン繊維に共有結合させることができる。第３に、ＥＤＣを用いて、コラーゲンを活性化し、次いで、プロタミンをコラーゲンに共有結合させ、次いで、イオン結合したヘパリンを補綴に共有結合させることができる。多くの他のコーティング、結合および付着手法が当該分野でよく知られており、これも使用することができよう。
【００３１】
次いで、医療デバイス滅菌の分野で知られた手段を用いて構築体を末端滅菌する。滅菌のための好ましい方法は、ここにその開示を一体化させる、米国特許第５，４６０，９６２号に従って、十分量の１０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で中和した滅菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理と構築体を接触させることによる。汚染除去は、１Ｌ  Ｎａｇｌｅ容器のごときシェーカープラットフォーム上の容器中にて約１８±２時間行う。次いで、３倍容量の滅菌水と各すずきにて１０分間接触させることによって構築体をすすぐ。
【００３２】
また、本発明の構築体はガンマ線照射を用いて滅菌することもできる。構築体を、ガンマ線照射に適した材料で作成された容器に充填し、真空シーラーを用いてシールし、これを２５．０および３５．０  ｋＧｙの間のガンマ線のためにハーメチィックバッグに入れた。ガンマ線照射は、劇的ではないが、有意にヤング率および収縮温度を低下させる。ガンマ線照射後の機械的特性は、適用の範囲で使用するのに依然として十分であり、ガンマ線は滅菌する好ましい手段である。というのは、それは移植可能医療デバイスの分野で広く使用されるからである。
【００３３】
チューブ状補綴を用いて、例えば、血管系、食道、気管、腸、およびＦａｌｌｏｐｉｕｓに起因するチューブのごときチューブ状器官の断面を置き換えることができる。これらの器官は外方表面および内方管腔表面を持つ基本的チューブ状形状を有する。平坦シートは器官支持体で用いて、例えば、膀胱または子宮のごとき器官のための三角布としてシートを用いることによって脱したおよび過剰運動性器官を支持することもできる。加えて、平坦シートおよびチューブ状構築体は一緒に形成して複合構築体を形成させ、心臓または静脈値を置き換えまたは増加させることができる。
【００３４】
本発明の生物工学移植片補綴を用いて、宿主組織で損傷したまたは病気となった身体構造を修復し置き換えることができる。代替身体一部または支持体として機能させつつ、補綴は、宿主細胞の内方増殖のための生体再造形可能マトリックス足場としても機能する。本明細書で用いる「生体再造形」とは、宿主細胞または酵素による移植補綴のマトリックス成分の生分解、再形成および置換の速度とほぼ等しい速度で宿主細胞の内方増殖による構造コラーゲンの生産、血管形成および細胞再集団形成を意味するように使用される。移植片補綴は、宿主によって全ての、または実質的に全ての宿主組織に再造形されつつその構造特徴を保持し、それ自体はそれが修復し置き換える組織のアナログとして機能する。
【００３５】
組織マトリックス補綴の収縮温度（℃）はマトリックス架橋の程度のインジケーターである。収縮温度が高ければ、材料はより架橋している。非架橋ＩＬＣは約６８±０．３℃の収縮温度を有する。好ましい具体例においては、ＥＤＣ架橋補綴は約６８±０．３±ないし約７５±１℃の間の収縮温度を有するべきである。
【００３６】
機械的特性は、補綴が生体再造形の間にクリープに抵抗し、加えて、柔軟であって縫合可能であるように機械的一体性を含む。用語「柔軟」は臨床使用の容易性のための良好な取り扱い特性を意味する。
【００３７】
用語「縫合可能」とは、層の機械的特性が、針および縫合材料が補綴の天然組織のセクションへの縫合への時点で補綴材料を通過することを可能とする縫合保持（吻合として知られたプロセス）を意味する。縫合の間、かかる補綴は縫合によりそれに適用された引張力の結果として裂けてはならず、また縫合が結ばれる場合に裂けてはならない。補綴の縫合性、すなわち、縫合されつつ裂けに抵抗する補綴の能力は、補綴材料の固有の機械的強度、移植片の厚み、縫合に適用された引張力、および結びが引かれて閉じられる速度に関連する。１００ｍＭ  ＥＤＣおよび５０％アセトン中で架橋した高度に架橋した平坦６層補綴のための縫合保持は少なくとも約６．５Ｎである。水中の１ｍＭ  ＥＤＣ中で架橋した２層チューブ状補綴のための縫合保持は約３．９Ｎ±０．９Ｎである。好ましいより低い縫合保持強度は架橋した平坦２層補綴については約２Ｎである；縫合する場合に外科医が引っ張る強度は約１．８Ｎである。
【００３８】
本明細書で用いる「非−クリーピング」は、補綴が移植後に正常限界を越えて伸びたり、広がったり、拡大されたりしないように補綴の生物機械的特性が持続性を付与することを意味する。後記するごとく、本発明の移植された補綴の全ストレッチは許容される限界内にある。本発明の補綴は、生分解および再造形による移植された材料の機械的強度の喪失よりも速い速度で宿主細胞による構造コラーゲンの置換による移植後細胞生体再造形の機能としてストレッチングに対する抵抗性を獲得する。
【００３９】
層とされ、かつ結合されているにもかかわらず、本発明の加工された組織材料は「半透性」である。半透性は再造形のため、あるいは生体再造形性、細胞内方増殖、接着予防または促進、または血流に永久するであろう剤および成分の沈積のために宿主細胞の内方増殖を可能とする。補綴の「非多孔性」性質は補綴の移植によって保持されることを意図する流体の通過を防止する。逆に、もし多孔性または開口性質が補綴の適用に必要であれば孔を補綴中に形成することができる。
【００４０】
