(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗原結合部位を有することにより、ヒトリンパ球の表面に置かれているヒトＣＤ４０抗原に結合可能であり、且つヒトＣＤ８６抗原に結合特異性を示す可溶性蛋白分子。
【請求項２】
ＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗原結合部位を有する抗体である請求項１記載の可溶性蛋白分子。
【請求項３】
ＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗原結合部位を含むことにより、ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合することのできる二特異的ジアボディーである請求項２記載の可溶性蛋白分子。
【請求項４】
宿主細胞中で抗体分子を発現することのできる調節配列に作動可能に結合された、請求項１〜３のいずれかに記載の可溶性蛋白分子断片をコードするヌクレオチド配列を有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターで安定に形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項5記載の宿主細胞を培養し、培養基から、ＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗原結合部位を有することによりヒトＣＤ４０抗原および少なくともヒトＣＤ８６抗原に結合することのできる組換え分子を単離することからなる、結合性組換え分子の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の治療効果量の可溶性蛋白分子および薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、Ｔ細胞寛容誘導のための薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の治療効果量の可溶性蛋白分子および薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、Ｔ細胞仲介免疫応答の治療のための薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の治療効果量の可溶性蛋白分子および薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、同種移植臓器あるいは異種移植臓器拒絶反応の防止のための薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の治療効果量の可溶性蛋白分子および薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、同種移植臓器あるいは異種移植臓器寛容の誘導のための薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の治療効果量の可溶性蛋白分子および薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、自己免疫疾患の予病または治療のための薬組成物。
【請求項１２】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症または乾癬である請求項１１に記載の薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は免疫系が関与する疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、移植片拒絶、自己免疫疾患、またはＴ細胞依存免疫応答が治療用分子またはキャリヤー（遺伝子治療ビヒクル等）に対して作られる場合等のＴ細胞仲介免疫応答を妨げる方法に関する。
発明の背景
Ｔ細胞の活性化：
Ｔ細胞の活性化は抗原提示細胞（ＡＰＣ）との複数の相互作用を必要とすることが知られている。ＴｃＲ−ＣＤ３複合体は、抗原誘導活性化において、特異的抗原が適当なＭＨＣ分子に関連して認識される認識機能、および認識結果が血漿膜を通って伝えられるシグナル機構の二つの機能を有する。しかし、増殖と成熟をイフェクター細胞に誘導するために、Ｔ細胞はＴｃＲ−ＣＤ３複合体により仲介されるものに加えて第二シグナルを必要とする。この共刺激シグナルは、通常はＡＰＣの細胞表面により提供される。共刺激シグナルの不存在化でのＴｃＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用後の細胞間シグナルは、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞非反応性として知られるＴ細胞不活化をもたらす。ＡＰＣ上に公知リガンドを有するＴ細胞の細胞表面に存在する幾つかのアクセサリー分子は、Ｔ細胞活性化で共刺激シグナルを提供することに関連している。
Ｂ７−ＣＤ２８共刺激経路：
完全Ｔ細胞活性化をもたらす最善の候補共刺激シグナルはＡＰＣ上のＢ７共刺激分子に対するＴ細胞上のＣＤ２８の相互作用により作られる。インビトロ研究はＣＤ２８共刺激経路によるシグナルはアネルギーの誘導を妨げうることを示している。
現在まで、Ｂ７ファミリーの二メンバーである当初はＢ７／ＢＢ１と名付けられたＢ７．１（ＣＤ８０）、およびＢ７０またはＢ７．２（ＣＤ８６）と名付けられた第二Ｂ７分子が分子的にクローン化され、機能的に特性付けられている。ＣＤ８０は４５〜６５ｋＤａの見掛け分子質量を有する単量体トランスメンブラン糖タンパク質であり、ＣＤ２８のように免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（Freeman et al., J. Immunol. 143:2714（1989））。最初に、ＣＤ８０分子の発現は、ＩＦＮ−γで刺激された活性化Ｂ細胞と単球に制限されていることが報告された（Freedman et al., Cell Immunol. 137:429（1991））。さらに最近、ＣＤ８０発現は培養末梢血液樹枝状細胞（Young et al., J. Clin. Invest. 90:229（1992））およびインビトロ活性化Ｔ細胞（Azuma et al., J. Exp. Med. 177:845（1993））にも発見されている。ＣＤ８６は約７０ＫＤａの見掛け分子質量を有するトランスメンブラン糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーでもある（Freeman et al., Science 262:909（1993）; Azuma et al., Nature 366:76（1993））。ＣＤ８６分子は、細胞表面発現の誘導が速く思え、それが新しく単離された単球上に存在することを除けば、ＣＤ８０に非常に類似する分散パターンを有するように思える。
ＣＤ８０のみをブロックすることはＴ細胞活性化の部分的な抑制をもたらすことが文献から明らかである。アロ抗原を発現する単球によるＴ細胞の活性化は主にＣＤ８６共刺激に依存する。刺激細胞として単球を用いるＭＬＣの間、抗ＣＤ８６Ｍａｂだけが増殖応答を強く阻害するが完全には阻害することはできなかった。しかし、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ＣＤ８０とＣＤ８６に結合することのできる、ヒトＩｇＧに結合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外領域［ＣＨ２とＣＨ３領域］からなる可溶性融合タンパク質）のみ、または抗ＣＤ８０＋抗ＣＤ８６Ｍａｂｓの組み合わせが最大阻害を示した。
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ共刺激経路：
上記の概説された文献データから、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８による共刺激がブロックされているときに他の共刺激分子がＴ細胞の活性に非常に重要性を持ちうるように思える。そうした一つの代用共刺激経路はＡＰＣ上のＣＤ４０とＴ細胞上のＣＤ４０Ｌとの相互作用により調節される。ＣＤ４０分子はタイプＩのトランスメンブランタンパク質のＴＮＦレセプターファミリーに属する。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、ＴＮＦについて２レセプター；低親和性神経成長因子レセプター；Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２７；ＣＤ３０および；ＣＤ９５が挙げられ、これらはシステインに富む細胞外領域中の配列相同性により特性付けられる（Armitage et al., Current Opinion in Immunology 6:407（1994））。興味深いことに、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーの関する公知のリガンドは同じく非常に均一的であり、ＴＮＦ／ＣＤ４０Ｌ遺伝子ファミリーと名付けられたもう一つの遺伝子ファミリーを形成している。ＴＮＦ−αは可溶性サイトカインであるが、それは膜に会合した分子として最初に合成される。ＴＮＦ／ＣＤ４０ＬレセプターファミリーのメンバーのほとんどはタイプＩＩのトランスメンブランタンパク質である。
