(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＩＰ３を検出するための、以下の(a)、(b)または(c)に記載のタンパク質を含むＩＰ３指示薬。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)  配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＩＰ３受容体に結合するタンパク質
【請求項２】
上記タンパク質が蛍光または発光タンパク質と融合されている、請求項１記載のＩＰ３指示薬。
【請求項３】
上記タンパク質がＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちのいずれか一方の蛍光分子で標識されており、上記組合せのうちの他方の蛍光分子で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質と組合わせてＦＲＥＴ法によりＩＰ３を検出するための、請求項２記載のＩＰ３指示薬。
【請求項４】
２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項３記載のＩＰ３指示薬。
【請求項５】
サンプル中のＩＰ３濃度を測定するための方法であって、
(i)  配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質と、ＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなるタンパク質複合体を調製し；
(ii)  上記タンパク質複合体とサンプルを接触させ；
(iii)  遊離した、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質および／または上記複合体を定量すること；
を含む、上記方法。
【請求項６】
上記(iii)における定量が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質に対する抗体および／または抗ＩＰ３受容体抗体を用いた免疫化学的反応系を利用して実施されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記(iii)における定量が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質、あるいはＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質を予め標識しておいて、該標識物に由来するシグナルを測定することにより実施されることを特徴とする、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光標識である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記(iii)における定量が、ＦＲＥＴ法により実施されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ＹＦＰもしくはＶｅｎｕｓで標識した、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質と、ＣＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＣＦＰで標識した、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質と、ＶｅｎｕｓまたはＹＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
生細胞の細胞内のＩＰ３濃度を定量する方法であって、
(i)  細胞に、ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識された、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で導入して発現させ；
(ii)  該細胞を蛍光顕微鏡下で、上記の２つの蛍光分子のうち低波長側の蛍光分子の励起波長を照射して、該分子の蛍光波長と、他方の長波長側の蛍光分子の蛍光波長とを測定すること；
を含む上記方法。
【請求項１３】
ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質と、ＩＰ３受容体またはその少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなる、ＩＰ３濃度を定量するためのタンパク質複合体。
【請求項１５】
ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識された、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含みかつＩＰ３受容体に結合するタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で含み、生細胞内のＩＰ３濃度を定量するためのベクター。
【請求項１６】
２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項１５記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、IP3受容体に結合する新規タンパク質に関する。該タンパク質は、細胞内およびセルフリー(cell free)の系においてIP3指示薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜上のレセプターの活性化に伴いホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール1,4,5-三リン酸(inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3))が生成する。IP3はIP3受容体(IP3R)に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのCa2+放出を誘導する。このIP3/Ca2+シグナル経路において、IP3受容体は、IP3のシグナルをCa2+のシグナルへ変換する役割を担っている(1-3)。
【０００３】
IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+ 放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）である(3, 4)。哺乳動物では、3種の異なるIP3受容体が存在する(5-7)。IP3受容体タイプI(IP3R1)は、中枢神経系、特に小脳において高発現している(8, 9)。マウスIP3R1は、2749アミノ酸からなり(5)、 ３つの機能的に異なる領域に分かれている。すなわち、N末端近傍にIP3結合ドメイン、C末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら2つの領域のあいだに制御領域が存在する(10, 11)。IP3結合ドメインの欠失突然変異体解析より、IP3受容体のアミノ酸226〜578残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な最小領域であることが示され、IP3結合コアと呼ばれている(12)。IP3により誘発されるIP3受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明であるが、IP3結合がIP3受容体の何らかの立体構造変化を誘導することによって、チャネルの開口が起こると考えられる(10)。チャネルの開口以外にも、IP3-誘導性の立体構造変化は、IP3受容体の分解にも関与していると考えられる (13, 14)。
【０００４】
IP3受容体の活性化による細胞質Ca2+濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている (1-2, 15)。このような多岐に渡る細胞機能を制御するために、Ca2+シグナルは、空間、時間、および濃度の点で厳密に制御される必要がある(2, 15)。このようなCa2+シグナルの複雑な制御は、IP3受容体アイソフォームの発現の多様性、IP3受容体アイソフォームのヘテロ4量体の形成、IP3受容体の細胞内分布、ならびにCa2+自体、ATPおよびリン酸化によるIP3受容体の制御によって部分的にになわれている (3-4, 16)。IP3受容体チャネルはまた、カルモジュリン(18, 19)、FKBP12 (20-22、23-24)、カルシニューリン(21、25、23-24)、アンキリン (26-28)、σ-1 受容体(28)、クロモグラニンAおよびB (29-31)、IRAG (32)、 Fyn (33)ならびにBANK (34)などの該チャネルと相互作用するタンパク質によっても制御される(4, 17)。さらに、CaBPと呼ばれるファミリーが、Ca2+依存的にIP3受容体と結合し、IP3非存在下でIP3受容体を直接活性化することが示された(35)。IP3受容体はまた、タンパク質-タンパク質間相互作用によってその上流または下流のシグナル分子に物理的に会合していることが示されている。例えば、IP3受容体は、Homerファミリータンパク質を介して代謝型グルタミン酸受容体グループ１(mGluRs)と結合し(36)、また、未知の機序によってB2ブラジキニン受容体 (B2Rs)と結合している(37)。mGluRsやB2Rsの活性化によって、IP3受容体に近接した位置でIP3が産生され、効率的かつ特異的にシグナルが伝播される。
【０００５】
このように、IP3分子は、様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。しかし、in vitroでのIP3の定量に有効な指示薬として[3H]IP3を用いた方法が開発されているものの、放射性同位元素を使用するなどの点で簡便ではない。さらに、Ca2+やcAMPといった他のセカンドメッセンジャーとは異なり、生細胞内のIP3濃度変化の経時的な検出法は、GFP-プレクストリン相同性ドメイン(pleckstrin homology domain)の細胞膜から細胞質への移行をモニターすることにより検出する方法があるのみで、該方法も間接的、かつ定量性及び空間解像度の等の点で問題があるなど、必ずしも有効な方法ではない。このことが、細胞内IP3動態解析の障害となっている。
【０００６】
【非特許文献１】
Berridge, M. J. (1993) Nature 361, 315-325
【非特許文献２】
Berridge, M. J., Lipp, P., and Bootman, M. D. (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21
【非特許文献３】
Furuichi, T., and Mikoshiba, K. (1995) J. Neurochem. 64, 953-960
【非特許文献４】
Patel, S., Joseph, S. K., and Thomas, A. P. (1999) Cell Calcium 25, 247-264
【非特許文献５】
Furuichi, T., Yoshikawa, S., Miyawaki, A., Wada, K., Maeda, N., and Mikoshiba, K. (1989) Nature 342, 32-38
【非特許文献６】
Sudhof, T. C., Newton, C. L., Archer, B. T., III, Ushkaryov, U. A., and Mignery, G. A. (1991) EMBO J. 10, 3199-3206
