(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
図２に示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有する修飾されたタンパク質であって、うどんこ病及び／又はさび病感染に対する耐性を変更することが出来るタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
図２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾されたタンパク質であって、うどんこ病及び／又はさび病感染に対する耐性を変更することが出来るタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
図２に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高緊縮条件下でハイブリダイズすることが出来、修飾されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、当該修飾されたタンパク質がうどんこ病及び／又はさび病感染に対する耐性を変更することが出来るものである、前記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
図２に示されるコード領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾されたアミノ酸配列が、Trp162→Arg、フレームシフト後Phe395、フレームシフト後Trp159、Met1→Ile(a)、Gly226→Asp、Met1→Val(a)、Arg10→Trp、Phe182及びThr183の欠失、Val30→Glu、Ser31→Phe及びLeu270→His〔(a)は次の開始コドンがヌクレオチド位置79−81にあり、コード配列のフレーム内にあることを示し、アミノ酸番号及びヌクレオチド番号は図２に示されるMlo  cDNA配列に翻訳開始部位から始まる）から成る群から選択される変更を含む、請求項２〜４の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾されたアミノ酸配列が、図２に示されるアミノ酸配列において240位における変更を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾されたアミノ酸配列が240位におけるロイシンを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現のための制御配列に作用可能に連結されている請求項１〜８の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記制御配列がプロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
宿主細胞の形質転換に適当であり且つ請求項１〜11の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸ベクター。
【請求項１３】
前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項12に記載の核酸ベクター。
【請求項１４】
前記宿主細胞が植物細胞である、請求項12に記載の核酸ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜11の何れか１項に記載の非相同ポリヌクレオチド或いは請求項12〜14の何れか１項に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
微生物である、請求項15に記載の細胞。
【請求項１７】
植物細胞である、請求項15に記載の細胞。
【請求項１８】
前記非相同ポリヌクレオチドがそのゲノム内に組み込まれている、請求項17に記載の細胞。
【請求項１９】
一倍体ゲノムあたり１より多くの前記ポリヌクレオチドを有する、請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
植物中に含まれる、請求項17〜19のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項17〜20のいずれか一項に記載の細胞を含んで成る植物。
【請求項２２】
請求項21に記載の植物の有性もしくは無性繁殖子孫、クローンもしくは後代であるか、または前記植物、子孫、クローンもしくは後代の任意部分もしくは栄養分体である植物。
【請求項２３】
請求項21又は22に記載の植物の一部分または栄養分体。
【請求項２４】
請求項１〜11の何れか１項の記載のポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブであって、図２に示されるヌクレオチド配列において、少なくとも300個の連続するヌクレオチドを含んで成るプローブ。
【請求項２５】
請求項１〜11の何れか１項の記載のポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブであって、図２に示されるヌクレオチド配列において、少なくとも600個の連続するヌクレオチドを含んで成るプローブ。
【請求項２６】
請求項１〜４及び６〜11の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの製造方法において、図２に示されるヌクレオチド配列を変更する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記変更が部位特異的変異を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記変更が、エチルメタンスルホネート、ニトロソメチル尿素又はアジ化ナトリウムによる変異である、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記変更が、Ｘ−線又はγ−線照射による変異である、請求項26に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、増強された病原体耐性を植物に提供するために、植物の防御応答を刺激することに関する。より詳しくは、本発明は、大麦Mlo遺伝子、様々な変異型mlo対立遺伝子、および様々な種からの多数の相同体のクローニングに基づく。Mlo遺伝子は大麦では今まで成功したことのない位置クローニング方法を使って単離された。詳細と考察を下記に与える。野性型Mloは病原体防御応答に負の調節機能を及ぼし、その変異体は病原体の非存在下で病原体防御応答を示す。本発明によれば、Mlo機能のダウンレギュレーションまたはアウトコンペティションを利用してトランスジェニック植物における防御応答を刺激し、増強された病原体耐性を付与することができる。
病原体に対する防御応答が構成的に発現されると思われる突然変異が幾つかの植物について記載されている。大麦のMlo遺伝子座の変異誘発型劣性対立遺伝子（mlo）は葉病斑表現型を示し、そしてうどんこ病菌Erysiphe graminis f sp hordeiに対する見かけ上永続的な広域スペクトル耐性を付与する。
うどんこ病病原体に対する耐性応答は遺伝学的に十分特徴づけられている
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解析された大多数の例では、耐性はFlorの遺伝子対遺伝子説の法則に従って品種特異的耐性遺伝子により特定される（Flor, 1971）。この型の植物／病原体相互作用では、耐性は１つが宿主からのでもう１つが真菌病原体からのである２つの相補的遺伝子により指定され且つ該遺伝子の存在に依存している。この相補的遺伝子は、それぞれ（病原体）耐性（「Ｒ」）遺伝子および非病原性遺伝子と作用上名付けられた。うどんこ病耐性遺伝子（Mlx）の大部分は優性または半優性形質として働く
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Mlo遺伝子座の劣性（mol）対立遺伝子により媒介される一遺伝子性耐性はそれとは異なる。劣性であることの他に、この耐性は（i）それが該病原体のほとんど全ての既知分離物に対して広域スペクトル耐性を付与すること、（ii）mlo耐性対立遺伝子が試験した任意の感受性野性型（Mlo）品種の変異原処理により得られたこと、そして（3）mlo耐性対立遺伝子が病原体の不在下で防御摸擬表現型を示すことから、単一病原体株に対する品種特異的耐性とは異なる（Wolter他，1993）。遺伝情報は、Mlo野性型対立遺伝子が病原体の侵襲に対する防御応答に対して負の調節機能を果たすことを示す。
mlo対立遺伝子により媒介される耐性は大麦育種において現在広く利用されており、ヨーロッパでは見積りで１千万ヘクタールがこの遺伝子型の種子を使って毎年栽培されている。別の穀物におけるうどんこ病に対する「mlo様」遺伝耐性は今まで報告されていないが、真菌が小麦（うどんこ病菌Erysiphe graminis f sp triticiにより発病）、エンバク（E. g. f sp avenaeにより発病）およびライ麦（E. g. f sp secalisにより発病）における関連病原菌である。穀類は形態学的に、遺伝学的におよび生化学的に互いに高度に関連している（Moore他，1995）ので、それらの種に相同遺伝子が存在することは予想されるだろう。小麦やエンバクにおいて「mlo様」遺伝耐性を見出せなかったのは、おそらく、突然変異誘発による６遺伝子コピーの全部の欠損対立遺伝子の獲得を難しくするそれらの六倍体ゲノムのためであり、そして全てのそのような変異が自然に起こる見込みはごくわずかである。別の穀類においてmlo同等物を見出せなかったのは、おそらく、それらの種での突然変異分析が不十分なこととそれらの異系交配性質の結果としての複雑化のためであろう（例、ライ麦）。
大麦の第４染色体上のMloに密接に連鎖したRFLPマーカーは、６つの遺伝的背景からmlo対立遺伝子を含むmlo戻し交雑系の収集に基づいて同定された（Hinze他，1991）。RFLPマーカーに基づいたMloの地図位置は、形態マーカーを使ったマッピングにより以前に決定されたそれの染色体位置と一致した
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両端が遺伝子マーカーに隣接したMlo遺伝子を含む〜３cM（センチモルガン）の遺伝距離が同定されたので、我々は位置クローニングによって該遺伝子の単離を試みることを決断した。
しかしながら、大麦遺伝子の位置クローニング試験の成功例は一つも報告されていない。我々は多数の困難に直面した。
第一に、大麦のゲノム（5.3×109bp／一倍体ゲノム当量；Bennett & Smith, 1991）はヒトゲノムのほぼ２倍のサイズを有し、そして全遺伝地図が〜1,800cMに及ぶ（Becker他，1995）ため、我々は非常に不利な遺伝距離と物理距離の割合に直面した（1cMが〜3Mbに相当する）。
第二に、0.1cMより高い精密度での連鎖マーカーの位置確認を可能にするMlo周辺の高分解能遺伝地図を作製しなければならなかった。
第三に、我々は個々の大きな挿入ゲノムクローン上で標的遺伝子と両隣接ＤＮＡマーカーの範囲を物理的に定めようと試みた。この方法は後に「染色体ランディング」と名付けられた（Tanksley他，1995）。このために、大麦のメガ塩基ＤＮＡから、500〜600kbの平均挿入断片サイズを有する完全大麦ＹＡＣライブラリーを作製しなければならなかった。これは先例のないことであった。
第四に、我々は、時間のかかる大麦トランスジェニック植物の作製や種々の候補遺伝子の試験を必要とすることなく、物理的に範囲が定められた領域内でMlo遺伝子を同定できるようにする、普通とは違う遺伝材料を調製しなければならなかった。10種類の特徴付けられた放射線または化学的誘導mlo変異体
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を我々の研究に使用した。遺伝子単離の一連の決定的証拠を得るために、我々は、特徴付けられたmlo欠損対立遺伝子から取り掛かり野性型Mlo対立遺伝子の機能回復を当てにすることにした。このために、我々はmloヘテロ対立遺伝子間交雑を実施し、そして感受性遺伝子内Mlo組換え体を単離した。これらの組換え体の配列分析は記載の遺伝子の機能を証明する。
大麦Mlo遺伝子および相同体（他の植物種からの相同体を含む）のクローニングは多数の実用的用途を引き出し、それが本発明の様々な観点に反映される。
本発明の第一の観点によれば、Mlo機能を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子が提供される。当業者は、「Mlo機能」が防御応答を抑制する能力を指し、前記防御応答が品種および／または病原体に無関係であり且つ病原体の存在に対し自律性であることを認識するだろう。Mlo機能は例えば大麦のMlo遺伝子、アブラナ科（Arabidopsis）のAcd遺伝子およびLsd遺伝子である。
野性型Mloの配列の機能的発現をダウンレギュレートするまたは破壊するmlo変異は劣性であるので、それらは野性型配列の発現により補完される。よって「Mlo機能」は、構成的防御応答および／または例えばうどんこ病やさび病（例えば黄さび病）のような病原体に対する植物の感受性のレベルを評価することにより決定することができる。従って、Mlo機能を有する推定ヌクレオチド配列を適当なmlo変異体の補完について試験することができる。「mlo機能」という語句は、植物にmlo変異型表現型を付与する配列を言及するために用いられる。
「Mlo」の大文字使用および「mlo」の小文字使用は、「野性型」機能と「変異型」機能とを区別するために用いられる。
mlo変異型表現型は、品種および／または病原体に無関係であり且つ病原体の存在に対し自律性である。１または複数の病原体に対する増強された耐性の提示により特徴づけられる。
試験植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。適当な単子葉植物としては、大麦、米、小麦、トウモロコシまたはエンバクのいずれかが挙げられるが、特に大麦である。適当な双子葉植物としてはアブラナ科（Arabidopsis）が挙げられる。
本発明の核酸は、図２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、またはそれの対立遺伝子、変異形、誘導体もしくは突然変異体、または相同体をコードすることができる。
本発明の核酸は、大麦のMlo遺伝子の配列を有するか、与えられる配列の突然変異体、変異形（もしくは誘導体）もしくは対立遺伝子、または相同体であることができる。好ましい突然変異体、変異形および対立遺伝子は、野性型遺伝子の機能的特性、特に本明細書に記載されるような防御応答を抑制する能力、を保持している配列をコードするものである。別の好ましい突然変異体、変異形および対立遺伝子は、例えばMlo機能を低下させるかまたは完全にもしくは部分的に廃止することにより、防御応答の構成的活性化を引き起こすか、または少なくとも防御応答の活性化を促進する配列（すなわち、mlo変異型配列である）をコードする。mlo変異型配列を与える好ましい変異は表１に示される。突然変異体、誘導体または変異形を生成する配列変更は、１もしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失および／または置換を引き起こす、核酸中の１もしくは複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換のいずれか１つまたは複数によることができる。もちろん、コードされるアミノ酸配列に全く相違を引き起こさない核酸の変更も含まれる。特定の変異形、突然変異体、対立遺伝子および誘導体、並びに相同体については下記に更に記載される。
本発明の一観点に係る好ましい核酸配列は、推定アミノ酸配列と一緒に図２に示される。核酸は、コードされるアミノ酸配列の変更を伴うかまたは伴わない（遺伝暗号の縮重のために）、ヌクレオチドの置換によりおよび／または１もしくは複数のヌクレオチドの付加、挿入および／または置換の組合せにより変更を受けてもよい。
下記に論じるように、本発明の更なる観点は、米（ゲノム配列：図５の下側の行、ｃＤＮＡ配列：図10、アミノ酸配列：図13）および大麦（ゲノム配列：図６の下側の行、ｃＤＮＡ配列：図11、アミノ酸配列：図14）由来のものを含む図２に示されるMlo配列の相同体を提供する。更には表５Ｂ（ヌクレオチド配列）および図５Ａ（アミノ酸配列）は米およびシロイヌナズナ由来の相同ＥＳＴを示す。
本発明は、提供される配列のいずれか１つを有する核酸を含んで成るベクター、好ましくは或る生成物を発現させることができるベクターも提供する。ベクターは好ましくは、植物細胞および／または微生物細胞中への形質転換に適するものである。本発明は更に、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞、特に植物細胞または微生物細胞〔例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）〕を包含する。従って本発明の核酸を含んで成る宿主細胞、例えば植物細胞が提供される。細胞内では、核のゲノム、即ち染色体中に該核酸が組み込まれてもよい。一倍体ゲノムあたり複数の非相同ヌクレオチド配列が存在してもよい。
本発明の核酸を含んで成るベクターは、特に該ベクターがゲノム中への組換えのために細胞に核酸を導入する目的で使用するつもりである場合には、必ずしもプロモーターを含む必要はない。
本発明に係る核酸分子とベクターは、それらの自然環境から単離されそして／または精製された形で、関連する配列以外の起源のまたは目的の種の核酸もしくは遺伝子を含まないまたは実質的に含まない、実質的に純粋なもしくは均質な形で、提供することできる。本発明の核酸はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを含んでもよく、完全にまたは部分的に合成であってもよい。「分離物」という語はそれらの可能性の全てを包含し得る。
本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現生成物、および適当な宿主細胞（例えばＥ．コリ）中での適当な条件下でのコード核酸からの発現により発現生成物を生産する方法も包含する。当業者は、ベクターを作製することや発現および組換え遺伝子発現の生成物の回収のためのプロトコルをデザインすることが十分できる。１または複数の適当な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適宜他の配列を含む、適当なベクターを選択または作製することができる。詳細については、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual:第２版，Sambrook他，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。形質転換法は、使用する宿主細胞によるが、十分に知られている。例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現に際しての核酸の操作、並びにタンパク質の分析のための多数の既知技術およびプロトコルが、Short Protocols in Molecular Biology，第２版，Ausubel他編，John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。言及される他の文献に加えて、Sambrook他とAusubel他の開示が参考として本明細書に組み込まれる。