また、本発明の補綴の機械的一体性は垂らすまたは折り畳まれるその能力、ならびに補綴を切断または整えて構築体のエッジを脱ラミネートまたはほぐすことなく清浄エッジを得る能力にある。
【００４１】
以下の実施例は本発明の実施をよく説明するために掲げ、本発明の範囲を断じて限定するものと解釈されるべきではない。その組成、形状および厚みにおけるデバイス切形は構築体のための最終適用に応じて選択されるべきであることが理解されよう。当業者ならば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に記載した方法に種々の修飾をなすことができるのを理解するであろう。
【００４２】
【実施例】
実施例１：機械的に清浄されたブタ小腸の化学的清浄
機械的作用および水を用いる洗浄の組合せを用いて粘膜下層から脂肪、筋肉および粘膜層を強制的に取り出すＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）を用い、ブタの小腸を収穫し、機械的にストリップした。機械的作用は、無傷小腸をその間に走行させると粘膜下層からの連続層を圧縮しそれをストリップする一連のローラーとして記載することができる。小腸の粘膜下層は周囲の層よりも比較的硬くしっかりしておりローラーはより柔らかい成分を粘膜下組織から圧搾する。機械清浄の結果は、腸の粘膜下層のみが残るものであった。該手法の残りは無菌下かつ室温にて行った。化学溶液はすべて室温で用いた。次いで、腸を管腔の長さにそって切断し、次いで１５ｃｍセクションに切断した。材料を秤量し、小腸に対する溶液の約１００：１ｖ／ｖの比率にて容器に入れた。
【００４３】
Ａ．腸を含有する各容器に０．２２μｍ（ミクロン）濾過滅菌下１００  ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）／１０  ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、容器を約２００ｒｐｍにて約１８時間シェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＥＤＴＡ／ＮａＯＨを各ボトルから取り出した。
【００４４】
Ｂ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）／１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約６ないし８時間の間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液を各容器から取り出した。
【００４５】
Ｃ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０  ｍＭリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）のほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにてほぼ１８時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を各容器から取り出した。
【００４６】
Ｄ．次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した１０ｍＭ  ＰＢＳのほぼ１Ｌ溶液を添加した。次いで、２００ｒｐｍにて約２時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、リン酸緩衝化セーラインを各容器から取り出した。
【００４７】
Ｅ．最後に、次いで、各容器に、０．２２μｍ濾過滅菌した水１Ｌを添加した。次いで、約２００ｒｐｍにて約１時間容器をシェーカーテーブル上に置いた。震盪後、次いで、水を各容器から取り出した。
【００４８】
組織学的分析のために加工ＩＬＣ試料を切断し固定した。ヘモトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭａｓｓｏｎ三色染色を対照および処理組織双方の断面および長手方向面試料で行った。加工ＩＬＣ試料は細胞および細胞球雑物がないように見え、他方、対照試料は正常かつ予測されたごとくに非常に細胞が見えた。
【００４９】
実施例２：コラーゲン質組織についての他の清浄処理の比較実験
Ｋｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号に記載されたコラーゲン質組織を消毒し滅菌する他の方法を、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１５８にＣｏｏｋらによって記載された同様の方法と比較した。非緩衝化過酢酸方法に加えてＫｅｍｐからの実施例１、２、および３を行った。
【００５０】
小腸を四匹の大きなブタから収穫した。腸を獲得し、外方腸間膜層をストリップし、腸に水を満たした。
【００５１】
実験は７つの条件を含むものであった：
条件Ａは国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１５８におけるＣｏｏｋらの実施例１の開示に従って行った。条件Ｂは、腸材料を開示された化学処理を使用する前に機械的に清浄した点でＡの変形である。条件Ｃ、ＤおよびＥはＫｅｍｐに対する米国特許第５，４６０，９６２号における実施例１、２および３の方法に従って行った。すべての条件において、材料に対する溶液の１０−対−１比率を用いた、すなわち、１００ｇの組織材料を１Ｌの溶液で処理する。
【００５２】
Ａ．４つの腸の各々からの材料を、５％エタノール中の０．２％過酢酸（ｐＨ２．５６）の１リットル溶液を含有する別々のボトル（ｎ＝５）に入れ、シェーカープラットフォーム上で震盪させた。震盪の２時間後、条件ＡはＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーン上で機械的に清浄した。
