(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ｐ５３結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、この最小プロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、
（２） 被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程と
を含む変異原性試験方法であって、
ｐ５３結合配列が、配列番号３に示す塩基配列を３個含む配列である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物質の哺乳動物細胞に対する変異原性ひいては発癌性を確認するための変異原性試験方法、並びに、この方法に用いられる組み換えベクター及び形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品や環境中に廃棄される製品に含まれる物質は、発癌性がないことが求められる。変異原性物質は発癌性を有するものが多いため、使用する物質が変異原性を有するか否かを評価することは、これらの物質の安全性評価の必須事項である。
【０００３】
変異原性試験の一次スクリーニングとしては、通常、サルモネラ菌を用いたエイムス（Ames）試験やウム試験（umu-test）などが行われている。これらの試験は微生物を対象とした試験であるため、これらの試験で変異原性陽性と判定された化学物質は、必ずしもヒトに対して同様の結果をもたらさない。一方、哺乳類の培養細胞を対象とした試験や動物個体を対象とした試験、例えば、染色体異常試験や小核試験等も変異原性試験法として確立されているが、操作が煩雑で、結果が得られるまでに比較的長時間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確かつ簡便に確認できる試験方法、及び、それに用いる材料を提供することを主目的とする
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
▲１▼  p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターによって発現可能であるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する哺乳動物細胞を用い、この細胞に被験物質を接触させて、接触によりレポーター遺伝子の発現量が変化するか否かを判定することにより、被験物質が哺乳動物のDNAに損傷を与える変異原性物質であるか否かを正確かつ簡便に検出できる。
▲２▼  p53結合配列が、そのコンセンサス配列とされている配列番号２に示す塩基配列を３個含む場合には、特に感度良く変異原性物質を検出できる。
【０００６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の組み換えベクター、形質転換体及び変異原性試験方法を提供する。
【０００７】
項１．  p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクター。
【０００８】
項２．  上流側から、p53結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子の順に配置されている項１に記載の組み換えベクター。
【０００９】
項３．  上流側から、最小プロモーター、p53結合配列、及びレポーター遺伝子の順に配置されている項１に記載の組み換えベクター。
【００１０】
項４．  p53結合配列が、配列番号１に示す塩基配列（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１１】
項５．  p53結合配列が、配列番号２（配列番号２中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）に示す塩基配列を有するものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１２】
項６．  p53結合配列が、配列番号２に示す塩基配列を３個有するものである項５に記載の組み換えベクター。
【００１３】
項７．  変異原性試験用の項１から６のいずれかに記載の組み換えベクター。
【００１４】
項８．  項１から６のいずれかに記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【００１５】
項９．  変異原性試験用の項８に記載の形質転換体。
【００１６】
項１０．  (1)  項８に記載の形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、(2)  被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程と
を含む変異原性試験方法。
【００１７】
項１１．  p53結合配列が、配列番号２（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）に示す塩基配列からなるものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１８】
項１２．  p53結合配列が、配列番号２に示す塩基配列を３回繰り返したものである項１１に記載の組み換えベクター。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、p53結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターにより発現可能であるように連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターである。
p53結合配列
p53は、化学物質、紫外線又はガンマ線などによるDNA損傷時に、特定部位がリン酸化されることにより活性化し、特定遺伝子群の転写調節領域に結合して、その転写を調節する機能を有する転写因子である。
【００２０】
p 53結合配列としては、哺乳動物細胞において、DNA損傷を契機としてp 53により転写活性が調節される標的遺伝子群の上流又はイントロン中の転写調節領域中に存在するDNA配列が挙げられる。
【００２１】
