(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤を含む反応液中で遺伝子増幅反応に付し、遺伝子増幅産物を検出することを特徴とする遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項２】
遺伝子増幅法による遺伝子増幅の有無を光学的に検出するに際して、遺伝子増幅反応に付す前に、遺伝子増幅反応の反応温度よりも低い曇点を有する第１界面活性剤を含有する遺伝子増幅用の反応液に、前記第１界面活性剤とは異なる第２界面活性剤を添加して前記反応液の曇点を遺伝子増幅反応の反応温度よりも高めることを特徴とする遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項３】
界面活性剤又は第２界面活性剤の曇点が、７０℃以上である請求項１又は２に記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項４】
界面活性剤又は第２界面活性剤がポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項１又は２に記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項５】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が以下の式
R1−R2−(CH2CH2O)n−H
（式中、R1は炭素数８〜２２のアルキル又はアルケニル、R2は−O−、−（C6H4)−O−又は−COO−、ｎは１０〜１００の整数である）
で表される請求項４に記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項６】
界面活性剤が、反応液に対して０．０５〜１０重量％である請求項１〜５のいずれか１つに記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項７】
遺伝子増幅反応温度が４０〜９５℃である請求項１〜６のいずれか１つに記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項８】
遺伝子増幅産物を濁度により検出する請求項１〜７のいずれか１つに記載の遺伝子増幅産物の検出方法。
【請求項９】
少なくとも、遺伝子を増幅するために必要なプライマー、遺伝子を増幅する酵素、遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤を含んでなり、
遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤が、プライマー及び／又は酵素とともに、あるいはこれらと別々にパッケージされてなる遺伝子増幅産物の検出試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子増幅産物の検出方法及び遺伝子増幅産物の検出試薬キットに関し、より詳細には、遺伝子増幅法による遺伝子増幅の有無を検出する場合において、遺伝子増幅の有無にかかわらず反応液中に発生する濁りを低減して、精度よく遺伝子増幅産物を検出するための遺伝子増幅産物又は遺伝子増幅に伴って生じる副産物の検出方法及び遺伝子増幅産物の検出試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
医療現場などでの遺伝子疾患、癌化、微生物の識別等において、その簡便性及び迅速性により、種々の遺伝子増幅法が有効に利用されている。なかでも、ＰＣＲ法の遺伝子増幅法は、感度が良好であることから、特に医療分野において多く使われている（例えば、特許文献１参照）。また、ＬＡＭＰ法は反応が特異的で増幅産物が多いことで注目されている（例えば、特許文献２参照）。
また近年は、遺伝子増幅のみならず、目的遺伝子の存在量を定量する定量ＰＣＲ法なども開発されている。この方法によれば、目的遺伝子の増幅の度合いをリアルタイムで検出し、増幅が確認された時間をもとに定量することができる。
遺伝子増幅のリアルタイム検出法は、大きく分けて蛍光法と比濁法との２種類があるが、特に比濁法は、遺伝子の増幅反応によって生じるピロ燐酸とマグネシウムとの反応により生じた反応溶液中の沈殿を濁度として、リアルタイムに遺伝子産物を検出することで、定量的な遺伝子増幅を実施することが可能であり、検出装置も簡便であるという点で優れている。
【０００３】
