(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊毛を刺激する薬剤であって、アンギオテンシンIIもしくはその塩、または、アンギオテンシンIIアミド、アンギオテンシンIII及びアンギオテンシンIVからなる群より選ばれるアンギオテンシンIIの類縁化合物を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項２】
前記薬剤が繊毛打数を増加させる薬剤であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記薬剤が卵管繊毛打数を増加させる薬剤であることを特徴とする請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記薬剤が気管支上皮細胞繊毛打数を増加させる薬剤であることを特徴とする請求項２に記載の薬剤。
【請求項５】
前記薬剤が錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射可能な溶液、座剤、膣座剤、スプレー剤、吸入剤、徐放性インプラント、または、クリーム剤として製剤されていることを特徴とする上記の請求項のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
卵管における卵子輸送を促進する薬剤であって、アンギオテンシンIIもしくはその塩、または、アンギオテンシンIIアミド、アンギオテンシンIII及びアンギオテンシンIVからなる群より選ばれるアンギオテンシンIIの類縁化合物を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項７】
前記薬剤が錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射可能な溶液、座剤、膣座剤、スプレー剤、吸入剤、徐放性インプラント、または、クリーム剤として製剤されていることを特徴とする請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
喘息治療用の薬剤であって、アンギオテンシンIIもしくはその塩、または、アンギオテンシンIIアミド、アンギオテンシンIII及びアンギオテンシンIVからなる群より選ばれるアンギオテンシンIIの類縁化合物を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項９】
前記薬剤が錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射可能な溶液、座剤、膣座剤、スプレー剤、吸入剤、徐放性インプラント、または、クリーム剤として製剤されていることを特徴とする請求項８に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、卵管繊毛及び呼吸器系の分泌上皮繊毛等の繊毛を刺激する薬剤を製造するために、アンギオテンシンII（ＡｎｇII）若しくはその類縁化合物を使用する方法に関するものである。本発明は、特に、繊毛を刺激する薬剤を製造するために、ＡｎｇII若しくはその類縁化合物を使用する方法に関するものであり、例えば、繊毛を刺激することで、妊娠、特にヒトの妊娠に対して、結果的に有利な効果を有する卵巣輸送を促進するような薬剤を製造するための使用方法に関するものである。
一方、この薬剤は、喘息、気管支炎、あるいは肺炎等の呼吸器系の状態を治療するのに使用可能である。
アンギオテンシンIIは、オクタペプチドであり、通例、血中で生成されると考えられており、第一に、腎臓から分泌される酵素であるレニンのアンギオテンシノゲンに対する作用により、デカペプチド前駆体であるアンギオテンシンＩの構造になり、第二に、ジペプチダーゼである“アンギオテンシン変換酵素”が作用する。すなわち、本酵素がアンギオテンシンＩに作用しアンギオテンシンIIを形成する。また、アンギオテンシンIIはアミノペプチダーゼにより加水分解を受け、ヘプタペプチドであるアンギオテンシンIIIアンギオテンシン１−７）を生じる。
ホルモンであるアンギオテンシンII（ＡｎｇII）は、生体内で電解質平衡及び血圧の調節に役立つレニン−アンギオテンシン系の一部になる。
生体内には、ＡｎｇIIが作用する組織が幾つかあり、副腎、子宮、肝臓、脳、及び腎臓が含まれる。
アンギオテンシンIIの幾つかの確立した機能の中では、血管収縮に深く関与し、高血圧症を引き起こすことが知られている。多くの高血圧症治療は、何らかの方法でアンギオテンシン機能を遮断阻害することを含んでいる。ＡｎｇIIは、副腎皮質からのアルドステロンの分泌をも刺激する。アルドステロンは、主として腎臓に作用し、ナトリウムの貯留を促し、結果として、とりわけ、血管に直接作用するアンギオテンシンの血圧亢進効果を高める強力なホルモンである。
