(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ1，Ｐ4−ジチオ−Ｐ2，Ｐ3−モノクロロメチレン５；５”’ジアデノシンＰ1，Ｐ4−テトラホスフェート：を含む組成物。
【請求項２】
Ｐ1，Ｐ4−ジチオ−Ｐ2，Ｐ3−モノクロロメチレン５；５”’ジアデノシンＰ1，Ｐ4−テトラホスフェートが有効な抗血栓量で存在し、さらに、薬剤として許容しうるキャリヤーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
有効な抗血栓量が１ｍｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の間である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
さらに、少なくとも一つの血栓崩壊量の血栓崩壊剤を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
血栓崩壊剤が組織プラスミノーゲン活性化剤であるストレプトキナーゼおよびウロキナーゼからなる群より選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
さらに、少なくとも一つの血栓崩壊量の血栓崩壊剤を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
血栓崩壊剤が組織プラスミノーゲン活性化剤であるストレプトキナーゼおよびウロキナーゼからなる群より選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
Ｐ1，Ｐ4−ジチオ−Ｐ2，Ｐ3−モノクロロメチレン５；５”’ジアデノシンＰ1，Ｐ4−テトラホスフェートおよび薬剤として許容しうるキャリヤーを含む、薬剤組成物。
【請求項９】
哺乳動物に投与するための一回の投与量を含むように組成物を調合する、請求項８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
政府援助
本明細書に記載の発明は、一部、ＮＩＨ補助金ＩＲ４３ＨＬ５３８６４−０１（ＡＨＲ−Ｂ１）による援助を受けた。
発明の背景
血管内凝固は一般的な疾病である。そのような疾病の内、最も一般的なものの一つは、形成ポイントに残留する動脈血管内の血栓形成である。血栓は、個体に重大な悪影響を及ぼす可能性がある。例えば、心臓動脈内の血栓形成は、血流を制限し、その結果、最も重い型の心臓発作の一つである心筋梗塞（心筋の死）が起こる。
動脈血管および人工器官医療装置（prosthetic medical device）内の血栓症は、傷ついた血管壁または人工器官の表面への血小板の癒着、それらの顆粒内容物の放出、プロスタグランジンエンドペルオキシドの合成、および血小板の凝集を特徴とする。新しく形成された血小板凝集は、壊れやすい集塊（clump）であり、いわゆる「白色血栓」と呼ばれる。凝集し（活性化される）ことによって血小板表面上に凝固性活性前駆体が晒し出されることによって、白色血栓上にフィブリンネットワークが形成され、それを安定化する。様々な抗血小板薬剤が、血栓の形成阻害に関する有益な臨床的発明の潜在的標的として、長年にわたって、研究されてきた。アスピリンおよびジピリダモールのようないくつかの薬剤が、抗血栓予防薬として使用されるようになり、その他の薬剤は臨床研究の対照であった。今日までに、ジスインテギン（disintegins）、チクロピジン（ticlopijine）およびその類似体のような強力な薬剤は、本質的に副作用があるが、これに対してアスピリンのようなより温和な薬剤は有益であるが、効果には限界がある（Ｈａｓｓ，Ｗ．Ｋ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１，５０１−５０７、１９８９；Ｗｅｂｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，６６，１４６１−１４６８、１９９０；Ｌｅｋｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ａ．、Ｂｅｌｌ，Ｗ．Ｒ．、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７０，１６１−１７７、１９９１）。情報の入手できる、ＲｅｏＰｒｏ（７Ｅ３）のようなより新しい薬剤の臨床効果は印象的であるが、最近の試行の成功は、これらの方法が、時には血液輸血を必要とする出血を主とする危険性の増加とも関連している、という知見によって複雑になる（Ｔｈｅ  ＥＰＩＣ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、１９９４、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３０，９５６−９６１）。従って、理想的な「恩典（benefit）／危険」率（即ち、望ましくない出血の原因となる性質と比較して、アスピリンでの「恩典／危険」率より改善された効率）は、達成されなかったと考えられる。
血小板の凝固を阻害するより効果的で選択的な化合物に関する最近の研究では、それら化合物が抗血栓効果により大きい恩典をもたらすことが示唆されている。一般的なアゴニストであるＡＤＰは動脈血栓形成の開始および進行に鍵の役割を演ずることが、数多くの研究から示唆された（Ｂｅｒｎａｔ，Ａ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ，Ｈａｅｍｏｓｔ，７０，８１２−１２６、１９９３；Ｍａｆｆｒａｎｄ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ，５９，２２５−２３０、１９８８；Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，１３，１１７１−１１７９、１９９３）。それ故、ＡＤＰの誘導する血小板凝固の効果的阻害剤は、抗血栓剤の検索に特別な利益をもたらすであろう。ジアデノシン５’，５”’−Ｐ1，Ｐ4−テトラホスフェート（ＡＰ4Ａ）は、ＡＤＰの誘導する血小板凝固の競合阻害剤であることが知られている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３、１９９２；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５４（１），５７−６０、１９７５；Ｌｕｔｈｊｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１１８，７０４−７０９、１９８４；Ｃｈａｏ，Ｆ．Ｃ．ら、Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６５，６１０、１９８４）。
ジヌクレオチドＡＰ4Ａは、生きた細胞の随所に存在する成分である（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．およびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，タンパク質合成の調節メカニズム（Regulatory mechanisms for protein synthesis）、「哺乳動物細胞」（”Mammalian Cells”）、Ｓａｎ  Ｐｉｅｔｒｏ，Ａ．，Ｌａｍｂｏｒｇ，Ｍ．Ｒ．およびＫｅｎｎｙ，Ｐ．Ｃ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３−１６、１９６７）。ＡＰ4Ａは、正常なヒト血小板中に、任意のその他の細胞区画中に存在するより高い濃度で、存在する（Ｆｌｏｄｇａａｒｄ，Ｍ．およびＫｌｅｎｏｗ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０８，７３７−７４２、１９８３）。血小板を3Ｈ−アデノシンとインキュベーションすると、ＡＴＰは標識されるが、ＡＰ4Ａは標識されないため、貯蔵されたＡＰ4Ａは、代謝上不活性であると考えられた。血小板をトロンビン処理すると、ＡＤＰおよびジヌクレオチド、ジアデノシン５’，５”’−ｐ1，ｐ3−トリホスフェート（ＡＰ3Ａ）を含むその他の貯蔵プールヌクレオチドと共に、ＡＰ4Ａが完全に遊離する（Ｌｕｔｈｊｅ，Ｊ．およびＯｇｌｉｖｉｅ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１１５，２５２−２６０、１９８３）。ＡＰ3Ａは、血漿中でＡＭＰ（アデノシンモノホスフェート）およびＡＤＰ（アデノシンジホスフェート）に加水分解され；ＡＰ4Ａは、ＡＭＰおよびＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）に分解される（Ｌｕｔｈｊｅ，Ｊ．およびＯｇｌｉｖｉｅ，Ａ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４９，１１９−１２７、１９８５）。
ＡＰ4Ａの正確な生理学的役割は明らかではないが、様々な細胞内での代謝に関与していた（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３４，１−１０，１９８３）。血小板中のＡＰ4Ａ濃度が通常より高くなると、血小板生理の役割を危機に導く。凝集を受けて刺激された血小板は、高濃度の顆粒中に貯蔵された内因性ＡＤＰの放出時に第二期の凝集を示す。インビトロでの実験では、凝集が６０％に進行した場合でさえ、ＡＰ4Ａは凝集した血小板を即時に分散させて、ＡＤＰ誘導血小板凝集を競合的に阻害することが証明された（Ｃｈａｏ，Ｆ．Ｃ．およびＺａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６５：６１０、１９８４）。これとは対照的に、ＡＰ3Ａは、多分その分解生成物であるＡＤＰを通して、血小板を徐々に凝集させる原因となる。ＡＰ3Ａの凝集活性は、ＡＰ4Ａ追加時に即座に可逆になる（Ｌｕｔｈｊｅ，Ｊ．およびＯｇｌｉｖｉｅ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１１８，７０４−７０９、１９８４）。
血栓形成のプロセスは、不完全に理解されているのみであるが、２つの主な段階；動脈血管損傷部位での血小板の凝集および生成した血餅を一緒に結合する架橋フィブリンポリマーの形成：が確認されている。
