(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるペプチド。
NTCPPCPXYCPPCPAC．．．（１）
（式中、XおよびYは同一でも異なっていてもよく、かつそれぞれ中性脂肪族Lアミノ酸残基である）。
【請求項２】
Xがアラニン残基である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Yがトレオニン残基である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
１つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、前記鎖はアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC（ＸおよびＹは請求項１に規定される通り）を含むことを特徴とする、タンパク質。
【請求項５】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、前記各鎖はアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC（ＸおよびＹは請求項１に規定される通り）を含み、各鎖は、前記各アミノ酸配列に存在する１、２、３または４つのシステイン残基を介して他と共有結合することを特徴とする、タンパク質。
【請求項６】
抗体またはそれらの抗原結合部位である、請求項４または５に記載のタンパク質。
【請求項７】
FaｂまたはFab'フラグメントである、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
１つまたはそれ以上のエフェクターまたはレポーター分子が付着されていることを特徴とする請求項４から７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質中のヒンジ領域として機能するペプチド、このようなヒンジ領域を含むタンパク質および薬物における前記タンパク質の使用に関する。
【０００２】
臨床抗体治療および画像分析へ適用するには、二量体抗体種の結合活性は、しばしばin vivoにおける有効な抗体親和性を達成するために必要であるが、エフェクター機能またはFcドメインによって付与される長期の血清耐久性を有さない（文献番号１〜３−本明細書中、文献は番号によって表されている。本明細書の以下に記載の「参考文献」のリストを参照のこと）。F(ab')2分子は、この必要性を満たし、適切なイソタイプのモノクローナル抗体のタンパク質分解切断またはE. coli中で産生されたドメイン由来の組換え免疫グロブリンの使用して産生することができる。
【０００３】
E. coliの酸化周辺質に抗体フラグメントを分泌することができれば、グラフト化された、高発現Fab'の操作を迅速に行えるという利点がえられる。重要なことは、E. coliを使用することにより、費用効果および巨大市場に供給するのに必要とされる抗体物質を迅速に生産することができる（文献番号４、５）。操作されたFab'は、しばしばたった１個のヒンジ−システインで発現する。このシステインは、F(ab')2を作製するための他のFab'の付着または放射性核種、酵素、またはトキシンなどの治療エフェクター分子の付着に使用することができる（文献番号６）。
【０００４】
修飾scFvおよびFab'の両方を用いたE. coliにおけるiv vivoでの二価の抗原結合種を産生するためのいくつかのタンパク質工学アプローチが報告されている。単純なヒンジ修飾では、E. coli由来の二量体種は、in vivoで実質的に得られない（文献番号７〜９）。in vivoで二量体化を増大させる技術は十分に特徴づけられているが、これらは、しばしば潜在的に免疫原性で、溶解タンパク質の発現レベルを非常に減少させることが可能な巨大な非免疫グロブリン二量体化モチーフを使用する（文献番号１０〜１３）。二量体抗原結合種の最も単純なルートとしては、in vitroでのFab'の直接的ジスルフィドまたは化学的架橋がある（文献番号２、７、１４、１５）。２つのFab'の間の共有結合の選択は、非常に重要な選択である。(Fab')2がin vivoで切断されるならば、得られたFab'は結合活性の喪失および循環系からの非常に迅速な浄化値の両方が欠点となる（文献番号１、２）。一本のジスルフィド結合は、保護されたジスルフィド、スルフィド、またはチオエーテル結合よりもin vivoにおいて切断の影響を受けやすいことが公知である（文献番号２、９、１６）。しかし、IgG１のタンパク質分解切断から単離された(Fab')2のヒンジ領域に見出される２つのジスルフィド結合は、血清耐久性によって判断された１つのチオエーテル結合と同じぐらい強力であることが以前に見出されている（文献番号９）。
【０００５】
製造および他のエフェクター分子へのカップリングがさらに効率がよい容易なin vivo切断の問題を克服する非免疫原性二量体抗体種が必要である。本発明者らは、今回、Fab'フラグメントなどの巨大タンパク質の一部である場合、効率よく二量体を作製し、そしてin vitroでの化学的還元に高い耐性があり、かつin vivoで長い血清耐久性時間を有する二量体を産生するペプチドを見出した。有利には、ペプチドはE. coli中で非常に耐性があり、本発明者らの今回の試験において免疫原性を示さなかった。
【０００６】
従って本発明の一つの態様によれば、本発明者らは、式（１）で示されるペプチドを提供する。
NTCPPCPXYCPPCPAC．．．（１）
（式中、XおよびYは同一でも異なっていてもよく、かつそれぞれ中性脂肪族Lアミノ酸残基である）。
【０００７】
式（１）および本明細書中に記載の他のペプチドにおいて、特に示さない限りアミノ酸残基を示すために従来の一文字表記を使用する。上付き文字の「N」および「C」は、それぞれペプチドのN−およびC−末端を示すために使用する。
【０００８】
XおよびYの各基で示された中性Lアミノ酸残基には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニン残基が含まれる。
【０００９】
式（１）のペプチドの保護誘導体には、N−末端のアミノ基またはC−末端のカルボキシル基が保護誘導体に結合しているN−およびC−末端保護誘導体が含まれる。N−保護誘導体には、例えば、ベンジルオキシ−カルボニルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ、シクロアルキルオキシカルボニルアミノ、t−ブトキシカルボニルアミノ、トリフルオロアセチルアミノ、フタリルアミノ、アラールキルアミノ、例えば、ベンジルアミノ、ジフェニルメチルアミノもしくはトリフェニルメチルアミノ、トシルアミノまたはホルミルアミノ誘導体又はこれらの置換体が含まれる。C−保護誘導体には、任意に置換されたエステル、例えばアルキルエステル（メチル、エチルまたはt−ブチル）、アラールキルエステル（例えば、ベンジルまたはベンツヒドリル）、シリルエステル（例えば、トリメチルシリル）および、フタリミドメチルエステルならびにポリマーとのエステル（例えば、官能基化スチレンベースの樹脂）が含まれる。
【００１０】
式（１）のペプチドの反応性誘導体は、式中C−末端カルボキシル基が官能基化されているものを含み、そして、例えば、アシルクロライドなどのアシルハロゲン化物、アシルシアニドまたはアジド、無水物、エステル（例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド、p−ニトロフェニルまたはペンタクロロ−フェニルエステル）、N−アシルイミダゾール、ピラゾールもしくはトリアゾールなどのN−アシル複素環またはカルボジイミドもしくはイソキサゾリウム試薬の添加によって形成された活性酸である。
【００１１】
式（１）の特に有用なペプチドとしては、式中、Ｘがアラニン残基であるものを含む。別の好ましい態様においては、Ｙは特にトレオニン残基である。本発明の特に有用なペプチドは、以下の式（２）
NTCPPCPATCPPCPAC．．．（２）
およびそれらの保護され、反応性のあるその誘導体である。
【００１２】
本発明のペプチドは、慣例的なペプチド合成技術（例えば、Merrifield、B.Science、（１９８５）、２３２、３４１〜３４７を参照のこと）を用いて適切に活性化および／または保護されたアミノ酸（例えば、式（１）のペプチドと共に記載された型の反応性誘導体および保護基を利用する）から調製してもよい。
【００１３】
式（１）の各ペプチド中の４つのシステイン残基の存在は、ジスルフィド結合および／またはチオエーテル結合を形成する４つの反応中心を提供し、よってチオール反応基を含む他の分子との反応を可能にする。特に、二量体タンパク質は、タンパク鎖中にペプチドを組み込むことによって得られ、本発明はこのような用途にも関する。タンパク質の二量体化を達成するために、式（１）のペプチドは、現存のタンパク質に最初にカップリングされるか、またはde novoでその一部として合成されるかしなければならない。従って、本発明の別の態様において、鎖がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC（式中、ＸおよびＹは、式（１）のペプチドとして規定される）によって特徴づけられる１つのポリペプチド鎖を含むタンパク質を提供する。
【００１４】
