(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊婦の体液中に存在するα―フェトプロテイン類を糖鎖構造の違いに基づいて分画した後、特定糖鎖構造を有するα―フェトプロテイン類の一つ又はそれ以上を測定し、その測定結果に基づいて判別することを特徴とする、胎児染色体異常の判別のためのデータを得るための方法。
【請求項２】
特定糖鎖構造を有するα―フェトプロテインが、コンプレックス二本鎖又は当該コンプレックス二本鎖が変異した糖鎖を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定糖鎖構造を有するα―フェトプロテインが、α―フェトプロテイン類の少なくとも一つの特定の糖鎖を認識し得るタンパク質によって分画され得るものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
特定糖鎖構造を認識し得るタンパク質が、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン―Ｅ４又はコンカナバリンＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
染色体異常が、常染色体異常又は性染色体異常である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
体液が、羊水、血漿、又は血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
体液が、妊娠週数１０〜２０週の妊婦から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
α―フェトプロテイン類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るタンパク質を含有して成る、胎児染色体異常の判別用試薬。
【請求項９】
α―フェトプロテイン類の特定糖鎖構造が、コンプレックス二本鎖又は当該コンプレックス二本鎖が変異した糖鎖である、請求項８に記載の判別用試薬。
【請求項１０】
特定糖鎖構造を認識し得るタンパク質が、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン―Ｅ４又はコンカナバリンＡである、請求項８に記載の判別用試薬。
【請求項１１】
染色体異常が、常染色体異常又は性染色体異常である、請求項８〜１０の何れかに記載の判別用試薬。
【請求項１２】
妊婦の体液中に存在するα―フェトプロテイン類を糖鎖構造の違いに基づいて分画した後、総α―フェトプロテイン量中の、特定糖鎖構造を有するα―フェトプロテイン類の一つ又はそれ以上の割合を測定し、その測定結果に基づいて判別することを特徴とする、胎児染色体異常の判別のためのデータを得るための方法。
【請求項１３】
特定糖鎖構造を有するα−フェトプロテイン類が、コンプレックス二本鎖又は当該コンプレックス二本鎖が変異した糖鎖を有するものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
特定糖鎖構造を有するα―フェトプロテイン類が、α―フェトプロテイン類の少なくとも一つの特定の糖鎖を認識し得るタンパク質によって分画され得るものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
特定糖鎖構造を認識し得るタンパク質が、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン―Ｅ４又はコンカナバリンＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
染色体異常が、常染色体異常又は性染色体異常である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
体液が、羊水、血漿、又は血清である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
体液が、妊娠週数１０〜２０週の妊婦から採取されたものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
(1)α−フェトプロテイン類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るレクチン、及び(2)抗α―フェトプロテイン抗体、を含んで成る、胎児染色体異常判別用キット。
【請求項２０】
レクチンが、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン―Ｅ４又はコンカナバリンＡである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
(1)α−フェトプロテイン類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るレクチン、(2)当該レクチンの結合の有無に関わらず全てのα―フェトプロテイン類に結合し得る抗α―フェトプロテイン抗体及び(3)当該レクチンが結合したα―フェトプロテイン類には反応性が低いが、当該レクチンが結合していないα―フェトプロテイン類には反応性が高い抗α―フェトプロテイン抗体、を含んで成る、胎児染色体異常判別用キット。
