(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微区画マイクロチャネルを複数組有する基材を備えて、各組の寸法が均一であり、組によって微区画の寸法が異なり、前記マイクロチャネルには少なくとも１種類の定量試薬がコーティングされていることを特徴とする、液体試料内の微生物を検知するための定量器具。
【請求項２】
異なる微区画には、異なった定量試薬がコーティングされていることを特徴する、請求項１に記載の定量器具。
【請求項３】
前記定量試薬は、栄養培地を備えることを特徴とする、請求項１または２に記載の定量器具。
【請求項４】
複数列の微区画を有することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の定量器具。
【請求項５】
多層構造の微区画を有することを特徴する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の定量器具。
【請求項６】
毛管作用により液体試料を接種されるように適合されていることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の定量器具。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の定量器具を用いて最確数分析を実施する方法であって、
ａ）  試料を培養器の複数の微区画に分注するステップと、
ｂ）  該培養器を、前記微生物が少なくとも１細胞分裂周期を終えることができる充分な時間をかけてインキュベートするステップと、
ｃ）  該微区画内における該微生物の有無を検知するステップと、
ｄ）  微生物が検知されたウェル数に基づいて最確数分析を実施するステップと、
を備えることを特徴する方法。
【請求項８】
試料を該培養器に分注する前記ステップは、毛管作用を介して微区画に接種される試料に該定量器具を挿入するステップを備えることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９７年４月９日出願第０８／８３８，５５２号の一部係属出願である。
【０００２】
本発明は微量用区画を用いて微生物を迅速かつ正確に検知し計数する方法および器具に関する。
【０００３】
微生物の検知および計数は、食品加工業界（Ｅ．ｃｏｌｉおよび黄色ブドウ球菌などの微生物による食品の汚染をテスト）、医療業界（患者の検体あるいは他の医学的試料の感染あるいは汚染をテスト）、環境試験業界、製薬業界、および化粧品業界などのさまざまな分野で実施されている。
【０００４】
微生物の増殖による検知および計数は一般に、液体培地（最確数分析（ＭＰＮ法））あるいは半固体培地（寒天ぺトリ皿などを用いる直接計数）のいずれかを利用して行っている。液体ＭＰＮ方式を用いた計数では通常、対象試料の１０倍希釈液を順次、選択された培地および化学指示薬を含有する複数組の試験管に繰り返し投入して実施する。この試験管を高温（２４〜４８時間）でインキュベートした後、微生物の増殖を調べる。各組の試験管のうち陽性および陰性の数に基づいて統計式を用い、初期試料に含有されている微生物の数を推定する。
【０００５】
ＭＰＮ分析によるこの方法にはいくつかの欠点がある。まず、この分析の実施には複数回に及ぶ希釈およびピペット測量が必要であるため、労働集約的である。さらに、各希釈について約３〜５本の試験管の複数組を繰り返し用いなければならない。その結果、微生物濃度に対するＭＰＮ推定値の９５％信頼限界は極めて広範囲である。例えば、３本の試験管によるＭＰＮ推定値２０の９５％信頼限界は７〜８９にわたる。
【０００６】
上述の方法とは対照的に、試料内の生育可能な微生物を直接計数する方法は、ゲル化剤を含有する培地を用いた規定領域上に試料を塗沫することで実施可能である。このゲル化剤（寒天）がインキュベート（２４〜４８時間）中の微生物の拡散を防止し、微生物が配置された元の領域内にコロニーを形成する。しかしながら、培地の所与領域におさまるコロニーの数には限界があり、やがて隣接するコロニーは融合して、数の正確さに悪影響を与えることになる。このため、通常は各試料に対していくつかの希釈液が必要となる。さらに、混合された個体群のなかに存在する微生物の個々の種類を識別するために使用可能な化学指示薬微粒子の種類は、ゲル化された培地において不溶性の生成物を生産するものに限定される。
【０００７】
これらの欠点に加え、現在使用されているＭＰＮ分析においてもゲルを用いるシステムにおいても、陽性結果が出るまで比較的長いインキュベートが必要である。
【０００８】
本発明の方法は、現在使用されている方式が抱える問題を解決する。一般に、本発明は、使用量を微量にすることにより検知速度が実質的に増すという驚くべき結果に基づいて、微生物の迅速かつ正確な検知および計数を可能にする方法を提供する。本明細書において用いるように、用語「微生物」とは、例えば単細胞（組織あるいは臓器から直接培養されるあるいは派生する）である真核細胞あるいは細胞の小集塊といった微形態ばかりでなく、細菌、マイクロプラズマ、リケッチア、スピロヘータ、イースト菌、カビ、原生動物も含み、これらに限定されないすべての微生物および細胞を含む。微生物は、その完全な細胞が直接に検知される場合にのみ検知および／または計数されるのではなく、細胞の断片、細胞から派生した生物学的分子、細胞による生成物が検知あるいは定量された細胞などが間接的に検知された場合にも検知あるいは定量される。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、液体試験試料内の微生物を検知する方法を特徴とする。この方法は、試料の微量を培養器の複数の微区画に分注するステップと、その培養器を、微生物が少なくとも１細胞分裂周期を終えるまで充分な時間をかけてインキュベートするステップと、微区画内における微生物の有無を検知するステップとを含む。
【００１０】
本明細書で用いる用語「微量」とは、約０．０１〜約２５マイクロリットルの範囲の量を意味し、用語「微区画」とは、微量の液体試験試料を保持できる容量あるいは容積を有する区画を意味する。
【００１１】
好適実施例において、本方法はさらに、液体試験試料内の微生物を定量するステップを含む。この定量には、試料内のＭＰＮを特定するステップを含んでも、あるいは培養器内の各微区画内に存在する微生物を計数するステップを含んでもよい。
【００１２】
他の実施例において、微区画に培地のコーティングを施してもよく、この培地はさらに、少なくとも１種類の指示薬物質を含有してもよい。別の方法として、液体試験試料に少なくとも１種類の指示薬物質を含有してもよい。どちらの場合も、指示薬物質は、液体試験試料内において検知可能な標識を示すことができればいずれでもよい。このような指示薬物質の例として、色素産生指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬、および電気化学指示薬を挙げられるがこれらに限定されるものではない。本願の目的でいう用語「電気化学」とは、微生物と反応して試料の抵抗あるいは電気導電性を変化させる化学的指示薬を意味する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、液体試験試料内の微生物を検知する方法を特徴とする。この方法は、試料のアリコートを、各組は均一な寸法であるが組が異なると寸法も異なる微区画の複数組を具備する培養器の複数の微区画に分注するステップと、その培養器を、微生物が少なくとも１細胞分裂周期を終えるように充分な時間をかけてインキュベートするステップと、微区画内における微生物の有無を検知するステップとを含む。
【００１４】
好適実施例において、これらの方法で用いる微区画の寸法は均一であり、各微区画の容積は約０．０１〜約２５マイクロリットルである。各微区画の容積が約０．１〜約１０マイクロリットルであればより好ましく、約１〜約２マイクロリットルであれば尚一層好ましい。
【００１５】
培養器は１〜約１００，０００個の微区画を具備することが好ましく、約１００〜約１０，０００個であればより好ましく、約２００〜約５，０００個であれば尚一層好ましく、約４００〜約６００個であれば最も好ましい。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は定量器具を特徴とする。この器具は複数の微区画を有する基材を具備しており、各微区画は頂部および低部を有する。この基材の微区画間に疎水性である「陸域」を設けてもよい。微区画には、例えば栄養分などの定量試薬、ゲル化剤または、色素産生指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬あるいは電気化学指示薬などの指示薬を含有することが好ましい。液体試料をウェル内に投入する際に気泡を形成しないよう、頂部および低部の双方に開口部を設けた微区画があってもよい。底面の開口部を、通気性であるが水性液体については実質的に不透過性である材料で閉鎖する。
