(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号４の核酸分子；
（ｂ）配列番号５の核酸分子；
（ｃ）配列番号６の核酸分子；
（ｄ）配列番号９の核酸分子；
（ｅ）配列番号８のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）配列番号１０のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｇ）配列番号１１のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｈ）配列番号７、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１１の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加することによって配列番号７、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１１のポリペプチドから得られるポリペプチドであって、かつ哺乳動物において食物摂取を増大させる生物学的活性を有する前記ポリペプチド
をコードする核酸分子；及び
（ｉ）上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかの相補体である核酸分子
からなる群から選択される前記核酸分子。
【請求項２】
配列番号４の核酸分子。
【請求項３】
配列番号５の核酸分子。
【請求項４】
配列番号６の核酸分子。
【請求項５】
配列番号９の核酸分子。
【請求項６】
配列番号７のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項７】
配列番号８のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項８】
配列番号１０のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項９】
配列番号１１のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
ポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）適当な宿主中で、請求項１に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを発現させるステップ；及び
（ｂ）該ポリペプチドを分離するステップ
を含む前記方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号７のポリペプチド；
（ｂ）配列番号８のポリペプチド；
（ｃ）配列番号１０のポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号７、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１１の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加することによって前記（ａ）から（ｄ）のいずれかから得られるポリペプチドであって、かつ哺乳動物において食物摂取を増大させる生物学的活性を有する前記ポリペプチド
からなる群から選択される前記ポリペプチド。
【請求項２７】
アミノ末端メチオニンを有していない、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
アミノ末端メチオニンを有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
有効量の請求項２６に記載のポリペプチドを含む、哺乳動物の食物摂取を増大させるための医療用または農業用組成物。
【請求項３０】
哺乳動物に請求項２６に記載のポリペプチドを投与することを含む、ヒト以外の哺乳動物の食物摂取を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規なヒト遺伝子配列及び該遺伝子配列によりコードされるタンパク質に関する。より特定的に言えば、本発明は、選択された組織で発現し、食物摂取を増大させる、「ＡＲＴ」と称される新規な遺伝子に関する。
関連技術の説明
１．アグーティ遺伝子
アグーティ遺伝子は殆どの哺乳動物に存在するが、げっ歯動物以外の哺乳動物におけるその機能は解明されていない。アグーティ遺伝子産物は、マウス、リス及びオオカミを含む多くの動物の被毛の黒色素又は黄色素の相対的産生を調節している〔Ａ．Ｇ．Ｓｅａｒｌｅ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｏａｔ  Ｃｏｌｏｒ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９６８）〕。
マウスのアグーティ遺伝子がクローン化され、配列決定された〔Ｂｕｌｔｍａｎら，Ｃｅｌｌ，７１：１１９５−１２０４（１９９２）〕。該遺伝子は、分泌される１３１個のアミノ酸タンパク質をコードする。アグーティタンパク質は、メラニン細胞上で発現するメラノコルチン−１−受容体（「ＭＣ１ｒ」）に対する拮抗物質として作用するようである〔Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９２：２３９Ｓ−２４２Ｓ（１９８９）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：５８７−５８８（１９９３）参照〕。ＭＣ１ｒは、メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）で占められると、メラニン細胞に黒色素を合成させる（Ｊａｃｋｓｏｎ，前掲参照）。従って、アグーティがα−ＭＳＨの作用をブロックし、その結果、被毛が黄色素を有するようである〔Ｌｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３７１：７９９−８０２（１９９４）〕。
同様に、Ｗｉｌｌａｒｄら〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１２３４１−１２３４６（１９９５）〕は、部分精製されたマウスのアグーティタンパク質が、Ｂ１６Ｆ１０マウスの黒色腫細胞培養のＭＣ１受容体でα−ＭＳＨの強力な拮抗物質として作用することを証明した。アミノ酸８３でアグーティタンパク質をタンパク質分解切断すると、全長のアグーティタンパク質と同等な活性を有するＣ末端断片が生成するが、これは、アグーティタンパク質の活性ドメインが該タンパク質のＣ末端内に存在することを示唆している〔Ｗｉｌｌａｒｄら，前掲〕〕。このＣ末端断片は１０個のシステインを有する（全長の分子は１１個のシステインを有する）。
ヒトのアグーティ遺伝子は、皮膚、心臓、精巣、卵巣及び脂肪組織で発現する。このように広範な組織で発現するということは、アグーティが色素産生以外の生理過程に関与している可能性があることを示唆している〔Ｗｉｌｓｏｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．，４：２３３−２３０（１９９５）：Ｋｗｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９７６０−９７６４（１９９４）〕。
トランスジェニックマウスにおいてアグーティの過発現に起因する数種の優性表現型が確認された。該表現型には、例えば、肥満症、インスリン過剰血症、糖尿病及び高腫瘍感受性が含まれる〔Ｍａｎｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４７２１−４７２４（１９９５）参照〕。肥満症及びインスリン過剰血症の程度及び発症時期はアグーティ遺伝子の発現レベルと関連するようである（Ｍａｎｎｅら，前掲）。さらに、これらの表現型は、褐色素の過剰産生とは関連がないようである。というのは、不活性ＭＣ１受容体を有するマウスも同じ表現型を示すからである。
アグーティ遺伝子産物を過発現する突然変異マウスは、骨格筋中に高レベルの細胞内カルシウムを有している〔Ｚｅｍｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４７２８−４７３２（１９９５）〕。アグーティがこの作用を生み出すメカニズムは不明であるが、細胞内に貯蔵されたカルシウムの放出やカルシウムの流出速度の低下に起因するものではないようである。骨格筋はインスリンの取り込みに重要であり、且つ該プロセスは少なくとも部分的にカルシウムレベルにより調節されるので、この高レベルの細胞内カルシウムはアグーティ突然変異マウスに認められるインスリン過剰血症の原因の一部を明らかにし得る。
興味深いことには、マウスのアグーティは、特異的神経伝達物質受容体又はイオンチャンネルを標的とする特定のクモ及びヘビ毒とある程度のアミノ酸配列相同性を共有している〔Ｍａｎｎｅら，前掲；Ｉｃｈｉｄａら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１８：１１３７−１１４４（１９９３）；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏら，Ｔｏｘｉｃｏｎ，３３：８３−９３（１９９５）〕。この相同性は主として、該毒素とアグーティが８個のシステイン残基を共有するアグーティタンパク質のＣ末端に限られている。毒素では、これらのシステイン残基は、毒素活性に決定的な４個のジスルフィド結合を形成している。三次元ＮＭＲを用いた構造活性関係の分析により、カルシウムチャンネルのブロックに必要な三次構造の形成にはジスルフィド結合が必要であることが予言される〔Ｋｉｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：６５９−６７２（１９９５）〕。
アグーティとクモ及びヘビ毒素とのアミノ酸配列相同性や、アグーティを過発現する突然変異マウスから得られた結果から、アグーティがメラノコルチン受容体又は特定タイプのカルシウムチャンネルタンパク質の活性を調節する分子の新規クラスの一員であり得ることが示唆された（Ｍａｎｎｅら，前掲）。
２．メラノコルチン受容体
ヒトには、現在、ＭＣ１ｒ−ＭＣ５ｒとして知られている５種の既知メラノコルチン受容体が存在する。このうちの２種、ＭＣ１ｒ及びＭＣ２ｒは、それぞれリガンドα−ＭＳＨ及びＡＣＴＨに対し相対的特異性を示す。ＭＣ１ｒ及びＭＣ２ｒはそれぞれメラニン細胞及び副腎で発現する〔Ｍｏｕｎｔｊｏｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１２４８−１２５１（１９９２）〕。ＭＣ３ｒは特定の脳領域で発現するが、ＭＣ４ｒはより広範に脳全体で発現し、ＭＣ５ｒは多くの末梢組織で発現する〔Ｒｏｓｅｌｌｉ−Ｒｅｙｆｕｓｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８８５６−８８６０（１９９３）；Ｍｏｕｎｔｊｏｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，前掲；Ｌａｂｂｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：４５４３−４５４９（１９９４）〕。ＭＣ３ｒ、ＭＣ４ｒ及びＭＣ５ｒのリガンド及び生物学的機能は現在のところ不明である。
最近、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）をラットの脳に注入すると食事応答を刺激するという観察により、肥満症の中枢性制御におけるメラノコルチン受容体の役割が示唆された〔Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９６）〕。ＭＣＨはアグーティとのアミノ酸配列相同性を有してはいないが、抗ＭＣＨ抗体もアグーティ上のエピトープを認識し、さらにＭＣＨはＭＣ１受容体で拮抗活性を示す。
アグーティ及びＭＣＨの関与が示唆されている生理的障害及び疾患（肥満症、インスリン過剰血症、糖尿病）の多様性や、アグーティ及びＭＣＨがＭＣ受容体を拮抗するという事実を考慮すると、上記障害に関与し得る関連遺伝子及びタンパク質を同定・分析する方法が当業界で必要とされる。
従って、本発明の目的は、直接又は間接に、メラノコルチン受容体シグナル伝達、細胞内カルシウムレベル、及び／又は体脂肪組成（例えば、脂肪組織のレベル及び／若しくは分布、循環性グルコースレベル、並びに／又はインスリンレベル）を調節し得る化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、食物摂取を増大させ得る化合物を提供することである。
