(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の画像を構成する複数の画像パネルの画素の強度を各画素位置ごとに平均して、同複数の画像パネルの強度の平均ひずみマップを獲得し、
前記平均ひずみマップを、前記平均ひずみマップの平均強度によって正規化し、
前記各画像パネルを前記正規化された平均ひずみマップで割算する、
ことを含む画像のフィールドひずみを低下させる方法。
【請求項２】
前記平均ひずみマップを平滑化することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バックグランドの強度よりも大きくない画素だけを使用して前記平均ひずみマップを獲得することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
画像の画素を曲線に当てはめることによって、前記平均ひずみマップの画像のノイズを減らすことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０００年１月２７日付けで出願された米国仮特許願第６０／１７８，４７６号の特典を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は画像分析に関し、さらに詳しく述べると、単一画像のいくつものパネル間の不均一性を修正するのに画像分析を使用することに関する。
【０００３】
背景
生物医学の研究が、生物試料の逐次プロセシング（sequential processing）に基づいて、急速に進歩している。逐次プロセシングによって、とりわけ遺伝学、生化学、免疫学および酵素学を含む生物学に関する各種の分野で重要な発見がもたらされている。歴史的に見ると、逐次プロセシングを行うには２、３の生物学的に関連のある分子の試験を同時に行う必要があった。しかしこれらの最初の逐次プロセシングは極めて遅くかつ面倒であった。必要な数の試料（何万個もの）の試験は時間がかかりかつ高値であった。
【０００４】
蛍光標識化を利用して生物試料を平行処理する方法が開発されて、生物試料の逐次プロセシング法が、飛躍的に進歩した。複数の試料が、基板のスライドガラスまたは類似の部材の上のフィールドに列と行を有する、本明細書でマイクロアレイと呼称するアレイに配列される。上記スライドガラス上の試料は次に、平行して生化学的にプロセスされる。これら試料分子は、その試料分子と他の生物物質との相互作用によって蛍光で標識される。このような方法は、多数の試料のプロセシングを迅速に行うことができる。
【０００５】
画像形成のためのいくつかの用途には、高い解像度と高い内容という二つの明らかに相容れない特性が必要である。解像度の必要条件は、画像の細部が、画像である物体の情報内容の少なくとも２倍を超えなければならないということによって推進される（いわゆるナイキストの限度）。内容の必要条件は、大きな面積にわたる情報をもっていなければならないということによって推進される。このような要求を処理する一方法は、高い空間解像度の複数の個々の画像（パネル）を獲得して、これらのパネルを隣接する領域に集めて、大きな望ましい領域を包含させる方法である。次に、これら多数のパネルは、各パネルが集められた時の光学器械と試料との相対的位置に基づいて、単一の大きな画像に組み立てることができる。複数のパネルを、単一のモンタージュに組み立てるとき、いくつものステップを経て、各パネル内の強度の不均一性を修正する[本明細書では平坦フィールド校正およびパネルの平坦化（flat-field calibration and Panel Flattening）として知られている]ことができ、かつパネル内のパネル強度の不均一性を修正できる。
【０００６】
本発明のこれらのおよびその外の特徴は、以下の詳細な説明を読んで添付図面を参照すれば一層明らかになるであろう。
【０００７】
詳細な説明
