(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物生細胞を含む試料液中の微生物細胞を、直径４０μｍ以下のアガロースゲル微小粒子中に包括すること、それによって少なくとも一部が１個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子の集団が得られ、該アガロースゲル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生物の内、平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖できるような増殖環境下におくこと、および上記増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団から、死滅していないが増殖できなかった１個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子をセルソーターにより識別して分離すること、からなる微生物の単離方法。
【請求項２】
セルソーターによるアガロースゲル微小粒子中の微生物の分別・識別が、前方散乱光強度（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光強度（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）、および生菌を死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いた蛍光強度の３種類のパラメーターのうち、２種類（二次元）または３種類（三次元）を組合わせたセルソーターサイトグラムによるものである請求項１に記載の微生物の単離方法。
【請求項３】
蛍光染色できる色素が、カルボキシフルオレッセンアセトキシメチルエステル（ＣＦＤＡ）又はカルボキシフルオレッセンチアセテイトアセトキシメチルエステル（ＣＦＤＡ−ＡＭ）である請求項２に記載の微生物の単離方法。
【請求項４】
上記アガロースゲル微小粒子中への微生物細胞の包括が、アガロースのゲル化温度より高い温度にて、アガロース溶液と上記試料液とを混合し、得られた混合液に油分を加えて乳化物を形成させ、次いで、得られた乳化物の温度をアガロースのゲル化温度より低い温度にしてアガロースをゲル化させることにより調製される、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の単離方法に関し、特に通常の平板培養法では単離が困難な微生物を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の単一コロニーまたは単一細胞の分離は、従来、複数種の微生物が混在する試料液を平板培地に播き、培養後形成されたコロニーを単離する、平板培養法によりなされてきた。しかし、この平板培養法は、使用された培地や環境下では増殖できず、したがってコロニーを形成できない微生物種は単離することができない。そこで、培地や環境を種々変えて平板培養分離が繰り返されるが、あらゆる未知の微生物が増殖できるような培地や環境を想定し作成することは実際上できない。
【０００３】
したがって、種々の微生物が混在する試料から平板培養法により単離できる微生物種は、限られたものになる。例えば、V. Torsvikら(Appl. Environ. Microbiol. 56, 782-787 (1990))は、土壌中の微生物について、全菌数中に占めるコロニーを形成できる菌数は０．３％であったと報告している。M. Wagner ら（Appl. Environ.Microbiol. 59, 1520-1525 (1993)）は、活性汚泥中の全菌数中、コロニーを形成できる菌数は、１ないし１５％にすぎないと報告している。J. T. Staleyら（Annu. Rev. Microbiol. 39, 66-68 (1985)）は、中性を示す湖水中の全菌数に占めるコロニーを形成できる菌数の割合は０．１ないし１％であったと報告している。また、R. L. Fergusonら（Appl. Environ. Microbiol. 42, 49-55 (1984)）、およびK. Kogureら(Can. J. Microbiol. 25, 415-420 (1979)、およびCan. J. Micorobiol. 26, 318-323 (1980))は、海水中の微生物について検討し、海水中の全菌数に対するコロニー形成能を有する菌数の割合は０．００１ないし０．１％であると報告している。さら、J. G. Jones (Freshwater Biol. 7, 67-91 (1997))は、湖水とその沈澱物について、コロニー形成能を有する菌種の全菌種に対する割合はいずれも０．２５％であったと報告している。
【０００４】
このように、平板培養法によっては単離できない微生物種が多いにも拘わらず、その必要性は、食品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等において強く望まれている。また、深海などの極端な環境、またはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海洋生物等の生物体内から、平板培養法では単離できない、したがって未だ単離されていない微生物種を単離し、微生物の新規機能を見出し利用したり、その天然環境下における有害な活性を抑制することにおいても、単離が困難な微生物種を分離することは必要である。
【０００５】
ゆえに、複数の微生物種が混在する試料から、平板培養法では単離できないような単一の微生物種を分離する方法の改善が強く望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、種々の微生物種が混在する試料から、平板培養法では単離が困難な微生物種を単離することができる方法を開発することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、微生物生細胞を含む試料液中の微生物細胞をアガロースゲル微小粒子中に包括すること、それによって少なくとも一部が一個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子の集団が得られ、上記アガロースゲル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生物の内平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖できるような増殖環境下におくこと、および、上記増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団から一個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子をセルソーターにより識別して分離すること、により達成できた。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において取り扱うことができる微生物生細胞を含む試料は、土壌、泥、湖水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境から採取されるもの、深海、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境から採取されるもの、病院や食品工場における空気および活性汚泥や食品加工産業原料（風味付け汁等）等の人工的環境から採取されるもの、ならびに金属表面等の人工的特殊環境から採取されるもの等、いかなるものも含まれる。
