(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｆ）を包含することを特徴とするトロンビンの製造方法。
（ａ）血漿中の全血漿タンパク質に対して行なう沈殿工程であって、０℃〜４℃の温度において塩析効果及び７．５〜８．５へのｐＨ調整効果を果たすのに充分な量の第１塩類を血漿に加えるか、又は温度が４℃〜２０℃でｐＨが４．５〜５．５の条件下において酸性沈殿物を得るのに充分な量の第２塩類を血漿に加え、その際該工程を５０ｍＭ以上のアミノ−６−ヘキサン酸の存在下で行って、フィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンを選択的に沈殿させ、プロトロンビンを含む上清を回収する工程；
（ｂ）該上清を、１００ mOsmole/kg以下の浸透圧を示すプロトロンビン溶液となるまで透析濾過する工程；
（ｃ）該プロトロンビン溶液の容量の４倍の容量の水を該プロトロンビン溶液に加えることで該プロトロンビン溶液を希釈する工程；
（ｄ）該プロトロンビン溶液に、プロトロンビン溶液のｐＨが５．２になるまで酸性溶液を加えてプロトロンビンを沈殿化する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で生じた沈澱物を、ｐＨが中性付近の溶液中に可溶化して溶解する工程；及び
（ｆ）工程（ｅ）で得た溶液に、該溶液の４倍の容量の４０ｍＭ 塩化カルシウム溶液を添加し、該溶液中のプロトロンビンを２０〜３２ｍＭの塩化カルシウムの存在下でトロンビンに変換する工程。
【請求項２】
更に、以下の工程（ｇ）〜（ｉ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
（ｇ）溶媒／界面活性剤溶液を殺ウイルス剤として用い、脂質含有ウイルスを不活化するのに充分な量の溶媒／界面活性剤溶液と該トロンビンとをインキュベートする工程；
（ｈ）イオン交換クロマトグラフィーを逐次用いてインキュベートしたトロンビンを精製する工程であって、スルホアルキル−活性化ポリアガロース、スルホアルキル−活性化ポリデキストラン、及びスルホアルキル−活性化デキストランとシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体からなる群より選ばれる、トロンビンに対して高い選択性を示す１つのスルホアルキル−活性化ポリサッカリド−陽イオン交換体を用い、溶出剤としては、少なくとも３種類の、塩濃度を増加した塩水溶液を用いる；及び
（ｉ）工程（ｈ）のクロマトグラフィーによって得た溶出液のトロンビン溶出ピーク部分を回収し、該溶出液に含まれる塩類を、回収したトロンビンを安定化するための生理的に許容可能な安定化処方緩衝液に交換し、該トロンビンを含有する処方緩衝液を回収する工程。
【請求項３】
工程（ｂ）で透析濾過を行なう際に、該上清の容量の４倍に相当する量の水を交換することを包含する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
該陽イオン交換体が、スルホアルキル−活性化デキストランとシリカ粒子からなる非圧縮性の複合担体であることを特徴とする、請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
該陽イオン交換体が、スルホプロピル−活性化デキストランとシリカ粒子からなる非圧縮性の複合担体であることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
更に、以下の工程（ｊ）を包含することを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の製造方法。
（ｊ）トロンビンを含有する安定化処方緩衝液を、該安定化処方緩衝液中に存在するウイルス粒子を除去するために銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜で濾過し、そしてウイルス粒子を含まないトロンビン含有処方緩衝液を回収する工程。
【請求項７】
該銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜の孔径が１５ｎｍであることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
更に、以下の工程（ｋ）及び（ｌ）を包含することを特徴とする、請求項６又は７に記載の製造方法。
（ｋ）工程（ｊ）で得たトロンビン含有処方緩衝液を凍結乾燥する工程；及び、
（ｌ）凍結乾燥したトロンビン含有処方緩衝液の乾熱処理を行い、トロンビンを変性させることなく残留ウイルス粒子を不活化する工程。
【請求項９】
請求項２〜５のいずれかに記載の製造方法であって、更に最終工程として、トロンビン含有処方緩衝液を凍結乾燥し、凍結乾燥したトロンビン含有処方緩衝液を熱処理に付して、ウイルス粒子を含まず、且つ、変性していないトロンビンを回収する工程を包含する製造方法。
【請求項１０】
凍結乾燥製品を１００℃で１〜２時間加熱することによって該乾熱工程を行なうことを特徴とする、請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該処方緩衝液が、熱処理による活性の低下からトロンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び血漿アルブミンを含有する、ｐＨ７．３の水溶液であることを特徴とする、請求項２〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該処方緩衝液が、０．２５ｗ／ｖ％のクエン酸ナトリウムと、０．４５ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムと、０．２５ｗ／ｖ％のＴｒｉｓ−ＨＣｌと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の２０倍に相当する量であり、凍結乾燥前のトロンビン溶液において２ｗ／ｖ％となる量の血漿アルブミンとを含有する、ｐＨ７．３の水溶液であることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
該少なくとも３種類の、塩濃度を増加した塩水溶液は、０．０８Ｍ、０．１５Ｍ及び０．４ＭのＮａＣｌをそれぞれ含むヒト トロンビン用緩衝液であることを特徴とする、請求項２〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
インキュベーションを行う工程（ｇ）において、クエン酸ナトリウムを含まない溶媒／界面活性剤溶液を殺ウイルス剤として用いることを特徴とする、請求項２〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、血液凝固タンパク質の濃縮物、主にフィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンからなる第１成分と、第１成分と同じヒト血漿プールに由来するトロンビン濃縮物からなる第２成分とを含有し、ウイルス汚染に対する安全性の高い生体組織接着剤を製造するための方法に関する。より詳細には、上記製造方法は３つのウイルス不活化工程、即ち、溶媒／界面活性剤処理、ナノフィルトレーション（nanofiltration）及び熱処理の工程を包含する。
【０００２】
従来技術
生体組織接着剤は、カルシウムイオンの存在下でトロンビンとXIII因子によって活性化されたフィブリノーゲンより生成される、フィブリンからなる接着性タンパク質の濃縮物である。重合したフィブリンのネットワークによる血餅の接着力は昔から知られている。フィブリンは今世紀の初めから接着剤として使用されており、Bergelによって１９０９年に発見された（Bergel, Uber Wirkungen des Fibrins (Dtschr. Med-Wochenschr 1909; 3: 633-665)参照）。Bergelは、フィブリンが生理学的接着性物質であることに気づき、更にフィブリンには治癒を促す特性があることを見出した。この発見にひき続き、１９１５年におけるGreyの研究では、脳や肝臓の出血を止めるためや脳外科手術にフィブリンタンポンを用いた（Grey, Fibrin as a hemostatic in cerebral surgery (Surg. Gynecol. Obstet. 1915; 21: 452)参照）。しかしながら、まずCronkite（Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting (JAMA 1944; 124: 976-978)参照）が、続いてR.T. TidrickとE.D. Warner（Fibrin fixation of skin transplants (Surgery 1944; 15: 90-95)参照）が、皮膚移植を確実にするためにフィブリノーゲンと共にトロンビンを用いたのは１９４４年にもなってのことである。しかし、これらのタンパク質は低濃度であったので、良好な接着性が得られず、効果も持続しなかった。１９４６年にE．J．Cohn等による血漿タンパク質類の分画に関する重要な科学的研究（E．J．Cohn et al., Preparation and properties of serum plasma proteins. A system for the separation into fractions of the proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. Chem. Soc.
