(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号３６のペプチド又はポリペプチドの少なくとも２つの変異体であって、
式中、それぞれの変異体がＹに異なるアミノ酸残基を有し、
ＹがＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｓｎからなる群から選択され、
Ｒ１が不在であるか、又は、１〜５の追加のアミノ酸配列であり、
Ｒ２が不在であるか、又は、１〜１４の追加のアミノ酸配列である、
前記少なくとも２つの変異体を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、−Ｘ−Ｐｒｏ−であり、ＸがＧｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ２が、−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−  配列番号１０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１１；
Ｒ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１２；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１３；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１４；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１５；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１６；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｒ２  配列番号１７；及び
Ｒ１−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号６；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号７；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号８；及び
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２  配列番号９からなる群から選択される、３つ又は４つの前記変異体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
以下の式：
Ｒ３−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ  配列番号３７（式中、ＸはＧｌｙ又はＡｌａからなる群から選択され；Ｒ３は不在であるか又は１〜５の追加のアミノ酸の配列である）
のペプチド又はポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＸがＧｌｙである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＸがＡｌａである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ３が不在である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチド又はポリペプチドが合成的に製造される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチド又はポリペプチドが組換え的に製造される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドのそれぞれがアミノ末端のアミノ酸上で低級アルキル又は低級アルカノイルによって化学的に修飾される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドのそれぞれのカルボキシ末端アミノ酸がアミドで修飾される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドの１つ以上が担体タンパク質に結合した合成ペプチドとして発現される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドの１つ以上が、多重抗原性ペプチドとして発現される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが担体タンパク質に結合している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
選択されるペプチドが、組換え的に製造されるタンパク質内又は融合タンパク質内に発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
選択された各ペプチドがスペーサーで分離されている、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質又は融合タンパク質が担体タンパク質に結合している、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記担体タンパク質がＥ．ｃｏｌｉのＤｎａＫタンパク質、ＧＳＴタンパク質、ミコバクテリアの熱ショックタンパク質７０、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ガラクトキナーゼ、ユビキチン、α−交配因子、β−ガラクトシダーゼ及びインフルエンザＮＳ−１タンパク質からなる群から選択される、請求項１４、１６又は１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の前記変異体、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
【請求項２２】
前記ペプチド又はポリペプチドをコードする前記核酸の配列が、宿主細胞においてその産物の発現を指令及び制御する調節的な核酸配列と作動可能に連結された、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
プラスミドである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸の配列の多重コピーを宿主細胞内で発現し得る組換えウイルスであって、前記ウイルスがヒトに対して非病原性である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
ＤＮＡワクチンである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
単離された複数の抗体を含む抗体組成物であって、各抗体が請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の変異体、ペプチド又はポリペプチドに向けられており、ここで前記抗体組成物が多数のＨＩＶ−１株及びサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と結合し得る抗体を含む、前記抗体組成物。
【請求項２７】
多重抗体を含み、各抗体が請求項５の組成物のペプチド及びポリペプチドの異なる変異体に結合する、請求項２６に記載の抗体組成物。
【請求項２８】
請求項６の組成物のペプチド又はポリペプチドに結合し得る抗体を少なくとも１つ含む、請求項２６に記載の抗体組成物。
【請求項２９】
各前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ハイブリドーマ若しくはコンビナトリアルライブラリー又は抗体ファージディスプレイをスクリーニングすることによって創出される抗体、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項２６に記載の抗体組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物を製剤的に許容される担体中に含む、多数の株及びサブタイプのＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と反応する抗体の誘導に有用な医薬組成物。
【請求項３１】
さらにアジュバントを含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物で感染又はトランスフェクトされた培養された哺乳類の宿主細胞。
【請求項３３】
（ａ）請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記培養物から、請求項１〜９のいずれか１項中に定義したペプチド又はポリペプチドを単離すること、
を含む、ペプチド又はポリペプチドを製造するための方法。
【請求項３４】
ＨＩＶ−１の多数の共通Ｂサブタイプ及び非Ｂサブタイプに由来するＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に結合するＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質抗体を患者において能動的に誘導するための医薬の製造における、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
ＨＩＶ−１感染への有効又は迅速な免疫応答を展開することができない患者における受動免疫治療に用いられる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、症候性又は無症候性の感染患者におけるヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の増殖を阻害すること、及び感染経験の無い被検者の一次感染時におけるＨＩＶ−１増殖を緩和してＡＩＤＳへの進行を最少化するのに有用な組成物及び方法に関する。
背景技術
血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の疾患であるＨＩＶ−１一次感染時には、高血漿レベルのヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ＲＮＡが見出される［Ｃ．Ｂａｕｍｂｅｒｂｅｒら、ＡＩＤＳ，７：（補遺２）：Ｓ５９（１９９３）；Ｍ．Ｓ．Ｓａａｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：６２５（１９９６）］が、その後それは免疫応答が感染を様々な程度に抑制するにつれて沈静化する。血清変換の後では、より低いが検出可能なレベルの血清ＨＩＶ−１ＲＮＡが存在していて、このレベルは疾患の進行につれて上昇し、ＡＩＤＳの段階になると最高レベルに到達する［Ｍ．Ｓ．Ｓａａｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：２６５（１９９６）］。
【０００２】
血清変換の時には約５０％の患者が症候性の疾患を有していて［Ｂ．ＴｉｎｄａｌｌとＤ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，ＡＩＤＳ，５：１（１９９１）］、症候性の血清変換がＡＩＤＳ発症の高リスクと関連しているのは、重篤な主要疾患が恐らくはＨＩＶの初期の広汎な広がりに関連しているためであろう。
【０００３】
初期感染時にウイルス増殖を阻害すれば、ＡＩＤＳにつながるその後の慢性ウイルス血症の発症が抑えられるだろう。汚染された血液のついた針で刺すこと又はＨＩＶに感染した母親の妊娠のような「リスクがある」と定義された状況に対して抗ウイルス薬を投与する現代の医療はこのコンセプトを支持する。
【０００４】
血清変換後の血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡレベルは、ＡＩＤＳへの進行の可能性を最も強力に予知するものであることが証明されている［Ｊ．Ｗ．Ｍｅｌｌｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：１１６７（１９９６）：Ｍ．Ｓ．Ｓａａｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：２６５（１９９６）；Ｒ．Ｗ．Ｃｏｏｍｂｓら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１７４：７０４（１９９６）：Ｓ．Ｌ．Ｗｅｌｌｅｓら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１７４：６９６（１９９０）］。細胞性ＲＮＡ［Ｋ．Ｓａｋｓｅｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１０４（１９９４）及び細胞性ＨＩＶプロウイルスＤＮＡ［Ｔ−Ｈ．Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，７：３８１（１９９４）］のような他のウイルス負荷測定も同様に、その後の疾患進行を決定するウイルス負荷を確証することにおける初期感染の重要性を立証する。
【０００５】
従って、初期感染のときにＨＩＶ−１の感染性を阻害する及び／又は血清変換後のウイルス負荷を低下させるどんな介入もＡＩＤＳへの進行を遅延するか又は防止して、最終的な結果に好ましい影響を及ぼす。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に感染した患者を治療するために、プロテアーゼ阻害剤の複合療法を包含する、多種多様な治療法が利用されている。しかしながら、残念なことに、このタイプの治療法はある患者には重篤な副作用の原因となっている。別のやり方では、非感染者に対するＨＩＶ−１の伝播をコントロールするためにワクチンが開発されている。しかし、この営為が主として、被感染細胞の消滅に関わる細胞毒性的なＴ細胞によって認識される被感染細胞の表面に発現されるウイルスのタンパク質に向けられきた一方で、フリーなウイルスは、ウイルス粒子の表面抗原に対する抗体によって阻止され一掃されている。この形式の予防接種の限界はＨＩＶ−１とってすぐに明らかである。免疫原のウイルスエピトープに著しい多様性があり、個人の内部及び個人間で急速な突然変異の起こることが示されているからである［Ｂ．Ｄ．Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１６８（１９８８）；Ｊ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１７１（１９８８）；Ａ．Ｒ．Ｍｅｙｅｒｈａｎｓら、Ｃｅｌｌ，５８：９０１（１９８９）；Ｋ．Ｋｕｓｕｍｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６６：８７５（１９９２）；Ｂ．Ａ．Ｌａｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１７３１（１９８９）；Ｍ．Ｓ．Ｓａｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２９：１０６５（１９９３）；Ｍ．Ａ．Ｓａｎｄｅら、ＪＡＭＡ，２７０：２５８３（１９９３）；Ｍ．Ｓｅｌｉｇｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ，３４３：８７１（１９９４）；Ｇ．Ｍｅｙｅｒら、Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９３，Ｉ−Ｖ．Ａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ロスアラモス、ＮＭ．］。
【０００７】
ＨＩＶ−１株の変異及びウイルスタンパク質の頻繁な突然変異は、従来のワクチンアプローチの成功する応用を阻んできた［Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，Ｃｅｌｌ，８２：１７７（１９９５）；Ｊ．Ｅ．Ｏｓｂｏｒｎ，Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，９：２６（１９９５）］。突然変異及び抵抗性変異体を選別することは、成功するＨＩＶ−１ワクチンの開発における中心的な問題である［Ｍ．Ｄ．Ｄａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１９３８（１９９２）；Ｎ．Ｌ．Ｌｅｔｖｉｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２９：１４００（１９９３）；Ｍ．Ｃｌｅｒｉｃｉら、ＡＩＤＳ，８：１３９１（１９９４）；Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｉｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：５３７（１９９６）］。
【０００８】
ＨＩＶ−１治療に対する他のアプローチは、ウイルスの転写に必須なタンパク質（Ｔａｔ）を産生するＨＩＶ−１のトランス活性化（ｔａｔ）遺伝子に集中してきた。ｔａｔ遺伝子及びそのタンパク質は配列決定され、ＨＩＶ−１の提案された治療法との関わりが検証されてきた［例えば、米国特許第５，１５８，８７７号；米国特許第５，２３８，８３２号；米国特許第５，１１０，８０２号；国際特許出願第ＷＯ９２／０７８７１号（１９９２年５月１４日公開）；国際特許出願第ＷＯ９１／１０４５３号（１９９１年７月２５日公開）；国際特許出願第ＷＯ９１／０９９５８号（１９９１年７月１１日公開）；国際特許出願第ＷＯ８７／０２９８９号（１９８７年５月２１日公開）を参照のこと］。Ｔａｔタンパク質は細胞外に遊離され、他の被感染細胞に取込まれてその細胞内のＨＩＶ−１の転写を増強したり、非感染細胞に取込まれて宿主細胞の遺伝子を活性化しウイルスによる感染にその細胞を罹りやすくする。細胞によるＴａｔの取込みは非常に強く、このタンパク質の短い基本配列によって仲介されていると報じられている［Ｓ．Ｆａｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：６６４−６６８（１９９４）］。
【０００９】
１９９２年９月３日に公開された国際特許出願第ＷＯ９２／１４７５５号は、Ｔａｔタンパク質及びＴａｔタンパク質に結合し得るインテグリン細胞表面受容体に関する。インテグリンに結合する２つのＴａｔ配列が同定され、それは主なインテグリン結合部位である基本領域又はドメインであって、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］並びに−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］というペプチド配列を有する。この明細書は、このＴａｔ配列に対応する多くのペプチド及び対応するインテグリンが、適当なインテグリンに対する抗体のように、細胞がＴａｔ被覆プレートへ結合することをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止することを示している。しかしながら、この明細書はまたこれらの試薬が細胞による機能性Ｔａｔの取込みを阻止しないことも示し（ＷＯ９２／１４７５５号の実施例９を参照のこと）、ＨＩＶ−１感染における治療ベネフィットに対して提起された作用機序を無効にしている。この国際出願に記載されたＴａｔ配列は本発明のペプチド免疫原とは異なっている。
【００１０】
Ｔａｔタンパク質に対するモノクローナルとポリクローナル抗体はいずれも動物で容易に産生され、Ｔａｔタンパク質の取込みをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止することが示された［例えば、Ｄ．Ｂｒａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，９６２（１９９０）；Ｄ．Ｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：１７３３（１９９１）；Ｊ．Ａｂｒａｈａｍら、上掲；Ｐ．Ａｕｒｏｎら、上掲；Ｍ．Ｊａｙｅら、上掲；Ｇ．Ｚａｕｌｉら、上掲、を参照のこと］。さらに最近の報告は、組織培養基へ加えたＴａｔタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体がＨＩＶ−１感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減弱化することを示した［Ｌ．Ｓｔｅｉｎａａら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３９：２６３（１９９４）；Ｍ．Ｒｅら、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１０：４０８（１９９５）；及びＧ．Ｚａｕｌｉら、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１０：３０６（１９９５）］。
