(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号：１で示される塩基配列の１番目から３４５０番目の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号：１で示される塩基配列の２２１２番目から６２７５番目の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの一部であって、Ｎ末端のアミノ酸配列がアミノ酸配列の１番目から始まり、分子量が１３０ｋＤａであるポリペプチド。
【請求項５】
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドであって、赤血球凝集抑制抗体を誘導し及び／又は鶏伝染性コリーザを阻止する、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列からなり、赤血球凝集抑制抗体を誘導し及び／又は鶏伝染性コリーザを阻止することを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
該ポリペプチドが遺伝子組換え技術により得られる組換え型ポリペプチドであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項９】
配列表の配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】
配列表の配列番号：１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが赤血球凝集抑制抗体を誘導し及び／又は鶏伝染性コリーザを阻止することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１１】
配列表の配列番号：１で示される塩基配列の２２１２番目から６２７５番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片）又は配列表の配列番号：１で示される塩基配列の１番目から３４５０番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片）である、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
組換えＤＮＡ分子のベクターがプラスミド、ウイルスベクター及びコスミドよりなる群から選ばれる請求項１２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項８ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ又は請求項１２もしくは１３に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した形質転換体。
【請求項１５】
形質転換体が、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞よりなる群から選ばれる宿主である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドを認識することを特徴とする抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
ポリクローナル抗体である請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１４もしくは１５に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体に請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドを産生させ、ついで該ポリペプチドを精製することを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドを主成分とする鶏伝染性コリーザのワクチン。
【請求項２１】
請求項１４もしくは１５に記載の形質転換体を主成分とする鶏伝染性コリーザのワクチン。
【請求項２２】
請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチド、請求項８ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ、請求項１２もしくは１３に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１４もしくは１５に記載の形質転換体又は請求項１６ないし１８のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とするヘモフィルス・パラガリナルムの検出方法。
【請求項２３】
請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１４もしくは１５に記載の形質転換体又は請求項１６ないし１８のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とするヘモフィルス・パラガリナルムに対する抗体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は鶏伝染性コリーザを阻止するポリペプチドに関する。さらに詳細には、鶏伝染性コリーザを引き起こす因子であるヘモフィルス・パラガリナルム由来のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子及び該ポリペプチドを認識する抗体蛋白質に関する。本発明はさらに、該ポリペプチドの製造方法並びにワクチン、診断薬及び治療薬への利用に関する。
背景技術
家禽の重要な呼吸器官系疾病として伝染性コリーザがある。この鶏伝染性コリーザは、ヘモフィルス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum：以下、ＨＰＧと称することもある）の感染によって起こる急性呼吸器伝染病であり、鼻汁の漏出、顔面の腫脹あるいは流涙を主な症状とする。鶏伝染性コリーザは、家禽の育成率の低下、産卵開始の遅延、産卵率の低下あるいは産卵停止をもたらすため、その経済的損失は大きい。従来、鶏伝染性コリーザの予防には、ヘモフィルス・パラガリナルムを培養し、回収した菌体をホルマリン、チメロサール等で不活化したワクチンが広く応用されている。しかしながら、これらのワクチンを投与した場合、接種鶏の局所に壊死病巣を形成することが報告される（松本（Ｍ．Ｍatsumoto）および山本（Ｒ．Ｙamamoto）、Ａvian Ｄis．，１５：１０９−１１７、１９７１）など、ワクチンの副作用が問題となっており、安全性の高いワクチンの開発が強く待望されている。
また、近年、養鶏規模の拡大に伴って飼養管理の省力化が進められており、その一環としてワクチン接種に対する省力化の要望が強く、これに応えて、数種のワクチンを混合することにより接種回数を減らすことを狙った混合ワクチンが既に開発され、野外で広く用いられている。
混合ワクチンにおいて、注射量を増やすことなくそれぞれの単味ワクチンと同等の免疫原性を得るためには、混合するそれぞれの抗原量を増やすか、あるいは、良いアジュバントを探し用いることが必要となる。しかしながら、ＨＰＧのようなグラム陰性菌は、抗原量を増やした場合には、それに伴って接種局所の腫脹のような注射反応も強まる傾向がある。従って、菌体あるいは培養上清から感染防御抗原すなわち有効な成分（コンポーネント）のみを取り出すか、遺伝子組換え技術により感染防御抗原をコードする遺伝子をクローニングし、該遺伝子を細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等に発現させ、大量に発現した発現産物を精製し、これを他のワクチンとともに適当なアジュバントと混合する等して、上記の副反応を低減することが望まれる。
一方、ワクチン接種の省力化の方法として、ウイルスや細菌をベクターとして使用することも試みられている。すなわち、一つの弱毒ウイルスあるいは細菌に１ないし複数の病原体の感染防御抗原をコードする遺伝子を組み込むことで多価の生ワクチンを作製するという方法である。これまでに鳥類ではベクターとしてポックスウイルスやマレック病ウイルス等を使用した研究が実施されており、鶏痘ウイルスにニューカッスル病ウイルスのＨＮ及びＦ蛋白遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチンが実用化されている。
従って、これからの鶏伝染性コリーザに対する安全で有効なワクチンの開発には、コンポーネントワクチン、ベクターワクチンのいずれの場合においても、ＨＰＧの感染防御抗原を同定することが重要と考えられる。
ＨＰＧの感染防御抗原として赤血球凝集素（ＨＡ）、外膜蛋白などが報告されているが、その中でも、鶏にＨＰＧを免疫すると赤血球凝集抑制抗体（以下、ＨＩ抗体という）が上昇し、ＨＩ抗体が高い鶏ほど感染防御能が高いことなどから、ＨＡが最も重要な感染防御抗原と考えられている（大槻（Ｋ．Ｏtsuki）及び入谷（Ｙ．Ｉritani）、Ａvian Ｄis．，１８：２９７−３０４、１９７４及び久米（Ｋ．Ｋume）ら、Ｊpn．Ｊ．Ｖet．Ｓci．，４６：８４３−８５０、１９８４）。
ＨＰＧの血清型は凝集反応に基づいて、ページ（Ｐage）（Ａm．Ｊ．Ｖet．Ｒes．，２３：８５−９５、１９６２）によりＡ、Ｂ及びＣ型に、また沢田（Ｓawata）ら（Ｊpn．Ｊ．Ｖet．Ｓci．，４０：６４５−６５２、１９７８）により１型及び２型に型別されているが、ページのＡ型は沢田らの１型に、ページのＣ型は沢田らの２型に相当すると考えられている（久米ら、Ａm．Ｊ．Ｖet．Ｒes．，４１：７５７−７６０、１９８０及び沢田ら、Ａm．Ｊ．Ｖet．Ｒes．，４１：１９０１−１９０４、１９８０）。
久米らは、Ａ型（１型）菌にはＨＡ−Ｌ（易熱性、トリプシン感受性）、ＨＡ−ＨＬ（易熱性、トリプシン耐性）及びＨＡ−ＨＳ（耐熱性、トリプシン耐性）の少なくとも３種類のＨＡが存在すること及びこれらのうち、ＨＡ−Ｌのみが、通常行われている新鮮鶏赤血球に対するＨＡ活性以外に、グルタルアルデヒド固定鶏赤血球に対してもＨＡ活性を有し、且つ、Ａ型菌の感染防御に関与することを報告している（久米ら、Ｊpn．Ｊ．Ｖet．Ｓci．，４５：７８３−７９２、１９８３及び沢田ら、Ｊpn．Ｊ．Ｖet．Ｓci．，４６：２１−２９、１９８４）。また、入谷らは、Ａ型菌にはタイプ１ＨＡ＜易熱性、蛋白分解酵素感受性）及びタイプ２ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素耐性）の２種類のＨＡが存在し、このうち易熱性、蛋白分解酵素感受性で分子量約３９ｋｄのポリペプチドをサブユニットとするタイプ１ＨＡが感染防御に関与すると報告している（山口（Ｔ．Ｙamaguchi）及び入谷、Ｊpn．Ｊ．Ｖet．Ｓci．，４２：７０９−７１１、１９８０及び入谷ら、Ａm．Ｊ．Ｖet．Ｒes．，４１：２１１４−２１１８、１９８０）。久米らのＨＡ−Ｌ及びＨＡ−ＨＬは、それぞれ入谷らのタイプ１ＨＡ及びタイプ２ＨＡに相当すると考えられている。Ｃ型（２型）菌においても、沢田らは、易熱性、トリプシン感受性でグルタルアルデヒド固定鶏赤血球に対してＨＡ活性を示す抗原が存在し、Ａ型菌のＨＡとは抗原性を異にすると報告している（沢田ら、Ａm．Ｊ．Ｖet．Ｒes．，４３：１３１１−１３１４、１９８２）。しかしながら、入谷らが報告したＡ型菌の産生するタイプ１ＨＡを除いて、感染防御抗原は物質として明確に同定されていないのが現状である。
上述したように、従来のヘモフィルス・パラガリナルム菌体をチメロサール、ホルマリン等で不活化したワクチンを鶏に大量に使用した場合には、感染防御に関与する抗原以外に、菌体に由来する種々の物質が含まれているために、上記の様な副作用を生じるという問題点があった。
発明の開示
本発明者らは、かかる問題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌の培養液から、ＨＩ抗体産生を誘導し、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌による鶏伝染性コリーザを防御する該Ａ型菌に由来する分子量約１３０Ｋｄのポリペプチドを精製することに成功した。さらに、該Ａ型菌よりゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、この中から上記の１３０Ｋｄポリペプチドをコードする遺伝子断片をクローニングし、これを大腸菌にて発現させ、得られた該ポリペプチドがヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌による鶏伝染性コリーザを阻止することを見い出した。また、上記の１３０Ｋｄポリペプチドをコードする遺伝子断片をプローブとして用いてＣ型菌からも該ＤＮＡ断片とハイブリダイズする遺伝子断片をクローニングし、Ｃ型菌由来のポリペプチドを発現する大腸菌をも得た。
本発明は、ヘモフィルス・パラガリナルムを病因菌とする鶏伝染性コリーザに対する、副作用の少ない、より安全で、有効なワクチン及びその製造方法を提供する。
すなわち、本発明の目的は、ヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチド及びそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するペプチドを提供することにある。
本発明の他の目的は、ヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチド及びそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子及び該遺伝子を発現させるための組換えベクターを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、上記組換えベクターで形質転換された微生物又は細胞形質転換体から、ヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチド及びそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、かくして得られたヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なペプチド及びそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として作製されるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、上記のペプチド、ＤＮＡ断片、形質転換体、もしくは抗体の組み合わせによるヘモフィルス・パラガリナルム及び該菌体に対する抗体を検出する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、ヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチドに対する抗体を主成分とする鶏伝染性コリーザの治療剤を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
図１は、モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−４０、ＨｐｇＡ ５９−１８０、ＨｐｇＡ ５９−２８４）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あらかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−４０、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時期が遅れることを示す。
図２は、モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−３３、ＨｐｇＡ ５９−４８Ｂ、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あらかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時期が遅れることを示す。
