(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に２−Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸化合物、その脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族もしくはヘテロ脂肪族アルコールとの全エステルまたは部分的エステルである誘導体またはそれらの塩であって、該ヒアルロン酸化合物は５０，０００〜３００，０００Ｄａの範囲の分子量を有し、該化合物または該誘導体のグルコサミンが部分的にＮ−硫酸化され、または部分的にＮ−硫酸化され且つ６位が全体的または部分的にＯ−硫酸化されており、Ｎ−脱アセチル化の百分率が３〜３６％の範囲である、化合物、誘導体または塩。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸誘導体が、
ベンジルアルコールとのヒアルロン酸の全エステルエステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約２５％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約５０％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約７５％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
エチルアルコールとのヒアルロン酸の全エステルエステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約２５％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約５０％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約７５％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシ基がドデシルアルコールにより５％〜１００％の程度までエステル化されているヒアルロン酸のエステル、および
ヒアルロン酸のカルボキシ基がヘキサデシルアルコールにより５％〜１００％の程度までエステル化されているヒアルロン酸のエステル
からなる群から選択される、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸誘導体が架橋された化合物であり、Ｄ−グルクロン酸残基のカルボキシ基の一部または全部が、同じポリサッカライド鎖のまたは他の鎖のアルコール官能基によってそれぞれ、内部エステルまたは分子間エステルを形成している、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項４】
ヒアルロン酸誘導体が架橋された化合物であって、該架橋された化合物が、Ｄ−グルクロン酸残基のカルボキシ基の一部または全部が、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族またはヘテロ環系の多価アルコールと反応し、スペーサー鎖により架橋を生じることによって形成される、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項５】
前記化合物または前記その誘導体が重金属との塩にされている、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項６】
前記重金属が、周期表の第４、５および６周期から選択される金属元素である、請求項５記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項７】
前記重金属が、銀、コバルト、鉄、銅、亜鉛、砒素、ストロンチウム、ジルコニウム、アンチモン、金、セシウム、タングステン、セレン、白金、ルテニウム、ビスマス、スズ、チタンおよび水銀である、請求項６記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項８】
前記化合物または前記その誘導体が薬学的に活性な物質と塩を形成する、請求項１に記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項９】
薬学的に活性な物質が、抗生物質、抗感染剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤、抗ガン剤、抗炎症剤、創傷治療剤、麻酔薬、コリン性作動薬、コリン性拮抗薬、アドレナリン性作動薬、アドレナリン性拮抗薬、抗血栓症剤、抗凝固剤、止血剤、フィブリン溶解剤、血栓溶解剤、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項８記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項１０】
アミノ基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が１〜７０％の間であり、６位のヒドロキシル基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が０〜１００％の間である、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項１１】
アミノ基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が５〜４０％の間であり、６位のヒドロキシル基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が０〜１００％の間である、請求項１記載の硫酸化されたヒアルロン酸化合物。
【請求項１２】
薬学的に有効な量の請求項１記載の化合物またはその誘導体を含有する医薬組成物であって、該化合物または該誘導体が場合により塩にされ、および場合により他の薬学的に活性な物質と、および場合により薬学的に許容し得る担体と組み合わされている医薬組成物。
【請求項１３】
前記誘導体が
ベンジルアルコールとのヒアルロン酸の全エステルエステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約２５％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約５０％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約７５％がベンジルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