上記及び他の目的は当業者には容易に明らかであろう。
発明の要旨
本発明は、１つの実施態様において、
（ａ）配列番号４の核酸配列；
（ｂ）配列番号５の核酸配列；
（ｃ）配列番号６の核酸配列；
（ｄ）配列番号９の核酸配列；
（ｅ）配列番号８のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）配列番号１０のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｇ）配列番号１１のポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｈ）配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１のポリペプチドと少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；及び
（ｉ）上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかの相補体である核酸分子
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明は、別の実施態様において、上記群から選択される核酸分子を含むベクター、及び該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに別の実施態様において、ＡＲＴポリペプチドの製造方法を提供し、該方法は、
（ａ）上記群から選択される核酸（該核酸は適当な宿主中に挿入されている）によりコードされるポリペプチドを発現させるステップ；及び
（ｂ）該ポリペプチドを分離するステップ
を含む。
本発明はさらに、
（ａ）配列番号７のポリペプチド；
（ｂ）配列番号８のポリペプチド；
（ｃ）配列番号１０のポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のポリペプチド；及び
（ｅ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと７０％相同であるポリペプチド
からなる群から選択されるＡＲＴポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、アミノ末端メチオニンを有していても有していなくてもよい。
本発明は他の１つの実施態様において、哺乳動物にＡＲＴポリペプチドを投与することを含む、哺乳動物の食物摂取を増大させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び１Ｂは、ヒトＡＲＴのゲノムＤＮＡ配列を示している（配列番号４）。
図２は、ヒト脳組織由来のＡＲＴ  ｃＤＮＡを示している（配列番号５）。
図３は、ヒト末梢組織由来のＡＲＴ  ｃＤＮＡを示している（配列番号６）。
図４は、ヒトＡＲＴ  ｃＤＮＡの翻訳された全長アミノ酸配列を示している（配列番号７）。
図５は、切断されたヒトＡＲＴポリペプチドを示している（配列番号８）。
図６は、示されている種々のヒト組織のノーザンブロットを示している。該ブロットは、実施例に記載のようにＡＲＴ  ｃＤＮＡを用いてプローブ検出した。
図７は、エキソン２（最初のコードエキソン）で出発し、さらにエキソン３及び４並びに対応イントロンを含むマウスゲノムＤＮＡを示している（配列番号９）。
図８は、マウスＡＲＴ  ｃＤＮＡの翻訳された全長アミノ酸配列を示している（配列番号１０）。
図９は、ヒトＡＲＴ遺伝子多型性のアミノ酸配列を示している。該図で明らかなように、この多型性配列では、４５位のアミノ酸（図４ではＬｅｕ）はＰｒｏである。
図１０は、ヒトＡＲＴポロペプチドを注射したラットの採食挙動パターンのグラフである。Ｘ軸は、ＡＲＴ注射後の食物の摂取を測定した時間を表し、Ｙ軸は、消費された食物の累積量（ｇ）を表す。ラットには、ＰＢＳのみ（対照）か、「非折りたたみ」ＡＲＴ（対照）か、約２μｌ容量中０．０７５、０．３、３．０又は７．５ｎｍｏｌの折りたたみＡＲＴのいずれかを注射した。標準誤差を表す棒が示されている。適合するところにはデータの統計的分析が、*＝ｐｓ＜０．００６−０．０００１対ＰＢＳ、及び＃＝ｐｓ＜０．０１−０．００１対非折りたたみＡＲＴとして示されている。
発明の詳細な説明
本明細書において、核酸分子の記載に用いられている用語「ＡＲＴ」とは、（ａ）配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその断片；（ｂ）配列番号４、配列番号５又は配列番号６のいずれかによってコードされるポリペプチドと、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上一致しているポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子又はその断片；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の天然対立遺伝子変異体である核酸分子又はその断片；及び／又は上記（ａ）〜（ｄ）に相補的な核酸分子又はその断片を指す。
配列一致率は、２種のポリペプチドのアミノ酸位置の類似性の比較に一般に用いられている標準法により決定し得る。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのコンピュータープログラムを用い、２種のポリペプチドを（一方若しくは両方の配列の全長に沿って、又は一方若しくは両方の配列の所定部分に沿って）それぞれのアミノ酸の最適なマッチングが得られるように整列させる。該プログラムにより、「デフォールト」オープニングペナルティー及び「デフォールト」ギャップペナルティーが得られ、該コンピュータープログラムと連係して、ＰＡＭ２５０などのスコアリングマトリックス〔標準スコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５巻，ｓｕｐｐ．３（１９７８）参照〕を用い得る。その場合、一致率は以下のように計算し得る：
0004219404.tif 000002
７０％以上一致しているポリペプチドは、典型的には１個以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有している。通常、置換は、タンパク質の全体的な実効電荷、極性又は疎水性に殆ど又は全く影響を与えないように保存性（conservative）である。保存性置換を以下の表Ｉに記載する。
0004219404.tif 000003
用語「緊縮条件」とは、オリゴヌクレオチドなどの核酸分子又はｃＤＮＡ分子のプローブと高度に相同性の配列との結合のみを可能にする条件下でのハイブリダイゼーション及び洗浄を指す。１種の緊縮洗浄溶液は、５５〜６５℃の温度で用いられる、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５Ｍ  クエン酸ナトリウム及び０．１％ＳＤＳである。別の緊縮洗浄溶液は、５０〜６５℃の温度で用いられる、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングにオリゴヌクレオチプローブを用いる場合、以下の緊縮洗浄条件を用い得る。第１のプロトコルでは、オリゴヌクレオチドプローブの長さに応じて、３５〜６２℃の温度で０．０５％ピロリン酸ナトリウムを含む６×ＳＳＣを用いる。例えば、１４塩基対のプローブは３５〜４０℃で、１７塩基対のプローブは４５〜５０℃で、２０塩基対のプローブは５２〜５７℃で、また２３塩基対のプローブは５７〜６３℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高度に出現する場合には、温度を２〜３℃上げてもよい。第２のプロトコルでは、オリゴヌクレオチドプローブの洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を用いる。１種の緊縮洗浄溶液は、３Ｍ  ＴＭＡＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び０．２％ＳＤＳである。該溶液を用いて洗浄する場合の温度は、プローブの長さの関数である。例えば、１７塩基対のプローブは約４５〜５０℃で洗浄する。
本明細書に用いられている用語「ＡＲＴタンパク質」又は「ＡＲＴポリペプチド」とは、本明細書でＡＲＴについて記載した特性を有する任意のタンパク質又はポリペプチドを指す。該ＡＲＴポリペプチドは、製造法によって、アミノ末端メチオニンを有していても有していなくてもよい。例えば、ＡＲＴタンパク質又はＡＲＴポリペプチドには、上記項目（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸分子及び該分子由来のペプチド若しくはポリペプチド断片によりコードされるアミノ酸配列、配列番号７若しくは８に記載のアミノ酸配列、並びに／又は本明細書に提供されているその化学修飾誘導体や核酸及び／若しくはアミノ酸配列変異体を含む。
本明細書に用いられている用語「ＡＲＴ断片」とは、天然ＡＲＴタンパク質の全長アミノ酸配列より短いが、上記ＡＲＴポリペプチド又はＡＲＴタンパク質と実質的に同じ生理活性を有するペプチド又はポリペプチドを指す。そのような断片は、アミノ末端、カルボキシ末端及び／又は内部で切断し得、且つ化学修飾し得る。ＡＲＴ断片は少なくとも全10個のＣ末端システイン残基を保有するカルボキシ末端断片であるのが好ましい。そのようなＡＲＴ断片は、アミノ末端メチオニンを含むか又は含まずに作製し得る。好ましいＡＲＴ断片は配列番号８に記載のものである。
本明細書に用いられている用語「ＡＲＴ誘導体」又は「ＡＲＴ変異体」とは、（１）例えば、ポリエチレングリコール若しくは他の化合物を付加することにより化学修飾されたＡＲＴポリペプチド若しくはＡＲＴタンパク質並びに／又は（２）１個以上の核酸又はアミノ酸配列の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むＡＲＴポリペプチド若しくはＡＲＴタンパク質を指す。
本明細書に用いられている用語「生理活性ポリペプチド」及び「生理活性断片」とは、ＡＲＴ活性を有する（即ち、メラノコルチン受容体のシグナル伝達活性を調節し得、細胞内カルシウムレベルを調節し得、且つ／又は脂質代謝を調節し得る）ペプチド又はポリペプチドを指す。
本明細書に用いられている用語「有効量」及び「治療上有効量」とは、上記のようなＡＲＴの１種以上の生理活性の支持に必要なＡＲＴの量を指す。
本発明の実施に用いられるＡＲＴポリペプチドは、天然の全長ポリペプチド、又は切断されたポリペプチド若しくはペプチド（即ち、「断片」）であってよい。該ポリペプチド又は断片は、以下に記載のように、化学修飾、即ち、グリコシル化、リン酸化し得、且つ／又はポリマーに結合し得、製造法に応じて、アミノ末端メチオニンを有し得る。さらに、該ポリペプチド又は断片は、天然ＡＲＴポリペプチドの変異体であってよい（即ち、天然ＡＲＴと比較して、１個以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換を含み得る）。
全長ＡＲＴポリペプチド又はその断片は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）〕及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら編〔Ｃｕｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）〕に記載のものなどの周知の組換えＤＮＡテクノロジー法を用いて製造し得る。ＡＲＴタンパク質又はその断片をコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、例えば、ゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするか、又はＰＣＲ増幅により得ることが出来る。あるいは、ＡＲＴポリペプチド又は断片は、Ｅｎｇｅｌｓら〔Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）〕により記載のものなどの当業者には周知の方法を用い化学合成法に従って製造し得る。これらの方法には、特に、核酸を合成するためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法及びＨ−ホスホネート法が含まれる。そのような化学合成に好ましい方法は、標準ホスホロアミダイト化学を用いるポリマー支持合成法である。ＡＲＴポリペプチドをコードするＤＮＡは、典型的には、数百個のヌクレオチドの長さである。約１００ヌクレオチドより大きい核酸は、上記方法を用い、複数の断片として合成し得る。次いで、該断片を連結して、全長ＡＲＴポリペプチドを形成し得る。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。このメチオニンは、宿主細胞中で産生されたポリペプチドが該細胞から分泌されるか否かによって、成熟形態のＡＲＴポリペプチド上に存在する場合も存在しない場合もあり得る。
