(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、
（a）図1-1から1-5（配列認識番号2）に示されるアミノ酸配列を含むヒトY4受容体蛋白質をコードする核酸分子；または
（b）（a）のヒトY4受容体蛋白質と同じ結合特性を有し且つ前記アミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、
（a）図3-1から3-4（配列認識番号28）に示されるアミノ酸配列を含むラットY4受容体蛋白質をコードする核酸分子；または
（b）（a）のラットY4受容体蛋白質と同じ結合特性を有し且つ前記アミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である、請求項1または2に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記DNA分子がcDNA分子である、請求項3に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記DNA分子がゲノムDNA分子である、請求項3に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ヒトY4受容体が、図1-1から1-5（配列認識番号2）に示されたアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、プラスミドpcEXV-Y4（ATCC受入れ番号75631）に含まれる、請求項1に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記ラットY4受容体が、図3-1から3-4（配列認識番号28）に示されたアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、プラスミドpcEXV-rY4（ATCC受入れ番号75984）に含まれる、請求項2に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項1〜5の何れか一項に記載の核酸分子によりコードされる、精製されたY4受容体蛋白質。
【請求項１１】
請求項1〜9の何れか一項に記載の核酸分子を備えたベクタ。
【請求項１２】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、前記細胞内で核酸を発現するのに必要な制御配列を備え、該制御配列が、Y4受容体をコードするDNAに対してその発現が可能なように機能可能に連結されている、請求項11に記載のベクタ。
【請求項１３】
前記ベクタがバキュロウイルスである、請求項12に記載のベクタ。
【請求項１４】
前記ベクタがプラスミドである、請求項12に記載のベクタ。
【請求項１５】
pcEXV-Y4と命名された、請求項14に記載のベクタ（ATCC受入れ番号75631）。
【請求項１６】
pcEXV-rY4と命名された、請求項14に記載のベクタ（ATCC受入れ番号75984）。
【請求項１７】
請求項13又は14のベクタを備えた哺乳類細胞。
【請求項１８】
前記細胞が神経以外の細胞由来である、請求項17に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞がCOS-7細胞またはLM（tk-）細胞である、請求項17に記載の細胞。
【請求項２０】
L-hY4-3と命名された、請求項19に記載の細胞（ATCC受入れ番号CRL 11779）。
【請求項２１】
前記細胞がNIH-3T3細胞である、請求項17に記載の細胞。
【請求項２２】
N-hY4-5と命名された、請求項21に記載の細胞（ATCC受入れ番号CRL 11778）。
【請求項２３】
請求項1の核酸分子によりコードされるヒトY4受容体または請求項2に記載の核酸分子によりコードされるラットY4受容体に結合する抗体。
【請求項２４】
請求項23に記載の抗体の、請求項1の核酸分子によりコードされるヒトY4受容体または請求項2の核酸分子によりコードされるラットY4受容体への結合を競合して阻止する抗体。
【請求項２５】
リガンドがヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、または該細胞の膜分画を、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させることと、係るリガンドの係る受容体への結合親和性を測定するための結合アッセイを用いて該受容体に特異的に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リガンドがヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合するかどうかを決定することとを備えた方法。
【請求項２６】
前記リガンドが、存在すること又は前記Y4受容体に結合することが既知ではない、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
リガンドがヒトまたはラットのY4受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャアッセイによってY4受容体活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがヒトまたはラットのY4受容体作用薬であるか否かを決定することとを備えた方法。
【請求項２８】
リガンドがヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で、既知のヒトまたはラットのY4受容体作用薬の存在下で、前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャアッセイによりY4受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬であるか否かを決定することとを備えた方法。
【請求項２９】
前記セカンドメッセンジャアッセイが、細胞内cAMPまたは細胞内のカルシウム動員を測定することを備えた、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項25〜29の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
神経起源でない前記哺乳類細胞が、COS-7細胞、CHO細胞、LM（tk-）細胞、またはNIH-3T3細胞である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
細胞表面上のヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、または該細胞の膜分画を、化合物が前記Y4受容体に結合する条件下で複数の化合物と接触させることと、係る化学的化合物の係る受容体への結合親和性を測定するための結合アッセイを用いて該形質転換細胞に特異的に結合する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合する候補の薬剤を同定することとを備えた方法。
【請求項３４】
ヒトまたはラットのY4受容体の作用薬として機能する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で、複数の化合物と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイによって該受容体を活性化する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体作用薬として機能する候補の薬剤を同定することとを備えた方法。
【請求項３５】
ヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬として機能する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で、既知のヒトまたはラットのY4受容体作用薬の存在下で、複数の化合物と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイにより前記受容体の活性化を阻害する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬として機能する候補の薬剤を同定することとを備えた方法。
【請求項３６】
前記セカンドメッセンジャアッセイが、細胞内cAMPまたは細胞内のカルシウム動員を測定することを備えた、請求項34又は35に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項33〜36の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞が神経起源でない、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
神経起源でない前記哺乳類細胞が、COS-7細胞、CHO細胞、LM（tk-）細胞、またはNIH-3T3細胞である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
細胞表面上のヒトまたはラットのY4受容体の存在を検出する方法であって、前記細胞を、請求項23に記載の抗体の前記受容体への結合を許容する条件下で、該抗体に接触させることと、前記細胞へ結合した前記抗体の存在を検出し、それによって前記細胞表面上のヒトまたはラットのY4受容体の存在を検出することとを備えた方法。
【請求項４１】
精製された請求項10に記載のヒトまたはラットのY4受容体を調製する方法であって、
a）細胞内での発現に適用されるベクタを構築するステップであって、該ベクタはヒトまたはラットのY4受容体を発現するように、該受容体をコードしている核酸に対して機能可能なように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選ばれる、ベクタ構築ステップと、
b）ステップaのベクタを適切な宿主細胞へ導入するステップと、
c）ステップbの細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体の発現を許容する条件下でインキュベーションするステップと、
d）上記のように発現された受容体を回収するステップと、
e）上記のようにして回収された受容体を精製することにより、ヒトまたはラットのY4受容体を調製するステップとを備えた方法。
【請求項４２】
ヒトまたはラットのY4受容体と特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、（a）請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を細胞表面上に発現している、神経起源でない細胞を又は（b）その細胞抽出液からの膜画分を、前記化学的化合物と結合に適切な条件下で接触させることと、前記化学的化合物と前記ヒトまたはラットのY4受容体との特異的な結合を検出することとを備えた方法。
【請求項４３】
ヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するために競合的結合が関与する方法であって、（a）請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を細胞表面上に発現している、神経起源でない細胞を又は（b）その細胞抽出液からの膜画分を、前記化学的化合物および前記Y4受容体と結合することが知られている第2の化学的化合物の両方と、および前記第2の化学的化合物のみと、両方の化学的化合物の結合に適切な条件下で接触させることと、係る化学的化合物の係る受容体への結合親和性を測定するための結合アッセイを用いて前記Y4受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、前記Y4受容体への前記第2の化学的化合物の結合親和性が前記化学的化合物の存在下で減少することによって、前記化学的化合物が前記ヒトまたはラットのY4受容体と特異的に結合することが示される方法。
【請求項４４】
化学的化合物が、ヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合し、活性化するか否かを決定する方法であって、（a）請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を細胞表面上に発現し、セカンドメッセンジャ応答を産生する神経起源でない細胞を、前記化学的化合物と、前記Y4受容体の活性化に適切な条件下で接触させることと、前記セカンドメッセンジャ応答を、前記化学的化合物の存在下および非存在下で測定することとを備え、前記化学的化合物の存在下で前記セカンドメッセンジャ応答が変化することによって、前記化学的化合物が前記ヒトまたはラットのY4受容体を活性化することが示される方法。
【請求項４５】
化学的化合物が、ヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合し、活性化を阻害するか否かを決定する方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を細胞表面上に発現し、セカンドメッセンジャ応答を産生する神経起源でない細胞を、前記化学的化合物および前記Y4受容体を活性化することが知られている第2の化学的化合物の両方と、および前記第2の化学的化合物のみと、前記Y4受容体の活性化に適切な条件下で、別々に接触させることと、前記セカンドメッセンジャ応答を、前記第2の化学的化合物のみの存在下で及び前記第2の化学的化合物および前記化学的化合物の両方の存在下で測定することとを備え、前記化学的化合物および前記第2の化学的化合物の両方の存在下における前記セカンドメッセンジャ応答が、前記第2の化学的化合物のみの存在下よりも少なく変化することによって、前記化学的化合物が前記ヒトまたはラットのY4受容体の活性化を阻害することが示される方法。
【請求項４６】
前記セカンドメッセンジャ応答がアデニレート・シクラーゼ活性を含み、セカンドメッセンジャ応答における前記変化がアデニレート・シクラーゼ活性の減少である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記セカンドメッセンジャ応答がアデニレート・シクラーゼ活性を含み、セカンドメッセンジャ応答における前記変化が、前記化学的化合物および前記第2の化学的化合物の両方の存在下におけるアデニレート・シクラーゼ活性のレベルの減少が前記第2の化学的化合物のみの存在下における減少よりも少ない減少である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記セカンドメッセンジャ応答が細胞内のカルシウムレベルを含み、セカンドメッセンジャ応答における前記変化が細胞内のカルシウムレベルの増加である、請求項45に記載の方法。
【請求項４９】
前記セカンドメッセンジャ応答が細胞内のカルシウムレベルを含み、セカンドメッセンジャ応答における前記変化が、前記化学的化合物および前記第2の化学的化合物の両方の存在下における細胞内のカルシウムのレベルの増加が前記第2の化学的化合物のみの存在下における増加よりも少ない増加である、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
前記神経起源でない細胞が哺乳類細胞である、請求項43〜50の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記哺乳類細胞が、COS-7細胞、CHO細胞、LM（tk-）細胞、またはNIH-3T3細胞である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
薬学的組成物を生産する方法であって：
（a）細胞表面上のヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、または該細胞の膜分画を、化合物が前記ヒトまたはラットのY4受容体に結合する条件下で複数の化合物と接触させることと、係る化合物の係る受容体への結合親和性を測定するための結合アッセイを用いて該形質転換細胞に特異的に結合する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体に特異的に結合する候補の薬剤を同定することとを備えた方法を実行することと；および
（b）（a）で同定された候補の薬剤を薬学的に許容される担体と混合することとを備えた方法。
【請求項５３】
薬学的組成物を生産する方法であって：
（a）ヒトまたはラットのY4受容体の作用薬として機能する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で、複数の化合物と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイによって該受容体を活性化する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体作用薬として機能する候補の薬剤を同定することとを備えた方法を実行することと；および
（b）（a）で同定された候補の薬剤を薬学的に許容される担体と混合することとを備えた方法。
【請求項５４】
薬学的組成物を生産する方法であって：
（a）ヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬として機能する候補の薬剤を同定するために化学的化合物をスクリーニングする方法であって、請求項1のヒトY4受容体または請求項2のラットY4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している複数の細胞を、ヒトまたはラットのY4受容体を活性化させる条件下で、既知のヒトまたはラットのY4受容体作用薬の存在下で、複数の化合物と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイにより前記受容体の活性化を阻害する化合物を決定し、それによってヒトまたはラットのY4受容体拮抗薬として機能する候補の薬剤を同定することとを備えた方法を実行することと；および
（b）（a）で同定された候補の薬剤を薬学的に許容される担体と混合することとを備えた方法。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
本願明細書の全体を通して、括弧のなかに著者と発行年とを記載することにより種々の刊行物を引用する。これらの引用文献は、請求の範囲の直前の、明細書の末尾に記述する。これらの刊行物の開示は、本発明に関わる技術をより完全に記載するために、参照として本明細書に組み込まれる。
神経ペプチドは、ペプチド性ニューロン及び内分泌／傍分泌細胞が合成する、大型の前駆体蛋白質由来の小型ペプチドである。神経ペプチドは神経学的、精神医学的、及び内分泌的疾患の治療に対して有望である（De Wied,1990）。当該前駆体は、数種の生物学的活性をもつペプチドをもつことがよくある。脳内の神経ペプチドには非常に大きな多様性があるが、これは遺伝子の初期転写物の二者択一的（alternative）スプライシング及び、前駆体の異なるプロセッシングによって生じるものである。神経ペプチド受容体はリガンド間の違いを区別したり、適当なシグナルを活性化するのに役立っている。それゆえに、神経ペプチド受容体は多くの種類からなっていることが期待される。