【００５３】
他の６つの条件ＢないしＧについては、化学的処理に先立ってＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄マシーンを用いて腸を機械的に清浄した。機械的清浄後、４つの腸からの代表的なピースを化学処理用の溶液を含有するボトルに入れた。ボトルをプラットフォーム上で１８±２時間震盪した。残りの６つの条件ＢないしＧは以下の通りであった：
Ｂ．５％エタノール中の０．２％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ２．５６）（ｎ＝５）。
【００５４】
Ｃ．リン酸緩衝化セーライン中の０．１％過酢酸の１リットル溶液（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）。
【００５５】
Ｄ．０．１％過酢酸および１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の１リットル溶液（ｐＨ７．２）（ｎ＝３）。
【００５６】
Ｅ．０．１％過酢酸および１Ｍ  ＮａＣｌの１リットル溶液（ｐＨ２．９）（ｎ＝３）。
【００５７】
Ｆ．実施例１で前記した「化学清浄」溶液の１リットル（ｎ＝４）。
【００５８】
Ｇ．ｐＨ７．０に緩衝化された、脱イオン水中の０．１％過酢酸の１リットル溶液（ｎ＝２）。
【００５９】
化学的および機械的処理、すべての条件を合計４回濾過滅菌精製水ですすいだ。機械的および化学的に処理した材料はＭａｙｅｒヘマトキシリンで細胞夾雑物を調べるのに大いに染色された。形態学的評価はヘマトキシリンおよびエオシン、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム、およびアリザリンベッド染色技術。種々の処理からの組織学的結果は、条件Ａの方法は化学的処理後にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ上の粘膜層を取り出すのが非常に困難な場合に材料を生じさせることを示す。該材料は１０−１２回過剰にＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇを通さなければならなかった。該材料は一見して非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり大量の細胞夾雑物を有した。条件Ｂの方法も非常に膨潤し、材料の表面上および血管系においてかなり多量の細胞夾雑部を示した。条件ＣおよびＤの方法は血管系中に最小細胞夾雑物を有する非膨潤材料を生じた。条件Ｅはわずかに膨潤し、血管系に最小の細胞夾雑物を含有する材料を生じた。
【００６０】
ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄組織中に含有される残存ＤＮＡ／ＲＮＡを定量した。結果を表１にまとめる。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
形態学的分析はＤＮＡ／ＲＮＡ定量と相関して、条件ＡおよびＢの清浄方法の結果、高度に細胞的なままであって結果として残存ＤＮＡを含有するコラーゲン質組織マトリックスが得られることを示す。Ｋｅｍｐの清浄方法はコラーゲン質組織マトリックスからの細胞および細胞夾雑物の除去でかなり効果的である。最後に、Ａｂｒａｈａｍらに対する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／４９９６９に記載され、前記実施例１に概説した条件Ｆの化学的清浄方法はすべての細胞および細胞夾雑物ならびにそのＤＮＡ／ＲＮＡをこれらの方法により検出できないレベルまで除去する。
【００６３】
実施例３：ＩＣＬチユーブ構築体を作成する方法
層流キャビネットの滅菌分野において、ＩＣＬを以下のプロセスによってＩＣＬコラーゲンチューブに形成した。ＩＣＬの漿膜表面からリンパ系タグをトリムした。ＩＣＬを滅菌吸収剤タオルでにじませて過剰の水を材料から吸収し、次いで、多孔性ポリカーボネートシート上に広げ、層流キャビネットの気流中で乾燥した。一端乾燥すると、ほぼ１０％重複した２層移植片用にＩＣＬを２８．５ｍｍ×１０ｃｍピースに切断した。チューブの形成においてＩＣＬを支持するために、約４ｍｍの直径を持つ円筒ステンレス鋼マンドレルを、ＫＲＡＴＯＮ8（マンドレルからの形成されたコラーゲンチューブの取り出しを容易とし、ＩＣＬに接着せずまたはそれと反応しない弾性スリーブ材料）で被覆した。次いで、ＩＣＬの長いエッジを滅菌水で湿らせ、マンドレルに接着させ、約１５分間乾燥させて「フラッグ」を形成させた。一旦接着すると、ＩＣＬを、マンドレルの周りおよびそれ自体にわたり一回完全に圧延した。ローリングが完了した後、気泡、折り畳みおよびしわを材料の下方および層の間から延ばした。マンドレルおよび
圧延した構築体を室温（ほぼ２０℃）にてキャビネット中約１時間層流キャビネットの気流中で乾燥させた。
【００６４】
チューブ当たり約５０ｍＬ架橋溶液の容量で、水中の架橋した１  ｍＭ  ＥＤＣまたは１０ｍＭ  ＥＤＣ／２５％アセトンｖ／ｖいずれかの化学的架橋溶液を架橋直前に調製し；ＥＤＣは経時的に活性を喪失するであろう。次いで、水和したＩＣＬチューブをいずれかの架橋剤を含有する２つの円筒容器のいずれかに移した。容器を覆い、ヒュームフード中に約１８±２時間置き、しかる後、架橋溶液をデカントし、捨てた。次いで、ＩＣＬをすすぎ当たり約５分間、滅菌水で３回すすいだ。
【００６５】
