(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び宿主の選択のための遺伝子を順番に有するクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して得られる組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することを含む、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する方法において、宿主の選択のための遺伝子が、蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子であり、プロモーター配列がＴ７プロモーター配列であり、宿主がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、上記の方法。
【請求項２】
宿主の選択のための遺伝子が、緑色蛍光蛋白質又はその変異体をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リボソーム結合配列がＳＤ配列又はコザック配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
宿主の選択のための遺伝子として、可視光下で蛍光を発する蛍光蛋白質の遺伝子を使用する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
宿主の選択のための遺伝子として、野生型緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列において６４番目のアミノ酸がＬｅｕであり、６５番目のアミノ酸がＴｈｒであり、９９番目のアミノ酸がＳｅｒであり、１５３番目のアミノ酸がＴｈｒであり、１６３番目のアミノ酸がＡｌａであり、２０８番目のアミノ酸がＬｅｕであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を使用する、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに複製起点を有する、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらに抗生物質耐性遺伝子を有する、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
クローニングベクターが配列番号５に記載の塩基配列を有するクローニングベクターである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を順番に有するクローニングベクターのクローニング部位に、末端にＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して組み換えベクターを作成する工程；
（Ｂ）得られた組み換えベクターを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌に形質転換して形質転換体を作成する工程；及び
（Ｃ）得られた形質転換体中に導入されている蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、組み換えベクターを有する形質転換体を選別する工程；
を含む遺伝子のクローニング方法。
【請求項１０】
工程（Ｃ）を蛍光セルソーター又はマイクロチップセルソーターにより行う、請求項９に記載の遺伝子のクローニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、緑色蛍光蛋白質の遺伝子等のような宿主の選択のための遺伝子を用いたクローニングベクター及びそれを利用したシステムに関する。より詳細には、本発明は、緑色蛍光蛋白質が発する蛍光又は薬剤耐性等のような宿主の選択のための指標を用いてインサートの挿入の有無を簡単に判別することができるクローニングベクター及びそれを利用したシステムに関する。
背景技術
近年、国際ヒトゲノムプロジェクト及びセレーラ社に代表される研究機関において、ゲノムサイズでの大規模シーケンスの需要が世界的に広がっている。さらに今後は疾患遺伝病同定を目的にＳＮＰ（点突然変異多型）解析が盛んになり、それに伴いシーケンスの需要が急速に高まると考えられている。ゲノム（ＤＮＡ）断片のクローン化は、このような配列決定方法においても、また一般的な遺伝子工学においても、極めて重要な基盤技術である。
一般にＤＮＡのクローン化はＤＮＡ断片をベクターに挿入、大腸菌に導入後、プレート上で大腸菌コロニーを作成させて目的断片を持つコロニーを得る。挿入ＤＮＡ配列（インサート）のベクターへの導入の確認は、現在のところ、β−ガラクトシターゼやＧＦＰ遺伝子の挿入失活により判別する方法が報告されている（ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｒ  ｇｒｅｅｎ−ｗｈｉｔｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ３３  １０３−１１９（１９８５）；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００））。しかし、この方法による判別では、インサート配列が導入される遺伝子配列（β−ガラクトシターゼ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子）やその転写開始部位となるプロモーター配列などに有害突然変異が生じることにより、その蛋白質の機能を示さなくなるため、大腸菌コロニーの色や蛍光性を選別基準としてインサートの有無を判別する場合に、判別の効率が低くなるという問題点があった（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００））。また、このような従来法においては、プレート上で大腸菌コロニーを形成させてインサートの有無を判別しなければならないため、機械的システムを採用してハイスループット化する上で極めて難しい制約があった。
発明の開示
