(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号 DSM 11617およびDSM 11616で寄託された、アミコラトプシス ＮＡ４０株およびアミコラトプシス ＮＥ３１株の微生物であって、ニトリルをアミドに変換できることを特徴とする微生物、並びに前記微生物の酵素抽出物。
【請求項２】
寄託番号 DSM 12211および DSM 12175で寄託された、ロドコッカス（Rhodococcus）ＧＦ２７０株およびＧＦ３７６株の微生物であって、ニトリルをアミドに変換できることを特徴とする微生物、並びに前記微生物の酵素抽出物。
【請求項３】
アミコラトプシス ＮＡ４０株（寄託番号 DSM 11617）から入手可能である、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素であって、
ａ）最適ｐＨがｐＨ 6.5±1.0であり、
ｂ）最適温度がｐＨ 7.0で35〜40℃であり、
ｃ）基質３-シアノピリジンに対するＫM値が41.7 mM±7.7 mMであり、
ｄ）分子量が106 kDaである
ことを特徴とする酵素。
【請求項４】
アミドの調製方法であって、請求項１または２記載の微生物により、あるいは前記微生物の酵素抽出物を用いて、あるいは請求項３記載の酵素により、基質としてのニトリルを対応するアミドに変換することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法であって、使用される前記ニトリルが、１〜10の炭素原子を有する、任意に置換された脂肪族ニトリルであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法であって、使用される前記ニトリルが、芳香環システムにおいて４〜10の炭素原子を有する、任意に置換された芳香族ニトリルであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法であって、前記芳香族ニトリルが、一般式
【化１】
0004302876.tif 000018
（ここでＲ1およびＲ2は、水素原子、ハロゲン原子、またはＣ1-4アルキル基である）の化合物から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項４ないし７の何れか１項記載の方法であって、前記反応が、温度０〜50℃、およびｐＨ 4.5〜10で行われることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項４ないし８の何れか１項記載の方法であって、前記反応が、名称ＮＡ４０（DSMZ 11617）もしくはＮＥ３１（DSMZ 11616）のアミコラトプシス属の微生物を用いて行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アクチノマズラ属（Actinomadura）、アミコラトプシス属（Amycolatopsis）、またはロドコッカス属（Rhodococcus）の新規微生物、並びに前記微生物または前記微生物の酵素抽出物を用いたアミドの新規調製方法に関する。
【０００２】
アミド、例えばニコチンアミド、動物およびヒトに必須のビタミンＢ複合体のビタミンに対して、多くの生物工学的方法が既に公知である。一般に、ニトリルヒドラターゼを有する微生物が、ニトリルを対応するアミドに変換することは公知である。従って、EP-A-0 188 316は、ロドコッカス属（Rhodococcus）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、またはミクロバクテリウム属（Microbacterium）の微生物を用いた、３-シアノピリジンを出発物質としたニコチンアミドの調製方法を記載している。
【０００３】
この方法の欠点は、前記微生物の、３-シアノピリジンをニコチンアミドに変換する活性が低いことにのみある。
【０００４】
EP-A-0 307 926は、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１種の微生物による、３-シアノピリジンのニコチンアミドへの変換を記載している。前記微生物が所望の変換を触媒するために、前記微生物は誘発されなければならない。
【０００５】
この方法の更なる欠点は、ロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１が赤色であるため、該生成物の色が変色することである。その上、この微生物は熱安定性が低く、例えば基質の３-シアノピリジンにより阻害される。
【０００６】
ロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１種の微生物による、３-シアノピリジンを出発物質としたニコチンアミドの別の調製方法が、EP-A-0 362 829に記載されている。ニトリルヒドラターゼを有する微生物の比活性を高めるために、尿素または尿素誘導体をインデューサーとして培地に添加した。上述の方法と同様に、該生成物の変色はこの方法でも起こる。
【０００７】
その上、WO 95/17 505は、ロドコッカス・ロドクロウス Ｍ３３種の微生物による、対応するニトリルを出発物質とした芳香族アミドの調製方法を記載している。この方法の欠点は、ロドコッカス・ロドクロウス Ｍ３３が赤色であること、並びに基質の３-シアノピリジンのＫM値が高いことである。
【０００８】
本発明の目的は、前記欠点を取り除くこと、並びに高い収率および純度で、対応するアミドを単離することができるアミドの調製方法を利用可能にすることである。
【０００９】
この目的は、請求項１および３に記載の新規微生物、並びに請求項６に記載の方法により達成される。
【００１０】
本発明に従って、前記方法は、アクチノマズラ属（Actinomadura）、アミコラトプシス属（Amycolatopsis）、またはロドコッカス属（Rhodococcus）の微生物により、あるいは前記微生物の酵素抽出物を用いて、あるいはアミコラトプシス属またはアクチノマズラ属の微生物の精製されたニトリルヒドラターゼにより、基質のニトリルを対応するアミドに変換することにより行われる。
【００１１】
生物変換（biotransformation）に使用されるニトリル、例えば３-シアノピリジンは、商業的に入手可能な化合物である。
【００１２】
