(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞におけるプロモーターに影響する物質の同定方法であって、
a) 前記真核細胞は、プロモーターの制御下に抗生物質耐性遺伝子とレポーター遺伝子との融合遺伝子を含むことよりなり、当該融合遺伝子の発現物質が真核細胞に毒性を有しかつ前記プロモーターの活性が前記抗生物質の不存在下でスイッチオフされるDNA構築物を有する細胞であって、当該真核細胞を前記抗生物質遺伝子に対応する抗生物質を含む培地でインキュベートし、
ｂ）前記a）工程でインキュベートした細胞を、前記抗生物質を欠いた培地に接種し、
ｃ）前記ｂ）工程から得た細胞を接種した培地を約５時間ないし約１００時間インキュベートし、
ｄ）前記レポーター遺伝子の発現が、同定しようとする物質の不存在下においてそのレポーター遺伝子の発現量が決まることを検査し、
e）前記の同定しようとする物質を、前記ｃ）工程から得た真核細胞を有する培地に添加し、
ｆ）前記真核細胞および前記の同定しようとする物質を含有する培地を約１日間ないし約５日間インキュベートし、
ｇ）前記ｆ）工程で得た真核細胞が前記の同定しようとする物質の存在下で前記レポーター遺伝子の発現量が決まることを検査し、および
ｈ）前記の同定しようとする物質の存在下での発現量を、前記ｄ）工程において当該物質の不存在下における発現量と比較する（ここで、前記の同定しようとする物質の存在下での発現量の増加は当該物質が前記真核細胞におけるプロモーターに影響を有することを意味する）、
の各工程を含んでなることを特徴とする真核細胞におけるプロモーターに影響する物質の同定方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ構築物をプラスミドまたはウイルス中に有する請求項１記載の同定方法。
【請求項３】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターよりなる群から選択されたものである請求項１記載の同定方法。
【請求項４】
前記耐性遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子よりなる群から選択されたものである請求項１記載の同定方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子がＧＦＰ、ＬａｃＺおよびルシフェラーゼよりなる群から選択されたものである請求項１記載の同定方法。
【請求項６】
前記真核細胞が細胞株Ｕ８７−ＨＧＦＰ（ドイツ、ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺにおいて、ブタベスト条約に基づいて２０００年１１月１９日に、ＤＳＭ  ＡＣＣ２４７３として寄託されている）である請求項１記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は真核細胞において分化を誘導する物質を同定する方法、上記方法で用いるDNA構築物、プラスミド、ウイルスおよび細胞株、ならびに同定された物質を用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
幹細胞からの細胞の分化は胚発達中の一般的な生体現象であるだけでなく、成体器官の再生プロセス(例えば皮膚の再生、造血、腸管上皮の再生、中毒またはアルコール濫用後の肝再生など)にも極めて大きな役割を果たす。重要な生体プロセスはいずれについても損なわれれば慢性疾患を引き起こしたり、死に至ったりすることがある。
【０００３】
腫瘍形成の際、常にというわけではないが極めて頻繁に細胞の「逆」分化が見られ、すなわち細胞が未分化の胚状態に戻る。腫瘍性疾患の早期診断および治療方法が著しく向上したにもかかわらず、死亡率はなお極めて高く、罹患患者の苦しみは大きい。よって、新規かつより効果的な癌薬剤(細胞増殖抑制剤)を発見、開発することは健康政策にとって特に重要なことであり、医薬産業の見通しからも薬剤市場に極めて大きな成長の可能性を持っている。
【０００４】
正常な健康細胞から腫瘍細胞へ過程で多くの遺伝的改変が起こることから、基本的に腫瘍細胞の代謝に干渉し、ひいては成長や伝播を阻害する様々な可能性もある。このように最大級の細胞増殖抑制は細胞DNAの損傷をもたらす。これは細胞分裂の後に致死的突然変異、すなわちプログラムされた細胞死(アポトーシス)の引き金を引く直接の結果としての細胞死を引き起こす。これは旺盛に増殖しているあらゆる細胞、すなわち腫瘍細胞だけでなく健康な増殖細胞にも影響を及ぼす。
【０００５】
もう1つの細胞増殖抑制剤種としては、旺盛に増殖している細胞の代謝を停止させる代謝拮抗物質がある。第3の細胞増殖抑制剤種は分裂中の細胞の、いわゆる紡錘体を損ない、それにより細胞分裂を阻害するか、直接細胞を死滅させる。比較的新しい第4の種としては、腫瘍細胞の、それら自身への供給のための新しい血管を誘導する能力に干渉する抗脈管形成物質がある。
本発明に関する比較的新しい種の細胞増殖阻害剤は、腫瘍形成中に部分的にスイッチオフされていた遺伝子の発現パターンに干渉するものである。これらの多くはいわゆる腫瘍抑制遺伝子および分化遺伝子である。上記遺伝子の新たな誘導および発現は通常、癌細胞の増殖の優位性を弱め、また、免疫系が上記細胞を攻撃しやすいようにする。
