(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の９５番目のバリンがアラニンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の１６１番目のアラニンがバリンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２０３番目のイソロイシンがスレオニンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２５５番目のセリンがプロリンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の４０８番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項７】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項８】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリン、更に２５５番目のセリンがプロリンに置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリン、２５５番目のセリンがプロリン、更に４０８番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されてなる変異型ヘキソキナーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の変異型ヘキソキナーゼをコードすることを特徴とする変異型ヘキソキナーゼ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０記載の変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換したことを特徴とする形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養することにより変異型ヘキソキナーぜを生成させ、該ヘキソキナーゼを採取することを特徴をする変異型ヘキソキナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、野生型ヘキソキナーゼと比較して液状安定性の向上した変異型ヘキソキナーゼ及び該変異型ヘキソキナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ヘキソキナーゼ（EC 2.7.1.1）は、臨床的に筋疾患、神経疾患、心筋梗塞等の診断の指標となっている体液中のクレアチニンキナーゼ、あるいは高血糖、低血糖を引き起こす様々な疾患や病態の診断としてグルコースの測定等に、共役酵素であるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と共に使用されている。
【０００３】
このようなヘキソキナーゼは、高等動物から微生物まで普遍的に存在する酵素であるが、臨床検査用途としてはヘキソキナーゼと同じ反応を触媒するグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)も含めて、酵母サッカロミセス(Saccharomyces）属、バチルス（Bacillus）属細菌（特公昭６３−２６９９１号公報）、サーマス（Thermus ）属細菌（特公昭６３−２６９９０号公報）由来の酵素などが知られており、また化学修飾によるヘキソキナーゼの安定化法（特開平８−５６６６１号公報）も報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
臨床検査用試薬として用いるヘキソキナーゼは、溶液状態における長期保存時の安定性に優れたものが望まれている。本発明は、野生型ヘキソキナーゼを構成するアミノ酸に変異を導入することにより安定性を改良した変異型ヘキソキナーゼ及び該変異型ヘキソキナーゼの製造法に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、既にサッカロミセス・パスツリアヌス（Saccharomyces pastorianus ）ＡＴＣＣ２３６６より抽出した染色体ＤＮＡよりヘキソキナーゼ遺伝子を単離し、その構造遺伝子配列を決定し、更に該遺伝子を含む組み換えベクターによる形質転換体で大量生産させることに成功している（特開平１０−２１５８７８号公報）。本発明者らは更に上記サッカロミセス・パスツリアヌスが生産するヘキソキナーゼをコードする遺伝子を基に、臨床検査用途として液状での安定性に優れたヘキソキナーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、野生型ヘキソキナーゼを構成するアミノ酸配列に変異を導入することにより、液状での安定性が向上した変異型ヘキソキナーゼを造成することに成功した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）ヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入もしくは置換により変異せしめたヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質であって、液状において５０℃、３０分間の処理を施した場合の残存するヘキソキナーゼ活性率が変異前の該蛋白質と比べて向上していることを特徴とする変異型ヘキソキナーゼ。
（２）ヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる（１）の変異型ヘキソキナーゼ。
（３）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる（１）または（２）の変異型ヘキソキナーゼ。
（４）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸、９５番目のバリン、１６１番目のアラニン、２０３番目のイソロイシン、２５５番目のセリン、４０８番目のグリシンからなる群より選択される１箇所もしくは２箇所以上が置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（５）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸が置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（６）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の９５番目のバリンが置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（７）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の１６１番目のアラニンが置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（８）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２０３番目のイソロイシンが置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（９）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の２５５番目のセリンが置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（１０）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の４０８番目のグリシンが置換箇所である（３）の変異型ヘキソキナーゼ。
（１１）下記の理化学的性質を有する変異型ヘキソキナーゼ。