エチルアルコールとのヒアルロン酸の全エステルエステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約２５％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約５０％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシル基の約７５％がエチルアルコールでエステル化されているヒアルロン酸の部分的エステル、
ヒアルロン酸のカルボキシ基がドデシルアルコールにより５％〜１００％の程度までエステル化されているヒアルロン酸のエステル、および
ヒアルロン酸のカルボキシ基がヘキサデシルアルコールにより５％〜１００％の程度までエステル化されているヒアルロン酸のエステル
からなる群から選択される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記誘導体が架橋された化合物であり、Ｄ−グルクロン酸残基のカルボキシ基の一部または全部が、同じポリサッカライド鎖のまたは他の鎖のアルコール官能基によってそれぞれ、内部エステルまたは分子間エステルを形成している、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記誘導体が架橋された化合物であって、該架橋された化合物が、Ｄ−グルロン酸残基のカルボキシ基の一部または全部が、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族またはヘテロ環系の多価アルコールと反応し、スペーサー鎖により架橋を生じることによって形成される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記化合物または前記その誘導体が重金属との塩にされている、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記重金属が、周期表の第４、５および６周期から選択された金属元素である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記重金属が、銀、コバルト、鉄、銅、亜鉛、砒素、ストロンチウム、ジルコニウム、アンチモン、金、セシウム、タングステン、セレン、白金、ルテニウム、ビスマス、錫、チタンおよび水銀である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記化合物または前記誘導体が薬学的に活性な物質と塩を形成する、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項２０】
薬学的に活性な物質が、抗生物質、抗感染剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤、抗ガン剤、抗炎症剤、創傷治療剤、麻酔薬、コリン性作動薬、コリン性拮抗薬、アドレナリン性作動薬、アドレナリン性拮抗薬、抗血栓症剤、抗凝固剤、止血剤、フィブリン溶解剤、血栓溶解剤、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、およびポリヌクレオチド、成長因子、酵素、ワクチン、遺伝的欠陥に関連する疾患、奇形生成性の疾患および遺伝性の疾患の処置に使用される物質からなる群からなる群から選択される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アミノ基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が１〜７０％の間であり、６位のヒドロキシル基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が０〜１００％の間である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項２２】
アミノ基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が５〜４０％の間であり、６位のヒドロキシル基の２量体単位あたりの硫酸化の程度が０〜１００％の間である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１記載の化合物またはその誘導体を含む生体用材料であって、該化合物または該誘導体が場合により塩にされ、および場合により天然、半合成または合成ポリマーと組み合わされ、および場合によりさらに生物学的に活性な物質と組み合わされている生体用材料。
【請求項２４】
天然のポリマーが、コラーゲン、コラーゲンの共沈物およびグリコサミノグリカン、セルロース、並びにキチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゼラチン、アルギン酸、アルギン酸塩、ポリマンナン、ポリグリカン、デンプン、および天然ゴムからなる群から選択されるゲルの形態のポリサッカライドからなる群から選択される、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項２５】
半合成ポリマーが、アルデヒド、アルデヒドの前駆体、ジカルボン酸、ジカルボン酸ハロゲン化物、ジアミンからなる群から選択される試薬で架橋したコラーゲン、セルロース誘導体、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、ゼラチン、キサンタン、ペクチン、ペクチン酸、ポリグリカン、ポリマンナン、寒天、アガロース、天然ゴムおよびグリコサミノグリカンからなる群から選択される、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項２６】
合成ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸のコポリマー、ポリ乳酸の誘導体、ポリグリコール酸のコポリマー、ポリグリコール酸の誘導体、ポリジオキサン、ポリホスファゼン、ポリスルホン酸樹脂、ポリウレタンおよびＰＴＦＥからなる群から選択される、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項２７】
フィブリンと組み合わせた、および場合により別の生物学的に活性な物質と組み合わせた、外科用接着剤である、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項２８】
培養細胞の支持体である、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項２９】
ガイドチャネル、糸、ゲル、ヒドロゲル、緩衝材、フィルム、膜、スポンジ、不織布、ミクロスフェア、ナノスフェアからなる群から選択される、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項３０】
