(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応生成物としてグルコースを得る酵素反応において、セルラーゼがAcremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、さらにAspergillus属の菌が生産する、エンドグルカナーゼ（CMCase）活性が加圧状態で向上するセルラーゼ製剤を混合した酵素組成物からなり、酵素反応を１００〜１５０ＭＰａで行うことを特徴とする、酵素処理法。
【請求項２】
Acremonium属の菌がAcremonium  sp. Y-94であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素処理方法に関し、詳しくは、加圧下に酵素反応を行うことを特徴とする、酵素処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、海洋・湖沼・河川・土壌などの環境汚染の改善、及びそれと関連してバイオマス資源などの環境保全エネルギーの開発が大きな関心となっている。バイオマス資源として、もみがらや木材、サトウキビなどの植物が利用されるが、これらに存在するセルロースやリグニンが難分解性であるゆえ、植物の利用を阻む原因となっており、これらを効率よく分解する手段が必要である。
セルロースを酵素により分解してグルコースを製造することは公知であり、このような酵素は一般にセルラーゼと称されている。セルラーゼには、（１）セルロースの固い結晶領域を非還元末端からエキソ型に加水分解しセロビオースを生成するセロビオヒドロラーゼ（アビセラーゼ）活性、（２）セルロースの非結晶領域をエンド型に加水分解しセルロース分子の低分子化と各種のセロオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ（CMCase）活性、（３）セロビオースやセロオリゴ糖をグルコースに分解するβ−グルコシダーゼ活性、の３種の酵素活性が含まれており、この３種の活性によりセルロースはセロビオースやセロオリゴ糖を経てグルコースにまで分解される。
従来のセルラーゼを使用したセルロースの分解反応は、常圧下に酵素の活性を損なわない温度で行われるものであり、反応に時間がかかる。また酵素を安定な状態で作用させることが困難であることから収率も劣り、実用レベルに到達するものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、環境保全と資源の有効活用の観点から、セルロース廃棄物の効果的な処理法や再資源化法の開発が望まれるところである。
従って、本発明は、セルラーゼを使用したセルロースの酵素分解処理を短時間で効率良く行う方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、セルラーゼによるセルロースの酵素分解反応をはじめ、各種酵素による酵素反応を加圧下に行うことにより、基質を効率よく変換して酵素反応生成物を得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
（１）  セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応生成物としてグルコースを得る酵素反応において、セルラーゼがAcremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、さらにAspergillus属の菌が生産する、エンドグルカナーゼ（CMCase）活性が加圧状態で向上するセルラーゼ製剤を混合した酵素組成物からなり、酵素反応を１００〜１５０ＭＰａで行うことを特徴とする、酵素処理法。
（２）Acremonium属の菌がAcremonium  sp. Y-94であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）  粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明においては、基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物を得る酵素反応を、加圧下に行う。具体的には、酵素反応を０．２〜１，０００MPa、好ましくは１０〜５００MPa、特に好ましくは１００〜１５０Mpaの加圧下に行う。当該範囲の圧力に加圧することにより、酵素が活性化されるとともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での反応が可能となる。圧力が上記範囲よりも高い場合には、酵素が失活し、反応効率が低下し、また、圧力が上記範囲よりも低い場合には、所望の程度にまで反応効率が向上せず、好ましくない。
【０００７】
本発明において使用する酵素としては、代表的にはセルラーゼを挙げることができるがこれに限定されるわけではなく、グルコアミラーゼ、タンナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ等の加水分解酵素のほか、各種の酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵素、除去付加酵素、合成酵素をも同様に使用することができる。また、これらの酵素の起源は、微生物、植物、動物由来のいずれであってもよく、市販品を利用してもよい。
【０００８】
例えば、セルラーゼを使用する場合、一般にセルラーゼとして知られた酵素であれば特に制限なく使用できるが、Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系、特にAcremonium  sp. Y-94が生産するセルラーゼ系が好適に使用できる。
【０００９】
また、上記Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、CMCase活性が加圧状態で向上する酵素を混合した酵素組成物を使用すると、セルロースの酵素分解反応の効率が一段と向上するので好ましい。CMCase活性が加圧状態で向上する酵素としては、例えばAspergillus属の菌が生産する酵素が挙げられる。
【００１０】
このような酵素混合物を使用する場合には、酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する酵素とCMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比を、CMCase活性当量として７：５０〜５０：７になるように混合とすることが例示される。