合衆国特許第５，０４９，５５０号、１９９１年９月１７日、Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋに発行（以後、”Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５５０”）は、抗血栓剤としてのＡＰ4ＡおよびＡＰ4Ａ類似体を、例えば、冠状血管および大脳血管の血栓症の予防に用いること、ならびに血栓症の予防および血液透析動静脈シャントに用いること、について記載している。また、Ｚａｎｅｃｎｉｋ’５００特許は、血栓凝集の阻害による血栓形成の予防法、およびＡＰ4Ａ類似体を単独でまたは血栓崩壊剤と共に含む関連組成物についても記載している。特に、Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００は、これらの薬剤の抗血栓効果についての一つの測定法として、ＡＤＰ誘導血小板凝集への様々なＡＰ4Ａ類似体の阻害効果（ＩＤ50）について、報告している。Ｐ2、Ｐ3位に位置するＰ−Ｃ−Ｐブリッジを持つＡＰ4Ａの二ホスホン酸類似体内のフッ素を塩素に置換しても、ＡＤＰ誘導血小板凝集アッセイにおける類似体の阻害活性に実質的な影響を与えるとは考えられなかった。
発明の概要
本発明は、Ｐ1，Ｐ4−ジチオ−Ｐ2，−Ｐ3モノクロロメチレン５’，５”’ジアデノシン  Ｐ1，Ｐ4−テトラホスフェート（代わりに、本明細書中では、「チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ」または「ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ」と呼ぶこともある）が、以前にＺａｍｅｃｎｉｋ’５５０に開示されたその他のＡＰ4Ａ類似体で認められた阻害効果と比較して、より有効なＡＤＰ誘導血小板凝集阻害効果を持つという、発見に基づいている。従って、本発明は、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む組成物、ならびにそのような組成物を、冠状血管および大脳血管の血栓症の予防および血液透析動静脈シャントおよび血栓形成の予防に用いることに関する。さらに、本発明は、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む組成物を、単独でまたは血栓崩壊剤と組み合わせて、医療に用いることに関する。
本発明の一つの態様に従って、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む組成物を開示する。特に好ましい実施態様では、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、薬剤として許容しうるキャリヤーと共に、有効な抗血栓量で存在する。一般的には、有効な抗血栓量とは、血小板凝集を阻害するのに有効な量である。
本発明のもう一つの態様では、薬剤組成物が提供される。組成物は、ＡｐsｐＣＨＣＬｐｐsＡおよび薬剤として許容しうるキャリヤーを含む。特に好ましい実施態様では、薬剤組成物は、哺乳動物内での血栓崩壊効果を調整する（modulating）量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む。従って、好ましい実施態様では、薬剤組成物は、哺乳動物に投与するためにあらかじめ選択された量（例えば、単一投与量）のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含むように調合される。
本発明のさらなるその他の態様に従って、血栓崩壊量の少なくとも一つの血栓崩壊剤と共にＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む薬剤組成物が、ここに開示される。好ましくは、ＡｐsｐＣＨＣｌＰＰs３Ａは、有効な血栓崩壊量の組成物内に存在する。より好ましくは、血栓崩壊剤は、組織プラスミノーゲン活性化剤であるストレプトキナーゼおよびウロキナーゼからなる薬剤の群から選択される。
哺乳動物で血栓崩壊効果の調整を必要とするそのような調整（modulating）の方法も、ここに開示される。方法は、哺乳動物に有効量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む薬剤組成物を投与して、血栓崩壊効果を調整することを含む。一つの実施態様では、血栓崩壊効果を調整する方法は、哺乳動物の血栓を溶かすことを含む。血栓崩壊効果を調整する必要のあるＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、有効な抗血栓量である。好ましくは、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを、血栓崩壊に有効な量の血栓崩壊剤と共に、哺乳動物に投与する。好ましい血栓崩壊剤は、組織プラスミノーゲン活性化剤であるストレプトキナーゼおよびウロキナーゼからなる群より選択される。当業者らはすぐに分かるであろうが、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、血栓崩壊に有効な量の血栓崩壊剤の哺乳動物への投与と同時にまたは順番に、哺乳動物に投与することができる。
さらにもう一つの実施態様では、哺乳動物内で血栓崩壊効果を調整する方法は、哺乳動物での血栓の成長阻害を含む。血栓の成長阻害に必要なＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、血小板凝集を阻害するに有効な量または有効な抗血栓量である。
さらにもう一つの実施態様では、哺乳動物での血栓崩壊効果を調整する方法は、哺乳動物内での血栓形成の減少（例えば妨害）を含む。哺乳動物内での血栓の形成は、哺乳動物に有効な抗血栓量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを投与することによって、または血小板凝集の阻害に有効な量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを投与することによって、減少させることができる。出願人は、血栓形成の減少の一つの特別なメカニズムに本発明を制限するつもりではないが、哺乳動物内での血栓の形成は、血小板の凝集を阻害することによって減少し、さらに、哺乳動物への有効量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの投与は血小板の凝集を阻害し、それによって血栓の形成が減少または妨害される、と考えられる。
哺乳動物内での血栓崩壊効果を調整する方法のさらなるその他の実施態様に従って、インビボでは、血小板凝集の阻害に有効な量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを哺乳動物に投与し、血小板凝集を阻害する。
本発明のこれらのおよびその他の態様ならびに様々な長所および効用は、好ましい実施態様の詳細な記載によって、より明らかになるであろう。
本明細書にて特定された個々の特許、特許公報および参考文献は、その全体をここに参照として採用する。
発明の詳細な説明
主題とする発明は、抗血栓剤としてのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの使用に関する。本発明は、哺乳動物へのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの投与が血小板の凝集を阻害し、たぶんそれによって血栓症の発生を減少させるとの発見に基づいている。驚くべきことに、インビトロでのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの凝集阻害活性は、天然発生のＡＰ4Ａの阻害活性より大きさで一桁近く大きく、既知のＡＰ4Ａ類似体（ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡとは違い、メチレンブリッジに塩素ではなくフッ素を持つ、Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００に開示されているような化合物Ｅ13）の活性より有意に大きい。また、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、それに相当するＳを含まない対応物（Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００内に開示されているような化合物Ｅ10、本明細書中の実施例もまた参照のこと）の活性より、有意により大きい血小板凝集阻害活性を持つ。血小板凝集阻害活性のこの実質的な増加は、ＡＰ4Ａまたは既知のＡＰ4Ａ類似体との構造類似性（その構造は以下に提供される）からは予想し得なかった。例えば、Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００（表３）は、ＡｐｐＣＨＣｌｐｐＡ（化合物Ｅ10）の阻害効果（ＩＤ50値）が３μＭであり、そしてＡｐｐＣＨＦｐｐＡ（化合物Ｅ5）のＩＤ50値が４μＭであることを、示している。従って、これらのＡＰ4Ａ類似体では、フッ素の塩素への置換は、ＡＤＰ誘導血小板凝集阻害活性への影響は少ない。この結果から、当業者は、先行技術のＡＰ4Ａ類似体と比較して、本発明の阻害活性の実質的改良を期待しないであろう。
天然発生ＡＰ4Ａは、以下の式（「式Ｉ」）：
0004212114.tif 000002
を持つ。
Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００のＥ5組成物（省略形ＡｐｐＣＨＦｐｐＡ）は、以下の式：
0004212114.tif 000003
を持つ。
Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００のＥ10組成物（省略形ＡｐｐＣＨＣｌｐｐＡ）は、以下の式：
0004212114.tif 000004
を持つ。
Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００のＥ13組成物（省略形ＡｐsｐＣＨＦｐｐsＡ）は、以下の式：
0004212114.tif 000005
を持つ。
新たに開示されたＡＰ4Ａ類似体、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、以下の式：
0004212114.tif 000006
を持つ。
