(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスゲノムのＥ１領域をコードする細胞の染色体核酸と、Ｅ１領域を欠損しているアデノウイルスのゲノムを含む染色体外核酸の間の分子内又は分子間相同組換えイベント頻度の低減方法であって、
他のパートナーに対する相同度を低減するように２つの核酸の少なくとも１種の配列を縮重すること、および当該縮重配列がコーディング配列であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
少なくとも全２０塩基対、好ましくは少なくとも全１０塩基対に対して１塩基対の割合で配列を縮重させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可能な全位置で配列を縮重させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相補細胞のコドンの使用に応じて縮重を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ１領域を欠損するアデノウイルスゲノムの配列をｐＩＸ遺伝子において縮重させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｅ１領域を欠損するアデノウイルスゲノムの配列を更にＩＶａ２遺伝子において縮重させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
欠損組換えアデノウイルスのゲノムを２９３系細胞又は２９３系細胞からの誘導細胞に導入することにより欠損組換えアデノウイルスを製造する方法であって、前記ゲノムがＥ１領域を欠失しており、ｐＩＸ及び／又はＩＶａ２遺伝子において縮重を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項８】
アデノウイルスゲノムのＥ１領域をコードする染色体核酸との分子間相同組換えイベント頻度を低減するように配列を縮重した少なくとも１個の領域を含む、Ｅ１領域を欠損している組換えアデノウイルスであって、前記配列が他のパートナーに対する相同度を低減するように縮重されていることを特徴とする前記欠損組換えアデノウイルス。
【請求項９】
縮重配列がコーディング領域であり、ｐＩＸ遺伝子において縮重を含むことを特徴とする請求項８に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
縮重配列がｐＩＸ遺伝子を含み、配列番号１の配列であることを特徴とする請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
ＩＶａ２遺伝子がその元の位置以外のゲノム位置にも存在することを特徴とする請求項９又は１０に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
ＩＶａ２遺伝子がＥ４領域に配置されていることを特徴とする請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
縮重領域がｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子を含むことを特徴とする請求項８に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
縮重領域が配列番号３の配列であることを特徴とする請求項１３に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
Ｅ１領域の欠失を含むことを特徴とする請求項８から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
ｐＩＸ遺伝子の縮重配列が配列番号１の配列であることを特徴とする請求項９又は１０に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
Ｅ１領域を欠損しているアデノウイルスを含む２９３系細胞又は２９３系細胞からの誘導細胞であって、欠損アデノウイルスのＥ１領域をコードする細胞の染色体核酸の配列又は前記アデノウイルスのゲノムを含む染色体外核酸の配列が、前記２種の核酸間の相同度を低減するように縮重されていることを特徴とする前記細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は核酸間の組換えイベントの低減方法に関する。本発明は更にプラスミド又はウイルスベクター等の核酸の製造方法における前記方法の適用にも関する。本発明は更に新規ウイルス構築物にも関する。
【０００２】
核酸間の組換えは分子生物学の周知現象である。組換えは遺伝子材料の新規組み合わせを生じ、自然選択のための材料源を提供することにより生物進化に役立つ分子メカニズムである。組換えられる核酸間に高い配列相同度を必要とする遺伝子組換えは一般に相同組換えと呼ばれる。相同組換え時には核酸の２領域間で遺伝情報の交換が行われ、交換は相互（「クロスオーバー」）の場合と、非相互（変換）の場合がある。
【０００３】
減数分裂時に、相同組換えは遺伝情報の補充に関与し、染色体の正しい分離に重要な役割を果たす。減数分裂時に相同組換えはＤＮＡの修復に寄与する。相同組換えは、分散された相同領域が関わっている場合には欠失や重複、タンデム反復配列が関わっている場合には収縮や膨張等の、ゲノム再配列を導入することができる。
【０００４】
相同組換えが生じるメカニズムは部分的に解明されている。例えば細菌では相同組換えは１本鎖末端に作用する段階により開始する（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，１９６４；Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，１９７５）。逆に、真核生物では、殆どの結果が２本鎖切断メカニズム（ＤＳＢ“ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ”）に関係があることを示唆している（Ｓｚｏｓｔａｋら，１９８３）。ＤＳＢは組換えられる全核酸配列が組換え産物で再現される保存メカニズム（Ｓｚｏｓｔａｋら）と、所定の配列が失われる非保存メカニズムとの２種の主要な相同組換えメカニズムの原因であると思われる。哺乳動物体細胞では、ＤＳＢによる相同組換えの大半は非保存プロセスに従って行われるらしい（Ｌｉｎら，１９９０，Ｊｅｏｎｇ−Ｙｕ，１９９２）。
【０００５】
バイオテクノロジーの不断の発展に伴い、ＤＮＡは組換えタンパク質の生産、トランスジェニック動物の創製、遺伝子及び細胞治療等にますます利用されている。これらの種々の分野で無制御な組換えイベントは不都合な場合がある。
【０００６】