図３は、モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−４８Ａ、ＨｐｇＡ ５９−１４５、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あらかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−１４５、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時期が遅れることを示す。
図４は、モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−１８８、ＨｐｇＡ ５９−２３６、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あらかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時期が遅れることを示す。
図５は、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９−１８０）をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製したＨＰＧｐ１３０ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した後、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。
図６は、ａ）２−メルカプトエタノール処理した精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド及びヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した後、ＣＢＢ染色した結果を示す写真；及びｂ）２−メルカプトエタノール処理した精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド及びヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した後、薄膜（ＰＶＤＦ）に転写し、精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドに対するモルモット抗血清を用いて、これと反応する蛋白質を検出した結果を示す写真である。
図７は、ヘモフィルス・バラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムよりクローニングしたＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ、ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ、ＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡ及びＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡ断片の位置を示す模式図である。
図８は、ヘモフィルス・バラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化断片（ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ）をプラスミドｐＳＰ７２に挿入したプラスミドｐＳＡ４．１を構築し、さらに該プラスミドからのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ消化断片をプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＣに挿入したプラスミドｐＴＡ４．１を構築する手順を示す模式図である。
図９は、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来のＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ消化断片（ＨＰＧ６．７ｋＤＮＡ）をプラスミドｐＳＰ７２に挿入したプラスミドｐＳＡ６．７を構築し、さらに該プラスミドからのＸｂａＩ消化断片をプラスミドｐＳＰ７２に挿入したプラスミドｐＳＡ２．７を構築する手順を示す模式図である。
図１０は、制限酵素ＥｃｏＲＩ消化したヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌、Ｂ型菌及びＣ型菌由来ゲノムＤＮＡ断片をアガロース電気泳動した後、薄膜（ハイボンドＮ＋）に転写し、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとし、これとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した結果を示す写真である。
図１１は、ヘモフルス・バラガリナルムＣ型菌５３−４７株ゲノムより、クローニングしたＨＰＧ−Ｃ１ＤＮＡ、ＨＰＧ−Ｃ２ＤＮＡ、ＨＰＧ−Ｃ３ＤＮＡ及びＨＰＧ−Ｃ４ＤＮＡ断片の位置を示す模式図である。
図１２は、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドのＮ末端側およびＣ末端側アミノ酸残基をコードする塩基配列をもとに作製したプライマーを用いて、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌、Ｂ型菌及びＣ型菌由来ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を更に詳しく説明する。
本発明のＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドは、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより該Ａ型菌の培養上清又は菌体の破砕液から調製される。
ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（以下、ＨＩ−ＭＣＡと称することもある）は、常法の細胞融合法により、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、ついで、この中からＨＩ試験により、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択することにより取得できる。
上記の抗体を作製する際の免疫原として用いられるヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌は、通常のヘモフィルス・パラガリナルムの培養に用いられる方法に準じて得られる。例えば２２１株は、鶏血清加鶏肉汁培地（培地１０００ｍｌ中、鶏肉水３００ｍｌ、鶏血清１０ｍｌ、ポリペプトン５ｇ、ブドウ糖１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルタミン酸ナトリウム５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド０．０２５ｇを含む）中で３７℃、一夜振盪培養し、遠心分離することによって回収できる。
免疫は一般的方法により、例えば、上記のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌をチメロサール、ホルマリン等で不活化した後、これを通常のアジュバントを併用してＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与、皮下投与、皮内投与あるいは静脈内投与することにより行われる。免疫原としては、菌体そのものあるいはロダン化カリウム、超音波、ヒアルロニダーゼ等で処理した菌体もしくはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ノニデート（Ｎonidet）Ｐ−４０、トリトン（Ｔriton）Ｘ−１００等の界面活性剤で処理した加工抗原であってもよい。アジュバントとしてはフロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル等が使用される。より具体的には以下のように行う。鶏血清加鶏肉汁培地中で培養したヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株をチメロサールで不活化した後、これを超音波処理する。得られた破砕液とフロインド完全アジュバントを混合して得たエマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に投与し、その後２〜４週間おきに同量を不完全アジュバントとともに調製したエマルジョンを背部皮下に投与する。血清抗体をチェックし、抗体価が上がっていることを確認した後、最終免疫として、更に、２〜４週間後に、超音波破砕液を静脈内投与する。
モノクローナル抗体を作製する際の免疫細胞としては、最終投与の２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いるのが好ましい。マウスミエローマ細胞としては、例えば、ＮＳＩ−Ａｇ４／１（Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．，６：５１１、１９７６）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｃurr．Ｔopics Ｍicrobiol．Ｉmmunol．，８１：１，１９７８）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉmmunol．，１２３：１５４８、１９７９）等を使用することができる。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合反応はミルシュタイン（Ｍilstein）らの方法（Ｍethod Ｅnzymol．，７３、３−４６、１９８１）に準じて行うことができる。すなわち、融合する際には、マウスミエローマ細胞に対し、１〜１０倍程度の脾臓細胞が用いられる。また、融合促進剤としては、分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコールが３０〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。より具体的には、細胞融合は、約１０8個の脾臓細胞と約１０7個のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１ミエローマ細胞を用いて、予め３７℃に加温した４５％ポリエチレングリコール４，０００を含むリンパ細胞の培養に通常に用いられる培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地中で行うのが好ましい。
ハイブリドーマは、未融合細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間、ＨＡＴ培地中で培養することにより得られる。かくして得られるハイブリドーマに対し、その培養上清を用いて、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体産生株の選択及びクローン化が行われる。
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌を認識する抗体を産生する株の検索は、通常使用されるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンプロット法等に従って行われる。上記方法に使用される抗原はヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌体の懸濁液、該菌体をロダン化カリウム、超音波、ヒアルロニダーゼ等で処理した菌体、該菌体の界面活性剤による抽出液のいずれであってもよい。
ついで、ＨＩ活性を有する抗体を産生する株が、上記ハイブリドーマの培養上清もしくは該ハイブリドーマを投与したマウスの腹水を用い、通常に行われているＨＩ試験に従って検索される。ＨＡ抗原としては、ヘモフィルス・パラガリナルム菌体の懸濁液あるいは該菌体をロダン化カリウム、超音波、ヒアルロニダーゼ等で処理した菌体が使用される。ＨＩ試験に用いる赤血球は、０．５％新鮮鶏赤血球、グルタルアルデヒド固定１％鶏赤血球あるいはホルマリン固定１％鶏赤血球のいずれでもよいが、好ましくは、グルタルアルデヒド固定鶏赤血球が用いられる。
より具体的には、５倍量の２５％カオリン溶液で処理した腹水の遠心上清をグルタルアルデヒド固定鶏赤血球の沈澱に加え、３７℃で６０分間振盪感作する。この上清の２倍階段希釈液に４赤血球凝集単位を含む２２１株の菌懸濁液を等量加えて混和後１５分間静置する。次に、グルタルアルデヒド固定１％鶏赤血球懸濁液を加え、室温に６０分間静置した後、管底像により判定する。赤血球凝集を阻止する最高希釈倍数をＨＩ抗体価とする。
かくして得られたＨＩ活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからの該抗体の採取には、該ハイブリドーマを大量に培養し、その培養上清から又は該ハイブリドーマに適合するマウスにこれを投与して増殖させ、その腹水から得る方法等がとられる。
モノクローナル抗体の精製は、蛋白質化学において通常使用される方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を適宜選択して行えばよい。より具体的には、腹水からのモノクローナル抗体の精製は、プロテインＡ−セファロース（Ｐrotein Ａ−Ｓepharose）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）及びＭＡＰＳ−IIマウスモノクローナル抗体精製キット（バイオ・ラッド製）を用い、製造業者のプロトコールに従うことによって達成される。
本発明のＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドの精製に使用されるＨＩ活性を有する抗体をリガンドとするアフィニティーカラムは、一般的な方法、例えば、製造業者のプロトコールに従い、ハイトラップＮＨＳ−アクチベーテッド（ＨiＴrap ＮＨＳ−Ａctivated）カラム（ファルマシア製）に、精製した上記抗体を結合させることにより得られる。
かくして調製されたアフィニティーカラムを用いることにより、該Ａ型菌の培養上清又は菌体の破砕液から、ＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドを得ることができる。具体的には、２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地中で３７℃、２日間培養した上清から、高いＨＩ抗体産生能と鶏伝染性コリーザを防御する活性を有する分子量約１３０Ｋdのポリペプチドを取得した（ＨＰＧｐ１３０と称する）。
このようにして得られたポリペプチドのアミノ酸配列は、エドマン分解法など一般的な方法（エドマン（Ｐ．Ｅdman，Ａcta Ｃhem．Ｓcand．，４：２８３、１９５０）により決定することができる。該ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配列を配列表の配列番号：２に示す。
