(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｒｏｍａｎ）及び／又は薬理学的に許容されるその塩を有効成分として含有することを特徴とする、老人性痴呆症、末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、及び黄斑変性症からなる群より選ばれる神経成長因子産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤。
【請求項２】
３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｒｏｍａｎ）及び／又は薬理学的に許容されるその塩を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生増強剤。
【請求項３】
７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−６−ｐｒｅｎｙｌ ｃｏｕｍａｒｉｎ）またはその塩。
【請求項４】
４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（４’−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌ−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）またはその塩。
【請求項５】
８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（８−ｃａｒｂｏｘｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｒｏｍａｎ）またはその塩。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、クマリンまたはクロマン骨格を有する化合物の神経成長因子産生増強作用を利用した医薬、食品、飲料または飼料に関する。
背景従来
ヒトの知的機能、記憶、感情、行動などの精神活動の維持には神経細胞が主要な役割を担っている。これら精神活動の基になっている神経細胞の分化、生存、機能発現には、それぞれの神経細胞に特異的な神経性栄養因子が必要であると考えられている。神経性栄養因子のうち最初にその存在および機能が明らかにされたのが神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、以下ＮＧＦと略する）であり、現在では脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ−ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３、ニューロトロフィン−４／５などが見出されている。
ＮＧＦは前脳基底部の大細胞性コリン作動性神経細胞の神経性栄養因子であることから、アルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている〔ファルマシア、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２、１４７〜１５１（１９８６）、老年精神医学、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．６、７５１〜７５８（１９８６）〕。
アルツハイマー型痴呆症とは発育障害、巣症状、下肢の強直拘攣、てんかん様発作などの臨床を伴い、老人性プラーク、アルツハイマー原線維変化などの病理学的所見を見る疾患であり、老人性痴呆の一病型である。近年の高齢化社会で増加の傾向が見られ、重大な社会的関心が払われているが、これといった症状の改善法、治療法が見つかっていない。また、若年性アルツハイマーについても症状の改善法、治療法が見つかっていない。
アルツハイマー型痴呆症患者脳には、マイネルト基底核を中心とする前脳基底部に顕著な変性、コリンアセチル基転位酵素（ＣＡＴ）活性の著しい低下が認められている〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３，７７（１９８０）〕。１９８５年にラット脳を用いた研究で、ＮＧＦが脳のこの部位での神経性栄養因子であることが明らかにされ〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．４，１３８９（１９８５）〕、ＮＧＦと本疾患との関連が注目された。またハンチントン舞踏疾患者の脳の線条体では、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の脱落と共にコリン作動性神経細胞の脱落が著しく、ＮＧＦが線条体の内在性コリン作動性神経細胞にも作用することが明らかにされ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３４，１３４１（１９８６）〕、本疾患がＮＧＦと関連している可能性が指摘されている。各種の神経疾患のモデルとなり得るラットなどの動物でＮＧＦの効果が研究され、ラットでは神経細胞の変性が顕著になる以前にＮＧＦを脳内投与すれば、変性を食い止めることができ、ＣＡＴ活性の低下も防げることが報告されている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６，２１５５（１９８６）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２９３，３０５（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３５，２１４（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，９２３１（１９８６）〕。末梢の交感神経支配組織および脳でＮＧＦが生合成されていること、このＮＧＦの生合成に末梢組織あるいは脳組織の間質細胞である線維芽細胞あるいはアストログリア細胞が各々重要な役割を担っていることも証明されている〔Ｊ．Ｂｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５９，１２５９（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１３６，５７（１９８６）〕。また、この線維芽細胞やアストログリア細胞の産生するＮＧＦの抗原性、分子量、等電点、生物活性は、従来よく研究されていた顎下腺ＮＧＦと同一であることが明らかにされるとともに、線維芽細胞（Ｌ−Ｍ細胞）およびアストログリア細胞の培養液に種々の神経伝達物質を加える実験によって、カテコールアミン（ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン）がＮＧＦ合成促進効果を示すことが見出されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１，６０３９（１９８６）〕。
このように、ＮＧＦが神経性栄養因子として作用する部位が変性するこれらの神経疾患において、ＮＧＦは変性を食い止める治療薬として用いることができるのではないかと期待される。また脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒など脳神経細胞が一旦変性に陥れば、生涯回復することがなく、その結果、知的機能低下、記憶障害のみならず、感情障害、行動異常など様々な障害を引き起こすが、神経線維には可塑性があり、損傷を受けると、その付近の健常な線維から発芽が起こり、障害されたシナプスに変わって新しいシナプスが形成されるので、この時ＮＧＦが神経機能の修復再生を促す治療剤として用いることができるのではないかと期待される。
しかしながら、ＮＧＦを各種神経疾患の治療に応用しようとした場合、ＮＧＦはＮＧＦを必要とする神経細胞の極く近傍に達していなければならないし、中枢神経疾患の場合も脳細胞の患部にＮＧＦを送り届けなければならないが、血管系を通してＮＧＦを脳内に送り込むことはできない。なぜならば、脳内の血管内皮細胞は、互いに密着結合で結合しており（脳血液関門という）、水、ガス、脂溶性物質以外の物質の血液から脳組織への移行は制限を受けているからであり、高分子物質である蛋白質（ＮＧＦも含む）はまったく脳血管関門を通ることが出来ないからである。このＮＧＦを直接脳内に外科的手法を用いて投入することは、現在の技術をもってしても危険が大き過ぎる。
一方、直接、ＮＧＦを投与するのでは無く、ＮＧＦの産生を増強する物質の開発も行われているが、その多くは、強い毒性を有するか、毒性が出る濃度と有効な濃度が非常に接近した物質、または神経興奮作用など神経系に対して重大な副作用を生じる物質であるなど、多くの問題点を抱えており、いまだ実用化には至っていない。
発明の開示
本発明の目的は、ＮＧＦ産生増強を要する疾患の治療、症状改善、予防等に有効な、ＮＧＦ産生増強作用を有する化合物を有効成分とする医薬、食品、飲料または飼料を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討した結果、クマリンおよび／またはクロマン骨格を有する化合物がＮＧＦ産生増強活性を有することを見出し本発明を完成させた。
すなわち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、（Ａ）クマリン骨格を有する化合物、（Ｂ）２−ジメチルクロマン骨格を有する化合物、および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とするＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤（本明細書において医薬という場合がある）に関する。
本発明の第１の発明において、クマリン骨格を有する化合物としては、一般式（Ｉ）：
0004358515.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子、水酸基、脂肪族基、芳香族基、芳香脂肪族基または糖残基であり、各々同じであっても異なっていてもよい。）
または一般式（ＩＩ）：
0004358515.tif 000003
（式中、Ｒ４、Ｒ５は水素原子、水酸基、ＲｉＯ基、ＲｉｉＣＯＯ基または糖残基であり、各々同じであっても異なっていてもよい。）
で表される化合物が例示される。