天然ＡＲＴの核酸及び／又はアミノ酸変異体を製造することが望ましい場合がある。（１個以上のヌクレオチドが野生型又は天然ＡＲＴとは異なるように設計されている）核酸変異体は、プライマーが所望の点変異を有する部位指向突然変異誘発又はＰＣＲ増幅を用いて製造し得る（突然変異誘発法の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲、及びＡｕｓｕｂｅｌら，前掲を参照されたい）。そのような変異体の製造には、Ｅｎｇｅｌｓら，前掲により記載された方法を利用することもできる。当業者には公知の他の方法を用いてもよい。好ましい核酸変異体は、ＡＲＴの産生に用いられる宿主細胞中でのコドン優先をもたらすヌクレオチド置換を含むものである。他の好ましい変異体は、野生型とは対比的に、保存性アミノ酸置換（例えば、天然アミノ酸側鎖の電荷又は極性が、別のアミノ酸で置換しても実質的に変わらない）をコードするもの、並びに／又はＡＲＴ上で新規なグリコシル化及び／若しくはリン酸化部位を生成するように設計されたもの、又は、ＡＲＴ上に存在するグリコシル化及び／若しくはリン酸化部位を欠失させるように設計されたものである。
ＡＲＴ遺伝子又はｃＤＮＡは、宿主細胞中で発現させるために適切な発現ベクター中に挿入し得る。該ベクターは、用いられる特定の宿主細胞において機能性である（即ち、該ベクターは、ＡＲＴ遺伝子の増幅及び／又は該遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞機構と適合し得る）ように選択される。ＡＲＴポリペプチド又はその断片は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）及び／又は真核宿主細胞中で増幅／発現し得る。宿主細胞の選択は、少なくとも部分的には、ＡＲＴポリペプチド又はその断片がグリコシル化されるか否かに依存する。グリコシル化される場合、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞が好ましい。酵母細胞は、ポリペプチドをグリコシル化し、昆虫及び哺乳動物細胞は、ＡＲＴポリペプチド上で天然に生起するようにポリペプチドをグリコシル化及び／又はリン酸化（即ち、「天然」グリコシル化及び／又はリン酸化）し得る。
典型的には、どの宿主細胞にも用いられるベクターは、５′フランキング配列（「プロモーター」とも称される）や、エンハンサー、複製起点成分、転写終結成分、供与及び受容スプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位成分、ポリアデニル化配列、発現させるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカー成分などの他の調節成分を含む。各成分については以下で説明する。該ベクターは、場合によって、「標識」配列、即ち、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）をコードするＡＲＴコード配列又は別の小さい免疫原性配列の５′末端又は３′末端に位置するオリゴヌクレオチド配列を含み得る。この標識はタンパク質と一緒に発現し、宿主細胞からＡＲＴポリペプチドを精製するための親和性標識としての役割を果たし得る。場合により、該標識は、その後で、例えば選択されたペプチダーゼを用いるものなどの種々の手段により精製されたＡＲＴポリペプチドから除去し得る。
５′フランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同種及び／又は同株由来）でも、異種（即ち、宿主細胞種又は株以外の種由来）でも、ハイブリッド（即ち、２種以上の起源由来の５′フランキング配列の組み合わせ）配列でも、合成配列であってもよいし、あるいは天然ＡＲＴ５′フランキング配列であってもよい。従って、５′フランキング配列源は、該配列が宿主細胞機構において機能性であり且つ該機構により活性化され得る限り、いずれの単細胞原核若しくは真核生物でも、いずれの有脊椎又は無脊椎動物でも、いずれの植物であってもよい。
本発明のベクターにおいて有用な５′フランキング配列は、当業界で周知のいくつかの方法のいずれによっても得ることができる。典型的には、ＡＲＴの５′フランキング配列以外の本発明に有用な５′フランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化により既に同定されているであろうし、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から分離し得る。５′フランキング配列の全ヌクレオチド配列が公知である場合もあり得る。その場合、該５′フランキング配列は、上記の核酸合成法又はクローニング法を用いて合成し得る。
５′フランキング配列の全部又は一部のみが知られている場合、該配列は、ＰＣＲを用いるか、並びに／あるいはゲノムライブラリーを適当なオリゴヌクレオチド及び／又は同種若しくは異種由来の５′フランキング配列断片でスクリーニングすることにより得られる。
５′フランキング配列がわからない場合、５′フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えば、コード配列又は別の１種若しくは複数種の遺伝子を含み得る大きいＤＮＡ断片から分離し得る。分離は、慎重に選択された１種以上の酵素を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化して、適切なＤＮＡ断片を分離することにより実施し得る。消化後、アガロースゲル精製法、Ｑｉａｇｅｎ▲Ｒ▼カラム又は当業者には公知の他の方法を用いて目的の断片を分離し得る。この操作に適した酵素の選択は、当業者には用意に明らかであろう。
複製起点成分は、典型的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞中の該ベクターの増幅を促進する。該ベクターを特定のコピー数まで増幅することがＡＲＴポリペプチドの最適な発現に重要である場合がある。選択されたベクターが複製起点部位を含んでいない場合、該部位は、既知配列に基づいて化学合成し、該ベクター中に連結し得る。
転写終結成分は、典型的には、ＡＲＴポリペプチドコード配列の３′末端に位置し、ＡＲＴポリペプチドの転写を終結させる役割を果たす。通常、原核細胞中の転写終結成分はポリＴ配列が後に続くＧ−Ｃに富む断片である。該成分はライブラリーから容易にクローン化し得るし、ベクターの一部として市販されているものさえあるが、該成分は、先に記載のものなどの核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子成分は、選択培地中で増殖される宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン若しくはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥を補うタンパク質、又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。
一般にシャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）と称されているリボソーム結合成分は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要なものである。該成分は、典型的には、プロモーターに対して３′位置、合成すべきＡＲＴポリペプチドのコード配列に対して５′位置に存在する。シャイン・ダルガーノ配列は様々であるが、典型的には、ポリプリン（即ち、高Ａ−Ｇ含量を有する成分）である。多くのシャイン・ダルガーノ配列が同定されているが、該配列はいずれも上記方法を用いて容易に合成し得、原核生物ベクター中で用い得る。
ＡＲＴを宿主細胞から分泌させるのが望ましい場合には、シグナル配列を用いてＡＲＴポリペプチドが合成される宿主細胞から該ポリペプチドを誘導し得る。シグナル配列は、典型的には、ＡＲＴ核酸配列のコード領域に位置するか、又は直接ＡＲＴコード領域の５′末端に位置し得る。多くのシグナル配列が同定されているが、選択される宿主細胞中で機能性であれば、どのシグナル配列でもＡＲＴ遺伝子と一緒に用い得る。従って、シグナル配列はＡＲＴポリペプチドに対して同種であっても異種であってもよく、上記方法を用いて化学修飾し得る。殆どの場合、シグナルペプチドの存在を介して宿主細胞からポリペプチドを分泌させると、ポリペプチドからアミノ末端メチオニンが除去される。
多くの場合、ベクター上に１個以上のイントロンが存在するとＡＲＴポリペプチドの転写が増強される。これは特に真核宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞の場合に当てはまる。イントロンは、特に用いられるＡＲＴ配列が全長のゲノム配列又はその断片である場合に、ＡＲＴ核酸配列内で自然に発生する。（殆どのｃＤＮＡの場合のように）イントロンがＡＲＴ  ＤＮＡ配列内で自然発生しない場合、イントロンは別の供給源から得ることができる。５′フランキング配列及びＡＲＴコード配列に関するイントロンの位置は、イントロンが効果的であるように転写されなければならないので重要である。従って、ＡＲＴ核酸配列がｃＤＮＡ配列の場合、好ましいイントロンの位置は、転写開始部位に対して３′位置、且つポリＡ転写終結配列に対して５′位置である。ＡＲＴ  ｃＤＮＡの場合、イントロンはＡＲＴコード配列に干渉しないように、該コード配列のどちらか一方の末端（即ち、５′末端又は３′末端）に位置するのが好ましい。任意のウイルス性、原核性及び真核性（植物又は動物）生物を含めた任意の起源由来のどのイントロンも、該イントロンが挿入される宿主細胞と適合し得る限り、本発明の実施に用い得る。本発明には合成イントロンも包含される。場合により、ベクター中に１個以上のイントロンを用い得る。
用いるべきベクター中に１種以上の上記成分がまだ存在していない場合、該成分を個別に得て、ベクターに連結し得る。それぞれの成分を得るのに用いられる方法は当業者には周知であり、上記方法（即ち、ＤＮＡ合成法、ライブラリーのスクリーニング法など）と類似のものである。
本発明の実施に用いられる最終ベクターは、典型的には、市販のベクターなどの出発ベクターから構築する。そのようなベクターは、完成ベクターに含まれるべき成分の一部含んでいても含んでいなくてもよい。出発ベクター中に所望の成分が全く存在していない場合、連結すべき成分の末端とベクターの末端とが連結に適合し得るように、該ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断して、各成分を個別にベクターに連結し得る。満足すべき連結が得られるように、連結すべき末端を「平滑にする」ことが必要な場合があり得る。平滑化は、先ず、全４個のヌクレオチドの存在下にクレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて「付着末端」を充填して行う。この手順は当業界では周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に記載されている。
あるいは、先ず、ベクターに挿入すべき２種以上の成分を互いに連結し（該成分が互いに隣接するように配置される場合）、次いで、ベクターに連結し得る。
ベクターの他の構築法の１つは、１種の反応混合物中で種々の成分を全て同時に連結するものである。この場合、成分の不適切な連結又は挿入により、多くのナンセンス又は非機能性ベクターが生成するが、制限エンドヌクレアーゼ消化により、機能性ベクターを同定・選択し得る。
本発明の実施に好ましいベクターは、細菌、昆虫及び哺乳動物宿主細胞に適合し得るものである。そのようなベクターには、特に、ｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃII；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