本発明はまた、上記で説明のように、NTCPPCPXYCPPCPAC中のシステイン残基を介して共有結合された２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質に関する。従って、本発明の更なる態様では、本発明者らは、２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各鎖がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC（式中、ＸおよびＹは式（１）のペプチドとして規定される）を含み、そして各々の鎖は、前記各アミノ酸配列に存在する１、２、３または４つのシステイン残基のいずれかを介して共有結合していることを特徴とするタンパク質を提供する。
【００１５】
本発明のタンパク質において、アミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPACは、好ましくは、配列NTCPPCPAYCPPCPACであるかNTCPPCPXTCPPCPACであり、特に配列NTCPPCPATCPPCPACである。
【００１６】
本発明のタンパク質は、式（１）のペプチドがカップリングされている天然に存在するタンパク質かまたはアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPACが組み込まれた組換えタンパク質であってもよい。タンパク質は、一般に、構造タンパク質または、特に結合タンパク質であってもよい。特定の結合タンパク質には、ホルモン、サイトカイン、コロニー刺激因子、成長因子、放出因子、イオンキャリア、トキシンおよびそれらのレセプター（細胞表面結合分子への結合に関連するレセプター、Ｔ細胞レセプター、CD４、ＣＤ８，CD２８、サイトカインレセプター（例えば、インターロイキンレセプター、TNFレセプターまたはインターフェロンレセプター）、コロニー刺激因子のレセプター（例えば、G-CSFまたはGM-CSF）を含む）、血小板由来成長因子（例えば、PDGF-αおよびPDGF-β）ならびに特に、抗体およびそのフラグメントに結合する抗体種の全体又は一部分が含まれる。
【００１７】
本発明のタンパク質がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPACを含む１つのペプチド鎖を有する場合、タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく１つまたはそれ以上の他のポリペプチド鎖に別々に連結して包括的な多量体構造を形成してもよい。共有結合したNTCPPCPXYCPPCPAC配列を有する２つのポリペプチド鎖を含む本発明のタンパク質において、タンパク質は、少なくとも二量体であることは明確であるが、他の、別々に連結した鎖から成り、包括的な多量体構造を形成しても良い。二量体および多量体は、１つ以上の型のポリペプチド鎖で構成されてよく、ホモメリックまたはヘテロメリックであっていてもよい。
【００１８】
本発明のタンパク質の産生は、標準的な化学的または組換えDNA技術を用いて達成できる。化学技術には、式（１）のペプチドの産生に関する上記記載のタンパク質およびペプチドの活性化され保護された誘導体を使用するタンパク質および式（１）のペプチドの化学的カップリングが含まれる。この方法では、例えば、式（１）のペプチドは、適切なC−活性化タンパク質のC−末端に部位特異的にカップリングできる。
【００１９】
組換えDNA技術には、一般に、宿主細胞よりタンパク質の発現後標準的な分離および精製技術を用いてタンパク質を回収する技術が含まれる。周知の手順を用いて、タンパク質をコードするDNAを、DNAをベクター中の必要とされる任意の発現調節エレメントに操作可能に連結して任意の適切な発現ベクターに導入して、そのベクターを用いて適切な任意の原核生物または真核生物宿主細胞を形質転換してもよい。適切な技術のより詳細な記載を、本発明の明細書中の抗体産生に関する箇所に示す。これらは、一般に、組換え手段による本発明の任意のタンパク質の産生を可能にすることを後に行いおよび／または容易に適用してもよい。組換えDNA技術の使用は、タンパク質中の所望の任意の部位で式（１）のペプチドの容易な操作および挿入できるという点で、本発明のタンパク質に対する柔軟なアプローチを提供する。従って、式（１）のペプチドをコードするDNAは、特に有用であり、本発明の更なる態様を形成する。アミノ酸配列NTCPPCPATCPPCACをコードする以下のヌクレオチド配列：
５'ACATGCCCGCCGTGCCCGGCGACCTGCCCGCCGTGCCCGGCG３'
（各文字はヌクレオチドの標準的な記号を示す）を含むDNAは、特に有用である。本発明は、本配列ならびに遺伝コードの縮重によって１つまたはそれ以上のヌクレオチドが置換されているその変異体を含むDNAに関する。本発明はまた、式（１）のペプチドをコードするDNAを含む組換えプラスミド、前記プラスミドを含む細胞、および前記細胞を培養することにより所望のタンパク質を発現させ、培養物からタンパク質を回収する工程を包含する本発明のタンパク質産生法に関する。
【００２０】
アミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPACは、各配列が二量体化の能力を提供するヒンジ領域として機能する細胞表面レセプターまたは抗体などの結合タンパク質と使用するのに特に有用である。従って、例えば、有効なレセプター結合に必要な個々のレセプター鎖の二量体化を促進するためのこれらの配列を組み込む組換えレセプター（例えば、国際特許明細書WO９２/１００５９１、WO９２/１５３２２、WO９３/１９１６３、WO９５/０２６８６およびWO９７/２３６１３を参照のこと）がデザインされる。本発明は、式（１）のペプチドを少なくとも１つ含む組換えレセプターに関する。このようなレセプターは、例えば、細胞に再指向するかまたは活性化するのに有用である（上記特許明細書を参照のこと）。本発明は、式（１）のペプチドを少なくとも１つ含む組換えレセプターを発現する細胞を含む。
【００２１】
抗体において、配列NTCPPCPXYCPPCPACは、天然に存在するヒンジ領域（ヒンジ領域は、天然に存在する免疫グロブリンのCH１とCH２ドメインとの間に位置する）に対する置換物として使用できる。配列は、本目的に特に適切であり、本発明の好ましい態様では、本発明者らは、ヒンジ領域がアミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC（式中、ＸおよびＹは、式（１）で規定されている）を有することによって特徴づけられる、ヒンジ領域を含む抗体を提供する。この例において、ヒンジ領域は、好ましくは、アミノ酸配列NTCPPCPAYCPPCPACまたはNTCPPCPXTCPPCPACを有し、特にNTCPPCATCPPCPACを有する。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、一般に、一価、二価または他の多価抗体を含むことが意図される。従って、例えば、本発明の一価の抗体は、免疫グロブリン重鎖可変（VH）ドメインおよび好ましくはVHドメインのＣ−末端で直接付着したNTCPPCPXYCPPCPACヒンジ領域を含む一本鎖であってもよい。あるいは、VHドメインおよびヒンジ領域は、互いにまたは抗体の他の部分とペプチド結合する１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むスペーサー領域によって分離してもよい。スペーサー領域は、例えば、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖（CH）または軽鎖（CL）定常ドメインまたはそのフラグメント（例えば、CH１ドメインまたはそのフラグメントおよび／またはCH２および／またはCH３ドメインまたはそのフラグメント）であってもよい。所望の場合、上に述べた通り、ヒンジ領域が、そのＣ−末端に付着した１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域ドメインまたはそのフラグメント）を有することができる。VHドメインは、単量体または二量体でよく、そしてVH−VHまたはVH−ＶL（VLは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン）二量体（VHおよびVL鎖は、非共有結合的に連結している）を含む。しかし、必要であれば、鎖は、２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介する等して直接、若しくはペプチドリンカー等のリンカーを介して共有結合的にカップリングし、一本鎖ドメインを形成することができる。本発明の一価の抗体の特定の例として、各々が配列NTCPPCPXYCPPCPACを有するヒンジ領域を含む、Fv、一本鎖FV、および特にFabまたはFab'フラグメントが含まれる。
【００２３】
本発明の二価の抗体は、各鎖のヒンジ領域NTCPPCPXYCPPCPACの１、２、３または４つのシステイン残基を介して共有結合された上に記載の２つの単量体鎖を含む。結合は単純なジスルフィド結合とすることができ、例えば、国際特許明細書WO９０/０９１９５およびWO９０/０９１９６に記載のリンカー基を介することができる。特定の二価の抗体は、F(ab)2およびF(ab')2フラグメントを含む。
【００２４】
本発明の多価抗体には、例えば、それらのヒンジ領域をリンカーによって結合した上記の３つまたは４つの単量体の鎖を含む三価または四価の抗体が含まれ、それは、例えば、国際特許明細書第９２/２２５８３号に記載されている。
【００２５】