また、一般式（Ｉ）で表される化合物としては、特に好適には７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリン（７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−８−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）、または７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−６−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）が、一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、特に好適には３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトン（３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｙｌ  ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）、または４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（４’−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌ−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）が例示される。
本発明の第１の発明において、２−ジメチルクロマン骨格を有する化合物としては、一般式（ＩＩＩ）：
0004358515.tif 000004
（式中、Ｒ６は水素原子、水酸基、カルボキシル基、脂肪族基、芳香族基、芳香脂肪族基または糖残基である。）
で表される化合物が例示される。
また、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、特に好適には８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（８−ｃａｒｂｏｘｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）、または３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）が例示される。
本発明の第２、第３の発明は、本発明の第１の発明と同様の有効成分を含有することを特徴とするＮＧＦ産生増強剤、ＮＧＦ産生増強用食品、飲料または飼料に関する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「ＮＧＦ産生増強作用」および「ＮＧＦ産生増強活性」はそれぞれＮＧＦ産生増強をもたらすことおよびＮＧＦ産生を増強する機能をいうが、その意味において特に厳密に区別するものではない。「増強」には、本発明の有効成分の作用前に比し、作用後において目的物質の量が増加するという態様と共に、本発明の有効成分を作用させることにより目的物質を生起せしめるという態様（誘導）を含む。また、本明細書において有効成分として挙げるいずれの物質も単独でもしくは２種以上混合して本発明において用いることができる。
本発明で有効成分として使用される化合物は、（Ａ）クマリン骨格を有する化合物、（Ｂ）２−ジメチルクロマン骨格を有する化合物、および薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物（以下、本発明で使用される化合物という場合がある）であり、ＮＧＦ産生増強活性を有していれば特に限定されない。また、後述するようにプロドラッグとして機能し得る当該化合物の誘導体であってもよい。従って、本発明の有効成分としては、前記（Ａ）、（Ｂ）の化合物、および本発明の所望の効果が得られうる限り前記（Ａ）、（Ｂ）の化合物の誘導体、ならびに薬理学的に許容されるそれらの塩を包含する。なお、本明細書において「薬理学的に許容される」とは生物に対して実質的に無毒であることを意味する。また、前記（Ａ）、（Ｂ）の化合物の光学異性体、ケト−エノール互変異性体、幾何異性体などの各種異性体、各異性体の混合物もしくは単体であっても、ＮＧＦ産生増強活性を有する限り、全て本発明において使用することができる。
本発明において、クマリン骨格を有する化合物としては、特に限定はないが、たとえば、前記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物が例示される。
一方、２−ジメチルクロマン骨格を有する化合物としては、特に限定はないが、たとえば、前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物が例示される。
本明細書において脂肪族基としては、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などの炭素数１〜３０の直鎖状アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基などの分枝状アルキル基、エテニル基、アリル基、トランス−１−プロペニル基、シス−１−プロペニル基、シス−８−ヘプタデセニル基、シス−８−シス−１１−ヘプタデカジエニル基、シス−８−シス−１１−シス−１４−ヘプタデカトリエニル基、シス−５−シス−８−シス−１１−ヘプタデカトリエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−ノナデカトリエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−シス−１３−ノナデカテトラエニル基、シス−４−シス−７−シス−１０−シス−１３−シス−１６−ノナデカヘプタエニル基、シス−１２−ヘンイコセニル基、シス−３−シス−６−シス−９−シス−１２−シス−１５−シス−１８−ヘンイコヘキサエニル基などの直鎖状アルケニル基、プレニル基、イソプロペニル基、シス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−メチル−１−プロペニル基、トランス−１−エチル−１−プロペニル基などの分枝状アルケニル基が挙げられる。本発明の所望の効果の発現の観点から、かかる脂肪族基の好適な例としては、プレニル基が挙げられる。
また、芳香族基としては、たとえば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基の他、ピロリル基、ピリジル基、インドリル基、イミダゾリル基、トリル基、キシリル基などが挙げられる。
芳香脂肪族基の好適な例としては、炭素数が１〜２０である飽和もしくは不飽和の芳香脂肪族基が例示され、特に好適には３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル基が例示される。その他、たとえば、アルキル基の炭素数が１〜２０であるフェニルアルキル基（例、ベンジル基、フェネチル基）、スチリル基、シンナミル基などが挙げられる。
糖残基を構成する糖としては、たとえば、グルコース、スレオース、リボース、アピオース、アロース、ラムノース、アラビノピラノース、リブロース、キシロース、ガラクトース、マンノース、タロース、フコース、フルクトース、グルクロン酸、ガラクツロン酸等の単糖、ゲンチオビオース、ネオヘスペリドース、ルチノース、アガロビオース、イソマルトース、スクロース、キシロビオース、ニゲロース、マルトース、ラクトース等の二糖、アガロース、フコイダン等の多糖由来のオリゴ糖、およびアガロース、フコイダン等の多糖等が挙げられる。本発明の所望の効果の発現の観点から、かかる糖の好適な例としては、グルコース、ゲンチオビオースが挙げられる。また、糖残基としては、糖がＯ−、Ｎ−、Ｓ−、またはＣ−グリコシド結合した化合物の他に、糖の還元末端以外の炭素とＣ−Ｃ結合により結合した化合物をも含む。
ＲｉＯ基のＲｉとしては、前記例示した脂肪族基、芳香族基が例示される。
また、ＲｉｉＣＯＯ基のＲｉｉとしては、前記例示した脂肪族基、芳香族基が例示される。本発明の所望の効果の発現の観点から、ＲｉｉＣＯＯ基の好適な例としては、アンゲロイル基が挙げられる。
さらに、本発明において使用される前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で表される化合物から、たとえば、エステルとするなど、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る誘導体（プロドラッグ）をそれぞれ形成可能である。かかるプロドラッグの調製は公知の方法（たとえば、医薬品の開発、第７巻、分子設計、１６３〜１９８頁、廣川書店（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ  ７，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐ１６３−１９８，ＨＩＲＯＫＡＷＡ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）参照）に従えばよい。なお、かかる誘導体は、それらの塩であってもよい。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の特に好適な例としては、たとえば、７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリン（７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−８−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）、または７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−６−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）が挙げられる。また前記一般式（ＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、たとえば、３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトン（３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｙｌ  ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）、または４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（４’−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌ−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）が挙げられる。これらの構造式についてそれぞれ順に下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）に示す。
