(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図４に記載の配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、かつアネロセルム・サーモフィルムから得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、または図４に記載の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された組換え大腸菌株から得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型に加えて、２つの配列特異的なオリゴヌクレオチドの存在下で増幅することを特徴とするＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型からＤＮＡセグメントを増幅する方法であって、前記ポリメラーゼは、鋳型からのＤＮＡの重合を触媒し、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンが存在しない状態において５’−３’ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たない、上記方法。
【請求項２】
図４に記載の配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、かつアネロセルム・サーモフィルムから得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、または図４に記載の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された組換え大腸菌株から得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鋳型に加えて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドならびに標識されたデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドの存在下で標識することを特徴とするＤＮＡ標識方法であって、鋳型からのＤＮＡの重合を触媒し、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンが存在しない状態において５’−３’ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たない、上記方法。
【請求項３】
図４に記載の配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、かつアネロセルム・サーモフィルムから得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、または図４に記載の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された組換え大腸菌株から得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをｍＲＮＡ鋳型に加えて、１つのプライマーの存在下でＤＮＡに転写することを特徴とする逆転写方法であって、前記ポリメラーゼは、鋳型からのＤＮＡの重合を触媒し、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンが存在しない状態において５’−３’ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たない、上記方法。
【請求項４】
図４に記載の配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、かつアネロセルム・サーモフィルムから得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、または図４に記載の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された組換え大腸菌株から得ることができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鋳型に加えて、標識されたデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドならびに少なくとも１つの配列特異的なオリゴヌクレオチドの存在下で配列決定することを特徴とする、ＤＮＡ配列決定方法であって、前記ポリメラーゼは、鋳型からのＤＮＡの重合を触媒し、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンが存在しない状態において５’−３’ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たない、上記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アネロセルム・サーモフィルム（Anaerocellum thermophilum）から得ることができるＤＮＡポリメラーゼである耐熱性酵素に関する。
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（EC 2.7.7.7.ＤＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ特異的）が多くの好熱性微生物から単離されている（例えば、Kaledinら,1980,Biokimiya Vol.45,p.644-651;Kaledinら,1981,Biokimiya Vol.46,p.1247-1254;Kaledinら,1982,Biokimiya Vol.47,p.1515-1521;Ruttimannら,1985,Eur.J Biochem.Vol.149,p.41-46;Neunerら,1990,Arch.Microbiol.Vol.153,p.205-207）。
幾つかの微生物については、そのポリメラーゼ遺伝子がクローン化され、発現されている（Lawyerら,1989,J.Biol Chem.Vol.264,p.6427-6437;Engelkeら,1990,Anal Biochem.Vol.191,p.396-400;Lundbergら,1991,Gene,Vol.108,p.1-6;Kaledinら,1980 Biokimiya Vol.44,p.644-651;Kaledinら,1981,Biokimiya Vol.46,p.1247-1254;Kaledinら,1982,Biokimiya Vol.47,p.1515-1521;Ruttimannら,1985,Eur.J.Biochem.Vol.149,p.41-46;Neunerら,1990,Arch.Microbiol.Vol.153,p.205-207;Perlerら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.89,p.5577）。
