(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を分析する方法であって、
標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブの存在下でＰＣＲによって標的配列を増幅する工程であって、前記プローブの内の一方は蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブは該蛍光エネルギートランスファー対のドナー蛍光体によって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になって蛍光エネルギートランスファー関係となり、前記ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼと標的核酸配列に対するプライマーを生物学的試料に加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含むものである工程と、
ドナー蛍光体によって吸収される波長の光で生物学的試料を励起し、試料からの発光を検出する工程とを含む方法。
【請求項２】
生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列多型性、異型接合性又は突然変位について分析する方法であって、
標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブの存在下でＰＣＲによって標的配列を増幅する工程であって、前記プローブの内の一方は蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブは該蛍光エネルギートランスファー対のドナー蛍光体によって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になって蛍光エネルギートランスファー関係となり、前記ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼと標的核酸配列に対するプライマーを生物学的試料に加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含むものである工程と、
ドナー蛍光体によって吸収される波長の光で生物学的試料を励起する工程と、
生物学的試料からの温度に依存する蛍光をモニターする工程とを含む方法。
【請求項３】
生物学的試料における標的核酸配列のＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニターする方法であって、
（ａ）生物学的試料に二つの核酸プライマーと一つの核酸プローブを有効量加える工程であって、前記プライマーのうちの一つとプローブは、それぞれ、アクセプター蛍光体とドナー蛍光体とを含む蛍光エネルギートランスファー対の何れか一方によって標識されており、標識されたプローブは標識されたプライマーの０〜２５ヌクレオチド以内で標的核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイズすることにより、蛍光エネルギートランスファー対が相互に蛍光エネルギートランスファー関係となる工程と、
（ｂ）ＰＣＲによって標的核酸配列を増幅する工程であって、前記ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼと標的核酸配列に対するプライマーを加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含むものである工程と、
（ｃ）前記ドナー蛍光体によって吸収される選択された波長の光で試料を照射し、試料から放射される蛍光を検出する工程と
を含む方法。
【請求項４】
生物学的試料の標的核酸配列を増幅する改良された方法であって、
（ａ）標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブを生物学的試料に有効量加える工程であって、前記プローブの内の一方は蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブは該蛍光エネルギートランスファー対のドナー蛍光体とによって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になって蛍光エネルギートランスファー関係となる工程と、
（ｂ）ＰＣＲを使用して標的核酸配列を増幅する工程であって、このＰＣＲは、変性工程および伸長工程のための所定の温度と時間のパラメータを用いて生物学的試料を変性工程および伸長工程を含む温度サイクリングに付すことを含むものである工程と、
（ｃ）ＰＣＲの間に前記ドナー蛍光体によって吸収される選択された波長の光で生物学的試料を照射する工程と、
（ｄ）試料から放射される蛍光をモニターする工程と、
（ｅ）生成物の収率又は特異性を最適化するために、工程（ｄ）で得られたデータに従って前記変性工程および／または伸長工程のための温度と時間のパラメータを調整する工程とを含む方法。
【請求項５】
生物学的試料中の標的核酸配列のＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニターするための方法であって、
標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブの存在下でＰＣＲによって標的配列を増幅する工程であって、前記プローブの内の一方は蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブは該蛍光エネルギートランスファー対のドナー蛍光体によって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になって蛍光エネルギートランスファー関係となり、前記ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼと標的核酸配列に対するプライマーを生物学的試料に加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含むものである工程と、
ドナー蛍光体によって吸収される波長の光で生物学的試料を励起し、生物学的試料からの発光を検出する工程と、
生物学的試料からの、温度に依存する蛍光をモニターする工程とを含む方法。
【請求項６】
生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列多型性、異型接合性又は突然変位について分析する方法であって、
（ａ）生物学的試料に二つの核酸プライマーと一つの核酸プローブを有効量加える工程であって、プライマーの一方とプローブは、アクセプター蛍光体とドナー蛍光体とを含む蛍光エネルギートランスファー対の一方によって各々標識されており、標識されたプローブは、標識されたプライマーの０〜２５ヌクレオチド以内で標的核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイズすることにより、蛍光エネルギートランスファー対が相互に蛍光エネルギートランスファー関係となる工程と、
（ｂ）ＰＣＲによって標的核酸配列を増幅する工程であって、前記ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼと標的核酸配列に対するプライマーを加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含むものである工程と、
（ｃ）前記ドナー蛍光体によって吸収される選択された波長の光で試料を照射し、試料から発光される蛍光を検出する工程とを含む方法。
【請求項７】
前記増幅する工程が、３０増幅サイクルを１０〜３０分で完了する迅速温度サイクリングのプロフィルを用いて行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
１．発明の分野
本発明は一般に、反応の進行をモニタリングしながらＰＣＲ試料の迅速なコントロールを行う装置に関する。より詳細には、反応をモニタリングする一方で迅速ＰＣＲを迅速に行うことが出来る熱サイクリング装置に関する。
２．背景技術
様々な産業、技術、および研究の領域において、比較的少ない試料を高い信頼性とよい再現性で熱サイクリングに付す必要が存在する。ある試料を繰り返し熱サイクリングに付す需要は、特にバイオテクノロジーのアプリケーションにおいて高い。バイオテクノロジーの分野では、材料の小さな試料を短時間で加熱、冷却を繰り返すことがしばしば望まれる。規則的に行われるそうした生物学的手続きの一つとして環状ＤＮＡの増幅がある。
熱安定性のあるＤＮＡポリメラーゼを用いた環状ＤＮＡ増幅は、プライマー特異的なＤＮＡの増幅の自動化を可能とし、これは「ポリメラーゼ鎖反応」として広く知られている。この手続きの自動化には、通常複数の容器の中に含有される反応混合物に対して制御された精密な熱サイクリングを行うことを必要とする。これまで好まれていた容器は、標準的なプラスチック製マイクロフュージチューブであった。
従来、試料の温度サイクリングをマイクロフュージチューブ中で行うにあたっては市販のプログラム可能な金属製熱ブロックが用いられてきたが、これは温度−時間の好ましいプロフィルを与えるものである。しかし、短時間で広い温度幅を通して、ヒートブロックの温度を迅速に正確に調整することが不可能であることから、ポリメラーゼ鎖反応を実施するにあたり、熱制御システムとしてヒートブロック型装置を用いることは望ましくないとされてきた。
さらに、一般に用いられているマイクロフュージチューブは欠点を有する。即ち、マイクロフュージチューブの材質、壁の厚み、そしてマイクロフュージチューブの幾何学的形状が、その中に含まれる試料の迅速な加熱と冷却の障害となっている。マイクロフュージチューブのプラスチック材料と壁厚はその内部に含まれる試料とそれを取り巻く媒体の間で絶縁体として働き、その結果、熱エネルギーの移動を疎外する。また、マイクロフュージチューブの幾何学的形状は、どのような媒体を用いて熱エネルギーを移動させるにしても、小さい表面積しか呈しない。本技術分野において、最適とはいえない幾何学的形状を有するマイクロフュージチューブが継続的に使用されてきていることからみて、改良された熱移動の有利さ（一定量の試料に対する試料容器の表面領域を増加させることによる）はこれまで認識されていなかったといえる。
さらに、流体工学的スイッチ（または機械的トランスファー）を備えたウォーターバスを用いた装置もまた熱サイクラーとしてポリメラーゼ鎖反応に対して用いられてきた。反応を起こす上で好ましい温度−時間プロフィルを有することからウォーターバスがポリメラーゼ鎖反応混合物のサイクリングに用いられてきたとはいえ、水の高いサーマルマス（そしてプラスチックマイクロフュージチューブの低い温度伝導率）は、装置の性能と反応収率に関する限り、大きな制限となっていた。
ウォーターバスを用いた装置はその性能において限界がある。何故なら水のサーマルマスは、達成可能な温度−時間の最大勾配を大幅に制限するからである。またウォーターバス装置は、水を運ぶためのホースや水の温度を制御するための外部温度制御装置のサイズと数の点から、大変に不便であることが分かってきた。さらに、ウォーターバス装置におけるリークを検出するために、水回り取付け部品に対して余分な定期的メンテナンスと検査を行わなければならず、これらは面倒であり且つ時間がかかる。最後に、ウォーターバス装置においては好ましい精度で試料チューブの温度をコントロールすることは難しい。
レイ（Ray）の米国特許第３，６１６，２６４号は、空気を循環させて生物学的試料を一定の温度に加熱又は冷却する熱強制空気装置を示す。レイの装置が空気チャンバ内で一定温度を維持する上で幾らか効果があるとはいえ、この装置は、ポリメラーゼ鎖反応等の生物学的手続きに要求されるような温度−時間プロフィルに基づく循環方式で温度を迅速に調整する必要性については述べていない。
ホウ（Howe）の米国特許第４，４２０，６７９号とシスティ（Sisti）らの米国特許第４，２８６，４５６号は共にガスクロマトグラフィー式オーブンを開示している。ホウとシスティの特許に開示された装置はガスクロマトグラフィーの手続きを行うのに適しているが、これまでの文献に記載された装置のどれによって提供されるよりも実質的により迅速な熱サイクリングを提供するものではない。迅速な熱サイクリングは多くの手続きを行う上で有利である。ホウとシスティの特許に記載されたような装置は、熱サイクリングにおける反応を即座に効果的に且つ迅速に行う上では適していない。
特に、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は分子生物学において基礎的であり、臨床の研究室にとって最初の実践的分子技術である。その有用性と人気にも関わらず、ＰＣＲについての現在の理解はあまり進歩していない。増幅は試行錯誤で最適化されなければならず、またプロトコルについてはこれをただ闇雲に遵守していることが多い。本技術分野において見出される、ＰＣＲに対する浅い限定された理解は、いかに当業者が考察や深い理解なしに強力な技術を利用することに満足しているかを示す良い例である。
ＰＣＲは試料の温度サイクリングを必要とする。上に説明したように、従来技術は温度サイクリングをゆっくりと行うだけではなく、ＰＣＲを作動せしめＰＣＲをより有益なものとするために用いられるべき原理の存在を軽視している。このように、迅速にＰＣＲを行い、起こっている反応を分析するのに（もし反応が起こっている時にそのような反応が分析される場合にはリアルタイムで）特に適した方法と装置を提供することは、技術に於ける大きな前進となるであろう。
発明の簡単な概要及び目的
上記の技術水準の観点から、本発明は、以下の目的及び利点の実現を探求するものである。
本発明の目的は、生物学的試料の温度を正確に制御するための装置を提供することである。
本発明の他の目的は、所定の温度−時間プロフィルに従い、生物学的試料の温度を迅速かつ正確に変化させるための熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、多数の様々な生物学的試料を迅速な熱サイクリングに付すことに適した装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、サーマルマスの低い熱伝導媒体を有する熱サイクリング装置であって、対象試料を極めて短時間の間に大きな温度勾配に効果的に付することができる熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更なる目的は、空気を熱伝導媒体として使用する迅速熱サイクリングに生物学的試料を付すことができる装置を提供することである。
本発明の他の目的は、内蔵の流体チャンバ内に置かれた試料を、内部ヒータによって加熱した後、熱サイクルにおける適切な時点で、試料を冷却するために周囲の流体をチャンバ内へ移動させ、これにより試料を冷却する熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、ＰＣＲを迅速に行い、同時にその反応をモニターするためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、ＰＣＲを迅速に行い、継続的にその反応をモニターし、反応が進行している間に反応パラメーターを調整するためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の上記及びその他の目的及び利点は、以下の説明及びクレームから十分明らかとなり、あるいは、本発明の実施により完全に理解することができる。
本発明は、一以上の手続き又は工程を実行するため、生物学的試料を迅速な熱サイクリングに付すことに特に適した装置である。その好ましい一形態においては、装置は生物学的試料を保持する手段を含む。この生物学的試料を保持する手段、即ち試料チャンバは、熱エネルギーを維持するための断熱手段、及び試料チャンバの内部を加熱するための手段を備える。好ましくは、高電力白熱電球が、試料チャンバの内部を加熱するための手段として機能する。試料チャンバの内部は断熱材によって裏打ちされ、この断熱材が試料チャンバ内のランプが発生する熱を維持し、断熱手段としての役割を果たす。
試料チャンバを急速に冷却するため、好適な装置は、試料チャンバ内に空気を送る手段と、試料チャンバ内に送られた空気を分散させるための手段とを含む。高速ファンは、試料チャンバ内に空気を送るように機能し、回転パドルは試料チャンバ内に空気を分散させるように機能する。排気手段は、不要な熱を帯びた空気を試料チャンバの外へ逃がすことを可能にする。本発明は、試料の加熱及び冷却が迅速かつ均一に起こることを可能ならしめるものである。
本発明の装置は、所望の時間−温度プロフィルによって装置を作動させるためのコントロール手段を含む。本発明は、特にポリメラーゼ鎖反応を自動的に行うために適している。
本発明の他の実施態様は、閉ループ高温流体コンパートメント及び反応コンパートメントを含む。反応コンパートメントは高温流体コンパートメント内に位置し、排気ドアを介してアクセスできるようになっている。このドアにより、毛細管に入った試料を挿入することができる。この毛細管には、ポリメラーゼ鎖反応のための反応液が含まれていてもよい。加熱コイルもまた高温流体コンパートメント内に位置し、熱電対センサを介して、設定点をプログラムできるプロセスコントローラによって調整される。この熱電対センサもまた、高温流体コンパートメント内の、反応コンパートメントに直接隣接するように位置する。
加熱コイルは反応コンパートメントの上流に位置し、ファンはその加熱コイルの上流に位置する。その結果、ブロワユニットにより加熱コイルを横切って吹き込まれた流体は、閉ループ方式により、反応コンパートメント内を通過し、ブロワユニットの吸気側に入る。流体が反応コンパートメント内を通過する前に過熱された流体を均一かつ均質に混合するため、バッフルを加熱コイルと反応コンパートメントとの間に設置してもよい。
あるいは、前記ファンを加熱コイルの下流で、かつ反応コンパートメントの前に設置してもよい。この場合、ファンのブレードは、加熱された流体を混合するためのバッフルとしての役目を果たす。所定の熱サイクルにおける適切な時点で、コントローラがソレノイドを作動させ、このソレノイドは排気ドアを開ける。これにより、流体がコンパートメントから排出され、低温（常温）の流体が流入して試料を冷却することを可能にする。
本発明のコントローラは、チャンバが、次いでチャンバ内部の試料コンパートメント内に置かれた試料が、ポリメラーゼ鎖反応における変性、アニーリング及び伸長の各工程に対応する所定の温度サイクルを経るようにする。使用時においては、本発明の装置は、時間と温度の両方の面で変性、アニーリング及び伸長の各工程を迅速に最適化することができ、またある工程の温度から次の工程の温度に移るまでの時間（ランプ（ramp）時間）を短縮できる。
本発明は特に、従来の熱サイクリング装置に較べると、ポリメラーゼ鎖反応サイクルの完了に要する合計時間を短縮すると同時に、特異性及び収率を顕著に向上させる。
本発明の他の様相においては、本発明は、ＤＮＡ増幅を継続的に蛍光モニタリングする方法及び装置を提供する。本発明の好適な実施態様においては、様々な蛍光技術によりＤＮＡ増幅を継続的にモニターするため、光学的要素が迅速な温度サイクルを提供する構造と組合わされる。ガラス製の試料用毛細管及び複合プラスチック／ガラス試料管により、空気からの迅速な熱伝達（１５分未満で３０サイクル）と、これと同時的な反応の光学的モニタリングが可能となる。単一試料、若しくは回転するカルーセル上に置かれ迅速熱サイクリングに同時に付されている複数の試料から蛍光が継続的に検出される。
本発明の他の様相においては、ＤＮＡ増幅中の蛍光は、以下のものによってモニターされる：（１）二本鎖特異的色素であるＳＹＢＲTMグリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉ、（２）二重標識ハイブリダイゼーションプローブのエキソヌクレアーゼ分解後の、ローダミンによるフルオレセインの消光の減少量、及び（３）隣接するハイブリダイゼーションプローブによる、フルオレセインの共鳴エネルギーのＣｙ５TMへの遷移。蛍光特異性及び増幅効率が判っている場合、１サイクルに付き１回得られる蛍光データにより、初期テンプレートコピー数の定量が可能となる。
更に、１サイクルに付き１回の蛍光の測定と対照的に、本発明の実施態様においては、各サイクルを通じて継続的に温度、時間及び蛍光をモニターすることにより、３次元らせんを生成する方法が開示される。この３次元らせんは、温度−時間、蛍光−時間、及び蛍光−温度プロットから組み立てられる。ハイブリダイゼーションプローブの蛍光−温度プロットは、エキソヌクレアーゼ分解の累積的不可逆的シグナルと、隣接するプローブの温度依存的可逆性ハイブリダイゼーションとを区別する。二本鎖色素を使用して、生成物の変性、再アニーリング、及び伸長を各サイクル内で追跡することができる。
本発明は、ＤＮＡ定量のための強力なツールであるＰＣＲの蛍光モニタリングを提供する。ｄｓＤＮＡ結合色素を使用したサイクル毎のモニタリングは特別なプローブを必要とせず、広いダイナミックレンジでの定量を可能にする。配列特異的蛍光プローブは増強された特異性を提供し、テンプレートのコピー数が非常に少ない場合の定量に使用できる。ＰＣＲに有用な配列特異的な蛍光オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも２種類に大別される。信号発生のメカニズムにより当然ながらそれらは加水分解プローブとハイブリダイゼーションプローブに分けられる。蛍光を各サイクルで１回モニターすることで、どのようなプローブ系でも定量に使用できる。蛍光を連続的にモニターすれば、温度サイクル中に融解曲線と生成物アニーリング曲線とを得ることができる。
本発明の他の様相によれば、使用される迅速熱サイクラーと蛍光モニター用光学要素が組み合わされ、二本鎖特異的色素の蛍光モニタリングによりＰＣＲ手続き中にＤＮＡ融解曲線を得ることができる。熱サイクラーが生成物の解離温度をもって加熱する時の温度の関数として蛍光をプロットすることにより、ＤＮＡ融解曲線が得られる。このＤＮＡ融解曲線の形状と位置はＧＣ／ＡＴ比と長さと配列の関数となり、単離された増幅生成物を２℃未満の融解温度によって分別できる。必要とされる生成物は、プライマーダイマーなどの不要な生成物と分別できる。定量的ＰＣＲのダイナミックレンジを広げるために融解曲線分析を使用できる。本発明は、１５分以内より好ましくは１０分以内に増幅と完全な定量分析を組み合わせて行うことができる迅速サイクルＰＣＲのための装置と方法を提供する。
本発明は、標的ＤＮＡ配列のポリメラーゼ鎖反応による増幅をリアルタイムでモニタリングするための方法、及び生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列多型性、異型接合性又は突然変位について分析する方法を提供する。この方法は、標的配列の隣接する領域へハイブリダイズする２つの核酸プローブの存在下でのポリメラーゼ鎖反応により標的配列を増幅する工程と、ドナー蛍光体によって吸収される波長の光で試料を励起する工程と、試料から発光される蛍光を検出する工程とを含む。一方のプローブは蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブはドナー蛍光体によって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になる。ポリメラーゼ鎖反応自体は、温度的に安定なポリメラーゼと標的核酸配列についてのプライマーとを生物学的試料に加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含む。一つの他の実施態様では、試料からの蛍光を試料の温度の関数としてモニターする。好適な実施態様においては、ドナー蛍光体はフルオレセインである。フルオレセインと共に使用するのに特に適したアクセプター蛍光体はＣｙ５である。
本発明の他の実施態様として、生物学的試料中の標的核酸配列のポリメラーゼ鎖反応増幅をリアルタイムでモニターする方法が提供される。本実施態様は、生物学的試料の標的ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列多型性、異型接合性又は突然変位について分析するのにも有用である。この方法は下記の工程を含む：
（ａ）生物学的試料に二つの核酸プライマーと一つの核酸プローブを有効量加える。プライマーの内の一方とプローブは、アクセプター蛍光体とドナー蛍光体とを含む蛍光エネルギートランスファー対の何れか一方によって標識されており、標識されたプローブは、標識されたプライマーの０〜２５ヌクレオチド以内で標的核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイズする。
（ｂ）ポリメラーゼ鎖反応によって標的核酸配列を増幅する。このポリメラーゼ鎖反応は、温度的に安定なポリメラーゼと標的核酸配列についてのプライマーと加える工程と、少なくとも変性温度と伸長温度の間で生物学的試料を温度サイクリングに付す工程とを含む。
（ｃ）ドナー蛍光体によって吸収される選択された波長の光で試料を照明し、試料から発光される蛍光を検出する。
この方法は、試料の温度依存性蛍光をモニターする追加の工程を採用することにより更に有利になる。
生物学的試料の温度依存性蛍光に関するデータは、反応の収率又は特異性を最適化するために熱サイクリング条件を調整するための基礎データとして使用できる。したがって、生物学的試料の標的核酸配列を増幅する改良された方法も提供される。この方法は以下の工程を含む：
（ａ）生物学的試料に対し、標的配列の隣接する領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブの有効量を加える。これらのプローブの内の一方は、アクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブは蛍光共鳴エネルギートランスファー対のドナー蛍光体とによって標識され、二つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ドナー及びアクセプター蛍光体は相互に０〜２５ヌクレオチド以内になる。
（ｂ）ポリメラーゼ鎖反応を使用して標的核酸配列を増幅する。このポリメラーゼ鎖反応は、所定の温度と時間のパラメータを用いて生物学的試料を温度サイクリングに付す工程を含む。
（ｃ）ポリメラーゼ鎖反応の間に前記アクセプター蛍光体によって吸収される選択された波長の光で生物学的試料を照明する。
（ｄ）試料から発光される蛍光を検出する。
（ｅ）工程（ｄ）で生成したデータに従って温度と時間のパラメータを調節して生成物の収率又は特異性を最適化する。
本発明による各方法は、ポリメラーゼ鎖反応の状態を示す蛍光信号の発生源として蛍光共鳴エネルギートランスファー対を利用しているので、蛍光共鳴エネルギートランスファー対が、フルオレセインをドナーとして、またＣｙ５をアクセプターとして含む場合に良好な結果が得られる。本発明の方法は、光学的に透明な毛細管内の生物学的試料に対して、温度ランプ速度が高く、最高温度における保持時間が最小となるように熱サイクリングを行い、試料の蛍光を毛細管の端部を通して測定又は検出できるように設計された装置で行うのが有利である。
また本発明は、試料の蛍光をモニターするための装置を提供する。この装置は、
チャンバと、
容積に対する表面積の割合が高く光学的に透明な材料を含む毛細管と、
毛細管ホルダーと、
前記チャンバ内に取付けられ、毛細管の端部を通して毛細管を照明するように位置決めされた光源と、
前記チャンバ内に取付けられ、毛細管の端部を通して毛細管からの蛍光を測定するように位置決めされた光検出器とを含む。
本装置の一実施態様においては、毛細管ホルダーは複数の毛細管を保持するカルーセルである。カルーセルは前記チャンバ内に回転可能に取付けられ、装置はカルーセルを回転させるためのステッパーモーターと、前記カルーセルを前記モーターに結合する手段とを更に含む。他の実施態様においては、本装置はチャンバと空気の流れを許容するように連通しているファンとヒーターも備えている。チャンバの温度サイクルを速く回転させるためにファンとヒーターがプログラム可能なコントローラによって制御される。
また本発明は、ＰＣＲ反応を行うための装置に関する。この装置は、
チャンバと、
チャンバと空気の流れを許容するように連通しているファン及びヒーターと、
前記チャンバ内に回転可能に取付けられ、光学的に透明な材料を含む複数の毛細管を保持するカルーセルと、
前記チャンバ内に取付けられ、少なくとも１本の毛細管をその端部を通して照明するように位置決めされた光源と、
前記チャンバ内に取付けられ、少なくとも１本の毛細管からの蛍光をその端部を通して測定するように位置決めされた光検出器とを含む。
また、蛍光体を含む試料の蛍光の検出と収集効率を向上させるための方法が提供される。この方法は、蛍光発光の収集とモニターを最適化するために全内部反射を利用する。この方法は、光学的に透明な材料を含む毛細管内に試料を置く工程と、毛細管の端部を通して毛細管からの蛍光を測定する工程とを含む。毛細管の容積に対する表面積の割合は４ｍｍ-1以上であることが好ましい。試料の蛍光体励起による発光によって蛍光が引き起こされている場合には、本方法は更に、毛細管の端部を通して、好ましくは検出された蛍光の光通路に沿って、試料を照明する工程を含む。