例えば組換えタンパク質の生産時に、発現プラスミドにおける組換えイベント（分子内組換え）は例えば導入遺伝子の発現カセットの除去とそれに伴う発現低下をもたらすことがある。組換えイベントは生産宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれた発現カセットを除去する原因となり、安定性の低下をもたらすこともある。
【０００７】
ベクター、特にウイルスベクターの構築及び生産時にも相同組換えイベントに関連する望ましくない影響が生じることがある。ウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス等）は核酸を細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入するために特に有効な手段である。欠損ウイルスベクターを構築するためには、一般に野生型ウイルスの複製に必須の領域をゲノムから欠失させ、着目核酸で置換する。従って、これらのウイルスを生産及び増幅するためには、（プラスミド上に又は生産細胞のゲノムに組み込まれた形態で又は補助ウイルスにより）相補機能をトランス付加することが必要である。また、欠損ウイルスゲノムと相補機能の間で相同組換えイベントが行われ、複製ウイルス粒子が再構成される場合もある。例えば、アデノウイルスから誘導されるベクターはアデノウイルスゲノムの一部を組み込んだ相補系（２９３系又は誘導系）で一般に生産される。より詳細には、２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左末端（約１１〜１２％）を含み、左ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸ及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はＥ１領域を欠損即ち複製に必要なＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができる。しかし、この系のゲノムに組み込まれたアデノウイルスの領域と生産が所望される組換えウイルスのＤＮＡの間には相同ゾーンが存在する。このため、生産中に種々の組換えイベントが生じ、特にＥ１＋型のアデノウイルスの複製ウイルス粒子を生じることがある。例えば、図１に示すように、染色体の切断を伴う単純組換えイベント（図１Ａ）や、二重組換え（図１Ｂ）が生じることがある。これらの２種の修飾の結果、機能的Ｅ１領域を欠失する組換えＤＮＡの左部分はＥ１領域の機能的コピーをもつ細胞のゲノムに存在する対応部分で置換される。また、２９３系により生産される組換えベクターの力価が高いため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、欠損組換えアデノウイルスベクターの多数のバッチが複製ウイルス粒子で汚染されていることが認められた。
【０００８】
ウイルスバッチに複製粒子が存在すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入に利用するのに非常に不都合である（ウイルス増殖と無制御伝播の危険）。
【０００９】
欠損レトロウイルスの作製にも同種の問題がある。例えば、欠損レトロウイルス構築物は一般に生産系によりトランス導入されるウイルスのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を欠失している。この場合も、報告されている所定の系では欠損レトロウイルスのゲノムと細胞の相補機能の間にオーバーラップゾーンが存在する。特にＰＡ３１７、Ｐｓｉ２細胞等がこれに該当する。従って、これらのゾーンのレベルに相同組換えイベントが生じ、複製粒子を生産する可能性がある。
【００１０】
本発明は２種の所与核酸間の組換えイベントの頻度を低減し、その結果、生物プロセスに及ぼすこのようなイベントの影響を最小限にする方法に関する。
【００１１】
より詳細には、本発明は２種の所与核酸又は核酸の２領域間の相同組換えイベントの頻度を低減する方法に関する。
【００１２】
相同組換えイベントを低減するために、従来技術は種々のアプローチを教示しているが、これらはいずれも相同領域の置換又は除去という同一原理に基づく。例えば、着目遺伝子の発現を可能にする所定のプラスミドは宿主細胞のゲノムに相同の領域をもつ。このような領域は特にプロモーター領域、マーカー遺伝子又は複製起点である。組換えの危険を減らすために、これらの領域を他の非相同領域（別のプロモーター等）で置換することがこれまでに提案されている。他方、ウイルスベクター生産方法で組換えの危険を制限するために、相補遺伝子と欠損ウイルスゲノムの相同配列を除去することも提案されている。
【００１３】
例えば、特許出願ＷＯ９７／００３２６はＥ１領域をもつアデノウイルスゲノムの限定単位を含むＰＥＲと呼ぶアデノ生産細胞系を記載している。この系では、欠損ウイルスのゲノムに相同のフランキング配列を短縮し、その間の相同組換えの危険を制限している。同様に、特許出願ＷＯ９５／１１９８４はｐＩＸ遺伝子の一部まで延びるＥ１領域の欠失をもつ組換えアデノウイルスの構築を記載している。この場合には相補領域を修飾（短縮）するのでなく、欠損ゲノムに長い欠失を形成している。その結果、相同領域が残っていても組換えの危険が減る。
【００１４】
しかし、これらのアプローチは、細胞とウイルスゲノムの間の組換えの危険を減らし、従って複製粒子で汚染されたウイルスバッチが生産される危険を減らすことはできるとしても、完全に汚染の危険を除くことはできず、および／または新規細胞系の構築を必要とし、したがって、多大な労力を要する新規細胞系のバリデーションを必要とする。また、領域の置換は特に効率の点でさほど十分ではない。
【００１５】
本発明は分子間又は分子内相同組換えイベントの新規低減方法に関する。本発明は複製粒子に汚染されていない欠損ウイルスを製造するための前記方法の適用にも関する。本発明は更に、複製粒子生産の危険を著しく低くしながら、力価の面で最も有効な既存生産系で増幅することが可能な新規ウイルス構築物にも関する。
【００１６】
相同組換えの主要な初期段階は２種のパートナー核酸間（分子間組換え）又は核酸の２領域間（分子内組換え）の認識である。この段階は２つの相同領域間の直接相互作用の結果である。従って、２種の核酸間の相同組換えは同一性の存在即ちこれらの核酸の２領域間の高い配列相同度の存在に基づき、一般に相同程度と相同の長さ（即ち１又は２種の核酸の相同領域）の２つの因子に依存する。また、相同組換え頻度は核酸のある特定の領域にも依存する。例えば、ある特定の領域は平均頻度よりも高い頻度で組換え可能であることが確認された。更に、これらの局在変動の頻度は大腸菌のＣＨＩ部位やＳ．ｐｏｍｂｅのＭ２６部位等の特定配列に起因する場合もあることが判明した（Ｇａｎｇｌｏｆｆら，１９９４）。
【００１７】
