(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌において異種遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または数個の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された該異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または数個の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するDNAの塩基配列を含むDNAベクター。
【請求項２】
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌において遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または数個の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）（ｂ）のクローニング部位の下流に、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または数個の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するDNAの塩基配列を含むDNAベクター。
【請求項３】
（ａ）において含む塩基配列が配列番号：１に記載の塩基配列であり、（ｃ）において含む塩基配列が配列番号：３に記載の塩基配列である、請求項１または２に記載のDNAベクター。
【請求項４】
低コピープラスミドである、請求項１から３のいずれかに記載のDNAベクター。
【請求項５】
多コピープラスミドである、請求項１から３のいずれかに記載のDNAベクター。
【請求項６】
ゲノム組み込みベクターである、請求項１から３のいずれかに記載のDNAベクター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換されたストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌。
【請求項８】
蛋白質の製造方法であって、該蛋白質をコードする請求項１から６のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換したストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌を培養する工程、および該菌またはその培養液から生産された該蛋白質を回収する工程を含む方法。
【請求項９】
遺伝子の機能を抑制する方法であって、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする請求項１から６のいずれかに記載のDNAベクターでストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌を形質転換する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は放線菌発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の放線菌における発現ベクターとしては、放線菌由来の誘導性プロモーターを利用した例が幾つか報告されている。抗生物質のチオストレプトン添加により転写が誘導されるtipAプロモーター（Smokvina T. et al., 1990, Gene 94:53-59; Kuhstoss S., and Rao R.N., 1991, Gene 103: 97-99; Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137）、グリセロールにより誘導されるglyCABプロモーター（Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745）およびマイトマイシンCにより誘導されるmcrABプロモーター（August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267）が発現ベクターに利用されている。tipAやmcrABプロモーターを利用する場合には、誘導に薬剤を用いるため発現タンパクを実用化する際に精製段階でこれら薬剤を除去する必要がある。また構成的プロモーターを利用した発現ベクターとしては、人工的に変異させたermE*プロモーター(Schmitt-John, T., and Engels, J.W., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498; Bibb, M. J. et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545)を用いたものが報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Smokvina T. et al., 1990, Gene 94: 53-59
【非特許文献２】
Kuhstoss S., and Rao R.N., 1991, Gene 103: 97-99
【非特許文献３】
Takano E. et al., 1995, Gene 166: 133-137
【非特許文献４】
Hindle Z., and Smith C. P., 1994, Mol. Microbiol. 12: 737-745
【非特許文献５】
August P.R. et al., 1996, Gene 175: 261-267
【非特許文献６】
Schmitt-John, T., and Engels, J.W., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 493-498
【非特許文献７】
Bibb, M. J. et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 533-545
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、増殖期の放線菌において高レベルで遺伝子を発現させることができる発現ベクターを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
増殖期の放線菌において外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターを開発するため、本発明者らは放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子のプロモーターに着目した。リボゾームは生命に必須のタンパク合成装置であり、L11蛋白質の遺伝子は生育初期から発現され、生育の盛んな対数増殖期にはその発現は最大となると考えられる。本発明者らは以前、ストレプトミセス属 Streptomyces griseus由来のL11蛋白質遺伝子（rplK遺伝子）を含むDNA断片を単離している (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560)。また、S.coelicolorでのみrplK上流領域の転写開始点に関する報告がされている（Puttikhunt,C., T. Nihira, and Y. Yamada. 1995. Mol. Gen. Genet. 247: 118-122）。しかしプロモーター領域を含むrplK遺伝子断片を多コピープラスミドに挿入して放線菌に導入しても、形質転換体を得ることはできなかった (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560)。
【０００６】
そこで本発明者らは、約280塩基対からなるL11蛋白質遺伝子のプロモーター断片を選び出し、これに異種遺伝子を連結して新たな発現ベクターを構築した。ベクターからの遺伝子発現を測定した結果、このDNAの下流に連結した異種遺伝子の発現を非常に強く誘導することを突き止めた。すなわち、L11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流3番目から277番目のDNA断片を用い、さらに本来連結されているL11蛋白質コード配列ではなく異種遺伝子を連結することにより、放線菌内で起こる転写抑制または他の有害な効果を回避することが可能となり、異種遺伝子を高発現するベクターを構築できることを実証した。このとき、転写終結配列 (ターミネーター) として、ssgA遺伝子由来のターミネーター配列 (Kawamoto, S., and J.C. Ensign, 1995, Actinomycetologica 9:136-151; Kawamoto, S et al., 1997. Microbiology 143:1077-1086) を用いることにより、異種遺伝子の持続的な高発現をより確実に実現させることに成功した。ssgA遺伝子のターミネーターは大きなステムループを形成し得るパリンドローム配列を含んでおり、これにより転写終結因子に依存しないで強力に転写を終結させることができた。rplKプロモーターとssgA遺伝子のターミネーター配列を組み合わせることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にし、なおかつ、強力なターミネーターの利用によりmRNAの安定化の向上を可能とする新たな発現ベクターを構築することに成功した。
【０００７】
上記のrplKプロモーター−異種遺伝子の発現カセットは、低コピープラスミドの複製起点（ori）を持つプラスミド中に組み込むことにより低コピー型の発現プラスミドとして構築できたのみならず、多コピープラスミドの複製起点を持つプラスミド中に組み込むことにより、多コピー型の発現プラスミドとして構築することにも成功した。このように、本発明においてrplK遺伝子由来のプロモーター断片を持つ多コピー型の発現プラスミドが初めて提供された。
【０００８】