本発明の微生物は、基質としてのニトリルを対応するアミドに変換することができる。好ましくは、前記微生物は、唯一のＣ源および/またはＮ源としてニトリルもしくはアミド上で増殖する能力を有する。
【００１３】
本発明の微生物は、慣用的な微生物学的技術を利用して、例えば土サンプル、汚泥、または廃水から適切に選択することにより入手できる。便宜的に、前記微生物は、コバルトイオンの存在下で、好ましくは唯一のＣ源およびＮ源としてニトリルもしくはアミドとともに増殖させることにより選択される。選択に適したニトリルおよびアミドは、特に、後の生物変換の基質としても使用されるニトリル、および該生物変換から入手可能な対応するアミドである。適切な増殖培地は、同様に当業者に公知であり、例えば表１に記載の培地を使用することができる。
【００１４】
慣用的に前記微生物は、実際の生物変換の前も、上述の培地を使用して同じ方法で培養（増殖）される。
【００１５】
専門的に公知であるように、ニトリルヒドラターゼは、増殖培地に補因子としてコバルトイオンを含むときにのみ形成される。適切な「コバルトイオンを生成するコバルト化合物」は、Co2+塩もしくはCo3+塩である。Co2+塩およびCo3+塩の例には、塩化コバルト、硫酸コバルト、および酢酸コバルトがある。
【００１６】
便宜的に、使用される前記コバルト化合物は、Co2+塩であり、例えばCoCl2である。しかし、ビタミンＢ12の存在下において、コバルトイオンをin situで生成する金属コバルトまたは他のコバルト化合物とともに増殖を行うこともできる。便宜的に前記コバルト化合物は、１〜10 mg/L、好ましくは１〜３mg/Lの量で使用される。
【００１７】
慣用的に増殖は、20〜50℃の温度およびｐＨ５〜ｐＨ８、好ましくは30〜45℃およびｐＨ5.5〜ｐＨ7.5で行われる。
【００１８】
実際の生物変換は、アクチノマズラ属（Actinomadura）、アミコラトプシス属（Amycolatopsis）の微生物を用いて、あるいは前記微生物の酵素抽出物を用いて、あるいは前記微生物から精製されたニトリルヒドラターゼにより行うことができる。便宜的に前記生物変換は、アクチノマズラ・スパディクス（Actinomadura spadix）種の微生物、例えば単離株アクチノマズラ・スパディクス Ｅ３７３３、アクチノマズラ・スパディクス Ｅ３７３６、アクチノマズラ・スパディクス ４５Ａ３２、アクチノマズラ・スパディクス ４５０１、またはアクチノマズラ・スパディクス Ｃ１５を用いて行われる。前記生物変換は、好ましくはアミコラトプシス ＮＥ３１種およびアミコラトプシス ＮＡ４０種に該当する微生物、または該微生物と機能的に同等な変異株および突然変異株を用いて行われる。アミコラトプシス ＮＡ４０種に該当する微生物を使用することが特に好ましい。上述の微生物種は、1997年6月3日、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH], Mascheroderweg 1b, D-38124 Brunswickに、アミコラトプシス ＮＥ３１およびアミコラトプシス ＮＡ４０という名称で、ブダペスト条約に従って寄託され、それぞれ寄託番号 DSMZ 11616および DSMZ 11617が付与されている。これら二種の微生物は、より厳密に同定され、文献に未記載のアミコラトプシス属の種に属するものとされた。
【００１９】
従って、本発明は更に、アミドをニトリルに変換することができるアミコラトプシス属またはアクチノマズラ属の微生物、特にアミコラトプシス ＮＡ４０（DSMZ 11617）およびアミコラトプシス ＮＡ３１（DSMZ 11616）という名称の微生物に関する。
【００２０】
その上、ロドコッカス属の特定の微生物は、EP-A-0 362 829に記載のロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１より、ニトリルのアミドへの変換特性が優れていることを見出した。前記特定の微生物は、ロドコッカス ＧＦ６７４、ロドコッカス ＧＦ５７８、ロドコッカス ＧＦ４７３、ロドコッカス ＧＦ２７０（DSMZ 12211）、およびロドコッカス ＧＦ３７６（DSMZ 12175）、またはこれら微生物と機能的に同等の変異株および突然変異株である。微生物 DSMZ 12175は、1998年5月15日に、そして微生物 DSMZ 12211は、1998年6月8日に、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH]に、ブダペスト条約に従って寄託されている。
【００２１】
ロドコッカス菌株 ＧＦ２７０、ＧＦ３７６、ＧＦ４７３，ＧＦ５７８、およびＧＦ６７４は、同定に従って、文献に未記載のロドコッカス属の種に属するものとされた。従って、本発明は更に、ロドコッカス ＧＦ２７０、ロドコッカス ＧＦ３７６、ロドコッカス ＧＦ４７３、ロドコッカス ＧＦ５７８、およびロドコッカス ＧＦ６７４の微生物に関する。
【００２２】
アクチノマズラ属またはアミコラトプシス属の微生物と違って、前記ロドコッカス属の微生物は、実際の変換の前に便宜的に誘発される。適切なインデューサーは、EP-A-0 307 926に記載されたもの、例えば、アセトアミド、ブチルアミド、メタクリルアミド、プロピオンアミド、クロトンアミド、およびバレルアミドである。
【００２３】
「機能的に同等の変異株および突然変異株」は、上述の微生物源に由来し、これら微生物源と同じ特徴および機能を本質的に有する微生物という意味として理解される。このタイプの変異株および突然変異株は、例えばＵＶ照射または突然変異促進性化学薬品により偶然に形成することができる。
【００２４】
アミコラトプシス ＮＡ４０の同定
気中菌糸体の色                  白
基質菌糸体の色                  オレンジ
拡散した色素の色                −
糖スペクトル
ＡＲＡ                      ＋
ＧＡＬ                      ＋
ＭＡＤ                      −
ＸＹＬ                      −
ＧＬＵ                      ｔｒ
ＲＩＢ                      ＋
タイプ                          Ａ
ＤＡＰ                          ＤＬ
メナキノン（％）
８/４                       −
９/０                       (＋)
