(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３記載の第１番目〜第５５５番目の塩基配列又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプロモーター活性を有するＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ分子と外来タンパク質をコードする遺伝子とを有する組み換え体。
【請求項３】
組み換え体がウイルスである請求項２記載の組み換え体。
【請求項４】
外来タンパク質がニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、及びマイコプラズマからなる群より選択される病原体由来のタンパク質である請求項３記載の組み換え体。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の組み換え体を有効成分とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡ分子とその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、組み換えウイルスなどの組み換え体を、生体に直接接種する生ワクチンタイプの使用が検討されている（特開平６−０７８７６４号公報など）。こうした組み換えウイルスをワクチンとして用いる場合、一つのウイルス（以下、親ウイルスということがある）に複数の病原ウイルス由来の抗原遺伝子を挿入して多価組み換え体を得、これを多価ワクチンに用いることが可能である（特開平９−００９７９号公報など）。しかし、実際にはこうした多価組み換え体のワクチンは実用化されていない。これは、組織培養、１４巻、４号、１０７〜１１１頁、１９８８年発行や特開平１０−３２７８７１号公報などで指摘されているように、一つのウイルスゲノム内に複数の抗原遺伝子を挿入されて肥大化したゲノムを持った多価組み換え体である組み換えウイルスは増殖性が低下したり、挿入した遺伝子が脱落する、といった問題をもつことに起因している。通常、親ウイルスゲノムに対して挿入できる遺伝子は数％であるとされている。そこでゲノムの肥大化を抑えるため、親ウイルスゲノムの非必須な領域を削除し、そこに抗原遺伝子などを挿入する方法が広く用いられているが、このほか挿入する遺伝子を短くする方法も考えられている。
【０００３】
組み換え体には、抗原遺伝子の他にプロモーターなどの機能遺伝子を挿入するのが一般的である。プロモーターは通常、一つの抗原遺伝子に一つ必要であるため、挿入される抗原遺伝子の数が増えれば、挿入されるプロモーターの数も増える。従って親ウイルスゲノムの肥大化を防止するためにも、挿入するプロモーターを短くする必要が生じている。
【０００４】
ところで、プロモーターの下流領域には、イントロンと呼ばれる領域を持つものがある。一般に、イントロン領域があることでプロモーターの活性が高まると言われている（Ｇｒｏｓｓ、Ｍ．Ｋ．、Ｋａｉｎｚ、Ｍ．Ｓ．  ａｎｄ  ＭｅｒＲＩｌｌ、Ｇ．Ｆ．  （１９８７）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ７，４５７６−，Ｂｕｃｈｍａｎ、Ａ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．  （１９８８）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、４３９５−，Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．  ａｎｄＳｃａｒｐｕｌｌａ、Ｒ．Ｃ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８４，１３５−，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｔ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ．Ｍ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８、９３７−，）。
【０００５】
高発現プロモーターとして知られている鶏由来のβ−アクチンプロモーターの全長は約１．５ｋｂｐと長い（Ｋｏｓｔ、Ｔ．Ａ．、Ｔｈｅｏｄｏｒａｋｉｓ、Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｈ．  （１９８３）  Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：  ８２８７−３０１）。この鶏由来のβ−アクチンプロモーターの発現量をさらに高める目的で、このプロモーターにスプライシングアクセプター配列やエンハンサー配列などをプロモーターに付加することが提案されている（特開平２−１５６８９１号公報、特開平３−１６８０８１号公報、特開平７−２９８８７７号公報など）。しかしながら、こうした高発現プロモーター研究の流れは、上述した挿入遺伝子をより短くするという多価組み換え体構築の要請に合致しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる従来技術のもと、全長が短い高発現プロモーターを得るべく鋭意研究した結果、本発明者らは、これまで高発現化に有効といわれてきたイントロン部分を欠いても鶏由来のβ−アクチンプロモーターが高発現を実現できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かくして本発明によれば、配列番号３記載の第１番目〜第５５５番目の塩基配列又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプロモーター活性を有するＤＮＡ分子（以下、これらをまとめて、本発明のプロモーターということがある）が提供され、また当該ＤＮＡ分子と外来タンパク質をコードする遺伝子とを有する組み換え体が提供され、さらに当該組み換え体を有効成分とするワクチンが提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡ分子は、配列番号３記載の第１番目〜第５５５番目の塩基配列又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ分子である。また、本発明のＤＮＡ分子はプロモーター活性を有する。
このＤＮＡ分子は、配列番号１記載の塩基配列を有し、またはこれと相同性を有し、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さないものである。配列番号１記載の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモーターの５’側に存在する塩基配列との相同性が高く、配列番号２記載の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモーターの３’末端寄りに存在するイントロン中の配列と相同性が高い。従って、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さない本発明のＤＮＡ断片は、公知のβ−アクチンプロモーターとは異なるプロモーターである。
【０００９】
本発明のＤＮＡ分子として、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。
【００１０】
配列番号３記載のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ合成などにより得ることができるほか、配列番号１記載のＤＮＡ分子の５’側に、サイトメガロウイルス（以下ＣＭＶと言うことがある）のＩＥプロモーター（以下、単にＣＭＶプロモーターということがある。Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１，５２１−）の一部を付加することによって得ることもできる。
【００１１】
また、本発明のＤＮＡ分子は、少なくとも配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ分子と相同性を有し、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さず、配列番号１記載のＤＮＡ分子と同等またはそれ以上のプロモーター活性を有する限り、常法によって塩基が置換、欠損、または付加されたものであってもよい（その例が配列番号３記載のＤＮＡ分子である）。プロモーターとしての機能を十分に発揮させる点からＤＮＡ分子の全長は、１２０〜８５０ｂｐ、好ましくは１５０〜６００ｂｐ、特に好ましくは１５０〜３５０ｂｐである。