この発現ベクターにEGFPのコード配列を組み込み、放線菌に導入して発現を解析したところ、菌体からEGFPの強い発現が観察された。また、分泌性蛋白質であるアガラーゼ蛋白質のコード配列を組み込み、放線菌に導入して培養したところ、培養上清中に140 U/mlを超えるアガラーゼが分泌された。本来のアガラーゼ遺伝子の発現は、グルコースによるカタボライト抑制およびリプレッサー蛋白質による転写抑制などを受けるため高発現は期待できないが、本発明の発現ベクターを利用することにより、発現させる遺伝子が本来受けるはずの発現抑制を受けることなく、高レベルで蛋白質を発現させることができた。
【０００９】
また本発明者らは、この発現ベクターに宿主ゲノムへの組み込みに必要なφ31ファージのint遺伝子とattPを挿入し、ゲノム組み込み型の発現ベクターを構築した。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤等により選択する必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。このゲノム組み込み型ベクターにそれぞれssgA遺伝子およびeshA遺伝子の部分配列をアンチセンスに組み込み、放線菌に導入して発現量の測定と表現型の変化を観察した。形質転換株におけるアンチセンスRNAの転写をRT-PCRにより解析したところ、それぞれssgAおよびeshAのアンチセンスRNAが生育期を通じて発現されていることが明らかとなった。アンチセンスRNAの転写レベルは、内在性のhrdB遺伝子の転写レベルに匹敵していた。すなわち、ゲノムに組み込んだ形態においても、本発明のベクターは高いレベルで異種遺伝子を発現できることが証明された。ssgA遺伝子およびeshA遺伝子は共に必須遺伝子ではなく、これらの遺伝子を破壊した株は共に青色抗生物質アクチノロージンの生産が抑制される。上記のアンチセンスRNAを発現する形質転換株では青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制されたことから、アンチセンスRNA発現により、eshA遺伝子およびssgA遺伝子の機能が実際に抑制されたことが確認された。このように、本発明のベクターは、ゲノムに組み込まれ、安定に維持され、しかも遺伝子を高レベルで発現することもできる。本発明のベクターは遺伝子の高発現用ベクターとして、またはアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制用のベクターとして極めて有用であることが証明された。
【００１０】
すなわち本発明は、新規な放線菌発現ベクター、該ベクターを保持する宿主細胞、および該ベクターによる蛋白質の製造方法等に関し、より具体的には、
（１）放線菌において異種遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された該異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含むDNAベクター、
（２）放線菌において遺伝子を発現させるためのDNAベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）（ｂ）のクローニング部位の下流に転写終結配列を含むDNAベクター、
（３）転写終結配列が、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するDNAの塩基配列である、（１）または（２）に記載のDNAベクター、
（４）低コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（５）多コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（６）ゲノム組み込みベクターである、（１）から（３）のいずれかに記載のDNAベクター、
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換された宿主細胞、
（８）蛋白質の製造方法であって、該蛋白質をコードする（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで形質転換した宿主細胞を培養する工程、および該宿主細胞またはその培養液から生産された該蛋白質を回収する工程を含む方法、
（９）遺伝子の機能を抑制する方法であって、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする（１）から（６）のいずれかに記載のDNAベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、L11蛋白質遺伝子プロモーター配列を利用した、放線菌で遺伝子を発現する発現ベクターに関する。L11蛋白質遺伝子（rplK遺伝子）はリボゾーム蛋白質L11をコードする遺伝子であり、放線菌において高度に保存されている（図１参照）。本発明のベクターは、このL11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域のDNAを含む。本発明のベクターの１つの態様は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含む組み換えDNAであって、放線菌において該遺伝子を検出可能に発現するDNAベクターである。本発明者らは、配列番号：１に示した塩基配列からなるDNAが、下流に連結した異種遺伝子を増殖期の放線菌において高レベルで発現させることを見いだした。本発明のDNAベクターは、放線菌で所望の遺伝子を発現させるために用いる発現ベクターとして有用である。
【００１２】
本発明においてプロモーター活性とは、下流に連結した遺伝子を転写する活性を言う。プロモーター活性は、プロモーター活性について調べたい配列の下流に、発現を検出するための適当な指標遺伝子（例えばマーカー蛋白質をコードする遺伝子など）を連結し、放線菌等の宿主に導入する。宿主においてその指標遺伝子の発現（例えばマーカー蛋白質の活性など）が検出されれば、その配列はプロモーター活性を有すると判断される。また遺伝子の転写は、蛋白質を検出するかわりにRNAの転写をRT-PCR等により検出して測定することもできる。なお、下流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の3'方向のことであり、上流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の5'方向のことである。
【００１３】
また本発明において遺伝子とは、転写されるべき塩基配列を含む核酸を言う。また本発明において異種遺伝子とは、本発明のベクターのプロモーター配列が由来するL11蛋白質遺伝子とは異なる遺伝子のことを言う。遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、していなくてもよい。蛋白質をコードする核酸は、本発明において、その蛋白質の遺伝子と呼ぶ。アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードする核酸は、本発明においてそれらの遺伝子と呼ぶ。本発明のDNAベクターに組み込む異種遺伝子はL11蛋白質遺伝子以外の所望の遺伝子であってよく、好ましくはL11蛋白質、L1蛋白質、およびL10蛋白質のいずれもコードしない遺伝子である。ベクターに組み込む異種遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、あるいはアンチセンスRNAまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない配列であってよい。蛋白質としては、所望の酵素、構造蛋白質、調節因子などであってよく、天然の蛋白質、変異蛋白質、人工的に作り出した蛋白質などであってよい。例えば、分泌蛋白質を本発明のベクターを利用して発現させれば、この蛋白質を培養液中に大量に分泌させることができる。天然には分泌されない蛋白質であっても、分泌シグナルを付加した融合蛋白質を発現させることで、その蛋白質を菌体外等に分泌させることができる。本発明のベクターは、挿入する遺伝子がコードする蛋白質を分泌するように、予めベクター配列中に分泌シグナル配列をコードしていてもよい。配列番号：１または２の塩基配列を含む本発明のベクターはSD配列（AGGA）を含むが、目的の遺伝子の蛋白質コード配列の開始コドンからSDまでが離れている場合は、開始コドンの近くに適宜SD配列を挿入してよい。なお、本発明のDNAベクターは通常は２本鎖DNAであるが、放線菌に導入した時に２本鎖DNAを生じる限り、どちらか一方の鎖からなるDNAを含むベクター（例えば一本鎖DNAを含むファージなど）であってもよい。すなわち本発明においてある塩基配列を含むDNAベクターとは、その塩基配列を含む２本鎖DNAを生じることができるように、該塩基配列および／またはその相補配列を含むDNAベクターのことである。
【００１４】
本発明において放線菌とは、放線菌目（order Actinomycetales）に属する菌を言う。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり主に土壌などに生息する。原核生物でありながら、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Frankiaceae）、ミクロモノスポラ科（Micromonosporaceae）、プロピオニバクトリウム科（Propionibacteriaceae）、シウドノカルジア科（Psuodonocardiaceae）、ストレプトミセス科（Streptomyceae）、ストレプトスポランギウム科（Streptosporanguaceae）、テルモモノスポラ科（Thermomonosporaceae）、コリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）、マイコバクテリウム科（Mycobacteriuaceae）、およびノカジア科（Nocaudiaceae）が含まれる。本発明において放線菌とは、特に好ましくは、ストレプトミセス科（Streptomyceae）、より好ましくはストレプトミセス属（Streptomyces）に属する菌である。
【００１５】
