(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、フラビウイルス属に属するウイルス由来の、少なくともアンカー領域を含むＣ蛋白質、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、少なくともシグナル領域を含むＮＳ１蛋白質、及び少なくともプロテアーゼ領域を含むＮＳ３蛋白質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、該細胞を培養し、その培養上清から非感染性フラビウイルス様粒子を採取することを特徴とする、Ｍ又はＰｒＭ蛋白質成分及びＥ蛋白質成分を含み、分子量が６２±５ｋＤａの蛋白質で構成された非感染性フラビウイルス様粒子の製造方法。
【請求項２】
フラビウイルス属に属するウイルス由来の、少なくともアンカー領域を含むＣ蛋白質、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、少なくともシグナル領域を含むＮＳ１蛋白質、及び少なくともプロテアーゼ領域を含むＮＳ３蛋白質をコードする遺伝子が、構造遺伝子領域２９１−２６５３及び非構造遺伝子領域４６０８−５１４４である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法により得られる非感染性フラビウイルス様粒子。
【請求項４】
フラビウイルス属に属するウイルス由来の、少なくともアンカー領域を含むＣ蛋白質、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、少なくともシグナル領域を含むＮＳ１蛋白質、及び少なくともプロテアーゼ領域を含むＮＳ３蛋白質をコードする遺伝子のｃＤＮＡが、バキュロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域にタンデムに組み込まれた組換えバキュロウイルス。
【請求項５】
請求項３記載の非感染性フラビウイルス様粒子を含有するフラビウイルスワクチン。
【請求項６】
請求項３記載の非感染性フラビウイルス様粒子を含有するフラビウイルス感染症診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラビウイルス由来の非感染性フラビウイルス様粒子、その製造方法、及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トガウイルス科、フラビウイルス属の仲間には、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス等の脳炎ウイルス群と、黄熱病ウイルス、デングウイルス等の脳以外の臓器に障害を起こすウイルス群があり、世界中で合計約６０種類以上が存在すると言われている。こうしたフラビウイルスの特徴は、＋極性の１本鎖ＲＮＡを遺伝子とする、小型のエンベロープを有することであり、約７０％が感染した蚊やダニにより媒介され、節足動物媒介ウイルスと呼ばれている（蛋白質  核酸  酵素  Vol.37, No.14, 434-441, 1992）。
【０００３】
日本脳炎は、日本脳炎ウイルスによって発症する法定伝染病であり、近年日本での患者数は１０人未満を保っているが、依然アジアモンスーン地域を中心に猛威を振るっている。日本脳炎の致死率は現在でも依然約１５％と高く、治癒しても中枢神経障害を含む重篤な後遺症が多くの患者に残るとされている。現在日本脳炎に対する治療は原因療法がなく、実用的な予防手段はワクチンを使用する方法しかない（ワクチンハンドブック、P142-147、1994）。
【０００４】
現在、日本脳炎ワクチンとしては、不活化日本脳炎ウイルスを有効成分とするワクチンが用いられている。すなわち、健康マウス脳内に、同ウイルス北京株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、プロタミン法、ゾーナル遠心法等で高度に精製し、ホルマリンを添加して不活化したものである。このようなワクチン製造においては、多数のマウスを使用する為幾多の製造上の問題があり、マウスを用いない日本脳炎ワクチン及び診断剤の開発、市場供給が強く要望されている。
【０００５】
一方デングウイルスは、熱帯・亜熱帯地方に常在しているとされていたが、近年、森林破壊、気候変化等の影響のためか、東南アジア、オーストラリア等へも感染が広がる傾向が認められている。デング出血熱の死亡率は、酸素吸入及び輸液等の治療を確実に行うと１％以下であるが、適切な治療が遅れると５０％になることが報告されている（ワクチンハンドブック、P252-253、1994）。デング出血熱に対する治療も、原因療法がなく、予防手段としてのワクチンの開発は成功しておらず、現状ではネッタイシマカの発生源を断つ、また刺されないよう注意するしか防御手段がない。患者数が多く流行地域が広がっている点からも、ワクチン開発が緊急を要している。
【０００６】