1946; 68: 459-475)参照）がなされて以来、特に血液凝固タンパク質類が接着剤として使用されるようになり、上記研究の数年後には血液凝固のメカニズム及び主要な血液凝固タンパク質類、特にXIII因子が解明された。１９７５年には、Matrasが、初めて高度に濃縮されたフィブリノーゲンを用いて、フィブリンの接着特性の利用に成功した（Matras, Topographical anatomy of the total osteotomy of the midface (J. Maxillofac Surg. 1975; 3 (4): 260-262)参照）。以来、生体組織接着剤は完全に合成のりに取って代わり、ヒトの臨床分野においてますます多用されている。
【０００３】
生体組織接着剤は、外科手術や縫合に新しいアプローチを提供する。外科医は長い間、縫合糸に加えて用いるかあるいは縫合糸に代えて用いることのできる効果的で使いやすく、とりわけ容易に生体が許容する接着剤を捜し求めてきた。外科用縫合糸は現在重要である。しかしながら、生体による拒絶又は毒性などの多くの問題が発生している。血液は凝固特性が優れるので、常に外科医にとって生体組織接着剤の理想的なモデルとなってきたが、ヒト由来の材料から調製された生体組織接着剤の使用はウイルス感染の問題を引き起こす。ウイルス感染の危険性は、血漿濃縮物の精製方法に大きく依存している。ヒトの臨床に使用するためには、生体組織接着剤は、製品の品質に影響することなく過酷なウイルス不活化処理をして調製されなければならない。以下の特性を併せ持つ接着剤の開発研究は未だ継続中である。
−ウイルス汚染に対する高度な安全性
−十分な接着性
−良好な弾力性
−隣接組織との良好な親和性
−無毒性
−代謝されずに機能すること
−生体による許容度が良好であること
【０００４】
米国特許第５,２９０,９１８号及び第５,３９５,９２３号（権利者：Haemacure Biotech Corp.）には、フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの濃縮物を治療目的で調製及び利用するための方法が開示されている。
【０００５】
その優れた凝固性によって、フィブリノーゲンとXIII因子を多量に含有する濃縮物は、臨床医にとって、止血特性が非常に必要とされる外科手術のための貴重で効果的な道具となっている。臨床応用の分野としては、神経外科、心臓血管外科、形成外科（皮膚移植）、ＯＲＬ（耳鼻咽喉）外科、口腔病学、整形外科、一般外科及び外傷外科が挙げられる。
【０００６】
この濃縮物に含まれる主要なタンパク質はフィブリノーゲンであり、フィブリノーゲンは、トロンビンとカルシウムイオンの存在下で起きる酵素反応によって、フィブリンモノマーを形成させるフィブリノペプチドＡ及びＢを生成する。これらのモノマーは急速に重合し可溶性フィブリンとなる。その後、カルシウムイオンの作用により、フィブリン安定化因子（XIII因子）が溶解したフィブリンと共有結合を形成してフィブリンを安定化し、酸性溶媒中又は尿素の存在下でも不溶となる。
【０００７】
こうして形成されたフィブリンはフィブリノーゲンに戻ることはなく（非可逆的で）安定であり、血液凝固薬としての役割を十分に発揮する。フィブリンは、プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンが高濃度で集合しているために、線溶に対して耐性を示し、浸出が起きないので形態を維持する。この濃縮物は、以下の特性を有している：水溶液に再び溶解後の良好な安定性、室温において数分で溶解する性質、良好な弾力性、そして良好な接着性である。
【０００８】
こうした特性は血漿からの調製方法のみに依存する。この調製方法は簡単で迅速な方法であり、工業的生産に容易に適応可能である。生物学的、生化学的濃縮物は全て保存され、それらの製品は臨床的要求を満たす。
【０００９】
血液由来の製品のためのウイルス学的試験方法があるにもかかわらず、血液由来の製品には常にウイルス感染の問題がつきまとう。血液由来の安全な製品を提供するもっとも確実な方法は、適当な技術を用いて、血漿製品の生化学的特性を損ねることなく、存在する恐れのあるウイルスを周到なやり方で不活化することである。ウイルスの性質や単離するタンパク質のタイプに応じてウイルスを不活化する多くの方法が現在知られており、それはこの点に関する科学的刊行物の量の増大にも反映されている。
【００１０】
最も広く用いられている血漿製品は、アルブミン、免疫グロブリン類及び血液凝固因子類の濃縮物である。１９４８年にGellis等は、初めて、アルブミン調製物を６０℃で１０時間加熱処理することによってウイルスを不活化する方法を用いた（Gellis et al., Chemical, clinical and immunological studies on products of human plasma fractionation: inactivation of virus of homologous serum albumin by means of heat (J. Clin. Invest. 1948; 27: 239-244)参照）。それ以来、ウイルス感染の危険性を減少させることに関する効力が立証されているためにこの方法が一般に用いられている。同様の方法が免疫グロブリンＧ類（ＩｇＧ）の調製にも適用されており、同様の効果を示している。得られる効果は、これらの血液製品の精製方法に依存しており、特にCohn（Preparation and properties of serum plasma proteins. A system for the separation into fractions of the proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475)参照）、又はKistlerとNitschmann（Large scale production of human plasma fractions (Vox Sanguinis 1962; 7: 414-424)参照）の発表した完全な分画方法の使用に依存している。
【００１１】
アルブミンやＩｇＧ類の多くの分画工程におけるのエタノールの使用は、ウイルス量を異なる画分に配分させる。エタノールは、Henin等（Inactivation and partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann fractionation of human blood plasma (Vox Sanguinis 1988; 54: 78-83)参照）及びMorgenthaler（Effect of ethanol on virus. virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel Karger 1989; 56: 109-121)参照）が記載しているように、ウイルスなどの病原体に対する殺菌剤として知られている。
【００１２】
アルブミンやＩｇＧ類の低温殺菌方法は１９５０年代の初めに出現した。しかしながら、この技術は、肝炎ウイルス（Ｂ型及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス）を不活化するための方法であった。Curran等は、輸血、又は他の血液由来物質、特に血液凝固因子類の使用によるＨＩＶタイプのウイルス感染に関する問題を提示した（Curran et al., Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) associated with transfusion (N. Engl. J. Med. 1984; 310: 69-75)参照）。それ以来、ウイルスの不活化方法はＨＩＶに焦点が当てられてた。アルブミンやＩｇＧ類の使用においてＨＩＶの感染は認められず、これは、低温殺菌の結果であるとされている（Mitra et al., Elimination of infectious retroviruses during preparation of immunoglobulins (Transfusion 1986; 26: 394-397)参照）。VIII因子やIX因子などの血液凝固因子類は血友病患者に広く用いられている。Heimburger等は、VIII因子を調製する際に、ウイルスを不活化するために、アルブミンに用いられているのと同じ低温殺菌法を適用し、グリシンとショ糖の存在下で殺菌することによって、６０℃で１０時間の熱変性条件下におけるタンパク質の変性を防止した（Heimburger et al., (a) Faktor VIII - Konzentrat-hepatitissicher: Fortschritte in der Behandlung der Hamophilie A (Die gelben Hefte 1980; 20: 165-174) 及び (b) A Factor VIII concentrate, high purified and heated in solution (1st International Hemophilia Conference, Bonn. October 3-7, 1980, abstr. 110 and 117)参照）。彼らの研究は、ＨＩＶやＢ型及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの不活化に効力を発揮することを記載している。