【００１２】
また、ＴＡＴＡＡＡで表される塩基配列は転写開始のシグナル領域であり、本発明のプロモーターに必須であるので、たとえば配列番号１記載のＤＮＡ分子を修飾する場合でもこの領域を変更することはできない。
この部分塩基配列の最も５’側の塩基Ｔ（チミジン）より３’末端側の塩基の数の上限が、２００ｂｐ、好ましくは１８０ｂｐ、より好ましくは１５０ｂｐ、特に好ましくは１２０ｂｐであり、下限は３０ｂｐ、好ましくは５０ｂｐである場合、特に優れたプロモーター活性を示す。
【００１３】
本発明において「相同性を有する」とは、Ｌｉｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１４３５−（１９８５）のアルゴニズムを利用した配列データベースソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（販売元：宝酒造社、製造元：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）によって算出されたスコアが２００以上あることをいう。本発明において「相同性を有しない」とは同ソフトで算出されたスコアが１００以下であることをいう。
【００１４】
本発明において「プロモーター活性」とは、当該ＤＮＡ分子の下流にある遺伝子の発現を促す活性であり、その測定方法はプロモーターと思われるＤＮＡ領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子を挿入した組み換え体を作成し、マーカー遺伝子産物の発現量を測定する一般的な方法でよい。
【００１５】
より具体的には、以下の手順が例示される。
プロモーター活性を測定したいＤＮＡ配列の下流にマーカー遺伝子を挿入したプラスミドベクターを作製する。このマーカー遺伝子としてはサンプルの調製および測定の容易さからルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。このプラスミドは他の領域に同じマーカー遺伝子を含まないものであれば特に限定されるものではなく、後述する組み換え体の説明で例示されるものと同じものが使用できる。
【００１６】
この組み換えプラスミドを用いて組み換えベクターは常法に従って作製される。作製されたベクターは細胞内に導入される。ここで用いられる細胞は、プロモーターが転写され、マーカー酵素の測定に影響を与える物質、ルシフェラーゼを例に取れば発光基質、発光酵素などを含まない細胞であればよい。
【００１７】
このように遺伝子導入した細胞を一定時間培養した後、マーカー遺伝子によって発現されたタンパク質を抽出、回収する。培養時間は、マーカー遺伝子によって任意に設定できる。ルシフェラーゼの場合は１０時間後から５日以内であり、好ましくは１８時間後から３日以内で、より好ましくは約２４時間後である。培養時間はあまり短いとプロモーターの活性が完全に現れる前であり、長すぎると発現したタンパク質が分解され、プロモーターの活性が正しく測定できない。
【００１８】
回収されたマーカ遺伝子産物の活性を測定し、培養量あたりのマーカー遺伝子産物量を算出し、一定細胞あたりのプロモーターの量を換算する。マーカー遺伝子としてルシフェラーゼを使用する場合、発現量の測定にはルミノメーターを用いるのがよい。既知濃度のルシフェラーゼをまず測定し、ルシフェラーゼ量とルミノメーターより読みとれる数値の換算の標準直線を求める。この標準線より、ルシフェラーゼの量を換算する。この方法によれば、マーカー遺伝子産物量を換算することによって、プロモーター強度を測定することができる。
【００１９】
（２）組み換え体
本発明の組み換え体は、上述した本発明のプロモーターとその下流に外来性のタンパク質をコードする遺伝子（以下、外来遺伝子という）とを有するものである。
本発明において組み換え体は、組み換えウイルスや組み換えプラスミドなどの組み換えベクターである。組み換えウイルスは特に限定されるものではないが、真核生物の核内でＤＮＡ複製がおこるものが望ましい。具体例としては、組み換えウイルスとしては、組み換えアデノウイルスや組み換えヘルペスウイルスが好ましく、特に組み換え七面鳥ヘルペスウイルスや組み換えマレック病ウイルスなどの組み換えヘルペスウイルスが好ましい。
【００２０】
組み換えウイルスは、例えば、以下のように調製される。ベクターにクローニングされたウイルスゲノムの非必須領域に、当該ウイルス内で機能するプロモーターとともに他の病原体の抗原遺伝子を組み込む。ウイルス感染細胞に該ベクターを導入することにより、相同組み換えを起こさせ、その結果生じた組み換えウイルスを選択、純化する。ここで非必須領域は、外来遺伝子が挿入されても生体内での増殖低下が起こらないか、低下が少ないゲノム領域を選択するのが望ましい。
【００２１】
組み換えウイルスをワクチンとして用いる場合、組み込む外来遺伝子として抗原遺伝子を用いる。具体的な作製方法は以下の通りである。
すなわち、あらかじめウイルスを感染させた細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔法、遺伝子銃による挿入、リポフェクチン法等により組み換えベクターが導入することで、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換えが起こさせ、組み換えウイルスが構築される。または、感染性のあるウイルスゲノムＤＮＡとともに組み換えベクターを上記方法で細胞に導入することによっても組み換えウイルスを構築することができる。
【００２２】
得られた組み換えウイルスを、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、組み込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方法により、生育してくるプラークの中から候補株を純化する。候補株が目的の組み換えウイルスであることは、組み込んだ抗原遺伝子のコードするポリペプチドに対する抗体を使用したイムノアッセイ等の方法により確認できる。例えば、マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えウイルスの場合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、その基質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するので、その性質を利用して選択、純化することができる。
宿主細胞としては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを用いた場合は、ＣＥＦ細胞や、発育鶏卵しょう尿膜細胞等が挙げられる。
【００２３】
（ウイルス）
組み換えウイルスを作製するために用いるウイルス（親ウイルス）は、真核生物の核内で増殖するいかなるウイルスでもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家禽類の細胞中で増殖可能な、例えばトリアデノウイルスや、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）、マレック病ウイルス（以下、ＭＤＶということがある）、伝染性咽頭気管炎ウイルス（以下、ＩＬＴＶということがある）などのヘルペスウイルスが例示される。
【００２４】
ヘルペスウイルスの具体例としては、ＨＶＴではＦＣ１２６（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。また、ＭＤＶとしては、具体的にはＣＶＩ９８８やＳＢ１などが挙げられる。
ここに例示されたウイルスは、寄託機関、市販ワクチンとしてあるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などの機関から入手できる。
【００２５】
（非必須領域を含有するベクター）
組み換え用ベクターの構築に用いられるウイルスの非必須領域をクローニングするためのベクターは、特に限定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミドなどのベクターを適当な制限酵素で処理して、ウイルスの非必須領域を組み込めばよい。