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
至適温度：４５〜５０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４５〜５０℃以下（ｐＨ７．０，３０分間）
ｐＨ安定性：４．０〜９．０（２５℃，２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：０．２〜０．８ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：０．０１〜０．１ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する
分子量：５５，０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（１２）（１）〜（１１）のいずれかの変異型ヘキソキナーゼをコードすることを特徴とする変異型ヘキソキナーゼ遺伝子。
（１３）（１２）の変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
（１４）（１３）の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換したことを特徴とする形質転換体。
（１５）（１４）の形質転換体を培養することにより変異型ヘキソキナーぜを生成させ、該ヘキソキナーゼを採取することを特徴をする変異型ヘキソキナーゼの製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の変異型ヘキソキナーゼは、水溶液中においてＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する酵素であって、野生型ヘキソキナーゼに比べて液状安定性の改良された変異型ヘキソキナーゼである。本発明の変異を導入する前の野生型ヘキソキナーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばサッカロミセス属酵母由来のヘキソキナーゼが挙げられる。本発明ではその一例として、サッカロミセス・パスツリアヌスＡＴＣＣ２３６６由来のヘキソキナーゼ（特開平１０−２１５８７８号公報）を用いている。上記ヘキソキナーゼの性質は下記の通りである。また、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示す通りである。
【０００８】
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
至適温度：約４５〜５０℃
至適ｐＨ：７．５〜８．５
熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．０，３０分間）
ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃，２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：約０．２１ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：約０．０７４ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する
分子量：約５５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【０００９】
本発明の変異型ヘキソキナーゼは、例えば上記のようなヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入あるいは置換により変異させたヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質である。本発明における変異型ヘキソキナーゼは、液状安定性が変異前のヘキソキナーゼと比べて向上している。
【００１０】
本発明における液状安定性とは、例えば中性緩衝液中にヘキソキナーゼを溶解して、熱処理した後の残存酵素活性の割合を示す。本発明の一実施態様としては、例えば５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５０℃、３０分熱処理した後の活性残存率が野生型ヘキソキナーゼと比べて向上した変異型ヘキソキナーゼが挙げられる。また別な実施態様としては、クレアチンキナーゼ測定溶液中で４０℃、１週間保存した後の残存活性率が野生型ヘキソキナーゼと比べて向上した変異型ヘキソキナーゼが挙げられる。
【００１１】
ここで、クレアチンキナーゼ測定溶液とは、試料中のクレアチンキナーゼをＡＤＰの存在下にクレアチンリン酸に作用させ、生成されるＡＴＰをグルコースとマグネシウムイオンの存在下にヘキソキナーゼを作用させて、ＡＤＰ及びグルコース−６−リン酸を生成させ、次いでグルコース−６−リン酸とＮＡＤまたはＮＡＤＰにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変化を吸光度測定することにより、クレアチンキナーゼを測定する溶液である。該クレアチンキナーゼ測定溶液は、少なくともｐＨ緩衝剤、ＡＤＰ、Ｄ−グルコース、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、マグネシウムイオン、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼを成分として含み、ｐＨが約６．６の溶液である。なお、該クレアチンキナーゼ測定溶液は日本臨床化学会勧告法（臨床化学  第１９巻、第２号、第１８５頁、１９９０年６月）によりその望ましい組成が定められている。
【００１２】
本発明の具体的な実施態様としては、例えば、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸、９５番目のバリン、１６１番目のアラニン、２０３番目のイソロイシン、２５５番目のセリン、４０８番目のグリシンのうちの１つまたは２つ以上が他のアミノ酸に置換された変異型ヘキソキナーゼである。
【００１３】
更に具体的には、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、９５番目のバリンがグルタミン酸、１６１番目のアラニンがバリン、２０３番目のイソロイシンがスレオニン、２５５番目のセリンがプロリン、４０８番目のグリシンがアスパラギン酸への置換のうち、一または二つ以上を含む変異型ヘキソキナーゼである。
【００１４】
本発明の一例としては、下記の理化学的性質を有する変異型ヘキソキナーゼが挙げられる。
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
至適温度：４５〜５０℃
至適ｐＨ：８．０〜９．０
熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，３０分間）
ｐＨ安定性：５．０〜８．０（２５℃，２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：約０．２４ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：約０．０３１ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する
分子量：５５，０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１５】
また本発明の別な一例としては、下記の理化学的性質を有する変異型ヘキソキナーゼが挙げられる。
作用：ＡＴＰとマグネシウムの存在下にＤ−ヘキソースに作用して、Ｄ−ヘキソース−６−リン酸とＡＤＰを生成する。
至適温度：４５〜５０℃
至適ｐＨ：７．５〜８．５
熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，３０分間）
