(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を、摘出した膵臓の膵管内に注入する工程(1)、
該保護液が注入された膵臓に酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程(3)、及び、
分解された膵組織を、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて純化する工程(4)
を含む、膵島の分離方法。
【請求項２】
工程(1)において、前記保護液を臓器重量１グラムあたり、約0.1〜10mlの量で膵管内に注入する請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
プロテアーゼ阻害剤を含む保護液が、カリウム濃度約4〜50mmol/Lである請求項１に記載の分離方法。
【請求項４】
更に、保護液が注入された膵臓を二層法により保存する工程(2)を有する、請求項１に記載の分離方法。
【請求項５】
工程(2)の二層法が、（ｉ）パーフルオロカーボン（perfluorocarbon）溶液、及び（ii）プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである保存液を用いる二層法である、請求項４に記載の分離方法。
【請求項６】
（ii）の保存液が更にトレハロースを含んでいる請求項５に記載の分離方法。
【請求項７】
工程(4)における純化溶液が、更にトレハロースを含んでいる請求項１に記載の分離方法。
【請求項８】
工程(4)における密度勾配剤が、イオディキサノールである請求項１に記載の分離方法。
【請求項９】
工程(4)における純化溶液が、更にプロテアーゼ阻害剤を含んでいる請求項１に記載の分離方法。
【請求項１０】
膵島の分離方法において、膵臓の分解前に、摘出した膵臓の膵管内に注入して膵組織を保護するために、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を用いる方法。
【請求項１１】
前記保護液は、
カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである二層法用膵臓保存液。
【請求項１３】
密度勾配剤及びトレハロースを含んでいる膵島の純化溶液であって、前記密度勾配剤がイオディキサノールである純化溶液。
【請求項１４】
更に、プロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１３に記載の純化溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島移植における重要技術である膵島の分離方法に関する。更に、膵島の分離において好適に使用し得る膵管内注入用保護液、二層法用膵臓保存液及び膵島純化溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンを投与しなければ生命を維持できない、いわゆるインスリン依存状態にある１型糖尿病の患者に対して、膵島移植という技術が、大きな社会的注目を集めており、主に欧米において、臨床における治療法として確立されようとしている。【０００３】
膵島移植とは、生体での血糖調節に中心的役割を果たしている細胞集団の膵島を点滴の要領で門脈内に注入する細胞組織移植である。膵島移植は、移植を受ける側への侵襲が小さく、１型糖尿病患者にとって最も理想に近い治療法とみなされている。【０００４】
2000年に、カナダ・エドモントンのアルバータ大学で、臨床膵島移植の治験の成功が報告された。この報告以来、4年あまりで約300例の膵島移植が欧米を中心に行われてきた。それらの膵島移植は、アルバータ大学で確立された、いわゆる「エドモントン・プロトコール」を基本として実施されている。【０００５】
しかし、これまでの技術では、欧米で行なわれている脳死ドナーからの膵島移植においても、安定した膵島収量が得られず、移植した膵島が有効に機能しない場合もあった。さらに、脳死ドナーより条件が悪い心停止ドナーからの膵島移植は、世界的にもほとんど成功例が無く、心停止ドナーからの膵島移植はこれまで事実上不可能であった。【０００６】
膵島移植の成功率を高めるため、また心停止ドナーからの膵島移植を成功させるためには、移植に適した膵島をたくさん移植させることが重要である。このため、移植に適した膵島の収量を向上させるため、膵島の分離技術の改善が強く求められていた。【０００７】
一方、移植医療において、臓器移植後の臓器移植患者へ、ウリナスタチン又はその代替物を投与する方法が報告されている（特開2002−20309号公報参照）。【０００８】
また、移植用臓器を潅流又は保存するための溶液が報告されており、肺移植における優れた効果が確認されている（特開平6−40801号公報）。【０００９】
しかし、膵島移植、特に膵島の分離及び純化技術において、好適に用い得る手段は明らかになっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、移植に適した膵島の収量を向上させ得る、膵島の分離技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、膵島の収量向上を主な目的として、種々の検討を重ねた結果、特定の溶液及び方法を用いることによって、移植に適した膵島の収量が向上することを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は、下記分離方法、及び、溶液に関する。【００１３】
項１：プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を、摘出した膵臓の膵管内に注入する工程(1)、
該保護液が注入された膵臓に酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程(3)、及び、
該分解された膵組織を、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて純化する工程(4)
を含む、膵島の分離方法。【００１４】
項２：工程(1)において、前記保護液を臓器重量１グラムあたり、約0.1〜10mlの量で膵管内に注入する項１に記載の分離方法。【００１５】
項３：プロテアーゼ阻害剤を含む保護液が、カリウム濃度約4〜50mmol/Lである項１又は２に記載の分離方法。【００１６】
項３Ａ：プロテアーゼ阻害剤を含む保護液が、更にトレハロースを含んでいる項１〜３のいずれか１項に記載の分離方法。【００１７】
項４：更に、保護液が注入された膵臓を二層法により保存する工程(2)を有する項１〜３Ａのいずれか１項に記載の分離方法。【００１８】
換言すると、
プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を、摘出した膵臓の膵管内に注入する工程(1)、
該保護液が注入された膵臓を二層法により保存する工程(2)、
保存後の膵臓に酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程(3)、及び、
該分解された膵組織を、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて純化する工程(4)
を含む、膵島の分離方法。【００１９】
項５：工程(2)の二層法が、（ｉ）パーフルオロカーボン（perfluorocarbon）液、及び（ii）プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである保存液を用いる二層法である、項４に記載の分離方法。【００２０】
項５Ａ：（ii）の保存液が更にトレハロースを含んでいる項５に記載の分離方法。【００２１】
項６：工程(4)における純化溶液が、更にトレハロースを含んでいる項１〜５Ａのいずれか１項に記載の分離方法。【００２２】
項７：工程(4)における密度勾配剤が、イオディキサノールである項１〜６のいずれか１項に記載の分離方法。【００２３】
項８：工程(4)における純化溶液が、更にプロテアーゼ阻害剤を含んでいる項１〜７のいずれか１項に記載の分離方法。【００２４】
項８Ａ：プロテアーゼ阻害剤が、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上である、項１〜８のいずれか１項に記載の分離方法。【００２５】
項９：プロテアーゼ阻害剤を含む、膵管内注入用保護液。
別言すると、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を、膵島分離において膵管内に注入して使用する方法。
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上である。【００２６】
