(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
50〜95容量％のアセトン、イソプロパノール、エタノール及びメタノールからなる群から選択される有機溶媒と50〜5容量％の水を含む水混和性有機溶媒を使用して、5〜10のｐＨかつ30〜50℃の温度において組換えタンパク質を細菌細胞の濃縮懸濁液から抽出し、但し該細胞の懸濁液の重量と該水混和性有機溶媒の体積の比が1：1〜1：10であり、
該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から単離し、
該組換えタンパク質抽出物を濃縮して、該水混和性有機溶媒を除去し、
該組換えタンパク質を5℃の温度まで冷却して、該組換えタンパク質から固体を分離し、該固体を除去し、
酸を使用して、該組換えタンパク質を沈殿させ、
該組換えタンパク質を酢酸ナトリウムまたは酢酸で洗浄し、
該組換えタンパク質を回収する工程を含んでなる、組換えタンパク質を細胞から精製し回収する方法。
【請求項２】
該冷却と該沈殿の間に該組換えタンパク質を水溶性カルシウム塩で処理する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該水溶性カルシウム塩と該組換えタンパク質のモル比が1：1〜1：5である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
該酸が有機または無機酸である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該組換えタンパク質を3.5〜6.5のpHで沈殿させる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該組換えタンパク質を3.5〜6.5のpHで洗浄する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該組換えタンパク質がβカゼインである請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該細胞懸濁液を40℃の温度で有機溶媒で処理する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該水溶性カルシウム塩が塩化カルシウム、又は酢酸カルシウムである、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項１０】
該組換えβカゼインを酢酸ナトリウム又は酢酸で洗浄した後、該組換えβカゼインをクエン酸で洗浄する工程を更に含む、請求項7に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、組換えタンパク質を細胞から精製し回収する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
典型的には、タンパク質は、通常のクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー法を用いて精製される。タンパク質を精製するために使用しうるクロマトグラフィー法には、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび金属キレートアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。タンパク質を精製するために使用しうる高速液体クロマトグラフィー法には、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーおよび高速クロマトフォーカシングおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。
【０００３】
通常のクロマトグラフィーによるタンパク質の精製は、通常は、ゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用、色素相互作用、アフィニティーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法の組合せを用いて達成される。アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーで例外が考えられる以外は、単一のクロマトグラフィー工程で均一にまでタンパク質を精製することはほとんど不可能である（Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, 10.9.2, Ausubelら編, 1993を参照されたい）。ある特定のタンパク質を精製するのにアフィニティーまたはイムノアフィニティーカラムが利用できない場合には、典型的には、連続的なクロマトグラフィー工程を用い、各精製工程後に該タンパク質を分析して（例えば、1次元ゲル電気泳動により）、該タンパク質が均一であるか否かを確認する必要がある（同誌）。