精製されたMloタンパク質、またはそれの断片、突然変異体もしくは変異形、例えばそれをコードする核酸からの発現により組換え生産されたものは、当業界において標準的な技術を使って抗体を惹起せしめるために用いることができる。抗体および抗体の抗原結合性断片を含んで成るポリペプチドは、後述する通り、別の種からの相同体を同定する際に使用することができる。
抗体の産生方法は、該タンパク質またはその断片を用いて哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫処置することを含んで成る。当業界で既知の様々な方法のいずれかを使って免疫動物から抗体を得ることができ、そして好ましくは着目の抗原への抗体の結合を利用して、抗体をスクリーニングすることができる。例えば、ウエスタンブロット技術または免疫沈澱法を使うことができる（Armitage他，1992, Nature 357:80-82）。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
哺乳類を免疫処置することに代わるものまたは補足として、例え機能的免疫グロブリン結合領域を表面上に表示するλバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使って発現された免疫グロブリン可変領域の組換え生産ライブラリーから、適当な結合特異性を有する抗体を得ることができる。例えばWO 92/01047を参照のこと。
ポリペプチドまたはペプチドに対して惹起せしめた抗体は、相同ポリペプチドの同定および／または単離に、次いでコード遺伝子の同定および／または単離に利用することができる。よって、本発明は、Mloもしくはmlo機能を有するポリペプチドを同定または単離する方法（本明細書中に開示される態様に従う）であって、Mloもしくはmloペプチド、ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変異体を結合することができる。あるいは好ましくはそのようなペプチドもしくはポリペプチドに対する結合特異性を有する（例えば本明細書中に同定されたアミノ酸配列を有する）、抗体の抗原結合性領域を含んで成るポリペプチド（例えば完全抗体もしくはその断片）を用いて、候補のペプチドまたはポリペプチドをスクリーニングすることを含んで成る方法を提供する。Mloもしくはmloペプチドもしくはポリペプチドまたはそれらの突然変異体、変異形もしくは誘導体を結合しそして好ましくはそれらに特異的である抗体の抗原結合性領域を含んで成る抗体およびポリペプチドのような特異的結合メンバーは本発明の別の観点を表し、同様にそれらの使用およびそれらを使用する方法も本発明の別の観点を表す。
スクリーニング用の候補のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、着目の植物由来の核酸を使って作製された発現ライブラリーの生成物であるか、あるいは天然源からの精製工程の生産物であってもよい。
抗体を結合することがわかったペプチドまたはポリペプチドを単離し、次いでアミノ酸配列決定にかけることができる。任意の適当な技術を使ってペプチドまたはポリペプチドを完全にもしくは部分的に配列決定することができる（例えばポリペプチドの断片を配列決定してもよい）。アミノ酸配列情報は、例えば候補となる核酸へのハイブリダイゼーションの際にプローブもしくはプライマーとして使われる１もしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重プール）をデザインすることにより、または下記に記載するようにコンピューター配列データベースを検索することにより、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を得るのに利用することができる。
本発明の別の観点は、大麦以外の種を含む植物からMlo相同体を同定しそしてクローニングする方法であって、図２に示される配列から誘導されたヌクレオチド配列を使用する方法を提供する。更に類似の観点は、添付された他の図面のいずれかから誘導されたヌクレオチド配列を使用する。当業者に周知の技術を使って核酸ライブラリーをスクリーニングし、それによって相同配列を同定し、次いで試験することができる。大麦のMlo遺伝子および様々な相同体についての配列情報を提供することにより、大麦や本明細書中に更に例示されるような他の植物種から相同配列を獲得できるようになる。
また、図２（エキソンが強調されている）に提供されるMlo配列との比較により同定され得る推定上のエキソン配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを誘導し、そして着目の植物（例えば大麦や米）からの全ＲＮＡを使って、図５および６に示される相同体（cDNA配列およびアミノ酸配列は他の図に示される）についてRT−PCRを実施することができる。
ヌクレオチド配列が与えられておりそしてアミノ酸配列が与えられているかまたは推定可能である相同体は、図２に示される大麦遺伝子について開示されたものに準じて、本発明の別の観点を提供する。
本発明は、図２に示されるものから誘導されるヌクレオチド配列または図２に示されるアミノ酸配列を使って得られたMlo相同体をコードする核酸にも及ぶ。好ましくは、前記ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列は、図２のヌクレオチド配列によりコードされる配列と、好ましくは少なくとも約50％、または少なくとも約55％、または少なくとも約60％、または少なくとも約65％、または少なくとも約70％、または少なくとも約75％、または少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％の相同性を有し、最も好ましくは少なくとも約95％の相同性を有する。アミノ酸配列に関する「相同性」とは、同一性または類似性を言い、好ましくは同一性を言うために用いられる。高レベルのアミノ酸同一性は機能的に重要なドメインまたは領域に限定されてもよい。
本発明に係る突然変異体、対立遺伝子、変異形または誘導体アミノ酸配列としては、図２に示される配列内に、図２に示される配列に関して単一アミノ酸変更、または２，３，４，５，６，７，８もしくは９つの変更、約10, 15, 20, 30, 40もしくは50の変更、または約50, 60, 70, 80もしくは90より多くの変更を含むことができる。図２に示されるアミノ酸配列中の１または複数の変更に加えて、突然変異体、対立遺伝子、変異形または誘導体アミノ酸配列はＣ末端および／またはＮ末端に追加のアミノ酸を含んでもよい。
よく知られているように、アミノ酸レベルでの相同性は、一般にアミノ酸類似性または同一性として見られる。類似性は「保存的変更」、すなわちイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような或る疎水性残基から別の疎水性残基への置換、または或る極性残基から別の極性残基への置換、例えばアルギニンからリジン、グルタミンからアスパラギン酸、もしくはグルタミンからアスパラギンへの置換を考慮に入れる。類似性は当業界で標準使用されているAltschul他（1990）J. Mol. Biol. 215: 403-10のTBLASTNプログラムにより限定および測定することができ、あるいはこれにはWisconsin Package, Version 8, 1994年９月（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711）の一部である標準プログラムBestFitが好ましいかもしれない。BestFitは２つの配列間の最高類似性セグメントの最適整列を行う。最適整列は、SmithおよびWatermanの局部相同性演算法を使って対合の数を最大にするようにギャップを挿入することにより見出される。
相同性は本明細書中に示される関連配列の全長に及んでもよく、あるいはより好ましくは、場合場合で関連アミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、約20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, 333, 400, 450, 500, 550, 600もしくはそれ以上のアミノ酸またはコドンの連続配列に及んでもよい。
ここに提供されるＥＳＴ配列は、図２のMloアミノ酸配列に対して平均70％の類似性と50％の同一性を有する。我々は、米相同体（図５）と大麦相同体（図６）が81％のアミノ酸同一性を有することを示す（両アミノ酸配列は図13と図14に示される）。
ある態様では、特定配列の対立遺伝子、変異形、誘導体、突然変異体または相同体がその特定配列に関して、約20％、または約25％、または約30％、または約35％、または約40％、または約45％というように低い全体的相同性しか示さないことがある。しかしながら、機能的に重要なドメインまたは領域では、アミノ酸相同性はずっと高いに違いない。推定上の機能的に重要なドメインまたは領域は、相同体の配列比較をはじめとする生物情報科学プロセスを使って同定することができる。異なるポリペプチドの機能的に重要なドメインまたは領域を組み合わせて、コード核酸から融合タンパク質として発現させることができる。例えば、結果として得られるMloまたはmlo機能を有する発現生成物が種々の親タンパク質の断片を含むように、異なる相同体の特に有利なまたは望ましい性質をハイブリッドタンパク質のなかに組み合わせることができる。
本発明により提供されるヌクレオチド配列情報またはその任意部分を、相同配列を発見するためのデータベース検索に使用することができ、その相同配列の発現生成物をMloまたはmlo機能について試験することができる。それらは植物においてmlo変異型表現型を補完する能力を有するか、または植物中で発現させるとmlo表現型を付与することができる。
公開配列データベース中に、最近我々は図２の配列の相同体を幾つか同定した。我々は米と大麦並びに双子葉植物シロイヌナズナにおいて既に相同体を発見している。
相同体を配列決定し、それらの発現パターンを研究し、そしてそれらの発現を変更することの効果を調べることにより、大麦のMloに類似した機能を果たす遺伝子を得ることができる。もちろん、それらの配列の突然変異体、変異形および対立遺伝子も、大麦遺伝子について上述したのと同じ見地から本発明の範囲内に含まれる。
本明細書中に開示される相同体間の相同性は、例えば配列保存に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチド（例えば縮重プール）を使って、他の相同体の同定に利用することができる。
更に別の観点によれば、本発明は、例えば大麦以外の種から、Mlo相同体を同定する方法またはクローニングする方法を提供し、該方法は図２に示されたものまたは別の図面のいずれかに示されたものより誘導されたヌクレオチド配列を使用する。例えば、そのような方法は、相同体を検索するのに、図２および／または図５および／または図６および／または図10および／または図11および／または図12の配列間で保存された１もしくは複数のヌクレオチド配列を含んで成るか、あるいは図２および／または図７および／または図13および／または図14および／または図15の間で保存されたアミノ酸配列をコードしている。１もしくは複数のオリゴヌクレオチドを使用することができる。よって、オリゴヌクレオチドのまたはそのようなオリゴヌクレオチドを含んで成る核酸分子を標的／候補核酸にハイブリダイズせしめることを含んで成る。核酸を獲得する方法が提供される。標的または候補核酸は、例えば、そのような核酸を含むことが知られているかまたは含むと思われる、単子葉植物または双子葉植物のいずれかの生物体より得られるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを含んで成る。好結果のハイブリダイゼーションを同定し、そして更なる研究および／または利用のために標的／候補核酸を単離することができる。
ハイブリダイゼーションは、適当に緊縮な条件下で核酸を探査しそして陽性ハイブリダイゼーションを同定すること（既知技術に従う）および／または核酸増幅方法（例えばＰＣＲ）におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用を必要とし得る。探査のための好ましい条件は、更に調査することができるような、陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションを含む単純なパターンが得られるのに十分な位に緊縮である条件である。少数の陽性クローンだけが残るまでハイブリダイゼーションの緊縮性を高めることは当業界で周知である。
まだ核酸ハイブリダイゼーションを使用するけれども、探査に代わるものとして、ＤＮＡ配列を増幅せしめる目的でデザインされたオリゴヌクレオチドを、常用手順を用いて、ＰＣＲ反応においてまたは別の核酸増幅を伴う方法において使用することができる。例えば“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”，Innis他編，1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
何らかの目的でプローブまたはＰＣＲプライマーの設計に使用するのに好ましいアミノ酸配列は、植物の防御応答を抑制することができる遺伝子によりコードされる少なくとも２つのMloペプチドもしくはポリペプチド間で（完全に、実質的にまたは部分的に）保存された配列であり、例えば本願の添付図面のいずれかに記載のアミノ酸配列を有しそして／または本願の添付図面のいずれかに記載のヌクレオチド配列によりコードされる配列である。
アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝暗号の縮重、および適当ならば候補の核酸の起源である生物のコドン使用頻度を考慮に入れながら、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーをデザインすることができる。
好ましくは、本発明の或る態様に従ったオリゴヌクレオチド、例えば核酸増幅用のオリゴヌクレオチドは、長さが約50ヌクレオチドまで、または約40ヌクレオチドまで、または約30ヌクレオチド以下である（例えば18, 21または24）。
そのようなＰＣＲ生成物がMlo相同体遺伝子に該当するか否かの評価は様々な方法で行うことができる。そのような反応からのＰＣＲバンドは生成物の複雑な混合物を含む可能性がある。個々の生成物をクローニングし、各々を１つずつ個別にスクリーニングしてもよい。着目の植物への導入時に形質転換により分析して機能を評価してもよい。
記載の通り、本発明の核酸は、本明細書中に与えられる配列情報に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使って得ることができる。大麦または別の植物（上記参照）の１もしくは複数の細胞から単離および／または精製された核酸を、あるいは前記植物から単離および／または精製された核酸より誘導された核酸ライブラリー（例えば前記植物から単離されたｍＲＮＡより誘導されたｃＤＮＡライブラリー）を、選択的ハイブリダイゼーションの条件下で探査しそして／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような特異的核酸増幅反応にかけることができる。探査される核酸または増幅反応で鋳型として使われる核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。必要なら、１または複数の遺伝子断片を連結せしめて全長コード配列を作製してもよい。
我々は、本明細書中に開示されるMlo配列由来の幾つかのＰＣＲプライマーを試験して、大麦ゲノムＤＮＡとＲＴ−ＰＣＲ鋳型の両方を使って、本発明の核酸を増幅させるそれらの特異性について調べた。後者は大麦ポリＡ+ ＲＮＡから合成した。どちらの場合も、ＰＣＲ生成物のクローニングとその後のＤＮＡ配列決定により証明されるように、期待のMlo由来遺伝子断片を増幅させることができた。ＲＴ−ＰＣＲ生成物を鋳型として使用した場合、記載の通り５′および３′ＲＡＣＥ技術によって全長ｃＤＮＡクローンを得ることができる。
試験したプライマーの例としては以下のものが挙げられる：
0004324656.tif 000006
種々のプライマー組合せを試験した：38／39Ａ；38／39；38／33；38／37；38Ａ／39Ａ；38Ｂ／39Ａ；38／25Ｌ；38／25ＬＮ；25Ｒ／25Ｌ；25Ｒ／25ＬＮ；25Ｒ／53。
本発明の種々の観点は、得られる核酸、着目の核酸の存在についての材料（例えば細胞溶解物、核酸調製物）のスクリーニング方法、核酸の獲得方法並びに上記に与えたプライマーおよびプライマーの組合せの獲得方法を包含する。
本明細書中に提供する配列情報は、育種計画の中の任意の特定の植物、栽培品種、品種、個体群、土地品種（landrace）、家系の一部または別の選抜において、特定のmlo耐性対立遺伝子もしくは感受性対立遺伝子（例えば野性型）または他のそのような遺伝子型の存在を決定するための、診断試験の設計（デザイン）も可能にする。診断試験は、核酸またはポリペプチドの検出により特定の対立遺伝子の存否を測定することに基づいてもよい。
核酸レベルでは、これは適当なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、例えばMlo遺伝子もしくはその相同体（本明細書に開示されるいずれの相同体も含む）の断片、または任意の特定の対立遺伝子、例えばmlo表現型を与える対立遺伝子、例えば本明細書に開示される任意のそのような対立遺伝子のハイブリダイゼーションを必要とし得る。ハイブリダイゼーションは、mloの特定の対立遺伝子変異体からの生成物を増幅させるようにデザインされたＰＣＲに続いて、多数の可能な方法（非限定的例として、ゲル電気泳動、毛管電気泳動、ヌクレオチド配列プローブの直接ハイブリダイゼーションなどが挙げられる）のいずれかによる増幅生成物の検出を伴う。診断試験は、多数の可能な方法（例として、ＤＮＡ断片サイズ分画、制限部位変更（例えばCAPS）などが挙げられる）のいずれかにより種々の可能な対立遺伝子を識別する試験を使って、Mlo遺伝子座からの任意対立遺伝子または種々の対立遺伝子を増幅せしめるようにデザインされたＰＣＲに基づいて行うことができる。診断試験はまた、当業者に明白であろう多数の核酸分析の変形、例えばハイブリダイゼーションプローブとして合成mlo由来配列の使用、に基づいてもよい。
