(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）由来の、配列番号２または５に記載されるアミノ酸配列からなる、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  塩化マグネシウム、７．５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ）を含む組成物。
【請求項２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが下記理化学的性質を有する請求項１記載の組成物。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で６０％以上の残存活性を有する。
分子量：８６〜９２ＫＤａ
【請求項３】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）が、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＯＧ−１またはサーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭ−２である請求項１記載の組成物。
【請求項４】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）が、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＯＧ−１である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが下記理化学的性質を有する請求項４記載の組成物。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で６０％以上の残存活性を有する。
分子量：８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：６．５〜９
至適温度：７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：６０塩基／秒以上である。
【請求項６】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）が、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭ−２である請求項１記載の組成物。
【請求項７】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが下記理化学的性質を有する請求項６記載の組成物。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で６０％以上の残存活性を有する。
分子量：８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：６．５〜９
至適温度：７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：４０塩基／秒以上である。
【請求項８】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが組換え宿主細胞を用いて生産される請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス・ペプトノフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）由来の、配列番号１または３に記載される塩基配列からなる、ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を栄養培地で培養し、該培養物から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを採取されたものである工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１０】
ベクターが、ｐＬＥＤ−Ｍ１またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクターである請求項９記載の組成物を製造する方法。
【請求項１１】
宿主細胞が大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉである請求項９記載の組成物を製造する方法。
【請求項１２】
培養物からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを採取を、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含むことにより行う請求項９記載の組成物を製造する方法。
【請求項１３】
（ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程が高温熱処理である請求項１２記載の組成物を製造する方法。
【請求項１４】
高温熱処理条件が、７０℃以上である請求項１３記載の組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコ−ドする遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞ならびに該組換え宿主細胞を使用する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、大腸菌のような中温性細菌のＤＮＡポリメラーゼおよび中温性細菌に感染するファ−ジ由来のＤＮＡポリメラーゼに関しては、既に多くの研究がなされている。また、最近、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと略記する）等の核酸増幅を用いる組換えＤＮＡ技術に有用な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究も多くなされている。
ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Tth DNAポリメラーゼ) や、サーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ(Taq DNAポリメラーゼ) などが用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来から知られている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、耐熱性を有するものの、その熱安定性や、有機溶媒に対する安定性に若干、問題を残しているものがある。また、核酸の取り込みの際の正確性に欠ける点も有し、ＤＮＡ配列決定やポリメラーゼ連鎖反応に、これらの酵素を用いるにあたり、解決すべき課題が残っている。そのため、これらの課題を解消する新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。
【０００４】
また、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ、WO92/09689、特開平 5-328969 号公報）、サーモコッカス・リトラリス(Termococcus litoralis) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ、特開平 6-7160 号公報）なども知られている。しかしながら、これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、核酸の取り込みの際の正確性はＴａｑＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べて、合成速度が遅いなど、完全なものではなく、新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、熱安定性が高く、かつ、ＤＮＡ合成速度が高い熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生産する新規な超好熱古細菌を得ることに成功し、さらに、その遺伝子を解明して、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００７】
また、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡである。
【０００８】
さらに、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターである。
【０００９】
本発明は、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞である。
【００１０】
また、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を栄養培地で培養し、該培養物から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの製造法である。
【００１１】
さらに、本発明はサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベクターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクターを用いて形質転換された組換え宿主細胞を栄養培地で培養し、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含むことを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法である。
【００１２】
【発明の実施態様】
