(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜の再生を促進するための粘膜再生調製物であって、天然コラーゲン含有組織に由来する精製コラーゲン材料からなる膜を含み、前記膜は外側の平滑コラーゲン面を含む第１コラーゲン層を含み、そして前記平滑面の反対側に線維性コラーゲン面をさらに含み、前記膜は、前記線維性の面に接着されたコラーゲン材料からなる第２コラーゲン層を含む、コラーゲン膜材料からなる多層性のシートを含む、粘膜再生調製物。
【請求項２】
前記第１コラーゲン層は、主にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩまたはこれらの混合物である、請求項１に記載の粘膜再生調製物。
【請求項３】
前記第２コラーゲン層は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩまたはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の粘膜再生調製物。
【請求項４】
前記膜の厚みは０．５−５ｍｍである、請求項１に記載の粘膜再生調製物。
【請求項５】
前記第２コラーゲン層は主にコラーゲンＩを含む、請求項３に記載の粘膜再生調製物。
【請求項６】
前記第２コラーゲン層は主にコラーゲンＩＩを含む、請求項３に記載の粘膜再生調製物。
【請求項７】
前記膜は少なくとも１つの粘膜再生増殖因子を有する、請求項１に記載の粘膜再生調製物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子（β−ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）またはこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の粘膜再生調製物。
【請求項９】
前記膜は、損傷領域に適合性であり、かつ該領域で粘膜を再生可能である、請求項１に記載の粘膜再生調製物。
【請求項１０】
前記粘膜損傷は口腔粘膜損傷である、請求項９に記載の粘膜再生調製物。
【請求項１１】
請求項１に記載の粘膜再生調製物を製造するための、天然コラーゲン含有組織に由来する精製コラーゲン材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
この発明は、一般に、粘膜を再生するための方法に関する。
【０００２】
【背景技術の説明】
口腔内における、前庭の深化および他の種類の口腔前庭形成術の際に、分層（ｓｐｌｉｔ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）皮膚移植片および口腔粘膜遊離移植片を用いることは、これまで長い間確立された手法であった。さらに、口蓋および頬粘膜から採取した遊離粘膜移植片を用い、無歯性歯槽突起領域で付着させた粘膜表面を再定着させることは、特に歯根形成インプラントの使用とともに行なわれてきた。
【０００３】
このような移植法が十分に確立されている一方で、正常粘膜を再建および再生させるのに効果的なアロプラスト、または異種性の代用移植材料が開発されると、口腔前庭形成術の手法にきわめて広い用途がもたらされるであろう。
【０００４】
当該分野では、一般的な粘膜の再生、特に口腔前庭形成術の処置後の粘膜の再生における改良が必要である。
【０００５】
【発明の概要】
この発明に従い、粘膜の再生は、天然コラーゲン含有組織に由来する精製コラーゲン材料からなる膜を使用することによって促進される。
【０００６】
【好ましい実施例の詳細な説明】
この発明は、粘膜の再生を促進するための方法を提供する。この方法は、特定の種類の口腔外科手術の後の、口腔内粘膜の再生促進に関して説明されるが、この方法を用い、粘膜組織に損傷を受けた身体の、あらゆる部分の粘膜の再生を促進し得ることが分かる。
【０００７】
