(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４または１０〜１７で示されるマイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１８個の連続的なヌクレオチド配列、配列番号５〜９で示される配列、およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含む核酸プローブをマイコバクテリア・カンサシ核酸とハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）上記核酸プローブと前記マイコバクテリア・カンサシ核酸とのハイブリダイゼーションを検出するステップと、
を含むマイコバクテリア・カンサシの検出方法。
【請求項２】
（ａ）配列番号４または１０〜１７で示されるマイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１８個の連続的なヌクレオチド配列、配列番号５〜９で示される配列、およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含む標的結合配列を含む増幅プライマーをマイコバクテリア・カンサシ核酸とハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）上記マイコバクテリア・カンサシ核酸を増幅するステップと、
（ｃ）増幅したマイコバクテリア・カンサシ核酸を検出するステップと、を含むマイコバクテリア・カンサシの検出方法。
【請求項３】
第一及び第二の増幅プライマーを前記マイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２核酸とハイブリダイズさせ、上記増幅ステップがハイブリダイズした最初及び第二の増幅プライマーを結合して増幅産物を生産することによって行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
配列番号４または１０〜１８で示されるマイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１８個の連続的なヌクレオチド配列、配列番号５〜９で示される配列、およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含む核酸プローブまたは増幅プライマー。
【請求項５】
マイコバクテリア・カンサシを検出するための核酸プローブまたは増幅プライマーであって、前記核酸プローブまたは増幅プライマーは配列番号４または１０〜１７で示されるマイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１８個の連続的なヌクレオチド配列、配列番号５〜９で示される配列、およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、かつ、６０℃で０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーというストリンジェントな条件下では、非マイコバクテリア・カンサシ核酸とハイブリダイズしない核酸プローブまたは増幅プライマー。
【請求項６】
（ａ）請求項４または５に記載された前記核酸プローブまたは増幅プライマーと、
（ｂ）（ａ）前記核酸プローブまたは増幅プライマーを用いて前記マイコバクテリア・カンサシ核酸を検出するための手段と、を含んでなるマイコバクテリア・カンサシ核酸の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物を検出及び／又は同定する方法及び核酸配列に関し、特に、核酸の増殖及び核酸のハイブリッド形成を用いたＭ・カンサシ(Mycobacterium kansasii)を検出及び／又は同定する方法及び核酸配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイコバクテリアは、抗酸性及び非運動性のグラム陽性細菌の一属である。この属には、マイコバクテリウム・アフリカウム(Mycobacterium  africanum)、Ｍ・アビウム(M.avium)、Ｍ・ボビス(M.bovis)、Ｍ・ボビス−ＢＣＧ(M.bovis−BCG)、Ｍ・チェロナエ(M. chelonae)、M. fortuitum、M. gordonae、M. intracellulare、M. kansasii（Ｍ・カンサシ）、M. leprae、M. microti、M.scrofulaceum、M. paratuberculosis、M. tuberculosisと言った多くの菌種を含む。これらのマイコバクテリアの一部は人及び動物のいずれにとっても病原性であり、特にM. tuberculosisとM. leprae、M.bovis、である。その他のマイコバクテリア種は、一般的な病原菌ではないが、しかし、免疫システムが損なわれた人、例えば、ＡＩＤＳ患者にとっては日和見感染性を示す。例えば、Ｍ・カンサシとM.avium、M. intracellulareが、免疫システムが抑制され又は損なわれた人に対し過酷な肺の病気を引き起こす原因となる。実際に、１９５３年以降始めて、マイコバクテリアのよる感染ケースの記録がアメリカで増加していて、その多くのケースはエイズの流行と関係している。
【０００３】
一般の実験室的マイコバクテリアの特定は抗酸染色法及び有機体の培養に基づいて、生化学の分析法に従って行う。マイコバクテリアの低成長及び長い一生の結果、一般な技術をもって正確な実験室的マイコバクテリアの分析には約６週間がかかることになる。例えば、バックテックシステム（ＢＡＣＴＥＣTM（Becton Dickinson Microbiology Systems、通称ＭＤ））のような自動培養システムでは、マイコバクテリアの同定時間を１〜２週間に短縮できる。それにも関わらず、正確なマイコバクテリアの分析にかかる時間を１週間以内に、好ましくは１日に、短縮するという技術上の要求が存在する。
【０００４】
核酸塩基同定の分析方法、例えばサザンハイブリッド法では通常結果を出すには１日かからない。マイコバクテリア同定のためのＰＣＲ塩基法は感度が高く、通常数時間で結果を出せる。しかしながら、マイコバクテリアを同定するのに核酸塩基同定法を用いると、通常ではいくつの欠点を伴う。これらの方法の多くは高価であり、また、わずか数種のマイコバクテリアにしか利用できなく、しかも、一回のサンプルテストでは一種の菌しか決定できない。その上、核酸塩基同定法は、特定のマイコバクテリウム属あるいはマイコバクテリアの特定の種に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ又はプリマーの発生が要求する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
一般に実験室でのマイコバクテリア種Ｍ・カンサシの同定は、その成長の特性及び生化学的テスト法による。Ｍ・カンサシの生化学上の性質は、カタラーゼの産物、ウレアーゼ活性、TWEEN？加水分解、硝酸還元、そして光発色性（すなわち、細菌が光に露呈されると色素を生産する性質）を含む。いくつか他のマイコバクテリア種もＭ・カンサシと同様な生物化学的特性を示し、そして、Ｍ・カンサシの決定的な同定は通常その発色性に依存していうる。通常、発色性による決定には問題があり、それは純粋な有機培養を要求し、また、その特性が変りやすく、主観的であり、及びそれを確実に決定することが困難だからである。
【０００６】
従来からのＭ・カンサシ分析法に付随する問題を防止するために、種特異的ハイブリッド形成あるいはＭ・カンサシ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーによる核酸増殖を用いる核酸塩基同定方法の開発が試みられている。
ホアンら(Z. H. Huang)は、Ｍ・カンサシのゲノムライブラリからＤＮＡプローブ（pMK1-9）を公表している(J. Clin. Microbiol. 29, 2125 (1991))。このＤＮＡプローブ（pMK1-9）は、Ｍ・カンサシのＤＮＡとの相補的ハイブリッドを形成できるが、他の種のマイコバクテリアとも同様にハイブリッドを形成できる。更に、このプローブは遺伝子上明確なＭ・カンサシ種のサブグループの検出に失敗した。ホアンらは、pMK1-9のヌクレオチド配列のみならず、どの遺伝子から検出して同定したことも公表していない。
【０００７】
B.C.ロスら(B.C.Ross)がＭ・カンサシの同定にpMK1-9プローブ及びＭ・カンサシのｒＲＮＡ遺伝子と特異的にハイブリッド結合する市販のＤＮＡプローブ(ACCUPROBETM, GenProbe, San Diego,カリフォルニア州)を用いることに注目した(J. Clin. Microbiol. 30, 2930 (1992))。ロスらはpMK1-9プローブ及び市販のＤＮＡプローブ(ACCU−PROBETM)のいずれとも相当数のＭ・カンサシ株種を検出できなかったことを報告している。トラトリら(Tortoli et al.)も同様にＭ・カンサシを検出に市販のＤＮＡプローブ(ACCU−PROBETM)を用いる効力を評価した(Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13, 264 (1994))。その研究者らはACCU−PROBETMが１００％種特異的であり、他のマイコバクテリア種に対するクロス反応を示さないが、実験中では、Ｍ・カンサシ株の中の７３％しか検出することができず、それがいくつかの株の中での遺伝的な多様性の結果である可能性を見いだした。