神経ペプチドY（NPY）は、36アミノ酸からなるペプチドで、哺乳類の脳内で同定される最も多い神経ペプチドである。NPYは中枢神経系及び末梢神経系における重要な制御因子であり（Henigら、1990）、精神運動活性、食餌摂取、中枢内分泌物、循環系における血管作動性を含む、非常に広い範囲で、生理学的要因に影響を与える環状動脈、大脳、及び腎臓の血管系に通じた交感神経には、NPYが高濃度で存在し、血管狭窄を引き起こす。脾臓（Lundbergら、1988）、腸膜、脳（Hinsonら、1988）、大動脈平滑筋（Miharaら、1989）、腎臓、睾丸、及び胎盤（Dumontら、1992）といった種々の組織において、NPYの結合部位が同定されている。更に、結合部位は数多くのラットやヒトの細胞株においても報告されている（例えば、SK-N-MC、MC-IXC、CHP-212、及びPC12細胞中のY1；SK-N-Be（2）、CHP-234、及びSMS-MSN細胞中のY2）（Aakerlundら、1990；Grundemarら、1993）。
36アミノ酸からなり、PP-折畳みとよばれる三次構造（Gloverら、1985）をとる膵臓ポリペプチド（PP）及びペプチドYY（PYY）とともに、NPYは、（膵臓ポリペプチドファミリとよばれる）ファミリを形成する。このファミリに特異的な特徴としては、アミノ酸残基1から8までのポリプロリンヘリックス、9から14までのベータ-ターン、15から30までのアルファ-ヘリックス、30から36までの外側に突き出したC末端、及び生物学的活性に重要なカルボキシ末端アミド（Schwartzら、1990）がある。上記ペプチドのC末端のアミド化された残基は、生物学的活性にとって必須である（Wahlestedtら1986）。NPYの断片ペプチドの研究により、多種のNPY受容体サブタイプが存在することが示された（Wahlstedtら、1986）。3つの主要なNPY受容体サブタイプ（Y1、Y2、Y3）が、食餌行動を制御するとされている第四の「非典型的」Y1受容体とともに薬理学的基準により同定された。現在までにクローニングされたNPY受容体は、Y1受容体遺伝子のみであり、マウス（Evaら、1992）、ラット（Evaら、1990）、ヒト（Larhammarら、1992）から得られている。Y1とY2とを区別する重要な薬理学的特徴は、Y1受容体は31番目と34番目の残基とが修飾されたNPYのアナログ（［Leu31,Pro34］NPY）に応答するが（Y2受容体はそうではない）、一方Y2受容体は、NPYペプチドのカルボキシ末端であるNPY-（13-36）に対して高い親和性がある（Y1にはない）（Wahlstedtら、1986；Fuhlendroffら、1990）という事実である。
構造的に関連した他の二つのペプチドである、ペプチドYY（PYY）及び膵臓ポリペプチド（PP）、に対する受容体遺伝子もまた、クローニングされていない。ペプチドYYは主に下部消化器管の内分泌細胞内で存在する（Bottcherら、1984）。当初、PYY受容体は、ラットの小腸で発見された（Laburtheら、1986）。この受容体はPYY-優先性であるが、これはNPYに対する親和性よりもPYYに対するしんわせいの方が、5から10倍も高いためである（Laburtheら、1986；Laburthe、1990）。最近、腎臓の近位尿細管由来の細胞株、PKSV-PCTが、PYY受容体を発現することが報告されている（Voisinら、1993）。膵臓ポリペプチドは主に、膵臓ランゲルハンス島の内分泌細胞に存在している（Alumetsら、1978）。PPは膵臓の外分泌及び、胆嚢の収縮を阻止する（Schwartzら、1983）。興味深いことに、PPは中枢神経系における合成も中枢神経系への移行もおきないらしいが（Di Maggioら、1985）、選択的PPの結合部位が、postrema領域及び近傍の核、血液脳関門の透過領域（Whitcombら、1990）の様な、脳内の種々の領域に見いだされている。PP受容体の親和性は、NPY又はPYYに対するよりも、PPに対する方がずっと高い（Inuiら、1990）。PPは、褐色細胞腫株であるPC12の結合部に高親和性で結合することが示された（Schwaltzら、1987）。NPY及び関連ペプチドに対する、薬学的に定義された受容体への親和性度の比較を表1に示してある。
新規のNPY受容体遺伝子をクローニングするための相同性スクリーニングを用いた、Y4と名付けた新規のNPY/PYY/PP受容体の分離同定について記述する。他のNPY-関連受容体に比較して、Y4受容体は、独特の薬理学的特徴をもっていて、膵臓ポリペプチド自体に対する最も高い親和性を有する。この受容体クローンにより、更にこの受容体の多様性の可能性を調べたり、この受容体ファミリの多様なサブタイプの存在を調べたりすることが可能になる。そしてこれらの知見は、記憶喪失、鬱病、不安、てんかん、痛み、高血圧、運動障害、サーカディアン・リズム障害、食事/体重障害、性/生殖器障害、鼻詰まり、下痢、消化器系及び循環器系障害といった、種々の病理生理学的状態のための薬剤設計にとって価値のある道具として役立つことができるであろう。
［発明の概要］
この発明は、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。
この発明はまた、Y4受容体である単離された蛋白質を提供する。
この発明は、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を備えたベクタを提供する。
この発明はまた、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を備えた、細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、又は哺乳類細胞内での発現に適用される、プラスミド及びバキュロウイルスの様なベクタであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細胞内で発現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y4受容体をコードする核酸に対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。
この発明は、Y4受容体をコードする核酸を備えた哺乳類細胞を提供する。
この発明は、リガンドがY4受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させることと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リガンドがY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、リガンドがY4受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該細胞からのY4受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY4受容体活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY4受容体作用薬であるかを決定することとを備えた方法を提供する。
この発明は更に、リガンドがY4受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化させる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによりY4受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY4受容体拮抗薬であるか否かを決定することを備えた方法を提供する。
この発明は更に、Y4受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、複数の薬剤と接触させることと、該細胞に結合する薬剤を決定し、それによって該受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって前記細胞中の受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY4受容体作用薬を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の拮抗薬を同定するスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化する条件下で、既知のヒトY4受容体作用薬の存在下で複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイにより、細胞内で受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、それによってY4受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明は、核酸プローブであって、Y4受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの長さの核酸分子を備えた核酸プローブを提供する。
この発明はまた、Y4受容体をコードするmRNAを検出して細胞表面にあるY4受容体の発現を検出する方法であって、細胞より全mRNAを分離し、得られた該mRNAを、Y4受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイゼーションすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子を含んだ核酸プローブに、ハイブリダイゼーション条件下で接触させることと、該プローブにハイブリダイゼーションしたmRNAの存在を検出し、それによって該細胞のY4受容体発現を検出することを備えた方法を提供する。
この発明は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドであって、Y4受容体をコードするmRNAと特異的にハイブリダイゼーションし、該mRNAの翻訳を阻止するような配列を有するアンチセンスのオリゴヌクレオチドを提供する。
この発明は、Y4受容体に対する抗体を提供する。
この発明は、Y4受容体をコードする核酸を発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。この発明は更に、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムがY4受容体をコードしたDNAに対して相補的なアンチセンスDNAを備えており、該アンチセンスDNAは、Y4受容体をコードしたmRNAに対して相補的で且つ該受容体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションすることによりその翻訳を減少させるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置されている、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を提供する。
この発明は、Y4受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、Y4受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、Y4受容体の発現レベルが変化するような、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作り出すことを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、それぞれが異なる量のY4受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを作り出すことを備えた方法を提供する。
この発明は、ヒトY4受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素質を診断する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する：
a）疾患をもつ患者より核酸を取得すること；
b）一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素による消化を行うこと；
c）前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に分離すること；
d）電気泳動の終了したゲルを、Y4受容体と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触させること；
e）Y4受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可能な標識でラベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDNAに特異的なバンドパターンを作成すること；
f）上記ステップa-eの方法による診断用に得た核酸を調製すること；
g）ステップeの、前記疾患にかかった患者の核酸に特異的なバンドパターンを、ステップfで、診断用に得た核酸についてのパターンと比較して、両パターンが同じか異なるかを決定し、その結果同じであれば疾患の疾病素質ありと診断すること。
この発明は、単離精製されたY4受容体を調製する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する：
a）細胞内での発現に適用されるベクタを構築するステップであって、該ベクタはY4受容体を発現するように、該受容体をコードしている核酸に対して機能可能なように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選ばれる、ベクタ構築ステップ；
b）ステップaのベクタを適切な宿主細胞へ導入するステップ；
c）ステップbの細胞を、Y4受容体の発現を許容する条件下でインキュベーションするステップ；
d）上記のように発現された受容体を回収するステップ；
e）上記のようにして回収された受容体を精製することにより、単離精製Y4受容体を調製するステップ。
この発明はまた、単離したY4受容体を調製する方法であって、Y4受容体をコードした核酸を適当なベクタに導入すること、導入済み該ベクタを適当な宿主へ導入することと、導入された該細胞で合成された受容体を回収することと、該回収受容体を精製することとを備えた方法を提供する。
この発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドであって、Y4受容体をコードしたmRNAのいかなる配列にも特異的に結合して、Y4受容体をコードしたmRNA分子の翻訳を阻止することができる配列を備えた、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。
この発明はまた、ヒトY4受容体をコードしたDNAを発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。
この発明は更に、相同組み換えによるY4受容体のノックアウトを含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。
この発明は更に、受容体の発現量を変化させることの生理学的な影響を決定する方法であって、受容体の発現を制御する誘導性プロモータの使用により、ヒトY4受容体の発現レベルが変化するような、ヒト以外のトランスジェニック動物を作成することを備えた方法を提供する。
この発明はまた、ヒトY4受容体を異なったレベルで発現することの生理学的影響を決定する方法であって、それぞれが異なる量の該受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物のパネルを作成することを備えた方法を提供する。
この発明は更に、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムがヒトY4受容体をコードしたDNAに対して相補的なアンチセンスDNAを備え、該アンチセンスDNAがY4受容体をコードしたmRNAに対して相補的で、且つ該受容体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションすることによりその翻訳を阻止させるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置されている、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。
この発明は、Y4受容体に結合できることが知られていないリガンドが、該受容体に結合するか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードしている単離DNA分子を備えた哺乳類細胞及び前記リガンドを、前記受容体に結合することが分かっているリガンドを結合させる条件下で接触させて、Y4受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって該リガンドがY4受容体に結合するかを決定することを備えた方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図1
新規なヒトhp25a神経ペプチド受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列（配列認識番号1及び2）。ヌクレオチド配列は、5′から3′の方向に示されており、コード領域は開始部位のメチオニンから終始コドンまで番号付けしてある。長い蛋白質読み取り枠の推定アミノ酸を、5′及び3′の非翻訳領域とともに示してある。左右の余白に示した番号は、上側がヌクレオチド番号で、下側がアミノ酸番号であり、それぞれアデノシン（A）及び、メチオニン（M）で始まる。
図2
ヒトhp25aクローンの配列と、ヒトY1受容体遺伝子、ラットY1受容体遺伝子、及びマウスY1受容体遺伝子の配列との整列比較。ヒトhp25a（Y4）受容体（第1列目）の推定アミノ酸配列の開始メチオニン（M）から終始コドン（＊）までを、ヒトY1受容体クローン（Larhammarら、1992）、ラットY1受容体クローン（Evaら、1990）、マウスY1受容体クローン（Evaら、1992）と並べた。ハイフンは、適当な整列のために加えたスペースである。網かけは、各受容体クローンとhp25aとの間で同一の残基を示す。アミノ酸配列の上の番号は、hp78aのアミノ酸番号に対応し、開始部位のメチオニン（M）から始まって終始コドン（＊）で終わっていて、適当に整列させるために加えたスペースを含んでいる。配列の上の線は7つの推定膜貫通（TM）領域（TM I-VII）を示す。
図3
rs16bにコードされた、ラットのY4受容体のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（配列認識番号）。ヌクレオチドは5′から3′の方向に示されており、コード領域は推定開始メチオニンから始まり、終始コドンで終わるように番号付けされている。長い蛋白質読み取り枠の推定アミノ酸を、5′及び3’の非翻訳領域とともに示している。アミノ酸配列は、一文字の省略法で標記してある。
図4
ラット及びヒトのY4受容体の配列比較。ラットY4受容体（Y4rat）及びヒトY4受容体（Y4hum）の推定アミノ酸配列を示してある。配列は全体で75％、膜貫通領域で84％の相同性がある。アミノ酸の一文字省略法により示してある。7つの推定膜貫通（TM）領域（TM I-VII）を配列上に示してある。
図5
hp25aを一過性発現したCOS-7細胞より分離した膜に対する、12 5I-PYYの平衡結合。この膜を、表示した時間だけ、100nMのヒトPP存在下又は非存在下で、12 5I-PYYとインキュベーションした。特異的結合（B）を時間（t）に対してプロットして、方程式、B=Bt*（1-e-（Ko bs*t））により、平衡状態における最大の結合数（Bt）、及び測定結合速度（Kob s）を求めた。結合は平衡状態における全結合Btに対する割合で示し、これは、非線形回帰法により決定した。データは3つの独立した実験のものであり、それぞれの点では3回測定した。
