(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞にｐ５３依存性トランス活性化活性を復元するインビトロ方法であって、前記細胞で機能的なプロモータの制御下に、突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体をコードする核酸を前記細胞に導入し、該一本鎖抗体のみでｐ５３依存性トランス活性化活性を復元することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
一本鎖抗体がオリゴマー化ドメインと調節ドメインをもつｐ５３のＣ末端領域に存在するエピトープに特異的に結合可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖抗体が残基３２０〜３９３に含まれるｐ５３のＣ末端領域に存在するエピトープに特異的に結合可能であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖抗体が配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる一本鎖抗体ＳｃＦｖ４２１及び配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなる一本鎖抗体１１Ｄ３から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
核酸がベクターの一部を構成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ベクターがウイルスベクターであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ベクターが欠損組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ベクターが欠損組換えレトロウイルスであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ベクターが欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ベクターが欠損組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターが化学又は生化学ベクターであって、
ポリリジン、（ＬＫＬＫ）ｎ、（ＬＫＫＬ）ｎ、ポリエチレンイミン又はＤＥＡＥデキストランから選択されるカチオンポリマー；
ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥまたはリポフェクタントから選択されるカチオン脂質もしくは中性脂質；
リポフェクタミンまたはトランスフェクタムから選択されるリポポリアミン；
核由来ペプチド；及び
トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター又は肝細胞のアシアログリコプロテインから選択される膜レセプターのリガンド
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
突然変異ｐ５３タンパク質が腫瘍抑制活性を欠失していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
突然変異ｐ５３タンパク質が腫瘍細胞中に存在する形態であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
突然変異ｐ５３タンパク質がｐ５３Ｈ２７３、ｐ５３Ｗ２４８及びｐ５３Ｇ２８１タンパク質から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞が肺、結腸、頭蓋及び頚、肝臓、脳の腫瘍の細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
突然変異ｐ５３タンパク質が関与する過剰増殖疾患の治療用医薬組成物の製造のための、突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体をコードする核酸の使用であって、該一本鎖抗体のみでｐ５３依存性トランス活性化活性を復元することを特徴とする前記使用。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる１１Ｄ３分子、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入により１１Ｄ３分子から由来し、突然変異ｐ５３タンパク質に結合し、ｐ５３依存性トランス活性化活性を復元することができる変異体。
【請求項１９】
前記置換、欠失または挿入が、１０個未満のアミノ酸で生じる、請求項１８に記載の変異体。
【請求項２０】
請求項１８に記載の分子をコードする核酸。
【請求項２１】
ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成核酸又は半合成核酸であることを特徴とする請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
配列番号２の配列をもつことを特徴とする請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
請求項２０に記載の核酸を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１８に記載の分子を含む組成物。
【請求項２５】
請求項２０に記載の核酸と医薬的に許容可能なキャリヤーを含む過剰増殖疾患の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は転写因子機能が欠失又は低下した突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞にｐ５３依存性トランス活性化活性を復元するための方法に関する。より詳細には、本発明の方法は突然変異ｐ５３タンパク質に特定的に結合することが可能な一本鎖抗体の使用にある。本発明は更に、ｐ５３タンパク質に特定的且つ有効に結合することができ、更に腫瘍細胞にｐ５３活性を復元することが可能な新規分子と、これらの分子をコードする核酸及び該核酸を含むベクターにも関する。本発明の方法及び分子はｐ５３及びその突然変異形態の作用メカニズムを調査するため又はｐ５３タンパク質を精製するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで使用可能である。特に癌等の疾病の関連で特にｐ５３活性を復元する治療アプローチでｉｎ  ｖｉｖｏ使用することもできる。
野生型ｐ５３タンパク質は細胞周期の調節と細胞のゲノムの完全性の維持に関与している。このタンパク質は所定の遺伝子の転写アクチベーターであることを主機能とし、ゲノムの複製中に突然変異が出現すると、細胞周期のＧ１期の細胞を阻止し、所定数のＤＮＡ修復プロセスを開始することができるが、そのプロセスはまだ十分に解明されていない。更に、これらの修復プロセスが機能不良の場合又は突然変異現象の発生頻度が高過ぎて修復できない場合には、このタンパク質はアポトーシスと呼ばれるプログラムされた細胞死現象を誘導することができる。このように、ｐ５３タンパク質は異常に分化した細胞又はゲノムが損傷した細胞を除去することにより腫瘍抑制剤として作用する。