【請求項２２】
レクチンが、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン―Ｅ４又はコンカナバリンＡである、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、より簡便な胎児染色体異常の判別方法、特に胎児ダウン症候群の簡便な判別方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
ダウン症候群は、染色体異常症候群の一つとして広く知られている。ダウン症候群に於いてみられる染色体異常は常染色体異常であり、２１番染色体が３つあるトリソミー２１型が95％を占め、４％が２１番染色体の転移型、残り１％がモザイク型である。臨床症状としては典型的な特有の顔貌、身体発育のおくれ、重度の知的障害が多い。
【０００３】
ダウン症候群の出生前診断としては、例えば受胎10〜20週の羊水穿刺して、細胞の染色体を調べることにより胎児が２１トリソミーであるかどうかを検査する方法が一般的である。しかしながら、羊水穿刺は、診断効率は高いが、0.5〜１％の確率で流産を引き起こすという問題がある。また、超音波診断法、絨毛検査等の方法もあるがそれぞれ信頼度が低い、胎児に障害を与える可能性がある、等の問題点を有している。その他、母体の血液成分の測定に基づいて行う種々のスクリーニング法が開発されており、特に母親の年齢と、母体血中のα-フェトプロテイン(AFP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)及び非抱合エストリオール(uE3)の濃度とから危険率を算出する方法が広く使用されている（Wald NJ, Densem JW, Smith D, Klee GG: Four-Marker Serum Screening For Down's Syndrome. Prenat. Diagn, 1994;14：707-716）。その他にも、例えば特表平8-500181号公報には、妊婦の母体血液を乾燥処理した後、hCGレベルを基準値と比較する方法、及びＡＦＰレベルの値も併用する方法が記載されている。また、特許第2525474号公報には、母体の血清サンプルのuE3、プロゲステロン、16α-ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロン等の含有値を測定する方法に於いて、ＡＦＰの測定も併せて行う方法が開示されている。また、特開平2-5895号公報には、妊婦の血清、羊水等の細胞外体液中のSOD-1濃度を測定する方法等が記載されている。しかしながら、これらの方法は、測定結果の解析が煩雑なこと、感度が６０〜７０％と依然低いこと、体重、糖尿病の有無、喫煙の習慣の有無等母体条件の影響を受けやすいこと等の問題点を有している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、母体及び胎児に対する安全性に優れ、検査結果の信頼性も高い胎児染色体異常の判別方法、及びこれに用いられる試薬又はキットを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、妊婦の体液中に存在するＡＦＰ類を糖鎖構造の違いに基づいて分画した後、特定糖鎖構造を有するＡＦＰ類の一つ又はそれ以上を測定し、その測定結果に基づいて判別することを特徴とする、胎児染色体異常の判別のためのデータを得るための方法の発明である。
また、本発明は、ＡＦＰ類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るタンパク質を含有して成る、胎児染色体異常の判別用試薬の発明である。
更に、本発明は、妊婦の体液中に存在するＡＦＰ類を糖鎖構造の違いに基づいて分画した後、総ＡＦＰ量中の、特定糖鎖構造を有するＡＦＰ類の一つ又はそれ以上の割合を測定し、その測定結果に基づいて判別することを特徴とする、胎児染色体異常の判別のためのデータを得るための方法の発明である。
更にまた、本発明は、(1)ＡＦＰ類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るレクチン、及び(2)抗ＡＦＰ抗体、を含んで成る、胎児染色体異常判別用キットの発明である。
また、本発明は、(1)ＡＦＰ類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るレクチン、(2)当該レクチンの結合の有無に関わらず全てのＡＦＰ類に結合し得る抗ＡＦＰ抗体及び(3)当該レクチンが結合したＡＦＰ類には反応性が低いが、当該レクチンが結合していないＡＦＰ類には反応性が高い抗ＡＦＰ抗体、を含んで成る、胎児染色体異常判別用キットの発明である。
【０００６】
即ち、本発明者等は、母体及び胎児に対する影響がなく、検査結果の信頼性も高く、且つ簡便な胎児染色体異常の判別方法を確立すべく鋭意研究の結果、妊婦の体液中に存在する特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類を測定することにより、胎児染色体異常の危険度を信頼性高く判別することができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