Hilfenhaus等は、VIII因子濃縮物の調製において低温殺菌法がＨＩＶのようなウイルスを不活化するのに効率的な方法であることを確認した（Hilfenhaus et al., (a) Safety of human blood products: Inactivation of retroviruses by heat treatment at 60°C (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985; 178: 580-584)、(b) Inactivation of the AIDS-causing retrovirus and other human viruses in antihemophilic plasma protein preparations by pasteurization (Vox Sanguinis 1986; 50: 208-211) 及び (c) Pasteurization as an efficient method to inactivate blood borne viruses in F. VIII concentrates (Drug Res. 1986; 22: 621-625)参照）。Tabor等は、安定化剤としてのクエン酸の存在下でアンチトロンビンIIIを加熱処理することによってＢ型肝炎ウイルスを不活化した（Tabor et al., Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilized with citrates (Thromb. Res. 1982; 22: 233-238)参照）。Hollinger等は、ＨＩＶや肝炎ウイルスの感染の危険性を減少させるためにVIII因子濃縮物を、凍結乾燥した状態で加熱した（Hollinger et al., Reduction in risk of hepatitis transmission by heat treatment of a human factor VIII concentrate (J. Infect. Dis. 1984; 150: 250-262)参照）。Piszkiewicz等は、凍結乾燥した血液凝固因子類の濃縮物の加熱処理は、これらの因子類の活性に重大な影響は与えないことを記載している（Piszkiewicz et al., (a) Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized anti-inhibitor coagulant complex (Autoplex) (Thromb. Res. 1986; 44: 701-707) 及び (b) Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized factor VIII and factor IX concentrates (Thromb. Res. 1987; 47: 235-241)参照）。上記の著者等は、加熱処理による新生抗原の産生がみられなかったことを強調した。加熱処理によるウイルスの不活化に関する研究は、Piszkiewicz等によって“抗血友病因子類”（Hemofil T及びHemofil CT（Hemofilは登録商標））の調製、及び抗凝血物質インヒビター複合体類（Autoplex T（Autoplexは登録商標））やIX因子複合体（Proplex SX-T及びProplex T（Proplexは登録商標））の調製について行われ、抗血友病因子類の調製については、６０℃で７２時間加熱し、抗凝血物質インヒビター複合体類やIX因子複合体の調製については６０℃で１４４時間加熱した（Piszkiewicz et al., Virus inactivation by heat treatment of lyophilized coagulation factor concentrates. Virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger 1989; 56: 44-54)参照）。上記５つの熱処理された血液凝固因子製品の使用によるＨＩＶセロコンバージョンに関する報告はなされていない。サルの研究においては、ＨＢｓＡｇや抗ＨＢｃについてスクリーニングされた血漿由来のHemofil T濃縮物は、ＮＡＮＢＨに感染していないことが認められている。しかしながら、ＨＢｓＡｇについてのみスクリーニングされた血漿由来の同じ製品の使用は、患者にＮＡＮＢＨをもたらした（Colombo et al., Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985; ii: 1-4)参照）。Hemofil Tは、ＨＢｓＡｇに反応せず、正常ＡＬＴレベルにある血漿から一般に大量生産されている。
【００１３】
ウイルスと同様にタンパク質も、乾燥状態（即ち凍結乾燥された状態）の方が安定でより高い耐熱性を示す。タンパク質の変性を最小にするための温度や加熱時間は、タンパク質の性質によって異なる。しかしながら、完全なウイルスの不活化に関する報告は未だ存在しない。ＮＡＮＢＨ感染についてはColombo等（Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985; ii: 1-4)参照）によって報告され、ＨＩＶ感染についてはWhite等（HTLV-III seroconversion associated with heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 611-612)参照）及びVan den Berg等（Seroconversion to HTLV-III in hemophiliac given heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 803-803)参照）によって報告されている。こうした理由により、Winkelman等は、VIII因子（８Ｙ型）、IX因子（９Ａ型）、VII因子、XI因子及びトロンビンからなる濃縮物を８０℃で７２時間加熱した（A new therapeutic factor VIII concentrate of high specific activity and high yield (Thromb. Haemost. 1985; 54: 19-22)参照）。これらの熱処理された製品を施された２９人の患者について行われた研究においてＨＩＶやＨＢのセロコンバージョンが認められず、ＮＡＮＢＨ感染の発生の有意な減少が認められたことを示している。
【００１４】
光源（ＵＶ、γ線及びレーザー）で血漿中の感染病体を照射してウイルスを不活化するための方法が開発されており、以下の参考文献を引用することができる。Oliphant et al., Homologous serum jaundice: experimental inactivation of etiologic agent in serum by ultraviolet irradiation (Publ. Health Rep 1946; 61: 598-600). Wolf et al., Ultraviolet irradiation of human plasma to control homologous serum jaundice (JAMA 1947; 135: 476-477). Blanchard et al., Methods of protection against homologous serum hepatitis. II. The inactivation of hepatitis virus serum with ultraviolet rays (JAMA 1948; 138: 341). Murray et al., Effect of ultraviolet radiation on the infectivity of icterogenic plasma (JAMA 1955; 157: 8-14). Gurzadyan et al., Mechanism of high power picosecond laser UV irradiation of viruses and bacterial plasmids (Photochem. Photobiol. 1981; 3: 835-838). Redfield et al., Psoralen inactivation of influenza and herpes simplex virus and of viral infected cells (Infect Immun 1981; 32: 1216-1226). Heindrich et al., Clinical evaluation of the hepatitis safety of beta-propiolactone-ultraviolet treated factor IX concentrate (PPBS) (Throm. Res. 1982; 28: 75). Kitchen et al., Effect of gamma irradiation of the human immunodeficiency virus and human coagulation proteins (Vox Sang. 1989; 56: 233-229）.