ｐ５３のこの主機能はその転写因子機能に依存し、換言するならば、ゲノムＤＮＡのレベルで特異的配列を認識すると共に、一般転写機構を強化するという二重の機能に依存する。
ｐ５３タンパク質は以下の５個の機能ドメインを規定する３９３個のアミノ酸を含む。
−ＴＢＰタンパク質等の所定の一般転写機構因子と結合することが可能なアミノ酸１〜７３から構成される転写活性化ドメイン。このドメインは所定数の翻訳後修飾の場でもある。また、野生型タンパク質の機能を阻止することが可能な多数の他のタンパク質、特に細胞タンパク質ｍｄｍ２又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のＥＢＮＡ５タンパク質とｐ５３タンパク質との多数の相互作用の場でもある。更に、このドメインはタンパク分解を受け易いＰＥＳＴと呼ばれるアミノ酸配列をもつ。
−アミノ酸７３〜３１５に局在するＤＮＡ結合ドメイン。ｐ５３のこの中心ドメインのコンホメーションはｐ５３タンパク質の特異的ＤＮＡ配列の認識を調節する。このドメインは野生型タンパク質の機能に作用する以下の２種の変異の場である。
（ｉ）ＳＶ４０ウイルスの「ラージＴ」抗原又はユビキチン系によりその分解を生じることが可能なＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８ウイルスのＥ６ウイルスタンパク質のようにｐ５３の機能を阻止するタンパク質との相互作用。後者の相互作用は細胞タンパク質Ｅ６ａｐ（ユビキチン化カスケードのＥ３酵素）の存在下でしか生じることができない。
（ｉｉ）ｐ５３の機能に作用し、ほぼ全体がこの領域に局在する点突然変異。
−主機能を実施する区画にタンパク質を良好に送達するのに不可欠なアミノ酸３１５〜３２５から構成される核局在化シグナル。
−アミノ酸３２５〜３５５から構成されるオリゴマー化ドメイン。この３２５〜３５５領域はβシート（３２６〜３３４）−湾曲部（３３５〜３３６）−αヘリックス（３３７〜３５５）の型の構造を形成する。この領域に局在する機能変異は野生型タンパク質の機能を種々に変更し得る種々の突然変異形態と野生型タンパク質の相互作用に主に起因する。
−ｐ５３タンパク質の機能を正又は負に調節する所定数の翻訳後修飾（グルコシル化、リン酸化、ＲＮＡ固定等）の場であるアミノ酸３６５〜３９３から構成される調節ドメイン。このドメインは野生型タンパク質の活性の調節に極めて重要な役割を果たす。
ｐ５３タンパク質の機能は種々の方法で妨害され得る。
−例えばＳＶ４０ウイルスの「ラージＴ」抗原、エプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ５タンパク質又は細胞タンパク質ｍｄｍ２等の所定数の因子による機能阻止。
−特にｐ５３がユビキチン化周期に入るのを助長するヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６タンパク質との相互作用によるタンパク分解感受性の増加によるタンパク質の脱安定化。この場合、これらの２種のタンパク質の相互作用は細胞タンパク質が予め固定されていないと生じないが、Ｅ６ａｐタンパク質の固定部位はよくわかっていない。
−ｐ５３の遺伝子のレベルの点突然変異。
−ｐ５３の１又は２個の対立遺伝子の欠失。
後者２種の変異は種々の癌の約５０％で認められる。この点については、癌細胞で記録されているｐ５３の遺伝子の突然変異はこのタンパク質をコードする遺伝子の非常に大部分に及んでおり、その結果、このタンパク質の機能に種々の変異を生じている。但し、これらの突然変異は大半がｐ５３タンパク質の中心部分に局在しており、この部分はｐ５３タンパク質の特異的ゲノム配列との接触領域であることが知られている。ｐ５３タンパク質の突然変異体の大半が野生型タンパク質を認識するＤＮＡ配列に固定できず、従って、転写因子の役割を発揮できないという主特徴をもつのはこのためである。更に、突然変異体のうちには転写レベルで所定の遺伝子の活性化等の新規機能を獲得しているものもあるらしい。
現在、これらの変異は３種に分類されている。
−所謂弱変異体。この突然変異体の産物は非機能的タンパク質であり、２個の対立遺伝子のうちの１個だけが突然変異している場合には、他方の対立遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の機能は変わらない。この分類の代表例は突然変異体Ｈ２７３及びＷ２４８であり、後者は癌性疾患過敏家族性Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群に特異的である。
−優性ネガティブ変異体。この突然変異体の産物は非機能的タンパク質であり、２個の対立遺伝子のうちの１個のみが突然変異している場合には、野生型タンパク質との相互作用により、野生型タンパク質の特異的ＤＮＡ配列にもはや結合できない非活性混合オリゴマーを形成し、野生型タンパク質の機能を阻止することができる。
−優性癌突然変異体。この突然変異体の産物は、２番目の分類の突然変異体と同様に野生型タンパク質の機能を阻止すると共に、よくわかっていないメカニズムにより腫瘍発生を助長し、機能獲得することが可能なタンパク質である。この分類の代表例は突然変異体Ｈ１７５である。
野生型ｐ５３遺伝子は、抗腫瘍性とアポトーシス性をもち、多数の過剰増殖型疾患に関与しているため、遺伝子及び細胞治療のアプローチで使用されている。特に、野生型ｐ５３遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ投与、ｐ５３の機能の復元により所定の過剰増殖疾患、特に癌を治療することが提案されている。投与はウイルスベクター、特にアデノウイルス（ＷＯ９４／２４２９７）又はレトロウイルス（ＷＯ９４／０６９１０）により実施することが好ましい。例えば野生型ｐ５３タンパク質をコードする核酸を導入すると、細胞増殖の正常調節を部分的に復元できることが報告されている（Ｒｏｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６）９８５）。ｐ５３型の性質をもつ化学分子の使用に基づく代替ストラテジーも開発されている（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１１１１）。
野生型表現型即ち野生型ｐ５３の腫瘍抑制性とアポトーシス性をもつように内因性突然変異タンパク質を復帰突然変異させることより、野生型ｐ５３タンパク質の機能を復元するアプローチもある。このアプローチは、ｐ５３の突然変異体の機能喪失が突然変異により誘導されるタンパク質のコンホメーション変化に起因するという知見に基づく。この点で、ＷＯ９４／１２２０２はｐ５３タンパク質に対する特定モノクローナル抗体ｐＡｂ４２１がヒト癌に頻出するある種の突然変異体にＤＮＡ結合機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで復元できることを示している。しかし、この種の化合物を使用すると、多量の抗体が必要であり（従って、付随する製造／精製の問題）、細胞内に侵入しにくいため、重大な欠点がある。
本願はｐ５３タンパク質の突然変異体に野生型性質を復元するための高性能アプローチに関する。本願は特に、野生型ｐ５３機能の復元という有利な性質をもつｐ５３タンパク質に特に特異的なリガンドの構築に関する。より詳細には、本願はｐ５３タンパク質の特異的一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、特に１１Ｄ３分子の構築に関する。本願は更に、ＳｃＦｖがｐ５３を認識することができ、腫瘍細胞中で有効に発現でき、ｐ５３のある種の突然変異体のトランス活性化機能の一部を再活性化できることを実証する。
