(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（４−ヒドロキシブチレート）ホモポリマー、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−コ−２−ヒドロキシブチレート）コポリマー、および、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）コポリマーからなる群から選択されるポリヒドロキシアルカノエートを含む、生体適合性の多孔性医療用インプラントであって、その分解速度が前記インプラントの表面での前記ポリヒドロキシアルカノエートの多孔性により制御され、且つガスクロマトグラフィで測定される質量損失がインビボで６週の期間に亘って５％より大きいか、または前記ポリヒドロキシアルカノエートのゲルパーミエーションクロマトグラフィで測定される平均分子量がインビボで１０週の期間に亘って２０％から５０％減少する前記インプラント。
【請求項２】
前記インプラントが、ロッド、骨のねじ釘、ピン、外科手術の縫合、ステント、組織工学のデバイス、薬剤送達デバイス、および、パッチからなる群から選択される、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
組織工学での使用のための、請求項１または２に記載のインプラント。
【請求項４】
前記パッチが、ヘルニアのパッチまたは心膜のパッチである、請求項２に記載のインプラント。
【請求項５】
前記インプラントが、多孔性の創傷治癒デバイスである、請求項１に記載のインプラント。
【請求項６】
その分解速度が前記インプラントの表面での前記ポリヒドロキシアルカノエートの多孔性により制御され、且つガスクロマトグラフィで測定される質量損失がインビボで６週の期間に亘って５％より大きいか、または前記ポリヒドロキシアルカノエートのゲルパーミエーションクロマトグラフィで測定される平均分子量がインビボで１０週の期間に亘って２０％から５０％減少する多孔性医療用インプラントを製造するための、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）ホモポリマー、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−コ−２−ヒドロキシブチレート）コポリマー、および、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）コポリマーからなる群から選択されるポリヒドロキシアルカノエートの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的にポリヒドロキシアルカノエートポリマーおよびその分解速度を変化させる方法（特に、このプロセスを促進する方法）および特に医療用に適する新規な生分解性ポリヒドロキシアルカノエートに関する。
【０００２】
（発明の背景）
医療用分野において、インビボで数週間または２〜３か月で各々のモノマーに分解する多くの分解性ポリマーが開発された。これらの合成分解性ポリマーの有効性にもかかわらず、利用可能な選択肢の範囲をさらに拡大し得る分解性ポリマーを開発する必要が依然としてある。特に、より広い範囲の機械的特性を提供する分解性ポリマーを開発する必要がある。
【０００３】
ポリヒドロキシアルカノエートは、天然の、熱可塑性ポリエステルであり、消費者包装、使い捨てオムツのライニングおよびごみ袋、食品および医療品を含む、莫大に多様な適用分野での使用のために、伝統的なポリマー技術によって処理され得る。初期の努力は、成形する適用（特に、消費者包装の品目（例えば、ビン、化粧用容器、ペン、ゴルフのティーなど））に焦点が当てられた。米国特許第４，８２６，４９３号および同第４，８８０，５９２号は、ＰＨＢおよびＰＨＢＶフィルムの生産およびオムツのバックシートとしての使用を記載する。米国特許第５，２９２，８６０号は、ＰＨＡコポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）の生産ならびにこれらのポリマーの使用（オムツのバックシートフィルムおよび他の使い捨て品目を作製するため）を記載する。オムツのバックシート材料および他の材料（ＰＨＢＶ以外のＰＨＢコポリマーから生分解性またはコンポスト化可能な個人衛生品を生産するため）は、ＰＣＴ  ＷＯ  ９５／２０６１４、ＷＯ  ９５／２０６２１、ＷＯ  ９５／２３２５０、ＷＯ  ９５／２０６１５、ＷＯ  ９５／３３８７４、ＵＳ  ５，５０２，１１６、ＵＳ  ５，５３６，５６４、ＵＳ  ５，４８９，４７０およびＷＯ  ９６／０８５３５に記載される。
【０００４】
ＰＨＡの最も役に立つ性質のうちの１つ（これは石油化学から誘導されたポリマーとこれらとを容易に区別する）は、その生分解性である。土壌中のバクテリアにより天然に生産される場合、ＰＨＡは、土壌、堆肥、または海の堆積物中のこれらと同じバクテリアに引き続き曝露されると分解される。ＰＨＡの生分解性は、環境中の微生物の活性および品目の表面積などの多くの因子に依存する。加えて、温度、ｐＨ、分子量および結晶化度が重要な因子である。生分解は、微生物が可塑物の表面上で増殖し始め、ポリマーをヒドロキシ酸モノマーユニットに分解する酵素を分泌するときに始まる。それから、ヒドロキシ酸は、微生物によって摂取され、増殖のための炭素源として使用される。好気的な環境では、このポリマーは二酸化炭素および水に分解され、嫌気的な環境では分解生成物は二酸化炭素およびメタンである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｆ．およびＰｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、２６、３８−４４（１９９６））。環境中におけるＰＨＡの分解のメカニズムは、酵素的な攻撃を経由すると広く考えられており、比較的速いものであり得るが、一方、インビボでの分解のメカニズムは、一般的に、ポリマーのエステル結合上を単純に加水分解的に攻撃することを含むことが理解される。これは、媒介されるタンパク質があり得るかまたはあり得ない。ポリグリコール酸およびポリ乳酸のような２−ヒドロキシ酸を含むポリマーとは異なり、ポリヒドロキシアルカノエートは、通常３−ヒドロキシ酸を、特定の場合では、４、５および６−ヒドロキシ酸をさえ含む。これらのヒドロキシ酸から誘導されるエステル結合は、一般的に、２−ヒドロキシ酸から誘導されたエステル結合よりも加水分解を受けにくい。
【０００５】
研究者たちは、非常に多種類のＰＨＡの生産方法を開発し、約１００の異なるモノマーが制御された発酵条件下でポリマーに取り込まれた（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．およびＶａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｌｅｔｔ．、１２８：２１９−２２８（１９９５））。現在２つだけ市販のＰＨＡ組成物、ポリ−（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）およびポリ−（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート（ＰＨＢＶ）がある。その大きな組成上の多様性のために、物理的性質の範囲でＰＨＡは、作製され得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｆ．およびＰｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、２６、３８−４４（１９９６））。市販のＰＨＡ、ＰＨＢおよびＰＨＢＶは、ＰＨＡで得られ得る性質一式のうちの小さな成分だけを示す。例えば、ＰＨＢおよびＰＨＢＶの破断時伸び率は、約４〜４２％にわたるが、ポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）に対する同じ性質は、約１０００％である（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９４）１６：９９−１０４）。同様に、ＰＨＢおよびＰＨＢＶに対するヤング率および引っ張り強さの値は、それぞれ３．５〜０．５ＧＰａおよび４０〜１６ＭＰａ（２５モル％に増加するＨＶ量に対して）であるのに比較して、Ｐ４ＨＢに対してそれぞれ、１４９ＭＰａおよび１０４ＭＰａである（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９４）１６：９９−１０４）。
【０００６】
合成汎用（ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ）樹脂に対する生分解性代替物として商業用途を見つけることに加えて、ＰＨＢおよびＰＨＢＶは、医用の応用に使用するために広範に研究された。これらの研究は、制御放出における潜在性を有する使用（Ｋｏｏｓｈａ，Ｆ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．６：１１７−１３０（１９８９）およびＰｏｕｔｏｎ，Ｃ．Ｗ．およびＡｋｈｔａｒ，Ｓ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、１８：１３３−１６２（１９９６）によって総説が書かれた）から、錠剤の処方物、外科的縫合、傷用の包帯、潤滑パウダー、血管、組織の骨格、管状身体部位を結合するための外科的インプラント、骨折固定板、および他の整形的使用（Ｍｅｔａｂｏｌｉｘにより、ＷＯ  ９８／５１８１２に記載される）における使用までに及ぶ。おそらく、最も進歩した医療用開発は、損傷した軟部組織において、組織分離および組織再生の刺激のための多孔性生物再吸収可撓性シートを調製するために、ＰＨＢおよびＰＨＢＶを使用することである（欧州特許出願７５４  ４６７Ａｌ（Ｂｏｗａｌｄ，Ｓ．およびＪｏｈａｎｓｓｏｎ−Ｒｕｄｅｎ，Ｇ．１９８８年６月２６日出願）ならびにＥＰ  ０３４９５０５  Ａ２に記載される）。最近の報告はまた、持続細胞増殖へのＰＨＢＶの使用を記載した（Ｒｉｖａｒｄ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｍａｔ．、６：６５−６８（１９９５））。
【０００７】
生体適合性に加えて、インプラントされた医療用デバイスが、第一の機能が満たされた後に分解すべきであることがしばしば望まれる。ＰＨＢおよびＰＨＢＶ（現在まで医療用インプラントとしてＰＨＡだけが試験される）は、非常に長いインビボ分解期間（ＰＨＢに対して１年より長い）を示した（Ｄｕｖｅｒｎｏｙ，Ｏ．，Ｍａｌｍら、Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇｅｏｎ（１９９５）４３：２７１−７４、Ｍａｌｍら、Ｃ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．（１９９２）１０４：６００−６０７）。多くの適用に対して、この非常に長い分解時間は、創傷治療部位のポリマーの残留が患者に慢性炎症反応をもたらし得るので、望ましくない。動脈組織を再生するために使用される、ゆっくりと分解するＰＨＢパッチは、長期間（２年より長い）マクロファージ応答を誘発することが見出された（Ｍａｌｍら、Ｅｕｒ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１９９４、２６：２９８−３０８）。マクロファージはＰＨＢインプラントの分解に関与することが確認された。この長期間のマクロファージ応答は、インプラントに由来する、持続的なゆっくりとした分解をする粒子性材料の存在を示すようである。確かに、心膜の修復に使用されるＰＨＢパッチは、１２か月の埋め込みの後に普通の光学顕微鏡では見えなかったが、小さな残渣の粒子性材料は、偏光顕微鏡で観測された（Ｍａｌｍら、Ｃ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１９９２、２６：９−１４）。この粒子性材料がインプラントした部位に局在化したままであるか、または身体中を移動し得て、不測の合併症を引き起こすかは、明らかではない。生物学的運命（すなわちこの粒子性材料の医学的影響）は、長期間の研究なしでは予測され得ない。ゆっくりと分解するＰＨＡに付随する潜在的な問題を最小化するために、より速いインビボ分解速度を有する、再吸収可能な材料を利用することは利点がある。