次いで、Ｋｒａｔｏｎスリーブを引っ張ってマンドレルから一端を離すことによって、架橋ＩＣＬチューブをマンドレルから取り出した。一端取り出せば、Ｋｒａｔｏｎを含有するＩＣＬチューブをフード中で１時間乾燥させた。一旦乾燥すれば、単にそれを一端から引っ張ることによって、スリーブをＩＣＬチューブの管腔から除去した。
【００６６】
その開示を引用して全体を一体化させる共通した所有された米国特許第５，４６０，９６２号に記載された方法に従って、ＩＣＬチューブをほぼｐＨ７．０の０．１％過酢酸中で一晩滅菌した。次いで、ＩＣＬチューブをすすぎ当たり約５分間、滅菌水で３回すすいで滅菌溶液を除去した。次いで、過酢酸滅菌ＩＣＬコラーゲンチューブを層流フード中で乾燥し、次いで、移植まで滅菌１５ｍＬコニカルチューブ中に充填した。
【００６７】
実施例４：ＩＣＬチューブ補綴の機械的テスト
２０％重複にてマンドレルの回りに巻かれ、水中の１ｍＭ  ＥＤＣで架橋されたＩＬＣの単一シートから形成された２層ＩＣＬチューブ状構築体の種々の機械的特性を測定した。「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ」，  ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ，  １９９３年８月に従って、  縫合保持、破裂、多孔度合い（遺漏／一体的水透過性）、およびコンプライアンステストを行った。縫合保持、破裂およびコンプライアンス分析はＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウェアを備えたサーボヒドローリックＭＴＳテストシステムを用いて行った。結果を表２に示す。
【００６８】
略言すれば、縫合保持は一定速度で移植片のエッジから２．０ｍｍ引かれる縫合よりなるものである。縫合が移植片を通じて裂かれた場合のピーク力を測定した。得られた平均測定値は必要な限界を超え、構築体が臨床における医師の縫合圧力に耐えることができることを示す。
【００６９】
破裂テストにおいて、移植片が破裂するまで１分間隔で圧力を２．０ｐｓｉで増分にて移植片に適用した。参照のために、収縮期圧力は正常血圧のヒトにおいてほぼ１２０ｍｍＨｇ  （１６．０  ｋＰａ）であり、かくして、テストによって得られた破裂強度は、構築体が収縮期圧力の約７．７５倍に圧力を維持することを示し、かくして、構築体が血管適用のために移植でき厳格な血液循環に耐えることができることを示す。
【００７０】
コンプライアンステストでは、移植片を順次８０および１２０ｍｍＨｇとした。次いで、イメージ分析ソフトウェアを用いて各圧力にて移植片の直径を測定し、（Ｄ120−Ｄ80）／（Ｄ80×４０  ｍｍＨｇ）×１００％としてコンプライアンスを計算した。ウサギ頸動脈のコンプライアンスはほぼ０．０７％／ｍｍＨｇ，  ヒト動脈は約０．０６％／ｍｍＨｇであってヒト静脈は約０．０２％／ｍｍＨｇであり、これは構築体が血管移植片として働くのに必要なコンプライアンスを呈することを示す。
【００７１】
多孔度を測定するには、１２０ｍｍＨｇの静水圧下のＰＢＳを移植片に適用する。７２時間にわたって移植片を透過したＰＢＳの容量を時間および移植片の表面積に正規化した。
【００７２】
収縮温度を用いてコラーゲン質材料における架橋の程度をモニターする。移植片がより架橋すれば、より多いエネルギーが必要となり、かくしてより高い収縮温度が必要となる。示唆走査熱量計を用いて熱的に制御された条件下で試料へのおよび試料からの熱流を測定した。収縮温度は温度−エネルギープロットにおける変性ピークの開始温度と定義した。
【００７３】
縫合保持は２Ｎを十分に超え、縫合が約１．８ｎである場合の患者：外科医の引張力における補綴の縫合を示唆した。７回の収縮期圧力にわたる破裂強度。コンプライアンスはヒト動脈および静脈の範囲にある。ＩＣＬチューブの多孔度は織った移植片と比べて低い：ＩＣＬチューブはプレクロッティングを必要としない。収縮温度、コラーゲン変性温度の尺度は非架橋ＩＣＬのそれに近く、低い量の架橋を示す。機械的テストをＩＣＬスリーブ補綴で行ってＩＣＬスリーブの強度を測定した。２層ＩＣＬ構築体の機械的および物理的特徴の種々のテストからの結果の要約を表２に掲げる。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
実施例５：外部ステントとしてのコラーゲンチューブの移植
ニュージーランド白ウサギのオス２９匹に、逆の同側に頸静脈を用い右側総頸動脈の挿入バイパスグラフティングを受けさせた。実験群（ｎ＝１５）において、一旦近位吻合を行い、直径４ｍｍおよび長さ３５ないし４０ｍｍの寸法を有するコラーゲンチューブに該静脈を通し、次いで、遠位吻合を完了した。漏出を修復し、コラーゲンチューブを両吻合を含めて、静脈移植片を完全に覆うような形状とした。対照動物（ｎ＝１４）をチューブ支持体がない以外は同様に処理した。認識されない漏出からの１つの手術内死亡が、実験群における静脈移植片の中央セグメントで露見する。そうでなければ、いずれかの群における感染または出血のごとき他の重要な合併症はなかった。すべての動物は終点まで生存し、すべての静脈移植片は採取時に明らかであった。手術後には、静脈移植片における流速および管腔内圧力を第３日または２８日いずれかで測定した（ｎ＝５／群）。ウエスタンブロット分析によるチロシンのリン酸化の評価のため第３日に（ｎ＝４／群）、および形態測定（ｎ＝５／群）、走査型および透過型電子顕微鏡（ｎ＝５／群）および等張力実験（ｎ＝５／群）のために第２８日に静脈移植片を採取した。採取の日において、動物を麻酔し、引き続いて静脈過剰用量のバルビツレートで犠牲にした。
【００７６】