項１０：カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである、項９に記載の保護液。【００２７】
項１０Ａ：更に、トレハロースを含んでいる項９又は１０に記載の保護液。【００２８】
項１１：プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである二層法用膵臓保存液。
別言すると、プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が約4〜50mmol/Lである保存液を、膵島分離における二層法による膵臓保存に使用する方法。
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート、及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上である。【００２９】
項１１Ａ：更に、トレハロースを含んでいる項１１に記載の保存液。【００３０】
項１２：密度勾配剤及びトレハロースを含んでいる膵島の純化溶液。
別言すると、密度勾配剤及びトレハロースを含む溶液を、膵島分離における膵島の純化に使用する方法。【００３１】
項１３：密度勾配剤がイオディキサノールである項１２に記載の純化溶液。
換言すると、イオディキサノール及びトレハロースを含んでいる純化溶液。【００３２】
項１４：更に、プロテアーゼ阻害剤を含む項１２又は１３に記載の純化溶液。
換言すると、密度勾配剤、トレハロース及びプロテアーゼを含んでいる項１２又は１３に記載の純化溶液。【００３３】
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート、及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上である。【００３４】
本発明には、更に、以下の態様も含まれる。【００３５】
項１５：下記工程を有する膵島の分離方法：
トリプシンインヒビターを含む組織保護又は保存液を、摘出した膵臓の膵管内に注入する工程(1)；
前記保護又は保存液が注入された膵臓に、コラゲナーゼ溶液を注入し、膵臓を膨化させる工程(2)；
該膨化した膵臓内の溶液の温度を上昇させ、コラゲナーゼを活性化し、膵組織を分解する工程(3)；
分解された膵組織を回収する工程(4)；
回収された膵組織から膵島を分離して、膵島を純化する工程(5)。【００３６】
項１６：前記工程(5)が下記工程(5-1)〜(5-3）を有する項１５に記載の分離方法：
密度勾配剤を組織保護又は保存溶液に添加してなる純化溶液中に、密度勾配を作成する工程（5-1）；
密度勾配が作成された純化溶液中に、回収された膵組織を添加する工程(5-2)；
膵組織が添加された純化溶液を遠心分離し、膵組織から膵島を分離して、膵島を純化する工程（5-3）。【００３７】
項１７：前記工程（5-1）が下記工程（5-1')である項１６に記載の分離方法：
トリプシンインヒビター及び密度勾配剤を組織保護又は保存溶液に添加してなる純化溶液中に密度勾配を作成する工程（5-1’）。【００３８】
項１８：密度勾配剤がイオディキサノールである項１６又は１７に記載の分離方法。【００３９】
項１９：更に下記工程を有する項１５〜１８のいずれか１項に記載の分離方法：
前記保護又は保存液が注入された膵臓を、パーフルオロカーボン（perfluorocarbon）からなる層、及びトリプシンインヒビターを含む組織保護又は保存液からなる層の２層が形成された容器中に保存する工程(1-2)。【００４０】
項２０：トリプシンインヒビターがウリナスタチンである項１５〜１９のいずれか１項に記載の分離方法。【００４１】
項２１：組織保護又は保存液のカリウム濃度が4〜50mmol/Lである請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の分離方法。【００４２】
項２２：イオディキサノールを、カリウム濃度が4〜50mmol/Lである組織保護又は保存液に添加してなる膵島純化溶液。【００４３】
項２３：更にトリプシンインヒビターを添加してなる項２２に記載の純化溶液。【００４４】
項２４：トリプシンインヒビターがウリナスタチンである項２３に記載の純化溶液。【００４５】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。【００４６】
I．膵島の分離方法
本発明における膵島の分離方法は、下記工程を含む；
プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を、摘出した膵臓の膵管内に注入する工程(1)、
該保護液が注入された膵臓に酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程(3)、
該分解された膵組織を、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて純化する工程(4)。
また、本発明は、更に下記工程を含む方法も含む：
保護液が注入された膵臓を二層法により保存する工程(2)。【００４７】
I(1)．膵管内に保護液を注入する工程
本発明の分離方法は、ドナーから摘出した膵臓の膵管内に、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を注入することを含む。膵管内に、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を注入することにより、膵組織が適切に保護され、移植に適した膵島の収量が向上する。【００４８】
膵管内への保護液の注入量は、臓器の状態等により、適宜設定し得るが、臓器重量１グラムあたり、約0.1〜10ml程度、好ましくは約0.1〜2ml程度、更に好ましくは、約1〜1.5ml程度である。【００４９】
この程度の量を注入することは、保護液を膵臓全体の膵管へ適切に行き渡らせることが出来、質の良い膵島の収量が向上する点で好ましい。【００５０】
プロテアーゼ阻害剤は、適宜選定し得るが、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上が、膵島の収量がより優れる点で、特に好適である。【００５１】
また、保護液は、低カリウム濃度であることが、移植に適した膵島の収量が向上する点で好ましい。
具体的には、保護液1000ml当りのカリウム濃度が4〜50mM、特に10〜50mM程度であることが好ましい。【００５２】
また保護液は、トレハロースを含んでいることが、移植に適した膵島の収量が向上する点で好ましい。【００５３】
保護液の注入の時点は、適宜設定できるが、できるだけ早いことが好ましく、膵臓の摘出直後であることが好ましい。【００５４】
保護液の注入方法は、適宜設定し得るが、例えば、摘出した膵臓にカテーテルを挿入し、ポンプによる注入圧調節下に、該カテーテルを通して、注入することができる。【００５５】
挿入するカテーテルの数は適宜設定し得るが、好ましくは１本である。１本とすることで、臓器内に注入する溶液の液漏れを少なくし、より適確に液の注入を行うことができ、また臓器の損傷も低減することができる。【００５６】
I(2).二層法により保存する工程
膵管内に保護液を注入した後の膵臓は、二層法により保存することが好ましい。【００５７】
二層法は、容器内に、パーフルオロカーボン液と、保存液を入れて、二層を形成した後、容器内に酸素を供給し、該容器中で、膵臓を浸漬保存することにより行うことができる。パーフルオロカーボン液と、保存液との割合は、体積比で1:1程度である。酸素の供給は、少なくとも30分以上行うことが好ましい。【００５８】
二層法により膵臓を保存することにより、組織のviabilityを高く維持することができる。【００５９】
二層法に用いる保存液は、プロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましい。プロテアーゼ阻害剤を含む保存液とすることにより、膵島の収量を向上させることができる。【００６０】
プロテアーゼ阻害剤は、適宜選定し得るが、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上が、膵島の収量がより優れる点で、特に好適である。【００６１】
また、保存液は、低カリウム濃度であることが好ましい。具体的に4〜50mmol/L程度、特に10〜50mmol/L程度であることが好ましい。【００６２】
保存液が、低カリウム濃度であることにより、膵島の収量を一段と向上させることができる。【００６３】
また、保存液は、トレハロースを含んでいることが、好ましい。保存液がトレハロースを含んでいることにより、膵島の収量を一段と向上させることができる。【００６４】
I(3)．膵臓を分解する工程
保護液が注入された膵臓或いは二層法により保存した膵臓は、次いで、膵組織を分解される。【００６５】
