(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然環境試料から平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する方法であって、
（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離する工程、
（ｂ）前記のように単離されたゲノムＤＮＡ集団の複雑度を分析する工程、
（ｃ）平均化工程の前に、単離されたゲノムＤＮＡ集団を分画することにより、採取された生物のプールから少数の種由来のＤＮＡをクローニングする可能性を高める工程であって、前記分画は密度遠心分離技術を含み、各ピークからＡ２６０が等しい単位を取り出し、核酸を増幅するものであり、
（ｄ）前記（ｃ）で分画されたゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの表現を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製する工程、を含む前記方法。
【請求項２】
前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自然環境試料から平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する方法であって、
（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離する工程、
（ｂ）平均化工程の前に、単離されたゲノムＤＮＡ集団を分画することにより、採取された生物のプールから少数の種由来のＤＮＡをクローニングする可能性を高める工程であって、前記分画は密度遠心分離技術を含み、各ピークからＡ２６０が等しい単位を取り出し、核酸を増幅するものであり、
（ｃ）前記（ｂ）で分画されたゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの表現を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製する工程、を含む前記方法。
【請求項４】
前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子ライブラリーの作製およびスクリーニングの分野に関し、より詳しくは、微生物および／またはその他の生物の混合集団からの平均化ゲノムＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニングに関する。
発明の背景
研究用試薬、診断用試薬および化学プロセス工業においては、新規の性能を有するタンパク質を基剤とする触媒に対する要求が高まっている。現在、種々の培養細菌または菌類から精製された酵素を用いることによりこの要求に広く対処している。しかしながら、純粋培養で増殖できるのは天然に存在する微生物の１％未満であるので（Amann,1995）、潜在的に有用な新規産物に対して最大幅の微生物多様性（microbial diversity）を活用するために代替の技術を開発する必要がある。
現在使用されている市販の酵素の実質的に全てが培養生物由来のものである。これらの生物の大部分は細菌または菌類である。Amannら（Amann,1995）は、下記のような自然環境において培養微生物を評価した。
生育地 培養能（％）
海水                                0.001〜0.1
淡水                                0.25
中栄養湖                            0.01〜1.0
汚染されていない河口水              0.1〜3.0
活性汚泥                            1.0〜15.0
堆積物                              0.25
土壌                                0.3
これらのデータは、示された種々の生育地に由来する培養微生物の数に関する刊行物に記載された情報から測定されたものである。
その他の研究によっても、培養生物は自然環境に存在するバイオマスのほんのわずかの部分を含むだけであるということが立証されている。例えば、最近、１つの研究者グループがイエローストーン国立公園の「黒曜石池(Obsidian Pool)」から得た水および堆積物試料の採取物について報告しており（Barns,1994）、彼らは75の集積培養物の55％において古細菌特異的プローブにハイブリダイズする細胞を見出した。１６Ｓ ｒＲＮＡコード配列の増幅およびクローニングによって、以前にこの池から培養された生物の呈示(representation)がほとんどないか、または全くないほとんど独特の(unique)配列が判明した。これは、今まで知られていなかった形態学的、生理学的且つ生物化学的特徴を有する古細菌の実質的な多様性の存在を示唆するものである。別のグループがイエローストーン公園のOctopus Springのシアノバクテリア菌がい(mat)において同様の研究を行っており、同じ結論、すなわちおびただしい非培養性の多様性(uncultured diversity)が存在するという結論に達している（Ward,1990）。Giovannoniら(1990)およびTorsvikら(1990a)は、それぞれ、サルガッソー海および土壌試料において採取した細菌プランクトンを用いて同様の結果を報告している。これらの結果は、有用な酵素的またはその他の生物活性のスクリーニングにおける培養生物の排他的な使用が現存する潜在的な多様性のサンプリングを厳しく制限しているということを示すものである。