好ましい実施例において、粘膜の再生を促進する方法は、コラーゲン膜材料のシートからなるパッチで処置すべき領域を覆う工程を含み、このコラーゲン膜材料は、平滑面および平滑面の反対側に線維性の面を有する少なくとも１つの層からなり、線維性の面はその上で細胞を増殖させ、コラーゲン膜は、コラーゲンＩＩまたはコラーゲンＩおよびＩＩＩの混合物から主に成った、開放性スポンジ様構造を有する第２の層をさらに含むのが好ましい。パッチを粘膜の欠陥部上に、好ましくは縫合糸で固定し、粘膜を再生させる。
【０００８】
この発明に従い、図１に示されるように、粘膜表面Ｍの欠陥部は、欠陥部上にパッチ１０を置き、欠陥部周辺の粘膜表面の縁にパッチを固定することによって修復される。その後、パッチを付した領域で粘膜の再生が可能になる。図１で示されるパッチ１０は、縫合糸１２によって粘膜表面Ｍに固定される。代替的に、パッチの欠陥部上への固定は、周辺の被移植粘膜または処置すべき領域周辺の他の構造物に対して、たとえば、当該分野で公知の有機接着剤、または他の適切な方法を用いてパッチを接着接合することによって行なうこともできる。
【０００９】
パッチ１０は、適切な柔軟性を備えたコラーゲン膜を含む調製物からなり、接して置かれる粘膜表面の形状に密着する。好ましい実施例において、コラーゲン膜は、粘膜への縫合糸に適応し、治癒プロセスの間、外傷から粘膜表面を保護するのに十分な強度を有する、少なくとも１つのコラーゲン層を含む。
【００１０】
図２の１４において、この発明に従った、パッチとして用いるためのコラーゲン膜の、第１の実施例が示される。膜１４は、一方側面上に平滑面１８、および平滑面と反対の他方側面上に粗いまたは線維性の面２０を有する単一のコラーゲン層１６を含む。平滑面１８は非多孔性であることが好ましく、たとえば摂食時に、力学的保護をもたらす。線維性の面２０は、その上で細胞が増殖するよう構成される。使用の際、平滑面は処置すべき領域と離して配向されるのが好ましく、線維性の面は処置すべき領域に向って配向されるのが好ましい。
【００１１】
好ましい実施例では、コラーゲン層１６は主に、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩまたはこれらの混合物である。この層用に適切な材料の１つは、この発明の譲受人である、Ｅｄ．ガイストリヒ・ゾーネ・ＡＧ・フュール・ヒェーミシェ・インダストリー（Ｅｄ．  Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ）によるビオジード（Ｂｉｏｇｉｄｅ）（Ｒ）である。ビオジード（Ｒ）材料は、この明細書中に参考として援用する米国特許第５，８３７，２７８号で説明される。
【００１２】
図３は、この発明に従った、パッチとして使用可能な多層性コラーゲン膜１４’を示す。この膜は、図２で示されるような第１のコラーゲン層１６を含み、開放性スポンジ様構造を有する第２のコラーゲン層２２をさらに含む。第２のコラーゲン層２２を第１のコラーゲン層１６の線維性の面２０に付着させ、粘膜表面と接して置き、粘膜の再生を促進するのが好ましい。第２の層２２は、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、またはこれらのコラーゲンの種類の任意の組合せから形成することができるが、好ましくは主にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩまたはコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの組合せ（たとえばＩ型コラーゲン９５％およびＩＩＩ型コラーゲン５％）から形成される。第１の層１６と第２の層２２とを組合せることによって膜１４’の厚みが増して、扱いが容易になり、治癒が改善される。膜の厚みは用途に依存して変更できるが、典型的には約０．５ｍｍから約５ｍｍの間であり、好ましくは約２ｍｍから約５ｍｍの間であり、最も好ましくは約３ｍｍの厚みであり得る。
【００１３】