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、挿入ＤＮＡ配列（インサート）の導入の有無の判別を効率よく行うことができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、プレート上で形質転換体のコロニーを形成させることなく、インサートの導入の有無を確認することができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、蛍光セルソーター等の装置を使用することによりインサートを有する形質転換体のみを回収して、目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループット化することができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＤＮＡ断片（インサート）が挿入されたベクターを有する形質転換体のみがＧＦＰの蛍光を発することができるクローニングベクターを開発した。また、このクローニングベクターを使用することによりインサートの導入の有無を効率よく判別できることが分かった。またこの方法はクローニングマシンとしての蛍光セルソーター等と組み合わせることで、９６穴マイクロプレートへの直接クローニングを可能にした。その結果、上記クローニングベクターを用いたクローニング操作では、従来のクローニング操作に必要であったプレートを用いたコロニー形成の工程を省くことができ、クローニング操作に要する時間を約１６時間から約３時間へと大幅に短縮することができた。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び宿主の選択のための遺伝子を順番に有するクローニングベクターが提供される。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生合成経路の遺伝子、蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子、又は基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子から選択される遺伝子である。
さらに好ましくは、薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性遺伝子、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子であり、生合成経路の遺伝子は、グルタミン合成遺伝子又はプロリン合成酵素遺伝子であり、蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子は、緑色蛍光蛋白質又はその変異体、又はばさんご由来のＤｓＲｅｄ遺伝子であり、基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子は、β−ガラクトシターゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子である。
特に好ましくは、宿主の選択のための遺伝子は、緑色蛍光蛋白質又はその変異体をコードする遺伝子である。
好ましくは、リボソーム結合配列はＳＤ配列又はコザック配列である。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として、可視光下で蛍光を発する蛍光蛋白質の遺伝子を使用する。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として、野生型緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列において６４番目のアミノ酸がＬｅｕであり、６５番目のアミノ酸がＴｈｒであり、９９番目のアミノ酸がＳｅｒであり、１５３番目のアミノ酸がＴｈｒであり、１６３番目のアミノ酸がＡｌａであり、２０８番目のアミノ酸がＬｅｕであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を使用する。
好ましくは、本発明のクローニングベクターは、さらに複製起点を有する。
好ましくは、本発明のクローニングベクターは、さらに抗生物質耐性遺伝子を有する。
本発明の一例としては、配列番号５に記載の塩基配列を有するクローニングベクターが提供される。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のクローニングベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して得られる、組み換えベクターが提供される。
好ましくは、プロモーター配列はＴ７プロモーター配列である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することを含む、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する方法が提供される。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製した組み換えベクターを用いる。
本発明のさらに別の側面によれば、（Ａ）本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して組み換えベクターを作成する工程；
（Ｂ）得られた組み換えベクターを宿主に形質転換して形質転換体を作成する工程；及び
（Ｃ）得られた形質転換体中に導入されている宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、組み換えベクターを有する形質転換体を選別する工程；
を含む遺伝子のクローニング方法が提供される。
上記のクローニング方法において好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製したクローニングベクターを使用する。また、上記のクローニング方法において好ましくは、工程（Ｃ）を蛍光セルソーター又はマイクロチップセルソーターにより行う。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のクローニングベクターは、５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び宿主の選択のための遺伝子を順番に有することを特徴とする。
宿主の選択のための遺伝子の具体例としては以下のものが挙げられる。
（１）薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性遺伝子、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合、インサートが挿入されたクローンのみ、その薬剤の入っている培地上でコロニーを形成できるために宿主を判別することができる。
（２）生合成経路の遺伝子（例えば、グルタミン合成遺伝子又はプロリン合成酵素遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として生合成経路の遺伝子を使用する場合、形質転換に用いる大腸菌を選ぶことにより（即ち、その合成酵素の欠損株を選ぶ）、インサート有りのクローンはＭ９などの合成培地上でコロニーを形成できる。
