(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２．８ｋＤａの分子量、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、ｂａｃｉｌｌｉ、ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｓ、ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｉ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、およびｓｔｒｏｐｔｏｃｏｃｃｉに対する阻害活性、トリプシン、α−キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、およびプロナーゼＥのプロテアーゼに対して感受性であるがペプシンに対して非感受性、熱安定性、酸性ｐＨでの活性、およびナイシン産生細菌株の阻害能、によって特徴づけられる、ラクチシン３１４７と称するバクテリオシンであって、該バクテリオシンは、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４０７１６として寄託されたＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＤＰＣ３１４７株によって生産される、バクテリオシン。
【請求項２】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４０７１６として寄託されたＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＤＰＣ３１４７株に含まれ、ラクチシン３１４７産生に関与する６３ｋＤａのプラスミドｐＭＲＣ０１。
【請求項３】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４０７１６として寄託されたＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＤＰＣ３１４７株。
【請求項４】
請求項２に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞がチーズスターター培養物である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞が細菌である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
畜牛における乳腺炎の処置における使用、チーズのクロストリジウム属による損傷を防止するための使用、低温殺菌を行ったチーズおよびチーズスプレッドにおける食品保存料としての使用、ミルクおよびミルク製品における寿命延長剤としての使用、アルコール飲料の産生における使用、野菜発酵における使用、缶詰食品への取り込みによるおよび肉貯蔵における使用、経口ヘルスケア製品への取り込みにおける使用、アクネ座瘡のための美容上の処置における使用、およびキレート剤で処置されたグラム陰性細菌に対する使用から選択される、請求項１に記載のラクチシン３１４７、または請求項４から６のいずれか１項に記載のラクチシン３１４７産生細胞の使用。
【請求項８】
前記経口ヘルスケア製品は、練り歯磨きおよび口内洗浄剤を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項４から６のいずれか１項に記載のラクチシン３１４７産生細胞を培養する工程、および該培養物からラクチシン３１４７を単離する工程を包含する、ラクチシン３１４７を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗菌性物質、より詳細には、ナイシン様特性を有する新規なバクテリオシンに関する。
近年、食品に関連する腐敗および病原性微生物に対して拮抗活性を有する微生物の代謝産物の開発に大きな進歩が見られた。現在、7000を超える微生物起源の公知の抗生物質化合物が存在するが、食品への使用について評価されているものは非常に少ない。臨床的に重要な抗生物質抵抗性の微生物が、食品中の抗生物質に繰り返し曝されることで出現し、それにより、抗生物質の臨床的な有用性を損う（しかし、もちろん、臨床的に重要な抗生物質は食品用途には用いられない）という危険性がある。さらに、消費者は現在、天然物であり、そして保存薬の含まれていない最小限に加工された食品を重視する。化学的添加物および抗生物質の食品保存薬としての使用に対するこのかなりの、そしてもっともな抵抗のために、微生物によって産生される他の生物学的なインヒビターが、食品における使用について現在研究されている。特に興味深いものは、乳酸菌（LAB）により産生される阻害性物質である。これらの阻害性物質は、過酸化水素、ジアセチル、バクテリオシン、およびヒポチオシアナイト（hypothiocyanite）のような２次反応産物を含む。バクテリオシンは、潜在的に非常に魅力的な天然の保存薬である。なぜなら、バクテリオシンは、微生物の代謝の正常な副産物として産生されるからである。LABは、産業的に重要な微生物であり、そしてLactococcus属、Streptococcus属、Pediococcus属、Leuconostoc属、Lactobacillus属、およびCarnobacterium属を含む。これらの菌は、何百年もの間、安全に消費されてきた発酵食品の製造のために使用されてきた。これらの状態を「安全な」生物であるとすれば、これらは、食品に使用するための、バクテリオシンのような天然の抗菌性物質の特に適切な供給源である。
1925年に、最初の原型となるバクテリオシンが、Escherchia coliのある株からGratiaらにより発見された。バクテリオシンは、常に、広いまたは狭いスペクトルであり得るタンパク質であり、これらを産生する細胞に対して致死的でない。細菌は、翻訳後修飾または免疫タンパク質の産生のような機構によって、細菌自身のバクテリオシンの致死的効果から細胞自身を防御する。いずれにせよ、バクテリオシンは、広範な、そして多様な分類の種により産生される強力な抗菌性物質である。これらは、それらのプロデューサー、阻害スペクトル、作用様式、および化学的特性に関して不均質な群を形成する。以下のような４つの異なるクラスのLABバクテリオシンが存在する：−
Ａ．ランチバイオティック（Lantibiotic）−普通でないアミノ酸（例えば、ランチオニン、β-メチルランチオニン）および脱水された残基（例えば、ナイシン、ラクチシン481（lacticin 481）、カルノシンU149、およびラクトシンＳ（lactocin S））を含有する５kDa未満の小さなペプチド。
Ｂ．非ランチオニン含有ペプチド−10kDa以下の小さなペプチドであり、そして以下のようにさらに分類され得る：（i）Listeria活性ペプチド、例えば、ペディオシンPA-1（Pediocin PA-1）およびサカシンＡ（Sakacin A）、（ii）２つのタンパク様ペプチドからなるポラチオン（poration）複合体、例えば、ラクタシンＦ（Lactacin F）、（iii）活性のために、還元されたシステイン残基を必要とするチオール活性化ペプチド、例えば、ラクトコッシンＢ（Lactococcin B）。
Ｃ．大きな熱不安定性タンパク質−一般に31kDaより大きな分子量を有するより大きなタンパク質、例えば、ヘルベチシンV-1829（Helveticin V-1829）。
Ｄ．複合バクテリオシン−脂質または炭水化物の性質のものであり得る１つ以上の化学的部分を有するタンパク質から構成される、例えば、ペディオシンSJ-1（Pediocin SJ-1）。
Lactococciが、乳業においてスターター培養物として広範に使用され、そして乳用種の数株はバクテリオシンを産生し得る。L.lactisの亜種は、ジプロコッシン（diplococcin）、ラクトコッシン（lactococcin）、ラクトストレプシン（lactostrepcin）、またはナイシンを産生し得る。ジプロコッシンおよびラクトコッシンは、分子量の小さなタンパク質であり、他のlactococciに対して活性であるが、ナイシンは多くのグラム陽性細菌に対して広範な活性スペクトルを有するランチバイオティックである。
ナイシンはLABにより産生された抗菌性タンパク質のうち、最も詳細に特徴付けられたバクテリオシンであり、そして食品産業において広範囲におよぶ用途が見出されている。ナイシンは、商業的規模で食品産業において使用されるようになった最初の「抗菌性」化合物であった。ナイシンは、プロセスチーズおよびチーズスプレッドにおけるClostridium botulinumによる胞子の生長および毒素産生を防ぐために使用される。いくつかの国では、ナイシンは、乳製品の貯蔵寿命を延期するため、および高温菌による缶詰食品の腐敗を防ぐために使用されてきた。
ナイシンは、５員環のＡサブタイプのランチバイオティックであり、そしてこれは両親媒性特性を示し、そのＮ末端に疎水性残基（Ile）を、およびそのＣ末端に親水性残基（Lys）を有する。ナイシンは34アミノ酸のペプチドであり、そしてキモトリプシン、パンクレアチン、およびサブチロペプチダーゼ（subtilopeptidase）を含むプロテアーゼにより不活化される。ナイシンはカルボキシペプチダーゼＡ、エラスターゼ、エレプシン（erepsin）、ペプシン、およびトリプシンに不感受性である。ナイシンは、ランチオニン残基、４つのβ-メチルランチオニン、デヒドロアラニン、およびデヒドロブチリンを含有する。
チオエーテルアミノ酸（ランチオニンおよびβ-メチルランチオニン）は、ナイシンの高イオウ含有量の原因である。普通とは異なるアミノ酸残基は、ナイシンの重要な機能的特性を担うと考えられる（例えば、ナイシンの関連する酸抵抗性および熱安定特性は安定したチオエーテル結合の寄与によるが、一方特異的殺菌活性は非常に反応性の高い２重結合によると考えられる）。ナイシンは、3.5kDaの分子量を有し（GrossおよびMorell、1971）、そしてしばしば２量体およびオリゴマーを形成する。