培養試料から得られた遺伝子ライブラリーのスクリーニングは、既に有用であることがわかっている。しかしながら、ライブラリー作製のために培養生物のみを使用することが自然の多様性へのアクセスを制限するものであることが最近明らかになった。自然環境に存在する非培養生物、および／またはその非培養生物由来の酵素もしくはその他の生物活性は工業プロセスにおいて有用であり得る。所与の自然環境試料中に呈示された各生物の培養にかなりの時間と努力が必要であろう。土壌という肥沃な試料には、10,000以上の異なる種が存在し得るものと推定されている。これらの種のそれぞれを個々に培養しようとする試みは厄介な仕事であることは明白である。したがって、自然環境に存在する多様性に効率的にアクセスする新規方法が大いに望まれている。
発明の要旨
本発明は、単離された生物、微生物に属するもの(consortias of microorganisms)、初代集積物(primary enrichments)、自然環境試料などの種々の起源からＤＮＡを単離し、本来の(original)試料中のゲノム集団の呈示において「平均化」されたライブラリーを作製し、そして酵素およびその他の生物活性についてこれらのライブラリーをスクリーニングするための方法を提供することによってこの要求に取り組むものである。
本発明は、培養された、または好ましくは非培養の（もしくは「自然環境の」）試料の混合微生物集団から構築されるＤＮＡライブラリーを作製し、スクリーニングするための新規の組換え型アプローチを提供するものである。本発明によれば、自然集団における発生量が非常に異なり得る微生物からのゲノムを同等呈示(representation)で有するライブラリーが作製され、スクリーニングされる。この「平均化」によるアプローチは、豊富な種からのクローンの重複性を低減し、希少な種からのクローンの呈示を増大させる。この平均化されたライブラリーによって、新規生物学的触媒をコードする遺伝子の単離におけるスクリーニングの効率が大いに向上する。
本明細書に記載された技術は有用であることから生物の混合集団のスクリーニングは合理的なアプローチで行われるが、一方、混合集団のスクリーニングにおける以前の試みは実行不能であり、厄介な手順が必要であることから避けられていた。
したがって、一つの局面においては、本発明は、（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離し、（ｂ）前記のように単離されたゲノムＤＮＡ集団の複雑度を分析し、（ｃ）（ｉ）前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数の増幅および（ii）所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分の回収のうち少なくとも一つを行い、そして（ｄ）該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの呈示を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製することによって、自然環境試料から平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する方法を提供する。
この局面の一つの好ましい実施態様においては、この方法は、所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分を回収する工程を含む。
この局面の別の好ましい実施態様においては、この方法は、前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程を含む。
この局面の別の好ましい実施態様においては、前記のゲノムＤＮＡを増幅する工程は平均化工程の前に行われる。この局面の代わりとなる好ましい実施態様においては、ゲノムＤＮＡを平均化する工程は増幅工程の前に行われる。
この局面の別の好ましい実施態様においては、この方法は、（ｉ）前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程、および（ii）所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分を回収する工程の両方を含む。
本発明の別の局面は、（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離する工程、（ｂ）前記のように単離されたゲノムＤＮＡ集団の複雑度を分析する工程、（ｃ）（ｉ）前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程および（ii）所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分を回収する工程のうち少なくとも一つの工程、ならびに（ｄ）該ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの呈示を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製する工程、を含む方法によって自然環境試料から作製された平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを提供する。本発明の上記の方法の局面に関して記載された種々の好ましい実施態様は、本発明のこの局面に関して同様に適用できる。
また、本発明は、（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離し、（ｂ）前記のように単離されたゲノムＤＮＡ集団の複雑度を分析し、（ｃ）（ｉ）前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数の増幅および（ii）所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分の回収のうち少なくとも一つを行い、そして（ｄ）ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの呈示を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製することによって、自然環境試料から平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する方法も提供する。
