(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料に存在する予め選択された分析物のレベルを測定する方法であって、
ｉ）アリコートＡ、Ｂ、およびＣと呼ぶ、前記試料の３つのアリコートを準備すること、
ｉｉ）白血球の供給源および補体タンパク質の供給源を準備すること、
ｉｉｉ）アリコートＢに、前記試料中の前記分析物との検出可能な免疫複合体を形成するのに十分な量の抗分析物抗体を加えて、反応アリコートＢを得ること、
ｉｖ）反応アリコートＢの対照として、アリコートＡに前記抗分析物抗体を添加せずに、反応アリコートＡを得ること、
ｖ）アリコートＣに、反応アリコートＢと同様に等量の抗分析物抗体を加え、さらに最大刺激量の分析物を含めて、反応アリコートＣを得ること、
ｖｉ）反応アリコート中で形成された任意の免疫複合体が、白血球および補体タンパク質と反応するのに適切な条件下および十分な時間で、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣと、白血球および補体タンパク質の供給源とをインキュベートして、オキシダントを生成すること、
ｖｉｉ）ステップｖｉ）の前または後に、オキシダントと反応して光を発する化学発光化合物と反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣとを接触させること、
ｖｉｉｉ）適切な条件下で予め決定された期間にわたって、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣからの発光を測定すること、
ｉｘ）前記試料中の前記分析物の量の指標として、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣ間の発光における差違を下記式から得られる数値に従い相関させることを含む方法。
１００×（反応アリコートＢ光積分値−反応アリコートＡ光積分値）／（反応アリコートＣ光積分値−反応アリコートＡ光積分値）
【請求項２】
前記体液は全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記白血球は全血に由来する白血球画分からなり、前記画分は、好中球、リンパ球、単球、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫複合体への暴露により白血球が生成するオキシダントを増加することができる薬剤が反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣに含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤は、ザイモサン、ラテックス粒子、ホルボールエステル、ｆＭＬＰ、オプソニン化ザイモサン、オプソニン化ラテックス粒子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化学発光化合物は、ルミノール、ルシゲニン、およびホラジンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗分析物抗体は、クラスＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分析物は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類、ウイルス、グラム陽性細胞壁成分、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、テイコ酸、グラム陰性エンドトキシン、リピドＡ、Ａ型肝炎、炎症メディエーター、依存性薬物、治療薬、および心臓マーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記炎症メディエーターは、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターフェロン、およびトランスフォーミング増殖因子βからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析物は感染症を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析物は敗血症を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物はリポ多糖であり、前記抗分析物抗体は抗リポ多糖抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫複合体への暴露により白血球が生成するオキシダントを増加することができる薬剤が反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣに含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤は、ザイモサン、ラテックス粒子、オプソニン化ザイモサン、オプソニン化ラテックス粒子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤はザイモサンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
全血試料から患者の敗血症の段階を決定する方法であって、
（ａ）微生物産物または炎症メディエーターのレベルと、
（ｂ）患者好中球による最大オキシダント生成と、
（ｃ）最大刺激レベルの免疫複合体に対する患者好中球の反応性のレベルとを同時に測定することを含み、
ｉ）アリコートＡ、Ｂ、およびＣと呼ぶ、前記試料の３つのアリコートを準備すること、
ｉｉ）アリコートＢに、前記試料中の前記分析物と検出可能な免疫複合体を形成するのに十分な量の抗分析物抗体を加えて、反応アリコートＢを得ること、
ｉｉｉ）反応アリコートＢの対照として、アリコートＡに前記抗分析物抗体を添加せずに、反応アリコートＡを得ること、
ｉｖ）アリコートＣに、反応アリコートＢと同様に等量の抗分析物抗体を加え、さらに最大刺激量の分析物を含めて、反応アリコートＣを得ること、
ｖ）反応アリコート中で形成された任意の免疫複合体が、白血球および補体タンパク質と反応するのに適切な条件下および十分な時間で、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣと、白血球および補体タンパク質の供給源とをインキュベートして、オキシダントを生成すること、
ｖｉ）ステップｖｉ）の前または後に、オキシダントと反応して光を発する化学発光化合物と反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣとを接触させること、
ｖｉｉ）適切な条件下で予め決定された期間にわたって、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣからの発光を測定すること、