【０００９】
単離できる微生物はその分類学的位置に拘わることなく、すべての微生物種が含まれる。例えば、真正細菌（細菌、放線菌等）、古細菌（好塩菌、高温好酸菌、メタン生成菌等）、真核生物（真菌、藻類、原生動物等）およびウイルス（ファージを含む）等である。これらの微生物は、従来の微生物の単離方法（平板培養法）においてはその生育培地（栄養）や環境を予め知っている必要があったが、この発明の方法を用いる場合には、栄養や生育環境を知らなくとも、単一細胞の分離までは可能であり、本発明の著しい利点である。
【００１０】
採取された試料が固形物である場合は、採取環境に近いｐＨや浸透圧等を配慮した水に懸濁し（この段階で、特に極端な環境から採取された試料を取り扱う場合、試料中の微生物を死滅させてはならない）、必要により通常の生物より大きなサイズの粒子を適当な方法で除く。次いで、試料中に含まれる菌数が多い試料については、通常試料中の菌数が１ｘ１０７／ｍｌになる程度に希釈するのが好ましい。試料によっては、希釈度を種々変えて試験する必要があることもある。
【００１１】
上記のような試料液中の微生物細胞をアガロースゲル微小粒子中に包括せしめる。アガロースゲル微小粒子中に微生物細胞を包括せしめると、アガロースゲル微小粒子集団中には、一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル微小粒子が含まれている。本発明においては、一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル微小粒子がその集団中に多いほど好ましい。
【００１２】
そのような、一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル微小粒子がより多いアガロースゲル微小粒子集団は、本発明者らの研究によれば、以下の方法により得ることができる。
【００１３】
先ず、上記試料溶液とアガロース溶液とを、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合する。溶液中アガロースの濃度は、使用するアガロース、特にそのゲル化温度と、分離する微生物等に依存しているが、通常２％前後が好ましい。
【００１４】
アガロースはゲル化温度が低いものが望ましく、例示すれば、Ｓｉｇｍａ社のType VII （Low Gelling Temperature）が好ましい。高い温度でしか溶解しないアガロースを使用すると、以下の工程において試料中の微生物を死滅させるおそれがある。
【００１５】
次に上記試料／アガロース混合液を乳化する。乳化は、どのような方法でもよく、例えば、内圧式超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社製）を用いて行うことができる。
【００１６】
内圧式乳化モジュールによる乳化は次のようにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調整した油分（例えばミネラルオイル（Sigma社のLight White Oil等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし、他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにする。アガロースがゲル化しない温度にした試料／アガロース混合液を加圧室に滴下し加圧すると、加圧室から非加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されている非加圧室にて乳化液が生成される。
【００１７】
次いで、得られた乳化液をアガロースのゲル化温度以下に冷却するとアガロースゲルの微小粒子が形成される。必要により、アガロースゲル微小粒子を例えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を除く。
【００１８】
このような方法により、集団中の大部分のアガロースゲル微小粒子が一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル微小粒子集団が得られる。
【００１９】
アガロースゲル微小粒子を包み込んでいる細胞の数は、光学顕微鏡観察でも知ることができるが、光学顕微鏡で観察できるアガロースゲル微小粒子の数は、少数でしかあり得ない。
【００２０】
本発明者らの研究によれば、セルソーターによっても、一個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子を、それ以外のアガロースゲル微小粒子から識別することができることがわかった。セルソーターを使用することにより、極めて多くの数のアガロースゲル微小粒子を観察することができ、それによって、集団中に一個の微生物細胞を包括するアガロースゲル微小粒子の存在頻度が低くとも、そのようなアガロースゲル微小粒子を見出すことができるようになり、本発明の方法が実施可能な方法となった。
【００２１】
上記微生物細胞を包み込んでいるアガロースゲル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生物の内、平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖できるような増殖環境下におく。かくして、平板培養にてコロニーを形成することができる微生物種はアガロースゲル微小粒子中においても通常増殖して、アガロースゲル微小粒子中にその微生物種の複数の細胞が存在するようになる。一方、平板培養において増殖できないような微生物種は、アガロースゲル微小粒子中においても通常増殖することができず、アガロースゲル中の細胞数は、増殖前の一個に止まっている。
【００２２】