分解、別言すると、消化は、例えば、酵素溶液を膵臓の膵管内に注入し、膵臓を膨化させた後、酵素溶液の温度を上昇させ、酵素を活性化させることにより、行うことができる。【００６６】
酵素溶液の注入は、例えば、ポンプを用いて注入圧調節下に、酵素溶液を主膵管に注入することにより行うことができる。酵素溶液の注入は、保護液の注入に用いたものと同じカテーテルを通して行ってもよい。【００６７】
酵素溶液としては、例えば、コラゲナーゼ溶液等を用いることができる。【００６８】
膵臓に酵素溶液を注入した後、溶液の温度を、適当な装置を用いて、上昇させることにより、分解を開始することができる。【００６９】
例えば、コラゲナーゼ溶液を用いる場合、膨化させた膵臓をRicordiのチェンバーに入れ、分解のための回路を溶液で満たし、閉鎖系とする。溶液をポンプで循環させ、溶液の温度を体温近く、37℃程度に上昇させる。温度の上昇により、膵組織の中に注入されたコラゲナーゼが活性化し、細胞と細胞を結合している組織を形成するコラーゲンを溶解して、膵組織が分解する。【００７０】
分解の停止は、膵島を構成する細胞が凝集している形態を保ったまま、膵外分泌腺組織だけが膵島の周囲より解離する時点で行う。【００７１】
分解の停止は、溶液の温度を下げることにより行うことができる。また、血清蛋白を加え、酵素を不活化することにより、行うこともできる。【００７２】
例えば、回路を開放系として、ヒトアルブミンを含んだ室温の溶液を回路内に通すことにより、行うことができる。室温の溶液を通すことで、溶液の温度を下げ、また酵素を希釈することができ、また、血清蛋白を加えることで、酵素の活性を低下させることができる。【００７３】
分解を停止した後は、膵組織を回収する。回収した膵組織は、純化の前に、遠心分離器にて遠心洗浄し、濃縮しておくことが好ましい。【００７４】
I(4)．純化工程
純化は、膵島が膵外分泌腺組織に比べて比重が軽いことを利用して行うことができる。例えば、密度勾配、換言すると比重濃度勾配が形成された溶液中に、分解された膵組織を添加し、比重遠沈法にて膵島と膵外分泌腺組織を分離することにより、膵島の純化を行うことができる。【００７５】
例えば、以下のような手順で行うことができる。【００７６】
まず、密度勾配剤を含む純化溶液中で、密度勾配を形成する。【００７７】
次いで、密度勾配が形成された純化溶液中に、分解された膵組織を添加する。【００７８】
次いで、比重遠沈法により、分解膵組織が添加された純化溶液を遠心分離する。遠心分離によって、膵島と外分泌腺組織を分離し、回収された膵組織から、膵島を分離する。【００７９】
密度勾配剤は、粘度の低い溶液を作成できるものが好ましい。好適な密度勾配剤には、イオディキサノール（オプティプレップTM）やN,N’-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-〔N-（2,3-dihydroxypropyl）acetoamido〕-2,4,6-triiodo-isophthalamide）（ナイコデンツR）を挙げることができる。【００８０】
また、純化溶液は更に、プロテアーゼ阻害剤を含んでいることが好ましい。純化溶液が、プロテアーゼ阻害剤を含むことにより、膵島の収量を一段と向上させることができる。【００８１】
密度勾配は、連続密度勾配、非連続密度勾配のどちらでもよいが、連続密度勾配の方がより多くの膵島を回収し得る点で好ましい。【００８２】
密度勾配は、適宜公知の方法に従って形成することができる。また、適当な装置、例えば、連続比重作成装置を用いることもできる。【００８３】
また、純化において、COBE2991のような血球洗浄装置を利用することもできる。【００８４】
例えば、COBE2991内に、密度勾配剤を利用して密度勾配を作成し、その中に洗浄濃縮された分解膵組織を添加し、連続比重遠沈法にて膵島と外分泌腺組織に分離した後、COBE2991内の溶液を分画ごとに採取してもよい。分離後の液を検鏡し、どの分画に膵島が存在するかを判定し、膵島を回収する。【００８５】
純化された膵島の回収により、一連の分離操作が終了する。【００８６】
II.膵管内注入用保護液
本発明の保護液は、膵島移植における膵島の分離において、膵管内に注入して使用することができる。また、本発明の保護液は、上記本発明の分離方法における、プロテアーゼを含む保護液として、好適に用いることができる。【００８７】
本発明の保護液は、プロテアーゼ阻害剤を、組織保護又は保存液に添加することにより、得ることができる。【００８８】
II-1.プロテアーゼ阻害剤
本発明で用いるプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼ阻害活性を有するものであれば、その由来や種類は特に限定されず、適宜公知のものを使用することができるが、特にトリプシン阻害活性を有するトリプシンインヒビターが好ましい。【００８９】
プロテアーゼ阻害剤の例には、ウリナスタチン（ミラクリッドTM）、4-[2-aminoethylbenzenesulfonyl] fluoride（AEBSF、ペファブロックTM）、メシル酸ガベキサート（FOYTM）、メシル酸ナファモスタット（フサンTM）からなる群から選択される１以上が含まれる。このうち、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上が、膵島の収量がより優れる点で、好適に用いられる。また、ウリナスタチンやメシル酸ガベキサートは、抗炎症作用を有する点でも好適である。【００９０】
プロテアーゼ阻害剤の保護液における添加割合は、本発明の効果が奏される範囲内で、阻害剤の種類に応じて、適宜設定し得る。プロテアーゼ阻害剤が、ウリナスタチンであれば、１Lあたり10,000〜100,000U程度、好ましくは50,000〜100,000U程度である。また、メシル酸ガベキサートであれば、1Lあたり100〜10000mg程度、好ましくは500〜2000mg程度である。【００９１】
II-2.組織保護又は保存液
組織保護又は保存液は、組織（臓器及び細胞を含む）の保護又は保存のために用いられている公知の溶液から適宜選定することができる。【００９２】
例えば、ユーロコリンズ液（Euro−Collins液）、UW液（University of Wisconsin液）、ET-Kyoto液、Low-Potassium Dextran Glucose液、HTK溶液（CustodiolTM）等を用いることができる。【００９３】
また、下記の組成を有する液を挙げることができる。【００９４】
組織保護又は保存液（例１）
ナトリウム（Na+）10〜140mmol／L 
カリウム（K+）4〜140mmol／L
マグネシウム（Mg2+） 0〜4mmol／L
カルシウム （Ca2+）0〜2mmol／L
リン酸（H2 PO4 - 又はHPO4 ２-） 12〜65mmol／L 
Cl- 、HCO3 - 、CO3 ２-、有機酸又は有機酸アニオン 15〜150mmol／L 
ヒドロキシエチル澱粉 0〜80g／L
トレハロース 0〜240mmol／L【００９５】
組織保護又は保存液（例２）
ナトリウム（Na+）10〜140mmol／L
カリウム（K+ ）4〜140mmol／L
ヒドロキシエチル澱粉 0〜80g／L
グルタチオン  0〜10mmol／L
アデノシン    0〜10mmol／L
ラクトビオネート（Lactobionate）0〜140mmol／L
ラフィノース（Raffinose）0〜50g/L【００９６】
組織保護又は保存液（例３）
ナトリウム（Na+）80〜120mmol/L
カリウム（K+ ）4〜50mmol/L
グルコネート  15〜150mmol/L
リン酸  20〜40mmol/L
トレハロース  80〜160mmol/L（27〜55g/L）
ヒドロキシエチル澱粉（HES） 20〜60g/L
Dibutyryl cAMP 0〜10mmol/L
ニトログリセリン 0〜１g/L【００９７】
上記で例示した組織保護又は保存液のうち、特に、ET-Kyoto液、並びに、例１又は例3に記載の液が好適に用いられる。【００９８】
II-3.膵管内注入用保護液の態様
膵管内注入用保護液は、低カリウム濃度であることが好ましい。具体的に、保護液1000ml当りのカリウム濃度が4〜50mM、特に10〜50mMであることが好ましい。【００９９】
カリウムの濃度が低い場合には、脈管を攣縮させず、膵島からのインスリン放出を防止することができ、溶液を組織の隅々まで素早く到達させることが可能である。膵管保護作用がより高められ、移植に適した膵島の収量を向上させることができる。【０１００】
また、膵管内注入用保護液の浸透圧は、270〜450mOsm/l、特に、300〜400mOsm/l範囲にあることが好ましい。該範囲であると、組織が保護又は保存中に膨張又は収縮することを防ぐことができる。【０１０１】
また、膵管内注入用保護液のpHは、細胞や組織の酸性分解防止等のため、7〜8程度であることが好ましい。【０１０２】