動脈循環に移植した静脈移植片は壁厚化を検出可能に生じ、内膜および中膜中での平滑筋細胞過形成および細胞外マトリックスの沈積、ならびに「動脈化」と言われてきた適合プロセスが伴う。しかしながら、移植した静脈移植片の５０％において、このプロセスは通常は内膜過形成病巣のため病的となり、病巣狭窄を引き起こすか、あるいは加速されたアテローム性動脈硬化症を促進する。この研究は、静脈移植片の外部チューブ支持体は、増大した剪断応力および低下した壁張力にて、実験的静脈移植片においてチロシンキナーゼシグナリングおよびか過形成応答を効果的に変調することを示す。
【００７７】
実施例６：血流力学評価
血流の速度は、フローメータ−（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｉｔｈａｃａ，  ＮＹ）に連結したフロープローブ（３または４ｍｍ直径）を血管の外部表面に適用することによって測定した：流れはチューブ−支持静脈移植片においてイン・サイチュにて測定した。管腔内血圧は、圧力変換器およびモニター  （Ｐｒｏｐａｑ  １０６，  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｓ．，  Ｂｅａｖｅｒｔｏｎｅ，  Ｏｒｅｇｏｎ）に連結した２７−ゲージ針を用いて測定した。流速および管腔内圧力は、パイロット実験において、（静脈移植片に関して近位および遠位の）頸動脈および静脈移植片で；頸動脈の近位また遠位セグメントと比較して、静脈移植片において流速または圧力レベルに有意な差はなかった。よって、流速について報告する値（Ｑ；ｍｌ・分-1は静脈移植片中央セグメントから採取し、管腔内血圧の値（Ｐ；ｍｍＨｇ）は頸動脈の近位セグメントから採取した。
【００７８】
剪断応力は、τ＝４ηＱ／πｒi3（ダイン／ｃｍ2）（τ，  剪断応力；η、血液粘度；Ｑ、流速；ｒi、内径）として計算した。壁張力はＴ＝Ｐ・ｒi（１０3ダイン／ｃｍ1）（Ｔ、壁張力：Ｐ、平均動脈血圧：ｒi、内径）として計算した。血液粘度（ポイズ０．０３）は一定であると見なした。内径（ｒi）はモルホメトリーによって測定した；本発明者らは、以前、組織学的直径はイン・サイチュ直径を１０％だけ過小評価したことを示した。分析目的では、内径および壁張力は近似値として認識され、血液の流れは層状であると仮定した。壁の厚みにより壁張力を正規化するために、壁引張応力も計算した（壁引張応力＝圧力×内径／壁厚み）。壁厚みは、各々、内膜、中膜およびコラーゲンチューブの厚みの合計と定義した。
【００７９】
流速および圧力は対照と比較してチューブ支持体を持つ静脈移植片で有意には変化しなかった（表３）。前記方程式を適用し、対照と比較してチューブ支持静脈移植片において、計算された壁張力は１．７倍だけ減少し、剪断応力は４．８倍増加した（表３）。壁張力の減少は、圧力は異ならないが内径は対照と比較して支持静脈移植片では１．７倍低下したゆえと考えられた（各々、１．６３±０．０６ｍｍ  ｖｓ．  ２．６９±０．０９ｍｍ；ｐ＜０．０００１）。同様に、剪断応力の増加は予期された。というのは流速は有意には変化せず、剪断応力は内径の３乗に逆比例するからである。
【００８０】
血流力学力は血管壁を構成する細胞の調製において重要な役割を演ずることが知られている。特に、内皮細胞に対する剪断応力の効果はイン・ビトロで広く実験されている。いくつかの剪断応力−誘導内皮細胞遺伝子がイン・ビトロで同定されており、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびニトリックオキシドシンターゼを含み、そのすべては創傷再造形に関連づけられてきた。生物学的応答への生機械的（血流力学的）刺激の変換は、通常、蛋白質キナーゼおよび蛋白質−対−蛋白質相互作用で開始され、遺伝子転写（またはその阻害）に至る。ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＢｅｒｋ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ３４：２１２−２１９  （１９９６）は、剪断応力は培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞におけるチロシンキナーゼ−依存性経路を介して細胞外シグナル−調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）を活性化できることを示した。複雑であるが、イン・ビボでの血流力学因子は複雑であり、これらの因子の各々の相対的重要性が動物モデルで同定されている。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例７：  蛋白質抽出およびウェスタンブロット分析
切り出した静脈移植片から外膜組織を除き、冷リン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）中で洗浄し、１ｃｍのリング状に切断し、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で保存した。液体窒素中の乳鉢および乳棒で組織を微粉末に粉砕し、続いて氷冷溶解緩衝液（１：４  ｗ：ｖ；  ５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，  ｐＨ７．４，  １％  ＮＰ−４０，  ０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  フッ化ナトリウム、１  μｇ・ｍｌ-1アプロチニン、１μｇ・ｍｌ-1  ロイペプチンおよび１μｇ・ｍｌ-1ペプスタチン）中での超音波処理によって蛋白質を凍結試料から抽出した。不溶性夾雑物を４℃にて１４，０００ｇでミクロ遠心管中でペレット化した。上清を細胞溶解物として収集し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。蛋白質濃度は標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にてブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）を用いて測定した。