ベクターを構築し、ＡＲＴ核酸を該ベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを増幅及び／又はＡＲＴポリペプチド発現に適した宿主細胞に挿入し得る。
宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば、大腸菌）でも、真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞又は有脊椎細胞）でもよい。宿主細胞は、適切な条件下に培養すると、ＡＲＴタンパク質を合成し得る。次いで、該タンパク質を培地から回収する（宿主細胞が培地中に該タンパク質を分泌する場合）か、又は直接該タンパク質を産生する宿主細胞から合成し得る（該タンパク質が分泌されない場合）。回収後、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法を用い、ＡＲＴタンパク質を精製し得る。
宿主細胞の選択は、部分的には、ＡＲＴタンパク質がグリコシル化されるか又はリン酸化（この場合、真核宿主細胞が好ましい）されるか、また生理活性タンパク質が細胞によって産生されるように宿主細胞が該タンパク質をその天然の三次構造（例えば、ジスルフィド架橋の適切な配向など）に「折りたたみ」得る方式に依存する。しかし、宿主細胞が生理活性ＡＲＴを合成しない場合、以下に記載のような適切な化学条件を用いて合成後にＡＲＴを「折りたたみ」得る。
適当な細胞又は細胞系は、モルモット卵巣ホルモン（ＣＨＯ）又は３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞であってよい。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物の産生及び生成に適した哺乳動物宿主細胞及び方法の選択は当業界で公知である。他の適当な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７細胞系や、ＣＶ−１細胞系である。哺乳動物宿主細胞の他の例としては、形質転換細胞系を含めた、霊長類細胞系及びげっ歯動物細胞系が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株及び初代外殖片も適当であり得る。候補細胞は、選択遺伝子中に遺伝子型の欠損があるか、又は優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適当な哺乳動物細胞系には、ＨｅＬａ、マウス  Ｌ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＴＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系が含まれるがそれらには限定されない。
本発明に適した宿主細胞として同様に有用なものは細菌細胞である。例えば、種々の大腸菌株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１）がバイオテクノロジーの分野における宿主細胞として周知である。種々の枯草菌株、シュードモナス属、他のバシラス属、ストレプトミセス属などの株もこの方法に用い得る。
当業者には公知の多くの酵母細胞株も、本発明のポリペプチドを発現させるための宿主細胞として利用し得る。さらに、所望の場合には、本発明の方法に宿主細胞として昆虫細胞を利用し得る〔Ｍｉｌｌｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：２７７−２９８（１９８６）〕。
選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」又は「トランスフェクション」とも称される）は、塩化カルシウム法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法又はＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法を用いて実施し得る。選択される方法は、部分的には用いられる宿主細胞のタイプの関数である。上記方法及び他の適当な方法は当業者には周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に記載されている。
ベクターを含む宿主細胞（即ち、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞）は、当業者には周知の標準培地を用いて培養し得る。該培地は、通常、細胞の増殖及び生存に必要な全ての栄養素を含む。大腸菌の培養に適した培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／又はＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核細胞の培養に適した培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、該培地は全て、培養される特定の細胞系が要求する血清及び／又は増殖因子を補充し得る。昆虫培養に適した培地は、必要に応じ、イーストラート、ラクトアルブミン水解物、及び／又はウシ胎児血清を補ったＧｒａｃｅの培地である。
典型的には、形質転換細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質又は他の化合物を培地の補充物質として加える。どの化合物を用いるかは、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択マーカー成分に応じて選択される。例えば、選択マーカー成分がカナマイシン耐性の場合、培地に加える化合物はカナマイシンである。
宿主細胞中で産生されるＡＲＴポリペプチドの量は、当業界で公知の標準法を用いて評価し得る。該方法には、ウエスタンブロット法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、非変性ゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分離法、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなどの活性アッセイが含まれるがそれらには限定されない。
ＡＲＴポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されている場合、大多数のポリペプチドは細胞培地中に見出されるようである。このようにして製造されたポリペプチドは、典型的には、細胞からの分泌中に除去されるために、アミノ末端メチオニンを有していない。しかし、ＡＲＴポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、該ポリペプチドは、細胞質中（真核生物、グラム陽性菌、及び昆虫宿主細胞の場合）に、又はペリプラズム中（グラム陰性菌宿主細胞の場合）に存在し、アミノ末端メチオニンを有し得る。
細胞内ＡＲＴタンパク質の場合、典型的には、先ず、機械的に又は浸透圧により宿主細胞を破壊して細胞質の内容物を緩衝溶液中に放出させる。次いで、該溶液からＡＲＴポリペプチドを分離し得る。
溶液からのＡＲＴポリペプチドの精製は、種々の方法を用いて実施し得る。該ポリペプチドがそのカルボキシル又はアミノ末端にヘキサヒスチジンなどの標識（ＡＲＴ／ヘキサヒスチジン）や他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、該ポリペプチドは、該溶液を、カラムマトリックスが標識又は直接ポリペプチドに対し高親和性を有しているアフィニティーカラム（即ち、特異的にＡＲＴを認識するモノクローナル抗体）に通して本質的に１ステッププロセスで精製し得る。例えば、ポリヒスチジンは、強力な親和力及び特異性をもってニッケルに結合し、従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎニッケルカラム）は、ＡＲＴ／ポリＨｉｓの精製に用い得る。〔例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １０．１１．８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい〕。
ＡＲＴポリペプチドが標識を有しておらず且つ抗体が利用できない場合、他の周知の精製手順を用い得る。そのような手順には、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離を組み合わせた天然ゲル電気泳動及び分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機／技術，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれるがそれらには限定されない。これらの方法を２種以上組み合わせて高純度を得る場合もある。好ましい精製法には、分取等電点電気泳動と組み合わせたポリヒスチジン標識及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
ＡＲＴポリペプチドは、主として細菌の細胞周辺腔又は真核細胞の細胞質中に見出されると予測される場合、処理されるポリペプチドが封入体（例えば、グラム陰性菌）を含む複合体を形成している場合には、当業者には公知の任意の標準法を用いて、該封入体を含むペリプラズム又は細胞質の内容物を宿主細胞から抽出し得る。例えば、フレンチプレス、ホモジナイゼーション及び／又は音波処理により宿主細胞を溶解して、ペリプラズムの内容物を放出させ得る。次いで、ホモジネートを遠心分離し得る。
ＡＲＴポリペプチドがペリプラズム中の封入対を形成している場合、該封入体はしばしば内部及び／又は外部細胞膜に結合し得、従って、遠心分離後には主としてペレット物質として見出される。次いで、該ペレット物質を、グアニジン又は尿素などのカオトロピック物質で処理して、封入体を放出、破壊、可溶化し得る。次いで、可溶性形態となったＡＲＴポリペプチドを、ゲル電気泳動法、免疫沈降法などを用いて分析し得る。ＡＲＴポリペプチドの分離が望ましい場合には、以下に記載の方法及びＭａｒｓｔｏｎら〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）〕などの標準法を用いて分離し得る。
宿主細胞のペリプラズム中でＡＲＴポリペプチド封入体が有意には形成されていない場合、細胞ホモジネートを遠心分離した後では、ＡＲＴポリペプチドは主として上清中に見出され、以下に記載のものなどの方法を用い、上清から分離し得る。
ＡＲＴポリペプチドを部分的又は完全に分離することが望ましい状況では、当業者には周知の標準法を用い、精製を実施し得る。そのような精製法には、電気泳動及びその後の電気溶離による分離、種々のタイプのクロマトグラフィー（イムノアフィニティー、モレキュラーシーブ及び／若しくはイオン交換）、並びに／又は高性能液体クロマトグラフィーが含まれるがそれらには限定されない。精製を完全にするために、上記方法を１種以上用いることが好ましい場合もあり得る。
ＡＲＴポリペプチド、その断片及び／又は誘導体は、組換えＤＮＡ法を用いたＡＲＴポリペプチドの製造・精製に加えて、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６４）〕、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５）〕や、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ〔Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）〕により記載のものなどの当業界で公知の方法を用い、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成法）によって製造し得る。そのようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを有するか又は有さずに合成され得る。化学合成されたＡＲＴポリペプチド又はその断片を、上記文献に記載の方法を用いて酸化して、ジスルフィド架橋を形成し得る。ＡＲＴポリペプチド又はその断片は、天然の精製ＡＲＴポリペプチドの生理活性又は免疫学的置換体として治療法及び免疫法に利用し得る。