【非特許文献７】
Blondel, O., Takeda, J., Janssen, H., Seino, S., and Bell, G. I. (1993) J. Biol. Chem. 268, 11356-11363
【非特許文献８】
Worley, P. F., Baraban, J. M., Colvin, J. S., and Snyder, S. H. (1987) Nature 325, 159-161
【非特許文献９】
Furuichi, T., Simon-Chazottes, D., Fujino, I., Yamada, N., Hasegawa, M., Miyawaki, A., Yoshikawa, S., Guenet, J.-L., and Mikoshiba, K. (1993) Recept. Channels 1, 11-24
【非特許文献１０】
Mignery, G. A., and Sudhof, T. C. (1990) EMBO J. 9, 3893-3898
【非特許文献１１】
Miyawaki, A., Furuichi, T., Ryou, Y., Yoshikawa, S., Nakagawa, T., Saitoh, T., and Mikoshiba, K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4911-4915
【非特許文献１２】
Yoshikawa, F., Morita, M., Monkawa, T., Michikawa, T., Furuichi, T., and Mikoshiba, K. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18277-18284
【非特許文献１３】
Zhu, C.-C., Furuichi, T., Mikoshiba, K., and Wojcikiewicz, R. J. H. (1999) J. Biol. Chem. 274, 3476-3484
【非特許文献１４】
Zhu, C.-C., and Wojcikiewicz, R. J. H. (2000) Biochem. J. 348, 551-556
【非特許文献１５】
Berridge, M. J., Bootman, M. D., and Lipp, P. (1998) Nature 395, 645-648
【非特許文献１６】
Thrower, E. C., Hagar, R. E., and Ehrlich, B. E. (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 580-586
【非特許文献１７】
Mackrill, J. J. (1999) Biochem. J. 337, 345-361
【非特許文献１８】
Patel, S., Morris, S. A., Adkins, C. E., O'beirne, G., and Taylor, C. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11627-11632
【非特許文献１９】
Michikawa, T., Hirota, J., Kawano, S., Hiraoka, M., Yamada, M., Furuichi, T., and Mikoshiba, K. (1999) Neuron 23, 799-808
【非特許文献２０】
Cameron, A. M., Steiner, J. P., Sabatini, D. M., Kaplin, A. I., Walensky, L. D., and Snyder, S. H. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1784-1788
【非特許文献２１】
Cameron, A. M., Nucifora, F. C., Jr, Fung, E. T., Livingston, D. J., Aldape, R. A., Ross, C. A., and Snyder, S. H. (1997) J. Biol. Chem. 272, 27582-27588
【非特許文献２２】
Dargan, S. L., Lea, E. J. A., and Dawson, A. P. (2002) Biochem. J. 361, 401-407
【非特許文献２３】
Bultynck, G., De Smet, P., Weidema, A. F., Ver Heyen, M., Maes, K., Callewaert, G., Missiaen, L., Parys, J. B., and De Smedt, H. (2000) J. Physiol. 525, 681-693
【非特許文献２４】
Bultynck, G., De Smet, P., Rossi, D., Callewaert, G., Missiaen, L., Sorrentino, V., De Smedt, H., and Parys, J. B. (2001) Biochem. J. 354, 413-422
【非特許文献２５】
Cameron, A. M., Steiner, J. P., Roskams, A. J., Ali, S. M., Ronnett, G. V., and Snyder, S. H. (1995) Cell 83, 463-472
【非特許文献２６】
Joseph, S. K., and Samanta, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6477-6486
【非特許文献２７】
Bourguignon, L. Y. W., Jin, H., Iida, N., Brandt, N. R., and Zhang, S. H. (1993) J. Biol. Chem. 268, 7290-7297
【非特許文献２８】
Hayashi, T., and Su, T.-P. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 491-496
【非特許文献２９】
Yoo, S. H., So, S. H., Kweon, H. S., Lee, J. S., Kang, M. K., and Jeon, C. J. (2000) J. Biol. Chem. 275, 12553-12559
【非特許文献３０】
Yoo, S. H., and Jeon, C. J. (2000) J. Biol. Chem. 275, 15067-15073
【非特許文献３１】
Thrower, E. C., Park, H. Y., So, S. H., Yoo, S. H., and Ehrlich, B. E. (2002) J. Biol. Chem. 277, 15801-15806
【非特許文献３２】
Schlossmann, J., Ammendola, A., Ashman, K., Zong, X., Huber, A., Neubauer, G., Wang, G.-X., Allescher, H.-D., Korth, M., Wilm, M., Hofmann, F., and Ruth, P. (2000) Nature 404, 197-201
【非特許文献３３】
Jayaraman, T., Ondrias, K., Ondiasova, E., and Marks, A. R. (1996) Science 272, 1492-1494
【非特許文献３４】
Yokoyama, K., Su, I., Tezuka, T., Yasuda, T., Mikoshiba, K., Tarakhovsky, A., and Yamamoto, T. (2002) EMBO J. 21, 83-92
【非特許文献３５】
Yang, J., McBride, S., Mak, D.-O. D., Vardi, N., Palczewski, K., Haeseleer, F., and Foskett, J. K. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7711-7716
【非特許文献３６】
Tu, J. C., Xiao, B., Yuan, J. P., Lanahan, A. A., Leoffert, K., Li, M., Linden, D. J., and Worley, P. F. (1998) Neuron 21, 717-726
【非特許文献３７】
Delmas, P., Wanaverbecq, N., Abogadie, F. C., Mistry, M., and Brown, D. A. (2002) Neuron 14, 209-220
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、IP3の検出および定量に有効な指示薬となる新規IP3受容体結合タンパク質を提供し、ならびにそれを用いたIP3の検出および/または定量方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、IP3受容体結合タンパク質、特に、IP3受容体と相互作用し、かつ該相互作用がIP3により制御されている分子に注目し、鋭意検討を行った。IP3R1（アミノ酸配列を配列番号７に示している）の細胞質領域の大部分に当たるN末端2217アミノ酸残基を結合させたアフィニティカラムを用いて、IP3で該カラムに結合したタンパク質を溶出することにより、新規IP3受容体結合タンパク質を同定し、IRBIT(IP3R binding protein released with inositol 1,4,5-trisphospate)と命名した。IRBITは、in vitroおよびin vivoでIP3R1に結合し、その細胞内局在はIP3R1とよく一致した。さらに、IRBITは生理的濃度のIP3によりIP3R1から解離することも判った。これらの結果から、IRBITはIP3の指示薬として有用であると考え、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の態様：
１．  以下の(a)、(b)または(c)のタンパク質、
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列の1〜104番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)  配列番号１に示すアミノ酸配列またはその１〜104番目までのアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつIP3受容体に結合するタンパク質
２．  上記１記載のタンパク質をコードする遺伝子、
３．  以下の(a)、(b)または(c)のDNAからなる遺伝子、
(a)  配列番号２に示す塩基配列を含むDNA
(b)  配列番号２に示す塩基配列の1〜312番目までの塩基配列を含むDNA
(c)  (a)または(b)の塩基配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつIP3受容体に結合するタンパク質をコードするDNA
４．  上記２または３記載の遺伝子を含むベクター、
５．  上記２または３記載の遺伝子に、プロモーターが機能し得る形で連結されている、上記４記載のベクター、
６．  上記２または３記載の遺伝子を、蛍光または発光タンパク質をコードする遺伝子とインフレームで連結された形で含む、上記５記載のベクター、