ＡＰ4Ａは、哺乳動物に投与された場合に、顕著なＡＤＰ−誘導血小板凝集の阻害を示す。凝集前または凝集中に加えると、外因性のＡＰ4Ａは、二次波応答を鈍らせ、凝集した血小板の急速な分散の原因となる。阻害の大きさは、外因性ＡＰ4Ａ投与量と直接関係を持つことが示された。血小板栓（platelet plugs）は、動脈血栓の大部分を形成するので、血栓症を予防するための好ましい臨床戦略は、互いの、および多分管壁等への、血小板の粘着を妨害する医療薬剤（例えばＡＰ4Ａ）を利用することである。従って、本発明の一つの実施態様では、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを、哺乳動物に投与し、哺乳動物内の血栓崩壊効果を調整する、例えば再狭窄を予防または阻害する。
本明細書中に用いられている、「血栓崩壊効果を調整する」とは、哺乳動物内での血栓症発症の予防するまたは減少させること、例えば、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの非存在下での血栓形成／成長の可能性と比較して、血栓形成および成長の可能性を統計上減少させること、をさす。例えば、哺乳動物の血栓崩壊効果の調整とは、（１）哺乳動物の血栓の溶解を容易にし；（２）哺乳動物の血栓の成長を阻害し；（３）哺乳動物の血栓の形成を減少（例えば予防）し；そして（４）哺乳動物の血小板凝集を阻害する（例えば、血栓形成の可能性を減少させることが望ましい予防的適用）：ことを含む。
ＡＰ4Ａは、ウサギ血液中では、インビボおよびエキソビボの両方（ＡＰ4Ａを投与された患者の血液から得られた血小板）で半減期が短い。インビボでのクリアランスと比較して、エキソビボでのＡＰ4Ａの減衰は有意に長い。このことは、ＡＰ4Ａの異化によって金属イオン依存性加水分解酵素が阻害されることを示しており、クエン酸塩化血液を用いることによって説明することができ（Ｌｕｔｈｊｅ，Ｊ．およびＯｇｉｌｖｉｅ，Ａ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１４９，１１９−１２７、１９９５）、また、正常な血漿に加えられた32Ｐ−標識ＡＰ4Ａの９０％が、３７℃でインキュベートした場合に、１０分間で分解される（Ｋｉｍら、Ｂｌｏｏｄ，６６，７３５−７３７、１９９５）と言う結果と一致する。内因性血小板ＡＰ4Ａは、刺激を受けた血小板が遊離現象を起こした場合に濃厚な顆粒から比較的高濃度で遊離され、血小板の局所的凝集−分散の調整に重要であろう。従って、合衆国特許第５，０４９，５５０号（Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５５０）に記載のように、抗血栓症効果は、外因性ＡＰ4Ａの投与を通してＡＰ4Ａの高循環レベルを維持することによって得ることができる。このことから、ＡＰ4ＡまたはＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡのようなその類似体を、医療用抗血小板、抗血栓剤として用い得ることが示唆される。
本発明の一つの態様に従って、哺乳動物の血栓崩壊効果を調整する方法が、それを必要とする哺乳動物に提供される。血栓崩壊効果を調整する方法は、哺乳動物に有効量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを含む薬剤組成物を投与して血栓崩壊効果を調整することを含む。本明細書中で用いられているように、血栓崩壊効果の調整とは、哺乳動物中の血栓の溶解を容易にし、哺乳動物中に存在する血栓の成長を阻害し、血栓の形成を減少させ（例えば予防し）、そして（以前から存在する血栓の存在下または非存在下で）血小板の凝集を阻害する、ことを含む。
一般的には、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、腹膜内、筋肉内、経口、胃腸、皮下に、またはゆっくりと放出されるカプセルを通して、投与することができる。しかしながら、哺乳動物への好ましい投与方法は、静脈内注射による方法である。ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、任意の便利なポイントで哺乳動物の血流内に導入されるが、予想されるまたはすでに分かっている血栓の部位から上流およびその近くに注射することが望ましい。哺乳動物の血栓崩壊効果を調整するＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、治療される哺乳動物に特別な血栓崩壊効果を仲介するであろうその量である。例えば、血栓崩壊効果を調整する方法が哺乳動物の血栓の溶解を容易にする場合、この血栓崩壊効果を調整する有効量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、有効な抗血栓量、即ち抗血栓溶解剤と組み合わせて以前から存在する血栓の溶解を容易にするであろう量、である。好ましくは、有効な抗血栓量は、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇと２５ｍｇの間である。より好ましくは、有効な抗血栓量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇと１５ｍｇの間である。
血栓崩壊効果を調整する方法が哺乳動物の血栓の成長を阻害する方法である場合、有効量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、インビボでの血小板凝集の阻害に有効なＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡのその量（５−２５ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは１０−１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の間）である。一般的には、インビボでの血小板の凝集阻害に有効な量は、約５ｍｇと２５ｍｇ／ｋｇ体重の間、より好ましくは、約１０ｍｇと１５ｍｇ／ｋｇ体重の間、である。
血栓崩壊効果を調整する方法が哺乳動物の血栓形成を減少させる（例えば、インビボでの血小板凝集の阻害による）方法である場合、この目的を達成するに有効な量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、インビボでの血小板の凝集を阻害し、多分、それによって哺乳動物での血栓形成を減少させる（例えば予防する）であろうＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ量である。血栓崩壊効果を調整する方法が（血栓の存在するまたは存在しない）哺乳動物での血小板凝集を阻害する方法である場合、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、インビボで血小板の凝集阻害に有効なＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡとおおよそ同じ量である。
具体的例で上記目的を達成するために与えられる正確なＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ量は、調合された特別な組成物、投与方法および患者の臨床的必要性に従って、変化するであろう。しかしながら、一般的には、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの投与量は、１０μｇから１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
上記のように、インビボでの血小板の凝集阻害に有効な投与量は、血栓症の阻害に有効な投与量（「有効な抗血栓量」）とおおよそ同じである。しかしながら、インビボでの血管内の血餅形成（血栓症）は、例えば、
１）血小板活性化、凝集および凝固システムの活性化（血栓生成）、次いで損傷した血管壁への血小板の粘着；
２）損傷した血管による組織凝固因子の放出（本質的でない凝固経路による血栓生成）；
３）損傷した血管による組織プラスミノーゲン活性化因子の放出（プラスミン生成）；
４）（正常な生理活性と関連する）抗トロンビン活性；ならびに
５）内皮下組織との血小板相互作用の強化および血流による放出血餅の切断；を含む、一連の病態生理学的出来事を含む複合プロセスの結果である。まとめると、これらの出来事は、結果として血栓症を発症させるが、これらの出来事の内のいくつかは血餅を形成させるが、その他の出来事は、血餅形成を阻害する。従って、好ましい実施態様では、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、最も一般的に使用される抗トロンビン剤であるヘパリンのような抗トロンビン剤と組み合わせて投与される。
ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、薬剤として許容しうるキャリヤーと一緒に、単独でまたはその他の薬剤（例えば血栓崩壊剤）と組み合わせてのいずれかで、注射によって投与することができる。薬剤として許容しうるキャリヤーとは、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを溶解するまたは懸濁液の中にそれを保つそれら、および生理学的条件下と適合するそれらである。薬剤として許容しうるキャリヤーの例としては、塩化ナトリウムまたはグルコースのような、塩または非イオン性化合物の水溶液が挙げられる。他の薬剤もＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡと共に溶液中に存在することができるが、そのようなさらなる成分は、インビボで血小板の凝集を阻害するＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの能力を妨害しないことが重要である。当業者らは、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡに特定の薬剤として許容しうるキャリヤーを知っているか、または日常的実験で確かめることができるであろう。さらに、当業者らは、その他の薬剤がインビボで血小板の凝集を阻害するＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの能力を妨害することなく、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡと共に溶液中に存在することができるか否かを知っているか、または日常的実験で確かめることができるであろう。血栓崩壊効果を調整する組成物は、これらに限定されるわけではないが、ヒト、家畜および農場動物を含む任意の哺乳動物の治療に有用である。