【０００４】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるタンパク質の精製は、強固な微粒子マトリックスを高い運転圧力で使用することに基づく（同誌, 10.12.1）。通常のクロマトグラフィーとは異なり、HPLCは、小さな画分容積内に集められた低マイクログラム量のタンパク質を短い分離時間で精製するのに最も適している（同誌）。小さなサンプルのロード（load）の制約は、商業的に入手可能な分析用HPLCカラムの低いローディング容量から生じる（同誌）。典型的には、HPLCは、より後のタンパク質精製段階において（典型的には、混入タンパク質の質量を減少させ複雑なタンパク質混合物を単純化するために1以上の通常のクロマトグラフィー分離を行った後）、最も頻繁に用いられる（同誌）。
【０００５】
前記のとおり、通常のクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー法の問題の1つは、これらの方法のいずれにおいても単一の工程でタンパク質を均一にまで精製するのがほとんど不可能なことである。また、通常のクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー法は労働集約的であり、これらの方法を用いるためには高い経費を要する。
【０００６】
そのため、当技術分野においては、単一の工程でタンパク質を均一にまで精製するために使用されうる安価に使用される労働集約的でない方法が必要とされている。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、組換えタンパク質を細胞から精製し回収する方法に関する。本発明の方法は、水混和性有機溶媒で組換えタンパク質を細胞の濃縮懸濁液から抽出することを含む。該水混和性溶媒は、約50容量％〜約95容量％の有機溶媒および約50容量％〜約5容量％の水を含有する。該組換えタンパク質を、約5.0〜約10.0のpHおよび約30℃〜約50℃の温度で水混和性有機溶媒で処理する。有機溶媒としては、例えば、アセトン、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールが挙げられる。
【０００８】
該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から抽出した後、該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から分離する。単離後、該組換えタンパク質を濃縮して該水混和性有機溶媒を除去する。濃縮後、酸を使用して該組換えタンパク質を沈殿させる。該酸を約3.5〜約6.5のpHで使用して該組換えタンパク質を沈殿させる。沈殿後、該組換えタンパク質を洗浄溶液で洗浄する。代表的な洗浄溶液としては、酢酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。最後に、洗浄後、該組換えタンパク質を回収する。
【０００９】
好ましい実施形態においては、本発明はまた、組換えβカゼインを細胞から精製し回収する方法に関する。組換えβカゼインを細胞から精製し回収する方法は、水混和性有機溶媒を使用して組換えβカゼインを細胞の濃縮懸濁液から抽出することを含む。該水混和性溶媒は、約50容量％〜約95容量％の有機溶媒および約50容量％〜約5容量％の水を含有する。該組換えβカゼインを、約6.5〜約8.5のpHおよび約40℃の温度で水混和性有機溶媒で処理する。適当な有機溶媒としては、例えば、アセトン、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールが挙げられる。
【００１０】
該組換えβカゼインを該細胞懸濁液から抽出した後、該組換えβカゼインを該細胞懸濁液から単離する。単離後、該組換えβカゼインを濃縮して該水混和性有機溶媒を除去する。濃縮後、該組換えβカゼインを約5℃の温度に冷却して該組換えβカゼインから固体を分離する。冷却後、該組換えβカゼインを該固体から単離する。
【００１１】
遠心分離後、該組換えβカゼインを水溶性カルシウム塩で処理する。該水溶性カルシウム塩での処理後、酸を約3.5〜約6.5のpHで使用して該組換えβカゼインを沈殿させる。沈殿後、該組換えタンパク質を洗浄溶液で洗浄する。代表的な洗浄溶液としては、酢酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。最後に、洗浄後、該組換えタンパク質を回収する。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、組換えタンパク質を細胞懸濁液から精製し回収する方法に関する。本発明で用いる「精製する」、「精製」または「精製された」なる語は、他の化合物を実質的に含有しないことを意味する。当業者には明らかなとおり、本発明の方法により、任意の組換えタンパク質を精製し回収することができる。例えば、本発明の方法に従い精製および回収されうる組換えタンパク質には、βカゼインが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００１３】
