(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質またはその塩と該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号：１６または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質またはその塩と該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項４】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２、配列番号：１１３または配列番号：１３５で表されるアミノ酸配列である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）配列番号：１５、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質またはその塩と該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項６】
（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項７】
（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項８】
配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその塩、または該タンパク質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその塩、または該タンパク質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レセプターと該レセプターと特異的に結合する能力を有するポリペプチドとを用いる医薬（食欲（摂食）促進剤、抗肥満薬等）のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られうる化合物などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節によるホルモンや神経伝達物質のレセプターの多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合がある）と共役しており、このＧタンパク質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらのレセプタータンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうしたレセプターはＧタンパク質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対するレセプタータンパク質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対するレセプターが存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知のタンパク質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、７個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのようなタンパク質の中から明確にＧタンパク質共役型レセプターとして区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧタンパク質共役型レセプター遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧタンパク質共役型レセプターのうちには既知のレセプターとの構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらのレセプターは対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらのレセプターはオーファンレセプターと呼ばれている。このようなオーファンレセプターの未同定の内生リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、そのレセプター作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al.、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年、Howard, A. D. et al.、TiPS、22巻、132-140頁、2001年）。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファンレセプターのリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧタンパク質共役型レセプターＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入してレセプターを発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinとそれぞれ名付けられた同一の新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、レセプターのノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
その後これまでにＰｒＲＰ（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびＧＡＬＰ（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧタンパク質共役型レセプターのリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドのレセプターが解明された例もある。腸管収縮に関与するmotilinのレセプターがＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、ＳＬＣ−１がＭＣＨのレセプターとして同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、また、ＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がurotensin IIのレセプターであることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。さらに、最近、神経ペプチドであるneuromedin U、neuropeptide FFのレセプターが明らかにされたほか、これらのペプチド以外にもcysteinyl leukotriene類、sphingosine-1-phosphate、lysophosphatidic acid、sphingosylphosphorylcholine、UDP-glucoseなど低分子の生理活性脂質あるいは核酸誘導体がオーファンレセプターのリガンドとして同定された（Howard, A. D. et al.、TiPS、22巻、132-140頁、2001年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩の表現型（phenotype）を示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、そのレセプターが明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有するレセプター拮抗薬の探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。
このように、オーファンレセプターおよびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファンレセプターのリガンド探索においては多くの困難さが伴うことが知られている。例えば、細胞に発現させたオーファンレセプターがリガンドに応答した後にいかなる二次情報伝達系が作動するかは一般に不明であり、様々な応答系について検討する必要がある。また、リガンドの存在する組織は容易には予想されないため種々の組織抽出物を用意しなければならない。さらに、リガンドがペプチドである場合、レセプターを刺激するのに必要なリガンド量はごく低濃度で十分であるためにこのようなリガンドの生体内の存在量は極微量であることが多いことに加え、ペプチドはタンパク質分解酵素によって消化されて活性を失ったり、非特異的吸着によって精製過程において回収が悪かったりするために、生体より抽出して構造決定に必要な量を単離することは通常極めて困難である。これらの問題によって、これまでに数多くのオーファンレセプターの存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされたレセプターはごく一部に過ぎない。
オーファンＧタンパク質共役型レセプターとして報告されているものの一つにＧＰＲ７（配列番号：１２９、O' Dowd, B. F. et al., Genomics、28巻、84-91頁、1995年）がある。ＧＰＲ７はソマトスタチンレセプター（SSTR3）およびオピオイドレセプター（δ、κおよびμ）と低いホモロジーがあるが、そのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった。また、ＧＰＲ７は、ＧＰＲ８（配列番号：４、O'Dowd, B. F. et al., Genomics、28巻、84-91頁、1995年）とアミノ酸レベルで６４％程度の相同性が認められるものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、ＧＰＲ７の内因性リガンドを見出し、該リガンドを直接利用する、または該リガンド（好ましくはＧＰＲ７と組み合わせて）を用いた医薬のスクリーニング系を利用することにより、全く新規な作用機序を有する医薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ブタ視床下部抽出物より、ＧＰＲ７と相同性を有するＧＰＲ８に特異的に結合することを指標にして見出した内因性リガンドがＧＰＲ７に対しても内因性リガンドであることを見出すとともに、該リガンドが食欲（摂食）増進作用を有すること、ＧＰＲ７アゴニストが食欲（摂食）促進剤、ＧＰＲ７アンタゴニストが肥満症の予防・治療剤（抗肥満薬）になることを見出した。これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）該タンパク質と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質またはその塩と該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕ポリペプチドが、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕ポリペプチドが、配列番号：１６または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）該タンパク質と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質またはその塩と該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔５〕前記〔１〕記載のスクリーニング方法または前記〔４〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と（２）該タンパク質と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
〔６〕前記〔５〕記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔７〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する化合物である前記〔５〕記載の化合物、
〔８〕前記〔１〕記載のスクリーニング方法または前記〔４〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
〔９〕前記〔７〕記載の化合物またはその塩を含有してなる抗肥満薬、
〔１０〕哺乳動物に対し、前記〔７〕記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満の予防・治療方法、
〔１１〕抗肥満薬を製造するための、前記〔７〕記載の化合物またはその塩の使用などに関する。
【０００６】
さらに、本発明は、
〔１２〕配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２、配列番号：１１３または配列番号：１３５で表されるアミノ酸配列である前記〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔１３〕ポリペプチドが、配列番号：１５、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１４〕（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）該タンパク質と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１５〕（１）配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩および（２）該タンパク質と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１６〕配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその塩、または該タンパク質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１７〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる抗肥満剤、
〔１８〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲（摂食）促進剤、
〔１９〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲（摂食）促進剤、
〔２０〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる肥満の診断薬、
〔２１〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる抗肥満剤、
〔２２〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる肥満の診断薬、
〔２３〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる抗肥満剤、
〔２４〕配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる肥満の診断薬なども提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と特異的に結合する能力を有するポリペプチドを、以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する能力を有するポリペプチドとの結合の解離定数が、１ｎＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、さらに好ましくは１００ｐＭ以下、特に好ましくは８０ｐＭ以下、最も好ましくは５０ｐＭ以下であるポリペプチドなどが挙げられる。
本発明のポリペプチドの例として挙げられる、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【０００８】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【０００９】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性（例えば、後述の疾患の予防・治療活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等））などがあげられる。
実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２、配列番号：１１３または配列番号：１３５で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【００１０】
本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１００で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：１３５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどのＧＰＲ７と特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
【００１１】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合活性、該タンパク質発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）等を有するポリペプチドのみならず、該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味で用いられる。
該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド等があげられる。
より、具体的には、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
【００１２】
特に、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１３】
配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、本発明のレセプターと称する場合がある）は、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１４】
配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明のレセプターの部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであっていてもよいが、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
【００１５】
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
本発明のポリペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００１６】
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドは、前述したヒトや非ヒト温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチド、レセプター、その部分ペプチド、もしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、レセプター、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１８】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１９】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２０】
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２１】
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはレセプターの部分ペプチドについては、レセプターを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法があげられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００２２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば（i）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、（ii）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、（iii）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または（iv）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
【００２３】
配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５、または配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５、または配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２４】
より具体的には、
(i) 配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ii) 配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iii) 配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iv) 配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(v) 配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vi) 配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vii) 配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(viii) 配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ix) 配列番号：５６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(x) 配列番号：５７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xi) 配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xii) 配列番号：７４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiii) 配列番号：９１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiv) 配列番号：９２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xv) 配列番号：９５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvi) 配列番号：９６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvii) 配列番号：９７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
【００２５】
(xviii) 配列番号：９８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xix) 配列番号：９９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xx) 配列番号：１００で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxi) 配列番号：１０１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxii) 配列番号：１０２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiii) 配列番号：１０３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiv) 配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxv) 配列番号：１０５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxvi) 配列番号：１０６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxvii) 配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxviii) 配列番号：１０８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxix) 配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxx) 配列番号：１１０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxi) 配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxii) 配列番号：１１１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxiii) 配列番号：１１２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxiv) 配列番号：１１３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２６】