図6A
hp25a受容体を一過性発現したCOS-7細胞より分離した膜に対する12 5I-PYYの平衡状態における飽和結合。100nMのヒトPPの存在下または非存在下で、膜を0.003nMから2nMの範囲で125I-PYYとインキュベーションした。
図6B
hp25a受容体を一過性発現したCOS-7細胞より分離した膜に対する、図6Aに示した条件下での12 5I-PYYの特異的結合を、遊離型12 5I-PYY濃度［L］に対してプロットして、方程式、B=Bma x［L］/（［L］+Kd）により、最大飽和結合部位数Bma x、及び12 5I-PYYの平衡解離定数Kdを求めた。各点につき4回測定した実験を4同行って得たデータによる、特異的結合を示してある。
図7
hp25a受容体を一過性発現したCOS-7細胞での、12 5I-PYYの競合的置換。膜を12 5I-PYYとインキュベーションする際に、ペプチド競合剤を増加させた異なる濃度で加えた。50％置換に対応するIC50を非線形回帰分析により決定し、方程式Ki=IC50/（1+［L］/Kd）をもとにしてKi値に変換した（［L］は12 5I-PYYの濃度であり、Kdは12 5I-PYYの平衡解離定数である）。データは、各点において1または2回測定した独立の実験を少なくとも2回行ったものである。これらの化合物及びそのほかの化合物の親和性に関する度合いの比較は、表2にそれぞれ別にして示してある。
図8
ヒトY4受容体を安定発現したLM（tk-）生細胞における、フォルスコリン-刺激性cAMP蓄積の阻止。5分間にわたって10μMのフォルスコリンで刺激した、LM（tk-）細胞中のcAMPに関する、ラジオイミュノアッセイにより関数データを求めた。0.03pMから0.3μMまでの濃度範囲で5分間にわたり、ヒトPPの作用薬活性を調べた。データは非線形回帰法により、4変数ロジスティック（logistic）方程式に適合させた。データは3つの独立した実験で得たものを示してある。
図9Aよび9B
図9A。ヒトY4受容体を安定発現した、LM（tk-）生細胞中の細胞内遊離型カルシウム濃度の刺激。代表的な経時変化。100nMのヒトPP（中抜き四角）又は100nMのヒトNPY（黒塗り四角）で、矢印で示した時間だけ刺激したLM（tk-）細胞における、Fura-2/AM蛍光に基づいて関数データを求めた。二つの独立した実験に基づくデータを示してある。
図9B。濃度/応答カーブ。非線形回帰法により、4変数ロジスティック（logistic）方程式に適合させた。
［発明の詳細な説明］
この出願を通じて、以下の省略法によりヌクレオチドを記述する。
C=シトシン、A=アデニン、T=チミン、G=グアニン。
この発明は、Y4受容体をコードした分離核酸分子を提供する。一つの態様において、コードされた該Y4受容体は、ラットのY4受容体である。別の態様においては、コードされた該Y4受容体は、ヒトY4受容体である。一つの態様において単離核酸分子は、図2に示されたヒトY4受容体の膜通過領域のアミノ酸配列に対して、膜通過領域のアミノ酸配列が60％以上の相同性を有することで特徴付けられる、Y4受容体をコードしている。別の態様において該Y4受容体は、図1に記載のヒトY4受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する。また別の態様において該Y4受容体は、図3に記載のラットY4受容体と実質的に同じアミノ酸配列を有する。別の態様において該Y4受容体は、図3に記載のアミノ酸配列を有する。ここで使用される「Y4受容体」という用語は、表1から3、表6及び図5から7に示されるような、主題のY4受容体と実質的に同じ薬理学を有する何れのアミノ酸配列、ポリペプチド、または蛋白質をも包含する。ここで記述されているように、該ヒトY4受容体は、既知のいかなる神経ペプチドY受容体サブタイプ（すなわち、Y1、Y2、及びY3）、神経ペプチドYY受容体、及び膵臓ポリペプチド受容体とも異なる薬理学的特徴を有し、そのためヒトY4受容体と命名されている。
現在までにクローニングされている唯一のNPY受容体は、マウス（Evaら、1992）、ラット（Evaら、1990）及びヒト（Larhammarら、1992）から単離したY1受容体遺伝子である。該Y4受容体と、GenBank/EMBLデータベースに開示されている既知の配列との間で最も相同性の高い配列は、ヒトY1受容体で、全体の相同性が42％である。
本発明は、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。一つの態様において該Y4受容体は、ヒトY4受容体である。ここで使用される「単離された核酸分子」という用語は、自然界では発生しないような形態を有した分子である核酸分子のことを意味する。該単離核酸分子の例は、Y4受容体をコードした、RNA、DNA、または単離されたゲノムDNA分子である。ヒトY4受容体を単離する一つの方法は、当該分野でよく知られた方法により、ヒトゲノムライブラリを、天然のまたは人工的に設計したDNAプローブで調べることである。この目的のためには、ヒト受容体遺伝子Y4由来のDNAプローブは特に有用である。ヒトY4受容体をコードしたDNA及びcDNA分子は、ヒト、哺乳類、またはその他の動物から、相補的なゲノムDNA、cDNA、またはRNAを得るために、または以下に詳しく記述する方法により、cDNAもしくはゲノムライブラリのスクリーニングによって、関連したcDNAもしくはゲノムクローンを単離するために使用することができる。それによって、単離したクローンの5’非翻訳領域の転写制御配列、並びに単離遺伝子の3’及び5’非翻訳領域の安定性、プロセッシング、転写、翻訳、及び組織特異性決定の領域が得られる。核酸分子の例は、Y4受容体をコードしたRNA、cDNA、または単離されたゲノムDNA分子である。該分子は、図1または図3に記載されたようなコード配列を有することが可能である。図1のDNAは、ヒトY4受容体蛋白質をコードしているが、一方、図3のDNAは、ラットY4受容体のアミノ酸配列をコードしている。
本発明は更に、図1及び図3に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するY4受容体をコードしたcDNAを提供する。この分子は上記した方法により得ることができる。
本発明は、Y4受容体である単離された蛋白質を提供する。一つの態様において該Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において該Y4受容体は、ラットY4受容体である。ここで使用される「単離された蛋白質」という用語は、他の細胞構成物を含まない蛋白質分子を意味する。そのような蛋白質の例は、図1に記載のヒトY4受容体のアミノ酸配列、または図3に記載のラットY4受容体のアミノ酸配列と実質的に同じなアミノ酸配列を有する、単離された蛋白質である。単離されたY4受容体を得る一つの方法は、該受容体をコードするDNAを、当該技術分野で知られた方法で、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞などの適切な宿主で発現し、該宿主で発現した該受容体蛋白質を再び、当該技術分野でよく知られた方法により回収することである。該受容体はまた、それを発現している細胞、特に以下に詳しく記述した発現ベクタで形質転換した細胞から単離することが可能である。
この発明は、Y4受容体をコードした、DNA、RNA、またはcDNAの様な単離された核酸分子を備えたベクタを提供する。一つの態様において該Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において該Y4受容体は、ラットY4受容体である。ベクタの例は、バクテリオファージの様なウイルス（ラムダ・ファージの様な）、動物ウイルス（ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、及びバキュロウイルスの様な）、コスミド、プラスミド（Pharmasia,Piscataway,NJより入手可能なpUC18の様な）、及びその他の組み換えベクタである。当該技術分野でよく知られた方法で、核酸分子をベクタのゲノムへ挿入する。たとえば、挿入体及びベクタDNAを、共にある制限酵素で処理して、互いに塩基対を形成するような相補的末端を両分子に作り出すことが可能である。もう一方の方法では、ベクタの制限部位に対応したリンカを、挿入体DNAに連結し、次に該連結体を、連結部で切断する制限酵素で消化することが可能である。他の方法もまた可能である。該プラスミドの特定な例としては、図1に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するcDNAを備えて、hp25aクローンと命名されたもの（配列認識番号1）、または図3に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するcDNAを備えて、rs16bと命名されたもの（配列認識番号27）であるプラスミドがある。
この発明はまた、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を備えた、細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、又は哺乳類細胞内での発現に適用されるベクタであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細胞内で発現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y4受容体をコードするDNAに対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。図1に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するDNAは、該ベクタへ挿入されてヒトY4を発現するのに有用に用いられる。図3に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を有するDNAは、該ベクタへ挿入されてラットY4を発現するのに有用に用いられる。発現に必要な制御配列には、RNAポリメラーゼを結合するプロモータ配列、リボソームを結合する転写開始配列が含まれる。例を挙げると、細菌性発現ベクタには、転写開始のための、lacプロモータの様なプロモータ、及びシャイン−ダルガーノ配列及び開始コドンであるAUGが含まれる（Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、1982）。同様に、真核細胞発現ベクタには、RNAポリメラーゼ用の異種起源または相同起源のプロモータ、下流のポリアデニレーション・シグナル、開始コドンAUG、及びリボゾーム解離用の終止コドンが含まれる。更に、組み換えバキュロウイルスの様な昆虫発現ベクタは、挿入遺伝子を昆虫細胞内で発現させるために、ポリヘドリン遺伝子発現シグナルを利用する。このようなベクタは商業的に入手可能であり、また当該技術分野においてよく知られた方法、たとえば上記した一般的なベクタ作成方法によって、配列を組み立てて得ることも可能である。発現ベクタは、受容体を発現する細胞を作り出すのに有用である。このような細胞を使用の利用に関しては、以下に詳しく記載する。
この発明はまた、Y4受容体をコードする単離された核酸分子を備えた、細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、又は特に哺乳類細胞内での発現に適用されるプラスミドであって、それぞれ細菌細胞内、酵母細胞内、昆虫細胞内、哺乳類細胞内で発現するのに必要な制御配列を更に備え、該制御配列が、Y4受容体をコードするDNAに対してその発現が可能なように連結されているベクタを提供する。哺乳類細胞での発現に適用されるプラスミドは、pSVL（Pharmasia,Piscataway,NJより入手可能）、及びpcEXV-3（Miller J.とGemain R.N.,J.Exp.Med.164:1478（1986））がある。そのようなプラスミドの特定の例としては、哺乳類細胞内での発現に適用されるプラスミドであって、図1に記載のコード配列と実質的に同じなコード配列と、哺乳類細胞内でのDNA発現に必要な制御配列とを備えたcDNAを有し、pcEXV-Y4と命名されて、ATCC受入れ番号、75631のもとに、1993年12月23日に寄託されたプラスミドがある。そのようなプラスミドの別の例としては、哺乳類細胞内での発現に適用されるプラスミドであって、図3に記載のコード配列と実質的に同じなコード配列と、哺乳類細胞内でのDNA発現に必要な制御配列とを備えたcDNAを有し、pcEXV-rY4と命名されて、ATCC受入れ番号、75984のもとに、1994年12月21日に寄託されたプラスミドがある。当業者らは、哺乳類細胞内での発現に適用される種々のプラスミドであって、Y4受容体をコードしたDNAと、該DNAを哺乳類細胞内で発現するために必要な制御配列とを備えたプラスミドは、すでに存在しているプラスミドを使って構築できるということと、哺乳類細胞内でDNAを発現するのに必要な制御配列を含むように適用することとが可能であるということを、評価するにあたって何ら問題はないであろう。該プラスミドは、上記した方法により、発現及び一般的ベクタ用に構築することが可能であり、また当該技術分野の他の方法によっても可能である。上に議論した寄託物、及びここに議論する寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じ、またこれを満たして、American Tissue Cluture Collection（ATCC）,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852に寄託された。
この発明は、哺乳類細胞内での発現に適用されるプラスミドを備えた哺乳類細胞を例とする、Y4受容体をコードする核酸を備えた細胞であって、Y4受容体をコードした核酸分子で、それ自身がコードする蛋白質が細胞表面上に発現されるものと、該核酸分子の哺乳類細胞内での発現に必要な制御配列で、それ自身の発現を許容するようにY4受容体をコードした核酸に連結されたものとを備えた細胞を提供する。数多くの哺乳類細胞が宿主として用いられることが可能であるが、その中には例として、マウス繊維芽細胞株であるNIH-3T3、CHO細胞、HeLa細胞、LM（tk-）細胞、Y1細胞などがある。上記した様な発現プラスミドは、リン酸カルシウム沈殿法の様な当該技術分野でよく知られた方法により、哺乳類細胞を形質転換するのに用いることが可能であり、または、Y4受容体をコードしたDNAをさもなくば、微量注入（microinjection）により哺乳類細胞内へ導入して、例えばY4受容体をコードしたcDNAまたはプラスミドの様なDNAを備えた哺乳類細胞を得ることが可能である。一つの態様において前記LM（tk-）細胞は、L-hY4-3（ATCC受入れ番号CRL 11779）と命名されている。別の態様において前記NIH-3T3細胞は、N-hY4-5（ATCC受入れ番号CRL 11778）と命名されている。細胞株L-hY4-3及びN-hY4-5は、1994年12月21日にATCCに寄託された。
この発明は、リガンドがY4受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させることと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リガンドがY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。この発明は、リガンドがY4受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該受容体に前記リガンドが結合するような条件下で前記リガンドに接触させることと、該受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記リガンドがY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法であって、該Y4受容体が膜通過領域のアミノ酸配列で特徴付けされ、該アミノ酸配列が、図2に示されたヒトY4受容体の膜通過領域のアミノ酸配列と60%以上の相同性を有する方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は、リガンドがY4受容体へ特異的に結合するか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該受容体にリガンドが結合するような条件下でリガンドを該膜画分に接触させることと、該Y4受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記化合物がY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は、リガンドがY4受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、該細胞からのY4受容体機能性応答の活性化を行わせる条件下で前記リガンドに接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによってY4受容体活性の上昇を検出し、それによって前記リガンドがY4受容体作用薬であるかを決定することとを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は、リガンドがY4受容体の作用薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該受容体にリガンドが結合するような条件下でリガンドを該膜画分に接触させることと、該Y4受容体に結合するいかなるリガンドの存在をも検出し、それによって前記化合物がY4受容体に特異的に結合するか否かを決定することとを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は、リガンドがY4受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化させる条件下で前記リガンドに、PPの様な既知のY4受容体存在下で接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによりY4受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY4受容体拮抗薬であるか否かを決定することを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は、リガンドがY4受容体の拮抗薬であるか否かを決定する方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該受容体をY4受容体機能性応答を活性化させる条件下で前記リガンドに、PPの様な既知のY4受容体存在下で接触させることと、セカンドメッセンジャ応答のようなバイオアッセイによりY4受容体活性の低下を検出し、それによって前記リガンドがY4受容体拮抗薬であるか否かを決定することを備えた方法を提供する。一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
上記した方法における一つの態様において、前記リガンドはこれまでには知られていない。
この発明は、上記した方法により検出されるY4受容体作用薬を提供する。この発明は、上記方法により検出されるY4受容体拮抗薬を提供する。
ここで使用される「作用薬」という用語は、Y4受容体の活性を上昇させることができるいかなるリガンドをも意味する。ここで使用される「拮抗薬」という用語は、Y4受容体の活性を低下させることができるいかなるリガンドをも意味する。