ＣＤ４０はＢ細胞活性化における機能が最もよく知られている。この分子はすべてのＢ細胞上で構成的に発現される。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は精製されたＢ細胞の増殖を促進でき、サイトカイン類と組み合せて免疫グロブリン産生を仲介することができる。最近の研究はＣＤ４０分子の分布は最初に仮定されたようには制限されていないことを示している。新しく単離されたヒト単球は調節可能な低いレベルのＣＤ４０分子を発現し、これはＩＦＮ−γの存在下での培養により上昇するように調節できる（Alderson et al., J. Exp. Med. 178:669（1993））。ＣＤ４０による単球の刺激は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α等の前炎症サイトカイン類、酸化窒素等の毒性のあるフリーラジカル中間体の分泌およびＢ７共刺激分子の上昇調節をもたらす。末梢血液から単離されたヒト樹枝状細胞（ＤＣ）もＣＤ４０分子を発現できる（Caux et al., J. Exp. Med. 180:263（1994））ＤＣ上のＣＤ４０のリゲーションはインビトロで培養された場合にこれら細胞の向上生存性をもたらす。さらに、単球の場合と同じように、ＤＣの刺激はＩＬ−１およびＴＮＦ−α等の前炎症サイトカイン類の分泌およびＣＤ８０／８６共刺激分子の上昇調節をもたらす。
上記のすべての観察は、活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ分子は、免疫炎症応答に関与する多様な種類の細胞上に発現されるＣＤ４０のリゲーションにより刺激効果を仲介する重要なイフェクター分子であることを明らかに示している。しかし、ＣＤ４０Ｌ分子はＴ細胞それ自体の共刺激をもたらすシグナルを受け取ることができるとの実験的な証拠も存在する。ヒトＴ細胞に対する抗ＣＤ３モノクローナル抗体を、その細胞表面上のＦｃレセプターと結合することにより提示することのできるマウスＰ８１５細胞を用いて、ＣＤ４０をトランスフェクトしたＰ８１５細胞は、小さな休止ヒトＴ細胞の増殖とＣＴＬ活性を実質的に誘導することができることが示された（Cayabyab et al., J. Immunol. 152:1523（1994））。これはＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用が明らかに両方向性であることを示している。
ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８をブロックした後の延長した移植片生存度：
いくつかの現在のインビボモデルが、延長した移植片受容性の誘導がＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８経路の中断により可能であることを示した。マウスにおける異種間のヒト膵島移植直後のＣＴＬＡ−４による処置は長期の移植片生存度をもたらした（Lenschow et al., Science 257:789（1992））。しかし、完全にミスマッチしたラット心臓同種移植片の９０％は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇで７日間腹腔内（ＩＰ）処置されたラットで拒絶された（Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102（1992））。移植時には静脈内（ＩＶ）で、次に２〜１２日目では隔日で腹腔内処置で投与されたＣＴＬＡ−４Ｉｇはマウスの心臓同種移植片生存度を延長させたが、主要皮膚移植片の生存度を延長することはできなかった（Pearson et al., Transplantation 57:1701（1994））。ＣＴＬＡ−４ＩｇによるＣＤ２８経路のブロックは、コントロールと比較して、ラットでの小腸移植片生存度の顕著な延長をもたらしたが、すべての移植片は１５日後には拒絶された（Pescovitz et al., Transplant Proc. 26:1618（1994））。最後に、ＣＴＬＡ−４Ｉｇによる処置は完全な同種間骨髄の受容動物において致死的なネズミＧＶＨＤを減少させ、移植後３ヶ月以上生き延びるマウスの６３％までの生存度を有意に延長させた（Blazar et al., Blood 83:3815（1994））。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ単独でインビトロおよびインビボでアネルギーを誘導することができないことは、ＡＰＣ上の他のアクセサリー分子からのシグナルと組み合せたＴＣＲトリガーにより誘導された持続性ＩＬ−２産生によりほとんど説明することができよう。
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌをブロックした後の延長した移植片生存度：
最近の研究はＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路をブロックすることは移植モデルにおいて強く免疫抑制的であることも示した。同種間の小リンパ球またはＴ細胞除去の小リンパ球、プラスマウスＣＤ４０Ｌに対する抗体との組み合せ処置は、主要または小さい組織適合性座が異なる４０匹の受容動物のうち３７匹で膵島同種移植片の無限の生存を可能とした（Parker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:9560（1995））。これらの実験から、おそらくＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用の効果的ブロックが同種間反応性ホストＴ細胞による小休止リンパ球に対する共刺激分子の誘導の妨げを引き起こしたと結論された。もう一つの最近の研究において、移植時にマウスＣＤ４０Ｌへブロック性Ｍａｂを投与することはネーティブおよび感作ホストにおいて完全に異なるネズミ心臓同種移植片の生存を顕著に延長したことが示された。しかし、抗ＣＤ４０Ｌ治療は手術後５日目まで延期された場合、抗ＣＤ４０Ｌは移植片生存を延長させることはなかった。この研究から、抗ＣＤ４０Ｌ治療は主にエフェクター機能のためのＴ細胞援助に干渉することにより同種移植片拒絶を阻害したと結論された。
ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌのブロック後の慢性的拒絶の兆候のない同種移植片の長期受容：
二つの主要なＴ細胞共刺激経路のいずれかをブロックすることにより、ＣＤ８０／８６−ＣＤ２８のみ、またはＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌのみでは高く免疫原性同種移植片の不確定な移植を可能とするには不十分である。しかし、最近、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路のブロックはインビトロおよびインビボで効果的にＴ細胞クローナル膨張を抑え、完全な同種間の皮膚移植片の長期生存を促進し、主に血管形成心臓同種移植片の慢性血管拒絶の発達を阻害することが最近しめされた（Larsen et al., Nature 381:434（1996））。血管形成ネズミ心臓同種移植片モデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのみで処置されたＣ３ＨＪ受容動物（平均生存時間（ＭＳＴ）５０ｄ）、抗ＣＤ４０Ｌ Ｍａｂのみで処置された動物（ＭＳＴ ７０ｄ）、またはその組合せで処置された動物（ＭＳＴ＞７０ｄ）のすべてが未処置コントロール（ＭＳＴ １２ｄ）と比較してＢＡＬＢ／ｃ心臓同種移植片の延長した生存度を示した。興味深いことに、移植後５８〜６２日目に組織を調たときに、顕著な違いが明らかであった。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−処置マウスからの同種移植片は広範なリンパ球浸透、間質繊維症、および激しい心臓動脈内膜肥大および繊維症を示し、すべてが慢性拒絶プロセスの明らかな兆候であった。抗ＣＤ４０Ｌ処置受容動物はリンパ球浸透および間質繊維症が軽かったが、慢性拒絶の内膜血管病の特性も有した。対照的に、ＣＤ８０／８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路が同時にブロックされマウスからの同種移植片は、実質および血管が正常なＢＡＬＢ／ｃ心臓に見られるものと事実上区別されなかった。
本発明で提出される問題：
免疫学的寛容に関する現在の概念は、アネルギーが、所謂共刺激シグナルの不存在下で、ＴｃＲ／ＭＨＣペプチド相互作用後の細胞間シグナルの結果であることを支持する。上記のように、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８共刺激経路およびＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０共刺激経路の両方がＴ細胞の活性化に重要であり、アネルギーの防止に役割を果たす。ＴｃＲ／ＣＤ３複合物によるＴ細胞の刺激はＣＤ４０Ｌの低く一時的な発現をもたらす。ＴｃＲ／ＣＤ３およびＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８の共刺激によるＴ細胞の刺激はＣＤ４０Ｌ分子の強く、延長した発現をもたらすことが以前に示されている。ＣＤ８６の低いレベルは多様なＡＰＣ集団上に構成的に発見することができる。さらに、ＣＤ４０によるＡＰＣの刺激はＣＤ８０とＣＤ８６を上昇調節する最大のシグナルの一つである。同様に、ＣＤ４０Ｌの低いレベルは、完全な共刺激なしでさえも抗原の最初の遭遇（ＴｃＲ／ＣＤ３活性化）後にＴ細胞上に発現される。このＣＤ４０Ｌ発現はＣＤ４０によるＡＰＣからのシグナルを受け取るのみならず、ＣＤ８６の発現を向上させ、最も重要にはＣＤ８０発現を上昇調節するＡＰＣを刺激することもできる。同時に、専門的ＡＰＣ上の低いレベルのＣＤ８６発現はＴ細胞アネルギーの誘導を妨げることができ、ＣＤ８０とＣＤ８６発現の上昇調節はサイトカイン類を分泌させ、ＣＤ４０Ｌ発現を向上させるようにＴ細胞を強く刺激する。したがって、これらの二つの相互作用（ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０およびＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８）がＴ細胞仲介免疫応答の開始と増幅に関連していると本発明者らにより結論される。これは免疫応答の最適応答のために顕著な意味を有する。なぜならば、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用をブロックすることのみがＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８によるＴ細胞の活性化を完全には妨げず、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８相互作用をブロックすることのみがＡＰＣ集団のエフェクター機能の活性化を完全には妨げないからである。これらの発見から、最適免疫抑制のために、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は同時にブロックする必要はないと結論される。