しかし、遺伝子増幅を行う反応液中には、ポリメラーゼやリバーストランスクリプターゼなどの酵素の他に、通常、その溶液中に酵素の安定性、反応性を向上させるために界面活性剤が含まれていることから、このような反応液を用いて６５℃程度に加熱して増幅反応を行うと、反応液が界面活性剤により濁る。よって、医療現場等において、比濁法を用いて目的遺伝子の増幅を検出する場合、界面活性剤の濁りにより、反応液のバックグラウンドが高くなり、高感度かつ正確に遺伝子増幅を確認することが困難である。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたもので、反応液の加温による濁りを抑制することができる遺伝子増幅産物の検出方法及び遺伝子増幅産物の検出試薬キットを提供することを目的とする。
【０００４】
【特許文献１】
特公平４−６７９５７号公報
【特許文献２】
特許第３３１３３５８号公報
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤を含む反応液中で遺伝子増幅反応に付し、遺伝子増幅産物を検出することを特徴とする遺伝子増幅産物の検出方法が提供される。
また、本発明によれば、遺伝子増幅法による遺伝子増幅の有無を光学的に検出するに際して、遺伝子増幅反応に付す前に、遺伝子増幅反応の反応温度よりも低い曇点を有する第１界面活性剤を含有する遺伝子増幅用の反応液に、前記第１界面活性剤とは異なる第２界面活性剤を添加して前記反応液の曇点を遺伝子増幅反応の反応温度よりも高めることを特徴とする遺伝子増幅産物の検出方法が提供される。
さらに、本発明によれば、少なくとも、遺伝子を増幅するために必要なプライマー、遺伝子を増幅する酵素、遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤を含んでなり、遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤が、プライマー及び／又は酵素とともに、あるいはこれらと別々にパッケージされてなる遺伝子増幅産物の検出試薬キットが提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子増幅産物の検出方法は、遺伝子増幅法による遺伝子増幅（遺伝子産物合成）の有無を検出する場合に用いられる方法であり、光学系の技術を応用して遺伝子増幅の有無を分析、測定又は検出する全ての方法に用いることができる。具体的には、濁度を検出する方法、吸光度を検出する方法、散乱光強度を検出する方法、蛍光強度を検出する方法等の種々の方法に使用することができる。なかでも、濁度又は散乱光を検出する方法に利用することが好ましい。
【０００７】
遺伝子増幅の検出は、例えば、３１０〜１２８５ｎｍ程度の波長範囲の光、具体的には、４００、４０５、５７５、８００ｎｍ等の光を利用して行うことができる。濁度又は散乱光の検出は、例えば、図１に示すような、光源１からの光から、フィルタ２を通して所望の波長を有する光を取り出し、その光を検出対象３に照射し、受光素子４でその透過光又は散乱光を検出し、任意に電気信号に変換することにより行うことができる。
遺伝子増幅法としては、ＬＡＭＰ法（Notomi, T. et. al.,:Nucleic Acids Res. 28:e63,2000参照）、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＭＡ法、定量ＰＣＲ法又はこれらの方法を改変した方法等の種々の方法が挙げられる。なかでも、濁度又は散乱光を検出する場合、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅法を用いることが好ましい。
【０００８】
遺伝子増幅法では、一般に、反応液中で酵素反応が行われて遺伝子を増幅する。反応液は、通常、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持に必要な塩類、酵素の保護、安定化のための界面活性剤、希釈液、非特異反応を抑制するための物質や増感剤等を含んでいてもよく、増幅させようとする遺伝子、プライマー、酵素等が混合されて構成される。本発明の遺伝子増幅産物の検出方法では、さらにその反応液に、本来含まれている界面活性剤とは異なる種類の界面活性剤を添加して反応液の曇点を高める。なお、これらの成分の混合順序は、特に限定されない。緩衝液、塩類、界面活性剤等の反応液を構成している成分の種類や濃度は、増幅させようとする遺伝子、プライマー及び酵素の種類等により適宜調整することができる。また、遺伝子、プライマー、酵素等は、利用する遺伝子増幅法の種類、用いるこれらの種類や量等によって、適宜調整することができる。例えば、緩衝剤としては、Tris-HCl等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用をもつものが挙げられる。塩類は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4等が挙げられる。界面活性剤は、酵素にダメージを与えず、酵素の立体構造を保持し、酵素を安定に保ち得るものであることを要し、後述するような非イオン性界面活性剤、通常、アルキルアリールポリエチレングリコール（トリトンＸ−１００）が用いられるが、これに代えて、いずれの非イオン性界面活性剤が用いられていてもよい。なお、トリトンＸ−１００は、後述する遺伝子増幅反応の反応温度よりも曇点が低いため、遺伝子増幅反応時の加温によって濁りを生じさせる。