【０００８】
医療の応用におけるその他のＰＨＡポリマーの生体適合性またはインビボ分解を記載するただ１つの報告がある（ＷＯ  ９８／５１８１２）。Ｗｉｔｈｏｌｔ，Ｂ．およびＬａｇｅｖｅｅｎ，Ｒ．Ｇ．の米国特許第５，３３４，６９８号は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ細胞から単離された光学活性ポリエステルで生産された医療用品を記載するが、製造または生体適合性試験についての実施例または議論は記載されず、インビボの医学的使用に適する純粋な形態でポリマーを得るための方法は与えられない。これらのポリマーの作製に適するバクテリアはまた、内毒素および他の炎症媒介物を作成し得るので、このポリマーをこれらの混入物を除去するために処理することが重要である。
【０００９】
多くの応用に対して、ＰＨＡ生分解の速度は、必要とされる製品の寿命に十分適する。しかし、特定の場合では、ポリマーが環境中で分解する速度を超えてより制御を発揮し得ることが望ましい。このような制御は、このクラスのポリマーの応用範囲を広げる。例えば、ＰＨＡフィルムは、マルチフィルムとして使用されるために適した機械的特性を有し得るが、この応用に対して最も最適な分解速度を有さない。従って、環境中でポリマーの分解速度を制御し得る能力は、明確な利点である。
【００１０】
従って、ポリヒドロキシアルカノエートは、医学的応用に潜在的に役立つ幅広い範囲の機械的特性を提供する一方、特にインビボで再吸収し得るポリマーとしての使用は、そのゆっくりとした加水分解によって制限された。従って、ポリヒドロキシアルカノエートの分解速度を制御する方法を開発することが望まれる。
【００１１】
それゆえ、ポリヒドロキシアルカノエートの分解速度を制御する方法を与えることが本発明の目的である。
【００１２】
環境中および／またはインビボでより容易に分解するポリヒドロキシアルカノエートを含むまたはこれらから誘導される新規な組成物を与えることが、本発明のさらなる目的である。
【００１３】
これらの組成物から製品およびデバイスを製造するための方法を与えることが、本発明の別の目的である。
【００１４】
（発明の要旨）
制御された分解速度を有する生体適合性ポリヒドロキシアルカノエート組成物が開発された。１つの実施態様において、ポリヒドロキシアルカノエートは、分解速度を変化させるための添加剤を含む。別の実施態様において、ポリヒドロキシアルカノエートは、その分解速度を変化させるために、モノマーの混合物から形成され、あるいはその骨格にペンダント基または修飾を含む。さらに別の実施態様において、ポリヒドロキシアルカノエートは、化学的に改変される。多孔性または露出される表面積を増加するデバイスを生産する方法は、分解性を変えるために使用され得る。例えば、実施例によって示されるように、多孔性のポリヒドロキシアルカノエートは、細孔、空隙、または間質性の間隔を作成する方法（例えば、乳濁液またはスプレー乾燥技術）またはポリマー内で浸出可能または凍結乾燥可能な粒子を組み入れる方法を使用して作成され得る。実施例は、泡状体、コーティング、メッシュ、および微粒子を含むポリ（４ＨＢ）組成物を記載する。実施例に示されるように、これらのポリヒドロキシアルカノエート組成物は、極めて好ましい機械的特性を有し、生体適合性であり、生理学的条件下で所望される時間の枠内で分解する。これらのポリヒドロキシアルカノエート材料は、現在入手可能であるものよりも幅広い範囲のポリヒドロキシアルカノエート分解速度を与える。
【００１５】
これらの材料を処置する方法（特に、治療的、予防的、または診断的応用）、あるいはインプラントされ得るまたは注入され得るデバイス内にこれらの材料を処置する方法がまた、記載される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．ＰＨＡ組成物）
（ポリマー組成物）
本明細書で使用される場合は、「ＰＨＡ材料」は、１つ以上のユニット（例ええば、１０ユニットと１００，０００ユニットとの間、好ましくは１００ユニットと３０，０００ユニットとの間）の以下の式Ｉのユニットを含み：
−ＯＣＲ1Ｒ2（ＣＲ3Ｒ4）nＣＯ−；
ここで、ｎは整数（例えば、１と１５との間、好ましい実施態様においては、１と４との間）であり；そして
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は独立して、炭化水素基（長鎖炭化水素基を含む）；ハロ−およびヒドロキシ−置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素−置換基；酸素−置換基；および／または水素原子であり得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、式−（ＣＲ3Ｒ4）n−は、以下の式を含むものとして定義される：
−ＣＲ3Ｒ4−（ｎ＝１のとき）；
−ＣＲ3Ｒ4ＣＲ3’Ｒ4’−（ｎ＝２のとき）；および
−ＣＲ3Ｒ4ＣＲ3’Ｒ4’ＣＲ3’’Ｒ4’’−（ｎ＝３のとき）；
ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ3’、Ｒ4’、Ｒ3’’、およびＲ4’’は独立して、炭化水素基（長鎖炭化水素基を含む）；ハロ−およびヒドロキシ−置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素−置換基；酸素−置換基；および／または水素原子であり得る。従って、式Ｉは３−ヒドロキシ酸（ｎ＝１）、４−ヒドロキシ酸（ｎ＝２）、および５−ヒドロキシ酸（ｎ＝３）から誘導されたユニットを含む。
【００１８】
これらのユニットは、ホモポリマーにおいて同一であり得、あるいは、例えば、コポリマーまたはターポリマーにおいては、より異なるユニットであり得る。これらのポリマーは典型的には、分子量が３００ダルトンを越え（例えば、３００ダルトンと１０7ダルトンとの間）、そして好ましい実施態様においては１０，０００〜１０，０００，０００ダルトンである。
【００１９】
ＰＨＡ材料は、他の分子（例えば、生理活性化合物および検出可能な化合物、界面活性剤、他の分解性ポリマーまたは非分解性ポリマー）、ならびにＰＨＡの機械的性質を改変するのに使用される材料（例えば、可塑剤、充填剤、核生成剤（ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、着色剤、安定剤、調節剤、およびバインダー）を含み得るか、これらを含むために改変され得る。
【００２０】
本明細書中に記載されるように改変され得、または処方され得る代表的なＰＨＡは、Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．およびＶａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｌｅｔｔ．，１２８：２１９−２２８（１９９５）に記載される。
【００２１】
ＰＨＢおよびＰ４ＨＢは、非常に異なる物理的特性を有する。４−ヒドロキシブチレートを含むＰＨＡコポリマーの領域は公知であり得るか、またはＰＨＢの特性とＰ４ＨＢの特性との中間の特性の領域を用いて調製され得るかのいずれかである（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９４）１６：９９−１０４）。しかしながら、Ｐ４ＨＢおよびそのコポリマーの生物医学的用途、生体適合性試験およびインビボ分解は報告されていない。４ＨＢおよび３ＨＢのＰＨＡコポリマーは、組成が０〜１００％４ＨＢに変化するものは、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｄｏｉ，Ｙ．およびＳｃａｎｄｏｌａ，Ｍ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９２）２５：４２３７−４２３１）で生産されており、そして６４〜１００％４ＨＢに変化するものは、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓにおいて生産されている（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．およびＤｏｉ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９４）１６：９９−１０４）。しかしながら、これらのポリマーは、組換えＥ．ｃｏｌｉ中で生産された分子量（５×１０5ｇ／ｍｏｌより大きい、ＧＰＣ）と比較して、適切な分子量（１×１０5〜５×１０5ｇ／ｍｏｌ、ＧＰＣによる）を有する。
【００２２】
ＰＨＡ生体高分子は、それらのペンダント（ｐｅｎｄａｎｔ）基の長さ、および個々の生合成経路（図１）に従って大きく３つの群に分割され得る。短いペンダント基を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、Ｒ−３−ヒドロキシブチル酸（Ｒ−３ＨＢ）ユニットのホモポリマー）は、高い結晶性の熱可塑材料であり、そして最も長い間公知である（Ｌｅｍｏｉｇｎｅ，Ｍ．およびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ，Ｎ．，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ，５：５２７−５３６（１９２５））。ＰＨＡの第２の群は、かなり長いペンダント基ヒドロキシ酸ユニットとランダムに重合した短いＲ−３ＨＢユニットを含み、７０年代初頭に初めて報告された（Ｗａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｌ．およびＲｏｈｗｅｄｄｅｒ，Ｗ．Ｋ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８：５７６−５７９（１９７４））。これら、より長いペンダント基ヒドロキシ酸ユニットを有するＲ−３ＨＢのコポリマーを特異的に生産する多数の微生物もまた、公知であり、そしてこの第２の群に属する（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．およびＷｉｅｓｅ，Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７：６９１−６９７（１９９２））。８０年代初頭、オランダの研究グループは、ＰＨＡの第３の群を確認した。これは圧倒的に長いペンダント基ヒドロキシ酸を含んでいた（Ｄｅ  Ｓｍｅｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：８７０−８７８（１９８３））。
【００２３】
ＰＨＡポリマーは、細菌の乾燥細胞重量の９０％までを構成し得、そして細菌の細胞の内側で顆粒を分散させるものとして発見されている。これらＰＨＡ顆粒が栄養制限に応答して蓄積し、そして炭素およびエネルギー貯蔵物質として供する。微生物は明確な経路を使用して、各群のこれらのポリマーを生産する。これらの経路の１つによって、短いペンダント基ポリヒドロキシアルカノエート（ＳＰＧＰＨＡ）が導かれ、この経路は３つの酵素、すなわちチオラーゼ、リダクターゼ、およびＰＨＢシンターゼ（時折、ポリメラーゼと呼ばれる）を含む。この経路を使用し、２分子のアセチル−補酵素Ａの縮合によりアセトアセチル−補酵素Ａを得、続いてこの中間体の還元により、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａを得、そして続く重合によって、ホモポリマーＰＨＢは合成される（図２Ａ）。この経路における最後の酵素、シンターゼは、Ｃ3〜Ｃ5モノマー性ユニット（Ｒ−４−ヒドロキシ酸ユニットおよびＲ−５−ヒドロキシ酸ユニット含む）を収容し得る基質特異性を有する。この生合成経路は、例えば細菌、Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中で見出される。ＰＨＡの第３の群、長いペンダント基ポリヒドロキシアルカノエート（ＬＰＧＰＨＡ）を生産するために使用される生合成経路は、まだ部分的に不明であるが、現在、次のように考えられる。ＬＰＧＰＨＡを導くモノマー性ヒドロキシアシルユニットが、脂肪酸のβ（ｂ）酸化および脂肪酸経路によって誘導される（図２Ｂ）。次いで、これらの経路から得られた、Ｒ−３−ヒドロキシアシル−補酵素基質は、Ｃ６〜Ｃ１４の範囲の大きなモノマー性ユニットを好む基質特異性を有するＰＨＡシンターゼ（時折、ポリメラーゼと呼ばれる）によって重合される。長いペンダント基ＰＨＡは、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄによって生産される。