【００２６】
（非必須領域）
ウイルスの非必須領域は、親ウイルスゲノムと相同組み換えを起こしうる領域であって、親ウイルスの増殖に非必須な領域であれば特に制限されない。こうした非必須領域は、公知のものを用いることができ、例えばＷＯ９９／１８２１５号公報に記載された遺伝子間領域などを利用することもできる。より具体的に好ましい非必須領域としては、七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子間が挙げられる。
【００２７】
（抗原遺伝子）
抗原遺伝子は、組み換えウイルスが感染細胞中で、転写、翻訳し抗原タンパク質として発現しうるものであればよく、例えば、ニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶということがある）のＨＮタンパク質をコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７（１９８６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，５、３４３−３５６（１９８６））、ＭＤＶの糖タンパク質ｇＢをコードする遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１７８９−１８０４（１９８８））、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶということがある）の構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１、１３０３−１３１２（１９９０））、マイコプラズマ（以下、ＭＧということがある）のアドヘシンタンパク質、ＨＭＷ関連タンパク質、４０Ｋタンパク質（ＷＯ９３／２４６４６号公報）、６６Ｋタンパク質、６７Ｋタンパク質など（ＷＯ９７／０３１８７号公報）、伝染性喉頭気管炎ウイルスのｇＢタンパク質（Ｐｏｕｌｓｅｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、５、３３５−３４７（１９９１）、ＵＳＰ５，４４３，８３１）、ＵＬ３２タンパク質（ＷＯ９８／０７８６６号公報）等の感染防御に関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。
【００２８】
また、これら抗原遺伝子のうち、特にＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質などは株間によって変異が激しいことが知られているが、挿入される遺伝子は株によって特定されるものではなく、日本の超強毒株である、岡山株、愛媛株、徳島株、ヨーロッパの超強毒株であるＵＫ６６１、アメリカの強毒株であるＳＴＣ株やＶｉｒｕｌｅｎｔＥ株など由来のＶＰ２遺伝子（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ．ら、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．、１４２、１４４１−１４５８（１９９７））を例示することができる。
【００２９】
（組み換え用ベクター）
本発明で用いる組み換え用ベクターは、非必須領域に抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入されたものである。前述の非必須領域中に前述の抗原遺伝子及びそれを支配する本発明のプロモーターを挿入すればよい。さらに、組み換えウイルスの純化などの効率化のために大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子をプロモーターとともに組み込んでもよい。
【００３０】
（プロモーター）
本発明で用いるプロモーターは、上述した本発明のプロモーターである。このプロモーターは上述した外来遺伝子の発現を支配するようにウイルスゲノム中で、プロモーターの下流に抗原遺伝子が位置するように挿入される。
マーカーを挿入する場合、マーカーの発現を支配するプロモーターを用いる。ここで用いるプロモーターは特に制限されず、組み換えウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するものであればよい。
【００３１】
（エンハンサー）
さらに、本発明の組み換え体には、請求項１記載のプロモーターにエンハンサー配列を入れたものである。全長が短いプロモーターにエンハンサーを含ませても遺伝子の脱落が生じにくい。
【００３２】
（３）ワクチン
本発明を利用する生ワクチンは、上述した本発明の組み換え体を１種類以上含有し、これが有効成分となっているワクチンである。即ち、本発明の組み換え体、好ましくは組み換えウイルスを単独、または２種類以上混合または併用して用いることができる。さらにこのほか、本発明のワクチンと他のワクチンとを組み合わせてもよい。ここで、組み合わせ可能な他のワクチンとしては、たとえば特開平２−１５７３８１号公報や特開平３−２７２８４号公報記載の抗ＮＤＶワクチンとなる組み換えアビポックスウイルスや特開平６−７８７６４号公報や米国特許出願第０８／４９９，４７４号明細書に記載されている抗ＭＤＶワクチンとなる組み換えアビポックスウイルスなどの組み換えワクチン、抗ＭＤＶワクチンとして用いられる七面鳥ヘルペスウイルスワクチンなどが例示される。
また、組み換え体以外にも薬理学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含んでいてもよい。
【００３３】
本ワクチンの調製法は、組み換えウイルスを用いる場合、その感染細胞を当該ウイルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、ウイルスを増殖させた後、感染細胞を回収し、ウイルスをワクチンとして調製する。ＨＶＴの生ワクチンの場合を例にとって説明する。
宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好ましく、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ腎細胞などを好適に使用することができる。このような宿主細胞に感染させ、ウイルスを増殖させた後、細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清とに分離する。得られた感染細胞は、１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワクチンとして使用するときは１００倍量のリン酸緩衝液にこの凍結保存品を溶かして使用する。
【００３４】
液体窒素下で上記感染細胞を保存するための安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定に生存でき、かつレシピエントにとって薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。
【００３５】
本発明のワクチンの投与方法は特に限定されない。ＨＶＴの生ワクチンの場合は皮下に注射により接種する方法が一般的に用いられており、現行のＨＶＴワクチンと同じである。接種量も従来ワクチンと同様でよく、１０〜１０５ＴＣＩＤ５０を接種、好ましくは初日齢に鶏の背部皮下においての１０３ＴＣＩＤ５０接種である。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）高活性Ｐｅｃプロモーターの構築と活性測定
１−１  末端切り縮めβ−アクチンプロモーター
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載された、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトにｐｏｌｙＡ付加シグナルとＳｆｉＩサイトを導入したプラスミドｐＧＩＭＩＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（全長２７７３ｂｐ）を制限酵素ＮｈｅＩで処理して得られた断片と、Ｐｉｃａｇｅｎｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（全長５０６４ｂｐ。東洋インキ社製）をＮｈｅＩ及びＸｂａＩで切り出して得られた１７２１ｂｐとを連結し、プラスミドｐＬＵＣ−ｐｒｏ（全長４４９４ｂｐ）を作製した。