該組換えタンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法により製造することができる。典型的には、所望の組換えタンパク質をコードする遺伝子を組換え分子内に挿入する。該遺伝子を構成するポリヌクレオチドは、Sambrook, Jら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載のとおり、当技術分野で公知の標準的な方法により、例えば、クローン化DNA（例えば、DNA「ライブラリー」）、化学合成、cDNAクローニングから、あるいは所望の細胞のゲノムDNAまたはその断片のクローニングにより得ることができる。
【００１４】
該組換えタンパク質をコードする遺伝子を単離したら、それを適当なクローニングベクター内に挿入する。当技術分野で公知の多数のベクター-宿主系を使用することができる。可能なベクターには、プラスミド、修飾ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない（ただし、該ベクター系は、使用する宿主細胞に和合性でなければならない）。使用しうるベクターには、例えば、大腸菌（E. coli）クローニングベクター、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、プラスミド、例えばpBR322誘導体またはpUCプラスミド誘導体が含まれる。該クローニングベクターは、多コピーの該遺伝子配列が生成するよう、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞内に導入することができる。
【００１５】
該遺伝子を含むクローニングベクターでの宿主細胞の形質転換は、多コピーの該遺伝子の生成を可能にする。したがって、形質転換体を増殖させ、該クローニングベクターを該形質転換体から単離し、必要に応じて、単離されたクローニングベクターから該挿入遺伝子を回収することにより、該遺伝子を大量に得ることができる。
【００１６】
十分なコピーの該遺伝子配列が生成したら、該組換えタンパク質またはその機能的に活性な断片もしくは他の断片をコードする遺伝子を、適当な組換え分子内に挿入することができる。該組換え分子は、該組換えタンパク質の挿入されたタンパク質コード化配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するポリヌクレオチド発現ベクターである。好ましくは、該発現ベクターは複製起点をも含む。必要な転写および翻訳シグナルは、天然の遺伝子および／またはそのフランキング領域からも供給されうる。
【００１７】
組換え分子を調製したら、それを、増殖し分裂してクローンを産生する許容される宿主細胞内に挿入する。種々の宿主細胞-ベクター系を使用して、該組換えタンパク質を発現させることができる。適当な宿主細胞-ベクター系には、例えば、細菌発現ベクター系、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）に感染した哺乳類細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、微生物（例えば、酵母ベクターを含有する酵母、およびバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換された細菌）が含まれる。
【００１８】
関心のある遺伝子を含有する組換え分子は、所望のプラスミドDNAまたは特異的mRNAのPCR増幅、核酸ハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子の機能の存在または不存在、および挿入配列の発現により同定することができる。適当な宿主系および増殖条件を確立したら、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する組換え分子を、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどの当技術分野で公知の任意の方法により、宿主細胞内に導入することができる。
【００１９】