0004358515.tif 000005
0004358515.tif 000006
0004358515.tif 000007
0004358515.tif 000008
また、前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、たとえば、８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（８−ｃａｒｂｏｘｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）、または３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）が挙げられる。たとえば、前者の構造式を下記式（ＶＩＩＩ）に示す。
0004358515.tif 000009
上記するような本発明の有効成分は、前記するように、いずれのものもＮＧＦ産生増強作用を有するものである。当該作用の発現は、たとえば、後述の実施例１−（２）に示す方法により評価することができる。
本発明において有効成分として使用される化合物は、天然物として存在する場合は、たとえば、植物（たとえば、アシタバ等のセリ科植物）より常法に従って抽出し精製することにより得ることができる。抽出は、公知の方法に従い、たとえば、原料を粉砕もしくは細切した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式で行うことができる。抽出溶媒としては、たとえば、水、クロロホルム、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等の親水性もしくは親油性の溶媒を、それぞれ単独でもしくは混合液として用いることができる。抽出温度は必要に応じて適宜設定し、抽出操作は必要に応じて数回繰り返してもよい。精製方法としては、たとえば、各種クロマトグラフィー等により分画し、精製することができる。
すなわち、たとえば、アシタバから本発明に使用される化合物を精製する場合は、アシタバ根部を水を溶媒とする抽出操作に供し、次いで得られた抽出液を逆相クロマトグラフィーにより分画・精製し、本発明に使用される化合物を得ることができる。
前記した、７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−６−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）、４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（４’−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌ−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）および８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（８−ｃａｒｂｏｘｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）は、本発明において初めてアシタバから単離された化合物であり、そのＮＧＦ産生増強作用についても初めて確認された。本発明は、これらの化合物も包含するものである。
なお、本発明において有効成分として使用できる化合物としては、ＮＧＦ産生増強活性を有する限り、たとえば、市販の化合物も利用できるほか、オルトクマール酸を出発原料として公知の方法により適宜合成することもできる（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．，ｐ２９２９（１９７１）参照）。また、ジケテンとフェノールとの反応から適宜合成することもできる（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｐ８５４（１９５４）参照）
本発明で使用される種々の前記化合物の塩としては、たとえば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩などが例示される。当該塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムまたはプロトン化されたベンザチン（Ｎ，Ｎ′−ジ−ベンジルエチレンジアミン）、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグラミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ピペラジンもしくはトロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）との塩が挙げられる。
ＮＧＦは神経細胞の生存や機能を維持したり、ＮＧＦの濃度勾配に従って神経細胞を伸長させたりする内因性の成長因子であるため、ＮＧＦの産生を増強することにより、アルツハイマー病等の老人性痴呆症や、末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒等の神経機能の修復・再生を要する疾患の治療または予防を行うことができると考えられる。また、筋萎縮性側索硬化症、薬剤障害性末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害、パーキンソン病、感覚神経障害、色素性網膜症、黄斑変性症等の治療または予防にも有用であると考えられる。本発明の有効成分はＮＧＦ産生増強作用を有するものであるため、当該有効成分を含んでなる、本発明の医薬、食品、飲料または飼料は、ＮＧＦの産生増強を行うことで、治療または予防が可能な疾患であれば特に限定されるものではないが、ここに具体的に例示したようなＮＧＦ産生増強を要する疾患の治療、症状改善、予防等に特に有効である。また、本発明の有効成分には、後述するように特に毒性は認められず、副作用の発生の心配もない。それゆえ、安全かつ適切にＮＧＦの産生増強を行うことができる。このことは、本発明の医薬、食品、飲料または飼料の重要な利点である。
本発明のＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤としては、本発明の前記有効成分を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容され得る塩を用いる。
本発明の治療剤または予防剤の製造は、通常、前記有効成分を薬理学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われる。その際、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な液体担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。
医薬用担体は、治療剤または予防剤の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができる。たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができる。たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、所望により、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。
以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の治療剤および予防剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用剤では、たとえば、座剤をその適する投与方法により投与すればよい。
本発明の治療剤または予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該治療剤または予防剤の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明の治療剤または予防剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。投与期間も所望の効果の発現に応じて適宜決定すればよい。
また、本発明は前記有効成分を含むＮＧＦ産生増強剤を提供することもできる。当該増強剤としては、前記有効成分そのものであってもよく、また、前記有効成分を含む組成物であってもよい。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が好適である。ＮＧＦ産生増強剤は、たとえば、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分などと配合し、上記治療剤または予防剤の製造方法に準じて通常使用される試薬の形態に製造すればよい。かかる増強剤における前記有効成分の含有量は、当該増強剤の使用目的、使用方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。また、該増強剤の使用量も、本発明の所望の効果の発現が得られ得るようであれば特に限定されるものではない。特に、生体に投与して使用する場合には、任意の投与方法に応じ、好ましくは前記治療剤または予防剤における有効成分の投与量範囲内で有効成分を投与できるような量で使用すればよい。ＮＧＦ産生増強剤は、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患における当該成長因子の増強に有用である。また、当該増強剤はＮＧＦに関連する疾患に対する薬物のスクリーニングにも有用である。さらに当該増強剤は、ＮＧＦまたは神経細胞の物理的変化に関する機能研究にも有用である。