【００１７】
さらに別の実施態様において、この器具は、マイクロチャネルの形態をとる微区画を具備する。このマイクロチャネルを単層基材上に具備しても、フィルムなどの多層基材上に具備してもよい。この器具のマイクロチャネル間に疎水性の陸領域は設けても設けなくともよい。マイクロチャネルは基材に形成された細長い穴を備えてもよい。好適実施例において、マイクロチャネルをフィルムでカバーしている。
【００１８】
この微区画マイクロチャネルは毛管を具備してもよい。分離した毛管を合わせて形成／接合して培養器を形成する。このマイクロチャネルは少なくとも１種類の定量試薬をコーティングして有することが好ましい。
【００１９】
これらの微区画を、実質的に平行に配列することができる。通常、各列の微区画の容積は均一である。別の方法として、陽性を示す標識の確認および計数を容易にするようにさまざまなグループあるいはパターンに配列することも可能である。
【００２０】
これらの微区画の容積は約０．０１〜約２５マイクロリットルが可能であり、約０．１〜約１０マイクロリットルであればより好ましく、約１〜約２マイクロリットルであれば最も好ましい。
【００２１】
本明細書において説明するように、本発明にはいくつかの利点がある。第１に、微区画に微量を用いることにより、液体試験試料内の微生物を驚くほど迅速に検知できる。第２に、このように迅速に検知できることにより、液体試験試料内の微生物を迅速に計数あるいは定量できる。本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉあるいは黄色ブドウ球菌などの特定の微生物を含む液体試験試料のＭＰＮ分析に特に有用である。本発明により、別々の試験管を用いるのとは対照的に、ＭＰＮ分析を１つの器具内において便宜良く実施でき、有利なことに、微生物の増殖が検知可能となるまでのインキュベート時間を大幅に短縮できる。第３に、微区画に微量を適用することから、液体試験試料を比較的数多くの試験容積に分割することができる。一般に、微量を微区画に用いるのであれば、液体試料に対する試験の回数を大幅に増加できる、あるいは試験を繰り返し実施できる。ＭＰＮ分析の場合、微量を微区画に用いることにより、ＭＰＮ値を算出できるデータ資料数が増加し、これにより所与のＭＰＮ結果に対する９５％信頼限界を大幅に狭めることができる。第４に、試料を数多くの試験容積に分割することにより、計数する微生物の密度が高くなり、試料を希釈するステップを削減あるいは削除できる。第５に、本発明により、ＭＰＮ分析を、指示薬および／または栄養分を直接コーティングした１つの器具内で実施することが出来る。第６に、本発明により、ＭＰＮ分析を行う際、計数域を拡大すること可能である。
【００２２】
本発明は、液体試料内の微生物を標識を基にして検知する際、微区画に微量の液体試料アリコートを用いることに関する。
【００２３】
液体試料を微生物の存在あるいは量について試験する際に従来技術に起こる問題には、インキュベート時間が比較的長いこと、試験するアリコート用に別々の容器を使用する必要があること、およびテストに比較的大量の試料を必要とすることである。
【００２４】
本発明は、このような試験に関するこれらの問題および他の問題に対する解決策を提供する。本発明は、試験器の微区画に微量を分注することにより、液体試料内の微生物の存在、量、あるいは不在を検知する方法を提供する。本明細書内において使用する用語「微量」とは、約２５マイクロリットル未満の量をいい、サブマイクロリットル範囲の量も含む。本願の発明者たちは、液体試料内の微生物の検知を微量で行うと、検知可能な標識を得る増殖程度までに必要なインキュベート時間が著しく短縮できることを発見した。この分野において、インキュベート時間の短縮は非常に望ましいことであるため、本発明のこの特徴は大きな利点となる。さらに、微量区画を比較的多数使用することにより、結果に対する９５％信頼限界を大幅に狭めることが出来、濃縮試料の希釈液数を削減することが出来る。
【００２５】
上述の利点に加え、液体試料の試験を微量で行うことにより、実質的に少量の試験試料で足りる場合もある。試料源がわずかな量しかないためにごく少量の試験試料が必要な場合も、あるいは取扱が容易であるなどの理由からごく少量の試験試料が望ましい場合もある。
【００２６】
本願の発明者たちは、液体試料を微量で試験するための数多くの新規な器具を開発してきた。これらの器具の例として、複数の微区画を有し、さまざまな表面処理を有して性能および便宜を改良したマイクロエンボス加工あるいはプレス加工したフィルムおよび、通気性であるが、水性流体には実質的に不透過性である材料で各ウェル底部の開口部が閉鎖されている、底部が開口した複数の微区画を有するマイクロエンボス加工あるいはプレス加工したフィルムなどの基材を挙げられるが、これらに限定するものではない。底部を開口した形状にすることにより、気泡を微区画内の試料に包含する可能性を回避できる場合もある。
【００２７】
平面図で見る微区画の外観例として、略円形、小平面、正方形、楕円、あるいは細長を挙げられる。このような微区画の形状には、底部の開口あるいは閉鎖に関わらず、円柱、円錐、ピラミッド型、半球型、四面体、立方体、切頭形状などの数多くが適用可能であることを理解されたい。
【００２８】
他の例として、マイクロチャネルを具備して、毛管作用により液体試料がマイクロチャネル内に移動するプラスチックフィルムなどの基材を挙げられる。このマイクロチャネルは、合わせて形成あるいは接合することにより基材をなす別個の毛管でもよい。各チャネルの断面には、円形、三角形、正方形、長方形などの多くの形状をとることが可能である。マイクロチャネルの（両）端部における断面積は、その中間の断面積より狭い。このような形状をとることにより、器具の取扱中に試料が飛散することを防ぐ。
【００２９】
有利なことに、上記に要約した器具では、１つの器具で微量のアリコートを用いて液体試料の試験を行うため、別個の容器は不必要である。試験試料を数百あるいは数千の別個の微区画に分注してもよいことから、液体試料試験におけるデータ資料数が実質的に増加する。
【００３０】
これらの方法および器具を、増殖による液体試験試料内の微生物の検知および計数に適用すると、特に有用である。このような増殖による検知および計数は、食品、環境、医療、薬品、化粧品、および他の試料を微生物の汚染について調べる試験に非常に重要である。本発明の方法および器具により、これらの試料を効果的に、正確に、便宜良く、低コストで試験することができる。
【００３１】
本発明の方法および器具をＭＰＮ法において使用することが好ましい。各試験管用にピペットで移す必要がないため、労働量は大幅に削減される。それどころか、１つの器具を搭載し、試料を微区画上に拡散するなどの方法により、液体試料を微区画内に分注する事が出来る。さらに、器具内に数多くの微区画を具備しているため、試料の希釈回数も少なくてすむ。微区画の数が比較的多いため、微生物密度をより正確に推定することが出来る。これは、それ相当のデータ試料数が多いために、信頼限界区間がそれ相当に狭まることによる。
【００３２】
このように、本発明は液体試験試料内の微生物を検知する方法を提供する。この方法ではまず、試験試料の微量を培養器の複数の微区画に分注する。培養器は、複数の微区画を具備し、液体試験試料を搭載できる器具であればいずれでもよい。この培養器の例として本明細書内に説明する器具を挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００３３】
培養器の微区画の寸法は均一であり、各微区画が、約０．０１マイクロリットル〜約２５マイクロリットルの液体試料を保持できる容積を有することが好ましい。好適実施例において、各微区画の容積は約０．１〜約１０マイクロリットルである。別の好適実施例において、各微区画の容積は約１〜約２マイクロリットルである。培養器は約1〜約１００，０００個の微区画を具備することが好ましく、約１００〜約１０，０００個であればより好ましく、約２００〜約５，０００であれば尚一層好ましく、約４００〜約６００であれば最も好ましい。
【００３４】