【００３８】
次に、ニワトリのゲノムバンクを作製し、これをテンプレートとして、配列番号８記載のプライマーＰｒＢａｃ１（５’−ＣＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣ−３’）及び配列番号９記載のプライマーＰｒＢａｃ２（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）を用いてＰＣＲによりβ−アクチンプロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。
【００３９】
この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで処理して得られた約１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ−ｐｒｏをＰｓｔＩおよびＸｂａＩで処理して得られた４４８２ｂｐのＤＮＡ断片とを連結して、β−アクチンプロモータ領域を含むｐＬＵＣ−ｂａｃ（５９８６ｂｐ）を作製した。
【００４０】
得られたｐＬＵＣ−ｂａｃをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで処理した後、５９５８ｂｐの断片を回収、ライゲーションしてｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを作製した。このｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを、５’側の切り縮めにはＰｓｔＩとＳｍａＩ、３’末端側にはＳａｃＩとＸｂａＩを用いて処理した。引き続き、得られたＤＮＡ断片をＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、ＥｘｏＩＩＩと３分間反応させ、１分おきにサンプルを分取し、約２００ｂｐ〜約１５００ｂｐのプロモーター断片を含むプラスミドを多数取得した。
【００４１】
ルシフェラーゼ活性測定は、東洋インキ製造株式会社（販売元：和光純薬）の「ピッカジーン」を用いた。まず、これらのプラスミド２９個について各１μｇを、２×１０６個の細胞に、０．４ｃｍギャップのキュベットを用いて、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子を導入した。
約２４時間培養した後、培養液を捨て、細胞融解液を加えた後、−８０℃で１時間凍結し、細胞を完全に融解した。得られた液体を遠心分離して得られた上澄み活性測定用のサンプルとした。１００μｌずつ分注した前述記載のＫｉｔ添付の基質液に、１０μｌのサンプルを加え、１分後にルミノメータ（型番「ｍｏｄｅｌ１１２５３」、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、発光の強さ（単位：ＲＬＵ）からルシフェラーゼ生産量を算出し、プロモータ活性を調べた（図１参照）。
【００４２】
全長β−アクチンプロモーターのルシフェラーゼ生産量を１とすると、５’側の切り縮めサンプルは図１のように、ＴＡＴＡＡＡの配列より５’側が１２０ｂｐ以上欠損しているものの活性が急激に低下した。
一方、切り縮めた長さと活性には相関がなく、約８５０ｂｐ切り縮めたときの活性が最も高く、逆に１００ｂｐ足らずの切り縮めサンプルでは活性が全長の０．２倍にとどまった。
【００４３】
１−２  コアシークエンスプロモーター
ｐＬＵＣ−ｂａｃのβ−アクチンプロモーターを鋳型として、配列番号１０記載の５’−ＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴ−３’、配列番号１１記載の５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴ−３’及び配列番号１３記載の５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡ−３’をプライマーとしたＰＣＲを行ったところ、２７３ｂｐ、２１１ｂｐの他、１７５ｂｐ、１６３ｂｐの長さの断片も得られた。
得られたＤＮＡ断片をコアシークエンスプロモーター（ＣＯＡ）と名付けた。これらのＣＯＡを、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ−ｐｒｏをＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理して得られた約４４８２ｂｐの断片とをライゲーションしてプラスミドを得た。得られたプラスミドをそれぞれｐＵＬＣ−ＣＯＡ２７３、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ２１１、ｐＵＬＣ−ＣＯＡ１７５、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ１６３と銘々した。
得られたプラスミドを用いてプロモーターの活性を、前記１−１の方法と同様にして測定したところ、全長β−アクチンプロモーターのルシフェラーゼ生産量を１とすると２７３ｂｐで０．９７、２１１ｂｐで０．７６、１７５ｂｐで０．９６、１６３ｂｐで０．３４となった。
【００４４】
１−３  エンハンサー領域の付加
配列番号５記載のＣＭＶ由来（５９０ｂｐ）のエンハンサー、配列番号６記載のＲＳＶ由来のエンハンサー（９０ｂｐ）は、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプロモーターより上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入した。これらは、プラスミドへの挿入のために、５’側にはＣＴＧＣＡＧの６塩基を、３’末端側にはＧＡＡＴＴＣの６塩基が付加されている。
配列番号７記載のＳＶ４０由来のエンハンサー（２００ｂｐ）を、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３のルシフェラーゼ遺伝子より下流側に位置するＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
これらエンハンサー付加プラスミドについて、上述と同様の方法によりルシフェラーゼ生産量で求められるプロモーター活性を測定したところ、ＲＳＶエンハンサーを有するプラスミドでは１．４倍、ＳＶ４０を有するプラスミドでは３．６倍に活性が上昇することが確認された（図２参照）。
また、ＣＭＶエンハンサーについては、切り縮めたＤＮＡ断片を用意した。具体的には、配列番号５記載の第７番目〜第３７０番目、同配列の第７番目〜第２８２番目、同配列の第７番目〜第１５９番目、同配列の第７番目〜第８９番目、同配列の第９３番目〜第３７０番目、同配列の第９３番目〜第２８２番目、第９３番目〜第１５９番目のＤＮＡ断片を用意し、これらの断片を、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプロモーターより上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入しプロモーター活性への影響を確認した。その結果、挿入する領域によって活性促進の効果が異なっていたが、配列番号５記載の第７〜２８２番目の２７５ｂｐを付加した場合にプロモーター活性が６．５倍と最も高い活性を示した。
【００４５】
この最も高い活性が得られたプラスミドには、ＣＭＶ２７５ｂｐエンハンサーとコアシークエンス２７３ｂｐプロモーターとからなるキメラＤＮＡ領域が含まれている。このエンハンサーとプロモーターとからなるキメラＤＮＡ領域（Ｐｅｃ（＋））のサイズは５５７ｂｐである。また、このキメラＤＮＡ領域中、５’側にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣ）からＴを、３’末端側にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣ）のＡとＴの間のＣを欠失させた５５５ｂｐのキメラＤＮＡ領域を含むプラスミドｐＬＵＣ−Ｐｅｃ（全長５０３７ｂｐ）も作成した。いずれのプラスミドにおいても、従来組み換えＨＶＴの外来遺伝子用プロモーターであるＲＳＶやＣＭＶプロモーターの数倍以上の活性を示した（図３参照）。
【００４６】
（実施例２）組み換えベクターの構築
２−１  ＩＢＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓの構築
