(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンB12またはそれらの塩およびヘパリンまたはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養して神経細胞に分化誘導し、該培養物より神経細胞を採取する工程を含む、神経細胞の製造方法。
【請求項２】
神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
無血清培地中で分化誘導することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
無血清培地が、ビオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる１種以上の化合物を含有する無血清培地である、請求項４または５に記載の製造方法。
【請求項７】
ビタミンB12またはそれらの塩およびヘパリンまたはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法。
【請求項８】
神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
無血清培地中で分化誘導することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
無血清培地が、ビオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる１種以上の化合物を含有する無血清培地である、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法および分化誘導方法に使用される培地、ならびに胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  パーキンソン病は中脳黒質に存在するドーパミン作動性神経細胞が変性・脱落して発症する神経変性疾患であり、線条体でドーパミンが減少するため、振戦、固縮、寡動などの運動障害を生じる。その治療法としては線条体のドーパミンを補うためにドーパミンの前駆物質であるＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）の投与がよく用いられているが、長期投与や症状の進行に伴い効果の減弱が認められる。このような重症パーキンソン病患者に対しては細胞移植治療が試みられているが（非特許文献１参照）、移植するための細胞を大量に確保することは困難な状況にある。【０００３】  胚性幹細胞とはインビトロで培養が可能で、かつ他の個体の着床以前の胚、例えば胚盤胞の胞腔中に注入すると、生殖細胞をも含む全ての細胞に分化できる細胞であり、ＥＳ細胞とも呼ばれている。パーキンソン病患者へ移植する細胞を得るために、ＥＳ細胞からドーパミン作動性神経細胞への分化誘導も種々試みられている。【０００４】  ＬｅｅらはＥＳ細胞から細胞塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）を形成した後、ネスチン陽性細胞を選択・増殖させることによりドーパミン作動性神経細胞が得られることを報告している（非特許文献２参照）。また、川崎らはマウス由来ＰＡ６細胞をフィーダー細胞としてＥＳ細胞を培養することにより、ドーパミン作動性神経細胞が短期間に得られることを報告している（非特許文献３参照）。該フィーダー細胞からは、胚性幹細胞を外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する蛋白性の因子が同定され、該蛋白性因子を培地に添加することでＥＳ細胞からドーパミン作動性神経細胞が誘導されることが示されている（特許文献１参照）。また、核内受容体Ｎｕｒｒ１（非特許文献４参照）やＷｎｔアンタゴストＳＦＲＰ−２（非特許文献５参照）をＥＳ細胞に過剰発現させることによりドーパミン作動性神経細胞が誘導できることが報告されている。【０００５】  ビタミンＢ１２はメチル基転移反応により核酸、タンパク質、脂質の代謝を促進して末梢神経組織を修復するなどの薬理作用が古くから知られている。一方、ヘパリンと称される一群の硫酸化ムコ多糖類は、血栓閉塞性障害の予防や処置に使用されているが、最近、低分子ヘパリンについて、運動ニューロンの生存や成長に関する作用があることが報告されている（特許文献２参照）。ビオチン、プトレシン等のポリアミン、鉄含有化合物は微生物、植物細胞、動物細胞など様々な培養を行うための培地に一般的に含まれている成分であり、ビタミン、補酵素、ポリアミン、または微量栄養素としての役割を通じて、代謝亢進作用、タンパク質や核酸の合成促進作用など様々な作用を示すことが知られている。ビオチン（ビタミンＨ）は酵素触媒によるカルボキシル化反応および脱カルボキシル化反応において必須の役割を果たしているが、殆ど全ての動物は自らビオチンを合成できないため、外界からビオチンを摂取する必要があり、生細胞における必須の因子である。ポリアミンについては、ラット培養海馬神経細胞の軸索突起の伸展を促進する作用が知られている（非特許文献６参照）��【０００６】
【特許文献１】国際公開第０３／４２３８４号パンフレット
【特許文献２】特表２００２−５３２４３号公報
【非特許文献１】「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００１年、第３４４巻、ｐ．７１０
【非特許文献２】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、２０００年、第１８巻、ｐ．６７５
【非特許文献３】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２００２年、第９９巻、ｐ．１５８０
【非特許文献４】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００２年、第４１８巻、ｐ．５０
【非特許文献５】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．１２４０
【非特許文献６】「ニューロサイエンス・リサーチ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第１９巻、ｐ．１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）ビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養して神経細胞に分化誘導し、該培養物より神経細胞を採取する工程を含む、神経細胞の製造方法。
（２）神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である上記（１）に記載の製造方法。
（３）カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である上記（２）に記載の製造方法。
（４）無血清培地中で分化誘導することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（５）ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、上記（４）に記載の製造方法。