ヘルスケアまたは外科用品である、請求項２３記載の生体用材料。
【請求項３１】
前記ヘルスケアまたは外科用品が、ガイドチャネル、ガーゼ、糸、ゲル、ヒドロゲル、緩衝材、フィルム、膜、スポンジ、不織布、ミクロスフェア、ナノスフェアからなる群から選択される、請求項３０記載の生体用材料。
【請求項３２】
フィブリンおよび場合により他の生物学的に活性な物質と組み合わせた、請求項２３記載の生体用材料の外科用接着剤の製造のための使用。
【請求項３３】
培養細胞の支持体の製造ための、請求項２３記載の生体用材料の使用。
【請求項３４】
請求項１記載の化合物またはその誘導体でコーティングされた生体医療用品であって、バイパス、静脈カテーテル、シャント、カテーテル、ガイドチャネル、プローブ、心臓弁、人工腱、骨および心臓血管置換物、コンタクトレンズ、軟組織置換物、動物器官の置換物、血液酸素化装置、人工腎臓、心臓、膵臓および肝臓、血液バッグ、シリンジ、外科用器具、濾過システム、実験器具、培養容器並びに細胞および組織の再生のための容器、ペプチド、タンパク質および抗体のための支持体からなる群から選択される生体医療用品。
【請求項３５】
請求項１記載の化合物またはその誘導体の製造方法であって、以下の工程：
ａ）ヒアルロン酸またはその誘導体のヒドラジン一水和物中で、出発生成物の溶液に硫酸ヒドラジンを加えることにより、制御されたＮ−脱アセチル化を行うこと；
ｂ）Ｎ−脱アセチル化された化合物の４級アンモニウム塩を製造すること、
ｃ）ジメチルホルムアミドスルホトリオキシドの溶液とともに無極性溶媒中の塩の溶液を加えることにより４級アンモニウム塩をＮ−硫酸化すること、および
ｄ）場合により、ｃ）の溶液の混合物にピリジンスルホトリオキシドの溶液を加えることによって、６位でヒドロキシル基をＯ−硫酸化すること
を含む方法。
【請求項３６】
請求項１記載のヒアルロン酸エステルの製造のための、部分的にＮ−硫酸化された、または部分的にＮ−硫酸化され且つ全体的もしくは部分的に６位でＯ−硫酸化されたヒアルロン酸の使用。
【請求項３７】
請求項３記載の架橋されたヒアルロン酸の製造のための、部分的にＮ−硫酸化された、または部分的にＮ−硫酸化され且つ全体的もしくは部分的に６位でＯ−硫酸化されたヒアルロン酸の使用。
【請求項３８】
請求項４記載の架橋されたヒアルロン酸の製造のための、部分的にＮ−硫酸化された、または部分的にＮ−硫酸化され且つ全体的もしくは部分的に６位でＯ−硫酸化されたヒアルロン酸の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、抗凝固および抗血栓活性を有するヒアルロン酸の新規の硫酸化化合物およびその誘導体、並びにそれらの製造方法に関する。この化合物は、医薬組成物および生体用材料の製造並びに生体医療用品のコーティングの製造において有用である。
発明の背景
ヘパリンは、もっとも生物学的活性の高い硫酸化されたグリコサミノグリカンである。その抗血栓および抗凝固特性はよく知られている。実際、血栓症の危険性のある心血管の病気の処置に使用されており、直視下心臓外科の成功に大きく貢献してきた。ヘパリンの構造は完全には分かっていない。
商業用のヘパリンには、分子量３，０００〜３７，５００Ｄaの範囲の、種々の抗凝固活性を有する２１の異なる種類が含まれている（Naderら,1974,Biochem.Biophys.Res.Commun.57:488）。
ヘパリンの抗凝固活性は、その構造上の特徴、例えば硫酸化の程度、解離の程度、ＣＯＯ−およびＳＯ3−基の配列、分子の形状および大きさに依存する。これらの因子は、ヘパリンの生物学的活性の原因となるイオン結合の形成にとって重要である（Stivalaら,1967,Arch.Biochem.Biophys.122:40）。
その高密度の負電荷のために、ヘパリンは、カチオンに対し強力な活性を有し、その活性はpＨ依存的である。特に、ヘパリンのグルコサミン残基のＮ−硫酸化された基は、凝固過程を調節する因子との相互作用において重要な役割を担っている。
Ｎ−硫酸化された基の有意の減少は、ヘパリンの抗凝固および抗血栓活性を劇的に減少させる。
多くの天然のポリサッカライドが、ヘパリン様産物を得るために硫酸化されてきた（Hofmanら,1982,Carbohydrate Res.2:115;Kindnessら,1980,Birt.J.Pharmac.69:675;Hofmanら,1973,Carbohydrate Res.30:349;Okadaら,1979,Makromol.Chem.180:813;Kikuchiら,1979,Nippon Kagaku Kaishi 1:127;Manzacら,1981,Proc.Third M.I.S.A.O.5:504）。さらに、硫酸基、カルボキシ基またはスルホン化された基が、ポリスチレン（Kanmaugueら,1985,Biomaterials,6:297）およびポリウレタン（Itoら,1992,Biomaterials,13:131）等の合成ポリマーに結合された。
しかしながら、これら物質の抗凝固活性は、ヘパリンと比較するとかなり低く、置換基の種類、結合の種類、置換の程度および配列に依存する。
最後に、ポリサッカライドの硫酸化のための化学反応がいくつか知られているが（ＷＯ ８８／００２１１；ＥＰ ０３４０６２８；Carbohydrate Reseach,158-190,1986）、ポリサッカライド特有の理化学的特徴のほかに、抗凝固活性のようななんらかの新たな特徴が存在する誘導体は得られていない。
国際特許出願、公開公報第ＷＯ ９５／２５７５１には、抗血栓活性を有する化合物を得るためのヒアルロン酸とその誘導体の非選択的硫酸化に関する製造方法が記載されている。
トロンビンを不活性化するそれらの能力は、電荷密度に依存する静電気的相互作用の形成に起因し、電荷密度が硫酸化の程度によって増加し、一方、ヘパリンの活性は、アンチトロンビンＩＩＩとの直接的相互作用の結果である（T.W.Barrowcliffeら,Jornal of Pharmaceutical & Biochemical Analysis,Vol.7,No.2,Pages 217-226,1989;Peter D.J.Grootenhuiisら,J.Am.Chem.Soc.,113,2743-2747,1991）。
出血作用等の副作用があり、それが、気がねなくまたは医学的指針の必要なしに使用されることを妨げているが、ヘパリンは広く使用されている。
さらに、その理化学的特徴のために、ヘパリンは、生体用材料としては使用することができないが、単に他の材料のコーティングとして、局所的出血を引き起こすのを回避するに十分な少ない量で使用することができる。