【００１１】
発明者自身の公表物［Ｇ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：９６０（１９９６）；また、１９９５年１１月３０日に公開された国際特許出願第ＷＯ９５／３１９９９号も参照のこと］は、被感染細胞からのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の分泌及び被感染細胞と非感染細胞のいずれにもよるその取込みがＨＩＶ−１の感染性にとって重要であることを示す証拠を検討した。以前の研究は、Ｔａｔタンパク質に対する抗体がＴａｔの取込みをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止しｉｎ  ｖｉｔｒｏの感染性を阻害することも示した。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎは、哺乳動物を能動免疫して、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質に対する抗体を潜在力あるＡＩＤＳワクチンとして誘導することを提唱した。
【００１２】
ＨＩＶ−１の疾患進行に関する知識が増しているにもかかわらず、当技術分野には、予防的及び治療的にＨＩＶ−１を処置するための組成物及び方法の開発に対するニーズが残っている。それは、続発し、一般には致死的であるＡＩＤＳ疾患の治療及び可能ならば予防のためにＨＩＶ−１のウイルスレベルを低下させるのに有用なのである。
発明の要約
１つの側面では、本発明はペプチド又はポリペプチドを含む新規な組成物を提供し、それはエピトープＩ：Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６］（ここでＹは様々にもＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎである）として言及される式から選択されるアミノ酸配列を含む。Ｎ−末端のＲ１は水素（即ち、修飾されていないＮ末端アミノ酸上の水素）であるか又は低級アルキル又は低級アルカノイルを表し得る。Ｒ１はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約５のアミノ酸配列を包含し得る。１つの態様では、Ｒ１は−Ｘ−Ｐｒｏ−であり、ここでＸはＧｌｕ又はＡｓｐである。好ましくは、Ｒ１は２つのアミノ酸を表す。Ｃ末端のＲ２はまたＣ末端アミノ酸上のヒドロキシル基又はアミドを表し得る。力価を高めるためには、Ｒ２は好ましくはカルボキシル末端でアミド化された１〜約１４の追加的なアミノ酸である。好ましい態様では、Ｒ２は−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０］である。本組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成的に又は組換え的に産生される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの１つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の既知変異体の９５％より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【００１３】
もう１つの側面では、上記組成物はさらに、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のアミノ酸残基２又は４〜１０に対応する他のアミノ酸配列を表す１つ又はそれより多い追加的なペプチド又はポリペプチドを含有する。これらの所望されるアミノ酸配列は以下に詳しく記載される。これらの配列は、好ましくはその位置にＴａｔタンパク質変異を有するＨＩＶ−１株からのものである。
【００１４】
他の側面では、本発明はエピトープＩＩ：Ｒ３−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｒ４［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７］として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む新規な組成物を提供する。この式によれば、ＸはＧｌｙ又はＡｌａである。Ｎ−末端のＲ３は水素（即ち、修飾されていないＮ末端アミノ酸上の水素）を表し得るか又は低級アルキル又は低級アルカノイルであり得る。Ｒ３はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約５のアミノ酸配列を包含し得る。Ｃ末端のＲ４はＣ末端アミノ酸のフリーなヒドロキシル基又はアミド、又は所望によりアミドで置換された１〜約５までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。本組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成又は組換えによって産生されるが、組換えエピトープＩＩペプチドは組換えタンパク質のＣ末端に位置している。本組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの１つ又はそれより多くの形態をとり得る。本組成物は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の既知変異体の約９５％より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【００１５】
さらに別の側面では、本発明はエピトープＩＩＩ：Ｒ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｒ６［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８］として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む組成物を提供するが、ここでＸはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｎからなる群から選択され、ＹはＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＳｅｒからなる群から選択され、ＺはＰｒｏ及びＨｉｓからなる群から選択され、ＡはＧｌｎ及びＰｒｏからなる群から選択される。Ｎ末端のＲ５は水素、低級アルキル又は低級アルカノイルであるか又は所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約３のアミノ酸である。好ましい態様ではＲ５は所望により上記のように修飾された−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−である。Ｃ末端のＲ６はフリーなヒドロキシルか又はアミドである。そのような組成物の好ましい態様は少なくとも３つのエピトープＩＩＩペプチド、即ち所望により上記のように修飾された、−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５４−６２）、−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５のアミノ酸２−１０）及び−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸２６４−２７２）を含有する。Ｔａｔのアミノ酸５６−６２を代表するが、上記式の配列とは異なる配列を有する他のペプチド又はポリペプチドもその組成物に包含され得る。これら組成物のペプチド又はポリペプチドは合成的に又は組換え的に製造される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの１つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の既知変異体の約７５％より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【００１６】
さらに別の側面では、本発明はエピトープＩＶ：Ｒ７−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｒ８［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９］として言及される式のペプチド又はポリペプチドを含む組成物を提供し、ここでＸはＡｓｎ及びＴｈｒからなる群から選択され、ＹはＡｌａ及びＶａｌからなる群から選択される。Ｎ−末端のＲ７は水素、低級アルキル、低級アルカノイル、又は所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約３のアミノ酸配列であり得る。Ｃ末端のＲ８はまたフリーのヒドロキシル基、アミド又は所望によりアミドで置換された１〜約３までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。好ましいエピトープＩＶペプチドは、−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０］である。これら組成物のペプチド又はポリペプチドは、合成的に組換え的に産生される。この組成物は、担体に結合した合成ペプチドとして発現されるか又は多重抗原性ペプチドとして発現される上記ペプチドの１つ又はそれより多くの形態をとり得るか、又は選択されるペプチドは組換え的に産生されるタンパク質の内部に発現され得る。この組成物は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の既知変異体の６４％より多くと反応する抗体を誘導するように設計されている。
【００１７】
さらに別の側面では、本発明は、１つ又はそれより多くのエピトープＩＩペプチド及び／又は１つ又はそれより多くのエピトープＩＩＩペプチド及び／又は１つ又はそれより多くのエピトープＩＶペプチドと複合した１つ又はそれより多くのエピトープＩを含むペプチド又はポリペプチドを含有する上記の組成物を提供する。そのような組成物は、知られているすべてのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の約９９％より多くと反応する抗体を誘導する組成物を提供するように、適切なエピトープペプチドを複合し得る。
【００１８】
また別の側面では、本発明は、上記に定義された少なくとも１つのエピトープＩアミノ酸配列を所望によりカルボキシ末端のエピトープＩＩとともに含有するか又は少なくとも２つのエピトープＩアミノ酸配列を含有するペプチド又はポリペプチドを連続的にコードする合成遺伝子を提供する。この合成遺伝子はスペーサー遺伝子によって分離された各アミノ酸配列を含有し得るか又は担体タンパク質とのオープンリーディングフレームにおいて各ペプチド／ポリペプチドを発現し得る。この合成遺伝子は、スペーサーがエピトープＩ配列に融合していれば、エピトープＩＩ配列を組換えタンパク質のカルボキシ末端にして、スペーサーによって担体タンパク質から分離され得る。さらなる態様は、一緒に及び担体タンパク質に融合した多数のエピトープＩペプチドを包含する。
【００１９】
また別の側面では、本発明は合成分子、例えば宿主細胞において上記合成遺伝子の産物の発現を指令及び制御する調節的な核酸配列と機能的に連結した合成遺伝子を含むベクターを提供する。
【００２０】
また別の側面では、本発明は上記合成遺伝子又は合成分子を含有する組換えウイルスを提供するが、このウイルスは宿主細胞においてこの遺伝子又は分子の産物の多重コピーを発現し得る。このウイルスはヒトに対して非病原性である。
【００２１】
さらに別の側面では、本発明は上記の合成遺伝子又は合成分子を含有する共生細菌を提供するが、この細菌はこの遺伝子又は分子の産物の多重コピーを発現し哺乳類の細胞において抗体を誘導し得る。
【００２２】
さらに別の側面では、本発明は上記組成物のペプチド又はポリペプチドに対して向けられている単離された抗体の組成物を提供する。抗体は又上記組成物の多重成分に対しても獲得され得る。この抗体は、本発明のペプチド／ポリペプチド組成物、本発明の合成遺伝子又は合成分子、本発明の組換えウイルス又は共生細菌で哺乳動物を免疫化し、前記免疫された哺乳動物から抗体を単離して精製することによって産生される。別のやり方では、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はそれらの混合物であり得る。
【００２３】
従って、本発明のもう１つの側面は、既知のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９５％より多く、好ましくは９９％より多くと反応する抗体を誘導するのに有用な医薬組成物である。この誘導された抗体はＨＩＶ−１の増殖を抑え得る。この医薬組成物は、上記の組換え又は合成ペプチド／ポリペプチド組成物、上記の合成遺伝子／分子、本明細書に記載される組換えウイルス、又は本明細書に記載される共生細菌の少なくとも１つを、製剤的に許容される担体において含む。
【００２４】
本発明のさらに別の側面は、上記の抗体組成物を含有する、ＨＩＶ−１の増殖を抑えるのに有用な医薬組成物である。
【００２５】
本発明のさらなる側面では、ＨＩＶ−１のウイルスレベルを減少する方法は、上記の抗体誘導性の医薬組成物へヒトをさらすこと、ほとんどのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質と反応する抗体を能動的に誘導すること及びこのウイルスの増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで抑えることを含む。この方法は、十分な免疫系を有するＨＩＶ−１感染患者又は非感染又はごく最近感染した患者に対して適切である。この方法はＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質と反応する抗体を誘導し、この抗体がＨＩＶ−１初期急性感染時のウイルス増殖を減少させ、ＡＩＤＳに導く慢性のウイルス血症を最少化する。
【００２６】
さらにもう１つの側面では、本発明は、ＨＩＶ−１の感染に有効又は迅速な免疫応答を発動することができないヒトへ、上記の抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することによってＨＩＶ−１のウイルスレベルを減少させる方法を提供する。この方法は本組成物を慢性的に投与することを含み得る。
【００２７】
本発明のまた別の面は、上記の組成物並びにそのような組成物でトランスフェクトされた宿主細胞を生産する方法を包含する。
【００２８】
本発明のさらに別の側面は、上記組成物での予防接種により誘導された抗体の力価及び特異性の測定及び検出に有用なキットである。本発明のキットはエピトープＩ〜ＩＶのペプチド、及び被覆された固体支持体、これらのペプチドに対する抗体の結合を検出するための標識試薬、この標識によってもたらされるシグナルを励起又は検出するための様々な基質及び器具、並びに血液サンプルをとるための従来器具、適切なバイアル及び他の診断アッセイ成分を包含する。
【００２９】
さらなる側面では、本発明は、本発明の組成物で予防接種した患者の抗体の力価及び反応性を検出するための方法を提供する。この方法は、患者の生物学的体液、例えば血清の希釈液を、エピトープ１〜ＩＶの１つ又はそれより多くのペプチドが結合したプレート又はビーズとインキュベートすること、非結合性の生物学的材料を洗い流すこと、及び標識試薬、例えば酵素に結合した抗ヒト免疫グロブリンでこのペプチドに結合した所望の抗体を測定すること、という工程を包含する。利用される標識のタイプによって、標識によって産生されるシグナルは、酵素と反応する基質をさらに加えて、例えば色の変化を起こすことによって励起され得る。他の従来的な標識もこのアッセイ設計に取込まれ得る。
【００３０】
本発明の他の側面及び利点はその好ましい態様の以下の詳細な記載においてさらに記載される。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫原に対する免疫応答をまだ発動し得る非感染者又は感染初期の患者に抗体、つまり既知のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質変異体の９５％より多く、好ましくは９９％より多くと反応する抗体を誘導する組成物を提供することによって、上記の問題に対する解答を提供する。誘導された抗体はＨＩＶ−１の増殖を阻害することができる。このことがＡＩＤＳへのさらなる疾患の進行を防止する。抗体組成物はまた、ＨＩＶ−１感染への有効又は迅速な免疫応答を発動し得ない感染者又は非感染者における使用にも提供される。これら組成物はＴａｔタンパク質の９５％より多く、好ましくは９９％より多くと反応し、ＨＩＶ−１のウイルスレベルを減少させることができる。これら抗体は、免疫学的に独特なＴａｔタンパク質を感染時に産生するＨＩＶ−１にさらされたか又は感染された大きな人口集団におけるＡＩＤＳの進展をコントロールする治療と予防の両方のコンテクストにおいて有用である。
【００３１】
あるＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープによってもたらされるペプチドに基づいた、本発明の組成物は、タンパク質様の性質であるか、又はＴａｔへの抗体を誘導し、次いでＨＩＶ−１の増殖を抑えるペプチド及びポリペプチドをコードする核酸組成物であり得る。
【００３２】
ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質は２つのエクソンから産生される：エクソン１は７２のアミノ酸（ａａ）タンパク質（図１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照のこと）をコードし、これはスプライシングせずに発現され得るか又は約１０１のアミノ酸ペプチドを産生するエクソン２によってコードされる約２９のアミノ酸ペプチドをスプライスされ得る。エクソン１の７２アミノ酸産物はそれだけで細胞の取込み及び活性化が可能なので、抗体がこの７２アミノ酸ペプチドと反応し、その細胞内輸送を阻止することが必須である。ＨＩＶ−１Ｔａｔはエクソン１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２］のアミノ酸２２位及び３７位にＣｙｓを、及びこれらの間に５つの追加的なＣｙｓを含有する。このペプチド領域はＣｙｓリッチ領域と命名され、複雑な三次構造を産生するＣｙｓ−Ｃｙｓ共有結合を有する。科学文献はこの領域は免疫原ではないらしいと示している。
【００３３】
発明者は、エピトープ、即ちエクソン１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］又は他のＴａｔ配列変異体におけるＮ末端の直線配列１〜２１（２２ａａ）及びＣ末端の直線配列３８〜７２（３５ａａ）のなかに抗体（抗原性の配列）によって認識される結合領域を同定した。このより大きな配列の免疫原性領域が発明者によって同定され、以下のエクソン１のＮ末端及びＣ末端コンセンサス配列において下線を施されている：エピトープＩはエクソン１のアミノ酸２〜１０位の９アミノ酸配列として同定された。エピトープＩＩはエクソン１のアミノ酸４１〜５１位の１１アミノ酸配列として同定された。エピトープＩＩＩはエクソン１のアミノ酸５６〜６２位の７アミノ酸配列として同定された。エピトープＩＶは、エクソン２の最初のＰｒｏ（アミノ酸７３）及びエピトープＩＩＩに重なるＳｅｒ６２（点の下線）を包含する、Ｔａｔのアミノ酸６２〜７３位の１２アミノ酸配列として同定された。
【００３４】
【化１】
0004278293.tif 000002
【００３５】
