(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、 をコードする単離された核酸。
【請求項２】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、をコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号４に示すアミノ酸残基番号21から228までのアミノ酸配列からなる成熟ポリペプチド 、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、 をコードする単離された核酸。
【請求項４】
配列番号４に示すアミノ酸残基番号21から228までのアミノ酸配列からなる成熟ポリペプチド 、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、をコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項５】
プロモーターと機能的に結合した請求項１に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
発現ベクターが複製されるような条件下で 請求項６に記載の宿主細胞を培養する方法。
【請求項８】
宿主細胞を請求項５に記載の発現ベクターで形質転換し、該単離された核酸を発現させ、該ポリペプチドが合成されるような条件下で細胞を培養する 方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において合成されたポリペプチドを、細胞培養培地から回収する方法。
【請求項１０】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、 からなる単離された蛋白。
【請求項１１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる単離された蛋白。
【請求項１２】
配列番号４に示すアミノ酸残基番号21から228までのアミノ酸配列からなる成熟ポリペプチド 、またはそのアミノ酸配列変異体であって１または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有し、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるREK7蛋白と結合する活性を有する該変異体、 からなる単離された 蛋白。
【請求項１３】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合することができる抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である請求項１３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この出願は、ニューロンの生存および／または生長ならびに血管形成に関連するポリペプチドの生成、特に組換えＤＮＡ技術によるそれらの精製された型の生成に関するものである。
発明の背景
脊椎動物の神経系の生長および発達に影響を及ぼす幾つかの蛋白神経栄養因子、またはニューロトロフィンが同定されている。これらの因子は、脳および末梢の多様な群のニューロンの分化、生存、および機能の促進に重要な役割を果たしていると信じられている。
神経栄養因子が神経組織において重要なシグナル伝達機能を有するという考えは、神経成長因子（ＮＧＦ）を用いた仕事により確立された先例を基礎としている。ＮＧＦは、インビトロおよびインビボの両方で、交感神経、感覚、および基底前脳ニューロンの生存を支持することが示されている。外因性ＮＧＦの投与は、発達中の細胞死からニューロンを救済する。逆に、抗ＮＧＦ抗体の投与による内因性ＮＧＦの除去または駆逐は、係る細胞死を促進する。ヒューマン、J.Exp.Biol.、１３２巻１３３−１５０頁（１９８７）；ヘフティ、J.Neurosci.、６巻２１５５−２１６２頁（１９８６）；トーネンおよびバーデ、Annu.Rev.Physiol.、６０巻２８４−３３５頁（１９８０）。
ＮＧＦに関連するさらなる神経栄養因子がその後同定された。これらは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（ライブロック等、Nature、３４１巻１４９−１５２頁（１９８９））、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）（カイショ等、FEBS Lett.、２６６巻１８７頁（１９９０）；マイソンピエール等、Science、２４７巻１４４６頁（１９９０）；ローゼンタール等、Neuron、４巻７６７頁（１９９０））、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（バークマイアー等、Neuron、７巻８５７−８６６頁（１９９１））を包含する。
ニューロトロフィンは、他のポリペプチド成長因子と同様、細胞表面レセプターとの相互作用を介してそれらの標的細胞に作用する。本発明者等の現在の理解に従えば、２種類の貫膜糖蛋白が、既知のニューロトロフィンのレセプターとして働く。平衡結合研究により、ニューロトロフィン応答性のニューロン細胞は、共通した低分子量（６５０００−８００００ダルトン）の、典型的にはｐ７５LNGFRまたはｐ７５と呼ばれる低親和性レセプター、および高分子量（１３００００−１５００００ダルトン）の、ｔｒｋファミリーのレセプターチロシンキナーゼの一員である高および低親和性レセプターを有していることが示された。
レセプターチロシンキナーゼは、細胞の増殖、分化、および生存を促進する様々な蛋白因子のためのレセプターとして働くことが知られている。ｔｒｋレセプターに加えて、他のレセプターチロシンキナーゼの例には、表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のレセプターが包含される。典型的には、これらのレセプターは細胞膜にまたがっており、レセプターの一部分が細胞内にあって細胞質と接触し、レセプターの他の部分が細胞外にある。該レセプターの細胞外部分にリガンドを結合させることは、このレセプターの細胞内部分におけるチロシンキナーゼ活性を誘発し、続いて細胞のシグナル伝達経路に関係する種々の細胞内蛋白の燐酸化をもたらすと信じられている。
既知の蛋白因子のレセプターとして働くレセプターチロシンキナーゼに加えて、リガンドの知られていない多くのレセプター様チロシンキナーゼが同定されている。このような「オーファン」レセプターの例には、最近発見されたｅｐｈファミリーの成員が包含され、それらには、ｅｐｈ、ｅｌｋ、ｃｅｋ５、ｃｅｋ７、ｍｅｋ４／ｃｅｋ４／ｈｅｋ、ｓｅｋ、ｈｅｋ２およびｂｓｋが包含される（ツジ等、Br.J.Cancer、６９巻４１７−４２１頁（１９９４）；ゾウ等、J.Neurosci.Res.、３７巻１２９−１４３頁（１９９４））。近年、Ｂ６１、Ｅｃｋレセプターリガンド（バートレイ等、Nature、３６８巻５５８−５６０頁（１９９４）およびパンデイ等、Science（１９９５）、２６８巻５６７−５６９頁）、ＥＬＦ−１、Ｍｅｋ４およびＳｅｋレセプターリガンド（チェング等、Cell（１９９５）、８２巻３７１−３８１頁）、Ｅｈｋ−１−２、ＬＥＲＫ２、ＨＴＫ−ＬおよびＣＥＫ５−Ｌを包含する他のｅｐｈファミリーレセプターリガンドが報告されている。本出願に報告されている発見の後に、ＲＡＧＳと名付けられたニワトリＡＬ−１同族体が報告された（ドレッシャー等、Cell（１９９５）、８２巻３５９−３７０頁）。
ｅｐｈファミリーの成員は多くの異なる組織で発現されるが、幾つかのファミリー成員は神経系で、または特異的にニューロンで発現される（マイソンピエール等、Oncogene、８巻３２７７−３２８８頁（１９９３）；ライ等、Neuron、６巻６９１−７０４頁（１９９１）。神経系におけるこれらのおよびその他のオーファンレセプターチロシンキナーゼの役割をより良く理解するために、このようなレセプターに結合する新たなリガンドを同定することが有用であろう。
本発明は、ＲＥＫ７と呼称されるｅｐｈ関連チロシンキナーゼレセプター、およびＡＬ−１と呼称されるそのリガンドの同定、クローニング、および配列決定に至った研究の成功に基づくものである。
ＡＬ−１をコードしている核酸を提供し、そしてその核酸を用いて診断用途または治療用途のためのＡＬ−１を組換え宿主細胞内で産生することが、本発明の一つの目的である。
ＡＬ−１をコードしているこのような核酸、およびその一部を用いて、様々な動物種の細胞または組織において、関連した核酸を同定することが別の目的である。
アミノ酸配列変異体および共有結合誘導体を包含するＡＬ−１の誘導体および修飾型、ならびにＡＬ−１のアンタゴニストを提供することが、別の目的である。ＡＬ−１またはその誘導体もしくは修飾型に結合することのできる抗体を作製させるための免疫原を製造する事、および抗体を取得する事が、もう一つの目的である。
本発明のこれらのおよびその他の目的は、本明細書を全体として考察する時、当業者にとって明らかであろう。
発明の要約
これらの目的は、まず、ＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列を含む分離されたＤＮＡ、このＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列を含む発現ベクター、哺乳動物および細菌宿主細胞を包含する、該ベクターで形質転換された宿主細胞、および、係る核酸分子を発現するようトランスフェクトされた宿主細胞を培養する事を含む、ＡＬ−１をコードしている核酸分子を使用してＡＬ−１の産生を成し遂げる方法を提供し、そして、この宿主細胞培養からＡＬ−１を回収することによって達成される。この方法において、好ましくは宿主細胞は、ＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされる。
ＡＬ−１のための全ヌクレオチドコード化配列を提供することにより、本発明は、組換えＤＮＡ技術によるＡＬ−１の産生を可能とし、それにより、様々な神経学的異常ならびに充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および創傷治癒のような血管形成に依存する疾病および状態で診断的および治療的使用をするための、実質上純粋なＡＬ−１蛋白またはＡＬ−１アンタゴニストが、初めて充分な量で取得可能となる。
好ましい態様において本発明は、他のヒト蛋白を含まないＡＬ−１を提供する。
ＡＬ−１の修飾されたおよび変異体の型は、インビトロで化学的または酵素的処理によって、またはインビボで組換えＤＮＡ技術によって産生される。このようなポリペプチドは、例えば１またはそれ以上のアミノ酸置換、除去もしくは挿入の故に、またはグリコシル化の程度もしくはパターンの点で天然ＡＬ−１と異なるが、実質的には天然ＡＬ−１の生物活性を保持している。
ＡＬ−１に対する抗体は、動物を、所望により免疫原性ポリペプチドと共に、ＡＬ−１またはそのフラグメントで免疫し、その後この免疫された動物の血清から抗体を回収することによって生産される。別法として、免疫された動物の細胞から常法によりモノクローナル抗体が製造される。常套的スクリーニングにより得られた抗体はＡＬ−１と結合するであろうが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、またはその他の神経栄養因子とは実質上結合（即ち交差反応）しないであろう。固定化された抗ＡＬ−１抗体は特に、診断目的のための臨床試料中のＡＬ−１の検出に、そしてＡＬ−１の精製に有用である。
ＡＬ−１、その誘導体、またはその抗体は、特に治療用途のために、生理学上許容し得る担体と共に調合される。係る担体は、例えばＡＬ−１の持続放出製剤の提供に使用される。
さらなる態様において本発明は、細胞、組織、または生物学的液体から調製された被験試料中の、ＡＬ−１をコードしている核酸分子の存在を決定する方法であって、ＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列の全体または一部を含む分離されたＤＮＡに被験試料を接触させ、そして係る分離されたＤＮＡが被験試料中の核酸分子とハイブリダイズするか否かを決定することを含む方法を提供する。ＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列の全体または一部を含むＤＮＡはまた、ＡＬ−１のコード化配列との実質的な配列一致を共有する核酸、例えばＡＬ−１の対立遺伝子変異体をコードしている核酸を同定し分離するためのハイブリダイゼーション検定にも使用される。
被験試料中に存在するＡＬ−１をコードしている核酸分子を増幅する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとしてＡＬ−１のためのヌクレオチドコード化配列の一部を有するオリゴヌクレオチドの使用を含む方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、分離されたＲＥＫ７ ｃＤＮＡによりコードされている、ヌクレオチドコード化配列（配列番号１）、および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。成熟ＲＥＫ７蛋白のＮ末端を右向き矢印で示し、ＲＥＤ７細胞外ドメインのＣ末端を垂直の矢印で示す。
図２は、分離されたＡＬ−１ ｃＤＮＡによりコードされている、ヌクレオチドコード化配列（配列番号３）、および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。成熟ＡＬ−１蛋白のＮ末端を右向き矢印で示す（成熟蛋白はアミノ酸残基番号２１で始まる）。下線を付した配列は、精製されたＢＴ２０細胞由来ＡＬ−１の配列決定により得られた配列に対応する。陰を付した囲みは、可能性あるＮ−グリコシル化部位を示す。陰を付していない囲みはＣ末端疎水性ドメインを示し、上向き矢印はグリコホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）のための可能性ある結合部位を示す。このアンカーはＡｓｎ−１０３にあるようである。本明細書に教示されるように、ＢＴ２０細胞の表面上で発現されるＡＬ−１はＧＰＩに結合している。
図３は、ＡＬ−１配列と、ＥＬＦ−１（チェングおよびフラナガン、Cell、７９巻１５７−１６８頁（１９９４））、Ｂ６１（バートレイ等、Nature、３６８巻５５８−５６０頁（１９９４））、ＥＨＫ−１−Ｌ（デイヴィス等、Science、２６６巻８１６−８１９頁（１９９４））およびＬＥＲＫ２の細胞外ドメイン（ベックマン等、EMBO J.、１３巻３７５７−３７６２頁（１９９４））の配列との比較を示す。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適な並列のために導入した間隙をダッシュにより示す。陰を付した領域は、保存されているシステイン残基を強調している。
好ましい態様の詳細な説明
「ＡＬ−１」または「ＡＬ−１蛋白」とは、図２に開示されるＡＬ−１ヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドまたは蛋白；図２に開示される翻訳されたアミノ酸配列であるポリペプチド；約５以上のアミノ酸残基を持ち、ＡＬ−１の免疫エピトープまたはその他の生物活性部位を含む、そのフラグメント；図２に開示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体（ここで１またはそれ以上のアミノ酸残基が当該図２の配列または上記定義によるそのフラグメントのＮもしくはＣ末端または内部に付加されている）；当該図２の配列または上記定義によるそのフラグメントのアミノ酸配列変異体（ここでは、当該図２の配列またはそのフラグメントの１またはそれ以上のアミノ酸残基が除去されており、そして所望により１またはそれ以上のアミノ酸残基により置換されている）；および、上記蛋白、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントの誘導体（ここで、得られる生成物が天然に存在しないアミノ酸であるように、１個のアミノ酸残基が共有結合的に修飾されている）を指す。ＡＬ−１アミノ酸配列変異体は、例えば位置指定またはＰＣＲ突然変異誘発によって合成的に製造することができ、または、ヒトおよびその他の動物種に存在し得る図２に開示される翻訳されたアミノ酸配列の対立遺伝子型およびその他の天然に存在する変異体の場合のように、天然に存在するかも知れない。いずれにせよ、係るフラグメント、変異体、および誘導体は、既知の任意の神経栄養因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を包含する前記定義によるポリペプチド、ならびに法律上明白なそれらの変異体を除外する。
ＡＬ−１アミノ酸配列変異体は、それが機能的に活性であるならば、本発明の範囲内に包含される。ＡＬ−１に関連して本明細書中使用される「機能的に活性」および「機能的活性」とは、ニューロンが中枢、末梢、運動ニューロン、または感覚ニューロン、例えば光受容器、前庭神経節、脊髄神経節、聴毛細胞であるとに拘わらず、そのＡＬ−１が、ニューロンおよび膠細胞の生長、生存、機能、および／または分化、特に軸索の線維束形成および神経突起の伸長を促進または亢進することができ、そして／または、そのＡＬ−１が、天然に存在するＡＬ−１のエピトープに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応することを意味する。故にＡＬ−１アミノ酸配列変異体は一般に、例えばフィッチ等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８０巻１３８２−１３８６頁（１９８３）、ニードルマン等、J.Mol.Biol.、４８巻４４３−４５３頁（１９７０）により記載されたアルゴリズム版により決定されたように、最大の相同性を提供するようにその配列を並列させた後に、図２に開示される翻訳されたアミノ酸配列と、少なくとも約７５％（好ましくは８０％以上、そしてより好ましくは９０％以上）の配列一致を共有するであろう。
ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体は、ＡＬ−１ ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入し、その後、得られた修飾されたＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより、またはインビトロ合成により、製造される。このような変異体は、例えば図２に開示されるＡＬ−１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の除去、または挿入もしくは置換を包含する。このような変異体が本明細書に記載の所望の性質を有する限り、ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体に到達するための除去、挿入、および置換の任意の組み合わせを行うことができる。ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体に到達するために図２に開示されるアミノ酸配列に施される変更はまた、例えばグリコシル化部位を導入するもしくは移動するような変更、またはＰＣＴ特許公開第ＷＯ８９／０１０４１号（１９８９年２月９日公開）に記載されるような膜結合（アンカー）配列を導入するような変更のため、宿主細胞で発現される際、ＡＬ−１にさらなる修飾をもたらし得る。
ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体の組み立てには、二つの主たる変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質、がある。これらは図２に開示されるアミノ酸配列からの変異体であり、ＡＬ−１の天然に存在する対立遺伝子型を表すか、または、天然に見いだされない対立遺伝子もしくは変異体のいずれかに到達させるべくＡＬ−１ ＤＮＡを突然変異させることにより作成される、ＡＬ−１の予め定められた突然変異型を表すかも知れない。一般に、選択される突然変異の位置および性質は、修飾されるＡＬ−１の性格に依存するであろう。
例えば、ヌクレオチドコード化配列の縮重のため、それによりコードされているＡＬ−１のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく図２に開示されるＡＬ−１ヌクレオチド配列に突然変異を施すことができる。図２に開示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するが機能的に活性なＡＬ−１を産む、別の突然変異を施すことができる。このような、ＡＬ−１の機能的に活性なアミノ酸配列変異体は、例えば、図２に開示されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸残基を、類似のまたは異なる極性または電荷を有する別のアミノ酸残基に置換することによって選択される。
一つの有用なアプローチは「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、１個のアミノ酸残基または標的残基の群を特定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕのような荷電残基）、組換えＤＮＡ技術によって中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換して、そのアミノ酸と細胞内外を取り巻く水性環境との相互作用を起こさせる。カニングハム等、Science、２４４巻１０８１−１０８５頁（１９８９）。次いでこの置換に対して機能的感受性を示すドメインを、置換部位にまたは置換部位のためのさらなるまたはその他の変異体を導入することによって改良する。明らかに、例えば図２に開示されるアミノ酸配列を、既知の神経栄養因子、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、または別の既知のポリペプチドもしくは蛋白のアミノ酸配列（図３を参照されたい）に変換するような変異は、本発明の範囲には包含されず、また、先行技術に照らして新規でなく明白なアミノ酸ＡＬ−１のいかなるその他のフラグメント、変異体、および誘導体もまた同様である。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されるが、その突然変異自身の性質は前もって決定されている必要はない。例えば、与えられた部位での突然変異の挙動を最適化するため、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現されたＡＬ−１変異体を機能的活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列の除去は一般に約１から３０残基まで、より好ましくは約１ないし１０残基の範囲であり、典型的には隣接している。例えば、他のチロシンキナーゼレセプターリガンドと実質的な相同性を有する領域からの除去は、ＡＬ−１の機能的活性に、より影響を及ぼしやすい。一般に、連続する除去の数は、影響を受けるドメインにおけるＡＬ−１の三次構造、例えばβプリーツシートまたはαヘリックスを保存するよう選択されるであろう。