しかし、これが単一の医薬剤により達成できることは明らかではない。なぜならば、そのような薬剤は現在利用できないからである。上記のインビボ実験において、マウスＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体の組合せをＣＴＬＡ４−Ｉｇと組み合せて用いてＣＤ８０およびＣＤ８６の両方をブロックした。しかし、ＣＴＬＡ４−Ｉｇと抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のリガンド結合領域を組み合せることによる単一薬剤の生成はＴ細胞とＡＰＣの架橋をもたらすだろう。これはＴ細胞の活性化を疑いもなくもたらし、これは所望の効果とはまさに反対である。さらに、上記で挙げた刊行物のすべてはＣＤ８０およびＣＤ８６の両方をブロックすることはそれぞれを別々にブロックするよりも良好な免疫抑制をもたらすことを明らかに示唆している。また、ＣＤ８０とＣＤ８６の両方をブロックすることのみがＴ細胞アネルギーをもたらしうることが示されている。したがって、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と組み合わせて、ＣＤ８６のみのブロックは、ＣＤ８０がブロックされていないことにもかかわらずＴ細胞アネルギーをもたらすことを発見することは驚くべきことであった。これは、ＣＤ４０とＣＤ８６分子の両方に結合し、ブロックする能力を有する医薬分子からなる本発明を導いた。
発明の要約
本発明は、専門のＡＰＣ上に低い量で発現される、ＣＤ４０に結合する拮抗性分子およびＣＤ８６に結合する拮抗性分子の分子的組合せがＴ細胞の活性化を潜在的に阻害することができ、Ｔ細胞アネルギーさえもたらすとの発見に基づく。したがって、この組合せは、Ｔ細胞の活性化が関与する疾患の予防および治療に用いることができる。
したがって、本発明の第一の目的は抗原提示細胞の表面上に置かれているヒトＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合可能な単一の可溶性分子の治療効果量からなる医薬組成物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、患者において移植片拒絶、多硬化症、乾せん、リュウマチ性関節炎、および全身紅斑性狼そう等のＴ細胞媒介疾患の治療方法を提供することであり、該方法は、薬学的に許容される賦形剤中の、抗原提示細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合することのできる単一の可溶性リガンドの治療効果量を、それらの治療が必要な患者に投与することからなる。
この治療で用いられる好適な医薬組成物は、ＣＤ４０に対する薬学活性拮抗性モノクローナル抗体またはその断片と、ＣＤ８６に対するモノクローナル抗体、ＣＴＬＡ−Ｉｇ分子またはこれらの断片等の薬学活性拮抗性ＣＤ８６リガンドとの結合体、を包含する単一のタンパク質である。
さらに好ましい医薬組成物は、ＣＤ４０に対する薬学活性拮抗性モノクローナル抗体またはその断片と、薬学活性抗ＣＤ８６モノクローナル抗体Ｆｕｎ−１（Nozawa et al., J. Pathol. 169:309（1993））またはその薬学活性のある断片との結合体、を包含する単一タンパク質である。
発明の詳細な説明
ここに記載される発明は、以前に発表された研究および係属中の特許出願を参考にしたものである。上記または下記で挙げられるこれらのすべての刊行物および出願は文献の援用により編入される。本発明は添付の請求の範囲に定義されている。
ここに記載の抗原に結合できる分子とは、典型的には抗体を意味するが限定されない。特定の結合能力を有する他の分子、例えばリガンドも含まれる。
ここで用いられる「抗体」との用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一鎖抗体、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、および親抗体の抗原結合機能を保持するそれ以外の断片を意味する。
ここで用いられる「モノクローナル抗体」との用語は、均一抗体集団を有する抗体組成物を意味する。この用語は種または抗体の源に関して限定されるものではなく、それが作られた方法により限定を意図されるものでもない。この用語は全免疫グロブリンならびにおよびその断片、例えばＦab、Ｆ(ab’)2、Ｆv、および抗体の抗原結合機能を保持するそれ以外のものを意味する。どの哺乳種のモノクローナル抗体も本発明で用いることができる。
ここで用いられる「キメラ抗体」は、免疫グロブリンの定常部がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
ここに用いられている「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンの枠組みの少なくとも一部がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
ここに用いられている「単一鎖抗体またはＳｃＦｖ」との用語は、結合性抗体の結合領域（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能とする結合部分を供給することにより調製された抗体を意味する。これは、本質的には、抗体に結合するために必要な可変領域の部分のみを有する、ラジカルの省略された抗体を形成する。単一鎖抗体の測定と構築はＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
ここに用いられている「二特異的ジアボディー」とは、二つの異なる結合特異性を有する二つの一本鎖抗体断片が共に折りたたまれて二つの単一鎖抗体断片の組合された結合特異性を有する一分子を形成する単一の分子を意味する。
ここに用いられている「二特異的トリアボディー」とは、一特異性の二つの単一鎖抗体断片が別の特異性の単一鎖抗体断片とともに折りたたまれて、二つの異なる単一鎖抗体断片の組合された結合特異性を有する一分子を形成する単一の分子を意味する。
ここに用いられている「三特異的トリアボディー」とは、異なる結合特異性を有する三つの異なる単一鎖抗体が共に折りたたまれて三つの単一鎖抗体断片の組合された結合特異性を有する一分子を形成する単一の分子を意味する。
ここに用いられている「ＣＤ８０」、「ＣＤ８６」、「ＣＤ４０」および「ＣＤ４０Ｌ」との用語は上記で広範に論じたヒト表面分子を意味する。免疫目的のために、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ抗原は当分野で知られている技術により調製してよい。ヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌに対する抗体は当分野において知られている。本発明は既に詳細に説明したような抗体のための新しい利用を意図する。
ここに用いられている「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」との用語は、ヒトＩｇＧに結合させたヒトＬＴＬＡ４の細胞外領域［ＣＨ２およびＣＨ３領域］からなる可溶性融合タンパク質を意味する（Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561（1991））。
本発明で用いられている「複合体」および「融合タンパク質」との用語は抗原提示細胞の表面に置かれているヒトＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合可能な二つの可溶性リガンド間の結合タイプからの結果を意味し、該結合は当分野で公知の治術によりもたらすことができる。そのような技術としては公知の化学的操作の利用による化学的結合、または二つの可溶性分子の組換えＤＮＡ技術による単一鎖分子への融合が挙げられる。
ここに用いられている「拮抗性」との用語は、可溶性リガンドが標的細胞の膜上の置かれた抗原に結合する能力を意味し、ここで該結合は、天然リガンドによる該標的の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションの防止をもたらす該抗原の天然リガンドの結合を妨げる。細胞表面上に置かれたヒトＣＤ４０分子に結合できる拮抗性分子抗体がＡｌｄｅｒｓｏｎら（J. Exp. Med. 198（1993）, 669）により記載されている。