上記した方法の一つの態様において前記細胞は、哺乳類細胞である。別の態様において前記細胞は、起源が非神経性である。また別の態様において前記の非神経性の細胞は、COS-7細胞、CHO細胞、NIN-3T3細胞、またはLM（tk-）細胞である。
リガンドがヒトY4受容体に結合するかどうかを決定する方法の一つは、形質転換した非神経性細胞（すなわちNPY、PP、またはPYY受容体の何れのタイプも自然には発現しない細胞、故に形質転換された受容体のみを発現する）で、Y4受容体をその表面に発現しているもの、またはそのような形質転換細胞から調製した膜分画を、リガンドに、リガンドがよく行き渡る条件下、すなわち結合するような条件下で接触させることと、生体内でのリガンドのY4受容体への結合を行わせることと、該細胞の表面のY4受容体への結合を調べたいかなるリガンドの存在も検出することと、それにより、該リガンドが該受容体に結合するか、Y4受容体の活性化を促すか阻害するかを決定することを備えている。Y4受容体の活性化を促すか阻害するかを検出する応答系は、単離したDNAを、ホスホイノシチド加水分解、アデニレート・シクラーゼ、グアニレート・シクラーゼ、またはイオンチャンネルの様な所望のセカンドメッセンジャ系を持つ適切な宿主細胞へ形質転換して得る。そのような適切な宿主細胞は既存の細胞株から単離されるか、既存の細胞へセカンドメセンジャ系の適切な構成物を挿入することで作成される。そのような形質転換系は、上記した様な、Y4受容体のリガンドへの活性のアッセイ、または調査のための完全な応答系を提供する。形質転換系は、既知または候補の薬剤と、受容体に結合し、放射性の、分光学的な、またはその他の試薬でラベルされたリガンドとの間の競合的結合アッセイ用の生細胞培養と同様に有益である。形質転換細胞より分離した、受容体を含む膜画分もまた、このような競合的結合アッセイにとって有益である。セカンドメッセンジャ系のアッセイ、または形質転換における該アッセイの後遺的症状は、受容体機能の活性化における結合親和性及び有効性のためのアッセイとなる。形質転換系は、薬剤開発の可能性を有し、修飾して、またはそのままでY4受容体の自然な機能を活性化または阻害化するための治療用化合物として使用が可能な、天然のまたは合成の化合物を同定するのに有益な薬剤開発系を構成する。該形質転換系はまた、Y4受容体部における既知の薬剤の親和性及び有効性を決定するのに有益である。
この発明は更に、細胞表面上のY4受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、複数の薬剤と接触させることと、該細胞に結合する薬剤を決定し、それによって該受容体に特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明は更に、細胞表面上のY4受容体に特異的に結合する薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該膜分画に複数の薬剤を接触させることと、それによってY4受容体へ特異的に結合する薬剤を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の作用薬として機能する薬剤をスクリーニングする方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイによって前記細胞中の受容体を活性化する薬剤を決定し、それによってY4受容体作用薬を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の作用薬として機能する薬剤を同定するスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該膜分画を機能性Y4受容体応答を活性化させる条件下で複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイにより、細胞内でY4受容体の活性化を促進する薬剤を決定し、それによってY4受容体作用薬を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定するスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞を、Y4受容体機能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY4受容体作用薬の存在下で複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイにより、細胞内で受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、それによってY4受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。
この発明はまた、Y4受容体の拮抗薬として機能する薬剤を同定するスクリーニング方法であって、Y4受容体をコードした核酸で形質転換されて、該受容体を発現している細胞から細胞抽出液を調製することと、該細胞抽出液から膜画分を分離することと、該膜分画をY4受容体機能性応答を活性化させる条件下で、PPの様な既知のY4受容体作用薬の存在下で複数の薬剤と接触させることと、セカンドメッセンジャ・アッセイの様なバイオアッセイにより、細胞内で受容体の活性化を阻害する薬剤を決定し、それによってY4受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。
上記した方法の一つの態様において前記Y4受容体は、ヒトY4受容体である。別の態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。一つの態様において前記細胞は、哺乳類類細胞である。別の態様において前記細胞は、起源が非神経性である。更に別の態様において起源が非神経性である前記の細胞は、COS-7細胞、CHO細胞、LM（tk-）細胞、Y1マウス副腎細胞、またはNIH-3T3細胞である。
前記細胞内の核酸は、図1及び図3に示されたコード配列と実質的に同じコード配列を有する可能性がある。候補の薬剤は、当該技術分野でよく知られた標識済みリガンド結合法（例えばここに示された結合アッセイ）を使って、形質転換細胞内で発現したY4受容体へ高親和性で結合する化学的化合物を選択することで同定される。候補の薬剤はまた、前記Y4受容体に高親和性で結合するが他のNPY受容体サブタイプとは高親和性で結合しない化合物を同定することにより、選択性のスクリーニングにかけられる。患者に投与すると、選択的、高親和性の化合物は、主として標的のY4受容体部と結合するので、この方法によって、望ましくない副作用を持った薬剤を合成する確率が最小限に抑えられる。
この発明は、上記した方法で同定される薬剤と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。ここで使われる「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝塩液、水、並びに油／水、水／油エマルジョンの様なエマルジョン、及び種々のタイプの湿潤剤を包含する。薬剤が、経口投与や注射（作用部位において適切な期間、適切な治療濃度が維持されて所望の治療の恩恵が得られなくてはならない）といったような特別の投与経路に沿って、生体に適切に利用されることが示され、更に毒性がなく、適切な疾患モデルにおいて治療効果を有することが示されれば、該薬剤は、生体に利用されると決定された前記投与経路に従って、適切な固体または溶液の製剤で患者に投与して所望の治療の恩恵を得ることが可能である。
この発明は、核酸プローブであって、Y4受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列、例えば図1及び図3に示された配列内のコード配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの長さの核酸分子を備えた核酸プローブを提供する。一つの態様において前記核酸は、ヒトY4受容体をコードしている。別の態様において前記核酸は、ラットY4受容体をコードしている。ここで使われるように、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、核酸分子がそれ自身と相補的でかつ、相補的塩基対の間の水素結合の形成により二本鎖の分節を形成する核酸を認識する能力を意味する。ここで使われるように、「ユニークな配列」という用語は、Y4受容体をコードした核酸のみに特異的な配列のことである。核酸プローブ技術は当該技術分野の者にはよく知られており、当業者は、そのようなプローブは長さが異なり、ラジオアイソトープや蛍光色素といった検出可能なラベルで標識することが可能であり、該プローブの検出を容易にするということを、評価するに当たって何ら問題がないであろう。ヒトY4受容体をコードした核酸を検出することは、対応するY4受容体の発現レベルが変化する疾患の過程の診断にとって有益である。核酸プローブ分子は、Y4受容体またはその断片をコードした核酸分子を、プラスミドやバクテリオファージの様な適切なベクタへ挿入し、次に適切な細菌宿主へ導入し該核酸プローブを複製させて回収することを、全て当該技術分野でよく知られた方法により作成する。例として、核酸分子は、細胞抽出液よりフェノール及びエタノールを使用して抽出し、ベクタへ核酸を挿入した部位に対応した制限酵素で消化し（上記で議論した）、電気泳動して、泳動済みゲルから切り出すことができる。そのような核酸分子の例は、図1及び図3に示してある。このプローブは、「in situ」のハイブリダイゼーション用、この遺伝子ファミリを発現する組織の特定用、または種々の生物学的組織におけるこの遺伝子群とそのmRNAの存在を確かめるハイブリダイゼーションアッセイ用に、有益である。更に、Y4受容体をコードしたDNA分子の配列と相補的な合成ヌクレオチド（DNA合成機で作成した）は、これらの遺伝子、それに関連したmRNA、もしくはゲノムまたはcDNAの相同スクリーニング、またはPCRの様な増幅技術を使った関連遺伝子の単離、にとって有益である。上記した合成オリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーションによって該Y4受容体遺伝子のmRNAを細胞内で位置づけるのに使用することができる。
この発明はまた、Y4受容体をコードするmRNAの存在を検出して細胞表面にあるY4受容体の発現を検出する方法であって、当該技術分野でよく知られた方法を使って細胞より全mRNAを分離し、得られた該mRNAを、Y4受容体をコードした核酸分子中の配列に含まれるユニークな配列と特異的にハイブリダイゼーションすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子を含んだ核酸プローブに、ハイブリダイゼーション条件下で接触させることと、該プローブにハイブリダイゼーションしたmRNAの存在を検出し、それによって該細胞のY4受容体発現を検出することを備えた方法を提供する。mRNA分子のような核酸分子に対するプローブのハイブリダイゼーションは、当該技術分野でよく知られた方法によった。この方法を実施する一つの可能な手段においては、核酸を細胞抽出液より沈殿によって抽出し、mRNA分子のポリ-Aテイルと結合するカラムを使って、抽出物よりmRNAを分離する。該mRNAは次に、ニトロセルロース膜上で放射性ラベルしたプローブにさらされて、該プローブが相補的なmRNA配列にハイブリダイズし、それによって標識される。結合は、オートラジオグラフィー、またはシンチレーションのカウントで決定することができる。しかし、該工程を行うその他の方法は当業者によく知られており、上記の議論は単なる例である。
この発明は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドであって、Y4受容体をコードするmRNA分子と特異的にハイブリダイゼーションし、該mRNA分子の翻訳を阻止するような配列を有するアンチセンスのオリゴヌクレオチドを提供する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列が図1または図3に記載されたいかなるcDNA分子とも特異的にハイブリダイズすることができる配列を有することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異的な例としては、ヌクレオチドの化学的類縁体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
この発明は更に、薬学的組成物であって、細胞膜を通過し、Y4受容体をコードした細胞内mRNAに特異的に結合してその翻訳を阻止することにより、Y4受容体の活性を低下させるのに十分な、上記した量のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過することができる、薬学的に許容される担体とを備えた薬学的組成物を提供する。該オリゴヌクレオチドは、リボザイムのような、mRNAを不活化させる物質と結合させることができる。細胞膜を通過でき、薬学的に許容される担体はまた、細胞表面の受容体に結合する構造を有し、該構造への結合後に細胞に取り込まれることができる構造を備えている。この薬学的に許容される担体の構造は、選択した細胞の種類に特異的な受容体に対して結合することができるかも知れない。該構造は、細胞種特異的な受容体に結合することが知られている蛋白質（例えば、膵臓細胞を標的とするインスリン分子）の一部であってもよい。図1及び図3に示された配列と実質的に同じ配列を有する核酸分子は、上記薬学的組成物のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
この発明はまた、Y4受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を治療する方法であって、Y4受容体の活性を減少させるのに有効な、上記した量の薬学的組成物を患者に投与することを備えた方法を提供する。そのような異常のいくつかの例としては、記憶喪失、不安、てんかん、痛み、高血圧、歩行障害、概日周期障害、摂食／体重障害、性／生殖障害、鼻のうっ血、下痢、消化器系及び心臓血管系の障害、並びに睡眠及び摂食障害がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、これらの受容体をコードしたmRNAの翻訳を阻害する。合成オリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造体はY4受容体をコードしたmRNAに結合して、mRNAの翻訳を阻止するように設計されていて、患者におけるY4受容体遺伝子の発現を阻止するのに有益である。この発明は、ヒトY4受容体をコードしたmRNAの翻訳を阻止する合成アンチセンスヌクレオチド薬剤（SAOD）を使用して該受容体の発現レベルを、治療上変化させる方法を提供する。mRNAを認識して選択的に結合する様に設計された合成オリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造体は、図1及び図3に記載のDNA、RNA、または化学修飾された人工的核酸のヌクレオチド配列に対して相補的となるように構築されている。該SAODは、患者に注射できるように血液内で安定なように設計され、或いは患者より取り出した細胞に投与できるように細胞培養条件下でも安定なように設計されている。該SAODは、細胞膜を通過することを可能とする物理的及び化学的性質によるか（例として、小型の疎水性のSAOD化学構造を設計することで）、または該SAODを認識して細胞内へ輸送する特異的な細胞内輸送系によって、細胞の細胞質へ侵入するために、細胞膜を通過するように設計される。更に該SAODは、ある特定の細胞群内のみにおいて、該SAODを結合して取り込む様な、特異的取り込み機構によって認識される様にしむけることで、ある特定の細胞群のみに投与されるよう設計されている。例としては、該SAODは上記した様に、ある種の細胞でしか見いだされない受容体に結合するよう設計されている。該SAODはまた、図1及び図3に記載された配列に含まれた配列に対応する可能性のある標的mRNA配列を、該mRNAに対して塩基対を形成することで、認識して特異的に結合する様に設計されている。最後に、該SAODは以下の3つの機序のうちどれかにより、標的mRNAを不活化する：
1）標的mRNAに結合して、RNアーゼI消化の様な内在の細胞性機序によって該mRNAの分解を誘導する；
2）翻訳制御因子またはリボソームの結合を阻害して標的mRNAの翻訳を阻止する；または
3）リボソーム配列または反応性化学基の様な、標的mRNAを分解するか、または化学修飾する、その他の化学構造を導入する。
合成アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、標的mRNAに向けられると、上記した性質を有することができることが示されている（J.S.Cohen,Trends in Pham.Sci.10,435（1989）;H.M.Weintranb,Sci.Am.January（1990）p40）。更に、リボザイムをアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合することは標的mRNAを不活化するのに有望な戦略である（N.Sarverら、Science247,1222（1990））。SAODは、注射により患者に投与するように設計されているか、または患者の標的細胞を取り出して実験室内でSAODで処理し、患者に戻すと、効果的な治療剤として働く。このようにしてSAODは、Y4受容体の発現減少の恩恵を被る臨床的条件において、患者の特定の標的細胞における受容体発現を減少させるための療法として働く。
この発明は、Y4受容体に対する抗体、例としては、細胞表面上に存在するY4受容体のエピトープであって、図1に示されたヒトY4受容体のアミノ酸配列（配列認識番号2）、または図3に示されたラットY4受容体のアミノ酸配列（配列認識番号28）と実質的に同じアミノ酸配列を持つエピトープに向けられたモノクローナル抗体を提供する。アミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られた方法により分析され、該アミノ酸が構築する蛋白質が疎水性または親水性の領域を作るかどうかについて決定した。細胞膜蛋白質の場合は、疎水性領域は、細胞膜を形成する脂質二重層に挿入される蛋白質部分を形成し、一方親水性領域は、水性の環境下において細胞表面に局在することがよく知られている。それゆえに、図1及び図3に示された親水性のアミノ酸配列に対する抗体は、おそらく上述した様にヒトまたはラットのY4受容体の表面エピトープにそれぞれ結合するであろう。Y4受容体に向けられる抗体は、血清由来、またはモノクローナルのどちらかであってもよく、当該技術分野でよく知られた方法で調製される。例としてモノクローナル抗体は、免疫した動物の抗体産生B細胞を、ミエローマ細胞と融合させるハイブリドーマ技術を使い、その結果得られた、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択して調製する。ヒトY4受容体をコードしたDNAを備え、該ヒトY4受容体を発現するCOS-7細胞またはLM（tk-）の様な細胞を、上記した様な抗体を産生させるための免疫原として使うことが可能である。もう一方の方法としては、合成ペプチドを商業的に入手可能な機械並びに図1及び図3に示されたアミノ酸配列（配列認識番号2及び28）を使って調製することが可能である。もう一方の方法の延長として、cDNAまたはその断片の様なDNAのクローニング及び発現を行い、その結果得られるポリペプチドを回収して免疫原として使うことも可能である。これらの抗体は、該単離DNAにコードされるヒトY4受容体の存在を検出すること、または生きている動物、ヒト、または動物もしくはヒトから分離した生物学的組織もしくは体液中の該受容体機能を阻害することに有用である。