また、膵管内注入用保護液は、トレハロースを含んでいることが好ましい。トレハロースを含有することにより、膵管に対する保護作用が更に高まり、膵島の収量を向上させることができる。トレハロースには、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース及びβ，β−トレハロースの３種が存在するが、いずれを用いても良く、それらの混合物であってもよい。好ましくは天然に存在するα，α−トレハロースを用いる。【０１０３】
トレハロースの濃度は、保護液1000ml中、0〜400mmol、特に50〜240mmol、更に80〜160mmol程度である。【０１０４】
更に、膵管内注入用保護液には、本発明の効果を損なわない限りで、更に他の成分を含むことができる。他の成分としては、各種電解質、糖質、アミノ酸、薬剤、ビタミン等を挙げることができる。【０１０５】
またdibutyryl cAMP等のAMPやATP等の細胞賦活剤、プロスタグランジン、ニトログリセリン等の血管拡張剤、抗生物質、アデノシン、N-アセチル-L-システイン、グリシン、アスコルビン酸、グルタミン、ニコチン酸アミド、グルタチオン、ラフィノース等を含んでいてもよい。【０１０６】
本発明の膵管内注入用保護液の好ましい態様の例には、少なくとも下記成分を下記の割合で含む液が含まれる：
ナトリウム  80〜120mmol/L
カリウム  4〜50mmol/L
グルコネート  15〜150mmol/L
リン酸  20〜40mmol/L
トレハロース  80〜160mmol/L
ヒドロキシエチル澱粉（HES） 20〜60g/L
ウリナスタチン  10,000〜100，000U/L【０１０７】
本発明の膵管内注入用保護液は、膵管の保護作用が高く、組織のviabilityを維持したまま、組織を安定して適切に保護することができ、移植に適した膵島の収量を向上させることができる。【０１０８】
III.二層法用膵臓保存液
本発明の保存液は、膵島移植における膵島の分離において、二層法による膵臓の保存に使用することができる。また、本発明の二層法用膵臓保存液は、上記本発明の膵島の分離方法における、二層法に用いる保存液として、好適に用いることができる。【０１０９】
本発明の保護液は、プロテアーゼ阻害剤を、低カリウム濃度の組織保護又は保存液に添加することにより、得ることができる。【０１１０】
プロテアーゼ阻害剤としては、上記II-1に記載の阻害剤を用いることができる。【０１１１】
また、組織保護又は保存液としては、上記II-2に記載の液のうち、低カリウム濃度の液を用いることができる。特に、ET-Kyoto液等が好適に用いられる。【０１１２】
III-2.二層法用膵臓保存液の態様
プロテアーゼ阻害剤の保存液における添加割合は、本発明の効果が奏される範囲内で、阻害剤の種類に応じて、適宜設定し得る。【０１１３】
プロテアーゼ阻害剤が、ウリナスタチンであれば、１Lあたり10,000〜100,000U程度、好ましくは50,000〜100,000U程度である。また、メシル酸ガベキサートであれば、1Lあたり100〜10000mg程度、好ましくは500〜2000mg程度である。【０１１４】
二層法用膵臓保存液のカリウム濃度は、4〜50mM程度、特に10〜50mMである。【０１１５】
カリウム濃度が低い場合には、膵臓の保存作用をより適切なものとすることができ、移植に適した膵島の収量を向上させることができる。【０１１６】
また、保存液の浸透圧は、270〜450mOsm/l、特に、300〜400mOsm/lの範囲にあることが好ましい。該範囲であると、組織が保存中に膨張又は収縮することを防ぐことができる。【０１１７】
また、保存液のpHは、細胞や組織の酸性分解防止等のため、7〜8程度であることが好ましい。【０１１８】
また、保存液は、トレハロースを含んでいるものが好ましい。【０１１９】
トレハロースの濃度は、保存液1000ml中、0〜400mmol、特に50〜240mmol、更に80〜160mmolであることが好ましい。トレハロースを含有することにより、膵臓に対する保護作用が更に高まり、膵島の収量を向上させることができる。【０１２０】
更に、保存液には、本発明の効果を損なわない限りで、更に他の成分を含むことができる。他の成分としては、各種電解質、糖質、アミノ酸、薬剤、ビタミン等を挙げることができる。【０１２１】
またdibutyryl cAMP等のAMPやATP等の細胞賦活剤、プロスタグランジン、ニトログリセリン等の血管拡張剤、抗生物質、アデノシン、N-アセチル-L-システイン、グリシン、アスコルビン酸、グルタミン、ニコチン酸アミド、グルタチオン、ラフィノース等を含むこともできる。【０１２２】
本発明の二層法用保存液の好ましい態様の例には、少なくとも下記成分を下記の割合で含む液を挙げることができる：
ナトリウム  80〜120mmol/L
カリウム  4〜50mmol/L
グルコネート  15〜150mmol/L
リン酸  20〜40mmol/L
トレハロース  80〜160mmol/L
ヒドロキシエチル澱粉（HES） 20〜60g/L
ウリナスタチン  10,000〜100，000U/L【０１２３】
本発明の保存液を用いることにより、膵臓の保護作用が高まり、組織のviabilityを維持したまま、それらの組織を適切に保存することができ、移植に適した膵島の収量を顕著に向上させることができる。【０１２４】
IV.膵島純化溶液
本発明の純化溶液は、膵島移植における膵島の分離において、膵島の純化に好適に使用される。また、本発明の純化溶液は、上記本発明の膵島の分離方法における、純化溶液として、好適に用いることができる。【０１２５】
本発明の純化溶液は、密度勾配剤を、トレハロースを含む組織保護又は保存液に添加することにより、得ることができる。トレハロースを含む組織保護又は保存液としては、上記II-2に記載のうち、トレハロースを含む液を用いることができる。特に、ET-Kyoto液が好適に用いられる。【０１２６】
IV-1.密度勾配剤
密度勾配剤は、溶液内の密度勾配の調製に用いられる公知のものから、適宜選択することができる。特に、密度勾配剤は、粘度の低い溶液を作成できるものが好ましい。また、エンドトキシンレベルの低いものが好ましい。【０１２７】
好適な密度勾配剤には、イオディキサノール（オプティプレップTM）やN,N’-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-〔N-（2,3-dihydroxypropyl）acetoamido〕-2,4,6-triiodo-isophthalamide）（ナイコデンツR）等を挙げることができる。特に、イオディキサノールが好適である。【０１２８】
これらを密度勾配剤として用いることにより、粘度の低い純化溶液を得ることができ、純化速度を速めることができる。更に、エンドトキシンレベルの低い溶液とすることができる。【０１２９】
密度勾配剤の組織保護又は保存液に対する混合割合は、純化前に、膵組織の密度を測定し、密度勾配剤と組織保護又は保存液の比重を考慮して、適宜設定することができる。【０１３０】
IV-2.トレハロース
トレハロースは、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース及びβ，β−トレハロースの３種が存在するが、いずれを用いても良く、それらの混合物であってもよい。好ましくは天然に存在するα，α−トレハロースを用いる。【０１３１】
純化溶液におけるトレハロースの濃度は、0〜400mmol/L程度、特に50〜240mmol/L、更に80〜160mmol/L程度である。【０１３２】
IV-3.プロテアーゼ阻害剤
純化溶液は、更にプロテアーゼ阻害剤を含んでいることが好ましい。プロテアーゼ阻害剤としては、上記II-1に記載のものを用いることができる。特に、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート及びメシル酸ナファモスタットからなる群から選択される１以上が、膵島の収量がより優れる点で、好適に用いられる。【０１３３】
プロテアーゼ阻害剤を純化溶液に添加する場合、添加割合は、本発明の効果が奏される範囲内で、阻害剤の種類に応じて、適宜設定し得る。【０１３４】
プロテアーゼ阻害剤が、ウリナスタチンであれば、１Lあたり10,000〜100,000U程度、好ましくは50,000〜100,000U程度である。また、メシル酸ガベキサートであれば、1Lあたり100〜10000mg程度、好ましくは500〜2000mg程度である。【０１３５】
IV-４.純化溶液の態様
純化溶液は、低カリウム濃度であることが好ましく、4〜50mmol/L程度、特に10〜50mmol/L程度であることが好ましい。【０１３６】
純化溶液は、粘度が低いことが好ましい。特に、測定温度22℃において、ブルックフィールド法で測定される粘度が、5センチポアズ（cp）以下、好ましくは3cp、特に2cp以下であることが好ましい。【０１３７】