（６）無血清培地が、ビオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる１種以上の化合物を含有する無血清培地である、上記（４）または（５）に記載の製造方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の製造方法に使用される、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する活性を有する培地。
（８）ビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法。
（９）神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である上記（８）に記載の方法。
（１０）カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である上記（９）に記載の方法。
（１１）無血清培地中で分化誘導することを特徴とする上記（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、上記（１１）に記載の方法。
（１３）無血清培地が、ビオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる１種以上の化合物を含有する無血清培地である、上記（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）上記（８）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法に使用される、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する活性を有する培地。
（１５）ビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養した後、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む、胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法。
（１６）抗癌剤が、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣおよびメトトレキセートからなる群より選ばれる抗癌剤である、上記（１５）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法が提供される。
本発明により、特定の蛋白性因子を使用することなく、また、多段階の培養や異種細胞との共培養、特定方向へ分化を誘導するための遺伝子操作等の煩雑な操作を行うことなく、簡便、選択的かつ安価に胚性幹細胞をドーパミン作動性神経細胞へ分化誘導させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ヘパリンおよびビタミンＢ１２の濃度を変化させた場合において、ＥＢ５から形成されるコロニー数を示す図である。グラフの■はヘパリンの０．０１％添加条件、▲はヘパリンの０％添加条件を示す。また、グラフの横軸は試験溶液１に含まれているビタミンＢ１２の濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）、縦軸は培養開始１４日後に観察された総コロニーの個数を表す。
【図２】図２は、ヘパリンおよびビタミンＢ１２の濃度を変化させた場合において、ＥＢ５から誘導される神経細胞の割合、すなわち神経細胞誘導率を示す図である。グラフの■はヘパリンの０．０１％添加条件、▲はヘパリンの０％添加条件を示す。また、グラフの横軸は試験溶液１に含まれているビタミンＢ１２の濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）、縦軸は培養開始１４日後における神経細胞誘導率（％）を表す。
【図３】図３は、ビタミンＢ１２非添加条件でヘパリンの濃度を変化させた場合において、ＥＢ５から形成される総コロニー数および神経細胞コロニー数を示す図である。グラフの■は神経細胞コロニーを、▲は総コロニーを示す。また、グラフの横軸は試験溶液１に含まれているヘパリンの濃度（％）を、縦軸は培養開始１４日後に観察されたコロニーの個数を表す。
【図４】図４は、実施例１における試験溶液１に代えて試験溶液２〜７を添加した場合におけるＥＢ５から誘導される神経細胞の割合、すなわち神経細胞誘導率を示す図である。グラフのカラム１は試験溶液２の添加条件、カラム２は試験溶液３の添加条件、カラム３は試験溶液４の添加条件、カラム４は試験溶液５の添加条件、カラム５は試験溶液６の添加条件、カラム６は試験溶液７の添加条件を示す。また、グラフの縦軸は培養開始１４日後における神経細胞誘導率（％）を表す。
【図５】図５は、ＥＢ５から分化誘導した神経細胞におけるドーパミンの産生を示す図である。グラフのカラム１はＰＢＳの添加条件、カラム２は試験溶液８の添加条件、カラム３は試験溶液９の添加条件、カラム４は試験溶液１０の添加条件を示す。また、グラフの縦軸は、分化誘導した細胞１０７個あたりのドーパミン産生量（ｐｍｏｌ／１０７ｃｅｌｌｓ）を表し、値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】１．胚性幹細胞
本発明において、胚性幹細胞とはインビトロで培養が可能で、かつ他の個体の着床以前の胚、例えば胚盤胞の胞腔中に注入すると、生殖細胞をも含む全ての細胞に分化できる細胞であり、下記の（１）、（２）、および（３）にあげる胚性幹細胞を包含する。
（１）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞、より具体的には、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立されたＥＳ細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、もしくは着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、またはこれらの細胞を培養することによって得られる細胞、また、悪性奇形腫より樹立された胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ；以下「ＥＣ細胞」ともいう。）もＥＳ細胞と同様の性質を示すことが知られていることから、胚性幹細胞に含まれる。
（２）体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞。
（３）（１）または（２）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞。【００１２】２．胚性幹細胞の作製法
上記１で述べた（１）、（２）、および（３）の胚性幹細胞の作製法を具体的に説明する。
（１）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞の調製