９/２                       ＋
９/４                       ＋＋＋
９/６                       −
９/８                       −
16Ｓ rＤＮＡの相同性            96.9％
リン脂質                        調査せず
ＰＥ，ＯＨ-ＰＥ，lyso ＰＥ，
met ＰＥ，ＰＣ，ＮＰＧ，ＰＩ，
ＰＩＭ，ＰＧ，ＤＰＧ，ＧＬ
脂肪酸
iso 16                      ＋＋＋
iso 15                      ＋
iso 17                      (＋)
anteiso 15                  (＋)
anteiso 17                  (＋)
10-Me 16                    −
10-Me 17                    ＋
2-OH 15                     ＋
2-OH 16                     ＋
タイプ                          ３ｆ
ＭＳ                            −。
【００２５】
アミコラトプシス ＮＥ３１の同定
気中菌糸体の色                  白
基質菌糸体の色                  オレンジ
拡散した色素の色                −
糖スペクトル
ＡＲＡ                      ＋
ＧＡＬ                      ＋
ＭＡＤ                      −
ＸＹＬ                      −
ＧＬＵ                      ｔｒ
ＲＩＢ                      ＋
タイプ                          Ａ
ＤＡＰ                          ＤＬ
メナキノン（％）
８/４                       −
９/０                       (＋)
９/２                       ＋
９/４                       ＋＋＋
９/６                       −
９/８                       −
16Ｓ rＤＮＡの相同性            96.1％
リン脂質                        調査せず
ＰＥ，ＯＨ-ＰＥ，lyso ＰＥ，
met ＰＥ，ＰＣ，ＮＰＧ，ＰＩ，
ＰＩＭ，ＰＧ，ＤＰＧ，ＧＬ
脂肪酸
iso 16                      ＋＋＋
iso 15                      ＋
iso 17                      (＋)
anteiso 15                  (＋)
anteiso 17                  (＋)
10-Me 16                    −
10-Me 17                    ＋
2-OH 15                     ＋
2-OH 16                     ＋
タイプ                          ３ｆ
ＭＳ                            −。
【００２６】
同定のための略語および説明
(＋)                            1〜5％
＋                              5〜15％
＋＋                            15〜30％
＋＋＋                          ＞30％
ＤＡＰ                          ジアミノピメリン酸
ＡＲＡ                          アラビノース
ＧＡＬ                          ガラクトース
ＭＡＤ                          マズロース
ＸＹＬ                          キシロース
ＧＬＵ                          グルコース
ＲＩＢ                          リボース
Lechevalierら 1971による糖タイプ
Kroppenstedt 1985 and 1992による脂肪酸タイプ
９/４                           ＭＫ-９（Ｈ4）
９/６                           ＭＫ-９（Ｈ6）
９/８                           ＭＫ-９（Ｈ8）
ＭＳ                            ミコール酸
ＰＥ                            ホスファチジルエタノールアミン
ＯＨ-ＰＥ                       ヒドロキシ-ＰＥ
met ＰＥ                        ホスファチジルメチルエタノールアミン
ＰＣ                            ホスファチジルコリン
ＮＰＧ                          ホスファチジルグルコサミン
ＰＩ                            ホスファチジルイノシトール
ＰＩＭ                          ホスファチジルイノシトールマンノシド
ＰＧ                            ホスファチジルグリセロール
ＤＰＧ                          ジホスファチジルグリセロール
ＧＬ                            糖脂質
脂肪酸
iso-16                          イソヘキサデカノン酸または
14-メチルペンタデカノン酸
10-Me-18                        ツベルクロステアリン酸
2-OH-16                         ２-ヒドロキシパルミチン酸。
【００２７】
ＧＦ２７０、ＧＦ３７６、ＧＦ４７３、ＧＦ５７８、およびＧＦ６７４の同定
前記菌株の同定は、互いに独立した５つの特徴に基づいている。