ここに用いられている「非刺激性拮抗性」との用語は、細胞表面上に置かれた抗原に結合する可溶性リガンドの能力を意味し、該結合は、天然のリガンドにより誘導された標的細胞の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションの防止をもたらす該抗原の天然リガンドの結合を妨げ、さらに該結合それ自体が該細胞の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションをもたらさない。細胞表面上に置かれたヒトＣＤ４０分子に結合できる非刺激拮抗性モノクローナル抗体はＷＯ ９４／０１５４７に記載されている。
ここに用いられている「架橋」との用語は、細胞上に発現された単一または複数のリガンドの結合の結果として二細胞の物理的相互作用を意味し、ここで該結合は細胞の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションをもたらす。
本発明の医薬組成物は、同種間移植片拒絶を妨げ、異種間移植片拒絶を妨げ、自己免疫疾患を治療し、または治療用分子または治療用キャリヤー（遺伝子治療ベクター等）に対するＴ細胞依存性免疫応答の誘導を防止するために治療効果のある濃度で投与される。この目標を達成するために、活性分子は当技術で知られている多様な許容性のある賦形剤を用いて処方してもよい。典型的には、医薬組成物は静脈内または腹腔内のいずれかで注射により投与される。この投与を達成するための方法は当業者に公知である。局所または経口により投与してもよい組成物を得ることができ、または粘膜を経た透過が可能である組成物を得ることができる。
ヒトへの投与前に、処方物を医薬組成物に添加してもよい。液体処方物が望ましい。例えば、これらの処方物としてはオイル、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または増量剤が挙げられる。好ましくは、炭水化物としては糖または糖アルコール、例えば単糖類、二糖類または多糖類、または水溶性グルカン類が挙げられる。糖類またはグルカン類としては、フラクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、シュクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を挙げることができる。シュクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素と定義され、ガラシトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールが挙げられる。マンニトールが望ましい。上記のこれらの糖類および糖アルコールは単独または組み合せて用いてもよい。糖または糖アルコールは水性調製物に可溶性であるかぎり使用される量に一定の制限は存在しない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２．０ｗ／ｖ％〜６．０ｗ／ｖ％である。好ましくは、アミノ酸として左旋（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが挙げられる；しかし、他のアミノ酸を添加してもよい。好適なポリマーとしては、２，０００と３，０００の間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または３，０００と５，０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液中のｐＨ変化を最小化するために組成物中に緩衝液を使用することも好ましい。大体はどのような生理的緩衝液を用いてもよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が望ましい。最も好ましいのはクエン酸緩衝液である。好ましくは、その濃度は０．０１〜０．３モルである。処方物に添加することのできる界面活性剤はＥＰ−Ａ ２７０，７９９および２６８，１１０に示されている。
さらに、結合分子はポリマーへの共有複合化により化学修飾して、例えばそれらの循環半減期を増加させることができる。好ましいポリマー、およびそれらをペプチドに結合する方法は、文献の援用により全文がここに編入される米国特許第４，７６６，１０６号、４，１７９，３３７号、４，４９５，２８５号、および４，６０９，５４６号に示されている。好適なポリマーはポリオキシエチル化ポリオール類およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（式中、Ｒは水素であるか、またはアルキルまたはアルカノール基等の保護基であってよい）を有する。好ましくは、保護基は１〜８炭素を有し、好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１〜１，０００、より好ましくは２〜５００である。ＰＥＧは１０００〜４０，０００、より好ましくは２０００〜２０，０００、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも一つの水酸基を有し、より好ましくは、それは末端水酸基である。阻害剤上のフリーのアミノ基と反応するように活性化されるのが好ましいのがこの水酸基である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオール類も本発明に有用である。それらには、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等がある。ＰＯＧが好ましい。一つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば動物およびヒト中のモノ、ジ、トリグリセリド中に天然に存在するものと同じ骨格であるためである。したがって、この枝別れは体内の外来剤として必ずしも見なされないだろう。ＰＯＧはＰＥＧと同じ範囲の好ましい分子量を有する。ＯＰＧに関する構造はＫｎａｕｆら（J. Bio. Chem. 263:15064, 1988）に示されており、ＯＰＧ／ＩＬ−２複合体の議論が米国特許第４，７６６，１０６号に見られる（前記の二文献は援用によりその全内容をここに編入する）。
上記のように、本発明の医薬組成物は、同種間移植片拒絶を妨げ、異種間移植片拒絶を妨げ、または自己免疫疾患を治療するために用いられる。投与の好ましい経路は非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は薬学的に許容される非経口ビヒクルに組み合せて溶液、懸濁液またはエマルジョン等の単位投与可能形で配合されよう。そのようなビヒクルは内在的に非毒性であり、非治療的である。そのようなビヒクルの実例は塩溶液、リンガー溶液、デキトロース溶液、およびハンクス溶液である。固定化オイルおよびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルを用いてもよい。好適なビヒクルは塩溶液中の５％デキストロースである。ビヒクルは、緩衝液および保存剤等の等張性および化学安定性を高める物質など少量の添加物を含有してよい。
投与量と投与方法はそれぞれの場合に基づく。一般的に、組成物は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの量で与えられるように投与される。好ましくは、それは一回で投与される量として与えられる。連続的な点滴を用いてもよい。そのような場合、医薬組成物を０．０５〜１ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量で注入してよい。
以下、本発明は特に有利な実施態様を示す下記実施例により詳細に説明する。ただし、これらの実施態様は説明するためのものであって本発明を決して限定するものではないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ジアボディー構築物での最初の工程、Ｖ領域の交換の模式図を示す。
図２は、ジアボディー構築の第二工程であるリンカーの交換の模式図を示す。
図３は、抗ＣＤ４０／抗ＣＤ８６ジアボディーのクローニングに適用された方法の模式図を示す。
図４は、ＣＤ８６−ＩｇおよびＣＤ４０−Ｉｇ抗原に同時に結合するジアボディー能を示すＢＩＡ核センソグラムを示す。最初の洗浄後の応答と注入後の標準化されたシグナルとの違いからわかるように、６５３７応答単位（ＲＵ）ＣＤ８６−Ｉｇを含有する表面上でｔ＝１１０（秒）で注入された細胞質分画から、１３００ＲＵジアボディーがｔ＝２３０（秒）で捕捉された。ｔ＝３６０（秒）で、ＣＤ４０−Ｉｇは１２０秒間注入された。ＣＤ８６−Ｉｇに対する一つの結合領域で阻止されたジアボディーはＣＤ４０−Ｉｇに対する他の領域と反応して５５０ＲＵ捕捉抗原を生じた（ｔ＝４８０（秒）での第二洗浄間のシグナルとｔ＝３６０（秒）での第二洗浄前のシグナルの違い）。
図５は、Ｔ細胞がアロ原性単球で刺激されたＴ細胞活性化実験の結果を示す。Ｔ細胞活性化はＣＤ８０およびＣＤ８６を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたは拮抗性抗ＣＤ−４０モノクローナル抗体Ｍ３のみによりブロックすることにより部分的に阻害されるが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ３が組み合わされた場合にはほとんど完全にブロックされる。
図６は、Ｔ細胞が一次刺激中にブロック剤の存在下にアロ原性単球により刺激され、ブロック剤の不存在下での再刺激中に増殖能力について分析したＴ細胞再刺激実験の結果を示す。ＣＴＬＡ４−Ｉｇのみの存在は僅かにアロ抗原に特異的な低い応答性をもたらす一方で、ＣＴＬＡ４−ＩｇとＣｓＡまたは拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ１３との組合せはＴ細胞非反応性をもたらす。コントロールの第三のアロ抗原を発現する単球に対するＴ細胞応答は影響されない。黒く塗ったバーは一次培養に用いられたアロ抗原に対するＴ細胞応答であり、白抜きのバーは第三のアロ抗原を発現する単球に対するＴ細胞応答を示す。