本発明において好適に用いられるL11遺伝子プロモーター断片の塩基配列を配列番号：１に示す。この配列は、放線菌 S.griseusのL11遺伝子のプロモーター断片であって、強力なプロモーター活性を持っている。本発明者らが、S.griseus, S.lavendulae, S.virginia, および S.coelicolorを含む放線菌においてL11遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ、この領域の配列は極めて保存性が高いことが判明した（図１）。調べた放線菌４菌株で、-10領域、転写開始点、およびShine-Dalgarno (SD) 配列は100%保存されており、それ以外の領域の保存性も極めて高かった。本発明においては、これらの放線菌のL11蛋白質遺伝子のプロモーター配列を好適に用いることができる。例えば、本発明のベクターは、所望の放線菌のリボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の異種遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えDNAが含まれる。
【００１６】
また、本発明のベクターは、L11遺伝子上流領域を、翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列よりも広範囲にわたって有していてもよい。例えば、配列番号：１より長くL11遺伝子の上流領域を含むDNA断片である配列番号：２を好適に用いることができる。より具体的に例示すれば、本発明のベクターは、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流、約3塩基から約197塩基までの塩基配列、より好ましくは約3塩基から約277塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えDNAが含まれる。
【００１７】
また、本発明のベクターにおいては、放線菌L11蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を用いることもできる。このような塩基配列としては、図１に示した S.lavendulae, S.virginia, および S.coelicolor由来の配列（それぞれ配列番号：36、37、および39）を含むDNAが挙げられる。また、このような配列は人為的に変異させたものであってもよく、または天然に変異した配列であってもよい。例えば部位特異的変異導入による塩基置換、あるいは１または複数の塩基の欠失または挿入などにより塩基配列を改変し、プロモーター活性を上昇させたり、あるいはプロモーター活性に影響を与えない配列を除去することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。このように改変した配列のプロモーター活性は、実施例に示したように発現ベクターを構築し、下流に連結した遺伝子の発現を調べることにより評価することができる。改変前の配列とプロモーター活性を比較し、プロモーター活性が維持された（またはより強い）配列を適宜選択することができる。
【００１８】
本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、具体的には、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において、50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約60塩基目から約84塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より特定すれば、放線菌L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約57塩基目から約84塩基目までで保存された 5'-ATACCCGTTATCGT[G/T]GTGCGGTATGCCT-3' (配列番号：５) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。さらに好ましい態様では、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約101塩基目から約115塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より具体的に記載すれば、L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約98塩基目から約115塩基目までで保存された 5'-TCTGACCTGCT[G/C]GGTTTT-3' (配列番号：６) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。
【００１９】
また、本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）（ここでは、これらを基準配列と称す）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、比較したい２つの配列を、塩基がなるべく一致するように適宜ギャップを挿入して整列させ、基準配列全長に対する一致する塩基の割合として算出することができる。塩基配列の整列（アライメント）は、所望のコンピュータプログラムを利用することができ、例えばCLUSTAL W（Higgins, D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）、またはBLAST（National Center for Biothchnology Information）などを用いることができる。ギャップはミスマッチした塩基と同様に扱い、アライメントにおける基準配列全長の塩基数（ギャップを含む）のうち、両者の配列で一致した塩基数の割合として同一性が決定される。但し、両方の配列の同じ位置に共にギャップを入れた場合には、そのギャップは計算から除外する。後述するアミノ酸配列の同一性の算出も同様に行うことができる。
【００２０】
例えばBLASTにより塩基配列またはアミノ酸配列の同一性を決定する場合は、文献「Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410」に記載の方法に従って実施することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはblastnプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはblastpプログラムを用い、例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて"Low complexity"などのフィルターの設定は全てOFFにして計算を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）。パラメータの設定は、例えばopen gapのコストはヌクレオチドは5で蛋白質は11、extend gapのコストはヌクレオチドは2で蛋白質は1、nucleotide mismatchのペナルティーは-3、nucleotide matchの報酬は1、expect valueは10、wordsizeはヌクレオチドは11で蛋白質は2、Dropoff (X) for blast extensions in bitsはblastnでは20で他のプログラムでは7、X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastn以外では15、final X dropoff value for gapped alignment (in bits)はblastnでは50で他のプログラムでは25 にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとしてBLOSUM62を用いることができる。２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。
【００２１】
また本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）またはその相補配列を含むDNAまたはRNA、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）またはその相補配列を含むDNAまたはRNA（ここではこれらを基準核酸と称す）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、互いにハイブリダイズさせる核酸のうち、一方の核酸をプローブとして、対象とする配列を持つ核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上を用いる。ハイブリダイズに用いる基準核酸にL11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００２２】
上記のストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００２３】