【００２８】
１．コロニーの形態および色：杆状体様および胞子様の構成要素に崩壊する短分枝状菌糸。ＧＦ２７０およびＧＦ３７６のコロニーは、サーモンピンク（ＲＡＬ ３０２２）であり、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４のコロニーは薄赤（ＲＡＬ ３０１２）である。
【００２９】
２．ペプチドグリカンのジアミノ酸：メソ-ジアミノ-ピメリン酸。
【００３０】
３．ミコール酸：ロドコッカス属のミコール酸：長鎖ミコール酸の測定は、高温ガスクロマトグラフィーにより行った。ＧＦ２７０およびＧＦ３７６のミコール酸の溶出プロフィールと、ＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４のミコール酸の溶出プロフィールは同じであった。ＧＦ２７０およびＧＦ３７６のミコール酸の長さはＣ38〜Ｃ46であり、ＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４のミコール酸の長さはＣ40〜Ｃ48であった。該ミコール酸のパターンを、ロドコッカス菌株のミコール酸パターンと比較した。ＧＦ２７０は、非常に低い相関係数（0.086）でロドコッカス・ロドクロウスに属するものと同定され；この方法でＧＦ３７６を同定することはできなかった。他の３つの単離株ＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４は、非常に低い相関係数でロドコッカス・ラバー（Rhodococcus ruber）に属するものと同定された。
【００３１】
４．脂肪酸パターン：ツベルクロステアリン酸を含む非分枝、飽和および不飽和脂肪酸。脂肪酸パターンは、ロドコッカス属の全て、並びに近縁のミコバクテリウム属（Mycobacterium）、ノカルジア属（Nocardia）、ジエトジア属（Dietzia）、ツカムレラ属（Tsukamurella）、およびコリネバクテリア（Corynebacteria）種について鑑別する。種レベルでの同定は、ＧＦ２７０、ＧＦ３７６、ＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４の脂肪酸パターンの、ロドコッカス種の脂肪酸パターンとの質的および量的差異により成し遂げられた。
【００３２】
５．ＧＦ２７０およびＧＦ３７６の16Ｓ ｒＤＮＡの配列は同じ（100％）であったが、これとロドコッカス菌株との比較において、最も近縁のロドコッカス・ロドクロウスとも99.1％の相同性しか示さなかった。ＧＦ４７３およびＧＦ５７８は、16Ｓ ｒＤＮＡの配列は同じ（100％）であった。ＧＦ６７４は、ＧＦ５７８と500のうち僅か一つの塩基対が異なっていた（99.8％）。３つの単離株全てが、ロドコッカス・コプロフィラス（Rhodococcus coprophilus）と少し遠い関係にあることを示している（98.4％）。
【００３３】
化学走性の結果および分子生物学的結果によれば、一方でＧＦ２７０およびＧＦ３７６が、他方でＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４が、ロドコッカス属の２つの新種の菌株であると結論付けることができる。ＧＦ２７０およびＧＦ３７６は、16Ｓ ｒＤＮＡにおいてロドコッカス・ロドクロウスと近い関係にあるが（99.1％）、ＧＦ４７３、ＧＦ５７８およびＧＦ６７４は、ロドコッカス・コプロフィラスと少し遠い関係にある（98.4％）。
【００３４】
前記酵素抽出物は、微生物の専門的に慣用な破壊、例えば超音波、フレンチプレス法、またはリゾチーム法による破壊により得ることができる。この酵素抽出物、そして当然、完全な微生物細胞も、慣用的には当該方法を行うためにポリマーに包埋させて、あるいは適切な支持材料に吸収させて、適切な支持材料上に固定化することができる。
【００３５】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する本発明の酵素は、アミコラトプシス属の微生物から入手可能であり、ニトリルをアミドに変換することができ、特にアミコラトプシス ＮＡ４０（DSM 11617）から入手可能である。
【００３６】
前記酵素は、特に以下の特性を有し：
ａ）ｐＨ 6.5±1.0の最適ｐＨ
ｂ）ｐＨ 7.0で35〜40℃の最適温度
ｃ）41.7 mM±7.7 mMの基質３-シアノピリジンに対するＫM値（20℃、45 mM リン酸緩衝液、ｐＨ7.0）
特に前記酵素は、
ｄ）例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定される106 kDaの分子量
を有する。
【００３７】
ニトリルは、一般に生物変換のための基質として使用することができる。便宜的には、例えば水酸基、アミノ基、ハロゲン、もしくはカルボキシル基により任意に置換された、１〜10の炭素原子を有する脂肪族ニトリル、または芳香環システムにおいて４〜10の炭素原子を有する置換もしくは無置換の芳香族ニトリルの何れかが使用される。使用され得る１〜10の炭素原子を有する脂肪族ニトリルは、ジニトリル、ヒドロキシニトリル、アミノニトリルであり、例えばｎ-オクタンニトリル、シアノ酢酸、イソカプロニトリル、ｎ-バレロニトリル、アジポニトリル、グルタロニトリル、サクシノニトリル、セバコニトリル、プロピオニトリル、クロトノニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ-ブチロニトリル、またはアゼラニトリルである。使用され得る４〜10の炭素原子を有する芳香族ニトリルは、一般式
【化２】
0004302876.tif 000002
（ここでＲ1およびＲ2は、水素原子、ハロゲン原子、またはＣ1-4アルキル基である）のニトリルである。ハロゲン原子として、Ｆ、Cl、Br、またはＩを使用することができる。Ｃ1-4アルキル基として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、tert-プロピル基、ブチル基、イソブチル基、またはtert-ブチル基を使用することができる。一般式ＩまたはIIの芳香族ニトリルの好ましい代表例は、２-、３-、もしくは４-シアノピリジン、ベンゾニトリル、フルオロ-、クロロ-、もしくはブロモベンゾニトリル、例えばｏ-、ｍ-、もしくはｐ-クロロベンゾニトリル、または２-クロロ-３-シアノピリジンである。好ましくは、３-シアノピリジンが、４〜10の炭素原子を有する芳香族ニトリルとして使用される。