従来技術の方法に比較して、この分子は重要な利点があり、特に腫瘍細胞中で多量にｉｎ  ｓｉｔｕ発現できる。従来の抗体とＳｃＦｖの間には親和性がないことが多かったため、上記結果は予想外である。更に、本願出願人は最適生物活性を得られるように適当な細胞内区画でＳｃＦｖを発現できることを実証した。
従って、本発明の第１の目的は、突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞にｐ５３依存性トランス活性化活性を復元する方法にあり、突然変異体ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体を細胞に導入することを特徴とする。有利な態様によると、本発明の方法は細胞で機能的なプロモーターの制御下に前記一本鎖抗体をコードする配列を含む核酸を細胞に導入する。本発明の別の側面は、タンパク質のコンホメーションを改変するための、突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体の使用に関する。本発明は更に、突然変異ｐ５３タンパク質が関与する過剰増殖疾患の治療用医薬組成物を製造するための、突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体の使用と、突然変異ｐ５３タンパク質が関与する過剰増殖疾患の治療用医薬組成物を製造するための、突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体をコードする核酸の使用にも関する。
従って、本発明の方法の一面は突然変異ｐ５３抗体に特異的に結合することが可能な一本鎖抗体の構築、ベクタークローニング及び細胞導入にある。一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）はアームによりＶＬ領域に結合したＶＨ領域から主に構成される。ＳｃＦｖとこのような改変抗体をコードする核酸配列の構築は例えば参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，９４６，７７８号又はＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９４／２９４４６に記載されている。
本願はより詳細には、ｐ５３に対する抗体を産生するハイブリドーマバンクの作製と、このバンクからの対応ＳｃＦｖの構築に関する。本願は対応核酸の発現ベクタークローニングとその細胞導入にも関する。本願は、この導入によりｐ５３の突然変異体のＤＮＡ結合活性及びそのトランス活性化活性を有効にｉｎ  ｖｉｖｏで復元できることも実証する。
より詳細には、本発明の方法はオリゴマー化ドメインと調節ドメインをもつｐ５３のＣ末端領域に存在するエピトープに特異的に結合することが可能なＳｃＦｖを利用する。この点で、本願はＥＬＩＳＡ法によりこの性質をもつＳｃＦｖを選択する試験にも関する。
更に詳細には、本発明の方法で使用するＳｃＦｖは残基３２０〜３９３に含まれるｐ５３のＣ末端領域に存在するエピトープに特異的に結合することができる。この点で、本願は特定例として配列番号１のＳｃＦｖ４２１及び配列番号２の１１Ｄ３のＳｃＦｖの構築及び発現に関する。
本発明の方法は、ＤＮＡに結合する能力を完全又は部分的に失った突然変異ｐ５３タンパク質に一般に適用可能であり、本発明の方法はこの機能を復元することができる。より詳細には、本発明の方法はｐ５３転写因子機能を完全又は部分的に失った突然変異ｐ５３タンパク質に適用可能であり、この機能を復元することができる。復元レベルは完全でも部分的でもよい。有利な態様によると、突然変異体が細胞周期の阻止及び／又はアポトーシス誘導により腫瘍抑制機能を発揮できるために十分なレベルまで復元する。従って、本発明の方法は腫瘍抑制活性を欠失する内因性突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞にこの活性を少なくとも部分的に復元することができる。有利な態様によると、腫瘍細胞に存在する突然変異タンパク質に作用する。上述のように、ｐ５３タンパク質の種々の突然変異形態が腫瘍細胞で報告されている。例えば、ｐ５３Ｈ２７３、ｐ５３Ｗ２４８及びｐ５３Ｇ２８１タンパク質を挙げることができる。下記実施例では特に、本発明の方法がこれらの突然変異体のコンホメーション及び生物学的性質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで改変できることを立証する。特に、これらの実施例はＳｃＦｖ４２１及び１１Ｄ３がＤＮＡに特異的に結合してｐ５３依存性トランス活性化を誘導する機能を２７３及び２４８突然変異体に復元できることを立証する。
本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでは本発明の方法及び分子は例えばｐ５３の作用メカニズムとその突然変異形態を調査することができる。更に、本発明の分子は例えば支持体と結合し、ｐ５３タンパク質を含む溶液と接触させた後、形成された複合体を検出又は溶離することにより、ｐ５３タンパク質の検出又は精製に使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、特にヒトの場合、ｐ５３活性の欠失が認められる過剰増殖疾患等の疾病でこの機能を復元することができる。この点で、本発明は上記アプローチ（野生型ｐ５３遺伝子の導入）又は化学療法（ＷＯ９６／２２１０１）と併用することができる。更にｉｎ  ｖｉｖｏでは、本発明の方法及び分子は、例えばＳｃＦｖの発現レベルを測定し、ヒト治療アプローチの可能性を評価するために、動物で使用可能である。
有利な態様によると、突然変異ｐ５３タンパク質をもつ細胞は哺乳動物腫瘍細胞である。この点では、より詳細には（特に小細胞をもたない）肺癌、結腸癌、肝臓癌、脳、頭蓋及び頚癌、より一般的にはｐ５３タンパク質の突然変異形態が観察される任意癌の細胞を挙げることができる。有利な態様によると、突然変異体ｐ５３Ｈ２７３、Ｐ５３Ｗ２４８及び／又はｐ５３Ｇ２８１が観察されるヒト腫瘍細胞（肺、結腸、脳、頭蓋及び頚、肝臓）が挙げられる。本発明の方法を特定細胞に適用できるか否かは以下の方法により容易に決定できる。まず細胞に突然変異ｐ５３タンパク質が存在するか否かを調べる。次に、このタンパク質の突然変異の種類を調べる。公知突然変異、特に上記突然変異であるならば、細胞は本発明の方法により処理可能であるとみなすことができる。上記以外の突然変異の場合には別のアプローチが考えられる。まず突然変異タンパク質を単離（又は人工的に合成）し、実施例に記載するようにＳｃＦｖの存在下でそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を試験する。こうすると、このタンパク質の欠失機能を復元するのに適したＳｃＦｖを決定することができる。別のアプローチとして、細胞培養物でＳｃＦｖを直接試験し、ＳｃＦｖの生物学的効果を決定することもできる。
本発明の方法を利用するためには、細胞で機能的なプロモーターの制御下にＳｃＦｖをコードする核酸をもつベクターの形態でＳｃＦｖを細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入すると有利である。