ナイシンは、グラム陽性栄養細菌細胞に対して非常に広範な活性スペクトルを有する。非常に近縁のlactococciは、特に感受性であるが、ナイシンはまた数株のbacilliおよびclostridia（特にそれらの胞子）、lactobacilli、leuconostocs、micrococci、pediococci、streptococci、およびactinonycetesに対して阻害性である。他の感受性の株としては、Mycobacterium tuberculosis、Staphylococcus pyogenes、S.aureus、S.epidermidis、およびListeria monocytogenesが挙げられる（De VuystおよびVandamme、1994）。ナイシンは３つのNeisseria株（MattickおよびHirsch、1947）および３つのFlavobacter株（OgdenおよびTubb、1985）を除くグラム陰性細菌に対して活性を示さず、そしてナイシンは酵母およびウイルスを阻害しない。しかし、Salmonella亜種および他のグラム陰性細菌は、キレート剤をナイシンと組み合わせて使用することにより感受性にされ得る（Stevensら、1992）。ナイシンの作用部位は、細胞質膜であるようである。グラム陰性細菌の外膜は、バクテリオシンを細胞質膜と接触させないと考えられる。それゆえ、EDTAのようなキレート剤をナイシンと組み合わせることにより、外膜の構造が変化を受け、対応する細胞透過性の増大を伴ってリポ多糖（LPS）層の不安定化がもたらされる。膜へのバクテリオシンの結合は、同様のペプチドの凝集をもたらし、それによりオリゴマー化が開始される。このような凝集は、膜貫通の方向を選択し、それにより疎水性部分が膜のコアに曝され、そして親水性部分が水性チャンネルを形成する。膜挿入、孔の形成（これらは両方とも膜貫通ポテンシャルを必要とする）、およびその後の脱分極は、小さな細胞成分の流出および細胞のエネルギー代謝の破壊をもたらす（RuhrおよびSahl、1985）。これにより、代謝中間体の不足がもたらされ、それゆえDNA、RNA、タンパク質、および多糖の合成が阻害される。胞子の生長の防止には別の機構があるようである。栄養細胞とは異なり、細菌胞子はナイシンで処理した場合溶解しない。ナイシンの脱水素残基は、膜のスルフヒドリル基に可能な共有結合的付着部位を提供する。これらの残基は膜孔形成においてこのような役割を有しないようである（Morrisら、1984）。
ナイシンは、プラスミドDNAまたは染色体DNAのいずれにも挿入し得る接合トランスポゾンによりコードされる（Hornら、1991）。ナイシンオペロンの分析は、ナイシンの構造遺伝子ならびにプロセシングおよび成熟に必要な遺伝子が、8.5kbを超えるポリシストロン領域にわたってクラスター化していることを示す（Steenら、1991）。
ナイシンは、バクテリオシンに対して抵抗性のものが頻繁に生じ得るという、産業的用途に対する特定の欠点を有する。例えば、（免疫遺伝子とは対照的に）接合lactococcalプラスミドpNP40上にナイシン抵抗性遺伝子が存在する。ナイシンの２つ目の欠点は、ナイシン産生株が一般に良好な酸のプロデューサーではなく、ファージに感受性であり、そして非タンパク質分解性であり、それゆえ、有効なチーズスターター培養物ではないことである。
本発明の目的は、食品の使用に適切なバクテリオシン、特に広範な阻害スペクトルを有し、かつそれに対する検出可能な自発抵抗性が存在しないバクテリオシンを提供することである。さらなる目的は、ナイシンコード遺伝子よりも容易に接合的に（conjugally）移動し得るバクテリオシンコード遺伝子を提供することである。
目的の一つはまた、バクテリオシンコード遺伝子に接着し得る遺伝子とともに容易に接合的に移動し得るバクテリオシンコード遺伝子を提供することである。さらなる目的は、ラクトース異化遺伝子に連結されていないバクテリオシンコード遺伝子を提供することである。有効なチーズスターターであるバクテリオシン産生株を提供するというさらなる目的が存在する。本発明のさらなる目的は、ファージ抵抗性遺伝子、特に、バクテリオシンコード遺伝子に連結されたファージ抵抗性遺伝子を提供することである。
本発明によれば、約2.8kDaの分子量、lactococci、lactobacilli、enterococci、bacilli、leuconostocs、pediococci、clostridia、straphylococci、およびstreptococciに対する阻害活性、プロテアーゼであるトリプシン、α-キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、およびプロナーゼＥに対する感受性、しかしペプシンに対する非感受性、熱安定性、酸性pHでの活性、ならびにナイシン産生細菌株を阻害する能力により特徴付けられるバクテリオシンが提供される。
バクテリオシンは、ラクチシン3147（lacticin 3147）と称される。バクテリオシンラクチシン3147コード遺伝子は、ナイシンコード遺伝子とクロスハイブリダイズしない。
本発明はまた、National Collection of Industrial and Marine Bacteria，Aberdeen，Scotlandに1995年４月11日に受託番号NCIMB 40716で寄託されたL.lactis  DPC3147株に関する。この株は、バクテリオシンラクチシン3147を産生する。
本発明はまた、上記で規定したバクテリオシンをコードする63kDaプラスミドを提供する。このプラスミドは、ラクチシン3147およびラクチシン3147免疫遺伝子と称される新規のバクテリオシンをコードするプラスミドpMRC01であり得る。このプラスミドは、National Collection of Industrial and Marine Bacteria，Aberdeen，Scotlandに1995年４月11日に受託番号NCIMB 40716で寄託された。
さらに、本発明は、上記のプラスミドpMRCO1中に寄託される、ラクチシン3147の産生のためおよびその免疫のための単離された遺伝子を提供する。
本発明はまた、畜牛の乳腺炎の処置において、clostridiumによるチーズの腐敗を防ぐための、低温殺菌チーズおよびチーズスプレッドにおける食品保存薬としての、牛乳および乳製品の貯蔵寿命のエキステンダーとしての、アルコール飲料（特に醸造業における）製造においての、野菜の発酵においての、ラクチシン3147またはラクチシン3147産生宿主の缶詰食品および食肉保存に取り込ませることによる、使用に関する。さらなる使用としては、練り歯磨きおよび口内洗浄剤のような経口健康製品ならびに座瘡についての美容的処置への取り込みが挙げられる。バクテリオシンは、キレート剤で処置されたグラム陰性細菌に対して使用され得る。
本発明はまた、細菌のような宿主、特にチーズスターター培養物にバクテリオシン産生特性を付与するためのラクチシン3147バクテリオシンをコードするプラスミドまたは遺伝子の使用に関する。本発明はまた、ラクチシン3147をコードする上記のプラスミドまたは遺伝子を含有する、細菌のような宿主を提供する。本発明はまた、ラクチシン3147コード遺伝子を含有する細菌を培養する工程、および培養物からラクチシン3147を単離する工程を包含する、ラクチシン3147を産生する方法、ならびにラクチシン3147をコードする上記のようなプラスミドまたは遺伝子を宿主において導入する工程および発現させる工程を包含する、細菌のような宿主にラクチシン3147産生特性を付与する方法を提供する。
本発明はまた、プラスミドpMRC01によりコードされるようなラクチシン3147に対する免疫のための遺伝子を含む、食品規格の遺伝子マーカーシステムに関する。ラクチシン3147免疫をコードする遺伝子決定基は、それらに連結された任意の所望の遺伝子とともに細菌株に導入され得る。遺伝子を受けた細菌細胞は、ラクチシン3147を含む培地に播種することにより一般的な細胞集団から選択され得る。なぜなら、ラクチシン3147免疫遺伝子を含有する細胞は、この環境において増殖し得るからである。ラクチシン3147に対する自然発生の抵抗性がlactococcal株で低頻度で生じる（いくつかの株については望ましくない）ことを考えても、このマーカーシステムは、ネガティブな臨床的関連を有さずにアンピシリンおよびエリスロマイシンのような周知の抗生物質の全ての利点を提供するべきである。これらの3147遺伝子はGRAS生物に由来するので、これらは食品規格であると考えられる。
本発明はまた、ファージ抵抗性遺伝子、特に、小さなアイソメトリックヘッドファージ712（isometric-headed phage 712）に対する全体的な抵抗性およびプロレートヘッドファージc2（prolate-headed phage c2）に対する破裂サイズ制限をコードする遺伝子を提供する。ファージ抵抗性遺伝子は、上記のように寄託されたプラスミドpMRC01によりコードされ得る。
さらに、本発明は、上述で規定したファージ抵抗性をコードするプラスミドまたは遺伝子を含有する、細菌のような宿主に関する。細菌のような宿主、特にチーズスターター培養物にファージ抵抗性を付与する方法もまた提供される。この方法は、上記のファージ抵抗性をコードするプラスミドまたは遺伝子を導入する工程、およびそこで発現させる工程を包含する。本発明はまた、細菌のような宿主、特にチーズスターター培養物にファージ抵抗性を付与するための、プラスミドまたはファージ抵抗性遺伝子の使用に関する。
さらなる局面において、本発明は、National Collection of Industrial and Marine Bacteria，Aberdeen，Scotlandに1995年４月11日に受託番号NCIMB 40715で寄託されたL.lactis DPC2949株、その細菌コード遺伝子およびそれにより産生されるバクテリオシンを提供する。本発明はまた、後期のガス発生を防ぐ方法、またはチェダーチーズ製造中の非スターター乳酸菌を制御する方法に関する。この方法は、最初のチーズスターター培養物へのL.lactis DPC2949またはそれにより産生されたバクテリオシンのいずれかの添加を包含する。
本発明はまた、バクテリオシン産生ならびに免疫およびファージ抵抗性をコードする上述で規定したものに実質的に相同である、バクテリオシンコード遺伝子、バクテリオシン免疫遺伝子、ファージ抵抗性遺伝子、プラスミドおよび株を提供する。このような相同な遺伝子、プラスミド、および株は、遺伝コードの縮重、タンパク質の機能的特性への影響を伴わない別のアミノ酸によるあるアミノ酸の置換の可能性、および依然として機能的な最終産物を産生するが遺伝子またはアミノ酸配列の必須でない部分が欠失している可能性のために生じる。本発明はまた、他のDNA配列に連結した上述で規定した遺伝子を提供する。
