(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり、ここで、
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し、且つ、第２の結合ドメインは前記第１の分子とは異なる第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは前記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、
及びここで、
該多重特異性抗体は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側では同一であって、前記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可変ドメインを含むか又は第２の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第１の結合ドメインは前記第１の分子に結合し、前記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメインを含むか又は第１の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第２の結合ドメインは前記第２の分子に結合し、
工程：
（ｉ）前記ポリペプチドと軽鎖をコードしている核酸を含む宿主細胞を培養すること、ここで該核酸が発現され且つ該ポリペプチドと軽鎖が生産され；及び
（ｉｉ）該宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸又は前記第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインをコードしている核酸、又は両方が、コードされたアミノ酸配列を変更するような核酸の変更により提供される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、又は両方のマルチマー化ドメインをコードしている核酸が、前記第１及び／又は第２のポリペプチドのそれぞれの該マルチマー化ドメインが、前記第１及び／又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含むように変更される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み、該方法は工程（ｉ）の前に：
より大きな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に隆起を生成するように核酸を置換することによって該第１のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、および
より小さな側鎖容量を有する移入残基でアミノ酸残基を置換することによってコードされたポリペプチドのマルチマー化ドメイン中に相補的な空洞を生成するように核酸を置換することによって該第２のポリペプチドをコードしている核酸を用意すること、をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ファージディスプレー選択によって、隆起を有するマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプチド、空洞を有するマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチド、又は両方をコードする核酸を準備する請求項４記載の方法。
【請求項６】
より大きな側鎖容量を有する移入残基が、アルギニン(Ｒ)、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)、イソロイシン(Ｉ)及びロイシン(Ｌ)からなる群から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
より小さい側鎖容量を有する移入残基が、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ)からなる群から選択され、且つ該移入残基がシステイン(Ｃ)ではない、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ抗体定常ドメインを含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ＣＨ３ドメインとＩｇＧ定常ドメインからなる群から選択される抗体定常ドメインを含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該多重特異性抗体が免疫付着因子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）に先行する工程をさらに含み、ここで前記核酸が宿主細胞内に導入される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２の異なる結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここで
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し、且つ、第２の結合ドメインは前記第１の分子とは異なる第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは前記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、
及びここで、
前記多重特異性抗体は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側では同一であって、前記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可変ドメインを含むか又は第２の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第１の結合ドメインは前記第１の分子に結合し、前記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメインを含むか又は第１の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第２の結合ドメインは前記第２の分子に結合する、多重特異性抗体。
【請求項１５】
該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメイン又は該第２のポリペプチドのマルチマー化ドメイン、又は両方が、アミノ酸の変更により提供される請求項１４記載の多重特異性抗体。
【請求項１６】
前記第１又は第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインが、前記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含む請求項１５記載の多重特異性抗体。
【請求項１７】
前記ポリペプチドのマルチマー化が、空洞への隆起相互作用を含み且つ該第１のポリペプチドのマルチマー化ドメインが隆起を含み且つ第２のポリペプチドのマルチマー化ドメインが相補的な空洞を含む請求項１５記載の多重特異性抗体。
【請求項１８】
該隆起と空洞が、天然存在アミノ酸が該第１及び第２のポリペプチド中に移入される置換によって生成される請求項１７記載の多重特異性抗体。
【請求項１９】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１４記載の多重特異性抗体。
【請求項２０】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１９記載の多重特異性抗体。
【請求項２１】
請求項１４記載の多重特異性抗体とキャリアとを含んでいる組成物。
【請求項２２】
請求項１４記載の多重特異性抗体をコードしている核酸を含む宿主細胞。
【請求項２３】
宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
第１の分子に結合する第１の結合ドメインと、第１の分子とは異なる第２の分子に結合する第２の結合ドメインを含む多重特異性抗体の製造方法であり：
（ａ）第１の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第１のポリペプチドをコードしている第１の核酸を選択すること、及び第２の重鎖可変ドメインとマルチマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードしている第２の核酸を選択すること、ここで該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なっており、且つ前記第１及び第２のポリペプチドのそれぞれのマルチマー化ドメインは、前記第１及び第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのアミノ酸残基と特異的に相互作用するアミノ酸残基を含み、それによって該第１及び第２のポリペプチド間に安定な相互作用を生成する；
（ｂ）第１の軽鎖可変ドメイン-コード化核酸と第２の軽鎖可変ドメイン-コード化核酸を選択すること、ここで前記多重特異性抗体は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側では同一であって、前記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可変ドメインを含むか又は第２の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第１の結合ドメインは前記第１の分子に結合し、前記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメインを含むか又は第１の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第２の結合ドメインは前記第２の分子に結合する；
（ｃ）前記ポリペプチドと軽鎖をコードしている核酸を宿主細胞中に導入すること、及び該細胞を、該核酸が発現され且つ該ポリペプチドと軽鎖が生産されるように培養すること；
（ｄ）該細胞培養物から多重特異性抗体を回収すること、
を含む方法。
【請求項２５】
該第１のポリペプチドをコードしている前記第１の核酸、該第２のポリペプチドをコードしている前記第２の核酸、又は両方が、コードされたアミノ酸配列を変更するように変えられた核酸から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該第１及び第２のポリペプチドが、空洞への隆起相互作用によって相互作用する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該第１の核酸、該第２の核酸、又は両方が、そのコードされたアミノ酸配列中にフリーのチオール含有残基を移入するように変更される請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
該第１及び第２のポリペプチドが抗体定常ドメインをそれぞれ含む請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
抗体定常ドメインがＣＨ３ドメインである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
抗体定常ドメインがヒトＩｇＧからのものである請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドの混合物からヘテロマルチマー多重特異性抗体の形成を測定する方法であり、ここで該多重特異性抗体は少なくとも２の結合ドメインを含み、ここで
第１の結合ドメインは第１の分子に結合し、且つ、第２の結合ドメインは第２の分子に結合し、
それぞれの結合ドメインは、（ｉ）マルチマー化ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である重鎖可変ドメイン及び（ｉｉ）軽鎖の可変ドメインを含み、
該第１の結合ドメインは、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変ドメインを含み、該第２の結合ドメインは、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変ドメインを含み、且つ該第１及び第２の重鎖可変ドメインは異なり、及び
該ポリペプチドは前記マルチマー化ドメインの相互作用によってマルチマー化され、ここで前記第１又は第２のポリペプチドのぞれぞれのマルチマー化ドメインは、前記第１又は第２のポリペプチドの他方のマルチマー化ドメインのフリーのチオール含有残基とジスルフィド結合を形成するフリーのチオール含有残基を含み、
及びここで、
前記多重特異性抗体は、第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内側では同一であって、前記第１の結合ドメインが第１の軽鎖可変ドメインを含むか又は第２の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第１の結合ドメインは前記第１の分子に結合し、前記第２の結合ドメインが第２の軽鎖可変ドメインを含むか又は第１の軽鎖可変ドメインを含むかにかかわらず前記第２の結合ドメインは前記第２の分子に結合し、
工程：
（ａ）それぞれの多重特異性抗体をゲルマトリックスにおいて移動させること；及び
（ｂ）該第１及び第２ポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を有する多重特異性抗体に対応するバンドと、該第１及び第２のポリペプチド間に非天然存在ジスルフィド結合を欠いているヘテロマルチマーに対応する、遅く移動するバンドの相対量を測定すること、を含む方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドのマルチマー化が、該マルチマー化ドメイン間の空洞への隆起相互作用によって促進される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該多重特異性抗体が第１の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１の軽鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインとは互いに異なるが、互いに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ(Ｍｐｌ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３８】
抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ(Ｍｐｌ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項１４記載の多重特異性抗体。
【請求項３９】
請求項３８記載の多重特異性抗体と担体を含む組成物。
【請求項４０】
該多重特異性抗体が、抗-ヒトレプチンレセプターＥＣＤ(Ｏｂ-Ｒ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３及び抗-ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼ(Ｍｐｌ)／抗-ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３からなる群から選択される請求項２２記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法発明の分野本発明は、ヘテロマルチマー重鎖成分および共通する軽鎖成分を有する多重特異性抗体の作製方法に関する。このような多重特異性抗体として、二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因子、ならびに本発明の方法を使用して作製される抗体−免疫付着因子キメラおよびヘテロマルチマーポリペプチドなどが挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、インビトロおよびインビボでの免疫診断および治療に必要な標的化薬剤として、そして診断的な免疫アッセイに必要な標的化薬剤としての広範囲の診療適用における大きな可能性を有している。
【０００３】
診断領域において、二重特異性抗体は、細胞表面分子の機能的特性を探る際に、そして細胞傷害性を媒介する様々なＦｃレセプターの能力を明らかにする際に非常に有用である(Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１〜１２４(１９９２))。Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１〜１１（１９９０）は、ＢｓＡｂに関する他の診断適用を記載する。特に、ＢｓＡｂは、酵素免疫アッセイで使用される酵素を固定化するために構築することができる。これを達成するために、ＢｓＡｂの一方のアーム（腕）は、酵素表面の特定のエピトープに結合するように設計することができ、その結果、結合による酵素阻害は生じない。ＢｓＡｂのもう一方のアームは、所望の部位において高い酵素密度を確実にする固定化マトリックスに結合する。そのような診断的ＢｓＡｂの例には、表面抗原を探し出すために使用された、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１〜１４７３(１９６８)によって記載されたウサギ抗ＩｇＧ／抗フェリチンＢｓＡｂが含まれる。
【０００４】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ならびにホルモンに対する結合特異性を有するＢｓＡｂもまた開発されている。ＢｓＡｂに関する別の可能な免疫化学的適用には、二部位免疫アッセイにおけるその使用が含まれる。例えば、分析対象タンパク質の表面にある２つの異なるエピトープに結合する２つのＢｓＡｂか作製されている−一方のＢｓＡｂは複合体を不溶性マトリックスに結合させ、もう一方は指示酵素と結合する(Ｎｏｌａｎら（上記）を参照)。
【０００５】
二重特異性抗体はまた、ガンなどの様々な疾患のインビボ免疫診断またはインビトロ免疫診断を行うために使用することができる(Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５(１９９０))。ＢｓＡｂのこのような診断的使用を容易にするために、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍関連抗原と結合することができ、もう一方のアームは、放射性核種と強固に結合するキレート化剤などの検出可能なマーカーと結合することができる。このような方法を使用して、ＬｅＤｏｕｓｓａｌらは、結腸直腸ガンおよび甲状腺（ｔｈｒｙｏｉｄ）ガンの放射免疫検出に有用なＢｓＡｂを作製した。このＢｓＡｂは、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）と結合するアームを一方に有し、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）と結合するアームをもう一方に有する。ＬｅＤｏｕｓｓａｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５８〜６２（１９９２）
およひＬｅＤｏｕｓｓａｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２〜１６７１（１９９３）を参照。Ｓｔｉｃｋｎｅｙらは、放射免疫検出を使用してＣＥＡを発現する結腸直腸ガンを検出するための方策を同様に記載する。この研究者らは、ＣＥＡならびにヒドロキシエチルチオ尿素−ベンジル−ＥＤＴＡ（ＥＯＴＵＢＥ）と結合するＢｓＡｂを記載する。Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０〜６６５５（１９９１）を参照。
【０００６】
二重特異性抗体はまた、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）と結合する一方のアーム、およびＴ細胞レセプターまたはＦｃγレセプターなどの細胞傷害性誘引因子分子と結合するもう一方のアームが提供されることによって、細胞傷害性の対象を変えることでヒトの治療に有用であり得る。従って、二重特異性抗体を使用して、患者の細胞性免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体に特異的に向けさせることができる。このような方策を使用して、ＦｃγＲＩＩＩ（または、ＣＤ１６）に結合する二重特異性抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞によってインビトロでの腫瘍細胞殺傷を媒介することができ、インビボで腫瘍増殖を防止するのに効果的であることが明らかにされた。Ｓｅｇａｌら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１７９（１９８９）およびＳｅｇａｌら、ガンの生物学的治療（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆＣａｎｃｅｒ）２(４)、ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ(１９９２)、１頁。同様に、ＦｃγＩＩＩと結合する一方のアームと、ＨＥＲ２レセプターに結合するもう一方のアームとを有する二重特異性抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣腫瘍および乳腫瘍を治療するために開発された。(Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：６８３２〜６８３９（１９９２）およびＷｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：９４〜１００(１９９３))。二重特異性抗体はまた、Ｔ細胞による殺傷を媒介することができる。通常、二重特異性抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に結合させる。抗ｐ１８５ＨＥＲ２に結合した抗ＣＤ３からなる完全にヒト化されたＦ（ａｂ'）2ＢｓＡｂを使用して、Ｔ細胞の標的化が、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞を殺傷するために行われた。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５(１)：２１７(１９９２)。二重特異性抗体は、いくつかの初期の臨床試験において調べられ、有望な結果が得られている。１つの臨床試験において、肺ガン、卵巣ガンまたは乳ガンの１２名の患者が、抗ＣＤ３／抗腫瘍（ＭＯＣ３１）の二重特異性抗体で標的化された活性化Ｔリンパ球を注入することによって処置された。ｄｅＬｅｉｊら、「二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｅｉｎｈａｒｔ（１９９１）２４９頁。
【０００７】
標的化された細胞において、腫瘍細胞の相当の局所的な溶解、穏和な炎症反応が誘導されたが、毒性の副作用または抗マウス抗体の応答は誘導されなかった。Ｂ細胞の悪性疾患の患者での抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９二重特異性抗体の非常に予備的な試験において、末梢の腫瘍細胞数の大きな減少もまた達成された。Ｃｌａｒｋら、「二重特異性抗体および標的化細胞の細胞傷害性」、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ、ＦａｎｇｅｒおよびＳｅｇａｌ編、Ｌｅｉｎｈａｒｔ（１９９１）２４３頁。ＢｓＡｂの治療的適用に関してはＫｒｏｅｓｅｎら、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：４００〜４０７(１９９３)、Ｋｒｏｅｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７０：６５２〜６６１(１９９４)、およびＷｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５（１９９４）もまた参照。
【０００８】
二重特異性抗体はまた、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして使用することができる。さらに、このような抗体は、感染性疾患の処置において、（例えば、エフェタター細胞を、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスに感染した細胞あるいはトキソプラズマゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物に対して標的化するために）使用することができ、あるいはイムノトキシンを腫瘍細胞に送達するために、あるいは免疫複合体を細胞表面レセプターに標的化するために使用することができる(Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)。
【０００９】
ＢｓＡｂの使用は、ＢｓＡｂを十分な量および純度で得ることが困難であるということによって著しく妨げられている。従来、二重特異性抗体は、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７〜５３９(１９８３)）を使用して作製された。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は無作為に組み合わされるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、このうちの１個のみが、正しい二重特異性構造を有する(図１Ａを参照)。この正しい分子の精製は、通常的にはアフィニティークロマトグラフィー工程によって行われているが、かなり面倒であり、生成物の収量は少ない。例えば、（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．ら（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ４：８７〜９８；およびＭａｓｓｉｍｏ，Ｙ．Ｓ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１：５７〜６６）を参照。従って、より大きな収量のＢｓＡｂを産生するための技術が開発されている。抗体フラグメントの化学的な連結を行うために、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ'）2フラグメントを得る方法を記載する。
【００１０】
このようなフラグメントは、ジチオール複合化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、近傍のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド結合が形成されないようにする。次いで、得られたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換される。次いで、ＢｓＡｂを形成するために、１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体が、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換され、もう１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合されて、生成したＢｓＡｂは、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
近年の進歩は、二重特異性抗体を得るために化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収することを容易にした。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、ｐ１８５ＨＥＲ２と結合する一方のアームおよびＣＤ３と結合するもう一方のアームを有する完全にヒト化されたＢｓＡｂのＦ（ａｂ'）２分子の産生を記載する。ＢｓＡｂを形成するために、それぞれのＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別個に分泌させ、インビトロでの指向された化学的結合反応に供した。このようにして形成されたＢｓＡｂは、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を開始させるのと同様に、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ.）７：４５〜５０（１９９２）もまた参照。
【００１１】
ＢｓＡｂフラクメントを作製し、組換え細胞の培養物から直接分離するための様々な技術もまた記載されている。例えば、二重特異性のＦ（ａｂ'）2ヘテロダイマーが、ロイシンジッパーを使用して産生されている(Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８(５)：１５４７〜１５５３(１９９２))。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって抗ＣＤ３抗体および抗インターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）抗体のＦａｂ’部分に連結された。ホモダイマーの抗体をヒンジ部で還元してモノマーを形成させ、次いで、再酸化してヘテロダイマーの抗体を形成させた。このようなＢｓＡｂは、インビトロでＨｕＴ−１０２細胞を溶解するために、細胞傷害性Ｔ細胞を呼び寄せるのに非常に効果的であることが見出された。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４〜６４４８（１９９３）により記載される「ジアボディ(ｄｉａｂｏｄｙ)」技術の出現は、ＢｓＡｂフラダメントを作製するための代わりの機構をもたらした。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖の表面にある２つのドメインの間での対形成ができないリンカーによって軽鎖の可変ドメイン(ＶL)に連結された重鎖の可変ドメイン(ＶH)を含む。従って、１つのフラグメントのＶHドメインおよびＶLドメインは、別のフラグメントの相補的なＶHドメインおよびＶLドメインと対形成することを強いられ、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）のダイマーの使用によるＢｓＡｂフラグメントを作製するための別の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照。この研究者らは、２５アミノ酸残基のリンカーによって抗フルオレセイン抗体のＶHドメインおよびＶLドメインに連結されたＴ細胞レセプターに対する抗体のＶHドメインおよびＶLドメインを含む抗体を設計した。再生された分子は、フルオレセインおよびＴ細胞レセプターに結合し、フルオレセインがその表面に共有結合しているヒト腫瘍細胞を溶解させた。
【００１２】
組換え細胞の培養物から直接回収することができる二重特異性抗体を作製するためのいくつかの技術が報告されているようである。しかし、完全長のＢｓＡｂは、その血清半減期がより長いと考えられることおよび可能なエフェクター機能のために、多くの診療的適用に関しては、ＢｓＡｂフラグメントよりも好ましいとされ得る。
免疫付着因子(Immunoadhesins) 免疫付着因子（Ｉａ）は、細胞表面レセプターまたはリガンド（「付着因子」(adhesin)）などのタンパク質の結合ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメインのエフェタター機能とともに併せ持つ抗体様分子である。免疫付着因子は、ヒト抗体の多くの貴重な化学的特性および生物学的特性を有し得る。免疫付着因子は、適当なヒト免疫グロブリンのヒンジ配列および定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトのタンパク質配列から構築することができるので、目的とする結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成することができる。そのような免疫付着因子は、患者に対する免疫原性は最小であり、安全に長期間または繰り返し使用される。
【００１３】