本発明の特に好ましい実施態様に従って、哺乳動物での血栓崩壊効果の調整方法は、哺乳動物の血栓溶解を容易にすること、またはその拡張を防ぐことを含む。好ましくは、血栓溶解方法には、抗血栓に有効な量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡを血栓崩壊に有効な量の血栓溶解剤と共に、哺乳動物に投与することが含まれる。本明細書中で用いられる「血栓崩壊剤」とは、血栓を砕くまたは溶解する薬剤とさす。血栓とは、血液の構成成分から形成される心臓血管システム内の血餅をさし；管腔を完全に妨害することなく血管または心臓壁を閉塞させるまたはこれに付着することができる。従って、血栓崩壊に有効な血栓崩壊剤の量は、インビボで血餅を溶解するであろうその量である。当業者らは、有効な抗血栓量のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡならびに血栓崩壊に有効な血栓崩壊剤の量を、知っているか、または日常的実験で確かめることができるであろう。特に好ましい実施態様では、血栓崩壊剤は、組織プラスミノーゲン活性化剤であるストレプトキナーゼおよびウロキナーゼからなる群より選択される。
ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、哺乳動物受容個体に血栓崩壊剤と共に投与することができる。本発明の目的では、「共に投与する」（”coadministerting”）とは、（１）ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡと血栓崩壊剤の同時投与、および（２）血栓崩壊剤投与の少し前または後のＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ投与、を含む。この方式でのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの投与は、結果として血栓崩壊剤の作用に応じて血餅から遊離する血小板の再凝集を分散および／または予防する。ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、血栓形成の非常に早い段階で作用するので、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、上記のような一つまたはそれより多い血餅溶解剤と組み合わせた場合に、特に有用である。
本発明のさらなるその他の実施態様では、血栓崩壊効果の調整方法は、哺乳動物に存在する血栓の成長を阻害することを含む。この実施態様では、投与されるＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、インビボで血小板の凝集阻害に有効な量（「有効な抗血栓量」）である。出願者らは、本発明を特定のメカニズムに限定するつもりはないが、血栓の成長阻害は、存在する血栓の周辺でのさらなる血小板の凝集を予防することによって成し遂げられると考えられる。
本発明のさらなるその他の実施態様では、血栓崩壊効果の調整方法とは、哺乳動物の血栓形成を減少させることを含む。ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの投与は、インビボでの血小板の凝集を予防することによって、哺乳動物の血栓形成を阻害すると考えられる。従って、哺乳動物の血栓形成の減少（例えば予防）に有効なＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの量は、インビボでの血小板凝集の阻害に有効な量である。このように、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、冠状動脈および大脳の血管の血栓形成の予防に特に有用である。さらに、血栓は、動脈システム内に主に起こるため、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの好ましい用途は、心臓および脳内に危険性の高い動脈血栓を持つ患者の治療である。さらに、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、動静脈シャントでの血栓症を予防する目的で、患者を人口腎臓機と結びつける血液透析に有用である。さらに、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、血小板凝集阻害に十分な量で存在する場合に、心筋梗塞および／または発作の再発を予防する目的の二次予防剤として有用であると、考えられる。このように、一般的には、予防的適用としてのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有効量は、以前から存在している血栓部位でのインビボの血小板凝集の予防に有効な上記の量と同じ量である。
上記の血栓崩壊の出来事を調整するＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有用性は、インビボでの天然発生のＡＰ4Ａ分子の確立された有用性によって支持される。例えば、ＡＰ4Ａは、哺乳動物に投与される場合に、ＡＤＰの誘導する血小板凝集を著しく阻害することが示されている。凝集の前またはその間に加えると、外因性のＡＰ4Ａは、外因性ＡＰ4Ａの投与量と直接関係を持つ阻害の大きさで、凝集した血小板を急速に分散させる原因となる。血小板栓子は動脈血栓の大部分を形成するので、血栓症を予防するための好ましい治療戦略は、インビボで血小板の互いの粘着を妨害するための哺乳動物へのＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの上記投与と一致する。このように、インビボで血栓崩壊の出来事を調整するＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの有用性は、天然発生の親分子であるＡＰ4Ａおよびその類似体ＡｐｐＣＨＣｌｐｐＡが哺乳動物に臨床投与された場合に血栓形成を阻害するという科学的確信に基づいている。
驚くべきことに、好都合にも、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡは、天然発生のＡＰ4Ａまたは前記のＡＰ4Ａ類似体のそれらと比較して、血小板凝集を阻害する性質の増加を示す。これらの性質は、予想外であり、天然発生のＡＰ4Ａ分子の類似体との構造的類似性からは予想できなかった。既知のＡＰ4Ａ類似体と比較したＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの阻害活性の有意な差異は、添付の実施例で具体的に説明しているが、如何なる場合も制限として受け取られるべきものではない。
実施例
以下に提供されない限り、実験方法は、合衆国特許第５，０４９，５５０号（Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５００）に提供された方法に従って行われ、その内容全体をここに参照として採用する。いくらかの方法の変更（例えば、遊離反応およびＰＦ３アッセイ）および数多くの追加研究（例えば、細胞質のカルシウム移動性、フィブリノーゲン結合部位、ＡＤＰ以外のアゴニスト、血小板ｃＡＭＰおよび血液成分中へのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの分配）もまた提供される。少なくとも１０日間、抗血小板剤を差し控えた健康なボランティアから、血液を、０．１容量の３．８％クエン酸ナトリウム中に収集した。血小板に富む血漿（platelet rich plasma）（ＰＲＰ）を、勾配遠心分離によって分離し、血漿１ｍあたり３．３ｘ１０8血小板になるように調整した。実施例中には、記載されない限り、ＰＲＰを用いた。
この書類を通して、Ｐ1，Ｐ4−ジチオ  Ｐ2，Ｐ3−モノクロロメチレン  ５’，５”’−ジアデノシン  Ｐ1，Ｐ4−テトラホスフェートは、代わりに、「チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ」または「ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ」とも呼ばれる。
実施例１．ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの合成
ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡの合成は、英国シェフィールド大学、Ｍ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ教授の研究室（the laboratory of Professor M.Blackburn,University of Sheffield,England）で成し遂げられ、２つの段階を含んでいた。最初に、ジフェニルホスホクロリデートでのアデノシン５’−チオモノホスフェートの活性化を通して、（ｐα）−ビスチオ−類似体を製造し、次いで、アデノシン５’−チオモノホスフェートをモノクロロメチレンビスホスフェートと縮合した（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，６９９１−７００４、１９８７）。また、「ＡＰ4Ａおよびその他のジヌクレオシドポリホスフェート」（AP4A and Other Dinucleoside Polyphosphates）、Ａ．ＭｃＬｅｎｎａｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９９２、第１１章「ジヌクレオシドポリホスフェートの合成構造類似体」（”Synthetic Structural Analogues of Dinucleoside Polyphosphates”）、Ｇ．Ｍ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、も参照のこと。ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー後の生成物は、31Ｐ  ＮＭＲで純度９０％であった。逆層ＨＰＬＣを用いた分析的精製では、純度９９％の物質が提供され、４つの立体異性体、例えば、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐsＡ、ＡｐsｐＣＨＣｌｐｐａ、ＡｐｐＣＨＣｌｐｐsＡおよびＡｐｐＣＨＣｌｐｐＡ、が分析された。立体異性体のさらなる精製は行われなかった。
