(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラゲ（Aequorea）の緑色蛍光タンパク質と比較して増加された励起および発光波長の最大値を有する工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、該機能性蛍光タンパク質のアミノ酸配列が、少なくともアミノ酸置換T203X（ここで、XはH、Y、WまたはFから選択される芳香族アミノ酸である）を含むことで配列番号２と相違し、
（ｉ）アミノ酸配列がさらにS65に置換を含み、該置換がS65G、S65T、S65A、S65L、S65C、S65VおよびS65Iから選択され、または
（ｉｉ）アミノ酸配列が置換S65T/T203H、S65T/T203Y、S72A/F64L/S65G/T203Y、S72A/S65G/V68L/T203Y、S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y、S65G/S72A/T203YまたはS65G/S72A/T203Wによってのみ相違する、
上記核酸分子。
【請求項２】
目的のポリペプチドと前記工学的に作製された機能性蛍光タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項５】
原核細胞または真核細胞である、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２に記載の核酸分子でコードされる工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質に結合された抗体を含んでなる蛍光標識抗体。
【請求項８】
請求項６に記載の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された抗体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項９】
請求項６に記載の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質に結合された核酸プローブを含んでなる蛍光標識核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本出願は、「長波長変異体蛍光タンパク質」と題する、1996年8月16日出願の米国仮特許出願第60/024,050号、及び「長波長の工学的に作製された蛍光タンパク質」と題する、1996年8月30日出願の特許出願第08/706,408号の先の出願日の利益を主張するものであり、両者は引用により本明細書の一部とする。
本発明は、米国立科学財団により与えられた認可番号MCB 9418479のもと、一部政府の援助により完成された。政府は、本発明において権利を有し得るものである。
蛍光性分子はその高い感受性と定量の容易さのため多くのアッセイ系においてレポーター分子として魅力的である。近年、蛍光タンパク質は生物系によりin vivoで生産されることができ、マイクロインジェクションあるいは透過可能化（permeabilization）により細胞へ導入せずとも細胞内の事象を追跡するために使用できることから非常に注目されてきた。Aequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質として特に興味深いものである。このタンパク質のｃＤＮＡがクローン化されている（D. C. Prasherら、”Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein,”Gene（1992）111:229-33）。前記ｃＤＮＡからこのタンパク質の一次アミノ酸配列を発現することができるばかりでなく、発現されたタンパク質は蛍光を発することができる。これはこのタンパク質が蛍光に必要であると考えられる環化と酸化反応を経ることができることを示している。Aequorea緑色蛍光タンパク質（「GFP」）は、238残基の安定なタンパク質分解抵抗性の単一鎖であって、約395及び475nmで二つの吸収極大を示す。これらの二つのピークの相対的な強度は環境的要因に感受性を有し（W. W. Ward. Bioluminescence and Chemiluminescence（M. A. DeLuca及びW. D. McElroy,編）Academic Press pp.235-242（1981）; W. W. Ward及びS. H. Bokman Biochemistry 21:4535-4540（1982）; W. W. Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808（1982））、また照射歴に感受性を有し（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995））、これはおそらく二以上の基底状態を反映するものである。395nmの主要な吸収ピークでの励起により、508nmで0.72〜0.85の量子収量の発光最大を生じる（O. Shimomura及びF. H. Johnson J. Cell. Comp. Physiol. 59:223（1962）; J. G. Morin及びJ. W. Hastings, J. Cell. Physiol. 77:313（1971）; H. Moriseら、Biochemistry 13:2656（1974）; W. W. Ward Photochem. Photobiol. Reviews（Smith, K. C.編）4:1（1979）; A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995）; D. C. Prasher Trends Genet. 11:320-323（1995）; M. Chalfie Photochem. Photobiol. 62:651-656（1995）; W. W. Ward Bioluminescence and Chemiluminescence（M, A. DeLuca及びW. D. McElroy, eds）Academic Press pp. 235-242（1981）; W. W. Ward及びS. H. Bokman
Biochemistry 21:4535-4540（1982）; W. W. Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808（1982））。蛍光団は、残基Ser65及びGly67の間のポリペプチド主鎖の自己触媒的環化と、Tyr66の□-β結合の酸化から生じる（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995）; C. W. Codyら、Biochemistry 32:1212-1218（1993）; R. Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504（1994））。Ser65のThrへの突然変異（S65T）により、励起スペクトルが、増強された強度の488nmの単一のピークに単純化され（R, Heimら、Nature 373:664-665（1995））、これは配座異性体の兆候を示さなくなる（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995））。
蛍光タンパク質は、遺伝子発現のマーカー、細胞系統のトレーサー、生細胞内のタンパク質位置のモニターのための融合タグとして使用されている（M. Chalfieら、,”Green fluorescent protein as a marker for gene expression,”Science 263 :802-805; A. B. Cubittら、”Understanding, improving and using green fluorescent proteins”TIBS 20, November 1995, pp. 448-455.米国特許第5,491,084号,M. Chalfie及びD. Prasher）。さらに、工学的に作製されたAequorea緑色蛍光タンパク質は、変化した励起及び発光最大波長、種々の形態の励起及び発光スペクトル等の変化した蛍光特性を示すことが確認された（R. Heimら、”Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA,（1994）91:12501-04; R. Heimら、”Improved green fluorescence,”Nature（1995）373:663-665）。これらの特性は、生物学的蛍光性指示物質の系列に新たな種類と有用性を付加するものである。
種々の蛍光特性を有する工学的に作製された蛍光タンパク質が求められている。
【図面の簡単な説明】
図1A〜1B。（A）Molscriptによって生産されたGFPの主鎖の概略図である（J. P. Kraulis, J. Appl. Cryst., 24:946（1991））。発色団は球と棒のモデルにより示す。（B）GFPのフォールディング全体の概略図。概略残基数は、二次構造エレメントの最初と最後に記載する。
図2A〜2C。（A）発色団とその直近の残基の立体図。炭素原子は白丸、酸素は黒丸、窒素は影を付した丸で示す。溶媒分子は、単独の黒丸で示す。（B）1.0□で等高線を記した最終的な2F0-Fc電子密度地図の部分であり、発色団の周囲の電子密度を示している。（C）発色団の配位の最初と二番目の球を示す概略図。水素結合は破線で示し、Åで表した長さを示す。挿入図：発色団の生成時に形成されると推定されるカルビノールアミン中間体の推定構造。
図3は、Aequorea緑色蛍光タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号1）と推定アミノ酸配列（配列番号2）を示す。
図4は、好ましい哺乳動物コドンと最適なKozak配列を使用したAequorea関連の工学的に作製された蛍光タンパク質S65G/S72A/T203Yのヌクレオチド配列（配列番号３）と推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図5-1〜5-28は、Aequorea関連緑色蛍光タンパク質S65Tの結晶構造の座標（coordinate）を示す。
図6は、工学的に作製された蛍光タンパク質20A及び10C（表F）の蛍光励起及び発光スペクトルを示す。528nmの垂直の線は、線の左側の10Cと右側の20Aの発光最大を比較するものである。
発明の概要
本発明は、現在存在する緑色及び青色蛍光タンパク質から容易に区別できる種々の蛍光特性を有する機能性工学的に作製された蛍光タンパク質を提供する。そのような工学的に作製された蛍光タンパク質は、細胞内の二以上のプロセスを同時に測定することを可能にするものであり、FRETによりタンパク質-タンパク質相互作用をモニターするために使用する場合には、蛍光エネルギードナーまたはアクセプターとして使用できる。細胞の光力学的毒性及び自発蛍光はより長い波長で有意に減少するので、より長い波長の工学的に作製された蛍光タンパク質は特に有用である。特に、置換T203X（Xは芳香族アミノ酸である）を導入すると、Aequorea関連蛍光タンパク質の励起及び発光波長最大値は高くなる。
一つの形態において、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一である工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、該アミノ酸配列が少なくとも該工学的に作製された蛍光タンパク質の発色団から約0.5nm以下の範囲に位置するアミノ酸置換により配列番号２とは異なり、該置換が発色団の電子環境を変化させ、それにより該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質がAequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供するものである。
一つの形態において、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一であるが、少なくともT203における置換、特にT203X（XはH、Y、WまたはFから選択される芳香族アミノ酸である）により配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供するものである。一つの態様においては、前記アミノ酸配列がS65における置換をさらに含み、該置換はS65G、S65T、S65A、S65L、S65C、S65V及びS65Iから選択される。別の態様においては、前記アミノ酸配列は、置換S65T/T203H；S65T/T203Y；S72A/F64L/S65G/T203Y；S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y；S72A/S65G/V68L/T203Y；S65G/S72A/T203Y；またはS65G/S72A/T203Wのみによって異なる。また別の態様においては、アミノ酸配列はY66においてさらに置換を含み、該置換はY66H、Y66F及びY66Wから選択される。また別の態様においては、アミノ酸配列は、表Ａからの突然変異をさらに含む。また別の態様においては、アミノ酸配列はフォールディング突然変異（folding mutation）をさらに含む。また別の態様においては、前記タンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、好ましい哺乳動物コドンによる少くとも1つのコドンの置換により配列番号１のヌクレオチド配列と異なる。また別の態様においては、核酸分子が融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質が対象のポリペプチドと工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を含む。
別の形態においては、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一であるが少なくともL42、V61、T62、V68、Q69、Q94、N121、Y145、H148、V150、F165、I167、Q183、N185、L220、E222（E222Gではない）またはV224におけるアミノ酸置換により配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供するものである。一つの態様においては、アミノ酸置換は、
L42X（XはC、F、H、W及びYから選択される）、
V61X（XはF、Y、H及びCから選択される）、
T62X（XはA、V、F、S、D、N、Q、Y、H及びCから選択される）、
V68X（XはF、Y及びHから選択される）、
Q69X（XはK、R、E及びGから選択される）、
Q94X（XはD、E、H、K及びNから選択される）、
N121X（XはF、H、W及びYから選択される）、
Y145X（XはW、C、F、L、E、H、K及びQから選択される）、
H148X（XはF、Y、N、K、Q及びRから選択される）、
V150X（XはF、Y及びHから選択される）、
F165X（XはH、Q、W及びYから選択される）、
I167X（XはF、Y及びHから選択される）、
Q183X（XはH、Y、E及びKから選択される）、
N185X（XはD、E、H、K及びQから選択される）、
L220X（XはH、N、Q及びTから選択される）、
E222X（XはN及びQから選択される）、または
V224X（XはH、N、Q、T、F、W及びYから選択される）である。
別の形態においては、本発明は、前記の核酸分子のいずれかに機能的に連結した発現制御配列を含む発現ベクターを提供する。別の形態においては、本発明は、上記発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
別の形態においては、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一である工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、該アミノ酸配列が少なくとも該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質の発色団から約0.5nm以下の範囲に位置するアミノ酸置換により配列番号２とは異なり、該置換が発色団の電子環境を変化させ、それにより工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質がAequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を提供する。