関心のある組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された大腸菌（E. coli）などの宿主細胞を直接的に反応容器に加えることができる。該遺伝子を含有する宿主細胞が培地内に組換えタンパク質を発現する場合には、該培地を該反応容器に直接的に加えることができる。
【００２０】
該組換えタンパク質を精製し回収するために、宿主細胞を濃縮して全細胞の濃縮懸濁液を得る。宿主細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により濃縮することができる。例えば、宿主細胞を遠心分離することができる。遠心分離は宿主細胞から水を除去し、該細胞を濃縮し、細胞ペーストを与える。また、該組換えタンパク質が培地内に発現されている場合には、遠心分離は培地から宿主細胞を分離する。
【００２１】
細胞の濃縮懸濁液が得られたら、該細胞を反応容器内に配置し、水混和性有機溶媒で処理する。該組換えタンパク質を該細胞から抽出するために、任意の水混和性溶媒を使用することができる。該抽出に使用する水混和性溶媒は、好ましくは、約50容量％〜約95容量％の有機溶媒および約50容量％〜約5容量％の水を含有する水溶液である。本発明の方法で使用しうる代表的な有機溶媒には、アセトン、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールが含まれる。
【００２２】
該水混和性溶媒での細胞からの組換えタンパク質の抽出は、約5.0〜約10.0のpHおよび約30℃〜約50℃の温度で生じるに違いない。好ましくは、該pHは、約6.5〜約8.5であり、該温度は約35℃〜約45℃である。反応容器内の有機溶媒に対する細胞のモル比は約1:1〜約1:10、好ましくは約1:1〜約1:5である。
【００２３】
該水混和性有機溶媒は、該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から抽出する。該水混和性有機溶媒は、該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から液相内に選択的に分配すると考えられる。該液相は、該組換えタンパク質、水混和性溶媒、水および低レベルのタンパク質性不純物を含有する。
【００２４】
また、該水混和性有機溶媒を使用する該細胞懸濁液からの該組換えタンパク質の抽出は、該組換えタンパク質を精製する。該精製は、該水混和性溶媒が主として該組換えタンパク質を該細胞懸濁液から抽出する一方で、細胞残渣および不純物の大部分を後に残すということから生じる。
【００２５】
該細胞懸濁液からの該組換えタンパク質の抽出の後、該液体抽出物を該細胞懸濁液から単離する。当技術分野で公知の任意の技術を用いて、該抽出物を該細胞から単離することができる。好ましくは、遠心分離により該抽出物を単離する。該抽出物を遠心分離すると、該抽出物は該細胞懸濁液から分離され上清中に含まれる。ついで該上清を、該細胞懸濁液を含有する反応容器から取り出し、新鮮な反応容器内に配置する。
【００２６】
該組換えタンパク質を含有する液体抽出物を該細胞から単離した後、該抽出物を濃縮する。該濃縮は、該抽出物から該水混和性有機溶媒のほとんどを除去する。該抽出物は、当技術分野で公知の任意の方法により濃縮することができる。例えば、該抽出物を遠心分離により該細胞懸濁液から単離する場合には、真空蒸留を用いて該反応容器内の圧力を減少させることにより、該抽出物を含有する上清を濃縮することができる。真空蒸留は、該反応容器内の液体を除去し該上清を濃縮する。該抽出物を、約1/2倍〜約1/20倍、好ましくは、約1/3倍〜約1/7倍の容積に減少するまで濃縮する。標的抽出物濃度は、該抽出物内に残存する全固体（組換えタンパク質および不純物）1L当たり約30〜約110g、好ましくは、約40〜約70gである。
【００２７】
濃縮後、所望により、該濃縮液体抽出物を約0℃〜約15℃、好ましくは、約5℃〜約10℃の温度にまで冷却することができる。該抽出物を冷却すると、該抽出物中に存在する固体または不純物は該反応容器の底に沈降する。冷却後、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、該濃縮液体抽出物を該固体および／または不純物から単離する。例えば、遠心分離により、該抽出物を該固体および／または不純物から単離することができる。遠心分離は、該抽出物から分離され反応容器の底に沈降している固体および／または不純物から該抽出物を分離する。該産物は、遠心分離後は上清中に含まれ、当技術分野で公知の任意の方法により反応容器から取り出されうる。
【００２８】