好ましい一実施態様においては、生物学的試料の蛍光は温度に依存するものであり、本方法は、蛍光を検出する間に生物学的試料を加熱又は冷却して試料中の温度に依存する蛍光をモニターすることを更に含む。試料は、蛍光エネルギートランスファー対を含むことができ、この場合、蛍光エネルギートランスファー対の少なくとも一方の蛍光体の蛍光が検出される。一実施態様においては、試料は、核酸プローブを含有する核酸を含む。一方のプローブは蛍光エネルギートランスファー対のアクセプター蛍光体によって標識され、他方のプローブはドナー蛍光体によって標識される。検出される蛍光はドナー蛍光体、アクセプター蛍光体、又はその両方である。
本発明の他の様相によれば、試料のための取扱いシステムが提供される。このシステムは毛細管を含み、この毛細管は試料デリバリーポートと前記毛細管に充填するための漏斗キャップとを有する。毛細管は光学的に透明な材料を含み、毛細管の容積に対する表面積の割合は４ｍｍ-1以上である。漏斗キャップは試料受入れオリフィスと、試料移送オリフィスと、漏斗キャップの試料移送ポートと毛細管の試料デリバリーポートとが位置合わせされるように毛細管の試料デリバリーポートに開放可能に係合する手段とを有する。試料取扱いシステムは、漏斗キャップの試料受入れポートと摩擦嵌め合いシール係合のためのプラグを更に含む。
本発明の他の重要な実施態様は、ＰＣＲを行うとともに、その反応をリアルタイムでモニターするためのシステムである。このシステムは、
チャンバと、
前記装置内に取付けられチャンバと空気流的に連通しているファンとヒーター、及び初期の所定の温度及び時間のパラメータに従ってチャンバ内の温度サイクリングを制御するコントローラと、
前記チャンバ内に回転可能に取付けられ、光学的に透明な材料を含み且つ容積に対する表面積の割合が大きく熱伝導の速い複数の毛細管を保持するカルーセルと、
前記チャンバ内に取付けられ、少なくとも１本の毛細管をその端部を通して照明するように位置決めされた光源と、
前記チャンバ内に取付けられ、少なくとも１本の毛細管からの蛍光をその端部を通して測定するように位置決めされた光検出器と、
検出された蛍光に基づいて反応の状態を表示する手段とを含む。
好適な一実施態様においては、システムは、一以上の反応パラメータがリアルタイムで調節されるようにコントローラを調節するための手段を含む。試料毛細管は、約０．０２ｍｍ〜約１．０ｍｍの範囲の内径を有することができる。他の実施態様では、その装置は、前記カルーセルを回転させて、好ましくは試料毛細管の端部を通して行われる照明と蛍光検出のための前記カルーセルによって保持された毛細管の位置決めを行うステッパーモーターを更に含む。
【図面の簡単な説明】
本発明に於ける上述の及びその他の利点と目的がどのように得られるのかについてより良い理解を得るために、上に簡略に説明した本発明を、以下、添付図中に描かれている具体的実施態様についてより詳細に説明する。これらの図は本発明の典型的な実施態様を記載するにとどまるものであり、従ってその範囲を限定すると考えてはならないとの理解の上に立って、本発明は、添付の図を用いて付加的な具体性と詳細とをもって描写、説明される：
図１は、本発明の着想に従って、生物学的試料の熱サイクリングに適用され、特に環状ＤＮＡ増幅に使用して適用される熱サイクリング装置の斜視図である。
図２は、図１の装置の流体チャンバ部の側面図である。
図３は、図１中に描かれた装置の流体チャンバ部の内部平面図である。
図４は、本発明の他の実施態様の流体チャンバの内部平面図である。
図５は、本発明の熱サイクリング装置を用いたポリメラーゼ鎖反応に対する最適化した温度−時間プロフィルを示す。
図６は、本発明の熱サイクリング装置を用いた場合のポリメラーゼ鎖反応特異性に及ぼすアニーリング時間の影響と収率とを示すグラフである。
図７は、本発明の熱サイクリング装置を用いた場合のポリメラーゼ鎖反応収率に及ぼす変性時間の影響を示すグラフである。
図８Ａ−Ｂは、本発明の他の好ましい実施態様の、斜視図および縦断面図である。
図８Ｃは、図８Ａ−Ｂに記載の実施態様における生物学的試料を支持する毛細管と熱発生エレメントの関係の概念図である。
図９Ａは、４つの異なる温度／時間プロフィル（Ａ−Ｄ）の結果と、３０サイクル後に得られた増幅生成物（Ａ−Ｄ）を示す。
図９Ｂは、本発明によって用いられる他の好ましい温度／時間プロフィルのサイクルを示す。  図９Ｃ−Ｇは、本発明によって用いられる他の好ましい温度／時間プロフィルのサイクル例を示す。
図１０は、本発明による温度傾斜制御回路のブロックダイアグラムを示す。
図１１は、本発明による蛍光検出を伴う好ましい迅速温度サイクラーの概略図を示す。
図１１Ａは、図１１の装置の或る好ましい操作を示した温度−時間チャートである。
図１２は、温度−時間、蛍光−時間、蛍光−温度の２Ｄプロットを示したチャートであり、これらはまた３Ｄプロットとしても示す。
図１３は、ヒトβ−グロビン遺伝子の５３６塩基対フラグメントに対する蛍光−温度の投影図である。
図１４は、本発明の一様相に従って得られたサイクル数−蛍光のプロットである。
図１５は、本発明の一様相に従って得られたサイクル数−蛍光比のプロットである。
図１６は、本発明の一様相に従って得られた蛍光比−温度のプロットである。
図１６Ａは、本発明の一様相に従って得られた蛍光比−サイクル数のプロットである。
図１７は、本発明の一様相に従って得られた蛍光比−温度のプロットである。
図１８は、本発明の一様相に従って得られた異なる初期テンプレート（テンプレート）コピーの数に対する蛍光−サイクル数のプロットである。
図１９Ａ−Ｄは、本発明の一様相におけるＰＣＲ産物の塩基配列特異的な検出を提供する２つの好ましいアレンジメントを示す。
図２０は、本発明の一様相に従って得られた二重標識された加水分解プローブを用いてモニターされたＤＮＡ増幅の、蛍光比（フルオレセイン／ローダミン）−サイクル数のプロットである。
図２１Ａ−Ｄは、ＰＣＲに対する、ｄｓＤＮＡ結合色素ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩ（Ａ）、二重標識フルオレセイン／ローダミン加水分解プローブ（Ｂ）、そしてＣｙ５標識プライマーを有するフルオレセイン標識ハイブリダイゼーションプローブ、の３種類の蛍光モニタリング技術を比較して示したものである；図２１Ｄは、図２１Ａ−Ｃ中に示された３つのモニタリング技術における変動係数を示す。
図２２は、ＰＣＲ蛍光曲線を用いた定量化のための内挿法の応用を示すプロットを示す。
図２３Ａは、温度に伴う蛍光比の線形的変化と、より多くのプローブが加水分解される場合の蛍光の並行的増大を示すプロットである。
図２３Ｂは、ハイブリダイゼーションプローブにおける蛍光比が温度によって劇的に変化することを示すプロットを示す。
図２４は、本発明に従ったＰＣＲ手続き中の、生成物のストランドの状態の温度依存性を示したプロットである。
図２４Ａは、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉを用いたＰＣＲの温度−蛍光のプロットである。
図２５は、本発明に従った生成物融解曲線の本来の（native）成分と競合成分を示すプロットである。
図２６は、本発明に従ったＰＣＲ産物の異なる濃度に対する生成物再アニーリングの速度のプロットである。
図２７は、速度定数の初期決定を示すプロットを示す。
図２８は、平衡ＰＣＲパラダイムと動力学的ＰＣＲパラダイムを示すグラフである。
図２９は、ルーチン増幅のｌｏｇ−直線部分において１０倍ダイナミックレンジに亘ったモニタリングが完了したことを示す。
図３０は、一つの試料の継続的モニタリングに対して設定した本発明の一実施態様を示す。
図３１は、ＰＣＲ試料の継続的なモニタリングを提供するための、本発明に従った他の実施態様の光学的レイアウトを示す。
図３２は、試料毛細管の側面ではなくむしろ先端を見ることによる、光パイピングの効果を示したチャートである。
図３３は、毛細管試料チューブを使用した時に観察される偏光は、励起ビームに対するチューブの精密な位置決めに依存していることを示したチャートである。
図３４は、本発明に従って一偏光プローブを用いて得られた結果を示す。
図３５は、フルオレセインとローダミン標識の間で５つの介在塩基を有するプローブから得られた蛍光ＰＣＲの結果を示す。
図３６は、感度に対するプローブ濃度の効果を示す。
図３７は、本発明に従った共鳴エネルギートランスファーと加水分解プローブによってモニターしたＰＣＲ中のサイクル数−蛍光比のプロットである。
図３８は、本発明に従ったフルオレセイン／Ｃｙ５二重標識プローブの共鳴エネルギートランスファーに対する発光波長−蛍光のプロットである。
図３９は、ハイブリダイゼーションプローブを用いた共鳴エネルギートランスファーによってモニターしたＰＣＲ中のサイクル数−「バックグラウンド値を超える蛍光比」のプロットである。
図４０は、隣接するハイブリダイゼーションプローブによってモニターしたＰＣＲ中の温度−蛍光比のプロットである。
図４１は、加水分解プローブによってモニターしたＰＣＲ中の温度−蛍光比のプロットである。
図４２Ａは、温度と蛍光の間の逆関係を示す時間−蛍光のプロットである。
図４２Ｂは、温度と蛍光の間の逆関係を示す時間−温度のプロットである。
図４３Ａは、３つの異なる精製されたＰＣＲ産物の融解曲線に対する温度−蛍光のプロットである。
図４３は、ＰＣＲ産物の見かけのＴmが加熱速度に依存していることを示す温度−蛍光のプロットである。
図４４は、ＰＣＲ産物のＴmがｄｓＤＮＡ結合色素の濃度に依存していることを示す温度−相対蛍光のプロットである。
図４５は、約２℃のＴmの違いがある２つの精製ＰＣＲ産物を混合した時に得られた融解曲線を示す温度−フルオレセインのプロットである。
図４６は、各ＰＣＲ産物の相対量がどのように定量化されるのかを示したプロットである。
図４７は、毛細管試料チューブの端部における蛍光検出を行う迅速温度サイクラーである本発明の他の実施態様の概略図である。
図４７Ａ−Ｄは、試料を載荷するための複合プラスチック／ガラス容器を示す。
図４８は、蛍光ハイブリダイゼーションモニタリングに関する有用な温度−時間セグメントを例示す。
図４９は、融解ピークを示す融解曲線情報である。
図５０は、反応の個別のサイクルの間のストランドの状態のモニタリングを許容することのできるＰＣＲ中の、温度の関数としてのｄｓＤＮＡ特異的な色素からの蛍光をプロットしたものである。
図５１は、融解曲線取得サイクルをプロットしたものである。
図５２Ａは、ＰＣＲ産物融解曲線の絶対位置をプロットしたものである。
図５２Ｂは、変性温度を通る急速な温度移行がどのように融解曲線をより高い見かけのＴmへシフトさせるかを示したプロットである。
図５３は、３つの異なる精製ＰＣＲ産物に対する融解曲線をプロットしたものである。
図５４は、精製ＰＣＲ産物を混合した時の重複する融解曲線をプロットしたものである。
図５５は、融解ピークに変換した後の結果をプロットしたもので、これは２℃未満しか違わないＴmを有する反応産物の混合物を分離したピークへと分解することができることを示す。
図５６は、プライマーの二量体のような非特異的な生成物から意図した生成物を分離するために用いられる融解曲線分析をプロットしたものである。
図５７は、様々な初期テンプレート濃度のもとで行われた一連の反応に関し、生成物のポリメラーゼ伸長の後、各サイクルごとに一回、得られた相対蛍光をプロットしたものである。
図５８は、多数の試料について得られた融解ピークをプロットしたものである。
図５９は、補正したプロットを与えるために適切な比を乗じて図５７のデータポイントをプロットしたものである。
図６０は、電気泳動の結果に非常によく一致する図５８の結果を示したものである。
図６１は、図５６に示す融解曲線を、存在する異なる生成物の相対量の見積りに関する生成物ピークへと分解することが出来ることを示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
次に、図を参照しつつ本発明を説明するが、図中、同一の構造には同一の符号を用いる。
図１に示すように、熱サイクリング装置１０は、全体を符号１１で示す閉ループ流体（最も好ましくは空気）チャンバを含む。このチャンバは、排気ドア１４を通してサイクル処理に付される試料を収納するように適合されている。この閉ループ流体チャンバ１１は複数のコンパートメントを含むが、それぞれについて以下簡単に説明する。装置１０はまた、コントローラ１２を含む。このコントローラは、チャンバ１１が所定の時間に亘って一連の温度を通してサイクル処理に付されるように、入力キー２５及びディスプレイ２６を用いてプログラムされうる。チャンバ１１の熱サイクリングは多数の処理を行うために用いることができるが、以下に説明するように、特に反応混合物を含む試料から得られるプライマー特異的ＤＮＡの増幅に適する。
閉ループ流体チャンバ１１は、ハウジング１３によって概ね箱型の形状に包まれる。ブロワ取付け板１６は、必要に応じ、チャンバ１１の小さい長方形部分を区切るように配置してもよく、略円筒状の下ハウジング１５を保持し、チャンバに固定するよう機能する。あるいは、ブロワ２８のファンを、チャンバハウジング１３内に一体化して収納してもよい。
ブロワハウジング１５の内部には、ブロワのブレードとシャフトが内包される。ブロワモータ（図示せず）はブロワハウジング１５の外側に位置し、従って、内包されたチャンバ１１の外部に位置する。この配置では、ブレード及びシャフトが、チャンバ１１内で熱い循環流体に曝されることになるブロワの唯一の部分となる。チャンバ内にモータを取り付けることは、モータを温度変化に曝露し、またモータのサーマルマスを加熱・冷却に付される試料のサーマルマスに付加することになるので好ましくない。チャンバ１１内の流体に曝されるサーマルマスを減少させることは、試料を内部に置いて所定の温度−時間プロフィル（以下、より詳細に説明される）に付すという装置１０の総合的な機能の点から重要である。
ブロワ２８は、通常「インライン」タイプのブロワとして知られる公知タイプのブロワである。このブロワは、通常サーマルマスが低いため、プロペラタイプのファンを採用していることが好ましい。あるいは、必要であれば、リス籠タイプのファンにしてもよい。この場合のファンは、７５立方フィート／分の性能を有することが好ましい。
ソレノイドプラットフォーム１７には、ソレノイド１８が固定される。ソレノイド電機子１９はロッド２０の上端２１に装着される。このロッドは排気ドア１４に固定され、かつ排気ドア１４の上方及び下方の部分においてハウジング１３に対し回転自在に装着される。従って、ロッド２０により、排気ドア１４が、ロッドの長手方向軸を中心にハウジング１３に対し自由に回転することが可能となる。
スプリング２２は、支柱２３によって、ハウジング１３のいずれかの端に取付けられる。スプリング２２の反対側の端は、ロッド２０の上端２１にソレノイド電機子１９取付け部分に隣接して取付けられる。スプリング２２は、上記２箇所の取付けポイントの間で、張力を保つように引伸ばされる。従って、スプリング２２は、上端２１を支柱２３の方向に引っ張るようになる。そのため、この支柱は、排気ドア１４を閉鎖位置にまで回転させるようになる。ソレノイド１８が作動すると、電機子１９が、ロッド２０の上端２１をソレノイド１８の方向に引っ張ることになる。この方向は、スプリング２２が引っ張る方向とは逆の方向であり、また排気ドア１４を開く方向でもある。
全体を符号１２で示すコントローラは、トランスミッションケーブル２４によって、チャンバ１１に電気的に取付けられる。このケーブル２４はまた、ブロワモータ（非図示）及び加熱コイル３１に電力を供給する。また、コントローラ１２は、温度データに対応する信号を受信するための熱電対センサ３５、及びソレノイド電機子を作動させるためのソレノイド１８にも接続される。
コントローラ１２は、加熱コイル３１、排気ドア１４、及びブロワを制御して、チャンバ１１内を時間を関数とした所定の温度にするようにプログラムでき、かつ所定の時間及びチャンバの温度レベルでソレノイドを動作させるためのリレー出力を作動させるようにプログラムできるものであれば、公知のいかなるタイプの温度コントローラユニットであってもよい。図１乃至図３の実施態様において使われている好ましい温度コントローラ１２は、パートロウ（Ｐａｒｔｌｏｗ）ＭＩＣ−６０００比例制御式温度コントローラである。このコントローラは、型番Ｎｏ．ＣＮ８６００のプロセスコントローラとして、コネチカット州スタンフォードのオメガエンジニアリングインコーポレイテッド（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）から入手可能である。
図２及び図３に示すように、チャンバ１１の内部は、４つの主要コンパートメントに区切られている。ブロワコンパートメント２８は、ブロワハウジング１５及びブロワ取付け板１６から形成される。ブロワコンパートメント２８の全体は、上述のように、ブロワのファンとシャフト部分で満たされる。ブロワは、上述のように多くの既知のデザインによるものでよいので、解り易くするために図３では省略した。本発明においては、ブロワコンパートメント２８内に位置するファンにより、流体が吸気口３６を介してブロワコンパートメント２８内に引き込まれ、また排気口３７から押し出されることが理解されれば十分である。
流体は、ブロワにより７５立方フィート／分以上の速度で駆動されることが好ましい。ただし、本発明に関して重要なことは、チャンバ１１内に位置する流体がブロワのファン及び駆動シャフトの一部のみと接触し、ブロワモータ自身はチャンバ１１内の流体との接触を避けるためにブロワハウジング１５の外側に位置することを理解することである。本発明動作スピードの達成にとって、チャンバ１１内の流体と接触する材料をできるだけ少なくして、サイクリング処理中に加熱され及び／又は冷却されるべき材料のサーマルマスを極小化することが極めて重要であるので、上記の理解が重要となる。流体によって加熱又は冷却されるべきサーマルマスを極小化することにより、チャンバ１１の内包物を均一な温度にするのに要する応答時間が大幅に短縮される。
ブロワコンパートメント２８内に存在する流体は、排気口３７を通って加熱コンパートメント２９に流入する。加熱コンパートメント２９に入りこむ流体は、過熱コイル３１の傍を通過しなければならない。過熱コイル３１が加熱コンパートメント２９内を通過する流体より熱くなると、流体は、コンパートメントを通過させられる際にコイルによって熱せられる。加熱コイルは、マイクロサポートの周りに巻かれた１０００ワット（１２５ ＶＡＣ）のニクロム線コイルであることが好ましい。ただし、チャンバ内に存在するタイプの流体を過熱するのに適した過熱ユニットであれば、どのようなものでも使用できる。図１乃至図３の実施態様における具体的な加熱コイルは、オレゴン州ポートランドのジョンストーンサプライ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ Ｓｕｐｐｌｙ）が製造している。
加熱コイルは、コントローラ１２に含まれる出力リレーによって作動する。好ましいリレーは、型番オメガ（Ｏｍｅｇａ）ＳＳＲ ２４０ Ｄ２５のプロセスコントローラとして、コネチカット州スタンフォードのオメガエンジニアリングインコーポレイテッド（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）が製造している、２５Ａ、１２５ ＶＡＣのソリッドステートリレーである。
加熱コンパートメント２９を通過する流体は、反応コンパートメント３０に流入する前に、バッフル３２及び３３に当たる。バッフル３２及び３３は、流体の層流を破壊し、流体中に乱流を起こして効果的に流体を攪拌する結果、流体が反応コンパートメント３０内に到達するときには均一な温度となる。
熱電対３５は、反応コンパートメント３０内の流体の温度に呼応した電気的入力信号をコントローラ１２に提供する。熱サイクリング装置１０作動中の温度のモニタリングは、３０ゲージの鉄−コンスタンタン「Ｊタイプ」熱電対を用いて行うことが好ましい。この後すぐに説明するように、コントローラはこの情報を利用し、プログラム入力されている所定の熱−時間プロフィルに従い加熱コイル３１を調節し、ソレノイド１８を作動させる。
反応コンパートメント３０からリターン空気コンパートメント３４に流入する流体は、まず（点線で示す）試料コンパートメント２７を通過しなければならない。試料コンパートメント２７についても、この後すぐに説明する。
リターンコンパートメント３４内の流体は、試料コンパートメント２７内に置かれた試料への熱移動により、わずかに冷却されている。リターンコンパートメント３４内の流体は、吸気口３６を介してブロワコンパートメント２８に引き込まれ、ファンの動作によりそこから排気口３７を介して加熱コンパートメント３９へと再び送られる。即ち、流体チャンバ１１は、排気ドア１４が閉じられた状態で作動すると、閉ループ流体チャンバとなる。このチャンバでは、内包物を均一な温度にするため、流体が、内部の各コンパートメントを通る閉ループ経路に沿って連続的に再循環させられる。空気チャンバ１１内での空気の連続的循環により、試料コンパートメント２７内の試料が、可能な限り迅速に所定の温度に到達することが可能となり、次いで、必要であればその温度を維持することもできる。
装置１０により、反応コンパートメント２７内に置かれた材料を加熱するだけでなく、その後可能な限り迅速に冷却し周囲の流体（空気）温度まで下げなければならない場合には、ソレノイド１８を作動させて排気ドア１４を開け、加熱された内部の流体を同時に放出しながら大量の常温の流体をコンパートメント１１内に直ちに流入させるように、コントローラ１２をプログラムすることができる。
排気ドア１４を開けながらブロワの作動を継続させつつ加熱コイル３１を停止することにより、周囲の流体がリターンコンパートメント３４内に引き込まれ、今度はそこからブロワコンパートメント２８に送られる。次にブロワは、周囲の流体を加熱コンパートメント２９に押し込む。流体はコイル３１で熱せられることなくそこを通過し、直接反応コンパートメント３０内に流入する。周囲の流体は、試料コンパートメント２７を通過し、排気ドア１４を介してチャンバ１１から出る。チャンバ１１内に置かれた材料のサーマルマスが最小であるため、またブロワのファンの作用により、大量の周囲の流体が試料コンパートメント２７を通過させられ、そこからチャンバ１１の外に放出される。従って、反応コンパートメント２７内に置かれた試料又は材料に対する迅速な冷却が達成できる。
試料コンパートメント２７は、各試料を入れた細長い中空ガラスチューブ等の複数の試料を、間隔を置いて同じ向きに容易に置けるようなサイズとされ、流体が各試料の周りを一様に通過するようにされる。必要に応じ、試料コンパートメント２７は、均一な間隔を置いて配置された複数の試料を収納できるように設計された、ラックやバスケット等の挿入が可能となるサイズや形状に形成して、試料チャンバ２７への試料の載荷を簡単にすることもできる。
試料コンパートメント２７へのアクセスは、排気ドア１４を開放位置まで回転させることにより達成される。排気ドア１４が、一旦その閉鎖位置から約９０度回転させられると、試料コンパートメント２７はそのドアを通じて容易にアクセス可能となる。また、見てわかるように、排気ドア１４がその閉鎖位置から約９０度回転させられると、リターン流体コンパートメント３４が反応コンパートメント３０からほぼ遮断される。従って、本発明の装置１０が「冷却」モードにある時は、周囲の流体は直接リターン流体コンパートメント３４に流入し、上記の閉ループ流体流路と実質的に同じ経路に沿って、ブロワコンパートメント２８、加熱コンパートメント２９、反応コンパートメント３０、そして試料コンパートメント２７に送られる。流体は次に、空気チャンバ１１から押し出されるが、排気ドア１４を試料コンパートメント２７とリターンコンパートメント３４との間に位置させることにより、流体が空気リターンコンパートメント３４に戻ることが阻止される。
従って、排気ドア１４は、周囲の流体がチャンバ１１内に流入することを可能とするだけでなく、周囲の流体がチャンバ１１内をループ式に再循環することをも阻止する。その代わり、流体は、試料コンパートメント２７を通過させられた後、チャンバ１１の外に出され、内部の試料及びチャンバ１１の迅速な冷却を助ける。
本発明の装置１０が環状ＤＮＡ増幅のために用いられる場合、温度−時間プロフィルに基づく繰返しサイクリングが必要となる。ポリメラーゼ鎖反応のための反応混合物を含む試料は、通常、増幅過程における変性、アニーリング、及び伸長の段階に対応した温度対時間プロフィルにより、約３０回サイクル処理に付される。
本発明の装置１０は、その全体的なサーマルマスが低いため、従来技術に較べて著しく短い温度−時間プロフィルで試料をサイクル処理に付することができる。図１乃至図３の実施態様に係るＤＮＡ増幅アプリケーションは、温度−時間プロフィルのサイクルを３０〜６０秒内で通過できる（図５参照）。従来技術の装置を用いた同じサイクルでは、約５〜１０倍も長い時間がかかるであろう。こうした短いサイクル時間は、従来技術によるサイクル処理に較べ、ポリメラーゼ鎖反応の収率及び特異性を向上させることが証明された。
実施例１
５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５、２５℃）、３．０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ塩酸、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンから成る反応緩衝液中に、５０ｎｇのテンプレート（鋳型）ＤＮＡ、０．５ｍＭの各デオキシヌクレオチド、５００ｎＭの各オリゴヌクレオチドプライマーを入れ、ポリメラーゼ鎖反応を容量１０μｌにて行った（５）。サーモ・アクアティックス（“thermosaquatics”）ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼの０／４ユニット−ストラタジーン（StratageneTM））を加え、試料を８ｃｍ長の薄壁毛細管（キンブル（Ｋｉｍｂｌｅ）製、キマックス（Ｋｉｍａｘ）４６４８５−１）の中に置き、各チューブの両端に空泡ができるように、両端を実験室用ガスバーナーで融着させた。
次に毛細管を、厚さ１ｍｍの「予め穴を開けたパネル板」（ラジオシャック（Ｒａｄｉｏ  Ｓｈａｃｋ）製）のホルダーに垂直に立てた。図５の温度−時間プロフィルに示された時間の間、混合物を変性（９０〜９２℃）、アニーリング（５０〜５５℃）、及び伸長（７２〜７５℃）に３０回繰り返し付した。毛細管の温度モニタリングは、脱イオン水（１０μｌ）中に設置され、熱電対モニター（ＢＡＴ−１２、センサーテック（Ｓｅｎｓｏｒｔｅｋ））に連結された小型熱電対（ＩＴ−２３、センサーテック（Ｓｅｎｓｏｒｔｅｋ）製、ニュージャージー州クリフトン）を用いて行った。増幅生成物を１．５％アガロースゲルで電気泳動によって分別した。良い結果が得られた。
本発明装置１０は、水の代わりに空気を熱移動溶媒として循環させるので、非常に迅速に温まる低熱容量溶媒（空気）を介して熱移動が起こるという利点をこの装置は持っている。
先行技術プロセスでこれまで用いられてきたプラスチックのマイクロフュージチューブの代わりに薄壁ガラス毛細管チューブを試料保持のために用いることにより、またチャンバ１１（図５参照）内部の材料の熱量を極小化することにより、試料を冷却するためのレスポンス時間は非常に速められる。このようなレスポンス時間により、ポリメラーゼ鎖反応における変性及びアニーリング、並びに伸長過程の時間と温度における最適化が可能となる。
さらに、「ランプ（ramp）」時間が短縮される。即ち、増幅過程の各段階に対応して、試料の温度をある温度レベルから次の温度レベルへ移すのに要する時間が短縮される。これにより、増幅の完了に要する時間が短縮し、ポリメラーゼ鎖反応プロトコルにおけるアニーリング、変性、及び酵素動態学の具体的な研究を可能にする。
試料コンパートメント２７内部で適切な温度均一性を達成することが必要であれば、バッフル３２と３３（図３に示す）が使用されるであろう。本実施態様に見られるように、バッフル３２と３３は、反応コンパートメント３０中の温度変動を約１０℃から約２℃まで減少させる。もし必要であれば、反応コンパートメント３０に於ける温度変動をさらに減少させるためにさらに（またはより複雑な）バッフルを使用する場合もある。或いは、図４に見られるように、一層均一な混合を達成するために、ファンをヒーティングコイル３１の下流の、試料コンパートメントの前方に設けることもできる。
装置１０を用いて得られた増幅産物は、手動ウォーターバスサイクリング法によって得られた生成物と定性的および定量的には同一である。しかし、反応混合物を迅速熱コントロールすることで特異性と収率に有利点をもたらすことができる。図６は、熱サイクリング装置１０を用いた場合の、ＤＮＡ増幅収率に及ぼす図５の温度−時間プロフィルの変性時間の変化の効果を示す。明るい垂直な線の各々は、変性温度における特定の時間に対応する。変性時間を可能な範囲で最も短縮した場合に収率が最大になる。そのような結果は従来技術のシステムでは得られない。