着床以前の初期胚を、文献（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に記載された方法に従って培養することで、該初期胚より胚性幹細胞を調製することができる。【００１３】  得られた胚性幹細胞の培養方法としては、文献（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）等に記載の胚性幹細胞を培養するための方法があげられる。胚性幹細胞は無血清培養することも可能で、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１５〜２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１００μｍｏｌ／ｌ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール、および１，０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦを加えた培地を用い、未分化な胚性幹細胞としての形質を保ったまま継代培養することができる［Ｆｏｃｕｓ，２０，８，（１９９８）］。【００１４】（２）体細胞の核を核移植した胚性幹細胞の作製
哺乳類動物細胞の体細胞の核を移植し正常な発生を開始した卵は、［Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０，（１９９７）］、［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６，（１９９８）］、［蛋白核酸酵素，４４，８９２，（１９９９）］、［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６，（１９９９）］、［Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９，（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７，（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４，（１９９９）］、［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９，（２０００）］等に記載された方法を用い、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、以下の方法が知られている。【００１５】  核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合に好適である。また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。【００１６】  初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することができる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生させる方法としては複数の方法が知られている。例えば、細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合に好適である。【００１７】  また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。【００１８】  いったん発生を開始した卵が得られれば、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、ジーン・ターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
（３）染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞の作製
相同組換え技術を用いることによって、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。【００１９】  例えば、改変する染色体上の遺伝子としては、組織適合性抗原遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患に関連した遺伝子などが挙げられる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、ジーン・ターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法を用い、行なうことができる。【００２０】  具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。【００２１】  標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下「モレキュラー・クローニング第２版」と略す。）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｎｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」と略す。）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。【００２２】  標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、ジーン・ターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、ジーン・ターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。【００２３】３．神経細胞
本発明において、胚性幹細胞から分化誘導させて、製造することができる神経細胞とは、他の神経細胞または刺激受容細胞からの刺激を受け、別の神経細胞、筋または腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。【００２４】  神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類されており、具体的には、神経伝達物質、神経伝達物質の合成酵素などの違いで分類されている。神経伝達物質としては、ペプチド性、非ペプチド性のいずれも包含される。非ペプチド性の神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、アセチルコリン、γアミノ酪酸、グルタミン酸があげられる。ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンの３種類をカテコールアミンと称す。【００２５】  これら神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドーパミン作動性神経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、γアミノ酪酸作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞などがあげられる。ドーパミン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞を総称してカテコールアミン作動性神経細胞と呼ぶ。【００２６】  カテコールアミン作動性神経細胞は共通してチロシン水酸化酵素を発現し、ノルアドレナリン作動性神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞では共通してドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを発現する。また、ノルアドレナリン作動性神経細胞ではフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼを発現し、セロトニン作動性神経細胞ではトリプトファン  ヒドロキシラーゼを発現し、アセチルコリン作動性神経細胞ではコリンアセチルトランスフェラーゼを発現し、γアミノ酪酸作動性神経細胞ではグルタミン酸デカルボキシラーゼをそれぞれ特異的に発現している。したがって、神経細胞を認識する方法としては、上記酵素を認識する抗体を用いた識別方法、上記酵素をコードするｍＲＮＡの発現を検出する方法などがあげられる。【００２７】  ペプチド性の神経伝達物質としては、副腎皮質刺激ホルモン［Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ（ＡＣＴＨ）］、ααγ，β−リポトロピン（Ｌｉｐｏｔｒｏｐｉｎ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、α−エンドルフィン（Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）、β−エンドルフィン、γ−エンドルフィン、メチオニンエンケファリン（Ｍｅｔ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ロイシンエンケファリン（Ｌｅｕ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、α−ネオエンドルフィン（Ｎｅｏｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）、β−ネオエンドルフィン、ダイノルフィンＡ（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ａ）、ダイノルフィンＢ（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ｂ）、ロイモルフィン（Ｌｅｕｍｏｒｐｈｉｎ）、バソプレッシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ニューロフィシン（Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、ニューロフィシンＩ（Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ  Ｉ）、サブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）、ニューロキニンＡ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ａ）、神経ペプチドＫ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｋ）、神経ペプチド−γ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ−γ）、ニューロキニンＢ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  ���）、ボンベシン（Ｂｏｍｂｅｓｉｎ）、ガストリン放出ペプチド（Ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、セクレチン（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、バソアクチブインテスティナルペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、インスリン様増殖因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ）、ガストリン（Ｇａｓｔｒｉｎ）、コレシストキニン（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、神経ペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ）、膵臓ポリペプチド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ペプチドＹＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、アンギオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ニューロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ）、ガラニン（Ｇａｌａｎｉｎ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｄｏｒｍｏｎｅ）等があげられる。これらのペプチド性の神経伝達物質を産生する神経細胞は、神経伝達物質または神経伝達物質前駆ペプチドを認識する抗体、神経伝達物質または神経伝達物質前駆ペプチドをコードするｍＲＮＡの発現を検出することで識別することができる。【００２８】  また、運動神経は、その神経終末よりアセチルコリンを分泌することで骨格筋に情報を伝えており、アセチルコリン作動性神経細胞に分類される。運動神経のマーカー蛋白質としては、ｉｓｌｅｔ  １［Ｎａｔｕｒｅ，３４４，８７９，（１９９０）］等があげられる。
本発明の製造方法は、神経細胞、好ましくはカテコールアミン作動性神経細胞、より好ましくはドーパミン作動性神経細胞の製造に用いられる。【００２９】  特に、本発明の製造方法により、胚性幹細胞から分化誘導され、製造されるドーパミン作動性神経細胞は、前述したように、カテコールアミン作動性神経細胞に共通して発現が観察されるチロシン水酸化酵素を発現しているが、ノルアドレナリン作動性神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞に共通して発現が観察されるドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを発現しない細胞として特徴づけられ、移植により神経変性疾患、例えばパーキンソン病の症状を改善することができる。【００３０】４．ヘパリンおよびヘパリン様作用を有する物質
