(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、かつ配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列を有しているペプチドを有効成分とする血管炎（但し、皮斑様血管炎を除く）治療剤。
【請求項２】
該ペプチドが、配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列を有し、ｉ）配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列を含むか、または、ｉｉ）上記配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該ペプチドがトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する、の何れかのペプチドである請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
該ペプチドが、界面活性剤の非存在下で可溶性であるペプチドである請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
該ペプチドが、配列番号３または配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得される可溶性ペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
該ペプチドが、配列番号３の１９−５１６のアミノ酸配列または配列番号５の１９−５１６のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
血管炎が、アレルギー性肉芽腫性血管炎、顕微鏡的多発動脈炎、ベーチェット病、抗リン脂質抗体症候群、または全身性エリテマトーデスのいずれかである請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、かつそのアミノ酸配列中に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有しているペプチドを有効成分とする血管炎治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンと特異的に結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を著しく促進する作用を有するペプチドは、トロンボモジュリンとして知られている（以下、このペプチドをトロンボモジュリンと記することがある）。
一方、プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性のたん白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性型プロテインＣとなる。この活性型プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第五因子、および活性型第八因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲンアクチベーターの産生に関与していることが知られている［鈴木宏治、医学のあゆみ、第１２５巻、９０１頁（１９８３年）］。
【０００３】
したがって、トロンボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に生産せしめるものであり、抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされている。
従来、トロンボモジュリンは、ヒトを始めとする種々の動物種の血管内皮細胞上に発現している糖たん白質として発見取得されたが、発明者らのグループは、初めてヒトトロンボモジュリンのクローニングに成功した。即ち、遺伝子工学的手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーから、シグナルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、１８アミノ酸残基のシグナルペプチドを含む５７５残基のアミノ酸配列が明らかにされている［特開平１−６２１９号公報］。シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（１−２２６番目）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（４６３−４９８番目）、膜貫通領域（４９９−５２１）、そして細胞質内領域（５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されており、そして全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分（即ち、最小活性単位）は、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域のうちＮ末端側から４、５、６番目のＥＧＦ様構造からなる部分（以下、ＴＭＥ４５６と略すことがある）であることが知られている［Ｍ．Ｚｕｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１０３５１−１０３５３（１９８９）］。
【０００４】
少なくとも、膜貫通領域を含有しないように調製されたトロンボモジュリンにおいては、界面活性剤の非存在下でも綺麗に溶解することができる性質（以下、可溶性ということがある）を有し、例えば、Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域からなる（即ち、配列番号２の１９〜５１６位のアミノ酸配列からなる）トロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２３と略することがある）は、組換え技術の応用により取得できること、そしてその組換え体トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている［特開平１−６２１９号公報］。