「Ｔａｔ配列変異体」という用語は、Ｔａｔタンパク質アミノ酸残基を含有するポリペプチド又はペプチド、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列と実質的に同等である他のＨＩＶ−１株のＴａｔタンパク質に由来する配列を意味する。それぞれの変異体は、図１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］のコンセンサス配列及び／又は他の変異体から、エピトープＩ〜ＩＶの関心対象の残基内の少なくとも１つのアミノ酸変化によって区別され得る。この変化は、本発明の組成物へ加えられるとき、特定のＴａｔエピトープに対して同じか又は異なる抗原特異性を提供し得る。
【００３６】
Ａ．エピトープＩ免疫原性組成物
従って、１つの態様では、本発明は天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを含有し、１つ又はそれより多くのエピトープＩアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープＩ配列は、エピトープＩ配列にｉｎ  ｖｉｖｏでさらされた哺乳動物において（本発明の目的のために）特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープＩアミノ酸配列は、数多くの「Ｔａｔ配列変異体」に由来する図１のＴａｔコンセンサス配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］のアミノ酸残基２〜１０又は４〜１０に対応する。
【００３７】
エピトープＩは、Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６］という一般式のペプチドと定義される。Ｎ末端のＲ１は修飾されていないＮ末端アミノ酸のＶａｌ上の水素を表し得るか、又はＲ１はＶａｌに結合した低級アルキル又は低級アルカノイルであり得る。Ｒ１はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約５のアミノ酸配列を包含し得る。１つの態様では、Ｒ１は−Ｘ−Ｐｒｏ−であり、ここでＸはＧｌｕ又はＡｓｐである。Ｃ末端のＲ２はまたＣ末端アミノ酸のＰｒｏ上のヒドロキシル基を表し得るか、Ｒ２はＰｒｏ上のアミドであり得る。別のやり方では、Ｒ２は、所望によりカルボキシル末端でアミド化された１〜約１４の追加的なアミノ酸配列であり得る。Ｘ及びＹの位置はこのエピトープペプチドの共通変異体を表し、ここでＸはＧｌｕ（９０％）又はＡｓｐ（１０％）であり、Ｙは様々にもＡｒｇ（７４％）、Ｌｙｓ（１１％）、Ｓｅｒ（９％）又はＡｓｎ（４％）である。Ｘ位にＧｌｕ又はＡｓｐを含有するペプチドは他の変異体と有効に交叉反応する抗体を誘導する。別のやり方では、Ｘ−Ｐを省略するペプチドは、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４〜１０）に対する抗体を有効に誘導する。式Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６］という望ましい免疫原が既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９５％より多くと反応する／交叉反応するのに対し、式Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７］という免疫原は、既知のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９７％より多くと反応する／交叉反応する。
【００３８】
４つのＹ位変異体すべてに対する抗体がこの４つすべてを免疫原として使用することによって産生される。別のやり方では、交叉反応性によって、免疫する配列を２つ又は１つにさえ減らして４つのＹ位変異体すべてに対して反応を誘導することができる。以下の実施例で詳しく論じられるように、エピトープＩ含有ペプチド：Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８］（ここでＹはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎである）によって誘導される抗体の反応性を以下の表１に報告する。暗いシェードは自己反応性を示し、薄いシェードは顕著な（４０％以上）交叉反応性を示す。
【００３９】
【表１】
0004278293.tif 000003
【００４０】
本発明の組成物は、好ましくは以下のエピトープＩペプチド又はポリペプチドの１つ又はそれより多くを含有する：
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９］。
【００４１】
上に示したように、ＹがＬｙｓである免疫原［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］は、他の３つの変異体と良好な反応性を有する抗体を誘導する。ＹがＳｅｒである変異体と良好な交叉反応性の有る高力価の抗体を誘導した免疫原はなかった。従って、ＹがＬｙｓであったエピトープＩの免疫原［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］は４つのＹ位変異体すべてに対して十分な交叉反応性を有し、単独で免疫原性の組成物に使用され得る。ＹがＬｙｓであるペプチドのこの反応パターンは今日までのテストの大部分で出現するが、あるテストサンプルでは交叉反応性において上記結果とは異なることが起こり得ると当業者は期待すべきである。
【００４２】
別のやり方では、本発明の組成物はこれらアミノ酸配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９］の２つ、３つ又は４つすべてを含む。別に、ＹがＬｙｓであるエピトープＩ免疫原及びＹがＡｓｎ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］のエピトープＩ免疫原の複合物は、ＹがＳｅｒであるか又はＹがＡｓｎであるエピトープＩ変異体に対してやや優れた力価を提供する。
【００４３】
さらに別のエピトープＩペプチド免疫原はＹの位置にオルニチンを含有するが、これはオルニチンの側鎖が１つ−ＣＨ2−が少ないリジンに似ているからである。このエピトープＩ配列はさらに大きい交叉反応性を提供し得て、単独又は他のエピトープＩ免疫原と組み合わせて使用され得る。
【００４４】
上記エピトープＩの式によると、反応性のあるエピトープＩの最少配列を形成する７つのアミノ酸残基に他のアミノ酸が隣接され得て、全エピトープＩ配列の長さは７〜約２５アミノ酸になり得る。以下の実施例１に示すように、このフランキングアミノ酸の同一性はエピトープＩ免疫原の生物学的機能に本質的ではない。特に、エピトープＩ配列のＮ末端上の追加的なアミノ酸は免疫原性に影響しない。従って、エピトープＩのＮ末端Ｒ１は、フリーのＮ末端アミノ水素、低級アルキル（即ち、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アセチル基のような低級Ｃ１〜Ｃ１０アルカノイル又は１〜約５のアミノ酸の配列からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｒ１は２つのアミノ酸を表す。
【００４５】
エピトープＩ最少配列のＣ末端上の追加的なアミノ酸は、抗体の力価を増強する。エピトープＩの免疫原は最適な免疫原性のためにはＣ末端に少なくとも２つのアミノ酸の延長を必要とし、延長されたアミノ酸配列の内部に存在するとき免疫原となる。従って、Ｃ末端Ｒ２は単純なフリーヒドロキシル基であり得る一方で、それはまたＣ末端アミドでもあり得る。しかしながら、力価を高めるためには、Ｒ２は好ましくはカルボキシル末端でアミド化された１〜約１４の追加的なアミノ酸配列である。好ましい態様では、Ｒ２は−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０］である。
【００４６】
本発明の上記エピトープＩ組成物は数多くの追加的なペプチド又はポリペプチドを含有し得るが、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２〜１０アミノ酸のアミノ酸残基に対応する他の配列を含有するが、上記エピトープＩ組成物に対する抗体とは交叉反応しない他のＴａｔ変異体に由来する。これらの追加的なペプチド及びポリペプチドは「所望のエピトープＩａ免疫原」として言及される。たとえば、本発明の組成物に存在し得る任意エピトープＩａ免疫原は以下のアミノ酸配列［順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１８］の少なくとも１つの少なくとも１つのコピーを含有し得る：
Ｒ１−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｒ２；及び
Ｒ１−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
本発明のエピトープＩ組成物は、単一ペプチドの多重コピー、又は任意の順序のエピトープＩａペプチド、又はこれらペプチドの少なくとも２つの多重コピーを所望により包含する、異なるエピトープＩペプチドの多重コピーを含有し得る。１つの態様では、全４種のアミノ酸配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９］の少なくとも１つのコピーが存在する。
【００４７】
以下により詳しく論じるように、これら組成物のエピトープＩ及びＩａペプチド又はポリペプチドは合成的に組換え的に製造される。エピトープＩ免疫原は、担体タンパク質が結合した合成ペプチドとして発現され得る。エピトープＩ免疫原はまた、所望により担体タンパク質に結合した、多重抗原性ペプチドとしても発現され得る。別のやり方では、エピトープＩ免疫原は、所望により担体タンパク質と同時発現されるか又はフレームで融合した、組換え的に生産されるタンパク質の内部に発現され得る。
【００４８】
エピトープＩ組成物は、免疫化される免疫能のある哺乳動物、即ち、非感染者又は無症候性の感染者において、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の既知変異体９５％以上、及び好ましくは９９％以上に対して向けられる能動的な体液性の免疫応答（即ち、抗体）を誘導する生物学的な活性を示す。そのような処置の最終結果は、急性感染状態のＨＩＶ−１の増殖を抑制し、ＡＩＤＳへの進行に関連する血清変換後の高いＨＩＶ−１血漿レベルを防止することである。ＨＩＶ−１感染初期の無症候性フェーズにおける抗体の能動誘導は、ウイルス増殖を抑制し、血漿ウイルス負荷量を下げ、ＡＩＤＳへの進行の可能性を低下させ得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９であるアミノ酸配列全４種のうち少なくとも１つのエピトープを含有する組成物は、ＨＩＶ−１の共通Ｂサブタイプについて知られている４００種のＴａｔ配列の約９７％、及び配列決定された全１８種の非ＢサブタイプＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質［Ｄｒ．Ｅｓｔｈｅｒ  Ｇｕｚｍａｎの好意によるロスアラモスＮＩＡＩＤ  ＨＩＶ−１データベース；ＧｅｎＢａｎｋデータベース］に対して免疫応答を誘発し得る。
【００４９】
Ｂ．エピトープＩＩ免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも１つのエピトープＩＩアミノ酸配列を含む組成物を提供する。このエピトープＩＩ配列は、エピトープＩＩ配列にｉｎ  ｖｉｖｏでさらされた哺乳動物において（本発明の目的のために）特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープＩＩは、Ｒ３−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｒ４という式のペプチドを規定し、ここでＸはＧｌｙ（７０％）又はＡｌａ（３０％）である。この配列は高度に保存されている。ＸがＧｌｙである免疫原はＸがＡｌａである配列と交叉反応する抗体を誘導する。
【００５０】
Ｎ末端のＲ３は、修飾されていないＮ末端アミノ酸Ｌｙｓ上の水素を表し得るか、Ｒ３はＬｙｓ上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルであり得る。Ｒ３はまた、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約５のアミノ酸配列を包含し得る。Ｃ末端のＲ４はＣ末端アミノ酸Ｌｙｓのフリーなヒドロキシル基を表し得るか、Ｒ４はＣ末端アミノ酸上のアミドであり得る。Ｒ４は所望によりアミドで置換された１〜約５までの追加のアミノ酸の配列で所望によりあり得る。エピトープＩＩの現在好ましい免疫原は、−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）である。これは、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９６％以上と反応／交叉反応し得る。
【００５１】
エピトープＩＩは他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。従って、最適な免疫原性のためには、この配列は担体タンパク質に融合又は結合した合成ペプチドとしてかまたは所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造される。別のやり方では、エピトープＩＩは、所望によりそのアミノ末端配列で担体タンパク質とフレームで融合した組換えタンパク質のＣ末端配列として発現され得る。本発明の組成物では、エピトープＩＩペプチドは好ましくは単独で又は１つ又はそれより多くのエピトープＩペプチドと複合して提示される。他の組成物は、１つ又はそれより多くのエピトープＩＩＩ又はＩＶペプチドを利用し得る。
【００５２】
Ｃ．エピトープＩＩＩ免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも１つの、好ましくは２つ又はそれ以上のエピトープＩＩＩアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープＩＩＩ配列は、エピトープＩＩＩ配列にｉｎ  ｖｉｖｏでさらされた哺乳動物において（本発明の目的のために）特定の体液性免疫応答を誘発する。このエピトープはエピトープＩ及びＩＩよりもかなり多い変異を示す。このエピトープＩＩＩ免疫原性ペプチド及びポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５６〜６２に対応するＴａｔ変異タンパク質配列から派生する。エピトープＩＩＩは、Ｒ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｒ６［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８］という式のペプチドを規定するが、ここでＸはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＧｌｎであり、ＹはＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、ＺはＰｒｏ又はＨｉｓであり、ＡはＧｌｎ又はＰｒｏであり得る。ＸがＡｌａであるエピトープＩＩＩは他のＸ位変異体と交叉反応する抗体を誘導する。Ｙ位にＡｓｐを含有するエピトープＩＩＩ免疫原は、他のＹ位変異体と交叉反応する抗体を誘導する。Ｚ及びＡ位についての最も一般的な３つの変異体は、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−（６１％）、−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−（８％）及び−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−（８％）である。この３種の免疫原によって誘導される抗体は他のものと交叉反応しないので、これら変異体（７７％）をカバーするには３種の免疫原を使用する必要があろう。
【００５３】
上記エピトープＩＩＩの式によると、反応性のあるエピトープＩＩＩの最少配列を形成する７つのアミノ酸残基は他のアミノ酸を隣接し得て、全エピトープＩＩＩ配列の長さは７〜約２５アミノ酸になり得る。以下の実施例３に示すように、このフランキングアミノ酸の同一性はエピトープＩＩＩ免疫原の生物学的機能に本質的ではない。特に、エピトープＩＩＩ配列のＮ末端上の追加的なアミノ酸は免疫原性に影響しない。Ｎ末端Ｒ５は、Ｎ末端Ａｒｇ上の水素を所望により表し得るか、Ｒ５はＮ末端Ａｒｇ上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルである。別のやり方では、Ｒ５は、所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約３のアミノ酸である。好ましい態様ではＲ５は所望により上記のように修飾された−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−であり、このエピトープの免疫原性を高める。Ｃ末端のＲ６はＣ末端アミノ酸上のフリーなヒドロキシルか、又はＣ末端アミノ酸上のアミド置換基であるが、これはＣ末端を延長すると免疫原性を損ねるためである。
【００５４】
本発明の組成物において提示され得るエピトープＩＩＩ免疫原は、以下の好ましいエピトープＩＩＩアミノ酸配列のうち少なくとも１つの、所望により上記のように修飾された、少なくとも１つのコピーを包含し得る：Ｒ５−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６、Ｒ５−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６及びＲ５−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６（順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜２２）。
【００５５】
エピトープＩＩＩ組成物に包含され得る他の所望の免疫原性配列は、Ｒ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｒ６、Ｒ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｒ６；Ｒ５−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６；Ｒ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６；又はＲ５−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｒ６（順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２７）を包含する。以下の実施例の検討から決定されるように、本発明の組成物にこれらエピトープＩＩＩを包含することで、好ましいエピトープＩＩＩ免疫原によって誘導される抗体と交叉反応しないか又はそれに対して十分強い交叉反応性を有さない、ＨＩＶ−１の稀なＴａｔタンパク質と反応する抗体を誘導することができる。
【００５６】
以下により詳しく記載されるように、エピトープＩＩＩペプチド又はポリペプチドは他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。エピトープＩＩＩは最適な免疫原性のために組換え的に製造され得るが、この配列は合成的に担体タンパク質に結合させるか又は所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造され得る。別のやり方では、エピトープＩＩＩは、所望によりそのアミノ末端配列で担体タンパク質とフレームで融合した組換えタンパク質のＣ末端配列として発現され得る。本発明の組成物は、所望により少なくとも１つのエピトープＩ免疫原と、及び所望により１つ又はそれより多くのエピトープＩＩ又はエピトープＩＶ免疫原と一緒になった３つ又はそれ以上の異なるエピトープＩＩＩ免疫原を好ましくは含有する。
【００５７】
Ｄ．エピトープＩＶ免疫原性組成物