本発明のバクテリオシンの生物学的活性はナイシンの生物学的活性と同様であるので、本発明のバクテリオシンは同様の用途に使用され得る。北欧とは異なって、南欧における多くの発酵乳製品は、いまだ市販のスターターを用いずに、伝統的な方法を用いて製造されている。アイルランドにおけるこれらの株の１つの供給源は、アイルランドの主婦により製パンのためにパンに酸味をつけることにおいて一般に使用されるバターミルク植物である。ケフィール粒子としても知られるこれらのバターミルク植物はまた、乳白色であり、そしてカリフラワーの小花に似ている。これらは弾力があり、そして植物中のlactobacilliにより産生される水溶性多糖中にケフィールが存在するので破壊することが難しい。これらは、lactococci、leuconostocs、lactobacilli、酵母、および酢酸菌からなり、これらはマトリックス中で互いに支えあっており、そして発酵プロセスの最後に固体の塊として回収される。いくつかの単離株は、穀物中の他の全ての生物はそれに抵抗性であると考えられるので、穀物の完全な状態を維持するのに重要であり得る、バクテリオシンを産生する（ReaおよびCogan、1994）。
そこで、本発明は、添付の図面を参照してより詳細に記載される。図面においては以下のようである：
図１。交差感受性試験。a．L.lactis DPC3147；b．NCDO496；c．DPC2949；d．DPC3220；e．DPC33（1）を、GM17寒天プレート上で増殖させ、その後Ａ．DPC3147およびＢ．NCDO496を重層した。増殖が生じなかった領域は、プロデューサーにより産生されたバクテリオシンによるインディケーターの阻害を示す。
図２。プロテアーゼ感受性アッセイ。濾過した無細胞バクテリオシン溶液および酵素溶液（Ａはコントロールの酵素なし；Ｂ．α-キモトリプシン；Ｃ．トリプシン；Ｄ．プロナーゼＥ；を示し、そしてＥはプロテイナーゼＫを示す）を、１cmの間隔を置いてGM17寒天プレートにスポットし、その後インディケーターであるL.lactis HP株を重層した。
図３。ポリメラーゼ連鎖反応。L.lactis NCDO496から単離したゲノムDNAに由来する166bpのPCR増幅フラグメントを、レーン１に示す。DPC3147株、MG1614株、およびDPC2949株から単離したDNAをテンプレートとして使用した場合、増幅産物がないことが明らかである。レーン３は、DNA分子量マーカーに対応する。
図４。DNAハイブリダイゼーション。L.lactis DPC3147、MG1614、およびNCDO496由来のHindIII制限ゲノムDNAを、それぞれ、レーン１、２、および３に示す。レーン４は、DNA分子量マーカーに対応する。nis A遺伝子プローブは、NCDO496ゲノム上の3.5kbフラグメントにハイブリダイズした（レーン３’）。DPC3147（レーン１）またはMG1614（レーン２）から単離されたDNAにはハイブリダイズするDNAは観察されない。
図５。GM17培地およびTYT30培地におけるL.lactis DPC3147の増殖。
図６。pH５、pH７、pH９でのラクチシン3147の安定性に対する60℃〜121℃で10分間の加熱の影響。100％活性は、pH5.7および９で加熱なしでの活性である。
図７。重層SDS-PAGEゲル。ラクチシン3147（Ａ．レーン２、３、および４；Ｂ．レーン２）およびラクトコッシンＡ（Ｂ．レーン３）の調製物を10％ SDS-PAGEゲルで電気泳動した。これに、L.lactis HPの活性な培養物を重層した。インディケーターの阻害は、インディケーターローンの領域として見られる。分子量マーカー（2.5kDa〜17kDa）をＡのレーン１に示す。
図８。L.lactis DPC3147（レーン１）とプラスミドを有しないMG1614株との間の交配から得た推定のトランス接合体（transconjugants）（レーン２）のプラスミド相補性の分析。トランス接合体は、DPC3147ドナーから獲得した63kDaのプラスミドを含む。このプラスミドは、プラスミドを有しないMG1614株には明らかでない。
図９。チーズスターターとしてDPC3147株を用いるチェダーチーズ製造の間のpHプロフィール。
図10。チーズスターターとしてDPC3147株を用いるチェダーチーズの熟成の間のスターターおよびNSLABの増殖。
図11。チーズスターターとしてラクチシン3147を産生する303株のトランス接合物を用いるチェダーチーズ製造の間のpHプロフィール。
図12。チーズスターターとしてラクチシン3147を産生する303株のトランス接合物を用いるチェダーチーズの熟成の間のスターターおよびNSLABの増殖。
図13A。２週間後、４カ月後、および６カ月後にサンプリングした、バクテリオシン産生株（DPC3147、DPC3256、およびDPC3204）を用いて製造したチェダーチーズにおける残存ラクチシン3147活性。市販のDPC4268株をコントロールスターターとして使用した。
図13B。バクテリオシン産生トランス接合物DPC4275を用いて製造したチェダーチーズにおける残存ラクチシン3147活性。再度、DPC4268をコントロールとして使用した。
図14A。ラクチシン3147の殺菌効果は、Tweenの存在を必要とする。AU/ml）が添加された。
図14B。Streptococcus dysgalactiaeの静止細胞に対するラクチシン3147（10.240AU/ml）の添加の効果。
材料および方法
本研究を通じて使用された株、その増殖培地、およびインキュベートの温度の完全なリストが、表１中に含まれる。L.lactis DPC3147およびDPC3220の両方を、ケフィールグレーン（kefir grain）から単離した。一方、L.lactis NCD0496株およびNCD0497株（公知のナイシンプロデューサーである）は、National Collection of Dairy Organisms（NCDO）、National Institute for Research and Dairying、Shinfield、Reading、Berkshire、RG2 9AT、Englandから得た。試験した各々のインディケーター生物の供給源も、表１に挙げる。L.lactis細胞を、0.5%グルコースまたはラクトースを補充したM17（Difco Laboratories、Detroit、USA）中で30℃でルーチン的に増殖させた。本研究において使用した他の培地（表１に示す）は、MRS（Difco Laboratories）、BHI（Oxford Ltd.、Hampshire、England）、TYP（トリプトン16g/l、イーストエキス16g/l、NaCL 2.5g/l、K2HPO4 2.5g/l）、TYT30（トリプトン2.5g/l、イーストエキス5g/l、Tween 201g/l、グルコース10g/l、β-グリセロホスフェート19g/l、MgSO47H2O 0.25g/l、MnSO44H2O 0.05g/l）、TSA（Becton Dickinson Microbiology Systems、Maryland、USA）、Baird-Parker培地（Merck、Darmstadt、Germany）、RSM（Reconstituted Skim Milk）および低温減菌全乳を包含する。
株のDPC3147、L.lactis NCD0496、およびL.lactis DPC3220に対する感受性を試験するために、10μlアリコートの新鮮な各々の一晩培養物を、まずGM17寒天プレート上にスポットし、そして30℃で一晩インキュベートした。次いで、これらのプレートを、100μlの試験株を播種した３mlの軟寒天で、増殖したプロデューサーを乱さないように、穏やかに重層した。株の各々のバクテリオシンプロデューサーに対する感受性を、そのプロデューサーのまわりの阻止域の直径に従って記録した。採用した記録システムは、以下のとおりである：０〜１mm（-）；１〜５mm（+）；５〜15mm（++）；15mmより大きい（+++）。すべての株を40%グリセロール中にストックし、そして-80℃において保存した。作業培養物を５℃で保存し、そして定期的に移した。
バクテリオシンを含有するプレートを、以下のように調製した。無細菌無菌バクテリオシン溶液を、GM17中で増殖させたL.lactis DPC3147の一晩培養物から、まず10分間遠心分離（8000g（Sorvall RC-5B））することにより得た。次いで、得られた上清を、Millipore HVLPフィルター（0.45μm）で濾過することにより滅菌し、そして45℃に調整した。次いで、等容量を二倍強度のGM17に加え、プレートに注いだ。必要な場合、ストレプトマイシンを寒天に500μg/mlの濃度で加えた。
ラクトース代謝細菌を同定するために、Lactose Indicator Agar（LIA）を使用した（トリプトン20g/l、イーストエキス5g/l、ラクトース10g/l、NaCl 4g/l、無水酢酸ナトリウム1.5g/l、アスコルビン酸0.5g/l、ゼラチン2.5g/l、ブロモクレゾールパープル（0.004%）、Agar Bacteriological 15g/l）。Sucrose Indicator Agarプレートを、炭素源としてショ糖をラクトース置換した以外は同様に調製した。
バクテリオシン活性の測定：バクテリオシン活性を、本質的にParenteおよびHill（1992）に記載される、寒天ウェル拡散アッセイを用いて評価した。寒天ウェル拡散アッセイにおいて、溶融した寒天（lactococcusのためのGM17）を48℃に冷却し、そして適切な指示株の一晩培養物で接種した（25mlの寒天中200μl）。この接種した培地を、滅菌ペトリ皿中に迅速に分配し、そして固化後、層流フード下で30分間乾燥させた。均一な直径のウェルを寒天中にあけ、そして15μlの調整した軟寒天密封した。次いで、滅菌した培養上清液（50μl）を、ウェル中に分配し、そしてこれらのプレートを30℃で一晩インキュベートした。これらの無細胞バクテリオシン溶液を、上記のように得た。阻止域の面積（mm2）とウェルの面積との差を測定して、バクテリオシン活性を評価した。
プロテアーゼ感受性アッセイ：以下の酵素を、滅菌蒸留水（SDW）中に、最終濃度50mg/mlになるように溶解した。：トリプシン（タイプII、Sigma Chemical Co.、Poole、Dorset、England）、αキモトリプシン（タイプII、Sigma）、プロテイナーゼＫ（Sigma）、プロナーゼＥ（タイプXIV、Sigma）、カタラーゼ（Sigma）。ペプシンを、0.02N HCl中に、これも最終濃度50mg/mlになるように溶解した。すべての酵素溶液を、ディスポーザブルフィルター（Rotrand/Red rim 0.2μm、Schleicher & Schuell）を用いて濾過滅菌した。20μlアリコートの濾過した無細胞バクテリオシン溶液および20μlのそれぞれの酵素溶液を、１cm間隔でGM17寒天プレート上にスポットし、そして30分間乾燥させた。すべてのプレートを、一晩30℃でインキュベートした。次いで、このプレートに指標生物で重層した。プロデューサーの増殖は阻止域として明白であった。コントロールは、バクテリオシンまたは酵素溶液のいずれかのスポットを有するプレートを含んだ。
