(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の分析物を系列的にプロセシングするための装置であって、該装置は、
微粒子の集団が単層の平面アレイに配置されたフローチャンバーであって、各微粒子に係留された分析物を有する、フローチャンバー、
該各微粒子に係留された分析物が系列的にプロセシング試薬に曝露されるように、１つ以上のリザーバーからプロセシング試薬をフローチャンバーに系列的に送達するための流体手段、および
該微粒子の各々からの光学シグナルのシーケンスを検出するための検出手段であって、該シーケンスの各光学シグナルが、プロセシング試薬と該各微粒子に係留された該分析物との間の相互作用の指標である、検出手段、を備える、装置。
【請求項２】
前記フローチャンバーが軸を有し、そして該軸に沿って連続して、入口、平面キャビティ、ダム、および出口を、前記プロセシング試薬が該入口を通って該フローチャンバーに進入し、そして該軸の方向に該平面キャビティを通って該出口へと流動するように備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記フローチャンバーの前記平面キャビティがさらに光学的に透過性の天井および床を有し、該光学的に透過性の天井および床が互いに平行であり、かつ該床が複数の平行な隆起を有し、該平行な隆起が該フローチャンバーの前記軸に対して平行に配置され、そして該平行な隆起が、前記微粒子が該平面キャビティ中で該平行な隆起の間に列を形成するように間隔を空けている、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記検出手段がさらに、光学列であって、前記微粒子の前記平面アレイからの前記光学シグナルの画像を、該光学シグナルのデジタル画像を発生させるための電気光学検出器上に焦点を合わせる光学列と、該微粒子の該平面アレイの複数のデジタル画像を記録するための記録手段とを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記検出手段がさらに、シグナル追跡手段であって、前記微粒子の各々からの前記光学シグナルを前記デジタル画像の各々において相関させて、該微粒子の各々について、該光学シグナルのシーケンスを形成する、シグナル追跡手段を備える、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記電気光学検出器がＣＣＤカメラである、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記分析物がＤＮＡであり、そしてここで前記光学シグナルが蛍光シグナルである、請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般に、固相支持体上での大規模並行反応を実行するためのシステムおよび装置に関し、そしてより詳細には、微粒子のアレイ上での反応のモニターおよび実行のためのシステムおよび装置に関する。
背景
複雑な化学的および生物学的システムの理解および分析に対する要求は、分析物プロセシングの並行化および小型化を利用する分析技術の開発を導いてきた。例えば、Graberら、Current Opinion in Biotechnology，9：14-18（1998）；Fodorら、Nature，364：555-556（1993）；Meier-Ewertら，Nature，361：375-376（1993）；Taylorら，Nucleic Acids Research，25：3164-3168（1997）；Garnerら，Bio Techniques，14：112-115（1993）；Lamら，Nature，354：82-84（1991）；Ohlmeyerら，Proc．Natl．Acad．Sci．，90：10922-10926（1993）；DeRisiら，Science，278：680-686（1997）；Wodickaら，Nature Biotechnology，15：1359-1367（1997）；など。
これらの技術の多くは、分析物の合成のため、あるいは次の分析のために分析物を捕捉するために、微粒子を利用する。例えば、Lamら（前掲）；Benkovicら、国際特許出願PCT/US95/03355；Gavinら、国際特許出願PCT/EP97/02039；；Brennerら、国際特許出願PCT/US96/09513など。異なるタイプの微粒子の特性は広範囲に変化し得るが、微粒子は、一般に、最小限の試薬および／またはサンプルの消費を伴って、大量の分析物の構築および操作を容易にする。しかし、特定の化学的および／または生化学的分析を実行するために多数（例えば数十個から数十万個）の微粒子を取り扱いおよび操作することは、多くの困難を生じさせる。この困難には、個々の微粒子上に検出のために十分なシグナルが生じるかどうかということ、プロセスの複数の工程を通してどのように個別の微粒子を追跡するかということ、圧力または流動条件下での微粒子の機械的強度、分析プロセスの工程を実行するために微粒子に試薬を均一に送達する能力、微粒子および／または試薬の凝集または他の不適切な相互作用が生じるかどうかということ、分析物および／またはプロセシング試薬が容器の壁に吸着する程度、タンパク質試薬または分析物の変性が試薬の分配および接近を混乱させるかどうかということ、隣接の微粒子が相互作用して、例えばシグナルを劣化または不明瞭化させるか、あるいは試薬のアクセスを阻害するかどうかということ、などを包含する。
これらの困難からみて、複数の固相支持体（例えば微粒子の集団）の取り扱いおよびプロセシングのためのシステムおよび装置を提供することが望ましい。このようなシステムおよび装置が、一連のいくつかのプロセシングおよび／または分析工程を通じて、別々の微粒子に係留された複数の分析物の追跡および分析を可能とするならば、これはとくに望ましい。
発明の要旨
従って、本発明の目的としては、試薬を別々の微粒子に係留された分析物の集団に系列的に送達するためのシステムおよび装置を提供すること；平面アレイに配置された微粒子の表面上のプロセシング試薬および分析物の相互作用を同時にモニターするための装置を提供すること；光学シグナルを検出するための装置を提供すること（このシグナルは平面アレイに配置された微粒子の表面上でのプロセシング試薬と分析物との相互作用により、あるいはその結果として生じる）；複数の光学シグナルを検出するための装置を提供すること（このような複数のシグナルの各々は同一の微粒子の表面で、プロセシング試薬とこのような微粒子の表面に係留された分析物との間の相互作用の結果として生じる）；緊密に充填された平面アレイとしてフローチャンバー中に配置された微粒子の集団の中の個別の微粒子の位置を同時に追跡するための装置を提供すること；およびフローチャンバー中の平面アレイに配置された微粒子に係留したポリヌクレオチドの集団のヌクレオチド配列を同時に分析するためのシステムおよび装置を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、これらおよび他の目的を、微粒子の集団を平面アレイに配置するためのフローチャンバー；プロセシング試薬を１つ以上の試薬リザーバーからフローチャンバーに系列的に送達する流体手段；および集団の各微粒子からの光学シグナルのシーケンスを検出するための検出手段を含む装置で達成する。好ましくは、光学シグナルのシーケンスは核酸配列分析のような多段階分析プロセスの結果として発生する。
ひとつの局面では、本発明は分析物の集団を同時にモニターするためのシステムを提供し、このシステムは本発明の装置と、分析物を保持する微粒子と、微粒子が平面アレイに配置されたときの、その画像、および／またはそれによって発生する光学シグナルのプロセシングのためのソフトウェア手段とを含む。好ましくは、フローチャンバーは試薬送達のサイクルの間、微粒子の動きを制限するための拘束手段を含む。
他の局面では、本発明はポリヌクレオチドの集団のヌクレオチド配列を同時に分析するためのシステムを包含する。集団中の各種類のポリヌクレオチドのコピーを、ロードされた微粒子の集団が形成されるように、１つ以上の微粒子の上にソートおよび係留する。ロードされた微粒子をフローチャンバー中で平面アレイに配置する。このフローチャンバーを通して、プロセシング試薬がロードされた微粒子に、１つ以上の試薬リザーバーから流体手段によって系列的に送達される。微粒子上でのプロセシング試薬とポリヌクレオチドとの相互作用によって発生する、あるいはその結果として生じる光学シグナルを検出手段によって画像化する。好ましくは、分折が異なる微粒子上の各ポリヌクレオチドの一部のヌクレオチド配列を決定する工程を包含する場合、例えば、Albrechtら、国際特許出願PCT/US97/09472に記載のような大規模並行シグネチャー配列決定（massively parallel signature sequencing（MPSS））分析が利用される。
【図面の簡単な説明】
図１aは、cDNA分子のような配列決定のための分析物分子がロードされた微粒子の平面アレイを観察するための、フローチャンバーならびに流体システムおよび検出システムの略図である。
図１bは、フローチャンバーのための好適なホルダーの略図である。
図２aは、フローチャンバーの左右対称断面図である。
図２bは、フローチャンバーの上面図である。
図２cは、フローチャンバーにロードされた微粒子を示す。
図３aから３dは、フローチャンバーのための微粒子拘束手段を模式的に示す。
図４は、微粒子をフローチャンバーにロードするための装置の略図である。
図５は、本発明で使用するための流体システムの略図である。
図６aおよび６bは、アレイにおける微粒子中心を決定するためのトップライトおよびバックライトアプローチを模式的に示す。
図7は、データプロセシングのための微粒子への画素の割り当てを模式的に示す。
図８は、本発明のシステムの操作をまとめたフローチャートである。
定義
オリゴヌクレオチドタグに関して本明細書中で使用する「相補物」または「タグ相補物」とは、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして、完全に適合した二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖をもたらす実施態様において、オリゴヌクレオチドタグは、２本鎖または１本鎖のいずれかであるように選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補物」とは、１本鎖オリゴヌクレオチドタグの２本鎖相補物または２本鎖オリゴヌクレオチドタグの１本鎖相補物のいずれかを含むことが意味される。