フラビウイルス属に属する、日本脳炎ウイルスやデングウイルスのワクチン及び診断剤製造には、天然のウイルスを使用する代わりに、組換えＤＮＡ技術によって製造した、ウイルス由来蛋白質を用いることが可能である。これらウイルス共通の特徴として、遺伝子翻訳枠がただ一つ存在する約１１kbの＋鎖ＲＮＡをもとに、翻訳された一つのポリペプチドが細胞内においてウイルス及び宿主細胞由来のプロテアーゼやシグナラーゼによってプロセッシングを受け、１０個のウイルス由来蛋白質（Ｃ／ＰｒＭ／Ｅ／ＮＳ１／ＮＳ２Ａ／ＮＳ２Ｂ／ＮＳ３／ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５）が産生されることが知られている（Annu. Rev. Microbiol. 44, 649-688, 1990）。
【０００７】
これらウイルス由来蛋白質のうち、Ｃ蛋白質、ＰｒＭ蛋白質及びＥ蛋白質は、構造蛋白質と呼ばれ、ウイルスの構成成分である。一方、ＮＳ１以下ＮＳ５までの蛋白質は、非構造蛋白質と呼ばれ、ウイルス複製の際に関与するものの、ウイルスの構成成分ではない。Ｃ蛋白質は、ウイルスＲＮＡと結合してコアを形成し、ＰｒＭ蛋白質及びＥ蛋白質がコアを覆う形でエンベロープを形成する。ＰｒＭ蛋白質及びＥ蛋白質は、別名「表面抗原蛋白質」と呼ばれている。ＰｒＭ蛋白質は、Ｍ蛋白質の前駆体であり、細胞からウイルス遊離する際に、ＰｒＭ蛋白質からＭ蛋白質が形成されることが知られている（Annu. Rev. Microbiol. 44, 649-688, 1990）。
【０００８】
ＮＳ１以下ＮＳ５までの非構造蛋白質のうち、機能が明確に判明しているのは、ＮＳ２Ｂ( プロテアーゼ／レプリカーゼ) とＮＳ３( プロテアーゼ／ヘリカーゼ) である（Charles M. Rice, Annu.Rev. Microbiol. 44, 649-688, 1990 ）。また、ＮＳ３のプロテアーゼ発現には、ＮＳ２Ｂ遺伝子が必要であることも報告されている(Preugschat, F., J. Virol., 64, 4364- 4374) 。
【０００９】
Ｃ蛋白質は、ウイルスのコアを形成する上で重要であり、この蛋白質のＣ末端にはＮＳ３のプロテアーゼで切断される、疎水性の高いアンカー領域があることが知られている。ＮＳ１蛋白質のＮ末端には細胞由来のシグナラーゼで切断される、疎水性の高いシグナル領域が存在している。Ｅ蛋白質とＮＳ１蛋白質は、宿主由来のシグナラーゼによってプロセッシングされることが知られている（蛋白質  核酸  酵素  Vol.37, No.14, 434-441, 1992）。
【００１０】
上記ウイルス由来１０種類の蛋白質が全て発現され、鋳型ＲＮＡと複合体を形成すると、感染性のウイルス粒子が形成される。感染性のないワクチンとしては、ウイルスの表面抗原蛋白質のみを、ウイルス粒子に近い形で発現させることが望ましい。しかしながら、上記１０種類の蛋白質をどの様に選択し、どの発現系を用いたらよいかに関して、現在まで多くの試みがなされたが、ワクチンとして実用に耐える組換え蛋白質粒子の製造は成功していなかった。
【００１１】
例えば、日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質の一部（Ｅ蛋白質）を、バキュロウイルスベクターを用いて発現する試み（特許第2511494号）がなされ、昆虫細胞内にＥ蛋白質を発現することが報告されている。しかしながら、この方法ではウイルス様粒子は得られず、Ｅ蛋白質を取得するのに昆虫細胞を破砕しなければならず、同細胞由来物質との分離が困難であるという問題があった。また、得られたＥ蛋白質のワクチン効果が明確ではなかった。
【００１２】
このため、ワクチン効果を得るために必要な、ウイルスと類似の蛋白質構造（粒子化）を形成するための研究がなされ、組換えワクチニアウイルスを用いて、分子量５３ｋＤａのＥ蛋白質を含んだ非感染性の構造物粒子を製造する報告がなされた（特開平5-276941号、特開平6-181792号、臨床とウイルス, Vol.23, No.5, 296-300, 1995 ）。しかしながらこれらの方法では、組換えウイルス感染細胞上清中に放出される構造物粒子の量が少なく、実用に耐えないとともに、哺乳動物に感染性のあるワクチニアウイルスを使用するため、製造時に組換えウイルスが作業者に感染する危険性、及びワクチンとしての安全性に問題があった。
【００１３】
本発明者らは、人体への感染性の面から、バキュロウイルスベクターを用いた発現系が好ましいと考え、特開平6-181792号の実施例に記載されている、ワクチニアウイルス発現系でのウイルスｃＤＮＡの組合わせを、バキュロウイルス発現系に適用して検討したが、構造物粒子の形成が不首尾であり、実製造に耐えないことを確認した。同特許出願人もまた、後にこのことを確認報告している（ＨＳ報告書  p156, 1993年）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ワクチンや診断剤として有用な非感染性フラビウイルス様粒子を、バキュロウイルス発現系で大量に産生することができる方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、哺乳動物に感染性のない、バキュロウイルス発現系を用いて、フラビウイルス由来の各１０種類の蛋白質の発現領域及び組合わせに関して鋭意検討した結果、ウイルス由来蛋白質のＣ蛋白質の一部、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、ＮＳ１蛋白質の一部、及びＮＳ３蛋白質の一部をコードする遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させて培養すれば、培養上清中に大量（１００μｇ／ml以上）の非感染性のウイルス様粒子が産生されることを見出した。