本発明の別の局面は、（ａ）自然環境試料からゲノムＤＮＡ集団を単離する工程、（ｂ）前記のように単離されたゲノムＤＮＡ集団の複雑度を分析する工程、（ｃ）（ｉ）前記のように単離されたＤＮＡ集団のコピー数を増幅する工程および（ii）所望の特性を有する単離されたゲノムＤＮＡの画分を回収する工程のうち少なくとも一つの工程、ならびに（ｄ）ゲノムＤＮＡ集団内の種々のＤＮＡの呈示を平均化して自然環境試料からゲノムＤＮＡの平均化ライブラリーを作製する工程、を含む方法によって自然環境試料から作製された平均化ゲノムＤＮＡライブラリーを提供する。本発明の上記の方法の局面に関して記載された種々の好ましい実施態様は、本発明のこの局面に関して同様に適用できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例２に記載されたようにして試験した種々のゲノムＤＮＡ単離物におけるＧ＋Ｃによって示される総ＤＮＡ含量のパーセントを示すグラフである。
発明の詳細な説明
ＤＮＡ単離：
自然環境試料から平均化ＤＮＡライブラリーを作製する際に重要な工程は、試料からの核酸の調製である。ＤＮＡは、当技術分野で周知の種々の技術を用いて試料から単離することができる（Nucleic Acids in the Environment Methods & Applications,J.T.Trevors,D.D.van Elsas,Springer Laboratory,1995）。得られるＤＮＡは、サイズが大きく、酵素阻害物質およびその他の不純物(contaminant)を含まないものが好ましい。ＤＮＡは自然環境試料から直接単離することができ（直接溶解）、またはＤＮＡの回収の前に細胞を試料から採取することも可能である（細胞分離）。直接溶解手順には、細胞分離に基づいたプロトコール以上の利点がいくつかある。直接溶解技術によれば一般的に高呈示の微生物群集を用いてより多くのＤＮＡが得られるが、細胞分離技術を用いて回収されたＤＮＡよりもサイズが小さい場合があり、酵素阻害物質を多く含むようである。最近、高分子量且つ高純度のＤＮＡを得る非常に有用な直接溶解技術が記述された（Barns,1994;Holben,1994）。阻害物質が存在する場合、使用可能な細胞単離を利用するプロトコールがいくつかある（Holben,1994）。さらに、下記のようなビス−ベンズイミド分離（塩化セシウム単離）などの分画技術を使用してＤＮＡの純度を高めることができる。
複雑度の分析：
自然環境試料から回収された核酸の複雑度の分析は、単離および平均化プロセスの間モニタリングすることが重要であり得る。１６Ｓ ｒＲＮＡ分析は、自然環境試料から回収されたＤＮＡの複雑度を分析するために使用することができる技術の１つである（Reysenbach,1992;DeLong,1992;Barns,1994）。３つの記述されたドメインのそれぞれからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異的増幅についてのプライマーが記述されている。
分画：
平均化前にＤＮＡ試料を分画することによって、採取された(sampled)生物のプールから少数の種由来のＤＮＡをクローニングする可能性が高まる。本発明においては、密度遠心分離技術を用いることによってＤＮＡを分画するのが好ましい。かかる技術の一つの例が塩化セシウム勾配法である。好ましくは、この技術は、ＤＮＡの領域に結合し、核酸の浮遊密度を変化させる核酸挿入剤の存在下で行う。より好ましくは、前記核酸挿入剤は、ＤＮＡの領域（ビス−ベンズイミドの場合にはAT）に選択的に結合するビス−ベンズイミドなどの色素である（Muller,1975;Manuelidis,1977）。ビス−ベンズイミドなどの挿入剤と複合体化した核酸が適切な塩化セシウム勾配において分離される場合、核酸は分画される。挿入剤がGCまたはAT領域などのＤＮＡの領域に選択的に結合する場合、核酸はＤＮＡ中の相対的な塩基含量に基づいて分離される。多数の生物からの核酸をこの様式で分離することができる。
密度勾配は、現在、核酸を分画するために使用されている。例えば、土壌分類およびバイオ改善(bioremediation)において使用するための微生物核酸の分離のためのビス−ベンズイミド密度勾配の使用が記載されている。これらの実験においては、細菌集団がどの程度影響を受けたかを調べるために、改善処置の前後に固定ベンズイミド勾配内のＡ260ピークの相対的な発生量を評価する。この技術は、平均して種のGC含量が比較的安定しているという前提に依拠するものである。この技術を本発明に適用することにより複雑なゲノムの混合物が分画される。試料由来の核酸を超遠心分離し、刊行物に記載された手順にてＡ260を測定しながら分画する。
本発明の一つの局面においては、各ピークからＡ260が等しい単位を取り出し、核酸を、後述のプロトコールなどの当技術分野で公知の種々の増幅プロトコールを用いて増幅し、遺伝子ライブラリーを調製する。一方、各ピークからＡ260が等しい単位を取り出し、この核酸から直接遺伝子ライブラリーが調製される。したがって、遺伝子ライブラリーは各ピークからの等量のＤＮＡの組み合わせから調製される。この方法によって自然環境試料および集積物内の少数の生物からの遺伝子へのアクセスが可能になる。ライブラリーが総非分画ＤＮＡ試料から構築された場合には、生物がそのような少量で存在するという事実のためにそのゲノムが呈示されない可能性があるか、または失われている可能性すらある。一方、分画後、後述の技術を用いることによりＤＮＡを平均化することができる。次いで、この分画／平均化ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを作製することができる。
多数の分画化核酸画分の組成は、当技術分野で周知の分類についてのＰＣＲ関連増幅法を用いて決定することができる。
平均化：
以前の平均化プロトコールは平均化ｃＤＮＡライブラリーを構築するために立案された（WO95/08647、WO95/11986）。これらのプロトコールは、当初、ｍＲＮＡ由来の希少ｃＤＮＡのクローニングおよび単離のために開発された。本発明は、非培養または自然環境試料からの平均化ゲノムＤＮＡ遺伝子ライブラリーの作製に関する。
