(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有するキメラ分子：
Ｒ1−（Ｌ）j−（Ｒ2）n
［式中Ｒ1は、１４０ｋＤａのｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるｈＩＬ４レセプターサブユニットと相互作用するドメイン中にアミノ酸残基１３のリジンへの突然変異を含むＩＬ１３である突然変異型ヒトインターロイキン１３（ＩＬ１３）であり、
Ｊ及びｎは独立に０または１であり；
Ｒ2はエフェクター分子であり；及び
Ｌはリンカーである。］
【請求項２】
前記エフェクター分子は、サイトトキシン、標識体、抗体、リポゾーム及び脂質からなる群から選択される請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項３】
前記リンカーがペプチドリンカーである請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項４】
Ｒ2がジフテリア毒素及びシュードモナス外毒素からなる群から選択されたサイトトキシンである請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項５】
Ｒ2が本質的にドメインＩａを欠いた修飾シュードモナス外毒素である請求項４に記載のキメラ分子。
【請求項６】
Ｌ又はＲ2が存在する場合、それらがＲ1のカルボキシル末端に結合している請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項７】
Ｌ又はＲ2が存在する場合、それらがＲ1のアミノ末端に結合している請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項８】
Ｒ2がＰＥ３８ＱＱＲ及びＰＥ４Ｅからなる群から選択されるシュードモナス外毒素である請求項５に記載のキメラ分子。
【請求項９】
該分子が、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ６６Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．ＥＩ３Ｋ／ＲＳ６９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／ＲＩ１２Ｄからなる群より選択される請求項１２に記載のキメラ分子。
【請求項１０】
突然変異型ヒトＩＬ１３が、１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるヒトＩＬ４及びＬ１３レセプターサブユニットと相互作用するドメイン内にアミノ酸残基１３のリジンへの突然変異を含む、突然変異型ヒトインターロイキン１３（ＩＬ１３）を含む特異的結合部分。
【請求項１１】
結合部分がさらに該突然変異型ヒトインターロイキン１３に結合したエフェクター分子を含む請求項１０に記載の結合部分。
【請求項１２】
エフェクター分子がサイトトキシン、標識体、抗体、核酸及びリポゾームよりなる群より選択される請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１３】
エフェクター分子が該突然変異型ヒトインターロイキン１３と化学的に結合する請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１４】
結合部分が組換えにより発現した融合蛋白である請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１５】
エフェクター分子が該突然変異型ヒトインターロイキン１３のカルボキシル末端に融合する請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１６】
エフェクター分子が該突然変異型ヒトインターロイキン１３のアミノ末端に融合する請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１７】
エフェクター分子がシュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン、アビリン、サポリン、及びアメリカヤマゴボウウイルスタンパク質よりなる群より選択される請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１８】
サイトトキシンがドメインＩａを欠いたシュードモナス外毒素である請求項１７に記載の結合部分。
【請求項１９】
突然変異型Ｌ１３が、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄよりなる群から選択される請求項１８に記載の結合部分。
【請求項２０】
結合部分が、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ６６Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．ＥＩ３Ｋ／ＲＳ６９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄからなる群より選択される請求項１８に記載の結合部分。
【請求項２１】
医薬品として許容される添加物；及び
１４０ｋＤａのｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるヒトＩＬ４及びＬ１３レセプターサブユニットと相互作用するドメイン内にアミノ酸残基１３のリジンへの突然変異を含むＩＬ１３である突然変異型ヒトインターロイキン１３（ＩＬ１３）に共有結合したサイトトキシンを含む細胞毒性分子、を含む薬学的組成物。
【請求項２２】
突然変異型ＩＬ１３が、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄよりなる群から選択される請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
エフェクターがジフテリア毒素、及びシュードモナス外毒素よりなる群より選択される請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
サイトトキシンがドメインＩａを欠いたシュードモナス外毒素である請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
サイトトキシンが、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ６６Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／ＲＳ６９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄからなる群より選択される請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
キメラ分子では、その未変性状態では分離して存在している２またはそれ以上の分子が１つに結合し、構成分子全ての所望機能を有する単一単位（分子）を形成する。キメラ分子の構成分子の一つは“ターゲティング分子”であることが多い。ターゲティング分子は、リガンドや抗体などの分子であり、対応する標的、例えば細胞表面上のレセプターと特異的に結合する。すなわち、例としてターゲティング分子が抗体である場合、キメラ分子は、（標的）細胞とその抗体に対するエピトープを有する組織とを特異的に結合するだろう。
【０００２】
キメラ分子の別の構成要素は“エフェクター分子”である。エフェクター分子は、キメラ分子が特異的に指向する標的に特異的に輸送される分子を意味する。エフェクター分子は、通常、標的細胞に与えられることが望まれる特徴的な活性を有する。エフェクター分子は、サイトトキシン、標識体、放射性核種、その他のリガンド、抗体、薬物、プロドラッグ、リポソーム等を含む。
【０００３】
具体的には、エフェクター成分がサイトトキシンの場合、キメラ分子は、特別な標識分子を有する細胞にサイトトキシンを特異的に狙い付けさせる強力な殺細胞物質として機能するだろう。例えば、シュードモナス外毒素（ＰＥ）と融合したインターロイキン４（ＩＬ４）又は形質転換成長因子（ＴＧＦα）、ジフテリア毒素（ＤＴ）と融合したインターロイキン（ＩＬ２）を含むキメラ融合タンパク質は、ガン細胞を特異的に標的とし殺滅する（Pastan et al., Ann.Rev.Biochem., 61:331-354(1992)）。
【０００４】
これらキメラサイトトキシンのターゲティング部分は、成長因子レセプター、特に正常細胞に比べガン細胞において過剰発現されているレセプターを特異的に標的とし結合するものより選択されることが多い（例えば、Debinski et al.(1993)J.Biol.Chem., 268:14065-14070, Phillips et al,(1994) Cancer Res., 54:1008-1015, Debinski et al.(1994) Int.J.Cancer, 58:744-748）。しかし、標的レセプターがガン細胞上に過剰発現されている場合においても、やはり有意なレベルで正常細胞上でもレセプターが発現されている。従って、サイトトキシンに関する治療ウインドウを得ることができる場合でも、その投与に関しては正常細胞上の成長因子レセプターの存在に関連する毒性により用量が規定される（Phillips et al.(1994) Cancer Res., 54:1008-1015, Debinski et al. (1994) Int. J.Cancer, 58: 744-748）。従って、正常細胞と比較してガン細胞に対しより高い特異性を有する標的、又は標的リガンドを特定し、それにより有毒な副作用が低減するかあるいはこれをともなうことなく投与できるように投与レベルを改善できれば望ましい。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、正常細胞に比べガン細胞に対し高い特異性を有し、従って各種新生物に対しエフェクター分子を特異的に送達するうえで極めて効果的な新規ターゲティングリガンド（特異的結合部分）を提供する。ターゲティングリガンドは、１４０ｋＤａのｈＩＬＲβサブユニットと称されるｈＩＬ４レセプターサブユニットと相互作用するドメイン中に１またはそれ以上の突然変異を有する突然変異型ＩＬ１３分子である。
【０００６】
特に好ましい本発明の突然変異型ＩＬ１３分子（特異的結合部分）は突然変異したヒトＩＬ１３分子である。これら分子は残基１２，１３，１４，６５、６６、６７、６８、６９、７０、１０９又は１１２を含む様々な残基の１またはそれ以上に突然変異を起こすことができる。具体的実施態様の１つでは、残基１３は塩基性アミノ酸である。別の好ましい突然変異型ＩＬ１３分子は、残基１３にリジン又はアスパラギン酸を、そして／又は残基６６にアスパラギン酸を、そして／又は残基６９にアスパラギン酸、及び／又は残基１０９又は１１２にアスパラギン酸を含む。未変性ヒトＩＬ１３が突然変異する場合、これら突然変異はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｒ、ｈＩＬ１３．Ｒ６６Ｄ、ｈＩＬ１３．Ｓ６９Ｄ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ｈＩＬ１３．Ｒ１０９Ｄ及びｈＩＬ１３．Ｒ１２２Ｄを含むことができる。好ましい二重突然変異はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ６６Ｄ又はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｓ６９Ｄを含む。特異的結合部分（突然変異型ＩＬ１３）はここに記載の如くにエフェクター分子に結合し、従って含むことができる。
【０００７】
実施態様の１つでは、ここに記載の突然変異型ＩＬ１３分子のいずれかは以下の式を有するキメラ分子の成分である；
Ｒ1−（Ｌ）j−（Ｒ2）n
式中、Ｒ1は突然変異型ヒトインターロイキン１３であり、ｊ及びｎは独立に０又は１である；Ｒ2はエフェクター分子である；そしてＬは随意のリンカーである。エフェクター分子は突然変異ＩＬ１３に結合できる何れの分子でもよい。エフェクター分子は、サイトトキシン、標識体、抗体、リポソーム、脂質、ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター、組換え体ウイルス、化学療法薬、抗癌性抗生物質、光増感剤等を含むが、これに限定されるものではない。特に好ましいサイトトキシンは、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素を含む。シュードモナス外毒素は実質的にドメインＩａを欠くように修飾でき、最も好ましいシュードモナス外毒素はＰＥ３８ＱＱＲ及びＰＥ４Ｅを含む。エフェクター分子は、末端への結合が好ましいが、突然変異型ＩＬ１３分子のアミノ末端、カルボキシル末端、又は中間残基に結合することができる。
【０００８】
好ましい細胞毒性キメラ分子は融合蛋白であり、ここの記載のサイトトキシンと融合した突然変異型ＩＬ１３分子の何れかを含む。特に好ましいサイトトキシンはシュードモナス外毒素と融合した上記突然変異型ＩＬ１３分子の何れかを含む（すなわち、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ等）。特に好ましいサイトトキシン分子は、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｒ６６Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｒ６６Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｓ６９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｓ６９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ６６Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ｈＩＬ１３．ＥＩ３Ｋ／ＲＳ６９Ｄ−ＰＥ４Ｅ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｒ６６Ｄ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｓ６９Ｄ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｒ１０９Ｄ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｒ１１２Ｄ、ＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１０９Ｄ及びＤＴ３９０−ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ／Ｒ１１２Ｄを含むが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００１１】