ｖｉｉｉ）（ａ）前記微生物産物または炎症メディエーターのレベルの指標として、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣ間の発光における差違を下記式から得られる数値に従い相関させること、
１００×（反応アリコートＢ光積分値−反応アリコートＡ光積分値）／（反応アリコートＣ光積分値−反応アリコートＡ光積分値）
（ｂ）前記患者好中球による最大オキシダント生成の指標として、反応アリコートＡの計数率の測定最大値に従い決定すること、および、
（ｃ）前記最大刺激レベルの免疫複合体に対する患者好中球の反応性のレベルの指標として、反応アリコートＡおよびＣ間の発光における差違を下記式から得られる数値に従い相関させること、
１−［（反応アリコートＡ光積分値）／（反応アリコートＣ光積分値）］
ｉｘ）前記レベルから患者の敗血症の段階を決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、一般に、血液試料中の分析物のレベルを測定することに関する。分析物として、感染性微生物、その毒性産物、炎症メディエーター、ホルモン、急性期タンパク質、毒素、依存性薬物（ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ａｂｕｓｅ）、心筋損傷マーカー、治療薬、サイトカイン、ケモカインなどが挙げられ得る。
【０００２】
【定義】
「分析物」は、体液試料に存在し、本発明の方法により分析される目的の特定の物質と定義される。感染症および敗血症に関連する分析物の場合、分析物として、例えば、微生物およびその成分（グラム陽性細胞壁成分およびグラム陰性エンドトキシン、リポ多糖、リポテイコ酸を含む）、ならびにこれらの成分が存在する結果として循環中に現われる炎症メディエーター（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ならびに他のインターロイキンおよびサイトカインを含む）が挙げられ得る。他の分析物として、依存性薬物、ホルモン、毒素、治療薬、心筋損傷マーカーなどが挙げられ得る。
【０００３】
「敗血症」は、以下の続発症：発熱、低血圧、血中酸素減少、頻拍、低体温、好中球増加、および好中球減少の１または複数として臨床的に現われる、感染性微生物が存在する結果として生じる身体の病理学的状態として定義される。
【０００４】
「免疫複合体」は、抗体−抗原複合体と同義である。
【０００５】
「オプソニン化」は、免疫グロブリンおよび補体因子が結合された粒子を意味する。この結合により、粒子は免疫系によりさらに強く認識される。例えば、酵母多糖であるザイモサンまたはラテックス粒子は、その表面に免疫グロブリンおよび補体因子を結合させることによりオプソニン化することができる。オプソニン化ザイモサンまたはラテックスは、免疫複合体への暴露により白血球が活性化された後の白血球によるオキシダント生成の増加を刺激する。
【０００６】
「反応性」は、最大刺激量の免疫複合体に反応する患者の能力の尺度である。
【０００７】
【発明の背景】
患者血液中の特定の分析物を迅速に定量することは、病理学的状態の進行の監視ならびに外科治療および薬物治療による回復過程の追跡における、疾患およびその重篤度の（多くの場合、緊急状態での）診断のために臨床上重要である。特定の状態または疾患の現在の段階を決定して特定の段階で最も有効な治療薬を処方するために、特定の分析物が存在するかを知るだけでなく、分析物のレベルを知ることも重要である場合が多い。多くの疾患の治療では、ある特定の療法が疾患の最も悪い段階でなされた場合、無効であるか、または毒性である可能性がある。例えば、特定の複数の心筋損傷マーカーのレベルと、これらのレベル間の関係により、患者が心臓発作を起こしたか、または心臓発作を起こしている可能性があることが分かる。循環中の治療薬のレベルにより、患者が最適に投薬されているかどうか、推定される副作用の原因が過剰量の薬物にあるかどうかが分かる。感染症および敗血症において、感染性微生物に由来する毒素と、これらの毒素に反応して患者の白血球により産生される炎症メディエーターの循環レベルにより敗血症の重篤度およびレベルまたは段階が分かり、最も有効な治療方針が突きとめられる。緊急状態で、かつ特定の療法を処方する知識を用いて分析物を定量することは、患者の生命を救うことと、患者の死の一因となることとの違いを表しているかもしれない。
【０００８】
例えば、感染症の場合、手術前もしくは手術後の免疫抑制の結果として後天的院内感染に罹患するか、または膵炎、低血圧ショックもしくは血液量減少性ショック、外傷、熱傷、または臓器移植のような他の疾患過程から派生した感染症に罹患し、その後、敗血症性ショック症候群を発症した、病院（特に、集中治療室）にいる患者の死亡率は、他の併発する合併症に応じて３０〜７０％と見積もられている。ますます強力な抗菌剤の開発にもかかわらず、院内感染、特に、敗血症につながる感染症の発生率が増加している。見込みのある治療薬の多くに伴う問題は、タイミングの良い機会および使用のための指示が、主として、適切に迅速かつ定量的な診断手順が無いために、部分的には、敗血症症候群の病因が完全に理解されていないために十分に示されていなかったことである。
【０００９】
血液に細菌、ウイルス、または菌類もしくはその細胞壁成分（グラム陽性ペプチドグリカン、リポテイコ酸およびテイコ酸、ならびにグラム陰性エンドトキシン（リポ多糖，ＬＰＳ））が存在することは、感染症を示している。さらに、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のような、前炎症性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）メディエーターの産生による、これらの外来抗原が存在することに対する免疫系の反応もまた感染症を示している。循環中のこれらの分析物を定量することにより、敗血症の重篤度およびレベルまたは段階が分かる。例えば、グラム陰性菌敗血症の初期段階では、ＬＰＳは、５０ｐｇ／ｍｌ全血と低い濃度で存在し得る。次の段階では、敗血症は進行しており、敗血症のメディエーターであるＴＮＦをＴＮＦ抗体を使用して検出および測定することができる。段階３では、ＴＮＦは一過性メディエーターであるので、より少ない量で存在し得、別の一過的性メディエーターであるＩＬ−１が出現し得る。敗血症がさらに進行するにつれて、ＬＰＳレベルは減少し、ＴＮＦは無くなるが、ＩＬ−１は増加し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）が出現し得る。最後に、さらに長期の敗血症の場合、ＬＰＳは存在し、ＩＬ−１は低レベルであるが、ＩＬ−６が非常に高レベルであり得る。従って、敗血症の診断およびこの疾患の過程における段階の同定は、この重篤かつ死に至る可能性がある感染症の結果を首尾よく治療するのに重要である。敗血症に関連する分析物のレベルを定量すると、この急性疾患を治療するのに最良の治療方針を決定するための必要な情報が得られる。