【００３８】
便宜的に前記生物変換は、基質濃度が40重量％、好ましくは30重量％を越えないように、基質を一部ずつまたは連続して添加して行われる。
【００３９】
前記方法は、便宜的には休止（非増殖）細胞を用いて行われる。
【００４０】
前記生物変換に適切な培地は、当該専門分野において慣用的な培地であり、例えば低分子量のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、表１ないし３に記載の培地、またはその改変形態、例えば例８(１)に記載の培地、またはＴＲＩＳ/ＨＣｌ緩衝液である。
【００４１】
前記生物変換は、便宜的には０〜50℃の温度およびｐＨ 4.5〜ｐＨ 10のｐＨで、好ましくは20〜40℃の温度およびｐＨ 4.5〜ｐＨ 10.0のｐＨで行われる。
【００４２】
特に好ましい態様において、前記生物変換は、Ｃ1-4アルコールの存在下で行うことができる。使用されるＣ1-4アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、またはブタノールであり得る。好ましくは、メタノールが使用される。
【００４３】
前記反応の後、次いで結晶化のような慣用的な調製（working-up）方法により、対応するアミドを単離することができる。
【００４４】
［実施例］
例１
アクチノマヅラ属またはアミコラトプシス属微生物の増殖
ａ）表１記載の増菌培地においてＣ源およびＮ源として種々のニトリルまたはアミドを用いて、種々の土サンプルを接種し、37℃もしくは45℃で７〜10日間インキュベートした。次いでその培養物を同培地に移し、37℃で７〜10日間再び培養した。全工程を３回繰り返した。次いでその培養物を希釈し、個々のコロニーを得るためにプレートに播いた。そのプレートを37℃で５日間インキュベートした。次いで種々のコロニーを所望の活性について試験した。
【００４５】
アミコラトプシス ＮＡ４０（DSMZ 11617）およびアミコラトプシス ＮＥ３１（DSMZ 11616）はこのように単離され、次いで37℃で振とうしながら90〜100時間、最適化培地（表３）で増殖させた。
【００４６】
アジポニトリルは、アミコラトプシス ＮＥ３１（DSMZ 11616）、アクチノマズラ・スパディクス Ｅ３７３３、およびアクチノマズラ・スパディクス Ｅ３７３６のためのＣ源およびＮ源として使用され、アゼラニトリルは、アミコラトプシス ＮＡ４０（DSMZ 11617）およびアクチノマヅラ・スパディクス ４５Ａ３２のためのＣ源およびＮ源として使用され、ｎ-オクタンニトリルは、アクチノマズラ・スパディクス ４５０１のためのＣ源およびＮ源として使用され、シアノ酢酸は、アクチノマズラ・スパディクス Ｃ１５のためのＣ源およびＮ源として使用された。
【００４７】
ｂ）アミコラトプシス ＮＡ４０を、表３に記載の培地で培養した。その培養は、好気条件下37℃の温度で２または３〜４日間、サブ培養（4 mL/チューブ）および「主培養」（500 mL/フラスコ）で行った。細胞増殖を610ｎｍにおける濁度で測定し、細胞の乾燥重量を以下のように計算した：乾燥細胞の重量 [mg/mL]＝ＯＤ610 nm×0.277。
【００４８】
【表１】
0004302876.tif 000003
【００４９】
【表２】
0004302876.tif 000004
【００５０】
【表３】
0004302876.tif 000005
【００５１】
例２
アクチノマヅラ属またはアミコラトプシス属微生物を用いた生物変換
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を測定するため、３-シアノピリジン（1.0 M, 1.0 mL）、リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0, 0.1 M, 0.5 mL）、および0.5 mLの細胞懸濁液を含む反応混合液（2 mL）を、20℃で30分間撹拌しながらインキュベートした。該反応を0.2 mLの３Ｎ ＨＣｌを添加することで停止させた。短時間の遠心の後、生成したニコチンアミドをＨＰＬＣにより測定した（Ｃ18カラム（Develosil ODS-HG-5, 4.6×250 cm）を用いたShimadzu SPD 6A システム；溶出液：10 mM KH2PO4/H3PO4（pH 2.8）/アセトニトリル  ９：１（v/v）；流速：1 mL/分；230 nmにおける吸収を測定した）。比活性は、生成ニコチンアミドのμmol/mL/分/ＯＤ610 nmとして表示した。
【００５２】
単離した細菌を用いた、増菌培地（表１）における脂肪族ニトリルの反応速度を表５に要約し、基礎培地（表２）におけるインデューサーおよび補因子の効果を表４に要約し、基礎培地（表２）におけるアミコラトプシス属のロドコッカス属との活性比較を表６に要約する。表４の結果は、アミコラトプシス ＮＡ４０のニトリルヒドラターゼは構成的に発現しているが、補因子のコバルトが活性に必要であることを示している。
【００５３】
（２）ＮＡ４０の増殖に対する温度の効果
サブ培養物（2 mL）を、表３記載の培地において２日間37℃でインキュベートし、次いで表３記載の培地 20 mLを含有する振とうフラスコに移した。37℃、40℃、45℃、50℃、および55℃で３〜４日間、振とう培養を行った。細胞の増殖を測定し、ニトリルヒドラターゼ活性を20℃で測定した。表７は、ニトリルヒドラターゼ活性に対する温度の効果、および細胞増殖に対する温度の効果を示す。
【００５４】
【表４】
0004302876.tif 000006
【００５５】
【表５】
0004302876.tif 000007
【００５６】
【表６】
0004302876.tif 000008
【００５７】
（３）幾つかの基質に対してＮＡ４０の活性を測定するため、乾燥重量 0.0388 mgの細胞を、上述の緩衝液でインキュベートした。該反応は適切な基質の添加により開始し、20℃で振とうしながら10分間インキュベートした。該反応は、0.2 mLの２Ｎ ＨＣｌを添加して停止し、反応混合液を短時間遠心した。上清をＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィーにより分析した。表８は、基質特異性のための試験条件を示し、表９は、種々の基質に対する休止ＮＡ４０細胞の基質特異性を示す。
【００５８】
各々の試験条件は、表８に要約され、その結果は表９に要約されている。
