(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板上に形成された少なくとも作用極および対極から成る電極系と、少なくとも酸化還元酵素およびメディエータを含む反応層とを具備する使い捨てのバイオセンサを用いて、試料中の基質と前記酸化還元酵素およびメディエータとの反応に際しての物質濃度変化を、前記作用極と対極との間に電圧を印加することで得られる電流に基づいて検知する定量法において、
試料と反応層が接触してから一定時間経過後に対極を基準として０〜７０ｍＶの範囲にある作用極電位Ｅ１を印加してバックグラウンド電流を得、その後、Ｅ２＞Ｅ１の条件を満たす電位Ｅ２での応答電流を得、前記応答電流と前記バックグラウンド電流の差に基づいて検知することを特徴とする基質の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサを用いて、試料中のグルコースなどの基質を定量する定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
基質の定量法の一例として、グルコ−スの定量法について説明する。電気化学的にグルコ−スを定量する方法としては、グルコ−スオキシダ−ゼと酸素電極あるいは過酸化水素電極とを組み合わせた方式が一般的に知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサ−」講談社）。グルコースオキシダーゼは、酸素をメディエータとして、基質であるβ−Ｄ−グルコ−スをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。この反応に伴い、酸素は過酸化水素に還元される。この時の酸素消費量を酸素電極によって測定するか、もしくは過酸化水素の生成量を過酸化水素電極によって測定することによって、グルコ−スを定量することができる。
【０００３】
一般に、電極を用いた定量法においては、所定の電位を作用極、対極間に印加し、このときに得られる電流に基づいて目的対象物の濃度を定量する。しかし、所定の電位を印加した時に得られる応答電流は、目的対象物に由来するシグナル電流と目的対象物以外に由来するバックグラウンド電流からなる。すなわち、（応答電流）＝（バックグラウンド電流）＋（シグナル電流）と表せる。当然、バックグラウンド電流を含む応答電流に基づいて目的対象物の濃度を定量するよりも、目的対象物に由来するシグナル電流のみに基づいた方が精度良く、正確な定量が可能である。そこで、上記のように酸素電極や過酸化水素電極を用いて目的対象物の濃度を定量する場合、緩衝液など目的対象物を含まない、言い換えれば目的対象物の濃度がゼロである溶液を用いて、予めバックグラウンド電流を測定しておき、未知濃度の目的対象物質を含む溶液を測定するときには、応答電流からバックグラウンド電流を差し引くことによってシグナル電流を抽出し、これに基づいて目的対象物の濃度を求めている。
【０００４】
しかしながら、上記のシグナル電流の抽出方法は、例えば、一回使い捨てタイプのバイオセンサを用いる場合などには適用できない。一回使い捨てタイプのバイオセンサは、文字通り、一回の測定にしか使用できず、同一のセンサを用いて連続的に別々の溶液を測定することはできず、予め目的対象物の濃度がゼロである溶液を測定することは不可能だからである。しかし、通常、バックグラウンド電流はセンサ毎に異なり、あるセンサにおけるバックグラウンド電流を予め測定しておき、その値を別のセンサに適用する、という方法は正確さを欠く。
【０００５】
また、酸素電極や過酸化水素電極を用いる方法によると、その反応過程からも推測できるように、測定結果は試料溶液中に溶存している酸素濃度の影響を大きく受ける。また、酸素のない条件下では測定が不可能となる。
【０００６】
そこで、酸素をメディエータとして用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体をメディエータとして用いる新しいタイプのグルコ−スセンサが開発されてきた。このタイプのセンサは、酵素反応の結果生じたメディエータの還元体を、電極で酸化することにより、その酸化電流からグルコ−ス濃度を求めるものである。
【０００７】
さらに、このようなメディエータを酸素の代わりに用いると、既知量のグルコースオキシダーゼとメディエータを、安定な状態で、正確に電極上に担持させることが可能となる。その場合、電極系と反応層を乾燥状態に近い状態で一体化することができる。この技術に基づいた使い捨てタイプのグルコ−スセンサは、測定器に挿入されたセンサチップに検体試料を導入するだけで容易にグルコ−ス濃度を測定することができることから、近年多くの注目を集めている。このような手法は、グルコ−スの定量に限らず、他の特定化合物の定量にも応用可能である。
【０００８】
しかし、上記のような使い捨てタイプのバイオセンサにあっては、通常、目的対象物以外に由来するバックグラウンド電流を含む応答電流全体に基づいて目的対象物の濃度を定量しており、シグナル電流の抽出を行っていない。というのは、応答電流全体の内、バックグラウンド電流の構成比がどれほどであって、シグナル電流の構成比がどれほどであるのかを知る手段が無かったためである。このため、シグナル電流に全くバラツキが無い場合であっても、バックグラウンド電流のセンサ間差によって、定量結果にバラツキを生じるという問題がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記の様なメディエータを用い、さらに電極系と反応層を一体化する技術により、基質の簡便な電気化学的定量評価が可能となった。
