(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳類宿主細胞を、ポリオール及び銅イオンが補充された血漿由来のタンパク質を含まない培地中で培養することを特徴とする、因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳類宿主細胞からの組み換え因子ＶＩＩＩの生産方法。
【請求項２】
ポリオールがプルロニックＦ−６８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）（登録商標；コポリマーの２０重量％のポリ（オキシプロピレン）の中心ブロック及び両端のポリ（オキシエチレン）ブロックからなる平均分子量が８４００の非イオン性ブロックコポリマー）であり、０．０２５〜０．２重量％の範囲の濃度で培地中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地が硫酸銅を５０〜８００ｎＭの範囲の量で含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マンガンイオンが１．５〜４．５ｎＭの範囲の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
モリブデンを含有するイオンが１．５〜４．５ｎＭの範囲の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ケイ素を含有するイオンが７５〜３００ｎＭの範囲の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
クロムイオンが１．０〜４．０ｎＭの範囲の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リチウムイオンが１２０〜４８０ｎＭの範囲の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該哺乳類宿主細胞がベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胚腎臓細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）基礎培地；
（ｂ）ポリオール；及び
（ｃ）銅イオン
を含んでなり、血漿由来のタンパク質を含まない組み換え因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳類宿主細胞の培養のための培地。
【請求項１１】
マンガン、モリブデン、ケイ素、クロム及びリチウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の微量金属をさらに含んでなる請求項１０に記載の培地。
【請求項１２】
銅イオンが５０〜８００ｎＭの範囲の量で存在する請求項１０に記載の培地。
【請求項１３】
１．５〜４．５ｎＭの範囲の量で存在するモリブデンイオンをさらに含んでなる請求項１２に記載の培地。
【請求項１４】
１２０〜４８０ｎＭの範囲の量で存在するリチウムイオンをさらに含んでなる請求項１２に記載の培地。
【請求項１５】
組み換え法により生産されたインスリンをさらに含んでなる請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
分野：
本発明は一般的に組み換え因子ＶＩＩＩの製造にならびに特定的に血清又はタンパク質を含まない培地中における組み換え因子ＶＩＩＩの製造に関する。
【０００２】
先行技術：
血友病Ａは欠陥又は欠失因子ＶＩＩＩ分子に基因するＸ−連鎖劣性遺伝病（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）であり、出血傾向を生ずる。出血場面（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を抑制するために、血友病者は因子ＶＩＩＩで処置される。歴史的には、因子ＶＩＩＩはヒト血漿から単離された。しかしながら、血漿−由来因子ＶＩＩＩを用いる治療は肝炎及びヒト免疫不全ウィルスなどの数種のヒトのウィルスの伝染を伴ってきた。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術が出現し、ヒト因子ＶＩＩＩ及びその遺伝子の構造が明らかになった。２６個のエキソンから誘導される遺伝子の転写産物は長さが約９０００塩基のメッセンジャーＲＮＡであり、２３５１個のアミノ酸の大きなタンパク質をコードする。因子ＶＩＩＩの構造的研究は、それがかなりの数の炭水化物残基を含有する糖タンパク質であることを示している。
【０００４】
因子ＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡがクローニングされ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で安定して発現された。血友病Ａの処置のために組み換え因子ＶＩＩＩを生産する商業的プロセスが開発された。現在組み換え因子ＶＩＩＩは遺伝子工学的に操作された哺乳類細胞により製造され、かくして血漿への信頼を取り除き（ｏｂｖｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｌｉａｎｃｅ）、考えられるウィルス伝染の危険を最小にしている。
【０００５】
遺伝子増幅は治療的タンパク質のための高生産性細胞系を誘導するために選ばれる方法であった。増幅戦略は、所望のタンパク質をコードする転写単位をジヒドロ葉酸レダクターゼなどの増幅可能なマーカーに連鎖させること（ｌｉｎｋｉｎｇ）を含む。次いでトランスフェクション法が適用され、ベクターＤＮＡを受容細胞に転移させる。メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などの選ばれた薬剤への耐性の向上に関して細胞集団を選択する。限界希釈クローニングにより安定な細胞クローンの確立を行う。次いでこれらの細胞クローンを無血清生産培地に適応させ、所望のタンパク質の生産に関して監視する。
【０００６】