本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」とは、規則的なパターンのモノマー対モノマー相互作用（例えば、ワトソン・クリック型塩基対、塩基の積み重なり、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型塩基対など）のために標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変されたモノマーまたは結合（デオキシボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー形態、ペプチド核酸（PNA）などを含む）の直鎖状オリゴマーを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結されて、サイズが数モノマー単位（例えば、３〜４）から数十モノマー単位（例えば、40〜60）の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字配列（例えば、「ATGCCTG」）により示されるときはいつでも、ヌクレオチドは、他に言及されない限り、左から右に5’→3’の順であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは４つの天然ヌクレオチドを含むが；それらはまた、非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。天然または非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合、例えば、酵素によるプロセシングが要求される場合に、通常、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされることは、当業者に明らかである。
二重鎖に関して「完全にマッチした」とは、二重鎖を構成するポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖における全てのヌクレオチドがもう一方の鎖におけるヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対形成を受けるように、他の鎖と２本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、ヌクレオシドアナログ（例えば、2-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドであるデオキシイノシンなど）の対形成を含み、これは使用され得る。三重鎖に関して、この用語は、三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第３の鎖からなることを意味し、第３の鎖における全てのヌクレオチドは、完全にマッチした二重鎖の塩基対とフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合を受ける。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「ミスマッチ」とは、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレットが、ワトソン・クリックおよび／またはフーグスティーンおよび／または逆フーグスティーン結合を受けないことを意味する。
本明細書中で使用する「ヌクレオシド」とは、例えば、KornbergおよびBaker，DNA Replication，第２版（Freeman，San Francisco，1992）に記載されるような、天然ヌクレオシド（2’-デオキシおよび2’-ヒドロキシ形態を含む）を含む。ヌクレオシドに関する「アナログ」とは、特異的ハイブリダイゼーションが可能であるという唯一の条件付きで、例えば、Scheit，Nucleotide Analogs（John Wiely，New York，1980）；UhlmanおよびPeyman，Chemical Reviews，90：543-584（1990）などに記載される、改変塩基部分および／または改変糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このようなアナログとしては、結合特性を増強する、複雑性を低減する、特異性を増加させるなどのために設計された合成オリゴヌクレオシドが挙げられる。
ポリヌクレオチドに関して、本明細書中で使用する「配列決定」または「ヌクレオチド配列を決定すること」は、ポリヌクレオチドの部分的配列情報ならびに完全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチドについての配列比較、フィンガープリンティング、および同様のレベルの情報、ならびに標的ポリヌクレオチドにおけるヌクレオシド（通常、各ヌクレオシド）の明確な同定および順序付けを含む。この用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４つの型のヌクレオチドのうち１つ、２つ、または３つの同定、順序付け、および位置の決定を含む。例えば、いくつかの実施態様において、配列決定は、標的ポリヌクレオチド「CATCGC．．．」内での１つの型のヌクレオチド（例えば、シトシン）の順序付けおよび位置を同定することによりもたらされ得、その結果、この配列は、バイナリコード（例えば、「C-（Cでない）-（Cでない）-C-（Cでない）-C．．．」については「100101．．．」など）として示される。
ポリヌクレオチドの集団に関して、本明細書中で使用する用語「複雑性」は、集団に存在する異なる種の分子の数を意味する。
発明の詳細な説明
本発明のシステムおよび装置は、重複コピーの集団中で粒子状の固相支持体に係留され得る分子の分析に特に適用可能である。すなわち、本発明によれば、集団の各アナライトは少なくとも１つの微粒子上に、行われる分析のタイプに十分な量で存在する。例えば、微粒子上でコンビナトリアルに合成されたペプチドが可溶性レセプタータンパク質に対して安定な複合体を形成するものの検出のためにスクリーニングされる場合、微粒子の表面上への結合に利用可能なペプチドの数は結合事象が起こったときに検出可能なシグナルを発生するために十分多数でなければならない。もちろん、当該分野に周知の多くのさらなる因子がさらなる設計の制約を提示する。例えば、光学シグナルを発生するためのシステムの性質、レセプターの濃度、pH、塩濃度、微粒子表面上のペプチドの密度および接近可能性、使用される溶媒系などである。本発明の装置での使用に特に適切なアナライト集団は、微粒子支持体上で合成されるコンビナトリアルなライブラリ（例えば、Lamら，Chem．Rev．，97：411-448（1997）；またはDowerら，米国特許第5,708,153号に開示のようなもの）、および微粒子支持体上にソートされるポリヌクレオチドライブラリ（例えば、Brenner（前掲）に開示のようなもの）を包含する。
図１aは、蛍光シグナルを検出するための本発明の実施態様の模式図である。入口（102）、出口（104）、および平面キャビティ（106）を有するフローチャンバー（100）は、微粒子を平面アレイにおいて保持し、平面アレイから微粒子上のアナライトおよび／または反応物から発生する光学シグナル（108）が収集および画像化され得る。フローチャンバー（100）は、流体システム（112）および検出システム（114）と作動的に連動し（operationally associated with)、その結果、流体の送達およびシグナルの収集がコンピュータ（116）の制御下となる。好ましくは、光学シグナルは顕微鏡（118）で収集され、そしてソリッドステート画像化デバイス、例えば電荷結合素子（CCD）（120）上で画像化され、これは、微粒子アレイの物理的画像のデジタル画像を個別の微粒子を識別するのに十分な分解能で生じさせ得る。蛍光シグナルについては、検出システム（114）は通常、光学シグナル（108）のための適切な帯域通過フィルタ（122）、光源（126）によって発生する励起ビーム（128）のための帯域通過フィルタ（124）、および他の標準的な構成成分を備える。図示されるように、落射型（epiillumination）に構成されている従来の蛍光顕微鏡が好ましい。適切な蛍光顕微鏡の選択のための多くのガイダンスが当該分野に存在する。例えば、WangおよびTaylor編、Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture，パートAおよびB、Methods in Cell Biology，第29巻および第30巻（Academic Press，New York，1989）。
本発明の重要な特徴はフローチャンバー（100）である。フローチャンバー（100）の本体（130）は好ましくは入口（102）、出口（104）、および平面キャビティ（106）から構成され、これらは標準的な微細加工技術（例えば、Ekstromら、国際特許出願PCT/SE91/00327；Brown，米国特許4,911,782号；Harrisonら、Anal．Chem．64：1926-1932（1992）など）によって形成される。透明板（132）が本体（130）に密着して（sealingly）取り付けられ、作動的な（operational）フローチャンバー（100）を形成する。本体（130）はガラス、ケイ素、ポリエチレン、ポリエステル、テフロン、他のプラスチックなどを包含するいくつかの異なる材料の任意のものから構築され得る。好ましくは、透明板（132）はガラスまたは石英である。そして本体（130）および透明板（132）がガラスまたはケイ素である場合、透明板（132）は好ましくは本体（130）にアノード結合（例えば、Pomerantz、米国特許第3,397,279号）によって取り付けられる。フローチャンバーの重要な機能は、i）微粒子の集団を一連のプロセシング工程の間中、実質的に固定化された平面アレイ、すなわち単層に保持すること、ii）プロセシング試薬がプロセスの各工程の間中、各微粒子に接近し得ることを保証すること、およびiii）プロセシング試薬の使用量を最少化することを包含する。必要とされる固定化の程度は異なる実施態様で異なり得る。一般に、微粒子が平面アレイの中で運動するほど、微粒子の位置を画像処理ソフトウェアにより追跡するコンピュータおよび測定の負荷が増す。従って、画像処理ソフトウェアの使用と、微粒子の運動を拘束するための物理的および／または化学的な手段との間に、設計のトレードオフが存在する。好ましくは、物理的および／または化学的手段を使用して、フローチャンバー（100）の中の微粒子の平面アレイ内の微粒子の運動を拘束する。このような手段は本明細書において「運動拘束手段」と呼ばれる。最も好ましくは、物理的または機械的な運動拘束手段が使用される。
