(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主内のｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることにより臓器移植における宿主ｖｓ移植片反応の重篤度を低下させるための医薬組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸残基１６６〜１８５に対応する配列からなるｈｓｐ６０ペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７のアミノ酸配列からなるｈｓｐ６０ペプチドアナログ、およびそれらの塩から選択された化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
担体として：
１０％〜２０％  植物および／または動物起源のトリグリセリド；
１．２％〜２．４％  植物および／または動物起源のリン脂質；
２．２５％〜４．５％  浸透圧調節物；
０％〜０．０５％  抗酸化剤；および
滅菌水
を含む脂肪エマルジョンを含有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
供与体臓器または組織の移植前の宿主へ、経口、鼻内、静脈内、筋肉内、または皮下投与するための請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のアミノ酸残基１６６〜１８５に対応する配列からなるｈｓｐ６０ペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７のアミノ酸配列からなるｈｓｐ６０ペプチドアナログ、およびそれらの塩から選択された化合物の、宿主内のｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることによる臓器移植における宿主ｖｓ移植片反応の重篤度を低下させるための医薬組成物の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、宿主ｖｓ移植片（ＨＶＧＲ）反応の重篤度を、熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０に対する自己免疫性をダウンレギュレーションすることにより低下させる方法に関する。特に、本発明は、ｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることにより移植片拒絶を抑制するための、ｈｓｐ６０タンパク質のまたはｈｓｐ６０のエピトープペプチドの使用に関する。
背景技術の説明
自己免疫障害、例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）、多発性硬化症、慢性関節リューマチ、および甲状腺炎は、免疫系の内因性抗原に対する反応性と、その結果生じる組織への損傷により特徴付けられる。これらの自己抗原に対する免疫応答は、自己反応性Ｔリンパ球の持続的な活性化により維持されている。
６０kDaの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）は、体の全細胞において発現可能なストレスタンパク質である。にもかかわらず、健康な個体には、ｈｓｐ６０自己エピトープに特異的な自己免疫性Ｔ細胞が高頻度で現れる。正常な健康マウスおよびヒトは、それらの自己ｈｓｐ６０抗原を標的とするＴ細胞を有することが示された（Kaufmann, 1990; Kaufmann et al., 1994; Young, 1989; Cohen, 1992b）。しかしながら、これらの自己免疫性Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞仲介性自己免疫疾患にも関与する。自己ｈｓｐ６０抗原を標的とする高濃度のＴ細胞が、ヒト慢性関節炎（Cohen, 1991; Res et al., 1989; van Eden et al., 1989）、多発性硬化症（Selmaj et al, 1991）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Selmaj et al., 1991）およびアジュバント関節炎（Hogervorst et al., 1992）の自己免疫損傷において見出された。抗−ｈｓｐ６０Ｔ細胞はまた、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルの真性糖尿病においてある役割を果たすことも示されている（Elias et al., 1990; Elias et al., 1991; Elias et al., 1994; Elias et al., 1995; Birk et al., 1996a; Birk et al., 1993; Cohen, 1991）。
ＮＯＤマウスは、インスリンを生産する島のβ細胞を攻撃する自己免疫Ｔ細胞によって引き起こされるＩ型糖尿病を自発的に発生する。この自己免疫攻撃は、６０kDaの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のペプチドおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）のペプチドを含む種々の自己抗原に対するＴ細胞の反応性と関連している。したがって、例えば、ＮＯＤ／Ｌｔ系のマウスにおいて発生した糖尿病はｈｓｐ６０を用いて（米国特許第５，１１４，８４４号）、またはそれらの抗原性フラグメント、例えば、ヒトｈｓｐ６０配列の４３７〜４６０位に対応するｐ２７７と命名されたペプチド（ＰＣＴ特許公報ＷＯ９０／１０４４９）；６位および／または１１位のシステイン残基の一方または両方がバリンにより置換されているか、および／または１６位のＴｈｒ残基がＬｙｓによって置換されているｐ２７７ペプチドの変種（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１９２３６）；またはｐ１２およびｐ３２と命名された、ヒトｈｓｐ６０配列の１６６〜１８５位、および４６６〜４８５位にそれぞれ対応するもののような種々の他のペプチド（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１３７５）を用いて処置することができる。このｈｓｐ６０タンパク質は、依然はｈｓｐ６５と命名されていたが、より正確な分子量情報の観点から現在ではｈｓｐ６０と命名されており、どちらの命名によってもこのタンパク質は同じものであることに留意されたい。
適切なアジュバントでのｈｓｐ６０またはペプチドｐ２７７に対する免疫化は、免疫化がＴＨ１応答の引き金をひく場合には、ＩＤＤＭを誘導することが公知である（ＷＯ９０／１０４４９）。しかしながら、効果的なアジュバントのない、そして好ましくは免疫寛容を生じる担体を伴った、より好ましくはＴＨ２誘導活性担体を伴ったｈｓｐ６０またはペプチドｐ２７７によるワクチン接種は、ＩＤＤＭの自己免疫過程に対する耐性を生じることができる。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ；鉱物油）でのｐ２７７の皮下投与は、若いＮＯＤマウスでは疾患の進行の停止を（Elias et al., 1991）、１２−１７週齢のＮＯＤマウスでは進行したインスリン炎を導いた（Elias et al., 1994および1995）。ｐ２７７のヒト変種（Elias et al., 1994および1995）およびマウス変種（Birk et al., 1996a）は共に効果的であった。ＭＨＣクラスIIプロモーター上のマウスｈｓｐ６０遺伝子についてトランスジェニックなＮＯＤマウスは、ｐ２７７に対するそれらの自発的なＴ細胞増殖性応答のダウンレギュレーションを示し、有意な割合のマウスが糖尿病を発症しなかった（Birk et al., 1996b）。さらに、ｐ２７７のＣ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスへの投与は、初期に非常に低用量のβ細胞トキシンであるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を与えられたマウスにおける自己免疫糖尿病の発症を阻止した；これらのマウスのＧＡＤ６５分子のペプチドでの処置は効果的ではなかった（Elias et al., 1996）。そのようなｈｓｐ６０フラグメントの投与に用いるための好ましいＴＨ２誘導活性担体は、ある種の脂肪エマルジョン、例えば、IntralipidまたはLipofundin（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１３７３を参照）である。