【００２４】
短いＲ−３ＨＢユニットおよびこれより長いペンダント基モノマーの両方を含むＰＨＡの第２の群は、恐らく、図２Ａおよび図２Ｂに示される両方の経路を利用して、ヒドロキシ酸モノマーを提供する。次いで後者が、これらのユニットを受容することが可能なＰＨＡシンターゼによって重合される。
【００２５】
結局、約１００個の異なるタイプのヒドロキシ酸が、醗酵方法によってＰＨＡ中に取り込まれている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．およびＶａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｌｅｔｔ．，１２８：２１９−２２８（１９９５））。特に、これらは官能基化されたペンダント基（例えば、エステル、二重結合、アルコキシ、芳香族、ハロゲンおよびヒドロキシ基）を有するＰＨＡを含む。
【００２６】
医療用途のための好ましいポリヒドロキシアルカノエートは、Ｐ４ＨＢである。Ｐ４ＨＢは、生体適合性であり、再吸収性であり、加工可能（ｐｒｏｃｅｓｓａｂｌｅ）であり、強固かつ延性を有する。破損強度（ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の維持は、縫合材料、およびステープル（ｓｔａｐｌｉｎｇ）材料、特に、再吸収性材料のための非常に重要なもう一つのパラメータである。再吸収性の材料がインビボで分解されるとき、この分解の結果として、これらの物理的および化学的特性は変化する。例えば、再吸収性縫糸は、その破損強度、すなわち組織を固定する能力の大半を、その完全な再吸収にかかる時間よりも速く失う。例えば、ＰＧＡ縫糸は６週間以前には完全には再吸収されず、インビボ３週間でそれらの強度の大半を失う（Ｖｅｔ  Ｓｕｒｇ２１；１９２：３５５−６１）。この機械的な強度の損失は、ポリマーの分子量の減少の結果である。多くのパラメータがインビボでの再吸収速度および縫糸の破損強度に影響を与える（例えば、組織のタイプ、機械的な応力、感染の存在など）ことに注目することが重要である。
【００２７】
実施例は、インビボでのＰ４ＨＢの分解速度が、他のＰＨＡと比較して速いが、再吸収速度は多くの再吸収縫糸として使用される材料よりも遅いことを示す。さらに、表７に示されるように、Ｐ４ＨＢ移植は、再吸収のプロセス中にそれらの分子量を維持する。分子量の維持は、機械的特性すなわち傷の閉鎖材料として使用されるＰＨＡの破損強度の維持に有利であることが期待される。これらの優れた機械的特性、高い分子量の維持、加工能力（ｐｒｏｃｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）、生体適合性能および再吸収性能によって、Ｐ４ＨＢおよびＰ４ＨＢ−ｃｏ−ＨＡは、特に、本明細書中で改変されてそれらの分解速度を増加させるならば、再吸収可能な傷の閉合材料（例えば、縫合材料およびステープル材料）として有用である。
【００２８】
（ＰＨＡの源）
改変されてＰＨＡの分解速度を変換し得るＰＨＡ材料は、生物学的な源、酵素的な源、または化学的な源のいずれかから誘導され得る。生物学的な源は、微生物または高等生物（例えば、植物）であり得、そして遺伝子工学によって誘導され得る。
【００２９】
１９８０年代中期の間、いくつかの研究グループは、ＰＨＡの合成に用い得る遺伝子および遺伝子生成物を活発に同定および単離した。これらの努力が、微生物および植物の両方でのＰＨＡ生産のための遺伝子組換系、ならびにＰＨＡ合成のための酵素的な方法の発展をもたらした。このような経路はさらに利用可能なＰＨＡの種類を増加させ得た。これらの進歩は、以下に総説されている：Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｆ．およびＰｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６，３８−４４（１９９６）、ならびに、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｆ．およびＰｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．，Ｃｈｅｍ，Ｂｒ．３３，２９−３２（１９９７）。
【００３０】
後に改変して、それらの分解速度を変えることに適している、ＰＨＡポリマーを生成するために使用される得る方法は、以下に記載されている：米国特許第４，９１０，１４５号（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐ．Ａ．およびＬｉｍ，Ｇ．Ｂ．）；Ｄ．Ｂｙｒｏｍ編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９１、頁３３３−３５９中における、Ｂｙｒｏｍ，Ｄ．「Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」；Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４、頁４８−９６中における、Ｈｏｃｋｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．およびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，Ｒ．Ｈ．「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」；Ｄ．Ｃ．Ｂａｓｓｅｔｔ編「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｖｏｌ．２，１９８８、頁１−６５中におけるＨｏｌｍｅｓ，Ｐ．Ａ．「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  （Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」；Ｈ．Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ．Ｒｅｅｄ編「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｖｏｌ．６６，１９８８，頁１３５−１７６中におけるＬａｆｆｅｒｔｙら、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ−ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ」；ＭｕｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：４７７−５０２（１９９３）；Ｄ．Ｂｙｒｏｍ編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９１、頁１２３−２１３中における、Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．「Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃ  Ａｃｉｄｓ」；ならびに、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６：３８−４４（１９９６）；ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７：６９１−６９７（１９９２）；米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号；Ａｇｏｓｔｉｎｉ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｏｌｙｍ，Ｓｃｉ．，ＰａｒｔＡ−１，９：２７７５−２７８７（１９７１）；Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１：２６５７−２６６８（１９８８）；Ｄｕｂｏｉｓ，Ｐ．Ｉ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４４０７−４４１２（１９９３）；Ｌｅ  Ｂｏｒｇｎｅ，Ａ．およびＳｐａｓｓｋｙ，Ｎ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３０：２３１２−２３１９（１９８９）；Ｔａｎａｈａｓｈｉ，Ｎ．およびＤｏｉ，Ｙ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４：５７３２−５７３３（１９９１）；Ｈｏｒｉ，Ｙ．Ｍ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４３８８−４３９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：１２２１−１２２９（１９９３）；Ｈｏｒｉ，Ｙ．Ｍ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５５３３−５５３４（１９９３）；Ｈｏｃｋｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．およびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．，３０：１６３−１７０（１９９３）：Ｘｉｅ，Ｗ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０：６９９７−６９９８（１９９７）、および、米国特許第５，５６３，２３９号（Ｈｕｂｂｓ，Ｊ．Ｃ．およびＨａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｎ．）。これらの方法で誘導されるＰＨＡは、任意の形態（ラテックスまたは固体形態を含む形態）であり得る。
【００３１】
組換え生物のうち幾つかの微生物から、ＰＨＡの生合成に関する遺伝子の同定、クローニング、および発現によって、自生のＰＨＡ生産者でない生物でのＰＨＡの生産が可能となる。このような組換え生物は研究者にＰＨＡ生成プロセスのより高度な制御を供する。なぜなら、それらは、所望しないＰＨＡ前駆体の生合成またはＰＨＡ分解に関する酵素活性のバックグラウンドがないからである。さらに、組換え生物の適切な選択によって、生産されたＰＨＡの精製を促進し得るか、または生産されたＰＨＡの生体適合性の増加が可能となり得る。
【００３２】
組換え生物におけるＰＨＡの合成に対する最低限の要件は、ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡの源および適切なＰＨＡシンターゼの源である（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５）９２：６２７９−６２８３．）。従って、組換えＰＨＡ生産者は、ヒイドロキシアルカノイル−ＣｏＡモノマーの生合成経路および適切なＰＨＡシンターゼを必要とする。多様性基質の生産によってＰＨＡコポリマーの形成が起こるので、ホモポリマーの生産には、この生物がＰＨＡシンターゼに対する１つの適切な基質のみを生産することが必要である。ＰＨＡシンターゼをコードする導入遺伝子を含む組換え生物は、Ｐ４ＨＢの生産に十分である。
【００３３】
