(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７を有する不死化した細胞系。
【請求項２】
角膜の細胞の代謝に対するある剤の変異誘発性作用、毒性作用または有益な作用を同定するための方法であって、（１）請求項１に記載の細胞系を含有する培養物を、ヒト角膜の細胞の代謝に対し、変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤であると考えられる剤と反応させ、ついで（２）該剤の該細胞系に対する作用を測定することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の不死化したヒト角膜上皮細胞、および変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤に対する該細胞の代謝応答を測定するための試薬を含有する診断用キット。
【請求項４】
角膜細胞の代謝に対して変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤の同定のための方法における、請求項１に記載の不死化したヒト角膜上皮細胞の使用。
【請求項５】
目的遺伝子を発現する組換え細胞を開発するための、請求項１に記載のヒト角膜の不死化した上皮細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は新規な不死化したヒト角膜上皮細胞系、および角膜細胞の代謝に対して変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤の同定のための方法におけるその使用である。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、感染症、炎症、癌等のヒトの病気の研究に適したヒト細胞系を開発する努力が、長年、なされてきた。病気の初めにしばしば関与する細胞の中に、人体を取り巻く環境に感受性である上皮細胞がある。
【０００３】
上皮細胞は、上皮細胞にのみ見出される化合物または構造、例えば、サイトケラチン類（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ）（Ｍｏｌｌら；Ｃｅｌｌ，３１，１１−２４，１９８２）、細胞間の結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ，６９，３８５−３８７，１９９２）およびビメンチン（Ｒｉｃｈａｒｄら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，２８２，５１２−５１５，１９９０）等、の発現において、人体の他の細胞と異なる。
【０００４】
他の化合物、例えば、チトクロームＰ４５０類（Ｍｅｒｃｕｒｉｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２１０，Ｎｏ．２，３５０−３５５，１９９５；Ｍｃｋｉｎｎｏｎら、Ｇｕｔ，３６，２５９−２６７，１９９５）、細胞酸化からの防御に関与する酵素類（Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキサイドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼおよびカタラーゼ：Ａｌｂｅｒｓら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１０９，５０７−５１３，１９９１）および／または求電子体の解毒に関与する酵素類（α−、μ−またはπ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ：Ｓｉｎｇｈら、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，４０，４３１−４３７，１９８５；アルデヒドリダクターゼ：Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，３１２，５３５−５４１，１９９５）も一般にヒト上皮細胞中に見出されるが、上皮細胞中のみではない。
【０００５】
ヒト角膜の上皮細胞は、他のヒト上皮細胞とは、角膜上皮細胞中にのみ見出される化合物、例えば接眼組織（ｏｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ）中に見出される６４ｋＤのサイトケラチンおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８（ｈＧＳＴ５．８：Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３６，１４２−１５０，１９９５；６４ｋＤ：Ｋｉｒｉｔｏｓｈｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．ｖｉｓ．ｓｃｉ．，３２，３０７３−３０７７，１９９１）の発現において異なる。
【０００６】
ヒト角膜上皮細胞におけるある種のサイトカイン類および増殖因子類の、炎症性刺激なしでの、発現の分析はすでにＣｕｂｉｔｔら、Ｗｉｌｓｏｎら、ＫｅｎｎｅｄｙらおよびＤｅ−Ｑｕａｎらによって、測定に基づいて、なされてきた（Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６３，６１−７９，１９９５；Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９５，８２−８８，１９９５；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３３，１７５６−１７６２，１９９２；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３６，３３０−３４０，１９９５；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ．＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３４，３１９９−３２１０，１９９３）。さらに、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍらは角膜細胞のサイトカインプロフィールが角膜のある種の病気の存在を有効に検出するための手段となり得ることを示唆した（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ．＆  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３６，２１５１−２１５５，１９９５）。したがって、角膜上皮細胞中でのある種のサイトカイン類および増殖因子類の発現のプロフィールによって、正常の角膜上皮細胞を他の細胞、特に異常な角膜上皮細胞から特徴づけ、識別することが可能になる。
【０００７】
さらに、目に非炎症性である分子をスクリーニングする方法では実験動物を使用する。ヒトの目とこれらの動物の目との間に実質的な形態学上のおよび生化学上の差異があるという事実を克服するために、Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈらはこれらのスクリーニング試験を角膜の初代（ｐｒｉｍａｒｙ）上皮細胞培養物に対して行うことを提案している（Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．，１３，４５−４８，１９９１）。残念ながら、角膜の初代細胞培養物は、各パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）（継代）が該細胞を合流する（ｂｅｃｏｍｅ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）まで増殖後新鮮な培地中で継代培養することよりなる１回または２回のパッセージの後に増殖することを停止する。さらに、これらの初代細胞は液体窒素中での凍結を越えて生き残れない。