大まかに言えば、上記方法は、核酸配列の存在についてスクリーニングするものと、ポリペプチドの存否を検出することによるものとに分かれる。該方法は、核酸配列またはポリペプチドを含むと思われる１個以上の植物または植物細胞からの生物学的試料を利用する。
核酸またはポリペプチドを検出するための代表的アプローチは、
(a)  植物または植物細胞からの試料中の核酸の配列を図７に示されるヌクレオチド配列の全部または一部と比較して、被検体からの試料が変異を含むかどうかを決定すること；
(b)  図２に示されるアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドが試料中に存在するかどうか決定し、そして存在するなら、該ポリペプチドが全長であるか、そして／または変異形であるか、そして／または正常レベルで発現されるかどうかを決定すること；
(c)  フィンガープリント法を実施して、制限酵素が試料中の核酸を切断する時に生じる制限パターンを、図７に示されるヌクレオチド配列からまたはそれの既知の突然変異体、対立遺伝子もしくは変異形から得られる制限パターンと比較すること；
(d)  図７に示されるヌクレオチド配列もしくはその断片、またはそれの突然変異体、対立遺伝子もしくは変異形を含んで成る核酸に結合することができる特異性結合メンバーと試料とを接触せしめ、ここで前記特異的結合メンバーとしては図７の配列とハイブリダイズできる核酸、または図７の配列を含む核酸に対して特異的を有する結合性領域を含むポリヌクレオチドもしくはそれによりコードされるポリペプチド、またはそれの変異形が挙げられ、そして前記特異的結合メンバーの結合を測定すること；
(e)  図７に示されるヌクレオチド配列に基づく１または複数のプライマーを使用したＰＣＲを実施して、図７のヌクレオチド配列またはそれの突然変異体、対立遺伝子もしくは変異形を含んで成る核酸について前記試料をスクリーニングすること
により前記植物または植物細胞からの試料を分析することを含んで成る。
耐性対立遺伝子について核酸をスクリーニングする時は、例えばＰＣＲを使って初めに試料中の核酸を増幅させ、試料中に存在する他の配列に比べて分析対象の量を増加させておくだろう。これにより、試料中に標的配列が存在するならば高感度で標的配列が検出できるようになる。この初期段階は、当業界で次第に重要性が増してきている高感度アレイ技術を使うことによって回避することが可能である。
該遺伝子の変異形は、野性型配列と比較して、遺伝子機能を破壊してもしなくてもよい１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または付加のいずれか１つまたは複数を含む（表１に示されるような）。ヌクレオチドレベルでの差異はコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の差異に必ずしも反映されるとは限らない。しかしながら、遺伝子の突然変異または他の差異が、生産されるポリペプチド（もしあるなら）の性質に重大な影響を及ぼし得るフレームシフトまたは終止コドンを生じさせるか、あるいはコードされるポリペプチドに点変異または大規模変異（gross mutational change）を生じさせてもよい。そのような変異としては、ポリペプチド中の１もしくは複数のアミノ酸もしくは領域の挿入、欠失、置換および／または付加が挙げられる。プロモーター配列または他の調節領域中の変異は、遺伝子からの発現を減少させるかまたはmRNA転写物のプロセシングもしくは安定性に影響を及ぼし得る。
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを含む調製物に関して試験を実施することができる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを試験することは、イントロン配列の不在により核酸の複雑さが減るという利点を持つが、調製物を作製するのに過剰な時間と努力が必要であるという潜在的欠点も有する。ＲＮアーゼが広く散在するためにＲＮＡはＤＮＡよも操作がより難しい。
試験試料中の核酸を配列決定し、その配列を図２または他の図面に示される配列と比較して差異があるかどうかを決定することができる。もしあるなら、その差異を既知の感受性対立遺伝子（例えば表１に要約されるような）と比較して試験核酸が指摘の変異を１つもしくは複数含むかどうかを決定することができ、またはその差異を病気耐性との関連性について調べることができる。
次いで増幅された核酸を上記と同様に配列決定しそして／または任意の別の方法で試験して、特定の特徴の存否を調べることができる。試験用の核酸は、制限酵素消化や電気泳動といった様々な別の技術を使って、細胞から分離された核酸からまたはライブラリー中の核酸から調製してもよい。
核酸は変異体特異的または対立遺伝子特異的プローブを使ってスクリーニングすることができる。そのようなプローブは、病気耐性と関連することが知られている配列変更を含む、遺伝子の一領域またはその相補物に配列が一致する。適当に緊縮性の条件下での試験核酸へのそのようなプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、試験核酸中に配列変更が存在することを示す。効率的スクリーニングのために、同一試験試料について複数のプローブを使用してもよい。
対立遺伝子特異的または変異体特異的オリゴヌクレオチドは、試験試料中に特定の配列が存在するならば同様にＰＣＲにおいて使用して、その特定の配列を特異的に増幅させることができる。ＰＣＲバンドが遺伝子変異体を含むかどうかの評価は、当業者によく知られている様々な方法で実施することができる。例えば、変性ポリアクリルアミドＤＮＡ配列決定用ゲル上に変異または多形性を表示できるようにする方法でＰＣＲ生成物を処理し、遺伝子変異体に関連する特定のバンドを選択することができる。
試験試料中の変異型配列の存在を探査することに代わるものまたは補足は、適当に特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを使って、正常配列の存在を探査することである。
プローブと試験核酸との間のハイブリダイゼーションに続いて不正対合（ミスマッチ）の検出を頼みにするアプローチを使ってもよい。適当な条件（温度、ｐＨなど）下で、オリゴヌクレオチドプローブは完全には相補的でない配列とハイブリダイズするだろう。２つの核酸分子間の塩基対合の程度は、不正対合にもかかわらずそれらをアニールせしめるのに十分なものであろう。アニールしている２つの核酸分子間の存在を検出するには様々なアプローチが公知である。
例えば、ＲＮアーゼＡは不正対合の部位のところを開裂する。開裂は、関連する１または複数のプローブとアニーリングした試験核酸を電気泳動し、そして全長プローブ／試験ハイブリッドよりも小さい分子（すなわち高い電気泳動移動度を有する分子）を探すことにより検出することができる。別のアプローチはリゾルベースまたはエンドヌクレアーゼのような酵素の使用に頼る方法である。
かくして、病気耐性に関連する変異が起こることが知られている正常遺伝子（センス鎖かまたはアンチセンス鎖のいずれか）の一領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ（例えば表１参照）を試験核酸にアニーリングさせ、そして不正対合の存否を検出することができる。不正対合の存在の検出は、病気耐性と関連する変異が試験核酸中に存在することを表す。他方で、病気耐性と関連する変異を含む遺伝子の一領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを試験核酸にアニーリングさせ、そして不正対合の存否を検出することができる。不正対合の存在の検出は、試験試料中の核酸が正常配列を有するか、または別の変異配列もしくは対立遺伝子配列を有することを示す。どちらの場合でも、該遺伝子の異なる領域に対して一組のプローブを使用する。
核酸分子の配列差異の存在は、制限酵素消化によって、例えば１または複数の制限酵素を使って核酸の試料を切断した時に生じる制限パターンを、正常遺伝子または変異体もしくは対立遺伝子を含む試料を同じ１または複数の制限酵素を使って消化した時に得られるパターンと比較するというＤＮＡフィンガープリント法において、検出することもできる。
プロモーターまたは他の調節領域中の傷害（lesion）の存否は、転写によるｍＲＮＡ産生レベルまたは該ｍＲＮＡからの翻訳によるポリペプチド産生レベルを測定することにより、評価することもできる。
植物の細胞から単離および／または精製された核酸、または細胞から単離および／または精製された核酸より誘導された核酸ライブラリー（例えば細胞から単離したｍＲＮＡより誘導されたｃＤＮＡライブラリー）を、選択的ハイブリダイゼーション条件下で探査し、そして／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような特異的核酸増幅反応にかけることができる。
方法としては、標的核酸への１または複数（例えば２つ）のプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションが挙げられる。核酸が二本鎖ＤＮＡである場合、ハイブリダイゼーションより前に一本鎖ＤＮＡを生成させるための変性が実施されるだろう。ハイブリダイゼーションはＰＣＲ手順の一部であるか、またはＰＣＲを含まない探査手順の一部であろう。典型的手順はＰＣＲと低緊縮性ハイブリダイゼーションの組合せである。好結果のハイブリダイゼーション現象を同定しそしてハイブリダイズした核酸を単離するために、当業者に利用可能である多数のものから選ばれたスクリーニング方法を用いる。
標的核酸（例えばＤＮＡ）へのプローブの結合は、当業者の自由裁量で様々な技術を使って測定することができる。例えば、プローブを放射性標識、蛍光標識または酵素標識してもよい。プローブの標識付けを使わない別の方法としては、制限断片の長さ多形性の調査、ＰＣＲを使った増幅、ＲＮアーゼ開裂および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ探査が挙げられる。
探査には標準サザンブロット技術を使用することができる。例えば細胞からＤＮＡを抽出し、そして種々の制限酵素で消化する。次いで制限断片をアガロースゲル上での電気泳動により分離した後、変性させそしてニトロセルロースフィルターに移行する。フィルター上のＤＮＡ断片に標識プローブをハイブリダイズせしめ、そして結合を測定する。探査用のＤＮＡは細胞からのＲＮＡ調製物より調製することができる。
制限酵素で消化したＤＮＡのサザンブロットに低緊縮性条件下で様々なプローブをハイブリダイズせしめることにより、予備実験を実施する。バックグラウンドハイブリダイゼーションが低くて且つ多数のハイブリダイズした断片が得られた時、最適条件に達したのである。この条件を使って、発現配列の標本である核酸ライブラリー、例えばｃＤＮＡライブラリーを検索することができる。
指摘したように、当業者は、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成および温度といった要因を考慮に入れながら、適切な所望の緊縮性条件を選択的ハイブリダイゼーションに使用することが十分可能である。
本発明の診断アッセイの或る好ましい態様では、図２に示される配列の断片であるか、または例えば表１に記載されるものような病気耐性に関連した任意の対立遺伝子の断片である本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約30ヌクレオチドである。そのような断片はそれ自体、個々に本発明の観点を表す。断片および他のオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして用いられることもあるが、試験試料中の病気耐性を示す配列の存在を測定することに関連した方法において作製されることもある（例えばＰＣＲにより）。
試験試料中の特定ポリペプチド、例えば図２もしくは別の図面に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれのアミノ酸配列突然変異体、変異形もしくは対立遺伝子（例えば表１に示される変更を含む）の存否を測定するには、様々な方法がある。
図２に示されるポリペプチドの１もしくは複数の特定の変異形（例えば表１参照）に特異的である、特異的結合メンバー（例えば抗体または抗体の混合物）の結合相手の存在について、試料を試験してもよい。
そのような場合、特異的結合に適した条件下で特異的結合メンバー（例えば抗体）と接触せしめることにより試料を試験した後、例えば記載するようなレポーター系を使って、結合を測定する。抗体のパネルを使う時、各々の結合を測定できるように各抗体ごとに異なるレポート用標識を使ってもよい。
抗体のような特異的結合メンバーを使って、それの結合相手ポリペプチドが野性型ポリペプチドの配列および／または性質を有するかあるいはそれの特定の突然変異体、変異形もしくは対立遺伝子の配列および／または性質を有するのかを決定するポリペプチドの配列および／または生化学分析を考慮に入れて、試験試料から前記結合相手ポリペプチドを単離および／または精製することができる。アミノ酸配列決定は自動配列決定装置を使って当業界で日常的に行われる。
mlo対立遺伝子についての診断試験を用いると、研究者または植物育種家たちが時間のかかる耐性試験に頼らずに且つ十分な確信をもって、着目の植物（またはその細胞）中に所望の対立遺伝子が存在するか否か、該植物が他の遺伝学的に同一の植物（例えば近交品種または栽培品種）の集団の代表物であるのかまたは関連植物（育種家種子）もしくは無関連植物の標本の中の一個体であるのかを確立できるようになる。所望の病気耐性表現型を付与するmlo対立遺伝子は劣性であり、従って野性型Mlo対立遺伝子の存在下での異型接合条件の時には完全植物表現型レベルで検出できない。従って、そのような劣性対立遺伝子の存在についての表現型スクリーニングはmlo遺伝子座に対して同型接合である材料においてのみ可能であり、それ故に合理的に且つ原価効率良く選択を適用することができるような植物育種計画の世代を実質的に遅らせる。例えば、育種家が所望のmlo対立遺伝子を有望な適応性高性能標的遺伝子型に遺伝子移入することを目指している戻し交雑育種計画では、自殖を行うまでmlo遺伝子座は永続的に異型接合状態にあるだろう。劣性対立遺伝子の存在についての核酸またはポリペプチド試験は、戻し交雑世代個体の自殖子孫を試験する必要性を回避するので、かなりの時間と費用を節約する。望ましい個体の選抜と自殖に基づく他のタイプの育種法において、本発明により提供される高処理量で低費用のアッセイによる望ましいmlo対立遺伝子についての核酸またはポリペプチド診断法は、他の方法で可能であるよりも早い世代で且つより多くの材料に関して、所望のmlo対立遺伝子についての確かな選抜を行うことができる。これはより早期に且つ費用がかからずに材料を試験できることによって選抜の確実性に加えて時間の節約を増大させるので、耐性表現型スクリーニングは植物育種において大きな価値がある。
核酸試験の一例として、大麦mlo-5耐性対立遺伝子がMlo遺伝子の推定開始コドン中のＧからＡへのヌクレオチド置換により特徴づけられる（表１）。この変異は、次のプライマー（例）：
0004324656.tif 000007
を用いたゲノム鋳型ＤＮＡからのMlo遺伝子セグメントの標準的ＰＣＲ増幅の後、制限酵素PshA1での消化により、容易に検出することができる。これは、常用アガロースゲル電気泳動を使って表示することができるCAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーを与える。769bp断片の存在はmlo-5対立遺伝子の存在を表す。
mlo-9耐性対立遺伝子は、ＣからＴへのヌクレオチド置換により特徴づけられる（表１）。この対立遺伝子は、しばしば育種材料として使われるので特に重要である。突然変異現象は次のプライマー（例）：
0004324656.tif 000008
を使い、続いてゲノム増幅生成物を制限酵素Hha1で消化することにより、容易に検出することができる。これは常用アガロースゲル電気泳動を使って表示することができるCAPSマーカーを与える。374bp断片の存在はmlo-9対立遺伝子の存在を表す。
第三の特に重要な対立遺伝子はmlo-12であり、これは残基240の置換、具体的にはPhe240からロイシンへの置換により特徴づけられる。これは、コードするヌクレオチド配列中のＣ720からＡへの置換に起因し得る（表１）。これは、変更タンパク質が残余野性型活性を保持するという確証が入手できる、現在報告されている唯一のmlo対立遺伝子である（Hentrich, 1979, Arch. Zuchtungsvorsch., Berlin 9, S. 283-291）。mlo-12は検出可能な自然細胞死反応を示さないで、うどんこ病菌のような病原体に対して十分なレベルの耐性を付与する。従って、有望育種系統へのmlo耐性の遺伝子移入後に最少の多面作用（自然細胞死）が望ましいならば、mlo-12は育種計画において一般的に好まれる対立遺伝子である。更に、Mloタンパク質内のアミノ酸置換の分子部位は、残余野性型活性を有する対立遺伝子の設計、更にはMloタンパク質の機能の完全な損失からくる望ましくない多面作用を減らす相互作用および／または阻害分子の獲得も可能にする。
mlo対立遺伝子の存否の核酸検定は、RFLP、微小付随体またはSSRs、AFLPs、RAPDsなどのような確立されたマーカーのセットを使った隣接連鎖ゲノムＤＮＡおよび他の非連鎖ゲノムＤＮＡの遺伝子型の決定と組み合わせることができる。これは、研究者または植物育種家が、所望のmlo対立遺伝子の存在だけでなく連鎖と非連鎖の遺伝子背景の最も望ましい組合せを有する個々の植物または植物の系統群についても選抜できるようにする。そのような望ましい材料の組換えは、与えられた育種分離集団または戻し交雑子孫内で稀にしか起こらないことがある。本発明により提供されるようなmlo遺伝子座の直接アッセイは、まず１つの隣接マーカーについて固定された個体を同定し、次いで望ましいmlo対立遺伝子がまだ存在するという確信をもっている時は常にmlo遺伝子座の他方の側で固定された子孫を同定することにより、研究員が隣接マーカーとmlo対立遺伝子との所望の組合せを固定する（同型接合にする）ことに段階的に近づけるようにする。
