(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）のコドン１９６番目のアミノ酸残基の変異を検出することを含む、全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法。
【請求項２】
アミノ酸残基の変異がメチオニンからアルギニンへの変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチオニンからアルギニンへの変異に対応する遺伝子の変異が、ＡＴＧからＡＧＧへの変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異を検出すること、およびＴＮＦＲ２以外の全身性エリテマトーデスと関連を示す他の遺伝子の多型性を検出することを含む、全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法。
【請求項５】
全身性エリテマトーデスと関連を示す他の遺伝子がＤＲＢ＊１５０１またはＤＲ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子増幅法によって変異を検出する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子増幅法がＰＣＲ法である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬を含む、全身性エリテマトーデス診断キット。
【請求項９】
試薬が、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと相補的なヌクレオチド配列の連続する少なくとも２０以上の塩基からなるヌクレオチド断片である、請求項８に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、全身性エリテマトーデスの判定方法および診断キットに関し、さらに詳細には、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）のコドン１９６番目のアミノ酸変異を検出することを特徴とするエリテマトーデスの判定方法および診断キットに関する。
【０００２】
背景技術
慢性関節リウマチや全身性エリテマトーデスに代表されるリウマチ性疾患は、現在までその本質的病因・病態、決定的な治療法が明らかにされていない難治性炎症性疾患である。これらの疾患は厚生省特定疾患である難病の多くを占め、しかも発症年齢が若年であることから社会的にもその治療法の開発が強く期待される。また、それらの疾患の診断も比較的非特異的な症候、臨床検査所見などの組み合わせからなる診断基準でなされているため、発症予防や早期治療のための早期診断に利用しうるより特異的かつ敏感な臨床検査が求められているのが現状である。
【０００３】
これらの疾患は、双生児における発症一致率や、一般集団と患者近親者における罹患率の検討から、複数の遺伝的素因と、おそらく比較的普遍的な環境要因との相互作用によって発症する多因子疾患であると考えられる。遺伝子解析技術の進歩した現在では、まず遺伝的素因を分子レベルで決定し、その後に同様の遺伝素因を持つ健常者との比較において環境要因を決定することが病因解明における有用な方法であると考えられる。
【０００４】
全身性エリテマトーデスは代表的な自己免疫疾患である。原因は不明であるが、多遺伝子性と考えられており、疾患感受性を示すいくつかの遺伝子があって、環境因子との相互作用により発症すると考えられている（Schur,P,H.,(1995) Lupus 4,425-437;Dong,P.R.,et al.(993)Tissue Antigens 41,20-25;Sterfelt,G.et al.,(1990) Clin.Genet.38,427-433）。
【０００５】
これらの疾患における遺伝的関与のアプローチは家族内発生はもとより、ＨＬＡ、補体系遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子など多岐にわたるが、全身性エリテマトーデスと比較的強い関連を示す遺伝子としては、日本人ではＨＬＡ抗原のＤＲＢ１＊１５０１、白人ではＤＲ３のみであり（Schur,P.H.,(1995) Lupus 4,425-437; Hashimoto, H., Nishimura, Y., Dong,R.P.,et al.(1994) Scand.J.Rheumatol.23, 191-196)）、他に感受性遺伝子が存在すると考えられる。
【０００６】
腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）は多機能性のサイトカインで、標的細胞のアポトーシスやＮＦ−ｋＢの活性化を誘導する。ＴＮＦＲ２遺伝子についてはエキソン４、６、および９にアミノ酸置換を伴う変異が知られている（Santee,S.M.,Owen-Schaub,L.B.(1996)J.Biol.Chem.271,21151-21159）。しかし、これらの変異と全身性エリテマトーデスとの関連は報告されていない。
【０００７】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、ＴＮＦＲ２遺伝子の１９６Ｒアリルを持つ全身性エリテマトーデス患者が健常者と比較し高頻度に出現することを見いだした。
【０００８】
本発明は、全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法および全身性エリテマトーデス診断キットの提供をその目的とする。
【０００９】
本発明によれば、ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異を検出することを含む全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法が提供される。
【００１０】