【００１０】
現在、敗血症インターベンションの臨床試験を行っている製薬会社により試験されている治療プロトコールの多くに関する主要な問題の１つは、初期および進行した敗血症を迅速に検出できないことである。血液培養の結果を得るのが遅すぎる場合もある。他の敗血症試験もまた時間がかかり、初期検出するのに十分な感度がない場合がある。ＷＯ９０／０６３１４に記載のようなＣｅｎｔｏｃｏｒ  Ｉｎｃ．の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）免疫測定アッセイは２種類の抗体（このうち一方が標識されている）を使用する。米航空宇宙局は、Ａｚｕｒｉｎを抽出し、Ａｚｕｒｉｎ特異的抗体を使用して検出することによりシュードモナス属細菌を検出している（米国特許第７，５０１，９０８号）。ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）またはＳｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋｏｇｙｏ  Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のエンドトキシンアッセイキットは、本発明の比較として使用することができるＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイ技術である。
【００１１】
敗血症反応の複雑さに精通している多くの研究者は、治療が、敗血症の古典的な臨床症状（すなわち、収縮過多性循環、低血圧、全身血管抵抗の減少、発熱、および酸素依存性の増加）を既に発症している患者に対して効果的でないと考えている。炎症プロセスの経過が進行しすぎて、インターベンションの多くが患者の利益につながらなかった。なぜなら、身体が感染攻撃を退けるために用いられる複数の相互作用する炎症カスケードは、多くの場合、最悪の状態にあり、薬理学的に制御することが難しいからである。従って、主要な臨床上および診断上の目標は、患者を理想的には敗血症反応の進行の初期に同定し、段階付けること、または劇症敗血症症候群を発症するリスクが高い患者を同定することである。敗血症プロセスのある段階で与えられた同じ治療薬が、別の段階で与えられた時より著しく有益な効果を示す場合がある。なぜなら、どんな治療薬でも効果を発揮するためには、最適なウィンドウピリオドが存在することは明らかであるからである。例えば、患者の循環中に存在するこれらの薬剤のレベルは検出できず、サイトカインカスケードが既に最大まで活性化されている場合に、患者にグラム陰性エンドトキシンに対する抗体または受容体を与えても、資源の無駄であり、患者の治療に何のメリットもない。これらの抗敗血症戦略の潜在的な市場は依然として大きく（米国では毎年約２５０，０００症例）、適切な薬理学的インターベンションの恩恵を受け得る患者を同定し、段階付けできないために限定されていた。
【００１２】
本願は、全血試料中の分析物、特に、感染症および敗血症に関連する分析物を迅速に定量する改良された方法の開発に関する。
【００１３】
【発明の概要】
最も広い態様では、本発明は、体液試料中の予め選択された分析物の量を測定する方法に関する。前記方法は、（ａ）分析物と分析物抗体との免疫複合体を形成するステップと、（ｂ）活性化剤の存在下で、免疫複合体を、オキシダントを生成する食細胞と反応させるステップと、（ｃ）試料中の分析物の量の指標として、活性化剤の存在下で分析物と抗体との最大量の免疫複合体により生成されたオキシダントの量と比較して、生成されたオキシダントの量を測定するステップを含む。例えば、体液は全血でもよい。オキシダントを生成する食細胞は、好中球、リンパ球、単球、またはその組み合わせである。体液試料が全血の場合、オキシダントを生成する食細胞は試料に存在する。
【００１４】
限定しない例として、活性化剤は、ザイモサン、ラテックス粒子、オプソニン化ザイモサン、オプソニン化ラテックス粒子、ホルボールエステル、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、またはその組み合わせであり得る。オキシダントと反応して光を発する化学発光化合物を使用して、オキシダント生成細胞により生成されるオキシダントの量が得られる。限定しない例として、ルミノール、ルシゲニン、およびホラジンが挙げられる。抗体は、クラスＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体である。
【００１５】
分析物は、添加された外因性抗体との抗原−抗体複合体（免疫複合体）形成に関与し得る、体液試料に存在する任意の物質または成分である。例えば、分析物として、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類、ウイルス、グラム陽性細胞壁成分、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、テイコ酸、グラム陰性エンドトキシン、リピドＡ、Ａ型肝炎、炎症メディエーター、依存性薬物、治療薬、または心臓マーカー（例えば、ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ、トロポニンＩもしくはトロポニンＴ）が挙げられる。炎症メディエーターとして、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターフェロン、およびトランスフォーミング増殖因子βが挙げられるが、これに限定されない。分析物は、感染症を示すものでもよく、敗血症を示すものでもよい。
【００１６】
好ましい態様では、分析物はリポ多糖であり、抗体は抗リポ多糖抗体であり、試料は全血試料であり、活性化剤はザイモサンである。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、体液試料に存在する予め選択された分析物のレベルを測定する方法に関する。前記方法は、
ｉ）アリコートＡ、Ｂ、およびＣと呼ぶ、試料の３つのアリコートを準備するステップと、
ｉｉ）オキシダントを生成する食細胞の供給源および補体タンパク質の供給源を準備するステップと、
ｉｉｉ）アリコートＢに、試料中の分析物と免疫複合体を形成するのに十分な量の抗分析物抗体を加えて、反応アリコートＢを得るステップと、
ｉｖ）反応アリコートＢの対照として、アリコートＡに抗分析物抗体を添加せずに、反応アリコートＡを得るステップと、
ｖ）アリコートＣに、反応アリコートＢと同様に等量の抗分析物抗体を加え、さらに最大刺激量の分析物を含めて、反応アリコートＣを得るステップと、
