(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸から選択されるウロン酸又はそれらのラクトンを酸性〜中性の条件下で８０〜１５０℃、数分〜数日加熱処理して得られる、がん細胞増殖抑制活性を有する加熱処理物。
【請求項２】
アルギン酸を酸性〜中性の条件下で８０〜１５０℃、数分〜数日加熱処理して得られる加熱処理物より、分子量５００以下の画分を調製して得られる、がん細胞増殖抑制活性を有する加熱処理物。
【請求項３】
ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸から選択されるウロン酸又はそれらのラクトンを酸性〜中性の条件下で８０〜１５０℃、数分〜数日加熱処理する工程を包含することを特徴とする、がん細胞増殖抑制活性を有する加熱処理物の製造方法。
【請求項４】
アルギン酸を酸性〜中性の条件下で８０〜１５０℃、数分〜数日加熱処理する工程、および前記の工程で得られる加熱処理物より分子量５００以下の画分を調製する工程、を包含することを特徴とする、がん細胞増殖抑制活性を有する加熱処理物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明の目的は、制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する安全性の高い生理活性物質含有物を開発し、該含有物を含有する、生理的効果に優れた機能性食品又は飲料を提供することにある。また本発明は該含有物を有効成分とする抗菌剤、歯磨剤、防腐剤、アポトーシス誘発剤、制がん剤、抗潰瘍剤を提供する。また本発明はアポトーシス機構解明、アポトーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトーシス誘発方法も提供し、本発明の生理活性物質含有物質の製造方法も提供する。
従来の技術
近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptosis、アポプトーシスともいう；自爆死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。
このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれている死であると考えられている。すなわち何らかの外部的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を基にプログラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したプログラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。
このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることができれば、不要若しくは病原細胞、例えばがん細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する安全性の高い生理活性物質含有物を開発し、該含有物の製造方法及び該含有物を含有する食品又は飲料を提供することにある。また本発明の目的は該化合物を含有する抗菌剤、アポトーシス誘発剤等の医薬品、及び該含有物を有効成分として使用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）より選択される少なくとも１種の物の加熱処理物である。
（ａ）ウロン酸又はウロン酸誘導体、
（ｂ）ウロン酸含有糖化合物又はウロン酸誘導体含有糖化合物、
（ｃ）ウロン酸含有糖化合物含有物又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物。
本発明の第２の発明は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）より選択される少なくとも１種の物を加熱処理する工程を包含することを特徴とする加熱処理物の製造方法である。
（ａ）ウロン酸又はウロン酸誘導体、
（ｂ）ウロン酸含有糖化合物又はウロン酸誘導体含有糖化合物、
（ｃ）ウロン酸含有糖化合物含有物又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物。
本発明者らはウロン酸、ウロン酸誘導体、ウロン酸含有糖化合物、ウロン酸誘導体含有糖化合物、ウロン酸含有糖化合物含有物又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物から選択される少なくとも１種の物の加熱処理物（以下、本発明の加熱処理物と称す）が強い制がん作用、アポトーシス誘発作用、抗菌作用、抗潰瘍作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】
図１はペクチン加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図２は透析処理前後の試料のがん細胞に対する作用を示すものである。
図３は限外ろ過ろ液のがん細胞に対する作用を示すものである。
図４はゲルろ過画分のがん細胞に対する作用を示すものである。
図５はウロン酸加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図６はウロン酸加熱処理時のｐＨと加熱物のがん細胞に対する作用の関係を示すものである。
図７はペクチンの酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図８はペクチンの酸性下加熱処理物の溶媒抽出画分のがん細胞に対する作用を示すものである。
図９はペクチンのアルカリ性下に次いで酸性下での加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図１０はガラクツロン酸の酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図１１はグルクロン酸の酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図１２はペクチン加熱処理液Ｉのがん細胞に対する作用を示すものである。
図１３はグルクロン酸加熱処理物の希釈倍数と細胞生存率の関係を示すものである。
図１４はアルギン酸加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。
図１５はペクチン加熱処理物の白血病細胞株に対する制がん作用を示すものである。
図１６はウロン酸加熱処理物の白血病細胞株に対する制がん作用を示すものである。
図１７はウロン酸加熱処理物の分化誘導作用を示すものである。
発明の実施の形態
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明において、ウロン酸、ウロン酸誘導体、ウロン酸含有糖化合物、ウロン酸誘導体含有糖化合物、ウロン酸含有糖化合物含有物又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物とは、その加熱処理物が制がん作用、アポトーシス誘発性等を有し、その加熱処理物中に制がん活性物質及び／又はアポトーシス誘発性物質が生成されれば特に限定はない。
ウロン酸はグリクロン酸ともいい、アルドースのアルデヒド基はそのままにして他端の第１アルコール基だけをカルボキシル基に酸化したヒドロキシアルデヒド酸の総称であり、天然では動植物の各種の多糖の構成成分として存在する。ウロン酸を含有する多糖としては、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、フコイダン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硝酸等があり、種々の生理機能が知られている。
本発明で使用することができるウロン酸は特に限定されるものでなく、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸等があり、ウロン酸の誘導体としては、それらのラクトン、それらのエステル、それらのアミド、それらの塩等があり、加熱処理により制がん活性物質及び／又はアポトーシス誘発活性物質を生成する物は全て本発明の誘導体に包含される。ウロン酸のラクトンとしてはグルクロノ−６，３−ラクトン（以下グルクロノラクトンと略記する）、マンヌロノ−６，３−ラクトン、イズロノ−６，３−ラクトン等が例示される。ウロン酸エステルとしては、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルエステル等がありウロン酸より製造することができる。又ウロン酸のアミド化によりウロン酸アミドも製造することができる。更にこれらの塩は常法により製造することができる。
次に本明細書において、ウロン酸、ウロン酸誘導体を含有する糖化合物とは、ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物を意味し、それらは特に限定されるものでなく、例えばペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、フコイダン、コンドロイチン硝酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、それらの化学的、酵素的、物理的処理物である、その分解物、分解物の誘導体、分解物の塩を使用することができる。
前記の化学的な処理方法としては、原料糖化合物を例えば室温〜２００℃で数秒〜数時間、好ましくは５０〜１３０℃で数秒〜６０分処理すれば良く、ペクチンの場合、例えばｐＨ６．８、９５℃で数分〜数十分処理することによりβ−脱離反応が生じ、２３５ｎｍ付近の吸光度が増大した不飽和ウロン酸及び／又は不飽和ウロン酸エステルを有する糖化合物が得られる。本発明の糖化合物にはウロン酸及び／又はウロン酸エステルを含有する多糖類のβ−脱離反応により生成する非還元末端に不飽和ウロン酸及び／又は不飽和ウロン酸エステルを含有する糖化合物が含まれる。
また前記の酵素学的な処理方法としては、原料糖化合物のウロン酸及び／又はウロン酸エステル含有多糖加水分解酵素によるウロン酸及び／又はウロン酸エステル含有多糖の公知の分解が挙げられる。また、ウロン酸及び／又はウロン酸エステル含有多糖リアーゼによるウロン酸及び／又はウロン酸エステル含有多糖の公知の分解が挙げられる。例えばペクチン、ペクチン酸の場合、各々公知のペクチンリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１０）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）、エキソポリガラクツロン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．９）で分解することによって、非還元末端に４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキス−４−エノピラノシル  ウロネート（4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyl uronate）又はそのメチルエステルを有する糖化合物が得られる。また、ヒアルロン酸の場合はヒアルロン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．１）、アルギン酸の場合はアルギン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．３）が使用される。この非還元末端に４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘキス−４−エノピラノシル  ウロネート又はそのメチルエステルを有する酵素分解物も本発明の糖化合物に包含される。
更に前記の物理的な処理方法としては、原料糖化合物の近赤外線、赤外線、マイクロ波、超音波処理等が挙げられ、例えばペクチン及び／又はペクチン酸をｐＨ中性又はアルカリ性の溶液中に入れ、温度は適宜、室温以上で、適宜還元下、例えばアスコルビン酸存在下で、時間は１秒以上、好ましくは５秒〜１時間の超音波処理をし、振動エネルギーを与えることが挙げられる。なお超音波以外にもマイクロ波、近赤外線、赤外線等の照射も有効で、これらを組合せ照射しても良い。照射は連続的に行っても良く、断続的に行っても良い。
また本発明においてはこれらのウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の含有物、例えば果物、果物果皮、果物搾汁かす、野菜、野菜搾汁かす、海藻等をそのまま、あるいは乾燥、粉砕して用いても良く、またこれらのウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の含有物よりのウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。これらのウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の抽出液の調製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えば良く、特に限定はない。