本発明の抗体は、一般に、抗原に選択的に結合できる。抗原は、任意の細胞結合性抗原（例えば、Ｔ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞マーカーなどの細胞表面抗原）であってもよく、あるいは可溶性抗原であってもよい。細胞表面抗原の特定の例として、接着分子、例えばE−セレクチン、P−セレクチンまたはL−セレクチンなど、CD２、CD３、CD４、CD５、CD７、CD８、CD１１a、CD１１b、CD１８、CD１９、CD２０、CD２３、CD２５、CD３３、CD３８、CD４０、CD４５、CDW５２、CD６９、癌胎児性抗原（CEA）、ヒト乳脂肪グロブリン（HMFG１および２）、MHCクラスIおよびMHCクラスII抗原およびVEGFならびに適切な場合そのレセプターが含まれる。可溶性抗原には、インターロイキン例えばIL-１、IL-２、IL-３、IL-４、IL-５、IL-６、IL-８またはIL-１２など、ウイルス抗原例えばRSウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原など、インターフェロン例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γなど、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子例えばGCSFまたはGM-CSFなど、および血小板由来成長因子例えばPDGF−αおよびPDGF−βなど、ならびに適切ならば、そのレセプターが含まれる。
【００２６】
可変領域ドメインは、任意の天然に存在する可変ドメインまたはその操作バージョンであってもよい。操作バージョンとは、組換えDNA操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作バージョンには、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列の挿入、欠損または置換により、天然の抗体可変領域から作られたものが含まれる。この型の具体例として、少なくとも１つの相補性決定領域（CDR）および必要に応じて１つまたはそれ以上の第一の抗体由来のフレームワークアミノ酸ならびに第二の抗体由来の可変領域ドメインの残りの部分を含む操作された可変領域ドメインが含まれる。
【００２７】
本発明の抗体は、（従来の免疫感作および融合手順によって調製された）完全な抗体、特に完全なモノクローナル抗体から、任意の適切な標準的酵素切断および／または分解技術（例えば、ペプシンで処理後、式（１）のペプチドまたはその保護あるいは活性化誘導体を、式（１）のペプチドの産生に関する上記の慣用のタンパク質合成技術を用いて化学的にカップリングする）により、得ることができる。あるいは、本発明の抗体は、抗体の可変領域および／または定常領域をコードするDNAの操作および再発現を包含する組換えDNA技術の使用によって調製できる。このようなDNAは公知および／または例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含むDNAライブラリーから容易に得られる（Chiswell、D.J.およびMcCaferty、J. Tibtech.、１０、８０〜８４、１９９２を参照のこと）かまたは所望であれば合成できる。DNAを配列決定および操作するために、標準的な分子生物学および／または化学手順が使用される。例えば、配列NTCPPCPXYCPPCPACを作製するためにコドンを移入し、他のアミノ酸またはドメインを所望の通り修飾、付加または欠損させる。
【００２８】
ここから、DNAを含む１つまたはそれ以上の複製可能な発現ベクターが調製され、適切な細胞株（例えば、非産生メラノーマ細胞株（マウスNSO株など）または細菌（E. coli株など）、）を形質転換するために使用でき、これらは抗体を産生させる。有効な転写および翻訳を得るために、各ベクター中のDNA配列は、適切な調節配列（特に、可変ドメイン配列に操作可能に連結されたプロモーターおよびリーダー配列）を含むべきである。本方法における特定の抗体産生法は、周知であり、そして慣用的に使用されている。例えば、基本的な分子生物学的手順は、Maniatisら（Molecula Cloning、Cold Spring Harbor Latoratory、New York、１９８９）によって記載されている。DNA配列決定は、Sangerら（PNAS、７４、５４６３、１９９７）およびAmersham International plc sequencing handbookに記載のように行い得る。部位特異的変異誘発は、Kramerらの方法（Nucl. Acids Res.、１２、９４４１、１９８４）およびAnglian Biotechnology社のハンドブックに従って行い得る。さらに、DNAの操作による抗体の調製、発現ベクターの作製および適切な細胞の形質転換に適切な技術を説明する特許明細書を含む多数の出版物が存在し、これらは例えば、Mountain AおよびAdair J RのBiotechnology and Genetic Engineering Review（Tombs, MP編、１０、第１章、１９９２、Intrercept、Andover、UK）および国際特許明細書第WO９１/０９９６７に概説されている。一旦発現すると、抗体は宿主細胞から分離され、標準的な遠心分離、濾過、クロマトグラフィーおよび他の分離／精製技術例えば、以下の実施例に記載されているものを用いて精製され得る。
【００２９】
配列NTCPPCPXYCPPCPACを含む抗体フラグメント、特に、FabまたはFab'フラグメントは、上記および以下の実施例に記載のE. coliにおける操作に特に適切である。
【００３０】
所望ならば、本発明のタンパク質（抗体を含む）は、それに付着した１つまたはそれ以上のエフェクターまたはレセプター分子を有していても良い。本発明は、このような修飾タンパク質および、特に、抗体に関する。エフェクターおよびレポーター分子は、タンパク質中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基（例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基）を介してタンパク質に付着し得る。しかし、好ましくは、分子は、アミノ酸配列NTCPPCPXYCPPCPAC中のシステイン残基に付着してもよい。これらの配列を含む二量体は、in vitroにおける化学的還元に特に耐性を示し、エフェクターまたはレポーター分子が付着される反応性チオールを曝露するのに有利に部分的還元できる。１、２、３、または４つのエフェクターまたはレポーター分子がこの方法で付着できる。
【００３１】
エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍因子、トキシン（細菌または植物由来の酵素活性トキシンおよびそのフラグメント（例えばリシン(ricin)およびそのフラグメント）など）、生物学的に活性なタンパク質（例えば酵素）、合成または天然に存在するポリマー、核酸およびそのフラグメント（例えば、DNA、RNAおよびそのフラグメント）、放射性核種（特に放射性ヨウ素）ならびにキレート化金属が含まれる。適切なレポーター基には、キレート化金属、蛍光化合物またはNMRまたはESR分光法によって検出し得る化合物が含まれる。
【００３２】
特定の抗腫瘍因子には、細胞障害性および細胞増殖抑制性因子（例えば、ナイトロジェンマスタードなどのアルキル化剤（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミドまたはウラシルマスタード）およびその誘導体、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファンまたはシスプタチン、代謝拮抗物質例えばメトトレキセート、フルオロウラシル、フロクスウリジン(floxuridine)、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸、抗生物質例えばブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンスルフェート）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトマイシン（例えば、ミトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリカエミシンおよびその誘導体またはエスペラミシンおよびその誘導体など；有糸分裂インヒビター例えばエトポシド、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびその誘導体など；アルカロイド例えばエリプチシンなど；ポリオール例えばタキシシン−Iまたはタキシシン−IIなど；ホルモン例えばアンドロゲン（例えば、ドロモスタノロンまたはテストラクトン）、プロゲスチン（例えば、メゲストロールアセテートまたはメドロキシプロゲステロンアセテート）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロールジホスフェート、ポリエストラジオールホスフェートまたはエストラムスチンホスフェート）またはアンチエストロゲン（例えば、タモキシフェン））、アントラキノン例えばミトキサントロンなど、尿素例えばヒドロキシ尿素；ヒドラジン例えばプロカルバジンなどまたはイミダゾール例えばダカルバジンなどが含まれる。
【００３３】
合成または天然に存在するポリマーには、例えば、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコールおよび特に、メトキシポリエチレングリコール、または分枝状および非分枝状多糖類例えばラクトース、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンなどのホモまたはヘテロ多糖が含まれる。