文献に報告されている免疫付着因子には下記が含まれる。Ｔ細胞レセプターの融合体(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９３６〜２９４０(１９８７))；ＣＤ４の融合体(Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５〜５３１(１９８９)；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８〜７０(１９８９)；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７〜３５３(１９９０)；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７〜６７０(１９９０))；Ｌ−セレクチンまたはホーミングレセプターの融合体(Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１〜２２２９(１９９０)；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４９：１６４〜１６７(１９９１))；ＣＤ４４の融合体(Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ６１：１３０３〜１３１３(１９９０))；ＣＤ２８およびＢ７の融合体(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０(１９９１))；ＣＴＬＡ−４の融合体(Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１〜５６９(１９９１))；ＣＤ２２の融合体(Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ６６：１１３３〜１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプターの融合体(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５〜１０５３９(１９９１)；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９(１９９１))；ＮＰレセプターの融合体(Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０〜２３０６７(１９９１))；インターフェロンγレセプターの融合体(Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４〜９３６０(１９９２))；４−１ＢＢの融合体（Ｃｈａｌｕｐｎｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９：１０３６０〜１０３６４(１９９２)）およびＩｇＥレセプターαの融合体(ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１５巻、抄録番号１４４８(１９９１))。
【００１４】
治療的使用について記載されている免疫付着因子の例には、細胞表面ＣＤ４に対するＨＩＶの結合を阻止するためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子が含まれる。
【００１５】
ＣＤ４−ＩｇＧを出産直前の妊娠女性に投与した第Ｉ相臨床試験から得られたデータにより、この免疫付着因子は、ＨＩＶの母−胎児間移動を防止することにおいて有用であり得ることが示唆されている。Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９〜２２７(１９９３)。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と結合する免疫付着因子もまた開発された。ＴＮＦは、敗血症性ショックの主要なメディエーターであることが明らかにされている前炎症性サイトカインである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免疫付着因子は、敗血症性ショックの処置において臨床的に使用するための候補物として有望であることが明らかにされた(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免疫付着因子は、治療以外にもまた使用される。例えば、Ｌ−セレクチンレセプター免疫付着因子は、末梢リンパ節の高内皮細静脈（ＨＥＶ）の組織化学的染色を行うための試薬として使用された。この試薬はまた、Ｌ−セレクチンのリガンドを分離してその特徴づけを行うために使用された(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、上記)。免疫付着因子構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、免疫付着因子は、二重特異性抗体に対する類推によって「二重特異性免疫付着因子」と呼ばれる。
【００１６】
Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１６２：１２３（１９９３）は、接着分子（Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン）の細胞外ドメインを併せ持つそのような二重特異性免疫付着因子を記載する。結合性の研究により、そのようにして得られた二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質は、それが誘導された単一特異性の免疫付着因子と比較して、骨髄様細胞株に対する結合能か高まったことが示された。
抗体−免疫付着因子のキメラ 抗体−免疫付着因子（Ａｂ／Ｔａ）キメラもまた文献に記載されている。このような分子は、免疫付着因子の結合領域を抗体の結合ドメインとともに併せ持つ。
【００１７】
Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３〜４７２７（１９９１）は、マウスのＣＤ４−ＩｇＧから誘導された二重特異性の抗体−免疫付着因子キメラを作製した。この研究者らは、２つのアームを有する四量体分子を構築した。一方のアームは、抗体軽鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４とともに、抗体重鎖の定常ドメインと融合したＣＤ４からなった。もう一方のアームは、抗ＣＤ３抗体の完全な軽鎖とともに、抗ＣＤ３抗体の完全な重鎖からなった。ＣＤ４−ＩｇＧのアームによって、この二重特異性分子は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面にあるＣＤ３に結合する。細胞傷害性細胞およびＨＩＶ感染細胞を一緒にすると、ＨＩＶ感染細胞が特異的に殺傷される。
Ｂｅｒｇら（上記）は四量体構造の二重特異性分子を記載しているが、１個のＣＤ４−ＩｇＧ融合体のみを含有するトリマーのハイブリッド分子を作製することができる。Ｃｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）を参照。この構築物の第１のアームは、ヒト化された抗ＣＤ３κ軽鎖およびヒト化された抗ＣＤ３γ重鎖によって形成される。第２のアームは、ＩｇＧのＦｃドメインによるｇｐ１２０の結合を担うＣＤ４の細胞外ドメインの一部を併せ持つＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子である。得られるＡｂ／Ｉａキメラは、ＨＩＶ感染細胞の殺傷を、純粋な細胞傷害性Ｔ細胞調製物、またはＦｃレセプターを産生する大顆粒状リンパ球エフェクター細胞をさらに含む全末梢血リンパ球（ＰＢＬ）画分のいずれかを使用して媒介した。
【００１８】
多重特異性抗体ヘテロマルチマーの製造においては、ホモマルチマーよりも、所望のヘテロマルチマーの産生を増大させることが望ましい。Ｆｃ含有のＢｓＡｂを得るために選択される現在の方法は、依然として、２つの抗体を同時に発現するハイブリッドハイブリドーマである(ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５４０(１９８３))。
【００１９】
ハイブリッドハイブリドーマにおいて、重（Ｈ）鎖は、典型的には、所望のヘテロダイマーと同様に、ホモダイマーを形成する。さらに、軽（Ｌ）鎖は、同系でない重鎖との誤った対形成を形成することが多い。従って、２つの抗体が同時に発現すると、重鎖および軽鎖の１０個までの対形成が生じ得る(Ｓｕｒｅｓｈ，Ｍ．Ｒ．ら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０〜２２８(１９８６))。これらの望ましくない鎖の対形成は、ＢｓＡｂの産生を低下させ、そして重大で、ときには克服できない精製問題を必然的に強いる(Ｓｍｉｔｈら(１９９２)上記、およびＭａｓｓｉｍｏら（１９９７）上記)。
【００２０】
抗体重鎖は、立体的に相補的な変異をマルチマー化ドメインのＣH３ドメイン界面に導入することによるヘテロダイマー化(Ｒｉｄｇｗａｙら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９：６１７〜６２１(１９９６))、および本明細書中に記載されるファージディスプレーによる最適化を行うために以前に操作されている。改変されたＣH３ドメインを含有する鎖によって、抗体／免疫付着因子ハイブリッド（Ａｂ／Ｉａ）の生成により判断されるように、約９０％までのヘテロダイマーが生じる。ヘテロダイマー化した重鎖は、依然として、同系でない軽鎖との誤った対形成を形成し得るので、目的のＢｓＡｂの回収が妨げられる。
【００２１】
発明の要旨本出願は、モノマー混合物から所望するヘテロマルチマー二重特異性抗体の形成を高めるのに役立つ方法を記載する。この方法は、共通する可変軽鎖を提供して二重特異性抗体のヘテロマーの各可変重鎖領域と相互作用させることによるヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界面を操作することによる。３つの可能なヘテロマルチマーおよびホモマルチマーが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから形成され得る。そのようなポリペプチドのそれぞれは、同様に、第１の軽鎖および第２の軽鎖とそれぞれ会合する。これにより、鎖の対形成は合計で１０通りが可能である(図１Ａ)。所望のヘテロマルチマー形成を高める方法によって、その産生を、望ましくないヘテロマルチマーおよびホモマルチマーよりも大きく高めることができる。
【００２２】
ヘテロマルチマー抗体の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも一部を含む。
【００２３】
界面で相互作用する第１および第２の各ポリペプチドのドメインは、マルチマー化ドメインと呼ばれる。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの問の相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの産生を増大させる(図１Ｂ)。相互作用は、空洞への隆起(protuberance-into-cavity)の相補的な領域の形成；天然に存在しないジスルフィド結合の形成；ロイシンジッパー；疎水性領域；および親水性領域によって接触面で促進され得る。「隆起」(protuberance)は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代替的な「空洞」(cavity)は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。適切に配置され、そして適切な大きさを有する隆起または空洞が第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかの界面に存在する場合、隣接する接触面において、それぞれ、対応する空洞または隆起の設計が必要とされるだけである。天然に存在しないジスルフィド結合は、第１のポリペプチドにおいて、天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊離チオールを含有する残基と置換して、遊離チオールが第２のポリペプチドの別の遊離チオール含有側鎖と相互作用し、そしてジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成されるようにすることによって構築される(図１Ｂ)。
【００２４】
大きな非免疫化ファージディスプレーライブラリー(Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０９〜３１４、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に由来する単鎖Ｆｖフラグメントは、Ｖ-遺伝子の使用を明らかにした。この場合、いくつかの生殖系列のＶ-遺伝子セグメントに由来するＶH配列およびＶL配列が優勢であり、ファミリーがレパートリーにおいて優勢であった。異なるパートナー鎖との組合せで特定の重鎖または軽鎖が見出されるレパートリーにおいて、鎖の入り交じった状態の例が認められた(Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６）上記)。
【非特許文献１】Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１〜１２４(１９９２)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
所望するヘテロマルチマー多重特異性抗体の調製は、共通する軽鎖が多重特異性抗体の可変重鎖のそれぞれと対形成するように提供される場合に増強されることが本明細書中に開示される。共通する可変軽鎖の使用によって、抗原結合ドメインを形成するために正しく対形成しなければならないモノマーの数が減少する。これは、軽鎖の数を、（本発明が開示される前の二重特異性抗体または多重特異性抗体のそれぞれにおける）２つ以上の軽鎖から、（本発明の多重特異性抗体（図１Ｃを参照）における）１つの軽鎖に制限することによる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
従って、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法に関する。この抗体は、下記の１）および２）を含む：１）界面で接する第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド(および抗体の多重度に従ってさらなるポリペプチド)、ただし、第１のポリペプチドおよびさらなるポリペプチド（または、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）のそれぞれは、第１のポリペプチドと第２の（または、少なくとも１つのさらなる）ポリペプチドとの間の界面を形成するマルチマー化ドメインを含み、そしてこのマルチマー化ドメインは、第１のポリペプチドとさらなるポリペプチドとの間の安定な相互作用を促進する；および２）前記の第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）のそれぞれの結合ドメイン、ただし、各結合ドメインは可変重鎖および可変軽鎖を含み、第１のポリペプチドの可変軽鎖および第２のポリペプチドの可変軽鎖は共通するアミノ酸配列を有し、そしてそのような共通する配列は、前記ポリペプチドのそれぞれの元の軽鎖に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性のアミノ酸配列同一性を有する。この方法は下記の工程を含む：（ｉ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび共通する軽鎖をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、この培養によって核酸を発現させる工程；および （ｉｉ）宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。
【００２７】
本発明の関連する実施態様において、第１のポリペプチドをコードする核酸または第２のポリペプチドをコードする核酸、あるいはその両方は、その界面またはその一部をコードするように元の核酸から変更されている。
本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドの界面は、第２のポリペプチドの界面の遊離チオール含有残基と相互作用するように配置され、そうすることによってジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成される遊離チオール含有残基を含む。本発明により、第１のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいは第２のポリペプチドをコードする核酸は、遊離チオール含有残基をコードするように元の核酸から変更され、あるいはその両方である。
【００２８】
本発明の方法の別の実施態様において、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）の両方をコードする核酸は、それぞれ、隆起および空洞をコードするように変更されている。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、それぞれ、好ましくは、ヒトＩｇＧ1のＣH３ドメインなどの抗体の定常ドメインを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は、界面で接する第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むヘテロマルチマー（二重特異性抗体、二重特異性免疫付着因子または抗体／免疫付着因子キメラなど）を提供する。第１のポリペプチドの界面は、少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）
【００３０】
上のマルチマー化ドメインと相互作用するように配置されて、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの界面を形成するマルチマー化ドメインを含む。本発明の好ましい実施態様において、マルチマー化ドメインは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用が促進されるように変更される。そのような変更には、隆起または空洞あるいはその両方の生成；天然に存在しないジスルフィド結合の生成；相補的な疎水性領域；および相補的な親水性領域の生成が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロマルチマー多重特異性抗体は、薬学的に受容可能な担体をさらに含む組成物の形態で提供され得る。
【００３１】
本発明はまた、前記のヘテロマルチマー多重特異性抗体をコードする核酸を含む宿主細胞に関する：この場合、第１のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなるポリペプチド（または、第２のポリペプチド）をコードするこの核酸は、１つのベクターまたは別個のベクターに存在する。宿主細胞は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を作製する方法で使用することができる。この方法は、核酸を発現するように宿主細胞を培養すること、およびその細胞培養物からヘテロマルチマー抗体を回収することを含む。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、ヘテロマルチマー多重特異性抗体を調製する方法を提供し、この方法は下記の工程を含む：（ａ）少なくとも１つのさらなるポリペプチドの界面のアミノ酸と相互作用するように配置されているアミノ酸残基を第１のポリペプチドの界面に含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を選択する工程。実施態様において、核酸は、相互作用するアミノ酸残基をコードするように元の核酸から変更されている。
【００３３】
別の実施態様において、第１の核酸は、より大きな側鎖容量を有するアミノ酸をコードするように変更され、それによって、隆起か第１のポリペプチドに形成される；
（ｂ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を変更し、その結果、第２のポリペプチドの界面内のアミノ酸残基を、より小さな側鎖容量を有するアミノ酸残基と置換し、それによって、第２のポリペプチドに空洞を形成させる工程。
【００３４】
この場合、前記の隆起は、この空洞と相互作用するように配置される；
（ｃ）前記の第１の核酸および第２の核酸を宿主細胞に導入して、前記の第１の核酸および第２の核酸が発現されるように宿主細胞を培養する工程；および （ｄ）細胞培養物から生成したヘテロマルチマー抗体を回収する工程。
【００３５】
前記の抗体が組み込まれた多重特性抗体（二重特異性抗体など）を構築することもまた望ましいことであり得る。このような状況下では、元の軽鎖と対形成する場合、目的の第２の抗原に特異的に結合する重鎖を同定することは望ましい。
【００３６】
Ｆｉｇｉｎｉらの方法（Ｆｉｇｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：６８〜７８、これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）を使用して、そのような重鎖を同定することができる。最初に、ファージライブラリーをグアニジン塩酸で処理して、元の軽鎖を解離させる。次に、ファージにディスプレーされた重鎖を、（透析などにより）変性剤を除くことによって目的の軽鎖と再構成させる。次いで、目的の第２の抗原に対して選別を行い、所望の重鎖を同定する。本発明はさらに、選択された軽鎖と対形成するように重鎖を選択するこの方法によって調製される多重特異性抗体、そのような抗体をコードする核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を含む。
【００３７】
本発明は、望ましくないヘテロマルチマーおよび／またはホモマルチマーなどの他の望ましくない最終産物よりもヘテロマルチマーの産生を増大させるための機構を提供する(図１Ａ〜図１Ｃを参照)。組換え細胞の培養物から回収される所望のヘテロマルチマーの産生量は、好ましくは、副生成物の望ましくないヘテロダイマーまたはホモマルチマーと比較して、少なくとも８０重量％を超え、好ましくは少なくとも９０重量％を超える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
Ｉ．定義 一般に、下記の用語または表現は、本説明、実施例および請求項において使用される場合には下記の意味を有する。
「ヘテロマルチマー」，「ヘテロマルチマーポリペプチド」または「ヘテロマルチマー多重特異性抗体」は、少なくとも、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子である。この場合、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列において、第１のポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。ヘテロマルチマーは、少なくとも２つの異なるリガンドに対する複数の結合特異性または結合部位を有する。好ましくは、ヘテロマルチマーは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロダイマー」を含むことができ、あるいはポリペプチドが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド以外に、さらに存在する場合には、より高次の三次構造を形成することができる。
【００３９】
ヘテロマルチマーに関する例示的な構造には、ヘテロダイマー(例えば、Ｄｉｅｔｓｃｈら（上記）によって記載される二重特異性免疫付着因子)、ヘテロトリマー(例えば、Ｃｈａｍｏｗら（上記）によって記載されるＡｂ／Ｉａキメラ)、ヘテロ四量体（例えば二重特異性抗体）及び更なるオリゴマー構造が含まれる。
【００４０】
本明細書中で使用されている「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマーの各ポリペプチドの領域をいう。「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマー複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。マルチマー化ドメインは、好ましくは、特定の第１のポリペプチドと特定の第２のポリペプチドとの間の相互作用を促進し、それによって所望のヘテロマルチマーの形成が増強され、そして望ましくないヘテロマルチマーまたはホモマルチマーの形成の可能性が実質的に低下する。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラなヘテロマルチマーのキメラ分子間での分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用することができる。遊離チオールは、ポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にする位置において、ポリペプチドの天然に存在する残基を、例えば、システインと置換することによって１つまたは複数の相互作用ポリペプチドの界面に導入することができる。マルチマー化ドメインは、免疫グロブリンの定常部を含むことができる。本発明において有用で可能なマルチマー化ドメインが、ハイブリッドの免疫グロブリンを記載する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８４９号（これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）に開示されている。さらに、マルチマー化ドメインは、立体的な相互作用によって、安定な相互作用が促進されるだけでなく、モノマーの混合物に由来するホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成がさらに促進されるように設計することができる。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に組込まれる）を参照。これは、ヘテロオリゴマー化のために第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用に関する「空洞への隆起」法を開示する。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一の大きさまたは類似する大きさの代償的な「空洞」は、任意に、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２のポリペプチドの界面に作製される。
【００４１】
免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンの定常ドメインであることが好ましいが、必ずしも、免疫グロブリンの定常ドメインである必要はない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4が好ましい。
【００４２】
「遊離チオール含有化合物」は、本発明のポリペプチド界面のアミノ酸に組み込むことができるが、またはそのようなアミノ酸と反応することができる化合物であって、この化合物の遊離チオール部分は、本発明のさらなるポリペプチドの界面において遊離チオール部分と相互作用して、ジスルフィド結合が形成されるように配置されているそのような化合物を意味する。遊離チオール含有化合物は、好ましくは、システインである。
用語「標識されたエピトープ」は、本明細書で使用される場合、「標識ポリペプチド」に融合したキメラなヘテロ付着因子の全体またはそのフラグメントを含むキメラなポリペプチドを示す。標識ポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、キメラなヘテロ付着因子の活性を妨げないように十分に短い。標識ポリペプチドは、好ましくは、他にないほど非常に特徴的であり、その結果、それに対する抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切な標識ポリペプチドは、一般には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は、８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約９残基〜３０残基の間）を有する。本発明の実施態様は、エピトープ標識に結合したキメラなヘテロ付着因子を含み、そのような標識を使用して、サンプル中の付着因子の検出またはサンプルからの付着因子の回収が行われる。
【００４３】
本明細書中で使用されている「共通する軽鎖」または「軽鎖の共通するアミノ酸配列」は、本発明の多重特異性抗体における軽鎖のアミノ酸配列をいう。抗体パネルが、ファージディスプレーライブラリーの選別を行うことによって、少なくとも２つの異なる抗原に対して作製された。そのようなファージディスプレーライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）(上記)により記載されている(これは、ファージミドライブラリーを選択する方法を特に参照して、参考としてその全体が本明細書中に組込まれる)。軽鎖配列を、可変軽鎖アミノ酸配列に関して比較した。比較されたパネルに由来する有用な軽鎖は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖である。共通する軽鎖配列は、比較された２つの軽鎖配列が近似するように考えられた配列である。比較される軽鎖が、アミノ酸レベルで１００％の配列同一性である場合、共通する軽鎖は、軽鎖が多重特異性抗体の異なる結合ドメインにおいて機能するとして、選択されたライブラリーのクローンに由来する軽鎖と同一である。比較される軽鎖が上記と異なる場合、共通する軽鎖は、ライブラリーのクローンに由来する比較される軽鎖の１つまたはもう一方、あるいはその両方と異なり得る。共通する軽鎖が、ライブラリーのクローンの１つまたはもう一方と、あるいはその両方と異なる場合、異なる残基は、抗体軽鎖の抗原結合ＣＤＲ残基の外側に存在することが好ましい。例えば、抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、配列定義（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ(１９８７)Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に従って決定することができる。
【００４４】
本明細書中で用いている「アミノ酸配列同一性」は、１つの配列のアミノ酸が第２のアミノ酸配列のアミノ酸とどのくらい同じであるかの割合をいう。ポリペプチド鎖の間において１００％の配列同一性は、鎖が同一であることを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用されている「ポリペプチド」は、一般に、約１０個よりも多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、哺乳動物のポリペプチド（哺乳生物から最初に得られたポリペプチド）が使用され、より好ましくは、培地に直接分泌されるポリペプチドである。細菌のポリペプチドの例には、例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれる。哺乳動物のポリペプチドの例には、レニン、成長ホルモンなどの分子が含まれ、下記が含まれる：ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；
副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺接触面活性物質；ウロキナーゼまたはヒトウリンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ｐＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙＴ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄ)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰＩ−１−α)；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモンまたは成長（増殖）因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５またはニューロトロフィン−６(ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６)、あるいはＮＧＦ−βなどの神経増殖因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの繊維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子(ＴＧＦ)；