【０００８】
これらの不利な条件を克服するために、ヒト角膜上皮細胞系がＫａｈｎら（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３４，３４２９−３４４１，１９９３）およびＡｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉら（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３６，６１４−６２１，１９９５）によって開発された。しかし残念ながら、これらの細胞系は未だ十分に満足し得るものではない。
【０００９】
実際、Ｋａｈｎらによって開発された細胞系は、約２５の引き続いての培養パッセージに至るまである種のもとの分化特性を保持しており、したがって完全には不死化されていない（Ｋａｈｎら参照）。これらの細胞系も培養培地中にＳＶ４０ウイルスを放出する（Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉらの分析を参照）。最後に、それらがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８、および適当なサイトカインおよび増殖因子プロフィール等の他の分化マーカー、並びに炎症反応に特異的なまたは必要なマーカーを有効に発現するかどうか知られていない。
【００１０】
他方、Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉらによって開発された不死化細胞系は、インビボ角膜再構築試験で重層化することができず（Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉら参照）、またそれらがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８、および適当なサイトカインおよび増殖因子プロフィール等のある種の分化マーカー、並びに炎症反応に特異的なまたは必要なマーカーを発現するかどうか知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は新規な、ヒト角膜の正常な上皮細胞に、潜在的に炎症性の分子をスクリーニングするための試験に有効に使用し得る程度において、遺伝的におよび生理学的に似ている、ヒト角膜上皮細胞系を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、重層化する（ｂｅ  ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ）ことができ、不死化していないヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、不死化していないヒト角膜上皮細胞に特異的な代謝マーカーおよび炎症反応に特異的なマーカーを発現することができる不死化したヒト角膜上皮細胞系に関する。
【００１３】
本発明の別の面は、角膜の細胞の代謝に対するある剤の変異誘発性作用、毒性作用または有益な作用を同定するための新規な方法であって、（１）本発明の細胞系を含有する培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）を、ヒト角膜の細胞の代謝に対し、変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤であると考えられる剤と反応させ、ついで（２）該剤の該細胞系に対する作用を測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）ことを特徴とする新規な方法に関する。
【００１４】
本発明の主題はまた、本発明の不死化したヒト角膜上皮細胞、および該細胞に対し変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤に対する該細胞の代謝応答を測定するための試薬を含有する診断用キットである。
【００１５】
最後に、本発明はまた、角膜細胞の代謝に対して変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤の同定のための方法における、本発明の細胞系の使用、並びにこれらの細胞系の活性薬剤としての使用に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「正常細胞」、「初代細胞」および「不死化されていない細胞」は、大きな損害を与える生理学的または遺伝的欠陥を有していない健康な成人の角膜から集めることができ、もとの分化特性を失うことなしに限られた時間培養することができるヒト角膜上皮細胞を意味する。
【００１７】
他方、「不死化した細胞」なる表現は、細胞が無限に、すなわち２５パッセージより長く、好ましくは少なくとも６０パッセージ、増殖することができるようにする、ＤＮＡ構築物による遺伝子操作を受けた細胞を意味する。
【００１８】
同様に、「パッセージ」（ｐａｓｓａｇｅ）（継代）なる語は、細胞系の合流したまたは飽和した培養細胞の一部を取り、新鮮な培地に接種し、ついで該細胞系を合流または飽和に達するまで培養することよりなる方法を意味する。細胞系はこのように継続的パッセージによって新鮮な培地中で常法に従い培養する。細胞系が、数回の継続的パッセージ後に、そのもとの分化特性を失うかも知れないことに留意すべきである。したがって、多数のパッセージ後でも、好ましくは少なくとも３０〜６０パッセージ後でもその特性が保存される細胞系を持つことができることが非常に有利である。
【００１９】
最後に、「もとの分化特性」なる語は、ヒト上皮細胞上に特異的に見出されるマーカーとヒト角膜の上皮細胞上に特異的に見出される分化マーカーとの両方を意味する。
【００２０】
好ましくは、本発明の不死化したヒト角膜上皮細胞系は腫瘍マーカーを発現しない、すなわち、発ガン遺伝子を有していないか、または該細胞の腫瘍細胞への形質転換のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質または分化した細胞構造および特性を発現しない。これらのマーカーの存在は、例えば、特異的プローブを用いるそれらのＤＮＡのハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって、抗体によって、および／または電子顕微鏡法によって検出し得る。細胞中にマーカーが存在することは、その細胞が、２〜３か月後に、免疫防御のないマウスにガンを与えることができることを意味せず、それらが由来するもとの細胞と比べて細胞のガンのような形質転換された状態を反映している。
【００２１】
好ましくは、本発明の細胞系はウイルスも欠いている、すなわち、Ｋａｈｎらによって開発された細胞系（Ａｒａｋｉ−Ｓａｓａｋｉらのイントロダクション参照）の場合と同様、当初それらを不死化したウイルスを生産することができない。本発明の細胞系は重層化することができる、すなわち連続する層を組織することができる。そのため、本発明の細胞系は、実際、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ2 を含有する無血清培地中で合流するまで培養されなければならず、ついで、実際、例えば、細胞が層に発展するかどうかを目視で観察されなければならない。