【００８３】
等量の蛋白質抽出物（１５μｇ）をゲル負荷緩衝液（２０％グリセロール、１００ｍＭ  トリス− ＨＣｌ−ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００  ｍＭ  ジチオスレイトール）（１：４；ｖ／ｖ）中に混合し、９分間煮沸した。次いで、試料を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル上に負荷し、電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜上に移した。非特異的結合は、該膜を１％ＢＳＡを含有するＴＴＢＳ  （１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で膜を４℃にて一晩インキュベートすることによってブロックした。次いで、モノクローナルマウス抗−ホスホチロシン抗体  （ＰＹ２０、１μｇ／ｍｌ；  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を該ブロットに室温にて１時間適用した。該ブロットをホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーティドヤギ抗−マウスＩｇＧ  （１：５０００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）と共にインキュベートすることによって抗体結合を検出した。該ブロットをＴＴＢＳでのブロッキング工程の間に数回洗浄した。免疫ブロットを増強された化学ルミネセンスキット  （Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）  を用いて可視化し、オートラジオグラフィーに付した。オートラジオグラフィーをスキャンし、分析し  （Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ３．０，  Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）、可視化されたバンドの積分密度を測定した。  （Ｎ．Ｉ．Ｈ．  Ｉｍａｇｅ  １．６１）。特記しない限り化学薬品はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から得た。
【００８４】
ウェスタンブロツト分析は、対照と比較して、第３日のチューブ支持静脈移植片の壁抽出物においてリン酸化チロシン残基の１５倍減少  （ｐ＜０．００１）を示した。リン酸化チロシン残基は支持静脈移植片におけるほぼ１１３  ｋＤａ蛋白質で検出された。しかしながら、対照静脈移植片においては、ほぼ１１３  ｋＤａ蛋白質におけるより多量のリン酸化チロシン残基に加えて、リン酸化チロシン残基はちょうど８２ｋＤａおよび２００ｋＤａを超える分子量にて蛋白質に存在した。
【００８５】
蛋白質チロシンキナーゼ活性は、減少した壁張力および減少した剪断応力（この双方はチューブ支持体の結果である）で静脈移植片にて顕著に低下した。（ほぼ８２、１１３および２００ｋＤａの）チロシンリン酸化蛋白質の同一性はさらに定義されるべく残っている。しかしながら、本発明者らは、支持された静脈移植片における低下したチロシンキナーゼ活性は、部分的には、ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよび表皮細胞成長因子のごとき成長因子についての受容体の減少した発現または活性化と関連し得ると仮定した；これらの成長因子についての受容体は固有の蛋白質チロシンキナーゼを有し、これは分子量が１１０ないし１７０  ｋＤａの範囲である。さらに、Ｋｒａｉｓｓら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９６：７９：４５−５３）は、血流および剪断応力における突然の減少が、バルーン補綴移植片において増大したＰＤＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡおよび蛋白質発現に関連することを示した。平行して、Ｍｅｈｔａら  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８；４：２３５−２３９）は、最近、ブタモデルにおける静脈移植片の外部ステンティングに関するＰＤＧＦ−Ｂ蛋白質のかなりの減少を示した。壁張力および剪断応力は前記Ｍｅｈｔａらの実験で評価されていないが、その外部ステントモデルはわれわれのチューブ支持体モデルと同様の血流力学効果を生じたようである、すなわち、壁張力を減少させ、剪断応力を増加させる。
【００８６】
実施例８：形態学的評価