７．  蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、VenusおよびFlAsHならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、上記６記載のベクター、
８．  上記４〜７のいずれか1つ記載のベクターを含有する宿主細胞、
９．  哺乳動物細胞である、上記８記載の宿主細胞、
１０．  サンプル中のIP3を検出するための、上記１記載のタンパク質を含むIP3指示薬、
１１．  上記タンパク質が蛍光または発光タンパク質と融合されている、上記１０記載のIP3指示薬、
１２．  上記タンパク質がFRET法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちのいずれか一方の蛍光分子で標識されており、上記組合せのうちの他方の蛍光分子で標識されたIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質と組合わせてFRET法によりIP3を検出するための、上記１１記載のIP3指示薬、
１３．  ２つの蛍光分子からなる組合わせが、VenusとCFPとの組合せ、YFPとCFPとの組合せ、またはFlAsHとCFPとの組合せである、上記１２記載のIP3指示薬、
１４．  上記１記載のタンパク質を特異的に認識する抗体またはその機能的フラグメント、
１５．  ウサギポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、上記１４記載の抗体およびその機能的フラグメント、
１６．  サンプル中のIP3濃度を測定するための方法であって、
(i)  IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質とIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質からなるタンパク質複合体を調製し；
(ii)  上記タンパク質複合体とサンプルを接触させ；
(iii)  遊離IRBITもしくはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質および/または上記複合体を定量すること；
を含む、上記方法、
１７．  上記(iii)における定量が、抗IRBIT抗体および/または抗IP3受容体抗体を用いた免疫化学的反応系を利用して実施されることを特徴とする、上記１６記載の方法、
１８．  上記(iii)における定量が、IRBITもしくはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質またはIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質を予め標識しておいて、該標識物に由来するシグナルを測定することにより実施されることを特徴とする、上記１６または１７記載の方法、
１９．  標識が蛍光標識である、上記１８記載の方法、
２０．  上記(iii)における定量が、FRET法により実施されることを特徴とする、上記１６記載の方法、
２１．  YFPもしくはVenusで標識したIRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質と、CFPで標識したIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、上記２０記載の方法、
２２．  CFPで標識したIRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質と、VenusまたはYFPで標識したIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、上記２０記載の方法、
２３．  生細胞の細胞内のIP3濃度を定量する方法であって、
(i)  細胞に、FRET法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたIRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で導入して発現させ；
(ii)  該細胞を蛍光顕微鏡下で、上記の２つの蛍光分子のうち低波長側の蛍光分子の励起波長を照射して、該分子の蛍光波長と、他方の長波長側の蛍光分子の蛍光波長とを測定すること；
を含む上記方法、
２４．  FRET法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせが、VenusとCFPとの組合せ、YFPとCFPとの組合せ、またはFlAsHとCFPとの組合せである、上記２３記載の方法、
２５．  IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質とIP3受容体またはその少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質からなる、IP3濃度を定量するためのタンパク質複合体、
２６．  FRET法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたIRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたIP3受容体の少なくともIP3結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で含み、生細胞内のIP3濃度を定量するためのベクター、ならびに
２７．  ２つの蛍光分子からなる組合わせが、VenusとCFPとの組合せ、YFPとCFPとの組合せ、またはFlAsHとCFPとの組合せである、上記２６記載のベクター、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】
本発明者らが新たにクローニングした新規IP3受容体タンパク質であるIRBITは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、これはN末端領域(アミノ酸1〜104)とC末端領域(アミノ酸105〜530)とに分けられ、C末端領域はS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼに相同性を有しているものの該酵素活性は示さず、N末端領域はIP3受容体(本明細書中、IP3受容体とはIP3R1およびIP3受容体タイプII(IP3R2)を含むIP3受容体の任意のサブタイプを指す)との結合に必須な領域である。該タンパク質の特徴としては、以下の：(1)中性タンパク質である(推定pI値：6.48)が、N末端領域は比較的酸性である(推定pI値：4.98)こと、(2)N末端領域に7つのリン酸化部位が集中的に局在しており、リン酸化がIP3R1との相互作用に必要であると推測されること、(3) IP3R1のIP3との結合に必須である508番目のリジン残基がIRBITとの相互作用においても必須であること、(4) IP3によりIP3R1との相互作用が解離すること、および(5)高塩濃度により、IP3R1との相互作用が解離し、かつ粗ミクロソーム画分から抽出されることから、IP3R1との相互作用は静電気的結合によると推測されること：が挙げられる。
【００１２】
したがって、本発明は、IRBITタンパク質、IRBITのIP3受容体への結合に必須な領域であるN末端領域(1〜104番目のアミノ酸)、およびこれらのアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。場合によっては、IRBITの1〜277番目のアミノ酸を含むタンパク質が好ましい。さらに、これらのタンパク質の変異体であって、IP3受容体結合活性を保持したまま、1もしくは複数個のアミノ酸、好ましくは1〜50個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ配列を含むタンパク質もまた、本発明に包含される。
【００１３】
さらに、これらのタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。該遺伝子は、例えばIRBITタンパク質をコードする配列番号２に示す塩基配列、またはIRBITのIP3受容体結合ドメインであるN末端領域(1〜104番目のアミノ酸)をコードする配列番号２に示す塩基配列の1〜312番目までの塩基配列を含むDNAである。また、これらのDNAまたはその相補鎖DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAをも含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が10mM〜300mMであり、好ましくは37〜65℃、より好ましくは42℃である条件をいう。あるいは、このような条件は、ECLTM direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmacia製)を用いて、添付されている説明書の記載に従うことにより達成することができる。さらに、配列番号２の塩基配列またはその１〜312番目までの塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつIP3受容体結合活性を有するタンパク質をコードするものも含む。ここで、欠失、置換または付加を受ける塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１〜100個、より好ましくは１〜50個、さらに好ましくは１〜20個、最も好ましくは1〜10個である。このような核酸の塩基配列としては、配列番号１に表される塩基配列との相同性が、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合）、70％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上もしくは99％以上である。さらに、これらのDNAに対応するRNA、これらのDNAを含むベクター、上記DNAが発現可能なように該DNAにプロモーターが機能し得る形で連結されているベクター、および上記DNAの発現産物(IRBIT分子等)を標識化するための何らかの標識物をコードするDNAと上記DNAがインフレームで連結されているベクター、さらにはこれらのベクターを含有する宿主細胞(昆虫細胞、大腸菌および哺乳動物細胞が好ましいが、これらに限定はされない)も、本発明に包含される。上記標識物は、ヒスチジンタグ(His-tag)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）およびビオチン等の免疫学的反応またはタンパク質間結合を利用するための標識でもよく、緑色蛍光タンパク質（GFP）CFP、Venus、FlAsHおよびReAsHならびにこれらの誘導体などの蛍光または発光タンパク質であってもよいが、これらに限定されることはなく、公知のあらゆる標識物のうちの任意のものであってよい。
【００１４】