バクテリオシン安定性に対するpHおよび温度の影響：無細胞バクテリオシンを、種々のpH/温度処理に曝した。サンプルを、60、70、80、90、100、110および121℃に、pH5、pH7およびpH9において、10分間加熱した。処理後、すべての溶液を迅速に冷却し、そしてバクテリオシン活性をウェル拡散法によりアッセイした。
分子量の評価：3147バクテリオシンを有するサンプルを、SwankおよびMunkres（1971）により記載されるように調製された、尿素-SDSポリアクリルアミドゲルにかけた。2.5〜17kDaの範囲のペプチド用の分子量マーカー（Sigma）を、基準として使用した。lactococcinのサンプルもまた、別の分子量指標としてゲルに含めた。22mAでの16時間の電気泳動の後、ゲルを分割した。サンプルおよび分子量マーカーを含有する一方の半分を、製造者（Hoeffer Scientific Instruments）により推奨される手順に従い染色した。これは本質的には、0.125%クーマシーブリリアントブルーR250染色液で一晩染色する工程を包含した。翌日に、ゲルを「Destain Solution１」{メタノール50%（v/v）、酢酸10%（v/v）}で５時間脱色し、次いで、「Destain Solution２」{メタノール５%（v/v）、酢酸７%（v/v）}中に入れた。ゲルの他方の半分を、20%（v/v）イソプロパノールおよび10%（v/v）酢酸の溶液中で２時間すぐに固定した。次いで、これを数容量の脱イオン水中で、４〜６時間洗浄した。ゲルを大きな滅菌ガラスペトリ皿の中に入れ、そして800μlの指示株を播種した30mlの柔調整寒天で重層した。このプレートを一晩30℃でインキュベートし、そして阻止域について検査した（Bhuniaら、1987）。
DNAの単離：lactococcus由来のプラスミドDNAを、AndersonおよびMcKayの方法（1983）により、以下のように単離した。活発に増殖中のlactococcus細胞を、５秒間の遠心分離により以前の方法でのように採集した。次いで、ペレット化された細胞を、6.7%スクロース、50mM Tris、１mM EDTA（pH8）を含有する379μlの溶液中に再懸濁し、そして37℃に加熱した。25mM Tris pH8中に溶解したリゾチーム（Sigma）を加え（96.5μl）、そして37℃で５分間インキュベートした。次いで、48.2μlの0.25M EDTA、50mM Tris pH8を、穏やかにヴォルテックスすることにより混合し、次いで、27.6μlの溶解溶液（20%SDS、50mM Tris、20mM EDTA pH８）を加えた。次いで、得られた混合物を５〜10分間37℃でインキュベートして、溶解を完了させ、その後この混合物は完全に透明であった。溶解物を30秒間激しくヴォルテックスし、そして３Ｎ NaOH（27.6μl）を加えた。これを、逆転により10分間穏やかに混合し、その後49.6μlの２Ｍ Tris pH7を加えた。これをさらに３分間、逆転により混合した。次いで、71.1μlの５Ｍ NaClを加え、そして得られた混合物はヴォルテックスした。これを、フェノールで一回、そしてクロロホルムイソアミルアルコール（24：1）で１回抽出した。次いで、DNAを600μlのイソプロパノールの添加により沈澱させた。10分間の遠心分離の後、沈澱したDNAを70%エタノール中で１回洗浄し、乾燥し、そして30μlのSDW中に再懸濁し、次いでこれらのすべてをゲルにかけた。
ゲノムDNAを、HoffmanおよびWinston（1987）により概説された方法（これは細胞を溶解するために、ガラスビーズでの剪断を使用する）の改変に従って、lactococccusから抽出した。そこからDNAを抽出した株を、５mlの容量の適切な培地中で一晩増殖させた。細胞を、２mlの容量の培養物を５秒間遠心分離することにより採集した。上清を捨て、そして残存するペレットを軽くヴォルテックスした。この細胞は、0.2mlの滅菌「Extraction Solution」（これは２％Triton X100、１％SDS、100mM NaCl、10mM Tris（pH8）、および1mM EDTAからなる）中に再懸濁した。次いで、フェノール-クロロホルム（0.2ml）を加え、続いて、酸洗浄した直径0.45〜0.52mmのガラスビーズ（Sigma）0.3gを加えた。この懸濁液を２分間激しくヴォルテックスし、次いで、５分間マイクロ遠心分離した。得られた上部の水相を、穏やかに無菌マイクロ遠心チューブに移し、そこに20μlの３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた。穏やかなヴォルテックス後、600μlの無水エタノール（-20℃）を加え、そして混合した懸濁液を、10分間遠心分離した。次いで、このペレットを70%アルコール中で洗浄し、乾燥し、そして最後に50μl SDW中に再懸濁した。DNA濃度を評価するために、５μlのサンプルを0.7%アガロースゲル上で電気泳動し、エチヂウムブロミドで染色した。あるいは、lactococcusゲノムDNAを、AndersonおよびMcKayの手順の改変により単離した。これを、アルカリ変性工程を削除した以外、上記に概説した方法と同じく行った。
ポリメラーゼ連鎖反応：lactococcus DNAの増幅を、Perkin Elmer DNA Thermal Cyclerを用いて、以下の方法により行った。100μlのPCR反応物を設置し、これには10分の１容量の10×緩衝液（Bioline）、５mM MgCl2、200μMの各dNTP、１μMのプライマー（単数または複数）、および1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼが含まれた。各々のチューブを100μlの滅菌パラフィンオイルで重層した後、１μlのDNA（以前に記載のように単離した）を反応物に加えた。Taq酵素を、最初の温度サイクルの間に加え（「ホットスタート」）、そしてDNAを35サイクル増幅させた。各々のサイクルには、93℃での１分間変性、ならびにそれに続く55℃での１分間のアニーリング工程、および72℃での１分間の伸長工程が含まれた。最終反応混合物のうち、10%を、エチヂウムブロミド染色を用いて1.8%（w/v）アガロース（Sigma）ゲルで分析した。
DNAの制限：３つのL.lactis株、DPC3147（lacticin 3147プロデューサー）、MG1614（Bac-）およびNCDO496（ナイシンプロデューサー）から単離したゲノムDNAを、Hind III酵素で制限した。制限を10×「Cuts-All」緩衝液（これは、200mM Tris-HCl（pH7.5）、70mM MgCl2、１Ｍ KClおよび20mMβ-メルカプトエタノールを含有する）中で行ない、そして全反応混合物を37℃で一晩インキュベートした。このDNAサンプルを、1.8%（w/v）アガロースゲル上で25Ｖで一晩泳動した。このように得られたDNAフィンガープリントを、次の工程に進む前に、充分なDNAが制限されていることを確実にするために、紫外線光下で検査した。
サザンブロッティング：電気泳動後、制限したDNAを、キャピラリーブロッティングにより、Hybond N+ナイロンメンブレンに移した。使用した手順は、Maniatisら（1989）により記載された手順であった。最初に、ゲルを数容量の0.2N HCl中に10分間浸し、そして脱イオン水で簡単にリンスした。次いで、DNAを数容量の1.5M NaCl、0.5N NaOHに、一定の穏やかな撹拌を伴って、45分間ゲルを浸すことにより変性させた。再度、このゲルを脱イオン水でリンスした。ゲルを中和するために、ゲルを２回１Ｍ Tris（pH7.4）、1.5M NaCl中に30分間、穏やかな撹拌を伴って浸した。中和後、DNAをHybond N+ナイロンメンブレンへ毛管現象により移した。10×SSCトランスファー緩衝液（NaCl 87.65g/l、クエン酸ナトリウムpH7.0 44.1g/l）にあらかじめ５分間浸しておいたメンブレンを、ゲルの上に直接置き、そして転移を24時間進行させた。この時間の後、メンブレンを取り出し、乾燥し、そして２時間80℃でベーキングした。
ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーションは、Techne Hybridiser HB-1において「Enhanced Chemiluminescence」ECL Gene Detection Systemに従って行なった。全てのハイブリダイゼーションを製造者に示唆されるように42℃で行なった。移したDNAを含有するナイロンメンブレンを、42℃においてハイブリダイゼーション緩衝液（ECLキットと共に供給される）中に入れ、そしてプレハイブリダイゼーションを15分間行なった。次いで、標識DNAプローブを加え、そしてインキュベーションを一晩42℃において進行させた。次いで、メンブレンをハイブリダイゼーション溶液から取り出し、そして42℃において20分間２回、一次洗浄緩衝液（尿素36%（w/v）、SDS 0.4%（w/v）および20×SSC 2.5%（v/v）からなる）で洗浄した。次いで、これを二次洗浄緩衝液（すなわち20×SSC 10%（v/v））中で５分間、室温において洗浄した。
L.lactis NCD0496から増幅したDNA（20μl）を、0.6%（w/v）低融点Sea Plaque Agarose（FMC）ゲルにかけた。NCD0496 DNAから増幅した166bpナイシンプローブDNAを、注意深くゲルから切り取った。このDNAの標識を、以下のように達成した。20μlのDNA標識試薬を等容量の37℃に冷却し変性DNAに加え、そして十分に混合した。次いで、20μlのグルタルアルデヒド溶液を加え、そしてこの混合物を37℃で10分間インキュベートした。標識試薬およびグルタルアルデヒド溶液の両方は、ECLキットと共に供給された。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は、製造者の推奨に従い行った。