図７は、熱サイクリング装置１０を用いた場合の、特異性（即ち、複数の同様のまたは「影の」生成物に対する一つの特異的生成物の収率）に対する図５の温度−時間プロフィルの効果を示している。ランプとアニーリング時間を短くすると、生成物の特異性が高くなる。装置１０の迅速温度反応は、従来技術のシステムでは不可能だった特異性と収率を改善することを可能にしている。
図示したように、装置１０の熱容量（熱量）を減少させることによって、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応に必要な全時間を驚くほど減少させることが出来る。加えて、小さな試料を用いれば、使用しなければならない高価な試薬の量を最大９０％減らし、これにより本発明を用いた手続きを行うコストをさらに削減できる。例えば、内径が約０．２５ｍｍから約１．０ｍｍの毛細管チューブ１０８を使用できる。幾つかの応用においては、内径が約０．０２ｍｍから約０．１ｍｍの毛細管チューブ１０８も使用できる。
本発明の装置１０は、どのような材料からのＤＮＡ増幅にも役立つ。本発明の特定の構成と配置を、本発明の教示に従って構成された熱サイクリング装置１０の具体的な実施態様との関連で議論してきたが、他の配置と構成も利用できるであろう。例えば、空気以外の一般に低熱量の様々な液体も装置１０に使用できる。
本発明のもう一つの実施態様を、図８Ａ−Ｃに示す。図８Ａは斜視図であり、図８Ｂは本実施態様の縦断面図である。前に述べたコンポーネントと教示の多くが、図８Ａ−Ｃに図示された実施態様に適用できることは理解されよう。したがって、本実施態様についての関連する追加の情報のみを以下に記載する。重要なことは、図８Ａ−Ｃの実施態様中で、熱発生エレメントが生物学的試料容器に隣接しており、以下に説明するように、生物学的試料の加熱と冷却をより迅速に行うことを可能としていることである。
直ぐに分かるであろうが、図８Ａ−Ｃの装置は、従来技術に比べて、例えば３０分、１５分、１０分〜５分、あるいはさらに少ない分で、１５または３０サイクルのＤＮＡ増幅の熱サイクリングを行うことが出来る速度に於いて、非常に大きな改善が計られている。さらに、装置１００は、以前に可能であったものよりも試料全体を通してさらに良好な熱均一化を提供する。
図８Ａには、本実施態様のハウジング１０２の全体的な構成を示す。ハウジング１０２は、脚１０４（図８Ｂに於いて最も良く見える）の上に位置しており、記述された他の構造体を所定位置に支持するように機能し、熱くなる構造体を周囲の環境から隔離する働きがある。図８Ａに示す実施態様１００には、前述した装置１０で用いられたような入力キー２５とディスプレイ２６が含まれる。前述のコントロール構造体は容易に変更でき、また、図８Ａ−Ｃに示す実施態様における使用に係るコントロール手段のためのパターンとして使用できる。
図８Ｂの断面図に最も良く示されるように、試料チャンバはブラケット１０６によって具体的に示される。ヒンジ１３１によってハウジング１０２に連結される蓋１３８は、これを開くことにより、試料チャンバ１０６にアクセスすることが出来る。試料チャンバ１０６は円筒形であることが好ましいが、特定の応用で必要とされる任意の形状又はサイズとすることができる。
試料チャンバ１０６は、黒色の発泡材料１１０によってライニングされていることが好ましく、この泡材料１１０の表面は光吸収特性を有し、その厚さにより断熱特性を有する。黒色の発泡材料は、本技術分野で容易に入手可能でプラスチック材料から作られるものとすることができる。発泡体１１０は、その上を通過する空気によって簡単に冷却できる材料であることが好ましく、それは熱伝導性が低く多孔性表面を有する材料である。
材料の暗色又は黒色の多孔性表面は、表面に衝突する短い放射線波長を長い放射線波長、即ち熱に変換する。この熱は試料チャンバに放射される。
発泡体１１０は、ハウジング内の周囲を取り巻く空間から試料チャンバを熱的に隔離し、ランプ１１２から発光される光を熱エネルギーに変換する機能を有する。発泡体１１０は、他の構造体と置き換えることもできる。例えば、片側の表面が黒く塗られたポリカーボネートの薄いシートなどの、黒色、暗色、または他の非反射性の表面を有する材料を、断熱性の材料、例えばファイバーグラスまたは発泡材料によって裏打ちすることができる。多数の異なる基材上に塗布された黒または暗色の表面は、その表面に衝突する短い波長の放射線を熱放射に変換し、その一方で、断熱材料は試料チャンバを周囲の環境から熱的に隔離する。このように、ここで示された教示を用いて、当業者は多くの異なる材料と構造体を試料チャンバの裏打ちとして利用することができる。
ランプ１１２は出来れば５００ワットのハロゲンランプであることが好ましい。適当なコントロール装置を用いれば、高パワーランプまたは複数のランプ、例えば、４つの５００ワットハロゲンランプなどを使用することが出来る。ランプソケット１１２Ａはサポート１１２Ｂによってハウジング１０２に取り付けられている。ランプ１１２は、試料チャンバ１０６を望ましい温度まで、非常に迅速に、かつ均一的に加熱することができる。すでに述べたニクロム線素子などの、熱即ち赤外線放射のための他のソースも、本発明の範囲の中で用いることが出来る。
図８Ｂに示すのは、すでに説明したような２つの薄壁毛細管チューブ１０８である。２つの薄壁毛細管チューブ１０８が示されているが、試料チャンバ１０６は多くのそうしたチューブを支持することが出来る。薄壁毛細管チューブ１０８は、前述した以前から用いられている装置を上回る幾つかの重要な利点があり、また試料チャンバ１０６と共に、生物学的な試料を支持する手段の一つの好適な例として機能する。
同等又は類似の機能を有する多くの他の構造もまた用いることができることが理解されよう。薄壁毛細管チューブ１０８の一部を試料チャンバの貫通孔１４０から外方に延出して接近を容易にすることが好ましい。しかし、特定の応用に適している数多くの他の流体支持構造体のように、試料チャンバ１０６の内部に完全に収容されるようにしてもよい。好ましい薄壁毛細管チューブ１０８は、１０μｌの容量を有する。理解されるであろうが、試料の体積を小さくし、試料支持構造体の表面領域を比較的大きくし、それら全体が比較的小さなサーマルマスを示すようにしなければならない。また、試料支持構造体はどこでも約０．１μｌから約１０，０００μｌまでの容積を有するのが望ましい。しかし当業者であれば、構造体の異なるサーマルマスを考慮するならば、他の容積の試料も使用可能であり、本発明の範囲に含まれることは分かるであろう。
ランプ１１２と断熱発泡体１１０は共に、薄壁毛細管チューブ１０８の中の試料と試料チャンバ１０６内の空気の迅速で均一的な加熱を提供する。熱電対１３４は、チャンバ内の温度を検出するために試料チャンバ１０６内に設けられており、前述のように試料チャンバ内部を好ましい温度に維持するために使用するものである。
好ましくは、熱電対１３４は、生物学的試料とそれを支持する容器の熱応答性と実質的に適合する熱応答性を備えた当技術分野で入手可能なものである。そのような熱電対は、金属シース付きＪ−タイプ熱電対と呼ばれる熱電対製品群を製造しているアイダホラブス（Ｉｄａｈｏ  Ｌａｂｓ）のような販売元から購入できる。好ましくは、下記のようにして熱電対の熱応答性が生物学的試料と容器の熱応答性と整合される。当技術分野で知られているようにフィジテンプ（ＰｈｙｓｉＴｅｍｐ）から購入できるモデルＩＴ−２３熱電対などのミクロ熱電対を選択された容器に支持されている典型的な生物学的試料に挿入し、試験中の試料と熱電対を同じ温度変化に付す。試験中の熱電対または他の外部基準は、熱電対の熱応答性が試料とその容器の熱応答性に一致するまで変えることが出来る。
図８Ｂに示す配置は、以前に利用可能だった装置よりも、試料をより一層均一に加熱、冷却できるものを示している。従前利用可能だった装置では、試料全体を通しての熱の伝達は、試料を通した対流によって行われる。試料を支持するために用いられるものが何であっても、対流による試料の運動は、一般に小さな生物学的試料（例えば、１０−１００μｌ）内の温度勾配または温度差によって起こる。
試料内の温度勾配の効果は、試料のための熱サイクル時間が短くなるにつれてより顕著になり、コントロールを難しくする。試料内の温度が不均一であること、そして、特に従来技術の装置が依存している試料内の「対流による混合」への依存は一般に一試料に対するサイクル時間を増加させ、生物学的試料に有害な影響をもたらしているようである。装置１００は、１０μｌ試料内の温度差が、３０秒サイクルの間、どの時点でも±１℃よりも大きくならないように維持するように、加熱と冷却を行うことができる。
均一な加熱と冷却を促進するために、薄壁毛細管チューブ１０８が熱源、例えば装置１００中のランプ１１２から少なくとも幾分は均一に離間されていることが好ましい。図８Ｃは、図８Ａ−Ｂ中に示した装置１００の中に配置されたランプ１１２と複数の薄壁毛細管チューブ１０８の図式化した平面図である。
図８Ｃ中に示す配置において、ランプ１１２から最も離れた（線Ｆで示す）薄壁毛細管チューブ１０８とランプ１１２との間の距離は、ランプ１１２に最も近い（線Ｎで示す）薄壁毛細管チューブ１０８とランプ１１２との間の距離に対して実質的に４０％以上、より好ましくは実質的に２５％以上長くないことが好ましい。例えば、線Ｎで示された距離は約７．３ｃｍで、線Ｆで示された距離は約８．５ｃｍである。
薄壁毛細管チューブ１０８の配置は図に示すものでなくともよく、例えば、円形又は半円形に配置してもよいことが理解されよう。また、熱生成要素と試料容器との間の距離を測定する起点は、熱生成要素のタイプやサイズの変化に対応して変更される。例えば、熱生成要素は、形状及びサイズが異なる複数のランプ又は電気抵抗要素を含んでもよい。いくつかの実施態様においては、試料容器が位置決めされる試料チャンバ壁からの距離を考慮することが重要となる場合がある。例示された実施態様では、アパーチャ１４０（図８Ａ参照）が試料容器の保持手段として機能するが、同等の機能を果たす他の構造を本発明に従って用いてもよい。
また装置１００は、毛細管チューブ１０８内に入れられた試料を、極めて迅速かつ均一に冷却する。試料チャンバ１０６を冷却するため、ハウジング１０２の外部から、下部ハウジングポータル１１４を介してハウジングの内部にファン１１６を用いて空気が引き込まれる。このファン１１６は、モータ１１８によって駆動されるモータシャフト１２２に接続されている。試料チャンバの迅速な冷却が望まれるので、直ぐ後で説明するように、モータ１１８とファン１１６は、十分量の空気を試料チャンバ１０６内に送った後、試料チャンバ１０６内の空気を分散させることができることが好ましい。図８Ｂに例示されるモータ１１８とファン１１６以外の構成も、本発明の範囲内で採用することができる。
熱移動媒体としての空気の使用には、他の気体や液体とは対照的に、廉価で、入手が容易であり、攪拌しやすく、汚れが付かないといった利点がある。ここで説明される実施態様の場合、試料の入った毛細管チューブの表面積対体積の高い比により、熱移動媒体として空気を使用した迅速な熱移動が得られる。
熱サイクルにおける冷却段階の際、ファン１１６の作用により、周囲の空気がハウジング１０２内に引き込まれる。排気ドア１２８は、ヒンジ１２９に接合されて設けられる。この排気ドア１２８は、ハウジング１０２の内部が上部ハウジングポータル１３０から遮断されるように、ソレノイド１３２により自動的に開かれる。いくつかの実施様態においては、ソレノイド１３２を、本技術分野で知られているステッパーモータに置き換えることが好ましい。ステッパーモータの使用により、排気ドア１２８が、試料の加熱及び冷却の必要に応じて正確にかつ少しずつ開閉することが可能となる。当業者であれば、ステッパーモータのための適切な制御機構は、例えば、当業界では既知のＳＣ−１４９ステッパーモータコントローラ（アルファプロダクツ（Ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から入手可能）等を本明細書に開示される情報を利用して構成できるであろう。
下部試料チャンバポータル１２０の配置、及び上部試料チャンバポータル１２６の増加させた断面積と位置により、室温の空気は試料チャンバ１０６に送られた後、モータシャフト１２２に接続されたパドル１２４を用いて、試料チャンバ１０６内で分散及び攪拌される。このパドル１２４は、比較的高い速度、例えば、好ましくは約２５０ｍ／分、より好ましくは約５００ｍ／分、最も好ましくは約１０００ｍ／分の試料チャンバ１０６内での空気速度をもたらすのに十分な速度で回転させられる。この高速回転する単翼又は多翼のパドル１２４により、空気が移動し、試料チャンバ１０６内に引き込まれた後、点線１３６で示された経路に沿って試料チャンバ１０６から排気される。パドル１２４の回転はまた、試料チャンバ１０６に入って来る空気の攪拌をも促進し、薄壁毛細管チューブ１０８の表面から試料チャンバ１０６内を通過する空気への熱エネルギーの最も効率的な移動を確実にする。本明細書に例示されるもの以外の構造でも、同様の機能が発揮できることが理解されよう。
ソレノイド１３２が作動して排気ドア１２８が開くと、試料チャンバ１０６内に送られていた室温の空気全てが、試料チャンバ上部ポータル１２６を介し、次に上部ハウジングポータル１３０を介して排気され、試料チャンバ１０６内の熱が周囲の大気に放出される。試料チャンバ１０６内を通過し、その中に分散される空気を迅速に攪拌する結果、試料の迅速かつ均一な冷却が実行される。
実施例２
図９Ａは、４つの異なる温度／時間プロフィル（Ａ〜Ｄ）と、３０サイクル実施後に得られた増幅産物を示す。図９ＡのプロフィルＡ及びＢは、従来技術のマイクロフュージチューブを用いた従来技術の加熱ブロック装置を使用して得た。図９Ａに見られるように、異なる温度間の移行は遅く、多くの非特異的バンドがプロフィルＡ及びＢの中に存在している。プロフィルＢでは、各試料が各温度に留まる時間を制限することにより、（プロフィルＡとは対照的に）一部の非特異的バンドが除去され改善されている。これは、前記時間がより短ければ、より多く所望の結果が得られることを示唆するものである。
プロフィルＣ及びＤは、図８Ａ及び図８Ｂに示す装置を使用して得た。図９Ａに見られるように、増幅は特異的であり、好ましいことには、収率はプロフィルＣ（６０秒伸長）で最大であるが、プロフィルＤ（１０秒伸長）においても全体としては適切である。
ヒトのゲノムＤＮＡから採取したβ−グロビンの５３６ｂｐフラグメントの増幅に関する最適時間及び最適温度もまた決定された。増幅における収率及び生成物特異性は、変性（９３℃）及びアニーリング（５５℃）を１秒未満行った時に最適となった。これより長時間の変性又はアニーリングには、いかなる利点も見出せなかった。伸長（７７℃）時間を長くすると収率は増加するが、１０〜２０秒を超える伸長時間ではほとんど変化が見られなかった。これらの予期し得ぬ結果は、ＤＮＡ増幅に用いられる従来から入手可能であった装置が、反応の物理的及び酵素的な要件を最適化するのに必要な条件を最大にするものでないことを示唆している。
更なる情報は、以下の文献から得られる：カール・Ｔ・ウィットワー（Wittwer, Carl T.）、ブルース・Ｃ・マーシャル（Marshall, Bruce C.）、ガドラン・Ｂ・リード（Reed, Gudrun B.）、及びジョシュア・Ｌ・チェリー（Cherry,Joshua L.）らの「嚢胞性繊維症ΔＦ50B遺伝子座を用いた迅速な対立遺伝子特異的増幅サイクル（Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF50BLocus）」39クリニカルケミストリ（Clinical Chemistry）804（1993）、並びにカール・Ｔ・ウィットワー（Wittwer, Carl T.）、ガドラン・Ｂ・リード（Reed,Gudrun B.）、及びカーク・Ｍ・ライア（Rire, Kirk M.）らの「迅速なＤＮＡ増幅（Rapid DNA Amplification）」ザポリメラーゼチェーンリアクション（The Polymerase Chain Reaction）174（1994）。これら両文献を、本明細書の一部を構成するものとしてここに引用する。
図９Ａに提示した情報から、本発明の実施態様では、そこに置かれた試料が、好ましくは少なくとも０．５℃／秒を超える速度で試料の温度が増減される迅速な熱サイクルに付されることが解る。ポリメラーゼ鎖反応を行う本発明の場合には、温度の変化が、好ましくは約３０℃から５０℃の範囲にわたり行われることである。熱サイクルは、少なくとも３０サイクルを４０分以内で行えるだけ十分に迅速に行うことが望ましく、さらに好ましくは３０サイクルを２０分以内で行うことであり、最も好ましくは３０サイクルを１０分以内に行うことである。
装置１００は、好ましくは少なくとも１．０℃／秒の速度で試料の温度を増加減少させ、より好ましくは少なくとも４．０℃／秒の速度で増加減少させ、最も好ましくは少なくとも１０．０℃／秒の速度で増加減少させる。厳密には、周囲の媒体および／または試料容器ではなく、生物学的試料も、特定の熱変化を行わなければならない。本発明ほど迅速な熱変化を行うことができない欠点を有する以前に利用可能であった装置も、周囲の媒体と容器の温度ではなく、試料の温度を迅速にかつ均一に変化させる問題を認識していなかった。
次に図９Ｂの図を参照すると、本発明の方法は好ましくは少なくとも１０℃／秒の速度、より好ましくは少なくとも２０℃／秒の速度で、約２０℃以上の温度範囲、より好ましくは約３０℃以上の温度範囲、最も好ましくは約４０℃の温度範囲に渡って熱サイクリングを達成することができる。図９Ｂは、生物学的試料の熱サイクルが始まってからの、周囲の空気や容器ではなく、生物学的試料の温度を℃で示したものである。図９ＢはＰＣＲ試料の温度変化を示す。約７４℃から始まり、Ｄで示す変性温度（約９２℃）まで２秒加熱される。次に試料はＡで示すアニーリング温度（約５５℃）まで２秒冷却される。変性温度とアニーリング温度の遷移（３７℃の範囲）は４秒以下であり、少なくとも１０℃／秒の速度を達成している。次に、図９Ｂ中のＥに示すように、試料を５秒７４℃の伸長温度まで加熱する。変性温度、アニーリング温度、そして伸長温度を通した試料のサイクリングは３０回繰り返すか、あるいは望みの回数だけ繰り返す。
図９Ｃ〜Ｇは、本発明によって達成された他の好ましい温度／時間プロフィルの例示的なサイクルを示している。これから、当業者であれば、本発明に従って特異的なプロセスを行うために代表的な温度／時間プロフィルを変更できることは理解されるだろう。また当業者であれば、以前に利用可能であった装置と方法、例えば固体または液体を介して試料に熱を伝導し、試料から熱を伝導する装置は、ここで示した温度／時間プロフィルを提供できず、また示唆も教示もしていないことが分かるであろう。さらに、当業者であれば、以前に利用可能であった、空気と転移媒体を使用する装置と方法、例えば以前に利用可能だったクロマトグラフィーオーブンは、本明細書に示された温度／時間プロフィルを提供できず、又示唆も教示もしていないことが分かるであろう。
最も速い熱サイクリング時間を提供するために、ランプ（図８Ａと８Ｂの１１２）の定格が２０００ワットであるか、または同様の出力を提供する複数のランプを設けることが好ましい。コネティカット州、ダリアン（Ｄａｒｉａｎ）のアルファプロダクツ（Ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から入手可能なクロックと高性能プログラムインタプリター付き８０５２マイクロコントローラボードを用いたＡ−バスコントローラ／アクイジションシステム（モデル番号ＳＰ−１２７）と関連して図１０に示した温度勾配制御回路を含むことも好ましい。好ましいマイクロコントローラーと関連して用いられるプログラミングコードの例は、添付のプログラミングコード付表に含まれ、これを本明細書の一部として掲載する。付表のプログラミングコードは、マイクロコントローラへのシリアルダウンロードのためのＢＡＳＩＣ５２のファイルであり、熱サイクリングの間の例示的熱勾配制御を提供する。２０００ワット熱発生装置と上記の制御構造を使用することによって、好ましい２０℃／秒の速度で温度サイクルを行なうことができる。
次に、図１０に示す温度勾配制御回路の好ましい構成を説明する。なお、図１０中に明示的に描かれていない他の必要な部品は、当業者が容易に提供できるものである。
図１０に示す温度勾配制御回路は、すでに説明されたように試料の温度応答性に適応した熱電対２００を含む。熱電対２００は集積回路２０６に連結されている。この集積回路２０６は、好ましくはＡＤ５９５として知られているものであり、その出力は、カットオフ周波数が１００Ｈｚの４次ローパスフィルター２０８に運ばれ、そして１２ビットＡ／Ｄ変換器２１０へ運ばれる。このＡ／Ｄ変換器２１０の出力は、温度のデジタル表示を提供するために用いられる。
回路２０６の出力は測定勾配回路２１２へも運ばれる。この測定勾配回路２１２は、好ましくは３５３演算増幅器２１８、１００ＫΩのポテンシオメーター２１４、１ＭΩのポテンシオメーター２３０、そして２２μＦのコンデンサを含む。測定勾配サーキット２１２は、３５３演算増幅器２４６の反転入力へ信号を出力する。
勾配設定回路２２２は、正勾配設定ＤＡ変換器２２６と、負勾配設定ＤＡ変換器２２４とを含む。ＤＡ変換器２２４と２２６は、当技術分野でＤＡ１４７と呼ばれる８ビットＤＡ変換器であることが好ましい。勾配設定回路は、パーソナルコンピュータのような他のデジタル装置（図１０中に描かれていない）からの命令を受け得るようになっているのが好ましい。勾配設定回路２２８の出力は、加算回路２４０に送られる。
加算回路２４０は、１００ＫΩの抵抗２３６、２３８、２４４と、３５３演算増幅器２４２を含んでいるのが好ましい。加算回路の２４０の出力は、演算増幅器２４６の非反転入力へ運ばれるが、これは温度変化の好ましい勾配を示す。演算増幅器２４６の出力は、パワースイッチング回路２６２の内に含まれるトランジスタ２４８に供給される。
パワースイッチング回路２６２は、５ＶのＤＣ電源２５０を有し、これはトランジスタ２４８に電流を供給する。トランジスタ２４８のエミッタは、好ましくは抵抗値が３３０Ωである抵抗２５２を介して３０１０回路２５４に接続されている。３０１０回路２５４の出力には、好ましくは抵抗値が１８０Ωである抵抗２５６が直列に接続されている。好ましくは、ＡＣ電流源２６０からランプ２６２又は他の熱発生装置に供給される電流を制御するためにトライアック２５８が用いられる。
図１０に示された温度勾配制御回路は、他の既に述べたシステムの構成要素と協力して、生物学的試料全体を通しての均一性を維持しながら、温度範囲３０℃に渡って、最も好ましくは４０℃の温度範囲に渡って、２０℃／秒の速度で生物学的試料の熱サイクリングを行う。
本明細書に記載した装置は、ポリメラーゼ鎖反応過程、サイクルシークエンシング、及びリガーゼ鎖反応のようなその他の増幅プロトコルなどの多くの異なるアプリケーションのために容易に使用できる。本発明はまた、試料チャンバ中に置かれた試料の温度を正確にコントロールし、所定の温度−時間プロフィルに従って、迅速に正確にチャンバ内に置かれた試料の温度を変化させるための装置を有利に提供する。
ＤＮＡ増幅の連続蛍光モニタリング
前に示したように、ポリメラーゼ鎖反応を迅速に行うことができる。本明細書に記載された方法と装置を用いることにより、必要な回数の温度サイクルを、従来技術で可能であった時間よりも遥かに短時間で、例えば１５分未満で完了できる。変性とアニーリングの時間を最短にすることで、サイクルを早くした増幅の特異性と収率も以前には可能ではなかったレベルまで改善される。さらに、迅速な熱移動に加えて、光学的に透明な毛細管チューブを使用することで、本発明に従ったＤＮＡ増幅の継続的な蛍光モニタリングが可能となる。
ＤＮＡ増幅を検出及びモニターするために蛍光プローブを使用できる。有用なプローブには、二本鎖ＤＮＡ特異的色素、及び配列特異的プローブがある。インターカレーター臭化エチジウムにより、紫外線励起赤色蛍光は、毛細管チューブまたはミクロフュージチューブ内での増幅の後に増強する。配列特異的蛍光検出はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用することで可能となる。例えば、二重標識フルオレセイン／ローダミンプローブは、ポリメラーゼ伸長の間、５’−エキソヌクレアーゼ活性によって開裂することが可能で、蛍光体を分離し、フルオレセイン／ローダミンの蛍光比を増加する。
蛍光の測定を、温度サイクリングが完了した後で、生成物の堆積のモニターとしてサイクル毎に一回、又は各サクイル内で連続的に行なうことができる。本発明と異なり、従来使用可能であった配列特異的方法は終点分析に限られていた。
本発明により、初期テンプレートコピー数の数量化のためのサイクル毎のモニターが可能となる。そのようなサイクル毎のモニターを行なうために、各サイクルの伸長段階又はアニーリングと伸長を組み合わせた段階の間における蛍光が収集され、生成物の濃度と関連付けられる。インターカレーターＹＯ−ＰＲＯ−１を使用したＣ型肝炎ＲＮＡのための量的アッセイが当技術分野で知られている。より詳細な情報は、イシグロ  Ｔ．（Ishiguro, T.）、Ｊ．サイチ（J. Saitch）、Ｈ．ヤワタ（H. Yawata）、Ｈ．ヤマギシ（H. Yamagishi）、Ｓ．イワサキ（S. Iwasaki）、及びＹ．ミトマ（Y. Mitoma）による１９９５年発行の「蛍光インターカレーター存在下におけるポリメラーゼ鎖反応によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの均質な量的アッセイ（Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of afluorescent intercalater）」、アナリチカルバイオケミストリ（Anal. Biochem.）２２９：２０７−２１３を参照のこと。本発明以前は、各サイクル内の温度遷移の間における連続的な蛍光モニターは試みられなかった。
本明細書に開示するのは、連続的な蛍光モニタリングを提供する２色蛍光光学装置と一体化された迅速温度サイクラーである。下記においてさらに十分に検討するように、ＤＮＡ増幅を追跡するための３つの異なった好ましい蛍光技術を本発明の具体例として本明細書に示す。当業者であれば、本発明に従って使用できる蛍光技術におけるエチジウムブロマイドの使用に親しんでいるであろう。下記に記載した現時点での好ましい実施態様においては、当技術分野でよく知られ、オレゴン州、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）のモレキュウラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）から入手できるＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉを二重鎖特異的色素として用いることが好ましい。
本発明によれば、時間、温度、蛍光が２００ｍｓｅｃごとに収集される。今まで利用可能であった装置と方法では得られなかった、生成物の変性、再アニーリング、伸長の細部がそのようなデータから明らかとなる。さらに、以下に完全に説明されるように、当技術分野においてよく知られている５’−エキソヌクレアーゼクエンチングプローブを用いて得られた結果が、二本鎖特異的な蛍光を用いて得られた結果と比較されている。さらに、これも以下に完全に説明されるように、フルオレセインから、既知のシアニン色素Ｃｙ５TMへの共鳴エネルギー転移を伴った、隣接するハイブリダゼーションプローブに基づいた新しい蛍光スキームの使用が開示されている。ムジュムダルＲ．Ｂ．（Mujumdar, R.B.）、Ｌ．Ａ．エルンスト（L.A.Ernst）、Ｓ．Ｒ．ムジュムダル（S.R.Mujumdar）及びＡ．Ｓ．ワゴナー（A.S.Waggoner）、１９８９年、「イソシアネート基含有シアニン色素標識試薬」（Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ）、サイトメトリ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）１０：  １１−１９。
当業者であれば分かるように、ＤＮＡ増幅が行われている多数試料の一サイクルに一度のモニタリングは、強力な定量化ツールである。本開示を理解することによって分かるように、サイクル内の連続的なモニタリングは、プローブ蛍光の性質を同定することができ、当技術分野では今まで利用できなかったＤＮＡ増幅機構への洞察を提供できる。
次に図１１を参照すると、全体を３００で示す、蛍光検出付の好ましい迅速温度サイクラーの概略図が示されている。強制空気熱空気源３０２は、好ましくは、１６００ワットの加熱コイルとファンを含む市販の装置である。強制空気冷空気源３０４も提供されることが好ましい。この強制空気冷空気源３０４は、イリノイ州ナイルス（Ｎｉｌｅｓ）のダイトン（Ｄａｙｔｏｎ）から入手可能な２２００ｒｐｍのシェード付きポールブロワ、モデル番号４Ｃ００６Ｂである。冷空気源３０４が常温の空気を提供することが好ましいが、周囲の空気温度よりも低い温度の流体を提供する手段を利用することも本発明の範囲に入るものである。図１１の実施態様では、強制熱空気源３０２と強制冷空気源３０４のそれぞれを試料チャンバ３１０に連結するために、２．５ｃｍの直径を有する波形黒色ナイロンチュービング３０６と３０８が使用されている。ベント３１２と排出ファン３１４は試料チャンバ３１０から空気を外に出すように機能する。さらに、試料チャンバ３１０の内部が周囲光から遮蔽されている。