【０００８】
Ｍ．ヤンら(M. Yang et al. )がＭ・カンサシ特異的なＤＮＡハイブリッド形成プローブ(p6123) をＭ・カンサシの臨床分離体から精製することができた(J. Clin. Microbiol. 31, 2769 (1993))。このプローブ(p6123)は実験に用いたすべてのＭ・カンサシ株に対してハイブリッド結合ができ、ロスらのＤＮＡプローブ（pMK1-9）に反応しなかったサブグループをも含む。スピアース（Spears）に与えられた米国特許第5,500,341号は、p6123プローブから精製したＭ・カンサシ特異的増殖プライマーを開示している。
【０００９】
Ｂ．ボディングハウスら(B.Boddinghaus et al.)は、特異的に増殖し、マイコバクテリアＤＮＡにハイブリッド結合する、１６ＳのｒＲＮＡから精製分離したマイコバクテリア属特異的オリゴヌクレオチドを開示している(J. Clin. Microbiol. 28, 1751 (1990))。
Ｔ．ロガルら(T. Rogall et al.)は、１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子の一部のＰＣＲ増殖法とそれに続く直接の配列決定により多様なマイコバクテリア種を識別した(J. Gen. Microbiol. 136, 1915 (1990))。しかしながら、Ｍ・カンサシとM.gastri（Ｍ・ガストリ）とは表現型上異なる特性を有しても、それらの１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子配列が全く同じであるため、この方法ではＭ・カンサシをＭ・ガストリから分離して識別することができなかった。
【００１０】
ヒューズら(Hughes et al.)は、１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法で増殖して制限酵素解析あるいは直接サイクル配列法のいずれかにより、多様なマイコバクテリア種を識別した(J. Clin. Microbiol. 31, 3216 (1993))。ヒューズらもまたこの方法ではＭ・カンサシとＭ・ガストリとを区別することができないことを発見した。キルシェナら(Kirschner et al.)も同様な結果を報告している(J. Clin. Microbiol. 31, 2882 (1993))。キルシェナらは、また光発色性テストを用いた特徴な方法を核酸配列法に補ってやれば、Ｍ・カンサシとＭ・ガストリとが分別することができることを報告している。
【００１１】
Ｍ．バネチョートら(M. Vaneechoutte et al.)は、１６ＳのｒＲＮＡのＰＣＲ増殖法と増殖物の制限分析法と併用することによって、Ｍ・カンサシを含めた特異的なマイコバクテリア種を識別する方法を提供している(J. Clin. Microbiol. 31, 2061 (1993))。このテクニックによりＭ・カンサシの陽性同定に要する時間を一日以内に押さえることができた。Ｍ．バネチョートらは、このテクニックをもってＭ・ガストリの同定の可否及びＭ・カンサシとＭ・ガストリとの分別の可否につきなんの評価も示さなかった。
よって、技術上において迅速な、正確かつ好感度なＭ・カンサシを同定する方法に対する要請が存在している。
【００１２】
【課題を解決する手段】
本発明は、ハイブリッド結合及び増殖アッセイによってＭ・カンサシ核酸の識別に用いることができる、Ｍ・カンサシゲノムの新しい同定フラグメントを提供する。
第一態様では、本発明は以下の（ａ）及び（ｂ）で構成するマイコバクテリウム・カンサシを識別する方法を提供する。即ち、（ａ）核酸プローブに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有する核酸プローブにマイコバクテリウム・カンサシの核酸をハイブリッド結合させ、及び、（ｂ）核酸プローブとマイコバクテリウム・カンサシの核酸とのハイブリダイゼーションを識別する。
【００１３】
第二態様では、本発明は、（ａ）核酸プローブに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有する核酸プローブにマイコバクテリウム・カンサシの核酸をハイブリッド結合させることと、（ｂ）核酸プローブとマイコバクテリウム・カンサシの核酸とのハイブリダイゼーションを識別することとを含んでいる種特異的なマイコバクテリウム・カンサシを識別する方法を提供する。
【００１４】
第三態様では、本発明は、（ａ）バインドするターゲットを含む増殖プライマーに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有する配列に結合するターゲットを含む増殖プライマーにマイコバクテリウム・カンサシの核酸をハイブリッド結合させることと、（ｂ）マイコバクテリウム・カンサシの核酸を増殖することと、（ｃ）増殖したマイコバクテリウム・カンサシの核酸を識別することとを含んでなるマイコバクテリウム・カンサシを識別する方法を提供する。
【００１５】
第四態様では、本発明は、（ａ）バインドするターゲットを含む増殖プライマーに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有する配列にバインドするターゲットを含む増殖プライマーにマイコバクテリウム・カンサシの核酸をハイブリッド結合させることと、（ｂ）マイコバクテリウム・カンサシの核酸を増殖することと、（ｃ）増殖したマイコバクテリウム・カンサシの核酸を識別することとを含んでなる種特異的なマイコバクテリウム・カンサシを識別する方法を提供する。
【００１６】
第五態様では、本発明は単離したマイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列を含有するＤＮＡを開示する。本発明は更に、ストリンジェントな条件下、特に６０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエンナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーという条件下で、非マイコバクテリウムカンサシ核酸とハイブリッドを形成しないオリゴヌクレオチド、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１７】
第六態様では、本発明は（ａ）本発明と一致する新規なオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）マイコバクテリウムカンサシの核酸を検出するための方法に用いるオリゴヌクレオチドで構成するマイコバクテリウム・カンサシを識別するキットを提供する。更に、本発明は、マイコバクテリウム・カンサシ核酸の種特異的な検出用キットも開示している。
本発明の以上及びその他の態様は、以下の本発明の記載において更に詳しく述べる。
【００１８】
本願において提示したヌクレオチド配列は、左から右に５'から３'までの直鎖のみである。また、本願発明においてのヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨された方式で表され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８２２と確立した慣用名に一致する。
【００１９】
遺伝子工学におけるクローン遺伝子の使用と生産、組み替え型ＤＮＡ、ベクター、トランスフォーム宿主細胞、選択可能なマーカー、タンパク質、タンパク質のフラグメントは当業者にとって常識なものである。例えば、ベルら(Bell et al.)の米国特許第４，７６１，３７１号の第６列第３行目から第９列の第６５行目、クラークら(Clark et al.)の米国特許第４，８７７，７２９号の４列第３８行目から第７列第６行目、シェリングら(Schilling et al.)の米国特許４，９１２，０３８号の第３列第２６行目から第１４列の第１２行目、ワルナーら(Wallner et al.)の米国特許４，８７９，２２４号の第６列第８行目から第８列の第５９行目を参考にする。ここに引用したすべての米国特許がこれらの全体のままで本明細書の一部をなすものとして組み込まれているものとする。
【００２０】
本願発明に開示した、数多くの典型的又は非典型的なＭ・カンサシ株からのＭ・カンサシＤＮＡのある部分の配列を“ＫＡＴＳ２"と呼ぶ。このＫＡＴＳ２断片では典型的と非典型的なＭ・カンサシ株の間に配列の高度な同一性を示している。本願に開示したいくつかのＫＡＴＳ２配列がＭ・カンサシの診断及び検出用の方法を提供する。例えば、これらの配列を用いて、伝統的なサザンあるいはドットブロットハイブリダイゼーション用のハイブリダイゼーションプローブを設計し、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction (PCR)）、リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction (LCR)）、ストランド置換増幅（Strand Displacement Amplification (SDA)）、好熱性のストランド置換増幅（Strand thermophilic Displacement Amplification (tSDA)）用の増幅プライマーを設計することができる。
【００２１】