本発明のレセプターをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１２８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：１２８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：１２８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１２９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のレセプターの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のレセプターの部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００２７】
本発明のレセプターの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：１２８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１２８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２８】
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチド（以下、これらポリペプチド等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチド等を単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２９】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。
【００３０】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００３１】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７）、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００３３】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００３４】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３６】
以下に、本発明のスクリーニング方法について詳述する。
（i）本発明のレセプター、部分ペプチドもしくはその塩（以下、これらを本発明のレセプターと略記する場合がある）用い、または組換え型本発明のレセプターの発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることにより、および（ii）本発明のポリペプチドを用い、または組換え型本発明のポリペプチド発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることにより、本発明のレセプターと本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることがおできる。
該化合物またはその塩には、１）本発明のレセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（アゴニスト）、２）上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、３）本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、４）本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。
【００３７】
具体的には、本発明のレセプターに、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）本発明のレセプターに、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としては、例えば、
▲１▼標識した本発明のポリペプチドを、本発明のレセプターに接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のレセプターに接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本発明のレセプターに対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のポリペプチドを、本発明のレセプターを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のポリペプチドを、本発明のレセプターをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のレセプターをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポリペプチドのレセプターに接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本発明のレセプターに対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲４▼本発明のポリペプチドを本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合と、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合における、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼本発明のポリペプチドを本発明のレセプターをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合と、本発明のレセプターを活性化する化合物および試験化合物を、本発明のレセプターをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合における、本発明のレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などが挙げられる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明のレセプターとしては、ヒトや非ヒト温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明のレセプターなどが適している。
本発明のレセプターを製造するには、前述の本発明のレセプターの製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプターを含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明のレセプターを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
本発明のレセプターを含有する細胞としては、本発明のレセプターを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、本発明のレセプターを発現した宿主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明のレセプターと細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明のレセプターを含有する細胞や膜画分中の本発明のレセプターの量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００３９】
前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法を実施するためには、適当な本発明のレセプター画分と、標識した本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明のレセプター画分としては、天然型の本発明のレセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明のレセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明のレセプターを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のレセプターや本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチドを添加し、同時に１０-10〜１０-7Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４０】
前記▲４▼〜▲５▼のスクリーニング方法を実施するためには、本発明のレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を、公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明のレセプターを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明のレセプターを発現した細胞が必要である。本発明のレセプターを発現した細胞としては、前述の本発明のレセプター発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセプターまたは本発明のレセプターを含有する細胞もしくは細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（a）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、または用時調製しても良い。
（b）本発明のレセプター標品
本発明のレセプターを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（c）標識リガンド
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識した本発明のポリペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、４℃または−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（d）リガンド標準液
本発明のポリペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４２】
２．測定法
（a）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプターを発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（b）１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０-3Ｍの本発明のポリペプチドを５μｌ加えておく。
（c）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（d）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0   ：最大結合量
【００４３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合を変化させる化合物あるいは本発明のレセプターの活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、１）本発明のレセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明のレセプターアゴニスト）、２）該刺激活性を有しない化合物（本発明のレセプターアンタゴニスト）、３）本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、４）本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００４４】
上記本発明のレセプターアゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下の（i）または（ii）に従えばよい。
（i）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明のレセプターを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明のレセプターアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明のレセプターアンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させ、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明のレセプターアゴニストである。
(b)本発明のポリペプチドを本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合と、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合における、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のレセプターを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明のレセプターアンタゴニストである。
【００４５】
本発明のレセプターアゴニストは、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドが有する生理活性〔例、食欲（摂食）増進作用〕と同様の作用を有しており、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療剤、食欲（摂食）促進剤等）として有用である。
本発明のレセプターアンタゴニストは、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドが有する生理活性〔例、食欲（摂食）増進作用〕を抑制することができるので、安全で低毒性な医薬、例えば、肥満症〔例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など〕、摂食亢進症(hyperphagia)などの予防・治療剤として有用である。
本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療剤、食欲（摂食）促進剤等）として有用である。
本発明のレセプターと本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、肥満症〔例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など〕、摂食亢進症などの予防・治療剤として有用である。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（予防・治療剤）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的（例、静脈投与、皮下投与、経鼻投与等）に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００４７】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
【００４８】
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。
例えば、拒食症患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき該化合物（アゴニスト）を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で拒食症患者（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。好ましくは、中枢に投与する、または中枢移行性の高い投薬形態により投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき該化合物（アンタゴニスト）を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で肥満症患者（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。好ましくは、中枢に投与する、または中枢移行性の高い投薬形態により投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４９】
さらに、本発明は、（a）本発明のレセプター、（b）本発明のＤＮＡ、（c）本発明の抗体、および（d）アンチセンスＤＮＡの用途も提供する。以下、本発明のレセプター、レセプターまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある。
（１）本発明のレセプターが関与する疾患の予防・治療剤
本発明のレセプターが本発明のポリペプチドに応答すると、摂食行動が促進される。
従って本発明のレセプターまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、または本発明のレセプターまたは該レセプターをコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、食欲不振症等となる可能性が高い。従って、本発明のレセプターおよび該レセプターをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、例えば、拒食症の予防・治療剤、食欲（摂食）促進剤等として使用することができる。
【００５０】
本発明のレセプターおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のレセプターが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のレセプターを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のレセプターを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のレセプターを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のレセプターの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは非ヒト温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のレセプターを上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のレセプターは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的（例、静脈投与、皮下投与、経鼻投与等、好ましくは皮下投与）に使用できる。例えば、本発明のレセプターを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００５１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
【００５２】
本発明のレセプターの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、食欲促進剤として本発明のレセプターを皮下投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該レセプターを約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。好ましくは、中枢に投与する、または中枢移行性の高い投薬形態により投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５３】
（２）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のレセプターをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現低下が検出された場合は、例えば、拒食症である可能性が高いまたは将来拒食症となる可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症である可能性が高いまたは将来肥満症となる可能性が高いと診断することができる。
【００５４】
（３）抗体を含有する抗肥満薬およひ診断薬
本発明のレセプターに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のレセプターもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のレセプターに対する抗体は、本発明のレセプターを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプターは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプターと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識された抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識されたレセプターを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５５】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（レセプター抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプターに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５６】
本発明の抗体は、例えば、肥満症〔例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など〕、摂食亢進症などの予防・治療剤、好ましくは抗肥満薬などとして使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の抗肥満薬として使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００５７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５８】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のレセプター、レセプターまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のレセプターのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００５９】
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症〔例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など〕、摂食亢進症などの予防・治療剤、好ましくは抗肥満薬などとして使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００６０】
さらに、本発明は、
（i）本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ii）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
（iii）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
（iv）前記リボザイムを含有してなる医薬、
（v）前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明のレセプターまたは本発明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、肥満症〔例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など〕、摂食亢進症などの予防・治療剤、好ましくは抗肥満薬などの医薬として使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記（v）の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
