(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物における微生物数測定方法において検量線を作成する方法であって、
１）１つの測定対象物の微生物数を変化させた試料を検量線作成に適する数だけ調製する工程、
２）得られた試料それぞれにおける、二酸化炭素濃度、溶存酸素量、インピーダンス、およびＡＴＰよりなる群から選択される所定のパラメーターを測定し、同時に対応する試料それぞれにおける微生物数を定量する工程、および
３）測定した所定のパラメーターと微生物数を定量して得られた微生物数とを相関させて、検量線を作成する工程、を含む方法。
【請求項２】
第１工程において、測定対象物を常温または低温にて保存することにより微生物数を増加させ、あるいは冷凍保存することにより微生物数を減少させ、それにより測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いて微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いて微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈し、次いで希釈物それぞれを該測定対象物の均質化液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第２工程において、微生物数を定量する手段が標準平板菌数測定法である、請求項１から４までのいずれか記載の方法。
【請求項６】
第２工程において、所定のパラメーターの測定を微生物数測定装置によって行う、請求項１から５までのいずれか記載の方法。
【請求項７】
微生物数測定装置が酸素電極を利用し溶存酸素量を測定する装置である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１工程において、酸素電極を利用し溶存酸素量を測定する装置によって、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象物における微生物数測定方法において検量線を作成する方法に関し、詳細には検量線作成に適した試料の調製工程を包含する検量線作製方法、その方法を包含する微生物測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食肉、野菜、乳製品等の食材の衛生管理を達成するため、食材に含まれる微生物数を測定することが要求されている。そして、この要求を満足するため、食材検体を培養することにより、微生物の呼吸量を測定して微生物数を求める方法（特開昭５６−１４０８９８号公報）、微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める方法（特開昭６３−１５１５０号公報）、微生物の代謝物を溶液中のインピーダンスを測定することで微生物数を求めるインピーダンス法、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用してＡＴＰを特異的に測定するＡＴＰ−バイオルミネッセンス法（ＡＴＰ法）等が提案されている。
いずれの方法においても、食材検体における微生物数を測定するには、検量線を作成しなければならない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
食材それぞれに対応した高精度の検量線を得るには、微生物数が幅広い範囲に散らばった食材を検体として測定するのが望ましい。そのためには種々の食材を選定することにより微生物数が幅広く変動している試料を調製し、得られる検量線の相関係数が高くなるまで食材選定を繰り返す。しかし、通常の無処理の食材では一般に微生物数が揃っていることが多い。そこで、特定の微生物の組合せのみを食材に添加し、微生物数の範囲を広げて検量線を作成するのが一般的である。しかしながら、食材中の微生物数を微生物の代謝物から換算する微生物数測定方法、例えば溶存酸素測定法またはインピーダンス法等では、食材における固有の条件、例えば存在する菌の菌相、食材の栄養分、香辛料や防腐剤等の増殖妨害成分の有無等により、菌の増殖速度や代謝量が異なってくるため、微生物を食材に添加する一般的な方法はこれら微生物数測定方法には不向きである。
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、食材の微生物数を所望の程度の範囲に変動させる簡便な手法を見出し、本発明の検量線作成方法を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、測定対象物における微生物数測定方法において検量線を作成する方法であって、
１）測定対象物の微生物数を変化させた試料を検量線作成に適する数だけ調製する工程、
２）得られた試料それぞれにおける所定のパラメーターを測定し、同時に対応する試料それぞれにおける微生物数を定量する工程、および