図２および図３で示される実施例の第１の層１６は、種々の方法で生成することができ、米国特許第５，８３７，２７８号に記載されるプロセス工程、スラリー（フィルム様透明膜）を脱気して空気乾燥させる工程、スラリー（フィルム様透明膜）を脱気して真空乾燥させる工程、または圧縮スポンジを使用する工程、が挙げられるが、これに限定されない。第１の層１６はコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはこれらのコラーゲンの種類の組合せから形成することができる。
【００１４】
図３に示される実施例において、第２のスポンジ様の層２２は、凍結乾燥したコラーゲンスラリーであることが好ましい。第２の層２２はコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩまたはこれらのコラーゲンの種類の組合せから形成することができる。好ましくは、第２の層はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩまたはコラーゲンＩおよびＩＩＩの混合物からなる。
【００１５】
第２のコラーゲン層２２をウシまたはブタ材料から形成してもよく、好ましくはブタ材料から形成する。
【００１６】
図３で示される実施例において、第１の膜層１６および第２の膜層２２は、任意の適切な様式で互いに連結されるか結合される。３つの適切な結合方法の例としては、第１の膜層を繊維素接着剤で第２の膜層に付着させること、第１の膜層をコラーゲンスラリーを用いて第２の膜層に付着させること、または第１の膜層を、第２の膜層に対して所望されるコラーゲンの種類からなるコラーゲンスラリーで被覆した後、この結合を凍結乾燥させることが含まれる。
【００１７】
所望ならば、粘膜の再生を促進する増殖因子、たとえばＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子）、β−ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＴＧＦ−β（トランスホーミング増殖因子）を膜に付与すること、および／または粘膜に接して置かれる膜の表面に加えることが可能である。
【００１８】
例１
パッチの調製
（Ａ）  第１の膜層を、この明細書中に参考として援用する、ＷＯ９３／１１７２３に記載される手順（精製Ｉ型コラーゲンの調製物、ブタ皮膚）に従って生成する。最終洗浄した繊維は凍結乾燥せず、材料を真空脱気してトレース（ｔｒａｃｅ）に注入し、室温の層流内で乾燥する。
【００１９】
（Ｂ）  第２の膜層を、ＷＯ９３／１１７２３に記載される手順（精製Ｉ型コラーゲンの調製物、ブタ腱）に従って生成する。最終洗浄した繊維は凍結乾燥しない。最終洗浄した繊維を塩酸でｐＨ２．９−３．２まで再び酸性化し、乾燥容量を１．２−１．８％にする。このスラリーは凍結乾燥されてスポンジ状になる。
【００２０】
（Ｃ）  第１および第２の膜層を、第１の膜層の一方側面上を上述のｐＨ２．９−３．２のスラリーで覆うことによって結合する。スラリー上をスポンジで吸い取り、凍結乾燥を行なう。
【００２１】
例２
パッチの調製
（Ａ）  第１の膜層を、米国特許第５，８３７，２７８号に記載される手順に従って生成する。
【００２２】
（Ｂ）  第２の膜層を、この明細書に参考として援用する、ＷＯ９９／１９００５に記載される、ＩＩ型コラーゲンスラリーを調製するための手順により生成する。具体的には、屠殺直後のブタ由来冷凍軟骨を、リンスしてｐＨ値がｐＨ３−３．５になるまで十分な長さだけ冷水を用いた洗浄工程に従って調製する。その後、この材料を５回均質化し、水で希釈して乾燥容量が０．５−２．０％である均質な塊を得る。
【００２３】
（Ｃ）  第１および第２の膜層を、第１の層上に前の工程からのスラリーを注入することによって結合する。約３０分後、結合した生成物を凍結乾燥する。
【００２４】
例３
パッチの調製
（Ａ）  第１の膜層を、米国特許第５，８３７，２７８号に記載される手順に従って生成する。
【００２５】
（Ｂ）  第２の膜層の生成は、ブタ由来の脱脂した皮を約２０℃にて１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で約４時間処理した後、約２０℃にて１Ｎの塩酸溶液で約２時間処理し、例２で示されたように均質化することによって行なわれる。