別の形態においては、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一であるが、少なくともT203における置換、特にT203X（XはH、Y、WまたはFから選択される芳香族アミノ酸である）により配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を提供する。一つの態様においては、アミノ酸配列がS65における置換をさらに含み、該置換はS65G、S65T、S65A、S65L、S65C、S65V及びS65Iから選択される。別の態様においては、アミノ酸配列は、置換S65T/T203H；S65T/T203Y；S72A/F64L/S65G/T203Y；S72A/S65G/V68L/T203Y；S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y；S65G/S72A/T203Y；またはS65G/S72A/T203Wのみによって異なる。また別の態様においては、アミノ酸配列は、Y66においてさらに置換を含み、該置換はY66H、Y66F及びY66Wから選択される。また別の態様においては、アミノ酸配列はフォールディング突然変異をさらに含む。また別の態様においては、工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質が、対象のポリペプチドと該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の一部である。
別の形態においては、本発明は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）と実質的に同一であるが、少なくともL42、V61、T62、V68、Q69、Q94、N121、Y145、H148、V150、F165、I167、Q183、N185、L220、E222またはV224におけるアミノ酸置換により配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有する該工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を提供するものである。
また別の形態においては、本発明は、前記工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質のいずれかに結合された抗体を含む、蛍光標識抗体を提供する。一つの態様においては、蛍光標識抗体は融合タンパク質であり、該融合タンパク質は工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質に融合した抗体を含む。
また別の形態においては、本発明は、本発明の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
また別の形態においては、本発明は、アミノ酸配列が本発明のアミノ酸配列である工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質に結合された核酸プローブを含む蛍光標識核酸プローブを提供する。融合はリンカーペプチドにより行うことができる。
また別の形態においては、本発明は、混合物が標的を含むどうかを判定する方法であって、該混合物をプローブと本発明の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質とを含む蛍光標識プローブと接触させ、標的がプローブに結合したかどうかを判定することを含む方法を提供する。一つの態様においては、標的分子は固相マトリックス上に捕捉されている。
また別の形態においては、本発明は、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有する工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を製造する方法であって、Aequorea関連緑色蛍光タンパク質の発色団中の任意の原子から約0.5nm以内の範囲に位置するアミノ酸を別のアミノ酸により置換し、この置換により該タンパク質の蛍光特性を変化させることを含む方法を提供する。一つの態様においては、前記アミノ酸置換は発色団の電子環境を変化させる。
また別の形態においては、本発明は、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有する工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を製造する方法であって、Aequorea関連緑色蛍光タンパク質のループドメイン中のアミノ酸をアミノ酸により置換し、リン酸化またはタンパク質分解のためのコンセンサス配列を形成することを含む方法を提供する。
また別の形態においては、本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移を生み出す方法であって、本発明の工学的に作製された機能性の光タンパク質を含むドナー分子を用意し；蛍光タンパク質のための適当なアクセプター分子を用意し；蛍光共鳴エネルギー転移が可能となるように前記ドナー分子とアクセプター分子とを十分接近して接触させることを含む方法を提供する。
また別の形態においては、本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移を生み出す方法であって、本発明の工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質を含むアクセプター分子を用意し；蛍光タンパク質のための適当なドナー分子を用意し；蛍光共鳴エネルギー転移が可能となるようにドナー分子と前記アクセプター分子とを十分接近して接触させることを含む方法を提供する。一つの態様においては、ドナー分子が、そのアミノ酸配列が置換T203Iを含む工学的に作製された蛍光タンパク質であり、アクセプター分子が、そのアミノ酸配列が置換T203X（XはH、Y、WまたはFから選択される芳香族アミノ酸である）を含む工学的に作製された蛍光タンパク質であり、工学的に作製された機能性の蛍光タンパク質がAequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有するものである。
また別の形態においては、本発明は、配列番号2と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を含むタンパク質の結晶であって、少くとも2.0〜3.0Åの分解能で回折する結晶を提供する。
また別の態様においては、本発明は、結合したリガンドを有する蛍光タンパク質を含む結晶化蛍光タンパク質の三次元モデルから、リガンドの少なくとも一つの第一化学部分と相互作用する蛍光タンパク質の少なくとも一つの相互作用性アミノ酸を決定し、該相互作用性アミノ酸と第一化学部分との相互作用に比べて、該相互作用性アミノ酸と第二化学部分との相互作用を低下または増加させる構造をもつ第二化学部分を生成するように、第一化学部分の少なくとも一つの化学修飾を選択することを含む蛍光タンパク質のコンピュータによる設計方法を提供する。
また別の態様においては、本発明は、図5-1〜5-28の原子座標に挙げられた少くとも二つの原子の三次元的関係を測定することを含む、蛍光タンパク質の三次元構造をコンピュータによりモデル化する方法を提供する。
また別の態様においては、本発明は、図5-1〜5-28に挙げられた原子座標から選択された少くとも10の原子座標をデバイス中に記憶した記憶デバイスを含むデバイスを提供する。一つの態様においては、記憶デバイスが原子座標をインプットとして受け取るコードを記憶するコンピューターで読み取り可能な装置である。また別の態様においては、コンピューターで読み取り可能な装置は、フロッピーディスクあるいはハードドライブである。
発明の詳細な説明
1.定義
別途に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似した、あるいは等価の任意の方法及び材料を本発明の実施あるいは試験において使用することができるが、好ましい方法と材料を記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下の通り定義する。
「結合対」とは、互いにアフィニティを有する二つの部分（例えば化学的、あるいは生化学的）をいう。結合対の例としては、抗原/抗体、レクチン/アビジン、標的ポリヌクレオチド/プローブオリゴヌクレオチド、抗体/抗-抗体、アクセプター/リガンド、酵素/リガンド等が挙げられる。「結合対の一つのメンバー」とは、抗原、あるいはリガンドのような対の一つの部分をいう。
「核酸」は、一本鎖あるいは二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、特に限定しない限り、天然のヌクレオチドに類似した形態で機能できる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含する。核酸分子がＤＮＡ配列によって表現される場合は、これは「U」を「T」に置き換えた対応するＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子を含むことは理解されるであろう。
「組換え核酸分子」とは、天然には存在しない核酸分子であって、天然には結合しない二つのヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。組換え核酸分子は、人工的な組換え、例えば遺伝子操作技術、あるいは化学合成によって作製される。
ポリペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列と記載する場合は、ｍＲＮＡの転写と翻訳により、配列が該ポリペプチドを産生することを意味する。これは、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡと同一であり、その配列が配列リストに通常記載されるコード鎖、及び転写の鋳型として使用されるその相補鎖の両方を含む。当業者には明らかなように、これは同じアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド配列も全て含む。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含む配列を含む。
「発現制御配列」は、それらが機能的に連結するヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列をいう。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写及び適当な場合に翻訳を制御及び調節する場合に、発現制御配列はヌクレオチド配列に「機能的に連結している」ものとする。従って、発現制御配列は、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ATG）、イントロン、ｍＲＮＡの適当な翻訳を可能とするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル及び停止コドンを含み得る。
本明細書で「天然の」をある対象に使用する場合、対象が自然において見られるという事実をいう。例えば、自然の起源から分離され得、実験室において人為的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドあるいはポリヌクレオチド配列は天然のものである。
「機能的に連結された」は、そのように記載した要素がそれらに意図されるような形態で機能することを可能とするような関係にある並列状態をいう。コード配列に「機能的に連結した」制御配列は、適当な分子（例えば、誘導物質及びポリメラーゼ）が制御配列あるいは調節配列に結合した場合等、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような形態で結合されている。
「制御配列」は、それが結合したコード配列あるいは非コード配列の発現を行うのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。そのような制御配列の種類は宿主生物により異なり、原核生物においては、そのような制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を一般に含み、真核生物においては、一般にそのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は少なくとも、存在が発現に影響し得る要素を含むことを意図するものであり、また例えばリーダー配列及び融合パートナー配列のように存在が有利である追加的な要素を含み得る。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、ゲノムのもの、ｃＤＮＡもしくは合成起源のもの、またはそれらの何等かの組み合わせであるポリヌクレオチドであって、その起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が自然において見られる細胞と結合していないか、（2）それが自然において結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結しているものである。
「ポリヌクレオチド」は、長さが少くとも10塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいい、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、あるいはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態のいずれでもよい。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖の形態を含む。
用語「プローブ」は、別の物質（「標的」）に特異的に結合する物質をいう。プローブは、例えば抗体、核酸、受容体及びそのリガンドを含む。
「モジュレーション」は、生物学的活性あるいはプロセス（例えば、酵素活性あるいは受容体結合）の機能特性を増強または阻害する能力をいう。そのような増強あるいは阻害は、シグナル伝達経路の活性化等の、特異的な事象の発生に付随するものでもよく、及び／または特定の細胞型だけにおいて発現するものでもよい。
用語「モジュレーター」は、合成分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドあるいは有機分子）のような化学物質（天然あるいは非天然のもの）、あるいは細菌、植物、真菌あるいは動物（特に哺乳動物）細胞もしくは組織のような生物学的な材料から製造した抽出物をいう。モジュレーターは、本明細書に記載するスクリーニングアッセイに使用することにより、生物学的プロセスの（直接または間接の）阻害剤または活性剤としてのその潜在的な活性について評価できる（例えばアゴニスト、半アンタゴニスト、半アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、抗腫瘍剤、細胞毒性剤、腫瘍性転化あるいは細胞増殖の阻害剤、細胞増殖促進剤等）。モジュレーターの活性は、既知でもよく、未知でもよく、あるいは部分的に既知でもよい。
用語「試験化学物質」は、推定のモジュレーターとして本発明のスクリーニング方法の一以上により試験される化学物質をいう。試験化学物質は通常、対象の標的に結合するかどうか未知のものである。用語「対照試験化学物質」は、標的に結合することが知られている化学物質をいう（例えば、既知のアゴニスト、アンタゴニスト、半アゴニストあるいは逆アゴニスト）。通常、例えば.01μM、.1μM、1.0μM、10.0μM等の試験化学物質の種々の所定濃度をスクリーニングに使用する。
用語「標的」は、生物学的プロセスに関与する生化学的対象をいう。標的は、典型的には、生物の生理学あるいは生物学において有用な役割を演ずるタンパク質である。治療用の化学物質は標的に結合してその機能を変えるか、モジュレートする。本明細書で使用するように、標的は細胞表面受容体、G-タンパク質、キナーゼ、イオンチャネル、ホスホリパーゼ及び本明細書で挙げたその他のタンパク質を含み得る。