試料チャンバ３１０内部の試料の温度は、アイダホ州アイダホフォールズ（Ｉｄａｈｏ  Ｆａｌｌｓ）のアイダホテクノロジ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手可能な、管状の金属シース付き熱電対（モデル番号１８４４）３１６によってモニターされる。この熱電対は、毛細管チューブ内に保持された試料と熱応答性が適合している。試料チャンバ３１０内部の温度均一性は中央試料チャンバファン３１８によって達成される。この試料チャンバファンは、好ましくはアイダホテクノロジ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手可能な１．７ｘ１１ｃｍのファンブレード（モデル番号１８６２）、およびアイダホテクノロジ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手可能なモータ（モデル番号１８６１）を含むのが好ましい。このモータは、試料チャンバ３１０内に於いて少なくとも８００から１０００ｍ／分の空気速度を作り出す。
試料チャンバ３１０内部に於いて、複数の試料が毛細管チューブに保持される。そのうちの幾つかが３２０で示されており、回転するカルーセル３２２に垂直に置かれている。カルーセル３２２は、好ましくは１４ｃｍの直径であり、マイクロステッピングドライブモジュール３２６によって制御される、一回転当たり４００ステップのステッパーモーター３２４によって回転される。ステッパーモーター３２４は、好ましくは、マサチューセッツ州ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）のニューインクランドアフィリエイテッドテクノロジーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手可能なステッパーモーター（モデル番号２１９８３６４）であり、マイクロステッピングドライブモジュール３２６は、同じくニューインクランドアフィリエイテッドテクノロジーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手可能なマイクロステッピングドライブモジュール（モデル番号ＭＤＭ７）である。このモジュールは、カルーセル３２２の１回転当たり１２，８００ステップを提供する。
引き続き図１１を参照すると、蛍光励起源３２８が提供されている。以下、励起パスについて記載する。蛍光励起源３２８は、好ましくは楕円形のリフレクタによって焦点合わせされた７５ワットのキセノンアーク源であり、このキセノンアーク源は、好ましくは、ｆ／２．５の楕円形リフレクタを有する、ニュージャージー州サウスブランズウィック（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）のフォトンテクノロジインターナショナル（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から入手可能なモデル番号Ａ１０１０である。あるいは、発光ダイオードを用いることもできる。蛍光励起源３２８から発光した光は、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）（カルフォルニア州コビナ（Ｃｏｖｉｎａ））のから入手可能なアイリス（モデル番号７５．０１２５）など調整可能なアイリス３３４を用いて約２ｍｍに集光される。蛍光励起源３２８から発光された光は、冷鏡３３０（好ましくは、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号６０．４４００）に当たり、さらに熱吸収ガラス３３２（好ましくは、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号６５．３１３０）を通り抜ける。平凸レンズ３３６（好ましくは、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号１０．０２６０）でコリメーションを行なった後、４５０−４９０ｎｍのバンドパス干渉フィルター３３８（好ましくはバーモント州ブラットルボロ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ）のオメガオプティカル（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）から入手可能なもの、モデル番号４７０ＲＤＦ４０）、フォーカシング平凸レンズ３４０（好ましくは、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号１０．０２６０）及び１ｍｍのシリカウィンドウ３４２（好ましくは、オメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの）を通過する。これにより、温度サイクリングの間、直前に述べた光学部品上での凝縮を避けることができる。記述した励起パスを用いて、一つの毛細管試料チューブ３２０Ａの５−７ｍｍのセクションが照明される。
次に、試料３２０Ａから発光した蛍光を集めるための集光パスについて、引き続き図１１を参照して説明する。集光パスに設けられた光学部品には、他の光学部品上での凝縮を避けるために設けられた１ｍｍのシリカウィンドウ３４４が含まれる。２つの対向して設けられた非球面のレンズ３４６Ａと３４６Ｂ（好ましくはロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号１７．１１７５）は、発光された蛍光の焦点を２Ｘ１０ｍｍのスリット３４８上に合わせるように機能する。スリット３４８は、露光されたＸ線フィルムを切断することによって製作でき、空間的なフィルターとして機能する。空間的なフィルター３４８の後に、発光された蛍光は、電子シャッター制御装置３５２を介して操作される３５ｍｍの電子シャッター３５０の上に照射される。３５ｍｍの電子シャッター３５０は、好ましくはユニブリッツ（Ｕｎｉｂｌｉｚｔｓ）シャッター、モデル番号ＶＳ３５であり、電子シャッター制御装置３５２は、好ましくはドライバー  モデルＤ１２２であり、両方ともニューヨーク州ローチェスタ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）のビンセントアソシエーツ（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）から入手可能である。また、コリメーション用非球面レンズ３５４（好ましくはロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なもの、モデル番号１７．１１７５）が設けられている。
ＳＹＢＲ▲Ｒ▼のグリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉの発光を検出することが望まれる場合には、フィルター３５６も設けられる。フィルター３５６は、５２０−５８０ｎｍのバンドパスフィルターであり、オメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能であり（モデル番号５５０ＲＤＦ６０）、単色の収集のために用いられる。他の発光の検出のために、二色フィルター３５８と波長フィルター３５８Ａと３５８Ｂの組み合わせがフィルターブロック内で用いられる。フルオレセインとローダミンの発光の分離には二色フィルター３５８が用いれらる。この二色フィルター３５８は、５６０ｎｍのロングパス二色フィルター、好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手できるもの（モデル番号５６０ＤＲＬＰ）から構成するのが好ましい。フルオレセインの検出のためには、５２０−５５０ｎｍのバンドパスフィルター（３５８Ａ）（好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの、モデル番号５３５ＤＦ３０）が使用され、ローダミンの検出のためには、５８０−６２０ｎｍバンドパスフィルター（３５８Ｂ）（好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの、モデル番号６００ＤＦ４０）が使用される。フルオレセインとＣｙ５の発光の分離を行なう場合、二色フィルター３５８が、好ましくは５９０ｎｍのロングパス二色フィルター（好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの、モデル番号５９０ＤＲＬＰ）であり、フィルター３５８Ａと３５８Ｂが、フルオレセイン検出用の５２０−５５０ｎｍバンドパスフィルター（３５８Ａ）（好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの、モデル番号５３５ＤＦ３０）と、Ｃｙ５検出用の６６０−６８０ｎｍバンドパスフィルター（３５８Ｂ）（好ましくはオメガ（Ｏｍｅｇａ）から入手可能なもの、モデル番号６７０ＤＦ２０）とから構成されるのが好ましい。
引き続き図１１を参照すると、フィルター３５８を通った後、蛍光は２つの平凸レンズ３６０Ａと３６０Ｂ（好ましくは、ニュージャージー州バリントン（Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ）のエドムンド（Ｅｄｍｕｎｄ）から入手可能なもの、モデル番号３２９７０）を通して、光電子増倍管３６２Ａと３６２Ｂの上に焦点が合わされる。光電子増倍管３６２Ａと３６２Ｂは、好ましくはニュージャージー州ミドルセックス（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ）のハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）から入手可能なモデル番号Ｒ９２８であり、ハウジング内に収容される。このハウジングは、好ましくはフォトンテクノロジインターナショナル（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から入手可能なモデル番号７１４で、アナログ収集が付いている。また、ＰＭＴ及びデータ収集制御モジュール３６４を設けることも好ましい。当技術分野で知られている、手動式のＰＭＴシャッター３６６Ａと３６６Ｂも設けられている。
上記した光学部品は、好ましくは直径が５ｃｍで、５ｃｍの汎用レンズマウント（例えば、ロリン（Ｒｏｌｙｎ）から入手可能なモデル番号９０．０１９０）に取り付けられている。当業者であれば分かるように、必要な構造的部品の多くは黒色のデルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）TMから加工された。
図１１に示す装置を用いて、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５（２５℃）、３ｍＭＭｇＣｌ2、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．５μＭの各プライマー、０．５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸と、５μｌ試料に対して０．２ＵのＴａｑポリメラーゼの条件下でＤＮＡ増幅を行なった（別途記載がない限り、下記の実施例も同じ条件）。ヒトゲノムＤＮＡ（沸騰１分で変性）、または精製を行った増幅生成物をＤＮＡテンプレートとして用いた。精製した増幅生成物はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって得た。（ウォレスＤ．Ｍ．（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｍ．）、１９８７年、大規模及び小規模のフェノール抽出と核酸の沈殿（Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids）、ｐ．３３−４８、Ｓ．Ｌ．バーガー（S.L.Berger）とＡ．Ｒ．キンメル（A.R. Kimmel）（Eds.）、「分子クローン技術ガイド（Guide to Molecular Cloning Techniques）」（メソッズインエンザイモロジ（Methods in Enzaymology），Vol. 152）、アカデミックプレス（Academic Press），オーランド（Orlando）を参照のこと。これに引き続き、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０ミクロコンセントレーター（マサッチューセッツ州ダンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）のアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）から入手可能）を通して洗浄を繰り返してプライマーを除去した。テンプレートの濃度は、２６０ｎｍに於ける吸収によって測定した。テンプレートのＡ260／Ａ280比率は、１．７よりも大きかった。
プライマーは当技術分野で知られている標準ホスホラミダイト化学によって、即ち、ファーマシアバイオテックジーンアッセンブラプラス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））を用いて合成を行った。肝炎ウイルスＢ表面抗原遺伝子の１８０ｂｐフラグメントをプライマー５’−ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ−３’（配列番号１）、および５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２）を用いて増幅した（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＨＶＨＥＰＢ）。ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉはモレキュウラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））から入手した。β−アクチンプライマーとフルオレセイン／ローダミン二重プローブはパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（カルフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））（ｎｏ．Ｎ８０８−０２３０）から入手した。ヒトβ−グロビンプライマーＲＳ４２／ＫＭ２９（５３６塩基対）と、ＰＣ０３／ＰＣ０４（１１０塩基対）は、ウィットワー  Ｃ．Ｔ．（Wittwer,C.T）、Ｇ．Ｃ．フィルモア（G.C.Fillmore）、及びＤ．Ｒ．ヒルヤード（D.R. Hillyard）、「熱した空気を用いた毛細管内における自動ポリメラーゼ鎖反応（Automated polymerase chainreaction in capillary tubes with hot air）」、Nucl.Acids. Res.１７：４３５３−４３５７に記されており、この文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
シングル標識プローブ、５’−ＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡ−フルオレセイン−３’（配列番号３）と５’−Ｃｙ５−ＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧ−リン酸−３’（配列番号４）は、フルオレセインホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（バージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）のグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能、番号１０−１９６３）、Ｃｙ５TMホスホラミダイト（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能、番号２７−１８０１−０２）、化学的リン酸化試薬（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能、番号１０−１９００）を用いて合成を行った。これらの隣接するプローブは、同じＤＮＡ鎖の、ＰＣ０３／ＰＣ０４β−グロビンプライマー対の内側にハイブリダイズし一塩基対によって分離する。プローブは逆相Ｃ−１８高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、均一性をポリアクリルアミド電気泳動と吸収（Ａ260と蛍光体の最大吸収）によって調べた。ハイブリダイゼーションプローブ（β−アクチンとβ−グロビン）はそれぞれ０．２μＭにて使用した。
本明細書に記載した関連する実施例に於いては、５μｌの増幅試料を毛細管試料チューブ２３０に充填した。毛細管試料チューブは好ましくはアイダホテクノロジ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手可能なモデル番号１７０５で、外径が１．０２ｍｍ、内径が０．５６ｍｍのものである。充填の後、毛細管試料チューブをブタンの火炎で密封した。毛細管試料チューブの表面を、蛍光検出３００のついた迅速温度サイクラーのカルーセル３２２に乗せる前に、光学グレードのメタノールで清浄化した。
図１１に示す部品の制御は、１２０ＭＨｚのクロック速度で走る８０４８６Ｉｎｔｅｌ▲Ｒ▼のマイクロプロセッサを用いたＰＣ互換のコンピューター３６６に内蔵した、ＬａｂＶｉｅｗ（テキサス州ＡｕｓｔｉｎのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能）として知られているグラフィックプログラミング言語と、１２−ビット多機能入力／出力カード（ＡＴ−ＭＩＯ−Ｅ２という名称でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能）を使って行った。入力／出力カード上のアナログ出力チャンネルを、各光電子増倍管チューブ３６２Ａと３６２Ｂの感度、即ちＰＭＴ電圧を制御するために用いた。入力／出力カード上のアナログ入力チャンネルは、各光電子増倍管３６２Ａと３６２Ｂからの信号を受け取る。ＰＣ互換のコンピューターは、入力／出力カードを通して、カルーセルの動作の位置、速度、方向を制御する。以下、理解されるように、多数の毛細管試料チューブがロードされた時、カルーセル３２２は、迅速に各毛細管試料チューブ３２０を順次、１００ｍ秒の収集のためにモニタリング位置に位置決めする。単一の毛細管試料チューブ３２０Ａの継続的なモニタリングに対しては、データを平均化し、各２００ｍ秒ごとに収集する。時間、温度、そして蛍光の２チャンネルが、蛍光−サイクル数のプロット、及び蛍光−温度のプロットとして表示される。カルーセルは最大の蛍光と信号が得られる位置に置かれなければならない。単一の毛細管試料チューブ３２０Ａを解析した場合、光電子増倍管３６４の積分時定数を５０ｍ秒にセットして２００ｍ秒ごとに信号を収集した。複数の光電子増倍管３６６Ａと３６６Ｂを用いた場合、時定数を０．５ｍ秒にセットし、各チャンネルで各毛細管試料チューブ３２０が最大の蛍光を提供する正確な位置を見つけるために、カルーセルを一度だけ回転させた。毛細管試料チューブ３２０Ａを最大の蛍光が得られる位置に位置決めした後、各ＰＭＴ３６２Ａ、３６２Ｂの感度を調整し、全ての毛細管試料チューブ３２０の位置をカウントして配置するためにカルーセルをもう一度回転させた。カルーセル３２２上の各毛細管試料チューブ３２０をモニタリング位置に各１００ｍ秒間、順次位置決めすることにより、伸長の間、各増幅サイクルごとに一回、信号を得た。温度制御プログラミングは、ユタ州ソルトレイクシティ（Salt Lake City）のＳｙｓｔｒｏｎｉｃｓから入手可能な８０５１クロスカンパイラー（ＢＣＩ５１）と、Ｄａｌｌａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｔｒｏｎｉｃｓからも入手可能、ＤＰＢ２という名前）を用いて、Ｉｄａｈｏ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからＲａｐｉｄｃｙｃｌｅｒという名称で出ている市販の迅速温度サイクラーを改造した。
実際には、蛍光検出３００を有する迅速温度サイクラーの温度応答性は、図８Ａと図８Ｂに開示した本発明の実施態様で得られる応答性と同様であり、図１１Ａの温度−時間チャートに示されたように２０−３０秒サイクル（１０−１５分に３０サイクル）が可能である。二本鎖特定的蛍光色素が増幅の間、存在する場合、より多くの二本鎖生成物が製造されるにつれて、蛍光は一般に増加する。以下を参照のこと。Higuchi, R.（ヒグチ，Ｒ．）、G. Dollinger（Ｇ．ドリンガー）、P.S. Walsh（Ｐ．Ｓ．ウォルシュ）、及びR. Griffith（Ｒ．グリフィス）、1992、Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences（特異ＤＮＡ列の同時増幅及び検出）、Bio/Technology 10:413-417。
蛍光はまた、温度サイクリングの間、交絡効果（confounding effect）である温度に依存するが、この影響は、一サイクル当たり一回、一定の伸長温度で蛍光を考慮することで普通は除去できる。しかし、もし温度、時間、蛍光を迅速サイクル増幅の間に２００ｍ秒ごとに収集すると、図１２に示されるような空間で三次元らせんが追跡される。図１２に示された３Ｄ曲線はまた、図１２に温度対時間、蛍光対時間、蛍光対温度の２Ｄプロットとして投影されている。図１２の温度対時間の投影は各サイクルで繰り返し、図１１Ａに示した情報と本質的に同じ情報を提供する。蛍光は温度に対して逆比例で変化するので、各サイクルに於ける図１２に見られる蛍光対時間投影は、温度対時間プロットの一定の割合を有する鏡像である。生成物が蓄積するにつれて、二本鎖生成物については全ての温度で蛍光は増加する。しかし変性温度に於いて、単鎖ＤＮＡのみが存在するため、蛍光はベースラインに戻る。
図１２に示す二本鎖色素の蛍光−温度の投影は時間軸を除いてあり、ＤＮＡ増幅の間の鎖の状態の温度依存性を示す。図１２に見られる蛍光対温度投影は、肝炎Ｂウイルスの１８０塩基対フラグメントに関するものである。
図１３に示す蛍光−温度の投影は、ヒトβ−グロビンＤＮＡの５３６塩基対フラグメントに対するものである。図１３に示された初期のサイクルは、低温度での蛍光の非線形的な増加を伴って、同等であることを示す。増幅が進むと、後続サイクルが顕著なヒステリシスを示す上昇ループとして、アニーリング温度と変性温度の間に現れる。即ち、加熱中の観察される蛍光が冷却中の蛍光よりも大きいのである。試料を加熱するにつれて、蛍光は変性が起こるまで（蛍光の急激な落下として明かである）、高いレベルにある。変性温度からアニーリング温度まで試料が冷えるにつれ、二本鎖信号が迅速に増加する。温度が一定に保たれている間は、伸長の間、蛍光は増加し続ける。
多数の試料を、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いて各サイクルごとに一度、モニターする場合、図１４に示されたように、１０7-１０8の範囲の初期テンプレート濃度を認めることができる。データを各毛細管試料チューブ３２０のパーセント最大蛍光として正規化した場合、１００の初期コピーが１０のコピーから明確に分離される。しかし、コピー数が１と１０の差異はわずかであり、毛細管試料チューブ３２０当たりのコピー数がゼロと平均で１の間の差は観察されない。
これに対し、配列特異的プローブは同様のダイナミックレンジを有しているが、図１５のプロットに示すように、ネガティブコントロールからの単一の初期テンプレートコピーさえ識別することが明かである。５’−エキソヌクレアーゼプローブを有するシグナルの生成は、ＤＮＡ合成に依存するのみではなく、ハイブリダイゼーションと二重標識プローブの蛍光体の間の加水分解を必要とする。この加水分解は消光を減少させ、ローダミン発光に対するフルオレセインの蛍光比が増加する。二本鎖色素からの蛍光が過剰のサイクリングによってレベルが落ちる一方で、エキソヌクレアーゼプローブからのシグナルは、各サイクルで増加し続ける。正味の生成物が合成されなくとも、プローブハイブリダイゼーションと加水分解は起こり続ける。テンプレートコピー数が１０3以下に減少するにつれ、シグナル強度は減少し、しかし、ネガティブコントロールのシグナルが安定なので、低コピー数でも定量化できる。
５’−エキソヌクレーゼプローブの蛍光対温度プロットから、プローブの加水分解がシグナル生成の機構であることが確認できる。図１６には、β−アクチンエキソヌクレアーゼプローブを用いた２温度サイクリングの蛍光−温度プロットを示す。各サイクルで、蛍光比は温度とともに線形に変化し、ヒステリシスは殆どない。プローブの加水分解が起こると推定される場合、アニーリング／伸長相の間、各サイクルに於いてシグナルは増加する。温度が増加するにつれて（データは示されない）、フルオレセインとローダミンの両方の蛍光が減少するが、変化の速度はローダミンの方が大きく、その結果、温度が増加するにつれて比率も増加する。５’−エキソヌクレアーゼプローブでは、温度依存性ハイブリダイゼーション効果は明かではない。図１６Ａは、異なる初期テンプレートコピー数についての蛍光比−サイクル数のプロットを図１８の記号一覧に従って示したものである。
これに対し、蛍光シグナルがハイブリダイゼーションのみに依存する場合、蛍光比−温度プロットは、図１７にプロットされたように、２温度サイクリングの間、明らかなヒステリシスを伴った、異なったパターンを示す。隣接するハイブリダイゼーションプローブは存在し、３’をフルオレセインで標識された上流プローブと、５’をＣｙ５TMで標識された下流プローブである。プローブは１塩基ギャップによって分離される。アニーリング／伸長相の間、プローブは蓄積してゆく生成物にハイブリダイズし、フルオレセインに対するＣｙ５の蛍光比は増加する。生成物の変性温度まで加熱する間、プローブは６５℃から７５℃の間で解離し、蛍光比がバックグラウンドレベルまで戻る。ハイブリダイゼーションの間の蛍光比の変化は、共鳴エネルギー転移からのＣｙ５の蛍光の増加に大きく拠るものである。
前述の議論から、ＤＮＡ増幅の間の蛍光モニタリングは極めて強力な解析技術であることが理解されよう。リアルタイムモニタリングを提供する、生産的でコスト効率のよい装置を用いることにより、存在する初期テンプレートコピーの数に依存して、配列特異的な検出と定量化を５分から２０分の間に達成することができる。エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような二本鎖特異的色素を、増幅の総括的なインジケーターとして用いることができる。ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素は、フルオレセインに近い励起最大を持ち、しばしばエチジウムブロマイドの可視励起よりもＤＮＡの強力なシグナルを提供するため、エチジウムブロマイドよりも多くの応用に於いて好まれる。二本鎖色素は増幅プライマー固有の特異性に依存している。当業者であれば分かるように、高いサイクル数での非特異的増幅は、約１００個の初期テンプレートコピーに検出感度を制限するが（図１４を参照）、一方で本発明は、この性能をさらに改善できる増幅特異性の更なる改良を実現することができる。
低コピー数の検出と定量化が必要である場合、シグナル発生にハイブリダイゼーションを必要とする蛍光プローブにより付加的な特異性を提供できる。二重標識エキソヌクレアーゼプローブの切断は、単一のテンプレートコピーをネガティブコントロールから識別することができる（図１５を参照）一つの技術である（Lee, L.G.（リー，Ｌ．Ｇ．）、C.R. Connell（Ｃ．Ｒ．コネル）、及びW.Bloch（Ｗ．ブロック），1993, Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes（蛍光プローブを用いたニック翻訳ＰＣＲによる突然変異識別）、Nucl. Acids. Res. 21:3761-3766、並びにLivak, K.J.（リバク，Ｋ．Ｊ．）、S.J.A. flood（Ｓ．Ｊ．Ａ．フラッド）、J. Marmaro（Ｊ．マーマロ）、W. Giusti（Ｗ．ギュスティ）及びK. Deetz（Ｋ．ディーツ）、1995、Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide aquenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acids hybridization（蛍光色素を両端に有するオリゴヌクレオチドはＰＣＲ産物と核酸ハイブリダイゼーションの検出に有用な消光プローブシステムを提供する），PCR Meth. Appl.  4:357-362を参照）。低コピー数を増幅した場合、最終的な蛍光シグナルが減少するとはいえ（おそらく増幅効率が減少するため）、ゼロと１００コピーの間の定量化は可能であると思われる。エキソヌクレアーゼプローブによって産生されたシグナルは累積的であり、生成物濃度に非直接的に関連するだけである。一方、生成物の量がプラトーに達した後でさえ、蛍光シグナルは増加し続ける。増幅と切断の効率に対してコントロールする適当なスタンダードが、絶対値定量化には必要となるであろう。