図７は、Ｔ細胞が一次刺激中、ブロック剤の存在下にアロ原性ＰＢＭＣにより刺激され、ブロック剤の不存在下での再刺激中に増殖能力について分析したＴ細胞再刺激実験の結果を示す。ＣＤ４０に対する拮抗性モノクローナル抗体およびＣＤ８６に対する拮抗性モノクローナル抗体の存在は、ＣＤ８０に対する拮抗性モノクローナル抗体がある場合もない場合も、アロ抗原に特異的なＴ細胞非反応性をもたらす。ＣＤ４０のみに対する拮抗性モノクローナル抗体の存在、またはＣＤ８０のみに対する拮抗性モノクローナル抗体と組合せた場合は、Ｔ細胞の部分的な不活化をもたらす。
実施例
材料と方法：
ＣＤ４０とＣＤ８６細胞外領域Ｉｇ融合タンパク質
幾つかの実験でリンパ球細胞表面レセプターおよびヒトＩｇＧのＦｃ−領域の融合タンパク質を用いた。発表されたｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲ増幅により作られた細胞表面レセプターの細胞外領域をコードする核酸配列配列を、Ｅｌｌｉｓｏｎら（NAR 10:4071（1982））による配列に基づくヒトＩｇＧ１のＣＨ１／ヒンジ−ＣＨ３領域（Ｆｃ）に対して融合させることにより、これらの細胞外領域（ＥＤ）融合タンパク質（ＥＤ−Ｉｇ融合タンパク質）を作った。ＥＤ−Ｉｇ融合タンパク質をＳｆ９昆虫細胞に発現させてならし培地として用いるか、またはプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製後に用いた。
細胞系と培養条件
Ｂ細胞系ＪＹを、Ｔ７５培養フラスコ中（コスタール、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ヒクローン、ロガン、ユタ州、米国）を加えたＩｓｃｏｖｅの改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で通常通り培養した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で、湿度調整インキュベーターで培養した。毎週、細胞を分けた（１／２０〜１／１００）。細胞系を保存するために、５〜１０×１０６細胞／ｍｌの２０％ＦＣＳおよび１０％のＤＭＳＯを補ったハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含有するアンプルを作り、これを液体窒素中で保存した。
リンパ球の単離および刺激
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心法により健康な提供者からのヘパリン化血液から単離し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）および５％熱不活化同原血漿を補ったＲＰＭＩ １６４０（ギブコ、ペイスレイ、英国）からなる完全培地中に再懸濁した。基本的にはＺｕｐｏら（Eur. J. Immunol. 21:351（1991））に記載されたように、ＰＢＭＣをＡＥＴ処理ヒツジ赤血球細胞によるロゼット形成およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度グラジエントによるＥ−ロゼット細胞の除去、さらにその後の単球の冷凝集によって、単球の豊富な調製物を調製した。Ｔ細胞は、単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞をＬｙｍｐｈｏ−Ｋｗｉｋ Ｔ（ワンラムダ、ロスアンゼルス、カリフォルニア州、米国）を、製造業者の指示にしたがって除去することによりＰＢＭＣ調製物からさらに精製した。
豊富な単球および精製Ｔ細胞を用いた一次混合リンパ球培養のために、９６ウエルプレート中、２００ｍｌ完全培地中の０．５〜１×１０６／ｍｌの精製Ｔ細胞と０．１〜０．２×１０６／単球を６日間、１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃度のブロック剤の存在または不存在化に培養した。培養時間の最後の８時間、細胞を１ｍＣｉ［３Ｈ］−チミジン（アマルシャムインターナショナル、アマルシャム、英国）でパルスをかけた。細胞をＳｋａｔｒｏｎ自動細胞ハーベスターを用いてガラス濾過フィルター上に集め、紙の上の放射活性を液体シンチレーションカウンターでカウントした。再刺激実験のために、Ｔ細胞（０．５〜１×１０６／ｍｌ）および同一の提供者からの単球（０．１〜０．２×１０６／ｍｌ）を６日間、１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃度のブロック剤の存在下または不存在下および４００ｎｇ／ｍｌ濃度のシクロポリンＡ（ＣｓＡ）の存在下または不存在下で２４ウエルのプレート中、１ｍｌの完全培地で６日間培養した。６日後、残っている細胞を集め、ブロック剤の不存在下での３日間の再刺激前にさらに２日間培養した。Ｔ細胞増殖は主要混合リンパ球培養に関して既に記載したように決定した。
混合リンパ球培養は非分離ＰＢＭＣを用いても行った。これらの実験において、応答細胞としての新しいＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−４（２０μｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）（０．１×１０６／ｍｌ）により前活性化させたＰＢＭＣを１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃度のブロック剤の存在下または不存在下で、２４ウエルプレート中、１ｍｌの完全培養物中で６日間培養した。６日後、残っている細胞を集めて、ブロック剤の不存在下で３日間刺激細胞としてヒトＩＬ−４（２０μｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）（０．１×１０６／ｍｌ）で前活性化させた同一のＰＢＭＣでアロ反応性Ｔ細胞を再刺激する前に、さらに３日間培養した。Ｔ細胞増殖は上記のように［３Ｈ］チミジン取込みにより検定した。
ポリメラーゼチェインリアクション
ＤＮＡ断片を増幅するために、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行った。典型的なＰＣＲ混合物は、０〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、それぞれ０．０２５ｍＭ ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌプライマー／１００μｌ反応混合物、１〜１０００ｎｇ ＤＮＡ／１００μｌ反応混合物および２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含有した。反応をパーキンエルマーサーモサイクラー（パーキンエルマー社、ノルワーク、コネチカット州）を用いて行った。標準的なＰＣＲはＤＮＡを変性させるために９５℃で２〜５分の一工程後に、９５℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１〜４分間の２０〜４０サイクルからなった。最終工程後に伸長工程を７２℃で７分間行った。
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）
細胞（０．１〜０．２×１０６／試料）を２０分間、４℃で、特異的モノクローナル抗体（０．１〜１ｍｇ／試料）とともにインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）による洗浄後、細胞をさらに２０分間４℃で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリチン（ＰＥ）に複合させたヤギ抗マウス抗体とともにインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、最後に０．５％パラホルムアルデヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣスキャンフローサイトメーター（ベクトンデッキンソン）を用いて分析した。モノクローナル抗体の特異的な結合は任意の単位で平均蛍光強度として示される。類似の方法を用いて、一本鎖抗体を発現するファージ粒子を調べるために用いた。この場合、検出は非複合ヒツジ抗Ｍ１３抗体（ファルマシアＡＢ、アップサラ、スウェーデン）を用いることにより行い、その後の洗浄後に、ロバ抗ヒツジ複合ＦＩＴＣ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー州、米国）とともにインキュベーションした。同様に、類似の方法を用いてジアボディーとトリアボディー構築物の生物学的活性を示した。これらの実験において、検出は細胞をジアボディーまたはトリアボディー構築物とインキュベーションした後にＥＤ−Ｉｇ融合タンパク質の一つとインキュベーションし、その後にＦＩＴＣ複合抗ヒトＩｇＧ抗血清とインキュベーションすることにより行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析
