(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCMV pp67配列内に位置する標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドのペアであって、
ヒトサイトメガロウィルスpp67をコードする核酸配列の一部に対応する第１のオリゴヌクレオチドであって、該第１のオリゴヌクレオチドが、15〜35ヌクレオチド長であり、5’-GGGTCGATTCAGACTGA-3’（配列番号1）という核酸配列またはその相補的配列の少なくとも15ヌクレオチド断片を含む第１のオリゴヌクレオチド；および
ヒトサイトメガロウィルスpp67をコードする核酸配列の一部に対応する第２のオリゴヌクレオチドであって、該第２のオリゴヌクレオチドが、15〜35ヌクレオチド長であり、かつ、5’-CTGGAGATATATGTTGACCA-3’（配列番号2）という核酸配列またはその相補的配列の少なくとも15ヌクレオチド断片を含む第２のオリゴヌクレオチド
を含んでなるオリゴヌクレオチドのペア。
【請求項２】
１または両方のオリゴヌクレオチドがプロモーター配列に連結している、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのペア。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの１つが5’-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3’という配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドのペア。
【請求項４】
サンプル中におけるヒトサイトメガロウイルスの後期構造タンパク質をコードするpp67 mRNAの存在を検出するための方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのペア、ならびにDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたはその両方、RNアーゼHおよびAMV逆転写酵素、モノヌクレオチド、緩衝液および塩からなる増幅試薬を使用して前記mRNA内の標的配列を増幅する；
増幅された核酸を含有する該サンプルを、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドプローブと反応させる；および
増幅配列とプローブとの間で形成されたハイブリッドを検出する
という工程を含む前記方法。
【請求項５】
転写に基づく増幅技術を用いてmRNAを増幅する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅技術がNASBAである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドのペアのオリゴヌクレオチドの１つが5’-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3’である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅反応に使用するオリゴヌクレオチドのペアにおける、
ヒトサイトメガロウィルスpp67をコードする核酸配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、15〜35ヌクレオチド長であり、5’-CTGGAGATATATGTTGACCA-3’（配列番号2）という核酸配列またはその相補的配列の少なくとも15ヌクレオチド断片を含むオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項９】
HCMV症の診断のための試験キットであって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのペア；ならびに
DNAポリメラーゼおよび／またはRNAポリメラーゼ、モノヌクレオチド、RNアーゼHおよびAMV逆転写酵素、緩衝液および塩からなる増幅試薬
を含む試験キット。
【請求項１０】
検出可能な標識を有する、増幅された核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む請求項９に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）mRNAの増幅検出に使用可能なオリゴヌクレオチドに関する。さらに、HCMV症の診断方法を提供する。
ヒトサイトメガロウイルスは、思春期前のヒトの40〜80％に感染する約240,000ヌクレオチド長の二本鎖DNAゲノムを有する遍在性のヘルペス型ウイルスである。すべてのヘルペスウイルスに共通の顕著な特徴は、感染後にそれらが生涯にわたり持続的に定着すること、およびそれらが再活性化後に反復感染を引き起こしうることである（Stevens,J.G.,Microbiol.Rev.53,318-332.,1989）。また、HCMVは、臨床的症状を伴わずに生じることが多い初感染の後に潜伏性となる。ほとんどの場合、反復感染でさえ無症候性となるか、あるいは免疫適格宿主において軽症を引き起こすにすぎない。しかしながら、先天的に感染している乳児および免疫低下している患者、例えば同種移植レシピエント（Meyers,J.D.ら,J.Infect.Dis.153,478-488.,1986）またはエイズ患者（Drew,W.L.J Infect.Dis 158,449-456.,1988；Drew,W.L.Clin.Infect.Dis 14,608-615.,1992）では、免疫系と潜伏的に存在するウイルスとの間の微妙なバランスが崩れ、HCMVが、網膜炎、胃腸障害、脳炎などの重篤かつ時には生命を脅かす疾患を引き起こす可能性がある（Drew,1992）。ガンシクロビル、フォスカルネットなどの抗ウイルス薬の早期投与は、患者の予後に有意な有益な効果を与えうる（Jahn,G.ら,Intervirology 35,60-72.,1993；Schmidt,G.M.ら,N.Engl.J Med.324,1005-1011.,1991）。したがって、臨床的に有効な抗ウイルス療法が利用可能になるにつれて、早期かつ高感度の診断が非常に重要となる。