自然環境試料または初代集積培養から直接単離した核酸試料には、典型的には、多数の微生物からのゲノムが含まれている。生物のこれらの複雑な群集は、集団内に存在する種の絶対数および試料内の各生物の相対的な発生量によって記述することができる。試料内の各生物の全体的な平均化を行うことは非常に困難である。光学ピンセットなどの分離技術を用いて試料に関して形態学的に別個のメンバーを選択することができる。次いで、各メンバーからの細胞を同じ数ずつ組み合わせるか、または試料内の各メンバーの純粋培養物を調製し、各純粋培養物からの細胞を同じ数ずつ組み合わせることにより平均化を行うことができる。実際問題として、これを特に高処理量(high thru-put)様式で行うことは非常に困難である。
本発明は、自然環境試料内に存在するゲノムを平均化し、該平均化核酸からＤＮＡライブラリーを作製し、目的とする活性について該ライブラリーをスクリーニングすることに取り組むための技術の使用を含む。
本発明の一つの局面においては、試料からＤＮＡを単離し、分画する。次いで、核酸の鎖を溶融して固定条件下で選択的にリアニーリングする（Ｃ0ｔ駆動(driven)ハイブリダイゼーション）。一方、この溶融プロセス前にＤＮＡは分画されない。核酸断片の混合物を溶融し、ストリンジェント条件下でリアニーリングさせた場合、通常の配列は、希少配列よりも早く相補鎖を見つける。任意の１本鎖核酸単離工程の後、希少配列の集積を呈示する１本鎖核酸を増幅し、遺伝子ライブラリーの作製に使用する。この手順によって希少のまたは低発生量の核酸分子が増幅される。次いで、これらの分子を使用してライブラリーを作製する。全ＤＮＡが回収される一方、本来的にＤＮＡを含む生物の識別が失われ得る。この方法によって、「クローニング不可能な起源」からのＤＮＡを回収する能力が付与されるものである。
以前に記載された技術を用いて誘導された核酸試料を増幅して平均化プロセスを完了させる。例えば、Koら（Ko,1990b;Ko,1990a,Takahashi,1994）によって記載されたようなＰＣＲ増幅プロトコールや、より好ましくはBarns(1994)もしくはCheng(1994)によって記載されたようなロングＰＣＲプロトコールを用いて試料を増幅することができる。
平均化は直接行うことができ、または平均化プロセス前に核酸プールの複雑度を低減する工程を行うこともできる。そのような複雑度の低減は、ほとんど呈示されていない生物からの核酸を回収することにおいて有益であり得る。
ライブラリーが調製され得る微生物としては、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに菌類、いくつかの藻類および原生動物のような低級真核微生物が挙げられる。微生物は、培養微生物でも自然環境試料から得られた非培養微生物でもよく、そのような微生物は、好熱性、超好熱性、好冷性、冷栄養性(psychrotrophs)などの好極度性(extremophiles)であり得る。
上記のように、ライブラリーは、ＤＮＡが生物を培養することなく回収され得る場合、またはＤＮＡが培養生物から回収され得る場合に、自然環境試料から作製され得る。
ターゲットＤＮＡが得られる出発材料ライブラリーとしての微生物ＤＮＡの起源には、特に、北極および南極の氷、水もしくは永久凍土層から得られた微生物試料、火山起源の材料、熱帯地方の土壌もしくは植物源由来の材料などのような自然環境試料が含まれるものである。したがって、例えば、ゲノムＤＮＡは培養可能な生物もしくは培養不可能な生物のどちらかから回収し得るものであり、そのゲノムＤＮＡを用いることにより、その後の酵素活性の測定のために適切な組換え発現ライブラリーを作製し得るものである。
細菌および多くの真核生物は、その産物が関連プロセスに関与している遺伝子を調節するための調整機構(coordinated mechanism)を有する。遺伝子は、１個の染色体上で「遺伝子クラスター(cluster)」と称される構造にクラスター化され(clustered)、そのクラスター全体の転写を開始させる１個のプロモーターを含む１つの調節配列の制御下でともに転写される。該遺伝子クラスター、該プロモーター、および調節において全体的に機能する付加的な配列は「オペロン」と称され、20個以下またはそれ以上の遺伝子、通常、２〜６個の遺伝子を含み得る。したがって、遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して同一であるか関連している隣接遺伝子のグループである。
いくつかの遺伝子ファミリーは同一のメンバーからなる。クラスター化された遺伝子は必ずしも同一である必要はないが、クラスタリング(clustering)は遺伝子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子クラスターは、隣接関連遺伝子に重複が発生する最末端(extremes)から何百もの同一遺伝子が縦に一列に並ぶ状態までの範囲にわたる。時々、特定の遺伝子の反復において有意性が認識できない場合がある。この主な例は、いくつかの種において発現した重複インスリン遺伝子であるが、その他の哺乳類種においては１個のインスリン遺伝子が適当である。
遺伝子クラスターおよびそのクラスターの全長がそれから生じるタンパク質の発現に必要である程度をさらに調査することは重要である。さらに、遺伝子クラスターは継続的に認識され、よって、例えば細菌またはその他の原核生物源などから遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製することができるということは、特に、例えば、多数の有用な活性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチドシンターゼなどの酵素を含む新規タンパク質の起源を決定するのに有用である。遺伝子クラスターの産物であるその他の型のタンパク質、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、インスリンのような調節タンパク質なども含まれるものである。
ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリン、エリスロマイシンなど）、抗がん剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（ＦＫ５０６およびラパマイシン）、獣医学的産物（モネンシン）などの生物活性についての非常に豊富な起源となる分子である。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼによって産生される）は治療剤として有用である。ポリケチドシンターゼは、官能性および環化の長さおよびパターンが異なる非常に多くの種類の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに分類され、ポリケチドシンターゼの少なくとも１種の型（Ｉ型という）は大型サイズの遺伝子および酵素を有しており、これらの遺伝子／タンパク質の遺伝子操作およびin vitro研究を複雑なものとしている。
研究用の新規ポリケチドの作製のためにポリケチドおよびポストポリケチド(postpolyketide)生合成遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択し、組み合わせることができるということは興味深い。本発明の方法によりそれが可能となり、新規ポリケチドシンターゼのクローニングを容易にする。というのは、大きな挿入物を含むクローンを用いて遺伝子バンクを作製することができるからであり（特にｆ−因子を基本とするベクターを用いる場合）、これは、遺伝子クラスターのクローニングを容易にする。
好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡはベクターに連結される。特に、このベクターは、連結された遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質の産生またはタンパク質関連活性を制御し、調節することができる発現調節配列をさらに含む。外来ＤＮＡ導入に対して非常に大きな能力を有するベクターを使用することは、そのような遺伝子クラスターとともに使用するのに特に適しており、本明細書の実施例においてはE.coliのｆ−因子（または稔性因子）を含むことが記載されている。このE.coliのｆ−因子は、接合中にそれ自身の高頻度伝達に影響を及ぼすプラスミドであり、混合微生物試料からの遺伝子クラスターのような大型ＤＮＡ断片を生じさせて、安定に増殖させるものと考えられる。
ライブラリースクリーニング：
平均化ライブラリーを作製した後、種々の固相または液相スクリーニングアッセイを本明細書に記載された高処理量の自動的な様式などの種々の様式で用いることにより独特の酵素活性を発見することができる。ライブラリーの構築に使用されるＤＮＡの平均化は、このプロセスにおいて重要な構成要素である。平均化によって、試料中に少量呈示されているものなどの重要な生物からのＤＮＡの呈示が増大するであろう。
実施例１
ＤＮＡの単離
１．試料を下記の緩衝液中に直接再懸濁する：
500mM Tris-HCl,pH8.0
100mM NaCl
1mMクエン酸ナトリウム
100μg/mlポリアデノシン
5mg/mlリゾチーム
２．時々攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。
３．2mg/mlのプロテイナーゼＫ酵素（Boehringer Mannheim）を用いて37℃で30分間消化する。
４．8mlの溶解緩衝液［200mM Tris-HCl,pH8.0/100mM NaCl/4%(wt/vol)SDS/10%(wt/vol)4-アミノサリシレート］を添加し、逆さまにすることによって穏やかに混合する。
５．ドライアイス-エタノール浴中での凍結および65℃水浴中での融解を３サイクル実施し、核酸を放出させる。
６．フェノールを用いてこの混合物を抽出し、次にフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールを用いて抽出する。
７．得られた水相に酸で洗浄したポリビニルポリピロリドン（PVPP）を4g添加し、37℃で30分間インキュベートして混入有機物を除去する。
８．PVPPをペレット化し、上清を0.45μmの膜で濾過して残留PVPPを除去する。
９．イソプロピルアルコールを用いて核酸を沈殿させる。
10．ペレットを500μlのＴＥ（10mM Tris-HCl,pH8.0/1.0mM EDTA）に再懸濁する。
11．0.1gの酢酸アンモニウムを添加し、混合物を4℃で30分間遠心する。
12．イソプロパノールを用いて核酸を沈殿させる。
実施例２
ＤＮＡのビスベンズイミドによる分離
ウェルチ菌（Clostridium perfringens）（27% G+C）、大腸菌(Escherichia coli)（49% G+C）およびミクロコッカス・リソディクチウム(Micrococcus lysodictium(72% G+C)由来のゲノムＤＮＡからなる試料を塩化セシウム勾配を用いて精製した。塩化セシウム(Rf=1.3980)溶液を0.2μmのフィルターで濾過し、15mlを35mlのOptiSealチューブ(Beckman)に加えた。ここに上記ＤＮＡを加え、完全に混合した。10μgのビスベンズイミド(Sigma;Hoechst 33258)を加え、完全に混合した。次に、チューブに塩化セシウム溶液を満たして、Beckman L8-70超遠心機のVTi50ローターで33,000rpmで72時間遠心した。遠心後、シリンジ(syringe)ポンプおよび分画装置(Brandelモデル186)を用いて勾配を280nmにセットしたISCOUA-5 UV吸光度検出器に通した。３つの微生物由来のＤＮＡをあらわす３つのピークが得られた。真正細菌配列を増幅するための下記のプライマーを用いて、大腸菌ピークの10倍希釈物由来の、ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施した：
0004227196.tif 000002
実施例３
宿主から物理的に分離することができない内部共生体を有するハマグリのえら組織から得たＤＮＡ試料