発現された構築物を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析を行った。簡単に説明すると、試料を０．８％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中で５分間沸騰させた。次に、試料を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；２時間、１００Ｖ）で泳動した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロースフィルターに電気ブロットするか、または１０％メタノールおよび１０％酢酸中の０．１％クマシーブルーで染色した。電気ブロットは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシンおよび１０％メタノール中で１時間、１００Ｖ、４℃で行った。ブロット後、ニトロセルロースフィルターをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中で１時間室温にて１％ＢＳＡでブロックした。次に、該ブロットを室温、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、検出用抗ｍｙｃ抗体とともにインキュベートした。第二抗体（パーオキシダーゼで標識したもの）とのインキュベーション後、該ブロットを４−クロロ−ナフトールにより染色した。
ＢＩＡ核分析
ファルマシアバイオセンサー２０００を用いて分析を行った。ＣＭチップを０．２Ｍ ＥＤＣ／０．０５Ｍ ＮＨＳで５分間活性化した。次に、リガンドの結合を１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中で５分間（０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ構築物）行った。この後、ＰＢＳ緩衝液中の多様な濃度のＳｃＦｖ、Ｍａｂまたはジア／トリアボディー構築物をかけた。ジア／トリアボディー構築物の場合、チップを洗浄した後に第二Ｉｇ構築物をかけた。センサー表面を０．１ＭのＮａＯＨで再生した。
実施例１
ヒトＣＤ４０およびＣＤ８６に対するモノクローナル抗体からの単一鎖抗体断片を発現するファージの生成：
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｄ１２の一本鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）の生成のために、ＶＨとＶＬ領域の両方をＰＣＲで増幅した後に第二アッセンブリＰＣＲを行って両領域を結合した。この目的のために、４プライマーを設計した（配列番号１〜４）。配列番号１は、クローニング目的のＨｉｄＩＩＩおよびＳｆｉＩ制限部位およびその後の５Ｄ１２の５′ＶＨ領域にアニーリングする縮重配列を有する。配列番号２はＶＨ領域の３′部分の縮重配列およびその後の（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーおよびＶＬ領域の５′部分をコードする配列を有する。配列番号３はＶＬ領域の５′部分に対する相同性を有する縮重プライマーであり、一方、最後のプライマー（配列番号４）はＮｏｔＩ制限部位を有し、ＶＬ領域の３′部分にアニールする。簡単に記載すれば、これらのプライマーを用いて、モノクローナル抗体５Ｄ１２のＶＨおよびＶＬ領域を別個にＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ反応用の鋳型として、我々は５Ｄ１２のＶＨまたはＶＬ領域を有するプラスミドを用いた（ＶＨ：配列番号５およびＶＬ：配列番号６）。このＰＣＲ工程で得られたｃＤＮＡをゲル精製し、アッセンブリーＰＣＲに用いて（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーによりＶ領域の結合を行った。次に、得られた単一鎖５Ｄ１２構築物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化した後に、ｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（プロメガ、マジソン、米国）中で連結を行った。この連結物でＤＨ５αを形質転換し、これをＬＢプレートに塗布した。幾つかのクローンの配列決定により、正しい５Ｄ１２ ＳｃＦｖクローンが発見された（配列番号７）。
ヒトＣＤ８６と反応性のあるＳｃＦｖの生成のために、我々は５Ｄ１２として示された同じプライマーを用いた。抗ＣＤ８６モノクローナル抗体Ｆｕｎ−１のＳｃＦｖの生成の全工程がヒトＣＤ４０と反応性のある５Ｄ１２ ＳｃＦｖについて上記したように行った。Ｆｕｎ−１のＶ領域（ＶＨ：配列番号８；ＶＬ：配列番号９）を抗ＣＤ８６ ＳｃＦｖ構築物（配列番号１０）を得るための鋳型として用いた。
実施例２
ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異的ジアボディー分子の構築：
抗ＣＤ４０ ＳｃＦｖおよび抗ＣＤ８６ ＳｃＦｖ中の柔軟性リンカー配列を１５残基から５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）まで短くすることにより、および異なる抗原認識を有する二つの一本鎖Ｆｖ断片からの可変重鎖領域と軽鎖領域を交差させて対とすることにより二特異的二価分子を作った。この構築は三段階で行われた。軽鎖可変断片を抗ＣＤ８６（ａＣＤ８６）および抗ＣＤ４０（ａＣＤ４０）からのＳｃＦｖ構築物中で、５′末端に位置する制限酵素部位（ＶＬの塩基番号７〜１２のＳａｃＩ）および軽鎖可変遺伝子の３′部分のちょうど外側の制限酵素部位（ＮｏｔＩ）を用いることにより交換した（図１を参照されたい）。それに続く工程で、キミラ構築物ＶＨ−ａＣＤ８６／１５ＡＡ−リンカー／ＶＬ−ａＣＤ４０（７．２／１５／４０でコード）およびＶＨ−ａＣＤ４０／１５ＡＡ−リンカー／ＶＬ−ａＣＤ８６（４０／１５／７．２でコード）の１５残基リンカーを、ＶＨの３′部分に置かれた部位（抗ＣＤ４０ ＶＨの塩基番号３３５または抗ＣＤ８６ＶＨの３７１からリンカー配列の番号＋２までのＢｓｕ３６１）およびＶＬ末端の５′部分（両ＶＬの塩基番号７〜１２のＳａｃＩ）（図２を参照されたい）。最後に両キメラカセットを、二シトロン発現ベクターカセットを有するベクターｐＵＣ１９ファブソール（ｐＵＣ１１９ＨＩｓ６ｍｙｃＸｂａ（Low et al., J. Mol. Biol. 260:359（1996））に類似するが、インビトロ変異誘発により検出されたベクター骨格中にすべてのＡｐａＩＩ部位を有するｐＵＣ１１９誘導体）中で組み合せた。最初に、ａＣＤ８６／５ＡＡ−リンカー／ａＣＤ４０構築物を、制限部位ＳｆｉＩとＮｏｔＩを用いてｐＵＣ１１９ファブソールにクローニングした。次に、ａＣＤ４０／５ＡＡ−リンカー／ａＣＤ８６のＳｃＦｖカセットを、５′−ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧ−３′（配列番号１１）および５′−ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＣＣ−３′（配列番号１２）を用いて増幅した。これらのプライマーは、ＡｐａＬＩ部位およびＡｓｃＩ部位をそれぞれ含む（下線部）。増幅されたＰＣＲ断片はＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩで消化し、ａＣＤ８６／５ＡＡ−リンカー／ａＣＤ４０構築物を含むｐＵＣ１１９ファブソールプラスミド中で連結した。両ＳｃＦｖカセットを有するジアボディー産生クローンを同定し、組換えジアボディー分子（ｐＵＣ１１９−ファブソール−ＣＤ４０／ＣＤ８６）（５Ｄ１２ＶＨ＋ＦＵＮＶＬ：配列番号１３；ＦＵＮＶＨ＋５Ｄ１２ＶＬ：配列番号２２）の発現のために用いた。
抗原提示細胞上のヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合することのできる、拮抗性抗ＣＤ４０Ｍａｂｓおよび拮抗性抗ＣＤ８６ Ｍａｂ Ｆｕｎ−１に基づく二特異的ジアボディー分子を得るための全クローニング方法を図３に示す。同じ操作を、抗原提示細胞上のヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ８０およびヒトＣＤ８６分子に結合することのできる、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方と反応性のある拮抗性抗ＣＤ４０ Ｍａｂｓおよび拮抗性Ｍａｂｓに基づく二特異的ジアボディー分子の生成のためにも用いられる。
実施例３
ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異性ジアボディー分子の発現、単離および特性付け：
ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異性ジアデフィー分子の産生のために、上記の実施例２に記載のａＣＤ８６／ａＣＤ４０−ビシストロン発現カセットを有するプラスミドを用いた。５０ｍｌの２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコース）に飽和培養物（３０℃で１６時間生育させたもの）を接種した（１ｖ／ｖ％）。３０℃での５時間の生育後および６００ｎｍで０．９の光学密度を有する培地を用いて、ジアボディー産生を、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度まで加えることにより誘導した。培養を２０℃で４時間続け、１５ｍｌ培養物からの細胞をペレット化した（室温、１１００*ｇで１０分間）。上清および細胞をさらに処理するまで−２０℃で保存した。残った３５ｍｌの培養物を２０℃でさらに１６時間生育させた。細胞を上記のようにペレット化した。細胞質フラクションは、細胞を０．５３ｍｌの冷ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５Ｍシュクロース、ｐＨ８．０）に再懸濁することにより調製した。その混合物を２時間氷中でインキュベートし、次に０．５９ｍｌの冷却３倍希釈ＴＥＳを加えて、インキュベーションを３０分間延長した。スフェロブラストを１５分間１１００*ｇ、４℃で遠心し、細胞質タンパク質を含有する上清を集めた。ペレットフラクションを０．７５ｍｌのＴＥＳ／ＭｇＳＯ４（ＴＥＳ緩衝液；１５ｍＭ ＭｇＳＯ４）に再懸濁し、３０分間氷上でインキュベートした。スフェロプラストを１５分間１１００*ｇ、４℃で遠心し、上清を最初の上清フラクションに加えた。全細胞質フラクションを再び清澄化し（４℃で、１０００*ｇで１５分間）、ＰＢＳに対して透析した。すべてのフラクションをＰＡＧＥ、および検出用抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した。ＳｃＦｖの最大濃度は４時間の誘導後培養物から調製された細胞質フラクションに見られ、ある程度は２０時間誘導された培養物の培地フラクション中に見られた。産生されたジアボディーの機能性はＢＩＡ核中で調べられた。精製ＣＤ８６−ＩｇはＣＭチップの表面に固定化されて、結合タンパク質の６５００ＲＵ（応答単位）を与えた。細胞質フラクションの１２０秒間の１０μｌ／分での注入により約１２００ＲＵジアボディーの捕捉をもたらした。次に、ＣＤ４０−Ｉｇを、さらに５４０ＲＵ抗原の結合をもたらすジアボディーと同じ条件下で注入した。この実験はＣＤ４０およびＣＤ８６と同時に結合する産生ジアボディー分子の能力を示した（図４を参照されたい）。