【０００５】
因みに、遺伝子においては、自然の変異または取得時の変異により、多くのケースで認められる通り、ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、上述の５７５残基のアミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第４７３位のアミノ酸においてＶａｌであるものと、Ａｌａであるものが現在確認されている。このアミノ酸をコードする塩基配列においては、第１４１８位において、それぞれＴとＣとの変異に相当する［Ｗｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：４３５０−４３５７（１９８７）］。しかし、活性及び物性においては、全く相違なく、両者は実質的に同一と考えることができる。したがって、上述の配列番号２のアミノ酸配列からなるトロンボモジュリンは、配列番号３のアミノ酸配列からなるトロンボモジュリンの多形性のペプチドであり、実質的に同一と判断できる。
【０００６】
トロンボモジュリンは、従来血栓症およびＤＩＣなどの凝固亢進を伴う疾患の治療、予防に有効であることが動物実験により証明されている［Ｋ．Ｇｏｍｉら，Ｂｌｏｏｄ，７５：１３９６−１３９９（１９９０）］。また、血栓症やＤＩＣなどの凝固亢進を伴う疾患以外の疾患に対する適用として、肝臓障害［特開平８−３０６５号広報］、吸収性骨疾患［特開平８−３０３７８６号広報］、創傷治癒［特開平９−２０６７７号広報］などが挙げられる。しかし、血管炎に効果のあることについては記載がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来より、より有効な血管炎治療剤の提供が求められていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
血管炎は、血管壁自体を炎症の場とし、血管壁の炎症と壊死を主な病変とする疾患であり、単一の疾患ではなく病因学的にも病態学的にも多様な疾患群であり、必ずしも十分な治療法が確立されていなかった。近年、血管炎は、宿主の免疫異常による自己免疫を基盤とするＩＩ，ＩＩＩあるいはＩＶ型アレルギーにより発症すると考えられ、血管炎の分類とそれぞれの発症機序の関連性が示唆されている［宮崎龍彦ら，臨床科学，３３：１４４１−１４４９（１９９７）］。
【０００９】
本発明における血管炎としては、代表的には、アレルギー性肉芽腫性血管炎、顕微鏡的多発動脈炎、ベーチェット病、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス等が挙げられ、その他に、高安動脈炎、炎症性腹部大動脈瘤、側頭動脈炎、結節性多発動脈炎、川崎病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、過敏性血管炎、Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ紫斑病などが例示される。
【００１０】
これらの血管炎の治療には、ステロイドや免疫抑制剤が優先的に用いられる。血管炎治療の主たる薬剤であるステロイド剤は、病状が初期の場合や免疫抑制剤を併用することによって病状が軽減され寛解することがある。しかし、ステロイド剤の投薬中止直後あるいは一定期間後に病状が再燃することが多く、その場合ステロイド剤の大量投与や長期投与が行われるようになる。ステロイド剤の長期投与は、高脂血症や高血圧さらに血管の線維化を惹起し、虚血性心疾患を生ずる例が増加している［北本清，別冊  日本臨床，領域別症候群１５：１８５−１８７（１９９３）］。また、免疫抑制剤では、貧血、白血球および血小板減少や肝機能障害、感染症などの副作用が報告されている。これらのことから副作用を伴わずに血管炎を寛解させる薬剤が臨床現場で必要とされている。
【００１１】
本発明者らは血管炎の治療方法を鋭意種々検討した結果、驚くべきことに、配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列を含むトロンボモジュリンが、血管炎の治療剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、かつ配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列を有しているペプチドを有効成分とする血管炎治療剤である。
【００１２】
前述の通り、本発明でトロンボモジュリンとは、トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する物質であり、本発明の血管炎治療剤として用いることのできるトロンボモジュリンとしては、上記のトロンボモジュリンとしての活性を有し、かつそのアミノ酸配列中に配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列を有していれば特に限定されない。さらに好ましくは、可溶性トロンボモジュリンである。可溶性トロンボモジュリンとしては、上記のトロンボモジュリンとしての活性を有し、界面活性剤の非存在下でも容易に溶解し得る物質であり、例えば、注射用蒸留水に対して、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３ｍｇ／ｍｌの溶解性が得られるものが好ましい。
【００１３】