該固体および／または不純物の除去後、所望により、該組換えタンパク質を含有する濃縮抽出物を水溶性カルシウム塩で処理することができる。本発明の方法においては、任意の水溶性カルシウム塩を使用することができる。使用しうる水溶性カルシウム塩には、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウムなどが含まれる。該抽出物から後に沈殿させる該組換えタンパク質の質を改善するために、該カルシウム塩を加えることができる。反応容器内の組換えタンパク質に対するカルシウム塩のモル比は、約1:1〜約1:10、好ましくは、約1:2〜約1:5である。
【００２９】
水溶性カルシウム塩を加えた後、所望により、該抽出物のpHを約3.5〜約6.5に維持するために必要に応じて該濃縮抽出物に酸を加えることができる。該抽出物のpHを調節するために、任意の無機または有機酸を使用することができる。使用しうる有機酸には、例えば、カルボン酸およびジカルボン酸が含まれる。使用しうるカルボン酸には、例えば、酢酸およびギ酸が含まれる。使用しうるジカルボン酸には、例えば、クエン酸、シュウ酸、フタル酸、セバシン酸およびアジピン酸が含まれる。使用しうる無機酸には、例えば、リン酸、塩酸、硝酸および硫酸が含まれる。
【００３０】
濃縮後に、または所望によりカルシウム塩処理後に、該組換えタンパク質を含有する濃縮抽出物を酸性化する。該濃縮抽出物が酸性化されると、該組換えタンパク質は該抽出物から沈殿する。該タンパク質を沈殿させるためには、前記で特定された無機または有機酸を使用することができる。該タンパク質を沈殿させるために使用する酸の量は、pHをモニターすることにより決定する。該濃縮抽出物からの該組換えタンパク質の沈殿は、約3.5〜約6.5、好ましくは約5.0〜約5.8のpHで生じるに違いない。該酸を使用する該組換えタンパク質の沈殿は、該組換えタンパク質を更に精製する。
【００３１】
沈殿後、該組換えタンパク質を含有する沈殿物を濾過または遠心分離し、ついで洗浄溶液で洗浄する。該洗浄溶液は、酢酸ナトリウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどの溶液であってもよい。該洗浄溶液での該沈殿物の洗浄は、約3.5〜約6.5、好ましくは約5.0〜約5.8のpHで行う。少なくとも1ケーク容積（元のスラリー容積の10〜25％）の洗浄容積を使用する。該沈殿物を洗浄溶液で処理して、該沈殿物中に捕捉された不純物を除去する。該洗浄溶液での該沈殿物のこの洗浄は、該組換えタンパク質の最終的な精製をもたらす。
【００３２】
本発明の方法に従い精製した該組換えタンパク質を、ヒトが消費するのに使用する場合には、洗浄後に所望により、該組換えタンパク質を、該タンパク質の風味を改善する又は添加する化合物で処理することができる。例えば、酢酸ナトリウムで洗浄した後、該組換えタンパク質をクエン酸、クエン酸ナトリウムなどで洗浄して、該組換えタンパク質の風味を改善することができる。
【００３３】
該組換えタンパク質を該洗浄溶液で洗浄した後、該組換えタンパク質を回収する。該組換えタンパク質を回収したら、その意図される用途および／または最終的な包装要件に応じて、それを更なる加工に付すことができる。
【００３４】
本発明に従い精製したタンパク質は、約90〜約97％の純度、好ましくは約92〜約96％の純度を有する。本発明の方法から回収される組換えタンパク質の量は、約80〜約90％である。
【００３５】
前記のとおり、所望の任意の組換えタンパク質を細胞懸濁液から精製し回収するために本発明の方法を用いることができる。好ましい実施形態においては、組換えβカゼインを宿主細胞から精製し回収するために本発明の方法を用いる。組換えβカゼインを産生する宿主細胞を遠心分離して、細胞懸濁液（細胞ペーストとも称される）を得る。該細胞ペーストを、約6.5〜約8.5のpHおよび約40℃の温度にて55％イソプロパノールの水溶液で処理して、βカゼインを該細胞ペーストからイソプロパノールおよび水（液体抽出物）中に抽出することができる。該細胞ペーストからβカゼインを抽出した後、遠心分離により該液体抽出物を該細胞ペーストから単離することができる。遠心分離後、該液体抽出物を減圧濃縮することができる。該抽出物は、該抽出物中に残存している全固体（組換えタンパク質および不純物）1L当たり約40〜約70gの濃度にまで濃縮することができる。濃縮後、該液体抽出物を5℃に冷却し、ついで遠心分離することができる。上清中に含まれる固体は、当技術分野で公知の方法により除去することができる。
【００３６】
該固体の除去後、水溶性カルシウム塩を該抽出物に加え、該抽出物のpHを酸で調節してβカゼインを沈殿させることができる。βカゼインの沈殿は、約5.0〜約5.8のpHで生じる。βカゼインの沈殿後、該沈殿物を遠心分離し、ついで約5.4〜約5.8のpHにて酢酸ナトリウムの溶液で洗浄することができる。酢酸ナトリウムでの洗浄後、βカゼインをクエン酸で洗浄することができる。クエン酸での洗浄後、βカゼインを回収することができる。
【００３７】
以下の実施例は、本発明の方法の好ましい実施形態を例示するものであり、本明細書および特許請求の範囲を何ら限定するものではない。