また、純化溶液には、本発明の効果を損なわない限りで、他の成分を適宜添加することができる。他の成分には、例えば、アデノシン、デキストラン、ヘパリン等が含まれる。【０１３８】
好ましい純化溶液の態様の例には、少なくとも下記成分を下記の割合で含む液を挙げることができる：
ナトリウム  80〜120mmol/L
カリウム  4〜50mmol/L
グルコネート  15〜150mmol/L
リン酸  20〜40mmol/L
トレハロース  80〜160mmol/L
ヒドロキシエチル澱粉（HES） 20〜60g/L
イオディキサノール  100〜500ml/L            【０１３９】
プロテアーゼ阻害剤を含む純化溶液の好ましい態様の例には、少なくとも下記成分を下記の割合で含む液を挙げることができる。【０１４０】
ナトリウム  80〜120mmol/L
カリウム  4〜50mmol/L
グルコネート  15〜150mmol/L
リン酸  20〜40mmol/L
トレハロース  80〜160mmol/L
ヒドロキシエチル澱粉（HES） 20〜60g/L
イオディキサノール100〜500ml/L    
ウリナスタチン  10,000〜100，000U/L【０１４１】
膵島移植における膵島の純化においては、膵島の３次元構造が維持されるように純化を行うことが重要であるが、本発明の純化溶液を用いれば、膵島の３次元構造が適切に維持された状態で、移植に適した膵島の収量を向上させることができる。【０１４２】
V.  膵島移植
膵島移植は、上記一連の分離操作で得られた膵島を、患者の門脈に注入することにより、実施することができる。【０１４３】
分離された膵島は、規定の基準を満たした場合に移植に適当と判断され、移植に用いられる。【０１４４】
移植に用いられる膵島は、有効性の点から、移植後、膵島として機能するかどうかを判定することが求められる。更に、病原体や有害物質等がレシピエントに混入する危険性が、極力排除されている必要がある。【０１４５】
移植に適合する分離膵島の基準としては、具体的には、以下の基準が用いられる。
・膵島量＞4,000 IE／kg（患者体重）
・純度＞30 ％
・組織量＜10 ml
・Viability＞70 ％
・エンドトキシン＜5 IE/kg（患者体重）
・グラム染色陰性【０１４６】
膵島移植をより効果的に実施するためには、膵島量＞5,000 IE/kg（患者体重）であることがより適当である。【０１４７】
移植に適当と判断された膵島は、患者（レシピエント）の準備ができるまで保存される。そして、患者の準備が整った後、門脈に点滴の要領で注入される。【０１４８】
本発明における膵島分離技術には、膵島移植及び膵島分離における各種の公知技術を必要に応じて付加することができる。【０１４９】
本発明によって、移植に適した膵島の収量が向上する。そして本発明により、純化効率を高めることができ、純化速度も改善することができる。これにより、質のよい膵島をたくさん移植することが可能になり、移植後の膵島をより有効に機能させることが可能となる。【０１５０】
本発明の分離方法及び溶液を用いることにより、膵島移植の治療成績を向上させることができる。
【発明の効果】
【０１５１】
本発明における膵島の分離方法によれば、移植に適した膵島の収量が増加する。更に、膵島の分離をより短時間で効率良く行うことも可能となる。【０１５２】
本発明の分離方法は、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を膵管内に注入するという特徴を有する。【０１５３】
膵管内に、プロテアーゼ阻害剤を含む保護液を膵管内に注入することにより、膵組織が適切に保護され、移植に適した膵島の収量が向上する。【０１５４】
また、本発明の分離方法は、二層法による膵臓の保存工程を含んでもよい。好ましくは、（ｉ）パーフルオロカーボン（perfluorocarbon）液、及び（ii）プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が4〜50mmol/Lである保存液を用いる二層法で保存する。これにより、移植に適した膵島の収量が格段に向上する。【０１５５】
更に、本発明の分離方法は、密度勾配剤を含む純化溶液で純化する工程を含む。好ましくは、密度勾配剤及びトレハロースを含む純化溶液で純化する。より好ましくは、更にプロテアーゼ阻害剤を含む純化溶液を用いて純化する。このような純化溶液を用いることにより、純化効率が向上し、更に、移植に適した膵島の細胞が向上する。【０１５６】
本発明の分離方法は、このような特徴を有することにより、移植に適した膵島の収量を顕著に向上させるという特徴を有する。【０１５７】
また、本発明によれば、プロテアーゼ阻害剤を含む、膵管内注入用保護液が提供される。該保護液は、膵管の保護作用が高く、膵島収量を増加させることができる。【０１５８】
また、本発明によれば、プロテアーゼ阻害剤を含み、カリウム濃度が4〜50mmol/Lである二層法用膵臓保存液が提供される。該保存液は、膵臓の保護作用が高く、組織のViabilityを維持して、組織を適切に保護し、移植に適した膵島の収量を向上させる。【０１５９】
また、本発明によれば、密度勾配剤及びトレハロースを含む膵島純化溶液が提供される。更には、密度勾配剤、トレハロース及びプロテアーゼ阻害剤を含む純化溶液が提供される。これらの純化溶液は、純化効率を高め、また、移植に適した膵島の収量を向上させることができる。さらに純化溶液の粘度を下げ、純化速度を早くすることができる。更に、エンドトキシンレベルが低くなり、患者の危険性を低減させることもできる。【０１６０】
このように、本発明は、移植に適した膵島の収量を増加させ得る膵島の分離方法、膵管内注入用保護液、二層法用膵臓保存液及び膵島純化溶液を提供する。【０１６１】
本発明により、移植適合基準を満たす膵島の収量が向上し、これにより、膵島移植の成功率を向上させることができる。更に、従来の方法では事実上不可能であった心停止ドナーからの膵島移植を実現可能とする。    【０１６２】
このように、本発明は、インスリン依存状態糖尿病、特に１型糖尿病患者に対し、より有効で確実な治療法を提供し得るものであり、膵島移植の臨床実施に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】膵管保護の有無による膵島収量を比較検討した実験の結果を示した図面である。図1Aは、純化前の膵島収量を示す。図1Bは、純化後の膵島収量を示す。IE/gは、膵臓１グラム当りの収量膵島の平均個数を示す。Ductal injection(-)は膵管内に保護液を注入しなかった場合、Ductal injection(+)は膵管内に保護液を注入した場合を示す。
【０１６４】
【図２】二層法に用いる保存液の違いによる純化後の膵島収量を比較検討した実験の結果を示す図面である。IE/pancreasは膵臓一つあたりから取れる膵島の総収量を示す。PFCはパーフルオロカーボン液（PFC ）、UWはUW液、M−UWはUW＋ウリナスタチン液、ET−KyotoはET−Kyoto液、M−KyotoはET−KYOTO＋ウリナスタチン液を示す。
【０１６５】
【図３】プロトコール毎に比較したブタ膵島分離における膵島収量の結果を示す図面である。
【０１６６】
図3Aは純化前の結果を示す。図3Bは純化後の結果を示す。IE/gは、膵臓１グラム当りの収量膵島の平均個数を示す。【０１６７】
【図４】図4Aは、心停止ドナーからの膵島移植前後の患者6人のHbAlc値の変化を示した図面である。各患者のデータは異なる記号により区別されている。図4Aの縦軸は、ヘモグロビン全体に対するHbAlcの割合を表す。点線は正常上限値を表す。
【０１６８】
図4Bは、グルカゴン刺激試験におけるC−ペプチド値（平均値）を示す。■は基礎値、□は刺激後の値を示す。【０１６９】
【図５】図5Aは朝食前及び夕食前の血糖値を膵島移植前後で測定した結果を示す図面である。図5Aの２つの点線は、正常範囲を表す。◆は朝食前、■は夕食前の値を示す。
【０１７０】
図5Bは膵島移植前後における患者の１日あたりのインスリン量を示した図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７１】
以下、本発明を更に明確にするために、実施例及び実験例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。【０１７２】
材料及び手順
・  材料
1(1)：保護液又は保存液
UW液（ViaSpanTM、DuPont 製）、及び、ET-Kyoto液（キョウトソリューション、株式会社キョウトバイオメディカルサイエンス）を使用した。【０１７３】
更に、ET-Kyoto液１Lに、100,000単位（U）のウリナスタチン（Ulinastatin、ミラクリッドTM、持田製薬株式会社）を添加して、ET−Kyoto＋ウリナスタチン液（以下、M-Kyoto液ともいう。）を調製した。【０１７４】
