(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス、石英及びシリカ系セラミックスの中から選ばれた不活性材料からなる基板表面に幅１０〜５００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、長さ１００〜３００ｍｍのマイクロチャネルを蛇行状に刻設し、次いでそのマイクロチャネルの壁面全体にわたって壁面に存在するシラノール基にアミノ基含有ケイ素化合物残基を導入したのち、無水コハク酸とＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとを反応させて、壁面にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させ、次いでこれに酵素分子を結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法。
【請求項２】
請求項１の方法により製造された、不活性材料からなる基体表面に、蛇行状に刻節された幅１０〜５００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、長さ１００〜３００ｍｍのチャネルの壁面全体にわたって酵素分子を固定させたマイクロリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素作用を有する新規なマイクロリアクターの製造方法及びその方法により得られるマイクロリアクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、化学分野、電気機械的分野において、径１０〜１００μｍのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている［「サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ），第２８５巻，第８３〜８５ページ」］。これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。
【０００３】
ところで、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。
【０００４】
他方、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。
したがって、マイクロリアクターについても触媒反応を効率よく行わせるためのマイクロチャネル構造を組み立てることが、これを実用化するために必要な要件となっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、触媒反応特に酵素反応を効率よく行うためのマイクロリアクターを提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酵素反応を効率的に行うためのマイクロリアクターを開発するために鋭意研究を重ねた結果、マイクロリアクターに設けたマイクロチャネルの壁面全体にわたって酵素分子を固定することにより、酵素反応に好適なマイクロリアクターが得られることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ガラス、石英及びシリカ系セラミックスの中から選ばれた不活性材料からなる基板表面に幅１０〜５００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、長さ１００〜３００ｍｍのマイクロチャネルを蛇行状に刻設し、次いでそのマイクロチャネルの壁面全体にわたって壁面に存在するシラノール基にアミノ基含有ケイ素化合物残基を導入したのち、無水コハク酸とＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとを反応させて、壁面にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させ、次いでこれに酵素分子を結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法、及びその方法により製造された、不活性材料からなる基体表面に、蛇行状に刻節された幅１０〜５００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、長さ１００〜３００ｍｍのチャネルの壁面全体にわたって酵素分子を固定させたマイクロリアクターを提供するものである。
ここで、マイクロチャネルとは、１０〜５００μｍの範囲の幅及び１０〜５００μｍの範囲の深さをもつ微小チャネルを意味する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のマイクロリアクターのベースとして用いられる不活性材料としては、ガラス、石英、又はシリカ系セラミックス、例えばＳｉ／ＳｉＯ2系セラミックスを挙げることができる。
【０００９】
次に、これらの不活性材料に設けるマイクロチャネルはマイクロドリルやレーザを用いる加工やエッチング処理により簡単に刻設することができる。このマイクロチャネルは幅１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍのサイズで刻設される。このマイクロチャネルの長さは、１００〜３００ｍｍの範囲で選ばれる。
【００１０】
次に、本発明においては、このように刻設されたマイクロチャネルの壁面全体にわたって酵素分子を固定することが必要であるが、これは例えば先ず不活性材料にそれと親和性を有するアミノ基含有化合物をマイクロチャネルの壁面全体と接触させて壁面にアミノ基含有化合物残基を導入したのち、これに酵素分子を反応させ、固定することによって行うことができる。
【００１１】
すなわち、ガラスや石英や、シリカ、Ｓｉ／ＳｉＯ2のようなシリカ系セラミックスに、アミノプロピルシランのようなアミノ基含有ケイ素化合物を反応させ、マイクロチャネル壁面のシラノール基にこの化合物の残基を導入し、この残基中のアミノ基に酵素分子を結合させて固定することができる。
【００１２】
このアミノ基に酵素分子を結合させる方法としては、酵素分子中の酵素機能を有しないアミノ基又は水酸基に無水コハク酸を介して壁面に形成させたＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを結合させる。
【００１３】
このようにして、マイクロチャネルの壁面全体にわたってアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼなどの酵素を固定させることができる。
このようにして、酵素分子を固定したマイクロチャネルを設けられた固体ベースは、必要に応じ透明板で被覆し、マイクロリアクターとして用いる。
【００１４】
図１は、このようにして得た本発明のマイクロリアクターの拡大平面図であって、不活性材料からなる基板１にマイクロチャネル２が蛇行して刻設され、このマイクロチャネル２の壁面には、酵素分子が固定されている。
このようなマイクロリアクターを用いて酵素反応を行うには、第一シリンジ３及び第二シリンジ４から溶媒に溶解した２種の反応体をマイクロチャネル２に注入し、マイクロチャネル２を通過中に、その壁面に固定した酵素の作用により、両者を反応させる。反応により生成した目的物を含む反応混合物は受器５に集められ、必要に応じ外部に取り出される。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
