(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１）〜７）の酵素学的性質を有することを特徴とするエンド−β−マンノシダーゼを含有し、かつα-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを含有しないことを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼ画分。
１）作用：下記式(1)で示される糖鎖中のβ−マンノシド結合を特異的に分解し、下記式(2)及び(3)で示される糖鎖を生成する。
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(1)
Manα1-6Man 式(2)
GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(3)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
２）基質特異性：下記式(4)〜(6)で示される糖鎖には作用しない。
Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(4)
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(5)
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man 式(6)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。また式中、( )内の糖は、分枝していることを示す）
３）至適ｐＨ：５（下記式(1)で示される糖鎖を基質として用いた場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(1)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
４）分子量：６９０００（ゲル濾過により測定）
５）阻害及び活性化：1mM Ca2 + の存在下で活性が増加しない。5mMのEDTA存在下で不活化されない。
６）安定性：pH８の条件下で、37℃、２時間インキュベートすると失活する。
７）ミカエリス定数(Km)：1.4mM（下記式(1)で示される糖鎖を基質とした場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA 式(1)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
【請求項２】
エンド−β−マンノシダーゼがユリ科に属する植物由来である、請求項１に記載のエンド−β−マンノシダーゼ画分。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンド−β−マンノシダーゼ、およびそれを含有する特定の画分に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
以下に本発明に最も近い技術について説明する。
生化学辞典(東京化学同人発行、1990年)には、β−マンノシダーゼは、β結合をもつマンナンの非還元末端のマンノース残基をエキソ様式で加水分解する酵素である旨、およびこの酵素は酵母、軟体動物、ウマやウサギの精液、カサガイでその存在が知られている旨が記載されている。
【０００３】
また新生化学実験講座３「糖質Ｉ−糖タンパク質(上)」(東京化学同人発行、1990年)にも、β−マンノシダーゼは、β−マンノシル残基が非還元末端に露出したときに作用するエキソグリコシダーゼである旨、およびこの酵素はアフリカマイマイ、ニワトリ輸卵管、Aspergillus nigerの培養液、キノコ、ナタマメ等から精製されている旨が記載されている。このようなβ−マンノシダーゼは「エキソ型」の酵素であることから、本明細書中では「エキソ−β−マンノシダーゼ」という。
【０００４】
一方、β−マンノシド結合を分解する「エンド型」の酵素としては、β−マンナンに作用するβ−マンナナーゼが知られている(Eur.J.Biochem.,234,278(1995)、Biochem.J.,175,1079(1978)、Biochem.J.,290,857(1993))。しかしながら、β−マンナン以外の糖鎖に特異的に作用するエンド型酵素については知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
新規なエンド−β−マンノシダーゼや、当該エンド−β−マンノシダーゼを含有する画分が得られれば、例えばアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型糖鎖）中に存在するβ−マンノシル残基を、他のグリコシダーゼ等によって非還元末端に露出させることなく作用させることができるので、新規な糖鎖構造分析用試薬等として利用することができる。またこの新規なエンド−β−マンノシダーゼの逆反応を利用して、新規な生理活性糖鎖の創製も期待される。
【０００６】
すなわち本発明は、新規なエンド−β−マンノシダーゼ、及び当該エンド−β−マンノシダーゼを含有する画分を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ユリ科の植物の花から新規なエンド−β−マンノシダーゼの分離を試み、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下記▲１▼〜▲３▼の酵素学的性質を有することを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼ（以下、「本発明酵素」ともいう）を提供する。
▲１▼作用：
下記式(1)で示される糖鎖中のβ−マンノシド結合を特異的に分解し、下記式(2)及び(3)で示される糖鎖を生成する。
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
Manα1-6Man  式(2)
GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(3)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
▲２▼基質特異性：
下記式(4)〜(6)で示される糖鎖には作用しない。
Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(4)
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(5)
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man  式(6)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。また式中、(    )内の糖は、分枝していることを示す）
▲３▼至適ｐＨ：
約５（下記式(1)で示される糖鎖を基質として用いた場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
【０００９】
好ましくは、上記▲１▼〜▲３▼の酵素学的性質に加え、さらに下記▲４▼〜▲７▼の酵素学的性質を有することを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼを提供する。
▲４▼分子量：
約６９０００（ゲル濾過により測定）
▲５▼阻害及び活性化：
1mM Ca2+の存在下で活性が増加しない。
5mMのEDTA存在下で不活化されない。
▲６▼安定性：
pH８の条件下で、37℃、２時間インキュベートすると失活する。
▲７▼ミカエリス定数(Km)：
1.4mM（下記式(1)で示される糖鎖を基質とした場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
（式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す）
【００１０】
より好ましくは、ユリ科に属する植物由来である上記エンド−β−マンノシダーゼを提供する。
【００１１】
また本発明は、本発明酵素を含有し、かつα-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼ画分（以下、「本発明画分」ともいう）を提供する。
【００１２】
α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、その基質が本発明酵素の基質と共通するグリコシダーゼである。従って、これら類縁のグリコシダーゼを実質的に含有しない本発明画分は、たとえ前記類縁のグリコシダーゼ以外の酵素が混入していても、本発明酵素とほぼ同様に利用することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
なお、以下特にことわりがない限り、Manはマンノース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Xylはキシロース残基を、Fucはフコース残基を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、β1-2はβ1-2グリコシド結合を、PAはピリジルアミノ基をそれぞれ示す。また式中の(    )内の糖（例えば(Manα1-3)、(Xylβ1-2)、(Fucα1-3)等）は、分枝していることを示す。
【００１４】
＜１＞本発明酵素
本発明酵素は、下記▲１▼〜▲３▼の酵素学的性質を有することを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼである。
▲１▼作用：
下記式(1)で示される糖鎖中のβ−マンノシド結合を特異的に分解し、下記式(2)及び(3)で示される糖鎖を生成する。
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
Manα1-6Man  式(2)
GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(3)
▲２▼基質特異性：
下記式(4)〜(6)で示される糖鎖には作用しない。
Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(4)
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(5)
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man  式(6)
なお上記式(6)で示される糖鎖は、β−マンナナーゼは作用するが、本発明酵素は作用しない。本発明酵素はこの点で公知のエンド型酵素と区別される。
▲３▼至適ｐＨ：
約５（下記式(1)で示される糖鎖を基質として用いた場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
【００１５】
本発明酵素のなかでも、上記▲１▼〜▲３▼の酵素学的性質に加え、さらに下記▲４▼〜▲７▼の酵素学的性質を有することを特徴とする、エンド−β−マンノシダーゼが好ましい。
▲４▼分子量：
約６９０００（ゲル濾過により測定）
▲５▼阻害及び活性化：
1mM Ca2+の存在下で活性が増加しない。
5mMのEDTA存在下で不活化されない。
▲６▼安定性：
pH８の条件下で、37℃、２時間インキュベートすると失活する。
▲７▼ミカエリス定数(Km)：
1.4mM（下記式(1)で示される糖鎖を基質とした場合）
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  式(1)
【００１６】
なお本発明酵素はもともとは植物から得られたものであるが、本発明酵素が得られる限りにおいてその由来は限定されない。例えば動物由来であってもよく、また遺伝子工学的手法等により製造されたものであってもよい。
【００１７】
これらの中でも植物由来のものが好ましく、ユリ科に属する植物由来のものがより好ましく、テッポウユリ(Lilium longflorum Thumb)由来（例えば、花）のものが特に好ましい。