本願明細書は、当業者が任意の特定の新規または現存のmlo対立遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を入手しそして適当な核酸および／またはポリヌクレオチドに基づく診断アッセイを考案するのに十分な情報を提供する。この情報を応用することができる現存mlo対立遺伝子としては、例えば、mlo-1, mlo-3, mlo-4, mlo-5, mlo-6, mlo-7, mlo-8, mlo-9, mlo-10, mlo-12, mlo-13, mlo-16, mlo-17, mlo-26およびmlo-28が挙げられ、その全てについての配列情報が本明細書中に与えられる（例えば図２と表１を参照のこと）。核酸アッセイをデザインする時には、特定の変異型対立遺伝子を特徴づける特有の配列変異を考慮に入れる。従って、本発明は、別のmlo対立遺伝子と比較してその対立遺伝子に特異的にハイブリダイズできるようにする配列を有する、mlo対立遺伝子のオリゴヌクレオチド断片にも及ぶ。そのようなオリゴヌクレオチドは、その場所でmlo変異が起こるヌクレオチドを包含し、そしてそれの３′もしくは５′末端のところまたはその近くに変異型ヌクレオチドを含んでもよい。そのようなオリゴヌクレオチドはセンス鎖またはアンチセンス鎖とハイブリダイズする。変異はmlo遺伝子のコード配列内であるか、あるいは遺伝子の破壊がうどんこ病耐性表現型を生じるMlo中の傷害に影響を及ぼすかまたは別の形でそれと関連づけられる、イントロン配列内または上流もしくは下流非コード配列中に存在してもよい。
mlo-9対立遺伝子は広くしかし排他的にではなく植物育種に利用されており〔J Helms Jorgensen, Euphytica（1992）63:141-152〕、mlo-11も利用されている。しかし、実際の育種でのmlo変異体の使用は春大麦に大きく限定されている。何故なら、該変異体対立遺伝子の多数に関連する自然細胞死応答が、多収性冬大麦遺伝子型に組み込むと植物成長および生産力に不利益を与えるように見えるからである。しかしながら、mlo対立遺伝子によって付随の細胞死応答の程度は異なるので、現存するものまたは突然変異誘発プログラムから新たに作製されたもしくは自然変異体として単離されたものは、他のものよりも冬大麦背景への組み込みに適する。mlo-12対立遺伝子は、十分なレベルの病原体耐性を付与するにもかかわらず検出可能な多面作用が全く起こらないので、特に適当かもしれない。冬大麦におけるより広範囲でのmlo型うどんこ病耐性の使用は、大麦栽培者にとって大きな価値があり、更には殺真菌剤投入の使用を減らすと共にそれらに関連する処理費用を減らすといった重大な経済的および環境的意味を有するだろう。本明細書に与えられるような核酸診断法の提供は、冬大麦生殖質中への新規および現存mlo対立遺伝子の迅速且つ正確な配置を可能にする。
本発明に係る植物細胞を含んで成る植物、更にはそれの任意部分または栄養分体、種子、自殖もしくは雑種子孫もしくは後代も提供される。本発明に係る植物は、１または複数の性質について純粋に育種しないものであってもよい。植物品種、特に植物育種法（Plant Breeders’Rights）に従って登録可能な植物品種は除外される。植物は、植物の細胞またはその子孫に導入されたトランスジェン（transgene）をそのゲノム内に安定に含有するため、単純に１つの「植物品種」であると見なされる必要がないことに注意。
植物に加えて、本発明はそのような植物の任意のクローン、種子、自殖または雑種後代もしくは子孫、並びにそれらのいずれかの任意部分（例えば挿木、種子）を提供する。本発明は任意の植物栄養分体、すなわち有性または無性の生殖または繁殖に使用することができる任意部分（挿木、種子などを含む）を提供する。そのような植物の有性もしくは無性繁殖された後代、クローンもしくは子孫、または前記植物、後代、クローンもしくは子孫の任意部分もしくは栄養分体である植物も本発明に包含される。
本発明の更なる観点は、植物細胞中に前記配列（例えば適当なベクターの一部分として）を導入し、そしてベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えを誘発または許容してそのヌクレオチド配列をゲノム内に導入することを含んで成る、植物細胞の作製方法を提供する。
植物細胞の形質転換に続いて、植物を再生することができる。
本発明は更に、植物の防御応答を調節することができる植物中のMlo発現を調節する方法であって、植物の細胞内での非相同Mlo遺伝子配列（またはそれの突然変異体、対立遺伝子、変異形または相同体）の発現を含んで成る方法を提供する。後述するように、植物の構成的防御応答のレベルの調節または変更は、抑制、抑圧または低下（野性型Mloの場合）または促進、刺激、活性化、増加、増強または強調（変異型mloの場合）によることができる。防御応答の活性化または増強は、植物の病原体耐性、特にうどんこ病および／またはさび病（例えば黄さび病）に対する耐性を付与または強化することができる。
「非相同」という語は、問題の遺伝子／ヌクレオチド配列が、遺伝子工学を使って、すなわち人的介入によって、植物の当該細胞またはその祖先に導入されていることを示すために用いられる。トランスジェニック植物細胞、すなわち問題の核酸についてのトランスジェニック体を提供することができる。トランスジェンはゲノム外ベクター上にあってもよくゲノム中に組み込まれてもよい（好ましくは安定に）。非相同遺伝子は内因性同等遺伝子、すなわち同じもしくは類似の機能を通常に実施するものに取って代わってもよく、または挿入された配列が内因性遺伝子もしくは他の配列への付加物であってもよい。非相同遺伝子の導入の利点は、好みに応じて発現に影響を及ぼすことができる選り抜きのプロモーターの調節下に、例えば特定の発育的、空間的もしくは時間的調節下にまたは誘導性プロモーターの調節下に、或る配列の発現を置くことができることである。更に、野性型遺伝子の突然変異体、変異形および誘導体、例えば野性型よりも高いまたは低い活性を有するものを内因性遺伝子の代わりに使用できる。
植物細胞にとって非相同または異種または外来である核酸は、そのタイプ、品種または種の細胞中に天然に存在しないものであることができる。よって、核酸は、別のタイプまたは種または品種の植物細胞の範囲内に入る、特定の植物の細胞タイプまたは種または品種のコード配列またはそれに由来するコード配列を包含し得る。別の可能性としては、ある核酸配列がそれ自体または相同体が天然に見出される細胞の中に存在しているけれども、該核酸配列はそのタイプまたは種または品種の植物の細胞中には天然に存在しない核酸に連結および／または隣接しており、例えば発現調節のための１または複数の調節配列、例えばプロモーター配列に作用可能に連結しているというものである。植物または別の宿主細胞内の配列は確認できるように非相同、異種または外来のものであることができる。
野性型Mlo遺伝子機能のダウンレギュレーションは、構成的防御応答の刺激を誘導する。これは後述するような多数の異なる方法で達成することができる。
本発明の核酸を誘導性遺伝子プロモーターの調節下に置き、かくして発現を使用者の制御下に置くことができる。
別の観点によれば、本発明は、本発明により提供されるヌクレオチド配列に作用可能に連結された誘導性プロモーターを含んで成る遺伝子構成物を提供する。記載されるように、これは該遺伝子の発現調節を可能にする。本発明はまた、前記遺伝子構成物により形質転換された植物、および、そのような遺伝子構成物を植物細胞細胞中に導入しそして／または例えば適当な刺激物質（例えば効率的外因性誘導物質または内因性シグナル）の適用により植物細胞内での構成物の発現を誘導することを含んで成る方法も提供する。
プロモーターに用いられる時の「誘導性」という語は、当業者により十分に理解されている。本質的に、誘導性プロモーターの調節下での発現は、適用された刺激物質（これは細胞内で生産されてもよく外因性的に提供されてもよい）に応答して「スイッチオン」されまたは増大される。刺激物質の性質はプロモーター間で異なる。ある誘導性プロモーターは適当な刺激物質の不在下では小さいかまたは検出不可能なレベルでしか発現を引き起こさない（または全く発現を引き起こさない）。またある誘導性プロモーターは、刺激物質の不在下でも検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激物質の不在下での発現がどのようなレベルであっても、正しい刺激物質の存在下ではどんな誘導性プロモーターからの発現でも増加する。好ましい状況は、表現型形質を変更するのに有効な量による関連刺激物質の適用とともに発現レベルが増加する場合である。よって、刺激物質の不在下では基準レベル（そのレベルは所望の表現型を与えるには低すぎ、そして実際にゼロであってもよい）の発現を引き起こす誘導性（すなわち「スイッチ可能」）プロモーターを使用することができる。刺激物質の適用とともに、発現が所望の表現型を与えるレベルへと増加（またはスイッチオン）される。
適当なプロモーターとしては、事実上全ての植物組織において高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウイルス35Ｓ（CaMV 35S）遺伝子プロモーター〔Benfey他（1990a）EMBO J 9: 1677-1684〕；植物体の栄養成長点（頂端分裂組織）並びに幾つかの限局化された場所（例えば内師部、花原基、根および茎の分岐点）で発現されるカリフラワーmeri 5プロモーター〔Medfolrd, J.I.（1992）Plant Cell 4, 1029-1039; Medforld他（1991）Plant Cell 3, 359-370〕；および花成のごく初期に発現されるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）LEAFYプロモーター〔Weigel他（1992）Cell 69, 843-859〕が挙げられる。
本発明の一観点は、トランスジェニック植物の生産における本発明の核酸の使用である。
遺伝子構成物を細胞に導入する時、当業者に周知の幾つかの考慮すべき事柄を斟酌しなけれはならない。挿入しようとする核酸を、転写を作動させる効率的な調節因子を含有する構成物の中で構築することができる。該構成物を細胞中に導入する方法は入手可能であるに違いない。構成物が一端細胞膜の内側に入ったら、内因性染色体物質中への組込みが起こってもよくまたは起こらなくてもよい。最終的に、植物に関する限り、標的細胞のタイプは、細胞を完全な植物に再生することができるようなものでなければならない。
該配列を含むＤＮＡセグメントにより形質転換された植物は、植物の遺伝子操作について既に知られている標準技術によって作製することができる。任意の適当な技術、例えば本来の遺伝子伝達能力を利用したアグロバクテリウム（Agrobacterium）所有の武装解除Tiプラスミドベクター〔EP-A-270355, EP-A-0116718, Bevan, NAR 12（22）8711-87215, 1984〕、微粒子もしくはマイクロプロジェクタイル衝撃（US 5100792, EP-A- 444882, EP-A-434616）、マイクロインジェクション〔WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green他（1987）Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press〕、エレクトロポレーション（EP 290395, WO 8706614）、他の形態の直接ＤＮＡ取込み（DE 4005152, WO 9012096, US 4684611）、リポソーム媒介ＤＮＡ取込み〔例えばFreeman他，Plant Cell Physiol. 29: 1353（1984）〕、または渦動攪拌法〔例えばKindle, PNAS U.S.A. 87: 1228（1990d）〕を使って、ＤＮＡにより植物細胞を形質転換せしめることができる。植物細胞の物理的形質転換法がOard, 1991, Biotech. Adv. 9:1-11に概説されている。
アクロバクテリウム形質転換は、双子葉植物種を形質転換せしめるのに当業者により広く利用されている。近年、ほとんど全ての経済的に重要な単子葉植物種における安定な不稔性トランスジェニック植物の日常生産の方向に向かってかなり進歩している〔Toriyama他（1988）Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang他（1988）Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang他（1988）Theor. Appl. Genet. 76, 835-840; Shimamoto他（1989）Nature 338, 274-276; Datta他（1990）Bio/Technology 8, 736-740; Christou他（1992）Bio/Technology 9, 957-962; Peng他（1991）International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao他（1992）Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li他（1993）Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore他（1993）Plant Molecular Biology 21, 871- 884; Fromm他（1990）Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm他（1990）Plant Cell 2, 603-618; D’Halluin他（1992）Plant Cell 4, 1495-1505; Walters他（1992）Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel他（1993）Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I.K.（1994）Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks他（1993）Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers他（1992）Bio/Technology 10, 1589-1594；WO 92/14828〕。特に、アクロバクテリウム媒介形質転換は、単子葉植物種における高度に効率的な代替形質転換法としても現在浮かび上がってきている〔Hiei他（1994）The Plant Journal 6, 271-282〕。
不稔性トランスジェニック植物の作製は米、とうもろこし、小麦、エンバクおよび大麦等の穀類において達成されている〔Shimamoto, K.（1994）Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162; Vasil他（1992）Bio/Technology 10, 667-674; Vain他（1995）Biotechnology Advances 13（4）: 653-671; Vasil（1996）Nature Biotechnology 14, p 702に概説されている〕。
アグロバクテリウムが非効率的であるかまたは無効である場合にはマイクロプロジェクタイル衝撃、エレクトロポレーションまたは直接ＤＮＡ取込みが好ましい。あるいは、異なる技術の組合せを使って、例えばアグロバクテリウムがコーティングされた微粒子での衝撃（EP-A-486234）、または外傷を誘発するためのマイクロプロジェクタイル衝撃の後のアグロバクテリウムとの共生培養（EP-A- 486233）を使って、形質転換工程の効率を増大させることができる。
形質転換後、当業界で標準的である方法で、単細胞、カルス組織または葉片から植物を再生することができる。ほとんどどの植物でも植物の細胞、組織および器官から完全に再生することができる。利用可能な方法は、Vasil他，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第Ｉ，IIおよびIII巻，Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984中と、Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press, 1989中に概説されている。
形質転換技術の特定の選択は、ある植物種を形質転換させるそれの効率並びに特定の選択方法論を使って本発明を実施する者の経験と好みによって決定されるだろう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換系の特定の選択は本発明にとって重要でないかまたは本発明の限定とはならず、また植物再生技術の選択もそうでないことは、当業者には明白であろう。
本発明では、センス方向でのヌクレオチド配列の導入により発現が達成できる。よって、本発明は、植物の防御応答の調節方法であって、植物の細胞内での本発明の核酸の発現を誘発するかまたは許容することを含んで成る方法を提供する。一般に、防御応答を刺激することが望ましく、これはMlo遺伝子機能を破壊することによって達成することができる。
標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションはアンチセンス技術または「センスレギュレーション」（「コ・サプレッション」）を使って達成することができる。
アンチセンス遺伝子または部分遺伝子配列を使って遺伝子発現をダウンレギュレートする場合、転写の結果が標的遺伝子の「センス」鎖から転写される正常ｍＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡを与えるように「逆方向」でヌクレオチド配列がプロモーターの調節下に置かれる。例えば、Rothstein他，1987; Smith他（1988）Nature 334, 724-726; Zhang他（1992）The Plant Cell 4, 1575-1588；English他（1996）The Plant Cell 8, 179-188を参照のこと。アンチセンス技術はBourque（1995）Plant Science 105, 125-149とFlavell（1994）PNAS USA 91, 3490-3496にも概説されている。
別法は、センス方向、すなわち標的遺伝子と同一方向で挿入された標的遺伝子の全部または一部のコピーを使用して、コ・サプレッション（co-supression）により標的遺伝子の発現を減少させることである。例えば、van der Krol他（1990）The Plant Cell 2, 291-299; Napoli他（1990）The Plant Cell 2, 279-289; Zhang他（1992）The Plant Cell 4, 1575-1588および米国特許第5,231,020号明細書を参照のこと。