実施例４
ヒトＣＤ４０およびＣＤ８６またはヒトＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合可能な二特異的および三特異的トリアボディー分子の構築：
二特異的および三特異的トリアボディー分子の構築は、リンカーを除去しなければならなかった（ゼロ残基リンカー）以外は上記ジアボディーについて記載した方法と同じである。これは、インビトロ変異誘発により、一本鎖ファージミドＤＮＡおよび該変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて行われた。ヒトＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する拮抗性モノクロナール抗体のＳｃＦｖ構築物を用いて、（ｉ）ＶＨαＣＤ４０／０／ＶＬαＣＤ８０−ＶＨαＣＤ８０／０／ＶＬαＣＤ８６−ＶＨαＣＤ８６／０／ＶＬαＣＤ４０および（ｉｉ）ＶＨαＣＤ４０／０／ＶＬαＣＤ８６−ＶＨαＣＤ８６／０／ＶＬαＣＤ８０−ＶＨαＣＤ８０／０／ＶＬαＣＤ４０の少なくとも二つの遺伝子構築物が可能である。５ＡＡリンカーを有する二特異的ジアボディーについて上記に記載されたよように、構築物中のＶＨ−およびＶＬ−領域を交換し、ＶＨ領域を交換するためにＳｆＩおよびＢｓｕ３６ＩおよびＶＬ領域を交換するためにＳｃＩおよびＮｏｔＩを用いて上記の方法を適用することによりすべてのＶＨ／ＶＬ組み合わせが作られる。次に、３つのＳｃＦｖ−カセットを、トリシストロンｍＲＮＡをコードする単一の発現モジュール中にクローン化する。このＤＮＡはオリゴ指令インビトロ変異誘発用鋳型として用いて、１〜３のＶＨ−ＶＬ対中の５残基リンカーを除去する。作られる多様なトリアボディーはＳｃＦｖ領域の他の向きによる結合特性およびリンカー長さで異なってよい。３つのＳｃＦｖカセットのうち一つのみには前に記載のタグ配列が設けられている。トリアボディー形成を誘導し、安定性を保持するために、システイン残基をＣ末端にまたはＶ領域内に付加することによりジスルフィド橋を導入することができる。
実施例５
ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することのできるヒトＣＴＬＡ４の細胞外領域にＣ末端残基により連結された拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体からなる融合分子の構築：
概念的治療剤はＣＤ８０およびＣＤ８６の両方に対するＣＴＬＡ４の高い親和性と特異性を拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に組み合せた融合タンパク質である。この融合分子は、ヒトＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ４ＥＤ）の細胞外領域が柔軟性のあるリンカーによりＣ末端に結合させた完全抗ＣＤモノクローナル抗体として安定で活性のある形で作られる。Ｆｃ部分をＣＴＬＡ４の細胞外領域に結合させた抗ＣＤ４０抗体の構築をその後のＰＣＲとクローニング工程により行う。オリゴヌクレオチド５′ＧＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＧＣ３′（配列番号１４）および５′ＡＧＡ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ３′（配列番号１５）を用いて、抗ＣＤ４０のＶＨおよびＣＨ１領域をリーダー配列とともに増幅する。この後に、オリゴヌクレオチド５′ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ３′（配列番号１６）および５′ＧＣＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ３′（配列番号１７）を用いて、ヒトＩｇＧのＣＨ２とＣＨ３領域の増幅を行う。プライマーの除去後、第二ＰＣＲを行って両ＰＣＲ産物を組み合せて完全長５Ｄ１２重鎖を得る。得られたＰＣＲ産物をゲルで精製し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅクローニングキットを用いてＰＣＲ Ｓｃｒｉｐｔにクローニングした。簡単に記載すれば、ＰＣＲ産物をＴ４リガーゼおよびＳｒｆＩと一緒にプラスミドとともに１時間室温でインキュベートし、その後、その全試料でＸＩｌＢｌｕｅ大腸菌細胞を形質転換する。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび２０μｇ／ｍｌのＸｇａｌを含有するＬＢプレートに塗布する。３７℃でのインキュベーション後、挿入物を有する推定の白いクローンを分析する。挿入物を含有するクローンをＭ１３とＭ１３リバースプライマーを用いるサイクル配列決定により分析する。正確な配列を確認した後、抗ＣＤ４０重鎖を、ｐ１０プロモーター後の２シストロンバキュロウイルス発現プラスミドｐＡｃＵＷ５１（ファルミンゲン）のＥｃｏＲＩ制限部位を用いてクローニングした。こうして得られた構築物は、後部にＣＴＬＡ４ＥＤ部分がクローニングされた柔軟性のある（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーをＣ末端に既に有する。したがって、ＣＴＬＡ４ＥＤ部分を、オリゴヌクレオチド５′ＧＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＴ Ｇ３′（配列番号１８）および５′ＧＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣ ＣＴＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＴＴＣ３′（配列番号１９）を用いるＰＣＲにより増幅し、ゲルで精製し、ＮｏｔＩクローニング部位を用いる５Ｄ１２の重鎖の後部にクローニングする。この工程の配列分析による確認後、軽鎖をクローニングする。これは、ヒトＣＬ領域に結合させた５Ｄ１２のＶＬ領域を既に有したプラスミドを用いて行う。よって、オリゴヌクレオチド５′ＧＣＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＣ３′（配列番号２０）および５′ＧＣＧＣ ＧＧＡＴＣ�� ＣＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣ３′（配列番号２１）を用いて、５Ｄ１２の軽鎖を増幅して、構築されたｐＡｃＵＷ５１発現プラスミドに、ポリヘドリンプロモーター後部のＢａｍＨＩクローニング部位を用いてクローニングする。ＤＮＡ配列分析後に正しいクローンが得られる。この確認後、５Ｄ１２−ＣＴＬＡ４ＥＤ構築物を有する発現プラスミドを、ファルミンゲンのバキュロゴールドトランスフェクションシステムを用いて、ウイルスＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡとともにＳｆ９昆虫細胞に導入する。組換えウイルスをプラーク精製し、発現カセットの統合性をＰＣＲおよびサイクル配列決定によりチェックする。タンパク質産生のために、昆虫細胞を使用する。これらの細胞は血清を含まない培地に生育でき、不均一タンパク質の最もよく知られている分泌物である。融合タンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８）により無血清ならし培地から精製される。二量体化の程度を評価するために、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、還元下および非還元下によりチェックする。
実施例６
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０および／またはＣＤ８０／８６−ＣＤ２８経路のブロックのＴ細胞活性化に対する効果：
ＣＤ８０／８６経路のブロックはＴ細胞活性化の阻害をもたらすことが示されている（Van Good et al., Res. In Immunol. 146:183（1995）に概説されている）。しかし、多くの環境下においてはＣＤ８０／８６相互作用がＴ細胞活性化の完全な阻止をもたらさない。これは図５により具体的に示され、ここでは精製Ｔ細胞が、材料と方法で既に詳細に示したようにアロ単球で刺激される。（ＣＤ８０とＣＤ８６の両方をブロックする）ＣＴＬＡ４−Ｉｇの添加のみがアロ特異的Ｔ細胞の部分的阻害をもたらす。驚くべきことに、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ３も、ＣＴＬＡ４−Ｉｇと同じ程度までＴ細胞活性化の部分的阻害をもたらした。さらに驚くべきことには、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ３のＣＴＬＡ４−Ｉｇとの組合せはＴ細胞活性化のほとんど完全な阻止をもたらした。