【００１８】
本発明酵素の製造方法も、最終的に本発明酵素が取得できる限りにおいて特に限定されない。例えば上述したような植物等の天然物から本発明酵素を抽出し、次いで精製することにより製造することができる。
【００１９】
天然物からの本発明酵素の抽出方法として具体的には、例えばホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００２０】
抽出物からの本発明酵素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。このような精製方法を用い、本発明酵素に特徴的な活性を指標として、本発明酵素を適宜精製することができる。本発明酵素に特徴的な活性は、例えば後述の「酵素活性測定方法」に従って測定することができる。
【００２１】
なお、本発明酵素は完全に精製されていなくても良く、本発明酵素の作用が発揮でき、かつ本発明酵素の利用上好ましくない物質を含まない限りにおいて、部分精製されたものであってもよい。「本発明酵素の利用上好ましくない物質」は、本発明の利用の目的・態様に応じて、当業者が適宜決定でき、除去できる。
【００２２】
精製された酵素の酵素学的性質を分析し、本発明により開示された本発明酵素の酵素学的性質と比較することにより、本発明酵素の製造が確認できる。
【００２３】
なお、本発明酵素は以下に示す一連の工程によって初めて得られたものである。
工程１：天然物からの本発明酵素の抽出、硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー
工程２：陰イオン交換クロマトグラフィー
工程３：ゲル濾過クロマトグラフィー
工程４：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
工程５：疎水性クロマトグラフィー
工程６：陰イオン交換クロマトグラフィー
工程７：ゲル濾過クロマトグラフィー
なお本発明酵素の具体的な製造方法は、後述の実施例で詳述する。
【００２４】
本発明酵素は、特定のβ−マンノシル残基をエンド様式で分解するので、糖鎖構造分析用試薬として利用でき、また本発明酵素の逆反応を利用して、新規な生理活性糖鎖の創製も期待される。
【００２５】
＜２＞本発明画分
本発明画分は、本発明酵素を含有し、かつα-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とする、本発明酵素画分である。
【００２６】
本発明画分は、少なくとも本発明酵素を含有しており、かつα-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しない限りにおいて特に限定されない。
【００２７】
なお本明細書において「実質的に」とは、この言葉のかかる状態が、いわゆる当業者において、その状態であると認識するのに十分な実質を備えている状態を意味する。例えば「実質的に含有しない」とは、全く含有しない、又は含有しているとしてもその含有量が極僅かであって、いわゆる当業者において検出できない、若しくは検出できたとしても微量であって、測定誤差範囲内と認識される状態であることを意味するものである。
【００２８】
なお、α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことは、例えば後述の「夾雑酵素検出方法」により判定できる。
【００２９】
本発明画分の製造方法は、最終的に本発明画分が取得できる限りにおいて特に限定されない。
例えば、上記＜１＞で説明したような方法で精製された本発明酵素をそのまま本発明画分としてもよい。また精製された本発明酵素を、α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを含有しない適当な溶媒に溶解して溶液画分としてもよく、これを凍結させて凍結画分としてもよく、また凍結乾燥させて、凍結乾燥画分としてもよい。
【００３０】
また、本発明酵素が、α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しない程度にまで部分精製されたものを、そのまま本発明画分としてもよい。
【００３１】
本発明画分には、α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ以外の成分であって、かつ本発明酵素の活性を実質的に害さない限り、他の成分を含有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有せしめることもできる。
【００３２】
なお本発明画分の具体的な製造方法は、後述の実施例で詳述する。
【００３３】
本発明画分は、特定のβ−マンノシル残基をエンド様式で分解する本発明酵素を含有し、かつα-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有していないので、これらの酵素の影響を受けることなく、本発明酵素と同様に糖鎖構造分析用試薬として利用できる。特にMan及びGlcNAcを含有する糖鎖構造分析用試薬として有用である。
また本発明画分に含有される本発明酵素の逆反応を利用して、新規な生理活性糖鎖の創製も期待される。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
＜１＞本実施例中で共通に用いた材料及び方法
以下に本実施例で用いた材料及び方法をまとめて説明する。なお下記の糖鎖に付された[  ]中の記号は、当該糖鎖を示すために本実施例中で共通して用いた記号である。
【００３６】
(A)材料
テッポウユリ（Lilium longflorum Thumb)
下記の糖鎖は、J.Chromatogr.A, 800,187-198 (1998)に記載の方法で得た。
PA-GlcNAc
GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA
Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M1A]
Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M2B]
Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M2A]
Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M3B]
Manα1-3Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M3C]
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M4B]
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA  [M5A]
Manα1-6(Manα1-3)(Xylβ1-2)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-PA  [M2FX]
【００３７】
なお、M3B、M4B、M5A及びM2FXについて、念のためその構造を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0004241964.tif 000002
【００３９】
下記の糖鎖は、フナコシから購入した。
Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Man
Manα1-6(Manα1-3)Man
下記のβ1-4マンノオリゴ糖(β1-4Mannooligosaccharides)
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man  [βM6]
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man
Manβ1-4Manβ1-4Man
【００４０】
下記の糖鎖は、シグマ(Sigma)社より購入した。
Manα1-6Man
Manα1-3Man
【００４１】
なお、M2Bは前記の式(1)に、Manα1-6Manは前記の式(2)に、GlcNAcβ1-4GlcNAc-PAは前記の式(3)に、M2Aは前記の式(4)に、M5Aは前記式の(5)に、βM6は前記の式(6)にそれぞれ相当する。
【００４２】
下記の試薬は、ナカライテスク(Nacalai Tesque)社より購入した。
p-ニトロフェニルα-マンノピラノシド(p-Nitrophenyl α-mannopyranoside)
【００４３】
下記のカラムは、ファルマシア(Pharmacia社)より購入した。
DEAE-Sephacel(6.5x1.5cm)
Q-Sepharoseカラム(1.6x8cm)
Superdex 200カラム(1.6x60cm)
Mono Q HR5/5カラム(0.5x5cm)
【００４４】
下記のカラムは、東ソーより購入した。
ハイドロキシアパタイト(hydroxyapatite) HA 1000 カラム(0.75x7.5cm)
【００４５】
下記カラムは、PerSeptive Biosystemsより購入した。
Poros PE/Mカラム(0.46x10cm)
【００４６】
下記カラムは、昭和電工から購入した。
Shodex Asahipak NH2-Pカラム(0.46x7.0cm)
【００４７】
下記カラムは、ナカライテスクより購入した。
Cosmosil 5C18-Pカラム(0.46x15cm)
【００４８】
下記カラムは、Dionex社より購入した。
CarboPak PA-1カラム(0.2x25cm)
【００４９】
(B)方法
(B-1)酵素活性測定方法：
本発明酵素(エンド−β−マンノシダーゼ)の酵素活性は、特に示さない限りM2Bを基質として用い、以下の方法で測定した。
酵素溶液および270pmolのM2Bを含有する16μLの0.16M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)を、37℃で30分間インキュベートした。酵素反応は100℃で３分間加熱することにより停止させた。酵素反応後の溶液中における遊離されたPA-キトビオース(GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA)を、後述のサイズ分画HPLCで定量した。酵素活性の１ユニットは、37℃、pH5.0の条件下において、M2Bから１分間に１nmolのPA-キトビオースを遊離させる酵素量として定義した。
【００５０】
(B-2)夾雑酵素検出方法
検体を、上記「酵素活性測定方法」に準じてM1(エキソ−β−マンノシダーゼ活性、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の検出に用いる)、およびp-ニトロフェニルα-マンノピラノシド(α−マンノシダーゼの検出に用いる；後述)にそれぞれ作用させ、蛍光検出器を用いたサイズ分画HPLCや逆相HPLC(後述)、パルス電流測定検出器を用いたHPAEC(後述；非蛍光標識生成物を検出する)により分析し、酵素分解産物が検出されなかった場合に、α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有していないと判定した。
【００５１】
なお、α-マンノシダーゼ活性については、以下の方法で測定した。
p-ニトロフェニル α-マンノピラノシドを基質として測定した。酵素溶液および2.1mMのp-ニトロフェニル α-マンノピラノシドを含有する14μLの0.11M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)を、37℃で２時間インキュベートした。酵素反応は100℃で３分間加熱することにより停止させ、遊離したp-ニトロフェノールを400nmの吸収により定量した。
【００５２】
(B-3)本発明酵素の精製に用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