（３）蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子（例えば、緑色蛍光蛋白質又はその変異体、又はばさんご由来のＤｓＲｅｄ遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用する場合、クローンの蛍光性の有無によりインサート挿入の有無を確認することができる。
（４）基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子（例えば、β−ガラクトシターゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子を使用する場合、例えばｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇで使用されているｂｅｔａ−ガラクトシターゼとＸ−ｇａｌ、ルシフェラーゼとルシフェリン（＋ＡＴＰ）などの組み合わせを使用することにより、インサート挿入の有無を確認することができる。
本発明においては、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異、体の遺伝子を使用することが好ましく、緑色蛍光蛋白質又はその変異体をコードする遺伝子を使用することが特に好ましい。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、クラゲの１種のエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）（オワンクラゲ）に由来する蛍光タンパク質である。エクオリア・ビクトリアにおいてＧＦＰは、カルシウムにより刺激されたエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）により産生されたエネルギーを吸収し、緑色光を発する。近紫外線または青色光により励起されると、原核細胞および真核細胞中において発現したＧＦＰは、強い緑色蛍光を発光する。
ＧＦＰのアミノ酸配列は公知である（Ｐｒａｃｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，他、（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１１，２２９−２３３）。アミノ酸残基は通常複数のＤＮＡトリプレットによってコードされているので、野生型ＧＦＰ又は変異型ＧＦＰのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は多数存在する。本発明のクローニングベクター中のＧＦＰ遺伝子はこれらのＤＮＡ配列の何れでもよい。本発明では、可視光下で蛍光を発する、又はレーザーによって励起できる各種のタンパク質発光体（例えば、緑色蛍光蛋白質又はその変異体）を使用することが好ましい。
また、本発明では変異体ＧＦＰを用いることができ、特に、緑色蛍光の強度が野生型ＧＦＰよりも高まっている変異体ＧＦＰを用いることが好ましい。そのような変異体ＧＦＰの例としては、野生型ＧＦＰのアミノ酸配列中に１個以上（例えば、１〜数個、具体的には１から３０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。本明細書で緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰとも略記する）という場合には、緑色蛍光性を有する変異体ＧＦＰの全てを包含するものとする。
変異体ＧＦＰ遺伝子を得る方法としては、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの当分野で既知の任意の方法を用いることができる。入手可能なＧＦＰ遺伝子を得て、これを基にして変異体ＧＦＰのＤＮＡを得ることができる。ある遺伝子への変異導入は多くの方法により行うことができる。例えば、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明で用いるのに好適な変異体ＧＦＰの例としては、例えば、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６４，５５６−５６０に記載されているＧＦＰの変異体が挙げられ、具体的にはＧＦＰｕｖ（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）、ＧＦＰｕｖ２（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｓ２０８Ｌ）、ＧＦＰｕｖ３（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ）、およびＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）などどが挙げられる（上記において、括弧内は野生型ＧＦＰに対するアミノ酸変異を示し、例えば、Ｆ９９Ｓは９９番目のアミノ酸がＦからＳに置換されていることを示す）。上記の変異体ＧＦＰの中でも、ＧＦＰｕｖ２（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｓ２０８Ｌ）、ＧＦＰｕｖ３（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ）、およびＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）がより好ましく、ＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）が特に好ましい。
例えば、宿主の選択のための遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用する場合、従来法の場合のようにインサートがＧＦＰ遺伝子に挿入することによりＧＦＰの蛍光を失活させる方法では、ベクター中にインサートが挿入された場合にのみ、ＧＦＰ由来の緑色蛍光が発するようにすることはできない。そこで、本発明者らは、ベクター中に挿入するＤＮＡ配列に注目し、インサート配列の末端にプロモーター配列を付加させることとした。このようなプロモーター配列を末端に有するインサート配列をベクターに挿入した場合、インサート配列の末端のプロモーター配列の下流に存在するＧＦＰ遺伝子が発現することになり、発現したＧＦＰの蛍光を指標とすることにより、インサートのベクターへの挿入の有無を判別することが可能となる。
本発明で用いるリボソーム結合配列は、宿主の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主が大腸菌などの原核細胞の場合にはＳＤ配列を選択することができ、宿主が酵母や動物細胞などの真核細胞の場合にはコザック配列を選択することができる。