さらに、IRBITはIP3により選択的かつ濃度依存的に、IP3受容体から解離し得るタンパク質である。例えば、IP3受容体をIP3受容体タイプIとした場合、その上記解離に対するEC50値は約0.5μMである。この値は従来法によるIP3結合アッセイにより測定されたIP3R1のIP3への結合におけるKd値(Kd＝83〜100 nM：60, 61)より高いが、この差は、IP3のIP3受容体への結合親和性はpHおよびイオン強度に大きく依存していることから(62-64)、おそらくバッファー条件が異なる(該アッセイでは、pH8.0〜8.3、低イオン強度の条件で測定している)ことに起因するのではないかと考えられる。従来法とは異なる表面プラズモンレゾナンスバイオセンサーによる研究では、IP3R1のN末端領域(アミノ酸1〜604)について生理的条件下(pH7.4、150 mM NaCl)で測定するとKd値は336 nMであり(64)、これは従来法によるKd値と比較して親和性が約7.5倍低いことを示す。この値は、IRBITのIP3R1(本発明においては、実験の利便性のためにGST融合タンパク質を用いており、これをGST-ELと本明細書中では呼ぶ)との相互作用の解離におけるEC50値(約0.5 μM：pH7.4、100 mM NaCl下で測定)に近い。以上のことから、IRBITはIP3受容体にIP3が結合することによりIP3受容体と解離すると考えられる。これを支持するデータとして、Luzziらが検出細胞/キャピラリー電気泳動システムを用いて測定した結果によると、IP3の細胞内濃度は、刺激前は数十nMであり刺激後は数μMに上昇するとされている（50）。上述のとおりIP3R1からのIRBITの解離に対するIP3のEC50値が約0.5μMであり、この値は、刺激前と刺激後の細胞内IP3濃度の変化範囲に含まれており、IRBITは細胞外刺激により誘導されるIP3産生後にIP3受容体から解離することが強く示唆される。
【００１５】
IP3により濃度依存的にIP3受容体から解離するというIRBITの特性によって、IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを少なくとも含有するタンパク質を新規IP3指示薬として利用できる。すなわち、例えばIRBITを用いる場合、対象とするサンプルを、IRBIT-IP3受容体複合体（この際のIP3受容体は完全な分子である必要はなく、IP3とIRBITの両方が結合できる領域を少なくとも含むフラグメント（以下、IP3BDと称する）でよい）と接触させて、IP3受容体から解離したIRBITの量を定量するか、逆にIP3との接触後に残存するIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体を定量することにより、IP3の定量的検出が可能となる。IRBITのIP3受容体結合ドメインを少なくとも含有するタンパク質を用いた場合も同様である。
【００１６】
遊離IRBITまたはIRBIT-IP3受容体複合体の定量的検出は、免疫学的手法によっても可能である。
【００１７】
本明細書において「抗体」という用語は、完全な抗体分子およびその完全な抗体に由来する抗原結合能を保持しているフラグメント、およびこれらの誘導体を含む。IRBITに対する抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよく、いずれの場合も、IRBIT分子またはその一部のペプチドを動物に免疫することによる一般的な方法で取得できる。これらの抗体分子を精製する方法、およびIRBITに対する結合性を有する抗体の断片に切断してこれを精製する方法もまた当業者には公知であり、所望により適切な方法を選択することができる。これらの抗体分子を用いて、遊離IRBITを検出することは、当業者であれば容易に達成し得る。また、該抗体分子を用いてIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体を検出する方法も、当業者であれば容易に達成し得る。例えば、IP3R1を予め固相支持体（ビーズ、またはアッセイプレート表面等）に結合させておき、IP3R1を介して固相に結合しているIRBITを検出するとよい。
【００１８】
さらに、IRBITを適切な分子で標識化し、該標識を検出することにより遊離IRBITまたはIRBIT-IP3受容体/IP3BDの定量的検出が可能である。標識は、放射性標識、免疫標識、色素標識、蛍光標識または発光標識等、タンパク質の標識物として公知である標識分子のうち任意のものを該標識分子に応じた公知の方法でIRBIT分子に結合させることにより達成できる。また、使用する標識によって、その標識に由来するシグナルを検出することは、当業者であれば公知技術に基づいて容易に達成できる。
【００１９】
まず、IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを少なくとも含むタンパク質とIP3受容体またはIP3BDからなる複合体(IRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体と称する)を調製する。IRBITは細胞内でIP3受容体と複合体を形成するため、IP3受容体を発現する天然の細胞（小脳神経細胞等）から精製することもできるが、IRBITまたはそのIP3受容体結合ドメインを少なくとも含むタンパク質とIP3受容体分子またはIP3BDを含むタンパク質を強制発現させた細胞（大腸菌またはSf9細胞等）から、生化学的分画法によりミクロソーム画分を分画してもよい。あるいは、分子標識物（ヒスチジンタグ等）が付いた形で上記タンパク質を強制発現させて、細胞溶解液から標識物を利用して抽出することもできる。場合によっては、その他公知の精製法（カラムクロマトグラフィーなど）を用いてもよい。
【００２０】
さらに、IRBITとIP3BDを別々にそれぞれ調製し、複合体を形成させることも可能である。すなわち、例えば、GST-IP3BDを大腸菌で発現させてグルタチオン-セファロースで精製し、IRBITまたはそのIP3受容体結合領域を含むタンパク質を大腸菌またはSf9細胞で発現させる。該IRBITまたはそのIP3受容体結合領域を含むタンパク質をGST-IP3BDと接触させることにより複合体を形成させ、グルタチオン-セファロースでプルダウンすることにより該複合体を精製できる。あるいはまた、小脳高塩抽出画分などより、組織中のIRBITをGST-IP3BDとグルタチオン-セファロースでプルダウンすることにより上記複合体を調製してもよい。
【００２１】
調製したIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体（1〜100μM程度に10 mM Hepes、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-ME、pH7.4中にて調製する）にIP3を含むサンプルを接触させて、5〜30分程度氷上でインキュベートした後、該溶液中に存在する遊離IRBITまたは残存するIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体を検出する。反応に用いるIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体を予め固相担体に結合させておき、反応後固相担体を液相から分離して液相中の遊離IRBITを検出するか、または固相担体に結合しているIRBIT-IP3受容体/IP3BD複合体中のIRBITを検出することもできる。IRBITの検出は、IRBITを認識する抗体を用いて免疫学的反応系により行ってもよく、また標識化IRBITを用いた場合には該標識を検出することで行ってもよい。
【００２２】
さらに、本発明の１実施形態では、蛍光のエネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer, FRET）を利用した方法により、IP3を定量することも可能である。
【００２３】
蛍光のエネルギー移動（FRET）とは、２つの蛍光団が互いに近距離で適切な位置関係にある時に、一方の蛍光団（エネルギー供与体(donor)）から、もう一つのより長波長側の蛍光団（エネルギー受容体(acceptor)）へ励起エネルギーが移動する現象である。2つの分子を特定の2種の蛍光分子で標識することにより、その２つの分子間の相互作用の変化をFRET効率の変化として測定することができる。また、分子間の相互作用を制御する別の分子の濃度変化を測定することも可能となる。
【００２４】
FRET法により、細胞内Ca2+濃度変化の検出法(72)またはｃAMP濃度変化の検出法(71)等が開発されている。
【００２５】
IRBITはIP3受容体のIP3BDに結合しており、IP3によりIP3受容体から解離する。この性質を利用し、IRBITとIP3BDを各々FRETが可能な2種の蛍光標識からなる組合わせのそれぞれで標識することにより、in vitroあるいは細胞内でのIP3濃度変化を検出することができる。すなわち、例えば、IRBITを例えば黄色蛍光タンパク質 (YFP)またはその改良体であるVenusで標識し、IP3BDをシアン蛍光タンパク質(CFP)で標識する。IP3非存在下ではIRBITはIP3BDに結合しておりCFPからVenusにFRETが起こるが、IP3存在下では両者は解離し、FRETが起こらなくなる。さらにVenus-IRBITとCFP-IP3BDをリンカー配列を介して結合させる（Venus-IRBIT-IP3BD-CFP）と両者のモル比が等しくなり、効率的である。in vitroでIP3濃度を測定する場合は、細胞の抽出液などにVenus-IRBIT-IP3BD-CFPタンパク質を加え、FRETを測定する。また、Venus-IRBIT-IP3BD-CFPの遺伝子を細胞内に導入させれば、生きた細胞内のIP3濃度変化を時間空間的に解析することができる。FRET法の測定は、蛍光顕微鏡または蛍光計等で測定することができる。
【００２６】
FRET法によるIP3検出法の例をさらに詳細に以下に記載する。
まず、Venus-IRBIT-IP3BD-CFP発現ベクターを作成する。IRBIT全長またはIP3BDとの結合に必要十分な領域を含むその欠失変異体（例えば、アミノ酸1〜104またはアミノ酸1〜277からなる変異体）、マウスIP3受容体タイプIのIP3結合領域（配列番号７のアミノ酸224〜604からなる領域）を含むタンパク質、VenusおよびCFPの4つのcDNAをPCRで増幅し、フレームが合うように哺乳動物細胞発現ベクター（pcDNA3など）に挿入する。順番は、例えばVenus-IRBIT-IP3BD-CFPのように内側２つにIRBITとIP3BD、外側２つにVenusとCFPというようにすれば、特に制約はない。リコンビナントタンパク質調製用には、大腸菌発現用ベクター（pETなど）あるいはSf9発現用ベクター（pFastBacなど）に挿入する。この場合は精製用にタグ（Hisタグなど）をN末端あるいはC末端に付加する。
【００２７】
Venus-IRBIT-IP3BD-CFPを大腸菌あるいはSf9細胞で発現させ、Hisタグを付けた場合はProBond resin（Invitorgen）などで精製する。場合によってはイオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製してもよい。
【００２８】
精製したVenus-IRBIT-IP3BD-CFPタンパク質に、濃度の分かっているIP3溶液を添加し、CFPの励起波長（440 nm付近）をあて、CFPの蛍光波長（480 nm付近、CFP蛍光）と、Venusの蛍光波長（535 nm付近、FRET蛍光）を測定する。IP3濃度とFRET蛍光/CFP蛍光比をプロットすることにより、検量線を決定する。IP3濃度が未知のサンプル（細胞抽出液など）にVenus-IRBIT-IP3BD-CFPタンパク質を添加し、FRET蛍光/CFP蛍光比を求め、検量線と比較することにより、IP3濃度を定量する。
【００２９】