【００１５】
１０年以上もの間、血液由来の製品中のウイルスを不活化するために最も一般的に用いられている方法の１つは、溶媒と界面活性剤を組み合わせて使用する方法である。この方法は、NeurathとHorowitzによって開発された（１９８５年９月に発行された米国特許第４,５４０,５７３号、１９８８年８月に発行された米国特許第４,６１３,５０１号及び第４,７６４,３６９号、１９８９年４月に発行された米国特許第４,８２０,８０５号、１９８９年６月に発行された米国特許第４,８４１,０２３号、及び１９９６年７月に発行された米国特許第５,５４１,２９４号参照）。溶媒／界面活性剤（トリ−ｎ−ブチルフォスフェート／界面活性剤）混合物は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＢＶ及びＥＢＶなどのエンベロープをもつウイルスを概して不活化する。
【００１６】
しかしながら、溶媒／界面活性剤に非感受性のウイルス、即ち、エンベロープをもたないパルボウイルスやポリオウイルスが存在することから、溶媒／界面活性剤法は安全な血漿製品類を提供するには十分ではない。溶媒／界面活性剤の効果がない、エンベロープをもたないウイルスを除去するために別の技術が最近導入されてきている。その技術はナノフィルトレーションである。ナノフィルターは、微孔性ファイバーで構成され、“Planova BMM”という商品名（日本国、東京、旭化成工業社製）で販売されている。このフィルターの孔径は約１５〜３５ｎｍと様々である。これらのフィルターは約２５ｎｍよりも大きなサイズを有する特定のタイプのウイルスを保持することができる。こららのフィルターは、ＨＩＶ−１（８０〜１００ｎｍ）、ＨＢＢ（４２ｎｍ）、ＨＣＶ（＜８０ｎｍ）、デルタ型肝炎ウイルス（３５ｎｍ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（６０〜７０ｎｍ）、シンドビスウイルス（６０〜７０ｎｍ）、３型レオウイルス（６０〜８０ｎｍ）、セイビン１型ポリオウイルス（２５〜３０ｎｍ）、及びヒトパルボウイルス（２０〜２５ｎｍ）などのウイルスの除去に有効である。参考文献： Sekiguchi et al., Possibility of hepatite B virus (HBV) removal from human plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane 1989; 14: 253-261); Hamamoto et al., A novel method for removal of human immunodeficiency virus: filtration with porous polymeric membranes (Vox Sang. 1989; 56: 230-236); Tsurumi et al., Structure of cuprammonium regenerated cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for virus removal (Polym. J. 1990; 22: 751-758); Ishikawa et al., Novel determination method of size of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (BMM) (Membrane 1991; 16: 101-111); Tomokiyo et al., Studies on virus elimination and inactivation effect of highly purified F-VIII concentrate (The clinical report 1991; 25: 271-275); Manabe, Virus removal and inactivation in process validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects) (Murakami, H., Shirahata, S. 及び Tachibana, H. 編集, 1992; 15-30); Burnouf-Radosewich et al., Nanofiltration, a new specific virus elimination method applied to high-purity factor IX and factor VI concentrates (Vox Sanguinis 1994; 67 (2): 132-138））．
【００１７】
Rubinstein等は、VIII因子濃縮物を溶媒／界面活性剤で処理し、最終製品を１００℃で３０分間加熱するというVIII因子濃縮物の２段階ウイルス不活化法を用いた（Rubinstein et al., Combined solvent-detergent and 100°C (boiling) sterilizing dry-heat treatment of Factor VIII concentrates to assure sterility (Vox Sanguinis 1991; 60: 60)参照）。この著者等によると、最終製品の熱処理は、脂質エンベロープをもたない非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを不活化させる。最終製品の熱処理は、操作中又は装置による偶発的なウイルス汚染に対する予防処置でもある（Vox Sang. 1991; 60：60）。
【００１８】
近年、Proba等（米国特許第５,５０６,１２７号参照）はトロンビンの調製に３段階ウイルス不活化法を導入した：（１）溶媒／界面活性剤処理、（２）ナノフィルトレーション、及び（３）凍結乾燥製品の１００℃、１時間の熱処理（米国特許第５,５０６,１２７号（権利者：Haemacure Biotech Inc.））。
【００１９】
３段階ウイルス不活化処理は、血液由来製品、特に、血液凝固因子類又は生体組織接着剤の使用における安全性を増大させている。
【００２０】
上述した以外の血液凝固因子類、例えばフィブリノーゲンの濃縮物の調製に用いるための３工程からなるウイルス不活化方法については誰も開示していない。又、ウイルス不活化工程を用いることは、血液由来製品の生産工程に更に多くの工程を追加することによって有用な製品の収率の減少を生じさせることも意味している。依然として、ウイルス汚染に対する安全性や製品の品質を犠牲にすることなく血液由来製品の収率を向上させたり、製品の収率や性質を犠牲にすることなく製品の安全性を向上させる余地がある。
【００２１】
発明の概要
本発明によると、高収率、高品質でウイルス汚染に対する安全性の高い生体組織接着剤成分の調製方法が提供される。
【００２２】
本発明の目的は、実質的にウイルス活性を有さない、トロンビンによって凝固可能なタンパク質濃縮物の調製方法であって、タンパク質濃縮物が含むタンパク質成分は実質的にフィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンからなり、以下の工程（ａ）〜（ｌ）を包含することを特徴とする調製方法を提供することである。
（ａ）血漿中の全血漿タンパク質に対して行なう沈殿工程であって、約０℃〜４℃の温度において塩析効果及び約７．５〜８．５へのｐＨ調整効果を果たすのに充分な量の塩類を血漿に加えるか、又は温度が約４℃〜２０℃でｐＨが約４．５〜５．５の条件下において酸性沈殿物を得るのに充分な量の塩類を血漿に加え、その際該工程を５０ｍＭ以上のアミノ−６−ヘキサン酸の存在下で行って、フィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンを選択的に沈殿させる；
（ｂ）沈殿せしめたタンパク質類を、１ｇのタンパク質類に対して約０．２〜０．３ｇのＬ−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解し該タンパク質類を含む溶液を得る工程；
（ｃ）殺ウイルス剤となる溶媒／界面活性剤溶液を用いて、工程（ｂ）で得られた溶液中のウイルスを不活化する工程；