従来技術で提案されているストラテジーとは異なり、本発明の方法はパートナー核酸間の相同ゾーンを抑圧しない。本発明の方法は２種の組換えパートナー核酸の少なくとも一方の配列を修飾してこれらの核酸間に存在する相同度を低減することを基礎とする。
【００１８】
従って、本発明の第１の目的は他のパートナーに対する相同度を低減するように組換えパートナー核酸の少なくとも１種の配列を縮重させることを特徴とする核酸間の分子内又は分子間相同組換えイベント頻度の低減方法に関する。
【００１９】
本発明の意味で核酸間の「相同組換えイベント頻度の低減」とは、対応する非修飾核酸で観察される頻度よりもこの頻度を下げることを意味する。この低減は当業者に公知の慣用試験（特に「マーカーレスキュー」試験又は複製ウイルス粒子生産試験）により容易に測定することができる。有利な態様では、「低減」なる用語は好ましくは少なくとも１対数単位の相同組換え頻度の有意低下を意味する。
【００２０】
分子間相同組換えとは、異なる２種の核酸間（又は２種の核酸の２領域間）の相同組換えを意味する。分子内相同組換えとは、同一核酸の２領域間の相同組換えを意味する。更に、相同組換えのパートナー核酸は染色体外核酸、染色体核酸又は両者の組み合わせ（即ち染色体核酸と染色体外核酸）のいずれでもよい。染色体外核酸としては。プラスミド、ベクター、エピソーム、ウイルスゲノム等が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法は染色体核酸と染色体外核酸の間の分子間相同組換えイベントの頻度を低減するのに特に適している。
【００２２】
本発明の方法は全般に、
（ｉ）相同組換えに関与する領域を同定する段階と、
（ｉｉ）この領域を修飾する段階と、
（ｉｉｉ）配列を確認する段階と、
（ｉｖ）修飾配列（合成遺伝子と呼ぶ）を合成する段階と、
（ｖ）元の配列を合成遺伝子で置換する段階を含む。
【００２３】
（ｉ）核酸間の相同組換えに関与する領域の同定は任意の公知方法により実施される。特に、組換えイベントが観察される場合には、これに関与する領域を配列分析により調べ、核酸間（分子間）又は核酸内（分子内）の相同領域を調べることができる。
【００２４】
組換えに関与する配列が同定されたら、以下の段階（ｉｉ）即ち修飾に使用するこれらの配列の全部又は一部を含む領域を決定する。
【００２５】
（ｉｉ）配列の修飾
相同度は組換えイベントが有意頻度で生じるために十分長い領域にわたって非常に高くなければならないことが一般に認められている。特に、文献データによると、このようなイベントを生じるためには少なくとも約２００ｂｐに等しい長さの完全相同領域が必要である。実際に、もっと短い領域で組換えが生じることもあるが、その頻度は著しく低いか例外である。また、相同度を１９％下げたこのような領域では組換え頻度は１０００分の１になると思われる（ＷａｌｄｍａｎとＬｉｓｋａｙ，１９８７）。
【００２６】
配列は種々の方法で修飾することができる。コーディング配列は遺伝コードの縮重に基づいて修飾することができる。従って、配列を変えて相同度を低くしても発現産物は同一である。
【００２７】
従って、本発明は特に２つの相同領域間の対合を避けるように配列を修飾する。修飾により該当２領域間の相同長及び相同度を低減することができる。
【００２８】
本発明の方法では、少なくとも全２０塩基対に対して１塩基対の割合で相同組換えに関与する領域において核酸の配列を縮重させると有利である。少なくとも全１０塩基対に対して１塩基対の割合で配列を縮重させると、より好ましい。
【００２９】
本発明の特定態様によると、可能な全位置で配列を縮重させる。
【００３０】
本発明による配列の縮重は細胞又は生物のコドンの使用に応じて行う（核酸は使用されるべきものである）と有利である。ヒト細胞系で生産するウイルスベクターの場合には、可能であれば、ヒトにおけるコドンの優先的使用を優先させることにより配列を縮重させると特に有利である（実施例参照）。
【００３１】
また、核酸配列に付加修飾を加えてもよい。例えば、非コーディング領域で所定エレメント（発現調節配列、プロモーター）の寸法を短くしたり、これらのエレメントを修飾したり、所定の他のエレメントを異種領域で置換することが可能である。
【００３２】
本発明の特定態様によると、相同ゾーンが数個の遺伝子に及ぶ場合には、１個以上の遺伝子の配列を縮重させると共に、相同ゾーンに存在する所定の遺伝子のゲノム位置を変えることにより、即ちアデノウイルスゲノム内の元の位置とは異なるゲノム位置にこれらの遺伝子を配置することにより相同ゾーンを短縮することが可能である。ゲノム位置を変えた遺伝子の配列を更に縮重させてもよい。移動していない遺伝子の配列のみを縮重させることが好ましい。
【００３３】
（ｉｉｉ）配列の確認
確認は合成遺伝子の活性に作用することが可能な調節エレメント、二次構造等の存在を検出することが可能な情報処理法により実施する。実施例参照。
【００３４】
（ｉｖ）合成遺伝子の合成
合成遺伝子は当業者に公知の任意技術により合成することができ、特に核酸合成器を使用することができる。
【００３５】
（ｖ）合成遺伝子による元の配列の置換
次に、合成した合成遺伝子を元の配列の代わりに核酸に導入する。この段階も当業者に周知の慣用分子生物学技術により実施することができる。
【００３６】
本発明の方法の適用の１例はベクター、特に複製コンピテントウイルス（ＲＣＶ）粒子をもたないウイルスベクターの製造である。この点では、本発明の方法はより詳細には欠損ウイルスの相補機能をコードする染色体核酸と、前記欠損ウイルスのゲノムを含む染色体外核酸の相同組換えイベント頻度を低減することを目的とする。
【００３７】
該当ウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はヘルペスウイルスが有利である。アデノウイルスが特に有利である。
【００３８】
従って、本発明の特定実施態様はアデノウイルスゲノムのＥ１領域とフランキング領域を含む染色体核酸と、Ｅ１領域を欠損するアデノウイルスゲノムを含む染色体外核酸の相同組換えイベント頻度の低減方法である。
【００３９】
この特定方法では、本発明の縮重配列はＥ１領域を欠損するアデノウイルスのゲノムのｐＩＸ遺伝子を含むと有利である。縮重配列がアデノウイルス下のｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子を含むとより好ましい。
【００４０】
別の実施態様によると、縮重配列はアデノウイルスのゲノムのｐＩＸ遺伝子を含み、ＩＶａ２遺伝子の配列はその天然遺伝子座からＥ４領域に移動している。
【００４１】
本発明の方法は２９３細胞系又は誘導細胞系でＥ１領域を欠損する組換えアデノウイルスを生産するのに特に適している。
【００４２】