ｖｉ）反応アリコート中で形成された任意の免疫複合体が、オキシダントを生成する食細胞および補体タンパク質と反応するのに適切な条件下および十分な時間で、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣと、オキシダントを生成する食細胞および補体タンパク質の供給源とをインキュベートして、オキシダントを生成するステップと、
ｖｉｉ）ステップｖｉ）の前または後に、オキシダントと反応して光を発する化学発光化合物と反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣとを接触させるステップと、
ｖｉｉｉ）適切な条件下で予め決定された期間にわたって、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣからの発光を測定するステップと、
ｉｘ）試料中の分析物の量の指標として、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣ間の発光における差違を相関させるステップとを含む。
【００１８】
前記ステップは、手操作による手順、半自動化手順、自動化手順に従って行うことができる。この試験により短時間で結果を得ることが可能になり、その結果、分析物を測定して患者の疾患を迅速に診断することができる。救急室で、枕元で、または家庭用に動かすことができる機器を提供することができる。アッセイ形式に応じて、約２０分以内で試験を行うことができる。
【００１９】
限定しない例として、前記方法における体液は全血でもよく、この全血中にオキシダントを生成する食細胞が存在する。あるいは、好中球、リンパ球、単球、またはその組み合わせを含む白血球画分のような、オキシダントを生成する食細胞の供給源を添加してもよい。免疫複合体への暴露により白血球が生成するオキシダントを増加することができる薬剤を、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣに含めてもよい。限定しない例として、この薬剤は、ザイモサン、ラテックス粒子、ホルボールエステル、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、オプソニン化ザイモサン、オプソニン化ラテックス粒子、またはその組み合わせであり得る。化学発光化合物は、例えば、ルミノール、ルシゲニン、またはホラジンであり得る。抗分析物抗体は、クラスＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体であり得る。
【００２０】
分析物は、添加された外因性抗体との抗原−抗体複合体（免疫複合体）形成に関与し得る、体液試料に存在する任意の物質または成分である。例えば、分析物として、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類、ウイルス、グラム陽性細胞壁成分、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、テイコ酸、グラム陰性エンドトキシン、リピドＡ、Ａ型肝炎、炎症メディエーター、依存性薬物、治療薬、および前記のような心臓マーカーが挙げられ得る。炎症メディエーターとして、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターフェロン、およびトランスフォーミング増殖因子βが挙げられるが、これに限定されない。分析物は、感染症を示すものでもよく、敗血症を示すものでもよい。
【００２１】
好ましい態様では、分析物はリポ多糖であり、抗体は抗リポ多糖抗体であり、試料は全血試料であり、活性化剤はザイモサンである。
【００２２】
本発明のさらなる態様では、体液試料に存在する予め選択された分析物のレベルを測定する診断キットが提供される。前記キットは、予め選択された分析物に特異的なＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体の第１の容器と、化学発光化合物の第２の容器と、分析物の第３の容器を備える。オキシダントを生成する食細胞を含まない試料の場合、オキシダントを生成する食細胞の供給源をキットに含めることができる。これらの細胞は、好中球、リンパ球、単球、またはその組み合わせでもよい。診断キットはまた、ザイモサン、ラテックス粒子、ホルボールエステル、Ｎ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、オプソニン化ザイモサン、オプソニン化ラテックス粒子、またはその組み合わせのような、免疫複合体への暴露により白血球が生成するオキシダントを増加することができる薬剤を含む、さらなる容器を備えてもよい。化学発光化合物は、ルミノール、ルシゲニン、またはホラジンであり得る。
【００２３】
別の態様では、本発明は、全血試料から患者の敗血症の段階を決定する方法に関する。前記方法は、（ａ）微生物産物または炎症メディエーターのレベルと、（ｂ）患者好中球による最大オキシダント生成と、（ｃ）最大刺激レベルの免疫複合体に対する患者好中球の反応性のレベルを同時に測定することを含む。これらのパラメーターは、
ｉ）アリコートＡ、Ｂ、およびＣと呼ぶ、前記試料の３つのアリコートを準備するステップと、
ｉｉ）アリコートＢに、試料中の分析物と免疫複合体を形成するのに十分な量の抗分析物抗体を加えて、反応アリコートＢを得るステップと、
ｉｉｉ）反応アリコートＢの対照として、アリコートＡに抗分析物抗体を添加せずに、反応アリコートＡを得るステップと、
ｉｖ）アリコートＣに、反応アリコートＢと同様に等量の抗分析物抗体を加え、さらに最大刺激量の分析物を含めて、反応アリコートＣを得るステップと、
ｖ）反応アリコート中で形成された任意の免疫複合体が、オキシダントを生成する食細胞および補体タンパク質と反応するのに適切な条件下および十分な時間で、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣと、オキシダントを生成する食細胞および補体タンパク質の供給源とをインキュベートして、オキシダントを生成するステップと、
ｖｉ）ステップｖｉ）の前または後に、オキシダントと反応して光を発する化学発光化合物と反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣとを接触させるステップと、
ｖｉｉ）適切な条件下で予め決定された期間にわたって、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣからの発光を測定するステップと、
ｖｉｉｉ）微生物産物または炎症メディエーターのレベル；患者好中球による最大オキシダント生成；および最大刺激レベルの免疫複合体に対する患者好中球の反応性のレベルの指標として、反応アリコートＡ、Ｂ、およびＣ間の発光における差違を相関させるステップと、