【０００９】
また、反応液にさらに添加する界面活性剤は、反応液の曇点（主として反応液に本来含まれている界面活性剤に起因する曇点）を後述する遺伝子増幅反応の反応温度よりも高めることができるものであることが必要であり、さらに、酵素にダメージを与えず、酵素を安定に保持することができるものであることが必要である。添加する界面活性剤は、反応液に本来含有されている界面活性剤の種類や量、用いる遺伝子、プライマー、酵素の種類や量等によって適宜調整することができ、一般的には、反応温度よりも高い曇点を有するものが有利である。
反応液にさらに添加する界面活性剤としては、例えば、曇点が７０℃以上であるものが挙げられる。このような界面活性剤として例えば曇点が９８℃のエマルゲン220 (花王(株)社製)、曇点が１００℃以上のTERGITOL NP-40（シグマ社製）、エマルゲン123P (花王(株)社製)、エマルゲン147 (花王(株)社製)、ニッサンノニオンE-230 (日本油脂(株)社製)などが挙げられる。
【００１０】
また、種々の界面活性剤のうち、非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的には、
（１）ポリオキシ化合物の脂肪酸エステル型
・高級脂肪酸のグリセリン・エステル（モノステアリン酸グリセライド、モノオレイン酸グリセライド）
・脂肪酸のグリコール・エステル（ステアリン酸ポリグリコールエステル、ラウリン酸ジエチレングリコールエステル、モノラウリン酸プロピレングリコールエステル、モノオレイン酸プロピレングリコールエステル、モノステアリン酸プロピレングリコールエステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルケニルエーテル）
・脂肪酸のペンタエリスリトール・エステル（モノステアリン酸ペンタエリスリトールエステル、モノカプリル酸ペンタエリスリトールエステル、大豆油脂肪酸ペンタエリスリトールエステル、モノラウリン酸ペンタエリスリトールエステル）
・脂肪酸の蔗糖エステル（蔗糖−ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パリミチン酸エステル）
・脂肪酸のソルビタン及びマンニタン・エステル（セスキオレイン酸ソルビタンエステル、モノラウリン酸ソルビタンエステル、モノラウリン酸ソルビタンエステルのポリエチレンオキサイド縮合物、モノオレイン酸マンニッタンエステル、モノパルミチン酸マンニッタンエステルのポリエチレンオキサイド縮合物）
【００１１】
（２）ポリエチレンオキサイド縮合型
・高級アルコール縮合物（ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ヘキサデシノール、ドデカノール・ポリエチレンオキサイド等）、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル（例えば、オレイノール・ポリエチレンオキサイド等）、脂肪酸アルコール・ポリエチレングリコールエーテル、ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル等）
・高級脂肪酸縮合物（モノラウリン酸エステルのポリエチレンオキサイド縮合物、リシノール酸エステルのポリエチレンオキサイド縮合物等）
・高級脂肪酸アミド縮合物
・高級アルキル・アミン縮合物
・高級アルキル・メルカプタン縮合物
・アルキル・フェノール縮合物（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル、アルキルアリルエーテルのポリエチレンオキサイド縮合物、ジアミフェノールエーテルのポリエチレンオキサイド縮合物、アルキルフェノールエーテルのポリエチレンオキサイド縮合物等）
・ポリプロピレン・オキサイド縮合物（ポリオキシプロピレングリコール等）
等が挙げられる。
【００１２】
なかでも、ポリオキシエチレン系の界面活性剤が好ましく、エチレンオキサイドの付加モル数は１０〜１００程度が挙げられる。この界面活性剤の具体例としては、以下の式
R1−R2−(CH2CH2O)n−H
（式中、R1は炭素数８〜２２のアルキル又はアルケニル基、R2は−O−、−（C6H4)−O−又は−COO−、ｎは１０〜１００の整数である）