【００２２】
また、本発明の細胞系は正常ヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、すなわち上皮細胞に一般に見出されるマーカーを発現する。
【００２３】
これらの特異的マーカーは、例えば、皮膚、目、腸管または肝臓の上皮細胞から得ることができる、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質および／または分化した細胞構造であることができる。好ましくは、本発明のヒト上皮細胞は、ビメンチン、サイトケラチン類、細胞間の結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ）（「接着結合」とも呼ばれる）、チトクロームＰ４５０類、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰ）、グルタチオンリダクターゼ（ＧＲ）、カタラーゼ（ＣＡ）およびアルデヒドリダクターゼ（ＡＲ）よりなる群から選ばれる少なくとも２つのマーカーを発現する。
【００２４】
本発明の細胞系は、細胞酸化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）に関与する酵素（ＳＯＤ、ＧＰ、ＧＲおよびＣＡ）および／または求電子体の解毒に関与する酵素（ＧＳＴおよびＡＲ）を発現することができることも留意されるべきである。かくして、これらの細胞系はヒト角膜の炎症または刺激の現象の研究に特に適している。
【００２５】
本発明の細胞系は、角膜細胞、特にヒト角膜の上皮細胞に特異的な代謝分化マーカー（Ｒｅｉｎｅｒｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１１，９５７−９６３，１９９０参照）をも発現する。これらの分化マーカーは、ｍＲＮＡ、タンパク質または分化した細胞構造であることができる。好ましくは、本発明の細胞系は、６４ｋＤのサイトケラチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８、およびいずれも化合物であるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ  ＣＳＦ−β、ＩＬ−ｒａ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ−βよりなるサイトカインおよび増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）のプロフィールよりなる群から選ばれる少なくとも２つのマーカーを発現する。
【００２６】
本発明の細胞系はまた、炎症反応に特異的な少なくとも１つのマーカー、すなわち、細胞が炎症刺激物質（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ）および／または炎症反応に必要である分子または構造と反応するとき検出され得る分子を発現することができる。
【００２７】
炎症刺激物質は本発明の細胞系を、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種の微生物（Ｋｅｒｎａｃｋｉら、Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０，２８１−２８８，１９９４）、血小板活性化因子ＰＡＦ（Ｂａｚａｎら、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，７６９−７７５，１９９５）、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール（ＴＰＡ：腫瘍促進剤）、ヒスタミン（Ｓｈａｒｉｆら、Ｊ．ＯｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．，１０，６５３−６６４，１９９４）、ブラジキニン（Ｓｈａｒｉｆら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１８，８９−９６，１９９１）または他の炎症性化合物と接触させるときに誘導され得る。
【００２８】
コラゲナーゼＩは細胞系を炎症性刺激物質にさらしたときに容易に検出し得るマーカーである（Ｂａｚａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８６７８−８６８２，１９９３）。他のマーカー、例えばｃ−ｆｏｓ（Ｂａｚａｎら参照）、アラキドン酸中間体（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）１２−ＨＥＴＥおよび１２−ＨＥＴｒＥ（Ｃｏｎｎｅｒｓら、Ｉｎｖｅｓ．Ｏｐｈｔｈ．＆  Ｖｉｓｕ．Ｓｃｉ．，３６，８２８−８４０，１９９５）または新規なサイトカインおよび増殖因子プロフィールも検出し得る。
【００２９】
本発明の細胞系はまた、炎症反応に必要な少なくとも１つのマーカー、例えばブラジキニン受容体、ヒスタミン受容体、ＰＡＦ受容体、およびホスホイノシチド類によるシグナルの形質導入のための系（ホスホイノシチド回転シグナル形質導入法、Ｓｈａｒｉｆら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２，１３１３−１３２０，１９９３）等を発現することができる。
【００３０】
本発明はまた、特に、ブダペスト条約のもとに、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓに、１９９６年１０月２２日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７を付与された本発明の不死化した細胞系に関する。
【００３１】
本発明の上皮細胞系は、有利なことに、多数のパッセージ、特に少なくとも２５パッセージ、好ましくは少なくとも３０〜１００パッセージ後でも、それらのもとの分化特性を保存している。
【００３２】
本発明の細胞系を得るために、ヒト角膜から得られる初代上皮細胞の培養細胞（ｃｕｌｔｕｒｅ）を調製し、該培養細胞に組換えウイルスを感染させ、ついで得られる不死化した細胞を無血清培養培地で培養することが可能である。この目的のため、当業者は利用し得る多数の無血清培養培地を用いることができる。このための案内として、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら（Ｇｕｔ，３５，７９１−７９７，１９９１）、Ｐｆｅｉｆｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５１２３−５１２７，１９９３）、Ｋｕｌｋａｎｉら（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，Ｎｏ．１０，２５１５−２５２１，１９９５）、またはＥＰ９６２０１０６４．１およびＵＳ０８／５７６４８３によって記述された無血清培地を挙げることができる。本方法の必要性に完全に適合する無血清培地はＫＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＵＳ）である。
【００３３】
好ましくは、以下の工程が用いられる：
（１）ヒト角膜の上皮細胞の試料を得、
（２）この試料について、そのインビトロ培養の目的のための準備をし、