【０００６】
かかる分化誘導物質がいわゆる「CpGアイランド」のメチル化状態に干渉するということは長年知られていた。GpGアイランドは特に遺伝子の5'調節配列でよく見られ、遺伝的インプリンティング、すなわち父系遺伝子発現と母系遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす。プロモーターに存在するGpGアイランドをメチル化することで遺伝子をスイッチオフすることができる。マウスのノックアウトモデルで見られるように、主としてメチル化をつかさどるDNAメチラーゼが不活性であれば、発達の致死的破壊が起こる。
【０００７】
従って、現在では、胚形成におけるメチル化と脱メチル化には遺伝的に制御された平衡状態が存在すると推測されている。腫瘍細胞ではこの平衡の混乱がしばしば存在する。このように、例えば多くのタイプの腫瘍で低メチル化誘導物質5'-アザシチジン(Aza)が強力な細胞増殖抑制剤として働くことから、CpGアイランドのメチル化によって腫瘍抑制遺伝子のプロモーターをスイッチオフすることが可能であることが分かっている。
【０００８】
分化にとって重要なもう1つの機構として、ヒストンのアセチル化の影響がある。ヒストンは染色質の構造を調節して遺伝子発現に影響を及ぼしうるDNA結合タンパク質である。これは好ましくは例えばアセチル化またはリン酸化による上記ヒストンの生化学的修飾を介して起こる。そして、トリコスタチンA(TSA)という物質がヒストンデアセチラーゼの特異的阻害剤として知られている。最近、ヒストンH4の脱アセチル化が染色質凝縮をもたらし、それにより遺伝子発現を抑制することができることが示された。従って、TSAによりヒストンの脱アセチル化を阻害することで染色質の脱凝縮をもたらし、それにより遺伝子発現の抑制を解除することができる。
【０００９】
腫瘍細胞がそれらにとって有害な分化遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現をスイッチオフするために使用できる未知の機構としてまだ多くのものがあると考えなければならない。
いくつかのタイプの細胞増殖抑制剤ではすでに、新規な化合物の同定にも使用できる極めて良好なアッセイ系がありながら、上記のように、分化を誘導しうる物質を同定する方法はない。しかしながら、この新規なタイプの細胞増殖抑制剤は腫瘍の制御に極めて有効であり、かつ、従来の細胞増殖抑制剤よりも不随する副作用が実質的に少ないことから特に注目されるものである。
【００１０】
DNAの損傷を引き起こし、従って細胞増殖抑制剤として使用できる可能性のある物質を同定するには以下の汎用in vitro試験系が利用できる：エームス試験その他のネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)試験(STY)は細菌における物質の変異原性に基づくものであり、SOSクロモテストは遺伝的毒性剤による細菌のSOS系の誘導に基づくものである。両試験とも匹敵する感度を持つが、物質の遺伝的毒性作用が細菌やより高等な生物によって様々であるという基本的な欠点を持っている。
【００１１】
このため、コメットアッセイとしても知られる単一細胞ゲル試験(SCG試験)である小核試験および姉妹染色体交換試験(SCE試験)が開発された。文献では、重金属誘導性メタロチオネインプロモーターの制御下にlacZ遺伝子を含む細胞株A4/4が記載されている。著者らは、このプロモーターは培養中はスイッチオフされているが、脱メチル化物質5'-アザシチジンによって再び誘導することができると報告している(Biard et al., 1992)。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、DNA傷害剤を同定するためにこれまで知られているアッセイ系は、その機構が全く異なっているため、分化を誘導する物質を同定する目的では適切でない。
Biard et al., (aoc. cit. loc.)により記載されているレポーター細胞株は誘導系であるという決定的な欠点を持つ。物質の脱メチル化作用は同時にプロモーターのインデユーサーを用いる場合にしか可視化できない。著者らはカドミウムおよび亜鉛などの重金属によって誘導されるメタロチオネインプロモーターを選択した。遺伝子発現を誘導する重金属自体は何百と文献に示されている。結果として、この系に必要な重金属の遺伝子発現誘導作用はいくつかの物質の脱メチル化作用を重ね合わせたものであり、すなわち、非特異的、偽陰性または偽陽性結果が非常に出やすい。これらの細胞株は脱メチル化物質を発見すべく作り出されたものである。これらの物質は分化を誘導しうるが、上記に説明したようにその能力を持つ物質のみに限ったことではない。1992年以降、この細胞株に関するそれ以上の刊行物はないので、この細胞株が安定かどうかも、同様に他の分化プロセスの検出にも適切かどうかも分からない。
【００１３】