ｉｘ）前記レベルから患者の敗血症の段階を決定するステップにより測定される。
【００２４】
前記のステップのための成分の限定しない選択されたものは、前記に記載したものである。
【００２５】
本発明は、試験試料と分析物に特異的な抗体とをインキュベートして免疫複合体を形成し、この免疫複合体が試料に存在する食細胞または試料に添加された食細胞と反応し、オキシダント生成を引き起こすことにより、体液試料（例えば、ヒトを含む哺乳動物の全血）中の予め選択された分析物のレベルを測定する方法に関する。試料に添加される化学発光試薬を使用して、オキシダントを検出することができる。ザイモサンのような選択された活性化剤を含めることにより、食細胞のオキシダント反応を最適に増強することができる。特定のレベルの免疫複合体によりオキシダントを生成する食細胞から生じる化学発光のレベルは、最大量の免疫複合体により食細胞から生じる最大化学発光と対応している。このアッセイにより試料中の分析物の量の測定値を得るために、本発明では、試料中の食細胞の免疫複合体に対する最大反応性を別個に測定し、分析物から形成された免疫複合体によるオキシダント生成と、最大量の分析物−抗体免疫複合体によるオキシダント生成との比により、試料中の分析物の量の相対値が得られる。患者の敗血症の重篤度およびレベルを本明細書に記載のアッセイから推論される他のパラメーターと組み合わせて評価するか、または患者の敗血症の段階を評価し、適切な治療方針を指示および監視するために、この方法を使用して、血液試料中の分析物（例えば、エンドトキシンおよび敗血症に関連する他の分析物）のレベルを決定することができる。このアッセイを使用して、ホルモン、急性期タンパク質、毒素、依存性薬物、心筋損傷マーカー、治療薬、サイトカイン、ケモカインなどの、血液試料に存在する他の予め選択された分析物のレベルを測定することができる。試料中の任意の分析物を本発明のアッセイで測定することができ、食細胞によるオキシダント生成を刺激することができる免疫複合体を形成する抗体を添加することができる。
【００２６】
本発明は、予め選択された分析物を測定するために３アリコートアッセイ形式を利用する。３つ全てのアリコートには、ザイモサンのような、オキシダント生成の最適な活性化剤または促進剤が含まれる。２つのアリコートには分析物に対する抗体が含まれ、このうちの一方には、最大量の免疫複合体を生じるために添加された分析物も含まれる。３つ全てのチューブに試料が添加される。プレインキュベーション時間および平衡化時間、アッセイの様々な成分とのインキュベーション時間、プレインキュベーションおよび反応時間に関する詳細の限定しない例を以下に示し、本開示を考慮すれば、アッセイの感度および速度を最大にするように当業者により容易に決定することができる。アリコートを調製する順番、試料をインキュベートし、さらに分ける順番に関する詳細を例示のためだけに示し、改良することができる。
【００２７】
前記のアッセイは、手操作による手順、半自動化手順、自動化手順に従って行うことができる。この試験により短時間で結果を得ることが可能になり、その結果、分析物を測定して患者の疾患を迅速に診断することができる。特に、救急室で、枕元で、または家庭用に動かすことができる機器を提供することができる。アッセイ形式に応じて、約２０分以内で試験を行うことができる。
【００２８】
一般的に、アッセイを以下のように行う。特定の分析物のアッセイ測定値を活性の単位で示す。目的の分析物としてエンドトキシンの例では、アッセイ測定値はエンドトキシン活性すなわちＥＡである。アッセイは、自動化または半自動化のために改良することができ、等価なデータを生じる任意の順番または順序で行うことができる。例えば、全血の２つのアリコートを、汚染物質も試験結果に悪影響を及ぼす可能性のある他の物質も含まない適切なチューブに入れる。これらのチューブを、インキュベーターまたは他の同等の装置に入れる。この装置では、３つ全てのチューブの温度を同じように維持して、チューブ間の条件を同一に保つことができる。例えば、約３７℃に予め加熱されたサーモスタット付アルミウムブロックを使用することができる。一方のチューブには、後の段階で混合した時に、分析物に対する抗体によりオキシダント生成を最大まで刺激する量の分析物が含まれている。他方のチューブには添加物が含まれていない。これらのチューブを、３７℃で約１０分間インキュベートする。このインキュベーションアッセイの最後の５分間、アッセイチューブにつき３つのチューブを加熱ブロックに装填する。本明細書でチューブＡと呼ぶチューブには、抗体安定化に使用される対照試薬が含まれるか、または試薬が全く含まれない。チューブＢおよびＣには、分析物に対する等量の抗体が含まれる。各チューブには、必要に応じて刺激剤（例えば、非オプソニン化ザイモサン）と共に化学発光化合物を含む緩衝液からなる混合物を添加する。少なくとも約５分間、この混合物の温度を平衡に保つ。血液を約３７℃で合計約１０分間インキュベートした後、ＬＰＳを含まない血液チューブから等量（例えば、２０μｌ）をアッセイチューブＡおよびＢに移し、ＬＰＳを含む血液チューブから等量（本実施例では２０μｌ）をアッセイチューブＣに移す。全てのチューブをよく混合し、測定のためにケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）に入れる。このルミノメーターは、約３７℃にサーモスタットで調節され、アッセイを合計約２０分間測定する。個々のチューブの光積分値を計算し、この計算により分析物の活性（例えば、ＥＡ）を決定する。
活性＝１００×チューブＢ光積分値−チューブＡ光積分値
チューブＣ光積分値−チューブＡ光積分値
【００２９】
前記の様々な成分および条件を、測定される特定の分析物に合わせることができる。成分の量、プレインキュベーションおよびインキュベーションの長さ、発光が測定される期間、アッセイの温度および他のパラメーターは、この特定のアッセイが実施可能な範囲内で当業者により調節することができる。示される実施例の多くの変化が本明細書に含まれる。
【００３０】
前記アッセイの様々な成分は以下の通りである。
【００３１】
予め選択された分析物。分析物は、添加される外因性抗体との抗原−抗体複合体（免疫複合体）の形成に関与し得る、体液試料に存在する任意の物質または成分である。例えば、分析物として、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類、ウイルス、グラム陽性細胞壁成分、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、テイコ酸、グラム陰性エンドトキシン、リピドＡ、Ａ型肝炎、炎症メディエーター、依存性薬物、治療薬、または心臓マーカー（例えば、ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ、トロポニンＩもしくはトロポニンＴ）が挙げられ得る。炎症メディエーターとして、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１、インターロイキン６、インターロイキン−８、インターフェロン、およびトランスフォーミング増殖因子βが挙げられるが、これに限定されない。分析物は、感染症を示すものでもよく、敗血症を示すものでもよい。