本願に開示したＫＡＴＳ２配列は、配列番号４と配列番号１０から配列番号１７として提供された配列、及びそれらの補体を含む。典型的又は非典型的なＭ・カンサシ株のいずれからのＫＡＴＳ２配列、特にここに開示されたもの以外の配列も本願発明の一態様である。更に、別の態様として、本願発明のＫＡＴＳ２配列は、増幅産物（即ち、アンプリコン（amplicons））や、Ｅ１Ｃ（配列番号５）とＥ３（配列番号９）のような増幅プライマーを用いてテンプレートとしたＭ・カンサシ核酸の増幅の結果物を含む。Ｍ・カンサシ株のいずれからのＫＡＴＳ２配列、特にここに開示されたもの以外の配列は、ここに与えられた配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の配列を有するＭ・カンサシのＫＡＴＳ２部位の範囲内に見いだされた連続なＤＮＡセグメントと一般には少なくとも７５％以上の相同性（そして、８０％、８５％、９０％あるいは９５％の相同性）を保有し、また、以下に定義する高度にストリンジェントなの条件下で、Ｍ・カンサシ核酸とハイブリッド結合できうる。
【００２２】
本願発明のＫＡＴＳ２配列は、高度にストリンジェントな条件下でＭ・カンサシ核酸とハイブリッド結合し、ここに特に開示したＫＡＴＳ２配列、特にここに配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の配列として開示したＫＡＴＳ２配列と実質上相同である配列を含む。この定義は自然な対立性的なＫＡＴＳ２配列中の変異体を包含するものである。ここにおいて使用する意味でヌクレオチド配列が「実質上の相同」であるとは、少なくとも７５％以上、特に８０％、８５％、９０％あるいは９５％の相同性であることが好ましい。
【００２３】
相同性のＤＮＡ配列とここで示すＤＮＡ配列とのハイブリッド結合させるための高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によく知られている。例えば、このような配列とここに開示したＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミド、5X SSC、5Xデンハート液、１００μｇ／ミリリットルのＤＮＡ一本鎖、及び５％のデキストラン硫酸、そして４２℃で１５分間２５％ホルムアミド、5X SSCの洗浄で達成することができ、そして約６０％の相同性の配列のハイブリダイゼーション許容される。よりストリンジェントな条件は、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳによる６０℃、さらには７０℃までの洗浄のストリンジェンシーによって与えられる。サムブルークらの分子クーロニングの実験室マニュアル(SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (2d ed. 1989))を参照する。一般に、ここに開示するＫＡＴＳ２配列の調節的な要素にハイブリッド結合するＫＡＴＳ２配列は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％あるいは９５％まで、またはそれ以上の相同性を保有する。
【００２４】
核酸ハイブリダイゼーションプローブは、本願発明の一態様である。ここに用いる、“プローブ"という用語はターゲットヌクレオチド配列とハイブリダイズして、その検出に有用なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーとは異なって、プローブはポリメラーゼによって延長されない。プローブは時に検出可能なラベルと結合してターゲット配列とハイブリダイズした時にそれ自身の検出と捕捉を可能にして、ターゲット配列の検出を可能にする。ここにいうハイブリダイゼーションプローブの“ターゲット配列"とは、プローブが特定的にバインドする核酸配列を意味する。
【００２５】
ここに開示したプローブはＭ・カンサシの核酸とハイブリダイズする。具体的には、本発明のプローブは、上記で定義したストリンジェントなな条件下、本願で開示したＫＡＴＳ２配列の連続なヌクレオチドとハイブリダイズする。本発明のプローブは、本発明で開示したＫＡＴＳ２配列を含有する連続的なヌクレオチド、特に、配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％あるいは９５％まで、またはその以上の相同性を有する。本発明の実施例によれば、このプローブはここで与えられた配列番号５から配列番号９及びそれらの相補的配列を有する。ハイブリダイズするには核酸の完全な相同性を要求しないが、本発明で特定して開示したプローブ配列に対して、本発明で開示したＭ・カンサシプローブの機能の喪失しないプローブ配列と実質的な相同性を保持する程度に修飾を行うことがこの技術分野における当業者にとっては明白である。相同性なあるいは部分的相同性な核酸配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーを増やすあるいは減らすによってハイブリダイゼーション条件を調整して完成されることがこの技術分野では周知である。
【００２６】
核酸ハイブリダイゼーションプローブは適当な長さであってよい。プローブの長さは特別な上限も下限も設けていないが、ターゲットのＫＡＴＳ２核酸とハイブリダイズし、プローブとして有効な機能（例えば、検出を容易にする）を有するプローブの長さと同様であればよい。少なくとも１０個の連続的な、上記で定義したＭ・カンサシ配列のヌクレオチドを包含するプローブが本発明の具現化の一選択である。本発明のプローブの長さは、５０、４０、３０、２０、１５あるいは１０個、更にもっと短いヌクレオチドであっても構わない。同様に、プローブの長さは、２０、４０、５０、６０、７５、１００あるいは２００個、更にもっと長いヌクレオチドであってもよい。プローブの長さの上限は選択した特定なＫＡＴＳ２配列の長さである。例えば、Ｍ・カンサシ株７１１のＫＡＴＳ２核酸に由来するプローブ（図３の配列番号１１を参照）の長さは、３０９個のヌクレオチドである。しかしながら、便宜上一般的に、プローブは１０〜２００個のヌクレオチドであり、特に１２〜１００個のヌクレオチドが、更に１５〜１００ヌクレオチドが、もっとも１５〜７５個のヌクレオチドが好ましい。
【００２７】
本発明の好適な態様では、ヌクレオチドプローブは上記したストリンジェントな条件下（例えば、６０℃で、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシー）ではマイコバクテリア以外のすべての属からの核酸とハイブリダイズしないが、するとしても、マイコバクテリア核酸をハイブリダイズして検出するプローブを用いて同じ条件下で、非マイコバクテリアのハイブリダイゼーションあるいは検出することが非現実であるように無視できる程度のものである。本発明の更なる態様として、このプローブはストリンジェントな条件下ではマイコバクテリア属のＭ・カンサシ及びＭ・ガストリ以外のすべての核酸とハイブリダイズしないが、するとしても、Ｍ・カンサシ及びＭ・ガストリ核酸をハイブリダイズして検出するプローブを用いて同じ条件下で、非Ｍ・カンサシ及び非Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーションあるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。本発明のさらなる態様として、このプローブはストリンジェントな条件下ではＭ・ガストリ核酸とハイブリダイズしないが、するとしても、Ｍ・カンサシ核酸をハイブリダイズして検出するプローブを用いて同じ条件下で、Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーションあるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。本発明のもっとさらなる態様として、このプローブは種特異性である。つまり、このプローブは、ストリンジェントな条件下ではＭ・カンサシからの核酸としかハイブリダイズすることができなく、ほかのマイコバクテリアあるいは非マイコバクテリア種からの核酸とハイブリダイズすることができないが、できるとしても、プローブがＭ・カンサシからの核酸とハイブリダイズして検出する条件と同じくして、非マイコバクテリア種の核酸のハイブリダイゼーションあるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。
【００２８】
本発明の一つの態様は上述のような核酸プローブを用いたＭ・カンサシの検出用方法である。本発明のこの実施態様では、核酸プローブがＭ・カンサシとハイブリダイズし、そして、このプローブとＭ・カンサシ核酸との間のハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションがこの分野において周知ないずれかの適当な方法で実施することができる。一般には、ハイブリダイゼーションは高度なストリンジェンシーの条件下で形成される。ハイブリダイゼーション条件を変更して、ハイブリダイゼーションの程度の増加若しくは減少、つまりハイブリダイゼーション特異性のレベル及び非特異性結合のバックグランドレベルを変更できることは、分野の当業者にとっては明白である（例えば、ハイブリダイゼーションあるいは溶出液の塩濃度又は温度を変更する）。
【００２９】