好ましくは、微粒子はフローチャンバー（100）の中に緊密に充填された平面アレイにおいて配置される。本明細書において使用される、「緊密に充填された」は平面アレイについて言及するときに、平面アレイの単位面積当たりの微粒子の数が等面積の六方晶系アレイ中の微粒子の数の少なくとも80パーセントであることを意味するか、あるいは隣接する微粒子の中心間の平均距離が２つの微粒子の直径未満であるかのいずれかを意味する。本明細書で使用される、微粒子の「六方晶系」アレイは、微粒子の平面アレイであって、図３aに示すように、アレイ中のどの微粒子も少なくとも６つの他の隣接する微粒子と接するようなアレイを意味する。
好適な実施態様のフローチャンバー（100）のさらなる特徴は、図２aから２cに図示される。図２aはフローチャンバー（100）を二分する長軸面に沿った断面図である。同じ図をより抽象的に示したものを図２cに示す。両図において、入口（102）は平面キャビティ（106）および出口（104）と流体連通する。アナライトを担持する微粒子（200）は入口（102）に進入し、そして懸濁バッファーによって平面キャビティ（106）に運搬され、ここで微粒子はダム（202）に対して充填されることになる。ダム（202）は微粒子がフローチャンバーから出口（104）を通じて外に出ることを妨げる。構造的に、ダム（202）は平面キャビティ（106）の垂直寸法の急激な減少によって形成され得る。好ましくは、平面キャビティ（106）の垂直寸法（204）は、微粒子（200）がダム（202）に対して充填されたとき、微粒子（200）が平面（すなわち単層）に拘束されるように選択される。より好ましくは、垂直寸法（204）は、使用される微粒子の直径の約120パーセントから150パーセントの間で選択される。例えば、5μmの直径を有する微粒子が使用されるとき、垂直寸法（204）は7μmであり得る。磁性微粒子は、磁場を印加して、微粒子が平面キャビティ（106）の天井または床に誘引されるようにすることによって、平面に拘束され得、かつ運動から拘束され得る。平面キャビティ（106）の幅（206）は重大な寸法ではない。しかし、利便性および効率のために、幅（206）は検出システム（114）のシグナル収集領域の寸法に対応するように選択され得る。そのような領域は図２bで１からkで示され、これは本明細書において「タイル」と称される。すなわち、微粒子で占有される平面キャビティ（106）の領域は、重複しない領域（「タイル」と称される）に分割され得、これは占有領域全体をカバーする。図２bは図２aのフローチャンバーの平面図であり、これもまた入口（102）、平面キャビティ（106）、ダム（202）、および出口（104）を示し、これはフローチャンバー（100）の軸（217）に沿って連続して配置される。
多くの運動拘束手段が、フローチャンバーとの単独または組み合わせのいずれかでの使用のために選択され得る。そのような手段は、微粒子を、活性化されて架橋され得る微量の化学反応種と共にロードすること；物理的または機械的構造（例えば隆起（ridge））をフローチャンバー内に提供すること；外部磁場により固定化され得る磁気応答性微粒子を提供すること；アナライト含有集団の後にフローチャンバー中にロードされ、アナライト含有集団をダム（202）に対して押しつける第２の微粒子集団を提供することなどを包含する。核酸アナライトと共に使用される化学反応種の例はSummertonら、米国特許第4,123,610号；Gamperら、J．Mol．Biol．，197：349-362（1987）；Hearst，Ann．Rev．Phys．Chem．39：291-315（1988）；Pielesら、Nucleic Acids Research，17：8967-8978（1989）などに開示される。
好ましくは、微粒子の運動は、フローチャンバーの軸（217）に平行に（すなわち試薬の流れ方向に平行に）走る複数の隆起を含む平面キャビティ（106）を備えるフローチャンバーを提供することによって拘束され、そのため微粒子は列に配置されるようにされ、この列は一列、または図３aおよび３bに示すように数微粒子の幅であり得る。個々の選択はいくつかの因子に依存し得、この因子は、所望される固定化の程度、フローチャンバーを構築するために使用された製造技術によって負わされる拘束、所望される試薬の接近量、流動抵抗または背圧が許容され得る程度などを包含する。図３aおよび３bは、平行な隆起間の2つの可能な距離を例示する。図３aでは、距離は微粒子が六方晶系アレイに最密充填可能であるように選択され、そして図３bでは、距離は、充填の効率はそれより低いが、微粒子表面への試薬の接近は増加するように選択される。図３cおよび３dは、それぞれ図３aおよび３bの微粒子配置を示すフローチャンバーの軸方向図である。
酵素的プロセスを利用するようないくつかの実施態様では、フローチャンバー（100）の内表面は不動態化される。すなわちそのような表面が酵素に関して不活性および／または非吸着的となるように処理される。処理のタイプはプロセスに用いられる酵素の感度、および表面に対するその親和性に依存する。表面処理は、シラン化（silanization）、例えば市販の試薬でのシラン化（Pierce，Rockford，IL）；および／またはポリ-a-アラニン、ポリグリシン、ポリアデニル酸、ポリマレイミド、ポリビニルピロリドンなどのような種々のブロッキングポリマーの吸着（例えば、Shoffnerら、Nucleic Acids Research，24：375-379（1996））を包含する。好ましくは、フローチャンバー（100）のガラスの内表面は、アリルメタクリレートのような中性のコーティングで、Sandovalら、米国特許第5,326,738号（これは参考として援用される）に開示の技術を用いて共有結合的にコートされる。
図１bは、ホルダー（140）とホルダー（142）との間に据え付けられたフローチャンバー（100）を例示し、これらのホルダーは各々、入口（102）を入口管（144）に、そして出口（104）を出口管（146）に密着して接続する。好ましくは、ホルダー（140）は回転バルブ（図示せず）を備え、これはアクチュエータ（148）によって作動され、入口管（144）を通る流体の流れを入口（102）または廃液ライン（150）へと切り換える。このようなバルブは、次のプロセス工程の開始の前にフローチャンバー（100）を通過させなければならない、先の工程からのプロセス試薬の量を最小化する。すなわち、このような回転バルブは、入口管（144）の中の試薬を廃液へと切り換えて、実行しているプロセスの次の工程に必要とされるプロセシング試薬で置き換えるのを可能にする。好ましくは、DNA分析での使用のためには、ペルチエブロック（152）を利用してフローチャンバー（100）内の温度を制御し、そしてフローチャンバー（100）およびペルチエブロック（152）を含む全体の組立物はxyzステージ（154）上に搭載され、このxyzステージ（154）はコンピュータ（116）の制御下にある。
好ましくは、微粒子はホルダー（140）および（142）の取付ならびにプロセシング工程の開始の前にフローチャンバー（100）中にロードされる。図４は微粒子をフローチャンバー（100）中にロードする微粒子ローダーを例示する。フローチャンバー（100）は、ホルダー（400）、（402）、（404）、および（406）の間に搭載される。ホルダー（400）および（402）はフローチャンバー（100）の入口端（101）に密着して締め付け、そしてホルダー（404）および（406）はフローチャンバー（100）の出口端（103）の上に密着して締め付け、その結果、微粒子ローダーを組み立てたときに入口管（408）が出口管（410）に流体連通する。入口管（408）はシリンジ（416）に接続され、これを用いてフローチャンバー（100）を通して流体を駆動させる。ホルダー（400）は円錐形の通路（412）を有するように構築され、この通路はフローチャンバー（100）の入口（102）の直径に適合するように狭くなっている。ホルダー（400）、（402）、（404）、および（406）の組立の後、微粒子の懸濁液を円錐形の通路の中に配置し、その後、取付具（414）をホルダー（400）に密着して接続する。次にシリンジ（416）によって発生する流体圧および流動が、微粒子を平面キャビティ（106）の中に、そしてダム（202）に向かって駆動する。DNAを担持した5μm直径のGMA微粒子を用いる好適な実施態様では、5μLの10万微粒子/μL溶液（TEバッファー、pH8.0、Sambrookら、Molecular Cloning，第2版（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989））を円錐形通路（412）の中に入れ、取付具（414）を取り付け、そしてシリンジ（416）を用いて微粒子を入口（102）を通じて、そして平面キャビティ（106）へと駆動することによって、約50万個の微粒子がフローチャンバー（100）の中にロードされる。ロードした後、ホルダー（400）、（402）、（404）、および（406）をフローチャンバー（100）から取り去り、次にフローチャンバー（100）を図１bに示すような装置の上に搭載する。