実施例２．ＡｐsＣＨＣｌｐｐsＡの特徴
結果
Ｉ．ＡＤＰ−誘導血小板凝集へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害能力：
ＡＤＰによって誘導される血小板凝集への様々な薬剤（例えば、対照薬剤としてチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣＬ−ＡＰ4Ａを含む）の阻害効果について、最初のスクリーニングを行った。血小板の凝集は、血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏｌ−ｌｏｇ，Ｍｏｄｅｌ  ５３０  ＶＳ）を用いたＢｏｒｎの比濁法（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６２，６７、１９６２）によって、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）を用いて測定された。５μＭの薬剤の不在または存在下で５μＭのＡＤＰによって誘導された血小板の凝集を、試験した。以前に説明した方法（Ｐ．Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７２、１９９２）に従って、投与量依存阻害アッセイを行うことによって、それぞれの薬剤のＩＣ50値を概算することに、研究を広げた。結果を表１に示す。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ（対照薬剤）のＩＣ50の値は、以前に報告された値（Ｐ．Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３、１９９２）と一致した。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの値が、試験した薬剤の中では最も低く（０．８１μＭ）、最も高い阻害能力を示した。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａのアデノシン分子の両方をでオキシアデノシンで置換した（チオ−ＣＨＣｌ−ｄＡＰ4ｄＡ）場合、阻害能力が有意に減少した（９．２２μＭ）。同様に、デオキシアデノシンで非チオホスホネート化合物を置換する（ＣＨＣｌ−ｄＡＰ4ｄＡ）と、その結果、阻害効果が完全に失われた（＞１００μＭ）。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害速度論的研究は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａについて前記した方法（Ｐ．Ｚａｍｅｃｎｉｋら、ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３、１９９２）に従って、行われた。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害定数（Ｋｉ）の値は、０．３３μＭであり、対照薬剤であるＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害定数（１．１μＭ）より高い能力を持つが、同じ性質を持つ競合阻害を示した。
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II．凝集以外の血小板応答へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの影響：
アゴニストへの血小板応答とは、凝集に加え、ａ）遊離反応、ｂ）フィブリノーゲンレセプター部位（ＧＰIIｂ／IIIａ）および血小板因子３の活性化、を含む。これらの応答のそれぞれについて、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａおよび対照薬剤（ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ、Ｚａｍｅｃｎｉｋ’５５０の化合物Ｅ10）の効果を試験した。
ａ）血小板遊離反応：血小板凝集ならびに遊離反応を誘導するＡＤＰおよびコラーゲンの両方へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａおよび対照薬剤の効果を、光凝集計（lumiaggregometer）で試験した。正常なヒトＰＲＰを、クエン酸ナトリウム抗凝固化（０．３８％）血液から分離した。血小板凝集および遊離反応は、５μＭのＡＤＰまたは１μｇのコラーゲン／ｍｌで誘導された。ａ）薬剤不在下（対照）；および様々な濃度のチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡまたはＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ存在下で、血小板凝集およびＡＴＰのルシフェラーゼ反応の両方を、同時にアッセイするために、光凝集計を装備した。アゴニストによって活性化された血小板から遊離したＡＴＰ測定量は、遊離反応を表す。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって生成した発光は、遊離したＡＴＰ量に関して直線であった。
結果を表２に示す。遊離反応への阻害効果としてのＩＣ50値は、一般的に、凝集のそれより低く、このことは、遊離反応への薬剤（チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ）の阻害効果が、凝集反応へのこれら薬剤の阻害効果以上に有意であることを示している。コラーゲンの誘導する凝集は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａによって阻害されなかったが、遊離反応は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａによって阻害された。
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ｂ）血小板上のフィブリノーゲン結合部位（Fibrinogen Binding Sites）（ＧＰ−IIｂ／IIIａ）；フィブリノーゲンの血小板表面レセプターは、活性化によって増加することが知られている。活性化された血小板のフィブリノーゲン結合部位へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの影響を、蛍光イソチオシアネート複合抗フィブリノーゲン抗体（Fluorescein isothiocyanate conjugated antifibrinogen antibody）（ＦＩＴＣ−抗−ｆｇｎ）技術によって、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイした。ＰＲＰを１：２０に最終希釈して用いた。血小板を、薬剤存在下または非存在下、ＡＤＰによって２２℃で５分間活性化した。活性化された血小板をＦＩＴＣ−抗−Ｆｇｎと共に２２℃で１０分間インキュベーションの後、０．５ｍｌの０．２％ホルミル塩類溶液（０．２％ホルムアルデヒド／０．９％ＮａＣｌ）を加え、さらに活性化を阻害した。サンプルは、ａ）５μＭ  ＡＤＰで刺激していない；ｂ）刺激した；ｃ）ＡＤＰで刺激する前に、５分間、薬剤（ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたはチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ）に晒した：血小板を含む。ＡＤＰで活性化された血小板に結合したフィブリノーゲンは、対照試薬ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａでの阻害と比較して、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａによって優先に阻害された。
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ｃ）血小板因子３（Platelet Factor ３）（ＰＦ３）活性化；血小板のＰＦ３活性を、ＡＤＰ刺激によって強化し、Ｓｔｙｐｖｅｎ血餅化時間（clotting time）（Ｐ．Ｚａｍｅｃｎｉｋら、ＰＮＳＡ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３、１９９２）によって測定した。表４は、ＡＤＰ−刺激ＰＦ３活性への薬剤の影響の結果について要約した。データは、２回の実験の平均を示している。新しい正常なヒトの血小板を多く含む血漿（３ｘ１０8血小板／ｍｌ）を、薬剤（１０μＭ）存在下または非存在下、３７℃で５分間、プレインキュベートし、次いで１０μＭ  ＡＤＰによって刺激された血小板のＰＦ３活性について試験した。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害効果は、非チオの対照薬剤（ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ）のそれより有意に大きかった。
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III．ＡＤＰ−誘導血小板活性化の調節因子へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの影響；
血小板活性化のプロセスでの３つの調節因子；ａ）細胞質カルシウムイオン移動性；ｂ）細胞内ｃＡＭＰレベルの変化；およびｃ）アラキドン酸代謝活性：が知られている。これら因子の最初２つについて、薬剤（チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ）を試験した結果を以下に記載する。