本発明によれば、また、ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異の検出を、ＴＮＦＲ２以外の全身性エリテマトーデスと関連性を示す他の遺伝子、例えば、ＤＲＢ１＊１５０１またはＤＲ３、の多型性を検出する方法と組み合わせて実施する全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法が提供される。
【００１１】
本発明によれば、ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異の検出用試薬を含む全身性エリテマトーデス診断キットが提供される。
【００１２】
本発明によれば、また、上記全身性エリテマトーデス診断キットを、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１検出用プライマーまたはプローブあるいはＤＲ３検出用プライマーまたはプローブと組み合わせて含む全身性エリテマトーデス診断キットが提供される。
【００１３】
【発明の具体的説明】
ＴＮＦＲ２の１９６番目のコドンはＴＮＦＲ２遺伝子のエクソン６に存在する。ＴＮＦＲ２遺伝子のエクソン６中の１９６番目のコドンは通常メチオニンをコードするが、全身性エリテマトーデス患者では、この部位に他のアミノ酸をコードする多型が存在する。一例としては、後記実施例に示した様にこの部位にアルギニンをコードする多型が挙げられる。
【００１４】
以下、ＴＮＦＲ２遺伝子のエクソン６中の１９６番目のコドンがアルギニンをコードするＴＮＦＲ２遺伝子を「ＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｒアリル」といい、ＴＮＦＲ２遺伝子のエクソン６中の１９６番目のコドンがメチオニンをコードするＴＮＦＲ２遺伝子を「ＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｍアリル」という。
【００１５】
ＴＮＦＲ２遺伝子１９６ＲアリルおよびＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｍアリルのエクソン６の例は配列番号１および２に記載される。配列番号１中第１３２〜１３４塩基「ＡＧＧ」が１９６番目のコドンに相当し、アルギニンをコードしている。配列番号２中第１３２〜１３４塩基「ＡＴＧ」が１９６番目のコドンに相当し、メチオニンをコードしている。配列番号１および２のヌクレオチド配列を整列させたものは図２に示される。
【００１６】
本明細書において「ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬」とは、ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出に必要とされる試薬をいい、本発明による全身性エリテマトーデスまたはその発症可能性の判定法に使用される。この試薬は、好ましくは、ＴＮＦＲ２の１９６番目のメチオニンからアルギニンへの変異の検出に必要とされる試薬であることができる。
【００１７】
「ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬」としては、ＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異（好ましくは、１９６Ｒアリル）の検出に用いられるプライマー、プローブ、制限酵素、並びにマクサムギルバート法やチェインターミネーター法のような塩基配列決定法に用いられる試薬が挙げられる。
【００１８】
ＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｒアリルの検出に用いられるプライマーおよびプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列若しくはこれと相補的なヌクレオチド配列の連続する少なくとも１２以上、好ましくは２０以上、の塩基からなるヌクレオチド断片であることができる。
【００１９】
ＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｒアリルの検出に用いられるプライマーは、配列番号３または４のヌクレオチド配列またはこれと相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチド断片であることができる。
【００２０】
また、ＴＮＦＲ２遺伝子１９６Ｒアリルの検出に用いられるプローブは、配列番号５のヌクレオチド配列またはこれと相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチド断片であることができる。プローブは慣用技術に従って標識されていてもよい。
【００２１】
全身性エリテマトーデスの診断および判定は例えば以下のようにして実施できる。
【００２２】
まず、検出しようとする対象者から遺伝子およびｍＲＮＡを抽出する。核には遺伝子本体と転写された後のｍＲＮＡが存在する。ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに変換して試料として使用できる。本明細書において「遺伝子」にはこのようなｃＤＮＡも含まれるものとする。
【００２３】
被験者の遺伝子およびｍＲＮＡは人体のすべての細胞から抽出することが可能であるが、一般的には末梢血リンパ球、あるいは口腔のぬぐい液に含まれる細胞から容易に得ることができる。抽出した遺伝子あるいはｍＲＮＡはそのまま制限酵素多型性解析法（ＲＦＬＰ法）（Southerns,E.M.(1975)J.Mol.Biol.98,503)、アリル特異性オリゴヌクレオチドプローブ法（ＡＳＯ法）（Wallace,R.B.,Schaffer,N.J.,et al.(1979)Nucleic Acid Res.,6,3543)あるいはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法を用いてＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異を検出することができる。
【００２４】
