(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する抗体または線維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）に対する抗体を有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項２】
前記ｂＦＧＦに対する抗体が慢性関節リウマチにおいて滑膜細胞の異常な増殖を抑制することを特徴とする請求項１記載の慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項３】
ｂＦＧＦに対する抗体またはＦＧＦＲに対する抗体を有効成分とする滑膜細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤または滑膜細胞増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節滑膜の異常増殖とそれに伴う関節破壊であり、難治性の自己免疫疾患の一つである。その発症原因にレトロウイルス感染、自己応答性Ｔ細胞の関与等が示唆されているものの、未だ不明な点が多い。
【０００３】
ＲＡの慢性変化では関節軟骨、腱、骨の破壊が特徴的であり、関節炎が持続し一旦慢性化すると激しい血管新生や滑膜細胞増殖による滑膜の肥厚が起こり、さらに活性化した滑膜細胞は軟骨組織へと侵入し、軟骨・骨破壊を引き起こして重篤な破壊性の関節炎となる。この後期（第３，４期）の激しい関節炎は、長期間種々のサイトカインに暴露された結果、もはや増殖抑制コントロール機能を失った滑膜細胞の増殖によるものである。そのため滑膜細胞をターゲットにした増殖抑制活性あるいはアポトーシス誘導活性をもつ抗リウマチ薬の必要性が問われだし、最近国内外で盛んに開発が行われている。ＲＡ患者の関節液中には滑膜細胞の増殖に関わる多くのサイトカインが存在することが知られている。この滑膜の増生に関与する可能性のあるサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、γインターフェロン（γＩＮＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等の報告がある。
【０００４】
ｂＦＧＦは、９種類からなる（最近は１８種類とも言われている）ＦＧＦファミリーの一つでＦＧＦ２と呼ばれ、分子量１７万〜２３万のアイソフォームを有するヘパリン結合タンパク質である（Abrahamら, EMBO J., 5, pp.2523-2528(1986)；Pratsら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, pp.1836-1840(1989)）。ｂＦＧＦは、ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）を介して、線維芽細胞の増殖因子として発生、分化、成長に重要な役割を果たしているのみならず、血管内皮細胞、軟骨、骨芽細胞、表皮細胞など様々な細胞増殖を促進し、血管新生、軟骨・骨形成、創傷治癒などにも関わっている。現在、ＦＧＦＲは４種類（ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４）が報告されており、ＦＧＦＲ１〜３はさらにコード部分のスプライシングの異なるアイソフォームが知られている。ＦＧＦとＦＧＦＲの対応は１対１ではなく、そのクロストークは複雑である。ｂＦＧＦについてはＦＧＦＲ１IIIb、IIIc、ＦＧＦＲ２IIIc、ＦＧＦＲ３IIIc及びＦＧＦＲ４IIIcに結合することが知られている（Ornitzら, J. Biol. Chem., 271, pp.15292-15297(1996)）。また、ｂＦＧＦは、ＲＡでは培養滑膜細胞（Goddardら, Arthritis Rheum., 35, pp.1296-1303(1992)）、滑膜組織のlining細胞（Nakashimaら, Ann. Rheum. Dis., 53, pp.45-50(1994)）、肥満細胞や血管細胞（Quら, Lab. Invest., 73, pp.339-346(1995)）に多く発現していることが報告されている。しかし、ｂＦＧＦとＲＡ病態との直接的な因果関係やｂＦＧＦを抑制することによる関節炎の阻害を証明したものはない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
