(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルキル基、置換基を有してよいＣ2〜Ｃ6のアルケニル基、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルコキシル基、置換基を有してよいアリール基、置換基を有してよいアリールオキシ基、又は置換基を有してよい複素環基を示す。）で表される化合物を微生物の作用により加水分解して、式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物に変換する製造法において、バリオボラクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属又はアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、式［Ｉ］で表される化合物を加水分解して式［II］で表される化合物に変換する能力を有すると共に、式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物及び／又は式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物に対する濃度耐性及び耐久性を有する微生物により、式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物を水性溶媒中に生成蓄積させ、これを採取すること特徴とする、式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物の製造法。
【請求項２】
Ｒが水素原子、置換基を有してもよいＣ1〜Ｃ6のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基である請求項１記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項３】
Ｒが水素原子、Ｃ1〜Ｃ6のアルキルチオアルキル基、Ｃ1〜Ｃ6のヒドロキシアルキル基又はフェニル基である請求項１又は２記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項４】
式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮで表される化合物が、ラクトニトリル、マンデロニトリル又は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルからなる群から選ばれる一種である請求項１記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項５】
バリオボラクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属に属する微生物がバリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）である請求項１ないし４のいずれかに記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項６】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物がアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ１０４である請求項１ないし４のいずれかに記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項７】
一般式［III］：Ｍm（ＣＮ）n（式中、Ｍは水素、アンモニウム又は金属イオンを表し、m、nは１−３の整数を表す。）で示されるシアン化物を存在させることを特徴とする請求項１記載の式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物の製造法。
【請求項８】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルキル基、置換基を有してよいＣ2〜Ｃ6のアルケニル基、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルコキシル基、置換基を有してよいアリール基、置換基を有してよいアリールオキシ基、又は置換基を有してよい複素環基を示す。）で表される化合物及び／又は式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物に対する濃度耐性及び耐久性を有し、式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表される化合物を式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される化合物に変換する能力を有するＮＳＳＣ１０４株。
【発明の詳細な説明】
微生物を用いたα−ヒドロキシ酸の製造方法及び新規微生物
技術分野：
微生物を用いたα−ヒドロキシ酸の製造方法及び新規微生物：本発明は微生物を用いてα−ヒドロキシニトリルを加水分解し、α−ヒドロキシ酸を製造する方法に関する。α−ヒドロキシ酸のうち乳酸は、食品、醸造用、工業用として、また２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸は家畜の飼料添加物として有用である。
背景技術：
α−ヒドロキシニトリル［Ｉ］から微生物によってα−ヒドロキシ酸［II］を製造する方法として、例えば、
（１）バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属及びブレビバクテリウム属の微生物による乳酸、グリコール酸等の製造方法〔特公昭58-15120〕、
（２）コリネバクテリウム属に属する微生物による乳酸、グリコール酸及び２−ヒドロキシイソ酪酸の製造法〔特開昭61-56086〕、
（３）シュードモナス属、アースロバクター属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、コクリオボラス属、及びフザリウム属の微生物による乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−ヒドロキシフェニルプロピオン酸及びマンデル酸の製造方法〔特開昭63-222696〕、