（３）該上皮細胞を細胞の付着およびその増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を容易にする皮膜（ｃｏａｔｉｎｇ）を有する培養平板（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）上の無血清培養培地中に接種し、
（４）培地を、合流増殖を最適化するために必要な多くの回数、交換し、
（５）細胞に組換えウイルスを感染させ、ついで
（６）不死化した細胞を無血清培養培地中で培養する。
【００３４】
さらに詳しくは、段階１）は外科的な行為を通して正常な個人からの角膜細胞の試料を得ることに関する。段階２）において、試料を培養培地で洗い、寸断し、ついで上皮部分を他の組織から物理的および／または化学的手段によって分離することができる。例えば、組織断片をプロテアーゼを含有する溶液中に、細胞の分離を達成するのに十分な時間、保持する。
【００３５】
段階３）において、上皮細胞を無血清培養培地中に接種することができる。培養プレートは、例えば０．０１〜１％ゼラチン溶液よりなる皮膜を有する。
【００３６】
段階４）において、上皮細胞を含有する培養培地を合流増殖を最適化するために必要な多くの回数で交換する。好ましくは、培地を２日毎に取り替える。一般に接種から１０〜１４日で起こる、利用し得る表面積の９０％の程度の合流に達したら、プロテアーゼ溶液での処理によって細胞を分離する。
【００３７】
段階５）において、分離した細胞を新鮮な培養培地に移し、ついで細胞に、常法に従って、組換えウイルスを感染させる。当業者は多くのトランスフェクション技術を利用することができる。例えば、ＷＯ９６／０７７５０に記載された技術、Ｃｌａｕｄｉａ  Ｃｈｅｎら（Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２７４５−２７５２，１９８７）による技術、またはＷｉｌｓｏｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２６，２１２−２２０，１９９５）による技術を挙げることができる。
【００３８】
好ましくは、Ｔ抗原（Ｔ−Ａｇ）、不活性化したウイルス複製起点および選択し得る遺伝子を含有する組換えＳＶ４０ウイルスを用いる。例えば、Ｓｔｏｃｋｓｈｌａｅｄｅｒらによって記載された、その配列をＧｅｎｅＢａｎｋデータバンク［アクセスＮｏ．（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｍ６４７５３；Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２，３３−３９，１９９１］から入手し得る、ＤＮＡ構築物ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０＋を用いることができる。
【００３９】
他の適当なベクターは、当業者が、Ｔ−Ａｇをコードする遺伝子、選択し得る遺伝子および／または不活性化したウイルス複製起点を含有する、商業上入手し得るベクターからまったく容易に構築できる。例を挙げると、ＳＶ４０のＢｇ１Ｉ−ＨｐａＩ断片の末端にＢａｍＨＩ部位を作り、ついでこの断片を、下記図１に記載されたプラスミドｐＺＩＰＳＶＵ１９のＢａｍＨＩ部位にクローン化することによって、およびＪａｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，１６７２−１６８１，１９８９によって、構築物ｐ１／ＳＶ４０Ｕ１９を調製することができる。
【００４０】
段階６）において、上皮細胞を上述の皮膜を有する培養プレート上の新鮮な増殖培地に移す。
【００４１】
本発明の上皮細胞系の新たなおよびもともとの性質を知ることによって、免疫学的、薬理学的および毒物学的研究におけるそれらの適用を思い描くことができる。
【００４２】
かくして、本発明の細胞系は、例えば、（１）本発明の細胞系を含有する培養細胞を、角膜の細胞の代謝に対し、変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤であると考えられる剤と反応させるか、該培養細胞を培養して該剤と接触させるか、または該培養細胞を該剤と接触させ、ついで（２）該剤の該細胞系に対する作用を決定するかまたは測定することを特徴とする方法において、角膜の細胞の代謝に対して変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤をスクリーニングするのに特に適している。
【００４３】
したがって、本発明の上皮細胞、および変異誘発性の、有毒なまたは有益な剤に対する該細胞の免疫応答を測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）ための試薬を含有する診断用キットを調製することも考えることができる。
【００４４】
本発明の細胞系はまた、組換えタンパク質の発現にも適合させることができる。外来ＤＮＡのトランスフェクションの方法は現在当業者に周知である（例えば、ＷＯ９４／０５４７２参照）。
【００４５】
本発明の細胞系はまた、生体外遺伝子療法における潜在的有用性を有している。これらの細胞系は、実際、療法適用の目的から興味ある遺伝子を発現する組換え細胞を開発する適当な道具を構成するかも知れない。本発明の細胞系によってもたらされるさらなる利点は、それらが動物血清にさらされないことであり、このことはウイルスや他の病原性剤による潜在的汚染の危険をかなり減ずる。
【００４６】
【実施例】
本発明を、以下に示す本発明の細胞系の調製の実施例に関するさらなる記述の助けを借りて、より詳しく下記に記述する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の主題の例示のために記述するものであって、それらへの限定を何等示すものではないことは言うまでもない。細胞系の培養、ＳＶ４０ベクターの調製、トランスフェクション、ＤＮＡプライマーおよびプローブの調製、およびマーカーの発現の分析は、他に注記がなければ、上述の参考文献に記載された操作やＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）によるマニュアルに記載された操作に従って行われる。パーセンテージは、他に注記がなければ、重量によるものとする。
【００４７】
実施例１
ＳＶ４０Ｂｇ１Ｉ−ＨｐａＩ断片の末端にＢａｍＨＩ部位を創出しかつこの断片を、Ｊａｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，１６７２−１６８１，１９８９によって記述されたプラスミドｐＺＩＰＳＶＵ１９のＢａｍＨＩ部位中にクローン化することによってプラスミドｐ１／ＳＶ４０Ｕ１９を構築する。案内として、図１に概略的に提示したベクターｐＺＩＰＳＶＵ１９は選択し得るマーカーとしてネオマイシン、およびモロニーウイルスＬＴＲを含有している。
【００４８】