DNA損傷によりリン酸化された活性型p53が、その転写調節領域を認識し結合することにより、転写が活性化され、転写量が増大する遺伝子群のp53結合配列を用いることが好ましい。p53により転写が活性化される遺伝子としては、具体的には、DNA修復に関わるp53R2、細胞周期調節に関わるp21／Waf-1、アポトーシスの調節に関わるp53AIP1、Bax、p53DINP1等が挙げられる。
【００２２】
天然の哺乳動物細胞においてp53により転写が促進される遺伝子群のp53結合DNA配列は、通常、コンセンサス配列である5'-RRRCWWGYYY -3'（配列番号１：Rはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を２回繰り返した配列5'-RRRCWWGYYY RRRCWWGYYY -3'（配列番号２：Rはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Wはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Yはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を含む。
【００２３】
従って、本発明の組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号１のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。また本発明の組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号２のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。本発明の組み換えベクターは、p53結合配列として配列番号２の塩基配列において数個程度まで、特に１〜２個のヌクレオチドが置換された塩基配列を１個以上含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の組み換えベクターは、p53結合配列として、配列番号２の塩基配列又は配列番号２の塩基配列において数個までのヌクレオチドが置換された塩基配列を３個程度含むことがより好ましい。配列番号２のコンセンサス配列を２個以上含む場合は、それらは直接連結されていてもよく、間に１〜２０個程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。
【００２５】
天然の哺乳動物細胞においては、p53R2のイントロン1には、5'- TGACATGCCCAGGCATGTCT - 3'（配列番号３：Nature, 404, 42-49 (2000)）が存在し、Baxのイントロン1には5'- GGGCAGGCCCGGGCTTGTCG - 3'（配列番号４：Oncogene,21,990-999 (2002)）が存在し、p53AIP1のイントロン1には5'- TCTCTTGCCCGGGCTTGTCG - 3' （配列番号５：Cell, 102,849-862 (2000)）が存在し、p53DINP1のイントロン２には5'- GAACTTGGGGGAACATGTTT - 3' （配列番号６：Mol. Cell, 8, 85-94(2001)）が存在し、p21／Waf−1の上流には5'- GAACATGTCCCAACATGTTG - 3' （配列番号７：Cell, 75, 817−825(1993)）が存在する。
【００２６】
本発明の組み換えDNAにおけるp53結合配列としては、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号３又は５の塩基配列）を１個以上含む配列を好ましく用いることができる。また、塩基番号２の塩基配列に該当すれば、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列において１〜３個程度のヌクレオチドが置換されている塩基配列を１個以上含む配列であってもよい。特に、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号３又は５の塩基配列）を３個含む配列が好ましい。また、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列が複数含まれる場合は、これらが組み合わされて含まれていてもよい。このような例として、例えば、配列番号３の配列と配列番号４の配列と配列番号５の配列とが連結された塩基配列が挙げられる。
【００２７】
コンセンサス配列を含むDNA配列は、化学合成することができ、また哺乳動物の染色体DNAを鋳型にして、上記コンセンサス配列に基づき設計したプライマーを用いたPCRにより増幅しクローニングすることによっても調製できる。
【００２８】
本発明の組み換えベクターにおいては、p53の結合により転写量が低下するような遺伝子群のp53結合配列を用いることもできる。
【００２９】
また本発明の組み換えベクターにおいては、p53結合配列に代えて、DNA損傷を契機として活性化する他の転写因子の結合配列を用いることもできる。すなわち、哺乳動物細胞においてDNA損傷を契機として転写活性が調節される他の標的遺伝子群の転写因子結合配列を用いることもできる。このような標的遺伝子として、キナーゼタンパク質であるATM又はATRなどが挙げられる。ATMはDNA損傷に応答してp53をリン酸化するキナーゼである。従ってp53結合配列に代えて、ATM遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。また、ATRは主に紫外線などによるDNA損傷に応答してp53をリン酸化するキナーゼである。従って、p53結合配列に代えて、ATM遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。
最小プロモーター
哺乳動物細胞で発現可能な最小プロモーターは、コアプロモーターともいわれ、通常、遺伝子の転写開始部位付近の比較的狭い部分にみられる領域である。また、最小プロモーターは、転写調節に関わる主たる機能性エレメントであり、例えば他の転写調節因子の認識配列のような転写調節に関わる他の機能性エレメントを含まないか、または、このような機能性エレメントを含んでいてもそれがp53結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させることのない配列である。
【００３０】