同様に、プローブとＭ・カンサシ核酸間のハイブリダイゼーションの検出はこの分野の周知の方法によって成し遂げることができる。このプローブにはプローブとＭ・カンサシ核酸間のハイブリダイゼーションを示す検出可能なラベルを含ませることが可能である。このプローブの検出可能なラベル（標識）とは直接又は間接的に検出されうる部分のことである。直接的な検出ラベルの場合、プローブが放射線同位元素で修飾され、オートラジオグラフィーで検出される。また、プローブが蛍光標識され、この分野における周知な蛍光検出法により、検出される。更に、プローブが自己検出可能な補助的な試薬要求するラベルによって標識することによって間接的に検出され得る。具体的な間接標識する方法は、化学発光剤、識別のできる反応物を生じる酵素、及び、ラベルされた特殊的にパートナーと結合（例えばハプテンがラベルされた抗体との結合）によって検出されうるリガンド（例えば、ハプテン、抗体あるいは抗原）の使用を含む。リガンドラベルがオリゴヌクレオチドプローブ（即ち、キャプチャプローブ）固相キャプチャに有用である。典型的なラベルは、例えば、ビオチン（ラベルされたアビジンあるいはストレプトアビジンと結合することにより検出可能性物質）と、西洋わさびペルオキシダーあるいはアルカリホスファターゼ（酵素基質の添加により検出可能性物質）のような酵素を含む。ヌクレオチドを標識する方法はこの分野において周知である。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様は、種特異性な核酸プローブを用いたＭ・カンサシを検出する方法である。“Ｍ・カンサシ検出の種特異性な方法"によるとは、上述したようにプローブがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズすると同様な条件下では、このプローブが非Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズしない上、それを検出できないと言う意味合いである。特に、上述したようにプローブがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズするのと同様な条件下では、このプローブがＭ・ガストリからの核酸とハイブリダイズせず、そしてそれを検出できないが、ハイブリダイゼーションから見分けのできる程度の最小限にＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズする。更に、上述したようにプローブがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズすると同様な条件下では、このプローブは、例えば、Rhodococcus rhodochrous andNocardia asteroides  のようなＭ・カンサシと近い関係を有する別菌種からの核酸ともハイブリダイズしない、あるいはそれらを検出しない。別の態様として、“種特異性"の用語はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、あるいは、微生物の種類、又は、実質なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを伴わない関連種類のグループの検出、あるいは、同じ属の他の菌種、又は、異なる属の菌種の検出に適用する。特に、ここに使用された核酸プローブを用いたＭ・カンサシの検出の種特異性方法は、このプローブがストリンジェントな条件下でＭ・カンサシとハイブリダイズし、そして、それを検出することであり、このプローブがストリンジェントな条件下では、特に、非マイコバクテリア種からの核酸、他の非マイコバクテリア種からの核酸、及び、例えば、Rhodococcus rhodochrous andNocardia asteroides  のようなＭ・カンサシと近い関係を有する別菌種からの核酸のような非Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズしない上、それを検出できないことであることを指す。
【００３１】
本発明の他の態様は増幅プライマーである。増幅プライマーは、標的配列とのハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの延長により、あるいは、標的配列とのハイブリダイゼーションと同時に隣接する複数のオリゴヌクレオチドの結合により、標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドである。増幅反応過程で得られる標的配列のコピーは“増幅産物"、“アンプリマー(amplimers)"或いは“アンプリコン(amplicons)"と称される。延長産物とは、プライマーのハイブリダイゼーション及びテンプレートとしての標的配列を用いてポリメラーゼによるプライマーの延長によって合成された標的配列のコピーをいう。
【００３２】
ここにいう増幅プライマーの“標的配列"とは、増幅プライマーと特異的に結合そして増幅する核酸配列である。これらは増幅されるオリジナルな核酸配列及びそれに相補的な第２のストランド、そして、増幅反応過程において生成されたオリジナルな標的配列のコピーのいずれかの一本鎖を含む。
【００３３】
ＳＤＡ増幅プライマーは、標的結合配列、制限エンドヌクレアーゼ及び末端配列を含む。この標的結合配列はＳＤＡ増幅プライマーの３'末端にある。標的配列の３'末端にハイブリダイズする。一般には、ＳＤＡ増幅プライマーの全長は約２０〜７５ヌクレオチドであり、好ましいのが、２５〜５０ヌクレオチドである。標的結合配列が特異的に増幅プライマーとのハイブリダイゼーションを寄与する。制限エンドヌクレアーゼ用認識部位は標的結合配列の５'である。認識部位がヘミ修飾(hemimodified)された時に、ＤＮＡ複合体の一本鎖にニックを生じさせるための認識部位がG. WalkerらによりProc. Nat'l Acad. Sci. USA89, 392 (1992)、Nucl. Acids. Res.20, 1691 (1992)において紹介されている。増幅プライマーの末端部位は制限エンドヌクレアーゼ認識部位の５'側のヌクレオチドに含有される。ＳＤＡの中で増幅プライマーの残りの部分が置換され、ニックが生成された時、この末端と制限エンドヌクレアーゼ認識部位の領域がポリメラーゼリプライミング（repriming）部位として機能する。この端末のポリメラーゼリプライミング機能がＳＤＡ反応を維持し、そして、シングル標的分子からの複数のアンプリマーの合成を許容する。この末端部位はほとんどの場合では短い。その長さ及び配列が、通常では決められていて、またこの末端部位の安定なハイブリダイゼーションを形成させるように選択及び修飾されていて、そして増幅プライマーにニックが生じた後、標的に対する制限エンドヌクレアーゼの認識部位の部分を以外に残される部分がほとんどない。そこで、この末端部位通常では、標的結合配列或いは他のプライマーのいずれかとハイブリダイズする配列が含有しないという一つの考えがある。
【００３４】
本願発明で開示したＫＡＴＳ２配列は制限エンドヌクレアーゼBsoB1の認識部位を内部に含有する。図１及び図２により、BsoB1は一般的に好熱性のＳＤＡ法(tSDA)用の制限ヌクレアーゼとして用いられる。ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法によるＫＡＴＳ２遺伝子の増幅は、ＳＤＡ法において機能が一致するHincII,HindII,Nci I, とFnu4H1、或いはｔＳＤＡ法において機能が一致するBsrI,BstNI, BsmAIとBslIのような制限エンドヌクレアーゼを用いて成し遂げることができる。このような制限エンドヌクレアーゼがこの分野の当業者にとっては周知のものである。このことがG. WalkerらのProc. Nat'l. Acad. Sci. USA89, 392 (1992)ページ 394と米国特許第5,455,166号、及びヨーロッパー特許公報第 0 684 315 A1号を参照することで裏付けられる。特に、その認識部位が好熱性制限エンドヌクレアーゼのためである場合には、ｔＳＤＡ法が使用されることによって、より高い増幅の特異性及び有効性が得られる。更に、この増幅プライマーはＫＡＴＳ２配列内のBsoB1のの５'或いは３' の両方とも直接に結合することにより標的配列と結合ができ、よって、BsoB1の認識部位が増幅されない。例えば、ＫＡＴＳ２配列の内在するBsoB1部位から３'末端までの２５０塩基断片を、ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法により増幅することができる。図１の配列番号４を参照。
【００３５】
ここに、用いられる「パンバープライマー」("bumper primer")或いは「外的プライマー」("external primer")は、ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法による増幅反応中にプライマー延長産物を置換するために使用されるプライマーである。このパンバープライマーは、増幅プライマーの結合する標的配列の上流配列にハイブリダイズし、パンバープライマーの延長鎖が下流にある増幅プライマー及びその延長鎖を置換してしまう。Ｍ・カンサシ或いはマイコバクテリア属にとって、ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法により増幅反応に使用されるパンバープライマーが特異であることが常に必要とされるわけではない。このパンバープライマーは、増幅プライマーから上流の標的にハイブリダイズすることにより、パンバープライマーが延長され、それが増幅プライマー及びその延長鎖を置換することしか要求されていない。従ってパンバープライマーの配列は、あまり重要ではなく、パンバープライマーが延長したとき増幅プライマーの延長鎖を置換できるほど、増幅プライマーの結合部位に十分に近い上流のどのような標的配列に由来するものであってもよい。
【００３６】