ＰＨＡ分解経路がない場合、組換え生物において蓄積されたＰＨＡの分子量は、非常に高くなり得る。組換えＥ．ｃｏｌｉ中で生産されたＰＨＢが、４×１０6ｇ／ｍｏｌの分子量を有することが報告されている（Ｓｉｍ．Ｓ．Ｊ．，Ｓｎｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．，Ｈｏｇａｎ，Ｓ．Ａ．，Ｓｔｕｂｂｅ，Ｊ．，Ｒｈａ，Ｃ．およびＳｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）１５：６３−６７）。この分子量は所定のＰＨＡの物理的特性を制御するため重要である。なぜなら、組換え生物中で生産されたＰＨＡの増加した分子量によって、改善された物質の特性（例えば、増加した引っ張り強さ、および極限のび）がもたらされ得るためである（Ｋｕｓａｋａ，Ｓ．，Ｉｗａｔａ，Ｔ．およびＤｏｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｍ．Ｓ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）Ａ３５：３１９−３３５）。
【００３４】
低レベルの４ＨＢ（１．５％）を含むＰ３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢの生合成が、組換えＥ．ｃｏｌｉで説明されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９７，５８；３３−３８）。これらＰＨＡの分子量が非常に大きかった（１×１０6ｇ／ｍｏｌより大きい）ことに注目すべきである。さらに、組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるＰ３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢおよびホモポリマーＰ４ＨＢの生合成が説明されている（Ｈｅｉｎら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｌｅｔｔ．１９９７，１５３；４１１−４１８）。
【００３５】
ＰＨＡ合成の生物学的経路の使用の他に、ＰＨＡポリマーはまた、化学合成により誘導され得る。広く用いられる１つのアプローチは、様々な触媒または開始剤（例えばアルミノオキサン、ジスタノオキサン、またはアルコキシ−亜鉛およびアルコキシ−アルミニウム化合物）を使用する、β−ラクトンモノマーの開環重合を含む（Ａｇｏｓｔｉｎｉ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ  Ａ−１，９：２７７５−２７８７（１９７１）；Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１：２６５７−２６６８（１９８８）；Ｄｕｂｏｉｓ，Ｐ．Ｉ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４４０７−４４１２（１９９３）；Ｌｅ  Ｂｏｒｇｎｅ，Ａ．およびＳｐａｓｓｋｙ，Ｎ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３０：２３１２−２３１９（１９８９）；Ｔａｎａｈａｓｈｉ．Ｎ．およびＤｏｉ，Ｙ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４：５７３２−５７３３（１９９１）；Ｈｏｒｉ，Ｙ．Ｍ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４３８８−４３９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：１２２１−１２２９（１９９３）；Ｈｏｒｉ．Ｙ．Ｍ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５５３３−５５３４（１９９３）；Ｈｏｃｋｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．およびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．，３０：１６３−１７０（１９９３）を参照のこと）。第２のアプローチは、エステルの縮合重合を含み、そして米国特許第５，５６３，２３９号（Ｈｕｂｂｓ，Ｊ．Ｃ．およびＨａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｎ．）ならびにその明細書中の参考文献で説明されている。研究者はまた、化学酵素的（ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）方法を開発し、ＰＨＡを調製している。例えば、Ｘｉｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０：６９９７−６９９８（１９９７）は、好熱性リパーゼによるβ−ブチロラクトンの開環重合を報告しており、ＰＨＢを得ている。
【００３６】
Ｐ４ＨＢまたはＰ４ＨＢ−ｃｏ−ＨＡの生物学的な生成は、従来の化学的合成方法に優る、ある程度の利点を有する。高い分子量のＰ４ＨＢ（１×１０5ｇ／ｍｏｌより大きい）の化学合成は困難である。それは、ラクトン化して、比較的に歪みのかからない、かつ速度論的に好ましい５員環を形成する、遊離酸の傾向のためである。従って、４−ヒドロキシブチル酸の重縮合を達成することは困難である。同時に、γ−ブチロラクトンの高圧の開環重合反応から生じるこの物質が非常に低い分子量を有し（Ｋｏｒｔｅ，Ｆ．およびＧｅｌｔ，Ｗ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９９６，４，６８５）、かつ低い機械的特性を有する。Ｐ４ＨＢの代替合成戦略、２−メチレンジオキソランのフリーラジカル開環重合によって、開環および閉環ユニットが混入するコポリマーが生じる（Ｂａｉｌｅｙ，ら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２０：３０２１−３０；Ｂａｉｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ（１９８４）２５：２１０−１１．）。４ＨＢはうまく、開環重合を経由して３ＨＢと共重合される（Ｈｏｒｉ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａ．およびＨａｇｉｗａｒａ，Ｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒ１９９６，３６，４７０３−４７０５）、しかしながら、特に、４ＨＢが８０％より多い組成物（２×１０4ｇ／ｍｏｌ未満）に関して、このコポリマーの分子量は適切であった（１×１０5ｇ／ｍｏｌ未満）。さらに、ポリエステルのこの化学的合成に使用された多くの触媒は、毒性金属を含む。これらの毒性混入物は、生物学的なプロセスを使用してＰＨＡを生成することで回避され得る。
【００３７】
（ＩＩ．変更された分解速度を有するＰＨＡ処方物）
ポリマーの分解速度は、様々な成分のポリマーの組成物への添加、ならびに化学組成、分子量、加工条件および最終ポリマーの生成物の形態の選択を通して変化され得る。この化学組成は、ポリマー中に取り込まれるモノマーの選択を通して、結合、化学骨格またはペンダント基の変更によって、および／または分子量の調節によって変更され得る。多孔度、親水性物質の包含物の増加、および／または水に曝露される表面積の増加により、分解速度が結局、増加する。疎水性コーティング、またはこのポリマーの疎水性物質への取り込み、またはこのポリマーの疎水性物質との混合により分解の速度が減少せられる。
【００３８】
（分解速度を変更させる添加剤）
ポリヒドロキシアルカノエートの加水分解は、酸性のｐＨおよび塩基性のｐＨにおいて加速される。従って、酸性または塩基性の添加剤もしくは賦形剤の包含物が、ＰＨＡの分解速度を変えるために使用され得る。このような包含物は、顆粒として添加され得、任意の他の添加剤、もしくは、取り込まれた、または取り込まれるべき試剤と混合され得るか、あるいはポリマー内に溶解され得る。
【００３９】
分解速度を促進させる添加剤には、無機酸（例えば、硫酸アンモニウム、および塩化アンモニウム）、有機酸（例えば、クエン酸、安息香酸、ぺプチド、アスコルビン酸）、無機塩基（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛）、および有機塩基（例えば、硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン）および界面活性剤（例えば、ＴｗｅｅｎTMおよびＰｌｕｒｏｎｉｃTM）が挙げられる。このような添加剤は、好ましくは、０．１重量％と３０重量％との間の濃度で使用される。
【００４０】
また、細孔を形成するか、さもなくばポリマー中の表面積を増大させ、もしくはポリマーのアモルファス含有量を増加させる添加剤によって、分解速度は促進され得る。増孔剤ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は一般に、微粒子として添加され、そして浸出によって除去される水溶性の化合物（例えば、無機塩、および糖）を含む。適切な粒子には、塩結晶、タンパク質（例えば、ゼラチン、アガロース）スターチ、多糖類（例えば、アルギネート）および他のポリマーが挙げられる。これらの粒子の直径は好適に、ナノメートルと５００ミクロンとの間であり得る。それらはまた、凍結乾燥可能であり得る。増孔剤０．０１％と９０％（容量に対する重量）との間の量、好ましくは、１％と３０％（ｗ／ｗ、ポリマー）との間のレベルで含まれ得、細孔の形成を増加させる。例えば、スプレー乾燥または溶媒の蒸発において、増孔剤（例えば、揮発性の塩（例えば、炭酸水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、または安息香酸アンモニウム）または他の凍結乾燥可能な塩）をまず、水に溶解させる。次いで、増孔剤を含む溶液を、ポリマー溶液で乳化して、ポリマー中に増孔剤の液滴を形成させる。次いで、このエマルジョンをスプレー乾燥または溶媒蒸発／抽出プロセスに通す。ポリマーを沈殿させた後、この硬化微少粒子を、凍結および凍結乾燥して、増孔剤を除去する。可塑剤（例えば、クエン酸エステル、およびアタクチックポリヒドロキシアルカノエートのような他のポリマー）を添加し、ポリマーのアモルファス特性を増加させ得る。
【００４１】
分解速度を増加させるために取り込まれ得る疎水性コーティングまたは疎水性物質は、疎水性化合物（例えば、リン脂質、コレステロール、および他のポリマー）、ならびに界面活性剤を含む。これらの材料および、この材料中へのコーティングまたは組み込みを形成するための方法は、以下で説明されている：ＷＯ９６／１８４２０（Ｂｒａｃｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡによる）、ＷＯ９２／１８１６４（Ｄｅｌｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．による）、ＷＯ９５／０３３５６（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３００７（Ａｃｕｓｐｈｅｒｅによる）、米国特許第５，２７１，９６１号（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら）、米国特許第５，７１１，９３３号（Ｂｉｃｈｏｎら）、ならびに米国特許第５，７０５，１８７号（Ｕｎｇｅｒ）。特定の実施例は、エマルジョン／カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）プロセスの間、水相中の油相を安定化させるための乳化剤としての脂肪酸およびリン脂質を開示し、これらの微粒子は界面活性剤の外層により被膜されるという結果を伴う。また、ポリマー壁（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｗａｌｌ）を疎水化（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚｅ）するため、および水の浸透を遅らせるための、添加剤（例えば、脂質、ワックスおよび高分子量の炭化水素）の使用を、開示する。
【００４２】
（ＰＨＡペンダント基の改変）