なお、本発明のベクターは、L11蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない。また好ましくは、本発明のベクターはL11蛋白質遺伝子とゲノム上でオペロンを構成するL1蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない（Kuberski,S. et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 119 (1-2), 33-39; Kuster,C. et al. (1998) Mol. Gen. Genet. 257 (2), 219-229; Accession No. X72787）。より好ましくは、本発明のベクターはL10蛋白質のコード配列の全長を含まない。具体的には、本発明のベクターは、例えば配列番号：８（L11蛋白質）のアミノ酸からなる蛋白質またはこの蛋白質のアミノ酸配列と10アミノ酸以内、好ましくは20、30、40、または50アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：８のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは80、70、または60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNAを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：７（L11蛋白質 CDS）からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含まない。また好ましくは、本発明のベクターは、配列番号：１０（L1蛋白質）、および/または１２（L10蛋白質）、あるいはこれらの蛋白質のアミノ酸配列と10アミノ酸以内、好ましくは20、30、40、または50アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：１０または１２のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは80、70、または60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNAを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：９（L1蛋白質 CDS）または１１（L10蛋白質 CDS）からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含まないことが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は上記の通りである。
【００２４】
本発明のベクターは、異種遺伝子の下流に転写終結配列（ターミネーター）を含む。転写終結配列は、その上流のプロモーターからの転写を終結させる能力を持つ所望の配列を用いることができ、例えば所望の放線菌遺伝子の転写終結配列を用いることができる。但し、本発明のベクターにおいては、Rho因子非依存的に転写を終結させることができる転写終結配列（すなわちintrinsic terminator）を用いることでより優れた効果を発揮する。このような転写終結配列は、一般に 7 bpから20 bpまたはそれ以上のステムループ構造をつくるパリンドローム配列を有している。また一般にGCに富む。特に、ステムループを形成させたときの自由エネルギー低下（ΔG）が-50 Kcal以下、より好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70Kcal以下となる配列が好ましい。ステムループのΔGは、例えばRNA二次構造予測プログラムを用いて計算することができる。具体的には、DNASIS（Hitachi Software Engineering Co., Ltd.）を利用することができる。
【００２５】
ステム部分は全域にわたって塩基対を形成しなくてもよい。好ましくは、20塩基以上の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、30塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、35塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。ループ部分の大きさは特に制限はないが、典型的には2〜100塩基、例えば3〜50塩基である。
【００２６】
より好ましい態様では、転写終結配列としては放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列が用いられる。ssgAの転写終結配列は20塩基対以上のステムを形成しRho非依存的に転写を終結させることができる。ssgAの転写終結配列を用いることによって、より性能の高い発現ベクターを構築することが可能である。好適に用いられるssgAのRho非依存的転写終結配列を配列番号：３に例示した。この配列はS. griseus ssgAの転写終結配列に由来し、20塩基以上のステムを形成する。本発明のベクターにおいては、ssgAの翻訳停止コドンの次の塩基から200、250、または300塩基を含む領域を用いてよい。例えば、配列番号：４に示した塩基配列を含むDNAを転写終結配列として好適に用いることができる。また本発明においては、放線菌 ssgAの転写終結配列（例えば配列番号：３または４）の塩基配列、または該配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を含み、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。
【００２７】
具体的に例示すれば、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）において50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、上記したように、ΔGが-50 Kcal以下、好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70 Kcal以下となるように調整する。また、ステムの長さおよび塩基対の割合も上記に従うことが好ましい。あるいは、本発明のベクターに用いる転写終結配列は、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列、あるいは、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）またはその相補配列を含むDNAまたはRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。塩基配列の同一性の算出、およびハイブリダイゼーションの条件は、本明細書に記載した通りである。
【００２８】
また本発明は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有する塩基配列を含み、（ｂ）その下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）その下流に転写終結配列を含む組み換えDNAであって、該クローニング部位に挿入した遺伝子を放線菌において検出可能に発現することができるDNAベクターを提供する。このクローニング部位に所望の遺伝子を挿入することによって、増殖期の放線菌においてその遺伝子を高発現させることができる。このようなベクターは、例えば上記の異種遺伝子を有する本発明のDNAベクターにおいて、異種遺伝子が除去され、その部分にクローニング部位が残されたようなベクターが挙げられる。
【００２９】
クローニング部位とは、発現させたい核酸をベクターに組み込むための配列を言う。クローニング部位は、典型的には制限酵素認識配列を含む。クローニング部位は、複数の制限酵素認識配列（すなわちマルチクローニングサイト）を含むことが好ましい。別の態様では、クローニング部位は、例えば3'にチミジンが一塩基突出したDNA末端とすることもできる。このような発現ベクターは、直鎖状の二本鎖DNAとして提供される。このベクターには、PCRにより増幅したDNA断片を、T:A塩基対を利用したライゲーションにより簡便に組み込むことができる。また、クローニング部位は、例えば相同組み換えを利用してベクターに核酸を組み込むための配列であってもよい。クローニング部位以外の配列の構成は、本明細書に記載した通りである。
【００３０】
本発明のベクターの１つの態様はプラスミドベクターである。プラスミドには、放線菌で増幅するための複製起点（ori）が含まれている。さらに大腸菌で増幅するための複製起点を有していてもよい。放線菌と大腸菌の両方で増幅可能なベクターは、大腸菌−放線菌シャトルベクターとして利用することができる。放線菌で増幅するための複製起点（ori）は、低コピー型であっても多コピー型であってもよい。低コピープラスミドとは、放線菌内で1から10コピー程度のプラスミド増幅をもたらすプラスミドを言い、多コピープラスミドとはそれ以上、具体的には40コピーから400コピー程度またはそれ以上のコピー数をもたらすプラスミドを言う。低コピーのoriを例示すれば、例えば SCP2* ori（Lydiate, D.J. et al. (1985) Gene 35(3):223-235）が挙げられる。高コピーのoriとしては、例えば pIJ101 ori（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）が挙げられる。またプラスミドベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適当な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびアプラマイシン耐性遺伝子などが含まれ、これらはいずれも当業者にはよく知られている。また、放線菌プラスミドの構築には、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995))、pIJ702（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）、pIJ8600（Sun, J. et al. (1999) Microbiology 145:2221-2227）などの配列を利用することができる。
【００３１】
本発明のDNAベクターは、好ましい態様において、異種遺伝子としてS.coelicolorのdagA遺伝子を挿入した場合、pIJ101 oriなどを含む多コピープラスミドの形態で放線菌S.coelicolor M145株 (ATCC Number: BAA-471）に形質転換したときに、適当な培地（例えばYEME培地）で30℃での振盪培養条件において、培養上清中のアガラーゼ活性の最大値が、dagA遺伝子を持たない空ベクターを挿入した対照におけるアガラーゼ活性との差として、50 U/ml以上、好ましくは60 U/ml以上、より好ましくは70 U/ml以上、より好ましくは80 U/ml以上、より好ましくは90 U/ml以上、より好ましくは100 U/ml以上となる発現能力を持つ。