パンバープライマー配列が特異な標的配列とハイブリダイズする限り、時にあるパンバープライマー配列のミスマッチあるいはいくつかの非標的配列とのクロス−ハイブリダイゼーションは、一般に増幅効率には悪影響を与えない。本願発明の一実施例として、このパンバープライマーはＫＡＴＳ２の少なくとも１０個の連続配列或いはその補体である部分を含有するが、それは一般的に上記したプローブとサイズ上似ている。この場合におけるパンバープライマーは増幅プライマー或いはプローブの結合配列の標的として使用される。
【００３７】
標的末端に特異の配列を要求しない（即ち、ＰＣＲとＬＣＲ）増幅方法のため、通常では、この増幅プライマーを標的と実質上結合できる配列のみで構成することができる。増幅プライマーの中に特殊な配列を要求する（即ち、自己持続性配列複製(Self-Sustained Sequence Replication)用のＲＮＡポリメラーゼプロモータ(3SR; J. C. GuatelliらProc Natl. Acad. Sci. USA87, 1874-78 (1990)）、核酸配列を基準とする増幅（(NASBA; van der Vliet et al., J. General Microbiol.139, 2423-29 (1993)）、あるいは、転写に基づいた増幅(transcription based amplification)（D. Y. Kwoh et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA86, 1173-77 (1989)）のようなＳＤＡのほかの増幅方法用に、これらの特異性配列が、標的結合配列のハイブリダイゼーションの特異性を変動することなくオリゴヌクレオチドの調整のための通常の方法を用いて標的結合配列をリンクすることができる。
【００３８】
従って、この分野の当業者にとっては、本願発明のプライマーおよびプローブは、多くの場合、構造上類似または同一である。プライマーとプローブという用語は、オリゴヌクレオチドの機能を意味してうる。オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズし、その標的配列を捕捉して検出できるならば、そのオリゴヌクレオチドがプローブとしての機能を有する。更に、同じオリゴヌクレオチドが上記のように増幅に用いられるならば、そのオリゴヌクレオチドはプライマーとしての機能も有する。
【００３９】
本願発明におけるオリゴヌクレオチドプローブまたは増幅プライマーを調整するための適切な塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル及びチミンのような自然界に存在するヌクレオチド塩基、並びに８−オキソーグアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２'−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２チオリジン（5-carboxymethylamino-methyl-2-thioridine）、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−ウリジン、ジヒドロウリジン、２'−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルクエオシン（queosine）、２'−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、６Ｎ−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルクエオシン（β-D-mannosylqueosine）、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ウェブトシキシン（wybutoxosine）、プソイドウリジン、クエオシン（queosine）、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２'−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２'−Ｏ−メチルウリジン、ウェブトシン（wybutosine）、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンのような自然界に存在しないあるいは「合成」されたヌクレオチド塩基から選択することができる。いずれのオリゴヌクレオチドバックボーン、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ＲＮＡよりＤＮＡの方が好ましいが）、炭素環類のような修飾された糖、及びフッ素化とメチル化のように２'置換基を含有する糖などを使用することができる。このオリゴヌクレオチドでは、その中に少なくとも一またはすべての内部ヌクレオチド架橋リン酸塩残基が、メチルホスホン酸塩(methyl phosphonates)、メチルホスホノチオ酸塩類(methyl phosphonothioates)、ホスホロモルフォリン酸塩類(phosphoromorpholidates)、ホスホロピペラジン酸塩(phosphoropiperazidates)、ホスホラミダイト(phosphoramidates)（たとえば、内在するヌクレオチドのりん酸基がすべてがここ記載したように修飾される）のように修飾されたリン酸塩類である。このオリゴヌクレオチドは、P. NielsenらがScience254, 1497-1500 (1991)で開示したように「ペプチド核酸」でありうる。オリゴヌクレオチドプローブが、標的ＤＮＡ分子の配列の一部と結合できる部位を少なくとも配列の一部として所有するすることが唯一の要件である。
【００４０】
本願発明に開示した増幅プライマーは、Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズする。一般的には、このような配列が前記したようなストリンジェントな条件下で、本発明で開示したＫＡＴＳ２配列の連続なヌクレオチドとハイブリダイズする。換言すれば、本発明のプライマーは、ここで開示したＫＡＴＳ２配列に含まれる、特に配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の連続的なヌクレオチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％あるいは９５％以上の相同性を保有するものである。更なる本願発明の態様として、プライマーが本発明で開示した配列番号５から配列番号９、およびそれらの相補体のようなヌクレオチド配列を有する。核酸はハイブリダイズするのに完全な相同性を要求しないので、この分野の当業者にとっては、本発明で特に開示したプライマー配列は、Ｍ・カンサシの増幅プライマーとしての機能を失わない程度に本発明で開示したプライマー配列の実質的な相同性を保って修飾されうることが明白である。ストリンジェンシーを増加あるいは減少することで、ハイブリダイゼーションの条件を調整することにより、相同または部分的に相同の核酸配列のハイブリダイゼーションが形成され得ることが当業者にとって周知である（たとえば、ハイブリダイゼーションの温度あるいは緩衝液の塩濃度を調整する）。
【００４１】
増幅プライマーは適合した長さであれば、任意である。それには特別の長短の限度は設けていなく、標的ＫＡＳＴ２ＤＮＡとハイブリダイズし、有効に増幅プライマーとして機能するプライマーの長さあればよい。本願発明の一態様として、前記のように、このプライマーがＭ・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有する。このプライマーを50、40、30、20、15、あるいは10ヌクレオチド以下まで短くすることができる。同様に、このプライマーを20、 40、 50、 60、 75、100あるいは200以上に長くすることができる。
【００４２】
本願発明の一態様として、このプライマーはマイコバクテリア属中のいずれ他の属からの核酸とも、前記したようなストリンジェントな条件下（例えば、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳで、６０℃の洗浄ストリンジェンシー）ではハイブリダイズ及び増幅が行われず、また、増幅プライマーがマイコバクテリアからの核酸とハイブリダイズし、それを増幅及び検出する条件と同じ条件下で、非マイコバクテリアのハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出することが非現実であるように無視できる程度のものである。本発明の更の態様として、この増幅プライマーはストリンジェントな条件下ではマイコバクテリア属のＭ・カンサシ及びＭ・ガストリ以外のすべて株の核酸とハイブリダイズ及び増幅しないが、するとしても、Ｍ・カンサシ及びＭ・ガストリ核酸をハイブリダイズして、増幅及び検出する増幅プライマーを用いて同じ条件下で、非Ｍ・カンサシ及び非Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。本発明のさらなる態様として、この増幅プライマーはストリンジェントな条件下ではＭ・ガストリ核酸とハイブリダイズして増幅及び検出しないが、するとしても、Ｍ・カンサシ核酸をハイブリダイズして増幅及び検出する増幅プライマーを用いて同じ条件下で、Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。本発明のもっとさらなる態様として、この増幅プライマーは種特異性がある。つまり、これはストリンジェントな条件下ではＭ・カンサシからの核酸としかハイブリダイズして増幅することができなく、ほかのマイコバクテリアあるいは非マイコバクテリア種からの核酸とハイブリダイズして増幅することができないが、できるとしても、プローブがＭ・カンサシからの核酸とハイブリダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、非マイコバクテリア種の核酸のハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出することが非現実であるほど無視できる程度のものである。