５’−エキソヌクレアーゼのデザイン、合成、精製には注意が必要である。ハイブリダイゼーションは必要であるが、十分ではない、エキソヌクレアーゼから得られたシグナルに対する条件；全てのプローブは効率的に切断されない。８を参照。Lee, L.G.（リー，Ｌ．Ｇ．）、C.R. Connell（Ｃ．Ｒ．コネル）、及びW. Bloch（Ｗ．ブロック），1993, Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes（蛍光プローブを用いたニック翻訳ＰＣＲによる突然変異識別）、Nucl. Acids. Res.  21:3761-3766、並びにLivak, K.J.（リバク，Ｋ．Ｊ．）、S.J.A. flood（Ｓ．Ｊ．Ａ．フラッド）、J. Marmaro（Ｊ．マーマロ）、W. Giusti（Ｗ．ギュスティ）及びK. Deetz（Ｋ．ディーツ）、1995、Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide aquenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acids hybridization（蛍光色素を両端に有するオリゴヌクレオチドはＰＣＲ産物と核酸ハイブリダイゼーションの検出に有用な消光プローブシステムを提供する），PCR Meth. Appl.  4:357-362。この両文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。二重標識プローブの合成はローダミン標識のマニュアルによる添加を含み、普通は次に逆相高圧液体クロマトグラフィーを行う。
二重標識プローブの加水分解に依存する代わりに、Morrison（モリソン）によって概要が示された共鳴エネルギー転移を直接、介してハイブリダイゼーションを検出することができる。Morrison, L.E.（モリソン，Ｌ．Ｅ．）、1992、「エネルギー伝達の検出及び蛍光消光」（″Detection of energy transfer and fluorescence quenching″）、P. 311-352、L.J. Kricka（Ｌ．Ｊ．クリッカ）（Ed.）、Nonisotopic DNA Probe Techniques（非同位ＤＮＡプローブ技法）、Academic Press、San Diegoを参照のこと。この文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。フルオレセインとＣｙ５で別々に標識した２つの隣接するプローブを用いると、各増幅サイクルで生成物の蓄積を伴って、Ｃｙ５へのエネルギー転移が増加する。エキソヌクレアーゼプローブとは対照的に、自動合成の間、フルオレセインとＣｙ５の両方に対するアミデテスを直接導入するのに直接利用することが出来るため、プローブの合成は比較的簡単である。従来技術はフルオレセインとＣｙ５を共鳴エネルギー転移対として用いることを開示していない。スペクトルのオーバーラップが小さいとはいえ、Ｃｙ５のモル吸収計数と吸収波長はローダミンに比べて高い。３つの全ての因子（オーバーラップ、吸収性、波長）がエネルギー転移速度を決定するオーバーラップ積分に寄与する。Ｃｙ５はフルオレセイン励起波長に於いて、低い吸収があり、アクセプターの直接励起を減少させる。
ゲル電気泳動法によるＤＮＡ増幅の従来の終点解析は生成物のサイズを同定し、精製度を予測する。しかし、増幅は最初が確率論的で、次に指数関数的であり、最後が停滞的であるため、定量化のためには終点解析の利用は限界がある。本発明によって提供されるサイクル毎のモニタリングは比較的単純な定量化を供給し、閉チューブ蛍光モニタリングは更なる利点があることは当業者であれば分かるであろう。
終点及びサイクル毎の解析とは対照的に、本発明はまた各温度サイクルを通して蛍光をモニターすることができる。すでに議論したように、二本鎖特異的色素を用いた継続的な蛍光モニタリングは温度サイクリングパラメータをコントロールするために用いることができる。ある量の生成物が合成された後、増幅を止めることにより、他のテンプレートが過剰増幅されることを避けることができる。各サイクルの伸長段階は、蛍光が増加している間だけ、継続することが必要とされる。生成物の変性はリアルタイムで確かめることができ、蛍光がベースラインに達するまで温度を上げる。生成物が変性温度に晒される時間を制限することは、特に長い生成物の増幅の場合に有益である。
蛍光色素を用いた連続的なモニタリングを付加的に使用することも本発明の範囲に含まれる。例えば、正確な温度コントロールを行い、二本鎖特異的色素を用いれば、生成物の純度は融解曲線によって見積もることが出来るであろう。迅速温度コントロールを行えば、絶対生成物濃度を再アニーリング動力学（kinetics）によって決定することが出来るだろう。必要なのは、蛍光の能力、温度を迅速に変化させる能力、そして厳密な試料内温度均一性だけである。毛細管試料チューブの容積に対して表面積の比が高いことは、空気撹拌の容易性と共に、他のデザインでは可能ではない速度で試料温度の正確なコントロールを可能にする。例えば、毛細管チューブ内での試料温度対時間プロットは、変性とアニーリング温度に於いて、鋭いスパイクを示すが、これに対し、従来技術で用いられている円錐のプラスチックチューブ内では、全ての試料が平衡に達するのに数秒を必要とする。さらに、エッチングされたシリコンまたはガラスチップでは容積に対する表面積の比を高くすることは可能であるが、報告されているサイクル時間は、毛細管試料チューブを用いた本発明によって達成される時間にまだ近づいておらず、試料に晒されている大きなチップ表面に渡って温度均一性を達成するのは難しい。
本発明によって、これまでほとんど理解されていなかったＤＮＡ増幅の多くの側面が識別できるようになった。例えば、生成物の変性は１秒未満で起こるが、従来技術では変性のために、１０秒から１分を要求している。本発明に従った（図１２、図１３を参照）二本鎖色素を用いたリアルタイム蛍光モニタリングによって生成物融解を観察すると、短い変性時間を用いる方が効果的であることが分かる。もう一つの例として、知られている「プラトー効果」の多くの原因が提唱されてきたが、代替物の間の差異を識別するために利用できるデータはほとんどない。図１３に示すように、生成物の再アニーリングは非常に迅速である。事実、増幅の後半のサイクルの間、生成物の大部分が、プライマーアニーリング温度に達する前の冷却の間に各サイクルで再アニーリングされる。これは、本発明に於いて行なわれる５−１０℃／秒の冷却速度で起こる。生成物の再アニーリングをゆっくり行えば行うだけ、従来技術の温度サイクラーにおける望ましくない効果は一層大きくなる。生成物の再アニーリングは、「プラトー効果」の主要な、そして恐らく唯一の原因であると思われる。
サイクルごとのモニタリングによって定量化を行うための迅速サイクルＰＣの蛍光モニタリング
従来技術においては、通常、ＰＣＲ産物の解析は増幅が完了してから行われていた。しかし、定量的ＰＣＲの場合、このような終点解析方法を用いて正確な結果を得るためにはテンプレート濃度の初期値を正確に見積もることが必要とされる。ＰＣＲ試料を蛍光でモニタすることによる定量的ＰＣＲは、エチジウムブロマイドを用いて出来ることが示されているが、本発明は、ＰＣＲ試料の蛍光モニタリングを、少なくとも各サイクルにおいて行うことによる利点を提供する。蛍光は通常、１サイクルに１回、アニーリング／伸長を組み合わせたフェーズの間に得られる。エチジウムブロマイド蛍光はエチジウムブロマイドが二本鎖ＤＮＡにインターカレートされたときに増強し、生成物濃度の目安となる。各サイクルに１回、二本鎖ＤＮＡ結合色素を有する生成物の量をモニタすることは、初期テンプレート濃度が非常に広範囲にわたっていても解析出来るということであり、これは本発明が達成した重要な進歩である。
本発明の一様相においては、二本鎖ＤＮＡに特異的な色素の使用が好ましい。例えば、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  ＩはＰＣＲ産物の蓄積を追ってゆくのに好ましい感度を有する色素である。図１８に示すように、初期テンプレートコピー数は１０８倍の範囲にわたって定量できる。図１８では、蛍光曲線は初期テンプレート濃度に応じて水平に移行している。図１８のプロットに示すように、初期テンプレート濃度が低い場合、増幅特異性が完全ではないためその感度は限定されている。テンプレートが存在しないとき、例えばプライマー２量体のような望ましくない産物が偶然増幅されてくるからである。このため、平均初期テンプレートコピー数が０、１、１０の間ではほとんど差がみられない。
二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いた低コピー数の定量はいままでなされていなかったが、本発明ではこの種の色素を用いることが出来る。これは、とりわけこの種の色素を用いる場合の簡便さの点で有利である。二本鎖ＤＮＡ結合色素はどのような増幅に際しても使用することが出来、そしてこのような色素を使用する場合、特別な蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドは必要でない。二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて低コピー数の試料を定量するためには優れた増幅特異性が必要とされる。あるいは本発明で提供されるように、非特異的に増幅されたものと目的の産物とを区別する手段が必要とされる。
図１８は、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩ色素を用いてモニタしたＤＮＡ増幅に際しての蛍光−サイクル数のプロットを示す。図１８のプロットは、ヒトβ−グロブリン遺伝子の５３６塩基対フラグメントを使用し、１：１０，０００希釈ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩ存在下で０〜平均１０9のテンプレートコピーへと増幅することによって得られた。精製テンプレートＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、フェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈澱、さらに限外濾過（セントリコン３０（マサチューセッツ州ダンバースのアミコン社より入手可能）により得られ、２６０ｎｍの吸光度測定により定量した。各温度サイクルは２８秒の長さであった（最高９５℃、最低６１℃、７２℃で１５秒、温度間の平均変化率は５．２℃／秒）。すべての試料は同時に増幅され、伸長期の５秒と１０秒目の間で１００ミリ秒の間モニタされた。表示データは各サイクル、すべての試料にわたって更新された。そして４５サイクル、２１分間で完了した。各々の毛細管中の試料のデータは各毛細管試料の最低値、最高値の差（図１８のＹ軸として示す）に対するパーセントとして表わした。
本発明の別の様相に従えば、塩基配列に特異的な蛍光でモニタする方法も提供される。オリゴ核酸プローブに２つの異なった蛍光含有物を含ませることにより、本発明を用いて塩基配列に特異的にＰＣＲ産物を検出することが出来る。図１９Ａ−Ｄに示すように、本発明に属するものとして、当面、２通りのやり方が好ましい。これら２通りの方法には、アクセプターの吸収スペクトルと重複する発光スペクトルをもつドナーが必要である。
図１９Ａ−ＤはＰＣＲの際、配列特異的に蛍光モニタを行うための２つの異なった好ましいアレンジメントを示す。図１９Ａはアクセプター（Ａ）が存在するため、最初から消光されてしまっているドナー（Ｄ）を示す。なお、この消光はこれら２つの物質が１つのオリゴ塩基プローブ上に存在しているために起こる。ポリメラーゼの５’ーエキソヌクレアーゼ活性による加水分解の後、ドナーとアクセプターが分離した場合、ドナーの蛍光が増加する（図１９Ｂ）。図１９Ｃの場合は、ドナーはプローブ上に存在し、アクセプターはプライマーの一つに存在している。これらプローブとプライマー上に存在している色素はハイブリダイゼーションにより互いに接近し、その結果、共鳴しそのエネルギーはアクセプターに転移され、これによりアクセプターの蛍光を増加させる（図１９Ｄ）。
もし、ドナーとアクセプターがともに同じオリゴ核酸上に合成されている場合、これらの色素がお互いに接近しているため、アクセプターの色素はドナーの蛍光を消光してしまう（図１９Ａ）。温度サイクルを行っている間、プローブのあるものは一重鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイゼーションするかもしれない。そして、ポリメラーゼの５’ーエキソヌクレアーゼ活性により加水分解されてしまうかもしれない。この場合、もはやドナーとアクセプターはリンクしていないため、ドナーはアクセプター消光作用から解放され、ドナーの蛍光は増加する。この蛍光シグナルはハイブリダイゼーションにではなく、プローブの加水分解に依存しているため、この種のプローブをここでは“加水分解”プローブと呼ぶこととする。
図１９ＣおよびＤに示す方法では、ドナーとアクセプターが異なったオリゴ核酸上に存在しているため、異なった蛍光様式が可能である。図１９ＣおよびＤではドナーはプローブの３’末端に置かれ、そして一つのプライマーがアクセプターで標識されている。これらは別々のオリゴ核酸上に位置しているため、これらの色素間での相互作用は非常に少ない。温度サイクルを行っている際、プローブは標識されているプライマーの近くにハイブリダイゼーションし、共鳴エネルギートランスファーが起こる。この蛍光シグナルはプローブのハイブリダイゼーションに依存しているため、この種のプローブをここでは“ハイブリダイゼーション”プローブと呼ぶ。
ドナー蛍光が単に消光されるのかアクセプター蛍光を実際に増大させるのかは蛍光物を含んでいる物質の特異性および溶媒の条件による。加水分解プローブでのＰＣＲの場合、ドナー蛍光の増加を通常観察する。一方、ハイブリダイゼーションプローブを用いたモニタの場合はアクセプター蛍光の増加を観察する。
加水分解プローブに関するさらなる情報およびデータを以下に述べる。二本鎖ＤＮＡに結合する色素に較べ、配列に特異的なプローブは、図２０に示すように、初期値のテンプレート数が非常に少なくても定量することが出来る。以下で示される情報から理解され得ると思われるが、１コピーのテンプレートがある場合とテンプレートのない場合とを区別することが出来る。ただ、増幅の効率は初期値のコピー数が１，５００以下で低下する。何サイクルもの後ですら、蛍光シグナルは増加し続けるが、これは加水分解が蓄積してゆくためであり、ＰＣＲ産物濃度に厳密に比例しているわけではない。
なお、図２０に示すものは、２重標識した一つの加水分解プローブでモニタしてＤＮＡ増幅時のサイクル数に対して蛍光比（蛍光／ローダミン）をプロットしたものである。図の細い直線は各々の曲線の対数直線部を示し、ヒトβーアクチン遺伝子の２８０塩基対フラグメントが試料チューブあたり０．１５から１５，０００ヒトゲノムＤＮＡ（平均）コピー数に増幅された。用いられた加水分解プローブ（０．２μＭ）はパーキン・エルマー（Perkin Elmer）（フォスターシティ、カルフォルニア（Foster City, California））より得ることが出来る。各々の温度サイクルは２６秒の長さであった（最大９４℃，６０℃１５秒、温度間の平均変化率：６．２℃／秒）。すべての試料は同時に増幅され、アニーリング／伸長時期の５秒と１０秒目の間で１００ミリ秒の間モニタされた。表示データは各サイクル、すべての試料にわたって更新された。そして４５サイクル、２０分間内で完了した。
ハイブリダイゼーションプローブに関するさらなる情報およびデータを以下に述べる。加水分解プローブとは異なり、ハイブリダイゼーションプローブからのシグナルは蓄積性を持たず、各アニーリング時毎に新たにつくられる。ハイブリダイゼーションは疑似一次反応であるため（ヤングＢ．及びアンダーソンＭ．著「液中ハイブリダイゼーションの定量的解析：実際的アプローチ」参照。（ヘイメスＢ．及びヒギンズＳ．編「核酸ハイブリダイゼーション」（ワシントンＤ．Ｃ．ＩＲＬプレス）（１９８５）ｐ４７−７１）（Young B. and Anderson M.,（1985）, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames B., Higgins S., eds., pp. 47-71, Washington D.C. IRL Press）、蛍光は生成物濃度の直接の目安となる。プローブの濃度は生成物の濃度よりもはるかに高濃度であるため、プローブにハイブリダイゼーションする産物の割合は生成物の濃度とは独立している。
図２１Ａ−Ｄでは、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素、加水分解プローブ、そしてハイブリダイゼーションプローブによる蛍光シグナルが直接に比較されている。いずれののプローブもサイクル２０辺りで検出できる蛍光を生じ、ほぼ同じ感度をもっている。増幅をさらに進めた場合、加水分解プローブではシグナルは増加し続け、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素では同じレベルとなり、ハイブリダイゼーションプローブでは少し減少する。ハイブリダイゼーションプローブの場合、３５サイクル後、シグナル減少が起きるが、これはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性のためにプローブの加水分解が起きているためかもしれない。加水分解プローブの蛍光比（Ｙ軸値）はハイブリダイゼーションプローブのものに較べはるかに大きく増大するが（図２１Ｂ及び２１Ｃ）、蛍光のばらつきの相関係数をみた場合、加水分解プローブの方がずっと大きい（図２１Ｄ）。即ち、ハイブリダイゼーションプローブにより生じる蛍光は、その絶対的レベルははるかに低いにもかかわらず、加水分解プローブの場合よりも、より正確である。
図２１Ａ−ＤはＰＣＲに際しての３種類の蛍光モニタ技術の比較を示す。各々の蛍光プローブは二本鎖ＤＮＡに結合する色素ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（図２１Ａ）、蛍光／ローダミン２重標識加水分解プローブ（図２１Ｂ）、そしてＣｙ−５標識されたプライマーとカップルした蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブである。すべての増幅は１５，０００テンプレートコピー（５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ／１０μｌ）をそれぞれ有する１０サンプルを使って行われた。それぞれの温度サイクルは３１秒の長さであった（最高温度９４℃、６０℃で２０秒、温度平均変化率は６．２℃／秒）。蛍光はアニーリング／伸長段階の１５秒と２０秒目の間で得られた。平均＋／−標準偏差は各点でプロットされている。プライマーＫＭ２９とＰＣ０４を用いて２０５塩基対のヒトβーグロビンフラグメントを増幅するに際し、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉは１：１０，０００希釈で用いられた。加水分解プローブ及びその使用条件は図２０に示すものを用いた。ハイブリダイゼーションプローブ  ＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧ−フルオレセイン（配列番号５）（フルオレセインＣＰＧ（バージニア州スターリングのグレン・リサーチより入手出来る））をＫＭ２９及びＣｙ５TM−標識プライマー  ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＮＣＡＣＣ（配列番号６）と共に使用した。なお、Ｃｙ５TM−標識プライマーのＮはＣｙ５TM（アメルシャム（イリノイ州アーリントン・ハイツ）より入手可能な単量体反応性）で標識されたアミノ基改変されたＣ６ｄＴ（グレン・リサーチ）である。これら３種類の蛍光モニタ技術が図２１Ｄで精細に比較されている。データはベースライン（サイクル１１〜１５を平均して得られた）より上の蛍光比のばらつき係数（標準偏差／平均）としてプロットされた。
サイクル毎のモニタによる定量化のアルゴリズムを次に議論する。初期値のテンプレート濃度に関する定量的情報は図１８や図２０にプロットされている蛍光曲線のセットに含まれているが、この定量的情報をどのようにして引き出すのが一番いいのか、当業者も容易には理解しないだろう。図２２には、５０ｎｇゲノムＤＮＡの増幅と比較して、精製された１０4と１０5コピーのテンプレートの増幅曲線（図１８から得た）が示されている。これらのデータから、当業者に言えることは、ゲノムＤＮＡは１０4コピーよりも少し多い標的としてのテンプレートをもつが、どのくらい多くのコピー数をもっているかは言えないということである。しかし、本発明に従えば、そのコピー数を決定することが出来る。
図２２に、ＰＣＲ蛍光曲線の定量化のための内挿法を比較するプロットを示す。この図には、未知の蛍光とある任意のサイクルでの標準蛍光との比較をおこなう終点内挿法が示してあり、また、各々の曲線が任意の蛍光値を超えている場合のサイクル数決定を行う閾値内挿法も示してある。
本発明に従い、データを内挿するための２つの好ましい方法がここに開示される。一つの好ましい方法は、すべての関連しているデータ値を使用するためにすべての曲線を内挿するというものである。この曲線合致によるアプローチは最も正確な結果をもたらす。別の好ましい方法としては、一つの垂直もしくは水平ラインに沿って未知のものを内挿する方法である。単一垂直内挿法の場合は現行の終末点解析に似ている。あるサイクル数で、未知の蛍光が既知の値の間に内挿される。下記の表１にサイクル２０〜２４の垂直内挿法により得た結果を示す。水平ラインに沿っての内挿の場合には、蛍光閾値の確立を必要とする。閾値１０、２０、３０そして４０％からの内挿もまた表１に示す。
0004278712.tif 000002
後でわかるように、終点内挿もしくは閾値内挿は存在しているデータをそれほど使用していず、１ヵ所に異常なデータがある場合は、大きな影響をうける。たとえば、サイクル２０での終点内挿がそれである。本発明は、データにうまく合致した曲線を内挿するという一改良法を提供する。例えば、各曲線の対数直線部域内のデータに合致している指数関数は次式に従う：Ｆ＝ＡＮ（１＋Ｅ）n。ここで、Ｆは蛍光シグナル、Ａは一つの蛍光スケール因子、Ｎは初期値のコピー数であり、Ｅは増幅効率、そしてｎはサイクルの数である。括弧でくくった未知のＮ値のために、まずＡとＥを最初に決定することが出来、この後、ベストとされる未知のＮ値を決定することができる。このアプローチを使った場合、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ中の遺伝子コピー数は１．７×１０4となり、これは表１の中間値に近く、一般に容認されている値１．５×１０4に近い。なお、上記の指数関数よりも他の種類の曲線の適用の方がより適しているかもしれない。というのは指数関数適用は対数直線部区域にあるサイクル（４５サイクルのうち７サイクル）にのみ依存する必要があるが、この部分は蛍光の精密性が良くない部分に相当するからである（図２１Ｄ）。
さらに次に、本発明に従えばシグモイド曲線を使用することが出来る。この曲線は対数期、対数直線期、そしてプラトー期を記述するパラメータを包含しており、従って、存在しているすべてのデータを使用することが出来る。その適用は、あらかじめ予測されているデータの正確性を反映して判断される。また、曲線の形状に差異があるため、異なった蛍光プローブには異なったパラメータが必要である（図２１Ａ−Ｄ）。
連続モニタリングという本発明の特徴、即ち各ＰＣＲサイクル内で何回ものモニタを行うことに関して次に議論する。一般に、ＰＣＲの際の蛍光モニタを各々のサイクルに１回、ある一定温度で行うことが出来る。一方、これに対して、本発明はＰＣＲサイクルの間を通じて連続的にモニタを行うことが出来るという重要な利点を有する。蛍光変化は温度の関数であるため、温度は重要である。本発明に従えば、温度変化の際の蛍光モニタにより、非常に多くの情報を得ることが出来る。例えば、もし温度サイクルの間を通じて蛍光を連続的に得ることが出来るならば、加水分解プローブは温度に対する蛍光比の線形的変化を示し、そしてプローブが加水分解されればされるほど、蛍光も並行的増加を示す（図２３Ａ）。これに比し、ハイブリダイゼーションプローブから得た蛍光比は温度とともに急激に変わる（図２３Ｂ）。低い温度でのハイブリダイゼーション時の蛍光比は増加し、この後、ハイブリダイゼーションプローブとテンプレートが融解したとき、蛍光比はベースラインレベルへと減少して行く。
図２４において、蛍光と温度との関係をＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いてプロットすることにより、産物のＤＮＡ鎖状態の温度依存が明らかにされている。増幅が進行するに従い、アニーリングと変性温度の間を結ぶ温度サイクルのループの立ち上がりがどんどん大きくなって行く。試料が熱せられるに従い、変性が生じてくるまで蛍光は増加する。そして、また、試料が冷えるに従い、蛍光は増強して行く。これは産物が再アニーリングされてきたことを意味している。伸長の際の温度が一定の時、増強する蛍光は増加してくるＤＮＡ合成に相関している。図２４はＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いたＤＮＡ増幅時の蛍光対温度のプロットを示す。ヒトβーグロビン遺伝子の５３６塩基対フラグメントは１０6コピーの精製されたテンプレートと１：３０、０００希釈のＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いて増幅された。ここで用いられた他の条件は図１８に関連して述べられている条件と本質的に同じである。図ではサイクル１５〜２５が示されている。また、蛍光対温度データは蛍光に対する温度効果を取り除くために補正されている。
産物の変性及び産物の再アニーリングをモニタできるという本発明は、ＤＮＡ定量のためのさらにいくつかの方法を導く。ＤＮＡ定量のための本発明のこれらの方法は各々個々の温度サイクル内での蛍光モニタを必要とし、サイクル毎に１回だけしか蛍光が利用できないときには使用出来ない。例えば、ＰＣＲ産物は産物のＧＣ／ＡＴ比及びその長さに依存した特徴的な融解曲線をもっているが（図２５参照）、融解温度を予見するための経験的アルゴリズムを使用した場合、色々なＰＣＲ産物は５０℃台の領域で有意に融解するはずである。非特異的産物は目的のＰＣＲ産物とは異なって融解するであろうから、二本鎖ＤＮＡ蛍光を特異的なものと非特異的なものに分離することができる。本発明の方法によって得たこれらの性質を利用することにより、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉやエチジウムブロマイド等の一般的な二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて非常に少ないコピー数を定量することが出来る。図２５は３つの精製したＰＣＲ産物の融解曲線を示す。これらＰＣＲ産物は精製し、図１８に関して説明されているようにして定量した。１：１０，０００希釈のＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、そして３ｍＭ  ＭｇＣｌ2の１０μｌ液に存在している５０ｎｇＤＮＡに加えた。温度は０．２℃／秒で増加し、蛍光を測定し、温度に対してプロットした。