さらに、本発明の別の態様として、本発明に係る前記有効成分を動物に投与するＮＧＦ産生の増強方法を提供することもできる。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が好適である。かかる方法は、ＮＧＦ産生の増強が必要であると予想される、または、その必要のある動物に対し、前記有効成分を、好ましくは、前記ＮＧＦ産生増強剤として投与することにより行うことができ、かかる投与により、ＮＧＦの産生を増強せしめる。有効成分の投与方法、投与量などは、前記ＮＧＦ産生増強剤の場合と同様とすればよい。なお、ＮＧＦ産生の増強方法では、本発明の治療剤または予防剤、後述の食品、飲料または飼料を用いることもできる。また、「動物」としては、たとえば、哺乳動物であるヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ等を挙げることができ、中でも、ヒトに対し好適に用いられる。かかるＮＧＦ産生の増強方法は、たとえば、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療または予防におけるＮＧＦ産生増強に有用である。また、該増強方法はＮＧＦに関連する疾患に対する薬物のスクリーニングに有用である。また、該増強方法はＮＧＦまたは神経細胞の物理的変化に関する機能研究にも有用である。
また、本発明は、前記有効成分を含有、添加および／または希釈してなるＮＧＦ産生増強用の食品、飲料または飼料を提供する。本発明の態様においては、有効成分の塩としては、薬理学的に許容される塩、またはそれと同等の安全性を有する塩が好適である。本発明の食品、飲料または飼料は、そのＮＧＦ産生増強作用により、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の症状改善、予防に極めて有用である。
なお、本明細書において、「含有」とは食品、飲料または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品、飲料または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。
本発明の食品、飲料または飼料の製造法に特に限定はない。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品、飲料または飼料のものに従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた食品、飲料または飼料にＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の前記有効成分が含有されていれば良い。
本発明の食品または飲料としては特に限定はないが、たとえば、本発明の前記有効成分が含有されてなる、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなど）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりんなど）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体食品（スープなど）、香辛料類などの農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品などが挙げられる。
本発明の食品または飲料には、本発明において有効成分として使用される前記化合物が単独でもしくは複数含有、添加および／または希釈されており、そのＮＧＦ産生増強作用を発現するための必要量が含まれていれば特にその形状に限定はない。たとえば、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
本発明の食品または飲料中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その食感と活性発現の観点から適宜選択できる。たとえば、食品中、好ましくは０．００００１重量％以上、より好ましくは０．０００１〜１０重量％、更に好ましくは０．０００６〜６重量％である。また、たとえば、飲料中、好ましくは０．００００１重量％以上、より好ましくは０．０００１〜１０重量％、更に好ましくは０．０００６〜６重量％である。本発明の食品または飲料は、それらに含有される有効成分の摂取量が、たとえば、成人１日当たり好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように摂取するのが望ましい。
また、本発明は、前記有効成分を含有、添加および／または希釈してなる、ＮＧＦ産生増強作用を有する生物用の飼料を提供する。さらに、別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法をも提供する。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。
これらの発明において、生物とは、たとえば、養殖動物、ペット動物などであり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類または貝類が例示される。飼料としては体調の維持および／または改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明に使用される前記有効成分のＮＧＦ産生増強作用に基づき、本発明の前記治療剤または予防剤によるのと同様の効果の発現が期待できる。すなわち、当該生物におけるＮＧＦ産生増強作用を要する疾患の治療または予防効果を有する。
本発明に使用される前記有効成分は通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ投与される。投与は本発明の飼料により行なうのが好適である。たとえば、当該有効成分を、対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合することで行うことができる。前記有効成分の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、０．００１〜１５重量％の割合が好適である。
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油などの動物性油脂、大豆油、菜種油などの植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤などを原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチなどの魚類用飼料が挙げられる。
本発明の飼料の製造法に特に限定はなく、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中にＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の前記有効成分が含まれていればよい。
また、ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の前記有効成分をプール、水槽、保持タンクまたは飼育領域の水、海水などに直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。水または海水中のＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは０．００００１〜１重量％の割合が適当である。
また、ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の前記有効成分を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。該飲料中のＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．０００１〜１重量％の割合が適当である。ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明の前記有効成分を含んでなる生物飼育用剤、たとえば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の配合および製造法で製造すれば良い。該生物飼育用剤における有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られ得る限り特に限定されるものではない。
本発明が適用できる生物としては限定はないが、養殖動物としては、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズなどの魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミなどの甲殻類など、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキなどの貝類、ペット動物としてはイヌ、ネコなどが挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
本発明の生物の飼育方法は、本発明の前記飼料や生物飼育用剤を用いて、それらの使用方法として具体的に例示した方法により、生物に本発明の有効成分を摂取させることにより行なうことができる。
たとえば、ＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分を含んでなる飼料を摂取させること、またはＮＧＦ産生増強作用を有する本発明に使用される前記有効成分の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物などの体調を良好に維持し、または、改善させたりすることができる。
さらに、本発明の別の態様として、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、ＮＧＦ産生増強剤、またはＮＧＦ産生増強用の食品、飲料もしくは飼料の製造のための本発明の前記有効成分の使用を提供する。かかる使用の態様としては、本発明の前記治療剤もしくは予防剤、ＮＧＦ産生増強剤、またはＮＧＦ産生増強用の食品、飲料もしくは飼料の製造における前記有効成分の使用の態様を挙げることができる。たとえば、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、またはＮＧＦ産生増強剤の製造における、前記有効成分の使用としては、前記のような錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤などの固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品の製造においての使用が例示される。