ＡＦＰは、胎児血清或いは肝細胞癌、ヨークサック腫瘍等の悪性腫瘍で発現される癌胎児性糖タンパク質であり、各種肝疾患診断の重要な指標の一つとして良く用いられている。
【０００８】
ＡＦＰは、一般には１分子あたり１本のアスパラギン結合型（N-グリコシド型）の二本鎖複合型糖鎖（コンプレックス二本鎖）を有する。そのため、ＡＦＰは、オリゴ糖に対する特異性が異なるレクチンを用いた親和電気泳動で分画されたＡＦＰバンドを抗体親和転写法で検出する方法により異なる糖鎖を持つＡＦＰに分画することができる。例えばコンカナバリンＡ（ConA）を用いた場合、ＡＦＰはその糖鎖の種類によりAFP-C1、AFP-C2に分画される。レンズマメレクチン（LCA）を用いた場合は、AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3に分画される。インゲンマメレクチンＥ４（PHA-E4）を用いると、AFP-P1〜AFP-P5に分画され、AFP-P3よりも移動度が速いAFP-P3fも出現する。カブトムシ幼虫レクチン（alloA）では、AFP-A1、AFP-A2、AFP-A3に分画され、AFP-A1より移動度が遅いAFP-A1sが出現することもある。ヒママメレクチン（RCA-120）を用いた場合、AFP-R1、AFP-R2、AFP-R3に分画され、AFP-R1より移動度が速いAFP-R1fが出現することもある。ダツラレクチン（DSA）では、AFP-D1〜AFP-D6に分画される。ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）では、AFP-AA1〜AFP-AA4に分画される（武田和久,「臨床検査」vol.39,No.1,p.66-70(1995)、Shimizu K.,Clin.Chim.Acta.,254,23-40(1996)）。
【０００９】
ＡＦＰは、妊娠時に羊水及び母体血清で高値を示すことが知られている。これは未成熟の胎児肝臓でＡＦＰが生産されるためである。即ち、胎生期の初期には肝臓でコアのN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）がフコシル化されたもの、及びマンノース（Man）α１→６分岐側のガラクトース（Gal）が露出したモノシアロＡＦＰが比較的多く作られる。また、妊娠初期の羊水中にはバイセクト（bisect）型のGlcNAcを有するＡＦＰが出現する。胎児が成長し肝臓が成熟するにつれ、ＡＦＰの生成は低下する。一方、成人では通常血清ＡＦＰ濃度は10ng／ml以下であるので、妊娠時に母体血清中に出現するＡＦＰの大部分は胎児に由来していると考えられている。
【００１０】
本発明に係るＡＦＰ類としては、特定の糖鎖構造を有するものが好ましく挙げられ、特定の糖鎖構造としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
１．下記式１で示されるコンプレックス２本鎖
【００１１】
【式１】
0004207283.tif 000002
【００１２】
２．コンプレックス２本鎖が変異したもの
▲１▼糖が付加したもの
ｉ）還元末端のGlcNAcへフコースがα１→６結合で付加したもの
具体的には、例えば下記式２で示されるもの等が挙げられる。
【００１３】
【式２】
0004207283.tif 000003
【００１４】
ii）α１→６,α１→３及びβ１→４結合を有するManへGlcNAcがβ１→４結合で付加したもの
【００１５】
具体的には、例えば下記式３で示されるもの等が挙げられる。
【式３】
0004207283.tif 000004
【００１６】
iii）β１→２及びα１→６結合を有するMan又は／及びβ１→２及びα１→３結合を有するManへ糖鎖が付加して３本鎖、４本鎖構造となったもの
【００１７】
▲２▼糖が脱離したもの
ｉ）末端シアル酸が欠如したもの
具体的には、例えば下記式４〜７で示されるもの等が挙げられる。
【００１８】
【式４】
0004207283.tif 000005
【００１９】
【式５】
0004207283.tif 000006
【００２０】
【式６】
0004207283.tif 000007
【００２１】
【式７】
0004207283.tif 000008
【００２２】
ii）非還元末端側Galが欠如したもの
具体的には、例えば下記式８で示されるもの等が挙げられる。
【００２３】
【式８】
0004207283.tif 000009
【００２４】
▲３▼糖が付加及び脱離したもの
具体的には、例えば下記式９で示されるもの等が挙げられる
【００２５】
【式９】
0004207283.tif 000010
【００２６】
▲４▼末端シアル酸の結合様式が変異したもの（通常はα２→６結合で付加、変異はα２→３結合で付加）
具体的には、例えば下記式１０で示されるもの等が挙げられる。
【式１０】
0004207283.tif 000011
【００２７】
また、本発明に係る特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類には、各種レクチンによって分画されるものも含まれ、具体的には、例えばＣonＡを用いて分画されるAFP-C1，AFP-C2、ＬＣＡを用いて分画されるAFP-L1，AFP-L2，AFP-L3、ＰＨＡ―Ｅ４を用いて分画されるAFP-P1，AFP-P2，AFP-P3，AFP-P4，AFP-P5，AFP-P3f、alloＡを用いて分画されるAFP-A1，AFP-A2，AFP-A3，AFP-A1s、ＲＣＡ−１２０を用いて分画されるAFP-R1，AFP-R2，AFP-R3，AFP-R1f，AFP-R3f、ＤＳＡを用いて分画されるAFP-D1，AFP-D2，AFP-D3，AFP-D4，AFP-D5，AFP-D6，AFP-D7、ＡＡＬを用いて分画されるAFP-AA1，AFP-AA2，AFP-AA3，AFP-AA4等が挙げられるが、これらに限定されない。また、用いられるレクチン、及びＡＦＰ類もこれらに限定されない。