インシュリン様増殖因子−Ｉおよびインシュリン様増殖因子−ＩＩ(ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ)；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）類、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）類、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；および上記のポリペプチドのいずれかのフラグメント。
【００４６】
「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと会合し得る任意のポリペプチドである。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、「界面」(下記において定義)で接する。界面に加えて、第１のポリペプチドは、「結合ドメイン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメインまたは酵素活性ドメイン)、またはＣH２、ＣH１およびＣLドメインを含む抗体の定常ドメイン（またはその一部）などのさらなるドメインを１つまたは複数含むことができる。通常、第１のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体のＣH３ドメインなどの定常ドメインであり、第１のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第１のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプターポリペプチド(特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド)、リガンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３５０(１９９３))、および抗体の可変ドメインポリペプチド(例えば、ジアボディ(ｄｉａｂｏｄｙ))。好ましい第１のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した抗体の重鎖から選択され、この場合、定常ドメインは、本発明の第２のポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように変更されている。
【００４７】
「第２のポリペプチド」は、「界面」を介して第１のポリペプチドと会合し得る任意のポリペプチドである。界面に加えて、第２のポリペプチドは、「結合ドメイン」(例えば、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または酵素活性ドメイン)、またはＣH２ドメイン、ＣH１ドメインおよびＣLドメインを含む抗体の定常ドメイン（または、その一部）などのさらなるドメインを含むことができる。通常、第２のポリペプチドは、抗体から誘導される少なくとも１つのドメインを含む。このようなドメインは、好都合なことに、抗体のＣH３ドメインなどの定常領域であり、第２のポリペプチドの界面を形成することができる。例示的な第２のポリペプチドには下記が含まれる。抗体重鎖ポリペプチド、異種ポリペプチドの結合ドメインとともに抗体の定常ドメインを併せ持つキメラ(すなわち、免疫付着因子、下記の定義を参照)、レセプターポリペプチド (特に、別のレセプターポリペプチド、例えば、インターロイキン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）およびインテグリンヘテロダイマー（例えば、ＬＦＡ−ＩまたはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）とダイマーを形成するポリペプチド)、リガンドポリペプチド(例えば、神経増殖因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）−Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９(４５)：２７８３３〜２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２(４８)：１３５０(１９９３))、および抗体の可変ドメインポリペプチド(例えば、ジアボディ)。好ましい第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインに融合した抗体の重鎖から選択されこの場合、この場合、定常ドメインは、本発明の第１のポリペプチドとの優先的な相互作用が促進されるように変更されている。
【００４８】
「結合ドメイン」は、目的の分子（例えば、抗体、リガンド、レセプター、基質または阻害剤）との選択的な結合を担うポリペプチドの任意の領域を含む。例示的な結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、レセプター結合ドメイン、リガンド結合ドメインおよび酵素活性ドメインが含まれる。好ましい実施態様において、結合ドメインは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を含む。本発明の二重特異性抗体およびその作製方法により、二重特異性抗体の各結合ドメインに関する軽鎖は、共通する軽鎖であり、それによって重鎖および軽鎖の誤った対形成が存在する望ましくないヘテロマルチマーの形成が避けられる。
用語「抗体」は、それが本発明に関連する場合、目的の抗原のエピトープと結合するドメインを１つまたは複数含有するポリペプチドを意味するものとする。
【００４９】
この場合、そのようなドメインは、抗体の可変部から誘導されるか、または抗体の可変部との配列同一性を有する。抗体の例には、全長の抗体、抗体フラグメント、単鎖分子、二重特異性分子または二機能性分子、ジアボディー、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体およびＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTM抗体）および免疫付着因子が含まれる。「抗体フラグメント」には、Ｆｖ、Ｆｖ'、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ'）2のフラグメントが含まれる。
【００５０】
「ヒト化(された)」形態の非ヒト（例えば、齧歯類または霊長類）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小の配列を含有する特異的でキメラな免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。その大部分において、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体あるいは持ち込まれたＣＤＲ配列または枠組み構造配列のいずれにおいて見出されない残基を含むことができる。このような改変は、抗体の能力を改良して最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。そのような可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒトの免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、好ましくは、免疫グロブリンの定常部(Ｆｃ)、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、目的の抗原でマカク（ｍａｃａｑｕｅ）サルを免疫化することによって産生される抗体から誘導されるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTM抗体を含む。
【００５１】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する分子である。そのような分子は、通常、２つの抗原と結合するだけである(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)が、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体も、本明細書中で使用される場合には本発明により含まれる。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞の抗原に対する一方のアームと、細胞傷害誘引因子分子に対するもう一方のアームとを有する下記のような二重特異性抗体が含まれる。例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５HER2、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１(抗結腸ガン)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞付着因子分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎カルシノーマ関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ−３；腫瘍抗原に特異的に結合するアームと、毒素に結合するアームとを有するＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど；変換酵素によって活性化されるプロドラッグに対するＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（これは、マイトマイシンホスフェートプロドラッグのマイトマシンアルコールへの変換を触媒する）など；フィブリン溶解剤として使用することができるＢｓＡｂ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など；細胞表面レセプターに対して免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂ、例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）など；感染性疾患の治療において使用されるＢｓＡｂ、例えは、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス (ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど；インビトロまたはインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５HER2／抗ハプテン；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ(Ｆａｎｇｅｒら（上記）を参照)；および診断用具としてのＢｓＡｂ、例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら（上記）を参照）など。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗CＤ３７および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。
【００５２】
本明細書中で使用されている用語「免疫付着因子」は、免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能とともに、異種タンパク質（「付着因子」、例えば、レセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を併せ持つ抗体様の分子を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識部位および結合部位（抗原結合部位）以外である（すなわち、「異種である」）所望の結合特異性を有する付着因子のアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫付着因子における免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3もしくはＩｇＧ4のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５３】
本明細書中で使用されている用語「リガンド結合ドメイン」は、定量的なリガンド結合能、および好ましくは対応する天然のレセプターの生物学的活性を少なくとも保持する任意の天然の細胞表面レセプターまたはその任意の領域もしくは誘導体をいう。特定の実施態様において、レセプターは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相同的な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーではないが、それにもかかわらず、この定義によって具体的に含まれる他の代表的なレセプターは、サイトカインに対するレセプターであり、特にチロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）であり、そしてヘマトポイエチンおよび神経増殖因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞付着因子分子、例えは、（Ｅ、ＬおよびＰ−）セレクチンである。
【００５４】
用語「レセプター結合ドメイン」は、定量的なレセプター結合能、および好ましくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を少なくとも保持するレセプターに対する任意の天然のリガンド（細胞付着因子分子を含む）またはその任意の領域もしくは誘導体を示すために使用される。この定義は、特に、具体的には、上記のレセプターに対するリガンドに由来する結合配列を含む。
【００５５】
本明細書中で使用されている用語「多重特異性免疫付着因子」は、少なくとも２つの結合特異性を有する（すなわち、２つ以上の付着因子結合ドメインを併せ持つ）(上記に定義されている)免疫付着因子を示す。多重特異性免疫付着因子は、本質的には、国際特許公開第ＷＯ８９／０２９２２号(１９８９年４月６日公開)、欧州特許ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）および米国特許第５，１１６，９６４号(１９９２年５月２日発行)に開示されているように、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロ四量体として組み立てることができる。好ましい多重特異性免疫付着因子は二重特異性である。二重特異性免疫付着因子の例には、ＣＤ４−ＴｇＧ／ＩＮＦレセプター−ＩｇＧおよびＣＤ４−１ｇＧ／Ｌ−セレクチン−ＩｇＧが含まれる。後者の分子は、リンパ球ホーミングレセプター（ＬＨＲ、Ｌ−セレクチン）のリンパ節結合機能と、ＣＤ４のＨＩＶ結合機能とを併せ持ち、ＨＩＶ感染、関連する症状の予防または処置において診断薬としての適用の可能性が見出されている。
【００５６】
「抗体−免疫付着因子キメラ(Ａｂ／Ｉａキメラ)」は、（本出願において定義されている）少なくとも１つの免疫付着因子とともに、（上記に定義されている）抗体の少なくとも１つの結合ドメインを併せ持つ分子を含む。例示的なＡｂ／Ｉａキメラは、Ｂｅｒｇら（上記）およびＣｈａｍｏｗら（上記）によって記載されている二重特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
【００５７】
「界面」は、第２のポリペプチドの界面内において１つまたは複数の「接触」アミノ酸残基（または、アミノ酸でない他の基）と相互作用する第１のポリペプチドにおける「接触」アミノ酸残基（あるいは、炭水化物基、ＮＡＤＨ、ピオチン、ＦＡＤまたはヘム基などのアミノ酸でない他の基）を含む。好ましい界面は、可変ドメインまたは定常ドメイン（またはその領域）などの免疫グロブリンのドメインである。しかし、ヘテロマルチマーレセプターを形成するポリペプチド間の界面、またはＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦなどの２つ以上のリガンドの間の界面も、この用語の範囲に含まれる。好ましい界面は、好ましくはＩｇＧ抗体から誘導され、最も好ましくはヒトＩｇＧ1抗体から誘導される免疫グロブリンのＣH３ドメインを含む。
【００５８】
「元の」アミノ酸残基は、元の残基よりも小さな側鎖容量または大きな側鎖容量を有し得る「移入」残基によって置換されるアミノ酸残基である。移入アミノ酸残基は、天然存在アミノ酸残基または非天然存在アミノ酸残基であり得るが、天然存在アミノ酸残基が好ましい。「天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８号（これは参考としてその全体が本明細書中に取込まれる）の表１に列記されるアミノ酸残基である。「非天然存在」アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされていないが、ポリペプチド鎖で隣のアミノ酸残基と共有結合することができる残基を意味する。非天然存在アミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載されるアミノ酸残基アナログなどの他のアミノ酸残基のアナログが挙げられる。天然に存在しないそのようなアミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（上記）の方法を使用することができる。簡単に記載すると、この方法は、非天然存在アミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、インビトロでＲＮＡの転写および翻訳を行うことを含む。本発明の方法には、少なくとも１つの元のアミノ酸残基を置換することが含まれるが、２つ以上の元の残基を置換することができる。通常は、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面におけるすべての残基が、置換される元のアミノ酸残基を含むにすぎない。置換に好ましい残基は「埋もれている」。「埋もれている」は、残基が本質的には溶媒と接触できないことを意味する。移入残基は、好ましくは、酸化または誤ったジスルフィド結合の形成の可能性を避けるために、システインではない。
【００５９】
「元の核酸」は、アミノ酸側鎖が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で界面で相互作用して、ポリペプチド間の安定な相互作用を促進させるアミノ酸がマルチマー化ドメイン内でコードされるように変更することができる、目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。そのような変更によって、空洞への隆起、天然に存在しないジスルフィド結合、ロイシンジッパー、疎水性相互作用および親水性相互作用のような安定な相互作用に限定されないが、そのような安定な相互作用を生じさせることができる。このような変更は、好ましくは、目的とする第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の特異的な相互作用を促進し、望ましくないヘテロマーの対形成またはホモマーの形成が生じる相互作用を効果的に除くように選択される。元の核酸または出発核酸は、天然に存在する核酸であり得るか、または以前に変更が行われた核酸（例えば、ヒト化抗体フラグメント）を含み得る。核酸を「変更する」は、元の核酸を、目的のアミノ酸残基をコードしているコドンの少なくとも１つの挿入、欠失または置換による遺伝子操作または変異処理を行うことを意味する。通常、元の残基をコードしているコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。このようにＤＮＡを遺伝子的に改変するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９９１）に総説されており、例えば、部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発法を含む。
【００６０】
隆起、空洞、または（ジスルフィド結合の形成に必要なシステイン残基などの）遊離チオールは、合成的手段によって、例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、前記の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するためのそのような技術、ペプチドの酵素的または化学的な連結、あるいはこれらの技術のいくつかの組合せによって、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に「導入する」ことができる。従って、「導入される」隆起、空洞、または遊離チオールは、「天然に存在しない」、すなわち、「非天然」である。これは、自然界または元のポリペプチド(例えば、ヒト化モノクローナル抗体)に存在しないことを意味する。
【００６１】
隆起を形成するために移入アミノ酸残基は、比較的少数（例えば、約３個〜６個）の「回転異性体」を有することが好ましい。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に有利な立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数は、ＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５〜７９１（１９８７）に総説されている。
【００６２】
「分離された」ヘテロマルチマーは、その天然の細胞培養環境の成分からの同定および分離および／または回収が行われたヘテロマルチマーを意味する。その天然環境の混入成分は、ヘテロマルチマーに関する診断使用または治療使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶解物を含み得る。好ましい実施態様において、ヘテロマルチマーは、（１）ローリー法によって測定されるように９５重量％を超えるように、最も好ましくは９９重量％を超えるように、あるいは（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基が得られるのに十分な程度に、あるいは（３）クマシーブルー染色、または好ましくは銀染色を使用して、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。
【００６３】
本発明のヘテロマルチマーは、一般には、実質的に均一になるまで精製される。「実質的に均一」、「実質的に均一な形態」および「実質的な均一性」という表現は、生成物が、望ましくないポリペプチドの組合せ物に由来する副生成物（例えば、ホモマルチマー）を実質的に有していないことを示すために使用される。
【００６４】
純度に関して表現される場合、実質的な均一性は、副生成物の量が、１０％を超えないこと、好ましくは５％未満であること、より好ましくは１％未満であること、最も好ましくは０．５％未満であることを意味する。ただし、割合は重量比である。
【００６５】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボソーム結合部位、および可能であれば、未だあまりよく理解されていない他の配列が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００６６】
核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に「機能的に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、ＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に参加しているプロタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに関してＤＮＡに機能的に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを、そして分泌リーダーの場合には、読み取り相で連続していることを意味する。
【００６７】
しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位で結合させることによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実施に従って使用される。
【００６８】
ＩＩ．ヘテロマルチマーの調製１．出発材料の調製 最初の工程として、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド（およびヘテロマルチマーを形成する任意のさらなるポリペプチド）が選択される。通常、これらのポリペプチドをコードする核酸は分離しなければならず、その結果、核酸は、本明細書中で定義されているように、隆起または空洞またはその両方をコードするように変更することができる。しかし、変異は、合成的な手段を使用することによって、例えば、ペプチド合成を使用することによって導入することができる。同様に、移入残基が天然に存在しない残基である場合には、Ｎｏｒｅｎら（上記）の方法を、そのような置換を有するポリペブチドを作製するために用いることができる。さらに、ヘテロマルチマーの一部は、細胞培養で組換え的に適切に作製され、そのような分子の他の部分は、上記のそのような技術によって作製される。
【００６９】
抗体の分離および免疫付着因子の調製に関する技法が次に行われる。しかし、ヘテロマルチマーは、当技術分野で知られている技術を使用して、他のポリペプチドから形成され得るか、または他のポリペプチドを組み込むことができることが理解される。例えば、目的のポリペプチド（例えば、リガンド、レセプターまたは酵素）をコードする核酸は、ポリペプチドのｍＲＮＡを有し、そのｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現していると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから分離することができる。ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、抗体または約２０塩基〜８０塩基のオリゴヌクレオチドなど）を用いてスクリーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９）の第１０章〜第１２章に記載される標準的な手順を使用して行うことができる。
【００７０】
（１）抗体の調製 抗体の産生に関する技術がいくつか記載されている。そのような技術には、モノクローナル抗体を作製するための従来のハイブリドーマ法、抗体(キメラ抗体、例えば、ヒト化抗体を含む)を作製するための組換え技術、トランスジェニック動物での抗体産生、および「完全なヒト」抗体を調製するために近年記載されたファージディスプレー技術が含まれる。これらの技術を下記に簡単に記載する。
【００７１】
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、一般には、抗原およびアジュバントの皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射を多数回行うことによって動物に生起させることができる。抗原（または、標的アミノ酸配列を含有するフラグメント）を、免疫化される種において免疫原であるタンパク質（例えば、キーホルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズのトリプシン阻害剤）に、二官能性薬剤または誘導化剤を使用して結合させることは有用であり得る。そのような二官能性薬剤または誘導化剤は、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ただし、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）である。動物は、免疫原性のコンジュゲートまたは誘導体に対して、（ウサギまたはマウスに関して、それぞれ）１ｍｇのコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと一緒にして、その溶液を皮下に多数の部位に注射することによって免疫化される。１ヶ月後、動物は、コンジュゲートを含むフロイント完全アジュバントの最初の量の１／５〜１／１０を用いて、多数の部位に皮下注射することによって追加免疫される。
【００７２】
７日〜１４日の後に、動物は採血され、血清を抗体力価についてアッセイする。
【００７３】
動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫される。動物は、好ましくは、同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に結合させたコンジュゲートおよび／または異なる架橋剤によるコンジュゲートで追加免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質の融合体として、組換え細胞培養で作製することができる。同様に、ミョウバンなどの凝集化剤を使用して、免疫応答を増強することができる。
【００７４】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載されたハイブリドーマ法を使用して実質的に均一な抗体集団から得られるか、または、組換えＤＮＡ法 (Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号)によって作製することができる。
【００７５】
ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターなどの他の適切な宿主動物を上記のように免疫化して、免疫化のために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球が誘導される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合化剤を使用してリンパ球をミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る(Ｇｏｄｉｎｇ、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０３頁(ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８６))。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない元のミエローマ細胞の生育または生存を阻害する物質を１つまたは複数含有することが好ましい適切な培養培地に播種して、増殖させる。例えば、元のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(ＨＡＴ培地)。好ましいミエローマ細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定で高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性を有するミエローマ細胞である。このような細胞の中で、好ましいミエローマ細胞株は、ネズミのミエローマ細胞株であり、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１のマウス腫瘍から誘導されるミエローマ細胞株、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ)から入手可能なＳＰ−２細胞などである。ヒトのミエローマ細胞株およびマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトのモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１３３：３００１(１９８４)；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋａｒ，Ｉｎｃ.、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７)。ヒトモノクローナル抗体の産生技術に関しては、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１４７（１）８６：〜９５（１９９１）および国際特許公開第ＷＯ９１／１７７６９号（１９９１年１１月２８日公開）もまた参照。ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、目的の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。