【００５９】
【表７】
0004302876.tif 000009
【００６０】
【表８】
0004302876.tif 000010
ｏ-、ｍ-、ｐ-クロロベンゾニトリルおよび２-クロロ-３-シアノピリジンを、メタノールに溶解した反応混合液に添加した。
【００６１】
【表９】
0004302876.tif 000011
【００６２】
（４）休止細胞における最適温度および熱安定性
反応は、標準的な反応混合液中で10分間行った。最適温度は35〜40℃であった（図５）。次いでその細胞を種々の温度で30分間インキュベートし、標準的な反応条件下で活性を試験した。図４から明らかなとおり、熱安定性は40℃であった。
【００６３】
（５）休止細胞における最適ｐＨおよびｐＨ安定性
この目的のため、反応は、リン酸カリウム緩衝液を種々の0.1 M緩衝液に置き換えた標準的な反応混合液中で10分間行った。図６から明らかなとおり、最適ｐＨは4.5〜10であった。その細胞懸濁液を、20℃で30分間種々のｐＨでインキュベートした後、細胞を遠心した。次いでその細胞を洗って、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ 7.0に再懸濁した。反応は、標準的な条件下で３-シアノピリジンの添加により10分間行った。当該酵素は、ｐＨ 4.5〜ｐＨ 10.0で安定であった（図７）。
【００６４】
（６）ＮＡ４０による３-シアノピリジンからニコチンアミドの蓄積
反応は、500 mM ３-シアノピリジン、40 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、および休止細胞（乾燥重量 2.3 mg）を含む反応混合液（30 mL）中で行った。この反応の間、３-シアノピリジン（500 mM）は消費されるとすぐに７回添加された。このように、4.0 M ３-シアノピリジンを15時間にわたって添加し、収率 97.3％に相当する3.89 M（475 g/L）ニコチンアミドが生成された。ニコチン酸は形成されなかった。
【００６５】
例３
アミコラトプシス属微生物の同定
以下の５つの化学走性マーカーにより、当該同定は支持される：
１．ペプチドグリカンの鑑別用アミノ酸：メソジアミノピメリン酸
２．鑑別用糖：アラビノースおよびガラクトース
３．ミコール酸：ミコール酸は存在せず
４．メナキノン：ＭＫ-９（Ｈ4）
５．脂肪酸パターン：イソ/アンテイソ-分枝状、および２-ヒドロキシ脂肪酸、少量の10-メチル-分枝状脂肪酸が、更に検出された。この脂肪酸パターンは、アミコラトプシス属の代表例全てに見出された（脂肪酸パターン３ｆ）。
【００６６】
前記化学的特性の組み合わせは、アミコラトプシス属の全ての種について鑑別される。
【００６７】
二つの培養物の脂肪酸データを、脂肪酸データベースをのエントリーを用いた主要な構成成分の解析を利用して比較した。この方法を用いて、ＮＥ３１もＮＡ４０もアミコラトプシス属に属すことができるが、相関係数が非常に低いため、種の同定はできなかった。しかし、両菌株の脂肪酸パターンの比較により、両菌株は、異なるタイプの二種類の菌株であることが示された。
【００６８】
前記結果は、16Ｓ ｒＤＮＡ配列の解析結果により確認された。ここでも、アミコラトプシス属に属するとされたが、記載のアミコラトプシス種の何れにも属さなかった。この方法で、16Ｓ ｒＤＮＡの配列は、ＰＣＲ増幅された16Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の直接配列決定により決定された。16Ｓ ｒＤＮＡ配列の鑑別部分を、アミコラトプシス属および関連タクソンの典型種の配列と比較した。その結果により、該菌株はアミコラトプシス属に属することが示された。最も高い一致率は、アミコラトプシス・メタノリカ（Amycolatopsis methanolica）に対して96.9％（ＮＡ４０）および96.1％（ＮＥ３１）で見出された。それらの間で、二つの単離株は、99.0％の配列の一致率を示した。アミコラトプシス属の代表株に関する我々の研究により、充分な種の同定には相関係数が99.5％以上でなければならないことが示された。96.9％では、その値は明らかに99.5％以下であるため、このことから、二つの単離株は既知のアミコラトプシス種の代表株でないことが推定できる。
【００６９】
本発明の結果に基づいて、前記単離株は、既知のアミコラトプシス種の何れに属すこともできなかった。このことから我々は、ＮＡ４０およびＮＥ３１が、アミコラトプシス属の二つの新規な、未記載の種であると推論する。
【００７０】
アミコラトプシス属微生物の同定特徴
気中菌糸体の色
基質菌糸体の色
拡散した色素の色
糖スペクトル
ＡＲＡ                      ＋
ＧＡＬ                      ＋
ＭＡＤ                      −
ＸＹＬ                      −
ＧＬＵ                      ｖ
ＲＩＢ                      ＋
タイプ                          Ａ
ＤＡＰ                          ＤＬ
メナキノン（％）
８/４                       −
９/０                       (＋)
９/２                       ＋
９/４                       ＋＋＋
９/６                       −
９/８                       −
16Ｓ rＤＮＡの相同性            ＞99.5％
リン脂質
ＰＥ                        ＋
ＯＨ-ＰＥ                   ＋
lyso ＰＥ                   −
met ＰＥ                    −
ＰＣ                        −
ＮＰＧ                      −
ＰＩ                        ＋
ＰＩＭ                      ｖ
ＰＧ                        ＋
ＤＰＧ                      ＋
ＧＬ                        −
タイプ                          ＩＩ＋ＯＨ−ＰＥ
脂肪酸