ａ）細胞質カルシウムイオン（Ｃａ++）移動性：血小板内の細胞質Ｃａ++の増加は、活性化状態を示している。Ｉｎｄｏ−１アセトメチルエステル（Ｉｎｄｏ−１）は、細胞内の遊離Ｃａ++を検出するための試薬として一般に用いられている。Ｉｎｃｏ−１は、Ｃａ++と反応して、二波長（４０８／４８５）フローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でモニターすることのできる蛍光を生成する。血小板を、Ｉｎｄｏ−１と共に３７℃で４５分間、インキュベートした。培地中の過剰のＩｎｄｏ−１は、ゲルろ過法で除去された。次いで、Ｉｎｄｏ−１負荷血小板を、チオ−ＣＨＣｌ−Ａ4Ａ（３．３μＭ）、またはＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ（６．７μＭ）の非存在下あるいは存在下で、６．７μＭ  ＡＤＰによって活性化した。血小板の蛍光強度をモニターし、血小板数に対してプロットした。プロットから作成したヒストグラムを分析した。刺激しなかった血小板では、ピーク１３３で４２と２５０の間に蛍光強度（ＦＩ）を記録した（基準線対照）。２μＭのＡ２３１８７（カルシウムイオノホア）で処理された血小板は、正の制御を示す右への明らかなシフトを示した（ピーク５３０で１５０と１，０００の間にＦＩ）。ＡＤＰ−活性化血小板は、右への穏やかなシフトを示す（ピーク１５８で６７および３００の間にＦＩ）。Ｃａ++移動性へのＡＤＰ活性化の影響は、カルシウムイオノホアのそれと比較して比較的温和であるが、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡまたはＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａのいずれかの存在下では完全にブロックされる、例えば、阻害剤存在下でのＡＤＰ−活性化血小板は、刺激されなかった血小板で得られたそれと同じパターンを示した。
ｂ）細胞内ｃＡＭＰのレベル：血小板凝集へのｃＡＭＰの阻害効果は、カルシウムイオン移動性の反作用として知られている。従って、メカニズムを仲介するｃＡＭＰに関して試薬の阻害効果を試験した。ＰＲＰを、塩類溶液（対照）、薬剤（２０μＭおよび１００μＭ）またはホルスコリン（forskolin）（１０μＭ）と共に、３７℃で５分間、インキュベートした。インキュベーションの後、Ｂａ（ＯＨ）2およびＺｎＳＯ4を用いて抽出を行った。抽出物中のサイクリックＡＭＰをエテノ−ｃＡＭＰ誘導体に転化し、蛍光検出器を用いて、そのレベルをＨＰＬＣによって評価した（Ｗ．Ｗｏｊｃｉｋら、Ｊ．Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，７，２７−３５、１９８１）。未知の抽出物中のｃＡＭＰレベルを、標準グラフからの外挿によって定量した。抽出されたサンプル内のｃＡＭＰレベルと蛍光検出との間には直線関係が得られた。表５は、血小板ｃＡＭＰレベルへの薬剤の影響の結果について示している。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａは両方とも、２０μＭではｃＡＭＰレベルへの影響を示さなかったが、より高い濃度（１００μＭ）では血小板内のｃＡＭＰレベルの温和な増加を示した。しかしながら、この増加は特異的影響ではないらしい。試験したＡＰ4Ａ薬剤内にアデノシンの混入は検出されなかったが。細胞内アデノシンヌクレオチド代謝生成物または試験した薬剤内の混入アデノシンのいずれかがｃＡＭＰレベルの上昇の原因であるかも知れない。アデニレートシクラーゼの強力な刺激剤である１０μＭのホルスコリンによって血小板内ｃＡＭＰが明らかに増加することが、正の対照として示された。これらの結果から、ＡＤＰによる血小板活性化への薬剤の阻害効果はｃＡＭＰ仲介メカニズムによらないであろうと考えられる。
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IV．ＡＤＰ以外のアゴニストによって誘導される血小板凝集へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの影響：
遊離反応は、血小板活性化に伴うユニークな応答であると考えられる。様々な血小板構成成分の内、ＡＤＰは、活性化の強化に重要な役割を演じていると考えられる。われわれは、アラキドン酸、コラーゲン、エピネフリン、トロンビンおよびリストセチンを含むその他のアゴニストによって誘導される血小板凝集中に放出されるＡＤＰの役割について、試験した。与えられた濃度のアゴニストによって誘導される血小板凝集能は、薬剤不在下でおおよそ６０−８０％であった。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａおよびチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの濃度を変えて投与量依存性阻害研究を行うことによって、ＩＣ50値を評価した。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡもＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａも両方とも、トロンビンおよびリストセチン−誘導血小板凝集に影響しなかった。その他の３種類のアゴニストに対しての阻害能力の値（ＩＣ50）を表６に示している。コラーゲン誘導凝集は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａによっては影響を受けないと考えられるが、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａについては、検出可能な阻害効果が示された。これらの結果から、アラキドン酸、コラーゲン、エピネフリンによって誘導された血小板凝集能の少なくとも５０％は、最初の血小板活性化から放出されたＡＤＰに依存していると考えられる。この発見は、遊離反応への薬剤の阻害効果についての上記の知見を支持している。
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Ｖ．前もってチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａに晒した血小板の凝集能：
血小板は、血小板表面上にＡＤＰに特異的な結合部位、プリノセプター（Ｐ2T）を持つ。われわれは、ＡＰ4Ａ類似体の阻害メカニズムが血小板プリノセプターに結合するＡＤＰとの競合を含むと、考えている。結合剤の安定効果および阻害効果を試験するために、ＡＣＤ溶液で抗凝集化された血小板を多く含む血漿を、２５μＭのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたは５０μＭのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａと共に、２２℃で３０分間、プレインキュベートした。ゲル−カラムろ過（２ｘ１０8細胞／ｍｌ）または遠心分離（３ｘ１０8細胞／ｍｌ）によって単離された血小板を、阻害剤を含まない血漿内に再懸濁し、ＡＤＰ−誘導凝集能を測定した。値は、ゲルろ過分離のシリーズでは３回の実験の平均を、遠心分離による分離では２回の実験の平均を示している。表７に結果を示している。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａに晒した血小板は、ＡＤＰに晒したことに伴い、凝集能力の中程度の阻害を示す（２２−３３％）が、これに対して、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａに晒した血小板は、わずかな阻害効果を示す（８％）のみであった。結果から、血小板と結合するＡＰ4Ａ類似体の阻害活性は可逆である、と考えられる。
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VI．ＡＤＰ−誘導凝集へのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの時間依存性能力：
機能アッセイによって薬剤の安定性を観察するために、ＰＲＰを、２．５μＭのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたは５μＭのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａと共に、３７℃で３時間、インキュベートした。この実験に用いられた阻害剤の濃度は、比較的低く、特にチオ化合物については低かった。示した時間に採取したサンプルを、ＡＤＰ−誘導（１０μＭ）凝集について試験した。結果を表８に示す。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの阻害効果は、最大で３時間、良好に残存するが、これに対して、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの効果は、インキュベーション時間を延長すると徐々に減少した。結果から、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａは、３７℃Ｃでは６０分より多くＰＲＰ中に保つと不安定になるが、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａは、少なくとも３時間の期間、非常に安定であると考えられる。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの同様の安定性は、全血液のインキュベーションでも認められた。
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ＶII．チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの熱安定性：
両薬剤を沸騰温度に加熱した。サンプルを５、１５および３０分に採取した。血小板凝集能への阻害効果およびＨＰＬＣによってアッセイした薬剤の物理的保全は、変化を示さず、このことから、両薬剤は最大で３０分間の熱処理に耐性であると考えられる。
ＶIII．全血液中でのチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4ＡおよびＡＰ4Ａの安定性：