（４）アースロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、バクテリジウム属、ブレビバクテリウム属、コクリオバラス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルディア属、ペニシリウム属、シュードモナス属及びフザリウムの微生物による、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトンの製造法〔特開昭64-10996〕、
（５）ロドコッカス属、シュードモナス属、アースロバクター属及びブレビバクテリウム属の微生物による２−ヒドロキシイソ酪酸の製造法〔特開平4-40897〕、
（６）カセオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属及びアースロバクター属の微生物によるα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法〔特開平4-40898〕、
（７）アルカリゲネス属、ロドコッカス属及びゴルドナ属の微生物による４−メチルチオ酪酸の製造法〔ＷＯ 96/09403〕、
（８）パントエア属、ミクロコッカス属及びバクテリヂウム属等の微生物によるｄ−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造法〔特開平8-173175〕等、が知られている。
しかしながら、これらα−ヒドロキシ酸の製造方法は、目的とする物質を高濃度で生成蓄積させることにおいて必ずしも満足しうるものではない。例えば、乳酸は、コリネバクテリウム属に属する微生物により９．８重量％〔特開昭61-56086〕、シュードモナス属に属する微生物により１０重量％〔特開昭63-222696〕、アースロバクター属に属する微生物により０．１５重量％〔特開昭63-222696〕の蓄積が確認されているにすぎない。また、α−ヒドロキシイソ酪酸はシュードモナス属に属する微生物により０．８重量％〔特開昭63-222696〕、α−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸はカセオバクター属に属する微生物により１８８ｍＭ（２．８重量％）〔特開平4-40898〕、アースロバクター属に属する微生物により５５ｍＭ（０．８重量％）〔特開平4-40898〕、アルカリゲネス属に属する微生物により９４０ｍＭ（１４重量％）〔ＷＯ 96/09403〕の蓄積が各々確認されているにすぎない。
このように生成物の蓄積濃度が低い理由として、α−ヒドロキシニトリルが水溶液中で対応するアルデヒドもしくはケトンと青酸に部分的に解離し〔ケミカルレビューズ（Chemlcal Revlews）第４２巻、１８９ページ、１９４８年〕、青酸によって酵素活性が阻害されることが挙げられる〔アグリカルチュラル  バイオロジカル  ケミストリー（Agricaltural Biologlcal Chemistry）第４６巻、１１６５ページ、１９８２年〕。また解離したアルデヒドの作用で酵素が短時間で失活する可能性も指摘されており、これを解決するための方法として、酸性亜硫酸イオンまたは亜ジチオン酸イオンを添加する方法〔特開平5-192189〕、亜リン酸イオンまたは次亜リン酸イオンを添加する方法〔特開平7-213296〕が提案されている。しかしながらこれらの添加物を使用してもα−ヒドロキシ酸の生成蓄積濃度は高いものではない。
一般的に生成物の蓄積濃度が低い場合、これを製造するための設備が複雑かつ大規模になることは当業者によく知られている。このためこれらの方法によって工業的にα−ヒドロキシ酸を製造することは製造効率の点で問題があった。本発明は、微生物を用いてα−ヒドロキシ酸を高濃度に蓄積し効率的にα−ヒドロキシ酸を製造する方法を提供することを目的とする。
発明の開示：
本発明者らは、一般式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒは水素原子、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルキル基、置換基を有してよいＣ2〜Ｃ6のアルケニル基、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルコキシル基、置換基を有してよいアリール基、置換基を有してよいアリールオキシ基、又は置換基を有してよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］から、一般式［II］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同じ意味を表す。）で表されるα−ヒドロキシ酸［II］を生成する微生物について、高濃度のα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］またはα−ヒドロキシ酸［II］によって活性の抑制を受けにくく、長期間活性が持続する耐久性を有し、なおかつ高濃度のα−ヒドロキシ酸［II］を蓄積する能力を有する工業的に有利な微生物の探索を行った。