因子ＶＩＩＩのような不安定なタンパク質の場合、製造及び精製手順の間、安定剤としてヒトアルブミンが加えられてきた。アルブミンは低温殺菌によりウィルス不活化段階に供されるが、ヒト及び動物の血液タンパク質の完全な不在下で組み換え因子ＶＩＩＩを製造することができたら理想的である。今回、私は、新規な細胞培養培地を用いることによりこれが可能であることを見いだした。詳細を下記に記載する。
【０００７】
【発明の概略】
ヒト又は動物−由来血漿タンパク質の不在下で哺乳類細胞から比較的大量の組み換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）を連続的に生産するための方法は、プルロニックＦ−６８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）などのポリオールポリマーが補充されたタンパク質を含まない培地中で哺乳類宿主細胞を培養することを含む。好ましい培地は硫酸銅、硫酸第１鉄／ＥＤＴＡ錯体ならびにマンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム及びクロムなどの微量金属の塩を含む。
【０００８】
【発明の詳細な記述】
組み換えタンパク質発現法における近年の発達は、哺乳類細胞中で大量にタンパク質を生産することを可能にしてきた。因子ＶＩＩＩ生産に適した宿主細胞には、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞などの細胞系が含まれる。特に好ましいのはベビーハムスター腎臓細胞であり、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）に記載されているような因子ＶＩＩＩの発現を方向付けることができる遺伝子でトランスフェクションされたものが特別に好ましい（クローン変異株及びその子孫などの誘導体を含む）。そのような細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受理番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８５４４が指定されている。
【０００９】
因子ＶＩＩＩ遺伝子を保有している所望の宿主細胞系は、典型的に、リポタンパク質が補充されたタンパク質を含まない生産培地中の懸濁培養として生育するように適応させられる。宿主細胞系の培養のために選ばれる基礎培地は、本発明にとって重要ではなく、哺乳類細胞の培養のために適した当該技術分野で既知の培地のいずれかの１つ又は組み合わせであることもできる。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｈａｍの培地Ｆ−１２（Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ−１２）、Ｅａｇｌｅの最少必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）及びＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地が商業的に入手可能である。組み換えインスリンなどの成長因子の添加は当該技術分野において通常である。
【００１０】
因子ＶＩＩＩの不安定性の故に、操作された宿主細胞の生産性はタンパク質を含まない条件下で非常に低下する。組み換えタンパク質の生産のための無血清培養補充物としてヒト血清アルブミンが通常用いられる。ヒト血清アルブミンは：（１）脂肪酸、コレステロール及び親油性ビタミン類、ステロイドホルモンならびに成長因子のための担体として；（２）剪断力による損傷に対する保護剤として；（３）ｐＨ変化のための緩衝剤として；ならびに（４）浸透圧調整剤としてを含む多くの機能を提供する。アルブミンの他の重要な役割はおそらく、プロテアーゼのための基質として働くこにより因子ＶＩＩＩなどの不安定なタンパク質をタンパク質分解から保護することである。
【００１１】
アルブミン調剤中に存在する不純物もアルブミンの安定化効果に寄与しうる。リポタンパク質（Ｃｈａｎ，１９９６）などの因子は、無血清条件下における組み換え因子ＶＩＩＩの生産のためのヒト血清アルブミンのための代替物として同定された。
【００１２】
ヒト血漿−由来アルブミンを含有しない生産培地を開発する我々の試みは、本開示の発明、組み換え因子ＶＩＩＩ生産のための基礎無タンパク質培地に導いた。好ましい培地は、１０μｇ／ｍｌにおける組み換えインスリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）及びＦｅＳＯ4・ＥＤＴＡ（５０μＭ）が補充された修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地及びＨａｍのＦ−１２培地（重量で５０：５０）から成る。因子ＶＩＩＩ生産を除き、操作されたＢＨＫ細胞はこのタンパク質を含まない基礎培地中で十分に生育する。
【００１３】
驚くべきことに、プルロニックＦ−６８などのポリオールの添加は生育に効果を有していなかったが、因子ＶＩＩＩに関するＢＨＫ細胞の特異的生産性を増強した。予期しないことに、硫酸銅の添加はさらに因子ＶＩＩＩの生産を増強する。マンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム及びクロムなどの微量金属の一団の含有も因子ＶＩＩＩ生産をさらに増加させた。次いでヒト血漿−由来タンパク質を含有しない条件下における因子ＶＩＩＩ生産のための連続プロセスが開発された。プルロニックポリオールの使用に関するさらなる情報は、Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（１９９１）及びＳｃｈｍｏｌｋａ（１９７７）に見いだすことができる。
【００１４】