【００３２】
好ましい態様では、分析物はリポ多糖であり、抗体は抗リポ多糖抗体であり、試料は全血試料であり、活性化剤はザイモサンである。
【００３３】
抗分析物抗体。本発明の方法の予め選択された分析物に対する抗体は、好ましくはＩｇＭクラスの抗体である。ＩｇＭ−分析物の免疫複合体は、補体経路活性化を介して白血球のオキシダント生成を刺激する一連の反応を誘発する。分析物に対する抗体はＩｇＧクラスの抗体でもよい。
【００３４】
ＬＰＳ（エンドトキシン）を検出するためには、Ｘｏｍａ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡにより製造される、グラム陰性エンドトキシンのリピドＡ成分に対する市販マウスモノクローナルＩｇＭペンタマーであるＸｏｍｅｎ−Ｅ５が適している。
【００３５】
抗体は、安定化された液体または固体の形で供給することができる（例えば、安定化剤であるトレハロースと共にビーズの形で凍結乾燥することができる）。このようなビーズ形態の限定しない例は、本明細書に参考として援用される同時係属出願番号（代理人整理番号１１１２−１−９９９））に記載されている。
【００３６】
最適な白血球刺激剤。ザイモサンまたはラテックスビーズなどの刺激剤は、前記の試験手順に必要とされる添加物ではないが、このような刺激剤を含めることにより、試験試料中の免疫複合体により生じる化学発光が増強される。ザイモサンおよびラテックスビーズは、協奏的な白血球のオキシダント生成および食作用を刺激することにより化学発光反応を増強する。免疫グロブリンＧと補体因子（ｉＣ３ｂおよびＣ３ｂ）の結合によりザイモサンまたはラテックスビーズがオプソニン化された場合、この刺激をさらに増強することができる。ザイモサンまたはラテックスの添加は、オキシダント生成を増大させる増幅プロセスとして働き、本発明の実施において好ましいが、白血球が免疫複合体を認識するのに必須のものではない。ラテックスビーズが調製されるポリマーに応じて、本発明の実施において利用することができる多くの種類のラテックスビーズがある。これらのポリマーとして、例えば、ポリスチレン、スチレンジビニルベンゼン、およびアクリル酸ポリマーが挙げられる。ポリスチレンが好ましい。
【００３７】
適切な刺激剤のさらなる例として、ホルボールエステル（例えば、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）、およびペプチド（例えば、Ｎ−ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン、ｆＭＬＰまたはＮ−−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅと略す）が挙げられる。
【００３８】
化学発光指示薬。好中球オキシダントの生成から生じる化学発光の現象は、発光剤としてアシルアジ化物色素であるルミノールを使用したＡｌｌｅｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：４４９（１９８６）で述べられている。この方法を使用すると、わずかな多形核白血球を使用して、または全血中の白血球を使用しても、好中球呼吸バースト活性化の感度の高い測定を行うことができる。ルシゲニンおよびホラジンを含む、好中球オキシダント生成の結果として光を発する他の化学発光色素もまた同定されている。他の化学発光色素が当業者に周知である。
【００３９】
オキシダントを生成する食細胞。全血試料または白血球を含む他の体液試料を使用する場合、オキシダントを生成する食細胞は試料中に既に存在している。全血は好ましい体液である。このような細胞を含まない、または少なすぎて免疫複合体の量に比例するオキシダントを生成する手段を提供できない試料については、食細胞を試料に添加することができる。
【００４０】
適切な細胞として、好中球、リンパ球、および単球が挙げられるが、これに限定されない。これらの細胞は、別の試料、細胞培養、人工的に調製された細胞、および他の供給源に由来してもよい。
【００４１】
白血球を最大まで刺激する免疫複合体。本明細書に記載のアッセイに、試料に存在する白血球または試料に添加された白血球による最大刺激レベルの免疫複合体に対する最大反応の測定を含めると、本発明により試料中の分析物の量を測定することができる。この測定は、任意の抗原と所望の刺激を行う対応する抗抗原抗体（例えば、エンドトキシンと抗エンドトキシン抗体）を使用して行うことができる。ＩｇＭクラスの抗体が好ましい。アッセイを簡単にするために、予め選択された分析物と同じ分析物を使用することが好ましい。例えば、ＬＰＳアッセイの場合、３つ全てのチューブにザイモサンが含まれる。２つのチューブには等量の抗ＬＰＳ抗体が含まれ、このうち一方のチューブには、抗ＬＰＳと最大量の免疫複合体を形成する量のＬＰＳも含まれる。３つ全てのチューブに等量の試料（未知量のＬＰＳを含む全血）を添加する。全てのチューブに、オキシダントに反応して光を発する試薬が含まれる。試料中の白血球が、免疫複合体に反応してオキシダントを生成する。試料およびザイモサンしか含まない第１のチューブは、バックグラウンドレベルの化学発光を生じる。ザイモサン、試料ＬＰＳ、抗ＬＰＳ抗体を含む第２のチューブは、試料中の分析物であるＬＰＳの量に比例したレベルの化学発光を生じる。ザイモサン、試料ＬＰＳ、添加された最大ＬＰＳ、および抗ＬＰＳ抗体を含む第３のチューブは、最大量の化学発光を生じる。以下に示すように、第２のチューブの化学発光の積分値−対照チューブの化学発光の積分値と、第３のチューブの化学発光の積分値−対照チューブの化学発光の積分値との比により、試料中のＬＰＳの相対量の測定値が得られる。
【００４２】
免疫複合体に反応してオキシダントを生成することができる白血球を含まない試料の場合、別の供給源（例えば、全血試料）に由来する白血球もしくは等価な細胞、培養白血球、または他の白血球、人工的に調製された細胞、および他の供給源が適している。
【００４３】