好ましくは、プロセス試薬はフローチャンバー（100）に、複雑な分析プロセスのための多数の異なる試薬を取り扱う能力を有する図5に示す流体システムによって送達される。図示された実施態様はDNA配列決定に関連して用いられ、ここでは流体システムは洗浄バッファー、リンス、酵素、ハイブリダイゼーションプローブ、アダプターなどを含む38種までの試薬を収容し得る。好ましくは流体システムの機能は、選択されたプロセシング試薬をフローチャンバー（100）に連続的に計量することである。フローチャンバー（100）の入口（102）はホルダー（140）に密着して接続され、ホルダー（140）は回転バルブ（148に示されるアクチュエータ）（図5には図示されず）を備える。回転バルブの機能は上述している。プロセシング試薬をリザーバーから管を通じてフローチャンバー（100）に移動させるためには、重力送り、加圧送り、およびポンプ（例えば、蠕動ポンプ）、シリンジなどを包含する種々の手段が使用され得る。好ましくは、共通のシリンジポンプ（500）を、所定量のプロセシング試薬をリザーバーから取り出すためと、そのような試薬を所定の流速でフローチャンバー（100）を通じて押出すためとに使用する。コンピュータ（116）の制御下、バルブブロック（502）および回転バルブ（504）に作動的に連動したポンプ（500）は、所定量のプロセシング試薬を、ポンプ（500）のプランジャー（501）の外衝程でリザーバーから試薬を吸い上げることによって、選択されたリザーバーから取り出す。プランジャー（501）の内衝程で、回転バルブ（504）はプロセシング試薬を管（503）からポンプ（500）のリザーバー（505）に向ける。プランジャー（501）の外衝程で、回転バルブ（504）の状態が変化して、プロセシング試薬をリザーバー（505）から入口管（144）に向ける。管（503）は回転バルブ（504）とマニホルド（508）とを接続し、このマニホルド（508）は順次、複数の（5つが図示される）ゼロデッドボリューム（zero dead volume）バルブ（506）のバンクに接続される。ゼロデッドボリュームバルブ（506）は、プロセシング試薬を保持する個々のリザーバーを共通の通路（図5には図示せず）に接続し、この通路はマニホルド（508）に接続するバルブのバンクの各々を通じて延びている。
好ましいゼロデッドボリュームバルブは米国特許第4,558,845号および4,703,913号に記載されており、これらは参考として援用される。リザーバー（514）からのプロセス試薬は、マニホルド（510）によってデッドボリュームバルブのバンクに分配される。プロセス試薬のフローチャンバー（100）への送達を制御するための別のバルブブロックは、米国特許第5,203,368号に開示のバルブマトリクスを含む。
本発明の検出手段（114）の重要な特徴は、個別の微粒子を複数のプロセス工程および／またはサイクルを通じて追跡し続ける能力である。このような追跡に関連して、検出手段（114）は個別の微粒子の光学的特徴を周期的に記録し、この光学的特徴が極めて近似した微粒子中心を提供する。好ましくは、徹照（trans-illumination）型、すなわち「逆光照明型」のフローチャンバー（100）が可能な場合、光学特性は微粒子からの集束したバックライトである。すなわち、図６aを参照すると、バックライト（600）はフローチャンバー（100）を垂直に通過し、ここで微粒子（602）によって焦点面（604）上に集束する。焦点面（604）の画像はこの構成では輝点の場として現れ、ここで各点はその対応する微粒子のほぼ中心に位置する。落射型システムでは、フローチャンバー（100）の上方からの光、すなわち「トップライト（610）」は垂直方向から微粒子（602）に向けられ、ここでトップライトは微粒子の頂部面から散乱する。この構成では、光学特性は微粒子の散乱中心である。従って、画像はこのような頂部照明から得られる散乱中心（612）を含む平面から収集される。集束された逆光照明と同様に、散乱中心の画像は微粒子のおよその中心を容易に決定する便利な方法を提供する。
好ましい画像プロセシングアプローチでは、一旦微粒子中心（700）が決定されたら、画素（702）が、各微粒子（602）で発生する光学シグナルの特性（例えば、強度）を決定するために割り当てられる。微粒子（602）および画素領域のサイズにより、いくつの画素を各微粒子に割り当てるかが決定される。このような割り当てを行うときに重要な因子は、微粒子の（上記のように）算出された中心が幾何学的中心から逸脱しているであろう程度、画像の縁から収集された光学シグナルが偽の情報（例えば重複あるいは隣接した微粒子からのシグナル）を含んでいる程度、微粒子の直径および形状の均一性などを包含する。本発明の好適な装置では、直径５μmの微粒子が使用され、そしてCCD検出器の画素寸法は約0.9μm×0.9μmである。従って、９つの画素が微粒子画像の内部に容易に適合し、どの画素と微粒子画像の縁との間にも少なくとも約１μmのマージンがある。好適な実施態様では、最初の画素は微粒子の計算された中心を囲むように割り当てられる（例えば図７の画素「５」）。その後、さらなる画素（通常、すぐ隣接した画素）が割り当てられる。好ましくは、微粒子の表面でプロセスにより発生する光学シグナルの値は、その微粒子に割り当てられた画素から収集された光学シグナルの平均値である。
好適な実施態様のシステムの一般的な操作を図８のフローチャートにまとめる。分析の開始（800）のときに、係留されたアナライトを有する微粒子をフローチャンバー（100）の中にロードし、これをホルダー140および142に作動的に搭載した。最初の操作は微粒子焦点面の較正（802）である。すなわち、微粒子の散乱中心（すなわち順光照明については、微粒子の頂部）、あるいは逆光照明については微粒子の焦点のいずれかの焦点を最適化する、xyzステージの垂直位置、すなわち「z」位置を決定する。最適化は従来の自動焦点アルゴリズムによって行われ、これは収集された画像内の領域の所定のサンプルから構築される画像コントラスト関数（contrast function）を提供する。例えば、コントラスト関数の連続した値の差異が決定され得るように、コントラスト関数を一連のz位置に関して反復的に評価し得る。これらは差異が所定の閾値を下回ることが見いだされるまで試験され、これがコントラスト関数の最大値とされる。焦点面位置は、画像コントラスト関数を最大化するz位置とされる。このような較正は、１つより多くのタイルが使用されている場合には各タイルについて行われ、その結果、次のタイルに並進（translation）したときにシステムを焦点合わせするのに必要とされる第１のタイルの設定のステージ設定値に対する変化の較正表が構築される。これらの値はコンピュータ（116）に保存される。
較正の後、コンピュータ（116）に作動的に連動した流体コントローラによりプロセス工程を開始（804）する。プロセス工程（804）が完了した後、ステージ設定を調節して、第１のタイルを自動焦点アルゴリズムを用いて焦点に配置する（806）。これは、顕微鏡の対物レンズの焦点面を微粒子のおよそ頂部に配置する。次にステージ設定を調節し（808）、顕微鏡対物レンズの焦点面を図６aおよび６bに例示するように（606）、微粒子のおよそ中心に持ってくる。この再焦点合わせでのステージの移動量は用いられる微粒子の直径に依存する。フィルター（124）および（122）の適切な選択の後、第１のタイルの蛍光イメージを収集し（810）、そしてデータサーバー（812）に移す。平面アレイが不完全なので、蛍光画像を微粒子中心の平面上で収集する。すなわち、平面キャビティ（106）中の微粒子は種々の理由のため、完全な平面アレイで位置していない。例えば、いくつかの微粒子はフローチャンバーへの充填の結果、他のものよりも上に上がっている。微粒子のサイズおよび形状にいくらかの変動がある。そして平面キャビティ（106）の床は平坦ではない場合がある。蛍光画像が収集された後、顕微鏡対物レンズの焦点面を微粒子焦点面に戻し（814）、上述のように微粒子中心を計算する目的で、ここで別の画像を収集する（816）。微粒子中心の画像をデータサーバー（812）に移し、ここでデータプロセッサ（818）が上記のように蛍光画像の画素を各微粒子中心に割り当てる。微粒子中心の画像を収集した後（816）、ステージを移動し、その結果、次のタイルの画像を収集し得る（822）。さらなる微粒子のタイルが存在しない場合（820）、プロセスの次の工程および／またはサイクルを実行する（826）。さらなるプロセス工程がない場合（824）、プロセスを完了し、そして装置を保持モードに置く。
分析の過程で収集される光学シグナルは、吸収および蛍光、化学発光、電気化学発光、または生物発光放出を包含する種々の機構で発生され得る。適切な光学シグナル伝達手段の選択についての広範囲なガイダンスが入手可能である。例えば、Kessler編、Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules（Springer-Verlag，Berlin）；KellerおよびManak，DNA Probes，第2版（Stockton Press，New York，1993）など。好ましくは、プロセシング工程で発生する光学シグナルは蛍光発光である。
微粒子
本発明のシステムの重要な特徴は、アナライトを担持するために微粒子を使用することである。種々の微粒子が特定の用途に応じて使用され得る。一般に、微粒子は試薬ならびに実行されるプロセス工程の化学と適合する材料で構成されなければならず、そして微粒子はその形状およびサイズがプロセス工程の間保持されるように、実質的に機械的に剛性でなければならない。好ましくは、本明細書で使用される用語「実質的に機械的に剛性」は、微粒子がいかなるプロセス溶媒または試薬の中でも（直径で測定して）10パーセントより多く膨張も収縮もしないことを意味する。好ましくは、微粒子は均一のサイズのマイクロスフェアである。すなわち微粒子は単分散である。より好ましくは、球形の微粒子の直径は、5パーセント未満の、そして最も好ましくは2パーセント未満の変動係数を有する。微粒子の直径は0.1μmから100μmの範囲である。好ましくは、微粒子直径は1μmから20μmの範囲である。最も好ましくは、微粒子直径は1μmから5μmの範囲である。適切な微粒子材料は、無機支持体材料、例えば、ガラス（例えば、制御孔（controlled-pore）ガラス、Balltoniビーズ）；シリカ、ジルコニアなど（Weetall，Methods in Enzymology，44：134-148（1976）；および有機支持体材料、例えば、高架橋ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート（GMA）、Dynabeads（Dynal，Oslo，Norway）など、Rembaumら、米国特許第4,046,720号；HodgeおよびSherrington編、第435-456頁、Polymer-supported  Reactions in Organic Synthesis（Wiley & Sons，New York，1980）；Andrusら、米国特許第5,047,524号などを包含する。
固相クローニングによる同一コピーのポリヌクレオチドの微粒子への付着