CMV特異的抗体、特にIgM抗体は、CMV感染のマーカーとして使用することができるが、潜伏感染と活動性感染との識別となると、限られた価値しか有さない。現在用いられているほとんどのウイルス検出方法では、ある感染が症候性となるか否かを予想できないことは明らかである。さらに、血清学的方法は間接的であり、しばしば感度が不十分である。ウイルス培養は、CMVウイルス血症に関する、より直接的な診断指標である。血液細胞からのCMV培養は、活動性CMV感染を示すようであるが、この方法は、迅速な診断を可能にせず、技術的に困難である。さらに、ウイルス培養は、HCMV症に必ずしも対応するわけではない。免疫抑制された幾人かの患者においては、末梢白血球からのウイルス分離と臨床的症状の出現との間に信頼しうる関連性が存在しない可能性がある（Delgado,R.ら,J Clin.Microbiol.30,1876-1878.,1992）。また、尿または咽頭からのウイルスの放出が、臨床的症状および器官関与を伴わずに頻繁に生じる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による末梢白血球中のHCMV DNAの増幅は、CMVウイルス血症に関する非常に高感度な技術であるが、臨床的に症候性のいずれのHCMV感染のマーカーとしても用いることはできない。酵素的増幅は高感度であるため、時には、HCMV関連疾患の不存在下で末梢白血球においてHCMV DNAの検出が可能であった。この技術により潜伏性ウイルスゲノムを検出することが可能であり、あるいは該疾患から回復した後、患者は長期間にわたりHCMV-DNA陽性のままとなる可能性がある（Jahn,Gら,1993；Zipeto,D.ら,J Clin.Microbiol.30,527-530.,1992；Delgadoら,1992）。
現在のところ、急性症候性HCMV感染の早期診断のための選り抜きの方法は、特異的抗体を使用する構造タンパク質pp65の免疫学的検出に基づく抗原血症アッセイである（Storch,G.A.ら,J.Clin.Microbiol.32,997-1003.,1994；Gerna,G.ら,J.Infect.Dis.164,488-498.,1991；Gerna,G.ら,J Clin.Microbiol.30,1232-1237.98.,1992）。しかしながら、この方法の使用において懸念されることは、その感度である。感染の初期経過におけるpp65陽性細胞の数は非常に少ないことがある。さらに、発現細胞においては、pp65抗原の安定性が限られたものとなるらしく（Chou,S.,Curr.Opin.Infect.Dis.5,427-432.,1991）、また、該タンパク質の種々のエピトープを認識する抗pp65抗体のプールではなくモノクローナル抗体を適用しているために感度が減少する可能性がある。
ウイルスの複製にはmRNA種の転写が要求されるため、活動性CMV感染のマーカーとしてHCMV mRNA検出を用いることが検討された（Bitsch,A.ら,J Infect.Dis 167,740-743,1993）。
最近、HCMV感染が、RNA増幅を用いて転写産物レベルで検討された（Bitsch,A.ら,1993；Meyer,T.ら,Mol.Cell Probes.8,261-271.,1994；Gerna,G.ら,J Clin.Microbiol,30,1232-1237.98,1993；Gerna,G.ら,J Clin.Microbiol.30,1232-1237.98,1992）。原則として、ウイルス抗原の検出と同様に、ウイルスの複製に関連して発現されたウイルス転写産物の分析は、症候性感染の信頼しうる診断を可能にするはずである。
その後、HCMVの或るmRNAの検出（すなわち、IEA（前初期抗原）およびマトリックステグメントタンパク質pp67 mRNAに基づくもの）が、WO 96/06191に記載された。しかしながら、前記特許出願に開示されているHCMV pp67 mRNAの検出においてプローブとして及び増幅において使用するオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドと比べていくつかの欠点を有する。比較研究では、本発明の新規オリゴヌクレオチドが、WO 96/06191に開示のオリゴヌクレオチドより優れたいくつかの利点を有することが明らかとなった。これらの研究については、本明細書の実験の部に記載する。
CMV mRNA検出の感度および信頼性（確かさ（robustness））は、増幅で使用するオリゴヌクレオチドの選択に大きく左右される。なぜなら、潜在的にはゲノムの各領域においてCMV株間の配列変異が存在するからである。理想的には、プライマーの選択は、候補プライマー配列中の株間変異およびプライマー部位におけるミスマッチの結果の知見に基づくべきである（Chou S.,J.of Clin.Microbiol.,2307-2310,1992）。