iso 16                      ＋＋＋
iso 15                      ＋
iso 17                      (＋)
anteiso 15                  ＋
anteiso 17                  (＋)
10-Me 16                    (＋)
10-Me 17                    ＋
2-OH 15                     ＋
2-OH 16                     ＋
タイプ                          ３ｆ
ＭＳ                            −。
【００７１】
例４
菌株ＮＡ４０微生物からのニトリルヒドラターゼの精製
前記菌株を、37℃で３日間、表３に記載の培地中で培養した。２Ｌ培養物の細胞を、遠心により収穫し、次いで0.85％強度のNaCl溶液に再懸濁した。次いでその細胞を、44 mM n-酪酸を含む0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に移し、超音波で処理した。その細胞抽出物を遠心し、細胞断片を除去した。この抽出物を酵素精製のために使用した。
【００７２】
完全な精製の間、44 mM n-酪酸を含むリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を使用した。表１０から明らかなとおり、当該酵素は、３つの工程で均質になるまで精製された。
【００７３】
【表１０】
0004302876.tif 000012
１ユニット：20℃で１μmolニコチンアミド/分の生成を触媒する酵素量。
【００７４】
例５
ニトリルヒドラターゼの特徴付け
（１）分子量の測定、サブユニット構造、およびコバルトイオンの含量
0.2 M ＫＣｌおよび44 mM n-酪酸を含む0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を用いた、ＴＳＫゲルカラム G3000 SW（0.75×60 cm）クロマトグラフィーにより、分子量は106 kDaであると測定された。該酵素は２つの異なるサブユニットαおよびβから成ることが決定され、その分子量は各ケース30,000と26,000であると測定された。
【００７５】
図１は、ＴＳＫゲル G3000 SWクロマトグラフィーによる分子量の測定を示す。
図２は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分子量の測定を示す。
図３は、精製された酵素の吸収スペクトルを示す。300〜400 nmの広い吸収が観察された。
【００７６】
（２）精製された酵素の基質特異性
例２(１)と同様にして基質特異性を決定した。その結果を表１１に要約する。
【００７７】
【表１１】
0004302876.tif 000013
1.7ユニットの酵素を、反応混合液（2.0 mL）に添加した。その反応混合液は、45 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中に各基質を含有していた。
【００７８】
（３）ＫM値の決定
ラインウィーヴァー‐ブルク（Lineweaver‐Burk）図により、３-シアノピリジンに対するＫM値は41.7 mM、アクリロニトリルに対するＫM値は3.7 mMであると決定された。３-シアノピリジンに対するＫM値が200 mMであるロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１と比較すると、ＮＡ４０のＫM値は有意に小さかった。これはＮＡ４０の主な利点の一つである。
【００７９】
（４）熱安定性および最適温度
精製された酵素を、30分間ｐＨ 7.0において種々の温度でインキュベートし、次いで３-シアノピリジンのニコチンアミドへの変換を、20℃で１分間測定した。その酵素を40℃以上の温度で不活性化した。熱安定性は休止細胞と同様、約40℃であり、最適温度は35〜40℃であった（図５）。
【００８０】
（５）最適ｐＨおよびｐＨ安定性
この目的のため、３-シアノピリジンのニコチンアミドへの変換は、種々の緩衝液（42.5 mM）、1.71ユニットの精製された酵素、および500 mM ３-シアノピリジンを含む反応混合液（2.0 mL）中で20℃で行った。最適ｐＨは、約ｐＨ 6.5±1.0であった（図８）。
【００８１】
ｐＨ安定性の測定のため、4.2ユニットの精製された酵素を、20℃で１時間、種々の緩衝液（45 mM）中でインキュベートした。インキュベートした溶液の一部、1.71ユニットを、標準的な反応混合液に添加した（例２(１)を参照）。残りの活性を測定した。該酵素はｐＨ５〜９のｐＨ範囲において安定であった。その結果を図９に示す。
【００８２】
（６）阻害剤
種々の阻害剤の効果を測定した。その結果を表１２に要約する。
【００８３】
【表１２】
0004302876.tif 000014
【００８４】
例６
ＮＡ４０の休止細胞に対するメタノールの効果
反応は、表１３に従って０〜20％(v/v)メタノールの存在下で10分間行った。表１４に示すとおり、活性は５〜15％メタノールの添加により増大した。
【００８５】
【表１３】
0004302876.tif 000015
【００８６】
【表１４】
0004302876.tif 000016
【００８７】
例７
ロドコッカス属微生物の増菌
表１記載の増菌培地においてＣ源およびＮ源としてシアノ酢酸を用いて、種々の土サンプルを接種し、微生物ロドコッカスＧＦ２７０、ＧＦ５７８、ＧＦ４７３、およびＧＦ３７６を例１に従って単離した。
【００８８】
例８
ロドコッカス属の微生物を用いた生物変換
（１）ロドコッカス・ロドクロウスＪ１と比較した、微生物ロドコッカスＧＦ６７４、ロドコッカスＧＦ５７８、ロドコッカスＧＦ２７０、およびロドコッカスＧＦ３７６の熱安定性
熱安定性の測定のため、上記微生物を以下の培地で培養した。
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１を、EP-A 0 307 926に記載の培地で72時間培養した。微生物ロドコッカスＧＦ６７４、ＧＦ５７８、ＧＦ２７０、およびＧＦ３７６を、以下の培地でｐＨ 7.0で96時間まで培養した：