現在、ＲＡ治療薬としてステロイド剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）および金製剤などが使用されているが、それぞれ腎障害などの重篤な副作用をもつことが知られている。従って、副作用が少なく、かつ治療効果の高い新規なリウマチ薬の開発が昨今切に望まれている。最近、自己応答性Ｔ細胞をターゲットとした抗ＣＤ４抗体、ニワトリII型コラーゲン経口投与、Ｔ細胞受容体ワクチンなど免疫学的手法を用いた治療法が開発されつつある。しかしながら、病因に関わる自己抗原は未だ特定されておらず、これらの治療法が過剰な免疫抑制を誘導する可能性もある。また、治療効果についても有効性を否定する考えもあり、問題が残るところである。また、ＲＡにおいて最も重要な破壊因子はパンヌスと呼ばれる肉芽組織で、滑膜細胞由来の増殖性の線維芽細胞、たくさんの小血管、種々の炎症細胞からなる。このパンヌス形成を抑制することが可能であれば、ＲＡの症状も軽減できると考えられるが、現在までにこの抑制物質については報告されていない。
【０００６】
本発明の目的は上記の欠点のない、しかも滑膜のパンヌス形成を阻止しうる新規な慢性関節リウマチ治療剤を提供することである。さらに詳細には、ｂＦＧＦアンタゴニストを有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤、及びこの作用を有する慢性関節リウマチ治療剤を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が滑膜の増生に深く関与することを明らかにし、このｂＦＧＦ活性を阻害することで、滑膜細胞の増殖を抑制し、かつ慢性関節リウマチの臨床症状を著しく軽減できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はｂＦＧＦアンタゴニストを有効成分として含有する慢性関節リウマチ治療剤に関する。さらに、本発明はｂＦＧＦアンタゴニストを有効成分として含有する滑膜増殖抑制剤に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で述べるｂＦＧＦ活性とは、ｂＦＧＦが関与する滑膜細胞増殖活性を指す。そのメカニズムとしては、ｂＦＧＦが単独、あるいはヘパリンかヘパラン硫酸と会合して滑膜細胞表面上に存在するＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）と結合し、ＦＧＦＲの二量体形成後、細胞内シグナル伝達ではチロシンキナーゼの活性化やＲａｓ−Ｇタンパク質とＭＡＰキナーゼ系、ホスホリパーゼＣ系の活性化等を引き起こして滑膜細胞の増殖を誘導するものである。
【０００９】
本発明のｂＦＧＦアンタゴニストとは、上記のｂＦＧＦ活性を効果的に阻害しうるもの、すなわちｂＦＧＦからレセプター等を介して滑膜細胞に伝達されるシグナルを遮断することによりｂＦＧＦにより惹起される滑膜細胞の増殖を抑制するものである。そのような例としては、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）抗体、またはｂＦＧＦ活性部位に結合可能なペプチド等が挙げられる。
【００１０】
抗ｂＦＧＦ抗体は、その由来および種類（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）を問わないが、特に哺乳類由来のモノクローナル抗体が好ましい。
【００１１】
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作製の簡便さからマウス、ラット、ハムスター等の齧歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。
【００１２】
このような抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体及びその作製方法については、Lappiら（WO94/21813）や香西ら（特表平5-503814号）などに開示されている。
【００１３】
モノクローナル抗体は基本的には常法に従い作製することができる。すなわち、ｂＦＧＦを免疫原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合方法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１４】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する抗原性を低減させるために、人為的に改変されたものでもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス由来モノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体や、可変領域にある相補性決定領域がマウス由来である他は全てヒト抗体由来のもので構成された改変（Reshaped）ヒト型化抗体などが使用されうる。
【００１５】