【００４３】
本発明の一つの態様は、標的バインド配列を含有する増幅プライマーをＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズすること、Ｍ・カンサシを増幅すること、増幅されたＭ・カンサシを検出することとによりＭ・カンサシを検出する方法である。本発明の具体的態様として、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のように、増幅がハイブリダイズされた増幅プライマーを延長することにより達成され、そして、増幅産物あるいはアンプリコンを得る。更に、別の具体的態様として、二つの増幅プライマーがＭ・カンサシの核酸にハイブリダイズして延長されていく。増幅反応はＰＣＲ、ＳＤＡ、ｔＳＤＡ法に限らない延長反応を含むことを必要とする。
【００４４】
増幅反応で使用する本願発明のプライマーは、G. Walkerらが (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA  89, 392 (1992)、Nucl. Acids. Res.20, 1691 (1992))において開示しているように、チミンを取り込める。また、それらが全体または一部的にＴＴＰの変わりに２'−デオキシウリジン−５'−三リン酸にすることにより、反応中において、例えば、ヨーロッパ特許公報第0 624 643号にあるように、試薬、ピペット由来及び実験室での以前の増幅反応から持ち越された増幅産物との交差混入を減少することができる。デオキシウリジン（ｄＵ）が増幅産物に取り込まれ、そして、それがウリジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理で切除され得る。これら基本なサイトが後の増幅反応において、混入する増幅産物を増幅不可能にする。ＵＤＧが後の増幅を行う前にＵＤＧ阻害剤より失活されることで、新たに形成された増幅産物からｄＵの切除を防止することができる。
【００４５】
本願発明の別の態様において、増幅はＭ・カンサシ核酸を２以上の増幅プライマーとハイブリダイズし、それらのそれぞれの標的配列とハイブリダイズする時これらのプライマーが互いに隣接しているようにすることにより達成され、そしてハイブリダイズした増幅プライマーを結合して、より長い増幅産物を生産する。
【００４６】
増幅されたＭ・カンサシ核酸の存在を測定することにより、Ｍ・カンサシ及びＭ・カンサシ核酸の存在が検出される。増幅産物は、前記のようにラベルされたプローブとハイブリダイゼーションにより検出することができる。プローブが増幅の検出に使用された場合、プローブは増幅プライマー間に横たわっている配列とハイブリダイズするように選択される。ＬＣＲ法で増幅を実施する場合に、両方のプライマーと重複し、そして結合していないプライマーを検出しないプローブが使用され得る。また、増幅産物は、例えば、電気泳動法とそれに続くエチジウムブロミド染色で核酸種を可視化するといった方法で、それらの特徴的大きさにより検出される。これがＬＣＲ法のための増幅産物を検出する好ましい方法である。さらに、標識された増幅プライマーが用いられる。更にまた、G. Walker らがProc. Nat'l Acad. Sci. USA  89, 392 (1992); Nucl. Acids. Res.20, 1691 (1992)で記載したように、標識された増幅プライマー又は内部プローブが増幅産物の検出のために標的配列（検出プライマー）の上に延長されるようにする。
【００４７】
特殊な増幅産物を検出として使用される検出方法の例は、米国特許第5,470,723号の記載のように、ビオチンで標識したキャプチャプローブ（capture probe）及び酵素結合検出プローブを用いることにより増幅産物が検出される化学発光の方法を含む。標的配列のアッセイ領域（即ち、２つ増幅プライマーの結合部位の間）の異なる部位を２つプローブとハイブリダイゼーションした後、その結合体がストレプトアビジンがコーティングされたマイクロタイターのプレートに捕捉され、そして、化学発光のシグナルが展開されて発光検出器により認識される。また、ヨーロッパ特許公報第0 678 582号の記載のように、シグナルプライマーが増幅反応に含まれると増幅産物の検出を促進される。この方法により、標識したセカンダリ増幅産物が標的増幅に依存して増幅過程で生産され、そして結合したラベルの手段により標的増幅表示として検出されうる。
【００４８】
増幅プライマーを用いるＭ・カンサシの検出の種特異的な方法は本願発明の一好ましい態様である。“Ｍ・カンサシを検出する種特異的な方法"によるとは、前記のようにＭ・カンサシからの核酸とハイブリダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、前記のように増幅プライマーが非Ｍ・カンサシの核酸のハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出しないことを意味する。また、前記のようにＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、増幅プライマーがＭ・ガストリの核酸のハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出しない。更に、上述したように増幅プライマーがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、増幅プライマーは、例えば、Rhodococcus rhodochrousやNocardia asteroides  のようなＭ・カンサシと近い関係を有する別菌種からの核酸ともハイブリダイゼーション、増幅あるいはそれらを検出しない。
【００４９】
換言すれば、“種特異性"の用語は、微生物の一種類あるいは関連のある種のグループをオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションし、それらを増幅し、検出するが、異なる属の菌種あるいは同属の異なる菌種において実質なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、増幅、あるいは、検出ができないことを指す（意味する）。特に、ここに使用された核酸増幅プライマーを用いたＭ・カンサシの検出の種特異的方法は、この増幅プライマーがストリンジェントな条件下でＭ・カンサシとハイブリダイズして増幅し、そしてそれを検出するが、この増幅プライマーがストリンジェントな条件下では、特に、非マイコバクテリア種からの核酸、他の非マイコバクテリア種からの核酸、例えば、Rhodococcus rhodochrousやNocardia asteroidesのようなＭ・カンサシと近い関係を有する菌種からの核酸、及びＭ・ガストリからの核酸のような非Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズや増幅せず、そしてそれを検出できないことを指す。
【００５０】
本願発明は、上に記載したような核酸プローブ、増幅プライマー、特に一組の増幅プライマーを含んでなるＭ・カンサシ核酸を検出するためのキットをも提供している。上に記載したような種特異的方法、Ｍ・カンサシの検出用のプローブと増幅プライマーが好ましい。このキットは更に、上に記載したような、増幅プライマー又はオリゴヌクレオチド核酸を用いてＭ・カンサシ核酸を検出するための手段を含むことができる。好ましくは、Ｍ・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、特に好ましいのは５０以下のヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドプローブあるいは増幅プライマーである。別の一態様として、上に記載したように増幅プライマーは、標的結合配列に加えて標的核酸の増幅用の配列を含む。このキットは更に、ハイブリダイゼーションと増幅方法を遂行するための他のコンポーネント及び試薬（例えば、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＳＤＡ等及びその同類の方法）を含有できる。一実施例として、本願発明に従って、このキットは少なくとも一対の増幅プライマーを含有することができる。ハイブリダイゼーションを検出するには、ハイブリダイゼーション溶媒が２５％のホルムアミド、5X SSC、 5Xのデンハート溶液、１００〓g/ml一本鎖ＤＮＡ、そして、５％デキストラン硫酸塩、あるいはプローブハイブリダイゼーション用に有用な周知な試薬等をも含有することができる。これに関しては、SAMBROOKらの「分子クローニング、実験室マニュアル」（ MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL ）(2d ed. 1989)を参照する。特に、一つ以上の周知な核酸増幅方法の使用に適切な試薬をＭ・カンサシＫＡＴＳ２増幅プライマーに含ませることが可能である。このキットの複数のコンポーネントを通常の容器の一緒にパッケージングすることができ、そして一般的にここに開示された方法の特殊な態様を実施するため説明書をも含有する。上に記載したように、検出方法用のコンポーネントには、例えば、第二のプローブ、及び／又は標識検出を行うための試薬と手段（例えば、放射能標識、酵素基質、抗体等）を任意にこのキットに追加することができる。