【００１１】
本発明において、酵素を作用させる基質としては、酵素により加水分解、酸化還元、転移、異性化、除去付加、合成反応を触媒され、酵素反応生成物を生じるものであれば、特に制限はない。例えば、上記各酵素に対応してセルロース、デンプン、タンニン酸、フィチン酸、タンパク質、キチン等を挙げることができる。
例えば、基質がセルロースの場合は、具体的には、樹木、廃木材、紙、麦わら等各種の天然セルロース類を使用することができる。
【００１２】
また、基質の形状やサイズも特に制限はないが、酵素反応を効率良く行わせるためには、粉末状、シート状又は粒状に加工したものを使用することが好ましい。
【００１３】
基質と酵素の混合割合は、各酵素反応において任意に選択することができるが、例えばセルロースの場合、濾紙等の分解すべき基質１ｇに対して、CMCase活性当量として０．０００５〜１０，０００国際単位（IU）程度の酵素を使用することができる。
【００１４】
また、本発明による酵素処理は、通常の加圧に耐える化学反応容器中でバッチ式、半連続式、連続式等任意の状態で行うことができる。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（活性測定）
以下の実施例（比較例）１〜３では、酵素活性の測定は、酵素反応によってセルロースが、ｐＨ４．５，５０℃，０．１MPa（常圧）の条件下で、１分間に１マイクロモルの還元糖を遊離せしめる酵素量を１国際単位（IU）と定め、反応終了後加熱失活させた反応上清液を一部採り、一定倍率に希釈し酵素反応により遊離した還元糖をSomogyi-Nelson法で定量することによって行った。
【００１６】
（実施例１及び比較例１）
短冊状にカットしたWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセルラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性として０．００７８IU使用して、恒温バス中のステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することにより、セルロースの酵素分解反応を行った。
４０mM Britton-Robinson広域緩衝液（以下、B-R bufferと略す）２ml（pH４．５）に酵素及び基質を添加し、６０℃で１、２４、４８、７２時間、０．１MPa（常圧：比較例１）と１５０MPa（実施例１）に加圧下、それぞれ反応を行った結果を表１に示す。表１の各反応時間における数値は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖量に対する１５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で表した。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
（実施例２及び比較例２）
反応温度を６５℃とした他は、実施例１と同様にしてセルロースの酵素分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
（実施例３及び比較例３）
短冊状にカットしたWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセルラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性として０．００７８IU及びAspergillus属の生産するセルラーゼ製剤（商品名：セルソフトウルトラ）をCMCase活性として０．０１８８IUを混合使用して、恒温バス中のステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することにより、セルロースの酵素分解反応を行った。
４０mM B-R buffer ２ｍｌ（pH４．５）に酵素及び基質を添加し、６５℃で１、８、２４、４８時間、０．１MPa（常圧：比較例３）と１５０MPa（実施例３）に加圧下、それぞれ反応を行った結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
（実施例4及び比較例4）
酵素としてRhizopus Niveusの生産するグルコアミラーゼ（生化学工業（株）製）１ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質として可溶性デンプンを５％（w/v）濃度となるように、B-R bufferに加え、加温して溶解した。
上記基質溶液１１．８８ｍｌに、上記酵素原液の１２８倍希釈酵素液１２０μｌを加えて混合し、４５℃、５５℃、６５℃で、０．１MPa（常圧：比較例４）と１５０MPa（実施例４）に加圧下、ｐＨ４．５にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で酵素を１０分間加熱失活させた。反応上清液を適当な倍率に希釈し、その１ｍｌを用いてSomogyi-Nelson法で本上清液中の還元糖量（反応生成物）を算出した。結果を表４に示す。表４の各反応温度における数値は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖量に対する１５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で表した。
【００２３】
【表４】
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【００２４】
（実施例５及び比較例５）
酵素としてAspergillus oryzaeの生産するタンナーゼ（和光純薬工業（株）製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ５．５）５ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質としてタンニン酸を２％（w/v）濃度となるように、蒸留水に溶解した。