さらにはｂＦＧＦに結合し、ｂＦＧＦの活性を阻害することが可能な限り、抗体の断片、例えば、ＦabあるいはＦｖ、Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを一本鎖となるよう適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる（Birdら参照：TIBTECH, 9, pp.132-137(1991)）。
【００１６】
また抗ＦＧＦＲ抗体についても、ＦＧＦＲを免疫原として使用する他は上記と同様にして作製することができる。
【００１７】
本発明のｂＦＧＦアンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチ治療剤は、ｂＦＧＦのシグナル伝達を遮断し、ｂＦＧＦにより惹起される滑膜細胞の増殖が抑制される限り、これが関与する慢性関節リウマチの治療に有効である。
【００１８】
本発明の慢性関節リウマチ治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、関節腔内、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。本発明の慢性関節リウマチ治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが適宜適当な量を選択する必要がある。
【００１９】
本発明の慢性関節リウマチ治療剤は、常法に従って製剤化することができる。例えば、注射用製剤は、精製されたｂＦＧＦアンタゴニストを溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、例えばTween80、ゼラチン、ヒト血清アルブミンなどを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００２０】
以下に、実施例をあげて本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
《実施例１：関節炎誘導実験》
本発明者らは既にＲＡ患者の活性化関節液Ｔ細胞を重症複合性免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）マウスSCID-CB.17/Icrに移入することにより、ヒトＲＡに酷似したＲＡ−ＳＣＩＤ関節炎モデルを確立している(Clin. Exp. Immunol. 1996; 104, 247-254)。関節液Ｔ細胞の他に関節炎発症に関与する因子を探るために、関節液付着細胞、関節液上清、滑膜細胞等をＴ細胞移入と同様の方法でＳＣＩＤマウスに移入し、関節炎の発症誘導能について調べた。
【００２２】
ＲＡ関節液をヒアルロニダーゼ処理後、細胞画分をFicol-Hypaqu(1.077g/ml)に重層し遠心して得られた単核球を２時間・37℃で培養し、付着細胞をトリプシン-EDTA溶液で剥離し、１×106細胞を500μlに懸濁して関節液付着細胞を調製した。関節液上清はヒアルロニダーゼ処理後の関節液をヒアルロニダーゼ処理後、10,000rpmで20分間遠心した上清を500μl用いた。滑膜細胞はＲＡ患者の滑膜組織の小切片をコラゲナーゼ/ディスパーゼ処理後、遊離した線維芽細胞様滑膜細胞（滑膜細胞Ｂ細胞）を３〜５継代培養し、１×106細胞を500μlに懸濁した。これらの検体をそれぞれＳＣＩＤマウスの右膝関節腔と腹腔にそれぞれ50μl及び450μlを移入し、６週後の右膝関節を病理組織学的に検討した。
【００２３】
その結果を図１のＡ〜Ｃに示した。単球／マクロファージや樹状細胞を含む付着細胞では関節炎は起こらなかった。未処理対照群（図１Ａ）は正常膝関節の滑膜周辺の病理組織像を示す。正常滑膜は網目状の白い脂肪細胞に富んでおり、関節腔との境は１〜２層の薄い滑膜上皮細胞で隔たっている（白矢印）。また右下の軟骨組織（黒の部分）も滑膜細胞には覆われていない（黒矢印）。これに対して、ＲＡ患者由来の関節液上清（図１Ｂ）や滑膜細胞（図１Ｃ）を移入した場合、網目状の脂肪細胞が減少し、滑膜の肥厚・絨毛化（図１Ｂ中、白矢印）、線維芽細胞による肉芽形成（図１Ｃ中、白矢印）、ならびに軟骨組織への浸潤（図１Ｂ及びＣ中、黒矢印）など増殖性の滑膜炎を発症していた。このことはＲＡ関節液上清中にマウス滑膜細胞の増殖を誘導する可溶性因子が存在することを示唆している。
【００２４】