【００１６】
また、このウイルス様粒子は、従来報告されていたSHA 様粒子（”The Toga Viruses“ p503-429, R.W. Schlesinger, Academic Press., Inc.）と異なり、Ｍ又はＰｒＭ蛋白質成分及びＥ蛋白質成分を含み、分子量が６２±５ｋＤａの蛋白質で主に構成された粒子であり、立体的構造形成（粒子化）がなされ、その結果、現行不活化ワクチンに匹敵する中和抗体価が誘導されることも確認し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、バキュロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に、フラビウイルス属に属するウイルス由来の、少なくともアンカー領域を含むＣ蛋白質、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、少なくともシグナル領域を含むＮＳ１蛋白質、及び少なくともプロテアーゼ領域を含むＮＳ３蛋白質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだ組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、該細胞を培養し、その培養上清から非感染性フラビウイルス様粒子を採取することを特徴とする、Ｍ又はＰｒＭ蛋白質成分及びＥ蛋白質成分を含み、分子量が６２±５ｋＤａの蛋白質で構成された非感染性フラビウイルス様粒子の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記製造方法により得られる非感染性フラビウイルス様粒子を提供するものである。
また、本発明は、前記非感染性フラビウイルス様粒子を含有するフラビウイルスワクチンを提供するものである。
また、本発明は、前記非感染性フラビウイルス様粒子を含有するフラビウイルス感染症診断剤を提供するものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、組み換えウイルスの作製に供されるウイルス（親ウイルス）としては、バキュロウイルスに分類されるものであれば特に限定されないが、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni ）、ラキブルシア・オウ（Rachiplusia ou）、ガリレア・メロネラ（Galleria mellonella ）、ボンビックス・モリ（Bombix mori ）等が挙げられる。これらのうち、特にオートグラファ・カリフォルニカ（以下、ＡｃＮＰＶと略す。）が好適である。
【００１９】
一方、ｃＤＮＡの由来となるフラビウイルスは、フラビウイルス属に属するものであれば特に限定されないが、例えば日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ダニ脳炎ウイルス等が挙げられる。
バキュロウイルスに組み込まれるｃＤＮＡは、前記フラビウイルス由来のＣ蛋白質の一部、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、ＮＳ１蛋白質の一部、及びＮＳ３蛋白質の一部をコードする遺伝子のｃＤＮＡであれば特に限定されず、通常の方法に従って調製することができる。
【００２０】
このようなｃＤＮＡにおいて、Ｃ蛋白質の一部としては、アンカー領域を含むのが好ましく、特にＣ末端から６２アミノ酸程度であるのが好ましい。ＮＳ１蛋白質の一部としては、シグナル領域を含むのが好ましく、特にＮ末端から５７アミノ酸程度であるのが好ましい。ＮＳ３蛋白質の一部としては、セリンプロテアーゼ様活性を有するプロテアーゼ領域（蛋白質  核酸  酵素  Vol.37, No.14, 434-441, 1992）を含むのが好ましく、特にＮＳ３領域のアミノ酸末端から１７９アミノ酸を含むのが好ましい。
また、このようなｃＤＮＡと実質的に同一の機能を有するものであれば、塩基が置換、付加、欠失等で修飾されたｃＤＮＡであっても良い。
【００２１】
このようなｃＤＮＡは、例えばフラビウイルス属に属するウイルス由来のプロテアーゼのうち、ＮＳ３蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡを、同ウイルス由来Ｃ蛋白質の一部、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、及びＮＳ１蛋白質の一部をタンデムにコードするｃＤＮＡの、Ｃ末端にある適当な制限酵素サイトを介して、インフレームかつタンデムに連結し、この挿入遺伝子に人為的に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を付加した後、バキュロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域（例えばポリヘドリン蛋白質をコードする領域）に組み込まれる。或いはＣ蛋白質の一部、ＰｒＭ蛋白質、Ｅ蛋白質、及びＮＳ１蛋白質の一部をタンデムにコードするｃＤＮＡと、ＮＳ３蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡをそれぞれ開始コドンと翻訳終止コドンを付加した後、上記２種類のｃＤＮＡを同一または異なるバキュロウイルスに組み込んでもよい。