コード配列（アンチセンス鎖に対して逆方向）に該当する完全配列を使用する必要はない。例えば、十分な長さの断片を使用することができる。アンチセンス阻害レベルを最適にするためにコード配列の様々な部分からの様々なサイズの断片をスクリーニングすることは、当業者の日常的作業である。メチオニンＡＴＧ開始コドンと、おそらく開始コドンの上流の１個または複数個のヌクレオチドを含めることが有利であるだろう。他の可能性は、ある遺伝子の保存配列、例えば１または複数の遺伝子に特徴的である配列、例えば調節配列を標的とすることである。アンチセンス構成物はMloまたは相同体の５′末端または３′末端配列を含んでもよい。１つの植物種のなかに複数のMlo相同体が存在するような場合には、該構成物への５′および３′末端非翻訳配列の包含が転写の抑制（サイレンシング）の特異性を増強するだろう。
使用する配列は約500ヌクレオチド以下、おそらく約400ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、または約100ヌクレオチドである。もっと短い鎖長、例えば14〜23ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用できるかもしれないが、長鎖の断片、できるなら通常は約500ヌクレオチドより長い、例えば約600ヌクレオチドより、約700ヌクレオチドより、約800ヌクレオチドより、約1000ヌクレオチドより、約1200ヌクレオチドより、約1400ヌクレオチドより、またはそれよりも長い断片が好ましい。
標的配列の発現のダウンレギュレーションに使われる配列と標的配列中には、完全な配列同一性があることが好ましい場合があるが、配列の全体的相補性または類似性は必須でない。使用する配列中の１もしくは複数のヌクレオチドが標的配列と異なっていてもよい。よって、本発明に従って遺伝子発現のダウンレギュレーションに使われる配列は、入手可能なものから選択された野性型配列（例えば遺伝子）であるか、またはそのような配列の１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換による突然変異体、誘導体、変異形もしくは対立遺伝子であることができる。前記配列は転写解読枠を含む必要はなく、また翻訳されるであろうＲＮＡを特定する必要もない。それぞれのアンチセンスおよびセンスＲＮＡ分子がハイブリダイズするのに十分な相同性があることが好ましい。使用する配列と標的遺伝子との間に約５％、10％、15％または20％以上の不正対合（ミスマッチ）が存在する場合でも、遺伝子発現のダウンレギュレーションが起こる場合がある。
一般的には、転写される核酸がMlo遺伝子の断片、例えば図２に示されるヌクレオチド配列を含む断片、もしくはそれの相補物を表すか、またはコード配列に作製される変更および変更された配列の相同性に関連して上述したのと同じような意味で、突然変異体、誘導体、変異形もしくは対立遺伝子であってもよい。転写されたアンチセンスＲＮＡが植物の細胞内の核酸とハイブリダイズするのに十分な相同性はあるだろうが、ハイブリダイゼーションが起こるかどうかにかかわりなく、所望の結果が遺伝子発現のダウンレギュレーションなのである。
アンチセンスレギュレーションは、適当な構成物中で誘導性プロモーターを使うことによってそれ自体制御することができる。
構成物は生来のプロモーターを使って、例えば構成的に発現されるプロモーター、例えばCaMV 35Sプロモーターにより、組織特異的もしくは細胞型特異的プロモーターにより、または外部シグナルもしくは外部因子によって活性化され得るプロモーターにより、発現させることができる。CaMV 35Sプロモーターだけでなく米のactin1およびとうもろこしのユビキチンプロモーターも、米のレポーター遺伝子の高レベル発現を与えることが証明されている〔Fujimoto他（1993）Bio/Technology 11, 1151-1155；Zhang他（1991）Plant Cell 3, 1155-1165; Cornejo他（1993）Plant Molecular Biology 23, 567-581〕。
アンチセンスレギュレーション用に、Mlo遺伝子のコード配列に相補的であるヌクレオチド配列（すなわち相同体を含む）、または発現のアンチセンスレギュレーションでの使用に適当である前記コード配列の断片、といった核酸が提供される。これはＤＮＡであってもよく、そして着目の細胞中でのアンチセンス転写に適当な調節配列の調節下にあってもよい。
よって、本発明は、植物に病原体耐性を付与する方法であって、前記植物の細胞内での本発明の非相同核酸からのアンチセンス転写を誘発するまたは許容することを含んで成る方法も提供する。
本発明は更に、好ましくは植物に病原体耐性を付与する目的での、遺伝子発現のダウンレギュレーション、特にMlo遺伝子またはその相同体の発現のダウンレギュレーションのための、図２のヌクレオチド配列またはそれの断片、突然変異体、誘導体、対立遺伝子、変異形もしくは相同体、例えば本明細書中に記載または同定された任意の配列の使用を提供する。
標的遺伝子の追加のコピーをセンス方向で、すなわち標的遺伝子と同一方向で挿入すると、標的遺伝子からのタンパク質の過剰発現が起こる個体と発現不足が起こるものとを含む、一定範囲の表現型が生産される。挿入された遺伝子が内因性遺伝子の一部のみである時、トランスジェニック集団中の発現不足の個体の数が増加する。センスレギュレーション、特にダウンレギュレーションが起こるメカニズムは十分解明されていない。しかしながら、この技術は科学文献や特許公報に多数報告されており、遺伝子制御によく利用されている。例えば、van der Krol他（1990）The Plant Cell 2, 291-229；Napoli他（1990）The Plant Cell 2, 279-289；Zhang他（1992）The Plant Cell 4, 1575-1588を参照のこと。
同じく、アンチセンスレギュレーションに関して上述したのと同様な意味で断片、突然変異体等を使用することができる。
よって、本発明は、植物に病原体耐性を付与する方法であって、植物の細胞内での本発明の核酸からの発現を誘発するまたは許容することを含んで成る方法も提供する。これはMlo活性を抑制（サプレス）するために用いることができる。この場合、生成物の活性化は好ましくは植物細胞内での発現不足の結果として抑制される。
上述した通り、Mloダウンレギュレーションは防御応答の活性を促進することができ、これが引いては病原体耐性、特にうどんこ病および／またはさび病（例えば黄さび病）に対する耐性を付与するかまたは増強することができる。
よって、本発明は、植物のMlo機能を調節する方法であって、前記植物の細胞内での本発明の核酸からの発現を誘発または許容して内因性Mlo発現を抑制する方法も提供する。
Mloの変更形を使って内因性Mlo機能をダウンレギュレートしてもよい。例えば、突然変異体、変異形、誘導体等を使用してもよい。例えば、高レベルでのmlo変異体配列の発現は内因性Mloの活性と競争（out-compete）し得る。
Mlo野性型活性の低下は、リボザイム、例えば複製リボザイム、例えばシュモクザメ類のリボザイム（Haseloff & Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591; Feyter他，1996, Mol. Gen. Genet. 250: 329-338）を使って達成することができる。
植物においてMlo機能を低下させるための別の方法はトランスポゾン変異誘発を使用する〔Osborne他（1995）Current Opinion in Cell Biology 7, 406-413により概説されている〕。遺伝子の不活性化は、異種ゲノム中で移動性を保持する内因性可動要素または非相同クローン化トランスポゾンのいずれかを使った「標的指向型標識付け（targeted tagging）」によって証明されている。既知配列の任意挿入を有するMlo対立遺伝子は、挿入配列とMlo相同体の両方に対して結合特異性を有するＰＣＲプライマーを使うことによって同定することができる。不活性化された対立遺伝子中のトランスポゾンを安定化するのに「二要素系」を使うことができる。この二要素法では、切除マーカー中に挿入された選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含有する非自律性トランスポゾンを有するＴ−ＤＮＡを作成する。それらのＴ−ＤＮＡを有する植物を、トランスポゾン機能を発現する第二のＴ−ＤＮＡを有する植物と交雑せしめる。雑種をトランスポゾン内のマーカーの存在についてと切除について二重選抜（double selection）して、入れ替わった要素を有するＦ2植物を与える。二要素アプローチはトウモロコシのAc／Dsに関して特に有利である。何故なら、入れ替わったDsがトランスポザーゼに連鎖しないようであり、Ds挿入の安定化と他殖を容易にするからである〔Jones他（1994）Science 266, 789-793；Osborne他（1995）Current Opinion in Cell Biology 7, 406-413〕。
劣性耐性表現型を生じるMlo野性型対立遺伝子の不活性化によりmloに基づくうどんこ病耐性が引き起こされる。Mlo野性型タンパク質の活性を阻害する物質を使って耐性表現型を誘導することができる。
Mlo発現の完全な不活性化は必須ではなく有害でさえあり得るという重要なヒントが、残余野性型対立遺伝子活性を保持しているようである変異原誘発mlo耐性対立遺伝子の説明によって提供される。これらの対立遺伝子は、光合成の速度と収率に悪影響を及ぼす検出可能な量の自然葉壊死を全く示さない
0004324656.tif 000009
Mloタンパク質は７本の膜貫通型らせんによって膜に固定されていると推定される（図７参照）。この構造の推定は、最近、米とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるMlo相同体の分析によって更に強められた。シロイヌナズナ相同体の構造推定も７本の膜貫通型らせんの存在を示唆している。その上、Mlo相同体の比較の結果、推定細胞外ループ１と３の中に保存されたシステイン残基が存在することと、推定膜貫通型らせん３と４に隣接した第２の細胞内ループ中に高確率で両親媒性らせんがあることが明らかになった。これらのMloタンパク質ファミリーにおいて保存された構造モチーフは、哺乳類系に広く記載されているＧタンパク質結合レセプター（GPCR）を思い出させる。GPCRはリガンドにより活性化されることそしてヘテロ三量体Ｇタンパク質によって細胞内でシグナルを増幅することが知られている。本発明のいずれかの観点の性質または範囲に対して少しも限定を与えることなく、Mloはヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧα阻害サブユニットを活性化し、それによって今までのところ知られていないエフェクタータンパク質のダウンレギュレーションを引き起こすと推定される。
本明細書中のMlo配列情報の提供は、Mloタンパク質の機能（例えばGPCR機能）のアンタゴニストの同定を可能にする。Mloのアンタゴニストは、Mlo遺伝子中の劣性変異を模倣したそれの未知の真正リガンドによるレセプター活性化を阻止することができる。そのようなMloアンタゴニストは作物保護化合物として利用でき、例えば植物もしくは作物に外的に適用されるか、あるいは該化合物がペプチド性質であるならば、生物学的ベクター（例えば、標的植物細胞内でアンタゴニスト分子を発現する組換え感染性ウイルス粒子）を介してまたはトランスジェニックルート〔おそらく外的に適用された化合物によって誘導されるプロモーター（例えばトウモロコシ由来のGST-IIプロモーター；Jepson他，Plant Molecular Biology 26:1855-1866, 1994）の支配下でアンタゴニスト分子を発現するように遺伝的に改変された植物または植物細胞〕を介して内的に運ばれて、mlo不活性化表現型の発現のタイミングを調節できるようにすることができる。
Mlo野性型植物の葉片を、ランダムまたは組合せ化合物ライブラリーからの試験物質で処理し、うどんこ病菌のような病原体でのチャレンジに対する耐性について試験することができる。うどんこ病菌胞子を接種した時の感受性／耐性について記録する標準試験法として、分離式葉片アッセイが使われる。遺伝子型Mlo RorIの７日齢実生の葉片を寒天上に、例えば50μｌの寒天を含む96ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエル上に置く。各ウエルの寒天表面に、DMSO中に溶かした種々の化合物を約１ppmの濃度で適用する。分離した葉片に病原体（例えば毒性うどんこ病菌分離株の胞子）を接種した後７日目あたりに、耐性を誘導する化合物を、マイクロタイタープレート中の葉片の上に菌糸が無いことにより識別することができる。
mlo経路で作用する化合物と別の機構により耐性を付与するものまたは直接真菌毒性活性を示すものとを区別するために、更なる選抜を用いることができる。このために、mlo耐性に要求され得る遺伝子（Ror遺伝子）の突然変異体〔Freialdenhoven他（1996）The Plant Cell 8, 5-14〕を使ってもよい。これらの遺伝子の突然変異体は、mlo耐性対立遺伝子の存在にかかわらずうどんこ病菌侵襲に対する感受性を付与する。遺伝子型Mlo ror1（野性型Mloタンパク質と欠損型Ror1遺伝子）の植物を使って例えばMlo Ror1遺伝子型に耐性を誘導するがMlo ror1遺伝子型には感受性を示す化合物を試験し、それにより候補のMloアンタゴニストの選択を可能にする。葉片試験によって同定された候補化合物を試験することにより、更に先の試験管内試験に用いる候補化合物の数を大幅に減らすことが可能である。
候補アンタゴニストの更なる選択段階は、Mloタンパク質またはその断片の非相同発現（例えばバキュロウイルス−昆虫細胞系中で）およびその後の標識分子を用いた結合アッセイを含む。野性型Mloタンパク質を発現する細胞系への化合物の特異的結合はそれらのアンタゴニストの作用形態のよい指標となる。推定Mloタンパク質配列の分析は、該タンパク質が７本の膜貫通型らせんを介して膜に固定されそしていわゆるセルペンチンレセプターファミリーの新規メンバーを表し得るという強固な証拠を提供した。この結論は、大麦、米およびシロイヌナズナにおいて同定された相同遺伝子より得られた配列データにより支持される。７つの膜貫通型タンパク質がバキュロウイルス／昆虫細胞系中で高レベルで発現されることが示されている（細胞あたり107分子まで；Tate & Grisshamer, 1996, TIBTECH 14: 426-430）。Mloタンパク質ファミリーは植物界に限定されているようであり、これは試験化合物に低バックグラウンド環境を提供する。放射性または非放射性標識された候補化合物を、組換えバキュロウイルス構成物による感染後にMloタンパク質を発現するSf9昆虫細胞への特異的結合について試験する。生体内で耐性を誘導する特徴づけられた変異（例えば表１に記載のような）を担持している変異型mloタンパク質のSf9発現により、結合の特異性を更に試験することができる。
よって、別の様々な観点において、本発明は、Mlo機能を阻害することができる、すなわちmlo変異型表現型を付与することができる物質についてのアッセイ、そのような物質それ自体、およびそれの使用に関する。
Mlo機能を阻害する物質を同定しそして／または獲得することにおけるMloの使用も本発明により提供され、同じく植物に病原体耐性を誘導する物質を同定しそして／または獲得することにおけるMloの使用も提供される。
本発明に従って有用である物質は、試験を受ける物質がMlo機能を抑制または破壊してmlo表現型を誘導するかどうかを測定することを伴うスクリーニング技術により同定することができる。Mloを結合する物質は阻害剤候補である。
もちろん、アッセイおよびスクリーニングに関して「Mlo」に言及する時は、当然大麦ではなく、米や小麦をはじめとする他の種に存在する相同体、並びにそれの適当な断片、変異体、対立遺伝子および誘導体を指すと理解すべきであることを注意すべきである。試験物質がMloタンパク質を結合できるかどうかの評価は、必ずしも全長Mloタンパク質を使用する必要はない。適当な断片（またはそれの類似体または変異形）を使ってもよい。
Mloの適当な断片としては、mlo変異型対立遺伝子により同定されるようなMlo機能にとって有害であるとわかった残基（表１）を含むものが挙げられる。この断片よりも小さい断片並びにこの断片の類似体および変異形を同様に使用してもよく、例えば、欠失分析またはアラニンスキャニングといった技術を使って同定されたものを使用してもよい。
更に、Mlo活性を破壊するために使用できる物質の１クラスはそれのペプチド断片である。そのようなペプチドは短鎖である傾向があり、長さが約40アミノ酸以下、好ましくは長さが約35アミノ酸以下、より好ましくは長さが約30アミノ酸以下、より好ましくは長さが約25アミノ酸以下、より好ましくは長さが約20アミノ酸以下、より好ましくは長さが約15アミノ酸以下、より好ましくは長さが約10アミノ酸以下、または長さが９，８，７，６，５アミノ酸以下のことがある。本発明は、野性型Mlo配列の配列変異体または誘導体であるがMlo機能を妨害する能力、例えばmlo変異型表現型を誘導する能力を保持しているペプチドも包含する。１または複数の追加のアミノ酸が含まれる場合、そのようなアミノ酸はMlo由来であってもよくまたはMloにとって非相同もしくは外来であってもよい。ペプチドがより大型の融合タンパク質、特にペプチドが非Mlo配列（すなわち非相同または外来配列）、例えばポリペプチドまたはタンパク質領域に融合されている形の融合タンパク質の中に含まれてもよい。
ペプチドは化学合成により部分的にまたは全体的に合成することができる。本発明の化合物は、十分に確立された標準的液相または好ましくは固相ペプチド合成法に従って、容易に合成することができる。そのような方法の概説は広く入手できる〔例えば、J.M. Stewart & J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis,第２版，Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois（1984）；M. Bondanzsky & A. Bondanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York（1984）；およびApplied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California〕。あるいはそれらは溶液中で、液相法により、または固相、液相および溶液化学の任意組合せにより、例えば各々のペプチド部分を仕上げ、次いで所望および適当ならば、存在している任意の保護基を除去した後、各々のカルボン酸もしくはスルホン酸またはそれの反応性誘導体の反応によって残基Ｘを導入することにより、調製することができる。
本発明に係るペプチド分子（ペプチドまたはポリペプチド）を製造する別の便利な方法は、本明細書中に記載するように、発現系中での核酸の使用により、該分子をコードする核酸を発現させることである。この方法は、コード核酸によってトランスジェニックルートでペプチド物質が植物に運ばれるのを考慮に入れる。使用者の制御下での発現のために誘導性プロモーターに連結されるなら、これはmlo表現型と病原体耐性の誘導に際しての融通性を考慮に入れる。これはMlo機能の妨害に起因する副作用を和らげるよう備える。