上記の点で、本発明の目的は分化を誘導する物質を迅速、簡便かつ信頼性のある方法で同定するために使用できる、はじめに記載したタイプの方法、およびその方法で使用できる補助物質を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この目的はプロモーターの制御下に融合遺伝子を含んでなるDNA構築物によって達成され、この融合遺伝子は少なくとも1つの耐性遺伝子と少なくとも1つのレポーター遺伝子を含んでなり、上記DNA構築物でトランスフェクトされた宿主細胞に対してやや毒性があり、これにより、例えば栄養培地に適当な抗生物質が含まれていない際に、トランスフェクトされた宿主細胞の増殖に耐性遺伝子の発現が必要でない場合は上記プロモータースイッチオフされる。
【００１５】
本発明はさらに、このようなＤＮＡ構築物を有するプラスミド、上記ＤＮＡ構築物を含む、またはそれをコードする発現カセットを有するウイルス、すなわちＤＮＡウイルスまたはレトロウイルス、および真核細胞、特に上記プラスミドで安定トランスフェクトした、または上記ウイルスを感染させたヒト細胞、特に２０００年１１月９日にＤＳＭＺ（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）にて受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２４７３としてブダペスト条約に従って寄託された細胞株Ｕ８７−ＨＧＦＰ、ならびに真核細胞において分化を誘導する物質を同定するために、上記ＤＮＡ構築物、および／または上記プラスミド、および／または上記ウイルス、および／または上記細胞を用いる方法に関する。
【００１６】
この目的はさらに、
a)耐性遺伝子に相当する選択物質を含有する培地でこの新規な細胞をインキュベートし、
b)上記選択物質を欠いた培地に工程a)のインキュベート細胞を接種し、このインキュベート細胞を約5ないし約100時間、好ましくは約24時間インキュベートし、
c)上記工程b)の細胞の培地に同定しようとする物質を添加し、さらに約1ないし約5日間、好ましくは約2日間インキュベートし、さらに
d)工程b)の細胞と比較して、工程c)のインキュベート細胞のレポーター遺伝子発現が上昇したかどうかを確認する
工程を含んでなり、真核細胞において分化を誘導しうる物質を同定する方法によって達成される。
【００１７】
本発明は分化を誘導する物質の同定に関する問題を完全に解決するものである。
この点で、プロモーターはCMVプロモーター、RSVプロモーター、腫瘍抑制遺伝子の細胞プロモーターおよび分化遺伝子のプロモーターから選択し、レポーター遺伝子はGFP、LacZ、ルシフェラーゼから選択し、耐性遺伝子はハイグロマイシン遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、および／または例えばそれ自体やや毒性があるGFPまたはそれぞれプロドラッグとしての5'-フルオロシトシンおよびガンシクロビルを毒性物質に変換するシトシンデアミナーゼもしくはチミジンキナーゼなど、宿主細胞に有毒な作用を発現しうるポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を含有する融合遺伝子を選択するのが好ましい。
【００１８】
この細胞株はまた、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター(CMVプロモーター)の制御下に融合遺伝子を含む。このプロモーターは通常、先行技術のメタロチオネインプロモーターとは対照的に、細胞中で極めて強力であるので誘導する必要がない。さらにまた、このプロモーターは特にin vivoにおいて、ある特定の条件下でスイッチオフできることが知られている。
この融合遺伝子は抗生物質ハイグロマイシン(hygro)耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質(GFP)からなる。神経膠芽腫細胞株U87をこの構築物でトランスフェクトし、抗生物質ハイグロマイシンを用いて選択したところ、U87-HGFPが得られた。この細胞株は抗生物質の存在下で融合遺伝子を発現し、これはGFPの蛍光に基づき、蛍光顕微鏡下で極めて明瞭に確認される。この抗生物質数日間で除去すれば、この融合タンパク質は細胞に対してやや毒性があるので、細胞はCMVプロモーターをダウンレギュレートする。本発明者らが観測したように、上記融合タンパク質は特定の細胞コンパートメント(おそらくはER)に集積する。この細胞を極めて低濃度の分化誘導物質5'-アザシチジンおよび／またはトリコスタチンAで処理すると、わずか2日以内にGFP蛍光の増強によって確認できるCMVプロモーターの極めて強力なアップレギュレーションが生じる。
【００１９】
これまでに分化誘導物質がCMVプロモーターとハイグロマイシンGFPの融合物からなる発現ユニットを用いて検出できるという細胞株は記載されたり、知られたりしていない。この系は極めて信頼性の高いものであり、この細胞株の通常培養下にハイグロマイシンが存在すればこの発現ユニットの欠損は避けられる。この細胞株はハイグロマイシンを除去した後数日だけ実質的に完全にCMVプロモーターをダウンレギュレートする固有の能力を有する。このプロモーターは分化誘導物質を添加すると再びアップレギュレートされる。
【００２０】