さらに、ｈｓｐ６０および他のｈｓｐ分子に反応性のＴ細胞が、心臓の同種移植片から（Moliterno et al., 1995）、ならびに他の炎症性損傷から（Selmaj et al., 1991; Mor et al., 1992）単離された。したがって、抗−ｈｓｐ６０自己免疫性Ｔ細胞は炎症の部位に蓄積する。細胞溶解活性およびリンホカイン産生のような特徴を示す供与体特異的同種反応性Ｔリンパ球は、ｈｓｐ反応性Ｔ細胞が移植拒絶における炎症過程の免疫カスケードにおいてある役割を果たし得る場合に、移植拒絶を仲介すると考えられる（Moliterno et al., 1995）。
本発明者の研究室により、油中のペプチドｐ２７７の投与によるＩＤＤＭにおける自己免疫過程の効果的な処置は、いくつかの異なる抗原に対するＴＨ１型の自己免疫を阻止すること、およびその代わりにｐ２７７の自己免疫性をＴＨ２モードに活性化させることにおけるこの処置の効果により引き起こされるということが最近発見された。ＣＤ４「ヘルパー」型のＴ細胞は、活性化された場合にそれらが分泌する特徴的なサイトカインによりＴＨ１およびＴＨ２という２つの群に分けられる（Mosmann et al., 1989）。ＴＨ１細胞は、Ｔ細胞の増殖を誘導するＩＬ−２、および組織の炎症を仲介するＩＮＦ−γのようなサイトカインを分泌する。ＴＨ２細胞は、対照的に、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を分泌する。ＩＬ−４はＴ細胞がある種のＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌することを助け、そしてＴＨ１炎症性サイトカインの産生を抑制する（Abas et al., 1994）。ＩＬ−１０は、マクロファージによる抗原提示および炎症性サイトカインの産生に影響を及ぼすことによりＴＨ１の活性化を直接阻害する（Moore et al., 1993）。臓器特異的自己免疫疾患の病因に寄与するのはＴＨ１細胞である。ＴＨ１型の応答はまた、他のＴ細胞仲介性疾患または状態、例えば、接触皮膚炎（Romagnani, 1994）に関与しているようである。したがって、自己反応性のスペクトルを持つ疾患は、Ｔ細胞サイトカインシフトを誘導し得る単一のペプチドで阻止することができる。
移植は、現在では、臓器不全の特別な処置である。１９８０年代の間は、サイクロスポリンＡが、移植片の生存における著しい増加に役目を果たした。しかし、移植の利用は、依然として、手術後数日から数ヶ月以内に移植した組織を破壊する急性の免疫拒絶現象（宿主ｖｓ移植片拒絶、またはＨＶＧＲ）のため、かぎられている。ＨＶＧＲの制御および調節は、よりよい移植法の開発に非常に重要である。
成人患者における非特異的免疫抑制療法は、通常サイクロスポリンを介して、移植の時点で静脈内で開始され、一旦補給が寛容されると経口的に与えられる。典型的には、メチルプレドニゾンもまた移植時に開始され、次いで、維持用量に減少させられる。アザチオプリンもまた十分な免疫抑制を達成するためにプレドニゾンと共にしばしば用いられる。免疫抑制の目的は、移植片を保護することであるが、一般的な、または過度の免疫抑制は望ましくない合併症、例えば、日和見感染症および潜在的悪性疾患を導くこともある。免疫抑制剤の傷害性は用量依存的である。
ＨＶＧＲを低下させるか排除する手段は、当該分野で長く探索されてきた。拒絶過程の活力を低下させ、移植片を維持するのに必要な免疫抑制剤の用量を低下させることのできるいかなる方法も、当該分野では重要な進歩であろう。
本明細書中のいかなる文献の引用も、それらの文献が適切な先行技術であるか、あるいは本願の任意の請求項の特許性に対して重要な材料であるという承認を意図するものではない。いかなる文書の内容に関するいかなる記述も日付も出願人の出願時に利用可能な情報に基づくものであり、そのような記述の正しさに関する承認を構成するものではない。
発明の要旨
供与体の臓器または組織の移植受容体における移植片拒絶を抑制するかまたは予防する方法を提供することが本発明の目的である。
本発明は、熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０またはそれらのペプチドおよびアナログが、臓器または組織の移植前に受容検体に投与されると、ｈｓｐ６０に対する自己免疫がダウンレギュレーションされ、その結果移植された臓器または組織の移植片拒絶の予防または抑制に至るという知見に関する。
自己免疫疾患で観察されるｈｓｐ６０自己免疫が、移植片拒絶に関与しているかどうかについての実験において、本発明者らの研究室は、ｈｓｐ６０の発現が拒絶の間に受容体の皮膚においてアップレギュレーションされていることを示した。マウスにおける外来皮膚移植片の拒絶がさらに研究され、自己ｈｓｐ６０を過剰に発現しているトランスジェニック皮膚移植片は、この移植片が主要または非主要外来性組織適合性抗原のいずれかをも生じる場合には、正常マウスによって加速された拒絶を受けることを観察した。しかしながら、受容体マウスが、自己ｈｓｐ６０を構成的に過剰に発現する場合、それらは低下したｈｓｐ６０自己免疫性を示すだけでなく、外来性皮膚移植片の遅延した拒絶もまた示す。移植片の受容体は、それらのｈｓｐ６０自己免疫性がｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドおよびペプチドアナログの投与前に低下させられている場合に、外来性移植片を寛容するようになり得る。したがって、本発明者らは、自己免疫性が外来免疫性を調節し得るという驚くべき知見を得たのである。ｈｓｐ６０の自己免疫性が強化されると、外来免疫性および移植片拒絶もまた強化される；ｈｓｐ６０の自己免疫性が低下するかダウンレギュレーションされた場合、外来免疫性および移植片拒絶は抑制されるか予防される。
したがって、本発明は、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションを、移植片受容体において、臓器または組織の移植前に、あるいはそれらと同時に、あるいはその後に、好ましくはそれらの直前に引き起こすように移植片受容体検体を処置することにより、移植片拒絶を抑制するかまたは予防する方法を含む。
ｈｓｐ６０自己免疫性は、任意の公知の方法で、好ましくはＩＤＤＭの処置におけるｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションのための公知の手段によりダウンレギュレーションすることができる。したがって、ダウンレギュレーションはｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることができる化合物、例えば、ｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０のペプチドフラグメントまたはそれらのアナログ、塩または機能的誘導体を含む医薬組成物を投与することにより行うことができる。そのような化合物の例は、ヒトｈｓｐ６０（SEQ ID NO.1）およびSEQ ID NO.1の以下のアミノ酸残基：残基３１〜５０、残基１３６〜１５５、残基１５１〜１７０、残基１６６〜１８５、残基１９５〜２１４、残基２５５〜２７４、残基２８６〜３０５、残基３４６〜３６５；残基４２１〜４４０、残基４３６〜４５５、残基４３７〜４６０、残基４６６〜４８５、残基５１１〜５３０、残基３４３〜３６６および残基４５８から４７４である。用いられてもよいアナログの例は、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、およびSEQ ID NO.8のペプチドを含む。この化合物は、フロイント不完全アジュバントのような免疫寛容性担体で、あるいはＴＨ１→ＴＨ２シフトを誘導する生物学的に活性な担体、例えば、植物および／または動物起源のトリグリセリド１０％〜２０％；植物および／または動物起源のリン脂質１．２％〜２．４％；浸透圧調節物質２．２５％〜４．５％；抗酸化剤０％〜０．０５％；および滅菌水を含む脂肪エマルジョンで好ましくは投与される。
本発明はさらに、処置されるべき特定の個体におけるｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションするための最適なｈｓｐ６０ペプチドまたはアナログを選択するための手段に関する。その個体の血液から単離した末梢血リンパ球の抗原提示細胞を、個々のペプチドのパネルと接触させてもよい。このスクリーニングの結果得られたｈｓｐ６０免疫性に対して最適の効果を有するペプチドを、移植片拒絶を予防するためにこの特定の個体に用いるワクチンにとって最適の抗原として選択する。