好熱性ＤＮＡポリメラーゼはますます分子生物学において用いるための重要なツールとなってきており、ＲＮＡ及びＤＮＡの診断上の検出、遺伝子クローニング並びにＤＮＡの配列決定において用いるための、より適切な特性及び活性を有する新規ポリメラーゼの発見について関心が高まっている。現在、これらの目的で主として用いられる好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、T.アクアティクス（T.aquaticus）に由来するTaqポリメラーゼのようなサーマス（Thermus）種に由来するものである（Brockら1969,J.Bacteriol.Vol.98,p.289-297）。
逆転写は、通常、トリ骨髄芽球症ウイルス又はモロニー（Moloney）マウス白血病ウイルスから単離される酵素のようなウイルス性逆転写酵素を用いて行われ、これらはマグネシウムイオンの存在下において活性であるが、逆転写反応の間に鋳型ＲＮＡを破壊するＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有するという不利な点があり、かつ、それぞれ、42℃又は37℃の温度最適を有する。
高温で活性である好熱性微生物のＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を用いる代替法が記載されている。高温での逆転写には、産生物の早すぎる終結を生じ得るＲＮＡ鋳型の二次構造を克服するという利点がある。逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、通常、サーマス種から単離される。しかしながら、これらのＤＮＡポリメラーゼはマンガンイオンの存在下においてのみ逆転写活性を示す。これらの反応条件は、マンガンイオンの存在が鋳型ＲＮＡを転写するＤＮＡポリメラーゼの忠実度を低下させるため、最適を下回るものである。
したがって、ＲＮＡ鋳型から高い忠実度でｃＤＮＡを調製するため、高温で鋳型の二次構造を克服するように作用し、かつマグネシウムイオンの存在下において活性である逆転写酵素を開発することが望ましい。
本発明はこれらの要求に取り組み、マグネシウムイオンの存在下において逆転写酵素活性を有する、高温で活性の精製ＤＮＡポリメラーゼ酵素（EC 2.7.7.7.）を提供する。本発明はアネロセルム・サーモフィルムDSM 8995から単離されたＤＮＡポリメラーゼを包含し、これはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweigに寄託されている。さらなる局面において、本発明は、ＤＮＡの鋳型指令重合を触媒し、及び5’−3’ポリメラーゼ活性及び5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ実質的に3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを包含する。
本発明によるポリメラーゼは、安定化界面活性剤が存在しない状態において80℃で30分間インキュベートした後にその活性の少なくとも90％を保持する。
さらなる局面において、本発明は、in situ活性ＰＡＧＥ分析による測定で約96〜100kDaの分子量を有するＤＮＡポリメラーゼを包含する。
さらなる局面において、本発明は、マグネシウムイオンの存在下において、及び実質的にマンガンイオンが存在しない状態において逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを包含する。本発明によるこのポリメラーゼは、そのＤＮＡポリメラーゼ活性を100％に設定して30％を上回るＭｇ2+依存性逆転写酵素活性を示す。さらなる局面において、本発明は、Ｍｎ2+依存性である逆転写酵素活性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包含する。このＭｎ2+依存性逆転写酵素活性はそのＤＮＡポリメラーゼ活性に対して60％を上回る。
さらなる局面において、本発明は耐熱性逆転写酵素を包含する。この耐熱性逆転写酵素は80℃で60分間インキュベートした後に80％超を保持する。
さらに、アネロセルム・サーモフィルムから得ることができる96,000−100,000ダルトンの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡが単離されており、これは大腸菌において発現させることにより本発明の耐熱性酵素を得ることを可能にする。このアネロセルム・サーモフィルムＤＮＡポリメラーゼコーディング配列全体が以下に配列番号7として示されている。この組換えアネロセルム・サーモフィルムＤＮＡポリメラーゼも5’−3’ポリメラーゼ活性を有し、実質的に3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつＭｇ2+依存性の逆転写酵素活性を有する。
アネロセルム・サーモフィルムはカムチャッカのガイサース谷（Valley of Geysers）の温泉から単離された（V.SvetlichnyらMikrobilogiya,Vol.59,No.5 p.871-879,1990）。アネロセルム・サーモフィルムはブダペスト条約に従ってDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweigに寄託され、DSM受託番号8995を受けた。アネロセルム・サーモフィルムから単離された耐熱性ポリメラーゼは96〜100kDaの分子量を有し、安定化界面活性剤が存在しない状態において80℃で30分間加熱した後に90％を超える活性を保持する。この耐熱性酵素は5’−3’ポリメラーゼ活性を有し、かつＭｇ++依存性であることに加えてＭｎ++依存性である逆転写酵素活性を有する。この耐熱性酵素は天然型であっても組換え型であってもよく、ｃＤＮＡクローニング、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識及びＤＮＡ増幅において第1及び第2鎖ｃＤＮＡの合成に用いることができる。
本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）配列を複製及び増幅するための方法を提供する。これらの改良は熱活性ＤＮＡポリメラーゼの従来知られていない特性の発見及び適用により達成される。好ましい態様において、本発明は、熱反応性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型からＤＮＡセグメントを増幅するための方法（ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲ）を提供する。
「逆転写酵素」という用語はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼのクラスを表す。全ての既知逆転写酵素はＲＮＡ鋳型からＤＮＡ転写体を合成するのにプライマーを必要とする。歴史的には、逆転写酵素は主としてｍＲＮＡからｃＤＮＡへの転写に用いられており、このｃＤＮＡはさらに操作するために次にベクターにクローン化され得る。
天然型のタンパク質を回収するため、Svetlichnyら,1991,System.Appl.Microbiol.Vol.14,p.205-208に記載される技術のような適切な技術を用いてアネロセルム・サーモフィルムを成長させることができる。細胞が成長した後、酵素の単離及び精製に好ましい1つの方法を多工程プロセスを用いて以下のように行う。