別の態様では、本発明は少なくとも１つの、好ましくは２つ又はそれ以上のエピトープＩＶアミノ酸配列を含む組成物を提供する。これらエピトープＩＶ配列は、エピトープＩＶ配列にｉｎ  ｖｉｖｏでさらされた哺乳動物において（本発明の目的のために）特定の体液性免疫応答を誘発する。エピトープＩＶ免疫原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＩＶ−１Ｔａｔのエクソン２由来のＣ末端Ｐｒｏを包含する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６２〜７２に対応するＴａｔ変異体タンパク質配列から派生する。エピトープＩＶは、Ｒ７−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｒ８［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９］という式のペプチドを規定し、ここでＸはＡｓｎ又はＴｈｒであり、ＹはＡｌａ又はＶａｌであり得る。ＸがＴｈｒである免疫原はＸがＡｓｎであるペプチドと交叉反応する抗体を誘導する。ＹがＶａｌである免疫原はＹがＡｌａであるペプチドと交叉反応しない抗体を誘導する。しかしながら、Ｙ位にＡｌａを含有するペプチドは、ＹがＶａｌであるエピトープＩＶに対するペプチドと交叉反応する抗体を誘導する。従って、最適のエピトープＩＶ免疫原は、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０］であり、これは既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の６４％と反応／交叉反応する抗体を誘導する。
【００５８】
上記エピトープＩＶの式によると、反応性のあるエピトープＩＶの最少配列を形成する１２のアミノ酸残基は他の数個のアミノ酸を隣接し得て、全エピトープＩＶ配列の長さは１２〜約１８アミノ酸になり得る。Ｎ末端Ｒ７は、Ｎ末端アミノ酸の水素、又はＮ末端アミノ酸上の置換基である低級アルキル又はアセチル基のような低級アルカノイルを表し得る。Ｎ末端の延長は免疫原性を顕著に阻害するが、Ｒ７はまた所望により低級アルキル又は低級アルカノイルで置換された１〜約３のアミノ酸配列であり得る。Ｃ末端のＲ８はＣ末端アミノ酸上のフリーなヒドロキシルか、又はＣ末端アミノ酸上のアミド置換基であるか、Ｒ８は所望によりアミドで置換された１〜約３までの追加的なアミノ酸の配列であり得る。追加的に言うと、このエピトープの重要成分であるＣ末端Ｐｒｏは、Ｔａｔのエクソン２によってコードされる。従って、エピトープＩＶに対する抗体は、スプライスされないＴａｔエクソン１タンパク質とほとんど反応しない。
【００５９】
このエピトープＩＶ配列は他の配列の内部に存在する時は免疫原性に乏しい。従って、最適な免疫原性のために、この配列は担体タンパク質に結合した合成ペプチドとして、又は所望により担体タンパク質に結合した多重抗原性ペプチドとして製造され得る。本発明の組成物は、所望により少なくとも１つのエピトープＩ免疫原と、及び所望により１つ又はそれより多くのエピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩ免疫原と一緒になった、２つ又はそれ以上の異なるエピトープＩＶ免疫原を好ましくは含有する。
【００６０】
Ｅ．複数のエピトープを含有する組成物
エピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ及び本明細書で同定される所望の免疫原のアミノ酸配列がＨＩＶ−１の４００以上の既知Ｔａｔ配列に関する厳密な分析から得られたが、当業者には、本発明の教示の後で、さらなるＴａｔタンパク質、それらをコードする核酸配列及び新たに単離されるＨＩＶ−１サブタイプＢのＴａｔタンパク質、又は他のサブタイプのＴａｔタンパク質、又は他のＨＩＶ株に由来するそれらのフラグメントに関する研究から同様の組成物を入手し得ることが理解されるべきである。
【００６１】
従って、本発明の組成物、即ち上記に同定されたアミノ酸配列を含有するペプチド／ポリペプチドは、ヒト被検者に提供されるとき、ほとんどのＨＩＶ−１株の細胞外Ｔａｔタンパク質を免疫学的に阻止することに有用である。これら組成物はこのウイルスの爆発的な増殖をきわどく減少させ、ウイルスの有効な免疫コントロールを可能にするように機能する。
【００６２】
各エピトープの免疫原は、好ましくは天然に存在する各エピトープ変異体の最も高い比率と反応する抗体を誘導するように設計されている。エピトープＩのようなエピトープに対しては、ある免疫原の多重コピーを合成又は組換え免疫原に取込んで、免疫原性を高めてより高い力価の抗体を産生し得る。さらに、各エピトープの配列における変異が独立に起こるので、２つ又はそれ以上のエピトープを複合してカバレッジを拡張することも可能である。例えば、エピトープＩ免疫原（９５％）をエピトープＩＩ免疫原（９６％）と複合すれば、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９９．８％と反応する抗体が免疫応答性の被検者に生じる。従って、１例として、本発明の組成物は、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７］のような１つのエピトープＩ（下線部）−エピトープＩＩ（二重下線部）が融合し、エピトープＩに担体タンパク質が結合したペプチド免疫原、又は多重抗原性ペプチドとして合成され、所望により担体タンパク質が結合した同様のペプチド（カップリングのためにＮ末端のＣがない）を含有する。別のやり方では、２つ又はそれ以上の免疫原の混合物が以下のように使用され得る。
【００６３】
任意のエピトープＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ又は他の所望の免疫原と一緒であるか又は一緒でないエピトープＩが製造され、例えば化学合成物又は組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質又は融合ペプチドといった様々な形態の免疫原性組成物において使用され得る。
【００６４】
１．担体に結合した合成ペプチド／タンパク質
１つの態様として、本発明の組成物は、選択される担体タンパク質に結合した、同一又は異なるエピトープＩ免疫原のアミノ酸配列及び／又はエピトープＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ免疫原性アミノ酸配列及び所望の免疫原の所望によるアミノ酸の単一又は多数のコピーを含有する合成ペプチドであり得る。本発明の組成物のこの態様では、フランキング配列を有するか又は有さない上記多数のエピトープＩアミノ酸配列がポリペプチドにおいて連続的に複合され、同一の担体に結合され得る。別のやり方では、エピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの免疫原が同一又は異なる担体タンパク質へペプチドとして別個に結合され、得られる免疫原−担体構築体は一緒に混合して単一の組成物を形成する。
【００６５】
この態様に対しては、担体タンパク質は、望ましくは選択される免疫原の免疫原性を増強し得るタンパク質又は他の分子である。そのような担体は、アジュバント効果を有するより大きな分子であり得る。例示的な従来のタンパク質担体は、制限しないが、Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ、細菌におけるガラクトース代謝の第１段階を触媒する）、ユビキチン、α−交配因子、β−ガラクトシダーゼ及びインフルエンザＮＳ−１タンパク質を包含する。ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドのようなトキソイド（即ち、天然に存在する毒素をコードする配列で、その毒性を消失させる十分な修飾を施したもの）もまた担体として利用され得る。同様に、多種多様な細菌性の熱ショックタンパク質（例、ミコバクテリアｈｓｐ−７０）が使用され得る。グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＴ）はもう１つの有用な担体である。当業者は適切な担体を容易に選択し得る。
【００６６】
特に望まれる免疫原−担体タンパク質構築体においては、１つ又はそれより多くのエピトープ免疫原及び所望の免疫原ペプチド／ポリペプチドをミコバクテリアＥ．ｃｏｌｉ熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）に共有結合し得る［Ｋ．Ｓｕｚｕｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：８７３（１９９６）］。もう１つの望まれる態様では、組成物は免疫原含有のペプチド又はポリペプチド配列をジフテリアトキソイドに共有結合させることによって形成される。
【００６７】
２．多重抗原性ペプチド
また別の態様では、ペプチド又はポリペプチドエピトープ免疫原及び任意に選択される所望の免疫原は、多重抗原性ペプチド（「ＭＡＰ」、オクタマーリジンコアペプチドとしても言及される）構築体の形態であり得る。そのような構築体は、Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５４０９〜５４１３（１９８８）によって記載されたＭＡＰシステムを利用することによって設計され得る。このシステムは、リジン残基のコアマトリックスを利用し、その上に本発明の同一エピトープＩ、又は所望の免疫原の多重コピーが［Ｄ．Ｐｏｓｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（４）１７１９〜１７２５（１９８８）；Ｊ．Ｔａｍ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｗ．ＫｏｆｆとＨ．Ｓｉｘ編、５１〜８７頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｂｌａｕ社、ニューヨーク、１９９２）］に記載されるようにして合成される。各ＭＡＰは唯一のペプチドの多重コピーを含有する。それ故、例えば本発明のエピトープ組成物は、そのリジンコアに結合したペプチド又はポリペプチドエピトープ免疫原が上記に同定した４アミノ酸配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９］の１つ又は連続リピートを含有するＭＡＰを包含する。エピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ配列の任意の所望される複合物を得るために多数の異なるＭＡＰが利用され得る。好ましくは、これらＭＡＰ構築体は、他のＴ細胞刺激性の配列と結合しているか、又は医薬組成物として、既知のアジュバントのようなＴ細胞刺激剤とともに投与される。
【００６８】
３．スペーサー
例えばペプチド／ポリペプチド−担体構築体のような上記組成物又はＭＡＰのいずれかにおいて、各ペプチド／ポリペプチド免疫原又は免疫原の各アミノ酸配列は、所望により「スペーサー」と呼ばれる所望のアミノ酸によって分離され得る。スペーサーは、２つの配列の間に挿入され、免疫原の三次元構造に不都合に影響することなくそれらの連結を可能にする１〜約４のアミノ酸配列である。スペーサーは、所望されるならば、配列の分離を可能にする制限エンドヌクレアーゼ開裂部位も含有し得る。適切なスペーサー又はリンカーが知られていて、当業者により容易に設計され、選択され得る。好ましいスペーサーはＧｌｙ及び／又はＳｅｒアミノ酸を含有する配列である。
【００６９】
Ｆ．合成遺伝子を包含する、本発明の核酸組成物
本発明の他の態様は、担体タンパク質に融合したペプチド及びポリペプチドを包含する上記組成物のペプチド及びポリペプチド免疫原を包含する、上記ペプチド／ポリペプチド組成物をコードする核酸配列を包含する。核酸配列はまた担体タンパク質をコードする配列も包含し得る。
【００７０】
従って、本発明の１つの好ましい態様は、１つ又はそれより多くのエピトープＩ免疫原性ペプチド／ポリペプチドを連続的にコードする「合成遺伝子」である。この合成遺伝子は好ましくは２種、３種又は全４種のエピトープＩアミノ酸配列［それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９］をコードする：
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２；
Ｒ１−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ２。
【００７１】
合成遺伝子はまた上記に同定された所望の免疫原から任意に選択されるものをコードし得るし、エピトープＩＩ又はＩＩＩのペプチドがエピトープＩ配列のＣ末端に融合してそれ自身のＣ末端上でさらに修飾されていなければ、エピトープＩＩ又はＩＩＩ免疫原を包含し得る。合成遺伝子は、同一アミノ酸配列の多重コピー、多くの異なる免疫原又はアミノ酸配列のコピー又は多くの異なる免疫原又はアミノ酸配列の多重コピーをコードし得る。合成遺伝子は、担体タンパク質をコードする核酸配列とオープンリーディングフレームのなかにあるか又は融合した、選択されるアミノ酸配列をコードし得る。合成遺伝子のさらなる特徴は、免疫原をコードする各配列の間及び／又は免疫原をコードする配列と担体タンパク質をコードする配列との間にあるスペーサーをそれがコードすることであり得る。
【００７２】
本発明の合成遺伝子はまた合成又は組換え分子の一部であり得る。この合成分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質又は、プロモーター、終止コドン等のような調節要素をコードする核酸配列の機能的コントロール下にある融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含有する、ベクター又はプラスミドのような核酸構築体であり得る。そのような合成分子は、ポリペプチド／ペプチド免疫原組成物を組換え的に生産するために使用され得る。
【００７３】
合成遺伝子又は合成分子は、化学的な合成法の使用又は、好ましくは組換え技術によって製造され得る。例えば、合成遺伝子又は分子は、指定される宿主細胞の種に選好されるあるコドンを含有し得る。
【００７４】
好ましくはＤＮＡの形態をした、合成遺伝子又は分子は、多種多様なやり方で使用され得る。例えば、これらの合成核酸配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏの宿主細胞培養において本発明のペプチド／ポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現された免疫原は、適切な精製の後に、医薬用の試薬又はワクチンへ組み込まれ得る。
【００７５】
別のやり方では、本発明の合成遺伝子又は合成分子は、哺乳動物、好ましくはヒト被検者へ、いわゆる「裸のＤＮＡ」として患者においてｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質／ペプチド免疫原を発現させるために、直接投与され得る。例えば、Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１６９１〜１６９２（１９９３年３月１９日）；Ｅ．Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４７８〜１１４８２（１９９３年１２月）；及びＪ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：４７４〜４８５（１９９１）を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。合成分子、例えばベクター又はプラスミドは、哺乳類の宿主への直接注入のために使用され得る。このことが宿主細胞によるタンパク質の発現及び引き続くｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体形成を誘導する免疫系への表出をもたらす。
【００７６】
Ｇ．合成遺伝子を発現する微生物
本発明のさらに別の態様では、本発明の合成遺伝子又は分子は非病原性の微生物へ取込まれ得る。得られた微生物は、哺乳類の宿主へ投与されるとき、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の発現される組成物を発現して増加させ、特定の抗体形成を誘導する。例えば、本発明の組成物又は合成遺伝子を担い、哺乳類の患者への投与に有用である非病原性の組換えウイルス又は共生細菌は、従来法の使用により製造され、既知の非病原性微生物のなかから選択され得る。
【００７７】
合成分子を患者へ体外デリバリーする及び／又は合成遺伝子を患者へｉｎ  ｖｉｖｏで運び込むのに有用であり得る共生細菌は、例えば、様々な菌株のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、又はＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを包含する。
【００７８】
宿主の細胞へ合成遺伝子を運び込むように工学処理され得る適切な非病原性のウイルスは、ワクシニアのようなポックスウイルス、アデノウイルス、カナリア痘、レトロウイルス等を包含する。そのような数多くの非病原性ウイルスがヒト遺伝子治療のために、及び他のワクチン薬の担体として一般に使用され、当業者によって知られていて、選択可能である。
【００７９】
Ｈ．本発明の組成物の調製又は製造
本発明の組成物、及びエピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はエピトープＩＶ又は本発明の所望の免疫原を含有する個々のポリペプチド／ペプチド、本発明の合成遺伝子及び合成分子は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９〜２１５４（１９６３）によって記載されるような既知の化学合成技術の手段による従来のやり方で製造され得る。別のやり方では、本発明の組成物は、宿主微生物又は細胞の内部で、エピトープＩ及び／又は所望の免疫原及び所望の担体タンパク質を含有するペプチド／ポリペプチドをコードする配列を担うＤＮＡフラグメントをクローニングして発現させることによる既知の組換えＤＮＡ技術によって製造され得る。エピトープＩ及び所望の免疫原のコード配列は、合成的に［Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ，１６４：４９（１９９５）］製造され得るか又は既知の技術によってウイルスＲＮＡからか又は入手可能なｃＤＮＡ含有プラスミドから派生され得る。
【００８０】
連続した免疫原を従来の分子生物学の技術でアセンブリーすること、及び免疫原の所望の配列を提供する部位特異的突然変異誘発を必要とし得る合成遺伝子の生産のような場合、これらの技術の組み合わせが使用され得る。従って、合成遺伝子の産物は組換え的に産生される。これらの操作のすべては従来の方法により実施され得る。
【００８１】
合成遺伝子又は分子を使用して本発明のペプチド／ポリペプチド組成物をクローニングして発現させるためのシステムは、組換え技術においてよく知られている様々な微生物及び細胞を包含する。これらは、例えば、様々な菌株のＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、並びに哺乳類、酵母及び昆虫細胞を包含する。そのための好適なベクターが知られていて私的及び公的な研究所及び保管所から及び市販ベンダーから入手可能である。現在、最も好ましい宿主は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ−１細胞のような哺乳類細胞である。これら宿主は、ワクシニア又は豚痘のようなポックスウイルスベクターと連結して使用され得る。他の適切な宿主及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の生産及び精製の方法に関する選択は既知の技術を参考にして当業者によって達成され得る。例えば、ＧｅｔｈｉｎｇとＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２３〜６２５（１９８１）を参照のこと。
【００８２】
他の好ましいシステムはバキュロウイルスの発現系及びベクターを包含する。  従来の組換え手段によって生産されるとき、本発明の組成物、即ちエピトープＩ免疫原及び所望の免疫原の指定されたコピーを含有するポリペプチド／ペプチドは、従来の溶解技術により細胞内容物から、又はクロマトグラフィーのような従来法により細胞培地から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８９）を参照のこと。