薬剤の分子安定性を試験するために、血液を、それぞれの薬剤と共に、３７℃で４時間、インキュベートした。指示されたインキュベーション時間でのサンプリングを抽出し、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたはチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａを、４級アミンアニオン交換カラム（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ  １０）のＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅポンプおよびコントローラー）でアッセイし、分析した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａおよびチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの保持時間は、それぞれ３．３９および５．９５であった。ピーク領域を積分し、これを用いて、以下の濃度範囲（１、２、４、６、８および１０μＭ）の標準曲線を構築した。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａおよびチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａは両方とも、ＨＰＬＣでの単一ピークによって、および薬剤濃度とＨＰＬＣピーク領域の間の直線関係によって示されるように、純粋であった。０．３８％のクエン酸ナトリウムで抗凝集化した正常なヒトの血液を、２５０μＭのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたはチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの存在下、３７℃で４時間、インキュベートした。血液サンプルを３％の過塩素酸で抽出し、Ｋ2ＣＯ3で中和した。抽出物は、ＨＰＬＣを用いてアッセイするまで、−８０℃に保持つ。血液抽出の結果を表９に示す。表９の値は、２回の実験の平均を示しており、ｎｍｏｌ／ｍｌ血液で表している。我々は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａまたはチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａについて、血液抽出物から２つのピーク（主要および第二）を同定した。全体の抽出効率は、ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ、６０分で１１０％を示し、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ、１２０分では８５％を示す。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの抽出効率での明らかに高い値は、血液生まれのアデノシン化合物（アデノシンおよびＡＭＰの可能がある）が主なピークを構築するであろうことを、示唆している。ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ主要ピークの概算量は、４時間インキュベーションの後、３０％の減少を示す緩やかな分解を示した。少なくとも８０％の分解生成物、多分クロロメチレンモノアデノシントリホスフェート（ＡｐｐＣｐ）は、第二のピーク（ＸＩ）と関連する。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの抽出効率は、時間０では比較的乏しかった（６９％）が、改善が示され（８１−８５％）、６０分後にはサンプル間で互いに接近してきた。データから、チオ誘導体は、一般的に、血液中、３７℃で少なくとも４時間は非常に安定であると、考えられる。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａと共に抽出した血液の第二のピークは、異性体（Ｘ２）、例えば、モノチオ化合物（ＡｐsｐＣｐｐＡまたはＡｐｐＣｐｐsＡ）である可能性がある。それは、純粋化合物のＨＰＬＣによっては検出されず、時間０では血液抽出物中の小部分（＜１０％）を示し、その後は主要ピークの約２０％を示した。
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ＩＸ．異なる血液細胞フラクション内の125Ｉ−標識ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの分布：
血小板は、ＡＤＰおよびＡＴＰの特異的部位であるＰ2Tプリノセプターを持つ（Ｒ．Ｇ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｊ．Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，７，２７−３５、１９８１）。しかしながら、その他の細胞型には、様々なプリノセプターがある全血液を薬剤で処理する場合、ＡＰ4Ａ類似体は、血小板にのみ結合するのではなく赤血球および白血球にも結合できる。我々は、３つの細胞画分のすべてがＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａと本当に結びつくことを確認した。我々の研究では、ヒト血液を、微量の125Ｉ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ（比活性〜３５μＣｉ／μＭｏｌ、Ｄａｖｉｄ  Ｅｌｍａｌｃｈ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｍａｓｓａｃｙｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡよりの贈り物）を含む２３μＭのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａと共に、２２℃で３０分間、インキュベートした。血小板を勾配遠心分離によって分離し、バフィーコート（白血球）でパックした赤血球を混合し、ヒストパック勾配分離の手段によって分画した（Ａ．Ｂｏｙｕｍ，Ｓｃ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２１、増補９７版、７７、１９６８）。細胞画分を二度洗浄し、最終懸濁液の細胞数および放射活性を計測した。％分布は、全血液のＣＢＣデータを基にして、計算された。結果（２回の定量の平均）を表１０に示す。結合部位を細胞当たりの値で表す。
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３つの細胞画分のすべてが放射能活性と関連し、このことはＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａが複数の血液細胞型と結合することを示している。細胞型と分布データの間の比較から、細胞当たりの結合部位の全体評価を計算することができる。血小板は、赤血球と比較して細胞当たりより高い（一桁）結合部位を持つと考えられるが、血小板の大きさは、赤血球のそれの１／１０より小さい。他方、細胞当たりの結合部位は、血小板で認められるそれと比較して白血球では２桁高かった。結果から、細胞の表面領域当たりのＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの結合部位は、白血球、血小板および赤血球上、それぞれ１０3、１０2および１の相対値で表されると、考えられる。
実施例３：チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａのさらなる特徴
１．薬物動態学および薬力学
一般的プロトコール
前に報告されたウサギ（Ｓ．Ｌｏｕｉｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，４９，５５７−５６５、１９８８；Ｂ．Ｋ．Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１０５６−１１０５８、１９９２）と同一のウサギモデルを、この実施例に用いた。当業者らは、このウサギモデルがヒト内での試験薬剤の影響を予想し、ヒトへの投与薬剤の投与量の範囲を選択するのに有用であると考える。外科技術の些細な違いによる癖の可能性を避けるために、同一の技術者が全ての動物実験を行い、ウサギはランダムに実験グループまたは対照グループに割り当てた。
雄のニュージーランド白色ウサギ（体重２−２．５ｋｇ）に、耳周辺静脈を通して、ボーラスまたは２時間連続的に、指示された投与量のチオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａを注入する。血液を、薬剤注入後の指示された時間に、１／１０容量の３．８％クエン酸ナトリウム内に、耳の動脈からサンプリングする。血液サンプリング後すぐ、微小血管出血時間を測定する（Ｍｉｅｌｋｅ，Ｃ．Ｈ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５２，２１０−２１１、１９８４）。薬剤をＨＰＬＣでアッセイするために、血液のアリコートを過塩素酸で抽出する。ＡＤＰによる全血液血小板凝集を、全ての血液サンプルについてアッセイする。結果から、有効投与量ならびに有効時間の予備情報が提供される。
連続注入またはボーラス注入での予備試験の後、標準的チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａ注入プロトコールを以下のように確定する。３種類の異なる投与量、０．５ｘ、１ｘおよび２ｘの投与量で、具体的プロトコールで指示された時間に、ウサギの頸動脈内カニューレ血栓症モデルでのそれらの抗血栓効果を試験する（Ｓ．Ｌｏｕｉｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，４９，５５７−５６５、１９８８；Ｂ．Ｋ．Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１０５６−１１０５８、１９９２）。チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの投与量を、１０ｍｌの正常な塩類溶液内に再形成し、一定速度のポンプによって、またはボーラス注入によって、注入する。対照のウサギには、１０ｍｌの塩類溶液のみを注入する。麻酔をかけたウサギに、血管鉗子を用いることによって、頸動脈セグメントを分離する。カニューレを挿入し、血流を１５分間再確立する。注入完了時、またはボーラス注入の１時間後に、頸動脈内の挿入チューブを取り除き、その内容物をペトリ皿内に追い出した。血餅または液体の血液内容物の存在が認められる。異なるグループの頸動脈内カニューレ内の血餅形成の発生を、Ｃｈｉ−Ｓｑｕａｒｅ試験によって比較する。