【００２２】
このようなｃＤＮＡを組み込んだ組み換えバキュロウイルスの作製方法は特に制限されず、例えば大腸菌由来のプラスミドベクターであるｐＵＣ系のクローニングベクターを用いて構築した転移ベクターｐＡｃＹＭ１内へ挿入し、ＡｃＮＰＶと共に昆虫細胞内にコ・トランスフェクトして相同組換えを行うことによって作製することができる。
【００２３】
次に、このようにして得られた組み換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させる。ここで用いられる昆虫細胞としては、バキュロウイルスが感染増殖可能な細胞であれば良く、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda ：Ｓｆ９）やトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni ：Ｔｎ５）等が挙げられる。
【００２４】
感染後、常法により適当な条件下で、当該細胞を培養する。培養条件は、例えばＥｘ−ｃｅｌｌ  ４０ｌ培地を用い、培養温度２６〜２８℃で４〜６日培養するのが好ましい。
その後、培養上清から、通常の方法により、非感染性フラビウイルス様粒子を採取する。
【００２５】
このようにして得られる本発明の非感染性フラビウイルス様粒子は、Ｍ又はＰｒＭ蛋白質成分及びＥ蛋白質成分で構成され、分子量は６２±５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）である。また、粒子の粒径は、５〜２５nm、好ましくは８〜１８nmである。
さらに、本発明の非感染性フラビウイルス様粒子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６２±５ｋＤａの単一のバンドが認められることから、Ｍ又はＰｒＭ蛋白質成分及びＥ蛋白質成分がＳＤＳ等の界面活性剤により分離しないように融合したものであることが推定される。
【００２６】
かくして得られる非感染性フラビウイルス様粒子は、ワクチン及び診断剤として有用である。ワクチンの調製に当たっては、凍結乾燥品とすることもでき、アジュバントを添加した沈降ワクチンとすることもできる。また、生理食塩水や緩衝液に分散した液状ワクチンとすることもできる。
【００２７】
本発明の非感染性フラビウイルス様粒子を含有するフラビウイルス感染症診断剤は、例えばＥＬＩＳＡ、赤血球凝集試験、赤血球凝集阻止試験、受身凝集試験、補体結合試験、さらに蛍光色素、酵素、放射性同位元素等で標識された粒子又は抗体を用いる種々の試験において有用である。かかる診断剤としては、本発明粒子、固相化粒子、標識抗体、固相化抗体等を組み合せたキットとするのが好ましい。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。以下に記載する各工程の方法についてはあくまで好ましい方法を例として示すものであり、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
（１）フラビウイルス属に属するウイルス由来ＲＮＡを抽出する工程：
フラビウイルス属に属するウイルスである日本脳炎ウイルス（以下、ＪＥＶと略す）の現行ワクチン株である北京株（Beijing-1 strain）をマウス脳内に接種し、３日目の日本脳炎発症マウス脳乳剤上清液約１００μｌを用いてＲＮＡ抽出キット（ベーリンガーマンハイム社製）の方法に従って日本脳炎ウイルスのゲノミックＲＮＡの抽出を行った。
【００３０】
（２）抽出済みウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程：
日本脳炎ウイルスより抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡの合成はランダムプライマーを使用し、、First strand synthesis kit(Pharmacia社製) を用いて実施した。
【００３１】
（３）日本脳炎ウイルス遺伝子のクローニング：
前記で合成したｃＤＮＡを用い、Ｃ、ＰｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３及びＮＳ４Ａの一部を含む約６．７ＫｂｐをＰＣＲ法により増幅した。なお、塩基配列の番号は、住吉等の論文（Virology 161, 497-510, 1987）記載の番号に全て準拠した。ＰＣＲを行う際用いたプライマーを以下に示す。
【００３２】
（化１）
0004268245.tif 000002
【００３３】
ＰＣＲはタックポリメラーゼ（タカラ製）を用い常法に従って実施した。ＰＣＲの詳細条件は以下全て同一である（変性９４℃，１分；アニーリング５５℃，２分；伸長７２℃，３分，３５サイクル＋７２℃，７分；冷却４℃）。