【００２６】
（Ｃ）  第１および第２の膜層を、前の工程からのスラリーを第１の膜上に注入することによって結合する。約３０分後、結合した生成物を凍結乾燥させる。
【００２７】
例４
パッチの調製
（Ａ）  第１の膜層は、例３で得たスラリーを、アセトンによる水の除去を経て乾燥することによって生成され、アセトンで湿った生成物を２枚のガラス板の間で圧縮し、アセトンを約３５℃にて約１ｍＢａｒ未満の気圧を用いて約４８時間真空除去する。
【００２８】
（Ｂ）  第２の膜層を、例２および例３の第２の工程から生じたスラリーを等量で混合することによって生成し、その混合物を凍結乾燥してスポンジにする。
【００２９】
（Ｃ）  第１および第２の膜層を繊維素接着剤で接着することによって結合する。
【００３０】
例５
試験
調査する膜材料を、２つの層で形成されたブタのＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンによって調製した。コラーゲン膜の、深いかまたは内側の（第２の）層は粗面を有し、それを被移植の、手術用に準備された部位に隣接して置くことにより血餅の形成を容易にし、新脈管の形成を促進させる。二重層コラーゲン膜の外側の（第１の）層は、適切な弾性特性を有する平滑構造を有し、被移植粘膜縁への縫合糸に適応し、生体内分解および治癒プロセスの間、口腔の外傷から移植片（パッチ）材料を保護する。使用した部位は、アヌビスヒヒの成体の口腔粘膜の４分円の４つすべてであった。直径３ｃｍ×２ｃｍの楕円形の切除生検創傷を犬歯および小臼歯の前庭深部内の粘膜下組織に形成した。このモデルから、前庭を深くした部位を評価するための、１２の標本を得た。
【００３１】
さらに、この材料を無歯の歯槽突起領域に付着させた粘膜を再建するためのベースとして用いる場合、無歯の上顎骨に付着させた粘膜の領域を使用して、この材料がいかに効果的であるかを判断した。動物３体において、頬側面および左右の口蓋表面から１ｃｍ上の突起の稜から延びる突起の稜にわたり、１．５ｃｍ×３ｃｍの領域を切開した。
【００３２】
膜材料を、被移植粘膜表面の縁に置き、４−０単繊維ナイロンの結節縫合糸で、その縁に固定した。（各コラーゲン膜配置に対する総縫合数は、１０から１６であった。）動物は、ペニシリン、プロカイン１５０，０００単位およびビシリン１５０，０００単位からなる抗生物質の適用を、術後４日間筋肉投与により受けた。動物には定期的に節食させ、運動場付きの大きなカゴの中で自由運動させた。
【００３３】
前庭の手術部位への生検を、３週目および６週目終了時に行なった。３週目において、各動物の一方側（２つの４分円）の生検は、上方のネイティブな残存被移植粘膜表面から、膜材料の表面を横切って、反対側にある下方の移植片の被移植縁まで延長して行なわれた。標本の表面に、組織学的検査に向けて縫合糸により適切な標識を付けた。生検領域を結節縫合によって閉鎖し、治癒を促した。各動物の２つの４分円を６週間そのままにし、その時点で領域全体を切除し、粘膜表面を剥離して合わせることにより、１次的創閉鎖を得た。
【００３４】
付着させた粘膜領域の生検も同様に行なった。すなわち、各動物の一方側を３週目で、他方側を６週目で採取し、各期間で合計３つの標本を採取した。
【００３５】
すべての場合、縫合糸を術後第１４日目に除去した。動物の臨床的術後経過には特記すべきことがなかった。炎症または感染症の臨床的徴候はなく、膜材料の腐肉化もなかった。膜はその場に留まり、縁は被移植粘膜周辺表面からの緩やかな再上皮化を示した。残存する膜材料の領域は、臨床的に術後第２から第３週目まで見られた。６週目で、手術部位全体は正常な外観の粘膜で再上皮化された。
【００３６】
３週目終了時の生検は、正常なレテペグ（ｒｅｔｅｐｅｇ）形成で縁の上皮化を示した。膜表面上を移動する上皮による、コラーゲンの分解領域が見られた。（もとのサイズ３×２ｃｍから）約０．５ｃｍ×０．３ｃｍと計測される膜の中央部において、再上皮化はなかった。
【００３７】