これらの細胞を解凍し、バッファーＡ（40mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7mM 2−メルカプトエタノール、0.4M ＮａＣｌ、10mM ペファブロック（Pefabloc）TMＳＣ（4−（2−アミノエチル）ベンゾールスルホニルフルオリド、塩酸塩）に懸濁し、ガウリン（Gaulin）ホモジナイザに2回通すことにより溶解する。この生抽出物を遠心により清澄化し、その上清をバッファーＢ（40mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7mM 2−メルカプトエタノール、10％グリセロール）に対して透析して、ヘパリン−セファロース（Pharmacia）を充填したカラムにかける。各々の場合において、これらのカラムは出発溶媒で平衡化し、サンプルを適用した後にはこの溶媒をそれらの体積の3倍用いて洗浄する。第1カラムの溶出はバッファーＢ中の0〜0.5M ＮａＣｌの直線勾配を用いて行う。ポリメラーゼ活性を示す画分をプールし、硫酸アンモニウムを20％の最終濃度まで添加する。この溶液を、ブチル−ＴＳＫ−トヨパール（Toyopearl）（TosoHaas）を収容する疎水性カラムにかける。このカラムを硫酸アンモニウムの20％〜0％の下降勾配で溶出する。活性を含むプールを透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（Pharmacia）のカラムに再度移して、バッファーＢ中の0−0.5M ＮａＣｌの直線勾配で溶出する。第4カラムはトリス−アクリル−ブルー（Biosepra）を収容するもので、これを前述の場合と同様に溶出する。最後に、活性画分をバッファーＣ（20mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7.0mM 2−メルカプトエタノール、100mM ＮａＣｌ、50％グリセロール）に対して透析する。
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、合成されたＤＮＡへの32Ｐ−ｄＣＴＰの取込み、又はジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取込みのいずれかにより測定した。取込まれたジゴキシゲニンの検出及び定量は、本質的に、
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及びSchmitz,G.,1992,Biotechniques Vol.12,p.104-113に記載される通りに行った。
逆転写酵素活性は、オリゴｄＴでプライムした（primed）ポリＡ鋳型を用いて、相補鎖に32Ｐ−ｄＴＴＰ又はジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰのいずれかの取込みにより測定した。取込まれたジゴキシゲニンの検出は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に用いた手順と同様に行った。
ポリメラーゼ活性及び逆転写酵素活性のin situ ＰＡＧＥの分析は、本質的に、Spanos A.及び
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に記載される方法に従って行った。元の方法に対する些少ではあるが必須の改変は、再折り畳みを補助するためにマグネシウムイオン（3mM）及びｄＡＴＰ（0.5−１μM）の存在下においてＳＤＳ変性ポリペプチドの再生を行うことである。
本発明の耐熱性酵素は、この酵素をコードする遺伝子がアネロセルム・サーモフィルムゲノムＤＮＡからクローン化されているため、組換えＤＮＡ技術により産生させることもできる。さらなる局面において、本発明は、アネロセルム・サーモフィルムＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するベクターpASK75及びpAR10と命名されたベクターを含む組換えプラスミドを包含する。
アネロセルム・サーモフィルム由来ＤＮＡポリメラーゼを発現する組換えクローンの単離は以下の工程を包含する：細胞を界面活性剤、例えばＳＤＳ、及びプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫ、で処理することによりアネロセルム・サーモフィルムに由来する染色体ＤＮＡを単離する。その溶液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させることによりＤＮＡを精製する。このＤＮＡをトリス／ＥＤＴＡバッファーに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を2種混合オリゴヌクレオチド（プライマー1及び2）を用いてＰＣＲ技術により特異的に増幅する。配列番号1及び配列番号2に記載されるこれらのオリゴヌクレオチドは、Braithwaite D.K.及びIto J.,1993,Nucl.Acids Res.Vol.21,p.787-802によって公開されたＡ族ＤＮＡポリメラーゼの保存領域に基づいて設計した。特異的に増幅した断片をベクター、好ましくはpCRTMIIベクター（Invitrogen）にライゲートし、その配列をサイクルシークエンシングにより決定する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコーディング領域及び隣接配列の完全な単離は、スクリーニングの第1回目においては別の制限酵素でアネロセルム・サーモフィルムＤＮＡを制限断片化することにより、及び逆ＰＣＲ（Innisら,（1990）PCR Protocols;Academic Press,Inc.,p.219-227）により行うことができる。これは、この遺伝子部分の外側ＤＮＡ配列に結合するがその方向が反対である合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行うことができる。配列番号3及び4によって記述されるこれらのオリゴヌクレオチドは、最初の上記ＰＣＲによって決定された配列に基づいて設計した。鋳型しては、制限消化により開裂し、かつＴ4 ＤＮＡリガーゼに接触させることにより環化されるアネロセルム・サーモフィルムＤＮＡを用いる。全ポリメラーゼ遺伝子のコーディング領域を単離するため、配列番号5及び6に示されるプライマーを用いて別のＰＣＲを行い、完全なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡから直接増幅し、かつ直線化発現ベクターに適合する末端を導入する。
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遺伝子を、原核又は真核宿主／ベクター系のいずれかにおいて、発現に適する調節配列に作動可能に連結させる。このベクターは適切な宿主における形質転換及び維持に必要とされる全ての機能を好ましくはコードし、且つ選択可能なマーカー及び／又はポリメラーゼを発現させるための調節配列をコードし得る。形質転換された宿主の培養物により、連続的に、又は発現を誘導した後に、活性のある組換え耐熱性ポリメラーゼを産生させることができる。活性のある耐熱性ポリメラーゼは、宿主細胞から、又は、このタンパク質が細胞膜を通して分泌される場合には培養培地から、回収することができる。