【００２８】
尚、式１で示されるコンプレックス２本鎖の糖鎖構造を有するＡＦＰ類は、レクチンを用いて分画した場合、例えばAFP-C2，AFP-L2，AFP-P2，AFP-A3，AFP-R1等に分画される。式２で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C2，AFP-L3，AFP-P2，AFP-A3，AFP-R1等に分画される。式３、式４及び式９で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C1，AFP-P5，AFP-A3，AFP-R3等に分画される。式５で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C2，AFP-P4，AFP-A3，AFP-R2等に分画される。式６で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C2，AFP-P4等に分画される。式７及び式８で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C2，AFP-P3，AFP-A3等に分画される。式１０で示される糖鎖構造を有するＡＦＰ類はAFP-C2，AFP-P5，AFP-A3，AFP-R1等に分画される。また、上記以外のレクチンを用いて分画すれば、これらＡＦＰ類は、使用したレクチンの性質に従って、種々の画分に分画される。
【００２９】
また、特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類を測定するに当たっては、ＡＦＰ類を予め、例えばシアリダーゼ、N-アセチルヘキソサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ等の糖加水分解酵素により処理してから、測定に供してもよい。例えば１８トリソミー、２１トリソミー（＝胎児ダウン症候群）等の常染色体異常を判別する場合には、これら特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類の中でも、例えばＬＣＡ、ＰＨＡ―Ｅ４、ＣonＡ等のレクチンで分画されるものが好ましく挙げられ、より好ましくはAFP-L2、AFP-L3、AFP-P4、AFP-P5、AFP-C1等が挙げられる。また、性染色体異常を判別する場合には、例えばＬＣＡ等で分画されるＡＦＰ類が好ましく挙げられ、より好ましくはAFP-L2、AFP-L3等が挙げられる。
【００３０】
本発明に係る測定用試料として用いられる母体液としては、羊水、血漿、又は血清等が挙げられる。また、母体液としては、妊娠週数１０〜２０週の範囲にある妊婦から採取されたものが通常用いられる。
【００３１】
本発明に係る特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類の糖鎖構造或いはその近傍を認識することができるタンパク質としては、例えばレクチン類、抗体等が挙げられる。このようなレクチン類としては、例えばＣonＡ，ＬＣＡ，alloＡ，RCA−120，ＤＳＡ，ＡＡＬ，ＰＨＡ−Ｅ４，エンドウマメレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等が挙げられ、測定しようとするＡＦＰ類の特定の糖鎖構造に合わせて適宜選択して用いられる。中でも、ＣonＡ，ＬＣＡ及びＰＨＡ−Ｅ４が好ましく用いられる。
【００３２】
抗体としては、ＡＦＰ類の特定の糖鎖構造或いはその近傍に対する抗体であれば何れにてもよく、特に限定されない。例えばポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。尚、均一の性質を有する抗体の特異性を考慮すると、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体の方が好ましい。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してF(ab')2、Fab'、或はFabとして使用してもよい。さらに抗体には種々の物質、例えば酵素免疫測定法（EIA）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（RIA）で用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等の標識物質、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等を用いて抗原抗体複合物を分離する際に当該複合体の例えば分子量、疎水性、等電点等の性質を変化させて、当該複合体とその他の成分とをより明確に分離させ得る性質を有する物質（以下、分離向上物質と略記する。）