ここに記した細胞毒性キメラ分子は、医薬組成物の成分として利用できる。この実施態様では、組成物は１またはそれ以上の本発明の細胞毒性キメラ分子及び医薬品として受け入れ可能な賦形剤を含む。
【００１２】
変異型ＩＬ１３は検出可能な標識体を結合することができる。キメラ標識体を用いて、ＩＬ１３レセプターを発現している細胞、または細胞群を検出し／又は局在化し／又は定量化できる。被検体に投与されると、標識体はＩＬ１３レセプターを発現又は過剰発現している細胞部位に局在化し、標識体の検出はこれら細胞の存在、不在、又は位置の指標を提供するだろう。同様に、例えば被検体より得た生物サンプルを使いｅｘ  ｖｉｖｏ検出もできる。
【００１３】
本発明はＩＬ１３を発現している細胞の検出、又はこれら細胞の成長及び／又は増殖の阻害に適したキットを提供する。キットは本発明の突然変異型ＩＬ１３を含む１又はそれ以上の容器を含むことが好ましい。突然変異型ＩＬ１３は標識体（例えば、ＩＬ１３Ｒを持つ細胞の検出の為の）又はサイトトキシン（例えば、ＩＬ１３Ｒを持つ細胞の成長を阻害する為の）に結合できる。本発明の細胞毒性まはた標識性（又はその他の）キメラ分子の何れかをキットに含めることができる。
【００１４】
（用語の定義）
ここで用いる“特異的に結合する”という用語は、タンパク質又はポリペプチド、あるいはレセプターを指す場合には、タンパク質及びその他の生体物質の異種集団においてタンパク質又はポリペプチド、或いはレセプターの存在を決定する結合反応を意味する。すなわち、定められた条件下（例えば抗体の場合では免疫アッセイ条件）では特異的リガンド又は抗体はその特定の“ターゲット”に結合し（例えばＩＬ１３はＩＬ１３レセプターと特異的に結合する）、サンプル中に存在するその他のタンパク質、又は生体内に於いてリガンド或いは抗体が接触するであろう他のタンパク質に有意量結合することはない。
【００１５】
１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるｈＩＬ４レセプターサブユニットは、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞）の様な“正常細胞”（非新生物性細胞）上にある共有ＩＬ１３／ＩＬ４レセプター及びその他全てのＩＬ４レセプターに共通するポリペプチドを指す(see, e.g., Idzerda et al (1990)J Exp. Med., 171: 861-873)。
【００１６】
ここで用いる“１４０ｋＤＡｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるｈＩＬ１３／ＩＬ４レセプターサブユニットと相互作用する（又は特異的に相互作用する）ドメイン”という句は、その分断がＩＬ１３／ＩＬ４レセプターに対するＩＬ１３の結合を減じ又は除き、又は１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットを発現する細胞又は細胞群（例えばＨＵＶＥＣ内皮細胞）に及ぼす、分断されたＩＬ１３分子を有するキメラ分子のエフェクター活性（例えば細胞毒性活性）を減じ又は除くような、ポリペプチド（例えばＩＬ１３）のドメインを意味する。ドメイン中の１又はそれ以上のアミノ酸の変化は、１４０ｋＤＡｈＩＬ４Ｒβサブユニットを発現している細胞との相互作用を減じるが、制限ＩＬ４Ｒ独立ＩＬ１３結合部位を過剰発現している細胞（例えば神経膠腫）上に於けるＩＬ１３又はＩＬ１３キメラ分子の相互作用の改善を示す。
【００１７】
ポリペプチド中の突然変異とは、ポリペプチド中の特定位置のアミノ酸が、その位置で別のアミノ酸に置換することを意味する。すなわち、例えば突然変異ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋは、ＩＬ１３の位置１３に於ける天然アミノ酸（グルタミン酸、Ｅ）がリジン（Ｋ）に置き換わることを示す。“突然変異”は問題となるアミノ酸の実際の除去及び置換を必要としない。タンパク質は、所望突然変異位置にあるアミノ酸を“置換”することで、総合的な結果が問題のアミノ酸置換に等しくなるようにｄｅ  ｎｏｖｏ創製することが可能である。
【００１８】
“突然変異型ＩＬ１３”または“突然変異型ｈＩＬ１３”とは、１以上のアミノ酸がＩＬ１３の天然形態中の該当アミノ酸とは異なるＩＬ１３を意味する。すなわち、例えば天然ヒトＩＬ１３が位置１３にグルタミン酸を持つが、突然変異型ヒトＩＬ１３は位置１３にグルタミン酸以外のアミノ酸（例えばグルタミン酸がリジンに置換される）を持つことができる。本発明の突然変異型ＩＬ１３分子は、他の哺乳動物種の突然変異型ＩＬ１３分子を含み（例えば、ラット、マウス、ブタ、ラルゴモルフ（largomorph）、ヒト以外の霊長類、ウシ、イヌ等）、また本発明は獣医学並びにヒト医療条件でのキメラ分子の利用を企図するものである。
【００１９】
ここで用いるキメラ分子とは、天然状態に於いて分離して存在する２またはそれ以上の分子が一つに結合し、その構成分子の全ての所望機能を有する単一要素（分子）を形成する分子を意味する。本発明の好ましいキメラ分子は、１またはそれ以上のエフェクター分子に結合した１以上のＩＬ１３（より好ましくは突然変異型ヒトＩＬ１３）を含む。突然変異型ＩＬ１３はターゲティング分子として機能し、制限されたＩＬ４Ｒ独立型ＩＬ１３レセプター（ＩＬ１３Ｒ）を発現又は過剰発現する細胞にキメラ分子を結合させる。
【００２０】
ここで用いる融合タンパク質とは、キメラ分子を構成する要素がポリペプチドであり、これらのポリペプチドはペプチド結合を介して直接（あるいはペプチド結合を介して）結合しているキメラ分子である。すなわち融合タンパク質は異なる（例えばターゲティング及びエフェクター）成分に対応するドメインを有する連続する単一のポリペプチドを形成する。
【００２１】
“特異的結合部分”または“ターゲティング部分”とは、特定の標的に特異的に結合する分子（例えばポリペプチド）を意味する。すなわち、例えばインターロイキン１３（ＩＬ１３）は、ＩＬ１３レセプターに特異的に結合する特異的結合部分である（ＩＬ１３レセプターはＩＬ４レセプターとを要素を共有することは認識されているが）。この特異的結合部分はＩＬ４レセプターと交叉反応する場合もありうる。にも関わらず、この結合部分は、これら２つの要素と特異的に相互作用し、生体又は生物サンプル中に一般的に認められるいずれのタンパク質とも結合しないことから、特異的であると見なされる。本発明の好ましい特異的結合部分は、ＩＬ４レセプターに比べ制限ＩＬ４Ｒ独立腫瘍関連ＩＬ１３レセプターに選択的に結合し、一般にＩＬ４レセプターに対するその親和性及び／又は特異性に比べ、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍あるいはより更には少なくとも１００倍の結合活性及び／又は特異性を示す。
【００２２】
ここに用いた“エフェクター分子”とは、特定の標的（例えば標的細胞）に送達されることが望ましい分子を意味する。エフェクター分子は、標的細胞に与えられることが望ましい特徴的な活性を好ましくは有する。エフェクター分子としては、サイトトキシン、標識体、放射性核種、その他のリガンド、抗体、薬物、プロドラッグ、リポゾーム、脂質、組換えウイルス、化学療法薬、抗癌抗体、光増感剤等を含む。一度細胞に送達されたエフェクターは、選択的に取り込まれるものもあれば、取り込まれる必要のないものもある（例えば標識物）点は認識されよう。しかし多くのエフェクター（例えばＰＥ又はＤＴサイトトキシン）は細胞内に取り込まれることによって一層の効果を発揮する。
【００２３】
“細胞へエフェクター分子を送達する”という用語は、好ましくは生物を本発明の突然変異型ＩＬ１３を含むキメラ分子によって全身処理した場合、または細胞カルチャーを本発明の突然変異型ＩＬ１３を含むキメラ分子にて処理した場合に、キメラ分子が標的細胞近傍あるいは標的細胞に選択的に蓄積するか、あるいは、突然変異型ＩＬ１３が標的とする標的（例えばＩＬ１３レセプター）を欠くかもしくはその濃度が低い細胞に比べてより選択的に細胞によって取り込まれるような選択的結合を意味する。
【００２４】
“細胞の成長を阻害する”という用語は、細胞又は細胞群の成長及び／又は増殖の阻害を意味する。こうした阻害には１以上の細胞を殺すことが含まれる。細胞成長及び／または増殖をアッセイする方法は当業者公知である。
【００２５】
タンパク質について云う場合の“分離された”または“ほぼ精製された”、または“分離された”という用語は、その他の細胞成分をほぼ含まない化学組成物を意味する。それは乾燥又は水溶液いずれでも良いが、均一状態にあることが好ましい。精製度及び均一度は通常はポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学的技術を用いて決定される。調製物中に多く存在するタンパク質はほぼ精製される。一般に、タンパク質はほぼ精製又は分離されると調製物中に存在する全大型分子種の８０％以上を占めることになる。好ましくは、タンパク質は存在する全大型分子種の９０％以上を占めるまでに精製される。より好ましくは、タンパク質は９５％以上に精製され、最も好ましくはタンパク質は実質均一に精製され、その場合通常技術により他の大型分子種は検出されない。タンパク質またはレセプターについて云う場合の“精製する”という用語は、タンパク質またはレセプターをこうした単離またはほぼ精製された状態とすることを意味する。
【００２６】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”はここでは互換可能に使用され、アミノ酸残基の重合体を意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が自然に存在するアミノ酸に対応した人工的な化学的類似体であるアミノ酸重合体、ならびに、自然に存在するアミノ酸重合体に対して用いられる。
【００２７】
用語“核酸”は、特に限定しない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド重合体を意味する。
【００２８】
（詳細な説明）
本発明は、ＩＬ１３レセプターに対し高い特異性を有し、キメラ分子（例えばキメラ融合タンパク質）中に組み込まれた場合にキメラ分子を、ＩＬ１３レセプター発現細胞に標的として向かわせることができるリガンドを提供する。標的であるＩＬ１３レセプターはガン細胞において特徴的に過剰発現していることから、本発明のターゲティング物質はこれらガン細胞（例えば神経膠腫）へ薬物を特異的に向かわせるのに特に有効である。好ましい実施態様では、リガンドは突然変異型ＩＬ１３分子であり、特に１４０ｋＤＡｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるｈＩＬ１３／ｈＩＬ４レセプターサブユニットと相互作用するドメイン内に１またはそれ以上の突然変異を含むＩＬ１３分子である。
【００２９】
標的であるＩＬ１３レセプターは、ＩＬ４レセプターと多くの類似性を示す成長因子レセプターである。ＩＬ１３レセプター（ＩＬ１３Ｒ）及びＩＬ４レセプター（ＩＬ４Ｒ）間の類似性と相違に関する研究により、ＩＬ１３がＩＬ４レセプターに結合し（同様にＩＬ１３レセプターにも）、そしてＩＬ１３のＩＬ４レセプターへの結合はＩＬ４と完全に競合することが示された（Zurawski et al (1995)) J. Biol.Chem, 270:13869-13878 , Vita et al (1995)) J.Biol.Chem., 270: 3512-3517, and Tony et al (1994) Eur.J.Biochem., 225: 659-665)）。
【００３０】
ヒトＩＬ１３レセプターに関し最近提唱されたモデルは、これがヘテロ２量体であり、ＩＬ１３結合タンパク質（Debinski et al (1995) J.Biol.Chem.,270: 16775-16780), Obiri et al (1995) J Biol. Chem: 270 : 8797-8804, Caput et al (1996)J.Biol Chem. 271: 16921-16926; Hilton et al.,(1996) Proc. Natl Acad. Sci., USA, 93: 497-501）及び１４０ｋＤａ  ｈＩＬ４Ｒβ(Obiri et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2:1743-1749)(Fig. 1)を含むことを示している。後者はＩＬ４レセプターと共通のサブユニットである(Debinski et al (1996) J.Biol.Chem., 271:22428-22433, Zurawski et al.,(1995)J.Biol.Chem., 270:13869-13878., Vita et al.(1995) J.Biol. Chem., 270:3512-3517, and Tony et al (1994) Eur. J Biochem., 225: 659-50 665, Hilton et al(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 497-501)。したがって、ヒトインターロイキン１３（ｈＩＬ１３）は少なくとも２つのレセプターと相互作用する部位（ドメイン）を含む。すなわち、（ｉ）１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットを認識する部位、及び（ｉｉ）適当な結合タンパク質と相互作用する別の部位である(Obiri et al (1995) J Biol. Chem. 270: 8797-8804, Caput et al.,(1996) J Biol Chem. 271: 16921-16926; Hilton et al. (1996) Proc. Natl. Acad. S ci., USA, 93: 497-501)。これら推定部位は、ｈＩＬ４との構造上の相同性及び、ｈＩＬ１３は４本の逆平行α螺旋からなるサイトカインのコンパクトなコアバンドルとして存在するとの考えに基づいて提唱されている（図２）。
【００３１】
ｈＩＬ１３の推定モデルは、Bamborough et al,(1994) Prot.Eng., 7:1077-1082に述べられている。このモデルは、ＩＬ４が一方の部位で１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβと結合し、もう一方の部位でγcサブユニットと結合してヘテロ２量体である高親和性ｈＩＬ４Ｒを生ずることを提案しているｈＩＬ４モデル（Russell et al, (1993) Science, 262:1880-1883）に似ている。ｈＩＬ４の９番目のグルタミン酸がリジンへ突然変異（ｈＩＬ４．Ｅ９Ｋ）すると、ｈＩＬ４の１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβへの結合は妨害される（Kruse et al.(1993) EMBO J.12:5121-5129）（図３）。
【００３２】