「試料中に含まれている微生物の内、平板培養法にてコロニー形成する微生物が増殖できるような増殖環境」は、平板培養の培地（栄養）や環境（嫌気性／好気性、ｐＨ、温度、浸透圧等）とほぼ同じであるが、固体培養（平板培養）と液体培養（アガロース微小粒子の懸濁液）の相違による変更を平板培養の培地や環境に加えなければならない場合には、例えば酸素や栄養源としてのガス（例えば炭化水素ガス資化菌についての炭化水素）の補給）等、必要な変更を平板培養の培地や環境条件に加える。このようなことはこの分野ではよく知られている。
【００２３】
試料中に含まれている、または含まれているであろう微生物がコロニーを形成できる平板培養の培地や環境は、実際に予め試験することにより容易に知ることができる。また試料の分離源が当然わかっているので、そこに含まれているであろう微生物を推測することができ、その推測に基づいて容易にそれら微生物が増殖するであろう平板培養の培地や環境を推定することができる。試料中に種々の微生物種が含まれていて、それぞれが異なる平板培養の培養条件でしか増殖できない場合には、それら異なるそれぞれの増殖環境下にアガロースゲル微小粒子をおくのが好ましい。これによって、どのような条件でも分離できない微生物種を分離することができる確率が高くなる。
【００２４】
上記増殖環境は、したがって、通常平板培養法に用いれられる完全培地を使用する等、大多数の微生物にとって望ましい環境である。しかし、古生物や極端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生物やその試料中に含まれていることが予想される微生物にとって望ましいと考えられる環境を配慮する必要がある。さもなければ殆ど全部が単細胞のままゲル中に止まることになるか、あるいは多くの微生物が死滅するおそれさえもある。もちろん上記増殖環境は、すべての微生物種が増殖するような環境である必要はなく（そのような環境を整えることもできないが）、要するにある環境下に置いて、よく増殖するものと死滅しないが増殖はできないものとを区別できればよいのである。
【００２５】
具体的には、特に温和な環境から採取された試料については、培地について例示すれば、NUTRIENT BROTH (DIFCO社)やTORYPTIC SOY BROTH (DIFCO社)を用いたり、乳酸菌の分離を目指す場合にはGYP-S培地（１％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．２％酢酸ナトリウム、０．５％Tween80、０．５％塩溶液、ｐＨ６．８）や酵母、酢酸菌、乳酸菌等の生育に適したGYMP培地（１％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、ｐＨ６．０）等がある。
【００２６】
次いで、セルソーターを使用して、上記増殖環境下においた後も一個の微生物細胞しか含まないアガロースゲル微小粒子を識別し分離すれば、平板培養法によりコロニーを形成しない微生物種の単一細胞を高い確率で得ることができる。
【００２７】
セルソーター（Flow cytometry and cell sorting system, FC／CS）は、ここでは１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP (Coulter社)を使用したが、同様な機能を有するものであればどのようなものでもよい。ここでは、フローセルのノズル部分は直径１００μｍのものを使用し、サンプルは分離操作に入る前に孔径４０μｍのセルストライナーを用いて不要な凝集塊を除いた。しかしこの前処理は、必要により行えばよい。
【００２８】
微生物（アガロースゲル微小粒子）の分別・識別は、粒子の大きさを表すレーザー光の前方散乱光強度（Forward scatter (FS)）、粒子の内部構造の複雑性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Side Scatter (SS)）、および細胞が特定の蛍光染料により染色されるか否かを知ることができる蛍光強度（FL）の三個のパラメーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の組み合わせにより行う。
【００２９】
すなわち、一個しか微生物細胞を含まないアガロースゲル微小粒子と複数個の微生物細胞を含むアガロースゲル微小粒子とは、ＦＳとＳＳとを用いて識別することができる。また、必要があれば、生きている細胞と死滅した細胞とは、例えばＣＦＤＡ(carboxyfluorescein acetoxymethyl ester)やＣＦＤＡ―ＡＭ(carboxyfuoresceindiacetate acetoxymethyl ester)等の生菌を死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて（ＦＬシグナル）識別することができる。
【００３０】
ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルター（dichroic long-pass filter）によってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。４８８ｎｍレーザーブロックフィルター(laser blocking filter)を用いることによって、自家蛍光から散乱光フラクションを除いた。
【００３１】
蛍光は５５０ｎｍ二色長経路フィルターで分離し、５２５ｎｍパスフィルター（pass filter）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０―５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（band pass filter）を通過したものをＦＬ２（５７０―５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５―６８５ｎｍ）として測定した。
【００３２】
かくして単一細胞を単離でき、得られた単一細胞について、その増殖条件を、検討し、増殖できるようにすれば、通常の平板培養条件では分離できない微生物を分離したことになる。
【００３３】
【実施例】
実施例１
ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＮＲＩＣ１０７９を試験菌として用いた。これを５ｍｌのＧＹＰ―Ｓ培地（ｐＨ６．８）を用いて３０℃にて後期対数増殖期まで静置培養した。得られた培養液を細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるように顕微鏡下で観察しながらリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。一方、アガロース（Sigma社、Type VII）の２％水溶液を電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて４０℃に保温した。