、具体的には例えばα−キモトリプシノーゲン，β−ガラクトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームｃ，トリプシンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニルアラニン，プロリン，アルギニン，リジン，アスパラギン酸，グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例えば臭素，塩素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチレングリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミン酸，ポリアスパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、例えば特開平9-301995号公報に開示された、例えば硫酸、リン酸等の強酸に由来する残基を少なくとも３個有するポリペプチド、炭素数３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン酸，オレイン酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド［N-(ε-maleimidocaproyloxy)succinimide］（EMCS）,N-スクシンイミヂル-6-マレイミドヘキサノエイト（N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoate），ビスマレイミドヘキサン（Bismaleimidohexane）（BMH），オクチルアミン等の第１抗体に結合し得る反応基を有し且つ疎水性若しくはイオン性を有する化学物質等を導入して使用してもよい。
【００３３】
本発明に係る特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ類の測定方法の具体例としては、例えばＡＦＰ類の特定の糖鎖構造を認識し得るタンパク質（例えばレクチン類や抗体等）を用いる方法等が挙げられる。より具体的には、自体公知の、抗ＡＦＰ抗体やＡＦＰの特定の糖鎖構造を認識し得るタンパク質としてレクチンを用いるレクチン親和電気泳動法、レクチンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いる方法等が挙げられる。これら自体公知の方法に関しては、各種キットが市販されているので、それを用いて行ってもよい。
【００３４】
レクチン親和電気泳動法は、例えば以下のようにして行えばよい。
即ち、先ず試料をＡＦＰ類の特定糖鎖構造を認識し得るレクチンを含有するゲルで電気泳動し、ＡＦＰ類の画分を得る。次いで抗ＡＦＰ抗体、酵素で標識された、抗ＡＦＰ抗体に対する抗体で処理し、ゲルを洗浄後、酵素基質を含有する溶液で処理して酵素反応により発色させ、次いでデンシトメーター等で各画分の吸収を測定する。総ＡＦＰ面積に対するＡＦＰ類画分のピーク面積の百分率を、ＡＦＰ類の分画比（％）として求める。
【００３５】
ＨＰＬＣを用いる方法は、例えば以下のようにして行えばよい。即ち、レクチンと、酵素等の標識物質又は分離向上物質を結合させた、ＡＦＰ類に対する認識部位の異なる二種の抗体を用いる。まず試料を、少なくとも一つのＡＦＰ類の特定糖鎖構造を認識し得るレクチンと、当該レクチンの結合の有無に関わらず全てのＡＦＰ類に結合し得る標識物質結合抗体と反応させる。次いで、当該レクチンが結合したＡＦＰ類には反応性が低いが当該レクチンが結合していないＡＦＰ類には反応性が高い分離向上物質結合抗体と更に反応させた後、ＨＰＬＣにより、ＡＦＰ類を分画する。各画分中の標識物質を測定し、その結果に基づいて総ＡＦＰ面積に対するＡＦＰ類画分のピーク面積の百分率を、ＡＦＰ類の分画比（％）として求める。
【００３６】
レクチン親和電気泳動法による測定方法を、例えばＡＦＰ―Ｌ３測定用キットであるＡＦＰ−Ｌ３テストワコー（和光純薬工業(株)製）を用いて、AFP-L3を測定する方法を例にとって具体的に説明すると、概略以下の如くである。
即ち、先ず試料を例えばレクチンとしてＬＣＡを含有するアガロースゲル等で電気泳動し、ＡＦＰ類の夫々の画分を得る。該アガロースゲルに、モノクローナル抗ヒトＡＦＰマウス抗体が結合した抗体結合膜をかぶせて抗原抗体反応を行わせる。これによりＡＦＰ画分は、抗体結合膜上に移る。アガロースゲルから抗体結合膜をはがし、洗浄する。次いでウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体溶液に浸し、免疫反応を起こさせる。次いで洗浄後、ペルオキシダーゼ（POD）標識抗ウサギIgGヤギ抗体溶液に浸し、反応後、洗浄し、次いで該抗体結合膜を発色試液に浸して染色する。染色、洗浄後、測定波長550〜650nmで、デンシトメーターで吸収を測定する。AFP―L3分画比（％）は、デンシトグラムから各ピークの面積を算出し、総ＡＦＰ面積に対するAFP-L3画分のピーク面積の百分率として求める。
【００３７】