公知の系に比べた場合の利点としては、とりわけ、（Ｉ）ハイグロマイシン耐性遺伝子による正の選択性（すなわち、この発現ユニットは抗生物質を添加すると安定して維持される）、（ＩＩ）負の選択性（すなわち、ハイグロマイシンＢの不在下ではＧＦＰ遺伝子の毒性作用が、プロモーターをスイッチオフする細胞を選択する）、（ＩＩＩ）ＧＦＰの固有蛍光による同定性といった複数の特性を組み合わせた融合遺伝子を用いることである。これらの特性によってこの系は極めて安定かつ信頼性の高いものとなる。
【００２１】
この系は処理する分化物質以外にはインデューサーを必要としないことから、インデューサーによる妨害や重ね合わせが影響することはない。
この系は脱メチル化だけでなくヒストンのアセチル化を見出しうることが分かっている。
レポーターとしてGFPを用いると、生細胞および固定細胞のいずれであってもプロモーター活性、ひいては分化誘導物質の作用を観測することが可能となり(蛍光顕微鏡)、かつ、フローサイトメトリーの手段によってそれを正確かつ再現性よく定量することが可能となる。
【００２２】
この新規な方法では、プロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、腫瘍抑制遺伝子または分化遺伝子の細胞プロモーター）、レポーター（ＧＦＰ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ）と融合させた選択マーカー（ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、および「毒性」遺伝子（例えば、ＧＦＰ、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ）からなる他のレポーター発現ユニットを用いることもできる。
【００２３】
シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼはさらに、それぞれ致死的ではないが毒性がある濃度のプロドラッグ5'-フルオロシトシンおよびガンシクロビルが必要となる。これはプロモーターをダウンレギュレートする細胞を選択する。
これらの構築物はまた、U87以外の細胞株においてトランスフェクトしてもよいし、あるいはこの研究はin vivo、すなわちトランスジェニック動物で行ってもよい。
【００２４】
細胞株U87-HGFPは特に、短時間内に信頼をもってプロモーターがスイッチオフできるという利点を有する。さらにまた、この方法は自動化可能であり、短時間に多くの物質をスクリーニングすることが可能となる。
この細胞株は腫瘍細胞であるというさらなる利点を有し、従ってモデル系のみならず、同時に試験系でもある癌細胞に関して物質を検討できる。もう1つの利点として、これらの細胞は適当な物質を添加することで分化し、これが形態的変化によって観察できるということである。
【００２５】
従って、このようにして同定された物質はダウンレギュレートされたプロモーターを再活性化できるだけでなく、癌細胞を分化へ向かわせることもできるので、可能性のある細胞増殖抑制剤となる。
このような背景に対し、本発明はまた、悪性および良性の腫瘍性疾患を治療するための医薬組成物を調製することを目的として、この新規な方法によって同定された物質を使用する方法、およびこの新規な方法と、同定された物質を医薬上許容される担体と混合することを含んでなる医薬組成物の調製方法に関する。
【００２６】
さらなる利点は説明および添付の図面から明らかになる。
上記またはさらに以下で説明する特徴は各事例に示されている組合せだけでなく、本発明の範囲を逸脱しない限り、他の組合せやそれら単独でも使用できることは明らかである。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施形態および添付の図面をもとに説明する。
図１
5'-アザシチジンおよびトリコスタチンAによるH-GFP遺伝子の増幅を蛍光顕微鏡によって検出したものを示す。カバースリップ上で増殖中のU87 H-GFP細胞を5-アザシチジン(0.5〜2.5〜20μM)およびトリコスタチンA(0.1〜1μM)で48時間処理した。処理細胞で処理しなかったものに比べ、H-GFP遺伝子の増幅による緑色蛍光シグナルの増強が見られた。親細胞は蛍光顕微鏡によって観察するに十分強いシグナルは見られなかった(データは示されていない)。画像は全て400倍である。
図２
種々の濃度の5-アザシチジンおよびトリコスタチンAを用いて48時間処理した後に得られたU87 H-GFP細胞および親細胞でのFACS蛍光プロフィールを示す。1〜2×105細胞のU87 H-GFPおよび親株を6ウェルプレートに播種し、5-アザシチジンおよびトリコスタチンAで48時間処理した後、下記のようにフローサイトメトリーで分析した。ヒストグラムはいずれも、横座標は蛍光強度を表す任意のログスケールに相当し、縦座標は細胞数を表す。各曲線は総数2×104細胞に相当し、重なりの部分で濃いプロフィールは未処理細胞に相当し、薄いものは処理細胞に相当する。
【００２８】
プロフィール(a)〜(e)：U87 H-GFP。2.5、20μM Azaおよび1μM TSAで蛍光強度の高い方へのシフトが明らかに見られ、一方、0.5μM Azaおよび100nM TSAの曲線では未処理細胞のシフトを完全に抑制する。