本発明の組み換えベクターは、哺乳動物の最小プロモーターとして公知のものを制限なく使用できる。このような最小プロモーターの塩基配列としては、例えば、RNAポリメラーゼIIによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与するDNA領域であるTATAボックスおよび転写開始点近傍の塩基配列が挙げられ、具体的には例えば、マウスのメタロチオネインI遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Genbank Accession No.J00605）、チキンオボアルブミン遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Genbank accession No.J00895）、単純ヘルペスウイルス（HSV）由来のチミジンキナーゼ（tk）遺伝子の5'上流領域の塩基配列（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,78,1441-1445(1981)）、シミアンウィルス（SV40）の最小プロモーター等が挙げられる。本発明の組み換えベクターにおける最小プロモーターとしては、これらの最小プロモーター配列を用いることが好ましい。また、これらのDNA配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したDNA配列も、哺乳動物細胞において最小プロモーターとして機能する限り使用できる。
【００３１】
また本発明の組み換えベクターは、p53結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させない限り、最小プロモーターを含むより広範囲なプロモーター領域を含むものであってもよい。
【００３２】
これらの配列からなるDNAは、その塩基配列に基づいた化学合成などにより調製できる。
レポーター遺伝子
本発明において、レポーター遺伝子とは、その遺伝子の発現を定性的又は定量的に確認できる遺伝子をいう。レポーター遺伝子としては、例えば公知のレポーター遺伝子を広く使用できる。特に、発現量の測定が容易である点で、その転写産物（レポーター蛋白質）の有する酵素活性等に基づいて発現量を測定できる遺伝子が好ましく、このようなレポーター遺伝子として、例えばホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼのような酵素蛋白質をコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP :green fluorescent protein)のような発光タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００３３】
これらのレポーター遺伝子はレポータープラスミドとして市販されているものを使用してもよい。
細胞選択マーカー遺伝子
本発明の組み換えベクターは、細胞における組み換えベクターの保持を確認できるように、哺乳動物細胞で機能可能な細胞選択マーカー遺伝子が含まれていてよい。「細胞選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子を含むDNAで形質転換された細胞と非形質転換細胞とを見分ける際に目印となり得る表現形質をコードする遺伝子である。「動物細胞で機能可能な」とは、動物細胞で前記形質を発現することができることを意味し、「動物細胞で機能可能な遺伝子」とは、動物細胞で転写開始能を有するプロモーターの制御下にあることにより動物細胞で発現可能な状態にある遺伝子をいう。
【００３４】
動物細胞で有効な細胞選択マーカー遺伝子としては、例えば、動物細胞の増殖を抑制または阻害する薬剤に対する耐性を細胞に付与することの可能な遺伝子を挙げることができる。具体的には、ネオマイシン耐性付与遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子（ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子）等が挙げられ、形質転換細胞の選抜がより短期間で行える点で、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子が好ましい。
構成
本発明の組み換えベクターは、p53結合配列と最小プロモーターとを含む転写調節領域の下流に、レポーター遺伝子が発現可能に連結されている。転写因子結合配列と最小プロモーターとはいずれがより上流に存在していてもよい。
【００３５】
p53結合配列と最小プロモーターとの間には１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。また、p53結合配列及び最小プロモーターを含む転写調節領域とレポーター遺伝子との間には、レポーター遺伝子が発現可能な範囲で、１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。
【００３６】
このようなベクターとするために、本発明の組み換えベクターは、最小プロモーター及びその下流に遺伝子挿入部位を有する市販の哺乳動物細胞用発現ベクターを利用し、このベクターにp53結合配列及びレポーター遺伝子を挿入したものとしてよい。このような市販の哺乳動物用発現ベクターとしては、pUC18、pUC19等が挙げられる。また前述したように、本発明の組み換えベクターは、市販のレポータープラスミドとして市販されているベクターにp53結合配列を挿入したものとすることもできる。市販のレポータープラスミドとしては、ルシフェラーゼプラスミドであるpT81lu、pSluc2、pGL3等が挙げられる。
【００３７】
本発明の組み換えベクターは、取扱い易く、ベクター分子内または分子間の遺伝子組換えや安定形質転換細胞における染色体からの脱落等が起こる頻度が低くなる点で、コンパクトな大きさであることが望ましく、例えば2〜10kb程度の大きさであることが好ましい。
【００３８】
本発明の組み換えベクターは、後述する変異原性試験に供する細胞として好適に使用できる。
(II)形質転換体
本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組み換えベクターを保持する細胞である。本発明の形質転換体は、上記組み換えベクターを一時的に保持してていもよく、安定的に保持していてもよい。
細胞