【００５１】
本願発明に開示された方法、プローブ、増幅プライマー及びキットはいずれのマイコバクテリアの含まれると思われるようなサンプル中のＭ・カンサシを検出するのに有用である。このサンプルは単離された核酸、単離された微生物からなり、それらは臨床的なサンプルであってもよい。一般的には、臨床的なサンプルは、生物学的な液体あるいは組織の形（即ち、痰、気管支の洗浄水、胃の洗浄水、血液、ミルク、リンパ液、皮膚、あるいは軟組織）で提供される。人あるいは人でない動物のいずれにも感染するマイコバクテリアのように、本願発明は人と動物（獣医）の診断手法に応用でき、そして、サンプルは何れのソースからも獲得され得る。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例は本願発明を例証するために提示されるが、本願発明はこれらに限定されるものではない。ここに、使用される“ｍｌ"はミリリットルを、“μｌ"はマイクロリットルを、“μＭ"はマイクロモルを、“ｍＭ"はミリモルを、“ｍｇ"はミリグラムを、“ｎｍ"はナノグラムを、“ｍｉｎ"は分を、“ｓｅｃ"は秒を、そして、“ｗ／ｖ"は重量／体積を意味する。
【００５３】
実施例１
Ｍ・カンサシ特異的なＤＮＡフラグメント（ＫＡＴＳ２）の単離
典型的な（TMC1201）と非典型的（LCD724）なＭ・カンサシ、及び非Ｍ・カンサシ株のM. tuberculosis (H37Rv)とM. avium (CDC33)とM. intracellulare (ATCC 13950)からの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを作成するには、任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）が有用であった。AP-PCR用のプライマーは5'-CGTCATGCTGAAGTCCCT-3'（配列番号１）であった。増幅反応が、１０ｍＭトリス−塩酸、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．０００１％（ｗ/ｖ）ゼラチン、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、３．５μＭの各３２Ｐ標識されたプライマー、２．５ユニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ、及びテンプレートとして各微生物からの１ngのゲノムのＤＮＡを含有するｐH８．３の５０マイクロリットル溶液で行われた。ＡＰ−ＰＣＲ法がPerkin Elmer Cetus温度サイクル（モデル４８０）を用いて実施された。９５℃で３分間標的ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で２分間の増幅サイクルを４０回繰り返して増幅が達成された。最後の増幅サイクルが完了後、サンプルは７分間７２℃に加熱され、そして、４℃で一晩放置された。増幅産物が８％の変性アクリルアミドゲル（１００W）を用いた電気泳動により単離され、可視化され、そしてオートラジオグラフィーにかけられた。
【００５４】
一つの特異的なバンドが、典型的なまたは非典型的なＭ・カンサシ株の双方に存在し、テストされたあらゆる非Ｍ・カンサシ株には存在しないことがわかった。そのバンドを“ＫＡＴＳ２"と命名した。このＫＡＴＳ２バンドがゲルから切除され、そして、そのＤＮＡがアクリルアミドのスライスを１００マイクロリットルの蒸留した無菌な水で１５分間煮沸した後にＤＮＡのエタノール沈殿より抽出された。抽出された５マイクロリットルのＤＮＡが、配列番号１を有するプライマーを用いてＡＰ−ＰＣＲ法でＫＡＴＳ２バンドを再増幅するのに用いられた。それが、上文の記載と同様に、９４℃で１分、６０℃で２分、７２℃で２分のような増幅サイクルを３５回繰り返して反応が行われる。
【００５５】
実施例２
ＫＡＴＳ２Ｍ・カンサシＰＣＲ産物のクローニング
再増幅された５０ｎｇのＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントは、製造者に提供された手順にしたがって、pCRII (インビトロゲン社製の製品、Carlsbad, カリフォルニア州)にてクローニングされた。ONE SHOT？バクテリア細胞(インビトロゲン社製の製品、Carlsbad, カリフォルニア州) がpCRII-KATS2ベクタにより形質転換されていた。形質転換バクテリアコロニーが白く、アンピシリン／Ｘゲル（４０ｍｇ／ミリリットル）を含有する寒天に成長することにより選ばれた。陽性なコロニーが採取され、２５ミリリットルのＬＢ培地に一晩３７℃で増幅された。プラスミドＤＮＡが、業者のインストラクションに従って商業的に入手可能なプラスミド精製キット(Qiagen Plasmid Midi Kit-25, Catalog # 12143; Qiagen, Santa Clarita,カリフォルニア州)により分離された。単離されたプラスミドＤＮＡの中のＫＡＴＳ２フラグメントの存在が、各陽性コロニーからのプラスミドをEcoRIで切断したことによって立証された。EcoRIでの切断の後、１％のアガロースゲルの電気泳動による分離で陽性コロニーが適当な大きさのＤＮＡ挿入断片を含有したことを確認したものである。
【００５６】
実施例３
ＫＡＴＳ２フラグメントを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション
M・カンサシからの核酸とＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントとの特異的なハイブリダイゼーションが調べられた。ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントが多くのＭ・カンサシ及び非Ｍ・カンサシマイコバクテリアからのゲノムＤＮＡとハイブリダイズする。マイコバクテリア及び非マイコバクテリアの多くの菌種から７５０ｎｇのゲノムＤＮＡが変性され、ZETA-PROBE？のGT膜（Bio-Rad社製の製品）の上にドットブロッティングにより固定された。ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントを含有するｐＣＲＩＩベクタがEcoRIで切断され、ＫＡＴＳ２を含有する小さいなＤＮＡフラグメントが電気泳動により精製され、そしてランダムプライムドＤＮＡラベリングキット(Random Primed DNA Labeling Kit) (Boehringer-Mannheim社製の製品)を用いて３２Ｐで放射能標識された。３２Ｐ−ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントが、２Ｘハイブリダイゼーション溶媒(Gibco-BRL社製の製品)に多くのマイコバクテリア及び非マイコバクテリアからのゲノムＤＮＡドットブロットとハイブリダイズされ、そして６５℃で１８時間培養された。ブロットが室温で２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄され、そして、放射能標識のバックグランドレベルが十分に減少されるまで６５℃の０．１％のＳＤＳで洗浄された。その後にブロットが蒸留水で濯がれ、分子ダイナミックホスホイメージシステム (Molecular Dynamics World Headquarters、Sunnyvale社製の製品、カリフォルニア州)を使って２時間露出された。露出が分子ダイナミックス（Molecular Dynamics） (Sunnyvale社製の製品, カリフォルニア州)より提供されたイメージクアント（ImageQuant V1.1）というソフトで、そのホスホイメージシステムを使用して解析された。そのデータを表１にまとめた。ＫＡＴＳ２は、テストした典型的あるいは非典型的なＭ・カンサシ株の両方の６種類すべてとハイブリダイズした。また、１７種類の非Ｍ・カンサシマイコバクテリア及び非マイコバクテリアのすべてとハイブリダイズできなかったが、ただ、Ｍ・ガストリがＫＡＴＳ２プローブと弱いクロス反応性を示した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例４
ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントの配列決定
ｐＣＲＩＩベクタ中でクーロンされたＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントがＴ７及びＳＰ６プライマー(Invitrogen社製の製品、 T7 primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'、配列番号２、SP6 primer: 5'-ATTTAGGTGACACTATA-3',配列番号３)を使用して配列決定された。この配列情報はＰＣＲでＫＡＴＳ２を増幅するのに使用するプライマーをデザインするのに有用である。Perkin Elmer Cetus Model 480 PCR machinにおいてABI Prism DNA Sequencing Kit (Perkin Elmer社製の製品)がＫＡＳＴ２の配列決定サイクルに使用された。増幅サイクルが、９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で4分を一サイクルとして、２５回行われた。その増幅産物が後に４℃で保存された。その結果ＰＣＲの産物がApplied Biosystems, Inc. (Foster City社製の製品、カリフォルニア州)により提供された手順に従って精製され、また、業者のガイドラインによりApplied Biosystems 373 DNA Sequencerで行った。