プロモーターは哺乳動物、好ましくはヒト細胞で機能的なプロモーターから選択すると有利である。過剰増殖（癌、再発狭窄症等）細胞で核酸の発現を可能にするプロモーターがより好ましい。この点では種々のプロモーターを使用することができる。例えばｐ５３遺伝子の固有プロモーターを挙げることができる。（合成タンパク質も含めた他のタンパク質の発現に関与する）別の起源の領域でもよい。従って、ある遺伝子の転写を特異的又は非特異的、誘導的又は非誘導的に強く又は弱く刺激又は抑制する任意プロモーター又は誘導配列を挙げることができる。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列を挙げることができる。例えば、標的細胞のゲノムに由来するプロモーター配列を挙げることができる。真核プロモーターのうちでは、特に、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、α−アクチン、チューブリン等の遺伝子のプロモーター）、中間フィラメントのプロモーター（ＧＦＡＰ、デスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチン等の遺伝子のプロモーター）、治療遺伝子のプロモーター（例えばＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子、Ａｐｏ  ＡＩ等の遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質、平滑筋細胞のαアクチン等の遺伝子のプロモーター）又は刺激応答プロモーター（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター等）を使用することができる。あるいは、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列（例えばアデノウイルスのＥ１Ａ及びＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの初期プロモーター又はＲＳＶのＬＴＲのプロモーター等）でもよい。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的発現もしくは最大発現を可能にする配列を付加してこれらのプロモーター領域を修飾してもよい。
上述のように、本願は特に有利な突然変異ｐ５３タンパク質の結合及び復帰突然変異性をもつ新規分子にも関する。本発明はより詳細には、特定ＳｃＦｖ（１１Ｄ３、４２１）の構築、ベクタークローニング及び細胞導入に関する。これらのＳｃＦｖの核酸及びペプチド配列を配列表１及び２に示す。後記実施例では、（ｉ）Ｃ末端領域で突然変異ｐ５３タンパク質に特異的に結合することができ、（ｉｉ）これらの突然変異タンパク質にＤＮＡ結合能を与え、（ｉｉｉ）これらのタンパク質に転写活性化能を与えるというこれらの分子の特に有利な機能を立証する。更に実施例では、これらの分子が腫瘍細胞で適正に発現され、過剰増殖疾患に有利に利用できることも立証する。また、本発明のＳｃＦｖの性質を更に改善することもできる。特に、ＳｃＦｖの親和性はＣＤＲ領域（配列に下線で示す）によって変化し、突然変異誘発／選択の日常実験により改善できることが知られている。因に、抗体の突然変異誘発は例えばＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）及びＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．とＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．（Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９，１９９１）により記載されている。これらの文献に記載されている技術を利用し、本発明により改変した親和性をもつＳｃＦｖの変異体を作製することができる。その後、実施例に記載する条件で選択することができる。
従って、本発明は配列番号２のペプチド配列をもつ１１Ｄ３分子と、ｐ５３タンパク質に結合する能力を保存しながらＣＤＲ領域に変異をもつ任意変異体にも関する。変異はＣＤＲ領域の１個以上の残基の欠失、置換又は挿入のいずれでもよい。変異は１０個未満の残基とすると有利である。
本発明はＳｃＦｖ１１Ｄ３をコードする任意核酸又は上記変異体にも関する。
本発明の核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）でもデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもよい。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が有利である。ヒト、動物、ウイルス、合成又は半合成のいずれの起源のものでもよい。核酸は種々の方法で得られ、特に、本明細書に示す配列と例えば核酸合成器を使用することにより化学的合成により得られる。特に本明細書に記載するような特異的プローブを使用してバンクスクリーニングにより得ることもできる。バンクからスクリーニングした配列を化学的に修飾（伸長、欠失、置換等）する混合法でも得られる。一般に、本発明の核酸は当業者に公知の任意方法により製造することができる（特に参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，９４６，７７８号及びＷＯ９４／０２６１０に記載の技術参照）。ＳｃＦｖをコードする核酸の慣用構築ストラテジーは以下の通りである。選択した抗ｐ５３抗体を産生するハイブリドーマからＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを獲得する。このためには、ハイブリドーマの全ＲＮＡを抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用することにより逆転写反応を行う。この種のプライマーを使用すると、免疫グロブリンの特異的プライマーを使用せずに済む。得られたｃＤＮＡのクローンはＶ領域をクローニングするために十分な長さをもつ。クローンの寸法が存在する全ｃＤＮＡの非常に小さいフラクションにしか相当しない場合には、予備増幅反応を実施し、クローニングに十分なＤＮＡを作製することができる。このためには、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを夫々別個に増幅する。使用するプライマーは各鎖（Ｈ及びＬ）の可変領域の両端のレベルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。次に、Ｈ鎖の特異的プライマーを使用する増幅産物と、Ｌ鎖の特異的プライマーを使用する増幅産物を精製する。精製後、抗体のＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡをヌクレオチドアーム（Ｌ）により結合し、単一鎖とする。ヌクレオチドアームは一方の末端がＶＨ領域をコードするｃＤＮＡの３’末端に結合し、他方がＶＬ領域をコードするｃＤＮＡの５’末端に結合するように構築しておく。アームの配列はペプチド（Ｇ４Ｓ）３をコードする。結合後の配列は約７００ｂｐであり、例えば配列番号１及び２に示す配列をもつＶＨ−Ｌ−ＶＬ鎖をＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして含む。