さらに滑膜細胞を移入した場合について、滑膜細胞自身が必須なのかあるいは滑膜細胞が産生遊離する可溶性因子でも関節炎が誘導できるのかについて検討するため、滑膜細胞の培養上清を移入して調べた。培養上清は滑膜細胞を５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中で培養し、その培養上清をＳＣＩＤマウスの右膝関節腔と腹腔にそれぞれ50μlおよび450μlを移入し、６週後に上記同様、右膝関節を調べた。その結果を図１Ｄに示した。等量の５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液のみを移入した対照群は正常な関節病理組織像であった。しかし、滑膜培養上清を移入することにより、線維芽細胞の増殖を誘導し肉芽形成を伴った関節炎が惹起された（図１Ｄ中、黒矢印）。このことから、滑膜培養上清中にin vivoで滑膜細胞の増殖に関わる可溶性因子が存在することが強く示唆された。
【００２５】
《実施例２：ＲＡ患者関節液上清のin vitroにおける滑膜細胞増殖活性》
実施例１でＲＡ患者の関節液上清中にin vivo滑膜細胞を増殖させ関節炎を誘導しうる可溶性因子の存在が示されたので、つぎにこの因子のin vitroにおける滑膜細胞増殖活性について検討した。滑膜細胞は実施例1と同様に調製した。増殖活性は、滑膜細胞（４×103細胞/well)を５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中で96穴プレートに蒔き、ＲＡ患者（Donor#1）の関節液上清を最終濃度１，５，10，20および40％となるように添加し、48時間培養した。終り16時間前に0.2μCiの[3Ｈ]-チミジンを加え、16時間の[3Ｈ]-チミジン取込量(cpm)で測定した。図２（上図）に示すようにＲＡ患者（Doner#1）由来の関節液上清は濃度依存的に培養滑膜細胞の増殖を約５倍まで増強し、およそ10％以上の上清でほぼプラトーに達した。また他のＲＡ患者（Doner#2〜#6）由来の関節液上清も同様に増殖増強活性を有していた（図２下図)。このことはＲＡの関節液中にin vitroで直接的に滑膜細胞の増殖を促す可溶性因子の存在を示す。
【００２６】
《実施例３：ＲＡ患者関節液上清の滑膜細胞増殖活性に対する各種抗サイトカイン中和抗体の影響》
これまでＩＬ-１、ＩＬ-６、ＴＮＦαをはじめ、多くのサイトカインが滑膜細胞の増殖を促進することが報告されている。本発明者らは実施例２にみられたＲＡ患者由来関節液上清の強い増殖増強活性がどの因子によるものかを調べるため、関節液上清の増殖増強活性に及ぼす各種サイトカインに対するポリクローナル中和抗体の影響について調べた。
【００２７】
抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体及び抗ＴＮＦα抗体はヤギＩｇＧで、抗ＴＧＦβ抗体及び抗ＰＤＧＦ抗体はウサギＩｇＧで、全てＲ＆Ｄ社より入手した。また、コントロール抗体である正常ヤギＩｇＧ（ＧＩｇＧ）及び正常ウサギＩｇＧ（ＲＩｇＧ）はそれぞれインターセルテクノロジーズ社及びケミコンインターナショナル社より購入した。これら中和抗体及びコントロール抗体（最終濃度100μg/ml）存在下、滑膜細胞を培養し、実施例２と同様に増殖活性を測定した。
【００２８】
図３にその結果を示す。ＲＡ患者３検体（Donar#1〜#3）のいずれの関節液上清も、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ及びＰＤＧＦに対する中和抗体（100μg/ml）では影響を受けなかったが、ｂＦＧＦの中和抗体（100μg/ml）では３例全てについて増殖増強活性が強く阻害され、滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジン取込量はほぼ関節液上清非添加時の低い値まで低下した。コントロール抗体として使用した正常ウサギ抗体（ＲＩｇＧ）及び正常ヤギ抗体（ＧＩｇＧ）はほとんど影響を及ぼさなかった。この結果からＲＡ患者由来関節液に存在する種々の滑膜細胞増殖因子の中でｂＦＧＦが最も有力に働いている可能性が示唆された。
【００２９】
《実施例４：ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中の滑膜細胞増殖活性に対する各種抗サイトカイン中和抗体の影響》
実施例２のコントロール実験でみられるような５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中での滑膜細胞の緩やかな増殖に対する上記各種サイトカインの影響について、実施例３と同様に検討した。
【００３０】
図４に示すように、抗ｂＦＧＦ抗体のみが５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中での培養滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジン取込も抑制することが明らかとなった。この結果から、ｂＦＧＦは滑膜細胞の本質的な増殖においても重要な因子で、おそらくはオートクライン的に自らｂＦＧＦを産生し、増殖しているのではないかと推定された。実際、ＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果、この培養滑膜細胞はｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）のｍＲＮＡを発現していることを確認した。