大きい画像をつくるため、複数の小さい画像を検出器によって集めて単一の大画像に組み立てる。検出器によって集められた複数の小画像は各々、光学器械と検出器の不均一な応答の組合せによって影響を受けている。光学器械の場合、照明の口径食および集光の口径食が検出器によって集められた画像に、顕著な強度のひずみ（intensity curvature）をもたらす。検出器の不均一な応答は、検出器のすべての素子間でゲインとオフセットが異なるという形態で起こる。
【０００８】
これらの誤差を修正するため、暗電流（露出なし）からフルウェル近く（near full-well）までの範囲内の一連の画像を獲得する。検出器の各画素の線形回帰分析を行うと、傾斜（ゲイン）とインターセプト（オフセット）が生じる。すなわち、各画素について、下記式をｍとｂについて解く。
【数３】
測定された＿画像＝所望の＿画像＊ｍ＋ｂ
次に、平坦フィールド校正が下記計算によって（やはり各画素について）達成される。
【数４】
所望の＿画像＝（測定された＿画像−オフセット＿マップ）／ゲイン＿マップ
上記式中、ｍは「ゲイン＿マップ」で置き換えられ、かつｂは「オフセット＿マップ」で置き換えられている。
【０００９】
ゲインマップとオフセットマップは、照明光学器械、集光光学器械および検出器の不均一性を同時に修正する。
【００１０】
画像フィールドのひずみとオフセットの問題を修正する平坦フィールド校正マップは、画像にノイズを付け加えるという犠牲をはらって修正を行う。両方のマップは、測定ノイズを含有しており、次にそのノイズは校正された画像に送られる。ゲインマップは、ほとんどが光子のカウンティングノイズであるノイズ（ショットノイズ）を含んでおり、一方、オフセットマップはＣＣＤカメラの電子読取りノイズによって支配されている。
【００１１】
オフセットマップノイズを修正するため、平均暗電流マップ（露出なし）を線形回帰分析の結果の代わりに利用できる。すなわち、平坦フィールド画像に使用されるオフセット＿マップは、線形回帰分析によって計算されるインターセプトよりむしろ、多くの暗電流画像の平均である。前記インターセプトは本来ノイジーなものであることは経験によって分かっている（そのインターセプトはカメラレンジの低い信号／ノイズの部分で測定される）。計算されたオフセットマップを使用すると、ベースラインのノイズが増大することによって測定装置の感度が低下する。図１と図２に示すオフセットマップは平均暗電流である。計算されたインターセプトは、平均暗電流のノイズの約２倍である。
【００１２】
各測定を行うのに用いる複数のフレームを平均すると、データのＳ／Ｎ比が改善されて、得られるゲインマップとオフセットマップのノイズを減らす（計算されたオフセットマップがフラットフィールディングのために用いられる場合）。
【００１３】
もう一つの方法は、ゲインマップを低域フィルターで平滑にする方法である。
【００１４】
完全に均一なフラットフィールド校正スライドガラスを組み立てることはほとんど不可能である。不均一な蛍光は、非常に注意深く調製したスライドガラスでもよくあることである。しかし、校正スライドガラスをカメラ露出中に移動させると、そのスライドガラスの不均一な蛍光応答を均分する。フラットフィールド校正マップは、かなり品質が低い校正スライドガラスから得ることができる。
【００１５】
図１と図２は、均一な蛍光校正スライドで製造したフラットフィールド校正マップを示す。ゲインマップ１０５、２０５は約０．３％のノイズを含有し、一方、オフセットマップ１１０、２１０は１.２４カウントを提供する（ゲイン修正は乗法的であり、オフセットは加法的である）。
【００１６】
フラットフィールド校正は有効な方法であるが、この方法はノイズを導入する。フラットフィールド校正マップのクリーニングを行うと、画像の質が大きく改善される。特に、オフセットマップのノイズをさらに減らすと低末端の感度（low-end sensitivity）が改善される。マップを集めるために使用したＣＣＤカメラのリードノイズ（read-noise）は約１.７７カウントのリードノイズを有している。オフセットマップノイズを（直角位相で）加えると、約２.２カウントのベースラインノイズが生じ、これは２４％の増加である。