【００７６】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、あるいは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｎｄのスキャッチャード分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０(１９８０)）によって測定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンを限界稀釈法によってサブクローニングを行い、標準的な方法によって生育させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０４頁(ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８６)。この目的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の体内において腹水腫瘍としてインビボで生育させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって適切に分離される。
【００７７】
あるいは、免疫化したときに、内因性の免疫グロブリンを産生することなく、完全なレパートリーのヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製が現在可能である。例えば、キメラな生殖系列の変異マウスにおける抗体の重鎖連結領域（ＪH）遺伝子のホモ接合型欠失によって、内因性の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒトの生殖系列の免疫グロブリン遺伝子列をそのような生殖系列の変異マウスに移すことによって、ヒト抗体が、抗原を投与したときに産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５〜２５８(１９９３)；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ１４：８４５〜８５１；およびＭｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６を参照。
【００７８】
さらなる実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５２２〜５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから、目的の抗原を使用して、適切な抗体または抗体フラグメントに関する選択を行うことによって分離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２２２：５８１〜５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用するマウス抗体およびヒト抗体の分離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライブラリーを構築するための方法として、鎖シャッフリング(Ｍａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３(１９９２))、ならびに結合感染およびインビボ組換えによる高い親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の産生を記載する(Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６(１９９３)；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５〜３２６０；およびＶａｕｇｈａｎら（１９９６）上記)。従って、これらの技術は、本発明により含まれる「モノクローナル」抗体（特に、ヒト抗体）の分離に関する、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
【００７９】
本発明の抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して(例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に分離され、そして配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として有用である。ＤＮＡが一旦分離されると、そのＤＮＡは、発現ベクター内に配置することができ、次いで、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成物が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、コード配列を、相同的なマウス配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインに置換することによって改変することができる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１(１９８４)。そのようにして、本明細書中の抗抗原モノクローナル抗体の結合特異性を有する抗体が調製される。
【００８０】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では十分に知られている。
【００８１】
一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からヒト化抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５(１９８６)；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２７(１９８８)；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４〜１５３６(１９８８)）に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置換することによって行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラな抗体であり、(Ｃａｂｉｌｌｙ、上記)。実質的には元のままでないヒトの可変ドメインは、ヒトでない種に由来する対応の配列によって置換されている。実際、典型的には、ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、および可能であれば、いくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体の類似する部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。抗体は、抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持してヒト化されることが重要である。このような目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、元の配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、元の配列および様々な考えられるヒト化配列を解析することによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、当業者には熟知されている。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能性な三次元の立体配置構造を図示して表示するコンピュータープログラムを入手することができる。このような表示を検討することによって、候補の免疫グロブリン配列の機能発現における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補の免疫グロブリンのその抗原に対する結合能に影響する残基の分析が可能になる。このように、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および持ち込み配列からの選択および組合せを行うことができ、その結果、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成される。さらなる詳細については、国際特許公開第ＷＯ９２／２２６５３号（１９９２年１２月２３日公開）を参照。
【００８２】
（ｉｉ）免疫付着因子調製 免疫グロブリン(Ｉｇ)、およびその変異体が知られており、その多くが、組換え細胞培養によって調製されている。例えば、米国特許第４，７４５，０５５号；欧州特許第２５６，６５４号；Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：２８６ (１９８２)；欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １２３：７９３ (１９７９)；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２１９７ (１９８０)；Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１：２０７３ (１９８１)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：２３９ (１９８４)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２ (１９８５)；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１ (１９８４)；欧州特許第２５５，６９４号；欧州特許第２６６，６６３号；および国際特許公開第８８／０３５５９号を参照。再編成された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号；国際特許公開第８８／０３５６５号；および欧州特許第６８，７６３号、ならびに、それらで引用されている参考文献を参照。
【００８３】
付着因子結合ドメインの配列を、適当な免疫グロブリン定常ドメイン位配列に連結させて構築したキメラ(免疫付着因子)が当技術分野において知られている。
【００８４】
文献で報告されている免疫付着因子には、Ｔ細胞レセプターとの融合タンパク質(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２９３６−２９４０ (１９８７))；ＣＤ４との融合タンパク質（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１ (１９８９)；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０ (１９８９)；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７−３５３ (１９９０)；およびＢｙｍら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７−６７０(１９９０))；Ｌ−セレクチン（ホーミンクルセプター）との融合タンパク質(Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９(１９９０)；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４９：１６４−１６７(１９９１))；ＣＤ４４との融合タンパク質(Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３ (１９９０))；ＣＤ２８とＢ７との融合タンパク質(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０ (１９９１))；ＣＴＬＡ−４との融合タンパク質(Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９ (１９９１))；ＣＤ２２との融合タンパク質(Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ６６：１１３３−１１４４(１９９１))；ＴＮＦレセプターとの融合タンパク質(Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５−１０５３９ (１９９１)；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６ (１９９１)；およびＰｅｐｐｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９ (１９９１))；およびＩｇＥレセプターαとの融合タンパク質（ＲｉｄｇｗａｙとＧｏｖｍａｎ、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８ (１９９１)）などがある。
【００８５】
もっとも単純で、もっとも素直な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)）を、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とＦｃ領域に結合させるものである。通常、本発明の免疫付着因子を調製するときには、付着因子の結合ドメインをコードする核酸がＣ末端になるように、免疫グロブリンの定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端の融合も可能である。
【００８６】
典型的には、このような融合配列において、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのヒンジ、ＣH２、ＣH３の各ドメインの機能的活性を保持している。定常ドメインのＦｃドメインのＣ末端側で融合させたり、重鎖のＣH１、または軽鎖の対応領域のすぐＮ末端側で融合させたりする。正確にどの位置で融合させるかは重要ではないが、特定の部位がよく知られていて、生物学的活性、分泌、またはＩａの結合特性を最適なものにするときに選択される。
【００８７】
好ましい実施態様において、免疫グロブリンＧ1（ＩｇＧ1）のＦｃドメインのＮ末端に付着因子の配列を融合させる。重鎖の定常領域全体を付着因子の配列に融合させることも可能である。しかし、より好ましくは、化学的にＩｇＧＦｃを画定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の最初の残基を１１４とすると残基２１６にあたる）のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まる配列、または、他の免疫グロブリンの同様の部位を融合に用いる。特に好ましい実施態様においては、付着因子のアミノ酸配列を、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、またはＩｇＧ3の重鎖の（ａ）ヒンジ領域、およびＣH２とＣH３からなる領域に、または、（ｂ）ＣH１、ヒンジ、ＣH２、およびＣH３ドメインに融合させる。融合させる正確な部位は重要ではなく、最適な部位を通常の実験によって決定することができる。
【００８８】
双特異的免疫付着因子では、免疫付着因子はマルチマーとして集合し、ヘテロダイマーまたはヘテロ四量体として集合する。一般的には、これらの分子集合した免疫グロブリンは、既知のユニット構造をもっているはずである。基本的な４本鎖の構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに見られる構造である。高分子量の免疫グロブリンでは、４本鎖の構造単位が繰り返される。すなわち、ＩｇＭは、一般的に、４本鎖の基本ユニットをジスルフィド結合によって結合させた五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、場合によってはＩｇＧグロブリンも、血清中ではマルチマーの形で存在することがある。マルチマーの場合、４本鎖ユニットは同じものであることもあれば、異なることもある。
【００８９】
本明細書の範囲に含まれる集合免疫付着因子のさまざまな例を以下に概略的に示す：
（a）ACL-ACL；
（b）ACH-[ACH,ACL-ACH,ACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；
（c）ACL-ACH-[ACL-ACH,ACL-VHCH,VLCL-ACH,またはVLCL-VHCH]；
（d）ACL-VHCH-[ACH,またはACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；
（e）VLCL-ACH-[ACL-VHCH,またはVLCL-ACH]；および（f）[A-Y]n-[VLCL-VHCH]2；
ここで、Ａは、それぞれ、同一か異なった付着因子のアミノ酸配列を表しており、 ＶLは、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインであり；
ＶHは、免疫グロブリン重鎖の可変ドメインであり；
ＣLは、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインであり；
ＣHは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインであり；
ｎは、１よりも大きい整数であり；
Ｙは、共有結合的な架橋剤の残基を示している。
【００９０】
簡潔を期するために、上記の構造は、主要な特徴を示しているにすぎず、結合ドメイン（Ｊ）や、免疫グロブリンのその他のドメインは示されていない。さらに、ジスルフィド結合も示されていない。しかし、このようなドメインが結合活性にとって必要である場合には、それらが、免疫グロブリン分子の中で占める通常の位置に提示されるよう構成されている。
【００９１】
または、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の配列の問に付着因子の配列を挿入することも可能である。この実施態様では、免疫グロブリンの各アームにおける、免疫グロブリン重鎖のヒンジとＣH２ドメインの間か、またはＣH２とＣH３ドメインの間の３’末端に付着因子の配列を融合させる。同様の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
【００９２】
免疫グロブリンの軽鎖が、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に会合しているか、または、付着因子に直接融合するかして存在することもあろう。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、典型的には、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡとともに発現する。分泌されるときに、ハイブリッドの重鎖と軽鎖が共有的に会合して、ジスルフィド会合で結ばれた免疫グロブリン重鎖−軽鎖の２組の組み合せを含む免疫グロブリン様構造物が提供される。このような構造物を調製するのに適した方法は、例えば、１９８９年３月２８日公開の米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【００９３】
好ましい実施態様において、本発明の免疫付着因子の構築に用いる免疫グロブリンの配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の定常部位からとってくる。ヒトの免疫付着因子については、ヒトＩｇＧ1およびＩｇＧ3免疫グロブリンの配列が好ましい。ＩｇＧ1を使用することの主な利点は、固定したプロテインＡ上で、ＩｇＧ1免疫付着因子を効率的に精製できることにある。これに対して、ＩｇＧ3の精製には、これよりもかなり使い勝手の悪い媒体であるプロテインＧが必要となる。しかし、特定の免疫付着因子構築物のＩｇの融合相手を選ぶときには、免疫グロブリンのこの他の構造的性質および機能的性質も考慮すべきである。例えば、ＩｇＧ3のヒンジは、より長く、可塑性もより高いため、ＩｇＧ1に融合させると正しく折り畳まれて機能することができないような長い”付着因子”ドメインを受け入れることができる。もう一つ考慮すべきなのは、原子価である。ＩｇＧ免疫付着因子は２価性のホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭなどのＩｇサブタイプは、それぞれ、基本的なＩｇホモダイマーユニットからなるダイマーと五量体を生じよう。インビボでの実用に供するために設計された免疫付着因子では、Ｆｃ領域によって特定される薬理動態的性質およびエフェクター機能も重要である。ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびＩｇＧ4はすべて、インビボでの半減期が２１日で、補体系を活性化する相対的能力はそれぞれ異なる。ＩｇＧ4は、補体をほとんど活性化せず、ＩｇＧ2は、ＩｇＧ1よりもかなり弱くしか補体活性を活性化しない。さらに、ＩｇＧ1とは異なって、ＩｇＧ2は、単核球または好中球上のＦｃレセプターには結合しない。補体の活性化に関しては、ＩｇＧ3が最適であるが、インビボでの半減期が、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。ヒトの治療薬として使用するために、免疫付着因子を設計するときに考慮すべき他の重要な点は、特定のアイソタイプがもつアロタイプの数である。一般的には、血清学的に区別されるアロタイプの数が少ないＩｇＧのアイソタイプほど好ましい。例えば、ＩｇＧ1は、血清学的に区別されるアロタイプ部位を４つしかもっておらず、これらのうち２つは（Ｇｍ１とＧｍ２）はＦｃ領域に位置しているが、このうちの１つの部位であるＧ１ｍ１は、免疫原性がない。これに対して、ＩｇＧ3には１２の血清学的に区別されるアロタイプがあり、それらのすべてがＦｃ領域中にあって、その内の３つの部位（Ｇ３ｍ５、１１および２１）だけが免疫原性をもつ同一のアロタイプをもっている。したがって、γ１免疫付着因子よりも、γ３免疫付着因子方が免疫原としての可能性が高い。
【００９４】
付着因子部分をコードするｃＤＮＡ配列を、ＩｇのｃＤＮＡ配列にフレームを合わせて融合させることによって、もっとも好都合に免疫付着因子が構築される。しかし、ゲノムのＩｇフラグメントに融合させることもできる(例えば、Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ６１：１３０３−１３１３(１９９０)；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４ (１９９１)）参照)。後者のタイプの融合には、発現のためのＩｇ調節配列が存在することが必要である。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓または末梢血のリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの公開された配列をもとに、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって分離することができる。免疫付着因子の”付着因子”とＩｇ部分をコードするｃＤＮＡを、選んだ宿主細胞の中で効率的に発現させるためのプラスミドベクターの中にひとつながりになるように挿入する。
【００９５】
２．隆起および／または空洞の作出 隆起および／または空洞を形成するもととなる残基を選択するための最初の工程として、Ｘ線結晶解析やＮＭＲなど、当技術分野において既知の技術を用いて、ヘテロマルチマーの三次元構造を得る。三次元構造に基づいて、当業者は、接触面の残基を同定することができる。
【００９６】
好ましい接触面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣH３ドメインである。各種のＩｇＧサブタイプの接触面残基と”埋もれた”残基が同定されていたため、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣH３ドメインの接触面の残基で、取り入れる残基と置換するのに最適な残基などの残基が同定されている(例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８を参照、その全文が、参照してここに組み込まれる)。ＣH３接触面を改変するための基礎となるのは、Ｘ線結晶解析によって、ヒトＩｇＧ1重鎖の間に生じる、Ｆｃ領域での分子間結合は、ＣH３ドメイン間では広範なタンパク質／タンパク質間相互作用を含むのに対して、グリコシル化されたＣH２ドメインでは、その糖部分によって結合するということが示されたことである。(Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１−２３７０ (１９８１))。さらに、哺乳動物細胞の中には、欠失によりＣH２およびＣH３ドメインが除去されないかぎり、２つの重鎖間では、抗体が発現されるときにジスルフィド結合が効率よく形成される(Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７ (１９９２))。したがって、重鎖の集合は、ジスルフィド結合を促進すると考えられ、その逆ではないと考えられる。これらの構造および機能に関するデータをまとめて考えると、抗体の重鎖の会合はＣH３部位によってもたらされるという仮説に至る。さらに、ＣH３ドメイン間の接触面を改変して、異なった重鎖のヘテロマルチマーの形成を促進して、対応するホモマルチマーの集合を阻害することができるかもしれないという推測がなされた。
【００９７】
本明細書で説明する実験によって、この方法を用いれば、ホモマルチマーよりもヘテロマルチマーの形成を促進することが可能なことが示された。したがって、目的のポリペプチドと抗体のＣH３部位とを含むポリペプチド融合体を作出して、第１または第２のポリペプチドを形成させることができる。好ましいＣH３ドメインは、ヒトＩｇＧ1のようなＩｇＧ抗体に由来するものである。
【００９８】
隆起または空洞を形成するための候補となりうる接触面残基が同定されている。 ”埋もれた”残基を選んで置き換えることが好ましい。ある残基が埋込まれているか否かを判定するために、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００（１９７１）の表面接触プログラムを用いて、接触面にある残基と溶媒との接触可能性（ＳＡ）を計算することができる。そして、第１と第２のポリペプチドのそれぞれの残基について、一方のポリペプチドを除いた上で、ＳＡを別々に計算することができる。そして、ＳＡ（ダイマー）−ＳＡ（モノマー）という等式を用いて、接触面のモノマー型とダイマー型の間の各残基のＳＡの差異を計算することができる。これによって、ダイマーを形成するときにＳＡが減少する残基のリストが示される。ダイマーの各残基のＳＡを、同じアミノ酸のトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙのＳＡの理論値と比較する。ただし、Ｘ＝目的のアミノ酸(Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８３４−８３８(１９８５))。（ａ）モノマーに較べてダイマーでＳＡ減少した残基、および（ｂ）ＳＡが、対応するトリペプチドにおけるＳＡの２６％よりも少ない残基を接触面残基と考える。
【００９９】
２つの分類を明らかにすることができる。すなわち、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも低いＳＡをもつ残基(すなわち、”埋もれた”残基)、および、対応するトリペプチドに較べて１０％よりも高く２５％よりは低いＳＡをもつ残基（すなわち、”一部埋もれた”残基）である（下記の表１参照）
【０１００】
【表１】
0004324231.tif 000002
【０１０１】
†残基番号は、IgG結晶構造にある通り（Deisenhofer,Biochemistry 20:2361-2370(1981)）ポリペプチド鎖構造に対する残基置換の効果は、ＩｎｓｉｇｈｔTMプログラム（ＢｉｏｓｙｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの分子図形モデリングプログラムを用いて、調べることができる。このプログラムを用いて、第１のポリペプチドの接触面中に埋もれた残基で、側鎖容量の小さい残基を、例えば、より大きな側鎖容量をもつ残基（すなわち、隆起）に変えることができる。そして、第２のポリペプチドの接触面中の残基で、隆起に隣接する残基を調べて、空洞を形成するために適した残基を見つける。通常、この残基は側鎖容量が大きいので、側鎖容量の小さな残基と置き換える。一定の実施態様において、接触面の三次元構造を調べると、第１のポリペプチドの接触面上に適当な位置に置かれた、適当な大きさの隆起、または第２のポリペプチドの接触面上の空洞が明らかになるはずである。これらの例では、単一突然変異体、すなわち、合成によって導入された隆起または空洞をモデル化する必要があるだけである。
【０１０２】
第１および第２のポリペプチドがそれぞれＣH３ドメインを含む場合に、置換することのできる元の残基を選択することに関しては、ヒトＩｇＧ1のＣH３／ＣH３の接触面は、各表面から１０９０Å2埋もれた４つの逆平行β鎖上にある各ドメイン上の１６の残基を含んでいる（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，上記、およびＭｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：９６５(１９９０)。突然変異は、好ましくは、中央の逆平行β鎖上にある残基を標的とする。この目的は、作出した隆起が、相手方のＣH３ドメインの相補的な空洞の中に入らずに、周囲の溶媒の中に突出して親和してしまう危険を最小限にするためである。
【０１０３】
分子モデリングによって、好ましい元／取り込み残基が一旦同定されたら、当技術分野において周知の技術を用いて、ポリペプチドの中にアミノ酸置換を導入する。通常は、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、突然変異誘発：実用的方法(Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ)、上記、に記載されている技術を用いて遺伝子工学により改変する。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発が、第１または第２のポリペプチドをコードするＤＮＡの置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）によって説明されているように、当技術分野において周知の技術である。簡単に述べると、所望の変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることによって、第１または第２のポリペプチドＤＮＡを改変する。この鋳型ＤＮＡは、ヘテロマルチマーの未変更または天然のＤＮＡ配列を含む、一本鎖のプラスミドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込んだ相補鎖で、ヘテロマルチマーＤＮＡへの部位特異的な変化をコードする相補鎖である、鋳型に相補的な第２鎖の全長を合成する。
【０１０５】
Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ３４：３１５（１９８５）が述べるところにしたがって、目的とするＤＮＡ領域を、相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて作製した合成変異フラグメントで置換することによって、カセット突然変異誘発を行なうことができる。ＰＣＲ突然変異も、第１または第２ポリペプチドＤＮＡの変異配列を作製するのに適している。以下の考察においてはＤＮＡを引用しているが、この技術は、ＲＮＡでも応用することができると解される。ＰＣＲ技術とは、一般的には、次の手順をさす(Ｅｒｌｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−１６５０ (１９９１)、Ｒ． Ｈｉｇｕｃｈｉが担当した章、ｐ．６１−７０を参照)。
【０１０６】