最近、ヒト（ｈ）神経膠腫がインターロイキン１３（ＩＬ１３）に対するレセプターを多数発現していることが示された（Debinski et al.(1995)Clin.Cancer Res.1:12531-1258）。ＩＬ４及び１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβ鎖タンパク質と結合し正常細胞上でのｈＩＬ１３及びｈＩＬ４の作用を妨害するｈＩＬ４のアンタゴニストであるｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄはいずれも、正常細胞及び幾つかの腺癌細胞と異なり、神経膠腫細胞ではＩＬ１３の結合と細胞内への取り込みを妨害しなかった(Debinski et al. (1995) Clin. Cancer Res 1:1253-1258;Debinski et al  (1996) J Biol. Chem. 271: 22428-224; Debinski et al. (1995) J Biol. Chem. 270:16775-16780)。これら及びその他所見は、ＩＬ４と相互作用せず、１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβ鎖（ｈＩＬ４Ｒβ）を含まないと推測されるｈＩＬ１３レセプター（例えば、癌）の存在を示すものである。
【００３３】
これは、ｈＩＬ４及びｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄを、ＩＬ１３Ｒに差し向けられたキメラ分子と組合せて使用すると、ＩＬ１３レセプターを有する細胞に対するこれら分子の特異性が高まることから示された。
【００３４】
ｈＩＬ４及びｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄにより示されたものと類似の作用は、ＩＬ１３そのものを突然変異し、突然変異したＩＬ１３をキメラ分子中のターゲティング部分として利用することで得られる。一実施態様においては、サイトトキシンはターゲティング部分（ＩＬ１３）が位置１３のグルタミンがリジンに変わることで突然変異し（ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋを生ずる）、毒性エフェクター分子はシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）誘導体（例えばＰＥ３８ＱＱＲ又はＰＥ４Ｅ）である。
【００３５】
ここでは、１４０ｋＤａＩＬ４レセプターβ鎖と相互作用するＩＬ１３の推定結合部位を変化させることで、正常組織中に多く発現しているＩＬ１３Ｒ及びＩＬ４Ｒの共通要素とサイトトキシン（又はその他のＩＬ１３向けキメラ分子）との相互作用を変えられることも教示される。更に、例えばｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅは、ｈＩＬ４及びｈＩＬ１３Ｒの両方に共通する要素を発現している内皮細胞などの正常細胞上では活性は低いことが示された。予期されなかったこととして、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの作用は、野生型のｈＩＬ１３を含むものと比べるとヒト神経膠腫に対し大幅に強力である。ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋをベースとしたサイトトキシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性は、非突然変異型ｈＩＬ１３をターゲティング部分として利用するキメラサイトトキシンに比べても数倍低い。すなわち、ここでは１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットと称されるｈＩＬ４レセプターサブユニットと相互作用するＩＬ１３ドメイン内の突然変異（例えばＩＬ１３残基１３の突然変異）により、正常細胞に対する活性が低く、かつ、驚くべきことに神経膠腫細部に対して遥かに高い活性を有するキメラサイトトキシンが作られる。全体として、特異的サイトトキシン活性は１００倍程度増加する。すなわち、ｈＩＬ３は、正常細胞上に存在するものからガン細胞上に発現するｈＩＬ１３Ｒをより区別して認識するような操作において有用である。
【００３６】
以下に説明される好適な実施例では、突然変異型ＩＬ１３はキメラ分子の構成要素として提供される。あるいは、突然変異型ＩＬ１３は単独で提供され、ＩＬ１３レセプターに結合することによりこれを特異的に阻害することが可能である。
【００３７】
Ｉ．ＩＬ１３レセプターを標的としたキメラ分子の利用
本発明は、突然変異型ＩＬ１３分子を利用し、その一実施態様においてＩＬ１３レセプターを有する細胞（例えば神経膠腫の様な腫瘍細胞）に対しエフェクター分子を特異的に送達する方法を提供する。これら方法はエフェクター分子に結合した突然変異型ＩＬ１３（ターゲティング分子）を含むキメラ分子を利用する。本発明のキメラ分子は、当分野において既知の他の標的化キメラ分子に比べ非標的細胞に対する結合性が低い一方で、腫瘍細胞（特に神経膠腫細胞）を特異的に標的とするものである。
【００３８】
これにより多くのエフェクター分子のすべてを標的細胞に特異的に送達することが可能である。エフェクター分子がサイトトキシンの場合、本発明は細胞（例えば遊離細胞又は腫瘍内細胞）の成長及び／又は増殖を阻害する方法及び組成物を提供する。キメラサイトトキシンは、ＩＬ１３レセプター保有細胞（例えば癌細胞）を含む生体に投与され、キメラ分子によって接触される。キメラ分子の突然変異型ＩＬ１３部分は細胞上に過剰発現したＩＬ１３レセプターに特異的に結合する。サイトトキシンエフェクター分子は、細胞表面上のＩＬ１３レセプターに結合すると、細胞内への取り込みを仲介し、細胞内においてサイトトキシンが細胞の増殖を阻害するか細胞を殺す。サイトトキシンはシュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アビリンなどの天然または修飾サイトトキシンを使用することが可能である。
【００３９】
別の一実施態様では、本発明のキメラ分子は腫瘍細胞の有無を検出するための成分及び方法を提供することが可能である。これら方法は、突然変異型ＩＬ１３に結合した標識体を検出できるエフェクター分子を含むキメラ分子を提供することを含む。突然変異型ＩＬ１３は、ＩＬ１３Ｒを有する標的細胞（例えば癌細胞）にキメラ分子を特異的に結合させ、次にこの標的細胞を検出可能な標識と結合させることによってマークする。細胞に結合した標識の検出により、標的細胞の存在が示される。
【００４０】
別の実施態様では、エフェクター分子は抗体、成長因子又はリガンドなどの別の特異的結合部分でありうる。この場合、キメラ分子は高度に特異的な二価性リンカーとして機能する。このリンカーは融合タンパク質が結合する細胞または細胞成分間の相互作用を結合、促進するうえで機能する。すなわち、例えばキメラ分子が抗体又は抗体フラグメント（例えば抗体のＦｖフラグメント）が結合した本発明の突然変異型ＩＬ１３を含む場合、突然変異型ＩＬ１３は標的細胞（例えば癌細胞）に特異的に結合し、エフェクター部分は免疫細胞表面のレセプター（例えばＩＬ−２又はＩＬ−４レセプター）に結合する。キメラ分子は免疫応答を促し、標的癌細胞に差し向けるうえで作用する。または、突然変異型ＩＬ１３はブドウ球菌内毒素Ａ及びＢ（ＳＥＡ及びＳＥＢ）などの細菌性スーパー抗原、又はその他のスーパー抗原に結合でき、それによりキメラ分子を保有する細胞（例えば神経膠細胞）に対する応答を標的とする免疫細胞を活性化できる。
【００４１】
さらに別の実施態様では、エフェクター分子は医薬品（例えば薬剤）又は医薬品を含む賦形剤である。すなわち、本発明の突然変異型ＩＬ１３はビンブラスチン、ドキソルビシン、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害剤）、アンチセンス分子、リボザイム及びその他の当業者公知の医薬品と結合でき、それによりＩＬ１３レセプターを過剰発現している標的細胞を医薬品により特異的に狙うことが可能である。
【００４２】
あるいは、突然変異型ＩＬ１３は治療組成物を含む賦形剤に結合させることが可能である。この様な賦形剤には、リポゾーム、脂質、ミセル、様々な合成ビーズ等が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００４３】
当業者であれば、本発明のキメラ分子には、単一エフェクターに結合した突然変異型ＩＬ１３分子、又は逆に単一突然変異型ＩＬ１３分子に複数のエフェクター分子が結合したものが含まれることは認識されよう。すなわち、一実施態様では、あるエフェクターは突然変異型ＩＬ１３アミノ末端に結合するが、別のエフェクターは突然変異型ＩＬ１３のカルボキシル末端に結合する。この２つのエフェクターは同じかまたは異なりうる。
【００４４】
さらに別の実施態様では、キメラ分子は複数の突然変異型ＩＬ１３分子と複数のエフェクター分子を共に含むことが可能である。すなわち、例えば、本発明は突然変異型ＩＬ１３が細胞毒性分子に結合し、別の分子（例えば抗体、あるいは他のリガンド）が毒素のもう一方の末端に結合している“二重標的”細胞毒性キメラ分子を提供する。このような二重標的サイトトキシンは、ＰＥのアミノ末端のドメインＩａが置換し、ドメインＩＩＩのアミノ酸６０４と６０９の間に抗ＴＡＣ（Ｆｖ）が挿入された突然変異型ＩＬ１３を含みうる。他の抗体も好適でありうる。
【００４５】
ＩＩ．突然変異型インターロイキン１３（ＩＬ１３）
本発明の発見は、突然変異型ＩＬ１３によって、制限（ＩＬ４レセプター独立型）ＩＬ１３レセプターを発現する細胞に対する特異性が向上したリガンドが提供されるということである。更に、突然変異型ＩＬ１３はＩＬ１３レセプター（非新生物細胞上の）とＩＬ４レセプターの両方に共有される１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβサブユニットには有意に結合しないことから、突然変異型ＩＬ１３はＩＬ１３／ＩＬ４レセプターを発現している正常細胞に対しては低い結合性を示す。特に好ましい本発明の突然変異型ＩＬ１３リガンドは後述するように１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβと相互作用するドメイン内に１またはそれ以上の突然変異を有する。
【００４６】
天然インターロイキン１３（ＩＬ１３）はＩＬ４の特性の多くを共有することが認められている多形質発現性サイトカインである。ＩＬ１３はＩＬ４と約２０％の配列同一性を有し、単核球／マクロファージ及びＢ細胞に対しＩＬ４様の活性を示す（Minty et al., Nature, 362:248(1993),  McKenzie et al. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 90: 3735（1987））。
【００４７】
ＩＬ１３の核酸及びアミノ酸配列は良く特徴付けられており（SWISS-PROT: P35224, McKenzie et al. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 90: 3735-3739参照）、さらにポリペプチド又は核酸配列情報を以下及び実施例１に記載のような突然変異型ＩＬ１３の産生に利用できる。
【００４８】
Ａ．好ましい突然変異型ＩＬ１３分子。
好ましい実施態様では、本発明の突然変異型ＩＬ１３分子は共通するＩＬ１３／Ｉｌ４レセプターに対しては低減した相互作用を示し、制限（ＩＬ４Ｒ非依存型）ＩＬ１３レセプターとは同じまたは向上した相互作用（例えば結合又はレセプター介在活性）を示す。上記説明の如く、これはＩＬ１３を突然変異させ突然変異型ＩＬ１３（又はキメラ分子）と１４０ｋＤａＩＬ４Ｒβサブユニットとの相互作用を低下させるかまたはなくすことにより達成される。これは、１４０ｋＤａＩＬ４Ｒβと相互作用するＩＬ１３ドメインに突然変異を導入することで好ましく達成される。
【００４９】
すなわち、好ましい突然変異はα螺旋Ａ及びＣの中に局在する。好ましい突然変異型ＩＬ１３分子は、残基１３及び／又は残基６６及び／又は、残基６９及び／又は、残基あるいは残基群１２，１４，６５，６７，６８、７０及び７６の１またはそれ以上の突然変異を含む。特に好ましい突然変異は、以下の突然変異の１又はそれ以上を含む：残基１３のリジンからアルギニンへの突然変異、残基６６のアスパラギン酸への突然変異、残基６９のアスパラギン酸への突然変異又は残基１０９あるいは１１２のアスパラギン酸への突然変異。
別の突然変異の方法は、共通ＩＬ１３／ＩＬ１４レセプターの別のサブユニットである適当な結合タンパク質（例えばｈＩＬ１３Ｒα１）との相互作用を欠くｈＩＬ１３突然変異を同定することである（図１及びMiloux et al.(1997) FEBS Letts., 401: 163-166参照）。
【００５０】
Ｂ．突然変異型ＩＬ１３分子のスクリーニング
上記の如く、好ましい突然変異型ＩＬ１３分子は１４０ｋＤａｈＩＬＲβサブユニットと称するヒトＩＬレセプターサブユニットとの相互作用を低減し、またはなくす一方で、その制限癌関連ＩＬ１３レセプター、特に１４０ｋＤａｈＩＬ４Ｒβを含まないＩＬ１３レセプターに対するそれらの特異性及び活性度は減じず、むしろ増加さえする突然変異を有する。こうした突然変異型ＩＬ１３分子の同定では、一般にまず１またはそれ以上の突然変異型ＩＬ１３分子を生産し、続いて突然変異型ＩＬ１３分子をスクリーニングし共通ＩＬ４／ＩＬ１３レセプターと相互作用しないが、制限（ＩＬ４レセプター独立型）ＩＬ１３レセプターとは結合するものを同定する。
【００５１】
ｉ）ＩＬ１３の突然変異誘導
本発明に適した突然変異型ＩＬ１３分子は普通に生産され、またスクリーニングできる。ポリペプチドを突然変異誘導する多くの方法が当業者に公知である。未変性ＩＬ１３のアミノ酸配列は完全に既知であることから、突然変異型ＩＬ１３分子は化学的に合成でき、あるいは組換体として発現できる。
【００５２】
本発明の突然変異型ＩＬ１３ポリペプチドは、標準的化学的ペプチド合成技術を用い合成することが可能である。幾つかのＩＬ１３突然変異タンパク質は単一ポリペプチドとして合成できる。また、別々に短い配列を合成し、続いて一方の分子のアミノ末端を別の分子のカルボキシル末端と縮合することによりペプチド結合を形成せしめ短い配列同士を融合することで化学合成を行うことが可能である。ポリペプチドの固相合成に関する技術は当業者公知である。(例えば, Barany and Merrifield, Solid-Phase Pepeide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis. Synthesis, Biology. Vol 2: Special Methods in Peptide Synthesis , Part A., Merrifield, et at 」  Am. C/tern. Soc., 85: 2149-2156 (1963), and Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984))。
【００５３】