ＨＰＬＣを用いる測定方法は、具体的には例えば特開平9-301995号公報に記載された方法に準じて行えば良い。即ち、AFP-L3を測定する方法を例にとって説明すると、ＡＦＰ類の認識部位が異なる３種類の抗ＡＦＰモノクローナル抗体から得られたFab'に、例えばPOD等の酵素等の標識物質、例えば4-(p-マレイミドフェニル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))5、4-(p-マレイミドフェニル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8等の分離向上物質を結合させてFab'-1-POD、Fab'-2-Ala-(Tyr(S03H))5、Fab'-3-Ala-(Tyr(SO3H))8とする。試料とFab'-1-PODとＬＣＡとを反応させた後、Fab'-2-Ala-(Tyr(S03H))5、Fab'-3-Ala-(Tyr(SO3H))8をさらに反応させる。これらのうち、Fab'-3はＬＣＡが結合したＡＦＰ類に対しては反応性が低いが、ＬＣＡが親和性を有さない（結合しない）ＡＦＰ類に対しては反応性が高いという性質を有している。また、Fab'-1及びFab'-2は、ＬＣＡが結合しているか否かに関わらず、全てのＡＦＰ類に結合する性質を有している。そのため反応液中に２種類の免疫複合体、即ち、ＬＣＡが親和性を有するＡＦＰ類とFab'-2-Ala-(Tyr(S03H))5とFab'-1ーPODの免疫複合体と、ＬＣＡが親和性を有さない（結合しない）ＡＦＰ類とFab'-2-Ala-(Tyr(S03H))5とFab'-3-Ala-(Tyr(SO3H))8とFab'-1-PODの免疫複合体が生成する。次に、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて免疫複合体中の硫酸残基の個数により、この２種の複合体を分離し、各々のピークのPOD活性を測定する。２種の免疫複合体ピークの合計面積は総ＡＦＰ量を示すので、ＬＣＡが親和性を有するＡＦＰピーク面積を総ＡＦＰのピーク面積で割ることにより、AFP-L3分画比の値（％）を求めることができる。
【００３８】
尚、測定するＡＦＰ類は、一つであっても、また２つ以上であっても何れにてもよい。
【００３９】
胎児染色体異常の判別方法としては、まず検査対象の妊婦と実質的に年齢及び妊娠週数が一致し、且つ羊水検査により染色体異常を有さない胎児を持つことが確認された妊婦（正常）から得られた試料について、本発明の方法を用いて、測定を行う。即ち、妊婦の体液中に存在するＡＦＰ類を糖鎖構造の違いに基づいて分画し、特定糖鎖構造を有するＡＦＰ類の一つ又はそれ以上を測定する。このようにして得られた特定のＡＦＰ類の量を基準値として用い、上記と同様の方法で試料から得られた特定のＡＦＰ類の量を、正常値と比較する。これらの量の違いに有意差が見られる場合を陽性［胎児染色体異常の可能性有り（危険度が高い）］と判断する。
【００４０】
また、例えば年齢及び妊娠週数がほぼ一致し、羊水穿刺検査等により胎児が染色体異常ではないことが確認された母体（正常母体）から得られた試料について、本願発明の方法を用いて、妊婦の体液中に存在するＡＦＰ類を糖鎖構造の違いに基づいて分画し、特定糖鎖構造を有する一つ又はそれ以上のＡＦＰ類量の、総ＡＦＰ量に対する比を求め、得られた所定のＡＦＰ類の分画比の値を基準として、診断すべき試料から同様にして得られた所定のＡＦＰ類の分画比の値を比較し、基準値との有意差が認められれば、陽性と判断する等してもよい。ＡＦＰ類の分画比の値が基準値と比較して高い場合を陽性とするか、低い場合を陽性とするかは、測定対象のＡＦＰ類の種類、試料の種類によって異なる。例えば胎児ダウン症候群の診断をAFP(L2＋L3)分画比に基づいて行う場合、血清及び羊水中の値が正常群に比べて有意に高値となるし、AFP-C1分画比に基づいて行う場合、血清中の値が正常群に比較して有意に低値を示す。また、AFP(P4＋P5)分画比、AFPーP4分画比に基づいて行う場合、羊水中の値が正常群に比較して有意に低値を示す。性染色体異常の診断を、AFP(L2＋L3)分画比に基づいて行う場合、羊水中の値が正常群に比較して有意に低値を示す。
【００４１】
本発明の胎児染色体異常判別用試薬は、ＡＦＰ類の特定の糖鎖構造を認識し得るタンパク質、例えば抗体、レクチン等を含有するものであり、その構成要素の好ましい態様と具体例は上で述べたとおりである。
【００４２】
本発明の胎児染色体異常判別用キットは、少なくとも一つのＡＦＰ類の特定の糖鎖を認識し得るレクチンと、抗ＡＦＰ抗体を含有するものである。
【００４３】
また、本願発明に係る胎児染色体異常判別用キットは、ＡＦＰ類の少なくとも一つの特定糖鎖構造を認識し得るレクチン、当該レクチンの結合の有無に関わらず全てのＡＦＰ類に結合し得る抗ＡＦＰ抗体及び当該レクチンが結合したＡＦＰ類には反応性が低いが、当該レクチンが結合していないＡＦＰ類には反応性が高い抗ＡＦＰ抗体、を含有していても良い。
【００４４】
より具体的には、例えば所定のレクチンを含有するアガロースゲル，抗ヒトＡＦＰ抗体が結合した抗体結合膜，抗ＡＦＰ抗体（第２抗ＡＦＰ抗体）を含有する溶液，POD等の酵素で標識された、第２抗ヒトＡＦＰ抗体に対する二次抗体溶液，発色試液［例えば標識酵素がPODの場合はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及びニトロテトラゾリウムブルー(Nitro-TB)等］，過酸化水素水，洗浄液等を含有するレクチン親和電気泳動法用キット、例えばＬＣＡ等のレクチン，例えばAla-(Tyr(SO3H))5、Ala-(Tyr(SO3H))8等の分離向上物質が結合した抗ＡＦＰ抗体―１，POD等の酵素で標識された抗ＡＦＰ抗体―２，抗ＡＦＰ抗体―１に結合させたものとは異なる分離向上物質が結合した抗ＡＦＰ抗体―３，基質液（PODを抗体の標識酵素として用いる場合は4-アセトアミドフェノール，過酸化水素水等を含有。）等を含有するカラムを用いるＡＦＰ類測定法用キット等が挙げられる。ここで、抗ＡＦＰ抗体―１と抗ＡＦＰ抗体―２は、当該レクチンの結合の有無に関わらず全てのＡＦＰ類に結合し得る抗体であって、抗ＡＦＰ抗体―３は、当該レクチンが結合したＡＦＰ類には反応性が低いが、当該レクチンが結合していないＡＦＰ類には反応性が高い抗体である。