また、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を示すためには、例えば、ヒト型のトロンボモジュリンにおいてこの作用の中心部位として知られている配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列を該ペプチド中に包含していることが好ましく、この配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する限り自然または人工的に変異していてもよく、すなわち配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加していても良い。許容される変異の程度は、活性を有するか否かであり特に限定されないが、例えばアミノ酸として５０％、好ましくは７０％、特に好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％または９５％以上であることが例示される。後述の通り、これらの変異については通常の遺伝子操作技術を用いれば容易に取得可能である。配列番号１の１９−１４０のアミノ酸配列のＣ末端に、上述の配列番号８の１９−１３２のアミノ酸配列またはその変異したアミノ酸配列が結合していることが好ましい。例えば、配列番号１０の１９−２５４のアミノ酸配列、又は配列番号１２の１９−２５４のアミノ酸配列が好ましい例として挙げられる。
【００１４】
また、本発明に用いることのできるトロンボモジュリンとしては、例えば、配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドが挙げられる。この形質転換細胞により取得されるペプチドとしては、配列番号３の１９−５１６位のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい例として挙げられる。その他に宿主細胞によっては、シグナル部分がそのままや、前記配列番号３の１７−５１６位のアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらの混合物であってもよい。勿論これらのペプチドは極めて溶解性が高いもので、前述の溶解性を十分に有するものである。本発明において、上記の配列番号３および配列番号５の１９−５１６位のアミノ酸配列からなるペプチドは特に好ましい。またその他に、配列番号２および配列番号３の２４５−４８０位のアミノ酸配列からなるペプチドも例示される。
【００１５】
さらに、これらのペプチドは、前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、糖鎖が付いていても、又付いていなくともよく、特に限定されるものではない。また、宿主細胞の種類により、糖鎖の種類や、付加位置や付加の程度は相違するものであり、いずれも用いることができる。前述の通り、遺伝子操作により取得することに特定されるものではないが、遺伝子操作により取得する場合には、発現に際して用いることができるシグナル配列としては、上述の配列番号８の１−１８のアミノ酸配列からなる塩基配列や、配列番号８の１−１６のアミノ酸配列からなる塩基配列、その他公知のシグナル配列、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のシグナル配列を利用することができる（国際公開８８／９８１１号公報）。
【００１６】
これらのペプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞等が挙げられる。ＣＨＯ細胞においては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
【００１７】
また、遺伝子操作の過程やペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。
遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている［特開平１−６２１９，特開平２−２５５６９９，特開平５−２１３９９８，特開平５−３１０７８７，特開平７−１５５１７６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１０３５１−１０３５３（１９８９）］。したがって本発明のトロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することができる。例えば特開平１−６２１９号では、全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐｓＶ２ＴＭＪ２を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｔｒａｉｎ  ＤＨ５（ＡＴＣＣ  寄託番号６７２８３号）を開示しているが、出願人らは、再度、同じ菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５／ｐｓＶ２ＴＭＪ２）を生命研に寄託した（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５７０）。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。
【００１８】
本発明に用いられる可溶性トロンボモジュリンは、従来公知の方法またはそれに準じて調製すればよいが、例えば、前記山本らの方法［特開平１−６２１９号実施例参照］、または特開平５−２１３９９８号公報を参考にすることができる。すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、さらに必要に応じた改変を行うことも可能である。この改変としては、例えば、配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなすために、配列番号３のアミノ酸配列の第４７３位のアミノ酸をコードするコドン（特に、第１４１８位の塩基）に、メソッド  イン  エンザイモロジー［Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００：４６８（１９８３年），アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）］に記載の方法に従って、部位特異的変異を行う。