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドをコードする遺伝子又はその断片のクローン化は、サムブルック（Ｓambrook）らが述べている一般的な方法（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版（Ｍolecular Ｃloning，Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｓecond Ｅdition）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress）、ニューヨーク、１９８９）に従い行うことができる。すなわち、上述した方法によりヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を培養、回収した後、セパジーンキット（三光純薬社製）を用い、添付のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出・精製し、これを適当な制限酵素（好ましくは、ＥｃｏＲＩが使用される）で切断し、市販のクローニングベクター（例えば、λｇｔ１１）に挿入し、ＤＮＡライブラリーを調製する。この中から、ＨＩ活性を有する適当な抗体と反応する抗原を発現しているクローンを選択する。ＨＩ活性を有する抗体としては、上記の方法により得られたモノクローナル抗体を含むハイブリドーマの培養上清又はマウスの腹水等が挙げられるが、好ましくは、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーによって得られたヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドで免疫した抗血清が使用される。このようにして得られた組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡ中の外来ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（例えば、アプライド・バイオシステムズ（Ａpplied Ｂiosystems）３７７型）により決定することができる。また、得られた外来ＤＮＡ断片の新規性は、その全塩基配列と既存のデータベース（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬなど）とのホモロジー検索を行うことにより確認できる。
例えば実施例３に示すように、ＤＮＡライブラリーからは、１０個の陽性λｇｔ１１ファージが得られ、これらのファージＤＮＡは、アガロース電気泳動法の結果から、いずれも約１．２ｋｂの外来ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片とも称する）を含有する。その外来ＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号：１に記載の１９８８番目から３１５７番目の塩基配列に相当する。
このＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片には、開始及び終止コドンが見い出されないので、該ＤＮＡ断片は上記のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来ポリペプチドの一部をコードしていると考えられる。該ポリペプチドの全長をコードする遺伝子は、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片をプローブとし、より長鎖のＤＮＡ断片を得、該断片の塩基配列を調べ、配列内に開始コドン及び終止コドンを見い出すことにより達成される。
より具体的には、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡを１．２ｋｂ ＤＮＡ断片の内部で切断しない制限酵素（例えばＨｉｎｄIII）で切断した後、これをアガロース電気泳動法により、各ＤＮＡ断片を分離する。ＤＩＧ−ＤＮＡ標識キット（ベーリンガーマンハイム製）を用いて、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した１．２ｋｂ ＤＮＡ断片をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ断片を検出する。その結果、１．２ｋb ＤＮＡ断片とハイブリダイズする約３．５ｋｂのＨｉｎｄIII消化ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片とも称する）を得た。このＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の１番目から３４５０番目の塩基配列に相当する。なお、前述のＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配列と一致する配列を、配列表の配列番号：１に記載の１番目から１３番目のアミノ酸配列（４５３番目から４９１番目の塩基配列に相当する）に見い出した。
このＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片には、開始コドンは見い出されたが終止コドンが見い出されないので、さらに、ＤＩＧで標識した１．２ｋｂ ＤＮＡ断片および３．５ｋｂ ＤＮＡ断片を用いて、約４．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片とも称する）を得た。このＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の２２１２番目から６２７５番目の塩基配列に相当する。さらに、ＤＩＧで標識した１．２ｋｂ ＤＮＡ断片および３．５ｋｂ ＤＮＡ断片を用いて、約６．７ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ消化ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡ断片とも称する；この断片内には上記のＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片が含まれる）を得た。このＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の２２１２番目から８９３０番目の塩基配列に相当する。このＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡ断片に終止コドンが見い出された。
配列表の配列番号：１に記載の塩基配列は、全長８９３０塩基からなる塩基配列であり、その中に塩基番号２４３から翻訳され２０４２個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームが存在することが明らかとなった。この２０４２個のアミノ酸からなるポリペプチドを以下、Ａ型ＨＭＴｐ２１０とも称する。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドは新規物質と考えられた。
また、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列の中に塩基番号８３７５から翻訳され１８５個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームの存在の可能性が示された。なお、この配列内に終止コドンは見い出されていない。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、このオープンリーディングフレームがコードするポリペプチドも新規物質と考えられた。
上記のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来ＤＮＡ断片は、これをプローブとして、血清型の異なるヘモフィルス・パラガリナルムＢ型菌及びＣ型菌由来のＤＮＡ断片、更には該ＤＮＡ断片がコードするポリペプチドを取得するために使用することができる。
より具体的には、Ｃ型菌５３−４７株からゲノムＤＮＡを抽出・精製し、これを適当な制限酵素（好ましくは、ＨｉｎｄIIIが使用される）で切断し、市販のクローニングベクター（例えば、λＤＡＳＨII）に挿入し、ＤＮＡライブラリーを調製する。この中から、ＤＩＧ標識したＡ型ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片をプローブとして、クローンを選択する。
実施例５に示すように、ＤＮＡライブラリーからは、１０個の陽性λＤＡＳＨIIファージが得られ、これらのファージＤＮＡは、アガロース電気泳動法の結果から、いずれも約１３．５ｋｂの外来ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡとも称する）を含有する。
このＨＰＧ−Ｃ１ＤＮＡ断片は約１３．５ｋｂとかなり大きく、そのままではプラスミドベクターにサブクローニングするのは困難であることから、ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡ断片を適当な制限酵素（好ましくは、ＸｂａＩが使用される）で切断し、市販のクローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１１９）に挿入する。その結果、約５．６ｋｂ（以下、ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡとも称する）、約０．９ｋｂ（以下、ＨＰＧ−Ｃ３ ＤＮＡとも称する）及び約６．９ｋｂ（以下、ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡとも称する）のＤＮＡ断片を得た。ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片の一部とＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片の塩基配列を調べたところ、これらの断片内に開始及び終止コドンが見い出された。
配列表の配列番号：５に記載の塩基配列は、全長７４８６塩基からなる塩基配列であり、その中に塩基番号８４８から翻訳され２０３９個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームが存在することが明らかとなった。この２０３９個のアミノ酸からなるポリペプチドを以下、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０とも称する。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドは新規物質と考えられた。
また、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列とＡ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列のホモロジーを調べたところ、約８０％のホモロジーがあること、さらに、５’側の約３．４ｋｂの領域と３’側の約１．２ｋｂの領域が非常にホモロジーが高いこと、２つの領域にはさまれた約１．５ｋｂの領域はホモロジーが低いことが明らかとなった。また、これらの遺伝子にコードされるポリペプチドについても、同様のことが認められた。
Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列をもとに、ＰＣＲによりヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌のみならず血清型の異なるＢ型菌及びＣ型菌由来のＤＮＡ断片、更には該ＤＮＡ断片がコードするポリペプチドを取得することもできる。
より具体的には、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列をもとに、上流側のＰＣＲプライマーとして、配列番号：３に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、下流側のＰＣＲプライマーとして、配列番号：４に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを作製した。これらのプライマーは、それぞれ５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を付加させ、また、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの翻訳領域の全長を増幅できるようにデザインした。これらのプライマーを用いてヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌の２２１株、０８３株、Ｗ株、Ｇermany株及びＧeorgia株、Ｂ型菌のＳpross株及び０２２２株、Ｃ型菌のＭodesto株及び５３−４７株の計９株からのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析したところ、いずれの株にも約６．１ｋｂのサイズの増幅フラグメントが認められた。
かくして得られたＤＮＡ断片あるいはその一部を適当な発現ベクターに組み込み、これを用いて、微生物又は動物細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより、本発明のヘモフィルス・パラガリナルム由来のポリペプチドあるいはそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するペプチドを生産することができる。このような一部のアミノ酸配列を有するペプチドを生産する場合は、ペプチド合成機を利用することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に、分泌のための微生物用又は動物細胞用の適当なシグナル配列を接続すれば、該ポリペプチドを培地中に分泌発現させることも可能である。このように分泌型に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した該ポリペプチドの精製を容易にする点で有用である。シグナル配列としては、大腸菌用としてｐｅｌＢシグナル（レイ（Ｓ．Ｐ．Ｌei）ら、Ｊ．Ｂacteriology,１６９：４３７９−４３８３、１９８７）、酵母用としてα因子のシグナル（ブレイク（Ａ．Ｊ．Ｂrake）、Ｙeast Ｇenetic Ｅngineering,ｐ２６９、バターワース、１９８９）、動物細胞用としてイムノグロブリンのシグナルＳＧ−１（前田（Ｈ．Ｍaeda）ら、Ｈum.Ａntibod.Ｈybridomas,２：１２４−１３４、１９９１）、Ｃ２５のシグナル（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４/２０６３２）などが挙げられる。
発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、ｌａｃ、ｔａｃ、ｐｈｏ５、ａｄｈ、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、βアクチン等、最終的に鶏伝染性コリーザを防御する活性を有するポリペプチドが得られるのであればどのようなものでもよい。また、他の蛋白質やペプチド、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白、プロテインＡ、ヒスチジンヘキサマー等との融合蛋白として発現させることもできる。マーカー遺伝子として、微生物細胞用発現ベクターを用いる場合は、宿主として大腸菌を用いる場合、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、宿主として酵母を用いる場合、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２）遺伝子などが利用される。また、動物細胞用発現ベクターを用いる場合は、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子などを利用できる。選択用添加物質としては、Ｇ４１８、ネオマイシン、メソトレキセート等が例示される。