【００３４】
キレート化金属には、２〜８の配位数を有する２＋または３＋のキレートが含まれる。このような金属の具体例として、テクネチウム（Tc）、レニウム（Re）、コバルト（Co）、銅（Co）、金（Au）、銀（Ag）、鉛（Pb）、ビスマス（Bi）、インジウム（In）、ガリウム（Ga）、イットリウム（Y）、テルビウム（Tb）、ガドリニウム（Gd）、スカンジウム（Sc）が含まれる。一般に、金属は放射性核種である。特定の放射線核種には、99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y、160Tb、153Gdおよび47Scが含まれる。
【００３５】
キレート化金属は、任意の適切な多座キレート試薬（例えば、非環式または環式ポリマー、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテル、およびその誘導体）、ポリアミド、ポルフィリン、および炭素環式誘導体でキレート化された金属の上記タイプの１つであってもよい。
【００３６】
一般に、キレート試薬の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明のコンジュゲートにおける１つの特に有用なキレート試薬の基は、非環式および環式ポリアミン、特にポリアミノカルボン酸例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸およびその誘導体、巨大環式アミン例えば環式トリ−アザおよびテトラ−アザ誘導体（例えば、国際特許明細書WO９２/２２５８３に記載されている）、およびポリアミド、特にデスフェリオックスアミンおよびその誘導体である。
【００３７】
特に有用なエフェクター基は、カリカエミシンおよびその誘導体である（例えば、南アフリカ特許明細書第８５/８７９４号、同第８８/８１２７および同第９０/２８３９を参照のこと）。
【００３８】
エフェクターまたはレポーター分子に連結した本発明のタンパク質を得ることを所望する場合、タンパク質が直接かまたはカップリング剤を介してエフェクターまたはレポーター分子に連結される標準的な化学または組換えDNA手順によって調製しうる。特定の化学手順には、例えば、国際特許明細書WO９３/０６２３１、WO９２/２２５８３、WO９０/０９１９５およびWO８９/０１４７６および官能基（例えばタンパク質中のチオールおよび必要なら適切に活性化されたエフェクターおよびレポーター分子（例えば、標的がタンパク質チオール基であるマレイミドなどのチオール選択性誘導体））を利用した本明細書中の実施例に記載の手順が挙げられる。あるいは、エフェクターまたはレポーター分子がタンパク質またはポリペプチドであるならば、結合は、組換えDNA手順例えば、本明細書、国際特許明細書WO８６/０１５３３および欧州特許明細書第３９２７４５号に記載されている手順を用いて達成できる。
【００３９】
本発明のタンパク質は、多数の疾患または障害の検出または治療に有効に利用することができる。このような疾患または障害には、感染症例えば、ウイルス感染、炎症性疾患／自己免疫（例えば、慢性リウマチ関節炎、骨関節炎、炎症性腸疾患）、癌、アレルギー性／アトピー性疾患（例えば、喘息、湿疹）、先天性疾患（例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血）、皮膚病（例えば、乾癬）、神経疾患（多発性硬化症）、移植（例えば、器官移植片拒絶、移植片対宿主病）、および代謝／特発性疾患（例えば、糖尿病）等の一般的な項に記載の疾患または障害が含まれ得る。
【００４０】
本発明のタンパク質は、治療および／または診断における使用のために処方できる。本発明のさらなる態様では、本発明者らは、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアとともに本発明のタンパク質を含む薬学的組成物を提供する。上記説明のように、本発明の本態様におけるタンパク質は、必要に応じて１つまたはそれ以上のエフェクター基あるいはレポーター基に連結できる。
【００４１】
薬学的組成物は、投与のための任意の適切な形態、好ましくは、非経口投与例えば、注射または注入（例えば、ボーラス注射または連続的注入による）に適切な形態を取り得る。組成物が注入又は注射用であるならば、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶解液または乳濁液の形態を取ることができ、そして懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤などの製剤を含んでもよい。
【００４２】
あるいは、タンパク質組成物は、使用前に適切な滅菌液体で再形成させる乾燥形態であってもよい。
【００４３】
タンパク質組成物が経口投与に適切な場合、製剤は、有効成分に加えて、ジャガイモ、トウモロコシまたは小麦デンプンなどのデンプン、もしくはセルロースまたは微結晶セルロースなどのセルロースまたはデンプン誘導体、シリカ、ラクトースなどの種々の糖、炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムなどの添加物を含むことができる。製剤が経口投与用である場合、患者の消化系に対して良好な耐性を有することが望ましい。この目的のため、処方において粘液形成および樹脂を含むことが望ましい。胃液に不溶なカプセルにタンパク質を入れることで耐性を改善することが望ましい。放出調節製剤中にタンパク質または組成物を含ませることが好ましい。
【００４４】
タンパク質組成物が腸投与に適切である場合、製剤は、結合剤および／または潤滑剤例えば、重合グリコール、ゼラチン、ココアバターまたは他の植物性ワックスまたは脂肪を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明のタンパク質の治療および診断のための使用は、典型的には、有効量のタンパク質をヒト被験体に投与する工程を包む。投与すべき正確な量は、タンパク質の使用および年齢、性別および患者の健康状態によって変化するが、典型的には、約０.１mg〜１０００mg（例えば、１mg〜５００mg）で変化する。タンパク質は、単回量または期間中連続様式で投与できる。用量は、適切に反復できる。典型的な用量は、例えば、０.１〜５０mg／kg体重／単回治療用量、詳細には、０.１〜２０mg／kg体重／単回治療用量であり得る。
【００４６】
以下の実施例は本発明を例示する。以下の略語を使用する：AUC  曲線以下の領域、β−ME  β−メルカプトエチルアミン、DCM  ジ−Fab'マレイミド、DTDP  ４,４ジチオジピリジン、Fab'  抗原結合抗体フラグメント（ヒンジを有する）、F(ab')2  二量体Fab'、HC  重鎖、LC  軽鎖、NEM  N−エチルマレイミド、PEG  ポリエチレングリコール。
【実施例】
【００４７】
実施例１異なるヒンジ配列を利用するE. coli中でのジFab'産生の評価
ストラテジー−ヒンジ領域と任意の他のシステインとの間の不正確である可能性のある鎖間の任意のジスルフィド結合を最小にするために、鎖間のジスルフィド結合を全てのFab'から取り除いた。ジ−Fab'の鎖間のジスルフィド結合の除去は、血清耐久性時間で判断したように、タンパク質の安定性に影響を与えないことが以前に示されている（文献番号９）。PCR変異誘発を使用して、cκおよびCH１の鎖間システインをセリンと交換した。これはまた、非還元SDS-PAGEによる周辺質抽出物の分析後、重鎖（HC）特異的ウエスタンブロッティングによってジ−Fab'形成％の分析を可能とした。従って、このアプローチは、振盪フラスコ規模での多数の構築物の分析を可能にした。利点は、アニーリングオリゴヌクレオチドカセットとして新規のヒンジ配列の迅速なクローニングを促進するために、SpeI制限部位を移入してCH１の変異誘発を得たことである。この部位を移入するために、重鎖中の鎖間のジスルフィドCysに付くSer N末端をThrに置換し、それによりCH１のC末端がNKSCDKTHTCAACからNKTSDKTHTCAACに変化した。（変更部は下線）
【００４８】
細菌株およびプラスミド構築物−全ての最終発現プラスミドは、pACYC１８４（Yarranton、G.T.およびMountain A、１９９２中の「Protein engineering-a Practical Approach」（Rees、AR、Starnberg、M.J.E.およびWetzelら編）、IRL Press、Oxford、３０３〜３２６頁）に基づき、そしてW３１１０（野生型E. coli ATCC ２７３２５）を形質転換するために使用した。
【００４９】
鎖間のジスルフィド結合を欠くA５B７g３ Fab'（グラフト数３のCEA−癌胎児性抗原へのヒト化Fab'結合）の変異体を、最初に構築した。軽鎖（LC）Cκ中の鎖間のCysコドンを変異オリゴ５'-GCCGCGAATTCCGCACTTCTCCCTCTAAGACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-３'を用いるPCR変異誘発によってSerと置換した。
【００５０】
同様のストラテジーを用いて重鎖（HC）のCH１由来の鎖間Cysコドンを取り除き、変異オリゴ５'-CCGCAAAGCTTGGATCCTCATCACGCGGCGCATGTGTGAGTTTTGTCACTAGTTTTGGGCTCAACTTTC-３'を用いてSpeI制限部位を移入した。
【００５１】