本発明で使用される前記有効成分は、その作用発現にとっての有効量の投与を行っても毒性は認められない。たとえば、経口投与の場合、３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトン、７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリン、７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン、４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン、８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン、３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマンもしくはこれらの光学活性体またはそれらの塩のいずれかを１ｇ／ｋｇでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。また、副作用の発生も認められない。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は特段の事情がない限り重量％を意味する。
調製例１  アシタバ根部由来フラクションの分画
（１）乾燥アシタバ根部粉末５．８ｋｇに２４リットルの酢酸エチルを加え室温で３時間、抽出をおこなった。吸引ろ過後の残渣に１８リットルのエタノールを加え室温で一晩抽出をおこなった。つぎに、吸引ろ過後の残渣に５２リットルの蒸留水を加え６０℃で３時間抽出をおこなった。固形残渣を除いた液体部分をロータリーエバポレーターで濃縮したものに２．５倍量のエタノールを加え、４℃で一晩静置した。その後、吸引ろ過で沈殿物と液体部分に分画した。液体部分を、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固しアシタバ根部水抽出低分子画分を得た。つぎにアシタバ根部水抽出低分子画分をアンバーライトＸＡＤ−２（オレガノ社製：樹脂量２リットル）に供し、蒸留水３０リットルで非吸着物を十分に洗いだし、次に、１６リットルのメタノールで吸着物を溶出した。メタノール溶出液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、アシタバ根部水抽出低分子画分ＸＡＤ−２処理物を得た。
（２）調製例１−（１）記載のアシタバ根部水抽出低分子画分ＸＡＤ−２処理物を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について示す。樹脂はコスモシール１４０  Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製：樹脂量４００ｍｌ）を用いた。アシタバ根部水抽出低分子画分ＸＡＤ−２処理物を前記樹脂を充填したカラムに供し、展開溶媒としてそれぞれ１リットルの蒸留水、２０％アセトニトリル水溶液、２５％アセトニトリル水溶液、４０％アセトニトリル水溶液、メタノールの順に溶出を行い、各溶出画分を減圧濃縮し、各コスモシール分画物を調製した。
（３）調製例１−（２）で得たコスモシール１４０からの２５％アセトニトリル水溶液溶出画分を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について示す。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍ  Ｘ  ３０ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒Ａ（蒸留水）と溶媒Ｂ（蒸留水とアセトニトリルを容量比１対１で混合したもの）の溶出比は、０分から１２０分にかけて溶媒Ｂ比を直線的に２５％から１００％に、続く２０分間は溶媒Ｂ比を１００％に保持、最後に溶媒Ｂ比を２５％にし、２０分間保持とした。溶出速度は５ｍｌ／分、検出は２３５ｎｍで行った。紫外線吸収を指標にフラクション１〜３０を採取した。
実施例１  ３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトン（３’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｙｌ  ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）調製例１−（３）で得たアシタバ根部由来フラクション１０（保持時間６２．２分の検出のピークを含むフラクション）の質量スペクトル（ＭＳ）を質量分析計（ＤＸ３０２：日本電子社製）によりＦＡＢ−ＭＳの手法で測定した。マトリックスにはグリセロールを用いた。その結果、ｍ／ｚ  ２４５（Ｍ−ＯＧｌｃ）＋のピークを検出した。第１図に、アシタバ根部由来フラクション１０のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す。第１図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１０を核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル装置（ＪＮＭ−Ａ５００：日本電子社製）を用い各種ＮＭＲスペクトルを測定し構造解析した。以下にＮＭＲの帰属の信号を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．３６（３Ｈ，ｓ，２’−ＣＨ３），１．３７（３Ｈ，ｓ，２’−ＣＨ３），３．０８（２Ｈ，ｍ，２”−Ｈおよび４”−Ｈ），３．１２（１Ｈ，ｍ，３”−Ｈ），３．４１（１Ｈ，ｍ，５”−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，３’−Ｈ），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，１１．５Ｈｚ，６”−Ｈ），４．３５，（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，６”−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１”−Ｈ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，４’−Ｈ），６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，３−Ｈ），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，６−Ｈ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，５−Ｈ），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４−Ｈ）
但し、１Ｈ−ＮＭＲにおいては、試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、残留ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．４９ｐｐｍとして表した。第２図に、アシタバ根部由来フラクション１０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第２図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１０について行ったＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトン（分子量４２４）であることを確定した。
（２）実施例１−（１）で構造が確定したアシタバ根部由来フラクション１０のＮＧＦ産生増強活性を測定した。マウス線維芽細胞Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ＩＣＮ社製）に１．５×１０５細胞／ｍｌで懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき無菌的に培養した。３日間培養後、培地を取り除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。これに試料としてアシタバ根部由来フラクション１０を添加し、２０時間培養した。培養終了後、培養液中のＮＧＦの濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。試料を添加していない細胞培養液中のＮＧＦ濃度（対照のＮＧＦ産生量）を１００％として試料添加時のＮＧＦ濃度（試料添加時のＮＧＦ産生量）を表わし、試料のＮＧＦ産生増強活性について評価した。試料は最終濃度が表１に示す濃度となるように添加した。実験は２連で行い、その平均値を採用した。その結果、アシタバ根部由来フラクション１０、すなわち３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノイル  ケラクトンにＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表１にその結果を示す。
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実施例２  ７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリン（７−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−８−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）調製例１−（３）で得たフラクション１３（保持時間６６．９分の検出のピークを含むフラクション）を逆相クロマトグラフィーを用いてさらに分画した。以下にその条件について示す。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ（４．６ｍｍ  Ｘ  ２５ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水）と溶媒Ｂ（蒸留水とアセトニトリルを容量比１対１で混合したもので０．１％トリフルオロ酢酸を含む）の溶出比は２０分間、溶媒Ｂ比を５０％保持とした。溶出速度は１ｍｌ／分、検出は２３５ｎｍで行い、紫外線吸収を指標にフラクション１３−１〜１３−８を採取した。
（２）実施例２−（１）において得たアシタバ根部由来フラクション１３−２（保持時間８．７分のピークを含むフラクション）のＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトルを実施例１−（１）と同様の方法で測定した。