宿主細胞の形質転換は公知の方法、例えば、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム共沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法等が利用でき、用いる宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
本発明のヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規ポリペプチドあるいはそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するペプチドは、以下の方法により製造される。例えば、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ（インビトロジェン（Ｉnvitrogen）社製）にＡ型菌由来のＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片を組み込み、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換を行う。形質転換細胞の中から、該ポリペプチドに対する抗体との反応性を指標とするドットブロット法により、目的の新規ポリペプチドを生産する形質転換細胞をスクリーニングする。この細胞の超音波破砕液の遠心上清で免疫された鶏は，Ａ型菌２２１株の攻撃に対し、高い防御能を有する。
新規ポリペプチドの精製は、該ポリペプチドを産生する形質転換細胞を大量培養し、回収したその細胞抽出液又は培養上清から、前述した蛋白質化学において通常使用される方法を適宜選択することにより達成される。
かくして得られるヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチドは、鶏伝染性コリーザを防御する活性を有するものである。ヘモフィルス・パラガリナルム由来の該ポリペプチド、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びに上記の発現ベクターは、鶏伝染性コリーザのワクチン及び治療薬として、単独であるいは薬剤として投与可能な適当な担体、希釈液又は安定剤を添加することにより、注射剤、経口剤等の任意慣用の方法で医薬品に使用される。
上述のヘモフィルス・パラガリナルムの新規ポリペプチド及びそのアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、上述した方法により、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用される。また、該ポリペプチド及びこれらとの結合能を有する抗体は、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの抗原及び抗体検出系に利用することができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、上記のポリペプチドを精製することができる。
本発明によると、鶏伝染性コリーザを予防するためのヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子断片並びに治療薬として使用可能なＨＩ活性を有する抗体が提供される。
本発明者が見い出したヘモフィルス・パラガリナルム由来のポリペプチドは、分子量が約１３０Ｋｄで、ＨＩ抗体産生を誘導する活性を有し、ヘモフィルス・パラガリナルムによる鶏伝染性コリーザを防御するための重要な新規なポリペプチドである。該ポリペプチドをコードする遺伝子の単離、発現ベクターの構築、発現細胞の作製、上記ポリペプチドの精製法など、該ポリペプチドを実用化するための技術的な問題は本発明により解決され、従来技術に比較してより効果的なワクチンを提供することが可能になった。更に、これらは、迅速かつ簡便な鶏伝染性コリーザ診断薬を提供するための材料としても有用である。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１：モノクローナル抗体の作製及び性状
１）モノクローナル抗体の作製
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地１００ｍｌに接種し、３７℃で一夜振盪培養した後、遠心分離（８，０００回転、２０分間）により菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳで遠心洗浄後、約５×１０10個／ｍｌとなるように０．０１％チメロサールを含むＰＢＳに懸濁した。この懸濁液をブランソン・ソニファイアー（Ｂranson Ｓonifier）３５０を使用して２０ｋＨｚで、４℃、１０分間超音波にかけた（０．５秒間超音波にかけ、０．５秒間の冷却を交互に実施）。このようにして得られた超音波破砕液とフロインドの完全アジュバントとを等量ずつ混合し、油中水滴型（ｗ／ｏ）の状態になるまで充分混和した。このエマルジョン０．１ｍｌずつをＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下２箇所に投与し、４週間後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製したエマルジョン０．１ｍｌずつを背部皮下２箇所に投与した。さらに１８日後に超音波破砕液０．１ｍｌを静脈内投与した。
最終投与の３日後に脾臓細胞を採取した。１×１０8個の該脾臓細胞と１×１０7個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１をパディングにより混合し、これに予め３７℃に加温した４５％ポリエチレングリコール４，０００を含むＲＰＭＩ１６４０培地を加え、細胞融合を行わせた。この融合反応後の細胞をＨＡＴ培地（１×１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０-5Ｍチミジンを添加した５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、細胞培養用９６ウエルマイクロプレート（コーニング製）に分注後、３７℃、５％炭酸ガスの条件下で培養した。
ハイブリドーマの増殖が認められたウエルについて、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中のヘモフィルス・パラガリナルムを認識する抗体の存在の有無を検索した。上記の方法により調製したヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株の超音波破砕液をＰＢＳで３００倍希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（イムロンII、ダイナテック製）のウエルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ（１ウエル当たり２００μｌ）で室温、２時間マスキングを行った。０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈したハイブリドーマ培養上清を１００μｌ加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（バイオ・ラッド製）を１００μｌずつ加え、室温で２時間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１１ｍｌ当たりオルト−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ、片山化学製）６ｍｇ及び過酸化水素水（Ｈ2Ｏ2 ３１％含有、三菱瓦斯化学製）４．７５μｌを含む０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸水素二ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を１００μｌずつ加え、室温で３０分間反応させた。３Ｍ硫酸を５０μｌずつ加え、反応停止後、各ウエルの吸光度（４９０ｎｍ）をＥＬＩＳＡ用オートリーダーで測定した。
培養上清中にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌に対する抗体が認められたウエルのハイブリドーマは、さらに限界希釈法でクローニングを行い、単クローンとした。このようにして、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌に対するモノクローナル抗体を産生する株９クローンを得た。
２）モノクローナル抗体のＨＩ活性
これらのハイブリドーマを大量に培養し、免疫抑制剤のプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリッチ製）で前処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与して増殖させ、１０〜２０日後に産生された腹水を屠殺開腹したマウスより採取し、得られた腹水中のＨＩ活性を調べた。
ＨＩ試験に用いるＨＡ抗原としてヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株のチメロサール不活化菌懸濁液を用い、ＨＡ価を基に調製した。まず、Ｖ型マイクロプレート（三光純薬製）を用い、上記のＨＡ抗原の２倍階段希釈液０．０５ｍｌにグルタルアルデヒド固定１％鶏赤血球懸濁液０．０５ｍｌを加え、室温に６０分間静置した後、管底像により判定した。赤血球を凝集させる最高希釈倍数をＨＡ価とし、このときのＨＡ抗原濃度を１単位とし、ＨＩ試験には４単位になるように該ＨＡ抗原液を調製した。
次に、マウス腹水０．２ｍｌに５倍量の２５％カオリン溶液を加えて３７℃で３０分間振盪感作し、遠心分離により上清を得た。グルタルアルデヒド固定１０％鶏赤血球２ｍｌを遠心して得られた沈澱に、このカオリン処理済の遠心上清を加え、３７℃で６０分間振盪感作した。感作後、遠心により上清を得、５倍希釈マウス腹水としてＨＩ抗体の測定に使用した。Ｖ型マイクロプレートを用い、この上清の２倍階段希釈液０．０２５ｍｌに上記の４赤血球凝集単位を含む２２１株のチメロサール不活化菌懸濁液を等量加えて混和後、１５分間静置した。充分感作した後、グルタルアルデヒド固定１％鶏赤血球懸濁液０．０５ｍｌを加えた。室温に６０分間静置した後、管底像により判定した。赤血球凝集を阻止する最高希釈倍数をＨＩ抗体価とした。９クローンの内３クローン（ＨｐｇＡ ５９−４０、ＨｐｇＡ ５９−１４５、ＨｐｇＡ ５９−１８０）のモノクローナル抗体が高いＨＩ活性を示した（表１）。なお、クローンＨｐｇＡ ５９−１８０はＦＥＲＭ ＢＰ−６０８４として、１９９６年９月５日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に出願人により寄託されている。
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３）モノクローナル抗体の防御活性
これらの抗体を含むマウス腹水０．３ｍｌを一群８〜１０羽の４〜６週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏の腹腔内にそれぞれ注射し、翌日にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株約１０8個を鼻腔内に滴下し攻撃した。対照としてマウス腹水非投与群をおき、同様な攻撃を行い、コリーザ症状（鼻汁の漏出、顔面腫脹、流涙）の有無について１０日間観察した。あらかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（以下、ＨＩ−ＭＣＡとも称する）を投与していた群は３クローンとも、対照群に較べて発症時期が遅れる傾向が見られた。一方、他のクローンを投与していた群は、いずれも対照群との差は認められなかった（図１〜４）。
実施例２：ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の精製及び性状
１）ＨＩ−ＭＣＡの精製
ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ  ５９−１８０）をマウス腹水からプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）及びＭＡＰＳ−IIマウスモノクローナル抗体精製キット（バイオ・ラッド製）を利用して、添付のプロトコールに従い精製した。まず、マウス腹水４ｍｌに等量の抗体精製キットに含まれる結合バッファーを加え、０．４５ミクロンのステリベックス・フィルター（ミリポア製）で濾過後、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ゲルベッドボリューム５ｍｌ）にかけ、結合バッファーで２８０ｎｍの吸光度が０．０５以下になるまで充分洗浄した。ついで、キットに含まれる溶出バッファーでカラムに結合した抗体を溶出した。溶出した抗体は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）に対して透析し、精製ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）４０ｍｇを得た。ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−４０）についても同様に精製し１２ｍｇを得た。
２）ＨＩ−ＭＣＡの担体への結合
次に、精製したＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）をリガンドとして、ハイトラップＮＨＳ−アクチベーテッドカラム（ファルマシア製）に、添付のプロトコールに従い結合させた。まず、ハイトラップＮＨＳ−アクチベーテッドカラム（ゲルベッドボリューム１ｍｌ）を１ｍＭ塩酸で洗浄後、これに前記の精製ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）１０ｍｇの０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍｌ）を室温で３０分間循環させることによりＨＩ−ＭＣＡを結合させた。得られたＨＩ−ＭＣＡ結合ハイトラップカラムを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）で交互に３回洗浄後、ＰＢＳで平衡化し、ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の精製に供試した。
３）ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の精製
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株の培養液から、ＨＩ−ＭＣＡをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーにより、抗原の精製を行った。なお、抗原の検出は、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を利用して行った。
前記の精製したＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−４０）を０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で１．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートのウエルに入れ、４℃で一夜放置した後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温、２時間マスキングを行った。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０倍に希釈したカラム溶出液を室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）を室温で２時間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＯＰＤ及び過酸化水素水を含む基質液を加え室温で３０分間反応させた。ペルオキシダーゼ標識ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）は吉竹（Ｙoshitake）らの方法（Ｊ．Ｂiochem．，９２：１４１３−１４２４、１９８２）に準じて、前記の精製したＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）に西洋わさびペルオキシダーゼ（東洋紡製）を結合させることにより調製した。