得られたこれらおよび以下の全てのクローンをPRISMサイクル配列決定キットを用いたABI ３７３AシークエンサーによるDNA配列決定により確認した。新規のヒンジ配列を、同様に制限したA５B７g３ HCプラスミドのみを介して５'SpeI-HindIII３'末端を有するアニーリングオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、その後最終ジシストロン発現プラスミドの再構築によって産生した。
【００５２】
同様に、Fab' ４０.４（ヒトサイトカインに結合したヒト化Fab'）cκのコード領域を、変異オリゴヌクレオチド５'-GGCCTGAGCTCACCAGTAACAAAAAGCTTTAATAGAGGAGAGTCTTGAGGAGGAAAAAAAAATGAAG-３'を用いて変異した。
【００５３】
鎖間のジスルフィド結合システインを欠く元のFab'ヒンジ（NCAAC）CH１の制限フラグメントを、A５B７g３から制限フラグメントとしてFab ４０.４の発現プラスミドへ移動させた。 Fab ４０.４最終発現プラスミドpDPH４０中のSpeI部位がユニークだったので、５'SpeI-NotI３'突出部を有するアニーリングオリゴヌクレオチド対を同様の制限pDPH４０に直接ライゲーションすることにより、更なるヒンジ変異体が作製可能であった。ヒンジ配列およびプラスミドの詳細を、表１に示す。DNA操作工程の間、Wada, K.N.ら、Nucleic Acidds Res.、１９９１、１９、１９８１に規定のE. coliの好ましいコドンを選択した。
【００５４】
振盪フラスコ実験−振盪フラスコ実験を、これらの実験が一本鎖プラスミド実験であり、１０μgml-1のテトラサイクリンを必要としたことを除いて本質的に前記のように行った（Humphreys, D.P.、ら、FEBS Lett.、１９９６、３８０、１９４）。A５B７を用いる全ての実験にL-Brothを使用し、可能な限り最高な細胞密度を得るために、２×TYをFab ４０.４を用いる実験のために使用した。酸化還元活性化合物を固体として添加して、必要な場合１mMの最終濃度にした。サンプルを、０、１、２および４時間後誘導として採取した。
【００５５】
培養−合成SM６ C培地：（５.０g/L（NH4）2SO4、３.３１２ g/L Na2H2PO4・H2O、３.８７０ g/L KCl、１.０ g/L MgSO4・７H2O、１.０ g/Lクエン酸塩、４.００ g/L クエン酸、０.０５ g/L CaCｌ2・６H2O、０.０２ g/L ZnSO4・４H2O、０.０２ g/L MnSO4・４H2O、０.００５ g/L CuSO4・５H2O、０.００４ g/L CoSO4・６H2O、０.０９６７ g/L FeCl3・６H2O、０.０００３ g/L H3BO3、０.０００２ g/L NaMoO4）。炭素源としてグリセロールを３％（w/v）で使用し、MAZUを消泡剤として０.０２％（v/v）で使用した。pHを５０％（v/v）NH4OHで調節した。Fab'発現を、炭素源を５％（w/w）のラクトースと切り替えることによって誘導し、細胞を２４〜３６時間の誘導後に回収した。Fab'回収率は、典型的には１００〜１５０mg/Lであった。
【００５６】
ウエスタンブロッティング−２１の周辺質フラクションと等価のサンプルを、５倍量のdH2Oで希釈し、非還元SDS-PAGEローディング緩衝液で５分間ボイルし、４〜２０％ Tris−グリシンゲル（Novex）により、１２５vで１.７５時間電気泳動した。タンパク質を、１００mAで２時間PVDFメンブラン（Novex）にトランスファーした。メンブランを５０ml／メンブランの「ブロッキング緩衝液」（PBS／０.１％（v/v）Tween ２０／２％（w/v）スキムミルク）を用いて室温で１時間ブロッキングし、「抗体緩衝液」（PBS／０.１％（v/v）Tween ２０／０.１％「ブロッキング緩衝液」）中、１／１０００（v/v）で５ml／メンブランの抗Fd抗体（ヒツジIgG抗ヒトIgG（Fd）、ref.PC０７５、The Binding Site、Biringham、U.K.）を用いて室温で１時間振盪した。メンブランを大量のPBS／０.１（v/v）Tween ２０で洗浄し、「抗体緩衝液」中、１／１０００（v/v）で５ml／メンブランのロバ抗ヒツジHRP複合化抗体（ウサギF（ab'）2抗ヒツジIgG FcフラグメントHRPコンジュゲートref.313-036-046 Jackson）を用いて室温で１時間振盪した。メンブランを大量のPBS／０.１%（v/v）Tween ２０で洗浄し、DAB基質（Pierce）で現像した。LC交差反応バンドを、それぞれ、図１と２のレーン４および１に示す。ブロットのライフサイズ陽性透明度を、ImageQuantソフトウェアバージョン４.２を用いて、Molecular Dynamics モデル３００Aマシンによるレーザースキャニングデンシトメトリーのために使用した。電気泳動の間に、ジ−Fab由来の重鎖（ジ−HC）を、Fab由来HC（遊離HC）から分離する。各レーンにおける容易に同定できる２つのバンドの相対強度の定量により、形成されたジ−Fab％の評価を得た。これにより、相対的に一定レベルHCが産生され、LCと異なるFab'変異体との間に会合が生じたと推測される。使用したpTTO-１由来のプラスミドは、LCを過剰に産生し、周辺質の遊離HCは、検出不可能であった（Shauna West、personal communication）。鎖間のジスルフィド結合を欠くタンパク質のジ−HCは、鎖間にジスルフィド結合を有する精製Fab'スタンダードと類似した移動度で移動する（図１のレーン１１および３を比較のこと）。各ピークの全吸光度を定量化し、各サンプルのジ−Fab%を以下のように計算した：ジ−HC バンドの吸光度÷ジ−HCバンドの吸光度＋HCバンドの吸光度。
【００５７】
Fab'精製−周辺質抽出物を、２５,０００Gで３０分間の遠心分離で明澄化し、２.５M TrisでpHを６.５まで上昇させ、P.B.S.で予め平衡化したProteinG sepharose（GammaBind、Pharmacia Biotech）カラムに供した。P.B.S.で洗浄して非結合の物質を取り除いた後、Fab'関連物質を０.１M Glycine.Cl（pH ２.７）でカラムを洗浄することによって溶出した。溶出物のpHを、４℃で保存するために２.５MのTris で中性まで上昇させた。精製後のFab'濃度は、典型的には０.２mgｍｌ-1以下であった。
【００５８】
０〜５つのスペーシング残基を有するリピート配列TCPPCPAの２つのコピーを有するプラスミドを構築した。ｐDPH３０-３５、表１参照（Fab'構築物の命名は、中央のヒンジ配列リピートの数を示し、ローマ数字はスペーサー残基の数を示し、タンパク質が鎖間のジスルフィド結合形成システインを有するか欠いているかを示す。例えば、pDPH３４は、A５B７g３ヒンジ２ivインターを発現し、これは４つのアミノ酸によってスペースが空けられた、鎖間のジスルフィド結合を欠く２つのヒンジ反復を有するA５B７のグラフト３である。pDPH４２はFab'４０.４ヒンジ２0＋Cysを発現し、２つのヒンジリピートを有し、スペーシング残基を有さず、鎖間にジスルフィド結合を有する）。これらを、振盪フラスコ培地中のジ−Fab'を形成する能力についてウェスタンブロッティングおよびヒンジ１/２およびヒンジ１構築物と比較して判断することによって評価した。結果を表IIに示す。
【００５９】
他（文献番号７）で見とめられたのと同様に、ヒンジ１/２Fab'は、振盪フラスコ中に検出可能なジ−Fab'を産生しなかった。「ヒンジ１」および「ヒンジ２o」は、中位量のジ−Fab'を産生した（それぞれ、７.３％および４.８％）。次いで、これらのバージョンをより高く発現させたFab ４０.４において作製し、これらのFabの周辺質タンパク質濃度の増加がin vivoでのジ−Fab'形成の増加に影響を及ぼすかを観察し、漸増数のヒンジリピートの数を増やすことの相対メリットを識別した。
【００６０】
ヒンジリピートの間にスペーシング残基を有するA５B７構築物の全てが、検出可能なジ−Fab'を産生しなかったことは、驚くべきである。これらのスペーシング領域の長さおよび柔軟性が増加することにより、ヒンジリピートの第２のコピーが再び折り畳まれ、イントラ−HCジスルフィド結合を形成でき、それにより、所望のインター−HCジスルフィド結合の形成からシステインを遮蔽する。この仮定を直接証明することは非常に難しいが、堅いポリプロリンIIヘリックスの間の内因性スペーシング残基の１つ（Ala）または２つ（Ala-Thr）を取り除くことによってスペーシング／柔軟性が減少した２つの新規の構築物をFab ４０.４を用いてデザインした。表IIに示した結果は好ましくなかったので、ヒンジの３つのコピーを有するFab'４０.４（「ヒンジ３0」）を作製した。
【００６１】
結果は、ヒンジリピートのコピー数の増加により、産生されたジ−Fab'％が一定して減少することを示す。このジ−Fab'％の減少は、タンパク質がよりシステインリッチになるにつれて周辺質中のタンパク質の毒性が増大することによると推測され得る。ジ−Fab'％の減少は、低いO.D.600ピークで示されるジFab'誘導後の細胞の生存能力の減少およびより遅い時点での細胞溶解の増大と相関関係がある。E. coli周辺質中のジスルフィド酸化還元機構は、よく理解されているが、小胞体の配置よりも複雑なジスルフィド配置を有するタンパク質に対処するようにはうまく適用されていないと思われる（Humphreyら、１９９６、同書に概説）。複雑なヒンジは耐性が低いと思われる。
【００６２】