ＡＲＴポリペプチドがポリマーに結合している（「ＡＲＴ−ポリマー」）化学修飾ＡＲＴ組成物（即ち、「誘導体」）は本発明の範囲内に包含される。選択されるポリマーは、典型的には、結合対象のタンパク質が生理的環境などの水性環境中で沈降しないようにするために水溶性である。選択されるポリマーは、通常、アシル化する場合には活性エステル、アルキル化する場合にはアルデヒドなどの単一の反応性基を有するように修飾し、それによって、本発明の方法に用いられるように重合度を制御し得る。好ましい反応性アルデヒドは、水溶性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドか、そのモノＣ1−Ｃ10アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）である。該ポリマーは分枝鎖のものでも非分枝鎖のものでもよい。ポリマー混合物もＡＲＴポリマーの範囲内に包含される。最終生成物製剤を治療に用いる場合、該ポリマーは医薬上許容し得るものであるのが好ましい。水溶性ポリマー又はその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピエロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコールからなる群から選択し得る。アシル化反応の場合に選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有していなければならない。還元的アルキル化の場合に選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有している必要がある。該ポリマーは任意の分子量を有していてよく、且つ分枝鎖であっても非分枝鎖であってもよい。
ＡＲＴのペギル化〔ＰＥＧ化（pegylation）〕は、例えば、以下の参考文献：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６号；及びＥＰ０４０１３８４号に記載されているような、当業界で公知のペギル化反応のいずれかを用いて実施し得る。ペギル化は、以下に記載の、反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応又はアルキル化反応を介して行うのが好ましい。
アシル化を介したペギル化は、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エステル誘導体とＡＲＴタンパク質とを反応させることを含む。ＡＲＴのペギル化には、任意の公知又はその後で発見された反応性ＰＥＧ分子を用い得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）にエステル化されたＰＥＧである。「アシル化」は、本明細書では、ＡＲＴと水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）との以下のタイプの結合体：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）に記載されているような、アミド、カルバメート、ウレタンなどを含むがそれらには限定されないものとする。反応条件は、ペギル化法において公知のもの又はその後で開発されたものから選択し得るが、但し、修飾すべきＡＲＴ種を不活化するような温度、溶媒及びｐＨなどの条件は回避する。
アシル化を介してペギル化すると、通常、リシン  ε−アミノ基はアシル結合基を介してペギル化されたポリペギル化ＡＲＴ生成物が生成する。連結結合基はアミドであるのが好ましい。また、得られた生成物が、約９５％以上、モノ−、ジ−又はトリペギル化されているのが好ましい。しかし、通常、より高度に（ＡＲＴの最大数のリシン  ε−アミノ酸基＋ＡＲＴのアミノ末端の１個のα−アミノ基まで）ペギル化された種が、用いいられる特定の反応条件に応じた量で形成される。所望なら、特に、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び電気泳動を含めた標準的な精製法により、高度に精製されたペギル化種を、混合物、特に反応しなかった種から分離することができる。
アルキル化を介したペギル化は、一般に、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＡＲＴなどのタンパク質を還元剤の存在下に反応させることを含む。ペギル化の程度には関係なく、ＰＥＧ基は−ＣＨ2−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合するのが好ましい。特に−ＣＨ2−基に関して、このタイプの結合を、本明細書では「アルキル」結合と称する。
還元的アルキル化を介して誘導体化してモノペギル化生成物を製造することにより、ＡＲＴの誘導体化に利用し得る異なるタイプの第１級アミノ基（リシン対Ｎ末端）が得られる。該反応は、典型的には、タンパク質のリシン残基のε−アミノ基とＮ末端残基のα−アミノ基とのｐＫaの差を利用し得るｐＨ（以下参照）で行う。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含む水溶性ポリマーとタンパク質との結合が制御される。該ポリマーとの結合は、主としてタンパク質のＮ末端で、リシン側鎖アミノ基などの他の反応性基を有意に修飾することなく生起する。本発明は、〔ポリマー分子が実質的にＡＲＴタンパク質の単一位置においてのみ（即ち、約９５％以上）結合しているＡＲＴタンパク質を意味する〕ＡＲＴ−モノポリマータンパク質結合体分子を提供する。より特定的に言えば、ポリエチレングリコールを用いるならば、本発明はさらに、恐らく抗原性結合基を欠き、且つＡＲＴタンパク質に直接結合したポリエチレングリコール分子を有するペギル化ＡＲＴタンパク質を提供する。
本発明に用いるのに特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（略号ＰＥＧ）である。本明細書において、ポリエチレングリコールとは、モノ−（Ｃ1−Ｃ10）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどの、他のタンパク質の誘導体化に用いられているＰＥＧの形態のいずれをも包含するものと解釈される。
一般に、化学誘導体化は、生理活性物質と活性化ポリマー分子との反応に用いられる任意の適当な条件下に実施し得る。ペギル化ＡＲＴの製造法は、一般に、（ａ）ＡＲＴと１個以上のＰＥＧ基とが結合状態になるような条件下に、ＡＲＴポリペプチドとポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）を反応させるステップ、及び（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知パラメーターと所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比率が大きくなればなるほど、ポリペギル化生成物の比率も高くなる。
モノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体分子の実質的に均一な集団を生成するための還元的アルキル化は、一般に、（ａ）還元的アルキル化条件下に、ＡＲＴタンパク質のアミノ末端のα−アミノ基の選択的修飾に適したｐＨで、ＡＲＴタンパク質と反応性ＰＥＧ分子を反応させるステップ；及び（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。
モノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体分子の実質的に均一な集団を得るための還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分がＡＲＴのＮ末端に選択的に結合し得るものである。そのような反応条件により、一般に、リシンアミノ基と、Ｎ末端のα−アミノ基との間にｐＫａの差が生じる（該ｐＫａはアミノ基の５０％をプロトン化し、あとの５０％はプロトン化しないｐＨである）。ｐＨはさらに、用いられるポリマーとタンパク質との比率にも影響を与える。一般に、ｐＨが低い場合には、タンパク質に対して大過剰のポリマーを用いるのが望ましい（即ち、最適な条件を得るには、反応性Ｎ末端α−アミノ基が少ないほど、より多くのポリマーが必要となる）。ｐＨが高い場合には、ポリマー：タンパク質比をそれ程大きくする必要がない（即ち、より多くの反応性基が利用可能であれば、必要とされるポリマー分子の量が少なくなる）。本発明の場合、ｐＨは一般に、３〜９の範囲、好ましくは３〜６の範囲内に含まれる。
考慮すべき別の重要な点はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合し得るポリマー分子の数が少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化する際には、ポリマーの分岐度も考慮する必要がある。通常、分子量（又は分岐度）が高いほど、ポリマー：タンパク質比も高くなる。本発明が企図するペギル化反応に関して、一般に好ましい平均分子量は、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（用語「約」とは±１ｋＤａを意味する）である。好ましい平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、特に好ましいのは、約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマーとＡＲＴタンパク質の比率は、一般に、１：１〜１００：１、好ましくは、（ポリペギル化の場合は）１：１〜２０：１であり、（モノペギル化の場合は）１：１〜５：１である。
上記条件を用いて還元的アルキル化を行うと、ポリマーとアミノ末端にα−アミノ基を有するＡＲＴタンパク質との選択的結合が得られ、且つモノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体の実質的に均一な調合物が得られる。本明細書に用いられている用語「モノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体」とは、ＡＲＴタンパク質分子と該分子に結合した単一のポリマー分子とからなる組成物を意味する。モノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体は、ポリマー分子がリシンアミノ側基上ではなく、Ｎ末端に位置するのが好ましい。該調合物は、好ましくは、９０％を超えるモノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体、より好ましくは、９５％を超えるモノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体を含み、残りの観察可能な分子は反応しなかったもの（即ち、ポリマー部分を欠くタンパク質）である。以下の実施例は、約９０％以上がモノポリマー／タンパク質結合体であり、約１０％が反応しなかったタンパク質である調合物を提供する。モノポリマー／タンパク質結合体は生理活性を有する。
本発明の還元的アルキル化の場合、還元剤は水溶液中で安定である必要があり、且つ還元的アルキル化の初期過程で形成されるシッフ塩基のみを還元し得るのが好ましい。好ましい還元剤は、ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びピリジンボランからなる群から選択し得る。特に好ましい還元剤はシアノホウ水素化ナトリウムである。
溶媒、反応時間、温度などの他の反応パラメーターや、生成物の精製法は、水溶性ポリマーを用いたタンパク質の誘導体化に関する公開情報に基づいて決定し得る。
ポリマー−ＡＲＴタンパク質結合体分子の混合物は、上記のように、アシル化及び／又はアルキル化法に従って製造し得、混合物中に含まれるモノポリマー／タンパク質結合体の割合を選択し得る。従って、望ましい場合には、種々のタンパク質と該タンパク質に結合している種々の数（即ち、ジ−、トリ−、テトラ−など）のポリマー分子の混合物を製造し、本発明の方法を用いて製造したモノポリマー／ＡＲＴタンパク質結合体物質と組み合わせ得る。
一般に、本発明のポリマー／ＡＲＴを投与することにより軽減又は緩和し得る状態には、ＡＲＴ分子について本明細書に一般的に記載されているものが含まれる。しかし、本明細書に開示されているポリマー／ＡＲＴ分子は、非誘導体化分子に比べて、さらなる活性、亢進若しくは低減された活性、又は他の特性を有し得る。
それ自体では活性アッセイにおいて活性であるポリペプチドをコードしないＡＲＴ核酸分子、その断片および／又は誘導体は、哺乳動物組織又は体液試料中のＡＲＴ  ＤＮＡ又はＲＮＡの存在を質的又は量的にテストする診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