突然変異型ＩＬ１３は、核酸分子がランダム又は部位特異的方法により修飾され、コードされるポリペプチド中のアミノ酸の一部又は全てが変化（置換）され、付加され、あるいは欠失したＩＬ１３をコードする核酸の組換え発現により生産することもできる。アラニン−スキャニング突然変異法はポリペプチドの構造−機能関連性を検討するために広く利用されている。
【００５４】
部位特異的突然変異は、科学的及び特許文献に良く既述された各種通常技術術により、ＩＬ１３をコードする核酸内に導入できる。例としてはＰＣＲをベースとする部位指向型突然変異誘導“メガプライマー”法（アーバン）（Urban (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2227-2228; Ke (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3371-3372, and Chattopadhyay (1997) Biotechniques 22:1054）、制限酵素を使用しないＰＣＲをベ−スとする食い違い再アニーリング法（ボーンサック）（アイレンバーグ）（Bohnsack (1997) Mot Biotechnol. 7:181-188; Ailenberg (1997) Riotechniques 22: 624-626）、長いプライマー特異部位排除とエクソヌクレアーゼＩＩＩを用いた部位指向型突然変異誘導法（ニコラス）（Nicolas (1997) Biotechniques 22: 430434）による、重複型の延長ポリメラーゼチェーンリアクション（ＯＥ−ＰＣＲ）による部位指向型突然変異法が含まれる。特定部位排除による突然変異誘導も利用できる。(例えば Dang et at (1992) Anal Biochem., 200:81参照)。ＩＦＮ−ベータ及びＩＬ−２などの生物学的活性を有するタンパク質の変異体タンパク質作製については米国特許第４８５３３３２号に詳細既述されており、また、ＩＬ１３の突然変異は実施例１に既述される。
【００５５】
本発明の修飾型ＩＬ１３は更に化学的修飾法によっても製造できる（Belousov (1997) Nucelic Acids Res. 25;3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med, 19: 373-380; Blommers(1994) Biochemistry 33:7886-7896等を参照）。
【００５６】
ｉｉ）ＩＬ１３突然変異タンパク質のスクリーニング
続いて突然変異型ＩＬ１３分子をスクリーニングし、制限（ＩＬ４レセプター独立型）ＩＬ１３レセプターと選択的に結合し、相互作用（例えば一般的にはＩＬ１３／ＩＬ４レセプターとの結合、あるいは１４０ｋＤａｈＩＬ４βサブユニット又は７０ｋＤＡＩＬ１３Ｒα1との特異的結合）が低減しているかまたは失っているものを同定する。単純な結合についてのアッセイ（例えば標識された野生型ＩＬ１３をＩＬ１３又はＩＬ４レセプターに結合させ、突然変異型ＩＬ１３の競合を検出する）、又は突然変異型ＩＬ１３及び／又は突然変異型ＩＬ１３キメラ分子の結合を介し伝達される幾つかの生物学的活性（例えばエフェクター分子の活性）をアッセイすることは可能である。単純結合アッセイは米国特許第５，６１４，１９１号に記述されている。
【００５７】
このデータは一般的に、神経膠腫上（例えば細胞株Ｕ−２５１ＭＧ及びＳＮＢ−１９）のＩＬ１３レセプターはＩＬ４と相互作用しないように制限されていることを示す。すなわち、これら細胞は正のＩＬ１３Ｒ結合又は活性に関するアッセイの良い標的を提供する。ＨＵＶＥＣ内皮細胞などのその他の細胞は、共通の１４０ｋＤａｈＩＬ４βサブユニットを利用するとともに７０ｋＤａＩＬ１３Ｒα1サブユニットを含むと思われるＩＬ１３／ＩＬ１４レセプターを発現する。すなわち、これら細胞は突然変異型ＩＬ１３分子の低下した結合又は活性のアッセイに適した良い標的を提供する。すなわち本発明の好ましい突然変異型ＩＬ１３分子又はキメラ分子は、Ｕ−２５１ＭＧ及びＳＮＢ−１９神経膠腫及び同様の細胞に対し増加した活性を、そしてＨＵＶＥＣ（内皮）細胞に対する低下した結合または活性を示す。これは増殖アッセイによりアッセイできる（例えば実施例１記載の共有ＩＬ１３／ＩＬ４レセプターを発現するＴＦ−１細胞に対する増殖アッセイを参照）。
【００５８】
特に好ましい実施態様では、突然変異型ＩＬ１３はサイトトキシンと融合し発現され（例えばＰＥ３８ＱＱＲ、ＰＥ４Ｅ等）、標的細胞に対する細胞毒性活性（例えば成長又は増殖の阻害、又はアミノ酸の様な標識基質の理込み等）をアッセイされる。この様な活性をアッセイする方法は当業者公知であり、実施例１及び米国特許第５，６１４，１９１号に例示されている。その他好適アッセイには、ＴＮＦ及びＩＦＮγ（Farfaing-Koka et al, (1995) J.I.154:1870-1878）によるＰＡＮＴＥＳ誘導の阻害が含まれる。
【００５９】
この様なアッセイは単一アッセイ形式にて実施できることが認識されるだろう。あるいは、この様なアッセイは高スループットスクリーニングシステム、例えば結合をアッセイするＢｉａＣｏｒｅシステムの利用に適している （Nang et al, (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:1654-1662参照）。
【００６０】
タンパク質結合又は細胞活性の有無又は定量化に適した高スループットアッセイは当業者公知である。すなわち、例えば米国特許第５，５５９，４１０号はタンパク質の高スループットスクリーニング法を開示しており、一方米国特許第５，５７６，２２０号及び第５，５４１，０６１号はリガンド／抗体結合に関する高スループットスクリーニング法を開示している。
【００６１】
更に、高スループットスクリーニングシステムは市販されている（例えばZymark Corp., Hopkinton, MA; Precision Systems, Inc., Natick, MA等を参照）。これらシステムは典型的には全てのサンプル及び試薬のピペッティング、液体分注、指定時間インキュベーション、及び最終的なアッセイに適した適当な検出装置によるマイクロプレートの測定を含む全工程を自動化する。これら配置可能なシステムは、高スループットと迅速なセットアップ、ならびに高度の柔軟性とカスタマイゼーションを提供する。
【００６２】
ＩＩＩ．エフェクター分子。
上記の如く、本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分は、ＩＬ１３レセプターを過剰発現する細胞へその活性が送達されることが望ましい何れかの分子である。特に好ましいエフェクター分子には、ＰＥ又はＤＴ、放射性核種、成長因子などのリガンド、抗体、蛍光又は放射活性標識体の様な検出可能な標識体、及びリポソーム、脂質及び各種薬物などの治療成分が含まれる。
【００６３】
Ａ）サイトトキシン
特に好適なサイトトキシンには、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン及びアブリンが含まれる。シュードモナス外毒素及びジフテリア毒素が最も好ましい。
【００６４】
ｉ）シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａより分泌される極めて活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化を触媒（ＥＦ−２上への酸化ＮＡＤのＡＤＰリボシル成分の移動を触媒する）することでそれを不活性化し、これにより真核生物に於ける蛋白合成を阻害する。
【００６５】
この毒素は、細胞毒性に関連した３種類の構造ドメインを含む。ドメインＩａ（アミノ酸１−２５２）は細胞結合を介在する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３−３６４）は細胞質への移動に関係し、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００−６１３）は伸長因子２のＡＤＰリボシル化を伝達し、これにより蛋白を不活性化して細胞死をもたらす。ドメインＩｂの機能（アミノ酸３６５−３９９）はまだ明らかではないが、その大部分であるアミノ酸３６５−３８０は細胞傷害性を消失することなしに欠失させることが可能である（Siegall et al., (1989)J.Biol.Chem.264:14256-142610）。
【００６６】
突然変異型ＩＬ１３をＰＥと融合させる場合に好ましいＰＥ分子は、そのドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）が欠失し、アミノ酸３６５〜３８０がドメインＩｂより欠失しているものである。しかし、ドメインＩｂの全て、及びドメインＩＩ（アミノ酸３５０〜３９４）は削除でき、特に削除された配列がＧＧＧＧＳなどの結合ペプチドで置換される場合に削除することが可能である。
【００６７】
更に、ＰＥ分子は部位指向型突然変異誘導又はその他当分野既知の方法を用い変更され、特定の所望応用に適した分子に変更できる。ここに記したＰＥ分子より提供される機能上の利点に実質影響しない方法にてＰＥ分子を変える方法を用いることも可能であり、生じた分子はここに包含されるものである。
【００６８】
好ましいＰＥ分子の最大細胞毒性特性に関し、分子に対する複数の修飾が推奨されている。組換体分子に対する適当なカルボキシル末端配列は分子の標的細胞の細胞質内への移動に好適である。有効であることが分かっているアミノ酸配列にはＲＥＤＬＫ（未変性ＰＥ）、ＲＥＤＬ、ＲＤＥＬ又はＫＤＥＬ、それらの繰り返し、又は小胞体内への蛋白の保持又は循環に機能し、ここでは“小胞体配列”と称されるその他の配列が含まれる。例えば（Chaudhary et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA87;308-312及びSeetharam(1991) et al., J.Biol.Chem.26 6:17376-17381）。
【００６９】
ドメインＩｂのアミノ酸３６５−３８０の削除は、活性の消失なしに実施できる。更に、アミノ酸位置２８０のメチオニンをグリシンに置換すると、タンパク質合成を開始でき、アミノ酸位置２８７のセリンをシステインに置換すると、不適当なジスルフィド結合の形成を阻止でき有益である。
【００７０】
好ましい実施態様では、突然変異型ＩＬ１３ターゲティング分子はドメインＩａに置換挿入される。類似体分子、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲの調整は米国特許第５，６１４，１９１号に既述されている。更に、同様の挿入はHeimbrookら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 87:4697-4701及び米国特許第５，４５８，８７８号既述のＴＧＦα０ＰＥ４０分子（ＴＰ４０とも称される）として知られる分子に於いて達成されている。
【００７１】
ＰＥの好ましい形態には、アミノ酸２５３−３６４及び３８１−６０８を含み、未変性配列ＰＥＤＬＫ又は突然変異型配列ＫＤＥＬ又はＲＤＥＬが続く。位置５９０及び６０６のリジンはグルタミンに突然変異してもよく、またしなくても良い。
【００７２】
特に好ましい実施態様では、本発明のＩＬ１３レセプターを標的とするサイトトキシンは、ＰＥ３８ＱＱＲと称されるＰＥ分子を含む。このＰＥ分子はアミノ酸２５３−３６４及び３８１−６０８を含むＰＥの切断形態である。位置５０９及び６０６のリジン残基はグルタミンに置換され、位置６１３のグルタミンはアルギニンに置換される（Debinskiら、(1994) Bioconj.Chem., 5:40）。
【００７３】
別の特に好ましい実施態様では、ＩＬ１３レセプターを標的とする本発明のサイトトキシンはＰＥ４Ｅと称されるＰＥ分子を含む。ＰＥ４Ｅは突然変異し、不活性化した未変性の結合ドメインを持ち、アミノ酸５７，２４６、２４７及び２４９が全てグルタミン酸により置換された“完全長”のＰＥを含む（例えばChaudharyら、(1995) J.Biol.Chem., 256;16306参照）。
【００７４】
突然変異型ＩＬ１３ターゲティング分子もＰＥ分子のドメインＩＩＩ内の点に挿入できる。この場合、突然変異型ＩＬ１３分子はＰＥ分子のアミノ酸位置６０７ないし６０９付近の間と好ましく融合される。このことは、突然変異型ＩＬ１３が分子のアミノ酸６０７付近の後に挿入され、ターゲティング分子の後にＰＥのアミノ酸６０４−６１３付近が配置されることでＰＥの適当なカルボキシル端が創られることを意味する。すなわち、突然変異型ＩＬ１３はアミノ酸６０７付近の後に組換体ＰＥ分子内に挿入され、続いてドメインＩＩＩのアミノ酸６０４−６１３が続く。突然変異型ＩＬ１３もドメインＩｂ内に挿入され、毒性に関し必要とされない配列と置き換わる。Debinski, et al. Mol.Cell. Biol., 11:1751-1753(1991)。
【００７５】
好ましい実施態様では、ＰＥ分子は組換え的手技によりターゲティング分子と誘導する。タンパク質鎖をコードする遺伝子は、ｃＤＮＡ内又は当業者公知のいずれかのクローニング法により形成されたゲノムの中にクローン化されるだろう（例えば、Sambrook et al.(1989), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory参照）。各種リガンドと融合したＰＥをコードする遺伝子のクローニング法は当業者公知である（例えばSiegall et al.(1989) FASEB J.,3:2647-2652; 及びChaudhary et al.(1987) Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 84;4538-4542参照）。
【００７６】
当業者は、別の修飾、欠失、挿入等が本発明のキメラ分子に対し、又はＩＬ１３レセプター指向キメラ分子をコードする核酸配列に対し実施できることを認識するだろう。特に、欠失または交換はＰＥ内、又は突然変位型ＩＬ１３をＰＥに連結するリンカー内に実施され、抗体に対する抗原なしに標的細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性を強化し、又は細胞に対する非特異的細胞毒性を低下させる。この様な構築体は、当業者公知の遺伝子工学法によって作られ（一般的にはSambrook et al.,上記を参照）、それらを様々な臨床又は生物学的応用に特に好適とさせる親和性、特異性、安定性及び毒性について各種特性を有する蛋白を生ずるだろう。
【００７７】
ｉｉ）ジフテリア毒素（ＤＴ）。
ＰＥ同様、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ＡＤＰ−リボシル化伸長因子２を介してタンパク質合成を阻害することで細胞を殺す。しかし、ジフテリア毒素は、ジスルフィド結合により結合する２本の鎖、Ａ及びＢに分けられる。ＰＥと異なり、カルボキシル端にあるＤＴのＢ鎖がレセプター結合に関与し、アミノ末端に存在する鎖Ａは酵素活性を含む（Uchida et al., Science, 175:901-903(1972); Uchida et al., J. Biol. Chem., 248:282802844 1873）).。