該ＳＶ４０ウイルスはＬｙｎｃｈおよびＭｉｌｌｅｒ操作の改良法によって調製する（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３８８７−３８９０，１９９１）。そのため、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）細胞系Ｐｓｉ２（Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９，１９８３）および両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）細胞系ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９０７８）を１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，ＵＳＡ）中、３７℃で、５％ＣＯ2 を含有する雰囲気下で培養する。これらの細胞系を、２５０ｍＭＣａＣｌ2 および１０μｇのプラスミドｐ１／ＳＶ４０Ｕ１９を用いて、別々に、常法に従って、トランスフェクトし、４８時間のインキュベイション後トリプシンでの処理に付し、両者を等量で混合し、ついで全体を、３７℃で、５％ＣＯ2 を含有する雰囲気下で培養する。８０％の合流に増殖後、該ウイルスを無血清培地ＫＧＭ−１（さらに０．１５ｍＭＣａＣｌ、３０μｇ／ｍｌウシ下垂体エキス、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌネズミ表皮増殖因子（ＥＧＦ）、１００００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含有する、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＵＳからのＫＢＭ培地）で回収する。濾過（０．４５μｍ、ミクロポア）後、ウイルスの量をＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）について測定する。
【００４９】
初代角膜上皮細胞は心筋梗塞で死亡した７３才のドナーについての目の生検（ｂｉｏｐｓｙ）によって得た。試料をリン酸緩衝液ＰＢＳで洗浄し、ついで、５０％のＫＧＭ−２培地（＝ＫＢＭ＋０．０５ｍＭＣａＣｌ2 、３０μｇ／ｍｌウシ下垂体エキス、１０ｎｇ／ｍｌネズミ表皮増殖因子、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．０５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５μｇ／ｍｌインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）を含有する緩衝液中、４℃で２４時間、１０Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）ＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｎｏ．２９５８２５）で処理した。インキュベーション後、細胞を手先で（ｍａｎｕａｌｌｙ）分離し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地、ＵＳ）で洗浄し、遠心分離し、ペレットをＫＧＭ−２培地に取り、ゼラチンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ２５００）の０．１％溶液中で予め前インキュベートした培養平板（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）上に散布する。平板を、１００％相対湿度、９５％酸素および５％二酸化炭素よりなる雰囲気下に、３７℃でインキュベートする。上皮細胞を含有する培養培地を合流増殖を最適にするのに必要な多くの回数交換する。
【００５０】
２週間の培養後９０％の程度の合流に達したら、細胞を常法的にｄｉｓｐａｓｅＩＩの溶液で処理することによって分離する。分離した細胞をついでＫＧＭ−１培地に移し、培養平板中でゼラチンＡの０．１％溶液を用いて前インキュベートする。ついで培養細胞を、８μｇ／ｍｌポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）および上述のようにして調製した高組換えＳＶ４０ウイルス力価（１０5 〜１０7 ＣＦＵ）の存在下に、感染させる。ウイルスとの２時間のインキュベイション後に、培養細胞をＰＢＳで洗浄し、引き続いてのパッセージ、新鮮なＫＧＭ−１培地中で、各パッセージでＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ  Ｎｏ．３２５）で細胞を引き続き洗うよう注意しながら、培養する。ついで、細胞を、２．４Ｕ／ｍｌのｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ、５０％ＨＢＳＳ緩衝液および５０％ＫＢＭ培地を含有する溶液中、３７℃で１〜２時間の処理によって、分離し、ＫＢＭ培地中に回収し、遠心分離し、ペレットをＫＢＭ−１培地中に取り、新鮮な新たな平板上に散布する。
【００５１】
引き続いてのパッセージによって、形質転換された細胞を初代上皮細胞から精製する。ついで、上記でｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩによって分離した形質転換細胞を培養培地で希釈することによって、９つの個別化した不死化したヒト角膜上皮細胞系を選択することができた。そのうちの１つは、ブダペスト条約の下に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓに、１９９６年１０月２２日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７を付与された。
【００５２】
１．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７株の核型の分析
ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７株の核型の分析は“Ｃｈｉｌｄｒｅｎ´ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ”，３９０１  Ｂｅａｕｂｉｅｎ  Ｂｌｖｄ，デトロイトによって、マニュアル“Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ”、Ｅｄｔｓ：Ｒｏｏｎｅｙ  ＤＥ，Ｃｚｅｐｕｌｋｏｗｓｋｉ  ＢＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６に記載された方法に従って行った。結果は、該細胞系がそのゲノム中に染色体の各対の１つの染色体をそっくりそのまま保存していることを示している。細胞系の性はＸＸであった。
【００５３】
２．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７株の腫瘍発生能
３３番目のパッセージで得たＣＮＣＭ  Ｉ−７７７細胞系の１０7 個の細胞を免疫防御を有さない（「ヌード」）マウスに、Ｓｔａｕｆｆｅｒらによって記述された操作（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１６９，１９０−１９６，１９９５）に従って、注入する。数か月後に、腫瘍発生は認められない。
【００５４】
４．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系のウイルス汚染
ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系が肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）およびエイズ（Ａｉｄｓ）ウイルス（ＨＩＶ−１）によって汚染されているかどうかを決定する。下記実験の結果はこれら３種のウイルスの存在について陰性である。
【００５５】