で表されるものが挙げられる。
なお、式中、R1の炭素数８〜２２のアルキル基としては、直鎖又は分岐のいずれであってもよく、例えば、オクチル、ノニル、ドデシル（ラウリル）、ヘキサデシル等が挙げられる。炭素数８〜２２のアルケニル基としては、直鎖又は分岐のいずれであってもよく、例えば、オクテニル、オレイル、ヘキサデケニル等が挙げられる。なお、R2の(C6H4)は芳香環を示す。
【００１３】
また、添加する界面活性剤は、反応液の曇点を反応温度よりも高め、濁りを抑制し、かつ特異的な遺伝子増幅反応に影響を及ぼさない量が好ましく、反応液に本来含有されている界面活性剤の種類や量、用いる遺伝子、プライマー、酵素の種類や量等を考慮して、反応液に本来含有されている界面活性剤の量に対して、０．１〜２０倍重量程度、０．１〜１０倍重量程度、好ましくは０．５〜２倍重量程度が挙げられる。特に、トリトン−ＸとTERGITOL NP-40とが反応液中に併用されている場合には、トリトン−ＸとTERGITOL NP-40は０．１％：０．０１％〜２．０％（重量）が好ましい。また、別の観点から、添加する界面活性剤は、反応液に対して０．０５〜１０．０％（重量）、さらに０．１〜１．０％（重量）程度であることが好ましい。
【００１４】
遺伝子増幅反応は、等温反応あるいは、温度サイクリング反応により行うことができる。遺伝子増幅反応温度は、遺伝子増幅法で最も反応温度の低いＴＭＡ法の反応温度４０℃から最も反応温度の高いＰＣＲ法の反応温度９５℃を含む範囲、つまり、４０〜９５℃が好ましい。
例えば、等温反応においては、反応液を一定温度に加温し、一定時間保持することにより行うことができる。反応は、通常、４０℃〜７０℃程度に加温し、１０分間〜３時間程度保持することにより行われる。但し、この反応に前後してさらに別の温度の反応を加えることもできる。
【００１５】
一方、温度サイクリング反応においては、例えば、反応液を９５℃１分、５５℃１分、７２℃１分というサイクルを１５〜４０回繰り返すことにより遺伝子増幅反応を行う。但し、この反応に前後してさらに別の温度の反応を加えることもできる。
本発明においては、遺伝子増幅反応温度は、遺伝子増幅反応における実際の増幅反応温度だけでなく、遺伝子増幅産物の検出をおこなう温度もこれに含まれる。遺伝子増幅反応の温度と遺伝子増幅産物の検出温度とは、一致していた方が好ましいが、必ずしも一致していなくてもよい。
また、等温反応あるいは、温度サイクリング反応において、遺伝子増幅の有無を、例えば、上述した光学系の技術を応用して検出することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子増幅産物の検出方法に用いられる種々の試薬成分は、予めパッケージされキット化されて構成される。キットは、少なくとも、遺伝子を増幅するために必要なプライマー、遺伝子を増幅する酵素、遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤から構成される。さらに、必要に応じて、塩類、希釈液、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、非特異反応を抑制するための物質、増感剤等の試薬成分を含んでいてもよい。キットにおいては、プライマーは、酵素と別々にパッケージされることが好ましい。遺伝子増幅反応温度よりも高い曇点を有する界面活性剤は、プライマー及び／又は酵素とともに、あるいはこれらと別々にパッケージされていてもよい。また、この界面活性剤は、他の成分の１以上とともに、あるいは別々にパッケージされていてもよい。なお、他の成分は、それぞれ単独でパッケージされていてもよいし、１以上が一緒にパッケージされていてもよい。
【００１７】
【実施例】
本発明の遺伝子増幅産物の検出方法を以下に詳細に示す。
実施例１
まず、氷上にＣＡ−６０００反応チューブ（シスメックス株式会社製）を載置し、反応溶液を調製した。
・反応液
水    ５２．０μｌ
１０Ｘ Thermopol buffer (ニュー・イングランド・バイオラボ（NEB）社製）
２０．０μｌ
10mM dNTPs（GIBCO製）                ８．０μｌ
100mM MgSO4（NEB社製）               ４．０μｌ
5Mベタイン（シグマ社製）           ３２．０μｌ
ＦＡプライマー（４０pmol/μｌ）      ８．０μｌ
ＲＡプライマー（４０pmol/μｌ）      ８．０μｌ
Ｆ３プライマー（５pmol/μｌ）        ８．０μｌ
Ｒ３プライマー（５pmol/μｌ）        ８．０μｌ。
なお、１０Ｘ Thermopol bufferは、