隆起または空洞の突然変異以外にも、本発明は、ヘテロマルチマーのＤＮＡの中に適当なヌクレオチド変異を導入するか、または所望のヘテロマルチマーポリペプチドを合成することによって調製することのできるヘテロマルチマーのアミノ酸配列の変異配列を含む。このような変異配列には、例えば、ヘテロマルチマーを形成する第１および第２のポリペプチドのアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入、または置換が含まれる。最終的な構築物が望ましい抗原結合特性をもっているとすれば、最終的な構築物ができるように、欠失、挿入および置換を組み合わせる。グリコシル化部位の数と位置を変更したりして、アミノ酸を変えることによっても、ヘテロマルチマーの翻訳後のプロセッシングを変えることができる。
【０１０７】
突然変異を誘発するのに好ましい位置にある、ヘテロマルチマーポリペプチドの一定の残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって述べられている“アラニンスキャニング突然変異誘発法”といわれるものである。ここで、標的残基の残基またはそのグループが同定され (例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、およびＧｌｕなどの荷電性残基)、中性のアミノ酸または負に荷電したアミノ酸（もっとも好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えて、アミノ酸と、細胞の内外の周囲の水性環境との相互作用に影響を与える。そして、置換部位で、またはそれに対する、および／または別の変異残基を導入することによって、置換に対して機能的な感受性を示すドメインをさらに明確にすることができる。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決まっていても、突然変異そのものの性質を予め測ることはできない。
【０１０８】
通常、突然変異には、ヘテロマルチマーの非機能的な領域における保存的なアミノ酸置換が含まれる。突然変異の例を表２に示す。
【０１０９】
【表２】
0004324231.tif 000003
【０１１０】
ヘテロマルチマーのポリペプチドの共有修飾も、本発明の範囲に含まれる。ヘテロマルチマーの共有修飾は、ヘテロマルチマー、またはそのフラグメントの標的アミノ酸残基を、Ｎ末端またはＣ末端の残基の選ばれた側鎖と反応することのできる有機的誘導化剤と反応させて、分子の中に導入することができる。ヘテロマルチマーポリペプチドの別のタイプの共有修飾で、本発明の範囲に含まれるものには、ポリペプチドの本来のグリコシル化パターンを改変することが含まれる。改変とは、もとのヘテロマルチマーの中に見られる糖部分を一つ以上欠失させるか、および／または、もとのヘテロマルチマーには存在しないグルコシル化部位を一つ以上付加することを意味する。ヘテロマルチマーポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位が含まれるよう、アミノ酸配列を改変することによって適宜行われる。一つ以上のセリンまたはトレオニン残基を、もとのヘテロマルチマー配列に付加または置換することによって改変を行なうこともできる(Ｏ結合型グリコシル化部位)。簡単にするために、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを作出するよう、ヘテロマルチマーポリペプチドをコードするＤＮＡの予め決定された塩基突然変異を起こすことによって、ヘテロマルチマーのアミノ酸配列を改変する。ヘテロマルチマーポリペプチド上の糖部分の数を増加させる別の方法は、化学結合または酵素結合によってグリコシドをポリペプチドに結合させることである。これらの方法については、１９８７年９月１１日発行の国際特許公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。ヘテロマルチマーに存在する糖部分の削除は、化学的または酵素的に行なうことができる。
【０１１１】
ヘテロマルチマーの別のタイプの共有修飾には、ヘテロマルチマーポリペプチドを、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４，１７９，３３７号において提示されている方法で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、さまざまな非タンパク質性ポリマーの一つに結合させることが含まれる。
【０１１２】
変異ヘテロマルチマーの特性を前もって予測することは困難であるため、回収された変異体をスクリーニングして、最適な変異体を選抜することが必要であると認められよう。
【０１１３】
３．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの発現ＤＮＡを突然変異させて、本明細書で開示されているような共通の軽鎖を選抜した後、当技術分野において広く利用可能な組換え技術を用いて、この分子をコードするＤＮＡを発現させる。しばしば、優れた発現系は、ヘテロマルチマーを適切にグルコシル化するための(例えば、グリコシル化されている抗体部位を含むヘテロマルチマーの場合など)、哺乳動物細胞の発現ベクターと宿主とを含んでいる。しかし、下で詳述するように、この分子は、原核生物の発現系で産生させることもできる。通常、一つのベクター、または別々のベクター上に存在する、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、共通の軽鎖ポリペプチド、および、ヘテロマルチマーを形成するのに必要な別のポリペプチドのすべてコードするＤＮＡによっての宿主細胞を形質転換する。しかし、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、および共通の軽鎖ポリペプチド（ヘテロマルチマーの成分）を、別々の発現系で発現させ、発現したポリペプチドをインビトロで結合させることも可能である。
【０１１４】
ヘテロマルチマーと共通の軽鎖をコードするヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために、複製可能なベクターの中に挿入する。多くのベクターを利用することができる。一般的に、ベクターの構成要素として、次のものを一つ以上含むが、これらに限定はされない。すなわち、シグナル配列、複製開始点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列。
【０１１５】
ヘテロマルチマーの成分であるポリペプチドは、シグナル配列、または、それ以外で、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位をもつポリペプチドに融合したポリペプチドとして作製することができる。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であるか、または、ベクターの中に挿入されるＤＮＡの一部であろう。好んで選ばれる異種由来のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって開裂される）配列である。原核生物の宿主細胞では、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンドトキシンＩＩの先導配列からなるグループから選択される、原核生物のシグナル配列で置き換えることができる。酵母での分泌を行なわせるためには、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子の先導配列(サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子の先導配列、後者については、１９９１年４月２３日公開の米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、または酸性ホスファターゼの先導配列、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼの先導配列(１９９０年４月４日公開の欧州特許第３６２，１７９号)、または、１９９０年１１月１５日発行の国際特許公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルなどによって置換することができる。哺乳動物細胞で発現させるときには、本来のシグナル配列（例えば、抗体または付着因子のプレ配列で、通常、インビボで、これらの分子をヒト細胞から分泌させる配列）で十分であるが、哺乳動物の別のシグナル配列も適しているし、また、例えば、単純ヘルペスのｇＤシグナルのような、ウイルスの分泌を促す配列も適当であろう。このような前駆体領域に対するＤＮＡを、読み枠がずれないように、ヘテロマルチマーを形成するポリペプチドをコードするＤＮＡと連結させる。
【０１１６】
発現ベクターもクローニングベクターも、一つ以上の選ばれた宿主細胞の中でベクターの複製が可能になる塩基配列を含んでいる。一般的に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立に、ベクターが複製できるようにする配列であり、複製開始点または自律複製配列を含む配列である。このような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に適合し、２μプラスミドの開始点は酵母に適合し、また、さまざまなウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞でのクローニングベクターとして有用である。一般的に、複製開始点という構成因子は、哺乳動物の発現ベクターには不要である(ＳＶ４０の複製開始点は、初期プロモーターを含んでいるというだけの理由で一般的には用いられている)。
【０１１７】
発現ベクターとクローニングベクターは、選抜可能マーカーとも言われる選抜用遺伝子を持っていなければならない。典型的な選抜用遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他の毒素に対する抵抗性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するか、または（ｃ）例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地からは摂取できない重要な栄養分を供給する。選抜計画の一例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬剤を利用する。異種由来の遺伝子によって形質転換するのに成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、それによって、選抜試験を生き残る。このような優性選抜の例では、ネオマイシン(Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７(１９８２))、マイコフェノール酸(Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２２(１９８０))、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３(１９８５)）という薬剤が用いられる。上記の３つの例は、それぞれ、Ｇ４１８もしくはネオマイシン(ゲネチシン(ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ))、Ｘｇｐｔ(マイコフェノール酸)、またはハイグロマイシンという、適当な薬剤に対する抵抗性を持ち込むために、真核生物の遺伝子の調節下に置かれた細菌遺伝子が用いられている。
【０１１８】
哺乳動物にとって適当な選抜マーカーのもう一つの例は、ＤＨＦＲ、またはチミジンキナーゼのように、ヘテロマルチマーの塩基配列を取り込む能力のある細胞の同定を可能にする選抜マーカーである。マーカーを取り込んだために、形質転換体だけが、唯一、適応して生き残れるという選択圧の下に、哺乳動物細胞の形質転換体を置く。培地の中の選抜用薬剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選抜用遺伝子とヘテロマルチマーをコードするＤＮＡの両方の増幅がもたらされるような条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧をかける。増幅されたＤＮＡからは大量のヘテロマルチマーが合成される。この他に増幅可能な遺伝子の例には、メタロチオネイン−Ｉおよび−２、好ましくは、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどがある。
【０１１９】
例えば、まず、ＤＨＦＲの競合的な拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）
を含む培養培地の中で、全部の形質転換細胞を培養して、ＤＨＦＲ選抜用遺伝子によって形質転換された細胞を同定する。野生型のＤＨＦＲを用いるときに、適当な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０）による説明にしたがって、調製および増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のＤＨＦＲ活性欠損株である。次に、形質転換された細胞を、濃度を上げたメトトレキセートに曝す。これによって、ＤＨＦＲ遺伝子のコピーが多数合成されるようになり、同時に、ヘテロマルチマーの成分をコードするＤＮＡなど、発現ベクターを含むその他の遺伝子のコピーも多数合成されるようになる。この増幅技術は、例えば、ＡＴＣＣＣＣＬ６２、ＣＨＯ−Ｋ１などの適当な宿主とともに用いることができ、Ｍｔｘに高い耐性をもつ変異ＤＨＦＲ遺伝子を用いるならば、内生的なＤＨＦＲがあったとしても構わない(欧州特許第１１７，０６０号)。
【０１２０】
または、ヘテロマルチマー、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの選抜マーカーをコードするＤＮＡ配列によって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内生ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などのアミノグリコシド系抗生物質選抜マーカーに対する選抜用薬剤を含む培地の中で細胞を増殖させることによって選抜することができる。米国特許第４，９６５，１９９号参照。
【０１２１】
酵母の中で用いるための適当な選抜用遺伝子は、酵母のプラスミドＹＲｐ７の中にあるｔｒｐ１遺伝子である。(Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９(１９７９)；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ ７：１４１(１９７９)；または、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ１０：１５７(１９８０))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンの中では増殖できない酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ４４０７６、またはＰＥＰ４−１に対する選抜マーカーを提供する(Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２(１９７７))。酵母宿主ゲノムにｔｒｐ１障害があることによって、トリプトファンなしで増殖させることによって、形質転換体を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ−２欠損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子をもつ既知のプラスミドによって相補される。
【０１２２】
さらに、クルイベロマイセス属の酵母を形質転換するためには、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを用いることができる。Ｂｉａｎｃｈｉら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ １２：１８５(１９８７)。さらに最近、組換えウシキモシンの大量生産のための発現系が報告された。Ｖａｎ ｄｅｎＢｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：１３５(１９９０)。クルイベロマイセス属の工業用菌株により成熟組換えヒト血清アルブミンを分泌させるための、安定したマルチコピー発現ベクターも開示されている(Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５(１９９１))。
【０１２３】
発現ベクターとクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ヘテロマルチマーの核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。宿主に可能性のある、さまざまな細胞によって認識されるプロモーターが多数ある。制限酵素消化によって、もととなるＤＮＡからプロモーターを除去し、分離したプロモーターをベクターに挿入にして、これらのプロモーターは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結する。
原核生物宿主で使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースのプロモーター系(Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５(１９７８)；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４(１９７９))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，８：４０５７(１９８０)、および欧州特許第３６，７７６号)、および、ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１−２５(１９８３)）が含まれる。しかし、細菌のこれ以外の既知のプロモーターが適当である。それらの塩基配列は公開されているので、当業者は、必要な制限酵素部位をもたらすためのリンカーまたはアダプターを用いて、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的にプロモーターを連結させることができる(Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ ２０：２６９(１９８０))。また、細菌の系で使用するためのプロモーターは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ.）配列も含んでいる。
【０１２４】
プロモーターの配列は、真核生物で知られている。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写開始部位から約２５から３０塩基上流にあるＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始点から上流７０から８０塩基のところに見つかっている別の配列とはＣＸＣＡＡＴ領域である、ただし、Ｘを任意のヌクレオチドである。殆どの真核生物遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルらしいＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列はすべて、真核生物の発現ベクターの中に適当に挿入する。
【０１２５】
酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター(Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３(１９８０))、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど、その他の解糖酵素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇ．７：１４９(１９６８)；および、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：４９００(１９７８)）などである。
【０１２６】
この他の酵母プロモーターで、増殖条件によって転写を調節するという、さらに別の利点をもつ誘導的プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母での発現に用いるのに適したベクターとプロモーターについては、Ｈｉｔｚｅｍａｎら、欧州特許第７３，６５７Ａ号でさらに説明されている。また、酵母のエンハンサーも、酵母プロモーターとともに適宜用いられる。
哺乳動物の宿主細胞での、ベクターからのヘテロマルチマーの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日発行の英国特許第２，２１１，５０４号)、アデノウイルス(アデノウイルス２など)、ウシポリオーマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および、もっとも好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなど、異種由来の哺乳動物のプロモーター、または、ヒートショックプロモーターによって調節される。
ＳＶ４０ウイルスの前者および後者のプロモーターは、都合のよいことに、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素フラグメントとして得られる。Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３ (１９７８)；ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：７３９８−７４０２ (１９８１)。ヒトサイトメガロウイルス最早期プロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限酵素フラグメントとして得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０ (１９８２)。ウシポリオーマウイルスをベクターとして用いた、哺乳動物の宿主の中でＤＮＡを発現させるための系が米国特許第４，４１９，４４６号に記載されている。
【０１２７】
この系を改変したものが、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。
【０１２８】
また、免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡのサル細胞での発現については、Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３−５０８(１９８２)；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下での、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡのマウス細胞における発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１ (１９８２)；ヒトインターフェロンβ１遺伝子の培養マウス細胞とウサギ細胞における発現についてはＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５１６６−５１７０ (１９８２)；および、マウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（長い末端反復配列）をプロモーターとして用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およひマウスＮＴＨ−３Ｔ３細胞における、細菌のＣＡＴ配列の発現についてはＧｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７−６７８１（１９８２）も参照。
高等真核生物による、ヘテロマルチマー成分をコードするＤＮＡの転写は、ベクターの中にエンハンサー配列を挿入することによって亢進することがよくある。エンハンサーは、方向や位置に比較的無関係であり、転写単位に対して５’側(Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：９９３(１９８１))、３’側（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．３：１１０８(１９８３)）イントロンの内部(Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ３３：７２９(１９８３))、および、コーディング配列そのものの中（Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．４：１２９３(１９８４)）にも見つかっている。今では、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞のウイルスに由来するエンハンサーが使用される。例としては、複製開始点の後方側（１００−２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製開始点の後方側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーなどがある。また、真核生物のプロモーターを活性化するための促進因子については（Ｙａｎｉｖら、Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７−１８（１９８２）を参照。エンハンサーは、ベクターの中のヘテロマルチマーをコードする配列の５’側か３’側の位置に挿入することができるが、好ましくは、プロモーターの５’側の部位に存在する。
【０１２９】
真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終結、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側にある非翻訳領域から広く利用することができる。これらの領域には、ヘテロマルチマーをコードするｍＲＮＡの非翻訳部位のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチド分節が含まれる。
【０１３０】
上記で挙げた構成要素を一つ以上含む適当なベクターを構築するには、標準的な結紮技術を用いる。分離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とするプラスミドを作出するのに望ましい形になるように、開裂し、加工してから再連結する。
【０１３１】
構築したプラスミドの配列が正しいことを確認するための解析を行なうために、結紮混合液を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）を形質転換して、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によって選抜された、形質転換に成功した株が適正なものである。形質転換からプラスミドを調製して、制限酵素消化によって解析し、および／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，９：３０９（１９８１）の方法、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９（１９８０）の方法によって配列決定を行なう。
【０１３２】
本発明の実施において特に有用なのは、ヘテロマルチマーをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞の中で一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般的には、一過性発現には、宿主細胞が多くの発現ベクターのコピーをもち、次いで、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを大量に合成するように、宿主細胞の中で効率的に複製することのできる発現ベクターを使用することが含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２。適当な発現ベクターと宿主細胞を含む一過的発現系によって、クローニングされたＤＮＡによってコードされているポリペプチドを便利に陽性のものを同定することと、所望の結合特性／親和性、または、本発明によって作出される、天然のジスルフィド結合をもたないヘテロマルチマーまたホモマルチマーに対して、所期のゲル泳動度をもつヘテロマルチマーを迅速にスクリーニングすることが可能になる。
【０１３３】
脊椎動物の組換え細胞培養でヘテロマルチマーを合成するように調整するのに適した、この他の方法、ベクター、および宿主細胞については、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５(１９８１)；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：４０−４６(１９７９)；欧州特許第１１７，０６０号；および欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。哺乳動物の培養細胞でヘテロマルチマーを発現させるのに特に役立つプラスミドは、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＰＣＴ国際特許公開第９１／０８２９１号）である。
【０１３４】
ヘテロマルチマーを発現させるために、どの宿主細胞系を選択するかは、主に、発現ベクターによって決まる。もう一つ考慮すべきなのは、必要とするタンパク質量である。ミリグラム単位の量を、一過的形質転換によって産生することができる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ−によって形質転換された２９３ヒト胚腎臓細胞系を、ヘテロマルチマーの効率的な発現が可能になるよう、リン酸カルシウム法を修正した方法によって、ｐＲＫ５を基本とするベクターで一過的に形質転換することができる。ＣＤＭ８を基本とするベクターを用いて、ＤＥＡＥ−テキストラン法によってＣＯＳ細胞を形質転換することができる(Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３(１９９０)；および、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ ＣｅｌｌＢｉｏｌ.(ＵＳ)９：３４７−３５３(１９９０))。より大量のタンパク質が必要ならば、宿主細胞系を安定的に形質転換させた後、免疫付着因子を発現させることができる。例えは、ｐＲＫ５を基本とするベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする別のベクターの存在下で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に導入して、Ｇ４１８に対する抵抗性を付与することができる。Ｇ４１８に抵抗性のクローンは、培養によって選抜することができる。これらのクローンを、ＤＨＦＲのインヒビターであるメトトレキセートの量を増加させながら培養して、ＤＨＦＲとヘテロマルチマーの配列をコードする遺伝子のコピー数が共に増幅されているクローンを選抜する。免疫付着因子が、Ｎ末端に疎水性の先導配列をもっていれば、形質転換された細胞によって加工されて分泌される可能性が高い。より複雑な構造をもつ免疫付着因子の発現には、特に適した宿主細胞が必要となろう。例えば、軽鎖またはＪ鎖などの構成成分は、一定のミエローマまたはハイブリドーマの宿主細胞によって提供されよう(Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、上記；およびＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３５６１−３５６８(１９９３))。
【０１３５】