ウロン酸又はウロン酸エステルを含有する糖化合物含有物としてはリンゴ、例えばミカン、レモン等の柑橘類、バナナ、白菜、キャベツ、レタス、シソ、カボチャ、セロリ、ゴボウ、エシャロット、ブロッコリー、ピーマン、ほうれん草、人参、人参の葉、大根の葉、茶、ゴマ、マメ、イモ等の双子葉類植物の果実、野菜、葉、種実等、麦、米等の単子葉植物の穀物、褐藻類、例えば昆布、ワカメ等、紅藻類、緑藻類、単細胞緑藻類等の藻類、微生物としてはリオフィラム  ウルマリウム、ハタケシメジ、ナメコ、シイタケ、エノキタケ、ヒラタケ、マッシュルーム等の担子菌類、サナギタケ、ノムシタケ等の子のう菌類、酵母、糸状菌、例えば麹菌、細菌、例えば納豆菌、乳酸菌等、動物としては脊椎動物又は無脊椎動物が例示され、本発明においては、これらの植物、微生物又は動物由来のウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の含有物を使用することができる。
ウロン酸、ウロン酸誘導体を含有する糖化合物である多糖類は公知の化学的、酵素学的、物理的な処理方法により製造することができる。例えばペクチンとしては、例えば柑橘類の果皮及びリンゴの果実より抽出される高分子の多糖類を使用することができる。工業的なペクチン製造の原料はフルーツで、レモン、ライム等の柑橘類のジュースのしぼりかす（主として内果皮）が用いられるほか、リンゴのジュースのしぼりかすも用いられている。ジュースのしぼりかすには主として不溶性のプロトペクチンが含まれており、製造の段階でこれを可溶化（抽出）し、ペクチンを調製する。可溶化は酸性の温水〜熱水で抽出することによって行うことができ、抽出時の温度、ｐＨ、時間条件を原料に合わせてコントロールすることにより、分子量やエステル化度の一定なペクチンを高収量で製造することができる。抽出液は遠心分離やろ過によって精製し、濃縮後アルコールを添加してペクチンを沈殿させ回収することができる。回収された沈殿を乾燥、粉砕し、所定の乾燥ペクチンを調製することができる。
ペクチンの主構造は、部分的にメチル化されたガラクツロン酸のポリマーである。カルボキシル基はメチルエステル化されたり、フリーの酸のままか、あるいはアンモニウム塩、カリウム塩、又はナトリウム塩化されている。ペクチンはメチルエステル化度（ＤＭ度：全カルボキシル基に対するメトキシル基の割合）によって、ＤＭ度の高いＨＭペクチン及びＤＭ度の低いＬＭペクチンに分類され〔吉積智司ほか編、（株）光琳発行、新食品開発用素材便覧、第１１４〜１１９頁（１９９１）〕、本発明においては市販の食品添加物ペクチン〔外山章夫編、食品と科学社発行、天然物便覧、第１２版、第１３８頁（１９９３）〕、市販のＨＭペクチン、ＬＭペクチン等（前出の新食品開発用素材便覧）を使用することができる。
ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物の分解物は、公知の化学的、酵素学的、物理的な処理方法により製造することができる。また合成法により合成されるウロン酸、ウロン酸誘導体、オリゴ糖等も本発明に包含されるものである。
本発明に使用する加熱処理物は、（ａ）ウロン酸又はウロン酸誘導体、（ｂ）ウロン酸含有糖化合物又はウロン酸誘導体含有糖化合物、（ｃ）ウロン酸含有糖化合物含有物又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物から選択される物を原料として製造することができる。
本発明の加熱処理物の製造における加熱処理方法としては、ウロン酸、ウロン酸誘導体、ウロン酸含有糖化合物、ウロン酸誘導体含有糖化合物、ウロン酸含有糖化合物含有物及び／又はウロン酸誘導体含有糖化合物含有物を例えば６０〜３５０℃で数秒〜数日、好ましくは８０〜１５０℃で数分〜数日加熱処理すれば良く、ペクチンの場合、例えば８０〜１５０℃で数分〜数日の加熱処理を行うことにより、制がん作用アポトーシス誘発性等の生理活性を有する加熱処理物を得ることができる。またウロン酸、ウロン酸のラクトン、ウロン酸エステルを６０〜１５０℃で数分〜数日加熱処理することにより目的の加熱処理物を得ることができる。
加熱処理時のｐＨは特に限定はないが、中性から酸性下で行うのが好ましく、その原料に応じ加熱処理時のｐＨを調整すればよいが、通常は酸性下の加熱処理により、制がん活性物質、アポトーシス誘発活性物質等の生理活性物質の生成が加速される。
加熱処理時の原料の濃度はその加熱処理により制がん活性物質、アポトーシス誘発活性物質等の生理活性物質を生成しうる範囲内であれば特に限定は無く、操作性、収率等の点を考慮し設定すれば良い。
本発明における加熱処理は湿式加熱でも、乾燥加熱でも良い。湿式加熱としては、水蒸気加熱、水蒸気加圧加熱、加圧式加熱等任意の湿式加熱方法を用いることができる。乾燥加熱としては、乾燥熱風による直接加熱法、熱源から隔壁を通して加熱する間接加熱法等が使用できる。直接加熱方法としては、気流乾熱法、噴霧乾熱法等があり、間接加熱法としてはドラム乾熱法等が使用できる。また本発明の加熱処理物の原料は通常の、煮る、焼く、炒る、煎じる、蒸す、炒める、揚げる等の任意の加熱方法で処理することができる。
本発明の加熱処理物とは上記加熱方法で得られる加熱処理物、及び該加熱処理物中の生理活性物質を含有する画分である。
本発明の加熱処理物中には複数のアポトーシス誘発作用、制がん作用、抗菌作用、抗ウイルス作用等を示す物質が生成されており、また抗酸化作用を有するレダクトン類も、本発明の加熱処理物中に生成される。従って目的に応じて、加熱処理条件を変えることにより、希望する物質を有する本発明の加熱処理物を調製することができる。本発明の加熱処理物はその生理活性を指標に分画でき、例えば加熱処理物の分子量分画を公知の方法、例えばゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により行い、各分子量画分を調製することにより、高活性の本発明の加熱処理物を調製することができる。又、溶媒抽出法、分留法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等により目的の画分を調製することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳ０３８２を用いることにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することによって分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合わせることにより、任意の分子量画分を調製することができる。
本発明の加熱処理物は分子量分画３００００以下の画分に強い制がん活性、アポトーシス誘発活性を有し、特に分子量分画１００００以下の画分、好適には分子量５００以下の画分に強い制がん活性、アポトーシス誘発活性、抗菌活性等が認められ、目的に応じ、本発明の加熱処理物の分子量分画物を本発明の加熱処理物の有効成分として用いることができる。
本発明の加熱処理物はがん細胞増殖抑制活性を有する。本発明の加熱処理物のがん細胞増殖抑制の作用機作は、本発明を何ら限定するものではないが、例えばがん細胞に対するアポトーシス誘発作用も本発明に包含される。
本発明の加熱処理物は、例えばヒト前骨性白血病細胞ＨＬ−６０、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＯＬＴ−３、肺がん細胞Ａ−５４９、ＳＶ４０形質転換肺細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３、肝がん細胞Ｈｅｐ  Ｇ２、結腸がん細胞ＨＣＴ  １１６、ヒト結腸がん細胞ＳＷ４８０、ヒト結腸がん細胞ＷｉＤｒ、胃がん細胞ＡＧＳ、ミエローマ細胞等のがん細胞の増殖抑制作用、アポトーシス誘発活性を有し、本発明の加熱処理物中の制がん活性物質量は制がん活性単位で表示することができる。
本明細書において制がん活性単位とは、本発明の加熱処理液を試料とし、その希釈液０．５ｍｌを用い、２．５×１０5個のヒト前骨性白血病細胞ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地４．５ｍｌに添加し、５％炭酸ガス存在下３７℃で２４時間培養した後、生細胞数を測定し、細胞生存率が対照の５０％になる培地１ｍｌ当たりの制がん活性を１単位と定義し、培地１ｍｌ当たりの制がん活性が１単位と算出される境合、試料１ｍｌは１０単位の制がん活性を有する。
なお、細胞生存率Ｒ（％）は下記式で計算する。
Ｒ＝Ｖs／（Ｖs＋Ｄs）×１００＋Ｄc／（Ｖc＋Ｄｃ）×１００
なお、式中でＶs、Ｄsはそれぞれ試料添加時の生細胞数と死細胞数、Ｖc、Ｄcはそれぞれ水添加時の生細胞数と死細胞数を示す。
本発明の加熱処理物は天然食物由来物質であり、マウスに経口投与、非経口投与を行っても毒性は認められない。
本発明の食品又は飲料とは、特に限定はないが、例えば原料として穀類、いも及びデンプン類、甘味料類、油脂類、種実類、豆類、魚介類、獣鳥鯨肉類、卵類、乳類、野菜類、果実類、きのこ類、藻類等を使用して製造される菓子類、パン類、麺類、嗜好飲料類（非アルコール飲料、アルコール飲料）、調味料、醸造物（味噌、醤油、食酢）、酒類及び香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に本発明の加熱処理物が含有されていれば良い。
調理及び加工においては、調理、加工後に制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物が含有されていれば良い。
すなわち調理・加工前、調理・加工時、更には調理・加工後に制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物を添加してもよいし、調理及び加工品やその材料を、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物へ添加し、該加熱処理物を希釈してもよい。
次に食品又は飲料の製造においては、任意の工程で、加熱処理を行い、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、本発明の加熱処理物を含有させれば良く、また制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、本発明の加熱処理物を添加してもよいし、食品又は飲料やその原料を、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、本発明の加熱処理物へ添加し、該加熱処理物を希釈してもよい。また、添加は１回又は数回に渡って行ってもよい。したがって、簡便に新規な制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する食品又は飲料を製造することができる。また製造時においてウロン酸、ウロン酸のラクトン、ウロン酸エステル、ウロン酸及び／又はウロン酸エステルを含有する糖化合物又は糖化合物含有物を含有せしめ、製造時において生成した制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、その加熱処理物を構成成分とする食品又は飲料も本発明に包含される。いずれの工程を経た場合も、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、本発明の加熱処理物を含有する食品又は飲料、本発明の加熱処理物を添加及び／又は希釈してなる食品又は飲料は本発明の食品又は飲料と定義される。
本発明において、制がん作用、アポトーシス誘発性、抗菌力等を有する本発明の加熱処理物の食品中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択できるが、例えば加熱処理物の含有量は食品１００部当り加熱処理物固形物換算で０．００１部以上、食品としての官能、制がん作用、アポトーシス誘発作用、抗菌力等の生理活性の面及びコストの面からは好ましくは０．００５〜１０部、更に好ましくは０．０１〜１部である。
本発明において、制がん作用、アポトーシス誘発性、抗菌力等を有する本発明の加熱処理物の飲料中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択できるが、例えば加熱処理物の含有量は飲料１００部当り加熱処理物固形物で０．００１部以上、飲料としての食味、制がん作用、アポトーシス誘発作用、抗菌力等の生理活性の面及びコストの面からは好ましくは０．００５〜１０部、更に好ましくは０．０１〜１部である。なお、本明細書において部は重量部を意味する。
本発明の制がん作用を有する食品中の加熱処理物含有量は、制がん活性の点より適宜選択できるが、食品１００ｇ当り制がん活性単位として０．１単位以上、好ましくは１０単位以上、更に好適には１００単位以上である。
又本発明の制がん作用を有する飲料中の加熱処理物の含有量は特に制限されず、制がん活性の点より適宜選択できるが、飲料１００ｇ当り制がん活性単位として０．１単位以上、好ましくは１０単位以上、更に好適には１００単位以上である。