【００１７】
もう一つの問題点は、パネルの強度のひずみが眼に見えるアーチファクトを生じることである。図３はひずみを全く修正していない画像３００を例示している。照明の口径食と集光の口径食の組合せが、より高い明るさまたは集光効率それぞれを視野の中心にもたらす。フラットフィールディング法をパネルに適用した場合でも、各種の因子が残留ひずみの原因になっている。例えばランプの揺らぎ、カメラバイアスの不安定性が、獲得された画像の一般的な強度レベルを変化させて、
【数５】
フラット＿画像＝（獲得された＿画像−オフセット＿マップ）／ゲイン＿マップ
という標準のフラットフィールディング計算に影響する。オフセットマップの小さな誤差は、ゲインマップ（通常湾曲している）に、フィールドひずみを導入させる。獲得された画像に存在するひずみが大きければ大きいほど、残留ひずみが存在している可能性が大きい。
【００１８】
強度のひずみは一般に一つのパネルから次のパネルへと一貫して存在しているので、各パネルの強度プロフィールを平均すると、平均ひずみマップが得られる。各パネルをひずみマップで割り算することが、すべてのパネルに一貫して存在している強度ひずみを平坦にする一方法である。ひずみマップを、ひずみマップの平均強度または類似の値で正規化すると、画像の正味の強度スケールを変えることなしに計算することができる。
【００１９】
各パネルの強度プロフィールを平均する方法の一例は、各パネル内の各画素について下記の処置を実施する方法である。第一に、現行パネルの画素が画像信号でない場合（言い換えれば、画素の強度を表す信号である場合）、下記式を適用する。
【数６】
アキュムレータ＿マップ＝アキュムレータ＿マップ＋画素＿強度
【数７】
アキュムレーション＿カウンター＿マップ＝アキュムレーション＿カウンター＿マップ＋１
第二に、アキュムレータ＿マップ内のすべての画素について、下記の方法を使用してひずみマップを計算する。
カウンター＿マップがゼロより大きい場合、
【数８】
ひずみ＿マップ＝アキュムレータ＿マップ／アキュムレーション＿カウンター＿マップ
その外の場合、
【数９】
ひずみ＿マップ＝隣接するひずみ値の平均値
これによって、ひずみ平坦化マップ（curvature flattening map）がつくられ、そのマップは
【数１０】
ひずみ＿フラットナー（flattener）＝１／ひずみ＿マップ
と定義される。
【００２０】
上記処置はいくつもの方式で改善することができる。第一に、ひずみマップを平滑化して、平均ひずみ画像のノイズとスプリアス信号に対する感度を低下させることができる。第二に、バックグランドの強度よりそれほど大きくない各パネルからの画素だけを平均する。各パネルのヒストグラムを利用して、バックグランド領域（所望の）を画像信号（望ましくない）から区別する。すべてのパネルがひずみマップの各画素に情報を提供するわけではないので、ひずみマップの各点に加えられた画素の数のマップが、前記平均値を計算するために必要である。情報を全く含んでいない画素は、隣の画素の平均値から合成することができる。第三に、ひずみマップは、比較的低い強度値を強調する重みづけ法を利用して曲線当てはめを行うことができる。曲線当てはめはノイズを減らすのに有用である。曲線当てはめの目的は、バックグランドのひずみだけを測定して画像信号の影響を減らすことである。その外の改善としては、小パネルのロットを平均すると、画像信号の汚染（image signal corruption）と所望の画像領域の過剰走査（over-scanning）を減らして、平均を行うパネルおよびバックグランドの強度のゆがみだけを含むパネルをより多く提供する。
【００２１】
複数の小さい画像を組み合わせて一つの大きい画像をつくる場合の別の問題点は、隣接するパネル間の小さな不連続点が目視可能になることである。１〜２カウントのランダムノイズの存在下においてさえも重要な情報が非常に強力である場合には、１〜２カウントの強度の差は人の眼によって容易に検知できる。残っている不連続点は目視可能な縫目上のアーチファクトをつくる。不連続点の例を図３の画像３００に示す。