生細胞中のIP3濃度もまた、FRET法により測定できる。まず、pcDNA-Venus-IRBIT-IP3BD-CFPを培養細胞（Cos-7、HeLaなど）に遺伝子導入試薬（Trans IT (Mirus)など）で遺伝子導入する。遺伝子導入してから1〜3日後のグラスボトムディッシュ上の細胞を冷却CCDカメラ付き倒立型蛍光顕微鏡（IX71 (Olympus)など）で観察する。CFPの励起波長（440 nm付近）をあて、CFPの蛍光波長（480 nm付近、CFP蛍光）と、Venusの蛍光波長（535 nm付近、FRET蛍光）を測定する。両者の蛍光強度の比をとることによりFRET効率を定量する。IP3を産生するアゴニスト（Cos-7の場合はATP、HeLaの場合はヒスタミンなど）をグラスボトムディッシュに添加し、FRET効率を経時的に測定する。アゴニストによりIP3が産生されれば、FRET/CFPの比が低下することが期待される。
【００３０】
上記にVenusとCFPの組合せの蛍光標識を用いた場合について例示的に述べたが、この組み合わせは、YFPとCFPまたはFlAsHとCFPでも可能であり、またこれらに限定されない。さらに、FRET法に用いるための蛍光分子は今後種々のものが開発されるであろうと予測されるが、それらもまた本発明の実施に使用可能であろう。
【００３１】
また、本発明のIP3検出方法に使用するための本発明のIP3指示薬またはIP3検出用キットもまた、本発明に包含される。該指示薬またはキットには、IRBITの少なくともIP3受容体結合領域を含むタンパク質またはこれをコードするDNAもしくはRNAが含まれている。場合によっては、IP3受容体の少なくともIP3結合領域を含むタンパク質またはコードするDNAもしくはRNAを含む。さらに、標識試薬（蛍光標識化合物等）および/または上記タンパク質を認識する抗体を含んでいてもよい。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００３３】
方法
IP3R1アフィニティカラムの作製
マウスIP3R1のN末端領域(アミノ酸１〜225)をコードするcDNAをグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）融合ベクターpGEX-KGに挿入した(40)。該GST-IR3R1(1-225)断片をバキュロウイルストランスファーベクターpBlueBac4.5(Invitorogen)にサブクローニングした。該GST-IR3R1(1-225)のSmaI部位より下流の領域を、マウスIP3R1(アミノ酸79〜2217に相当)のSmaI-EcoRI断片で置き換え、GST-IP3R1(1-2217)ベクター(GST-ELと命名した)を構築した。コントロールとしてGSTのみをコードする断片をpBlueBac4.5にサブクローニングした。Sf9細胞は27℃で10％ウシ胎仔血清を添加したTNM-FH培地で培養した。GST-ELまたはGST遺伝子を持つ組換えバキュロウイルスをBac-N-Blue(商標)トランスフェクションキット(Invitrogen)を用いて、添付の説明書にしたがって作製した。感染多重度５で組換えバキュロウイルスを感染させて48時間インキュベートすることにより、GST-ELおよびGSTを２×108個のSf9細胞で発現させた。細胞を回収後-80℃で保存した。凍結保存しておいた細胞を10 mM Hepes (pH 7.4)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール(2-ME)、0.1% Triton X-100、およびプロテアーゼインヒビター(1 mM フェニルメチルスフホニルフロライド(PMSF)、10 μM ロイペプチン、2 μM ペプスタチンA および10 μM E-64)に懸濁し、ガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズした(1000 rpm、10ストローク)。ホモジネートを20,000 x gで 30分遠心し、上清を 3 mlのグルタチオン-セファロース 4B (Amersham Pharmacia Biotech)と共に3時間 4℃でインキュベートした。40 mlの10 mM Hepes (pH 7.4)、250 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-MEおよび0.1% Triton X-100で8回洗浄後、グルタチオン-セファロースに結合した GST-ELまたはGSTをカラムに充填して10 mM Hepes (pH 7.4)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-MEおよび0.1% Triton X-100で平衡化した。約5mgのGST-ELを固定化した。
【００３４】
IRBITの精製および部分アミノ酸配列決定
成熟ラット小脳(約5g)をホモジナイズバッファー(10 mM Hepes (pH 7.4)、20 mM ショ糖、 2 mM EDTA、1 mM 2-ME、およびプロテアーゼインヒビター)45ml中でガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズした(950 rpm、10 ストローク)。ホモジネートを1,000 x gで10分間遠心し、上清(S1画分)をさらに100,000 x gで60分間遠心して、細胞質画分(上清)と粗ミクロソーム画分(ペレット)とを得た。粗ミクロソーム画分を、500 mM NaClを含むホモジナイズバッファー25ml中でガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズし(1,200 rpm、10 ストローク)、15分氷上でインキュベート後、100,000 x gで60分間遠心して高塩抽出画分(上清)と高塩抽出後粗ミクロソーム画分(ペレット)とを得た。高塩抽出画分を希釈バッファー(10 mM Hepes (pH 7.4)、2 mM EDTA、1 mM 2-ME、 0.01% Brij 35、およびプロテアーゼインヒビター)で5倍希釈し、希釈した高塩抽出画分をグルタチオン-セファロースで前処理した後、結合バッファー (10 mM Hepes (pH 7.4)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、および1 mM 2-ME)で平衡化しておいたGST-EL アフィニティカラムに添加した。コントロールとしてGSTカラムを用いた。カラム容量の20倍の結合バッファーにてカラムを洗浄した後、50 μM IP3 (Dojindo)と0.05% Brij 35とを含む結合バッファーでカラムに結合しているタンパク質を溶出させた。溶出液を濃縮して、10％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分離してクマシーブリリアントブルー(CBB)で染色した。約60kDaの位置にあるタンパク質のバンドをゲルから切り出し、公知の方法(41)に従いリジルエンドペプチドチダーゼ(Wako)で切断した。切断したペプチドをSMARTシステム(Amersham Pharmacia Biotech)につないだC-18 逆相カラム(μRPC C2/C18 SC 2.1/10、Amersham Pharmacia Biotech)で分離した。各ペプチドのアミノ酸配列を494 procise protein sequencer (Applied Biosystems)で配列決定したところ、2つのペプチド配列、N-YSFMATVTK-C（配列番号３）およびN-QIQFADDMQEFTK-C（配列番号４）が得られた。
【００３５】
IRBITのcDNAクローニング
上記60kDaのタンパク質から得られた上記2つのペプチド配列を非重複データベース(non-redundant database)についてBLAST検索したところ、これらの配列は、データベース中の１つの配列(登録番号 CAC09285)にマッチした。マウス発現配列タグのデータベース(登録番号AW229870およびBE282170)に基づいて、該cDNAに相同的なプライマー(5'-ATGTCGATGCCTGACGCGATGC-3'（配列番号５）および5'-GCGTGGTTCATGTGGACTGGTC-3'（配列番号６）)を合成した。IRBITのcDNAを、oligo dT-プライマーを用いて合成したマウス小脳第1鎖cDNAをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にて増幅させた。PCR産物をpBluescript II KS(+) (Stratagene)にクローニングして配列決定した。3つの独立クローンの配列を確認した。
【００３６】
組換えタンパク質の調製
IRBITの全長およびN末端(アミノ酸1〜104)をコードするcDNAを、大腸菌ヘキサヒスチジン(His) 融合ベクターpET-23a(+) (Novagen)にサブクローニングして、各々IRBIT-HisおよびIRBIT(1-104)-His 発現ベクターを作製した。同じcDNAをGST融合ベクター pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) にサブクローニングし、各々GST-IRBITおよびGST-IRBIT(1-104) 発現ベクターを作製した。マウスIP3R1のアミノ酸配列(配列番号７)のアミノ酸1〜225、1〜343、341〜923、600〜1248、916〜1581および1553〜1943をコードするcDNA断片を pGEX-KGに挿入して、各々GST-Ia、GST-Iab、GST-IIab、 GST-IIbIIIa、GST-IIIabおよびGST-IV発現ベクターとした。マウスIP3R1のアミノ酸1593〜2217をpGEX-4T-1に挿入してGST-IV-Va発現ベクターを得た。これらの融合タンパク質を大腸菌で発現させた。GST-ELは、上記のようにしてSf9 細胞で発現させた。発現されたHis-タグ融合タンパク質はProBond樹脂(Invitrogen)を用いて精製し、GST融合タンパク質は、グルタチオン-セファロースで精製した。GST-IbIIa(マウスIP3R1のアミノ酸224〜604)とその部位特異的突然変異K508AおよびR441Qは既に公知であるものを用いた(引用文献42参照のこと、GST-IbIIaは該文献中G224と称されている)。
【００３７】
酵素活性測定
S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼの加水分解方向への活性を測定するために、公知の方法に(43)したがって、精製したIRBIT-His(3.0 μg)、GST-IRBIT(4.3 μg)、GST(1.3 μg)およウサギS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(Sigma) (2.4 μg)を用いて、生成産物(ホモシステイン)と5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(Sigma)との反応による発色を光学的に測定した。 412 nmでの吸光度を、DU 640分光光度計(Beckman)にて0、5、20および60分後に測定した。3回の独立した実験結果を平均 ± 標準偏差で示した(図2)。
【００３８】
アフィニティ精製用抗IRBIT抗体の作製
ニホンシロウサギに、精製IRBIT(1-104)-Hisを、完全フロイントアジュバントと共に14日間隔で皮下注射して免疫した。抗IRBIT抗血清を、シアノジェンブロマイド-活性化セファロース4B(Amersham Pharmacia Biotech)に共有結合させたGST-IRBIT(1-104)に通し、該カラムに特異的に結合した抗体を100 mM グリシン-HCl (pH 2.5)で溶出した。
【００３９】
細胞画分の調製およびイムノブロッティング