形質転換体を調製するに際し、組み換えベクターを導入する宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞としては、野生型p53が発現し、正常に機能している哺乳動物細胞を用いることができるが、p53機能が低下、欠損又は変異している異常細胞であっても、野生型p53遺伝子を別途導入することによりp53を発現させてやれば使用することができる。また、野生型p53が発現している細胞であっても、その発現量が少ない場合や組み換えベクター中のプロモーター活性が弱すぎる場合等は、さらに野生型p53遺伝子を別途導入してp53遺伝子の発現量を増大させて使用すればよい。
【００３９】
操作の容易性や再現性等を考慮すると安定に継代可能な樹立細胞株が好ましい。このような細胞株は特に限定されず公知のものを使用できる。P53が正常に発現しかつ安定に継代可能な樹立細胞株としては、例えばヒト乳ガン由来のMCF-7細胞、ヒトリンパ球由来のTK6細胞、ヒト肝臓癌細胞HepG2のようなヒト由来の細胞；マウス繊維芽細胞であるNIH3T3細胞；アフリカミドリザル腎臓由来のVero細胞、COS-7細胞；チャイニーズハムスター由来のCHO細胞等が挙げられる。特に、ヒトにおけるDNA損傷とp53の活性化との関係を再現でき被験物質のヒト細胞に対する変異原性を正確に評価できる点で、ヒト由来の細胞を用いることが好ましい。上記の培養細胞は、いずれもAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手できる。但し、これらの細胞を使用するにあたっては、その細胞が野生型のp53を発現していることをDNAシーケンスなどで予め確認することが好ましい。
形質転換方法
形質転換体の調製に当たっては、本発明の組み換えベクターを宿主細胞に一過的又は安定的に導入すればよい。形質転換率を考慮する必要がない点で、安定的に導入することが好ましい。
【００４０】
ベクター導入方法はすでに周知である。具体的には、例えば、まず105〜107細胞程度の宿主細胞を直径6〜10cm程度のシャーレに播き、5〜10%程度の血清を含有するMEM培地等を用いて、5% CO2および飽和湿度条件下に37℃で数時間〜一晩程度培養することができる。このようにして培養した細胞へ、上記DNAを導入すればよい。宿主細胞に導入されるDNAの純度は、CsCl密度勾配遠心法で精製したプラスミドDNAとほぼ同等であることが望ましい。
【００４１】
DNA導入法は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の一般的な方法を制限なく採用できる。これらの方法によりベクターを導入した場合は、通常、発現ベクターは一過的に発現できる状態である。従って、DNA導入後直ぐに形質転換体を変異原性試験に供すればよい。また、発現ベクターが安定的に発現している細胞を選択するには、ベクター導入後、薬物耐性又は陽性対照物質によるレポーター遺伝子の活性化を指標に、組み換えベクターが適切に導入された宿主細胞を選択すればよい。ここで、陽性対照物質を添加したときにルシフェラーゼ活性が基底レベルの2倍以上認められる細胞をレポーター遺伝子が活性化している細胞とみなす。
【００４２】
本発明の形質転換体は、後述する変異原性試験に供する細胞として好適に使用できる。
(III)変異原性試験方法
本発明の変異原性試験方法は、
(1)  上記説明した本発明の形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、
(2)  被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程と
を含む方法である。
被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。低分子化合物、高分子化合物等の他に、例えば、食品、食品加工物、廃棄物、ゴミ焼却物等の複数種類の物質の混合物であってもよい。
工程(1)
本発明の形質転換体と被験物質とを接触させるに当たっては、先ず、形質転換体を細胞培養容器に播種し、８時間〜一晩程度培養すればよい。培養温度は、その細胞に適した温度とすればよく、通常は３７℃程度とすればよい。培養液は特に限定されず、細胞に適した培養液を使用すればよい。細胞数は特に限定されないが、例えば９６穴プレートを使用する場合は、通常１穴あたり1×104個程度の細胞を播種すればよい。
【００４３】
次いで、細胞培養液に被験物質を添加する。被験物質はそのまま又は溶媒に溶解させて添加する。溶媒としては、例えば蒸留水、細胞に影響を与えないPBS（−）のような緩衝液、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、エタノール、メタノール等を用いることができる。被験物質は、細胞培養液中の最終濃度が通常0.1〜1重量％程度になるように添加すればよい。食品加工物の場合は、細胞に影響を与えないPBS（−）のような緩衝液で混和したものを培養液に対して１０容量％以内添加するか、被験物質をメタノール等の有機溶媒で抽出、濃縮したものを最終濃度が通常0.1〜1重量％程度になるように添加すればよい。被験物質を溶媒に溶解させて添加する場合は、対照形質転換体の培養液には、その溶媒を被験物質溶液の添加量と同量添加する。
【００４４】
細胞培養液に被験物質を添加した後、前記と同様の温度範囲で通常は１２〜７２時間程度、好ましくは２４〜４８時間程度培養を継続する。
工程(2)
その後、被験物質を接触させた形質転換体と接触させていない形質転換体との間で、レポーター遺伝子の発現量を比較する。比較するに当たっては、両細胞のレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、両測定値を比較することができ、又は、両細胞のレポーター遺伝子発現量を目視などにより直接定性的に比較することもできる。
【００４５】
それぞれ測定したレポーター遺伝子発現量を比較する場合は、各レポーター遺伝子の発現量をレポーター遺伝子の種類に応じた方法で測定すればよい。例えばレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である場合には、各細胞をPBS（−）等で洗浄した後、界面活性剤入りの細胞溶解剤を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを細胞溶解物に添加し、ルシフェリンの分解による発光量をルミノメーターを用いて定量することによりルシフェラーゼ活性を測定することができる。
【００４６】
レポーターアッセイは、マニュアル作業でも行えるが、機械を用いて自動で行ういわゆるハイスループットスクリーニング（組織培養工学、vol123,No.13,521-524、米国特許第5,670,113号）を用いることにより迅速かつ簡便に行うことができる。