【００１０】
特に血糖値測定用バイオセンサは、上記の様な技術の発展により、同様のタイプのセンサが多数開発され、市場競争は激化する一方である。また、センサの主使用者である糖尿病患者も、上昇の一途をたどっている。
【００１１】
そのような状況下でセンサ特性の更なる高性能化が望まれており、その開発競争が激化している。
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、応答電流（全体）のバラツキのうち、少なくともバックグラウンド電流のバラツキを排除でき、一回使い捨てタイプのバイオセンサに適用可能である基質の定量方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記の少なくともバックグラウンド電流のバラツキが排除できる基質の定量方法を提供するため、本発明は、以下の手段を用いる。すなわち、絶縁性の基板上に形成された少なくとも作用極および対極から成る電極系と、少なくとも酸化還元酵素およびメディエータを含む反応層とを具備する使い捨てのバイオセンサを用いて、試料中の基質と前記酸化還元酵素およびメディエータとの反応に際しての物質濃度変化を、前記作用極と対極との間に電圧を印加することで得られる電流に基づいて検知する定量法において、対極を基準として０〜７０ｍＶの範囲にある作用極電位Ｅ１を印加してバックグラウンド電流を得、その後、Ｅ２＞Ｅ１の条件を満たす電位Ｅ２での応答電流を得、前記応答電流と前記バックグラウンド電流の差に基づいて検知することを特徴とする基質の定量方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の基質の定量法は下記実施例に限るものではなく、Ｅ１、Ｅ２の値、印加時間および組み合わせ方等は、これに限定されるものではない。
【００１５】
また、実施例では酸化還元酵素としてグルコ−スオキシダ−ゼを用いたが、これに限定されることはない。酸化還元酵素として乳酸オキシダーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼを用いた乳酸センサ、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いたコレステロールセンサ、ウリカ−ゼを用いた尿酸センサ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼの組合せ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタロターゼの組合せ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、インベルターゼの組合せ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、インベルターゼ、ムタロターゼの組合せを用いたしょ糖センサ等においても、実施例にあげたグルコ−スセンサと同様の効果が得られる。
【００１６】
更に、実施例では親水性高分子としてカルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣと略記）を用いたが、これに限定されることはなく、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩、そして、セルロース誘導体、具体的には、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロースを用いても同様の効果が得られる。
【００１７】
一方、メディエータとしては、実施例に示したフェリシアン化カリウムは安定性の点等から優れているが、これ以外にもｐ−ベンゾキノン、ｏ−ベンゾキノン等のキノン化合物、フェロセンおよびフェロセン誘導体等のメタロセン化合物、ならびにオスミウム錯体等の金属錯体なども使用できる。さらに、実施例では測定極と対極からなる二電極系について述べたが、参照極を加えた三電極方式においても同様の効果が得られる。
【００１８】
また、実施例においては、試料液に反応層を溶解する方式について示したが、これに制限されることはなく、固定化によって試料液に不溶化させた場合にも適用することができる。
【００１９】
印加電位Ｅ１については、目的対象物の電解酸化が実質的に起こらない範囲の電位であって良いが、得られる電流の絶対値が小さいと精密な測定装置が必要となるため、少なくとも１０-9アンペア以上の電流が得られる電位に設定するのが望ましい。また、印加電位Ｅ２については、実質的に目的対象物の電解酸化が起こる範囲の電位であって良いが、溶媒の電解酸化が起こる電位以下であることが必要である。溶媒の電解酸化が起こる電位では、溶媒の電解酸化に由来する電流がノイズとなり、正確な測定が不可能となるためである。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
【００２１】
（実施例１）