UW液、ET-Kyoto液、及び、M-Kyoto液に含まれる主な成分の組成及び浸透圧を下記表１に示す。【０１７５】
【表１】
0004324679.tif 000002
【０１７６】
また、ET-Kyoto液１Lに、0.4〜8mMの4-[2-aminoethyl］benzenesulfonyl]fluoride.HCL（AEBSF、ペファブロックTM、Roche製）を添加して、ET−Kyoto＋ペファブロック液を調製した。【０１７７】
また、ET-Kyoto液１Lに1000mgのメシル酸ガベキサート（Gabexate mesilate、FOYTM、小野薬品工業製）を添加して、ET−Kyoto＋FOY液を調製した。【０１７８】
1(2)．純化溶液
ファイコール液（Ficoll液）は、濃度の異なる２種類のファイコール（FicollTM、Pharmacia社製）溶液（ハンクス溶液で希釈したもの）を混合し、軽い比重がおよそ1.07-1.08、重い比重が1.09-1.12となるように調製した。【０１７９】
また、ET-Kyoto液に、60重量％イオディキサノール（Iodixanol）水溶液（ OptiPrepTM、AXIS-SHIELD社製）を混合して、ET-Kyoto＋イオディキサノール液（以下、I-Kyoto液ともいう。）を調製した。【０１８０】
また、M-Kyoto液に、60重量％イオディキサノール水溶液（ OptiPrepTM、AXIS-SHIELD社製）を混合して、ET−Kyoto＋ウリナスタチン＋イオディキサノール液（以下、MI-Kyoto液ともいう。）を調製した。また、ET−Kyoto液に、4-[2-aminoethylbenzenesulfonyl]fluoride.HCL（ペファブロックTM、Roche製） 及び、60重量％イオディキサノール水溶液（OptiPrepTM、AXIS-SHIELD社製）を混合して、ET−Kyoto＋ペファブロック＋イオディキサノール液（Kyoto＋AEBSF＋Idx液）を調製した。【０１８１】
ET-KYOTO溶液の比重はおよそ1.04、イオディキサノール溶液の比重は約1.32であり、これらを混合する場合は、両液の比率を変えることで、軽い比重がおよそ1.07-1.08、重い比重が1.09-1.12となるように調製した。【０１８２】
2.ブタ膵島分離手順
ブタ膵島分離は以下の手順で行った。【０１８３】
ブタの膵臓を京都市内の屠殺場で取得した。膵臓を取得した後、(1)すぐに二層法により二層が形成された容器中に保存するか、もしくは、(2)取得直後の膵臓にカテーテルを1本挿入し、カテーテルを通して膵管保護液を該膵臓の主膵管に注入した後、速やかに、二層法により、PFCと保存液により二層が形成された容器中に保存した。(2)において、膵管保護液の注入量は、膵重量1グラム当り1mlとした。【０１８４】
ここで、心停止から膵臓が保存液に浸けられるまでの時間を温疎血時間と定義する。また、膵臓が保存液に浸けられてから、膵島分離が始まるまでの時間を冷疎血時間と定義する。【０１８５】
前記二層法で保存した膵臓を、京都大学の膵島分離施設に運んだ後、殺菌した。【０１８６】
ついで、該膵臓の主膵管に冷コラゲナーゼ溶液（リベラーゼHITM、Roche Molecular  Biochemicals社製）を注入し、溶液を還流して、膵臓を膨化した。【０１８７】
該膨化した膵臓を、九つに切り分けた後、リコルディーチャンバー(Ricordi chamber)に入れた。該チャンバー内において、回路を溶液で満たし、閉鎖系とした。溶液をポンプで循環させながら、溶液の温度を37℃程度に上昇させて、コラゲナーゼを活性化し、リコルディ-チャンバーを通してコラゲナーゼ溶液を繰り返し循環させて、膵組織の分解を行った。分解操作は、膵島を構成する細胞が凝集している形態を保ったまま、膵外分泌腺組織だけが膵島の周囲より解離する時点で、停止させた。【０１８８】
分解の停止は、回路を開放系として、ヒトアルブミンを含んだ室温の溶液を回路内に通すことにより、溶液の温度を下げ、コラゲナーゼを不活化することで行った。【０１８９】
室温の溶液を回路内に通して、分解を停止した後、膵組織を回収した。【０１９０】
リコルディーチャンバー内に膵臓を設置してから、分解された膵臓の回収が始まるまでの時間を、第1相とした。【０１９１】
また、回収の始まりから終了までの間を第2相とした。【０１９２】
回収した膵組織は、遠心分離器にて遠心洗浄し、集めて濃縮した。【０１９３】
血球洗浄装置（COBE2991セルプロセッサー、ガンブロ株式会社）内に、密度勾配剤を含む純化溶液を用いて、連続比重濃度勾配を形成した。【０１９４】
ついで、前記洗浄濃縮した膵組織を、該密度勾配が形成された溶液中に添加した。【０１９５】
連続比重遠沈法を用いて、遠心分離を行ない、膵島と膵外分泌腺組織を分離させ、膵組織から膵島を分離して、純化を行った。その後、血球洗浄装置内の溶液を分画ごとに採取し、検鏡によってどの分画に膵島が存在するかを判定し、膵島を回収した。【０１９６】
3．評価方法
膵島の収量と純度は、ディチゾン(dithizone）染色によって評価した。膵島収量は、ディチゾン(dithizone）染色の後、200ｍｌに懸濁した溶液から100マイクロのサンプルを取り、顕微鏡下で大きさごとに数えた。純度（purity）は、膵島、膵島以外の外分泌組織、膵管などのすべてを含む全体における膵島の割合で示した。【０１９７】
膵島の大きさ（Islet size)は、大きさごとに数えた膵島を平均化した。【０１９８】
純化効率は、純化後の膵島の数を純化前の膵島の数で割った値とした。【０１９９】
形態スコア（全体の形態学的な評価）は、形状（平坦vs.球状）、辺縁（粗造vs.良好な丸みがある）、全体性（断片化vs.かたまり／密集）、染色度（不均一vs.均一）及び直径（全て＜100μｌvs.＞10％＞200μｌ）について、二人の調査員によるスコアリングで質的に評価した。それぞれのパラメーターを0から2まで設定し、ゼロが最低点で2が最高点とした。従って、膵島分離の総計の最低点は0点であり、最高点は10点である。球状なもの、良好な丸みがあるもの、かたまり若しくは密集しているもの、均一に染色されているもの、直径の大きいものが好ましい膵島として特徴づけして、スコア化した。【０２００】
膵島のViabilityはアクリディンオレンジ(acridine orange)（10μmol/L）とプロピディウムアイオダイド(propidium iodide)（15μmol/L）(AO/PI)染色を用いて、生存している細胞と死んでいる細胞とを同時に可視化し、評価した。50個の膵島を調査し、それぞれのViabilityを視覚的に決定し、続いてそれらの平均を計算した。【０２０１】
刺激指数（Stimulation Index）は、低グルコース濃度と高グルコース濃度におけるインシュリン分泌の比率から導き出した。【０２０２】
膵島の機能はShapiroとColleaguesにより書かれた方法に準じて、糖負荷に対する純化膵島のインシュリン分泌反応をモニタリングすることによって評価した。略説すると、37℃と5％CO2の環境で、100個の膵島同等物（Islet Equivalents,IE) をCMRL溶液で培養し、更に、2.8mM エーテルか20mMエーテル及び20mMグルコースの入ったRPMI1640溶液（GIBCO BRL社）にて2時間、37℃と5％CO2の環境で培養を行った後、上澄みを採取し、ELISAキット（森永生化学工業株式会社）による抗原抗体反応を利用してインシュリン値の計測を行った。【０２０３】
実施例及び実験例により得られる値は、平均値と標準偏差（means+SE）により示した。3グループ間はmean of ANOVAとFisher’s PLSD post-hoc testにて比較した。P値は0.05より小さい値を有意とした。【０２０４】
実施例1：膵管保護に関する検討
膵管保護の有無に関する比較検討を行うために、上記手順において、膵臓を取得した後、(1)すぐに二層法により保存するか（膵管保護無し）、もしくは、（2）取得後直ぐに膵臓の主膵管に保護液を注入した後、二層法により保存する（膵管保護有り）のいずれかとする以外は、同様の手順として比較実験を行った。【０２０５】
該実験において、膵管保護液は、M-Kyoto液を用いた。また、二層法は、M-Kyoto液とPFC液を用いた。また、純化溶液は、Ficoll溶液を用いた。【０２０６】
該実験における純化前後の膵島収量を図1（1A：純化前、1B純化後）並びに下記表に示す。IE/gは、膵臓１グラム当りの膵島の平均個数である。【０２０７】
【表２】
0004324679.tif 000003
【０２０８】
表2に示されるように、純化前後いずれにおいても、膵管保護を行った場合（膵管保護有り）の方が、膵管保護を行わなかった場合に比べて、膵島収量が有意に高いことがわかった。【０２０９】
他の膵島の特色を、下記表3に示す。【０２１０】
【表３】