アミノ酸配列の挿入は、長さが１アミノ酸残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（即ち、図２に開示されるアミノ酸配列内部に施される挿入）は一般に、約１ないし１０残基、より好ましくは１ないし５残基、最も好ましくは１ないし３残基の範囲であり得る。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＡＬ−１（例えば組換え細胞培養におけるＡＬ−１の直接発現から生成し得る）、および、組換え宿主細胞からのＡＬ−１の分泌を改善するための、ヘテロローガスなＮ末端シグナル配列を有するＡＬ−１が包含される。このようなシグナル配列は一般に、ＡＬ−１の発現に使用される宿主細胞とホモローガスであって、大腸菌のためのＳＴIIまたはｌｐｐ、酵母のためのα因子、そして哺乳動物細胞のためのヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルを包含する。その他の挿入は、ＡＬ−１のＮまたはＣ末端への、免疫原性ポリペプチド（例えば細菌性ポリペプチド、例えばβラクタマーゼまたはＥ.ｃｏｌｉ ｔｒｐ遺伝子座によりコードされている酵素、または酵母蛋白）の融合、および、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ８９／０２９２２号（１９８９年４月６日公開）に記載の、長い半減期を有する蛋白、例えば免疫グロブリン不変領域、アルブミン、またはフェリチンを用いたＣ末端融合を包含する。
変異体の第三の群は、図２に開示されるアミノ酸配列中少なくとも１個のアミノ酸残基、好ましくは１ないし４個、より好ましくは１ないし３個、さらに好ましくは１ないし２個、そして最も好ましくはただ１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている変異体である。このような置換を行うための最も興味深い部位は、他のチロシンキナーゼレセプターリガンドとの相同性が最大である、図２に開示されるアミノ酸配列の領域にある（非限定的実施例については図３を参照されたい）。それらの部位はＡＬ−１の機能的活性にとって重要であるようである。したがって、機能的活性を保持するため、それらの部位、特に、他に少なくとも３個、完全に保存されている部位を有する配列内にある部位は、比較的保存的なやり方で置換する。このような保存的置換を、第１表で、好ましい置換という項の下に示す。もしこのような置換が機能的活性に変化をもたらさないならば、第１表において例示的置換と称される、またはアミノ酸クラスに関してさらに下に記載されるような、より実質的な変化を導入し、得られる変異体ＡＬ−１を機能的活性について分析することができる。
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ＡＬ−１の安定性を改善するため、図２に開示されるアミノ酸配列に、挿入、除去、および置換的変化を施すことができる。例えば、トリプシンまたはその他のプロテアーゼ開裂部位を、アルギニンまたはリジン残基について、コードされているアミノ酸配列を調査することにより同定する。この残基を別の残基、好ましくはグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような疎水性残基に置換することにより；この残基を除去することにより；またはこの残基の直後にプロリル残基を挿入することにより、これらはプロテアーゼに対し不活性とされる。さらに、機能的活性のためのＡＬ−１の適正なコンホメーションの維持に関わっていない任意のシステイン残基を置換、一般にセリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。
図３は、ＡＬ−１配列の、他の配列との比較を示し、ＡＬ−１が新生のリガンドファミリーの新たな成員であることを示している。ＥＬＦ−１はＥｐｈ関連レセプターＨＥＫおよびＳＥＫのためのリガンドであり、ＡＬ−１と最も密接に関連している（５０.５％の一致）。Ｂ６１は４４２.９％の類似性を示し、ＥＨＫＬ−１、報告されているＥＨＫ−１／ＲＥＫ７のリガンドは４１.４％の一致を示す。したがって、突然変異のためのさらなる部位は、ＡＬ−１（またはＲＥＫ７）の種変異体中のＡＬ−１（または代わりにＲＥＫ７）では保存されているが、ＡＬ−１とｅｐｈファミリーの他のリガンドとの間、好ましくはＡＬ−１と少なくとも２つのリガンド、そしてより好ましくは少なくとも３つのリガンドとの間では保存されていない部位である。このような部位は、レセプターの特異性および選択性の調節のための候補部位である。
ＡＬ−１分子の共有結合的修飾もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、ＡＬ−１の標的アミノ酸残基を、選ばれたアミノ酸側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬と反応させることによって、共有結合的修飾をＡＬ−１中に導入する。
システイン残基は、最も一般的にはα−ハロアセタート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応によっても、誘導体化される。
ヒスチジン残基はｐＨ５.５−７.０でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジン側鎖に対し相対的に特異的であるためである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は好ましくは０.１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６.０で実施する。
リジンおよびアミノ末端残基は無水琥珀酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬は、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミダート；燐酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２,４−ペンタンジオン；およびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応を包含する。
アルギニン残基は１または数種の常套的試薬との反応により修飾され、それらの中にはフェニルグリオキサル、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫaのため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同時にリジンの基とも反応するかも知れない。
チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入に特段の興味を伴って行われる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシン残基は、ラジオイムノアッセイに使用するための標識化蛋白を製造するために125Ｉまたは131Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が適当である。
カルボキシ側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）［式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である］、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。
二価の試薬による誘導体形成は、抗ＡＬ−１抗体の精製のための方法で使用するための、または治療用途のための、水不溶性支持体マトリックスまたは表面へのＡＬ−１の架橋にとって有用である。一般的に用いられる架橋剤は、例えば１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３,３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステル類を包含するホモ二価イミドエステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタンのような二価マレイミド類を包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体形成試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成する。別法として、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび米国特許第３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号；および４３３０４４０号に記載の反応性基質が、蛋白の固定化に使用される。
グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば、各々対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。別法としてこれらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。
その他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシ基のアミド化が包含される。クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、７９−８６頁（W.H.フリーマン・アンド・Ｃｏ.、１９８３）。ＡＬ−１はまた、米国特許第４１７９３３７号；４３０１１４４号；４４９６６８９号；４６４０８３５号；４６７０４１７号；または４７９１１９２号に開示される方法で、非蛋白ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類に共有結合する。
「ＡＬ−１アンタゴニスト」または「アンタゴニスト」とは、ＡＬ−１の機能的活性に対抗するまたはこれを妨害する物質を指す。
「細胞」、「宿主細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」は互換的に用いられ、これらの語は全て子孫を包含すると理解されるべきである。したがって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という語は、第一番目の対象細胞と、その培養が継代された回数に拘わらずそれから誘導された培養とを包含する。全ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異のために、ＤＮＡ内容が厳密に同一ではないかも知れないということもまた理解されるべきである。
「プラスミド」は、染色体外で、または宿主細胞の染色体の一部として、宿主細胞内で複製することのできるＤＮＡ分子であり、大文字および／または数字の前および／または後の小文字「ｐ」によって表記される。本発明における出発プラスミドは、市販品を入手できるか、無制限に一般に入手できるか、または本明細書に開示される係る入手可能なプラスミドから、そして／または公表されている方法に従って組み立てることができる。或る例においては、当業者には明らかであろうが、当分野において知られるその他のプラスミドを、本明細書に記載のプラスミドと互換的に使用することができる。
「調節配列」とは、特定の宿主細胞における機能的に結合したヌクレオチドコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物での発現に好適な調節配列は、例えば、複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止部位を包含する。真核生物での発現に好適な調節配列は、例えば複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを包含する。
「外因性」要素とは、その宿主細胞にとって外来性であるか、またはその宿主細胞にとってホモローガスではあるがその要素が通常見いだされない宿主細胞内の位置にある、要素を意味する。
ＤＮＡの「消化」とは、そのＤＮＡの或る位置でのみ作用する酵素を用いたＤＮＡの酵素的開裂を指す。このような酵素は制限酵素または制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、係る酵素が開裂するＤＮＡ内の部位は制限部位と呼ばれる。もしそのＤＮＡ内に複数の制限部位があると、消化は２またはそれ以上の線状化されたＤＮＡフラグメント（制限フラグメント）を産むであろう。本発明において使用される種々の制限酵素は市販品が入手でき、酵素製造者により確立されたそれらの反応条件、補助因子、およびその他の要件が用いられる。制限酵素は一般に、それぞれの制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字とその後の他の文字、そして次に特定の酵素を指定する数字から成る略語によって表記される。一般に、ＤＮＡ約１μｇが、緩衝溶液約２０μｌ中約１−２単位の酵素で消化される。特定の制限酵素のための適当な緩衝液および基質量は、製造者により明記されており、そして／または当分野において良く知られている。
制限消化物からのＤＮＡの所定のフラグメントの「回収」または「分離」は、典型的には、電気泳動によりポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上で消化生成物（これを「制限フラグメント」と称する）を分離し、既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度に対する、その移動度を基にして、目的フラグメントを同定し、所望フラグメントを含有するゲル部分を切り取り、そしてそのＤＮＡを例えば電気溶出によりゲルから分離することによって達成される。
「ライゲーション」とは、二つの二本鎖ＤＮＡフラグメントの間にホスホジエステル結合を形成させる工程を指す。別途記載の無い限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件を用い、ライゲーションされるべきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメント０.５μｇに付き１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて達成される。
「オリゴヌクレオチド」とは、エンゲルス等、Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.、２８巻７１６−７３４頁（１９８９）に記載されるような既知の方法（例えば、トリエステル、ホスホルアミダイト、またはホスホナート化学を含む）によって化学合成される、短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。
本明細書中使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは一般に、米国特許第４６８３１９５号に記載のように、所望のヌクレオチド配列のインビトロでの増幅のための方法を指す。一般にＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、プライマー伸長合成の反復サイクルを含む。典型的にはＰＣＲ法で用いられるプライマーは、鋳型内部のヌクレオチド配列と両端で相補的であり、または増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているであろうが、増幅されるべきヌクレオチド配列に対し相補的なプライマーを使用することもできる。ワング等、ＰＣＲプロトコルズ、７０−７５頁（アカデミック・プレス、１９９０）；オッホマン等、ＰＣＲプロトコルズ、２１９−２２７頁；トリグリア等、Nuc.Acids Res.、１６巻８１８６頁（１９８８）。
「ＰＣＲクローニング」とは、全ゲノムＤＮＡおよび細胞の全ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを包含する、適当な細胞または組織供給源由来の核酸中に存在する特定の所望ヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲ法の使用を指す。フローマン等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８５巻８９９８−９００２頁（１９８８）；サイキ等、Science、２３９巻４８７−４９２頁（１９８８）；ミュリス等、Meth.Enzymol.、１５５巻３３５−３５０頁（１９８７）。
核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングのための「緊縮条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば５０℃で０.０１５Ｍ ＮａＣｌ／０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用し、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば、０.１％牛血清アルブミン／０.１％フィコール／０.１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.５）と共に５０％（容量／容量）ホルムアミドを４２℃で使用する条件である。別の例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０.７５Ｍ ＮａＣｌ、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％ピロ燐酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０.１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０.２ｘＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ中４２℃で洗浄するものである。
「ＡＬ−１核酸」は、ＡＬ−１をコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。「ＡＬ−１ ＤＮＡ」は、ＡＬ−１をコードしているＤＮＡである。ＡＬ−１ ＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、またはインビトロ合成によって得られる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中、または様々なＤＮＡから成る他の何らかの混合物中のＡＬ−１ ＤＮＡの同定は、放射性同位元素のような検出可能な原子団で標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用によって簡便に達成される。ケラー等、ＤＮＡプローブズ、１４９−２１３頁（ストックトン・プレス、１９８９）。ＡＬ−１をコードしているＤＮＡを同定するためには、好ましくはハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列を、このハイブリダイゼーションプローブが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で、図２に開示されるＡＬ−１アミノ酸配列または本明細書に記載のその変異体もしくは誘導体をコードしているＤＮＡと優先的にハイブリダイズできるように選択する。ＡＬ−１核酸を取得するもう一つの方法は、例えばエンゲルス等、Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.、２８巻７１６−７３４頁（１９８９）により記載された方法の１つを用いてこれを化学合成することである。
例えばＤＮＡ配列決定または制限エンドヌクレアーゼ分析により決定されたＡＬ−１のヌクレオチドコード化配列全体が、単一のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはその他のＤＮＡで得られない場合、適当なＤＮＡフラグメント（例えば制限フラグメントまたはＰＣＲ増幅産物）を幾つかのＤＮＡから回収し、互いに共有結合させてコード化配列全体を組み立てることができる。ＤＮＡフラグメントを共有結合させる好ましい手段は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼ酵素を使用するライゲーションによるものである。
「分離された」ＡＬ−１核酸とは、他のポリペプチドをコードしている混入核酸から同定および分離された（または他のやり方で実質上それらが除去された）ＡＬ−１核酸である。分離されたＡＬ−１核酸はプラスミドまたは発現ベクター中に組み込まれ、または、本明細書の診断検定および核酸ハイブリダイゼーション法の論考でさらに記載されているような標識を使用して、診断およびプローブ目的のために標識化することができる。
例えば、分離されたＡＬ−１ ＤＮＡ、または少なくとも約１５ヌクレオチドを含むそのフラグメントは、ニューロンの損傷に起因するようなＡＬ−１発現の変化を含む異常または疾病を検出、診断、または監視するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用される。本発明の一つの態様において、患者（即ち人間またはその他の哺乳動物）由来の組織試料中の全ＲＮＡを、ＡＬ−１メッセンジャーＲＮＡの存在について検定することができ、ここでＡＬ−１メッセンジャーＲＮＡ量の減少はニューロンの変性を示す。
分離されたＡＬ−１核酸はまた、組換えＤＮＡおよび組換え細胞培養法によりＡＬ−１を産生させるのに使用される。本発明の様々な態様においては、宿主細胞を、分離されたＡＬ−１ ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトし、このＡＬ−１ ＤＮＡの発現を得、したがって大量のＡＬ−１の産生が得られる。ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体をコードしているＤＮＡは当分野で知られる様々な方法によって製造される。これらの方法は、天然供給源からの分離（ＡＬ−１の天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）または位置指定（またはオリゴヌクレオチド仲介）突然変異誘発による製造、ＰＣＲ突然変異誘発、および先に製造されたＡＬ−１の変異体または非変異体型をコードしているＤＮＡのカセット突然変異誘発を包含するが、これらに限定される訳ではない。
位置指定突然変異誘発は、ＡＬ−１ ＤＮＡの置換、除去、および挿入変異体の製造のための好ましい方法である。この技術は、当分野において周知であり、ゾラー等、Meth.Enz.、１００巻４６６８−５００頁（１９８３）；ゾラー等、Meth.Enz.、１５４巻３２９−３５０頁（１９８７）；カーター、Meth.Enz.、１５４巻３８２−４０３頁（１９８７）；ホルウィッツ等、Meth.Enz.、１８５巻５９９−６１１頁（１９９０）、例えば、その変異体が或る望ましい機能的性質を持っている、トリプシンおよびＴ４リゾチームのアミノ酸配列変異体の生成に使用されている。ペリー等、Science、２２６巻５５５−５５７頁（１９８４）；クレイク等、Science、２２８巻２９１−２９７頁（１９８５）。
簡潔に述べると、ＡＬ−１ ＤＮＡの位置指定突然変異誘発を実施する際には、まず、所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＡＬ−１ ＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズすることにより、このＡＬ−１ ＤＮＡを変化させる。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＡＬ−１ＤＮＡの一本鎖を鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼを使用して第二の鎖全体を合成する。このようにして所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドが、得られる二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、任意の適当な方法、例えば天然に存在するＤＮＡの精製またはインビトロ合成によって製造できる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ナラング等、Meth.Enzymol.、６８巻９０−９８頁（１９７９）；ブラウン等、Meth.Enzymol.、６８巻１０９−１５１頁（１９７９）；カルーサー等、Meth.Enzymol.、１５４巻２８７−３１３頁（１９８５）により記載されるような様々な有機化学技術を用いて容易に合成される。好適なハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーを選択するための一般的アプローチは良く知られている。ケラー等、ＤＮＡプローブズ、１１−１８頁（ストックトン・プレス、１９８９）。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーは１０−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含み、そして、このオリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子と優先的にハイブリダイズすることが確実となるよう、所望の突然変異をコードしている配列の両側に少なくとも５個のヌクレオチドを含むであろう。