本明細書のベクターをクローニングし、発現させるのに適した、この他の宿主細胞は、上記のような原核生物、酵母、または、高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌で、例えば、腸内細菌である、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)、エンテロバクター属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)、エルウィニア属(Ｅｒｗｉｎｉａ)、クレブシアラ(Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ)、プロテウス属(Ｐｒｏｔｅｕｓ)、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ)、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラティア属(Ｓｅｒｒａｔｉａ)、およびシゲラ属(Ｓｈｉｇｅｌｌａ)、ならびに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０で開示されているＢ．リケニフォルミス４１Ｐ)などのバシラス属、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などである。好ましい大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、その他、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１，５３７)、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの菌株も適している。これらの例は、例示のためのものであり、制限のためのものではない。菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物の発酵のための一般的な宿主菌株であるため、この菌株は、特に好ましい宿主、または宿主の親株である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するものでなければならない。例えば、Ｗ３１１０株を改変してタンパク質をコードする遺伝子に遺伝的変異を生じさせることができる。そのような宿主の例として、大腸菌Ｗ３１１０の２７Ｃ７株などがある。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔｏｎＡΔｐｔｒ３ ｐｈｏＡΔＥ１５ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｏｍｐＴΔｄｅｇＰ４１ｋａｎｒである。２７Ｃ７株は、１９９１年１０月３０日に、ＡＴＣＣ番号５５，２４４として、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された。または、１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号で開示されている、ペリプラズマプロテアーゼの変異体をもつ大腸菌の菌株を用いることもできる。または、例えば、ＰＣＲ、または、別の核酸のポリメラーゼ反応などのクローニング法が適している。
【０１３６】
原核生物の他に、糸状菌類または酵母のような真核生物微生物が、ヘテロマルチマーをコードするベクターに適したクローニングおよび発現のための宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)、すなわち一般的なパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中で、もっとも一般的に用いられている。しかし、本明細書においては、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）(ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ２９０：１４０(１９８１)；１９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９，３８３号)；クルイベロマイセス属の宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、上記）で、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）(ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，７３７(１９８３))、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｅｓ）(ＡＴＣＣ １２，４２４)、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ） (ＡＴＣＣ １６，０４５)、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｈｅｒａｍｉｉ）(ＡＴＣＣ２４，１７８)、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）(ＡＴＣＣ ５６，５００)、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）(ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、上記)、Ｋ．テルモトレランス(Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ)、およびＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）(欧州特許第４０２，２２６号)；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）(欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８(１９８８))；カンジダ属；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ）(欧州特許第２４４，２３４号)；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）(Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５２５９−５２６３(１９７９))；シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオマイセス属(１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３８号)；および、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)、トリポタラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌(１９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５７号)、ならびに、アウペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ） (Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９(１９８３)；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ ２６：２０５−２２１(１９８３)；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４(１９８４)、およびＡ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）(ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯＪ．４：４７５−４７９(１９８５))など、この他数多くの属、種、および株を用いることが可能であり、また有用でもある。
【０１３７】
グリコシル化されたヘテロマルチマーを発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。そのような宿主細胞は、複雑なプロセッシングを行なうことができ、グリコシル化活性をもつ。原則として、脊椎動物由来でも、無脊椎動物由来でも、どのような高等真核生物の細胞培養を使うこともできる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞、昆虫細胞などがある。多数のバキュロウイルス株とその変異株、および対応する昆虫宿主許容細胞として、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）(毛虫)、アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）(蚊)、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）(蚊)、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）(ショウジョウバエ)、およびボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）などか確認されている。例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５(１９８８)；Ｓｅｔｌｏｗら編、遺伝子工学（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ）第８巻より、Ｍｉｌｌｅｒら、ｐｐ．２７７−２７９(プレナムパブリッシング社(ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ)、１９８６年)；および、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−５９４（１９８５）を参照。例えば、アウトグラファ・カリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異株、およびカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉＮＰＶ）のＢｍ−５株など、形質転換用のさまざまなウイルス株が一般に利用可能であり、そのようなウイルスは、本明細書において、本発明に記載されているウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の形質転換に用いることができる。
【０１３８】
ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物培養細胞を宿主として利用することができる。典型的には、予め、ヘテロマルチマーＤＮＡを持つように操作してあるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌の一定の菌株とインキュベートして、植物細胞を形質転換する。植物培養細胞をＡ．ツメファシエンスとインキュベートしている間に、ヘテロマルチマーをコードしているＤＮＡが植物細胞宿主に移行して、それを形質転換し、適当な条件の下でヘテロマルチマーを発現させる。さらに、ノパリンシンターゼプロモーター、およびポリアデニル化シグナル配列のように、植物細胞と親和性のある調節配列とシグナル配列を利用することができる。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎ．１：５６１(１９８２)。なお、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離したＤＮＡ分節は、組換えＤＮＡを含む植物組織において、植物で発現する遺伝子の転写レベルを活性化あるいは上昇させることができる。１９８９年６月２１日発行の欧州特許第３２１，１９６号。
【０１３９】
好ましい宿主は脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の細胞を培養して増殖させること（組織培養）は、近年では日常的な処理になっている(アカデミックプレス社 (Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ)、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、組織培養（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ）(１９７３))。有用な哺乳動物の宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓系統(２９３、または、懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９(１９７７))；仔ハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６(１９８０))；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｄ．２３：２４３−２５１(１９８０)）；サル腎臓細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０)；アフリカミドリザルの腎臓細胞(ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７)；ヒト子宮頚部ガン細胞(ＨＥＬＡ、 ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳ガン(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１)；ＴＲＩ細胞(Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８(１９８２))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０１４０】
宿主細胞を本発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換して、プロモーターを誘導したり、形質転換体を選抜したり、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適合するように修正した通常の培地で培養する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した標準的な技術を用いて形質転換を行なう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記の１．８２節で説明されているように、一般的には、実質的な細胞壁という障壁を含む、原核生物またはその他の細胞に対して、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはエレクトロポレーションを用いる。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ２３：３１５(１９８３)、および１９８９年６月２９日発行の国際特許公開第８９／０５８５９号に記載されているようにして、アクロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染を、一定の植物細胞を形質転換するために用いる。さらに、１９９１年１月１０日発行の国際特許公開第９１／００３５８号に記載されているようにして、超音波を用いて、植物を形質転換することができる。
【０１４１】
このような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については、ＧｒａｈａｍとｖａｎｄｅｒＥｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様を、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号において、Ａｘｅｌが記述している。酵母への形質転換は、一般的には、ＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６(１９７７)、およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：３８２９（１９７９）の方法にしたがって行われる。ＤＮＡを細胞の中に導入するために、核へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無処理の細胞とバクテリアのプロトプラストとの融合、または、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンのような別の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するためのさまざまな技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(１９８９)、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７(１９９０)、およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。
【０１４２】
本発明のヘテロマルチマーポリペプチドを産生するために用いた原核生物細胞を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記において、一般的に説明されているところにしたがって、適当な培地で培養する。
【０１４３】
本発明のヘテロマルチマーを産生するために用いた哺乳動物宿主細胞は、さまざまな培地出培養することができる。宿主細胞を培養するには、Ｈａｍ’ｓＦ１０(シグマ社(Ｓｉｇｍａ))、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ社)、ＲＰＭＩ−１６４０(シグマ社)、およびダルベッコの修正イーグル培地 ((ＤＭＥＭ)、シグマ社)などの市販の培地が適当である。さらに、それらの開示内容がすべて、参照してここに組み込まれる、ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４(１９７９)、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５(１９８０)、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；または、第４，５６０，６５５号；国際特許公開第９０／０３４３０号；国際特許公開第８７／００１９５号；米国特許第４，７９１，１９２号；および米国特許（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｒｅ.）第３０，９８５号；または、米国特許第５，１２２，４６９号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞用の培養培地として用いることができる。これらの培地はどれも、必要ならは、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子(インシュリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩類(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸)、緩衝液(ＨＥＰＥＳなど)、ヌクレオシド(アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(登録商標ゲンタマイシン薬剤)、微量要素(最終濃度がマイクロモルの単位で存在する無機化合物と定義される)、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加することもできる。この他の添加物も、当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選ばれた宿主細胞によって以前用いられた条件であり、当業者にとっては明らかである。
【０１４４】
一般的に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実際の技術については、ＩＲＬプレス社(ＩＲＬＰｒｅｓｓ)、１９９１年、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、哺乳動物細胞のバイオテクノロジー：実際的方法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）に書かれている。
【０１４５】
本開示で言及されている宿主細胞は培養細胞だけでなく、宿主動物の中の細胞も含む。
４．ヘテロマルチマーの回収ヘテロマルチマーは、好ましくは、一般的に、分泌ポリペプチドとして、培養培地から回収するが、分泌シグナルなしに、直接産生されたときには、宿主細胞溶解物から回収する。ヘテロマルチマーに膜結合があるときには、適当な界面活性剤（例：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて膜から解離することができる。
【０１４６】
ヒトに由来しない組換え細胞の中でヘテロマルチマーが産生されたときには、ヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、組換え細胞のタンパク質やポリペプチドからヘテロマルチマーを精製して、ヘテロマルチマーについて実質的に均質な調製物を得る必要がある。最初の工程として、培養培地または細胞溶解物を普通に遠心分離して、微粒子化した細胞残滓を取り除く。
【０１４７】
抗体の定常部位をもつヘテロマルチマーは、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、都合のよいように精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。ヘテロマルチマーがＣＨ３部位を含むときは、登録商標ベーカーボンド ＡＢＸ(Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ)樹脂(Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ (Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ))が、精製するために有用である。この他に、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースによるクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫安沈殿などのタンパク質精製技術も、回収するポリペプチドによっては利用可能である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、キメラで用いられた免疫グロブリンＦｃドメインの種類およびアイソタイプによって異なる。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、またはγ４のＨ鎖に基づいて、免疫付着因子を精製することができる (Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３(１９８３))。マウスのアイソタイプのすべてとヒトγ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７−１５７５(１９８６)）には、プロテインＧが推奨されている。親和性リガンドが結合する基質は、もっとも普通にはアガロースであるが、その他の基質を用いることもできる。調節された多孔性ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンジンのような物理的に安定した基質なら、アガロースを用いるよりも流速が早くなり、短い処理時間でできる。プロテインＡまたはＧアフィニティーカラムに免疫付着因子を結合させる条件は、Ｆｃ部位の特徴によって全面的に決定される。すなわち、その分子種とアイソタイプによって決まる。一般的には、適正なリガンドが選択されれば、直接、条件付けていない培養溶液からでも、効率的な結合が起こる。免疫付着因子の顕著な特徴の一つは、ヒトγ１分子で、同じＦｃ型の抗体に較べて、プロテインＡに対する結合能力が幾分低下することである。結合した免疫付着因子は、酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）で、または、僅かにカオトロピックな塩を含む中性ｐＨの緩衝液の中で効率的に溶出することできる。このアフィニティークロマトグラフィー工程によって、＞９５％純粋なヘテロマルチマー調製物を作製することができる。
【０１４８】
５．共通の軽鎖をもつヘテロマルチマーの多官能性抗体の使用ヘテロマルチマーについては、治療薬としての多くの応用が考えられる。例えば、細胞傷害性を切り換える（例：腫瘍細胞を殺す）ために、ワクチンのアジュバントして、血栓溶解剤を血餅まで輸送するために、標的部位（例えば、腫瘍）で、酵素的に活性化されたプロドラッグを転化するために、感染病を治療するために、免疫複合体を細胞表面へと向かわせるために、または、腫瘍細胞にイムノトキシンを輸送するためにヘテロマルチマーを用いることができる。例えば、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体であるモデル内皮抗原を標的とすることによって、抗体−リシンイムノトキシンによって、腫瘍の脈管構造を標的とすることができた(Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８９９６−９０００)。
【０１４９】
抗−内皮イムノトキシンを別のイムノトキシンと組み合わせることによって、腫瘍細胞そのものに対する有意に高い効能が得られた(Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．とＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）上記)。最近、双特異的抗体を用いて、組織因子を腫瘍脈管構造に向かわせることに成功し、かなり高い抗腫瘍効果を生じる局所的な血栓症を引き起こした(Ｈｕａｎｇ，Ｘら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：５４７−５５０)。さらに、双特異的抗体を用いて、細胞傷害性Ｔ細胞に、インビトロで、標的乳ガン細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞を殺させることに成功した(Ｚｈｕ，Ｚ．ら、（１９９６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１９２−１９６；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｅｎｇｉｎ．９：２９９−３０５)。
【０１５０】
望ましい精製度をもつヘテロマルチマーを、選択的に、生理学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（レミントンの製薬科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編(１９８０)）と混合して、凍結乾燥した固形または水溶液の形状で保存するために、ヘテロマルチマーの治療用処方剤を調製する。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量と濃度では受容者にとって非毒性で、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などを含む緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの疎水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類；二糖類；および、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール、またはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；および／または、トィーン(Ｔｗｅｅｎ)、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤を含んでいる。
【０１５１】
ヘテロマルチマーは、例えば、コアセルベート化技術、または界面ポリマー化（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、または、それぞれ、ゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−［メチルメトアシレート］マイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセルの中に取り込んだり、コロイド剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込んだり、または、マクロエマルジョンの中に取り込んだりすることができる。このような技術については、レミントンの製薬科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ)、上記で開示されている。
【０１５２】
インビボでの投与に用いるヘテロマルチマーは、滅菌されていなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前か後に、滅菌フィルター膜で濾過すれば簡単に行なえる。ヘテロマルチマーは、通常、凍結乾燥状態か水溶液の状態で保存する。
【０１５３】
治療用ヘテロマルチマー組成物は、一般的に、滅菌的に接触することのできる通路をもった容器、例えば、静脈注射用のバック、または皮下注射用の注射針によって貫通することのできる栓をもったバイアルの中に置かれる。
【０１５４】
ヘテロマルチマーの投与経路は、例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内などの経路による注射または点滴のような既知の方法、または下記に示すような徐放性システムによる。ヘテロマルチマーは、点滴またはボーラス注射によって、連続的に投与する。
【０１５５】
徐放性調製物の適当な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性基質で、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような形のあるものになっている基質を含む。徐放性基質の例は、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７(１９８１)、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）に記載されているポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メトアクリル酸)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリアクチド(米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号)、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー(Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６(１９８３))、非分解性エチレン−ビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒら、上記）(欧州特許第１３３，９８８号)、登録商標ルプロンデポット（ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔ）のような分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフィア)、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）などがある。
【０１５６】
エチレン−ビニル酢酸、および乳酸−グリコール酸などのコポリマーは、１００日間にわたって分子を放出することが可能であるが、ある種のヒドロゲルでは、タンパク質を放出する期間が短くなる。カプセルに入ったタンパク質は、長時間体内に残留して、３７℃で湿気に曝される結果、変性するか凝集して、生物学的活性を失うことになり、免疫原性にも変化が生じうる。関係するメカニズムによって、タンパク質を安定化させるための合理的な方策を考え出すことができる。例えば、凝集を起こすメカニズムが、チオ−ジスルフィド基の交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されていれば、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適当な添加剤を使用し、また、特異的なポリマー基質組成物を開発することによって、安定させることができる。
【０１５７】