この発明は、薬学的組成物であって、リガンドのY4受容体への結合を阻止するのに効果的な量の抗体と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。細胞表面上に存在するY4受容体のエピトープであって、図1及び図3に示されたY4受容体の細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を持つエピトープに向けられたモノクローナル抗体は、この目的にとって有益である。一つの態様において前記Y4受容体は、ラットY4受容体である。
この発明は更に、Y4受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を治療する方法であって、上記の薬学的組成物の有効量を患者に投与して、リガンドのY4受容体への結合を阻害して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。抗体の受容体への結合は、該抗体の機能を阻害して、それによってY4受容体活性の効果を中和させる。上記したモノクローナル抗体は、共にこの目的にとって有益である。異常のいくつかの例としては、記憶喪失、うつ病、不安、てんかん、痛み、高血圧、及び睡眠／摂食障害がある。
この発明は、細胞表面上のY4受容体の存在を検出するための方法であって、前記細胞を、抗体の該受容体への結合を許容する条件下で、Y4受容体に向けられた抗体に接触させることと、該細胞へ結合した前記抗体の存在を検出し、それによって該細胞表面上のY4受容体の存在を検出することとを備えた方法を提供する。このような方法は、与えられた細胞がその表面上にあるY4受容体の活性に関して、欠損しているかどうかを決定するのに有益である。結合した抗体は、当該技術分野でよく知られた方法により検出され、例としては、蛍光標識を抗体に結合させて、蛍光顕微鏡を使って細胞検体を調べ、抗体結合を示す、細胞表面上の蛍光を検出する方法がある。上記した抗体は、この目的にとって有益である。
この発明は、Y4受容体をコードした核酸を発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。この発明は更に、天然Y4受容体の相同組み換えによるノックアウトを備えた、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。この発明は更に、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムがY4受容体をコードしたDNAに対して相補的なアンチセンスDNAを備え、該アンチセンスDNAは、Y4受容体をコードしたmRNAに対して相補的で、且つY4受容体をコードしたmRNAにハイブリダイゼーションすることによりその翻訳を減少させるアンチセンスmRNAへと転写されるように配置されている、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。該DNAは更に、発現が誘導されるか、または特異的細胞種において制限される、誘導性のプロモータ、または組織特異的制御配列を備えることが可能である。DNAの例としては、図1及び図3に示されたコード配列と実質的に同じコード配列を有するDNAまたはcDNA分子がある。トランスジェニック動物の例としては、トランスジェニックマウスがある。組織特異性決定領域の例としては、メタロチオネインプロモータ（Low,M.J.,Lechan,R.M.,Hammer,R.E.ら、Science 231:1002-1004（1986））及びL7プロモータ（Oberdick,J.,Smeyne,R.J.,Mann,J.R.Jackson,S.及びMorgan.J.I.Science 248:223-226（1990））がある。
Y4受容体の生理学的及び行動学的役割を解明する動物モデル系は、Y4受容体の活性が増加もしくは減少されているか、または発現するY4受容体蛋白質のアミノ酸配列が種々の技術によって改変された、ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出すことで生産できる。これらの技術の例には、1）Y4受容体をコードした正常もしくは変異体DNA、またはこの遺伝子の他の動物の相同体を、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染、または当該技術分野でよく知られた他の方法で、適切な受精卵へ挿入してトランスジェニック動物を作り出すこと（Horgan,B.ら、Manipulating the mouse embryo,A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1986））、2）ヒト及び動物の相同体の、これらの遺伝子の正常または変異体を相同組み換えにより、トランスジェニック動物の天然の遺伝子座と組み換えて、これらのY4受容体の発現または構造を変化させること（Capecchi M.R.,Science 244:1288-1292（1989）;Zimmer,A.及びGruss,P.Nature 338:150-153（1989））、が含まれる。相同組み換えの技術は、当該技術分野ではよく知られている。当該技術は、天然の遺伝子を挿入遺伝子と入れ替えており、従って、天然の遺伝子は発現しないが、たとえば、組み換えによって該動物のゲノム中の天然の受容体と入れ替わり、該受容体発現を抑えるような、挿入された変異受容体を発現する動物を作り出すのに有益である。マイクロインジェクションは遺伝子をゲノムに加えるが、それらを取り除くことはできず、従ってもとの遺伝子と加えた遺伝子とを発現し、その結果該受容体を過発現させる動物を作り出すのに有益である。トランスジェニック動物を作り出す方法の一つは、マウスを一つの例とすると、以下のようになる。雌のマウスを交配させ、受精卵を解剖により卵管より取り出す。該受精卵をM2培地の様な適切な培地に保存する（Horgan,B.ら、Manipulating the mouse embryo,A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1986））。ヒトY4受容体をコードしたDNAまたはcDNAをベクタ（上記したプラスミドpcEXV-Y4等）から当該技術分野でよく知られた方法で分離する。誘導プロモータは、該DNAと融合して導入遺伝子を制御するための実験的方法を提供することが可能である。上記方法に代わるものとしてまたは上記方法に加えて、組織特異的制御配列をコード領域に結合して、導入遺伝子の発現を組織特異的に制御させることが可能である。該DNAを、適切な緩衝液中において、マイクロインジェクション針（ピペット・プラー（pipet puller）を使用してキャピラリ管から作成できる）にいれ、また注入を施すべき該受精卵を、くぼみのあるスライドに置く。針を該受精卵の前核に注入し、該DNA溶液を注入する。次に、注入済みの卵を、疑似妊娠させたマウス（適切なホルモンで刺激して妊娠を維持するが実際には妊娠していないマウス）の卵管に移し、該受精卵は子宮に到達し、着床し、発生して出産される。上記した様にマイクロインジェクションは、DNAを卵細胞へ挿入するための唯一の方法ではなく、ここにおいては例示的目的のために使用している。
受容体特異的薬剤の正常な作用は、受容体作用を活性化するかまたは阻害することにあるので、上記したトランスジェニック動物モデル系は、これらY4受容体に向けられた薬剤が手に入る前であっても、そのような薬剤の生物学的活性を、試験するのに有益である。これらの動物モデル系は、天然のまたは導入した遺伝子の発現を誘導または阻害して生きた動物におけるY4受容体の正常体または変異体の活性を増加または減少させる薬剤について、これを治療に用いることの可能性を予測または評価するのに有益である。このため、これらY4受容体に向けられた薬剤の生物学的活性を、該薬剤が手に入る前において評価するようなモデル系が作成される。Y4受容体活性が増加または減少したトランスジェニック動物は、その生理学的状態によって、Y4受容体活性の増加または減少が、治療にとって有益であるかどうかを示す。それゆえに、トランスジェニックモデル系に基づいて薬剤の活性を評価することは有益である。一つの使用法は、抗うつ剤の様な薬剤は神経伝達物質の取り込みを阻害して、それによってシナプスの中裂における神経伝達物質の量を増加させるという、当該技術分野ではよく知られている事実に基づいている。この作用の生理学的な結果は、影響を受けた細胞内において、より少ない受容体の生成を刺激し、結果的に該受容体の活性を減少させることである。それゆえに、受容体活性の減少した動物は、受容体活性の減少を起こすそのような薬剤の作用が、実際に治療効果があるかどうかを試験する系として有益である。別の使用法は、増加した受容体活性が異常を導くならば、Y4受容体を下方調節する薬剤か、またはY4受容体の拮抗薬として作用する薬剤は、開発する価値のあることが示される。また、これらの動物モデル系によって有望な治療への応用が明かになれば、Y4受容体活性の増加または減少は、該Y4受容体に向けられた作用薬または拮抗薬を製造すること、またはこれらのY4受容体の活性を増加または減少させる何らかの方法によって、治療的に成し遂げることができる。
この発明は、Y4受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、Y4受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用により、ヒトY4受容体の活性が変化するような、ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出すことを備えた方法を提供する。この発明は更に、Y4受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、それぞれが異なる量のY4受容体活性を有するヒト以外のトランスジェニック動物のパネルを作り出すことを備えた方法を提供する。そのような動物はY4受容体をコードした核酸を異なる量だけ、トランスジェニック動物を発生させる卵母細胞に導入することで作り出すことができる。
この発明はまた、Y4受容体の活性を減少させることで軽減されるような、患者の異常を軽減させることができるY4受容体拮抗薬を同定する方法であって、Y4受容体をコードし、人工的に導入された核酸分子を少なくとも一つ発現している、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に拮抗薬を投与することと、該拮抗薬が、Y4受容体の活性の結果として現れる、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否かを決定し、それによってY4受容体拮抗薬を同定することとを備えた方法を提供する。ここで使っているように、「拮抗薬」という用語は、天然、合成、またはスクリーニング由来の産物である、化合物または組成物を意味する。核酸分子の例は、図1及び図3に示したコード配列と実質的に同じコード配列を持つDNA、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはRNA分子がある。この発明はまた、上記した方法によって同定される拮抗薬を提供する。
この発明は、上記の量の拮抗薬と、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。
この発明は更に、Y4受容体の活性を減少させることにより軽減されるような、患者の異常を治療する方法であって、上記した薬学的組成物の有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。
この発明は、Y4受容体を活性させることで軽減されるような、患者の異常を軽減させることができるY4受容体作用薬を同定する方法であって、該作用薬を、上記したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に投与することと、該作用薬が、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の肉体的及び行動的異常を緩和するか否かを決定することとを備え、その異常の緩和によって、Y4受容体作用薬が同定される方法を提供する。
この発明は、上記した方法により同定される作用薬を提供する。
この発明はまた、上記の方法で同定される量の作用薬及び、薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物を提供する。
この発明は更に、Y4受容体を活性化させることで軽減されるような、患者の異常を治療する方法であって、上記した薬学的組成物の有効量を患者に投与して、それによって異常を治療することを備えた方法を提供する。
この発明は、ヒトY4受容体の特異的対立遺伝子の作用に関わる疾患の疾病素質を診断する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する：a）疾患をもつ患者より核酸を取得すること；b）一連の制限酵素を使って上記核酸の制限酵素による消化を行うこと；c）前記の消化済み核酸断片を分離ゲルを使って電気泳動的に分離すること；d）電気泳動の終了したゲルを、Y4受容体と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、且つ検出可能な標識でラベルされたプローブと接触させること；e）Y4受容体をコードした核酸にハイブリダイゼーションして検出可能な標識でラベルされた標識済みバンドを検出し、前記疾患にかかった患者のDNAに特異的なバンドパターンを作成すること；f）上記ステップa-eの方法による診断用に得た核酸を調製すること；g）ステップeの、前記疾患にかかった患者の核酸に特異的なバンドパターンを、ステップfで、診断用に得た核酸についてのパターンと比較して、両パターンが同じか異なるかを決定し、その結果同じであれば疾患の疾病素質ありと診断すること。この方法はまた、特異的Y4受容体の対立遺伝子の発現に関連した疾患を診断するのに使うことが可能である。
この発明は、単離精製されたY4受容体を調製する方法であって、以下のステップを備えた方法を提供する：a）細胞内での発現に適用されるベクタを構築するステップであって、該ベクタはY4受容体を発現するように、該受容体をコードしている核酸に対して機能可能なように連結された、細胞内での核酸の発現に必要な制御配列を備えており、前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選ばれる、ベクタ構築ステップ；b）ステップaのベクタを適切な宿主細胞へ導入するステップ；c）ステップbの細胞を、Y4受容体の発現を許容する条件下でインキュベーションするステップ；d）上記のように発現された受容体を回収するステップ；e）上記のようにして回収された受容体を精製することにより、単離精製Y4受容体を調製するステップ。単離されたY4受容体の例は、アミノ酸配列が図1及び図3に示されたアミノ酸配列と実質的に同じである、単離された蛋白質である。例えば、ホルモンのような物質に細胞を露出して受容体発現の誘導を行わせることができる。該細胞は次に、ホモジナイズして、例えばPPまたは該受容体に結合することがわかっている別の物質からなるアフィニティーカラムを使って、該ホモジネートから受容体を単離する。得られた画分は次に、イオン交換カラムにかけて、どの画分に受容体活性、または抗受容体抗体への結合性を決定して精製する。Y4受容体を調製するこの方法は、当該技術分野でよく知られた組み換えDNA技術を使っている。例えばY4受容体をコードした単離核酸を、発現ベクタの様な適切なベクタへ導入する。細菌細胞または酵母細胞のような真核細胞といった適切な宿主細胞をベクタで形質転換する。Y4受容体を親和性精製、クロマトグラフィー、または当該技術分野でよく知られた他の方法で培養液より単離する。
この発明は、新規の蛋白質、そのアミノ酸、及びそのヒト遺伝子をはじめて同定している更に、この発明は、以前は認識されていなかった、Y4受容体として定義される受容体群を記述している。この発見によって提供される情報、および実験的手法は、新規の治療剤、この新規蛋白質、関連したmRNA分子、または関連したゲノムDNAに対する治療または診断のアッセイを作り出すことに有益である。この発見によって提供される情報及び実験的手法は、新規の治療剤、この新規蛋白質、関連したmRNA分子、または関連したゲノムDNAに対する治療または診断のアッセイを作り出すことに有益となるであろう。
特に、この発明は、Y4受容体をコードしたヒト及びラットのゲノムクローンのはじめての単離に関わる。ここでY4として同定された新規のヒト遺伝子を同定し、特徴づけを行った。更に、ヒトY4受容体をCOS-7細胞で発現した。コードされた蛋白質の薬理学的結合性質を決定し、これらの結合性質によりこの蛋白質を、われわれがY4受容体と命名した新規のNPY/PYY/PP受容体に分類した。このY4受容体を細胞表面で発現している哺乳類細胞株を構築し、それゆえにY4受容体を研究するための、よく定義された、培養細胞株をはじめて樹立している。
この発明は、以下に続く実験の詳細を参照することによって、この発明をより良く理解できるであろう。しかし、当該技術分野の熟練者らは、そこで詳述される特定の実験は、後述の請求の範囲に完全に記載されている発明の単なる例示に過ぎないということを容易に認めるであろう。
［実験の詳細］
ヒト（Y4）神経ペプチド受容体のクローニング及び配列決定。ラットのY1神経ペプチド受容体遺伝子（Eva,C.ら、1990;GenBank受入れ番号Z11504）由来の、重複（overlapping）した膜通過（TM）領域のオリゴヌクレオチドプローブ（TM1、2、3、5、及び7）を使って、λダッシュII中のヒト胎盤ゲノムライブラリ（約1.5X106の全組み換え体、Stratagene、LaJolla、CA）を、スクリーニングにかけた。以下に示す重複（overlapping）オリゴマに［32P］dATP及び［32P］dCTP、並びにDNAポリメラーゼ大断片を使ってラベルを入れた：
0004216326.tif 000002
ハイブリダイゼーションは、低厳密度（stringency）の条件で行った：すなわち、40℃；25.0％のホルムアミド、5 X SSC（1XSSCは0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）、1 X Denhardtの溶液（0.02%ポリビニルピロリドン、0.02％ファイコール（Ficoll）、0.02％ウシ血清アルブミン）、及び25μg/μlの超音波処理済みサケ精子DNAを含む溶液中の条件である。フィルタを40℃で、0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを含んだ0.1 X SSCで洗浄し、-70℃で増強スクリーンと一緒にしてKodakのXARフィルムに露出した。プローブとハイブリダイズしたラムダファージクローンのプラークを精製し、サザンブロット用のDNAを調製した（Southern,1975;Sambrookら、1989）。5つのラットY1 TMプローブ全てとハイブリダイズしたゲノムクローンをhp25aと命名し、上記の方法で分離した。サブクローニング及び以後のサザンブロッティング用に、上記hp25aをpUC18（Pharmaisa、Piscataway、NJ）中へクローニングした。ヌクレオチド配列分析は、シーケナーゼ（Sequenase）（US Biochemical Corp.,Cleavland,OH）を使って、変性二本鎖プラスミド鋳型のサンガー・ジデオキシヌクレイチド鎖終結法（Sangerら、1977）で行った。