それ自体では活性アッセイにおいて活性ではないＡＲＴポリペプチド断片及び／又は誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＲＴ受容体のモジュレーター（例えば、阻害剤又は賦活剤）として、又はＡＲＴポリペプチドに対する抗体の産生に有用であり得る。
ＡＲＴポリペプチド及びその断片は、化学修飾されているか否かに拘わらず、単独か、又は、例えば、神経栄養性因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬、神経伝達物質受容体作動薬若しくは拮抗薬、及び／又は抗体などの他の医薬組成物と組み合わせて、内分泌系障害の治療に用い得る。
ＡＲＴポリペプチド及び／又はその断片は、標準法により産生される抗体の製造に用い得る。従って、ＡＲＴポリペプチドと反応する抗体及び該抗体の反応性断片も本発明の範囲内に包含される。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、単鎖及び／又は二特異性などであってよい。抗体断片は、本発明のＡＲＴと反応し得る任意の断片、例えば、Ｆab、Ｆab′などであってよい。また、本発明により、ＡＲＴ又はその断片を抗原として選択された哺乳動物に提示し、次いで、公知方法に従って、動物の細胞（例えば、脾臓細胞）を特定のガン細胞と融合させて不死化細胞系を作出することにより得られるハイブリドーマも提供される。そのような細胞系及び本発明のヒトＡＲＴポリペプチドの全部又は一部に対して誘発される抗体の製造に用いられる方法も本発明の範囲内に包含される。
該抗体は、治療用にＡＲＴとその受容体との結合の阻害などに用い得る。該抗体はさらに、体液中のＡＲＴの存在を検出するために標識した形態などでｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用に用い得る。
治療用組成物及び投与
種々の内分泌系及び／又は神経内分泌系障害、例えば、糖質コルチコイド耐性、（遺伝性又は下垂体腫瘍、小細胞肺ガン又は副腎腫瘍による転移性コルチコトロピン産生により引き起こされる）クッシング症候群、先天性副腎過形成、視床下部下垂体軸（ＨＰＡ）の他の障害、及び／又は肥満症などを治療するための治療用組成物は本発明の範囲内に包含される。該組成物は、治療上有効量のＡＲＴポリペプチド又はその断片（いずれも化学修飾されていてよい）と医薬上許容し得る担体とを混合して含み得る。担体物質は、注射用水、好ましくは哺乳動物に投与するための溶剤に共通の他の物質を補った水であってよい。ＡＲＴ治療用化合物は、典型的には、精製タンパク質（化学修飾されていてよい）と、１種以上の生理的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤とを混合して含む組成物の形態で投与する。適切な担体の例には中性緩衝食塩液又は血清アルブミンと混合した生理食塩液がある。該生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いた凍結乾燥体として製剤するのが好ましい。望ましい場合には、他の標準的な担体、希釈剤及び賦形剤を含み得る。他の組成物の例は、ｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液又はｐＨ約４．０〜５．５のアセテート緩衝液を含むものがあり、該組成物はさらにソルビトール又はその適当な代替体を含み得る。
ＡＲＴ組成物は、非経口的に全身性投与し得る。あるいは、該組成物は、静脈内又は皮下投与し得る。全身性投与の場合、本発明に用いられる治療用組成物は、発熱物質を含まない非経口的に許容し得る水溶液形態であってよい。ｐＨ、等張性、安定性などにに留意してそのような医薬上許容し得るタンパク質溶液を製造することは当業界の技術の範囲内である。
本発明の実施に有用なＡＲＴ組成物の治療用製剤は、選択された所望の純度を有する組成物と任意の生理的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤〔Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）〕とを混合して貯蔵用に凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で製造し得る。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、受容者に対して無毒性であり且つ好ましくは用いられる用量及び濃度では不活性であり、リン酸、クエン酸又は他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストランを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含む。
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられるＡＲＴ組成物は、滅菌性でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。ＡＲＴ組成物を凍結乾燥する場合、上記方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前か後に実施し得る。非経口投与用組成物は、通常、凍結乾燥形態又は溶液状で貯蔵される。
治療用組成物は、一般に、滅菌出入口を有する容器、例えば静注溶液嚢、又は皮下注射針で穿孔し得る栓を有するバイアル中に入れる。
該組成物の投与経路は、公知方法、例えば、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳質内、筋肉内、眼内、動脈内若しくは病巣内経路を介した注射若しくは注入、あるいは、持続性放出システム又は場合によってカテーテルの使用を含み得る埋没装置による。所望の場合には、該組成物は、注入、ボーラス注入又は埋没装置を介して連続的に投与し得る。あるいは又は上記方法に加えて、ＡＲＴは、罹患領域に、ＡＲＴポリペプチドを吸収させた膜、海綿又は他の適切な物質を埋没させて局所的に投与し得る。
埋没装置を用いる場合、該装置は、例えば、脳室又は脳の実質中などの任意の適当な組織又は器官に埋め込み得、ＡＲＴは、ボーラス若しくは連続投与により、又はカテーテルを用いた連続注入により該装置を通して直接導入し得る。
ＡＲＴポリペプチドは、持続性放出組成物又は製剤の形態で投与し得る。持続性放出製剤の適当な例としては、成形品形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム又はマイクロカプセルが挙げられる。持続性放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー〔Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）〕、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）〔Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）〕、ビニル酢酸エチレン（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）、又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）が含まれる。持続性放出組成物にはさらにリポソームが含まれる。リポソームは、当業界で公知の方法〔例えば、ＤＥ３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２号；ＥＰ３６，６７６号；ＥＰ８８，０４６号；ＥＰ１４３，９４９号〕のいずれによっても製造し得る。
ｅｘ  ｖｉｖｏでＡＲＴ組成物を用いること、即ち、患者から取り出した細胞又は組織を処理し、次いで、患者に再移植すすることが望ましい場合があり得る。
（上記方法を用いた）遺伝子操作によりＡＲＴポリペプチドを発現・分泌するようにした特定の細胞を患者に移植することによりＡＲＴを導入する場合もあり得る。そのような細胞はヒト細胞であってよく、患者自身の組織由来、又はヒト若しくは非ヒトの別の起源由来であってよい。場合によって、細胞を不死化し得る。該細胞を、脳、副腎中に移植するか、又は他の体組織若しくは器官中に移植し得る。
特定の状況下には、特定の内分泌系及び／又は神経内分泌系の障害又は疾患、例えば、糖質コルチコイド耐性、（遺伝性又は下垂体腫瘍、小細胞肺ガン又は副腎腫瘍による転移性コルチコトロピン産生により引き起こされる）クッシング症候群、先天性副腎過形成、視床下部下垂体軸（ＨＰＡ）の他の障害、及び／又は肥満症などに罹患している患者にＡＲＴを投与するための遺伝子療法を用いることが望ましい場合がある。そのような状況下には、ＡＲＴ又はその断片若しくは変異体をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は合成ＤＮＡを、組成物を注入する組織において活性である構成性又は誘発性プロモーターに作動可能に結合させ得る。このＡＲＴ  ＤＮＡ構築物をそのまま脳又は他の神経組織に注射して治療し得る。
あるいは、該ＡＲＴ  ＤＮＡ構築物は、該ＡＲＴ  ＤＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、又は筋肉クレアチンキナーゼプロモーターなどの筋肉組織中で活性であるプロモーターに作動可能に結合しているならば、該構築物が細胞内に取り込まれ、該細胞で発現し得る筋肉組織中に注射し得る。該ＤＮＡ構築物は、典型的には、（ＡＲＴ  ＤＮＡ及びプロモーターの他に）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又はヘルペスウイルスベクターなどのベクターから得られるベクター配列を含み得る。該ベクター／ＤＮＡ構築物は、注射用の医薬上許容し得る担体と混合し得る。
治療に用いられるＡＲＴ組成物の有効量は、例えば、ＡＲＴが用いられる適応症などの治療目的、投与経路及び患者の状態に応じて異なる。従って、最適な治療効果が得られるように、療法士が必要に応じて用量を決めたり、投与経路を変えたりする必要がある。１日当たりの典型的な用量は、上記要素に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってよい。臨床医は、目的の効果が達成される用量に到達するまでＡＲＴ組成物を投与する。従って、ＡＲＴ組成物は、１回用量として、又は２回以上の用量（該用量は、同量のＡＲＴを含んでいても含んでいなくてもよい）として経時的に投与してもよいし、埋没装置又はカテーテルを介して連続注入してもよい。
さらに研究を進めるに従い、種々の患者における種々の状態の治療に要する適切な用量レベルに関する情報が出てくるであろうし、通常の技術を有するものであれば、治療状況、治療中の障害のタイプ、受容者の年齢及び全般的な健康を考慮して、適切な投薬量を決定し得るであろう。一般に、用量は、体重１ｋｇ当たり、０．０１μｇ（化学修飾されていないタンパク質のみの量を計算した場合）〜３００μｇ（同様な基準に基づく）の範囲であろう。
ＡＲＴタンパク質、その断片及び／又は誘導体は、ＡＲＴの発現パターンの改変に関連し得るか又はＡＲＴ若しくは抗ＡＲＴ抗体に暴露された場合に有利であり得る内分泌系の疾患又は障害の治療に用い得る。
ＡＲＴタンパク質、及び／又はその断片若しくは誘導体は、内分泌系及び／又は神経系の種々の細胞が変性しているか及び／又は先天性障害、外傷、手術、卒中、虚血、感染症、代謝性障害、栄養失調、悪性及び／又は毒性物質により損傷を受けた患者の治療に用い得る。
本発明の他の実施態様において、ＡＲＴタンパク質及び／又はその断片若しくは誘導体は、内分泌系及び／又は神経内分泌系の障害又は疾患、例えば、糖質コルチコイド耐性、（遺伝性又は下垂体腫瘍、小細胞肺ガン又は副腎腫瘍による転移性コルチコトロピン産生により引き起こされた）クッシング症候群、先天性副腎過形成、視床下部下垂体軸（ＨＰＡ）の他の障害、及び／又は肥満症などの治療に用い得る。さらに、ＡＲＴ組成物は、細胞内カルシウムレベルの調節にも有用であり得る。
さらに、ＡＲＴタンパク質又はそのペプチド断片若しくは誘導体は、組織移植が示唆される疾患の治療において、組織の移植手術と連係して用い得る。
以下の実施例は、本発明の例示を目的とするに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