ＰＣＲ法によって増幅したＰＣＲ断片を直接クローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）へＴＡクローニング法によって結合し、ＪＥＶ遺伝子のうちＣ、ＰｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３及びＮＳ４Ａの一部を含む約６．７Ｋｂｐの遺伝子のクローニングを完了した（ｐＪＥ−Ｌ１）。
【００３４】
（４）日本脳炎ウイルス構造遺伝子及び非構造遺伝子（部分ＮＳ３）のＰＣＲ法を用いた増幅：
（ｉ）日本脳炎ウイルス構造遺伝子の増幅；
ｐＪＥ−Ｌ１を用い、Ｃの一部、ＰｒＭ、Ｅ及びＮＳ１の一部を含む約２．４Ｋｂｐの増幅を実施した。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
【００３５】
（化２）
0004268245.tif 000003
【００３６】
この増幅の際、これらを包含する領域のアミノ末端側には後の工程（バキュロウイルス転移ベクターへのクローニング）で必要となる制限酵素サイトＮｏｔＩ及び転写開始コドン（ＡＴＧ）を導入した（図１）。さらに、これらの領域のカルボキシ末端には非構造遺伝子（ＮＳ３）との結合に必要な制限酵素サイトＢｇｌIIを導入した（図２）。
（ii）日本脳炎ウイルス非構造蛋白質の増幅；
日本脳炎ウイルス遺伝子のうち、ウイルス自体が持つプロテアーゼの活性中心とされるＮＳ３のアミノ末端側１７９アミノ酸を含む領域を、前述同様ＰＣＲプライマーを用いて人為的に導入した。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
【００３７】
（化３）
0004268245.tif 000004
【００３８】
この増幅の際、アミノ末端には構造遺伝子との結合に必要な制限酵素サイトＢｇｌIIをＰＣＲプライマーを用いて導入した（図２）。また、カルボキシ末端には制限酵素ＸｂａＩ及び転写終止コドン（ＴＡＡ）を前述同様ＰＣＲプライマーを用いて人為的に導入した（図３）。以下に各遺伝子の増幅領域を記述する。
構造遺伝子領域  ：２９１−２６５３      Ｃ１
非構造遺伝子領域：４６０８−５１４４  ＮＣ１
【００３９】
（５）各増幅断片を用いたバキュロウイルス転移ベクターの構築：
（ｉ）各増幅断片の制限酵素処理；
構造遺伝子領域は、ＮｏｔＩ及びＢｇｌIIを用いて、常法に従い、制限酵素による消化を実施した。非構造遺伝子領域は、ＢｇｌII及びＸｂａＩを用いて、常法に従い、制限酵素による消化を行った。常法に従い、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（インビトロジェン社製）をＮｏｔＩ及びＸｂａＩの各酵素で消化した。
（ii）制限酵素処理後の各断片の電気泳動による処理；
制限酵素処理済みの各断片及びバキュロウイルス転移ベクターを１％アガロースゲルを用いて電気泳動を実施した。
（iii）電気泳動後の各目的遺伝子のアガロースゲルからの切り出し及び遺伝子抽出；
電気泳動により精製された断片をアガロースゲルごとカッターで切り出しそれぞれ透析チューブ内に入れる。それらにＴＥバッファー（pH７．６）を約５００μｌずつ添加しクローサーで透析チューブの両サイドを結窃し電気泳動を行いゲル中に存在する遺伝子断片を透析チューブ中に溶出する。
（iv）エレクトロエリューション後の各遺伝子断片の処理；
透析チューブ中に存在する溶出遺伝子をフェノール・クロロホルム溶液によって抽出し、抽出遺伝子に塩・アルコールを添加し、エタノール沈澱を行いバッファー交換を行う。その後、遠心沈殿し、上清を廃棄し、７０％エタノールを用いてリンスする。さらに遠心沈殿後、上清を廃棄し、真空乾燥機により各遺伝子を乾燥させる。乾燥済み各遺伝子断片に適当量のミリ−Ｑ水を加え再溶解する。
（ｖ）バキュロウイルス転移ベクターと各断片のライゲーション反応；
精製済み各断片及びベクターの濃度を電気泳動法によって確認した後、各遺伝子をライゲースを用いて結合させる。
これら一連の操作によりバキュロウイルス転移ベクター内へ日本脳炎遺伝子断片のクローニングが完了した（ｐＡｃＥｎｖ１；図４）。なお、図４中の数字は、前述の住吉等の論文に基づく塩基配列の番号を示す。
【００４０】
（６）組換えバキュロウイルスの作製：
構築転移ベクター（ｐＡｃＥｎｖ１：1 μｇ／μｌ）及びバキュロウイルス致死欠損遺伝子( １００ng／μｌ：バキュロゴールド；Pharmingen社製) をLipofectin(BRL社製) 存在下で昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）１×１０６cell／３５mm dishに滴下し、その後２６〜２８℃で約４日間培養を継続し、培養上清を回収した。細胞培養用メディウムには昆虫細胞用無血清培地であるＥｘ−ｃｅｌｌ  ４０１（JRH Bioscience社製）を使用した。
【００４１】
コ・トランスフェクション後の上清回収後、ブラインドで２〜３回ウイルス液の力価を増幅した後、昆虫細胞の細胞変性効果を確認して細胞をハーベストし、細胞ライゼートを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン・ブロッティングを実施した。
【００４２】
（７）発現蛋白質の分子量解析：