【００６１】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
Ｉ            ：イノシン
Ｒ            ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ            ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ            ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ            ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ            ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ            ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ            ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ          ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ      ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ          ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ          ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ          ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ        ：ジイソプロピルエチルアミン
ＢＳＡ          ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ      ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスホナート
【００６２】
Ｇｌｙ又はＧ    ：グリシン
Ａｌａ又はＡ    ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ    ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ    ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ    ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ    ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ    ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ    ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ    ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ    ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ    ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ    ：リジン
Ａｒｇ又はＲ    ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ    ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ    ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ    ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ    ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ    ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ    ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ    ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）    ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ          ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｐｂｆ          ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ          ：２−クロロトリチル
Ｂｕt           ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）    ：メチオニンスルフォキシド
【００６３】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＧＰＲ８をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２〕
ヒトＧＰＲ８をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：３〕
５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、また３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ８  ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトＧＰＲ８の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞株の各クローンにおけるＧＰＲ８  ｍＲＮＡの発現量を測定するために使用したriboprobeの配列を示す。
〔配列番号：６〕
ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのアミノ末端アミノ酸配列解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＷ００７５３１）を示す。
〔配列番号：８〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＩ５００３０３）を示す。
〔配列番号：９〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＩ９９０９６４）を示す。
〔配列番号：１０〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＡ７４４８０４）を示す。
〔配列番号：１１〕
ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ｈ３１５９８）を示す。
〔配列番号：１２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１４〕
ヒト脳由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
配列番号：１５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
後述の参考例１４で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
後述の参考例１５で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
後述の参考例１６で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
後述の参考例１７で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
後述の参考例１８で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
後述の参考例１９で合成されたヒトＧＰＲリガンド（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：３４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：３５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：３７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：３８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：４６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：４８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
【００６４】
〔配列番号：５１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：５２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：５５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５６〕
配列番号：５５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５７〕
配列番号：５５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５８〕
配列番号：５６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
配列番号：５７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：６３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：６８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：７０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：７１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：７２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７３〕
配列番号：７２から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７４〕
配列番号：７２から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７５〕
配列番号：７３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
配列番号：７４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるマウスゲノム断片配列を示す。
〔配列番号：７８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：７９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８０〕
マウス精巣由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：８１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：８４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：８７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：８９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：９０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９１〕
配列番号：９０から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９２〕
配列番号：９０から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９３〕
配列番号：９１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
配列番号：９２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
後述の参考例４４で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９６〕
後述の参考例４５で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９７〕
後述の参考例４６で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９８〕
後述の参考例４７で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９９〕
後述の参考例４８で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１００〕
後述の参考例４９で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
【００６５】
〔配列番号：１０１〕
後述の参考例５０で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０２〕
後述の参考例５１で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０３〕
後述の参考例５４で合成さブタＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０４〕
後述の参考例５５で合成されたラットあるいはマウスＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０５〕
後述の参考例１２で合成されたＦｍｏｃ化ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０６〕
後述の参考例５６で合成された[Nα-Acetyl-Trp1]−ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０７〕
後述の参考例５７で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０８〕
後述の参考例５８で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（４−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０９〕
後述の参考例５９で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（９−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１０〕
後述の参考例６０で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１５−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１１〕
後述の参考例６１で合成された[N-Acetyl-Tyr2]−ヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１２〕
後述の参考例６２で合成された[D-Trp1]−ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１３〕
後述の参考例６３で合成された[N-3-Indolepropanoyl-Tyr2]−ヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１４〕
配列番号：９６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１５〕
配列番号：９７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１６〕
配列番号：９８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１７〕
配列番号：９９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１８〕
配列番号：１００で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１９〕
配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２０〕
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２１〕
配列番号：１０７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２２〕
配列番号：１０８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２３〕
配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２４〕
配列番号：１１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２５〕
配列番号：６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２６〕
ヒトＧＰＲ７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１２７〕
ヒトＧＰＲ７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１２８〕
５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、また３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ７タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：１２９〕
ヒトＧＰＲ７の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３０〕
標準ヒトＧＰＲ７  ＤＮＡを増幅するのにプライマーとして使用したＤＮＡ塩基配列を示す。
〔配列番号：１３１〕
標準ヒトＧＰＲ７  ＤＮＡを増幅するのにプライマーとして使用したＤＮＡ塩基配列を示す。
〔配列番号：１３２〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプライマーとして用いた合成ＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：１３３〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプライマーとして用いた合成ＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：１３４〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプローブとして用いた合成ＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：１３５〕
［Ｐｈｅ2］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
後述の参考例３で得られた形質転換体、Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8は、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ  １６５６４として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４０として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例２８で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ  １６５６８として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７５４４として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例３２で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ  １６５６５として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４１として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例３６で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ  １６５６７として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４３として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例４１で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ  １６５６６として、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７５４２として、それぞれ寄託されている。
【００６７】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１  ヒト脳由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ８  ｃＤＮＡの増幅
ヒト脳由来poly (A) +RNA（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写は、タカラRNA PCR ver 2.1キット試薬を使用した。次にこの逆転写生成物を鋳型として用い、配列番号：１および配列番号：２で表される合成プライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。合成プライマーはレセプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型５μｌ、合成ＤＮＡプライマー各０．４μＭ、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）０．５μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９４℃・６０秒、６５℃・６０秒、７２℃・１５０秒のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は、０．８％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【００６８】
参考例２  ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ｃＤＮＡ配列の確認
参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。PCR-ScriptTM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）DH5α competent cell（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体Escherichia coli DH5α/GPR8を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩによる切断を行ない、挿入されているレセプターｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit（PE Biosystems）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：３）。図１にヒトＧＰＲ８レセプタータンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列（配列番号：２３）およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ８レセプタータンパク質の全アミノ酸配列（配列番号：４）を示した。
