(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
AGAL 受託番号NM98/08610で寄託されたOkadaella gastrococcusの以下の特徴：
ヒトの胃にコロニーを形成する能力がある；
胃腸疾患を引き起こす能力がある；
球状；
直径0.2〜0.75 μm；
外膜に線毛を有する；
テトラサイクリン、メトロニダゾール、H2拮抗薬を含む3剤抗生物質療法に耐性；
を有する、単離されたOkadaella gastrococcus細菌。
【請求項２】
以下のさらなる特徴：
グラム陰性；
微好気性および嫌気性条件下で培養可能；
２週間の培養でウレアーゼ陰性；
カタラーゼ陰性；
オキシダーゼ陰性；
鞭毛無し；
細菌コロニーが、紫外線（360nm）照射下で蛍光を発しない；および
コロニーがWarthin-Starry銀染色で多数の丸い「点」として観察される；
を有する、請求項１記載の単離されたOkadaella gastrococcus細菌。
【請求項３】
AGAL 受託番号NM98/08610で寄託されたOkadaella gastrococcusを含む、請求項１または２記載の単離されたOkadaella gastrococcus細菌。
【請求項４】
動物から得られた臨床標本において請求項１〜３のいずれか1項で定義される細菌の存在を同定するステップを含んでなる、動物の胃腸管における細菌Okadaella gastrococcusの存在を検出する方法。
【請求項５】
臨床標本が胃吸引液を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
胃吸引液が胃粘膜を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
胃吸引液が表在性潰瘍部を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
胃吸引液が胃上皮細胞を含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
臨床標本が生検、便検体、または血液サンプルである、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
臨床標本において細菌の存在を同定するステップが、顕微鏡により細菌を同定することを含んでなる、請求項４〜９のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
臨床標本において細菌の存在を同定するステップが、細菌に対する抗体を使用することを含んでなる、請求項４〜９のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
臨床標本において細菌の存在を同定するステップが、16S rRNAを含む細菌ゲノムの一部のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により細菌を同定することを含んでなる、請求項４〜９のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
臨床標本において細菌の存在を同定するステップが、臨床標本由来の細菌を培養することを含んでなる、請求項４〜９のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
顕微鏡により細菌を同定することをさらに含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細菌に対する抗体を使用して細菌を同定することをさらに含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
16S rRNAを含む細菌ゲノムの一部のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により細菌を同定することをさらに含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
臨床標本がヒト由来である、請求項４〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか1項記載の単離された細菌が原因で起こる疾患を検出または診断するための診断ツールまたは診断補助ツールの開発における、該細菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、単離した細菌、および該細菌が原因となる胃腸疾患を診断するための該細菌の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
胃腸疾患は、動物およびヒトにおいて一般的な疾患である。ウィルス、細菌、原虫などの多くの病原体がこの疾患の原因となることが認識されているが、未だ原因病原体を同定できない臨床例が多く存在する。さらに、多くの症例が標準的な医薬品治療レジメに応答しないことから、１以上の未知の病原体の関与が示唆される。
【０００３】