用語「標識」は、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、あるいは化学的手段によって検出可能な組成物をいう。例えば、有用な標識としては、32P、蛍光染料、蛍光タンパク質、高電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般に使用されるもの）、ビオチン、ジオキシゲニン、あるいはハプテン、及び抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用できるタンパク質が挙げられる。例えば、本発明のポリペプチドは、例えばポリペプチドにそれらを導入することにより検出可能な標識として製造することができ、そしてポリペプチドと特異的に反応する抗体を標識するのに使用することができる。多くの標識は、放射能、蛍光、あるいは酵素活性のような測定可能なシグナルを生成するものであり、結合した標識の量を定量するのに使用できる。
用語「核酸プローブ」は、別の核酸分子の特異的な配列またはサブ配列に結合する核酸分子をいう。プローブは、好ましくは標的核酸の全配列またはサブ配列に相補的な塩基対形成により結合する核酸分子である。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブ配列と完全な相補性がない標的配列にプローブが結合し得ることは理解されるであろう。プローブは、好ましくは同位元素、発色団、発光団、色原体、蛍光タンパク質により直接標識されるか、ストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチンのようなもので間接的に標識する。プローブの有無についてアッセイすることにより、選択配列またはサブ配列の有無を検出することができる。
「標識核酸プローブ」は、プローブに結合した標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるように、共有結合により、あるいはリンカーを介して、あるいはイオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合のいずれかにより標識に結合した核酸プローブである。
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然のアミノ酸ポリマーに使用される。用語「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ分子からのタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現によって産生されるタンパク質をいう。
用語「組換え宿主細胞」は、組換え核酸分子を含む細胞をいう。即ち、例えば、組換え宿主細胞は、その細胞の天然状態（非組換体）には見られない遺伝子を発現することができる。
用語「単離された」、「精製された」あるいは「生物学的に純粋な」は、天然の状態で見られる、通常それに伴う成分を実質的に、または本質的に含まない物質をいう。純度及び均質性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいは高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して測定される。調製物中に存在する優勢なタンパク質または核酸種であるタンパク質または核酸分子を実質的に精製する。一般に、単離されたタンパク質または核酸分子は、調製物中に含まれる全ての高分子種の80%を越える量を構成する。好ましくは、タンパク質は存在する全ての高分子種の90%を越える量を構成するように精製される。より好ましくは、タンパク質は95%を越えるまで精製され、最も好ましくは、タンパク質は、通常の技術によっては他の高分子の種が検出されないような、実質的に均質になるまで精製される。
ある対象に使用された用語「天然の」は、対象が自然において見つけることができるという事実を示す。例えば、天然の起源から単離することができ、実験室において人為的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）において存在するポリペプチドあるいはポリヌクレオチド配列は天然のものである。
用語「抗体」は、一以上の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片であって、被検体（抗原）に特異的に結合しそれを認識するものをいう。認められている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば、完全な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生産された多くの特性化された断片として存在する。これは例えばFab’及びF（ab）’2断片を含む。本明細書で使用するように用語「抗体」は、抗体全体の修飾により生成された抗体断片、あるいは組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成された断片も含む。
用語「イムノアッセイ」は、被検体に特異的に結合する抗体を使用するアッセイをいう。イムノアッセイは、被検体を単離、標的化、及び／または定量するために特定の抗体の特異的結合能を使用することを特徴とする。
二つの核酸またはポリペプチド配列に関しての「同一」の用語は、対応を最大にしてアライメントをとったときに同じである二つの配列中の残基をいう。配列同一性のパーセンテージをタンパク質またはペプチドに関して使用する場合、同一でない残基位置は保存アミノ酸置換によって異なることが多いことが認められ、この場合アミノ酸残基は類似した化学的性質（例えば電荷あるいは疎水性）を有し、従って分子の機能的特性を変化させない他のアミノ酸残基により置換されている。配列が保存的置換により異なる場合は、配列同一性を上流へ調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は当業者に周知である。これは典型的には、完全なミスマッチではなく部分的なものとして保存的置換にスコア付けし、それによりパーセント配列同一性を上昇させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が1のスコア、非保存的置換が０のスコアで示されるとすると、保存的置換は０と１との間のスコアで示される。保存的置換のスコアは例えば公知のアルゴリズムにより計算される。例えば、Meyers及びMiller, Computer Applic. Biol, Sci.,4:11-17（1988）; Smith及びWaterman（1981）Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman及びWunsch（1970）J. Mol. Biol. 48:443; Pearson及びLipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 85:2444; Higgins及びSharp（1988）Gene, 73:237-244及びHiggins及びSharp（1989）CABIOS 5:151-153; Corpetら、（1988）Nucleic Acids Research 16, 10881-90; Huangら、（1992）Computer Applications in the Biosciences 8, 155-65、及びPearsonら、（1994）Methods in Molecular Biology 24, 307-31を参照。アライメントは、観察及び手作業のアライメントにより行われることが多い。
特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」は、同一であるか本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一な核酸により任意の所定のポリペプチドがコードされる。例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGA、及びAGGは全てアミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンによって指定されるいずれの位置においても、コードされたポリペプチドを変えることなくそのコドンを対応するコドンに変化させることができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、「保存的に修飾された変異」の一種である。本明細書の、ポリペプチドをコードする核酸配列はいずれも、あらゆる可能なサイレント変異も意味するものである。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるAUGを除く）を標準的な技術により修飾して機能的に同一の分子が生成できることを理解するであろう。従ってポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変異」は、各記載した配列に内在するものである。さらに当業者であれば、コード配列中の一つのアミノ酸または小さいパーセンテージ（典型的には5%未満、より典型的には1%未満）のアミノ酸の変化、付加または欠失を起こす個々の置換、欠失あるいは付加が、「保存的に修飾された変異」であり、該変化によりアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されることを理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的アミノ酸置換は当分野において周知である。以下の6つのグループは、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リシン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；及び
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
用語「相補的」は、一つの核酸分子が別の核酸分子の結合パートナーの配列を有することを意味する。即ち、配列5’-ATGC-3’は、配列5’-GCAT-3’に相補的である。
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が所定の比較ウィンドウにおいて基準配列に対して少くとも80%の配列同一性を有する場合に、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は基準配列に「実質的に同一」であるか「実質的に類似している」ものとする。従って、実質的に類似した配列として、例えば少くとも85%の配列同一性、あるいは少くとも90%の配列同一性、あるいは少くとも95%の配列同一性、あるいは少くとも99%の配列同一性を有するものが挙げられる。互いに同一である二つの配列はもちろん実質的に同一でもある。
対象ヌクレオチド配列の相補配列が基準ヌクレオチド配列に実質的に同一である場合、対象ヌクレオチド配列は基準ヌクレオチド配列に「実質的に相補的」である。
用語「ストリンジェントな条件」は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用される温度とイオン条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、また種々の環境パラメータにより異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、特定のイオン強度及びpHにおいて特定の配列に対する熱変性温度（Tm）より約５℃〜20℃低く選択される。Tmは、（特定のイオン強度及びpHにおいて）標的配列の50%が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。
用語「対立遺伝子変異体」は、特定の遺伝子座における遺伝子の多形性形態、並びに遺伝子のｍＲＮＡ転写産物から誘導されたｃＤＮＡ及びそれらによってコードされるポリペプチドをいう。
用語「好ましい哺乳動物コドン」は、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質において最も頻繁に使用されるアミノ酸をコードするコドンのセットからの、コドンのサブセットをいい、以下のリストから選択される。
アミノ酸        高等哺乳動物発現に好ましいコドン
Gly                    GGC、GGG
Glu                    GAG
Asp                    GAC
Val                    GUG、GUC
Ala                    GCC、GCU
Ser                    AGC、UCC
Lys                    AAG
Asn                    AAC
Met                    AUG
Ile                    AUC
Thr                    ACC
Trp                    UGG
Cys                    UGC
Tyr                    UAU、UAC
Leu                    CUG
Phe                    UUC
Arg                    CGC、AGG、AGA
Gln                    CAG
His                    CAC
Pro                    CCC
蛍光性分子は、蛍光共鳴エネルギー転移（「FRET」）において有用である。FRETはドナー分子とアクセプター分子を使用する。FRETの効率と検出感度をドナーとアクセプター分子の間で最適化するためには、いくつかの因子のバランスを図る必要がある。ドナーの発光スペクトルはアクセプターの励起スペクトルにできるだけ大きくオーバーラップさせて重なり積分を最大にする。また、ドナー部分の量子収量とアクセプターの吸光係数は同様にできるだけ高くして、エネルギー転移効率が50%である距離、R0を最大にする。これに対し、ドナーとアクセプターの励起スペクトルはできるだけオーバーラップしないようにし、直接アクセプターを励起させることなくドナーが効率的に励起されるような波長領域があるようにする。アクセプターの直接の励起から生じる蛍光をFRETから生じる蛍光から区別するのは困難である。同様に、ドナーとアクセプターの発光スペクトルはできるだけオーバーラップしないようにし、二つの発光が明確に識別できるようにする。アクセプターからの発光が唯一の読み取り値として測定される場合、あるいは発光割合の一部として測定される場合は、アクセプター部分の高い蛍光量子収量が望ましい。ドナー及びアクセプター対を選択する際に考慮すべき一つの因子は、それらの間の蛍光共鳴エネルギー転移の効率である。好ましくは、ドナーとアクセプターの間のFRETの効率は、少くとも10%、より好ましくは少くとも50%、さらにより好ましくは少くとも80%である。
用語「蛍光特性」は、適当な励起波長でのモル吸光係数、蛍光量子効率、励起スペクトルまたは発光スペクトルの形状、励起波長最大値及び発光波長最大値、二つの異なる波長での励起強度の比、二つの異なる波長での発光強度の比、励起状態の寿命、あるいは蛍光異方性をいう。野生型Aequorea GFPと変異体形態の間で、これらの特性のいずれかにおける測定可能な差違を検出するのが有用である。測定可能な差違は、任意の量的な蛍光特性、例えば特定の波長での蛍光の量、あるいは発光スペクトルに対する蛍光の積分量等の量を測定することによって決定することができる。二つの異なる波長における励起強度または発光強度の比の測定（それぞれ「励起強度比測定」及び「発光強度比測定」）は特に有利であり、これは比測定プロセスにより内部基準が得られ、励起源の絶対輝度、検出器の感度、サンプルによる光散乱あるいは消光による変動が相殺されるからである。
II.工学的に作製された長波長蛍光タンパク質
A.蛍光タンパク質
本明細書で使用するように用語「蛍光タンパク質」は、適当な電磁放射線で励起されたときに蛍光を発する能力を有する任意のタンパク質をいう。これは、アミノ酸配列が天然のもの、あるいは工学的に作製されたもの（即ち、類似体または突然変異体）である蛍光タンパク質を含む。多くの刺胞動物が、生物発光におけるエネルギー転移アクセプターとして緑色蛍光タンパク質（「GFP」）を使用している。本明細書で使用するように「青色蛍光タンパク質」は、緑色光蛍光を発するタンパク質である。同様に、「青色蛍光タンパク質」は青色光蛍光を発し、「赤色蛍光タンパク質」は、赤色光蛍光を発する。GFPは、太平洋北西部のクラゲであるAequorea victoria、ウミシイタケ、である。Renilla reniformis及びPhialidium gregariumから分離されている。W. W. Wardら、Photochem. Photobiol.., 35:803-808（1982）; L. D. Levineら、Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85（1982）。