【００７８】
好ましい実施態様では、本発明のターゲティング分子−ジフテリア毒素融合タンパク質はジフテリア毒素Ｂ鎖を切断し取り出した未変性レセプター−結合ドメインを有する。特に好ましいものは残基３８９が除かれたカルボキシル末端配列のＤＴ、ＤＴ３８８である（Chaudhary, et al.(1991) Bioch. Biophys.Res. Comm.,180:545-551）。
【００７９】
別の好ましいジフテリア毒素は、未変性結合ドメインが排除され、位置３９０のＬに突然変異型ＩＬ１３のＳＰＧＰＶＰＰＳＴが続くジフテリア毒素、ＤＴ３９０である。
【００８０】
ＰＥキメラ毒素同様、ＤＴ分子も化学的にＩＬ１３レセプターターゲティング分子に結合できるが、好ましい実施態様ではターゲティング分子は組換え法によりジフテリア毒素に融合される。タンパク質鎖をコードする遺伝子はｃＤＮＡ内又はゲノム形態の中に、当業者公知の何れかのクローニング方法によりクローン化される。各種リガンドと融合したＤＴをコードする遺伝子をクローニングする方法も当業者公知である（Williams et al. J. Biol.Chem.265:11885-11889(1990)）。
【００８１】
ここで用いる“ジフテリア毒素”（ＤＴ）という用語は、全長の未変性ＤＴ又は修飾を受けたＤＴを意味する。修飾は典型的にはＢ鎖中のターゲティングドメインの除去を含み、またより具体的にはＢ鎖のカルボキシル領域の切断を含む。突然変異した結合ドメインも存在するだろう。
【００８２】
ｉｉｉ）その他の毒素
本発明のキメラ分子は、ジフテリア毒素又はシュードモナス外毒素以外のサイトトキシンも含むことができると認識される。これらサイトトキシンの多くは当業者公知であり、リシン、アブリン、サポリン、アメリカヤマゴボウウイルス蛋白等ポリペプチドと結合又は融合することができるその他の毒素を含むが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００８３】
Ｂ）検出可能標識体
本発明の突然変異ＩＬ１３分子に結合した検出可能標識体は、診断アッセイ（例えば、ＩＬ１３レセプターを過剰発現する共通腫瘍細胞の検出）及び／又は腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの位置決めに利用できる。本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分としての利用に好適な検出可能標識体には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的方法により検出可能な何れかの成分が含まれる。本発明に於ける有用な標識体には、ビオチン／アビジン、磁性ビーズ（例えばDynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性標識体（例えば3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は32Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びその他ＥＬＩＳＡに通常使用されるもの）、及び金コロイドまたは色付きガラスまたはプラスチック製ビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）の様な比色分析標識体が含まれる。
【００８４】
これら標識体の検出方法は当業者公知である。すなわち、例えば放射性標識体は写真フィルム又はシンチレーションカウンターを利用し検出され、蛍光マーカーは光検出器を用い放射光を検出し、検出されるだろう。酵素標識体は、典型的には酵素に基質を提供し、基質への酵素の作用により生じる反応物質を検出し、発色した標識体を単純に視覚化し比色分析標識体を検出し、検出されるだろう。
【００８５】
Ｃ）リガンド
上記の如く、エフェクター分子はリガンド又は抗体でも良い。特に好ましいリガンド及び抗体は、免疫細胞上の表面マーカーに結合するものである。キメラ分子はこれら抗体をエフェクター分子として利用し、リガンド又は抗体に関する結合相手を有する免疫細胞とＩＬ１３レセプターを過剰発現している腫瘍細胞間の結合を確立する２元機能的リンカーとして作用する。好適抗体及び成長因子は当業者公知であり、又ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、抗−Ｔａｃ、ＴＧＦα、ＳＥＡ、ＳＥＢ等が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
Ｄ）核酸
核酸も本発明の突然変異型ＩＬ１３分子に結合できる。この場合には、ＩＬ１３は標的細胞に核酸を効率的に提供する非ウイルス型ベクターとして機能する。核酸は突然変異型ＩＬ１３に直接結合でき、あるいはそれはリンカーを介在させ結合でき、又はそれは別の成分と複合体を形成、あるいは被包化し（例えば脂質、リポソーム、ウイルスコート等）突然変異型ＩＬ１３に結合できる。核酸は複数のエフェクター機能を提供できる。核酸は１又はそれ以上のタンパク質をコードでき、それにより特定の酵素活性、基質及び／又はエピトープを細胞に提供できる。この意味では、典型的には核酸が発現し、そして核酸が発現カセットの好ましい成分であることが望ましい。発現カセットは典型的には、プロモーター開始部位及び停止コドンを含み、標的細胞内に於いて発現が最適化されるように選択される。好適な発現カセットの構築方法は当業者公知である（例えばSambrook et al. (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory参照）。
【００８７】
核酸はまたそれ自体が特定の活性を有することもある。すなわち、核酸は１またはそれ以上の標的遺伝子の発現を阻害するために選択されたアンチセンス核酸又はリボザイムであることもある。
【００８８】
Ｅ）増感剤
他のエフェクター分子には、標的（例えば癌）細胞に各種癌治療薬に対する感受性を付与する増感剤が含まれる。増感剤は薬剤または遺伝子でありうる（適当な発現カセット内のプロモーターをコントロールし、標的細胞内に於ける発現を誘導する）。
【００８９】
薬物条件“殺傷”機能を持つ遺伝子は腫瘍治療に利用できることが長い間提案されてきた。例えば、増殖細胞中での単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の発現は、デオキシヌクレオシド類似体であるガンシクロビルに対する感受性を細胞に付与すると提言されている（Moolten et al.(1986) Cancer Res.46:5276-5281; Moolten et al. (1990) Hum.Gene Ther 1: 125-134; Moolten et al. (1990) J.Natl.Cancer Inst. 82:297-300; Short et al.(1990) J.Neurosci Res. 27:427-433; Ezzed ine et al.(1991) New Biol.3:608-614, Boviatsis et al.(1994) Hum. Gene Ther.5:183-191）。ＨＳＶ−ＴＫはガンシクロビルのリン酸化に介在し、これが細胞周期中のＤＮＡ複製（Ｓ期）にＤＮＡ鎖に取り込まれ、鎖の停止を招き細胞を殺す（Elion(1983) Antimicr. Chemother. 12,上記、B:9-17）。
【００９０】
薬物条件“殺傷”機能を持つ第２の遺伝子例は、相対的に無毒である５−フルオロウラシル前駆体５−フルオロシトシンに対する化学感受性を付与する細菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子である（Mullenら、(1992) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89:33-37; Huber et al. (1993) Cancer Res. 53:4619-4626; Mullen et al.(1994) Cancer Res. 54:1503-1506）。
【００９１】
さらに別の薬剤条件“殺傷”機能を持つ遺伝子の例は、チトクロームＰ４５０遺伝子である。遺伝子産物の発現は腫瘍細胞を化学療法剤、特にシクロフォスファミド又はイフォスファミドに対するする感受性を提供する（米国特許第５，６８８，７７３号参照）。
【００９２】
別の増感剤は遺伝子を必要としない。すなわち、例えば米国特許第４，２８２，２３３号は、感受性腫瘍細胞の多剤抵抗性を治療する化合物を記載している。本発明のキメラ分子を利用してこれら化合物を腫瘍細胞に供与することで、標的細胞の多剤抵抗性を低下でき、これらを通常の癌治療に対し感受性にすることができる。
【００９３】
Ｆ）その他のエフェクター成分
その他の好適なエフェクター分子には、医薬品又は各種医薬品を含むカプセルシステムが含まれる。すなわち、キメラ分子のターゲティング分子は直接薬剤に結合され、腫瘍に直接送達される。これら薬剤は当業者公知であり、ドボルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子等を含むが、もとよりこれに限定されない。
【００９４】
あるいは、エフェクター分子は、薬剤、核酸（例えばアンチセンス核酸）の様な治療成分を含むリポゾーム又はミセルの様な、又は循環系への直接の暴露から好ましく遮断されたその他治療成分の様なカプセルシステムでもよい。抗体に結合したリポソームの調整方法は当業者公知である（例えば米国特許第４，９５７，７３５号、Connor et al., Pharm. Ther.,28:341-365(1985)）。
【００９５】
ＩＶ．エフェクター分子へのターゲティング分子の結合
当業者は、ターゲティング分子、突然変異型ＩＬ１３及びエフェクター分子を何れの順番でも連結できることを認識するだろう。すなわち、エフェクター分子は突然変異型ＩＬ１３のアミノ又はカルボキシ末端のいずれかの結合される。結合が分子の目的活性に干渉しない限り突然変異型ＩＬ１３は又エフェクター分子の内部域にも結合され、あるいは逆にエフェクター分子は突然変異型ＩＬ１３の内部域に結合できるだろう。
【００９６】
突然変異型ＩＬ１３及びエフェクター分子は、当業者公知の数ある方法の何れかにより結合することが可能である。典型的には、エフェクター分子は、直接又はリンカー（スペーサー）を介して突然変異型ＩＬ１３に結合される。しかし、エフェクター分子がポリペプチドである場合には、単鎖型融合タンパク質としてキメラ分子を組換体として発現することが好ましい。
【００９７】
Ａ）突然変異型ＩＬ１３へのエフェクター分子の結合
実施態様の一つでは、ターゲティング分子（例えば、突然変異型ＩＬ１３又は環状に配置された突然変異型ＩＬ１３）は化学的にエフェクター分子（例えばサイトトキシン、標識体、リガンド、又は薬剤あるいはリポソーム）に結合される。化学的に分子を結合する方法は当業者公知である。
【００９８】
作用物質（エフェクター）をＩＬ１３に結合する方法は、作用物質の化学構造により様々である。突然変異型ＩＬ１３は他のポリペプチド同様に各種官能基；例えばカルボキシル基（ＣＯＯＨ）あるいは遊離アミン（−ＮＨ２）基を含み、これら突然変異型ＩＬ１３はエフェクターをこれらに結合せしめるエフェクター分子上の好適官能基との反応に利用できる。
【００９９】
あるいは、突然変異型ＩＬ１３及び／又はエフェクター分子は別の反応性官能基を露出し、又は結合する用に誘導されるだろう。誘導反応には、Pierce Chemical Company, Rockford Illinoisより入手できる様な多数のリンカー分子の幾つかを結合することが含まれる。
【０１００】
ここで使用する“リンカー”とは、エフェクター分子へのターゲティング分子（突然変異型ＩＬ１３）の結合に使用される分子である。リンカーは突然変異型ＩＬ１３及びエフェクター分子の両方に共有結合を形成できる。好適リンカーは当業者公知であり、直鎖は分枝鎖型炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、又はペプチドリンカーを含むが、もとよりこれに限定されない。エフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーはその側基をを開始構成的アミノ酸と結合するだろう（例えばシステインへのジスルフィド結合を介し）。しかし、好適実施態様では、リンカーは末端アミノ基のアルファ炭素アミノ又はカルボキシル基に結合するだろう。
【０１０１】
特定作用物質上の基と反応する１官能基及び抗体と反応する別の官能基を有する二価性リンカーは所望の共役体の形成に使用できるだろう。あるいは、誘導反応は突然変異型ＩＬ１３の化学処理を含むだろう。例えば、抗体又は抗体フラグメントのようなポリペプチド上の遊離型スルフヒドリル基を産生するための操作も公知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照）。
【０１０２】
放射性核種金属キレート、毒素、及び薬物を含む各種化合物のタンパク質（例えば抗体）への結合に適した多くの方法及びリンカーは既知である。例えば欧州特許出願番号１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、４，６５９，８３９号、４，４１４，１４８号、４，６９９，７８４号；４，６８０，３３８号；４，５６９，７８９号；及び４，５８９，０７１号；及びBorlinghaus et al. Cancer Res.47:4071-4075(1987)を参照せよ。特に、各種胃免疫毒素の生産は当分野公知であり、例えば“Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the  Magic Bullet,  Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp.168-190(1982), Waldmann(1991) Science, 252:1657, 米国特許第４，５４５，９８５号及び同第４，８９４，４４３号に見ることができる。
【０１０３】
幾つかの状況に於いては、キメラ分子がその標的部位に達するまで突然変異型ＩＬ１３からエフェクター分子が遊離していることが望ましい。従って、標的部位近傍で切断可能な結合を含むキメラ共役体は、エフェクターが標的部位にて放出される場合に利用できるだろう。突然変異型ＩＬ１３から作用物質を放出する結合の切断は酵素活性、又は共役体が標的細胞内部又は標的部位近傍に共された状態で促進されるだろう。標的部位が腫瘍の場合、腫瘍部位に存在する条件下に切断可能なリンカー（例えば、腫瘍関連酵素又は酸性ｐＨに曝された場合）が使用できるだろう。
【０１０４】
各種切断可能な多数のリンカーが当業者に既知である。米国特許第４，６１８．４９２号；４，５４２，２２５号及び４，６２５，０１４号を参照せよ。これらリンカー基からの作用物質の放出に関するメカニズムには、例えば感光性結合の照射及び酸触媒加水分解が含まれる。例えば米国特許第４，６７１，９５８号には患者の補体系のタンパク質分解酵素により、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的部位に於いて切断されるリンカーを含む免疫共役体の記載を含む。各種放射性診断用化合物、放射性治療用化合物、薬物、毒素及びその他作用物質の抗体への結合に関し報告されている多数の方法を概観すれば、当業者は抗体又はその他のポリペプチドに問題の作用物質を結合するのに適した好適な方法を決定できるだろう。