図２に開示されるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸残基の挿入、除去、または置換の幾つかをまたは組み合わせを含むＡＬ−１のアミノ酸配列変異体を生成するため、ＡＬ−１ ＤＮＡに複数の突然変異を導入する。突然変異させるべき部位が接近している場合、突然変異は、所望の突然変異の全てをコードしている一つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に導入することができる。しかしながら、もし突然変異させるべき部位が互いに幾らかの距離をおいて位置している（約１０ヌクレオチド以上離れている）と、所望の変化の全てをコードしている１個のオリゴヌクレオチドを作成することは、より困難である。その代わりに、二つの別法のうち一つを利用することができる。
第一の方法では、所望の突然変異各々のための別々のオリゴヌクレオチドを作成する。次いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすると、その鋳型から合成される第二のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードしているであろう。
これに代わる方法は、所望の突然変異を産むための２回またはそれ以上の突然変異誘発を含むものである。第一回目は単一の突然変異の導入について記載された通りである：前に製造されたＡＬ−１ ＤＮＡの一本鎖を鋳型に使用し、第一の所望突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、するとヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。第二回目の突然変異誘発は、第一回目の突然変異誘発で作成された突然変異したＤＮＡを鋳型として利用する。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。そこで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、得られたＤＮＡの鎖はその結果、第一回目および第二回目両方の突然変異誘発由来の突然変異をコードしていることになる。この得られたＤＮＡは第三回目の突然変異誘発で鋳型として使用することができ、以下同様である。
ＰＣＲ突然変異誘発もまたＡＬ−１のアミノ酸配列変異体の作成に好適である。ヒグチ、ＰＣＲプロトコルズ、１７７−１８３頁（アカデミック・プレス、１９９０）；ヴァレット等、Nuc.Acids Res.、１７巻７２３−７３３頁（１９８９）。簡潔に述べると、少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲでの出発物質として使用する時、鋳型ＤＮＡの対応領域と僅かに異なる配列のプライマーを用いて、そのプライマーが鋳型と相違している位置でのみ鋳型配列と異なっている比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、例えば、一方のプライマーは突然変異の位置に一部重複し且つその突然変異を含むように設計し；他方のプライマーの配列は、プラスミドＤＮＡの反対の鎖の中のヌクレオチド配列と一致させねばならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は、プライマーにより境界を与えられるＤＮＡの増幅された領域全体が最終的に容易に配列決定されるよう、第一プライマーの配列の２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好ましい。今記載したようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そして鋳型の複製は多少誤りが起こり易いので事によるとその他の位置で相違するＤＮＡフラグメントの集団を生成する。ワグナー等、ＰＣＲトピックス、６９−７１頁（シュプリンガー−フェアラーク、１９９１）。
増幅されたＤＮＡ生成物に対する鋳型の比が極端に低い場合、生成物のＤＮＡフラグメントの大多数に所望の突然変異（群）が組み込まれる。この生成物ＤＮＡは、標準的組換えＤＮＡ法を用いて、ＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応領域を置き換えるのに使用される。別々の位置にある突然変異は、突然変異体第二プライマーを使用することにより、または、異なる突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを行い、得られた二つのＰＣＲフラグメントを三部（またはそれ以上の）ライゲーションでプラスミドフラグメントに同時にライゲーションすることによって同時に導入することができる。
変異体を製造するためのもう一つの方法、カセット突然変異誘発は、ウェルズ等、Gene、３４巻３１５−３２３頁（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物質は、突然変異させようとするＡＬ−１ ＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。突然変異させるＡＬ−１ ＤＮＡ中のコドンを特定する。特定された突然変異部位の両側には特異な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合は、それらをＡＬ−１ ＤＮＡ中の適当な位置に導入するための上記オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発法を用いてそれらを作り出すことができる。このプラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードしており所望の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準法を用いて合成するが、ここでは、２本のオリゴヌクレオチド鎖を別々に合成し、次いで標準技術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションできるよう、線状化されたプラスミドの末端と適合する５’および３’末端を有するよう設計される。その結果このプラスミドは突然変異したＡＬ−１ ＤＮＡ配列を含むことになる。
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはインビトロ合成の産物の如何に拘わらず、ＡＬ−１ ＤＮＡは、さらなるクローニングのためまたは発現のために、複製可能なベクター中にライゲーションされる。「ベクター」とは、宿主細胞内部で自立的に複製可能なプラスミドまたはその他のＤＮＡであって、それ自体、適合し得る宿主細胞（ベクター−宿主系）に関連した二つの機能を果たすのに有用である。一つの機能は、ＡＬ−１をコードしている核酸のクローニングを容易にする、即ち使用し得る量の核酸を生成させることである。別の機能は、ＡＬ−１の発現を指令することである。これらの機能の片方または両方は、ベクター−宿主系により実行される。ベクターは、それらが果たす機能ならびにクローニングまたは発現のために共に使用される宿主細胞に応じて異なった成分を含むであろう。
ＡＬ−１を産生するため、発現ベクターは上記のようにＡＬ−１をコードしている核酸を含むであろう。本発明に係るＡＬ−１は、組換え細胞培養中で直接的に、またはヘテロローガスなポリペプチド、好ましくはシグナル配列、またはヘテロローガスポリペプチドとＡＬ−１との間の結合位置に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドとの融合物として発現される。
組換え宿主細胞発現の一つの例において、哺乳動物細胞をＡＬ−１ ＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトし、そしてそれによりコードされたＡＬ−１を、組換え宿主細胞が生育している培養基から回収する。しかし、本明細書に開示される発現ベクターおよび方法は、広範な原核生物および真核生物にわたる使用に好適である。
原核生物は、本発明において有用なＤＮＡの最初のクローニングおよびベクターの組み立てに使用することができる。しかし、原核生物は、ＡＬ−１をコードしているＤＮＡの発現にも使用することができる。原核生物宿主細胞中で産生されるポリペプチドは典型的にはグリコシル化されていないであろう。
宿主細胞に適合し得る種から誘導された複製起点およびその他の調節配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターを、分離されたＤＮＡのクローニングまたは発現のために、原核生物宿主細胞と共に使用する。例えば、大腸菌は典型的には、ｐＢＲ３２２、大腸菌種から誘導されるプラスミドを用いて形質転換する。ボリヴァー等、Gene、２巻９５−１１３頁（１９８７）。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を持っており、その結果、このプラスミドにより形質転換された細胞は、容易に同定または選択することができる。それが発現ベクターとしての役割を有するためには、ｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他のプラスミドもしくはウイルスベクターは、さらに、プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を提供するよう宿主細胞中で機能する、プロモーターを含むか、または含むよう修飾されねばならない。ランガグワラ等、Bio/Technology、９巻４７７−４７９頁（１９９１）。
原核生物に加えて真核微生物、例えば酵母もまた本発明において有用なＤＮＡのクローニングまたは発現のための宿主として使用することができる。サッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母は、最も一般的に使用される真核微生物である。所望のＤＮＡを酵母細胞中でクローニングまたは発現させるために役立つプラスミドは良く知られており、酵母細胞中でｍＲＮＡ転写物を生成するよう機能する様々なプロモーターもまた良く知られている。
さらに、多細胞生物から誘導される細胞もまた本発明に有用なＤＮＡのクローニングまたは発現のための宿主として使用することができる。哺乳動物細胞が最も一般的に使用され、このような細胞をインビトロで維持し増殖させる方法（この方法は一般に組織培養と呼ばれる）は良く知られている。クルースおよびパターソン編、ティシュー・カルチャー（アカデミック・プレス、１９７７）。有用な哺乳動物細胞の例は、２９３、ＨｅＬａ、およびＷＩ−３８のようなヒトセルライン、ＣＯＳ−７およびＶＥＲＯのようなサルセルライン、ならびにＢＨＫ−２１およびＣＨＯのようなハムスターセルラインであり、これらは全てアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックヴィル、メリーランド、２０８５２、ＵＳＡから一般に入手し得る。
クローニングベクターとは異なり発現ベクターは、宿主生物により認識され且つＡＬ−１核酸と機能的に結合しているプロモーターを含んでいなければならない。プロモーターは、遺伝子の開始コドンの上流に位置し、その遺伝子の転写（即ちｍＲＮＡの合成）を調節する、非翻訳配列である。プロモーターは、典型的には、誘導性および構成性という二つのクラスに分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件の若干の変化、例えば栄養素の存在もしくは不在または温度変化に応答してそれらの調節下にＤＮＡの高レベルの転写を開始するプロモーターである。
ＡＬ−１ ＤＮＡと機能的に結合して宿主細胞におけるＡＬ−１の発現を達成することのできるプロモーターが多数知られている。天然に存在するＡＬ−１ＤＮＡに付随するプロモーターが使用できないという訳ではない。しかし、ヘテロローガスなプロモーターは一般に、大量の転写と高収量の発現ＡＬ−１をもたらすであろう。
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター、ゲッデル等、Nature、２８１巻５４４−５４８頁（１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ゲッデル等、Nuc.Acids Res.、８巻４０５７−４０７４頁（１９８０）、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター、デボーア等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８０巻２１−２５頁（１９８３）が包含される。しかしながら他の既知の細菌プロモーターもまた好適である。それらのヌクレオチド配列は公表されており（ジーベンリスト等、Cell、２０巻２６９−２８１頁（１９８０））、それにより、当業者は、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーおよびアダプターを用いて、ＡＬ−１をコードしているＤＮＡにそれらを機能的にライゲーションすることができる。ウー等、Meth.Enz.、１５２巻３４３−３４９頁（１９８７）。
酵母宿主と共に使用するための好適なプロモーターは、３−ホスホグリセラートキナーゼ、ヒッツェマン等、J.Biol.Chem.、２５５巻１２０７３−１２０８０頁（１９８０）；キングズマン等、Meth.Enz.、１８５巻３２９−３４１頁（１９９０）、またはその他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。ドドゥソン等、Nuc.Acids Res.、１０巻２６２５−２６３７頁（１９８２）；エムル、Meth.Enz.、１８５巻２３１−２７９頁（１９９０）。
哺乳動物細胞において有用な発現ベクターは、典型的にはウイルスから誘導されるプロモーターを包含する。例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導されるプロモーターが一般に使用される。さらに、組換えＤＮＡ発現のために用いられる特定の宿主細胞において調節配列が機能的であるならば、ＡＬ−１をコードしている天然に存在するＤＮＡに付随するプロモーターまたはその他の調節配列を利用することも可能であり、そしてこれがしばしば望ましい。
プロモーターに加えて発現ベクター中に望まれるその他の調節配列はリボソーム結合部位であり、そして真核生物宿主細胞と共に使用される発現ベクターの場合は、エンハンサーである。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写のレベルを増大させる、通常約１０−３００ｂｐの、ｃｉｓ作動要素のＤＮＡである。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリンの遺伝子）。しかしながら、典型的には、使用されるエンハンサーは真核細胞ウイルス由来のエンハンサーであろう。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。クリーグラー、Meth.Enz.、１８５巻５１２−５２７頁（１９９０）。
発現ベクターはさらに、転写の終止およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定化に必要な配列を含むであろう。バルバス等、Meth.Enz.、１８５巻１４−３７頁（１９９０）；レヴィンソン、Meth.Enz.、１８５巻４８５−５１１頁（１９９０）。真核生物宿主細胞と共に使用される発現ベクターの場合、このような転写終止配列は、真核生物のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域から取得することができる。これらの領域は、ポリアデニル化部位および転写終止部位を含んでいる。バーンステイル等、Cell、４１巻３４９−３５９頁（１９８５）。
一般に、調節配列は、特定の宿主細胞において機能的に結合したコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列である。「発現」とは、転写および／または翻訳を指す。「機能的に結合」とは、酵素的ライゲーションまたはその他の手段によって、２またはそれ以上のＤＮＡ配列が、その配列の正常な機能が遂行され得るような、互いに対するコンフィギュレーションに、共有結合的に連結していることを指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしこれがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば、そのポリペプチドのＤＮＡと機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、もしこれがその配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列と機能的に結合しており；または、リボソーム結合部位は、もしこれが翻訳を促進するように位置しているならば、コード化配列と機能的に結合している。一般に、「機能的に結合」とは、結合しているＤＮＡ配列が連続しており、そして、分泌リーダーの場合は、連続し且つ読み取り相内にある。結合は、簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。もしこのような部位が存在しないならば、標準的組換えＤＮＡ法と共に合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
発現およびクローニングベクターはまた、１またはそれ以上の選択された宿主細胞でそのベクターを複製可能とする配列を含んでいるであろう。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、ベクターが宿主染色体とは独立して複製することを可能にする配列であって、複製起点または自立的に複製する配列を包含する。このような配列は、様々な細菌、酵母、およびウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は殆どのグラム陰性菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に好適であり、そして様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、またはアデノウイルス由来）が、哺乳動物細胞でのベクターのクローニングに有用である。殆どの発現ベクターが「シャトル」ベクターである。即ちこれらは、少なくとも一つのクラスの生物で複製することができるが、発現のため別の生物中にトランスフェクトされ得る。例えば、或るベクターは大腸菌中でクローニングされ、次いでその同じベクターが、たとえそれが宿主細胞染色体と独立して複製できなくても、発現のため酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。
発現ベクターはまた、増幅可能な遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のコード化配列を含む遺伝子を含み得る。ＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターを含む細胞は、メソトレキサート、ＤＨＦＲの競合的拮抗物質の存在下で培養することができる。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピーの合成が導かれ、同時に該発現ベクターを含む別のＤＮＡ配列、例えばＡＬ−１をコードしているＤＮＡ配列の多数のコピーが導かれる。リンゴールド等、J.Mol.Apl.Genet.、１巻１６５−１７５頁（１９８１）。このようなやり方で、この細胞により産生されるＡＬ−１のレベルを増大させることができる。
発現ベクターによりコードされているＤＨＦＲ蛋白は、トランスフェクションの成功のための選択マーカーとして使用することもできる。例えば、形質転換前の宿主細胞がＤＨＦＲ活性を欠く場合、ＡＬ−１およびＤＨＦＲ蛋白をコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターによる形質転換の成功は、メソトレキサートを含有する培地中での細胞の生育によって決定することができる。さらに、ＡＬ−１、ＤＨＦＲ蛋白、およびアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換された哺乳動物細胞は、カナマイシンまたはネオマイシンのようなアミノグリコシド抗生物質を含有する培地中での細胞の生育によって決定することができる。真核生物細胞は通常、内因性ＡＰＨ活性を発現しないため、一般にｎｅｏ「遺伝子と呼称されるＡＰＨ蛋白をコードしている遺伝子は、ベクターによりトランスフェクトされた細胞が容易に同定または選択され得る、優れた選択マーカーとして、広範な真核生物宿主細胞において使用することができる。ジミネツ等、Nature、２８７巻８６９−８７１頁（１９８０）；コルベーレ−ガラピン等、J.Mol.Biol.、１５０巻１−１４頁（１９８１）；オカヤマおよびバーグ、Mol.Cell.Biol.、３巻２８０−２８９頁（１９８３）。
ＡＬ−１を発現する組換え宿主細胞を同定し分離するために使用できるその他の多くの選択マーカーが知られている。例えば、酵母での使用に好適な選択マーカーは、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。スティンチコウム等、Nature、２８２巻３９−４３頁（１９７９）；キングズマン等、Gene、７巻１４１−１５２頁（１９７９）；チェンパー等、Gene、１０巻１５７−１６６頁（１９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ.４４０７６またはＰＥＰ４−１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、２０８５２、ＵＳＡから入手可能）のための選択マーカーを提供する。ジョーンズ、Genetics、８５巻１２頁（１９７７）。そうすると、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファンの不在下で増殖させることによる形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣ Ｎｏ.２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