ＰＨＡポリマーの分解速度を変化させるさらなる方法は、ポリヒドロキシアルカノエートペンダント基の改変を含有する。このペンダント基は、全体または部分で改変され得る。例えば、ペンダント基は、カルボン酸およびアミンのような酸性基および塩基性基に変換され得る。これらのタイプの基は、局所的なｐＨ値を変化させることで、分解を増進させ得る。あるいは、このペンダント基は、アルコールおよびアミンなどの反応基に変換され得、分子内または分子間の反応のどちらかでポリマーの骨格を切断し得る。これらの変換に加えて、このペンダント基はまた、水のような加水分解性の試薬の取込みを増加させるために親水基に変換し得、またはこれらはポリマーの非結晶性を増加させる基に変換し得る。このペンダント基の官能基の変換を実施するために必要な手順は、当業者にとって周知である。本発明のＰＨＡを調製するために使用され得る１つの適切な方法は（ポリマーの分解速度を変える単位を取り込む）は、Ｈｅｉｎ、Ｓｏｈｌｉｎｇ、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌらによるＷＯ９８／３９４５３に開示される。分解速度を変化させるＰＨＡポリマーの中で適切なペンダント基はまた、発酵によって直接誘導され得る。
【００４３】
（ＰＨＡの化学修飾）
ポリヒドロキシアルカノエートの加水分解の速度は、多数の因子に依存する。１つの鍵となる因子は、モノマー間のエステル結合の化学的な性質または反応性である。次いで、ＰＨＡ骨格の分解速度は、加水分解または酵素の攻撃に対して、より敏感な化学結合をポリマー骨格の中に取り込むことによって変化し得る。ポリマーの分解速度を変えるために、ポリヒドロキシアルカノエート骨格に取込まれ得るモノマーの例は、グリコール酸および乳酸のような２−ヒドロキシ酸、ならびに２−ヒドロキシエトキシ酢酸のようなエステル結合の反応性を変調するような他のヒドロキシ酸がある。加水分解またはヒドロキシ酸の攻撃に、より敏感なエステルを得る他のヒドロキシ酸の取込みに加えて、他のタイプの官能基がポリマー骨格に取込まれ得る。例えば、１以上のエステル結合が、アミド、無水物、カルボネートまたはカルバメートのような基によって置換され得る。ポリヒドロキシアルカノエート骨格に取込まれ得るモノマーの例は、アミノ酸およびアミノアルコールである。さらに、多官能基モノマーは、ポリヒドロキシアルカノエート骨格に取込まれ得る（例えば、トリオールまたはテトラオール）。これらのタイプのモノマー単位はまた、架橋剤の交換によってポリマーの分子量を増加させ、または保持し、あるいは、ポリマーの結晶性を改変するために使用され得る。
【００４４】
さまざまな方法が、敏感な化学結合を、ポリヒドロキシアルカノエート骨格に取込むために使用され得る。例えば、コフィード（ｃｏ−ｆｅｅｄ）が、ＰＨＡの発酵の間に加えられ得、その結果所望のモノマーが取込まれる。適切なコフィードは、ヒドロキシアルコキシ酢酸を含有する。これらのタイプのモノマーはまた、触媒を使用して、およびＰＨＡ合成酵素のような酵素触媒を使用する補酵素Ａ誘導体を介して、ヒドロキシ酸モノマーからの化学合成の間に取込まれ得る。
【００４５】
敏感な化学結合はまた、初期合成の後、ポリヒドロキシアルカノエート骨格に取込まれ得る。これを達成する方法は、挿入反応、放射線、エステル化、エステル交換（例えば、Ｏｔｅｒａ，Ｊ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２７：２３８３〜２３８６（１９８６）、Ｏｔｅｒａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５６：５３０７〜５３１１（１９９１）、Ｏｔｅｒａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４：４０１３〜４０１４（１９８９）およびＯｔｅｒａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７４２〜１７４３（１９９１）を参照のこと）、エステル転移反応（例えば、Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．およびＧａｇｎｅ，Ｍ．Ｒ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１９：５０７５〜５０７６（１９９７）ならびに本明細書の文献を参照のこと）、および反応性ブレンディング（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｅｎｄｉｎｇ）などの化学形質転換を含む。後者の場合において、化学反応は、触媒存在下での融解した状態にて実施され得る。例えば、エステルまたはポリエステルは、ポリヒドロキシアルカノエートを化学的に改変するために適切な触媒の存在下で、ポリヒドロキシアルカノエートとともに融解させ得る。
【００４６】
（敏感な結合を含有するＰＨＡの処理）
ポリヒドロキシアルカノエートは、さらに幅広い範囲のポリマー処理技術を使用して操作され得る。これらの材料を処理するための好ましい方法は、以下を含有する：溶媒キャスティング、融解処理、ファイバー処理／紡績／織り込み、押出し、射出および圧縮成形、ならびに積層化。
【００４７】
（ＩＩＩ．  医療デバイスの製造のための方法）
このポリマー組成物は、様々な生分解性医療デバイスを調製するために有用である。好ましくは、この生分解性ポリマーは、比較的遅い生分解性を示し、例えば、インビボで３ヶ月〜６ヶ月、またはそれ以下の半減期を有する。好ましくは、このポリマーは、比較的低い融解点／ガラス転移温度を有し（例えば１３６℃未満）および／または無毒性、非ハロゲン化溶媒に、簡単な処理で溶解する。
【００４８】
非熱分解性（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）のＰＨＡが体内に移植される場合、これらの材料は、もしあるにしても、急性の炎症反応または、任意の有害な組織反応をほとんど示さない。これらは、重要な炎症応答または傷跡組織形成が全くない。炎症細胞の補充は、最小である。外移植されたデバイスの組織学的な実験によると、この材料は基本的に不活性であることが実証された。さらにＰＨＡで構成されたデバイスは、周りの組織に最小の有害な影響で移植され得る。移植された材料からのヒドロキシ酸分解生成物の放出は、典型的に遅く、そして体によい耐溶性を示す。従って、ＰＨＡは、おおよそ１ヶ月間材料特性を保持し、そして最終的に無毒性材料に分解することが期待される。
【００４９】
ＰＨＡから調製されるデバイスは、幅広い範囲の異なる医療用途のために使用され得る。このような用途の例としては、制御された放出、薬物送達、組織工学骨格、細胞のカプセル化；ターゲット送達、生体適合性コーティング；生体適合性移植片；誘導組織再生、傷口の包帯、整形デバイス、補綴ならびに骨の接合剤（接着剤および／または構造賦形剤を含有する）、および診断が挙げられる。
【００５０】
ＰＨＡは、任意の様々な治療的、予防的または診断上の試薬と混合され得るか、もしくは、それらにイオン結合的にまたは共有結合的に結合されてカプセル化し得る。幅広い様々な生分解性活性材料が、ポリヒドロキシアルカノエートによる部位への送達のため、またはポリマーへの特性を賦与する（例えば、バイオ接着、細胞付着、細胞成長の増強、細菌の成長の阻害および血塊形成の防止など）ためのどちらかで、カプセル化または取込まれ得る。
【００５１】
適切な医療的および予防的な試薬の例として、医療的、予防的または診断上の活性を有する合成無機化合物および有機化合物、タンパク質およびペプチド、ポリサッカリドおよび他の糖や脂質、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列として、遺伝子、転写を阻害するために相補的にＤＮＡに結合するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。幅広い範囲の分子量を有する化合物は、例えば、１モル当り１００〜５００，０００グラムでカプセル化され得る。適切な材料の例は、抗体、受容体リガンドおよび酵素のようなタンパク質、接着ペプチドのようなペプチド、サッカリドおよびポリサッカリド、合成有機薬剤または無機薬剤、ならびに核酸を含有する。カプセル化され得る材料の例は、酵素、血液凝固因子、阻害剤またはストレプトキナーゼのような血栓溶解剤、および組織プラスミノーゲン活性化因子；免疫に対する抗原；ホルモンおよび成長因子；へパリンのようなポリサッカリド；アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび遺伝子治療に使用するためのレトロウイルスのベクターを含有する。このポリマーはまた、細胞および組織をカプセル化し得る。代表的な診断剤は、Ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像法、放射活性、超音波、コンピュータ断層診断（ＣＴ）および陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出可能な試薬である。超音波診断剤は、典型的に空気、酸素またはパーフルオロカーボンのようなガスである。
【００５２】
制御された放出の場合において、幅広い範囲の異なった生理活性化合物は、制御された放出デバイスに取込まれ得る。これらは疎水性、親水性および高い分子量の高分子（例えば、タンパク質）を含む。この生理活性化合物は、０．１重量％と７０重量％、より好ましくは５重量％と５０重量％の間の充填割合で、ＰＨＡ内に取込まれ得る。このＰＨＡは、粉末、フィルム、成形品、粒子、球体、ラテックスおよび結晶または非結晶の材料のような、ほぼ任意の物理形状となり得る。これらは、例えば、他のポリマーのような追加の非ＰＨＡ材料と結合し得る。これらは、遅い分解性の、生体適合性の、成形可能な材料（例えば医療デバイス）を必要とする用途での使用に適している。ポリマーから調製し得る医療デバイスの例としては、ロッド、骨のねじ釘、ピン、外科手術の縫合、ステント、組織工学のデバイス、薬剤送達デバイス、傷口の包帯、ならびにヘルニアのパッチおよび心膜のパッチのようなパッチが挙げられる。
【００５３】
ＰＨＡで作製される分解可能な移植片は、幅広い範囲の整形および血管性の用途、組織工学、誘導組織再生、ならびに他の熱可塑性のエラストマーによって現在役立っている用途に使用され得る（ＭｃＭｉｌｌｉｎ，Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６７：４１７〜４６（１９９４））。この移植は、修復および治癒を刺激する他の要素を含有し得る。好ましいデバイスは、体液の通過に適切なチューブである。これらのデバイスは、細胞接着因子、成長因子、ペプチドならびに抗体およびそれらの断片で修飾され得る。
【００５４】
製造された医療デバイスの好ましい方法としては、溶媒キャスティング、融解処理、押出、注射および圧縮成形、ならびにスプレー乾燥が挙げられる。部品は、好ましくは、発酵に基づくプロセス、または溶媒エバポレートの技術、二重の乳濁液技術、または当該分野で利用可能な方法を使用したミクロ流動化によって直接調製される（Ｋｏｏｓｈａ，Ｆ．Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，１９８９，Ｕｎｉｖ．Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ．，Ｄｉｓｓ．Ａｂｓｔｒ．Ｉｎｔ．Ｂ５１：１２０６（１９９０）；Ｂｒｕｈｎ，Ｂ．Ｗ．およびＭｕｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｗ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１８：６６８〜６９（１９９１）；Ｃｏｎｔｉ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、９：１５３〜１６６（１９９２）；Ｏｇａｗａ，Ｙ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５〜１０３（１９８８）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．およびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．「Ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍ．Ｄｏｎｂｒｏｗ編、「Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  Ｎａｎｏｐａｒｔ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍ．」ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２年、５章、９９〜１２３頁）。