上述のように、２９３細胞系はＥ１領域と、特にｐＩＸ遺伝子とＩＶａ２遺伝子の一部をもつＥ１領域の（３’）下流に配置されたフランキング領域を含むアデノウイルスゲノムの左部分をそのゲノムに含む。複製コンピテントアデノウイルス（ＲＣＡ）を生産する相同組換えが生じるのは厳密にこのフランキング領域のレベルである。本発明において「誘導細胞系」とは、アデノウイルスのＥ１領域と、欠損ウイルスとの組換えを生じることが可能なフランキング領域をもつ細胞系を意味する。例えば、２９３に存在するよりも短い領域（例えばｐＩＸに制限）でもよいし、長い領域でもよい。誘導系は付加相補配列（例えばＥ４）の導入により２９３細胞から構築した系でもよい。
【００４３】
この点では、本発明は欠損組換えアデノウイルスのゲノムを２９３系細胞又は誘導細胞に導入することにより欠損組換えアデノウイルスを製造する方法にも関し、前記ゲノムがＥ１領域を欠失しており、ｐＩＸ及び／又はＩＶａ２遺伝子に縮重を含むことを特徴とする。
【００４４】
本発明は更に、そのゲノムが少なくとも配列を縮重した領域を含む任意ウイルスベクターにも関する。特に、（ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子に縮重配列をもつ）レトロウイルス、（ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子に縮重配列をもつ）ＡＡＶ又はアデノウイルスが挙げられる。
【００４５】
そのゲノムが縮重ｐＩＸ遺伝子をもつアデノウイルスが有利である。ｐＩＸ遺伝子の縮重配列が配列番号１又は配列番号４の配列であることが好ましい。アデノウイルスが更にＩＶａ２遺伝子のゲノム位置の修飾を含むと、更に好ましい。この遺伝子はＥ４領域のレベルに配置すると有利である。
【００４６】
別の実施態様によると、ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子を縮重したアデノウイルスに関する。ｐＩＸ遺伝子の天然配列を配列番号１の配列又は配列番号４の配列で置換し、ＩＶａ２遺伝子の縮重配列は配列番号２の配列又は配列番号５の配列であることが好ましい。ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子の天然配列を配列番号３の配列で置換することが好ましい。
【００４７】
別の実施態様によると、ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子を縮重し、更にｐＩＸ遺伝子のプロモーターの配列の修飾及び／又はこれらの遺伝子のポリアデニル化配列の置換を含むアデノウイルスに関する。配列番号８の配列を含むアデノウイルスが好ましい。
【００４８】
アデノウイルスは更に少なくともＥ１領域の欠失をもつと有利である。アデノウイルスは少なくともＥ１及びＥ３領域の全部又は一部を欠損しているとより好ましい。Ｅ１及びＥ４領域の全部又は一部と、場合によりＥ３領域も欠損する組換えアデノウイルスでもよい。また、このアデノウイルスは種々の血清型とすることができる。ヒト起源のアデノウイルスについてはＣ亜属に分類されるものを好適例として挙げることができる。
【００４９】
種々のヒトアデノウイルス血清型のうち、本発明の範囲では特に２又は５型のアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）を使用するとより好ましい。動物起源の種々のアデノウイルスのうち、本発明の範囲ではイヌ起源のアデノウイルス、特に完全アデノウイルスＣＡＶ２株［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）］を使用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルスは参考資料として本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９４／２６９１４に特に記載されている。アデノウイルスの構築ストラテジーと、これらのベクターに着目遺伝子を導入するために使用可能な部位については、従来技術、特にＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／１００８８、ＷＯ９６／１３５９６又はＷＯ９６／２２３７８に詳細に記載されている。
【００５０】
特に有利な態様によると、本発明の組換えアデノウイルスではアデノウイルスＡｄ５の配列上のヌクレオチド４５４からヌクレオチド３３２８のＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを欠失させることによりＥ１領域を不活化する。この配列は文献に記載されており、データベース（特にＧｅｎｅｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｍ７３２６０）からも得られる。別の好適実施態様では、ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６のＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメントを欠失させることによりＥ１領域を不活化する。
【００５１】
本発明の組換えアデノウイルスは細胞、臓器又は生物への導入及び／又は発現が所望される異種核酸配列も含むと有利である。
特に、異種ＤＮＡ配列は１種以上の治療遺伝子及び／又は抗原ペプチドをコードする１種以上の遺伝子を含むことができる。
こうして導入することができる治療遺伝子は、標的細胞に転写して場合により翻訳すると治療効果をもつ産物を生産する任意遺伝子である。
【００５２】
このような遺伝子としては、治療効果をもつタンパク産物をコードする遺伝子が特に挙げられる。このようにコードされるタンパク産物としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸等が挙げられる。このタンパク産物は標的細胞に対して同種でもよい（即ち標的細胞が病原性をもたない場合に標的細胞で正常に発現される産物）。この場合には、タンパク質の発現の結果、例えば不十分な細胞発現をなくしたり、修飾による不活性又は弱活性タンパク質の発現をなくしたり、このようなタンパク質を過剰発現させたりすることができる。治療遺伝子は更に安定性を増したり、活性を変えた細胞タンパク質の突然変異体もコードすることもできる。タンパク産物は標的細胞に対して異種でもよい。この場合には、発現されるタンパク質は例えば疾病に対抗することができるように細胞に欠失している活性を補充又は付加することができる。
【００５３】
本発明の意味での治療物質としては、特に酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、アポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（ＦＲ９３０５１２５）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｆ等）（ＦＲ９３０４７４５）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等の凝血関与因子をコードする遺伝子、ＧＡＸタンパク質をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５４】