例えば、配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡ断片および配列番号７に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用い、上記部位特異的変異を行い、配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号６の塩基配列よりなる）となすことができる。このようにして、調製したＤＮＡを、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、適宜選択し、この細胞を培養して得た培養液から、公知の方法により精製された可溶性トロンボモジュリンが製造できる。前述の通り配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを前記宿主細胞にトランスフェクトすることが好ましい。本発明に用いられるトロンボモジュリンの生産方法は、上記の方法に限定されるものではなく、すなわち、尿や血液、その他体液等から抽出精製することでも可能であるし、またトロンボモジュリンを生産する組織またはこれら組織培養液等から抽出精製することも、また必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。
【００１９】
次いで上記により取得された培養上清、または培養物からのトロンボモジュリンの単離精製方法は、公知の手法［堀尾武一編集；蛋白質・酵素の基礎実験法］に準じて行なうことができる。例えば、トロンボモジュリンと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、トロンボモジュリンとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。吸着体の好ましい例として、トロンボモジュリンのリガンドであるトロンビンやトロンボモジュリンの抗体を利用する例が挙げられる。これらの抗体としては、適宜の性質、或いは適宜のエピトープを認識するトロンボモジュリンの抗体を利用することができ、例えば、特公平５−４２９２０号公報、特開昭６４−４５３９８号公報、特開平６−２０５６９２号公報などに記載された例が挙げられる。また、トロンボモジュリンの分子量サイズを利用した、ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過が挙げられる。そしてまた、疎水性基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンのもつ疎水性部位との間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせることができる。精製の程度は、使用目的等により選択できるが、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが望ましい。
【００２０】
精製法を具体的に例示すれば、トロンボモジュリン活性を指標に精製する方法が挙げられ、例えばイオン交換カラムのＱ−セファロースＦＦで培養上清または培養物を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラムのＤＩＰ−ＴＢ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｇａｒｏｓｅ）で主精製しトロンボモジュリン活性が強い画分を回収し、回収画分を濃縮し、ゲルろ過にかけトロンボモジュリン活性画分を純品として取得する精製方法［五味ら；Ｂｌｏｏｄ、７５、１３９６−１３９９、１９９０］が挙げられる。指標とするトロンボモジュリン活性としては、例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性が挙げられる。その他に、好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
【００２１】
トロンボモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を選定し、イオン交換クロマト精製を行なう。特に好ましい例としては、０．１８Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−セファロースＦＦを用いる方法である。適宜洗浄後、例えば０．３Ｍ  ＮａＣｌ含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し粗精製品のトロンボモジュリンを得ることができる。
【００２２】
次に、例えばトロンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固定化しアフィニティークロマト精製を行なうことができる。好ましい例としてＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムの例と、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムの例が挙げられる。ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムは、予め、例えば、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化せしめ、上記の粗精製品をチャージして、適宜の洗浄を行い、例えば、１．０Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し精製品のトロンボモジュリンを取得することができる。また抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムにおいては、予めＣＮＢｒにより活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社）に、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を溶解した０．５ＭＮａＣｌ含有０．１ＭＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に接触させ、セファロース４Ｂに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体をカップリングさせた樹脂を充填したカラムを、予め例えば１．０Ｍ  ＮａＣｌ含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、適宜の洗浄の後、例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌ含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出せしめる方法が例示される。溶出液は適当な緩衝液で中和し、高純度精製品として取得することもできる。これらは、限外濾過により濃縮することが好ましい。