【００３２】
また本発明のベクターの他の１つの態様は、ゲノム組み込み型ベクターである。ゲノム組み込み型ベクターとは、放線菌に導入されたときに、放線菌ゲノムに組み込まれて、ゲノム上から組み込んだ遺伝子を発現できるベクターである。放線菌に導入する前では、このベクターは、プラスミドの形態で調製することもできる。ゲノム組み込み型ベクターの作成においては、放線菌ファージが持つ、宿主ゲノムへのファージDNAの組み込みに必要な組み換え配列を利用することができる。具体的には、例えばφ31ファージのint遺伝子とattPをベクターに挿入すればよい（Bierman, M. et al., (1992) Gene 116: 43-49）。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤により選択し続ける必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。
【００３３】
本発明のベクターは蛋白質の製造に有用である。製造する蛋白質としては、例えばL11蛋白質、L10蛋白質、またはL1蛋白質以外の所望の蛋白質が挙げられる。また、蛋白質自体の製造ではなく、例えば抗生物質など、形質転換菌から生産される有用物質の生産量が、ある蛋白質を発現させることにより上昇する場合には、本発明のベクターを用いてこの蛋白質を発現させ、有用物質の生産を高めることができる。蛋白質の生産は、目的の蛋白質を発現する本発明のベクターで形質転換した放線菌を培養し、該蛋白質を含む培養物または培養上清を回収することにより得ることができる。得られる蛋白質溶液から、公知の方法により該蛋白質をさらに精製することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００３４】
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用する放線菌の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００３５】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、宿主として使用する放線菌が増殖し、目的の蛋白質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節する。温度は宿主とする放線菌の生育に適した温度を適宜選択する。培養時間は、十分量の蛋白質が宿主放線菌が得られれば特に制限はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日培養する。遺伝子発現に伴って生産蓄積された蛋白質は、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３６】
蛋白質が放線菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、放線菌をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチーム処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより放線菌を破砕し、発現させた蛋白質を抽出することができる。こうして得られた粗蛋白質は、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００３７】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories、1989年; 微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版）。例えば、ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って実施することができる。形質転換は、例えば文献（Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D.J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom）記載の方法に準じて実施することができる。
【００３８】
製造された蛋白質は、精製蛋白質および部分精製蛋白質として得ることもできる。また、蛋白質を公知の方法により不溶性の担体に固定化してもよい。本発明においては、このようにして製造された蛋白質も包含する。また、本発明においては、本発明のベクターで形質転換された放線菌にも関する。また本発明は、形質転換放線菌の処理物にも関する。処理物とは、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理処理、リゾチームなどの酵素処理のような生化学的処理、もしくは界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などの化学的処理等を行った産物を指す。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた放線菌、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００３９】
また本発明は、本発明のベクターを用いて、所望の遺伝子の機能を抑制する方法に関する。この方法は、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする核酸が組み込まれた本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む。アンチセンスとしては、標的遺伝子の転写領域全体のアンチセンスを用いることもできるし、あるいは該遺伝子の転写領域の連続した少なくとも15塩基、好ましくは20塩基以上、より好ましくは50塩基以上、より好ましくは80塩基以上、より好ましくは100塩基以上（例えば150塩基以上）に対するアンチセンス配列を用いる。例えば、翻訳開始コドンを含む領域に対するアンチセンス配列は特に好ましい。
【００４０】
細菌でのmRNAの代謝回転は極めて速い。従ってアンチセンスRNAを用いて遺伝子の発現を抑制するには、恒常的に高いレベルでアンチセンスRNAを発現することが必要である。本発明の発現ベクターを用いれば、効果的に目的の遺伝子の発現をアンチセンス効果により抑制することができる。この系は、所望の遺伝子機能抑制への活用が期待される。特に二次代謝等の生育後期に開始される遺伝子の抑制（制御遺伝子のアンチセンスRNAの発現による機能抑制）には、生育初期からアンチセンスRNAの高発現が必要である。アンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制を利用した解析手法は、ポストゲノム解析の一手法として活用が期待される。従来の遺伝子破壊による解析では、その遺伝子の機能が失われるため、必須遺伝子の解析は不可能であった。一方アンチセンスRNA発現は、発現条件をコントロールすることにより必須遺伝子の解析も可能である。本発明のベクターからの発現は、増殖速度と比例すると考えられるため、培養条件を検討することにより、必須の未知機能遺伝子の解析も可能である。また本発明のベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
[実施例１]  放線菌Streptomyces griseus由来のL11リボゾームタンパク遺伝子(rplK)プロモーター領域を用いた発現カセットの構築
本発明者らは、L11リボゾームタンパク遺伝子（rplK）プロモーターとssgA遺伝子のターミネーター配列の特性を巧みに利用した新たな発現ベクターを開発するため、rplK遺伝子プロモーター・マルチクローニング部位・ssgA遺伝子由来の強力な転写ターミネーターの配置を持つ発現カセットを構築した。
【００４２】
放線菌Streptomyces属において、rplK遺伝子の推定プロモーター領域の塩基配列は極めて保存性が高いことを見出した（図１）。RNAポリメラーゼによる転写に必要な-35と-10認識配列および転写開始点を含む塩基配列領域の相同性は極めて高い。また翻訳に必要なリボゾーム結合SD配列を含む領域も100%保存されている。ハウスキーピング遺伝子のL11プロモーターを用いることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にした。
また、本発明者らは、発現カセットの構築において、放線菌由来の転写終結因子非依存型のステム・ループ構造を持つターミネーターの中でも最強の一つと考えられる S. griseus由来ssgA遺伝子 (Kawamoto,S., and J.C.Ensign.1995. Actinomycetologica 9:136-151. Kawamoto,S., H.Watanabe, A.Hesketh, J.C.Ensign, and K.Ochi.1997. Microbiology 143:1077-1086) のターミネーター配列を組み合わせることにした (図２)。すなわち強力なターミネーターの利用によりmRNAの安定化の向上を図った。
【００４３】