0004324679.tif 000004
【０２１１】
表3に示されるように、他の膵島の特色において、2つのグループの間に有意な差異はみられなかった。【０２１２】
実施例2．二層法保存に関する比較検討 
二層法に用いる溶液の違いを比較検討するために、二層法に用いる液を、下記表4に示すものとする以外は、同様の手順を用いて、比較検討を行った。尚、M-UW液は、UW液１Lに、100,000単位（U）のウリナスタチンを添加して得た。【０２１３】
実験は、以下の手順で行った。【０２１４】
膵島は、300から380g重量の近親交配雄Lewisラット（Chaeles River Laboratories, Wilmington, MA）から分離した。ラット試験は、京都大学大学院医学研究科審査委員会で承認を受けた。共通の胆管を24ゲージカテーテル（Baxter、Deerfield,IL）を用いて挿入し、固定し、次いで、末端を締めた。膵臓、脾臓、及び十二指腸をまとめて取り除き、各溶液に保存した。膵臓は、4 ℃で6時間保存した。膵島はSawada（Transplantation.2003;75(12):1965-1969）の改変法を用いて分離した。保存後、各膵臓を2mg/mLのコラゲナーゼ溶液（24mg of Serva collagenase; Serva, Heidelberg,Germany）を 12mLのHanks’平衡塩類溶液（HBSS）に入れたものを用いて膨化した。脾臓及び十二指腸を取り除き、膵臓を50mLの円錐チューブにて、振動させず37 ℃で22分、インキュベートした。分解された膵臓を、UW溶液で、遠心分離（150g、3分、8℃）により、3度洗浄した。次いで、M-Kyoto液にIodixanol（OptiprepTM、Nycomed  Pharma AS, Olso, Norway）を加えた溶液を用いて、非連続密度勾配（1.030,1.095,1.105,1.125g/cm3）を形成させて、純化した。得られた膵島収量は、ディチゾン(dithizone）染色により、評価した。【０２１５】
純化後の膵島収量の結果を図2並びに下記表4に示す。IE/pancreasは膵臓一つあたりから取れる膵島の総収量を示す。【０２１６】
【表４】
0004324679.tif 000005
【０２１７】
表４及び図２に示されるように、二層法保存においてM-Kyoto液を用いた場合、純化後の膵島収量が顕著に高くなることがわかった。【０２１８】
実施例3：分離プロトコールに関する検討
3-1．プロトコールの概要
上記ブタ膵島分離手順において、以下の3つの分離プロトコールを用い、比較検討を行った。【０２１９】
C1プロトコール
・膵管内への保護液の注入は行わなかった。
・二層法は、UW液、及び、パーフルオロカーボン液（PFC）を用いた。
・純化溶液は、ファイコール液を用いた。【０２２０】
C2プロトコール
・膵管へ保護液を注入し、膵管の保護を行った。保護液は、M-Kyoto液を用いた。
・二層法は、M-Kyoto液、及び、パーフルオロカーボン液（PFC）を用いた。
・純化溶液は、ファイコール液を用いた。【０２２１】
Kyotoプロトコール
・膵管に保護液を注入し、膵管の保護を行った。保護液は、M-Kyoto液を用いた。
・二層法は、M-Kyoto液、及び、パーフルオロカーボン液（PFC）を用いた。
・純化溶液は、I-Kyoto液を用いた。【０２２２】
各プロトコールの特色を下記表５に示す。【０２２３】
【表５】
0004324679.tif 000006
【０２２４】
3-2．プロトコールの比較
3-2(1)．分離過程の特色
各プロトコールにおける分離過程の特色を表６に示す。【０２２５】
【表６】
0004324679.tif 000007
【０２２６】
表中、*は、温疎血時間において、C1プロトコールは、 C2プロトコール（P＜0.01）、Kyotoプロトコール（P＜0.01）より有意に短かったことを示す。【０２２７】
** は、冷疎血時間において、C1プロトコールは、 C2プロトコール（P＜0.01）、Kyotoプロトコール（P＜0.01）より有意に長かったことを示す。【０２２８】
*** は、第Ｉ相において、C1プロトコールは、 C2プロトコール（P＜0.02）、Kyotoプロトコール（P＜0.01）より有意に長かったことを示す。【０２２９】
膵臓の大きさ及び操作時間は、３つのプロトコール間で目立った差異は無かった。【０２３０】
温疎血時間は、C1プロトコールが、膵管内注入工程がないため、他のプロトコールより、有意に短かった。しかし、冷疎血時間は、カテーテルの挿入が必要であることから、C1プロトコールが、他のプロトコールより有意に長かった。【０２３１】
第1相は、C1プロトコールが特に長かった。しかし、第２相は、３つのプロトコール間でほぼ同じであった。【０２３２】
3-2(2)膵島収量
各分離プロトコールにおける純化前後の膵島収量を、下記表7並びに図3A及びBに示す。IE/gは、膵臓１グラム当りの収量膵島の平均個数である。【０２３３】
【表７】
0004324679.tif 000008
【０２３４】
表7及び図3に示されるように、純化前の膵島収量は、C2プロトコールとKyotoプロトコールが、C1プロトコールより有意に高い値となった（図3A）。
また、純化後の膵島収量は、Kyotoプロトコールが、C1プロトコールと、C2プロトコールより有意に高かった（図3B）。
3-2(3)膵島の特色
分離した膵島の特色を、下記表8に示す。【０２３５】
【表８】
0004324679.tif 000009
【０２３６】
表中、*は、形態スコアにおいて、KyotoプロトコールがC1プロトコール（P<0.03）より有意に高かったことを示す。【０２３７】
**は、純化効率において、Kyotoプロトコールが、C1プロトコール（P<0.05）及びC2プロトコール（P<0.01）より有意に高かったことを示す。【０２３８】
*** は、純化後の膵島の大きさにおいて、Kyotoプロトコールが、C2プロトコール（P<0.04）より有意に大きかったことを示す。【０２３９】
表8に示されるように、刺激指数、Viability、純度、及び純化前の膵島の大きさにおいて、３つのプロトコール間で有意な差はなかった。【０２４０】
しかし、形態スコアと純化効率、そして純化後の膵島の大きさにおいて、Kyotoプロトコールの結果が特に優れることがわかった。【０２４１】
3-2(4)．純化速度
各分離プロトコールにおける純化速度を調べた結果、Kyotoプロトコールでは、純化溶液を60ml/minの速度でCOBE2991セルプロセッサーに運搬することができた。【０２４２】
一方、純化溶液としてファイコール溶液を用いたC1及びC2プロトコールでは、純化溶液の運搬速度は10〜20ml/minであった。【０２４３】
この結果から、密度勾配剤としてイオディキサノールを用いる場合、膵島の純化の速度が3〜6倍速くし得ることがわかった。これは、イオディキサノールを用いた純化溶液の粘度が低いことが主な要因と考えられた。【０２４４】
実施例4．プロテアーゼ阻害剤に関する検討
プロテアーゼ阻害剤の種類を検討するために、更に以下の試験を行った。【０２４５】
主膵管に注入する保護液、及び、二層法による保存液を表９に記載するものとする以外は、上記Kyotoプロトコールと同様の手順によって、膵島の収量を評価した。【０２４６】
【表９】
0004324679.tif 000010
【０２４７】
その結果、膵管に注入する保護液にプロテアーゼ阻害剤を添加した場合、膵島の収量が向上することがわかった。【０２４８】
特に、プロテアーゼ阻害剤がウリナスタチン及びメシル酸ガベキサートである場合、膵島の収量が格段に向上することが分かった。【０２４９】
また、主膵管に注入する保護液、及び、二層法による保存液として、ET-Kyoto+メシル酸ガベキサート液を用いた場合には、分離膵島について純度89％、Viabilityについて90％の値が得られた。【０２５０】
実施例5：純化に関する検討
純化溶液を変えて、更に、以下の検討を行った。【０２５１】
上記ブタ膵島分離手順において、純化溶液を表10に記載するものとする以外は、上記Kyotoプロトコールと同様にして、純化効率を、前述の方法で評価した。【０２５２】
【表１０】
0004324679.tif 000011
【０２５３】
表10に示されるように、純化溶液としてプロテアーゼ阻害剤を含む溶液を用いる場合、純化効率が向上することがわかった。【０２５４】
特に、MI-Kyoto液を用いた場合、換言すると、プロテアーゼ阻害剤としてウリナスタチンを用いた場合には、純化効率が格段に向上することが分かった。【０２５５】
また、I-Kyoto液を用いた場合と同様に、MI-Kyoto液を用いた場合においても、純化溶液を60ml/minの速度でCOBE2991セルプロセッサーに運搬することができた。【０２５６】
実施例6：ヒト膵島分離
6-1．ヒト膵島分離手順