本発明の好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、超好熱古細菌の１種であるサーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ１（ＪＣＭ番号９６５３）または、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２（ＪＣＭ番号９６５４）から入手可能なＤＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ１は伊豆小笠原沖の熱水鉱床から、また、サーモコッカス・ペプチトフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２は、南マリアナトラフの熱水鉱床から単離した菌株である。これら菌株の菌学的性質は、Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.に詳しく記載されている。また、これらの菌株は、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手可能である。
【００１４】
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは、以下の方法により行う。
クローニングの方法は、ＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼ（Nucleic Acids Research、1993, vol.21, 259-265)、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ（VentＤＮＡポリメラーゼ)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, vol.89, 5577-5581）の保存領域のアミノ酸配列に基づき、プライマーを設計し、合成する。
【００１５】
まず、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)の染色体ＤＮＡを鋳型に、上記調製したプライマー（例えば、配列番号６および７、８および９に記載）を用いて、ＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を決定し、当初設定したアミノ酸配列をコードしていることを確認した後、該ＤＮＡ断片をプローブとし、染色体ＤＮＡの染色体ＤＮＡの制限酵素分解産物に対し、サザンハイブリダイゼーションを実施する。目的とするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のおおよその大きさを約４〜７Ｋｂｐに限定することが好ましい。
【００１６】
更に、約４〜７ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収し、これを用いて、大腸菌にてＤＮＡライブラリーを作製し、上記したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブにしてプラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションを行い、クローン株を取得する。
【００１７】
本発明においてクローン化したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ１株のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、２３２５塩基（推定アミノ酸７７４個）から構成されている（配列番号１）。また、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２は、３４９２塩基（推定アミノ酸１１６４個）から構成されている（配列番号３）。
ＳＭ−２株由来の遺伝子には介在配列が１個存在しており、かつ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が保存された形でつながっている。
他のＤＮＡポリメラーゼと比較したところ、これらの遺伝子には真核生物型であるα−ＤＮＡポリメラ−ゼの保存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１〜５が存在している。また、これらの遺伝子のＮ末端側に３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフであるＥＸＯ１〜３が存在している。
【００１８】
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株およびサーモコッカス・ペプチトフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を、同じサーモコッカス(Termococcus）属由来の既知酵素であるサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来のＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子と比較したところ、ＴｌｉＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子には、２種の介在配列が存在するが、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来の遺伝子には、このような介在配列が存在せず、また、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来の遺伝子には介在配列が１個存在する。
【００１９】
本発明の遺伝子は、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡである。該ＤＮＡの一例は、配列番号２または５に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。また、このようなＤＮＡは、配列番号１または３に記載される塩基配列またはその一部分を含有する。
本発明の１例であるサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを大腸菌で発現させるため、配列番号３に示される塩基配列の１６２１〜２７９０ｂｐの介在配列をＰＣＲ融合法により取り除き、完全な形のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を構築する。具体的には、介在配列を含むクロ−ン化した遺伝子を２組のプライマ−の組み合わせによりＰＣＲを行い、介在配列により分断される２断片を増幅する。さらに各々断片を結合することによって、介在配列を含まない完全な形のサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を得る（配列番号４参照）。
【００２０】
本発明において使用するベクターは、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよびその発現を可能とするものであれば、いかなるものでもよく、たとえばファージまたはプラスミドがあげられる。プラスミドとしてはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ８ｃなどがあげられる。ファージとしてはたとえばλｇｔ１１、λＺＡＰＩＩなどがあげられる。
【００２１】
本発明において使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母などがあげられる。大腸菌としては、例えばＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＬＥ３９２、ＢＬ２１（ＤＥ３）などがあげられる。
本発明では上記サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え発現ベクターとし、さらにこの組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。
【００２２】
本発明の製造方法では、上記組換え宿主細胞を培養して、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を誘導発現させる。組換え宿主細胞の培養に使用する培地ならびに条件は常法に従う。
具体例としては、サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、またはサーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＳＭ−２株由来の介在配列を含まない完全な形のＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含むｐＬＥＤ−Ｍ１プラスミドにより形質転換された大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培養する。
【００２３】
本発明の製造法の１つでは、（ａ）組換え宿主を集めた後、破砕し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含む。
組換え宿主細胞より産出された耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心分離等にて分離・回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁した後、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレンス等により菌体を破砕する。次いで、熱処理を実施し、上清より耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを回収する。菌体破砕方法は、超音波処理・ダイノミル・フレンチプレス法などが好ましい。