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地１００ｍｌに接種し、３７℃で２日間振盪培養した。次に８，０００回転、２０分間の遠心により菌体を除去した培養上清に、直ちにセリンプロテアーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリドを１ｍＭになるように加え、０．４５ミクロンのステリベックス・フィルターにて濾過した。予めＰＢＳで平衡化したＨＩ−ＭＣＡ結合ハイトラップカラムに、上記の濾液６０ｍｌを添加後、ＰＢＳで洗浄し、２８０ｎｍの吸光度が０．０５以下になった時点で、ＨＩ−ＭＣＡと結合する抗原を３Ｍチオシアン酸ナトリウムで溶出した。ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原は素通り画分には認められず、ほとんどが３Ｍチオシアン酸ナトリウム溶出画分に回収された。この溶出液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に対して透析した。
４）ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原のＮ末端側アミノ酸分析
アフィニティーカラムからの溶出液について２−メルカプトエタノール処理後、５−２０％ポリアクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をレムリ（Ｌaemmli）の方法（Ｎature,２２７：６８０−６８５、１９７０）に準じて行い、５０％メタノール−１０％酢酸で溶解した０．２５％クマジーブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色を行ったところ、分子量約１３０Ｋｄのバンドが確認できた（図５）。そこで、このポリペプチドをＨＰＧｐ１３０と名付け、そのＮ末端側アミノ酸配列の決定を以下の方法に従って行った。
まず、該精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドを２−メルカプトエタノール処理後、５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１１）で洗浄し、あらかじめ１００％メタノール及びトランスファーバッファーの順に浸しておいたポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア製）上に重ね、トランス・ブロット・セル（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＣＥＬＬ）（バイオ・ラッド製）を用いて２０Ｖ、一夜転写を行った。転写後のＰＶＤＦ膜を水洗し、４５％メタノール−１０％酢酸に溶解した０．１％アミドブラックで３０秒間染色後、蒸留水で脱色を行った。
染色された分子量１３０Ｋｄのバンドを切り出し、この膜をプロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ４７７Ａ型）を用いて分析した。Ｎ末端側の１３アミノ酸残基を解読した結果、そのアミノ酸配列は配列番号：２で示されるＬｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであった。
５）ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＨＩ抗体産生の誘導
ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドがＨＩ抗体産生を誘導するかを調べた。該ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド溶液（約４０μｇ／ｍｌ）を同量のフロインドの完全アジュバントと混合して調製したエマルジョン１ｍｌ（１匹当たりＨＰＧｐ１３０ポリペプチド約２０μｇ）をモルモットの背部皮下２箇所に注射し、免疫した。約３週間後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製したエマルジョン１ｍｌを背部皮下２箇所に注射した。さらに２週間後に、フロインドの不完全アジュバントで調製した同エマルジョンを背部皮下２箇所に追加投与し、その４週間後に採血した。前記と同様の方法で、得られた抗血清中のＨＩ抗体価を調べたところ、高いＨＩ抗体価（５，１２０倍）を有していた。このように、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドは、鶏伝染性コリーザの防御に深く関わりがあるといわれているＨＩ抗体の産生を誘導することが明らかとなった。
６）抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清が認識するペプチド
次に抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清が認識するポリペプチドの解析をウエスタンブロット法で調べた。まず、精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド及び前述の鶏血清加鶏肉汁培地中で培養したＡ型菌２２１株を２ーメルカプトエタノール処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）に５分間浸し、あらかじめ１００％メタノール及びトランスファーバッファーの順に浸しておいたＰＶＤＦ膜上に重ね、トランス−ブロットＳＤセル（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ ＣＥＬＬ）（バイオ・ラッド製）を用いて７Ｖで１時間転写を行った。この膜を５％スキムミルクを含むＰＢＳで４℃、一夜マスキングの後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１，０００倍に希釈した抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清を室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ（ザイメット（Ｚymed）製）を室温で２時間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１０ｍｌ当たり、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ、同仁化学製）５ｍｇ及び過酸化水素水３μｌを含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に浸し反応させた。その結果、抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清はＨＰＧｐ１３０ポリペプチド及びその前駆体と考えられる分子量約１６０Ｋｄのバンドを認識した（図６）。
７）ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドの免疫原性
前記と同様の方法に従い、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド溶液（約４０μｇ／ｍｌ）を同量のフロインドの完全アジュバントで調製したエマルジョン０．５ｍｌ（約１０μｇのＨＰＧｐ１３０ポリペプチドを含有する）を１０羽の５週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏脚部皮下に注射し、免疫した。３週間後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製したエマルジョン０．５ｍｌを脚部皮下に注射した。さらに２週間後に、フロインドの不完全アジュバントで調製した同エマルジョンを脚部皮下に追加投与し、初回免疫後７週目にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した。他に対照として、水酸化アルミニウムゲル（アルミニウム量換算で０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した０．２５％ホルマリン不活化Ａ型菌２２１株（不活化前生菌数４×１０8個／ｍｌ）０．５ｍｌを３週間の間隔で２回免疫した群及び非免疫群をおき、同様な攻撃を行った。その結果を表２に示す。ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドあるいはホルマリン不活化菌を免疫した群はいずれも全羽について発症防御が認められた。非免疫群では全羽発症した。
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実施例３：ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチド（Ａ型ＨＭＴｐ２１０）をコードする遺伝子のクローニング
１）ゲノムライブラリーからのスクリーニング
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地５ｍｌに接種し、３７℃で一夜振盪培養した後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳで遠心洗浄後、セパジーンキット（三光純薬製）を用い、添付のプロトコールに従って該菌体のＤＮＡを抽出・精製した。これを５０μｌのＴＥバッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．０）に溶解してゲノムＤＮＡ溶液とした。次に、ｃＤＮＡラピッド・クローニング・モジュール（rapid cloning module）−λｇｔ１１（アマシャム製）を用い、添付のプロトコールに従って、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した該ゲノムＤＮＡ０．２μｇを、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したλｇｔ１１アーム０．５μｇに連結させ、さらにλ−ＤＮＡイン・ビトロ・パッケージング・モジュール（in vitro packaging module）（アマシャム製）を用い、添付のプロトコールに従って、ラムダファージに導入した。得られたリコンビナントファージ液をゲノムライブラリーとした。
上記ゲノムライブラリー液を、１０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液に懸濁した大腸菌Ｙ１０９０株（アマシャム製）約１０8個に加え、３７℃で１５分間吸着させた。さらに４５℃に加温した重層用ＬＢ軟寒天培地（１０００ｍｌ中、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン５０ｍｇ、マルトース４ｇ、寒天８ｇを含む、ｐＨ７）を加え、ＬＢ寒天培地（１０００ｍｌ中、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン５０ｍｇ、寒天１５ｇを含む、ｐＨ７）に重層し、４２℃で３時間インキュベートした。次に、１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸し、風乾したニトロセルロース膜を上記のプレートに重層し、さらに３７℃で一夜インキュベートした。ニトロセルロース膜をプレートより剥がし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温、２時間マスキングを行った。以後、実施例２の６）と同様の方法に従い、抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清、ペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ及び基質を順次反応させた。これらの一連の操作により、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の抗ＨＰＧｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現しているプラークを得た。約５，０００プラークを上記イムノスクリーニングすることで４３個の陽性プラークが得られた。該陽性プラークをＳＭバッファー（０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラチンを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５）に回収し、クロロホルムを数滴加え、４℃に保存した。回収した陽性プラークのうち１０個について、一次スクリーニングと同様な操作で二次、三次スクリーニングを行った。
イムノスクリーニングで陽性となった組換えλｇｔ１１ファージを、１０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液に懸濁した大腸菌Ｙ１０９０株約１０8個に加え、３７℃で１５分間吸着させた。さらに０．４％マルトース、５ｍＭ塩化カルシウム及びアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌを加え、３７℃で一夜培養した。クロロホルムを数滴加えて溶菌させた後、遠心により未溶菌の大腸菌及びその老廃物等を除去した培養上清５ｍｌに等量の２０％ポリエチレングリコール６，０００を含む２．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、氷中に１時間放置した後、１０，０００ｒｐｍの遠心によりλｇｔ１１ファージを沈殿させ、フェノール処理、イソプロパノール沈澱により該ファージＤＮＡを回収した。得られたファージＤＮＡ約１５０μｇをＥｃｏＲＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来のＤＮＡ断片を分離し、セファグラス（Ｓephaglas）TMバンドプレップ・キット（ＢandＰrep Ｋit）（ファルマシア製）を用い、添付のプロトコールに従って、ゲルから該ＤＮＡ断片を溶出、回収した。１０個の陽性ファージから得られたＤＮＡ断片はいずれも約１．２ｋｂであった。そのうちの１個のクローン（クローン２）のファージから得られたＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡと称する）を以下の試験に用いた。