治療遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第１４０３０８号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。
【００５５】
上述のように、異種ＤＮＡ配列はヒトで免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする１個以上の遺伝子も含むことができる。従って、この特定実施態様によると、本発明は特に微生物又はウイルスに対してヒトを免疫することが可能なワクチンを製造することができる。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）が挙げられる。
【００５６】
一般に、異種核酸配列は感染細胞で機能的な転写プロモーター領域も含む。例えば、感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与するプロモーター領域が挙げられる。（合成タンパク質も含めた他のタンパク質の発現に関与する）別の起源の領域でもよい。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。また、使用するアデノウイルスを含めたウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化、調節又は組織特異的もしくは大半の発現を可能にする配列を付加することにより、これらのプロモーター領域を修飾してもよい。また、異種核酸がプロモーター配列を含まない場合には、このような配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入することができる。
【００５７】
更に、異種核酸配列は標的細胞の分泌経路に合成治療物質を誘導するシグナル配列を特に治療遺伝子の上流に含むことができる。このシグナル配列は治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列でもよいし、人工シグナル配列でもよい。
【００５８】
特に有利な態様では、本発明のベクターは更に異種プロモーターの制御下で機能的なＥ３遺伝子をもつ。ベクターはｇｐ１９Ｋタンパク質の発現を可能にするＥ３遺伝子の一部をもつと、より好ましい。このタンパク質は実際に、（ｉ）その作用を制限して（ｉｉ）望ましくない副作用を生じるような免疫反応をアデノウイルスが受けないようにすることができる。
【００５９】
これらの組換えベクターは核酸を細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入するために使用することができる。
【００６０】
本発明は更に上記のような１種以上の組換えアデノウイルスを含む任意医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。
【００６１】
医薬組成物は注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことが好ましい。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。
【００６２】
注射に使用するウイルス用量は種々のパラメーター、特に使用する投与経路、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明の組換えアデノウイルスは１０4〜１０14ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０6〜１０10ｐｆｕ／ｍｌの用量形態で調剤及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に５日後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。
【００６３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、発明を制限するものではない。
【００６４】
一般分子生物学技術
プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈殿、大腸菌での形質転換等の分子生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に十分に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら（編），“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７］。
【００６５】
プラスミドｐＩＣ−２０Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）は市販品である。
【００６６】
連結については、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によりそのサイズに応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈殿させた後、製造業者の指示に従ってＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすればよい。
【００６７】
付着５’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントにより実施することができる。付着３’末端の破壊は、製造業者の指示に従って使用するＴ４ファージのポリメラーゼＤＮＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下に実施される。付着５’末端の破壊はヌクレアーゼＳ１で処理することにより実施される。
【００６８】
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従って実施することができる。
【００６９】
所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；  Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ  Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施することができる。
【００７０】
ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により実施することができる。
【００７１】
使用した細胞系