ｈｓｐ６０、ｈｓｐ６０ペプチド、およびそれらのアナログ、塩ならびに機能的誘導体を、宿主におけるｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーション用の、および臓器移植における宿主ｖｓ移植片反応の重篤度のダウンレギュレーション用の医薬組成物の調製のために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
ＦＩＧ．１は、マウス皮膚におけるｈｓｐ６０の発現を示す。レーン１〜４はそれぞれ、同種異系ＮＯＤ（Ｈ−２g7）マウスへの移植１０日後に取り出したＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）皮膚の拒絶の間のｈｓｐ６０の発現を示す。レーン５〜８は、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスへの移植の１０日前のＢＡＬＢ／ｃ皮膚でのｈｓｐ６０の発現を示す。レーン９は、移植されなかったＥα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤ皮膚でのｈｓｐ６０の自発的発現を示す。レーン１０は、移植されなかった野生型ＮＯＤ皮膚でのｈｓｐ６０の発現を示す。
ＦＩＧ．２Ａ〜Ｆは、ｈｓｐ６０の発現が、同種間の皮膚の拒絶に影響を及ぼすことを、時間経過に伴う移植片の生存により測定して示す。皮膚移植片生存の統計的分析は、Wilcoxonテストを用いて行った。ＦＩＧ．２Ａは、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニック皮膚が野生型ＮＯＤマウスに移植された場合に拒絶されないことを示し、そしてＦＩＧ．２Ｂは、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックマウスが野生型皮膚を拒絶しないことを示す。ＦＩＧ．２ＣはＥα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤ皮膚（ひし形）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植された野生型ＮＯＤ皮膚（四角）と比較して、拒絶が加速されていることを示す（ｐ<０．０００１）。ＦＩＧ．２Ｄは、ＨＹ不適合の野生型雌ＮＯＤマウスに移植されたＥα−ｈｓｐ６０トランスジェニック雄ＮＯＤ皮膚の加速された拒絶を示す（ｐ<０．０３８）。ＦＩＧ．２Ｅは、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤマウス（Ｈ−２g7）による同種のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）皮膚の拒絶における遅延（ｐ＝０．００４）を示す。ＦＩＧ．２Ｆは、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックマウスによるＢＡＬＢ／ｋ ＣＨ−２ｋ皮膚の拒絶における遅延（ｐ＝０．００１）を示す。各群は１０〜１２匹のマウスを含んでいた。
ＦＩＧ．３Ａ〜Ｂは、ｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドによる処置が皮膚同種移植片の遅延した拒絶を誘導することを、時間経過にともなう移植片の生存により測定して示す。ＦＩＧ．３Ａおよび３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ６（Ｈ−２b）マウス（ＦＩＧ．３Ａ）または野生型ＮＯＤ（Ｈ−２g7）マウス（ＦＩＧ．３Ｂ）の、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）皮膚の移植の２週間前に背中に皮下投与されたｈｓｐ６０（不完全フロイントアジュバント；Sigma中５０μg）による処置の効果を示す（Elias et al., 1994; Elias et al., 1995）。組換えヒトｈｓｐ６０を記載されたように調製した（Elias et al., 1990）。対照マウスは処置しないか（白い四角）または５０μgの組換えグルタチオントランスフェラーゼを含む不完全フロイントアジュバント（白いひし形）で処置した。ｈｓｐ６０（黒い四角）および対照での処置との間の拒絶の違いは、Wilcoxon試験を用いて測定したところ、有意であった（ＦＩＧ．３Ａについてはｐ<０．０５、ＦＩＧ．３Ｂについてはｐ<０．０００１）。
ＦＩＧ．４は、ｈｓｐ６０ペプチドによる処置が、皮膚同種移植片の遅延した拒絶を誘導することを示す。野生型ＮＯＤ（Ｈ−２g7）マウスを、不完全フロイントアジュバント中の種々のｈｓｐ６０ペプチドで処置した。マウスｈｓｐ６０配列のペプチドは、記載どおりに合成し、精製した（Elias et al 1991）。ペプチドｐ１１の配列は、Val-Ile-Ala-Glu-Leu-Lys-Lys-Gln-Ser-Lys-Pro-Val-Thr-Thr-Pro-Glu-Glu-Ile-Ala-Gln（SEQ ID NO.11）であり、ペプチドｐ１２のそれは、Glu-Glu-Ile-Ala-Gln-Val-Ala-Thr-Ile-Ser-Ala-Asn-Gly-Asp-Lys-Asp-Ile-Gly-Asn-Ile（SEQ ID NO.9）である。ペプチド２７７は、以前に記載された（Elias et al 1991）Ｖ置換ヒトｐ２７７ペプチドVal-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp（SEQ ID NO.7）であり、マウスｐ２７７ホモログと交差反応性を示す（Birk et al 1996a）。対照マウスは処置しないか（白い四角）、５０μgのペプチドｐ１１（対照非免疫原性ｈｓｐ６０ペプチド）を含む不完全フロイントアジュバント（黒いひし形）で処置した。ｐ１２（黒い四角）またはｐ２７７（白い三角）および対照での処置との間の拒絶の違いは有意であった（ｐ<０．０００１）。各群は１０〜１２匹のマウスを含んでいた。
発明の詳細な説明
本発明は、ｈｓｐ６０自己免疫性が外来性免疫の加速物質として機能するという知見、およびｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションが移植片拒絶反応を抑制するかまたは予防するというさらなる知見に基づく。したがって、本発明による方法は、宿主ｖｓ移植片反応（ＨＶＧＲ）の力を低下させ、移植片を維持するために必要とされる免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンおよびプレドニゾンの用量の減少を可能にする。本発明の治療法は、好ましくは免疫抑制剤処置と同時に投与されるが、その薬の用量ははるかに低く、ほとんど副作用を引き起こさない。
ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションは、ＩＤＤＭまたは初期ＩＤＤＭの予防または処置のような他の適用については既に公知である。このような技術は、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ６０分子またはその変種のペプチドの、ｈｓｐ６０に対する寛容性を生じさせ、それによりｈｓｐ６０自己免疫攻撃をダウンレギュレーションするための寛容性担体との、あるいはＴＨ１→ＴＨ２シフトを仲介する生物学的に活性な担体との投与を含むことが知られている。ｈｓｐ６０の自己免疫性は、ＴＨ１型が支配的なｈｓｐ６０Ｔ細胞から、ＴＨ２型が支配的なｈｓｐ６０Ｔ細胞へのシフトが引き起こされた場合はいつでも、ダウンレギュレーションされ得る。したがって、そのようなＴＨ１→ＴＨ２シフトを引き起こすか仲介するそのようなワクチンにおける生物学的に活性な担体の使用は、そのようなｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーションを達成するために好ましい。
ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションのために当該分野で公知のもう一つの方法は、自己由来のＴ細胞のｈｓｐ６０またはそのペプチドまたは変種に対するex vivoでの活性化、およびその後それらを宿主に、該Ｔ細胞に対して生じるはずの免疫応答を引き起こすよう再投与し、その結果、抗ｈｓｐ６０Ｔ細胞自己免疫性を抑え、それによりｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションする。許可された米国出願第０８／１５１，０５２号を参照されたい。その全内容を参考として本明細書に組込む。
したがって、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションの多くの方法は既に公知であり、本発明は、それ自体、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションのそのような方法に対するものではない。本発明は、そのようなダウンレギュレーションが、移植の受容体に投与された場合に、移植片拒絶を予防するかまたは抑制するであろうという知見に対するものである。したがって、ｈｓｐ６０の自己免疫性ダウンレギュレーションを引き起こすいかなる技術も、移植受容体に用いられる場合には、移植の直前であろうと、同時であろうと、直後であろうと、包含されることが本発明により意図される。
ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションを引き起こす１つの好ましい方法は、ｈｓｐ６０タンパク質またはｈｓｐ６０ペプチドまたは変種を免疫学的物質として寛容性担体または生物学的に活性な担体と共に投与することである。ヒトｈｓｐ６０タンパク質配列は、SEQ ID NO.1であり、表１は、ｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションするであろうｈｓｐ６０のペプチドおよびペプチドアナログを列挙している。これらのペプチドおよびアナログはインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の自己免疫過程の予防または処置に有用であることが示されている（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１３７５参照）。表１に認められるｈｓｐ６０タンパク質およびｈｓｐ６０ペプチドは、ｈｓｐ６０自己免疫性および移植片拒絶をダウンレギュレーションする医薬組成物の一部として投与され得る免疫学的物質の限定のない例であることは当業者によって理解されるであろう。個々の移植片受容体に対して最適に用いられるタンパク質またはペプチド免疫学的物質の選択は、この章の後で考察する。
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特定されない限り、ヒトの配列が意図される。マウスｐ１２およびマウスｐ３８ペプチドは、マウスｈｓｐ６０タンパク質から誘導され、マウスｈｓｐ６０の残基１６８〜１８８、および５５６〜５７３にそれぞれ対応する。
移植片拒絶を予防するかまたは抑制するために投与される医薬組成物中で免疫学的物質として用いられるｈｓｐ６０タンパク質またはｈｓｐ６０ペプチドは、その塩および機能的誘導体、ならびに表１のペプチドＰ２７７で例示されるようなｈｓｐ６０ペプチドアナログを、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションに関してそのタンパク質またはペプチドの生物学的活性が維持される限り、含むことを意図する。
ｈｓｐ６０の変種ペプチドｐ２７７は、本明細書中では「ペプチドアナログ」というが、１つのトレオニン残基がリジン残基によって置換されるか、および／または１つまたは両方のシステイン残基がバリン残基によって置換されている場合、本発明者らの研究室では、以前に、ＩＤＤＭの処置としてのｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーションではｐ２７７と同等に活性であることが見出されていた。これらの同じペプチドアナログは、臓器または組織移植後の移植片拒絶を予防または抑制するために投与される場合、ｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションをすることが期待される。
本発明によって意図される本発明のｈｓｐ６０ペプチドの「塩」は、生理学的に受容可能な有機および無機の塩である。
本明細書中で用いられるｈｓｐ６０ペプチドの「機能的誘導体」は、残基上の側鎖として生じる官能基、Ｎ−またはＣ−末端基から、当該分野で公知の手段により調製され得る誘導体を含み、そしてそれらが薬学的に受容可能である限り、すなわち、それらがペプチドの活性を破壊せず、それを含有する組成物に毒性を賦与せず、さらに、それらの抗原性特性に不都合な影響を及ぼさない限り、本発明に含まれる。
これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応によって生じるカルボキシル基のアミド、アシル部分との反応によって形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）、またはアシル部分との反応により形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えば、セリル残基またはトレオニル残基のそれ）を含み得る。
ｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーション処置は、好ましくは、移植手術の直前に投与される。用語「直前」とは、そのような処置によって行われたｈｓｐ自己免疫性のダウンレギュレーションが宿主に依然として残っている間の時間、好ましくは、最適なダウンレギュレーションが移植の時間と一致するような時間と理解されることを意図する。ｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーション処置はまた、移植と同時かまたはその直後に投与されてもよい。用語「直後」とは、ｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーションが実質的な移植片拒絶の開始の前に起きるような時間を含む。
本発明において、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ６０ペプチドまたはそのアナログを、受容体におけるｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションのための免疫学的に活性な物質として含む医薬組成物の投与は、当該分野で公知の種々の経路、例えば、経口、鼻内、静脈内、筋肉内、または皮下を通じて行うことができる。投与の好ましいモードは静脈内であり、それは寛容性を誘導することが知られているし、経口または鼻内はＴＨ１→ＴＨ２シフトを誘導することが知られている。Wraith et al., 1995; Metzler et al., 1996; Metzler et al., 1995; Tian et al., 1996; Daniel et al., 1996; Weiner et al., 1994を参照されたい。ｈｓｐ６０タンパク質、はたはそのペプチドおよびアナログの好ましい用量は、臓器または組織の移植の前に、約１００μgから２５〜３０mgの範囲である。最適用量およびレジメは、ＴＨ１サイトカイン応答からＴＨ２サイトカイン応答へのシフトの測定により当業者によって決定することができる。
ｈｓｐ６０免疫学的物質を移植前に投与することが好ましいのであるが、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションのレベルに応じて、ｈｓｐ６０タンパク質、またはそのペプチドもしくはアナログのさらなる投与が、ｈｓｐ６０自己免疫性のレベルのさらなる低下またはダウンレギュレーションのために与えられてもよい。同様に、ｈｓｐ６０免疫学的物質に特異的で、ｈｓｐ６０免疫学的物質との接触によりin vitroで活性化されるＴ細胞によるワクチン接種もまたｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションし、移植後の移植片拒絶を抑制し得る。
ｈｓｐ６０免疫学的物質の投与は、従来の免疫抑制療法の投与と同時が好ましいが、ＨＶＧＲの重篤度の低下が従来の免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンおよびプレドニゾンの用量の低下を可能にするであろう。
移植片拒絶はｈｓｐ６０自己免疫性によって調節されることがわかり、臓器または組織移植に続くｈｓｐ６０自己免疫性の抑制または予防は、Ｔ細胞の寛容またはアネルギーには関連せず、むしろｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドに反応性の自己免疫性Ｔ細胞によって産生されるサイトカインのＴＨ１様プロファイル（ＩＬ−２、ＩＮＦγを産生する）からＴＨ２様プロファイル（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）へのシフトに関連している。ｈｓｐ６０タンパク質またはｈｓｐ６０ペプチドの投与の、これら免疫学的物質との反応性におけるＴ細胞増殖から抗体へのスイッチとの関連は、保護的効果が、処置された検体内で自己免疫性Ｔ細胞によって産生される支配的なサイトカインのシフトの結果であることを示している。ＴＨ１細胞はＩＬ−２を分泌するが、これはＴ細胞増殖を誘導し、ＩＦＮ−γのようなサイトカインは組織の炎症を仲介し、それにより移植された臓器または組織に対する炎症性応答に貢献している；ＴＨ２細胞は、対照的に、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を分泌する。ＩＬ−４はＢ細胞がある種のＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌するのを助け、ＴＨ１炎症性サイトカインの産生を抑制する。ＩＬ−１０は、マクロファージによる抗原提示および炎症性サイトカイン産生に影響を及ぼすことによって、間接的にＴＨ１活性化を阻害する。したがって、ＴＨ２細胞はＴＨ１活性を抑制する（Liblau et al., 1995参照）。ＴＨ１からＴＨ２様作用へのシフトは、ＩＤＤＭの処置としてのペプチドｐ２７７の使用においてその療法の前および後に産生された抗体のアイソタイプの分析により支持された。このＴＨ１→ＴＨ２シフトを増加させるいかなる同時の処置も本発明と組み合わせて用いることができる。