【００２２】
この問題点を修正するため、パネル端縁の接続法を実施する。この方法では、各パネルの境界（border）を、左、右、頂部および底部のすべての隣りと比較する。この比較によって、各パネルの全境界線（boundary）に対し、境界強度のスケーリング値（scaling value）が生成する。次にその境界線は、結果が現行パネルと隣接パネルの境界線の間の中間になるように度合いを合わせる（scaled）ことができる。次に前記強度は、隣接境界の強度間の中間点で接続される。境界線のスケーリングは前記四つの境界線からの距離に基づいて、パネルの各画素に適用される。スケーリング因子の重みづけ組合せ法を利用して、連続強度のランプ（ramp）を一つの境界線から次の境界線へ適用する（画像の中央におけるスケーリング因子は左、右、頂部および底部のスケーリング因子の平均値でなければならない）。重みづけ法のいくつかの例としては逆２乗重みづけ法（inverse square weighting）と逆重みづけ法がある。これらの方法は下記式を利用して実施できる。
【００２３】
逆２乗重みづけ法：
【数１１】
左＿重み＝１／（ｉ＋１）＾２
右＿重み＝１／（ｎｘ−ｉ＋１）＾２
底部＿重み＝１／（ｊ＋１）＾２
頂部＿重み＝１／（ｎｙ−ｊ＋１）＾２
【００２４】
逆重みづけ法：
【数１２】
左＿重み＝１／（ｉ＋１）
右＿重み＝１／（ｎｘ−ｉ＋１）
底部＿重み＝１／（ｊ＋１）
頂部＿重み＝１／（ｎｙ−ｊ＋１）
全＿重み＝左＿重み＋右＿重み＋頂部＿重み＋底部＿重み
【００２５】
スケーリング因子：
【数１３】
左＿スケール（ｊ）＝１／２＊[左＿境界（ｊ）＋左＿パネル（ｊ）の＿右＿境界]／左＿境界（ｊ）
右＿スケール（ｊ）＝１／２＊[右＿境界（ｊ）＋右＿パネル（ｊ）の＿左＿境界（ｊ）]／右＿境界（ｊ）
頂部＿スケール（ｉ）＝１／２＊[頂部＿境界（ｉ）＋頂部＿パネル（ｉ）の＿底部＿境界]／頂部＿境界（ｉ）
底部＿スケール（ｉ）＝１／２＊[底部＿境界（ｉ）＋底部＿パネル（ｉ）の＿頂部＿境界]／底部＿境界（ｉ）
画素（ｉ、ｊ）の強度スケーリング因子＝[左＿スケール（ｊ）＊左＿重み＋右＿スケール（ｊ）＊右＿重み＋底部＿スケール（ｉ）＊底部＿重み＋頂部＿スケール（ｉ）＊頂部＿重み]／全＿重み
【００２６】
諸定義：
ｎｘ  画素の列の数
ｎｙ  画素の行の数
ｉ    列の番号（ゼロベース）
ｊ    行の番号（ゼロベース）
【００２７】
接続とひずみの平坦化はともに、かなりのバックグラウンド強度を有するパネルにとって重要である。ひずみが平坦化されている画像を図３に示してある。さらなる改善法は、境界線のスケーリング値の中央値フィルタリングを行って、外れ値に対する感度を低下させる方法である。パネルの配列を誤まると、スケーリング因子の計算間違いを起こす。計算まちがいは、明るい（または暗い）スポットが隣接パネルの境界にそってオーバーラップしないときにかなり起こる。その上に、中央値をフィルタされた境界線スケーリング値を平滑化する方法を使って、配列の問題で起こったスパイクを除くことができる。最終的に、境界線スケーリング値の曲線当てはめを行って、一般的な傾向を見つけて、ノイズと配列の誤りを避けることができる。
【００２８】
本発明の多くの変型と改良は、当業技術者には容易に明らかになるであろう。したがって、本発明は、その精神と不可欠の特徴から逸脱することなく、他の特別な形態で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施態様による全体のひずみマップとオフセットマップを示すフラットフィールド校正マップである。
【図２】  図１の逆のゲインマップとオフセットマップの２０×２０領域の近接図である。
【図３】  本発明の一実施態様による、ひずみ平坦化を適用する前と適用した後の画像を示す。
【図１】
0004278901.tif 000002
【図２】
0004278901.tif 000003
【図３】
0004278901.tif 000004