−２９３ヒト胎児腎細胞系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系は特にヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左部分（１２％）をそのゲノムに組み込んでいる。
【００７２】
実施例１：アデノウイルスにおける相同組換え
アデノウイルスのゲノムが遺伝子組換え可能であるという知見は２５年以上前に報告されている（ＷｉｌｌｉａｍｓとＵｓｔａｃｅｌｉｂｉ，１９７１）。しかし、これらの組換えの基礎となるメカニズムは殆ど解明されていない。組換えと複製には密接な関係があるらしいと示唆されており、アデノウイルス感染時に観察される高頻度組換えに必要な特定基質を複製により生産可能な組換えモデルを報告したデータもある。問題の１つはウイルス又は細胞タンパク質が組換え中間体の形成と最終組換え産物へのその分解に関与しているか否かを知ることである。この点では、試験ウイルス遺伝子Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ１ａ、Ｅ３のいずれも組換えイベントに関与していると認められなかった（Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，１９８６；Ｙｏｕｎｇ，１９９５）。同様に、細胞タンパク質も検出できなかった。アデノウイルスゲノムにおける組換えメカニズムとして、いずれも長いヘテロデュプレクスの形成を予想する２種のモデルが最終的に提案された（Ａｈｅｒｎら，１９９１；Ｙｏｕｎｇ，１９９５）。
【００７３】
欠損ゲノムと細胞系の相同組換えに関与する領域は、特にアデノウイルスのゲノムのｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子のレベルに特定された。欠損ゲノムに存在するこの領域の構造を図２に示す。
【００７４】
細胞ゲノムとの組換えに関与するアデノウイルスのゲノムの配列の修飾を行った。より詳細には、ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子の発現産物の構造を変えずに天然配列との相同度を低減するようなサイレント突然変異を導入することによりこれらの遺伝子の天然配列を修飾した。
【００７５】
得られた配列（合成遺伝子と呼ぶ）をアデノウイルスの対応する天然配列の代わりに使用して欠損ベクターを構築する。
【００７６】
１．組換えに関与する領域の同定
地図試験の結果、２９３細胞のゲノムに存在するアデノウイルスのゲノムの部分はアデノウイルスゲノムの左部分に対応し、その約１２％即ち約４３００ｂｐに相当することが判明した（Ａｉｅｌｌｏら，１９７９；Ｓｐｅｃｔｏｒら，１９８３）。本発明者らはＰＣＲにより追加地図実験を行った処、２９３のゲノムには４４２０位が存在することが判明した。この４４２０位を相同ゾーンの右端、従って合成遺伝子の右端として後続実験に選択した。クローニングの技術的理由により、修飾フラグメントはクローニング部位を導入した４４４５位まで延びる。
【００７７】
合成遺伝子の左端はｐＩＸ遺伝子の発現調節エレメント中で選択し、より詳細にはｐＩＸ遺伝子の−５６位に選択した。実際に、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターは５６ヌクレオチド領域に短縮できることが判明した。結合部位ＳＰ１とＴＡＴＡボックスを含むこの領域の活性は２５０ヌクレオチドフラグメントと同等である（Ｂａｂｉｓｓら，１９９１；Ｍａｔｓｕｉら，１９８９）。
【００７８】
従って、相同ゾーンは欠損ウイルスのゲノムの３５２０位から４４４５位に位置することが判明した（図２参照）。
【００７９】
２．修飾配列の設計
本発明者らはアデノウイルスＡｄ５のゲノムにおけるコドンの使用表を作成し、ウイルスタンパク質の発現に使用するのに最適なコドンを決定するために使用した。この表はアデノウイルスの１０種のタンパク質即ちｐＩＸ、ヘキソン、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩ、５２−５５ｋ、ｐＰｏｌ、ｐＴＰ、ＤＢＰ、２３Ｋ及び１９ｋの分析後に得られたデータを組み合わせることにより得た（表参照）。その後、ＧＣＧプログラムを使用することにより、得られた結果をＧｅｎｂａｎｋデータベースに存在する１９５２種の遺伝子の分析により得られたヒトコドンの使用表と比較した。
【００８０】
次に、コドンの使用優先順位を決定し、ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子のコーディング配列を修飾した。
【００８１】
・天然配列で使用されているコドンが優先コドンでない場合には、このコドンを合成遺伝子で使用する。
【００８２】
・天然配列で使用されているコドンが優先コドンである場合には、第２位優先コドンとして使用する。
【００８３】
・例えば制限部位を導入する場合などには、特にその頻度が第２位優先コドンの頻度に十分近いときには第３位優先コドンを使用してもよい。
【００８４】
下表はヒト及びアデノウイルス（ＡＤＶ５）におけるコドンの使用頻度と、ヒトにおける優先順位（Ａ列）、アデノウイルスにおける優先順位（Ｂ列）及び合成遺伝子の合成に採用される選択（Ｃ列）を示す。
【００８５】
【表１】
0004376454.tif 000002
【００８６】
【表２】
0004376454.tif 000003
【００８７】
【表３】
0004376454.tif 000004
【００８８】
第１の特定例の合成遺伝子（合成遺伝子＃１）には次の修飾を導入した。
【００８９】
−ｐＩＸプロモーターでは配列をできるだけ短くした。元のベクターは１３５ヌクレオチドであったが、採用したフラグメントは５６ヌクレオチドしか含んでいない。ＳＰ１結合部位とＴＡＴＡボックスの間の９ヌクレオチドを修飾することにより付加修飾を加えてもよい。
【００９０】
−ｐＩＸ遺伝子では、上記基準に従い、可能な場合には対応アミノ酸配列（配列番号１）を変えずに全位置を縮重させた。天然配列と縮重配列の比較及びこれらの配列の発現産物の構造を図８に示す。別のストラテジーによると、１０個のうち１個の位置（ｂｐ）のみを縮重させる。更に別のストラテジーでは２０個のうち１個の位置のみを縮重させる。
【００９１】
−ｐＩＸとＩＶａ２の中間領域では、本実施例ではこの領域の５９ヌクレオチドの配列を修飾しなかった。
【００９２】
−ＩＶａ２遺伝子では、上記基準に従い、対応アミノ酸配列（配列番号２）を変えずにＩＶａ２遺伝子のコーディング配列の全２０ｂｐを縮重させた。天然配列と縮重配列と対応アミノ酸配列を図９に示す。別のストラテジーによると、同様に対応アミノ酸配列を変えずに１０個のうち１個の位置（ｂｐ）のみ又は全位置を縮重させる。
【００９３】
合成遺伝子＃１の構造を図２に模式的に示す。合成遺伝子＃１の配列を図１０に示し、配列番号３とする。
【００９４】