本発明のクローニングベクターは、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位を有する。クローニング部位を構成する制限酵素部位の種類は特に限定されず、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ等のような複数の制限酵素部位を含むマルチクローニングサイトでもよい。なお、クローニング部位は、本発明のクローニングベクターの構築の際に出発材料として用いるベクター中に予め存在するものを利用してもよいし、組み換え遺伝子技術を用いてＧＦＰベクター中に導入することもできる。
本発明のクローニングベクターは複製起点を含むことが好ましい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、ｐＢＲ３２２由来の複製起点、宿主が酵母である場合にはＡＲＳなどを選択することができる。
本発明のクローニングベクターは抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ましい。抗生物質耐性遺伝子をベクター中に含めることにより、形質転換操作後の形質転換体を抗生物質含有培地で培養することにより形質転換されていない（ベクターを保持しない）宿主細胞を排除することができる。
抗生物質耐性遺伝子の種類は特に限定されず、例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。
なお、  宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合は、当該薬剤耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ましい。
本発明のクローニングベクターの一例としては以下の実施例で作成したプラスミドｐＧＦＰｃｌｎが挙げられる。ｐＧＦＰｃｌｎでは、ＧＦＰ遺伝子の上流に、ＳＤ配列、マルチクローニングサイトを配置している（ｐＧＦＰｃｌｎの構造の概略を図１に示し、ｐＧＦＰｃｌｎの塩基配列を配列番号５に記載）。
本発明のクローニングベクターは、当業者により適宜製造することができる。例えば、当業者に入手可能なＧＦＰベクターを用いてＧＦＰ遺伝子の上流にクローニング部位とリボソーム結合配列（例えば、ＳＤ配列など）を配置することにより製造することができる。
本発明はさらに、上記したクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して得られる、組み換えベクターにも関する。
インサートへ付加するプロモーター配列はその末端に外側方向へ向くように導入する。即ち、インサートの３’末端にプロモーター配列を付加する場合には、プロモーター配列の５’末端をインサートの３’末端に連結し、インサートの５’末端にプロモーター配列を付加する場合には、プロモーター配列の５’末端をインサートの５’末端に連結すればよい。
プロモーター配列とインサート配列との連結方法は特に限定されないが、例えば、プロモーター配列は以下の方法によりインサート配列に付加できる（図２）。
（１）挿入配列をＰＣＲで増幅する際に、プライマー配列にあらかじめ導入する方法；又は
（２）挿入配列が制限酵素で切断された断片の際には、アダプター配列に導入する方法：
特にＰＣＲによりプロモーター配列を付加する方法では、片方のみに導入することでインサートの挿入方向を決めることができる（図２）。
本発明で用いるプロモーターとしては、宿主細胞中で機能できるものであればいかなるものでもよい。例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ  ｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰ  ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔ１プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
酵母で機能するプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
動物細胞で機能するプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
他の宿主を使用する場合にも、該宿主において機能する調節配列（プロモーター等）を適宜選択することができる。
上記したようにプロモーター配列を付加された目的挿入配列は、本発明のクローニングベクター中に、（Ｉ）マルチクローニング部位内の制限酵素部位、（ＩＩ）Ｔ−拡張ベクター法、（ＩＩＩ）平滑末端法を利用して連結することができる。
本発明はさらに、上記したクローニングベクター又は組み換えベクターを有する形質転換体に関する。即ち、本発明によれば、上記したクローニングベクター又は組み換えベクターを宿主に形質転換して得られる形質転換体が提供される。
本発明で用いる宿主の種類は特に限定されないが、好ましくは、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞または動物細胞から選択される。
細菌細胞、真菌細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等に属する微生物を挙げることができ、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の具体例として、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、同ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、同ＤＨ１、同ＤＨ５α、同ＭＣ１０００、同ＫＹ３２７６、同Ｗ１４８５、同ＪＭ１０９、同ＨＢ１０１、同Ｎｏ４９、同Ｗ３１１０、同ＮＹ４９、同ＭＰ３４７、同ＮＭ５２２などが挙げられる。
酵母細胞としては、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）等が挙げられる。
動物細胞としては、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、並びに様々な脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物の細胞が含まれる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