（ｄ）孔径約３５ｎｍのフィルターを用いて濾過する際に該タンパク質類の実質的な損失がないように、該溶液の界面活性剤濃度を調整する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で得られた溶液を孔径約３５ｎｍのフィルターを用いて濾過する工程；この工程により２回目のウイルス除去工程が提供される；
（ｆ）工程（ａ）で用いたのと同じ塩類を用い、工程（ａ）と同様の温度条件及びアミノ−６−ヘキサン酸濃度において、工程（ｅ）で濾過して得た溶液から沈殿物を得る工程；
（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿物のｐＨが中性になるまで該沈殿物を洗浄する工程；
（ｈ）工程（ｇ）で洗浄した沈殿物を、該沈殿物に含まれるタンパク質１ｇに対して約０．２〜０．４ｇのＬ−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解する工程；
（ｉ）工程（ｈ）で溶解した沈殿物に含まれるタンパク質の量に対応する量のタンパク質安定化剤を、溶解した沈殿物に加えてタンパク質溶液を得る工程；
（ｊ）工程（ｉ）で得たタンパク質溶液を濾過滅菌に付して滅菌濾液を得る工程；
（ｋ）滅菌済のビンに工程（ｊ）で得た滅菌濾液を分注する工程；及び
（ｌ）工程（ｋ）で分注した滅菌濾液を凍結乾燥して凍結乾燥されたタンパク質濃縮物を得る工程。
【００２３】
３段階ウイルス不活化処理製品を提供するために、該方法は、工程（ｌ）で得られた凍結乾燥製品を、更に、約１００℃において約１〜２時間の乾熱処理に付す工程を包含する。
【００２４】
工程（ｃ）におけるウイルスの不活化は、約１０ｍｇ／ｍｌの溶解したタンパク質、１％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、及び０．３％のトリ−ｎ−ブチルフォスフェート（いずれも終濃度）からなる溶液を、約２４±１℃において、約６時間の連続攪拌に付すことによって行う。
【００２５】
ナノフィルトレーションの前に、約２％〜４％の濃度のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを使う。
【００２６】
好ましい態様において、該沈殿させるための塩類は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、リン酸一ナトリウム塩、リン酸二ナトリウム塩、リン酸一カリウム塩及びリン酸二カリウム塩からなる群より選ばれる塩類である。工程（ａ）及び（ｆ）の工程は少なくとも３０分行う。工程（ｇ）は約２℃〜２０℃で行う。
【００２７】
更に好ましい態様において、工程（ｇ）は、更に、（g.i）ｐＨが中性の純水又はｐＨを約７．３に塩基性化した純水中に洗浄した沈澱物を可溶化して溶解する工程、及び（g.ii）上記（g.i）で得た溶解した沈澱物を透析もしくは透析濾過に付す工程を包含し；工程（ｈ）においては、透析又は透析濾過した沈澱物に、タンパク質１ｇに対して終濃度が約０．２〜０．３ｇとなるようにＬ−ヒスチジン添加する。
【００２８】
透析又は透析濾過工程の前に該沈殿物を可溶化して溶解するために用いる塩基性の純水は、純水を用いて調製した０．１〜０．５％のＴｒｉｓ溶液である。
【００２９】
他の１つの態様において、工程（ｇ）における該沈澱物の洗浄には、純水を用いて調製した０．１％のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液であって、ｐＨが４．５〜５．０又は９．５０〜１０．５０である溶液を用いる。
【００３０】
タンパク質を可溶化する工程（ｂ）においては、好ましくは１％のＴｒｉｓ及び１．６％のクエン酸ナトリウムからなるｐＨ６〜７．３又はｐＨ９．５〜１０．５の溶液を用い、Ｌ−ヒスチジンを添加する前のタンパク質濃度を約２０〜２２ｍｇ／ｍｌとする。
【００３１】
タンパク質を可溶化する工程（ｈ）においては、好ましくはｐＨが６〜７．３の０．５％Ｔｒｉｓ溶液を用い、Ｌ−ヒスチジンを添加する前のタンパク質濃度を約１７〜２０ｍｇ／ｍｌとする。
【００３２】
ショ糖、アルブミン及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレートをそれぞれ添加後の濃度が約０．５ｇ／ｇタンパク質、約０．０５ｇ／ｇタンパク質、及び１７〜２０μｇ／ｍｇタンパク質となるように包含するタンパク質安定化剤を用いる。
【００３３】
本発明の方法により得られた凍結乾燥されたタンパク質濃縮物は、室温において手動による攪拌を伴う条件下において、５分以内に水に可溶化して溶解し、溶解タンパク質濃縮物を生じ、該溶解タンパク質濃縮物は、約４〜２０℃の温度において少なくとも２４時間は安定である。
【００３４】
工程（ａ）で用いた全血漿タンパク質は、ヒト由来の全血漿タンパク質または動物由来の全血漿タンパク質である。
【００３５】
本発明の他の１つの目的は、活性を有するウイルスを実質的に含まない、保存安定性に優れた治療学的品質のトロンビン組成物の大量生産を行なうための製造方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｉ）を包含することを特徴とする製造方法を提供することである。
（ａ）請求項１の方法の工程（ａ）で得られる上清を回収する工程；
（ｂ）低塩濃度溶液または塩を含まない溶液を交換しながら、該低塩濃度溶液または塩を含まない溶液に対して該上清の透析濾過を行なう工程；
（ｃ）透析濾過した上清を、約１００ mosmoles/kg以下の値を示すプロトロンビン溶液となるように希釈する工程；
（ｄ）該プロトロンビン溶液に、プロトロンビン溶液のｐＨが約５．２になるまで酸性溶液を加えてプロトロンビンを沈殿化する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で生じた沈澱物を、ｐＨが中性付近の溶液中に可溶化して溶解する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得た溶液中のプロトロンビンを、塩化カルシウムを含む希釈液を用いて、約２０〜３０ｍＭの塩化カルシウムの存在下でトロンビンに変換する工程；
（ｇ）溶媒／界面活性剤溶液を殺ウイルス剤として用い、脂質含有ウイルスを不活化するのに充分な量の溶媒／界面活性剤溶液と該トロンビンとをインキュベートする工程；
（ｈ）イオン交換クロマトグラフィーを逐次用いてインキュベートしたトロンビンを精製する工程であって、スルホアルキル−活性化ポリアガロース、スルホアルキル−活性化ポリデキストラン、及びスルホアルキル−活性化デキストリンとシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体（noncompressible composite medium）からなる群より選ばれる、トロンビンに対して高い選択性を示す１つのスルホアルキル−活性化ポリサッカリド−陽イオン交換体を用い、溶出剤としては、少なくとも３種類の、溶出剤濃度を増加した水系緩衝液を用いる；及び
（ｉ）工程（ｈ）のクロマトグラフィーによって得た溶出液のトロンビン溶出ピーク部分を回収し、該溶出液の緩衝液を、回収したトロンビンを安定化するための生理的に許容可能な安定化処方緩衝液（stabilizing formulation buffer）に交換し、該トロンビンを含有する処方緩衝液を回収する工程。
【００３６】
好ましい態様において、工程（ｂ）で行なう溶液の交換の際に、該上清の容量の約４倍の量の水溶液を用いる。
【００３７】
更に好ましい態様において、工程（ｆ）では、工程（ｅ）で溶解した沈殿物の容量の約４倍の量の４０ｍＭの塩化カルシウム溶液を希釈液として該溶解した沈殿物に添加する。
【００３８】
該陽イオン交換体が、スルホアルキル−活性化デキストリンとシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体である。
【００３９】
好ましくは、該スルホアルキル−活性化デキストリンは、スルホプロピル−活性化デキストリンとシリカ粒子からなるものである。溶出剤濃度を増加した緩衝液は、実質的に約０．０８Ｍ、０．１５Ｍ及び０．４ＭのＮａＣｌを含むヒトトロンビン用緩衝液である。
【００４０】