合成遺伝子の別の例は合成遺伝子＃２であり、
−ｐＩＸ遺伝子のプロモーター配列を配列番号６に示すように修飾した配列で置換し、
−対応アミノ酸配列を変えずにｐＩＸ遺伝子の配列を配列番号４に示す配列に従って置換し、
−対応アミノ酸配列を変えずにＩＶａ２遺伝子の配列を配列番号５に示す配列に従って置換し、
−遺伝子導入ベクター（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，８９４６−８９５１）として使用されるＢ亜属のアデノウイルスである７型アデノウイルス（Ａｄ７）中で同一機能をもつ領域でポリアデニル化領域を置換した（この配列を配列番号７に示す）。
【００９５】
修飾配列全体を合成遺伝子＃２と呼び、配列番号８に示す。
【００９６】
３．合成遺伝子配列の確認
天然配列と合成遺伝子の塩基特性を情報処理分析により確認する。この確認の目的は特定構造、特に、
・スプライス供与又は受容部位（ＳｐｌｉｃｅＶｉｅｗ及び／又はＳｐｌｉｃｅ  Ｎｅｔプログラム）、
・ポリアデニル化部位（Ｈｃｐｏｌｙａプログラム）、
・潜在的転写因子結合部位（Ｔｒａｎｓｆａｃプログラム）、
・対応するＲＮＡ（ＲＮＡフォールディング）も含めて直列反復型の特定二次構造であるヘアピン（Ｓｉｇｓｃａｎプログラム，ＢＮＬ）を形成することが可能な領域、
・ＣＨＩ又はＭ２６型コンセンサス部位
が合成遺伝子に存在するか否かを調べることである。
【００９７】
このような配列が確認される場合には、上記第２項に定義したストラテジーに従って対応する塩基を場合により置換することができる。
【００９８】
４．対応する天然領域の代わりに合成遺伝子＃１をもつ欠損ウイルスの構築
１．出発材料：
・合成遺伝子＃１（配列番号３）
・合成遺伝子＃１の５’及び３’末端に夫々対応するオリゴヌクレオチド合成遺伝子Ｉ及び合成遺伝子ＩＩ（図７）
・プラスミドｐＪＪ１０５（図３）
・プラスミドｐＪＪ１１０（図４）
・プラスミドｐＩＣ−２０Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・プラスミドｐＳｙｎｇｅｎ：ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）にクローニングした合成遺伝子。
【００９９】
２．欠損ウイルスゲノムの構築
構築ストラテジーを図６に示す。
【０１００】
プラスミドｐＪＪ１１０をＸｂａＩで消化し、得られた４．８及び５．０ｋｂのＸｂａＩフラグメントを連結してプラスミドｐＪＪ２０１を形成する。次にプラスミドｐＪＪ２０１をＢｓｔＥＩＩとＸｍａＩで消化し、充填及び連結し、プラスミドｐＪＪ２０２を形成する。ＢｓｔＥＩＩとＸｍａＩの２部位を保存する。
【０１０１】
オリゴ合成遺伝子Ｉ及びオリゴ合成遺伝子ＩＩと鋳型としてプラスミドｐＪＪ１０５を使用することにより、ＩＶａ２遺伝子のフラグメント１（Ｆｇｔ１  ＩＶａ２、図６）に対応するＰＣＲ増幅産物を作製する。
【０１０２】
オリゴ合成遺伝子Ｉの配列（配列番号９）
ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＧＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＣＣＣ
オリゴ合成遺伝子ＩＩの配列（配列番号１０）
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＡＣＧＡＡＴＧＣ。
【０１０３】
増幅したフラグメントをｐＩＣ−２０ＲのＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＪＪ２０３を作製する。プラスミドｐＪＪ１０５のＩＶａ２遺伝子の隣接フラグメント（図６にＦｇｔ２  ＩＶａ２として示すフラグメント２）をＮｓｉＩ／ＢｓｔＥＩＩにより切出した後、ｐＪＪ２０３の対応部位に挿入し、ｐＪＪ２０４を作製する。次に合成遺伝子をＦｓｅＩ／ＮｒｕＩで消化し（図６）、ｐＪＪ２０４の対応部位間に挿入し、ｐＪＪ２０５を作製する。
【０１０４】
ｐＪＪ２０５の完全フラグメント（合成遺伝子＃１−Ｆｇｔ１＋２  ＩＶａ２）をＳｓｅ８３８７Ｉ／ＢｓｔＥＩＩで消化し、ｐＪＪ２０２の対応部位に挿入し、ｐＪＪ２０６を作製する（図５）。
【０１０５】
次に、このフラグメントを使用してＣｒｏｕｚｅｔら（ＰＮＡＳ（９４）１４１４−１４１９（１９９７））に記載されている方法に従い、合成遺伝子＃１を含む修飾アデノウイルスゲノム（Ｅ１を欠損し、場合によりＥ３も欠損する）を含む原核プラスミドを作製する。得られたプラスミドを次に２９３細胞にトランスフェクトし、対応するウイルスを生産する。
【０１０６】
２９３細胞による２種のウイルスＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３及びＡｄ５ＣＭＶｐ５３の増殖時におけるＲＣＡ（複製コンピテントアデノウイルス）の創発能を比較するために実験を行った。
【０１０７】
配列番号３の配列（合成遺伝子＃１）とｐ５３発現カセット（ＣＭＶ−ｐ５３−ｐｏｌｙＡＳＶ４０）をもつベクター（ＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３）をＣｒｏｕｚｅｔら（ＰＮＡＳ（９４）１４１４−１４１９（１９９７））に従って構築した。
【０１０８】
Ａｄ５ＣＭＶｐ５３はＡｄ５の（非修飾）ｐＩＸ−ＩＶａ２領域を含む。ｐ５３発現カセットは２種のウイルスに対して同質遺伝子型である。２種のウイルスＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３及びＡｄ５ＣＭＶｐ５３は２９３細胞で同等の生産性をもつ。２９３細胞で各ウイルス５個のプラークを精製した。連続７世代継代中に２×５個のプラークを増幅した。この増幅後にＲＣＡ検出実験で第７世代の２×５個のサンプルを分析した。実験は３回ずつ実施した。結果を図１２に示す。
【０１０９】
ＲＣＡ検出法は試験サンプル用量中のＲＣＡ数に対応する数のプラークを計数することが可能な定量法である。サンプルの所与ウイルス用量（常法では３×１０１０ｐｖ）を使用し、寒天層を堆積した非トランス相補細胞（Ｅ１を発現しない、この場合にはＡ５４９細胞）の細胞層に感染させる。出発感染用量がＲＣＡを含んでいる場合には１４日後に層内にプラーク形成が観察される。
【０１１０】
ＲＣＡ検出実験を３回実施した結果、ＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３のＲＣＡは０であり、Ａｄ５ＣＭＶｐ５３のＲＣＡは６である。この結果は観測の条件付確率による比較統計法を使用した場合に統計的に有意である。ベクターＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３を２９３細胞で増殖させると、ＲＣＡの創発の低下という点で慣用ベクターに比較して統計的に有意な改良が観察される。これらの結果をまとめると、合成遺伝子の存在はウイルス生産力価を悪化させず、合成遺伝子＃１を含むウイルスバッチはＲＣＡの汚染を受けないと言うことができる。