本発明の好ましい実施態様において、集団に由来する同一コピーのポリヌクレオチドは、固相クローニング（すなわち、同じ種類のポリヌクレオチドだけが同じ微粒子に付着されるように、ポリヌクレオチドを微粒子へ分類するためのオリゴヌクレオチドタグの使用）により別々の微粒子に固定される（例えば、Brenner、米国特許第5,604,097号、これは参考として援用される）。この情況は、タグ-ポリヌクレオチド結合体の完全集合のサンプルを採取することにより達成される。（同一のポリヌクレオチドが異なるタグを有することは容認できる。なぜなら、単に、２つの異なる位置で２回操作されるか、または分析される同じポリヌクレオチドをもたらすに過ぎないからである。）このようなサンプリングは、明白に、例えば、タグがポリヌクレオチドに付着された後に、多量の混合物から少量を採取することにより行われ得るか（これは、ポリヌクレオチドおよびタグをプロセシングするために使用される技術の２次的な効果として本来行われ得る）、またはサンプリングは、明白におよびプロセシング工程の固有の部分としての両方で行われ得るかのいずれかである。
本発明による使用のためのオリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドの最小に交差ハイブリダイズするセットのメンバーである。このようなセットのオリゴヌクレオチドの配列は、同じセットの他の全てのメンバーの配列と少なくとも２つのヌクレオチドで異なる。従って、このようなセットの各メンバーは、２未満のミスマッチを有する他の任意のメンバーの相補物とニ重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。本明細書中で「タグ相補物」と呼ばれる、本発明のオリゴヌクレオチドタグの相補物は、天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。タグ相補物は微粒子に付着される。
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物の最小に交差ハイブリダイズするセットは、所望のセットのサイズ、および交差ハイブリダイゼーションの最小化が求められる程度（または別の点を述べると、特異性の増強が求められる程度）に依存して、組み合せ的（combinatorially）または個々のいずれかで合成され得る。例えば、最小に交差ハイブリダイズするセットは、少なくとも４ヌクレオチドで互いに異なる個々に合成された10マー配列のセットからなり得、このようなセットは、（３種のヌクレオチドから構成され、そして国際特許出願PCT/US96/09513のAppendix Icに開示されるようなコンピュータープログラムを用いて計算された場合）332の最大サイズを有する。あるいは、オリゴヌクレオチドタグの最小に交差ハイブリダイズするセットはまた、それら自体が最小に交差ハイブリダイズするセットから選択されるサブユニットから組み合せ的にアセンブリされ得る。例えば、少なくとも３つのヌクレオチドで互いに異なる最小に交差ハイブリダイズする12マーのセットは、各々が３つのヌクレオチドで互いに異なる最小にハイブリダイズする４マーのセットから選択される、３つのサブユニットをアセンブリすることにより合成され得る。このような実施態様は、93すなわち729の最大サイズのセットを12マーに与え、「９」は、国際特許出願PCT/US96/09513のAppendix Iaのコンピュータープログラムにより作製されるオリゴヌクレオチドの数であり、これは、10マーの場合、４つの異なる型のヌクレオチドのうち３つだけが使用されると仮定する。このセットは「最大」と記載される。なぜなら国際特許出願PCT/US96/09513に開示されるコンピュータープログラムは、所定のインプット（例えば、長さ、組成、メンバー間のヌクレオチド数の差異）について最も大きなセットを提供するからである。さらなる最小に交差ハイブリダイズするセットは、このように計算されたセットのサブセットから形成され得る。
組み合わせ的に合成される場合、本発明のオリゴヌクレオチドタグは、好ましくは、複数のサブユニットからなり、各サブユニットは、長さが３〜９のオリゴヌクレオチドからなり、ここで各サブユニットは、同じ最小に交差ハイブリダイズするセットから選択される。このような実施態様において、利用可能なオリゴヌクレオチドタグの数は、タグあたりのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。
オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物に関して本明細書中で使用する用語「レパートリー」は、特定の実施態様におけるタグを構成するオリゴヌクレオチドの最小に交差ハイブリダイズするセットまたはタグ相補物の対応するセットのセットを意味する。
好ましくは、実質的に全て異なるcDNAが異なるタグを有するcDNAライブラリーを構築することにおいて、複雑度すなわち別個のタグの数が細胞または組織サンプルから抽出されたmRNAの総数を大いに超える、タグレパートリーが使用される。好ましくは、タグレパートリーの複雑度は、ポリヌクレオチド集団の複雑度の少なくとも10倍であり；より好ましくは、タグレパートリーの複雑度は、ポリヌクレオチド集団の複雑度の少なくとも100倍である。以下に、例示的な９文字タグの完全レパートリーを含むプライマー混合物を使用するcDNAライブラリー構築のためのプロトコルが開示される。このようなタグ含有プライマーの混合物は、89すなわち約1.34×108の複雑度を有する。Winslowら、Nucleic Acids Research，19：3251-3253（1991）により示されるように、ライブラリー構築のためのmRNAは、10〜100個ほどの哺乳動物細胞から抽出され得る。単一の哺乳動物細胞は、約５×105コピーの約3.4×104個の異なる種類のmRNA分子を含むので、標準的な技術により、約100個の細胞からmRNAを、すなわち（理論的には）約５×107個のmRNA分子を単離し得る。この数とプライマー混合物の複雑度を比較すると、任意のさらなる工程なく、そしてmRNAが完全効率（１％以下の効率がより正確である）でcDNAに変換されると仮定しても、このcDNAライブラリー構築プロトコルは、異なるタグの総数の37％以下を含む集団をもたらすことが示される。すなわち、任意の明白なサンプリング工程が全くなく、このプロトコルは、タグレパートリーの37％以下を含むサンプルを固有に生成する。これらの条件下で２重（double）を得る確率は約５％であり、これは好ましい範囲内である。10個の細胞に由来するmRNAを用いて、サンプリングされたタグレパートリーの画分は、全プロセシング工程が100％の効率で起こると仮定しても、わずか3.7％まで低減される。実際、cDNAライブラリーを構築するためのプロセシング工程の効率は非常に低く、よいライブラリーは、106個の哺乳動物細胞から抽出されたmRNAに由来する約108個のcDNAクローンを含むべきだという「経験則」がある。
上記のプロトコルにおけるより多量のmRNAまたは一般的により多量のポリヌクレオチドの使用により（ここでこのような分子の数はタグレパートリーの複雑度を越える）、タグ-ポリヌクレオチド結合体混合物は、潜在的に、タグおよびmRNAまたはポリヌクレオチドの型の全ての可能な対を含む。このような場合において、明白なサンプリングは、タグ-ポリヌクレオチド結合体の出発混合物の連続希釈後に、サンプル容量を取り出すことにより実行され得る。必要とされる希釈量は、出発材料量およびプロセシング工程の効率に依存し、これらは容易に見積もられる。
代表的なプロトコル（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，第２版，8.61頁）において要求されるように、mRNAが106個の細胞（これは、約0.5μgのポリ（A）+RNAに対応する）から抽出され、そしてプライマーが約10〜100倍濃度過剰で存在する場合（１mg/mLの1.8kb mRNA 10μLは約1.68×10-11モルに等しく、そして１mg/mLの18マープライマー10μLは約1.68×10-9モルに等しい）、次に、cDNAライブラリーにおけるタグ-ポリヌクレオチド結合体の総数は、mRNAの出発数すなわちタグ-ポリヌクレオチド結合体を含有する約５×1011個のベクターに単に等しいか、またはそれ未満である。再度、これは、cDNA構築における各工程―第１鎖合成、第２鎖合成、ベクターへの連結―が完全効率で起こると仮定し、これは非常に控えめな見積もりである。実際の数は著しく少ない。
サンプル容量を採取することによりもたらされ得るように、ｎ個のタグ-ポリヌクレオチド結合体のサンプルがランダムに反応混合物から抜き取られる場合、同じタグを有する結合体を抜き取る確率は、ポアソン分布、P（r）＝ｅ-λ（λ）r/rにより説明され、ここでｒは同じタグを有する結合体の数であり、そしてλ＝npであり、ここでｐは所定のタグが選択される確率である。ｎ＝106およびｐ＝1/（1.34×108）であれば、λ＝0.00746およびP（2）＝2.76×10-5である。従って、100万個の分子のサンプルは、好ましい範囲内で二重の期待数を十分に生じさせる。このようなサンプルは、以下のように容易に得られる：５×1011個のmRNAは、挿入物としてタグ-cDNA結合体を有する５×1011個のベクターに完全に変換され、そして５×1011個のベクターは、100μlの容量を有する反応溶液中にあると仮定する。４回の10倍連続希釈は、最初の溶液からの10μlを、適切な緩衝液（例えば、TE）90μlを含む容器に移すことにより行われ得る。このプロセスはさらなる３回の希釈のために繰り返されて、１μlあたり５×105個のベクター分子を含む100μl溶液を得ることができる。この溶液からの２μlアリコートは、挿入物としてタグ-cDNA結合体を含む106個のベクターを生じる。次いで、このサンプルは、コンピテント宿主細胞のストレートフォーワード形質転換（straight forward transformation）、続いて培養により増幅される。
もちろん、上記のように、上記のプロセスにおける工程は完全効率で進行しない。特に、タグ-ポリヌクレオチド結合体のサンプルを増幅するためにベクターが使用される場合、宿主を形質転換する工程は、非常に非効率的である。通常、ベクターのわずか１％しか宿主により吸収されず、そして複製されない。従って、このような増幅方法については、106個の結合体のサンプルを得るために、さらに少しの希釈しか必要とされない。
オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、多数の方法（直接的酵素連結、タグ配列を含むプライマーを用いた増幅（例えば、PCRを介して）などを含む）でポリヌクレオチドの集団に結合され得る。最初の連結工程は、単一のタグが一般的に多くの異なるポリヌクレオチドに付着されているような、タグ-ポリヌクレオチド結合体の非常に大きな集団を生成する。しかし、上記のように、結合体の十分に少量のサンプルを採取することにより、「二重」（すなわち、同じタグが２つの異なるポリヌクレオチド上にある）を得る確率は無視され得る。一般的に、サンプルが多くなるほど、二重を得る確率は大きくなる。従って、設計の交換は、タグ-ポリヌクレオチド結合体の多量のサンプルを選択すること（これは、例えば、ショットガン配列決定操作における標的ポリヌクレオチドの十分な適用範囲または急速に変化するmRNAプールの十分な提示を確実にする）と、少量のサンプルを選択すること（これは、最小数の二重が存在することを確実にする）との間に存在する。大部分の実施態様において、二重の存在は、さらなるノイズ源を、または配列決定の場合ではスキャニングおよびシグナル処理にわずかな困難を単に加えるのにすぎない。なぜなら複数の蛍光シグナルを生じる微粒子は、簡単に無視され得るからである。
タグの分子（特に、ポリヌクレオチド）への付着に関して本明細書中で使用する用語「実質的に全て」は、本質的に二重を含まないタグ-分子結合体の集団を得るために使用されるサンプリング手順の統計学的性質を表すことが意味される。タグ-分子結合体の実際のパーセンテージに関する実質的に全ての意味は、どのようにタグが使用されているかに依存する。好ましくは、核酸配列決定については、実質的に全ては、ポリヌクレオチドの少なくとも80パーセントが独特のタグを付着されたことを意味する。より好ましくは、これは、ポリヌクレオチドの少なくとも90パーセントが独特のタグを付着されたことを意味する。いっそうより好ましくは、これは、ポリヌクレオチドの少なくとも95パーセントが独特のタグを付着されたことを意味する。そして、最も好ましくは、これは、ポリヌクレオチドの少なくとも99パーセントが独特のタグを付着されたことを意味する。
タグは、標準的なクローニング方法により存在するライブラリーのcDNAに結合され得る。cDNAは、それらの存在するベクターから切除され、単離され、次いで、タグレパートリーを含むベクターに連結される。好ましくは、タグ含有ベクターは、切除されたcDNAが予め決定された方向で連結され得るように、２つの制限酵素で切断することにより線状化される。線状化タグ含有ベクターの濃度は、連結が固有のタグのサンプリングを提供するように、cDNA挿入物の濃度以上で実質的に過剰である。
増幅後に１本鎖タグを曝露するための一般的な方法は、標的ポリヌクレオチド含有結合体を、例えば、Kuijperら、Gene，112：147-155（1992）に記載されるような、T4 DNAポリメラーゼまたは同様の酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性で消化する工程を含む。単一のデオキシヌクレオシド３リン酸の存在下で使用される場合、このようなポリメラーゼは、単一のデオキシヌクレオシド３リン酸の相補物が鋳型鎖に到達されるまで、２本鎖フラグメントの非鋳型鎖に存在する3’陥没末端（recessed end)からヌクレオチドを切断する。このようなヌクレオチドが到達されると、切除活性がヌクレオチドを除去するより速い速度でポリメラーゼ伸長活性がヌクレオチドを付加するので、5’→3’消化は効果的に止まる。結果として、３つのヌクレオチドにより構築された１本鎖タグは、固相支持体上へのローディングのために容易に調製される。
オリゴヌクレオチドタグが、例えば、それらを上記のように１本鎖にすることにより、特異的ハイブリダイゼーションのために調製された後、ポリヌクレオチドは、タグとそれらの相補物との間の完全に適合したニ重鎖の形成に有利な条件下で、タグの相補配列を含む微粒子と混合される。これらの条件を作ることについては、文献に広い指針がある。このような指針を提供する例示的な参考文献は、Wetmur，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，26：227-259（1991）；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989）などを含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、完全に適合した配列のみが安定なニ重鎖を形成するように、十分にストリンジェントである。このような条件下で、タグを通して特異的にハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、微粒子に付着された相補配列に連結され得る。最後に、微粒子は、連結されなかったタグおよび／またはミスマッチタグを有するポリヌクレオチドを除去するために洗浄される。
好ましくは、配列決定適用のために、20〜50μm範囲の直径の標準的なCPGビーズは、約105個のポリヌクレオチドと共にロードされ、そして５〜10μm範囲の直径のBangs Laboratories（Carmel，IN）から入手可能なグリシダルメタクリレート（GMA）ビーズは、数万個のポリヌクレオチド（例えば、４×104〜６×104個）から10万個のポリヌクレオチドと共にロードされる。
DNA配列決定
微粒子上にロードされたポリヌクレオチドは、「１塩基ずつの（base by base）」DNA配列決定方法論を用いて即時（instant）装置において同時に配列決定され得る。このような配列決定方法論は、処理および検出の連続サイクルにより、標的ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列（通常、１度に１塩基）の段階を追った同定を可能にする。１塩基ずつのアプローチは、以下の参考文献において開示される：Cheeseman、米国特許第5,302,509号；Tsienら、国際出願WO 91/06678；Rosenthalら、国際出願WO 93/21340；Canardら、Gene，148：1-6（1994）；Metzkerら、Nucleic Acids Research，22：4259-4267（1994）など。好ましくは、Brenner、米国特許第5,599,675号により開示される１塩基ずつアプローチは、フローチャンバーにおいて平面アレイとして配置されたロード微粒子の集団上のポリヌクレオチドを配列決定するために、本発明の装置を用いて使用される。従って、Brenner、米国特許第5,599,675号は参考として援用される。好ましくは、配列決定のためのロード微粒子の集団は、少なくとも１万個のロード微粒子を含み；より好ましくは、このような集団は、少なくとも５万個のロード微粒子を含み；いっそうより好ましくは、このような集団は、少なくとも10万個のロード微粒子を含む。
好ましくは、Brenner（上記で引用）の配列決定方法は、コードアダプター（encoded adaptor）の使用を開示する、Albrechtら、国際特許出願PCT/US97/09472に開示される実施態様において使用される。コードアダプターは、突出鎖およびオリゴヌクレオチドの最小に交差ハイブリダイズするセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグを含む２本鎖オリゴヌクレオチドである。突出鎖が標的ポリヌクレオチドの相補突出鎖と完全に適合したニ重鎖を形成する、コードアダプターは連結される。連結後、突出鎖におけるヌクレオチドの同一性および順序付けは、標識タグ相補物を連結されたアダプター上のその対応するタグに特異的にハイブリダイズさせることにより、決定または「解読（decode）」される。コードアダプターは、連結、同定、および切断の反復サイクルを含むDNA配列決定のアダプターに基づく方法（例えば、Brenner（上記で引用）に記載される方法）において使用され得る。簡単には、このような方法は以下の工程を含む：（ａ）コードアダプターをポリヌクレオチド末端に連結する工程であって、コードアダプターはヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位はその認識部位から離れている、工程；（ｂ）ポリヌクレオチド末端の１つ以上のヌクレオチドを、それに連結されたコードアダプターの同一性により同定する工程；（ｃ）ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが１つ以上のヌクレオチドだけ短くされるように、コードアダプターのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼで切断する工程；および（ｄ）ポリヌクレオチドの上記ヌクレオチド配列が決定されるまで、上記工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程。同定工程において、タグ相補物の連続セットは、上記のような、標的ポリヌクレオチドの末端に連結されたコードアダプターにより保持されるそれぞれのタグに特異的にハイブリダイズされる。ポリヌクレオチドの突出鎖におけるヌクレオチドの型および配列は、特異的にハイブリダイズされたタグ相補物およびタグ相補物が生じるセットにより保持される標識により同定される。
コード化アダプターでのシグネチャー配列決定（signature sequencing）のためのcDNAライブラリの構築およびソーティング
この実施例では、cDNAライブラリを構築し、ここで８個の４ヌクレオチド「ワード」からなるオリゴヌクレオチドタグが各cDNAに付加される。上記のように、このサイズのオリゴヌクレオチドタグのレパートリーは十分に大きく（約108）、そのためcDNAが約106のmRNAの群から合成された場合、各cDNAはソーティングのためのユニークなタグを有する高い可能性がある。mRNA抽出の後、第１鎖の合成を5-Me-dCTP（特定のcDNA制限部位のブロックのため）およびオリゴヌクレオチドタグを含むビオチン化プライマー混合物の存在下で行う。従来の第２鎖の合成の後、タグ−cDNA結合体をDpn II（これは5-Me-デオキシシトシンに影響されない）で切断し、ビオチン化部分を反応混合物からストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて分離し、そしてタグ−cDNA結合体を磁性ビーズからビオチン化プライマーで運ばれるBsm BI部位によって切断することにより回収する。タグ−cDNA結合体を含むBsm BI-Dpn IIフラグメントを次にプラスミドに挿入し、増殖する。プラスミドの単離の後、タグ−cDNA結合体をプラスミドから、5-Me-dCTPの存在下で予め定義された制限エンドヌクレアーゼ部位を含むビオチン化および蛍光標識されたプライマーを用いて、PCRにより増幅する。ストレプトアビジン被覆磁性ビーズでのアフィニティー精製の後、タグ−cDNA結合体をビーズから切断し、T4 DNAポリメラーゼでdGTPの存在下で処理して、タグを一本鎖にし、そして次に付加されたタグ補体を有するGMAビーズのレパートリーと組み合わせる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、GMAビーズをFACSによってソートして、cDNAがロードされたGMAビーズの富化された集団を生成する。ロードされたGMAビーズの富化された集団をフローチャンバー中に平面アレイで固定化し、ここで塩基−塩基（base-by-base）配列決定をAlbrechtらの国際特許出願PCT/US97/09472に開示のようにコード化アダプターを用いて行う。