また、これらの構成要素の好ましい態様と具体例は、上で述べた通りである。
【００４５】
これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したり、ＡＦＰ類とレクチン類（又は抗体）との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
また、マグネシウム等の金属イオンがレクチン活性や安定性に影響を与えることはよく知られており、これらを含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の試薬やキットに於いて用いることのできる緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常免疫比濁法、免疫比ろう法、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法に用いられている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０の範囲から好ましく選択される。
【００４７】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限されるものではない。
【００４８】
【実施例】
実施例  １．胎児ダウン症候群における母体血清中および羊水中のＡＦＰ類についての検討
（１）検体
羊水検査によりダウン症候群罹患胎児を持つことが確認された２７〜４４歳の妊婦１７例の、妊娠１５〜１９週の血清および羊水を使用した。
また、該罹患症例と年齢および妊娠週数が一致し、且つ羊水検査により染色体異常を有さない胎児を持つことが確認された正常妊婦２０例の血清および羊水を対照として用いた。
（２）総ＡＦＰ量の測定
アボット社のIMx AFPアッセイシステムを使用し、添付文書に記載の標準操作法に従って、測定した。
（３）ＡＦＰ分画比の測定
２μｌの血清検体あるいは総ＡＦＰ濃度が50ng／ml前後になるように生理食塩水で希釈した羊水検体２μlを、所定レクチンを所定濃度含む厚さ１mmの１％アガロースゲルに塗布し、以下の条件で電気泳動を行い、特定の糖鎖構造を有するＡＦＰ（以下、マーカーと略記する。）を分離した。尚、レクチンとしてDSA又はRCA-120を使用する際は、検体をシアリダーゼで処理した後に、アガロース膜に塗布した。
0004207283.tif 000012
また、各マーカーを分離するために使用したレクチンと、そのアガロースゲル中の濃度を表１に示す。
【００４９】
0004207283.tif 000013
0004207283.tif 000014
0004207283.tif 000015
0004207283.tif 000016
0004207283.tif 000017
0004207283.tif 000018
【００５０】
分離された各ＡＦＰ画分をモノクローナル抗ＡＦＰ抗体（マウス）を塗布したニトロセルロース膜に転写し、洗浄処理後、該膜上で更にポリクローナル抗ＡＦＰ抗体（ウサギ）とPOD標識抗ウサギIgG抗体（ヤギ）とを反応させた。洗浄処理後、これにニトロテトラゾリウムブルー、NADH、フェノールおよび過酸化水素を反応させ、各ＡＦＰ画分を発色させた。各画分のピーク面積をデンシトメーター（580nm）により測定し、分画比を次の式により算出した。
分画比（％）＝（各画分のピーク面積／各画分のピーク面積の総和）×１００
（４）結果
それぞれのマーカーについて、胎児ダウン症候群と正常群の平均値±ＳＤと２群間の有意差を表２に示した。尚、有意差検定にはｔ検定（Student's t）を使用した。
【００５１】
表  ２
0004207283.tif 000019
【００５２】
表２から明らかな如く、胎児ダウン症候群は正常群と比較すると、血清中総ＡＦＰ量で有意に低値を示し、AFP(L2＋L3)分画比で有意に高値を示した。また、AFP(L2＋L3)分画比は、総ＡＦＰ量よりも、正常群に対し有意差が大きかった。更に、AFP-C1分画比は、検体数が少ないため有意差は出なかったが、正常群に対し低値を示す傾向が強く示唆された。
同様に、羊水ではAFP(L2＋L3)分画比で有意に高値を、AFP(P4＋P5)分画比で有意に低値を、AFPーP4分画比で有意に低値を示した。また、AFP(L2＋L3)分画比、ＡＦＰ(P4＋P5)分画比、AFP-P4分画比共に、総ＡＦＰ量よりも正常群に対し有意差が大きかった。
【００５３】
表２で有意差のあったものについて、平均値＋２ＳＤ又は平均値―２ＳＤをカットオフ値とし、感度、特異性及び診断効率を求めた結果を表３に示す。
【００５４】
表  ３
0004207283.tif 000020
【００５５】