２つのヒンジリピート間のスページングの減少は、ジ−Fab'形成を増加させない。「Fab'４０.４インターヒンジ２-1」は、「ヒンジ２0」変異体と比較してジ−Fab'の減少を示す（２５.１％±８.４３と比較して８.１％±４.３（表IIを参照のこと））。「Fab'４０.４インターヒンジ２-2」は、４９.８％±１６.７８ジ−Fab'を示す。この数字は、高レベルのジ−Fab'産生を示唆する。実際、このタンパク質は実質量の全長Fab'すら産生不可能であるようである。これは、図１に示されたウエスタンブロットのレーン７におけるタンパク質分解バンドの数および強度によって示される。従って、Fab'の量と非常に関連があるジ−Fab'の量が少ないが、いずれのタンパク質も、「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」に関連してほとんど産生されない。これらのスペーシング残基の一方または両方が取り除かれると、ヒンジ領域は非常に非柔軟になり、システインが天然のE. coliタンパク質にタンパク質分解的に曝露され、反応性となるコンフォメーションを強いられるということが仮定できる。非修飾１ヒンジがiv vivoで最大のジ−Fab'を産生したため、他のヒンジイソタイプをそれらの効率について試験することとした。
【００６３】
ヒンジイソタイプの効果−IgG２、３、および４の真のヒンジ配列は作製できないが、むしろ各ヒンジの中位をヒンジより上に存在するIgG１に融合した。従って、作製したヒンジをIgG２「様」と呼ぶ。長くシステインリッチなヒンジは耐性が低く、IgG３中位ヒンジのCPRCおよび最初の３つのリピート配列のみを使用した。最初の上付き文字を使用して、このIgG３配列が切り出されたことを示す。これらの構築物を、前記のものと同一の方法で分析、結果を表IIに示す。
【００６４】
IgG３'様ヒンジは耐性が低く、ヒンジ２-2と同一の方法で測定したジ−Fab'％は、人為的に高かった。このタンパク質分解の例を図２のレーン４に示す。長いIgG３ヒンジは高度に柔軟であると考えられ（Brekke, O.H.ら、１９８５、Immunol. Today、１６、８５）、これはこのイソタイプのいくつかの特性に原因する。周辺質において、曝露されたペプチドのこの長さはタンパク質分解を受けやすく、このことがこのタンパク質の産生レベルが低い理由であろう。IgG２様ヒンジは、妥当な量のジ−Fab'を産生する（２０.８％±３.５８）。しかし、IgG１誘導体を用いる場合以上の増加は認めれなかった。ジ−Fab'産生におけるIgG４様Fab'の相対的不能（８.６３％±１.４１）が認められた。IgG４様ヒンジとIgG１ヒンジとの間にはたった１つのアミノ酸の相違が存在するだけである（それぞれCPSPに対してCPPC）。この結果は以前の研究（文献番号２２、２３）に一致するが、これは、IgG４がIgG１よりインター−HCジスルフィド結合を形成する能力が低いことが見出されたというものである。２つのシステインの間のセリンの存在により、中位ヒンジの柔軟性が増加され、それによりインター−HCジスルフィド形成をブロックするイントラHCジスルフィドが形成される。
【００６５】
IgMおよびIgAテール断片の効果−両IgMおよびIgAは、分泌性テール片と呼ばれる１８アミノ酸長のＣ−末端を有し、それらは重合に関与する。両方のテール片の最後から２番目の残基はシステインである。非共有結合に加えて、これと他のＨＣのシステインは、重合体形成に関与することが公知であるにも関わらず、正確なジスルフィド体制は、完全には理解されていない（Davis,A.C.ら、１９８９、EMBO J.、８、２５１９およびWirsma、E.J.およびShulmanM.J.、１９９５、J. Immunol.、１５４、５２６５）。テール片は４つ全てのIgGイソタイプに付加されると、更なるHCシステインの付加および非共有結合性の相互作用残基がIgMおよびIgAに存在しなくても、それらの重合に影響を与える（Smith、R.I.F.ら、１９９５、J. Immunol.、１５４、２２２６）。Sorensen, V.ら、１９９６、J. Immunol.、１５６、２８５８に記載の野生型およびテール片配列を、「ヒンジ１」配列を含むFab'４０.４に付加した。テール片ＨＣに供給するため少なくとも１つの遊離システインがIgMのCys414の模倣物として作用することが必要とされ、互いに、ＩｇＭのＣｙｓ３３７によって提供されるものと考えられるような直接のインター−ＨＣ相互作用をなす可能性があると見られたので、「ヒンジ１」配列を選択した。pDPH５０および５１で構築した配列を、表１に示す。
【００６６】
重合体形成の増加について、振盪フラスコ培養／ウエスタンブロッティングによってFab'を分析した。「ヒンジ１」が３０％までのジ−Fab'形成しか与えないことは知られていたが、テール片のいずれかの存在が、ジ−Fab'形成を完全になくすことが見出された。非還元ネイティブのウエスタンブロットおよびSDS-PAGEで判断されたような高度な重合状態の形成についての証拠は見出されていない。「ヒンジ１」に固有の二量体形成の消滅は、テール片の再折りたたみによりテール片のCysとヒンジ中のCysの１つとの間のイントラ-HCジスルフィドを形成するということによるものと推測された。この可能性はかなり高いと思われる。なぜならば、テール片配列が、テール片Cysをヒンジに近づけることを可能にする１つのβ鎖を形成しうると考えられるからである（Pumphrey,R.、１９８６、Immunol. Today、７、１７４）。
【００６７】
一般に、これらの結果は、元のFab'に見出される一本鎖のヒンジの上の過剰なヒンジシステインの存在が、in vivo でのジ−Fab'形成を促進する最も重要な因子であり、「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」が最高の配列であることを示す。１ヒンジの他のバージョンを用いても、試験した他の任意の３IgGイソタイプを用いても、これ以上の利点は見出されなかった。単純なヒンジが最も有用であり、ヒンジが長くなるほど、ジ−Fab'産生％は低く、細胞死の率が上がることが示された。これは、IgG１ヒンジ配列すなわち、ヒンジ１、２0、３0のコピー数の増加および長く柔軟なIgG３の切断の両方で認められた。
【００６８】
より微妙な構造の相違はまた、in vivoでのジ−Fab'形成効率に影響する。ヒンジ配列NTCPPCPACの２つのコピー間のスペーシング残基の操作には、ジ−Fab'形成状態におけるヒンジシステインのコンフォメーションの維持の重要性を暗示した。スペーシング領域が非常に長くなる場合、おそらくヒンジシステインをマスクするヒンジの再ループ形成によるジ−Fab'形成は完全に破壊されスペーシングが非常に短い場合は、ヒンジはin vivoであまり破壊されない。
【００６９】
以前の報告では、ヒンジ配列NCPPCPPCPPC（文献番号９）を用いた５〜７０％の高細胞密度での培養由来のジ−Fab'の産生量が変化しやすいことを見出した。本明細書における結果は、in vivo培養ではジ−Fab'は５〜１０％以上産生することは困難であるが、再生産可能であることを示す。ヒンジ配列に加えて、これらの相違はFab'発現レベル、培養条件および宿主株の相違によって説明できる。本明細書でのFab'回収は、Rodringueら（文献番号９）に記載のものより５〜１０倍低かった。しかし、特定の条件によって自発的で効率の良い（約８０％）、精製の間のバッチ特定のジ−Fab'形成を引き起こす。このようなタンパク質精製条件は、これらの小規模実験では使用されていなかった。
【００７０】
要約すると、E. coliの周辺質のin vivoでのジ−Fab'形成は、ヒンジ配列および複雑性によってinter aliaを調節される有効でないプロセスである。２つのヒンジ配列（「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」）は、ジ−Fab'形成に最も有効であるin vivoでの選択条件下で確認された。
【００７１】
実施例２
修飾ヒンジを用いたF(ab')2分子の血清耐久性時間およびヒンジ特異的pegylationの調査
試薬
MEM、β−MA、DTDP、およびTrisを、Sigma（UK）から購入し、そのグレードは、購入できる最高のものである。パイロージェンフリーの「Flowfusor」水がクロマトグラフィーに使用された（Fresenius, Basingstoke,UK）。他の全ての研究試薬は、BDH（UK）の試薬グレードである。
【００７２】
Fab'の産生および精製
使用したFab'は、実施例１に記載の「Fab ４０.４」であった。Fab'培養およびProtein G sepharose精製（GammaBind Plus、Pharmacia Biotech）を、１つ改変しているが、実施例１に記載のように行った。E. coli周辺質タンパク質を、１００mM Tris/１０mM EDTA（pH ７.４）の１回の培養回収体積で、２５０rpmで振盪しながら３０℃で一晩のインキュベーションによる培養細胞ペーストから抽出した。粗抽出物の電導性およびpHを、水および氷酢酸をそれぞれ添加することにより、３.５mScm-1以下および４.５以下に変化させた。次いで、粗抽出液を、８０ml（圧縮）のベッド体積のStreamline SP陽イオン交換樹脂（Pharmacia Biotech）上に拡大したベッドモードで通した。樹脂を、拡大したベッドモードで、５０mM酢酸ナトリウム（pH ４.５）で事前に平衡化した。十分に洗浄した後、結合した物質を５０mM酢酸ナトリウム／２００mM NaCl（pH ４.５）を用いて圧縮モードで溶出した。ピークフラクションのpHは、２.５M Trisで６.５以上に上昇させ、PBSで事前に平衡化したProtein G sepharoseカラムに供した。PBSで洗浄して非結合の物質を取り除いた後、Fab'物質を０.１MグリシンCl（pH２.７）で溶出した。溶出液を２.５M Trisで中性にし、４℃で保存した。