ｈｓｐ６０タンパク質の異なるエピトープは、異なる個体におけるｈｓｐ６０自己免疫性においてより重要であり得ることが予想される。例えば、異なるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型の個体は、異なるＨＬＡ分子を有していることが知られている。異なる型のＨＬＡ分子はそれぞれそれらの個々のペプチド結合モチーフを有している。したがって、本発明の好ましい実施態様においては、意図された受容体の自己由来の末梢血リンパ球を、ｈｓｐ６０ペプチドのパネルに対してスクリーニングし、どのペプチドがｈｓｐ６０自己免疫性に対して最適な効果を有しているかを見ることができる。ＭＨＣクラスII分子が長さ１２〜１５アミノ酸残基、最短で９アミノ酸残基のペプチドに結合すること、およびＭＨＣクラスＩ分子が７〜９アミノ酸残基のペプチドに結合することは当該分野ではよく確立されていることである。したがって、ｈｓｐ６０のペプチド、例えば、表１に示したようなものは、特定の個体受容体に、あるいは所定のＨＬＡ型の受容体に投与され得る１以上の最適なペプチドを決定するため容易にスクリーニングすることができ、ＴＨ２サイトカイン応答へシフトさせ、それにより彼／彼女の自分のｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることができる。最適なペプチドは、同じＨＬＡ型の異なる個体にとって同じ物であるべきである。
最終的には、ＨＬＡ分子のペプチド結合モチーフについてのより多くの知識により、クレフトに最も適合しそして提示されるペプチドはどれかという予測が可能になるであろう。そのときまで、以下の任意のもののようなスクリーニング技術を用いることができる。
個々のヒト受容体の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、当該分野で周知のようにFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離により全血から単離することができる。受容体のリンパ球の試料を、Mozes et al.，米国特許第５，３５６，７７９号に開示された方法に従ってスクリーニングされるべきペプチドへの結合について、あるいは、in vitroでのＴ細胞増殖とそれに続くＴ細胞サイトカイン応答について、特定の個体受容体に最適なまたは最適に近いｈｓｐ６０ペプチドを決定するアッセイによって試験することができる。本明細書中に参考として組込んだMozes et al.，米国特許第５，３５６，７７９号は、Ｔ細胞エピトープであるペプチドの、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離により全血から単離した末梢血リンパ球における、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）への直接結合を開示している。結合したＴ細胞エピトープの検出は、例えば、ペプチドエピトープに共有結合する蛍光プローブ（例えば、フィコエリトリンおよびそのアナログ）をモニターすることにより行われる。したがって、全長のｈｓｐ６０タンパク質からの７〜１５アミノ酸残基の長さの重複ペプチドのパネルを調製して、受容体のＡＰＣへの結合についてスクリーニングすることができる。最適に結合するものは、ｈｓｐ６０自己免疫性のダウンレギュレーションにおける特定の受容体に用いるのに好ましい。
このペプチドのパネルをスクリーニングする別の方法は、受容体のリンパ球をパネルのペプチドのそれぞれの存在下でのin vitro増殖について試験することか、あるいはそのようなペプチドによって引き起こされるＴＨ１→ＴＨ２シフトを試験することである。したがって、５〜５０μg/mlの濃度で試験ペプチドと一緒に培養されたＴ細胞の上清を、異なる時点で回収し、培地内に分泌された種々のサイトカイン、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４（これらは標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いてＥＬＩＳＡにより定量することができる）の活性について、あるいは、特定のクラスの抗体の存在について試験してもよい。
例えば、マウスではＴＨ１型のＴ細胞はＩｇＧ２ａクラスの抗体の産生を誘導するが、ＴＨ２型の抗体はＩｇＧ１クラスの抗体の産生を誘導する。ヒトの等価物は未だによく定義されていないが、一旦違いが確立すれば、ｈｓｐ６０免疫学的物質に対する抗体のアイソタイプについてのアッセイを用いて、ＴＨ１Ｔ細胞応答からＴＨ２Ｔ細胞応答へのシフトをモニターすることができる。例えば、ヒトでは、ＩｇＥアイソタイプはＴＨ２細胞によって誘導されることが知られている。
同様に、ＴＨ１細胞はＴ細胞増殖を誘導するサイトカイン、およびＩＦＮγのような組織炎症を仲介するサイトカインを分泌する。一方、ＴＨ２細胞は、β細胞がＩｇＧおよびＩｇＥクラスの抗体を分泌するのを助け、ＴＨ１炎症性サイトカインの産生を抑制するＩＬ−４、ならびにＴＨ１活性化を、マクロファージによる抗原提示と炎症性サイトカイン産生に影響を及ぼすことによって間接的に阻害するＩＬ−１０を分泌する。よって、in vitroで増殖したＴ細胞のサイトカインプロファイルの測定もまた、ＴＨ１ Ｔ細胞応答からＴＨ２ Ｔ細胞応答へのシフトの指標となろう。したがって、ＴＨ１→ＴＨ２シフトは、受容体のＴリンパ球の種々の試験ペプチドに対するin vitro応答を、最適なまたは最適に近いペプチドを決定することにおいてモニターするためのマーカーとして作用し得る。
抗体のアイソタイプのアッセイ、および種々のサイトカインの存在のアッセイのための特別な技術は、それ自体は本発明の新規な部分ではない。当業者は抗体アイソタイプの、およびＴＨ１およびＴＨ２のＴ細胞により産生される種々のサイトカインのアッセイのための種々の方法を承知している。本発明の過程では、そのような技術ならいかなるものを用いてもＴＨ１からＴＨ２へのシフトを検出することができる。本明細書中に示される例は、そのようにする例示的な方法を開示するが、本発明がそれに限定されることを意図するものではない。
ｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーションのために選択された技術がｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドまたはその変種の投与である場合、選択される担体またはアジュバントは、投与されるペプチドに対する寛容を生じさせるものか、あるいは活発にＴＨ１→ＴＨ２シフトを誘導するものでなければならない。そうでなければ、自己免疫応答は、実際にはアップレギュレーションされ得る。そのような公知の寛容性担体の例には、鉱物油担体、例えば、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む。ＩＦＡは、鉱物油のエマルジョンである。しかしながら、鉱物油は代謝されないものであり、人体によって分解され得ないのでヒトでの使用は許されない。
ＴＨ１→ＴＨ２シフトを増加させる生物学的に活性な担体は、本発明によると特に好ましい。ある種の脂肪エマルジョンは、何年もの間ヒト患者の静脈内栄養摂取のために用いられてきたが、本発明のペプチドを用いるペプチド療法用の生物学的に活性なビヒクルとしても作用し得る。そのようなエマルジョンの２つの例は、IntralipidとLipofundinとして知られる市販の脂肪エマルジョンである。「Intralipid」は、静脈内栄養摂取のための脂肪エマルジョンのKabi Pharmacia, Swedenの登録商標であり、米国特許第３，１６９，０９４号に記載されている。「Lipofundin」は、B.Braun Melsungen, Germanyの登録商標である。どちらもダイズ油を脂肪として含有している（蒸留水１，０００ml中１００または２００ｇ：それぞれ１０％または２０％）。卵黄リン脂質は、Intralipidでは乳化剤として（蒸留水１ｌあたり１２ｇ）、Lipofundinでは卵黄レシチンとして（蒸留水１ｌあたり１２ｇ）用いられている。等張性は、IntralipidおよびLipofundinへのグリセロールの添加（２５g/l）の結果である。これらの脂肪エマルジョンは非常に安定で、胃腸障害または神経障害の患者の静脈内栄養摂取に用いられてきており、それにより患者は栄養分を経口的に与えられなくてすみ、したがって、生命を維持するのに必要とされる栄養価を得る。静脈内栄養摂取の通常の一日の用量は一日１リットルまでである。