１つの一般的観点によれば、本発明は、Mloの関連領域と相互作用することができる物質についてのアッセイ方法を提供し、該方法は
(a)  Mloポリペプチドもしくはそれのペプチド断片、またはそれの変異体、誘導体もしくは類似体と試験化合物とを接触させ；そして
(b)  前記ポリペプチドまたはペプチドと試験化合物との相互作用または結合を測定する
ことを含んで成る。
既に上述したように、Mloの関連部分と相互作用することがわかった試験化合物を、Mlo機能を調節する（例えば破壊するかまたは妨害する）能力について試験することができる。
本発明の別の一般的観点は、植物においてmlo変異型表現型を誘導することができる物質についてのアッセイ方法を提供し、該方法は
(a)  植物またはそれの部分（例えば葉または葉片）と試験化合物とを接触させ；そして
(b)  植物のMlo機能および／または病原体耐性および／または防御応答の刺激を測定する
ことを含んで成る。
病原体に対する感受性または耐性は、病原体の増殖、例えばうどんこ病菌の場合は菌糸の存在もしくは不在、または菌糸の成長の程度を評価することにより、測定することができる。
植物の防御応答を刺激する試験化合物の能力に加えて、ポリペプチドまたはペプチドへの試験化合物の結合を評価することができる。そのような試験は平行して行ってもよいし、またはある１つの試験で陽性結果を示す物質について別の試験を行ってもよい。
もちろん、当業者は試験アッセイで得られる結果を比較するために任意の適当な対照実験を考案するだろう。
本発明のアッセイ方法の実施に続いて、Mlo機能を変更する能力および／または病原体耐性、例えばうどんこ病菌に対する耐性を誘導する能力について試験陽性である化合物、物質または分子の単離および／または製造および／または利用を行うことができる。
本発明のアッセイの正確な形式は当業者の通常の能力と知識によって変更可能である。例えば、ある物質を検出可能標識で標識し、それを固体支持体上に固定化されている別の物質と接触させることにより、物質間の相互作用を試験管内で研究することができる。特にペプチド物質用の適当な検出可能標識としては、組換え生産されるペプチドおよびポリペプチドに組み込むことができる35Ｓ−メチオニンが挙げられる。組換え生産されるポリペプチドおよびペプチドは、エピトープ（抗体で標識することができる）を含む融合タンパク質として発現させることもできる。
本発明に係るアッセイは生体内アッセイの形をとってもよい。生体内アッセイは、細胞中に導入された１または複数のベクターから関連のポリペプチドまたはペプチドが発現されるという細胞系、例えば酵母株または哺乳類細胞系において実施することができる。
例えば、Mloの断片を含むポリペプチドもしくはペプチド、またはそれのペプチド誘導体もしくは変異体を、ＤＮＡ結合領域、例えば酵母転写因子GAL 4のＤＮＡ結合領域に融合することができる。GAL 4転写因子は２つの機能領域を含む。それらの領域はＤＮＡ結合領域（GAL4DBD）とGAL4転写活性化領域（GAL4TAD）である。そのようなポリペプチドまたはペプチドを前記領域の１つに融合せしめ、そして別のポリペプチドまたはペプチドをもう片方に融合せしめることにより、着目の２つのポリペプチドまたはペプチドが相互作用した時にだけ機能的GAL 4転写因子が回復される。かくして、レポーター遺伝子の転写を活性化することができるGAL 4 ＤＮＡ結合領域におそらく連結しているレポーター遺伝子を使うことによって、ポリペプチドまたはペプチドの相互作用を測定することができる。このアッセイ形式は、FieldsおよびSong, 1989, Nature 340:245-246に記載されている。この型のアッセイ形式は哺乳類細胞と酵母細胞の両方で用いることができる。ＤＮＡ結合領域と転写活性化領域の別の組合せも利用可能であり、例えばLexA ＤＮＡ結合領域とVP60転写活性化領域の組合せが好ましい場合がある。
Mloと相互作用するペプチドまたは他の物質を探すとき、MloポリペプチドまたはペプチドをLexA ＤＮＡ結合領域（例）との融合体として使用し、試験ポリペプチドまたはペプチド（例えばランダムまたは組合せペプチドライブラリー）をVP60（例）との融合体として使用することができる。レポーター遺伝子発現の増加（例えばβ−ガラクトシダーゼの場合、青色の強化）は、Mloと相互作用するペプチドの存在に起因するのであり、この相互作用はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写活性化に必要である。
本発明のアッセイに添加できる試験物質または化合物の量は通常、使用する化合物のタイプに依存して手探り法により決定されるだろう。典型的には、約0.001nMから1mMまでまたはそれ以上の濃度、例えば0.01nM〜100μM、例えば0.1〜50μM、例えば約10μMの濃度の推定阻害剤化合物を使用することができる。試験物質がペプチドである時にはより高い濃度を使用できる。効果が弱い分子であっても、その先の研究および開発のための有用な先導化合物であることがある。
使用される化合物が、薬剤スクリーニング計画において使われる天然または合成化学化合物であってもよい。複数の特徴付けられたまたは未だ特徴づけられていない成分を含有する植物抽出物を使用してもよい。Mloに向けられる抗体またはその断片は、推定阻害剤化合物の別のクラスを構成する。阻害剤候補の抗体を特徴づけ、そしてそれらの結合領域を決定づけて、相互作用を破壊する原因となる一本鎖抗体およびその断片を提供することができる。他の候補の阻害剤化合物は、ポリペプチドまたはペプチド断片の三次元構造をモデル化し、そして合理的薬剤デザイン法を使って特定の分子形状、サイズおよび電荷特性を有する潜在的阻害剤化合物を提供することに基づいてもよい。しかしながら、組合せライブラリー技術が、あるポリペプチドと相互作用しそして／またはペプチドの活性を調節する能力について潜在的に莫大な数の異なる物質を試験する効率的方法を提供することは注目に値する。そのようなライブラリーおよびそれらの使用は、あらゆる種類の天然物、中でも小分子およびペプチドについて当業界で知られている。ある状況下ではペプチドライブラリーの使用が好ましい。
Mlo機能を変更するかまたは悪影響を及ぼす物質または剤の同定に続いて、そのような物質または剤を更に調べることができる。更に、それを製造し、そして／または植物に病原体耐性を誘導する組成物の調製、すなわち製造または配合の際に使用することができる。それらは、例えば病原体耐性、例えばうどんこ病菌耐性を誘導するために、植物に適用することができる。本発明の更なる観点は、植物において病原体耐性を誘導する方法であって、前記植物にそのような物質を適用することを含んで成る方法を提供する。ペプチド分子は、記載した通り、それをコードする核酸からの発現により、トランスジェニックルートで植物に適用することができる。
Mlo機能を変更または妨害し、植物に病原体耐性を誘導することができるポリペプチド、ペプチドもしくは他の物質、またはそのようなペプチド分子をコードする核酸分子は、キットの形、例えば外的環境からその内容物を保護する適当な容器の中に封入されたキットの形で提供することができる。そのようなキットは使用説明書を含んでもよい。
本発明の他の観点および態様は当業者に明白であろう。次の図面を参照しながら本発明を説明のつもりで例証する。
図１はMloの位置クローニングを示す。形態マーカー、RFLPマーカーおよびAFLPマーカーを使って大麦第４染色体の長いアーム上に高い精密度でMlo遺伝子座をマッピングした。この図の上部は、Mloに関するそれらのマーカーの遺伝子連鎖地図を与える。全ての遺伝距離は、２点評価法により計算されるAFLPマーカー間の遺伝距離を除いて、多点連鎖分析法に基づきセンチモルガン（cM）で示される。形態マーカー地図
0004324656.tif 000010
は、有毛性葉しょう（Hs）と光沢性葉しょう／穂（gsl）に対して20cM以上の距離でMloを位置づける。RFLPマーカー地図は、Carlsberg II Mlo×Grannenlose Zweizeilige mlo-11の交雑から得られた257のＦ2個体の分析に基づく。先に公表された同一交雑のRFLP地図（Hinze他，1991）はわずか44のＦ2個体に基づいていた。前記遺伝子はマーカーbAO11とbAL88により縁取られた2.7cM範囲に境界が定められた。AFLPマーカーは実験手順に記載の通りに同定されマッピングされた。それらとMloとの遺伝距離はIngrid Mlo×BC7Ingrid mlo-3の交雑に基づく。AFLP分析の決定的結果は、Mlo遺伝子座を含む0.64cM範囲を境界決定する２つのマーカーBpm2とBpm9、並びに4,000以上の減数分裂現象に基づきMloと共分離する１つのマーカー（Bpm16）の同定であった。BAC F15鋳型ＤＮＡから、Mloに対して0.1cMテロメア側に位置するマーカーBxm2が誘導された（下記参照）。共分離マーカーBpm16と２つの隣接遺伝子座（Bpm2とBpm9）を含む１つのYACクローンYAC YHV303-A6が、図面の中央部分に示される。マーカーBpm9の位置は矢印によって示される通りYACクローン内に大まかにしか推定されなかった。BAC F15の挿入断片はこの図の下部に示すようなこのYACの60kb部分断片を表す。BAC F15中のAFLPマーカーBpm2の同定の後、マーカーBxm2がMloの0.1cMテロメア方向に発見され位置づけられた。AFLPマーカーBpm2, Bpm16およびBxm2のおよその物理的位置（約30kbの範囲に及ぶ）並びに幾つかの稀に存在する制限部位の位置が示される。BAC F15 ＤＮＡの概略図の下の破線は、確立された最大ＤＮＡ配列連続物（contigs）の位置を示す。Mlo遺伝子の構造はこの図面の下側の行に概略的に示される。エキソンは黒いボックスにより強調される。試験した11個のmlo対立遺伝子について突然変異現象の位置が示される。欠失を有する変異型対立遺伝子はΔで表示され、残りの変異型対立遺伝子は各々アミノ酸変化を引き起こす単一ヌクレオチド置換を表す。
図２は、本発明に係るMloコード配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。Ingrid MloからのRT-PCR生成物のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が示される。ヌクレオチド番号は翻訳開始部位に従って与えられる。
図３はMlo転写物蓄積のノーザンブロット分析を示す。１つの野性型（栽培品種Ingrid Mlo）と２つの変異型（BC Ingrid mlo-1とBC Ingrid mlo-3）栽培品種の７日齢の未感染大麦初生薬から全ＲＮＡ（20μｇ）とポリ（A）+ ＲＮＡ（５μｇ）を単離し、1.2％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてニトロセルロース膜（Hybond）に移行せしめた。Ingrid Mloに由来する放射性標識全長RT-PCR生成物（図７）を使って、緊縮条件（Sambrook他，1989）下で該フィルターを探査した。ポリ（A）+ ＲＮＡを含むレーンのところにだけ明白なシグナルが検出される。このシグナルは約２kbのサイズに相当する。
図４はmloヘテロ対立遺伝子間交雑から得られた遺伝子内組換え体のサザンブロット分析を示す。感受性Ｆ2個体かまたは同型接合感受性および同型接合耐性子孫のいずれかの、反対側でMloに隣接している２つのRFLPマーカーの対立遺伝子をサザンブロット分析により分析した。そのような個体の植物ＤＮＡ（10μｇ）を、標準手順（Sambrook他，1989）に従って、Pst Ｉ（Ａ）またはHae III（Ｂ）で消化し、そして放射性標識RFLPマーカー  WG114（上のパネル；Mloに対して3.1cMセントロメア方向に位置する；図１参照）とABG366（下のパネル；Mloに対して0.7cMテロメア方向に位置する；図１参照）とハイブリダイズせしめた。
Ａ．親の系統mlo-8およびmlo-1並びに２つの感受性Ｆ2植物（個体１および２と命名）より誘導された２つの同型接合感受性（Ｓ，Mlo Mlo）と２つの耐性（Ｒ，mlo mlo）子孫のＤＮＡを試験した。レーンＳおよびＲのＤＮＡは、感受性Ｆ2個体１および２を自殖することにより得られたＦ3ファミリーからの選抜Ｆ3個体を表す。感受性Ｆ2個体はこの選抜スキームにおいてMloのところで異型接合であると予想される。mlo毒性分離物K1の接種後７日目に感染表現型を記録した。このヘテロ対立遺伝子交雑の第三の感受性個体からのＤＮＡ（表７参照）はこの図には含まれない。
Ｂ．親の系統mlo-5およびmlo-1並びに７つの感受性Ｆ2植物（個体１〜７と命名）より誘導された７つの同型接合感受性（Ｓ，Mlo Mlo）と７つの耐性（Ｒ，mlo mlo）子孫のＤＮＡを試験した。レーンＳおよびＲのＤＮＡは、感受性Ｆ2個体１〜７を自殖することにより得られたＦ3ファミリーからの選抜Ｆ3個体を表す。Ｆ2世代においてだけこのヘテロ対立遺伝子交雑の更に２つの感受性個体からのＤＮＡを分析した（８*および９*）。
図５は、大麦Mlo遺伝子、大麦遺伝子特異的プローブを使った交差ハイブリダイゼーションにより単離された米相同体とを包含するゲノム配列の整列を示す。上の行は大麦MloゲノムＤＮＡ配列を示す（エキソン配列に下線が引かれている）。下の行は米Mlo相同体を含む米ゲノム配列を示す。
図６は、大麦Mlo遺伝子を含むゲノム配列と、大麦遺伝子特異的プローブとの交差ハイブリダイゼーションにより単離された大麦相同体を含むゲノム配列との整列を示す。上の行は大麦MloゲノムＤＮＡ配列を示す（エキソン配列に下線が引かれている）。下の行は大麦Mlo相同体を含むゲノム配列を示す。
図７は、大麦Mlo ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。このヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列は、栽培品種Ingrid MloのＲＮＡを使った実験から得られたＲＴ−ＰＣＲとＲＡＣＥの組合せデータに基づく。終止コドンが星印（＊）により示され、推定ポリアデニル化配列に下線が引かれ、そしてＲＡＣＥ産物の推定末端が配列の上の矢印により示される。対応するゲノムクローンとの比較により同定されたイントロンの位置は、核酸配列の下の三角形により表示される。MEMSAT演算法（Jones他，1994）に従った６つの推定膜貫通らせんが灰色のボックスに入れられている。タンパク質のカルボキシ末端側半分における推定核限局化シグナル（K-K-K-V-R）およびカゼインキナーゼII部位（S-I-F-D）は太字体で示される。
図８はコード配列と隣接配列を含む、米（Oryza sativa）相同体のゲノム配列を示す。
図９はコード配列と隣接配列を含む、大麦（Hordeum  vulgare）のゲノム配列を示す。
図10は米相同体のｃＤＮＡ配列を示す。
図11は大麦相同体のｃＤＮＡ配列を示す。
図12はシロイヌナズナ相同体のｃＤＮＡ配列を示す。
図13は米相同体のアミノ酸配列を示す。
図14は大麦相同体のアミノ酸配列を示す。
図15はシロイヌナズナ相同体のｃＤＮＡ配列を示す。
図16は、Mlo、大麦、米およびシロイヌナズナ相同体のアミノ酸配列の多数のボックスを示す。
本明細書中に言及される全ての書類は参考として取り込まれる。
実施例１：大麦のMloのクローニング
Mloに密接に連鎖したAFLPマーカーの標的指向検索
Mloの周辺のＤＮＡマーカー密度を増加させるための努力を、高分解能局所遺伝地図を作製する試みと協調させた。特徴付けられたCarlsberg II Mlo×Grannenlose Zweizeilige mlo-11交雑（Hinze他，1991）の母集団サイズを拡大する別の可能性もあっただろうが、入手可能なBC mlo系統の１つとそれの反復親系統とから出発して高分解能地図を作製することが有利であると思われた。重要なのは、BC系統のドナー親が反復親系統に比較して異なる遺伝的背景を表すことである。こうして、同一遺伝子系統間での交雑から大型マッピング集団を作製することと並行して、連鎖したAFLPマーカーの検索を開始することができた。その上、BC系統に基づく交雑はCarlberg II Mlo×Grannenlose Zweizeilige mlo-11交雑（Hinze他，1991）から決定される、Mloの周辺のＤＮＡマーカーの線状対応性の試験を可能にした。新規交雑には、遺伝的背景Ingrid中に７回戻し交雑されたmlo-3戻し交雑（BC）系（BC7 Ingrid mlo-3；Hinze他，1991）を使用した。この系統は、大麦第４染色体上に比較的小さい遺伝子移入ＤＮＡセグメントを有すると以前に特徴付けられた。加えて、ドナー親系統Malteria Heda mlo-3は、再現親IngridからのＤＮＡと比較して、Mloに連鎖した同定済RFLP遺伝子座の大部分に関して多形性を示した。よって、わずか２つのＤＮＡ鋳型間の多形性を調べることにより、標的指向（ターゲッティング）方式でMloの周辺にAFLPを有するＤＮＡマーカーの密度を増加できると期待された。
この同一２系統を交雑して、形式上８回の戻し交雑を表すＤＮＡマーカーの高分解能マッピング用の分離集団を確立した。分離物K1（Ingrid Mloに毒性でBC7 Ingrid mlo-3に非毒性）を使ったうどんこ病菌接種の後、Ｆ2個体をmlo耐性について記録した。最初に、Ｆ2個体の小部分（77個体）だけを隣接RFLPマーカーとの組換え現象について分析した。同定された４つの組換え体（8-32-2, 7-38-4, 1-34-1および1-49-4と命名）の分析は、以前に分析されたCarlsberg II Mlo×Grannenlose Zweizeilige mlo-11交雑（Hinze他，1991）に比較して、この交雑でのマーカー順序の線状対応性を示した。試験した隣接ＤＮＡマーカー遺伝子座（bAO11, bAL88/2およびbAP91；Hinze他，1991）に対する異型接合性と感受性表現型とを示す77のＦ2実生のうちの幾つかを成熟まで成長させて、Ｆ3世代でのMlo／mlo-3に分離する自殖種子材料を提供した。全体で、自殖Ｆ2またはＦ3世代のいずれかより得られた2,026個体から、高分解能マーカーマッピング用の葉材料を収穫した。