【００６９】
参考例３  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例２で配列が確認されたヒト脳由来のＧＰＲ８の全長アミノ酸配列をコードし５’側にＣｌａＩ認識配列を付加し、また３’側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたEscherichia coliのクローンからPlasmid Midi KIt（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで消化してインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。このインサートＤＮＡをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H（S. Hinuma et al.、Biochim. Biophys. Acta、1219巻、251-259頁、1994年、記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加え、Ｔ４ライゲース（タカラ）を用いてライゲーションを行ない、タンパク質発現用プラスミドpAKKO-GPR8を構築した。このプラスミドpAKKO-GPR8で形質転換した大腸菌をDH5α/pAKKO-GPR8（Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8）と命名した。
pAKKO-GPR8で形質転換したEscherichia coli DH5α（トーヨーボー）を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてpAKKO-GPR8プラスミドＤＮＡを調製した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ  ｄｈｆｒ-細胞に導入した。４．５μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、２４時間前に５×１０5または１×１０6個のＣＨＯ  ｄｈｆｒ-細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４７クローンを選択した。
【００７０】
参考例４  全長ヒトＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量の高いＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の選択
参考例３で樹立されたＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株４７クローンの全長ＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量をCytostar T Plate（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、添付のプロトコールに従って以下のように測定した。ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の各クローンをCytostar T Plateに１well当たり２．５×１０4個ずつ播種して２４時間培養した後、１０％ホルマリンによって細胞を固定した。各wellに０．２５％ Triton X-100を添加して細胞の透過性をあげた後、35Ｓラベルした配列番号：５のriboprobeを加えてハイブリダイズさせた。２０μｇ／ｍｌのRNase Aを各wellに加えて遊離のriboprobeを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたriboprobeの放射活性をTopcounterで測定した。放射活性の高い細胞株は、ｍＲＮＡ発現量が高い。ｍＲＮＡ発現量の高い３クローン（＃１７、４１および４６）を以下に実験に用いたが、特にクローン番号１７を用いた。
【００７１】
参考例５  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定
参考例４で作製したＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞およびｍｏｃｋ  ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５×１０4 cell/wellで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％  ＢＳＡと２０ｍＭ  ＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した（以下、０．２ｍＭ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％  ＢＳＡと２０ｍＭ  ＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭ  フォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させた。１００μｌの２０0％  過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【００７２】
参考例６  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する[35S]-Guanosine 5'-(γ-thio)triphosphateの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分の調整法を記載する。１×１０8個のＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に１０ｍｌのホモジネートバッファー（10mM NaHCO3, 5mM EDTA, 0.5mM PMSF, 1μg/ml pepstatin, 4μg/ml E64, 20μg/ml leupeptin）を添加し、ポリトロン（１２，０００ｒｐｍ、１分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Beckman type 30ローター、３０，０００ｒｐｍ、１時間）し、得られた沈殿物をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
ＧＴＰγＳ結合活性の測定は以下の通りである。ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.4）, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 1μM GDP）で希釈して、タンパク質濃度30 mg/mlのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、51.5nM濃度の[35S]-Guanosine 5'-(γ-thio)triphosphate（NEN社）を2μlと試料を添加し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液(pH 7.4), 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.1% BSA）1.5mlで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００７３】
参考例７  ブタ視床下部抽出物に含まれ、ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株に対して特異的にｃＡＭＰ産生抑制およびＧＴＰγＳ結合促進を示す活性の検出
ブタ視床下部抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フラクションを以下に述べる方法で調製した。東京芝浦臓器（株）より購入した、処理当日に屠殺して摘出後は氷冷保存したブタ視床下部500 g（30頭分）を細かく切断し、直ぐに沸騰した蒸留水2.0 lに投じて10分間煮沸した。煮沸後、直ちに氷冷し、120 mlの酢酸を加えて終濃度1.0 Mとし、ポリトロン（20,000 rpm、6分間）を用いて破砕した。破砕液を遠心（8,000 rpm、30分）して上清を取り、沈殿には1.0 M酢酸2.0 lを加えて再度ポリトロンによって破砕し、一晩攪拌した後、遠心（8,000 rpm、30分）して上清を得た。上清に２倍量の冷アセトンを4℃でゆっくり滴下した後、１回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、２回目の遠心によって得た上清については４時間攪拌した。アセトンを加えた抽出液は遠心（8,000 rpm、30分）して沈殿を除き、得られた上清からエバポレーターによって減圧下にアセトンを溜去した。アセトンを除いた抽出液に等量のジエチルエーテルを加え、分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収した。エーテル脱脂した抽出液はエバポレーターによって減圧下に濃縮してエーテルを完全に除去した。濃縮液をガラス繊維濾紙（アドバンテック、DP70 (90 mmφ)）で濾過し、濾液をガラス製カラム（30φ x 240 mm）に充填したC18（ワイエムシー、YMCgel ODS-AM 120-S50）カラムに添加した。カラムを1.0 M酢酸400 mlで洗浄後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む60％アセトニトリル500 mlで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮して溶媒を溜去した後、濃縮液を凍結乾燥した。凍結乾燥品約0.5 gを30 mlの0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリルに溶解し、１０ｍｌずつをＣ１８カラム（トーソー、TSKgel ODS-80TS (21.5φ x 300 mm)）を用いた１０％から６０％の０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配溶出法によるＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣは３回行なった。溶出液は６０分画に分取し、３回分の溶出液をまとめた。各分画を減圧下に濃縮・乾固し、残渣を０．５ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した。
上記によって得られたＨＰＬＣフラクションのＤＭＳＯ溶液を参考例５に示した方法によってＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定を行なった結果、分画番号３０に顕著なｃＡＭＰ産生抑制活性が認められた。また同様な試料についてＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞用いてＧＴＰγＳ結合促進活性を調べたところ、やはり分画番号３０付近に顕著な活性が確認された。これらの活性は他のレセプター発現細胞では認められなかったことからブタ視床下部抽出物にＧＰＲ８特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。
【００７４】
参考例８  ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質のプロナーゼによる失活
参考例７でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示したＨＰＬＣ分画３０をタンパク質分解酵素であるプロナーゼ（Sigma, protease Type XIV (P5147)）で処理し、活性物質がタンパク性であるかを調べた。
上記視床下部抽出物ＨＰＬＣ分画（＃３０）２μｌを0.2 M酢酸アンモニウム２００μｌに加え、これにプロナーゼ３μｇを添加して３７℃で２時間インキュベートした後、沸騰水中で１０分間加熱してプロナーゼを失活させた。これにBSA 0.05mgおよびCHAPS 0.05 mgを含む蒸留水２ｍｌを加えてから凍結乾燥した。プロナーゼそのものあるいは加熱および凍結乾燥の影響を調べるため、プロナーゼのみ、ＨＰＬＣ分画のみおよびプロナーゼのみを加熱処理した後にＨＰＬＣ分画を加えたものについても同様に処理して凍結乾燥した。凍結乾燥した各試料を参考例５に示す方法によってＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に添加して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質はプロナーゼによって完全に失活したことからこの物質がタンパク質もしくはペプチドであることが示された。
【００７５】
参考例９  ブタ視床下部からのＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質の精製
ＧＰＲ８に特異的なリガンド活性を示す物質をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を指標としてブタ視床下部から精製した代表例を以下に具体的に述べる。参考例７に述べた方法と全く同一の方法により、ブタ視床下部５００ｇ（３０頭分）を1.0 M酢酸で抽出し、アセトン沈殿およびエーテル脱脂をした後、Ｃ１８（ワイエムシー、YMCgel ODS-AM 120-S50）カラムに吸着させ、0.1％トリフルオロ酢酸を含む60％アセトニトリルで溶出した。溶出液を濃縮し、凍結乾燥した後、Ｃ１８カラム（トーソー、TSKgel ODS-80TS (21.5φ x 300 mm)）を用いたＨＰＬＣによって活性分画を得た。活性は分画番号30に回収された。これを以下の方法によってさらに精製した。
この分画を１０％アセトニトリルを含む10 mMギ酸アンモニウム１０ｍｌに溶解し、陽イオン交換カラム（トーソー、TSKgel SP-5PW (20 mmφ x 150 mm)）に添加した後、10％アセトニトリルを含む10 mMから2.0 Mのギ酸アンモニウムの濃度勾配によってカラムを溶出した。活性はギ酸アンモニウム0.8 M付近に回収された。活性分画を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリル1.0 mlに溶解し、CNカラム（野村化学、Develosil CN-UG-5 (4.6 mmφx 250 mm)）に添加した後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む21％から26％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル22.1％付近に出現した。活性分画を凍結乾燥し、0.1 mlのＤＭＳＯで溶解し、さらに0.4 mlの0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリルを加えてODSカラム（和光純薬、Wakosil-II 3C18HG (2.0 mmφx 150 mm)）に添加した後、0.1％トリフルオ酢酸を含む22.5％から32.5％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル26.5％付近に単一ピークとして出現した（図２）。
【００７６】
参考例１０  ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列の解析およびＧＰＲ８リガンドのヒトおよびラットホモログペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列
参考例９で精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列解析を行なった。本活性物質は参考例８に示すようにタンパク質またはペプチドであることが推定されていたので、活性ピークを含む溶出液を用いてパーキンエルマー社Procise 494 Protein Sequencerによってアミノ末端アミノ酸配列分析を行なった。その結果、アミノ末端から１７残基までに配列番号：６に示す配列が得られた。この配列はリガンドペプチドの一部であると考えられた。
この配列に基づいて遺伝子データベースの検索を行なったところ、そのものもしくはその相補鎖がこのペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定される幾つかのＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）配列が見出された。それらのアクセッション番号、ｃＤＮＡの由来、配列の長さおよび配列番号は次の通りである。AW007531 (anaplastic oligodendroglioma、438 base、配列番号：7)、AI500303 (anaplastic oligodendroglioma、 264 base、配列番号：8)、AI990964 (colonic mucosa from patient of Crohn's disease、424 base、配列番号：9)、AA744804 (germinal center B cell、375 base、配列番号：10)、H31598 (PC12 cells、260 base、配列番号：11)。初めの４つはヒト由来であり、最後の１つはラット由来である。これらのＥＳＴのＤＮＡ配列はブタ視床下部より単離した活性ペプチドの配列に相当するアミノ酸配列をコードする領域では極めてよく一致してしており、また翻訳されたアミノ酸配列はブタ視床下部より単離され明らかとなったペプチドの配列とは５残基目のＴｈｒがＶａｌであること以外はほぼ一致した。以上からこれらのＥＳＴはＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトおよびラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしているものと推定した。
【００７７】
参考例１１  ＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするヒトｃＤＮＡの増幅と増幅ｃＤＮＡ配列の解読
参考例１０に述べたＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードすると推定されたＥＳＴ配列に基づいてプライマーを設計し、ヒト脳由来ｃＤＮＡよりＰＣＲによってＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするｃＤＮＡを増幅した。
ヒト脳由来poly (A) +RNA（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写反応には、RNase H活性を欠失させたMMLV由来の逆転写酵素であるReverTra Ace（トーヨーボー）を使用した。続いて参考例１０に述べたＥＳＴ配列に基づいて設計した配列番号：１２および配列番号：１３の合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型2μl、合成ＤＮＡプライマー各0.5μＭ、1.6mM dNTPs、LA Taq （タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は20μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、70℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、68℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを5回、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを20回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅産物の確認は、3％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
ＰＣＲ反応液を3％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いてＤＮＡを回収した。TOPO TAクローニングキット（インビトロゲン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR2.1-TOPOへサブクローニングした。これをEscherichia coli TOP10（インビトロゲン）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid KIt （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１４に示すＤＮＡ配列を得た。このこの配列から翻訳されるＧＰＲ８リガンドぺプチド前駆体タンパク質の一部（配列番号：１５）には予想どおりブタ視床下部より単離されて配列が明らかになった活性ペプチドに相当するペプチド配列が存在した。さらに、そのC末側には通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列は配列番号：１６および１７のいずれかもしくは両方であると推定された。
【００７８】
参考例１２  Fmoc化ヒトＧＰＲ８ ligand (1-23)：Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０５）およびヒトＧＰＲ８ ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１６）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Leu を導入したFmoc-Leu-O-Clt resin(0.76mmol/g) 0.25mmol を出発原料とし、ペプチド合成機ABI 433A を用い Fmoc/ DCC/ HOBt法により、Fmoc-Gly, Fmoc-Met, Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Thr(But), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(But), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-His(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Trp(Boc) の順に縮合を行い、Fmoc-Trp(Boc)-Tyr(But)-Lys(Boc)-His(Trt)-Val-Ala-Ser(But)-Pro-Arg(Pbf)-Tyr(But)-His(Trt)-Thr(But)-Val-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-O-Clt resin 830 mg を得た。
この樹脂150mgに TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)  5 ml を加え、室温にて 2時間振盪した後樹脂をろ去し、溶媒を濃縮後エーテルを加え、粗 Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu を沈殿として得た。これを YMC D-ODS-5-ST S-5 120A カラム(20 x 150mm)を用いた分取ＨＰＬＣで、A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルによるA/B: 72/28〜52/48への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末9.7mgを得た。
質量分析による(M+H)+   2805.7 (計算値2805.4)
ＨＰＬＣ溶出時間  25.1 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
得られた Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu  5 mg に 20% diethylamine / DMF 1 mLを加え室温にて 2 時間撹拌した。溶媒を留去後 YMC D-ODS-5-ST S-5 120A カラム(20 x 150mm)を用いた分取ＨＰＬＣで、A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルによるA/B: 74/26〜64/36への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末1.2mgを得た。
質量分析による(M+H)+  2583.6 (計算値2583.4)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.4 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【００７９】