ＡｎｇIIは、脳内で種々の活性部位に作用することが知られており、動物におけるそれらの作用の一つが渇きと水分摂取の調節である。
アンギオテンシンは、脈管系に対し栄養効果も有し、動脈壁において筋の成長を促進する。また、脈管形成性であると考えられ、すなわち新たに発達する組織の血管新生を起こす。
ＡｎｇIIの確立された効果の大部分が、第７膜内外領域受容体（ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＡｎｇII受容体のＡＴ1サブタイプを経て起こることが見出されている。本受容体は、種々の組織からクローニングされ、配列を決定されており、３５９個のアミノ酸からなる予想分子量約４０ｋＤを有するポリペプチドであることが分かっている（ベルステイン、アレキサンダー、（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）（１９９２）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１３，３８１−３８６）。光親和性の標識剤及び架橋剤を用いた研究では、成熟受容体の分子量は、各々、およそ６５ｋＤ及びおよそ１１６ｋＤであるとされるが、細胞外領域内でのアスパラギン残基のグリコシル化を反映したものかもしれない。
最近のハイブリドーマセルラインの開発から、（バーカー  エス（Ｂａｒｋｅｒ，Ｓ．，）他、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒ．，１１，２４１−２４５，（１９９３）参照）、ＡｎｇII受容体のＡＴ1サブタイプに対するモノクローナル抗体の産生が可能であると確認された。その結果、当該受容体が、成熟ラットと成人の精子尾部、交尾後のラットの膣洗浄によって得られた自由遊泳精子、及び射精されたヒトの精子に存在するとわかった。
ＷＯ（９５／０１２０２）は、精子の運動性の増進により、哺乳類の卵子の受精を促進するためにアンギオテンシンIIを使用することを開示している。特に、ＡｎｇIIは、試験管内受精の促進に用いることができると開示している。
ＡｎｇII受容体は、卵巣内及び子宮内について広く研究されてきているが、卵管内の存在及び役割についての情報はない。実際のところ、子宮にはＡＴ2サブタイプは存在するが、ＡＴ1サブタイプは欠損していると報告されている。ＡｎｇIIは、現在までに、ＡｎｇII受容体のＡＴ1サブタイプに対するモノクローナル抗体を用いることにより、卵管内及び子宮内に発見されている。卵管内、及び腎臓の細管、気道、腸、乳管（ｂｒｅａｓｔ  ｄｕｃｔｓ）、前立腺管、膵管、血管内でも、この抗体はその受容体が上皮細胞（血管においては内皮細胞）に特異的に局在することを明らかにし、上皮輸送及び管輸送における受容体の役割を示唆している。卵管内では気道内と同様、分布区域が、特異的に上皮細胞の繊毛との密接な関わりを示しており、したがって、繊毛の機能がこの受容体によって調節されているのかもしれない。
慢性呼吸器疾患の発生率は、近年著名な増加を示している。この大部分が大気汚染と関係していることはほぼ間違いない。現在のところ、係る慢性症状は、様々な緩和方法により治療される。概して、有用ではあるが、これらのほとんどが、粘液性繊毛クリアランス（ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）に対し直接に処置していない。この機序は、全気道にとって主となる自然防御システムであり、粘液性の覆膜（ｍｕｃｏｓ  ｂｌａｎｋｅｔ）における整合的な繊毛打を介して、潜在的に有害な物質を除去する。したがって、クリアランスに影響を与える因子には、繊毛打数（ｂｅａｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の他に、粘液自体の流動学的特性も含まれる。通常の生理的条件の下で、これらの特性がどんな手段で調節されているかは、繊毛作用が多くの因子の影響を受けると知られているにもかかわらず、十分に明らかにされていない。これらは神経伝達物質及びその作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）、拮抗薬、細胞内シグナル分子、サイクリックＡＭＰ、カルシウムイオンを含む。
現在までに、ＡｎｇII若しくはその類縁化合物が卵管繊毛打数（ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｂｅａｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＣＢＦ）及び気管支上皮細胞繊毛打数に刺激作用を有することが分かっており、したがって、これらの化合物は、前述の場所に存在する繊毛に対しても、同様な刺激効果を有するかもしれない。