【００２３】
さらに、ゲル濾過による緩衝液交換を行なうことも好ましい。例えば、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化せしめたＳｅｐａｈｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムもしくはＳ−２００カラムに、限外濾過により濃縮した高純度精製品をチャージし、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で展開分画し、トロンビンによるプロテインＣの活性化の促進活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した高純度精製品を取得することができる。
【００２４】
かくして取得された精製された可溶性トロンボモジュリンを、塩化水銀を投与して白血球破壊性血管炎を発症させたＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットに投与したところ、腸に対する障害を抑制し、さらに抗好中球細胞質抗体（以下、ＡＮＣＡと略することがある）の１つである抗ミエロパーオキダーゼ抗体（以下、ＭＰＯ−ＡＮＣＡと略することがある）の増加を抑制した。
【００２５】
近年、ＡＮＣＡの血管炎における病因的意義が示唆されている。ＡＮＣＡには、プロテイナーゼ−３を対応抗原とし、細胞質がびまん性に染色されるｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＡＮＣＡ（以下、ｃ−ＡＮＣＡと略することがある）とミエロパーオキシダーゼを対応抗原とし、核の周辺のみが染色されるｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ  ＡＮＣＡ（以下、ｐ−ＡＮＣＡと略することがある）の２つのサブタイプに分類されている。
【００２６】
ｃ−ＡＮＣＡは、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症の病因に関わっているとともに、ｃ−ＡＮＣＡの検出が診断に有用であることが知られている［矢野哲朗ら，臨床科学，３３，１３９５−１４０４（１９９７）］。一方、ｐ−ＡＮＣＡは、顕微鏡的多発動脈炎、壊死性半月体形成性腎炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、悪性リウマチ、血管ベーチェット病、白血球破壊性皮膚血管炎において高頻度に陽性となることが知られている［宮崎龍彦ら，臨床科学，３３，１４４１−１４４９（１９９７）］。
【００２７】
ｐ−ＡＮＣＡのうち、ミエロパーオキシダーゼ（以下、ＭＰＯと略することがある）を抗原とするＭＰＯ−ＡＮＣＡは、特に顕微鏡的多発動脈炎で高率に検出されており、同抗体の早期診断の必要性と疾患活動の指標としての有用性が確立している。さらに、顕微鏡的多発動脈炎では、腹部臓器における血管炎が観察され、しばしば重篤であることが報告されている［竹内健ら，臨床科学，３３，１３８８−１３９４（１９９７）］。
【００２８】
塩化水銀を投与したＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、ポリクローナルにＢ細胞が活性化されるため、抗糸球体基底膜抗体、抗ＤＮＡ抗体を産生する自己免疫病モデルとして知られていた。最近、塩化水銀を投与したＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、腸管など腹部臓器で壊死性血管炎を発症し、さらに血管炎で高率に検出されるｐ−ＡＮＣＡを産生することが報告された［Ｖ．Ｌ．Ｍ．Ｅｓｎａｕｌｔら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６７，１１４−１２０（１９９２）］。従って、本モデルは、壊死性血管炎に分類される顕微鏡的多発動脈炎やアレルギー性肉芽腫性血管炎の病態を示しているといえる。
【００２９】
さらに、可溶性トロンボモジュリンをＭＲＬ／ｌｐｒマウスに投与したところ、血管炎の指標となる尿蛋白および抗二本鎖ＤＮＡ（以下、抗ｄｓ−ＤＮＡと略することがある）抗体価の上昇を有意に抑制した。
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、遺伝的な欠損によりヒトの全身性エリテマトーデスに類似した病態像を自然発症する。その病態像は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＭａｃ−２＋活性化マクロファージの病変局所への集簇を特徴とする肉芽腫性動脈炎であり、マクロファージの浸潤に伴う外弾性板の破壊と中膜変性が観察される。その結果、局所に抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体などの免疫複合体が沈着し、免疫複合体型腎炎を発症する［伊藤美津子ら，日本臨床，５２，２４−２８（１９９４）］。ＭＲＬ／ｌｐｒが示す蛋白尿および抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体陽性は、全身性エリテマトーデスの分類基準［Ｅ．Ｍ．Ｔａｎら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｒｈｅｕｍ．，２５，１２７１−１２７７（１９８２）］に挙げられていることから、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスが全身性エリテマトーデスを発症するモデル動物であるといえる。