IntralipidとLipofundinは、移植片拒絶の抑制または予防のための処置として投与されるタンパク質またはペプチド免疫学的物質用の生物学的に活性な担体の好ましい例であるが、任意の薬学的に受容可能な担体、特に脂質担体はＴＨ１応答からＴＨ２応答へのシフトを引き起こし、本発明の医薬組成物において用いることができる。好ましくは、そのような生物学的に活性な脂質担体は、植物および／または動物起源のトリグリセリド１０〜２０％、植物および／または動物起源のリン脂質１．２〜２．４％、浸透圧調節物質２．２５〜４．５％、抗酸化剤０〜０．０５％、および滅菌水で１００％まで、を含む脂肪エマルジョンを含む。IntralipidとLipofundinは、この好ましい脂肪エマルジョンの最も好ましい例である。植物または動物起源のトリグリセリドおよびリン脂質は、任意の適切な植物油、例えばダイズ油、コットンシード油、ココナッツ油またはオリーブ油から誘導してもよいし、卵黄またはウシ血清から誘導してもよい。好ましくは、トリグリセリド／リン脂質の重量比は、約８：１である。
任意の適切な浸透圧調節物質を脂肪エマルジョンに添加してもよく、好ましくはグリセロール、キシリトールまたはソルビトールである。この脂肪エマルジョンは場合により抗酸化剤、例えば、０．０５％トコフェロールを含んでもよい。
本発明に用いてもよい好ましい生物学的に活性な担体は、ダイズ油１０％、卵黄リン脂質１．２％、グリセロール２．５％を含み滅菌水で１００ml（Intralipid１０％）にした脂肪エマルジョンである。別の実施態様においては、ビヒクルは、ダイズ油２０％、卵黄リン脂質２．４％、グリセロール２．５％を含み滅菌水で１００mlにした脂肪エマルジョンである。
別の好ましい実施態様においては、ビヒクルは、ダイズ油５％、および動物起源の別のトリグリセリド５％（例えば、バター由来の中くらいの鎖のトリグリセリド５％）、卵黄レシチン１．２％、グリセロール２．５％を含み蒸留水で１００ml（Lipofundin１０％）にした脂肪エマルジョンである。生物学的に活性な脂質担体のさらに別の好ましい実施態様においては、上で定義した脂肪エマルジョンは、遠心分離、例えば、１０，０００ｇ以上によりプロセスされ、それにより小さなトリグリセリドが豊富な（約９０％がトリグリセリド）層が、約１：１でトリグリセリド：リン脂質を含むリン脂質が豊富な水性分散物の上に形成され、この後者の水性分散物は本発明の医薬組成物で脂質ビヒクルとして用いられる。
本発明に用いられ得る脂肪エマルジョンは、好ましくは新しく調製された場合か、あるいは大気に触れていないコンテナ内で保存された後に用いられる。例えば、Intralipidを空気の存在下で長く保存すると、pHの低下と、それに対応する生物学的活性の低下を引き起こす。
ｈｓｐ６０自己免疫性ダウンレギュレーションが効果的であることは、宿主内でのＴＨ１→ＴＨ２シフトをモニターすることによりモニターしてもよい。これは、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１３７４に記載された方法で行ってもよく、その全体の内容を本明細書中に参考として組み入れる。
ここまで本発明を一般的に記載してきたが、同じことは例示の方法によって提供され、本発明の限定を意図していない以下の実施例の引用を通してさらに容易に理解されるであろう。本明細書中に記載される実施例は、皮膚の同種移植の生存のため科学的に受容されたマウスモデルにおける本発明の有効性を確立するものである。
実施例１：
ｈｓｐ６０に対する天然の自己免疫性は単に健康と適合性があるか、天然のｈｓｐ６０自己免疫性は実際に免疫系の機能に貢献しているのかを確立するため、本発明者らの研究室は、マウスｈｓｐ６０を主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスIIＥα分子プロモーターの指示下で過剰に発現するｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤマウスを開発した（Birk et al., 1996b）。これらのマウスは、多量のｈｓｐ６０を胸腺および体全体の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現し、その結果それらの自発的なｈｓｐ６０自己免疫性をかなり損失している。これらのトランスジェニックＮＯＤマウスにおける自発的な自己免疫性糖尿病の研究は、ｈｓｐ６０自己免疫性が自己β細胞の破壊にとって重要であることを示した（Birk et al., 1996b）。以下に示すように、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックマウスは、自己ｈｓｐ６０発現を豊富化した皮膚の供与体として、および外来性皮膚の受容体のいずれかとして活用されている。
本発明者らは、ｈｓｐ６０が拒絶された皮膚の同種移植片で過剰に発現されていること、およびＥα−ｈｓｐ６０トランスジェニックマウスではそのような過剰発現には同種移植片拒絶において機能的なＴＨ１仲介性の役割があることが示されていることを見出した。さらに、同種移植片の拒絶は、ｈｓｐ６０自己免疫性の治療的な調整により遅延、さらには予防することさえできる。これらの実験の結果を下に示す。
ＦＩＧ．１はマウスｈｓｐ６０の、同種宿主に移植された野生型マウス皮膚で拒絶を受けているもの（レーン１〜４）、または同系宿主に移植され寛容されているもの（レーン５〜８）における発現を示す。剃毛した皮膚を外科的に取り出し、ＴＥＮＮ緩衝液（５０mM Tris, pH８．０、５mM ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、１５０mM ＮａＣｌ）で溶解した。等量のタンパク質（５０μg、Bradford試薬、Bioradを用いて決定）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース紙（Towbin et al., 1979）に移し、１：５００希釈のｈｓｐ６０に特異的なモノクローナル抗体（Boog et al., 1992）であるＬＫ１を用いるウェスタンブロット分析およびＥＣＬ検出システム（Amersham, UK）に付した。レーン１〜４とレーン５〜８とを比較すると、拒絶のプロセスが野生型皮膚におけるｈｓｐ６０の発現を増加させることがわかる。したがって、拒絶のプロセスの標的におけるｈｓｐ６０の高くなった発現は、ｈｓｐ６０自己免疫性が移植片拒絶プロセスにおいてある役割を果たすことを可能にしているようである。
この疑問を探求するため、本発明者らの研究室は、トランスジェニックマウスを用いた。ＦＩＧ．１は、ｈｓｐ６０の発現が、野生型のＮＯＤ皮膚（レーン１０）においてと比べて、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤ皮膚（レーン９）で構成的に増加していることを示しており、それはおそらく、皮膚の樹状細胞におけるＭＨＣクラスIIプロモーターの活性化のためである（Kanpgen et al., 1991）。この構成的過剰発現の結果をＦＩＧ．２に示すが、皮膚１cm2切片を屠殺した供与体マウスの背中から切り出し、生理食塩水で洗浄した。１cm2の背中の皮膚のパッチを、Nembutal６mg/ml、マウス１匹当たり０．２５mlで処理した、麻酔した受容体マウスから取り出し、供与皮膚移植片で置換えた。Histoacryl（B.Braun Meleungen AG, D-34209 Melsungen, Germany）を、移植片の周囲に適用し、Nobecutan（ASTR, Astra Tech, POB 13, Gros G15, UK）をそれらの上に噴霧した。