したがって、CMVの全株変異体の増幅およびそれに続く検出において使用しうる核酸配列を含む適当なオリゴヌクレオチドが必要とされている。
本発明は、ある後期HCMV mRNAの検出に関するものであり、このmRNAの増幅およびそれに続く検出における使用に適したオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドの結合部位は、CMV感染の後期に発現されるマトリックステグメントタンパク質pp67をコードする遺伝子配列（UL65）内に位置する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、10〜35ヌクレオチド長であり、
0004256477.tif 000002
またはその相補的配列よりなる群から選ばれる配列の少なくとも10ヌクレオチド断片を含む。
本発明の好ましい実施形態は、プロモーター配列に連結したオリゴヌクレオチドに関する。
本発明の好ましい実施形態は、以下のオリゴヌクレオチド配列に関する：
5′-CTGGAGATATATGTTGACCA-3′と組合された5′-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3′。
T7プロモーター配列が示されているが、それは適当な他の任意のプロモーター配列で置換することができる。
前記で既に示し、また、本明細書の実験の部に記載するとおり、この技術分野で使用されている公知オリゴヌクレオチドと比較して、本発明のオリゴヌクレオチドを使用することによりCMV mRNA検出の感度および信頼性の両方が著しく改善される。
本発明で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、2以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子、例えばプライマーおよびプローブを意味する。
本発明で用いる「プライマー」なる語は、ヌクレオチドおよび核酸重合剤（例えば、DNA依存性またはRNA依存性ポリメラーゼ）の存在下で適当な条件下（例えば、バッファー、塩、温度およびpH）に配置した場合に核酸鎖（鋳型または標的配列）に相補的なプライマー伸長産物の合成の開始点として作用しうる、天然に存在する（例えば、制限断片として）または合成的に製造されるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な程度に長くなくてはならない。典型的なプライマーは、標的配列に実質的に相補的（P1）または相同（P2）な少なくとも約10ヌクレオチド長の配列を含有するが、それよりいくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約15〜26ヌクレオチドを含有するが、より長いプライマーも使用することが可能である。
通常、プライマーのセットは、少なくとも2つのプライマー、すなわち、一緒になって増幅体（amplificate）（前記プライマーを使用して増幅される配列）の境界を定める1つの「上流」および1つの「下流」プライマーよりなる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、プロモーター配列に連結していることが可能である。「プロモーター配列」なる語は、認識配列に結合し転写過程（これにより、RNA転写産物が生成する）を開始するRNAポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列の領域を意味する。原則として、該開始配列を認識しうる公知で入手可能なポリメラーゼが存在する任意のプロモーター配列を使用することができる。公知で有用なプロモーターとしては、あるバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージT3、T7またはSP6）により認識されるプロモーターが挙げられる。
本発明の配列よりなるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の僅かな欠失、付加および／または置換を含有することが可能である（ただし、そのような改変が、得られる収率または産物に負の影響を有意に及ぼさない程度である場合に限られる）と理解される。
本発明の好ましい実施形態は、検出可能な標識を有する配列5′-GGATTCGGACTTTCCGTTCGA-3′または5′-CCAAAAAGCTAGCCGTCACG-3′より実質的になるオリゴヌクレオチドに関する。前記オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して生成した増幅体の検出に使用することができる。
前記配列を含むプローブも、本発明の一部である。
検出プローブとして使用するオリゴヌクレオチド配列は、検出可能な部分で標識することができる。種々の標識部分が当技術分野で公知である。前記部分は、例えば、放射性化合物、検出可能な酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP））、または比色、蛍光、化学発光または電気化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを生成しうる他の任意の部分であることが可能である。前記標識が使用される好ましい分析系は、電気化学発光（ECL）に基づく分析または酵素結合ゲルアッセイ（ELGA）に基づく分析である。