【００３０】
これらのモデル動物に対する効果から、本発明の改善剤は血管炎の治療剤として有用であることが確認された。
本発明の血管炎治療剤を製造するに際しては、有効量のトロンボモジュリンを医薬上許容される担体と混合する公知の方法により調製すればよい。担体としては、水溶性の担体が好ましく、例えば、ショ糖、グリセリン等や、その他の無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えて調製することができる。さらに必要に応じて、特開平６−３２１８０５号公報、特開平１−６２１９号公報等に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加しても良いし、また、防腐剤を添加することも好ましく、例えば、パラ安息香酸エステル類が好ましい例として挙げられ、パラ安息香酸メチルが特に好ましい例として挙げられる。防腐剤の添加量は、通常０．０１〜１．０％が例示され、好ましくは０．１〜０．３％が挙げられる。
【００３１】
これらの添加方法は特に限定されないが、凍結乾燥とする場合には、通常予想される通り、例えば、添加物を直接トロンボモジュリン含有溶液に添加したり、またはあらかじめ添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解して互いに添加混合する方法にて溶液を調製し、凍結乾燥する方法が挙げられる。
本発明の血管炎治療剤としては、注射液の形態で提供されても、また凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されてもよい。
【００３２】
また、例えば製剤化工程においては、アンプルまたはバイアルに、水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液１ｍｌあたり０．０５〜１５ｍｇ、好適には０．１〜５ｍｇのトロンボモジュリン及び上記添加物を含有する溶液を、例えば０．５〜１０ｍｌ充填し、凍結乾燥するか、またはそのままに水溶液注射用製剤として調製できる。このような製剤は、例えば１日１〜３回投与として０．０１〜１００ｍｇ含有した注射用水溶液として得ればよい。
【００３３】
本発明の血管炎治療剤は、非経口投与法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与することが望ましい。また経口投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与なども可能である。
本発明の血管炎治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、投与経路などによっても異なるが、一般的に０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、一日あたり一回または必要に応じて数回投与する。投与間隔は、２日に１回、３日に１回とすることも可能である。
【００３４】
このトロンボモジュリンの急性毒性を調べたところ、各群５匹の雌雄ＳＤラットを用いて、トロンボモジュリン量として１８０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与しても死亡例は１例も見られなかった。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
【００３６】
【参考例１】
本実施例で用いる可溶性トロンボモジュリンの生産
実施例に用いる可溶性トロンボモジュリンは、前記山本らの方法（特開平１−６２１９号の実施例１０に記載の方法）に従って行った。すなわち配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号４の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より定法の精製法にて、精製された可溶性トロンボモジュリンＴＭＤ１２３を取得した。同様に、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２の塩基配列よりなる）を用いることにより配列番号１の１９−１２２のアミノ酸を少なくとも有するペプチド（以下、ＴＭＥ１２３と略すことがある）を取得した。同様に、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号９の塩基配列よりなる）を用いることにより、配列番号８のアミノ酸配列の１９−１３２のアミノ酸を少なくとも有するペプチド（以下、ＴＭＥ４５６と略することがある）を、さらに配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に配列番号８の１９−１３２のアミノ酸を結合したペプチド（具体的には、配列番号１０のアミノ酸配列からなる）をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１１の塩基配列よりなる）を用いて配列番号１０のアミノ酸配列の１９−２５４のアミノ酸を少なくとも有するペプチド（以下、ＴＭＤ２と略することがある）を取得した。
【００３７】
また、配列番号１１の塩基配列を含むＤＮＡ断片および配列番号７に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用いて前述の部位特異的変異を行い、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１３の塩基配列よりなる）を取得した。このＤＮＡ配列をＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、上述の方法にて配列番号１２のアミノ酸配列の１９−２５４のアミノ酸を少なくとも有するペプチド（以下、ＴＭＤ２Ｍと略すことがある）を取得した。