【００５９】
ＫＡＴＳ２が図１（配列番号４）に示すような、独特な配列を有することが発見された。現在のGENEWORKS？データベースに寄託されたマイコバクテリア配列がＫＡＴＳ２配列でスクリーンされたが、一致するものは同定されていなかった。BsoB1エンドヌクレアーゼのための制限部位がＫＡＴＳ２配列内に局在する。ＫＡＴＳ２特異なプライマーが、最初の配列決定結果を確認するために、ＤＮＡ鎖の両方の５'と３'の双方からのクローニングされたＫＡＴＳ２フラグメントを完全に再配列決定に有用であった。これらのＫＡＴＳ２プライマーは、E1C(5'-GTTGGCGTGGAGCTGTCT-3'、配列番号５)、I4 (5'-TCCCTGGCTGCTCTTGAT-3'、配列番号６)、I5 (5'-ATCAAGAGCAGCCAGGGA-3'、配列番号７)、I2 (5'-ACAACGTGATGAGGCAGAC-3'、配列番号８)、及び、E3 (5'-GGTGGAGATGGAGATGTT-3'、配列番号９)のように命名された。各プライマーのための相補的なＫＡＴＳ２標的配列が図１に示されている。プライマーI５、I2とE3が図１に示したＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントに対する鎖と相補性を有する。
【００６０】
実施例５
クロス反応性の研究
テンプレートとして、Ｍ・カンサシ、多くのマイコバクテリアと非マイコバクテリアの菌種からのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅用にＫＡＴＳ２ＰＣＲプライマーセットＥ１Ｃ／Ｅ３が選択された。ＰＣＲ反応が、２０ｎｇのＤＮＡテンプレート、０．２５ｍＭずつのdATP、 dTTP、dCTP、及びdGTP、1.5 mMのMg2+、 0.5〓MのプライマーE1C、0.5 〓Mのプライマー E3、 2.5ユニットのTaq ポリメラーゼ、インビトロゲン社製のWax Beadを含有する、全部で５０マクロリットルのインビトロゲン社製のＰＣＲバッファー（60 mM トリス塩酸、15 mM (NH4)2SO4、pH 8.5）において実施された。テンプレートＤＮＡが９５℃で2分変性され、そして、９４℃で１分、５４℃で２分、７２℃で2分を一サイクルとして３０回の増幅サイクルにより増幅が行われた。そして、増幅産物が４℃で一晩保存された。
【００６１】
ＫＡＴＳ２プライマーによる増幅が、各ＰＣＲ増幅反応混合液１０マイクロリットルを取り出しアガロースゲルにおいて増幅産物の存在を判定するために、検出された。その結果を下の表２にまとめた。ＫＡＴＳ２プライマーにより、テストした典型的と非典型的の両方の１１種Ｍ・カンサシの株からのＤＮＡを増幅できた。但し、テストした１３種の非マイコバクテリア株のうち、Ｍ・ガストリのみが陽性の結果を示した。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
実施例６
Ｍ・カンサシ株及びＭ・ガストリからのＰＣＲ産物間のＫＡＴＳ２配列の相同性
ＫＡＴＳ２プライマーセットにより増幅した配列の一致の程度を判定するために、実施例５から得たＰＣＲ増幅産物を、業者のインストラクションに従ってQiagen's Qiaex II キットを用いて精製した。各精製された増幅されたＤＮＡフラグメントが、実施例４のように、複数のプライマー（E1C、E3、I2、I4とI5）を用いて、サイクル配列決定用のテンプレートとして使用された。典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列がそれぞれ図１（配列番号4）と図２（配列番号１０）に示されている。
【００６４】
増幅されたＰＣＲ産物（配列番号4と配列番号１０から配列番号17）から入手した配列が図３のように整列され、典型的と非典型的なＭ・カンサシＫＡＴＳ２配列から一致する配列（配列番号１８）を導き出した。高いレベルの相同性（９１．６％）が典型的と非典型的なＭ・カンサシ株間に存在し、但し、予想通りＫＡＴＳ２プライマーで増幅されたＭ・ガストリフラグメント（配列番号２０）とＭ・カンサシの部位間では実質な同一（８６．１％）が認められた（図4）
【００６５】
実施例７
Ｍ・カンサシとハイブリダイゼーションするが、Ｍ・ガストリとはクロス反応しないＫＡＴＳ２の反応結果
図４の配列情報を、ＤＮＡ増幅とＤＮＡハイブリダイゼーション反応の中にＭ・カンサシをＭ・ガストリから区別する、Ｍ・カンサシに特異的なオリゴヌクレオチドを生産するに使用する。Ｍ・カンサシとＭ・ガストリのＫＡＴＳ２の９１から１００、１２０から１４０、そして２５０から２７５のヌクレオチドの領域にある配列が高いレベルの相違を示している。これらの領域が、高度にストリンジェントな条件（即ち、６０℃で、０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシー）下でクロスハイブリダイズを行わないオリゴヌクレオチドをデザインするのに使用される。Ｍ・カンサシに特異的なオリゴヌクレオチドが、実施例３に記載のような条件下でハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは、実施例５に記載のような条件下で増幅プライマーとして利用され、Ｍ・カンサシを検出するが、Ｍ・ガストリ核酸とは実質上ハイブリダイズ、増幅、検出しない。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の典型的なＭ・カンサシ株のＤＮＡゲノムから、ＡＰ−ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ二本鎖ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメント（株１２０１配列番号４）中の一本鎖の配列を表す図である。その配列が５'から３'の方向に示されている。ＢｓｏＢ１認識部位（ＣＴＣＧＧＧ）がイタリックで示されている。ＫＡＴＳ２の特異プライマーの所在部位（EIC：配列番号５、 E3：配列番号９、I2：配列番号８、I4：配列番号６及びI5：配列番号７）が指摘されている。E3、I2及びI5のプライマーは示されたＤＮＡ鎖に対するもう一本ＤＮＡ鎖とハイブリッド結合する。
【図２】本発明の非典型的なＭ・カンサシ株（株１４９２、配列番号１０）からのＫＡＴＳ２部位一本鎖のＤＮＡ配列を表す図である。ＢｓｏＢ１認識部位（ＣＴＣＧＧＧ）がイタリックで示されている。プライマーは図１の記載に指摘されたと同様である。
【図３】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列（配列番号４、配列番号１０から配列番号１７）をＫＡＴＳ２のコンセンサス配列（先頭配列、配列番号１８）を得るために整列させたものである。１位から１００位までのヌクレオチドを表す図である。以下図６までが３０９位までを順に並べたものである。
【図４】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。１０１位から２００位までのヌクレオチドを表す図である。
【図５】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。２０１位から３００位等までのヌクレオチドを表す図である。
【図６】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。３０１位から３０９位等までのヌクレオチドを表す図である。
【図７】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列（配列番号４、配列番号１０から配列番号１７）及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列（配列番号２０）を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴＳ２コンセンサス配列（先頭配列、配列番号１９）を得るものである。１位から９８位、又は１位から１００位までのヌクレオチドを表す図である。以下図１０までが３０９位、３１１位までを順に並べたものである。
【図８】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。９９位から１９８位、又は１０１位から２００位までのヌクレオチドを表す図である。
【図９】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。１９９位から２９８位、又は２０１位から３００位までのヌクレオチドを表す図である。
【図１０】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。２９９位から３０９位、又は３０１位から３１１位までのヌクレオチドを表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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