本発明の食品又は飲料としては、本発明の制がん作用、アポトーシス誘発性、抗菌力等を有する、本発明の加熱処理物が含有、添加及び／又は希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状、ゲル状、ゾル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
本発明の食品又は飲料は生理活性を有する本発明の加熱処理物を多量に含有し、該加熱処理物の有する種々の生理活性、抗菌力、アポトーシス誘発作用、制がん作用、抗ウイルス作用、抗潰瘍作用、血管新生抑制作用、肝機能改善作用、食物繊維作用、鉄・重金属等の不要金属除去作用等によって、これらを摂取することにより発がん予防、がん抑制効果、抗潰瘍効果、肝機能改善効果、便秘予防効果、インフルエンザウイルスによるかぜの予防効果、アルツハイマー病予防効果を有する健康食品又は飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な食品又は飲料である。またその抗菌力により、極めて保存性の良い、食品又は飲料である。
本発明の加熱処理物は食品又は飲料の保存性を向上させる防腐剤として使用することができる。また、本発明の加熱処理物を食品又は飲料に添加し、食品又は飲料を防腐する方法に使用することができる。
抗菌性を有する本発明の加熱処理物はウロン酸、ウロン酸のラクトン、ウロン酸エステル、ウロン酸を含有する糖化合物及び／又はウロン酸エステルを含有する糖化合物等の加熱処理により、容易に調製でき、天然食品由来の本発明の加熱処理物を含有する抗菌剤の食品又は飲料への使用は極めて安全性に優れたものである。
食品又は飲料に添加する場合の本発明の加熱処理物含有抗菌剤の形状は、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等いずれの形状でも良い。取り扱いやすさや、他の添加物と混合して使用することも考えれば、乾燥して粉末状、フレーク状、顆粒状にすることが好ましい。乾燥方法としては、通常の乾燥方法、例えばスプレー乾燥、ドラム乾燥、棚式乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などで行うことができる。
本発明の抗菌剤及び防腐剤は当業者に公知のいかなる方法によっても製造することができ、その製造に際しては、製剤上許容される公知の添加物、例えば賦形剤、安定剤、崩壊剤、結合剤、溶解補助剤等を適宜添加しても良い。またエタノール、グリシン、酢酸ナトリウム、アスコルビン酸、グリセリン脂肪酸エステル、食塩、ＥＤＴＡ等の他の抗菌性物質と組合せて使用しても良い。
本発明の加熱処理物の食品又は飲料への添加量は食品又は飲料の種類により異なり、その目的に応じた量を添加すれば良い。
本発明の抗菌剤の使用方法として、食品又は飲料に適当な方法で添加する方法が行われる。添加する方法は特に制限はなく、要するに何らかの方法で本発明の加熱処理物が食品又は飲料に含有されれば良い。したがって、本発明の抗菌剤の使用において、添加とは本発明の加熱処理物を食品又は飲料中に含有させるいかなる方法も含む。通常の方法は食品又は飲料の製造工程中に添加するが、本発明の加熱処理物を含有する溶液に食品を一定時間浸漬する方法も用いることができる。更にまた、食品中に添加する方法と浸漬方法を併用することもできる。浸漬方法に適する食品としては、水中でも形くずれしない食品、例えば、蒲鉾、ウインナソーセージ等の魚畜肉練り製品、ゆで麺等の麺類、冷凍前の海老、貝、魚類等の冷凍食品などを挙げることができる。
本発明の抗菌剤を防腐剤として用いることにより、食品又は飲料の保存性を一段と向上させることができる。また冷凍食品や冷菓等においては、冷凍前の加工工程において、汚染した微生物の増殖を抑制することができ、衛生上極めて好ましい結果を得ることができる。本発明の抗菌剤はグラム陽性細菌、グラム陰性細菌の両方に効果を有し、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の薬剤耐性菌、サルモネラ菌、エンテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、嘔吐型のバシルス  セレウス、下痢型のバシルス  セレウス、腸出血性大腸菌Ｏ−１５７等の食中毒菌に極めて有効である。また、酵母、カビ等の微生物にも有効である。特に本発明の加熱処理物を含有する防腐剤は天然の食中毒予防剤、除菌剤として有用性が高い。なお、本発明の抗菌剤を用い、衣服、敷布等の殺菌を行うことができ、本発明の抗菌剤を散布すること、本発明の抗菌剤での拭取り等により目的物の除菌、殺菌を行うことができる。
本発明の抗菌剤は虫歯菌や歯周病菌にも抗菌活性を示し、本発明の抗菌剤を含有する口内用剤を提供することができる。口内用剤の形状は液状、ペースト状等の公知の形状とすることができる。口内用剤としては歯磨剤が例示される。歯磨剤としては液状でもよく、またペースト状、粉末状でもよく、公知の歯磨剤の形状とすることができる。歯磨剤中の本発明加熱処理物の含有量は特に制限されず、虫歯菌や歯周病菌に対する有効濃度が含有されていればよい。歯磨剤中には公知の添加剤、例えば湿潤剤、界面活性剤、結合剤、香料、甘味料等を添加すればよい。本発明の歯磨剤の有効成分としては前述の様に、ウロン酸、ウロン酸エステルを含有する糖化合物の含有物、例えばペクチン含有物、例えば野菜、果物等の加熱処理物も使用でき、ペクチン含有野菜の加熱処理物を含有する口内用剤、例えば歯磨剤も本発明に包含される。
本発明のアポトーシス誘発剤は、アポトーシス誘発性を有する、本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるアポトーシス誘発活性を有する加熱処理物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人１日当り２０〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
制がん作用を有する本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、縣濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
制がん剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人１日当り２０〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
本発明の加熱処理物は制がん作用を有するが、低濃度ではがん細胞の分化誘導能を有し、本発明の加熱処理物はがん細胞の分化誘導剤（脱がん剤）としても有用である。本発明の加熱処理物を有効成分とするがん細胞分化誘導剤は、上記制がん剤に準じ、製剤化することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。
がん細胞分化誘導剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人１日当り０．２〜５００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
本発明の加熱処理物は抗ウイルス作用や肝機能改善作用を有し、本発明の加熱処理物を有効成分とする抗ウイルス剤や肝機能改善剤を、上記制がん剤に準じ、製剤化することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。
抗ウイルス剤や肝機能改善剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人１日当り０．２〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもでき、本発明の加熱処理物含有物を摂取することにより、インフルエンザウイルスによる風邪等のウイルス性疾患が予防、治療でき、肝機能障害も改善され、ＧＯＴ、ＧＰＴ値が正常化する。
本発明の加熱処理物は７０−ｋダルトン等の熱ショックタンパク（heat shock protein）誘導活性を有し、肝炎ウイルス、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等のＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルスに対する抗ウイルス作用を有する。又抗炎症等の生体防御作用をも有する。
抗潰瘍作用を有する本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗潰瘍剤を製造することができる。抗潰瘍剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
抗潰瘍剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準じ使用すれば良い。
抗潰瘍剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
抗潰瘍剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人１日当り２０〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
本発明によれば制がん作用、アポトーシス誘発作用等の生理活性を有し、がん患者や、ウイルス性疾患において、病変細胞に制がん作用やアポトーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な食品又は飲料が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞の増殖抑制やがん細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、本発明の加熱処理物を含有、添加及び／又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系がんの治療、予防に優れた効果を有している。
また本発明の加熱処理物は抗ウイルス作用、抗菌作用を有し、抗ウイルス剤、抗菌剤、口内用剤、例えば歯磨剤、食品用又は飲料用防腐剤として有用であり、またその抗潰瘍作用により抗潰瘍剤、潰瘍の予防剤等としても有用である。更にその肝機能改善作用により肝機能改善剤としても有用である。
本発明により、食品又は飲料中に生理活性を有する本発明の加熱処理物を多量に含有させることが可能となった。本発明の加熱処理物が有する種々の生理活性、アポトーシス誘発作用、抗菌作用、制がん作用、抗ウイルス作用、血管新生抑制作用、異常増殖細胞の抑制作用、抗潰瘍作用、肝機能改善作用、食物繊維作用、鉄・重金属等の除去作用等によって、本発明の食品又は飲料は発がん予防、制がん効果、抗菌効果、抗ウイルス効果、抗潰瘍効果、便秘予防効果、肝機能改善効果、アルツハイマー予防効果、アポトーシス誘発作用等の生体の恒常性（ホメオスタシス）維持機能を有する健康食品又は飲料であり、本発明により、胃腸健康保持に有用な機能性物質入りの食品又は飲料が提供される。また、本発明の加熱処理物、特に分子量５００以下の画分を添加することにより、食品又は飲料の抗菌力を簡便に増強することができ、本発明の加熱処理物は食品又は飲料の防腐剤としても極めて有用である。本発明の加熱処理物、特に分子量１００００以下の画分、好ましくは分子量５００以下の画分はその種々の生理機能により、食品又は飲料に使用することにより、簡便に食品又は飲料に種々の生理機能を付与することができ、例えば食品又は飲料の抗菌付与用添加剤、食品用又は飲料用の防腐剤として極めて有用である。
更に本発明によれば制がん作用やアポトーシス誘発作用を有し、がん患者や、ウイルス性疾患において、病変細胞の増殖抑制や病変細胞にアポトーシスを誘発させることにより、該疾患の予防、治療に有効なアポトーシス誘発剤、及び制がん剤が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞の増殖抑制やがん細胞のアポトーシス誘発により、本発明の加熱処理物を添加及び／又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系がんの治療、予防に優れた効果を有している。また本発明によれば抗潰瘍作用を有し、潰瘍患者において、該疾患の予防、治療に有効な抗潰瘍剤が提供される。消化器系の潰瘍の場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することにより抗潰瘍作用を発揮させることができるため、本発明の加熱処理物を添加及び／又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系潰瘍の治療、予防に優れた効果を有している。本発明の薬剤は、食用果物果皮、食用海藻等を原料として安価に大量に供給可能であり、食品由来で安全性が高い点においても優れている。また、本発明により簡便なアポトーシス誘発方法が提供され、本発明の方法を使用することにより、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等を行うことができる。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。