最近、ヒトを含む動物において胃腸疾患の原因となる数種の新微生物が同定された。1984年に、MarshallおよびWarren（Lancet 1984;1312-1314）は、胃炎および消化性潰瘍患者において、カンピロバクター様の、らせん状で長さ2.5μm、直径0.5μmのグラム陰性細菌について述べた。これが現在良く知られるヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）である。1987年に、Dentら（Lancet 1987 ii:96）は、胃炎患者において、長さ3.5-7.5μm、直径0.9μmの新しいグラム陰性らせん状細菌を報告し、それをGastrospirillum hominisと命名した。この細菌は、現在Helicobacter helimaniiと呼ばれている。
本発明者は、ヒトの胃腸疾患に関与する新しい細菌を単離し同定した。
【０００４】
（発明の開示）
消化不良症状の患者から、ヘリコバクター・ピロリの球菌体とは別個の、ヒトの胃にコロニーを形成する新しい球状細菌を同定・単離し、この細菌はびらん性胃十二指腸炎ならびに多発性表在性潰瘍と関連した広汎性胃炎を引き起こすことを見出した。この細菌は、テトラサイクリン、メトロニダゾール、H2拮抗薬から成る通常の3剤抗生物質療法に耐性を示した。プロトンポンプインヒビターに続く胃十二指腸の病因の症候的緩解ならびに組織学的および電子顕微鏡像から、びらん性胃十二指腸炎ならびに多発性表在性潰瘍の病因における潜在的役割が示唆される。この微生物は球状で、大きさは直径0.2〜0.75μmの範囲であり、多くは直径0.3〜0.5μmで、外膜に線毛がある。この細菌は、本発明者によりOkadaella gastrococcus Gen.nov, Sp.nov.と命名された。
【０００５】
第一の実施態様において、本発明は、動物に胃腸疾患を引き起こす能力があり、かつ本明細書中に定義されるOkadaella gastrococcusの特性を有する、単離された細菌に関する。
【０００６】
好ましくは、前記細菌は以下の特性を有する。すなわち、
グラム陰性；
球状；
微好気性および嫌気性条件下で培養可能；
2週間培養下でウレアーゼ陰性；
カタラーゼ陰性；
オキシダーゼ陰性；
鞭毛無し；
細菌コロニーが紫外線（360nm）照射下で蛍光を発しない；
コロニーがWarthin-Starry銀染色により多数の丸い「点」として観察される；および
非Helicobacter pyloriおよび非Helicobacter helimanii；である。
【０００７】
Okadaella gastrococcusのサンプルは、ブタペスト条約の規定の下、1998年9月22日に、オーストラリア政府分析研究所（Australian Government Analytical Laboratories: AGAL）に寄託され、受託番号NM98/08610を与えられた。
【０００８】
第二の実施態様において、本発明は、動物におけるOkadaella gastrococcusによる胃腸疾患の診断法に関し、該方法は、動物の胃腸管または動物由来の臨床標本において、本発明の第一の実施態様に従う細菌の存在を確認することを含んでなる。
【０００９】
前記細菌は、臨床標本から細菌を培養し、顕微鏡で該細菌を同定することにより直接的に検出されるか、あるいは該細菌に対する抗体の使用により間接的に同定され得る。臨床標本は、生検、便検体、血液試料などである。前記細菌の発見とその胃腸疾患との関連により、当技術分野で公知の方法による検出が可能であると認識されよう。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの分子検出法も臨床標本中の該細菌の存在を同定するために使用できることが理解されよう。
【００１０】
胃腸疾患の臨床徴候を示さない動物において前記細菌が存在する場合は、その動物に胃腸疾患の疾病素質があることが示唆される。従って、本発明の第二の実施態様の範囲は、前記細菌による胃腸疾患を罹患しやすい動物の検出法として、動物における該細菌の存在をスクリーニングする方法をも含む。
好ましくは、動物はヒトである。
【００１１】
第三の実施態様として、本発明は、前記細菌による疾患の検出または診断のための診断ツールまたは診断補助ツールを開発するための、本発明の第一の実施態様に従う細菌の使用に関する。このような診断ツールや診断補助ツールとして、前記細菌のゲノムから考案された分子プローブおよび抗体がある。
【００１２】
本明細書を通して、特に要求しないかぎり、「含む」という用語、または「含んでなる」などの派出語は、記載した要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を包含することを示唆し、その他の要素、整数または工程、ならびに要素、整数または工程の群を除くことを示唆しないと理解されよう。
本発明をより明確に理解するために、添付の図面を参照しながら、好ましい実施形態について説明する。
【００１３】
（発明の説明）
1983年に、MarshallおよびWarrenは、胃炎および消化性潰瘍患者において、カンピロバクター様の、グラム陰性で、長さ2.5μm、直径0.5μmのS字状細菌について述べた。これが現在よく知られるヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）である。1987年に、Dentらは、胃炎患者において、長さ3.5〜7.5μm、直径0.9μmのグラム陰性らせん状細菌を報告し、Gastrospirillum hominisと命名したが、現在ではHelicobacter helimanniiと呼ばれている。