【００３８】
【実施例１】
塩化水銀投与Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットにおける効果
１０週齢のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を７群に分け、第１群には生理食塩水、第２群には１ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ１２３、第３群には２．５ｍｇ／ｍｌのＴＭＥ１２３、第４群には２．５ｍｇ／ｍｌのＴＭＥ４５６、第５群には５ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ２、第６群には５ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ２Ｍ投与群とした。ＴＭＤ１２３は１週間に１回、それ以外の可溶性トロンボモジュリンは１日に１回の皮下投与とし、それぞれ１回あたり２ｍｌ／ｋｇの用量で２週間投与した。さらに第１群、第２群、第３群、第４群、第５群および第６群は、塩化水銀［ＨｇＣｌ２］（和光純薬工業製）を１ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水で調製した溶液を、１回あたり１ｍｇ／ｋｇの用量で薬物投与開始日から２日に１回、２週間皮下投与した。第７群は無処置コントロール群とした。
【００３９】
塩化水銀溶液の投与を開始してから１４日後、塩化水銀投与による白血球破壊性血管炎に対するＴＭの効果を病理組織学的検査により検討した。すなわち、投与翌日に摘出した小腸および大腸を１０％ホルマリン溶液で固定した後、常法に従いパラフィン包埋、薄切、ヘマトキシリン・エオジン染色後検鏡した。Ｑａｓｉｍら［Ｆ．Ｊ．Ｑａｓｉｍら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７２，１８３−１９０（１９９５）］による、塩化水銀投与Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットの消化管組織における血管炎の分類に従い、５段階［ｓｃｏｒｅ０：正常、ｓｃｏｒｅ１：血管周辺への好中球の浸潤、ｓｃｏｒｅ２：軽度の血管炎、ｓｃｏｒｅ３：壊死性血管炎、ｓｃｏｒｅ４：白血球破壊性血管炎］に評価した。各個体の小腸および大腸における血管炎のｓｃｏｒｅを合計し、各群で比較した。
【００４０】
また、臓器摘出直前に採血を行い、血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法［Ｆ．Ｊ．Ｑａｓｉｍら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７２，１８３−１９０（１９９５）］に準じて測定した。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に、０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて５μｇ／ｍｌとなるように溶解して調製したＭＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）を０．０５ｍｌずつ各ウェルに加え、４℃で一晩放置してコーティングした。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと略することがある）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製）にＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ製）を０．１％含む溶液で洗浄後、ウシ胎児血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略することがある）を２％含むＰＢＳを０．１ｍｌずつ各ウェルに加え、３７℃で２時間放置してさらにコーティングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０倍に希釈した各群のラット血清を０．０５ｍｌずつ加え、３７℃で２時間放置することにより血清中の抗ＭＰＯ抗体を結合させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ラットイムノグロブリン抗体（ベーリンガー・マンハイム製）を０．１ｍｌずつ加え、３７℃で２時間放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ製）を０．１ｍｌずつ各ウェルに加えて３７℃で保温した。０．０５ｍｌの３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ製）で４０５ｎｍの吸光度を測定し、血清無添加のウェルで得られた吸光度をバックグラウンドとして差し引いた値をＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価とした。
【００４１】
結果は表１に示される通り、ＴＭＤ１２３投与群、ＴＭＤ２投与群およびＴＭＤ２Ｍ投与群では血管炎ｓｃｏｒｅの有意な改善が認められた。ＴＭＥ４５６投与群では血管炎ｓｃｏｒｅの改善傾向が観察されたが有意なものではなく、ＴＭＥ１２３投与群は、生理食塩水投与群と差がなかった。また、表２に示される通り、塩化水銀の投与によりＭＰＯ−ＡＮＣＡ産生が認められるが、ＴＭＤ１２３投与群、ＴＭＤ２投与群およびＴＭＤ２Ｍ投与群におけるＭＰＯ−ＡＮＣ抗体価は、生理食塩水投与群と比較して有意に抑制された。ＴＭＥ４５６投与群およびＴＭＥ１２３投与群ではＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の抑制効果は観察されなかった。プロテインＣ活性化を促進するトロンボモジュリンとしての活性を有するＴＭＥ４５６に配列番号１のアミノ酸配列を付加することにより、消化管組織における血管炎ｓｃｏｒｅの上昇を有意に抑制しことから、本発明の改善剤が血管炎の治療剤として有用であることが確認された。また、本モデルは、上述の通りｐ−ＡＮＣＡが高値を示すアレルギー性肉芽腫性血管炎および顕微鏡的多発動脈炎のモデルと考えることもできるため、ＴＭがアレルギー性肉芽腫性血管炎、顕微鏡的多発動脈炎に対する治療剤として有用であることを明示するものである。