接合：接合は以下のように行った。接合交配（conjugal mating）を、ドナー株としてL.lactis DPC3147（bac+、bacr、streps）を、そして受容株としてプラスミドを有しないMG1614株（bac-,bacs,strepr）を用いて準備した。両方の株を中対数期（OD600nm0.5〜１）まで増殖させた。DPC3147株を、プロナーゼＥ（50mg/ml）を含有するGM17中で培養し、一方、MG1614をストレプトマイシン（500μg/ml）を補充したGM17中で増殖させた。次いで、これらの培養物の１mlアリコートを、マイクロ遠心分離器中で30秒間遠心分離し、そして得られたペレットを１ml容量のGM17中で１回洗浄した。得られたペレットを、25μlのGM17中に再懸濁し、混合し、そして非選択的GM17寒天プレート上にスポットした。ドナーおよび受容株のコントロールを、類似の方法で調製した。一晩の30℃でのインキュベーション後、培養物を、-80℃での長期保存のために40%グリセロールを補充したGM17ブロス中に、再懸濁した。段階希釈を、アリコートの交配混合物に対して行い、次いでこれを選択培地上にプレートした。接合頻度を、トランス接合体（選択プレート上に出現する）の数を、受容株細胞数で割ったものとして評価した。推定のトランス接合体を、LIAプレート上にストリークすることにより、ラクトース代謝活性についてチェックした。バクテリオシン生産をコードするプラスミドの分子量を決定するために、トランス接合体由来のプラスミドDNAをAndersonおよびMcKayの方法により単離し、そして0.7%アガロースゲルで泳動した。L.lactis MG1614をネガティブコントロールとして用い、そしてL.lactis subsp．lactis DRC3のプラスミドプロフィールを、分子量基準として用いた。
チーズ製造試行用の接種物の調製：選択した株を-80℃において保存し、そして使用前にLM17ブロス中で30℃において一晩１回、およびRSM中で２回継代培養した。バルクスターターを、30分間90℃に事前に加熱しておいた10% RSM中で培養し、そして接種前に21℃に冷却した。全ての株を21℃において16時間別々に培養し、等比率で混合し、そして表２に示すレベルで接種した。
チーズ製造：ミルクを低温殺菌（72℃×15s）し、そして30℃に冷却した。チーズを、環状のジャケット付ステンレススチール500lバット中で製造した。ミルクに、表１に要約したレベルで培養物を接種した。濾過滅菌したレンネット（Chr．Hansens Laboratories: 500mlの無菌蒸留水で希釈した31ml）を、スターターの添加30分後に加え、そして凝塊を約40分後に切断した。カードおよびホエーを38℃に温め、そしてpH6.2にあわせた（pitch）。チェダーカードを約pH5.2において製粉し、27g/kgのレベルで塩を加え、約412kPaにおいて一晩18kgの型に圧縮した。チーズを真空包装し、そして８℃で12か月間熟成した。
チーズの分析：細菌学的分析：間隔をおいて、チーズを無菌的サンプリングした。スターター細胞を、LM17寒天上で30℃におけるインキュベーションの後の３日間、lactobacilliをLBS寒天上で30℃における５日後、enterococciをKanamycin aesculin寒天（Oxoid）上で37℃における24時間後、そしてcoliformをVRB寒天上で30℃における24時間後、計数した。細菌学的分析は、各サンプリング時間において単一評価（single estimation）であった。
総組成：すりおろしたチーズのサンプル（２週間熟成）を塩分、脂肪、タンパク質および水分について検査した。pHを、10gのすりおろしたチーズを、10mlの蒸留水中で柔らかくすることによって調製したペーストについて測定した。すべての数値は、二連の分析の平均値である。
タンパク質分解：チーズのタンパク質分解を、pH4.6において水に可溶性の、または５％ホスホタングステン酸（PTA-N）に可溶性の、全窒素の割合を測定することによりモニターした。
遊離アミノ酸：遊離アミノ酸を、Beckman 6300 Amino Acid Analyserで、WSNの12%TCA可溶性画分において測定した。
官能評価：チーズを３、６、９、および12か月目に、０〜８（０〜１ 許容不可；２〜３ 劣等；４〜５ 許容可能；６〜７ 良好；８ 優良）のスコアに基づいて感覚評価パネルにより、風味を評価した。
チーズサンプル中のバクテリオシンの直接アッセイ：バクテリオシン活性を、チーズサンプルから以下のようにアッセイした。最初に、チーズサンプルをストマッカー（stmacher）（Lab-Blender 400）中で等容量の蒸留水中で15分間柔らかくし、そして10分間80℃に加熱した。次いで、50μlアリコートをウェルに分配し、そしてバクテリオシン活性を、阻止域の面積（mm2）とウェルの面積との差として計算した（以前概説したように）。
lactococcusスターター株へのpMRC01の移入：最初に、ドナー株としてのL.lactis DPC3147（Lac+、Bac-およびStreps）ならびに受容株としてプラスミドを有しない抗生物質感受性L.lactis MG1363を用いて、接合を準備した。両方の株を一晩培養物からL/GM17中で、30℃において４時間増殖させた。接合を、受容株対ドナーの20:1の比率で行なった。1mlの受容株（MG1363）および50μlのドナー（DPC3147）を遠心分離した。ドナー（Bac+）をLM17ブロスで洗浄し、そして50μlのLM17中に再懸濁した。ドナー、受容株および交配混合物を、非選択GM17寒天プレート上にスポットし、そして乾燥させた。一晩の30℃でのインキュベーションの後、培養物を寒天プレートから採集し、そして40%グリセロールを補充した（-80℃での長期保存用に）GM17 500μl中に、再懸濁した。交配混合物のアリコートの段階希釈を、選択的培地（lacticin 3147を含有するLIA）上にプレートした。接合頻度を、選択プレート上に出現するトランス接合体数を、ドナー細胞数で割ることにより評価した。この場合、トランス接合体は容易には目に見えなかった。なぜなら、ドナーLac+コロニーはLIAプレートを黄色にし、そしてLac-コロニーがマスクされるからである。この問題を克服するために、コロニーをランダムに拾い、そしてLIA上にスポットし、そしてラクトース利用について観察した。この交配から得られたトランス接合体は、市販のlactococcusスターターとのさらなる交配に、食品規格ドナーとして使用した。これらの交配を、1:1の比率である以外、上記と同様に行なった（AM2株は除く）。これらの交配において、トランス接合体は、Lac-バックグラウンドにおけるLac+コロニーとして観察された。推定のトランス接合体を、交配プレートから拾い、そして純度のために（for purity）ストリークした。これらをLacticin 3147生産（これは通常、交配の成功の指標である）について試験し、そしてプラスミドプロフィールを、トランス接合体に対して受容株を比較するために調製した。
ファージ抵抗性：-培養物のファージ抵抗性を、親に相同なファージに対する抵抗性について、トランス接合体と親株とを比較することによって決定した。プラークアッセイを、以下のように行なった。0.25mlの一晩培養物、0.1mlの１M CaC12、および0.1mlの適切なファージ希釈液を、３mlのL/GM17スロッピー（sloppy）アガー（0.7％アガー）に添加した。内容物を混合し、M17アガー上に流し込み、そして30℃で18時間インキュベートした。
ジアセチル、クエン酸塩、およびアセトラクテートの検出。アッセイを、10％RSM（＋0.5％トリプトン）中で増殖した細胞について、PrillおよびHammer（1938）、MarierおよびBoulet（1958）、およびJordanおよびCogan（1995）にそれぞれ記載されたジアセチル、クエン酸塩、およびアセトラクテートの検出法に従って、21℃および30℃で16時間および18時間（それぞれ）行なった。各アッセイを、３連で行ない、そしてその平均を表５に示した。
乳頭シール（teat seal）への取り込みのためのラクチシン3147の濃縮および部分精製：-TY（トリプトン2.5g/L、酵母抽出物５g/L、グルコース10g/L、b-グリセロフォスフェート19g/L、MgSO4.7H2O 0.25g/L、MnSO4.4H2O 0.05g/L、pH6.75）ブロスを、HA（Millipore）フィルターで予め濾過して（15フィルター/リットル）、フィルターに結合する倍地中のタンパク質を除去した。次いで、L.lactis DPC 3147を、濾過したTY-ブロス中で一晩増殖させた。この培養物を、10,000rpmで15分間遠心分離し、次いで、HVLPフィルター（Millipore）を通過させて濾過した。次いで、バクテリオシンをHAフィルター（８フィルター/リットル）に結合させ、続いて、アセトン/５mMリン酸緩衝液（pH7.0）（２：１）を用いてこのフィルターから回収した。続いてこの混合物を遠心分離し、アセトンを蒸発させて除去した。得られたバクテリオシン調製物を凍結乾燥し、そして滅菌蒸留水に溶解した。次いでこれを、上記のようにアッセイした。乳頭シール中にバクテリオシンを添加するために、上記のように調製した17,000単位のバクテリオシンを、滅菌ペトリ皿中のシールに添加した。混合の際、バクテリオシンおよびシールは乳濁液を形成し、次いで、この乳濁液をシリンジ（Cross Vetpharm）に無菌的に移した。
Streptococcus dysgalatiae Mにおけるラクチシン3147の有効性：-一晩培養物からの10μlを、490μlの滅菌した50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に添加した。次いで、500μlのラクチシン3147（10,000AU/ml）を添加し、そしてプレートの計数を、37℃で、０、15、30、60、90、および120分後に行ない、細胞生存力を評価した。
経口のStreptococci：-感染した患者から単離された４つの、齲食原性streptococcus株を、Brain Heart Infusionブロス中で30℃で一晩増殖させた。これらの株は、Ger博士（Fitzgerald University College Cork）から提供された。次いで、これらの株の各々のバクテリオシンに対する相対的な感受性を、L.lactis HPとの比較により決定した。
結果
抗菌活性を示す多数のlactococciをケフィール粒子（kefir grain）から単離した。プロテアーゼ感受性アッセイにより、その抗菌物質はプロテアーゼＫで容易に分解され得たので、それはバクテリオシンであることが示された。交差感受性アッセイを基礎として、これらのバクテリオシンプロデューサーは、異なるグループに分類され得る。第１のグループ由来の株であるDPC3147、DPC3153、DPC3215、DPC3400、DPC3204、およびDPC3244は交差免疫性を示し、これらは全て、同じかまたは非常に類似したバクテリオシンを産生することを示唆した（図１を参照のこと）。同様に、第２のグループ由来の株であるDPC3220およびDPC33（1）もまた、相互に交差免疫性を示したが、第１のグループによって産生されるバクテリオシンに対して感受性であった。DPC2949株は、第１のグループのメンバーに対して交差感受性を示す第３セットのプロデューサーであると定義された。