ＨＢＶの分析については、ＤＮＡを約２×１０6 個の細胞から、フェノールおよびクロロホルム溶液で処理することによって、抽出し、ついでエタノールによって沈殿させる。ついでＤＮＡ試料を該ウイルスのプレコア（ｐｒｅ−ｃｏｒｅ）領域（Ｌｙｎｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，３８８７−３８９０）に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付す。ついで増幅生成物をアガロースゲルで分離し、ＵＶ下に臭化エチジウムの存在下に視覚化する。比較のために、１０〜１０5 のＨＢＶ（Ａｎａｗａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ６Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＵＳＡ）を含有する血清の希釈液を、並行して、同様にして分析する。
【００５６】
ＨＩＶ−１の分析については、上述のＤＮＡ試料を該ウイルスのＧＡＧ領域に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付す。ついで増幅生成物をアガロースゲルで分離し、ＵＶ下に臭化エチジウムの存在下に視覚化する。比較のために、１０〜１０5 のＨＩＶ−１（Ａｎａｗａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ６  Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＵＳＡ）を含有する血清の希釈液を、並行して、同様にして分析する。
【００５７】
ＨＣＶの分析については、そのＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）によって、約２×１０6 個の細胞から抽出する。逆転写は常法に従って行い、得られる相補ＤＮＡを該ウイルスの非コード５´領域に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付す。ついで増幅生成物をアガロースゲルで分離し、ＵＶ下に臭化エチジウムの存在下に視覚化する。比較のために、１０〜１０5 のＨＣＶ（ＡｎａｗａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ６  Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＵＳＡ）を含有する血清の希釈液を、並行して、同様にして分析する。
【００５８】
５．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系のためのヒト上皮細胞に特異的なマーカー類５．ａ．サイトケラチン類
２２番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の培養液の細胞を１００％冷メタノール溶液によってガラス平板上に付着させ、ついでプレートを０．０５ＭトリスｐＨ８．６、１．８％ＮａＣｌおよび０．２％ポリエチレングリコール２０００を含有する緩衝液（ＴＮＰ緩衝液）で洗浄する。ついで細胞をある種のサイトケラチン類（抗ＣＨペプチド４、７、８、１３、１４、１７、１８、１９、２０、ＳｉｇｍａおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に特異的なマウス抗体の存在下に３０分インキュベートする。０．５％ＢＳＡを含有するＴＮＰ緩衝液で３回洗浄後、平板を、免疫蛍光化合物を含有するヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：３００、ＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ；Ｂｉｏｓｙｓ）と共に６０分インキュベートする。上記緩衝液で３回洗浄後、平板を固定し、蛍光顕微鏡法によって分析する。すべての細胞はサイトケラチン類４、７、８、１３、１４、１７、１８、１９に対して陽性である。
【００５９】
５．ｂ．ビメンチン
２２番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の培養物の細胞を上記と同様にして付着させる。付着させた細胞をマウス抗ビメンチン抗体（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）に付し、ついで上記ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体に付す。蛍光顕微鏡法によって、すべての細胞はビメンチンに対して陽性である。
【００６０】
５．ｃ．細胞間結合
２２番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の細胞をガラス平板で合流するまで培養し、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の２．５％グルタルアルデヒド溶液で室温で１時間処理することによって固定する。同じリン酸緩衝液で２回洗浄後、細胞を同じ緩衝液中の２％ＯｓＯ4 溶液で再度固定する。細胞を、ついで、引き続いての各３０、５０、７０、９０および１００％エタノール溶液（Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）で脱水し、細かい金の層（ＳＥＭ  Ｃｏａｔｉｎｇｕｎｉｔ  Ｅ５１００，Ｐｏｌａｒｏｎ）で被覆する。ついで細胞を電子顕微鏡法（Ｐｈｉｌｉｐｓ５０５  ＳＥＭ）によって検査する。分析は細胞が上皮細胞の特性である細胞間結合（「接着結合」）を有していることを示している。
【００６１】
５．ｄ．チトクロームＰ４５０
３０番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の細胞によるチトクローム類の発現を、異なるチトクロームＰ４５０類に特異的なＤＮＡプライマーを用いる既知のＲＴ−ＰＣＲ技術の助けを借りて分析する。これらのプライマーは、ＧｅｎｅＢａｎｋデーダベースから利用し得る、異なるチトクローム類のＤＮＡ配列（ＣＹＰ１Ａ１：アクセス（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｎｏ．Ｘ０２６１２；ＣＹＰ２Ｃ：アクセスＮｏ．Ｍ６１８５５またはＭ６１８５８またはＭ６１８５６またはＭＭ６１８５４；ＣＹＰ２Ｄ６：アクセスＮｏ．Ｍ３３３８８；ＣＹＰ１Ａ２：アクセスＮｏ．Ｚ０００３６）から常法により調製した。
【００６２】
そのため、該細胞を３５ｍｍ皿（Ｃｏｓｔａｒ）上で合流するまで培養し、そのＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）の助けを借りて抽出し、逆転写を行い［ＲＴ−ＰＣＲ用１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（一重鎖ｃＤＮＡ合成キット），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ］、得られる相補ＤＮＡを異なるチトクロームＰ４５０類に特異的なＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付し、増幅生成物をアガロースゲルで分離し、ついでＵＶ下に臭化エチジウムの存在下に視覚化する。結果は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞がチトクロームＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６を発現することを示している。
【００６３】
５．ｅ．細胞酸化および求電子体の解毒に関与する酵素