ＡＬ−１をコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞での一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明において特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによりコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率的に複製され得る発現ベクターを使用することを含む。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。ヤング等、Cell、４７巻３−１０頁（１９８６）；ウォング等、Science、２２８巻８１０−８１５頁（１９８５）；リー等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８２巻４３６０−４３６４頁（１９８５）。よって、一過性発現系は、ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体をコードしているＤＮＡを発現させるための本発明において、機能的に活性な変異体を同定するために特に有用である。
ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体の性質を前もって予測することはしばしば困難であるため、機能的に活性な変異体を同定するために、このような変異体の何らかのスクリーニングが必要であることは理解できるであろう。このようなスクリーニングは、レセプター結合のための常套的検定、または軸索の生長もしくは発達のための検定を用いて、または機能的に活性なＡＬ−１であるＡＬ−１に選択的に結合するモノクローナル抗体、例えばＡＬ−１の活性部位またはレセプター結合部位に選択的に結合するモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイを用いて、インビトロで実施することができる。
本明細書中使用される「形質転換」および「トランスフェクション」という語は、プラスミドまたは発現ベクターのような所望の核酸を宿主細胞中に導入する工程を指す。宿主細胞の性質に応じて様々な形質転換およびトランスフェクションの方法が利用できる。大腸菌細胞の場合、最も一般的な方法は、この細胞を塩化カルシウムおよび他の塩類の水溶液で処理することを含む。哺乳動物細胞の場合、最も一般的な方法は、燐酸カルシウムまたはＤＥＡＥデキストラン、または電気穿孔により仲介されるトランスフェクションである。サムブルック等編、モレキュラー・クローニング、１.７４−１.８４頁および１６.３０−１６.５５頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）。形質転換またはトランスフェクションの後、所望の核酸を宿主細胞ゲノム中に統合し、または染色体外要素として存在させることができる。
上記プラスミドおよび発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトさせた宿主細胞は、プロモーターの誘導または薬物耐性もしくはその他の何らかの選択マーカーもしくは表現型について選択するのに適当であるよう修飾された常套的栄養培地で培養する。温度、ｐＨ等といったような培養条件は、場合によってはクローニングまたは発現に用いられた宿主細胞の培養にかつて使用された条件が適当であり、当業者には明白であろう。
本明細書に記載のベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、ならびに、昆虫、脊椎動物、および哺乳動物宿主細胞を包含する高等真核生物細胞である。適当な原核生物は、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性菌、例えば大腸菌、Ｂ.サブティリスのようなバシルス種、Ｐ.アエルギノーサのようなシュードモナス種、サルモネラ・ティフィムリウム、またはセラティア・マルセスキャンスを包含する。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、ＡＬ−１をコードしているベクターのための好適な宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、幾つかのその他の属、種、および菌株、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（ビーチおよびナース、Nature、２９０巻１４０−１４２頁（１９８１））、ピチア・パストリス（クレッグ等、Bio/Technology、５巻４７９−４８５頁（１９８７）；スリークリシュナ等、Biochemistry、２８巻４１１７−４１２５頁（１９８９））、ニューロスポラ・クラッサ（ケイス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７６巻５２５９−５２６３頁（１９７９））、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ.ニデュランス（バランス等、Biochem.Biophys.Res.Commun.、１１２巻２８４−２８９頁（１９８３）；ティルバーン等、Gene、２６巻２０５−２２１頁（１９８３）；イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻１４７０−１４７４頁（１９８４））およびＡ.ニガー（ケリー等、EMBO J.、４巻４７５−４７９頁（１９８５））もまた一般に利用でき且つ本発明において有用である。
ＡＬ−１の発現のための好適な宿主細胞が、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活動が可能である。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養由来の如何に拘わらず、任意の高等真核生物細胞培養が使用可能である。しかしながら、グリコシル化の、種−、組織−、および細胞−特異性（ラドマッチャー等、Ann.Rev.Biochem.、５７巻７８５−８３８頁（１９８８））のため、外来宿主細胞中でのＡＬ−１のグリコシル化の程度またはパターンは、典型的には、天然に発現される細胞から得られるＡｌ−１のそれとは異なるであろう。
無脊椎動物細胞の例には、昆虫および植物細胞が包含される。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリのような宿主からの対応する受容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。ラッコウ等、Bio/Technology、６巻４７−５５頁（１９８８）；ミラー等、Genetic Engineering、８巻２７７−２７９頁（プレナム・パブリッシング、１９８６）；マエダ等、Nature、３１５巻５９２−５９４頁（１９８５）。
綿花、トウモロコシ、馬鈴薯、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコといった植物細胞培養を宿主として利用できる。典型的には、ＡＬ−１ ＤＮＡを含むよう前もって変化させておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共にインキュベートすることにより、植物細胞をトランスフェクトする。Ａ.トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ＡＬ−１をコードしているＤＮＡが細胞中に移され、その結果細胞はトランスフェクトされ、そして適当な条件の下でＡＬ−１ ＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列、ならびにリブロース二燐酸カルボキシラーゼプロモーターのような植物細胞と適合し得る調節およびシグナル配列が利用できる。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻５６１−５７３頁（１９８２）。ヘレラ−エストレラ等、Nature、３１０巻１１５−１２０頁（１９８４）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または増強することができる。欧州特許公開第ＥＰ３２１１９６号（１９８９年６月２１日公開）。
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、近年常套的手法となっている。クルースおよびパターソン編、ティシュー・カルチャー（アカデミック・プレス、１９７３）。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓ライン２９３（または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）、グラハム等、J.Gen Virol.、３６巻５９−７２頁（１９７７）；ハムスター幼体腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞、ウアラウプ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６−４２２０頁（１９８０）を包含；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー、Biol.Reprod.、２３巻２４３−２５１頁（１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス胸部腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（マザー等、Annals N.Y.Acad.Sci.、３８３巻４４−６８頁（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌ライン（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
ＡＬ−１をコードしているヌクレオチド配列および適当な調節配列を含む適切なベクターの組み立ては、標準的組換えＤＮＡ法を使用する。ＤＮＡはフラグメントに開裂し、整え、そして必要なベクターの生成にとって望ましい形にライゲーションする。
組み立てられたベクター中に正しい配列を確認する分析のために、ベクターを、制限消化によって（予想された制限エンドヌクレアーゼがベクター中に存在することを確認するため）、そして／またはサンガー等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、７２巻３９１８−３９２１頁（１９７９）のジデオキシ鎖終止法による配列決定によって分析する。
本発明に係るＡＬ−１の産生に使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムのＦ１０（シグマ）、最少必須培地（ＭＥＭ、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）のような市販品が入手できる培地が、この宿主細胞の培養に適している。加えて、ハム等、Meth.Enz.、５８巻４４−９３頁（１９７９）；バーンズ等、Anal.Biochem.、１０２巻２５５−２７０頁（１９８０）；ボッテンシュタイン等、Meth.Enz.、５８巻９４−１０９頁（１９７９）；米国特許第４５６０６５５号；４６５７８６６号；４７６７７０４号；または４９２７７６２号；またはＰＣＴ特許公開第ＷＯ９０／０３４３０号（１９９０年４月５日公開）に記載される任意の培地が、この宿主細胞のための培養基として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質、微量元素（最終濃度が通常マイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて添加することができる。他の必要な添加物もまた、当業者により知られる適当な濃度で含有させることができる。温度、ｐＨ等といった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞についてかつて用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。
本明細書中で言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞および、例えば移植またはインプラントの結果として宿主動物内にある細胞を包含する。
さらに、本発明に係るＡＬ−１は、例えばＰＣＴ特許公開第ＷＯ９１／０６６６７号（１９９１年５月１６日公開）に記載のホモローガスな組換えによって生産することができるということが考えられる。簡潔に述べると、この方法は、ＡＬ−１をコードしている内因性遺伝子を含む細胞をホモローガスなＤＮＡで形質転換することを含み、このホモローガスなＤＮＡは、（１）増幅可能な遺伝子、例えばＤＨＦＲ、および（２）少なくとも約１５０塩基対長の、少なくとも１個の隣接する（フランキング）配列（これはＡＬ−１をコードしている遺伝子の内部または近位にある細胞ゲノム中のヌクレオチド配列とホモローガスである）、を含む。形質転換は、ホモローガスなＤＮＡが組換えにより細胞ゲノム中に統合するような条件下に実施する。次に、ホモローガスＤＮＡを統合した細胞を、増幅可能な遺伝子の増幅を選択する条件に付し、それによりＡＬ−１が同時に増幅される。次いで、得られた細胞を所望量のＡＬ−１の産生についてスクリーニングする。ＡＬ−１をコードしている遺伝子の近位にあるフランキング配列は、例えば図２に開示されるＡＬ−１ヌクレオチド配列を出発点として使用する、ゲノム歩行の方法によって容易に同定される。スポアレル等、Meth.Enz.、１５２巻５９８−６０３頁（１９８７）。
遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、例えば、本明細書に提供される配列に基づき、適当に標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ＤＮＡを定量する常套的サザンブロッティング、またはｍＲＮＡを定量するノーザンブロッティングにより、試料中で直接測定することができる。様々な標識が使用され、最も一般的には放射性同位元素、特に32Ｐが使用され得る。しかし、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドを使用するといった、その他の技術もまた使用できる。次いでビオチンは、アビジンまたは抗体への結合部位として働き、これらは放射性同位元素、発蛍光団、発色団等のような多岐にわたる標識を用いて標識することができる。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−蛋白二本鎖を包含する特異的な二本鎖を認識することのできる抗体を使用することができる。次にこの抗体を標識し、検定を実施するが、ここで、この二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面に二本鎖が形成されると、この二本鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
別法として、遺伝子の発現は、遺伝子産物ＡＬ−１の発現を直接定量するための、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定といったような免疫学的方法によって測定することができる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定によって細胞試料を調製し、次いで、結合した遺伝子産物に特異的な標識化抗体と反応させるが、ここで通常この標識は、酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等のように視覚的に検出可能である。本発明での使用に好適な、特に感受性の高い染色技術は、シュー等、Am.J.Clin.Path.、７５巻７３４−７３８頁（１９８０）に記載されている。試料液の免疫組織化学的染色および／または検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれであってもよい。この抗体は、簡便には、本明細書に提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。
ＡＬ−１は、宿主細胞溶菌液から回収することもできるが、好ましくは分泌されたポリペプチドとして培養基から回収する。それが産生される宿主細胞の夾雑蛋白またはポリペプチドを実質上含まないＡＬ−１を得るためには、付随しているかも知れない夾雑物質に比較して異なるＡＬ−１の物理的性質に基づき、ＡＬ−１を精製することが必要である。例えば第一段階として、培養基または溶菌液を遠心して粒状の細胞残屑を除去する。その後、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱化、ゲル濾過（分子排除クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、および／またはゲル電気泳動により、ＡＬ−１を、混在する可溶性蛋白およびポリペプチドから精製する。例えば、ＡＬ−１は、実施例５に記載されるように、ＲＥＫ７−ＩｇＧ樹脂（樹脂材料に結合させたＲＥＫ７−ＩｇＧを含む）を用いる免疫親和クロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＰＩ膜アンカーの除去で生成された、分泌された可溶性ＡＬ−１の挙動は、実施例に説明されるように、そのレセプターに結合するもののレセプターを活性化しないことから、アンタゴニストの一例である。対照的に、ＡＬ−１細胞外ドメインがＩｇＧ Ｆｃ領域と融合した、分泌された可溶性ＡＬ−１−ＩｇＧは、ＡＬ−１アゴニストとして挙動する。
ＡＬ−１のアミノ酸配列変異体および誘導体は、そのＡＬ−１に顕著な特徴または物理的性質があればそれを考慮に入れて、同じやり方で回収する。例えば、ＡＬ−１と、細菌またはウイルス抗原のような他の蛋白またはポリペプチドとを含む融合蛋白の場合、その抗原に対する抗体を含む免疫親和カラムを使用することにより、かなりの程度の精製が達成され得る。いずれにせよ、当業者は、天然に存在するＡＬ−１に適する精製法は、組換え宿主細胞において産生されたＡＬ−１またはその変異体もしくは誘導体の性質の変化を考慮した修飾を必要とすることが理解できるであろう。
本発明に従って生成されたＡＬ−１の純度は、当分野で良く知られる方法に従って、例えば分析用ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動、イムノアッセイ、またはアミノ酸組成または配列分析電気泳動に従って測定される。好ましくは、ＡＬ−１は、実質上他の蛋白を含まなくなる程度まで精製する。治療用途のためには、精製されたＡＬ−１は９９％以上のＡＬ−１であり、したがって、精製されたＡＬ−１組成物には非ＡＬ−１蛋白が総蛋白の１％未満含まれるであろう。
ＡＬ−１は、抗ＡＬ−１抗体を作製するための免疫原として使用できる。ＡＬ−１に特異的に結合するこのような抗体は、例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、または競合型レセプター結合検定、放射性レセプター検定、および親和精製技術における標準として使用するために、精製ＡＬ−１を標識することにより、ＡＬ−１のための検定の標準として有用である。通常、抗ＡＬ−１抗体は、少なくとも約１０6Ｌ／モル、好ましくは少なくとも約１０7Ｌ／モルの親和性でＡＬ−１と結合するであろう。
ＡＬ−１に対して作製されたポリクローナル抗体は一般に、ＡＬ−１およびアジュバントを複数回皮下または腹腔内注射することにより、動物において作製される。ＡＬ−１またはそのペプチドフラグメントを、二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介するコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である］を用いて、免疫される種において免疫原性である担体蛋白、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターとコンジュゲートさせることが有用であるかも知れない。
動物は、コンジュゲート１ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と合し、この溶液を複数部位に皮内注射して、ＡＬ−１−担体蛋白コンジュゲートで免疫する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、抗ＡＬ−１抗体価について血清を検定する。動物は、抗体価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じＡＬ−１のコンジュゲートで、但し異なった担体蛋白を用い、そして／または異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートでの注射によって追加免疫する。ＡＬ−１および適当な担体蛋白とのコンジュゲートはまた、融合蛋白として組換え細胞培養中で製造することもできる。さらに、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために使用される。
ＡＬ−１に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインにより抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、コーラー等、Nature、２５６巻４９５−４９７頁（１９７５）の最初のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、コズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁（１９８４）；ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ.、ニューヨーク、１９８７）が包含される。
本発明に係るモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する（キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号；モリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻６８５１−６８５５頁（１９８４））。
好ましい態様において、キメラ抗ＡＬ−１抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。
ヒト化は当分野で知られる方法（ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁（１９８６）；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２７頁（１９８８）；ベルホーエン等、Science、２３９巻１５３４−１５３６頁（１９８８））に従って、齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）でヒト抗体の対応領域を置換することにより、実施することができる。別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできる、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.Natl,Acad.Sci.、９０巻２５５１−２５５５頁（１９９３）；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５−２５８頁（１９９３）；ブラガーマン等、Year in Immuno.、７巻３３頁（１９３３）を参照されたい。ヒト抗体はさらにファージディスプレイライブラリーで産生させることもできる（フーゲンブーム等、J.Mol.Biol.、２２７巻３８１頁（１９９１）；マークス等、J.Mol.Biol.、２２２巻５８１頁（１９９１）。
診断適用のためには、抗ＡＬ−１抗体は典型的には検出可能な原子団で標識されるであろう。検出可能な原子団は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成できる任意のものとすることができる。例えば、検出可能な原子団は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのような放射性同位元素、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセンス化合物；例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射性同位元素標識、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であってよい。