【００７３】
F(ab')2、の産生および精製
Fab'物質を濃縮し、１０kDaカットオフのメンブランを用いた超濾過を用いて緩衝液交換し、０.１Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH ８.０）１２mgml-1以上の溶液とした。ヒンジチオールを活性化し、最終タンパク質濃度によっては、F(ab')2の痕跡を３７℃、４５分間、０.１Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH ８.０）中９mM β-MAで還元することによって取り除いた。０.１Mリン酸緩衝液（pH ８.０）で事前に平衡化したG２５M sephadexカラム（PD１０）（Pharmacia Biotech）で脱塩することによって還元剤を取り除いた。室温で一晩のインキュベーションにより、 F(ab')2を形成させた。任意の残存チオール基をPBS中１０mM NEMとのインキュベーションによってブロックし、SDS-PAGE（４〜２０％Tris／グリシンゲル、Novex UK）およびHPLC（０.２Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH ７.０）で平衡化したGF-２５０カラム）によって分析した。
【００７４】
F(ab')2を、小規模の場合は、予備的なHPLCでフラクションを回収することによって（０.２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH ７.０）で平衡化したGF-２５０XLカラム）または大規模の場合は疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によってFab'と分離した。固体（NH4）2SO4を、Fab'/F(ab')2混合物に０.７５Mまで添加し、５０mMリン酸緩衝液（pH ７.０）／０.７５M（NH4）2SO4で平衡化したphenyl-sepharose HPカラムにロードした。平衡化緩衝液で洗浄した後、結合物質を、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH ７.０）で溶出した。二量体種は、単量体のFab'よりもHICマトリックスに高い親和性を有する。全ての精製F(ab')2は、HPLCでは１００％F(ab')2、クマジー染色SDS-PAGEでは９５％ 以上のF(ab')2と判断された。
【００７５】
化学的架橋F(ab')2（DFM）の産生
DMFを、１,６-ビスマレイミドヘキサン（BMH）架橋剤で前記されたように産生した（文献番号２）。
【００７６】
F(ab')2の還元に対する耐性
０.１Mリン酸塩（pH ７.０）中、０.２５mgml-1の精製F(ab')2を、３７℃で４５分間０〜２mMのβ−MAで処理した。還元をNEMの１０mMまでの添加によって停止し、F(ab')2およびFab'の相対量をHPLC分析によって計算した。
【００７７】
ヒンジ特異的修飾のための「ヒンジ２0」F(ab')2の部分的還元
０.１Mリン酸塩（pH ６.０）中、６mgml-1の精製F(ab')2を、３７℃で４５分間０〜２mMのβ−MAで処理した。還元剤を、P６ Biospinカラム（BioRad、UK）で脱塩することによって取り除き、試料をとって即座にチオールアッセイ、NEMクエンチングならびにHPLC分析および修飾を行った。１.３mM β−MAを、全ての予備的な部分的還元のために用いた。
【００７８】
F(ab')2の産生および陽イオン交換精製
上記のように部分的に還元したPEG- F(ab')2を、０.１Mリン酸塩（pH ６.０）（Shearwater Polymers社、Birmingham、Alabama、USA）中、同体積の２５kDa直鎖状PEG-マレイミドと混合して、最終モル過剰３０倍のPEG：F(ab')2を得た。室温で一晩反応させた後、F(ab')2−PEGを、予備スケールのHPLCを用いて残存F(ab')2のバルクから分離した。濃縮およびPD１０カラムを用いて５０mM酢酸ナトリウム（pH ４.５）に緩衝液を交換した後、 F(ab')2−PEG／非反応PEGフラクションを、BioCad Vision workstation上のベッド体積１.６mlのPoros HSカラム（PerSeptive Biosystems、Hertford、UK）にロードした。５カラム体積で洗浄して非結合PEG−マレイミドを取り除き、F(ab')2-PEGを、５０mM酢酸ナトリウム／４０mMNaCl（pH ４.５）で溶出し、 F(ab')2を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH ４.５）の、４０mM〜１M NaClでの直線的勾配でカラムから取り除いた。フラクションを濃縮し、緩衝液を０.２Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH ７.０）と交換し、タンパク質の濃度をA280を用いて評価した。タンパク質を、４〜１２％Tris-MESゲル（Novex、UK）を用いたSDS-PAGEで分析した。
【００７９】
チオールアッセイ
F(ab')2あたりのチオールを、前記のようにDTDPを用いて評価した（文献番号１７）。
【００８０】
F(ab')2のヨウ素処理
アミノ基あたり３００μgのF(ab')2を、BoltonおよびHunter試薬（Amersham）を用いて125I標識し、比活性を０.２２〜０.３３μCi／μgとした。
【００８１】
質量分析法
Fab'の分子量を、電子スプレーイオン化モード(electrospray ionisation mode)でのFisons VG Quatro triple quadrupole装置を用いて測定した。
【００８２】
動物分析
２２０〜２５０gの雄Sprague Dawley（Harian）ラットに、ハロタン麻酔の間に２０μgの125I標識Fab４０.４ F(ab')2ヒンジ変異体を静脈内注射した（n =６／群、ただし「ヒンジ２０」のn＝１０を除く）。投与の０.５、２、４、６、２４、４８、７２および１４４時間後に尾から連続的に動脈採血を行った。サンプルを、COBRA（商標） Autogammaカウンター（Canberra Packard）を用いてカウントした。データをプロットし、曲線の下側の領域をGraphPad Prism（GraphPad Software Incorporated）で計算し、％注射用量時間（％id.hr）として表した。t1/2βを２４、４８、７２の時間点として規定する。データの平均および平均の標準誤差（SEM）を示す。
【００８３】
結果
in vitroでのF(ab')2産生
３つのヒンジ配列を使用してin vitroでF(ab')2を産生した。「ヒンジ1/2」＝NTHTCAAC、「ヒンジ１」＝NTHTCPPCPAC、および「ヒンジ２0」＝NTHTCPPCPATCPPCPAC。これらは、それぞれ１、２および４ヒンジシステインを含む。「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」タンパク質はまた、「ヒンジ1/2」とは異なるアミノ酸を１つ含み、実施例１に記載のように、CH１のC末端のSerがThrへ変化されている。
【００８４】
pH ８.０での精製および濃縮後、Fab'は、大量のF(ab')2を含んでいることが見出された。F(ab')2産物が可能な限り均一であるために、Fab'調製物を同一の強い還元条件（８０mM β−MA、pH ８.０）に供して酸化処理を１００％Fab'から開始した。 F(ab')2の抗原結合分析（BIAcore）は、これらの非常に強い還元条件が溶解性抗原のFab親和性に影響を与えないことを示す。還元され、脱塩されたFab'を、室温で一晩放置すると、最大のF(ab')2収率となる。しかし、NEMでクエンチングするための酸化処理の間サンプルを取り出すことによって、約６０％の達成可能なF(ab')2が酸化の最初の６０分以内で形成した（図３を参照のこと）。「ヒンジ1/2」および「ヒンジ２0」の両方が、一晩のインキュベーション後に類似の最終収率（〜６５％）に達成したが、最初の３０分以内のF(ab')2形成は、「ヒンジ1/2」より「ヒンジ２0」の方が迅速であった。これは、おそらく、より多数のヒンジシステインがFab'−Fab'ヒンジシステイン相互作用をおこす機会が増大した結果である。「ヒンジ２0」を用いたF(ab')2の収量は、単にFab'の濃度が２０mgml-1以上に増加することにより、８０％に増加する。
【００８５】
「ヒンジ１」が、他の２つのタンパク質のようにF(ab')2形成の同一の収率に達しないことは驚くべきことである。還元後、あるパーセンテージの「ヒンジ１」は、イントラ−ヒンジジスルフィド結合を迅速に受けることによりインター−ヒンジジスルフィド形成からチオールをキャッピングすることが可能である。
【００８６】
精製「ヒンジ１」または「ヒンジ２0 」F(ab')2を用いてもＣ−末端タンパク質分解は認められないことから、一部のヒンジ分子がシステイン欠落を有しているという可能性を取り除ける。「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」の還元由来のHCは、質量分析法によって以下の完全長分子を示した：「ヒンジ１」は、予想分子量２４７０５.１２Daと比較して２４７０３.６５±０.５５Da、「ヒンジ２0」は予想分子量２５３７４.８８Daと比較して２５３６６.４０±６.１３Da。