宿主由来の不純蛋白質を除去する工程の１つとして、熱処理が好ましい。熱処理条件は、７０℃以上、好ましくは８５℃以上である。他の不純タンパク質の除去法としては各種クロマトグラフィーなどを実施する。
【００２４】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、下記理化学的性質を有する。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で約６０％の残存活性を有する。
分子量：約８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：約６．５〜９
至適温度：約７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：約６０塩基／秒以上である。
【００２５】
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptono  philus）ＳＭ−２由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、下記理化学的性質を有する。
作用：（１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するポリメラーゼ反応を触媒する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
熱安定性：１００℃、３０分間処理で約６０％の残存活性を有する。
分子量：約８６〜９２ＫＤａ
至適ｐＨ：約６．５〜９
至適温度：約７０〜８０℃
ＤＮＡ合成速度：約４０塩基／秒以上である。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)由来の熱安定性ＤＮＡポリメラ−ゼは、１００℃、３０分の処理で、６０％以上の残存活性を示し、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などに適した酵素である（図３参照）。
【００２７】
【実施例】
次に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１  サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus  ）ＯＧ−１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング
サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株（ＪＣＭ番号９６５３）を８５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、染色体ＤＮＡを調製した（Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.参照）。
【００２８】
ＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼの保存領域のアミノ酸配列に基づき、４種のプライマ−（配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９）を合成した。このプライマーの配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９をそれぞれ１組とし、調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７５℃、２分３０秒、２５サイクル。プライマー１００ピコモル、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ使用した。酵素はＴａｑｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）５ユニット用いた）を行った。
その結果、配列番号６および配列番号７を用いた場合、約７４０ｂｐの予想された長さの増幅産物、配列番号８および配列番号９を用いた場合、約４００ｂｐの予想された長さの増幅産物が得られた。
【００２９】
このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の部分的な塩基配列を決定し、目的とする領域の増幅産物であることを確認し、この増幅断片をプロ−ブとして、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で処理した該染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼ−ションを行った結果、約４．４ｋｂの断片中にＤＮＡポリメラ−ゼをコ−ドする断片が存在することを確認した。
更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロ−スゲルから回収し、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１ｂｌｕｅ）に形質導入し、ライブラリ−を作製した。
【００３０】
次にサザンハイブリダイゼ−ションで使用したプロ−ブを用いて、プラークハイブリダイゼ−ションを行った。約５０００個のプラークをスクリーニングした結果、１０個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンからヘルパーファージＲ４０８を用いて常法に従い、プラスミドをレスキューし、部分的に塩基配列を決定したところ、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の５’側をコードするクローン（ｐＯ５’１、挿入断片約４．４ｋｂｐ）と３’側をコードするクローン（ｐＯＧ７、挿入断片４．４ｋｂｐ）を取得した。
【００３１】
実施例２  組換え発現ベクターの構築
完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を作製するため、上記で得られた２種のクローンのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード部分を図１に示した構築図に従い連結した。ｐＯ５’１を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次にｐＯＧ７を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた２種類の断片を制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）に連結し、完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含有する発現組換えベクターｐＯＧＳＢ（６．６４ｋｂ）を得た。
【００３２】
実施例３  クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例２で取得したプラスミドＤＮＡｐＯＧＳＢを大量調製し、常法に従い塩基配列の決定を行った。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定した（配列表１、配列表２）。サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子は２３２５塩基からなり、７７４個のアミノ酸がコ−ドされていた。アミノ酸配列から推定されるタンパク質の分子量は約９００００ダルトンであった。
【００３３】
実施例４  形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを実施例２で作製したｐＯＧＳＢで形質転換し、形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）を得た。
【００３４】
実施例５  サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの活性確認
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A. 2に記載）５ｍｌを２０ｍｌ容の試験管に分注した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で生育させた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）を１白金時接種し、３５℃で１６時間振蕩培養した。この培養培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離により菌体を回収した。この菌体を、０．６ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。更に、宿主細胞由来のＤＮＡポリメラーゼを不活化するために、細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した。遠心処理にて不溶画分を除去し、以下に示す方法にて熱処理液のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００３５】
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【００３６】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液の各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記熱処理液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり、１０ナノモル（ｎＭ）の全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００３７】