デイヴィッド等、Biochemistry、１３巻１０１４−１０２１頁（１９７４）；ペイン等、J.Immunol.Meth.、４０巻２１９−２３１頁（１９８１）；およびバイアー等、Meth.Enz.、１８４巻１３８−１６３頁（１９９０）により記載の方法を包含する、抗体を検出可能な原子団に別々にコンジュゲートするための、当分野で知られる任意の方法を使用することができる。
抗ＡＬ−１抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接および間接サンドイッチ検定、および免疫沈降検定に使用することができる。ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・マニュアル・オブ・テクニークス、１４７−１５８頁（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ.、１９８７）。
競合的結合検定は、標識された標準（例えばＡＬ−１またはその免疫学的に反応性の部分）が限られた量の抗体との結合について被験試料の被検体（ＡＬ−１）と競合する能力に依るものである。被験試料中のＡＬ−１の量は、抗体と結合するようになる標準の量と逆比例する。結合するようになる標準の量の測定を容易にするため、抗体は一般に競合の前または後に不溶化し、その結果、抗体に結合する標準および被検体は、未結合のままである標準および被検体から簡便に分離され得る。
サンドイッチ検定は二つの抗体の使用を含み、各々が、検出すべき蛋白の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合することができる。サンドイッチ検定においては、被験試料の被検体は、固体支持体上に固定化された第一の抗体と結合し、その後第二の抗体が被検体と結合し、こうして不溶性三部複合体が形成される。デイヴィッド等、米国特許第４３７６１１０号。第二の抗体は、検出可能な原子団で自身標識されていてよく（直接サンドイッチ検定）、または検出可能な原子団で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することもできる（間接サンドイッチ検定）。例えば、サンドイッチ検定の一つの型はＥＬＩＳＡ検定であり、この場合、検出可能な原子団は酵素である。
本発明に係る抗ＡＬ−１抗体はまた、インビボ画像化にも有用であり、ここでは、検出可能な原子団で標識された抗体を、宿主に、好ましくは血流中に投与し、この宿主中の標識された抗体の存在および位置を検定する。この画像化技術は、様々な神経学的異常の期決定および処置に有用である。抗体は、核磁気共鳴、放射線医学、またはその他の当分野で知られる検出手段によって、宿主中で検出され得る任意の原子団で標識することができる。
中和抗ＡＬ−１抗体はＡＬ−１のアンタゴニストとして有用である。本明細書中使用される「中和抗ＡＬ−１抗体」という語は、ＡＬ−１に特異結合し、インビボまたはインビトロでＡＬ−１の機能的活性を実質上阻害または排除することのできる抗体を指す。典型的には、中和抗体は、例えば実施例８に記載のインビトロレセプター結合検定、またはインビトロ軸索束形成検定により測定されるＡＬ−１の機能的活性を、少なくとも約５０％、好ましくは８０％以上阻害するであろう。
他のＡＬ−１アンタゴニストは、ＡＬ−１レセプター蛋白、例えばＲＥＫ７を用いて製造される。ＡＬ−１アンタゴニストの一例は、本明細書に記載されるＲＥＫ７−ＩｇＧキメラ蛋白である。ＡＬ−１アンタゴニストのもう一つの例は、ＡＬ−１レセプターの可溶性型であって、これは細胞外ドメインまたは実質上貫膜ドメインを含まないレセプターを含む。レセプターの可溶性型はアンタゴニストとして直接使用することができ、またはこのレセプターはＡＬ−１活性に拮抗する小分子についてのスクリーニングに使用することができる。
ＡＬ−１は、中枢（脳および脊髄）、末梢（交感、副交感、感覚、および腸ニューロン）、および運動ニューロンを包含するニューロンの発達、維持、または再生をインビボで亢進するのに有用であると信じられている。したがって、ＡＬ−１は様々な神経学的疾患および異常の診断および／または処置のための方法に利用することができる。
本発明の様々な態様において、精製されたＡＬ−１は、外傷、外科手術、卒中、虚血、感染、代謝性疾患、栄養障害、悪性腫瘍、または毒物により神経系が損傷を受けた患者に投与して、ニューロンの生存または生長を促進することができる。例えば、ＡＬ−１は、外傷または外科手術により損傷された運動ニューロンの生存または生長を促進させるために使用できる。さらに、ＡＬ−１は、運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリヒ病）、ベル麻痺、および脊髄性筋萎縮症または麻痺を含む種々の状態の処置に使用することができる。ＡＬ−１は人間の神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経聾、およびメニエル病の処置に使用することができる。ＡＬ−１は、特にＲＥＫ７を発現する海馬ニューロンおよびＡＬ−１を発現する皮質ニューロンの軸索の伸長およびシナプスの可塑性を促進できるため、特に痴呆症または外傷の際の学習を増強する認識促進物質として使用できる。ナショナル・インスティテューツ・オブ・エイジングにより、老年者の痴呆症の５０％以上の原因であると確認されたアルツハイマー病は、６５歳以上のアメリカ人の死亡の第四または第五の主要な原因でもある。４００万人のアメリカ人、８５歳以上のアメリカ人（米国の人口のうち最も急速に増加している世代）の４０％がアルツハイマー病に罹患している。パーキンソン病患者全体の２５％はアルツハイマー病様痴呆症にも罹患している。そして痴呆症患者の約１５％には、アルツハイマー病および多発梗塞性痴呆が共存している。アルツハイマー病および血管性痴呆に次ぐ第三番目に多い痴呆の原因は、アルコール中毒症に直接関連する器質性脳疾患に起因する認識障害であって、これはアルコール中毒者の約１０％に起こる。しかし、血管性痴呆およびアルコール中毒に関連する器質性脳疾患に起因する認識障害と同様、アルツハイマー病の最も一貫した異常は、基底前脳（ＢＦ）に起始し皮質および海馬の両者に至るコリン作動系の変性である（ビグル等、ブレイン・コリナージック・システムズ、Ｍ.ステリアードおよびＤ.ビーソルド編、オクスフォード・ユニヴァーシティー・プレス、オクスフォード、３６４−３８６頁（１９９０））。そして、アルツハイマー病によって冒される神経伝達系が他に幾つかある（デイヴィス、Med.Res.Rev.、３巻２２１頁（１９８３））。ところが、例えばコリン作動性神経伝達系の変性に関連する認識障害は、痴呆症に罹患した人に限定されない。これは健康な老年者およびラットにも見られている。老齢のラットにおいて学習障害の程度と皮質脳血流の低下の程度とを比較する研究は、良好な相関を示す（ベルマン等、Neurobiol.Aging、９巻６９１頁（１９８８））。慢性アルコール中毒症において、結果として生ずるアルツハイマー病および正常な老化のような器質的脳疾患は、コリン作動性ニューロンが起始し（基底前脳）それらが投射する先である（脳皮質）脳領域の皮質脳血流の広汎性な低下によっても特徴付けられる（ロフティ等、Cerebrovasc.and Brain Metab.Rev、１巻２頁（１９８９））。
さらに、ＡＬ−１はニューロパチー、特に末梢ニューロパチーの処置に使用することができる。「末梢ニューロパチー」とは、最もしばしば運動、感覚、感覚運動、または自律神経機能異常のうちの一つまたはその組合わせとして現れる、末梢神経系を冒す疾患を指す。末梢ニューロパチーにより示される多様な形態は、これもまた多数の原因に、各々個別的に帰することができる。例えば、末梢ニューロパチーは、遺伝的に獲得され、全身性疾患が原因となり、または毒物により誘発され得る。例には、遠位型感覚運動ニューロパチー、または胃腸管の運動性低下もしくは膀胱の無緊張といった自律神経ニューロパチーが包含されるが、これらに限定される訳ではない。全身性疾患に付随するニューロパチーの例には、ポリオ後症候群が包含され；遺伝性ニューロパチーの例には、シャルコー・マリー・トゥース病、レフスム病、無βリポ蛋白血症、タンジール病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ファブリ病、およびデジュリン・ソッタス症候群が包含され；そして毒物により誘発されるニューロパチーの例には、ビンクリスチン、シスプラチン、メソトレキサート、または３’−アジド−３’−デオキシチミジンのような化学療法剤による処置によって誘発されるものが包含される。
本発明のさらなる態様において、ＡＬ−１アンタゴニスト、およびとりわけ抗ＡＬ−１抗体は、ＡＬ−１の過剰な産生または活性を特徴とする神経学的疾患および異常に罹患している患者に投与することができる。ＡＬ−１アンタゴニストは、例えば外科手術後に起こり得る感覚ニューロンの迷行性再生の防止に、または、例えば慢性疼痛症候群における感覚ニューロンの選択的切除に使用することができる。
血管供給の発達、血管形成は、ニューロン組織を包含する正常な組織の生長、成熟、および維持にとって必須である。さらにこれは創傷治癒および充実性腫瘍の迅速な生長にとっても必要であり、様々なその他の病理学的状態に関わっている。その大部分が腫瘍の血管新生に関する研究を基礎としている、血管形成の現在の概念は、細胞が血管形成因子を分泌し、これが内皮細胞の遊走、増殖、および毛細血管の形成を誘発することを示唆している。動物モデルにおいてインビトロまたはインビボで血管形成を誘発する多数の因子が同定されている。これらは、ＦＧＦα、ＦＧＦβ、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、ＶＰＦまたはＶＦＧＦ、モノブチリン、アンギオトロピン、アンギオゲニン、ヒアルロン酸減成産物、ならびにより近年では、ＴＮＦ−αにより誘発される血管形成のためのＢ６１を包含する（パンデイ等（１９９５）、Science、２６８巻５６７−５６９頁）。血管形成のインヒビターには、ＴＩＭＰとして同定された軟骨から誘導されるインヒビター、ＰＦ−４、トロンボスポンジン、ラミニンペプチド、ヘパリン／コーチゾン、ミノサイクリン、フマギリン、ジフルオロメチルオルニチン、硫酸化キチン誘導体、およびＢ６１抗体が包含される。血管供給の主な発達は、胚の発生中に、黄体形成中の排卵時に、そして創傷および骨折の治癒中に起こる。腫瘍の生長、糖尿病性網膜症、新血管緑内障、乾癬、および慢性関節リウマチを包含する多くの病理学的疾病状態は、血管形成の増大を特徴とする。このようなプロセス中に、血管に沿って並んでいる、通常では静止している内皮細胞が、血管に沿った部位から発芽し、細胞外マトリックス障壁を減成し、増殖し、そして遊走して新たな血管を形成する。周りの組織から分泌される血管形成因子は、内皮細胞に対し、間質コラーゲンを減成し、指令された遊走を行い（走化性）、増殖し、そして毛細血管へと再編成するよう命令する。
ＡＬ−１は、内皮または間質細胞上のレセプター活性化による血管形成の促進または亢進に、さらなる用途を見いだすことができる。血管新生の誘導は、創傷治癒工程の重要な構成因子である。血管形成としても知られる新血管新生は、基礎膜の減成、内皮細胞の動員および増殖、血管の疎通、および新たな基礎膜の形成を包含する幾つかの連続した段階を含む複雑な工程である（マントヴァーニ、Int.J.Cancer、２５巻６１７頁（１９８０））。血管新生は、増殖しつつあるそして分化しつつある線維芽細胞に栄養および酸素が供給され、液性および細胞性免疫の要素が、細菌感染の可能性ある部位に運ばれることを確実にする。創傷治癒の過程、とりわけ例えば火傷、褥瘡性潰瘍、糖尿病、肥満および悪性腫瘍のように創傷治癒が遅延する傾向のある状態の患者の場合、新血管新生をできるだけ早く誘導することが望ましい。通常の外科手術後の患者であっても、創傷治癒の加速のため、より早く病院での治療から開放されたなら、それは彼等の利益になるであろう。本発明は、血管形成を調節するための新規な組成物および方法を提供するものである。創傷を有する患者は、ＡＬ−１化合物の血管形成上活性な用量を創傷に適用することにより、処置することができる。これは、治癒の加速が望まれる外科的切開、火傷、外傷を受けた組織、皮膚移植、潰瘍およびその他の創傷または損傷の新血管新生を容易にする。創傷治癒能力が実質上損なわれており、故に創傷部位に創傷治癒の過程に必要な内因性因子を提供する能力を欠いている人間では、外因性ＡＬ−１および本発明に係る組成物の添加により、創傷治癒が正常に進行することが可能となる。本発明に係る蛋白は、広い範囲の創傷状態において、治癒のプロセスを加速すると予想される。ＡＬ−１化合物を含有する新規な局所用組成物が本発明方法での使用に供され、ＡＬ−１化合物を含有する縫合糸、移植片および外傷用医学材料といったような新規な物品もまた同様である。本明細書において「創傷」という語は、皮膚、粘膜または上皮内層の任意の開口部として定義され、一般にこのような開口部は大抵、露出した、生のまたは擦過された組織を伴っている。本発明に従って処置することのできる創傷またはその他の外傷の型に関して制限は無く、係る創傷には、一度、二度および三度の火傷（特に二度および三度）；美容外科手術の切開を包含する外科的切開；裂傷、切開、および貫通を包含する創傷；ならびに潰瘍、例えば褥瘡性潰瘍（床ずれ）を包含する慢性の非治癒性皮膚潰瘍ならびに糖尿病、歯科、血友病、悪性腫瘍および肥満の患者に付随する潰瘍または創傷が包含される（しかしこれらに限定される訳ではない）。さらに、正常な創傷治癒は、加齢、糖尿病、癌、および抗炎症薬または抗凝固剤による処置を包含する幾つかの因子によって遅延することがあり、本明細書に記載の蛋白は、このような処置の創傷治癒遅延効果を相殺するために使用することができる。
第一の関心は新血管新生による大きな創傷の治癒であるが、ＡＬ−１化合物は、小さな創傷、および美容上の上皮細胞の再生にも有用であり得ると考えられる。好ましくは、処置されるべき創傷は、ウイルス感染または腫瘍を伴っているか否かに拘わらず、火傷および外科的切開である。殆どの場合創傷は、腫瘍またはウイルス感染の結果ではなく、通常それらは腫瘍細胞を含んでいない。
ＡＬ−１は好ましくは局所適用により創傷にデリバリーされるが、この文脈中「局所的」とは、創傷に対して局所的という意味であり、必ずしも表皮への適用を指すものではない。局所的に適用される時、ＡＬ−１化合物は通常、担体および／またはアジュバントのような他の成分と合する。係る他の成分には、それらは薬学上許容し得るものでなければならず、それらの意図される投与に対して効能がなければならず、そしてＡＬ−１を減成または不活性化し得ないという事以外、性質上の制約は無い。ＡＬ−１は洗浄剤または軟膏の形で火傷に適用され、もしそうであるならば生理食塩水またはＤ５Ｗのような等張溶液中で適用される。ＡＬ−１は特に、火傷に適用された皮膚移植片の生長および生存の促進に有用である。普通、ＡＬ−１含有組成物は、移植片中に浸透させ、または、火傷に適用される移植片の側、または移植片の外側のいずれかに、移植片表面に被覆付着させる。ＡＬ−１はさらに、挫滅壊死組織除去酵素がＡＬ−１を蛋白分解的に不活性化しない限り、プロテアーゼを含有する火傷挫滅壊死組織除去軟膏に含有させる。
ＡＬ−１は、本発明に従い、外科用器具に浸透させるが、このような器具は、創傷に接触する道具と定義され、係る器具は典型的には水吸着性または含水し得るものであり、創傷の処置において治療的用途を有する。外科的器具の例は、臨床医が知悉するように、包帯、縫合糸、ガーゼ、皮膚移植フィルム（生きている皮膚移植片およびコラーゲン含有膜または合成代用皮膚を包含する）等である。本発明における使用のための包帯とは一般に、創傷に接触するように付着させるＡＬ−１を含有する水吸着性ラミネートを含む。本明細書に記載されるＡＬ−１と共に使用するための改良包帯は、好ましくは、創傷表面と包帯の吸着物質との間に挿入された透析膜といったような膜を有し、この膜は、ＡＬ−１が創傷中に拡散するに充分なほど小さく、それでいて上皮細胞が吸着剤中に浸透するに充分なほど大きくはない細孔を有する。吸着の度合いはかなり様々であり、事実、非吸着性の包帯が本発明に包含される。即ち、ＡＬ−１を水槽に保管または保存し、これを、連続的または間欠的に創傷の洗浄に使用する。
ＡＬ−１はさらに、半固体または懸濁液の媒質を生成させるため、好ましくは精製コラーゲンと組み合わせて軟膏または懸濁剤に調合される。ＡＬ−１を含有する常套的な油性調合物は軟膏として有用である。このようなＡＬ−１担体および調合物は創傷においてＡＬ−１を持続的に放出し、それにより、例えば皮膚移植片中への、新血管新生を指向する化学走性勾配を作り出す働きをする。ＡＬ−１のための持続放出調合物は、成型された物品、例えば薄膜またはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。インプラント化し得る持続放出マトリックスは、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタマート（シドマン等、Biopolymers、２２（１）巻５４７−５５６頁（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（ランガー等、J.Biomed.Mater.Res.、１５巻１６７−２７７（１９８１）およびランガー、Chem.Tech.、１２巻９８−１０５頁（１９８２））、エチレンビニルアセタート（ランガー等、同書）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８Ａ）のコポリマーを包含する。これらの調合物は、生物学的に腐食され得るマトリックスまたはＡＬ−１の受動拡散のための安定な供給源として機能することができる。
創傷との接触のための持続放出ＡＬ−１組成物はさらに、リポソームに捕捉されたＡＬ−１を包含する。ＡＬ−１を含有するリポソームは自体既知の方法：ＤＥ３２１８１２１Ａ；エプスタイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻３６８８−３６９２頁（１９８５）；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４０３０−４０３４頁（１９８０）；ＥＰ５２３２２Ａ；ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２６４１Ａ；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許４４８５０４５および４５４４５４５；およびＥＰ１０２３２４Ａ、によって製造される。通常リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ％コレステロール以上であり、選択される比率がＡＬ−１漏出の最適な速度のために調節される、小さな（約２００−８００オングストローム）一層の薄層型のものである。
ＡＬ−１は、担体および／またはアジュバント、例えばアルブミン、非イオン性界面活性剤およびその他の乳化剤のようなその他の成分と共に調合される。このようなその他の成分の性質には、それらが薬学上許容し得、それらの意図される投与に対して効果が無ければならず、そして該組成物の活性成分の活性を減成し得ないということを除けば、制約は無い。好適なアジュバントにはコラーゲンまたはヒアルロン酸調製物、フィブロネクチン、第XIII因子、または活性な治療用成分を安定化またはそれ以外の方式で能力向上させるよう設計されたその他の蛋白もしくは物質が包含される。
所望によりＡＬ−１は、他の既知の血管形成剤、例えば熱火傷の治癒を促進することが示されているヘパリン、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、Ｂ６１、アンギオゲニン、血小板因子４、インシュリン、ＰＤＧＦ、および血管形成因子と共に供給され、その組み合わせ物の血管形成活性に相乗効果が観察される。さらにＡＬ−１は所望によりＩＦＮ、例えばＩＦＮ−γ、およびその他のサイトカインと合せられ、またはＩＦＮ−γのようなインターフェロンを含まなくとも良い。係るサイトカインまたは既知の血管形成剤が種特異的である場合は、処置される種にとって適当なサイトカインまたは薬物が選択されるであろう。
動物または人間が本発明に従って処置される。或る動物種を別の種のＡＬ−１で処置することは可能であるが好ましくない。本発明に係る使用にとって好ましいＡＬ−１は可溶性ＡＬ−１−ＩｇＧである。
創傷に接触させるべきＡＬ−１の量は、そのＡＬ−１調合物中の他の血管形成剤の存在、処置されるべき創傷の性質、患者の状態、選択されたＡＬ−１調合物、選択されたＡＬ−１の分子種の新血管新生活性、および投与経路を包含する、臨床医により考慮される極めて多数の変数に依存する。ＡＬ−１を持続放出媒質中、例えば外傷用医学材料または軟膏中に調合する場合、および包帯または外傷用医学材料中に浸透させるのではなくＡＬ−１を局所への直接接触により投与する場合、典型的にはより少ない量のＡＬ−１が投与される。０.１０ｎｇ／ｍｌ−１００ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度を使用することができる。典型的な局所用調合物は、約０.１０ｎｇ／ｍｌないし１００００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０.２０ｎｇ／ｍｌないし１０００ｎｇ／ｍｌ、そしてさらに好ましくは０.２５ｎｇ／ｍｌないし３５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のＡＬ−１−ＩｇＧまたは等価物を、新血管新生標的部位（例えば皮膚移植片）に到達させることができるであろうが、この治療用量範囲は上記のようにかなりの変化が施される。この範囲外の濃度のデリバリーは、ＡＬ−１新血管新生の恩恵を若干提供するかも知れないが、臨床医は、創傷治癒におけるＡＬ−１の挙動を最適化するため、用量を監視すると予想されるであろう。さらに、もし分子量および／または血管形成強度がＡＬ−１−ＩｇＧのそれと異なるならば、重量が他のＡＬ−１変異体および型と相違するであろう事は留意すべきである。力価の相違は、本明細書中の実施例に開示される任意の検定で、候補ＡＬ−１およびＡＬ−１−ＩｇＧで達成される新血管新生の程度を比較することによって容易に測定される。
したがって、腫瘍壊死因子を含む組成物の血管形成的有効用量を創傷に適用する工程を包含する、創傷の新血管新生を促進する方法が提供される。この組成物は、特に創傷が新しい外科的切開である場合、その創傷と直接接触させることにより局所的に適用することができる。好ましい態様において、該組成物はさらにコラーゲンまたは合成代用皮膚を含む。看護者はさらに、成長因子、抗生物質、挫滅壊死組織除去剤、および／またはアンギオゲニンを創傷に投与することができる。火傷の好ましい挫滅壊死組織除去のための組成物は、ＡＬ−１化合物およびＡＬ−１の新血管新生活性を不活性化しない蛋白分解酵素を含有する。この治療用組成物は、治癒が完了するまで１ないし数日の間隔で再適用することができる。