発現後の蛋白質を細胞ライゼート及び培養上清とに分けてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色で発現蛋白質の分子量を比較した。この際、分子量マーカーとして蛋白質分子量マーカー（第一化学薬品社製）を同時に泳動した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルは単一（１５％）又はグラジエントゲル（アトー社製、５〜２５％）を使用した。
その結果、細胞ライゼートは、陰性対照として同時に泳動した昆虫細胞Ｓｆ９細胞ライゼートと比較して、大きな差異は確認できなかった。しかし、培養上清中の蛋白質に関しては、陰性対照には認められない６２±５ｋＤａ付近にほぼ単一の発現蛋白質（７５０μｇ／ml）が確認された。
【００４３】
（８）発現蛋白質の免疫学的解析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛋白質をゲルから、メタノールを用いて親水性処理したＰＶＤＦ膜にブロット槽を用いてトランスファーし、各種免疫血清を用いて免疫学的解析を実施した。今回の検討中で最も有用であった抗体は、日本脳炎患者血清であった。これらの血清の希釈倍率は１００倍希釈で使用し、Anti-human  ＩｇＧ  ＰＯＤ標識抗体は１０００倍希釈で使用した。この際の希釈液には、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）で行った。
その結果、培養上清中に主に、また細胞ライゼート中に痕跡程度、６２±５ｋＤａに反応する単一のバンドが確認された。対照として泳動した現行日本脳炎ワクチンは、５３±２ｋＤａ（Ｅ蛋白質）と２２±２ｋＤａ（ＰｒＭ蛋白質）にそれぞれ単一のバンドが確認された。
【００４４】
（９）電子顕微鏡による観察：
７５cm２のプラスティック製静置培養用ボトル５本に対して、昆虫細胞Ｓｆ９を６×１０６cell／７５cm２で調製し、組換えウイルス液１mlを用いてM.O.I.約０．５で接種した。発現時の培養用メディウムには、無血清培養用培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ ４０１を使用した。
【００４５】
目的の発現蛋白質は上清部分に産生されていることからプラスティックチューブ（ファルコン社製）に細胞培養上清液を回収し、そのうちの５μｌを、金属メッシュ上に滴下した。それらにサンプルと等量の４％酢酸ウラニウム溶液を添加混合し、約５分間陰性染色を行った。その後、過剰量の液体成分を除去し電子顕微鏡の拡大倍率３０，０００倍で観察を行った。その結果、直径約８〜１８nmの不均一な粒子状構造物が確認された（図５）。
【００４６】
試験例１
実施例１で得られた非感染性フラビウイルス様粒子を、生物学的製剤基準に従い、マウスに対して３０μｇ／ml濃度で０．５ml腹腔内接種し、一週間後に同量の追加免疫を行った。その一週間後にマウスより心臓採血を行い、それらの血清を用いてＪＥＶに対する中和抗体価の測定を実施した。
その結果、コントロールの現行ＪＥＶワクチンでの中和力価が２．６３だったのに対し、本発明粒子を用いた抗原の場合の中和力価は２．６６であり、中和活性も同等の力価を示し、現行ワクチンに匹敵することが判明した。
【００４７】
試験例２
（１）非感染性フラビウイルス様粒子を用いた抗体の作製：
体重約３Kgの兎（日本白色種）３羽に対して、それぞれ１mg／ml濃度の抗原液１mlとフロイトの完全アジュバント（ギブコ社製）と等量混合した後、十分混和した乳剤で初回免疫を実施した。この際、免疫を実施した部位は、上肢及び下肢の付け根部分皮下及び背部皮下に全部で４箇所（２５０μｌ／箇所）注入した。初回免疫後、２週目に初回免疫時と同一箇所に同一抗原を注入した。さらに、この一週間後に耳部静脈部分より直接同一抗原を免疫した。この静脈内免疫は週に２回実施２週間継続した。その後３週目に全採血を実施し、それらの力価測定をインヒビションアッセイ法によって行った。
その結果、非感染性粒子により作製した抗ＪＥＶポリクローナル抗体の力価は、抗体検索ＥＩＡにおいて２５，０００倍希釈でＯ．Ｄ．値＝０．５を示しており、高力価の抗体を取得した。
【００４８】
（２）抗原検出系の構築：
（１）において取得した兎血清を、ＦＰＬＣを用いてグロブリン分画まで精製し、蛋白質濃度０．２５μｇ／mlで平底の９６穴プラスティックプレート（Ｆ８ＭＡＸＩＳＯＲＰ；ヌンク社製；以下共通）各ホール１００μｌずつ固相した。固相時の抗体希釈用バッファーとしては、pH９．６の５０mM炭酸バッファーを使用した。固相時間は、４℃で２０時間程度静置し、抗原（日本脳炎ウイルス）検出用抗体固相プレートとした。
【００４９】
（３）非感染性粒子に対する抗体のペルオキシダーゼ標識：
取得した血清成分を分離し、硫安分画後、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）で４℃、一晩透析した。次に、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）で平衡化した。さらに、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０nmでモニタリングし、Ｏ．Ｄ．値のピークを回収して精製ＩｇＧ画分とした。