参考例１３  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-30)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trp（配列番号：１７）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Trp(Boc) を導入したFmoc-Trp(Boc)-O-Clt resin(0.64mmol/g) 0.25mmol を出発原料として参考例１２と同様に配列順通りにアミノ酸を縮合、最後のTrpを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。 粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製しTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trpを得た。
質量分析による(M+H)+   3543.4 (計算値3544.2)
ＨＰＬＣ溶出時間  21.5 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【００８０】
参考例１４  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-29)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu（配列番号：２０）の製造
参考例１２の樹脂を用い参考例１３と同様に配列順にアミノ酸を縮合したのち樹脂からの切り出しと精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leuを得る。
【００８１】
参考例１５  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-28)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr（配列番号：２１）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Tyr(But) を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyrを得る。
【００８２】
参考例１６  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-27)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro（配列番号：２２）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Proを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Proを得る。
【００８３】
参考例１７  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-26)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser（配列番号：２３）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Ser(But)を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Serを得る。
【００８４】
参考例１８  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-25)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg（配列番号：２４）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Argを得る。
【００８５】
参考例１９  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-24)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg（配列番号：２５）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Argを得る。
【００８６】
参考例２０  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した23残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例１２で合成した23残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）と記載することがある）を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図３に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１６の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【００８７】
参考例２１  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例１３で合成した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）と記載することがある）を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図４に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１７の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【００８８】
参考例２２  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例１２で合成したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を種々の濃度で参考例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図５に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図中、 ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【００８９】
参考例２３  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例１３で合成したｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を種々の濃度で参考例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図７に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図７中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【００９０】
参考例２４  ＧＰＲ８ ligandの摂食行動に対する作用
Wistar雄性ラット（９週令）の側脳室（AP:8.1，L：1.8，H：7.1mm）にペントバルビタール麻酔下でガイドカニューレ（AG-8）を挿入した。その後、１週間以上回復させてから実験を行った。回復期間中、毎日ハンドリングを行い、脳室内投与時のストレスを軽減させた。
摂食実験は15:00から開始した。ラットに無麻酔、無拘束下でマイクロインジェクションカニューレを取り付け、PBSに溶解させた参考例１２で得たペプチド（配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）またはPBSのみを5μl/minで2分間投与した。投与終了後から１分後にマイクロインジェクションカニューレを取り外し、あらかじめ重量を計測しておいた餌（固形飼料  CE2：日本クレア）を自由に摂食させた。投与開始から時間を計測し、30、60、120分後に餌を計量して摂食量を求めた（図６）。
【００９１】
参考例２５  ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
参考例１１に記載したＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ヒトＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型とした5' RACE PCRを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCRクローニングは、ヒト視床下部Marathon-Ready cDNA (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：３３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：３４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はヒト視床下部ｃＤＮＡ 4μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：３３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・240秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：３４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを１７回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約1,200塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３５に示すＤＮＡ配列を得た。
【００９２】
参考例２６  ヒト脳ｃＤＮＡの作製
ヒト脳ｃＤＮＡは、Marathon TM  cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を用いてヒト脳poly A(+) RNA (CLONTECH)から作製した。RACE  PCRに供されるｃＤＮＡは1st strand cDNA合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。1st strand cDNAは、キットに添付の逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RNAse H)（RevTraAce,トーヨーボー）を用いて、1μgのヒト脳poly A(+) RNAから合成した。
【００９３】
参考例２７  ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
参考例１１に記載のヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト脳ｃＤＮＡを鋳型とした3' RACE PCRを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンドをコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ヒト脳 ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：３６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：３７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したヒト脳ｃＤＮＡ 1μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：３６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・240秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：３７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを１７回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３８に示すＤＮＡ配列を得た。
【００９４】
参考例２８  ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基に作製したプライマーとヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ヒト視床下部Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) 1μl、配列番号：３９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：４０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、2.5 mM MgCl2、5% DMSO、LATaqポリメラーゼ(タカラ)0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを３５回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４１に示すＤＮＡ配列を得た。
この配列（配列番号：４１）はヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOヒトＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human ＧＰＲ８ Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：４１に示すＤＮＡ配列には、参考例１１に記載したヒトＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在するが、その5'上流側にはタンパク質翻訳の開始コドンであると予想されるATGが存在しない。しかし、これまでに幾つかのタンパク質でATG以外のコドンを開始コドンとすることが予想されている例が報告されている（ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（H. Prats et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、1836-1840頁、1989年、R. Z. FlorkiewiczおよびA. Sommer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、3978-3981頁、1989年）、マウスレチノイン酸レセプターβ4（S. Nagpal et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、2718頁、1992年）、ヒトホスホリボシルピロリン酸合成酵素（M. Taira et al.、J. Biol. Chem.、265巻、16491-16497頁、1990年）、ショウジョウバエコリンアセチル転移酵素（H. Sugihara et al.、J. Biol. Chem.、265巻、21714-21719頁、1990年））。
これらの例ではＡＴＧに代わりＬｅｕをコードするＣＴＧが開始コドンとして仮定されていることが多い。ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質においても同様であると考え、後述のブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク質との比較からこれらの前駆体タンパク質における開始コドンと予想されるＡＴＧにほぼ対応する位置に存在するＣＴＧコドンを開始コドンと仮定し、前駆体タンパク質の配列を推定した。この仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４２に示した。また、仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図８に示した。
【００９５】
参考例２９  ブタ脊髄ｃＤＮＡの作製
ブタ脊髄ｃＤＮＡは、MarathonTM  cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を用いてブタ脊髄poly A(+) RNAから作製した。ブタ脊髄poly A(+) RNAは、ブタ脊髄から以下のように調製した。ブタ脊髄を、ISOGEN（日本ジーン）中にてポリトロンホモゲナイザーで完全に破砕し、この破砕溶液からISOGEN溶液を用いたtotal RNA調製法に従ってブタ脊髄total RNAを得た。次に、ブタ脊髄total RNAからmRNA Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech）に添付のoligo dT celluloseカラムを用いた クロマトグラフィーを２回行なうことにより、7μgのブタ脊髄poly A(+) RNAを得た。RACE  PCRに供したｃＤＮＡは1st strand cDNA合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。1st strand cDNAは、キットに添付の逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RNAse H)（RevTraAce,トーヨーボー）を用いて、１μｇのブタ脊髄poly A(+) RNAから合成した。
【００９６】
参考例３０  ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
１回目の5'RACE PCR クローニングと、そのＰＣＲ増幅 ＤＮＡの塩基配列を利用した２回目の5'RACE PCR クローニングにより、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのブタホモログ（以下、ブタＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。
１回目の5'RACE PCR クローニングは、上記ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：４３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：４４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 4μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：４３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：４４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを３回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを３回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを１５回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約300塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４５に示すＤＮＡ配列を得た。
２回目の5'RACE PCR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：４６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：４７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：４６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：４７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを2.0%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約200塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４８に示すＤＮＡ配列を得た。
【００９７】
参考例３１  ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流端の塩基配列を基に作製したプライマーを用いた3'RACE PCRクローニングにより、ブタＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：４９の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：５０の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：４９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、70℃・120秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：５０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを2.0%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約650塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-gal、IPTGを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５１に示すＤＮＡ配列を得た。
【００９８】
参考例３２  ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型として、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基に作製したプライマーとブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、配列番号：５２の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：５３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５４に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：５４）はブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOブタＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine ＧＰＲ８ Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：５４のＤＮＡ配列がコードするブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５５に示した。この前駆体タンパク質のアミノ酸配列には参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列は配列番号：５６および５７のいずれかもしくは両方であると推定された。ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図９に示した。
【００９９】
参考例３３  ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
参考例１０に記載したように、ＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ末端から１７アミノ酸配列（配列番号：６）に基づいてデータベース検索を行なったところ、配列番号：１１の塩基配列に合致するラットＥＳＴ塩基配列（アクセッション番号：H31598）が見出された。このＤＮＡ配列は１５アミノ酸の配列がブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）と同一となる翻訳枠を持っていた。このH31598は、ラットPC12細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー由来のＥＳＴ 配列であり、未確定な７塩基を含む２６０塩基からなる。このH31598はＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチド（以下、ラットＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されたのでその正確な塩基配列を決定するため、H31598の5'塩基配列と3'塩基配列を基に作製したそれぞれのプライマーでラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONTECH)を鋳型としたＰＣＲクローニングを行なった。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。ラット脳Marathon cDNA (CLONTECH) 2μl、配列番号：６０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：６１の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、次に96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクルを35回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを4.0%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約250塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６２に示すＤＮＡ配列を得た。ＰＣＲクローニングしたＤＮＡの塩基配列（配列番号：６２）とH31598の塩基配列との比較により、１塩基欠失の読み誤りがH31598の塩基配列にあることが明らかになった。