B-R buffer ８．９ｍｌ、２％タンニン酸水溶液１ｍｌおよび上記酵素原液の８０倍希釈酵素液１００μｌを混合し、３０℃、５５℃で、０．１MPa（常圧：比較例５）と１５０MPa（実施例５）に加圧下、ｐＨ５．５にてそれぞれ６０時間反応を行った。反応終了後、酵素を沸騰水中で１０分間加熱失活させた。反応液１ｍｌに８０％エタノール４ｍｌを加え、波長３１０ｎｍにおける吸光度の減少量を測定し、酵素反応によって分解された基質残存量から間接的に反応生成物の量を算出した。結果を表５に示す。表５の各反応温度における数値は波長３１０ｎｍにおける吸光度を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける吸光度に対する１５０ＭＰａにおける吸光度の比率で表した。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
（実施例６及び比較例６）
酵素として小麦由来のフィターゼ（Sigma Chemicals 社製）２０ｍｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１５）２ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質として米由来のフィチン酸１２ナトリウム塩（Inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt）を２％（w/v）濃度となるように、上記緩衝液に加え溶解した。
上記基質溶液９．９ｍｌに、上記酵素原液の８倍希釈酵素液１００μｌを加えて混合し、５５℃、６５℃で、０．１MPa（常圧：比較例６）と１５０MPa（実施例６）に加圧下、ｐＨ５．１５にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で１０分間酵素を加熱失活させた。酵素反応によって遊離した無機リンの定量はFiske-Subbarrow法に準拠した。すなわち、上記反応液１ｍｌに蒸留水６．６ｍｌ、２.５％モリブデン酸アンモニウム１ｍｌ、３N硫酸１ｍｌ、アミノナフトールスルホン酸（０．５ｇの１，２，４アミノナフトールスルホン酸に１５％亜硫酸水素ナトリウム１９５ｍｌと２０％亜硫酸ナトリウム七水和物５ｍｌを加え溶解した）０．４ｍｌを加え、混合後３０分間静置した後、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定して無機リン酸量を算出した。結果を表６に示す。表６の各反応温度における数値は無機リン酸量（μｇ/ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける無機リン酸量に対する１５０ＭＰａにおける無機リン酸量の比率で表した。
【００２７】
【表６】
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【００２８】
（実施例７及び比較例７）
酵素としてBacillus subtilis由来のプロテアーゼ製剤『「プロテアーゼN「アマノ」』（天野製薬（株）製）１０ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)１ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質としてナトロース[Nutrose；カゼインナトリウム（和光純薬（株）製）]を１％（w/v）濃度となるように、４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)に懸濁し、１５分間熱湯中で溶解した。
上記基質溶液９．９ｍｌに、上記酵素原液の７００倍希釈酵素液１００μｌを加えて混合し、５５℃、７０℃で、０．１MPa（常圧：比較例７）と１５０MPa（実施例７）に加圧下、ｐＨ７．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、５％三塩化酢酸（TCA）３ｍｌを添加して酵素を失活させた。反応上清液について波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表７に示す。表７の各反応温度における数値は波長２８０ｎｍにおける吸光度を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける吸光度に対する１５０ＭＰａにおける吸光度の比率で表した。
【００２９】
【表７】
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【００３０】
（実施例８及び比較例８）
酵素としてStreptomyces griseus由来のキチナーゼ（Sigma Chemical社製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ６．０)３６ｍｌに溶解し、酵素溶液とした。基質として２ｍｌ容量のキュベットに２０ｍｇのキチンを秤量した。
２０ｍｇのキチンを含む２ｍｌ容量のキュベットに２ｍｌの上記酵素溶液を加えて混合し、３０℃、６０℃で、０．１MPa（常圧：比較例８）と１５０MPa（実施例８）に加圧下、ｐＨ６．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で１０分間酵素を加熱失活させた。反応上清液を適当に希釈し、ＴＯＣアナライザー（Total Organic Carbon analyzer）で定量した。結果を表８に示す。表８の各反応温度における数値はＴＯＣ（ＴＯＣｍｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおけるＴＯＣに対する１５０ＭＰａにおけるＴＯＣの比率で表した。
【００３１】
【表８】
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【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素反応を短時間に効率的に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本発明方法においては、加圧によって酵素が活性化されるとともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によりセルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセルロース廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全と資源の有効活用の面で非常に有用である。