ヘパリンとは一群の硫酸化（スルホン化）ムコ多糖類をいい、これらはまたグリコサミノグリカンとも呼ばれる。ヘパリンの構造の特徴は、α−１，４−グリコシド結合したＤ−グルコサミンおよびＬ−イズロン酸ユニットから成る二糖ユニット、およびα−１，４−グリコシド結合したＤ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸ユニットから成る二糖ユニットである。スルフェート基（スルホ基）の位置および数はいずれも可変である。それらは酸素（Ｏ−硫酸化）および窒素（Ｎ−硫酸化）を介して結合してもよい。イズロン酸残基は多くの場合２−Ｏ−硫酸化され、グルコサミン残基は多くの場合Ｎ−硫酸化されるが、必要により６−Ｏ−硫酸化もされる。グルクロン酸残基は多くの場合硫酸化されない。次に、その二糖ユニットは互いにα−１，４−グリコシド結合してヘパリン分子を形成する。これらの二糖ユニットの数および配列は同様に可変である。従ってヘパリンは多くの構造的に異なる分子であり、それらは例えば元素分析によって、またはその鎖長、分子量、もしくは電荷に基づいて区別できる。ヘパリンとは、通常、上記のタイプの構造的に異なるヘパリン分子（α−ヘパリン）の混合物を意味し、これは必要により、他の成分、例えばいわゆるβ−ヘパリン（コンドロイチン硫酸Ｂまたはデルマタン硫酸とも呼ばれる）および／または他の細胞成分（特にタンパク質）を含有してもよい。ヘパリンは遊離酸として、または生理学上許容される塩の形態で存在してもよい。ヘパリンの生理学上許容される塩としては、ナトリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩等があげられる。【００３１】  ヘパリン分子の分子量は通常、２００から３０，０００Ｄａの範囲内にある。本発明において使用されるヘパリンは、この分子量の範囲内のヘパリン、またはその断片化したもののいずれでもよい。このうち、重量平均分子量が約５００から約１０，０００Ｄａであるヘパリン分子の混合物（ＬＭＷヘパリン）を使用することが好ましい。断片化は、好ましくはヘパリンの制御された部分的な化学的、酵素的、または物理的開裂によって行うことができる。化学的開裂は、例えば硝酸ナトリウムを用いて行うことができ、酵素的開裂は、例えばフラボバクテリウム由来のヘパリナーゼを用いて行うことができ、また、物理的開裂は、例えば超音波により行うことができる。【００３２】  ヘパリン様作用を有する物質とは、ヘパリンのように血液の凝固および血栓の生成を阻害する作用を有する一群の物質をいう。具体的には、硫酸化した植物性オリゴ糖または多糖、例えばアルギン酸、ペクチン、キシラン、デンプン、またはデキストランから調製した多硫酸エステル、および硫酸化した動物性グリコサミノグリカン等があげられる。これらのヘパリン様作用を有する物質は天然物から得るか、または半合成もしくは完全合成して調製してもよく、合成は通常、上記の植物性または動物性多糖の硫酸化により、例えばクロロスルホン酸と反応させ、遊離した塩酸を塩基で中和することにより行う。【００３３】  本発明の製造方法において、ヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩の培養液中の濃度は、ヘパリンまたはヘパリン類似物質として、好ましくは０．００００１〜５重量％、より��ましくは０．０００１〜１重量％、特に好ましくは０．００１〜０．１重量％である。【００３４】５．ビタミンＢ１２
本発明において使用されるビタミンＢ１２としては、例えば塩酸ヒドロキソコバラミン、酢酸ヒドロキソコバラミン、ヒドロキソコバラミン、シアノコバラミン、メチルコバラミン、ニトリトコバラミン、アデノシルコバラミン、アコココバラミンおよびそれらの塩等があげられる。
本発明の製造方法において、ビタミンＢ１２またはそれらの塩の培養液中の濃度は、ビタミンＢ１２として、好ましくは１００ｐｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１ｎｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは１０ｎｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌである。【００３５】６．ビオチン  ビオチンはビタミンＢ群の一種であり、ビタミンＨとも呼ばれているが、本発明においてはビオチンおよびそれらの塩が使用される。本発明の製造方法において、ビオチンまたはその塩の培養液中の濃度は、ビオチンとして、好ましくは０．００１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１μｇ／ｍｌである。【００３６】７．ポリアミン
本発明において使用されるポリアミンとしては、複数のアミノ基を持つ非蛋白性の脂肪族アミンがあげられ、具体的には、プトレシン、スペルミン、カダベリン、スペルミジン等の生体アミンがあげられる。本発明の製造方法において、ポリアミンの培養液中の濃度は、好ましくは０．００１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌである。【００３７】８．鉄含有化合物
本発明において使用される鉄含有化合物としては、鉄イオン（ＩＩ）または鉄イオン（ＩＩＩ）を含有する化合物があげられるが、好ましくは、鉄イオン（ＩＩ）を含有する化合物が使用される。
鉄イオン（ＩＩ）を含有する化合物としては、例えば、ＦｅＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＦｅＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｆｅ［ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ］２、Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、等の鉄イオン（ＩＩ）を含有する無水物または水和物があげられる。
鉄イオン（ＩＩＩ）を含有する化合物としては、例えば、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ２（ＳＯ４）３、Ｆｅ２（ＳＯ４）３・（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、等の鉄イオン（ＩＩＩ）を含有する無水物または水和物があげられる。【００３８】  本発明の製造方法において、鉄含有化合物の培地中の濃度は、鉄イオン（ＩＩ）または鉄イオン（ＩＩＩ）として、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／ｌである。
９．培地の調製