続いて、L.lactis DPC3147、L.lactis DPC2949、およびL.lactis DPC3220を、さらなる研究のための各グループの代表として選択した。最初に、これらの株を、広範な生物を阻害する能力についてテストした。これらの実験の結果を表１に示す。バクテリオシンプロデューサーであるDPC3147、DPC2949、およびDPC3220は自分自身を阻害しないが、しかし、互いに阻害することが観察され得る。このことは、これらの株が、少なくとも互いに異なることを示す。これらが以前十分に特徴づけされたバクテリオシン産生株であり得る可能性を減少させるために、交差感受性研究を、いくつかの周知のバクテリオシンプロデューサー（ラクチシン481のプロデューサーであるL.lactis CNRZ481（Piardら、1991）、ナイシンプロデューサーであるL.lactis NCDO496（図１）およびNCDO497、およびラクトコッシン（lactococcin）Ａ、Ｂ、およびＭのプロデューサーであるL.lactis亜種cremoris 9B4）に対して行なった。問題のバクテリオシン産生株の各々は、これらの４つの以前に特徴づけされた株を非常に良好に阻害し、DPC3147は、特にこれらに対して効果的である。さらに、これらの４つの株は、DPC3147、DPC2949、およびDPC3220を効果的に阻害した。従って、これらの観察に基づいて、DPC3147、DPC2949、およびDPC3220株は、ナイシン、ラクチシン481、またはラクトコッシンＡ、Ｂ、およびＭのいずれも産生しないようであった。
阻害のスペクトル：各株によって阻害される生物の範囲を試験した。ナイシンが食品産業に見出した広範囲の適用と仮定して、ナイシンプロデューサーNCDO496を、比較の目的でこの研究に含んだ。L.lactis DPC3147、NCDO496、DPC2949、およびDPC3220に対する54株の相対的感受性を、表１に示す。４つのプロデューサーは全て、多数のチーズ作製株を含む他のlactococciの阻害に非常に効果的であった。しかし、DPC3220によって示された阻害の範囲は、lactococciに制限されるようであり、そしてそれ自体は狭いスペクトルを有すると記載されている。対照的に、DPC3147によって産生されたバクテリオシンは、阻害の非常に広範なスペクトルを有し、これは、ナイシンプロデューサーNCDO496のスペクトルと酷似している。例外なく、試験された全てのグラム陽性指示細菌（lactococci、lactobacilli、enterococci、bacilli、leuconostocs、pediococci、clostridia、staphylococci、およびstreptococciを含む）は、これに感受性であった。特に、試験された２つのClostridium株は、DPC3147に対して特に感受性であった。さらに、C.sporogenesは非常に感受性であったので、完全な重層が阻害され、そして事実上の阻害領域が測定できなかった。C．tyrobutyricumもまた、非常に感受性であることが見出された。試験されたListeria株（病原性株L．monocytogenes NCTC5348を含む）もまた、DPC3147株によって産生されたバクテリオシンに対して感受性であった。全体的にみて、3147バクテリオシンの生物学的活性は、ナイシンの生物学的活性に酷似していた。興味深いことに、DPC3147はS.thermophilus HAに対して、ナイシンプロデューサーよりも有意に活性であることが見出された。密接に関連するlactococciは全て非常に感受性であった。
対照的に、L.lactis DPC2949は、DPC3147株およびDPC3220株で観察されたスペクトルの間のどこかに位置する、中間の阻害スペクトルを有する。DPC3220と同様に、この株は、試験したlactococciの全てを阻害するのに効果的であったが、さらに、LactobacillusおよびLeuconostoc種のほとんどを阻害した。従って、その生物学的活性はラクチシン481プロデューサーの生物学的活性とは非常に異なる。しかし、上記のように、DPC2949株およびL.lactis CNRZ481は、交差感受性を示した。興味深いことに、この株はまた、Escherichia coliおよびPseudomonas aeroginosaに対してわずかに活性を有するが、enterococci、Listeria、またはstaphylococciに対して全く阻害を示さなかった。
ナイシンとの関係：交差感受性の研究は、たとえ生物学的活性が非常に類似しているようであるとしても、DPC3147はナイシンプロデューサーではないことを示唆するが、次いで、この２つのバクテリオシンの間の関係を調べる目的の多くの実験を行なった。プロテアーゼ感受性アッセイは、3147バクテリオシンがトリプシン、α-キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、およびプロナーゼＥに対して感受性であるが、ペプシンに対して感受性ではないことを実証した（図２）。対照的に、ナイシンはトリプシンに感受性ではないが、α-キモトリプシン、パンクレアチン、およびズブチロペプチダーゼによって分解される。予期されたように、カタラーゼは3147バクテリオシンの抗菌活性に影響を有さず、従って、この抗菌活性が過酸化水素に起因し得るという可能性を排除する。さらに、ラクチシン3147を産生する株のいずれもスクロースを発酵し得なかった。このことは、このバクテリオシンがナイシンではないというさらなる証拠を提供する。なぜなら、ナイシンをコードする遺伝子（nis A）は、ナイシン-スクローストランスポゾンであるTn5276上のスクロース異化作用を担う遺伝子と連結されているからである（Hornら、1991）。従って、現在までに研究された、全てのこれらのNip+（ナイシン産生）株は、さらにSuc+（スクロース発酵）である。予期されたように、L.lactis NCDO496は、Suc+であることが見出された。一方、DPC3220株およびDPC2949株のいずれも発酵の基質としてスクロースを利用し得なかった。さらに、DPC3147株およびNCDO496株の阻害に必要な純粋なナイシンの最少濃度（MIC）を決定した。DPC3147は、100μg/mlのナイシンで阻害されたが、NCDO496は、400μg/mlのナイシンが添加されるまで阻害されないことが見出された。DPC3147およびNCDO496についてのこれらの異なるナイシンのMIC値は、上記の全ての結果とともに、全て、DPC3147バクテリオシンがナイシンとは異なることを強く示唆する。
最初に、特定の株を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってナイシンを産生するその遺伝的潜在能力について調べた。公表されたナイシン構造遺伝子配列（Doddら（1990））を用いて、nis A遺伝子の3’および5’末端に近接して存在する配列に相補的な２つのプライマーを合成した。これらは、nis A含有テンプレートDNAから166塩基対のPCR産物を増幅するはずである。さらに、ほぼその大きさの増幅産物をNCDO496（図３）株から単離されたゲノムDNAから矛盾なく増幅した。対照的に、DPC3147、DPC2949、およびDPC3220由来のゲノムDNAを用いた場合、増幅産物は観察されなかった。次いで、nis A遺伝子のほとんどを示すL.lactis496から増幅したDNAを、lactococcus株NCDO496、DPC3147、DPC2949、およびDPC3220から単離されたDNAに対する遺伝子プローブとして使用した。これらのDNAを、最初にHind IIIで消化し、そして１％（w/v）アガロースゲル上で電気泳動し、その後、ナイロメンブレンに移した。図４に示すように、nis A遺伝子プローブは、496ゲノム上の3.5kbのHind IIIフラグメントにハイブリダイズした。対照的に、MG1614株またはDPC3147株から単離したDNAにおいてはいずれも、ハイブリダイズするDNAは観察されなかった。このことは、DPC3147によって産生されるバクテリオシンがナイシンの近密な相同物ではないことを示唆する。L.lactis DPC3147によって産生されるバクテリオシンの阻害スペクトルおよびそれがナイシンではないことを実証する上記の実験結果を仮定すれば、DPC3147は新規な広範なスペクトルのバクテリオシン（これは、ラクチシン3147と命名された）を産生すると結論づけられた。
L.lactis DPC3147の増殖およびラクチシン3147の産生を、GM17およびTYT30中で24時間にわたってモニターした。図５に示すように、より多い細胞数およびバクテリオシン活性が、より栄養分の高い培地であるGM17において得られる。両方の培地において、ラクチシン3147は、指数的成長相の間に産生され、そして初期定常期間にピークに達する。続いて、バクテリオシン活性は、定常期の間に徐々に減少する。産生を、MRS、BHI、TYP、RSM、および全乳を含む、種々の異なる培地においてもまた決定した。活性（mm2）を、一晩培養物の濾過した上清から測定した。産生は、MRSにおいて最大（170mm2の活性）であることが見出された。RSMおよび全乳における活性は、MRSにおいて見出された活性の90％および73％であった。このことは、ラクチシン3147産生スターター培養物を用いて、ラクチシン3147含有乳製品を産生し得ることを示す。
バクテリオシン安全性に対するpHおよび温度の効果：ラクチシン3147の安定性に対するpHおよび温度の効果を調べた。その結果を表６に示す。バクテリオシンの３つのサンプルを、pH5.7および９にし、続いて各々のアリコートを60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、および121℃で10分間加熱した。加熱処理の前に、各pHでの活性を測定し、そしてそのpHについての100％として採用した。図６のグラフ表示から、ラクチシン3147は、特に産生pHにおいて熱安定性であることが観察され得る。さらに、pH５で、このバクテリオシンは、121℃で10分間でのオートクレーブで残存し、そしてpH９で100℃の温度まで、その活性の50％より多くを維持する。