６週目標本において、パッチを付した領域の完全切除および生検の結果、良好な粘膜表面が、粘膜下組織の新脈管形成、および正常な重層（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ）扁平上皮の形成の徴候とともに、パッチを付された領域にわたって完全に生じていることが確認された。膜材料を完全に受容する徴候も見られた。残存するコラーゲンの極めて小さな領域が表面上皮下に見られた。使用した染色剤は、マッソン（Ｍａｓｏｎ）のトリクロームおよびヘマトキシリン−エオジンであった。
【００３８】
パッチを付した領域全体の完全な評価ができるように、複数の部分を６週目標本から採取し、組織学的検査プロセスにおいて検出されない残存膜材料がないようにした。
【００３９】
パッチを後側歯槽突起および口蓋上顎表面に置くと、前庭深部タイプの試験部位で見られたのと同様に、膜材料に置き代わったことを示した。３週目で、パッチを付した部位の中央部に残存粘膜材料が存在する徴候が示された。線維芽細胞および移動する上皮がパッチを付した部位の周辺縁から見られた。６週目標本では、新しく付着した粘膜が口蓋表面上、歯槽突起稜上、および歯槽突起の頬面上ですべての標本に見られた。このことは、材料の完全な受容および付着した粘膜の良好な再形成を示した。
【００４０】
組織学的外観は、上顎後側領域の有効性が本試験において特に研究されなかったものの、この領域内で本材料を歯根形成インプラントとともに用い、付着させた粘膜の再建が可能になることを示した。
【００４１】
前庭の移植のための、動物において選択した部位は、上顎および下顎の犬歯、および小臼歯前庭粘膜領域内にあった。この領域は特に、アヌビスヒヒにおいて、採餌および咀嚼中に外傷を受けやすく、ストレスを生じる試験部位として働いた。したがって、材料は、傷害がきわめて起こりやすい状態に置かれ、結果として感染およびパッチの位置ずれを生じる可能性があった。しかし、これはいかなる試験部位においても起こらず、材料はその場に留まり、被移植細胞活動の極めて緩やかなプロセスによって生体内分解された。
【００４２】
この発明に従った、パッチとしてのコラーゲン膜の使用は、自原性軟組織移植の優れた代用品であると、これらの試験に基づいて結論付けられた。ある種のアロプラストまたは同種の表面包帯材は、創傷の拘縮および瘢痕の形成を生じる傾向がある。人工皮膚表面包帯材も、早期に生体分解して腐肉化するか、遅延炎症性反応を伴って、過長期間残存する傾向がある。この発明では、瘢痕も過長炎症反応の徴候もなかった。外科的包帯材の使用の際に時折生ずる粘膜下線維素の徴候も、全く見られなかった。
【００４３】
したがって、この材料を遊離粘膜移植片または分層皮膚移植片の代用として用いることで前庭の高さを維持し、歯根形成インプラント領域内に付着させた粘膜の再生が可能になることは明らかである。この方法の明らかな利点のいくつかとは、この膜が（ａ）有害な炎症反応なしに生体分解すること、（ｂ）正常粘膜でその領域の再生を促進すること、および（ｃ）外科的操作が技術的に可能であり、縫合に対して耐性を呈することにある。
【００４４】
上述の実施例に対して多くの詳細な改変、変形および変更が行なわれる可能性があるので、上述の説明内にあり、添付の図面に示されるすべての事項は例示的に解釈され、限定的な意味で解釈されないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  コラーゲン膜材料からなるパッチが、処置すべき粘膜の領域を覆っているのを示す平面図である。
【図２】  この発明に従った、膜の使用を示す側断面図である。
【図３】  この発明に従った、別の膜の使用を示す側断面図である。
【符号の説明】
１０  パッチ、１２  縫合、１４  膜、１４’  多層性コラーゲン膜、１６  第１のコラーゲン層、１８  平滑面、２０  線維性の面、２２  第２のコラーゲン層。
【図１】
0004285940.tif 000002
【図２】
0004285940.tif 000003
【図３】
0004285940.tif 000004