プロフィール(f)〜(l)：U87。特に20μM Azaおよび1μM TSAを用いた場合に小さなシフトが見られるが、これはプラスミドにより生じたバックグラウンドの増強であると考えられ、蛍光顕微鏡によっては観察できない。
図３
(A)は種々の最終濃度の5-アザシチジンで48時間処理したU87親株およびH-GFPを示す。U87 H-GFPは2.5μM Azaですでに蛍光強度の平均値に2倍の増強を示す(非処理細胞と比較)。このレポーター細胞株は20μM Azaを用いた場合には3倍の増強を示す。最高濃度を用いた場合にのみU87親株の蛍光強度平均値におよそ2倍の増強が得られる。
【００２９】
(B)はトリコスタチンAによるH-GFP遺伝子発現の増強を示す。各細胞株およそ105細胞ずつを種々の最終濃度のトリコスタチンAとともに48時間培養した。ヒストグラムが示しているように、U87 H-GFPで1μMおよび3μM TSAを用いた場合には蛍光強度平均値に3倍および4倍の増強が得られた(非処理細胞と比較)。
両ヒストグラムとも、全ての平均値、標準偏差、およびP値は、2つの異なる独立した実験から得られた少なくとも5つの異なる値(n=5)から導き出したものである。P値は全て非処理細胞をさす。
【００３０】
(Cの上)は5-アザシチジンおよびトリコスタチンAの異なる2種類の組合せによる処理を示す。2種類の細胞株(105細胞／ウェル)をAzaおよびTSAの2種類の異なる組合せの存在下で48時間培養した。いずれの場合にも、U87 H-GFPでは蛍光強度平均値に3倍の増強が見られた(非処理細胞と比較)。しかし、この違いはこの2種類の異なる薬剤の組合せで処理したU87 H-GFPに関する増強と比べると有意ではない(p=0.09)。
【００３１】
(Cの下)はそれぞれ単独、および組み合わせたトリコスタチンAおよび5-アザシチジンを示す。105細胞のU87 H-GFP細胞株を200nM TSA、1μM Aza、および両者の組合せで48時間処理した。この2種類の薬剤それぞれ単独で処理した場合、蛍光強度平均値におよそ2倍の増強が得られる(P〜109および<10-4、非処理細胞と比較)。この2種類の薬剤の組合せを用いた場合は、それぞれ単独の薬剤を用いた場合に比べて蛍光強度に小さいが有意な増強が得られた(P-0.02)。
【００３２】
平均値、標準偏差、およびP値は2つの独立した実験で得られた10個の値(n=10)に基づくものである。
図4
それぞれ5μM 5-アザシチジンで48時間処理した、または処理しなかったU87 H-GFPおよび親株のFACS分析によって得られたドットプロットを示す。両細胞株とも5μM Azaの存在下で培養維持した。2日後、記載のように細胞種浮きを調べた。10,000細胞を分析した。FACS分析による細胞周期の調査方法を以下に示す。
【００３３】
[IおよびII]は処理細胞および非処理細胞のDNA染色を示したドットプロットを示す。(2N+4N)核の母集団を正確に定義するために(R1)領域を用いた。[IIおよびV]はDNAへのBrdUの組み込みを示したドットプロットを示す。FL3-Aの蛍光の直線スケール上の値200および400は核内の2Nおよび4N DNAの量に相当する。示されているものは全てR1領域に相当する。[IIIおよびVI]はBrdU組み込みのドットプロットの象限を確率するためのイソタイプ対照を示す。抗イソタイプ抗体は非特異的結合を示し、抗BrdU抗体の負の対照として用いた。このBrdU組み込みのドットブロットを用いて種々の細胞周期相にある細胞のパーセンテージを求めた(象限：左下の領域=G1〜G0期；右下の領域=G2期；左上の領域=S期；右上の領域=M期)。
図5
実験に用いたプラスミドpCMV-HygroEGFPを示す。
1)pCMV-HygroEGFPのクローニング
pScriptpolyAと呼ばれる中間プラスミド1(3595bp)：
出発プラスミドcCRScript SK(+) AmpR+をEcoRVおよびHindIIIで切断した後、pTKneo由来の625bp HSVチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルを含むSmaI/HindIIIと連結(平滑末端連結)。
【００３４】
中間体2：pCMVA(4260bp)
pL15TK由来の670bp hCMVプロモーター断片(PstIで切断し、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化)をSrfIで切断した中間体I pScriptpolyAに挿入。
中間体3：pCMV-EGFP(4975bp)
BamHI/NotIで切断したプラスミドpEGFP(Clontech)由来のEGFPリーディングフレーム(クレノウポリメラーゼを用いて末端を埋めたもの)をPstIで開環したベクターpCMVA(中間体2、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化)に連結(平滑末端連結)。
【００３５】
最終のpCMV-HygroEGFP(6052bp)
pTkHygro由来のハイグロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する1026bpのPCR断片(このPCRによって停止コドンは除去)をAgeIで開環したベクターpCMV-EGFP(クレノウポリメラーゼを用いて末端を埋めることで平滑末端化)へ連結(平滑末端連結)。