【００５５】
このＰＨＡは、創傷治癒に適切なデバイスの中に組み込まれ得る。例えば、この目的のための織り込まれていない繊維状の材料は、第一にポリマー繊維を生成し、穿孔処理した放出口からポリマーに圧力をかけ、当業者に公知の手順を使用して調製され得る。この繊維は、次いでこれらを固体支持体上に展開し、そして圧縮成形をかけることで多孔性の膜（織物）に組み込まれ得る。このデバイスの厚さは、好ましくは５００μｍ未満である。この創傷治癒デバイスはまた、多孔性を得るためにレーザーを使用するか、または多孔性の材料を調製するために浸出技術を使用して、フィルムまたは膜を穿孔処理することで調製し得る。この細孔の寸法は、理想的には細胞および他の組織物質を閉塞するのに十分に小さくあるべきである。この創傷治癒デバイスは、インビボで組織を分離しそして組織再生を刺激するために配置され得る。
【００５６】
このＰＨＡは、細胞をカプセル化するために使用され得る。当業者に公知の手順を使用することで、最初に細胞を事前コートされ得る。Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６；１５〜３３（１９９５）を参照のこと。次いで、二重エマルジョンの技術のような粒子カプセル化の手順を使用して、この細胞はＰＨＡによってカプセル化され得る。Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５〜１０３（１９８８）を参照のこと。カプセル化した細胞は、次いで、インビボで移植され得る。
【００５７】
このＰＨＡは、幅広い範囲のポリマーの処理技術を使用して組織工学骨格に取り込まれ得る。ＰＨＡ組織工学骨格を取込む好ましい方法としては、溶媒キャスティング、融解処理、ファイバー処理／紡績／織り込み、抽出、注射および圧縮成形、ならびに積層化、そして溶媒浸出／溶媒キャスティングを含有する。このような方法は、当業者に公知である。
【００５８】
ＰＨＡ組織工学骨格を組込む一つの好ましい方法は、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ押出し機のような、押出し機の使用を含有する。例えば、この技術は、ある範囲の長さおよび寸法、移植に適切な押出されたチューブを調製するために使用され得る。
【００５９】
別の好ましい方法は、繊維から不織のＰＨＡ骨格の処理を含有する。繊維は、融解または溶媒から調製され得、そして当業者に公知の方法を使用して不織布に処理され得る。不織布の特性は、例えば、ＰＨＡ材料、繊維の寸法、繊維の密度、材料の厚さ、繊維の配向、および繊維の処理の方法を変化させることで変更され得る。この多孔性の膜は、所望すれば、さらに処理され得る。例えば、これらの膜は、中空のチューブに形成され得る。
【００６０】
別の好ましい方法は、適切なＰＨＡを適切な型わく内に処理し、そして所望の多孔性を達成するためにレーザーまたは、他の方法を使用して材料を穿孔する融解または溶媒を含有する。圧縮成型したＰＨＡシートをループに巻く工程および熱シールする工程を包含する方法もまた好ましい。このＰＨＡシートは、必要に応じて、第二生分解ポリマーのような他の物質と共に巻かれ得る。例えば、後者の物質は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはグリコール酸および乳酸の共重合体の不織布であり得る。このような手順によって、新しい容器、ダクトおよびチューブの工業技術での使用に適した積層チューブが提供されるべきである。このＰＨＡはまた、他の組織工学骨格をコートするのに使用され得る。このような材料は、他の分解性ポリマーから誘導され得る。コーティングはまた、例えば、溶液を基礎とした溶媒で、または融解技術によって、またはＰＨＡラテックスを使用して実施され得る。
【００６１】
この組織工業デバイスは、本明細書中において、移植の前または移植の後に細胞でシードされ得る。この細胞は、ドナーの組織の健康な部分から取り出され、インビボで細胞培養技術を使用して展開し、次いで移植の前または後のどちらかで骨格（または基質）にシードされ得る。あるいは、この細胞は、他のドナーの組織からまたは現存の細胞株から獲得され得る。
【００６２】
このＰＨＡはまた、他のデバイスおよび材料をコートするために使用される。このようなコーティングは、医療の用途のために特性を改良し得、例えば、生態適合性、機械的な特性を改良し、ならびに分解および制御された放出の性質を合わせる。このＰＨＡはまた、上に記載される取り込みの手順を使用して、他のデバイスの上にコートされ得る。このコーティングの厚さは、コーティングの重量または適用する濃度を変えること、または／および保護膜によって特定の用途の要求に対して調整され得る。
【００６３】
このＰＨＡは、幅広いポリマー処理技術を使用してステントの中に取込まれ得る。ＰＨＡステントを取込む好ましい方法は、溶媒キャスティング、融解処理、ファイバー処理／紡績／織り込み、押出、射出および圧縮成形を含む。このような方法は、当業者に公知である。
【００６４】
移植の前に、生体再吸収可能な重合体物質は、受容者の疾患および感染を防ぐため滅菌しなければならない。滅菌は、ポリマーデバイスを細胞にシードする前に実施される。物質を含むＰＨＡの熱滅菌はしばしば、特にＰＨＡが熱滅菌処理に必要とされる温度よりも低い融解温度を有する場合、熱処理によって物質を変形し得るので実施不可能である。この問題は、滅菌剤として冷エチレンオキシドガスを使用することで克服され得る。移植前に物質を含有するＰＨＡをエチレンオキシドの蒸気に暴露することによってこの物質を滅菌し、移植にとって適したものにする。冷エチレンオキシドガスを用いた滅菌の間、物質を含むＰＨＡは、その形状を保った。このタイプの処理は、理想的には成型された、または形成された物質の滅菌に適しており、ここで、この物質の形状が適切な機能において重要な役割を果たす。
【００６５】
この本明細書中に記載されるデバイスは、全身的または局部的に投与され得、またはさらにインビボで、特に細胞培養に使用され得る。このデバイスを全身に投与する好ましい方法は、注射、吸入、経口投与および移植によるものである。デバイスを投与する他の適切な方法は、局所的に、ローション、軟膏、パッチ、または包帯としてデバイスを投与する工程を包含する。
【００６６】
本明細書中に記載される組成物および方法は、さらに以下の非限定的な実施例を参考として理解される。
【００６７】
（実施例１：組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでのＰ４ＨＢｌの生成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１１７７（唯一の炭素源として４−ヒドロキシ酪酸（４ＨＢ）を成長させる能力から選択された株ＤＨ５αの誘導体）は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａからのＰＨＡ合成酵素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉからの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ転移酵素、およびアンピシリンへの耐性を与えるβ−ラクタマーゼ、をコードする遺伝子を含有するプラスミドであるｐＦＳ３０で形質転換した。この合成酵素および転移酵素は、ｐＦＳ３０の中で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって導入されるｔｒｃプロモータの制御下にある。これらの細胞は、最初に２５０ｍｌのエルンマイヤーフラスコ中で１００ｍｌのＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．；２５ｇ／Ｌ）および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中で一晩、３７℃、２００ｒｐｍで振盪させることで成長させた。この全培養物を、７Ｌの容器で実施される発酵のための種菌として使用した。この発酵の第一ステージは、３７℃において８００ｒｐｍでの攪拌、および１分間当りの体積測定の１容量（ｖｖｍ）で通気しながら、５ＬのＬＢ−アンピシリン中で成長するバイオマスからなる。１７時間後、この容量は、１リットルの媒体を加えることによって６Ｌに調整し、全容量が１リットル当り以下を含むようにした：２．５ｇのＬＢ粉末、ナトリウム塩としての５ｇの４ＨＢ、２ｇのグルコース、５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム（ｐＨ７）、７ｇのリン酸、１００μｇのアンピシリン、および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧ。この時点で、温度は３３℃に調整され、そしてこの攪拌速度は、４００ｒｐｍに減少させた。グルコースおよびナトリウム４ＨＢの周期的添加は、ｐＨが顕著にそれぞれ７未満または７より上である場合になされた。なぜならグルコースの添加はこのｐＨを徐々に減少させ、および４ＨＢの添加はこのｐＨを徐々に増加させるからである。このｐＨは、自動的に制御されなかった。この発酵は、さらに７０時間の間この方法で進行し、その時間に、全部で３４ｇ／Ｌのグルコースおよび１５ｇ／Ｌの４ＨＢが供給された。この細胞は４℃にて２日間静置させ、この時間の後、液体相は取り除かれ、そして細胞の懸濁液は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）Ｍ１１０−ＥＨ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ内で１８，０００ｐｓｉで流動化された。得られた物質は、凍結乾燥され、加熱（６０℃）そして機械的に攪拌されながらテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３％ｗｔ／ｖｏｌのＰ４ＨＢ）の中に抽出された。この得られたＴＨＦ抽出物は、ガラスミクロ繊維（２．３μｍ）およびＴｅｆｌｏｎ（２μｍ）デプスフィルターを通して圧力濾過した。このポリマーは、等しい容量の水の中で沈殿させ、そして凍結乾燥した。このポリマーは、ＴＨＦ（３％ｗｔ／ｖｏｌのＰ４ＨＢ）中で加熱（６０℃）しながら再溶解させ、そしてこの溶液をガラスミクロ繊維（２．３μｍ）およびＴｅｆｌｏｎ（２μｍ）デプスフィルターを通して濾過し、水／ＴＨＦ（１：１）中で沈殿させた。この沈殿物を水／ＴＨＦ（１：１）で洗浄し、そして凍結乾燥し、白色の発泡体（２０ｇ）を得た。この材料は、��リ−４−ヒドロキシブチレートであると同定し、寒天拡散アッセイ（ＩＳＯ  １０９９３、Ｔｏｘｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって非細胞毒性であることを示した。元素分析によると、Ｃ５５．６３％、Ｈ７．４１％、Ｏ３７．２８％、Ｎ４１ｐｐｍであった。ＧＣ分析は、精製したポリマー中の非常に低い脂質の存在を示す。ＮＭＲ分析では、予想のピークを示し、脂質は存在しない。
【００６８】