【００４７】
p53により転写が活性化される遺伝子群のp53結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子
発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、例えば１５０％以上、好ましくは２００％以上になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００４８】
また、p53により転写が抑制される遺伝子群のp53結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、例えば７０％以下、好ましくは５０％以下になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００４９】
また、本発明方法において、形質転換体に既知の変異原性物質とともに被験物質を接触させることにより、抗変異原性物質又は抗発癌性物質を選択することもできる。すなわち、対照形質転換体のレポーター遺伝子発現量と、変異原性物質のみ接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量と、変異原性物質及び被験物質を接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量とを比較して、変異原性物質を接触させることによるレポーター遺伝子発現の変化量が、さらに被験物質を接触させることにより例えば１０％、好ましくは５０％低下する場合に、その被験物質が抗変異原性物質又は抗発癌性物質であると判定できる。このような物質として、抗酸化物質等が挙げられる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確かつ簡便に確認できる試験方法、及び、それに用いる材料が提供された。
【００５１】
さらにいえば、本発明の変異原性試験方法は、DNA損傷による表現型の変化を直接評価するのではなく、DNA損傷による生物反応を評価するため、DNA損傷を高感度で検出することができる。
【００５２】
また本発明方法は、従来の変異原性試験のように微生物を利用するのではなく、ヒトをはじめとする哺乳類細胞のDNA損傷に対する反応系を利用するため、その試験結果はヒトでの変異原性を正確に反映したものとなる。
【００５３】
また本発明方法は、in vitroで簡便に行えるとともに、被験物質を細胞に接触させた後にレポーター遺伝子産物量を測定するだけの迅速な方法である。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例および試験例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ （組み換えベクターの作製）
DNA損傷で発現するp53R2遺伝子イントロンのp53結合配列を3回繰り返し含む塩基配列(5'-CTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTA-3'：配列番号８)からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列(5'-GATCTAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAGGTAC-3' ：配列番号９)からなるオリゴヌクレオチドをDNA合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNAとした。
【００５５】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、SV40最小プロモーターを含むプラスミドPGV-P2（東洋インキ製）を制限酵素KpnI及びBglIIで消化した後、低融点アガロース（NuSieve 3:1 Agarose；BMA製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4974bpのDNAを回収した。このDNA約30ngと、前記のp53結合配列を3回繰り返し含むDNA 1ngとを混合し、T4リガーゼ（DNA Ligation kit；TaKaRa製）で結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセル（TaKaRa製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RV3プライマー及びGL2プライマー（いずれもプロメガ製）を用いて、DNAシーケンス（ABI Prism BigDye Terminater v3.0；アプライドバイオシステムズ製）を確認した。正しくp53結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをPGV-p53R2x3-Lucと名づけた。
実施例２（組み換えベクターの作製；p53結合配列のレパートリー；p53AIP1由来p53結合配列を含むレポータープラスミドの作成）
DNA損傷で発現するp53AIP1遺伝子イントロンのp53結合配列を3回繰り返し含む塩基配列(5'-CTCTCTTGCCCGGGCTTGTCGTCTCTTGCCCGGGCTTGTCGTCTCTTGCCCGGGCTTGTCGA -3'：配列番号１０)からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列  (5'- GATCTCGACAAGCCCGGGCAAGAGACGACAAGCCCGGGCAAGAGACGACAAGCCCGGGCAAGAGAGGTAC -3' ：配列番号１１)からなるオリゴヌクレオチドをDNA合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNAとした。