このプラスミドは図5に示されている。
2)材料および方法
細胞株
U87 H-GFPはプラスミドpCMV-hygroEGFPで安定トラスフェクトした後のヒト神経膠腫細胞株U87に由来する細胞株である。ゲノムDNAに組み込まれるこのプラスミドはPCR-Script(商標)(Stratagene)に由来し、ヒトCMVプロモーターの下流に融合遺伝子を有している。この融合遺伝子は増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードする遺伝子に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。結果として得られた遺伝子(H-GFPと呼ばれる)はハイグロマイシンBに対する耐性を付与し、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー分析によって容易に検出できるタンパク質をコードしている。これに対し、親細胞株U87はいずれのプラスミドも含まず、負の対照として使用できる。
【００３６】
U87 H-GFPおよび親株U87は、5%CO2を含む加湿雰囲気下、37℃にて10%ウシ胎児血清(Seromed)、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび1μg/mlのアンフォテリシンB(Gibco, BRL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM、低グルコース、Gibco, BRL)中で培養した。U87 H-GFP細胞株については、培地に600単位/mlのハイグロマイシンB(Calbiochem)を添加した。
U87 H-GFPおよび親細胞をハイグロマイシンBを含まないD-MEMを用い、6ウェルプレート(Nuclon, NUNC)中、1〜2×105細胞/mlで播種し、接着させるために24時間インキュベートした。その後、培地に種々の最終濃度(Azaは2.5-5-10-20-40μM、TSAは10nMから3μM)で5-アザシチジンおよびトリコスタチンA(Sigma Chemicals, Co.)を添加した。処理から2日後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー分析を行った。
【００３７】
蛍光顕微鏡観察
各細胞株およそ105細胞をポリリジンコートカバースリップ上に播種し、種々の濃度のAzaおよびTSAで48時間処理した後、室温で30分間、5%ホルムアルデヒドで固定した。その後、蛍光顕微鏡(Axiophot, Zeiss, Germany)下で全てのサンプルを分析し、種々の最終濃度の各薬剤に対応する様々な画像を記録した(図1)。
ハイグロマイシン-EGFP融合遺伝子発現細胞のフローサイトメトリー分析
FACS分析用のサンプルを調製するため、細胞を37℃、6ウェルプレートにて、0.5mM EDTA(Gibco, BRL)を含有する0.05%トリプシン中で5分間インキュベートした後、2容量の培地を加えることでトリプシンの作用を停止させた。この細胞を回収し、500xgで5分間遠心分離し、1mlの完全D-EMEに再懸濁させた。死細胞を染色するため、ヨウ化プロピジウム(最終濃度10μg/ml)を各サンプルに加えた。次に細胞を再び遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1×, pH7.4)に再懸濁させた後、それらをFACSにより分析した。
【００３８】
細胞はFACScalibur(Becton Dickinson)を用い、およそ500度数/sに相当する流速で分析した。
細胞の母集団を正確に定義し、細胞屑や凝集物を除くため、ドットブロットにて目的領域を設定した(SSCと比較したFCS)。ヨウ化プロピジウムの2パラメーターヒストグラムにおいて、前方角光散乱(FSC)と比較することで死細胞を識別した。個々の細胞の蛍光強度は対数で測定し、各対数ヒストグラムは2×104度数表す。蛍光強度平均値(MFI)とは各細胞集団で蛍光強度の増強を定義するために用いたパラメーターである。
【００３９】
細胞周期の分析
U87 H-GFPおよび親細胞を、両細胞株ともハイグロマイシンBを含まないD-MEMを用い、T25フラスコ(Nuclon, NUNC)に5×103/cm2で播種した。これらフラスコの半数を5μMのAzaで処理し、他方は薬剤を用いずに負の対照とした。42時間後、培地にBrdUを加え(最終濃度10μM)、6時間後に細胞周期分析のために細胞を調製した。
【００４０】
細胞を回収し、500 x gで5分間遠心分離し、冷却した70%強度のエタノール中で20分間固定した。BrdUのDNAへの組み込みは各々Aza処理細胞株または非処理細胞株3×105細胞を用いて検出した。