Ｓｉ／ＳｉＯ2ウエハー基板（３０×３０×５ｍｍ）上に、マイクロドリルを用いて、幅４００μｍ、深さ４００μｍ、長さ２００ｍｍのチャネルを蛇行状に刻設し、このチャネル上をガラス板で被覆することにより、マイクロチャネル構造をもつマイクロリアクター基板を製造した。
次に、これを濃硫酸と３０％過酸化水素水との混合物（体積比７：３）１リットル中に１２時間浸漬してチャネル内を洗浄し、壁面に付着した有機物を分解、除去したのち、超純水で洗浄した。
【００１７】
次いで、３‐アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランとの混合物（体積比２：８）を９５％エチルアルコールに溶解して、３体積％溶液１リットルを調製し、この中に上記のマイクロリアクター基板を浸漬し、１時間処理したのち、エチルアルコールで洗浄し、窒素気流下１１５℃で１時間乾燥した。
このようにして得たマイクロリアクター基板のチャネル内に無水コハク酸のＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド溶液（１ミリモル／リットル）を満たし、３０分間反応させたのち、この溶液を排出させ、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドで十分に洗浄した。
【００１８】
次に１‐エチル‐３‐（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとをＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中に、それぞれ濃度１ミリモル／リットルで混合して処理液を調製し、これをマイクロチャネル内に注入し、反応させることによりＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを壁面に形成させた。
豚すい臓由来の酵素リパーゼをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に濃度が１００ミリグラム／ミリリットルになるように溶解し、上記活性エステルを結合したマイクロチャネル内に注入し、１２時間反応させてリパーゼを固定させることにより、マイクロリアクターを製造した。
【００１９】
実施例２
実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内を表面処理した後でＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを結合させた。次に、酵素α‐キモトリプシンをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）濃度に１００ミリグラム／ミリリットルになるように溶解し、上記の活性エステルを結合したマイクロリアクターに注入し、１２時間反応させ、α‐キモトリプシンを固定させることによりマイクロリアクターを製造した。
【００２０】
実施例３
実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内を表面処理した後にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを結合させた。次に豚すい臓由来の酵素トリプシンをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に濃度１００ミリグラム／ミリリットルになるように溶解し、上記活性エステルを結合したマイクロリアクターに注入し、１２時間反応させ、トリプシンを固定させることによりマイクロリアクターを製造した。
【００２１】
実施例４
実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内を表面処理した後でＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを結合させた。次にウサギ筋肉由来のＬ‐乳酸脱水素酵素をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に濃度１００ミリグラム／ミリリットルになるように溶解し、上記活性エステルを結合したマイクロリアクターに注入し、１２時間反応させ、Ｌ‐乳酸脱水素酵素を固定することによりマイクロリアクターを製造した。
【００２２】
参考例１
実施例１で得たリパーゼを固定化したマイクロリアクターを用いて、７‐アセトキシクマリンの加水分解による７‐ヒドロキシクマリンへの変換反応を行った。１００マイクロモル／リットルの濃度に調製した７‐アセトキシクマリンのリン酸緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に注入した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、図２に示すように滞留時間１分で９５％の反応収率を得た。
【００２３】
参考例２
実施例２で得たα‐キモトリプシンを固定化したマイクロリアクターを用いて、ベンゾイルチロシンパラニトロアニリドの加水分解によるパラニトロアニリンの生成反応を行った。１００マイクロモル／リットルの濃度に調製したベンゾイルチロシンパラニトロアニリドのリン酸緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に注入した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、滞留時間１分３０秒で１００％の反応収率を得た。
【００２４】
参考例３
実施例３で得たトリプシンを固定化したマイクロリアクターを用いて、ベンゾイルアルギニンパラニトロアニリドの加水分解によるパラニトロアニリンの生成反応を行った。１ミリモル／リットルの濃度に調製したベンゾイルアルギニンパラニトロアニリドのリン酸緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に注入した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、滞留時間２分で１００％の反応収率を得た。
【００２５】
参考例４
実施例４で得たＬ‐乳酸脱水素酵素を固定化したマイクロリアクターを用いて、ピルビン酸の還元によるＬ‐乳酸の生成反応を行った。１００マイクロモル／リットルの濃度に各々調製したピルビン酸とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのリン酸緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に各々注入した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、滞留時間２分で１００％の反応収率を得た。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によると、酵素反応に適したマイクロリアクターが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明マイクロリアクターの拡大平面図。
【図２】  参考例１における滞留時間と反応収率との関係を示すグラフ。
【符号の説明】
１  基板
２  マイクロチャネル
３，４  シリンジ
５  受器
【図１】
0004352119.tif 000002
【図２】
0004352119.tif 000003