（実施例２：組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．におけるポリ（４ＨＢ−ｃｏ−２ＨＢ）の生成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１１７７／ｐＦＳ３０およびＭＢＸ１８４（ＣＧＳＣ６９６６）／ｐＦＳ３０を、１リットルのエルレンマイヤーフラスコ中の３００ｍＬのＬＢ−アンピシリン中で、３０℃で一晩、２００ｒｐｍで振盪しながら前培養した。各々の前培養の２つの１００ｍＬのアリコートを遠心分離（２００００×ｇ、１０分間）し、これらのアリコートの各々から得られた細胞を、１リットル当り；６．２５ｇＬＢ粉末；２ｇグルコース；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム（ｐＨ７）；１００μｇアンピシリン；および１００μｍｏｌ  ＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地に再懸濁した。この培地はまた、２−ヒドロキシブチレート（２ＨＢ）および４ＨＢを含み；片方のフラスコでは、その濃度は８ｇ／Ｌ  ２ＨＢ、および２ｇ／Ｌ  ４ＨＢであり、そして他方では、２つの酸の濃度は各５ｇ／Ｌであった。両方の酸を、ナトリウム塩としてフラスコに添加した（酸についての所定の質量は、ナトリウムの質量を含まない）。これら４つのフラスコ（各株について２つのフラスコ）を、３０℃でさらに４８時間、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。これらの細胞を遠心分離（２０００×ｇ、１０分）により培地から取り出し、水で１回洗浄し、再び遠心分離し、そして凍結乾燥した。ガスクロマトグラフィー分析をこの凍結乾燥した細胞塊について実施し、ポリマー含量および組成について分析した（表２を参照のこと）。この細胞の生産ＰＨＡの含量および組成を表２に示した。２ＨＢの４ＨＢに対する比が４：１の場合、このポリマーの２ＨＢ含量は、ＧＣ分析により両株とも１９％より高く、一方、２ＨＢの４ＨＢに対する比が１：１では、このポリマーの２ＨＢ含量は約１％であった。４ＨＢは、２ＨＢよりもさらに容易にこのポリマー中に取り込まれ、それゆえ、４ＨＢが２ｇ／Ｌで存在した場合、細胞の総ポリマー含量は、それが５ｇ／Ｌで存在した場合よりも少ない。ＭＢＸ１８４／ｐＦＳ３０により生成されたポリマーを細胞から抽出し、分析した。凍結乾燥した細胞塊を５ｍＬのクロロホルム中、３７℃で２時間インキュベートした。細胞の残骸を遠心分離（２０００×ｇ、５分）により除去し、得られたポリマー溶液を５０ｍＬのエタノールに滴下してそれを沈殿させた。この沈殿したポリマーを、上記のようにエタノールから遠心分離した。２ＨＢ：４ＨＢ比が４：１の場合では、このポリマーをエタノールから遠心分離するのは難しく；エタノールに添加した場合、それはもや状のもの（ｈａｚｅ）を形成したが、恐らくこのポリマーの分子量がかなり低いため、そのほとんど全てが遠心分離により集められたわけではない。２ＨＢ：４ＨＢが１：１のフラスコから単離したポリマーはエタノールから容易に沈殿し、ほぼ完全にそれを回収した。これらの抽出試料のＧＣ分析（表２）は、２ＨＢ含量が、細胞全体について分析を行った場合よりも僅かに低いということを示した。ポリマー鎖中の２ＨＢ残基が抽出中に加水分解され、それゆえ、抽出試料中の見掛けの２ＨＢ含量を低下させるということは可能である。抽出ポリマーの分子量は、２ＨＢ含量がより高い場合に、見掛け上低かったという事実が、この説明と一致する。
【００６９】
第２の実験をＭＢＸ１８４／ｐＦＳ３０で実施した。これらの細胞を、１リットルのエルレンマイヤーフラスコ中の４００ｍＬ  ＬＢ−アンピシリン中で、３０℃で一晩、２００ｒｐｍで振盪しながら前培養した。各フラスコへ２０ｍｌの培地を加え、その全容量が１リットルあたり；２．５ｇの追加ＬＢ粉末；２ｇ  ４ＨＢ（ナトリウム塩として）；２ｇグルコース；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム（ｐＨ７）；１００μｇアンピシリン；５０μｍｏｌ  ＩＰＴＧ；および２、４、６または８ｇ  ２ＨＢ（ナトリウム塩として）を含むようにした。これらのフラスコを、３０℃、２００ｒｐｍでさらに４８時間インキュベートした。これらの細胞を遠心分離（２０００×ｇ、１０分）により培地から取り出し、水で１回洗浄し、再び遠心分離し、そして凍結乾燥した。この乾燥細胞塊を、上記のようにＧＣ分析に供した。表３は、得られたポリマーの細胞含量および組成を示す。低い２ＨＢ：４ＨＢ比では、２ＨＢは、ポリマー中に殆どまたは全く取り込まれなかったが、この比が３：１または４：１である場合、ポリマー中への２ＨＢの取りこみは非常に顕著であった。すべての細胞の総ポリマー含量は、これらの酸がその摂取および／または取りこみが高率で進行するのを可能にするのに十分に高い濃度で存在しないため、かなり低かった。
【００７０】
（実施例３：組換えＥ．ｃｏｌｉ．におけるポリ（４ＨＢ−ｃｏ−３ＨＢ）の生成）
ＭＢＸ１１７７／ｐＦＳ３０株を４つの別個の２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍｌ  ＬＢ−アンピシリン中で、３０℃で一晩、２００ｒｐｍで振盪しながら前培養した。各フラスコへ２０ｍｌの培地を加え、その全容量が１リットルあたり；２．５ｇの追加ＬＢ粉末；４ｇ  ４ＨＢ（ナトリウム塩として）；４ｇグルコース；５０ｍｍｏｌ  リン酸カリウム（ｐＨ７）；１００μｇアンピシリン；５０μｍｏｌ  ＩＰＴＧ；および０．２５、０．５、０．７５または１ｇの３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）（ナトリウム塩として）を含むようにした。これらのフラスコを、３０℃、２００ｒｐｍでさらに４８時間インキュベートした。これらの細胞を遠心分離（２０００×ｇ、１０分）により培地から取り出し、水で１回洗浄し、再び遠心分離し、そして凍結乾燥した。ガスクロマトグラフィー分析をこの凍結乾燥した細胞塊について実施し、ポリマー含量および組成について分析した。このポリマー中の３−ヒドロキシブチレート単位を試験するのに使用した標準物質はポリ（３−ヒドロキシブチレート）であった。生成されたＰＨＡの細胞含量および組成を表４に示した。培地中の４ＨＢ／３ＨＢの比が減少するにつれて、ポリマーの３ＨＢ含量は単調な様式で増加し、一方、細胞の総ポリマー含量は全ての試験で同様であった。このことは、総ポリマー収量に有意に影響を与えることなくコポリマー組成を予測可能に制御するのに、培地中の組成を使用し得るということを意味する。ポリマーを凍結乾燥塊の残分から抽出した。全てのサンプルについて凍結乾燥した細胞塊を、その自己の約３倍の体積の１，２−ジクロロエタンと混合し、閉鎖チューブ中で３７℃で６時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。この微粒子物質を遠心分離（２０００×ｇ、１０分）によりポリマー溶液から分離した。得られた溶液をその自己の約１０倍の体積のエタノールに滴下し、沈殿ポリマーを溶液から沈殿させた。上清を外へ注ぎ、残りの湿ったポリマーを乾燥するように見えるまで放置し、次いで凍結乾燥して完全に乾燥した。これらのＰ４ＨＢ−ｃｏ−３ＨＢ組成物の熱特性を表５に示した。
【００７１】
（実施例４：Ｐ４ＨＢのインビトロおよびインビボ分解）
Ｐ４ＨＢの分解をインビトロおよびインビボで試験した。様々な多孔性（０％、５０％および８０％多孔性）の３つの異なる配置について調べた。小さなディスク（直径５ｍｍ）を均一な厚さの圧縮成型Ｐ４ＨＢフィルムから穿孔した。Ｐ４ＨＢの多孔性サンプルを、下記に記載した塩溶出技術を使用して生成した。これらのディスクを滅菌したリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭリン酸カリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、保存剤としてＮａＮ3を含有）中、３７℃でインキュベートすることにより、インビトロでの分解挙動について試験した。ラットの皮下ポケットに移植後、インビボでの分解挙動について試験した。
【００７２】
（多孔性Ｐ４ＨＢの調製）
区分された塩化ナトリウム結晶（８０〜１８０μｍ）を溶融したＰ４ＨＢと混合した。このポリマー塩比を調整して所望の多孔性を生成し得、一方、粒子サイズを調整して種々のサイズの孔を生成し得る。このポリマー塩混合物をプレスして薄膜とした。この物質を固化させた後、マイラーバッキングから取り出した。このフィルムを徹底的に水で抽出して塩を除去すると、Ｐ４ＨＢの多孔性フィルムを残した。
【００７３】
（Ｐ４ＨＢの加速分解）
Ｐ４ＨＢの分解をインビボで試験した。様々な多孔性（０％、５０％および８０％多孔性）の３つの異なる配置について調べた。小さなディスク（直径５ｍｍ）を均一な厚さの圧縮成型Ｐ４ＨＢフィルムから穿孔した。Ｐ４ＨＢの多孔性サンプルを、塩溶出技術を使用して生成した。ラットの皮下ポケットに移植後、インビボでの分解挙動について試験した。サンプルを種々の時間で取り出した。この分子量をＧＰＣにより測定し、質量の損失をＣＧ分析による残りの４ＨＢの定量化により測定した。結果を図３に示した。図３に示したように、サンプルの質量損失は多孔性に応じて変化した。フィルム、５０％および８０％多孔性サンプルは、６週の期間に亘ってそれぞれ５％、２０％および７５％質量損失を示し、一方、これらのサンプルの平均分子量損失はまた有意に（２０〜５０％）減少した。これらのデータは、ＰＨＡの分解速度が、多孔性を変化させそして表面積を増加させることにより、改変しそして制御し得るということを立証する。
【００７４】
（結果）
Ｐ４ＨＢ移植片は、ＰＧＡ不織メッシュに対するよりも非常に少ないごく最小量の炎症応答を示した。このことは、これらの物質の生体適合性の大変良い指標である。サンプルを種々の時間で取り出し、移植片および周囲の組織の両方について組織学的に評価した。この分子量をＧＰＣにより測定し、質量の損失をＧＣ分析による残りの４ＨＢの定量化により測定した。結果を表６および７に示した。表６に示したように、Ｐ４ＨＢはインビトロでは１０週の期間に亘って有意に分解しなかった。全てのサンプルはそれらの当初の重量を維持し、約２０〜４０％の平均分子量の減少があった。インビボでインキュベートされたサンプルは、さらにより顕著な分解を示した。質量損失は多孔性に応じて変化した。フィルム、５０％および８０％多孔性サンプルは、１０週の期間に亘ってそれぞれ２０％、５０％および１００％質量損失を示し、一方、これらのサンプルの平均分子量損失はまた有意に（２０〜５０％）減少した。
【００７５】
これらのサンプルの光学顕微鏡および環境走査型電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）検査は、１０週のインキュベーション期間に亘ってインビトロサンプルに関して識別し得る変化をほとんど示さない。他方では、インビボの移植片は明瞭な分解の徴候を示した。これらの物質の表面は、１０週の移植期間中、漸次分解した。１週後、フィルムサンプルは多少の割れおよびクレージング（ｃｒａｚｉｎｇ）を示し、これは、続く９週間に亘って表面侵食およびくぼみに進展する。
【００７６】
インビトロの分解データは、Ｐ４ＨＢが単純な加水分解に対してかなり安定であり、生体再吸収性適用（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡおよびそれらのコポリマー）に使用される他のポリエステルとは異なるということを示唆する。しかしながら、これら移植片の分解は、Ｐ４ＨＢがインビボで分解し得、生物学的に媒介する様式での分解を示唆する。このデータは、多孔性が増加するに応じて分解が増加するということを示し、これはポリマー移植片の表面積がそのインビボでの分解にひとつの役割を果たすということを示唆する。このことは、Ｐ４ＨＢポリマーにインビボでの分解が移植片の表面で起こり、移植片全体にわたって加水分解により分解し、関連する分子量減少および機械的特性の損失を伴なうＰＧＡまたはＰＬＡとは異なるということを示唆する。これらのデータは、Ｐ４ＨＢの分解速度がその表面積を変化させることにより、改変しそして制御し得るということを示唆する。この型の表面分解が比較的緩やかな速度の分子量損失となり、現存する吸収性医療用ポリエステルよりもポリマー材料の特性のより長期にわたる維持を可能とするということがまた期待される。このＰ４ＨＢ移植片は非常に良好な耐容性を示し、ごく最小量の異物反応しか示さなかった。これらの知見は、これらの材料が現存する生体医用ポリエステルに対して有意な利点を有することを示す。
【００７７】
（実施例５：圧縮成型）
Ｃａｒｖｅｒ水圧プレスを使用してＰ４ＨＢを薄膜にプレスした。この圧盤を１１５℃まで加熱した。金属スペーサーを使用する２枚のマイラーの間にＰ４ＨＢをプレスした。スペーサーの厚さおよびプレスの圧力を調整してフィルム厚を制御し得る。このフィルムをプレスから取りだし、室温まで冷却させた。固化した後（およそ数秒以内）、このフィルムはマイラーバッキング物質から容易にはがれた。この物質に関する機械的データを表１に示す。Ｐ４ＨＢの迅速な凝固は、その迅速な結晶化を立証する。