血液チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａのアッセイ
血液サンプルを、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの注入前および後（０、１０、２０、４０、６０および１２０分）に、反対側の頸動脈または耳の動脈から収集する。血液を、１／１０容量の酸−クエン酸−デキストロース溶液と共に混合することによって、抗凝集化する。血液サンプルを過塩素酸で抽出し、遠心分離し、そして酸可溶性画分を５ＭのＫ2ＣＯ3で中和する（Ｓ．Ｌｏｕｉｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ、，４９，５５７−５６５、１９８８）。ＨＰＬＣによるヌクレオチドのアッセイを行うまで、サンプルを−８０℃に保つ。
血小板凝集の研究
実施例１記載の方法に従って、血小板凝集を測定するために、記録計を装備した時間対数（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）全血液血小板凝集計（Ｍｏｄｅｌ５３０ＶＳ）を用いる。
微小血管出血時間の研究
Ｓｉｍｐｌａｔｅの出血時間装置を用いる（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）。耳背面表面をそった後、大脈管構造を避けるために、照明器下で部位を注意深く選択する。出血時間を、自由な流れのもと、無圧下で、測定する。非対合ｔ−テストを用いて、異なるグループ内の出血時間の延長について比較した。
頸動脈カニューレ血栓症モデル
ウサギを、塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ筋肉内）で麻酔する。左頸動脈のセグメントを血管鉗子によって分離する。１ｃｍ長のポリエチレンチューブ（１ｍｍ内径、医療用ポリエチレンチューブＰＥ−９０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＹ）を挿入し、縫い合わせ用絹糸で縛り、鉗子を取り除くことによって血流を再確立した。
具体的プロトコール
ａ）投与量および時間に依存する血小板凝集への影響
一連の４種類の投与量および時間間隔について、ＡＤＰ−誘導血小板凝集への阻害効果を、研究する。おおよそ２．５ｋｇのウサギに、５、１０、２０、４０および１００ｍｇ／ｋｇの薬剤を、単一のボーラス投与量で静脈内注入する。血液サンプルを、注入前、ならびに注入後３０分、２時間、６時間、２４時間および（必要であれば）４８時間に集める。血液サンプリング後すぐに、微小血管出血時間を測定する。ＡＤＰによる全血液血小板凝集を、全血液サンプルについてアッセイする（Ｂ．Ｋ．Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１０５６−１１０５８、１９９２）。
結果から、有効投与量ならびに有効な時間間隔が示される。好ましくは、６匹のウサギを個々の投与量の研究に用い、必要なウサギ数は全体で２４匹である。
ｂ）抗血栓効果
前述の研究を基にして、３種類の異なる投与量、０．５Ｘ、１ｘおよび２ｘの有効投与量（ＥＤ）（effective dose）について、ウサギの頸動脈内カニューレ血栓症モデル（Ｓ．Ｌｏｕｉｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，４９，５５７−５６５、１９８８；Ｂ．Ｋ．Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１０５６−１１０５８、１９９２）で、薬剤注入後の有効時間（ＥＴ）（effective time）ｘ１、ｘ２、ｘ４に、それらの抗血栓効果を試験する。好ましくは、１５匹のウサギを個々の投与量の研究に用い、必要なウサギ数は全体で１５０匹である。
ｃ）二重盲検効果研究
有効投与量を前述の研究をもとに選択し、上節に記載したプロトコールと同一のプロトコールを用いて二重盲検研究行った。ランダムにＩＤ＃を付けたウサギに、薬剤を含まないかまたは有効な投与量の薬剤を含む塩類溶液を、研究が完了するまで研究者に開示しないで、注入する。
好ましくは、（薬剤を含むまたは含まない）それぞれのグループ当たり１５匹のウサギを用い、必要なウサギ数は全体で３０匹である。２つのグループの頸動脈内カニューレ内の血餅形成をＣｈｉ−Ｓｑｕａｒｅ試験によって比較する。
ｄ）薬剤の生分解およびクリアランス時間の研究
チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａを、Ｄａｖｉｃ  Ｅｌｍａｌｃｈ博士（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって、またはコマーシャルラベリングサービスによって、125Ｉで標識した。［125Ｉ］−チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａの生分解を、２グループのウサギ（１グループ当たり３匹）で研究する。０．２ｍｌ塩類溶液中の２−５μＣｉの薬剤をウサギの片方の耳の静脈に静脈内注射する。血液サンプルを、注入後５、１０、２０、４０および９０分にもう一方の耳の動脈から採取し、次いで、ペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ）で動物を屠殺する。主要器官、例えば、血液、腎臓、肝臓、肺、脾臓、脳、甲状腺、筋肉および骨、ならびに膀胱から吸引した尿、を集め、重量を測定する。組織または器官をより小さい片に切断し、重量を測定し、シンチレーションバイアルに入れ、125Ｉについてアッセイする。器官当たりの注入された投与量（％）を計算する。
ｅ）投与方法、経路および頻度
ホスホジエステル型のＡＰ4Ａ類似体は、外側の細胞膜を通過しない（ＺａｍｅｃｎｉｋおよびＭ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ、Ｈ．Ｍ．Ｋａｌｃｋａｒら編、Ａｌｆｒｅｄ  Ｂｅｎｚｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｉ，２７６−２９１，Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、１９６８）。しかしながら、最近の研究では、オリゴデオキシヌクレオチドのチオ化は、一般的にそれらの抗ウイルス効果を強める（Ｌｅｉｔｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４３０−３４３４、１９９０；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７０７９−７０８３，１９８８；Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、第１巻、Ｋｏｆｆ，Ｗ．Ｃ．ら編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３０１−３１３、１９９１；Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ５０５−５２０、１９９３）。このことから、チオ−ＣＨＣｌ−ＡＰ4Ａは摂取による投与が適当である可能性を我々に示唆した。
麻酔したウサギで胃カテーテルを通して投与した後の薬剤の血液レベルを測定する。麻酔後、胃カテーテルを口から挿入し、所望の薬剤投与量を投与する。薬剤投与後、血液サンプルを１０、３０、６０、１２０、２４０および３６０分に採取する。全血液の血小板凝集について、血液サンプルをモニターする（Ｃａｒｄｉｎａｌ．Ｄ．Ｃ．およびＦｌｏｗｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３，１３５−１５８、１９８０）。薬剤を抽出し、血液内でのそのレベルをＨＰＬＣによって測定する。望ましい頻度で服用を繰り返して、哺乳動物に投与して、抗血小板活性に有効な薬剤の血液レベルを維持する。
好ましくは、６匹のウサギをこの研究に用いる。この実験から得られた結果を用いて、経口経路での投与に関するパラメーターをより明らかにする。
２．薬剤の毒性および安全性
標準的方法による上記の薬理研究を成功裡に完了した後、動物毒性研究を行った。好ましくは、毒性研究のために、２種類の動物種、ウサギおよびブタ、を選択した。これらから、毒物学研究のための動物の種を確定し、適当な法定代理機関（regulatory agency）にそのような研究を行って頂いた。動物毒物学研究は、標準的方法に従って、ＧＬＰ施設（ＴＳＩ  Ｍａｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）で行った。典型的には、急性毒性の研究には、２つの部分：（１）許容投与量の範囲を確定するための範囲決定の研究、および（２）最大許容投与量を確定するための急性毒性の研究：が含まれる。急性毒性の研究に次いで、（期待された毒性レベルを含む）何種類かの投与量レベルを動物に繰り返し投与することによって、動物の機能的および／または形態学的変化を誘導する慢性毒性研究を行う。慢性毒性試験を行い、不利な副作用が起こることを期待できる、標的器官を同定する。研究の期間中、動物には、身体的外観および臨床行為、体重増加ならびに食物および水分消費量に変化が認められる。実行可能な、眼科試験、心臓血管およびその他の物理的パラメーターを測定またはモニターする；すべての主要な器官および組織を組織病理学的に試験する。
薬剤の急性毒性試験は、一般的に、その毒性能力を評価する第１段階を構成する。急性毒性試験の目的は、逆作用、可能であれば、比較的高い投与量で一回のみ投与した場合の薬剤による死亡率を明らかにすることである。存在するならば、一回またはそれより多い投与量のレベルで生まれる毒性の明白なサインに注目し、一度より多くの投与量レベルで死に至るならば、半致死量を概算する。
本明細書中で確認される特許、特許公報、参考文献およびその他の書類のそれぞれは、その全体をここに参照として採用する。
前記の記述およびそれに続く実施例は、単にある好ましい実施態様の詳細な記載であることを理解されたい。それ故、当業者らには、様々な修飾および対応物もまた、本発明の精神または範囲から離れることなく行うことができることは明らかである。