【００５０】
このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法〔酵素免疫測定法，２：９１（１９８２）〕でペルオキシダーゼ標識した。すなわち、ペルオキシダーゼ４mg／mlになるように蒸留水にて溶解した。次いで、０．１Ｍ過ヨーソ酸ナトリウム０．２mlを加え、室温で約２０分間反応させ、１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．０）で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH９．５）を０．０２ml加え、pH９〜９．５にすると同時に前述したＩｇＧ抗体を８mg加えた。
【００５１】
室温で２時間反応させ、４mg／ml水素化ホウ素ナトリウムを０．１ml加え、４℃で２時間反応させた後、１０mMリン酸バッファーを用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８０nmでモニタリングしてペルオキシダーゼ標識抗体画分を回収した。
【００５２】
抗体固相プレートを用いてホルマリン不活化日本脳炎ワクチン原液中より日本脳炎ウイルス抗原の検出を行った。抗体固相後９６穴マイクロプレートウエル中に分注したプレート保存液を除き、次いで、ワクチン原液の１０倍希釈系列液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMＰＢＳで作製し、抗体固相マイクロプレート中に１００μｌ／ウエル加え室温（１５〜２５℃）で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。
【００５３】
０．０５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mMＰＢＳで２０００倍に希釈した標識抗体を１００μｌ／ウエル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mMＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。
【００５４】
洗浄後、３．３mg／ml  Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウエルを加えて、室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにより波長４９２nmを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定した。結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
表１の結果より、本発明の非感染性粒子で免疫した抗ＪＥＶ抗体を用いて構築した抗原検出系は、抗原希釈倍率と測定Ｏ．Ｄ．値間に相関関係が認められた。
【００５７】
試験例３
バキュロウイルス発現抗原を用いた抗ＪＥＶ−ＩｇＧ特異抗体の検出：
（１）非感染性粒子固相プレートの作製：
実施例１で得られた非感染性粒子を５０mM炭酸バッファー（pH９．５）で０．１〜１０μｇ／mlに希釈し、ポリスチレン製平底９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ウエルで分注し、４℃で１晩静置した。次に、マイクロプレートを最終濃度０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３回洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMＰＢＳ  ２００μｌ／ウエルを加えて４℃で１晩静置し、非感染性粒子固相マイクロプレートを作製した。
【００５８】
（２）抗ＪＥＶ−ＩｇＧ特異抗体の検出：
前記の非感染性粒子固相マイクロプレート中の各ウエルに注入してあるプレート保存液を除去し、６回程度洗浄バッファーを用いて洗浄後、過去２年以内に日本脳炎ワクチン接種歴のあるヒト血清を０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM  ＰＢＳ（pH７．２）で１００倍に希釈し、その１００μｌを抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳで約２００００倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギペルオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社製）を１００μｌ／ウエル加え、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ  ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。洗浄後、３．３mg／mlのＯ−フェニレンジアミンを含む、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）に、０．０２％過酸化水素水を加えた基質を１００μｌ／ウエル加えて室温にて約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９２nmで各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定し、ホルマリン不活化日本脳炎ウイルスと、バキュロウイルス発現蛋白質各固相プレート間の、抗体検出率を比較した。結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