Aequorea victoriaからの天然のGFPのアミノ酸配列を修飾することによって、有用な励起及び発光スペクトルを有する種々のAequorea関連蛍光タンパク質が工学的に作製されている（D. C. Prasherら、Gene, 111:229- 233（1992）; R. Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci.., USA, 91:12501-04（1994）; 1994年11月10日出願の米国特許出願第08/337,915号、1995年11月10日出願の国際出願PCT/US95/14692）。
本明細書で使用するように蛍光タンパク質が「Aequorea関連蛍光タンパク質」であるのは、蛍光タンパク質の任意の150アミノ酸の連続する配が、図3の238アミノ酸の野生型クラゲ（Aequorea）緑色蛍光タンパク質（配列番号2）からの連続的であっても連続的でなくてもよいアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する場合である。より好ましくは、合蛍光タンパク質がAequorea関連蛍光タンパク質であるのは、蛍光タンパ任意の200アミノ酸の連続する配列が、図3の野生型Aequorea緑色蛍光タンパク質（配列番号2）からの、連続的であっても連続的でなくてもよいアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する場合である。同様に、蛍光タンパク質は同じ基準でRenillaまたはPhialidium野生型蛍光タンパク質と関連するものであってもよい。
Aequorea関連蛍光タンパク質としては、限定するものではなく例として、野生型（天然）Aequorea victoria GFP（D. C. Prasherら、”Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein,”Gene（1992）111 : 229-33）（このタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号1）と推定アミノ酸配列（配列番号2）を図3に示す）；この配列の対立遺伝子変異体、例えば80位のグルタミン残基をアルギニンで置換したQ80R（M. Chalfieら、Science,（1994）263:802-805）；本明細書で記載した工学的に作製されたAequorea関連蛍光タンパク質、（例えば表AまたはFのもの）一以上の折り畳み変異を含む変異体、及び蛍光性を有するこれらのタンパク質の断片、（例えばAequorea緑色蛍光タンパク質から二つのアミ末端アミノ酸を除去したもの等）が含まれる。これらのいくつかのものは、中心の色団内に野生型とは異なる芳香族アミノ酸を含み、野性型よりも明らかに短い波長の蛍光を発する。例えば、工学的に作製されたタンパク質P4及びP4-3は（他の突然変異に加えて）置換Y66Hを含むが、W2及びW7は（他の突然変異に加えて）Y66Wを含む。一次配列においてタンパク質の発色団領域に近いその他の突然変異及びそれから遠いその他の突然変異は、GFPのスペクトル特性に影響を及ぼす可能性があり以下の表の最初の部分に挙げる。
0004232992.tif 000002
0004232992.tif 000003
「折り畳み変異」と呼ばれるAequorea関連蛍光タンパク質における別の変異は、より高い温度で折り畳まれ、哺乳動物細胞において発現された場合ににより蛍光性が高くなるという蛍光タンパク質の能力を改善するが、励起及び発光のピーク波長に殆どあるいは全く影響を及ぼさない。これらをGFPのスペクトル特性に影響を与える変異と組み合わせて改変されたスペクトル及び折り畳み特性を有するタンパク質を生産し得ることに注目すべきである。折り畳み変異としては、F64L、V68L、S72A、さらにT44A、F99S、Y145F、N146I、M153TまたはA、V163A、I167T、S175G、S205T及びN212Kが挙げられる。
本明細書で使用されるように用語「ループドメイン」は、□-バレルまたは中央□-ヘリックスの11の鎖の二次構造に関与するアミノ酸を結合するAequorea関連蛍光タンパク質のアミノ酸配列をいう（残基56-72）（図1A及び1B参照）。
本明細書で使用されるように、蛍光タンパク質の「蛍光タンパク質部分」は、蛍光タンパク質基質のアミノ酸配列を天然の蛍光タンパク質のアミノ酸配列と最適な形で並べたとき、天然の蛍光タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端とカルボキシ末端のアミノ酸のこれらも含めた間にある蛍光タンパク質のアミノ酸配列の部分である。
蛍光タンパク質を他の標的タンパク質に遺伝学的に融合し、マーカーとして使用して、生産された標的タンパク質の位置と量とを確認できることが判明した。従って本発明は、蛍光タンパク質部分とさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質を提供する。そのような配列は例えば、約15以下、あるいは約50以下、あるいは約150以下、あるいは約1000以下のアミノ酸長を取り得る。融合タンパク質は電磁放射線で励起したときに蛍光を発する能力を有する。一つの実施態様においては、融合タンパク質は該タンパク質の精製に役立つポリヒスチジンタグを含む。
B.改変した蛍光特性を有する突然変異体を設計するための緑色蛍光タンパク質の結晶構造の使用
本発明者らは、X線結晶学及びコンピューター処理を使用して、分子中の原子の相対的位置を示すAequorea緑色蛍光タンパク質の結晶構造のモデルを作製した。この情報は、置換されるとこのタンパク質の蛍光特性を変えるアミノ酸を同定するのに有用である。
Aequorea関連蛍光タンパク質の蛍光特性は、部分的には発色団の電子環境に依存する。一般に、発色団の約0.5nmの範囲内にあるアミノ酸は、発色団の電子環境に影響する。従ってそのようなアミノ酸の置換により、改変した蛍光特性を有する蛍光タンパク質を生産することができる。励起状態においては、電子密度はフェノラートから発色団のカルボニル末端の方へ移動する傾向を示す。従って、発色団のカルボニル末端の近傍に正電荷を配置して高くしていくと、励起状態のエネルギーは低下し、タンパク質の吸収及び発光波長最大値の赤色へのシフトを起こす傾向を示す。発色団のカルボニル末端の近傍の正電荷を減少させると逆の効果を有する傾向を示し、タンパク質の波長において青色へのシフトを引き起こす。
荷電側鎖基を有するアミノ酸（イオン化したD、E、K及びR）、双極性側鎖基を有するアミノ酸（H、N、Q、S、T及び荷電していないD、E及びK）及び分極性側鎖基を有するアミノ酸（例えばC、F、H、M、W及びY）は、特にそれらを荷電していない側鎖基を有するアミノ酸、無極性側鎖基を有するアミノ酸、あるいは非分極性側鎖基を有するアミノ酸で置換する場合、発色団の電子環境を変えるのに有用である。一般に、分極性側鎖基を有するアミノ酸は電子の環境を最も変化させないものであり、従って比較的小さい蛍光特性の変化を生じると予測される。荷電側鎖基を有するアミノ酸は最も大きく環境を変えるものであり、従って比較的大きい蛍光特性の変化を生じると予測される。しかし、荷電側鎖基を有するアミノ酸は、さらなる溶媒和あるいは塩架橋せずに発色団のそばに埋め込まれると、タンパク質の構造を分断し、適当な折り畳みを阻害しやすい。従って、荷電アミノ酸が最も許容されやすく、それが既に溶媒和されたあるいは塩架橋に関与するその他の荷電あるいは高極性アミノ酸を置換する場合、有用な効果を与える傾向が強い。分極性のアミノ酸による置換を選択したある特定の場合においては、タンパク質の構造により、より大きいアミノ酸、（例えばW）を選択することがより適当でないものとなり得る。あるいは、好ましくない方向に配向した荷電あるいは極性の側鎖基を有するアミノ酸で占められた位置を、より低い荷電あるいは極性の側鎖基を有するアミノ酸で置換することもできる。別の選択肢としては、側鎖基がタンパク質中で一方向に配向した双極子を有するアミノ酸を、異なる方向を向く双極子を有するアミノ酸で置換することができる。
特に、表Bは、発色団から約0.5nmの範囲内に位置し、置換によって変化した蛍光特性を生じ得るアミノ酸のいくつかを挙げたものである。この表は、タンパク質の蛍光特性を変化させるための、示した位置での下線を付した好ましいアミノ酸置換を示す。そのような置換を導入するために、増幅を含む部位特異的突然変異誘発において使用したプライマーのコドンも表に示す。これらのプライマーは好ましいアミノ酸を経済的にコードするために選択されたものであるが、それらは示したように他のアミノ酸、あるいはZで示される停止コドンもコードする。このような縮退プライマーを使用した置換の導入においては、最も有効な戦略は、集合物（collection）をスクリーニングして所望の特性を有する変異体を同定し、そしてそのＤＮＡを配列決定して可能性のある置換のどれが関与しているかを見つけ出すことである。コドンは二本鎖形態で示し、センス鎖を上に、アンチセンス鎖を下に示す。核酸配列においては、R=（Aまたはg）；Y=（CまたはT）；M=（AまたはC）；K=（gまたはT）；S=（gまたはC）；W=（AまたはT）；H=（A、TまたはC）；B=（g、TまたはC）；V=（g、AまたはC）；D=（g、AまたはT）；N=（A、C、gまたはT）である。
0004232992.tif 000004
0004232992.tif 000005
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分極可能な側鎖基で置換可能な極性側鎖基を有するアミノ酸の例としては、例えば表Cのものが挙げられる。
0004232992.tif 000007
別の実施態様においては、発色団の約0.5nmの範囲内の第二のアミノ酸に近いアミノ酸は置換されると該第二のアミノ酸の電子特性を変化させ、そして発色団の電子環境を変化させることができる。表Dにそのようなアミノ酸を二種示す。L220及びV224のアミノ酸はE222の近くにあり、□プリーツシート中で同じ方向を向いている。
0004232992.tif 000008
本発明の一つの実施態様は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）に実質的に同一であり、かつ少なくともQ69において置換が起こっている点が配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有することを特徴とする工学的に作製された機能性蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。好ましくは、Q69における置換はK、R、E及びGの群から選択される。Q69置換は、S65における機能性変異のような他の突然変異と組み合わせてタンパク質の特性を改善することができる。
本発明の一つの実施態様は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）に実質的に同一であり、かつ少なくともE222において置換が起こっている点が配列番号２とは異なるが、E222Gは含まない工学的に作製された機能性蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有することを特徴とする工学的に作製された機能性蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。好ましくは、E222における置換はN及びQの群から選択される。E222置換は、F64における機能性変異のような他の突然変異と組み合わせてタンパク質の特性を改善することができる。
本発明の一つの実施態様は、アミノ酸配列がAequorea緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）に実質的に同一であり、かつ少なくともY145において置換が起こっている点が配列番号２とは異なる工学的に作製された機能性蛍光タンパク質であって、Aequorea緑色蛍光タンパク質とは異なる蛍光特性を有することを特徴とする工学的に作製された機能性蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。好ましくは、Y145における置換はW、C、F、L、E、H、K及びQの群から選択される。Y145置換は、Y66のような他の突然変異と組み合わせてタンパク質の特性を改善することができる。
本発明はまた、新規な蛍光タンパク質突然変異を設計するための、結晶座標を使用する計算方法と、座標を含む結晶データを記憶するための装置とを包含するコンピューターに関連する実施態様も包含する。例えば本発明は、記憶装置と、該装置に記憶される、図5-1〜5-28に挙げた原子座標から選択される少なくとも10の原子座標を装置中とを含む装置を包含する。計算の複雑さあるいは座標を使用する目的により、より多くの座標を記憶させることができる（例えば約100、あるいは1000、あるいはそれ以上の座標）。例えば、蛍光タンパク質構造のより詳細な表現のためには座標の数がより大きいことが望ましい。典型的には、記憶装置は、原子座標を入力として受け取るコードを記憶するコンピューターで読み取り可能な装置である。しかし、当分野で公知のその他の記憶手段も使用できる。コンピューター読み取り可能な装置は、フロッピーディスクあるいはハードディスクドライブとすることができる。
C.工学的に作製された長波長蛍光タンパク質の製造
蛍光タンパク質の組換えによる生産は、該タンパク質をコードする配列を有する核酸分子を発現することを含む。
一つの実施態様においては、核酸は、単一のポリペプチドが蛍光タンパク質部分を長いポリペプチド内に含む融合タンパク質をコードする。この長いポリペプチドは、第二の機能性タンパク質、例えばFRETパートナーあるいは第二の機能を有するタンパク質（例えば、酵素、抗体、あるいはその他の結合性タンパク質）を含み得る。蛍光タンパク質をコードする核酸は出発物質として有用である。
蛍光タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により融合タンパク質として生産することができる。蛍光タンパク質の組換えによる生産は、該タンパク質をコードする配列を有する核酸を発現することを含む。蛍光タンパク質をコードする核酸は、当分野において公知の方法によって得ることができる。蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質をコードしている他の核酸の部位特異的突然変異により、または0.1mM MnCl2及びバランスされていないヌクレオチド濃度により元ののポリヌクレオチドのPCRのエラー率を高めることにより起こるランダム突然変異誘発によって生産することができる。例えば、1994年11月10日に出願された米国特許出願08/337,915号、あるいは1995年11月10日出願の国際出願PCT/US95/14692を参照。緑色蛍光タンパク質をコードする核酸は、図3に示すように、A. victoria緑色蛍光タンパク質のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを使用した、A. victoria由来のｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。PCR法は、例えば、米国特許第4,683,195号；Mullisら、（1987）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263;及びErlich編.,PCR Technology,（Stockton Press, NY, 1989）に記載されている。
発現ベクターの構築とトランスフェクトされた細胞中での遺伝子の発現は、やはり当分野において周知の分子クローニング技術を使用することを含む。Sambrookら、Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,（1989）及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編.,（Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.及びJohn Wiley & Sons, Incの共同事業.）。発現ベクターは、適当なプロモーター、複製配列、マーカー等を包含させることにより、原核生物あるいは真核生物に機能を適合させることができる。