好ましくは、本発明の核酸はｃＤＮＡ又はＲＮＡである。
本発明の核酸は、
（ａ）配列番号２の配列の全部もしくは一部又はその相補鎖、
（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、好ましくはＣ末端領域のレベルでｐ５３タンパク質に特異的に結合することが可能なＳｃＦｖをコードする任意配列、
（ｃ）遺伝コードの縮重による（ａ）及び（ｂ）の変異体から選択すると有利である。
本発明は更に、上記核酸と、その発現を可能にするプロモーターと、転写終結シグナルを含む任意発現カセットにも関する。
本発明の方法では、（ｉ）細胞侵入効率、（ｉｉ）ターゲティング及び／又は（ｉｉｉ）細胞外及び細胞内安定性を改善することが可能な投与ベクターにより核酸を細胞に導入すると有利である。
本発明の特に好ましい実施態様では、化学的起源（リポソーム、ナノ粒子、ペプチド複合体、カチオン脂質又はポリマー等）、ウイルス起源（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ、ワクチンウイルス等）又はプラスミド起源のいずれでもよいベクターに核酸を組み込む。
ウイルスベクターの使用はウイルスの天然トランスフェクション性を利用するものである。従って、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスを使用することができる。これらのベクターはトランスフェクション面で特に高性能であることがわかっている。特に、アデノウイルスとレトロウイルスは腫瘍細胞感染能をもつため、本発明の範囲で選択されるベクターである。この点では、本発明の好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター即ち上記のようなＳｃＦｖをコードする核酸を含むゲノムをもつ欠損組換えレトロウイルスの形態で核酸を導入する。本発明の別の好ましい実施態様では、アデノウイルスベクター即ち上記のようなＳｃＦｖをコードする核酸を含むゲノムをもつ欠損組換えアデノウイルスの形態で核酸を導入する。
本発明のベクターは核酸の真核細胞導入及び発現を助長することが可能な非ウイルス剤でもよい。天然又は合成の化学又は生化学ベクターは特に便利で安全であり、トランスフェクトしようとするＤＮＡの寸法に関して理論的制限がないため、天然ウイルスに代わる有利な代用品である。これらの合成ベクターはトランスフェクトしようとする核酸を圧縮し、細胞固定とその形質膜及び場合により２つの核膜の通過を助長するという２つの主機能をもつ。核酸のポリアニオン性を緩和するために、非ウイルスベクターは全ポリカチオン電荷をもつ。本発明の特定方法では、ベクターは化学又は生化学ベクターである。
本発明は更に少なくとも１種の上記核酸を含む任意組成物にも関する。
本発明は更に、少なくとも１種の上記ベクターを含む任意組成物にも関する。
本発明は更に、少なくとも１種の上記ＳｃＦｖを含む任意組成物にも関する。
本発明は更に、同時又は別時点で併用するために、上記核酸又はベクターと、野生型ｐ５３をコードする核酸又はベクターを含む組成物にも関する。
本発明の医薬組成物は、抗増殖性により、特に癌や再発狭窄症等の過剰増殖疾患の治療に特に適している。従って、本発明は細胞、特に過剰増殖細胞の破壊に特に有効な方法を提供する。
本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで使用することができる。この場合には、１種以上の核酸（又はベクター又はカセット又は直接ＳｃＦｖ）の存在下に細胞をインキュベートすることから主に構成される。細胞１０６個当たりベクター０．０１〜１０００μｇ用量又はウイルスベクター１個当たり０．１〜１０００ＭＯＩを使用することができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、有効量の本発明のベクター（又はカセット）を好ましくは治療部位（特に腫瘍）のレベルで直接生物に投与する。この点で、本発明は過剰増殖細胞又はその一部を上記核酸と接触させることを特徴とする、過剰増殖細胞の破壊方法にも関する。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために本発明で使用される核酸又はベクターは局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。注射可能な形態で核酸又はベクターを使用するのが好ましい。従って、特に治療部位のレベルに直接注射することを目的とした注射用製剤に医薬的に許容可能な任意のキャリヤーに混合することができる。キャリヤーとしては特に、滅菌等張溶液又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。患者の腫瘍に核酸を直接注入すると、患部組織のレベルに治療効果を集中させることができるので有利である。核酸の使用量は種々のパラメーター、特に使用する遺伝子、ベクター、投与方法、該当疾病又は必要な治療期間に応じて適応できる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与量はアデノウイルス等のベクターでは１０６〜１０１０ｐｆｕとすると有利である。また、反復投与も考えられる。
更にｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の方法及び分子を使用し、ｐ５３の作用メカニズムを調査し、動物モデルでＳｃＦｖの力価を測定することができる。
本発明は過剰増殖（即ち異常増殖）細胞の破壊にｉｎ  ｖｉｖｏ使用すると有利である。本発明は腫瘍細胞又は血管壁の平滑筋細胞（再発狭窄症）の破壊にも適用できる。本発明は、ｐ５３の突然変異体が観察される癌の治療に特に適している。このような癌としては、例えば結腸アデノ腺癌、甲状腺癌、肺上皮腫、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、神経膠芽腫、肝癌、骨癌、皮膚癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、食道癌、喉頭癌、頭蓋及び頚癌、ＨＰＶ陽性生殖器癌、ＥＢＶ陽性上咽喉癌、細胞タンパク質ｍｄｍ２が過剰発現される癌等を挙げることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、発明を制限するものではない。
図面の説明
図１：抗体のスクリーニングストラテジー。
図２：ｐ５３のゲルに遅延を誘導する抗体の能力の試験結果。
図３：ｐ５３Ｈ２７３のゲルに遅延を誘導する抗体の能力の試験結果。
図４：ＳｃＦｖと野生型ｐ５３の結合のＥＬＩＳＡ試験結果。●：ＩｇＧ  １１Ｄ３（出発時１μｇ／ｍｌ）；○：ＩｇＧ４２１（出発時１μｇ／ｍｌ）；□：ビオチン化ポリクローナル血清（出発時１μｇ／ｍｌ）；▲：ＳｃＦｖ１１Ｄ３−ｍｙｃ（出発時１／２）；△：ＳｃＦｖ４２１−ｍｙｃ（出発時１／２）；◇：非該当ＳｃＦｖ（抗ＣＤ３、出発時１／２）。
図５：ＳｃＦｖにより誘導されるゲル上の遅延の試験結果。
図６：ｐ５３の突然変異体のＤＮＡ結合活性の復元。
図７：Ｈ１２９９細胞におけるＳｃＦｖ４２１の発現。
図８：Ｈ３５８系における突然変異体Ｈ２７３の転写活性の復元。
図９：ＨＴ２９系における内因性突然変異体Ｈ２７３の転写活性の復元。