実施例
実施例１：  ヒトＡＲＴ  ｃＤＮＡの同定
（マウスアグーティとヒトアグーティの第２２アミノ酸で出発する）ヒトアグーティ遺伝子とマウスアグーティ遺伝子の配列整列と共に、ＰＡＭ２５０アミノ酸置換表〔Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５巻，ｓｕｐｐ．３（１９７８）〕とを用い、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）データベースと称される一般に公開されているＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｍｅｒｃｋ  ＤＮＡ配列データベースを、配列プロフィール〔Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：４３５５（１９８７）及びＬｕｅｔｈｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３：１３９−１４６（１９９４）〕に関して検索した。
該データベースで相同アミノ酸配列を検索するために、検索に先だって、先ずＥＳＴデータベースの各エントリーをコンピューターでＤＮＡからアミノ酸配列に翻訳した。１つのＥＳＴデータベース提出物ｃＤＮＡクローン、Ｈ６３７３５はこのプロフィール配列と相同性を有することが判明した。このｃＤＮＡクローンの対向末端配列を含む提出物、Ｈ６３２９８を調べたが、プロフィール配列との相同性は認められなかった。
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから、Ｈ６３７３５及びＨ６３２９８に対応するｃＤＮＡクローンを含む大腸菌株（株番号２０８６４１）を得た。このクローン由来のＤＮＡを、標準ミニプレプ法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）〕を用いて作製した。該ＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）に通して精製した。精製後、標準ジデオキシ鎖終結法を用いて該ＤＮＡの配列決定を行った。この精製ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化すると、約１．２と０．３ｋｂの２つの断片が得られたが、これは、該クローンが約１．５ｋｂの挿入体を含むことを示している。配列決定ベクターのＴ３及びＴ７プライマー由来の配列から、提出された配列とほぼ一致する配列が得られたが、これは、クローン２０８６４１が提出物Ｈ６３７３５とＨ６３２９８の製造に用いたＤＮＡを含んでいることを示している。
クローン２０８６４１の全ｃＤＮＡ配列を分析して、システインに富むカルボキシ末端にアグーティ遺伝子との相同性が存在することを確認した。クローン２０８６４１のｃＤＮＡ配列とデータベースに提出されている元の配列（Ｈ６３７３５）とを比較すると、提出されている配列にエラーがあることが判明した。具体的に言えば、Ｈ６３７３５の１６４位に別のグアニンヌクレオチドが存在し、それによってＨ６３７３５を翻訳するとフレームシフト変異及び早期フレーム内終結が生じた。このエラーを修正すると、プロフィール配列とＨ６３７３５との間の相同性が増大することが判明した。このエラーの修正により、クローン２０８６４１とアグーティ遺伝子との間にもさらなる配列相同性が生じた。しかし、このフレームシフトを修正しても、読み取りフレームから予測される２０８６４１のタンパク質配列は、ヒトアグーティでは１３２アミノ酸であるのに対し、９４アミノ酸からなるタンパク質という結果となった。さらに、予測されるタンパク質相同性はアミノ末端に向かって劇的に低下した。これは、２０８６４１が実際には本当のｃＤＮＡではなく、むしろ部分的にスプライスされたゲノムイントロンＤＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドであることを示唆しており、このことは、以下に記載のように、ヒトゲノムクローン配列（配列番号４）を得たときに確認された。
該クローンの遺伝子発現パターンを評価するために、１レーン当たり約２μｇの種々のヒト組織由来のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含むナイロンノーザンブロットを、約６００塩基対プローブ〔クローン２０８６４１をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて６００塩基対断片を分離して得たもの〕で調べて、ＡＲＴの存在についてスクリーニングした。分離したこの６００ｂｐ断片を、ランダムプライム反応（ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標準法（ＲｅｄｉＶｕｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いてα−32Ｐ−ｄＣＴＰで放射性標識した。取り込まれなかった放射能をサイズ排除クロマトグラフィー（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎカラム，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にかけて排除した。ノーザンフィルターを、５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｓ、１００ｍｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ及び５×ＳＳＰＥを含む緩衝液中約４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、フィルターを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中室温で約４０分間、洗浄液を３回変えて洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中約５０℃で３０分間洗浄した。フィルターをホスホイメージャーカセット（phosphoimager cassette）中に一晩入れてハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
ノーザンフィルターと６００ｂｐのＮｃｏＩ―ＮｏｔＩプローブとのハイブリダイゼーションにより、図６に示されているように，ＡＲＴの顕著で相対的特異的な発現パターンが明らかになった。発現が最も豊富な部位は副腎皮質であり、次いで、副腎髄質、視床下部、視床下核、及び精巣であった。肺に弱いハイブリダイゼーションシグナルが検出された。ホスホイメジャーでハイブリダイゼーションの相対強度を定量し、副腎皮質に関して表すと、以下の値：副腎皮質、１００；副腎髄質、４６；視床下部、２３；精巣、１５；視床下核、１１；及び肺、３．６が得られた。次いで、フィルターをβアクチンプローブで調べて、ＲＮＡのローディングが等しく、ＲＮＡサイズマーカーの配置が正確であることを確認した。
サイズマーカーに関してノーザンブロットを調べると、脳組織と末梢組織との間で、ＡＲＴの転写体の長さにエキソンのスプライシングの違いに起因し得る有意な差があることが判明した。転写体のサイズは、脳組織では約０．８ｋｂであるが、末梢組織はそれより小さい約０．５ｋｂの転写体を有していた。これがコードエキソンの異なるスプライシング及び／又は翻訳されなかったエキソンを表しているのかを明らかにするために、視床下核のｃＤＮＡと副腎のｃＤＮＡとを下記のようにクローン化した。
標準的なファージライブラリーを用いて全長ｃＤＮＡをクローン化しようとする初期の試みは失敗に終わったが、これは、該ライブラリーの作製中に排除される小さい転写体サイズに起因する可能性が極めて高かった。従ってＰＣＲを用い、より高性能で技術的に難度の高いクローニング法を試みた。クローン２０８６４１に対応する全長ヒトｃＤＮＡクローンを得るために、副腎、視床下核及び肺由来のヒトポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；それぞれカタログ番号  ６５７１−１，６５８１−１及び６５２４−１）を逆転写し、第２のｃＤＮＡ鎖を合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、アダプタープライマーに連結した。最終ｃＤＮＡ生成物を連結されなかったアダプタープライマーから精製（ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）し、ＰＣＲを用いた後続ＲＡＣＥ反応にテンプレートとして用いた。各ｃＤＮＡについて、以下のプライマー：
0004219404.tif 000004
及びＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲキット成分（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ＰＣＲを実施した。最初の変性ステップ（９４℃で３分間）の後、９４℃で１５秒間、次いで、７２℃で２分間の反応を５サイクル；９４℃で１５秒間、次いで７０℃で２分間の反応を５サイクル；及び９４℃で１５秒間、次いで６８℃で２分間の反応を２５サイクル行った。全ての反応はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２４００  ＰＣＲ装置で行った。
各ＰＣＲ反応混合物のアリコートをアガロースゲル上で電気泳動させ、約６００塩基対で移動するバンドを切り出して、精製（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）し、配列番号２のプライマー及び以下のプライマー：
0004219404.tif 000005
を用いる後続ＰＣＲのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ条件は上記のものと同じであった。
この第２のＰＣＲ反応のアリコートをアガロース上で電気泳動させ、約６００塩基対で移動するバンドを切り出して、精製し、プラスミドにクローン化した（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。次いで、細菌宿主細胞を該プラスミドで形質転換し、ＤＮＡを精製するために一晩増殖させた。次いで、該プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレププロトコルを用いて細菌宿主細胞から分離し、ＥｃｏＲＩで消化、電気泳動させて、挿入体の存在及びサイズを確認した。種々のサイズの挿入体を含むクローンを種々のＴ７及びＭ１３プライマーを用いて配列決定した。該クローンの配列決定により、予測アミノ酸Ｌｅｕ（ＣＴＧ）又はＰｒｏ（ＣＣＧ；図４及び図９参照）に対応するコドン１３５の第２位に多型性が示された。得られた配列を用いて、どのクローンがＡＲＴ  ｃＤＮＡを含む挿入体を有するかを決定し、ＡＲＴ  ｃＤＮＡの５′部分に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これら挿入体のいくつかを配列決定すると、視床下核及び副腎では、それぞれ７００ｂｐ及び５００ｂｐという大きなサイズの挿入体のみがＡＲＴ転写体を含んでいた。該挿入体はどちらも同じ読み取りフレーム（ＯＲＦ）を含んでいたが、５′非翻訳領域の量が異なっていた。このＯＲＦは、３′領域が２０８６４１由来の配列とマッチしていた。
３′ＲＡＣＥ反応では、５′ＲＡＣＥ生成物と約１８０ｂｐ重複する前進鎖上のオリゴヌクレオチドを配列番号１と共に用いた。該反応により、３種全ての組織から同じサイズのアンプリコン（約３００ｂｐ）が得られた。このアンプリコン由来の配列は全３種の組織由来の配列と同一であり、また、クローン２０８６４１由来の配列ともマッチしていた。副腎と肺（「末梢組織」）ＡＲＴ  ｃＤＮＡの配列は図３に示されている（配列番号６）。
視床下核ＲＡＣＥ反応由来の組み合わせ配列は図２に示されている（配列番号５）。上述のように、副腎及び肺由来の配列は、５′非翻訳領域の長さ以外は配列番号５と一致していた。該ｃＤＮＡ配列は、予測された翻訳開始部位由来のフレーム内終結コドン、ポリアデニル化シグナル、及びポリＡ末端を含んでいる。このＯＲＦから予測されるタンパク質は、１３２個のアミノ酸、シグナルペプチド配列及び１１個のシステインを含んでおり、該配列は図４に示されている（配列番号７）。シグナルペプチドは、最初の２０個のアミノ酸からなり、成熟ポリペプチドは、第２１アミノ酸（Ａｌａ）から開始される。