係る新規に発見されたＡｎｇIIの特性は、妊娠不能な、若しくは妊娠に障害を有する女性に対し、卵管を経由する卵子輸送の促進に用いることを可能とする。一方で、繊毛活性は、卵子輸送に責任のある機構の一つであり、ＡｎｇIIの刺激性作用が妊娠の促進を助けるので、卵管繊毛活性を保持しない女性でも妊娠できるかもしれない。
さらに、ＡｎｇIIは、粘液性繊毛クリアランスの促進に用いることも可能であり、喘息や他の気管支疾患の苦痛症状を緩和する。
本発明の第一の態様では、繊毛を刺激する、特に繊毛打数を増加する、好ましくは卵管繊毛打数及び気管支上皮細胞繊毛打数を増加する薬剤の製造に、アンギオテンシンII、若しくはその塩、若しくはその類縁化合物を使用する方法を提供する。
本発明の第二の態様では、卵管における卵子輸送を促進する薬剤の製造に、アンギオテンシンII、若しくはその塩、若しくはその類縁化合物を使用する方法を提供する。
本発明の他の態様では、喘息、あるいは他の気管支疾患を緩和する薬剤の製造に、アンギオテンシンII、若しくはその塩、若しくはその類縁化合物を使用する方法を提供する。
繊毛を刺激する、すなわち繊毛打数を増加するのに用いることができるＡｎｇIIの類縁化合物には、ＡｎｇIIアミド、アンギオテンシンIII（Ａｎｇ１−７）、及びアンギオテンシンIV（Ａｎｇ３−８）が含まれる。
薬剤は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射可能な溶液、座剤、膣座剤、スプレー剤、吸入剤、徐放性インプラント、クリーム剤とされた剤型であってもよく、体表面（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または体内に、例えば、膣、直腸、口腔、鼻腔を通して用いることができる。したがって、当該調合物は、経口、筋肉内、静脈内、経腸、経鼻、経膣投与可能である。気管支疾患治療の場合、薬剤の剤型の好ましい形態の一つには、吸入器用エアロゾルがある。
こうした剤型に混合してもよい賦形剤には、担体、結合剤、安定剤、保存剤、香味料がある。こうした剤型に混合される適切な賦形剤の例には、トラガントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン等の結合剤、微結晶セルロース等の賦形剤、トウモロコシデンプン、未ゼラチン化デンプン（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤、オレンジ、ペパーミント、冬緑油、チェリー油等の香味料が含まれる。剤型がカプセルの場合、前述に例示の物質に加えて、脂肪油等の液状担体を含んでもよい。種々の他の物質を、コーティングとして、若しくは別の方法で剤型の物理的形状を変更するために用いてもよい。例えば、錠剤はシェラック、糖、またはそれら両方で被覆してもよい。シロップ剤やエリキシル剤は活性化合物、すなわち甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素及びチェリーまたはオレンジ風味等の香味料を含有してもよい。
本発明の第三の態様は、有効量のアンギオテンシンII、若しくはその塩、若しくはその類縁化合物を、動物、好ましくはヒトへの投与することを特徴とする繊毛刺激方法、特に繊毛打数増加方法、好ましくは卵管繊毛打数及び気管支上皮細胞繊毛打数の増加方法を提供する。
本発明のさらなる他の態様は、有効量のアンギオテンシンII、若しくはその塩、若しくはその類縁化合物を、動物、好ましくはヒトへの投与することを特徴とする、卵管における卵子輸送の促進方法を提供する。
以下の実施例を参照し、本発明をさらに説明する。
実施例１  卵管繊毛打数（ＣＢＦ）の研究
卵管は、良性状態に向けて不妊法あるいは子宮摘出術を施された女性から、インフォームドコンセント及び地域の倫理委員会の承認を取得後に得られた。ホルモン状態の把握のために、手術の直前に静脈血試料を採取し、ＦＳＨ、ＬＨ、エストラジオール（Ｅ2）及びプロゲステロンを測定し、ノイエス（Ｎｏｙｅｓ）他、１９５０、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．１，３−２５に記された判定基準を用いて、子宮内膜の組織学的検査により確認した。部分群あるいは受精能を有する排卵のあることを証明された女性からなる標準群において、毎日の静脈血検体及び／または早朝尿検体でＬＨ値の動き（ＬＨ  ｓｕｒｇｅ）を検出して月経周期を記した。