【０１００】
参考例３４  ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
5'RACE PCR クローニングによりラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCR クローニングは、ラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：６３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：６４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。 反応液はラット脳Marathon cDNA 2μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：６３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（I）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで２００倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：６４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH)  0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３１回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１０１】
参考例３５  ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流端の塩基配列を基に作製したプライマーおよびラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片配列を基に作製したプライマーを用いた3'RACE PCRクローニングにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：６６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番号：６７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Marathon-Ready cDNA 2μl、AP1プライマー0.5μM、配列番号：６６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで２００倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、AP2プライマー0.5μM、配列番号：６７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１０２】
参考例３６  ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット脳ｃＤＮＡを鋳型として、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基にしたプライマーとラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Marathon-Ready cDNA 1μl、配列番号：６９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：７０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約750塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：７１に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：７１）は、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOラットＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8 Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：７１のＤＮＡ配列がコードするラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：７２に示した。この前駆体タンパク質のアミノ酸配列には参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似した配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトあるいはブタホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列は配列番号：７３および７４のいずれかもしくは両方であると推定された。ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図１０に示した。
【０１０３】
参考例３７  マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
配列番号：５８の２３アミノ酸残基のブタＧＰＲ８リガンドペプチドをコードする塩基配列に基づいてデータベース検索を行なった。セレラ社マウスゲノムデータベースに対して検索を行なった結果、配列番号：５８の塩基配列に類似した塩基配列を含む配列番号：７７のマウスゲノム断片配列が見出された。この配列はＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ（以下、マウスＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコードするゲノム断片配列であることが予想された。
マウス精巣ｃＤＮＡを鋳型として、このマウスゲノム断片配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行ない、増幅ＤＮＡの塩基配列を決定した。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。マウス精巣ｃＤＮＡ (CLONTECH) 1μl、配列番号：７８の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：７９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（I）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを10回繰り返し、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約350塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：８０）。ここに得られたＰＣＲクローニングしたｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：８０）は、配列番号：７８および配列番号：７９のプライマーに用いた２つの塩基配列に挟まれたマウスゲノム断片塩基配列に完全に一致した。
【０１０４】
参考例３８  マウス脳ｃＤＮＡの作製
マウス脳ｃＤＮＡは、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を用いてマウス脳poly A(+) RNA (CLONTECH)から、キットに添付のプロトコールに従って作製した。合成した1st strand cDNA溶液を、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１０倍に希釈し、この溶液をRACE PCR反応に供した。
【０１０５】
参考例３９  マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流端のクローニング
5'RACE PCR クローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCR クローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cDNA Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配列番号：８１の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNested Universal Primerと配列番号：８２の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。 反応液はマウス脳ｃＤＮＡ 1μl、Universal Primer Mix 2μl、配列番号：８１の合成ＤＮＡプライマー0.2μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液0.5μl、Nested Universal Primer 0.5μM、配列番号：８２の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約300塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８３に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１０６】
参考例４０  マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流端のクローニング
3'RACE PCRクローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cDNA Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配列番号：８４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNested Universal Primerと配列番号：８５の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ 1μl、Universal Primer Mix 2μl、配列番号：８４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液0.5μl、Nested Universal Primer 0.5μM、配列番号：８５の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８６に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１０７】
参考例４１  マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を基にしたプライマーとマウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ 0.5μl、配列番号：８７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：８８の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、1.6 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.2μlおよび酵素に付属のGC（I）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを４０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア  コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８９に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：８９）は,マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするため、このＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOマウスＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8 Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：８９に示すＤＮＡ配列には、参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似したアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在する。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体の場合と同様に、その5'上流側にはタンパク質翻訳の開始コドンであると予想されるATGが存在しない。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質において推測されたように、ブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク質との比較からこれらの前駆体タンパク質における開始コドンと予想されるATGにほぼ対応する位置に存在するCTGコドンを開始コドンと仮定し、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の配列を推定した。この仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：９０に示した。マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列と予想される配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒト、ブタあるいはラットホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列は配列番号：９１および９２のいずれかもしくは両方であると推定された。なお、配列番号：９１の２３残基型マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列は、２３残基型ラットＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列（配列番号：７３）と一致している。仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図１１に示した。
【０１０８】
参考例４２  ラクトパーオキシダーゼ法を用いた [125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23) および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)の作製
ＤＭＳＯ 5μlに溶かしたhＧＰＲ８L(1-23)（配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド） 1 nmolを0.1 M 塩化ニッケル5μl と混合し、 0.1 M HEPES (pH 7)に溶かした 0.001% 過酸化水素水 10μl、0.1 M HEPES (pH 7)に溶かしたラクトパーオキシダーゼ (シグマ社) 10μg/ml を10μlおよび [125I] NaI 37 MBq (NENライフサイエンスプロダクツ社) 10μlを混合後、室温で６０分反応し、以下の条件でＨＰＬＣ分取した。
用いたカラムは、ODS-80TM (4.6 mm x 15 cm)(トーソー社)、溶出液Aとして10% アセトニトリル/0.1% TFA、溶出液Bとして60% アセトニトリル/0.1% TFA を用い、0-0 (2 min)、0-30 (3 min)、30-38 (5 min)、38-43 (55 min) %B/A+B  のグラディエント溶出法を行なった。流速は1 mL/min、カラム温度は２５℃、検出は220nmの吸光度を用いて行った。
hＧＰＲ８L(1-23)には、チロシン残基が２つ存在するので、ヨード化によって、[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)および [125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)が生成する。このＨＰＬＣ条件では、hGPR8L(1-23)が24分、[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)が30分、[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)が32分付近に溶出した。
【０１０９】
参考例４３  [125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いたレセプター結合実験
参考例４２に記載したように作製した[125I]-標識hＧＰＲ８L(1-23)および参考例６に記載した方法と同様にしてヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いてレセプター結合実験を行なった。
ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、0.05% CHAPS（３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン硫酸）、0.1％ BSA（ウシ血清アルブミン）、0.25 mM PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオライド）、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチン、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Falcon 2053）に200μlずつ分注した。最大結合量（TB）を測定するために2μlのＤＭＳＯと7 nMの[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)または[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合（NSB）を測定するために100μM hGPR8L(1-23)のＤＭＳＯ溶液2μlと7 nMの[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)または[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。25 ℃で60分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（GF-F）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ-カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量（SB）を見積もった。[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)を用いた場合に比べて[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いた方が、特異的結合量が２倍多かったので実際の結合実験には[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いた。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)の特異的な結合が認められた。また、膜画分濃度を5μg/ｍｌに設定して阻害率（％） からhGPR8Ｌ(1-23)の50％阻害濃度（IC50値）を算出したところ、IC50値は0.25 nMであった。図１２に種々の濃度におけるhGPRL(1-23)の結合阻害を示す。
【０１１０】
参考例４４  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：９５）の製造
参考例１２の化合物0.45 mg を 50% 酢酸水0.5 mlに溶解後、0.3%過酸化水素水0.05 mlを 加え、室温にて8時間放置した。減圧濃縮後SepPakにより精製し、白色粉末0.443 mgを得た。
質量分析による(M+H)+：2599.2 (計算値2599.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：19.1 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１１１】
参考例４５  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-22)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly（配列番号：９６）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33 mmol/g) にFmoc-Gly を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１１２】
参考例４６  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-21)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met（配列番号：９７）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)にFmoc-Met を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１１３】
参考例４７  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-20)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu（配列番号：９８）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2282.8 (計算値2282.6)
ＨＰＬＣ溶出時間：17.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１１４】
参考例４８  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-19)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu（配列番号：９９）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2169.6 （計算値2169.5）
ＨＰＬＣ溶出時間：16.4 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１１５】
参考例４９  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-18)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly（配列番号：１００）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Glyを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2056.8 （計算値2056.3）
ＨＰＬＣ溶出時間：14.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１１６】
参考例５０  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-17)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala（配列番号：１０１）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Alaを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１１７】