このことは、ラクチシン3147が強酸性および弱酸性の両方で缶詰にされた食品においての使用についての潜在能力を有することを意味する。弱酸性食品（pH4.5）は、病原性のC.botuliniumの熱抵抗性胞子を破壊するために十分な熱処理を受けるべきである。これらの食品にラクチシン3147を添加することにより、必要とされる熱加工の程度を減少させ、従って、改善された風味、増加した栄養価、および全体的により経済的な加工をもたらすことが可能であるに違いない。このような適用は、加熱浸透性がしばしば問題となる缶詰にされたミルクプディングのような製品について特に有益であり得る。ラクチシン3147はまた、その酸性pHが最適であるならば、強酸性食品（pH<4.5）においても極めて上首尾に潜在的に用いられ得る。たとえラクチシン3147のうちの実質的な割合が100℃より高い温度に加熱した際に喪失されても、食品保存料としてのその有効性は熱によって傷つけられないに違いない。なぜならば、熱処理した細菌の胞子は、バクテリオシンに対してより高い感受性を示すからである。従って、このような細胞の阻害は、同じレベルの活性なラクチシン3147を必要とするだろう。上記の理由のために、ラクチシン3147はまた、食肉保存料において役割を有する。
分子量決定：ラクチシン3147の分子量を、SwankおよびMunkres（1971）の方法に従って、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により概算した。コントロールとして、ラクトコッシンＡのサンプル（これは、３kDAの分子量を有する）もまた分析した。L.lactis指示株HPを接種したアガーを続いて重層したゲルを、図７に示す。ラクチシン3147はラクトコッシンＡよりもいくらか小さく、その分子量は、2.8kDaに概算されたことが観察され得る。2.5〜17kDaの範囲の分子量マーカーを、ゲルの反対側半分に、標準として用いた。
遺伝的研究：ラクチシン3147を用いた最初の遺伝的研究の間、バクテリオシン産生特性は容易に喪失する特性であることが観察された。DPC3147によるバクテリオシン産生が接合的に遺伝性のDNA断片にコードされるか否かを確立するための予備的な実験を試みた。これらの接合的交配は、DPC3147をドナー株として、そしてプラスミドを含有しないl.lactis亜種lactis MG1614株（これは、ストレプトマイシン抵抗性である）を受容体株として用いることを含んだ。このような交配由来のトランス接合体の選択を、プラスミドにコードされるバクテリオシン免疫性/抵抗性決定因子を選択マーカーとして用いて達成した。これは、選択培地中へのラクチシン3147の取り込みを含んだ。高い細胞密度（108〜109CFU/mlまで）でプレーティングした場合でさえ、L.lactis亜種lactis MG1614感受性細胞は、このような培地において増殖できず、このことは、この株が3147バクテリオシンに対して生じる自然発生的な抵抗性のレベルが非常に低いことを示す。ラクチシン3147の選択培地への取り込みは、従って、lactococciの遺伝子操作における使用のための新規な食品等級マーカーシステムについての基礎を形成し得る。MG1614株およびDPC3147株を含む交配において、推定的なトランス接合体（bacimm.strepr）を、ドナー細胞当たり10-3の頻度で単離した。続いてこれらの細胞はラクトース欠損であることが見出され、そしてまたバクテリオシンを産生する能力を獲得していた。予期されたように、これらの推定的なトランス接合体は、DPC3147に対する交差免疫性を示し、そしてまた、広範なグラム陽性細菌を阻害し得た。これらが真のトランス接合体を実際に表すという証拠を、それらのプラスミド相補物を分析することにより得た。全ての場合において、bac-、bacimm.strepr細胞は、pMRCO1と名付けられた63kDaのプラスミドを獲得していた。類似の大きさのプラスミドは、DPC3147株のプラスミドプロフィールにおいて極めて明らかである（図８）。このことは、ラクチシン3147をコードする遺伝的決定因子がpMRC01接合プラスミド上にコードされることを示す。さらに、ストレプトマイシンおよびバクテリオシンを含有する培地上にプレーティングした場合と、ストレプトマイシンのみを含有する培地上にプレーティングした場合、類似の数のコロニーが交配によって得られた。さらに、これらのstreprコロニーをMG1614株で重層した場合、全てがbac+であることが観察された。このことは、交配の間、プラスミドを受け取らなかったこれらのMG1614細胞の全てが、交配混合物中のDPC3147によって産生されたラクチシン3147によって殺傷されていたことを示す。このことは、このような交配においてトランス接合体を選択するためのバクテリオシンの取り込みの必要性を否定する。
乳腺炎：-ラクチシン3147がS.aureus ATCC25923ならびにS.thermophilus HAおよびST112の阻害に効果的であることが示された（表１）ので、乳腺炎の動物から得られた種々の臨床単離物を阻害するその能力を調べる別の研究を開始した。これらの有毒細菌を、Department of Dairy Husbandry．Teagasc．Moorepark．Fermoy．Co．Corkから入手した。全ての中で、６つのstreptococciおよび10のstaphylococciを試験した。表３に示したように、DPC3147はこれらの病原性株に対してほとんど効果的であった。S.dysgalactiae M株を除いて、全てのstreptococciが極めて感受性であり、株12を除くstaphylococciの全ても同様であった。類似の結果がNCDO496で観察されたが、いくつかの場合、DPC3147はstreptococciに対してわずかにより好結果である。DPC3220はstreptococciまたはstaphylococciのいずれに対しても何ら活性を示さない。
一般的にStreptococcus株はStaphylococcus株よりもDPC3147に対して感受性であった一方、ナイシンプロデューサーであるNCDO496およびNCDO497については逆が真である。このことは、ナイシンのような別のバクテリオシンとともにラクチシン3147を使用することが、乳腺炎処置として特に効果的であることを示唆する。このような状況において、感染した生物が、両方のバクテリオシンに対する抵抗性を発達させる可能性はずっと低い。明らかに、乳腺炎の処置におけるバクテリオシンの使用は、抗生物質処置を用いた場合のように、ミルクを控える必要がないことを意味し得る。
ファージ抵抗性：-接合プラスミド、pMRCO1はまた、L.lactis亜種lactis MG1614への増加したレベルのファージ抵抗性を供与する。MG1614の親とは対照的に、このプラスミドを含有するトランス接合体は、小さな等軸頭部を有するファージ712に対する全抵抗性を示した。さらに、バースト（burst）サイズの扁長頭部有するファージc2は、劇的に減少されたようであった（少量のプラークによって証明されたように）。さらなる研究は、pMRCO1プラスミドによってコードされる抵抗性の機構は細胞に吸着するファージの能力をもたらさず、そして一旦感染したファージDNAが宿主の中で自己化（internalise）されると、それはファージDNA複製を阻害しないようであることを証明した。結果として、ファージの生活環は、ファージDNA複製が生じた後にいくつかの点で阻害された。従って、この強いファージ抵抗性機構は、不全型感染（またはAbi）機構であると推定された。
lactococciにおけるラクトースの異化作用は、通常プラスミドに連結している。従って、プラスミドを含まない株であるL.lactis亜種lactis MG1614は、ラクトースを発酵し得ない。多機能のpMRCO1を含有するMG1614トランス接合体もまたlac欠損であるので、このことは、ラクトース異化作用に必要な遺伝子はpMRCO1プラスミドによってコードされないことを示唆する。次いで、pMRCO1を含有するMG1614をLactococcusチーズスターター株HPと交配した。推定的なトランス接合体を、ラクトースを発酵し、そしてラクチシン3147に抵抗性になる能力に基づいてこのような交配から選択した。これらのlac-細胞はまた、この時ラクチシン3147を産生し、そしてまた、通常HP株に感染するファージに対して全体として抵抗性になった。これらの株のプラスミド相補物の試験は、それらが、pMRCO1のサイズである63kbの余分なプラスミドを獲得したことを明らかにした。このことは、ファージ抵抗性に連結したバクテリオシンは、市販のチーズスターターの改良において非常に効果的な方法であることを証明し得ることを実証する。
これらの結果は、ラクチシン3147プロデューサーが、ナイシンのようなバクテリオシン調製物を添加するよりもむしろチーズスターター株として実際に使用され得ることを示す。この第１の利点は、産生株を直接添加することによって、食品添加物の法律が克服され得ることである。なぜなら、この株はそれ自体使用の制限がないからである。
チーズ作製試験：-ナイシン産生スターターに関する問題は、チーズ作製のための十分な酸を産生する能力がないこのような所望でない特徴を包含する。通常、それらは、プロテイナーゼ欠失であり、かつファージ感受性でもある。上記概説のように、後者の特徴は、ラクチシン3147プロデューサーに関連していない。なぜなら、バクテリオシン機能およびファージ抵抗性は、pMRCO1上で連結しているためである。このような株のチーズスターターとして作用する能力を試験するために、２つの異なるチーズ試験を行った。最初に、３つの株を使用した。その１つは、DPC3147株であった。他の２つ、DPC3204および3256はまた、ケフィール単離物であり、それらの両方は、DPC3147に交差免疫性を示す。従って、これらもまた、ラクチシン3147プロデューサーである。図９に示すように、これらの株は、チーズ作製中に市販の耐酸性株303のようにたくさんの酸を産生した。従って、酸産生に関して、これらの株は受容可能なスターターを生成すると結論づけられ得る。チェダーチーズの熟成中、非スターター乳酸細菌（NSLAB）は、107cfu/gを超えるレベルに到達し得る。これらは、主にlactobacilliであり得るので、それらの増殖またはラクチシン3147プロデューサーを用いて作製されたチーズにおける他の細菌を調べることが重要であった（ラクチシン3147は、テストされた全てのlactobacilliを阻害することを記憶されたい）。図10に示すように、バクテリオシン産生株で作製されたチーズ中にNSLABは、６カ月（チェダー熟成の平均継続期間）後でさえも検出されなかった。これに反して、バクテリオシンなしで作製されたコントロールにおいて、NSLABは、約４カ月後、107.5cfu/gのレベルに達した。第２のチーズ試験において、ラクチシン3147を産生する303株のトランス接合体を、さらにコントロール株として303とともにスターターとして使用した。図11に示した結果は、さらにトランス接合体303がチーズ製造の間のスターターとして十分に機能することを示す。さらに、この試験において作製されたチーズに現れるNSLABレベル（図12）は、コントロールチーズより著しく低かった（100分の１以下）。次いで、官能分析は、２つのチーズの間の風味および香気に大きな差異は無いことを示した。