ＣｓＡと組合された場合のＣＤ８０／８６のブロックは、抗原に特異的なＴ細胞非応答性をもたらすことも示されている（Van Good et al., Res. In Immunol. 146:183（1995）に概説されている）。これは、混合リンパ球培養で示されており、ブロック剤をアロ抗原による一次刺激中に加えた後に、短い休止期間を設け、その後ブロック剤の不存在下に同一のアロ抗原により再刺激する。図６は、アロ原性単球で刺激された精製ヒトＴ細胞へのＣＴＬＡ４−Ｉｇ単独の添加ではなくＣＴＬＡ４−ＩｇプラスＣｓＡの添加がアロ抗原特異的なＴ細胞非反応性（黒塗りのバー）をもたらすことを実際に示している。関連性のない第三のアロ抗原を発現する単球に対する応答は変わらない（白抜きのバー）。また、図６はアロ原性単球で刺激された精製ヒトＴ細胞へのＣＴＬＡ４−Ｉｇプラス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ３の添加のみがアロ抗原特異的なＴ細胞非反応性（黒塗りのバー）をもたらすことも示している。再度、関連性のない第三のアロ抗原を発現する単球は変わらないので（白抜きのバー）、最初にの培養のアロ抗原に対するこの非応答性は特異的である。
もう一対の実験において（図７）、ＣＤ４０のブロックと拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｄ１２との組合せおよびＣＤＣＤ８０とＣＤ８６の拮抗性モノクローナル抗体との組合せが、方法と材料のセクションで既に詳細に説明したように、ＰＢＭＣを用いるＭＬＣ実験で調べた場合にアロ抗原特異的Ｔ細胞非応答性をもたらすことが示されている。驚くべきことに、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、ＣＤ８０共刺激レセプターをブロックすることなしに拮抗性抗ＣＤ８６モノクローナル抗体に組み合せた場合にもアロ抗原特異的Ｔ細胞非応答性が誘導された。対照的に、ＣＤ８６レセプターをブロックすることなく、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体および抗ＣＤ８０モノクローナル抗体との組合せのみが、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体単独と同じレベルまでＴ細胞低応答性をもたらした。これは驚くべきことであった。なぜならば、ＣＤ８０とＣＤ８６の両方のブロックはそのいずれか単独によるよりもさら完全な阻害を常にもたらすことが広く示されたからである。これは、ＣＤ８６−ＣＤ２８の共刺激相互作用のブロックが、上記実施例で記載されたような一つの治療分子とのＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０共刺激相互作用のブロックとともに、Ｔ細胞仲介疾患の免疫治療のために強い潜在力を有することを示している。
本発明に係る可溶性結合分子および抗体は、下記の態様で実施することができる。
１．ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外領域により少なくともＣＤ８６に結合することのできる請求項１または３記載の可溶性結合分子。
２．ＣＤ８６に対する抗体が抗体Ｆｕｎ−１である請求項４または５記載の抗体。
３．ＣＤ４０に対する抗体がＣＤ４０に対する拮抗性抗体である請求項２〜７のいずれかに記載の抗体。
４．ＣＤ４０に対する抗体がＣＤ４０に対する非刺激拮抗性抗体である請求項２〜７のいずれかに記載の抗体。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願
（Ａ）名称：パンゲネチックスＢ．Ｖ．
（Ｂ）通り：パーシオイベルヴェヘ１５
（Ｃ）都市：アムステルダム
（Ｄ）国：オランダ
（Ｅ）郵便番号：１１０５ＢＥ
（ｉｉ）発明の名称：Ｔ細胞寛容の誘導用組成物と方法
（ｉｉｉ）配列の数：２２
（ｉｖ）コンピュータ読み取り可能形態
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ互換機
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：パテントインリリース＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（ｖｉ）先行出願データ
出願番号：ＷＯ ＰＣＴ／ＮＬ９７／００４３８
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１：
0004219985.tif 000002
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２：
0004219985.tif 000003
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：
0004219985.tif 000004
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４：
0004219985.tif 000005
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号５：
0004219985.tif 000006
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号６：
0004219985.tif 000007
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７２３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号７：
0004219985.tif 000008
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３７５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号８：
0004219985.tif 000009
（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号９：
0004219985.tif 000010
（２）配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７５９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１０：
0004219985.tif 000011
（２）配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１１：
0004219985.tif 000012
（２）配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２：
0004219985.tif 000013
（２）配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：７６４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３：
0004219985.tif 000014
（２）配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４：
0004219985.tif 000015
（２）配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１５：
0004219985.tif 000016
（２）配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６：
0004219985.tif 000017
（２）配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１７：
0004219985.tif 000018
（２）配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１８：
0004219985.tif 000019
（２）配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１９：
0004219985.tif 000020
（２）配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２０：
0004219985.tif 000021
（２）配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２１：
0004219985.tif 000022
（２）配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８７６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２２：
0004219985.tif 000023
【図１】
0004219985.tif 000024
【図２】
0004219985.tif 000025
【図３】
0004219985.tif 000026
【図４】
0004219985.tif 000027
【図５】
0004219985.tif 000028
【図６】
0004219985.tif 000029
【図７】
0004219985.tif 000030