本発明のもう1つの好ましい実施形態は、症候性CMV症を保持すると疑われる個体の血液サンプル中のヒトサイトメガロウイルスの後期構造タンパク質をコードするpp67 mRNAの存在を検出する、症候性CMV症の診断方法であって、
・本発明のオリゴヌクレオチドおよび適当な増幅試薬を使用して前記mRNA内の標的配列を増幅し、
・増幅された核酸を所望により含有する該サンプルを、検出プローブとしての本発明のオリゴヌクレオチドと反応させ、
・該増幅配列と該プローブとの間で形成されたハイブリッドを検出する工程を含んでなる方法に関する。
核酸を増幅するための種々の技術が当技術分野で公知である。DNA標的セグメントの増幅のための技術の一例として、いわゆる「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）が挙げられる。PCR技術を用いて、ある特定の標的セグメントのコピー数を多数のサイクルで指数関数的に増加させる。プライマーのペアを使用し、各サイクルにおいて、DNAプライマーを、二本鎖DNA標的配列の2本の各鎖の3′側にアニーリングさせる。種々のモノヌクレオチドの存在下、該プライマーをDNAポリメラーゼで伸長させて、再び二本鎖DNAを得る。該二本鎖DNAの鎖を熱変性によりお互いから分離し、各鎖を、次のサイクルにおけるプライマーアニーリングおよびそれに続く伸長のための鋳型として使用する。PCR法は、Saikiら,Science 230,135,1985ならびに欧州特許EP 200362およびEP 201184に記載されている。
核酸の増幅のためのもう1つの技術は、いわゆる、転写に基づく増幅系（TAS）である。TAS法は、国際特許出願WO 88/10315に記載されている。転写に基づく増幅技術は、通常、2つのオリゴヌクレオチド（その1つはプロモーター配列を含む）で標的核酸を処理して、機能的プロモーターを含む鋳型を得ることを含む。複数のRNAコピーが、前記鋳型から転写され、さらなる増幅の基礎として使用することができる。
等温連続転写に基づく増幅方法は、欧州特許EP 329822に記載のいわゆるNASBA法（「NASBA」）である。NASBAは、T7プロモーターを含む鋳型から複数のRNAコピーを転写するためのT7RNAポリメラーゼの使用を含む。
RNA増幅のためには（本発明の方法の場合）、NASBA技術、または別の転写に基づく増幅技術が、好ましい技術である。
ウイルス転写産物の検出のためにRT-PCRを用いる場合には、mRNAに由来するPCR産物とDNAに由来するPCR産物との識別が必要である。IEA mRNAなどのスプライシングされた転写産物には、エキソン−イントロン構造を用いることができる。しかしながら、後期構造タンパク質をコードするmRNA種は、スプライシングされていない転写産物にほとんど独占的にコードされている。RT-PCRの前にデオキシリボヌクレアーゼ処理を行なうことが可能であるが（Bitsch,A.ら,J Infect.Dis 167,740-743.,1993；Meyer,T.ら,Mol.Cell Probes.8,261-271.,1994）、混入DNAを十分に除去できない場合がある（Bitschら,1993）。
RT-PCRとは対照的に、T7 RNAポリメラーゼのRNA転写に基づくNASBA（Kievitsら,1991；Compton,1991）は、その主要標的としてRNAだけを使用するため、RNAに由来する増幅産物とDNAに基づく増幅産物との識別を必要としない。NASBAは、DNAのバックグラウンド中であってもRNA標的の特異的増幅を可能にする。ほとんどのすべての後期HCMV遺伝子転写産物などのスプライシングされていない標的では特に、この方法は、時々非効率的になりうるデオキシリボヌクレアーゼ処理を回避するため（Bitsch,A.ら,1993）、有益である。
HIV感染個体からの全血サンプル中のCMV転写産物の分析には、この方法を用いた。
臨床サンプル中のCMVの検出のための試験キットも、本発明の一部である。本発明の試験キットは、本発明のオリゴヌクレオチドのペアと、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプローブとを含むことが可能である。そのような試験キットは、さらに、DNAおよび／またはRNAポリメラーゼなどの適当な増幅試薬とモノヌクレオチドとを含むことが可能である。本発明の方法と共に用いることができる試験キットは、pp67 mRNAの増幅およびそれに続く検出のための本発明のオリゴヌクレオチドを含むことが可能である。
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例：
実施例1：増幅および検出におけるCMVpp67オリゴヌクレオチドの分析感度
1.1．材料および方法
1.1.1．インビトロRNA