ラットNPY（Y4）神経ペプチド受容体のクローニングと配列決定：図2に示したヒトY4受容体のアミノ酸配列のTM領域にほぼ対応するヌクレオチド配列由来の、重複（overlapping）TMオリゴヌクレオチドプローブ（TM1-7）を用いて、ラット脾臓ゲノムライブラリ（Stratagene,LaJolla,CA）をスクリーニングにかけた。使用した重複（overlapping）オリゴマーは以下のとおりであった：
0004216326.tif 000003
0004216326.tif 000004
0004216326.tif 000005
以上のオリゴマに、［32P］-dATP及び［32P］-dCTP、並びにDNAポリメラーゼ大断片を使ってラベルを入れた。ハイブリダイゼーションは厳密度（stringency）を下げた次の条件で行った：すなわち、40℃；37.5％のホルムアミド、10％硫酸デキストラン5 X SSC、1 X Denhardtの溶液、及び100μg/μlの超音波処理済みサケ精子DNAを含む溶液中である。フィルタを45℃で、0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含んだ0.1XSSCで洗浄し、-70℃で増強スクリーンと一緒にしてKodakのXARフィルムに露出した。プローブとハイブリダイズしたラムダファージクローンのプラークを、プレーティング及び再スクリーニングを繰り返して精製した。7つのラットY1 TMプローブ全てとハイブリダイズしたゲノムクローンをrs16bと命名し、上記の方法で分離した。発現及び配列分析のため、真核細胞発現ベクタであるpcEXV-3（MillerとGemain、1986）を修飾して、EcoRI、SstI、ClaI、KpnI、SmaI、XbaI、BamHI、SalI、及びHindIII制限部位のポリリンカを含みEXJ.RHと命名されたベクタのポリリンカー部に、rs16bの2.0kbのBamHI/HindIII断片を対応する部位へサブクローニングした。ヌクレオチド配列分析は、シーケナーゼ（Sequenase）（US Biochemical Corp.,Cleavland,OH）を使って、二本鎖プラスミド鋳型のサンガー・ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Sanger、1977）で行った。
＜一過性形質転換＞：680bpの非翻訳領域（5′UT）及び205bpの3’非翻訳領域（3′UT）を含む、hp25a（1127bp）の全コード領域を、ポリリンカー修飾済みのpCEXV-3（Millerら、1986）である、EXJ.HRのBamHI及びEcoRI部位へクローニングした（J.B.,未発表データ）。DEAEデキストラン法（試薬はSpecailty Media、Lavellete,NJより入手）により、サル腎臓細胞（Cos-7）を、プラスミドhp25a/EXJ（hp25aを含んだ発現ベクタ）で一過性形質転換した。
プラスミドrs16b/EXJ（rs16b受容体遺伝子を含む発現ベクタ）を同様の方法で、ヒトY1受容体（Larhammar,1992）やヒトY2受容体の時と同様に、Cos-7細胞へ一過性形質転換をした。クローン化されたY2受容体は、1994年2月2日付けで出願された、現在係属中の、米国特許出願08/192,288に開示されており、その内容は参照として本願に取り込まれている。
＜安定な形質転換＞
ヒトY4受容体を、G-418抵抗性遺伝子と共にマウス胚NNIH-3T3細胞株へ、リン酸カルシウム形質転換法（Cullen,1987）で同時形質転換した。安定にに形質転換された細胞を、G-418で選択した。ヒトY4受容体を同様にして、マウス繊維芽細胞LM（tk-）へ形質転換した。
＜細胞培養＞：COS-7細胞を150mmのプレート（Corning）を使って、添加物含有のD-MEM（10％のウシ血清、2mMグルタミン、100単位／mlペニシリン、及び80単位／mlストレプトマイシンを含んだ、ダルベッコの改変イーグル培地）中で、37℃、5％CO2で増殖させた。COS-7細胞のストックは、3-4日毎にトリプシン処理して1：6に分配した。SK-N-Be（2）ヒト神経芽腫細胞を同様にして、50％イーグルの改変必須培地、50％ハムの栄養素混合物F-12、15％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、100単位／mlペニシリン、80単位／mlストレプトマイシン、及び1％非必須アミノ酸を用いて、225cm2のフラスコ（Co-star）中で増殖させた。SK-N-Be（2）のストックは、7日毎にトリプシン処理して1：10に分配した。
マウス胚NIH-3T3細胞を150mmのプレートを使って、添加物含有のダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）（10％のウシ血清、4mMグルタミン、100単位／mlペニシリン、及び100μg／mlストレプトマイシン）中で、37℃、5％CO2で増殖させた。NIH-3T3細胞のストックは、3-4日毎にトリプシン処理して1：15に分配した。マウス繊維芽細胞LM（tk-）を150mmのプレートを使って、添加物含有のダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）（10％のウシ血清、4mMグルタミン、100単位／mlペニシリン、及び100μg／mlストレプトマイシン）中で、37℃、5％CO2で増殖させた。LM（tk-）細胞のストックは、3-4日毎にトリプシン処理して1：10に分配した。
細胞培養の培地と添加物は、Specialty Media（Lavallete,NJ）より入手した。細胞培養皿（150mm）はCorning（Corning,NY）より入手した。細胞培養フラスコ（225cm2）及びポリプロピレン・ミクロタイター・プレートはCo-star（Cambridge,MA）より入手した。
＜膜の回収＞：細胞分配後48時間でCOS-7細胞から、また細胞分配後7日間でSK-N-Be（2）細胞から膜を回収した。接着した細胞は、氷冷したリン酸緩衝塩液（138mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、2.5mM KCl、1.2mM KH2PO4、0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2、pH7.4）で洗浄し、氷冷した低張液（20mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH7.7）中で超音波処理して破壊した。大型の粒子及び破壊断片を低速の遠心（200 X g、10分、4℃）で取り除いた。膜は、上清分画を高速で（32,000 X g、18分、4℃）遠心して回収し、氷冷した低張液で洗浄し、もう一度高速で（32,000 X g、18分、4℃）遠心して回収した。最終膜沈殿物を超音波処理により小量の（約500μl）氷冷済み結合緩衝液（10mM NaCl、20mM HEPES、0.22mM KH2PO4、1.26mM CaCl2、0.81mM MgSO4、pH7.4）に再懸濁した。蛋白質濃度は、Bio-Radの試薬を使い、ウシ血清アルブミンを標準試料として使ったブラッドフォード法（Bradford、1976）により決定した。
＜標識済みリガンドの膜懸濁液への結合＞：膜懸濁液を、0.1％の牛血清アルブミン及び0.1％のバシトラシン（bacitracin）を添加した結合緩衝液で希釈し、最適膜蛋白質濃度をヒトY1受容体に対しては約0.02mg/ml、hp25a受容体に対しては約0.015mg/ml、SK-N-Be（2）に対しては約0.25mg/mlとなるようにした（この条件下では、アッセイで膜に結合した12 5I-PYYは試料に入れた12 5I-PYYの量の10％以下である）。12 5I-PYY及び非標識ペプチド競合剤もまた添加済み結合緩衝液で所望の濃度に希釈した。次に、膜懸濁液（200μl）、12 5I-PYY（25μl）、及び非標識ペプチド又は添加済み結合緩衝液（25μl）を混合して、個々の検体を96穴のポリプロピレン・マイクロタイター・プレートに調製した。検体を30℃の水浴中で常に震盪して120分間インキュベーションした。Whatman GF/Cフィルタ（0.5％のポリエチレンイミンで被膜して、使用前に風乾済み）を使ってろ過してインキュベーションを終了させた。フィルタにトラップした膜の12 5Iを、ガンマカウンタで計測した。非特異的結合を、hp25a受容体に対しては100nMのヒトPPで、またY1及びSK-N-Be（2）受容体に対しては100nMのNPYで求めた。経時変化及び競合実験における特異的結合は概して80％であった；ほとんどの非特異的結合はフィルタに関わるものであった。結合のデータは、GraphPAD InPlotパッケージ（San Diego、CA）の非線形の回帰分析と統計的技法により分析した。ブタ12 5I-PYYは、New England Nuclear（Boston、MA）より入手した。NPY及び関連ペプチド類縁体をBachem California（Torrance、CA）又はPeninsula（Belmont,CA）の何れかより入手した。WhatmanのフィルタはBrandel（Gaitherberg,MD）より入手した。Bio-Radの試薬は、Bio-Rad（Hercules,CA）より入手した。ウシ血清アルブミンとバシトラシン（bacitracin）はSigma（St.Louis,MO）より入手した。その他の実験材料は、全て試薬グレードのものであった。
＜機能アッセイ：cAMPのラジオイミュノアッセイ＞
定常に形質転換された細胞を96穴のマイクロタイタプレートにまき、プレート内に密集するまで培養した。受容体の機能消出の可能性を低減するため、培地中の血清をアッセイ前4時間から16時間1.5％に減らした。細胞をHankの緩衝塩液または0.1％のウシ血清アルブミンと5mMテオフィリン（theophyllin）を添加したHBS（150mM NaCl、20mM HEPES、1mM CaCl2、5mM KCl、1mM MgCl2、及び10mMブドウ糖）で洗浄し、同溶液中で20分間、5％CO2中で37℃で前平衡化した（pre-equilibrated）。次に細胞を5分間、10μMのフォルスコリン（forskolin）及び種々の濃度の受容体選択的リガンドとインキュベーションした。HBSを取り除き、細胞を100mMのHClで酸性化してアッセイを終結させた。細胞内cAMPを抽出して、磁性ビーズを使ったラジオイミュノアッセイ（Advanced Magnetics,Cambridge,MA）の改変版により定量した。最終抗原／抗体複合体は、真空ろ過によりマイクロタイタプレート中のPVDFフィルタを通して遊離型の12 5I-cAMPと分離した。フィルタを切断してPackardガンマカウンタで12 5Iを計測した。結合のデータは、GraphPAD Prismパッケージ（San Diego、CA）の非線形の回帰分析と統計的技法により分析した。
＜機能アッセイ：細胞内カルシウム動員＞
細胞内遊離カルシウムの濃度を蛍光支持染料Fura-2/AMを使って、マイクロ分光蛍光光度法により測定した。定常に形質転換した細胞を、硝子のカバースリップを入れた35mmの培養用皿にまいた。細胞をHBSで洗浄し、次に100μlのFura-2/AM（10μM）を20分から40分間加えた。HBSで洗浄してFura-2/AM溶液を除去した後、細胞をHBSで10分から20分間平衡化した。次に細胞を、Leitz Fluovert FS顕微鏡で40Xの対物レンズを使って視覚化し、励起波長を340又は380nMとし、蛍光発光を510nMで測定したカルシウム濃度の標準曲線とソフトウェア分析技術とを使って蛍光の生データをカルシウム濃度に変換した。
＜組織局在と遺伝子発現：逆転写酵PCR＞
ヒトの組織（National Disease Reseach Interchangeより入手）をホモジナイズして、全RNAをグアニジンイソチオシアネート／CsClクッション法（Kingston,1987）により抽出したRNAをDNアーゼで処理して、混在しているゲノムDNAを取り除いた。逆転写酵素（Superscript II;BRL）を使ってランダム・ヘキサヌクレオチド・プライマと全RNAからcDNAを調製した。cDNAの第一鎖を少し（全RNAのうち250ng）を使って、50μlのPCR反応液中で増幅させた：その反応液の内訳は、200μMdNTPs、製造社（Perkin-Elmer Corporation）提供の緩衝液中の1.2単位のTaqポリメラーゼ、及び1μMプライマで、反応サイクルの内訳は、94℃2分間、68℃2分間、72℃2分間を30サイクル繰り返し、その前後にそれぞれ95℃5分間、72℃10分間のインキュベーションを行った。ヒトY4用のPCRプライマは、以下に示すヒトY4の第三細胞内ループ及びカルボキシ末端の配列に対するようにそれぞれ設計した：
0004216326.tif 000006
PCR産物を1.5％のアガロースゲルに流し、電荷負荷済みナイロン膜にトランスファし、サザンブロットで分析した。PCRプライマではさまれた受容体領域に対応するハイブリダイゼーションプローブを調製し（5’-TCCGTATGTACTGTGGACAGGGGCAGATGCTCCGACTCCTCCAGG-3′）、ヒトY1及びヒトY2受容体サブタイプとの交差性がないことを確かめるためのプレスクリーニングを行った。フィルタは、PCRプライマに対する、［γ-32P］ATPで末端標識した内部プローブでハイブリダイゼーションし、高厳密度で洗浄し、上記のように、増強スクリーンと一緒にしてKodak XARフィルムに露出した。ハウスキーピング遺伝子である、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデハイドロゲナーゼ（Clontech,PaloAlto,CA）、に対するプライマとプローブとを用いて、同様のPCR及びサザンブロットを行い、異なる組織より得た等量のcDNAをNPY発現に関してアッセイしていることを示した。
［結果］
ラットY1神経ペプチド受容体遺伝子（Eva,C.ら、1990;GenBank受入れ番号Z11504）の第1、第2、第3、第5、第7膜通過領域を認識するオリゴヌクレオチドプローブを使って、ヒト胎盤ゲノムライブラリを、低厳密度でのスクリーニングにかけた。ハイブリダイゼーション陽性クローン（約100から150）を分離し、プラーク精製し、サザンブロット及び配列決定により調べた。一つのクローン、hp25aには、ラットY1-由来のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする1.3kbのPstI断片が含まれおり、これをpUCベクタへサブクローニングした。DNA配列分析は、ラット及びヒトY1受容体遺伝子に対する相同性が最も大きいことを示した。このクローンは、終止コドンを含んだカルボキシ末端までの細胞内第3ループの一部をコードした、イントロンの無い遺伝子の断片である。
全長のクローンを得るため、全コード領域を含む、2.0kbのBamHi/EcoRIハイブリダイズ断片を発現ベクタにサブクローニングし、配列を決定した。発現ベクタ（hp25a/EXJと呼ぶ）中のゲノムの全長構築物は、680bpの予測5′UT及び205bpの予測3’UTを有する1127bpの蛋白質読み取り枠を含み、これは長さが375アミノ酸で分子量が約41,000ダルトンの蛋白質をコードしている。該蛋白質の親水疎水性分析は、7つの膜通過領域の推定トポグラフィと一致しており、G蛋白質結合受容体ファミリであることを示している。
一回目の配列決定により、クローンhp25a/EXJは、神経ペプチド受容体ファミリに見られる、いくつかの保存された構造的特徴／残基を含んでいることが明かになったが、これらの残基は：
TM1中の2つのグリシン残基とアスパラギン残基（それぞれ図2の55、58、及び59位）；
TM2中のアスパラギン残基、ロイシン残基、及びアスパラギン酸残基（それぞれ図2の82、83、及び87位）；
TM3中のセリン残基とロイシン残基（それぞれ図2の128、及び132位）；
TM4中のトリプトファン残基とプロリン残基（それぞれ図2の164、及び173位）；
TM5中のチロシン残基とプロリン残基（それぞれ図2の223、及び226位）；
TM6中のフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、及びプロリン残基（それぞれ図2の275、279、及び281位）；
TM7中のセリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、及びプロリン残基（それぞれ図2の315、316、319、及び320位）である。
ヒトhp25a受容体遺伝子に関するその他の特徴は、アミノ末端のN-連結型糖鎖付加が可能な部位が3つ（図1の2、19、29位のアスパラギン残基）あること、カルボキシ末端にセリン及びスレオニンがあること、更にプロテインキナーゼによるリン酸化の部位になることが可能な細胞内ループがあることである。
クローンhp25a/EXJのヌクレオチド及びペプチド配列を、GenBank/EMBLのデータベースに登録されているものと比較して、該クローンが、ラット、マウス、ヒトY1受容体遺伝子及び蛋白質と最も関連していることがわかった（図2を参照）。hp25aクローンは、ヒトNPY-1に対してアミノ酸配列全体で42％の相同性があり、hp25aとY1の膜通過領域のみを比較する場合には、55％の相同性がある。hp25aとY1との間でのTM領域のアミノ酸を比較すると、7つのTM領域における相同性は、それぞれ＜30％、57％、57％、57％、52％、63％、71％であることがわかる。hpa25aクローンとハイブリダイズするのは、ラット由来TMプローブ群のうちのTM7特異的プローブのみであるが、これはラットY1受容体のTM7領域のアミノ酸と最も高い相同性をもつhp25aクローンと一致するライブラリのスクリーニングに元々使われたものである。
rs16bと呼ばれる、ヒトY4受容体のラットの相同体を、ヒトY4受容体の膜通過領域由来のプローブを使って、ラットの脾臓ゲノムライブラリから分離した。rs16bのヌクレオチド配列は、そのコード領域においてヒトY4受容体のヌクレオチド配列と80％の相同性を有し、全長375アミノ酸（図3）からなる蛋白質をコードする。rs16bクローンは、ヒトY4のアミノ酸配列と全体で75％の相同性を有し、また推定の膜通過領域に関するかぎり、rs16bがコードすると予測される蛋白質は、ヒトY4受容体と84％の相同性を有する。このアミノ酸一次配列の相同性の程度は、種の相同体群に典型的に見られるものよりは低く、ラットとヒトのY4受容体は、機能的な変異体を表現しているとも考えられる。第5及び第6TM領域の間の推定細胞内ループは特に多様であり、ラットとヒトのY4の間でわずか54％の相同性しか示さない；この領域の多様性は、ラット及びヒトの受容体との間におけるG蛋白質結合における差異を潜在的に仲介し得るであろう。ラット及びヒトY4受容体の一次配列はまた、カゼインキナーゼIIリン酸化、N-ミリストイル酸付加（N-myristoylation）、及びプロテインキナーゼCリン酸化の配列モチーフのパターンにおいて差異を示す；これらの部位は、前記の二つの受容体の機能もしくは制御における差異を潜在的に仲介し得るであろう。
hp25a受容体をコードした遺伝子を一過性発現したサルの腎臓細胞を使って、薬理学的評価を行った。一過性の形質転換をしたCos-7細胞から回収した膜は、高親和性で、飽和可能な［12 5I］PYY結合を示した。特異的結合の経時変化を、0.06nMの12 5I-PYY存在下で測定した（図5）。結合曲線は単一相的であり、測定された結合速度（Kob s）は0.12±0.02min-1、及びt1/2は6分であった；結合の平衡は26分で95％完了、50分以内で100％完了した（n=3）。比較のため、COS-7細胞で一過性発現しているヒトY1受容体への結合の経時変化も測定した。結合曲線は、単一相的であり、測定された結合速度（Kob s）は0.06±0.02min-1、及びt1/2は12分であった；結合の平衡は51分で95％完了、90分以内で100％完了した（n=3）（データ非掲載）。hp25aとヒトY1受容体への標識済みリガンドの異なる結合パターンは、受容体／リガンド相互作用の新規の機序を示唆する。