実施例１
リンゴ製ペクチン（和光純薬社製）５００ｍｇを１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌに懸濁し、１２１℃、２０分間オートクレーブし、ペクチン加熱処理溶液を調製した。
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて５×１０５個／９ｍｌとなるように懸濁した。
この懸濁液に対し、ペクチン加熱処理溶液を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で１６時間培養した。また確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤ（シグマ社製）の水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ及び生理食塩水０．９ｍｌを前述のペクチン溶液の代りに用いて同様の培養を行った。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、ペクチン加熱処理溶液、アクチノマイシンＤ添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお対照の生理食塩水１ｍｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
この結果よりペクチン加熱処理溶液はＨＬ−６０細胞にアポトーシスを誘発することが明らかとなった。
実施例２
市販のリンゴ製ペクチンを終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。これらを１２１℃、３０分間加熱処理し、紫外部吸収スペクトルを測定したところ、加熱処理したものでは加熱前に比べて２３５ｎｍ付近の吸光度が増大していた。
この試料を１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、アポトーシス誘発活性を実施例１の方法に従って測定した。但し、以下各実施例において、ＡＳＦ１０４培地の代りに１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、細胞はＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を用い、各試料はアポトーシス誘発活性測定時に１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、そのアポトーシス誘発活性を測定した。また、細胞懸濁液に２倍容の０．４％トリパンブルー水溶液を加えて光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排出して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。
その結果、ペクチン加熱処理物に顕著なＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性がみられた。
市販のレモン製ペクチンを１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解するとｐＨ５．０であった。これを１２１℃、３０分間加熱処理したものの紫外部吸収スペクトルを測定すると、加熱処理物では２３５ｎｍ付近の吸光度が増大していた。
この試料を１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、上記の方法でＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ、加熱処理物は顕著なアポトーシス誘発活性を示した。
その結果を図１に示す。すなわち図１はＨＬ−６０細胞の培養液にレモンペクチンの加熱処理物溶液を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図１中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）はレモンペクチン加熱処理物添加をそれぞれ示し、レモンペクチン加熱処理物は制がん作用を示した。
実施例３
（１）市販のリンゴ製ペクチンを１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１２１℃で２０分間加熱処理し、加熱処理液を調製し、その一部を凍結乾燥し、加熱処理液の凍結乾燥物を得た。
次に、加熱処理液の残部をセルロース透析膜（分画分子量１２，０００〜１４，０００、三光純薬社製）又はスペクトラ／ポア７透析膜（分画分子量１，０００、スペクトラム社製）を用いて純水に対して透析し、それぞれの透析内液を凍結乾燥して秤量したところ、どちらの透析内液の凍結乾燥物も加熱処理前のペクチンに比べて約１０％その重量が減少していた。
加熱処理液の凍結乾燥物を水に、透析内液の凍結乾燥物を１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にそれぞれ終濃度１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、実施例２の方法でＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定した。
加熱処理したペクチン溶液が活性を有していたのに対して透析した透析内液試料は活性が低下していた。
その結果を図２に示す。すなわち図２はＨＬ−６０細胞の培養液に加熱処理液の凍結乾燥物、セルロース透析膜内液の凍結乾燥物、スペクトラ／ポア７透析膜内液の凍結乾燥物をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図２中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）は加熱処理液の凍結乾燥物、白丸印（○）はセルロース透析膜内液の凍結乾燥物、白三角印（△）はスペクトラ／ポア７透析膜内液の凍結乾燥物の添加をそれぞれ示し、加熱処理液は制がん作用を示した。
（２）上記加熱処理ペクチン溶液を１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、セントリプラス１０（分画分子量１０，０００、アミコン社製）を用いて限外ろ過し、通過画分を得た。この画分のアポトーシス誘発活性を実施例２の方法で測定したところ、限外ろ過前の試料と同等の活性を有していた。
その結果を図３に示す。すなわち図３はＨＬ−６０細胞の培養液に加熱処理ペクチン溶液のセントリプラス１０通過画分を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図３中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）は通過画分添加をそれぞれ示す。なお、加熱処理ペクチン溶液は白ひし形印と同様の結果を示し、加熱処理ペクチン溶液、通過画分は制がん作用を示した。
実施例４
市販のリンゴ製ペクチンを１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後１２１℃で３０分間加熱処理した。この試料２０ｍｌを純水で平衡化したセファクリル  Ｓ−３００  ハイロード  ２６／６０  ハイレゾリューション  カラム（ファルマシア社製）にアプライし、ゲルろ過を行った。移動相は純水で、流速は１ｍｌ／ｍｉｎに設定し、示差屈折計で検出した。
試料をカラムにアプライしてから１１０分から１９０分までに溶出してきたものを画分▲１▼、１９０分から２７０分までに溶出してきたものを画分▲２▼、２７０分から４００分までに溶出してきたものを画分▲３▼として、それぞれエバポレーターで濃縮した。各々の画分に終濃度が１２０ｍＭと５０ｍＭになるようにＮａＣｌとＨＥＰＥＳを加えて２０ｍｌとし、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。
実施例２の方法に従ってＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ最も低分子側の画分▲３▼に強い活性が認められた。
その結果を図４に示す。すなわち図４はＨＬ−６０細胞の培養液に上記画分▲３▼を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図４中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白三角印（△）は画分▲３▼の添加を示し、画分▲３▼は制がん作用を示した。
実施例５
（１）Ｄ−α−ガラクツロン酸とＤ−グルクロン酸を各々１０ｍｇ／ｍｌになるように１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１２１℃で２０分間加熱処理した後１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。これらの試料のＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を実施例２の方法で測定したところ、ともに顕著な活性を示した。
その結果を図５に示す。すなわち図５はＨＬ−６０細胞の培養液に加熱処理ガラクツロン酸、加熱処理グルクロン酸をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図５中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）は加熱処理ガラクツロン酸、白丸印（○）は加熱処理グルクロン酸の添加をそれぞれ示し、各加熱処理物は制がん作用を示した。
（２）ガラクツロン酸を１０ｍｇ／ｍｌになるように１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整したもの及びｐＨ８．０に調整したものを１２１℃で２０分間加熱処理し、各々のｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで７．０に調整した。これらの試料のＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を実施例２の方法で測定したところ、ｐＨ７．０で加熱処理した試料がｐＨ８．０で加熱処理した試料よりも強い活性を示した。
その結果を図６に示す。すなわち図６はＨＬ−６０細胞の培養液にｐＨ７．０加熱処理ガラクツロン酸、ｐＨ８．０加熱処理ガラクツロン酸をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図６中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）はｐＨ７．０加熱処理ガラクツロン酸、白丸印（○）はｐＨ８．０加熱処理ガラクツロン酸の添加をそれぞれ示し、ｐＨ７．０加熱処理物は制がん作用を示した。
実施例６
リンゴ製ペクチンを１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１２１℃、２０分間加熱処理して加熱試料▲１▼を得た。これを上記セルロース透析膜を用いて１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して透析内液試料▲２▼を得た。更に透析内液試料▲２▼を１２１℃、１時間加熱処理して１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、再加熱試料▲３▼を得た。
１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した試料▲１▼〜▲３▼を実施例２の方法に従ってＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ、試料▲１▼、▲３▼は活性を有し、試料▲２▼は活性が低下していた。
このことから透析によって活性が低下した加熱処理ペクチンの透析内液は、再度加熱処理することにより活性を回復することが明らかになった。
実施例７
市販のリンゴ製ペクチンを１Ｎ  ＨＣｌに１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１２１℃で１．５時間加熱し、加熱処理物を調製した。次に該加熱処理物をＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を次のように測定した。
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）をＲＰＭＩ１６４０培地にて２．５×１０5コ／４．５ｍｌとなるように懸濁した。
