(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の遺伝子産物において、下記の変異：第240番目のセリンがトレオニンに置換、第247番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、第251番目のトレオニンがアラニンに置換、第258番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、第261番目のヒスチジンがアルギニンに置換、第261番目のヒスチジンがチロシンに置換、及び第265番目のセリンがグリシンに置換からなる群から選ばれる１又は２以上の変異を含む変異体遺伝子産物をコードする変異tax遺伝子。
【請求項２】
ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の遺伝子産物において、下記の変異：第240番目のセリンがトレオニンに置換、第247番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、第251番目のトレオニンがアラニンに置換、第258番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、第261番目のヒスチジンがアルギニンに置換、第261番目のヒスチジンがチロシンに置換、及び第265番目のセリンがグリシンに置換からなる群から選ばれる１又は２以上の変異を含む蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を有する、増殖能が高められたウシ白血病ウイルス。
【請求項４】
野生型ウシ白血病ウイルスの製造方法であって、請求項１に記載の遺伝子を含む組換えベクターを導入した宿主細胞に野生型ウシ白血病ウイルスを感染させた後、該細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項５】
野生型ウシ白血病ウイルスの増殖を促進する方法であって、野生型ウシ白血病ウイルスに感染した細胞において請求項１に記載の遺伝子を発現させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の変異体に関するものである。該変異tax遺伝子は、ウシ白血病ウイルスに対して増殖促進作用を有する。
【０００２】
【従来の技術】
ウシ白血病ウイルス(BLV)は、HTLVに最も近縁のレトロウイルスである。このウイルスは、ヒト免疫不全ウイウス (HIV)と同様にウイルス増殖を調節する遺伝子を有しており、転写に関与するtax遺伝子を有することが知られている。BLVに感染したウシの割合（日本における感染率）は10〜20％であり、そのうちの1 〜2 ％は10〜15年程度という長期の潜伏期間の後に極めて悪性の地方病性ウシ白血病を発症して死に至るので、このウイルスが引き起こす畜産農家への経済的損失は非常に深刻である。このため、BLVの増殖機構の研究は、このウイルス感染症を予防又は治療するための手段を開発するために極めて重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明者らは、BLVに感染したウシ個体が、抗ウイルス抗体には陽性でありながら健康な個体、持続性リンパ球増多症(PL)を発症した個体、及び長い潜伏期の後にＢリンパ腫である地方病性ウシ白血病を発症した個体の３つの特徴的な病態に分類されることに着目し、この理由を遺伝子レベルで解析するために鋭意研究を行った。その結果、tax遺伝子には様々な変異体が存在しており、特定の変異を有するtax蛋白質を有するウイルスでは野生型に比較して転写活性が高められていることを見出した。
【０００４】
本発明者らはさらに研究を続け、tax遺伝子の変異が、ウイルス遺伝子の活性化のみならず、ウイルスの増殖能の強弱にも影響しており、特定の変異tax遺伝子を有するウイルスでは極めて増殖能が高められていることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の遺伝子産物において、下記の変異：
第240番目のセリンがトレオニンに置換、
第247番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、
第251番目のトレオニンがアラニンに置換、
第258番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、
第261番目のヒスチジンがアルギニンに置換、
第261番目のヒスチジンがチロシンに置換、及び
第265番目のセリンがグリシンに置換
からなる群から選ばれる１又は２以上の変異を含む変異体遺伝子産物をコードする変異tax遺伝子を提供するものである。
【０００６】
上記変異tax遺伝子を含み、ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス（例えばHTLV又はHIVなど）、好ましくはウシ白血病ウイルスの増殖を促進する機能を有する遺伝子；及び上記変異tax遺伝子を含み、ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、好ましくはウシ白血病ウイルスの転写活性を促進する機能を有する遺伝子も本発明により提供される。
【０００７】
別の観点からは、ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の遺伝子産物において、下記の変異：
第240番目のセリンがトレオニンに置換、
第247番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、
第251番目のトレオニンがアラニンに置換、
第258番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、
第261番目のヒスチジンがアルギニンに置換、
第261番目のヒスチジンがチロシンに置換、及び
第265番目のセリンがグリシンに置換
からなる群から選ばれる１又は２以上の変異を含む蛋白質が提供される。
【０００８】
ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、好ましくはウシ白血病ウイルスの増殖を促進する上記蛋白質；及びウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、好ましくはウシ白血病ウイルスの転写活性を促進する上記蛋白質も本発明により提供される。