最後に、凝固因子に直接作用することにより、ヘパリンの抗凝固作用が非常に急速に開始し、その持続は、たとえ用量依存的であっても、一般的には一様に短い。これらの欠点は、所定の時間の間は血栓が絶対存在しないことが要求される、デバイスの埋め込みに関わる心臓血管外科のような、ある特定の外科の分野におけるヘパリンの応用性を制限している。
発明の要約
本発明は、抗凝固活性を有する医薬製剤、生体適合性で生体吸収性の生体用材料の製造および生体医療用品のコーティングの製造のための、グルコサミンが部分的にＮ−硫酸化され、または部分的にＮ−硫酸化され且つ６位で部分的もしくは全体的にＯ−硫酸化された、場合により塩にされた、抗凝固および抗血栓活性を有する、ヒアルロン酸の新規の硫酸化された化合物およびその誘導体、並びにその製造方法に関する。
本発明はさらに、ヒアルロン酸等のよく特徴付けられた出発物を使用する化学的製造方法を提供する。この方法はグルコサミンのアミノ基または６位のヒドロキシ基の選択的な硫酸化が可能であり、分子量範囲が変わらず、ヘパリンと同様の抗凝固活性を有する、ヒアルロン酸の新規の硫酸化誘導体が得られる。
トロンビンを不活性化する高硫酸化（hypersulphated）ポリサッカライドの能力は、硫酸化の程度にしたがって増加する電荷密度に依存する、静電気的相互作用の形成に起因するが、本発明において提供するＮ−硫酸化誘導体は、ヘパリンと同様の特異的な機構によって凝固因子に作用するようである。
本発明のさらなる利点は、高硫酸化誘導体の理化学的特徴と比較して改善された、Ｎ−硫酸化誘導体の理化学的特徴によって示され、それにより、その誘導体が、生物医薬およびヘルスケアの分野並びに薬学の分野において使用するための生体用材料の製造に適するものになる。
さらに、該アミノ基および６位のヒドロキシ基の選択的な硫酸化によって、抗凝固および非血栓形成活性を有する化合物が得られるという可能性は、すべての水酸基が一様に硫酸化されたヒアルロン酸の製造と比較して、製造過程のコストを大幅に減少する。
発明の詳細な記載
ここで使用される、ヒアルロン酸の「部分的２−Ｎ−硫酸化誘導体」なる用語は、予めP.Shaklee（1984）Biochem.J.217,187-197に記載の方法にしたがってＮ−脱アセチル化されているヒアルロン酸のグルコサミンのアミノ基の制御された硫酸化反応により得られる生成物を意味する。反応は、以下に示すように進行する。
0004278716.tif 000002
ここで使用される「部分的２−Ｎ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化誘導体」なる用語は、ダイヤグラム１に示される化学反応の生成物を意味し、ここで、グルコサミンのアミノ基のほかに、以下に示すように、同じ残基の一級水酸基も全体的にまたは部分的に硫酸化反応に関与している。
0004278716.tif 000003
ダイヤグラム１および２にしたがって製造される誘導体は、欧州特許０２１６４５３ Ｂ１に記載された方法にしたがって、化合物の製造における中間反応物質として使用することができる。部分的に２−Ｎ−硫酸化、または部分的に２−Ｎ−硫酸化および部分的にもしくは全体的に６−Ｏ−硫酸化されているヒアルロン酸のグルクロン酸残基のカルボキシ官能基を、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環系のアルコールと部分的にまたは完全に反応させてそれぞれの部分的エステルまたは全エステルを製造する。
0004278716.tif 000004
さらに、ダイヤグラム１および２の合成誘導体を中間体として、それぞれ欧州特許０３４１７４５ Ｂ１および２６５４４６ Ｂ１に記載にされている方法にしたがって、架橋化合物の製造に使用することができる。この方法では、Ｄ−グルクロン酸残基のカルボキシ基の一部またはすべてを、ｉ）縮合試薬を用いて同じポリサッカライド鎖または他の鎖のアルコール官能基と反応させ、内部エステル（またはラクトン）および分子間エステルを生じさせる；ｉｉ）脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環系の多価アルコールと反応させてスペーサー鎖により架橋を生じさせる。
本発明の製造方法にしたがって得られる上記の硫酸化化合物は、場合により重金属との塩にされていてもよい。重金属は、周期表の第４、５および６周期の金属元素の群から選択され、例えば、銀、鉄、コバルト、銅、亜鉛、砒素、ストロンチウム、ジルコニウム、アンチモン、金、セシウム、タングステン、セレン、白金、ルテニウム、ビスマス、スズ、チタンおよび水銀などである。これらの塩は、皮膚科学、眼科学、歯科学、口腔病学、リウマチ学、泌尿器科学、婦人科学、内部外科において、供給食品として、並びに抗酸化剤、抗リウマチ剤、抗ガン剤、抗炎症剤、鎮痛剤および抗潰瘍剤として、使用することができる。
最後に、硫酸化誘導体は、場合により、薬理学的に活性な物質、例えば抗生物質、抗感染剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤、抗ガン剤、抗炎症剤および創傷治癒剤、麻酔薬、コリン性またはアドレナリン性作動薬または拮抗薬、抗血栓症剤、抗凝固剤、止血剤、フィブリン溶解剤、および血栓溶解剤。タンパク質およびその断片、ペプチド、およびポリヌクレオチド等とともに塩にされていてもよい。
上記の抗血栓および抗凝固特性並びに生体適合特性とは別に、本発明のＮ−硫酸化誘導体は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびヘルペスに対する抗ウイルス剤として、並びに例えば医薬組成物の形態および生体用材料の形態の両方で直腸または膣の投与経路によって、全身、局所または局在的使用のための抗炎症剤として有利に使用することができる。
したがって、本発明の化合物およびその塩は、単独でまたはもう１つのもしくは他の薬学的に活性な物質と一緒に、医薬組成物の製造のための薬学的に許容し得る担体と組み合わせて有利に使用することができる。
そのような医薬組成物は、例えば抗血栓、抗凝固、抗炎症、抗ウイルス、抗水腫調製物として、創傷治癒を促進するために、やけど、ただれ、皮膚潰瘍、歯の齲（う）食、再狭窄および不完全骨折の処置において、および血管形成を助けるために使用することができる。
特に関心があるのは、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリヌクレオチド、成長因子、酵素、ワクチン、所定の酵素をコードする遺伝子の欠陥に起因する酵素の低活性または過剰活性による遺伝的欠陥に関連する疾患、奇形生成性の疾患および遺伝性の疾患の処置において使用される物質などの生物学的に活性な物質の輸送および放出のための製剤および生体用材料である。
本発明の硫酸化誘導体は、造影システムにおいて使用される、および腫瘍性のまたは損傷を受けている組織の同定および治療における、インビボ診断におけるトレーサーとして使用される放射性および非放射性物質と組み合わせることができる。