大脳、小脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、胸腺、脾臓、精巣および卵巣を、成熟マウスより摘出してS1画分を上記方法により得た。マウス小脳の細胞質画分、粗ミクロソーム画分、高塩抽出画分、および高塩抽出後粗ミクロソーム画分を、上記と同様の方法により得た。図に示す量のタンパク質を10％SDS-PAGEに供し、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜に電気的に転写した。ブロッキングした後に、該膜を抗IRBIT抗体(1 μg/ml)で室温にて1時間インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギIgG(Amersham Pharmacia Biotech)でブロットした。免疫反応したバンドを、増幅化学発光検出システム（enhanced chemiluminescence detection system；Amersham Pharmacia Biotech）で検出した。
【００４０】
ほ乳細胞発現ベクターの作製とトランスフェクション
全長IRBITをコードするcDNAをpcDNA3 (Invitrogen)にサブクローニングした。全長IRBITまたはその欠失変異体(アミノ酸1〜277、1〜104、および105〜530)をコードするcDNAをpEGFP-C1 (Clontech)にサブクローニングして、緑色蛍光タンパク質(GFP)融合タンパク質発現ベクターを作製した。マウスIP3R1発現ベクターpBact-STneoB-C1は既に公開されているものを用いた(44)。Cos-7細胞を10％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で37℃にて培養した。TransIT transfection reagents (Mirus)を用いて、添付の説明書にしたがって、一過性遺伝子導入を行った。遺伝子導入してから2日後の細胞をイムノブロッティング、プルダウン実験、または免疫染色に用いた。
【００４１】
in vitro結合実験
マウス小脳細胞質画分を10 mM Hepes (pH 7.4)、 200 mM NaCl、 2 mM EDTA、1 mM 2-ME および0.02% Triton X-100で２倍希釈した。高塩抽出画分は、10 mM Hepes (pH 7.4)、2 mM EDTA、1 mM 2-MEおよび0.01% Triton X-100で5倍希釈した。希釈した画分を(両画分ともNaCl最終濃度は100 mM)を20 μgのGST-ELまたはGSTと4℃にて2時間インキュベートした。10 μlのグルタチオン-セファロースを添加してさらに2時間インキュベートし、該樹脂を洗浄バッファー(10 mM Hepes (pH 7.4)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-ME、and 0.01% Triton X-100)で5回洗浄した後、結合したタンパク質を20mMのグルタチオンで溶出させた。溶出したタンパク質は抗IRBIT抗体によるウェスタンブロットにより解析した。
【００４２】
脱リン酸化のためには、希釈した高塩抽出画分を大腸菌アルカリホスファターゼ(Toyobo)の存在下または非存在下のいずれかで2 mM MgCl2と共に37℃にて30分インキュベート後、5 mMのEDTAを添加して、上述のとおりプルダウンアッセイに供した。
【００４３】
解離実験には、希釈した高塩抽出画分中のIRBITをGST-ELを用いて、上述のとおりプルダウンにより沈降させて洗浄の後、IP3、イノシトール4,5-二リン酸(IP2) (Dojindo)、イノシトール1,3,4,5-四リン酸(IP4) (Calbiochem)、イノシトール1,2,3,4,5,6-六リン酸(IP6)(Calbiochem)またはATP(Amersham Pharmacia Biotech) (各0.1、0.3、1、3または10 μM)を含む洗浄バッファー100μlを、樹脂に添加した。氷上で10分間インキュベートした後、サンプルを10,000 rpmで1分間遠心し、その上清を抗IRBIT抗体またはヤギ抗GST抗体(Amersham Pharmacia Biotech)によるイムノブロットに供した。定量化のために、Alexa 680-結合ヤギ抗ウサギIgG (Molecular Probes)を二次抗体として用いた。IRBITの免疫反応性のバンドの蛍光強度は、Odyssey infrared imaging system (Aloka)で測定した。定量データ(少なくとも3回の独立した実験の平均±SD)は、10μMの IP3溶出物中のIRBITの量に対する比率で示した。
【００４４】
IP3R1のIRBIT結合領域およびIRBIT結合に必要なアミノ酸残基を特定するために、希釈した高塩抽出画分を100 pmol のGST、GST-EL、GST-Ia、GST-Iab、 GST-IbIIa、 GST-IIab、GST-IIbIIIa、GST-IIIab、GST-IV、GST-IV-Va、K508AまたはR441Qを用いて上述のとおりプルダウンアッセイに供し、抗IRBIT抗体にてウェスタンブロッティングにより解析した。
【００４５】
IRBITのIP3R1-結合領域の同定は、GFP-タグ付き全長IRBITまたはこれの末端欠失型変異体を発現するCos-7細胞を溶解バッファー(10 mM Hepes (pH7.4)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 2-ME、0.5% Nonidet P-40、およびプロテアーゼインヒビター)で4℃にて30分間溶解させて遠心した(100,000 x g、 30分)。上清を、GST-ELまたはGSTで上述のとおりプルダウンアッセイに供し、結合したタンパク質を抗GFP抗体(Medical & Biological Laboratories)でイムノブロット解析に供した。
【００４６】
間接的免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法
遺伝子導入したCos-7細胞をガラスカバースリップ上で培養して、生理的リン酸バッファー(PBS)で1度洗浄して4% ホルムアルデヒド含有 PBSで15分間固定化し、0.1% Triton X-100含有PBSで5分間、膜透過処理した後、2%のヤギ血清を含むPBSで室温にて60分間ブロッキングした。細胞質中のタンパク質を洗い流すために、遺伝子導入した細胞を氷冷した0.1%サポニン含有細胞膜透過化バッファー(80 mM PIPES (pH 7.2)、1 mM MgCl2、1 mM EGTAおよび4% ポリエチレングリコール)中で細胞膜に穴をあけ、氷冷細胞膜透過化バッファーで2回洗浄した後、固定化した。その後細胞に、ウサギ抗IRBIT抗体(1μg/ml、室温、60分)およびラット抗IP3R1抗体18A10(45)(4℃にて一晩)を反応させた。PBSで5分間洗浄した後、Alexa 488-結合ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa 594-結合ヤギ抗ラットIgG(Molecular Probes)を37℃で45分間反応させた。PBSにて5分間ずつ4回洗浄した後、カバースリップをVectashield (Vector Laboratories)でマウントしてIX-70共焦点蛍光顕微鏡(Olympus)を用いて60倍の対物レンズで観察した。
【００４７】
免疫沈降
1% Nonidet P-40を含む50 mM Hepes (pH7.4)、1 mM MgCl2およびプロテアーゼインヒビターで4℃にて30分間処理することにより、粗ミクロソームから界面活性剤可溶化抽出物を得、20,000 x gで30分間遠心した。上清を免疫沈降バッファー(10 mM Hepes (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、および1% Nonidet P-40)にて10倍に希釈し、ウサギ抗IRBIT抗体(3μg)あるいはコントロールウサギIgG(3μg)と共に4℃にて2時間インキュベートした。免疫複合体を、プロテインG セファロース4ファストフロー(Amersham Pharmacia Biotech)を添加して4℃にて2時間反応させた。樹脂を免疫沈降バッファーで3回洗浄して抗IRBIT抗体またはマウス抗IP3R1抗体 KM1112(47)によるウエスタンブロットに供した。
【００４８】
結果
新規IP3R結合タンパク質の精製およびcDNAクローニング
IP3受容体と相互作用する分子を同定するために、マウスIP3R1のIP3結合ドメインおよび制御ドメインを含む細胞質領域(10, 11)の大部分をコードするN末端2217アミノ酸領域を、GSTとの融合タンパク質(GST-EL)として用いた。GST-ELおよびGSTをバキュロウイルス/Sf9細胞系により発現させて、グルタチオン-セファロースに結合させた。小脳の粗ミクロソーム画分から高塩濃度バッファー(500mMのNaClを含む)で抽出される画分は、膜結合タンパク質に富んだ画分であると考えられ、これをGST-ELまたはGSTを固定化したグルタチオン-セファロースアフィニティカラムに添加した。IP3が存在するとIP3受容体から解離するタンパク質を検出すべく、50μMのIP3を用いてアフィニティカラムに結合したタンパク質の溶出を行ったところ、GST-ELカラムから分子量約60kDaのタンパク質が溶出されたが(図１Ａ)、GSTカラムからはこのようなタンパク質は溶出されず(データは示していない)、かかるタンパク質がIP3R1に特異的に結合するタンパク質であることが示唆された。かかる60kDaのタンパク質に由来する2つのペプチドの配列を決定し、非重複データベースのBLAST検索を行ったところ、これらの2つの配列はデータベース中のあるヒト由来cDNAの配列とマッチした。このcDNAに相同性のあるマウス発現配列タグの配列情報に基づいて、マウス小脳から逆転写PCRにより、上記60kDaタンパク質のcDNAを得た。クローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列から530アミノ酸残基からなるタンパク質であることが示された(図１Ｂ)。計算上の分子量は58.9kDaであり、SDS-PAGEによって推定された分子量とほぼ一致していた。この60kDaの分子をIRBITと名付けた。
【００４９】
IRBITのC末端領域(アミノ酸105〜530)はメチル化経路の酵素S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(EC 3.3.1.1.)(48)に対して相同性(同一性51％、類似性74％)を有していることが明らかとなった(Fig. 1, ＣおよびＤ)。IRBITのN末端側の領域(アミノ酸1〜104)は、既知のタンパク質との相同性はなく、セリンに富んだ領域(アミノ酸62〜103)を含んでいた(Fig. 1, ＢおよびＤ)。IRBITの配列のモチーフ検索によって、推定コイルドコイルモチーフ(アミノ酸111〜138)および推定NAD+結合領域(アミノ酸314〜344)が存在することが明らかとなった(図１ＢおよびＤ)。カゼインキナーゼII、PKC、PKA/PKGおよびチロシンキナーゼなどのプロテインキナーゼによる推定リン酸化部位を17箇所含んでいた。そのうちの7箇所は、N末端側に集中していた(図１Ｂ)。推定膜貫通領域およびシグナル配列は見出されなかった。
【００５０】