【０１１１】
５．対応する天然領域の代わりに合成遺伝子＃２をもつ欠損ウイルスの機能性
同様に、合成遺伝子＃２とＬａｃＺ発現カセット（ＣＭＶ−ＬａｃＺ）をもつ同様のベクターＡＶ１．７＃２ＣＭＶｌａｃＺを構築した。このベクターの生産性と、ｐＩＸ及びＩＶａ２領域を修飾していない（野生型Ａｄ５配列）ＬａｃＺカセット（ＲＳＶ  ＬａｃＺ）をもつベクターＡＶ１．０ＲＳＶｌａｃＺの生産性を比較した。ＡＶ１．７＃２ＣＭＶｌａｃＺとＡＶ１．０ＲＳＶｌａｃＺの２種のベクターの生産性を２９３細胞で同時に試験した。結果を下表に示す。
【０１１２】
【表４】
0004376454.tif 000005
【０１１３】
これらの結果から明らかなように、合成遺伝子＃１よりも相同度が低く、ｐＩＸ及びＩＶａ２遺伝子のレベルのサイレント突然変異以外に非コーディング領域のレベル（即ちｐＩＸ遺伝子のプロモーターとｐＩＸ及びＩＶａ２のオーバーラップしたポリアデニル化配列のレベル）にも修飾を含む合成遺伝子＃２を５型アデノウイルスの野生型配列の代わりに導入すると、この合成遺伝子は生存可能であり、高い生産性を確保する。
【０１１４】
６．ｐＩＸ遺伝子の天然配列のみを配列番号１に示す縮重配列で置換し、ＩＶａ２遺伝子に対応する相同領域の部分をＥ４領域に移動した欠損ウイルスの構築
別の実施態様によると、ｐＩＸ遺伝子の天然配列のみを配列番号１に示す縮重配列で置換し、ＩＶａ２遺伝子に対応する相同領域の部分をＥ４領域に移動する。ＩＶａ２遺伝子のクローニングは参考資料として本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９６／１００８８に記載されている。
【０１１５】
ＫａｎＲ及びＳａｃＢ遺伝子をもつプラスミドｃｏｌＥ１に以下の３領域をクローニングして第１のプラスミドｐＩＥ１１を構築した。
【０１１６】
−５’−ａｔｃｇａｔｃｇＡＴＡＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＣ−３’と５’−ａｇｃｔｇａａｔｔｃＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ−３’をプライマーとしてＡｄ５で生成し、右ＩＴＲとｏｒｆ１（ヌクレオチド３５５２５〜３５９３７）のＡＴＧの手前までのＥ４のプロモーターを含むＰＣＲ産物、
−特許出願ＷＯ／９６１００８８に記載されているＩＶａ２遺伝子のｃＤＮＡ、
−Ｅ４のｏｒｆ６のスプライシングに必要な配列とＥｃｏＲＶ部位までのｏｒｆ６のコーディング配列を含むＡｄ５のＸｃｍＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント。
【０１１７】
プラスミドｐＩＥ１１にはＩＶａ２のｃＤＮＡの前に過剰のＡＴＧが配置されている。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して部位特異的突然変異誘発によりプラスミドｐＩＥ１１上のこの部位を破壊し、このＡＴＧを破壊したプラスミドｐＩＥ１２を形成する。
【０１１８】
プラスミドｐＩＥ１２から誘導されるプラスミドｐＩＥ１２はその天然遺伝子座のＩＶａ２の遺伝子をＥ４領域に移動し、Ｅ４のｏｒｆ１〜４をＩＶａ２のｃＤＮＡで置換し、Ｅ３を欠失させ、Ｅ１の代わりにＲＳＶ−ｌａｃＺカセットを挿入するように修飾したアデノウイルス５のゲノムを含む。参考資料として本明細書の一部とするＣｒｏｕｚｅｔら（ＰＮＡＳ（９４）１４１４−１４１９（１９９７））に記載されている技術を使用することにより特許出願ＷＯ９６／１００８８に記載されているようなプラスミドｐＸＬ２７８８βＧａｌとの組換えによりプラスミドｐＩＥ１２ｃを得た。
【０１１９】
ＰａｃＩで酵素消化後、プラスミドｐＩＥ１２ｃを２９３にトランスフェクトし、得られたウイルスを増幅した。ウイルスＡｄＩＥ１２の制限プロフィルは予想通りであることが認められる。
【０１２０】
生産されたウイルスバッチで分析した処、天然配列をｐＩＸ遺伝子の縮重配列で置換し、ＩＶａ２遺伝子をＥ４領域に移動してもウイルス生産力価は悪化せず、上記条件下で試験した場合にウイルスバッチはＲＣＡにより汚染されないことが判明した。
【０１２１】
参考資料
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【図面の簡単な説明】
【図１】  アデノウイルスと２９３系の組換えイベントを示す。
【図２】  合成遺伝子の構造を示す。
【図３】  プラスミドｐＪＪ１０５の制限地図を示す。
【図４】  プラスミドｐＪＪ１１０の制限地図を示す。
【図５】  プラスミドｐＪＪ２０６の制限地図を示す。
【図６】  天然領域の代わりに合成遺伝子をもつ欠損ウイルスの構築を示す。
【図７Ａ】  オリゴ合成遺伝子Ｉのオリゴヌクレオチドの構造と制限地図を示す。
【図７Ｂ】オリゴ合成遺伝子ＩＩのオリゴヌクレオチドの構造と制限地図を示す。
【図８Ａ】  天然ヌクレオチド配列とｐＩＸ遺伝子の縮重配列（配列番号１）と対応するアミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】  天然ヌクレオチド配列とｐＩＸ遺伝子の縮重配列（配列番号１）と対応するアミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】  天然ヌクレオチド配列とＩＶａ２遺伝子の縮重配列（配列番号２）と対応するアミノ酸配列を示す。
【図９Ｂ】  天然ヌクレオチド配列とＩＶａ２遺伝子の縮重配列（配列番号２）と対応するアミノ酸配列を示す。
【図１０Ａ】  合成遺伝子＃１のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１０Ｂ】  合成遺伝子＃１のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１１】  ２９３細胞のゲノムと組換えＡｄ５ベクターの相同を模式的に示す。ベクターＡｄ５ｐ５３はＥ１領域の下流に２９３細胞のゲノムと相同の８９８ヌクレオチドの連続配列をもつ。点突然変異を導入すると、連続相同最大長は合成遺伝子＃１（ＡＶ１．７＃１ＣＭＶｐ５３）の場合には９２ヌクレオチド、合成遺伝子＃２（ＡＶ１．７＃２ＣＭＶｌａｃＺ）の場合には２９ヌクレオチドに減る。
【図１２】  ２９３細胞で７回連続増幅後のベクターＡｄ５ｐ５３及びＡＶ１．７＃１ｐ５３に関するＲＣＡの検出を示す。
【図１】
0004376454.tif 000006
【図２】
0004376454.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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