上記方法により熱処理液の酵素活性を測定したところ、熱処理液１ｍｌあたり７５単位のＤＮＡポリメラーゼ活性が得られた。この力価は培養液１ｍｌあたり３０単位のＤＮＡポリメラーゼが発現したことを示す。比較として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードしていないベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を上記と同様の操作に供し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したが検出できなかった。
【００３８】
実施例６  サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの精製
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＯＧＳＢ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、実施例５で使用した破砕緩衝液４００ｍｌに懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。
【００３９】
次に細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（50mM Tris-pH8.0, 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1%Ｔｗｅｅｎ20、0.1%ノニデエトＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、高度に精製されたサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを得た。
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性は実施例５と同様の操作で行った。また、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
【００４０】
実施例７  サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株（ＪＣＭ番号９６５４）を８５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、染色体ＤＮＡを調製した（Arch Microbiol(1995) 164: 159-164, Gonzalez et al.参照）。
調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、実施例１で用いたプライマーで、ＰＣＲを行った。その結果、配列番号６、配列番号７を用いた場合、約７４０ｂｐの予想された長さの増幅産物、配列番号８、配列番号９を用いた場合、約４００ｂｐの予想された長さの増幅産物が得られた。
【００４１】
このＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の部分的な塩基配列を決定し、目的とする領域の増幅産物であることを確認し、この増幅断片をプロ−ブとして、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で処理した該染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼ−ションを行った結果、約５ｋｂｐの断片中にＤＮＡポリメラ−ゼをコ−ドする断片が存在することを確認した。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロ−スゲルから回収し、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物により大腸菌(E.coli ＸＬ１ｂｌｕｅ）に形質導入し、ライブラリ−を作製した。
次にサザンハイブリダイゼ−ションで使用したプロ−ブを用いて、プラークハイブリダイゼ−ションを行った。約５０００個のプラークをスクリーニングした結果、８個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンからヘルパーファージＲ４０８を用いて常法に従いプラスミドをレスキューし、部分的に塩基配列を決定したところ。プローブに用いた領域をカバーしているクローン（ｐＳＭ３、挿入断片約５ｋｂｐ）が得られた。しかしながらこのクローンはＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の３’端約１００ｂｐがカバーできていなかった。
【００４２】
そこで実施例２で得られたｐＯＧＳＢのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子領域をプローブとして再度プラークハイブリダイゼ−ションを行い上記と同様の操作を行った結果、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の３’側をカバーするクローン（ｐＳ３’１挿入断片約３ｋｂ）を取得した。
【００４３】
実施例８  クロ−ン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例７で取得したプラスミドＤＮＡｐＳＭ３及びｐＳ３’１を大量調製し、常法に従い、ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子領域の塩基配列の決定を行った。更に、求められた塩基配列よりアミノ酸配列を推定した（配列表３、配列表４、配列表５）。サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭ−２株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子は３４９２塩基（推定アミノ酸１１６４個）から構成されている。ＳＭ−２株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は介在配列（ｉｖｓ２）が１個存在しており、かつオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が保存された形でつながっていた。アミノ酸配列から推定される完全な形のＤＮＡポリメラーゼタンパク質の分子量は約９００００ダルトンであった。
【００４４】
実施例９  組換え発現ベクターの構築
完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を作製するため、図２に示したフローに従い介在配列を取り除いた組換え発現ベクターｐＳｐｏｌＭＴを構築した。ｐＳＭ３を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画した後、約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、セルフ・ライゲーションさせ、プラスミドｐｏｌＶを構築した。次にｐＳＭ３’の挿入断片約３ｋｂをｐｏｌＶのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐｏｌＥＶを構築した。挿入断片及び挿入方向は部分的に塩基配列を決定し、確認した。
【００４５】
次にｐＳＭ３を鋳型として配列番号１０及び配列番号１１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＶで切断し、アガロースゲル電気泳動によって分画し、約１. ６ｋｂｐのDNA を回収した。次にｐｏｌＥＶを鋳型として配列番号１２および配列番号１３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた平滑化処理及び、制限酵素ＳａｌＩで切断しアガロースゲル電気泳動によって分画し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡを回収した。ＰＣＲはＰＣＲ中の変異を抑えるため、鋳型ＤＮＡを１μｇ使用し、サイクル数は１０回行った。
【００４６】
上記で得られた２つのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｌＩで切断したプラスミドベクターｐＬＥＤ−Ｍ１に連結し、完全なＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子を含有する発現組換えベクターｐＳｐｏｌＭＴ（５．０２ｋｂ）を得た。
【００４７】
実施例１０  形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを実施例９で作製したｐＳｏｌＭＴで形質転換し、形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）を得た。
【００４８】
実施例１１  サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus ) ＳＭー２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの活性確認
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）５ｍｌを２０ｍｌの試験管に分注した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で生育させた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）を１白金時接種し、３５℃で１６時間振蕩培養した。この培養培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離により菌体を回収した。この菌体を、０．６ｍｌの破砕緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-メルカプトエタノール）に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。更に、宿主細胞由来のＤＮＡポリメラーゼを不活化するために、細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した。遠心処理にて不溶画分を除去し、実施例５と同様の方法で熱処理液のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００４９】