【００３８】
実施例1
40Lの収穫物からの100.0gの細胞バイオマス（cell biomass）を500mLの63％ (v/v)イソプロパノール／水と混合した。得られたスラリーを希水酸化ナトリウムで約8.2のpHに調節し、約40℃で約1時間維持して、該組換えタンパク質の完全な抽出が促進されるようにした。消費された細胞を遠心分離により除去し、全固体が42g/Lになるまで該上清を減圧下で濃縮した。遠心分離により取り出された不純物の沈殿を促進するために、該濃縮物を約5℃に冷却した。塩化カルシウムを、組換えヒトβカゼイン（SDS-PAGEにより測定）に対するモル比1:1で該上清に加え、硫酸の添加により該溶液を約5.8のpHに調節してタンパク質の沈殿を開始させた。産物を濾過により回収し、2ケーク容積（100mL）の1％クエン酸で洗浄して、80gの組換えヒトβカゼインを得た。SDS-PAGEによる分析は、約90〜約95％のタンパク質純度を示した。
【００３９】
実施例2
500Lの収穫物からの100.0gの細胞バイオマスを500mLの63％ (v/v)イソプロパノール／水と混合した。得られたスラリーを希水酸化ナトリウムで約8.3のpHに調節し、約40℃で約1時間維持して、該組換えタンパク質の完全な抽出が促進されるようにした。消費された細胞を遠心分離により除去し、全固体が65g/Lになるまで該上清を減圧下で濃縮した。遠心分離により取り出された不純物の沈殿を促進するために、該濃縮物を約5℃に冷却した。塩化カルシウムを、組換えヒトβカゼイン（SDS-PAGEにより測定）に対するモル比1:1で該上清に加え、該溶液を4つの等しいアリコートに分割した。種々の酸の添加により、各部分を約5.8のpHに調節した。クエン酸、塩酸、リン酸および硫酸を使用して該タンパク質の沈殿を開始させた。該産物を濾過により回収し、SDS-PAGEにより分析したところ、約90〜約95％のタンパク質純度が測定された。
【００４０】
実施例3
750Lの収穫物からの22.0gの細胞バイオマスを88mLの70％ (v/v)イソプロパノール／水と混合した。該抽出物を遠心分離し、残存した細胞を今度は88mLの60％ （v/v）イソプロパノール／水で抽出した。消費された細胞を遠心分離により除去し、それらの2つの抽出物を合わせ、減圧下、約40℃で濃縮した。希酢酸の添加により該溶液を約5.8のpHに調節してタンパク質の沈殿を開始させた。産物を遠心分離により回収し、50mM酢酸ナトリウムで洗浄し、再遠心分離して最終産物を回収した。SDS-PAGEによる分析は、約90〜約95％のタンパク質純度を示した。
【００４１】
実施例4
37,000Lの全細胞培養を遠心分離した。回収された細胞塊を蒸留水に懸濁させ、4,900Lの最終容積にまで再遠心分離した。洗浄した細胞を73％ (v/v)イソプロパノール／水の溶液（セル容積を用いて算出）で抽出した。該スラリーのpHを水酸化ナトリウムの添加により約8.1に調節し維持しながら、該混合物を約40℃に加熱し、約30分間維持した。消費された細胞を遠心分離により除去し、該抽出物を外界温度で濾過した。得られた8,090Lの濾液を、薄膜エバポレーターおよび／またはポットスチルを使用して3,370Lの最終容積まで濃縮した。該濃縮液体抽出物を約5℃に冷却し、沈殿した不純物を、フィルタープレスを用いて除去した。等モル量の塩化カルシウムを該濾液に加え塩酸でpHを約5.8に低下させることにより、βカゼインを沈殿させた。バスケット遠心機を使用して該産物を単離した。βカゼインの湿潤ケークをクエン酸溶液で洗浄し、再遠心分離して202.4Kgの産物を得た。SDS-PAGEによる分析は、約90〜約95％のタンパク質純度を示した。
【００４２】
実施例5
36,600Lの全細胞培養を遠心分離し、回収された細胞塊を蒸留水に懸濁させ、3,950Lの最終容積にまで再遠心分離した。洗浄した細胞を69％ (v/v)イソプロパノール／水の溶液（セル容積を用いて算出）で抽出した。該スラリーのpHを水酸化ナトリウムの添加により約8.1に調節し維持しながら、該混合物を約40℃に加熱し、約30分間維持した。消費された細胞を遠心分離により除去し、該抽出物を外界温度で濾過した。これは8,900Lの濾液を与え、それを、薄膜エバポレーターおよび／またはポットスチルを使用して2,680Lの最終容積まで濃縮した。該濃縮液体抽出物を約5℃に冷却し、沈殿した不純物を、フィルタープレスを用いて除去した。塩化カルシウムを、βカゼインに対して1：1のモル比で該濾液に加え、pHを塩酸で約5.8に調節して、βカゼインを溶液から沈殿させた。バスケット遠心機を使用して該産物を単離した。ついでβカゼインの湿潤ケークをクエン酸溶液で洗浄し、再遠心分離して135.7Kgの産物を得た。SDS-PAGEによる分析は、約90〜約95％のタンパク質純度を示した。