pp67マトリックステグメントタンパク質をコードするCMVmRNAの338ヌクレオチドを含む1125ヌクレオチドの長さを有するRNAを、対応する遺伝子のクローン化断片から、T7 RNAポリメラーゼに基づく転写によりインビトロで合成した。転写の前に、プラスミドDNAをBamHI消化［そのユニーク制限部位は、該CMVインサートの約800塩基対（bp）下流に位置する］により線状化した。その消化したDNAをフェノール抽出により精製し、エタノール沈殿により濃縮した。0.5mMの各rNTP、10mMジチオトレイトール（DTT）、1単位/μlのRNA Guard（Pharmacia）および約500単位のT7 RNAポリメラーゼ（Pharmacia）で補足された転写バッファー［40mM Tris-塩酸（pH7.5）；6mM塩化マグネシウム；2mMスペルミジン；10mM塩化ナトリウム］中、該線状化プラスミドDNAからの転写を行なった。37℃で4時間のインキュベーションの後、デオキシリボヌクレアーゼI（Boehringer）を、0.1単位/μlの最終濃度になるまで加え、該反応混合物を37℃で更に30分間インキュベートした。ついでインビトロで生成したRNAを、RNeasy RNA Purificationキット（Qiagen）を使用して該反応混合物から精製した。最後に、該インビトロRNAの濃度をOD（260nm）測定により決定し、水中の適当な系列希釈物を−70℃で保存した。
1.1.2．増幅において及びプローブとして使用するオリゴヌクレオチド
増幅において使用するオリゴヌクレオチドの及び特異的検出に使用するプローブの配列および極性を、表1に示す。
すべてのオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミジット生化学法を用いてPCR-MATE391 DNA合成機（Applied Biosystems）上で合成した。後続のホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）のカップリングのための5′アミノ連結（Aminolink 2；Applied Biosystems）を有するELGA検出（後記を参照されたい）用のオリゴヌクレオチドを合成した。
増幅において使用するオリゴヌクレオチドは、該粗製オリゴヌクレオチド溶液を20％ポリアクリルアミド/7M尿素スラブゲル上で電気泳動的に分離し、ついで対応するゲルバンドから完全長オリゴヌクレオチドを溶出することにより精製した。該ゲル切片からの溶出およびエタノール沈殿による濃縮の後、オリゴヌクレオチドをMilli-Q水に溶解し、OD（260nm）測定により濃度を決定した。
ELGA検出のために、オリゴヌクレオチドプローブCMV-pp67HRP1をHRP（Boehringer）とコンジュゲートさせた。これは、架橋試薬SDPD（Pharmacia）およびEMCS（Fluka）を使用して該オリゴヌクレオチドのアミノ連結に該酵素をカップリングさせることにより行なった。未結合HRPをQiagen Tip-100カラム（Qiagen）上で除去した。該HRP標識オリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれに続く水中での一晩のインキュベーションによる該ゲル切片からのHRP-オリゴヌクレオチドの溶出により精製した。HRP-コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの量を、OD（260nm）およびOD（400nm）測定から計算した。該溶液は、−70℃で保存した。
ECL検出のために、オリゴヌクレオチドプローブCMV-pp67-ECL（表1）をECL標識とコンジュゲートさせた。これは、該アミノ連結オリゴヌクレオチドをTAG NHS-Ester（Igen）と共にインキュベートすることにより行なった。該反応混合物をQiagen Tip-100カラム（Qiagen）に通過させることにより、未結合標識を除去した。ECL標識オリゴヌクレオチドの量を、OD（260nm）およびOD（460nm）測定から計算した。該溶液は、さらに精製することなく−70℃で保存した。
1.1.3．NASBA増幅
NASBA増幅技術を用いてRNA増幅を行なった。NASBA増幅反応を調製するために、4μlの5×反応バッファー［200mM Tris-塩酸（pH8.5）,350mM塩化カリウム,60mM塩化マグネシウム,25mMDTT,5mMの各dNTP,10mMのATP,CTPおよびUTP,7.5mMのGTPおよび2.5mMのITP］と、2μlの糖溶液［15%（w/v）ショ糖,5%（w/v）マンニトール,5%（w/v）デキストランT40］および75％DMSO中の該増幅に使用する1μMの各オリゴヌクレオチドを含有する4μlの混合物とを混合することにより予混物（premix）を得た。この予混物のうちの10μlを、5μlの核酸溶液に加え、65℃で5分間インキュベートした。ついで該反応チューブを41℃で5分間インキュベートした後、5μlの酵素混合物［32単位のT7 RNAポリメラーゼ；6.4単位のAMV逆転写酵素；0.08単位のRNアーゼH；2.1μgのBSA；20mM DTT；1.5Mソルビトール］を加えた。該最終添加の後、チューブを、穏やかに叩きながら混合し、遠心し、41℃で90分間インキュベートした。反応を−20℃に配置することにより、反応を停止した。
1.1.4．NASBA増幅反応産物のELGAによる分析