【００３４】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混ぜ、４０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌混合した。次にミネラルオイル（Sigma社、Light white oil）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に上記混合液をシリンジを用いて加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきアガロースをゲル化させた。これにＰＢＳを加えて遠心場にて二回過剰ミネラルオイルを洗い落とし、次いでこれを７０μｍのストレーナーに通し、ストレーナーを通過した画分を得た。
【００３５】
得られたアガロースゲル微小粒子をＧＹＰ―Ｓ液体培地５ｍｌ中（約１ｘ１０６粒子／５ｍｌ）に３０℃にて１５時間インキュベートした（増殖環境下に置いた）。これにインキュベート前アガロースゲル微小粒子５ｍｌを混ぜセルソーターにチャージした。
【００３６】
セルソーターは、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP（Coulter社）を用いた。フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった。アガロースゲル微小粒子を含む試料は、事前に孔径４０μｍのセルストレイナーに通して凝集塊を除いた。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＳＳシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００３７】
セルソーターサイトグラム（散乱光強度分布および積分）は、インキュベート前アガロースゲル微小粒子のＳＳシグナルの大きい一つの集団が観察される（図１）。この集団のアガロースゲル微小粒子中には、顕微鏡観察により一つのアガロースゲル微小粒子に一個の細胞が存在していることが観察された。インキュベート前アガロースゲル微小粒子とインキュベート後のアガロースゲル微小粒子とを混ぜた場合には、セルソーターサイトグラムによれば、上記一つの細胞を有するアガロースゲル微小粒子と同じ位置の集団と、ＦＳおよびＳＳが各々高めにシフトして帯状になった集団に分離した（図２）。帯状になっった集団は、顕微鏡観察の結果アガロースゲル微小粒子中に複数の細胞を含んでいた。一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかった。
【００３８】
実施例２
活性汚泥曝気槽より採取した汚泥試料１ｇに生理食塩水１０ｍｌを加えよく攪拌し、ガーゼ、次いで３５μｍのストレーナーに通した。得られた濾液を微生物を含む試料液とした。
【００３９】
この試料液について、実施例１に示した方法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られたアガロースゲル微小粒子をNUTRIENT BROTH (DIFICO社)５ｍｌ中（約１ｘ１０６粒子／５ｍｌ）に含ませ３０℃にて２４時間振とうした。
【００４０】
インキュベート後のアガロースゲル微小粒子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割した。その結果、NUTRIENT BROTH平板培養ではコロニーを形成しない微生物を分離することができた。
【００４１】
実施例３
メロン腐敗物１ｇを生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、懸濁液を、ガーゼ、次いで３５μｍのストレーナーに通し、得られた濾液を試料液とした。
【００４２】
この試料液について、実施例１に示した方法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られたアガロースゲル微小粒子をＧＹＭＰ培地５ｍｌ（約１ｘ１０６粒子／５ｍｌ）に含ませ、３０℃にて３時間インキュベートした。
【００４３】
次に、これに蛍光色素ＣＦＤＡを１０μモル／ｍｌとなるように添加して、３０℃にてさらに一時間インキュベートした。
【００４４】
インキュベート後のアガロースゲル微小粒子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割した。
【００４５】
その結果、アガロースゲル微小粒子のセルソーターサイトグラムは、増殖環境におく前にはおおむね３つのグループ（サイトグラムを上下左右に四分割した左下、右上および右下区域のグループ）に分割された（図３）。増殖環境においた後は、セルソーターサイトグラムは、図４に示すように、右下区域のグループの割合が減少していた。この右下区域グループのアガロースゲル微小粒子を採取して顕微鏡にて観察したところ一個の細胞が含まれていて、生細胞ではあるが、ＧＹＭＰ平板培養ではコロニーを形成することができなかった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、上に述べたように、平板培養法では単離が困難な微生物種の単一細胞を単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布および積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
【図２】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布および積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
【図３】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布および積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それぞれ表す。
【図４】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布および積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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