本発明のクローニングベクター又は組み換えベクターを宿主に導入する方法としては、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などを適宜選択してベクターを宿主に導入することができる。
上記方法により組み換えベクターが導入された形質転換体を用いて、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、該ベクターのクローニング部位にインサートを有しているかどうかを判別することができる。
本明細書で言う「指標」とは、宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合には、その薬剤の入っている培地上でコロニーを形成できるかどうかを言い、宿主の選択のための遺伝子として生合成経路の遺伝子を使用する場合には、合成培地上でコロニーを形成できるかどうかを言い、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用する場合には、クローンの蛍光性の有無を言い、宿主の選択のための遺伝子として基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子を使用する場合には、該基質の存在下で呈する発色、蛍光発光もしくは化学発光の有無を言う。
即ち、本発明によれば、本発明の組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することを含む、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する方法が提供される。本発明の好ましい態様では、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製した組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、該宿主が発する蛍光の有無を判別することにより、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する。
さらに、本発明によれば、
（Ａ）本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して組み換えベクターを作成する工程；
（Ｂ）得られた組み換えベクターを宿主に形質転換して形質転換体を作成する工程；及び
（Ｃ）得られた形質転換体中に導入されている宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、組み換えベクターを有する形質転換体を選別する工程；
を含む遺伝子のクローニング方法が提供される。
上記クローニング方法において、好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製したクローニングベクターを使用し、工程（Ｃ）を蛍光セルソーター又はマイクロチップセルソーターにより行う。
本発明の一例としてＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムの構成図を図３に示す。本発明のＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムおいては、１日で２〜３，０００個のクローンを処理することが可能であり、従来法と比較して処理効率を著しく向上させることができる。
インサートの有無に関わらず、ＧＦＰ遺伝子の発現に関わる配列への有害突然変異を持つクローンは蛍光性を持たない。そのためインサートを持つクローンのみが蛍光発光する本発明の判別方法は、従来法とは異なり、アーティファクト（ここではインサートを持たないクローンが蛍光発光する）が現れにくい。
また蛍光セルソーターの使用により、インサートを持つ蛍光性大腸菌クローンのみを回収することができる。さらに、このような蛍光性の大腸菌一個ずつ９６穴マイクロプレートの各ウェルにソートすることで簡単にそれらをクローン化することができる（直接クローニング）。この方法は従来法のようなプレート上でのコロニー形成にかかる時間を省くことができ、かつ目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループットに行うことができる。
発現ＧＦＰベクターと蛍光セルソーターを用いた遺伝子クローニングについてより具体的に記載する。
先ずシーケンスしたいＤＮＡ配列の片方にＴ７プロモーターをもつプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＧＦＰｃｌｎベクター（以下の実施例に記載）とライゲーションする。ライゲーション産物をＤＨ５α（ＤＥ３）株へトランスフォーメーションする（エレクトロポレーション、ケミカル法のどちらでもよい）。これをＳＯＢ５ｍｌに移し、３７℃で３０分間振とうさせたのち、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加え誘導する。
その後、３７℃で３時間インキュベートした後、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＧＦＰが発現している大腸菌をソートし、９６穴プレートのウエルそれぞれに一つの大腸菌を分注する。この際、アルゴンイオンレーザーを用いて励起し、ＦＩＴＣ用のフィルターを用いて蛍光を測定する。上記したＧＦＰ発現ベクターを選択するためのマイクロチップセルソーターの概念図を図４に示す。大腸菌１個が流れる５０μｍ径の流路に、蛍光検出器を設け、蛍光の強度で挿入の有無を識別する。この結果によって、２つの弁のうちの一方を開閉し、挿入された大腸菌のみを９６穴プレートに分注する。９６穴プレートに分注された大腸菌は、３７℃で１６時間インキュベーションし、ミニプレップ後、シーケンスする。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１３８２１４号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１
方法：
（１）プラスミドベクターの構築
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎは、ｐＧＦＰｇｃｎ４（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  ２６４  ５５６−５６０８（１９９９））を用いて以下の通り作製した。即ち、ｐＧＦＰｇｃｎ４のマルチクローニング部位とＧＦＰ遺伝子の間へＳＤ配列を導入し、ｌａｃプロモーター及びＳＤ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｍＢＩ間を欠失させ、さらにＧＦＰ遺伝子のＮ末端へＴ７ｔａｇを導入することにより作製した。図１にプラスミドｐＧＦＰｃｌｎの構造を示す。プラスミドｐＧＦＰｃｌｎの塩基配列を配列表の配列番号５に示す。