この懸濁液４．５ｍｌに対し、前記加熱処理物溶液を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で１６時間培養した。また確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤ（シグマ社製）の水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）０．０５ｍｌ及び生理食塩水０．４５ｍｌを前述の加熱処理物溶液の代りに用いて同様の培養を行った。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、加熱処理物溶液、及びアクチノマイシンＤ添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお対照の生理食塩水０．５ｍｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
また、細胞懸濁液に２倍容の０．４％トリパンブルー水溶液を加えて光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排出して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。
その結果を図７に示す。すなわち図７はＨＬ−６０細胞の培養液にペクチンの加熱処理物溶液を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）はペクチンの加熱処理物添加をそれぞれ示し、ペクチン加熱処理物は制がん作用を示した。
実施例８
市販のリンゴ製ペクチンを水に１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後１２１℃で１時間加熱した。加熱処理後のｐＨはｐＨ４．５であった。次にこの加熱処理物をＮａＯＨで再度ｐＨ７．０に調整し、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）及び０．２２μｍフィルターを用いたろ過によって不溶物を除いた後、等量のエタノールを加えて遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）して得た上清画分と沈殿画分をそれぞれ減圧下濃縮乾固し、最初にペクチンを溶解した量の水に溶解した。エタノール処理の上清画分の水溶解液と沈殿画分の水溶解液をＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、それぞれをＨＬ−６０細胞培養液４．５ｍｌに０．５ｍｌ添加してアポトーシス誘発活性を実施例７の方法で測定した。
その結果、ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性は上清画分に存在することが明らかになった。エタノールの代りに２−プロピルアルコールを用いても同様の結果であった。その結果を図８に示す。すなわち図８はＨＬ−６０細胞の培養液にエタノール処理後、又は２−プロピルアルコール処理後の上清画分の水溶解液又は沈殿画分の水溶解液を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白丸印（○）はエタノール処理沈殿画分添加、黒丸印（●）はエタノール処理上清画分添加、白三角印（△）は２−プロピルアルコール処理沈殿画分添加、黒三角印（▲）は２−プロピルアルコール処理上清画分添加をそれぞれ示し、各溶媒処理上清画分は制がん作用を示した。
ペクチンの加熱処理物に添加するエタノール又は２−プロピルアルコールの量を０．５倍量、１．５倍量、及び２倍量にして上記と同様の方法で試料を調製したところ、等量のエタノール又は２−プロピルアルコールを加えた場合と同様に活性は上清画分にあった。但し、アポトーシス誘発活性は以下の方法で測定した。すなわち、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに５，０００個のＨＬ−６０細胞を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌ、試料１０μｌ、及びアラマーブルー（アラマーバイオサイエンス社製）１０μｌを添加し、５％炭酸ガス存在下３７℃で４８時間培養した後の５６０ｎｍでの吸光度から５９０ｎｍでの吸光度を引いた値を測定し、これを細胞の増殖度とした。
実施例９
市販のリンゴ製ペクチンを１０ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、ｐＨを９．５に調整した。これを１２１℃で３０分間加熱処理した。加熱処理物のｐＨはｐＨ９．２であった。次にこの加熱処理物の一部をＨＣｌでｐＨ７．０に調整し（試料Ａ）、残部をｐＨ４．５に調整した。ｐＨ４．５に調整した試料を再度１２１℃で３０分間加熱処理し、次にｐＨを７．０に調整した（試料Ｂ）。試料Ａ、試料ＢのＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を実施例７の方法で測定したところ、試料Ａは活性を持たなかったが、試料Ｂ（ペクチン加熱処理液ＩＩ）は活性を有していた。
その結果を図９に示す。すなわち図９はＨＬ−６０細胞の培養液に試料Ａ又は試料Ｂを１ｍｇ／ｍｌになるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）は試料Ａ添加、白丸印（○）は試料Ｂ添加をそれぞれ示し、ペクチン加熱処理液は制がん作用を示した。
実施例１０
（１）Ｄ−α−ガラクツロン酸を１０ｍｇ／ｍｌになるように水に溶解するとｐＨ２．４であった。これを１２１℃で２０分間加熱した。加熱処理物のｐＨはｐＨ２．２であった。この加熱処理物のｐＨをＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、実施例７の方法、但しＨＬ−６０細胞が３×１０5コ／４．５ｍｌとなるように調整した細胞懸濁液を使用し、ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ本試料は活性を有していた。
この結果を図１０に示す。すなわち図１０はＨＬ−６０細胞の培養液にガラクツロン酸の酸性下加熱処理物を１ｍｇ／ｍｌになるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◇）はガラクツロン酸加熱処理物添加をそれぞれ示し、加熱処理物は制がん作用を示した。
（２）Ｄ−グルクロン酸を１０ｍｇ／ｍｌになるように１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したところ、ｐＨ３．１８であった。これを１２１℃で２０分間加熱した後、加熱処理物のｐＨをＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、実施例７の方法でＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ本試料は活性を有していた。
この結果を図１１に示す。すなわち図１１はＨＬ−６０細胞の培養液にグルクロン酸の加熱処理物を１ｍｇ／ｍｌになるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白丸印（○）はグルクロン酸加熱処理物添加をそれぞれ示し、ウロン酸加熱処理物は制がん作用を示した。
実施例１１
Ｄ−α−ガラクツロン酸を１％となるように水に溶解するとｐＨ２．４であった。この溶解液を１２１℃で２０分間加熱したところ、この加熱処理物のｐＨはｐＨ２．２であった。これを減圧下４０倍に濃縮し、そのうち２０μｌをパルパックＳ型（ＰＡＬＰＡＫ  ｔｙｐｅ  Ｓ）カラム（４．６×２５０ｍｍ）（宝酒造社製）を用いたＨＰＬＣに供した。流速は１ｍｌ／分、最初の３０分は９０％アセトニトリル水溶液、その後２０分かけて９０％アセトニトリル水溶液から５０％アセトニトリル水溶液の直線濃度勾配によって、ガラクツロン酸酸性下加熱処理物の分離を行った。９０秒ごとにフラクショネーションを行い、各フラクションを減圧下濃縮乾固した後、８０μｌの水に溶解し、そのうち１０μｌを用いてＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を以下に記載のＭＴＴ法で測定した。
その結果、溶出時間が４．５〜１２分と４５〜４８分の２画分に活性が見られた。
ＭＴＴ法：各被検液の希釈液５μｌ又は水５μｌをそれぞれ９６穴マイクロタイタープレートのウェルに入れる。そこに５０００個のＨＬ−６０細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で４８時間培養する。５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液１０μｌを加えて更に４時間培養を続けた後、顕微鏡で細胞の生育状態を観察する。また、０．０４Ｎ  ＨＣｌ含有２−プロピルアルコール１００μｌを加えてよくかくはんし、５９０ｎｍにおける吸光度を測定してこれを細胞増殖度とする。
実施例１２
（１）市販のリンゴ製ペクチンを２．５％になるように水に懸濁し、次いでＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、分画分子量１２０００〜１４０００の透析チューブに入れ、１５倍量の水で４回透析した。透析後、再度ｐＨ７．０に調整し、次いで１２１℃で１時間加熱し、加熱処理液を調製した。この加熱処理液のｐＨはｐＨ５．４であった。この加熱処理液をＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、遠心処理によって不溶物を除去した後、０．８μｍフィルター、０．４５μｍフィルター、０．２２μｍフィルターの順でフィルター処理を行い、フィルター処理液を調製した。次いでこのフィルター処理液を分画分子量１００００の限外ろ過膜でろ過した。次に、この限外ろ過膜ろ液を減圧下濃縮乾固し、乾固物を最初にペクチンを懸濁したときの１／４０量の水に溶解し、ペクチン加熱処理物溶液を調製した。
このペクチン加熱処理液を、水で平衡化したトヨパールＨＷ−４０Ｃカラム（４．４×９２ｃｍ；東ソー社製）にアプライして、流速２．５ｍｌ／分でゲルろ過を行い、各画分のアポトーシス誘発活性を実施例８に記載のアラマーブルーを用いる方法で測定した。その結果、溶出時間４４８〜４７２分の間に溶出してきた画分が活性を示した。
（２）Ｄ−α−ガラクツロン酸を１％になるように水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。これを１２１℃で２０分間加熱し、加熱処理液を実施例７の方法でＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ、加熱処理物はアポトーシス誘発活性を示した。
実施例１３
ペクチン（和光純薬工業株式会社製  code 167-00542）、アルギン酸（非膨潤型：和光純薬工業株式会社製  code 011-13341）、Ｄ-α-ガラクツロン酸（ナカライテスク製  code 165-18）、及びＤ-グルクロン酸（ナカライテスク製  code 169-28）をそれぞれ１％になるように蒸留水に溶解し、各溶液を調製した。更に、ペクチンは、１Ｎ  酢酸水溶液に溶解した溶液も調製した。
次に、これらの１％溶解液を、３０分、１時間、２時間、４時間、１６時間、１２１℃で加熱処理を行った。各々の加熱処理物をＮａＯＨでｐＨ７に調整した後、0.22μmのフィルター滅菌を行い、アポトーシス誘発活性の測定試料を調製した。
これらの試料の２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍希釈液を調製し、そのアポトーシス誘発活性を実施例１１に記載のＭＴＴ法でアッセイし、活性の強さを比較した。その結果を下記表１〜表５に示す。
（Ａ）  ペクチンの１％水溶液のｐＨはｐＨ３．４であった。ペクチン加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表１に示すように、１２０℃、４時間の加熱処理で、活性が顕著に増加した。
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（Ｂ）  ペクチンの１％酢酸溶液のｐＨはｐＨ２．６であった。ペクチン酢酸溶液の加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表２に示すように、１２０℃、１６時間の加熱処理で、活性が顕著に増加した。
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（Ｃ）  ガラクツロン酸水溶液の加熱前のｐＨはｐＨ２．５であった。ガラクツロン酸加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表３に示すように、１２０℃、１時間の加熱処理で、活性が顕著に増加した。
0004302186.tif 000004
（Ｄ）  グルクロン酸水溶液の加熱前のｐＨはｐＨ２．４であった。グルクロン酸加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表４に示すように、１２０℃、３０分の加熱処理で、活性が顕著に増加した。
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（Ｅ）  アルギン酸水溶液の加熱前のｐＨはｐＨ３．３であった。アルギン酸加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表５に示すように、１２０℃、２時間の加熱処理で、活性が顕著に増加した。