AFLPマーカー候補は、それぞれヌクレオチド位置＋２および＋３までのゲノム配列に及ぶ全ての考えられるPst Ｉ／Mse Ｉプライマー組合せ（1,024）を試験することにより同定された。同様に、1,900に近いEco RI／Mse Ｉプライマー組合せ（＋３／＋３）を分析した。この分析には４つのＤＮＡ鋳型を含めた：Ingred Mlo、BC7 Ingred mlo-3、表現型上mlo耐性である２つのＦ2個体のＤＮＡプール、および表現型上感受性である９つのＦ2個体のＤＮＡプール。AFLP検索においてＤＮＡプールとして含められた耐性および感受性Ｆ2個体は、77のＦ2分離物の上記RFLP分析から選抜された。プールしたＦ2 ＤＮＡは、親からの鋳型ＮＤＡ間に検出された候補多形性がＦ2に遺伝可能な形質であるかどうかを制御できるようにする。全ての同定されたAFLP候補マーカーを８つのＤＮＡ鋳型を使って再調査した：Ingrid Mlo；BC7 Ingred mlo-3；K1接種実験によると表現型上同型接合感受性（MloMlo）であった３つのＦ3ファミリーの個体からのＤＮＡプール；３つの耐性Ｆ2個体のＤＮＡ。選抜操作に基づいて合計18のPst Ｉ／Mse Ｉプライマーと20のEco RI／Mse Ｉプライマーが確認された。
同定されたAFLPマーカーの数は、それを最初はMlo周辺のRFLP地図に基づいたマーカー範囲に大まかに割り当てるのに有用な数となるようにした。このアプローチは、以前に同定されたMloに近接したRFLP範囲の中へのAFLPの分布の評価と、2,026の分離個体中に組換え体を同定することができる一対の隣接AFLPマーカーの選択の両方を可能にするだろうと期待された。AFLP割り当てには、Ingrid Mlo×BC7 Ingrid mlo-3からの77のＦ2分離個体の上記少数試料（範囲bAP91-bAL88中の組換え体２つ、Mlo-bAO11中の組換え体１つ、bAO11-ABG366中の組換え体１つ）のうちRFLPマーカーを使って同定された４つの組換え体を使用した。Mloを含む約3.5cMの遺伝距離の中に合計18のAFLPが位置することが判明した。
Mlo周辺の高分解能AFLP地図の作成
高分解能AFLP地図を作成するのに２段階法を使用した。第一に、2,026の分離個体全部をMloの反対側の２つのAFLPマーカー間での組換え現象についてスクリーニングし、続いてごく少数の同定された組換え体を使って3.5cM標的範囲の中に全ての同定AFLPを位置づけた。Ingrid MloとBC7 Ingrid mlo-3における各対立遺伝子ＤＮＡ断片を検出するAFLPマーカーBpm1とBpm9を選択しそしてMloの反対側に置くことにより、分離個体のＤＮＡ鋳型を組換え現象についてスクリーニングした。あるいは、組換え体の検索は隣接RFLPマーカーbAO11およびbAL88を使って行うことができた。しかしながら、CAPS（cleaved amplified polymorphic sites）中への転移は両マーカーとも好結果であったけれども、大まかに精製したゲノムDNAから両遺伝子座の対立遺伝子を同時に表示させることの難しさに遭遇した。合計2,026個体（Ｆ2またはＦ3分離個体）をAFLPマーカーBpm1とBpm9を使って同時にスクリーニングし、98の組換え体を同定した。続いて、この98の組換え体の各々のＤＮＡ鋳型を使ってAFLP分析を実施して、同定されたAFLP遺伝子座の各々対立遺伝子を同定した。組換え体を自殖させ、そしてMlo遺伝子座における前世代の対立遺伝子を推定するために各組換え体ファミリーの少なくとも25個体を使ってうどんこ病菌分離株K1の接種実験を行った。得られたデータから、4,000以上の減数分裂現象に基づいたMlo周辺の高分解能地図の作成および２点推測法による少なくとも0.025cMの分解能が可能であった。重要な結果は、Mloと共分離するＤＮＡマーカー（Bpm16）と、それぞれ0.25cMと0.4cMの距離のところに２つの隣接マーカー（Bpm2とBpm9）が同定されたことである（図１）。
巨大挿入断片サイズ大麦ＹＡＣライブラリーの作成、Bpm16を含むＹＡＣの単離、およびMloの物理的境界決定
遺伝的証拠はmlo耐性がMlo野性型対立遺伝子中の機能不全によるためであることを示す。従って、栽培品種Ingrid MloからのベクターpYAC4（Burke他，1987；hieter, 1990）中への大型挿入断片サイズＹＡＣライブラリーを確立することを決めた。Siedler & Graner（1991）により記載された改良プロトコルに従って、５日齢実生の葉肉プロトプラストから、ＹＡＣクローニング実験に適するメガ塩基ＤＮＡを調製した。該ＤＮＡをEco RIメチルトランスフェラーゼの存在下でEco RIで部分消化し、そして調製用パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）の後、500〜600kbのサイズ範囲内のＤＮＡ断片を得た。Eco RIで消化したpYAC4との連結後、ＤＮＡを酵母株AB1380中に形質転換せしめ、そしてトリプトファンとウラシルを欠く固形合成完全培地（Sherman他，1986）上で組換えpYAC4 ＤＮＡを有するコロニーを選択した。40個の無作為選択した酵母コロニーを、標識大麦ゲノムＤＮＡを使ってサザンブロット実験により大麦ＤＮＡの存在について調べた。ＹＡＣ挿入断片のサイズは、PFGE分離後に500〜800kbに及ぶことがわかった。平均すると0.2cMの遺伝距離が個々の組換えＹＡＣクローン上に提示されると予想された。４つの大麦ゲノム同等物を提示する合計〜40,000クローンが作製された。
Mloと共分離するマーカーBpm16を使って、４つのＹＡＣクローン（303A6, 322G2, 400H11および417D1と命名）が単離された。それらの挿入断片サイズはPFGEによりそれぞれ650, 710, 650および820kbであると測定された。AFLP分析は、それらのクローンのうちの３つ（303A6, 322G2および417D1）が両方の隣接マーカー遺伝子座も含有するのに対して、クローン400H11は遺伝子座Bpm16とBmp2だけを含むことを示していた。これらの観察結果は、Mlo遺伝子が組換えＹＡＣクローン303A6, 322G2および417D1上に物理的に境界決定されたことを強く暗示する。
ユニークEco RI部位を含むBACベクターpECSBAC4（Shizuya他，1992；ベクターpECSBAC4はFrijtersおよびMichelmore, 1996により記載されている；寄託）中へのサブクローニング実験に、YAC 303A6を選んだ。このクローンの全酵母ＤＮＡをEco RIで部分消化して、50kbの平均サイズを有するＤＮＡ断片を得、そしてEco RI消化され脱リン酸されたBACベクター中にそれを連結せしめた。pECSBAC4中にYAC 303A6由来のＤＮＡを含む細菌コロニーを、レプリカコロニーハイブリダイゼーション実験により同定した。コロニーを含む１セットの膜をAB1380標識酵母ＤＮＡとハイブリダイズさせ、そして複製セットをPFGE精製済のYAC303A6標識ＤＮＡとハイブリダイズさせた。続いて、コロニーハイブリダイゼーション実験においてプローブとしてクローン化108bp Pst I／Mse IゲノムBpm16断片を使って、AFLP遺伝子座Bpm16を含む組換えBACクローンを同定した。
約60kbの挿入断片を含む１つのBACクローンBAC F15を更に詳細な研究のために選んだ。この組換えBACクローンはAFLPマーカー遺伝子座Bpm2を更に含むがBpm9は含まないことがわかった。この時点で、BAC F15挿入断片ＤＮＡはテロメア方向での好結果の物理的境界決定を示した。しかし、この挿入断片がセントロメア方向に隣接配列を含むかどうかは未解決の問題であった。Bpm16とBpm9の間にBAC連続配列（contig）を作製する代わりに、BAC F15からの新規多形性マーカーを開発するという意見を選んだ。親系統Ingrid MloとBC7 Ingrid mlo-3の間に対立遺伝子Xba Ｉ／Mse Ｉ多形性（Bxm2と命名）が同定された。
Mlo含有Bpm2−Bpm9範囲内に組換え現象を有する25の組換え個体の分析は、Mloからセントロメア方向で0.1cMの距離のところでのBxm2のマッピングを可能にした。Bpm9−Mlo範囲中の入手可能な組換え体16個のうち４個だけがBpm2とMloの間の組換え現象を示し、Mlo−Bpm2範囲中の組換え体９個は１つも組換え現象を示さなかった。Mloをマーカー遺伝子座Bpm2とBxm2の間のBAC F15上に範囲限定されたという結論を下した（図１）。
Mlo遺伝子とmlo変異体の同定
マーカーBxm2を同定しそしてMlo遺伝子をテロメア方向で範囲決定することを示す前に、BAC F15の〜60kb挿入断片の配列連続物（contig）を決定するためにランダム配列決定計画を開始した。並行して、物理的地図を作製した（図１）。物理的地図は、隣接マーカーBpm2とBxm2が〜30kbだけ物理的に離れていることを示した。この配列連続物を、STADENプログラムパッケージのUNIXバージョンを使って高いコード確率を有する領域について検索した。共分離マーカーBpm16を含む6kbに近い唯一の配列連続物が、広範囲に渡る高コード確率領域を示した。
栽培品種Ingrid Mlo由来の全葉ＲＮＡを使って、高コード確率を示した領域から推定した一連のプライマーを用いてRT-PCR反応を実施し、そして各場合に別々の増幅生成物を得た。最大のRT-PCR生成物の配列分析は、1,602bpの単一の広大な転写解読枠を明らかにした（図２）。533アミノ酸の推定タンパク質は60.4キロダルトン（KDal）の分子量を有する。〜1.7kbのRT-PCR生成物をハイブリダイゼーションプローブとして使用すると、長さ〜1.9kbの単一RNA転写物が検出された（図３）。ゲノム配列とこの最大RT-PCR断片との比較は、各々特徴的なスプライス部位配列により隣接されている、12個のエキソンと11個のイントロンの存在を明らかにした（図１）。
マーカーBpm16は上記遺伝子の３′末端に位置し（エキソン11）且つMlo遺伝子座と共分離するので、我々は様々な利用可能な変異原誘発mlo耐性対立遺伝子の直接ＰＣＲ配列決定を開始した。我々は試験した15個の変異型対立遺伝子のうちの14個において、野性型配列の単一アミノ酸置換、欠失またはフレームシフト変異のいずれかを引き起こすヌクレオチド変更を同定した（表１）。我々は、変異型対立遺伝子mlo-2がプロモーター配列または５′非翻訳配列中に位置すると疑っている。この領域は直接ＰＣＲ配列決定によって配列決定するのが難しいと評判であるが、一連の重複したプライマーを使った実験がこの問題を解決すると思われる。要約すれば、様々な変異型mlo系列およびそれらの各々のMlo野性型栽培品種からのゲノムＤＮＡの比較配列決定が、強力な証拠を提供した。
遺伝子内組換え
トランスジェニック大麦植物を経由した補完実験に頼らないMloの分子単離の一連の証拠を提供することが目的であった。我々は、同定された遺伝子がMloであることを確証するために普通とは違う遺伝材料を開発することを選んだ。上記遺伝子中に観察される突然変異がうどんこ病菌に対する耐性を引き起こすならば、変異型対立遺伝子部位間での組換えが野性型配列を回復させるはずだと推論した。それらの遺伝子内組換えがうどんこ病菌侵襲に対して感受性を示すだろうと推測した。
mlo耐性対立遺伝子mlo-1, mlo-5およびmlo-8が関係する交雑スキームを開発した。変異体対立遺伝子は、遺伝的背景Haisa（mlo-1）とCarlsberg II（mlo-1およびmlo-8）から始まる。表２に示されるように変異体間交雑を実施して、各場合に少なくとも10個のＦ1植物を得た。自家受精（自殖）によりＦ2集団を得た。親のMlo野性型栽培品種の各々に対して毒性であるうどんこ病菌分離物K1の接種後、まれな感受性個体についてＦ2実生をスクリーニングした。感受性Ｆ2個体は〜６×10-4の頻度で同定された。対照的に、各々のmlo変異体の自殖から得られた同等数の子孫をK1に対する耐性について試験すると、感受性実生は全く同定されなかった。この観察結果は、感受性個体の大部分が変異型mlo対立遺伝子の自然復帰現象によるものでないことを強く示唆した。
Ｆ3ファミリー間での自殖後に感受性Ｆ2個体の遺伝を調べた。各Ｆ2個体は感受性Ｆ3個体と耐性Ｆ3個体に分離し、このことは、Ｆ2では耐性／感受性を付与する対立遺伝子が異型接合性であることを示唆した。感受性Ｆ2個体の大部分については、Ｆ3個体の自殖とその後の感受性個体のみを検出するＦ4ファミリーの同定により、同型接合感受性Ｆ3子孫が単離された。
Mlo遺伝子座の両側に近接に連鎖する（＜3cM）ことがわかったRFLPマーカーを使って、感受性個体の分子分析を実施した（図４）。RFLPマーカーWG114はMloに関してセントロメア方向でマッピングし、そしてマーカーABG366はテロメア方向でマッピングする。変異体間交雑mlo-8×mlo-1（Ａ）およびmlo-1×mlo-5（Ｂ）により検出されるRFLP対立遺伝子が示される。感受性Ｆ2個体（*により表示）のＤＮＡまたは感受性Ｆ2個体の自殖から得られた同型接合感受性（Ｓ）および同型接合耐性（Ｒ）Ｆ3子孫のＤＮＡを分析した。
mlo-8×mlo-1交雑の感受性Ｆ2植物＃１からの同型接合感受性Ｆ3子孫（図４）は、Mloに対してセントロメア方向で隣接したmlo-1親由来のWG114対立遺伝子と、Mloに対してテロメア方向にmlo-8親由来のABG366対立遺伝子の存在を明らかにした。この交雑のＦ2植物＃１からの同型接合耐性Ｆ3子孫は、対照的に親のmlo-1由来の隣接マーカー対立遺伝子だけを示した。この結果は、Ｆ2植物＃１の感受性が、Mlo野性型対立遺伝子の回復をもたらす第一の染色体の先行減数分裂中の乗換え型組換えによって引き起こされ、一方個体＃１の第二のＦ2染色体が機能的に変更されてないmlo-1対立遺伝子を含むことを強く示唆した。感受性Ｆ2植物＃１からの同型接合感受性Ｆ3子孫のRFLP遺伝子座の対立形質は、上述したものと同じである。しかしながら、この個体の同型接合耐性Ｆ3子孫からの隣接マーカー対立遺伝子はどちらの場合もmlo-8親由来である。再び、乗換え型組換えが感受性Ｆ2個体＃２において１つのMlo野性型対立遺伝子を回復させたと断定される。
mlo-1×mlo-5交雑から９つの感受性Ｆ2個体を回収した。感受性Ｆ2個体＃１〜＃７については、ＤＮＡレベルで同型接合感受性と同型接合耐性Ｆ3子孫の両方を分析した。個体＃８と＃９の場合は異型接合感受性Ｆ2個体からのＤＮＡだけを分析したことに注意（*により表示）。隣接RFLP遺伝子座に関して次のような対立遺伝子パターンが観察された：（i）同型接合耐性Ｆ3子孫は、Mloの両側にmlo-1親由来の遺伝子座WG114およびABG366の対立形質だけ（個体＃１，＃３，＃６，＃７）またはmlo-5親由来の対立形質だけ（個体＃２，＃４，＃５）のいずれかを示した。（ii）対照的に、同型接合感受性Ｆ3子孫は、Mloの両側にmlo-5親由来の両遺伝子座の対立形質だけを示す（＃３，＃５，＃６）かまたはそれらはMloの両側に異なる対立形質を示す（個体＃１，＃２，＃４，＃７）。（iii）両側に異なる対立形質を有する同型接合感受性Ｆ3子孫は、常にセントロメア方向にmlo-1由来のWG114対立遺伝子を含みそしてテロメア方向にmlo-5由来のABG366対立遺伝子を含む。（iv）異型接合感受性Ｆ2個体＃８は、Mloに隣接したいずれかの側にmlo-5親由来の対立遺伝子のみを示す。異型接合感受性個体＃９は、セントロメア方向に両親mlo-1とmlo-5由来の対立遺伝子を含むが、テロメア方向にはmlo-5由来の対立遺伝子だけが検出される。データの包括的解釈は、Ｆ2個体＃１，＃２，＃４，＃７および＃９の感受性が、Mlo野性型対立遺伝子を回復させる乗換え型の組換えによって生じることを示唆する。個体＃３，＃５，＃６および＃８においては非乗換え型の組換えがMlo野性型対立遺伝子を回復させたのだろう。
単離された全ての感受性Ｆ2個体または同型接合Ｆ3子孫の検出された隣接RFLP対立遺伝子を表３にまとめて示す。mlo-8×mlo-1交雑の個体＃３は図４に示してないことに注意。この表は、（i）乗換え型の組換え（CO）と非乗換え型の組換え（NCO）が７：５の比で認められること、（ii）乗換え型の組換えが一方向に分割されること、および（iii）親のmlo-1に連鎖したRFLP対立遺伝子を有するNCO組換え体が観察されなかったこと、を明らかにする。
ヘテロ対立遺伝子mlo交雑から単離されたCO型遺伝子内組換え体を使って、Mlo候補遺伝子の野性型配列が回復されたかどうかを試験した。３つの関連する対立遺伝子mlo-1, mlo-5, mlo-8について、候補となる突然変異部位が同定された（表１および４）。ヘテロ対立遺伝子交雑mlo-1×mlo-8およびmlo-1×mlo-5から誘導された感受性遺伝子内組換え体のゲノムＤＮＡの直接ＰＣＲ配列分析は、野性型配列の回復を示した（表４）。この観察結果は、前者の交雑ではヌクレオチド−１と＋483の間で、そして後者の交雑では＋３と＋483の間で（翻訳開始部位に従ったヌクレオチド番号）遺伝子内乗換え現象が起こったことを強力に示唆する。よって、２種類のヘテロ対立遺伝子交雑からの７つの遺伝子内組換え体の分子分析は、上述した候補遺伝子がMloを表すという最終証明を提供する。
実施例２：同定されたMlo遺伝子の相同体
米（Oryzae  sativa）とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の入手可能なＥＳＴ（expressed sequence tag）データベースを相同タンパク質配列について検索した。推定アミノ酸配列がMloタンパク質に対して実質的類似性を示す５つのシロイヌナズナｃＤＮＡクローンが同定された。顕著であるのは、1.2ｅ-45の偶発確率を示すｃＤＮＡクローン205N12T7である。加えて、米においても少なくとも１つの有意な相同体が見つかった（OSR16381A）。
Mloを含む標識大麦ゲノム断片を使って米のBACライブラリー（Wang他，1995）もスクリーニングした。〜23kbの挿入断片を含む１つのBACクローンを単離した。その後のサブクローニングにより、大麦Mlo遺伝子プローブとの強い交差ハイブリダイゼーションを示す2.5kb PstＩゲノム米断片を単離することができた。この断片のＤＮＡ配列分析は、大麦Mlo遺伝子のエキソン配列との著しいＤＮＡ配列類似性を明らかにした（図５）。
最後に、Mloを含む標識大麦ゲノム断片を使って栽培品種Igri（Stratagene）由来の13kb λゲノム大麦クローンを単離した。サブクローニングした2.6kb SacＩ断片からのヌクレオチド配列は、同じくMlo遺伝子に対して広範囲に渡る配列類似性を示した（図６）。このゲノム内の大麦Mlo相同体の位置はBAC F15 ＤＮＡ内ではない。
要約すると、単子葉植物種と双子葉植物種の両方にMlo相同体の決定的証拠がある。
考察
Mloおよびmlo核酸およびポリペプチドの作用形態に関するどんな推測も、本発明のいずれかの観点または態様の性質または範囲に対して制限を加えるものではない。