【０１０５】
Ｂ）突然変異型ＩＬ１３融合タンパク質の生産
エフェクター分子がポリペプチドの場合、キメラ突然変異型ＩＬ１３−エフェクター分子は融合タンパク質として調整できる。融合タンパク質は突然変異型ＩＬ１３に関する上記と同様にして化学的に合成できる。
【０１０６】
しかし、好ましい実施態様では、本発明のキメラ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ法を用い合成される。一般にこれには融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の作製、特定プロモーターのコントロール下にある発現カセット内へのＤＮＡの設置、宿主内でのタンパク質の発現、発現したタンパク質の分離、及び必要な場合にはタンパク質の変性が含まれる。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質（例えばＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ）をコードするＤＮＡは、例えばNarang et al.(1979) Meth. Enzymol.68:90-99の適当な配列をクローニングし制限する方法；Brown et al.(1979) Meth. Enzymol.68:109-151のフォスフォジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetra.Lett., 22:1859-1862のジエチルフォスフォルアミド法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持法を含む何れかの好適方法により調整される。
【０１０８】
化学合成は１本鎖型オリゴヌクレオチドを産する。この鎖は相補的配列とのハイブリダイズ、あるいは鋳型としてこの１本鎖を利用したＤＮＡポリメラーゼによる重合により２本鎖ＤＮＡに転換される。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基までの配列に限定されるが、それ以上長い配列は短い配列を結合し得ることができることを認識しているだろう。
【０１０９】
あるいは、サブ配列をクローン化し、適当な制限酵素を使い適当なサブ配列を切り出されるだろう。次にフラグメントは連結され、所望するＤＮＡ配列が作られる。
【０１１０】
好適実施態様では、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）の様なＤＮＡ増幅法を使いクローン化されるだろう。すなわち、好ましい実施態様では、ＩＬ１３に遺伝子を１またはそれ以上の突然変異を導入するプライマーを使い増幅される。プライマーは制限部位、例えばＮｄｅＩに関する制限部位を含むセンスプライマーとＨｉｎｄＩＩＩによる制限部位を含むアンチセンスプライマーを含むことが好ましい。特に好ましい実施態様では、プライマーはMcKenzie et al.(1987)上記により既述される如く、位置１９より開始するＤＮＡを増幅する様に選択される。これにより成熟ＩＬ１３配列をコードし、末端に制限部位を持つ核酸が生じる。ＰＥ３８ＱＱＲフラグメントはDebinski et al. Int.J.Cancer, 58:744-748(1994) Debinski et al.(1994) C lin. Cancer Res, 1:1015-1022にそれぞれ既述されているプラスミドｐＷＤＭＨ４−３８又はｐＳＧＣ２４２ＦｄＮ１から切り出されるだろう。突然変異型ＩＬ１３及びシュードモナス外毒素（例えばＰＥ３８ＱＱＲ）配列を連結し、ベクターに挿入してシュードモナス外毒素の末端に結合し（例えばＰＥ３８ＱＱＲのアミノ末端あるいはＰＥ４Ｅ（ＰＥの位置２５３）への結合）突然変異型ＩＬ１３をコードするベクターを作製した。好ましい実施態様では、２分子は直接結合する。あるいは、介在するペプチドリンカーが存在する（例えば、制限酵素部位により導入されたグルタミン酸、アラニン及びフェニルアラニンより構成される３アミノ酸結合体）。
【０１１１】
２分子が事実上直接に結合し一つになることが好ましいが、当業者は分子は１又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドスペーサーにより分離されることもあることを理解するだろう。一般に、スペーサーはタンパク質を結合し、又はその間に最小距離又はその他の空間的関連性を保存すること以外の特異的生物学活性は有さないだろう。しかし、スペーサーの構成的アミノ酸は溶解性、折りたたみ性、総電荷あるいは疎水性といった分子の特性の幾つかに影響を与えるように選択されるだろう。
【０１１２】
融合タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌やその他の細菌性宿主、酵母、及びＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅｌａ細胞株や骨髄芽腫細胞株の様な各種高等真核細胞を含む、様々な宿主細胞内に発現されるだろう。組換体タンパク質遺伝子は、欠く宿主の適当な発現制御配列に動作可能に結合される。大腸菌では、これにはＴ７、ｔｒｐ又はラムダプロモーターの様なプロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終止シグナルを含む。真核生物の場合、制御配列はプロモーター及び好ましくは免疫ブロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス等に由来するエンハンサー、及びポリアデニレーション配列を含み、又スプライスドナー及びアクセプター配列を含むこともある。
【０１１３】
発明のプラスミドは、大腸菌に関する塩化カルシウム又は熱ショック形質転換、及び哺乳動物に関するリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションの様な既知の方法により、選択された宿主細胞内に移される。プラスミドにより形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子の様なプラスミドに含まれる遺伝子により供与される抗生物質に対する耐性により選択できる。
【０１１４】
一度発現されれば、組換体融合タンパク質は硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等の当分野に於いて標準的な方法により精製できる（一般にはR.Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide t o Protein Purificaiton., Academic Press, Inc. N.Y.(1990)参照）。医薬品への横領には少なくとも９０％ないし９５％均一な本質的に精製された成分が好ましく、９８％ないし９９％、あるいはそれ以上均一なものが最も好ましい。所望される様に部分的に精製又は均一化すれば、ポリペプチドは治療にも有用であろう。
【０１１５】
当業者は、化学合成、生物学的発現又は精製の後、ＩＬ１３レセプター指向融合多パク質は、構成ポリペプチドの未変性立体構造とは本質異なる立体構造を採る可能性があることを認識するだろう。この場合、ポリペプチドを変性し、還元し、次にポリペプチドを好ましい立体構造に再度折り込ませる必要があるかもしれいない。タンパク質を還元し、変性させる方法、及び再折り込みを誘導する方法は当業者公知である（Debinski et al., (1993) J.Biol. Chem., 268:14065-14070; Kretiman and Pastan(1993) Bioconjug. Chem.,4:581-585; 及びBuchner, et al.(1992) Ana l. Biochem., 205:263-270参照）。例えばDebinskiらは、グアニジン−ＤＴＥ中に於ける封入体タンパク質の変性及び還元を既述している。続いてタンパク質を酸化グルタチオンとＬ−アルギニンを含む酸化還元バッファー中での再折りたたみについて既述している。
【０１１６】
当業者は、ＩＬ１３レセプター指向融合タンパク質についてその生物学的活性を減じることなく修飾することができると認識するだろう。幾つかの修飾はクローニング、発現又はターゲティング分子の融合タンパク質内への取り込みを促進するために行われるだろう。この様な修飾は当業者公知であり、例えば開始部位提供のためのアミノ末端へのメチオニン付加、又は任意位置への制限部位又は終止コドンの作製を目的とした、何れか末端へのアミノ酸の付加が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【０１１７】
Ｖ．標的細胞の同定
腫瘍細胞はＩＬ１３レセプターを過剰発現しているので、発明の突然変異型ＩＬ１３分子は腫瘍細胞を結合するのに適したターゲティング部分である。特に、癌腫瘍細胞（例えば腎癌細胞）はＩＬ１３レセプターを約２１００部位／細胞ないし１５０，０００部位／細胞の範囲のレベルに過剰発現する。同様に、神経膠腫及びカポシ肉腫もＩＬ１３レセプター（ＩＬ１３Ｒ）を過剰発現する。更に、これまで試験した癌腫は実質的には全てが対応する“健康”組織に比べ、ＩＬ１３レセプターを過剰発現すると考えられた。すなわち、ＩＬ１３レセプターの過剰発現は新生物細胞の一般的特徴であると考えられる。
【０１１８】
すなわち、本発明の方法を利用すれば、いずれの新生物細胞に対してもエフェクター分子を実施的に狙うことができる。新生物は当業者公知であり、皮膚癌（例えば、基底細胞又は扁平上皮細胞癌、メラノーマ、カポシ肉腫等）、生殖系の癌（例えば、精巣、卵巣、子宮頸癌）、胃腸管の癌（例えば胃、小腸、大腸、直腸等）、口腔及び食道の癌（例えば食道、喉頭、中咽頭、上咽腔、口腔等）、頭部及び頚部癌、骨癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌（例えば前立腺癌）、甲状腺癌、心臓癌、網膜癌（例えばメラノーマ）、腎臓癌、肺癌（例えば中皮腫）、膵臓癌、脳癌（例えば神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫等）及びリンパ系癌（リンパ腫）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
特に好ましい実施態様では、本発明の方法を利用しエフェクター分子に腎臓癌、皮膚癌（特にカポシ肉腫）、及び脳癌（特に神経膠腫、及び髄芽細胞腫）を狙わせることができる。
【０１２０】
当業者は、その他の細胞によるＩＬ１３過剰発現の同定と確認は、公知方法を用いた日常のスクリーニングのみを必要とすることを認識するだろう。典型的にはこれはＩＬ１３レセプター（例えば未変性又は突然変異型ＩＬ１３）と特異的に結合する標識され分子を提供することを含む。次に問題の細胞を分子と染色させ、洗浄した。試験細胞に関連し残った標本体量の定量化は、細胞の表面上に存在するＩＬ１３レセプター（ＩＬ１３Ｒ）量の測定値を提供する。好ましい実施態様では、ＩＬ１３レセプターは問題の細胞への125Ｉ−標識ＩＬ１３（125Ｉ−ＩＬ１３）の結合を測定することで定量化されるだろう。この様な結合アッセイの詳細は米国特許第５，６１４，１９１号に提供される。
【０１２１】
ＶＩ．薬学的組成物。
本発明の突然変異型ＩＬ１３キメラ分子（例えばｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ及びその他のサイトトキシン）は、例えばエアゾール又は経皮的な方法により非腸管、表面、経口あるいは局部投与に、予防及び／又は治療処置に関し有用である。薬学的組成物は投与法に従い様々な単位投与形状で投与できる。例えば、経口投与に好適な単位投与形態には、粉末、錠剤、ピル、カプセル及びロゼンジを含む。経口的に投与した場合、融合タンパク質及び薬学的組成物は消化より保護されなければならないと認識される。これは典型的には、タンパク質を組成物と複合体を形成せしめ酸性及び酵素加水分解に対し耐性を付与させること、又はタンパク質をリポソームの様な適当に耐性なキャリアー何にパッケージングさせることで達成できる。消化より化合物を保護する方法は当分野では公知である（例えば、治療作用物質の経口供給に関する脂質組成物を既述する米国特許第５，３９１，３７７号を参照せよ）。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は特に静脈投与あるいは体腔または期間腔内に投与する様な非腸管的投与に好適である。投与に適した組成物は一般に医薬品として受け入れ可能なキャリアー、好ましくは水性キャリアー内に溶解されたキメラ分子の液を含む。各種水性キャリアーが使用できる、例えば緩衝化した生理食塩水等である。これら溶液は無菌であり、一般には望ましくない物質を含まない。これら組成物は通常の、既知滅菌技術により滅菌されるだろう。組成物は、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の様なｐＨ調整及び緩衝作用物質の如く、生理学的条件を模擬するのに必要とされる医薬品として許容される補助物質を含む。これら調剤のキメラ分子濃度は、選択された投与の具体的方法及び患者の必要性に従い、液体容積、粘度、体重等に基づき大きく異なり、かつ一次的に選択される。
【０１２３】
すなわち、静脈内投与に適した典型的薬学的組成物は患者１日当たり約０．１ないし１０ｍｇであろう。薬物が体腔内又は期間内腔の様な予定部位に投与され血流内には投与されない場合、患者１日当たりの０．１から約１００ｍｇの投与量が使用されるだろう。典型的な用量は調整され、副作用を一般に許容されるレベルに維持しながら投与量を最大化されるだろう。非腸管的に投与可能な組成物の調整に適した実際の方法は当業者既知であり又明らかであり、Remington s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvaia(1980)の様な公開物内により詳細に既述されている。
【０１２４】
本発明のキメラ分子（例えば融合タンパク質）を含む組成物、又はそのカクテル（すなわち、その他のタンパク質を含む、例えばＴＧＦα−ＰＥ３８ＱＱＲ）は治療的処置に利用できる。治療応用に於いては、組成物は病気の患者に対し病気及びその合併症を治癒し、又少なくとも部分的に停止させるのに十分な量が投与される。これを達成するのに適当な量は、“治療有効投与量”と定義される。これに適した有効量は、病気の重症度及び患者健康の一般的状態に依存するだろう。
【０１２５】
組成物の単回又は複数回投与は、必要とされる投与量及び頻度、ならびに患者の耐性に依存し投与される。いずれの場合も、組成物は患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。
【０１２６】