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実施例１４
エタノール洗浄（８０％エタノール洗浄  →  ５０％エタノール洗浄  →  ８０％エタノール洗浄  →  １００％エタノール洗浄  →  減圧乾燥  →  粉末の粗精製ペクチン）したペクチン（和光純薬社製  code 167-00542）、未洗浄ペクチン（和光純薬社製  code 167-00542）、アルギン酸（非膨潤型：Ｄ-マンヌロン酸型：和光純薬社製  code 011-13341）、アルギン酸（膨潤型：L-グルロン酸型：和光純薬社製  code 014-13331）、Ｄ-グルクロン酸（ナカライテスク社製  code  169-28）、Ｄ-α-ガラクツロン酸（ナカライテスク社製  code 165-18）を０．５ｇずつ１０本（１本は未加熱のコントロール）の試験管に入れ、空気中で、１２０℃、１５０℃、１８０℃の３条件で、試料の色の変化を観察しながら乾熱を行い、色の変化に合せて、３点でサンプリングし、以下の方法で活性成分を抽出した。
乾熱試料を12.5mlの５０％エタノールに懸濁した。懸濁液を１６時間室温で振とうした後、遠心分離して、抽出液を得た。この抽出液を濃縮乾固し、最初の試料換算で、１％濃度になるように蒸留水に再溶解した。溶解液のpHを７付近に調整し、0.22μmフィルトレーション滅菌して、活性測定用の試料とした。これらの試料を用い、実施例１１に記載のＭＴＴ法で活性のアッセイを行った。その結果を乾熱温度、時間、再溶解時のpH、調整後のpHと共に表６〜表１１に示した。なお、未加熱の試料についても同様の操作を行ったところ、活性は認められなかった。なお表６〜１１において活性は活性を示した試料の希釈倍数を示す。
このことより、乾熱処理によっても活性物質が産生されることが明らかになった。
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市販のリンゴ製ペクチンを１％になるように水に溶解し、還流冷却器を取り付けたナス型フラスコに入れて１１０〜１２０℃に設定した油浴中１８時間、４２時間、及び６６時間加熱した。加熱中のペクチン溶液の温度は１００〜１０２℃であった。
上記ペクチン溶液を遠心して沈殿を除き、その上清を３倍及び１０倍に水で希釈した試料を調製した。希釈した試料１０μｌと５０００個のＨＬ−６０細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、５％炭酸ガス存在下３７℃で４８時間培養後、実施例１１に記載のＭＴＴ法で活性を測定した。
その結果、１８時間加熱ペクチンの３培希釈液添加区分、４２時間及び６６時間加熱ペクチンの３倍、１０倍希釈液添加区分において生細胞は観察されず、これらの希釈液濃度において１００℃加熱ペクチンは活性を示した。
一方、１８時間加熱ペクチンの１０倍希釈液添加区分ではほぼすべての細胞が生細胞であったが、対照の水添加区分と比べて５９０ｎｍにおける吸光度は低かった。
実施例１６
ポモシンペクチンＬＭ−１３ＣＧ（ハーキュリーズ社製）５ｋｇを水道水１００リットルに添加し、液温２８℃から液温１２０℃となるまで水蒸気吹き込みにより３５分間昇温させ、次いでかくはん下で１２０℃、５時間保温し、次いで冷却し、冷却物１３５リットルを調製した。次いで冷却物にろ過助剤として、セライト＃５４５（セライト社製）１．３５ｋｇ、及びシリカ＃６００−Ｓ（中央シリカ社製）１．３５ｋｇを添加し、次いでセライト＃５４５の０．１ｋｇ、及びシリカ＃６００−Ｓの０．１ｋｇでプレコートしたコンパクトフィルター（６インチ１６段ろ紙：ＡＤＶＡＮＴＥＣ＃３２７）でろ過を行った。得られたろ液はプレートヒーター（日阪製作所製）による連続瞬間加熱処理（９８℃、６０秒）を行った後冷却し、１５０リットルのペクチン加熱処理液Ｉを調製した。
ペクチン加熱処理液ＩのｐＨは約３．５、酸度は６．２ｍｌ、糖度は５．８Ｂｒｉｘ％であった。なおｐＨはｐＨメーターで測定し、酸度は試料１０ｍｌをｐＨ７．０に中和するのに要する０．１Ｎ  ＮａＯＨ量（ｍｌ）で表示した。更に糖度はブリックス糖度計で測定した。
本ペクチン加熱処理液Ｉの、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞に対する活性を次のようにして測定した。
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０）を上記培地にて２．５×１０5コ／４．５ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液４．５ｍｌに対して、２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌになるように水で希釈した上記加熱ペクチン溶液を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で２４時間及び４８時間培養した。
細胞培養液にトリパンブルー水溶液を加えて数分間室温で放置した後光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排除して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。また培養細胞を光学顕微鏡で観察し、１ｍｇ／ｍｌ以上の加熱ペクチンを添加した区分において核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお０．５ｍｇ／ｍｌ以下の加熱ペクチンを添加した区分と対照の水０．５ｍｌ添加区分においてはこれらの現象は認められなかった。
その結果を図１２に示す。すなわち図１２はＨＬ−６０細胞の培養液に様々な濃度の加熱ペクチンを添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5コ／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白逆三角印（▽）は２ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加、黒四角印（■）は１ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加、黒ひし形印（◆）は０．５ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加、黒丸印（●）は０．２ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加、黒三角印（▲）は０．１ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加をそれぞれ示し、５〜２０ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加は白逆三角印（▽）の２ｍｇ／ｍｌ加熱ペクチン添加と同様な活性を示し、加熱ペクチン１ｍｇ／ｍｌ以上の添加で制がん作用が認められた。
実施例１７
市販のＤ−グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ５２６９）を１％になるように水に溶解して１２１℃で４時間加熱し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に中和した後、水で１０倍、４０倍、８０倍、１６０倍に希釈した液を作製した。２．５×１０5個のＨＬ−６０細胞を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地４．５ｍｌに０．５ｍｌのグルクロン酸加熱物希釈液を添加し、５％炭酸ガス存在下３７℃で２４時間培養した後、実施例７の方法で細胞増殖抑制活性として制がん活性を測定した。その結果、１０〜８０倍希釈液添加区分では細胞数と細胞生存率の低下が見られた。また、４０〜８０倍希釈液添加区分ではＤＮＡの低分子化が見られた。なお、細胞生存率Ｒ（％）は下記式で計算した。
Ｒ＝Ｖs／（Ｖs＋Ｄs）×１００＋Ｄc／（Ｖc＋Ｄc）×１００
なお、式中でＶs、Ｄsはそれぞれ試料添加時の生細胞数と死細胞数、Ｖc、Ｄcはそれぞれ水添加時の生細胞数と死細胞数を示す。Ｒの値が５０％になる培地１ｍｌ中の制がん活性が１単位となる。
得られた細胞生存率をグルクロン酸加熱物の希釈倍率の常用対数値に対してプロットすると各点は１本の直線上に乗り、グルクロン酸加熱物での生存率Ｒ（％）は下記式で算出される。
Ｒ＝５８．６５６Ｘ−３１．８８４
〔式中Ｘはグルクロン酸加熱物の希釈倍率である〕
この直線から、グルクロン酸加熱物の非希釈物は２５０単位／ｍｌに相当することが明らかになった。
その結果を図１３に示す。すなわち図１３はＨＬ−６０細胞に様々な希釈倍率のグルクロン酸加熱物を添加し、２４時間培養したときの希釈倍率と細胞生存率の関係を示す図であり、横軸は希釈倍率（倍、対数値）、縦軸は細胞生存率（％）を示す。
実施例１８
（１）リンゴ剥皮ピューレ（丸善食品工業社製）、バナナピューレ（小川香料社製）、青ジソエキス１／４（ダンフーズ社製）、パンプキンエキス６０（ダンフーズ社製）、パンプキンミンチ（ダンフーズ社製）、セロリピューレ（ダンフーズ社製）、ゴボウピューレ（ダンフーズ社製）、エシャロットエキス６０（ダンフーズ社製）の各２５％溶液を調製し、１２１℃、４０分の加熱処理を行った。又同様に各２５％溶液を調製し１２１℃、４時間の加熱処理を行った。各処理液は冷却後、ろ過を行い、各加熱処理溶液を調製した。
１２１℃、２０分加熱処理物の糖度、ｐＨを表１２に示す。
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１２１℃、４時間加熱処理物の糖度、ｐＨを表１３に示す。
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各加熱処理液は分子量分画１万以下の画分に実施例１７記載の制がん活性が確認された。
次に糖度（Ｂｒｉｘ）値を１に濃度調整し、各加熱処理液の官能検査を行った。各加熱処理液共に食品用又は飲料用として良好な官能を示した。
（２）バナナピューレ、リンゴピューレ、セロリピューレの各々２５％水溶液の１２１℃、４時間加熱処理物を代表例とし、実施例１７記載の方法に準じ各加熱処理物の制がん活性単位を測定した。その結果を表１４に示す。加熱処理により制がん活性物質が各処理液で生成した。
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実施例１９
▲１▼大根葉、▲２▼人参葉、▲３▼人参、▲４▼キャベツ、▲５▼ナスの皮を除いた中身、▲６▼バナナ及び▲７▼ハッサクのアルベド各々４０ｇに１６０ｍｌの水を加えてミキサーでホモジナイズした。この一部を１２１℃で４時間加熱した後遠心し、その上清をＮａＯＨでｐＨ６に調整した物を試料Ａ、残りをＨＣｌでｐＨ３に調整した後１２１℃で４時間加熱し、その遠心上清をＮａＯＨでｐＨ６に調整した物を試料Ｂとした。
▲１▼〜▲７▼から調整した各試料Ａ、Ｂを希釈し、希釈液１０μｌを用い、制がん活性を実施例１１記載のＭＴＴ法で測定した。その結果を表１５に示す。なお、表１５に示す数値は活性が観察される希釈倍率であり、−は非希釈液添加区分で活性が観察されないことを示す。各果物、野菜においてその加熱処理物に活性の生成が認められた。なお表中において希釈倍数は完全に細胞が死滅した希釈倍数、括弧内の数字は細胞に影響の出た希釈倍数を示す。
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実施例２０
非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製、011-13341）及び膨潤性アルギン酸（和光純薬社製、014-13331）を１％になるように水に懸濁したところ、ｐＨはそれぞれ３．３２と３．３８であった。これらを１２１℃で２０分間加熱し、実施例７の方法でＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性として、その制がん活性を測定した。但し、培養開始時のＨＬ−６０細胞数は３×１０5個／５ｍｌとした。
その結果を図１４に示す。すなわち図１４はＨＬ−６０細胞の培養液に非膨潤性アルギン酸及びアルギン酸、膨潤性アルギン酸の加熱処理物溶液を１ｍｇ／ｍｌになるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０5個／５ｍｌ）を示す。図中において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白菱形印（◇）は非膨潤性アルギン酸加熱処理物添加、白三角印（△）は膨潤性アルギン酸加熱処理物添加をそれぞれ示す。
非膨潤性アルギン酸加熱処理物に高活性が認められた。
実施例２１
アルギニックアシッドＨＦＤ（大日本製薬社製）の１％の水懸濁溶液を調製し、１２０℃、４時間の加熱処理を行った。加熱処理液の遠心上清物について実施例１７記載の方法で制がん活性を測定し、制がん活性単位を算出した。結果を表１６に示す。アルギン酸加熱処理物に活性物質の生成が認められた。