３０番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の細胞を培養し、そのＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）によって抽出し、ついでこのＲＮＡについて、Ｃｕ／Ｚｎ−スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンパーオキシダーゼ（ＧＰ）、カタラーゼ（ＣＡ）およびπ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（πＧＳＴ）を部分的にコードするＤＮＡプローブを用いて、ノーザンブロットを行う。これらのＤＮＡプローブは、ＧｅｎｅＢａｎｋデーダベースから利用し得る、これらの酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（πＧＳＴ：アクセスＮｏ．Ｘ０８０５８；ＧＰ：アクセスＮｏ．Ｍ２１３０４；ＣＡ：アクセスＮｏ．Ｍ８１５７８；ＳＯＤ：アクセスＮｏ．７２９３３６）から常法に従って調製する。これらの試験の結果は、すべての細胞がＳＯＤ、ＧＰ、ＣＡおよびπＧＳＴ活性をコードする遺伝子の転写を発現することを示している。
【００６４】
さらに、グルタチオンリダクターゼの発現も、Ｇｏｎｄｈｏｗｉａｒｄｊｏによって記述された酵素試験（Ｃｏｒｎｅａ，１２，３１０−３１４，１９９３）によって確認される。カタラーゼ活性も、Ａｅｂｙらによって記述された酵素試験（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０５，１２１−１２６，１９８４）によって確認される。最後に、アルデヒドリダクターゼ活性も、Ｅｌｌｉｓらによって記述された酵素試験（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３１２，５３５−５４１，１９９５）によって実証される。
【００６５】
６．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系についての角膜の上皮細胞に特異的なマーカー
６．ａ．６４ｋＤのサイトケラチンの発現
上述のサイトケラチン類の分析については、細胞を１００％冷メタノール溶液によってガラス平板に付着させ、ついで平板をＴＮＰ緩衝液（既述）で洗浄する。細胞を６４ｋＤサイトケラチンに特異的なマウス抗体（ＡＥ５抗体、ＩＣＭ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，ＵＳ）の存在下に３０分インキュベートする。０．５％ＢＳＡ含有ＴＮＰ緩衝液で３回洗浄後、該平板を、免疫蛍光化合物を含有するヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：３００，ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ；Ｂｉｏｓｙｓ）と共に３０分インキュベートする。上記緩衝液で３回洗浄後、平板を固定し、蛍光顕微鏡法によって分析する。該細胞は６４ｋＤサイトケラチンに対して陽性である。
【００６６】
６．ｂ．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８の発現
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８の発現をＳｉｎｇｈａｌらによって記載された試験（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３６，１４２−１５０，１９９５）によって分析する。手短には、１０μｇ／ｍｌのＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の細胞質エキスを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５中の０．１ｍＭ４−ヒドロキシノネナール（４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ）および０．５ｍＭグルタチオンと混合し、ついで酵素活性を混合物における２２４ｎｍでの吸収の変化によって測定する。結果は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｈＧＳＴ５．８活性を発現することを示している。
【００６７】
６．ｃ．サイトカイン類および増殖因子の発現のプロフィール
３０番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系の細胞を培養し、そのＲＮＡを抽出し、ついで、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ  ＣＳＦ−β、ＩＬ−ｒａ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ−βであるサイトカイン類および／または増殖因子類をコードするＲＮＡ類の転写を確認するために、このＲＮＡについて異なるプライマーを用いてＰＣＲを行う。
【００６８】
これらのプライマーはこれらの化合物をコードする遺伝子の部分に相当し、これらの遺伝子のＤＮＡ配列はＧｅｎｅＢａｎｋデータベース上でアクセスできる（アクセスＮｏ．ＴＮＦα：Ｘ０２９１０；ＩＬ−１β：Ｍ１５８４０；ＩＬ−１α：Ｍ１５３２９；ＩＬ−６：Ｍ１４５８４、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、Ｉｎｖ．Ｏｐｔｈ．＆  Ｖｉ．Ｓｃ．，３６，２１５１−２１５５，１９９５；ＩＬ−８：Ｍ２８１３０；ＧＭ  ＣＳＦ−β：Ｘ０３０２１；ＩＬ−ｒａ：Ｍ９７７４８、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖ．，９５，８２−８８，１９９５；ＴＧＦ−β１：Ｘ０２８１２、Ｎｉｓｈｉｄａら、Ｃｕｒｒ．ＥｙｅＲｅｓ．，１４，２３５−２４１，１９９５；ＴＧＦ−β２：Ｙ０００８３；ＴＧＦα：Ｍ２２４４０；ＥＧＦ：Ｌ１７０３２；ＰＤＧＦ−β：Ｘ０２８１１）。
【００６９】
比較のために、該ヒト角膜の上皮組織から得られるＲＮＡについて、該サイトカイン類および増殖因子の発現のプロフィールの同様な分析を行う（４つの異なる生検）。
【００７０】
結果を下記表１に示す。＊なる記号は、化合物ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の発現を、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞培養培地を用いるＥＬＩＳＡ試験によっても確認したことを示している。これらの異なるサイトカイン類に対し特異的な抗体は商業上入手し得る（ＩＬ−１β、ＴＮＦα：ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒ．，ＵＳ，カタログＮｏ．ＫＨＣ００１２およびＫＨＣ３０１３；ＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＩＬ−８：ＣＬＢ  ｃｏｒｐ．，ＵＳ，カタログＮｏ．Ｍ１９０１、Ｍ１９１６、Ｍ１９１８）。
【００７１】
【表１】
0004376978.tif 000002
【００７２】
７．ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系についての炎症反応に特異的なマーカー
７．ａ．コラゲナーゼＩ
コラゲナーゼＩは、その発現が角膜細胞の炎症の正常な状態を特徴付ける分子である。コラゲナーゼの発現はＰＣＲによって、ウェスタンブロッティングによってまたはエライサによって検出することができる。
【００７３】