その結果、バリオボラクス属及びアースロバクター属に属する微生物に目的とする活性を見出した。さらに該反応系に、一般式［III］：Ｍm（ＣＮ）n（式中、Ｍは水素、アンモニウム又は金属イオンを表し、m、nは１−３の整数を表す。）で示されるシアン化物を添加することによって、酵素活性が改善されることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、α−ヒドロキシニトリル［Ｉ］を微生物の作用により加水分解して、α−ヒドロキシ酸［II］に変換するα−ヒドロキシ酸［II］の製造法において、α−ヒドロキシニトリル［Ｉ］及び／又はα−ヒドロキシ酸［II］に対する濃度耐性及び耐久性を有する微生物によりα−ヒドロキシ酸［II］を水性溶媒中に生成蓄積させ、これを採取すること並びに該反応系にシアン化物を添加することを特徴とするα−ヒドロキシ酸［II］の製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する微生物は、本発明の目的を達成する程度にα−ヒドロキシニトリル又はα−ヒドロキシ酸に対して濃度耐性を有するとともに長時間活性が持続する耐久性を有するものであれば特に制限はない。かかる微生物としては、バリオボラクス  パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＩＡＭ１２３７４及びアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４２４）が挙げられる。これらの微生物のうち、バリオボラクス  パラドキサスＩＡＭ１２３７４は東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ）より容易に得ることができる。またアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４は、本発明者らによって自然界から新たに分離され次の様に寄託されている。
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２９（微工研菌寄第Ｐ−１５４２４より移管）
寄託日：１９９６年２月６日に国内寄託し１９９７年２月２０日に国際寄託移管
寄託場所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
又、アースロバクター  ＮＳＳＣ１０４の菌学的性質は以下の通りである。
形態                          多形性桿菌
グラム染色性                  ＋
ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓサイクル  ＋
芽胞                          −
運動性                        −
細胞壁のジアミノ酸            リジン
酸素に対する態度              好気的
オキシダーゼ                  −
カタラーゼ                    ＋
ＤＮＡの分解                  ＋
ゼラチンの液化                ＋
デンプンの分解                ＋
カゼインの分解                ＋
ビタミン要求性                −
グリコリル試験                −（アセチル型）
キノン系                      ＭＫ−９（Ｈ２）
細胞壁の糖組成
ガラクトース                  ＋
グルコース                    ＋
以上の菌学的性質を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８６）に基づいて検索した結果、ＮＳＳＣ１０４株はアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する菌株と同定された。この菌株は上記寄託番号で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
次に、本発明の具体的な実施態様を述べる。
本発明に用いられる微生物の培養は、酵素誘導物質、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地で行われる。酵素誘導物質としては、イソブチロニトリル等のニトリル化合物、ε−カプロラクタムなどの環状アミド化合物等が使用される。炭素源としてはグルコース等の炭水化物、エタノール等のアルコール類、有機酸その他が適宜用いられる。窒素源としては、アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩その他が用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、鉄イオン、その他が必要に応じて使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸など及びこれらを含有するコーンスチープリカー、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、その他が適宜用いられる。培養は好気的条件下に、ｐＨ６ないし９、温度２５ないし３７℃の適当な範囲に制御しつつ行えばよい。
本発明に用いられる微生物による加水分解反応は、上記のように培養した菌体を採取し、必要に応じて固定化菌体、粗酵素、固定化酵素等の菌体処理物を調製し、水性溶媒中でα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］と接触させることによって行われる。菌体又は酵素を固定化する場合は担体結合法、包括法等の通常行われる固定化技術を適用できる。粗酵素を調製する場合は、菌体を超音波、高圧ホモジナイザー等によって破砕した後に、硫安塩析、クロマトグラフィー等の通常行われる酵素精製技術が適用できる。菌体は乾燥重量に換算して０．０１〜１０重量％の濃度で使用され、反応終了後は濾過、遠心分離または限外濾過膜濃縮法によって回収されて繰り返し加水分解反応に使用できる。水性溶媒としては、水、緩衝剤等の塩類又は有機溶媒を含む水溶液が挙げられるが、これらは二相に分離していてもよい。
本発明で用いられる一般式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮで表されるα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］のＲは、水素原子、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルキル基、置換基を有してよいＣ2〜Ｃ6のアルケニル基、置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルコキシル基、置換基を有してよいアリール基、置換基を有してよいアリールオキシ基、又は置換基を有してよい複素環基を示す。