【００３１】
《実施例５：培養滑膜細胞に対する種々のヒト組換えサイトカインの増殖増強活性》
実施例３でＲＡ関節液上清の滑膜細胞増殖増強活性を示す因子として、また実施例４では滑膜細胞自身の増殖に関わる本質的な因子として、ｂＦＧＦが最も有力なサイトカインであると推定されたので、さらにこれを裏付けるために、ヒト組換えｂＦＧＦ(ｒｂＦＧＦ)及びその他の組換えサイトカインの存在下に滑膜細胞を培養し、各種サイトカインの増殖誘導活性を調べた。
【００３２】
組換えＩＬ-１β（rＩＬ-１β：ベクトン・ディッキンソン社）, 組換えＩＬ-６（ｒＩＬ-６：ギブコBRL社）、組換えＴＮＦα（ｒＴＮＦα：Ｒ＆Ｄ社）及びｒｂＦＧＦ（パープロ・テックEC社）の各種組換えサイトカインを最終濃度1000、500、100、10、1ng/ml（ｒｂＦＧＦのみ0.1ng/mlについても実施）となるように滑膜細胞培養に添加し、実施例２と同様に増殖活性を測定した。
【００３３】
その結果、図５に示すように、rＩＬ-１β, ｒＩＬ-６及びｒＴＮＦαでは滑膜細胞の増殖増強活性はほとんどなかった。一方、ｒｂＦＧＦは0.1ng/ml以上で滑膜細胞の増殖を促し、１ng/ml以上でその強い増殖増強活性はほぼプラトーになった。このことは、中和抗体による抑制実験のみならず組換えサイトカインを用いた増殖実験でもｒｂＦＧＦが他のサイトカインより滑膜細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが裏付けられた。
【００３４】
《実施例６：ヒトｒｂＦＧＦのマウス線維芽細胞に対する増殖誘導活性》
ヒトｒｂＦＧＦがマウス線維芽細胞NIH3T3に対して増殖誘導活性を示すかどうか検討した。ＲＡ患者由来滑膜細胞（５×103細胞／ウェル）を５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培養液中で、またNIH3T3（５×103細胞／ウェル）を１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液中で一晩培養した。これにヒトｒｂＦＧＦを０，0.1，１，10，100，1000ng/mlとなるように添加し、さらに24時間培養し、終わり６時間の[3Ｈ]-チミジンの取込量を測定した。その結果、図６に示すように、ヒト滑膜細胞（図６左）のみならずマウス線維芽細胞（図６右）に対しても同様に濃度依存的に増殖誘導活性を有することがわかった。
【００３５】
《実施例７：ヒトｒｂＦＧＦのＳＣＩＤマウスへの移入による滑膜炎誘導》
実施例６においてヒトｒｂＦＧＦがマウスに対して同様の生物活性を示すことから、次にｒｂＦＧＦがin vivoにおいて単独で滑膜炎あるいは関節炎を誘導しうるかについて試験を行った。500ng及び50ngのヒトｒｂＦＧＦをそれぞれ500μlのＰＢＳに溶解し、得られた各濃度のｒｂＦＧＦ溶液500μlを、ＳＣＩＤマウスの右膝関節腔に50μlと腹腔に450μlとに分けて移入して６週後の右膝関節を病理組織学的に検討した。
【００３６】
その結果を図７に示した（図７Ａ及びＣ中、白く網目状に見える部分が滑膜組織の脂肪細胞を表す）。500ngのｒｂＦＧＦを移入した右膝関節は、滑膜上皮の肥厚・絨毛化（図７Ａ，矢印）、線維芽細胞様滑膜細胞の激しい増殖による肉芽形成（図７Ｂ，矢印）など、また一部軟骨破壊も起こっており、関節炎の病態を呈していた。このｒｂＦＧＦによる関節炎は右膝関節のみならず、非移入関節である左膝関節や足関節にも起こっており、ＲＡ様の対称性・多発性関節炎であった。また、50ngのｒｂＦＧＦを移入したものでも同様に滑膜上皮の肥厚・絨毛化（図７Ｃ，矢印）及び図７Ｄでは滑膜のほとんどの脂肪細胞が退縮し、線維芽細胞様滑膜細胞の増生により線維形成の進んだ滑膜病理像（図７Ｄ，矢印）が認められた。このようにｒｂＦＧＦは単独で滑膜炎様病態を惹起しうることから、滑膜炎や関節炎の発症メカニズムに関わる重要な因子であると推定された。
【００３７】
《実施例８：抗ｂＦＧＦ中和抗体による活性化関節液Ｔ細胞移入誘導関節炎の抑制》
本発明者らが既に確立したＲＡ患者由来活性化関節液Ｔ細胞を用いたＲＡ-ＳＣＩＤ関節炎モデルにおける抗ｂＦＧＦ中和抗体の抑制効果について検討した。ヒアルロニダーゼ処理したＲＡ患者関節液より比重遠心法ならびにヒツジ赤血球ロゼット法にて関節液Ｔ細胞を調製した。これをin vitroでＰＨＡ（10μg/ml）存在下３日間培養後、洗浄して活性化Ｔ細胞を得た。１×106細胞を500μlに懸濁し、ＳＣＩＤマウスの右膝関節腔と腹腔にそれぞれ50μlおよび450μlを移入して関節炎を発症誘導した（Clin. Exp. Immunol., 1996; 104, 247-254）。150μgヤギ抗ヒトｂＦＧＦポリクローナル中和抗体（Ｒ＆Ｄ社）を、移入後１，２，３，４週目に合計４回腹腔投与（i.p.）し、６週後の右膝関節を病理組織学的に検討した。対照群には等量の正常ヤギＩｇＧ抗体を投与した。