血管疾患、特に血管閉塞疾患を有する患者のための治療の選択肢は、時には限定されている。このような患者はしばしば伝統的手段には不応で、且つ典型的には薬物療法に応答しない（タケシタ等、J.Clin.Invest.、９３巻６６２−６７０頁（１９９４））。血管の閉塞が長期および／または広汎である時、非外科的再血管新生には無理があるかも知れない。動脈のバイパスおよび／または切断で構成される外科療法は、罹患率および死亡率の変動により複雑となり得、しばしばその有効性が、使用される導管の短期的および長期的強度に依存する。治療的血管形成は、このような患者のための代替処置法を構成する。本発明は、有効量のＡＬ−１を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における血管形成を亢進させる方法を提供するものである。ＡＬ−１は単独で哺乳動物に投与することができ、またはこれに代わり他の治療および／または薬理学的物質と組み合わせて哺乳動物に投与することができる。特別なＡＬ−１は、動脈閉塞疾患に二次的な肢虚血または血管不全症に罹患している患者に用途が見いだされる。本発明に係るＡＬ−１蛋白の血管形成に及ぼす効果は、例えばウサギの後脚虚血モデルで試験することができる。このウサギモデルは、重篤な下肢動脈閉塞疾患を有する患者の虚血の特徴をシミュレートするために設計され（タケシタ等、上記）、本質的にはタケシタ等、上記、の記載に従って実施される。ふくらはぎの血圧（ＢＰ）指数の測定；側枝形成の血管造影評点；血流の血管内ドップラー−ワイヤー分析；および、ミクロスフェアに基づく、静止時およびストレス中の筋灌流の分析を実施する。
ＡＬ−１アンタゴニストは、例えば腫瘍の血管新生の間の、病理学的血管形成の阻害、防止、または処置に用途を見いだすことができる。腫瘍の新血管新生は充実性腫瘍の生長における最重要な段階である（P.J.ポルヴェリニ等、Lab.Invest.、５１巻６３５−６４２頁（１９８５））。充実性腫瘍の進行性生長は、それらに酸素および必須栄養素を供給する新しい血管を誘引するそれらの能力に厳密に依存している（ボウック、Cancer Cells、２（６）巻１７９−１８５頁（１９９０））。血管形成は悪性腫瘍に先行または付随することが示されている。新血管新生が無い場合、腫瘍移植片の大きさは限定されるようになる。血管形成が無い場合、腫瘍は休眠し続ける傾向がある。故に、血管形成活性は腫瘍の生長と直接に相関してきた。本発明に係るＡＬ−１アンタゴニスト組成物および方法は、腫瘍への新毛細管の生長を調節（例えば防止または低減）することができる。
かつて無関係であると考えられていた様々な非新生物疾患は、毛細血管の病的生長が特色であることから、「血管形成疾患」であると考えることができる。これらの疾患は、糖尿病性網膜症、関節炎、血管腫、乾癬、および目の新血管新生を包含する。本発明に係るＡＬ−１アンタゴニスト組成物および方法は、これらの状態の処置に使用することができる。
血管新生はまた、慢性関節リウマチのような慢性炎症状態で重要な役割を果たしている（A.E.コッホ等、Arthr.Rheum.、２９巻４７１−４７９頁（１９８６））。慢性関節リウマチ（「ＲＡ」）は、多様な病因物質が原因で複数の関節に炎症を導く一連の事象が開始する、慢性の多相疾患である。この疾患の原因はまだ未知のままであるが、ライム病を伴うもののような他の型の関節炎との類似性により、遺伝的に罹患しやすい宿主におけるまだ未確認の細菌またはウイルスの感染が、開始事象であると仮定された。宿主の細胞産物の増殖現象と共に宿主組織との免疫反応または交差反応を産むウイルスまたは細菌抗原の存在から、持続がもたらされる。多くの患者がＲＡで全身症状を発現するが、最も重篤なＲＡの帰結の多くは、内層細胞の増殖を伴う滑膜の変化および慢性炎症細胞による浸潤を特徴とする、関節結合組織への作用から生ずる。骨の侵食は、炎症細胞集団と接触している領域ならびに該炎症から遠い骨髄に近接している領域に起こる。骨の侵食は恐らく破骨細胞祖先の分化および活性化の誘導から導かれるのであろう。軟結合組織、例えば軟骨、関節嚢、腱および靱帯の侵食は、炎症細胞集団の細胞から、または、滑膜には稀少であるが典型的にはリウマチ滑液に豊富にある多形核白血球からの蛋白分解酵素の直接放出に起因する。例えば、ハリス、テキストブック・オブ・リューマトロジー（W.N.ケリー等編）、W.B.ソーンダーズ、フィラデルフィア、８８６−９１５頁（１９８５）；ダイアーおよびクレイン、Clin.Rheum.Dis.、４巻５１７−５３７頁（１９７８）；クレイン、アースライティス・アンド・アライド・コンディションズ、を参照されたい。ア・テキストブック・オブ・リューマトロジー、D.J.マクカーティ編、５９３−６０４頁、リーおよびフェビガー、フィラデルフィア（１９８５）；およびクレイン等、Lymphokines、７巻７５−１３６頁（１９８２）。ＲＡの治療はこの疾病の期に依存する。明らかな関節炎の徴候を示すことなく仮定的抗原がＴ細胞に提示される第１期は、処置されない。第２期は、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖と滑膜での血管形成を含み、その結果、不定愁訴、軽度の関節強直、および腫脹が引き起こされる。第３期の最中には、好中球が滑液に蓄積し、滑液細胞が分極または軟骨の侵入無しに増殖し、その結果関節の疼痛および腫脹、早朝強直、不定愁訴、および衰弱を導く。第２期および第３期に対する現行の治療は、臥床、熱の適用、補充的アイコサペンタン酸およびドコサヘキサン酸、ならびに薬物を包含する。アスピリンを包含する非ステロイド抗炎症薬は、この疾患の第２期および第３期を処置する薬物療法の基礎をなし続けている。アスピリン以外の抗炎症薬には、インドメタシン、フェニルブタゾン、イブプロフェンおよびフェノプロフェンといったフェニル酢酸誘導体、ナフタレン酢酸（ナプロキセン）、ピロールアルカン酸（トメチン）、インドール酢酸（スリンダック）、ハロゲン化アントラニル酸（メクロフェナム酸ナトリウム）、ピロキシカム、ゾメピラック、およびジフルニサールが包含される。ＲＡの第２期および第３期のための第２列の薬物は、抗マラリア薬、例えばヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、金塩、およびペニシラミン、ならびに低用量のメソトレキサートを包含する。これらの代替薬は、網膜の病変ならびに腎および骨髄毒性を包含する重篤な副作用を頻繁に産む。この疾病の第４期には軟骨の不可逆的破壊が起こる。現在利用可能な薬物および処置には、全リンパ照射、高用量静脈内メチルプレドニソロン、およびシクロスポリンが包含される。シクロスポリンは腎毒性があり、他の処置も同様に実質的な毒性を示す。結果として、このような前記の免疫抑制剤は、重篤且つ非緩解的ＲＡの処置にのみ用いられてきた。ＲＡ第４期のためのその他の可能性ある治療薬は環状オリゴ糖（シクロデキストリン類）を包含するが、これは、非炎症性ステロイド（コルテキソロン）と合した場合インビボで血管形成を阻害する。フォークマン等、Science、２４３巻１４９０−１４９３頁（１９８９）。免疫反応の初期相の決定的な構成成分に対する抗体には、抗クラスII ＭＨＣ抗体（ガストン等、Arthritis Rheum.、３１巻２１−３０頁（１９８８）；サニー等、Arthritis Rheum.、２５巻１７−２４頁（１９８２））、抗インターロイキン２レセプター抗体（カイル等、Ann.Rheum.Dis.、４８巻４２８−４２９頁（１９８９））、抗ＣＤ４抗体（ヘルゾグ等、J.Autoimmun.、２巻６２７−６４２頁（１９８９）；ウォーカー等、J.Autoimmun.、２巻６４３−６４９頁（１９８９））、および抗胸腺細胞グロブリン（シュマーリングおよびトレンサム、Arthritis Rheum.、３２巻１４９５−１４９６頁（１９８９））が包含される。これらの薬物のうち最後の３種はＲＡの患者に使用されてきた。本発明は、付随する血管形成を調節することにより、ＲＡの炎症および増殖経路をダウンレギュレーションする組成物および方法を提供する。該組成物は、ＡＬ−１アンタゴニストの血管形成調節有効量を含有する。この組成物はさらに、他の血管形成調節薬、特に上記のようなＲＡを処置するための物質または腫瘍を処置するための物質を含むことができる。この方法は、ＡＬ−１アンタゴニストの血管形成調節有効量を、係る処置を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。血管形成が望ましくない状態の文脈において、「調節する」とは、血管形成を遮断、阻害、防止、逆転、もしくは低減させ、または血管形成のさらなる進行を防止することを意味する。
腫瘍により発現される血管形成ペプチドと正常組織により発現されるそれとの間には、生化学的相違は殆どまたは全く無いようである。悪性腫瘍に応答する新たな毛細血管と、生理学的新血管新生中に起こる毛細血管の生長の間にも、形態学的相違は無い（フォークマン等、Science、２３５巻４４２−４４７頁（１９８７））。非悪性疾患と悪性疾患の血管形成能の間に質的な相違が無いのであるから、正常および悪性の血管新生検定から得られる結果は容易に比較でき、使用される研究系に独立していずれの領域においても進歩することができる（パウェレッツ等、Critical Reviews in Oncology/Hematology、９（３）巻１９７−１９８頁（１９８９））。したがって本発明は、有効量のＡＬ−１アンタゴニストを投与することにより血管形成を阻害することを含む方法に関するものである。本発明は、有効量のＡＬ−１アンタゴニストを哺乳動物に投与することによる、血管形成依存的疾患の処置のための方法を含む。血管形成依存的疾患は、糖尿病性網膜症、関節炎、腫瘍の生長および転移、新血管緑内障、未熟児網膜症、老人性黄斑変性、および創傷治癒後の瘢痕の過度形成を包含する。本発明に係る薬用組成物は、血管形成を伴う疾病、例えば炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ）、糖尿病性網膜症、悪性腫瘍のような腫瘍（例えば乳癌、肝癌、腸癌、カポジ肉腫、肺癌およびその他の上皮癌のような癌）に対する治療性および予防的または阻害的性質を表す。
血管形成性または血管形成阻害性についてＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニスト候補化合物をスクリーニングするために、数多くのインビトロおよびインビボの方法が利用できる。内皮細胞の生長、遊走、および毛細管形成についての幾つかのインビトロ検定が知られており、本発明化合物と共に、特に血管形成または止血物質についての最初のスクリーニング法として使用することができる。さらなる試験は、典型的にはインビボ動物試験を使用することになるであろう。本明細書の一部となっている米国特許５３８２５１４は、インビボの血管形成のための数多くのモデルを記載している。例えば、角膜ポケット検定は、ウサギのような大型動物の角膜への血管形成因子を含有するポリマーペレットの外科的移植を含む。定量化が困難となり得るため、この検定は通常好ましい候補化合物について使用する。ウサギの耳チェインバー検定は、ガラスまたはプラスチックの観察器具を外科的に挿入し、顕微鏡によって毛細管の遊走を測定する必要がある。ラット背側肺胞検定は、血管形成因子を入れたステンレススチールの小室を移植することを含む。血管形成応答を生成させるアルギン酸検定が記載されているが、これはアルギン酸塩に包まれた腫瘍細胞をマウスに皮下注射することを含む。注射されたゲルへのヘモグロビンの蓄積を用いて血管形成応答を定量する。加齢した、典型的には３日齢の受精した鶏卵の絨毛尿膜に化合物を投与し、時間の経過後、典型的には２日間の新血管新生の様子を観察する（ＣＡＭ検定；アウスプランク等、Am.J.Pathol.、９７巻５９７頁（１９７５））。新血管新生阻害率を非処置対照群と比較する。より近年の検定法は、宿主に注射するとマトリックスゲルを形成する液体マトリックス材料を提供し；この液体マトリックス材料に血管形成剤を添加し；血管形成剤を含有するこの液体マトリックス材料を宿主に注射してマトリックスゲルを形成させ；マトリックスゲルを宿主から回収し；そして回収されたマトリックスゲルの血管形成を定量することを含む。この方法の変法を、宿主に注射するとマトリックスゲルを形成する液体マトリックス材料を提供し；この液体マトリックス材料に血管形成阻害剤を添加し；血管形成阻害剤を含有するこの液体マトリックス材料を宿主の組織位置に注射してマトリックスゲルを形成させることにより、組織における血管新生の阻害剤の試験に使用することができる。この系は、組織における血管新生の誘導が望まれる場合、宿主に注射するとマトリックスゲルを形成する液体マトリックス材料を提供し；この液体マトリックス材料に血管形成誘導剤を添加し；血管形成誘導剤を含有するこの液体マトリックス材料を宿主の組織位置に注射してマトリックスゲルを形成させることにより、本発明化合物と共に使用することができる。好ましい態様において、線維芽細胞成長因子およびヘパリンを添加した基礎膜蛋白の溶液を、それがゲルを形成する宿主、例えばマウスに皮下注射する。隣接する組織の血管から数日以内に芽がゲル中に貫入し、これが外部血管系と連結する。次いで、血管の画像解析およびゲル内部の血管に存在するヘモグロビンの測定により、血管形成を定量する。この検定法は、血管形成および止血物質の両者をインビボで試験することを容易にする。加えて、血管形成因子に応答する内皮細胞を、さらなる研究のためにインビトロで回収することができる。好ましい化合物は５０−７０％の阻害率を有し、より好ましい化合物は８０−１００％の阻害率を示す。本明細書に記載のように、本発明に係る血管形成的に活性な蛋白は、候補インヒビターの存在下および不在下でのＡＬ−１刺激された血管形成の阻害を測定することによる、血管形成を阻害する化合物についてのインビトロおよびインビボスクリーニングでの用途を提供する。
神経学的疾患および異常を処置するためのおよび血管形成を調節するためのＡＬ−１およびＡＬ−１アンタゴニストの治療用調合物は、所望の純度を有するＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニスト、例えば抗ＡＬ−１抗体または可溶性ＲＥＫ７を、既知の所望による生理学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって製造される。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度において非毒性であり、そして、燐酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を包含する抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。
損傷した神経組織の近傍に移植することのできるシラスティック膜のような膜上にＡＬ−１を吸着させ、またはＡＬ−１をリポソーム中に取り込ませることが望ましいかも知れない。ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９１／０４０１４号（１９９１年４月４日公開）。別の態様においては、治療効果のために使用されるＡＬ−１は、もう一つの蛋白、例えば免疫グロブリンドメインに共有結合で連結させたＡＬ−１である（例えばＡＬ−１−ＩｇＧ融合蛋白を生成させるため）。免疫グロブリン融合物、免疫アドヘシンは、結合する蛋白（この場合ＡＬ−１またはそのレセプター）の機能的ドメインを免疫グロブリン配列と結びつけるキメラ抗体様分子である。この免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン不変ドメインである（しかし必ずしもそうでなくとも良い）。免疫グロブリン（Ｉｇ）およびその或る変異体は既知であり、多くが組換え細胞培養で製造されている。例えば、米国特許４７４５０５５；ＥＰ２５６６５４；フォークナー等、Nature、２９８巻２８６頁（１９８２）；ＥＰ１２０６９４；ＥＰ１２５０２３；モリソン、J.Immun.、１２３巻７９３頁（１９７９）；ケーラー等、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、７７巻２１９７頁（１９８０）；ラソ等、Cancer Res.、４１巻２０７３頁（１９８１）；モリソン等、Ann.Rev.Immunol.、２巻２３９頁（１９８４）；モリソン、Science、２２９巻１２０２頁（１９８５）；モリソン等、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、８１巻６８５１頁（１９８４）；ＥＰ２５５６９４；ＥＰ２６６６６３；およびＷＯ８８／０３５５９を参照されたい。再構築された免疫グロブリン鎖もまた知られている。例えば米国特許４４４４８７８；ＷＯ８８／０３５６５；およびＥＰ６８７６３ならびにこれらに引用されている参考文献を参照されたい。本発明に係るキメラ中の免疫グロブリン部分はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３から取得する。
適当な免疫グロブリン不変ドメイン配列に連結させたレセプター配列から組み立てられたキメラ（免疫アドヘシン）は当分野で知られている。文献で報告された免疫アドヘシンには、Ｔ細胞レセプター*（ガスコイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８４巻２９３６−２９４０頁（１９８７））；ＣＤ４*（カポン等、Nature、３３７巻５２５−５３１頁（１９８９）；トラウネッカー等、Nature、３３９巻６８−７０頁（１９８９）；ツェットマイスル等、DNA Cell Biol.USA、９巻３４７−３５３頁（１９９０）；ビルン等、Nature、３４４６６７−６７０頁（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）（ワトソン等、J.Cell.Biol.、１１０巻２２２１−２２２９頁（１９９０）；ワトソン等、Nature、３４９巻１６４−１６７頁（１９９１））；ＣＤ４４*（アルフォ等、Cell、６１巻１３０３−１３１３頁（１９９０））；ＣＤ２８*およびＢ７*（リンスレイ等、J.Exp.Med.、１７３７２１−７３０頁（１９９１））；ＣＴＬＡ−４*（リンスレイ等、J.Exp.Med.、１７４巻６１−５６９頁（１９９１））；ＣＤ２２*（スタメンコヴィック等、Cell、６６巻１１３３−１１４４頁（１９９１））の融合物が包含され、ここで星印（＊）は、レセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーの成員であることを示す。
最も単純且つ直接的な免疫アドヘシンの設計は、「アドヘシン」蛋白（この場合ＡＬ−１またはＲＥＫ−７）の結合領域（群）を免疫グロブリン重鎖のヒンジおよびＦｃ領域と結びつけた。通常、本発明に係るキメラを製造する場合は、ＡＬ−１またはＲＥＫ−７の細胞外ドメインまたはそのフラグメントをコードしている核酸を、免疫グロブリン不変ドメイン配列のＮ末端をコードしている核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。典型的にはこのような融合において、コードされているキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン重鎖の不変領域の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持しているであろう。融合は、不変ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、または重鎖のＣＨ１のＮ末端に直接、もしくは軽鎖の対応領域にも施される。融合の行われる正確な部位は重要ではなく；特定の部位は既知であり、それを、ＡＬ−１またはＲＥＫ−７レセプター−免疫グロブリンキメラの生物活性、分泌または結合特性を最適化するために選択することができる。
幾つかの態様において、キメラは、単量体、またはヘテロもしくはホモ多量体として、そして本質的にはＷＯ９１／０８２９８に例示されるように、特に二量体または四量体として組み立てられる。好ましい態様において、ＡＬ−１またはＲＥＫ−７細胞外ドメイン配列は、免疫グロブリンのエフェクター機能を含む抗体、例えば免疫グロブリンＧ1（ＩｇＧ−１）のＣ末端部分（特にＦｃドメイン）のＮ末端に融合させる。重鎖不変領域全体をＡＬ−１またはＲＥＫ−７細胞外ドメイン配列に融合させることが可能である。好ましくは、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列（これがＩｇＧ Ｆｃを化学的に規定する。重鎖不変領域の最初の残基を１１４と定めた場合の残基２１６、または他の免疫グロブリンの類似部位。）を融合に使用する。一つの態様において、ＡＬ−１またはＲＥＫ−７アミノ酸配列を、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、またはＩｇＧ−３重鎖のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させる。融合が行われる正確な部位は重要でなく、常套的実験によって最適な部位を決定することができる。免疫グロブリン部分は、軸索または標的細胞に対してＡＬ−１またはＲＥＫ−７機能を提示するための足場性といったような望ましい性質を保持したまま、その免疫グロブリン部分の生物活性、例えばＴ細胞結合を不活性化するよう遺伝子工学的または化学的に修飾することができる。キメラは多量体、特にホモ二量体またはホモ四量体として組み立てることができる。一般に、これら組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有するであろう。基本的な四本の鎖構造単位が、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥの存在する形である。四本単位は、より高分子量の免疫グロブリンでは反復され、ＩｇＭは一般に、ジスルフィド結合で結合された基本的四本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時にはＩｇＧグロブリンもまた血清中で多量体の形で存在し得る。多量体の場合、各々の四本単位は同じまたは異なっている。これに代わり、ＡＬ−１またはＲＥＫ−７細胞外ドメイン配列は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列の間に挿入することができ、その結果、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られる。この態様では、該配列を、免疫グロブリンの各腕の免疫グロブリン重鎖の３’末端に、ヒンジおよびＣＨ２ドメインの間、またはＣＨ２およびＣＨ３ドメインの間のいずれかに融合させる。H.R.フーゲンブーム等、Mol.Immunol.、２８巻１０２７−１０３７頁（１９９１）を参照されたい。免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明に係る免疫アドヘシンでは必要無く、免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合して、またはＡＬ−１もしくはＲＥＫ−７細胞外ドメインに直接融合して存在し得る。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡは、典型的にはＡＬ−１またはＲＥＫ−７免疫グロブリン重鎖融合蛋白をコードしているＤＮＡと共に同時発現される。分泌の際、このハイブリッド重鎖および軽鎖は、共有結合して、二つのジスルフィド連結した免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対を含む免疫グロブリン様構造を提供するであろう。このような構造の製造は、例えば１９８９年３月２８日登録の米国特許第４８１６５６７号に開示されている。本発明に係る免疫アドヘシンの組み立てに使用される免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖不変ドメイン由来のものとすることができる。ヒト免疫アドヘシンのためには、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主たる利点は、ＩｇＧ１免疫アドヘシンは、固定化されたプロテインＡ上で効率的に精製できることである。これに対してＩｇＧ３の精製は、かなり用途の少ない媒質であるプロテインＧを必要とする。しかしながら、特定の免疫アドヘシン組み立て物のＩｇ融合相手を選択する場合、免疫グロブリンのその他の構造および機能特性を考慮すべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、長く且つ柔軟であり、したがってこれはＩｇＧ１と融合した時に折り曲げられたり適切に機能したりできない大きな「アドヘシン」ドメインを提供することができる。もう一つ考慮すべき事は価である。ＩｇＧ免疫アドヘシンは二価のホモ二量体であり、一方ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、それぞれ基本的Ｉｇホモ二量体単位の二量体または五量体構造を生じ得る。インビボ適用のために設計されたＡＬ−１−ＩｇまたはＲＥＫ−７−Ｉｇ免疫アドヘシンについては、Ｆｃ領域により特定される薬動力学的性質およびエフェクター機能が同様に重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は全て２１日というインビボ半減期を有するが、補体系を活性化する際のそれらの相対強度を異なっている。ＩｇＧ４は補体を活性化せず、ＩｇＧ２は補体活性化の際ＩｇＧ１より有意に弱い。その上、ＩｇＧ１とは異なりＩｇＧ２は単核細胞または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化には最適であるが、そのインビボ半減期は他のＩｇＧイソタイプのおよそ三分の一である。人間の治療薬として使用すべく設計される免疫アドヘシンのためにもう一つ考慮すべき重要な点は、特定のイソタイプのアロタイプ変異体の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプのより少ないＩｇＧイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は血清学的に定義されるアロタイプ部位を４個有するに過ぎず、そのうち２個（Ｇ１ｍおよび２）はＦｃ領域に位置し、これらの部位のうち１個、Ｇ１ｍ１は非免疫原性である。対照的にＩｇＧ３には、全てＦｃ領域にある１２の血清学的に定義されるアロタイプがあり、これらの部位のうち３個（Ｇ３ｍ５、１１および２１）のみが、非免疫原性である１個のアロタイプを有する。したがって、γ３免疫アドヘシンの可能性ある免疫原性は、γ１免疫アドヘシンのそれより大である。