２）ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）をＥｃｏＲＩで消化した後、５’末端リン酸をアルカリフォスファターゼ処理により除去し、開裂したｐＵＣ１１９ＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱により回収した。開裂したｐＵＣ１１９と上記のＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、コンピーテントな大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地（ＢＩＯ １０１製）で３７℃、一夜培養した。寒天培地上に生育したコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地０．５ｍｌに接種し、３７℃で５時間培養後、アルカリ法で菌体内のプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動によってヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の１．２ｋｂ ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを検出することにより形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養後、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内の組換えプラスミド（以下、ｐＵＡ１．２と称する）を回収し、プライマーウォーキング（Ｐrimer Ｗalking）法により、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ３７７型）を用いて解析した。その結果、１１７０塩基の配列が決定された。配列番号：１に、後述のＡ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの塩基配列を示すが、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡの塩基配列はこの配列の１９８８番目から３１５７番目に相当し、３８９アミノ酸をコードできること、開始及び終始コドンはこの配列内に存在しないことが明らかになった。対応するアミノ酸配列も示すが、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配列に相当する配列も認められなかった。従って、ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡはＨＰＧｐ１３０ポリペプチドの一部をコードしていると考えられた。
３）ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡのクローニング
上記のＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡ断片約０．３μｇをＤＩＧ−ＤＮＡ標識キット（ベーリンガーマンハイム製）を用い、添付のプロトコールに従って、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した。ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡを数種の制限酵素で切断後、適当量を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、泳動後にハイボンドＮ＋膜（アマシャム製）にトランスファーした。次に上記のＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとして、ＤＩＧ標識核酸検出キット（ベーリンガーマンハイム製）を用い、添付のプロトコールに従ってサザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡを検出した。その結果、ＨｉｎｄIIIで消化した約３．５ｋｂ断片がＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡとハイブリダイズしたことから、この断片を０．８％アガロースゲル電気泳動で各断片から分離し、セファグラスTMバンドプレップ・キットを用い、添付のプロトコールに従って、ゲルからＤＮＡ断片を溶出、回収した。
一方、プラスミドｐＵＣ１１９を同じくＨｉｎｄIIIで消化した後、５’末端リン酸をアルカリフォスファターゼ処理により除去し、開裂したｐＵＣ１１９ＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱により回収した。開裂したｐＵＣ１１９とヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来の前記ＨｉｎｄIII消化物（約３．５ｋｂ）をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２を用いて連結し、コンピーテントな大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地で３７℃、一夜培養した。形質転換大腸菌が生育した寒天培地にハイボンドＮ＋膜を載せ、コロニーをリフト後、上記のＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとして、常法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ標識核酸検出キットを用いて陽性クローンを選別した。
この陽性クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミド（以下、ｐＵＡ３．５と称する）をＨｉｎｄIIIで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の３．５ｋｂ ＤＮＡ断片を分離し、セファグラスTMバンドプレップ・キットを用い、ゲルから該ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡと称する）を溶出、回収した。なお、組換えプラスミドで形質転換した大腸菌ＵＡ３．５ＪＭはＦＥＲＭ ＢＰ−６０８３として、１９９６年９月５日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に出願人により寄託されている。
４）ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡの発現
発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ（インビトロジェン製）をＨｉｎｄIIIで消化後、５’末端リン酸をアルカリフォスファターゼ処理により除去し、開裂したｐＴｒｃＨｉｓＣＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱により回収した。開裂したｐＴｒｃＨｉｓＣと上記のＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２を用いて連結し、コンピーテントな大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地で３７℃、一夜培養した。寒天培地上に生育したコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地０．５ｍｌに接種し、３７℃で５時間培養後、アルカリ法で菌体内のプラスミドを抽出し、ＨｉｎｄIIIで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動によってヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の３．５ｋｂ ＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを検出することにより形質転換大腸菌を得た。
さらに、得られた形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地１ｍｌに接種し、３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃で３時間培養した。培養液より菌体を遠心で集菌し、ＰＢＳ５０μｌに懸濁した。１０μｌの菌懸濁液と等量の２％ＳＤＳを混合し、５分間煮沸後、２μｌをニトロセルロース膜にスポットした。ニトロセルロース膜を風乾後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで４℃、一夜マスキングを行った。以後、実施例２の６）と同様の方法に従い、抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清、ペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ及び基質を順次反応させた。これらの一連の操作により、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡが正方向に連結した組換えプラスミドで形質転換された、抗ＨＰＧｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現している大腸菌を得た。
５）ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチドの免疫原性
得られた形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地２００ｍｌに接種し、３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃で３時間培養した。培養液より菌体を遠心で集菌し、ＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にリゾチームを１００μｇ／ｍｌになるように加え、４℃で１時間反応させた後、超音波処理（ブランソン・ソニファイアー３５０）を４℃で１０分間行い、溶菌させた。遠心により未破砕の菌を除去し、得られた上清を粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチドとした。
粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチド溶液と同量のフロインドの完全アジュバントを充分混和したエマルジョン０．５ｍｌを１０羽の８週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏脚部皮下に注射し、免疫した。約３週間後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製したエマルジョン０．５ｍｌを脚部皮下に注射した。さらに２週間後に、フロインドの不完全アジュバントで調製した同エマルジョンを脚部皮下に追加投与し、初回免疫後７週目にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した。他に対照として、実施例２の７）と同様に、ホルマリン不活化Ａ型菌２２１株免疫群及び非免疫群をおき、同様な攻撃を行った。その結果を表３に示す。粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチド免疫群は１０羽中７羽に発症防御が認められた。ホルマリン不活化菌を免疫した群では全羽発症防御し、非免疫群は全羽発症した。
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６）ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列
ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、前記と同様にＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、３４５０塩基の配列が決定された。このＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の１番目から３４５０番目の塩基配列に相当する。なお、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配列と一致するアミノ酸配列をコードする領域を見い出した。ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡからＨＰＧｐ１３０ポリペプチドと同じフレームでオープンリーディングフレームを求めたところ、塩基番号２４３から翻訳され１０６９個のアミノ酸をコードすることが明らかとなった。該ＤＮＡ断片の配列内には終止コドンはなく、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡはＨＰＧｐ１３０ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡと推測された。対応するアミノ酸配列も示す。
７）ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡのクローニング
上記のＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片を前記と同様にＤＩＧで標識した。次にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断後、実施例３の３）と同様の方法に従い、ＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡあるいはＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、約５．５ｋｂ、約４．１ｋｂおよび約１ｋｂのＤＮＡが検出された。また、ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、約４．１ｋｂおよび約１ｋｂのＤＮＡが検出された。図７に示すように、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片内には、２箇所のＸｈｏＩ切断部位が存在するため、約５．５ｋｂのＤＮＡは最初のＸｈｏＩ切断部位より５’側の断片、約４．１ｋｂのＤＮＡは２番目のＸｈｏＩ切断部位より３’側の断片、そして約１ｋｂのＤＮＡは２箇所のＸｈｏＩ切断部位にはさまれた断片と考えられた。そこで、約４．１ｋｂの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動で各断片から分離、回収した。
次に、図８に示すように、プラスミドｐＳＰ７２（プロメガ（Ｐromega）製）を同じくＸｈｏＩとＸｂａＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来の前記ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化物（約４．１ｋｂ）を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌から、上記のＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行い陽性クローンを選別した。
この陽性クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。このヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の約４．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化断片（以下、ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡと称する）が組み込まれたプラスミド（以下、ｐＳＡ４．１と称する）をＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、上記のＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡにプラスミドｐＳＰ７２由来のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片が付加された約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。
８）ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡの発現