ポリグリコールであるプルロニックＦ−６８（ＢＡＳＦ、Ｗｙａｎｄｏｔ）は、通常、撹拌された培地において起こる発泡を防ぐためならびに散布された培養（ｓｐａｒｇｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における剪断応力及び泡損傷から細胞を保護するために用いられる。プルロニックＦ−６８は、ポリ（オキシプロピレン）（２０重量％）の中心ブロック及び両端のポリ（オキシエチレン）のブロックから成る平均分子量が８４００の非イオン性ブロックコポリマーである。プルロニックＦ−６８の役割に関する広範囲の研究は、プルロニックＦ−６８が界面活性剤として作用し、撹拌又は散布の間にバイオリアクター中に生成する泡から細胞のドレナージ（ｄｒａｉｎａｇｅ）を遠ざけることにより細胞への損傷を防ぐことを示している。しかし数人の研究者は、剪断が最小である培養条件下における生育へのプルロニックＦ−６８の有益な効果に気付いた（Ｍｉｚｒａｈｉ，１９７５；Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｏｃｈｅｅ，１９９０）。生成物精製の間のプルロニックＦ−６８との脂質の共−精製は、プルロニックポリマーが界面活性剤としてアルブミンの代替となるのみでなく、脂質のための担体としても作用することができるという話題となる証拠を与える。プルロニックＦ−６８は、おそらく膜内への直接の挿入により、修復を行うことができる前に細胞を死亡させないように膜の損傷を防ぐこともできる。金属イオン緩衝体として作用する時のプルロニックＦ−６８の役割は完全に未知である。
【００１５】
培地中におけるプルロニックＦ−６８は容量測定的生産性を増加させることができるという報告があるが、作用の機構は細胞生存率の維持であると思われる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９８９；Ｑｉ，１９９６）。我々の知識では、これがプルロニックＦ−６８が特定のタンパク質生成物の特異的生産を増加させることが観察された最初である。プルロニックＦ−６８を用いるか又は用いない我々の系において生存率及び生育速度は比例するので、細胞生存率の維持は我々の系におけるプルロニックＦ−６８の作用の機構ではあり得ない。しかしながら、機構が何であろうと、プルロニックＦ−６８添加の効果は直接的であり且つ劇的である。
【００１６】
ある範囲の他のポリオールが類似の効果を有するであろうことは予想される。そのような他のポリオールには、約１０００〜約１６，０００の範囲の分子量を有するポリ（オキシエチレン）とポリ（オキシプロピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが含まれる。
【００１７】
震盪フラスコ、スピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋｓ）及びローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅｓ）などの通常の懸濁培養法の他に、本発明の方法は潅流及びバッチバイオリアクターと一緒の使用にも適用できる。宿主細胞の培養に続き、限外濾過又は遠心分離などの標準的方法により、因子ＶＩＩＩを使用された培地から回収することができる。所望により、回収された因子ＶＩＩＩを例えばイオン交換又は寸法排除クロマトグラフィー、イムノアフィニティーあるいは金属キレートクロマトグラフィーなどにより精製することができる。
【００１８】
本明細書で用いる場合の「ヒト又は動物タンパク質を含まない培地」は、ヒト供給源又は動物供給源に由来するいずれのタンパク質も含有しない細胞培養培地である。ヒト又は動物供給源から単離されるタンパク質は、本来、ウィルス汚染を導入する危険を有する。ヒト又は動物タンパク質を含まない培地の目的は、かくしてウィルス伝染の危険を排除するか又は少なくとも大きく減少させることである。
【００１９】
【実施例】
実施例１：
因子ＶＩＩＩの発現を方向付けることができる遺伝子を用いてトランスフェクションされたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞はＧｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から得た。細胞系をＷｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）に詳細に記載されている通りに調製し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、受理番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８５４４が与えられた。この細胞系のクローン変異株もＧｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，から得、すべての実施例において用いた。
【００２０】
因子ＶＩＩＩをコードする遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞を、以下：ＨａｍのＦ−１２培地及びＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（重量で５０：５０）、Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（組み換えインスリン、５〜１０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ4・ＥＤＴＡ（５０μＭ）及びＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）を含有する無血清基礎培地を用い、震盪フラスコ中の懸濁培養として培養した。細胞を保持し、４８時間の間隔で継代させた。細胞を８００×ｇにおいて５分間回転させ、計数し、１ｍｌ当たり１×１０6個の細胞という密度で再播種した。各フラスコは５０〜１００ｍｌの新しい培地を含有する。震盪フラスコを回転機上に置き、３７℃でインキュベーションし、９０〜１１０ｒ．ｐ．ｍ．で穏やかに渦動させることにより懸濁培養として保持した。下記においてＦ−６８として示されるプルロニックＦ−６８（０．１％）などのポリオール及び硫酸銅（５０ｎＭ）の因子ＶＩＩＩ生産への効果を震盪フラスコにおいて調べた。因子ＶＩＩＩは色原体アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ）により定量した。アッセイはＣｏａｔｅｓｔ  ＶＩＩＩ：Ｃ／４として既知の試験キットとして市販され、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能である。細胞はこの手順により２４日間保持された。Ｃｏａｔｅｓｔ  ＶＩＩＩ：Ｃ／４キットを用いて決定された各培地における因子ＶＩＩＩ活性を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