患者には、ホルモン置換療法（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）を受けている若しくは経口避妊薬を服用している者はいなかった。卵管は、除去後即座に、１．８１Ｕ／ｍＬ  ヘパリン、５０μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍＬ  ペニシリン、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳを含有するＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培養液中に入れたままで、実験室へ運搬され、以前に記述されている通りに（Ｋｅｒｖａｎｃｉｏｇｌｕ他、１９９５，Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，８２，１０３−１０７）調製された。要するに、組織を切開し、明らかな血液の痕跡が残らない様に二度洗われた。膨大部（ａｍｐｕｌｌａｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の粘膜ヒダは切り離され、１ｍｍ3片に分割され、ヘパリンあるいはＨＥＰＥＳを含有しないこと以外は上述と同じ培養液に入れられた。全ての繊毛打数（ＣＢＦ）の実験は、室温で行われた。１個の粘膜片を、１ｍＬ培養液を含む６０×１５ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）組織培養皿（ベクトン  ディッキンソン社、ルザーフォード、ニュージャージー州（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ））に置かれた。繊毛活動をオリンパス倒立顕微鏡（キーメッド社、エセックス州、英国（Ｋｅｙｍｅｄ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ））で観察し、３０分までビデオテープに記録した。３分以内で安定なＣＢＦに到達することが実験で示された。録画は、試薬を添加してから５分後に開始した。各々の組織移植片には、コントロールの箇所と、刺激された箇所の両方を備えた。ＡｎｇIIは、ロザルタン（Ｌｏｓａｒｔａｎ）（１０００ｎｍｏｌ／Ｌ）又はＣＧＰ４２１１２Ｂ（１０００ｎｍｏｌ／Ｌ）の存在下あるいは非存在下で、０．１から１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で使用された。繊毛をテレビモニタに映すことが可能になるようにビデオ信号のコントラストを増幅するＣＥ−１増幅装置（ブライアン  リース化学器機、ニューブリー州、英国（Ｂｒｉａｎ  Ｒｅｅｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗｂｕｒｙ，ＵＫ））を用いて、録画を分析した。６個の異なる細胞のＣＢＦが、１分間経過すると決定された。個々の繊毛の位置は、十字線光検出器でスクリーンに固定され、検出器の交点における繊毛運動から生じる光強度の違いは、ＰＣＸ１ビデオ編集カード（Ｖｉｄｅｏ  Ｄｉｇｉｔｉｓｅｒ  Ｃａｒｄ）（バージョン７．１１）及び細胞透写第８（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅｋ  ８）ソフトウェア（ブライアン  リース化学器機）を組込んだコンピュータを使用して分析した。光強度の���違は、ヘルツ単位で算出された。1片の移植片から得られた六つの測定値の平均値が計算に用いられ、6人の閉経前の女性からのデータと統計学的な分析で比較された。
結果
ＣＢＦは、ナノモル濃度のＡｎｇIIで刺激され、それより高濃度のＡｎｇIIが、ＣＢＦをさらに増大させることはなかった（図1）。異なる濃度のＡｎｇIIを用いた全実験データを組合わせると（表1）、培養液へのＡｎｇIIの添加後、ＣＢＦは著名に増加しており（ＡＮＯＶＡによるＰ＝０．００４６）、この増加はロザルタンの存在によって阻害された（ＡＮＯＶＡによるＰ＝０．１１７６、ロザルタン添加ＡｎｇII対コントロール）。ＣＧＰ４２１１２Ｂは阻害作用を有さなかった（ＡＮＯＶＡによるＰ＝０．０１８６、ＣＧＰ４２１１２Ｂ添加ＡｎｇII対コントロール）。
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結論
これらのデータは、明白に、ＡｎｇIIが卵管ＣＢＦに対し、刺激作用を有することを示す。この効果はナノモル濃度のＡｎｇIIで達成され、さらにＡｎｇII濃度を上昇させても、この効果は増加しなかった。
実施例２