熟成チーズに見出されるNSLABは、チーズの風味に寄与し得る。ラクチシン3147またはラクチシンを産生する市販のスターター株をチーズの全微生物集団を制御するために使用し得る。従って、チーズの風味を設計することが可能である。
ラクチシン3147は、Clostridia tyrobutyricumおよびC.sporogenesに対して特に活性であることが見出された。C.tyrobutyricumおよびC.butyricumのようなミルクに混入する嫌気性胞子形成生物の副産物は、いくつかのチーズにおける後期のガス発生（すなわち、熟成の間の水素ガスおよび二酸化炭素の形成が大きな穴を発生させる）の問題の主な原因であることが十分に確立されている。これらの細菌は、乳酸を、風味および香気の消失をもたらす酪酸に変換する。従って、ラクチシン3147はまた、クロストリジウム株に対してその有効性を与えるこのような産物における使用を有する。
この遺伝物質のlactococcusの産業用株への導入は、食品規格の選択マーカーの利用性、および産業上重要なプラスミドがコードする機能（例えば、ラクトース発酵、タンパク質分解活性、バクテリオファージ抵抗性、およびクエン酸塩利用）の消失の可能性に関する複合物を提案する。これに関して、ラクチシン3147産生および免疫性は、多くの商業的な用途において使用されるいくつかの産業用スターター培養物の所望の表現型として組み込まれ得る。本明細書中に記載の結果は、選択マーカーとしてのこのバクテリオシンのその培地自身への取り込みが、新規の選択系のための基礎を形成し得ることを示す。ラクチシン3147に対する免疫性をコードする遺伝子（単数または複数）は、プラスミド上で所望の特性に連結され得、次いでこれらのプラスミドを含むトランス接合体は、バクテリオシン産生培地で選択的に増殖する。いくつかの商業的なチーズ作製株によるラクチシン3147に対する自発的な抵抗性のレベルは、非常に低く、そしてさらにpMRC01含有株によるプラスミド維持は、発酵において確実であることが観察されている。なぜなら、プラスミドを失った細胞は産生されたラクチシン3147により死滅するからである。これらの両方の特性は、有効な選択系に必要である。これは、今日までほとんどの選択マーカーが食品規格の品質でないので有意に有益である。実際、ほとんどは、臨床的に重要な抗生物質抵抗性株の出現の危険のために、使用され得ない実際の抗生物質である。
DPC2949株：L.lactis DPC2949によって示される生物学的活性は、以前に特徴づけられたL.lactis CNRZ481の生物学的活性に非常に類似した。それは、一般の感受性株として、lactococci、Clostridium tyrobutyricum、Leuconostocなどを含むが、lactobacilliの全てを含まない点である。さらに、Bacillus substilis、Enterococcus faecalis、Listeria innocua、およびL.monocytogenesは、どちらのバクテリオシンプロデューサーによっても阻害されなかった。しかし、交差感受性の研究は、両方がお互いに阻害されるために、それらは実際に異なるということを示した。思いがけなく、DPC2949は、２つのグラム陰性の株Escherichia coliおよびPseudomonas aeroginosaをわずかに阻害した。従って、DPC2949株は、チェダーチーズにおける後期のガス発生の防止のような適用を有する中間スペクトルのバクテリオシンを産生する。非スターター乳酸細菌（NSLAB）の制御、従って、チェダーチーズの品質（依然として確立されるべき状態のままである）に関する効果を評価するのにもまた適用され得る。
チーズ作製試験：上記のように、ラクチシン3147産生スターターを用いて作製したチーズは、市販のスターターを用いて作製した対応するチーズと比較した場合、それらの中に非スターター乳酸細菌（NSLAB）が有意に少なかった。その後、これらのチーズ中のバクテリオシンをアッセイした。チーズ試験１において、テストチーズに取り込まれたラクチシン3147の存在が、（指標株としてL.lactis AM2を用いて）約1,280AU/mlのレベルで確認され、これは、28週間の熟成期間にわたりチーズ中で一定であった（図13A）。それに対して、抗菌活性は、コントロールチーズにおいて検出されなかった。同様に、試験２におけるチーズ中で検出されたバクテリオシンの量は、約1,280AU/mlであり、これもまた熟成期間にわたって一定であった（図13B）。従って、チーズ中に観察されるバクテリオシンのレベルは、熟成の間にチーズ中に生じるNSLABの数に対応する。
遺伝学的研究：スターター株改良のためのラクチシン3147をコードするプラスミド（pMRC01）の潜在的有用性を評価するために、チェダーチーズおよび乳汁バターの製造のために現在使用されている株を含む種々のlactococcus株にそれを転移させた。これらの転移は、接合（細菌の交配）を介して食品規格様式において行い、その後新たに改変された株をバクテリオシンに対するそれらの免疫性に基づいて選択した。このような交配は、最初に、抗生物質に感受性のプラスミドのために食品規格のドナー株の構築が必要であった。使用したスターター受容株に依存して、交配の各々の３つの可能性のある結果のうちの１つを記録した。第一に、改善されたファージ抵抗性特性を有し、そしてバクテリオシン産生する（かつそれに抵抗性である）スターターを、単離した（表４）。遺伝学的分析は、それらが、この株から有効に戻し交配され得るpMRC01プラスミドを受け取ったことを確認した。これらの株は、商業的に重要な特徴（例えば、（チーズスターターのための（表２））酸および/または（乳汁バター産生のための）ジアセチルを産生する能力）を保持する。さらに、プラスミドはこれらの株中で安定であるようであり、そして多数の継続的なサブカルチャーにわたって維持された。続いて、１つのこのような株は、試験的規模のチェダーチーズ製造のために使用された。これらの接合の別の結果は、バクテリオシンを産生するがファージ抵抗性を改善していない株の同定であった。１つのこのような株の遺伝学的分析は、この株において、このような表現型がプラスミド同時組み込みに関連することを示した。最後に、多数の株は、pMRC01プラスミドに拮抗的であることが示された。この観察に関する１つの可能な説明は、このプラスミドが、株の内在するプラスミドにおそらく和合性ではないということである（例えば、pMRC01は、この研究において、lactococcusのプラスミドpNP40に和合性ではないことが見出された）。
これらの交配の結果の全体的な意味は、以下に要約され得る：１）ラクチシン3147に対する免疫性をコードする遺伝的決定基（単数または複数）は、スターター株の改良のための食品規格の選択マーカーとして非常に有用である。この研究において試験されたlactococcus株は、それらがバクテリオシン遺伝子を受け取っていない場合、固体培地中に取り込まれたバクテリオシンに対して非常な感受性であることが判明した。実際、このバクテリオシンは、このような研究のための従来の抗生物質と同様に便利に使用され得る。２）多数の新規のスターター株が、現在バクテリオシンを用いて生成されている。これらの多くはまた、それらのファージ抵抗性に関して改善されている。重要なことに、これら全ての新規の株が現在バクテリオシンを産生し、そして産物（ここで、バクテリオシンが所望の効果を付与され得る）のためのスターターとして使用され得る。実施例は、チーズ製品におけるNSLABの数の減少、またはいくつかの発酵させた肉製品および魚製品由来の所望でない細菌の除去を包含する。
乳腺炎：動物における疾患の処置および防止のための抗生物質の使用に関する増大する関心の結果として、ウシ乳腺炎の防止におけるラクチシン3147使用の可能性を調査した。これを達成するために、バクテリオシンを乳頭シール調製物（teat seals preparation）に取り込んだ。これらのシールは、Cross Vetpharm（Broomhill Road，Tallaght，Dublin 24，Ireland）により製造され、そしてウシにおける感染に対する物理的な障壁として作用する。バクテリオシンは、シール自身によって提供される物理的な障壁以上に、さらなる抗菌障壁を提供する。乳頭シール中へのバクテリオシンの取り込みは、最初に、高濃度かつ半精製形態のバクテリオシンの調製物を必要とした。シール環境におけるラクチシン3147の抗菌効果は、２％の濃度でのTween20またはTween80のいずれかの添加を必要とした（図14A）。界面活性剤が存在しない場合、ごくわずかなバクテリオシン活性が処理シールで記録された。次いで、効果的なバクテリオシン含有乳頭シールを首尾良く調製して、多数の動物の試験を行った。これらは、異なる期間、改変されたシールが動物に曝露され、その後シールを取り除くことを含んだ。全体的に、このような研究は、動物が、低い会合した体細胞数によって明らかにされるように、バクテリオシン含有シールに抵抗性であることを示した。さらに、動物から取り出されたシールは、バクテリオシン活性を保持することが後に示された。ラクチシン3147がある範囲の乳腺炎streptococciを阻害することが見出されたので、Streptococcus dysgalactiae M（感染した動物から以前に単離された株）におけるその効果を調べた。バクテリオシン（10,240AU/ml）をこの株の定常期細胞へ添加することにより、たった２時間で99.99％死滅という結果が得られた（図14B）。本発明の他の局面は、乳腺炎株がラクチシン3147に対する抵抗性を発達し得る頻度に注目した。なぜなら、これは、特定の条件下で、有効な抗菌剤としてのその実用的な有用性を制限し得るからである。しかし、M株のわずかに0.003％細菌細胞が、長期間の曝露後、バクテリオシンに対する抵抗性を増加させただけであった。
経口Streptococciの阻害：多数の経口streptococciがまた、口内洗浄剤、歯科用製品などの適用におけるバクテリオシンの使用を調査するために、ラクチシン3147に対する感受性について試験された。試験された株は、感染した患者から単離した４つの齲食原性のstreptococciを含んだ。試験された４株の全ては、バクテリオシンに感受性を示した（L.lactis HPと同様の12.5％の感受性）。従って、重要なことに、ラクチシン3147産生スターターを用いて製造された発酵された乳製品は、さらなる抗齲食原性特性を有し得る。
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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