ＭＰＮ法を用いて液体試料内の微生物の密度を調べる場合、約４００〜約６００の微区画を有する器具を使用すると特に有用である。具体的な規定要件によっては、試験方法を用いて１〜５ミリリットル試料内に１微生物を検知しなければならない。このような試料容量が食品加工業界の微生物検査には標準である。したがって、例えば各微区画の容量が約２マイクロリットルであって、その微区画を５００個有する培養器であれば１ｍｌ試料のテストに非常に有用であるということになる。２マイクロリットルの容積を有する微区画であれば、本発明による検知可能な標識が急速に表れ、約４００〜約６００個の微区画を使用することにより、充分に多くのデータ資料を得て、ＭＰＮ算出の信頼区間を改良することができる。さらに、検査対象の微生物について陽性である微区画試験の数を目視で計数することが可能である。
【００３５】
液体試験試料は、どこを源とする試料であっても微生物を含有していればいずれでもよい。この試料を、直接複数の微区画に分注しても、微区画への分注の前に希釈してもよい。試料の希釈液が必要かどうかの特定は、試料源、試料の年齢などのさまざまな要素に依存し、当業者がこれを特定することは慣例となっている。
【００３６】
液体試験試料に、対象となる微生物および／または増殖する微生物の存在を知らせる標識を産生する指示薬物質用に、任意にゲル化剤を含む栄養増殖培地を選択して含有してもよい。ゲル化剤は、水を添加するとゲル化する水吸収物質である。ゲル化剤を用いる場合、ゲルが増殖する微生物を包封するあるいは含有することが好ましい。選択した栄養増殖培地および指示薬物質のどちらか一方あるいは双方を微区画内に投入することができ、その量は、液体試験試料の微量が微区画内に分注されて所望の濃度となる充分な量とする。例えば、培地および／または指示薬物質の溶液を微区画内に配置あるいは分注して、溶液の水分を除去して培地および／または指示薬物質のコーティングを微区画内に生成することにより、コーティングを施してもよい。
【００３７】
広範囲の対象微生物用に選択する増殖培地はさまざまなものが周知であり、広範囲の微生物用の指示薬にもさまざまな種類が周知であり、本発明において、これらの培地あるいは指示薬のいずれも使用に適している。これらは微区画内に収容されたまま拡散しないため、本発明において可溶性指示薬も使用可能である。
【００３８】
液体試験試料を複数の微区画に分注する方法は、その方法に用いる具体的な培養器に依存する。微区画を具備するフィルム状器具を用いる場合、試料を器具上に単に注入するあるいはピペットで移して、例えば動揺、ブレードあるいは他のツーリングを用いて微区画上に拡散してよい。マイクロチャネルを用いる場合、試料を毛管作用によりマイクロチャネル内に分注してもよい。
【００３９】
試料を培養器の微区画に分注した後、培養器を任意にカバーあるいはシールして微区画を封入し、微生物が少なくとも１回細胞分裂周期を終えるまで充分な時間をかけてインキュベートする。一般に、培養器のインキュベートは約２５〜４５℃で、好ましくは約３０〜３７℃で行う。微区画を使用する本発明の実施におけるインキュベート時間はさまざまである。例えば、ほとんどの細菌を検知および計数する場合、インキュベートされている液体試験試料内の指示薬物質が反応して増殖を検知可能とするためのインキュベート時間は通常約２０分から約２４時間の範囲である。このようにインキュベート時間が比較的短い点は、通常約２４時間あるいはそれ以上のインキュベートを必要とする現在使用されている検知方法に対する大きな利点を示している。
【００４０】
培養器のインキュベート後、微区画内（したがって液体試験試料内）における微生物の存在の有無を検知する。検知の形態および反応度合いは、その方法に用いる指示薬物質の種類に依存する。場合によっては、標識を発生する指示薬物質がなくとも、各微区画内の試料の混濁あるいは透明度を見れば視覚的に微生物の有無を検知できることもある。液体試験試料内において検知可能な標識を発生する指示薬物質であればいずれも使用可能であり、例として色素産生指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬、電気化学指示薬などを挙げられるが、これらに限定するものではない。微区画内の微生物の有無を、裸眼、顕微鏡または、他の器具あるいは方法を用いて視覚的に検知してもよい。微生物の検知向けに従来技術において周知の指示薬物質および信号検知システムは数多くあり、そのいずれの物質あるいはシステムも本発明に従って使用することができる。
【００４１】
液体試料内の微生物の検知にはさらに、液体試験試料内の微生物数を計数するステップをさらに具備してもよい。好適実施例ではＭＰＮ法を用いて計数を行う。対象微生物を含有する微区画数と特定した後、周知のＭＰＮ技術を用いてＭＰＮ算出を行うことが出来る。周知である標準に標識強度を比較する、あるいは微区画の含有物を平板培養するなどの周知の技術を用いて、所望により各微区画内の微生物数を特定することも可能である。有利なことに、本発明の方法において数多くの微区画を用いることにより、液体試験試料のＭＰＮ分析における９５％信頼限界区分を狭めることができる。
【００４２】
本発明の方法および器具において１つの器具に数多くの微区画を用いることから、本発明の利点を保持しつつ、１つの器具のみを用いて複数の対象微生物の検知および計数を行うことができる。例えば、１種類の液体試験試料についてＥ．ｃｏｌｉおよび黄色ブドウ球菌の存在あるいは濃度について調べることができる。例えば微区画の１つの組に、どちらか１種類の微生物を検知するように選択した増殖培地および第１の指示薬物質をコーティングすることにより、培養器の一部に具備する微区画において、これらの微生物のうち、その種類を検知および計数することができる。微区画の第２の組には、別の対象微生物を検知できるよう、増殖培地および第２の指示薬物質を選択してコーティングすることができる。別の方法として、培養器のすべての微区画に、複数の微生物を同時に検知するように意図された複数の定量試薬をコーティングする場合もある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを蛍光指示薬物質で検知しながら、同時に大腸菌を色素産生指示薬で検知することができる。
【００４３】
別の実施例において、本発明は液体試験試料内の微生物を検知する方法に関する。この方法は、分注するステップが複数組の微区画を具備する培養器の複数の微区画に液体試験試料の微量を分注するステップを含む点を除き、上述の方法と類似である。微区画の各組を均一な寸法の区画とし、器具には少なくとも２組の微区画を設ける。例えば、培養器に複数の列あるいは他の配置を持たせ、それぞれに特定容積を有する微区画を備えることができる。この特徴により、１つの器具内において、液体試験試料を微量容積を超えた容積などの異なる試験容積で分注することが可能となる。ＭＰＮ法の実施にあたり、この特徴により、高密度試料について一連の希釈を必要とせずに適当な容積を選択して１つの器具内で１つの分注ステップによりＭＰＮ分析を行うことができるという大きな利点が得られる。
【００４４】
上述のように、本発明の方法は、実施される具体的な実施例に応じて、微区画を具備していれば培養器具あるいは試験器具のいずれを用いて実施してもよい。本願の発明者たちは、本発明の方法における使用に適したいくつかの新規な器具を開発してきた。以下はそれらの器具の例であるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
図１を参照すると、器具１０は、微区画１４の形態である複数の区画を有する基材１２を具備してよい。基材１２は、微区画を作製できる材料であればいずれからでも製造することができる。基材１２を、例えばポリマー製フィルムあるいは他の適した材料から製造することができる。適したポリマーの例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、フルオロポリマー、ポリカーボネ−ト、ポリエステル、ポリウレタン、およびポリスチレンを挙げられるが、これらに限定するものではない。微区画１４の形成には、基材１２の材料に適した工程であればいずれを用いてもよい。この工程の例として、熱エンボス加工、キャストエンボス加工、レーザー孔あけ加工、反応物質とのエッチング加工を挙げられるが、これらに限定するものではない。別の方法として、支持フィルム上に小さな複数の開口部を含むパターン化された材料のシートを積層することにより、微区画をその開口部と支持フィルムとの組み合わせにより形成して、器具を製造してもよい。ポリエチレンあるいはポリプロピレンフィルムを例えばプレスエンボス加工あるいは押出エンボス加工することが可能であり、さまざまな顔料および界面活性剤を含有させることができる。
【００４６】