コラゲナーゼＩをＰＣＲによって検出するために、２９番目のパッセージで取った、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡの存在下に１６〜２４時間培養し、そのＲＮＡを抽出し、ついでコラゲナーゼＩのｍＲＮＡの存在を、コラゲナーゼＩのＤＮＡ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｎｏ．Ｘ０５２３１）に由来するプライマーを用いるＰＣＲによって検出する。
【００７４】
ウェスタンブロッティングによってコラゲナーゼＩを検出するために、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡの存在下に１６〜２４時間培養した後、培養培地を回収し、それをＡｍｉｃｏｎ３０TMを用いて濃縮し、タンパク質をＳＤＳ−Ｐａｇｅポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、それらをウェスタンブロッティングによってフィルター上に移行させ、フィルターを第１抗コラゲナーゼＩ抗体（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ＵＳ，Ｎｏ．６０３３８Ｐ）、パーオキシダーゼにカップリングさせた第２抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳ，Ｎｏ．３１４００）ついでパーオキシダーゼ基質に付す。
【００７５】
エライサによってコラゲナーゼＩを検出するためには、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｈＭＭＰ−１キット（カタログ、ｒｐｎ２６１０）を、その供給者の勧めに従って、使用すれば良い。
【００７６】
結果は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞を炎症処理に付す場合に、コラゲナーゼＩの発現を検出し得ることを示している。他方、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞をＴＰＡと接触させない場合には、ＰＣＲ、ウェスタンブロッティングまたはエライサによって検出し得るコラゲナーゼＩを発現しない。
【００７７】
７．ｂ．炎症反応に必要なマーカー
ブラジキニン、ヒスタミンおよびＰＡＦ受容体、およびホスホイノシチド類の形質導入のための系は、生理的に炎症の正常な状態にあるＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞系について本質的なマーカーである。これらのマーカーの存在を検出するために、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞またはヒト角膜の一次上皮細胞を、ホスホイノシチド類による炎症シグナルの形質導入のための系とカップリングした受容体と相互作用すると考えられる炎症性化合物の存在下に、インキュベートし、ついで生成したリン酸イノシトール（ＩＰ）分子の濃度を測定する。ＩＰの蓄積は、実際、炎症性化合物についての受容体の存在に特有なことである。
【００７８】
試験は、Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０，６５３−６６４，１９９４およびＮｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２，１３１３−１３２０，１９９３に記載されたＳｈａｒｉｆｓらの操作に基づいている。手短に言うと、２４穴を有するプレート上で、各穴当り約２．５×１０5 個のＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞を、ＤＭＥＭ培地中、［ 3Ｈ］ミオイノシトール（１μＣｉ／０．５ｍｌ；１５−１７Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）の存在下、３７℃で２４時間培養する。穴から培地を吸い出し、細胞を、１０ｍＭのＬｉＣｌ、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、および異なる濃度の、ブラジキニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳ）、ヒスタミン（Ｓｉｇｍａ  ＵＳ）またはＰＡＦ（ＢｉｏＭｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．，ＵＳ）を含有するＤＭＥＭ培地に、３７℃で６０分さらす。反応を停止するため、培地を吸い出し、０．１Ｍギ酸を穴に加える。その後、細胞を溶かし、溶解細胞液の化合物をイオン交換カラム（ＡＧｌ×８樹脂、ＥｃｏｎｏRTカラム、Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳ）で分離し、脱イオン水１０ｍｌおよび５０ｍＭギ酸アンモニウム溶液でカラムを溶出し、溶出画分によって放出された放射能の量をシンチレーションカウンターで測定する。
【００７９】
結果をＳｈａｒｉｆらによって記載された方法（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１８，８９−９６，１９９１）に従って分析する。ＥＣ５０値は、ホスホイノシチド類の形質導入のための系の最大活性の５０％を刺激するのに要する化合物の濃度と定義される。
【００８０】
図２、３および４に示された結果は、ＣＮＣＭ  Ｉ−１７７７細胞がブラジキニン受容体、ヒスタミン受容体およびＰＡＦ受容体を有していること、および該細胞がヒト角膜の初代上皮細胞と同様に行動することを示している。
【００８１】
実施例２
実施例１に記載したようにして、１０６パッセージで得たＣＮＣＭ  Ｉ−７７７細胞系の、不死化していないヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、ヒト角膜の不死化していないヒト上皮細胞に特異的な代謝分化マーカー、および炎症反応のためのマーカーを発現する能力を分析する。結果は実施例１に示した結果と同様であった。
【００８２】
実施例３
実施例１に記載したようにして、実施例１で選択した他の細胞系の、不死化していないヒト上皮細胞に特異的な代謝マーカー、ヒト角膜の不死化していないヒト上皮細胞に特異的な代謝分化マーカー、および炎症反応のためのマーカーを発現する能力を分析する。これらすべての細胞系について、結果は実施例１に示した結果と同様であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト角膜の初代上皮細胞を不死化するように意図されたベクターｐ１／ＳＶ４０Ｕ１９を調製するのに用いたプラスミドｐＺＩＰＳＶＵ１９の概略図である。
【図２】ヒト角膜の初代上皮細胞およびＣＮＣＭ細胞による［ 3Ｈ］ホスホイノシチド類の蓄積パーセンテージを、適用されたブラジキニン濃度の関数として、示す。
【図３】ヒト角膜の初代上皮細胞およびＣＮＣＭ細胞による［ 3Ｈ］ホスホイノシチド類の蓄積パーセンテージを、適用されたヒスチジン濃度の関数として、示す。
【図４】ヒト角膜の初代上皮細胞およびＣＮＣＭ細胞による［ 3Ｈ］ホスホイノシチド類の蓄積パーセンテージを、適用されたＰＡＦ濃度の関数として、示す。
【図１】
0004376978.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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