本発明のキメラを設計する際、ニューロトロフィンの結合および／または生物活性にとって必要でないドメインは除去してよい。係る構造において、誤折り畳みを避けるため、融合の連結部をドメインの間にある残基に位置させることが重要である。親免疫グロブリンに関して、有用な連結点は、二本の重鎖の間にジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインのすぐ上流である。しばしば用いられる設計では、該分子の「アドヘシン」部分のＣ末端残基のためのコドンは、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ配列のためのコドンの上流に直接位置させる。
免疫アドヘシンの組み立ておよび発現にとって好適な一般法は、（天然または変異体）ＡＬ−１またはＲＥＫ−７に関して上に開示された方法と同じである。例えば、ＡＬ−１−Ｉｇ免疫アドヘシンは、フレーム内にＡＬ−１蛋白をコードしているｃＤＮＡ配列をＩｇ ｃＤＮＡ配列に融合させることによって最も簡便に組み立てられる。しかし、ゲノムＩｇフラグメントに対する融合もまた使用することができる（例えば、ガスコイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８４巻２９３６−２９４０頁（１９８７）；アルフォ等、Cell、６１巻１３０３−１３１３頁（１９９０）；スタメンコヴィック等、Cell、６６巻１１３３−１１４４頁（１９９１）を参照されたい）。後者の型の融合は、発現のためにＩｇ調節配列の存在が必要である。ＩｇＧ重鎖不変領域をコードしているｃＤＮＡは、公表されている、脾臓または末梢血リンパ球から誘導されたｃＤＮＡライブラリー由来の配列に基づいて、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって分離することができる。免疫アドヘシンのＩｇ部分および「アドヘシン」をコードしているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において有効な発現を指令するプラスミドベクター中に縦列挿入する。哺乳動物細胞での発現のためには、ｐＲＫ５に基づくベクター（シャル等、Cell、６１巻３６１−３７０頁（１９９０）］およびＣＤＭ８に基づくベクター（シード、Nature、３２９巻８４０頁（１９８９））である。正確な連結部は、オリゴヌクレオチド指定除去突然変異誘発を用いて、設計された連結部コドンの間の余分な配列を除去することによって作り出すことができる（ゾラーおよびスミス、Nucleic Acids Res.、１０巻６４８７頁（１９８２）；カポン等、Nature、３３７巻５２５−５３１頁（１９８９））。合成オリゴヌクレオチドを使用することができるが、その場合、各々半分は、所望の連結部の両側の配列に対し相補的であって、理想的にはこれらは３６ないし４８量体である。別法として、適当なベクターを用いて当該分子の二部分をフレーム内で連結するために、ＰＣＲ技術を使用することができる。
ＡＬ−１−Ｉｇ免疫アドヘシンの発現のための宿主セルラインの選択は、主に発現ベクターに依存する。もう一つ考慮すべき事は、必要とされる蛋白の量である。一過性トランスフェクションによってしばしばミリグラム量が生成され得る。例えば、アデノウイルスＥＩＡで形質転換された２９３ヒト胚腎臓セルラインは、燐酸カルシウム法の改良法によりｐＲＫ５に基づくベクターで一過性トランスフェクトされて、効率的な免疫アドヘシンの発現を可能にする。ＣＤＭ８に基づくベクターを使用して、ＤＥＡＥ−デキストラン法によるＣＯＳ細胞のトランスフェクトを行うことができる（アルフォ等、Cell、６１巻１３０３−１３１３頁（１９９０）；ツェットマイスル等、DNA Cell Biol.（US）、９巻３４７−３５３頁（１９９０））。より大量の蛋白が望まれる場合は、宿主セルラインの安定なトランスフェクションの後に免疫アドヘシンを発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５に基づくベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードしておりＧ４１８に対する耐性を付与するさらなるプラスミドの存在下にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入することができる。培養中でＧ４１８に耐性なクローンを選択し；これらのクローンを、漸増するレベルのＤＨＦＲインヒビターメソトレキサートの存在下で増殖させ；クローンを選択するが、この時、ＤＨＦＲおよび免疫アドヘシン配列をコードしている遺伝子コピーの数が同時増幅される。もし免疫アドヘシンがＮ末端に疎水性リーダー配列を含んでいるならば、それはプロセシングされてトランスフェクトされた細胞により分泌されると思われる。より複雑な構造の免疫アドヘシンの発現は、独特の適合した宿主細胞を必要とするかも知れず、例えば軽鎖またはＪ鎖のような構成成分は、ある種の骨髄腫またはハイブリドーマ宿主細胞によって提供され得る（ガスコイン等、１９８７、上記；マーティン等、J.Virol.、６７巻３５６１−３５６８頁（１９９３））。
免疫アドヘシンは親和クロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。親和リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、キメラに用いられている免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存している。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖を基礎とする免疫アドヘシンを精製するために使用できる（リンドマーク等、J.Immunol.Meth.、６２巻１−１３頁（１９８３））。プロテインＧはマウスの全イソタイプおよびヒトγ３に推奨される（ガス等、EMBO J.、５巻１５６７１５７５頁（１９８６））。親和リガンドが結合するマトリックスは、最もしばしばアガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。調節された細孔のガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンといったような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるより早い流速およびより短いプロセス時間を可能にする。免疫アドヘシンをプロテインＡまたはＧ親和カラムに結合させる条件は、完全に、Ｆｃドメインの性格、即ちその種およびイソタイプによって指令される。一般に、適切なリガンドが選択されている場合、有効な結合は非条件培養液から直接起こる。免疫アドヘシンの一つの顕著な特徴は、ヒトγ１分子について、プロテインＡの結合能は、同じＦｃ型の抗体に比較して幾分低下することである。結合した免疫アドヘシンは、酸性ｐＨ（３.０またはそれ以上）、または緩和なカオトロピック塩を含有する中性ｐＨ緩衝液のいずれかにおいて有効に溶出され得る。この親和クロマトグラフィー工程は、＞９５％純粋な免疫アドヘシン調製物を産む。
免疫アドヘシンを精製するために、プロテインＡまたはＧ上の親和クロマトグラフィーに代わり、またはこれに加えて、当分野で知られるその他の方法を使用することができる。免疫アドヘシンは硫黄好性ゲルクロマトグラフィー（ハッチェンズおよびポラス、Anal.Biochem.、１５９巻２１７−２２６頁（１９８６））および固定化された金属キレートクロマトグラフィー（アル−マシキーおよびマカイ、J.Dairy Sci.、７１巻１７５６−１７６３頁（１９８８））において抗体と同様に挙動する。しかし、抗体とは対照的に、イオン交換カラム上でのこれらの挙動は、それらの等電点のみならず、それらのキメラ的性質の故に分子中に存在し得る電荷双極子によっても左右される。
所望ならば免疫アドヘシンは、二重特異性、即ち２種の別個のリガンドに対して作製することができる。したがって、本発明に係る免疫アドヘシンは、ＡＬ−１およびＲＥＫ−７のための結合特異性を有し、または、ＡＬ−１（または逆にＲＥＫ７）に、そしてその免疫アドヘシン構造のＲＥＫ７（またはＡＬ−１）部分が結合する、ＡＬ−１（またはＲＥＫ７）を発現する細胞上で特異的に発現される他の決定基に、特異的に結合するかも知れない。二重特異性分子については、精製の容易性のために、それらの構体様構造の一方の腕にあるキメラ抗体重鎖および他方の腕にあるキメラ抗体重鎖−軽鎖対で構成される三量体分子が有利である。二重特異性免疫アドヘシンの産生に常套的に使用された、１０種の四量体の混合物を産生する抗体産生四部雑種とは対照的に、三量体免疫アドヘシン構造の三本の鎖をコードしている核酸でトランスフェクトされた細胞は、三種の分子のみの混合物を産生し、この混合物からの所望生成物の精製は、これに対応して、より容易である。
ＡＬ−１アゴニストが上記の指針を適切に適用して製造され使用され得ることは明白である。例えば、ＲＥＫ７−ＩｇＧまたは抗ＡＬ−１抗体をシラスティック膜のような膜上に吸着させ、これを腫瘍もしくはＲＡ組織の近傍に移植し、またはリポソーム中に取り込ませることができる。ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９１／０４０１４号（１９９１年４月４日公開）。
ＡＬ−１は所望により他の神経栄養因子と合しまたはそれと共に投与して、所望の治療効果を達成する。例えば、ＡＬ−１はＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、インシュリン様成長因子（例えばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−３）または別の神経栄養因子と共に使用して、感覚ニューロンの生長に相乗的刺激効果を達成することができるが、ここで「相乗的」という語は、ＡＬ−１と第二の物質の組み合わせの効果が、いずれかの物質を個々に使用して達成される効果より大であることを意味する。
インビボ投与のために使用されるＡＬ−１およびＡＬ−１アンタゴニストは無菌でなければならない。これは、ＡＬ−１または抗ＡＬ−１抗体の溶液を滅菌濾過膜で濾過することにより容易に達成される。その後、濾過された溶液を無菌取り出し口を有する容器、例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針を貫通させることのできる栓を有するバイアル中に入れることができる。濾過された溶液を凍結乾燥して、粉末型の無菌ＡＬ−１または抗ＡＬ−１抗体を生成させることもできる。
ＡＬ−１およびＡＬ−１アンタゴニストをインビボ投与する方法は、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内経路による注入または注射、および持続放出製剤による方法を包含する。
持続放出製剤は一般に、ＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニストおよびそこからＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニストがある程度の時間放出されるマトリックスで構成される。好適なマトリックスは、成型された物品、例えば膜、繊維またはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド、米国特許第３７７３９１９号、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタマート、シドマン等、Biopolymers、２２巻５４７−５５６頁（１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはエチレンビニルアセタート、ランガー等、J.Biomed.Mater.Res.、１５巻１６７−２７７（１９８１）；ランガー、Chem.Tech.、１２巻９８−１０５頁（１９８２）のコポリマーを包含する。
本発明の一つの態様において、治療用調合物は、リポソーム内に捕捉されたまたはリポソームと複合体形成したＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニストを含む。例えば、グリコホスファチジルイノシトール部分と共有結合させたＡＬ−１を用いてＡＬ−１を含むリポソームを形成させることができる。さらなる態様において、治療用調合物は、ＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニストを活発に産生する細胞を含む。このような細胞は患者の組織中に直接導入することができ、または多孔性膜内にカプセル化し、次いでこれを患者に移植することができるが、いずれの場合も、ＡＬ−１濃度の増加または減少が必要である患者の体内の領域にＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニストのデリバリーがなされる。別法として、ＡＬ−１ ＤＮＡを含む発現ベクターを患者の細胞のインビボ形質転換のために使用して、同じ結果を達成することができる。
治療に用いられるＡＬ−１またはＡＬ−１アンタゴニスト、例えば抗ＡＬ−１抗体の有効量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって治療者は、用量を滴定し、最適な治療効果の獲得に必要な投与経路を修飾することが必要とされるであろう。典型的な日用量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれ以上の範囲となろう。可能ならば、例えば当分野で既知のニューロン細胞の生存または生長のための検定を使用してまずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することが望ましい。本発明の特別な態様において、ニューロンの生存または生長の促進に有効な薬用組成物は、約０.１および１０ｎｇ／ｍｌの間のインビボ局所ＧＰＡ濃度を提供するであろう。
腫瘍の処置において本明細書に記載される組成物は、例えば皮下または筋肉内投与することができ、ＡＬ−１アンタゴニストに薬理活性は、本発明に係る組成物の持続放出効果により、長時間にわたって維持することができる。故に投与回数を減らすことができる。この組成物は、直接注射することにより、腫瘍を制御している動脈中への組成物とすることもできる。腫瘍を有する成人患者の処置の場合、ＡＬ−１アンタゴニストの用量は、腫瘍の種類、部位、大きさ、およびＡＬ−１アンタゴニストの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、蛋白ＡＬ−１アンタゴニスト、特に抗体の用量は、約０.１ｍｇないし約５００ｍｇ、典型的には約１.０ｍｇないし約３００ｍｇ、より典型的には約２５ｍｇないし約１００ｍｇとすることができる。投与頻度は疾病の種類および投与型に応じて適当に選択できる。腫瘍制御動脈中または腫瘍自身への注射の場合、頻繁な反復注射は必要なく、所望の治療効果のためには１ないし４週間に１回の単一注射で充分となり得る。
要約すると、ＡＬ−１をコードしている核酸分子を提供することにより、本発明は、組換えＤＮＡ法によるＡＬ−１の産生を初めて可能にし、したがって様々な診断および治療適用に使用するための充分量のＡＬ−１の信頼し得る供給源を提供するものである。その明確な生物学的性質に鑑み、精製された組換えＡＬ−１は、ニューロンの機能、生長および生存、または血管形成を確実にすることが必要または望ましいが、他の神経栄養因子または血管形成物質がいずれも使用できないまたは無効である、様々な状況において、特に有用であろう。
以下の実施例は例示のためにのみ供するものであって、いかなるやり方によっても本発明を限定する意図は無い。本明細書に引用される全ての特許および参考文献は、説明的に引用して本明細書の一部とするものである。
実施例１
REK7 cDNAの同定と単離
中枢神経系ニューロンに作用するかも知れない新規成長因子を単離するため、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて新規チロシンキナーゼレセプターの研究を行った。多くのレセプターチロシンキナーゼのキナーゼドメイン内の保存されたアミノ酸配列に対応する変性センスおよびアンチセンスプライマーを作製した。該プライマーのヌクレオチド配列は以下の通りである。
0004252111.tif 000003
これらの変性プライマーを用い、標準的PCR法を用いて成熟マウス海馬cDNAライブラリーのcDNAを増幅し、得られる増幅cDNAをサブクローンし、配列決定を行った。サイズ約200bpの、これらcDNAの１つは、レセプターチロシンキナーゼのephファミリーの該キナーゼドメイン内のアミノ酸配列に関連すると思われる推定アミノ酸配列をコードしていた。次に、この200bpのcDNAをプローブに用いてラット海馬cDNAライブラリーから完全長cDNAを単離した。図１は該完全長cDNAのヌクレオチド配列（配列番号１）およびそれがコードする、REK7と呼ばれる蛋白の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
REK7はcek7のラット相同体と思われ、ehk-1およびbskと密接に関連している（Maisonpierreらの、Oncogene 8：3277-3288（1993）；Zhouらの、J.Neurosci.Res.37：129-143（1994）。詳細には、REK7 cDNAは、２つのタンデムフィブロネクチンタイプ−ＩＩＩドメインの最初のドメインを欠くehk-1のスプライス変異体に対応する。
実施例２
REK7発現プラスミドの構築
REK7をコードするcDNAを、哺乳動物発現ベクターpRK7（PCT公開番号WO90／02798、1990年９月22日公開）中のpRK7のXbaIおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼ開裂部位間にクローンし、発現プラスミドpRK-REK7を製造した。
実施例３
REK7-IgG融合蛋白の製造
REK7の細胞外ドメインとIgG1重鎖のＦｃドメインをコードしているDNAを結合することにより、可溶性REK7-IgGキメラをコードしているDNAを構築した。REK7-IgGキメラのIgG1部分をコードしているDNA配列を−IgG発現プラスミドpRKCD42Fc1から得た（Caponらの、Nature 337：525（1989）；Byrnらの、Nature 344：667（1990））。そのプラスミドは（システイン残基重−軽鎖結合に関与した後のIgG1ヒンジの最初の残基である）216位のアスパラギン酸残基からアミノ酸残基441に及ぶヒト免疫グロブリンIgG1蛋白の部分に融合した成熟ヒトCD4蛋白（２つのＮ末端CD4可変ドメイン）の残基1-180からなるハイブリッドポリペプチドをコードしている（IgG1中の残基の番号付けは重鎖定常領域の最初の残基であるアミノ酸残基114を基準にしている（Kabatらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第４版（1987）））。
PCRを用いて、ヒトIgG1Ｆcドメインの５’末端をコードする配列と結合したREK7細胞外ドメイン（細胞外ドメインと貫膜ドメイン間の接合部、Gln462で終了）の３’末端をコードする配列を含む600bp断片を作製した。600bp断片は３段階で構築された。最初に、REK7細胞外ドメインの３’末端を含むDNA断片を、pRK/EK7を鋳型に用い、5’-TCTGTGACAGACGATCCTCCC（プライマー１、配列番号８）および5’-GCACGGTGGACATGTGTGAGTTTTGTCCTGGCTTTGATCATTAGATGCTGCAAC（配列番号９）をプライマーに用いて増幅させた。次に、ヒトIgG1Fcドメインの５’末端を含むDNA断片を、pRKCD-IgGを鋳型に用い、5’-GTTGCAGCATCTAATGATCAAAGCCAGGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGC（配列番号１０）および5’-GCACTTGTACTCCTTGCC（プライマー２、配列番号１１）をプライマーに用いて増幅させた。最後に、２つの得られる増幅DNA断片を一緒に混合し、プライマー１および２を用いて第３のPCR中で共有結合させ、REK7-IgG融合蛋白をコードする600bp DNA断片を得た。
REK7 cDNAはDNA操作中の再配列と欠失を促進する配列を含むと思われるため、完全長REK7-IgG蛋白をコードする発現プラスミドの組立は３段階で行われた。最初に、600bpのPCR産物（上記参照）をKpnIおよびSacII制限エンドヌクレアーゼ消化により切断し、得られるKPNI-AacII断片をゲルで精製した。pRKCD４-IgG1はHindIIIおよびSacII制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、502ｂｐの断片を単離した。これらKpnI−SacII断片および502ｂｐ断片をKpnIおよびHindIIIで開裂させたBluescriptベクター（Stratagene,La Jolla,california USA）と連結し、REK7-IgG Intermediate１を作製した。
第２に、REK7-IgG Intermediate１をKpnIおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断し、得られる1000ｂｐ断片を単離した。pRK-REK7をKpnIおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、786ｂｐ断片を単離した。1000ｂｐ断片および786ｂｐ断片をApaIおよびEcoRIで切断したBluescriptベクター中に連結し、REK7-IgG Intermediate 2を作製した。
最後に、完全pRKREK-IgG発現プラスミド（7004ｂｐ）を以下の３断片を連結することによって組み立てた。REK7-IgG Intermediate 2をPflMIおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断し、1860ｂｐ断片を単離した。pRK-REK7をPflMIおよびPstI制限エンドヌクレアーゼで切断し、512ｂｐ断片を単離した。これら２つの断片をPstIおよびEcoRIで切断したpRK7ベクターに連結し、pRKREK7-IgGを得た。