約5μgのポリ（A+）mRNAをDBY746酵母細胞から従来のプロトコルを用いて抽出する。Stratagene（La Jolla，CA）cDNA合成キットを製造者のプロトコルに従って用いて、第１鎖および第２鎖cDNA合成を、100〜150pmolの以下のプライマー（配列番号1）：
0004294740.tif 000002
を、ポリ（A+）mRNAと組み合わせることによって行う。この結果、第１鎖のデオキシシトシンが5-炭素位置でメチル化されたcDNAが得られる。上記式中「V」はG、C、またはAであり、「［W，W，W，G］」はBrenner、国際特許出願PCT/US96/09513の表IIから選択された4ヌクレオチドワードであり、一重の下線部分はBsm BI認識部位であり、そして二重の下線部分はPac I認識部位である。従来のプロトコルを用いてのサイズ分画（GIBCO-BRL cDNA Size Fractionation Kit）の後、cDNAをDpn II（New England Bioscience，Beverly，MA）で、製造者のプロトコルを用いて切断し、そしてストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（M-280ビーズ、Dynal A．S．，Oslo，Norway）でアフィニティー精製する。改変されたpBCSK-ベクター（Stratagene，La Jolla，CA）へのクローニングのためのタグ−cDNA結合体を、標準プロトコルを用いて、ビーズにより捕捉されたDNAをBsm BIで切断して遊離させる。pBCSK-ベクターは以下のフラグメント（配列番号2）をKpn I/Eco RV切断ベクター中に挿入することによってBbs I部位を付加することにより、改変される。
0004294740.tif 000003
Bsm BI/Dpn II切断されたタグ−cDNA結合体をpBCSK-の中に挿入する。これは予めBbs IおよびBam HIで切断されている。ライゲーションの後、ベクターを製造者が推奨する増殖のための宿主中にトランスフェクトする。
上記のpBCSK-ベクターを標準プラスミドミニプレップから単離した後、タグ−cDNA結合体をPCRで、5-Me-dCTPの存在下、タグ−cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的な20マーのプライマーを用いて増殖させる。「上流」プライマー（すなわちタグに隣接する）をビオチン化し、そして「下流」プライマー（すなわちcDNAに隣接する）をフルオレセインで標識する。増幅の後、PCR産物をアフィニティー精製し、次にPac Iで切断して、蛍光標識されたタグ−cDNA結合体を遊離させる。結合体のタグはT4 DNAポリメラーゼでdGTPの存在下、処理することにより、一本鎖になる。反応をクエンチした後、タグ−cDNA結合体をフェノール−クロロホルム抽出で精製し、そしてタグ補体を担持する5.5mmのGMAビーズと組み合わせる。各タグ補体は5’リン酸を有する。ハイブリダイゼーションを熱安定性リガーゼの存在下でストリンジェントな条件下で行い、その補体と完全に適合した二重鎖を形成するタグのみをライゲートする。GMAビーズを洗浄し、そしてロードされたビーズをFACSソーティングによって、ロードされたGMAビーズを同定するために蛍光標識されたcDNAを用いて、濃縮する。GMAビーズに付着したタグ−cDNA結合体をDpn IIで切断して、蛍光標識を除去し、そしてアルカリホスファターゼで処理して、cDNAを配列決定のために調製する。すなわち、ホスファターゼを用いて5’リン酸をcDNAの末端から除去して、パリンドロームDpn II部位による所望されないcDNA−cDNAのライゲーションを防ぐ。
以下の切断アダプター（配列番号3）を、Dpn II切断され、ホスファターゼ処理されたcDNAにライゲートする：
0004294740.tif 000004
ライゲーションの後、3’リン酸をアルカリホスファターゼで除去し、cDNAの5’鎖をT4 DNAキナーゼで処理し、そして切断アダプターとcDNAとの間のニックをライゲートする。Bbv Iによる切断の後、コード化アダプターをcDNAの末端にライゲートすると、ビーズはフローチャンバーへのローディングの準備が整う。
アダプターの標的ポリヌクレオチドへのライゲーションは、5μlのビーズ（20mg）、3μLのNEB 10xリガーゼ緩衝液、5μLのアダプター混合物（25nM）、2.5μLのNEB T4 DNAリガーゼ（2000単位／μL）、および14.5μLの蒸留水をからなる混合物中で行われる。混合物を16℃で30分間インキュベートし、その後、ビーズを3回TE（pH8.0）中で洗浄する。
遠心分離およびTEの除去の後、ライゲートされたアダプターの3’リン酸を、ポリヌクレオチド−ビーズ混合物を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIP）（New England Biolabs，Beverly，MA）で製造者のプロトコルを用いて処理することにより除去する。3’リン酸の除去の後、CIPを、例えばPronaseTM（Boeringer Mannhiem，Indianapolis，IN）、または等価なプロテアーゼを製造者のプロトコルと共に用いて、タンパク質加水分解切断により不活性化し得る。ポリヌクレオチドビーズ混合物を次に洗浄し、T4ポリヌクレオチドキナーゼとT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）との混合物で処理して、5’リン酸を標的ポリヌクレオチドとアダプターとの間のギャップに付加し、そしてアダプターの標的ポリヌクレオチドへのライゲーションを完了する。ビーズ−ポリヌクレオチド混合物を次にTE中で洗浄し、1μL当たり約10万ビーズの濃度まで希釈し、そして得られる溶液5μLを図4のホルダーで補助してフローチャンバーの中にロードする。
以下の16組の64のコード化アダプター（配列番号4から配列番号19）のトップ鎖が自動DNA合成機（392型、Applied Biosystems，Foster City）上で標準的な方法を用いて各々別々に合成される。ボトム鎖（これは全てのアダプターについて同一である）は別々に合成され、次に各々のトップ鎖とハイブリダイズされる：
0004294740.tif 000005
0004294740.tif 000006
ここでNおよびpは上記で定義されたとおりであり、そして小文字で示されるヌクレオチドは12マーのオリゴヌクレオチドタグである。各タグは他の全てのタグと6ヌクレオチド異なる。等モル量の各アダプターをNEB＃2制限バッファー（New England Biolabs，Beverly，MA）の中で合わせて、1000pmol/μLの濃度の混合物を形成する。
16タグの補体の各々をアミノ誘導体化オリゴヌクレオチドとして別々に合成し、そして各々をフルオレセイン分子で（Molecular Probe，Eugene，ORから入手可能なフルオレセインのNHS-エステルを用いて）標識し、これをタグ補体の5’末端にポリエチレングリコールリンカー（Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA）を通じて付加する。タグ補体の配列は、単に上で列記したタグの12マー補体である。
図２aおよび２bに示す設計のフローチャンバーを、Olympus Optical Co．，Ltd．（Tokyo，Japan）BX60MF5型蛍光顕微鏡に、U-ULS75XE型75ワットキセノンアークランプ、動力化フィルターホイール、Ludl Electronic Products，Ltd．コンピュータ制御ステージ、および2000×2000画素アレイを備えたPhotometrics，Ltd．（Tucson，AZ）PXL CCDカメラを装着したものと組み合わせて使用する。フルオレセインを励起させ、かつ蛍光シグナルをCCDカメラ（120）に透過させるために、適切なバンドパスフィルタ（122）および（124）を使用する。微粒子位置を、中性密度フィルタ（neutral density filter）で約10-4のファクターで減じたキセノンランプ（126）からの広帯域光でのトップライトによって決定する。蛍光画像を約2分間の露光時間で収集する。
フローチャンバー（201）の高さ（204）を7μm、またはGMAビーズの直径の約140％になるように選択する。フローチャンバー（201）の幅（210）を選択して、3×3アレイの９個の画像の画素が10倍に拡大した後にビーズの画像の約40〜60％をカバーすることを確実にするようにする（図７に示すように）。従って、約10万個の５μmGMAビーズのタイルの画像を捕捉するためには、幅（210）は1.7ｍｍの値を有するように選択される。長さ（212）はフローチャンバーが各々約10万の５μm直径のビーズのタイルを1個から10個保持し得るように選択される。入口通路（214）の断面（220）は入口管の断面に適合し、そして徐々に大きくなって平面キャビティの領域（すなわち、GMAビーズが保持され分析が実行される領域）でフローチャンバー（201）の断面に適合する。フローチャンバー（201）の平面キャビティを通じて一定の断面を有し、不均一な流動パターンの生成を最少化することが望ましい。なぜなら不均一な流動パターンは、断面の急激な狭窄および／または膨張で生じ得るからである。フローチャンバー（201）の本体（218）およびカバー（216）はガラスであり、そして本体（218）の平面キャビティおよびチャネルは標準的な化学エッチング技術で形成される。出口通路（224）の断面（222）はフローチャンバー（201）の断面にダム（202）のところで適合するように選択される。