アネロセルム・サーモフィルム耐熱性ポリメラーゼの発現を、クローニング及び発現の間、大腸菌において厳密に調節することも好ましい。本発明の実施において有用なベクターは、以下の調節の特徴の幾つか又は全てを提供することによりアネロセルム・サーモフィルムポリメラーゼの様々な程度に調節された発現をもたらす：（1）ポリメラーゼ遺伝子の開始位置に直接隣接するか、又は融合タンパク質としてのプロモーター又は転写開始部位、（2）遺伝子の発現の開始又は停止に用いることができるオペレーター、（3）翻訳を改善するためのリボソーム結合部位、及び（4）安定性を改善するための転写又は翻訳終結部位。アネロセルム・サーモフィルムポリメラーゼのクローニング及び発現に用いられる適切なベクターには、例えば、ファージ及びプラスミドが含まれる。ファージの例としてラムダgtl1（Promega）、ラムダ・ダッシュ（Dash）（Stratagene）、ラムダZapII（Stratagene）が挙げられる。プラスミドの例としてpBR322、pBTac2（Boehringer Mannheim）、pBluescript（Stratagene）、pET3A（Rosenberg,A.H.ら,（1987）Gene 56:125-135）、pASK75（Biometra）及びpET11C（Studier,F.W.ら（1990）Methods in Enzymology,185:60-89）が含まれる。本発明によると、プラスミド、特にはpASK75（Biometra）の使用が有利であることが示されている。このアネロセルム・サーモフィルムＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するプラスミドpASK75を、以下pAR10と呼ぶ。
形質転換、ファージ感染及び細胞培養の標準プロトコルが存在する（Maniatisら（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press）。プラスミド形質転換に用いることができる多くの大腸菌のうち、好ましい株としてはJM110（ATCC 47013）、LE392pUBS520（Maniatisら、前出；Brinkmannら,（1989）Gene 85:109-114;）、JM101（ATCC番号33876）、XL1（Stratagene）、及びRR1（ATCC番号31343）、及びBL21（DE3）plysS（Studier,F.W.ら,（1990）Methods in Enzymology,前出）が挙げられる。本発明によると、大腸菌LE392pUBS520株の使用が有利であることが示されている。アネロセルム・サーモフィルムＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するプラスミドpASK75（pAR10と呼ぶ）で形質転換したこの大腸菌LE392pUBS520株を、以下大腸菌AR220（DSM番号11177）と呼ぶ。ラムダファージに用いることができる株の中には大腸菌XL1.Blue株（Stratagene）があり、Y1089はラムダgt11の溶原性に用いることができる。形質転換した細胞を好ましくは37℃で成長させ、アンヒドロテトラサイクリンでクローン化遺伝子の発現を誘導する。
組換え型ＤＮＡポリメラーゼの単離は標準技術により行うことができる。大腸菌抽出物からのＤＮＡポリメラーゼの分離及び精製は標準法により行うことができる。これらの方法としては、例えば、塩析及び溶媒沈殿のような溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の違いを利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特異的な相互作用を用いる方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の違いを利用する方法及び等電点電気泳動のような等電点の違いを利用する方法が含まれる。
本発明の耐熱性酵素は、そのような酵素活性が必要とされ、又はそれが望まれるあらゆる目的に用いることができる。特に好ましい態様において、この酵素はＰＣＲとして知られる核酸増幅反応を触媒する。この核酸配列を増幅するための方法はEP 0 201 189号に開示され、特許請求されている。このＰＣＲ核酸増幅法は核酸又は核酸の混合物に含まれる少なくとも1つの特定の核酸配列を増幅することを含み、二本鎖ＤＮＡを生成する。精製もしくは非精製形態のあらゆる核酸配列が、所望の特定核酸配列を含み、又はそれを含むものと疑われるのであれば、出発核酸（1つもしくは複数）として用いることができる。増幅しようとする核酸はあらゆる供給源から、例えば、pBR322のようなプラスミドから、クローン化ＤＮＡもしくはＲＮＡから、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、及び高等生物、例えば植物及び動物を含むあらゆる供給源に由来する天然のＤＮＡもしくはＲＮＡから、又はin vitroで作製した核酸調製品から得ることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは血液、絨毛膜絨毛のような組織材料、又は羊膜細胞から様々な技術により抽出することができる。例えば、Maniatis T.ら,1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York）pp.280-281を参照のこと。したがって、このプロセスは、例えば、伝令ＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いることができ、このＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。加えて、各々の一方の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いることができる。
ＤＮＡ中の、又はＲＮＡに由来する標的配列の増幅を行い、分析しようとする核酸サンプルにおける特定の配列の存在を立証し、又は特定の遺伝子をクローン化することができる。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼはこれらのプロセスに非常に有用である。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼが、当該技術分野における現状をなす、逆転写酵素活性を有する好熱性微生物に由来する他のＤＮＡポリメラーゼのようにＭｎ++を必要とする代わりにＭｇ++イオンを補因子として必要とするという事実のため、ＲＮＡ鋳型をより高い忠実度でコピーすることができる。これらの特性はアネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼを分子生物学者にとって非常に有用なツールとする。