（strikethrough:２０ｍM）  ２００ｍM Tris-HCl pH8.8
（strikethrough:１０ｍM）  １００mM KCl
（strikethrough:１０ｍM）  １００mM (NH4)2SO4 
（strikethrough:２ｍM）    ２０mM MgSO4 
（strikethrough:０．１％）  １．０% トリトンＸ−１００（曇点：６３〜６９℃）からなる。
【００１８】
また、プライマーは、１本鎖DNAであり、以下の塩基配列を有する。
ＦＡプライマー：
ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC（Seq No.1）
ＲＡプライマー：
CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT（Seq No.2）
Ｆ３プライマー：GTTGGGAAGGGCGATCG（Seq No.3）
Ｒ３プライマー：ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA（Seq No.4）
この反応液に、さらに１．０％TERGITOL NP-40（ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル、オキシエチレン数：４０、曇点：１００℃以上、シグマ社製）を２０．０μｌ混合し、攪拌した。
【００１９】
次いで、Bst DNA ポリメラーゼ・ラージフラグメント（NEB社製）１６．０μｌと、テンプレートとしてＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（タカラ社製）を１６μｌ添加し、攪拌した。
続いて、反応チューブを、図１に示した、波長４００ｎｍの光を用いた検出部を有する装置（CA−１５００の改造機、シスメックス社製）の反応チューブに移した。この反応チューブは、６５℃のヒートブロック中に挿入されており、反応液を６５℃に保持することができる。なお、反応液は、混合後、反応チューブをヒートブロックに移した直後に、濁り具合をリアルタイムで測定し、透過光の変化によって遺伝子増幅の有無を検出した。
比較例として、１．０％TERGITOL NP-40を添加しない以外は上記と同様の反応液で同様に反応させて、反応液の濁り具合を測定した。
なお、透過光強度は、図１に示す受光素子４で透過光を受光して出力された任意の電気信号をＡ／Ｄ変換したものである。
結果を図２に示す。
【００２０】
図２によれば、１．０％TERGITOL NP-40を添加した場合には、反応液の曇点（主として反応液に本来含まれている界面活性剤に起因する曇点）を７０℃以上にすることによって、反応液の濁りを抑制して、透過光強度（透過光受光部からの出力値（Volt））の測定において、バックグラウンドを安定に保つことができたことがわかる。また、矢印で示した反応開始以降においても、透過光強度（透過光受光部からの出力値（Volt））の安定化を図ることができたことがわかる。さらに、矢印で示した反応開始位置が明確にわかり、正確な遺伝子増幅産物の有無の検出が可能となったことがわかる。一方、１．０％TERGITOL NP-40を添加しない場合には、透過光強度（透過光受光部からの出力値（Volt））の測定において、バックグラウンドにばらつきが認められたことがわかる。また、反応開始以降においても、透過光強度（透過光受光部からの出力値（Volt））にばらつきが認められたことがわかる。
【００２１】
実施例２〜５
まず、氷上にCA-6000反応チューブ(シスメックス株式会社製)を静置し、界面活性剤を含む反応液を調製した。そこへテンプレートとしてサイトケラチン20のmRNAを2.0μl添加して攪拌した。
この反応チューブを検出装置の65℃の検出部へ挿入して遺伝子増幅反応を開始させ、透過光強度をリアルタイムに検出し、濁り具合を確認した。
またこの比較例として、界面活性剤を添加しない反応液を調製し、同様の反応に付して、反応液の濁り具合を確認した。
・反応液
水      7.5μl
422mM Tris-HCl pH8.0(株式会社ニッポンジーン製)               14.2μl
10x Thermopol buffer(NEB社製)                                10.0μl
10mM dNTPs(インビトロジェン製)                                4.0μl
100mM MgSO4(シグマ社製)                                       4.0μl
0.1M DTT(和光純薬工業株式会社製)                              5.0μl