実施例
実施例１：抗体１１Ｄ３の獲得及びスクリーニング
本実施例はｐ５３の突然変異形態のＤＮＡ結合機能を活性化することが可能なｐ５３タンパク質の特異的モノクローナル抗体の作製、獲得及び選択に関する。
１．１．マウス免疫時に使用したタンパク質の獲得及びハイブリドーマのスクリーニング
組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９で野生型ｐ５３タンパク質及び腫瘍細胞に頻出する野生型ｐ５３の突然変異に対応する種々のタンパク質ｐ５３Ｈ２７３、ｐ５３Ｗ２４８、ｐ５３Ｇ２８１を生産し、ポリクローナル抗体ＰＡｂ４２１を結合したアガロースゲルでアフィニティ精製した（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，１６１５−１６２３（１９９６））。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示に従い、組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９で野生型ｐ５３タンパク質のフラグメント１〜３２０及び７３〜３２０に対応するタンパク質も生産した。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されているような慣用組換えＤＮＡ技術により、導入用プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃｌｌｌに挿入した相補的ＤＮＡを作製した。
１．２．ハイブリドーマの獲得及びスクリーニング
上記３種のｐ５３突然変異タンパク質の等モル混合物でマウスを免疫し、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記載されている操作プロトコールに従ってハイブリドーマを獲得した。上記ｐ５３の突然変異タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記載されている操作プロトコールに従い、上記３種のｐ５３突然変異タンパク質の等モル混合物１μｇ量を９６穴ＰＶＣプレートのウェルに予め固定化しておき、このウェルでハイブリドーマを培養して産生される抗体を捕獲する方法により実施した。この一次スクリーニングで陽性ハイブリドーマ３１７個を選択することができた。ハイブリドーマを２週間増幅後、増幅したハイブリドーマの上清をまず上記抗体捕獲法（方法１）により再評価した後、固定化するタンパク質の種類を変え、精製野生型ｐ５３タンパク質（方法２）、野生型ｐ５３のフラグメント１〜３２０を生産するＳｆ９細胞タンパク抽出物（方法３）、野生型ｐ５３のフラグメント７３〜３９３を生産するＳｆ９細胞タンパク抽出物（方法４）をウェルに固定化する以外は原則として上記と同一の３種のスクリーニング方法を使用することにより分類した。タンパク抽出物はＳｆ９細胞をリン酸緩衝液で凍結／融解により溶解後、細胞破片を超遠心することにより得た。３１７個の増幅ハイブリドーマ上清のうち、１６２個は方法１で陰性であった。残りの１５５個は全て方法２で陽性であり、そのうち３３個（グループＡ）は方法３及び４で陰性であり、１１５個（グループＢ）は方法３で陽性且つ方法４で陰性であり、最後の７個（グループＣ）はどちらの方法でも陽性であった。グループＢの上清はｐ５３の最初から７３個のアミノ酸に位置するエピトープをもつ抗体を含む上清に対応する。このグループの７７個の上清はｐ５３の最初から４０個のアミノ酸の配列に対応するペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）とプレインキュベートすると、方法２で陰性であった。グループＡの抗体と、上記７７個の排除後に残存するグループＢの３８個の抗体と、グループＣの抗体をイソタイプで分類すると、ＩｇＭを排除することができた。これらの結果を図１に要約する。
次にｐ５３／ＤＮＡ複合体にスーパーシフトを誘導する能力を４２個の抗体で試験した。プロテインＡ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製後、抗体を定量した。ｐ５３の特異的固定配列を示す３２Ｐ標識ＤＮＡプローブと共に精製野生型ｐ５３タンパク質３０ｎｇをインキュベートすることにより、ゲル遅延実験を実施した。次に各抗体３００ｎｇを加えた。複合体をアクリルアミドゲル上で分離させた。
図２の結果から明らかなように、これらの抗体のうちの２７個はスーパーシフトを誘導することができた。同一ゲル遅延実験で野生型ｐ５３タンパク質を突然変異体Ｈｉｓ２７３に置き換えることにより、これらの２７個のうちの１９個を試験した（図３）。これらの１９個の抗体は全て陽性の結果を与えた。抗体番号２６は特に遅延が顕著であった。この抗体を１１Ｄ３と命名し、後続実験で使用した。
実施例２：ＳｃＦｖ４２１及びＤ３Ｍの獲得
ＶＨ及びＶＬ領域の特異的縮重プライマーを用いてＰＣＲに基づく慣用分子生物学技術により、ハイブリドーマからＳｃＦｖを獲得した。抗体１１Ｄ３に由来するＳｃＦｖをＤＭ３と命名した。その配列を配列番号２に示す。ＳｃＦｖ４２１の配列は配列番号１に示す。
実施例３：ＳｃＦｖの発現ベクターの構築
本実施例は本発明の核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ導入に使用可能なベクターの構築に関する。
３．１．プラスミドベクターの構築
プラスミドベクターを構築するために、２種のベクターを使用した。
−ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ．２，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ（編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９８５に記載されているベクターｐＳＶ２。このベクターは真核発現ベクターである。ＳｃＦｖをコードする核酸をこのベクターにＨｐａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントとして挿入した。即ちＳＶ４０ウイルスのエンハンサーのプロモーターの制御下においた。実施例２に記載した全構築物をこのベクターに導入し、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ評価系で試験した。
−ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これも同様に真核発現ベクターである。本発明のＳｃＦｖをコードする核酸をＣＭＶの初期プロモーターの制御下にこのベクターに挿入した。実施例２に記載した全構築物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてこのベクターに導入した。
３．２．ウイルスベクターの構築
特定態様によると、本発明は上記核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ導入及び発現を可能にするウイルスベクターの構築及び使用にある。
特にアデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型が特性決定されている。これらの血清型のうち、本発明の範囲では２もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（ＷＯ９４／２６９１４参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲で使用可能な動物起源のアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭａｖ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（１９９０）８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）起源のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）］である。本発明の範囲ではヒトもしくはイヌ起源のアデノウイルス又は混合アデノウイルスを使用することが好ましい。
好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスはＩＴＲとパッケージングを可能にする配列と本発明の目的核酸を含む。更に好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくともＥ１領域は非機能的である。該当ウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の方法、特に完全抑圧、置換、部分欠失、又は該当遺伝子に１個以上の塩基を付加することにより非機能的にすることができる。このような改変は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎ  ｓｉｔｕで得られる。特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）及びＬ５（ＷＯ９５／０２６９７）領域等の他の領域も改変してもよい。好適実施態様によると、本発明によるアデノウイルスはＥ１及びＥ４領域に欠失を含む。別の好適実施態様によると、Ｅ１領域に欠失を含み、このレベルにＥ４領域と核酸を挿入する（ＷＯ９６／１３５９６）。本発明のウイルスでは、Ｅ１領域における欠失はアデノウイルスＡｄ５の配列のヌクレオチド４５５〜３３２９にわたることが好ましい。
本発明による欠損組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ  １０１（１９９１）１９５，ＥＰ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ  Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと特に目的ＤＮＡ配列をもつプラスミドの相同組換えにより作製することができる。適当な細胞系で前記アデノウイルス及びプラスミドの同時トランスフェクション後に相同組換えが生じる。使用する細胞系は、（ｉ）前記要素により形質転換可能であり、（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠損アデノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいることが好ましい。細胞系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞２９３系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）や、特にＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７及びＷＯ９６／２２３７８に記載されているようなＥ１及びＥ４機能を相補することが可能な細胞系を挙げることができる。
その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するように慣用分子生物学技術により回収及び精製する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに安定且つ部位特異的に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約４７００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
ＡＡＶから誘導されるベクターを遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ導入に利用することは文献に記載されている（特にＷＯ９１／１８０８８、ＷＯ９３／０９２３９、米国特許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。これらの文献は、ＡＡＶから誘導され、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠失し、目的遺伝子で置換された種々の構築物と、前記目的遺伝子を（培養細胞に）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は（生物に直接）ｉｎ  ｖｉｖｏ導入するためのその使用について記載している。本発明による欠損組換えＡＡＶは、ヒト補助ウイルス（例えばアデノウイルス）を感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれた本発明の目的核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶのパッケージング遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラスミドを同時トランスフェクトすることにより作製することができる。使用可能な細胞系は例えば２９３系である。生成した組換えＡＡＶをその後、慣用技術により精製する。
ヘルペスウイルスとレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築について文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３（１９９１）２０３；  ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（１９８５）６８９等を参照されたい。特に、レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、癌に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、パッケージング配列と、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから誘導される組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が完全又は部分的に欠失しており、目的異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは種々の型のレトロウイルスから作製することができ、特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから得られる。