ｐＨ安定性：４．５〜９．０（２５℃，２０時間）
グルコースに対するＫｍ値：約０．８２ｍＭ
ＡＴＰに対するＫｍ値：約０．０６３ｍＭ
基質特異性：Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに作用する
分子量：５５，０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１６】
または本発明の変異型ヘキソキナーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸、９５番目のバリン、１６１番目のアラニン、２０３番目のイソロイシン、２５５番目のセリン、４０８番目のグリシンからなる群より選択される箇所の１つまたは２つ以上が他のアミノ酸に置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子である。
【００１７】
更に具体的には、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、９５番目のバリンがグルタミン酸、１６１番目のアラニンがバリン、２０３番目のイソロイシン、２５５番目のセリンがプロリン、４０８番目のグリシンがアスパラギン酸への置換のうち、１つまたは２つ以上を含む変異型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１８】
更に本発明は、上記変異型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター該組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体、該形質転換体を培養して変異型ヘキソキナーゼを生成させ、該変異型ヘキソキナーゼを採取することを特徴とするヘキソキナーゼの製造法である。上記ベクターおよび上記宿主細胞は一般的に当該技術分野で使用されるものが適用される。
【００１９】
本発明の変異型ヘキソキナーゼを作製する為に、野生型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法でも用いることができる。すなわち、該野生型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子と変異源となる薬剤を接触させる方法、紫外線照射による方法、また遺伝子修復機構が欠損しているために高頻度に遺伝子に変異が生じる大腸菌を用いる方法がある。また部位特異的変異を導入する方法として合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法や市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００２０】
本発明の変異を導入する前の野生型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、例えば、配列表配列番号２記載のサッカロミセス・パスツリアヌス（Saccharomyces pastorianus ）ＡＴＣＣ２３６６由来のヘキソキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる（特開平１０−２１５８７８号公報）。
【００２１】
作製された変異型ヘキソキナーゼ遺伝子は、ベクターに連結した状態で複製可能な宿主微生物に移入後、得られた形質転換体を培養し、その培養物から該変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を含むベクターを分離、精製し、該ベクターから変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を採取することができる。
【００２２】
すなわち供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることにより変異型ヘキソキナーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組合わせても良い。
【００２３】
この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組合わせることにより行うことができる。
【００２４】
ベクターには、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19 、pBluescript 、pLED-M1 （Journal of Fermentation and Bioenzineering  第７６巻、第２６５〜２６９頁（１９９３年））などが使用できる。
【００２５】
宿主微生物は、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110 、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB101 、エシェリヒア・コリーJM109 などを用いることができる。
【００２６】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００２７】
上記のようにして得られた形質転換体である微生物は栄養培地で培養されることにより、多量の変異型ヘキソキナーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとヘキソキナーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつヘキソキナーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２８】
上記のようにして得られた変異型ヘキソキナーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２１４巻、第１２０５〜１２１０頁（１９８１年）に報告されているジデオキシ法により解読し、また該変異型ヘキソキナーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定した。この様にして一度選択された変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、変異型ヘキソキナーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲにより変異型ヘキソキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２９】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３０】
培養温度は菌が発育し、ヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ヘキソキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しヘキソキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００３１】
培養物中の変異型ヘキソキナーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従ってヘキソキナーゼが培養液中に存在する場合は濾過，遠心分離などにより、ヘキソキナーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ヘキソキナーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤をヘキソキナーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３２】