全てのバルブ、シリンジポンプ（500）、およびペルチエブロック（152）を含む図５aの流体システムは、LabVIEW 5.0（National Instruments，Austin，TX）でかかれたコードで制御され、そしてCompac Deskpro Pentiumベースのマイクロプロセッサ上で走る。このマイクロプロセッサは標準I/O回路基板で流体システムの種々の構成成分と接続している。検出システム（114）および装置の全体の制御はSun Microsystems（Mountain View，CA）Sparcstation 5によって達成される。
ライゲーション、同定、および切断の３つのサイクルはフローチャンバー（201）の中で行われ、約500,000のcDNAの各々の末端に12ヌクレオチドの配列を与える。すなわち、GMAビーズの5つのタイルを以下の一連のプロセス工程で分析する。
1．      GMAビーズの焦平面の較正。
2．      デコーダーのハイブリダイズ。
3．      タイル１の自動焦点合わせ。
4．      ビーズ中心に焦点を合わせる。
5．      蛍光画像の収集
6．      焦点をビーズの焦平面（散乱中心）に設定する。
7．      画像の収集。
8．      残りのタイルについて工程４〜７を繰り返す。
9．      洗浄
10．      残りのデコーダーについて工程２〜９を繰り返す。
11．      コード化アダプターを切断する。
12．      洗浄。
13．      次のコード化アダプターのトップ鎖のライゲート
14．      洗浄。
15．      工程13〜14を繰り返す。
16．      コード化アダプターのボトム鎖のキナーゼ。
17．      洗浄
18．      コード化アダプターのボトム鎖のライゲート。
19．      洗浄。
20．      工程２〜９を繰り返す。
21．      次のコード化アダプターについて工程11〜19を繰り返す。
工程２〜９において、cDNAのヌクレオチドはタグ補体をコード化アダプターにハイブリダイズすることによって同定される。詳細には、ハイブリダイズされたタグ補体はその蛍光標識をキセノンアークランプ（126）からの照射光（110）で励起することによって検出される。工程13において、コード化アダプターおよびT4 DNAリガーゼ（Promega，Madison，WI）を1μL当たり約0.75単位で1分間当たり約1〜2μLの流速で約20〜30分間16℃でフローチャンバーを通過させ、その後、工程14の洗浄は、PronaseTM（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の溶液、塩洗浄溶液、およびエタノール洗浄溶液を、全て1分間当たり1〜2μLの同じ流速で各々、15、10、および10分間の間、フローチャンバーに順次通すことによって実行される。塩洗浄溶液は150mMのNaClおよび10mMのTris-HCl（pH8.5）であり、そしてエタノール洗浄溶液は塩洗浄溶液およびエタノールの3：1（v/v）溶液である。ライゲーションおよび洗浄工程13および14を一回繰り返し、その後、アダプターおよびcDNAを、第２鎖のライゲーションのために、T4 DNAキナーゼ（New England，Bioscience，Beverly，MA）を1μL当たり7単位でフローチャンバーに37℃で1分間当たり1〜2μLの流速で15〜20分間通すことによって調製する。第２鎖のライゲーションは、T4 DNAリガーゼ（1mL当たり0.75単位、Promega）をフローチャンバーに20〜30分間、1分間当たり1〜2μLの速度で流し、次にPronaseTM処理および洗浄を上記のように行うことによって実行される。タグ補体を25nM濃度でフローチャンバーに1分間当たり1〜2μLの流速で10分間、20℃で通し、その後、タグ補体に担持された蛍光標識を照射し、蛍光を収集した。タグ補体は、NEB＃2制限緩衝液を3mMのMgCl2と共にフローチャンバーに1分間当たり1〜2μLの流速で55℃で10分間通すことによって、コード化アダプターから溶け落ちる。コード化アダプターは、Bbv I（New England，Biosciences，Beverly，MA）を1単位／μLで1分間当たり1〜2μLの流速で20分間37℃で通し、次にPronaseTM処理および洗浄を上記のように行うことによって、cDNAから切断される。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：リンクス  セラピューティクス、インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：分析物の系列的プロセシングのためのシステムおよび装置
（iii）配列数：19
（iv）連絡住所：
（A）住所：デリンジャー  アンド  アソーシエイツ
（B）番地：ピー．オー．  ボックス  60850
（C）市：パロ  アルト
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：94306
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：3.5  インチ ディスク
（B）コンピューター：IBM互換用
（C）OS：Windows  95
（D）ソフトウェア：マイクロソフト  ワード  フォー  ウインドウズ、バージョン  7.0
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：08/862,610
（B）出願日：1997年5月23日
（viii）代理人/事務所情報：
（A）名称：ビンセント  エム．パワーズ
（B）登録番号：36,246
（C）照会/記録番号：5525-0035.41
（ix）通信情報：
（A）電話：（650）324-0880
（B）テレファックス：（650）324-0960
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：78ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１
0004294740.tif 000007
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：17ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004294740.tif 000008
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：19ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
0004294740.tif 000009
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
0004294740.tif 000010
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0004294740.tif 000011
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0004294740.tif 000012
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
0004294740.tif 000013
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
0004294740.tif 000014
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号９：
0004294740.tif 000015
（2）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１０：
0004294740.tif 000016
（2）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１１：
0004294740.tif 000017
（2）配列番号１２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１２：
0004294740.tif 000018
（2）配列番号１３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１３：
0004294740.tif 000019
（2）配列番号１４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１４：
0004294740.tif 000020
（2）配列番号１５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１５：
0004294740.tif 000021
（2）配列番号１６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１６：
0004294740.tif 000022
（2）配列番号１７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１７：
0004294740.tif 000023
（2）配列番１８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１８：
0004294740.tif 000024
（2）配列番号１９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：30ヌクレオチド
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１９：
0004294740.tif 000025
【図１Ａ】
0004294740.tif 000026
【図１Ｂ】
0004294740.tif 000027
【図２Ａ】
0004294740.tif 000028
【図２Ｂ】
0004294740.tif 000029
【図２Ｃ】
0004294740.tif 000030
【図３Ａ】
0004294740.tif 000031
【図３Ｂ】
0004294740.tif 000032
【図３Ｃ】
0004294740.tif 000033
【図３Ｄ】
0004294740.tif 000034
【図４】
0004294740.tif 000035
【図５】
0004294740.tif 000036
【図６Ａ】
0004294740.tif 000037
【図６Ｂ】
0004294740.tif 000038
【図７】
0004294740.tif 000039
【図８】
0004294740.tif 000040