上記方法により熱処理液の酵素活性を測定したところ熱処理液１ｍｌあたり１００単位のＤＮＡポリメラーゼ活性が得られた。この力価は培養液１ｍｌあたり４０単位のＤＮＡポリメラーゼが発現したことを示す。比較として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードしていないベクターｐＬＥＤ−Ｍ１で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を上記と同様の操作に供し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したが検出できなかった。
【００５０】
実施例１２  サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus ) ＳＭー２株由来のＤＮＡポリメラ−ゼの精製
滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（Molecular Cloning 、p.A.2 に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブコ社製）で３０℃１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳｐｏｌＭＴ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し３５℃で１２時間通気攪拌培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの実施例５で使用した破砕緩衝液に懸濁後、超音波処理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（50mM Tris-pH8.0, 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1%Ｔｗｅｅｎ20、0.1%ノニデエトＰ４０）に置換し、高度に精製されたサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭー２由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを得た。
【００５１】
実施例１３  熱安定性の確認
実施例５及び実施例１２に記載のごとく精製したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)のＤＮＡポリメラ−ゼの熱安定性を以下の方法で測定した。
精製したサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＳＭー２株およびサーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)ＯＧ−１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（それぞれＳＭ−２ポリメラーゼ及びＯＧ−１ポリメラーゼと称する）各５単位を１００μｌの緩衝液（20mM Tris-HCl, pH8.8, 25℃、10mM塩化カリウム、10mM硫酸アンモニウム、2mM 硫酸マグネシウム、0.1% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA, 5mm 2- メルカプトエタノール）に混合し、１００℃でプレインキュベーとした。この混合液から経時的に試料を採取し、実施例５記載の方法にてポリメラーゼ活性を測定した。比較として、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡製）およびＴｌｉポリメラーゼ（Ventポリメラーゼ、ＮＥＢ社製）も同様の操作を行った。
図４に示したように、ＳＭ−２ポリメラーゼ及びＯＧ−１ポリメラーゼはＴｌｉポリメラーゼと同様、１００℃、３０分の処理で６０％以上活性が残存していたのに対し、Ｔａｑポリメラーゼは５％しか活性が残存していなかった。
【００５２】
実施例１４  ＤＮＡ合成速度測定
サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)のＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮＡ合成速度を以下の方法で測定した。
ＳＭ−２ポリメラーゼおよびＯＧ−１ポリメラーゼ５単位を１０μｌの反応液(20mM Tris-HCl, (pH7.5), 8mM塩化マグネシウム, 7.5mM ジチオスレイトール、 100μg/ml BSA, 0.1mM dNTP、0.2 μCi [α-32P]dCTP)で０．２μｇの配列番号１４のプライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で３０秒、６０秒、９０秒間反応させた。反応停止は等量の反応停止液（50mM  水酸化ナトリウム、10mM EDTA 、5%フィコール、0.05% ブロムフェノールブルー）を加えることにより行なった。
【００５３】
上記ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄIII を用いた。このマーカーのバンドを指標として、合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求めた。
その結果、ＳＭー２ポリメラーゼは約４０塩基／秒、ＯＧ−１ポリメラーゼは約６０塩基／秒の合成速度を有していた。これは同じサーモコッカス(Thermococcus)属のＴｌｉポリメラーゼの約２倍の速度であった。
【００５４】
【配列表】
0004217922.tif 000003
0004217922.tif 000004
0004217922.tif 000005
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
0004217922.tif 000023
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【００５８】
0004217922.tif 000029
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0004217922.tif 000031
0004217922.tif 000032
【００５９】
配列番号６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
配列
CCITTCGCIA AGCGITA(CT)CT CAT      23
【００６０】
配列番号７
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
AG(CT)TACCACT CIACIAGGTT ICC      23
【００６１】
配列番号８
配列の長さ：２６
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTIAGGCGIG ACTGGAG(CT)GA (AG)ATIGC    26
【００６２】
配列番号９
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ACIGCIGGCA IAAC(CT)TGGTT (CT)TC      23
【００６３】
配列番号１０
配列の長さ:23
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GGTGTCCCAT ATGATCCTCG ACA               23
【００６４】
配列番号１１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
CGTAACGATA TCAGCGTACA GCAG      24
【００６５】
配列番号１２
配列の長さ：２６
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
ACAGACGGTT TCTTCGCGAC AATACC            26
【００６６】
配列番号１３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
GGGTCGTCGA CGGATTTCTA GTTC              24
【００６７】
配列番号１４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：１本鎖
配列の種類：合成DNA
配列
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC              24
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＯＧＳＢの構築図である。
【図２】ｐＳｐｏｌＭＴの構築図である。
【図３】サーモコッカス・ペプトノフィラス（Thermococcus peptonophilus）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１００℃における熱安定性を示すグラフである。
【図１】
0004217922.tif 000033
【図２】
0004217922.tif 000034
【図３】
0004217922.tif 000035