発現カッセトの構築に際しては、S. griseusのrplK遺伝子プロモーター領域（図１に示した配列に加えさらに上流域120bpを含む計約280bp配列領域) (配列番号：２) を、組換えプラスミドpP34 (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560) を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BamHIとEcoRIを導入した。S. griseusのssgA遺伝子ターミネーター領域 (図２に示した配列に加えさらに下流域 50 bpを含む計約 340 bp配列領域) (配列番号：４) を組換えプラスミド pNY22 (Kawamoto, S. and J.C. Ensign, 1995, Actinomycetologica 9:136-151)を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列EcoRIとBamHIを導入した。ベクターpGEM3Zf(-) (Promega社) をEcoRIで切断し、Klenow enzymeでfill inした後、セルフライゲーションして、クローニング部位のEcoRI認識配列を潰したプラスミドpGΔEを文献（Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sanbrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）記載の方法に準じて構築した。次に、プライマー L11PBamF (5'-GCCAGGATCCACGAGATCAACGCCG-3'／配列番号：13) (下線部は制限酵素部位) および L11PEcoR (5'-TTGGGAGGAATTCCTCTCTCCGGG-3'／配列番号：14) を用いて、rplKプロモーター領域をPCRにより増幅し、280bpのPCR産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。また、プライマー SsgATerEF (5'-GGGTGAATTCGACGGCAACCTG-3'／配列番号：15) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16) を用いて、ssgAターミネーター領域をPCRにより増幅し、350 bp産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。pGΔEをBamHI切断後、BAP処理し、制限酵素処理したrplKプロモーター領域とssgAターミネーター領域のPCR産物をライゲーションし、組換えプラスミドpSK200を作製した。5'末端をキナーゼでリン酸化したプライマー PlinkF (5'-AATTCAGATCTTTAAATATTACTAGTAAGCTTG-3'／配列番号：17)および PlinkR (5'-AATTCAAGCTTACTAGTAATATTTAAAGATCTG-3'／配列番号：18) をアニーリングして、複数の制限酵素認識配列（高GC含量のDNAを持つ放線菌では稀にしか存在しないATリッチな制限酵素認識配列）を持つ合成DNAリンカーを作成し、これを制限酵素EcoRI（rplK遺伝子プロモーター領域とssgA遺伝子ターミネーター領域の接続部に唯一認識配列が存在）で切断したpSK200に挿入して組換えプラスミドpSK201を作製した。このプラスミドには、制限酵素BamHIで切り出し可能なrplK遺伝子プロモーター - クローニング部位 - ssgA遺伝子ターミネーターから構成される約700bp発現DNAカセットが挿入されている。
【００４４】
[実施例２]  各種発現プラスミドの構築
１．発現ベクターpSK210
pSK201を鋳型として、プライマー L11PSK (5'-GTCGGGATCCTCGGCCGCGAG-3'／配列番号：19) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16)を用いて発現DNAカセットをPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端に制限酵素認識配列BamHIを導入した。5'末端のBamHI認識配列は、DNA発現カセットのrplK遺伝子プロモーター5'末端部に存在するBglII認識配列を除去するため導入した。BamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpV1（Kawamoto, S. et al., 1997, Microbiology 143:1077-1086）のBglIIクローニングサイトに挿入し発現ベクターpSK210を作製した（図３）。
pSK210は放線菌で低コピー型であり、選択マーカーはアンピシリン耐性（amp;大腸菌）、チオストレプトン耐性（tsr; 放線菌）およびハイグロマイシン耐性（hyg; 放線菌）である。
【００４５】
２．発現ベクターpSK220
上記のBamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌多コピーベクターpIJ702 (Katz E. et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129: 2703-2714）のBglIIクローニングサイトに挿入し、多コピー型の発現ベクターpSK220を作製した（図４A）。本プラスミドの選択マーカーはチオストレプトン耐性である。
【００４６】
３．放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955
ベクターpBluescript SK(+) (Stratagene社製) を鋳型として、プライマー PBlueT7C (5'-CGCTGGCATATGTAGCGGTCACGCTGCGCG-3'／配列番号：20) および PBlueT3N (5'-GCTGGGACGTCAGGTTTCCCGACTGGAAAG-3'／配列番号：21) を用いて、このプラスミドの約580bpのマルチクローニング部位-lacZ遺伝子領域をPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列AatIIとNdeIを導入した。AatIIとNdeI で切断したPCR産物、放線菌多コピーベクターpIJ702から調製した約2.9 kbのNdeI-PstI DNA断片（放線菌での複製に必要なrep遺伝子とpIJ101 oriを含む）および放線菌ゲノム組込型ベクターpIJ8600 (Sun, J. et al., Microbiology 145: 2221-2227) から調製した約2.4 kbのAatII-PstI DNA断片（アプラマイシン耐性遺伝子であるacc(3)IVとpUC18 oriを含む）を連結することにより、放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955を作製した（図４B）。pSK1955は放線菌で多コピー型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４７】
４．発現ベクターpSK1127
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：22) (BglII siteの除去のため) およびSsgATmNde (5'-CTGGCATATGCGGGCGCGGCGCTGCCACTG-3'／配列番号：23) を用いてPCRにより605bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとNdeIを導入した。ClaIとNdeI で切断したPCR産物、およびベクターpSK1955から調製した約5.1 kbのClaI-NdeI DNA断片（rep遺伝子, pIJ101 ori, acc(3)IV遺伝子とpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK1127を作製した（図５A）。放線菌 - 大腸菌シャトルベクターのpSK1127は放線菌で多コピー型のであり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４８】
５．発現ベクターpSK811
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：22) (BglII siteの除去のため) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：16)を用いてPCRにより655bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとBamHIを導入した。ClaIとBamHI で切断したPCR産物、およびゲノム組込型ベクターpIJ8600から調製した約6.3 kbのClaI-BglII DNA断片（ゲノム組込に必要なφ31ファージのint遺伝子とattP, RK2 oriT, acc(3)IV遺伝子およびpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK811を作製した（図５B）。放線菌-大腸菌シャトルベクターのpSK811はゲノム組込型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４９】
[実施例３]  発現ベクターpSK210とpSK220による蛍光タンパク質の発現
クラゲ由来の改変緑色蛍光タンパク質EGFPの構造遺伝子をプラスミドpEGFP（Clontech社）を鋳型としてPCR増幅した。ベクター上の発現DNAカセットへの挿入のためPCR産物（約770bp）の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとHindIIIを導入した。具体的には、HindIIIサイトおよびEcoRIサイトの間にRBS (B. subtilis用)−EGFPコード配列 (ベーリンガー pSPT19由来。ただし、開始コドンを含むNcoIサイトからEcoRIサイトまでは、Clontech社のpEGFP由来。RBSは、合成DNAリンカーを作って挿入したものである) を含む断片 (図６A) を含むプラスミド (pSPT19) を鋳型に、プライマー EGFP-N (5'-GACCGAAGATCTGTTTAACTTTAAGAAG-3'／配列番号：24) (HindIIIサイトをBglIIサイトに変換するため) およびEGFP-C(5'-TACACGGAATTCAAGCTTCGCGGCCGC-3'／配列番号：25) を用いてRBS-EGFP遺伝子のPCRを行った。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、上記で構築した発現ベクターpSK210（低コピーベクター）とpSK220（多コピーベクター）に挿入してそれぞれ組換えプラスミドpLEGFPとpMEGFPを作製した。これらプラスミドおよび空ベクター (対照) を、S. coelicolor M145株 (ATCC Number: BAA-471, Hopwood, D.A., Microbiology 145: 2183-2202, 1999; Bentley, S.D. et al., Nature 417: 141-147, 2002; Hopwood, D.A. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual (The John Innes Foundation, Norwich, U.K.) に文献（Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D.J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom）記載の方法に準じて形質転換した。得られた形質転換株をYEME培地（組成：マルトエキス 0.3%, Difco酵母エキス 0.5%, Difcoバクトペプトン 0.3%, 5 mM MgCl2, グルコース 1%, ショ糖 34%）を用いて30℃で振盪培養し経時的に蛍光顕微鏡（Leica社製：蛍光フィルターブロックN3;S(NEW)励起光グリーンを使用）を用いて菌体を観察した。図６B〜Dは、各形質転換株の対数増殖中期の菌糸細胞の蛍光顕微鏡写真である。図６から明らかなようにpLEGFPとpMEFGP形質転換株では、蛍光タンパク質EGFPの発現により菌糸全体に渡り緑色蛍光が観察された。一方、対照として用いたベクターpSK220形質転換株の菌糸細胞では蛍光は全く観察されなかった。多コピー型ベクター由来のpMEFGP形質転換株の方が低コピー型ベクター由来のpLEGFP形質転換株に比べ遺伝子増幅効果によりはるかに高い蛍光強度を示した。なお、発現DNA カッセトのrplKプロモーター配列は、S. griseus由来であるが図１に示した配列の高い相同性からも予想されたようにS. coelicolor においても機能することが明らかとなった。
【００５０】
[実施例４]  発現ベクターpSK220による放線菌寒天分解酵素アガラーゼの高発現
S. coelicolor M145株のSD配列（リボゾーム結合配列）を含む寒天分解酵素アガラーゼ構造遺伝子（dagA遺伝子）を本菌株ゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅した。ベクター上の発現DNAカセットへの挿入のためPCR産物（約970bp）の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとHindIIIを導入した。具体的には、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー dagASD (5'-CGGGAGATCTGAAGAAGGAGAACGATCGTG-3'／配列番号：26) および dagATer(5'-ACTTGAAAGCTTCCGTTCCGTGAGGTGCTG-3'／配列番号：27) を用いてdagA遺伝子のPCRを行った。得られた約970bpのPCR産物をBglIIおよびHindIIIで切断し、上記で構築したpSK220（多コピーベクター）に挿入して組換えプラスミドpMDagAを作製した。
【００５１】
dagA 遺伝子産物のアガラーゼは、細胞内で前駆体タンパク質（30 kDa）として合成され細胞外に分泌される分泌酵素（28 kDa）である (Bibb, M.J. et al., 1987, J. Gen. Microbiol., 133:2089-2096)。また本来のdagA遺伝子の発現は、グルコースによる強力なカタボライト抑制や形態分化と連動した複雑な転写発現制御を受けることが知られている（Gonzalez, L.S. et al., 1994, Microbiology 140:2555-2565）。
【００５２】
S. coelicolor M145株のpMDagA形質転換株をYEME培地（組成前述）を用いて対数増殖後期まで30℃で振盪培養した。遠心分離により得た培養上清のアガラーゼ活性を文献 (Bibb, M.J.et al., 1987. J. Gen. Microbiol. 133:2089-2096) 記載の方法に準じて測定したところ、対照のpSK220形質転換株（2.5 U/ml）に比べてpMDagA形質転換株は約60倍高い 143 U/ml の活性を示した。また2%寒天固形培地のウェルに培養上清を添加し30℃一晩反応を行うことにより活性染色を行った（図７A）。さらに培養上清中の分泌タンパク質を60%硫酸アンモニウムで沈殿させ、Tricine-SDS PAGEにより電気泳動分析を行った（図７B）。図７Aから明らかなように上述のアガラーゼ活性測定結果と一致してpMDagA形質転換株では中央部が陥没した大きな透明ハローを形成した。一方対照のpSK220形質転換株でのハロー形成は極めて小さかった。また図７Bから明らかなようにpMDagA形質転換株では、アガラーゼ分子量から予想される位置に分泌タンパク質バンドが観察された。
【００５３】
以上結果から、pMDagA形質転換株では、対数増殖期からアガラーゼが高発現され培地中に大量に分泌されることが明らかとなった。対照のベクターpSK220形質転換株とpMDagA形質転換株共にゲノム中には本来のdagA 遺伝子が存在する。しかしながら用いた培地にはグルコースが炭素源として1%添加されているためカタボライト抑制によりゲノム上のdagA遺伝子発現が強く抑制されることは、ベクターpSK220形質転換株の活性測定結果から明らかである。従ってpMDagA形質転換株のアガラーゼ活性のほとんどはプラスミドpMDagA中のdagA遺伝子の発現によるものと考えられる。
放線菌Streptomyces属のカタボライト抑制等の複雑な遺伝子発現制御を受ける有用分泌タンパクの大量発現には、本発明の発現DNAカセットを持つベクターの利用が極めて効果的であることは明らかである。
また、本来分泌されな蛋白質であっても、放線菌の分泌シグナル配列を挿入したベクターにこの蛋白質をコードする遺伝子を組み込めば、放線菌の分泌系を利用して細胞内酵素の大量生産も可能である。これにより、異種タンパク質の細胞内大量発現による生産菌への悪影響を回避することができる。
【００５４】
[実施例５]  ゲノム組み込み型ベクターpSK811を用いたアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制
本発明の発現DNAカセットのマルチクローニング部位に目的の遺伝子を挿入することにより、放線菌で培養初期から恒常的に発現できることが前述のように明らかとなった。高等動植物では、アンチセンスRNA発現による特定遺伝子機能の抑制（遺伝子機能サイレンシング：遺伝子を破壊することなくアンチセンスRNAの発現によりmRNAからのタンパク合成すなわち遺伝子産物生成を阻害することにより遺伝子機能を抑制する方法）が基礎・応用面で利用されている。しかしながらmRNAの代謝回転が極めて速い細菌でのアンチセンスRNA発現利用は困難であった。そこで発現DNAカセットを持つゲノム組込型ベクターpSK811を用いてアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制効果の検証を行った。放線菌S. coelicolorの二次代謝誘発制御に関与する既知遺伝子ssgA（Kawamoto, S. et al., 1997. Microbiology 143:1077-1086; Wezel, G. P. et al., 2000. J. Bacteriol., 182:5653-5662）とeshA（Kawamoto, S. et al., 2001. J. Bacteriol., 183:6009-6016）遺伝子をモデルとして用いて実験を行った。
ssgAとeshA遺伝子は必須遺伝子ではないが、いずれの遺伝子を破壊してもS. coelicolorの青色抗生物質アクチノロージン生産が極端に低下する。一方、赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンの生産はほとんど影響を受けない。SsgA（135アミノ酸よりなる酸性タンパク質）とEshA（471 アミノ酸よりなるタンパク質）遺伝子産物共に二次代謝が開始される生育後期に出現し、その発現は転写レベルで時期特異的に制御されている。従って両遺伝子はRNAの代謝回転が速い放線菌でアンチセンスRNA発現による機能抑制が特に困難と考えられる。
【００５５】
S. coelicolor M145株のゲノムDNAを鋳型として、ssgA遺伝子（N-末端から約75アミノ酸に相当する塩基配列領域：約235bp）とeshA遺伝子（N-末端から約85アミノ酸に相当する塩基配列領域：約280bp）の一部をPCR増幅した。両PCR産物の5'末端 と3'末端にはそれぞれ制限酵素認識配列BglIIとSpeIを導入した。具体的には、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーSCp52-Bg (5'-TCCGGAGATCTCCCGGACCCGGGCG-3'／配列番号：28) および SCp52-Spe (5'-CTCCCACTAGTGCAAGGAGAAGGCC-3'／配列番号：29) を用いてeshA遺伝子 (アンチセンス発現方向へ挿入)のPCRを行い、得られた280bp産物をBglIIおよびSpeI で切断した。この断片は、5'-上流領域約20bpとEshAタンパク質(471アミノ酸)のN末端から約85アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。また、M145株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー SCssgA-Bg (5'-GTCAGATCTGCACCTCGGCCAGCGG-3'／配列番号：30) および SCssgA-Spe (5'-GGCACTAGTCATGATGAGCTTTCTC-3'／配列番号：31) を用いてssgA遺伝子(アンチセンス発現方向へ挿入)のPCRを行い、得られた235bp産物をBglIIおよびSpeIで切断した。この断片は、SsgAタンパク質(135アミノ酸)のN末端から約75アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。これらをBglIIおよびSpeI 処理したゲノム組込型ベクターpSK811にアンチセンスRNA発現方向に挿入して組換えプラスミドpEL7（anti-eshA RNA発現）とpSE1（anti-ssgA RNA発現）を作製した。これらプラスミドをS. coelicolor J1051株 (Chater, K.F. et al. (1982) Gene 19, 21-32; Chater, K.F. et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 97, 69-95; Kelemen, G.H. et al. (1995) Mol. Microbiol. 17, 221-230) に形質転換し、アプラマイシン耐性で組換えプラスミドがゲノムに挿入された形質転換株を選択した。得られた形質転換株を0.1% Difcoカザミノ酸を添加したR5寒天培地（1リットル当たりの組成：K2SO4 0.25g, MgCl2・6H20 10.12g, Difco酵母エキス 5g, TES 5.73g, グルコース10g, 寒天20g, 微量元素溶液* 2ml）で30℃、４日間培養して抗生物質生産性を調べた（図８）。*微量元素溶液（1リットル当たりの組成）：ZnCl2 10mg, FeCl3.6H2O 200mg, CuCl2・2H2O 10mg, MnCl2・4H2O 10mg, Na2B4O7・10H2O 10mg, (NH4)6Mo7O24・H2O 10mg