質量分析により、ｍ／ｚ  ３９３（Ｍ＋Ｈ）＋のピークを検出した。第３図に、アシタバ根部由来フラクション１３−２のＭＳスペクトルを示す。第３図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１３−２のＮＭＲの帰属の信号を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．６１（３Ｈ，ｓ，３’−ＣＨ３），１．７８（３Ｈ，ｓ，３’−ＣＨ３），３．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４”−Ｈ），３．２８（１Ｈ，ｍ，３”−Ｈ），３．２９（１Ｈ，ｍ，２”−Ｈ），３．３８（１Ｈ，ｍ，５”−Ｈ），３．４０（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ），３．４６（１Ｈ，ｍ，６”−Ｈ），３．５８（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ），３．６９（１Ｈ，ｍ，６”−Ｈ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１”−Ｈ），５．２０（１Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，３−Ｈ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，６−Ｈ），７．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，５−Ｈ），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４−Ｈ）
第４図に、アシタバ根部由来フラクション１３−２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第４図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１７．８（３’−ＣＨ３），２１．６（１’−ｃ），２５．５（３’−ＣＨ３），６０．６（６”−ｃ），６９．７（４”−ｃ），７３．４（２”−ｃ），７６．７（３”−ｃ），７７．１（５”−ｃ），１００．８（１”−ｃ），１１１．５（６−ｃ），１１２．８（３−ｃ），１１３．４（１０−ｃ），１１７．４（８−ｃ），１２１．３（２’−ｃ），１２６．８（５−ｃ），１３１．５（３’−ｃ），１４４．５（４−ｃ），１５２．１（９−ｃ），１５７．８（７−ｃ），１６０．２（２−ｃ）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲにおいては試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシドの化学シフト値を３９．５ｐｐｍとして表した。第５図に、アシタバ根部由来フラクション１３−２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第５図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１３−２について行ったＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリン（分子量３９２）であることが確定した。
（３）実施例２−（２）で構造が確定したアシタバ根部由来フラクション１３−２を試料として用い、そのＮＧＦ産生増強活性を実施例１−（２）と同様の方法で測定した。試料は最終濃度が表２に示す濃度となるように添加した。その結果、アシタバ根部由来フラクション１３−２、すなわち７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−８−プレニルクマリンにＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表２にその結果を示す。
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実施例３  ８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（８−Ｃａｒｂｏｘｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）調製例１−（３）で得たフラクション１８（保持時間７３．０、７３．８、７４．９７分の検出のピークを含むフラクション）を実施例２−（１）と同様の方法で逆相クロマトグラフィーを用いてフラクション１８−１〜１８−１２にさらに分画した。
（２）実施例３−（１）で得たアシタバ根部由来フラクション１８−４（保持時間１０．９分のピークを含むフラクション）のＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトルを実施例２−（２）と同様の方法で測定した。
質量分析により、ｍ／ｚ  ２５３（Ｍ＋Ｈ）＋のピークを検出した。第６図に、アシタバ根部由来フラクション１８−４のＭＳスペクトルを示す。第６図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
ＮＭＲの帰属の信号を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．１５（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ３），１．２７（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ３），２．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１７．０Ｈｚ，４−Ｈ），２．７６（，１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１７．０Ｈｚ，４−Ｈ），３．６２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ），３．８１（３Ｈ，ｓ，５−ＯＣＨ３），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，３−ＯＨ），６．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，６−Ｈ），７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１０−Ｈ），１１．８６（１Ｈ，ｂｒｓ，８−ＣＯＯＨ）
第７図に、アシタバ根部由来フラクション１８−４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第７図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ２０．４（２−ＣＨ３），２５．４（２−ＣＨ３），２６．２（４−Ｃ），５５．７（５−ＯＣＨ３），６７．０（３−Ｃ），７７．６（２−Ｃ），１０１．８（６−Ｃ），１０９．４（１０−Ｃ），１１２．５（８−Ｃ），１３０．７（７−Ｃ），１５３．３（９−Ｃ），１６０．４（５−Ｃ），１６６．６（８−ＣＯＯＨ）
第８図に、アシタバ根部由来フラクション１８−４の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第８図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１８−４のＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（分子量２５２）であることが確定した。
（３）実施例３−（２）で構造が確定したアシタバ根部由来フラクション１８−４を試料として用い、そのＮＧＦ産生増強活性を実施例１−（２）と同様の方法で測定した。試料は最終濃度が表３に示す濃度となるように添加した。その結果、アシタバ根部由来フラクション１８−４、すなわち８−カルボキシル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−ジメチルクロマンにＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表３にその結果を示す。
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実施例４  ７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（７−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ−６−ｐｒｅｎｙｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）調製例１−（３）で得たフラクション１９（保持時間７５．４分の検出のピークを含むフラクション）、フラクション２０（７６．５分の検出のピークを含むフラクション）を混合し、実施例２−（１）と同様の方法で逆相クロマトグラフィーを用いてフラクション１９／２０−１〜１９／２０−７にさらに分画した。
（２）実施例４−（１）で得たアシタバ根部由来フラクション１９／２０−５（保持時間１６．４分の検出のピークを含むフラクション）のＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトルを実施例２−（２）と同様の方法で測定した。
質量分析で、ｍ／ｚ  ３９３（Ｍ＋Ｈ）＋のピークを検出した。第９図に、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５のＭＳスペクトルを示す。第９図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
ＮＭＲの帰属の信号を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．６７（３Ｈ，ｓ，３’−ＣＨ３），１．６９（３Ｈ，ｓ，３’−ＣＨ３），３．１５（１Ｈ，ｍ，４”−Ｈ），３．２９（３Ｈ，ｍ，１’−Ｈ，２”−Ｈおよび３”−Ｈ），３．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１５．５Ｈｚ，１’−Ｈ），３．４５（２Ｈ，ｍ，５”−Ｈおよび６”−Ｈ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５，６”−Ｈ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１”−Ｈ），５．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２’−Ｈ），６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，３−Ｈ），７．０７（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），７．４１（１Ｈ，ｓ，８−Ｈ），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４−Ｈ）