【００１４】
消化不良が世界で最も一般的な医学的愁訴にも関わらず、消化不良患者由来の他種微生物の同定と単離に関する、利用可能な情報が全く発表されていない。本発明者らは、消化不良患者由来の新微生物を培養、単離、同定しようとした。病因が不明の、多発性表在性潰瘍を伴うびらん性胃十二指腸炎に罹患した若い日本人の症例。本発明者らは、この患者から、ヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）ではない球状の微生物を単離することに成功した。Chanらは、球状のヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）の存在が、胃の腺癌の主たる特徴であると報告した。しかしながら、ヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）の球状形態が、曲線状微生物の生存可能な休眠型であるのか、非生存可能な変性型であるのかについて、国際的に論議されている。従って、該球状の微生物と、ヒト消化管系にコロニーを形成するヘリコバクター（Helicobacter）種とを区別することが非常に重要である。以下に、新微生物の内視鏡的、顕微鏡的、組織学的、超微細構造的および分子生物学的な所見を述べる。
【００１５】
症例報告
20歳の男性が、消化不良、消化障害、胸焼けならびに時に胃食道逆流歴を示した。患者は、時に「げっぷ」によって緩解する食前食後の痛みを訴えた。患者は、鼓腸、悪心あるいは嘔吐を否定した。また、メレナ歴や腸習慣(bowel habit)の最近の変化を否定したが、十二指腸炎および多発性十二指腸びらんおよび表在性潰瘍と診断された頃に、3〜4回／日の下痢を罹患していた。患者はNSAIDの使用を否定し、喫煙習慣は3〜10本／日、飲酒習慣は発病まではビール375ml／日であった。家族に、消化性潰瘍および胃腸疾患に罹患した者はいなかった。H2拮抗薬を1ヶ月間毎日服用しても症状に変化が見られなかった上に、ヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）血清試験（HEL-pTEST（商標名）II、AMRAD）が陽性であったので、患者はビデオスコープ内視鏡検査（Olympus GIF XQ 230）と生検を受けた。ルーチンな手順として、組織学的および微生物学的検査のために少なくとも6〜10の生検標本を、胃および幽門洞から採取した。生検標本と胃吸引液を、微好気性および嫌気性条件下35℃で培養した。生検標本のウレアーゼ産生を、Christensenの尿素ブロス中で試験し、グラム染色し顕微鏡で調べた。組織学的および微生物学的検査により、ヘリコバクター様微生物の存在は明らかにならなかったが、患者には、テトラサイクリン1.5g、メトロニダゾール600mgおよびラニチジン300mgからなる3剤併用療法（ヘリコバクター・ピロリ菌を98％以上除去する）を毎日2週間にわたり投与した。更に、追跡調査として内視鏡検査を行った。全ての場合において、胃の内視鏡像は、多数の胃びらんと多発性表在性潰瘍を伴う一般的胃炎を示した。同時に、びらん性十二指腸炎および多発性表在性潰瘍も見られた。全ての場合において、胃および幽門洞から採取した標本は、組織学的検査に提出されたが、局所性表在性潰瘍と、粘膜固有層で局所性に増加した好中球と慢性炎症性細胞を伴うびらん性胃炎が見られた。組織学的検査では、胃十二指腸疾患の原因は同定されなかった。オメプラゾール20mgを1日2回1ヶ月間服用後に、3回目の内視鏡検査を行った際に採取した標本からだけ、上皮再生が見られた。従って、患者はオメプラゾール20mgを1日2回4ヶ月間服用し、4回目の内視鏡検査が行われた。内視鏡像は、胃十二指腸びらんと潰瘍を伴わない充血性紅斑性かつ鬱血性の胃・幽門洞および十二指腸が見られた。この組織学的検査から、びらん性胃十二指腸炎および多発性表在性潰瘍の完全な消散が明らかになった。走査型電子顕微鏡検査により、胃上皮表面の一部において、やや拡大し膨張した、散在する単一の球状微生物が同定された。胃や十二指腸において、電子顕微鏡的に同定される表面びらんや潰瘍は、観察されなかった。胃および十二指腸において、適切に再生した絨毛が見られた。グラム染色標本を検査し、本発明者らは、グラム陰性の球状細菌を発見し、該微生物の培養に成功した。微生物学的および電子顕微鏡検査によって、胃吸引液中に球状微生物の存在が確認された。走査型および透過型電子顕微鏡検査によって、胃粘膜層の下や胃上皮細胞上に豊富な球状細菌、ならびに胃粘膜のびらん病変部および表在性潰瘍部において球状細菌のクラスターが同定された。グラム(G)染色、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色、Warthin-Starry銀（WSS）染色の後で、全組織学標���の再検査の前に、培養微生物の特性を調べた。H&E染色した組織学的切片では、細菌は見にくかった。見えた場合、該微生物は好塩基性のクラスター塊と認識された。該微生物はWSS染色で多数の丸い「点」に見えた。該細菌は、胃粘膜の表層に多く、胃粘膜および胃小窩のびらん性病変部において同定し得た。