ＦＩＧ．２Ａおよび２Ｂは、Ｅα−ｈｓｐ６０ＮＯＤトランスジェニック皮膚は、非トランスジェニックＮＯＤ受容体マウスに移植された場合には拒絶されないことを示している。したがって、ｈｓｐ６０トランスジェニック皮膚は外来の組織適合性抗原を、マウスｈｓｐ６０導入遺伝子の挿入の間に獲得しなかった；Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニック皮膚は依然として自己のものである。にもかかわらず、ＦＩＧ．２Ｃおよび２Ｄは、過剰に発現されたＥα−ｈｓｐ６０導入遺伝子が２つの異なる拒絶システムにおいて同種移植片拒絶を明らかに増大させていることを示している。ＦＩＧ．２Ｃは、ＭＨＣ障壁を超えた皮膚拒絶の加速を示し（同種のＢＡＬＢ／ｃ Ｈ−２dマウスに移植されたＮＯＤ Ｈ２g7皮膚）、拒絶の日数の中間値は２０日から１２日に減少している（ｐ<０．０００１）が、一方ＦＩＧ．２Ｄは、野生型雄皮膚の拒絶と比較した雄Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤ皮膚の雌ＮＯＤ受容体による拒絶の加速を示し、拒絶の日数の中間値は５５日から３０日に減少した（ｐ<０．０３８）。雄皮膚の同系雌マウスによる拒絶は、雄のＹ染色体によってコードされる非主要（minor）組織適合性抗原によって引き起こされる（Scott et al., 1995）。したがって、供与体トランスジェニック皮膚における自己ｈｓｐ６０の構成的な過剰発現は、主要でも非主要でも外来性の移植抗原に向けられた拒絶プロセスを増大させる。
ＦＩＧ．２Ｅおよび２Ｆは、受容体ＮＯＤマウスがＥα−ｈｓｐ６０導入遺伝子を持っており、したがってｈｓｐ６０自己免疫性を抑制する、逆の実験を示す（Birk et al., 1996b）。野生型ＮＯＤマウスと比較して、Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックマウスは、同種のＣ５８ＢＬ／６（Ｈ−２b）皮膚移植片（ＦＩＧ．２Ｅ）の拒絶の日数の中間値を２０日にまで（ｐ＝０．００４）、ＢＡＬＢ／ｋ（Ｈ−２k）皮膚移植片（ＦＩＧ．２Ｆ）を１０日まで（ｐ＝０．０００１）遅延させたことは明らかである。ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）およびＢＡＬＢ／ｂ（Ｈ−２b）皮膚の拒絶もまた著しく遅延した（それぞれｐ＝０．００１、ｐ＝０．０１５）が示していない。したがって、低下した抗ｈｓｐ６０自己免疫性を持つマウスは、低下した同種移植片拒絶反応を表す。
本発明者らの研究室は、以前に、ｈｓｐ６０自己免疫性を、野生型ＮＯＤマウスで（Elias et al., 1990; Elias et al., 1991; Elias et al., 1994; Elias et al., 1995）、および他の系統で（Elias et al., 1996）、マウスの皮下への、鉱物油（不完全フロイントアジュバント；ＩＦＡ）でエマルジョン化した全ｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドの治療的なワクチン接種により調整することができることを見い出していた。調整の機序（Elias et al., 1996）は、ｈｓｐ６０に対するＴ細胞応答の表現系における前炎症性ＴＨ１型から抗炎症性ＴＨ２型への応答のシフトが関与しているようである（Finkelman et al., 1990）。
ＦＩＧ．３Ａ〜３Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）皮膚の移植の２週間前の、野生型ＮＯＤ（Ｈ−２g7）受容体マウスの、またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウスのワクチン接種が皮膚の同種移植片拒絶における遅延を引き起こしていることを示す。ＦＩＧ．３Ａでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは自発的な自己免疫性疾患に罹っていることが知られていない系統で、ｈｓｐ６０によるワクチン接種後もＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片の著しく長くなった生存を表していることがわかる（ｐ<０．０１）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＩＦＡのみまたは対照組換え抗原グルタチオントランスフェラーゼによりワクチン接種されたが、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚の長くなった生存は表さなかった。ＮＯＤマウスもまた、対照組換え抗原によるワクチン接種と比べて、ｈｓｐ６０ワクチン接種後にＢＡＬＢ／ｃ同種皮膚の遅延した拒絶を表すことがＦＩＧ．３Ｂでわかる（ｐ<０．０００１）。ＦＩＧ．４は、ＮＯＤマウスをｈｓｐ６０ペプチドでワクチン接種することも同種ＢＡＬＢ／ｃ皮膚の生存を引き伸ばすことを示している（ｐ<０．００１）。ｈｓｐ６０ペプチドｐ１２およびｐ２７７は、処置されないマウスに比べて効果的であることがわかる。対照的に、ＮＯＤマウスにおいて免疫原性でないペプチドｐ１１は、皮膚同種移植片の生存を引き伸ばさなかった。ＮＯＤマウスの、自己ｈｓｐ６０とは交差反応性ではないマイコバクテリウムのｈｓｐ６０の免疫原性ペプチドによる処置もまた、皮膚同種移植片の生存を引き伸ばさなかった（示していない）。したがって、ｈｓｐ６０または種々のｈｓｐ６０ペプチドによるワクチン接種は、以前に自発的なｈｓｐ６０自己免疫性を調整することが示されたが（Elias et al., 1990; Elias et al., 1991; Elias et al., 1994; Elias et al., 1995; Elias et al., 1996）、外来性の皮膚の拒絶を著しく阻害することができる。
ＦＩＧ．１に示すように、移植反応のストレスは、野生型の非トランスジェニック皮膚においてさえｈｓｐ６０発現をアップレギュレーションする。ｈｓｐ６０および他のｈｓｐ分子に対して反応性のＴ細胞は、心臓の同種移植片から（Moliterno et al., 1995）ならびに他の炎症性の障害から（Selmaj et al., 1991; Mor et al., 1992）単離されている。したがって、抗ｈｓｐ６０自己免疫性Ｔ細胞は炎症の部位に蓄積する。ｈｓｐ６０の供与体Ｅα−ｈｓｐ６０皮膚における構成的な過剰発現は、その部位で抗ｈｓｐ６０自己免疫性Ｔ細胞の活性化を増幅し、プロ炎症性（ＴＨ１型）サイトカイン、例えばＩＮＦγ（Finkelman et al., 1990）の同種移植片反応への付加により局所的な免疫応答を強化し、それにより外来性抗原に応答性の他のＴ細胞を刺激し扇動すると理論付けられる。逆に、活性化されてＴＨ２型の抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１０を産生するｈｓｐ６０自己免疫性Ｔ細胞は、傍観者の抑制という形態により、エフェクター免疫応答を静止するために働くはずである（Weiner et al., 1994）。ｈｓｐ６０ペプチドによる処置がサイトカイン応答を改変し得るかを試験するため、ＮＯＤまたはＣ５７ＢＬマウスをｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドｐ１２で処置した。対照マウスは処置しないか、またはＩＦＡでエマルジョン化した生理食塩水で処置した。これらのマウスにＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を移植し、２０日後、対照マウスで移植片拒絶が始まったばかりのときに、５〜１０匹のマウスを屠殺して、それらの脾臓細胞を、個々に、標準的な混合リンパ球反応物（ＭＬＲ）内で照射を受けたＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を刺激物質として用いてアッセイした（Lohse et al., 1990）。ＭＬＲ培養物をチミジンの取り込みによりＴ細胞増殖について試験し（Lohse et al., 1990）、処置した群と対照群との間で有意な差は見られなかった。しかしながら、ＭＬＲ培地はＴＨ１サイトカインであるＩＦＮγおよびＴＨ２サイトカインであるＩＬ−１０の存在についても試験された。対照マウスのＴ細胞は９．２５±１．７ng/mlのＩＦＮγを産生し、一方ｈｓｐ６０およびｐ１２で処置したマウス由来のＴ細胞はわずかに３．１３±１．４ng/mlのＩＦＮγしか産生していないことが見出された（ｐ＝０．００２）。ＩＦＮγの減少とは対照的に、処置したマウスはＩＬ−１０の増加した産生を示した；対照マウスでは３．５±０．６ng/mlであったのに比べて８±１．４ng/mlであった（ｐ＝０．００４）。したがって、ｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドでのワクチン接種によって誘導された皮膚同種移植片の生存の延長は、ＭＬＲの間に分泌されたin vitroでのＩＦＮγの減少とＩＬ−１０の増加に関連していた。Ｅα−ｈｓｐ６０トランスジェニックＮＯＤマウスが、ｈｓｐ６０に対するそれらのＩＦＮγ（ＴＨ１）応答における特異的な減少を示すこともまた見出された。これらの知見は、ｈｓｐ６０自己免疫性による同種移植片反応の調整は、特異なサイトカイン産生によって仲介され得ることを示唆している。しかし、その機序に関わりなく、この結果は、ｈｓｐ６０自己免疫性が外来性抗原への、強いまたは弱い、応答にとって重要であり得るということを示している。したがって、ｈｓｐ６０に対する、およびおそらくは免疫学的ホムンクルス（homunculus）���登録された他の天然の自己抗原に対する天然の自己免疫性には調節的役割がある。