【００３８】
その結果を図８に示した。正常ヤギＩｇＧ抗体を腹腔投与した対照群は、滑膜組織への細胞浸潤、滑膜上皮の増殖・肥厚、激しい肉芽形成、軟骨組織破壊など重篤な破壊性の関節炎を起こしていた（図８ＡとＢ矢印：図中、白く見える部分（脂肪細胞）が少ない程重篤な関節炎症状を呈していることを表す）。一方、ヤギ抗ヒトｂＦＧＦ中和抗体を投与した群では滑膜上皮はわずかな肥厚・絨毛化に留まり（図８Ｃ及びＤ，矢印）、細胞浸潤、肉芽形成や軟骨組織破壊など増殖性滑膜炎の病態は著しく抑制されており、大部分の滑膜は白い網目状の脂肪細胞に富んだ正常滑膜組織像に近いものであった。以上のことから、ｂＦＧＦを抑えることにより関節炎を有意に抑制しうることがわかった。これらの結果から、ｂＦＧＦをターゲットにした薬剤が強力な慢性関節リウマチの治療薬になりうる可能性が強く示唆された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のｂＦＧＦアンタゴニストは慢性関節リウマチ治療において極めて有効であることが明らかになった。ｂＦＧＦアンタゴニストは、破壊性の関節炎に密接に関与する滑膜細胞の増殖を、直接かつ強く阻害するために、速効性が期待でき、慢性関節リウマチの初期（第一期、第二期）の軽度の関節炎から病態の進んだ重篤な関節炎（第三期、第四期）まで広く適用可能であり、しかも局所投与も可能で副作用が顕著に抑制できるという特徴を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＲＡ患者由来の関節液上清、滑膜細胞、滑膜細胞培養上清をＳＣＩＤマウスへ移入した時の右膝関節の病理組織像を表す図面代用写真。Ａ（左上図）：未処理対照群（×80）、Ｂ（右上図）：ＲＡ関節液上清移入群（×100）、Ｃ（左下図）：ＲＡ滑膜細胞移入群（×100）、及びＤ（右下図）：ＲＡ滑膜細胞培養上清移入群（×100）。
【図２】  ＲＡ患者由来の関節液上清共存下における滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジンの取込量を示す図。上図は、各種濃度のＲＡ患者関節液上清における滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジンの取込量を、下図は、各ＲＡ患者関節液上清における滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジンの取込量を示す。
【図３】  ＲＡ患者由来の関節液上清共存下における各種抗サイトカイン中和抗体添加時の滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジンの取込量を示す図。
【図４】  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培養液中での培養における各種抗サイトカイン抗体添加時の滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジンの取込量を示す図。
【図５】  各種ヒト組換えサイトカイン添加時における滑膜細胞の[3Ｈ]-チミジン取込量の相対活性を示す図。
【図６】  ヒト組換えｂＦＧＦ（ｒｂＦＧＦ）添加時におけるＲＡ患者由来滑膜細胞（左図）及びマウス線維芽細胞（右図）の[3Ｈ]-チミジン取込量を示す図。
【図７】  ｒｂＦＧＦをＳＣＩＤマウスへ移入した時の右膝関節の滑膜病理組織像を表す図面代用写真。Ａ(左上図：×100)及びＢ(右上図：×100)はｒｂＦＧＦ(500ng)移入群で、Ｃ(左下図：×220)及びＤ(右下図：×80)はｒｂＦＧＦ(50ng)移入群である。
【図８】  ＲＡ患者由来活性化関節液Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスへ移入後、ヤギ抗ヒトｂＦＧＦ中和抗体を投与した時の右膝関節の病理組織像を表す図面代用写真。Ａ(左上図：×30)及びＢ(右上図：×60)は対照(正常ヤギＩｇＧ抗体)投与群で、Ｃ(左下図：×30)及びＤ(右下図：×60)はヤギ抗ヒトｂＦＧＦ中和抗体投与群である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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