器具１０に所望の数の微区画を備えてよい。さらに、器具内の湿度を適切に保つために容積の多い液体を保持できるように適合された比較的大きなリザーバあるいは他の区画を器具１０に具備してもよい。微区画数が比較的少なくてもよいが（例えば２〜５０個）、微区画の寸法が小さければ１つの器具１０上に比較的多くの微区画を製造することができる。器具は約１〜１００，０００個の微区画を有することが好ましく、約１００〜約１０，０００個であればより好ましく、約２００〜約５，０００であれば尚一層好ましく、約４００〜約６００であれば最も好ましい。器具１０は均一の寸法を有する微区画１４の個体群を有することができるが、微区画の寸法は均一でなくともよい。例えば、図２に示す器具１６には、組ごとの容積は同じであるが、異なる組では容積も異なる微区画を複数組（例えば複数列）備えることができる。図２に示すように、微区画の複数組の列ごとに増加していき、小さい方の微区画１８の容積はサブマイクロリットル台であり、大きい方の微区画２０の容積は倍量のマイクロリットルである。図２に示すように器具内の最大微区画が、「微区画」とは分類されない微区画２２である可能性もある。このような微区画の容積は例えば実質的イン２５マイクロリットル以上ミリリットル以下の場合もある。
【００４７】
定量用試薬を器具の微区画内にコーティングすることができる。このような定量用試薬の例として、微生物の増殖用栄養分、ゲル化剤および、色素産生指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬および電気化学指示薬などの指示薬物質を挙げられるが、これらに限定するものではない。定量試薬を固体基材上に固定するためには数多くの方法が当業者には周知であるが、そのいずれを用いても微区画内に固定することが可能である。その方法の例として、生体分子および定量試薬を共有結合せずに固体基材に付与する他の方法と同様、定量試薬を含有する液体を微区画内において乾燥して投入する方法を挙げられる。
【００４８】
好適実施例において、微区画に水性試料液を投入する際に気泡を包封しないように微区画を製造する。これは例えば、ウェル底部の開口部を、通気性であると同時に水性液に対しては実質的に不透過性であるように製造することで実施できる。このような実施例の１つを図３に示す。この実施例において、定量器具２４は、頂部２７と貫通する穴２８を設けられた底部２９とを有する微区画２６を具備する。これらの穴を、空気には透過性であるが水を含む試料液体には実質的に不透過性である材料３０で閉じる（ふさぐ、あるいはカバーする）。閉じている材料は、所望の透過性特性を備えた組成物であればいずれでもよい。図３に示す好適実施例において、閉じている材料は不織ウェブ３０であり、これを微区画２６の底部２９に接合している。不織ウェブ３０は、加圧すれば容易に底部２９に接合できるブローン繊維感圧接着剤材料であることが好ましい。図３に示すように、試料を微区画２６内に投入する間、気泡を形成しない、あるいは形成しても直ちに消散することにより、各ウェルの液体試料の容積をほぼ同じに保つことができる。
【００４９】
上述のように、定量器具に微区画を設けることにより、液体試験試料を比較的数多くの試験用微量に分割することができる。互いに混成することなく、液体試料を微区画に分離し、ＭＰＮ法あるいは他の定量を実施できることが本器具の主な利点である。しかしながら、以下のようにさらにさまざまな製造方法を用いて、微区画の分離機能を改良することが可能である。
【００５０】
再度図１を参照して、微区画１４間の領域１３（「陸領域」）を疎水性に製造してもよい。これにより、微区画１４間を水性流体が埋めることを防ぎ、互いの混成を防止する補助となる。陸領域１３をさまざまな方法で疎水性にすることができる。例えば、界面活性剤を組み入れて親水性にした押出エンボス加工済ポリエチレンフィルム上の陸領域は、アクリル系シリコーンあるいは他の疎水性物質の薄層を陸領域に移着することにより疎水性にすることができる。
【００５１】
図６を参照すると、微区画は基材３４内のマイクロチャネル３２の形態をとることができる。マイクロチャネル３２の形状はさまざまでよい。マイクロチャネルの底部を四角形、Ｕ型、Ｖ型にしても、あるいは細長い穴を持たせてもよい。
【００５２】
マイクロチャネル３２をカバーして、チャネルからの蒸発およびチャネルの汚染を防止することが好ましい。カバー３６は、少なくとも一部が水蒸気に対して不透過性である適した材料であればいずれの材料で製造してよい。例えば、カバーにシリコーン感圧接着剤フィルムあるいは加熱によりシール可能なフィルムを備えてもよい。
【００５３】
定量試薬をマイクロチャネル内にコーティングしてもよい。少なくとも１種類のこのような試薬を各マイクロチャネル内にコーティングすることが好ましい。
【００５４】
図７に示す別の好適実施例において、マイクロチャネル３２を有するフィルムの各層を互いに積層して多層構造３８を形成することができる。この構造には多くの利点があり、狭い領域に多くの微区画を備えられること、および数多くの微区画を容易に接種できることをその例として挙げられる。図示のように、印影を施したチャネル３３は対象微生物に対して陽性の標識を示したチャネルを表す。
【００５５】
別の方法として、図８に示すように器具４０は、複数の毛管４２を、図７に示すような基材に接合あるいは一体成形して備えてもよい。毛管の端部は開口していても、一方の端部を一部閉じていてもよい。
【００５６】
以下に、本発明をより理解できるように実施例を挙げるが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。特に指示のない限り、すべての部分および割合は重量基準である。
【００５７】
実施例１
エンボス加工を施したフィルム培養器
複数の微区画を具備し、液体試験試料内の微生物の検知に使用可能なエンボス加工を施したフィルム培養器を本実施例に説明するように製造した。
【００５８】
微区画を基材内に形成する方法は数多くあり、その例として、熱エンボス加工、キャストエンボス加工、レーザー孔あけ加工および、反応物質を用いて表面をエッチングする方法を挙げられる。ポリマーフィルムに凹部（すなわち「微区画」）を形成する方法は、米国特許第５，１９２，５４８号、同第５，２１９，４６２号、同第５，３４４，６８１号、および同第５，４３７，７５４号に詳細に記述されている。以下は、後に記載の実施例において使用するエンボス加工を施した具体的なフィルム培養器の代表例である。
【００５９】
Ａ．複数の微区画を具備するプレスエンボス加工済フィルム
ＴｉＯ2１０重量％（ＴｉＯ2５０％／ポリエチレン顔料濃縮５０％）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−３５  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）０．５重量％を含有するポリエチレン（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｒｅｓｉｎ  ＃１８ＢＯＡ）をフィルム（４ｍｉｌ厚さ）に押出流延した。このフィルムをシートに切断し、これらを、米国特許第５，１９２，５４８号に記載されているように製造され、複数の微区画を形成するように設計された、光リソグラフィによりエッチングしたマグネシウム合金ツーリング上に積み重ねた（２０枚まで）。エッチングしたマグネシウムツーリングは複数の隆起部を以下の実施例に説明するパターンに配置して備えた。積み重ねたポリエチレンシートを、米国特許第５，２１９，４６２号に説明されているように加熱した液圧プレス（１３２℃、１２０秒ドエル）上でエンボス加工した。この試料を冷却し、この時点でツーリングを取り外して、ツーリングの「雌型」像を具備する単層フィルムを得た。
【００６０】
Ｂ．複数の微区画を具備する押出エンボス加工済フィルム
光リソグラフィによりエッチングしたマグネシウムマスターツーリングのシートを感圧転写接着剤を用いてスチールロールに装着した。実施例１Ａにおいて説明したポリエチレン、顔料および界面活性剤の組成物を併せて配合し、米国特許第５，１９２，５４８号に説明されているように、このロール上に押出流延した。同特許の内容をここに引用したものとする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３５を含有しない試料も同じ方法で準備した。
【００６１】
Ｃ．  疎水性「陸」領域を有する押出エンボス加工済フィルム