PBS 1x/0.5% BSA(洗浄バッファー)を加え、細胞を500 x gで5分間遠心分離した。次にペレットを変性溶液(HCl 1M, PBS 0.5x BSA 0.5%)に再懸濁させ、20分後に再び洗浄した。その後、ペレットを0.1Mホウ酸ナトリウム(Na2B4O7)、pH8.5に2分間再懸濁させた後、洗浄バッファーを加えた。その後、各サンプルの全量を二等分し(半分はイソタイプ抗体用、もう半分はBrdU抗体用)、500 x gで5分間遠心分離し、抗イソタイプまたは抗BrdUモノクローナル抗体(Becton Dickinson)を含有するバッファーに再懸濁させ、30分後にPBS 1x/0.5% BSAで洗浄した。上清を廃棄し、ペレットをRNAアーゼAに再懸濁させ(最終濃度100μg/ml)、7-AAD溶液(Via-PROBE, Becton Dickinson)に加えることでDNAを染色した。1時間後(暗所)、サンプルを洗浄した後、PBS 1x/0.5% BSAに再懸濁させた。核のDNA蛍光(各細胞集団についておよそ104個の核を分析)を、上記のFACスキャンフローサイトメーター(Becton Dickinson)により測定し、細胞周期のG0およびG1、S、G2およびM期にある細胞のパーセンテージをFACスキャンソフトプログラムに基づいて分析した。
3)結果
細胞株U87 H-GFPはプラスミドpCMV-hydroEGFPを含み、hCMVプロモーターの活性が通常低レベルで調節される。このプラスミドは細胞株にハイグロマイシンBに対する耐性および親細胞株に対して基礎緑色蛍光を付与する。hCMVプロモーターはシトシンの5'-CpG部位のメチル化により完全に抑制されることが示されている(Prosh S. et al., Biol. Chem Hoppe Seyler 1996, Mar 377(3): 195-201)。このプロモーターの特性がDNAのメチル化状態および染色質凝縮に干渉する薬剤によって活性化されうるかどうかを評価するため、U87 H-GFPおよび親株U87を数日間AzaおよびTSAの存在下で維持した。hCMVプロモーターの基礎レベルの活性化を低下させ、AzaおよびTSAによるプロモーターの活性化を検出するため、実験前に培地からハイグロマイシンBを除いた。
【００４１】
図1は種々の最終濃度のAza(0.5-2.5-20μM)およびTSA(100nM, 1μM)で48時間処理したU87 H-GFP細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。レポーター細胞株(非処理細胞)の基礎発現を種々の最終濃度のAzaおよびTSAで処理したサンプルと比べると、これらの画像でH-GFP遺伝子の発現の増強を検出することができる。20μM Azaおよび1μM TSAで緑色蛍光シグナルの増強が明らかである。親細胞は基礎緑色蛍光の弱い増強を示したが、これはFACS分析によってのみ検出可能なものであり、蛍光顕微鏡観察では検出できなかった。
【００４２】
さらにまた、高濃度のTSAおよびAzaでは細胞の形態学変化が見られたが、これはこれらの物質が腫瘍細胞U87を分化へ引き戻しうることを示唆している。
図2は蛍光顕微鏡観察について同濃度のAzaおよびTSAで処理したサンプルのFACSプロフィール(対数ヒストグラム)を示す。
横座標は蛍光強度の対数を表す任意のスケールを示し、縦座標は細胞の相対数を表す。レポーター細胞株で処理しなかった対照と上記の最終濃度で処理したレポーター細胞株とを比べると、蛍光プロフィールのより高い強度の方向へのシフトが見られた。このシフトはすでに2.5μM Azaを添加した場合に明らかに認められ(図2のプロフィールb)、より高い濃度でも十分定義される(プロフィールc)。
【００４３】
最終濃度100nMでTSAはH-GFP発現に何ら増強を誘導しないが(プロフィールd)、最終濃度1μMで飽和限界に達する(プロフィールl)。3μMを超える最終TSA濃度は、極めて毒性が高く、FACSによって見られたように生細胞数を著しく少なくすることから使用できなかった(データは示されていない)。
親細胞株も同様にAza (図2、プロフィールf〜h)およびTSA(プロフィールIおよびl)に感受性があるが、蛍光強度のシフトはレポーター細胞株で得られたものに匹敵するものではないことから、プラスミドによって誘導されたものではなくバックグラウンドの増強であると説明できる。
【００４４】
図3Aのヒストグラムはレポーター細胞株および親細胞株を種々のAza濃度で48時間だけ処理した実験に相当する。このヒストグラムは、対照(非処理U87 G-GFP)と2.5μM Azaで処理した細胞を比較した場合、蛍光強度平均値に2倍の増強を示す(P>10-6、対照と比較)。20μM Azaを用いた場合、H-GFP遺伝子発現は蛍光強度に3倍の増強を達成できる(P>10-5、対照と比較)。基礎蛍光の緩やかな増強(FACS分析によってのみ、蛍光顕微鏡観察では認められず)は親細胞株でも見られ(ヒストグラムの下のバー)、これは最高濃度(40μM Aza)を用いた場合の2倍未満に相当する。この実験をAzaを144時間(5日間)保持し、同じ最終濃度で繰り返したところ、蛍光強度平均値に同様のシフトが見られた(データは示されていない)。
【００４５】