参考例５１  ヒトＧＰＲ８ ligand (1-16)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala（配列番号：１０２）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Alaを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１１８】
参考例５２  ブタＧＰＲ８ ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：５６）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析による(M+H)+：2585.2 (計算値2585.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：20.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１１９】
参考例５３  ラット／マウスＧＰＲ８ ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leuの製造（配列番号：７３および配列番号：９１）
参考例５２と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得ることができる。
【０１２０】
参考例５４  ブタＧＰＲ８ ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０３）の製造
参考例５２の化合物を用い参考例４４と同様に酸化して目的物を得た。
質量分析による(M+H)+：2601.3 (計算値2601.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：18.9 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１２１】
参考例５５  ラット／マウスＧＰＲ８ ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０４）の製造
参考例５３の化合物を用い参考例４４と同様に酸化して目的物を得ることができる。
【０１２２】
参考例５６  [Nα-Acetyl-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：Ac-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０６）の製造
参考例１２で調製した樹脂のFmoc基を除去、無水酢酸でアセチル化した後、TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。 粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による (M+H)+   2626.12625.8 (計算値2627.12626.1)
ＨＰＬＣ溶出時間  21.4 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ    直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２３】
参考例５７  ヒトＧＰＲ８ ligand (2-23)： Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０７）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のTyrを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   2397.1 (計算値2397.3)
ＨＰＬＣ溶出時間  19.9 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２４】
参考例５８  ヒトＧＰＲ８ ligand (4-23)： His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０８）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のHisを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   2106.0 (計算値2106.1)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.0 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２５】
参考例５９  ヒトＧＰＲ８ ligand (9-23)： Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０９）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   1615.0 (計算値1614.9)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.2 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２６】
参考例６０  ヒトＧＰＲ８ ligand (15-23)： Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１０）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   901.4 (計算値901.5)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.2 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２７】
参考例６１  [N-Acetyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-23)：Ac-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１１）の製造
参考例５７で調製した樹脂を無水酢酸でアセチル化した後、参考例５７と同様に処理、精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   2439.3 (計算値2439.3)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.2 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２８】
参考例６２  [D-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：D-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１２）の製造
参考例１２のFmoc-Trp(Boc)の代りにFmoc-D-Trp(Boc)を用い同様に目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   2583.4 (計算値2583.4)
ＨＰＬＣ溶出時間  20.6 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１２９】
参考例６３  [N-3-Indolepropanoyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-23)：3-Indolepropanoyl-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１３）の製造
参考例12のFmoc-Trp(Boc)の代りに3-Indolepropionic acidを用い所望の樹脂を得、此れをTFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol  (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+   2568.4 (計算値2568.4)
ＨＰＬＣ溶出時間  21.7 分
溶出条件
カラム  Wakosil-II 5C18 HG   (4.6 x 100mm)
溶離液  A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ  直線型濃度勾配溶出(35分)
流速  1.0ml/分
【０１３０】
参考例６４  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のＧＴＰγＳ結合促進活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。測定した誘導体の配列番号とＧＴＰγＳ結合促進活性を表１に示した。なお、活性は50％有効濃度（EC50値）で示した。また、参考例２０および２１に記載のhＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)のＧＴＰγＳ結合促進活性も合わせて記載した。
【０１３１】
参考例６５  ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性を参考例４３に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定した。測定した誘導体の配列番号とレセプター結合活性を表１に示した。なお、レセプター結合活性は50％結合阻害濃度（IC50値）で示した。また、参考例４３に記載のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のレセプター結合活性も合わせて記載した。
【０１３２】
【表１】
0004284034.tif 000002
【０１３３】
参考例６６  ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ７  ＤＮＡの増幅
ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：１２６および配列番号：１２７）を用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーはレセプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5'側に制限酵素Cla Iの認識する塩基配列が付加され、3'側に制限酵素Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、5'側および3'側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タカラ）0.5μg、合成ＤＮＡプライマー各1μM、0.8 mM dNTPs、1 mM MgCl2、KODポリメラーゼ（トーヨーボー）1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、94℃・60秒の加熱の後、98℃・15秒、65℃・2秒、74℃・30秒のサイクルを35回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8%アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１３４】
参考例６７  ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認
参考例６６で行なったＰＣＲ反応液を0.8%の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。pCR-ScriptTM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5αcompetent cell（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体Escherichia coli DH5α/GPR7を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。調整したＤＮＡの一部に対して制限酵素Cla IおよびSpe Iによる切断を行ない、挿入されているレセプターＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems社)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：１２８）。配列番号：１２８で表される塩基配列を有するＤＮＡを保持するpCR-Script Amp SK(+)プラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR7と命名した。配列番号：１２８で表される塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：１２９に示した。また、ヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を図１３に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列はO'Dowdらの報告（O'Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：１２８の893番目および894番目に当たり、O'Dowdらの報告ではそれぞれCおよびGであるが、本参考例ではGおよびCであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：１２９の296番目のアミノ酸が、O'Dowdらの報告のThrが本実施例ではSerとなる。
【０１３５】
参考例６８  ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例６７で配列が確認されたヒトＧＰＲ７の全長アミノ酸配列をコードし5'側にCla I認識配列を付加し、また3'側にSpe I認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたEscherichia coliのクローンからPlasmid Midi KIt（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整し、これを制限酵素ClaIおよびSpe Iで消化してインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。このインサートＤＮＡをClaIおよびSpe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H （Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta、1219巻、251-259頁、1994年、記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加え、T4ライゲース（タカラ）を用いてライゲーションを行ない、タンパク質発現用プラスミドpAKKO-Human GPR7を構築した。このプラスミドpAKKO-Human GPR7で形質転換した大腸菌をDH5α/pAKKO-Human GPR7と命名した。
pAKKO-Human GPR7で形質転換したEscherichia coli DH5α（トーヨーボー）を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてpAKKO-Human GPR7プラスミドＤＮＡを調整した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ dhfr-細胞に導入した。3μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、２４時間前に5 x 105または1 x 106個のCHO dhfr-細胞を播種した直径6 cmシャーレに添加した。10%ウシ胎児血清を含むMEMα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である10%透析ウシ胎児血清を含む核酸不含MEMα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー24クローンを選択した。
【０１３６】
参考例６９  TaqMan PCR法を用いたヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞株のヒトＧＰＲ７遺伝子発現量の測定
参考例６８に従って作製したヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞株24クローンを各25 cm2フラスコに培養し、増殖した細胞からISOGEN（ニッポンジーン社）を用いてtotal RNA画分を調製した。このtotal RNA画分に対してMessageClean (Gen Hunter社)キットを用いたDNase I処理を行ない、ＤＮＡを含まないtotal RNAを得た。
Total RNA を鋳型としたｃＤＮＡ合成は、TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems 社)キットを用いて行なった。反応液の組成は、DNase I処理したtotal RNA 4μg、ランダムプライマー1μl、25 mM MgCl2溶液4.4μl、10 mM dNTP mix 2μl、RNase Inhibitor 0.4μl、逆転写酵素0.5μlおよびキットに付属の反応バッファーで、総反応量を20μlとした。逆転写反応はサーマルサイクラー（タカラ）を用いて、25℃・10分、48℃・30分、95℃・5分の条件で行なった。
標準ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡは、全長ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅ＤＮＡを精製することにより調製された。ＰＣＲ反応液の組成は、参考例６７に記載のpCR-ScriptヒトGPR7 5pg、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１３０）0.5μM、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１３１）0.5μM、1.6 mM dNTPs、2.5 mM MgCl2、LATaqポリメラーゼ（タカラ）0.5μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のための反応はサーマルサイクラー（Applied Biosystems 社）を用い、94℃・120秒の加熱の後、94℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃・10分間保温した。ＰＣＲ反応液を0.8%のアガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）を用いてＰＣＲ増幅ＤＮＡを回収した。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ溶液に混入しているプライマーＤＮＡおよびdNTPsを取り除くため、このＤＮＡ溶液をクロモスピンカラム４００(CLONTECH社)ゲルクロマトグラフィーに供し、増幅ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡ溶出画分を得た。この増幅ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡ溶液の260 nmの吸収から計算されたＤＮＡ量と増幅ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡ塩基組成から、本増幅ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡのコピー数が算出された。このＤＮＡコピー数が明らかとなった増幅ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡを標準ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡとして、定量を目的としたTaqMan PCRに用いることにした。
【０１３７】
ヒトＧＰＲ７ＣＨＯ細胞株の発現ヒトＧＰＲ７遺伝子コピー数は、TaqMan PCR法により決定された。TaqMan PCR反応液の組成は、蒸留水で１００倍希釈した逆転写ｃＤＮＡ溶液 1μlまたは種々のコピー数の標準ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡ溶液 1μl、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１３２）0.2μM、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１３３）0.2μM、ヒトＧＰＲ７ TaqManプローブ〔 配列番号：１３４（Fam-TTCATCCTCA ACCTGGCCAT CGC-Tamra；配列中、Famは6-carboxy-fluoresceinを、Tamraは6-carboxy-tetramethyl-rhodamineを、それぞれ示す。)で表される塩基配列を有するプローブ〕0.2μMおよびTaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社)で、総反応量を25μlとした。ＰＣＲ反応は、ABI PRISM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems社)を用い、50℃・2分、95℃・10分で保温し、次に95℃・15秒、60℃・60秒のサイクルを40回繰り返すことにより行なった。ヒトＧＰＲ７遺伝子発現量はABI PRISM 7700 SDSソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が、設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、種々の標準ヒトＧＰＲ７ ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線より逆転写ｃＤＮＡに含まれるヒトＧＰＲ７ ｃＤＮＡのコピー数を算出し、total RNA 1ng当たりのヒトＧＰＲ７遺伝子発現量を決定した。ヒトＧＰＲ７遺伝子発現量の高いクローンNo. 7, 8および 14を、ヒトＧＰＲ７遺伝子高発現細胞株として選択した。
【０１３８】
参考例７０  ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定参考例６８で作製し、参考例６９に記載したようにして選択したヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x 104 cell/wellで播種し、48時間培養した。細胞を0.2 mM  3−イソブチル−メチルキサンチン、0.05%  BSA（ウシ血清アルブミン）および20 mM HEPESを含むMEMαバッファー(pH7.4)で洗浄した（以下、0.2 mM  3−イソブチル−メチルキサンチン、0.05%  BSAおよび20 mM HEPESを含むMEMαバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5 mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料と2μMフォルスコリンを含む0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加え、37℃で30分間反応させた。100μlの20％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、 cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【０１３９】
参考例７１
（１）[Phe2]ヒトＧＰＲ８リガンド(1-20): Trp-Phe-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu（配列番号：１３５）の製造
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機（ＡＢＩ ４３３モデル）を使用し、プログラムに従ってＣ端より逐次Ｆｍｏｃ法によりペプチド鎖を延長し目的の保護ペプチド樹脂の合成を行った。
出発アミノ酸樹脂担体はWang（p-benzyloxybenzyl alcohol）樹脂（0.25 mmol）を使用し、Fmoc-Leu、Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Val、Fmoc-Thr(But)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Tyr(But)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(But)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp(Boc)のFmocアミノ酸誘導体をHBTU（2−（1H−ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）によりシークエンスにしたがって逐次縮合した。