ハンクスの平衡塩溶液  （Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）の初期灌流にて静脈移植片から血液を除去した。前記したごとく、次いで、０．１Ｍスクロースを補足した０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に作成した２％グルタルアルデヒドで静脈移植片をイン・サイチュにて灌流固定して、８０ｍｍＨｇの圧力においてほぼ３００ｍＯｓｍの浸透圧を得た。４８時間固定剤に浸漬した後、静脈移植片の中央セグメントからの断面（移植当たり３）を形態評価のために加工した。略言すれば、形態的評価は、修飾されたＭａｓｓｏｎのトリクロームおよびＶｅｒｈｏｅｆｆのエラスチン染色で染色された切片で行われた。内膜および中膜は、中膜の内膜化形成平滑筋細胞および環状平滑筋細胞の十字形向きの間の境界の同定によって明らかにされた。中膜の外方限界は、中膜の環状平滑筋細胞および外膜の結合組織の間の界面によって規定された。管腔、内膜および中膜の寸法はビデオモルフォメトリー  （Ｉｎｎｏｖｉｓｉｏｎ  １５０，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｎｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって測定した。静脈移植片の内膜および中膜の内径および厚みは測定された管腔、内膜および中膜面積に由来した。内膜比率（内膜比率＝内膜面積／［内膜＋中膜面積］）および管腔指標（管腔指標＝管腔直径／［内膜＋中膜厚み］）も計算した。
【００８７】
前記したごとくさらなる検体加工後、走査型電子顕微鏡  （Ｐｈｉｌｉｐｓ  ５００走査型電子顕微鏡、Ｎ．Ｖ．  Ｐｈｉｌｉｐｓ，  Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および透過型電子顕微鏡  （Ｐｈｉｌｉｐｓ  ３００透過型電子顕微鏡、Ｎ．Ｖ．  Ｐｈｉｌｉｐｓ，  Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は代表的な中央セクションで行った。
【００８８】
コラーゲンチューブを持つ外部支持静脈移植片は対照静脈移植片と比較して第２８日静脈移植片の管腔直径を６３％だけ減少させた（表４）。各々、対照と比較してチューブ支持静脈移植片において、内膜の厚みは４５％だけ減少し  （４６±２μｍ  ｖｓ  ８４＋５μｍ，  ｐ＜０．０００１）、中膜の厚みは２０％だけ減少した  （６３±８μｍ  ｖｓ  ７９±４μｍ，  ｐ＜０．０５）。内膜および中膜面積も減少した、各々、６６％および４９％  （表４）。中膜における減少に対する管腔寸法のより大きな低下のため、内膜比率は１０％だけ減少した  （表４）。しかしながら、管腔指標、管腔直径に対する断面壁厚みの評価はチューブ支持体の有り無しで一定に維持された  （表４）。
【００８９】
走査型電子顕微鏡は、チューブ支持静脈移植片および対照静脈移植片双方において区別される細胞境界でもって密集した内皮細胞ライニングを示した。内皮細胞は、対照静脈移植片における立方体および膨らんだ内皮細胞と比較してチューブ支持体静脈移植片では変化がなくかつ平坦化されていた。透過型電子顕微鏡では、チューブ支持体をもつ静脈移植片は対照よりも少ない内皮細胞下浮腫およびより少ない夾雑物を有した；加えて、内膜平滑筋細胞の向きは順序よくかつ環状であり、その形状はチューブ支持静脈移植片においていくつかの層では細長くかつ組織化されていた。対照的に、内膜平滑筋細胞は、対照静脈移植片においては組織化されておらず、より細長くはなかった。
【００９０】
血流力学因子の多くは静脈移植片において壁厚みに影響することが知られている。Ｓｃｈｗａｒｔｚら（Ｊ．  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９９２；１５：１７６−１８６）は、「筋肉内膜」（内膜および中膜をいう）の厚化はウサギ静脈移植片における壁張力と最も強力に相関する。他方、Ｄｏｂｒｉｎ  （Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９９５；２６：３８−４３）は、低い流速（剪断応力の決定因子）と最良に相関し、内膜厚化は周囲方向の変形（壁張力の決定因子）の良好な相関であることを示した。優勢な概念は、壁再造形が剪断応力および壁張力双方に依存するというものである。この研究において、われわれは、各々、Ｄｏｂｒｉｎの結果を支持するであろう剪断応力における大きな増加および壁張力におけるより小さな減少と相関し得る中膜厚化よりも内膜のより大きな減少を見いだした。壁厚化は平滑筋細胞の過形成および細胞外マトリックスの技巧双方によるものであるが、後者よりも前者に関するものがより知られている。Ｚｗｏｌａｋら  （Ｊ．  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９８７；５：１２６−１３６）はウサギ静脈移植片における細胞反応速度論を記載した。平滑筋細胞の増殖は低い流動および剪断応力に付された移植片で増加することが示されている。  加えて、Ｍｅｈｔｈら（前掲）は、静脈移植片のステンティングが、増殖細胞核抗原  （ＰＣＮＡ）につき免疫染色することによって評価して内膜および中膜平滑筋細胞増殖を減少させることを報告している。
【００９１】
【表４】
0004356053.tif 000005
【００９２】
チューブ支持静脈移植片および対照静脈移植片の間の統計学的差異は不対Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ合計テストを用いて比較した。
【００９３】
実施例９
等張力試験