植物では、病原体に対する耐性はしばしば優性耐性遺伝子により決定され、その生成物が病原体由来の非毒性遺伝子産物を認識すると仮定されている。この病原体防御機構はFlorの遺伝子対遺伝子説（Flor, 1971）に従う。最近、「遺伝子対遺伝子」型の耐性遺伝子が幾つか分子的に単離されている（Martin他，1993；Bent他，1994;Jones他，1994；Mindrinos他，1994；Whitham他，1994；Grant他，1995；Lawrence他，1995；Song他，1995）。驚くべき所見は、推定タンパク質が、ウイルス、真菌および細菌のような種々の病原体に対する耐性反応を誘発するけれども、それらが顕著な類似構造領域を共有することである（Dangel, 1995；Staskawicz他，1995）。単離された遺伝子は、付随のヌクレオチド結合領域（ＮＢＳ）を有するかもしくは有しない高ロイシン領域（ＬＲＲ）（これはリガンド結合およびタンパク質−タンパク質相互作用の指標である）を含むタンパク質をコードするか、または単純なセリン／スレオニンキナーゼをコードする。ＬＲＲとキナーゼ領域の構造的組合せは、米Xa21耐性遺伝子からの推定タンパク質において報告されている（Song他，1995）。「遺伝子対遺伝子」防御において耐性遺伝子に構造的類似性があることから、共通の基礎的耐性メカニズムが存在しそうである。
Mlo遺伝子の劣性耐性対立遺伝子により媒介される耐性は、「遺伝子対遺伝子」耐性とは様々な点で異なる（上記の序論を参照のこと）。本明細書中に記載されるMlo遺伝子の分子単離および様々な変異誘発mlo対立遺伝子の配列決定は、突然変異とメンデル遺伝の組合せ研究からの当初の推測
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を確証する。Mlo遺伝子座の欠損対立遺伝子が、うどんこ病菌のような病原体に対する広域スペクトル耐性を媒介すると結論づけられる。これは、品種特異的耐性遺伝子について提案されたような病原体由来生成物の特異的認識現象の関与とは一致しない。
mlo対立遺伝子の多面作用は、観察された広域スペクトル耐性応答の分子概念の発達の方向へ幾つか手掛かりを与えた。
第一に、無菌成長させたmlo植物は、高頻度で葉表皮細胞中に細胞壁並置（ＣＷＡ）の自然形成を示す（Wolter他，1993）。それらのＣＷＡは通常、真菌付着器のすぐ下に病原体貫入の試みに応答して形成される。ＣＷＡは病原体の進入に対する物理的障壁を形成すると考えられ、且つmlo媒介耐性に繰り返し関係づけられている（Bayles, 1990）。
第二に、植物は後期になると、巨視的に検出可能な葉壊死小斑を発生する。自然葉壊死反応は、95の化学的に誘発されたmlo対立遺伝子のユニーク収集物を使って広く研究されている（Hentrich, 1979）。これらの対立遺伝子は、９種のうどんこ病菌分離物の混合物の感染によって段階的に異なる感染表現型を示すものとして分類された。中間的感染表現型（すなわち、接種すると相当数の胞子形成真菌コロニーの形成）を生じるそれらのmlo対立遺伝子は検出可能な自然葉壊死を全く示さず、一方で最も有効な耐性対立遺伝子のカテゴリーは病原体の不在下でも顕著な壊死を示す。よって、mlo対立遺伝子の前者のカテゴリーは残余野性型対立遺伝子活性を保持し、それらの対立遺伝子が検出可能な自然葉壊死を全く示さないようである確固たる証拠がある。
第三に、防御関連遺伝子の構成的発現は、うどんこ病菌のない条件下で成長させたmlo実生において、10〜11日齢時の初生葉に観察された。これはPR-1ファミリー、キチナーゼおよびペルオキシダーゼの遺伝子を包含する。
本発明者らは、防御関連遺伝子の構成的発現の開始後に（10〜11日齢のmlo実生）、タルク粉末と胞子の１：１混合物をmlo大麦植物の葉の上に吹付けた（aviblow）時、大麦のmloが黄さび病菌（Puccinia  struciformis）に対する増強された耐性を付与することを証明した。
よって、mlo植物において多重防御関連応答が構成的に発現されると思われる。
それらの現象の時間的関係が興味深い。すなわち、構成的防御関連転写物の蓄積の開始が11日齢の実生に検出され、次いでＣＷＡ形成が起こり、その後で巨視的に検出できる葉壊死が現れる。しかしながら、重要なのは、mlo耐性を５日齢の実生ほどの早期に実験的に調べることができ、そしてこの時点で該耐性が十分機能的であるという点である。我々は、Mloタンパク質が植物防御において負の調節機能を有し、そして欠損タンパク質を有する植物は防御応答の開始が「前もって用意されている」と結論づける。
Mloの推定アミノ酸配列は、今までに記載された植物耐性遺伝子のいずれとも全く有意な相同性を示さない。このことは、全く別の分子耐性メカニズムの考えを支持する。Mlo遺伝子はまた、様々なデータベース中のいずれの特徴付けられた植物または哺乳類遺伝子配列とも顕著な類似性を示さない。しかしながら、米およびシロイヌナズナからのＥＳＴおよびゲノムデータベース中に、高度に有意な相同配列が同定された（表５および図５）。これは、Mloタンパク質が新規タンパク質ファミリーの一員であることを強力に示唆する。該タンパク質の核内限局化を示唆する、推定核内限局化モチーフ（ＮＬＳ）がエキソン12中に認められる（KEKKKVR；Nigg他，1991）。このモチーフの重要性は、NH2末端方向に14アミノ酸だけ離れて置かれたカゼインキナーゼIIモチーフ（SIFD；Rihs他，1991）により支持される。機能試験によりMloタンパク質の推定上の細胞下限局化を調べることができる。
別の植物種においても、病原体に対する防御応答が構成的に発現されるらしい突然変異が記載されている（Walbot他，1983；Pryor, 1987；Jones, 1994）。病斑模倣変異体（Les）または壊死変異体（nec）と呼ばれるこの部類の変異体は、植物防御応答の制御に影響を及ぼす。劣性遺伝する病斑模倣変異体がシロイヌナズナにおいて系統的に分析されている（Greenberg & Ausubel, 1993；Dietrich他，1994; Greenberg他，1994; Weymann他，1995）。作用遺伝子はacd（accelerated cell death; acd1およびacd2）またはlsd（lesions simulating disease resistance response; lsd1〜lsd7）と命名されている。
それらの変異体の各々は、病原体の不在下では、植物細胞壁変形や防御関連遺伝子転写物の蓄積といったＨＲ特性を示す。acd2変異体の葉は高レベルのサリチル酸およびシロイヌナズナのフィトアレキシンであるカメレキシンを蓄積することが示されている（Tsuji他，1992）。重要なのは、acdおよびlsd変異体が細菌（Ｐ．シリンゲ）および真菌（Ｐ．パラシティカ）病原体に対して高められた耐性を示すことである。病変陽性状態でのみ高い病原体耐性を示す他の欠損遺伝子座とは異なり、lsd1変異体は病変前状態で強化された病原体耐性を付与することから例外的である。この点で、lsd1は大麦のmlo変異体と似ている。lsd1の別の顕著な特徴は病変の中間的広がりであり、それに対して他の変異体は病変成長が決定的である。
実験手順
植物材料
mlo変異体およびそれらの母系変異体の編集は
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により〔mlo-1, mlo-3, mlo-4, mlo-5, mlo-7, mlo-8, mlo-9, mlo-10, mlo-11〕およびHabekuss & Hentrich（1988）により〔栽培品種Plena変異体2018（mlo-13），2034（mlo-17），2118〕記載されている。変異体2118は今までに対立遺伝子番号が付与されていないので、我々はGrainGeneデータベース（gopher://greengenes.cit.cornell.edu:70/77/.graingenes.ndx/index?mlo）における現在の番号付けに従って、対立遺伝子をここでmlo-26と命名した。
高分解能地図はIngrid Mlo×BC7 Ingrid mlo-3の交雑に基づく。Ｆ1植物を自殖させて約600植物の分離Ｆ2集団を得た。Mloの反対側にあるRFLPマーカーについて異型接合性を示す表現型上感受性のＦ2植物を自殖させ、そして高分解能地図作成のためのＦ3世代の更なる分離個体を得た。
うどんこ病菌感染試験
真菌分離株K1（Hinze他，1991）は、Mlo対立遺伝子を有するこの実験に使用する全ての栽培品種に対して毒性であり、そして試験した全てのmlo遺伝子型に対しては非毒性である。植物成長およびうどんこ病菌（Erysiphe graminis f sp hordei）の接種は以前に記載された通りに実施した（Freialdenhoven他，1991）。高分解能地図作成に使用した組換え体のMloの遺伝子型は、少なくとも24個体を含んで成るＦ3またはＦ4ファミリーにおける自殖とその後の接種実験後に決定された。
AFLP分析
AFLP分析用のゲノムＤＮＡはStewartおよびVia（1993）に従って単離した。AFLP分析はVos他（1995）により記載されたものを僅かに変更して実施した。Mloに連鎖したAFLPマーカーのスクリーニング用に、酵素組合せPst Ｉ／Mse Ｉと共に、増幅断片のゲノム配列中にそれぞれ＋２および＋３選択塩基を有する増幅プライマーを使った。Eco RI／Mse Ｉ増幅プライマーにはそれぞれ＋３および＋３選択塩基を使用した。次の４つのＤＮＡ鋳型から成るセットを使用した：感受性親栽培品種Ingrid Mlo、耐性親BC7 Ingrid mlo-3、Mlo×BC7 Ingrid mlo-3交雑から得られる２つの耐性Ｆ2個体（mlo-3 mlo-3）のプールおよび９つの感受性Ｆ2個体（Mlo Mlo）のプール。AFLPマーカーBpm2, Bpm9およびBpm16を表す増幅ゲノム断片（図１）をクローニングし、そして次のようにして配列決定した：増幅ゲノム断片を含むゲル切片（真空乾燥によりWhatman 3MM紙上に固定したもの）をオートラジオグラフィーにより同定し、続いて切除した。100μｌの水を加え、10分間煮沸し、そして遠心した後、上清５μｌを鋳型として使用して選択AFLPプライマーを使って非放射性再増幅反応（30サイクル）を行った。増幅生成物をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ単離キット（Jetsorb, Genomed Inc., USA）を使って単離した。ＤＮＡをKlenowポリメラーゼとT4ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、続いてpBluescript SK（Stratagene）のEcoRV部位の中にクローニングした。配列決定反応は色素ターミネーターサイクル配列決定反応キット（Perkin Elmer）を使って実施し、そしてABI 373または377自動シークエンサー（Applied Biosystems）上で解析した。
大麦YACライブラリーおよびYAC YHV303-A6のBACサブライブラリーの作製
pYAC4ベクター（Burke他，1987；Kuhn & Ludwig, 1994）と酵母株AB 1380を使って大麦栽培品種IngridのYACライブラリーを作製した。該ライブラリーの作製およびそれの特徴づけの詳細は本明細書中のどこかに記載される。マーカーBpm16を含むYACクローンについてのスクリーニングはAFLP分析によって行った。YAC YHV303-A6のBACサブライブラリーの作製には、この酵母クローンの全ＤＮＡを使用した。部分的Eco RI消化と調製用パルスフィールドゲル電気泳動の後、50kbのサイズ範囲のＤＮＡ断片を回収し、そしてpECSBAC4ベクター中にサブクローニングした。YHV303-A6由来の挿入断片を有するクローンを２段階コロニーハイブリダイゼーション法により同定した。まず非組換え酵母株AB 1380の全標識ＤＮＡをプローブとして使用して、宿主株由来の挿入ＤＮＡを有するクローンの大部分を除去した。次のハイブリダイゼーション段階において、残ったクローンを、調製用パルスフィールドゲル電気泳動による濃縮後に標識組換え染色体YHV303-A6を使って探査した。
BAC F15のＤＮＡ配列決定
Sambrook他（1989）に従ったアルカリ溶解大規模プラスミド調製法によりBAC F15のＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡ 50μgを反応容器中でアルゴンガスでの150秒間の高圧処理により霧状にした。剪断されそして再沈澱したＤＮＡの末端をT4 DNAポリメラーゼ媒介フィルイン反応により平滑末端にした。800bp〜3kbのサイズ範囲のＤＮＡ断片をＤＮＡ単離キット（Jetsorb, Genomed Inc., U.S.A.）を使ってアガロースゲルから単離し、pBluescript SKベクター（Stratagene）中にサブクローニングし、そしてＥ．コリ DN5α中で増殖させた。BAC F15由来の挿入断片を有するクローンを、プローブとしてBAC F15の剪断ＤＮＡを使ったハイブリダイゼーションにより選択した。配列決定反応は上述した通りに実施した。配列決定データの評価、配列連続物の作製、およびコード確率の推定は、Unixユーザー用のSTADENソフトウエアパッケージ（第４版，1994）を使って行った。コード確率の評価は、試験した配列における不均等塩基配置頻度、塩基配置優先性および大麦コドン使用頻度の合同評価に基づいた。相同性検索はBLASTソフトウエアを使って行った。
Mloの対立遺伝子のＰＣＲに基づく配列決定
この分析用の植物染色体ＤＮＡはChunwongse他（1993）に従って単離した。ＰＣＲに基づく配列決定により、この実験に使用する様々な大麦変種、mlo変異体、BC系統、および遺伝子内組換え体のMlo対立遺伝子のＤＮＡ配列が得られた。該遺伝子の７つの重複部分断片（長さが各々400bp〜600bp）を、特異的プライマーセットを使ってＰＣＲ（35サイクル、60℃アニーリング温度）により増幅せしめた。調製用アガロースゲル電気泳動とJetsorbキット（Geromed Inc., U.S.A.）を使った増幅生成物の単離の後、断片を再増幅せしめて特異性を増大させた。次いで、得られた生成物をヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドから精製し（Jetpure, Geromed Inc., U.S.A.）、ＤＮＡ配列決定反応（上述）において鋳型として使用した。変異体対立遺伝子および親系統の対応する領域並びに遺伝子内組換え体のＤＮＡ配列は全て両方の鎖から誘導し、そして独立した系列の実験において２回ずつ確認した。加えて、栽培品種Ingridの対応するBC系統においても変異体対立遺伝子mlo-1, mlo-3, mlo-4, mlo-5, mlo-7, mlo-8, mlo-9およびmlo-10が確認された。
ＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）
ＲＴ−ＰＣＲは第一鎖ｃＤＮＡ合成用のSUPERSCRIPT予備増幅系（Gibco BRL）を使って行った。７日齢の大麦初生葉（栽培品種Ingrid）の全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型として使用した。オリゴ（dT）プライマーにより第一鎖ｃＤＮＡ合成を開始させた。続いて、オリゴヌクレオチド25L（GTGCATCTGCGTGTGCGTA）とオリゴヌクレオチド38（CAGAAACTTGTCTCATCCCTG）を使って単一増幅段階（35サイクル、60℃アニーリング温度）においてMlo遺伝子の推定コード領域を増幅せしめた。得られた生成物を直接配列決定により分析した。Mlo ｃＤＮＡの５′および３′末端を、MARATHON cDNA増幅キット（Clontech）を使ってＲＡＣＥ法（Frohman他，1988）により決定した。対応する実験手順は大体製造業者の説明書に従って実施した。特異的ＲＡＣＥ生成物を得るために、連続２回の増幅（35サイクル、55℃アニーリング温度）が必要であった。このために、前記キットのアダプタープライマーと共に、次の２セットの繰り込みプライマーを使用した：５′末端にはオリゴヌクレオチド46（AGGGTCAGGATCGCCAC）と55（TTGTGGAGGCCGTGTTCC）、そして３′末端にはプライマー33（TGCAGCTATATGACCTTCCCCCTC）と37（GGACATGCTGATGGCTCAGA）。ＲＡＣＥ生成物をpBluescript SK（Stratagene）中にサブクローニングした。10個の５′末端クローンと８個の３′末端クローンをＤＮＡ配列分析用に選んだ。
ここで用いる用語「AFLP」は「AFLPマーカー」を意味する。
表１は、Mlo遺伝子内の様々な変異体の同定された変異部位を要約する。アミノ酸レベルでの変異の起源、変異原および推定効果が示される。
表２は、遺伝子内組換え現象を単離するためのヘテロ対立遺伝子mlo間交雑および各々のmlo系列の自殖の結果を示す。
表３は、変異体間交雑からの感受性Ｆ2または同型接合Ｆ3子孫における隣接RFLPマーカーの遺伝子型を要約する。COおよびNCOは隣接分子マーカーの交換から推定される乗換え型および非乗換え型組換えを示す。表３は感受性遺伝子内乗換え型組換え体（同型接合感受性Ｆ3子孫から）および対応する親のmlo変異体系のＤＮＡ配列分析を要約する。同定された変異部位に隣接する配列が示される。
表４は、ヘテロ対立遺伝子間交雑mlo-1×mlo-8およびmlo-1×mlo-5の両者から得られた感受性遺伝子内組換え体のゲノムＤＮＡの直接ＰＣＲ配列決定の結果を示し、野性型配列の回復を明らかにする。
表５は、Mloタンパク質に対する相同性を有する、幾つかのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）および２つのコメのＥＳＴ（発現配列標識）を示す。
表５Ａはアミノ酸配列であって、「query」は相同性が認められたMloタンパク質配列の部分を示し、「subject」は各々同定されたＥＳＴの推定アミノ酸配列を示す。
表５Ｂは、表５Ａに示されたアミノ酸配列をコードするＥＳＴヌクレオチド配列を示す。GenBank受入れ番号T22145（定義4153シロイヌナズナcDNAクローン97N8T7, NCBI Seq ID 932185）、番号T22146（定義4153シロイヌナズナcDNAクローン97N9T7, NCBI Seq ID 932186）、番号N37544（定義18771シロイヌナズナcDNAクローン205N12T7, NCBI Seq ID 1158686）、番号T88073（定義11769シロイヌナズナcDNAクローン155I23T7, NCBI Seq ID 9359322）、番号H76041（定義17746シロイヌナズナcDNAクローン193P6T7, NCBI Seq ID 1053292）、番号D24287（米cDNA部分配列R1638＿1A, nID g428139）およびD24131（米cDNA部分配列R1408＿1A, nID g427985）が示される。シロイヌナズナ配列はNewman他（1994）Plant Physiol. 106, 1241-55からのである。米配列は1993年11月２日にDDBJに提出されたMinobe, Y.およびSasaki, T.からのである。
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１６】
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