競合的定量のための融解曲線使用に関する本発明の特徴を以下に述べる。本発明に従う、さらなる使用法は融解曲線を用いた競合的定量ＰＣＲに関するものである。本発明のこれらの方法は本来のテンプレートとともに同時増幅される一つの競合的テンプレートを必要とする。この場合、対照テンプレートは本来のアンプリコン（単位複製配列）とは融解温度が異なるようにデザインされる。３℃の融解温度シフトは産物のＧＣパーセントを７〜８％変えることにより達成することが出来る（ウエトマーＪ．著（１９９５）「核酸ハイブリッド、形成そして構造」（マイヤーズＲ．編「分子生物学とバイオテクノロジー：総合デスクレファレンス」（ニューヨーク：ＶＣＨ））６０５〜６０８ページ（Wetmur, J.,（1995）, Nucleic acid hybrids, formation and structures of, In: Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., ed. pp. 605-608, New York: VCH）；これを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。３℃の融解温度シフトは産物の融解曲線に関して本来のものと競合産物とを分離するに十分である（図２５参照）。増幅の間に得られるこれらの融解曲線は異なった融解ピークを示すようになる（ヒレンＷ．、グッドマンＴ．、ベナイトＡ．、ワーテルＲ．そしてウエルズＲ．著（１９８１）「大腸菌ラクトース遺伝制御区域を含み、重なりあった領域をもつ小さい制限酵素消化フラグメントに関する実験的そして理論的高分解能変性研究」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，２７６１−２７６６（Hillen W., Goodman T., Benight A., Wartell R. and Wells R.,（1981）, High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region, J. Biol. Chem. 256, 2761-2766）；この文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。これらの融解曲線は、競合産物とテンプレートとの相対的な量を決定するために用いられる。なおこの方法を用いることにより、温度サイクルを行った後で試料解析をする必要はないはずである。
本発明に従って絶対量の定量を行うためのハイブリダイゼーションの動力学（キネティクス）が次に議論される。本発明は、変性の後、産物間の再アニーリングをモニタすることを可能にし、直接的、絶対的ＤＮＡ定量の方法をもたらす。もし試料温度が変性温度から急に低下し、ある低い温度に保たれている場合、産物の再アニーリング速度は２次反応キネティクスに従うであろう（ヤングＢ．とアンダーソンＭ．著（１９８５）「液体ハイブリダイゼーションの定量的解析」（ヘイメスＢ．、ヒギンズＳ．編「核酸ハイブリダイゼーション：実際的アプローチ」４７〜７１ページ、ＩＲＬプレス、ワシントンＤ．Ｃ．（Young B. and Anderson M.,（1985）, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames B., Higgins S., eds., pp. 47-71, Washington D.C. IRL Press）；この文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。異なった濃度のＤＮＡをテストするとき、再アニーリング曲線の形状はそのＤＮＡ濃度に特徴的である（図２６参照）。図２６は異なった濃度のＰＣＲ産物の再アニーリング曲線を示す。異なった量の精製された５３６塩基対ＤＮＡフラグメント（図１８参照）を１：３０，０００希釈のＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉが５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，３ｍＭ  ＭｇＣｌ2の５μｌ溶液に混合した。試料を９４℃で変性し、８５℃に急冷した。この場合、任意のＰＣＲ産物と温度に対して、２次反応速度定数を測定することが出来る。ひとたびその速度定数が分かれば、未知のＤＮＡ濃度は再アニーリング実験データから決定することが出来る。ある速度定数の初期値決定法を図２７に示す。冷却する場合、冷却は瞬間的ではなく、ある一定温度に達するまでに、ある程度の再アニーリングが起きるが、本発明の装置による急冷は速度定数やＤＮＡ濃度決定に使用出来るデータ量を最大にする。図２７は２次反応再アニーリング速度定数の決定の仕方を示す。その曲線は、浮動パラメータＦmax、Ｆmin、ｔoそしてｋを用いた非線形最小２乗回帰にうまく合致した。決定した定数（ｋ）を用いて、未知試料のＤＮＡ濃度を決定することができる。
本発明のこの方法のためには純粋なＰＣＲ産物が必要であるが、その純度は温度サイクルを行うことによって得る融解曲線から確めることが出来る。このような本発明の再アニーリングによる定量化は毛細管試料チューブのシグナルのばらつきとは無関係であり、独立したものであるという長所を有する。
迅速サイクルＰＣＲの連続モニタリング
以下に行う議論から、今まで技術的に無かったいくつかの長所を本発明がなしとげたことが理解されるであろう。例えば、本発明はＰＣＲの際の産物の純度のモニタリング、テンプレートの定量、そして突然変異を検出するための単一色蛍光方法を提供している。ＰＣＲを行っている間、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の存在を蛍光色素を用いて追跡することが出来る。各サイクル内で、二本鎖ＤＮＡが変性されるとき蛍光は減少し、産物が再アニーリングされる時そしてプライマーにより伸長される時、蛍光は増加する。これらの色素は塩基配列に特異的ではないが、産物の純度はＤＮＡ融解曲線の形状の解析により知ることが出来る。純粋なＰＣＲ産物はシャープな融解転移を示すが、一方、不純物を含む試料は幅の広い温度範囲にわたって融解してゆく。
競合的定量ＰＣＲの場合は、本来の増幅ユニットであるアンプリコンとそれに競合する増幅ユニットとの間に差があることが必要である。これらはそれぞれ異なった融解温度を示すため、融解曲線をこれらの産物を区別するために使用することが出来る。そして、本来のアンプリコンとは異なった融解温度をもつ人工的に作られた対照用アンプリコンを用いて競合的増幅を行うことにより初期値のテンプレートのコピー数が定量出来るであろう。
また、ＰＣＲの際、融解曲線を使用して突然変異を検出することが出来る。完全な相補的同型接合体産物を形成するよりもより低い温度で融解した異型接合体ＤＮＡを増幅する際に異型接合体ＤＮＡが形成される。この時出来た融解曲線を解析することにより、欠損や突然変異の存在を同定出来るであろう。
二本鎖ＤＮＡ形成を連続的にモニタすることにより、ＤＮＡ絶対量の直接的定量を行うことが出来る。変性されたＤＮＡが急冷され、ある一定の再アニーリング温度に保たれている場合、その再アニーリング速度によってＤＮＡの絶対量を決定することが出来る。
本発明は、また、ＰＣＲの際に特異な配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ（加水分解プローブではなく）に依存して生じる２種色の蛍光法を提供する。アニーリングキネティクスとハイブリダイゼーションプローブの融解は、２つの蛍光体の関係がエクソヌクレアーゼ加水分解に依存しているプローブでは得られない情報を提供する。２種のテンプレート間を区別できるようなプローブ融解温度を使用して競合的増幅を行うことにより初期値テンプレートコピー数を定量することができるであろう。また、点突然変異もプローブ融解温度のシフトによって検出できるであろう。そして産物の絶対濃度はプローブアニーリングキネティクスの解析により決定出来ることが証明されている。
さらに、本発明は商業的応用および迅速サイクル増幅の際の連続的蛍光モニタを行うための安価な機器を提供する。本発明の熱サイクラーは１０〜２０分で増幅することが出来、１つ、２つ、もしくは３つの蛍光体を検出する光学的モジュールを連結することが出来る。本発明の好ましい付加装置は２４試料を１〜１０回／秒でモニタリングを実施することが出来る。本発明によれば、混合プラスチック／毛細管容器９６ウエル様式のものに試料を調整し、次いでこれらを温度サイクルおよび解析のための装置（図１１参照）に移動する。好ましい付属装置のひとつとして、ディスプレイ画面上で連続的に解析し表示出来るユーザーフレンドリーなグラフィックインターフェイスがある。
本発明は、また、リアルタイムでの増幅の制御及び至適化のための蛍光フィードバックを行う。蛍光は温度サイクルをコントロールするために使用されている。二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する色素を連続的にモニタすることにより、各サイクルで蛍光の増加が止まったときに、伸長を停止することが出来る。変性条件に関しては産物が完全に融解するまでのみ温度を増加し続けるというように自動的に制御されている。プライマーのアニーリングはＣｙ５修飾されたオリゴ核酸への共鳴エネルギートランスファーを見ることによりモニタされる。そして、温度サイクルは、ある量の産物が出来たときに自動的に停止する。
迅速温度サイクルの長所は、現在、研究界で認められている。最短アニーリング時間及び最短変性時間での迅速温度サイクルは定量化ＰＣＲをさらに改良し、より明確に、複対立遺伝子に特異的な増幅をおこなうからである。サイクル塩基配列決定の場合、迅速サイクルを行うことにより塩基配列の不明点を減少させ、そして反復している２つの塩基配列の増幅時に生じる“影のバンド”の出現を最小にする。また、３５ｋｂまでの長いＤＮＡのＰＣＲを行う場合、高い変性温度に試料を可能な限り短い時間さらすことにより、その収率を増加させることが出来る。
以下で述べることから、効率のいい、経済的な迅速サイクルＰＣＲは工業的に大きな進歩であるということが分かるであろう。これまでの技術的装置は高価でかつ扱いにくいものであった。例えば、ある装置、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６００は２つの温度設定プロフィル（６０℃、９０℃）で３０サイクルを１時間少し超える時間でＰＣＲすることが出来る。しかしこの装置は高価でかつ試料の間での温度の均一性に問題があり、さらに試料内で対流が起こるという問題がある（イッターＣ．Ｔ．、Ｇ．Ｂ．リードそしてＫ．Ｍ．リリエ著「迅速サイクルＤＮＡ増幅」（Ｋ．ムリス，Ｆ．フェーレ及びＲ．ギブス編「ポリメラーゼ遺伝子増幅法」（スプリンガーフェルラーク、ディアフィールド・ビーチ、フロリダ）１７４−１８１ページ、１９９４（Wittwer, C.T., G.B., Reed and K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K. Mullis, F. Ferre, and R. Gibbs（Eds.）, The Polymerase Chain Reaction, Springer-Verlag, Deerfield Beach, Florida, pp.174-181, 1994）；ハッフＬ．、Ｊ．Ｇ．アトウッド、Ｊ．ディセサーレ、Ｅ．カッツエ、Ｅ．ピコッザ、Ｊ．Ｆ．ウイリアムズ及びＴ．ウッデンバーグ著「ポリメラーゼ遺伝子増幅法の自動化のための高稼働システム」BioTechniques10:102-112,1991（Haff L., J.G. Atwood, J. DiCesare, E. Katz, E. Picozza, J.F. Williams, T. Woundenberg, A high-performance system for automation of the polymerase chain reaction, BioTechniques 10:102-112, 1991）；これら２文献を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。別の例としてはコダックにより開発されたものがある。これは熱で封じられたプラスチックの“ＰＣＲ袋”を使用した、ＰＣＲ増幅および検出のための閉鎖容器システムである。このコダックの装置では、試料はサンドイッチのように加熱用／冷却用の２つのプレートに挟まれて温度サイクルされる。２つの温度プロフィル（６２℃、９４℃）を３０サイクル行う時間は約３０分である。このように、これら２つの装置は本質的に重大な障害及び不利な点をもっている。
本発明によれば、ＰＣＲを一つの動力学パラダイムとしてとらえるのは妥当である。ＰＣＲを３つの異なった温度で起きる３つの反応（変性、アニーリング、伸長）としてとらえるのではなく、ＰＣＲを一つの動力学パラダイムとする方がより理にかなっているからである（図２８）。一動力学パラダイムによれば、温度対時間曲線は重複して起こる反応の間の連続的遷移から構成されている。ある完全な解析を行うためには、すべての温度にわたってのすべての関連している速度定数に関する知識が必要であろう。そして、もしすべての反応に関しての速度定数が分かるならば、“ＰＣＲの物理化学的な記述”を展開することができるであろう。これらの速度を決定するには精密な試料温度の制御が必要とされ、そしてこれは温度サイクルを行っている際の反応のモニタを行うことにより補佐されるであろう。
本発明はまた、一つの試料を連続的にモニタすることにより生じる長所を提供する。定量的ＰＣＲのために各サイクルで蛍光モニタできることは有益であり、これはエチジウムブロマイドを用いることにより達成できる。１サイクルに１回のモニタの場合、蛍光は１サイクル１回、アニーリング／伸長の併合期の間に得られ、相対的な産物濃度を知ることが出来る。
本発明に従えば、時間、温度、そして二本鎖ＤＮＡ蛍光は２００ｍｓｅｃごとに得ることが出来、そして産物変性及びアニーリングに関する精細な事柄を迅速な温度サイクルを行っている間に観察することが出来る。これらの情報は融解曲線による産物の同定を可能にし、また、相対的、絶対的産物濃度、突然変異の検出、温度制御のための迅速なフィードバックに関する手段を提供する。連続モニタリングとは別に、塩基配列に特異的なプローブの融解が共鳴エネルギートランスファーにより決定される。そして、このプローブの融解は産物の定量や点突然変異の検出にも利用できる特徴的な温度で起きるのである。
本発明の定量的ＰＣＲへの応用に関して次に議論する。今までの定量的ＰＣＲの方法は非常な労力を必要とし、かつ、高価であった。これらのほとんどの方法は終点解析法を使用しており、初期値の優れた予測をするためには正確な結果を必要としている。色素を用いて二本鎖ＤＮＡの蛍光を１サイクルに１回モニタすることは、非常に広範囲にわたる初期値テンプレート濃度を解析することが出来るようになるという点で重要な進歩である。しかし、本発明による温度サイクル中の連続的モニタは、産物純度の検査、競合プローブを用いての同時的な相対濃度の定量化、そして産物の絶対濃度の決定を可能にする。これらすべての情報は、一般的な二本鎖ＤＮＡ指示剤を使い、１つの毛細管試料チューブを１０分から２０分の温度サイクルを行うことにより得ることが出来る。塩基配列内部の特異性に基づいた定量化もまた２色解析と共鳴エネルギートランスファーを使用することにより可能である。
本発明の突然変異検出のための応用を次に議論する。遺伝子内に存在している突然変異をスクリーニングすることは難しい仕事である。今までの方法（変性用勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、１重鎖構造多形性、塩基配列決定）は、ＰＣＲによる増幅の後、電気泳動を行い、ついで検出を行うことを必要としている。二本鎖ＤＮＡに結合する色素を用いての融解曲線はＰＣＲの際にヘテロ二本鎖を形成する異型接合体突然変異を同定することが出来る。この解析は増幅している間に行われ、余分の試料操作や装置を必要としない。例えば、異型接合体を検出することは乳癌に関する遺伝的感受性を診断する際に重要である（シャッツック エイデンスＤ．、Ｍ．マックルアー、Ｊ．シマード、Ｆ．ラブリエ、Ｓ．ナロド、Ｆ．コーチ、Ｄ．ホスキンス、Ｂ．ウエバー、Ｌ．カスティーラ、Ｍ．エルドス、Ｌ．ブロディ、Ｌ．フリードマン、Ｅ．オスターメイヤー、Ｃ．スザボ、Ｍ．Ｃ．キング、Ｓ．ジャンワー、Ｋ．オフイット、Ｌ．ノートン、Ｔ．ゲレウスキー、Ｍ．ルービン、Ｍ．オズボーン、Ｄ．ブラック、Ｍ．ボイド、Ｓ．スティール、Ｓ．イングレス、Ｒ．ヘイル、Ａ．リンドブロム、Ｈ．オルソン、Ａ．ボーグ、Ｄ．Ｔ．ビショップ、Ｅ．ソロモン、Ｐ．ラディス、Ｇ．スパッティ、Ｓ．ゲイサー、Ｂ．ポンダー、Ｗ．ワレン、Ｍ．ストラットン、Ｑ．リウ、Ｆ．フジムラ、Ｃ．ルイス、Ｍ．Ｈ．スコルニック、Ｄ．Ｅ．ゴールドガー著「ＢＲＣＡ１乳癌、子宮癌感受性遺伝子における８０種の突然変異に関する共同調査：前駆症状テスト及びスクリーニングの意味」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７３：５３５−５４１、１９９５（Shattuck-Eidens D., M. McClure, J, Simard, F. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L. Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, M.C. King, S. Jhanwar, K. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne, D. Black, M. Boyd, S. Steel, S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, D.T. Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, M.H. Skolnick, D.E. Goldgar, A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene, Implications for presymptomatic testing and screening, J. Amer. Med. Assoc. 273:535-541, 1995））。臨床テストとしては、ＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２遺伝子（＞１０、０００塩基）の塩基配列決定による突然変異検出は実用的ではないかもしれない。一方、本発明によるヘテロ二本鎖スクリーニング方法を使用することによりテストに要する費用を非常に低くすることが出来る。なお、ＰＣＲの際に共鳴エネルギートランスファーをさせることにより、特異な突然変異もまた、塩基配列に特異なプローブを用いて検出することが出来る。
本発明に従うプローブの巧みな使用法に関して次に議論する。ＰＣＲの連続モニタリングを行うための最善のプローブとはそれらが特異的であり、安価であるということであろう。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合する色素はどのような増幅の場合にも用いることが出来、安価である。例えば、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉは通常、１０μｌの反応あたり０．０１セントである。これを用いて産物の特異性を融解曲線の解析によって得ることが出来る。しかし、塩基配列特異性が必要なときは、蛍光オリゴ核酸プローブがそれぞれの配列のために合成されなければならない。パーキン  エルマがすすめている“ＴａｑＭａｎ”プローブは２つの蛍光物質を各プローブへ取り込ませる。プローブがポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により加水分解される時、蛍光が発生する。しかし、これらのプローブは合成が難しく、且つ買うには高価である。その製造会社からのそれの現在のコストは１つのカスタムプローブ０．１μモルあたり１，２００ドルである。なお、１つのターゲット試料の競合的定量を行うためには２つのプローブが必要である。これに対して、加水分解に依存しない蛍光ハイブリダイゼーションプローブをデザインすることが出来る。これらのハイブリダイゼーションプローブはプローブあたり１つの蛍光体のみを必要としており、かつ、その合成はずっと簡単である。これらの蛍光はハイブリダイゼーションにより生じるため（加水分解によってではなく）、プローブの蛍光の温度依存を突然変異の検出や定量化に用いることが出来る。
今まで用いられてきた検出のための計測操作は多くの欠点を呈してきた。過去、機器の限界のために加水分解プローブの使用は終点検出の場合にのみ可能であったが、ここで言及されている本発明のシステムにより、速く、正確な温度サイクルを行うことが出来る。また、本発明のシステムにより提供される連続的蛍光モニタを行うことによりハイブリダイゼーションの温度依存を追って行くことが出来る。温度サイクルを行っている際、ハイブリダイゼーションを追うことによりプローブの数及び／又はスペクトルの色の数を最少にすることが出来る。最もコスト効率の良い本発明の統合を提供するために、試料照明にはレーザーの代わりに強力な光放射ダイオードが用いられ、そして検出には光ダイオードが用いられている。熱密封を必要としない９６ウエル様式のガラス毛細管試料チューブ、もしくは別のものとして複合ガラス／プラスチック試料チューブに試料を加える。このように、本発明はコスト効率のよい方法でリアルタイムでの蛍光解析を提供する。温度サイクルを行っている際のリアルタイムでの蛍光制御は増幅の質を向上させる。例えば、もし試料温度が変性が起きるまでの間でのみ増加するならば、試料が高温にさらされることを最小限におさえることが出来る。これにより産物及び酵素の分解が抑えられ、収率が増大する。そして高い融解温度をもつ産物の増幅を限定することにより特異性を増加させる。
図２９は、対数直線期区域内で１０倍の動力学的範囲にわたってあるルーチン増幅のモニタを十分に行うことが出来ることを示す。さらに、ただ単なるルーチン増幅（ゲノムＤＮＡ１５，０００コピー／試料チューブ）だけではなく、より少量の試料を使用しての難しい増幅の場合にもモニタを行うことが出来るようになった。
図２９に示すように、蛍光比はサイクル数ならびに初期テンプレート濃度に比例して増加する。各曲線の対数直線部分（細い直線）は４サイクル（ＤＮＡ濃度が約２４または１６倍の範囲）にまたがる。繰り返し（重複）試料は極めて似た経過をたどる。図２９は単一コピーのテンプレートは０コピーのテンプレートと区別できることを示す（おそらくは、０．１５平均コピー試料の１つは単一コピーに含まれるからであろう）。高い初期テンプレート濃度（１５，０００および１，５００／試料チューブ）では増幅効率は高くかつ一定になるが、低い初期濃度の試料の場合には効率は低下する。すべての試料は同時に増幅し、サイクルごとのデータの定量的ディスプレイに基づき解析した。４５サイクルの増幅は２０分以下という有利さで完了できた。
次に図３０を参照すると、これは単一試料の連続モニタリングができるようにした本発明の実施態様を示すものである。連続モニタリングを実施する場合、単一試料を温度制御した空気流と直線的な光経路の交点に置いた。毛細管の片側を発光ダイオードで照射し、反対側をフォトダイオードで観察した。空気を常に試料上に強制的に流し、温度は上流部の加熱コイルにより制御した。試料と容器の形状および配置はｄｓＤＮＡ結合色素であるＳＹＢＲ▲Ｒ▼Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色したヒトゲノムＤＮＡを使用して検討した。
図３１は、ＰＣＲ試料を連続モニタリングするための本発明に基づく別の実施態様の光学的配置を示す。励起および発光収率の両方を上げるために、毛細管試料管の全長にわたる全内部反射（“光パイピング”）を採用した。光学経路は、励起および放出光が同じ光学経路を通る直線形からエピ蛍光、つまり励起と放射光の両方が同一の光経路を通るもの、に変更した。光パイピングを最大にするために、光軸は毛細管の全長に平行（近軸）とし、毛細管先端を焦点とした。試料の反射率が１．３３であると仮定すると、放出光の１２．３％が先端部に導かれることになる。図３２は、光パイピングの効果は毛細管の側部（白抜き丸印）よりもむしろ先端部（閉じた菱形）で見ることにより、信号強度が１０倍増加することを示す図である。図３２に示すように、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩで染色したｄｓＤＮＡを異なる長さ迄充満した異なるサイズの２本の毛細管試料チューブを使用するのが好ましい。チューブに添加する試料量が多いほど観察される蛍光は増加するが、蛍光効率は低下する。
再び図１１を参照すると、蛍光検出器３００を備えた迅速温度サイクラーを連続モニタリングに使用することができるが、これについて以下さらに説明する。
蛍光検出器３００を備えた迅速温度サイクラーは、図１１に示す機能要素の代わりに同様に機能する発光ダイオード（ＬＥＤ）およびフォトダイオードを使用して有利に組み立てることができる。このようにして、蛍光励起源３２８は発光ダイオードにより機能させることができる。光増幅チューブ３６２Ａ＆Ｂもまた、フォトダイオードに置き換えることができる。この技法の感度はバックグラウンド蛍光により限定されるが、その大半は検出システムによるものではなく、プローブに起因するものである。安定性が絶対感度よりもはるかに重要なことである。
本発明はまた、毛細管試料チューブを使用した場合の偏光効果により起こる諸問題も解決する。試料の蛍光偏光を観察するためには、偏光された光をランダム化しない光学システムが必要である。毛細管先端部からのエピ蛍光モニタリングは複反射のためにすべての偏光をランダム化してしまう。丸いガラス毛細管を側部から偏光された光で照射した場合、図３３に示すように観察される偏光は励起ビームに対してチューブをいかに正確に配置するかで変わる。
本発明に基づいて、蛍光偏光プローブを使用することができる。偏光プローブは異なる長さのアミノリンカーにより連結した５’−フルオレセインの３０量体として合成された。ＰＣＲ中にポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、増幅中の偏光を減らすことが予想された。完全なプローブは約９０ミリポーラリゼーション単位（ｍＰ）を有したが、ホスホジエステラーゼＩにより広範囲に加水分解すると３５ｍＰに低下した。図３４は、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した単一複製遺伝子の増幅中に０．２μＭ含まれたプローブを使用して得られた結果を示す。偏光は２０から３０サイクルの間で減少し、少なくとも５０サイクルまで減少しつづけた。垂直蛍光に対する平行蛍光の比として表わされる減少は約１１％であった。リンカーの長さ、アミノリンカーの種類および５’−非相補性テールの有無は、ＰＣＲ中に観察される変化を著しく変えることはなかった。溶液の粘度を増加させるためにスクロースを添加すると完全プローブおよび加水分解プローブ両方の偏光を増加させたが、増幅後に発生する信号差は変化させなかった。
エキソヌクレアーゼ加水分解では偏光が減少するのに対し、加水分解をしないハイブリッド化は偏光を増加させる。本発明に基づいて、蛍光標識した１５量体のペプチド核酸を使用した。この核酸はアミド骨格であるため、エキソヌクレアーゼ活性では加水分解できないものである。１０倍過剰量の精製した相補性一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリッド化した場合、その偏光は８５から９７ｍＰに増加しただけであった。
要約すると、蛍光標識プローブはハイブリッド化または加水分解した場合に偏光の変化があることを示す。これらの変化をＰＣＲをモニタするために使用することができるが、その変化は小さいものである。本発明を鎖変位増幅のためにハイブリッド化の小さな偏光信号を増加させるための方法に使用することができる。切断活性は有さないが結合特異性を保持しているエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの遺伝子的変異体を複合体の偏光を増加させるために使用した。
共鳴エネルギートランスファープローブもまた本発明に基づいて使用することができる。共鳴エネルギートランスファープローブは信号強度が大きいために、ＰＣＲモニタリング用として偏光プローブより優れている。従来技術での共鳴エネルギートランスファーのＰＣＲでの利用は終点解析だけに限られていた。プローブのデザインは信号発生のためのエキソヌクレアーゼ加水分解に応じて変わる。フルオレセイン／ローダミンの二重標識プローブは５’−エキソヌクレアーゼ活性によりポリメラーゼ伸長中に切断され、蛍光体を分離し、フルオレセイン／ローダミン発光比を増加させる。図３５は、フルオレセインとローダミン標識の間に５つの塩基を介在させたプローブを用いた蛍光ＰＣＲ結果を示す。４５サイクルの増幅を図１１の蛍光検出器３００を備えた迅速温度サイクラーを使用して２０分間で完了した。各サイクルごとに蛍光比をモニタリングすることにより、１０9倍の範囲の初期テンプレート濃度のものを識別することができた。増幅曲線は初期テンプレート濃度が１０倍変化するごとに、およそ３〜４サイクルシフトした。初期テンプレート濃度が低い場合に効率は低下したが、単一複製物は複製物のないテンプレートから識別することができる。
加水分解をモニタリングすることにより発生する信号は蓄積的であり、かつ産物濃度に間接的に関係するだけである。したがって図３５に示すように、蛍光比は産物の量が水平域に到達した後も増加しつづける。それでもなお、蛍光信号は少なくとも水平域になるまでは32Ｐ−ｄＡＴＰ取り込みにより測定するＰＣＲ産物量とよく相関した。