【００５６】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、SV40最小プロモーターを含むプラスミドPGV-P2（東洋インキ製）を制限酵素KpnI及びBglIIで消化した後、低融点アガロース（NuSieve 3:1 Agarose；BMA製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4974bpのDNAを回収した。このDNA約30ngと、前記のp53結合配列を3回繰り返し含むDNA 1ngとを混合し、T4リガーゼ（DNA Ligation kit；TaKaRa製）で結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセル（TaKaRa製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RV3プライマー及びGL2プライマーを用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくp53結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをPGV-p53AIP1x3-Lucと名づけた。
実施例３（組み換えベクターの作製；プロモーターのレパートリー；tk最小プロモーターを含むレポータープラスミドの作成）
ヘルペスウイルス由来のthymidine kinaseプロモーターを含むプラスミドpRL-tk（東洋インキ製）を鋳型として、ヘルペスウイルス由来のthymidine kinaseプロモーターの最小領域（Genbank Accession No.M15234）をフォワードプライマー(5'-GATCTAAGAAATATATTTGCATGTCTTTA-3'：配列番号１２)、リバースプライマー(5'-GCCAAGCTTTTAAGCGG-3'：配列番号１３)  を用いたPCR法で増幅した。PCR反応は、TaKaRa Ex Taqを用い、この酵素に添付したDNAポリメラーゼ、反応用緩衝液、dNTP、及び、鋳型としてpRL-tk 100ng、上記プライマー各10pmolずつを混合し、反応液量50μlとして、95℃20秒間、次いで59℃にて20秒間、68℃30秒間の保温を１サイクルとしてこれを25サイクル行った。このPCR産物をTOPO TA Cloning Kits（invitrogen製）を用いて、クローニングプラスミドTOPOに挿入し、次いでキット付属のコンピーテントセルOne Shotに挿入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kitで精製し、制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の181bpのDNAを回収し、tk最小プロモーターと名づけた。実施例１で作成したレポータープラスミドPGV-p53R2x3-Lucを制限酵素BglII及びHindIIIで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の4832bpのDNAを回収した。このDNA約3ngと、前記のtk 最小プロモーターのDNA 10ngとを混合し、T4リガーゼで結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RV3プライマー及びGL2プライマーを用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくtk最小プロモーター配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをPGV-p53R2x3-tk-Lucと名づけた。
実施例４（組み換えベクターの作製；p53結合配列とプロモーター配列の順序を置換したレポータープラスミドの作成）
DNA損傷で発現するp53R2遺伝子イントロンのp53結合配列を3回繰り返し含む塩基配列(5'-AGCTTTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCTA-3'：配列番号１４)からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列(5'-AGCTTAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGCATGTCAA-3' ：配列番号１５)からなるオリゴヌクレオチドをDNA合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNAとし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(TaKaRa社製)で5'末端をリン酸化した。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、SV40最小プロモーターを含むプラスミドPGV-P2（東洋インキ製）を制限酵素HindIIIで消化し、アルカリフォスファターゼ（TaKaRa社製）で脱リン酸化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の5010bpのDNAを回収した。このDNA約3ngと、前記のp53結合配列を3回繰り返し含むリン酸化DNA 10ngとを混合し、T4リガーゼ（DNA Ligation kit；TaKaRa製）で結合させた後、この反応液を大腸菌 JM109コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNAをPlasmid Mini kit（QIAGEN製）で精製し、RV3プライマー及びGL2プライマー（いずれもプロメガ製）を用いて、DNAシーケンスを確認した。正しくp53結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをPGV-SV40-p53R2x3-Lucと名づけた。
実施例５（一過的形質転換体の作製・変異原性試験）
ヒト乳癌細胞株MCF-7の野生型p53が正常であることを、シーケンス用プライマーである5'-ACACGCTTCCCTGGATTG-3'（配列番号１６）及び5'-CTGTCAGTGGGGAACAAGAAGTGGAGA-3'（配列番号１７）を用いたDNAシーケンス（ABI Prism BigDye Terminater v3.0；アプライドバイオシステムズ製）により確認した。
【００５８】
この細胞を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3910）に約1×104細胞／穴ずつ播種し、MEM培地（GIBCO; インビトロジェン製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で一晩培養した。次いで、培養細胞に、実施例１〜４で作製されたプラスミドPGV-p53R2x3-Luc、PGV-p53AIP1x3-Luc 、PGV-p53R2x3-tk-Luc 、及び、PGV-SV40-p53R2x3-Lucを5 ng /穴添加し、遺伝子導入試薬TransFast（プロメガ製）を30 nl / 穴添加することにより、一過的に導入した。