３）測定した所定のパラメーターと微生物数を定量して得られた微生物数とを相関させて、検量線を作成する工程、を含む方法に関する。
別の態様として、本発明は本発明の検量線作成方法を行うための、あるいは包含する微生物測定装置に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の検量線作成方法は、測定対象物の微生物数を変化させた試料を調製する第１工程、試料における所定のパラメーターを測定し、同時に対応する試料における微生物数を定量する第２工程、および測定した所定のパラメーターと微生物数を定量して得られた微生物数と相関させて、検量線を作成する第３工程を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
【０００６】
第１工程
本発明において、測定対象物とは微生物数測定が行われ得る対象物であり、典型的には肉、野菜、海産物、総菜、乳製品等の食材、医薬品、化学製品等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、試料とは、測定対象物にストマッキング、ホモジナイズ等の均質化処理を施し、その処理物を抽出して得られる液体物等の、抽出液由来の材料を意味する。
従って、微生物数を変化させた試料とは、測定対象物を均質化した液状物等の材料であって、一定の処理によりその数が変動されたものを意味する。この試料には、以下で説明する処理により微生物数が変動された材料を、測定対象物を均質化した液状物等の抽出液に添加して調製される試料も包含される。
【０００７】
本発明において、試料において微生物数を変化させる手法は次の通りである。
第１の手法として、測定対象物を常温または低温にて保存することにより微生物数を増加させ、あるいは冷凍保存することにより微生物数を減少させ、それにより測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製することができる。
この手法によれば、理想の微生物数域の試料を取得することができる。
この場合、測定対象物が食肉であれば、低温でも充分に微生物数が増加し、常温ではその程度が著しいため、４℃付近にて１日ないし１週間程度保存する。通常の加工食品、例えば加熱処理済みの総菜や乳製品等の場合、常温にて保存する。微生物数が多い測定対象物、例えばレバー等の場合、冷凍して微生物数を減少させる。食肉において、１週間の冷凍保存で微生物数が１桁減少した実験例等もある。
【０００８】
第２の手法として、測定対象物を均質化した液状物を用いて微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製することができる。
この手法は第１の手法により微生物数を増加させることが困難である場合に有効である。
微生物の増殖方法としては、標準平板菌数測定法（平板法）、液体培養法にて微生物数を増加させるのが、通常である。平板法の場合、例えば、測定対象物をホモジナイズした液状物を通常の培地、例えば標準寒天培地を入れたシャーレ上に塗沫後、３５℃４８時間培養し、生成したコロニーの微生物の種類および量の割合になるように所定のコロニーから釣菌し、それを生理食塩水にて順次希釈した希釈液を作製し、微生物数を変化させた試料とする。
この手法は、希釈液を加える均質化した液状物に既に大量の微生物が存在する場合には添加する希釈液の微生物が誤差程度の意味合いしか持たなくなるので、測定対象物における初期微生物数が少ない場合に適している。
【０００９】
第３の手法として、第２の手法により調製した希釈液をそれぞれ測定対象物を均質化した液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製することができる。
該希釈液を、測定対象物を均質化した液状物に添加することにより、測定対象物における固有の条件、例えば食材の栄養分、香辛料や防腐剤等の増殖妨害成分の有無等が反映された微生物の増殖環境を設定することができる。
【００１０】
第２工程
第２工程は、第１工程により得られた試料それぞれにおける所定のパラメーターを測定し、それと同時に対応する試料それぞれにおける微生物数を定量する工程である。
第１工程により得られた試料の所定のパラメーターの測定は通常、酸素電極法によって溶存酸素濃度を測定し、またはインピーダンス法によって行われる（有害微生物管理技術、第二巻／製造・流通環境におけるエンジニアリングとＨＡＣＣＰ、ｐ４７２）。
ここで用いられる酸素電極法は、本出願人と同一の出願人であるＰＣＴ／ＪＰ００／０２３０５に詳細に説明されている。
微生物数の定量とは、実際の微生物数を測定することであり、通常標準平板菌数測定法（平板法）を用いて行う。
微生物数を定量するために平板法を用いる場合、対応する均質化した液状物を生理食塩水で希釈し、通常３段階の１０倍希釈液を作製し、それを平板法に付す。同時に所定のパラメーターを測定する。