実施例３の４）と同様の方法に従い、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣをＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記の約４．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ消化ＤＮＡ断片を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌の中から、ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡが正方向に連結した組換えプラスミドで形質転換された、抗ＨＰＧｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現している大腸菌を得た。
９）ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチドの免疫原性
得られた形質転換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地２００ｍｌに接種し、３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃で３時間培養した。培養液より菌体を遠心で集菌し、ＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にリゾチームを１００μｇ／ｍｌになるように加え、４℃で１時間反応させた後、超音波処理を４℃で１０分間行い、溶菌させた。遠心により未破砕の菌を除去し、得られた上清を粗ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチドとした。
粗ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチド溶液と同量のフロインドの完全アジュバントを充分混和したエマルジョン０．５ｍｌを１０羽の５週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏脚部皮下に注射し、免疫した。約３週間後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製したエマルジョン０．５ｍｌを脚部皮下に注射した。さらに２週間後に、フロインドの不完全アジュバントで調製した同エマルジョンを脚部皮下に追加投与し、初回免疫後７週目にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した。他に対照として、実施例２の７）と同様に、ホルマリン不活化Ａ型菌２２１株免疫群及び非免疫群をおき、同様な攻撃を行った。その結果を表４に示す。粗ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチド免疫群は１０羽中１０羽に発症防御が認められた。ホルマリン不活化菌を免疫した群では全羽発症防御し、非免疫群は全羽発症した。
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１０）ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列
ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片のＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片とオーバーラップしない部分の塩基配列、すなわち、ＨｉｎｄIII切断部位からＸｂａＩ切断部位までの塩基配列を、前述と同様に、ＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、２８３１塩基の配列が決定された。ＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片のうち解析した塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の３４４５番目から６２７５番目の塩基配列に相当する。なお、該ＤＮＡ断片の配列内には終止コドンは見い出されなかった。対応するアミノ酸配列も示す。
１１）ＨＰＧ６．７ｋＤＮＡのクローニング
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡをＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断後、実施例３の３）と同様の方法に従い、前述のＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡあるいはＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、約９．４ｋｂ、約６．７ｋｂおよび約１ｋｂのＤＮＡが検出された。また、ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、約６．７ｋｂおよび約１ｋｂのＤＮＡが検出された。前述のように、ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡ断片内には、２箇所のＸｈｏＩ切断部位が存在するため、約９．４ｋｂのＤＮＡは最初のＸｈｏＩ切断部位より５’側の断片、約６．７ｋｂのＤＮＡは２番目のＸｈｏＩ切断部位より３’側の断片、そして約１ｋｂのＤＮＡは２箇所のＸｈｏＩ切断部位にはさまれた断片と考えられた。そこで、約６．７ｋｂの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動で各断片から分離、回収した。
次に、図９に示すように、プラスミドｐＳＰ７２を同じくＸｈｏＩとＰｓｔＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来の前記ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ消化物（約６．７ｋｂ）を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌から、上記のＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを選別した。
この陽性クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミドを以下、ｐＳＡ６．７と称する。なお、組換えプラスミドで形質転換した大腸菌ＳＡ６．７ＪＭはＢＰ−６０８１として、１９９７年８月２７日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に出願人により寄託されている。
１２）ＨＰＧ２．７ｋＤＮＡのクローニング
得られた組み換えプラスミド（ｐＳＡ６．７）に組み込まれた約６．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡと称する）は、前述のＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片を含むことから、ＨＰＧ６．７ｋ ＤＮＡからＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ断片を除いた約２．７ｋｂの断片（以下、ＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡと称する）のサブクローニングを行った。ｐＳＡ６．７をＸｂａＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、上記のＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡ断片にプラスミドｐＳＰ７２由来のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片が付加された約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。
次に、プラスミドｐＳＰ７２を同じくＸｂａＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記の約２．７ｋｂのＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。さらに、得られた形質転換大病菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミドを以下、ｐＳＡ２．７と称する。
１３）ＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列
ＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、前記と同様にＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、２６６１塩基の配列が決定された。このＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：１に記載の６２７０番目から８９３０番目の塩基配列に相当する。また、該ＤＮＡ断片の配列内には終止コドンが見い出された。対応するアミノ酸配列も示す。
配列表の配列番号：１に記載の塩基配列は、全長８９３０塩基からなる塩基配列であり、その中に塩基番号２４３から翻訳され２０４２個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームが存在することが明らかとなった。この２０４２個のアミノ酸からなるポリペプチドを以下Ａ型ＨＭＴｐ２１０と称する。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドは新規物質と考えられた。
また、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列の中に塩基番号８３７５から翻訳され１８５個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームの存在の可能性が示された。なお、この配列内に終止コドンは見い出されなかった。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、このオープンリーディングフレームがコードするポリペプチドも新規物質と考えられた。
実施例４：ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片のヘモフィルス・パラガリナルム２２１株以外からの検索
実施例３の１）と同様の方法に従い、Ａ型菌の２２１株、０８３株、Ｗ株、Ｇermany株及びＧeorgia株、Ｂ型菌のＳpross株及び０２２２株、Ｃ型菌のＭodesto株及び５３−４７株の計９株からゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、実施例３の３）と同様の方法に従い、ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、血清型によってサイズが異なるものの、いずれの株にもＨＰＧ１．２ｋ ＤＮＡとハイブリダイズする断片が検出された（図１０）。
実施例５：ヘモフィルス・パラガリナルムＣ型菌由来のポリペプチド（Ｃ型ＨＭＴｐ２１０）をコードする遺伝子のクローニング
１）ゲノムライブラリーからのスクリーニング
実施例３の１）と同様の方法に従い、Ｃ型菌５３−４７株のゲノムライブラリーを作製した。すなわち、制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化したＣ型菌５３−４７株のゲノムＤＮＡを、ｃＤＮＡラピッド・クローニング・モジュール−λｇｔ１１を用い、同様に制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理したλＤＡＳＨII（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）製）アームに連結させ、さらにλ−ＤＮＡイン・ビトロ・パッケージング・モジュールを用い、ラムダファージに導入した。得られたリコンビナントファージ液をゲノムライブラリーとした。
上記ゲノムライブラリー液を、１０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液に懸濁した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）株（ストラタジーン製）約１０8個に加え、３７℃で１５分間吸着させた。さらに４５℃に加温した重層用ＬＢ軟アガロース培地（１０００ｍｌ中、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン５０ｍｇ、マルトース４ｇ、アガロース８ｇを含む、ｐＨ７）を加え、ＬＢ寒天培地に重層し、３７℃で一夜培養した。大腸菌が生育した寒天培地にハイボンドＮ＋膜を載せ、ファージプラークをリフト後、前述のＤＩＧ標識Ａ型ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡをプローブとして、常法に従ってプラークハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを選別した。約１，０００プラークを上記イムノスクリーニングすることで３７個の陽性プラークが得られた。得られた陽性プラークのうち１０個について、一次スクリーニングと同様な操作で二次、三次スクリーニングを行った。
プラークハイブリダイゼーションで陽性となった組換えλＤＡＳＨIIファージを、１０ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液に懸濁した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ株（ストラタジーン製）約１０8個に加え、３７℃で１５分間吸着させた。実施例３の１）と同様の方法に従い、該ファージＤＮＡを回収した。得られたファージＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、ヘモフィルス・パラガリナルムＣ型菌５３−４７株由来のＤＮＡ断片を分離、回収した。１０個の陽性ファージから得られたＤＮＡ断片はいずれも約１３．５ｋｂであった。そのうちの１個のクローン（クローン１）のファージから得られたＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡと称する）を以下の試験に用いた。
２）ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡの断片化及びサブクローニング
ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡは約１３．５Ｋｂとかなり大きく、そのままではプラスミドベクターにサブクローニングするのは困難であることから、ＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡを数種の制限酵素で切断後、適当量を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけたところ、ＸｂａＩで消化した場合に、約６．９ｋｂ、約５．６ｋｂ及び約０．９ｋｂのＤＮＡを検出した。