（２）ＰＣＲによりプロモーター配列を付加したインサートのベクターへの挿入  モデル挿入配列として、ＥＹＦＰ遺伝子、及びプライマー間に６０ｂｐのランダムヌクレオチドを持つ１００ｂｐをそれぞれＰＣＲ産物として使用した。
ＥＹＦＰ遺伝子は、ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレート配列とし、ＤＮＡオリゴマー１（５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＮＮＮＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１））及びＤＮＡオリゴマー２（５’−ＴＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号２））をプライマー（下線は制限酵素部位を示す。ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの何れかの塩基を示す）として用いて、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ、下記方法１及び２にの場合）またはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ、下記方法３の場合）を用いてＰＣＲを行うことにより作製した。なお、配列番号１の中の１３番目から３０番目のＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡはＴ７プロモーター配列を示す。
ランダム配列を持つ１００ｂｐはＥｌｉらの方法により得た（Ｅｌｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５  ７９０−７９４（１９９９））。
インサートのベクターへの挿入は以下の３通りで行った。
１．制限酵素部位を利用した場合
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎ及び上記ＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、それぞれアガロース電気泳動による分離をしてＤＮＡを抽出した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。
２．平滑末端法
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎをＳｍａＩで切断、大腸菌由来のアルカリホスファターゼ処理後、上記ＰＣＲ産物と連結した。
３．Ｔ−拡張ベクター法
Ｔ−拡張ベクターの作成は平滑末端に切断する制限酵素をＳｍａＩとした以外は、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００）と同様の方法で行った。
ＰＣＲ法を用いたプロモーター配列のインサートへの付加方法を図２の上段に示す。
（３）形質転換及びインサート有無の確認
上記（２）で作製した連結産物を、ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、またはλＤＥ３  Ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して作成した大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株に形質転換し、７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢプレートへまき、３７℃で１８時間インキュベートした。コロニーの蛍光性の有無は自然光下で判定した。自然光照射における蛍光性及び非蛍光性大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を図５に示す。
蛍光性クローンのインサート有無の確認は、マルチクローニング部位を挟むオリゴマー５（５’−ＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧＡＣＡ−３’（配列番号３））及びオリゴマー６（５’−ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＡＴ−３’（配列番号４））をプライマーとしたコロニーＰＣＲ法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００））、並びにミニプレップ法によるプラスミドを抽出し、制限酵素処理によりインサートを回収することにより行った。得られた断片は１％または１．５％アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で確認した。インサート配列決定はＤＮＡシーケンサー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０，ＡＢＩ）により行った。
（４）蛍光セルソーターを用いた直接クローニングの確認
上記した平滑末端法により作成したＥＹＦＰ導入プラスミド１００ｎｇとプラスミドｐＧＦＰｃｌｎ  １００ｎｇを混合し、ＤＨ５ａｌｐｈａ（ＤＥ３）株へケミカル法にてトランスフォーメーションした。７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地を加え、３７℃にて１６時間、振蕩培養を行った。サンプルはＰＢＳで希釈後、蛍光セルソーター（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。Ａｒイオンレーザーは波長４８８ｎｍを使用し、蛍光フィルターはＦｉＴＣ用のものを使用した。蛍光性大腸菌のソーティング方法はベクトンディキンソん社のマニュアルに従った。９６穴プレートへのソーティング条件は一個／ウェルで行った。９６穴プレートの各ウェルの蛍光性の有無はイメージアナライザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により評価した。
結果及び考察：
（１）プラスミドベクターについて