FPLCシステム(ファルマシア製)を用いて、25℃下で行った。なお用いたカラム等については、下記＜２＞で詳述する。
【００５３】
(B-4)糖鎖分析に用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)：
モデル 650-10M 蛍光スペクトロフォトメーター(日立製作所)を装着した、モデル 332 クロマトグラフ(ベックマン(Beckman))を使用した。
【００５４】
サイズ分画HPLCは、Shodex Asahipak NH2-Pカラムを用いて、25℃下、流速0.6mL/分で行った。溶離液としては、３％(v/v)の酢酸を含有する、アセトニトリル：水の400:85(v/v)混合液(トリエチルアミンでpH7.3に調整したもの)を使用した。励起波長は310nm、蛍光波長は380nmを使用した。
【００５５】
逆相HPLCは、Cosmosil 5C18-Pカラムを用いて、25℃下、流速1.5mL/分で行った。溶離液は、0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH4.0)(以下、溶離液Aという)および
0.5％ 1-ブタノールを含有する0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液(以下、溶離液Bという)を用いた。カラムは６％の溶離液Ｂで平衡化しておいた。サンプルを注入後、溶離液Ｂの比率を、30分間で直線的に31％まで増加させた。溶出液は蛍光でモニターした(励起波長：32Onm、蛍光波長：400nm)。
【００５６】
(B-5)糖鎖分析に用いた高pH陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)：
Dionex DX-500クロマトグラフ(Dionex社製)を使用した。非蛍光標識糖鎖は、CarboPak PA-1カラムを用いて分析した。溶出液は、パルス電流測定検出器(pulse
amperometric detector)によりモニターした。
【００５７】
濃度勾配溶出は次の通り行った。２つの溶離液AおよびBを用いた。溶離液Aは0.1M NaOH水溶液、溶離液Bは0.1M 酢酸ナトリウム(0.1M NaOH水溶液で溶解したもの)である。カラムは10％の溶離液Ｂで平衡化した。サンプルを注入後、溶離液Ｂの比率を、30分間、流速1.0mL/分で直線的に50％まで増加させた。
【００５８】
＜２＞本発明酵素及び本発明画分の製造
工程１：天然物からの本発明酵素の抽出、硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー
テッポウユリの花を液体窒素で凍結させ、その凍結物800gをブレンダーで破砕して粉末化した。この粉末を2500mLの0.11M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で懸濁し、４℃で撹拌した。このホモジネートを8000rpmで20分間遠心分離した。
この遠心分離により得られた上清を硫安沈殿により分画し、20％〜60％飽和の硫安により生じた沈殿を回収した。この沈殿を0.01M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0)に対して透析し、生成した沈殿を、9500rpm、30分間の遠心分離により除去した。
【００５９】
この遠心分離により得られた上清のpHを3.8に調整し、この上清(130mL)を、0.01M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH3.8)で平衡化したDEAE-Sephacelカラム(6.5x1.5cm)にアプライし、次いでこのカラムを400mLの同じ緩衝液で洗浄した。カラムに吸着せずに素通りした画分と、溶出した洗浄液とを合わせて、Amicon YM 10メンブレン(アミコン社製)を用いて50mLまで濃縮し、粗酵素溶液とした。
【００６０】
酵素はさらに以下に述べる方法で精製した。なお、都度、各画分の一部を採取して、α-マンノシダーゼ活性およびM2BからのPA-キトビオース遊離活性を測定した。
【００６１】
工程２：陰イオン交換クロマトグラフィー
工程１で得られた粗酵素溶液(49mL)を、0.05mM 酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0)で平衡化したQ-Sepharoseカラムにアプライした。0.05〜0.5mM NaClの直線濃度勾配(30分間、流速：2.0mL/分)により酵素を溶出させ、エンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収した。
【００６２】
工程３：ゲル濾過クロマトグラフィー
工程２で得られた画分を、0.1M NaClを含有する0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)で平衡化したSuperdex 200 カラムにアプライし、流速1.0mL/分で、同じ緩衝液により溶出されたエンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収した。
【００６３】
工程４：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
工程３で得られた画分を、0.01M リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化したハイドロキシアパタイト HA 1000カラム(0.75x7.5cm)にアプライした。0.01〜0.6M リン酸緩衝液の直線濃度勾配(30分、流速：1.0mL/分)により、酵素を溶出させた。エンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収した。
【００６４】
工程５：疎水性クロマトグラフィー