表３から明らかな如く、血清中および羊水中のAFP(L2＋L3)画分の診断効率が73％と一番高く、胎児のダウン症診断において有用性が高いことが確認された。言い換えれば、糖鎖の還元末端GlcNAcにフコースがα１→６付加したＡＦＰ類が、胎児のダウン症候群診断に有効であることが確認された。
【００５６】
実施例  ２．胎児染色体異常群と正常群との、母体血清および羊水中のAFP(L2＋L3)分画比の検討
（１）検体
羊水検査により胎児の２１トリソミー及び１８トリソミーの常染色体異常、あるいは性染色体異常が確認された24〜44歳の妊婦の妊娠週数15〜19週の血清および羊水を使用した。
また、該罹患症例と年齢および妊娠週数が一致し、且つ羊水検査により染色体異常を有さない胎児を持つことが確認された正常妊婦の血清およ羊水を対照として用いた。
（２）ＡＦＰ(L2＋L3)分画比の測定
ＡＦＰ−Ｌ３テストワコー（和光純薬(株)製）を用い、添付文書の標準操作法に従って、各画分を分離し、各画分のピーク面積をデンシトメーター（580nm）により測定して、AFP(L2＋L3)分画比を実施例１と同様に算出した。
（３）結果
それぞれの群について平均値±ＳＤと正常群に対する有意差を表４に示した。尚、有意差検定にはｔ検定（Student's t）を使用した。
【００５７】
表  ４
0004207283.tif 000021
【００５８】
表４から明らかな如く、２１トリソミー群で血清および羊水中のAFP(L2＋L3)分画比が有意に高かった。また、性染色体異常群では羊水中のAFP(L2＋L3)分画比が有意に低かった。
【００５９】
次に有意差のあったものについて、診断効率が最大となる値をカットオフ値とした場合の、感度、特異性および診断効率を求めた結果を表５に示す。
【００６０】
表  ５
0004207283.tif 000022
【００６１】
表５から明らかな如く、２１トリソミーあるいは性染色体異常診断において、血清および羊水中のAFP(L2＋L3)分画比の有用性、言い換えれば糖鎖の還元末端GlcNAcにフコースがα１→６付加したＡＦＰ類の有用性が確認された。
【００６２】
実施例  ３．胎児ダウン症候群における母体血清中の総ＡＦＰ量およびAFP(L2＋L3)分画比の検討
（１）検体
羊水検査によりダウン症候群罹患胎児を持つことが確認された27〜44歳の妊婦18名の、妊娠15〜19週の血清を使用した。
尚、該罹患症例と年齢および妊娠週数が一致し、且つ羊水検査により染色体異常を有さない胎児を持つことが確認された正常妊婦70名の血清を対照として用いた。
（２）総ＡＦＰ量の測定
アボット社のIMx AFPアッセイシステムを使用し、添付文書の標準操作法に従って測定した。
（３）AFP(L2＋L3)分画比の測定
ＡＦＰ−Ｌ３テストワコー（和光純薬工業(株)製）を用い、添付文書の標準操作法に従って、分離した各ＡＦＰ画分のピーク面積をデンシトメーター（580nm）で測定し、実施例１と同様の方法でAFP(L2＋L3)を算出した。尚、有意差検定にはｔ検定（student's t）を使用した。
【００６３】
（４）結果
正常群と胎児ダウン症候群に於ける母血清中の総ＡＦＰ量の分布を図１（ａ）に、AFP(L2＋L3)分画比分布を図１（ｂ）に夫々示す。
これらの結果から、総ＡＦＰ量及びAFP(L2＋L3)分画比は、何れも胎児ダウン症候群および正常群間で有意差が認められた。
次いで総ＡＦＰ量のカットオフ値を24ng／ml、AFP(L2＋L3)分画比のカットオフ値を42％とした場合の、それぞれの感度、特異性および診断効率を表６に示した。
【００６４】
0004207283.tif 000023
0004207283.tif 000024
0004207283.tif 000025
0004207283.tif 000026
0004207283.tif 000027
0004207283.tif 000028
【００６５】
また、総ＡＦＰ量及びAFP(L2＋L3)分画比の受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic : ＲＯＣ）曲線を図２（ａ），（ｂ）に夫々示す。図２（ａ），（ｂ）をもとに、ＡＵＣ（area under the curve）値を算出したところ、総ＡＦＰ量の場合のＡＵＣ値は0.700，AFP(L2＋L3)分画比の場合のＡＦＰ値は0.835であった。これらのことより、ダウン症診断において、母体血清中のAFP(L2＋L3)分画比は総ＡＦＰ量よりも有用であり、より正しい診断ができることが判る。
【００６６】
【発明の効果】
本発明は、母体及び胎児に対する影響がなく、検査結果の信頼性も高く、且つ簡便な胎児染色体異常の判別方法、試薬及びキットを提供するもので、斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３で得られた結果を示し（ａ）は正常母体又は胎児ダウン症候群罹患胎児を持つことが確認された母体の、各血清検体の総ＡＦＰ量の分布を、（ｂ）はAFP(L2+L3)分画比分布を夫々示す。
【図２】図２は、実施例３で得られた結果に基づく受信者動作特性曲線を示し、（ａ）は、総ＡＦＰ量を測定した結果に基づく受信者動作特性曲線、（ｂ）は、AFP(L2+L3)分画比を測定した結果に基づく受信者動作特性曲線を夫々示す。
【図１】
0004207283.tif 000029
【図２】
0004207283.tif 000030