【００１１】
第３工程
第３工程は、測定した所定のパラメーターと微生物数の定量によって得られた微生物数とを相関させて、検量線を作成する工程である。
検量線は好ましくは、相関係数ｒ＝０．７５以上であり、微生物数域１０２〜１０７ＣＦＵ／測定対象物１ｇ内で微生物数が４オーダー以上にわたるプロットである（例えば１０３〜１０６）。プロット数は１０〜５０を目安とし、数多くプロットするのが好ましい。
所定のパラメーターの測定により得られた結果と微生物数を定量して得られた結果から最小二乗法により回帰曲線を求め、それにより検量線が作成される。
【００１２】
本発明の第２工程において、所定のパラメーターの測定は通常用いられている微生物数測定装置によって行うことができる。ここに、微生物数測定装置とは、微生物の呼吸量を二酸化炭素濃度の測定により微生物数を求める装置、微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める装置（ダイキン環境研究所製ＤＯＸ、以下ＤＯＸと略称する）、微生物の代謝物を溶液中のインピーダンスを測定することで微生物数を求める装置、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用してＡＴＰを特異的に測定する装置等が包含される。
【００１３】
微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める装置（ＤＯＸ）を用いて本発明の検量線作成方法を行う場合、その微生物測定のチャートは図１に、検量線作成方法の概念図は図２によって説明できる。
ＤＯＸを用いた場合、本発明の検量線作成方法は次の通りに行う。
第１工程において、測定対象物を常温または低温にて保存することにより微生物数を増加させ、あるいは冷凍保存することにより微生物数を減少させ、それにより測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する場合、図３に示すチャートに沿って微生物数を測定する。
また、第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する場合、図４のチャートに沿って微生物数を測定することができる。
さらに、第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより調製した希釈液をそれぞれ測定対象物の均質化液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する場合、図５のチャートに沿って微生物数を測定することができる。
【００１４】
また、微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める装置または微生物の代謝物を溶液中のインピーダンスを測定することで微生物数を求める装置を用いる場合、第１工程において行う、測定対象物の微生物数を変化させた試料の作製をその装置自体によって行うことができる。
即ち、増殖微生物を適宜希釈して試料を作製するに当たり、その微生物の増殖を装置によって行うのである。
【００１５】
ＤＯＸを用いた場合、装置により微生物増殖を行い、検量線を作成する本発明方法は次の通りに行う。
第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸによる測定終了後の液を取りだす。ここでのＤＯＸ測定では、定量化された結果は出ないが、大まかな菌数が分かり、例えば菌数がゼロと判明すれば、その後の工程は不要となる。得られた液を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する。ＤＯＸは電極セル中にて微生物を液体培地とともに増殖させるため、このような手法が可能となる。この場合、図６のチャートに沿って微生物数を測定することができる。この場合、最短１日にて試料を作製できる。この手法によれば、平板法により微生物数を増加させる場合に比べ、微生物の混合比が実際の微生物相に近くすることができる。
また、第１工程において、測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸによる測定終了後の液を取りだし、該液を適宜希釈することにより調製した希釈液をそれぞれ測定対象物の均質化液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を作製する場合、図７のチャートに沿って微生物数を測定することができる。この場合も、最短１日にて試料を作製できる。この手法によれば、平板法により微生物数を増加させる場合に比べ、微生物の混合比を実際の微生物相に近くすることができる。
【００１６】