5M Betaine(シグマ社製)                                       12.8μl
FAプライマー  (40pmol/μl)                                    4.0μl
RAプライマー (40pmol/μl)                                     4.0μl
F3プライマー (5pmol/μl)                                      4.0μl
R3プライマー (5pmol/μl)                                      4.0μl
Loopプライマー Forward (20pmol/μl)                           4.0μl
Loopプライマー Reverse (20pmol/μl)                           4.0μl
10% 界面活性剤  10.0μl
10U/μl AMV逆転写酵素 (プロメガ社製)                          0.5μl
8000U/ml Bst DNAポリメラーゼ・ラージフラグメント(NEB社製)     8.0μl
【００２２】
なお、プライマーは、１本鎖DNAであり、以下の塩基配列を有する。
FAプライマー:
CAATTTGCAGGACACACCGAGATTGAAGAGCTGCGAAGTC（Seq No.5）
RAプライマー:
CTGCTGAGGACTTCAGACTGACTGACTTGGAGATCAGCTTCCAC（Seq No.6）
F3プライマー: CGACTACAGTGCATATTACAGAC（Seq No.7）
R3プライマー: GTAGGGTTAGGTCATCAAAGAC（Seq No.8）
LoopプライマーForward: GCAGTTGAGCATCCTTAATCT（Seq No.9）
Loopプライマー Reverse: GACTGCGCGCGGAATACGTC（Seq No.10）
また、界面活性剤は、以下の４種をそれぞれ用いた。
エマルゲン123P (ポリオキシエチレンラウリルエーテル、オキシエチレン数：２３、曇点：１００℃以上、花王(株)社製)
エマルゲン147 (ポリオキシエチレンラウリルエーテル、オキシエチレン数：１９、曇点：１００℃以上、花王(株)社製)
エマルゲン220 (ポリオキシエチレンセチルエーテル、オキシエチレン数：１３、曇点：９８℃、花王(株)社製)
ニッサンノニオンE-230 (ポリオキシエチレンオレイルエーテル、オキシエチレン数：３０、曇点：１００℃、日本油脂(株)社製)
【００２３】
検出装置として、波長400nmの光を用いた検出部を有し、図１に示す装置と同じ原理の装置(MU001、シスメックス社製)を用いた。この装置は、６５℃のヒートブロックの検出部に反応チューブを挿入した直後から、透過光強度をリアルタイムで測定することができる。
得られた結果を図３にそれぞれ示す。これらの図によれば、界面活性剤を添加した場合には、反応液の曇点（主として反応液に本来含まれている界面活性剤に起因する曇点）を７０℃以上にすることによって、反応液の濁りを抑制して、透過光強度の測定において、バックグラウンドを安定に保つことができたことがわかる。また、矢印で示した反応開始以降においても、透過光強度の安定化を図ることができたことがわかる。さらに、矢印で示した反応開始位置が明確にわかり、正確な遺伝子増幅産物の有無の検出が可能となったことがわかる。一方、界面活性剤を添加しない場合には、透過光強度の測定において、バックグラウンドにばらつきが認められたことがわかる。また、反応開始以降においても、透過光強度にばらつきが認められたことがわかる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、反応液に界面活性剤を添加することにより、反応液中に含まれる界面活性剤の曇点に起因する濁りの発生を抑えることができ、特異的な増幅反応に影響を及ぼさずに、増幅遺伝子の光学的な検出において、バックグラウンドを安定化及び低減することができ、より正確な遺伝子増幅産物の有無を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子増幅産物の検出方法において、濁度の検出装置の原理を説明するための図である。
【図２】本発明の遺伝子増幅産物の検出方法の実施例を示すグラフである。
【図３】本発明の遺伝子増幅産物の検出方法の別の実施例を示すグラフである。
【符号の説明】
１  光源
２  フィルタ
３  検出対象
４  受光素子
【図１】
0004257091.tif 000002
【図２】
0004257091.tif 000003
【図３】
0004257091.tif 000004