プローブの濃度は、図３６に示すように、感度にはごくわずかの影響しか及ぼさない。プローブ濃度を４０倍変化させても、約２サイクル曲線をシフトさせるだけである。プローブ濃度が低い場合はこれよりやや敏感であるが、信号強度が低いため変動も大きくなる。図３６のデータは、各プローブ濃度における最大信号値を平準化したものである。プローブ濃度を低下させれば同量の加水分解プローブより大きな信号を与えることになるが、この利点はハイブリッド化速度が低くなることにより相殺されてしまう。標的に対するプローブのハイブリッド化速度はプローブ濃度に直接的に依存する。
本発明はフルオレセインとローダミン、エオシン（eosin）またはボデイパイ（BODIPY）色素（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）社から入手可能）のいずれかで標識したものなど、多くの異なる加水分解プローブを使用することができるようにする。一般的に、蛍光体間のスペースが減少するほど冷却および／またはエネルギー伝達は増加するが、ＰＣＲ中の加水分解は減少する。加水分解を必要とする共鳴エネルギートランスファープローブには留意しなければならないいくつかの特性がある。その１つは、ある種のプローブは加水分解に抵抗性を有することである。もう１つの特徴は合成が難しいことであり、少なくとも１つの標識はマニュアルで添加しなければならず、また精製のために高圧液体クロマトグラフィが必要とされる。
Ｃｙ５はオリゴヌクレオチドへの直接組み込みのためのアミダイト（amidite）として最近入手可能になった赤色色素である。スペクトルの赤／赤外領域において作業を行うことは光学的要素の選択において有利である。レーザー・ダイオードを照射のために使用することができ、フォトダイオード検出器は優れた感度を有し、またほとんどの材料がこうしたスペクトル領域において最小の自己蛍光を示す。本発明に関連してＣｙ５／Ｃｙ７プローブが開発された。信号は弱いものの増幅はこのプローブで検出可能であった。このプローブをホスホジエステラーゼにより完全に加水分解した場合、信号が２倍だけ増加することが観察された。ＰＣＲの２０サイクルと４０サイクルの間では、図３７に示すように１．３倍の信号増加が起きた。Ｃｙ５／Ｃｙ７プローブの合成にはＣｙ７のマニュアル添加が必要であった。
フルオレセインとＣｙ５の二重標識プローブは自動オリゴヌクレオチド合成器で容易に調製することができる。これらフルオレセイン／Ｃｙ５プローブはホスホジエステラーゼで完全に加水分解した場合に優れた蛍光比の変化を示す。フルオレセインとＣｙ５の放出波長は十分に分離され、図３８に示すように蛍光体間で効率的な共鳴エネルギートランスファーが行われる。スペクトルの重なりは小さいが、Ｃｙ５のモル吸収係数と吸収波長は高い。スペクトルの重なり、アクセプターの吸収性およびアクセプターの波長はすべて重なり面積に関与し、これがエネルギー伝達速度を決定する。Ｃｙ５はフルオレセイン励起波長における吸収性が低いため、Ｃｙ５の直接励起もまた小さい。
フルオレセイン／Ｃｙ５プローブはＰＣＲ中に効率的に加水分解されることはなかった。完全な加水分解をした場合２００倍の蛍光比の変化が可能であるが、好ましいフルオレセイン／Ｃｙ５プローブはＰＣＲのサイクル２０と４０の間でわずかに１．４５倍の増加を示しただけである（図３７参照）。蛍光体間でスペースが異なり、５’端のフルオレセインまたはＣｙ５のいずれかを有するいくつかのフルオレセイン／Ｃｙ５プローブを合成した。これらはすべてＰＣＲにおける信号は低かった。加水分解プローブに関する本発明者らのいくつかの結果を以下に要約する：
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二重標識のフルオレセイン／Ｃｙ５オリゴヌクレオチドが加水分解に対して抵抗性を有することは、プローブの加水分解の代わりにプローブのハイブリダイゼーションに依存する共鳴エネルギートランスファー方式の開発により１つの利点となった。二重標識プローブを加水分解する代わりに、ＰＣＲ中の共鳴エネルギートランスファーによりハイブリダイゼーションを直接検出することができる。二重標識エキソヌクレアーゼ・プローブとは対照的に、一重標識プローブの合成は比較的簡単である。
ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションの共鳴エネルギートランスファーを検出するための２つの異なる方法を利用する本発明の実現の可能性を図３９に示す。最初の方法は、１つは３’をフルオレセインで標識したもの、もう１つは５’をＣｙ５で標識した２つの隣接ハイブリダイゼーション・プローブを使用する。ＰＣＲ中に産物が蓄積するに従い、各サイクルのアニーリング期間中にプローブは隣りあって互いにハイブリッド化する。第２の方法はＣｙ５で標識したプライマーと、単一ハイブリダイゼーション・プローブを使用する。この標識プライマーはＰＣＲ産物中に増幅中に組み込まれ、ハイブリダイゼーションが１回だけ必要になる。両者の方法とも、Ｃｙ５への蛍光エネルギー伝達はハイブリダイゼーションとともに増加し、フルオレセイン蛍光に対するＣｙ５の比としてプロットされる。蛍光を２−温度アニーリング／伸長時間帯の終了間際にサイクル毎に１回モニタする。これらハイブリダイゼーション・プローブの感度は加水分解プローブと同じようなものである（図２９と３９を比較されたい）。
ハイブリダイゼーション・プローブから出てくる蛍光の温度依存性は、図４０に示す蛍光対温度のプロットでよく示される。これらのプロットは温度サイクルの２００ミリ秒ごとに単一試料をモニタリングすることにより得られる。アニーリング／伸長段階中に、プローブは一本鎖産物にハイブリッド化し、蛍光比（Ｃｙ５／フルオレセイン）が増加する。産物の変性温度への加熱中にプローブは７０〜７５℃付近で解離し、蛍光比はバックグラウンド・レベルに戻る。対照的に、加水分解プローブはこうした温度依存性は示さない（図４１参照）。予想されるように、加水分解プローブの蛍光対温度のプロットは、温度に対する蛍光の直線依存性を示すだけである。温度サイクル中に蛍光によりハイブリッド化をモニタできることは強力なツールとなるのである。配列特異性プローブの融解温度によってＰＣＲ中の産物を同定および識別することができることになる。
２本鎖特異性の色素もまた、本発明のさまざまな視点に基づいて使用することができる。ＰＣＲ産物の鎖の状態はｄｓＤＮＡの存在下で蛍光を発する色素により追跡することができる。増幅中にＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩが存在する場合、ｄｓＤＮＡができるに伴って蛍光が増加する。しかしながら温度サイクルは、図４２Ａおよび４２Ｂに示すように蛍光が温度に逆比例するために交絡効果（confounding effect）を持ったものとなる。蛍光をＰＣＲ中の温度と時間の関数として連続的にモニタすると、これらのデータは図１２に示す三次元のスパイラルを作り出すことになる。既に議論したように、図１２に示す３Ｄ曲線は、温度対時間、蛍光対時間、および蛍光対温度の２Ｄプロットに直すことができる。図１２の温度対時間のグラフは各サイクルで繰り返されるが、そのわかりやすい形が図４２Ｂの下の図に明瞭に示す。図１２の蛍光対時間グラフは、図４２Ｂに示す初期サイクルにおける温度対時間グラフの拡大鏡映図（scaled mirror image）である。産物が蓄積するに従い、図１２に示すように蛍光が基準線に戻る変性温度以外では蛍光が増加する。
蛍光−温度グラフはＰＣＲ中の鎖の状態の温度依存性を示す（図２４および図２４Ａ参照）。増幅が進行するに従い、温度サイクルはアニーリングと変性温度の間で上昇ループを描く。試料を加熱すると、蛍光は変性が起こるまで強い状態となる。試料を冷却すると、ｄｓＤＮＡ形成による蛍光が増加し、産物のリアニーリングを反映したものとなる。伸長中に温度が一定になると、増加する蛍光がさらなるＤＮＡ合成と相関する。この蛍光対温度データは、蛍光に対する温度の影響を除いた形に変えることができる（図２４参照）。本発明に基づいて、増幅特異性を評価するために産物のＴmおよび融点曲線が使用される。多くの場合、この方法はハイブリダイゼーション・プローブを合成する必要をなくすものとなる。ハイブリダイゼーション温度に基づく識別は同定および定量のための強力なツールであり、多色解析によるスペクトル識別と併用または代用することができる。
ＰＣＲの連続モニタリング用プローブの要約：以下の表はＰＣＲの連続モニタリングに有用なｄｓＤＮＡ結合色素、加水分解プローブおよびハイブリダイゼーション・プローブを比較したものである。ｄｓＤＮＡ結合色素の蛍光はＤＮＡの鎖の状態に依存する。二重標識の加水分解プローブは完全なままで消光される。消光された蛍光体の蛍光はプローブが加水分解されると増加する。ハイブリダイゼーション・プローブはハイブリッド化によって２つの蛍光体が近接した場合に共鳴エネルギートランスファーが増加する。
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図１１に示す蛍光検出器３００を備えた迅速温度サイクラーは迅速な温度制御付きの蛍光定量装置の有用な特性を含み、文献ではどこにも示唆または教示されていない組み合わせであることが、当業者には理解いただけるであろう。ＰＣＲは１０分から２０分間温度サイクルの間に行い、分析することができる。本発明の組み合わせである（１）各温度サイクル内での連続蛍光モニタリングと（２）温度と時間に対するハイブリダイゼーションの依存性の分析は他では得られない利点を提供する。
本発明はＰＣＲ中の産物純度のモニタリング、テンプレートの定量、および突然変異の検出のための単色蛍光法も提供する。温度サイクル中の観察のためにＤＮＡの鎖の状態をモニタする色素をＰＣＲ反応に添加する。ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩは、二本鎖ＤＮＡに付加される場合にのみ強く蛍光を発する感度の高い色素である。ＰＣＲ反応が伸長温度から変性温度に加熱されるに従い、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩの蛍光の低下で変性を観察することができる。融解曲線は変性される産物に特徴的なものである。少量のＰＣＲ産物の場合、融解転移は狭い温度範囲で起きるが、融解の中間点をＴmと呼ぶ。３つの異なる精製ＰＣＲ産物の蛍光融解曲線を図４３Ａに示す。図４３Ａのデータは、温度を０．２℃／秒増加させながらＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩにより蛍光モニタリングすることによって得られたものである。相対的な融解位置はＧＣ量とＴmまでの長さを関係付けた実験式により予測することができる。ＰＣＲ産物の見掛けのＴmは図４３などに示すように加熱速度に依存する。加熱速度が減少するに従い、融解曲線は低温側に移行し、かつシャープになる。融解曲線の詳細およびＴmの正確な推測には、加熱速度の動力学的効果を小さくする必要がある。ＰＣＲ産物の見掛けＴmはまた、図４４に示すｄｓＤＮＡ結合色素濃度にも依存する。色素濃度が高くなれば複製物および観察されるＴmの安定性が増す。
異なるｄｓＤＮＡ結合色素の特性について次に議論する。第１には、ＰＣＲ中の融解曲線に最適の色素選定について、次にＰＣＲ産物の純度を評価し、また増幅中の突然変異を検出するために融解曲線に関する議論を提供する。そして最後に、競合定量ＰＣＲにおけるｄｓＤＮＡ結合色素の利用と絶対的産物定量について説明する。
以下、種々のｄｓＤＮＡ結合色素について詳しく議論する。本発明に基づいて使用することができる多くの二本鎖特異性色素がある。好ましい色素の１つとしてＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩがあるが、これは励起スペクトルがフルオレセインに似ていることから、より一般的な臭化エチジウムより好ましい。各種の二本鎖用色素を、（１）ＰＣＲの抑制、（２）検出感度、（３）融解曲線に対する加熱速度の影響、および（４）融解曲線に対する色素濃度の影響、を調べるために試験した。まず、迅速サイクルＰＣＲに適合する色素の最大濃度を求めた。この濃度は、最適の光学フィルタを使用してＰＣＲ中の連続モニタリングによって検出感度を評価するのに利用することができる。融解曲線に対する転移速度および色素濃度の影響は色素特異性である。得られたデータを図４３および４４に示す。下記の色素をＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩと比較する：
融解曲線のための各種ｄｓＤＮＡ結合色素
（Fu Y-H（フウ  Ｙ−Ｈ）、DPA Kuhl（ＤＰＡ  クール）、A Pizzute（Ａ  ピズート）、M Pieretti（Ｍ  ピエレッティ）、JS Sutcliffe（ＪＳ  サトクリフ）、S Richards（Ｓ  リチャーズ）、AJMH Verkerk（ＡＪＭＨ  ヴァーカーク）、JJA Holden（ＪＪＡ  ホールデン）、RG Fenwick（ＲＧ  フェンウィック）、ST Warren（ＳＴ  ウォレン）、BA Oostra（ＢＡ  ウーストラ）、DL Nelson（ＤＬ  ネルソン）、およびCT Caskey（ＣＴ  カスキー）、「遺伝子的不安定性につながる脆弱Ｘ部位の種々のＣＧＧ反復、シャーマン・パラドックスの解（Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability:resolution of the Sherman paradox）」、Cell 67:1047〜1058、1991参照。本明細書の一部を構成するものとしてここに引用する。）
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ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩに関しては、加熱速度０．１〜０．５℃／秒、稀釈率１：７，０００〜１：３０，０００で使用するのが好ましい。高いＧＣ量と低いＧＣ量を有する精製ＰＣＲ産物の融解曲線を各色素について求めた。異なる色素を使用した場合の融解曲線はそれらのＡＴ／ＧＣ選好度および結合の様式により異なる。色素は、臭化エチジウムの場合に知られているように、異なるＤＮＡドメインの融解時に再配分される。本発明に基づいて、最適色素、その濃度、および融解曲線に求められる加熱速度を決定することができる。
次に純度について議論する。ＰＣＲ産物はサイズとＧＣ量が不均一であるため４０〜５０℃の範囲で融解する。たとえば、プライマー・ダイマー類は低温で融解し、異種混在の非特異性産物は広い温度範囲で融解し、また純粋なＰＣＲ産物は特定のＴmでシャープに融解する。これらの特性を、蛍光融解曲線と好ましい産物を得るために最適化したＰＣＲ増幅物のアガロースゲル電気泳動との比較によって示す。長いＰＣＲ産物は同定のためのフィンガープリント（指紋）として使用することができる内部融解ドメインを有するが、小さいＤＮＡフラグメント（＜３００ｂｐ）は通常１つの転移で融解する。配列に応じて、ＤＮＡ融解ドメインは４０から６００塩基対の範囲で異なる。
突然変異の検出もまた本発明に基づいて検討しなければならない。融解曲線によって遺伝的多型性および突然変異を検出する能力を求める。反復多型性（ＶＮＴＲｓ、ジヌクレオチド反復）はサイズにより異なるが、配列では著しく異なることはない。ＤＮＡフラグメント中でのホモ接合体の点突然変異（塩基置換）は変性勾配ゲル電気泳動および温度勾配ゲル電気泳動により検出することができるが、その温度シフトは通常＜１℃であり、これは精密な技法を用いてのみ検出できるものである。しかしながら、ＰＣＲ中のＤＮＡ標的がヘテロ接合体の場合、ヘテロ複合体が消光中に形成され、そこで観察される温度シフトは１℃〜５℃である。ヘテロ接合体突然変異の大半は本発明を利用してＰＣＲ中の単純な融解曲線で検出することができる。最も一般的な嚢胞性繊維症変異（ΔＦ508）の３−塩基対欠失部位の周辺領域は、本発明に基づいて選別されたＤＮＡから増幅される。ホモ接合体野生型、ヘテロ接合体ΔＦ508、およびホモ接合体ΔＦ508の融解曲線についてもここで比較する。ホモ接合体試料はほとんど識別不可能であるが、ヘテロ接合体の曲線は正常な“ホモ複合体”融解に続いて低いＴmのヘテロ複合体融解を示す。この効果は小さなアンプリコンであるほど顕著である。
最もよく知られている血栓の遺伝的有害因子はＶ遺伝子因子中の一点での突然変異である。突然変異の周囲にある既に種類が分かっているホモ接合体およびヘテロ接合体ＤＮＡを増幅させ、融解曲線を得た。ホモ接合体突然変異は同量の野生型ＤＮＡとの同時増幅により検出される。ここで観察される混合融解曲線はヘテロ接合体増幅で得られたものと同一になるべきである。もし野生型ＤＮＡを常法により試験試料と１：２比で混合した場合、ヘテロ接合体の場合は２：１の野生型：突然変異融解を示し、ホモ接合体突然変異の場合は１：２の野生型：突然変異となるはずである。
ＢＲＣＡ１は最も早く同定された肺ガン感受性遺伝子で、肺ガンの約５％を占めるものである。突然変異のほとんどは、わずか１つまたは２つの塩基の置換、挿入または欠失であり、感受性は突然変異のヘテロ接合体によるものであるとされている。ヘテロ接合体は自動配列決定法により検出することができるが、従来技術の装置と方法を利用して５，０００以上のコーディング塩基の配列決定を行う臨床試験は高価かつ困難なことである。１０個の既知のＢＲＣＡ１突然変異体について、本発明を利用して、影響を受けたアンプリコンを増幅し、融解曲線を観察し、また野生型と比較することにより試験した。プライマーと既知のＤＮＡ試料は、ミリアッド・ダイアゴノスティックス社（Myriad Diagnostics）から入手できる。
競合定量ＰＣＲもまた本発明を利用して行うことができる。本発明では産物の融解温度の差を検出する能力を、ＰＣＲ産物と競合物の間の差を求めるための定量的ＰＣＲに活用する。同一のプライマーを使用するが、融解温度が天然のアンプリコンとは異なる制御テンプレートを用いた競合増幅により、初期テンプレートのコピー数を定量することができる。この方式の利点を図４５および４６に示す。図４５はＴmが約２℃異なる２つの精製ＰＣＲ産物を混合したときに得られた融解曲線を示す。蛍光に対する温度の影響を補正し、蛍光/温度の導関数をプロットすることにより、図４６に示す各ＰＣＲ産物の相対量を定量することができた。
本発明に基づいて、前述のプライマーからＨＢｓ抗原遺伝子の１８０塩基対フラグメントを増幅する競合テンプレートを作製した。テンプレート長さ、ＧＣ含量またはそれら両者の組み合わせのいずれかを変えることにより、３℃のＴm差を有する競合テンプレートを得ることができた。さらに小さいＢ型肝炎フラグメントのＰＣＲ増幅と、それに続く末端重ねあわせによる結合により下記のテンプレートを合成した：
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これらのテンプレートについてそれらのＡ260で定量し、各サイクルごとにＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩによるモニタリングを行うことにより増幅効率を求めた。これら３つの代替テンプレートによる野生型ＤＮＡの競合定量結果を、ハイブリダイゼーションを利用した標準的な臨床法とここで比較する。
本発明を利用して産物の絶対的定量もまた有利に行うことができる。二本鎖ＤＮＡ形成を連続モニタリングすることにより、直接かつ絶対的なＤＮＡ定量をリアニーリング動力学（reannealing kinetics）に基づいて行うことができる。試料温度を変性温度から迅速に低下させ、プライマーのアニーリングを防止するのに十分な低温で一定に保つ。そうすれば産物のリアニーリング速度は二次動力学に従ったものとなる。濃度の異なるＤＮＡを試験した場合、リアニーリング曲線の形はＤＮＡ濃度に特徴的なものとなる（図２６参照）。与えられたすべてのＰＣＲ産物と温度に対する二次速度定数を求めることができる。速度定数が分かれば未知のＤＮＡ濃度を実験的なリアニーリング・データから求めることができる。この原理を図２７に示す。曲線は前述のラブビュー（LabView）プログラミング環境を利用して温度サイクル中非線型最小二乗回帰により、リアルタイムに当てはめることができる。冷却は瞬間的なものではなく一定温度に到達する前にいくらかのリアニーリングが起きるが、回帰分析により本発明に基づいてこれが可能となる（図２７参照）。この技法では純粋なＰＣＲ産物が必要であるが、これは温度サイクル中に得られる融解曲線によって確保することもできる。リアニーリング動力学による定量は信号レベルには無関係で、小さな試料差異に影響されることはない。
産物のリアニーリングのための二次動力学の予測は、異なるＤＮＡ濃度における速度定数を求めることにより確認できる。ある種の蛍光色素は濃度依存性でリアニーリングに影響を及ぼす。その関係は明らかにすることができ、かつ定量が可能である。リアニーリング動力学による定量は各伸長期間終了時の蛍光を利用した定量と比較する。
本発明はまたＰＣＲ中の配列特異性検出のためにプローブのハイブリダイゼーション（加水分解ではない）に依存する二重色蛍光法も提供する。本発明に基づいて、フルオレセインとＣｙ５により標識された隣接ハイブリダイゼーション・プローブ間の共鳴エネルギートランスファーを増幅モニタリングのために使用することができる。しかしながら、本発明の実施態様を利用する際にはまた、プローブ長さ、プローブの濃度およびプローブ間の最適距離の効果について検討しなければならない。
本発明はまた、隣接ハイブリダイゼーション・プローブの最適化も提供する。プローブ間の距離の影響を求めた。本発明に基づいて、５，３’−フルオレセイン標識の３０量体および５，５’−Ｃｙ５−標識の３０量体を、フルオレセインで制御したポア・グラス（グレン・リサーチ（Glen. Research）社から入手可能）およびＣｙ５アミダイト（ファルマシア（Pharmacia）社から入手可能）を用いて合成した。プローブはβ−グロビン領域中の同じ鎖に、フルオレセインと０から２５塩基のＣｙ５間のプローブ間距離を用いてハイブリッド化するように設計した。精製にはタンデム吸収能を備えた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）および蛍光モニタを使用した。純度は好ましくは分析的ゲル電気泳動と、Ａ260：Ａ490またはＡ260：Ａ650比によりチェックする。プローブはＰＣＲ中０．２μＭとし、かつ２−温度サイクルを使用する。ＰＣＲ中の蛍光比の変化をプローブ間距離に対してプロットし、プローブ間の最適距離を求める。
上記のようにして求めた最適プローブ間距離を使用し、２０、２５および３５塩基のプローブ長さのものを合成し、３０量体プローブと比較した。これらのプローブの融解温度をＰＣＲ中に観察し、プローブ長さに対してプロットした。長いプローブを使用することにより、プライマーのアニーリング・ステップの前にプローブのアニーリング・ステップを入れた３−温度サイクルを使用することができる。ＰＣＲ中の検出感度および信号強度に対するプローブ濃度の影響を求めた。
共鳴エネルギートランスファーのために標識プライマーをハイブリダイゼーションプローブに使用することは本発明の一面に準じたものである。隣接する共鳴エネルギートランスファープローブの１つを図３９に示すＰＣＲプライマー中に組み込むことができる。図示のケースでは、１つの標識プローブを標識プライマーを取り込む一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリッド化する。Ｃｙ５（アマーシャム／ＢＤＳ（Amersham/BDS）社から入手可能）へのマニュアル結合のために、アミノリンカー（グレン・リサーチ社から入手可能）により変性したｄＴアミダイトを用いて標識プライマーを合成した。本発明はまた、変性Ｃｙ５−ｄＴがいかにプライマーの３’末端にＰＣＲを阻害することなく近接させることができるかを求めることも包含する。これを求めるためには異なる位置に標識した塩基により標識したいくつかのプライマーを必要とする。次に、いくつかの３’−フルオレセイン−標識プローブを合成および試験することにより蛍光体の最適距離を求めた。
共鳴エネルギートランスファーによってハイブリダイゼーションを検出するためのその他のフォーマットを利用することも本発明の範疇に入る。好ましい方法の１つでは、隣接するハイブリダイゼーション・プローブ方式は“非競合的フォーマット”と呼ばれる。これは２つの相補性オリゴヌクレオチドを蛍光体で単一標識する“競合的フォーマット”とは対照的なものである。これらのプローブは互いにハイブリッド化（エネルギー伝達または冷却をもたらす）、または競合標的にハイブリッド化するが、本発明者らのケースでは蓄積するＰＣＲ産物である。ＰＣＲ中での２０−、２５−、および３０−量体の５’−Ｃｙ５−標識および３’−フルオレセイン−標識相補性プローブの合成および試験は本発明に基づいて実施することができる。
モリソン（Morrison）の“インターカレータ・フォーマット（intercalater format）”は、ハイブリッド化させるときに二本鎖特異性色素と相互反応する標識プローブを必要とする。モリソン  Ｌ．Ｅ．、エネルギー伝達および蛍光消光の検出、Ｌ．Ｊ．クリッカ編、非同位体ＤＮＡプローブ技法、アカデミックプレス、サンディエゴ、３１１〜３５２ページ、１９９２年（Morrison L.E., Detection of energy transfer and fluorescence quenching, in L,J. Kricka（ed.）, Nonisotopic DNA probe techniques, Academic Press, San Diego, pp. 311-352, 1992）参照。これを本明細書を構成する一部としてここに引用する。３’および５’末端をＣｙ５で二重標識した２０−、２５−、および３０−量体プローブの合成、ならびにＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩを二本鎖特異性色素として使用することも本発明の範疇に入る。ＰＣＲ産物の形成はＣｙ５の発光増加として観察することができるハイブリダイゼーションをもたらす。この方法は配列特異性産物および二本鎖ＤＮＡの両方を同時にモニタすることができるという利点を有する。
本発明はまた、突然変異検出、競合定量ＰＣＲ、および産物定量のための二重色、配列特異性の方法にも適用できる。ハイブリダイゼーション・プローブのＴmは、もし単一の塩基不正対合（ミスマッチ）がある場合約１０℃シフトする。もしハイブリダイゼーション・プローブを突然変異部位に入れた場合、プローブ融解が１０℃シフトするので単一塩基突然変異は検出可能である。ヘテロ接合体の突然変異は中間的な融解曲線を与えることになる。前述のＶ因子突然変異と隣接フルオレセイン／Ｃｙ５プローブを使用することにより単一塩基を識別できることを示すことができる。
競合ＰＣＲテンプレートは内部の塩基変更により設計することができる。もし異なる標的を異なる温度で順番に融解させる検出プローブを使用すれば、相対的な定量が可能となる。絶対的な産物定量はプローブのアニーリング動力学に従うことにより可能である。もし１つの標識プライマーと１つのハイブリダイゼーション・プローブを使用すれば、アニーリング動力学は疑似一次となり、これは既知のテンプレート濃度で試験して予測できるものである。
図４７は一般的に４００で示される毛細管試料チューブの先端部で蛍光検出を行う迅速温度サイクラーの概略図である。下記は蛍光検出を含む本発明開示の種々の実施態様の比較である。
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毛細管試料チューブの先端で蛍光検出を行う図４７に示す迅速温度サイクラーは特に利点が多い。試料・チャンバー内の温度は４００Ｗの加熱カートリッジ（リヒート社（Reheat Inc.）から入手可能）およびチャンバー・ファンを駆動するＤＣ希土ブラシモータ（エスカップＡＧ（Escap AG.）社から入手可能、最高回転数＝１５，０００、推測寿命１０，０００時間）により制御される。加熱は、試料・チャンバー全体の温度を均一にするためにカートリッジを比例制御し、ファンを低速（１２Ｖ、０．５Ａ）で運転する。冷却は、加熱カートリッジを止め、またファンを最高速度で運転する（２７Ｖ、１．４Ａ）。このファンは空気を中央開口部に強制的に送り込み、出口から放出させる。加熱および冷却用部品は中心軸の周りに対照的に置かれ、ステッパ・モータにより位置決めされる円形カルーセル中に最大２４試料が入れられるようになっている。ステッパ・モータはカルーセル１回転当たり１０，０００ステップ以上となるようにマイクロステップする（ニューイングランド・アフィリエーテッド・テクノロジーズ（New England Affiliated Technologies）社から入手可能の装置を使用）。
図４７に示す実施態様の光学的デザインは、前述（図３１参照）のように毛細管先端部を近軸エピ蛍光照射する方法をベースとしている。励起源は“スーパー・ブライト”青色発光ダイオード（ＬＥＤトロニクス（LEDtronics）社から入手可能）である。蛍光信号は一体型の検出器／フィルタ・モジュール（イーリング・エレクトロオプティクス（Ealing Electrooptics）社から入手可能、ＴＯ５パッケージの中に高性能シリコンフォトダイオードを備えた０．５インチ干渉フィルタ）から得る。励起および検出要素は、関連電子部品とともに直接１つの回路基板上に搭載する。すべての光学機器の直径は０．５インチである。