アッセイ手順。以下の手順は、迅速なかつ感度の高いエンドトキシン（ＬＰＳ）アッセイを提供するために従うことができるプロトコールの限定しない例である。アッセイの測定値は、エンドトキシン活性すなわちＥＡである。このアッセイは、自動化または半自動化のために改良することができ、等価なデータを生じる任意の順番または順序で行うことができる。以下の実施例では、血液の２つのアリコート（５００μｌ）を、パイロジェンが除去されたガラスチューブに入れ、これらのチューブを、３７℃に予め加熱されたサーモスタット付アルミニウムブロックに入れる。一方のチューブには最大標準物質としてＬＰＳが含まれ、他方のチューブには添加物が含まれない。これらのチューブを３７℃で１０分間インキュベートする。このインキュベーションの最後の５分間、ガラスまたはポリスチレンのアッセイチューブを加熱ブロックに装填する。１回のアッセイにつき３つのチューブを使用する。チューブＡには、抗体安定化に使用される対照試薬が含まれるか、または試薬が全く含まれない。チューブＢおよびＣには抗体が含まれる。各チューブには、ルミノール緩衝液と非オプソニン化ザイモサンからなる混合物を添加する（チューブ１個あたり５００μｌ）。少なくとも約５分間、この混合物の温度を平衡に保つ。血液を３７℃で合計約１０分間インキュベートした後、ＬＰＳを含まない血液チューブから２０μｌをアッセイチューブＡおよびＢに移し、ＬＰＳを含む血液チューブから２０μｌをアッセイチューブＣに移す。全てのチューブをボルテックスし、測定のためにケミルミノメーターに入れる。このルミノメーターは、約３７℃にサーモスタットで調節され、アッセイを合計約２０分間測定する。このルミノメーターにより経時的に各チューブの光出力が積算され、光出力の積分値が得られる。個々のチューブの光積分値から、以下の式を使用してエンドトキシン活性（ＥＡ）を決定する。
ＥＡ＝チューブＢ光積分値−チューブＡ光積分値
チューブＣ光積分値−チューブＡ光積分値
【００４４】
このようにＥＡを計算し、範囲のカットオフ値に基づいて患者が内毒素血症であるかを決定する。アッセイの正常範囲および異常範囲、カットオフ値、ならびに陽性適中率および陰性適中率が得られるように、臨床カットオフ値を、目的の特定の分析物に関する疫学的研究ならびに特定のアッセイ成分の感度および特異性に基づいて選択することができる。限定しない例として本明細書に示される特定の一組の操作条件下で、＞３５ＥＡの値が臨床的に意味のある内毒素血症を表している。
【００４５】
前記のように、本発明の方法を使用して他の分析物を測定することができる。このような他の分析物のレベルもまた相対的な単位で表し、バックグラウンドにより補正された最大化学発光に対する比として表すことができる。例えば、ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ、トロポニンＩまたはトロポニンＴを含むマーカーの組み合わせを使用して、胸部痛の原因を明らかにし、不安定狭心症と心臓発作とを区別する心臓マーカー、および心臓発作において損なう、または心臓発作を妨げる他の心臓特異的マーカーおよび骨格筋特異的マーカーが本発明に含まれる。
【００４６】
前記のように、様々な自動化法および半自動化法を本発明に合うように使用することができる。例えば、３つのチューブの化学発光を、適切なタイミングおよび適切なチューブへの試薬添加と適切なプレインキュベーション時間により単一チャンネルを読み取る機器において連続的に測定することができる。バックグラウンドの化学発光、試料分析物の化学発光、最後に最大刺激量を決定するために、単一の全血試料を連続して使用することができる。多チャンネルルミノメーターは、測定中にバックグラウンド値を差し引くことができる。このアッセイは、アッセイの自動化および簡素化を容易にするためにチューブ中の液体ではなく薄膜形式に合うようにすることができる。例えば、指を刺すことで得られる全血試料を、各部分に前記のようなチューブＡ、Ｂ、およびＣに対応する適切な試薬がある３つ別々の部分に導く３つ別々の流路を備える、試験片のような装置を作成することができる。この試験片を手持ち式装置のようなルミノメーター装置に挿入することができる。別の態様では、食細胞オキシダントバーストのレベルを検出するために使用される試薬は色原体（可視または蛍光）を生成し、この色原体の密度は、オキシダントレベルに比例し、それに比例して免疫複合体レベルに比例する。反射率を使用して色を定量し、分析物のレベルを計算することができる。本発明に関するこれらのおよび他の変化が本明細書に含まれる。
【００４７】
前記のように、循環中の感染症または敗血症に関連する分析物の量を使用して、敗血症の重篤度およびレベルまたは段階を表すことができる。さらに、本発明のアッセイを使用して、さらなるパラメーターを敗血症の段階の診断に加えることができる。ＣＬｍａｘで示される好中球の最大オキシダント生成は、白血球がプログラムされたオプソニン攻撃（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｏｐｓｏｎｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に反応する能力の尺度である。免疫複合体に対する患者好中球の反応性（反応性と呼ぶ）は、白血球がオプソニン化免疫複合体に結合および反応する最大の能力の尺度である。大きな反応性は、オプソニン化免疫複合体を処理する余力が十分にあることを示し、正常な健康状態であるとみなされる。小さな反応性は、オプソニン化免疫複合体を処理する余力が少ないことを示し、免疫無防備状態または疾患状態を示している。強い反応の欠如は、免疫系が効果的な免疫反応を開始できないアネルギーの徴候である。敗血症アネルギーの最終段階（敗血症末期）では、患者の免疫系は微生物感染症と戦う能力がだんだんと弱まってきている。この末期まで進行している患者の予後は不良である。
【００４８】
以下の実施例は、試薬を添加する順番の変更、血液希釈物の変更、およびザイモサンの省略といった本発明を実施するいくつかの方法について述べる。本発明の範囲内であるが、これらのプロトコールを改良したものは当業者により考えられる。全血試料の代わりに、好中球またはリンパ球または単球のような、白血球のサブフラクションを基質として使用することができる。ルシゲニンまたはホラジンのような、ルミノール以外の化学発光化合物を使用することができる。
【００４９】
実施例Ｉ
ＬＰＳ測定
全血試料中のエンドトキシン量を測定するために、以下の反応アリコートを調製した。
Ａ＝全血＋ザイモサン
Ｂ＝全血＋ザイモサン＋抗ＬＰＳ抗体
Ｃ＝全血＋ザイモサン＋抗ＬＰＳ抗体＋外因性ＬＰＳ（８００ｐｇ／ｍｌ）
【００５０】
免疫複合体に反応した患者白血球のオキシダント生成を最適化するために、全ての反応アリコートにはザイモサンが含まれた。患者の血液試料およびザイモサンに加えて、チューブＢには、測定しようとする分析物（この場合、エンドトキシン）に対する抗体が含まれた。チューブＡはチューブＢの対照であった。免疫複合体に対する患者白血球の最大反応を決定するために、チューブＣには、チューブＢと等量の抗エンドトキシン抗体とＥ．ｃｏｌｉ０５５：Ｂ５由来ＬＰＳ（０．４μｇ／アッセイの抗体濃度で８００ｐｇ／ｍｌまたは０．６７ＥＵ／ｍｌであると決定された）を添加することにより生じた、最大刺激量の免疫複合体が含まれた。本実施例では、最大反応を決定するための免疫複合体（エンドトキシン−抗エンドトキシン）を形成するために使用された抗原は分析物と同一であったが、このことは全ての分析物に当てはまる必要はない。とはいえ、使用される抗原が分析物と同一であることは最も便利である。