実施例１Ｂに従って、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３５  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔを含有して押出エンボス加工したポリエチレンフィルムを準備した。架橋剤（Ｄａｒｏｃｕｒ  １１７３）４８％を含むアクリル系シリコーン（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ＦＣ  ７１１）の薄層をロール対ロールコーティング器具（Ｓｔｒａｕｂ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏ．）を用いて移着して、微区画間の領域（「陸」領域）を疎水性にした。このフィルムを、Ｈ電球を備えて８５ｍｉｌｌｉｊｏｕｌｅｓ／ｃｍ２の線量を提供するＦｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＶランプを用い、窒素ガス雰囲気下にて紫外線放射に暴露して、疎水性コーティングを硬化した。フェノールレッド指示薬を含有する水溶液を（対照させるため）、処理済および未処理試料上に散布した。疎水性コーティングを施した試料では、流体が微区画間を埋めることなく、液体は各微区画に分割された。
【００６２】
Ｄ．  複数のマイクロチャネルを具備するプレスエンボス加工済フィルム
ポリエチレンフィルム（実施例１Ａ）をシートに切断し、複数の平行なマイクロチャネルを形成するように設計されたマグネシウムツーリング上に積み重ね（４ｍｉｌシートを１０枚まで）、以下の実験記録に従って加熱された液圧プレス上でエンボス加工した。すなわち、１４３℃まで加熱し、０．７Ｎ／ｍ2で１分間保持し、圧力を２．８Ｎ／ｍ2まで高めて１分間保持し、圧力を２．１Ｎ／ｍ2まで下げて１５秒間保持し、２９℃に冷却して解除した。このツーリングを取り外して、ツーリングの「雌型」像を具備する単層フィルムを得た。エンボス加工の後、シリコーン間圧接着剤（ＰＳＡ）（ＣＷ１４ＨＴ、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｔａｐｅｓ，  Ｒａｃｉｎｅ，  ＷＩ）を含有するポリエステル（ＰＥ）支持材料をエンボス加工済フィルムの頂部に積層して、平行かつカバーされた一連のマイクロチャネルを作製した。
【００６３】
実施例２
底部に穿孔を設けた微区画を備えるエンボス加工済フィルム培養器
底部に穿孔を設けた微区画を備え、不織ウェブ状支持体でカバーした底部に開口部を有するエンボス加工済フィルム培養器を、本実施例に説明するように製造した。この培養器における試験試料充填効率および漏出量についても、本実施例において評価した。
【００６４】
Ａ．底部に穿孔を設けたエンボス加工済フィルム培養器の準備
ポリエチレン（１８ｍｉｌ厚さ、Ｃｏｎｐｌｅｘ  Ｃｏ）を実施例１Ａに説明したように、しかし、非常に薄い（＜１ｍｉｌ厚さ）底層を有する微区画を製造するように設計されたエンボス工具を用いてエンボス加工した。プロパントーチにより微区画の底面を加熱し、穴（穿孔）を形成した。このように形成した穴の直径は、元の微区画の底部の直径より小さい。
【００６５】
底部に穿孔を設けたエンボス加工済フィルム培養器の充填および漏出試験
充填効率および漏出について試験するため、視認検査を容易にするフェノールレッドを含有するＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤（Ｗｅｂｅｒ  Ｓｉｃｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＮＪ）の試験試料（１．５〜３．０ｍｉｌ）をピペットにより、いくつかは上記に説明したように穿孔を有する複数の微区画を備えたポリプロピレンエンボス加工済フィルム上に適用した。各微区画は、表面においておよそ１．９ｍｍ、底面において１．０ｍｍの直径を有する約１．１ｍｍの逆切頭六角錐の形状であった。エンボス加工済フィルムを手で旋回して、溶液を微区画に分注した。穿孔を設けた底部を有する微区画のほぼすべてに試験溶液が充填され、目に見える気泡はないことを確認した。これに比較して、底部に穿孔を設けなかった微区画では往々にして気泡が包封されるのが見られた。しかしながら、エンボス加工済フィルムの底面を第２の表面と接触させて配置したところ、開口した底部を具備する微区画から試験溶液が滲出した。さらに、接種工程中、高速でピペットから適用された試験溶液がしばしば、ピペット先端の直下に配置された少数の微区画から漏出するのが見られた。
【００６６】
不織ウェブでカバーし、底部に穿孔を設けた微区画を具備するエンボス加工済フィルムの準備
試験試料溶液の漏出を防止するため、間圧接着剤（ＰＳＡ）不織ウェブ材料を、底部に穿孔を設けた複数の微区画を具備するエンボス加工済ポリプロピレンフィルム培養器の底面に適用した。不織ウェブは、Ｋｒａｔｏｎ  １１１２（ウェブ重量は５０ｇ／ｍ2）から作製し、欧州特許出願第９４１１９８５１．７．に説明されているようにブローン繊維ＰＳＡを含有したものであった。このＰＳＡ不織ウェブを加圧してフィルムに容易に接合し、各微区画にカバーされているが通気性のある底部を形成した。
【００６７】
不織ウェブでカバーし、底部に穿孔を設けた微区画を具備するフィルムの充填および漏出試験
上述のようにフェノールレッドを含有したＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤を、幾つかは穿孔を設けて不織ウェブで底部をカバーした複数の微区画を具備するポリプロピレンエンボス加工済フィルム上に接種した。穿孔を有する微区画はすべてフィルムを手で旋回するだけで充填でき、穿孔を備えない微区画だけが空気を包封した。試験溶液の量を変えて（１〜３ｍｌ）ピペットで適用したところ、接種工程中に漏出は見られなかった。微区画の多孔質でカバーされている底部からの試験溶液の流出は、光学顕微鏡で見ても認められず、フィルムを第２の表面に接触させて配置した場合にも試験溶液の滲出は見られなかった。
【００６８】
Ｂ．不織ウェブでカバーされ、底部を開口した微区画を具備するシートの積層物
底部が開口している複数の微区画を具備し、ウェル底部開口部を不織ウェブ状支持体でカバーしたシートの積層物を本実施例において説明するように製造した。この積層されたシートを寸法に切断し、微生物の検知および計数用の培養器内で使用した。
【００６９】
複数の小型で均一に間隔を開けた開口部を具備するポリエチレンフィルム（Ｖｉｓｐｏｒｅ  ６６０７およびＶｉｓｐｏｒｅ  ６５８２、Ｔｒｅｇｅｄａｒ  Ｆｉｌｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を不織ＰＳＡウェブ上に積層して、不織ウェブでカバーした底部が開口している複数の微区画を具備するシートの積層物を得た。この出発フィルム材料の物性特性を表２Ｂに要約する。
【００７０】
【表１】
0004217378.tif 000002
【００７１】
充填した微区画の視認性を高めるためにフェノールレッドを含有した栄養液の少量を添加して、積層したシートを簡便に接種した。接種後のシート積層物の拡大光学画像により、微区画は均一に充填されていることがわかった。充填された微区画からは気泡も漏出も見られず、液体ではなく空気が、不織ウェブでカバーされた微区画の底部開口部から容易に流出できることがわかる。
【００７２】
実施例３
微生物の検知および計数
（複数の微区画を用いる方法）
Ｅ．ｃｏｌｉの検知および計数に複数の微区画を具備するエンボス加工済フィルム培養器を使用することの実現の可能性について、本実施例において例証する。