樹脂上へのペプチドの構築が終了後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護処理とペプチドの樹脂担体からの切り離しはTFA処理によって行なった。得られた粗ペプチドは0.1% TFA水によって抽出し、凍結乾燥により粉末固体として得た。続いて、粗ペプチドを逆相高速クロマトグラフィー（島津製作所、分取装置:モデルＬＣ８Ａ）によりアセトニトリル−0.1% TFA水の系（15-35％、80分）を用いて分取精製を行なって目的とする精製ペプチド35 mgを得た。
精製物を0.2% ３−（２−アミノエチル）インドールを含む4N メタンスルホン酸によって110℃・22時間の条件で加水分解して得た加水分解物のアミノ酸分析値は（括弧内は理論値）以下のとおり。
Thr (1) 0.93, Ser (1) 0.92, Gly (2) 2.03, Ala (3) 3.09, Val (2) 1.90, Leu (2) 2.02, Tyr (1) 1.02, Phe (1) 1.00, His (2) 1.91, Lys (1) 0.98, Trp (1) 0.88, Arg (2) 2.06, Pro (1) 1.02
純度はＨＰＬＣにより98.8%と算出された。また、質量分析値は2266.6（理論値2266.6）であった。
【０１４０】
（２）ラクトパーオキシダーゼ法を用いた[Phe2,125I-Tyr10]ヒトＧＰＲ８リガンド(1-20)の作製
ＤＭＳＯ 10μlに溶かした、上記（１）に記載した製法に準じて得られた[Phe2] ヒトＧＰＲ８リガンド(1-20)（配列番号：１３５）10 nmolを、0.1 M塩化ニッケル水溶液10μl、0.1 M HEPES (pH 7.6)に溶かした0.001%過酸化水素水10μl、0.1 M HEPES (pH 7.6)に溶かしたラクトパーオキシダーゼ (シグマ社) 10μg/mlを10μl、および[125I]NaI 40 MBq（NENライフサイエンスプロダクツ社）10μlを混合して室温で50分間反応させた後、生成した[Phe2, 125I-Tyr10] ヒトGPR8リガンド(1-20)を以下の条件のＨＰＬＣにより分取した。
用いたカラムは、ODS-80TM (4.6 mm x 15 cm)(トーソー社)、溶出液Aとして10%アセトニトリル/0.1% TFA、溶出液Bとして60%アセトニトリル/0.1% TFAを用い、0-0 (2 min)、0-27 (5 min)、27-32 (40 min) %B/A+Bのグラディエント溶出法を行なった。流速は1 mL/min、カラム温度は40℃、検出は215 nmとした。このＨＰＬＣ条件では、[Phe2, 125I-Tyr10] ヒトＧＰＲ８リガンド(1-20)は25分付近に溶出した。
【０１４１】
実施例１  ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した２３残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
hＧＰＲ８L(1-23)（配列番号：１６）またはhＧＰＲ８L(1-30)（配列番号：１７）を種々の濃度で、参考例７０に記載した方法に従い、ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に投与して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図１４に示す。図中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を100％として、hＧＰＲ８L(1-23) またはhＧＰＲ８L(1-30)を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
明らかにhＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)は濃度依存的にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。このことからhＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)が、ヒトＧＰＲ７に対するリガンドであることが明らかとなった。ｃＡＭＰ産生量から50％阻害濃度（IC50値）を算出したところ、hＧＰＲ８L(1-23)のIC50値は0.025 nMであった。また、hＧＰＲ８L(1-30)のIC50値は0.13 nMであった。
hＧＰＲ８L(1-23)のブタ、ラットおよびマウスのホモログ（配列番号：５６、配列番号：７３および配列番号：９１）およびhＧＰＲ８L(1-30)のブタ、ラットおよびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：７４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の反応を確認できる。
【０１４２】
実施例２  [125I-Tyr10]-hＧＰＲ８L(1-23)を用いたレセプター結合実験
参考例４２に記載した方法により作製した[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)およびヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いてレセプター結合実験を行なった。
最初に膜画分の調製法を以下に記載する。
1 x 108個のヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に10  mlのホモジネートバッファー（10  mM NaHCO3、5  mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、0.5  mM PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオライド）、1μg/ml ペプスタチン、4μg/ml E64、20μg/ml ロイペプチン）添加し、ポリトロン（12,000 rpm、1分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（1,000 g、15分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Beckman type 30ローター、30,000 rpm, 1時間）し、得られた沈殿物をヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
このようにして製された細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、0.05% CHAPS（3−〔（3−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−1−プロパン硫酸）、0.1％ BSA、0.5 mM PMSF、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチン、4μg/ml E-64、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Falcon 2053）に200μlずつ分注した。最大結合量を測定するために2μlのＤＭＳＯと8 nMの[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために1 mM hＧＰＲ８L(1-23)のＤＭＳＯ溶液2μlと8 nMの [125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。25 ℃で75分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（GF-F）を用いて反応液を吸引ろ過しさらにフィルターを洗浄用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、0.05% CHAPS、0.1％ BSA、pH 7.4）1.5 mlで2回洗浄した。ろ過後、γ-カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。
膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)の特異的な結合が認められた。膜画分濃度を10μg/mlに設定してhＧＰＲ８L(1-23)および hＧＰＲ８L(1-30)による[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)のヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を調べた。阻害率から50％阻害濃度（IC50値）を算出したところ、hGPR8L(1-23)のIC50値は0.099 nMであった。また、hＧＰＲ８L(1-30)のIC50値は0.025 nMであった。
これより、hＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)がヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分に対して高い親和性を有することが示された。このことは、hＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)がヒトＧＰＲ７レセプターの高親和性リガンドであることを意味するものである。図１５に、種々の濃度におけるhＧＰＲ８L(1-23)および hＧＰＲ８L(1-30)の結合阻害を示す。
hＧＰＲ８L(1-23)のラットおよびマウスのホモログ（配列番号：７３および配列番号：９１）およびhＧＰＲ８L(1-30)のブタ、ラットおよびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：７４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様に[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)のヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を確認できる。
【０１４３】
実施例３
１）ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する[35S]-guanosine 5'-(γ-thio)triphosphate（ＧＴＰγＳ）の結合促進活性を以下の方法により測定した。
実施例２に記載の方法により調製したＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（50mM トリス塩酸緩衝液（pH7.4）、5 mM MgCl2、150 mM NaCl、1μM GDP、0.1％  BSA）で希釈して、タンパク質濃度30 μg/mlのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液200 μlに、50 nM濃度の[35S]-guanosine 5'-(γ-thio)triphosphate（NEN社）を2 μlと適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料2 μlとを添加し、この混合液を25℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.4）、5 mM MgCl2、1mM EDTA、0.1% BSA）1.5 mlで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
２）ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したhＧＰＲ８L(1-23)またはhＧＰＲ８L(1-30)のＧＴＰγＳ結合促進活性
hＧＰＲ８L(1-23)またはhＧＰＲ８L(1-30)を種々の濃度で、上記１）に記載した方法に従い、ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。
結果を図１６に示す。
これより明らかに、hＧＰＲ８L(1-23)およびhＧＰＲ８L(1-30)は濃度依存的にＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。
ＧＴＰγＳ結合促進活性から50％有効濃度（EC50値）を算出したところ、hＧＰＲ８L(1-23)のEC50値は0.74 nMであった。また、hＧＰＲ８L(1-30)のEC50値は0.67 nMであった（表２）。
hＧＰＲ８L(1-23)のラットおよびマウスのホモログ（配列番号：７３および配列番号：９１）およびhＧＰＲ８L(1-30)のブタ、ラットおよびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：７４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の反応を確認できる。
【０１４４】
実施例４  ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体を、種々の濃度で、実施例３に記載した方法でＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。
測定した誘導体の配列番号およびＧＴＰγＳ結合促進活性を表２に示す。活性は、５０％有効濃度（ＥＣ50値）で示した。
【０１４５】
【表２】
0004284034.tif 000003
【０１４６】
実施例５  ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性
参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性を、実施例２に記載した方法でＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いて測定した。
測定した誘導体の配列番号およびレセプター結合活性を表２に示す。レセプター結合活性は５０％結合阻害濃度（ＩＣ50値）で示した。
【０１４７】
実施例６  ［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）とヒトＧＰＲとの結合を変化させる化合物のスクリーニング法
参考例７１に記載した方法によって作製した［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）および実施例２に記載した方法により調製されたＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いてレセプター結合実験を行ない、被検化合物の結合阻害活性を測定することができる。
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分をアッセイ用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、0.05% CHAPS、0.1％ BSA、0.5 mM PMSF、1μg/ml ペプスタチン、4μg/ml E-64、20μg/ml ロイペプチン、pH 7.4）で１５μｇ／ｍｌに希釈後、ポリプロピレン製試験管（Falcon 2053）に２００μｌずつ分注する。最大結合量を測定するために、２μｌのＤＭＳＯおよび７ｎＭ  ［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアッセイ用バッファー溶液2μlを膜画分溶液に添加する。また、非特異的結合を測定するために１００μＭ  ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌおよび７ｎＭ［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアッセイ用バッファー溶液2μlを膜画分溶液に添加する。さらに、被検化合物の結合阻害活性を測定するために、種々の濃度に希釈した被検化合物のＤＭＳＯ溶液２μｌおよび７ｎＭ  ［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアッセイ用バッファー溶液２μｌを膜画分溶液に添加する。２５℃で７５分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ／Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過する。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を減じて特異的結合量を見積もる。被験化合物のＧＰＲ７レセプターに対する結合阻害活性（阻害率、％）は、最大結合量（ＴＢ）から被検化合物および［Ｐｈｅ2，125Ｉ−Ｔｙｒ10］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）を加えたときに濾紙上に残った放射活性（Ｘ）を減じた値の特異的結合量（ＳＢ）に対する比率（（ＴＢ−Ｘ)／ＳＢ×１００（％））で示される。
【０１４８】
実施例７  ヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を変化させる化合物のスクリーニング法
参考例７０に記載した方法に従って、反応用バッファー溶液とした２５０ｎＭのヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）（配列番号：１６）２μｌおよび種々の濃度の被検化合物ＤＭＳＯ溶液２μｌを同時にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に投与することによりヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
被検化合物の、ヒトＧＰＲ８リガンドによるヒトＧＰＲ７発現細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性に対する作用は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量からヒトＧＰＲ８リガンドのみを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量からヒトＧＰＲ８リガンドおよび被検化合物を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量減じた量を％として表わす。被検化合物がヒトＧＰＲ８リガンドの作用を抑制する場合は、その値が１００％以下となり、被検化合物がヒトＧＰＲ８リガンドの作用を増強する場合は、その値が１００％以上となる。
【０１４９】
実施例８  ヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を変化させる化合物のスクリーニング法
実施例３に記載した方法に従って、１００ｎＭのヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）（配列番号：１６）ＤＭＳＯ溶液２μｌおよび種々の濃度の被検化合物ＤＭＳＯ溶液２μｌを同時にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞より調製したアッセイ用膜画分溶液に投与することによりヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
被検化合物の、ヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性に対する作用は、ヒトＧＰＲ８リガンドを添加したときの放射活性からＤＭＳＯ ２μｌのみを添加したときの放射活性を減じた量を１００％としてヒトＧＰＲ８リガンドおよび被検化合物を加えたときの放射活性からＤＭＳＯ ２μｌのみを添加したときの放射活性を減じた量を％として表わす。被検化合物がヒトＧＰＲ８リガンドの作用を抑制する場合は、その値が１００％以下となり、被検化合物がヒトＧＰＲ８リガンドの作用を増強する場合は、その値が１００％以上となる。
【０１５０】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られるうる化合物またはその塩は、低毒性で、例えば拒食症の予防・治療剤、食欲（摂食）促進剤、肥満症〔例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など〕の予防・治療剤、摂食亢進症の予防・治療剤などとして有用である。なかでも、本発明のレセプターアンタゴニストは、抗肥満薬として有用である。さらに、本発明のレセプター本発明のレセプターおよび該レセプターをコードするポリヌクレオチドは、例えば、拒食症の予防・治療剤、食欲（摂食）促進剤等として有用である。本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、拒食症または肥満症の診断に有用である。さらに、本発明のレセプターの抗体およびアンチセンスヌクレオチドは、抗肥満薬およひ診断薬として有用である。
【０１５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＧＰＲ８レセプタータンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ８レセプタータンパク質の全アミノ酸配列を示す。
【図２】  Wakosil-II 3C18HGカラムを用いたＧＰＲ８リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と各ピークのＧＴＰγＳ活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された。
【図３】  種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図４】  種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図５】  種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図６】  ＧＰＲ８リガンドペプチドの摂食量に対する作用を示す。各値は平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０）。
【図７】  種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図８】  ＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体レセプタータンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのヒトホモログペプチドの配列を□で示す。
【図９】  ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体レセプタータンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのブタホモログペプチドの配列を□で示す。
【図１０】  ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体レセプタータンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチドの配列を□で示す。
【図１１】  ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体レセプタータンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのマウスホモログペプチドの配列を□で示す。
【図１２】  ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた、［125Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドに対する２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドの結合阻害活性を示す図を示す。
【図１３】  ヒトＧＰＲ７ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ７の全アミノ酸配列を示す。
【図１４】  種々の濃度の２３残基および３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ７細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図１５】  ［125Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活性を示す図を示す。
【図１６】  ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＣＨＯ／ＧＰＲ７細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す図である。図中、−●−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−■−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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