IRBITはS-アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼと相同性を有しているため、まず、大腸菌で発現させた組換えIRBITを用いてこの酵素活性を有しているかどうかについて検討した。C末端にHisタグを付したIRBIT（IRBIT-His）およびN末端にGSTタグを付したIRBIT（GST-IRBIT）を精製し、加水分解方向への酵素活性を測定した。図２に示すように、両組換えIRBITは酵素活性を有していなかった。このことから、IRBITはS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を有していないと結論づけられる。S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼはその結晶解析および部位特異的変異体を用いた研究(43, 52-56)より、基質との結合およびNAD+との結合に関与する残基が決定されている。IRBITがS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を示さないのは、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼの基質結合に重要なアミノ酸、例えば54番目のリジン、302番目のフェニルアラニン、353番目のヒスチジンなどが置換されていることによるのではないかと推測される(図１Ｃ)。しかしながら、IRBITは、基質特異性を異にする酵素活性を有している可能性も否定できない。
【００５１】
IRBITの組織分布および細胞内局在
IRBITのN末端領域（図１Ｂ、枠内）に対する抗体をアフィニティ精製を経て作製した。該抗体の特異性を調べるために、IRBITのcDNAをCos-7細胞に遺伝子導入して、その細胞溶解液を抗IRBIT抗体によるイムノブロットにより解析した。図３Ａに示すように、抗IRBIT抗体は、約60kDaの位置にあるタンパク質のみを認識した。外来遺伝子から発現させたIRBIT（図３Ａ、レーン１）の分子量はCos-7の内因性タンパク質（図３Ａ、レーン３）と同じであり、上記cDNAが全長IRBITをコードしていることが確認された。抗IRBIT抗体を用いてイムノブロットによりマウスの組織におけるIRBITの発現を調べた。IRBITは普遍的に検出されたが、大脳および小脳で最も発現が強かった（図３Ｂ）。
【００５２】
次いで、マウス小脳を分画してIRBITの細胞内局在を調べた。IRBITは細胞質画分および粗ミクロソーム画分に存在していた（図３Ｃ、レーン２および３）。粗ミクロソーム画分をさらに、膜結合画分（最初にIRBITが単離された画分）、および高塩抽出後粗ミクロソーム画分に分離した。図３Ｃに示すように、粗ミクロソーム画分中のIRBITは高塩濃度バッファーで部分的に抽出された（図３Ｃ、レーン４）。対照的に、小胞体の膜タンパク質であるIP3R1は、全く抽出されなかった（図３Ｃ、下の図）。これらの結果から、IRBITは細胞質にも存在し、膜にも結合するタンパク質であることが示された。
【００５３】
高塩抽出画分中のIRBITはIP3R1と結合し、IRBITのN末端領域は結合に必須である
IRBITはマウス小脳の細胞質画分と膜結合画分との両方に存在していた（図３Ｃ）。そこで、これらの画分中のIRBITがin vitroでIP3R1と相互作用するか否かを、GSTプルダウン法により調べた。マウス小脳の細胞質画分と粗ミクロソーム由来の高塩抽出画分（すなわち膜結合画分）をGST-ELまたはGSTとインキュベートして、これらの組換えタンパク質とIRBITの結合を抗IRBIT抗体でイムノブロットにより解析した。図４Ａに示すように、高塩抽出画分中のIRBITはGST-ELと結合したが、GSTとはしなかった。（図４Ａ、レーン６およびレーン５）。一方、細胞質画分のIRBITはGST−ELとは結合しなかった（図４Ａ、レーン３）。これらの結果は、バッファーの影響または画分中に含まれる他の低分子物質の影響ではないことを、透析によるバッファー交換後に同様の実験を行うことにより確認した。したがって、IRBITの翻訳後修飾、例えばリン酸化などにより、IP3受容体との結合が制御されている可能性が考えられる。
【００５４】
次に、リン酸化の影響を調べるために、高塩抽出画分を非特異的ホスファターゼであるアルカリホスファターゼで処理した後、GST-ELまたはGSTと共にインキュベートした。図４Ｂに示すように、高塩抽出画分中のIRBITはホスファターゼ処理後GST−ELとは結合しなかった（図４Ｂ、レーン６）。この結果からIRBITがIP3R1と結合するには、IRBITのリン酸化が必要である可能性が示唆された。無論、他のタンパク質がリン酸化されることによりこれらのタンパク質の相互作用が制御されているという可能性も現時点では否定はできないが、IRBITはアルカリホスファターゼ処理により該相互作用は見られなくなり、リン酸化によっても、IRBITとIP3受容体との相互作用が制御されていると推測される。次に、IP3R1との相互作用に必要なIRBITの領域を特定するために、GFPのタグを付したIRBITの欠失変異体を用いて、GSTプルダウン法を行った。図５Ｂに示すように、GFP-IRBITおよびGFP-IRBIT(1-277)は両方ともGST-ELに効率よく結合した(図５Ｂ、レーン３および６)。GFP-IRBIT(1-104)はGST-ELと結合したが、GFP-IRBIT およびGFP-IRBIT(1-277)の該結合より弱かった(図５Ｂ、レーン７と９をレーン１と３およびレーン４と６と比較)。一方、N末端領域を欠失したGFP-IRBIT(105-530)はGST-ELと結合しなかった(図５Ｂ、レーン１２および１５)。これらの結果から、IRBITのN末端領域がIP3R1との結合には必須であり、コイルドコイル構造を有する約170アミノ酸(105〜277)が該結合の安定化に重要であることが示された。
【００５５】
IRBITには潜在的リン酸化部位が17箇所有り、そのうちの７つがIP3受容体との相互作用に必要な上記N末端領域に局在していることからも、リン酸化がIP3受容体との相互作用に関与している可能性が予想される。これから推測すると、IRBITは脱リン酸化された状態で細胞質中に遊離しており、リン酸化された状態のものはIP3受容体との相互作用を介して膜に結合しているという仮説が成り立つ。実証するまでには至っていないが、IRBITとIP3受容体との相互作用がIP3と直接または間接的なリン酸化とにより二元的に制御されているということが考えられる。
【００５６】
Cos-7細胞内ではIRBITはIP3R1と共に小胞体上に局在している
IRBITの細胞内局在を調べるために、IRBITとIP3受容体を過剰発現したCos-7細胞で共焦点免疫蛍光顕微鏡分析を行った。IRBITは細胞質に一様に分布していたが、核内では免疫反応性は示されなかった(図６Ａ)。IRBITは、生化学的分画法による実験では、細胞質画分および粗ミクロソーム画分の両方に存在していた(図３Ｃ)ので、膜に結合しているIRBITのみを可視化し、観察することとした。そのために、固定化の前にIRBITとIP3受容体を共発現したCos-7細胞の細胞膜をサポニンにより透過性にして細胞質に存在するIRBITを洗い出した。そうすると、図６Ｂに示すとおり、IRBITは網状のパターンで分布しており(図６Ｂ、左図)、このことから膜結合性IRBITは小胞体上に分布していることが示唆された。IRBITの免疫反応性は、IP3R1と大部分重複した(図６Ｂ、中央の図、および右図)。IP3R1の染色パターンは、サポニンで細胞膜透過性にしたことにより変化しなかった(データは示さず)。IP3R1とGFP-IRBITとを共発現して、GFPの蛍光を見た場合、同様の結果が観察された(図６ＣおよびＤ)。これらの結果より、過剰発現したCos-7においてIRBITは小胞体上のIP3R1と結合することが示唆された。これらの局在が特異的なものであることを確かめるために、N末端領域を欠損しているためにGST-ELと結合しないGFP-IRBIT(105-530)とIP3R1をCos-7細胞に共発現したところ、GFP-IRBITとは異なり、GFP-IRBIT(105-530)は細胞質と核に分布していた(図６Ｅ)。IRBITは核移行シグナルと推定される配列を有していないので、この核への移行の機序については明らかではない。サポニン処理により細胞質に存在するIRBITを洗い出すと、GFP-IRBIT(105-530)は核にのみ存在し、IP3R1との共局在は確認されなかった(図６Ｆ)。この結果は、IRBITのN末端領域がIP3R1への結合に必須であるという生化学的手法による結果(図５Ｂ)と一致する。
【００５７】
IRBITはin vivoでIP3R1と結合する
組織中でのIRBITとIP3R1との結合を確認するため、マウス小脳を用いた免疫共沈降を行った。マウス小脳の粗ミクロソーム画分の界面活性剤抽出物を抗IRBIT抗体で免疫沈降し、沈降物を抗IP3R1抗体でイムノブロット解析した。IP3R1は抗IRBIT抗体で共沈澱したが、コントロール抗体ではしなかった（Fig. ７）。この結果は小脳におけるIRBITとIP3R1とのin vivoでの結合を示している。
【００５８】
生理的濃度のIP3により選択的にIP3R1からIRBITの解離が起こる
IRBITは最初、50 μMのIP3によるGST-ELカラムからの溶出液中で同定された(図１Ａ)。このことは、IRBITとIP3R1との相互作用をIP3が解離させることを示唆する。しかし、IP3は刺激により上昇した場合でも数μM程度の細胞内濃度であり(50)、上記溶出に用いた50 μMというIP3の濃度は生理的範囲より高い。したがって、生理的濃度のIP3により該タンパク質間相互作用が解離するか否かを検討した。
【００５９】
マウス小脳の粗ミクロソームからの高塩抽出画分中のIRBITをGST-ELによりトラップし、これを0.1〜10 μMのIP3、および他のイノシトールポリホスフェートとしてIP2、IP4、IP6または ATPにて溶出を試みた。図８Ａに示すように、IP3はGST-ELからIRBITを濃度依存的に解離させた(図８Ａ a、下図)。このIP3溶出液中のGST-ELの存在を確認したが、検出されなかった(図８Ａ a、上図)。長時間露光しても同様であった。EC50(IRBITのGST-ELからの解離が最大量の50％となるIP3濃度)は、約0.5 μMであった。該濃度はIP3の生理的濃度の範囲内である(50) (図８Ｂ)。また、他のイノシトールポリホスフェートでは、解離効率はIP3の50分の1程度であり、ATPは10 μMの濃度でも解離させなかった。したがって、生理的濃度のIP3により選択的に、IP3R1からIRBITが解離することが示された。
【００６０】
IRBITはIP3R1のIP3結合領域と結合し、かつIP3R1のLys-508はIRBITとIP3の両方の結合にとって必須である
IP3R1のIP3結合領域または制御領域のいずれの領域がIRBITとの相互作用に必須であるかを調べるために、IP3R1のドメイン構造(51)に基づいてGST融合タンパク質として構築した8種のIP3R1の欠失変異体を用いた(Fig. ９Ａ)。図９Ｂに示すように、IP3結合コア領域(アミノ酸226〜576)(11)を含有するGST-IbIIa(アミノ酸226〜604)は、GST-ELと同程度にIRBITと結合した。一方、GST-IabおよびGST-IIabなどの他のGST融合タンパク質は、IRBITと結合しなかった。次いで、IRBITとの結合に重要なIP3R1のアミノ酸残基を特定するために部位特異的突然変異解析を実施した。IP3R1の508番目のリジン(Lys-508)はIP3結合に必須なアミノ酸残基であることが判っており(12)、該リジン残基をアラニンに置換したGST-IbIIa(K508A)では、そのIP3結合親和性が著しく減少することが判っている(42)。一方、GST-IbIIaの441番目のアルギニン残基がグルタミンに置換したR441Qは、IP3に対する結合親和性がGST-IbIIaより高いことが判っている(42)。これらの組換えタンパク質を用いてプルダウンアッセイを行ったところ、IRBITはGST-IbIIaとR441Qとには同じレベルで結合したが、K508AにはIRBITは結合しなかった(図９Ｃ)。IP3R1の508番目のリジンがIP3とのみならずIRBITとの相互作用にも必要であることを示しており、このことからも、IRBITとIP3R1との結合はIP3により解離するという結果が支持される。