また、アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼはサンプル中のＲＮＡ標的分子を検出するための方法を簡潔にし、かつ改善するのに用いることもできる。これらの方法において、アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼは（a）逆転写、（b）第2鎖ｃＤＮＡの合成、及び、所望であれば、（c）ＰＣＲによる増幅を触媒する。記載される方法においてアネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼを用いることで、各工程で異なる酵素を用いるために必要であった従来の2組のインキュベーション条件の必要性が排除される。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼを用いることで、ＲＮＡの逆転写及び生じる相補的ＤＮＡの増幅が特異性を高めて、並びに従来のＲＮＡクローニング及び診断方法よりも少ない工程でもたらされる。
【図面の簡単な説明】
図1はin situで行ったＤＮＡポリメラーゼ検定の写真を示す。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼI及びクレノウ断片並びにサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来するＤＮＡポリメラーゼとの比較で分析する。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼの画分を、活性化（DNAseI処理）ＤＮＡを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかける。電気泳動の後、ＳＤＳを除去してタンパク質を一晩再生し、マグネシウム塩、ｄＮＴＰ類及びジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ類の存在下において72℃でインキュベートして相補鎖を合成させた。その核酸をナイロンメンブランにブロットし、新たに合成されたＤＮＡを化学発光反応により検出した。
対照タンパク質として、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼI及びクレノウ断片並びにサーマス・サーモフィルスに由来するＤＮＡポリメラーゼを同じゲルで分析した。これらのタンパク質を標準として用いて、アネロセルム・サーモフィルム由来のDNAポリメラーゼの96,000〜100,000ダルトンの見かけの分子量を推定することができる。
図2は、様々な濃度のマグネシウム及びマンガンイオンに基づく逆転写酵素の相対活性を決定する検定から得られる結果を示す。
図3はアネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示す。ＤＮＡポリメラーゼのアリコートを80℃でインキュベートし、図において指示される時間でその活性を測定した。
図4は、アネロセルム・サーモフィルムのポリメラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号7）及びアネロセルム・サーモフィルムポリメラーゼの誘導されるペプチド配列（配列番号8）を示す。
図5は、アネロセルム・サーモフィルムポリメラーゼの逆転写活性とサーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）及びサーマス・サーモフィルスとの比較を示す。
実施例1
ＤＮＡポリメラーゼの単離
天然型のタンパク質を回収するため、Svetlichnyら,1991,System.Appl.Microbiol.Vol.14,p.205-208に記載される技術のような適切な技術を用いてアネロセルム・サーモフィルムを増殖させることができる。細胞が増殖した後、酵素の単離及び精製に好ましい1つの方法を多工程プロセスを用いて以下のように行う。
これらの細胞を解凍し、バッファーＡ（40mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7mM 2−メルカプトエタノール、0.4M ＮａＣｌ、10mM ペファブロックTMＳＣ（4−（2−アミノエチル）ベンゾールスルホニルフルオリド、塩酸塩）に懸濁し、ガウリン・ホモジナイザに2回通すことにより溶解する。この生抽出物を遠心により清澄化し、その上清をバッファーＢ（40mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7mM 2−メルカプトエタノール、10％グリセロール）に対して透析して、ヘパリン−セファロース（Pharmacia）を充填したカラムにかける。各々の場合において、これらのカラムは出発溶媒で平衡化し、サンプルを適用した後にはこの溶媒をそれらの体積の3倍用いて洗浄する。第1カラムの溶出はバッファーＢ中の0〜0.5M ＮａＣｌの直線勾配を用いて行う。ポリメラーゼ活性を示す画分をプールし、硫酸アンモニウムを20％の最終濃度まで添加する。この溶液を、ブチル−ＴＳＫ−トヨパール（TosoHaas）を収容する疎水性カラムにかける。このカラムを硫酸アンモニウムの20％から0％の下降勾配で溶出する。活性を含むプールを透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（Pharmacia）のカラムに再度移して、バッファーＢ中の0−0.5M ＮａＣｌの直線勾配で溶出する。第4カラムはトリス−アクリル−ブルー（Biosepra）を収容するもので、これを前述の場合と同様に溶出する。最後に、活性画分をバッファーＣ（20mM トリス−ＨＣｌ、pH7.5、0.1mM ＥＤＴＡ、7.0mM 2−メルカプトエタノール、100mM ＮａＣｌ、50％グリセロール）に対して透析する。
実施例2
エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼ活性の検出：
エンドヌクレアーゼ活性の不在：1μgのプラスミドＤＮＡを過剰の精製ＤＮＡポリメラーゼと共に50μlの試験バッファー中で、パラフィン油を上に被せて、72℃で4時間インキュベートする。
非特異的エキソヌクレアーゼ活性の不在：1μgのラムダＤＮＡのEcoRI／HindIII断片を50μlの試験バッファー中で、ｄＮＴＰの不在下及び存在下において（各々最終濃度1mM）、過剰の精製ＤＮＡポリメラーゼと共に、パラフィンを上に被せて、72℃で4時間インキュベートする。
リボヌクレアーゼ活性の不在：3μgのＭＳ2 ＲＮＡを過剰のＤＮＡポリメラーゼと共に20μlの試験バッファー中、72℃で4時間インキュベートする。続いて、このＲＮＡをＭＯＰＳゲル中での電気泳動（Maniatisら,1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York）により分析する。
実施例3
ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、合成されたＤＮＡへの32Ｐ−ｄＣＴＰの取込み（incorporation）又はジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの取込みのいずれかにより測定した。