実際に測定対象物に対して検量線を作成するためのプロトコルを図８に示す。図８において、▲１▼は、従来から行われている同類多種の試料を用いる標準平板菌数測定法（平板法）である。ここでは同じ測定対象物を最低３種類用いて検量線を作成する。▲２▼は、測定対象物を所定の条件により保存して微生物数を増加、減少させる図３に示すチャートによる測定である。▲３▼は、測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈する図４のチャートによる測定である。▲４▼は、▲３▼において適宜希釈した希釈液を測定対象物の均質化液状物に添加する図５のチャートによる測定である。▲５▼は、測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸにより微生物を増殖させ、適宜希釈する図６のチャートによる測定である。▲６▼は、▲５▼において適宜希釈した希釈液を測定対象物の均質化液状物に添加する図７のチャートによる測定である。
【００１７】
別の局面として、本発明は、本発明の検量線作成方法を行うための、あるいは包含する微生物測定装置を提供する。
本発明方法を包含する微生物測定装置とは、微生物の呼吸量を測定して微生物数を求める装置、微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める装置、微生物の代謝物を溶液中のインピーダンスを測定することで微生物数を求める装置、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用してＡＴＰを特異的に測定する装置等である。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００１９】
実施例１
以下の実施例中、食材としては牛肉および鶏肉をそれぞれ使用し、検量線を作成した。微生物数測定装置としては微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定して微生物数を求める装置（ＤＯＸ、株式会社ダイキン環境研究所）を用いた。
作成法▲１▼
作成法▲１▼は、従来から通常行われている、手を加えていない同類多種の試料を用いる検量線作成方法である。
食材１０ｇと生理食塩水９０ｍｌをホモジナイザー用検体バッグ（０．９８％塩化ナトリウム溶液を含有）に入れ、プロメディアＳＨ−００１（エルメックス）によって１分間ホモジナイズした。
微生物の呼吸による溶存酸素の減少量を測定するため、得られた均質化液状物１ｍｌとＤＯＸ専用培地（液体培地１Ｌ中、酵母エキス：２．５ｇ、ペプトン：５．０ｇ、ブドウ糖：１．０ｇ）１ｍｌを電極付きセルに注入し溶存酸素濃度を計測した。平板法で微生物数を定量するためにホモジナイズして得た均質化液状物１ｍｌ、それを10倍に希釈したもの１ｍｌ、１００倍に希釈したもの１ｍｌをそれぞれシャーレに分注後、寒天培地を混釈し、３５℃で４８時間培養して微生物数をカウントした。
この作業を、６種の牛肉と６種の鶏肉について行った。
測定結果をプロットし、最小二乗法で回帰曲線を求めて検量線とした。得られた結果を図９および図１０に示す。
【００２０】
作成法▲２▼
作成法▲２▼は、測定対象物を所定の条件により保存して微生物数を増加、減少させる図３に示すチャートによる測定である。
作成法▲１▼における手法と同様にして、食材１０ｇと生理食塩水９０ｍｌを１分間ホモジナイズした。
ＤＯＸ測定用にホモジナイズした均質化液状物１ｍｌとＤＯＸ専用培地１ｍｌを電極セルに投入し計測した。平板法で微生物数を定量するためにホモジナイズして得た均質化液状物１ｍｌ、それを１０倍に希釈したもの１ｍｌ、１００倍に希釈したもの１ｍｌをそれぞれシャーレに分注後、寒天培地を混釈し、３５℃で４８時間培養して微生物数をカウントした。
上記測定に使用した残りの食材を４℃で２４、４８時間保存後同様の作業を行った。正確な検量線を得るためには濃度域が異なる多くの試料での測定が望ましく、２４時間後で貯蔵前より多少増菌した試料を、４８時間後でかなり増菌した試料を得た。これら３点での計測結果から精密な１本の検量線が得られる。
測定結果をプロットし、最小二乗法で回帰曲線を求めて検量線とした。得られた結果を図９および図１０に示す。
【００２１】
作成法▲３▼
作成法▲３▼は、測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈する図４のチャートによる測定である。
作成法▲１▼における手法と同様にして、食材１０ｇと生理食塩水９０ｍｌを１分間ホモジナイズした。得られた均質化液状物０．１ｍｌを寒天平板に塗沫した。
２４時間後に、寒天平板上の適当なコロニーから微生物を白金耳で釣菌し、生理食塩水に懸濁させた。
懸濁液を９段階に１０倍段階希釈し、それぞれ１ｍｌとＤＯＸ専用培地１ｍｌを電極付きセルに注入しＤＯＸで測定した。
同様に平板法で微生物数を定量するために懸濁液を１００万倍に希釈したもの０．１ｍｌを寒天平板に塗沫し、３５℃で４８時間培養して微生物数をカウントした。なおＤＯＸ測定にはそれぞれの濃度の懸濁液から２〜３検体を測定するが、微生物数を定量するための平板は最低濃度の懸濁液のみ計測し、残りは希釈倍率から計算する。