１つの相当な利点は、硫酸化化合物およびその塩を、スポンジ、フィルム、膜、糸、タンポン、不織布、ミクロスフェア、ナノスフェア、ガーゼ、ゲル、ガイドチャネル等の様々な形態の生体用材料に加工する可能性によって示される。そのような形態の１つ、またはいくつかの形態と一緒になったこれらの生体用材料は、１またはそれ以上の硫酸化誘導体によっておよびそれらの塩によって構成され、場合により、他の天然の、合成の、半合成のポリマーと一緒に、そして場合により、生物学的に活性な物質と一緒に含まれている。
使用し得る天然のポリマーの例は、コラーゲン、コラーゲンの共沈物およびグリコサミノグリカン、セルロース、ゲルの形態のポリサッカライド例えばキチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゼラチン、アルギン酸またはアルギン酸塩、ポリマンナンまたはポリグリカン、デンプン、天然ゴムである。例えば半合成ポリマーは、アルデヒドまたはその前駆体、ジカルボン酸またはそのハロゲン化物、ジアミン等の試薬で架橋したコラーゲン、セルロース、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゼラチン、キサンタン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン、ポリマンナン、寒天、アガロース、天然ゴムおよびグリコサミノグリカンの誘導体からなる群から選択され得る。最後に、使用できる合成ポリマーの例は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそのコポリマーまたはその誘導体、ポリジオキサン、ポリホスファゼン、ポリスルホン酸樹脂、ポリウレタン、ＰＴＦＥである。
得られる生体用材料は、ヒアルロン酸のエステル誘導体の使用に起因する生体適合性および生分解性といった特徴を有すること以外に、使用する生体用材料に血餅形成性が全くないことが必要とされる心臓血管の分野でまたは血液とのもしくは高度に血管化した生体組織との接触を必要とするすべての適用において使用することができる。
上記の生体用材料は、外科の様々な分野：内部外科、骨関節外科、神経外科、吻合外科、粘弾性外科、眼外科、腫瘍外科、形成外科、耳鼻咽喉外科、腹部−骨盤外科、泌尿器婦人外科および心臓血管外科において、例えば血管弁、血管ステントの調製において、術後癒着の防止において、肥厚性瘢痕の防止などにおいて有利に使用することができる。
さらに、フィブリンあるいは他の生物学的に活性な物質と組み合わせた硫酸化化合物は、外科用接着剤の製造に使用することができる。
本発明の生体用材料は、外科以外の他の分野、例えば血管透析、心臓学、皮膚科学、眼科学、耳鼻咽喉科学、歯科学、婦人科学、泌尿器科学において、体外血液循環および酸素化において、並びに化粧品において使用することができる。
様々な形態の上記の生体用材料は、結合組織、腺組織および神経組織を得るために、間葉細胞または成熟細胞などの培養細胞の支持体として有利に使用することもできる。
本バイオポリマーは、医療の分野および他の工業分野の両方において使用される被覆品への加工に使用することもでき、支持体として使用される物質の表面に新たな生物学的特性を与えることができる。
このようにコーティングされ得る物の例には、カテーテル、ガイドチャネル、プローブ、心臓弁、軟組織置換物、ブタ由来の心臓弁などの動物由来の置換物、人工の腱、骨および心臓血管置換物、コンタクトレンズ、血液酸素供給装置、人工の腎臓、心臓、膵臓および肝臓、血液バッグ、シリンジ、外科用器具、濾過システム、実験器具、培養容器および細胞および組織の再生のための容器、ペプチド、タンパク質、抗体のための支持体である。
これらの物体の表面をコーティングする１つの方法は、国際特許出願番号ＷＯ９６／２４３９２に記載されているプラズマ・コーティング技術であり、後述の製造例により詳細に説明する。本発明の化合物の製造方法は、主に２つの工程からなる。第１の工程は、天然のポリサッカライドの制御されたＮ−脱アセチル化であり、第２の工程は、グルコサミンの１級ヒドロキシ基または遊離アミノ官能基の特異的な硫酸化反応である。
分子量５，０００Ｄa〜５，０００，０００Ｄaの、好ましくは５０，０００〜３００，０００Ｄaの生物および発酵起源のヒアルロン酸画分を、純度９８％以上の、濃度範囲１〜５０ｍg／ｍL、好ましくは５〜２５ｍg／ｍLの水酸化ヒドラジンに溶解する。次いで、この溶液に硫酸ヒドラジンを０．１〜３％、好ましくは１％の重量／体積濃度で加える。
反応は、４０〜９０℃の温度範囲、好ましくは６０℃で、撹拌しながら、所望の程度のＮ−脱アセチル化が達成されるのにかかる時間行う。
以下の表１に、反応の時間数で示した時間に関し、遊離アミノ基の百分率で示した収率を報告する。
0004278716.tif 000005
次いで、極性溶媒、好ましくはエタノールによる沈殿により反応を止める。沈殿を部分的に真空乾燥し、０．１〜１Ｍモル濃度、好ましくは０．５Ｍのヨウ素酸溶液で処理し、最後に５７％（Ｗ／Ｖ）の濃度のヨウ化水素酸で処理する。酢酸ナトリウム（１０％ｗ／ｖ）の溶液を加えることにより、溶液のpＨを５〜７に維持する。
修飾されたポリサッカライドを含む水相を、ジエチルエーテルで繰り返し処理することにより抽出し、次いで黄色の色が完全に消えたら、溶液をエタノールで再び処理する。
形成した沈殿は、４０℃でさらに乾燥した後、１０ｎｇ／ｍL〜４０ｎg／ｍL、好ましくは２５ｎg／ｍLの濃度で水に溶解し、その溶液を水酸化テトラアルキルアンモニウム（ここで４級アンモニウムのアルキル残基は、炭素原子１〜４の鎖からなり、好ましくは水酸化テトラブチルアンモニウムを用いる）で活性化したイオン交換樹脂を含むカラムに貫流させる。
次いで、修飾されたポリサッカライドの４級アンモニウム塩で示される貫流した生成物を凍結乾燥する。
２−Ｎ−硫酸化誘導体の製造：
方法Ａ
部分的にＮ−脱アセチル化されたポリサッカライドの４級アンモニウム塩、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を、無極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−ピロリドン、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）中に、５〜５０ｍg／ｍLの濃度（好ましくは２５ｍg／ｍL）で溶解する。
この有機溶液に、ジメチルホルムアミドスルホトリオキシド（ＤＭＦＡ−ＳＯ3）からなる硫酸化用複合体を、ＤＭＦＡ中、５０〜２００ｍg／ｍLの濃度、好ましくは１００ｍg／ｍLの濃度で溶解することにより得られる別の溶液を加えた。ＳＯ3のモル数で示される使用した複合体の量は、意外にも、Ｎ−脱アセチル化反応によって放出されるアミノ基のモル数と等しいことが分かる。