また、徐放性ヘテロマルチマー組成物は、リポソームによって取り込まれたヘテロマルチマーでもよい。ヘテロマルチマーを含むリポソームは、それ自体は既知の方法：独国特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０−４０３４(１９８０)；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号：欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号によって調製される。通常、リポソームは、小さな（２００−８００オングストローム）均一ラメラ型で、脂質成分が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも高く、ヘテロマルチマー治療を最適なものにするために、選ばれた部位が調整されている。
【０１５８】
治療に用いるヘテロマルチマーの効果的な用量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状によって変わる。したがって、至適な治療効果を得るためには、治療者が用量を希釈したり、投与経路を変更することが必要となろう。典型的な毎日の投与量は、上記の要素によって、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇかそれよりも多い量になろう。典型的には、臨床医は、所期の効果を納めるまで、ヘテロマルチマーの投薬を続けることになろう。この治療の進行状況は、常法によって容易に観察される。
【０１５９】
本明細書に記述されているヘテロマルチマーは、酵素免疫測定法で用いることもできる。それを行なうためには、結合によって、酵素を阻害しないために、ヘテロマルチマーの一方のアームを、酵素上の特異的なエピトープに結合するように設計することができ、ヘテロマルチマーのもう一方のアームを、所望の部位で、酵素が確実に高濃度になるようにしながら、固定基質に結合するように設計することができる。このような診断用ヘテロマルチマーの例としては、ＩｇＧ、およびフェリチンに対する特性を持ったヘテロマルチマー、および、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ならびに、例えば、ホルモンに対する結合特異性をもつヘテロマルチマーなどがある。
【０１６０】
このヘテロマルチマーは、２部位免疫測定法に用いるよう設計することもできる。例えば、双特異的な２つのヘテロマルチマーを産生させて、解析するタンパク質上の２つの別々のエピトープに結合させるが、一方のヘテロマルチマーは、不溶性の基質と複合体になるように結合し、もう一方は、指示酵素に結合する。
【０１６１】
また、ヘテロマルチマーは、ガンなど、さまざまな病気のインビトロおよびインビボでの免疫診断に用いることもできる。この診断への使用を容易にするために、ヘテロマルチマーの一方のアームを腫瘍関連抗原に結合するように設計し、もう一方のアームを検出用マーカー(例えは、放射性核種に結合するキレート剤)に結合するように設計することができる。例えば、腫瘍関連抗原ＣＥＡ、および二価性ハプテンに対して特異性をもつヘテロマルチマーは、結腸直腸ガンと甲状腺ガンを画像化するために用いることができる。この他にも、ヘテロマルチマーを、治療ではなく診断に使用できることは当業者にとって明らかであろう。
【０１６２】
診断に応用するためには、ヘテロマルチマーの少なくとも一方のアームが、典型的には、直接的または間接的に、検出可能な部分によって標識されている。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉなどの放射性同位元素；フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光化合物または化学発光化合物；または、アルカリホスファターゼ、β−ガラタトシダーゼ、またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素であろう。
【０１６３】
ヘテロマルチマーを検出可能な部分に別々に結合させるために、当技術分野において既知の方法を用いることができるが、そのような方法には、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５(１９６２)；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：１０１４(１９７４)；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９(１９８１)；および、Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載されている方法などがある。
【０１６４】
本発明のヘテロマルチマーは、競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイッチアッセイ法、および免疫沈殿法など、既知のアッセイ法に用いることができる。Ｚｏｌａ、モノクローナル抗体：技術マニュアル(Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ)，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，１９８７）。
【０１６５】
競合結合アッセイ法は、限られた量のヘテロマルチマーへの結合をめぐって、標識された標準化合物が、解析対象の試験用サンプルと競合できることに基づいている。試験サンプル中の解析化合物の量は、ヘテロマルチマーに結合した標準化合物の量に反比例する。結合した標準化合物の量を容易に決定するために、ヘテロマルチマーは、一般的に、競合の前か後に不溶化して、ヘテロマルチマーに結合している標準化合物と解析化合物が、非結合のままの標準化合物と解析化合物とから都合良く分離できるようにする。
【０１６６】
このヘテロマルチマーは、それぞれが、検出すべきサンプルの異なった免疫原部分またはエピトープに結合することのできる２種類の分子を使用することを含むサンドイッチアッセイ法にとって、特に有用である。サンドイッチアッセイ法において、試験用サンプルの解析化合物は、固体担体上に固定されたヘテロマルチマーの一方のアームに結合していて、その後、ヘテロマルチマーのもう一方のアームが解析化合物に結合して、３つの部分からなる不溶性の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。ヘテロマルチマー自体の第２のアームを、検出可能部分によって標識する（直接的サンドイッチアッセイ法）か、または、検出可能部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することができる(間接的サンドイッチアッセイ法)。例えば、サンドイッチアッセイ法の一つのタイプは、ＥＬＩＳＡ法であるが、この場合には、検出可能部分は酵素である。
【０１６７】
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示目的のだけに示されているのであって、いかなる意味でも、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【０１６８】
本明細書において引用されている刊行物、特許、および特許出願は、上記のものも下記のものもすべてが参照してここに組み込まれる。
【実施例】
【０１６９】
計画がＦｃ-含有ＢｓＡｂ(図1C)を製造するために提供される。この計画において、我々はそれがヘテロダイマー化であるがホモダイマー化されないように抗体重鎖のＣH３を工作している。これは、論理的設計(Ridgwayら，上記(1996))及びここに記載した通りのファージディスプレー選択によって得られた立体的相補変異と共同してＣH３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合を設けることによって達成された。両方の抗原結合特異性用の単軽鎖の使用は、軽鎖誤対合の問題を避ける(図1A- 1C)。同じ軽鎖を持った抗体は、非常に大きなヒトｓｃＦｖライブラリーを選別することによって容易に分離された(Vaughan,T.J.ら, (1996)上記)。
【０１７０】
実施例１：
空洞への隆起(protuberance-into-cavity)ヘテロマルチマー免疫付着因子の生成 Chamowら,J.Imminol.153:4268(1994)により先に記載されたヒト化抗-ＣＤ３／ＣＤ４-ＩｇＧキメラは、回収できたヘテロマルチマーのパーセンテージを最大化するように構築した。空洞への隆起及び野生型ＣH３変異体は、ヒト化抗体-免疫付着因子キメラ(Ab/Ia)抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した。
【０１７１】
かくして変異体は、ヒト化抗-ＣＤ３抗体重鎖のＣH３ドメインに及びミスマッチオリゴヌクレオチドを用いたサイト-誘導変異誘発(Kunkelら,Methods Enzymol.154:367(1987)とP.Carter,in Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson,Ed.,IRL Press,Oxford,UK,pp.1-25(1991))によってＣＤ４-ＩｇＧ中で構築され、且つジデオキシヌクレオチド配列によって実証した (Sangerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463(1977))。次の表３を参照
【０１７２】
【表３】
0004324231.tif 000004
【０１７３】
残基Ｔ３６６は、パートナーＣH３ドメイン上の残基Ｙ４０７の水素結合間隔内にある。実際は、残基Ｔ３６６への主要な分子間接触は、残基Ｙ４０７に対する及び逆の場合も同じである。一つの空洞への隆起ペアは、一つのＣH３ドメイン中のＴ３６６Ｙとそのパートナードメイン中のＹ４０７Ｔの相互の変異を持ったこれらの残基を逆転することによって創製され、かくしてその界面で側鎖の容量が維持される。変異は、Kabat数付与システム(Kabatら，(1991)上記)を用いてその位置の次の野生型残基によって、そして一文字コードで残基の置換が定義される。複数変異は、コロンによって単一変異成分をリスト化することによって定義される。
【０１７４】
抗-ＣＤ３軽鎖(L)と重鎖(H)変異体(Shalabyら,J.Exp.Mcd.175:217(1992)とRodriges ら,Int.J.Cancer(上記)7:45(1992))をコードしているファージミドは、以前に記載された通り(Chamow ら，J．Immunol．153:4268(1994))、ファージミドをコードしているＣＤ４-ＩｇＧ変異体(Byrnら,Nature 344:667(1990))と一緒に、ヒト胎児性腎細胞，２９３Ｓ中に共移入(co-transfected)した。移入されたファージミドＤＮＡの全量は固定した一方、異なるＤＮＡの比率はＡｂ／Ｉａキメラの生産を最大化するように変えた。投入ＤＮＡｓ(15μｇトータル)Ｉａ：重鎖：軽鎖の割合(質量で)は以下の通り：8:1:3；7:1:3；6:1:3；5:1:3；4:1:3；3:1:3；1:0:0。
【０１７５】
その生産物は、レーザーデンシトメトリースキャニングに続くＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析の前にスタヒロコッカス蛋白質(ProSep A,BioProcessing Ltd,UK)を用いてアフィニティー精製した。重鎖ＤＮＡを超える過剰軽鎖は、制限化されるものからの軽鎖を回避するために用いた。生産物の同定は、アミノ末端配列決定に続きＰＶＤＦ膜(Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035(1987))での電気ブロッティングによって証明した。
【０１７６】
重鎖及び野生型ＣH３を組み込んでいるＩａ用のそれと一緒に軽鎖用のファージミドの共移入は、予期した通り、Ａｂ／Ｉａキメラ，ＩｇＧとＩａホモダイマー生産物の混合物となる(Chamowら，J．Immunol．153:4268(1994))。抗体重鎖プラス軽鎖をコードしている投入ＤＮＡのより大きなフラクション又はホモダイマーに一致するより高いフラクションを回収した。Ｉａ：Ｈ：Ｌの６：１：３の投入ＤＮＡ比では、Ｉａホモダイマー(22.5％)とＩｇＧ(23.0％)の類似フラクションと共に54.5％のＡｂ／Ｉａキメラを生じた。これらの比率は、分析方法によって導かれるバイアスを伴わず重鎖のランダムな組合せに続く各鎖の等モル発現から予期されたそれらと良く一致する：50％Ａｂ／Ｉａキメラ、25％ Ｉａホモダイマー及び25％ ＩｇＧ。
【０１７７】
野生型ＣH３を含有している鎖に対して、Ａｂ／Ｉａキメラは、Ｙ４０７Ｔ空洞とＴ３６６Ｙ隆起変異をそれぞれ抗-ＣＤ３重鎖とＣＤ４-ＩｇＧＩａに含有せしめた共移入体から92％までの収率で回収された。抗体/免疫付着因子キメラの同様の収量は、もしこれらの相互変異が重鎖の隆起及びＩａ中の空洞により設けられたならば得られた。両方のケースにおいてモノマーは、隆起を含むが空洞のないその鎖で観測された。いずれか１つの理論に制限することなしに、Ｔ３６６Ｙ隆起がＹ４０７Ｔ空洞よりもホモダイマー形成のためにより分裂されると確信する。Ａｂ／Ｉａハイブリッドのフラクションは、隆起と空洞(Ａｂ Ｔ３６６Ｗ，ＩａＹ４０７Ａ)の両者のサイズを増加することによって有意に変更されることはない。第２の隆起と空洞ペア(Ａｂ Ｆ４０５Ａ，ＩａＴ３９４Ｗ)は、ホモダイマー化するＩａＴ３９４Ｗ隆起変異体の予期しない傾向を補うための投入ＤＮＡの小さいフラクションを用いてＡｂ／Ｉａの71％までを生じた。２つの独立した空洞への隆起変異体ペア(Ab T366Y：F405A、Ia T394W：Y407T)の組合せは、Ａｂ Ｔ３６６Ｙ，ＩａＹ４０７Ｔペア以上にはＡｂ／Ｉａハイブリッドの生産を改善しない。
【０１７８】
Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアにより得られたＡｂ／Ｉａキメラのフラクションは、試験した範囲にわたり、投入ＤＮＡｓの比に実質的に非従属であった。さらに汚染している種は、mono S HR 5/5カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)上でイオン交換クロマトグラフィー(20mMトリス塩酸，pH8.0中0-300mM ＮａＣｌ)によってＡｂ／Ｉａキメラから容易に除去された。これは、ＡｂとＩａの相対的な発現レベルが一時的な発現系におけるよりも容易な操作性が劣る、安定な細胞系を用いた大量のＡｂ／Ｉａキメラの製造のために良好であると予想する。
【０１７９】
同定した空洞への隆起変異体は、４又はそれ以下にまで下がった、可能性のある１０の主要な種(Sureshら，Methods Enzymol.121:210(1990))から得られた生産物の混合物の複雑性を減じることによってＦｃ-含有ＢｓＡｂの潜在的な適用を増加することが予期される(図1A-1B)。Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔが完全に保存され且つＩｇＧ1のＣH３ドメイン界面で他の残基が高度に保存されることから、Ｔ３６６ＹとＹ４０７Ｔ変異体ペアは、他のヒトＴｇＧアイソタイプ(IgG2，IgG3又はIgG4のような)のヘテロマルチマーを生産するために有用とされるであろう。
【０１８０】
実施例２：
ヘテロマルチマーの免疫付着因子中の非天然存在ジスルフィド結合の 生成 Ａ． ＣH３相互鎖-ジスルフィド結合の設計 ３つの基準を、パートナーＣH３ドメイン間のジスルフィド結合を作るための残基のペアを同定するために使用した：ｉ）Ｃα分離は、好ましくは自然ジスルフィド結合中に見出されるそれに類似している(5.0から6.8Å)(Srinivasan,N.等,Int.J.Peptides Protein Res.36:147-155(1990))。7.6Åまでの間隔は、主鎖移動を許すことおよび低い分解能の結晶構造での原子の位置を考慮することを許した(Deisenfofer，Biochemistry 20:2361-2370(1981))。ii）Ｃα原子は、２つのＣH３ドメイン上の異なる残基上にあるだろう。iii）その残基はジスルフィド結合を与えるように位置付けられる(Srinivasan,N.ら,上記)。
【０１８１】
Ｂ． ジスルフィド結合のモデル化。ジスルフィド結合は、Insight II release 95.0(Biosym/MSI)を用いてhumAb4D5-Fvについて記載された通り(Rodriguesら，Cancer Res.55:63-70(1995))、ヒトＩｇＧ1Ｆｃ(Deisenhofer，上記)中にモデル化した。
【０１８２】
Ｃ． ＣH３変異体。変異は、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて、特定部位の突然変異誘発(Kunkelら，Methods Enzymol.154:367-382(1987))によってヒト化した抗-ＣＤ３重鎖又はＣＤ４-ＩｇＧのＣH３ドメイン中に導入した。
【０１８３】
【表４】
0004324231.tif 000005
【０１８４】
変異は、置換アミノ酸の次の、アミノ酸残基と数(Kabatら，上記(1991)のＥｕ数字付与スキーム)によって表した。多重変異は、コロンによって分けた単一の変異によって表される。変異体は、シーケナーゼversion 2.0(United States Biochemicals，Cleveland，OH)を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定(Sangerら,上記(1977))によって確証した。
【０１８５】
Ｄ． ヘテロダイマー形成を増大する相互-鎖ジスルフィド。ＣH３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合を含んでいる６ペアの分子("ジスルフィド-ＣH３"変異体；v1-v6，表４)は、Ａｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgG(Chamowら，上記(1994))の形成を導くその能力において親の分子と比較した。ＣＤ４-ＩｇＧ及び抗-ＣＤ３重鎖変異体をコードしているプラスミドは、抗-ＣＤ３軽鎖をコードしている過剰のプラスミドと一緒に、２９３Ｓ細胞中に共移入した。ヘテロダイマーの収量は、Ｉａ：Ｈ鎖：Ｌ鎖ＤＮＡ比の範囲を持った移入により至適化した。Ａｂ／Ｉａヘテロダイマー、ＩｇＧ及びＩａホモダイマー生産物は、ストレプトコッカス蛋白質Ａアフィニティー-精製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとレーザーデンシトメトリースキャニング(Ridgwayら,上記(1996))によって定量した。
【０１８６】
それぞれのジスルフィド-ＣH３ペアは、親の分子に類似した、３つの主要な種を生じる。しかしながら、ジスルフィド-ＣH３変異体からのＡｂ／Ｉａヘテロマーは、ＣH３ドメイン中の相互-鎖ジスルフィドの形成に一致する、電気泳動の移動でシフトした。ジスルフィド結合形成の更なる証拠は、ヒンジにおいて相互-鎖ジスルフィドによって提供された。共有結合したＡｂ／Ｉａハイブリッドは、ジスルフィドＣH３変異体用の、しかしヒンジシステインがセリンに変異した野生型ＣH３ドメインを持った分子用ではないＳＤＳ-ＰＡＧＥによって観測された。ジスルフィドＣH３変異体を製造し、Y349C/S354'C，Y349C/E356'C，Y349C/E357'C，L351C/E354'C，T394C /E397'C,及びD399C/K392Cと定義した。唯一の変異体(D399C/K392'C)は、該変異体のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析による測定として野生型を越えるＡｂ／Ｉａハイブリッドの収量を実質的に増加した(それぞれ７６％対５２％)。変異は、置換アミノ酸の次の、アミノ酸残基と数(Kabat ら,上記(1991)のＥｕ数字付与スキーム)によって表した。ＣH３の第１及び第２のコピー中の変異は、それぞれ前後にスラッシュを付す。ＣH３の第２のコピー中の残基は、プライム符号(')によって表示される。この改善は、該変異体K392S/D399'Sが野生型に対して類似したＡｂ／Ｉａ収量とＡｂ／Ｉａ電気泳動移動性の両方を与えたことから、残基Ｋ３９２とＤ３９９の置換というよりむしろ、ジスルフィド結合形成を明らかに反映する。ホモダイマーは、ヘテロダイマーのＣH３ドメイン中に相互-鎖ジスルフィド結合形成を優先して行うことを実証している、野生型Ｆｃドメインの持つそれと同様に移動した。全てのジスルフィドＣH３変異体は、２９３Ｓ細胞中の親分子とほぼ同じレベルで発現した。
【０１８７】
Ｅ． 空洞への隆起工学によって構築したジスルフィドは９５％までヘテロダイマーの収率を増加する。最良のジスルフィドペアは、７６％までヘテロダイマーのパーセンテージを増加し、空洞への隆起方法は８７％までヘテロダイマーのパーセンテージを増加した(表４；Ridgwayら,(1996)上記も参照)。これら２つの方法は、ヘテロダイマー精製の確率を増加することの異なる原理による。従って、我々はヘテロダイマーにおける収率を更に改善することを意図して、その２つの方法を組み合わせた。Ｌ３５１Ｃ又はＴ３９４Ｃを含む、２つのモデル化したジスルフィドは、ジスルフィド結合ヘテロダイマー(L351C/S354'CとT394C/V397'C)と同じくジスルフィド結合ホモダイマーを潜在的に形成でき、かくしてそれの単一性を減じている。残る４つのジスルフィドペアは、ファージ選択したヘテロダイマー(変異体ｖ９-ｖ１６)中に配置し、ヘテロダイマーの収率を分析した(表４)。ヘテロダイマーのほぼ９５％の収率が得られた。再度、該ヘテロダイマーは、野生型及びｖ８変異体に匹敵する電気泳動移動シフトを示した。
【０１８８】
【表５】
0004324231.tif 000006
【０１８９】
実施例３：
ヘテロマルチマー中のタンパク質-タンパク質相互作用を増大する相補の変異のための構造-誘導ファージディスプレー選択以下の方法は、マルチマー化ドメインを経て界面で相互作用するポリペプチト中の相補の変異の選択において有用である。その方法は、相補の空洞への隆起変異の選択にそれを適用するとして次に説明される。しかしながら、その実施例は制限するためのものではなく、その方法は非天然存在ジスルフィド結合、ロイシンジッパーモチーフ、疎水性相互作用、親水性相互作用などの形成に適当な変異の選択に同様に適用することができる。
【０１９０】
Ａ． ファージディスプレー選択。ファージディスプレー方法は、安定なＣH３ヘテロタイマーの選択用に発展し、図２中に概要が示される。その選択は、隆起変異体、T366W(Ridgwayら,上記(1996))、Ｍ１３遺伝子IIIペプチドに融合したＣH３の第２のコピーと共発現されるペプチドフラッグに融合した(ｇＤペプチドフラッグ、例えばLasky，L.A.とDowbenko，D.J. (1984)DNA 3:23-29；及びBerman，P.W.ら，(1985)Science 227:1490-1492)を用いる。空洞変異体のライブラリーは、第１のＣH３ドメイン上の隆起に最も近い残基の無作為化によってＣH３のこの第２のコピー中に創製した。ファージディスプレー化安定ＣH３ヘテロダイマーは、次いで抗-フラッグＡｂを用いて補足した。
【０１９１】
ＣH３ファージディスプレーライブラリーの1.1ｘ105の独立クローンは、ＰＣＲフラグメントによる自然ＣH３遺伝子のセグメントの置換によって構築した。
【０１９２】
そのフラグメントは、標準的な技術を用いて位置366、368と407で無作為化するために分解プライマーを用いてＰＣＲ増幅化により得られた。
【０１９３】
選択の２から５ラウンドの後、完全長クローンのフラクションは、一本鎖ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による判断として、それぞれ９０％、６０％、５０％及び１０％だった。完全長クローンを含むファージミドは、選択の５ラウンド後にゲル-精製した。二千の形質転換体がＸＬ１-ＢＬＵＥTM細胞(Stratagene)を再形質転換後に得られた。
各クローンの平均＞１０6コピーを、選択(panning)のラウンド当たりに使用した。かくして、該ライブラリーにおいて各クローンの多数のコピーが、たとえ幾つかの削除変異体が選択の間に生じたとしても、選択のために利用可能であると確信した。
【０１９４】
選択の７ラウンド後、得られたＣH３変異体は、無作為化した残基でコンセンサスアミノ酸配列を研究した。実際に全てのクローンは、この位置でβ-ヒドロキシルの非常に強い優先性を示す残基 366でセリン又はトレオニンを有した。疎水性残基のための強い優先性は、バリンとアラニン優先化によって残基368と407で観測された。６の異なるアミノ酸の組み合わせは、１１度回収された、三重変異体、T366S:L368A:Y407Vを含む、少なくとも２度回収された。先に定義されたヘテロダイマー、T366W/Y407'A(Ridgway,J.B.B.ら,(1996),上記)と同一の配列を有するこれらのファージ選択物はない。そのファージ選択物は、ドメイン界面残基の全側鎖容量において40-80Å3減少により判断されるように野生型ＣH３ホモダイマーよりも劣る緊密性で詰め込まれ得る。
【０１９５】
発現プラスミドｐＡＫ１９(Carterら，1992)上にコードされたＣH３変異体は、大腸菌３３Ｂ６株中に導入し、培養槽中で高い細胞密度に増殖した大腸菌から創製した。ＤＥＡＥ-セファデックスＦＦ、ＡＢｘ及び Resource Sクロマトグラフィーによって精製したT366S:L368A:Y407V変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥの後に単一の主要なバンドを与えた。他のＣH３変異体は、同様の精製により回収した。
【０１９６】
高解析度電気スプレー質量分析法によって測定した野生型ＣH３、T366S：L368A：Y407V、T366W及びY407A変異体の分子質量は、予期した通りであった。
【０１９７】
Ｂ． ファージ選択したヘテロダイマー安定性。ＣH３ヘテロダイマーの安定性は、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって残るヘテロダイマーの希釈及び定量化に続き、グアニジン塩酸によって相当するファージを滴定することによって最初に評価した。ＣH３-ファージによるグアニジン塩酸分解アッセイは、選択物を直ちにスクリーンするための手段を提供する。
【０１９８】
ファージは、選択の７ラウンドの後の個別のクローンから及びコントロールベクター、ｐＲＡ１からでも製造された。概略的には、XL1-BLUETM中のファージミドが、109pfu/ml M13K07の存在中で50μg/mlカルベニシリンと10μg/mlテトラサイクリンを含有する25ml ＬＢ培地に接種するために使用し、37℃で一晩インキュベーションした。その細胞は遠心分離(6000g、10分、４℃)によってペレット化した。ファージは、５ｍｌの20％(w/v)ＰＥＧ、2.5M ＮａＣｌによって沈殿し遠心分離(12000g、10分、４℃)の後に上清から回収され、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。ＰＢＳ中0-6Mのグアニジン塩酸180μｌが20μｌファージ調製物に加えられ、5.0分間ほぼ〜25℃でインキュベーションした。各ファージサンプルのアリコート(20μl)は、水で十倍に希釈した。ＣH３のヘテロダイマーの存在は、５Ｂ６-被覆プレートを用い及び基質としてo-フェニレンジアミンを用いたホースラディッシュペルオキシダーゼに接合した抗-Ｍ１３ポリクローナルＡｂによってファージを検出するＥＬＩＳＡによって測定した。その反応は、2.5M Ｈ2ＳＯ450ml の添加によって抑止し、492nmで吸光度を測定した。その吸光度データは、その溶融の間にグアニジン塩酸濃度に対してプロットし、且つ Kaleidagraph 3.0.5(Synergy Software)を用いた非線形最小二乗法によって四つのパラメーターモデルに適用した。
【０１９９】
最も頻繁に回収されたヘテロダイマー、T366W/T366'S：L368'A：Y407'Vは、他のファージ-選択したヘテロダイマーと安定性において類似する。このファージ-選択したヘテロダイマーは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407'Aよりも有意により安定であるが、しかし野生型ＣH３よりは安定性に劣る。全てのＣH３変異体、個別及び組み合わせの両方は、これら同じ分子が熱量測定法によって研究された条件下にサイズ排除クロマトグラフィーによってダイマーであることが見出された(1.75mg/ml、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中)。唯一の例外は、ＣH３ダイマーよりも明らかに短い保持時間を有したT366S：L368A：Y407V変異体単独であった。
【０２００】
Ｔ３６６Ｗの１：１混合物、隆起、及びT366S：L368A：Y407V、69.4℃で単独転移を持つ変異体溶融物は、サブユニット交換及び安定なヘテロダイマーの形成と密接に結びつく。一方、Ｔ３６６Ｗ隆起ホモダイマーは、T366W/T366'S：L368'A：Y407'V空洞への隆起ヘテロダイマー(ΔＴm＝−15.0℃)よりもより劣った安定性である。それ自身の上のT366S：L368A：Y407V空洞変異体は、加熱によって集合する傾向があり、なだらかな溶融転移を成さない。
【０２０１】
設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａは、Ｔ３６６Ｗ隆起変異体の不在及び存在でそれぞれ58.8℃及び65.4℃で溶融する。これは、Ｔ３６６Ｗ(ΔＴm＝11.0℃)又はＹ４０７Ａ(ΔＴm＝6.6℃) ホモダイマーのいずれか一方よりもより大きな安定性を有するT366W/Y407'Aホモダイマーのサブユニット交換と形成と密接に結びつく。ファージ選択したヘテロダイマー、T366W/T366'S：L368'A：Y407'Vは、設計したヘテロダイマー、T366W/Y407'A,(ΔＴm＝4.0℃)よりも一層安定であるが、しかし、野生型ＣH３ホモダイマー(ΔＴm＝−11.0℃)よりも安定性が劣る。
【０２０２】
Ｃ． インビボでのファージ-選択した抗体免疫付着因子のマルチマー化。ファージ選択した及び設計したＣH３変異体は、インビボでＡｂ／Ｉａハイブリッド、抗-CD3/CD4-IgGの形成を導くその能力を比較した(Chamowら,(1994),上記。
【０２０３】
これは、ＣＤ４-ＩｇＧと一緒にヒト化した抗-ＣＤ３軽鎖(L)と重鎖の共発現により達成した。ヘテロダイマーとホモダイマーの形成は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとスキャニングレーザーデンシトメトリー(Ridgway,ら,(1996),上記)に続いてプロテインＡ精製によって評価した。Ａｂ／Ｉａハイブリッドの比較できる収量が、抗-ＣＤ３重鎖が設計した隆起変異体を含んだ、Ｔ３６６ＷとＩａがファージ-選択した変異体、T366S：L368A：Y407V、又は設計した空洞変異体、Ｙ４０７Ａのいずれかを含んだ共移入体から回収された(図３)。
【０２０４】
ファージ-選択した及び設計したＣH３変異体は、次にホモダイマーを形成するためのその傾向において評価した。隆起変異体、Ｔ３６６Ｗは、相当する重鎖と軽鎖の共移入がＩｇＧを越える過剰のＨＬモノマー(非-ジスルフィド結合ＩｇＧを含み得る)に至ることから、ホモダイマー化を明らかに非常に崩壊させた。一方、ＩｇＧしかしＨＬモノマーなしでは、野生型ＣH３ドメインを含む同じ抗体が観測された。空洞変異体、T366S：L368A：Y407Vは、相当するファージミドの遺伝子移入が幾つかのＩａモノマーを持つ優性なＩａダイマーの混合物に至ることから、多少ホモダイマー化を崩壊させる。空洞変異体、Y407Aは、Ｉａダイマーしかし相当するファージミドの移入後にＩａモノマー無し、の存在による判断として、ホモダイマー化を最小限崩壊する。
【０２０５】
ここに記載したファージディスプレー方法は、安定したヘテロダイマーを形成するＣH３変異体の援助での選択及び安定なホモダイマーを形成する変異体に対しての選択を与える。ホモダイマーに対するカウンター選択は、"遊離"ＣH３変異体が、利用可能なＣH３変異体-遺伝子III融合タンパク質への結合のためにフラッグ化ＣH３ノブ変異体と競合するであろうことから生じる。遊離ＣH３変異体は、自然ＣH３変異体とＭ１３遺伝子IIIの間のアンバー変異の結果として生じる。XL1-Blucのようなアンバー抑制宿主において、自然ＣH３遺伝子とＭ１３遺伝子IIIの両方が創製されるだろう。
【０２０６】
グアニジン塩酸分解は、ファージ上のＣH３ヘテロダイマー安定性を最初にスクリーニングするために有用なツールとして提供される。ファージは、5Mグアニジン塩酸にさらした後でも大腸菌への感染性を維持する(Figiniら,J.Mol.Biol.239:68-78(1994))。かくして、グアニジンは変異体選択の方法を増加するためにも有用となり得る。
【０２０７】