１．公表されたプロトコール（Sambrook,1989）にしたがって塩化セシウム勾配を用いてＤＮＡを精製する。
２．第２の塩化セシウム溶液（Rf=1.3980）を調製し、0.2μmのフィルターで濾過し、15mlを35mlのOptiSealチューブ(Beckman)に加える。
３．10μgのビスベンズイミド(Sigma;Hoechst 33258)を加え、混合する。
４．50μgの精製ＤＮＡを加え、完全に混合する。
５．Beckman L8-70超遠心機のVTi50ローターで33,000rpmで72時間遠心する。
６．シリンジポンプおよび分画装置(Brandelモデル186)を用いて勾配を280nmにセットしたISCO UA-5 UV吸光度検出器に通す。
実施例４
複雑度分析
１．16S ｒＲＮＡ分析を用いて、環境試料(Reysenbach,1991;DeLong,1992;Barns,1994)から実施例１に概略を示したプロトコールにしたがって回収したＤＮＡの複雑度を分析する。
２．下記のプライマーを用いて真正細菌の配列を増幅する：
0004227196.tif 000003
下記のプライマーを用いて始生代生物の(Archaeal)配列を増幅する：
0004227196.tif 000004
（Ｒ＝プリン；Ｙ＝ピリミジン）
３．文献記載のように増幅反応を進める。始生代生物の配列の増幅に用いる反応緩衝液は、5%のアセトアミドを含む(Barns,1994)。
４．Pfu ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることによって増幅産物を平滑末端とする。
５．SrfI制限エンドヌクレアーゼの存在下で、製造業者(Stratagene Cloning Systems)のプロトコールにしたがって、pCR-Scriptプラスミドに平滑末端連結する。
６．標準的配列決定プロトコールにしたがって（参照文献）試料の配列決定を実施し、試料中に存在する異なる配列の数を決定する。
実施例５
標準化
精製したＤＮＡを実施例２のビスベンズイミドプロトコールにしたがって分画し、回収したＤＮＡを剪断するか、または酵素的に切断して3〜6kbの断片とする。孤立リンカー(lone-linker)プライマーを連結し、ＤＮＡをサイズにより選択する。必要な場合は、サイズ選択したＤＮＡをＰＣＲで増幅する。
次に、以下のようにして標準化を行なう。
１．２本鎖ＤＮＡ試料をハイブリダイゼーション緩衝液（0.12M NaH2PO4,pH6.8/0.82M NaCl/1mM EDTA/0.1% SDS）に再懸濁する。
２．試料にミネラルオイルを重層し、10分間沸騰させることによって変性させる。
３．試料を68℃で12〜36時間インキュベートする。
４．標準的プロトコール（Sambrook,1989）にしたがって、60℃のヒドロキシアパタイト上で２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡから分離する。
５．１本鎖ＤＮＡ画分を脱塩し、ＰＣＲで増幅する。
６．このプロセスをあと数回（５回まで、またはそれ以上）繰り返す。
実施例６
ライブラリーの構築
１．TE緩衝液に溶解したゲノムＤＮＡを、剪断された断片が所望のサイズ範囲になるまで、25ゲージの２つ穴の（double-hubbed）針に勢いよく通す。
２．マングビーンヌクレアーゼを用いてＤＮＡ末端を「磨く」、つまり平滑末端とする。
３．標的ＤＮＡのEcoRI制限酵素部位をEcoRIメチラーゼで保護する。
４．標的ＤＮＡに対して非常に高いモル比のリンカーを用いて、EcoRIリンカー［GGAAGGCC］を上記の平滑末端とし保護したＤＮＡに連結する。
５．EcoRI制限エンドヌクレアーゼを用いてリンカーを切断し、ＤＮＡをサイズにより分画する。
６．標的ＤＮＡをλZAPIIベクターに連結し、in vitroラムダパッケージング抽出物を用いてパッケージし、そして適切な大腸菌XLI Blue宿主細胞中で増殖させる。
実施例７
ライブラリーのスクリーニング
以下は実施例６にしたがって調製した発現ライブラリーのスクリーニング方法の代表的な例である。
種々の化学的特性を試験するための一般的手順は、本実施例で特に言及されている以外の基質にも一般に適用できる。
活性のスクリーニング。実施例６に記述するように調製したライブラリーのプレートを用いて、各ウエルに200μlのLB Amp/Meth、グリセリンを含む１枚のプレートに菌を多重接種する。この工程は、Beckman BiomekのHigh Density Replicating Tool(HDRT)を用いて各接種の間に1%漂白剤、水、イソプロパノール、風乾による滅菌サイクルを１サイクル入れて実施する。この１枚のプレートを37℃で２時間増殖させ、次にそれを用いて各ウエルに250μlのLB Amp/Meth、グリセリンを含む２枚の白色96ウエルDynatechマイクロタイター娘プレートに菌を接種する。もとの１枚のプレートは37℃で18時間インキュベートした後-80℃で保存する。２枚の濃縮した娘プレートは70℃で45分間加熱し、細胞を殺して宿主大腸菌の酵素を不活性化する。DMSO 1mlあたり5mgのモルホウレアフェニルアラニル-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン（MuPheAFC、「基質」）を含むストック溶液を、50mM,pH7.5のHepes緩衝液（0.6mg/mlの界面活性剤ドデシルマルトシドを含む）を用いて600μMに希釈する。
MuPheAFC
上記Biomekの装置を用いて、１サイクルに100μl混合というサイクルで、50μlの600μM MuPheAFC溶液を白色濃縮プレートの各ウエルに加え、基質の最終濃度を約100μMにする。プレートの蛍光を示す蛍光計を用いて、基質の添加直後（t=0）に蛍光値を記録する（励起光=400nm、発光=505nm）。プレートを70℃で100分間インキュベートし、次に15分間で常温まで冷却する。蛍光値を再度記録する（t=100）。t=100の数値からt=0の数値を引き算して、活性なクローンが存在するかどうかを確認する。