更に好ましい態様において、該製造方法は、更に、トロンビンを含有する安定化処方緩衝液を、該安定化処方緩衝液中に存在するウイルス粒子を除去するために銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜で濾過し、そして実質的にウイルス粒子を含まないトロンビン含有処方緩衝液を回収することを包含する。
【００４１】
該銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜の孔径が、好ましくは約１５ｎｍである。
【００４２】
更により好ましい態様において、該方法は、トロンビン含有処方緩衝液を濾過した後に、更に凍結乾燥と乾熱処理を行なって、トロンビンを変性させずに残留ウイルス粒子を不活化することを包含する。
【００４３】
好ましくは、凍結乾燥製品を約１００℃で約１〜約２時間加熱することによって該乾熱処理を行なう。
【００４４】
該処方緩衝液が、熱処理による実質的な活性の低下からトロンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び血漿アルブミンを含有する、ｐＨ約７．３の水溶液である。
【００４５】
特定の態様においては、該処方緩衝液が、約０．２５ｗ／ｖ％のクエン酸ナトリウムと、約０．４５ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムと、約０．２５ｗ／ｖ％のＴｒｉｓ−ＨＣｌと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約２０倍に相当する量であり、凍結乾燥前のトロンビン溶液において２ｗ／ｖ％となる量の血漿アルブミンとを含有する、ｐＨ約７．３の水溶液である。
【００４６】
本発明の有利な点は、一定費用から得られる効果およびウイルス汚染に対する安全性の両方について、工業的要件を全て満たすことにある。
【００４７】
発明の詳細な説明
以下、実施例及び図面によって、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：
フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの含有量の高い濃縮物の調製：
【００４９】
第１の分画：
プール血漿を約１６℃〜約３７℃の間の温度で維持する。アミノ−６−ヘキサン酸の濃度が少なくとも５０ｍＭとなるように攪拌下（under agitation）で加える。得られた混合物を３５〜３７℃で最低１５分間インキューベートする。その後、得られた混合物を０℃±２℃まで冷却する。一塩基酸のリン酸ナトリウム又はリン酸カリウム（Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第５,２９０,９１８号）；あるいは酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム（Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第５,３９５,９２３号）を加えて終濃度を１Ｍとする。得られた混合物を約０〜４℃±２℃で、約０．５〜１時間攪拌する。リン酸塩類を用いた酸性沈殿処理を室温（約２０℃）で行っても良い。
【００５０】
遠心分離：
上記の混合物を濾過するか、４℃で２０分間４，２００ｒｐｍで遠心分離する（Beckman J6-MC、 4.2型ローター）。上清をトロンビン調製のために回収し、沈殿物を他のビーカーに移す。上清は後の工程に直ちに回してもよいし、又は−３０℃より低温、好ましくは−８０℃より低温で何ヶ月も保存してもよいし、又は２℃〜４℃で約２４時間保存しても良い。
【００５１】
可溶化：
フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンを多量に含有する沈殿物を、１％のＴｒｉｓと１．６％のクエン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ６．０±０．１（ｐＨ７．３でもよい））で可溶化して溶解させる。沈殿物の可溶化は攪拌下に室温で行なう。上記の緩衝液は約２０〜２２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得るのに必要とされるだけ加える。この時点で、Ｌ−ヒスチジンをタンパク質１ｇ当たり０．２〜０．３ｇの割合で加える。次に、タンパク質溶液を約４℃で２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離する（Beckman J2-MI、 JA-10型ローター）。タンパク質溶液の表面に浮遊する脂質層を取り除く。タンパク質溶液を静かにビーカーに移し、０．２ミクロンのカプセルフィルター（Gelman社製、SuporCap、 製品番号 12991又は12992）を用いて濾過する。
【００５２】
溶媒／界面活性剤処理：
上述のように濾過したタンパク質溶液を、１％のＴｒｉｓ、１．６％のクエン酸ナトリウム、２％のＴｗｅｅｎ８０（Ｔｗｅｅｎは登録商標）（ポリオキシエチレン ソルビタン モノオレエート）と０．６％のトリｎ−ブチルフォスフェート（ＴｎＢＰ）を含む溶液（ｐＨ６．８±０．１）の同容量と混合することによりウイルス不活化処理を行なう。これにより、最終濃度はタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ８０が１％、ＴｎＢＰが０．３％となり、最終的なｐＨは７．０±０．２となる。この溶液を、２４℃±１℃で継続的に攪拌しながら少なくとも６時間インキュベートする。
【００５３】
ナノフィルトレーションによるウイルスの除去：
ウイルスの不活化処理の後、タンパク質に含まれるＴｗｅｅｎ８０の終濃度が２％〜４％になるように、１％のＴｒｉｓ、１．６％のクエン酸ナトリウム、６％のＴｗｅｅｎ８０を含む緩衝液（ｐＨ７．０±０．１）を用いて調整する。得られた混合物を０．２ミクロン及び０．１ミクロンのカスケードカプセルフィルター（Gelman社製、CritiCap 0.2μ、 製品番号 12995又は12996; CritiCap 0.1μ 製品番号 12997又は12999）で濾過し、濾過した溶液をPlanova BMMフィルター３５ｎｍでさらに濾過する。フィブリノーゲンのような高分子量の分子の濾過を容易にし、また、その回収率を最適化するために、Ｔｗｅｅｎ８０を加えることが必要である。Ｔｗｅｅｎ８０を添加しないと、タンパク量が多いためにフィルターはすぐに詰まってしまう。
【００５４】
第２の分画：
５０ｍＭのアミノ−６−ヘキサン酸を攪拌下で濾液に加え、得られた混合物を約１時間３５℃±２℃でインキュベートし、その後０℃±２℃に冷却する。上記混合物１リットル当たり１モルに相当する一塩基酸のリン酸ナトリウム又はリン酸カリウム（Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第５,２９０,９１８号)、あるいは酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム(Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第５,３９５,９２３号）を上記混合物に加えると、沈殿物が即座に現れる。攪拌を０℃±２℃で１時間続ける。
【００５５】
遠心分離：
得られた混合物を濾過するか、４℃で２０分間４，２００ｒｐｍ（Beckman J6-MC、 4.2型ローター）で遠心分離する。溶媒と界面活性剤、不純物タンパク質を遠心分離で除去する。沈殿物を回収してビーカーに移す。
【００５６】
洗浄：
沈殿物を数回（少なくとも２回）０．１％Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０±０．１）で洗浄する。上記の沈殿工程に使用された塩類に応じて、溶液を中性にするためのＴｒｉｓ緩衝液のｐＨを４．５〜５．０の範囲内或いは９．５〜１０．５の範囲内（濃度は０．１〜０．５％）で選択する。各洗浄操作の後に沈殿物を遠心で分離する。Ｔｒｉｓ緩衝液は前もって０℃±２℃に冷却しておき、洗浄工程は０℃±２℃で行なう。室温で洗浄工程を行なっても良好な結果が得られる。沈殿物を最終的な緩衝液（ｐＨ７．３に塩基性化した水溶液を用る）中に戻した後に単純な透析又は透析濾過を行うことで、洗浄の回数を減らすことができる。