具体的には、水素原子、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ1〜Ｃ6アルキル基、メチルチオメチル、１−メチルチオエチル、２−メチルチオエチル、１−メチルチオプロピル、２−メチルチオプロピル、３−メチルチオプロピル、１−メチルチオブチル、２−メチルチオブチル、３−メチルチオブチル、４−メチルチオブチル、６−メチルチオヘキシル、エチルチオメチル、１−エチルチオエチル、２−エチルチオエチル、１−エチルチオプロピル、２−エチルチオプロピル、３−エチルチオプロピル、１−エチルチオブチル、２−エチルチオブチル、３−エチルチオブチル、４−エチルチオブチル、プロピルチオメチル、１−プロピルチオエチル、２−プロピルチオエチル、１−プロピルチオプロピル、２−プロピルチオプロピル、３−プロピルチオプロピル、１−メチルチオイソプロピル、１−エチルイソプロピル、１−プロピルチオブチル、２−プロピルチオブチル、３−プロピルチオブチル、４−プロピルチオブチル、プロピルチオメチル、１−プロピルチオエチル、２−プロピルチオエチル、１−イソプロピルチオプロピル、２−イソプロピルチオプロピル、３−イソプロピルチオプロピル、１−イソプロピルチオブチル、２−イソプロピルチオブチル、３−イソプロピルチオブチル、４−イソプロピルチオブチル等のＣ1〜Ｃ6アルキルチオＣ1〜Ｃ6アルキル基、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、１−ヒドロキシイソプロピル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル等のヒドロキシＣ1〜Ｃ6アルキル基、カルボキシメチル、２−カルボキシエチル、１−カルボキシエチル、３−カルボキシプロピル、２−カルボキシプロピル、１−カルボキシプロピル等のカルボキシＣ1〜Ｃ6アルキル基、カルバモイルメチル、１−カルバモイルエチル、２−カルバモイルエチル、１−カルバモイルプロピル、２−カルバモイルプロピル、３−カルバモイルプロピル等のカルバモイルＣ1〜Ｃ6アルキル基、メルカプトメチル、１−メルカプトエチル、２−メルカプトエチル、１−メルカプトプロピル、２−メルカプトプロピル、３−メルカプトプロピル等のメルカプトＣ1〜Ｃ6アルキル基、カルバミジノメチル、１−カルバミジノエチル、２−カルバミジノエチル、１−カルバミジノプロピル、２−カルバミジノプロピル、３−カルバミジノプロピル等のカルバミジノＣ1〜Ｃ6アルキル基、ベンジル、２−クロロベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、３−ニトロベンジル、４−ヒドロキシベンジル、α−メチルベンジル、α、α−ジメルベンジル等の置換基を有してもよいＣ1〜Ｃ6アラルキル基、３−インドリルメチル、２−インドリルメチル、２−（３−インドリル）エチル、１−（３−インドリル）エチル、２−インドリルメチル、２−（２−インドリル）エチル、１−（２−インドリル）エチル、４−イミダゾメチル、２−イミダゾメチル、１−（４−イミダゾ）エチル、２−（４−イミダゾ）エチル等の複素環で置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル基、ビニル、プロペニル、イソプロペニル���アリル、１−クロロアリル、２−クロロアリル、クロチル等の置換基を有してもよいＣ2〜Ｃ6のアルケニル基、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、トリフルオロメトキシ等の置換基を有してよいＣ1〜Ｃ6のアルコキシル基、フェニル、２−クロロフェニル、ｐ−トリル、３−ニトロフェニル、４−シアノフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル等の置換基を有してよいアリール基、フェニルオキシ、２−クロロフェニルオキシ、ｐ−トリルオキシ、３−ニトロフェニルオキシ、α−ナフチルオキシ、β−ナフチルオキシ等の置換基を有してよいアリールオキシ基、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−クロロ−３−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−フリル、３−フリル等の異種原子として、窒素、酸素、硫黄原子を少なくも一種含む３〜７員の複素環基を挙げることができる。
より具体的なα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］としては、ラクトニトリル、マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル等が挙げられる。
これらのα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］は、０．１〜５０重量％の濃度で反応に使用され、必要ならば反応の間逐次添加されてもよい。反応液のｐＨは適当な緩衝剤もしくは酸とアルカリによって５〜１１の間に保てばよい。反応の温度は４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃に保てばよい。
本発明で用いられる一般式［III］で表されるシアン化合物としては、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化カルシウム、シアン化マグネシウム、シアン化タリウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。シアン化物は、通常、０．４〜１０００ｍＭ、好ましくは４〜５００ｍＭの範囲で使用され、必要ならば反応の間逐次添加されてもよい。
かくして６時間ないし１２０時間で添加されたα−ヒドロキシニトリル［Ｉ］に対応するα−ヒドロキシ酸［II］がアンモニウム塩として１５重量％以上の高濃度で蓄積される。反応に用いた菌体は、実質的な活性低下なしに、繰り返し加水分解反応に使用することができる。
生成物は、濃縮、抽出などの常法によって分離精製することができ、必要ならば酸性条件下での有機溶媒抽出、熱分解等によってアンモニアと分離することができる。生成物であるα−ヒドロキシ酸［II］としては、乳酸、マンデル酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸などが挙げられる。
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に述べる。
（実施例１）
０．３％肉汁、０．５％ペプトン及び０．５％食塩を含む培地２ｍｌを試験管に、下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れ、各々１２１℃で１５分間滅菌した。バリオボラクス  パラドキサス  ＩＡＭ１２３７４株を２ｍｌの試験管に一白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、０．２ｍｌをバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに３日間３０℃で振盪培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、乾燥重量に換算して１．０重量％の菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを終濃度１６０ｍＭになるように添加し、３０℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加後１２時間毎に同量の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを９回繰り返し追加し、総計１２０時間の反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、キャリア：アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝２０／８０／０．１）を用いて定量した結果、２５重量％の２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩の蓄積を確認した。（収率９８％）
酵母エキス              ０．５％
グリセロール            ０．５％
リン酸一カリウム        ０．１％
リン酸二カリウム        ０．１％
食塩                    ０．０２％
硫酸マグネシウム７水塩  ０．０２％
ε−カプロラクタム      ０．５％
ｐＨ７．２（２Ｎ苛性ソーダで調整）
（実施例２）
０．３％肉汁、０．５％ペプトン及び０．５％食塩を含む培地２ｍｌを試験管に、下記の組成の培地２０ｍｌを１００ｍｌ容量のバッフル付き三角フラスコに入れ、各々１２１℃で１５分間滅菌した。アースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株を２ｍｌの試験管に一白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、０．２ｍｌをバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに５日間３０℃で振盪培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、乾燥重量に換算して０．６重量％の菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次にラクトニトリルを終濃度１２４ｍＭになるように添加し、３０℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加後５時間毎に同量のラクトニトリルを２０回繰り返し追加し総計１００時間の反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、キャリア：アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝５／９５／０．１）を用いて定量した結果、２３重量％の乳酸アンモニウム塩の蓄積を確認した。（収率９３％）
コーンスチープリカー      １．０％（別滅菌）
スクロース                １．０％（別滅菌）
リン酸一カリウム          ０．１％
リン酸二カリウム          ０．１％
食塩                      ０．０２％
硫酸マグネシウム７水塩    ０．０２％
硫酸第一鉄                ０．００１％（別滅菌）
ε−カプロラクタム        ０．５％
ｐＨ７．２（２Ｎ苛性ソーダで調整）
（実施例３）
実施例２と同様にして調製したアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株菌体を乾燥重量に換算して４重量％になるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを終濃度２００ｍＭになるように添加し、３０℃で緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。添加後１時間毎に同量の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを７回繰り返し追加し、さらに１．５時間毎に８回追加して総計１９時間の反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を実施例１と同様に定量した結果、４９重量％の２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム塩の蓄積を確認した。（収率９６％）
（実施例４）
実施例２と同様にして調製したアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株菌体を乾燥重量に換算して３．２重量％になるように蒸留水に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを、菌体乾燥重量１ｇ当たり０．４６ｇ／ｈｒの添加速度で連続的に添加し、０．５Ｍアンモニア水でｐＨ７．４〜７．６に調整しながら３０℃で２０時間の加水分解反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体を４０倍重量の蒸留水で３回洗浄した後、１回目と同量の蒸留水に再懸濁し、２回目の反応に用いた。２回目の反応、菌体回収及び菌体洗浄も１回目と同様に行った。このような反応の反復を１０回行い、各反復回毎の遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を実施例１と同様に定量した。結果を以下に示す。