NASBA反応産物の分析のために、液体ハイブリダイゼーションに基づく非放射性酵素結合ゲルアッセイ（ELGA）を用いた。特異的HRP標識オリゴヌクレオチドプローブに対する増幅産物のハイブリダイゼーションは、3μlのNASBA増幅反応物を1μlの6×SSC、1μlの濃縮ローディングバッファー［25%（v/v）グリセロール；10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）；0.05%ブロモフェノールブルー；0.01%キシレンシアノール］および1μlのHRP標識オリゴヌクレオチドCMV-pp67 HRP1（表1）ストック溶液と混合し、ついで45℃で15分間インキュベートすることにより行なった。ハイブリダイゼーション後、該反応混合物の半分を、0.04％（w/v）の硫酸デキストランで補足された7％ポリアクリルアミドゲル上に直接適用した。結合および未結合HRP標識オリゴヌクレオチドを電気泳動により分離した後、該プローブを50mlの基質溶液［1ml当たり125μgの3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン；0.003%過酸化水素；100mMクエン酸ナトリウムバッファー（pH5.2）］による室温で約10分間の直接染色により可視化した。最後に、該ゲルを、50％（v/v）メタノール溶液中での一晩のインキュベーションにより固定し、風乾した。
1.2．結果
1.2.1．NASBAにおいて使用した場合のCMV-pp67オリゴヌクレオチドの分析感度
本発明のオリゴヌクレオチドの改良型CMV-pp67 NASBAペア（CMV-pp67-5）の分析感度を測定し、この感度を公知（WO96/06191）CMV-pp67ペア（CMV-pp67-4）の分析感度と比較するために（表1）、両方のペアの標的配列を含むインビトロ生成RNAの希釈系列を調製した。この希釈系列の個々のサンプルは、インビトロ生成RNAのそれぞれ10.000、1.000、100および10分子を含有していた。いくつかの独立した実験において、この希釈系列のNASBA増幅を、これらの2つのCMV-pp67 NASBAペアのオリゴヌクレオチド（表1）で行なった。典型例を表2に示す。
該ペアの直接比較は、この実施例においては、CMV-pp67-4で検出されうるインビトロRNA分子の最低量が1.000分子であり、一方、改良された組合せCMV-pp67-5を用いると、100分子の投入RNAも陽性NASBA結果を表すことを示した。
表3は、5つの独立した実験の結果を要約している。各ペアに関して、ある特定の実験において依然として陽性NASBA結果を与える最低インビトロRNA量が示されている。
分析したペアは、NASBAにおいて、比較しうる分析感度を有する。なぜなら、どちらの組合せの場合にも、サンプル中の100分子のインビトロ生成RNAの存在を、NASBA増幅に際して示すことができるからである。しかしながら、5つの分析のうちの3つにおいては、CMV-pp67-4の組合せは、より低い検出限界（1.000分子のインビトロ生成RNA）を有するらしく、一方、CMV-pp67-5は、行なったすべての分析において100分子の投入RNAに関して一貫して陽性NASBA結果を示した（表3）。
したがって、CMV-pp67-5の組合せは、NASBA増幅に関して、より確かであると考えられた。この新規ペアのオリゴヌクレオチドのこの有利な態様は、インビトロ生成RNAの検出に当てはまるばかりでなくCMV感染個体の臨床試料中に見出される真のCMV-pp67タンパク質コード化mRNAの検出にも当てはまると考えられた。
実施例2：臨床サンプル中のCMV-pp67タンパク質コード化mRNAの検出
2.1．材料および方法
2.1.1．臨床試料
134人のエイズ患者のコホートから495個のサンプルを得た。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で抗凝固処理されたこれらの全血サンプル（これらは、該実験室が受領し次第順次提出された）を、9容量の溶解バッファー［50mM Tris-塩酸（pH6.4）；20mMEDTA；1.3%（w/v）Triton X-100；5.25Mグアニジニウムチオシアナート］と混合し、使用するまで−70℃で保存した。
2.1.2．オリゴヌクレオチド
増幅および検出において使用するオリゴヌクレオチドの配列および極性を、表1に示す。さらに詳しくは、実施例1の「材料および方法」の節の段落1.1.2.に記載されている。
2.1.3．核酸の単離
グアニジニウムチオシアナートにより媒介される細胞溶解およびシリカ粒子に対する核酸の吸着により、抗凝固処理された血液試料から全核酸を単離した（Boomら,J.of Clin.Microbiol.28,495-503,1990）。
溶解バッファー中の全血サンプルを融解し、各サンプルから1ml（100μlの全血と等価である）をエッペンドルフチューブ内に移した。ついで50μlの塩酸活性化二酸化シリカム（silicum dioxide）粒子［0.1M塩酸（Sigma）中の1mg/mlのサイズ選択された懸濁液；Boomら,1990を参照されたい］を加え、一定のボルテックスを行ないながら該懸濁液を室温で10分間インキュベートした。該シリカに結合した核酸を遠心分離により遠心沈殿させた。ペレット化したシリカ粒子を、1mlのGuSCN洗浄バッファー［50mM Tris-塩酸（pH6.4）；5.25Mグアニジニウムチオシアナート］で2回洗浄し、ついで1mlの70％エタノールでの2回の洗浄工程および1mlのアセトンでの1回の洗浄工程を行なった。各洗浄工程後、該懸濁液を短時間遠心し、該シリカペレットを混合により次の洗浄溶液に再懸濁した。該アセトンを除去した後、加熱ブロック中56℃で10分間のインキュベーションにより該シリカ粒子を乾燥した。50μlのTris緩衝溶出媒体（pH7.5）中56℃で10分間のインキュベーションにより、該シリカ粒子から核酸を溶出した。最後に、該シリカ粒子を再び遠心沈殿させ、シリカのいかなるキャリーオーバーも回避されるよう注意深く該上清を新鮮な反応チューブ内にピペッティングした。抽出された核酸サンプルを、使用するまで−70℃で保存した。