この様にして得られた変異型ヘキソキナーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは、メタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製された変異型ヘキソキナーゼを得る事ができる。
【００３３】
例えば、Sephadex  Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク製）、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製することにより、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例中、ヘキソキナーゼ活性の測定は以下の試薬および測定条件で行った。
【００３５】
＜試薬＞
試薬Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０；１３ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含む）
試薬Ｂ：０．６７Ｍグルコース溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｃ：１６．５ｍＭ  ＡＴＰ溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｄ：６．８ｍＭ  ＮＡＤ溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｅ：グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液（３００Ｕ／ｍｌに試薬Ａで溶解）
【００３６】
＜測定条件＞
まず試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄ、試薬Ｅを２．２８：０．５：０．１：０．１：０．０１の割合で混合して試薬混液を調製する。該試薬混液３ｍｌを３０℃で約５分予備加温後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え３０℃で反応を開始し、４分間反応させた後３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００３７】
実施例１  ヘキソキナーゼ遺伝子への変異の導入
サッカロミセス・パスツリアヌスＡＴＣＣ２３６６由来の野生型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターｐＨＸＫ１０（特開平１０−２１５８７８号公報）で市販の大腸菌コンピテントセル（E.coli XL1-Red；Clontech製）を形質転換した後、該形質転換体をアンピシリン（５０μｌ／ｍｌ；ナカライテスク製）を含んだ５ｍｌのＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）の接種し、３７℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。
【００３８】
実施例２  熱安定性の向上した変異体のスクリーニング
実施例１で調製したプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテントセル（E.coli HB101；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をアンピシリン（５０μｌ／ｍｌ；ナカライテスク製）を含んだＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．２）に塗布した後、３０℃で一晩培養して得られたコロニーを更にアンピシリン（１００μｌ／ｍｌ；ナカライテスク製）を含んだ５ｍｌのＴＢ液体培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、１．２５％Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．２３％ＫＨ2 ＰＯ4 ；ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００３９】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりヘキソキナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を４５または５０℃で３０分間熱処理した後、ヘキソキナーゼ活性を測定し、熱処理前のヘキソキナーゼ活性に対して熱処理後のヘキソキナーゼ活性の残存率が野生型ヘキソキナーゼに比べて高い菌株をスクリーニングした結果、３種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら３種の変異体が保持するプラスミドをｐＨＸＫ１０Ｍ１、ｐＨＸＫ１０Ｍ２、ｐＨＸＫ１０Ｍ３と命名した。
【００４０】
ｐＨＸＫ１０Ｍ１、ｐＨＸＫ１０Ｍ２、ｐＨＸＫ１０Ｍ３の変異箇所を同定するためにＤＮＡシーケンサー（ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer；Perkin-Elmer製）でヘキソキナーゼをコードする塩基配列を決定した結果、配列表配列番号１記載のアミノ酸のｐＨＸＫ１０Ｍ１では、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン（コドン：ＴＣＴがＣＣＴ）、ｐＨＸＫ１０Ｍ２では９５番目のバリンがアラニン（コドン：ＧＡＡがＧＴＡ）、２０３番目のイソロイシンがスレオニン（コドン：ＡＴＴがＡＣＴ）に置換されていることが確認された。
【００４１】
実施例３  変異体ヘキソキナーゼの作製
野生型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子を含む組み換えベクターｐＨＸＫ１０と配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、TransformerTM Site Directed Mutagenesis Kit （Clontech製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に実施例２と同様に方法にて塩基配列を決定して、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の１６１番目のアラニンがバリンに置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ４）を取得した。
【００４２】
また、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の２５５番目のセリンがプロリンに置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ５）を取得した。
【００４３】
更に、配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の４０８番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ６）を取得した。
【００４４】
実施例２で得たｐＨＸＫ１０Ｍ１と配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリンに置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ７）を取得した。
【００４５】
上記ｐＨＸＫ１０Ｍ７と配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリン、更に２５５番目のセリンがプロリンに置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ８）を取得した。
【００４６】