工程４で得られた画分を、1.0M 硫酸アンモニウムを含有する10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化したPoros PE/Mカラムにアプライした。1.0〜0M 硫酸アンモニウムの直線濃度勾配(５分間、流速：５mL/分)により、酵素を溶出させた。エンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収した。
【００６５】
工程６：陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
工程５で得られた画分を、0.01M リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化したMono Q HR5/5カラムにアプライした。0〜0.3M NaClの直線濃度勾配(30分間、流速1.0mL/分)により、酵素を溶出させた。エンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収した。
【００６６】
工程７：ゲル濾過クロマトグラフィー
工程６で得られた画分を、工程３と同様のSuperdex 200 カラムにアプライし、溶出されたエンド-β-マンノシダーゼ活性を有する画分を回収して、部分精製酵素画分とした。なおこの画分は、分子量約６９０００の位置に出現した。このことから、本発明酵素の分子量は、ゲル濾過により測定した場合、約６９０００であることが示された。
【００６７】
なお、上記各工程における本発明酵素の精製の度合いを、表２に示す。
【００６８】
【表２】
0004241964.tif 000003
【００６９】
工程７を経て得られた画分を、10％ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(Nature,227,680-685 (1970))に付し、蛋白質をクマシーブリリアントブルーR250(Coomassie brilliant blue R250)で染色した。その結果、当該画分には本発明酵素以外に複数の蛋白質が含有されていたが、前記の「夾雑酵素検出方法」の結果α-マンノシダーゼ、エキソ−β−マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは含有されていなかったので、この画分(本発明画分)を用いて本発明酵素の酵素学的性質を分析した。
【００７０】
なお所望により、さらに精製の工程を重ねることによって、完全に精製された本発明酵素を取得することができる。
【００７１】
＜３＞本発明酵素の酵素学的性質
▲１▼作用：
「酵素活性測定方法」に準じてM2Bに本発明酵素(本発明画分)を作用させ、酵素反応後の溶液中に存在する糖鎖を、サイズ分画HPLCで分析した。その結果、Manα1-6Man及びPA-キトビオースが検出されたが、Man、M1、およびPA-GlcNAcは検出されなかった。  この結果から、本発明酵素はM2B中のβ−マンノシド結合を特異的に分解し、Manα1-6Man及びPA-キトビオースを生成することが示された。また本発明酵素はエンド型酵素であることが示された。
なお、本発明酵素によるβ−マンノシド結合の特異的な分解は、加水分解によるものである。
【００７２】
▲２▼基質特異性：
「酵素活性測定方法」に準じて種々のPA-糖鎖に本発明酵素(本発明画分)を作用させ、酵素反応後の溶液中に存在するPA-糖鎖(酵素消化産物)を、蛍光検出器を用いたサイズ分画HPLCおよび逆相HPLCで分析し、PA-糖鎖の分解初速度を分析した。Ｍ２Ｂに対する分解初速度を１００とした時の相対分解初速度を表３に示す。
【００７３】
【表３】
0004241964.tif 000004
【００７４】
この結果から、本発明酵素は、分析した糖鎖の中でＭ２Ｂに最も良く作用することが示され、Ｍ２Ａ、Ｍ３Ｂ、Ｍ５Ａ及びβＭ６には作用しないことが示された。
また本発明酵素は、Ｍ１Ａ及びＭ２ＦＸには実質的に作用しないと判断された。
また本発明酵素は、Ｍ３Ｃ及びＭ４Ｂにも作用することが示された。なおＭ３ＣおよびＭ４Ｂを基質として用いた場合、PA-キトビオースおよびオリゴマンノシドが検出され、ManおよびＭ１は検出されなかった。
【００７５】
▲３▼至適ｐＨ：
本発明酵素の種々のpH条件下における分解初速度を、「酵素活性測定方法」に従って測定した。なおここでは、1nmolのM2Bを基質とし、酢酸アンモニウム緩衝液(0.1M、pH4.0-5.5)、MES緩衝液(0.1M、pH5.5-6.5)、およびHEPES緩衝液(0.1M、pH6.5-8.0)を用いた。
その結果、本発明酵素の至適pHは約５であることが示された。
【００７６】
▲４▼分子量：
上記＜２＞の工程７で示したとおり、ゲル濾過(Superdex 200)により測定した場合、約６９０００であることが示された。
【００７７】
▲５▼阻害及び活性化：
「酵素活性測定方法」において、1mM Ca2+を存在させた場合、又は5mMのEDTAを存在させた場合における酵素活性を測定した。
その結果、本発明酵素は1mM Ca2+の存在下で活性が増加せず、5mMのEDTA存在下で不活化されないことが示された。
【００７８】
▲６▼安定性：
本発明酵素を、pH８の条件下で、37℃、２時間インキュベートした結果、失活した。
【００７９】
▲７▼ミカエリス定数(Km)：
「酵素活性測定方法」に準じて種々の濃度のM2Bに本発明酵素を作用させ、ミカエリス定数(Km)を算出した結果、本発明酵素のM2Bに対するミカエリス定数(Km)は約1.4mMであった。
【００８０】
【発明の効果】
本発明酵素は、新規なエンド−β−マンノシダーゼであり、例えばアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型糖鎖）中に存在するβ−マンノシル残基を、他のグリコシダーゼ等によって非還元末端に露出させることなく作用させることができるので、糖鎖構造分析用試薬等として有用である。またこのエンド−β−マンノシダーゼの逆反応を利用して、新規な生理活性糖鎖の創製も期待される。
【００８１】
本発明画分も、本発明酵素と同様に糖鎖構造分析用試薬等として有用であり、また新規な生理活性糖鎖の創製への利用も期待される。