【００５６】
図８から明らかなようにベクターpSK811形質転換株では赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンと青色抗生物質アクチノロージンが生産されるのに対して、pEL7およびpSE1形質転換株共に予想されたように青色抗生物質アクチノロージンの生産が著しく抑制された。すなわちゲノムに挿入された組換えプラスミドからのアンチセンスRNA発現がeshAおよびssgA遺伝子機能を抑制したことが強く示唆された。pSK811はゲノム組込み型であり、培養する際に選択マーカーの抗生物質を添加しなくても安定に維持される利点がある。この様な条件でも遺伝子機能を充分抑制可能なアンチセンスRNA発現が行われることが証明された。
【００５７】
次に形質転換株のアンチセンスRNA発現に関するRT（逆転写）-PCR解析を行った（図９）。0.2% カザミノ酸を添加したR5培地で各形質転換株を30℃で振盪培養した。対数増殖の初期・中期・後期の培養菌糸から全RNAをRNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いて調製した。さらにRNA試料中に微量存在するDNAをRNase-free DNase I（Qiagen社）により分解した。RNA 濃度は、波長260nm の吸光度測定により定量した。RT-PCRはOne Step RT-PCR Kit（Qiagen社）を使用し、製造社のプロトコールに従い反応を行った。アンチセンスRNA検出のための特異的プライマーは図９Aに示したものを用いた。具体的にはanti-senseRNA検出用プライマー (pSK811, pEL7, pSE1) としては、RT-L11F (5'-GGACCCGGAGAGAGGAATTCAGATC-3'／配列番号：32) (予想されるmRNAのRT-PCR産物のサイズ：pSK811, 114bp; pEL7, 400bp)、および RT-ssgAR (5'-GTCAGCCGGCGTTCTGCTCCTCG-3'／配列番号：33) (予想されるmRNAのRT-PCR産物のサイズ：pSE1, 350bp) を用いた。放線菌で生育期を通じて比較的高レベルで発現されており、転写解析に際して内部標準として用いられるhrdB遺伝子に関するmRNAのRT-PCR反応も同時に行った。使用したプライマーは、RT-hrdBF (5'-AGAGCCCAAGCGCACCCGAAAGAG-3'／配列番号：34)および RT-hrdBR (5'-CTCGTCCTCGTCGGACAGCACGAAG-3'／配列番号：35) である (Kelemen, G.H. et al., 1991, Gene 98:53-60; Kelemen, G.H. et al., 1996, Mol. Microbiol., 21:593-603)。hrdBのRT-PCR反応に用いたプライマーで増幅される産物のサイズは370 bpである。
【００５８】
RT-PCRは50μl反応容量で行い、反応に添加した全RNA量は10 pg或いは100 pgであった。One Step RT-PCRは、50℃, 30min（逆転写酵素反応）次いで95℃ 15min (逆転写酵素の不活性化と耐熱性DNA Polymeraseの活性化)、そして95℃ 30 sec, 64℃ 30 sec, 72℃ 1 minを5サイクルと95℃ 30sec, 62℃ 30sec, 72℃ 1min を30サイクル、さらに72℃ 10minの反応条件で行った。なおOne Step RT-PCRにおいて最初の逆転写酵素反応を行わずに進めた場合には、増幅産物は全く得られないことから全RNA試料へのDNAの混入がないことを確認した。図９B から明らかなようにpSE1とpEL7形質転換株においてそれぞれ予想されるサイズのanti-ssgAとanti-eshA mRNAが生育期を通じて内部標準として同時に測定したhrdB遺伝子発現に匹敵するレベルで発現していた。以上の結果から、前述のpSE1とpEL7形質転換株の表現型は、アンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制効果に起因することが明らかとなった。
pSK811ベクターはゲノム組込型であり形質転換株において発現DNAカセットは１コピーで存在する。前述の結果から１コピーで存在しても遺伝子機能を抑制するのに充分なアンチセンスRNA発現が可能であることを示している。
発現DNAカセットを持つ放線菌低コピーベクターpSK210や多コピーベクターpSK220とpSK1127 を活用することにより今回検証したssgAやeshA遺伝子に比べさらに発現レベルの高い遺伝子の機能抑制を充分期待できる。
従って本発明の発現DNAカセットを持つベクターは目的遺伝子の放線菌における高発現に有効なばかりでなく今まで細菌で困難であったアンチセンスRNA発現による遺伝子機能抑制（遺伝子サイレンシング）をも可能にするものである。
これらベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。また放線菌のポストゲノム解析の遺伝子機能解析の手法として利用できる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、放線菌で所望の遺伝子を高レベルで発現させることが可能な発現ベクターが提供された。このベクターは、プラスミドとして、あるいはゲノム組み込み型ベクターとして使用することができる。本発明のベクターを用いれば、放線菌を宿主として所望の蛋白質を生産させることが可能であるほか、アンチセンスRNAやその他の所望の遺伝子を放線菌において高レベルで発現させることが可能である。
【００６０】
【配列表】
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【００６１】
【図面の簡単な説明】
【図１】放線菌株間のrplK（リボゾームタンパク質L11遺伝子）プロモーター領域塩基配列の相同性を示す図である。S.lavendulae (S. lav), S.virginia (S. vir), S.griseus (S. g), S.coelicolor (S. c) のrplKプロモーターの塩基配列を示した（順に配列番号：36〜39）。４種で同一の塩基はアルタリスクで示した。-35、-10、およびSD配列を囲みで示した。主要な転写開始点を太矢尻で、マイナーは転写開始点を小矢印で示した。
【図２】ベクターpSK811に挿入した、S. griseusのssgA遺伝子のターミネーター配列（配列番号：40）を示す図である。ΔG=-71.7 kcalのステムループを形成するパリンドローム配列を含む。塩基対を形成する塩基を囲みで示した。
【図３】  pSK210の構造を示す図である。
【図４】  pSK220（パネルA）およびpSK1955（パネルB）の構造を示す図である。
【図５】  pSK1127（パネルA）およびpSK811（パネルB）の構造を示す図である。
【図６】  pSK220とpSK210による蛍光タンパク質の S. coelicolorでの高発現を示す図である。Aは放線菌用EGFP発現カセットの構造、B〜Dは S. coelicolorのEGFPの発現の蛍光顕微鏡観察を示す。Aにおいて、EGFPの5'側および3'側に示した配列を、それぞれ配列番号：41および42とした。
【図７】アガラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換した放線菌からのアガラーゼの発現を示す図である。(A) 形質転換株の培養上清のアガラーゼ活性を示す図である。培養上清10μlをR2YE寒天培地のウェルに添加し、30℃で一晩インキュベートした。(B) 形質転換株の培養上清のTricine SDS-PAGE分析を示す図である。1, 分子量マーカー; 2, pSK220形質転換株; 3, pMDagA形質転換株。矢印はアガラーゼタンパク質のバンドを示す。
【図８】アンチセンスRNA発現によるeshAおよびssgA遺伝子機能の抑制を示す図である。空ベクター (pSK811) 形質転換株と比較すると、pSE1形質転換株およびpEL7形質転換株共に、青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制された。
【図９】アンチセンスRNA発現をRT-PCRにより解析した結果を示す図である。AはRT-PCRの増幅断片の位置を、BはRT-PCRの結果を示す。EL, 対数増殖初期; ML, 対数増殖中期; LL, 対数増殖後期。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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