【００５１】
アッセイを実施する際には以下の物質を使用し、以下の方法に従った。本発明から逸脱することなく、本明細書に記載の成分ならびに手順の変化を標準的な手順により改良することができる。
【００５２】
エンドトキシンアッセイまたはエンドトキシンアッセイ用試薬の貯蔵に使用される全てのガラスの表面（アッセイチューブを含む）のパイロジェンを、少なくとも６時間、３００℃で加熱することにより除去した。抗体、ＨＢＳＳ−ルミノール、または血液製剤の貯蔵に使用される全てのポリスチレンおよびポリエチレンの表面は滅菌し、パイロジェン除去水と目的の表面とを接触させる発色ＬＡＬ法（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  ａｓｓａｙ）により測定されたように本質的にエンドトキシンがなかった。液体を移すために使用される全てのピペットチップは滅菌し、パイロジェンが除去された（Ｄｉａｍｅｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）。アッセイに使用される血液試料を静脈穿刺により、または動脈経路を、ＬＰＳ含有量（０．００５ＥＵ／ｍｌ未満）について予備試験された滅菌３ｍｌ  ＥＤＴＡ抗凝固Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）の中に入れることにより採取した。
【００５３】
ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン，遊離酸）、ザイモサンＡ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型（０２６：Ｂ６，０５５：Ｂ５，０１１１：Ｂ４）に由来するリポ多糖（グラム陰性エンドトキシン）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に由来するリポテイコ酸（グラム陽性細胞壁成分）をＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から購入した。
【００５４】
全血または白血球の化学発光を測定するための緩衝液は、１．５ｍＭカルシウム塩および０．９ｍＭマグネシウム塩を含むＨＢＳＳ（パイロジェン除去、エンドトキシン０．００５ＥＵ／ｍｌ未満）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）であった。この緩衝液（５００ｍｌ）をルミノールと共に２５℃で一晩激しく混合して、飽和溶液（１５０μＭ，ＨＢＳＳ−ルミノール）を生成し、次いで、４Ｕ／ｍｌのリチウムヘパリンを添加した。
【００５５】
全ての化学発光実験を３回繰り返して行い、結果を平均ルミノメーターカウント／分±１ＳＤで表した。反応チューブＡ、Ｂ、およびＣ用に２連チューブまたは単一チューブを使用してアッセイ試料を調製することもできる。
【００５６】
以下のアッセイプロトコールに従った。血液の２つのアリコート（５００μｌ）を、パイロジェンが除去されたガラスチューブに入れ、これらのチューブを、３７℃に予め加熱されたサーモスタット付アルミニウムブロックに入れる。一方のチューブには最大量のＬＰＳが含まれ、他方のチューブには含まれない。これらのチューブを３７℃で１０分間インキュベートする。このインキュベーションアッセイの最後の５分間、ガラスまたはポリスチレンのアッセイチューブを加熱ブロックに装填する。１回のアッセイにつき３つのチューブを使用する。チューブＡには、抗体安定化に使用される対照試薬が含まれるか、または試薬が全く含まれない。チューブＢおよびＣには抗体が含まれる。各チューブには、ルミノール緩衝液と非オプソニン化ザイモサンからなる混合物を添加する（チューブ１個あたり５００μｌ）。少なくとも約５分間、この混合物の温度を平衡に保つ。血液を３７℃で合計約１０分間インキュベートした後、ＬＰＳを含まない血液チューブから２０μｌをアッセイチューブＡおよびＢに移し、ＬＰＳを含む血液チューブから２０μｌをアッセイチューブＣに移す。全てのチューブをボルテックスし、測定のためにケミルミノメーターに入れる。このルミノメーターは、約３７℃にサーモスタットで調節され、アッセイを合計約２０分間測定する。
【００５７】
内毒素血症患者の一般的な全血化学発光プロフィールを図１に示す。チューブＡ、Ｂ、およびＣの２０分の光積分値を使用して、以下のように試料中のＬＰＳ量を計算する。試料に存在するＬＰＳ量は「エンドトキシン活性」（ＥＡ）と呼ばれ、以下のように光積分値から計算する。
ＥＡ＝１００×チューブＢ光積分値−チューブＡ光積分値
チューブＣ光積分値−チューブＡ光積分値
【００５８】
このようにＥＡを計算し、範囲のカットオフ値（すなわち、臨床的に意味のある内毒素血症の指標である＞３５ＥＡ）に基づいて患者が内毒素血症であるかを決定することができる。
【００５９】
敗血症の段階に関連する３チューブアッセイの結果から、さらなるパラメーターが得られる。前記で定義されたように白血球がオプソニン化免疫複合体に結合および反応する最大の能力の尺度である患者白血球の反応性（Ｒ）を、以下のように計算する。
Ｒ＝１−［チューブＡ光積分値］
［チューブＣ光積分値］
【００６０】
さらに、白血球活性化レベルおよび細胞数（ＣＬｍａｘ）の尺度を、アッセイ中のチューブＡのルミノメーター計数率の最大値として測定することができる。ＣＬｍａｘとして示される好中球の最大オキシダント生成は、白血球がプログラムされたオプソニン攻撃に反応する能力の尺度である。
【００６１】
実験から表１の以下のデータを得た。Ｂ−Ａ、Ｃ−Ａ、ＥＡ、および反応性の計算についての説明を前記に示す。
【００６２】
【表１】
0004323744.tif 000002
【００６３】
本発明を、様々な特定の物質、手順、および実施例を参照して本明細書で説明および例示したが、本発明は、本発明を説明および例示するために選択された特定の物質、物質の組み合わせ、および手順に限定されないことが理解される。当業者により理解されるように、このような詳細の多くの変化が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、内毒素血症患者に由来する試料の一般的な全血化学発光プロフィールを示す図である。曲線Ａは、全血＋ザイモサンを示す。Ｂは、全血＋ザイモサン＋抗エンドトキシン抗体を示す。Ｃは、全血＋ザイモサン＋抗エンドトキシン抗体＋外因性エンドトキシン（８００ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図１】
0004323744.tif 000003