さらに、抽出した遺伝子あるいはｍＲＮＡを遺伝子増幅法によって増幅することにより、検出をより容易にかつ精度の高いものにすることができる。遺伝子増幅法の例としては、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,et al.(1986)Nature,324,163-166)、ＮＡＳＢＡ法（Comptom,J.(1991)Nature,650,91-92）、ＴＭＡ法（Kacian,D.L.,and Fultz,T.J.(1995)US.Patent 5,399,491）およびＳＤＡ法（Walker,G.T.,Little,M.C.,et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396）が挙げられる。これらの方法により増幅された遺伝子は、その増幅物の特性に応じてＴＮＦＲ２のコドン１９６番目のアミノ酸変異を検出できる。例えば、ＰＣＲ法で増幅された断片は、塩基配列決定法により容易にヌクレオチド配列を決定することが可能であり、それによりＴＮＦＲ２のコドン１９６番目がＡＴＧ（１９６Ｍ）かＡＧＧ（１９６Ｒ）かを決定することができる。また、ＰＣＲでの遺伝子増幅を一塩基の違いを識別して行うＰＣＲ−ＳＳＣＰ法で行うことができる（Orita,M.,Iwahara,H.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2776-2770）。
【００２５】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法はＰＣＲによって増幅した核酸断片を熱変性により一本鎖にした後、一定温度の非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離させることにより検出する方法である。ヌクレオチド断片の違いによる高次構造形成の違いを電気泳動度の差として評価する。
【００２６】
その他ＰＣＲ法で増幅された断片は、制限酵素多型性解析法（ＲＦＬＰ法）（ Southern,E.M.,(1975)J,Mol.Biol.98,503）、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法（ＡＳＯ法）（Saiki,R.K,Bugawan,T.L.,et al,(1986) Nature,324,163-166）、あるいはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法（Landegren,U,Kaiser,R.,et al.(1990)PCR Protocols,Academic Press,Inc.p92-98)などにより解析できる。さらに多検体同時処理を行う場合にはＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（Oka,T., Matsunaga, H.,et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1541-1547)が好ましい。
【００２７】
ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬により１９６番目のアミノ酸残基が変異していたと評価された場合、好ましくは、１９６番目のアミノ酸残基の変異がメチオニンからアルギニンへの置換であると評価された場合、全身性エリテマトーデス患者であるとまたはその発症可能性があると診断または判定できる。
【００２８】
具体的には、ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異は、ＴＮＦＲ２遺伝子の１９６番目のコドンの変異を検出することにより決定できる。例えば、ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬によりコドンの変異がＡＴＧからＡＧＧへの置換であると評価された場合、全身性エリテマトーデス患者であるとまたはその発症可能性があると診断または判定できる。
【００２９】
後記実施例に示されるようにＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１またはＤＲ３を有するか否かを調べることにより全身性エリテマトーデスおよびその発症可能性の診断の精度を向上させることができる。具体的には、ＴＮＦＲ２の１９６番目のアミノ酸残基の変異の検出用試薬により１９６Ｒアリル陰性と評価された場合であっても、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１またはＤＲ３陽性と評価された被験者は全身性エリテマトーデス患者であるとまたはその発症可能性があると診断または判定することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００３１】
ＴＮＦＲ２遺伝子の翻訳領域に存在する多型と全身性エリテマトーデス発症との関連
全身性エリテマトーデスと診断され、かつ治療中の患者８１名の遺伝子を用いてＴＮＦＲ２遺伝子の翻訳領域に存在する多型と全身性エリテマトーデス発症との関連を調べた。互いに血縁関係のない日本人で、かつ“Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ”の診断基準に基づいて全身性エリテマトーデスと診断された患者を被験者とした。男女の内訳は男性１０名、女性７１名で、年齢は１６歳から６３歳であった。また、コントロール群としては２０歳から５５歳の健康な大学職員あるいは学生２０７名（男性１０７名、女性１００名）を採用した。具体的には下記のようにして相関を調べた。
【００３２】
全身性エリテマトーデス（以下SLE）患者８１名および健常対照者２０７名より採血を行い、末梢血リンパ球を原料とし、QIAamp blood kit（QIAGEN社製）を使用して、染色体DNAを抽出した。
【００３３】
ＴＮＦＲ２遺伝子エクソン６断片を増幅するプライマー
５′  ＡＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴ  ３′  ＴＮＦＲ２Ｅ６−Ｆ１（配列番号３）