実施例II：  ヒトＡＲＴゲノムＤＮＡの同定
ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手）由来のＤＮＡがついた高密度フィルターを、ＲａｐｉｄＨｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ；カタログ番号ＲＰＮ  １６３６）中約６５℃で約４時間、６００ｂｐのα−32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡプローブ（実施例Ｉ参照）とハイブリダイズさせた。次いで、フィルターを、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中室温で３０分間、次いで、０．２％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で３０分間洗浄した。次いで、フィルターを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を備えたオートラジオグラフィーカセットに入れ、−８０℃で一晩置いた。次いで、フィルムを現像し、プローブにハイブリダイズしたＰ１クローンの位置を記録した。これらの陽性Ｐ１クローンを含む細菌株はＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から得、該株由来のＤＮＡを分離した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）。
ＤＮＡのアリコートをＥｃｏＲＩで消化し、０．９％アガロースゲル上で電気泳動させ、約２〜３ｋｂで移動するバンドを切り出して、精製し、前もってＥｃｏＲＩで消化しておいたプラスミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳII，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化した。挿入体を含む細菌からＤＮＡを分離し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＥｃｏＲＩで消化、電気泳動させ、ナイロンフィルター（Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ，Ｓ＆Ｓ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移し、ＵＶ架橋させた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。次いで、これらのフィルターを上記のようにＮｃｏＩ−ＮｏｔＩプローブとハイブリダイズさせて、ＡＲＴ配列を含むクローンを同定した。約２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むクローンが、ＡＲＴプローブにハイブリダイズしていることが判明した。次いで、該クローン由来のＤＮＡの配列決定を行った。該ＡＲＴゲノムＤＮＡの核酸配列は図１に示されている（配列番号１）。このゲノムクローン由来の配列を副腎及び脳から得られたｃＤＮＡ配列と比較すると、ＡＲＴコード配列が３つのエキソンに分断されていることが知見された。さらに、脳ｃＤＮＡに存在する５′非翻訳配列がこれら３つのコードエキソンに対して５′末端側に位置する別のエキソンであることが判明した。従って、該ＡＲＴ遺伝子は、３つのコードエキソンと、可変的にスプライスされる非翻訳エキソンとからなるようである。
末梢組織のノーザンブロットで同定された小さいＡＲＴ転写体はこの非コードエキソンの欠失に由来すると考えられる。興味深いことには、マウスアグーティは、被毛の成長サイクルの種々の時期に異なる部位でスプライスされる非コードエキソンを用いることが知られている。
実施例III：  ＡＲＴペプチドの製造
標準固相ＰＭＯＣ保護化学を用い、ＡＲＴの第７９〜第１３２アミノ酸を含む合成ペプチドを製造した。該ペプチドの配列は図５に記載されている（配列番号８）。ＡＲＴペプチドを再生するために、約５．０ｍｇの凍結乾燥粉末を２５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び４Ｍ  尿素（ｐＨ７．０）に溶解させた。この混合物を室温で一晩穏やかに攪拌した。攪拌後、試料を、３ｋＤａのカットオフ膜を用い、Ａｍｉｃｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）攪拌セル中で濃縮した。濃縮後の最終容量は約１ｍｌであった。次いで、該試料を約１５ｍｌの滅菌１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で希釈し、次いで、約１ｍｌの最終容量まで再濃縮した。攪拌セルを約２ｍｌのＤ−ＰＢＳで２回リンスし、この４ｍｌ溶液を前記試料に加えた。約５ｍｌとなった該試料溶液をさらにＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３装置中で約０．５ｍｌの最終容量（約１０ｍｇ／ｍｌに相当する）に濃縮した。次いで、試料をＣｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）０．２２μｍ  Ｓｐｉｎｅｘフィルター装置中で滅菌濾過し、４℃で貯蔵した。
該ペプチド試料を、以下の実施例Ｖに記載のようにラットに投与した。
実施例IV：  マウスＡＲＴゲノムＤＮＡのクローニング
６００ｂｐのα−32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡプローブ（実施例Ｉ参照）を用い、ＲａｐｉｄＨｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ；カタログ番号  ＲＰＮ  １６３６）中約６５℃で約４時間、マウス肝臓組織のゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をマウスＡＲＴゲノムＤＮＡについてスクリーニングした。次いで、フィルターを、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中室温で３０分間、次いで、０．２％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で３０分間洗浄した。フィルターを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を備えたオートラジオグラフィーカセットに入れ、−８０Ｃで一晩置いた。次いで、フィルムを現像し、１個のクローンがプローブに結合していることを確認した。
ｍ−ＡＲＴｇと称されるこのクローンを標準法を用いてプラーク精製し、細菌を溶解し、次いで、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）Ｍａｘｉｐｒｅｐカラムを用いてＤＮＡを分離した。精製ＤＮＡをＸｂａＩで消化し、約２．８ｋｂ断片がヒトＡＲＴ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしていることを見出した。この２．８ｋｂ断片をベクター  ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローン化し、配列決定した。該配列のコード領域は図７に記載されている。この遺伝子のスプライス供与／受容部位は、ヒトＡＲＴゲノムＤＮＡにおけるものと類似であることが知見されたが、これは、マウスＡＲＴ遺伝子も３つのコードエキソン（２、３及び４）と、１つの非コードエキソン（エキソン１）を有していることを示している。マウスの予測アミノ酸配列は図８に示されている。該配列はヒトＡＲＴポリペプチド配列と約８１％一致している。
実施例Ｖ：  ＡＲＴで治療したラットの採食挙動
体重３００〜５００ｇのＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ雄ラットの脳に側脳室を標的とする２２ゲージのカニューレを慢性的に埋没した。該カニューレの立体空間的位置はおおよそ：０．８ｍｍ前方／後方；１．４ｍｍ内側／外側；及び３．５ｍｍ背側／腹側であった。動物に注射する用意ができるまで、３．５ｍｍ、２８ゲージのスチレットを埋没したカニューレ内に入れておいた。カニューレの先端から約１ｍｍ突き出した２８ゲージの注射器でＡＲＴペプチド又は対照溶液を投与した。
ＡＲＴペプチドをＰＢＳ（ｐＨ約７．０）に溶解させ、約２μｌの容量中約０．０７５〜約７．５ｎｍｏｌの範囲の用量で側脳室に注射した。対照は、ＰＢＳと、約７．５ｎｍｏｌの変性ＡＲＴであった。粉砕したげっ歯動物の食べ物、糖及び練乳（４５％：２８％：２７％）の混合物を入れた、前もって重量測定しておいた皿から採食測定を行った。ラットには、この混合物と共に、ラットの通常の食べ物を注射の約２４時間前に与えた。注射の約１時間半前に、ラットの通常の食べ物を取り去ったが、ラットには甘味を付けた混合物は継続して摂らせた。注射は、午前８時又は午後８時半に行った。注射してから９０分、４時間、８時間、１２時間及び25時間後に、皿の重量を計って食物の摂取を評価した。１グループ当たり１０〜１２匹のラットを用いた。
結果が図１０に示されている。該図に見られるように、折りたたみＡＲＴを摂取したラットは対照と比べてその食物摂取が増大した。さらに、注射したＡＲＴの量とラットが摂取した食物の量には相関関係がある。
〔配列表〕
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  オリゴヌクレオチド
配列：
0004219404.tif 000006
配列番号：２
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  オリゴヌクレオチド
配列：
0004219404.tif 000007
配列番号：３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  オリゴヌクレオチド
配列：
0004219404.tif 000008
配列番号：４
配列の長さ：２３７１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列：
0004219404.tif 000009
0004219404.tif 000010
0004219404.tif 000011
配列番号：５
配列の長さ：８３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
0004219404.tif 000012
配列番号：６
配列の長さ：４７９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
0004219404.tif 000013
配列番号：７
配列の長さ：１３２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004219404.tif 000014
配列番号：８
配列の長さ：５４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004219404.tif 000015
配列番号：９
配列の長さ：７３４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列：
0004219404.tif 000016
配列番号：１０
配列の長さ：１３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004219404.tif 000017
配列番号：１１
配列の長さ：１３２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0004219404.tif 000018
【図１Ａ】
0004219404.tif 000019
【図１Ｂ】
0004219404.tif 000020
【図２】
0004219404.tif 000021
【図３】
0004219404.tif 000022
【図４】
0004219404.tif 000023
【図５】
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【図６】
0004219404.tif 000025
【図７】
0004219404.tif 000026
【図８】
0004219404.tif 000027
【図９】
0004219404.tif 000028
【図１０】
0004219404.tif 000029