【００４２】
【実施例２】
ＭＲＬ−１／ｌｐｒマウスにおける効果
６週齢の雌性ＭＲＬ−１／ｌｐｒマウス（日本ＳＬＣ）を７群に分け、第１群には生理食塩水、第２群には０．２ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ１２３、第３群には０．５ｍｇ／ｍｌのＴＭＥ１２３、第４群には０．５ｍｇ／ｍｌのＴＭＥ４５６、第５群には１ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ２、第６群には１ｍｇ／ｍｌのＴＭＤ２Ｍ投与群とした。ＴＭＤ１２３は１週間に１回、それ以外の可溶性トロンボモジュリンは１日に１回の皮下投与とし、それぞれ１回あたり１０ｍｌ／ｋｇの用量で１４週間投与した。第７群は無処置コントロール群とした。
【００４３】
薬物投与開始１４週間後に採尿を行い、尿中の蛋白量をエームス尿検査試験紙（Ｎ−マルティスティックスＳＧ−Ｌ，バイエル・三共製）を用いて測定した。試験紙の呈色を添付の比色表と比較することにより、グレード０（検出限界以下），１（−３０ｍｇ／ｄｌ），２（３０−１００ｍｇ／ｄｌ），３（１００−３００ｍｇ／ｄｌ），４（３００−１０００mg／ｄｌ），５（１０００ｍｇ／ｄｌ以上）の６段階で評価し、グレード２以上を陽性と判定した。
【００４４】
また薬物投与開始時と１４週間後に採血を行い、血清中の抗ｄｓＤＮＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法［Ｚ．Ａｍｏｕｒａら，Ａｒｔｈｒｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．，３７巻，１６８４ー１６８８頁，１９９４年］を用いて測定した。ポリ−Ｌ−リジンプレコート９６穴プレート（セルタイトＰＬ，住友ベークライト製）に、ＰＢＳを用いて３．７５ｕｇ／ｍｌとなるように溶解して調製したラムダファージ二本鎖ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ製）を０．１ｍｌずつ各ウェルに加え、３７℃で２時間放置後、４℃で一晩放置してコーティングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ウシ胎児血清を１０％含むＰＢＳを０．１ｍｌずつ各ウェルに加え、３７℃で２時間放置してさらにコーティングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１００倍に希釈した各群のマウス血清を０．１ｍｌずつ加え、３７℃で２時間放置することにより血清中の抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体を結合させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ｇａｍｍａ抗血清（Ｓｉｇｍａ製）を０．１ｍｌずつ加え、３７℃で２時間放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＡＴＢＳ緩衝液（ベーリンガー・マンハイム製）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＡＴＢＳタブレット（ベーリンガー・マンハイム製）を溶解して調製した発色溶液を０．１ｍｌずつ各ウェルに加えて３７℃で保温した。０．０５ｍｌの０．０５％アジ化ナトリウム溶液を加えて発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ製）で４０５ｎｍの吸光度を測定し、血清無添加のウェルで得られた吸光度をバックグラウンドとして差し引いた値を抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体価とした。
【００４５】
結果は表３に示される通り、ＴＭＤ１２３投与群、ＴＭＤ２投与群およびＴＭＤ２Ｍ投与群では尿蛋白量が有意に減少した。ＴＭＥ４５６投与群では尿蛋白量の減少傾向が観察されたが有意なものではなく、ＴＭＥ１２３投与群では尿蛋白量の減少は観察されなかった。また、表４に示される通り、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体の産生が認められるが、ＴＭＤ１２３投与群、ＴＭＤ２投与群およびＴＭＤ２Ｍ投与群における抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体価は、有意に抑制された。ＴＭＥ４５６投与群およびＴＭＥ１２３投与群では抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体価の抑制効果は観察されなかった。プロテインＣ活性化を促進するトロンボモジュリンとしての活性を有するＴＭＥ４５６に配列番号１のアミノ酸配列を付加することにより、血管炎の指標となる尿蛋白および抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体価の上昇を有意に抑制しことから、本発明の改善剤が血管炎の治療剤として有用であることが確認された。また、本モデルは、前述の通り全身性エリテマトーデスのモデルと考えることもできるため、ＴＭが全身性エリテマトーデスに対する治療剤として有用であることも明示するものである。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、血管炎に対する有用な治療剤が提供できる。
【００５１】
【配列表】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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