新規合成プロモーターＰｅｃ（＋）でＩＢＤＶのＶＰ２を発現させる組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰＥＣ（＋）ＶＰ２Ｓを、以下の手順で構築した。
ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＢｇｌＩで処理して得られた１２０ｂｐのマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｆｉＩで処理したｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂｐ、ＷＯ９９／１８２１５号公報）に挿入し、ｐＮＺ４５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡ （全長５６０６ｂｐ）を作製した。次に、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切り出したプロモーターＰｅｃ（＋）領域を含むＤＮＡ断片（５６１ｂｐ）とｐＮＺ４５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで処理したＤＮＡ断片（それぞれ３６１７ｂｐ、１９７７ｂｐ）の３断片をライゲーションによってｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡ（全長６１５５ｂｐ）を構築した。
【００４７】
ＩＢＤＶ超強毒株である岡山株よりｃＤＮＡを合成して、ＰＣＲにより、ｐＵＣ１９ＳｍａＩ部位にクローニングした３つの断片（Ｖｉｒｏｌ．２２３，２１９−２２３，１９９６）を岐阜大学より入手した。これら３つの断片をＣｌａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて接続して、ＳｅｇｍｅｎｔＡ全長約３．２Ｋｂｐを持つｐＵＣ１９ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭを作製した。このｐＵＣ１８ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭをテンプレートとして、配列番号１３記載のプライマーＰｒＶＰ２−２（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号１４記載のプライマーＰｒＶＰ２−３（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＣＣ−３’）を用いたＰＣＲにより、ＶＰ２のみを含有するＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
このＰＣＲ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＩＢＤＶのＶＰ２Ｓ遺伝子を、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片（６１１３ｂｐ）にライゲーションによって挿入し、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）（全長７４９０ｂｐ）を構築した。
【００４９】
２−２  ＮＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮの構築
新規合成プロモーターＰｅｃでＮＤＶのＦおよびＨＮ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮを以下の手順で構築した。
ｐＬＵＣ−Ｐｅｃから制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切り出したＰｅｃ領域を含むＤＮＡ断片（５５９ｂｐ）と、ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片（２７６１ｂｐ）と連結し、ｐＧＩＰｅｃ（全長３３２０ｂｐ）を作製した。
【００５０】
ＸＬＩＩＩ１０Ｈ（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７，２４１−２５５（１９８７））をテンプレートとして、配列番号１５記載のプライマーＰｒＦ１（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣ−３’）及び配列番号１６記載のプライマーＰｒＦ２（５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲを行いＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで切り出したＮＤＶのＦ遺伝子を含む領域（１８８９ｂｐ）を同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＦ（全長５１９１ｂｐ）を作製した。
【００５１】
同様に、ＸＬＩＩＩ１０Ｈをテンプレートとして、配列番号１７記載のプライマーＰｒＨＮ１（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣ−３’）及び配列番号１８記載のプライマーＰｒＨＮ２（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣＧ−３’）を用いて、ＰＣＲを行い、ＨＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで処理し（１８４２ｂｐ）、同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＨＮ（全長５１２３ｂｐ）を作製した。
【００５２】
ｐＧＩＰｅｃＦのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２５３８ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦ（全長８０２４ｂｐ）を構築し、次にｐＧＩＰｅｃＨＮのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２４７０ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮ（全長１０４９４ｂｐ）を構築した。
【００５３】
２−３  ＭＧ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ
新規合成プロモーターＰｅｃでＭＧの４０Ｋ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳを、以下の手順で構築した。
ｐＧＴＰｓ４０Ｋ−Ｓ（ＷＯ９７／３６９２４、全長３９６７ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＭＧの４０Ｋを含む領域（１３４４ｂｐ）を同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳ（全長４６２２ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（１９６７ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４９３ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ（全長１１４０５ｂｐ）を構築した。
【００５４】
２−４  ＩＬＴＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ新規合成プロモーターＰｅｃでＩＬＴＶのＵＬ３２およびｇＢ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢを、以下の手順で構築した。