ロドコッカスＧＦ６７４は、酵母抽出物 1.0 g/L、フルクトース 5.0 g/L、麦芽抽出物 10.0 g/L、アセトアミド 5.0 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4・7H2O 0.5 g/L、およびCoCl2・6H2O 10.0 mgを含む培地。ロドコッカスＧＦ５７８は、酵母抽出物 1.0 g/L、フルクトース 15.0 g/L、麦芽抽出物 10.0 g/L、アセトアミド 25.0 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4・7H2O 0.5 g/L、およびCoCl2・6H2O 5.0 mgを含む培地。ロドコッカスＧＦ２７０は、酵母抽出物 12.5 g/L、クエン酸ナトリウム 5.0 g/L、メタクリルアミド 7.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4・7H2O 0.5 g/L、およびCoCl2・6H2O 30.0 mgを含む培地。ロドコッカスＧＦ３７６は、酵母抽出物 1.0 g/L、クエン酸ナトリウム 10.0 g/L、麦芽抽出物 15.0 g/L、ブチルアミド 7.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4・7H2O 0.5 g/L、およびCoCl2・6H2O 15.0 mgを含む培地。
【００８９】
次に、休止細胞を種々の温度で15分間インキュベートし、次いで残りの活性を、例２(１)に従って標準的な反応条件下で測定した。
【００９０】
この間に、ロドコッカスＧＦ６７４は50℃の温度でほぼ100％の相対活性を有し、60℃でも約10％の活性を有していることが見出された。ロドコッカスＧＦ５７８も同様に、50℃で100％の相対活性を有し、60℃で20％の相対活性を有していた。ロドコッカスＧＦ３７６は、50℃まで100％の相対活性、60℃で70％の相対活性を有し、70℃でもほぼ５％の相対活性を有していた。ロドコッカスＧＦ２７０は、60℃までほぼ100％の相対活性を有し、70℃でも同様に５％の相対活性を有していた。これに対して、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１は、50℃まで100％の相対活性、60℃で80％の相対活性を有し、70℃ではもはや活性はなかった。
【００９１】
従って要約すると、ロドコッカスＧＦ２７０およびＧＦ３７６は、Ｊ１より優れた熱安定性を有し、ＧＦ２７０が最も優れた熱安定性を有していると強調することができる。
【００９２】
（２）ロドコッカス菌株の最適ｐＨ
ロドコッカス菌株ＧＦ６７４、ＧＦ５７８、ＧＦ２７０、およびＧＦ３７６のニトリルヒドラターゼ活性に対するｐＨの効果を、例２(５)に記載されたとおりに測定した。
【００９３】
ロドコッカスＧＦ６７４の最適ｐＨは、ｐＨ 7.5〜9.5であり、ＧＦ５７８ではｐＨ 8〜8.5であり、ＧＦ２７０ではｐＨ 6〜7.0であり、そしてＧＦ３７６ではｐＨ 6〜8であった。
【００９４】
（３）ロドコッカス菌株の基質特異性
基質特異性は、表１５に相対活性として要約されている。
【００９５】
（４）ロドコッカス菌株のニコチンアミドの蓄積
例２(６)と同様にして、ロドコッカス菌株ＧＦ６７４、ＧＦ５７８、ＧＦ２７０、およびＧＦ３７６を、３-シアノピリジン（約500 mM）とともに培養した。この間に、ロドコッカスＧＦ６７４は、25時間以内に６Mのニコチンアミドを生成し、ＧＦ５７８は10時間以内に5.5 Mのニコチンアミドを生成し、ＧＦ２７０は20時間以内に約8.5 Mのニコチンアミドを生成し、そしてＧＦ３７６は20時間以内に7.5 Mのニコチンアミドを生成した。
【００９６】
（５）ロドコッカス菌株の活性に対する３-シアノピリジンの耐性
３-シアノピリジンの耐性を試験するために、休止細胞を、１〜10％(w/v)の３-シアノピリジン濃度で、20℃において15分間インキュベートし、次いでその細胞を遠心により取り出した。細胞を0.85％ NaClで洗った後、残りの活性を測定した。
【００９７】
基質としての３-シアノピリジンの耐性を、種々の基質濃度で試験した。２％(w/v)の基質濃度においてロドコッカス・ロドクロウスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性は、ファクター1.4だけ低下し、４％(w/v)の基質濃度においてロドコッカスＧＦ６７４のニトリルヒドラターゼ活性は、ファクター1.4だけ低下し、ロドコッカスＧＦ５７８のニトリルヒドラターゼ活性は８％の基質濃度までほぼ一定のままであり、４％(w/v)の基質濃度においてロドコッカスＧＦ２７０のニトリルヒドラターゼ活性は、ファクター1.17だけ低下し、10％(w/v)の基質濃度においてロドコッカスＧＦ３７６のニトリルヒドラターゼ活性は、ファクター1.25だけ低下することが見出された。
【００９８】
他のロドコッカス菌株と比較して、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１は、３-シアノピリジンの最も低い耐性を示した。
【００９９】
【表１５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＴＳＫゲルカラム G3000 SWクロマトグラフィーによるニトリルヒドラターゼの分子量の測定結果を示す図。
【図２】  ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるニトリルヒドラターゼαサブユニットおよびβサブユニットの分子量の測定結果を示す図。
【図３】  精製されたニトリルヒドラターゼの吸収スペクトルを示す図。
【図４】  ＮＡ４０休止細胞におけるニトリルヒドラターゼの熱安定性を示す図。
【図５】  ＮＡ４０休止細胞におけるニトリルヒドラターゼの最適温度を示す図。
【図６】  ＮＡ４０休止細胞におけるニトリルヒドラターゼの最適ｐＨを示す図。
【図７】  ＮＡ４０休止細胞におけるニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を示す図。
【図８】  ＮＡ４０から精製されたニトリルヒドラターゼの最適ｐＨを示す図。
【図９】  ＮＡ４０から精製されたニトリルヒドラターゼのｐＨ安定性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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