＊３６個の試料の平均±標準偏差。細胞は上記の通り２４日間に及んで因子ＶＩＩＩ生産に関して監視された。
【００２３】
＊＊滴定実験が、０．１％がプルロニックＦ−６８の最適用量であることを示した。０．３％に濃度を増加させることは因子ＶＩＩＩ生産に有意な影響を有していなかった。用量−応答実験が、５０〜８００ｎＭの硫酸銅が因子ＶＩＩＩ生産に最適であることを明らかにした。
【００２４】
表１に示される通り、単独の又は好ましくは硫酸銅と組み合わされたプルロニックＦ−６８の添加は、タンパク質を含まない条件下で、因子ＶＩＩＩをコードする遺伝子を含有するＢＨＫ細胞の力価及び特異的生産性を有意に増強した。
【００２５】
実施例２：
タンパク質を含まない条件下における因子ＶＩＩＩの生産をさらに最適化するために、微量の金属を無タンパク質培地に加えた。次いで実施例１で記載された連続震盪フラスコ培養系により因子ＶＩＩＩ生産を１６日間評価した。データを表２に示す。硫酸銅の不在下では、微量金属は因子ＶＩＩＩ生産性に効果を有していなかった。表２を参照されたい。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
＊金属はＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（５０ｎＭ）、ＭｎＳＯ4（３ｎＭ）、Ｎａ2ＳｉＯ3・９Ｈ２Ｏ（１．５μＭ）、［ＮＨ4］6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ２Ｏ（３ｎＭ）、ＣｒＫ（ＳＯ4）2・４Ｈ2Ｏ（１．５ｎＭ）及びＬｉＣｌ（２３６ｎＭ）を含む。
【００２８】
実施例３：
因子ＶＩＩＩ生産への微量金属及び銅の効果を潅流発酵器においてさらに評価した。２つの１．５−リットル発酵器に表１に記載の基礎培地を用い、１ｍｌ当たり２ｘ１０6個という細胞の密度でＢＨＫクローン変異株を播種した。発酵器を０．５リットル／日の速度で潅流した。１つの発酵器を標準として保持し、他の発酵器に表２に記載されている通り、銅及び微量金属を補充した。発酵器を１ｍｌ当たり約２〜３ｘ１０6個の細胞という平均細胞密度で１５日間保持した。表３に示される通り、プルロニックＦ−６８、銅及び微量金属の添加は、連続潅流条件下における無タンパク質条件下で、因子ＶＩＩＩをコードする遺伝子を内在させているＢＨＫ細胞の特異的生産性を有意に増強した。この生産法は、沈降タンクなどの細胞保持装置が備えられた比較的大きな発酵器（２００〜５００リットル）に容易に適応させることができる。
【００２９】
【表３】
0004257685.tif 000004
【００３０】
上記の実施例は本発明を例示する手段として示されており、本発明を制限するとみなされるべきではなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３１】
本発明の主たる特徴及び態様は以下の通りである。
【００３２】
１．因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳類宿主細胞を、ポリオールが補充されたヒト又は動物タンパク質を含まない培地中で培養することを含む、因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳類細胞からの組み換え因子ＶＩＩＩの生産方法。
【００３３】
２．培地が銅イオンを含む上記１項の方法。
【００３４】
３．ポリオールがプルロニックＦ−６８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）であり、約０．０２５〜約０．２重量％の範囲の濃度で培地中に存在する上記１項の方法。
【００３５】
４．培地が硫酸銅を約５０〜約８００ｎＭの範囲の量で含む上記１項の方法。
【００３６】
５．マンガンイオンが約１．５〜約４．５ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００３７】
６．モリブデンを含有するイオンが約１．５〜約４．５ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００３８】
７．ケイ素を含有するイオンが約７５〜約３００ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００３９】
８．クロムイオンが約１．０〜約４．０ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００４０】
９．リチウムイオンが約１２０〜約４８０ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００４１】
１０．該哺乳類宿主細胞がベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胚腎臓細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる群より選ばれる上記１項の方法。
【００４２】
１１．ヒト又は動物タンパク質を含有しない、上記１項の方法に従って作られた組み換え因子ＶＩＩＩ生成物。
【００４３】
１２．ポリオールを含む基礎培地を含む組み換え因子ＶＩＩＩの生産のためのヒト又は動物タンパク質を含まない細胞培養培地。
【００４４】
１３．銅イオンを含む上記１２項の培地。
【００４５】
１４．マンガン、モリブデン、ケイ素、クロム及びリチウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の微量金属を含む上記１３項の培地。
【００４６】
１５．インスリンを含む上記１４項の培地。
【００４７】
【表４】
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