【００８３】
ＤＮＡワクチンとしてペプチド／ポリペプチドの生産のために使用される適切なプラスミド及びウイルスベクターは当業者によく知られていて、本発明の限定項目ではない。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記及びタンパク質の生産に関する上記の参考文献を参照のこと。また、国際特許出願ＰＣＴＷＯ９４／０１１３９（１９９４年１月２０日公開）も参照のこと。
【００８４】
簡略に言うと、選択されるペプチド／ポリペプチドをコードするＤＮＡは、他の所望のフランキング配列、プロモーター、ｍＲＮＡリーダー配列、開始部位及びｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでその配列の増殖及び発現を指令し得る他の調節配列を含有するベクター又はプラスミドへ挿入される。これらベクターは、患者細胞の感染及び合成遺伝子配列のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現又はそのタンパク質／ペプチドとしての又は融合したタンパク質／ペプチドとしてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現を可能にする。
【００８５】
得られた組成物は、任意数の所望免疫原を有するエピトープＩ組成物へ製剤化され、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより効力をスクリーニングされる。そのようなアッセイは、動物、例えばウサギ又はサルを本組成物で免疫化すること、及びＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質又は（以下の実施例に示されるような）変異体のＴａｔ配列に対応する合成の検出ペプチドに対する抗体力価の評価を利用する。
【００８６】
Ｉ．本発明の抗体組成物
上記のように本発明のペプチド又はポリペプチドに対して向けられる哺乳類の単離された抗体組成物も本発明の側面である。そのようなポリクローナル抗体組成物は、上記のようなエピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及び／又はＩＶ免疫原及び所望の免疫原の組み合わせを含有するペプチド／ポリペプチド組成物で哺乳動物を免疫化することによって産生される。
【００８７】
適切な哺乳動物は、サルのような霊長類、ウサギやマウスのような小型の実験動物、並びにウマ、ヒツジ、ウシのような大型動物を包含する。そのような抗体はトランスジェニック動物においても産生される。しかしながら、本発明の組成物に対するポリクローナル抗体を産生するのに望ましい宿主はヒトを包含する。
【００８８】
本組成物にさらされた哺乳動物で産生されるポリクローナル抗体は、免疫化された哺乳動物の血漿又は血清から従来技術によって単離されて精製される。従来の採取技術は、いくつかあるなかで、血漿分離法を包含し得る。
【００８９】
そのようなポリクローナル抗体組成物それ自身が本発明の医薬組成物として利用され得る。別のやり方では、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全なヒト抗体を包含する他の抗体の形態が従来技術を使用して創出され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９〜１００３２（１９８９）；Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１）；国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１５５４、公開番号第ＷＯ９２／０４３８１号及び国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９３／００７２５、公開番号第ＷＯ９３／２０２１０号を参照のこと。他の抗Ｔａｔ抗体は、ハイブリドーマ又はコンビナトリアルライブラリー、又は本発明により産生されるポリクローナル又はモノクローナル抗体及びエピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのアミノ酸配列又は所望の免疫原を使用して抗体ファージディスプレイ［Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５〜１２８１（１９８８）］をスクリーニングすることによって創出され得る。
【００９０】
これらの抗体組成物は既知のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質変異体の９５％以上、及び好ましくは９９％以上に結合し、Ｔａｔタンパク質がさらなるＨＩＶ−１増殖を支えることを防止する。従って、これらの抗体は以下に記載される医薬品の方法及び製剤において有用である。
【００９１】
Ｊ．本発明の医薬組成物
本発明のもう１つの側面として、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９５％以上、好ましくは９９％以上と反応し、ＨＩＶ−１の増殖を抑える抗体を誘導するのに有用な医薬組成物は、その活性薬剤として、エピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの１つ又はそれより多くのペプチド又はポリペプチドを含み得る。いくつかの望ましい組成物は以下の上記成分を包含する：
（ａ）エピトープＩのアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜９の少なくとも１つ、及び好ましくは４つすべてを含有するペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｂ）エピトープＩＩアミノ酸配列の少なくとも１つを含有するペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｃ）少なくとも１つ、及び好ましくは３つのエピトープＩＩＩアミノ酸配列を含有するペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｄ）少なくとも１つのエピトープＩＶアミノ酸配列をを含有するペプチド／ポリペプチド免疫原；
（ｅ）上記のようなエピトープＩ、エピトープＩＩ、エピトープＩＩＩ又はエピトープＩＶの１つ又はそれより多くをコードする合成遺伝子；
（ｆ）上記の合成分子；
（ｇ）合成遺伝子又は分子を担う組換えウイルス、及び
（ｈ）合成遺伝子又は分子を担う共生細菌。
【００９２】
選択される活性成分は製剤的に許容される担体のなかに存在し、この組成物は追加的な構成成分を含有し得る。本発明の組成物を含有する医薬製剤は、タンパク質／ペプチド組成物のために、ＭＡＰに対するＴ細胞刺激剤のような他の活性成分、アジュバント及び、ＩＬ−１２及び他の知られたサイトカインのような免疫刺激性サイトカインを含有し得る。これら医薬組成物のすべては哺乳動物のウイルスレベルを低下させるために機能し得る。
【００９３】
エピトープＩ及び／又はＩＩ、及び／又はＩＩＩ、及び／又はＩＶのアミノ酸配列を所望の免疫原性アミノ酸配列とともに含むこれら組成物は、医薬組成物として、ウイルス感染の予防又は治療用のタンパク質組成物としての投与に適した製剤的に許容される担体とともに混合される。これらのタンパク質は投与のための単一な医薬調製物において複合され得る。本発明の免疫原性タンパク質様組成物における使用に適した製剤的に許容される担体は、当業者によく知られている。そのような担体は、例えば、塩類溶液、緩衝化した塩類溶液、水酸化アルミニウム及びマグネシウムの水性懸濁液のような選択されるアジュバント、リポソーム、水中油型の乳剤、等を包含する。適切なアジュバントはまた本発明のタンパク質含有組成物においても利用され得る。本発明は、担体又はアジュバントの選択によって制限されない。
【００９４】
ＤＮＡ、プラスミド核酸又は組換えベクターの直接投与に適した担体は、限定しないが、塩類溶液、又はスクロース、プロタミン、ポリブレン、ポリリジン、ポリカチオン、タンパク質、ＣａＰＯ4又はスペルミジンを包含する。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０１１３９及び上記の参考文献を参照のこと。
【００９５】
ペプチド／ポリペプチド組成物及び合成遺伝子又は分子は、免疫化した宿主の哺乳動物、例えばヒトにおいて、既知ＨＩＶ−１由来の細胞外Ｔａｔタンパク質変異体の約９５％〜約９９％以上を駆逐し得る免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発し、それによってウイルスレベルを低下し得る。
【００９６】
ＨＩＶ−１の増殖を抑えるのに有用なさらにもう１つの組成物は、上記に詳しく記載された抗体組成物を含む。ある医薬組成物では、抗体は、塩類溶液又は他の適切な担体において担われ得る。この抗体組成物は、Ｔａｔに対して体外から提供された即時性の阻止を提供し得る。
【００９７】
上記成分から成る、適切なｐＨ、等張性、安定性及び他の従来特性を有するこれらの製剤的に許容される組成物の製造は、当技術分野のなかにある。
【００９８】
Ｋ．ＨＩＶ−１の増殖を抑制する本発明の方法
本発明によれば、ＨＩＶ−１のウイルスレベルを低下させる方法は、上記Ｔａｔ抗体誘導性の医薬組成物へヒトをさらすこと、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９５％以上、好ましくは９９％以上と反応する抗体を能動的に誘導すること、及びウイルスの増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで阻止することを含む。この方法は、十分な免疫系を有するＨＩＶ−１感染患者、又は非感染又は最近感染した患者に対して適切である。この方法はＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質と反応する抗体を誘導し、この抗体がＨＩＶ−１初期急性感染時のウイルス増殖を減少させ、ＡＩＤＳに導く慢性のウイルス血症を最少化する。この方法はまた感染患者における慢性のウイルス増殖を低下させ、やはりＡＩＤＳへの進行を最少化する。
【００９９】
１つの態様では、医薬組成物は、十分な免疫系を有するＨＩＶ−１感染者に対し、ウイルス感染の処置又はコントロールのために治療的に投与され得る。そのような感染者は無症候性であり得る。同様の態様では、医薬組成物は予防のために非感染者へ投与され得る。
【０１００】
上記２つの例では、医薬組成物は、好ましくはペプチド／ポリペプチド組成物、合成遺伝子又は分子、組換えウイルス又は共生組換え細菌を含有する。この医薬組成物のこれら活性成分のそれぞれは、さらされたヒトにおいて、Ｔａｔが感染細胞から他の感染又は非感染細胞へ移動することを阻止する抗Ｔａｔ抗体の形成を能動的に誘導する。この作用はウイルスの増殖を抑え、ＨＩＶ−１のウイルス爆発を阻止し、それによってウイルスレベルを低下させる。すでに感染した患者においては、ウイルスレベルを低下させるこの方法は、慢性ウイルス血症及びＡＩＤＳへの進行を抑制し得る。非感染者においては、本発明の組成物のこの投与は急性感染を減少させ、それによりＡＩＤＳへの進行につながる慢性のウイルス血症を最少化する。
【０１０１】
本発明のさらに別の側面は、ＨＩＶ−１感染に対して有効又は迅速な免疫応答を発動し得ないヒトへ、上記抗体組成物を含有する医薬組成物を投与することによってＨＩＶ−１のウイルスレベルを低下させる方法である。この方法は組成物を慢性的に投与することを含み得る。この方法で処置するのに適したそのような患者には、疾患によって免疫力が低下して強い免疫応答を発動することができないＨＩＶ−１感染患者がいる。ＨＩＶ−１感染の後期では、この疾患による免疫損傷によって、有効力価の抗体を産生する可能性がより低くなっている。そのような患者のなかにはまたＨＩＶ−１に感染した妊娠女性、感染した母親からの新生児、及び推定感染した免疫されていない患者（例、ＨＩＶ−１感染者が使用した針でうっかり「刺して」しまったヒト）がいる。
【０１０２】
そのような患者に対しては、本発明の方法は、好ましくは医薬組成物として、他の哺乳動物、好ましくは正常人において製造されたポリクローナル抗体組成物である本発明の抗体組成物を利用する。別のやり方では、上記抗体の他の形態が利用され得る。これら抗体組成物はウイルス増殖を阻害してウイルス負荷を低減するために受動免疫療法として投与される。ＨＩＶ−１由来の既知Ｔａｔタンパク質の９５％以上、好ましくは９９％以上と反応する外来の抗体は、ウイルス感染細胞から他の感染又は非感染細胞へのＴａｔの移動を即時的に阻止することを患者において提供する。この方法によれば、患者は、長期治療法のための抗体組成物で慢性的に治療され得る。
【０１０３】
上記方法のそれぞれにおいて、本発明のこれら組成物は適切な経路、例えば皮下、経口、静脈、腹腔内、筋肉内、経鼻又は吸入の経路によって投与される。当面好ましい投与経路は、免疫化（能動誘導）組成物に対しては筋肉内であり、抗体（受動療法）組成物に対しては静脈又は筋肉内である。組換えウイルスベクター又は裸のＤＮＡは、好ましくは筋肉内注射されるが、ある種の他の組換えウイルスベクター及び／又は生きた共生細菌は経口でデリバリーされ得る。
【０１０４】
各ワクチン投与に存在する本発明のタンパク質、ペプチド又は核酸配列の量は、患者の年齢、体重、性、全般的な身体状況等の考察に関して選択される。免疫応答、好ましくは防御的な応答を誘導するか又は患者に重篤な副作用を起こすことなく体外からの効果を産生するのに必要とされる活性成分の量は、利用される医薬組成物及び（タンパク質含有組成物のための）アジュバントの所望の存在に依存して変化する。
【０１０５】
一般に、タンパク質／ペプチド、融合タンパク質、ＭＡＰ又は結合したタンパク質、又は抗体組成物を含有する組成物に対しては、各投与量は、無菌溶液１ｍＬあたりペプチド／ポリペプチド免疫原を約５０μｇ〜約２ｍｇ含むものである。より好ましい投与量は免疫原約５００μｇであり得る。他の投与量の範囲も当業者によって考察され得る。望ましい場合は、所望により初期の投与量を追加免疫によって繰り返し得る。
【０１０６】
本発明の抗体組成物は、針刺し又は母子感染による急性感染のリスクがある患者に対する慢性治療において利用され得る。そのような「急性」感染に対する投与頻度は、約６週間、連日〜週１回又は２回の静脈又は筋肉内投与の範囲をとり得る。本発明の抗体組成物は、感染患者又は進行したＨＩＶの患者に対する慢性治療にも利用され得る。感染患者では、慢性投与の頻度は連日〜週１回又は２回の静脈又は筋肉内投与の範囲をとり得て、免疫原の半減期（例えば、約７〜２１日）に依存し得る。しかしながら、そのような感染患者に対する慢性治療の期間は、不定であるが長期化した期間であると予測される。
【０１０７】
別のやり方では、本発明の組成物は「裸のＤＮＡ」としての本発明の合成遺伝子又は分子を直接投与するために設計され得る。タンパク質の免疫原性組成物と同様に、ＤＮＡ及びベクター組成物における成分の量及び投与の形式（例えば、注射又は鼻腔内）は当業者によって選択及び調整され得る。一般に、各投与量は、無菌溶液１ｍＬあたり免疫原をコードするＤＮＡを約５０μｇ〜約１ｍｇ含むものである。
【０１０８】
合成遺伝子又は分子を含有する組換えウイルスに対しては、投与量は、本発明の組換えウイルス約１ｘ１０7〜１ｘ１０10ｐｆｕ／ｍｌの濃度を含有する塩類溶液の約２０〜約５０ｍｌの範囲をとり得る。ヒトへの好ましい投与量は上記の濃度で約２０ｍｌの塩類溶液である。しかしながら、組換えウイルスの同一性及び宿主へデリバリーされる免疫原の構成によって、当業者はそのような投与量を変更し得ることが理解される。
【０１０９】
患者へデリバリーされる合成遺伝子又は分子を担う共生細菌の量は一般に約１０3〜約１０12細胞／ｋｇの範囲であろう。これらの投与量は、当然ながら、使用される細菌及びこの生菌によってデリバリーされるエピトープＩ又はエピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩ又はエピトープＩＶ及び所望の免疫原を含有する特定の組成物に依存して、当業者により変更され得る。
【０１１０】
従って、本発明の組成物は、非感染の哺乳動物、例えばヒトの選択されたウイルスによる感染を遅延又は最少化するために設計されている。従って、そのような組成物はワクチンとしての用途を有する。抗Ｔａｔタンパク質抗体は、感染後の血清変換を検出する診断アッセイにおいて使用されるＨＩＶ−１タンパク質とは反応しない。従って、本発明の組成物で処置された被検者はＨＩＶ−１感染の偽陽性テストで誤診されず、処置された被検者が実際にＨＩＶ−１に感染したとしても血清変換を検出することは依然として可能であろう。
【０１１１】
本発明の組成物をタンパク質／ペプチド含有組成物として、又は免疫原をコードする新規核酸配列の投与により哺乳動物へ提供することがＡＩＤＳ予防接種にとっての根本的に異なる戦略となるのは、本発明の組成物が既知ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質変異体の約９５％以上、及び好ましくは９９％以上を生物学的に阻止してウイルスレベルを低減させ、ＨＩＶ−１の増殖を抑えることを可能にするからである。
【０１１２】
Ｔａｔ免疫原含有組成物の使用は、そのようなウイルスに対して利用されている他の治療及び予防方法に比較して特に望ましい利点を有する。Ｔａｔタンパク質の阻止はＨＩＶ類似の全種又は全株の増殖を区別なく体外から阻害するので、突然変異するウイルス変種を選別する方向に親ウイルスそのものへ選択圧力をもたらすことはない。従って、患者の細胞によるＴａｔタンパク質の取込みを妨害することは、ウイルス血症のレベルを低下させるだけでなく、「エスケープ変異体」の選択を除外するやり方でもそうするのである。
【０１１３】
追加的に言うと、細胞外のＴａｔタンパク質は、疾患の経過において、この段階のＨＩＶ−１感染に存在する持続感染及び免疫異常に貢献する可能性があるので、本発明はウイルス血症のある無症候性のＨＩＶ−１感染患者を能動的に処置する方法を含む。本発明による免疫化によって誘導される抗体によって細胞外のＴａｔタンパク質が阻止されれば、より有効な免疫コントロールでウイルス血症を低減し、ＡＩＤＳへの進行の遅延又は予防を結果的にもたらし得る。
【０１１４】
上記のような本発明の機序は、ウイルス感染の経過を妨害して望ましい臨床結果をもたらす上で有用である。より特定すると、本発明の組成物は、非感染細胞によるＴａｔタンパク質のさらなる取込みを阻止することによって、すでにこのウイルスに感染した患者のウイルス血症を低減することができる。本発明の組成物は、ＨＩＶ感染患者に対して単独か又は他の治療法と一緒かのいずれかで使用され、ウイルス血症の低減及び臨床的な悪化の予防に役立つことが期待される。
【０１１５】
そのような治療上の使用に対しては、投与の製剤及び形式は上記に特別に記載したものと実質的に同一であり、特定のウイルス感染に対する他の従来治療薬と同時又は一緒に投与され得る。治療用の使用又は予防用の使用のためには、この免疫化組成物を、毎年の追加免疫又は他の間隔での追加免疫のように、繰り返し投与することが所望され得る。
【０１１６】
Ｌ．本発明の診断キット
上記ペプチド及びポリペプチドは、上記組成物を用いた予防接種によって誘導される抗体の力価及び特異性の測定及び検出に有用なキットの試薬としても利用され得る。本発明のキットはエピトープＩ〜ＩＶの１つ又はそれより多くのペプチドを包含し得る。１つの態様では、各ペプチドはそのＮ末端にタンパク質ビオチン及び、例えば−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０］のようなスペーサーを有する。別のやり方では、ペプチドはそのＣ末端に、例えば−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０］のようなスペーサー及びタンパク質ビオシチンを有する場合がある。これらの態様はペプチドがアビジン被覆された固体支持体（例、プレート又はビーズ）に結合されることを可能にする。当然ながら、診断アッセイ技術の分野で当業者により知られている他の結合剤も同様の目的のために利用され得る。このキットにまた提供されるのは、ヤギの抗ヒト免疫グロブリン等のような、固定化エピトープペプチドへの抗体の結合を検出する標識化された試薬である。試薬上のラベルは、放射活性化合物、蛍光化合物及びタンパク質、比色定量用の酵素等のような、多くの既知診断ラベルから選択され得る。従ってキットはまた、酵素ラベルと相互作用して色シグナル等を発するある種の基質、血液サンプルを採取する装置、並びに適切なバイアル及び他の診断アッセイ成分のような、様々な試薬及びラベル読み取り用の装置も含有する。当業者はこのキットのために他の従来の診断成分も容易に選択し得る。