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実施例２２
アルギニックアシドＨＦＤ（大日本製薬社製）１ｇを５０ｍｌの水に懸濁し、各３０分、１時間、２時間、１４時間、１２１℃で加熱処理した。各加熱処理物の溶液を遠心分離法で調製し、その分子量を測定した。なお分子量測定は下記条件下で行った。
ガードカラム：ＴＳＫガードカラムＰＷＨ
カラム：ＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＰＷ
溶出剤：０．２Ｍ  ＮａＣｌ
検出：２１０ｎｍの吸収
加熱時間３０分では分子量１８００、加熱時間１時間では分子量１２００、６３０、加熱時間２時間では分子量１１００、６３０、加熱時間４時間では１１００、６３０、加熱時間１４時間では分子量６２０、４００を各々主要ピークとする低分子分解物が生成しており、同時に低分子分解物も生成していた。なお分子量１万以上の高分子は含有されず、制がん活性、抗菌活性は分子量５００以下の画分に認められた。
実施例２３
（１）市販のグルクロノラクトン（メルク社製  code No. 100282）を１％になるように水に溶解し、１２１℃で０．５時間、１時間、２時間、４時間または１６時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例１７の方法に従って測定した。加熱時間０．５時間で制がん活性物質の生成が認められ、制がん活性物質の生成は加熱時間を長くするに従って増加し、加熱時間４時間、１６時間でそれぞれ加熱時間０．５時間の約１０倍となった。
（２）上記グルクロノラクトンを０．１％、１％、２％、５％、１０％、または２０％になるように水に溶解し、１２１℃で４時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例１７の方法に従って測定した。いずれの濃度においても制がん活性物質の生成が認められたが、使用したグルクロノラクトン当たりの加熱処理物の制がん活性の強度は、０．１％グルクロノラクトン水溶液を用いた場合が最も強かった。
（３）上記グルクロノラクトンの１％水溶液のｐＨをＨＣｌまたはＮａＯＨで１、２、３、または４．５に調整し、１２１℃で４時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例１７の方法に従って測定した。グルクロノラクトンの加熱処理による制がん活性物質の生成は各ｐＨで認められたが、使用したグルクロノラクトン当たりの加熱処理物の制がん活性の強度はｐＨ３から４．５でｐＨ１の約１５倍を示した。
（４）市販のＤ−グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ５２６９）を１％になるように水に溶解し、１２１℃で４時間加熱し、ｐＨ未調整の試料（ｐＨ２．６）とＮａＯＨでｐＨ６．６に調整した試料を調製した。各々を１ｍｌずつ分注し、−２０℃、４℃、３７℃で保存した後、制がん活性を実施例１７の方法に従って測定した。
その結果、２５日間保存後では、３７℃で保存した場合に加熱処理物の制がん活性はやや減少していたが、−４℃、−２０℃ではほぼ安定であった。
実施例２４
ポモシンペクチンタイプＬＭ−１３ＣＧ（ハーキュリーズ社製）、アルギニックアシッドＨＦＤ（大日本製薬社製）、Ｄ−グルクロン酸（ナカライテスク社製）及びグルクロノラクトン（メルク社製）を１％となるように水に溶解、又は懸濁し、９５℃、１２１℃又は１３２℃で１６時間加熱した。この加熱処理物の制がん活性単位を実施例１７の方法で測定した。その結果を表１７に示す。
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実施例２５
（１）１．５ｇのリンゴペクチン（和光純薬社製）を１００ｍｌの水に懸濁し、ＮａＯＨでｐＨ１２に調整した。ＮａＯＨを徐々に添加してｐＨを１２に保ちながら４℃で攪拌した。８時間経過後からはｐＨの降下は見られなかった。２４時間経過後ＨＣｌでｐＨ５に調整し、４倍容のエタノールを加え、４℃で１時間攪拌後濾紙で濾過した。沈殿を６５％エタノールに続いて９９．５％エタノールで洗浄し、減圧下乾燥したところ１．３２ｇのペクチン酸を得た。
（２）上記（１）で得られたペクチン酸２００ｍｇを２００ｍｌの水に溶解し、濃塩酸２ｍｌを徐々に加えた。８０℃で６６時間加熱後、２００００×ｇで３０分間遠心し、上清と沈殿を得た。上清をＮａＯＨでｐＨ７に調製し、分画分子量１０００の透析膜で水に対して透析した後凍結乾燥して１８．４ｍｇの酸可溶性画分を得た。沈殿を３０ｍｌの水に懸濁し、ＮａＯＨでｐＨ６に調製し、分画分子量１０００の透析膜で水に対して透析した後凍結乾燥して１１４ｍｇの酸不溶性画分を得た。
（３）上記（２）で得られた酸可溶性画分と酸不溶性画分をそれぞれ１％になるように水に溶解し、ＨＣｌでｐＨ３に調整した後、１２１℃で２０分間加熱した。これらの加熱処理物の制がん活性を実施例２のアラマーブルーを用いる方法で細胞増殖抑制活性として測定した。その結果、酸可溶画分加熱処理物に制がん活性が見られた。
実施例２６
（Ａ）D-グルクロン酸（ナカライテスク製  code 169-28）を蒸留水に１％になるように溶解し、120℃で一晩加熱した後、pHを７付近にNaOHで調節した。このグルクロン酸加熱物を用いて抗菌活性を下記の様に検討した。
被検菌をL-ブロス（1%  トリプトン、0.5％酵母エキス、5% Nacl pH7.0）で、一晩種培養した。5mlのL-ブロスに50μl、100mμl、250μl、500μl、1000μlのグルクロン酸加熱物を添加した培地及び何も添加していない培地に5μlの種培養液を植菌し、37℃で振とう培養し生育を測定した。培養開始時と８時間後に、富士デジタル濁度計（販売元  富士工業株式会社、製造元  秋山電機製作所）を用い、調製目盛を82.3の条件で培養物の濁度を測定し、８時間後の濁度の値から培養開始時の濁度の値を引いた値（生育濁度）で被検菌の生育を測定した。なお被検菌▲６▼についてはＬ−ブロスの代わりにブレイン  ハート  インヒュージョン培地を使用した。
被検菌としてはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）HB101（ATCC 33694：被検菌▲１▼）、サルモネラ  ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）LT-2（ATCC 27106：被検菌▲２▼）、シュードモナス  アェルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（IFO 3080：被検菌▲３▼）、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）3A（NCTC 8319:被検菌▲４▼）、バチルス  ズブチリス（Bacillus subtilis）（IFO 3034::被検菌▲５▼）、ストレプトコッカス  ミュータンス（Streptococcus mutans）GS5（国立予防衛生研究所保存株：被検菌▲６▼）を使用した。
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各被検菌に対し加熱処理物は１００〜５００μｌ／５ｍｌの添加のいずれかで抗菌活性を示した。なお加熱処理物はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、エンテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、嘔吐型のバシルス  セレウス、下痢型のバシルス  セレウス、腸出血性大腸菌Ｏ−１５７にも抗菌活性を示した。
（Ｂ）食品添加用アルギン酸（アルギニック  アシッド  HFD：大日本製薬株式会社製）を蒸留水に1%になるように溶解し、120℃で一晩加熱した後、pHを７付近にNaOHで調節した。このアルギン酸加熱物を用いて上記の方法に順じ、加熱処理液を２５０〜１０００μｌ添加し、被検菌▲１▼〜▲６▼への抗菌活性を検討した。なお被検菌▲６▼の場合は１５００μｌまで添加した。その結果を表１９に示す。
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各被検菌に対し加熱処理物は２５０〜１５００μｌ／５ｍｌの添加のいずれかで抗菌活性を示した。なお加熱処理物はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、エンテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、嘔吐型のバシルス  セレウス、下痢型のバシルス  セレウス、腸出血性大腸菌Ｏ−１５７にも抗菌活性を示した。
実施例２７
市販のリンゴ製ペクチン５ｇを、２００ｍＭ  ＮａＣｌの５００ｍｌに溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。これを１２１℃で３０分間加熱処理後、更にＮａＯＨでｐＨ７．０に再調整した。１２，０００ｒｐｍ（約１０，０００×ｇ）で３０分間遠心分離を行い、得られた上清（本試料）の制がん作用を調べた。
マウス固形がんＭｅｔｈＡ（４×１０6細胞／マウス）を、１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、体重約２０ｇ）の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ箇所に１０日間連続して本試料（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を皮下注射した。
一方コントロール群には、本試料の代りに生理食塩水を同様に皮下注射した。２週間後にマウス腹部に形成された固形がん組織を摘出して、その重量を測定した。結果を表２０に示す。すなわちコントロール群においては、平均がん重量は１．２６ｇであったのに対し、本試料投与群においてのそれは０．８８ｇであり、約３０．１％のがん抑制率を示し、本試料に制がん作用が認められた。
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実施例２８
マウス白血病細胞株Ｐ−３８８（１×１０6細胞／ｍｌ）を、実施例２７で調製した本試料（１ｍｇ／ｍｌ）と共に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で６時間イン  ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養した後、５週齢のＤＢＡ／２マウス（メス、体重約２０ｇ）にそのまま１ｍｌ／マウスを腹腔内に注射した（Ｐ−３８８：１×１０6細胞／マウス、本試料：５０ｍｇ／ｋｇ）。
一方コントロール群マウスには、本試料の代りに生理食塩水と共に、同様の条件で培養したＰ−３８８を注射した。
それぞれ８匹ずつの２群において、マウスの生存数、平均生存日数、延命率を算定した。結果を図１５に示した。すなわち図１５は本試料の白血病細胞に対する制がん作用を示す図であり、縦軸はマウスの生存数、横軸は生存日数を示す。図中、破線はコントロール群を、実線は本試料投与群を示している。すなわちコントロール群では平均生存日数が８．０日であったが、本試料投与群においては平均生存日数は１４．６日であり、その延命率は１８２．５％を示し、本試料に有意な延命効果が認められた。
なお、同時に並行して行った実験で、６時間イン  ビトロで培養した後のＰ−３８８細胞の生存率は本試料の添加、無添加の両処理とも差がなく、細胞生存率は各１００％であった。
実施例２９
ガラクツロン酸又はグルクロン酸を各々５０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、１２１℃で２０分間加熱処理した後、１ＮのＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。本サンプルを、生理的食塩水で所定の濃度に希釈し、以下の試験を行った。
（１）ＭｅｔｈＡ細胞（４×１０6細胞／マウス）を８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、体重約２０ｇ）の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ箇所に１０日間連続してガラクツロン酸加熱処理物（１００ｍｇ／ｋｇ／日）又はグルクロン酸加熱処理物（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を皮下注射した。
２週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出して、その重量を測定した。
結果を表２１に示す。すなわち、コントロール群では平均がん重量は１．４８ｇであったのに対し、ガラクツロン酸加熱処理物投与群では０．９４ｇ、グルクロン酸加熱処理物投与群では０．８６ｇであり、抑制率は各々２６、５％、４１．９％でいずれも有意（コントロール群に対しｐ＜０．０５）な制がん作用が認められた。