【００７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３（〜１０9ＣＦＵ／ｍｌ、Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地内）の一晩ねかせた培養液を、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ＭＵＧ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌ、ＩＬ）を含有するＶｉｏｌｅｔ  Ｒｅｄ  Ｂｉｌｅ（ＶＲＢ）培地（Ｂａｃｔｏペプトン７．０ｇ／ｌ、酵母エキス３．０ｇ／ｌ、および胆汁塩１．５ｇ／ｌ）内に順次希釈した。希釈液を表３ａに示す近似細菌濃度に調製した。希釈した試料（１ｍｌ）をピペットで、５２５個の微区画（約１．９μｌ／微区画）を具備するポリエチレン製エンボス加工済フィルム培養器（実施例１Ｂ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３５を含まず）上に適用した。微区画を亀甲形に配置して（約１９微区画／ｃｍ2）、各微区画を、表面においておよそ１．９ｍｍ、底面において１．０ｍｍの直径を有する約１．１ｍｍの逆切頭六角錐の形状にした。微区画を、米国特許第５，２１９，４６２号に説明されているように、かみそり刃の縁部を用いてフィルム上に希釈した試料溶液を案内して充填した。希釈した試料（１ｍｌ）をさらにＰＥＴＲＩＦＩＬＭTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ２０００  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｌｉｆｏｒｍ  Ｔｅｓｔ  Ｐｌａｔｅ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）上に配置し、インキュベートして製造業者の指示に従って読み取った。接種したエンボス加工済フィルム培養器をぺトリ皿内に配置し、１２時間３７℃にてインキュベートした。蛍光発光を呈した微区画の数を各試料について計数した。最確数を式ＭＰＮ＝Ｎｌｎにより算出した。（Ｎ／Ｎ−Ｘ）において、Ｎは充填した微区画総数であり、Ｘは陽性反応を示した微区画総数である。結果をＰＥＴＲＩＦＩＬＭTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ２０００  Ｐｌａｔｅｓの数と比較して表３ａに示す。
【００７４】
【表２】
0004217378.tif 000003
*TNTC =多すぎてカウント不可
【００７５】
本実施例の結果から、複数の微区画を有するエンボス加工済フィルム培養器を用いれば、微生物の検知および計数を容易に実施可能であること、および得られた数値はＰＥＴＲＩＦＩＬＭTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ２０００  Ｐｌａｔｅｓの数値と共通点があることがわかる。さらに、この方法では、現在利用できる方法に比較して、試料あたりの計数可能な値幅を拡大することできる
【００７６】
実施例４
微生物の検知および計数
（底部に穿孔を設けた微区画を用いる方法）
レイ菌の検知および計数に、穿孔を設けて不織ウェブで底部をカバーした複数の微区画を具備するエンボス加工済フィルム培養器を用いることの実現の可能性について、本実施例において例証する。
【００７７】
ＴＳＢ内において３５℃で増殖したレイ菌の一晩ねかせた培養液を、順次Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの希釈剤内に１０倍増量して希釈した。１０-4、１０-5、１０-6倍希釈液倍を用いて、底部に穿孔を設けて不織ウェブでカバーした微区画（実施例２）を有するポリプロピレン製エンボス加工済フィルム培養器に接種した。細菌の接種、増殖および検知を行うため、各フィルムを直径５．１ｃｍの円に切断し、ポリスチレン製ぺトリ皿内に配置した。このフィルム円板をフォームスペーサリングでぺトリ皿の底部から引き上げた。硬化性シリコーンをフィルム円板縁部の縁沿いに適用して、フィルム円板と皿との間をシールした。このシールにより、試料溶液が接種中にフィルム縁部から漏出することを防止した。得られた培養器プレートのそれぞれは、約３００個の微区画（約２．０μｌ／ウェル）を具備しており、これをイソプロパノ−ルに２〜３分間含浸して周囲条件で一晩乾燥し、使用前に５分間６０℃でオーブン乾燥した。
【００７８】
各希釈液からの試料（０．１ｍｌ）を、表４ａに示す組成物を有し、４−メチルウンベリフェリルリン酸（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有して均衡している好気性計数培地（０．９ｍｌ）と混合した。得られた試験試料（〜１ｍｌ）をピペットで培養器プレート上に適用し、このプレートを静かに攪拌して試料の一部ずつ微区画のそれぞれに投入した。次いで、このプレートを傾斜させて、余分な試料をポリスチレン皿の周縁部に装着されている吸収パッドに吸収させた。さらに蒸留水（約０．３ｍｌ）をこの吸収パッドに添加して完全に湿らせ、加湿リザーバとした。接種したプレートを逆さにして、２４時間３５℃でインキュベートし、ＵＶ光（３６０ｎｍ）励磁電圧をかけて蛍光発光した（陽性）微区画数を計数した。最確数（ＭＰＮ）を実施例３に従って算出した。器具が具備する３００個の微区画内に含有される６００マイクロリットルの試用量を基準に、このＭＰＮに１．６６を掛けてＭＰＮ／ｍｌを算出した。結果を表４ｂに示す。
【００７９】
【表３】
0004217378.tif 000004
【００８０】
【表４】
0004217378.tif 000005
【００８１】
本実施例の結果により、穿孔を設けて底部を不織ウェブでカバーした複数の微区画を具備するエンボス加工済フィルム培養器を用いると、微生物を容易に検知および計数できることがわかる。微区画の底部にウェブでカバーした開口部を設けることにより、液体試料を適用すると液体でなく空気を逃がすことができた。検知された細菌数（陽性微区画あるいはＭＰＮ）はそれぞれの希釈倍率の順に相応して減少した。
【００８２】
実施例５
微生物の検知および計数
（複数組の微区画を用いる方法）
寸法の異なる複数の微区画（「組」）を具備するエンボス加工済フィルム培養器を用いてＥ．ｃｏｌｉを検知および計数することの実現の可能性について、本実施例において例証する。
【００８３】
実施例３に従ってＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３を希釈した試料を調製した。実施例１Ｂに従って２つのエンボス加工済フィルム培養器を準備した。第１のフィルムには、各微区画が表面においておよそ１．２ｍｍ、底面において０．７ｍｍの直径を有する約１．０ｍｍの逆切頭六角錐の形状である複数の０．８μｌ用微区画を正方形に配列して備えた。第２のフィルムには、各微区画が表面において３．７×３．７ｍｍ、底面において２．０×２．０ｍｍの開口部を有する約１．０ｍｍの切頭ピラミッドの形状である複数の５μｌ用微区画（〜４微区画／ｃｍ2）を正方形に配列して備えた。各希釈物の試料２５０μｌを実施例３に説明した工程を用いて微区画に分割した。これらの器具を一晩かけて３７℃でインキュベートし、蛍光発光を呈する微区画の数をフィルムの各組ごとに計数した。実施例３に説明したようにＭＰＮ値を算出した。マイクロリットルあたりのＭＰＮ値を、２５０μｌ接種で得られた値に４を掛けて算出した。結果を表５ａに示し、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ２０００  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓを用いて標準試験で得られた数と比較する。
【００８４】
【表５】
0004217378.tif 000006
【００８５】
本実施例の結果より、寸法の異なる複数の微区画を具備するエンボス加工済フィルム培養器を用いて微生物を容易に検知および計数できること、および、得られた数値が商業用ＰＥＴＲＩＦＩＬＭTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ２０００  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓで得られた数値と共通することがわかる。本実施例によりさらに、「小型」微区画１組を「大型」微区画１組と組み合わせて用いることにより、計数値幅を拡大できることがわかる。
【００８６】
実施例６
微生物の検知および計数
（高い計数限界）
本実施例において、高濃度試料（＞２００，０００ＣＦＵ／ｍｌ）向け検知および計数方法を例証する。
【００８７】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコロン酸（ＢＣＩＧ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）１ｍｇ／ｍｌおよびグルコース（１ｇ／１）を含有するＶＲＢ培地を実施例３に従って調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３の一晩寝かせた培養液をこの培地内でおよそ１，０００ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００８８】