32Ｐ−ｄＣＴＰの取込みの検出及び定量は以下のように測定した：反応混合物は50mM トリス−ＨＣｌ、pH8.5；12.5mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；10mM ＫＣｌ；5mM ＭｇＣｌ2；10mM 2−メルカプトエタノール、200μg／ml ＢＳＡ、200μMのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、100μM ｄＣＴＰ、12μgのDNAse活性化仔ウシ胸腺由来ＤＮＡ並びに0.1μlの32Ｐ−ｄＣＴＰ（10mCi／ml、3000Ci／ミリモル）を含んでいた。70℃で30分間インキュベートした後、これらのサンプルを氷上に置いて250μlの10％トリクロロ酢酸を添加し、サンプルを混合して氷上でさらに10分間インキュベートした。サンプルの150μlをナイロンメンブランを通して濾過し、それらのフィルターを5％トリクロロ酢酸で4回洗浄した。それらのフィルターを80℃で30分間乾燥させ、フィルターに結合している放射能をパッカード・マトリックス96ダイレクト・ベータ・カウンター（Packard Matrix 96 Direct Beta Counter）で測定した。
取込まれたジゴキシゲニンの検出及び定量は、本質的にHoltke,H.-J.;Sagner,G;Kessler,C.及びSchmitz,G.1992,Biotechniques Vol.12,p.104-113に記載される通りに行った。典型的には、この検定は、1もしくは2μlの希釈（0.05U−0.01U）ＤＮＡポリメラーゼ並びに50mM トリス−ＨＣｌ、pH8.5；12.5mM（ＮＨ4）2ＳＯ4；10mM ＫＣｌ；5mM ＭｇＣｌ2；10mM 2−メルカプトエタノール；33μM ｄＮＴＰ；２００μg／ml ＢＳＡ；12μgのDNAse活性化仔ウシ胸腺由来ＤＮＡ及び0.036μMジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを含んでなる総容積50μlの反応混合物中で行う。
サンプルを72℃で30分間インキュベートし、2μlの0.5M ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止させて管を氷上に置く。8μlの5M ＮａＣｌ及び150μlのエタノール（予め−20℃に冷却）を添加した後、氷上で15分間インキュベートすることによりＤＮＡを沈殿させ、13000×rpm及び4℃で10分間遠心することによりペレット化する。このペレットを100μlの70％エタノール（予め−20℃に冷却）及び0.2M ＮａＣｌで洗浄し、再度遠心して真空下で乾燥させる。これらのペレットを50μlのトリス−ＥＤＴＡ（10mM／0.1mM；pH7.5）に溶解する。5μlのサンプルを、ナイロンメンブランを底にした白色マイクロウェルプレート（Pall Filtrationstechnik GmbH,Dreieich,FRG、製品番号：ＳＭ045ＢＷＰ）のウェルにスポットする。70℃で10分間焼成することによりＤＮＡをメンブランに固定する。このＤＮＡをロードしたウェルに100μlの0.45μm濾過1％ブロッキング溶液（100mM マレイン酸、150mM ＮａＣｌ、1％（w／v）カゼイン、pH7.5）を充填する。以下のインキュベーション工程は全て室温で行う。2分間インキュベートした後、この溶液を、メンブランを通して適切な真空マニホールドを用いて−0.4バールで吸引する。洗浄工程を繰り返した後、これらのウェルに、上述のブロッキング溶液中に希釈した1:10000希釈抗ジゴキシゲニン−ＡＰ、Fab断片（Boehringer Mannheim,FRG、番号：1093274）100μlを充填する。2分間のインキュベーション及び吸引の後、この工程を1回繰り返す。これらのウェルを、真空下において、200μlの洗浄バッファー1（100mM マレイン酸、150mM ＮａＣｌ、0.3％（v／v）ツィーンTM20、pH7.5）で2回洗浄する。真空下において200μlの洗浄バッファー2（10mM トリス−ＨＣｌ、100mM ＮａＣｌ、50mM ＭｇＣｌ2、pH9.5）でさらに2回洗浄した後、洗浄バッファー2中に１：100で希釈したＣＳＰＤTM（Boehringer Mannheim、番号：1655884）（これはアルカリホスファターゼの化学発光基質としての役割を果たす）50μlをウェルに添加し、マイクロウェルプレートを室温で5分間インキュベートする。次に、この溶液をメンブランを通して吸引し、室温でさらに10分インキュベートした後、ＲＬＵ／s（毎秒当たりの相対光単位）を照度計、例えば、マイクロルーマット（MicroLumat）LB 96 P（EG＆G Berthold,Wildbad,FRG）で検出する。
Taq ＤＮＡポリメラーゼの連続希釈を用いて、その直線範囲が分析しようとするＤＮＡポリメラーゼ活性を決定するための基準としての役割を果たす検量線を作成する。
実施例4
逆転写酵素活性の測定
逆転写酵素活性を、オリゴｄＴプライム化ポリＡ鋳型を用いて、相補鎖への32Ｐ−ｄＴＴＰ又はジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰのいずれかの取込みにより測定した。32Ｐ−ｄＴＴＰの取込みは、1μgのポリＡ（ｄＴ）15、500μMのｄＴＴＰ、100mg／ml ＢＳＡ、10mM トリス−ＨＣｌ、pH8.5、20mM ＫＣｌ、0.5−10mM ＭｇＣｌ2もしくは0.1−5mM ＭｎＣｌ2、10mM ＤＴＥ、0.5μlの32Ｐ−ｄＴＴＰ（10mM Ci／ml、3000Ci／ミリモル）及び様々な量のＤＮＡポリメラーゼを含む混合物中で測定した。用いたインキュベーション温度は50℃であった。取込まれた放射能を、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するための検定に記載される通りに測定した。
ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰの取込みは、1μgのポリＡ（ｄＴ）15、330μMのｄＴＴＰ、0.36μMのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、200mg／ml ＢＳＡ、10mM トリス−ＨＣｌ、pH8.5、20mM ＫＣｌ、0.5−10mM ＭｇＣｌ2もしくは0.1−5mM ＭｎＣｌ2、10mM ＤＴＥ及び様々な量のＤＮＡポリメラーゼを含む混合物中で測定した。用いたインキュベーション温度は50℃であった。取込まれた放射能の検出は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に用いた手順と同様に行った。
実施例5
in situでのＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素活性の検出
ポリメラーゼ活性及び逆転写酵素活性のin situ ＰＡＧＥ分析は、本質的に、Spanos A.及びHubscher U.,1983,Methods in Enzymology Vol.91 p.263-277に記載される方法に従って行った。元の方法に対する些少ではあるが必須の修正は、再折り畳みを補助するためにマグネシウムイオン（3mM）及びｄＡＴＰ（0.5−１μM）の存在下においてＳＤＳ変性ポリペプチドの復元を行うことである。