この微生物は、ウレアーゼ陰性、カタラーゼ陰性およびオキシダーゼ陰性であった。これらは、アルギニン-β-ナフチルアミンをアルギニンに変換した。これは、該微生物がアルギニン・ジヒドロラーゼ／ヒドロラーゼをもつことを示唆する。この細菌に鞭毛は無いが、周囲に細かなマイクロフィラメント様構造の線毛があった。16S rRNA配列決定試験により、この球状細菌は球状のヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）と系統発生学的に関連しておらず、むしろHaemophilus haemolyticusに近いことが確かめられた。この球状細菌とH. haemolytcusのDNA比較研究により、両微生物が異なることが示された。Haemophilus属の決定に必要な、第X因子と第V因子に対する応答を調べたところ、結果は両因子に対し陰性であった。Haemophilusの生育条件および環境は、この球状微生物には不適当であった。増殖速度は、24時間のインキュベーション後に増殖が検出され得るHaemophilusとは、全く異なっていた。しかしながら、この球状微生物は、コロニー形成のきざしが見られるまでに少なくとも7日間を要した。コロニーの外観と形態も、異なっていた。生化学的試験の結果もHaemophilusとは、完全に異なっていた。また、市販されている同定キットであるNeisseria/Haemophilus同定カード（biomerieux、Vitek)では同定できなかったし、嫌気性生物を同定するRapid ANA IIシステム（Innovative Diagnostic Systems）でも同定できなかった。Haemophilusを培養するための標準としてチョコレート寒天培地を使用したが、これは新微生物には最適ではなかった。
【００１６】
ヘリコバクター・ピロリ（H. pyroli）コロニーの球状形態である可能性を排除するために、パラフィン・ブロック切片上で免疫ペルオキシダーゼ染色試験を行った。ヘリコバクター・ピロリ（H. pyroli）血清反応は認められなかった。
【００１７】
考察
これまで、ヒト胃粘膜でコロニーを形成する微好気性および嫌気性グラム陰性球状細菌は、培養されていなかった。そして、この細菌とびらん性胃十二指腸炎および多発性表在性潰瘍との関連も述べられていなかった。これまで新細菌が検出されなかった主な理由は、恐らく、この細菌の大きさと外観にある。その外観は、炎症性、びらん性、潰瘍化胃粘膜細胞上の細胞核から排出された染色質における、細胞質顆粒のような細胞破片に似ている。この微生物は、観察されたかもしれないが、口咽頭の夾雑物質と認識されるか、あるいはヘリコバクター・ピロリ（H. pyroli）の存在に取って代わられ共生体と認識されていたかもしれない。この細菌が誤って解釈され、ヘリコバクター・ピロリ（H. pyroli）の球状形態と考えられた可能性もある。第一には、グラム、H&E、WSSで染色された単離生物の大きさ、性質、特徴が明らかになるまでは、組織学標本で該生物の存在を検出するのは、非常に良く訓練され経験を積んだ生理学者でも非常に困難であった。第二は、約1週間のインキュベーション後でも直径が約0.5〜1mmという非常に小さい培養コロニーなので、それを捨てたり見逃すのは全く容易である。グラム染色した培養標本は、密に固まったクラスター状の細菌で「砂」のように見えるので、明確に区別される微生物ではなくグラム陰性のアーチファクト（人工産物）のように見える。その他の理由としては、胃微生物学の無視およびWarrenが胃炎患者でS字型細菌を同定した際に述べたように、胃は無菌臓器であるという考えのためでもあろう。
【００１８】
ヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）、H. helimannii、Okadaella感染（Okadaら、1998）または他の細菌感染のような細菌コロニー形成；カンジダ（Ralogeropoulosら、1988）、クリプトスポリジウム（Cersosimoら、1992）などを伴う場合には、胃十二指腸の病因を正確に診断することが重要である。なぜならば、治療法の選択が異なるからである。テトラサイクリンとメトロニダゾールを含む3剤併用療法を選ぶかもしれないが、この治療法は他の方法に比べ、ヘリコバクター・ピロリ菌（H. pylori）の除去率が顕著に高い（Chibaら、1992）。Okadaella gastrococciは、2週間にわたるラニチジン、テトラサイクリンおよびメトロニダゾールの併用療法に対して、耐性を示した。オメプラゾールによる4週間の治療後に組織学的にも微生物学的にも該微生物が除去されたと同時に、患者の組織学的および症状的改善が見られたことを考慮すると、プロトンポンプインヒビターは、他のクラスの制酸剤に比べ、ヘリコバクター（Helicobacter）およびOkadaella感染が原因の、びらん性胃十二指腸炎および消化性潰瘍の管理において、より有効であった。
【００１９】