【００５７】
可溶化：
洗浄した沈殿物は０．５％のＴｒｉｓ、０．１％のＮａＣｌと０．５％のクエン酸ナトリウムを含む最終緩衝液（ｐＨ６．８±０．１（ｐＨ７．３でもよい））に溶解させる。緩衝液の容量は計量した沈殿物１ｇにつき約２〜３ｍｌである。沈殿物の可溶化は３７℃に加熱することで促進される。完全な可溶化・溶解の後、出発血漿１リットル当たり０．２〜０．３ｇに相当する量のＬ−ヒスチジンを加える。そして、タンパク質溶液を濾過するか、または約４℃で２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心する（Beckman J2-MI、 JA-10型ローター）。
【００５８】
図１は、フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの濃縮物の調製の最終工程を示すものである。
【００５９】
タンパク質濃度の調整
最終的なタンパク質濃度は上記と同じ緩衝液を用いて約３０〜４０ｍｇ／ｍｌに調整する。タンパク質濃度はＯ.Ｄ.２８０ｎｍで測定する。
【００６０】
処方：
下記の式に従い、Ｌ−ヒスチジンの最終的な濃度をＯ.Ｄ.で測定したタンパク質１ｇ当たり０．２〜０．４ｇ、好ましくは０．４ｇとなるように調整する。
【００６１】
［Ｌ−ヒスチジン０．４ｇ×タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）（Ｏ.Ｄ.）×容量］−加えたＬ−ヒスチジン０．２〜０．３ｇ／血漿 １リットル］
【００６２】
混合物に、Ｏ.Ｄ.で測定したタンパク質１ｇ当たり０．５ｇに相当する量のショ糖を加える。
【００６３】
混合物に、Ｏ.Ｄ.で測定したタンパク質１ｇ当たり０．２ｍｌ／ｇに相当する量のヒトアルブミン（２５％溶液、人体への使用が承認されたPlasbumin 25（Plasbuminは登録商標）、Miles Inc.製、Pharmaceutical Division、IN 46515、USA）を加える。
【００６４】
０．５％のＴｒｉｓ、０．１％のＮａＣｌ、０．５％のクエン酸ナトリウム、及び１０％のＴｗｅｅｎ８０を含む緩衝液（ｐＨ６．８±０．１）を用いて、Ｔｗｅｅｎ８０の量をＯ.Ｄ.で測定したタンパク質１ｍｇ当たり１７〜２０μｇに調整する。Ｔｗｅｅｎ８０の濃度はNew York Blood Centerの技術に従い、調整前にＯ.Ｄ.６２０ｎｍで検査・確認しなければならない。
【００６５】
濾過滅菌：
最終タンパク質溶液は０．２ミクロンのカプセルフィルター（Gelman社製、CritiCap ０．２μ、製品番号 12995又は12996）を用いて濾過する。
【００６６】
無菌充填：
タンパク質溶液を、凝固可能なフィブリノーゲンの量が各バイアル当たり６０±５ｍｇとなるように１０ｍｌバイアルに充填する。
【００６７】
凍結乾燥：
凝固可能なフィブリノーゲン６０±５ｍｇの入ったフラスコを６６〜７２時間凍結乾燥に付す。そして、温度を−４０℃から２２℃±２℃まで、０．０２℃／分の昇温速度で次第に上げて行く。この凍結乾燥によって製品の残留水分が１％未満となり、その後の熱処理中の製品の変性を防ぐ。
【００６８】
乾熱処理：
凍結乾燥サイクルの後、バイアルに真空下で栓を閉め、アルミニウム製キャップで封止する。そしてバイアルを、１９９６年４月に発行された米国特許第５,５０６,１２７号に開示される方法に従い、約１００℃±１℃で約１〜２時間の乾熱処理による第３のウイルス不活化工程に付す。
【００６９】
ウイルス汚染に対する安全性：
ウイルス汚染に対する安全性を評価した。パルボウイルス、ポリオウイルスやＡ型肝炎ウイルスのような、小さくてエンベロープをもたないウイルスは熱処理によって不活化する。回収率について予想される主要な問題は、ナノフィルトレーション後のフィブリノーゲンをいかにして出来るだけ大量に得るかということである。Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を適宜調整してフィブリノーゲンのナノフィルターの通過を容易にすることによりこの問題を解決した。エンベロープをもたない３型レオウイルスとＳＶ４０はナノフィルトレーションで除去する。従って、ウイルス不活化のための各工程が、ウイルスを除去するか不活化することによりウイルス汚染に対する安全性の高い製品を提供するという目的に貢献する。このことは、３つの工程を組み合わせることにより、少なくともそれらの中の１つによってウイルスの不活化又は捕捉を確実に行なえることを意味する。本発明の方法を用いないと、上記の工程の１つ又は２つに抵抗力のあるウイルスが最終製品に残り得る。
【００７０】
回収率：
フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びXIII因子の全回収率は米国特許第５,２９０,９１８号及び米国特許第５,３９５,９２３号に報告されている回収率と同等であり、これは、タンパク質類の活性を損なわずに、ウイルス汚染に対する安全性を確実にできることを意味する。
【００７１】
トロンビン透析濾過（diafiltration）による塩含量の低減：
血漿を酸による沈殿処理または塩析処理に付すと、第１遠心処理によって得られる血漿上清（実施例１におけるような）は、大量の塩類を含んでいる。塩処理に基づく血漿の浸透圧モル濃度（osmolarity）は約２，２００〜２，５００ mOsm/kgである。該上清に含まれるプロトロンビンを単離するためには、上記の大量の塩類を除去する必要がある。特に酸により血漿を沈殿させた場合には、血漿のイオン強度が低くなければプロトロンビンを単離することができない。塩類の除去は、従来から公知の手法である透析濾過によって行なう。上記の上清を透析濾過システム（Amicon system社製、モデルＤＣ１０Ｌ、スパイラルカートリッジ付き）の貯槽（reservoir）に入れる。透析濾過の外液としては純水を用いる。血漿上清の容量に対して平均で４倍容量の純水を用いて、血漿の浸透圧モル濃度が約５０〜１００ mOsm/kgとなるまで透析濾過を行なう。
【００７２】
プロトロンビンの回収：
透析濾過を行なった血漿を純水で５倍に希釈する。希釈血漿のｐＨは約７．４〜７．８の間である。希釈血漿に酢酸溶液（２％〜５％；Allary et al., Isolement par chromatographie d’affinite, sur support de silice, de la thrombine humaine en vue de son utilisation dans les preparations de colle biologique (Ann. pharmaceutiques francaises 1990; 48 (3): 129-135)参照）を滴下して、ｐＨを５．２±０．１まで下げる。ｐＨの降下中に（およそｐＨ５．５〜６．０で）プロトロンビンが沈殿しはじめ、ｐＨが５．１〜５．３になったところで沈殿が完了する。プロトロンビンはｐＨが６．０を越えたり塩濃度を上げると急速に再可溶化する。血漿を室温で１時間静置してから、２０℃で２０分間、４，２００ｒｐｍで遠心する（Beckman J6MC、JS4.2型ローター）。沈殿物を回収して、２％のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）（容量：血漿上清１リットルあたり１２０〜１５０ ｍｌ）に溶解する。プロトロンビンを、クロノメトリック定量法（chronometric dosage）（Fibrometre Stago ST4-France）で定量する。プロトロンビンの回収率は血漿上清と出発血漿を基準として約９０％であり、血漿１リットルあたり７５０〜８５０単位のプロトロンビンを回収できることになる。
【００７３】
プロトロンビンのトロンビンへの変換：
プロトロンビンに４倍容量の４０ｍＭ ＣａＣｌ2を急速に添加して数分間攪拌する。得られた混合物を室温で少なくとも約１時間静置してから、２０℃において４，２００ｒｐｍで３０分間遠心する（Beckman J6MC、JS4.2型ローター）。トロンビンを含有する上清を回収し、０．２ミクロンフィルター（Gelman社製、SuporCap、製品番号 12991または12992）で濾過する。プロトロンビンの変換によって得られた粗トロンビン（crude thrombin）の活性は約１１０〜１２０ＮＩＨ単位／ｍｌである。比活性は約２５〜３０ＮＩＨ単位／ｍｇタンパク質、即ち、プロトロンビン１単位あたりトロンビン８０〜１００ＮＩＨ単位である。全体的なトロンビンの回収率は血漿上清１リットルあたり約６０,０００〜８０，０００ＮＩＨ単位であり、これは例えば、米国特許第５,５０６,１２７号に記載の方法によって得られる回収率の２倍である。