【００７８】
（実施例６：多孔性Ｐ４ＨＢの圧縮成型）
実施例４および５に記載したように、区分された塩化ナトリウム結晶（８０〜１８０μｍ）を溶融したＰ４ＨＢと混合した。このポリマー塩比を調整して所望の多孔性を生成し得、一方、粒子サイズを調整して種々のサイズの孔を生成し得る。実施例６に記載した条件を使用して、このポリマー塩混合物をプレスして薄膜とした。この物質を固化させた後、フィルムをマイラーバッキングから取り出した。このフィルムを徹底的に水で抽出して塩を除去すると、Ｐ４ＨＢの多孔性フィルムを残した。塩の除去を上清の塩化物の分析によりモニターし、溶出したフィルムの元素分析により確かめた（０．５％より少ない塩化物）。５０％および８０％多孔性Ｐ４ＨＢ（それぞれ、ｐＰ４ＨＢ５０およびｐＰ４ＨＢ８０）に関する機械的データを表１に示す。
【００７９】
（実施例７：Ｐ４ＨＢ骨格の細胞播種）
多孔性Ｐ４ＨＢ（実施例６に記載したような）を冷エチレンオキシド処理により滅菌した。ヒツジの血管細胞を播種し、インビトロで培養した。予備的なデータは、これらの細胞のこの物質への非常に良好な付着を示した。これは、この物質の生体適合性のさらなる証明である。この物質に付着した細胞数をＤＮＡに対するアッセイを使用して定量化し得、そして組織工学骨格、ＰＧＡメッシュに対するスタンダードと比較し得る。
【００８０】
（実施例８：繊維配向）
Ｐ４ＨＢの圧縮成型小片を一軸性に延伸した。このサンプルは細くなり、かつ透明となり、ネッキングの徴候を示した。この延伸プロセスの後、このポリマーはより丈夫にそして幾分かより柔軟になり、このサンプルの１軸性配向を立証した。
【００８１】
（実施例９：Ｐ４ＨＢ発泡体の生成のための熱的相分離方法）
Ｐ４ＨＢをジオキサン中に１〜５重量／体積％で溶解した。このポリマー溶液を薄膜としてキャストし、ジオキサンの融点未満に氷冷することにより固化させた。溶媒を低い圧力でこの固体物質からエバポレートし、開始時の膜厚のおよその寸法を有する多孔性発泡体を生成した。この物質のＥＳＥＭ分析は高度な多孔性、スポンジ様構造を示した。このポリマー濃度および冷却プロセスは、この発泡体の多孔性を改変するため変化し得る。冷凍する前に、このポリマー溶液は種々の形態の形となり得、特定の材料に細分化し得、またはコーティングとして使用し得る。それゆえ、この熱的相分離技術は、非常に種々の高度に多孔性の３次元形状のＰ４ＨＢを生成するのに使用し得る。
【００８２】
（実施例１０：ＰＧＡ不織メッシュのＰ４ＨＢコーティング）
Ｐ４ＨＢをテトラヒドロフラン中に１重量／体積％で溶解した。１ｍｍ厚の不織メッシュのＰＧＡ（Ａｌｂａｎｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、バルク密度５２ｍｇ／ｃｃ）を、気泡が排除されるようにこの溶液に浸漬した。このコーティングメッシュを風乾させ、そしてこのコーティング手順を繰り返した。このコーティングメッシュの光学顕微鏡およびＥＳＥＭ分析は、この乾燥プロセス中にこのポリマーが繊維の交点に移動し、繊維を一緒に結合するよう機能することを示した。この繊維結合技術がＰＧＡメッシュの強度および取り扱い性を劇的に改善することを見出した。ＡＳＴＭＤ６３８に従った引っ張り試験は、この物質の引っ張り強さ、ヤング率および極限伸びが１３０ｐｓｉ、２４０ｐｓｉおよび１７１％であることを示した。これは、これらのパラメータを試験するにはあまりにもろかった非コーティング物質に対する劇的な改善である。
【００８３】
（実施例１１：ＰＧＡ不織メッシュのＰ４ＨＢ発泡体コーティング）
Ｐ４ＨＢをジオキサン中に２．５重量／体積％で溶解した。１ｍｍ厚の不織メッシュのＰＧＡ（Ａｌｂａｎｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、バルク密度５２ｍｇ／ｃｃ）を、気泡が排除されるようにこの溶液に浸漬した。このコーティングメッシュを、コーティング溶液が固化するように氷冷した。このメッシュを凍結乾燥し、ジオキサンを除去した。このコーティングメッシュの光学顕微鏡分析は、この凍結乾燥プロセス中に、このポリマーがＰＧＡメッシュ全体を通して織物様発泡体を形成することを示した。この発泡体物質は良好な取り扱い性を有する。この高い表面積および改善した機械的特性は、種々の用途に魅力的である。
【００８４】
（実施例１２：Ｐ４ＨＢミクロスフェアの形成）
Ｐ４ＨＢをジクロロメタン中に１重量／体積％で溶解した。この溶液の１ｍｌ体積を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５重量／体積％溶液の５ｍｌと混合した。この二相混合物を機械的に混合してエマルジョンを生成した。ジクロロメタンの除去を容易とするため早く撹拌しながら、窒素気流をこの混合物を通して１時間泡立てた。この混合物を一晩空気に開放したまま撹拌し、ジクロロメタンを完全に除去した。位相差光学顕微鏡下でこれを測定すると得られた懸濁物は、約１〜１０μｍのＰ４ＨＢミクロスフェアを含有した。
【００８５】
（要約）
ホモポリマーＰ４ＨＢおよび４ＨＢを含有するコポリマーのようなポリヒドロキシアルカノエートは、それらを医療用用途に使用するための移植片として非常に魅力的とする物理的性質および分解特性を有する。これらのポリマーは、それらを移植可能な医療用材料として使用するための繊維、シート、発泡体、コーティング、構造体、フィラメントなどに製造され得る。
【００８６】
【表１】
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参考：１．この研究からＡＳＴＭＤ６３８に従って周囲温度および０．０５または０．１インチ／分のひずみ速度で測定した。２．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘ．Ｉｍｐ．１９９６、１１、６６７〜６７８。３．Ｎｏｂｅｓら、投稿中。４．Ｍａｒｋ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６。５．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｓ．ＳおよびＧｏｏｄｍａｎ、Ｓ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２。６．Ｓａｉｔｏ、ＹおよびＤｏｉ、Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．（１９９４）１６：９９−１０４。
【００８７】
【表２】
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aｄｃｗ：乾燥細胞重量
bＧＣ分析により決定。約２０ｍｇの凍結乾燥細胞質量を、９０体積％１−ブタノールおよび１０体積％濃塩酸を含む混合物の２ｍＬ中で１１０℃で３時間、ブタノリシスに供し、内部標準として２ｍｇ／ｍＬの安息香酸を添加した。得られた混合物の水溶性成分を３ｍＬの水で抽出することにより除去した。有機相（全体を通じて流速２ｍＬ／分、１：５０のスプリット比で１μＬ）を、次の温度プロフィール（８０℃、２分；２５０℃まで１０℃／分；２５０℃、２分）でＳＰＢ−１融解シリカキャピラリＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｌｐｅｌｃｏ；Ｂｕｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｐａ．）により分析した。ポリマー中の４−ヒドロキシブチレート単位の存在を試験するために使用した標準物質はγ−ブチロラクトンであった。ポリマー中の２−ヒドロキシブチレート単位を試験するために使用した標準物質は２−ヒドロキシ酪酸ナトリウムであった。
c括弧内のパーセントは、ポリマーのクロロホルム中への抽出、続いてエタノール中での沈殿後、上記のようにＧＣ分析により決定した。
【００８８】
【表３】
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aｄｃｗ：乾燥細胞重量
bＧＣ分析により決定。詳細については表２を参照のこと。
【００８９】
【表４】
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aｄｃｗ：乾燥細胞重量
bＧＣ分析により決定。詳細については表２を参照のこと。ポリマー中の４−ヒドロキシブチレート単位の存在を試験するために使用した標準物質はγ−ブチロラクトンであった。ポリマー中の３−ヒドロキシブチレート単位を試験するために使用した標準物質はポリ（３−ヒドロキシブチレート）であった。
【００９０】
【表５】
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ｎｄ−検出せず
aＧＣ分析により決定。詳細については表２を参照のこと。
bＤＳＣ分析により決定。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ１示差走査熱分析計を使用した。サンプル量は約４〜８ｍｇであった。使用した熱プログラムは以下の通りであった：２５℃、２分；１９５℃まで１０℃／分で昇温；１９５℃で２分間、保持；３００℃／分で−８０℃まで昇温；−８０℃で２分間保持；１０℃／分で１９５℃まで昇温。融解温度（Ｔｍ）およびこの融解ピークの融解エンタルピー（ｄＨＴｍ１）を第一加熱サイクルで決定した。ガラス転移温度（Ｔｇ）、結晶化温度（Ｔｘ）および融解温度（Ｔｍ２）を第二加熱サイクル中に決定した。
cＧＰＣ分析により決定。単離ポリマーをクロロホルム中に約１ｍｇ／ｍＬで溶解し、サンプル（５０μＬ）を、クロロホルム１ｍＬ／分の流速で、室温で屈折率検出器を使用するＷａｔｅｒｓ  Ｓｔｒｙａｇｅｌ  ＨＴ６Ｅカラムにクロマトグラフした。分子量を、狭い多分散性のポリスチレン標準物質と比較して決定した。
【００９１】
表６：Ｐ４ＨＢのインビトロでの分解。リン酸緩衝液（８ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭリン酸カリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、保存剤としてＮａＮ3を含有）中、３７℃でインキュベートしたＰ４ＨＢのフィルム、５０％多孔性および８０％多孔性サンプルの残存原型質量％および分子量
【００９２】
【表６】
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aＧＰＣ分析により決定。詳細については表３を参照のこと。
b定量的ＧＣ分析により決定。詳細については表２を参照のこと。
【００９３】
表７：Ｐ４ＨＢのインビボでの分解。ラットの皮下に移植したＰ４ＨＢのフィルム、５０％多孔性および８０％多孔性サンプルの残存原型質量％および分子量
【００９４】
【表７】
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Ｎ／Ｄ  検出せず
aＧＰＣ分析により決定。詳細については表３を参照のこと。
bＧＣ分析により決定。詳細については表２を参照のこと。外植片は、しばしば付着性組織または凝固した血液の存在のため原型移植片よりも重かった。従って、外植片におけるＰ４ＨＢの質量は定量的ＧＣ分析により決定した。Ｐ４ＨＢの残存重量％を、この重量の原型移植片による除算として求めた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ペンダント基の長さおよび個々の生合成経路に従って、広く群に分けたＰＨＡバイオポリマーの概略図である。
【図２Ａ】  図２Ａは、短いペンダント基のＰＨＡを導く経路の概略図である。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、長いペンダント基のＰＨＡを導く経路の概略図である。
【図３】  図３は、インビボでの経時的（数週間）なＰ４ＨＢ分解のグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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