硫酸化反応は、０〜２０℃の温度、好ましくは４℃で４時間を越えない時間行い、次いで冷却した蒸留水を加えることにより止める。
最初に、部分的に２−Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸をエタノールにより沈殿させた後、再溶解した生成物を蒸留水で透析することにより、反応溶媒を精製する。
最後に、溶液を凍結乾燥し、得られた固体の生成物を化学分析キャラクタリゼーションに付してＮ−硫酸化の程度と平均分子量を決定する（表２）。
0004278716.tif 000006
部分的に２−Ｎ−硫酸化され、６−Ｏ−硫酸化された誘導体の製造：
方法Ｂ
部分的にＮ−脱アセチル化されたポリサッカライドの４級アンモニウム塩、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を、無極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−ピロリドン、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）に、５〜５０ｍg／ｍLの濃度（好ましくは３０ｍg／ｍL）で溶解する。
有機溶液に、ジメチルホルムアミドスルホトリオキシド（ＤＭＦＡ−ＳＯ3）からなる硫酸化用複合体を、ＤＭＦＡ中、５０〜２００ｍg／ｍL、好ましくは１００ｍg／ｍLの濃度で溶解させることにより得られる別の溶液を加えた。ＳＯ3のモル数で示した使用した複合体の量は、意外にも、Ｎ−脱アセチル化反応によって放出されるアミノ基のモル数と等しいことが分かる。
硫酸化反応は、０〜２０℃の温度、好ましくは４℃で４時間行う。ピリジン−スルホトリオキシド複合体をジメチルスルホキシドに、硫酸化試薬のＳＯ3のモル数と−ＣＨ2ＯＨのモル数との間の比が１．１〜１．３になるような量で溶解することにより溶液を調製する。より多い量の試薬は、ポリサッカライド鎖の他のアルコール基（２級）におけるいずれかの置換反応に好都合であり得る。
次いで、少なくともさらに１６時間反応させた後、冷却した蒸留水を加えることにより反応を止める。
修飾されたポリサッカライドの生成に関するその後のすべての工程は、“方法Ａ”に記載されている工程である。
得られた誘導体に対して行った分析キャラクタリゼーションによって、その硫酸化方法が、意外にも、部分的なＮ−脱アセチル化により得られたすべてのアミノ基を置換するだけでなく、ヒアルロン酸のグルコサミン残基の１級アルコール基の完全な置換をももたらすことが確認された（表３）。
0004278716.tif 000007
さらに、１級ヒドロキシル基にしたがってピリジン−ＳＯ3複合体のモル数を変えることにより（０．１〜１のモル比）、“方法Ｂ”は、一連の、部分的に２−Ｎ−硫酸化され且つ部分的に６−Ｏ−硫酸化された誘導体を得ることが可能になる。
生物学的活性
上記のとおりに製造された化合物を、それら化合物の抗凝固活性を決定するようなやりかたで生物学的な見地から特徴付ける。参照生成物として、我々は、国際特許出願Ｎｏ．ＷＰ９５／２５７５１に記載の方法にしたがって得られたヒアルロン酸の硫酸化誘導体を使用した。この誘導体は、使用した硫酸化試薬の量にしたがって、ポリマー鎖の１級および２級ヒドロキシ基が−ＳＯ3−基で置換されている。さらに、未分画ヘパリン（ＵＦヘパリン）をさらなる参照生成物として使用する。未分画ヘパリンの抗凝固薬としての効力は、何十年間もの間広く認識されている。
次に、トロンビン時間（ＴＴ試験）および全血凝固時間（ＷＢＣＴ）を以下の化合物について評価した。
0004278716.tif 000008
血液凝固時間を延長させるＮ−硫酸化誘導体の能力を、凝固計により行うトロンビン時間試験によって測定する。トロンビンを血液試料に加えた後にフィブリノーゲンをフィブリンに変換するのにがかった時間を、出発物質として使用したポリマーの存在下で測定する。その時間が１２０秒を越えると試験の有為性が失われる。凝固時間は、ヒトの血液試料が試験物質の存在下で凝固するのにかかった時間を単純に観察することにより測定する。２時間を越える時間は考慮しない。
試験の結果を以下の表４に報告する。
0004278716.tif 000009
意外にも、ポリサッカライド鎖のグルコサミン残基のアミノ基が関与する化学修飾は、凝固時間に対する著しい効果を導びくことが明らかなようである。同じ結果は、ＨＡの化学構造を劇的に修飾すること、即ちモノマーの単位あたりの利用可能なヒドロキシル（４個）のすべてを同数のスルホン基で置換することによってしか得られない。
得られたデータは、前のＮ−脱アセチル化およびその後のＮ−硫酸化から得られた０．２５の硫酸化の程度は、凝固カスケードの最終部分に関与する因子に特異的に作用するに十分であり、フィブリノーゲンのフィブリン転換の過程を阻害する（抗凝固活性）ことを示している。グルコサミン残基の６位のＯにおける硫黄基の存在は、この活性の能力における決定的な因子ではなさそうである。しかし、２−Ｎ−硫酸化基と共同して、ＡＴＩＩＩとの相互作用によるＸa因子の阻害（抗血栓活性）、並びに血小板の活性化および増加の調節におけるＶＩＩＩa因子（またはｖＷｆ）の阻害に重要な役割を担っているかもしれない。
分析キャラクタリゼーション
本発明において製造および記載した誘導体すべての化学分析的プロファイルを特徴付けた。以下の分析的方法論を使用した。
硫酸化の程度（％硫黄）：富酸素環境下で完全に燃焼させた後、生成物をイオンクロマトグラフィー技術を用いてＨＰＬＣにより分析した。
２−Ｎ−硫酸化の百分率：このパラメータは、生成物のＮ−脱アセチル化の前と後の両方で存在するスルホン基の総数を、Nagasawa（Carbohy.Res.1977,58,pages 47-55）に記載の方法を用いて測定することにより間接的に決定する。２つの値の差は、グルコサミンのアミノ基に結合したＳＯ3−基の量を示す。
Ｎ−脱アセチル化の百分率：このパラメータは、J.Riesenfeld（Analy.Bioch.1990,vol.188,pages 383-389）に記載された方法によって測定する。
平均分子量：このパラメーターは、ＳｈａｄｅｘおよびＢ−８０３およびＢ−８０６カラムのセット、マルチアングルレーザー光スキャンニングモニター（ＭＡＬＬＳ）および屈折率（ＲＩ）を測定するための屈折計を用いて、ＧＰＣにより測定する。
実施例
実施例１
部分的に２−Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸の製造（約５％のＮ−アセチル基が硫酸化された基で置換されている）
雄鶏のとさかより得たＨＡ１．００ｇ（平均分子量１８１，０００Ｄa）を、０．５gの硫酸ヒドラジンとともに５０ｍLのヒドラジン一水和物に溶解する。
溶液を撹拌しながら、反応を６０℃にて８時間継続し、１００ｍLのエタノールを加えて反応を止めた。形成したゼラチン質の沈殿をエタノールで洗浄した後、室温で減圧下に乾燥した。