定量法の一例として、グルコ−スの定量について説明する。まず実施例に用いたグルコ−スセンサについて説明する。図１に示すように、ポリエチレンテレフタレ−トからなる絶縁性の基板１１に、銀ペーストをスクリ−ン印刷することによりリ−ド１２を形成した後、樹脂バインダ−を含む導電性カ−ボンペ−ストを印刷して作用極１３が形成される。この作用極は、リ−ドと接触している。
【００２２】
次に、絶縁性ペ−ストを印刷して絶縁層１４が形成される。絶縁層は、作用極の外周部を覆っており、これによって作用極１３の露出部分の面積を一定に保っている。さらに、絶縁層１４は、リ−ド１２を部分的に覆っている。
【００２３】
次に、樹脂バインダ−を含む導電性カ−ボンペ−ストをリ−ドと接触するように印刷して対極１５が形成される。図２に示すように、前記の電極系（作用極１３、対極１５）上にＣＭＣの水溶液を滴下し、乾燥させることによりＣＭＣ層２１が形成される。更に、前記電極系上に、酵素としてグルコースオキシダーゼ、メディエータとしてフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を滴下し、乾燥させることにより、一部がＣＭＣ層と混ざり合った反応層２２が形成される。
【００２４】
次に、反応層２２上への試料液の供給をより一層円滑にするために、レシチンの有機溶媒溶液、例えばトルエン溶液を試料供給部（センサ先端部）から反応層上にわたって広げ、乾燥させることによりレシチン層２３が形成される。最後に、図３に示すようなカバ−３１および２００μｍの厚みを持つスペ−サ−３２を接着する。こうすることにより、試料供給孔３３から空気穴３４へと通じるとともに反応層２２を覆う試料エリア３５が形成され、試料は毛細管現象により試料エリア３５へ導かれることとなる。こうしてグルコ−スセンサが作製される。
【００２５】
このようにして作製したセンサに試料液としてグルコ−ス水溶液３μｌを試料供給孔３３より供給した。グルコース濃度は、８４ｍｇ／ｄｌのものと２６０ｍｇ／ｄｌのものを用いた。試料液は、空気穴３４部分まで達し、電極系上の反応層２２が溶解した。図４に示すように、まず、試料供給から１０秒経過後、作用極に対極を基準として１０ｍＶ（Ｅ１ａ）、パルス幅２００ミリ秒の電位を印加し、パルスの最終１７ミリ秒間に電流を測定し、バックグラウンド電流ａを得た。続いて、８００ミリ秒の開回路の後、作用極に対極を基準として２０ｍＶ（Ｅ１ｂ）、パルス幅２００ミリ秒の電位を印加し、パルスの最終１７ミリ秒間に電流を測定し、バックグラウンド電流ｂを得た。同様にして、１０ｍＶ間隔で３０〜１００ｍＶ（Ｅ１ｃ〜ｊ）の印加電位に対してバックグラウンド電流ｃ〜ｊを得た。その後、試料供給から５５秒経過後に５００ｍＶ（Ｅ２）を印加して、電位印加から５秒後の電流を測定し、応答電流を得た。測定はグルコース１濃度に対して１６回づつ行った。
【００２６】
上記のようにして得られた応答電流と種々の印加電圧に対して得られたバックグラウンド電流ａ〜ｊの差を取り、シグナル電流を算出した。応答電流そのまま、および各バックグランド電流から得られたシグナル電流の変動系数をプロットしたものが、図５である。Ｅ１として０〜７０ｍＶを選ぶことによって、再現性が向上することが分かった。
【００２７】
（実施例２）実施例１と同様にして作製したグルコースセンサを用いて、異なるＥ１とＥ２の組み合わせにて測定を行った。図６に示すように、試料供給から２０秒経過後、作用極に対極を基準として４０ｍＶ（Ｅ１）を印加し、電位印加から５秒後の電流を測定してバックグラウンド電流を得た。その直後、すなわち、試料供給から２５秒経過後、作用極に対極を基準として５００ｍＶ（Ｅ２）を印加し、電位印加から５秒後の電流を測定して応答電流を得た。
【００２８】
上記のようにして得られた、応答電流とバックグラウンド電流の差を取り、シグナル電流を算出した。グルコース濃度と応答電流の関係、および、グルコース濃度とシグナル電流の関係をプロットしたところ、両者ともに良好な直線関係が得られた。しかしながら、応答電流の再現性が変動係数（ＣＶ）＝５．８９（％）であったのに対して、シグナル電流においては、ＣＶ＝３．８５（％）と、より良好な再現性が得られた。測定数は、３０であった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、使い捨てタイプのバイオセンサに適用可能で、少なくともバックグラウンド電流のバラツキのない基質の定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発明の実施例に使用したグルコースセンサの反応層を除いた平面図である。
【図２】グルコースセンサを図１中の点線部分で切った反応層等の断面図である。
【図３】グルコースセンサのスペーサ、カバーの平面図である。
【図４】加電位と時刻の関係を示すグラフである。
【図５】差し引く電流を得た印加電位と変動係数の関係を示すグラフである。
【図６】印加電位と時刻の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１１  絶縁性基板
１２  リード
１３  作用極
１４  絶縁層
１５  対極
２１  ＣＭＣ層
２２  反応層
２３  レシチン層
３１  カバー
３２  スペーサー
３３  試料吸引孔
３４  空気穴
３５  試料エリア
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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