鼻腔と気管支の組織標本は、Ｓｔ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ病院の耳鼻咽喉科と心臓胸部科にかかっている手術患者からそれぞれ得た。
組織標本は、切除後直ちに、ユニバーサル試験管中の冷塩基性培養液（ｃｏｌｄ  ｂａｓｉｃ  ｍｅｄｉａ）２０ｍｌに入れ、除去後３０分以内に実験室へ移した。標本は、次の通り処理された。
１．組織標本を、新しい塩基性培養液で２−３回洗浄して滅菌した。
２．洗浄の際、標本は５ｍｌ塩基性培養液を含有するＦａｌｃｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒｉａ培養皿（ベクトン  ディッキンソン会社  オックスフォード州）に入れられ、上皮組織は滅菌済ピンセット及び使い捨て滅菌済小刀を用いて切除された（スワン  モートン社、シェフィールド（Ｓｗａｎｎ  Ｍｏｒｔｏｎ，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ））。組織切片は切り出されると、新たな塩基性培養液を含む培養皿に入れられた。
３．これらの組織片は、１−２ｍｍ3大の片にさらに小さく分割された。
４．初代細胞培養は、ウシ胎児血清を含有する１．５ｍｌ培養液を含む６０×１５ｍｍ型Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒｉａ培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に、前段階で得られた小組織片３個を平板培養して得られた。
５．培養細胞は、ＣＯ２培養器２２０（ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ２２０）フロー研究所（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（英国）で、３７＝Ａ７Ｃで、空気にＣＯ２を５％混合して送気しつつ培養された。
ＣＢＦの測定は、アナログ階調増幅技術（Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅ，ＡＣＥＴ）の変法で行われた。本技術において、ＣＯＨＵソリッドステートカメラは、細胞の観察に使用されるホフマン変調光学システム（モジュレーション  オプティクス株式会社、グリーンベール、ニューヨーク州）を組込んだオリンパスＩＭＴ−２倒立顕微鏡（オリンパス光学株式会社、英国）に連結された。顕微鏡像は、ＣＯＨＵソリッドステートビデオカメラとＣＥ−１階調増幅器を介してモニタへ供給された。この過程で、像は、繊毛が観察できるようコントラストを増幅する電子ストレッチングを受ける。繊毛打は、選定された繊毛を有す細胞に位置を定めたマウス操作性の十字線光検出探触子によって検出される光強度に変動を起こす。ＰＣＸビデオ編集カード（ブライアン  リース化学器機、ニューブリー州）を伴うオンラインコンピュータは、探触子からのデータを用い、ＣＢＦを算出する。
ＣＢＦが測定される際は、各々の培養（同じ培養細胞）から６領域を無作為に選び、健常細胞のＣＢＦを測定した。３０秒走査によるＣＢＦ値の測定を、選定された領域の各々に行った。実験の目的のために、移植片を実験開始前にピンセットで無菌的に除去した。全ての培養の培養液を交換して、予備的ＣＢＦが測定された。これらの測定に続いて、培養液は、カプトプリル及び／またはアンギオテンシンIIを含む培養液に再び交換された。コントロール培養は、添加物なしで培養液を交換された。培養細胞はその後、ＣＢＦの測定前に、５−１０分間培養された。
結果
気管支上皮細胞培養を用いた。１０マイクロモル／リットルのカプトプリルを前述のグループに添加した。カプトプリルの添加後１時間には、２群の間には明らかな違いがあった。カプトプリルにさらされたグループのＣＢＦは、ＣＢＦの変化を百分率で示したように、基線以下に低下した。（図２を参照）対照的に、カプトリルを投与しなかったグループはＣＢＦが上昇を示した（図２）。両グループの相違は、実験の次段階の開始まで持続した。
アンギオテンシンIIの添加後、カプトプリルを投与したグループのＣＢＦ値は増加した。（図３を参照）
結論
結果は、他の組織と同様、気管支上皮細胞は内因的にアンギオテンシンIIを生成できることを示す。
アンギオテンシン変換酵素阻害薬の添加は、活性ホルモンの内因性の生成を制限する。結果として、繊毛打数は阻害を受け、内因性アンギオテンシンIIの添加によってのみ回復する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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