上記ｐＨＸＫ１０Ｍ８と配列表の配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列表配列番号１記載のアミノ酸配列の５３番目のグルタミン酸がバリン、１６１番目のアラニンがバリン、２５５番目のセリンがプロリン、更に４０８番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ヘキソキナーゼをコードする組み換えプラスミド（ｐＨＸＫ１０Ｍ９）を取得した。
【００４７】
ｐＨＸＫ１０Ｍ４、ｐＨＸＫ１０Ｍ５、ｐＨＸＫ１０Ｍ６、ｐＨＸＫ１０Ｍ７、ｐＨＸＫ１０Ｍ８、ｐＨＸＫ１０Ｍ９の各組み換えプラスミドにより、大腸菌コンピテントセル（E.coli HB101；東洋紡績製）の形質転換を行い、得られた形質転換体をそれぞれ取得した。
【００４８】
実施例４  変異体ヘキソキナーゼの製造
５００ｍｌのＴＢ培地を２Ｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを１００μｌ／ｍｌになるように添加した。この培地にＬＢで予め３０℃、１６時間培養したE.coli HB101（ｐＨＸＫ１０Ｍ１）の培養液をを５ｍｌ接種し、３０℃で３６時間通気攪拌培養した。培養終了時のヘキソキナーゼ活性は約１２０Ｕ／ｍｌであった。
【００４９】
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁後した。上記懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる徐核酸及び硫安分画を行った後、セファデックスＧ−２５（ファルマシアバイオテク製）により脱塩し、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィー、更にフェニルセファロース（ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約８００Ｕ／ｍｇ−蛋白であった。また、上記精製酵素標品をＨＸＫＭ１と命名した。
【００５０】
ｐＨＸＫ１０Ｍ２、ｐＨＸＫ１０Ｍ３、ｐＨＸＫ１０Ｍ４、ｐＨＸＫ１０Ｍ５、ｐＨＸＫ１０Ｍ６、ｐＨＸＫ１０Ｍ７、ｐＨＸＫ１０Ｍ８及びｐＨＸＫ１０Ｍ９それぞれのE.coli HB101形質転換についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。得られた精製酵素標品それぞれＨＸＫＭ２、ＨＸＫＭ３、ＨＸＫＭ４、ＨＸＫＭ５、ＨＸＫＭ６、ＨＸＫＭ７、ＨＸＫＭ８及びＨＸＫＭ９と命名した。
【００５１】
実施例５  各種変異型変異体ヘキソキナーゼと野生型ヘキソキナーゼの熱安定性の比較
実施例４で得た各種変異型ヘキソキナーゼ（ＨＸＫＭ１、ＨＸＫＭ２、ＨＸＫＭ３、ＨＸＫＭ４、ＨＸＫＭ５、ＨＸＫＭ６）と野生型ヘキソキナーゼを５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５０℃で熱処理した時の残存活性の経時的変化を比較した結果を図１に示す。図１から判るように、本発明の変異型ヘキソキナーゼの熱安定性が野生型ヘキソキナーゼの熱安定性よりも有意に向上していることが確認された。
【００５２】
また、２カ所以上の置換アミノ酸を有する各種変異体（ＨＸＫＭ７、ＨＸＫＭ８、ＨＸＫＭ９）と野生型ヘキソキナーゼ及びＨＸＫＭ１を１００ｍＭのイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．６）中で３０分間熱処理した時の残存活性を図２に示す。このように変異アミノ酸数の増加と共に熱安定性が有意に向上していることが確認された。
【００５３】
実施例６  各種変異型変異体ヘキソキナーゼと野生型ヘキソキナーゼのクレアチンキナーゼ測定溶液中の安定性の比較
実施例４で得られたＨＸＫＭ１、ＨＸＫＭ９と野生型ヘキソキナーゼを用いて、下記クレアチンキナーゼ測定試薬を作成して、４０℃での保存安定性を比較した結果を図３に示す。尚、クレアチンキナーゼ測定試薬は日本臨床化学会勧告法（臨床化学  第１９巻、第２号（１９９０年６月））に従って作成した。本発明の変異型ヘキソキナーゼがクレアチンキナーゼ測定溶液中で野生型ヘキソキナーゼよりも優れた安定性を示すことが確認された。
【００５４】
イミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．６）  １１５ｍＭ
ＥＤＴＡ  ２．３ｍＭ
酢酸マグネシウム  １１．３ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン  ２３ｍＭ
ＡＤＰ  ２．３ｍＭ
ＡＭＰ  １１．３ｍＭ
Ｐ１，Ｐ５−ジアデノシン−５’−ペンタリン酸  １１．５μＭ
Ｄ−グルコース  ２３ｍＭ
ＮＡＤＰ  ２．３ｍＭ
ヘキソキナーゼ  ３４５０Ｕ／Ｌ（３０℃）
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ  １７２５Ｕ／Ｌ（３０℃）
【００５５】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、ヘキソキナーゼ活性を有する蛋白質を変異させることにより改良し、安定性に優れた変異型ヘキソキナーゼを取得することができる。さらに、遺伝子工学的技術により、該変異型ヘキソキナーゼを高純度に且つ大量に供給することができる。
【００５６】
【配列表】
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0004239046.tif 000004
【００５７】
0004239046.tif 000005
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0004239046.tif 000007
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【００５８】
配列番号：３
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
CCTTTTCTTT CCCAGTTTCT CAAAACAAAA TCAATGAAG                         39
【００５９】
配列番号：４
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GCTACAAGGA AAACTACCTG ATGACATTCC ACCATC                            36
【００６０】
配列番号：５
配列の長さ：39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GCTGTCTGTC AAAAGAGAGA TTACAAGACC GGTCACATC                         39
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４で得た各種変異型ヘキソキナーゼ（ＨＸＫＭ１、ＨＸＫＭ２、ＨＸＫＭ３、ＨＸＫＭ４、ＨＸＫＭ５、ＨＸＫＭ６）と野生型ヘキソキナーゼを５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で５０℃で熱処理した時の残存活性の経時的変化を比較した結果を示す図である。
【図２】２カ所以上の置換アミノ酸を有する各種変異体（ＨＸＫＭ７、ＨＸＫＭ８、ＨＸＫＭ９）、野生型ヘキソキナーゼ及びＨＸＫＭ１を１００ｍＭイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ６．６）中で３０分間熱処理した時の残存活性を比較した結果を示す図である。
【図３】実施例４で得たＨＸＫＭ１、ＨＸＫＭ９及び野生型ヘキソキナーゼの４０℃での保存安定性を比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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