【００６１】
【発明の効果】
以上の結果を総合すると、IRBITは通常IP3R1と会合しており、細胞外からの刺激によりIP3の濃度が上昇するとIP3R1から解離すると考えられる。IRBITはIP3によりIP3受容体との相互作用が制御され得ることが示された、唯一のIP3受容体結合タンパク質である。
【００６２】
本発明者らが、発見したIRBITタンパク質は、IP3受容体と結合し、該結合はIP3によって濃度依存的に解離することから、IRBITは、細胞内およびセルフリーの系のいずれにおいてもIP3の検出および定量のための指示薬として有用なタンパク質分子であることが示された。また、IRBITのアミノ酸配列の1〜104番目までの配列がIP3への結合に必須な領域であることから、このアミノ酸配列を少なくとも含むタンパク質もIRBITと同様、IP3の指示薬として有用であると考えられる。
【００６３】
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【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、IRBITの精製とそのcDNAクローニングについて示した図である。図１Ａは、ラット小脳の粗ミクロソームからの高塩抽出画分よりGST-ELカラムを用いて精製したIRBITタンパク質のSDS-PAGEの結果である（矢印はIRBITの位置を示す）。IRBITは50μMのIP3で溶出された。溶出液を濃縮後、10％ゲル上でSDS-PAGEにより分離し、クマシーブリリアントブルーで染色した。200 kDa以上の位置および100〜200 kDaの位置に認められるバンドは、複数種の抗IP3R1抗体で認識されることから、GST-ELが樹脂からわずかに解離して溶出されたものおよびその分解物であると思われる。図１Ｂは、IRBITの推定アミノ酸配列を示す。精製したIRBITを消化して得られた2種のペプチド部分には太い下線を、セリンに富んだ領域は破線の下線を、コイルドコイル領域には2重下線を、NAD+結合部位には細い下線を、それぞれ付している。カゼインキナーゼ、プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼA/プロテインキナーゼG、およびチロシンキナーゼによる推定リン酸化部位は、それぞれ、黒丸、白丸、黒四角および白四角で配列上部に記している。N末端領域は、実線で囲んでいる。図１Ｃは、IRBITのC末端領域とS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(AHCY)(48)との配列アラインメントを表している。*印は同一残基、：印は類似残基を示している。S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼの基質結合に関与する残基には黒丸、NAD+結合に関与する残基には白丸をそれぞれ付している。図１Ｄは、IRBITの構造の模式図である。NTRはN末端領域、CTRはC末端領域、SERはセリンに富んだ領域、CCはコイルドコイル領域、およびNADはNAD+結合部位を表す。
【図２】図２は、IRBITはS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を有していないことを示す。組換えIRBIT-His(白丸)、GST-IRBIT(三角)、GST(四角)およびS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(黒丸)の加水分解方向へのS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を公知の方法(43)にしたがって測定した。結果は、3回の独立した実験の結果の平均±標準偏差として示す。
【図３】図３は、IRBITの組織分布および細胞内局在を示す図である。図３Aは、外来性発現させたIRBITと内因性IRBITのウェスタン分析の結果を示す。IRBIT(レーン１)およびモックコントロール(レーン２および３)を遺伝子導入したCos-7細胞の細胞溶解液を抗IRBIT抗体でウェスタンブロッティング分析した。レーン３はレーン１および２に対して10倍量の溶解液を添加した。図３Ｂは、マウス組織のS1フラクション(2 μgタンパク質)を抗IRBIT抗体でウェスタンブロッティング分析することにより、IRBITの組織分布を調べた結果である。図３Ｃは、マウス小脳の細胞内局在を調べた結果である。マウス組織のS1画分を100,000 x gで遠心後、その細胞質画分(レーン２)および粗ミクロソーム画分(レーン３)を得た。さらに、粗ミクロソーム画分を500 mM NaClを含む高塩濃度バッファーで抽出して、100,000 x gで遠心後、膜結合画分(レーン４)と高塩抽出後粗ミクロソーム画分(レーン５)を得た。上図は、各画分(１μgタンパク質)を抗IRBIT抗体によるウェスタンブロッティング分析した結果である。下図は、抗IP3R1抗体でのウェスタンブロッティング分析の結果である。
【図４】図４は、高塩抽出画分中のIRBITはIP3R1とin vitroで相互作用するが、細胞質中のIRBITは相互作用しないことを示す図である。図４Ａは、マウス小脳細胞質画分(レーン１〜３)および粗ミクロソームからの高塩抽出画分(レーン４〜６)を、GST-EL(レーン３および６)またはGST(レーン２および５)と共にインキュベートし、グルタチオン-セファロースにより結合したタンパク質をプルダウンし、グルタチオンで溶出後、抗IRBIT抗体(上図)でウェスタンブロッティング分析した。グルタチオン-セファロースでプルダウンしたGST-ELおよびGSTは、クマシーブリリアントブルーで染色した(下図)。図４Ｂは、マウス小脳から得た粗ミクロソームの高塩抽出画分を、アルカリホスファターゼ処理なし(レーン１〜３)または該処理後(レーン４〜６)にて、GST-EL(レーン３および６)またはGST(レーン２および５)と共にインキュベートし、図４Ａと同様にIRBITの結合を分析した結果を示す。
【図５】図５は、IP3R1との相互作用にはIRBITのN末端領域が必要であることを示す図である。図５Ａは、IRBITとIRBITのGFP融合欠失変異体の構造を模式的に示す。図５Ｂでは、GFP-IRBIT発現Cos-7細胞(レーン1〜３)、GFP-IRBIT(1-277)発現Cos-7細胞(レーン４〜６)、GFP-IRBIT(1-104)発現Cos-7細胞(レーン７〜９)、GFP-IRBIT(105-530)発現Cos-7細胞(レーン１０〜１２)およびGFP発現Cos-7細胞(レーン１３〜１５)の細胞溶解液をGSTプルダウンアッセイに用いた。各GFP融合タンパク質を発現しているCos-7細胞の溶解液(インプット：I)をGST-EL(E)またはGST(G)とインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン-セファロースでプルダウンし、グルタチオンで溶出後、抗GFP抗体でイムノブロット解析した。
【図６】図６は、共発現したCos-7細胞では、IRBITはIP3R1と共局在することを示す図である。IP3R1を、IRBIT(ＡおよびＢ)、GFP-IRBIT(ＣおよびＤ)およびGFP-IRBIT(105-530)(ＥおよびＦ)と共にCos-7細胞に一過性に共発現し、それぞれのタンパク質の細胞内局在を間接的免疫蛍光(抗IP3R1および抗IRBIT抗体にて)と蛍光共焦点顕微鏡法(GFP-IRBITおよびGFP-IRBIT(105-530))により分析した。Ｂ、ＤおよびＦは、細胞を固定化する前に、サポニンで細胞膜透過化して細胞質タンパク質を洗い出した。左列のパネルは、IRBIT(Ｂ)、GFP-IRBIT(Ｄ)およびGFP-IRBIT(105-530)(Ｆ)を示し、中央のパネルは、IP3R1を示す。右列のパネルは、左列および中央のパネルを合わせたものである。Ｂの下列のパネルは、上列のパネルを拡大したものである。スケールは10 μmを示す。
【図７】図７は、in vivoでのIRBITのIP3R1との会合を示す図である。マウス小脳粗ミクロソームの界面活性剤抽出液を抗IRBIT抗体またはコントロール抗体で免疫沈降した。沈降物をSDS-PAGE後、抗IP3R1(上図)または抗IRBIT(下図)の各抗体でウェスタンブロットした。
【図８】図８は、生理的濃度のIP3により、選択的にIP3R1からIRBITが解離する事を示す図である。図８Ａは、マウス小脳から得た粗ミクロソームからの高塩抽出画分をGST-ELとインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン-セファロースでプルダウンし、グルタチオン(Glu)(a)または0.1〜10 μM IP3(a)、IP2(b)、IP4(c)、IP6(d)またはATP(e)で溶出した。抽出液中のIRBITを抗IRBIT抗体とAlexa 680コンジュゲート二次抗体で分析した(aの下のパネル、およびb〜e)。グルタチオンおよび0.1〜10 μM IP3での溶出液中のGST-ELを抗GST抗体で分析した(aの上のパネル)。図８Ｂは、抗IRBIT抗体により検出されたIRBITのバンドに由来するシグナル強度を赤外イメージングシステムで定量した結果を示す。相対強度を溶出剤の濃度に対してプロットした。少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差で示している。
【図９】図９は、IRBITがIP3R1のIP3結合領域と相互作用すること、およびこの相互作用にはIP3R1の508番目のLysが必要であることを示す図である。図９Ａは、用いたマウスIP3R1と組換えGST融合タンパク質の構造を模式的に図示している。IP3結合コア領域は斜線部、推定膜貫通領域を黒塗りの線で示している。I〜Vのローマ数字は、トリプシン限定分解により決定したIP3R1のドメイン構造を示している(51)。各バーの上に付した数字は、アミノ酸残基の番号を示している。図９Ｂは、IP3R1のIRBIT結合領域を調べた結果を示す。マウス小脳から得た粗ミクロソームからの高塩抽出画分を(Ａ)に示すGST融合タンパク質とインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン-セファロースでプルダウンした後、グルタチオンで溶出して、抗IRBIT抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。図９Ｃは、(Ｂ)と同様に、高塩抽出画分をGST-IbIIa、R441QおよびK508Aでプルダウンアッセイした結果である。結合したタンパク質をグルタチオン-セファロースでプルダウンした後、グルタチオンで溶出して、抗IRBIT抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した(上図)。グルタチオン-セファロースでプルダウンしたGST融合タンパク質を、クマシーブリリアントブルーで染色した(下図)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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