(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
育毛効果を評価する素材の存在下、動物の毛乳頭細胞と毛包細胞とを共存させて培養し、その増殖の度合いを測定し、別途、毛包細胞のみを、前記育毛効果を評価する素材の存在下、単独培養させて、その増殖の度合いを測定し、前記育毛効果を評価する素材の存在下、毛乳頭細胞と毛包細胞を共存下で培養した時の増殖の度合いとの差を指標とすることを特徴とする、育毛剤のイン・ビトロの評価法。
【請求項２】
毛乳頭細胞と毛包細胞が髭由来の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の育毛剤のイン・ビトロの評価法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、育毛作用を有する物質のスクリーニングに好適な、育毛剤のイン・ビトロの評価法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
美しい黒髪を長い間維持しうることは、万人誰もが願うことであるが、必ずしも実現しうるものではない。特に、近年に於いては、著しい食生活の変化、行動パターンの夜行化に伴うサーカディアンリズムの変調、社会生活に於ける競争の激化とそれを起因とする心身への負荷ストレスの増大などが複雑に関連して、禿、薄毛等の毛髪トラブルが急激に増大している。これを反映して、この様な毛髪トラブルに対処する育毛化粧料が各種開発されているが、十分にこの様な毛髪トラブルに対処しているとは言えず、更なる育毛用の化粧料の登場が待たれていた。この為には、新規の育毛素材の開発が必要となる。
【０００３】
育毛素材の開発は、各種生薬などを、例えば、マウス等の実験動物の皮膚に投与して、毛髪の生え方を指標としてイン・ビボの試験によって評価してきた。しかしながら、この様なスクリーニング法では、非常に多くの動物を用いなければならず、動物愛護の観点での問題があったり、評価に要する時間が非常に長いという問題があり、こなせるサンプルの数も自ずと限られていた。イン・ビトロの育毛剤の評価法としては、毛包細胞を培養し、その増殖の度合いを指標とする評価法が知られているが、この方法ではイン・ビボとの相関性に問題ある場合があり、一次スクリーニングとしてしか使用できないと言う問題があった。又、一方発毛に於ける、毛包細胞と毛乳頭細胞の相互関係については、明確な関係が見いだされていなかった。更に、毛乳頭細胞と毛包細胞を共存して培養する共存培養系での育毛剤の評価に於いて、単独培養系ではスクリーニングで引っかけることのできなかったイン・ビボ評価で有効な物質が引っかけられることは全く知られていなかった。この様な状況を反映して、簡便で素早く評価ができ、多くのサンプルのスクリーニングが可能な、イン・ビボとの相関性が高いイン・ビトロの育毛剤の評価法が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの様な状況を踏まえて為されたものであり、イン・ビボとの相関性が高いイン・ビトロの育毛剤の評価法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題の解決手段】
本発明者らは、この様な状況に鑑みて、イン・ビボとの相関性が高いイン・ビトロの育毛剤の評価法を求めて鋭意研究を重ねた結果、動物の毛乳頭細胞と毛包細胞とを共存させて培養し、その増殖の度合いを指標とすることにより、その様なイン・ビトロの評価が可能となることを見いだし、発明を完成させるに至った。以下、本発明について、発明の実施の形態を中心に詳細に説明を加える。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の育毛剤のイン・ビトロの評価法は、動物の毛乳頭細胞と毛包細胞とを共存させて培養し、その増殖の度合いを指標とすることを特徴とする。ここで使用する動物としては、毛髪を有する動物であれば特段の限定なく使用することができ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ何れの動物も使用可能である。この中で特に好ましい動物は、ラットである。これは、毛乳頭細胞や毛包細胞の採取が行いやすい、評価の再現性が良い、安価で入手しやすい等の多くの利点を有する為である。又、使用する毛髪としては、髭を使用するのが好ましい。これは、毛包細胞や毛乳頭細胞を無菌的に取り出すに都合が良いことと、スクリーニングに於ける相関性と精度に優れる等の利点を有するためである。ラットの髭より毛乳頭細胞や毛包細胞を取り出す方法は、例えば、次の通りである。即ち、毛乳頭細胞は、ラットより左右両側の口唇部を無菌的にメスで切り出し、実体顕微鏡下で成長期の髭毛包を摘出し、当該毛包を毛球部の真上で切断し、毛球部からは毛乳頭を切り出し、これらを通常の細胞培養手段に従って培養すればよい。又、毛包細胞は、外毛根鞘部を含む部分の毛包外殻をメス及び２６Ｇの注射針を用いて注意深く取り除き、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ディスパーゼ中で処理した後、結合織鞘を取り除き、トリプシン処理して細胞を集め、培養すればよい。これらについては、小林らが既に報じている。(Proc.Natl.Acad.Sci.90:7391-7395,1993) 培養は、例えば、ウシ胎仔血清を加えたイーグルの最少培地で培養すればよい。