ＷＯ９８／０７８６６号公報記載のｐＧＴＰｓＩＬＵＬ３２（全長４３８３ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＩＬＴＶのＵＬ３２遺伝子を含む領域（１７６０ｂｐ）、およびＷＯ９８／０７８６６号公報記載のｐＧＴＰｓＩＬｇＢ（ＢｇｌＩ−）（全長５３０７ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切り出したｇＢ遺伝子を含む領域２６４８ｂｐをそれぞれ挿入領域を切り出した制限酵素と同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２（全長５０３８ｂｐ）、およびｐＧＩＰｅｃＩＬｇＢ（全長５９１８ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２のプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２３８５ｂｐ）、これをｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４９３ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２（全長７８７８ｂｐ）を構築し、次にｐＧＩＰｅｃＩＬｇＢのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（３２６５ｂｐ）、これをｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ（全長１１１４３ｂｐ）を構築した。
【００５５】
（実施例３）組み換えウイルスの構築純化
実施例２に記載のプラスミドについて、以下のブラックプラーク法を用いた純化法によって、組み換えＨＶＴの構築・純化を行った。
まず、Ｍｏｒｇａｎらの方法（ＡＶＩＡＮ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ、３４：３４５−３５１（１９９０））によって、野生型ＨＶＴ（以下ｗｔＨＶＴ）のＤＮＡの調製を行った。
組み換えベクターは、骨格領域にユニークに存在する制限酵素サイトを利用して直鎖状に加工した。
【００５６】
遺伝子導入は電気穿孔法を用い、具体的には以下の方法で行った。
組み換えベクターＤＮＡ ５μgおよび2５μgのＨＶＴ-ＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁した。２×１０６コのニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅＧに懸濁し、上記ＤＮＡ液を加え、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子導入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｎ（ともにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）（以下、ＬＭ（＋）と言う）を加え、６ｃｍ径の細胞培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社）で、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ）に分注し、プラークがでるまで培養した。各プレートから２枚ずつレプリカのプレートを作製し、同様にプラークがでるまで培養した。そのうちの１枚をメタノールで固定し、挿入遺伝子に対するウサギ抗体を１次抗体とした抗原抗体反応により、組み換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認されたｗｅｌｌに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣＥＦとまぜて９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ｗｅｌｌから由来するプラークがほぼ１００％組み換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに新たに調製したＣＥＦに感染させた。再び、希釈・レプリカの作製を、組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。
【００５７】
組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）を用いた場合、抗ＶＰ２タンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１６（以下、ＨＦ−ＰｅｃＶＰ２と言うことがある）を作製した。また、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮを用いた場合、抗ＮＤＶウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１８（以下、ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦと言うことがある）を作製した。同様に、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＭＧを用いた場合、抗ＭＧ４０Ｋタンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−Ｐｅｃ４０ＫＳを、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢを用いた場合、抗ｇＢタンパク質およびＵＬ３２タンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−ＰｅｃＩＬＴを作製した。
【００５８】
純化の終了したウイルスＤＮＡをＭｏｒｇａｎらの方法により回収し、制限酵素で処理し、アガロース電気泳動後にナイロン膜に移した。挿入抗原遺伝子を鋳型としたランダムプライマー法でサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果、組み換えウイルス中に挿入遺伝子が設計どおり正しく存在することが確認された。
【００５９】
（実施例４）挿入遺伝子の安定性
挿入遺伝子の安定性を選択なしに５代継代を重ねた組み換えウイルスについて調べた。
ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦの組み換え体について、継代後のウイルスを用いて、抗ＮＤＶ抗体を用いたＢＰＡ法によって純度の検定を行ったところ、すべてのプラークが継代前と全く同様に陽性であった。
また、組み換えに用いた相同領域および挿入遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、正しい組み換えが起こっていると得られる理論どおりの大きさの、継代前と同様な位置にバンドを検出することができ、これら挿入遺伝子がウイルス中で安定に存在することを確認した。
【００６０】
（実施例５）免疫蛍光抗体法による挿入遺伝子発現の確認
ＨＦ−Ｐｅｃ４０ＫＳおよびＨＦ−ＰｅｃＩＬＴについて、免疫蛍光抗体法を行った。それぞれの組み換え体をＣＥＦに感染させ、３７℃でプラークが出現するまで培養後、冷アセトンで固定し、抗４０Ｋウサギ抗体または抗ＵＬ３２、抗ｇＢウサギ抗体を一次抗体として、１００から１０００倍に希釈して反応させた。これらの培養細胞をさらに蛍光物質（ＦＩＴＣ）を結合した抗ウサギイムノグロブリンと反応させ、非特異反応部分を洗い流したのち蛍光励起波長光下で顕微鏡観察した。反応性は表１に示した。
【００６１】
【表１】
0004257472.tif 000002
【００６２】
この結果から本発明によるプロモーターによって抗原遺伝子が非常に良く発現していることがわかった。
【００６３】
（実施例６）鶏感染防御試験
６−１  ＮＤＶに対する効果実験
実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効果を判定するためにワクチン効果実験を実施した。
各群１０羽以上の市販されている白色レグホン（Ｄｅｋａｌｂ鶏、神奈川養鶏連合会）から生まれた初生鶏に、新規プロモーターの組み換えＨＶＴ：ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦを接種した。陽性対照群にはＮＤＶの市販生ワクチン（ＮＤＶ−Ｂ１
ｓｔｒａｉｎ日本生物科学研究所）を接種し、陰性対照群は非接種とした。
【００６４】
初生鶏に、組み換えＨＶＴを鶏の背部皮下に１０３ＴＣＩＤ５0となるように２６Ｇの注射針を使って接種した。陽性対照群に使用した市販のＮＤＶ生ワクチンは、７日齢鶏に用法通り点眼接種した。
接種４週後に、各群の雛に強毒ＮＤＶ（Ｓａｔｏ株）を１０４ｐｆｕとなるように右大腿部にチャレンジした。チャレンジ後４日目にＮＤＶの発症の有無を観察した。