ベクター内のインサートの有無は大腸菌のＧＦＰの蛍光性の有無により判断する。そこで、本実施例では、蛍光性の有無の判断を行いやすくするために、大腸菌内でのＧＦＰの蛍光強度が高いＧＦＰｕｖ４（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  ２６４  ５５６−５６０８（１９９９））を利用した。今回はＮ末端のマルチクローニングサイトを持つＬａｃＺ由来の２４アミノ酸に代わりＴ７  ｔａｇ配列（ＮＨ２−ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＡ−ＣＯＯＨ）を使用した。インサートに導入するプロモーター配列は、その配列長が短くかつプロモーター強度の高いＴ７プロモーター配列（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６  １２５−１３５（１９８７））を用いた。作成したクローニングベクターをキャリブレーションするため、ＥＹＦＰ遺伝子をモデル挿入配列として、ＰＣＲ法によりプロモーターをそれに付加し、（Ｉ）マルチクローニング部位内の制限酵素部位（今回はＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩを使用した。）、（ＩＩ）Ｔ−拡張ベクター法、（ＩＩＩ）平滑末端法により、クローニングベクターと連結、そして大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）株に形質転換した。
（２）コロニーの蛍光性について
インサートの連結産物を形質転換した大腸菌コロニーを図５に示す。ＧＦＰｕｖ４のＴ拡張ベクターを用いた方法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００））と同様に、緑色蛍光性及び非蛍光性の２種類のコロニーが現れた。それぞれは自然光照射でさえ簡単に区別することができた。また蛍光性コロニーのＰＢＳ懸濁液の蛍光スペクトルはＧＦＰの形のみを示し、ＥＹＦＰ由来のピークは現れなかった。このことは緑色蛍光コロニーの蛍光性は大腸菌内のＧＦＰの発現によるものであることを示す。プラスミドｐＧＦＰｃｌｎを形質転換した大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＪＭ１０９（ＤＥ３）株のコロニーは緑色蛍光を示さなかった。
本来大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＪＭ１０９（ＤＥ３）株ではＩＰＴＧによりＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは発現を誘導されるべきであるが、微量に発現することが知られている。しかしＩＰＴＧ無添加条件下にもかかわらず、肉眼で大腸菌コロニーの蛍光性の有無を区別できた。また、液体培地を用いた培養後の結果もコロニーと同様に、ＩＰＴＧ無添加条件でも蛍光性の有無が確認できた。
（３）蛍光性クローンのインサート確認について
得られた蛍光性クローンとインサート配列の有無との関係を確認した。ランダムに選んだ各インサート導入方法により得られた蛍光性の形質転換クローンの各４８個はすべてインサートを持っていた。
Ｔ−拡張ベクター法及び平滑末端法により連結されたインサートの挿入方向は２種類存在し、その確率は１／２であると期待される。ランダムに選んだクローン１６個を配列決定したインサートはすべて同方向であった。以上の結果より、本システムではインサートを方向づけてベクターに導入することが示された。
（４）挿入失活による従来法との判別効率の比較
従来の挿入失活によるシステムと本システムとの判別効率を比較した。ランダム配列を含む１００ｂｐをテスト配列として使用し、Ｔ−拡張ベクター法により形質転換産物を得た。ＥＹＦＰ遺伝子を導入した際と同様に、蛍光性及び非蛍光性の２種類の大腸菌クローンが得られた。ランダムにサンプリングした１１０個の蛍光性クローンはすべてインサートを持っていた（図６）。同様の実験をＧＦＰ遺伝子の挿入失活により判別した報告では判別効率は９４％であった（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｅ  ２４５  ５９−６３（２０００））。このことは本システムの非常に高い判別効率を持つことを示している。
（５）蛍光セルソーターを用いた直接クローン化について
蛍光性及び非蛍光性大腸菌の混合集団より、蛍光性クローンを９６穴プレートへ一個／ウェルの条件でソートした。ソートした大腸菌がクローンであることを確認するため、各ウェル上にて７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地を作成し、使用した。蛍光性クローンのみを９６穴プレートへソートした結果、５ウェルに各一個ずつ蛍光性コロニーが現れた（図７）。また、そのコロニーの形は、それらがクローンであることを示した。
実施例２：発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘ
方法
（１）プラスミドの構築
発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘはｐＧＦＰｇｃｎ４（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  ２６４，５５６−５６０８（１９９９））の（１）ＧＦＰ遺伝子上流へのマルチクローニング部位とＳＤ配列の導入、（２）ｌａｃプロモーター及びＳＤ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ間へプラスミドｐＢＡＤ２２由来のＡｒａＣ遺伝子及びＰＢＡＤプロモーター配列の導入、（３）ＧＦＰ遺伝子のＮ末端へＴ７ｔａｇ配列、Ｃ末端へ分解用タグ配列（ＮＨ２−ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡ−ＣＯＯＨ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６４，２２４０−２２４６（１９９８））の導入、により作成した（図８）。
（２）挿入したＥＹＦＰ遺伝子の発現
ＥＹＦＰ遺伝子を含むＰＣＲ産物はｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレート配列に、オリゴマー（配列番号１および配列番号７）をプライマーに、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ法により得た。プラスミドｐＧＦＰＥｘ及びＥＹＦＰ遺伝子のＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、それぞれをアガロース電気泳動による分離そしてＤＮＡ抽出後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。この連結産物を大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ形質転換、７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢプレートへまき、３７℃で１８時間インキュベートした。