中間生成物を水５０ｍLと酢酸ナトリウムの１０％溶液２０ｍLからなる混合物に溶解し、最後に、濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液２５ｍLで処理する。撹拌しながら約３０分反応させた後、過剰のヨウ素を５７％のヨウ素水素酸溶液５ｍLで滴定する。この操作の間、反応容器を氷により好ましく冷却し続ける。次いで、濃い褐色の溶液を、シエチルエーテル３０ｍLで少なくとも５回処理して、修飾されたポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後にこれを減圧下で、４０℃の温度にて濃縮して約４０ｍLの体積にした後、４０％Ｗ／Ｖの水酸化テトラブチルアンモニウム溶液で活性化した２０ｍLのイオン交換スルホン酸樹脂を詰めたカラムに貫流させる。
次いで、テトラブチルアンモニウム塩（ＨＡＴＢＡ）の形態の修飾されたポリサッカライドを含む水溶液を、回収して１回の凍結乾燥サイクルに付す。
凍結乾燥したＨＡのＴＢＡ塩１．３０ｇを、ジメチルホルムアミド４５ｍLに溶解し、得られた溶液に、５０ｍg／ｍLの濃度でＮ−Ｎジメチルホルムアミドスルホトリオキシドの複合体の溶液０．６ｍLを加える。穏やかに撹拌しながら４℃で反応を５時間継続した後、冷却した蒸留水４５ｍLを加えることにより反応を止める。２ＭのＮaＯＨで溶液を中和して溶液のpＨを７．５〜８にし、次いで孔サイズＧ２のゲーチフィルターで濾過し、２５０ｍLのエタノールで処理する。
形成した沈殿を少なくとも１５０ｍLのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間真空乾燥した後、蒸留水５０ｍLに再溶解し、次いで水５０ｍLに対して透析する。
生成物を凍結乾燥した後、キャラクタリゼーションを行い、Ｎ−硫酸化されたアミノ基の百分率と生成物の平均分子量を決定する。
凍結乾燥品の重量：０．７２ｇ；収率８５％
ＳＯ3−のモル数／ＨＡのモル数（モノマーの単位）：０．０４５
遊離−ＮＨ2基のモル数／ＨＡのモル数：０．０５２
脱Ｎ−アセチル化の％：５．２％
再Ｎ−硫酸化の％：４．５％
Ｎ−硫酸化反応からの収率：８７％
平均分子量：１７４，０００Ｄa
実施例２
部分的に２−Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸の製造（約２５％のＮ−アセチル基が硫酸化された基で置換されている）
雄鶏のとさかより得たＨＡ１．２ｇ（平均分子量１８１，０００Ｄa）を、０．６gの硫酸ヒドラジンとともに６０ｍLのヒドラジン一水和物に溶解する。
溶液を撹拌しながら、反応を６０℃にて２４時間継続した後、１２０ｍLのエタノールを加えて反応を止めた。形成したゼラチン質の沈殿をエタノールで洗浄した後、室温で減圧下に乾燥した。
中間生成物を水６０ｍLと酢酸ナトリウムの１０％溶液２５ｍLからなる混合物に溶解し、最後に、濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液３０ｍLで処理する。撹拌を続けながら約３０分反応させた後、過剰のヨウ素を５７％のヨウ化水素酸溶液６ｍLで滴定する。この操作の間、反応容器を氷により好ましく冷却し続ける。
次いで、濃い褐色の溶液を、シエチルエーテル４０ｍLで少なくとも５回処理して、修飾されたポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後にこれを減圧下で、４０℃の温度にて濃縮して約５０ｍLの体積した後、４０％Ｗ／Ｖの水酸化テトラブチルアンモニウム溶液で活性化した２５ｍLのスルホン酸樹脂を詰めたカラムに貫流させる。
次いで、テトラブチルアンモニウム塩（ＨＡＴＢＡ）の形態の修飾されたポリサッカライドを含む水溶液を、回収して１回の凍結乾燥サイクルに付す。
凍結乾燥したＨＡのＴＢＡ塩１．６５ｇを、ジメチルホルムアミド５５ｍLに溶解し、得られた溶液に、５０ｍg／ｍLの濃度のＮ−Ｎジメチルホルムアミドスルホトリオキシドの複合体の溶液３．０ｍLを加える。穏やかに撹拌しながら４℃で反応を６時間継続した後、冷却した蒸留水５５ｍLを加えることにより反応を止める。２ＭのＮaＯＨで溶液を中和して溶液のpＨを７．５から８の間にした後、孔サイズＧ２のゲーチフィルターで濾過し、３００ｍLのエタノールで処理する。
形成した沈殿を少なくとも１５０ｍLのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間真空乾燥した後、蒸留水５０ｍLに再溶解し、次いで水５０ｍLに対して透析する。
生成物を凍結乾燥した後、キャラクタリゼーションを行い、Ｎ−硫酸化されたアミノ基の百分率と生成物の平均分子量を決定する。
凍結乾燥品の重量：０．９８ｇ；収率８９％
ＳＯ3−のモル数／ＨＡのモル数（モノマーの単位）：０．２３
遊離−ＮＨ2基のモル数／ＨＡのモル数：０．２４
脱Ｎ−アセチル化の％：２４％
再Ｎ−硫酸化の％：２３％
Ｎ−硫酸化反応からの収率：９６％
平均分子量：１６１，０００Ｄa
実施例３
部分的に２−Ｎ−硫酸化され（約２５％のＮ−アセチル基が硫酸化された基で置換されている）且つ６−Ｏ−硫酸化されているヒアルロン酸の製造
発酵により得たＨＡ５．０ｇ（平均分子量１９５，０００Ｄa）を、２．５gの硫酸ヒドラジンとともに２５０ｍLのヒドラジン一水和物に溶解する。
撹拌しながら、反応を６０℃にて２４時間行った後、５００ｍLのエタノールを加えて反応を止める。形成したゼラチン質の沈殿をエタノールで洗浄した後、室温で減圧下に乾燥した。
中間生成物を、水２５０ｍLと酢酸ナトリウムの１０％溶液１０５ｍLからなる混合物に溶解し、最後に、濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液１２５ｍLで処理する。撹拌しながら約３０分反応させた後、過剰のヨウ素を５７％のヨウ化水素酸溶液２５ｍLで滴定する。この操作の間、反応容器を氷により好ましく冷却し続ける。
次いで、濃い褐色の溶液を、シエチルエーテル１５０ｍLで少なくとも５回処理し、修飾されたポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後に、減圧下で、４０℃の温度にて濃縮して約２００ｍLの体積にした後、４０％Ｗ／Ｖの水酸化テトラブチルアンモニウム溶液で活性化した１００ｍLのイオン交換スルホン酸樹脂を詰めたカラムに貫流させる。
次いで、テトラブチルアンモニウム塩（ＨＡＴＢＡ）の形態の修飾されたポリサッカライドを含む水溶液を、回収して１回の凍結乾燥サイクルに付す。
凍結乾燥したＨＡのＴＢＡ塩６．０ｇを、ジメチルホルムアミド３００ｍLに溶解し、得られた溶液を、５０ｍg／ｍLの濃度のＮ−Ｎジメチルホルムアミドスルホトリオキシドの複合体の溶液１３ｍLを加える。穏やかな撹拌を続けながら４℃で反応を６時間続ける。