データは、特定のウエル内のクローンの１つが基質を加水分解するかどうかを示すであろう。この活性を担持する一個のクローンを決定するため、供給源であるライブラリープレートを融解し、個々のクローンをLB Amp/Meth、グリセリンを含む新しいプレートに１回接種した。上記のようにこのプレートを37℃でインキュベートして細胞を増殖させ、70℃で加熱して宿主の酵素を不活性化させ、そしてBiomekを用いて50μlの600μM MuPheAFCを添加する。さらに、ほかの３つの基質も試験する。それらは、メチルウンベリフェロンヘプタノエート、CBZ-アルギニンローダミン誘導体、およびフルオレセイン結合カゼイン（カゼイン１モルあたり約3.2モルのフルオレセイン）である。
上記ウンベリフェロンおよびローダミンは、50μlのHepes緩衝液に溶解した600μMストック溶液として添加される。フルオレセイン結合カゼインもまた、ストック濃度が20および200mg/mlの50μlストック溶液の形で添加される。基質の添加後、上記のようにt=0における蛍光値を記録し、プレートを70℃でインキュベートし、そしてt=100における蛍光値を記録する。
これらのデータは、どのプレートに活性なクローンが存在して、そこではアルギニンローダミン誘導体もまたこの活性によって変化するが、しかしリパーゼ基質（メチルウンベリフェロンヘプタノエート）およびタンパク質（フルオレセイン結合カゼイン）は基質として機能しない、ということを示す。
少なくとも以下の基質を用いてキラルなアミノエステルを確認することができる。変化した各基質について、以下の式にしたがってエナンチオ選択性値Ｅを決定する：
0004227196.tif 000005
式中、eePは加水分解された生成物のエナンチオマー過剰率（ee）であり、cは反応の転化パーセントである。WongおよびWhitesides,Enzymes in Synthetic Organic Chemistry,1994,Elsevier,Tarrytown,New York,pp.9-12を参照されたい。
エナンチオマー過剰率は、キラル高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはキラル毛管電気泳動（CE）によって決定する。アッセイは以下のように実施する。200μlの適切な緩衝液を96ウエル白色マイクロタイタープレートの各ウエルに加え、次に50μlの部分的にまたは完全に精製した酵素を加える。50μlの基質を加え、蛍光の増加を基質の50%が消費されるまで、または反応が停止するまでのうちどちらか早い方まで、経時的にモニターする。
実施例８
安定な、大インサートピコプランクトン(picoplankton)ゲノムＤＮＡライブラリー
細胞採取およびＤＮＡ調製。オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルへの海洋周航時に採集した試料から、濃縮したピコプランクトン細胞を含むアガロース凝固物(plug)を調製した。海水（30リットル）をニスキンボトル（Niskin bottle）に集め、10μmのNitexでふるい、30,000MWカットオフポリフルフォン(polyfulfone)フィルターを通す中空糸濾過(Amicon DC10)によって濃縮した。濃縮した細菌性プランクトン細胞を0.22μm、47mmのDuraporeフィルターを用いて集菌し、最終密度が1mlあたり約1x1010細胞となるように1mlの2X STE緩衝液（1M NaCl,0.lM EDTA,10mM Tris,pH8.0）に再懸濁した。この細胞懸濁液を１容量の40℃に冷却した1%融解Seaplaque LMPアガロース(FMC)と混合し、ただちに1mlのスポイトに吸い上げた。スポイトをパラフィルムでシールし、氷上に10分間置いた。細胞含有アガロース凝固物を10mlの溶解緩衝液（10mM Tris-HCl,pH8.0,50mM NaCl,0.1M EDTA,1%サルコシル、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、1mg/mlリゾチーム）中に押し出し、37℃で１時間インキュベートした。次にアガロース凝固物を40mlのESP緩衝液（1%サルコシル、1mg/mlプロテイナーゼＫ、0.5M EDTA）中に移し、55℃で16時間インキュベートした。溶液を別の容器に移し、新鮮なESP緩衝液と交換し、55℃でさらに１時間インキュベートした。次にアガロース凝固物を50mM EDTA中に入れ、周航期間中船上で4℃で保存した。
オレゴン州の海岸で採取した試料から調製したアガロース凝固物のスライス１枚（72μl）を、1mlの緩衝液Ａ(100mM NaCl,10mMビストリスプロパン-HCl,100μg/mlアセチル化BSA;pH7.0,25℃）を外液として、2mlの微小遠心管内で一晩透析した。溶液を250μlの新鮮な緩衝液Ａ（10mM MgCl2および1mM DTTを含む）と交換し、揺れる台（rocking platform）の上で室温で１時間インキュベートした。次に溶液を250μlの同じ緩衝液（4ＵのSau3A1(NEB)を含む）に代え、水浴中で37℃まで平衡化させ、そして37℃のインキュベーター内の揺れる台の上で室温で45分間インキュベートした。凝固物を1.5mlの微小遠心管に移し、68℃で30分間インキュベートして酵素を不活性化し、アガロースを融解した。GelaseおよびHK-ホスファターゼ(Epecentre)を用いて製造者の指示にしたがって、それぞれアガロースを消化し、ＤＮＡを脱リン酸化した。穏やかなフェノール／クロロホルム抽出によってタンパク質を除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレット化し、次に70%エタノールで洗浄した。pF0S1ベクターに連結するため、この部分的に消化したＤＮＡを2.5ng/μlの濃度となるように滅菌水に再懸濁した。