表２の結果より、ホルマリン不活化日本脳炎ウイルス抗原とバキュロウイルス発現非感染性粒子を用いて構築した抗ＪＥＶ−ＩｇＧ抗体検出系の成績を比較したところ陽性一致率及び陰性一致率共に１００％を示した。以上より、現行ワクチンの原料となっているホルマリン不活化日本脳炎ウイルスと今回バキュロウイルス発現系を用いて発現させた遺伝子工学的手法によって作製した非感染性粒子の免疫学的性質は同等であり有効性が証明された。
【００６１】
試験例４
抗ＪＥＶ−ＩｇＭ特異抗体の検出：
抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を５０mM炭酸バッファー（pH９．５）で５００〜１０００倍に希釈し、ポリスチレン平底９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ウエル分注し、４℃、１８時間以上静置した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ  ２００μｌ／ウエルで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ２００μｌ／ウエル加えて４℃、一晩静置後、抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相プレートを用いて、抗ＪＥＶ−ＩｇＭ特異抗体検出系を構築した。
【００６２】
抗ＪＥＶ−ＩｇＭ特異抗体検出系プレート内の保存液を除外し、ホルマリン不活化日本脳炎ワクチン接種後、３週間以内のヒト血清をサンプルとして０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mM  ＰＢＳで２００倍に希釈し、抗体測定用プレートウエル内に１００μｌ／ウエルに加え室温で約１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳでバキュロウイルス発現非感染性粒子を０．０５〜５．０μｇ／ml濃度に希釈し、それらを１００μｌ／ウエル加え、室温で約１時間反応させた。さらに、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mM  ＰＢＳで２０００倍に希釈した非感染粒子（バキュロウイルス発現抗原）に対する標識抗体を１００μl ／ウエル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５mMＰＢＳ  ２００μl ／ウエルで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３mg／ml  Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）に、最終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウエル加えて室温で約３０分反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって波長４９２nmを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定し、ホルマリン不活化日本脳炎ウイルスと、バキュロウイルス発現蛋白質各固相プレート間の抗体検出率を比較した。結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３の結果より、現行ワクチン抗原と遺伝子組換え抗原を用いた系での抗ＪＥＶ−ＩｇＭ抗体の検出状況の比較では、陽性一致率及び陰性一致率が１００％であった。
【００６５】
【発明の効果】
本発明によれば、マウス脳乳剤を使用することなく、フラビウイルス様粒子を容易にかつ高収率で得ることができる。得られる非感染性フラビウイルス様粒子は、免疫原性及び安全性に優れ、フラビウイルスワクチン、フラビウイルス感染症診断剤として極めて有用である。
【００６６】
【配列表】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において、制限酵素サイトＮｏｔＩ及び転写開始コドンの導入を示す図である。
【図２】本発明において、制限酵素サイトＢｇ１IIの導入を示す図である。
【図３】本発明において、制限酵素ＸｂａＩ及び転写終始コドンの導入を示す図である。
【図４】本発明において、ベクター中の日本脳炎ウイルス遺伝子の組換え断片を示す図である。
【図５】実施例１で得られた非感染性フラビウイルス様粒子の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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