試料は図４７Ａ〜Ｄに示すように、プラスチック／ガラス複合試料容器中に注入される。５μｌの試料を各チューブに注入し（図４７Ａ）、試料を毛細管先端に１ｃｍの液柱として置く（図４７Ｂ）ために低速で遠心する。次にプラスチック／ガラス複合容器の入り口部をプラスチック・プラグにより密封し（図４７Ｃ）、毛細管試料チューブ４００の先端部に蛍光検出器を備えた迅速温度サイクラー中に置く（図４７Ｄ）。図４７Ａ〜Ｄから分かるように、毛細管試料チューブにプラスチックの充填および密封機構を付加すると好ましい温度特性を維持しながらガラス毛細管チューブを効率的に使用することができるという大きな利点を与える。試料はプラスチック／ガラス複合容器中に注入し、９６穴フォーマット中で遠心操作を行うが、計測装置の中には個々に充填する。プラスチック／ガラス複合試料容器は図４７に示すように、先端部が光学的焦点に合わせられた黄銅スリーブ中に収められる。この収まりは軸心が動けるようになっており、組み立て時に各スリーブの精密なアライメントを可能とする。
有利なことは、プラスチック／ガラス複合試料容器は簡便で安価な試料・フォルダを提供することになることである。一端を密封し、他端がアサガオ型（図４７Ａ〜Ｄに示すプラスチック密封装置を受け入れるため）で、内径０．８ｍｍ、外径１．０ｍｍのガラス毛細管チューブは安価に組み立てることができる。プラスチック部品もまた安価に組み立てることができる。これらの部品は組み立てた後、保護と充填を容易にするために９６穴ラックに収めることが好ましい。毛細管チューブの先端部の形状は光学的効率を考えて最適化される。フラットな先端部ならびにさまざまな外面の曲面および内面の曲面を有する先端部もすべて本発明の範疇に入る。
図４７の実施態様では各試料から１〜１０回／秒の蛍光を得るため、試料は比較的迅速に回転させる必要がある。２４試料をステッパ・モータで位置決めし、各試料には４．２〜４２ミリ秒が割り当てられることになる。
図４７に示す実施態様のユーザー・インターフェースと計器制御は、図１１の実施態様で説明したものと同一または類似のものである。図４７に示す実施態様のコントローラは、発光ダイオード、ステッパ・モータの方向、ヒータ、およびチャンバ・ファンのデジタルＩ／Ｏ制御を行う。効率的なユーザー・インターフェースが備えられている。
図４８は蛍光ハイブリダイゼーションのモニタリングのための有用な温度対時間の区分を示す。産物の融解曲線は変性に至るゆっくりした温度上昇期間中に得られる。変性後に迅速に温度を低下させて一定温度にすることにより、製品、プローブ、またはプライマーのアニーリングは任意に行うことができる。プローブの融解曲線はプローブＴm近傍の温度をゆっくり上げることにより得られる。図４７に示す実施態様では温度サイクル中のすべての分析は直ちにリアルタイムの表示がなされるようになっている。
本発明の実施態様は１色または２色だけの解析を利用しているが、図４７に示す実施態様は集光装置に別の２色性およびフォトダイオード／フィルタ構造物を付け加えることによって特に３色解析にも対応できる（図３１参照）。さらに多色解析のために直列フォトダイオード・アレイ上に波長を同時に分離することも本発明の範疇に入る。直列フォトダイオード・アレイを使用する場合、図４７に示す集光装置は複数の波長を検出するために、プリズムまたは回折格子、レンズおよびフォトダイオード・アレイあるいはＣＣＤに置き換えることになる。直列フォトダイオード・アレイは、５００から８００ｎｍの間で各１０〜２０ｎｍの１５〜３０の波長区画を集める。集光効率、スペクトル解像度および空間的な必要条件の間の妥協点を得るために、さまざまな構成（ほとんどのモノクロメーターに使用されている格子用のリトロー・オートコリメーション装置など）が利用される。
本発明はまたリアルタイムの制御と増幅の最適化のために蛍光フィードバックも利用する。リアルタイムの蛍光モニタリングは温度サイクリングを制御するために利用される。二本鎖特異性色素を使用することにより、伸長は蛍光の増加が停止した後に各サイクルで終了させることができる。変性のためには、産物が完全に融解するまでの間だけ温度を上げる必要がある。最後に、温度サイクリングは一定量の産物ができた後に自動的に停止させることができる。こうしたリアルタイムの制御は、蛍光温度サイクラーにオプションとしてプログラムすることができる。
アニーリングのリアルタイムモニタリングと制御も本発明は提供する。プライマーの１つがＣｙ５で３’−標識される場合には伸長は起こらない。標識プライマー（１〜１０％）を未標識プライマー（９０〜９９％）と混合した場合は、増幅効率はわずかに低下するもののアニーリングは二本鎖特異性色素からＣｙ５への蛍光エネルギー伝達として観察可能である。これが前述の“インターカレータ・フォーマット”である。最低Ｔm（熱力学的に最も近いと考えられるもの）を有するプライマーを、二本鎖特異性色素としてＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩで標識する。アニーリング中の増幅効率およびＣｙ５蛍光を、標識プライマーのパーセントに対して比較する。
本発明の実施態様による直接モニタリングはＣｙ５標識プライマーを用いて直接的に、または相当する相補オリゴヌクレオチドを用いて間接的に実施することができる。最も低い融解温度のプライマーと同じ長さとＴmを有し、増幅配列に相補性を持たないオリゴヌクレオチドを設計した。このオリゴヌクレオチドはＣｙ５で５’−標識し、またその補体についてはフルオレセインで３’−標識した。このペアをハイブリッド化した後、Ｃｙ５への共鳴エネルギートランスファーを行った。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（０．００５μＭ）およびＣｙ５−標識オリゴヌクレオチド（０．５μＭ）は、プライマー・アニーリング動力学とほぼ同じ擬似一次動力学でアニールする。このような方法で、アニーリングの効率をモニタすることができ、またそれをアニーリングの温度と時間を制御するために利用することができる。アニーリング効率をモニタリングすることによるアニーリング条件の制御は制御機器中に任意に含めることができる。
従来のＰＣＲは増幅の前にすべてのサイクリング・パラメータをプログラムすることにより実施されている。連続的なモニタリングのためには、アニーリング、伸長および変性の連続的観察に基づいて増幅期間中に温度サイクリングの要件を決定する必要がある。最低融解温度プライマーに相当する相補性オリゴヌクレオチドを使用することにより、アニーリング効率は初期のサイクル中でも制御される。しかしながら、伸長および変性は十分な産物ができる後期サイクル中にｄｓＤＮＡ結合色素によってのみモニタすることができる。ただしこれは通常は、変性と伸長条件はほとんどの産物を増幅するのに十分許容されるものであり、初回増幅からのデータをそれ以降の進行を最適化するために使用することができるため、問題にはならない。
ポリメラーゼ鎖反応中のＤＮＡ融解曲線の解析による製品識別のさらなる例について以下に述べる。
ＰＣＲを、５μｌ試料当たり５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５（２５℃）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０．５ｍＭの各デオキシヌクレオチド三りん酸塩、０．５μＭのプライマー、および０．２ＵのＴａｑポリメラーゼ中で実施した。別に特記しない場合は、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩも１：２０，０００に希釈して加えた。
テンプレートとして使用した増幅産物はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈降、続いてセントリコン（Centricon）３０マイクロ濃縮器（マサチューセッツ州ダンバーのアミコン（Amicon）社から入手可能）による繰り返し洗浄により精製した。テンプレート濃度は２６０ｎｍの吸光度で求め、Ａ260／Ａ280比が１．７以上であった。
プライマーは標準的なホスホアミダイト化学法（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック・ジーン・アセンブラー・プラス（Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus）から入手可能）により合成した。１８０塩基対のＨＢｓ抗原遺伝子増幅のためのプライマーは、５’−ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣ  ＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ−３’（配列認識番号１）および５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧ  ＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ−３’（配列認識番号２）とした。２９２塩基対の前立腺特異性抗原遺伝子増幅のためのプライマーは、５’−ＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡ  ＣＧＴＧＧＡＴＴ−３’（配列認識番号７）および５’−ＡＡＧＴＣＣＴＣＣＧ  ＡＧＴＡＴＡＧＣ−３’（配列認識番号８）とした。５３６塩基対のヒトβ−グロビン遺伝子増幅のためのプライマーはＲＳ４２およびＫＭ２９とした。
ＤＮＡ融解曲線は、図８ＡおよびＢの実施態様を用いてＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩからの蛍光を捉えるための光学モジュール（アイダホ州アイダホフォールのアイダホ・テクノロジー（Idaho Technology）社から入手可能のNo.２２１０型）を備えた２４試料熱サイクラーを一体化した微量蛍光計により得た。ＰＣＲ試薬（５μｌ容量）はガラス／プラスチック複合反応チューブの開放型プラスチック容器中にピペットで入れ、試料をガラス毛細管の先端部に押しやるために低速で遠心を行い、内部をプラスチック・プラグで密封した。ＰＣＲは前述の実施態様の１つで行った。融解曲線の蛍光データは、０．１〜１０．０℃／秒で９５℃までの直線的温度転移の間の０．２５〜２．０秒間を積分して得た。データは先に説明した制御機器を使用して連続的にディスプレイした。
融解曲線を融解ピークに変換するために一連の転換を行った（図４９参照）。バックグラウンド蛍光は、精製ＰＣＲ産物の融解温度以上の融解曲線に線型回帰（Ｌ１）を行うことにより取り除いた（Ｔ１）。近似式（図４９の融解曲線についてはＲ２＝０．９６）として、この線は温度の関数としてのバックグラウンド蛍光を表わしている。蛍光に対する温度の影響を取り除くために、産物の融解温度以下の融解曲線に対する線型回帰（Ｌ２）を利用した。最後に、分光測光融解曲線を融解ピークに転換するために使用されるのと類似の方法により、温度に対する蛍光の微分値（−ｄＦ／ｄＴ）をプロットして融解曲線から融解ピーク（Ｔ２）を導き出した。特定の産物の予想融解温度範囲の融解ピークを積分し、全体の融解ピーク範囲の積分値でこの値を除すことにより、非特異性産物に対する目的産物の比の上限が得られる。
ｄｓＤＮＡ特異性色素からの蛍光をＰＣＲ中の温度の関数としてプロットすると（図５０参照）、反応の各サイクルにおける鎖の状態をモニタできることになる。初期の温度サイクルはプロットの下部にバックグラウンド蛍光として表れた。増幅産物が蓄積されるにともなって、蛍光はアニーリング温度への転移中の各サイクルごとに、またポリメラーゼ活性が新しい産物を合成するに従い高くなった。変性温度に向けての加熱中に蛍光は数度の範囲で急にバックグラウンド・レベルに低下し、産物の変性を示した。この手順によりＰＣＲの蛍光対温度プロットの特徴的な時計周りのスパイラル構造が得られた。
２５温度サイクルの後、融解曲線を得るためのサイクルを開始した（図５１参照）。産物は変性され、完全にアニールされた後、変性温度中０．２℃／秒でゆっくり加熱した。融解は８５℃で始まり、蛍光は８７℃までにバックグラウンド・レベルに低下した。
ＰＣＲ産物の融解曲線の絶対的位置はＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩ濃度に影響を受けた（図５２Ａ参照）。色素の濃度が上がると、融解曲線は高温側にシフトした。濃度は１以上７，０００まではＰＣＲによる増幅を阻害した。
変性温度での迅速温度転移は融解曲線を高い見掛けＴmにシフトさせたが、これは動力学的効果によるものである（図５２Ｂ参照）。5℃／秒以上の温度転移速度は見掛けのＴmを約３℃シフトさせた。見掛けのＴmは、転移速度を０．１から０．２℃／秒へ増加させることにより０．２℃シフトした。その後の融解曲線解析は０．２℃／秒の転移速度で行った。この速度での融解曲線解析は、図５０に示す８分間の反応より３０秒間長くなった。
融解曲線を３つの異なるＰＣＲ産物について得た（図５３参照）。これら３つの産物はシャープな融解曲線を有し、２℃以内で融解した。１８０塩基対のＢ型肝炎フラグメント（５０．０％ＧＣ）の見掛けＴmは、５３６塩基対のβグロビン・フラグメント（５３．２％ＧＣ）のＴmより２℃低く、これらは容易に区別できるものであった。２９２塩基対の前立腺特異性抗原フラグメント（６０．３％ＧＣ）の見掛けＴmは、より大きなβグロビン・フラグメントよりほぼ５℃高い融解温度を有していた。
精製したＰＣＲ産物を混合した場合、それらの融解曲線は重なり合った（図５４参照）。融解ピークに変換した後、Ｔmが２℃以下異なる反応生成物の混合物を別々のピークに分解することができた（図５５参照）。
融解曲線解析は目的の産物をプライマー・ダイマーなどの非特異性産物から区分するのに利用した（図５６参照）。プライマー・ダイマーは７５〜８５℃の範囲の広い融解ピークを有しており、この融解ピークは特定のＰＣＲ増幅産物のシャープな融解ピークとは非常に異なるものである。厳格度の低いアニーリングでの多くのサイクル操作で得られた大きな不均質産物は純粋なＰＣＲ産物と比較した場合、低くかつ広い融解曲線を有する。
産物の純度決定のための本発明の方法を、ｄｓＤＮＡ特異性色素の蛍光をサイクルごとにモニタリングする方法に基づいて定量的ＰＣＲを改善するために利用した。蛍光は初期テンプレート濃度を変えた一連の反応において産物のポリメラーゼ伸長後に各サイクルごとに得た（図５７参照）。バックグラウンド蛍光以上の対数直線的増加は初期テンプレート濃度に応じて異なるサイクル数で始まる。１反応当たり１０6から１０2のコピーの範囲の５つの反応のプロットを約４サイクルで分離した。１反応当たり平均１０2のコピーを含む反応は反応効率の低下を示し、また初期コピー数が１００以下の反応はあまり有用でない蛍光プロファイルを示した。１０および１（平均）のコピーを含む反応の蛍光プロファイルは逆順に上昇し、また負の調節は約３０サイクル後に増幅を示した。これはプライマー・ダイマーおよびｄｓＤＮＡ特異性色素のサイクルごとの蛍光モニタリングでは目的産物から区別できないその他の非特異性増幅産物の増幅によるものである。
融解ピークを各試料について得たが（図５８参照）、これらは電気泳動の結果と非常に相関性の高いことが認められた（図６０）。０および１の平均初期テンプレートコピーを含む反応では、予期される５３６塩基対の位置では識別できる電気泳動バンドを作らない。１０および１００の初期テンプレートコピーを含む反応は弱い電気泳動バンドを示した。この結果は、０および１の初期コピーを含む反応の場合は目的とする産物の範囲（９０〜９２℃）ではＤＮＡ融解を示さず、また１０および１００コピーを含む反応の場合はこの温度範囲で小さいピークを示す、という融解ピーク解析と極めてよく一致する。１０3〜１０6の初期コピーを含む反応の場合の強い電気泳動バンドは、予想される９０〜９２℃の範囲における大きな融解ピークと極めて高い相関性を有する。
融解ピーク積分で求められる全産物に対する目的産物の比は、１０5コピーの場合の０．２８から０初期テンプレートコピーの場合の０．０００２の範囲であった。図５７の各データポイントに適当な比率をかけて補正プロットとした（図５９）。この方法は定量の有効ダイナミック範囲を１０と１の初期テンプレートコピー間にまで広げた。
上記のことから理解されるように、理想的には、ＰＣＲの産物検出と解析は増幅期間中の温度サイクリングと同時に行われる。もし産物の大きさ、配列、または融解プロファイルなどＤＮＡの基本的特性によってＰＣＲ中の産物を明確に同定することができれば、さらなる解析の必要はなくなる。
増幅中の配列特異性の検出は蛍光プローブにより行うことができる。単一プローブを２つの蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）色素で標識することができる。ポリメラーゼ・エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの加水分解は冷却時にドナー色素を放出させる。増幅が進行すると、ドナー色素からの蛍光は蓄積的に増加する。あるいはまた、ＦＲＥＴ色素を隣同士にハイブリッド化する２つの単一標識プローブ上に置くこともできる。加水分解とハイブリダイゼーション技法はともに、増幅と配列特異性産物の検出を同時にすることを可能にする。しかしながら、それぞれの標的に対しては特異なプローブが必要となる。プローブの合成と精製は取るに足らないことではなく、特に二重標識プローブの場合はそうである。
らせん／コイル安定性もまたＰＣＲ産物を具体的に同定するのに利用することができる。たとえば、一本鎖コンフォメーション多形性、変性勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動は、すべて異なるコンフォメーションの安定性に基づいて産物を分離する。ハイブリダイゼーションの安定性はＦＲＥＴを使用してリアルタイムにモニタすることができる。融解曲線のモニタリングもまた、ハイブリダイゼーション技法による配列における追加的な分別要素として利用されている。
エチジウム・ホモダイマーおよび臭化エチジウムがＤＮＡ変性をモニタするために使用される。ＰＣＲは臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩなどの多くのｄｓＤＮＡ特性色素と適合性がある。これらの色素は入手が容易かつ安価であり、プローブ合成は必要とされない。もしＰＣＲに臭化エチジウムが含まれていれば、ガラス毛細管試料チューブ中の試料からの蛍光が増加する。ＰＣＲ反応が起きたことを紫外線照射とＣＣＤカメラでモニタすることは本発明の範疇に入る。産物の同定ができるので、この種の色素を使用してのモニタリングは増幅後の別の解析を必要としなくなる。絶対的な配列特異性が必要とされることはめったにないが、産物の区別は通常必要となる。
形がＧＣ含量、長さおよび配列の関数である融解曲線を解析することによりＰＣＲ産物は増幅中に識別することができる。ＰＣＲ産物が融解する温度は広範囲にわたる。当分野で公知の実験式を使用すると、ＤＮＡの融解温度（Ｔm）に対するＧＣ含量の影響は、０％ＧＣ複合体は１００％ＧＣ複合体よりも４１℃低い温度で融解すると推測される。同じＧＣ含量とすると、４０塩基対のプライマー・ダイマーは１０００ｂｐの産物より１２℃低い温度で融解することになる。したがって、あるＰＣＲ産物のＴmの範囲は少なくとも５０℃にわたる。この広い温度範囲はほとんどのＰＣＲ産物を融解曲線で識別することを可能とする。長さの違いがあるため、プライマー・ダイマーは通常好ましいＰＣＲ産物より低い温度で融解する。不均質な産物は純粋なＰＣＲ産物より広い温度範囲で融解する。長いＰＣＲ産物は同定のためのフィンガープリントとして使用することができた内部融解ドメインを有するが、ここで試験したもの（図５３）を含めより小さなＰＣＲ産物は１つの主要転移温度で融解する。
ゲル電気泳動と異なり、融解曲線解析は長さが同じで異なるＧＣ／ＡＴ比を有する産物を区別することができる。加えて、同じ長さと同じＧＣ含量を有するが、それらのＧＣ分布が異なる２つの産物（均一分布のものに対して一端にＧＣクランプを有するもの）は、大きく異なる融解曲線を有する。小さな配列差異は、たとえばヘテロ接合体ＤＮＡの増幅においてヘテロ複合体が形成されるような場合でも観察が可能である。ヘテロ接合体ＤＮＡにおける単一塩基の違いは、完全相補性のＤＮＡと比べてヘテロ複合体のために１〜５℃の温度シフトを起こす。
混合物中で２℃以下の差で分離されたＰＣＲ産物は本発明を利用して区分することができる（図５６参照）。さらに、これらの融解曲線は存在する異なる産物の相対量を推測するために産物のピークに分解することができる（図６１参照）。異なるＰＣＲ産物の相対量を求めることができる能力は極めて有用である。たとえば、目的とする産物の全ｄｓＤＮＡに対する相対量の知識は、ｄｓＤＮＡ結合色素で反応をモニタするとき非特異性増幅を補正することができる。臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩを使用すると、初期テンプレート濃度が６〜８倍の大きさのものも定量することができる。しかしながら、感度は初期テンプレートコピー数が小さい場合は非特異性増幅によって制限される（図５７参照）。融解曲線（図５８参照）は複数のＰＣＲ産物を示し、特に初期コピー数が少ない場合にそうであるが、これは電気泳動にかけた後に観察される複数の産物とよく符合する（図６０参照）。予測範囲で融解する産物の全産物に対する比率は、非特異性増幅を補正するのに使用することができる（図５９参照）。この比率は全産物に対する予期産物量に上限を与えることになる。２つ以上の産物の混交のために電気泳動の結果を見誤ることがあるため、予期範囲で融解する産物のいくつかは目的とする産物でないことがありうる。しかしながら予期産物の範囲内で融解するｄｓＤＮＡがないとすれば、予期される産物がまったく存在しないと結論付けることができる。
融解曲線解析は定量のダイナミック範囲を低い初期コピー数へ広げるために使用することができる。さらに重要なことは、融解ピーク解析は、蛍光が非特異性増幅からではなく目的とする産物から派生されるという確実性のレベルを高いものとすることである。ＰＣＲにおける蛍光モニタリングの有用性は、もし産物の同定をチェックするためにゲル電気泳動を必要とするということになれば限定されたものとなる。融解ピーク解析は以後の電気泳動を必要とすることなくＰＣＲ期間中に産物の同定を可能とする。
２つのＰＣＲ産物の相対量に分解できる能力もまた競合定量ＰＣＲでは有用である。同じプライマーを使用し、産物のＧＣ／ＡＴ比または長さを変えることにより、天然のアンプリコンより２〜３℃離れた融解温度を有する競合テンプレートを本発明に基づいて設計した。既知量の競合物を未知量の天然テンプレートに添加し、テンプレートを増幅し、融解曲線を得、産物のピークを分解した。産物が同じ効率で増幅されると仮定すれば、産物の比率は初期テンプレート同士の比率ということになる。
融解曲線解析にはいくつかの限界がある。融解曲線の絶対位置と幅は温度転移速度（図５２Ｂ参照）および色素濃度（図５２Ａ）に影響を受ける。臭化エチジウムなどのインターカレータの添加は融解温度を上昇させ、融解転移の幅を広げる。融解曲線は確実に平衡させるために約０．５℃／分の速度で得ることが多いが、融解温度が２℃またそれ以下異なる産物を区分するために１２℃／分（０．２℃／秒）の速度を使用することができる（図５３参照）。遅い転移速度および／または試料温度の均一性が高い場合はさらに良好な分解が可能である。
本発明の融解ピーク解析はＰＣＲと完全に一体化した製品識別法を提供する。ゲル電気泳動によるサイズ分画と同様に、融解ピーク解析はＤＮＡの基本的特性を計測し、増幅した産物を同定するために使用することができる。ＰＣＲの蛍光モニタリングと融解曲線解析の組み合わせは、同時増幅、検出およびＰＣＲ産物の識別に関する有望な方法を提供する。
迅速サーマル・サイクリングを用いたオンラインＤＮＡ解析システムに関する情報は、米国特許願第０８／３８１，７０３号（１９９５年１月３１日出願）に見られるが、これを本明細書の一部を構成するものとしてここに引用する。
本発明はその精神または基本的特性から離れることなく別の特定の形で実施することもできる。説明した実施態様はすべての点において説明のためだけであり、かつ限定的なものではない。したがって、本発明の範囲は前述の説明ではなく付帯の請求項で示されるものとする。本請求項と均等の意味および範囲に入るすべての変更は、本請求項の範囲に入るものとする。
プログラミング・コード付表を次ページに示す。
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配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ウィットワー，カール，ティー．（Carl T. Wittwer）リリー，カーク，エム．（Kirk M. Ririe）ラスマッセン，ランディ，ピー．（Randy P. Rasmussen）ヒルヤード，デヴィッド，アール．（David R. Hillyard）
（ii）発明の名称：生物学的プロセスを実行し、モニターするためのシステム及び方法
（iii）配列の数：６
（iv）連絡先：
（Ａ）宛先：ソープ、ノースアンドウェスタン
（Ｂ）通り：南９０３５東７００番地、２００号室
（Ｃ）市：サンディ
（Ｄ）州：ユタ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：８４０７０
（ｖ）コンピュータ可読形式：
（Ａ）媒体のタイプ：３．５インチディスケット、記憶容量１．４メガバイト
（Ｂ）コンピュータ：東芝 ２００ＣＤＳ
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ ７．０
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト ７．０
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９７年６月４日
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（viii）弁護士／代理人の情報
（Ａ）氏名：グラント  Ｒ．クレイトン
（Ｂ）登録番号：３２，４６２
（Ｃ）整理／事件番号：８６１６ＣＩＰ５
（ix）通信情報：
（Ａ）電話番号：（８０１）５６６-６６３３
（Ｂ）ＦＡＸ番号：（８０１）５６６−０７５０
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号１
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（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号２
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（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号３
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（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号４
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（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号５
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（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０
（Ｂ）形式：核酸
（Ｃ）鎖性：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（xi）配列の記述：配列番号６
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004278712.tif 000023
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
0004278712.tif 000026
【図９Ａ】
0004278712.tif 000027
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６Ａ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
0004278712.tif 000053
【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４３Ａ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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