緑色コロニーを７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地で３７℃培養した。６６０ｎｍでの濁度が０．３の時、アラビノース（最終濃度０．２％）またはＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を加え、さらに２時間培養した。
培養液をＰＢＳにより置換、６６０ｎｍでの濁度を０．１へ希釈後、励起波長４８８ｎｍにより、蛍光波長４５０−６００ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した（Ｆ２０００，ＨＩＴＡＣＨＩ）。
オリゴマー配列；イタリック太文字はＳＤ配列、開始コドン部位（ＡＴＧ）を示す。
0004300031.tif 000002
結果及び考察；
（１）クローニング・発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘに関して
挿入する遺伝子の蛋白質発現を行うため、マルチクローニングサイトの上流にプロモーター配列を導入した。今回は大腸菌内での挿入遺伝子の発現を確認するため、転写調節をコントロールできるＰＢＡＤプロモーター配列（Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，４１２１−４１３０（１９９５））を使用した。
ＧＦＰは一度フォールディングすると、大腸菌内においても、安定に存在することが知られている。しかし本発現ベクターによる緑白スクリーニング後は、大腸菌内にＧＦＰがない方が望ましい。そこで発現したＧＦＰの分解を促進するため、ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｔａｇ配列をＧＦＰのＣ末端に導入した。
（２）プラスミドｐＧＦＰＥｘを用いたＥＹＦＰ遺伝子のクローニングとその発現
ＥＹＦＰ遺伝子をオリゴマー（配列番号１及び配列番号７）を用いてＰＣＲを行い、インサートとした。このインサートにはＨｉｎｄＩＩＩ認識部位方向（翻訳開始コドンの上流）にＳＤ配列、Ｋｐｎｌ認識部位にＴ７プロモーター配列を有している（図９）。このインサートを用いてｐＧＦＰＥｘベクターに導入し、大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。
プラミスドｐＧＦＰｃｌｎを用いたシステムと同様に、インサートの連結産物を形質転換した大腸菌コロニーは蛍光、非蛍光の２種類であった。またその蛍光発光した大腸菌２３クローンを無作為に選び、コロニーＰＣＲ法によりインサートの有無を確認した。その結果、選んだすべての蛍光性クローンはインサートを有していた。また上記とは別に無作為に選んだ８クローンの塩基配列解析結果は、すべてのクローンに関してインサートは同一方向、すなわち構築通りにＰＢＡＤプロモーターの下流にＳＤ配列そして翻訳開始コドンがみられたことを示した。
これらのクローンを、７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地による液体培養を行い、６６０ｎｍにおける濁度が０．３の時にＩＰＴＧまたはアラビノースを添加し（それぞれ最終濃度０．１ｍＭ，０．２％）、さらに２時間蛋白質を誘導発現した。またコントロール実験として、誘導なしの条件でも行った。それらの培養液をＰＢＳで置換後、励起波長４８８ｎｍにおける蛍光スペクトルを測定した結果を図に示す。ＩＰＴＧ誘導した場合はＧＦＰ特有の５１０ｎｍのみにピークがみられ、アラビノース誘導した場合はＹＦＰ特有の５２６ｎｍのみにピークがみられた。また誘導なし条件ではＧＦＰ、ＹＦＰのどちらのピークも示さなかった（図１０）。
以上の結果は、プラスミドｐＧＦＰＥｘに挿入したＥＹＦＰ遺伝子が上流のＰＢＡＤプロモーターにより誘導発現されたことを示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、挿入ＤＮＡ配列（インサート）の導入の有無の判別を効率よく行うことができるクローニングベクターを提供することが可能になった。本発明のクローニングベクターは、プレート上で形質転換体のコロニーを形成させることなく、インサートの導入の有無を確認することができ、また蛍光セルソーター等の装置を使用することによりインサートを有する形質転換体のみを回収して、目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループット化することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドｐＧＦＰｃｌｎの構造を示す。
図２は、プロモーター配列のインサートへの付加方法を示す。上図はＰＣＲ法を示し、下図はアダプター法を示す。
図３は、ＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムを示す。
図４は、ＧＦＰ発現ベクターを選択するためのマイクロチップセルソーターの概念図を示す。大腸菌１個が流れる５０μｍ径の流路に、蛍光検出器を設け蛍光の強度で挿入の有無を識別する。この結果によって、２つの弁のうち一方を開閉し、挿入された大腸菌のみを９６穴プレートに分注する。
図５は、自然光照射における蛍光性及び非蛍光性大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を示す。大腸菌は、Ｔ７プロモーターを付加したＥＹＦＰのＰＣＲ産物をＴ拡張ベクター法によりライゲーションした形質転換産物である。アンピシリンを添加したＬＢプレートを３７℃１８時間培養した。左の矢印はＤＮＡが挿入されたベクターをもつ大腸菌コロニーを示し、右の矢印はＤＮＡが挿入されていないベクターをもつ大腸菌コロニーを示す。
図６は、蛍光コロニーをコロニーＰＣＲしてインサートを確認した結果を示す。
図７は、セルソーターによってＧＦＰ発現大腸菌が選択されたことを示す。矢印はＬＢ寒天培地を加えた９６穴プレート内にセルソーター（ＦＡＣＳ）で選択されたＧＦＰ発現コロニーを示す。選択されたコロニーは全てＧＦＰが発現している（インサートＤＮＡが挿入されている）。
図８はプラスミドｐＧＦＰＥｘの構造を示す。
図９は、ＥＹＦＰ遺伝子を含むインサート配列の構造を示す。
図１０は、ＥＹＦＰ遺伝子を挿入したｐＧＦＰＥｘベクターを持つ大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株の４８８ｎｍ励起での蛍光スペクトルを示す。ＩＰＴＧ誘導ではＧＦＰのピークが、アラビノース誘導ではＥＹＦＰのピークがそれぞれ見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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