５′  ＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＴ  ３′  ＴＮＦＲ２Ｅ６−Ｒ１（配列番号４）
【００３４】
抽出した染色体ＤＮＡ３０ｎｇを鋳型として、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｐｍｏｌ各プライマーおよび1unit AmpliTaq Gold（PEアプライドバイオシステムズ社製）を加え、Ampli Taq Gold用緩衝液を用いて２５μｌの反応液を作製した。ＰＣＲ反応装置はGene Amp PCR System 9700( PEアプライドバイオシステムズ社製）を用い、９６℃、１０分の前処理の後、熱変性９６℃、３０秒、アニーリング５８℃、３０秒および伸長反応７２℃、１分を１サイクルとし、３５サイクル行った。増幅産物のうちＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によって、一般型のＴＮＦＲ２遺伝子エクソン６断片と異なる移動度を示すものを検索した。
【００３５】
１μｌのＰＣＲ増幅産物と変性用溶液（９５％  ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ブロモフェノールブルー、０．０５％  キシレンシアノール）７μｌとを混合し、９６度、５分熱変性した後、速やかに氷上に移した。反応液１μｌを５％グリセロールを含む１０％ポリアクリルアミドゲル（９０×８０×１ｍｍ）を用いて０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４５ｍＭ  ホウ酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）にて電気泳動を行った。電気泳動はＡＥ−６４１０電気泳動装置（アトー社製）をＡＥ−１６００循環恒温装置（アトー社製）を用いて２２℃に保ち、ポリアクリルアミドゲル１枚につき２０ｍＡの定電流で９０分行った。電気泳動後、銀染色用試薬（第一化学製）を用いて、バンドの染色を行った。
【００３６】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による解析の結果、一般型のＴＮＦＲ２エクソン６断片とは異なる移動度をしめす一種類の断片を確認した。電気泳動パターンの例を図１に示す。この断片をＰＣＲ直接シークエンシング法によってヌクレオチド配列を決定した（配列番号１）。この変異型ＴＮＦＲ２はコドン１９６がＡＴＧからＡＧＧとなっておりＭｅｔからＡｒｇへのアミノ酸置換を持っていた。一般型ＴＮＦＲ２遺伝子を１９６Ｍアリル、変異型を１９６Ｒアリルと呼ぶこととする。また、解析に用いた断片に含まれるイントロン５内にもＣからＴへの塩基の置換が確認された。
【００３７】
１９６Ｒアリルの陽性率を比較したところ、ＳＬＥ患者群で有意な増加が認められた。結果は表１に示される通りであった。
【００３８】
0004219027.tif 000002
表１に示されるように、全身性エリテマトーデスの患者においては１９６Ｒアリルの陽性率がきわめて高くなっており、１９６Ｒアリルの存在が全身性エリテマトーデスの発症に有意に関連していることが明らかとなった。
【００３９】
患者群とコントロール群の男女比の差を是正するために女性だけの統計処理を行った。結果は表２に示される通りであった。
【００４０】
0004219027.tif 000003
表２に示されるように、男女を含めた場合と大きな差はなかった。
【００４１】
さらに、１９６Ｒアリルと症状の特異性についても調べたが、明確な関連は見られなかった。
【００４２】
これらの結果は、ＴＮＦＲ２遺伝子１９６ＲアリルがＳＬＥにおける疾患感受性遺伝子のひとつであることを示す。
【００４３】
また、先の患者群でＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１を持つ頻度を調べ、統計学的に比較した。結果は表３〜５に示されるとおりであった。
【００４４】
全身エリテマトーデスの患者と健常対照者で、１９６Ｒの陽性率（表１参照）、ＤＲＢ１＊１５０１の陽性率（表３）、ＤＲＢ１＊１５０１または１９６Ｒのどちらかを持っている場合の陽性率（表４）、ＤＲＢ１＊１５０１および１９６Ｒの双方持っている場合の陽性率（表５）をそれぞれ比較した場合、ＤＲＢ１＊１５０１または１９６Ｒのどちらかを持っている場合の陽性率が一番高く、ＤＢＲ１＊１５０１及び１９６Ｒの双方持っている場合の陽性率が最も低いことが明らかとなった。従って、ＤＢＲ１＊１５０１又は１９６Ｒのどちらかを持っている場合の陽性率を調べることで、精度を向上させることができる。
【００４５】
0004219027.tif 000004
【００４６】
0004219027.tif 000005
【００４７】
0004219027.tif 000006
【００４８】
このようにＴＮＦＲ２の１９６ＲとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１の間には相乗的な効果がみられなかった。この結果により、これら二つの遺伝子を同時に調べることにより、より高感度で全身性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスの発症のリスクを予知できることが示された。
【００４９】
【配列表】
0004219027.tif 000007
0004219027.tif 000008
0004219027.tif 000009
0004219027.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】１９６Ｒアリルおよび１９６Ｍアリルの電気泳動パターンを示した電気泳動写真である。
【図２】１９６Ｍアリルおよび１９６Ｒアリルのヌクレオチド配列を整列させて示した図である。
【図１】
0004219027.tif 000011
【図２】
0004219027.tif 000012