簡潔に述べると、この方法は以下の通りである：
ゲル体積当たり150μgの活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡを含む変性8％ポリアクリルアミドゲル（濃縮用ゲル5％アクリルアミド）で粗製細胞抽出物又は精製サンプルのいずれかからポリペプチドを分離した後、このゲルを過剰の復元バッファー（トリス−ＨＣｌ、50mM、pH8.4；ＥＤＴＡ、1mM；2−メルカプトエタノール、3mM；ＫＣｌ、50mM；グリセロール、5−10％）で4回（15−30分、各々室温で穏やかに振盪しながら）洗浄してＳＤＳを除去する。次に、このゲルを、3mM ＭｇＣｌ2及び0.5−1μM ｄＡＴＰを含む同じバッファー中、4℃で一晩、攪拌することなくインキュベートする。翌日、復元バッファーを用いて最初の4回の洗浄を繰り返す。ＳＤＳを除去してタンパク質を復元した後、トリス−ＨＣｌ、50mM、pH8.4；ＫＣｌ、50mM；ＤＴＴ、3mM；ＭｇＣｌ2、7mM；12μMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（各々）、8μM ｄＴＴＰ及び４μM Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ；10％（v／v）グリセロールからなる反応混合物にゲルを移す。まずゲルを振盪しながら室温でインキュベート（30分）した後、5℃の温度増分で72℃まで徐々に暖める。中温好性の対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性をも検出するため、温度間隔の各々でＤＮＡ合成を30分間進行させる。ＤＮＡ合成の後、ＤＮＡを電気泳動（0.25×ＴＢＥ）又はキャピラリーブロッティング（15×ＳＳＣ）のいずれかによりナイロンメンブラン（Boehringer Mannheim）に移し、ＵＶ架橋させる。新たに合成されたＤｉｇ標識ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ活性の分析について記載される手順に従って検出する。
実施例6
アネロセルム・サーモフィルム（Anaerocellum thermophilum）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
アネロセルム・サーモフィルムからの染色体ＤＮＡの調製
0.8gのアネロセルム・サーモフィルムのバイオマスを20mlの1M ＫＣｌに懸濁し、遠心した。次に、そのペレットを4.8mlのＳＥＴ−バッファー（150mM ＮａＣｌ、15mM ＥＤＴＡ、pH8.0、60mM トリス−ＨＣｌ、pH8.0、50μg／μl RNaseA）に再懸濁し、次いで1mlの20％ＳＤＳ及び50μlのプロテイナーゼＫ（10mg／ml）を添加した。この混合物を45分間37℃に保持した。フェノール及び  で抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、Ｈ2Ｏに溶解した。このようにして約3.8mgのＤＮＡが得られた。
ＰＣＲによる特定のＤＮＡの増幅
アネロセルム・サーモフィルムのＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ技術により増幅するため、Braithwaite D.K.及びIto J.,1993,Nucl.Acids Res.Vol.21,p.787-802によって公開されたファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼの保存領域に基づいて2種混合オリゴヌクレオチド（プライマー1及び2）を設計した。
0004285615.tif 000005
このＰＣＲ増幅は、750ngのアネロセルム・サーモフィルム由来ゲノムＤＮＡ、10mM トリス−ＨＣｌ、pH8.8、2.5mM ＭｇＣｌ2、50mM ＫＣｌ、200μM ｄＮＴＰ、10ピコモルの各プライマー及び2.5単位のTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim GmbH）を含む100μlのバッファー中で行った。まず95℃で2分間変性し、続いて95℃で0.5分、50℃で1分及び72℃で2分のサイクルを30回行うことにより標的配列を増幅した。熱サイクリングはパーキン・エルマー（Perkin Elmer）GenAmp 9600サーマルサイクラーにおいて行った。アガロースゲル電気泳動により約1,900塩基対の断片が特異的に増幅されていたことが示された。この断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen）にライゲートし、その配列をサイクル配列決定法（cycle-sequencing）により決定した。このヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は他の既知ＤＮＡポリメラーゼのものに非常に似ており、そのため逆ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ）のためにプライマー3及び4を設計することができた。
0004285615.tif 000006
逆ＰＣＲは、本質的にTriglia T.ら,1988,Nucleic Acids Research Vol.16,p.8186に記載される通りに行った。５μgのアネロセルム・サーモフィルム由来ゲノムＤＮＡを供給元の仕様書（Boehringer Mannheim GmbH）に従ってEcoRIにより開裂し、等容量のフェノール／クロロホルム混合液で処理した。その水相を除去し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させて遠心により集めた。
環化するため、消化したＤＮＡをライゲーションバッファー（Boehringer Mannheim GmbH）中に50ng／μlの濃度に希釈した。Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim GmbH）を0.2単位／μlの濃度まで添加することによりライゲーション反応を開始させ、この反応を15℃で15時間進行させた。その後、ライゲートしたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、遠心により集めた。
ＰＣＲは、50mM トリス−Ｃｌ、pH9.2、16mM（ＮＨ4）2ＳＯ4、2.25mM ＭｇＣｌ2、2％（v／v）ＤＭＳＯ、0.1％（v／v）ツィーンTM20（ポリ（オキシエチレン）n−ソルビタン−モノラウラート）、上述の通りにして得た700ngの環化ＤＮＡ、50ピコモルの各プライマー、500μM ｄＮＴＰ及び0.75μlの酵素混合物（イクスパンド・ロング・テンプレートＰＣＲシステム（Expand Long Template PCR System）、Boehringer Mannheim GmbH）を含む50μlのバッファー中で行った。
サイクル条件は以下の通りであった：