図3で明らかなように、TSAもまたH-GFP遺伝子の増幅を誘導することができる。両細胞株とも種々の最終TSA濃度で48時間培養維持した。ヒストグラムから、TSAでは500nMではじめてU87 H-GFPの蛍光強度にわずかながら有意な増強が明らかであり、それより低い濃度を用いた場合では増強は見られない。しかし、TSA 1μMおよび3μMを用いた場合には3倍および4倍の蛍光強度増強が見られた(P=0.001およびP>10-5、非処理細胞と比較)。親細胞株では3μM TSAでのみ2倍の増強が見られる。
【００４６】
他の腫瘍細胞株で示されているように(Cameron E.E. et al., Nat. Genet. 1999; Vol. 21, 103-107)、TSAがAzaと相乗作用しうるかどうかをさらに検討するため、TSAをAzaと組み合わせて48時間用いた(図4c)。この実験では、TSAを最終濃度1μMに固定し、Azaを2.5から5μmに変化させた。いずれの場合にも、非処理細胞に比べU87 H-GFPでは3倍の蛍光増強が見られるが、この差は2種類の薬剤の組合せを比較した場合では有意ではない(p=0.09)。次の実験では(図4d)、TSAとAzaをそれぞれ単独で、また組み合わせて48時間用いた(図3c)。これらの薬剤単独による増強は有意であり、200nM TSAでも(P=10-9、非処理細胞と比較)1μM Azaでも(P<10-4、非処理細胞と比較)約2倍の増強に相当した。両者の組合せ(200nM TSA+1μM Aza)を用いた場合では、薬剤単独に関する小さな増強は有意であったが(P〜0.02、薬剤単独と比較)、これらの薬剤は相乗作用も相加作用も見られず、この理由はおそらく蛍光強度の増強がこれらの薬剤濃度でのCMVプロモーターの最大活性に相当していたためであろう。
【００４７】
細胞周期に対する5-アザシチジンの作用
細胞周期に対するシトシン類似体の作用を調べるため、U87 H-GFPおよび親細胞を5μM Azaで2日間処理した。図4が示すように、DNAは7-AADで染まり、1つの2N核集団と1つの4N核集団を正確に定義するため、最初の2つのドットプロット(I-IV)で1つのウインドウを用いた(R1)(FL3-Aスケールで200および400の値に相当する)。次に囲まれた核集団を、BruUに対するPEコンジュゲート抗体を用いてBrdUの組み込みに関して試験した(II-V)。BrdU抗体の非特異的結合を定義するため、また、BrdU組み込みドットプロットの象限を設定するためにイソタイプ染色(ドットプロットIII-VI)を用いた。このBrdU組み込みドットプロットから、種々の細胞周期にある細胞のパーセンテージを得た。表１は種々の細胞周期にある細胞のパーセンテージを示す。アザシチジン(5μM濃度)はG2期の細胞のパーセンテージをやや高める以外には、種々の細胞期に有意な作用を持たない。これに対し、親細胞株(U87)は5-アザシチジン感受性がより高いと見られる。この細胞株で5-アザシチジンは、S期(対照の〜6.9%、5μＭ Azaの〜13.5%と比較)およびG2期(対照の〜5.2%、5μM Azaの〜13.1%と比較)の細胞数の上昇に伴って、M期(対照の〜15.7%、5μM Azaの〜10.6%と比較)およびG1-G0期(対照の〜72.2%、5μM Azaの〜62.6%と比較)の細胞数の減少をもたらした。
【００４８】
【表１】
0004316875.tif 000002
【００４９】
4)統計分析
P値はMSエクセルで、プログラム"Anoza, 1-faktorielle-Varianz-Analyse"を用いて計算した。P値<0.05は統計学的に有意であるとみなされる。
表１は細胞周期分析を表すが、5-アザシチジンは親細胞株U87でのみ細胞周期に影響を及ぼし、U87 H-GFPには影響しなかった。細胞周期G1-G0、S、G2およびM期の細胞のパーセンテージが図4に記載のように得られた。
【００５０】
G2期の細胞数の増加を除けば、U87 H-GFPは5μM Azaで処理した場合でも細胞周期に有意な変化を示さなかった。これに対し、U87を5μM Azaを含有する培地で2日間維持した場合には細胞周期に有意な変化が見られた。G1-G0およびM期の細胞数の減少には、G2およびS期の細胞数の増加が伴っていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  5'-アザシチジンおよびトリコスタチンAによるH-GFP遺伝子の増幅を蛍光顕微鏡によって検出したものを示す。
【図２】  5-アザシチジンおよびトリコスタチンAで処理したU87 H-GFP細胞および親細胞でのFACS蛍光プロフィールを示す。
【図３】  (A)は、5-アザシチジンで処理したU87親株およびH-GFPの蛍光強度を示す。(B)のヒストグラムはトリコスタチンAによるH-GFP遺伝子発現の増強を示す。(C)は、5-アザシチジンおよびトリコスタチンの組合わせによる処理を示す。(D)は、トリコスタチンAおよび5-アザシチジンをそれぞれ単独、および組合わせた例を示す。
【図４】  5-アザシチジンで処理または未処理のU87 H-GFRおよび親株のFACS分析によって得られたドットプロットを示す。
【図５】  プラスミドpCMV-hydroEGFPを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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