【００５９】
DNAにインターカレートし、DNAを切断することが知られているアドリアマイシンをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、得られた形質転換体細胞を４群に分け、そのうちの３群にはそれぞれ、DMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終0.01μg/mL、0.1μg/mL、１μg/mLになるように添加した。（最終DMSO濃度0.1％（v/v））残りの１群にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。アドリアマイシン又はDMSO添加後、これらの細胞を37℃で24時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をPBS（−）で2回洗浄した後、5倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を20μl / 穴添加し、室温で15分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターLB96P（ベルトールド製）にセットし、100μL / 穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６０】
結果を図1に示す。レポータープラスミドPGV-p53R2x3-Luc、PGV-p53AIP1x3-Luc 、PGV-p53R2x3-tk-Luc 、及び、PGV-SV40-p53R2x3-Lucを導入した細胞において、細胞に添加されたアドリアマイシン濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。このことから、上記方法と同様にして、アドリアマイシンに替えて被験物質を各試験群に添加して試験することにより、被験物質の変異原性活性を確認できることが分かる。
実施例６（安定型形質転換体の作製・変異原性試験）
野生型p53が正常であるヒト乳癌細胞株MCF-7細胞を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用60mmシャーレ（ファルコン製＃3910）に約1×106細胞播種し、MEM培地（GIBCO; インビトロジェン製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で一晩培養した。次いで、得られた細胞に制限酵素Asp700とBamHIで切断した実施例１で作製されたプラスミドPGV-p53R2x3-Lucを300ng 添加し、遺伝子導入試薬TransFast（プロメガ製）を1.8μl添加することにより、培養細胞に導入した。48時間後、細胞を100細胞/10mLになるように調製し、細胞をルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3910）に約1細胞／穴ずつ播種し、MEM培地（GIBCO; インビトロジェン製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で３週間培養した。これにアドリアマイシンを添加し、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた細胞をクローニングし、安定型形質転換体MCF-7-p53R2x3-Luc細胞を得た。
【００６１】
非形質転換体のMCF-7細胞と安定形質転換体MCF-7-p53R2x3-Luc細胞のアドリアマイシン１μg/mLに対するルシフェラーゼ活性を測定した。細胞は約1×104細胞／穴ずつ播種し、MEM培地（GIBCO; インビトロジェン製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%、アドリアマイシンを１μg/mL含む培地を用いて、37℃で24時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をPBS（−）で2回洗浄した後、5倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を20μl / 穴添加し、室温で15分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターLB96P（ベルトールド製）にセットし、100μL / 穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６２】
結果を図２に示す。安定形質転換体であるMCF-7-p53R2x3-Luc細胞にのみ、添加したアドリアマイシンに伴うルシフェラーゼ活性の強い上昇が認められた。このことから、本安定形質転換体を用いて、アドリアマイシンに替えて被験物質を各試験群に添加して試験することにより、被験物質の変異原性活性を確認できることが分かる。
実施例７（変異原性の有無が既知である物質を用いた本発明試験法とエイムス試験との比較）
変異原性物質の有無が既に知られている被験物質を用いて、既存の変異原性試験法であるエイムス試験と本発明の変異原性試験法とを比較した。
【００６３】
エイムス試験は安衛法における変異原性試験（労働省化学物質調査課編）に記載された方法により実施した。すなわち、サルモネラティフィムリウムのヒスチジン要求性変異株ＴＡ１００株又はＴＡ９８株（財団法人発酵研究所から入手）を、ニュートリエントブロス培地に接種し、３７℃で１４〜１６時間培養した。この培養液に被験物質溶液を最終濃度が、菌の生育を阻害しない場合５０００μｇ/０．１ｍＬ、菌の生育を阻害する場合は阻害しない濃度を最高濃度から公比２の濃度間隔で４濃度になるように添加し、さらに３７℃で２０分間培養した。この菌液を希釈し、ヒスチジンを含まない合成平板培地及びヒスチジンを含む合成平板培地にそれぞれ塗布した。各平板培地を３７℃で４８時間培養し、被験物質を添加した菌株の復帰変異株の出現率を評価した。また、上記方法において、培養液に肝臓抽出液であるS9を添加し、肝臓代謝物の変異原性の有無も確認した。各被験物質につき２回試験を繰り返し、復帰変異株の出現率が陰性対照の２倍以上となった場合に変異原性が陽性（＋）と判定した。
【００６４】