見かけのKdを0.11±0.01mM、及び見かけのBma xを1.42±0.05pmol/mg膜蛋白質として、12 5I-PYYの飽和結合データを一部位（one-site）モデルに適合させた。これは、一細胞あたり約1.4 X 105受容体に相当する（n=4；図6）。形質転換の効率が20から30％だとすると（データ非掲載）、形質転換細胞上の受容体密度は、おそらく7 X 105／細胞に近い値であろう。hp25aで形質転換した細胞を使ったときのように、疑似形質転換した細胞（mock transfected-cells）から膜を調製して分析すると、12 5I-PYYの特異的結合は見られなかった。上記の条件下での12 5I-PYY結合部位は、hp25a構築物由来であると結論づけられる。
hp25aの薬理学的特性を膜結合アッセイで定義した。該受容体を、Y1、Y2、Y3、及びPPが含まれている膵臓ポリペプチドファミリ受容体の、よく特徴づけられた性質に関して調べた。いくつかのペプチド類縁体に対する親和性の度合いの評価は、12 5I-PYYの競合的置換から求めた（図7及び表2）。hp25a受容体を、下記の二つのモデル系と比較した：
1）COS-7細胞中で一過性の発現をした、ヒトY1受容体クローン（Larhammarら、1992；Herzogら、1992）、
2）ヒトSK-N-Be（2）神経芽種細胞（Wahlestedtら、1991；Dumontら、1992）が発現する、Y2様受容体の集団。
ヒトY3及びヒトPP受容体に対するモデルは記述されていない。
PPはhp25aに対して、非常に高い親和性、及び劇的な選択性で結合した（Ki=0.029nM）。PPはhp25aに対して、ヒトY1受容体に対するとき（Ki=200nM）及びSK-N-Be（2）受容体に対するとき（Ki＞300nM）と比較して、6000倍以上の選択性があった。この特徴は、hp25aが生体内でPP受容体として選択的に機能できることを示唆している。しかしながら上記データは、hp25aがヒトNPYに非常によく結合し（Ki=1.4nM）、またヒトPYYに対しては更によく結合する（Ki=0.62nM）ことを示した。これらのKi値はPPに対するものよりも低いが、種々の生理学的及び薬理学的実験（Dumont、1992）でのNPY及びPYYの有効濃度に匹敵する。我々の研究では、SK-N-Be（2）受容体は、ヒトNPY及びヒトPYYに対して、hp25aと同じ順位序列（rank order）で結合したが、おおよそ5から10倍親和性度が高く、一方、ヒトY1受容体はヒトNPY及びヒトPYYに対して逆の順位序列で、5から30倍、親和性が高く結合した。カルボキシ末端のアミドを加水分解して、遊離型のヒトNPYのような遊離型のカルボン酸にすると、全ての受容体に対する結合性が損なわれる。カルボキシ末端アミドが必要であることは、膵臓ポリペプチドファミリのペプチド／受容体の結合の全てにおいて共通した構造的特徴であるようだ。
Fuhlendorffらは、NPYのILe31とGln34を、PPの対応するそれぞれ残基と置換して、Y1受容体をY2受容体から識別するのによく用いられる、［Leu31、Pro34］NPYを作成した（Fuhlendorff、1990）。ヒト［Leu31、Pro34］NPYは、ヒトY1受容体に対して、SK-N-Be（2）よりも＞2300倍の選択性を表した。ヒト［Leu31、Pro34］hp25aに対してNPYは（Ki=0.60nM）、ヒトNPY（Ki=1.4nM）よりも良いリガンドである。これはおそらく、［Leu31、Pro34］NPYが31及び34位でPPに似ていることを反映しているためである。一方、［Leu31、Pro34］NPY類縁体は、ヒトY1受容体に十分許容（Ki=0.13nM）されるが、親ペプチド（Ki=0.049nM）よりも好ましいわけではない。
hp25aは、N末端を欠損したNPY及びPYYに対して、ヒトY1受容体よりも低い、中程度の選択性を有する。ブタのNPYからTyr1を取り除くと、ヒトY1受容体に対する親和性が、全長の親ペプチドの時と比較して29倍低下した。同様の修飾をhp25a受容体及びSK-N-Be（2）受容体に対して施すと、それぞれ4倍、3倍だけ親和性が低下する。この点に関して、ヒトPPがAla1を有することは興味深い。NPYのTyr1は受容体認識においてそれほどの機能を担っていない可能性がある。欠損により作成したNPY13-36は、ヒトY1受容体に対して1000倍、hp25aに対して33倍、及びSK-N-Be（2）受容体に対して4倍だけ親和性が低下した。更に欠損を施したブタNPY22-36は、ヒトY1受容体に対して3500倍、hp25aに対して120倍、及びSK-N-Be（2）受容体に対して11倍だけ親和性が低下した。この点においては、ブタNPYのN末端領域が受容体認識において少しだけ関わるとすると予期されるように、hp25a受容体はY1様及びY2様の薬理学的特徴を共に有している。
ヒトPP、ヒトPYY、及びヒトNPYの間の重要な構造的差異は、ヒトNPY及びヒトPYYの双方がGln34を有するのに対し、ヒトPPはPro34を有するということである。NPYのGln34を（［Leu31、Pro34］NPY類縁体のように）Pro34で置換すると、ヒトY4受容体に対する結合親和性が上昇した。PYYにおけるGln34をPro34で置換すると結合親和性における同様の上昇がみられ、これはPP様のペプチドがY4受容体に好まれるという提案を支持する。しかしながら、ヒトPPにおけるPro34をGln34で（［Ile31、Gln34］のように）置換したときには、PP結合親和性においてほとんど変化がないことより、PPの場合は、ペプチド構造の他の領域が結合親和性に対して顕著な貢献をしていることが示唆される。
発明者らは、更にヒトPP断片（PP2-36、PP13-36、PP20-36、PP27-36）に関しても構造／活性データを拡張した。PPの結合は、N末端を欠損させたPP2-36では影響を受けないが、更に欠損させたPP13-36では影響を受け、これ以上の欠損では結合がなくなった。調べたなかで最も短いPP断片であるPP31-36は、Ki=350でY4受容体に選択的に結合し、またNPYに対して前記したように、C末端アミドの加水分解は結合にとって有害であった（ヒトPP31-36遊離酸に対して、Ki＞10,000nM）。我々は、PPのY4に対する結合が、以下の点においてNPYのY1受容体に対する結合に似ていると結論する：
1）Pro34は十分に許容される；
2）ペプチドの両末端は最適な結合活性にとって必要である。これは、Y2の結合モデルとは以下の点において対照的である；
a）Pro34は、許容されない；
b）NPYのN末端は、結合活性に顕著な貢献をしない。
更に、Y2-選択的リガンドであるヒトPYY3-36及びC2-NPYは、ヒトY4受容体に対して相対的に低い親和性を持つことに注意されたい。
更に、テトラペプチド無脊椎動物神経伝達物質であるPhe-Met-Arg-Phe-アミド（FMRF-アミド）の結合についても調べた。このペプチドは、ラットにおける摂食の刺激（Robert、1988）を含む、NPYのいくつかの機能に似ていることが示されている。
FMRFアミドは、Ki値が4000nMで、Y4受容体に対して選択的に結合した。近縁の誘導体であるPhe-Leu-Arg-Phe-アミド（FLRFアミド）は選択性を維持したまま、Y4への結合親和性が改善された（Ki=750nM）。更に、［D-Trp32］NPYの結合についても調べた。このペプチドは、ラットの視床下部に注射すると摂食を刺激し、またNPY-誘導性の摂食を同じ規範において減少させることが報告されている（Balasubramaniam、1994）。［D-Trp32］NPYは、ヒトY1及びY2受容体サブタイプに対するのと同様に、Y4受容体に対しても相対的に低い結合活性を有する。上記した及び上記されていないペプチドに関するデータは、親出願には記述されていないので、表3に記載する。
形質転換していないNIH-3T3及びLM（tk-）を特異的12 5I-PYY結合に関してプレ・スクリーニングにかけて、陰性であることが判明した（データ非掲載）。ヒトY4 cDNA及びG-418抵抗性遺伝子による共形質転換、及びG-418による選択の後、生存コロニーを、特異的12 5I-PYY結合でスクリーニングにかけた。2つの陽性コロニーを同定して、以後の研究のために単離した（NIH-3T3 hY4クローン＃5及びLM（tk-）hY4クローン＃3）。NIH-3T3の安定クローンより分離した膜に対する12 5I-PYYの結合は、ラベルしたリガンドの濃度が0.5pMから2.5nMの範囲において飽和可能であった。結合データは、見かけのKdを0.17nM±0.005、受容体密度を350±80fmol/mg膜蛋白質として（平均±s.e.m.,n=2）、一部位結合モデルに適合させた。前記LM（tk-）クローンは、一次選択のスクリーニングの間、推定で7fmol/mg膜蛋白質の受容体密度を有し、飽和アッセイによる分析は行わなかった。
ここまででに記述した全てのY型受容体の活性化は、アデニレート・シクラーゼ活性（GiもしくはGO）を阻害する百日咳毒素-感受性G-蛋白質へのカップリングを伴うと考えられている（WahkestedtとReis、1993）。これら従来の知見に基づき、ヒトY4受容体を安定に発現したLM（tk-）細胞における、フォルスコリン刺激性のcAMP蓄積を阻害するPPの能力を調べた。生細胞を10μMのフォルスコリンと共にインキュベーションして、ラジオイミュノアッセイで調べると、5分間以上に亘ってcAMPの蓄積が約10倍になった。ヒトPPと共に同時にインキュベーションすると、安定な形質転換LM（tk-）細胞において、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積は67％減少したが（図8）、非形質転換細胞では減少しなかった（データ非掲載）。発明者らは、ヒトY4受容体が活性化すると、おそらくアデニレート・シクラーゼ活性が阻害されて、cAMP蓄積の減少が起きると結論している。
一過性発現したヒトY4受容体への結合能力で選択されたペプチドのヒトY4受容体活性化能を、cAMPアッセイで調べた（表4）。ヒトPP及びヒトPP2-36は共に、Y4受容体に対してKi値が0.06nMで結合し、cAMPアッセイにおいてそれぞれが匹敵する活性を有し、EC50値がそれぞれ0.09nM及び0.08nMと非常に近い値をとることに注意されたい。欠損型のPP断片であるPP27-36及びPP31-36は、結合アッセイでは相対的に弱いリガンドであり、全長のPPと比較して、フォルスコリン刺激によるcAMPの減少に対する効果が50％以下であったため、部分的作用薬として機能した。同様に、NPYとPYYの両方は（主としてPPのN末端領域から由来）、それらのKi値よりも10倍以上高いEC50値を生じた。それゆえに受容体の活性化は（結合の場合よりも更に）、PPのN末端構造に非常に依存している。また、報告されている摂食行動調節因子である［D-Trp32］NPYの機能活性についても調べた。ヒトY4受容体に対するこのペプチドの低い結合親和性と一致して、このペプチドの機能活性は、0.3uMまで濃度を上昇させても（表4参照）、PP機能応答の競合作用を0.3uMで試験した時でも（データ非掲載）検出されなかった。
細胞内遊離カルシウム濃度は、ヒトY4受容体で安定に形質転換されたLM（tk-）内において、100nMのヒトPPを加えた後に、顕著に上昇した（Δ［Ca2+］=325nM、図9）。100nMのNPYへの応答は相対的に低かった（Δ［Ca2+=68nM）。非形質転換LM（tk-）細胞は、どちらのペプチドに対しても応答はなかった（データ非掲載）。ヒトPPを、濃度／応答カーブにおいて更に分析すると、最大Δ［Ca2+］iは334nMで、EC50は35nMであった（図9の差し込み部分）。NPYよりもPPがより大きい活性を有することは、上記の結合及びcAMPアッセイにおいて判明した薬理学的特徴と一致している。それゆえにカルシウム動員アッセイは、Y4受容体の活性化を測定する第2の経路を提供する。
Y4mRNAは、ヒトの広い範囲の組織で、PCR技術により検出され、これは脳全体、心臓動脈、回腸において比較的強いハイブリダイゼーションシグナルが検出されて、CNS機能、心臓血管系制御、及び消化器系生理学におけるY4受容体の潜在的役割を示唆した（表5）。
ラットY4相同体に対応するcDNAをCOS-7細胞で一過性発現させて、膜結合を調べた。12 5I-PYYのラットY4受容体に対する結合は、ラベルしたリガンドの濃度が0.5pMから2.5nMの範囲において飽和可能であった。結合データは、見かけのKdを0.15nM±0.005、受容体密度を275±3fmol/mg膜蛋白質として（平均±s.e.m.,n=2）、一部位結合モデルに適合させた。膵臓ポリペプチドファミリのなかのペプチド類縁体を使った測定によると、ラットY4の薬理学的特徴は、ヒトY4受容体に対する類似性を有する；しかしながら、カエルPP、サケPP、ヒトPP31-36、及びニワトリ（avian）PPを含んだいくつかの興味深い例外があり、これらのそれぞれは、ラットとヒトの受容体サブタイプ間を10倍程度の差で区別した（表6）。この差は、PPの場合、NPYやPYYほどには種間で保存されていないという事実を反映していると考えられる；それゆえに、PPの種相同体は、リガンド結合に関してより多様性を表すであろう。
要約すると、ヒトY4受容体及びラットY4受容体は、神経ペプチドに特異的な特徴を表し、それぞれがNPYやPYYではなくPPに対して最適な結合をするという点において、最も近縁のY1やY2とは異なった特徴を有していた（表1、2、及び6参照）。Y1及びY2受容体モデルとは異なり、Y4受容体は3つのペプチドリガンド全ての適正な標的であることがわかる。
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［考察］
出願人らは、ヒトゲノムDNAから新規のヒト神経ペプチドであるY/ペプチド、YY/膵臓ポリペプチド（Y4）を発現するDNAをクローニングした。既知の全てのG蛋白質結合受容体配列（EMBL/GenBankデータベース）のなかでは、hp25a遺伝子とY1受容体遺伝子との間に、最も高い相同性があった（マウス--Evaら、1992；ラット--Evaら、1990；ヒト--Larhammarら、1992）。ヒトhp25aの推定アミノ酸配列を既知のG蛋白質結合受容体配列と比較すると、同じアミノ酸が膜通過領域に最も高率で存在することがわかる。このTM領域において、hp25aクローンの相同性は、ヒトY1に対して55％、ペプチドサブファミリの他のメンバー及び他のG蛋白質結合受容体サブファミリに対しては35%以下である。このヒトhp25a配列を、他のG蛋白質結合受容体や神経ペプチド受容体サブファミリの他のメンバー、特にヒトY1に対して整列させると、ユニークな配列であることがわかり、hp25aが新規の受容体であることを証明する。hp25aのY1に対する相同性は、hp25aがNPY/PYY/PP受容体ファミリに関連していることを示す。
hp25aヒト受容体配列は、rs16bラットY4受容体配列に対して、ヒトY1受容体のような他のY型受容体に対するよりも、全体及び膜通過領域における高い相同性を示すが、ラットY4及びヒトY4との間の多様性は、これら二つの受容体の薬理学的活性の差に貢献している可能性がある。Y4受容体のラットにおける相同体を分離することによって、ラットとヒトとのY4受容体（以下参照）の薬理学的性質を、一次構造に見られる差異との関係において比較する方法が提供される。これらのデータは、これらの部位で作用するヒトの治療薬を設計して試験するのに重要となるであろう。
hp25aヒトY4受容体のユニークな薬理学的性質は、この受容体がサブタイプ選択的リガンドの開発の新規標的となり得ることを示唆する。競合的置換実験は、ヒトPPがhp25aに対しての好ましいリガンドであることを示している。この受容体はまた、ヒトPPと47％以上のアミノ酸相同性を有する、ヒトNPY及びヒトPYYに対して高親和性で結合する。親和性は、［Leu31,Pro34］NPYのときのように、NPYをPPに近似するように修飾させると増強される。NPYのC末端断片で親和性が低下していることは、N末端領域及びC末端領域の両方が、hp25a受容体認識に貢献することを示唆している。hp25aは、NPYのN末端欠失に関して、ヒトY1受容体よりも感受性がない。Y1及びhp25aの両方が、それぞれNPYまたはPPのどちらかに対して最適化された、ペプチド相互作用の機序を共有すると推測するかも知れない。
薬理学的データは、ヒトPPに対するよりもヒトNPYに対するほうが結合の選択性が4000倍以上であるY1受容体に、hp25aを分類することを支持しない（表2）。また、該データは、NPYのN末端の欠損は許容するが、Gln34をPro34で置換することは許容しないY2受容体に分類することも支持しない。最後に、該データは、hp25aをY3受容体として分類すること支持できないが、これはPPやPYYに対してよりもNPYに対するほうがより高い親和性を示す（Wahlestedtら、1991）と期待できるからである。それゆえに、出願人らはhp25a受容体をY4受容体として命名している。
ここに含まれる追加のデータは、受容体-リガンド相互作用の理解が進んだことを反映している。Y4受容体の薬理学的特徴づけを更に行うことによれば、たとえばヒトNPY（Ki=2.2nM）またはヒトPYY（Ki=0.87nM）への結合親和性は、ヒト［leg、Pro34］NPY（Ki=1.1nM）または［Pro34］PYY（Ki=0.14nM）への変換によって増強されることが示された。この情報は、Pro34-はペプチドのファルマコフォア（Phamacophore）において重要であり、また代謝的に安定な、Y4選択的な非ペプチドリガンドの設計に取り入れられる可能性がある。更に、該データは［Pro34］PYYがY1選択的リガンドと記載されている文献を再評価することを促す。我々の結果によると、［Pro34］PYYは、クローン化したヒトY1及びY4受容体（それぞれKi=0.12、0.14nM）を区別できず、［Pro34］PYYは受容体サブタイプを分離して定義するのに使うことはできない。
他の非常に興味深いペプチドには、FMRF-アミド、FLRF-アミド及び、［D-Trp32］NPYが含まれる。FMRF-アミド及び［D-Trp32］NPYは両方とも、ラットにおいて摂食を調節することが示されている（George Mより文献入手）。FMRF-アミド及びその誘導体は幾分かのY4受容体選択性を示すが（ヒトPPに対しては相対的に低親和性であるが）、［D-Trp32］NPYは調べた全てのY型受容体サブタイプに関して本来不活性である。NPY-誘導性摂食の受容体機序を確認するために努力する際には、これらの特徴を考慮しなくてはならない。テトラペプチドFLRF-アミドは、Y4選択性を持った小型の非ペプチド性化合物を設計する出発点としての付加価値がある。
出願人らは、現在、Y4受容体を発現するための選択可能な系を数種類有しており、それぞれは、異なる研究課題に個別に適している。COS-7細胞での一過性発現系により、通常の構造／活性関係の研究用に十分な量の膜を作成することができる。出願人らはまた、部位特異的突然変異導入やその他の方法で、受容体の変異体を合成してCOS-7細胞内で一過性の発現をさせて、野生型との薬理学的性質の比較を行うことができる。このようにして、受容体結合ポケット、リガンド結合領域、及び活性化機序に関しての洞察を得ることができる。一過性の発現系では、細胞もしくは膜回収の度に新たな形質転換を行う必要があるが、安定な形質転換系では、一回だけの形質転換ステップとそれに続く通常の継代技術だけの至便性が提供される。安定系は更に、受容体密度を選択する機会を提供するが、これはY4受容体リガンドの本質的な活性を評価するのに重要な因子である。