下記の点以外はブタ膵島分離と同様の手順で、ヒトの膵島分離を行った。【０２５７】
13人分のヒトの膵臓は、日本臓器移植ネットワークの中日本支部及び西日本支部より、インフォームドコンセントを経て、心停止後のドナーから、入手した。【０２５８】
ドナーの鼠径部の血管より膵臓を急速に冷却する為カテーテルを挿入し、心臓が停止してから膵臓が摘出されるまで、そのカテーテルから冷乳酸リンゲル液を注入し、還流した。【０２５９】
次いで膵臓を摘出し、直ぐにカテーテルを1本挿入し、M-Kyoto液を膵重量1グラム当り1mlの量で主膵管に注入した後、速やかに、膵臓を二層法保存容器中の保存液に浸漬し、膵臓を、GMPレベルの京都大学人膵島分離施設（Center for Cell and Molecular Therapy)に運搬した。二層法は、M-Kyoto液とパーフルオロカーボン液（PFC)を用いた。【０２６０】
評価方法は、上記ブタ膵島分離における方法と同様とした。また統計学的評価もブタ膵島分離と同様とした。【０２６１】
6-2．分離プロトコール
ヒト膵島分離においては、13例中2例でC2プロトコール、13例中11例でKyotoプロトコールを用いた。【０２６２】
6-3．ヒトドナー及び膵臓の特色
ドナーの平均年齢は、44+4歳であった。ICU滞在期間は11+3日であった。BMIは21+1kg/m2であった。膵臓の大きさは87+6gであった。全てのドナーで血液生化学値（average blood chemistry value）に異常が見られた。【０２６３】
また、温疎血時間は7+3分であった。冷疎血時間は256+18分であった。冷乳酸リンゲル溶液による即時の還流により、温疎血時間は全ての膵臓で最小であった。また、冷疎血時間は、全てで６時間より短かった。【０２６４】
2つのプロトコール間でドナー条件、並びに、温疎血時間及び冷疎血時間における有意な差はなかった。【０２６５】
6-4．分離プロトコールの評価
2つのプロトコール（C2プロトコール、Kyotoプロトコール）における、ヒト膵島分離の評価結果を表11に示す。膵島数（IE）は、膵島の総収量を示す。【０２６６】
【表１１】
0004324679.tif 000012
【０２６７】
純化前後の膵島収量は、2つのプロトコール間で有意な差異はなかった。純度、Viability、形態スコアも、2つのプロトコール間で同様の結果であった。【０２６８】
純化効率は、Kyotoプロトコールの方が、C2プロトコールの1.6倍高かった。また、エンドトキシンレベルは、Kyotoプロトコールの方が、C2プロトコールより低かった。【０２６９】
純化速度は、Kyotoプロトコールでは、純化溶液を60ml/minの速度でCOBE2991セルプロセッサーに運搬することができた。一方、C2プロトコールにおける速度は10〜20ml/minであった。【０２７０】
この結果から、純化溶液としてI-Kyoto液を用いる場合に、膵島の純化速度が3〜6倍速くなることが、ヒト膵島分離においても確認できた。【０２７１】
更に、純化溶液に関して、以下の試験を行った。【０２７２】
上記ヒト膵島分離において、純化溶液を表12に記載するものとする以外は、Kyotoプロトコールと同様にして、純化効率及び膵島の収量について評価した。【０２７３】
【表１２】
0004324679.tif 000013
【０２７４】
表12に示されるように、純化溶液としてプロテアーゼ阻害剤を含む溶液を用いる場合、ヒト膵島分離においても純化効率が向上することがわかった。更に膵島の収量も向上することがわかった。【０２７５】
6-5．移植適合基準
移植適合基準は、エドモントン・プロトコールに準じて、以下のように設定した。
・膵島量＞5,000 IE/kg（患者体重）
・純度＞ 30 %
・組織量＜ 10 mL
・Viability＞70 %
・エンドトキシン＜5 IE/kg（患者体重）
・グラム染色陰性
上記基準に対し、膵島量を除き、13例全てが移植適合基準を満たしていた。【０２７６】
6-6．1型糖尿病患者に対する膵島移植
上記13例のうちの11例、即ち、C2プロトコールにより分離した膵島の1例、及び、Kyotoプロトコールで分離した膵島の10例を、6人の１型糖尿病患者に移植した。残りの2例の膵島分離分については、凍結保存した。【０２７７】
6人のうち4人の患者は複数のドナーから膵島を移植した。2人の患者は単一のドナーから膵島を移植した。【０２７８】
膵島移植後の評価は以下の方法で行った。【０２７９】
血清血糖値、インシュリン必要量、そしてヘモグロビンA1c（HbAlc）を移植前後で、日単位で評価した。またグルカゴン刺激試験を移植前と、第1回目の移植後30、60日後、第2回目の移植後30日と60日の間隔で行った。グルカゴン刺激試験において、1mgのグルカゴン注射の直前と6分後に、Cペプタイド計測用に採血を行った。【０２８０】
6-7．膵島移植後の評価
膵島移植後、患者6人全てが、低血糖による意識消失を生じずに、血中グルコースコントロールの改善ができた。また、全ての移植例で、C-ペプチド計測に基づくインスリン分泌の開始が認められた。【０２８１】
移植時の平均のインシュリン量は39.2+3.2単位であったが、11.0+4.4単位に減少した（P<0.0005）。2人の患者がインシュリンフリーとなり、他の2人の患者はインシュリン量が10単位より少なくなり、他の2人の患者もインシュリン量が減少した。【０２８２】
6人の患者全てのHbAlcレベルが徐々に減少し、6名全てにおいて、単独ドナーであるか又は複数ドナーであるかに拘らず、HbAlcのレベルは膵島移植から3ヶ月程度で正常となっていた（図4Ａ）。【０２８３】
6人の患者の平均のHbAlcレベルは著しく改善し、移植時の7.5+0.4％から5.1+0.2％まで改善した（P<0.0003）。【０２８４】
全ての患者が移植前は、検知できない程度のC-ペプチド値（＜0.1ng/ml）を有していたが、移植後はC-ペプチド値が明確となった。第1回目の移植後のC-ペプチド値は、基礎値が0.29+0.06 ng/ml、刺激後の値が0.52+0.11 ng/mlであった（N=6）（図4B）。C-ペプチド値は、2回目の膵島移植後、基礎値及び刺激後の値の双方で、１回目より著しく改善されていた。第2回目の移植後のC-ペプチド値は、基礎値が0.75+0.12 ng/ml（P<0.01）、刺激後の値が1.45+0.26 ng/ml（P<0.005）であった（N=3）（図4B）。【０２８５】
6-8．膵島移植の臨床経過
膵島移植の臨床実施を上記Kyotoプロトコールに則って行った。また、同患者に対する2度目の移植を約2ヶ月後に同様に行った。【０２８６】
1回目の移植の膵島収量は354,384 IE、2回目は474,234 IEであった。【０２８７】
レシピエントは36歳女性で、22年間1型糖尿病であり、頻繁な重い低血糖発作のエピソードと糖尿病性網膜症の病歴があった。【０２８８】
腎機能は正常でクレアチニンレベルは0.7 mg/dlであった。daclizumabの代わりにbasiliximab 20mgを用いる以外はエドモントン・プロトコールに則って、免疫抑制剤を、術後0日目と4日目に投与した。【０２８９】
移植前血糖値のコントロール（対照）のため、約2年前の約2ヶ月間の朝食前と夕食前の血糖値を測定しておいた。【０２９０】
膵島移植前の血糖値は、非常に不安定で、20 mg/dlから400 mg/dlの広がりがあった。【０２９１】
しかし、1回目の移植後、血糖値は狭い範囲内に維持されるようになり、50mg/dlから150mg/dlの狭い範囲に落ち着いてきた（図5A）。【０２９２】
移植前のインスリン必要量は30から40 unit/dayであったが、１回目の移植後1ヵ月でインスリン服用量を10 unit/dayまで徐々に減少させることができた。更に、2回目の移植後20日目には完全に止めることができ、患者はインシュリン離脱に至った（図5B）。【０２９３】
トランスアミナーゼ値は1回目の移植後一時的に上昇したが100 mg/dl以上にはならず、3週間以内に正常値に戻った。クレアチニン値は1.0 mg/dl以下にとどまり、BUN（blood urea nitrogen）は観察期間中を通してずっと正常値を維持していた。【０２９４】
上記結果から明らかなように、本発明によって、膵島の純化効率が向上し、移植適合基準を満たす膵島の収量が向上することが確認できた。更に、純化速度が向上し、膵島分離が、短時間で効率よく実施できることが確認できた。【０２９５】
更に、本発明によって心停止ドナーから質量共に良好な膵島が取得し得ることが確認できた。更に、ヒト心停止ドナーからの膵島移植において良好な成績が得られることが確認できた。
【図１】
0004324679.tif 000014
【図２】
0004324679.tif 000015
【図３】
0004324679.tif 000016
【図４】
0004324679.tif 000017
【図５】
0004324679.tif 000018