理論的考察を超えて、ｈｓｐ６０自己免疫性を操作することには実際的な利点があり得る。本発明者らの研究室は、天然のｈｓｐ６０自己免疫性が、ｈｓｐ６０ペプチド−細菌糖結合体（Konen-Waisman et al., 1995）の使用を介して、貧弱な免疫原性細菌性抗原に対する応答のためにＴ細胞の助けを誘導するために活用され得ることを、他の場所で示した。したがって、ｈｓｐ６０に対する自己免疫性のアップレギュレーションは感染と戦うのを助けることができる。本発明は、天然のｈｓｐ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることが、移植片拒絶を妨げることに有用であることを確立した。
ここまで本発明を十分に説明してきたが、同じことを幅広い範囲の等価なパラメーター、濃度、および条件で、本発明の意図および範囲を逸脱することなく、また過度の実験を要することなく行い得ることは、当業者により理解されるであろう。
本発明はその特定の実施態様に関連して説明されてきたが、更なる改変が可能であることが理解されるであろう。この出願は、一般的に、本発明の原則に従って本発明のいかなる変更、使用、および適応化をも含むこと、および本発明が属する分野において知られたまたは習慣的な実施に入るような、および添付の請求の範囲の範囲内の以下に説明するようなこれまでの本明細書中の実質的な特徴に当てはまるかもしれない本発明の開示からの逸脱を含むことを意図している。
雑誌の論文または要旨、公開されたかまたは対応する米国または外国特許出願、発行された米国および外国特許を含む本明細書中に引用された全ての参考文献、または他のいかなる参考文献も、全て本明細書中に参考として組込まれ、引用文献に表された全てのデータ、表、図、および文章も含まれる。さらに、本明細書中に引用された参考文献中に引用された文献の全ての内容もまた、本明細書中に参考として組込まれる。
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法または従来の方法への言及は、いかなる場合も、本発明のいかなる局面、記載または実施態様も、関連する分野で開示され、教示され、または示唆されているという承認ではない。
特定の実施態様のこれまでの記載は本発明の一般的な特徴を十分に明らかにしたので、当該分野の能力内の知識（本明細書中に引用された参考文献の内容を含む）を適用することにより、過度の実験なく、また本発明の一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施態様を種々の適用のために、容易に改変および／または適応させることができる。したがって、そのような適応化および改変は、本明細書中に表された教示および指針に基づいて、開示された実施態様の等価物の意味および範囲内にあることを意図する。本明細書中の専門語または用語は、説明を目的としたものではなく、また限定を目的ともしていない。そのため、本明細書の用語または専門語は、本明細書中に表された教示および指針を考慮して、当業者の知識を組み合わせて、当業者により解釈されるものである。
参考文献
0004256474.tif 000003
0004256474.tif 000004
配列表
（1）一般情報:
（i）出願人:コーエン，イルン・アール
バーク，オハド
（ii）発明の名称:宿主ｖｓ移植片反応の重篤度をＨＳＰ６０自己免疫性をダウンレギュレーションすることにより低下させる方法
（iii）配列の数: 11
（iv）通信宛先:
（A）名宛人:ブラウディ  アンド  ニーマーク  ピー.エル.エル.シー.
（B）通り:セブンスストリート419，エヌ.ダブリュ.，スィート 300
（C）市: ワシントン
（D）州: ワシントン特別区
（E）国: アメリカ合衆国
（F）郵便番号: 20004
（v）コンピューター読み取り形態:
（A）媒体タイプ: フロッピーディスク
（B）コンピューター: IBM PC互換機
（C）オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア: PatentIn Release #1.0，バージョン #1.30
（vi）現出願のデータ:
（A）出願番号: US
（B）出願日:
（C）分類:
（viii）代理人情報:
（A）氏名:ブラウディ，ロジャー・エル
（B）登録番号: 25,618
（C）整理番号: COHEN=32
（ix）通信情報:
（A）電話番号: 202-628-5197
（B）FAX番号: 202-737-3528
（2）SEQ ID NO: 1の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 573アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: タンパク質
（xi）配列: SEQ ID NO: 1:
0004256474.tif 000005
0004256474.tif 000006
0004256474.tif 000007
0004256474.tif 000008
（2）SEQ ID NO: 2の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 2:
0004256474.tif 000009
（2）SEQ ID NO: 3の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 3:
0004256474.tif 000010
（2）SEQ ID NO: 4の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 4:
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（2）SEQ ID NO: 5の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 5:
0004256474.tif 000012
（2）SEQ ID NO: 6の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 6:
0004256474.tif 000013
（2）SEQ ID NO: 7の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 7:
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（2）SEQ ID NO: 8の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 24アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 8:
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（2）SEQ ID NO: 9の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 20アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO: 9:
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（2）SEQ ID NO:10の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 18アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:10:
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（2）SEQ ID NO:11の情報:
（i）配列の性質:
（A）配列の長さ: 20アミノ酸
（B）配列の型: アミノ酸
（C）鎖の数: 一本鎖
（D）トポロジー: 直鎖状
（ii）配列の種類: ペプチド
（xi）配列: SEQ ID NO:11:
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0004256474.tif 000021
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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