【０００９】
本発明の好ましい態様によれば、上記変異体遺伝子産物は、第240番目のアミノ酸がセリンからトレオニンに置換され、第247番目のアミノ酸がアルパラギン酸からグリシンに置換され、又は第261番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンに置換された遺伝子産物のいずれかから選択される。また、本発明の好ましい遺伝子は、上記の好ましい遺伝子産物をコードする遺伝子である。別の観点からは、上記の遺伝子を有する、増殖能が高められたウシ白血病ウイルスが提供される。また、さらに別の観点からは、上記の遺伝子を含む組換えベクターであって、ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、好ましくはウシ白血病ウイルスの増殖促進作用を有するベクターが提供される。
【００１０】
さらに別の観点からは、野生型ウシ白血病ウイルスの製造方法であって、上記の遺伝子を含む組換えベクターを導入した宿主細胞に野生型ウシ白血病ウイルスを感染させた後、該細胞を培養する工程を含む方法；及び、ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、好ましくは野生型ウシ白血病ウイルスの増殖を促進する方法であって、ウシ白血病ウイルス又はウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルスに感染した細胞において上記の遺伝子を発現させる工程を含む方法が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子は公知であり、その全長は Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.4741-4745, 1984に記載されている。本発明の遺伝子はtax遺伝子の変異体に相当しており、ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子の遺伝子産物において、第240番目のアミノ酸がセリンからトレオニンに置換された；第247番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグリシンに置換された；第251番目のアミノ酸がトレオニンからアラニンに置換された；第258番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグリシンに置換された；第261番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンに置換された；第261番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンに置換された；又は第265番目のアミノ酸がセリンからグリシンに置換された変異体遺伝子産物をコードする遺伝子である。また、本発明の遺伝子は、これらの変異の２個以上を組み合わせて有していてもよい。
【００１２】
本発明の遺伝子はDNA配列又はRNA配列のいずれであってもよい。本発明の遺伝子は、例えば、適宜のプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）などの手段によって容易に入手可能である。その具体例は、本明細書の実施例に詳細に示されている。本発明の遺伝子の遺伝子産物は、本発明の遺伝子を組み込んだ遺伝子発現用のベクターを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより製造することができる。宿主細胞の種類は特に限定されないが、例えば、大腸菌などの微生物細胞、酵母、昆虫細胞、動物細胞などを用いることができる。
【００１３】
本発明の遺伝子は、ウシ白血病ウイルスの増殖を促進する機能、及びウシ白血病ウイルスの転写活性を促進する機能を有しているが、本発明の遺伝子の上記機能は、本明細書の実施例に具体的に説明した方法によって容易に確認することができる。また、本発明の遺伝子は、ウシ白血病ウイルスに近縁のレトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイウス (HIV)の増殖を促進する機能、及び該レトロウイルスの転写活性を促進する機能を有している。
【００１４】
本発明の遺伝子には、上記の遺伝子において１〜数個の核酸が置換、挿入、及び／又は欠失しており、実質的に上記の特定の遺伝子と同様の増殖促進機能又は転写活性促進機能を有する改変遺伝子はすべて包含される。本発明の遺伝子産物には、上記の特定の遺伝子及び上記の改変遺伝子によりコードされ、ウシ白血病ウイルス又はその近縁のレトロウイルスに対して増殖促進機能又は転写活性促進機能を有する蛋白質がすべて包含される。
【００１５】
このような改変遺伝子は、野生型の遺伝子を有する大腸菌などをN-ニトロ-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤を用いて突然変異処理し、菌体から改変蛋白質をコードする遺伝子を回収することにより入手することができ、その遺伝子産物は、通常の遺伝子発現操作を行うことによって製造できる。また、本発明の遺伝子を亜硫酸ナトリウムなどの薬剤で直接処理するか、あるいは部位特異的変異法（Kramer, W. et al., Methods in Enzymology, 154, 350, 1987）やリコンビナントPCR法（PCR Technology, Stockton press, 1989）などの手法によってヌクレオチドの欠失、置換、又は付加を直接導入してもよい。このような改変遺伝子が所望のウイルス増殖促進活性を有するか否かは、本明細書の実施例に記載の方法により、容易に検定することが可能である。
【００１６】
本発明の遺伝子の利用形態は特に限定されないが、例えば、ウシ白血病ウイルスのtax遺伝子を取り除いた後、本発明の遺伝子を外来遺伝子として導入して、増殖能を高めた組換えウイルスを産生する方法；遺伝子発現用のベクターに本発明の遺伝子を組み込み、得られた組換えベクターをBLV感染細胞に導入し、そのウイルス増殖率を高める方法；あるいは、得られた組換えベクターを種々の培養細胞に導入した後、該宿主細胞中で遺伝子産物を発現させるとともに、該宿主細胞に野生型ウイルスを感染させることによって、野生型ウイルス増殖率を高める方法などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