【０１１７】
そのようなキット及び試薬は、本発明の組成物で予防接種された被検者の抗体の力価及び反応性パターンを検出するための方法において利用され得る。Ｔａｔ免疫原に対する免疫化により誘導された抗体の存在及び力価を決定する方法は、免疫化した被検者由来の生物学的サンプル（例、体液、好ましくは血液、血清又は血漿、また可能ならば尿、唾液及び他の体液又は組織）を好ましくはプレート又はビーズのような固体支持体に固定化されたエピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの結合する配列の１つ又はそれより多くと接触させる工程を包含する。この方法に利用されるエピトープＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの結合配列は、非修飾で、最少の結合領域であり得る。従って、そのような配列は、−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６］又は−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４］（ここでＹはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及びＡｓｎからなる群から選択される）及び／又は−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７］（ここでＸはＧｌｙ又はＡｌａからなる群から選択される)；及び／又は−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８］（ここでＸはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｎからなる群から選択され、ＹはＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＳｅｒからなる群から選択され、ＺはＰｒｏ及びＨｉｓからなる群から選択され、ＡはＧｌｎ及びＰｒｏからなる群から選択される）；及び／又は−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９］（ここでＸはＡｓｎ及びＴｈｒからなる群から選択され、ＹはＡｌａ及びＶａｌからなる群から選択される）を包含する。
【０１１８】
生物学的サンプルを十分な時間固定化ペプチドにさらした後で、支持体を洗浄してペプチドに結合しない生物学的サンプル由来の物質をすべて除去する。そのような洗浄工程は診断アッセイでは従来的であり、塩類溶液を用いて実施される。エピトープＩ又はＩＩ又はＩＩＩ又はＩＶ又はそれらの組み合わせに対する抗体が上記の処置によって被検者に誘導されていれば、この生物学的サンプルに由来する抗体が固定化ペプチドに結合している。その後、標識試薬を支持体上の物質に加え、固体支持体上のペプチドと前記生物学的サンプル間の結合を検出する。好ましくは、そのような試薬は、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンのような抗ヒト免疫グロブリンである。ラベルは、すでに論じたように、従来から利用されている様々な診断用ラベルから選択される。１つの態様ではこのラベルは比色定量用の酵素であり得て、これは基質と接触すると検出可能な色シグナルを発する。この色の存在及び／又は強度が処置された被検者における抗体の誘導の証拠を提供する。このアッセイは免疫化の効果を決定するとともに患者の免疫状態を監視するために利用され得る。
【０１１９】
また、多種多様な検出ラベルシステムだけでなく特定のアッセイ工程を選択することは、当技術分野内に十分ある。そのような選択は定常的であり、本発明を制限しない。
【０１２０】
Ｍ．本発明の利点
本発明の組成物の利点の１つは、共通ＢサブタイプＨＩＶ−１の既知Ｔａｔタンパク質変異体の９５％以上〜９９％以上と交叉反応するのに必要とされる、本発明の組成物に包含される免疫原の数が少ないことにある。すでに述べたように、ＹがＬｙｓであるエピトープＩ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］は４種のＹ位変異体すべてに対する交叉反応性が十分にあり、単独で免疫原性組成物において使用され得る。別のやり方では、以下の実施例で説明されるように、４種のエピトープＩアミノ酸配列すべてを含有するエピトープＩ免疫原性組成物は、共通ＢサブタイプＨＩＶ−１の３９９種あるＴａｔタンパク質の３８７種と、並びにそれほど頻発性ではないＨＩＶ−１非Ｂサブタイプ由来の全１８種のＴａｔタンパク質と交叉反応する。従って、ある単一の組成物でも、遭遇し得る大部分のＨＩＶ−１株によって引き起こされる感染に対する防御又は治療において有用に利用され得る。
【０１２１】
さらに、結合することが所望されるＴａｔ上の正確なエピトープ（即ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２〜１０、アミノ酸４１〜５１又はアミノ酸５６〜６２）を同定したので、新たに発生するＨＩＶ−１株又は新たに発見される株由来の新たな望ましいＴａｔペプチド免疫原が、本明細書に記載される方法を使用して容易に同定され、本組成物のなかに包含され得る。この融通性により本発明の組成物は将来同定される任意の新しいＨＩＶ−１株に対して予防的に使用され得る。本明細書の教示に照らせば、当業者にはＴａｔ免疫原（及びそれをコードする核酸の構築体）の新しい組み合わせを組成物のなかへ容易に取り込むことができると期待される。
【０１２２】
例えば、ＰＣＲ及び高密度オリゴヌクレオチドアレイ［Ｍ．Ｊ．Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：７５３（１９９６）］のような従来技術の使用は、臨床的に単離されるＨＩＶ−１株及びサブタイプの変異体を代表する数多くのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列を得ることを当業者に可能にする。そのような技術を使用すれば、今日まであまり研究されてこなかった、ＨＩＶ−１Ｂサブタイプの他の変異体並びに低開発諸国の他のサブタイプを決定することが可能になる。新しいＴａｔ配列が決定されれば、対応するペプチドを免疫原として本発明の組成物へすぐに包含することが可能になり、他の稀なＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質に対する抗体応答を誘導することが可能になる。
【０１２３】
各Ｔａｔ変異体に対応する合成ペプチドに対して産生される抗体に関する交叉反応性試験は、配列変化が免疫学的にサイレントであるＴａｔ変異体で免疫化することの必要性をなくすために利用され得る。これらペプチドがコンセンサス配列又は他の変異体と抗体によって強く結合するからである。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の組成物を製造すること及びこれらの組成物を利用して免疫化した宿主においてこのウイルスのＴａｔタンパク質に対する抗体を誘導することの好ましい方法を説明する。これら実施例は説明するだけであって、本発明の範囲を限定しない。
実施例１−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープＩに対する抗体に結合するのに必要なＴａｔタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
図１に示したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４〜１６に対応するペプチドを以下に記載するようにして合成した。この配列は、ＮＩＡＩＤ・ＨＩＶデータベースに報告された共通Ｂサブタイプの３１種のＴａｔタンパク質配列においてこれらの位置で最も頻繁に現れる配列の１つである。この配列を推定免疫原として選択し、エピトープＩと命名した。
【０１２５】
Ａ．ペプチド合成−免疫化ペプチド
この免疫原のアミノ酸配列−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８］をＨ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９（１９８７）の方法により、担体タンパク質へのカップリングを促進するためにＮ末端システイニルを取込んで、ポリプロピレン・ぺグ（ｐｅｇ）上で固相法により合成した。以下の表２にデータが報告されている実験のほとんどでは、免疫化ペプチドのＮ末端はフリーのアミンとして残し、Ｃ末端はアミド化した。免疫化ペプチドは一般に逆相ＨＰＬＣによって９５％以上の純度へ精製され、純度は質量分析法（ＭＳ）によってさらに確認された。
【０１２６】
Ａ．Ｃ．Ｊ．Ｌｅｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：７４９（１９８０）の方法により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）１モルにつき６〜８モルのペプチドという比率を使用して、システイニル側鎖を介して、免疫化ペプチドをＤＴ担体タンパク質に共有結合させた。
【０１２７】
Ｂ．ペプチド合成−検出ペプチド
反応性及び交叉反応性を検出するＥＬＩＳＡアッセイでの使用のために、免疫原ペプチドのアミノ酸配列に対応するペプチドを、上記のようにＧｅｙｓｅｎの方法により合成した。Ｎ及びＣ末端を切断した追加的なペプチドも合成した。
【０１２８】
以下の表２及び３に報告される実験のほとんどでは、検出ペプチドはＮ末端に−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０」を付加し、この新たなＮ末端をビオチニル化し、Ｃ末端はフリーの酸のままであった。この実験のいくつかに対しては、このＣ末端検出ペプチドが不注意にもＣ末端がアミド化されて合成され、このために以下の表２及び３に報告されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−に対する見かけ上高い結合性につながった可能性がある。従って、いくつかのペプチドは適切なＣ末端基を有して再合成し、実験の肝要な部分は−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８］に対する抗体を用いて繰り返し、この結果を以下の表３に報告した。これらの検出ペプチドは質量分析では７０％を超える純度を有し、それ以上は精製しなかった。
【０１２９】
Ｃ．ウサギの免疫化
このペプチド結合体を精製水に取り、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１で乳化した［ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＰ．Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。ウサギ１匹につき全量は１ｍｌであり、これはＤＴに結合したペプチド１００μｇを含有した。
【０１３０】
免疫化ペプチドのために２兎を使用し、初めはＣＦＡの結合体で筋肉内（ＩＭ）注射し、次いで２週目にＩＦＡの結合体でＩＭ注射により追加免疫した。第１回目の注射の前に前採血をして、追加免疫の注射後３及び５週目により大量の採血をした。
【０１３１】
Ｄ．ビオチニル化ペプチドに対する抗血清結合のＥＬＩＳＡによる定量
これらのアッセイは、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３９９８（１９８３）に記載されるようにして実施した。簡略に言うと、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉｓｏｒｂTM９６穴プレートを使用して、ビオチニル化ペプチドをストレプタビジン被覆プレートへ結合させ、各工程間でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、抗血清の希釈液及び西洋ワサビペルオキシダーゼの結合した抗ウサギ免疫グロブリンとともに連続インキュベーションを実施し、結合した抗体を検出した。プレートをＡＢＴＳで発色させ、４０５ｎｍでＯ．Ｄ．を読み取った。Ｏ．Ｄ．１．０以上の吸光度を陽性とみなし、各抗血清の倍々希釈から力価を定量した。一定の免疫原に対する各抗血清対の幾何平均力価（ＧＭＴ）を算出した。
【０１３２】
【表２】
0004278293.tif 000004
【０１３３】
【表３】
0004278293.tif 000005
【０１３４】
表２及び３に報告されたＥＬＩＳＡの結果は、第一の免疫原に対する抗体が配列−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５〜１０］と反応していることを示した。これらの配列のＮ又はＣ末端を切断すると、ＥＬＩＳＡの力価が低下した。表２及び３の結果をまとめると、エピトープＩペプチドのＮ末端Ｖａｌは抗体結合に対してわずかに貢献している（欠失すると結合性が６５％になる）。従って、ＨＩＶ−１Ｔａｔの第一の抗体結合領域の定義は、本明細書でエピトープＩとして言及され、−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４］である。
【０１３５】
Ｅ．ＨＩＶ−１ＴａｔエピトープＩの最少配列分析
以下の実験は、免疫化ペプチド配列としてＶａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＮＨ2［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８］を使用して実施した。表３の結果で示されるように、抗体の最大結合を有するエピトープＩの最少配列は、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４］として確かめられる。Ｃ末端を延長したときの結合性の変化は有意でない。Ｎ末端のＶａｌ又はＣ末端のＰｒｏを切除すると結合力価がやや減少するが、これ以上の切断は特異的な結合をほとんど完全に消失させる。このことは、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５〜９）が特異抗体との相互作用を創出する最も重要なアミノ酸であることを示す（例えば、図３を参照のこと）。ＧＭＴは、免疫原配列を含有する検出ペプチドに関するＧＭＴの比率（％）として報告される。
【０１３６】
Ｆ．エピトープＩ免疫原の延長が抗体力価に及ぼす効果
免疫原のエピトープ配列のＮ末端を延長しても免疫原性に影響しない。対照的に、Ｃ末端をＶａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＮＨ2［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８］まで延長すると１０倍力価が増強される。現在の最適な免疫化配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８であるらしい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に関するＧＭＴは、表４に示すように、このペプチドに関するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８への抗血清のＧＭＴ％として報告されている。
【０１３７】
【表４】
0004278293.tif 000006
【０１３８】
Ｇ．Ｎ末端が延長された免疫原によって誘導される抗体の結合パターン
エピトープＩ免疫原に対する抗血清の、Ｎ末端Ｍｅｔを介してＮ末端配列を延長した配列との結合性を、完全長の検出ペプチド及びＮ又はＣ末端が切除された検出ペプチドを用いて試験した。これらの例では、免疫化ペプチドのいくつかは、担体タンパク質にカップリングするためのＣ末端Ｃｙｓアミドが付いて合成され、対応する検出ペプチドは、アビジン被覆プレートに結合するＣ末端−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ビオシチン−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１］が付いて合成された。
【０１３９】
【表５】
0004278293.tif 000007
【０１４０】
【表６】
0004278293.tif 000008
【０１４１】
上記のデータから、免疫化エピトープＩペプチドのＮ末端延長は、抗体結合領域をＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質配列のＧｌｕ2まで拡張することが明らかである。
【０１４２】
【表７】
0004278293.tif 000009
【０１４３】
これらのデータは、Ｎ末端が様々であるが結合領域はわずかに異なる免疫原から、非常に似た抗Ｔａｔ抗体の全力価が得られることを示す。
実施例２−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープＩにおける配列変異とこれらの配列に対する抗血清の免疫学的な交叉反応性
Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ロスアラモス、ＮＭのＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓグループによって公表されたＨＵＭＡＮ  ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳＥＳ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９６で入手される配列、及びこのＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＥｓｔｈｅｒ  Ｇｕｚｍａｎの厚意によりＧｅｎＢａｎｋから入手された追加的な配列で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＴａｔタンパク質アミノ酸５〜１０の配列における変異を分析した。
【０１４４】
Ａ．配列における変異
ＨＩＶ−１の共通Ｂサブタイプ３９９種の５〜１０アミノ酸Ｔａｔヘキサペプチド配列、及び非Ｂサブタイプから１８種（サブタイプＡから６種、サブタイプＣから２種、サブタイプＤから７種、サブタイプＦから２種、サブタイプＵから１種）を入手した。
【０１４５】
Ｂサブタイプについては、このヘキサペプチド内の唯一の変異として３位に、全３９９種のヘキサペプチドのうち３８６種（９７％）がＡｒｇ（２８９，７４％）又はＬｙｓ（４５，１１％）又はＳｅｒ（３６，９％）又はＡｓｎ（１６，４％）のいずれかを有していた。残りの変異（３％）は、
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（４）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１］、
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（２）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４］及び単独例の
−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１］、
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］、
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３］、
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５］、
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６］、
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７］及び