測定結果をプロットし、最小二乗法で回帰曲線を求めて検量線とした。得られた結果を図９および図１０に示す。
【００２２】
作成法▲５▼
作成法▲５▼は、測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸにより微生物を増殖させ、適宜希釈する図６のチャートによる測定である。
作成法▲１▼における手法と同様にして、食材１０ｇと生理食塩水９０ｍｌを１分間ホモジナイズした。
ＤＯＸ測定用に均質化液状物１ｍｌとＤＯＸ専用培地１ｍｌを電極付きセルに注入し計測した。
計測終了後、電極付きセル内の溶液を９段階に１０倍段階希釈し、それぞれ１ｍｌと液体培地１ｍｌを電極付きセルに注入しＤＯＸで測定した。
同様に平板法で微生物数を定量するために電極付きセル内の溶液を１００万倍に希釈したもの０．１ｍｌを寒天平板に塗沫し、３５℃で４８時間培養して微生物数をカウントた。
なおＤＯＸ測定にはそれぞれの濃度の懸濁液から２〜３検体を測定するが、微生物数を定量するための平板は最低濃度の測定液のみ計測し、残りは希釈倍率から計算する。
測定結果をプロットし、最小二乗法で回帰曲線を求めて検量線とした。得られた結果を図９および図１０に示す。
【００２３】
作成法▲６▼
作成法▲６▼は、作成法▲５▼において適宜希釈した希釈液を測定対象物の粉砕処理均質化液状物に添加する図７のチャートによる測定である。
作成法▲１▼における手法と同様にして、食材１０ｇと生理食塩水９０ｍｌを１分間ホモジナイズした。
ＤＯＸ測定用に得られた均質化液状物１ｍｌとＤＯＸ専用培地１ｍｌを電極セルに注入し計測した。
計測終了後、電極付きセル内の溶液を９段階に１０倍希釈し、それぞれ１ｍｌと液体培地１ｍｌを電極付きセルに注入しＤＯＸで測定した。
同様に平板法で微生物数を定量するために電極付きセル内の溶液を１００万倍に希釈したもの０．１ｍｌを寒天平板に塗沫し、３５℃で４８時間培養して微生物数をカウントする。
なおＤＯＸ測定にはそれぞれの濃度のサンプル液から２〜３検体を測定するが、微生物数を定量するための平板は最低濃度のサンプル液のみ計測し、残りは希釈倍率から計算する。
測定結果をプロットし、最小二乗法で回帰曲線を求めて検量線とした。得られた結果を図９および図１０に示す。
上記各方法により得られた検量線を示す図９および図１０により、従来から行われている作成法▲１▼に比し、いずれの方法も良好な相関計数を示すことが明らかである。
【００２４】
【発明の効果】
本発明は、食材の特性を含めた高精度の検量線を簡便に作成する方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＤＯＸを用いて本発明の検量線作成方法を行うに当たり、その微生物測定を行うチャート図である。
【図２】  ＤＯＸを用いて本発明の検量線作成方法を行う概念図である。
【図３】  測定対象物を常温または低温にて保存することにより微生物数を増加あるいは冷凍保存することにより微生物数を減少させ、測定対象物の微生物数を変化させた試料を用いた、ＤＯＸによる検量線測定方法のチャート図である。
【図４】  測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を用いた、ＤＯＸによる検量線測定方法のチャート図である。
【図５】  測定対象物を均質化した液状物を用いて平板法により微生物を増殖させ、増殖した微生物を適宜希釈することにより調製した希釈液をそれぞれ測定対象物の均質化液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を用いた、ＤＯＸ装置による検量線測定方法のチャート図である。
【図６】  測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸによる測定終了後の液を取りだし、該液を適宜希釈することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を用いた、ＤＯＸによる検量線測定方法のチャート図である。
【図７】  測定対象物を均質化した液状物を用いてＤＯＸによる測定終了後の液を取りだし、該液を適宜希釈することにより調製した希釈液をそれぞれ測定対象物の均質化液状物に添加することにより、測定対象物の微生物数を変化させた試料を用いた、ＤＯＸによる検量線測定方法のチャート図である。
【図８】  検量線を作成するためのプロトコルである。
【図９】  食材として牛肉を用いた場合の各種方法により作成した検量線である。
【図１０】  食材として鶏肉を用いた場合の各種方法により作成した検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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