また、ＮＤＶウイルスをチャレンジする前に各鶏から採血を行い、各鶏の血清中のＮＤＶに対する赤血球凝集抑制抗体の検出を行った。判定は市販されているＮＤＶ赤血球凝集素（日本生物科学研究所）の使用説明書に従った。
結果を表２にまとめた。
【００６５】
【表２】
0004257472.tif 000003
【００６６】
なお、初生齢のＨＩ抗体価は２９であった。
この結果から明らかなように、ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦを接種した群ではＮＤＶのチャレンジに対してほぼ完璧なワクチン効果が示された。また、チャレンジ時のＨＩ抗体価も非接種群（＜２）と比較して明らかに高い値を示した。
これらの結果から明らかなように、本発明による組み換えＨＶＴによる生ワクチンは移行抗体鶏に対しても充分な感染防御を付与できることが示された。
【００６７】
６−２  鶏ワクチンのＩＢＤＶに対する効果実験
実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効果を判定するためにＩＢＤＶに対するワクチン効果実験を実施した。なお、プロモーター配列がＣＭＶであることを除き、実施例２，３とほぼ同様な手順で作製した組み換えＨＶＴをコントロールとして用いた。
各群１０羽以上の試験用ＳＰＦ鶏（ＬｉｎｅＭ：日本生物科学研究所）に、ＰｅｃプロモーターまたはＣＭＶプロモーターに制御されるＶＰ２遺伝子を発現する組み換えＨＶＴを接種した。陽性対照群にはＩＢＤＶの市販のワクチンを接種し、陰性対照群は非接種とした。
【００６８】
試験用ＳＰＦ鶏が孵化したとき、各組み換えＨＶＴを鶏の背部皮下に１０４ＰＦＵとなるように２６Ｇの注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販のＩＢＤＶワクチン（北里研究所）は、１６日齢の雛に用法通り点眼接種した。
【００６９】
生ワクチン接種１７日後に、各群の雛に超強毒ＩＢＤＶ（Ｏｋａｙａｍａ株）を１．５×１０３.8ＥＩＤ５0となるように経口でチャレンジした。チャレンジ後約３日までの鶏の生死を観察した。その後生存した鶏を屠殺し、ＩＢＤＶの発症の有無をファブリキウス嚢の病変形成状態を指標として効果を判定した。ファブリキウス嚢の病変形成状態は、出血（Ａ）、嚢内チーズ様浸出物形成（Ｂ）、黄色病変（Ｃ）、ゼリー様浸出物形成（Ｄ）、水腫（Ｅ）の５点で判定した。各病変スコアは、病変を示した鶏羽数で表した。
結果は表３に示した。
【００７０】
【表３】
0004257472.tif 000004
【００７１】
ファブリキウス嚢体重比について各群間で統計的処理（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔ）で有意差検定を実施したところ、ＣＭＶ−ＶＰ２接種群および市販ワクチン接種群は非接種対照群と有意差（ｐ＜０．０５）を示したが、ＨＦ−ＰｅｃＶＰ２接種群はさらに強い有意差（ｐ＜０．０１）を示した。この結果から明らかなように、本発明によるプロモーターを有する組み換えＨＶＴを接種した群では従来のプロモーターを有する組み換えＨＶＴに比較してより効果の良いスコアを示した。また、このスコアは市販ワクチン接種よりもより高い感染防御効果を示していることがわかった。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、必要領域が短く高活性かつ安全で安定な新規プロモーターが提供され、そのプロモーターを含む組み換えベクター、および組み換えベクターを利用し創出される組み換えウイルス、組み換えウイルスを主成分とする遺伝子組み換えワクチン、あるいは組み換えＤＮＡワクチンが提供される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NIPPON ZEON Co. Ltd.,
<120> Novel Promoter, Recombinant Thereof, and the Uses Thereof
<130> pec promoter ID01-18
<140>
<141>
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> chicken
<400> 1
ggggcggggc caggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 60
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 120
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttc                        159
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> chicken
<400> 2
tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 60
ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg ga                    102
<210> 3
<211> 561
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Pec Promoter
<400> 3
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 60
gttacataac ttacggtaaa tggcccgccg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccatt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggatgcag tattttgtgc agcgatgggg 300
gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480
tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540
ctgactgacc gcgtctagag g                                           561
<210> 4
<211> 1495
<212> DNA
<213> chicken
<400> 4
gctgcagctc agtgcatgca cgctcattgc ccatcgctat ccctgcctct cctgctggcg 60
ctccccggga ggtgacttca aggggaccgc aggaccacct cgggggtggg gggagggctg 120
cacacgcgga ccccgctccc cctccccaac aaagcactgt ggaatcaaaa aggggggagg 180
ggggatggag gggcgcgtca cacccccgcc ccacaccctc acctcgaggt gagccccacg 240
ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttttt 300
tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 360
gggcggggcc aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 420
ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 480
cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc 540
gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 600
gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt 660
ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg 720
ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc 780
ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg 840
ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg 900
cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta 960
acccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc 1020
tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg 1080
tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc 1140
ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 1200
gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg 1260
cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa 1320
tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc 1380
ggggctgccg cgggggaccg ctgccttcgg gggggcgggg cagggcgggg ttcggcttct 1440
ggcgtgtgac cggcggggtt tatatcttcc cttctctgtt cctccgcagc cagcc      1495
<210> 5
<211> 599
<212> DNA
<213> cytomegalovirus
<400> 5
ctgcagagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 60
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 120
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 180
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 240
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 300
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 360
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 420
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 480
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 540
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca gatatgcat  599
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Rous sarcoma virus
<400> 6
ctgcagaatt ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg 60
ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca cctccatgca t                     101
<210> 7
<211> 269
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 7
caattggatc tgctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 60
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 120
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 180
gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 240
ccccatggtt cagatcctct agggaattc                                   269
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrBac1
<400> 8
cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc                        39
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrBac2
<400> 9
gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg            50
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non
<400> 10
tttctgcagt attttgtgca gcgat                                       25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non2
<400> 11
acgtctagaa ggcaacgcag cgact                                       25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non3
<400> 12
ctgtctagat aacgcggtca gtcaga                                      26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-2
<400> 13
gcggatcccc cgcagcgatg acgaacctgc                                  30
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-3
<400> 14
gcgtcgactc acctccttag ggccc                                       25
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:prF1
<400> 15
gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc                 45
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:prF2
<400> 16
gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg                             34
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrHN1
<400> 17
gcggatcctc ttcagtcatg gaccgcgcag ttagccaagt tgcgc                 45
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrHN2
<400> 18
gcggtaccgc atgcgggccc gctagcgagc tcgcgccggt actcagtttg attcttggcg 60
【図面の簡単な説明】
【図１】切り縮めたプロモーターの相対活性を示した図である。尚、図中１５００番目は切り縮める前のβ−アクチンプロモータの活性であり、この活性を基準（１．０）とした。
【図２】プロモーターとエンハンサーの連結様式と相対活性を示した図である。
【図３】本発明のプロモーターと従来のプロモーターとの相対活性を示した図である。
【図１】
0004257472.tif 000005
【図２】
0004257472.tif 000006
【図３】
0004257472.tif 000007