本発明の核酸を含む本発明の組換えレトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとパッケージング配列と前記核酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、欠損レトロウイルス機能をプラスミドにトランス導入することが可能なパッケージング系と呼ばれる細胞系にトランスフェクトする。従って、一般にパッケージング系はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現させることができる。このようなパッケージング系は従来技術に記載されており、特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる、更に、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲのレベルに修飾を含んでいてもよいし、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張パッケージング配列を含んでいてもよい（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
本発明を実施するには、欠損組換えアデノウイルス又はレトロウイルスを使用すると特に有利である。これらのベクターは腫瘍細胞に遺伝子を導入するために特に有利な性質をもつ。
３．３．化学ベクター
開発されている合成ベクターのうち、本発明の範囲ではポリリジン、（ＬＫＬＫ）ｎ、（ＬＫＫＬ）ｎ（ＷＯ９５／２１９３１）、ポリエチレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）及びＤＥＡＥデキストラン型のカチオンポリマー、又はカチオン脂質もしくはリポフェクタントを使用すると好ましい。これらのベクターはＤＮＡを圧縮し、細胞膜との結合を助長する性質をもつ。これらのうちでは、リポポリアミン（リポフェクタミン、トランスフェクタム、ＷＯ９５／１８８６３、ＷＯ９６／１７８２３）、種々のカチオン又は中性脂質（ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ等）及び核由来ペプチド（ＷＯ９６／２５５０８）を挙げることができる。更に、レセプターにより媒介されるターゲティングトランスフェクションの概念も開発されており、これは、グラフトしたい細胞型の表面に存在する膜レセプターのリガンドとカチオンポリマーの化学結合により錯体の膜固定を導きながら、カチオンポリマーによりＤＯＰＥを圧縮する原理を利用するものである。例えば、トランスフェリンレセプター、インスリンレセプター又は肝細胞のアシアログリコプロテインのレセプターのターゲティングが報告されている。このような化学ベクターを使用する本発明の組成物の製造は、一般に種々の成分と単に接触させることにより当業者に公知の任意技術により実施される。
実施例４：ｐ５３を認識するＳｃＦｖ
ＳｃＦｖとｐ５３の結合をＥＬＩＳＡ試験により確認した。
ＳｃＦｖを検出できるようにｍｙｃタグにＳｃＦｖを融合した。これらの種々のＳｃＦｖを発現する細菌ペリプラズムからＳｃＦｖ４２１、１１Ｄ３（ＤＭ３）及び対照ＳｃＦｖ（抗ＣＤ３）を作製した。
精製ｐ５３により被覆したＥＬＩＳＡプレートをＩｇＧ１１Ｄ３、ＩｇＧ４２１、ビオチン化抗ｐ５３ポリクローナル血清、ＳｃＦｖ１１Ｄ３、ＳｃＦｖ４２１及び抗ＣＤ３ＳｃＦｖの種々の希釈液と共にインキュベートした。
次いでアルカリホスファターゼに結合した抗ＩｇＧ二次抗体により２種のＩｇＧを検出した。ビオチン化血清はアルカリホスファターゼに結合したエキストラビジンにより検出した。ＳｃＦｖは抗ｍｙｃ９Ｅ１０抗体により検出後、アルカリホスファターゼに結合した抗ＩｇＧ抗体により検出した。アルカリホスファターゼ活性の比色分析を示す図４から明らかなように、２種の精製ＩｇＧ、ポリクローナル血清並びにＳｃＦｖ４２１及び１１Ｄ３はｐ５３を認識するが、抗ＣＤ３ＳｃＦｖは不活性である。
実施例５：ＳｃＦｖは野生型ｐ５３にスーパーシフトを誘導することができる。
ＳｃＦｖが野生型ｐ５３のＤＮＡ結合機能を活性化する能力をゲル遅延実験により試験した。
ｐ５３の特異的固定部位を示すＤＮＡデュプレクスを３２Ｐで標識後、精製野生型ｐ５３及び種々の精製抗体又は細菌ペリプラズムで生産されたＳｃＦｖと共にインキュベートした。複合体をアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。
得られた結果を図５に示す。
ＤＮＡ／ｐ５３複合体は「基線」に観察された。抗体ＨＲ２３１、ｐＡｂ４２１及び１１Ｄ３は付加遅延（スーパーシフト）を誘導し、ＤＮＡ／ｐＡｂ４２１複合体の量を増加することが可能である。
ＳｃＦｖ４２１及びＤＭ３もスーパーシフトを誘導できるが、抗ｒａｓ対照ＳｃＦｖ（Ｙ２８）は不活性である。ＳｃＦｖ４２１はＳｃＦｖＤＭ３と異なり、ｐ５３／ＤＮＡ複合体の量の増加を誘導しない。
実施例６：ＳｃＦｖはｐ５３の突然変異体にＤＮＡ結合機能を復元することができる。
同様に、ＳｃＦｖが不活性突然変異体Ｔｒｐ２４８のＤＮＡ結合機能を復元する能力を試験した。得られた結果を図６に示す。
２種のＳｃＦｖはｐ５３／ＤＮＡ複合体に対応する遅延バンドの出現を誘導することが明らかである。
実施例７：ＳｃＦｖは腫瘍細胞で適正に発現される。
腫瘍細胞Ｈ１２９９における発現ベクター（ＳＶ４０のプロモーター）の一過性トランスフェクションによりＳｃＦｖの発現を確認した。より詳細には、カチオン脂質リポフェクタミンの存在下に核酸をｐＳＶ２型プラスミドベクター（実施例３）の形態で投与した。
得られた結果を図７に示す。完全抽出物のウェスタンブロットによると、予想寸法に対応する約３０ｋＤで移動する最大バンドが観察され、分子は腫瘍細胞で有意レベルで発現されることが確認された。
実施例８：ＳｃＦｖは突然変異体Ｈｉｓ２７３のトランス活性化機能を部分的に復元することができる。
これらのＳｃＦｖが腫瘍細胞中でｐ５３の突然変異形態に欠損しているトランス活性化機能に及ぼす作用を次のように測定した。
（いずれもｐ５３を欠失している）Ｈ３５８もしくはＨ１２９９系又は（突然変異体ｐ５３Ｈｉｓ２７３を含む）ＨＴ２９系で一過性トランスフェクションを実施した。これらのトランスフェクションでは、ｐ５３依存性プロモーターの制御下に野生型ｐ５３又は突然変異体Ｈ２７３もしくはＨｉｓ１７５と２種のＳｃＦｖの発現ベクターと、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した。トランスフェクションから４８時間後に測定したＣＡＴ活性はｐ５３のトランス活性化機能を表す。
図８の結果から明らかなように、２種のＳｃＦｖはＨ３５８系で突然変異体Ｈｉｓ２７３の転写活性を有意に再活性化することができ、Ｈ１２９９系でも同一の結果が得られた。
更に、２種のＳｃＦｖはＨＴ２９系でも内因性突然変異体Ｈｉｓ２７３の転写活性を増加することができる（図９）。
配列
配列番号１：４２１の塩基及びペプチド配列
0004371178.tif 000002
配列番号２：Ｄ３Ｍの塩基及びペプチド配列
0004371178.tif 000003
【図１】
0004371178.tif 000004
【図２】
0004371178.tif 000005
【図３】
0004371178.tif 000006
【図４】
0004371178.tif 000007
【図５】
0004371178.tif 000008
【図６】
0004371178.tif 000009
【図７】
0004371178.tif 000010
【図８】
0004371178.tif 000011
【図９】
0004371178.tif 000012