本発明者により単離された前記微生物は、コロニー、細胞形態学、増殖特性、抗生物質感受性、生化学的検査およびDNA分析から判断すると、既知のHaemophilus属に当てはまらない。しかし、新微生物はH. haemolyticusと系統発生的に近い。Okadaella Gen. nov.(Oka.da-ella:Jap.n.Okada;N.L.masc.n.Okadaella,この細菌を同定したT.Okada博士にちなんで命名された), gastrococcus Sp.nov.(Gr.n.gastr:胃に属する;Gr.n.coccus:grain）と呼ばれる属が、本微生物に提供された。この微生物に対する抗体および免疫組織蛍光検査および間接免疫組織化学的検査の結果は、単離された本細菌が胃粘膜上皮表面の生物と同一であることを示すのに有用であろう。
【００２０】
Okadaella gastrococcusの生化学的特徴
増殖培地：ウマ血液寒天培地（例えばColombia寒天培地）
最適増殖温度：35〜37℃
増殖条件：微好気性および嫌気性（CO2:10%, O2:4.86%, N2:85.14%)
コロニーの大きさが0.5〜1.0mmに達する時間：7〜14日
コロニー形態：凸面、滑らか、半透明
細胞の直径：0.3〜0.5μｍ
細胞の長さ：0.2〜0.75μｍ
モル％G＋C：測定せず
X因子要求：無し
Y因子要求：無し
カタラーゼ：陰性
オキシダーゼ：陰性
ウレアーゼ：陰性
インドール：陰性
オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
溶血性：陰性
アルカリ-ホスファターゼ：測定せず
グルコース：陰性
酸産生：
L-アラビノース由来：陰性
D-ガラクトース由来：陰性
マルトース由来：陰性
スクロース由来：陰性
ガラクトシダーゼ（ONPG）：陰性
（ONPG：o-ニトロフェニル-D-ガラクトシダーゼ）
フルコシダーゼ：陰性
グルコシダーゼ：陰性
アルギニン・ジヒドロラーゼ／ヒドロラーゼ：陽性
硝酸還元：陰性
亜硝酸還元：陰性
H2S産生：測定せず
G-グルタミル・トランスペプチダーゼ：測定せず
−70℃にて、ウマ赤血球またはウマ血清と共に保存
（陽性：90％以上の菌株が陽性）
（陰性：10％以下の菌株が陽性）
【００２１】
参考文献
Noach L. A.、Rolf T. M.、Mytgat G. N.、ヘリコバクター・ピロリ（Helcobacter pylori）と胃および十二指腸粘膜との関連に関する電子顕微鏡研究、J Clin Pathol 1994;47:699-704
Ogata T.およびAraki K.、ヒト胃潰瘍におけるヘリコバクター・ピロリ（Helcobacter pylori）に誘導される胃粘膜細胞の形態的変化に関する電子顕微鏡研究、J. Submicrosc. Pathol.T, 28(2)255-264,1996
Bode G.、Malfertheiner P.およびDitschuneit H.、カンピロバクター・ピロリ（Campylobacter pylori）が関与する胃十二指腸疾患における超微細構造知見の病因的関与、Scand. J. Gastroenterol. 1998, 23(suppl 142),25-39
【００２２】
特定の実施形態に示されたように、広汎に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対する多数の変更および／または修正がなされる可能性があると、当業者には理解されよう。従って、本実施形態は、全ての点で、限定的ではなく例証的と考えるべきである。
【００２３】
Okadaella(O)およびHaemophilus(H)微生物の生化学的特徴
Gc, gastrococcus; Gf, gastrofilamenti; inf, influenzae;
par, parainfluenzae; haem, haemolyticus
0004278860.tif 000002
【００２４】
Okadaella(O)およびHaemophilus(H)微生物の生化学的特徴（続き）
Gc, gastrococcus; Gf, gastrofilamenti; inf, influenzae;
par, parainfluenzae; haem, haemolyticus
0004278860.tif 000003
＋、菌株の90％以上が陽性；
ｄ、菌株の11-89％が陽性；
ONPG、o-ニトロフェニル-d-ガラクトシダーゼ；
H.B.A.、ウマ血液寒天培地；CA、チョコレート寒天培地；
MA&A、微好気性および嫌気性；A/FAn、好気性／任意嫌気性
【図面の簡単な説明】
【図１】  胃生検標本の走査型電子顕微鏡写真で、損傷を受けた粘膜層上の球状細菌、ならびに大きさの比較のために赤血球と白血球を示した。2640倍。Bar=10μm。
【図２】  図１に示した走査型電子顕微鏡写真の拡大図である。
【図３】  球状細菌の陰性染色電子顕微鏡写真である。37,500倍。Bar=1μm。
【図４】  本発明に従う細菌の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１】
0004278860.tif 000004
【図２】
0004278860.tif 000005
【図３】
0004278860.tif 000006
【図４】
0004278860.tif 000007
0004278860.tif 000008
0004278860.tif 000009
0004278860.tif 000010