また、アドリアマイシンに代えて被験物質を用いた他は実施例２と同様にして、本発明の変異原性試験を実施した。各被験物質は、最終の最高濃度を100μg/mL とし、10倍希釈系列で最終最低濃度0.0001μg/mLになるように添加した。（最終DMSO濃度0.1％（v/v））残りの１群には同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。各被験物質につき２回試験を繰り返し、ルシフェラーゼ活性が溶媒のみを添加した陰性対照に対して150%以上、かつ、濃度依存的に上昇した被験物質を変異原性が陽性（＋）と判断した。
【００６５】
被験物質としては、アドリアマイシン、フリルフラミド、マイトマイシンC、シクロフォスファミド、4-ニトロキノリン-N-オキサイド、ダウノルビシン、ベンゾ(a)ピレン、クエルセチン、オーラミン、ビタミンD3を用いた。これらの化合物は（ＤＭＳＯ）に溶解して用いた。
【００６６】
本発明の変異原性試験法及びエイムステストの結果を以下の表１に示す。また、各被験物質の国際ガン研究機関（IARC：International Agency for Research on Cancer）による発ガン性の有無のデータを併記する。IARCのデータは、動物個体を用いた実験や疫学的調査などから得られたものである
【００６７】
【表１】
0004243716.tif 000002
【００６８】
表１から明らかなように、本発明方法による結果はIARCの結果と一致している。本発明方法によると、特にベンゾ(a)ピレンのように、エイムステストではS9処理による代謝活性化により始めて変異原性が確認できる物質も変異原性物質として検出できる。また、エイムステストでは陽性となるが、IARCデータでは発癌性が確認されていないクエルセチンは、本発明試験法では陰性を示した。また、IARCデータでは発ガン性物質とされているオーラミンは、エイムステストでは陰性と判定されたが、本発明方法では陽性と判定された。本発明方法は、動物個体を用いた結果とよく一致していることが分かる。
実施例８（p53結合配列繰り返し数がアドリアマイシンによるルシフェラーゼ活性上昇に与える影響）
実施例１と同様の手法でp53R2遺伝子イントロンのp53結合配列を１、又は２回繰り返し含むレポータープラスミドをPGV-p53R2x1-Luc, PGV-p53R2x2-Lucを作成した。ヒト乳癌細胞株MCF-7を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用96穴プレート（コーニング製＃3910）に約1×104細胞／穴ずつ播種し、MEM培地（GIBCO; インビトロジェン製）に牛胎児血清（FBS）を終濃度10%含む培地を用いて、37℃で一晩培養した。次いで、培養細胞に、制限酵素Asp700とBamHIで切断したプラスミドPGV-p53R2x1-Luc （p53結合配列 を１個含む）、PGV-p53R2x2-Luc（p53結合配列 を２個含む） 、及び、PGV-p53R2x3-Luc（p53結合配列 を３個含む）をそれぞれ5 ng / 穴づつ添加し、遺伝子導入試薬TransFast（プロメガ製）を30 nl / 穴添加することにより、一過的に導入した。
【００６９】
アドリアマイシン１μg/mLをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、培養細胞を６群に分け、２群ずつを３つのプラスミドでそれぞれ形質転換し、さらに、その１群にDMSOに溶解させたアドリアマイシンを最終1μg/mLになるように添加した。（最終DMSO濃度0.1％（v/v））残りの１群にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のDMSOを添加し、陰性対照とした。
【００７０】
アドリアマイシン又はDMSO添加後、これらの細胞を37℃で24時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をPBS（−）で2回洗浄した後、5倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を20μl / 穴添加し、室温で15分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターLB96P（ベルトールド製）にセットし、100μL / 穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７１】
結果を図３に示す。レポータープラスミドPGV-p53R2x1-Luc、PGV-p53R2x2-Luc、及び、 PGV-p53R2x3-Lucを導入した細胞において、細胞に添加されたアドリアマイシンに伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。また、p53R2由来のp53結合配列の繰り返し数の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。
【００７２】
このことから、p53結合配列の繰り返し数が３回のレポータープラスミドが、アドリアマイシンに対する反応性が最も高くなることが分かる。
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の変異原性試験法において、アドリアマイシンが濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増大させることを示すグラフである。DMSOは溶媒のみを添加した群、ADM 0.01、 ADM 0.1、 ADM 1は、アドリアマイシンをそれぞれ0.01μg/mL、 0.1μg/mL、 1μg/mL添加した群である。
【図２】本発明の変異原性試験法において発明した安定形質転換体であるMCF-7-p53R2x3-Luc細胞について、アドリアマイシンがルシフェラーゼ活性を増大させることを示すグラフである。
【図３】本発明の変異原性試験法において、p53結合配列の繰り返し数と、アドリアマイシンによって誘導されたルシフェラーゼ活性との関係を示すグラフである。PGV-p53R2x1-Luc、PGV-p53R2x2-Luc、及び、 PGV-p53R2x3-Lucは、p53R2由来のp53結合配列をそれぞれ1回、2回及び3回含むプラスミドを導入した細胞を用いた群である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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