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（実施例５）
実施例２と同様にして調製したアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株菌体を乾燥重量に換算して５重量％になるように、０．１Ｍシアン化ナトリウム水溶液に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを連続的に添加し、ｐＨコントローラーでｐＨ７．４〜７．６に調整しながら３０℃で１０時間の加水分解反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる乳酸の濃度を実施例２と同様に定量した。比較としてシアン化ナトリウム無添加の場合の反応もおこなった。結果を以下に示す。
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（実施例６）
実施例２と同様にして調製したアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株菌体を乾燥重量に換算して５重量％になるように、０．１Ｍシアン化カリウム水溶液に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを連続的に添加し、ｐＨコントローラーでｐＨ７．４〜７．６に調整しながら３０℃で１０時間の加水分解反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を実施例１と同様に定量した。比較としてシアン化カリウム無添加の場合の反応もおこなった。結果を以下に示す。
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（実施例７）
実施例２と同様にして調製したアースロバクター  ＮＳＳＣ１０４株菌体を乾燥重量に換算して５重量％になるように、４０ｍＭシアン化水素水溶液に懸濁した。次に２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを連続的に添加し、ｐＨコントローラーでｐＨ７．４〜７．６に調整しながら３０℃で１０時間の加水分解反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を実施例１と同様に定量した。比較としてシアン化水素無添加の場合の反応もおこなった。結果を以下に示す。
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（参考例）
特開平4-40898に記載されている培養方法並びに加水分解の方法によって、アースロバクターＮＳＳＣ１０４株の培養とその触媒反応を行なった。
（１）培地（単位：Ｗ／Ｖ）
グリセロール        ２％
酵母エキス          ０．３％
リン酸一カリウム    ０．６８％
リン酸二ナトリウム  ０．７１％
硫酸ナトリウム      ０．２８％
塩化マグネシウム    ０．０４％
塩化カルシウム      ０．００４％
硫酸マンガン        ４×１０−４％
塩化鉄              ６×１０−５％
硫酸亜鉛            ３×１０−５％
寒天                １．８％
α−クロルプロピオニトリル  ０．０５％
ｐＨ７．５
（２）培養条件
斜面培地から１白金耳の菌体を採り、蒸気寒天平板培地に塗布し、３０℃で４８時間好気的に培養した。
（３）加水分解反応
寒天平板培地から菌体を採取し、遠心分離によって菌体を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。沈殿菌体をＯＤ630が２５になるように１．５ｍＬの同様の緩衝液に再懸濁し、終濃度１００ｍＭの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを添加し、２５℃で２０時間、振とうしながら反応を行なった。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、遠心上清に含まれる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、キャリア：アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝２０／８０／０．１）を用いて定量した。２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の濃度は０．０１ｍＭだった。
アースロバクターＨＲ４株は、上記の培養方法並びに加水分解反応において５５ｍＭの２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を蓄積したことが、特開平4-40898号に記載されている。したがって、アースロバクターＮＳＳＣ１０４株はアースロバクターＨＲ４株とは明らかに異なる菌株である。
（発明の効果）
本発明によれば、α−ヒドロキシニトリル［Ｉ］及び／又はα−ヒドロキシ酸［II］に対する濃度耐性並びに活性が長時間持続する耐久性を有する微生物を用いることにより、α−ヒドロキシ酸［II］が高濃度に蓄積され、なおかつ菌体が繰り返し使用できるので、効率的にα−ヒドロキシ酸［II］を製造することが可能である。また反応系にシアン化物を添加することによりさらに効率的にα−ヒドロキシ酸［II］を製造することが可能である。
以上説明したように、本発明は、α−ヒドロキシニトリル［Ｉ］及び／又はα−ヒドロキシ酸［II］に対する濃度耐性並びに活性が長時間持続する耐久性を有する微生物を用いることにより、α−ヒドロキニトリルからα−ヒドロキシ酸［II］を工業的に有利に得る製造法である。従ってその産業的意義は大きい。