対象のポリペプチドの発現をコードする配列を用いて細胞をトランスフェクトするために使用される核酸は一般に、該ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように結合した発現調節配列を含む発現ベクターの形態である。使用するように、用語、ポリペプチドの「発現をコードするヌクレオチド配列」は、ｍＲＮＡの転写と翻訳によりポリペプチドを生産する配列をいう。これは、例えばイントロンを含む配列を包含し得る。発現調節配列は、核酸配列の転写及び適当な場合に翻訳を調節及び制御する際に、核酸配列に機能可能なように結合される。従って、発現調節配列は、適当なプロモーター；エンハンサー；転写ターミネーター；タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ATG）；イントロン、ｍＲＮＡの適当な翻訳を可能とするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル；及び終結コドンを含み得る。
当業者に周知の方法を使用して、蛍光タンパク質コード配列と適当な転写/翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。そのような方法としては、in vitro組換えＤＮＡ法、合成法、及びin vivo組換え/遺伝子組換えを含む（例えば、Maniatisら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989に記載された技術を参照）。
組換えＤＮＡを用いる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用の技術により行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取込むことができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後で回収した細胞から調製し、続いて当分野で周知の手順でCaCl2法により処理することができる。あるいは、MgCl2またはRbClを使用することができる。また形質変換は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後であるいはエレクトロポレーションにより行うこともできる。
宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈殿のようなＤＮＡのトランスフェクション方法、マイクロインジェクションのような慣用の物理的手法、エレクトロポレーション、リポソームに収容されたプラスミドの挿入、あるいはウイルスベクターを使用することができる。また真核細胞は、本発明の融合ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択可能な表現型をコードしている第二の外来ＤＮＡ分子とを用いて同時トランスフェクトすることもできる。また別の方法は、サルウイルス４０（SV40）あるいはウシ乳頭腫ウイルスのような真核生物ウイルスのベクターを使用して真核細胞に一時的に感染させ、即ち形質転換してタンパク質を発現させることである（Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編、1982）。好ましくは、本明細書で記載するように、真核生物宿主を宿主細胞として使用することが好ましい。
微生物によりあるいは真核細胞により発現された本発明のポリペプチドの単離及び精製のための方法は、例えば分取クロマトグラフィー分離や、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体あるいは抗原を使用する免疫学的分離のような任意の慣用の手段により行うことができる。
一つの実施態様においては、組換え蛍光タンパク質は、該タンパク質をコードする核酸を大腸菌中で発現することによって生産することができる。Aequorea関連蛍光タンパク質は約15℃及び30℃の間で培養された細胞によって最もよく発現されるが、さらに高い温度（例えば37℃）でも可能である。合成の後、これらの酵素はより高い温度（例えば、37℃）でも安定で、アッセイおいてはそのような温度で使用することができる。
種々の宿主-発現ベクター系を使用して蛍光タンパク質コード配列を発現することができる。そのようなものとしては、限定するものではないが、蛍光タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物；蛍光タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；蛍光タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）を感染させた植物細胞系、または蛍光タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；蛍光タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；または、蛍光タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、安定な発現のために工学的に作製された形質転換動物細胞系等が挙げられる。
使用する宿主/ベクター系に応じて、多数の適当な転写及び翻訳エレメントの任意のもの、例えば構成性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクター中に使用することができる（例えば、Bitterら、Methods in Enzymology 153:516-544, 1987を参照）。例えば、細菌系中でのクローニングの場合は、バクテリオファージ□のpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）のような誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳類細胞系中でのクローニングの場合は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、あるいは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5 Kプロモーター）を使用することができる。また、組換えＤＮＡあるいは合成法により生産されたプロモーターを使用して、挿入された蛍光タンパク質コード配列の転写を得てもよい。
細菌系においては、発現される蛍光タンパク質の使用目的に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、多量の蛍光タンパク質を生産することを意図する場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高いレベルの発現を指令するベクターが望ましいものであり得る。開裂部位を含むように工学的に作製して蛍光タンパク質の回収に役立つようにしたものが好ましい。
酵母においては、構成的あるいは誘導性のプロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。概説として、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubelら編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Grantら、Expression and Secretion Vectors for Yeast, Methods in Enzymology, Wu及びGrossman編, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3. 1986;及びBitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger及びKimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp.673-684, 1987;及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernら編、Cold Spring Harbor Press, Vols. I及びII, 1982を参照。ADHあるいはLEU2のような構成的酵母プロモーター、あるいはGALのような誘導性プロモーターを使用することができる（Cloning in. Yeast, Ch. 3, R. Rothstein: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, DM Glover編, IRL Press, Wash., D.C.. 1986）。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用してもよい。
植物発現ベクターを使用する場合においては、蛍光タンパク質コード配列の発現は、多数のプロモーターの任意のものにより駆動することができる。例えば、CaMVの35SＲＮＡ及び19SＲＮＡプロモーターのようなウイルス性プロモーター（Brissonら、Nature 310:511-514, 1984）、あるいはTMVに対するコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら、EMBO J. 6:307-311, 1987）を使用することができる。あるいは、RUBISCOの小サブユニット（Coruzziら、1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglieら、Science 224:838-843, 1984）のような植物プロモーター；あるいは熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eあるいはhsp17.3-B（Gurleyら、Mol. Cell. Biol. 6:559-565, 1986）を使用してもよい。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質変換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞に導入することができる。そのような技術の概説として、例えば、Weissbach及びWeissbach,Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463, 1988;及びGrierson及びCorey, Plant Molecular Biology,第２版., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988を参照。
蛍光タンパク質を発現するために使用できる別の発現系として昆虫系がある。そのような系の１つにおいては、Autographa californica核ポリヒドリシスウイルス（AcNPV）を外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。該ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。蛍光タンパク質コード配列をこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。蛍光タンパク質コード配列をうまく挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子の不活性化と非閉塞組換えウイルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパクコートを欠くウイルス）の生産が得られる。次に、これらの組換えウイルスを使用してSpodoptera frugiperda細胞に感染させ、この中で挿入された遺伝子が発現される（例えば、Smithら, 1983, J. Viol. 46:584; Smith,米国特許第4,215,051号を参照）。
真核生物系、好ましくは哺乳類発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の適当な翻訳後修飾が起こることを可能とする。一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のクリゴシル化及びリン酸化、及び有利には遺伝子産物の分泌のための細胞器官を有する真核宿主細胞を蛍光タンパク質の発現のための宿主細胞として使用しなければならない。そのような宿主細胞系としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293、WI38等が挙げられる。
発現を指令するために組換えウイルスあるいはウイルスエレメントを使用する哺乳動物細胞系を工学的に作製することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合は、蛍光タンパク質コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三分割リーダー配列に結合することができる。このキメラ遺伝子は次に、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1またはE3）に挿入することにより、感染した宿主中で生存可能であり、かつ蛍光タンパク質を発現できる組換えウイルスを得ることができる（例えば、Logan及びShenk,1984,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。あるいは、ワクシニアウイルス7.5 Kプロモーターを使用することができる
0004232992.tif 000009
特に興味深いのは、細胞質エレメントとして複製する能力を有するウシ乳頭腫ウイルスをベースとするベクターである（Sarverら、Moll. Cell. Biol. 1:486, 1981）。このＤＮＡをマウス細胞に導入したすぐ後、プラスミドは細胞あたり約100〜200コピー複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写には、宿主の染色体にプラスミドが組込まれることを必要とせず、従って高い発現レベルが得られる。これらのベクターは、プラスミド中で選択可能なマーカー、例えばneo遺伝子を含ませることにより安定な発現のために使用することができる。あるいはレトロウイルスゲノムを、宿主細胞に導入してその中で蛍光タンパク質遺伝子の発現を指令することができるようなベクターとして使用するために修飾することができる（Cone及びMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 81:6349-6353, 1984）。また、メタロチオネインIIAプロモーター及び熱ショックプロモーター等（これらに限定されない）の誘導性のプロモーターを使用して高レベル発現を達成することもできる。
また本発明は、局在性配列、例えば核局在性配列、小胞体局在性配列、ペルオキシソーム局在性配列、ミトコンドリア局在性配列、あるいは局在化タンパク質を含み得る。局在性配列は例えば、”Protein Targeting”, Stryer, L.,Biochemistry（第４版）W.H. Freeman, 1995の35章に記載されるような標的化配列とすることができる。局在性配列は、局在化タンパク質であってもよい。いくつかの重要な局在性配列としては、核（KKKRK）、ミトコンドリア（アミノ末端MLRTSSLFTRRVQPSLFRNILRLQST-）、小胞体（Ｃ末端のKDEL、Ｎ末端に存在するシグナル配列を想定する）、ペルオキシソーム（Ｃ末端のSKF）、プレニル化あるいは原形質膜への挿入（Ｃ末端のCaaX、CC、CXC、またはCCXX）、原形質膜の細胞質側（SNAP-25への融合）、あるいはゴルジ装置（フリンへの融合）を標的とするものが挙げられる。