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（２）６週齢の雌性ＩＣＲ系マウス（体重約２６ｇ）１６匹を用い、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０（５．５×１０6細胞／マウス）を腹部に皮下注射し、コントロール群８匹及びグルクロン酸加熱処理物投与群８匹を設定した。
グルクロン酸加熱処理物投与群には、グルクロン酸化熱処理物の摂取量が約１ｇ／ｋｇ／日となるよう上記グルクロン酸加熱処理物を水道水に希釈し、給水瓶にて自由摂取させた。コントロール群には同様に水道水を与えた。餌は両群とも実験期間中、自由摂食とした。
Ｓａｒｃｏｍａ−１８０皮下注射後３５日目の生存個体数はコントロール群で８例中２例、グルクロン酸加熱処理物投与群で８例全例で、グルクロン酸加熱処理物の経口摂取による顕著な延命効果が認められた。
実施例３０
マウス白血病細胞株Ｐ−３８８（ｌ×１０6細胞／ｍｌ）を実施例２９で調製したガラクツロン酸加熱処理物（１ｍｇ／ｍｌ）、グルクロン酸加熱処理物（１ｍｇ／ｍｌ）と共に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で６時間イン  ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養した後、８週令のＤＢＡ／２マウス（雌、体重約２０ｇ）にその１ｍｌをマウス腹腔内に注射した（Ｐ−３８８：１×１０6細胞／マウス、加熱処理物５０ｍｇ／ｋｇ）。コントロール群には生理的食塩水と共に同様の条件で培養したＰ−３８８細胞（１×１０6細胞／マウス）を注射した。なお、同時に並行して行った試験で、６時間のインビトロで培養した後のＰ−３８８細胞の生存率は加熱処理物添加群と生理食塩水添加群においての差はなく、いずれも生存率１００％であった。
各群それぞれマウス８匹ずつを使用し、その生存数より、平均生存日数及び延命率を算出した。
結果を図１６に示す。すなわち図１６は各群のＰ−３８８細胞移植後の日数とマウスの生存数の関係を示す図であり、縦軸はマウス生存数、横軸はマウスの生存日数を示し、図中、実線はコントロール群、破線はガラクツロン酸加熱物投与群、二点鎖線はグルクロン酸投与群を示す。
図１６の結果から算出されるように、コントロール群では平均生存日数芽１１．４日であったが、ガラクツロン酸加熱処理物投与群（５０ｍｇ／ｋｇ）においては細胞移植後２４日目において平均生存日数２３．５日以上、延命率２０６．１％以上、グルクロン酸加熱処理物投与群（５０ｍｇ／ｋｇ）においては平均生存日数１６．８日、延命率１４７．３％を示し、それぞれコントロール群に比べ有意な延命効果が認められた。
実施例３１
１０ｇのＤ−グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ５２６９）を１ｌの水に溶解し、１２１℃で４時間加熱した後ＮａＯＨでｐＨ７に中和した。
１×１０5／ｍｌのＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を含む１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に５００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌの本加熱物を添加し、５％炭酸ガス存在下３７℃で３日間培養した。次に培養細胞の一部をとってスライドガラスに塗抹し、「組織培養の技術」（日本組織培養学会編、朝倉書店、１９８２年）１９１頁に記載のライト−ギムザ染色を行い、光学顕微鏡で分化程度を観察した。その結果、添加したグルクロン酸加熱物の濃度に依存し、がん細胞が単球またはマクロファージ様細胞に分化し、培養細胞中の成熟骨髄細胞比率が高くなった。その結果を図１７に示す。すなわち図１７は培養時間と、培養細胞中において成熟骨髄細胞の占める比率の関係を示す図であり、横軸は培養時間（日）、縦軸は培養細胞中において成熟骨髄細胞の占める比率（％）を示す。図１７において白四角印（□）は試料無添加（対照）、白菱形印（◇）は５００μｇ／ｍｌグルクロン酸加熱物添加、白丸印（○）は５μｇ／ｍｌグルクロン酸加熱物添加、白三角印（△）は０．０５μｇ／ｍｌグルクロン酸加熱物添加をそれぞれ示す。
実施例３２
グルクロン酸加熱処理物の抗潰瘍作用
Ｄ-グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ  ５２６９）を１０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水に溶解し、１２１℃で４時間加熱処理した後、１ＮのＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した後、凍結乾燥処理により２００ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、グルクロン酸の加熱処理濃縮物を調製し、以下の実験を行った。
Ｗｉｓｔａｒラット（体重２２０〜２７５ｇ）は、２４時間絶食し、実験開始３時間前には絶水とした。
ラットに９９．５％エタノールを１ｍｌ経口投与し、１時間後にエーテル麻酔下、胃を摘出した。摘出した胃は、幽門及び噴門を結紮し、１％ホルマリン液を注入後、同液中に１０分間浸した。胃を大湾部に沿って切開し、腺胃部に発生している潰瘍の長さ（ｍｍ）を測定した。
グルクロン酸加熱処理物投与群は、エタノール投与の３０分前に１ｇ／ｋｇの割合で上記グルクロン酸加熱処理濃縮物を経口投与した。コントロール群には同様に、蒸留水を投与した。
エタノール投与１時間後の潰瘍の長さは、コントロール群（Ｎ＝６）で７８．２±２８．５ｍｍ（平均±Ｓ．Ｅ．）であった。一方、グルクロン酸加熱処理物投与群（Ｎ＝３）では潰瘍は全く存在せず、顕著な抗潰瘍作用が認められた。
実施例３３  注射剤
実施例８記載のエタノール処理の上清画分の濃縮乾固物を注射用蒸留水に溶解し、１％溶液を調製した。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、上清画分の乾燥物換算で１０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加した。
実施例３４  注射剤
ガラクツロン酸を１０ｍｇ／ｍｌとなるように注射用蒸留水に溶解し、１２１℃、２０分間の加熱処理を行い、次いで冷却後中和処理を行い加熱処理物の中性溶液を調製した。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、加熱処理物の乾燥物換算で５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加した。
実施例３５  錠剤
下記処方に従い錠剤を調製した。
ペクチン酸加熱処理物        １０ｍｇ
コーンスターチ              ６５ｍｇ
カルボキシメチルセルロース  ２０ｍｇ
ポリビニルピロリドン          ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム      ２ｍｇ
１錠当り        計        １００ｍｇ
ペクチンを実施例７に記載の方法で加熱処理し、中和後の凍結乾燥物をペクチン加熱処理物として使用した。
実施例３６
緑茶葉１０ｇ、ビタミンＣ０．２ｇ及びイオン交換水１０００ｍｌを用い、常法に従って緑茶を調製した。本発明品１は、実施例１６記載のペクチン加熱処理液Ｉを用い、製品１００ｍｌ当り固形物換算で５０ｍｇを添加した。対照は、無添加のものとした。パネラー２０名で、５段階（５良、１悪）の官能評価を行い、その結果の平均値を表２２に示した。
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表２２より、本発明品１は対照に比べて、味の幅と広がりが増し、味とのバランスが整い、茶の香味が引き立ち、隠し味の効果が出ているとの評価であった。
実施例３７
アルコール含有飲料を表２３に示す配合で、常法に従い調製した。
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本発明品２は、実施例１６記載のペクチン加熱処理物１を用い、製品１００ｍｌ当たり固形物換算で４５ｍｇ添加した。対照はペクチン加熱処理物Ｉ無添加のものを用いた。官能評価は、実施例３６と同様にして行い、その結果を表２４に示した。
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表２４に示すごとく、本発明品２は対照に比較的し、味の幅と広がりが増した。特に、本発明品２は酸味がマイルドになり、みかんの風味が引き立つように仕上がった。
実施例３８
常法により調製された清酒を用い、本発明品３は、実施例９記載のペクチン加熱処理物ＩＩを用い、製品１００ｍｌ当り固形物換算で３５ｍｇを添加した。対照は、ペクチン加熱処理物無添加のものを用いた。
官能評価は、実施例３６と同様にして行った。評価項目に香り、舌ざわり感を追加し、その結果を表２５に示した。
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表２５より、本発明品３は対照に比べて、味の幅や広がりが改善され、舌ざわり感も向上して、嗜好品としての味及び食感が改善される効果を見出した。
実施例３９
常法により調製されたみりん及び発酵調味料を用い、本発明品４（みりん）及び５（発酵調味料）は、実施例１６記載のペクチン加熱処理液Ｉを用い、製品１００ｍｌ当り固形物換算で４０ｍｇを添加した。対照は、ペクチン加熱処理物無添加のものを用いた。
官能評価は、実施例３６と同様にして行った。その結果を表２６に示した。
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表２６より、本発明品４及び本発明品５は、それぞれの対照に比べ、味のバランスと幅において向上効果を示し、奥みのある味の調味料とすることができた。
実施例４０
ふりかけとして、魚粉４．７ｋｇ、海苔０．８ｋｇ、ごま２．５ｋｇ、食塩１．０ｋｇ、グルタミン酸ソーダ０．５ｋｇを混合し、常法に従って造粒して調製した。
本発明品６は、実施例９記載のペクチン加熱処理液ＩＩを用い、製品１００ｇ当り固形物換算１０００ｍｇを添加した。対照は、ペクチン加熱処理物無添加のものとした。これらふりかけを米飯にふりかけ、食感の官能評価を実施例３６と同様にして行った。
その結果、本発明品６は対照に比べて、口に含んだとき、米飯とよくなじみ、味のバランスがよく、マイルドに仕上がり、総合してふりかけの品質を向上させることがわかった。
実施例４１
野菜、果物の加熱処理物を用いて、飲料を作成した。その配合を表２７に示す。
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表２７の配合の人参、パイナップル、バナナは各々市販のミキサーを用いて充分にかくはん、粉砕して、ピューレ状とした。本発明用品はこれらの人参、パイナップル、バナナのピューレを各々別に、密閉状態で１２１℃、４時間の加熱処理を行った後、配合表に従って、混合し飲料とした。
一方、対照は加熱処理することなく、そのまま配合表に従ってその粉砕物を混合し対照飲料とした。本発明品及び対照の官能評価を実施例３６と同様に行った。その結果を表２８に示す。
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表２８より、本発明品は対照と比較して、マイルドで味訓れに優れ、香りに一体感があり、舌触りもまろやかで、飲みやすい飲料に仕上がった。
発明の効果
本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又は昂進あるいはがん疾患、ウイルス性疾患、潰瘍、歯周病等の治療剤として用いることができる。また本発明のアポトーシス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウイルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等に有用である。特に、食用品中の本発明の糖化合物は食品として長い歴史を有するものであり、これらから調製した本発明の加熱処理物は経口投与の場合において、極めて安全性の高いものである。また本発明の加熱処理物を含有する食品又は飲料、本発明の加熱処理物を添加及び／又は希釈してなる食品又は飲料、食品用又は飲料用防腐剤等は当然安全性は高く、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用、血管新生抑制作用、抗ウイルス作用、抗潰瘍作用等により、消化器系がん、インフルエンザウイルスによるかぜ等のウイルス性疾患、潰瘍等の予防、治療に、肝機能改善等極めて有用である。
以上、本発明の加熱処理物は、安価に簡便に製造でき、その種々の生理的機能により、食品又は飲料の添加剤として使用することにより、食品又は飲料に簡便に種々の生理的機能、抗菌力、アポトーシス誘発作用、制がん作用、抗ウイルス作用等を付与することができ、本発明の加熱処理物は食品又は飲料への添加剤、特に食品又は飲料用防腐剤として極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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