静脈移植片を４つの５ｍｍリングに切断した。チューブ支持群においては、コラーゲンチューブを注意深く切開し、再度取り出して妨げられない血管収縮および弛緩に付した。各リングは、いくつかの修飾を施して前記したごとく、酸素化フレーブス溶液  （１２２ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2，１５．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4および５．５ｍＭグルコース、３７℃に維持し、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2で酸素化）を含有する５ｍＬ器官で浴中、２つのステンレス鋼フックの間に直ちに取り付けた。略言すると、平衡化に続き、休止張力を０．５ないし１．２５ｇの増分で調整し、６０ｍＭ  ＫＣｌ、６６．７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4および５．５ｍＭグルコースを含有する修飾された酸素化クレブス溶液に対する最大応答を測定して長さ−張力関係を確立した。収縮アゴニストブラジニキン  （１０-9ないし１０-5Ｍ）、ノルエピネフリン（１０-9ないし１０-4Ｍ）およびセロトニン  （１０-9ないし１０-4Ｍ）に対する累積用量応答曲線を行った。アセチルコリン  （１０-8  ないし１０-4Ｍ）、内皮細胞依存性アゴニスト、およびニトロプルシド  （１０-8ないし１０-4Ｍ）、内皮細胞非依存性アゴニストに対する弛緩反応を、最大修飾の８０％を生じる濃度においてノルエピネフリンで予備収縮させたリングで評価した。すべてのリングを、各実験ランの間に最大３０分間再平衡化させ、アゴニストテストの同一の系列をすべての実験で維持した  （すべての化学薬品は（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））．
チューブ支持静脈移植片は対照と比較してＫＣｌに対する同様の応答を示した（力：  ３００±４６ｍｇ  ｖｓ  ２８０±４７ｍｇ）。ノルエピネフリンおよびセロトニンに対する応答におけるチューブ支持静脈移植片の感度は対照のそれとは有意に異ならなかった  （表５）。しかしながら、チューブ支持静脈移植片は対照よりもブラジキニンに対してより感受性であった  （表５）。標準化された収縮比率として表して、すべての３つのアゴニスト（ノルエピネフリン、セロトニンおよびブラジキニン ）に対する応答で生じた最大収縮力は静脈移植片の外部チューブ支持体で有意に変化しなかった。
【００９４】
先に報告したごとく、対照静脈移植片はアセチルコリンに応答して弛緩しなかった。対照的には、チューブ支持静脈移植片からの２０のリングのうちの１０はアセチルコリンに応答して用量−依存性弛緩を示し、低い感度であったにもかかわらず予備収縮させた張力の６４％に対する最大弛緩であった  （表５）。実験した５つのチューブ支持静脈移植片のうち、１つのみがすべてのリングにおいてアセチルコリンに対する応答を有しなかった。ニトロプルシドに対する応答において、感度（表５）および最大弛緩はチューブ支持体の有り無しで静脈移植片において同様であった。
【００９５】
これらの結果は、静脈移植片のチューブ支持体での内皮細胞−依存性弛緩の平滑筋細胞機能および回復の完全な維持を示す。壁厚みにおける有意な減少にもかかわらず、チューブ支持静脈移植片はＫＣｌおよびテストしたすべての３つの収縮アゴニスト（ノルエピネフリン、セロトニンおよびブラジキニン）に応答しての同様の収縮力を生じた。血管リングによって生じた最大力は平滑筋細胞質量に相関でき、ただし  （アゴニストまたはカルシウムチャンネルについての一体性および受容体の数のごとき）すべての他の因子は一定であるとする。平滑筋細胞質量はチューブ支持体で有意には変化しないということとなり、これは、内膜厚みの減少が部分的には細胞外マトリックスの減少した生産によるものであろうことを示唆する。
【００９６】
【表５】
0004356053.tif 000006
【００９７】
半最大応答の濃度（ＥＣ50）は算定曲線分析によって計算し、感度は−
ＬＯＧ10（ＥＣ50）で定義される。各静脈移植片において、感度は各血管リングにつき決定され、（静脈移植片当たり４リング）平均値はその静脈移植片に対する値として採用した。値は平均値±標準偏差である（群当たりｎ＝５）。チューブ支持静脈移植片および対照静脈移植片の間の統計学的差異を、不対スチューデントのｔ−検定を用いて比較した。
【００９８】
チューブ支持体を持つ血管リングの５０％におけるアセチルコリンに対する内皮細胞−依存性弛緩の回復は、内皮細胞機能が変調されたことを示すであろう。増加した剪断応力はイン・ビトロにおける酸化窒素の増加した生産を刺激することが示されており、これは部分的にはチューブ支持静脈移植片におけるアセチルコリンに対する弛緩を説明し得る。Ｌ−アルギニン、酸化窒素前駆体での全身補足もまたアセチルコリンに対する静脈移植片の内皮細胞−依存性弛緩を維持することが示されている。また、改良された内皮細胞機能が、高い剪断応力に暴露された静脈移植片における増大したプロスタサイクリン  （ＰＧＩ）生産に関してＯｎｏｈａｒａら  （Ｊ．  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １９９３；５５：３４４−３５０）  によって報告されている。あるいは、静脈移植片における維持された内皮細胞機能はチューブ支持体を持つより少ない壁ストレッチ損傷に帰すことができる。概して、内皮細胞は機械的変換および血管運動応答におけるその役割に加えて平滑筋細胞増殖および移動において調節役割を有することが知られている。従って、本発明者らは、チューブ支持体での改良された内皮細胞機能はＰＤＧＦのごとき細胞分裂および走化性シグナルの放出を減少し得ると仮定する。
【００９９】
前記発明は明瞭性および理解の目的で説明および例によってある程度詳細に記載したが、添付の請求の範囲の範囲内である変形および修飾をなすことができるのは当業者にあきらかであろう。