プラスミドｐＵＣ１１９をＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記のＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡのＸｂａＩ消化物を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。さらに、約５．６ｋｂあるいは約０．９ｋｂ ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドで形質転換された大腸菌を培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミド（約５．６ｋｂあるいは約０．９ｋｂ ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドをそれぞれ以下、ｐＵ−Ｃ２、ｐＵ−Ｃ３と称する）をＨｉｎｄIII−ＸｂａＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、約５．６ｋｂ及び約０．９ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ及びＨＰＧ−Ｃ３ ＤＮＡと称する）をそれぞれ分離、回収した。なお、組換えプラスミドｐＵ−Ｃ２で形質転換した大腸菌Ｕ−Ｃ２ＪＭはＢＰ−６０８２として、１９９７年８月２７日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に出願人により寄託されている。
また、プラスミドｐＵＣ１１９をＸｂａＩで消化し５’末端を脱リン酸化後、前述のＨＰＧ−Ｃ１ ＤＮＡのＸｂａＩ消化物を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。さらに、約６．９ｋｂ ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドで形質転換された大腸菌を培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミド（以下、ｐＵ−Ｃ４と称する）をＸｂａＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、約６．９ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡと称する）を分離、回収した。尚、組換えプラスミドｐＵ−Ｃ４で形質転換した大腸菌Ｕ−Ｃ４ＪＭはＢＰ−６０８０として、１９９７年８月２７日に工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に出願人により寄託されている。
得られたＤＮＡ断片ＨＰＧ−Ｃ２、ＨＰＧ−Ｃ３およびＨＰＧ−Ｃ４をそれぞれハイボンドＮ＋膜にスポットした。次に前述のＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡあるいは実施例３の３）と同様にＤＩＧで標識したＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡ、ＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡをプローブとして、ドットハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ標識ＨＰＧ３．５ｋ ＤＮＡあるいはＨＰＧ４．１ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡを検出した。また、ＤＩＧ標識ＨＰＧ２．７ｋ ＤＮＡをプローブとした場合、ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡを検出した。このことから、図１１に示すように、５’側からＨＰＧ−Ｃ３、ＨＰＧ−Ｃ４、ＨＰＧ−Ｃ２の順番に並んでおり、ポリペプチドをコードしている部分は、主にＨＰＧ−Ｃ４にあると考えられた。
３）ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片の塩基配列
ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片の塩基配列は、前記と同様にＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、６８７１塩基の配列が決定された。このＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表の配列番号：５に記載の１番目から６８７１番目の塩基配列に相当する。なお、Ａ型ＨＭＴｐ２１０をコードする遺伝子と相同性が高いことが見い出されたことから、ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡからＡ型ＨＭＴｐ２１０をコードする遺伝子と同じフレームでオープンリーディングフレームを求めたところ、塩基番号８４８から翻訳され２００８個のアミノ酸をコードすることが明らかとなった。しかしながら、該ＤＮＡ断片の配列内には終止コドンは見い出されなかった。対応するアミノ酸配列も示す。
４）ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片の一部の塩基配列
ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片の配列内には終止コドンが見い出されなかったことから、ＨＰＧ−Ｃ４ ＤＮＡ断片より３’側のＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片の５’側の部分の塩基配列の解析を行った。図１１に示すように、ＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片に３箇所のＡｃｃＩ切断部位が存在し、クローニング部位であるＸｂａＩ切断部位から最初のＡｃｃＩ切断部位までのサイズが約０．６Ｋｂであることがアガロースゲル電気泳動により判明したことから、この約０．６Ｋｂの塩基配列を、前記と同様にＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、６２１塩基の配列が決定された。このＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片の一部の塩基配列は、配列表の配列番号：５に記載の６８６６番目から７４８６番目の塩基配列に相当する。また、このＨＰＧ−Ｃ２ ＤＮＡ断片の一部の配列内に終止コドンが見い出された。対応するアミノ酸配列も示す。
配列表の配列番号：５に記載の塩基配列は、全長７４８６塩基からなる塩基配列であり、その中に塩基番号８４８から翻訳され２０３９個のアミノ酸をコードできるオープンリーディングフレームが存在することが明らかとなった。この２０３９個のアミノ酸からなるポリペプチドを以下、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０と称する。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行ったところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモロジーが認められなかったことから、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドは新規物質と考えられた。
また、Ｃ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列とＡ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列のホモロジーを調べたところ、約８０％のホモロジーがあること、さらに、５’側の約３．４ｋｂの領域と３’側の約１．２ｋｂの領域が非常にホモロジーが高いこと、２つの領域にはさまれた約１．５ｋｂの領域はホモロジーが低いことが明らかとなった。また、これらの遺伝子にコードされるポリペプチドについても、同様のことが認められた。
実施例６：Ａ型菌、Ｂ型菌及びＣ型菌由来ゲノムＤＮＡからのＨＭＴｐ２１０遺伝子のＰＣＲ増幅
実施例３の１）と同様の方法に従い、Ａ型菌の２２１株、０８３株、Ｗ株、Ｇermany株及びＧeorgia株、Ｂ型菌のＳpross株及び０２２２株、Ｃ型菌のＭodesto株及び５３−４７株の計９株からゲノムＤＮＡを調製した。また、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドをコードする塩基配列をもとに、上流側のＰＣＲプライマーとして配列番号：３に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、下流側のＰＣＲプライマーとして配列番号：４に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡを作製した。これらのプライマーは、それぞれ５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を付加させ、また、Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの翻訳領域の全長を増幅できるようにデザインした。これらのプライマーを用いて、上記の調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はＬＡ ＰＣＲキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用い以下の条件、すなわち、９４℃で１分間の反応の後、９８℃で４０秒間、６０℃で１０分間の反応を３０サイクル行い、７２℃で１０分間反応させた。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析したところ、いずれの株にも約６．１Ｋｂのサイズの増幅フラグメントが認められた（図１２）。
実施例７：完全長のＡ型及びＣ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの発現
１）Ａ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの発現
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６で得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離後、約６．１Ｋｂの増幅フラグメントを、セファグラスTMバンドプレップ・キットを用い溶出、回収した。
プラスミドｐＵＣ１１９をＢａｍＨＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記の約６．１ｋｂの増幅フラグメントを連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。さらに、約６．１ｋｂ ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドで形質転換された大腸菌を培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミド（以下、ｐＵ−ＡＰ１と称する）をＢａｍＨＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、約６．１ｋｂ ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−ＡＰ１ ＤＮＡと称する）を分離、回収した。
実施例３の４）と同様の方法に従い、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＡ（インビトロジェン製）をＢａｍＨＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記のＨＰＧ−ＡＰ１ ＤＮＡを連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌の中から、ＨＰＧ−ＡＰ１ ＤＮＡが正方向に連結した組換えプラスミドで形質転換された、抗ＨＰＧｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現している大腸菌を得た。
２）Ｃ型ＨＭＴｐ２１０ポリペプチドの発現
ヘモフィルス・パラガリナルムＣ型菌５３−４７株ゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６で得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離後、約６．１Ｋｂの増幅フラグメントを回収した。
プラスミドｐＵＣ１１９をＢａｍＨＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記の約６．１ｋｂの増幅フラグメントを連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。さらに、約６．１ｋｂ ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドで形質転換された大腸菌を培養し、ＰＥＧ沈澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた組換えプラスミド（以下、ｐＵ−ＣＰ１と称する）をＢａｍＨＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、約６．１ｋｂ ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ−ＣＰ１ ＤＮＡと称する）を分離、回収した。
実施例３の４）と同様の方法に従い、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＡをＢａｍＨＩで消化し、５’末端を脱リン酸化後、上記のＨＰＧ−ＣＰ１ ＤＮＡを連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌の中から、ＨＰＧ−ＣＰ１ ＤＮＡが正方向に連結した組換えプラスミドで形質転換された、抗ＨＰＧｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現している大腸菌を得た。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：８９３０
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
起源：ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株
配列
0004219987.tif 000006
0004219987.tif 000007
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0004219987.tif 000024
配列番号：２
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株
配列
0004219987.tif 000025
配列番号：３
配列の長さ：４３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004219987.tif 000026
配列番号：４
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004219987.tif 000027
配列番号：５
配列の長さ：７４８６
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
起源：ヘモフィルス・パラガリナルムＣ型菌５３−４７株
配列
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0004219987.tif 000043
0004219987.tif 000044
【図１】
0004219987.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004219987.tif 000052
【図９】
0004219987.tif 000053
【図１０】
0004219987.tif 000054
【図１１】
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【図１２】
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