第１０図に、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第１０図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１７．６（３’−ＣＨ３），２５．５（３’−ＣＨ３），２７．４（１’−Ｃ），６０．６（６”−Ｃ），６９．６（４’’−Ｃ），７３．１（２”−Ｃ），７６．３（３”−Ｃ），７７．０（５”−Ｃ），１００．４（１”−Ｃ），１０２．０（８−Ｃ），１１２．８（１０−Ｃ），１１２．９（３−Ｃ），１２１．８（２’−Ｃ），１２７．４（６−Ｃ），１２８．０（５−Ｃ），１３２．４（３’−Ｃ），１４４．４（４−Ｃ），１５３．４（９−Ｃ），１５７．９（７−Ｃ），１６０．６（２−Ｃ）
第１１図に、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第１１図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５について行ったＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリン（分子量３９２）であることが確定した。
（３）実施例４−（２）で構造が確定したアシタバ根部由来フラクション１９／２０−５を試料として用い、そのＮＧＦ産生増強活性を実施例１−（２）と同様の方法で測定した。試料は最終濃度が表４に示す濃度となるように添加した。その結果、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５、すなわち７−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−６−プレニルクマリンにＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表４にその結果を示す。
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実施例５  ４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（４’−Ｏ−Ａｎｇｅｌｏｙｌ−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−ｋｈｅｌｌａｃｔｏｎｅ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）実施例４−（１）で得たアシタバ根部由来フラクション１９／２０−６（保持時間１８．８分の検出のピークを含むフラクション）のＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトルを実施例２−（２）と同様の方法で測定した。
質量分析計で、ｍ／ｚ  ２４５（Ｍ−２Ｇｌｃ−Ａｎｇｅｌ）＋、６６９（Ｍ＋Ｈ）＋、６９１（Ｍ＋Ｎａ）＋、７０７（Ｍ＋Ｋ）＋のピークを検出した。第１２図に、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６のＭＳスペクトルを示す。第１２図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。
ＮＭＲの帰属の信号を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．３６（３Ｈ，ｓ，２’−ＣＨ３），１．４３（３Ｈ，ｓ，２’−ＣＨ３），１．７９（３Ｈ，ｂｒｓ．，２”−ＣＨ３），１．８６（３Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３”−ＣＨ３），２．９０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２ｂ−Ｈ），２．９９（１Ｈ，ｍ，２ａ−Ｈ），３．０１（１Ｈ，ｍ，４ａ−Ｈ），３．０２（１Ｈ，ｍ，４ｂ−Ｈ），３．０５（１Ｈ，ｍ，３ｂ−Ｈ），３．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，３ａ−Ｈ），３．３５（１Ｈ，ｍ，５ａ−Ｈ），３．３９（１Ｈ，ｍ，５ｂ−Ｈ），３．３９（１Ｈ，ｍ，６ｂ−Ｈ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１１．０Ｈｚ，６ａ−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，６ｂ−Ｈ），４．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，６ａ−Ｈ），４．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１ｂ−Ｈ），４．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，３’−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｂｒｓ，６ｂ−ＯＨ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１ａ−Ｈ），４．５１（１Ｈ，ｂｒｓ，２ａ−ＯＨ），４．７２（１Ｈ，ｂｒｓ，３ｂ−ＯＨ），４．８３（１Ｈ，ｂｒｓ，２ｂ−ＯＨ），４．８６（１Ｈ，ｂｒｓ，４ａ−ＯＨ），５．０３（２Ｈ，ｂｒｓ，４ｂ−ＯＨ，３ａ−ＯＨ），５．９６（１Ｈ，ｂｒｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３”−Ｈ），６．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，３−Ｈ），６．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，４’−Ｈ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，６−Ｈ），７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，５−Ｈ），７．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４−Ｈ）
第１３図に、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第１３図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１５．２（３”−ＣＨ３），２０．０（２”−ＣＨ３），２１．３（２’−ＣＨ３），２６．４（２’−ＣＨ３），５９．１（４’−Ｃ），６１．０（６ｂ−Ｃ），６９．２（６ａ−Ｃ），７０．０（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７０．４（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７３．４（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７３．７（３’−Ｃ），７３．９（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７６．１（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７６．５５（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７６．５９（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７６．８（ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｃ），７７．８（２’−Ｃ），１００．５（１ａ−Ｃ），１０３．８（１ｂ−Ｃ），１０７．７（８−Ｃ），１１２．１（３−Ｃ），１１２．１（１０−Ｃ），１１４．２（６−Ｃ），１２８．０（２”−Ｃ），１２９．８（５−Ｃ），１３６．１（３”−Ｃ），１４４．５（４−Ｃ），１５３．６（９−Ｃ），１５６．２（７−Ｃ），１５９．４（２−Ｃ），１６６．３（１”−Ｃ）
第１４図にアシタバ根部由来フラクション１９／２０−６の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第１４図において、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）、縦軸はシグナルの強度を示す。
アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６について行ったＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトン（分子量６６８）であることが確定した。
（２）実施例５−（１）で構造が確定したアシタバ根部由来フラクション１９／２０−６を試料として用い、そのＮＧＦ産生増強活性を実施例１−（２）と同様の方法で測定した。試料は最終濃度が表５に示す濃度となるように添加した。その結果、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６、すなわち４’−Ｏ−アンゲロイル−３’−Ｏ−［６−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ケラクトンにＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表５にその結果を示す。
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実施例６  ３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）のＮＧＦ産生増強活性
（１）調製例１−（１）で得られた酢酸エチル抽出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮後、クロロホルムに溶解し、全量をシリカゲルＢＷ−３００ＳＰ（富士シリシア化学社製：７５０ｍｌ）に吸着させた。次いで、ヘキサン：クロロホルム＝２：５（７５０ｍｌ）、クロロホルム（１０００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝１０：１（１１００ｍｌ）を用いて吸着物を段階的に溶出し、各溶出画分を減圧濃縮して各シリカゲル分画物を調製した。