本発明の細胞毒性融合タンパク質の多様な応用の中には、タンパク質の有毒作用により排除されるであろう特異的ヒト細胞に起因する多様な病的状態が含まれる。一つの好ましい応用はサイトトキシンに結合された突然変異型ＩＬ１３リガンド（例えばＰＥ又はＰＥ誘導体）の利用による様な癌（例えば神経膠腫）治療である。
【０１２７】
血管新生が激しくなく、又はタイトジャンクションにより結合された細胞によって保護されている涼気が存在すること、及び／又は血流中に存在する高分子の侵入を減じ、又は阻止する能動的輸送メカニズムが存在することは当業者により認識されているだろう。すなわち、例えば、治療薬を全身性に投与し神経膠腫又はその他の脳腫瘍を治療することは、クモ膜下空間ないへの高分子の侵入を阻止する血管脳関門により抑制される。
【０１２８】
当業者はこれら例に於いて本発明の治療組成物が腫瘍部位に直接投与できるｋとを認識するだろう。すなわち、例えば脳腫瘍（例えば神経膠腫）は、治療組成物を腫瘍部位に直接投与することで治療できる（例えば手術的に埋め込まれたカテーテルを介し）。カテーテルを介した液供給に圧が加わる場合、典型的には低分子（例えば本発明の治療分子）は腫瘍周辺から２ないし３ｃｍまで浸透するだろう。
【０１２９】
あるいは、治療成分は標的部位に除法調剤として設置できる（例えばトロンビン−フィブリノーゲン混合体）。この用は調剤には、例えば治療組成物を浸透させた生体適合性スポンジまたはその他不活性な、あるいは吸収性のマトリックス材料、遅延溶解時間放出カプセル又はマイクロカプセル等が含まれる。
【０１３０】
典型的には、カテーテル、又はカテーテル、あるいは時間放出型調剤は手術作業の一部として腫瘍部位に設置されだろう。すなわち、例えば主な主要塊は手術的に切除され、灌流カテーテルあるいは時間放出型調剤を補助治療として腫瘍部位に置くことができる。もちろん、腫瘍塊の外科的除去が望ましくなく、または必要とされず、あるいは不可能な例では、本発明の治療組成物の供給は一次治療法を構成するだろう。
【０１３１】
ＶＩＩ．診断キット
別の実施態様では、本発明は腫瘍治療に適したキット、あるいはＩＬ１３レセプターを過剰発現する細胞を検出するためのキットを提供する。キットは典型的には本発明のキメラ分子（例えば突然変異型ＩＬ１３−標識体、突然変異型ＩＬ１３−サイトトキシン、突然変異型ＩＬ１３−リガンド等）を含む。更に、キットは典型的にはキメラ分子（例えば、腫瘍細胞の検出に関する免疫応答を増加するサイトトキシンの様な）の応用方法を開示する取り扱い資料を含む。キットは更にキットが目的とする特定の応用を促進する追加成分を含むだろう。すなわち、例えばキットがエフェクター分子が検出可能な標識体であるキメラ分子を含む場合、キットは更に標識体を検出する手段（例えば酵素標識体に適した酵素基質、蛍光標識体を検出するフィルターセット、ヒツジ抗マウスＨＲＰの様な適当な二次標識体等）を含むだろう。キットは更に、緩衝液及び特定の方法の実施に日常的に使用されるその他の試薬を含むだろう。これらキット及び適当な内容物は当業者公知である。
【０１３２】
実施例
以下の実施例は例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。
【０１３３】
最近、我々は脳腫瘍（神経膠腫）の大部分が大量にインターロイキン１３（ＩＬ１３）に対するレセプター（Ｒ）を発現していることを示した。神経膠腫に於けるＩＬ１３のより特異的ターゲティングを達成するために、我々はヒト（ｈ）ＩＬ１３を突然変異誘導した。共通機能性のＩＬ１３／ＩＬ４正常組織レセプターとのＩＬ１３の相互作用を変化させるが、神経膠腫関連レセプターとの相互作用は変化しない突然変異を作った。
【０１３４】
実施態様の一つでは、本発明は位置１３のグルタミン酸のリジンへの突然変異を含む。このｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋと称される突然変異は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）の誘導体と融合した。以下の実施例に示すように、突然変異したＩＬ１３をベースとするサイトトキシンは正常細胞に対する活性は及びｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性は無く、又非突然変異型ｈＩＬ１３を含むサイトトキシンに比べると抗腫瘍剤として良好である。我々はｈＩＬ１３は、正常組織の共通ＩＬ１３／ＩＬ４レセプターと癌に関連するｈＩＬ１３をより明瞭に識別する工学に適していると結論した。
【０１３５】
（実施例１）
ＩＬ１３及びＩＬ１３サイトトキシンの作製
材料
制限酵素とＤＮＡリガーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ）及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より得た。高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム及び溶媒はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）より購入した。オリゴヌクレオチドプライマーはＰｅｎｎ  Ｓｔａｔｔｅ以下大学のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成した。ＰＣＲキットはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）より得た。細胞タイター用の９６水性非放射性細胞増殖アッセイ向けＭＴＳ／ＰＭＳはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）より購入した。
【０１３６】
プラスミド、細菌株及び細胞株。
プラスミドはＴ７バクテリオファージ後期プロモーター、タンパク質のオープンリーディングフレームの端部にＴ７転写ターミネーター、複製のｆ１起点及びアンピシリン耐性遺伝子を有している（Debinski et al.(1992) J.Clin. Invest . 90:405-411）。ｈＩＬ１３に関する配列をコードするｃＤＮＡはＰＣＲでクローン化し、前述の如くに（Debinski et al.(1995) Clin.Cancer Res.1:1253-1258; Debinski et al.(1996) J. Biol.Chem.271:22428-22433;Debinski et al.(1995) .Biol.Chem.270:16775-16780）ｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ及びｈＩＬ１３を作製した。組換体タンパク質は大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）中に、Ｔ７後期プロモーター制御下に発現させた（Studier et al.(1986) J.Nol.Biol.189:113-130）。プラスミドは大腸菌（ＥＢ１０１又はＤＨ５α高効率トランスフォーメーション）（ＢＲＬ）中に増幅され、ＤＮＡはＱｉａｇｅｎキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用い抽出された。
【０１３７】
ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−サイトトキシンをコードするプラスミドの構築
ヒトＩＬ１３（ｈＩＬ３）はｐｈｕＩＬ１３鋳型より成熟型にＰＣＲ−増幅した（Debinski et al.(1995)J.Biol.Chem.270:16775-16780）。ヒトインターロイキン１３の位置にあるグルタミン酸からリジンへの突然変異をセンスＰＣＲプライマー（ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋセンスプライマー：5 -AGGAGATATACATATGTCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGA-3 、配列番号１）に取り込まれた。アンチセンスプライマーは5 -GTCGTGGGTGGATCCTCAGTTGAACCGTCCCTCGCGAA-3 （配列番号２）であった。
【０１３８】
新規部位はそれぞれインターロイキン遺伝子の５‘及び３’末端に２種類の制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ用に導入された。消化されたフラグメントは適当酵素で消化された発現ベクター内にサブクローン化された。プラスミドは医科大学分子遺伝学コア施設にある自動ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使い配列決定された。
【０１３９】
組換体タンパク質の発現及び精製
大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞を所望のプラスミドでトランスフォームし、テリフィックブロス（Ｇｉｂｃｏ、ＢＦＬ）にて培養した。サイトトキシン及びインターロイキンは封入体内に局在した。封入体からの組換体タンパク質の分離方法は既に既述されている（Debinski et al.(1993)J.Biol.Chem.268:14065-14070）。透析後、リネーチャータンパク質をイオン交換クロマトグラフィーカラム及びＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使った分子篩クロマトグラフィーにて精製した。蛋白濃度はＢＳＡを標準に使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ“Ｐｌｕｓ”、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）にて決定した。
【０１４０】
組換体タンパク質は発現され、ＳＴＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されたところに拠れば高い均一レベルに精製された。電気泳動はクマジーブルーで染色された１５％の還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用い行われた。ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００ＨＲ精製組換体タンパク質を６μｇ／レーンかけた。ｈＩＬ１３／ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、ｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ／ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ、ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ／ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅはそれぞれ１２−、５０−及び７８−ｋＤａのタンパク質であった。
【０１４１】
（実施例２）
突然変異型ＩＬ２３キメラ分子の活性
蛋白合成阻害アッセイ
サイトトキシンの活性は以下の様にして試験した；通常５×１０３細胞／ウエルを９６ウエル型組織培養プレート中、１５０μｌの培地中に播いた。各種濃度のサイトトキシンを０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈し、各希釈液２５μｌを細胞接種１８−２４時間後に細胞に加えた。細胞は更に４８時間３７℃にて培養された。次に、細胞毒性を比色ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩］／ＰＭＳ（フェナジンメタスルフェート）細胞増殖アッセイを利用し決定した。ＭＴＳ／ＰＭＳはメーカー推奨の最終濃度の半分が加えられた。細胞を色素と共に４時間インキュベーションされ、続いてマイクロプレートリーダー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）を用い各ウエル毎に４９０ｎｍの吸光度を測定した。シクロヘキサミド（１０ｍＭ）で処理された細胞を含むウエル、又は精細胞を含まないウエルをアッセイのバックグランドとしてそのまま保存した。我々は正常及び癌細胞に関する随伴実験についても同じサイトトキシン液を用いた。阻止試験については、サイトトキシン添加前に１．０μｇ／ｍｌ濃度のインターロイキンを細胞に６０分間加えた。結果はサイトトキシンが蛋白合成の５０％を阻害する濃度であるＩＣ50で表した。
【０１４２】
細胞増殖試験
ＴＦ−１細胞を利用した細胞増殖試験は実質既述の如くに行った（Zurawski et al.(1993) EMBO J.12:2663-2670）。インターロイキンの最大増殖活性は１００ｎｇ／ｍｌ濃度で得た。値はＡ490ｎｍにて記録されたバックグランドと最大（組換体タンパク質処理細胞）ＭＴＳ変換の差として表された。データは４重測定の平均値より得た、アッセイは少なくとも４回繰り返した。
【０１４３】
組換体インターロイキン及びそれらサイトトキシンのヒト神経膠腫へ結合実験
１×１０6Ｕ−２５１ＭＧ神経膠腫細胞を、２本ずつのチューブの中で１００ｐＭの125Ｉ−ｈＩＬ１３のみと、又は０．１−５００ｎＭの非標識ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ及びｈＩＬ１３又はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４ＥとｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅと共にインキュベーションした。インキュベーションは４℃で４時間行った。培養体は遠心分離（１０，０００ｇ）により４℃のフタラートオイル混合を通過させて遊離型125Ｉ−ｈＩＬ１３と細胞結合型125Ｉ−ｈＩＬ１３を分離した。細胞沈殿を各チューブ端から切り取り、ガンマーカウンターにて放射活性を測定した。実験は２回行った。
【０１４４】
抗腫瘍実験
０日目にＵ２５１−ＭＧヒト神経膠腫細胞（６×１０５／マウス）をメスのｎｕ／ｎｕ無胸腺マウス（４ないし５週齢）の皮下に移植した。腫瘍が確立した１１日又は１２日目に処理を開始した。その後行われるｈＩＬ１３をべースとしたサイトトキシンに関する４つの臨床試験でこのルートが薬物提供経路となることが予定されていたことから、サイトトキシンは腫瘍内へ注射された（Wersall et al.(1997) Cancer Immunol. Immunother, 44:157-164; Laske et al, (1997) Nature Medicine 3: 1362-1368）。注射用量は２５μｌであり、サイトトキシンはＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈された。各処置グループは５匹ずつから構成された。腫瘍はノギスで測定され、腫瘍容積計算式は以下の通りであった：長さ×幅2×０．４（Debinski et al.(1993) J.Biol.Chem.268:14065-14070）。.