組換え体タンパクの長期間にわたる高い収率の生産のためには安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）及び選択可能なマーカーにより制御された蛍光タンパク質ｃＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドをそのクロモソームに安定に組み込み、増殖して遺伝子座を形成し、そしてクローン化して細胞系へと拡大することを可能とするものである。例えば、外来ＤＮＡの導入の後、工学的に作製された細胞を富栄養化培地中で１〜２日増殖させ、そして選択培地に切り換えることができる。多数の選択系を使用することができ、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell 11:223, 1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell 22:817, 1980）遺伝子を、tk-、hgprt-またはaprt-細胞中でそれぞれ使用することができる。また、抗代謝物抵抗性を選択の基準として使用することができ、メトトレキセートに対する抵抗性を与えるdhfr遺伝子（Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77;3567, 1980; O’Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8;1527, 1981）、マイコフェノール酸に対する抵抗性を与えるgpt遺伝子（Mulligan及びBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981）、アミノグリコシドG-418に対する抵抗性を与えるneo遺伝子（Colberre-Garapinら、J. Mol. Biol. 150:1, 1981）、ヒグロマイシンに対する抵抗性を与えるhygro遺伝子（Santerreら、Gene 30:147, 1984）について代謝物抵抗性を選択の基準とし得る。最近、別の選択可能な遺伝子が記載されており、即ちtrpBはトリプトファンの代わりにインドールを細胞が利用できるようにするものであり、hisDはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞が利用できるようにするものであり（Hartman及びMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988）、ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する抵抗性を与えるものである（McConlogue L, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編., 1987）。
本発明の蛍光タンパク質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」はその中でベクターが増殖し、そのＤＮＡが発現され得る細胞である。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製の間に起こる突然変異があり得るので、全ての子孫が親細胞に同一でない場合があり得ると理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、そのような子孫を含む。安定な移入、つまり、外来ＤＮＡを連続的に宿主中に維持させるための方法は、当分野において公知である。
組換体核酸の発現のために発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。蛍光タンパク質融合タンパク質を精製するために、宿主細胞を高レベルの発現について選択することができる。この目的のためには大腸菌が有用である。あるいは宿主細胞は、細胞によって生産された酵素の活性を調べるために選択される原核生物または真核生物細胞と、することができる。この場合、リンカーペプチドを選択してプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列が含まれるようにする。細胞は、例えば培養細胞あるいはin vivoの細胞とすることができる。
蛍光タンパク質融合タンパク質の主要な利点は、それらが通常のタンパク質合成によって製造され、そのことにより有機合成及び特別な非天然のアミノ酸類似体の必要性を完全に回避するということである。構築物は、in vitroアッセイのために大腸菌中で大規模に発現させることができる。配列がニッケルキレートクロマトグラフィーによるワンステップ精製のためのポリヒスチジンタグを含む場合は、細菌からの精製は容易になる。あるいは、その場でのアッセイのために基質を直接所望の宿主細胞中で発現させることができる。
また別の実施様においては、本発明は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
本発明の「非ヒト動物」は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を有する任意の非ヒト動物を含む。そのような非ヒト動物としては、齧歯動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、両生類及び爬虫類動物のような脊椎動物が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、ラット及びマウスを含む齧歯動物科から選択され、最も好ましくはマウスである。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、「導入遺伝子」を非ヒト動物の生殖細胞系に導入することにより生産される。種々の発生段階における胎児標的細胞を用いて導入遺伝子を導入することができる。胎児標的細胞の発生段階に従い異なる方法を使用する。接合体はマイクロインジェクションの最良の標的である。マウスにおいては、雄性前核は直径約20μｍに達し、これはＤＮＡ溶液の1〜2plの再現可能な注入が可能である。遺伝子移入の標的として接合体を使用すると、殆どの場合において注入されたＤＮＡが最初の分割の前に宿主遺伝子に取り込まれるという大きな利点が得られる（Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985）。その結果、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞が取り込まれた導入遺伝子を担持する。また生殖細胞の50%が導入遺伝子を有しているので、これは一般に初代動物から子孫への導入遺伝子の効率的な伝達にも反映される。接合体のマイクロインジェクションは、本発明を実施する目的で導入遺伝子を取り込むための好ましい方法である。
用語「トランスジェニック」は、その全ての細胞中に外来遺伝物質を含む動物を記載するために使用する。「トランスジェニック」動物は、生殖において使用される細胞内に外来遺伝物質を含む二匹のキメラ動物を異種交配することによって生産される。結果として生ずる子孫の25パーセントは、トランスジェニック、即ちその全ての細胞中に両方の対立遺伝子中に外来遺伝物質を含む動物である。結果として生ずる動物の50%は一つの対立遺伝子中に外来遺伝物質を含み、25%は外来遺伝物質を全く含まない。
また、レトロウイルス感染を導入遺伝子を非ヒト動物に導入するために使用することもできる。発生段階にある非ヒト胚は、in vitroで胚盤胞段階まで培養することができる。この間に、分割細胞をレトロウイルス感染の標的とすることができる（Jaenich, R., Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:1260-1264, 1976）。酵素処理して透明帯を除去することにより分割細胞の効率的な感染が得られる（Hoganら、（1986）、Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y）。導入遺伝子を導入するために使用するウイルスベクター系は、典型的には該導入遺伝子を担持する複製欠陥レトロウイルスである（Jahnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985 ; Van der Puttenら、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 82:6148-6152, 1985）。ウイルス生産細胞の単層上で分割細胞を培養することによって、トランスフェクションが容易にかつ効率的に得られる（Van der Putten,前掲；Stewartら、EMBO J. 6:383-388,1987）。あるいは、感染を後期段階で行うこともできる。ウイルスまたはウイルス生産細胞を、胞胚腔に注入することができる（D. Jahnerら、Nature 298:623-628, 1982）。大部分の初代は導入遺伝子についてモザイク状であり、これは取込みがトランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットでのみ起こるからである。さらに、初代はゲノムの異なる位置で導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含む可能性があり、これは子孫においては一般に分離する。さらに、低い効率ではあるが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染によって導入遺伝子を生殖細胞系に導入することも可能である（D. Jahnerら、前掲）。
導入遺伝子導入のための標的細胞の三番目の種類は、胚性幹細胞（ES）である。ES細胞は、in vitroで培養して胚と融合させた前移植した胚から得られる（M. J. Evansら、Nature 292:154-156, 1981 ; M. O. Bradleyら、Nature 309: 255-258, 1984 ; Gosslerら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9065-9069, 1986；及びRobertsonら、Nature 322:445-448, 1986）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションあるいはレトロウイルスにより媒介される形質導入により効率的にES細胞に導入することができる。その後で、そのような形質転換されたES細胞を非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わせることができる。その後でES細胞は該胚をコロニー化し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（概説として、Jaenisch, R., Science 240:1468-1474, 1988を参照）。
「形質転換された」は、組換え核酸技術により異種核酸分子が導入された（またはその祖先に導入された）細胞を意味する。「異種」は、別の種に由来するか、またはその当初の形態もしくは最初に細胞中で発現された形態が修飾されている核酸配列をいう。
「導入遺伝子」は、人工的に細胞に挿入され、その細胞から発生した生物のゲノムの一部となる（即ち安定に組込まれているか、あるいは安定な染色体外エレメント細胞質因子として）ＤＮＡの任意の片を意味する。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的にもしくは完全に異種（即ち外来）である遺伝子を含み得、または生物の内在遺伝子と相同である遺伝子を示していてもよい。ＤＮＡに転写され、その後ゲノムに導入されるＲＮＡ配列を与えることにより作成された導入遺伝子もこの定義の範囲に含まれる。本発明の導入遺伝子は、トランスジェニック非ヒト動物中で発現され得る蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。本明細書で使用される用語「トランスジェニック」はさらに、特異的な遺伝子ノックアウトを誘発するために、早期胚または受精卵のin vitro操作、あるいは任意のトランスジェニック技術によりそのゲノムが変化させられた任意の生物を含む。本明細書で使用するように、用語「遺伝子ノックアウト」は、当分野でよく知られた任意のトランスジェニック技術により得られた、機能の完全な喪失を伴うin vivoでの標的とする遺伝子の破壊をいう。一つの態様においては、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、相同的組換えにより機能しないようにすべき遺伝子を標的とする挿入により該標的遺伝子が機能しないようにされたものである。本明細書で使用するように、用語「トランスジェニック」は、導入された導入遺伝子を有しているか、内在遺伝子が機能しないようにされた、即ち「ノックアウトされた」生物を生産することができる、当分野でよく知られた任意のトランスジェニック技術を含む。
III.工学的に作製された蛍光タンパク質の使用
本発明のタンパク質は、蛍光タンパク質を使用する任意の方法において有用である。
本発明の工学的に作製された蛍光タンパク質は、蛍光マーカーが既に使用されている多くの方法において蛍光マーカーとして有用である。これは例えば、イムノアッセイやハイブリダイゼーションアッセイのような検出アッセイにおいて使用するための抗体、核酸、あるいはその他の受容体に工学的に作製された蛍光タンパク質を結合することを包含する。
本発明の工学的に作製された蛍光タンパク質は、細胞中でのタンパク質の動きを追跡するのに有用である。この態様においては、発現ベクター中において、蛍光タンパク質をコードする核酸分子を対象のタンパク質をコードする核酸分子に融合する。細胞内で発現されると、対象のタンパク質は蛍光に基づいて位置を決定することができる。別の形態においては、対象の二種のタンパク質を、異なる蛍光特性を有する二種の工学的に作製された蛍光タンパク質と融合する。
本発明の工学的に作製された蛍光タンパク質は、転写の誘導を検出するための系において有用である。ある態様においては、工学的に作製された蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を対象の発現制御配列に融合し、発現ベクターを細胞にトランスフェクトする。プロモーターの誘導は、蛍光の発現及び／または量を検出することにより測定することができる。そのような構築物は、受容体からプロモーターへのシグナル伝達経路を追跡するのに使用することができる。
本発明の工学的に作製された蛍光タンパク質は、FRETを使用する用途において有用である。そのような用途は、蛍光ドナーとアクセプターが互いに近づくか離れる運動の関数として事象を検出することができる。ドナー/アクセプター対の一方あるいは両方を蛍光タンパク質とすることができる。FRETに基づいたアッセイのためのドナー及びアクセプターの好ましい対は、T203I突然変異を有するドナーと突然変異T203Xを有するアクセプターである（Xは芳香族アミノ酸-39、特にT203Y、T203WまたはT203Hである）。特に有用な対においては、ドナーが以下の突然変異：S72A、K79R、Y145F、M153A及びT203I（395nmの励起ピークと511nmの発光ピークを有する）を含み、アクセプターが以下の突然変異S65G、S72A、K79R及びT203Yを含む。この特定の対は、ドナーの励起及び発光ピークの間の広い分離を与え、ドナー発光スペクトルとアクセプター励起スペクトルの間の良好なオーバーラップを与える。また本明細書で記載するもののようなその他の赤色にシフトした突然変異体もアクセプターとしてそのような対において使用することができる。
一つの形態においては、基質の開裂を検出するためにFRETを使用し、この場合基質はその開裂部位の両側にドナーとアクセプターとが結合されたものである。基質が開裂すると、ドナー/アクセプター対は物理的に分離し、FRETを除去する。アッセイは、基質をサンプルと接触させ、FRETの質的または量的な変化を測定することを含む。一つの態様においては、工学的に作製された蛍光タンパク質を□-ラクタマーゼの基質に使用する。そのような基質の例は、1995年3月20日に出願された米国特許出願第08/407,544号及び1996年3月20日に出願された国際出願PCT/US96/04059に記載されている。別の態様においては、工学的に作製された蛍光タンパク質ドナー/アクセプター対はタンパク質分解性開裂部位を有するペプチドにより結合された融合タンパク質の部分である。そのような直列に並んだ（tandem）蛍光タンパク質は、1996年1月31日に出願された米国特許出願第08/594,575号に記載されている。
別の形態においては、膜を横切る電位の変化を検出するためにFRETを使用する。ドナー及びアクセプターを膜の両側に置き、電圧変化に応答して一方が膜を横切って移動するようにする。これにより測定可能なFRETが形成される。このような方法は、1995年6月7日に出願された米国特許出願第08/481,977号及び1996年6月6日に出願された国際出願PCT/US96/09652に記載されている。
本発明の合成タンパク質は、プロテインキナーゼの蛍光性基質の製造に有用である。そのような基質は、プロテインキナーゼにより認識され得るアミノ酸配列を組み込んだものである。リン酸化が起こると、工学的に作製された蛍光タンパク質はその蛍光特性に変化を起こす。このような基質は、トランスフェクトされ、基質が発現されることにより、細胞のサンプルの中のプロテインキナーゼ活性を検出し、測定するのに有用である。好ましくは、キナーゼ認識部位は、工学的に作製された蛍光タンパク質の末端の約20アミノ酸の範囲内に置く。またキナーゼ認識部位は、タンパク質のループドメイン内に置くこともできる（例えば図1B参照）。プロテインキナーゼ用の蛍光性基質を製造する方法は、1996年7月16日に出願された米国特許出願第08/680,877号に記載されている。