【００７４】
トロンビン活性はフィブロメーター（Fibrometre Stago ST4-France）を用いて凝固時間を測定することによって評価した。標準曲線はトロンボザイム(thrombozyme)（Stago reagents、Thrombozyme ref.00332）を用いて作製し、トロンボザイム活性の測定には、ＮＩＨ標準品、ロットＪ（titer 310 NIH）を基準にして行なった。プール血漿をトロンビン活性測定用のフィブリノーゲンの採取源として用いた。
【００７５】
溶媒／界面活性剤によるウイルスの不活化：
図２は、溶媒／界面活性剤を用いる処理、クロマトグラフィーによるトロンビンの精製、濾過によるウイルス除去、トロンビン製品の調製、凍結乾燥、及び１００℃での加熱によるウイルスの不活化をトロンビン溶液に順次行なうことによる、トロンビン溶液へのウイルス不活化処理の工程を示す。サーモスタットで２４±０．５℃に調温された液循環システムを備えた二重壁構造のタンクに、トロンビン溶液を入れる。０．５％のＴｒｉｓ溶液を用いて調製した１１％のＴｗｅｅｎ８０と３．３％のトリ−ｎ−ブチルフォスフェート（ＴｎＢＰ）の溶液（ｐＨ７．０±０．１）を、緩やかに攪拌しながらトロンビン溶液に加える。トロンビンに添加した溶媒／界面活性剤溶液の容量はトロンビン溶液の１０分の１である。１時間攪拌した後、得られた混合物を第１のタンクと同様の第２のタンクに移し、更に約５時間攪拌する。ウイルス不活化の後でトロンビン活性を測定すると、（０〜５％の）溶媒／界面活性剤処理による大きな活性の低下は無かったことが分かる。なお、プロトロンビンをトロンビンに変換する際に、溶液にして用いるＣａＣｌ2の量にほぼ相当する固体のＣａＣｌ2をプロトロンビンに加えると、粉末状のＣａＣｌ2を用いた場合で回収率が２０％下がり、また、溶媒／界面活性剤処理において約１０〜１５％の活性低下が起きることは、注目に値する。カルシウムの粉末を添加した場合とＣａＣｌ2溶液を添加した場合とを全体的に比較すると、前者ではトロンビン活性が約３０％低下することになる。
【００７６】
クロマトグラフィーによるトロンビンの精製：
陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を１回行なって、トロンビンを更に精製する。クロマトグラフィーによるタンパク質の精製は周知の技術であり、多くの文献に詳細に記載されている。精製の目的やタンパク質の性質に応じて、異なるマトリックス、即ち担体を使い分ける。本発明においては、担体としては、スルホプロピル（-ＣＨ2−ＣＨ2-ＣＨ2-ＳＯ3）がグラフトされた硬質アガロースゲルを用いる。SP Sepharose Fast Flow (商標）（Pharmacia社製、コード番号 17-0729-01）というゲルは、流動性に優れ、あらゆるｐＩ値のタンパク質に対して高い交換容量（capacity）を有する。このゲルのイオン交換基は、ｐＨ４〜１３の機能領域全体において電荷と高い交換容量を維持するスルホプロピルである。SP Sepharoseを充填したカラムに、粗トロンビンを含むタンパク質溶液を流す。トロンビンと不純物タンパク質（contaminating proteins）が支持体に吸着される。ゲルに吸着されたタンパク質を溶出する前に、０．０８ＭのＮａＣｌ溶液でゲルを充分に洗うことが必要である。トロンビンの溶出は、ＮａＣｌの非連続濃度勾配を用いて行なう。まず最初に０．１５ＭのＮａＣｌ溶液をカラムに流して不純物タンパク質を除去する。次に０．４ＭのＮａＣｌ溶液でトロンビンを完全に脱着して回収する。それからゲルを２ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄して、ゲルに吸着された不純物をすべて取り除く。クロマトグラフィーによるトロンビンの精製で、その前のウイルス不活化工程で用いた溶媒／界面活性剤も除去できる。精製されたトロンビン溶液にヒトアルブミン（２５％のヒトアルブミン溶液、USP Plasbumin 25、Miles Inc.製、Pharmaceutical Division、IN 46515、USA）を添加して安定化する。添加すべきアルブミンの量は下記式で算出する。
【００７７】
〔20 × トロンビン濃度（Ｏ.Ｄ.で測定）×トロンビン容量（クロマトグラフィー後）× 100 ml〕／（25 × 1,000）
【００７８】
クロマトグラフィー後のトロンビン溶液は非常に不安定である。従って、トロンビンを急速に低温で保存しなかったり、又は、安定化処理をせずに透析濾過や濃縮などの工程を行なうと、活性が大きく低下する場合がある。最終製品を処方するための緩衝液交換を行なう際にトロンビン活性を保護するためにアルブミンなどの安定化剤を使用することが必要である（Amicon system CH2PRS又はTCF 10の所要量を用いる）。最終処方に用いる緩衝液の組成は以下の通りである：０．２５％のＴｒｉｓ、０．２５％のクエン酸ナトリウム、０．４５％のＮａＣｌ、ｐＨ７．３０±０．１。トロンビン溶液に対して約６倍容量の処方緩衝液を交換する。交換する緩衝液の容量と透析濾過時間を低減するために、透析濾過の前にトロンビン溶液を数倍に濃縮する。
【００７９】
ウイルス濾過：
次に、米国特許第５,５０６,１２７号（１９９６年４月９日発行）の教示に従い、透析濾過したトロンビン溶液を、孔径約１５ｎｍの銅アンモニア再生セルロース繊維からなるPlanova BMM微多孔膜（BembergマイクロポーラスメンブランＢＭＭデベロップメント、旭化成工業社製、日本国、東京）などの中空糸膜を用いて濾過する。この技術によると、上記のＳＤ（溶媒/界面活性剤）処理では不活化できない脂質エンベロープをもたないウイルスをほぼ完全に除去できる。
【００８０】
無菌充填：
ナノフィルトレーションの済んだトロンビン溶液を約２５０ ＮＩＨ単位／ｍｌまで希釈し、５ｍｌのガラスフラスコ（バイアル）に均等に分注する。
【００８１】
凍結乾燥：
トロンビン溶液１ｍｌの入ったフラスコを６６〜７２時間凍結乾燥する。そして、温度を−４０℃から２２±２℃まで、約０．０２℃／分の昇温速度で次第に上げていく。この工程によって残留水分が１％未満になる。
【００８２】
乾熱処理：
凍結乾燥サイクルの後、バイアルに真空下で栓を閉め、アルミニウム製キャップで封止する。そしてバイアルを、約１００±１℃で約１〜２時間の乾熱処理による第３のウイルス不活化工程に付す。
【００８３】
結論：
以上のように、米国特許第５,２９０,９１８号、米国特許第５,３９５,９２３号と米国特許第５,５０６,１２７号（いずれもHaemacure Biotech Incに与えられた特許）に記載の方法を改善することができ、それによって安全性の高いトロンビンの回収率を向上できることと、フィブリノーゲン回収率を犠牲にせずにフィブリノーゲン濃縮物のウイルスに関する安全性を確実にできること、が本発明によって示された。
【００８４】
このように本発明を説明したが、本発明の教示と精神の範囲内で上記の好ましい実施態様を改変できることは当業者には自明である。そのような改変は添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明による、ヒトプール血漿から開始して、フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの濃縮物を調製するための工程を示すものである。
【図２】  図２は、本発明による、フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの濃縮物の単離工程において残存する血漿上清から開始して、トロンビンを調製する工程を示すものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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