１ｉｎ2当たり２，３３０個の微区画（微区画当たり０．０３マイクロリットル）を具備するフィルムを実施例１Ａに従って準備した。各微区画は、表面においておよそ０．３ｍｍ、底面において０．１５ｍｍの側部間直径を有する０．７ｍｍの逆切頭六角錐の形状であった。実施例３で説明したように、この微区画にかみそり刃の縁部を用いて接種物を微区画上に案内して充填した。本実施例には、シリコーン感圧接着剤テープ（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ＣＷ−１４ＨＹ、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｔａｐｅｓ、Ｒａｃｉｎｅ、ＷＩ）を用いて微区画の頂部をシールした。このように、一晩かけてインキュベートする間に微区画内の少量の試料が蒸発することを防止する手段を得られた。シールしたフィルムを３７℃で一晩（１８時間）インキュベートし、引き続きインキュベータから取り出して顕微鏡で観察した。試用量１５．６マイクロリットルに相当する５２０個の微区画を具備する顕微鏡部分を抜き出して陽性の微区画数（青色）を計数した。この部分には１９個の陽性微区画を確認でき、ＭＰＮ値を算出すると１，２９０ｍｌに匹敵した。本実施例における最大計数範囲（試用量１５．６マイクロリットルに対して５１９個の陽性）は２０８，０００ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００８９】
実施例７
微生物の検知および計数
（コーティングした複数の微区画を用いる方法）
本実施例において、試験試料を接種する前に養分および指示薬をフィルムの微区画内に組み入れる方法を例証する。
【００９０】
ＭＵＧ蛍光指示薬を含有したＶＲＢ培地を実施例３に説明したように調製した。この余分な溶液を、実施例３に説明したパターンおよび形状の微区画を備えたフィルム表面に適用した。溶液をフィルム表面上にナイフコーティングして微区画内に分注した。次いで、コーティングしたフィルムを５２℃にてオーブン乾燥した。セラチア乳化剤の水性希釈液を一晩寝かせた培養液から約５０ＣＦＵ／ｍｌ（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の近接濃度に調製した。この溶液の試料（３００μｌ）を実施例３の方法により養分をコーティングしたフィルムに適用し、４２０個の微区画を充填した。この試料を一晩３７℃でインキュベートした。算出すると３６（１３０／ｍｌ）のＭＰＮ値に匹敵する３６個の蛍光発光微区画が認められた。
【００９１】
実施例８
微生物の検知および計数
（微区画に組み入れたｐＨ指示薬および養分を用いた検知）
本実施例において、培地のｐＨを監視する指示薬を用いて吸収度を基準にした検知を例証する。
【００９２】
ｐＨ指示薬フェノールレッド（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を含有するＶＲＢ培地を実施例３に説明したように調製した。この溶液を実施例７に説明したようにフィルムの微区画内に投入した。セラチア液化剤の水性希釈液（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（約５０ＣＦＵ／ｍｌ）を実施例３に説明したようにフィルムに適用し、一晩３７℃でインキュベートした。充填した４２０個の微区画のうち、２１のＭＰＮ値（７０／ｍｌ）に匹敵する２１個が黄色を呈した。
【００９３】
実施例９
微区画を用いて促進した酵素反応速度
（酵素＋蛍光指示薬）
本実施例において、同数の酵素分子（２．５ｎｇ）を、容積が０．１〜５０μｌにわたる複数の微区画内に配置した。各ウェルに同じ濃度の蛍光指示薬（０．２５ｍＭ）を含有した。指示薬の酵素的加水分解による蛍光発光をＣＣＤカメラで各微区画について同時に測定した。実験中の各時点において画像を記録した。記録した画像を画像処理ソフトウェアに装填し、各微区画の中央部分において４ピクセルを超える強度値を平均して、各微区画における量的蛍光発光値を得た。
【００９４】
工程の詳細
光リソグラフィを用いてエッチングしたマグネシウム工具を、実施例１Ａの工程に従って準備するエンボス加工後のフィルムが０．１、０．５、１．０、３．０、１４、２０、および５０μｌ用微区画を具備するフィルムとなるように容積を増加していく逆円錐型隆起部を設けるように設計した。
【００９５】
アルカリホスファターゼ酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）をグリセリン緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ１０．４）内で調製し、１：１；１：４；１：１；１：２；１：１．３；１：１；１：０．４３；１：１５の連続希釈体系（ｍｌ）に順次さらにグリセリン緩衝液を加えて希釈した。各希釈液のアリコート（１００μｌ）を９６微区画を有するマイクロリットルプレートの隣接する微区画内に配置した。複数のチャネルを有するピペッターを用いて各微区画にメチルウンベリフェリルリン酸指示薬（グリセリン緩衝液内０．５ｍＭ）１００μｌを同時に添加した。第１の希釈駅のアリコート（０．１μｌ）をスポイトで直ちにこの容積（０．１μｌ）に対応する微区画内に注入した。容積０．５、１、３、１４．２０および５０μｌに対応する６種類の希釈液について順次これを繰り返した。この工程を用いて、各微区画に指示薬０．２５ｍＭ内に酵素２．５ｎｇを含有する希釈液を充填した。指示薬のみを含有する微区画を有する背景試料も調製した。
【００９６】
微区画を充填後、試料をカバーしたぺトリ皿内に配置し、テープでシールして蒸発を防止した。この皿を紫外線照明および画像装置（ＵｌｔｒａＬｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、３６５ｎｍ）内に配置した。ＣＣＤ画像を図４に示す時間間隔で記録した。各微区画の中央部における４ピクセルを平均して各時点での蛍光発光強度値を得た。同じ実験を２回繰り返し、それを平均して最終値を得た。
【００９７】
図４は（１）各ウェル内に同数の酵素分子を所与した場合、微区画の寸法が小さいほど反応速度は大幅に促進されること、および（２）微区画の寸法が小さいほど、検知システム（この場合ＣＤＤ）向け蛍光標識は明確になることを示している。この効果を例証するため、指示薬のみを含有する（酵素は含有せず）微区画の背景蛍光をグラフに示す。１ピクセルを基準に、微区画が小さいほど、大きな微区画に比べて標識はかなり高くなっている（容積が小さい場合は飽和）。２時間後では５０μｌの強度が背景の２．３倍であるのに対し、１μｌの値は９．８倍であることに留意されたい。促進された反応速度および明確になった蛍光標識の効果を得て、微区画の寸法が減少するにつれて、ますます迅速な検知が可能となった。
【００９８】
実施例１０
微区画を用いて改良された微生物の検知
（細菌＋蛍光指示薬）
本実施例において、同数の細菌（〜５０００ＣＦＵ）を、容積が０．１〜５０μｌにわたる複数の微区画内に配置した。各ウェルに同じ濃度の蛍光指示薬（０．２５ｍＭ）を含有した。各微区画内に養分増殖培地内において同じ濃度の蛍光指示薬（０．２５ｍＭ）を含有した。指示薬の酵素的加水分解による蛍光発光をＣＣＤカメラで各微区画について同時に測定した。
【００９９】
工程の詳細
１、３、７、１４、２０および５０μｌの液体を保持できるように設計した微区画を具備するポリエチレンエンボス加工済フィルムを実施例９に従って準備した。実施例３に説明したように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３（〜１０9ＣＦＵ／ｍｌ、ＴＳＢ内）の一晩ねかせた培養液を、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＶＲＢ培地内に順次希釈した。インキュベート前の各ウェル内が初期に５０００ＣＦＵ以下となるように希釈液を調製した。接種したフィルムをぺトリ皿内に配置し、３７℃でインキュベートした。実施例９に説明したＣＣＤ画像システムを用いて、図５に示す時間で相対蛍光発光を測定した。各微区画について相対蛍光値８０までにかかる時間を算出して表１０ａに示す。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
表１０ａの数値および図５のグラフが示すように、本実施例の結果から、微区画が小さいほど、大きな微区画より大幅に早く蛍光発光が見られることがわかる。
【０１０２】
実施例１１
微生物の検知および計数
（複数のマイクロチャネルを用いる方法）
本実施例のセクションＡ（単層フィルム培養器）およびセクションＢ（培地をコーティングした単層フィルム培養器）において、複数のカバーされたマイクロチャネルを具備するフィルム培養器を用いて細菌を検知および計数することの実現の可能性について例証した。カバーしたマイクロチャネルの多数「組」を具備し、多層フィルム構造を有するフィルム培養器の製造および接種を、本発明のセクションＣおよびセクションＤにそれぞれ説明する。