2.1.4．NASBA増幅
増幅のために、NASBA反応に必要なすべての成分を凍結乾燥形態で含有するいわゆるアキュスフェア（accusphere）（実施例1の「材料および方法」の節の「NASBA増幅」の段落を参照されたい）を、30%（v/v）DMSOのTris-HCl（pH8.5）緩衝溶液中で再構成した。ついで、分析する各サンプルについて、5μlの核酸溶液および10μlの該オリゴヌクレオチド溶液を試験チューブに加えた。得られた混合物を65℃で5分間加熱し、ついで該チューブを41℃で放置した。41℃で5分間のインキュベーションの後、32単位のT7 RNAポリメラーゼ、6.4単位のAMV逆転写酵素および0.08単位のRNアーゼHを含有する5μlの酵素溶液を加え、穏やかに叩くことにより該チューブの内容物を混合した。該反応を水浴中41℃で90分間インキュベートした。反応を−20℃に配置することにより、反応を停止した。
2.1.5．NASBA増幅反応産物のECL検出による分析
電気化学発光（ECL）に基づく分析のために、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（Dynal）上に固定化されたビオチン化捕捉プローブCMV-pp67 CAP（表1）を含有する捕捉プローブ溶液を、不透明な溶液が形成されるまでボルテックスし、ついで10μlのこの懸濁液（捕捉プローブと共にローディングされた3.4×105個のビーズを含有）および10μlのCMV-pp67-ECL（表1）プローブ溶液（ECL標識プローブの3.4×1011個の分子を含有）を新鮮な反応チューブ内に混合することにより、検出試薬を調製した。これらの混合物に、5μlの2倍希釈されたNASBA反応液を加え、41℃で30分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション中に、該チューブを10分毎に混合した。ついで300μlのNASBA QR System Assayバッファー（Organon Teknika）を各ハイブリダイゼーションチューブに加え、ECLシグナルの自動読取りのためにNASBA QR System内に該チューブを配置した。
2.2．結果
2.2.1．異なる2つのオリゴヌクレオチドペアによる臨床サンプル中のCMV-pp67 mRNAの検出
臨床的にCMV感染の危険にさらされている患者からの全血サンプルを、マトリックステグメントタンパク質pp67（CMV-pp67mRNA）をコードするCMV mRNAの存在に関して、NASBA増幅に適した2つの異なるオリゴヌクレオチドペア（表1）で分析した。
組合せCMV-pp67-4（表1）を用いるNASBA増幅により予め分析したエイズ患者からの合計495個のサンプルを今度は、本発明の対象である改良されたペアCMV-pp67-5を用いて同様のNASBA条件下で再分析した。表4に、該ペアのいずれかで得られた結果が示され、互いに比較されている。
先の実験からは、これらのセットのオリゴヌクレオチドの分析感度における（統計的に）有意な相違を確認することができなかったが（少数のサンプルしか試験しなかったため；実施例1を参照されたい）、改良されたCMV-pp67セットは、全血サンプルから抽出した核酸溶液中でのNASBAによるCMV-pp67 mRNAの検出に関してはるかに優れているようであった。サンプルの量（n=495）を考慮すると、この相違は統計的にも有意である。
65個のサンプルにおいて、改良されたペアのCMV-pp67-5は、陽性NASBA結果を示し、一方、CMV-pp67-4ペアで行なったNASBA反応は陰性であった。わずか9例（そのうち5個のサンプルは、解釈が困難であった）においては、その逆であった。
結論としては、本発明の新規の改良されたオリゴヌクレオチドペア（CMV-pp67-5）は、CMV-pp67-4セットより確かであることに加えて（実施例1を参照されたい）、臨床サンプル中のCMV-pp67 mRNAの検出においても優れているらしい。
実施例3：臨床サンプル中のCMV-pp67タンパク質コード化mRNAの検出
3.1．材料および方法
3.1.1．臨床試料
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で抗凝固処理された18個の全血試料を、エイズ患者のコホートから得た。採血後数時間以内に、該サンプルを9容量の溶解バッファー（段落2.1.1を参照されたい）と混合し、使用するまで−70℃で保存した。
ヘパリンで抗凝固処理された10個の全血試料を、腎臓移植レシピエントから得た（これは、該患者がCMV感染に罹患したと疑われた時点で採取した）。また、エイズ患者の試料については、これらのサンプルを採血の当日に溶解バッファーに加えた。
3.1.2．プライマーおよびプローブ
特異的検出に使用するプライマーおよびプローブの配列および極性を、表1に示す。さらに詳しくは、実施例1の「材料および方法」の節の段落1.1.2.に記載されている。
3.1.3．核酸の単離
溶解バッファー中の、抗凝固剤で処理された血液試料から、実施例2の「材料および方法」の節の「核酸の単離」の段落に記載されているのと実質的に同じ方法で、全核酸を単離した。抽出された核酸サンプルを、−70℃で予め保存することなく、NASBA増幅により分析した。
3.1.4．NASBA増幅
実施例1の「材料および方法」の節の「NASBA増幅」の段落に記載されているのと実質的に同じ方法で、RNA増幅を行なった。各核酸抽出物を、プライマーペアCMV-pp67-4およびCMV-pp67-5（表1を参照されたい）で二重に分析した。