【００８７】
F(ab')2ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の数
「ヒンジ1/2」F(ab')2は、ヒンジジスルフィド結合形成の産物が均一である点で、「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」を超える利点を有する。これに対して、「ヒンジ１」は、３つの異なるF(ab')2種を形成することができ、それには１つまたは２つのジスルフィドおよび「ヘッド−ヘッド」および「ヘッド−テール」種（図４を参照のこと）を含む。事態は、「ヒンジ２0」の場合より複雑になりうる。一次配列を考慮すると（モデリングによる予想なしに）、多数の種を形成することができることが示される。これらは、ジスルフィド結合の数（１〜４）、直鎖状配置のずれ、そして大まかな４次構造（「ヘッド−ヘッド」および「ヘッド−テール」形成の両方）において異なる。ジスルフィド結合の周りの回転は、「ヒンジ２0」の単一のジスルフィド結合化形式は、チオールキャッピング剤の非存在下で一時的よりも長く残存することはなさそうに思わせる。
【００８８】
E.coli中でin vivoで産生されるF(ab')2を用いて、より多いヒンジシステインの存在は、それ自身が高度なジスルフィド結合化ヒンジをもたらさない（文献番号９）。従って、２つのより大きなヒンジが１つを超える数のジスルフィド結合を含むかどうかを示すことが重要である。精製Fab'中に混入しているF(ab')2のすべてを還元させるために、「ヒンジ２0」が高いβ−MA濃度を必要とする還元／酸化条件を最適化している間に行われた観察において有利な点を得た。異なる精製F(ab')2タンパク質がFab'への還元に耐えるそれらの能力において相違を示すことが可能であった。０.２５mgml-1およびpH ７.０で、「ヒンジ1/2」は１２５μMβ−MAによって完全に還元されることが見出された（図５を参照のこと）。β−MA及び同じ濃度で、６８.３％の「ヒンジ１」調製物がまだ二量体であった。これは、「ヒンジ１」 F(ab')2の集団の約６８％が２つのジスルフィド結合を有することをことを意味する。わずかにより高い１６６μMのβ−MA濃度では、１００％の「ヒンジ２0」調製物がまだ二量体である。従って、外挿によって、６８％を超える「ヒンジ２0」分子が２本を超えるジスルフィド結合（すなわち、３または４）を有するはずである。ヒンジ構造の相違がヒンジジスルフィドの接近しやすさまたは化学反応性に効果を有するはずであるにも関わらず、それらが図５に見られる顕著な相違を引き起こすのに十分であるとは考えにくい。従って、「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」は、高い程度に多ジスルフィド結合を有する。
【００８９】
ラットにおけるヒンジ配列のF(ab')2薬物動態の影響
DFNコントロールに加えて、３つ全てのヒンジ構造から作製されたF(ab')2が、それらの薬物動態をラットモデルにおいて追跡し得るよう、125I標識された。表IIIに示されたデータは、in vitroでの「ヒンジ1/2」、「ヒンジ1」と「ヒンジ２0」の比較をサポートしている。１つのヒンジジスルフィドを有するF(ab')2「ヒンジ1/2」は、AUC１６６.２±９.８%注射用量、時間（％id.hr）で循環系から最も迅速に浄化される。同一のタンパク質配列を有するがチオエーテル結合で連結しているF(ab')2は、AUC＝３８４.２±３２.１％（％id.hr）でより遅く浄化される。これは、in vivoでのFab'へのより迅速な破壊を導く、チオエーテル結合以上のジスルフィドの不安定さの証拠となると解釈される。より小さなFab'は腎臓を介してF(ab')2より迅速に排出される。「ヒンジ１」および「ヒンジ２0」におけるヒンジ中のジスルフィド結合の平均の数の増加により、「ヒンジ1/2」の数を超えるAUC（それぞれ４２３.６±３５.０および５０９.７±３１.３（％id.hr））の増加がもたらされる。試験した４つのF(ab')2分子についてのラットの循環からの浄化値の曲線を、図６に示す。これは、異なるヒンジ安定性の主要な効果が、α−相であるようだということをありありと示す。「ヒンジ1/2」F(ab')2の最初の浄化値は、より互いに集団化する他の３つのF(ab')2分子よりもさらに迅速である。おそらくは、循環血液中の還元またはタンパク質分解力に対する「ヒンジ１」、「ヒンジ２0」およびDFMF(ab')2の増大した耐性は、より大きなF(ab')2種として、より長い分子の残存をもたらし、循環系からより遅く浄化される。
【００９０】
in vitroでの「ヒンジ２0」F(ab')2の部分的還元およびPEG化
「ヒンジ２0」 F(ab')2が多数のヒンジジスルフィド結合を有する分子の大きな部分を有するので、ある数のジスルフィドが、二量体種として分子を保持しつつも活性化されたチオールに破壊され脱カップリングされる可能性がある。このようなチオールは、放射性ヌクレオチド、トキシン、またはPEGのようなエフェクターまたはレセプター基の付着に特に有用であろう。血清耐久性を増大させる単純なルートであり、免疫原性を減少させ、そしてin vivoでのタンパク質分解を減少させるので、PEGのタンパク質への共有結合は魅力的である。
【００９１】
pH６.０でのβME濃度範囲およびHMPCのNEMクエンチサンプルの分析を使用して、１.８mM β−ME以下で、１００％のF(ab')2集団が二量体のままであることが見出された。この数字は、ヒンジジスルフィド占有の不均一により、F(ab')2のバッチ間で変化し得る。DTDPを用いた１.３mMβ−MEチオールアッセイは、F(ab')2あたり１.０３４±０.０９０チオールが反応のために遊離されたことを示した。β−MEで未処理のF(ab')2は、F(ab')2あたりほとんど遊離のチオールを示さなかった。 F(ab')2のPEG化効率を、陽イオン交換によるF(ab')2−PEGの精製後に計算し、A280におけるタンパク質濃度が１.３％以下であると評価した。
【００９２】
【表１】
0004257030.tif 000002
【００９３】
【表２】
0004257030.tif 000003
【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
0004257030.tif 000008
【００９９】
文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】in vivoでのジ−Fab'形成のヒンジ配列および複合度の効果を示す図である。４〜２０％Tris−グリシンSDS-PAGEの抗Fdウエスタンブロット。レーン１および２は還元され、レーン３〜１２は還元されていない。スタンダードの分子量（kDa）を右に示した。 LCのみのコントロール（レーン４）が５倍過剰であることを除いて全ての周辺質サンプルを等量ロードした。レーン１、pDPH５２ Fab ４０.４ヒンジ１＋cys、レーン２、pDPH４４ Fab ４０.４ヒンジ１インター、レーン３、精製Fab'  ４０.４＋cysコントロール、レーン４、Fab ４０.４軽鎖コントロールのみ、レーン５、pDPH４２ Fab４０.４ヒンジ２0＋cys、レーン６、pDPH５２ Fab４０.４ヒンジ１＋cys、レーン７、pDPH５４ Fab４０.４ヒンジ２-2インター、レーン８、pDPH５３ Fab４０.４ヒンジ２-1インター、レーン９、pDPH６９ Fab４０.４ヒンジ３0インター、レーン１０、pDPH４１ヒンジ２0インター、レーン１１、 pDPH４４ヒンジ１インター、レーン１２、pDPH４０ヒンジインター。
【図２】in vivoでのジ−Fab'形成に対するヒンジイソタイプの効果の比較を示す図である。４〜２０％Tris−グリシン非還元SDS-PAGEの抗Fdウエスタンブロット。スタンダードの分子量（kDa）を右に示した。LCのみのコントロール（レーン１）が５倍過剰であることを除いて全ての周辺質サンプルを等量ロードした。レーン１、Fab４０.４軽鎖のみコントロール、レーン２、精製Fab'４０.０＋cysコントロール、レーン３、pDPH６３ Fab ４０.０「IgG４様」ヒンジインター、レーン４、pDPH６２ Fab ４０.４「IgG３様」ヒンジインター、レーン５、pDPH６２ Fab ４０.４「IgG２様」ヒンジインター、レーン６、pDPH４４ Fab ４０.４ヒンジ１インター（IgG１）。
【図３】in vitroでのジ−Fab'形成におけるヒンジ配列および酸化の時間の効果を示す図である。pH ８.０および室温で行われた３つの独立した実験の平均およびSDを示す。
【図４】形成し得るF(ab')2分子の範囲を示す図である。A、「ヒンジ１」で形成したF(ab')2、およびＢ、「ヒンジ２0」で形成したF(ab')2。「ヒンジ２0」については「ヘッド−ヘッド」形態のみを示す。従って、可能な「ヘッド−テール」形式は「×２」を用いて示す。
【図５】in vitroでの還元に対するF(ab')2耐性に対するヒンジ配列の効果を示す図である。０.２５mgml-1でのF(ab')2をpH７.０、３７℃、４５分間、示したb-MA濃度範囲における還元に供する。
【図６】ラットにおけるF(ab')2薬物動態に対するヒンジ組成の効果を示す図である。各F(ab')2の平均および平均の標準誤差を示す。「ヒンジ２0」のn=１０を除いて、各群６匹の動物を用いた。
【図１】
0004257030.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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