必要に応じて、ＥＧＦ、インシュリン、ハイドロコルチゾン等を添加することもできる。かくして、得られた毛乳頭細胞と毛包細胞とを共存下、スクリーニングするべき素材を存在させて培養し、その増殖の程度を測定し、増殖を促進すれば、育毛剤として評価でき、その増殖の促進作用が大きければ大きいほど育毛効果の大きい育毛剤であると評価できる。この方法については、既に藤江らが報じているが、藤江らの報告には、育毛素材の非存在下の単独培養と共存培養に於いては、共存下の方が毛包細胞の増殖が促進されることが報じられているが、育毛素材の存在下で単独培養と共存培養の差が更に増幅されることは述べられていない。ここで、共存下とは、両細胞が影響を及ぼし合う環境にあることを言い、別々のシャーレにあっても、寒天ブリッジ等でメーディエーター類を交換しうる環境にあれば共存下ということができる。後記実施例に示すように、毛乳頭細胞と毛包細胞とを共存させることにより、育毛剤であって、どちらか一方では増殖促進を認めない物質でも、共存下にあることにより増殖促進作用を呈し、確実に実状に則したスクリーニングをすることができる。これらの細胞の増殖の測定は、常法に従って行えば良く、例えば、14Ｃや3Ｈ等の放射性元素でラベルした、チミジン等の必須成分の取込量を調べる方法などが例示できる。最も好ましいものは、3Ｈでラベルしたチミジンの取込量を調べる方法である。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【０００８】
＜実施例１＞
２１日齢のウィスター系ラット（雄性）を用い、毛包細胞と毛乳頭細胞とを単離した。即ち、ラット１匹分の左右両側の口唇部を無菌的にメスで切り出し、実体顕微鏡下で成長期の髭毛包２０本を摘出した。摘出した毛包を毛球部の真上で切断し、毛球部からは毛乳頭を取り出し、直径３５ｍｍの組織培養用ディッシュに付着させて静置培養した。培地は最初の４日間は２０％ＦＢＳ加イーグルの最少培地で培養した。その後１０％ＦＢＳ加イーグルの最少培地で培養した。継代培養は、培養４週間後に燐酸緩衝生理食塩水：カルシウム、マグネシウムフリー（以下、ＰＢＳ（−））でディッシュ表面を１回洗浄した後０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡで３７℃、１時間処理し、細胞を分散させて遠心分離で回収したものを用いた。毛包細胞は、外毛根鞘部を含む部分の毛包外殻をメス及び注射針で注意深く取り除き、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ディスパーゼ中で３７℃、３０分間処理した後、結合織鞘を取り除き、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡで１時間処理し、分散した細胞を遠心分離で集め、コラーゲンコートディッシュに播種し培養した。培地は、ヒトリコンビナントＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ、ヒトリコンビナントインシュリン４μｇ／ｍｌ、ハイドロコルチゾン０．４μｇ／ｍｌ、１５％ＦＢＳ加イーグルの最少培地を用いた。継代培養は、培養２週間後に燐酸緩衝生理食塩水：カルシウム、マグネシウムフリー（以下、ＰＢＳ（−））でディッシュ表面を１回洗浄した後０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡで３７℃、１時間処理し、細胞を分散させて遠心分離で回収したものを用いた。培養は全て５％炭酸ガス、９５％エアーで３７℃で行った。
【０００９】
共存培養は、継代培養２回目でサブコンフルエントになった、毛包細胞をＩＶ型コラーゲンコートプレートに２×１０2個／ｃｍ2の割合で播種し、同じく継代培養２回目のサブコフルエントになった、毛乳頭細胞をＩ型コラーゲンコートセルカルチャーインサート（ポアサイズ３μｍ）に、４×１０3個／ｃｍ2の割合で播種した。培養２４時間にセルカルチャーインサートをプレートのウェルに移し、それぞれ共存させて培養した。培養培地には、育毛効果がイン・ビボで確かめられているサンシャエキスを終濃度０％、１０-7％、１０-5％、１０-3％で含んだ１０％ＦＢＳ加イーグルの最少培地を用いた。共存培養３日後にセルカルチャーインサートを除き、3Ｈ−チミジン１μＣｉ／ｍｌを添加し更に５時間培養を続けた。常法に従って細胞内に取り込まれた放射活性を測定し増殖活性とした。比較として、セルカルチャーインサートをインサートしないものを用い、単独培養とした。結果を図１に示す。これより、単独培養では、育毛剤であるサンシャエキスの育毛効果は認められないが、共存培養でははっきりと有意差をもってサンシャエキスの育毛効果が認められていることがわかる。又、細胞の起源が同一動物であるので、動物差を考えずに比較することもできるし、マイクロプレートでスクリーニングできるので、同一条件で多種のサンプルのスクリーニングを短時間で行うこともできる。
【００１０】
【発明の効果】
本発明によれば、イン・ビボとの相関性が高いイン・ビトロの育毛剤の評価法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  サンシャエキスの育毛効果について、単独培養と共存培養で試験した結果を示す図である。
【図１】
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