3.1.5．NASBA増幅した反応産物のELGAによる分析
NASBA反応産物の酵素結合ゲルアッセイ（ELGA）による分析に関しては、実施例1の「材料および方法」の節の段落1.1.4に記載されている。しかしながら、ここで用いるハイブリダイゼーション温度は、実施例1と同じ45℃ではなく、41℃であった。
3.1.6．NASBA増幅反応産物のECL検出による分析
電気化学発光（ECL）に基づく分析は、実施例2の「材料および方法」の節の段落2.1.5に記載されているのと実質的に同じ方法で行なった。ELGA検出（段落3.1.5）の場合と同様に、41℃のハイブリダイゼーション温度を用いた。
3.2．結果
3.2.1異なる2つのプライマーペアで生成させたCMV-pp67 mRNAアンプリコンの検出
前記実施例（実施例2）においては、プライマーペアCMV-pp67-4（表1）を使用するNASBA増幅により生成させたRNAアンプリコンを、ELGA検出により分析し、一方、プライマーペアCMV-pp67-5を使用して同じ臨床試料から増幅したCMV-pp67 RNAを、ECLに基づく分析により検出した。本実施例では、CMV-pp67mRNAのためのこれらのNASBAプライマーペアの、より直接的な比較のために、核酸抽出物を、いずれかのプライマーペアで増幅し、ついで同じ検出方法により分析した。各増幅反応に関して、ELGAの結果およびECLの結果を得た。
臨床的にCMV感染の危険にさらされているエイズ患者の18個の全血試料から、全核酸を抽出した。ついで、CMV-pp67-4またはCMV-pp67-5のいずれかのプライマーペアを使用するNASBA増幅により、これらの抽出物からCMV-pp67 mRNAを二重に増幅した。最後に、個々の増幅反応のそれぞれにおいて得たアンプリコンを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識プローブCMV-pp67 HRP-1（表1）を使用するELGAにより、また、プローブCMV-pp67 ECL（表1）と該ELGAプローブオリゴヌクレオチドのビオチン化体であるCMV-pp67 CAPとを組合せて使用するECLに基づく検出により分析した。同様にして、腎臓移植患者の10個の臨床試料を分析し、結果を表5に要約する。いずれかのプライマーペアで得たELGAの結果を比較すると、10個の増幅反応に関しては、プライマーペアCMV-pp67-5は陽性結果を示すが、プライマーペアCMV-pp67-4での同じ核酸抽出物の対応増幅反応は陰性であった（表5、サンプル4、6、10、12、13、17、18、26（2反応）および27）。わずか4例（サンプル9（2反応）、10、28）において、その逆が成立した。
ECLデータの比較は同様の結果を示し、一致しない16個の結果のうちの11個において、プライマーペアCMV-pp67-5では陽性結果を示すが、プライマーペアCMV-pp67-4では陰性結果を示した（サンプル4、6、7、12（2反応）、13、15、18、26および27（2反応））。
一方または両方の個々の増幅反応が陽性である場合に試料がCMV-pp67 mRNAに関して陽性であると仮定してサンプルレベルで比較していたならば、8個の試料（サンプル4、6、12、13、17、18、26および27）は、このCMV mRNAに関してプライマーペアCMV-pp67-5では陽性でありプライマーペアCMV-pp67-4では陰性であり（ELGA検出を用いた場合）、また、1個の試料（サンプル9）は、プライマーペアCMV-pp67-4では陽性でありプライマーペアCMV-pp67-5では陰性であると示されていたであろう。ECL検出を用いた場合には、5個のサンプルは、プライマーペアCMV-pp67-4によりCMV-pp67 mRNA陽性とは認められなかったであろう。そしてこの場合もまた、1個のサンプルだけが、プライマーペアCMV-pp67-5により見落とされていたであろう。
結論としては、いずれかのプライマーペアで得られたアンプリコンを分析するために用いる検出方法に無関係に（それがELGAまたはECLに基づく検出の場合）、CMV-pp67-5は、CMV-pp67mRNAのNASBA増幅に関して、CMV-pp67-4より高感度なプライマーペアである。
0004256477.tif 000003
0004256477.tif 000004
0004256477.tif 000005
0004256477.tif 000006
0004256477.tif 000007
配  列  表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サイトメガロウイルス
（xi）配列：配列番号１：
0004256477.tif 000008
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サイトメガロウイルス
（xi）配列：配列番号２：
0004256477.tif 000009
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サイトメガロウイルス
（xi）配列：配列番号３：
0004256477.tif 000010
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（vi）起源：
（Ａ）生物名：サイトメガロウイルス
（xi）配列：配列番号４：
0004256477.tif 000011