ジメチルスルホキシドに５０ｍg／ｍLの濃度に溶解したピリジンスルホトリオキシドの複合体４０ｍLからなる別の溶液を反応混合物に加える。
約１６時間後、冷却した蒸留水２５０ｍLを加え、溶液を２Ｍ ＮaＯＨでpＨ８に中和したら、それを孔サイズＧ３のゲーチフィルターで濾過し、１２５０ｍLのエタノールで処理する。
形成した沈殿を少なくとも５００ｍLのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間真空乾燥した後、蒸留水２５０ｍLに再溶解し、次いで水５０ｍLに対して透析する。
生成物を凍結乾燥した後、キャラクタリゼーションを行い、Ｎ−硫酸化されたアミノ基の百分率と６−Ｏ−硫酸化の程度および平均分子量を決定する。
凍結乾燥品の重量：４．１２ｇ；収率８２％
ＳＯ3−のモル数／ＨＡのモル数（モノマーの単位）：１．２４
遊離−ＮＨ2基のモル数／ＨＡのモル数：０．２６
脱Ｎ−アセチル化の％：２６％
再Ｎ−硫酸化の％：２４％
Ｎ−硫酸化反応からの収率：１００％
平均分子量：１７０，０００Ｄa
実施例４
部分的にＮ−硫酸化され且つＯ−硫酸化されたヒアルロン酸のベンジルエステルの製造
実施例３で得た誘導体２．００ｇを蒸留水１００ｍLに溶解し、その溶液を、予め水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ＋型）で活性化した４０ｍLのイオン交換樹脂を詰めたガラスカラムに貫流させる。溶出液を凍結乾燥し、生成物３．３gを得る。
生成物をＮ−メチルピロリドン１３０ｍLおよび水１．３ｍLからなる混合物に溶解し、４℃にて臭化ベンジル０．２９ｍLと反応させる。溶液を撹拌し、光源から離して、２８℃にて４８時間反応させた後、酢酸エチル３００ｍLを加える。
主に修飾されたポリサッカライドからなる形成した沈殿を、アセトン１００ｍLで洗浄し、次いで室温で真空乾燥した後、塩化ナトリウムの１０％ｗ／ｖ溶液１００ｍLで処理する。
塩水処理の終わりで（約１時間後）、生成物を１５０ｍLの水／アセトン２０：８０で、そして最後にアセトン１００ｍLで洗浄する。
３０℃で４８時間乾燥した後、０．９２g（収率８０％）を得る。
キャラクタリゼーション
％エステル化          ９６％
実施例５
部分的にＮ−硫酸化され且つＯ−硫酸化された１０％自己架橋ヒアルロン酸の製造
実施例３で得た誘導体２．００ｇを蒸留水１００ｍLに溶解し、その溶液を、予め水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ＋型）で活性化した４０ｍLのイオン交換樹脂を詰めたガラスカラムに貫流させる。溶出液を凍結乾燥した後、生成物３．３gを得る。
生成物をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）１６５ｍLおよび水０．８ｍLからなる混合物に溶解し、次いで２０５ｍgのヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジンをＮＭＰ８．２ｍL中に溶解することにより得られた溶液と反応させる。-２０℃にて１８時間反応させた後、１６５ｍLの３％酢酸アンモニウム水溶液を加える。
混合物を約４時間終始撹拌した後、エタノール６５０ｍLで処理する。形成した沈殿を濾過により分離し、エタノールで洗浄した後２４時間真空乾燥する。
次いで、生成物を、イオン交換に都合良いように６０ｍLの３％塩化ナトリウム溶液で処理し、最後に１８０ｍLのエタノールを溶液に加えることにより再沈殿させる。上清を除いた後、生成物を５０ｍLのエタノールで少なくとも３回洗浄し、次いで１００ｍLのアセトンで処理した後、最後に３０℃にて４８時間乾燥させる。
硫酸化され部分的に自己架橋した誘導体０．９７ｇが得られる。
実施例６
部分的にＮ−硫酸化され且つＯ−硫酸化されたヒアルロン酸のベンジルエステルのフィルムの製造
部分的にＮ−硫酸化され且つＯ−硫酸化されたヒアルロン酸のベンジルエステルの溶液を、ジメチルスルホキシド中で１８０ｍg／ｍLの濃度に調製する。
溶液の薄い層を、ガラスプレート上に展開する：溶液の層の厚さは、最終のフィルムの厚さの１０倍以上でなければならない。ガラスプレートを、エステルを溶解せずにジメチルスルホキシドを吸収するエタノール中で浸漬すると、エステルが固化する。フィルムをガラスプレートからはがし、エタノール、水で繰り返し洗浄した後、エタノールで再び洗浄ずる。
得られたフィルムを加圧下、３０℃にて４８時間乾燥する。
実施例７
部分的に２−Ｎ−硫酸化（２５％）され且つ６−Ｏ−硫酸化されたヒアルロン酸誘導体の銀塩の製造
実施例２にしたがって得られた化合物０．５０ｇを蒸留水２５ｍLに溶解し、得られた溶液を、Ｈ+型の強力なイオン交換樹脂１６ｃｍ3を詰めたカラムに貫流させる。次いで、溶出液を回収して凍結乾燥する。凍結乾燥により得られた酸の形態の中間生成物を、光から遠ざけて撹拌しながら、２０ｍLのＡgＮＯ3の０．５Ｍ溶液で６０分間処理する。
濾過により液相を除いたら、生成物を１５０ｍLの蒸留水、次いで５０ｍLの無水アルコールで十分に洗浄する。硫酸化されたヒアルロン酸誘導体を真空乾燥した後、４０℃で銀塩０．６４９ｇが得られる（収率９５％）。
実施例８
部分的に２−硫酸化（２５％）され且つ６−Ｏ−硫酸化されたヒアルロン酸によるポリウレタン製心臓弁のコーティング
ポリウレタン製の心臓弁を高周波発生装置で発生させた酸素プラズマで処理する。
実施条件は以下のとおりである：反応チャンバー内の圧力を１００mtorrに設定し、プラズマ発生装置の強度は５０Ｗ、酸素の流速を２０ｃｍ3／分に設定し、処理時間は３０秒である。
次いで、処理したデバイスを、分子量５００，０００のポリウレタンアミン０．６５％溶液２５０ｍLに浸漬し、９０分間そこに漬けておく。蒸留水でよく洗浄した後、この材料を、実施例２に記載のようにして得られた部分的に２−硫酸化され且つ６−Ｏ−硫酸化された誘導体２．５gを溶解することにより得られた水溶液２５０ｍLと接触させる。さらに、以下の物質を、修飾されたポリサッカライドのカルボキシ基に関して化学量論的な量、即ちＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）０．７６ｇおよび３−ジメチルアミノプロピル−１−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）１．２３gで加える。反応は室温で約１６時間行う。
最後に、硫酸化されたヒアルロン酸誘導体でコーティングされたデバイスを蒸留水でよく洗浄した後、風乾する。
記載した発明は、これらの方法を様々なやり方に修飾することができることが明らかである。そのような修飾は、本発明の精神と目的から逸脱するものと解されず、そのような修飾のいずれもが、以下の請求の範囲の範囲内にあることは当業者には明らかであろう。