ファージディスプレーライブラリーの合理的な設計とスクリーニングは、ヘテロダイマー化を促進するためにホモダイマーのドメイン界面を再モデル化するための相補的なアプローチである。ＣH３ドメインのケースにおいて、設計した変異体は、ヘテロダイマー化を促進することを強化できるドメイン界面残基と同一視される。ファージディスプレーは、ヘテロダイマーを最も有効に形成する組み合わせのために固定した隆起の近くの３つの残基の置換をサーチするためにここに用いた。ファージ選択物は、ドメイン界面の更なる合理的な再設計を促進するために有効とされる一方、ここに記載したファージ選択方法は、タンパク質-タンパク質界面を再モデル化するためのその有用性を実証する。
【０２０８】
実施例４：
共通の軽鎖を有するヘテロマルチマー抗体又は抗体／免疫付着因子の生成と配置 以下の実施例は、本発明に従う同じ軽鎖を共有するヘテロマルチマー二重特異性抗体の調製とその標的抗原に結合する抗体の能力を実証する。
【０２０９】
Ａ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定：抗体ライブラリーの比較は１１の抗原に高まる。大きいヒト一本鎖Ｆｖ(scFV)抗体ライブラリー(Vaughanら(1996)上記)は、Ａｘ１(ヒトレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、ＧＣＳＦ-Ｒ(ヒト顆粒球コロニー刺激因子レセプターＥＣＤ)、ＩｇＥ(ネズミＩｇＥ)、ＩｇＥ-Ｒ(ヒトＩｇＥレセプターα-鎖)、ＭＰＬ(ヒトトロンボポイエチンレセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、ＭｕｓＫ(ヒト筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼＥＣＤ)、ＮｐｏＲ(ヒトオルファンレセプターＮｐｏＲ ＥＣＤ)、Ｒｓｅ(ヒトレセプターチロシンキナーゼ、Ｒｓｅ，ＥＣＤ)、ＨＥＲ３(ヒトレセプターチロシンキナーゼＨＥＲ３／c-erbB3 ＥＣＤ)、Ｏｂ-Ｒ(ヒトレプチンレセプターＥＣＤ)、及びＶＥＧＦ(ヒト脈管内皮成長因子)、ＥＣＤは細胞外ドメインに関する、を含む１１の抗原用の抗体特異性で選択した。各抗原に生じた抗体の集団からｓｃＦｖフラグメントのためのヌクレオチド配列データは、相当するタンパク質配列から得るように翻訳した。ＶLは異列は、鎖の全てのペア様態組み合わせ間の同一性パーセンテージを計算するためにFengとDoolittle(1985,1987,1990)のアルゴリズムによりプログラム"アライン"を用いて比較した(Feng,D.F.とDoolittle,R.F. (1985)J.Mol.Evol.21:112-123；Feng,D.F.とDoolittle,R.F. (1987)J.Mol.Evol.25:351-360；及びFeng,D.F.とDoolittle,R.F.(1990)Method Enzymol.183:375-387)。
【０２１０】
各ペア様態軽鎖アミノ酸配列比較の配列同一パーセントの結果は、マトリックスフォーマット中に調整した(追記参照)。
【０２１１】
最もペア様態の比較品として、少なくとも１の共通軽鎖配列が見出された。表５は、117ＶLアミノ酸配列のアラインメントによって決定した同じ軽鎖を共有する(100％同一性)ｓｃＦｖの頻度を示しているＶL鎖の比較である。例えば、そのエントリー４／９(ＨＥＲ３ｘＯｂ-Ｒ、黒いボックスで表した)は、結合ＨＥＲ３が１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-ＲクローンによってそれのＶL配列を分配することが見出される一方、Ｏｂ-Ｒ結合９クローンは、１又はそれ以上の抗-ＨＥＲ３クローンによってそのＶL配列を分配する、４クローンを表す。対角線上の参加物は、その集団中の１又はそれ以上のクローンによってＶL配列を分ける集団内の抗体クローンの数を表す。例えば、ＭＰＬクローンの調査は、１又はそれ以上の他のＭＰＬクローンによってそれのＶL配列が分けられた５クローンを明らかにした。(IgE x Ax1)又は(NpoR x IgE-R)についてのような観測された共通の軽鎖の無いケースにおいて、少なくとも１の特異性と比較されるフラグメントの数は非常に少なかった(５以下)。見出された共通の軽鎖の数が与えられ、それは共通の軽鎖が、もし十分な数のクローンが比較されるなら、いずれかのＶL比較物のために見出すことができることがありそうである。
【０２１２】
軽鎖のアミノ酸配列は、選択した共通の軽鎖に対しての配列相同性が98％と99％であった場合、異なったアミノ酸残基の位置によって決定された。図４は、Ａｘ１(クローンAx1.78)、Ｒｓｅ(クローンRse.23,Rse.04,Rse.20,及びRse.15)、ＩｇＥＲ(クローン IgER.MAT2C1G11)、Ｏｂ-Ｒ(クローンobr.4)、及びＶＥＧＦ(クローンvegf.5)に特異性を持つ８つの異なる抗体のＶL配列の比較である。配列の定義(Kabat，G.A.ら(1991)上記)又は構造の定義(ChothiaとLcsk,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917) に従う抗原結合ＣＤＲ残基の位置は、それぞれ下線と＃によって示した。Ax1.78配列と異なる軽鎖残基は二重下線により示した。比較した９軽鎖の、６が同一である。Rse.04とobr.4の軽鎖(ほぼ99％配列相同性)は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の１残基で相違するRse.20の軽鎖(ほぼ98％配列相同性)は、抗原結合ＣＤＲｓの外側の２残基で異なる。該アミノ酸残基の変化は、抗原結合性において僅かな又は影響なしを有し得る。かくしてこれらの軽鎖の配列類似性は、本発明の共通の軽鎖のためのその候補を作る。代替的に、期待される対になったｓｃＦｖ(例えばAx1.78)の軽鎖との98-99％相同性を有する軽鎖のように、本発明に従い、対になった軽鎖と置換でき且つ結合特異性を保持し得る。
Ｂ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定と軽鎖のそれを共有する二重特異性抗体の構築：抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３。
【０２１３】
ヒトレプチンレセプター(Ｏｂ-Ｒ)又はHER3/c-erbB3遺伝子生産物(ＨＥＲ３)の細胞外ドメインを結合したＳｃＦｖフラグメントは、大きいヒトｓｃＦｖファージライブラリーを用いた選別の３つのラウンドによって得られた(Vaughanら(1996)，上記)。レプチンレセプター-ＩｇＧとＨＥＲ３-ＩｇＧ(1ml ＰＢＳ中10μg)を、４℃で一晩、分離イムノチューブ(Nunc;Maxisorp)を被覆するために使用した。選別とファージ解放は、以下の修正を伴い、Vaugham(1996)，上記により記載されたように実行した。1mg/mlの濃度で、ヒト化した抗体、 huMAb4D5-8(Carter,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)又はヒト化した抗-ＩｇＥ(Presta,L.ら(1993)J．Immunol．151:2623-2632)は、Ｆｃ-結合ファージを吸着するための各選別工程中に含めた。加えて、溶液の選別化(Hawkins，R.E.ら (1992)J．Mol．Biol．226:889-896)は、ｓｃＦｖ結合レプチンレセプターを同定するためにも使用した。そのレプチンレセプターは、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーに続いて、工作したプロテアーゼ、ジェネナーゼ(Carter,P.ら (1989)Proteins:Structure,Function and Genetics 6:240-248)によるレプチンレセプター-ＩｇＧの位置特異的蛋白分解によってＦｃから分離した。そのレプチンレセプターはビオチン化し、それぞれ、選別の第１，第２，及び第３ラウンド用に100nM、25nM及び5nMの濃度で使用した。ファージ結合ビオチン化抗原は、ストレプタビジン-被覆パラ磁性ビーズ(Dynabeads,Dynal,Oslo,Norway)を用いて捕捉した。
【０２１４】
それぞれの選別のラウンド２及び３からのクローンは、ファージ及び相当する抗原及び制御免疫付着因子又は抗体をも用いるｓｃＦｖＥＬＩＳＡによってスクリーンした。抗原-陽性クローンの分割性は、プライマー、fdtetseqとPUC逆転(Vaughamら(1996)，上記)を用いるｓｃＦｖ挿入のＰＣＲ-増幅及びBstNIによる消化(Marksら(1991)上記)によって分析した。BstNIフィンガープリント当たり１から５のクローンがＰＣＲ重リンクとmyc seq 10プライマー(Vaughamら(1996)上記)を用いたcycle-sequencedusing fluorescent dideoxy chain terminators(Applied Biosystems)した。サンプルは、Applied Biosystems Automated DNA Sequencerを用いて分析し且つ配列をSeqEdを用いて分析した。グアニジン塩酸抗体分解及びファージディスプレー選択と組み合わせた Figiniのインビトロでの鎖シャフティング方法が同じ軽鎖を有する抗体を選択する方法として有用であることにも注目される(Figini，M.ら (1994)，上記、その全体が参照によりここに併合される)。
【０２１５】
上記の方法を用いて、１１の異なる抗-ＨＥＲ３クローンと１８抗-Ｏｂ-Ｒクローン(被覆した抗原を用いた選別からの１１とビオチン化抗原による選別からの７)が得られた。そのクローンは、各結合ドメインと結合した軽鎖の配列を決定するための標準技術により配列決定した(図５)。その配列は、二重特異性抗体を構成するために使用した抗-Ｏｂ-Ｒクローン26と抗-ＨＥＲ３クローン１８のVH及び共通のVL配列である(後記参照)。その残基は(Kabat，E.A.ら(1991)上記)に従い番号付けされる。配列の定義(Kabat，E.A.ら(1991)上記)又は構造の定義(ChothiaとLesk,(1987)J.Mol.Biol.(1987)196:901-917)は、それぞれ下線と上線によって示される。VH配列中の残基間の相同性は、*によって表示した。
【０２１６】
軽鎖の配列は、多重抗-Ｏｂ-Ｒクローンに対する多重抗-ＨＥＲ３クローンと比較した(図８及び表５)。１１の抗-ＨＥＲ３クローン以外の４つが、１又はそれ以上の抗-Ｏｂ-Ｒレセプタークローンと同じVLを共有することが観測された。
【０２１７】
反対に、１８の抗-Ｏｂ-Ｒクローン以外の９が抗-ＨＥＲ３クローンの一つとして同じVLを共有する(表５、黒い箱を参照)。
【０２１８】
【表６】
0004324231.tif 000007
【０２１９】
抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体の構築は以下の通り実行した。相補の隆起と空洞、同じく第１及び第２のポリペプチド間の非天然存在ジスルフィド結合を有する変更したＣH３第１及び第２のポリペプチドを、Ｆｃ-含有二重特異性抗体の構築において用いた。同じ軽鎖を、同じく各抗体からの重鎖を共有するクローンである、抗-Ｏｂ-Ｒクローン＃２６と抗-ＨＥＲ３クローン＃１８からのＶLを、ここに記載した手順に従って二重特異性抗体を製造するために用いた。
この抗体は、非天然存在ジスルフィド結合を生成するために変更を欠くことによってのみそれと異なる二重特異性抗体に対応する明確な分子量において電気泳動移動性シフトを有した。非天然存在ジスルフィド結合を持った及び持たないヘテロダイマーの抗体変異体の８％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルは、野生型ヘテロダイマーのほぼ230の見かけ上のＭＷから、一つの非天然ジスルフィド結合を有しているヘテロダイマーのほぼ200の見かけ上のＭＷまでの移動シフトを示した。そのＭＷシフトは非天然ジスルフィド結合を首尾良く形成するそれぞれの変異体のパーセントを与えるために十分であった。
二重特異性抗体のＯｂ-Ｒ及びＨＥＲ３の両方への特異的結合は、以下の方法のような標準ＥＬＩＳＡ法によって試験される。Ｏｂ-Ｒ結合は、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質として存在するＯｂ-ＲによってＥＬＩＳＡアッセイで実証される。該Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ融合タンパク質は、９６-ウェルのミクロタイター板のウェル上に被覆され、そして二重特異性抗体が加えられる。
【０２２０】
そのウェルは、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇへの非特異的結合を取り除くために数回洗浄される。同じアッセイにおける第２の成分として、ビオチン化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質が加えられ、そしてビオチン化ＨＥＲ３-Ｉｇ融合タンパク質に結合するストレプタビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体によって測定される。結合は、過酸化水素及びＴＭＢペルオキシダーゼ基質(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)の添加における着色の変化の生成により測定される。
【０２２１】
実際に記載した条件下、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方への二重特異性抗体の結合は、固定化Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇ／二重特異性抗体／ＨＥＲ３-Ｉｇビオチン／検出可能に標識したストレプタビジンを含む複合体の良好な形成のためにミクロタイター表面上に固定化した検出可能な標識として観測されるであろう。Ｏｂ- Ｒ-Ｉｇと結合するが、ＨＥＲ３-Ｉｇとはしない抗体は、陰性の結果を提供するように、上記複合体を形成しない。同様に、ＨＥＲ３-Ｉｇと結合するが、Ｏｂ-Ｒ-Ｉｇとはしない抗体は、陰性の結果を提供するように、上記複合体を形成しない。一方、Ｏｂ-Ｒ-ＩｇとＨＥＲ３-Ｉｇの両方に結合することが予期される二重特異性抗体は、該アッセイにおいて陽性の結果を生じる複合体を形成し、共通の軽鎖を有する、ＨＥＲ３とＯｂ-Ｒの両方に結合する、二重特異性抗体を表示する。
【０２２２】
抗-(Ｏｂ-Ｒ／ＨＥＲ３)二重特異性抗体の発現と精製は、以下の通り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞は、抗-Ｏｂ-Ｒ重鎖、抗-ＨＥＲ３重鎖、又は上述した通りそれぞれの抗体に共通であったクローン２６又は１８からの軽鎖をそれぞれ独立にコードしている３つのプラスミドＤＮＡによって移入した。それぞれの移入のために、軽鎖コード化ＤＮＡに対する重鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-Ｏｂ-Ｒ／抗-ＨＥＲ３二重特異性抗体の配列を制限しないであろうように１：３とした。両方の重鎖は、互いに関して１：１の比で移入した。12μgのトータルのプラスミドＤＮＡは、次いでリン酸カルシウム沈降によって 293S細胞中に共移入(co-transfected)した(Gorman,C.,DNA Cloning,Vol.II,D.M.Glover,ed.,IRL Press,Oxford,p.143(1985))。その細胞は、タンパク質発現の増大を意図して増殖培地に加える前に洗浄した。Ｆｃ-含有タンパク質は、固定化したプロテインＡ(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を用いて細胞懸濁物から精製し、そしてＰＢＳ中に緩衝化-交換した。ヨードアセトアミドは、ジスルフィド結合の再シャフト化を防止するために50mMの最終濃度までタンパク質調製物に加えた。
【０２２３】
付加の実施例として、抗-(CD3/CD4)抗体／免疫付着物の発現と精製を以下の通り実行した。ヒト胎芽腎臓２９３Ｓ細胞は、３つのプラスミドＤＮＡｓ、各プラスミドは抗-ＣＤ３軽鎖、抗-ＣＤ３ ＩｇＧ1重鎖、又は抗-ＣＤ４ ＩｇＧ1免疫付着因子を独立的にコードしている、によって移入した。それぞれの移入のために、重鎖コード化ＤＮＡに対する軽鎖コード化ＤＮＡの比率は、軽鎖が抗-ＣＤ３ ＩｇＧの整列のために制限されないであろうように、３：１とした。加えて、免疫付着因子が不十分に発現されるために、免疫付着因子コード化プラスミドの比率は、重鎖コード化プラスミドの過剰において加えた。試験したその比率は、免疫付着因子：重鎖：軽鎖が3:1:3から8:1:3間での範囲とした。トータルで10μgのプラスミドＤＮＡは、移入前にＰＢＳで細胞を洗浄し、次いでリン酸カルシウム沈降(Gorman，C.(1985),上記)により293S細胞中に共移入した。Ｆｃ-含有タンパク質は、固定化したプロテインＡ(ProSep A,BioProcessing Ltd.,UK)を用いて細胞懸濁物から精製し、そしてＰＢＳ中に緩衝化-交換した。ヨードアセトアミドは、ジスルフィド結合の再シャフト化を防止するために50mMの最終濃度までタンパク質調製物に加えた。
【０２２４】
上記それぞれの調製において、タンパク質サンプルは、８％ポリアクリルアミドゲル(Novex)で電気泳動し、Serva blueによる染色によって可視化した。ゲルは、マイナーな不純物の可視化及び定量化を与える努力において見せかけのバックグラウンドを無くすように脱- 染色化した。乾燥したゲルは、スキャニングデンシトメーター(GS-670，BioRad)によってスキャンし、そしてタンパク質製造物は Molecular Analystソフトウェアによって定量化した。
【０２２５】
ＣH３ドメイン中に導入した非天然 (工作した)ジスルフィド結合は、ヘテロダイマー形成を増大するためにここに開示されている。一つのペプチド、K392/D399'Cは、７６％までのヘテロダイマー(表４、変異体ｖ６)を精製することによってヘテロダイマー形成を増大した。さらに、相互-鎖ジスルフィド結合の存在が空洞への隆起技術と結び付けられた場合、ほぼ９５％ヘテロダイマーが得られた(表４変異体ｖ１１，ｖ１２，及びｖ１６)。かくして、二重特異性抗体の第１と第２のポリペプチド間のタンパク質／タンパク質相互作用を特異的に増加する本発明の方法は、望まれるヘテロマルチマーの収量を増加すると共に、望ましくないヘテロマルチマー又はホモマルチマーの形成を最小化する。
【０２２６】
加えて、電気泳動の移動性分析によって生産物ヘテロマルチマーを特徴付ける方法は、望ましくない生産物に対して、望まれるヘテロマルチマーの相対的な量の測定を与える。
【０２２７】
ここに記載したような共通の軽鎖の選択は、多重特異性抗体の可変の重鎖と軽鎖の間の誤対合の可能性を削除することによって望まれるヘテロマルチマーの収量を増加する。
【０２２８】
Ｃ． 同じ軽鎖を共有する抗体の同定とその軽鎖を共有している二重特異性抗体の構築：抗-Mpl/抗-HER3。
【０２２９】
本発明の別な二重特異性抗体の同定、構築及び発現がここに示される。この実施例のパートＡとＢ中に記載した方法を、抗-Mpl/抗-HER3二重特異性抗体の製造用に利用した。
【０２３０】
この実施例のセクションＡ中に記載した方法(１１の抗原を生じた抗体ライブラリーの比較)、上記、を用い、抗-ＨＥＲ３ｓｃＦｖのＶHとＶLアミノ酸配列を、ヒトトロンボポイエチンレセプター、ｃ-Ｍｐｌに結合する２３ ｓｃＦｖで比較した。１１の抗-ＨＥＲ３クローンの５つは、１又はそれ以上のＭｐｌ-結合クローンを持った同一のＶLアミノ酸配列を共有する。反対に、２３の抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ以外の７つは、抗-ＨＥＲ３クローンの一つと同じＶLを共有した(表５、上記、白い箱を参照)。一方、ＶHアミノ酸配列は、何れかの抗-Ｍｐｌと抗-ＨＥＲ３クローンの間に４０から９０％の同一性レベルを持つ、より多く相違するものであった。
【０２３１】
その抗-Ｍｐｌ ｓｃＦｖ，１２Ｂ５(Genbank accession number AF048775；配列番号：２７)と抗ＨＥＲ３ｓｃＦｖクローンＨ６(Genbank accession number AF048774；配列番号：２８)は、同一のＶL配列及び実質的に異なるＶH配列を利用する。これらのｓｃＦｖフラグメントは、共有した軽鎖に対する有効なヘテロダイマー化ができる抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３二重特異性ＩｇＧ抗体を構築すること、同じく孔-中-ノブ変異体(ここに記載した)及びＣH３ドメイン間に作られたジスルフィド結合の使用を通して用いた。同じＬ鎖を共有する抗体は、非-同系Ｈ鎖と対合するＬ鎖の問題を避けるために選択した。２つの天然存在ヒンジ領域ジスルフィド結合もまた存在した。その共通のＬ鎖は、変異体ｖ１１からのＣH３変異を含んでいる２つのＨ鎖と共移入した。そのＩｇＧ生産物は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、且つ標準技法を用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。
【０２３２】
二重特異性ＩｇＧ抗体(ＢｓＩｇＧ)調製物は、ＩｇＧ含有野生型ＣH３ドメインよりも、より大きい移動性を示す単一の主要バンドを生じる。電気泳動移動性におけるこの増加は、よりコンパクトなタンパク質種を形成するＢｓＩｇＧ中に作られたジスルフィド結合の形成と一致した。
【０２３３】
ＭｐｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原の両方に結合する工作した抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ＢｓＩｇG 抗体の能力は、以下の通りＥＬＩＳＡを用いて評価した。全ての工程でＰＢＳ緩衝液を用い、９６-ウェル板(Maxisorp,Nunc)の個々のウェルは、5μg/mlでＨＥＲ３-ＩｇＧ又はＭｐｌ-ＩｇＧで一晩被覆し、洗浄し次いで0.5％(w/v)ＢＳＡによって１時間ブロック化した。その最初の抗体は、変異体Y349C：T366S：L368A：Y407V/T366'W：S354'Cを含み、且つ変異したＦｃ領域を持つ親の抗-Ｍｐｌ又は抗 -ＨＥＲ３ ＩｇＧに一致する抗-Ｍｐｌｘ抗-ＨＥＲ３ＢｓＩｇＧとした。最初の抗体(１μg/mL)は、ビオチン化ＨＥＲ３-ＩｇＧ及びストレプタビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体 (Boehringer Mannheim)の1:5000希釈液と共に23℃で２時間、別個にインキュベーションし、次いで各ウェルに加え、23℃でさらに１時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性は、販売者(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)によって指示された通りにＴＭＢ試薬によって検出した。
【０２３４】
予想した通り、抗-Ｍｐｌ／抗-ＨＥＲ３ ＢｓＩｇＧは、個別にＭｐｌとＨＥＲ３ ＥＣＤ抗原のそれぞれに有効に且つ同時に、同じく両方の抗原に同時に結合した。これに対して、親の抗-Ｍｐｌと親の抗-ＨＥＲ３ ＩｇＧは、同系抗原に一致するそれにのみ結合した(図６)。
【０２３５】
Ｄ． 工作したＦｃ領域を含んでいる抗体は、有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力がある。
【０２３６】
本発明の実例化した二重特異性抗体の精製において用いた工作したＦc領域(ＣH３変異体、上記)が有効な抗体-依存細胞介在細胞毒性の能力があることを実証するため、以下の実験を実行した。
【０２３７】
そのＣH３変異体は、Lewis，G.D.ら(Lewis,G.D,ら(1993)Cancer Immunol.Immunother.37:255-263,その全部が参考により組込まれる)の方法を用いて示した通り、有能な抗体-依存細胞-介在細胞毒性(ADCC)をサポートする能力を維持する。概略的には、細胞毒性アッセイは、51Ｃｒ-標識したＳＫ-ＢＲ-３及びＨＢＬ-１００標的細胞(それぞれATCC受託番号HTB-30と45509)及びエフェクター細胞としてヒト末梢血液リンパ球によって実行した。しかしながら、Lewisらと異なり、そのリンパ球はＩＬ-２で活性化されなかった。
【０２３８】
ＣH３変異体S354:T366W及びY349C：T366S：L368A：Y407Vは、Carterら(Carter,P.ら(1992)PNAS USA 89:4285-4289)により製造されたヒト化抗-ＨＥＲ２抗体、huMAb4D5-5のＨ鎖中に別個に導入した。再モデル化した及び野生型Ｆｃ領域を含む抗体は、ＨＥＲ２-過剰発現乳癌細胞系、SK-BR-3によりＡＤＣＣ中で類似の能力を有した(図７)。再モデル化した及び野生型抗体の両方は、通常の胸部上皮細胞系に対する低い活性と比較できることを示した。Ｈ鎖中の効果は、これらBsIgG'sが抗体-依存細胞-介在細胞毒性において機能するであろうことを予報する、結合ドメインの独立がある。
【０２３９】
本発明は、最も実践的、且つ好適な実施態様であるとして考慮される何れかにおいてここに示され且つ記載される。それは、しかしながら、発展は本発明の範囲内から作製できること、及び自明な修正がこの開示を熟読した当業者に生起することが認識される。ここに用いた全ての参考文献はそれの全体において参考によってここに組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃ。図１Ａは、ホモマルチマー化よりもヘテロマルチマー化を増強させるための操作が行われない場合において、Ｆｃを含有する二重特異性抗体の形成を示す略図である。図１Ｂは、所望のヘテロマルチマー化が、望ましくないヘテロマルチマー化およびホモマルチマー化よりも好ましいように、重（Ｈ）鎖が操作される場合に生じる対形成を示す略図である。図１Ｃは、同じ軽（Ｌ）鎖を有する抗体を選択して、同系でない重鎖と対形成する軽鎖の問題が回避される場合に生じる対形成を示す略図である。
【図２ＡＢ】図２Ａは、ファージディスプレーベクターｐＲＡ２を使用するＣH３ヘテロダイマーの選択反応図式を図示する。安定なＣH３ヘテロダイマーをディスプレーするファージは、ｇＤフラッグに対する抗体を使用して捕獲される。図２Ｂは、合成された遺伝子から発現されるＣH３が、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質との融合タンパク質として、天然の遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１〜４０７９(１９８２)）から発現されるＣH３の第２の複製物とともに同時に分泌されるジシストロン性オペロンを図示する。合成されたＣH３遺伝子は、単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄから誘導されるペプチド(ｇＤフラッグ、Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．およびＤｏｗｂｅｎｋｏ，Ｄ．Ｊ．(１９８４)ＤＮＡ３：２３〜２９；Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１４９０〜１４９２)、および部位特異的なプロテアーゼのケネナーゼ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ）Ｊの開裂（Ｇ）部位（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０〜２４８）の上流に置かれる。
【図２Ｃ１】図２Ｃ１は、翻訳されるＣH３遺伝子の残基に、ＫａｂａｔらのＥｕ方式に従って番号を付けた図２Ｂのジシストロン性オペロンの核酸配列（配列番号２）である。「免疫学的に関心が持たれるタンパク質の配列」、第５版、第１巻、６８８〜６９６頁、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ(１９９１)。隆起の変異Ｔ３６６Ｗを示す。そのような残基は、天然のＣH３遺伝子における無作為化のために標的化される(３６６、３６８および４０７)。
【図２Ｃ２】図２Ｃ２は、翻訳されるＣH３遺伝子の残基に、ＫａｂａｔらのＥｕ方式に従って番号を付けた図２Ｂのジシストロン性オペロンの核酸配列（配列番号２）である。「免疫学的に関心が持たれるタンパク質の配列」、第５版、第１巻、６８８〜６９６頁、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ(１９９１)。隆起の変異Ｔ３６６Ｗを示す。そのような残基は、天然のＣH３遺伝子における無作為化のために標的化される(３６６、３６８および４０７)。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃ。図３Ａおよび図３Ｂは、免疫付着因子(Ia)とともに抗体(Ab)の重鎖および軽鎖の共-移入から得られるプロテインＡ精製された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥをデンシトメトリー分析で走査した結果の棒グラフである。示したデータは、２つの独立した実験の平均である。ｘ軸は、投入したＤＮＡの質量比（Ｉａ：Ｈ：Ｌ）を示し、ｙ軸は、全生成物タンパク質に対する生成物マルチマーの各タイプの割合を示す。図３Ｃは、可能な生成物マルチマーを図示する。
【図４】図４は、Ａｘ１、Ｒｓｅ、ＩｇＥＲ、Ｏｂ−ＲおよびＶＥＧＦに対する特異性を有する８個の異なる抗体のＶL配列の比較である。配列定義（Ｋａｂａｔら（１９９１）上記）または構造定義（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１〜９１７）に従った抗原結合ＣＤＲ残基の位置を、それぞれ、下線および＃によって示す。Ａｘ１．７８配列と異なる残基を二重下線によって示す。
【図５】図５は、選択された抗Ｏｂ−Ｒクローンおよび抗ＨＥＲ３クローンの重鎖および軽鎖の比較である。二重特異性抗体の構築に使用した抗Ｏｂ-Ｒクローン２６および抗ＨＥＲ３クローン１８のＶH配列および共通するＶL配列を示す。
【図６】図６。Ｍｐｌ−ＩｇＧおよびＨＥＲ３−ＩｇＧに対する同時結合を検出するためのサンドイッチＥＬＴＳＡ。試験した抗体は、Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６’Ｗ：Ｓ３５４’Ｃの変異を含有する抗Ｍｐｌ×抗ＨＥＲ３のＢｓＩｇＧであり、Ｆｃ領域を変異させた対応する元の抗Ｍｐｌまたは抗ＨＥＲ３のＩｇＧとともに使用した。
【図７】図７は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の研究結果の棒グラフである。ＡＤＣＣは、変異型（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４Ｏ７’Ｖ）または野生型のＦｃあるいはアイソタイプが一致するコントロール抗体（Ｅ２５、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２）のいずれかを含有するｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８９：４２８５〜４２８９）によって媒介された。抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）を、ヒト末梢血単核エフェクター細胞およびＳＫ−ＢＲ−３標的細胞とともに示した比でインキュベーションした。示したデータは、３連の測定値および３つの異なる実験の平均である。
【図８】図８は、ＨＥＲ３に対して生起された抗体の軽鎖とＯｂ−Ｒに対して生起された抗体の軽鎖との間のアミノ酸配列同一性を示す行列である。配列同一性が１００％である軽鎖を有する抗体を黒四角に示す。配列同一性が９８％〜９９％である軽鎖を有する抗体を白四角に示す。抗体クローンの同一性を行列の下部に示す。
【図１】
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【図２ＡＢ】
0004324231.tif 000009
【図２Ｃ１】
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【図２Ｃ２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004324231.tif 000014
【図６】
0004324231.tif 000015
【図７】
0004324231.tif 000016
【図８】
0004324231.tif 000017
【配列表】
0004324231000001.app