プロテアーゼ認識部位はループドメインに導入することもできる。開裂すると蛍光特性は測定可能な様式で変化する。
本発明はまた、試験化学物質を同定する方法も包含する。典型的には、該方法は、工学的に作製された機能性タンパク質または該工学的に作製された機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチドで標識された生物学的な実体を含むサンプルを試験化学物質と接触させることを含む。工学的に作製された機能性タンパク質を含むサンプルからの蛍光（即ち蛍光特性）をモニターすることにより、試験化学物質が活性かどうかを判定することができる。シグナルの特異性を保証するための対照を含めることができる。そのような対照は、試験化学物質の非存在下、予想された活性を有する化学物質（例えば既知のモジュレーター）または合成対照の存在下（例えば、工学的に作製された蛍光タンパク質の非存在下、工学的に作製された蛍光タンパク質ポリヌクレオチドの非存在下、あるいは工学的に作製された蛍光タンパク質機能可能なような結合の非存在下）で蛍光特性を測定することを含む。
試験化学物質の存在下での蛍光は、その試験化学物質がない場合より大きくなるか小さくなり得る。例えば、工学的に作製された蛍光タンパク質が遺伝子発現のレポーターを使用する場合、試験化学物質は遺伝子発現を増加または減少方向に制御し得る。そのようなタイプのスクリーニングのためには、工学的に作製された機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムポリヌクレオチドに機能的に連結する。あるいは、工学的に作製された機能性タンパク質を第二の機能性タンパク質に融合する。この態様は、第二のタンパク質の局在化を追跡したり、エネルギー転移を利用するタンパク質-タンパク質相互作用を追跡するために使用することができる。
IV.手順
サンプル中の蛍光は蛍光計を使用して測定する。一般に、第一の波長を有する励起源からの励起放射は、励起光学機器を通過するものとする。励起光学機器によりサンプルを励起する励起放射を生じる。これに応答して、サンプル中の蛍光タンパク質が励起波長とは異なる波長の放射（radiation）を発する。その後収集光学機器によりサンプルからの発光を収集する。デバイスを温度コントローラーを含むものとし、サンプルを走査する間、それを特定の温度に維持するようにすることができる。一つの態様によれば、多軸平行移動ステージ（multi-axis translation stage）により複数のサンプルを有するマイクロタイタープレートを動かし、位置を変えて異なるウェルが露出されるようにする。多軸平行移動ステージ、温度コントローラー、自動焦点装置、及び画像化及びデータ収集に関連する電子手段は、適切にプログラムされたデジタルコンピュータにより制御（manage）することができる。またコンピュータにより、アッセイの間に収集されたデータを表示のために別のフォーマットに変換することができる。この方法は、多くの化合物をスクリーニングすることを可能にするために、小型化することができ、また自動化することができる。
蛍光物質についてアッセイを行う方法は当分野において周知であり、例えばLakowicz, J. R.,Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press（1983）; Herman, B., Resonance energy transfer microscopy,Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D.L.及びWang, Y.-L., San Diego: Academic Press（1989）, pp. 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc.（1978）, pp. 296-361に記載されている。
以下の実施例は説明のために示すものであり、限定するためのものではない。
実施例
GFPの特性を理解する際の一つの段階として、また変化させた特性を有するGFPの製造の助とするために、我々はA. victoria GFPのS65T突然変異体（R. Heimら、Nature 373:664-665（1995））の三次元構造を1.9Åの分解能で測定した。この変異体はまた、GFPｃＤＮＡの早期分布（distribution）において偶然に起こり、タンパク質特性に対して何らかの効果を有することは知られていない、遍在的なQ80R置換を含む（M. Chalfieら、Science 263:802-805（1994））。
ヒスチジンタグを付したS65T GFP（R. Heimら、Nature 373:664-665（1995））を、JM109/pRSETBにおいて、41YT液体培地にアンピシリンを加えたものの中で37□、450rpm及び5l/分の空気流量で過剰発現させた。A595=0.3で温度を25℃に低下させ、その後１ｍＭイソプロピルチオガラクトシドで5時間誘導した。細胞ペーストを-80□で一晩貯蔵し、その後50mM HEPES, pH7.9, 0.3M NaCl, 5mM 2-メルカプトエタノール、0.1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）中に再懸濁し、10,000psiのフレンチプレスに一回通し、そして20K rpmで45分間遠心分離した。上清をNi-NTA-アガロースカラム（Qiagen）に適用し、その後20mMイミダゾールで洗浄し、次いで100mMイミダゾールで溶出した。緑色の画分をプールし、室温で22時間、キモトリプシン（Sigma）タンパク質分解（1:50w/w）にかけた。0.5mM PMSFを添加した後、消化物をNiカラムに再適用した。Ｎ末端配列決定により、正しいＮ末端メチオニンの存在が証明された。20mM HEPES、pH7.5に対するA490=20の濃度までの透析の後、5□lタンパク質及び5□lウェル溶液、22〜26% PEG 4000（Serva）、50mM HEPES pH8.0-8.5、50mM MgCl2及び10mM 2-メルカプトエタノールを含む懸滴中に、室温で棒状の結晶を5日以内に得た。結晶は、直径0.05mmで長さは最高で1.0mmであった。空間群は、a=51.8、b=62.8、c=70.7Å、Z=4のP212121であった。この形態とは無関係な野生型GFPの二種の結晶形がM. A. Perrozo, K. B. Ward, R. B. Thompson及びW. W. Ward. J. Biol. Chem. 203,7713-7716（1988）により記載されている。
GFPの構造を複数の同形置換及び異常散乱（anomalous scattering）（表E）、溶媒平坦化（solvent flattening）、フェーズコンビネーション、及び結晶学的改良（crystallographic refinement）により測定した。GFPのフォールディングの最も注目に値する特徴は、単一の中心ヘリックスの周りに巻かれた11鎖のβ-バレルであり（図1A及び1B）、その各鎖は約9〜13残基からなる。バレルは、長さ42Å、直径24Åのほぼ完全な円筒を形成する。ポリペプチドのＮ末端側半分は、三つの逆平行鎖、中央ヘリックス、そしてさらに三つの逆平行鎖を含み、その最後のもの（残基118-123）はＮ末端鎖（残基11-23）に平行である。そしてポリペプチド主鎖は、分子の「底」を横切り、五本鎖のGreek  Keyモチーフでバレルの残りの半分を形成している。円筒の上端は三つの短い、ねじれたらせん状セグメントによりキャップされ、一つの短い、非常にねじれたらせん状セグメントが円筒の底をキャップしている。円筒の表面を固定する主鎖水素結合は、変性とタンパク質分解に対するタンパク質の並はずれた安定性の原因である可能性が非常に高い。切り出すことができたポリペプチドには大きいセグメントはなく、発色団のまわりのシェルの完全性（intactness）は保存されていた。従って、大きいパーセンテージでその分子量を減らすようにGFPを再設計することは困難であるようである（J. Dopf及びT. M. Horiagon Gene 173:39-43（1996））。
p-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリジノン発色団（C. W. Codyら、Biochemistry 32:1212-1218（1993））は、周囲全溶媒から完全に保護されており、分子の中央に位置する。おそらく、全体的な剛性（rigid）であると思われる被包（encapsulation）が、小さいストークスシフト（即ち、励起及び発光最大波長の間の波長差）、蛍光の高い量子収量、O2が励起状態を抑える（quench）能力を有していないこと（B. Ｄ. Nageswara Raoら、Biophys. J. 32:630-632（1980））、そして、外部pH滴定（titration）に対する発色団の耐性（W. W. Ward.Bioluminescence and Chemiluminescence（M. A. DeLuca及びW. D. McElroy, eds）Academic Press pp. 235-242（1981）; W. W. Ward及びS. H. Bokman. Biochemistry 21:4535-4540（1982）; W. W. Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808（1982））の原因であると考えられる。これは、どのようにして酵素が基質に接近できるかということを想像することは困難であることから、蛍光団形成が自発的な分子内プロセスであることの理由の説明も可能とするものである（R. Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504（1994））。発色団の平面は周囲のバレルの対称軸にほぼ垂直である（60□）。発色団表面の一方は、約135Å3の容量を占める驚くほど大きい腔（cavity）に面している（B. Lee及びF. M. Richards. J. Mol. Biol. 55:379-400（1971））。1.4Åのプローブ半径のプログラムMS使用して計算した原子半径は、Lee及びRichardsのものであった（M. L. Connolly,Science 221:709-713（1983））。腔は、周囲全溶媒に開放していない。四つの水分子が腔中に位置し、Glu222及びGln69の埋め込まれた側鎖に結合する水素結合鎖を形成している。このような大きい腔は、占拠されてしまわない限り、数kcal/モルだけタンパク質を不安定にすると予想される（S. J. Hubbardら、Protein Engineering 7:613-626（1994）; A. E. Erikssonら、Science 255:178-183（1992））。腔の容量の一部は、環化と脱水反応に起因する圧縮の結果であり得る。また腔は一時的に酸化剤（O2の可能性が最も高い）を収容する（accommodate）かもしれず（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995）; R. Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504（1994）; S. Inouye及びF.I. Tsuji. FEBS Lett. 351:211-214（1994））、それはTyr66の□-□結合を脱水素する。発色団、腔、及び発色団と接触する側鎖を図2Aに示し、この近傍の最終的な電子密度地図を図2Bに示す。
発色団の反対の側面は、いくつかの芳香族性及び極性側鎖に対してパックされている。特に重要なのは、極性相互作用の発色団との複雑なネットワークである（図2C）。His148、Thr203及びSer205は、フェノール性ヒドロキシル基（Phenolic hydroxyl）と水素結合を形成し；Arg96及びGln94はイミダゾリジノン環のカルボニル基と相互作用し、Glu222はThr65の側鎖と水素結合を形成する。その他の極性相互作用、例えばThr62のカルボニル基及びGln183の側鎖カルボニル基からのArg96への水素結合は、埋め込まれたArg96をそのプロトン化された状態で安定させると推定される。そして、以前に示唆されているように、この埋め込まれた電荷が、部分的な負電荷が脱プロトン化された蛍光団のイミダゾリジノン環のカルボニル酸素上に存在することを示唆している（W. W. Ward.Bioluminescence and Chemiluminescence（M. A. DeLuca及びW. D. McElroy, eds）Academic Press pp. 235-242（1981）; W. W. Ward及びS. H. Bokman. Biochemistry 21:4535-4540（1982）; W. W. Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808（1982））。Arg960は、蛍光団の形成に必須であるらしく、最初の閉環を触媒作用を助け得る。さらに、Tyr145はベンジル環との典型的な安定化縁面相互作用を示す。GFP中の唯一のトリプトファンであるTrp57は、発色団から13Åから15Åに位置し、二つの環構造の長い軸はほぼ平行である。これは後者への効率的なエネルギー転移が起こることを示すものであり、何故別のトリプトファン発光が観察されないかということを説明するものである（D. C. Prasherら、Gene 111:229-233（1992））。GFP中の二つのシステイン、Cys48及びCys70は、24Å離れており、ジスルフィド架橋を形成するには離れすぎている。Cys70は埋め込まれているが、Cys48はスルフヒドリル（sulfhydryl）特異性試薬が比較的接近しやすい。そのような試薬、5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）は、GFPを標識し、その蛍光を消光すると報告されている（S. Inouye及びF.I. Tsuji FEBS Lett . 351:211-214（1994））。この効果は遊離のスルフヒドリル基が必要であることに帰するが、Cys48に結合される5-チオ-2-ニトロベンゾエート部分による特異的な消光を反映し得るものでもある。
電子密度地図は殆どの部分についてシス[Z-]配置の発色団の提案された構造と一致しているが（D. C. Prasherら、Gene 111:229-233（1992）; C. W. Codyら、Biochemistry 32:1212-1218（1993））、発色団二重結合のまわりの反対の異性体の実質的な部分については何の証拠もなく、最終的な（F0-Fc）電子密度地図において>4□で、完全な開環されたポリペプチドあるいはカルビノールアミンを示すものと解釈できる差違の特徴が見出されている（図2Cの挿入図）。これは、有意な部分、おそらく結晶中の分子の30%程度が最終的な脱水反応を受けることができなかったことを示唆している。不完全な脱水の確認はエレクトロスプレー（electrospray）質量分光測定法により得られ、これは野生型及びS65T GFP両方の平均質量（それぞれ31,086±4及び31,099.5±4Da）が完全に成熟したタンパク質について予測されたもの（それぞれ31,079及び31,093Da）よりも6〜7Da高いことを矛盾なく示している。そのような不一致はアポタンパク質またはカルビノールアミンの30〜35モル%部分が18あるいは20Da高い分子量を有することにより説明し得る。13C及び2Hが自然界に多量に存在することと、これらの測定を行うのに使用したHewlett-Packard 5989Bエレクトロスプレー質量分光計の限定された分解能のために個々のピークは解像できなかったが、その代わり約15Daの半最高値で全幅を有する平均質量ピークが得られた。示した分子量は、配列MRGSHHHHHH GMASMTGGQQM GRDLYDDDDK DPPAEF（配列番号５）を有するHis-タグを含む。蛍光団成熟の効率を増加させるGFPの突然変異体は、いくらかはより明るい調製物を生成し得る。アポタンパク質についてのモデルにおいては、Thr65-Tyr66ペプチド結合はほぼ□-ヘリックスコンフォメーションにあるが、Tyr66-Gly67のペプチドは、そのArg96との相互作用により、ヘリックス軸に対しほとんど垂直に傾いているようである。これは、Arg96が環化に必要なコンフォメーションを生成する際に重要であり、そしておそらくThr65のカルボニル炭素に対するGly67の攻撃を促進することにおいても重要であるという推定をさらに支持するものである（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995））。