【０１０３】
Ａ．単層フィルム培養器
平行なＶ形溝を具備するエンボス加工済フィルムを実施例１Ｄおよび米国特許第５，５１４，１２０号に説明されているように準備した。得られたフィルムをシリコーンＰＳＡ／ＰＥ表面フィルムでカバーし（実施例１Ｄ）、底辺がおよそ０．６ｍｍで高さがおよそ０．７５ｍｍの三角形断面を有する平行でカバーされたマイクロチャネルを作製した。およそ０．３ｍｍの平坦な「陸領域」が各マイクロチャネルを分断し、カバーフィルムの装着面を提供した。カバーされたフィルムを、縦２ｃｍ横５ｃｍの帯片に切断した。各帯片（フィルム培養器）は５０個の平行で２ｃｍ長さのマイクロチャネルを具備していた。各チャネルの容積はおよそ５μｌであった（総試用量はおよそ２５０μｌ）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３の一晩ねかせた培養液を、フェノールレッド（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＶＲＢ培地（実施例３）内に順次希釈した。希釈液をおよそ１０，０００；１，０００；１００；１０の近似細菌濃度に調製した。エンボス加工済フィルム培養器の一縁部を試料内に浸漬して、毛管作用により流体をマイクロチャネル内に浸入させた。次いで、器具の頂縁部を溶融したパラフィン内に浸漬してシールし、接種中の蒸発速度を下げた。底縁部は開口のままにした。この試料を一晩３７℃で加湿したぺトリ皿内においてインキュベートし、赤から黄色への色の変化を観察した。各チャネル沿いに黄色が表れたため、チャネル内に細菌が増殖されて酸が発生した（グルコースの発酵）ことがわかった。１０，０００ＣＦＵ／ｍｌおよび１，０００ＣＦＵ／ｍｌ希釈液において、５０チャネルのすべてで試料に黄色に変わったことから、浸入させる工程中に少なくとも１微生物が各チャネル内に分割されたことがわかる。１００ＣＦＵ／ｍｌ希釈液において、２９チャネルが黄色くなり（細菌が存在）、２１チャネルは赤であり（細菌は無）、これをＭＰＮ値に算出すると１７９に相当する（実施例３において提供したＭＰＮ法の式による）。１０ＣＦＵ／ｍｌ希釈液において、３チャネルのみが黄色と判断でき、相当するＭＰＮ値は１２であった。Ｅ．ｃｏｌｉを添加せずに調製した比較試料において、色の変化は見られなかった。
【０１０４】
Ｂ．培地をコーティングした単層フィルム培養器
シリコーンＰＳＡ／ＰＥ表面フィルムを具備しないエンボス加工済フィルムの帯片を、フェノールレッドを含有するＶＲＢ培地に浸漬した。Ｖ形溝マイクロチャネルを充填後、フィルムを培地から取り出して周囲温度で３０分間乾燥した。ＰＳＡ／ＰＥ表面フィルムをエンボス加工済フィルムに適用して、培地をコーティングしたフィルム培養器を得た。これをＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ５１８１３（〜５０ＣＦＵ／ｍｌ）の水性希釈液内に浸漬した。細菌溶液を、毛管作用により培地をコーティングしたマイクロチャネル内に浸入させた。一晩３７℃でインキュベートした後、エンボス加工済フィルム培養器を観察したところ、１０チャネルが黄色くなり、４０チャネルが赤であった。これはＭＰＮ値では４４に相当する。
【０１０５】
本実施例により、細菌栄養をフィルム培養器のマイクロチャネル内に組み入れることができ、この器具を用いて試験水溶液を試用することができることを例証している。
【０１０６】
Ｃ．複数組のマイクロチャネルを具備する単層フィルム培養器
容積が２０μｌ、２μｌ、および０．２μｌである多数組の封止されたマイクロチャネルを具備する単層のエンボス加工済フィルム培養器を以下のように製造した。各組毎のフィルムを形状が異なる工具を用いてエンボス加工し、実施例１１Ａにおいて説明したように表面フィルムでカバーして、所望のマイクロチャネル量を得られる特定幅の帯片に切断した。各組について帯片の寸法およびマイクロチャネルの容積を表１１ａに示す。
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
得られた単層フィルム培養器を、四角形ぺトリ皿（「Ｉｎｔｅｇｒｉｄ」１００×１５ｍｍ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）の底部で各容積組を有する２枚の帯片（１帯片あたり３０マイクロチャネル）を互いに隣接して接合して、組み合わせた。これらの帯片を移着テープ（Ｓｃｏｔｃｈ  ３００ＬＳＥ  Ｈｉ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ、３Ｍ  Ｃｏ．）を用いて装着し、およそ２ｍｍの間隔をあけて配置した。
【０１０９】
この器具を、対照させるために食品着色染料を含有する溶液を用いて接種した。ピペットを用いて、試験溶液を帯片の各組間の「側路領域」に移した。この器具を傾斜して、流体を「側路領域」から流出させて、毛管作用により端部が開口しているマイクロチャネル（「側路領域」に直交して位置する）を充填させた。余分な溶液は器具の底部に置いたペーパータオルの一片に沁み込ませた。本実施例の器具（組あたり６０マイクロチャネル）および実施例３に概略を示したＭＰＮ式を用いて３組各々の計数範囲を算出した。これらを表１１ａに示す。
【０１１０】
本実施例により、複数組のマイクロチャネルを具備する単層フィルム培養器が、反応が強く、計数範囲が非常に広い細菌計数試験向けの基準と成り得ることを例証している。
【０１１１】
Ｄ．多層フィルム培養器
試用する液体総量および培養器内の封止する各マイクロチャネル数を増加するため、多層フィルム構造を製造した。単層のエンボス加工済フィルムを互いに積層して２つの構造物を準備した。これを表１１ｂに記載する。多層構造物Ｄ１に使用した単層フィルムは、およ０．２ｍｍ×０．２ｍｍの正方形断面を有する平行なマイクロチャネルを具備した。それぞれのマイクロチャネルをおよそ０．１ｍｍの間隔をあけて配置した。単層フィルムを幅１．５ｃｍ縦１ｃｍの帯片に切断した。接着剤の薄層（ＲＤ  １２７３、３Ｍ  Ｃｏ．）を各帯片の裏側に適用し、これらの帯片を互いに積み重ねて、複数のマイクロチャネルを具備する多層構造物を形成した。接着剤の薄層（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ、３Ｍ  Ｃｏ．）により互いに積み重ねた、実施例１１Ａに説明した単層フィルムを用いて、構造物Ｄ２を組み合わせた。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
フェノールレッドを含有するＶＴＢ培地（実施例１１Ａ）の一連の細菌希釈液を用いて、多層フィルム器Ｄ２（表１１ｂ）でＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣ  ５１８１３の検知を例証した。この器具の一端部を培地に浸漬し、各マイクロチャネルを毛管作用により充填した。３７℃にて一晩インキュベートした後、器具を縁部から見て、増殖した細菌を含有するチャネル内における赤から黄色への変化を観察した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  微区画培養器の１実施例を示す斜視図である。
【図２】  異なる微区画容積を有する複数組の微区画を備えた微区画培養器の平面図である。
【図３】  開口した底部を不織ウェブ材料で閉鎖した微区画を有する微区画器の側面図である。
【図４】  微区画を用いることにより増進された酵素反応速度を示すグラフである。
【図５】  微区画を用いることにより増進された酵素反応速度を示すグラフである。
【図６】  マイクロチャネルを有する単層微区画器を示す分解斜視図である。
【図７】  マイクロチャネルを有する多層微区画器具を示す斜視図である。
【図８】  マイクロチャネルを有する単層微区画器を示す断面図である。
【符号の説明】
１０  器具
１２  基材
１３  陸領域
１４  微区画
１６  器具
１８  小さい微区画
２０  大きい微区画
２２  「微区画」とは分類されない微区画
２４  定量器具
２６  微区画
２７  頂部
２８  穴
２９  底部
３０  不織ウェブ材料
３２  マイクロチャネル
３３  チャネル
３４  基材
３６  カバー
３８  多層構造
４０  器具
４２  毛管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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