（２）実施例６−（１）記載のクロロホルム：メタノール＝１０：１溶出画分をクロロホルム３０ｍｌに溶解し、うち１５ｍｌをシリカクロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について示す。シリカゲルにはＢＷ−３００ＳＰ（３００ｍｌ）を用いた。展開溶媒としてクロロホルム（１８００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：７（３００ｍｌ）を用い、この順に溶出を行った。次いで酢酸エチル（３００ｍｌ）で溶出後、各溶出液を減圧濃縮して各シリカカラム分画物を調製した。
（３）実施例６−（２）記載の酢酸エチル溶出画分をクロロホルム：メタノール＝５０：１（２０ｍｌ）に溶解し、シリカクロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について示す。シリカゲルにはＢＷ−３００ＳＰ（３００ｍｌ）を用いた。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝５００：１０（１２００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：１３（５００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：１９（５００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：２２（８００ｍｌ）、酢酸エチル（５００ｍｌ）を用い、この順で段階的に溶出し、１フラクションに１８ｍｌずつ分取した。得られたフラクションのフラクション番号６８から８３を集めて減圧濃縮し、１０％エタノール水溶液に溶解してフラクション６８〜８３の１０％エタノール水溶液を得た。
（４）実施例６−（３）記載の１０％エタノール水溶液を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。樹脂はコスモシール１４０  Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製：樹脂量５０ｍｌ）を用いた。展開溶媒としてそれぞれ２００ｍｌの蒸留水、１０％エタノール水溶液、２０％エタノール水溶液、３０％エタノール水溶液、５０％エタノール水溶液、エタノールを用い、この順に溶出を行い、各溶出画分を減圧濃縮し、各コスモシール分画物を調製した。
（５）実施例６−（４）の３０％エタノール水溶液溶出画分から、酢酸エチルとヘキサンを用いて再結晶を行い、化合物Ａ  ３６ｍｇを得た。
（６）実施例６−（５）で調製した化合物ＡのＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトルを実施例２−（２）と同様の方法で測定した。なお、マトリックスにはｍ−ニトロベンジルアルコールを用いた。質量分析によりｍ／ｚ  ３５５（Ｍ＋Ｈ）＋のピークを検出した。
ＮＭＲの帰属の信号を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．２５（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ３），１．３２（３Ｈ，ｓ，２−ＣＨ３），２．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４，１７．２Ｈｚ，４−Ｈ），２．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１７．２Ｈｚ，４−Ｈ），３．７０（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ），３．８５（３Ｈ，ｓ，５−ＯＣＨ３），５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，３−ＯＨ），６．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，６−Ｈ），６．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，３”−Ｈおよび５”−Ｈ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，２’−Ｈ），７．４６（１Ｈ．ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，３’−Ｈ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，７−Ｈ），７．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２”−Ｈおよび６”−Ｈ），１０．０２（１Ｈ，ｓ，４”−ＯＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ２１．６（２−ＣＨ３），２６．３（２−ＣＨ３），２７．２（４−Ｃ），５６．６（５−ＯＣＨ３），６７．８（３−Ｃ），７８．５（２−Ｃ），１０３．４（６−Ｃ），１１０．０（１０−Ｃ），１１６．８（３”−Ｃおよび５”−Ｃ），１２２．４（８−Ｃ），１２５．０（２’−Ｃ），１２６．９（１”−Ｃ），１３０．３（７−Ｃ），１３０．８（２”−Ｃおよび６”−Ｃ），１４１．９（３’−Ｃ），１５３．８（９−Ｃ），１６０．５（４”−Ｃ），１６１．５（５−Ｃ），１９０．４（１’−Ｃ）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲにおいては試料は重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシドの化学シフト値を２．５０ｐｐｍとして表した。
（７）化合物Ａについて行ったＭＳスペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）（分子量３５４）であることが確定した。
（８）実施例６−（７）で構造が確定した３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）を試料として用い、そのＮＧＦ産生増強活性を実施例１−（２）と同様の方法で測定した。試料は最終濃度が表６に示す濃度となるように添加した。その結果、３−ヒドロキシ−８−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−アクリロイル］−５−メトキシ−２−ジメチルクロマン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−［３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ａｃｒｙｌｏｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｒｏｍａｎ）にＮＧＦ産生増強活性があることが明らかになった。表６にその結果を示す。
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産業上の利用可能性
本発明によりクマリンおよび／またはクロマン骨格を有する化合物を含有するＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療等に有効な、医薬、食品、飲料または飼料が提供される。
該医薬は痴呆症または神経障害等のＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の治療剤または予防剤として有用である。また、本発明により、クマリンおよび／またはクロマン骨格を有する化合物を含有するＮＧＦ産生増強剤も提供され、該増強剤はＮＧＦの機能研究、ＮＧＦに関連する疾患用医薬のスクリーニングに有用である。
また、該食品または飲料は、日常の飲食品として摂取することにより、ＮＧＦ産生増強を必要とする疾患の症状改善等に有効に働く。従って、クマリンおよび／またはクロマン骨格を有する化合物を有効成分とする本発明の飲食品は生体の恒常性の維持に有効な機能性飲食品である。
本発明の飼料は、その有効成分によるＮＧＦ産生増強作用により動物の生体の恒常性維持に寄与しうる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アシタバ根部由来フラクション１０のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
第２図は、アシタバ根部由来フラクション１０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第３図は、アシタバ根部由来フラクション１３−２のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
第４図は、アシタバ根部由来フラクション１３−２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第５図は、アシタバ根部由来フラクション１３−２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第６図は、アシタバ根部由来フラクション１８−４のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
第７図は、アシタバ根部由来フラクション１８−４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第８図は、アシタバ根部由来フラクション１８−４の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第９図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
第１０図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第１１図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−５の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第１２図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
第１３図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第１４図は、アシタバ根部由来フラクション１９／２０−６の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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