本発明の遺伝子は、ウシ白血病ウイルス及びその近縁のレトロウイルスの増殖機構の研究に有用であり、ウシ白血病の予防及び治療方法、又はBLVに近縁のレトロウイルス感染症の予防及び治療方法を確立するための研究にも有用である。また、本発明の遺伝子の遺伝子産物も、同様に、上記ウイルスの増殖機構の研究、及び上記疾患の予防及び治療方法の確立のための研究に有用である。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
BLV感染健康牛及び白血病発症牛各３頭より全DNAを抽出し、これを鋳型としてPCR法により全長tax遺伝子を増幅後に常法に従ってクローニングし、計８頭のBLV感染牛に由来するtax遺伝子の全塩基配列を決定した。PCRプライマーとしては下記のプライマーを用い、94℃で２分間のプレインキュベートを行った後、94℃で30秒間、60℃で30秒間、及び72℃で１分30秒間を１サイクルとして35サイクルを行い、最後に72℃で５分間のインキュベートを行った。。
Btax 2：5' AG TCT AGA GCT GAC GTC TCT GTC TG 3'（下線部はXbaI制限部位）Btax 3：5' AC C TCG AGA TGG CAA GTG TTG TTG GTT GG 3'（下線部はXhoI制限部位）
【００１９】
PCR産物を制限酵素XhoIとXbaIで消化後、変異tax遺伝子を含む断片を高度発現ベクターpME18NeoのXbaIとXhoIサイトに連結し、BLV Long terminal repeat (LTR)をルシフェラーゼ遺伝子ベクターpGV-P（東洋インキ社）の上流に連結したレポーターベクターpBLTR-Lucとを同時に293T細胞へ導入後、常法(Virology, 243, pp.235-246, 1998)に従ってルシフェラーゼ解析を行なった。
【００２０】
この結果、各変異tax遺伝子のBLV LTRに対する転写活性化能に関して、著しい活性の差異が観察された。変異体はその活性の強弱から、1）ほとんど転写活性の消失しているもの、2）野生型と同等の転写活性を有するもの、及び3）野生型に比べ約4〜18倍転写活性の高いものの３グループに分類された。各変異体の塩基配列を常法により決定し、それらから予測されるアミノ酸配列を比較したところ、高い転写活性化能を示すものの中に７種類のアミノ酸置換を伴う変異型を確認した（図１：S240T, D247G, T251A, D258D, H261R, H261Y, 及びS265G）。表１中、転写活性化能は野生型Tax遺伝子の活性に対する相対値として示した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
次に、高い転写活性化能を示す変異体のうちS240T、D247G、及びH261R、低活性変異体、及び野生型taxを含む発現ベクターをそれぞれBLV感染性クローンpBLF-IF(Virology, 245, pp.53-64, 1998)を安定に導入したAKATA細胞に一過性に導入した。60時間後にBLV感染ヒツジ血清を用いたウエスタンブロットを常法（Virology, 245, pp.53-64, 1998）に従って行ない、導入細胞内でのBLV構造蛋白質 (gp30, p24, gp51, Pr45Gag) の発現誘導能を野生型、低活性型、高活性型tax遺伝子で比較した（表２）。表中、蛋白の発現量はウエスタンブロットにおける各バンドの濃さをBio Image Analyzerにより測定して数値化した。高活性型tax遺伝子は野生型tax遺伝子に比べて２〜3.5倍高いBLV構造蛋白の発現誘導能を示した。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
さらに、各種遺伝子導入細胞の培養上清より回収したBLV粒子の逆転写酵素活性を常法（Virology, 245, pp.53-64, 1998）に従い測定した。野生型、低活性型、高活性型tax遺伝子発現ベクター、及びコントロールベクターをそれぞれBLV感染性クローンpBLF-IF安定導入AKATA細胞に一過性に導入した。60時間後に培養上清中のウイルスを超遠心により濃縮し、逆転写酵素活性をpoly(rT)・p(dT)12-18を鋳型とした3H-TTPの取りこみ量として測定した（表３）。表中、逆転写酵素活性は3H-TTPの取りこみ量で示してある。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
高活性型tax遺伝子は、野生型tax遺伝子に比較して約３倍BLV粒子の産生性を高めることが明らかとなった。また、ウイルス粒子のウエスタンブロット解析（Virology, 245, pp.53-64, 1998）を行うと、BLV粒子中の構造蛋白質 (gp30, p24, gp51)の発現量は、高活性型は、野生型、低活性型tax遺伝子に比べて５倍高いことが明らかとなった。以上のように、高い転写活性化能を示すtax遺伝子は、同時に、BLVのウイルス産生量、ウイルス抗原蛋白の発現も高めていた。
【００２７】
また、BLV感染性分子クローンpBLV-IFの野生型tax遺伝子の一部、ClaI切断部位からEco47III切断部位までの間の727塩基対（26番目から271番目のアミノ酸の間）を変異型tax遺伝子に置換した分子クローンを作成した。この組換えウイルスをtax発現ベクターの非存在下で細胞に導入すると、野生型感染性分子クローン導入細胞に比較して、ウイルス産生量及びウイルス抗原蛋白の発現が高められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型tax遺伝子の遺伝子産物のアミノ酸配列と、高い転写活性化能を示す変異tax遺伝子の遺伝子産物のアミノ酸配列を示した図である。アミノ酸は一文字標記で示してあり、各変異tax遺伝子の遺伝子産物については、相違するアミノ酸のみを示した。矢印はアミノ酸の置換位置を示す。
【図１】
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