これまでのランダム突然変異誘発の結果は、いくつかのアミノ酸側鎖がスペクトルに有意な影響を及ぼすことを示しており、原子モデルによりこれらの残基が発色団の近くにあることが確認されている。突然変異T203I及びE222Gは、吸収スペクトルに対し重大であるが反対の結果をもたらす（T. Ehrigら、FEBS Letters 367:163-166（1995））。T203I（野生型Ser65による）は、通常アニオン性発色団に起因する475nmの吸光ピークを欠き、中性の発色団を示すものと考えられる395nmのピークのみを示す（R. Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504（1994）; T. Ehrigら、FEBS Letters 367:163-166（1995））。実際、Thr203は発色団のフェノールの酸素に水素結合するので、Ileによる置換はフェノールの酸素のイオン化の障害となる。Glu222のGlyへの突然変異（T. Ehrigら、FEBS Letters 367:163-166（1995））は、Gly、Ala、Cys、ValまたはThrによりSer65を置換した場合とまったく同じ分光学的効果を示し、即ち395nmのピークを抑制し、470-490nmのピークに有利となる（R. Heimら、Nature 373:664-665（1995）; S. Delagraveら、Bio/Technology 13:151-154（1995））。実際、本発明の構造において、Glu222及びThr65の残余部分はおそらくThr65の側鎖酸素に対するドナーとして働くGlu222の非荷電カルボキシル基で互いに水素結合する。突然変異E222G、S65G、S65A及びS65Vは全てそのようなH-結合を抑制する。何故野生型タンパク質だけが両方の励起ピークを有するかを説明するものとして、Ser65が、Thr65とは異なり、そのヒドロキシル基がGlu222に水素を与え、Glu222をアニオンとして安定化させるコンフォメーションをとり得、その電荷が発色団のイオン化を阻害するということがある。また構造は、いくつかの突然変異が中性であることの理由を説明している。例えば、Gln80は発色団から遠く離れた表面残基であり、このことはなぜ偶発性の偏在的なArgへの突然変異が明らかな分子内分光学的効果を持たないかということを説明している（M. Chalfieら、Science 263:802-805（1994））。
赤色シフトした励起及び発光最大波長を有するGFP突然変異体の開発は、タンパク質工学における興味深い試みである（A. B. Cubittら、Trends Biochem. Sci. 20:448-455（1995）; R. Heimら、Nature 373:664-665（1995）; S. Delagraveら、Bio/Technology 13:151-154（1995））。またそのような突然変異体は、短い波長での細胞の自発蛍光を避けるために、少なくとも二つの細胞プロセスの活性を同時に多色でレポートするために、そしてタンパク質-タンパク質相互作用のシグナルとして蛍光共鳴エネルギー転移を発生させるために価値がある（R. Heim及びR. Y. Tsien.Current Biol. 6:178-182（1996））。ランダム突然変異誘発を使用した大規模な試みにより、発光最大波長は最大6nm長い波長、514nmまでシフトされているが（R. Heim及びR. Y. Tsien.Current Biol. 6:178-182（1996））、これまでに記載された「赤色シフトした」突然変異体は、単に395nmの励起ピークを抑制するもので475nmのピークには有用であるが、505nmの発光の有意な赤色化はなかった（S. Delagraveら、Bio/Technology 13:151-154（1995））。Thr203が発色団のフェノール末端に隣接していることが明らかにされているので、本発明者らは、それをHis、Tyr及びTrpのような極性芳香族性残基により変異させ、それらの□系の追加された分極性が隣接する発色団の励起状態のエネルギーを低下させるのではないかと期待した。三種の置換はいずれも実際に発光ピークを520nmより高くシフトさせた（表F）。特に興味深い突然変異は、T203Y/S65G/V68L/S72Aであり、それぞれ513及び527nmでの励起及び発光ピークを有する。これらの波長はこれまでのGFP突然変異体とは十分に異なり、蛍光顕微鏡上の適当なフィルターセットにより容易に区別できる。吸光係数36,500M-1cm-1及び量子収量0.63は、S65Tのそれらと殆ど同じ程度に高いものである（R. Heimら、Nature ; 373:664-665（1995））。
他のタンパク質色素を有するAequorea GFPを比較することにより示唆される点が多い。残念ながら、その最も近い特徴付けられた同族体、ウミシイタケRenilla reniformisからのGFP（O. Shimomura及びF.H. Johnson J. Cell. Comp. Physiol. 59:223（1962）; J. G. Morin及びJ. W. Hastings, J. Cell. Physiol. 77:313（1971）; H. Moriseら、Biochemistry 13:2656（1974）; W. W. Ward Photochem. Photobiol. Reviews（Smith, K. C. ed.）4:1（1979）; W. W. Ward. Bioluminescence and Chemiluminescence（M. A. DeLuca及びW. D. McElroy, eds）Academic Press pp.235-242（1981）; W. W. Ward及びS. H. Bokman Biochemistry 21:4535-4540（1982）; W. W. Wardら、Photochem. Photobiol. 35:805-808（1982））は配列決定あるいはクローン化されていないが、その発色団は野生型Aequorea GFPのものと同じFSYG配列に由来するものである（R. M. San Pietroら、Photochem. Photobiol. 57:63S（1993））。三次元構造が利用できる最も近い類似体は、光活性黄色タンパク質（PYP, G. E. O. Borgstahlら、Biochemistry 34:6278-6287（1995））、好塩菌からの14-kDa光アクセプターである。天然の暗い状態のPYPは最大波長として446nmで吸収を示し、0.64の量子収量で光を変換し、野生型GFPの475nm付近の長波長吸収最大波長と0.72-0.85の蛍光量子収量に比較的一致している。両者のタンパク質中の基本的な発色団は、アニオン性p-ヒドロキシシンナミル基であり、PYP中ではチオエステル結合を介し、GFP中ではヘテロイミノラクタム環を介してタンパク質に共有結合している。両者のタンパク質は埋め込まれたカチオン性アルギニンと中性のグルタミン酸基、PYP中のArg52及びGlu46、GFP中のArg96及びGlu222の助けを借りて発色団上の負電荷を安定させるが、PYPにおいては各残基はオキシフェニル環に近く、一方GFPにおいては発色団のカルボニル末端により近い。しかし、PYPは適当な柔軟性とシグナル伝達ドメインを有する全体的な□/□フォールディングを有し、それが細胞走光性反応（phototactic response）を媒介することを可能としているが、GFPはずっと規則的で剛性（rigid）の□-バレルであり、励起状態エネルギーの熱的あるいはコンホメーション運動としての渦流的散逸（parasitic dissipation）を最小にしている。GFPは視覚に訴える方法の洗練された例であり、非常に有用な機能である効率的な蛍光を接着性があり経済的なタンパク質構造から自発的に発生させることができる。
A.GFP構造測定の概要
データは、Molecular Structure Corp. R-axis IIまたはSan Diego Multiwire Systems（SDMS）検出器（CuK□）のいずれかを使用して社内で室温において収集し、後にイメージプレートを使用してセレン吸収縁（edge）（□=0.979Å）でブルックヘブン国立研究所においてビームラインX4Aで収集した。データは、HKLパッケージ（Z. Otwinowski, in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing , L. Sawyer, N. Issacs, S. Bailey, ed.（Science and Engineering Research Council（SERC）, Daresbury Laboratory, Warrington, UK,（1991））, pp56-62; W. Minor, XDISPLAYF（Purdue University, West Lafayette, IN, 1993））またはSDMSソフトウェア
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を使用して評価した。各データのセットは単結晶から収集した。重原子の浸漬（soaks）は、２mMの母液中に二日間とした。当初の電子密度地図は、社内のデータを使用して三種の重原子の誘導体に基づいたもので、後にはシンクロトロンデータで置き換えた。EMTS差分パターソン図を観察により解き、その後他の誘導体の差分フーリエ地図を計算するために使用した。Proteinパッケージを使用して重原子のパラメータの閉鎖改良の欠如（Lack of closure refinement）を行った（W. Steigemann、博士論文（Technical University, Munich, 1974））。MIR地図はメリットの全体値が示唆するものよりもずっと貧弱なものであり、EMTS同形体（isomorphous）の相違がフェージングを支配していることは明らかであった。シンクロトロンデータの占有を通常より高めることにより問題は部分的に解決された。フェージングパワーはシンクロトロンデータについては減少したが、メリットの数値は変化しなかった点に注意されたい。全ての実験的電子密度地図は、38%の溶媒含量と推定するCCP4（CCP4: A Suite of Programs for Protein Crystallography（SERC Daresbury Laboratory, Warrington WA4 4AD UK, 1979））パッケージのプログラムDMを使用した溶媒平坦化により改善された。原子モデル上で1.0の重量を使用してProteinパッケージのPHASCO2でフェーズコンビネーションを行った。重原子のパラメータは、その後組合せたフェーズに対する改良により改善した。モデル構築はFRODO及びOにより継続し（T. A. Jonesら、Acta. Crystallogr. Sect. A 47:110（1991）; T. A. Jones,Computational Crystallography D. Sayre, Ed.（Oxford University Press, Oxford, 1982）pp. 303-317）、TNTパッケージで結晶学的改良を行った（D. E. Tronrudら、Acta Cryst. A 43:489-503（1987））。発色団について結合距離と角度をCHEM3D（Cambridge Scientific Computing）を使用して評価した。（2F0-Fc）電子密度地図を使用して、最終的な改良とモデル構築をX4Aセレノメチオンデータセットに対して行った。1.9Åの分解能を越えるデータはこの段階では使用しなかった。電子密度地図においては末端残基は視認できないので最終的なモデルは残基2〜229を含み、いくつかの乱れた表面残基の側鎖は失われていた。残基156〜158については密度は弱く、これらの残基の座標は信頼できない。この不秩序は、残基1及び233〜238はなくてもよいが、それ以外の切断は蛍光を阻害し得るとする以前の分析と一致している（J. Dopf及びT. M. Horiagon. Gene 173:39-43（1996））。原子モデルはProtein Data Bankに寄託した（アクセスコード1EMA）。
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B.Thr203（「T203」）変異体のS65Tと比較したスペクトル特性
突然変異F64L、V68L及びS72AはGFPの37□におけるフォールディングを改善する（B. P. Cormackら, Gene 173:33（1996））が、発光スペクトルを有意にシフトさせることはなかった。
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本発明は、新規な長波長の工学的に作製された蛍光タンパク質を提供する。特異的な例を示したが、上記の記載は例示的なものであって限定的なものではない。本発明の多くの変形は本明細書を読むことにより当業者に明らかとなるであろう。従って本発明の範囲は、上記の記載により決定されるものではなく、添付の請求の範囲とその均等物の全範囲を考慮することにより決定されるものである。
本出願において引用した全ての刊行物及び特許文書は、全ての目的について引用によりその全体を本明細書の一部とするものであり、各刊行物及び特許文書について個々にそのように示したのと同様に扱われるものとする。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：カリフォルニア  ユニバーシティーの理事他
（ii）発明の名称：長波長の変異型蛍光タンパク質
（iii）配列の数：４
（iv）通信アドレス：
（Ａ）名称：フィッシュ  アンド  リチャードソン  Ｐ．Ｃ．
（Ｂ）通り：４２２５  イグゼクティブ  スクエア、スイート１４００
（Ｃ）都市：ラ  ジョラ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９２０３７
（ｖ）コンピューター読み取り可能形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース＃１．０，バージョン＃１．２５
（vii）先願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ  ６０／０２４，０５０
（Ｂ）出願日：１９９６年８月１６日
（Ｃ）分類：
（vii）先願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ  ０８／７０６，４０８
（Ｂ）出願日：１９９６年８月３０日
（Ｃ）分類：
（viii）代理人情報：
（Ａ）名前：ヘイル，リサ  Ａ．
（Ｂ）登録番号：３８，３４７
（Ｃ）参照／文書番号：０７２５７／０５６ＷＯ１
（ix）テレコミュニケーション情報：
（Ａ）電話：６１９／６７８−５０７０
（Ｂ）テレファックス：６１９／６７８−５０９９
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７１６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：1..714
（xi）配列の記載：配列番号１：
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（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２３８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２：
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（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：1..720
（xi）配列の記載：配列番号３：
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（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２４０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号４：
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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