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］を含んでいた。
【０１４６】
１８種の非Ｂサブタイプの配列については、ヘキサペプチドアミノ酸５〜１０の３位に、２つがＡｒｇを有し、１つがＬｙｓを有し、２つがＳｅｒを有し、９つがＡｓｎを有していた。他の変異体は、
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−（２）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２］、及び単独例の
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３］及び
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４］であった。
【０１４７】
Ｂ．４種の主要免疫原の免疫学的反応性及び交叉反応性の評価
以下の配列［順に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及び４５〜４７］につき、実施例１に記載されたようにして、免疫化及び検出の配列を合成した。
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−、
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−、
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−、
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−。
【０１４８】
ウサギを免疫化し，実施例１に記載されたようにして、ＥＬＩＳＡによって反応性及び交叉反応性をテストした。自己反応性を表８にまとめる。
【０１４９】
【表８】
0004278293.tif 000010
【０１５０】
エピトープＩの３位のアミノ酸残基が変化しているこれらの主要免疫原間の交叉反応性を表９に示す。以下に報告される結果が反応性の低い抗血清を用いた平均値であることに留意すること。
【０１５１】
【表９】
0004278293.tif 000011
【０１５２】
表８及び９は、各変異体は有効な免疫原であるが、変異体間には全体的にはごくわずかな交叉反応性しかないことを示している。最高の交叉反応性が得られるのはＬｙｓ３含有の免疫原である。このことは、最適のカバレッジのためには、上記のような主要組成物において免疫原として４種の変異体すべてを包含する必要があることを示唆する。
【０１５３】
Ｃ．他の変異体の交叉反応性の評価
残るすべてのエピトープ変異体のために検出ペプチドを合成し、適当な３位主要ヘキサペプチド免疫原に対する抗血清との交叉反応性を試験した。適当な３位主要免疫原との交叉反応性対自己反応性を表１０に示す。
【０１５４】
【表１０】
0004278293.tif 000012
【０１５５】
表８〜１０の結果は、４種の主要免疫原で免疫化すれば共通ＢサブタイプのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９７％以上と反応する抗体を産生し得ることを示した。興味深いことに、データベースにある１８種の非Ｂサブタイプはすべて主要免疫原に対する抗体と反応するエピトープＩ配列を有していた。
【０１５６】
Ｄ．ある種のエピトープＩ変異体の免疫原性
以下の２種のエピトープＩペプチド変異体について免疫化ペプチド及び検出ペプチドを合成し、実施例１のように免疫化及びＥＬＩＳＡ試験をした。自己力価（ＧＭＴ）を表１１に示す。
【０１５７】
【表１１】
0004278293.tif 000013
【０１５８】
これらのデータは、この一次免疫原に加えて稀な変異体を包含することで、抗体カバレッジがそのような稀なエピトープ変異体へ拡張することを示す。
【０１５９】
４種の一次エピトープＩ配列で免疫化すると、全ＨＩＶ−１株の９７％以上のＴａｔタンパク質と反応する高力価の抗体を誘導し得る。このカバレッジは、所望により免疫化組成物にさらに稀なエピトープＩ変異体を包含して拡張され得る。
【０１６０】
Ｅ．免疫原のＮ末端延長が免疫学的保存性及び交叉反応性に及ぼす結果
すでに試験したエピトープＩ配列を検討すると、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−延長における主要な変異は、配列の９％で起こっているＧｌｕのＡｓｐへの置換である。しかしながら、表１２で示されるように、Ｇｌｕ含有ペプチドに対する抗体は対応するＡｓｐ含有ペプチドと実質的に交叉反応し、逆もまた真である。
【０１６１】
【表１２】
0004278293.tif 000014
【０１６２】
Ｇｌｕ及びＡｓｐ間の変異の他には、この２つの位置には７つしか他の変異がなく（Ｌｙｓ／Ｇｌｕが５つ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ置換が２つ）、ＢサブタイプＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質における拡張エピトープＩの免疫学的保存性を９５％にしている。１８種の非Ｂサブタイプ配列については、１６種だけがＧｌｕ−Ｐｒｏ延長に対応する配列を含有し、Ｇｌｕ／Ａｓｐ変異とは異なり、２つのＦサブタイプ配列（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）を除くすべてがＧｌｕ−Ｐｒｏ又はＡｓｐ−Ｐｒｏであり、８８％の免疫学的保存性をもたらした。従って、Ｎ末端配列が拡張したペプチドで免疫化することは、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質配列の広汎なサンプルに対して高率の免疫反応性をやはり提供する。
実施例３−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のＣＹＳ37に続く直線状１８アミノ酸配列の内部に抗体結合性アミノ酸配列（エピトープＩＩ）を決定すること
図１に示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸３５〜５５に対応するペプチドを実施例１に記載されるようにして合成した。実施例１に記載される方法を使用して、低力価の抗体応答をウサギに検出した。この抗体結合に関わる配列を決定する試験を表１３に要約する。幾何平均力価（ＧＭＴ）は自己力価の比率として報告されている。
【０１６３】
【表１３】
0004278293.tif 000015
【０１６４】
このＥＬＩＳＡ試験の結果は、誘導された低力価の抗体が配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４３〜５１）と結合することを確定した。従って、この配列及び配列Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）を合成し、ウサギを免疫化するために使用した。
【０１６５】
最小のエピトープ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４３〜５１）で免疫化すると、低力価の抗体（ＧＭＴ１，０００）しか産生しなかったが、驚くべきことに、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）で免疫化すると、検出ペプチドＰｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５］に対して高力価の抗体（ＧＭＴ２０，０００）が誘導された。
【０１６６】
ほとんどのエピトープＩＩ配列と反応する抗体を誘導する免疫原の設計を可能にするためにエピトープＩＩ内部で起こる配列の変異を分析した。共通ＢサブタイプのＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質アミノ酸４１〜５１について４４１種の変異、及び非Ｂサブタイプから２１種（サブタイプＡから７種、サブタイプＣから４種、サブタイプＤから７種、サブタイプＦから２種、サブタイプＵから１種）を入手した。Ｂサブタイプについては、４４１種のうち４２２種（９６％）が正常な配列を有していたが、１３４種（３２％）でＡｌａがＧｌｙに置換されていた。非Ｂサブタイプの配列については２１種のうち２０種（９５％）が正常な配列を有していた。
【０１６７】
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）によって誘導される抗体の反応性を、以下のようにリストした検出ペプチドに基づいて、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）に対する抗血清の力価を検定して試験した。
【０１６８】
【表１４】
0004278293.tif 000016
【０１６９】
上記のデータは、Ａｌａ変異体について完全な免疫学的交叉反応性があること、及びＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）への抗体応答が先に同定したエピトープＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４３〜５１）に対して依然残っていることを示す。従って、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１〜５１）での免疫化は、既知ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９６％以上と反応する高力価の抗体を誘導する。
実施例４−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープＩＩＩの抗体に結合するのに必要なＴａｔタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
図１に示したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５３〜６２に対応するペプチドを以下に記載するようにして合成した。この配列は、ＮＩＡＩＤ・ＨＩＶデータベースに報告された共通Ｂサブタイプの３１種のＴａｔタンパク質配列においてこれらの位置で最も頻繁に現れる配列の１つである。この配列を第二の推定免疫原として選択した。
【０１７０】
Ａ．ペプチド合成−免疫化ペプチド
この免疫原のアミノ酸配列−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９］をエピトープＩの実施例１に記載されているようにして合成した。データが報告されている実験の結果は以下の表１５〜１６に表されている。免疫化ペプチドは一般に逆相ＨＰＬＣによって９５％以上の純度へ精製され、純度は質量分析法（ＭＳ）によってさらに確認された。実施例１ＡのエピトープＩについて記載したように、システイニル側鎖を介して、免疫化ペプチドをジフテリアトキソイド（ＤＴ）担体タンパク質に共有結合させた。
【０１７１】
Ｂ．ペプチド合成−検出ペプチド
反応性及び交叉反応性を検出するＥＬＩＳＡアッセイでの使用のために、免疫原ペプチドのアミノ酸配列に対応するペプチドを、上記のようにＧｅｙｓｅｎの方法により合成した。Ｎ及びＣ末端を切断した追加的なペプチドも合成した。
【０１７２】
以下の表１５に報告される実験のほとんどでは、検出ペプチドはＮ末端に−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０」を付加し、この新たなＮ末端をビオチニル化し、Ｃ末端はフリーの酸のままであった。これらの検出ペプチドは質量分析では７０％を超える純度を有し、それ以上は精製しなかった。
【０１７３】
Ｃ．ウサギの免疫化
このペプチド結合体を精製水に取り、実施例１Ｃに記載されているように、ＣＦＡ又はＩＦＡと１：１で乳化した。ウサギ１匹につき全量は１ｍｌであり、これはＤＴに結合したペプチド１００μｇを含有した。免疫化ペプチドのために２兎を使用し、初めはＣＦＡの結合体で筋肉内（ＩＭ）注射し、次いで２週目にＩＦＡの結合体でＩＭ注射により追加免疫した。第１回目の注射の前に前採血をして、追加免疫の注射後３及び５週目により大量の採血をした。
【０１７４】
Ｄ．ビオチニル化ペプチドに対する抗血清結合のＥＬＩＳＡによる定量
これらのアッセイは、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３９９８（１９８３）に記載されるように、及びエピトープＩの実施例１Ｄに記載されるようにして実施した。表１５の結果から、ＨＩＶ−１Ｔａｔのもう１つの抗体結合領域の定義は、本明細書でエピトープＩＩＩとして言及され、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９］である。
【０１７５】
Ｅ．ＨＩＶ−１ＴａｔエピトープＩＩＩの最少配列分析
以下の実験は、免疫化ペプチド配列としてＡｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＮＨ2［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９］を使用して実施した。以下の表１５の結果は、抗体の最大結合を有するエピトープＩＩＩの最少配列が、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９］であることを示す。検出ペプチドのＮ末端又はＣ末端を延長しても有意に異なる結合性は生まれない。Ｎ末端のＡｒｇを切除すると結合力価がやや減少するが、次のＮ末端Ａｒｇ又はＣ末端Ｓｅｒの切断は特異的な結合をほとんど完全に消失させる。このことは、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５７〜６２）が特異抗体との相互作用を創出する最も重要なアミノ酸であることを示す（図４を参照のこと）。ＧＭＴは、免疫原配列を含有する検出ペプチドに関するＧＭＴの比率（％）として報告される。
【０１７６】
【表１５】
0004278293.tif 000017
【０１７７】
Ｆ．ＨＩＶ−１ＴａｔエピトープＩＩＩ−抗体力価に対する免疫原の効果
Ｃ末端延長のどんな例も免疫原性を消失させ、力価を低下させる。対照的に、ある点までのＮ末端延長は免疫原性を高め、Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５４〜６２）で最大力価が得られ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５２〜６２）を免疫原とすると免疫原性が低下した。Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸５３〜６２）についてのＧＭＴをこのペプチドに対する抗血清の、この検出ペプチドについてのＧＭＴ％として表１６に報告する。
【０１７８】
【表１６】
0004278293.tif 000018
【０１７９】
実施例５−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープＩＩＩにおける配列変異とこれらの配列に対する抗血清の免疫学的な交叉反応性
ＨＵＭＡＮ  ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳＥＳ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９６（上記）で入手される配列及び追加的な配列［ＧｅｎＢａｎｋ］において、実施例４に記載されるようにして、Ｔａｔタンパク質のアミノ酸５６〜７２の配列における変異を分析した。
【０１８０】
Ａ．エピトープＩＩＩ配列における変異
ＨＩＶ−１の共通ＢサブタイプのエピトープＩＩＩ４８２種の配列を分析に供した。最も頻繁に見出された配列は式−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０］に一致し、ここでＸはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＧｌｎであり、ＹはＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒである。この配列タイプは、免疫学的に交叉反応するようだが（以下を参照）、入手された４８２種のＴａｔ配列のうち２９２種（６１％）に見出された。
【０１８１】
他の配列変異体はより低い率で起こり、これらは以下の表１７にリストされるものに包含された。
【０１８２】
【表１７】
0004278293.tif 000019
【０１８３】
これらの配列は、一緒にするとエピトープＩＩＩ変異体の８５％を占め、そのバランスは大多数の低率変異からなる。
【０１８４】
１８例のＨＩＶ−１非ＢサブタイプからだけエピトープＩＩＩ配列が入手された。エピトープＩと違って、それらはＢサブタイプ配列からの逸脱を示した。追加的な非ＢサブタイプエピトープＩＩＩ配列が決定され、本発明の免疫原性組成物に望まれるならば、所望により数多くの配列も本発明の組成物へ包含されるために選択され得る。
【０１８５】
Ｂ．選択されたエピトープＩＩＩ配列の免疫学的反応性及び交叉反応性の評価  表１８の配列について、実施例１に記載されるようにして、免疫化及び検出の配列を合成した。実施例４に記載されるようにして、ウサギを免疫化し、抗血清の反応性及び交叉反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。様々な抗血清及び検出ペプチドを利用して、様々な配列の免疫原性及び免疫学的な交叉反応性を決定した。式−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０］（上記参照）のエピトープＩＩＩ配列の範囲及び免疫学的反応性を表１８に示す。以下の表１８では、Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４］，自己力価＝４６，１１５に対する抗血清について、交叉反応性比率を測定した。表１８は、−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９］を用いた免疫化が、ＨＩＶ−１株の６１％に代表される、これら変異体のほとんどと有効な交叉反応性を提供することを示している。
【０１８６】
【表１８】
0004278293.tif 000020
【０１８７】
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０］及び−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］を用いた免疫化では、表１９に示されるように、いずれの検出ペプチドとも交叉反応する抗体を生じた。従って、いずれかの配列を本発明の免疫化組成物に包含すれば、４８２種のＨＩＶ−１株のさらに４１種（８．５％）におけるＴａｔタンパク質エピトープＩＩＩ変異体に対する抗体が提供される。
【０１８８】
−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２］［２０／４８２（４％）］で免疫化すると、自己力価が２０９，２８６で、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１］［１７／４８２（３．５％）］との交叉反応性が５，３５６（２．５％）である抗体が誘導された。従って、この配列を免疫原に包含するとＨＩＶ−１株のさらに２７／４８２（７．５％）がカバーされる。
【０１８９】
従って、３種のエピトープＩＩＩ変異体、
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９］、
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０］及び
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２］での免疫化は、ＨＩＶ−１株の７７％のＴａｔタンパク質と反応する抗体を提供する。
【０１９０】
【表１９】
0004278293.tif 000021
【０１９１】
実施例６−ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のエピトープＩＶの抗体に結合するのに必要なＴａｔタンパク質の最少アミノ酸配列に関する免疫学的試験
ＭｃＰｈｅｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３３：３９３（１９８８）の公表物は、ＨＩＶ−１感染被検者のある血清が合成ペプチドＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１］と反応することを示唆したが、誤ってＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のアミノ酸７１〜８３として報告された（正しい位置はアミノ酸６１〜７３である）。ゆえに発明者は合成ペプチド−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２］でマウスを免疫化し、このペプチドと反応する、幾何平均力価２６，５１７の抗体が産生されることを確定した。
【０１９２】
最小のエピトープサイズを決定するために、一連の末端切断ペプチドを合成し、結合のために必要な最小の配列長さを決定するための検出ペプチドとして使用した。表２０は、検出ペプチド及び、エピトープＩについて実施例１で記載されたようにして決定された結合性比率を報告する。
【０１９３】
【表２０】
0004278293.tif 000022
【０１９４】
これらのデータから、エピトープＩＶへの完全な結合に１２のアミノ酸がすべて必要であることは明らかであるが、１位及び２位におけるアミノ酸の貢献は主要ではない。
【０１９５】
エピトープＩ、ＩＩ及びＩＩＩに対する上記の方法に従って、エピトープＩＶにおける配列変異及び抗血清の免疫学的交叉反応性について以下のことを確かめた。この配列領域の４４４例がデータベースから入手された。最も一般的な変異は３位のＴｈｒがＡｓｎであるものと６位のＶａｌがＡｌａであるものであった。
指定ペプチドに対する抗血清の、これら配列に対応する検出ペプチドに対する反応性を上記のように試験し、結合性比率に関する結果を以下の表２１に報告した。
【０１９６】
【表２１】
0004278293.tif 000023
【０１９７】
従って、３位のアミノ酸がＴｈｒからＡｓｎへ置換しても抗体結合性にほとんど影響しないが、６位のアミノ酸がＶａｌからＡｌａに置換することは、本質的に交叉反応性でない。この領域の配列が決定された４４４例のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質では２８２／４４４（６４％）が指定配列に似た配列を有していた。３位アミノ酸のＴｈｒとＡｓｎ間の変異を無視すると、１９９／４４４（４５％）が６位アミノ酸にＶａｌを有し、８３／４４４（１９％）が６位アミノ酸としてＡｌａを有していた。Ａｌａ６ペプチドがＶａｌ６免疫原に対する抗血清との交叉反応性に乏しかったのに対し、Ａｌａ６ペプチドに対する抗血清は、Ａｌａ６ペプチドには力価２６，０００、Ｖａｌ６ペプチドには力価３２，０００をもたらし、完全な交叉反応性を示した。
【０１９８】
従って、アミノ酸配列−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４］を含有するタンパク質で免疫化すると、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質変異体の６４％と反応する抗体を惹起する。
実施例７−本発明の合成遺伝子の構築
（本発明の４種の主要免疫原を包含する）８つのエピトープＩ変異体及び１３のエピトープＩＩＩ変異体をフレームで組込んだ合成遺伝子を構築した。これらは、上記の１９９６  ＨＵＭＡＮ  ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳＥＳ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ編集物に報告された３１種のＨＩＶ−１Ｂサブタイプ株のＴａｔタンパク質配列に見出されるエピトープＩ及びエピトープＩＩＩ配列の全変異体を構成する。これらは、図１に示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のナンバリングを使用する場合のエピトープＩのアミノ酸４〜１６及びエピトープＩＩＩの５３〜６２を包含した。エピトープ配列はＧｌｙ及び／又はＳｅｒ残基を含有するジペプチドスペーサーによって分離されていた。
【０１９９】
本発明の１つの代表的な遺伝子の配列を図２Ａ〜２Ｃ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び３］に示す。遺伝子は、Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ，１６４：４９（１９９５）に記載されるようにして組み立てた。簡潔に言えば、２０ヌクレオチド（ｎｔ）が重なった、１１の上鎖６０マーオリゴヌクレオチド（オリゴ）及び１１の下鎖オリゴを、２つの末端５０マーとともに合成した。この２２の６０マーをともにハイブリダイズ条件の下でインキュベートし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して配列を埋め、それを増幅した。次いで末端５０マーを加え、ＰＣＲによって組立てを完了し、アガロースゲルで完全長の遺伝しを単離した。
【０２００】
この遺伝子の配列を決定し、１３６位でＡｌａがＴｈｒに置換されていることを除けば、実際のエピトープ内の正しい配列を有することを見出した（図２Ａ〜２Ｃ参照）。この変化はエピトープＩＩＩの抗体結合性に影響しないので、このことは許容された（実施例４参照）。
【０２０１】
次にこの遺伝子を制限酵素で切断し、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）［Ａ．Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４：３１５（１９９６）］の配列をフレームで含有する発現ベクターｐＢＡＤ［Ｌ−Ｍ．Ｇｕｚｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７７：４１２１（１９５０）］の中へ挿入した。ＴＧ１・Ｅ．ｃｏｌｉをトランスフェクトして、グリーン蛍光のコロニーを単離した。
【０２０２】
単離されたコロニーを生育させ発現を誘導した。３つのコロニーのそれぞれに由来するタンパク質は、ウエスタンブロットで、予想された分子サイズ（即ち、ＧＦＰ単独の２倍）の蛍光バンドを有していた。得られたタンパク質は可溶性で、この配列に取込まれていたヘキサ−ヒスチジルを利用するニッケルカラムアフィニティー精製によって精製された。
【０２０３】
収量は上澄液１リットルあたりタンパク質約１ｍｇで、２回のアフィニティー精製後９０％以上の純度を得た。
実施例８−組換え融合タンパク質を発現するＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質エピトープ変異体の免疫学的特徴付け
Ａ．エピトープＩ及び２種の変異体に対するウサギ抗血清に対する融合タンパク質の反応性
４つの主要エピトープＩ配列及び４つのエピトープＩＩＩ配列（以下を参照のこと）に対応する合成ペプチドに対して産生されたウサギ抗血清を、実施例１及び４に記載された方法を使用してＥＬＩＳＡによって試験した。ただし、プレートは最初から融合タンパク質に対する抗血清の１００μｇ／ｍｌ溶液で直接被覆した。
【０２０４】
【表２２】
0004278293.tif 000024
【０２０５】
上記のデータは、直線状の組換え融合タンパク質として発現される変異体のエピトープ配列が対応する合成ペプチドに対する抗体によって認識されるコンホメーションで発現されていることを示す。
【０２０６】
Ｂ．融合タンパク質を用いたマウスの免疫化
マウス３匹に、実施例７の融合タンパク質を等量のフロイント完全アジュバントで乳化した水性溶液の各１０μｇ相当量を腹腔内投与して免疫化した。２週間後、フロイント不完全アジュバントを使用して、同様に追加免疫した。３週間後に血清を採取した。
【０２０７】
Ｃ．融合タンパク質に組込まれたエピトープ変異体に対応する合成ペプチドに関しての、融合タンパク質に対する抗血清のＥＬＩＳＡ試験
抗体結合を検出するのに西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗マウス免疫グロブリンを使用した他は、実施例１に記載されたようにしてＥＬＩＳＡ試験を実施した。この試験結果を以下の表２３にまとめる。これらのデータは、エピトープＩ及びエピトープＩＩＩの配列がいずれも直線状の融合タンパク質において発現し、合成ペプチド（上記参照）に対する抗体と反応することを示す。エピトープＩに対する抗体が、マウスを用いたこの実験条件下で、組換え融合タンパク質によって検出可能なほどに誘導された。この直線状ペプチド内で発現されるエピトープＩＩＩの失敗は、免疫原のＣ末端を延長すると得られる抗体の力価を低下させる（実施例４を参照）という合成ペプチドに関する知見に一致している。
【０２０８】
【表２３】
0004278293.tif 000025
【０２０９】
実施例９−霊長類の動物試験
幼若の雄アカゲザル１０匹を使用して、本発明の合成ペプチドよって誘導されるＴａｔタンパク質に対する抗体が免疫不全ウイルスによる感染の前に存在していれば、感染を弱めて血漿ウイルスレベルを低下させるかを確かめる研究を実施した。ＨＩＶ−１はサルに感染しないが、対応するサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）は感染する。Ｐ．Ａ．Ｌｕｃｉｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７４９０（１９９５）は、サルに実際感染し、典型的には２週目にピークを迎えてその後８週目までには減退する急性ウイルス血症を引き起こす、ＳＩＶmac239及びＨＩＶ−１SF33の感染性組換えウイルス（キメラ）を構築した。ＳＨＩＶSF33と命名されたこのキメラ構築体では、ＳＩＶmac239のｔａｔ、ｒｅｖ及びｅｎｖ（ｇｐ１６０）をコードするＳＩＶヌクレオチドがＨＩＶ−１SF33の対応する領域で置換された。
【０２１０】
Ａ．サルの免疫化
上記のサルを２群に無作為化した。
【０２１１】
第１群（対照群）のサルそれぞれをジフテリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｃｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ビクトリア、オーストラリア）０．４ｍｇ、及びＭＦ７５アジュバント（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ，エメリビル、ＣＡ）０．５ｍｌで乳化した水０．５ｍｌに溶けたスレオニルムラミルジペプチド（Ｔ−ＭＤＰ）０．２５ｍｇで免疫化した。
【０２１２】
第２群（試験群）のサルそれぞれを、ジフテリアトキソイド０．４ｍｇが結合した合成ペプチドＣｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４］０．１ｍｇで免疫化した［Ａ．Ｃ．Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：７４９（１９８０）］。この結合体をＴ−ＭＤＰ０．２５ｍｇを含有する水０．５ｍｌに溶かし、ＭＦ７５アジュバント０．５ｍｌで乳化した。
【０２１３】
０日目及び２８日（４週）目に、２つの異なる部位へ２回０．５ｍｌ筋肉内注射をしてそれぞれのサルを免疫化した。合成ペプチド免疫原は、サルへのチャレンジに使用されたＳＨＩＶSF33分子クローンのなかに組込まれているＳＦ３３ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質のＢ細胞エピトープＩ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５］を含有していた（上記参照）。
【０２１４】
Ｂ．Ｔａｔタンパク質に対する抗体の試験
４２日（６週）目、追加免疫の注射後２週目に、血清を採取し、上記実施例１に記載したようにして、ＥＬＩＳＡによってＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＯＨ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５］に対する結合性を試験した。
【０２１５】
以下の表２４に示されるように、対照群のサルが２５〜４４のバックグラウンド力価を有していたのに対し、試験群は１７８８〜９５８８の力価を有していた。
【０２１６】
【表２４】
0004278293.tif 000026
【０２１７】
Ｃ．ウイルスのチャレンジ
最初の免疫化後４９日（７週）目、全部のサルへ動物滴定用ＳＨＩＶSF33ストックの１／１０００希釈液を１ｍｌ静脈内投与した（チャレンジ０日目）。これは５０匹の動物の感染量50%（５０ＡＩＤ50）、又は２００の組織培養の感染量50%（２００ＴＣＩＤ50）に相当する。
【０２１８】
Ｄ．感染の評価
２、４及び８週目に血漿をＥＤＴＡと採取し、血漿１ｍｌあたりのウイルスＲＮＡコピーを、ＳＨＩＶSF33のＳＩＶ成分に対するＳＩＶプローブを使用して、ＱＲ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定した［Ａ．Ｊ．Ｃｏｎｒａｄら、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１０：４２５（１９９５）］。この試験結果を以下のように表２５及び２６にまとめる。
【０２１９】
【表２５】
0004278293.tif 000027
【０２２０】
【表２６】
0004278293.tif 000028
【０２２１】
予期されたように、ＳＨＩＶSF33は、ウイルスＲＮＡのピークレベルが２週目にあり、８週までにはほとんどないか又は検出されないレベルになる、急性感染を引き起こした。チャレンジするＳＨＩＶSF33ウイルスのＴａｔタンパク質に対する抗体を誘導する合成ペプチド結合体で免疫化されたサルは、対照の免疫化サルに比較して、ウイルスチャレンジ後２週目の血漿ピークウイルスレベルが７１％減少し、血漿ウイルスレベルが減衰して依然検出される４週目では４３％阻害した。このことは、ＳＨＩＶのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が、ウイルスによって利用されるＴａｔタンパク質に対する抗体の存在で阻害されたことを示し、同様の効果がＨＩＶ感染者にも有効であることを示唆する。
【０２２２】
Ｅ．血清変換の評価
ＨＩＶに感染した被検者はビリオン表面タンパク質に対する抗体を産生し、これがＥＬＩＳＡにより検出されて感染を診断するために使用される。ウイルスチャレンジの前及びチャレンジ後８週目に、ＨＩＶＡＢ  ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，ＩＬ）を使用して、サルの血清を試験した。チャレンジ前の血清はすべて陰性であったが、チャレンジ後８週目の血清はすべて陽性であった。これらの知見は、Ｔａｔタンパク質に対する抗体がＨＩＶ血清変換の診断アッセイに向いていないという事実のさらなる裏づけを提供する。
実施例１０−霊長類の動物試験
ジフテリアトキソイドに結合した合成ペプチドでの免疫化（サル９匹）又はジフテリアトキソイドで免疫化した対照（サル５匹）を使用して、さらにサルの試験をした。最初の免疫化はフロイント完全アジュバントで、３、６及び９週目の追加免疫は不完全フロイントアジュバントで実施した。免疫化ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−アミド［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６］（エピトープＩ）及びＣｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−ＯＨ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７］（エピトープＩＩＩ）であった。
【０２２３】
上記のように、免疫原で最後の追加免疫をして２週後に、ＳＨＩＶ３３の５０ＡＩＤ50でサルをチャレンジした。免疫化した動物における１１週（チャレンジの時間）目の幾何平均力価はエピトープＩに対しては４６，０００であり、エピトープＩＩＩに対しては５，０００であった。
【０２２４】
ピーク時（２週目）の幾何平均血漿ウイルス負荷量は、試験群が４５６，０００で、対照群が２３４，０００であった。しかしながら、チャレンジ後４週以後、試験群のウイルス負荷量は対照群のそれより著しく低下した（表２７）。
【０２２５】
【表２７】
0004278293.tif 000029
【０２２６】
ＳＩＶ陽性への血清変換は４〜８週目に起こった。従って、血清変換後のウイルス負荷量（ＨＩＶ−１感染の最も重要な予後マーカー）が、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質に対する抗体の存在下で有意に低下したことになる。試験群における２週目のウイルス負荷量の高ピークを理解するために、ウイルスチャレンジの時点（最終免疫化から２週目）でＥＬＩＳＡによりＴＮＦαを試験した。免疫応答の間に放出されるＴＮＦαは、細胞を活性化してＴａｔ介在性の活性化がＨＩＶ−１増殖を支えるための必要条件を無用にすることが知られている。発明者は、血清ＴＮＦαが免疫化前は検出されないのに対し、免疫化して２週目にはＴａｔを免疫化したサルすべてにそれが平均レベル７ｐｇ／ｍｌで検出されることを確認した。
【０２２７】
急性感染に対するＴａｔ阻止の効果が、免疫化に伴うＴＮＦの活性化によって隠されたためであると結論された。これが減退するやＴａｔ免疫化群は有意に低いウイルス負荷量になり、その大部分が検出不能な血漿レベル（＜１００コピー／ｍｌ）になったのである。
実施例１１−予防接種によって誘導される抗体の力価及び特異性を検出するための方法及びキット
本発明のワクチンでの免疫化後に誘導される抗体の力価及び特異性を追跡するために、アッセイ法が利用され得る。そのようなアッセイ法の１つの態様では、予防接種された被検者の抗体の力価及び反応性パターンを測定するキットを創出するために、表２８に報告された配列を含有するペプチドが（免疫化ワクチンの組成物に応じて）使用される。
【０２２８】
【表２８】
0004278293.tif 000030
【０２２９】
これらのペプチドはＮ末端にビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３」を付けて合成される。各ペプチドは別々のアビジン被覆プレート上で被覆され、−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０］という配列は、関連するペプチド配列がアビジンのビオチン結合ポケットの外側になることを保証するスペーサーとして役立つ。次いでプレートを試験血清の希釈液とともにインキュベートして、洗浄し、抗体の結合をヒト免疫グロブリンに対する試薬（例えばビオチンに結合したウサギ抗ヒト免疫グロブリン）又は酵素で直接標識された試薬を用いて確認する。ビオチンラベルを検出するにはアビジン−酵素複合体を使用するか、又は酵素と反応して比色シグナルを発するのに利用される試薬（Ｒ＆Ｄキットインサート）が使用される。
本発明の多くの変更及び変形は、上記の明細書に包含され、当業者に自明であることが予測される。本発明の組成物及び方法に対するそのような変更及び変形は本発明の特許請求の範囲内に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  共通Ｂサブタイプ［ＮＩＨロスアラモスデータベース］に見出される３１の既知ＨＩＶ−１株のＴａｔタンパク質配列に基づいた、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のコンセンサス配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］を図示する。変異が出現するアミノ酸の位置は小文字になっている。
【図２Ａ〜２Ｃ】  以下の実施例５で詳細に記載される、本発明の融合タンパク質［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］をコードする合成遺伝子を図示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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