【０１４５】
結果
ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ増殖活性は変化する−
我々はＴＦ−１細胞（共通ＩＬ１３／４Ｒを発現するヒト前骨髄性赤血球性白血病細胞）（Obiri et al.(1997) J.Immunol.158:756-764; Zurawski et al.(1993) EMBO J.12:26 63-2670）に於けるインターロイキン及びその突然変異体に対する増殖反応を測定した。我々はＴＦ−１細胞をｈＩＬ１３、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、及びｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄで処理した（図４）。ｈＩＬ１３はＴＦ−１細胞の増殖の刺激に於いて極めて強力であった（図４）。これに対し、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋの活性は非常に弱く、一方ｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄはこれら細胞に対し増殖活性を示さなかった。
【０１４６】
細菌性毒素と融合したｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋは野生型ｈＩＬ１３含有サイトトキシンに比べ正常ヒト細胞に対し活性は低い−
次に我々は他の選択的正常細胞同様に機能的ｈＩＬ１３／４Ｒを発現している正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた（Schnyder et al.(1996) Blood 87:4286-4295, Bochner et al.(1995) J.Immunol. 154:799-803, Sironi(1994) Blood 84:1913-1921）。我々は、サイトトキシン濃度10,000μg.mlまではこれら細胞に対するｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲのＩＣ50を見いだせなかった。（Husain et al .(1997) Clin.Cancer Res.3: 151-156）。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞に対するより強力なサイトトキシンであるｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ（Debinski et al. (1996) J.Biol.Chem.271:22428-22433）は、ＨＵＶＥＣに対し一部殺滅活性を示した（２００−４００ｎｇ／ｍｌのＩＣ50）。平行してアッセイすると、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅは野生型ｈＩＬ１３含有サイトトキシンに比べＨＵＶＥＣに対する細胞毒性が５倍少ない（―１０００ｎｇ／ｍｌのＩＣ50）。正常細胞に対するいずれの作用を惹起するにも高いサイトトキシン濃度が必要とされることを強調することは重要である。
【０１４７】
ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋはヒト神経膠腫細胞に対する効力を獲得する
ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４ＥはｈＩＬ２４−ＰＥ４Ｅに比べ正常細胞に対する細胞毒性が低いことが示された（図５）ことから、癌細胞に対するその効力も消失している可能性があった。その為に、我々は複数の神経膠腫細胞株をｈＩＬ１３サイトトキシンで処理した。我々は、例えばＳＮＢ−１９神経膠腫細胞がＩＣ５０が０．７ｐｇ／ｍｌとｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅに対し極めて感受性であることを見いだした（図６Ａ）。一方、ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅの細胞毒性作用は非常に強力ではあるが、驚くべき事にｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅに見られるものに比べると６倍低くかった（図６Ａ）。ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅに対するｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの細胞毒性活性に関する同様の増加はＵ−２５１ＭＧ細胞でも観察された（図６Ｂ）。平均すると、他の複数の神経膠腫細胞はｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅに比べ、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅにより３ないし１０倍強く殺滅された。この様な予想外の結果は、正常細胞に及ぼすｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの細胞毒性活性減少と明確な対比を成す（図５）。
【０１４８】
ｈＩＬ１３及びｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋは神経膠腫に対するｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋサイトトキシンの作用をブロックしたが、ｈＩＬ４はしなかった
我々は細胞毒性融合タンパク質を添加する前にｈＩＬ１３又はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋの何れかで神経膠細胞を前処理した。我々は、試験した全ての神経膠腫細胞について過剰のｈＩＬ１３によりその細胞毒性作用が阻止されたことから、ｈＩＬ１３／Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４ＥはｈＩＬ１３Ｒ特異的であることを見いだした（例えば図６ＣのＤＢＴＲＧＭＧ）。更に、ｈＩＬ１３．Ｅ１３ＫはｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの細胞毒性を、ｈＩＬ１３同様に中和した。これに対し、我々の従来の研究（Debinski et al.(1995)Clin.Cancer Res.1:1253-1258; Debinski et al.(1996) J.Biol.Chem.271:22428-22433）と一致するが、ｈＩＬ４はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの作用の中和には有効では無かった（図６Ｃ）。
【０１４９】
突然変異型ｈＩＬ１３の神経膠腫細胞への結合活性−
ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋサイトトキシンの予想外の高い効力に関する考え得る理由を検討するために、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ突然変異型ｈＩＬ１３を使い、Ｕ−２５１細胞上の125Ｉ−ｈＩＬ１３の結合部位に関する競合アッセイを行った。代表的結果を図７に示す。突然変異型及び野生型ｈＩＬ１３は共に放射線標識されたｈＩＬ１３結合部位を効果的に競合した（図７）。しかし、ｈＩＬ１３．Ｅ１３ＫはＩＬ１３に比べると約５０倍良好な結合分子であった。さらにｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅも、ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅに比べると神経膠腫細胞に対し８ないし１０倍良好な親和性を示した（データ未提示）。
【０１５０】
ｈＩＬ１３サイトトキシンの抗腫瘍活性
我々は突然変異型ＩＬ１３を含むサイトトキシンと脳腫瘍細胞とのｉｎ  ｖｉｖｏに於ける相互作用を試験し（図６）たことから、その効果を野生型インターロイキン含有サイトトキシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果と比較することは重要である。我々はヒト悪性神経膠腫であるＵ−２５１ＭＧの異種移植体を持つマウスに於いて抗腫瘍実験を実施した。ＩＬ１３は種特異的ではないので、動物実験はヒトの条件をよく反映していると考えられる。処置は腫瘍が形成され、５０ｍｍ3以上になった１２日目に開始した（図８Ａ）。１日おきにｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅを３回注射したところ、マウス当たり４μｇ及び０．５μｇのサイトトキシンを投与したマウスグループでは腫瘍が完全に退行し、一方マウス当たり０．０６２５μｇのｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅを投与したグループでは腫瘍成長阻害が増強した。サイトトキシン４．０μｇを投与されたグループでは２匹の死亡例があったが、生存マウスでは無腫瘍状態が持続した。ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅをマウス当たり０．５μｇ投与された５匹のマウスの内３匹は８０日目に於いて無腫瘍であった。一方、マウス当たり２．０μｇ及び０．２５μｇのＩＬ１３−ＰＥ４Ｅを投与されたマウスでは、全マウスで完全退行が起こったが、前者のマウスグループでは３匹が死亡した（図８Ａ）。興味深いことに、ｈＩＬ１３Ｅ．Ｅ１３Ｋ−をベースとするサイトトキシンを注射されたグループの腫瘍部位は、皮膚創傷を生じたｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ注射マウスグループの腫瘍部位に比べより明瞭な炎症を示した。予備実験では、我々はマウス当たり０．５μｇのｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅを６回注射すると全ての治療動物で治癒する（１００日間無腫瘍）ことも見いだした。ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋサイトトキシンを使った治療の最適化を実施している。
【０１５１】
次の実験では、我々はｉｎ  ｖｉｔｒｏに於いて癌細胞に対しＰＥ４Ｅ含有サイトトキシンに比べ活性の低いｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８８ＱＱＲ及びｈＩＬ１３−ＰＥ３８８ＱＱＲを使用した（図８Ｂ）。樹立したＵ−２５１ＭＧ腫瘍を持つマウスに、マウス当たり５．０、１．０及び０．２μｇの何れかのサイトトキシンを１日おきに６回注射、処置した（図８Ｂ）。マウス当たり５．０μｇのｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲで処理されたマウスは全例４回目の注射時に死亡したが、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲ処置グループの動物では同じ処方量の５匹のマウスの内３匹が生き残った（図８Ｂ）。マウス当たり１．０μｇのｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲで処置されたマウスでは全例で腫瘍が退行したが、同用量のｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲは腫瘍成長を停止させた。同様に、マウス当たり０．２μｇのｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲは、マウス当たり０、２μｇのｈＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲの投与に比べはるかに良好な抗腫瘍効果を生じた（図８Ｂ）。さらにｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋをベースとするサイトトキシンで処理されたマウスの腫瘍部位はｈＩＬ１３をベースとしたサイトトキシンで処理されたマウスのものと比較すると、特に高用量のサイトトキシンに於いてより炎症が明瞭であった。
【０１５２】
考察
我々は、サイトトキシンの中で突然変異型ｈＩＬ１３、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋは毒性が低く、また野生型インターロイキンをベースとする融合蛋白に比べ良好な抗腫瘍活性を有することを見いだした。これらのデータは、腫瘍関連レセプターの治療特異性を増幅する有効な方法を示している。
【０１５３】
ｈＩＬ１３に関する機能的正常組織レセプターは、それが１４０−ｋＤａｈＩＬ４Ｒβを含むことからｈＩＬ４と相互作用する（Obiri et al.(1997) J.Immunol.158;756-764,Zurawski et al. (1993) EMBO J.12:2663-2670）。ｈＩＬ４の１４０−ｋＤａＩＬ４Ｒβとの結合に関与している（Kruse et al.(1992) EMBO J.12:51 21-5129）保存的アミノ酸の変化は、突然変異型ｈＩＬ１３の挙動も同様に変化させる。このことはｈＩＬ１３がｈＩＬ４の構造相同体であることを示すものである。更に、ｈＩＬ１３と１４０−ｋＤａＩＬ４Ｒβ間の相互作用は、少なくともその一部α螺旋Ａの中に局在するｈＩＬ１３レセプター結合域と１４０−ｋＤａＩＬ４Ｒβの細胞外ドメインとの直接結合を通じ行われると推測される。この特異性の問題については更に研究を進めている。
【０１５４】
ｈＩＬ１３，Ｅ１３Ｋ含有サイトトキシンはより良好な抗腫瘍剤でありながら、正常細胞に対する細胞毒性は低く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性も少ないことは興味深い。ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋは野生型インターロイキンに比べより強い結合活性にて神経膠腫と結合し、それがより強力なサイトトキシン活性をもたらすと考えられる。親和性の上昇は、癌細胞上に存在するｈＩＬ１３Ｒの特定の形に対するｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋの結合のシフトを反映したものであろう（Murata et al.(1997) Biochem. Biophys. Res. Comm.238:92-94）。同時に、我々はｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−をベースとしたサイトトキシンで処理された腫瘍部分の巨視的形態に違いがあることを観察している。これは、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋサイトトキシンを使用した時、変化しない死滅癌細胞により活発に炎症浸潤に対応したものであるか、あるいはこの現象はより迅速かつ強力な癌細胞の殺滅に関係している。
【０１５５】
標的となるレセプターへの結合を改良、あるいは細菌毒素のプロセッシングに関わる経路及び／又は細胞質内運搬の良好な利用を目指し、より活性な指向性サイトトキシンを探す研究が続けられている(Seetharam et al.(1991) J.B iol.Chem.266:17376-17381, Kreitman et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.91:6889-6893)。これら改良は、サイトトキシンが正常細胞に対しより有毒になることから、正常細胞に影響が出る。また、伝統的な抗癌剤、化学療法剤の効果を増強する試みには毒性の増大及び突然変異性の顕在化が伴う(Chinnasamy et al.(1997) Blood 89;1566-1573)。一方、我々のアプローチは最初に既に低い正常細胞とサイトトキシンとの相互作用を低下させるものである。我々は、これが脳腫瘍細胞に於ける結合性の低下とは平行しないシステムを特定した。
【０１５６】
要約すると、我々は神経膠腫関連レセプターを標的とするサイトトキシンの特異性を増す特有の単試薬法について既述した。これは、正常細胞での細胞内シグナリング、正常細胞への傷害的な指向の低下、及び脳腫瘍に対する抗腫瘍活性の増強を含む。
【０１５７】
ここに記載の実施例及び実施態様は例示を目的とするものであり、その範囲に於ける各種改良又は変更が当業者に対し示唆されるが、これらは添付されたクレー羽の本申請及び範囲の精神と理解の中に含まれると理解される。ここに引用された全ての公開物、特許及び特許申請は、全ての目的に関しその全体が参照されここに取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＩＬ１３／ｈＩＬ４Ｒのモデル図及びそれに対する突然変異型インターロイキン１３の作用。
【図２】インターロイキン１３及びインターロイキン４の略図。
【図３】第１αヘリックス、αヘリックスＡで終端するヒト及びマウスのインターロイキン１３及びインターロイキン４のＮ−末端。αヘリックスＡを形成するアミノ酸には下線を付した。グルタミン酸の保存残基は太字で記した。
【図４】ｈＩＬ１３、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ、及びｈＩＬ４．Ｙ１２４ＤのＲＦ−１細胞に及ぼす増殖活性を示す図。これらアッセイでは、ｈＩＬ４．Ｙ１２４Ｄについては０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度では使用しなかった。縦のバーはＳＤを表すが、シンボルより小さいこともある。
【図５】ｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ及びｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４ＥのＨＵＶＥＣ細胞に及ぼす細胞毒性活性を示す図。縦のバーはＳＤを表すが、シンボルより小さいこともある。
【図６】ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅ又はｈＩＬ１３−ＰＥ４ＥのＳＮＢ−１９（図６Ａ）及びＵ−２５１ＭＧ細胞（図６Ｂ）に及ぼす細胞毒性活性を示す図。ｈＩＬ１３、ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ及びｈＩＬ４による、ＳＮＢ−１９細胞に及ぼすｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ４Ｅの細胞毒性の中和（図６Ｃ）。ｈＩＬ４は最低濃度のサイトトキシンで処理された細胞には加えられなかった。縦のバーはＳＤ（Ａ及びＢ）を表すが、シンボルより小さいこともある。
【図７】ｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ及びｈＩＬ１３によるＵ−２５１ＭＧ細胞上を巡る125Ｉ−ｈＩＬ１３に関する結合部位の競合を示す。
【図８Ａ】マウス内に成長しているヒトＵ２５１−ＭＧ神経膠腫瘍に及ぼすｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ及びｈＩＬ１３サイトトキシンの抗腫瘍活性。矢印はサイトトキシン注射日を示す。縦のバーはＳＥｓに対応するが、シンボルより小さいことがある（８ＡではｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ２．０については示されていない）。
【図８Ｂ】マウス内に成長しているヒトＵ２５１−ＭＧ神経膠腫瘍に及ぼすｈＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ及びｈＩＬ１３サイトトキシンの抗腫瘍活性。矢印はサイトトキシン注射日を示す。縦のバーはＳＥｓに対応するが、シンボルより小さいことがある（８ＡではｈＩＬ１３−ＰＥ４Ｅ２．０については示されていない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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