安定発現したY4受容体の出願人らの解析によって、今や、Y4受容体が単一細胞種におけるcAMP制御及びカルシウム動員の両方と同時にカップリングしていることが明確に示されている。カルシウム応答のEC50は、cAMP応答に対するEC50よりも顕著に大きく、このことは、カルシウム動員はシクラーゼ制御に必要なものではなく、受容体のG蛋白質へのでたらめなカップリングを反映していることを示唆している。機能アッセイは、作用活性及び競合活性をそれぞれ受容体選択性化合物に割り当てて、それによって薬剤設計のための重要な道具を提供する。
hp25aをPP受容体として分類できるかどうかという問題が起きるのはもっともなことである。出願人らの知るかぎり、ヒトPP受容体はこれまでに記載されていない。それゆえに、ラットPP受容体を比較の為に参照しなくてはならない。ラットPP受容体は、PP及び類縁体に対して、hp25aと同じ順位序列で結合した（PP>［Leu31,Pro34］NPY>NPY）（Schwartzら、1990）。ラットPP受容体はまた、ペプチドリガンドのN末端及びC末端領域の両方に結合することがわかっている（Schwartzら、1987）。hp25a及びラットPPの間のはっきりしない違いは、後者にはNPYに対するよりもPPに対する選択性が＞10,000倍あるということである（Schwartzら、1990）。
出願人らの局在化実験において、Y4mRNAは、広い範囲のヒト組織においてPCR技術により検出された。脳全体、心臓動脈、回腸において比較的強いハイブリダイゼーションシグナルが検出されて、CNS機能、心臓血管系制御、及び消化器系生理学におけるY4受容体の潜在的役割を示唆した。局在化のパターンは以前に報告された、以下のPP仲介性の効果と一致している：
1）脳幹部における効果（McTigueら、1993；Whitcombら、1990）、
2）動脈血圧への効果（Wager-Pageら、1993a）、
3）胃酸分泌及び胃腸運動への効果（McTigueら、1993；Wager-Pageら、1993b）。
Y4受容体及びmRNA発現のより決定的な局在化（すなわち腸の細胞（enterocyte）、血管平滑筋、神経細胞等においてかどうか）は、in situのハイブリダイゼーション及び受容体オートラジオグラフィーにより決定することができる。出願人らの知るかぎり、結合または機能の研究によって得られた、ヒトの組織でのPP受容体の局在化に関する報告はない。しかしながら、ここに述べたヒトY4マクロ局在化データと、ラットのPP受容体の特徴づけとを比較することは有益であるかも知れない。たとえばPP受容体は、最後野（area postrema）、脚間核、背内側核、及び孤束核等の脳幹核において発現していて（Whitcombら、1990）、これはヒトの脳におけるY4mRNAの同定と一致している。ラットの脳幹のPP受容体は、循環しているPPに接近できるが、該循環PPは摂食中の膵臓における迷走神経性刺激によって放出される（Whitcombら、1990）。脳幹のPP受容体の活性化は、更に膵臓の分泌を阻害し、胃酸分泌を増加させ、消化器運動を増進し、胃内容排出時間を増大させる（Louieら、1985；McTigueとRogers、1993）。そうすると、Y4受容体の競合剤は胃内容排出時間を遅くし、摂食量を減少させる可能性が期待される。
報告済みのPP受容体及びhp25aヒトY4受容体の間の薬理学的特徴に相同性があるとすると、hp25aをヒトPP受容体と呼びたくなるであろ。しかしながら出願人は、hp25aをヒトPP受容体と呼ぶと誤解を生じるであろうと考えている。なぜなら、PP、PYY、NPYの親和性域が比較的狭い範囲にあるために、hp25aがこれら3つのペプチドリガンド全てに対しての潜在的な標的になるからである。もっと局在化の実験を行えば、hp25a及びPP受容体との間の関係を解明することが可能であるかも知れない。
出願人は、hp25aをY4受容体とすることを提案している。この名称は、膵臓ポリペプチドファミリの何れか一つのメンバーに偏ってはいない。「Y」の語源はY1及びY2受容体サブタイプの元々の分類に由来する（Wahlestedtら、1987）。この文字は、アミノ酸の一文字標記で「Y」と書かれるチロシンが、膵臓ポリペプチドファミリのメンバーのC末端に保存されていることを反映している。出願人らは、Larhammarとかれの共同研究者らが、クローン化ヒトY1受容体を、「ヒト神経ペプチド、Y/Y1タイプのペプチドYY受容体」として、親和性度の順位序列を列記したペプチドリガンドと共に紹介していることに注目している（Larhammarら、1992）。同様に、hp25aはY4タイプのヒト膵臓ポリペプチド／ペプチドYY/神経ペプチドY受容体と記述される。
出願人らの知るかぎり、hp25aは、Y1以外のサブタイプファミリからクローニングされた最初の「Yタイプ」受容体である。ウシの脳からクローニングされたと報告済みのY3受容体（Rimlandら、1991）は後に、間違いであったと記述された（Jazinら、1993；Herzogら、1993）。Y2様受容体（PR4）はショウジョウバエから分離されて、哺乳類の相同体であるNPYを使って特徴づけがされた（Liら、1992）；しかしながら、この受容体の分類には問題がある。この受容体は相対的にNPYに対して感受性がなく、PR4mRNAを注射した卵母細胞でのカルシウム動員を惹起するためには、0.3から10μMの濃度域を必要とする（Liら、1992）。この受容体はまた、哺乳類系で見られたものとは異ったNPY類縁体に対する効能の順位序列を有している（Wahlstedtら、1993；Liら、1992）。更に、NPY類縁体はショウジョウバエからは分離されていない（Wahlstedtら、1993）。未同定のリガンドが、ショウジョウバエにおいてPR4をNPY等よりも容易に活性化する可能性があり、該受容体は結果的に再分類されるかも知れない。
Y4（hp25a）のクローニングと発現は、膵臓ポリペプチドファミリによって仲介される種々の生理学的工程を分析する能力を太きく前進させる。PP、PYY、またはNPYの結合部位は、神経筋接合部、平滑筋、胃主細胞、腸の腸細胞（enterocytes）、腎臓の近位尿細管、及び脂肪細胞等の末梢標的において解剖学的に広く分布している（Dumontら、1992；Castanら、1992）。それゆえに、これらの受容体は、認識、概日周期、EEG同調、体温、血圧、歩行活動、神経内分泌放出、性／生殖行動、摂食、交感神経活性化、感覚伝達、消化器系機能、腸内分泌、腎性吸収（renalabsorption）、及び心臓血管機能などの種々の生理学的機能を潜在的に制御する地位を占めている（Wahlstedtら、1993）。
Y4受容体は薬剤の設計において有益な資源である。膵臓ポリペプチドファミリは、記憶喪失、憂鬱、不安、てんかんの発作、痛み、高血圧、歩行障害、概日周期障害、摂食／体重障害、性／生殖障害、鼻のうっ血、及び下痢等のいくつかの病態生理学的状態に潜在的に関わる（Wahlestedtら、1993；Dumontら、1992）。入手可能なデータによれば、この受容体は肥満や、大食症及び食欲不振を含むその他の摂食障害の制御に関係がある。Y4のみならず、その他の「Yタイプ」受容体の選択的薬剤の化学的な合成は、ヒトY4受容体クローンの均一なポピュレーションに対するスクリーニングによって大きく加速されるであろう。受容体機能を確かめるための、より特異的な薬理学的道具が手に入るにつれて、さらなる治療の兆候が発見されるであろう。
出願人らは、hp25aがヒトのゲノムで発現されている単一のY4受容体であるかどうかを知らないし、構造的に関連したY4受容体サブタイプが存在するかどうかも知らない。これは、Y4受容体からのヌクレオチド配列を、in situの局在化、アンチセンス、もしくは「ノックアウト」戦略、相同性クローニング、及び関連技術を用いて解決できる問題である。このような方法は、薬理学的及び治療的重要性を持った、潜在的に新規的な受容体サブタイプの存在を調べることを可能にするであろう。
結論すると、hp25a（Y4）遺伝子及びラットにおけるその相同体がコードしている蛋白質の一次構造は、Y4受容体サブタイプのユニークな薬理学的特徴と同様に、これらの遺伝子が新規の膵臓ポリペプチドサブファミリであることを示している。この新規に認識された神経ペプチド受容体ファミリの別のメンバを分離するためには、さらなるクローニングが必要となるだろう。
［参考文献］
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配列表
（１）一般的情報
（i）出願人：Bard,Jonathan A.
Walker,Mary
Branchek,Theresa
Weinshank,Richard L.
（ii）発明の名称：ヒト神経ペプチドY/ペプチドYY/膵臓ポリペプチド受容体（Y4）をコードしたDNA、及び該DNAの使用
（iii）配列の数：28
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：クーパー  ＆  ダンハム
（B）通り：1185  アベニュー  オブ  アメリカズ
（C）市：ニューヨーク
（D）州：ニューヨーク
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：10036
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC コンパチブル
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PastentIn リリース＃1.0  バージョン＃1.25
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：White,John P.
（B）登録番号：28,678
（C）参照／ドケット番号：44743-A-PCT＼JPW＼MAT
（viii）電信情報：
（A）電話：（212）278-0400
（B）テレファックス：（212）391-0525
（２）配列認識番号1のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：1320塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：88..1212
（xi）配列の記載：配列認識番号1
0004216326.tif 000025
0004216326.tif 000026
0004216326.tif 000027
（２）配列認識番号2のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：375アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列の記載：配列認識番号2
0004216326.tif 000028
（２）配列認識番号3のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号3
0004216326.tif 000029
（２）配列認識番号4のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列の記載：配列認識番号4
0004216326.tif 000030
（２）配列認識番号5のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号5
0004216326.tif 000031
（２）配列認識番号6のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列の記載：配列認識番号6
0004216326.tif 000032
（２）配列認識番号7のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：54塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号7
0004216326.tif 000033
２）配列認識番号8のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：54塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列の記載：配列認識番号8
0004216326.tif 000034
（２）配列認識番号9のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：42塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号9
0004216326.tif 000035
（２）配列認識番号10のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：42塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列の記載：配列認識番号10
0004216326.tif 000036
（２）配列認識番号11のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：48塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号11
0004216326.tif 000037
（２）配列認識番号12のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：48塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列の記載：配列認識番号12
0004216326.tif 000038
（２）配列認識番号13のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：47塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号13
0004216326.tif 000039
（２）配列認識番号14のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：46塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号14
0004216326.tif 000040
２）配列認識番号15のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号15
0004216326.tif 000041
（２）配列認識番号16のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号16
0004216326.tif 000042
（２）配列認識番号17のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号17
0004216326.tif 000043
２）配列認識番号18のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号18
0004216326.tif 000044
２）配列認識番号19のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号19
0004216326.tif 000045
（２）配列認識番号20のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号20
0004216326.tif 000046
（２）配列認識番号21のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号21
0004216326.tif 000047
（２）配列認識番号22のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号22
0004216326.tif 000048
（２）配列認識番号23のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：46塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号23
0004216326.tif 000049
（２）配列認識番号24のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号24
0004216326.tif 000050
２）配列認識番号25のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号25
0004216326.tif 000051
（２）配列認識番号26のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：45塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列の記載：配列認識番号26
0004216326.tif 000052
（２）配列認識番号27のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：1439塩基
（B）型：核酸
（C）鎖：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：178..1306
（xi）配列の記載：配列認識番号27
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0004216326.tif 000055
２）配列認識番号28のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：376アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列の記載：配列認識番号28
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【図１−１】
0004216326.tif 000058
【図１−２】
0004216326.tif 000059
【図１−３】
0004216326.tif 000060
【図１−４】
0004216326.tif 000061
【図１−５】
0004216326.tif 000062
【図２−１】
0004216326.tif 000063
【図２−２】
0004216326.tif 000064
【図２−３】
0004216326.tif 000065
【図３−１】
0004216326.tif 000066
【図３−２】
0004216326.tif 000067
【図３−３】
0004216326.tif 000068
【図３−４】
0004216326.tif 000069
【図４】
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【図５】
0004216326.tif 000071
【図６Ａ】
0004216326.tif 000072
【図６Ｂ】
0004216326.tif 000073
【図７】
0004216326.tif 000074
【図８】
0004216326.tif 000075
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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