0004285615.tif 000007
アガロースゲル電気泳動により、長さが6,500塩基対の特異的に増幅されたＤＮＡ断片が明らかになった。このＤＮＡ断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen）にライゲートし、配列決定した。この配列から推定することで、それぞれポリメラーゼ領域の5’及び3’末端をコードするプライマー5及び6を設計することができた。プライマー5はEclXl部位を含み、プライマー6はBamHI部位を含んでいた。
上述（逆ＰＣＲ）と同じ条件の下で、750ngのアネロセルム・サーモフィルム由来ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行った。
0004285615.tif 000008
クローニング及び発現
20μlのＰＣＲ混合物を0.8％アガロースゲルで電気泳動することによりＰＣＲ産物を精製した。ポリメラーゼコード領域の2.552kbバンドをフェノール抽出によりアガロースから精製した。その後、このＤＮＡをクロロホルムで処理してエタノールで沈殿させた。そのペレットを再懸濁し、供給元の仕様書（Boehringer Mannheim GmbH）に従ってEclXI及びBamHIで消化して定方向クローニング（directional cloning）のための付着末端を得た。このＤＮＡを、同様にEclXI及びBamHIで消化した発現ベクターpASK75（Biometra）にライゲートした。このライゲートした産物を形質転換により大腸菌LE392pUBS520株（Brinkmann U.ら,1989,Gene Vol.85,p.109-114）に導入した。組換え体の選択を可能にするため、100μg／mlアンピシリン及び50μg／mlカナマイシンを含むＬ−寒天で形質転換体を増殖させた。コロノーを拾い上げて100μg／mlアンピシリン及び50μg／mlカナマイシンを含むＬ−ブロスで増殖させ、アルカリ溶解によりプラスミドＤＮＡを調製した。これらのプラスミドを、BamHIで消化することによりインサートについてスクリーニングした。インサートを含む組換え体をアンピシリン及びカナマイシンを含むＬ−ブロスで増殖させ、0.2μg／mlアンヒドロテトラサイクリンで指数関数的に増殖する培養を誘発し、かつその熱処理抽出物を上述（ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定）の通りにＤＮＡポリメラーゼ活性について検定することにより耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの発現について試験した。アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼを発現する組換え体を得た。この株を大腸菌AR220（DSM番号11177）と命名し、このプラスミドをpAR10と命名した。
実施例7
アネロセルム・サーモフィルムに由来するＤＮＡポリメラーゼをサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）及びサーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）に由来するＤＮＡポリメラーゼと比較した。
同程度の量（単位）のＤＮＡポリメラーゼを分析した。各々の酵素を、ＤＮＡポリメラーゼ活性、Ｍｇ++（5mM）の存在下における逆転写酵素活性及びＭｎ++（1mM）の存在下における逆転写酵素活性について、個々の酵素に最適の反応条件下で試験した。ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性に対する比を比較するため、ＤＮＡポリメラーゼ検定において測定された相対光単位（ＲＬＵ）を100に設定した。逆転写酵素活性試験において測定されたＲＬＵをポリメラーゼ活性のパーセントで表す。結果を図5に示す。
配列表
配列番号：１：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２０塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000009
配列番号：２：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２１塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000010
配列番号：３：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２６塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000011
配列番号：４：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２４塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000012
配列番号：５：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：４２塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000013
配列番号：６：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：４０塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：/desc＝”oligonucleotide”
（xi）配列：
0004285615.tif 000014
配列番号：７：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：２５５３塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..2553
（xi）配列：
0004285615.tif 000015
0004285615.tif 000016
0004285615.tif 000017
0004285615.tif 000018
配列番号：８：
（i）配列の特色：
（A）配列の長さ：８５０アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：
0004285615.tif 000019
0004285615.tif 000020
0004285615.tif 000021
0004285615.tif 000022
0004285615.tif 000023
0004285615.tif 000024
【図１】
0004285615.tif 000025
【図２】
0004285615.tif 000026
【図３】
0004285615.tif 000027
【図４】
0004285615.tif 000028
0004285615.tif 000029
0004285615.tif 000030
0004285615.tif 000031
0004285615.tif 000032
【図５】
0004285615.tif 000033