Caponらの、既述およびByrnらの、既述に記載のリン酸カルシウム沈殿法を用い、ヒト胎児腎２９３細胞（Grahamらの、J.Gen.Virol.36：59（1977））およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でREK7-IgGを発現させた。REK7-IgGキメラは、Caponらの、既述に記載のごとく、固定化Staphylococcus aureus Protein Aアフィニティークロマトグラフィーにより無血清細胞培養上清から９５％以上の均一性で精製された。
実施例４
REK7リガンドの供給源の確認
推定上のREK7リガンドを確認するため、REK7-IgGを用いて、培養細胞系のREK7結合活性が細胞表面に発現しているかをスクリーニングした。細胞系は、REK7-IgGおよび蛍光抗IgG抗体とインキュベーションし、次いで蛍光活性化セルソーティング（FACS）することによりアッセイされた。
例えば、ヒト乳癌細胞系BT20（American type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA）は、5％CO2中、10％ウシ胎児血清（FCS）および1mMグルタミンを含有する50/50（v/v）F12/DMEM低グルコース培地（増殖培地）中で増殖させた。80〜90％コンフルエントとなった細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）中の5mM EDTAを用いて回収し、カウントし、バインディング緩衝液（50/50（v/v）F12/DMEM低グルコース培地、5％FCSおよび1mg/mLウシ血清アルブミン（BSA））中に、5x106個/mLの細胞密度で再懸濁した。細胞１mLにREK7-IgG 1μｇを加え、室温で２時間インキュベーションした。次に、遠心により細胞を回収し、室温で１時間フルオレセイン標識抗ヒトIgG1−Fcとインキュベーションし、次いでFACSにより分析を行った。
BT20細胞系およびヒト子宮頸癌細胞系HeLa（American type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA）はREK7-IgGと特異的に結合することがわかった。さらに、REK7-IgGとインキュベーションする前のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣによるこれら細胞の前処理によりREK7-IgGの結合が低下することがわかり、このことは、REK7リガンドがグリコホスファチジル−イノシトール（GPI）アンカーにより細胞膜に結合することを示唆した。
実施例５
BT20細胞からのREK7リガンドの精製
BT20細胞を150mmプレート中で80％コンフルエントまで増殖させ、PBS中の5mM EDTAで回収し、増殖培地を入れた850mm2ローラーボトル中に接種した。１週間の増殖後、細胞はほぼコンフルエントとなった。増殖培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、無血清増殖培地を加えた。５日後、順化培地を回収し（７２個のローラーボトルから12Ｌ）、遠心し、濾過滅菌し、カットオフ分子量12ｋＤのアミコンフィルター中で濃縮し、-70℃で保存した。
上記のごとく12Ｌから濃縮し、凍結したBT20順化培地200mLを溶解させ、Sorvall SS34ローター中で17,000rpmで遠心し、0.45μmフィルターで濾過して該溶液を浄化した。この200mLを、直列に並んだ2.0mL CD４-IgG-プロテインA（IgG部分を通してプロテインＡと共有結合したCD４-IgG）イムノアフィニティプレカラムおよび1.0mL REK7-IgG−プロテインＡ（IgG部分を通してプロテインＡと共有結合したREK7-IgG）イムノアフィニティカラムに、0.5mL/分の流速でポンプにて注入した。すべてのクロマトグラフィは４℃で実施した。両カラムに培地を１回完全に通した後、流速を0.2mL/分に下げ、培地を両カラム中に再循環させた。REK7-IgGカラムをローディングした後、２本のカラムをおのおの取り外し、カラム容量の10倍量のPBSで洗浄し、次いで100mMクエン酸ナトリウム（pH3.0）で４回それぞれ洗浄しながら溶出した（CD４-IgGカラムについては各2mL、およびREK7-IgGカラムについては各1mL）。最初の２回の洗浄ではカラムを速やかに流出させたが、終わりの２回は回収前に１５分間インキュベーションした。50mMリン酸カリウムを加えて溶出液をｐＨ7.4とし、各部分標本をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分析した。ゲルを銀染色した後、終わりの２回の洗浄からの溶出液で、約28,000、27,000、および25,000ダルトンの染色されたバンドが認められ、これらのバンドはCD４-IgGプレカラムの同様の処理によって得られた溶出液にはみられなかった。
実施例６
蛋白のシークエンシング
SDS-PAGEで観察された28,000、27,000、および25,000ダルトンの蛋白バンドをエレクトロブロッティングでPVDF膜（Millipore Corporation）に移し、次いでApplied Biosystems 473Aまたは470Aシークエンサーを用いてアミノ酸配列の決定を行った。28,000および25,000ダルトンの蛋白の各Ｎ末端はブロックされたが、27,000ダルトンの蛋白のＮ末端は以下の配列を示した：
0004252111.tif 000004
Lys-Cエンドペプチダーゼで臭化シアンを開裂または消化した後の３つの蛋白バンドの別々の配列分析から、28,000、27,000、および25,000ダルトン蛋白には関連があることが示された。特に、27,000ダルトンと25,000ダルトンの蛋白は28,000ダルトンの蛋白の蛋白分解処理された型であると思われた。Lys-Cエンドペプチダーゼで消化した後の28,000ダルトンのバンドの配列分析では２つの配列を生じ、その１つは27,000蛋白のＮ末端配列とほぼ同じであり、さらに３個のＮ末端残基、ＡＶＡも有していた。以下の内部アミノ酸配列を該蛋白の臭化シアンおよびLys-C断片について検討した。
0004252111.tif 000005
実施例７
REK7リガンドcDNAの単離
REK7リガンドについて得られた上記蛋白配列に基づいて、２つの変性PCRプライマーを合成し、REK7リガンドをコードするcDNAを単離した。
0004252111.tif 000006
これらの変性プライマーを用い、標準的PCR法を用いるＢＴ20細胞cDNAライブラリーのcDNAを増幅させ、得られる増幅cDNAをサブクローンし、配列決定した。サイズ約180ｂｐおよび１３５ｂｐのこれらcDNAはREK7リガンドについて決定された上記アミノ酸配列に対応する推定アミノ酸配列をコードしていた。180ｂｐ断片を用い、高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションによりヒト胎児脳cDNAライブラリー（約２ｘ１０6クローンを含む）をスクリーニングした。２つの別々の陽性cDNAクローンから決定したヌクレオチド配列を、ＡＬ−１と名付けたREK7リガンドの推定アミノ酸配列と共に図２に示す。
実施例８
生物活性
生後２日目（Ｐ２）のWistarラットの大脳皮質を、無菌条件下で４℃ハンクス平衡塩溶液（HBSS、カルシウムおよびマグネシウム不含）中で解剖した。10mLピペヅトで最初にトリチュレーションした後、10mLシリンジに取り付けた18ゲージの注射用カニューレを２回通して細胞を解離させた。細胞懸濁液を７０μｍ細胞濾過器（Falcon）で濾過し、800gで５分間遠心した。ペレット化した細胞を10％ウシ胎児血清、15mM HEPES（pH7.4）を含む50/50（v/v）DMEM/F12に再懸濁させた。細胞懸濁液を75cm2組織培養フラスコに入れ、これを37℃の5%CO2インキュベーターに入れた。培養をコンフルエントになるまで増殖させ（10〜15日）、３日毎に培地を交換した。培養がコンフルエントになったらフラスコを37℃、300rpmで24時間ロータリーシェーカー中で振とうさせ、純粋な星状細胞を得た。懸濁細胞および屑を含む培地を交換し、培養をさらに24時間インキュベーションした。純粋な星状細胞培養をフラスコからトリプシン処理し（ハンクス中0.05%トリプシン、0.025mM EDTA）、次いで60mm組織培養処理ディッシュ（75cm2フラスコあたり２枚）に入れ替えた。
胎齢16日目（E16）のラットの大脳皮質を無菌条件下、４℃HBSS中で解剖した。培地をDefined Neuronal Medium（「DNM」、Petersonらの、Dev.Brain Res.48：187-195（1989））1mLと交換し、プラスチックディスポーザブルピペットブルーで15回ピペッティングして皮質をトリチュレートした。次いでDNM 9mLを加え、細胞懸濁液を45μm細胞濾過器で濾過し、800gで５分間遠心した。ペレットになった細胞をDNM 5mLに再懸濁し、細胞４ｘ105個を、REK7-IgG（30μｇ/ｍＬ）またはCD４-IgG（30μｇ/ｍＬ）、もしくはIgG無添加（コントロール）であらかじめ６時間前処理した星状細胞を含む60mmディッシュ上に接種した。培養を４日間増殖させ、次いで100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中の4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した後PBSで３回洗浄した。
この共培養にREK7-IgGを加えると、軸索束の形成が完全に抑制された。反対に、CD４-IgG、他のレセプター-IgG（例えば、TrkA-IgG（Sheltonらの、J.Neurosci.15：477-491（1995））、およびEph関連HTK-IgG（Bennettらの、J.Biol.Chem.269：14211-14218（1994））を加えても軸索束の形成に影響はみられなかった。これらの結果は、傷害後の再生時の神経系の成長におけるきわめて重要な段階である軸索束形成におけるREK7とそのリガンドであるAL-1の役割を示す。
この役割と一致して、標識抗REK7抗体による培養神経細胞のインキュベーションにおいて、軸索束中の軸索繊維表面への抗体の特異的結合がみられた。関連EPHファミリーレセプターであるSEK1（Gilardi-Hebenstreitらの、Oncogene 7：2499-2504（1992）は軸索束中の軸索繊維表面に結合しなかった。さらに、AL-1は共培養の星状細胞上に優勢に発現するが、REK7は皮質ニューロンの細胞体と軸索繊維の両方に発現する。
実施例９
生物活性：AL-1によるREK7の活性化
REK7発現細胞をAL-1と共にインキュベーションするとREK7の特異的リン酸化が観察され、AL-1はREK7と結合するのみならず、REK7を活性化することが示唆された。培養一次皮質ニューロンは抗REK7および抗ホスホチロシン抗体を用いる免疫沈降法とイムノブロッティングによって分析された。トランスフェクトされた293細胞の表面に一過性に発現した膜結合AL-1は135K REK7ポリペプチドの自己リン酸化が示すように、皮質ニューロン中に発現した内因性REK7を強く活性化した。反対に、精製可溶性AL-1はREK7のチロシン自己リン酸化を弱くしか誘導しなかった（〜２倍）（Winslowらの、Neuron,14：973-981（1995）、この内容は本明細書の一部を構成する）。これらのデータは（i）皮質ニューロンにおけるREK7の存在を確認し、（ii）AL-1が活性化をもたらすリガンドであることを示し、（iii）このリガンドファミリーの他のメンバーで知られているように、レセプターが最大に活性化するには膜−付着が必要であることを示している（Davisらの、Science 266：816-819（1994））。
リン酸カルシウム共沈殿法を用いて、HEK293細胞をAL-1 cDNA発現プラスミドでトランスフェクトした（SimonsenとLevinsonの、Proc.Natl.Acad.Sci.80：2495-2499（1983））。E16ラットから得た一次皮質ニューロンを細胞5ｘ106個/15cmディッシュの密度で接種し、４日間培養した。次に、これらの細胞を、精製可溶性AL-1（0.1-１μg/mL）または膜結合性AL-1を発現している293細胞で37℃で10分間処理した。溶解物のウサギ抗REK7による免疫沈降法およびマウス抗ホスホチロシンによるイムノブロッティングは本質的にKaplanらの、Science 252：554-559（1991）およびKaplanらの、Nature 350：158-160（1991）に記載の通りである。イムノブロットされたバンドは、ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体およびECL蛍光検出システム（Amersham）を使用説明書に従って用い可視化した。
実施例10
AL-1-IgGの活性
AL-1-IgG融合蛋白はAL-1の可溶性、活性型であることがわかった。可溶性AL-1-IgGキメラをコードするDNAは、REK7-IgGの構築と同様に、AL-1の細胞外ドメインとIgG1のFcドメインをコードするDNAを結合することによって構築された。AL-1-IgG融合細胞は293細胞をプラスミドpRKAL-1-IgGでトランスフェクションすることによって製造された。３日後に順化培地を回収し、AL-1-IgGをプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。AL-1-IgGのREK7レセプター活性化能は、既述のごとくラット胎児（E16）皮質ニューロンREK7レセプターのチロシン自己リン酸化によって測定された。同じ密度と数の皮質細胞（5ｘ106個/15cmプレート）を用い、AL-1-IgG 1ug/mLを可溶性AL-1 1ug/mL、または同等の数の膜結合AL-1発現293細胞と比較した。無添加、およびmockトランスフェクション293細胞をコントロールとして含めた。AL-1-IgGは、膜結合AL-1と同程度にREK7の自己リン酸化を大きく活性化した。これらの結果は、可溶性AL-1-IgG融合蛋白がin vitroおよびin vivo研究においてREK7レセプターのアゴニストとして使用可能であることを示した。可溶性AL-1にREK7の自己リン酸化の活性化能がなかった（アフィニティークロマトグラフィー精製により該レセプターに結合することは解っている）ことは、可溶型のAL-1（および一般にEPHレセプターと同起源のレセプターに対するEPHレセプターリガンド）がREK7のアンタゴニストとして作用しうることを示している。
実施例11
可溶性AL-1は軸索束形成のアンタゴニストである
可溶性AL-1はREK7と結合したが、REK7を効率的に活性化せず、また可溶性AL-1はREK-7レセプター活性のアンタゴニストとして作用し、細胞培養系での軸索束形成をブロックした。皮質ニューロン−星状細胞共培養の培養培地に可溶性AL-1を加えると、REK7-IgGと同様に軸索束形成が特異的に抑制された。この結果は、（i）AL-1は共培養中に発現する（星状細胞に優性）、（ii）REK7は皮質ニューロンの細胞体と軸索繊維の両方に発現する、（iii）AL-1はREK7を活性化し得るという観察結果と共に、さらにAL-1およびREK7が分子として軸索束形成（この作用はREK7-IgGによって阻害される）に関与することを意味する。
培養培地に加えた抗REK7および抗SEK抗体200μg/mLの軸索束形成に対する影響を試験した。これらの培養では、いずれの試薬も軸索束形成に明らかな影響を示さなかった。抗REK7抗体は軸索繊維と結合するが束形成をブロックしないため、単に軸索と結合するだけでは束形成の進行と干渉するのに十分でなく、このことはさらにREK7-IgGおよび可溶性AL-1の阻害効果がREK7機能の特異的阻害によるものであることを裏付けるものである。
以下のメカニズムは本発明の限定を意味するものではない。軸索束形成におけるREK7の役割はおそらく二次的なものであり、REK7およびAL-1はそれ自身付着分子として機能するのではなく、むしろ軸索束形成過程の調節に関与している。星状細胞上に発現したAL-1によるニューロン上に発現したREK7の活性化は、（例えば、付着分子の活性化または促進的調節による）束形成を促すシグナリング経路を活性化するかも知れない。REK7の活性化は成長円錐の拒絶（repulsion）と衰退を引き起こし、軸索を合体させ、束形成を起こさせるのかも知れない。星状細胞に発現したAL-1は軸索の束形成をもたらす軸索に対する拒絶的合図として働くのであろう。このモデルは、星状細胞がCNSの発達時に重要な役割を果たすとする最新の見解（星状細胞は成長している軸索の基底と栄養的支持を提供すると考えられている）と矛盾しない（Hattenらの、Semin.Neurosci.2：455-465（1990））。
本明細書中に記載のごとくチロシンキナーゼは軸索束形成に必要である。発達または再生中の神経系のニューロンにはおそらく２つのタイプの因子、すなわち、成長と生存を促すものと、神経経路の樹立において空間的または方向的な誘導をもたらすもの、が必要である（Tessier-Lavigneの、Curr.Opin.Genet.Devel.4：596-601（1994））。チロシンキナーゼは前者において十分に確立された役割を演ずることが知られているが、後者に関与することは今までのところ示されていない。本明細書の開示内容はREK7およびAL-1が脳内で発現するという観察と共に、神経系の発達と再生におけるきわめて重要な特徴であるニューロン経路の形成における役割を示している。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：ジェネンテク・インコーポレイテッド
カラス,イングリッド・ダブリュー
ウィンスロー,ジョン・ダブリュー
（ii）発明の名称：ＡＬ−１神経栄養因子
（iii）配列の数：１８
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：ジェネンテク・インコーポレイテッド
（Ｂ）通り：ポイント・サン・ブルノ・ブールバード４６０番
（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：３.５インチ、１.４４Ｍｂフロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：WinPatin（Genentech）
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／３３０１２８
（Ｂ）出願日：１９９４年１０月２７日
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／４８６４４９
（Ｂ）出願日：１９９５年６月６日
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）氏名：トルチア,ティモシー・イー
（Ｂ）登録番号：３６,７００
（Ｃ）参照／整理番号：Ｐ０９２０Ｐ２ＰＣＴ
（ix）電話連絡先情報
（Ａ）電話番号：（４１５）２２５−８６７４
（Ｂ）ファックス番号：（４１５）９５２−９８８１
（Ｃ）テレックス：（９１０）３７１−７１６８
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１６５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0004252111.tif 000007
0004252111.tif 000008
0004252111.tif 000009
0004252111.tif 000010
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：９２８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0004252111.tif 000011
0004252111.tif 000012
0004252111.tif 000013
0004252111.tif 000014
0004252111.tif 000015
0004252111.tif 000016
0004252111.tif 000017
0004252111.tif 000018
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８３９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
0004252111.tif 000019
0004252111.tif 000020
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
0004252111.tif 000021
0004252111.tif 000022
0004252111.tif 000023
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0004252111.tif 000024
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0004252111.tif 000025
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
0004252111.tif 000026
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
0004252111.tif 000027
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号９：
0004252111.tif 000028
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１０：
0004252111.tif 000029
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１１：
0004252111.tif 000030
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１２：
0004252111.tif 000031
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１３：
0004252111.tif 000032
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１４：
0004252111.tif 000033
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１５：
0004252111.tif 000034
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１６：
0004252111.tif 000035
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１７：
0004252111.tif 000036
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１８：
0004252111.tif 000037
【図１Ａ】
0004252111.tif 000038
【図１Ｂ】
0004252111.tif 000039
【図１Ｃ】
0004252111.tif 000040
【図１Ｄ】
0004252111.tif 000041
【図２】
0004252111.tif 000042
【図３Ａ】
0004252111.tif 000043
【図３Ｂ】
0004252111.tif 000044