数種類のアガロース凝固物を用いたＰＣＲ増幅の結果（データはここに示していない）は、重大な量の始生代生物ＤＮＡの存在を示した。オレゴン海岸沖の海深200mから採取した試料より抽出したｒＲＮＡを用いた定量的ハイブリダイゼーション実験は、この集団におけるプランクトン性始生代生物は全ピコプランクトンバイオマスの約4.7%を構成することを示した（この試料はDeLongら、「南極海洋ピコプランクトンにおける始生代生物の豊富性」、Nature,371:695-698,1994の表１に示す”PACI”-200mに対応する）。アガロース凝固物の溶解物を用いて実施した、始生代生物のｒＤＮＡを増幅するためのＰＣＲの結果は、この試料における比較的大量の始生代生物ＤＮＡの存在を確認した。このピコプランクトン試料から調製したアガロース凝固物は、次に行なうフォスミド(fosmid)ライブラリーの調製用に選択された。この部位からの各1mlのアガロース凝固物は約7.5x105個の細胞を含んでいた。したがって、部分消化ＤＮＡの作製に用いた72μlのスライス中には約5.4x105個の細胞が存在していた。
pF0S1から文献に記述されるようにベクターアームを調製した（Kimら、「Ｆ因子に基づくベクターにおけるコスミドサイズにしたヒトＤＮＡインサートの安定な増殖」、Nucl.Acids Res.,20:10832-10835,1992）。すなわち、上記プラスミドをAstIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化し、次にBamHIで消化して２本のアームを作製する。各アームは、35〜45kbpの連結したＤＮＡをクローン化しパッケージングするための、正しい方向を有するcos部位を含んでいた。各25ngのベクターおよびインサート、および1UのT4 ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)を含有する15μlの連結反応液中で、部分的に消化したピコプランクトンＤＮＡを一晩pF0S1アームに連結した。Gigapack XLパッケージングシステム(Stratagene)を用いて、この反応液4ml中の連結したＤＮＡをin vitroでパッケージし、フォスミド粒子を大腸菌DH10B株（BRL）にトランスフェクトし、そして菌体をLBCM15プレートに播いた。得られたフォスミドクローンを、7%グリセリンを添加したLBCM15を含む96ウエルマイクロタイタープレートに取った。それぞれが約40kbのピコプランクトンＤＮＡインサートを含む組換えフォスミドは、約1.4x108塩基対のクローン化ＤＮＡをふくむ、3,552個のフォスミドクローンのライブラリーをもたらした。検査したクローンの全ては38から42kbpのインサートを含んでいた。このライブラリは後で分析するため-80℃で保存した。
上記の教示に照らすならば、本発明の夥しい数の改変および変法が可能である。それゆえ、請求の範囲内で、本発明は具体的に記述された以外の態様で実施できるのである。
引用文献
0004227196.tif 000006
0004227196.tif 000007
0004227196.tif 000008
配列表
（２）配列番号：１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：５２ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000009
（２）配列番号：２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３１ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000010
（２）配列番号：３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：５２ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000011
（２）配列番号：４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３１ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000012
（２）配列番号：５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：５２ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000013
（２）配列番号：６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３１ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000014
（２）配列番号：７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：５２ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000015
（２）配列番号：８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３１ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000016
（２）配列番号：９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：５２ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000017
（２）配列番号：10：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：３１ヌクレオチド
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：
0004227196.tif 000018
0004227196.tif 000019
0004227196.tif 000020
0004227196.tif 000021
0004227196.tif 000022
【図１】
0004227196.tif 000023