本発明の製造方法で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。【００３９】  基礎培地としては、ＢＭＥ培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，８９，３６２，（１９６５）］、ＢＧＪｂ培地［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２５，４１，（１９６１）］、ＣＭＲＬ  １０６６培地［Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５，３０３，（１９５７）］、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６，１４７，（１９６２）］、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地［Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，４９，１７０５，（１９７２）］、ＩＭＤＭ培地［Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，９，６，（１９７０）］、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１，（１９５０）］、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２，（１９５９）］、Ａｌｐｈａ  ＭＥＭ培地［Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３０，３１０，（１９７１）］、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６，（１９５９）］、ハム培地［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９，５１５，（１９６３）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８，（１９６５）］、ＲＰＭＩ  １６４０培地［Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．，１９９，５１９，（１９６７）］、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１０，（１９６４）］、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１００，１１５，（１９５９）］、ウイリアムスＥ培地［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，６９，１０６，（１９７１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，８９，１３９，（１９７４）］およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。【００４０】  また、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９３）；胚性幹細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の胚培養のための培地、例えば、Ｍ２培地、Ｍ１６培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、体外受精用培地など、胚の培養に用いることのできる培地であればいずれも基礎培地として用いることができる。【００４１】  さらに血清代替物としての各種増殖因子を添加した培地、または無蛋白培地であっても、動物細胞や胚の培養が可能なものであればいずれの培地も用いることができる。具体的には、ＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲを添加した無血清培地［Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら；Ｆｏｃｕｓ，２０，８，（１９９８）］、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地、細胞由来の因子を添加した培地等があげられる。【００４２】  インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地としては、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ｅＲＤＦ  Ｄｒｙ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＩＴＰＳＧ培地［Ｓ．Ｈｏｓｏｉら；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，Ｓ１７，（１９９１）］、ＩＴＳＦｎ培地［Ａ．Ｒｉｚｚｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇｒｏｗｌｅｙ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５７，（１９８０）］、ｍＮ３培地［Ｓ．Ｏｋａｂｅら；Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，５９，８９，（１９９６）］等があげられる。【００４３】  細胞由来の因子を添加した培地としては、多能性奇形癌腫細胞ＰＳＡ１の培養上清を添加した培地（Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４，１９８１）があげられる。
無蛋白培地としては、ＣＤ−ＣＨＯ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）等があげられる。
これら培地に、上述のビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を添加することで、胚性幹細胞を分化誘導するための培地を調製することができる。例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、および０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール、ならびにビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を添加することにより調製することができる。さらに、この培地に上述のビオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる１種以上の化合物を添加することが好ましい。【００４４】１０．培養器
本発明で使用される培養器としては、胚性幹細胞を培養できるものであればいかなる培養器でも用いることができるが、好ましくは細胞培養用に用いられる培養器が好ましい。細胞培養用の培養器としては、例えば、フラスコ、細菌培養用フラスコ、細胞培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、コンツアーデッシュ、パーマノックスデッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、セパレートストリップウエル、テラサキプレート、組織培養用チャンバースライド、シャーレ、細胞培養用シャーレ、組織培養用チューブ、トレイ、細胞培養用トレイ、セルファクトリー、培養バッグ、テクノポット、ローラーボトル、スピンナー、ホローファイバー等があげられる。培養器と細胞との接着性を制御するために、培養器の細胞と接触する側の表面に人工的に処理を施すこともできる。培養器の表面を人工的に処理する例としては、コラーゲンタイプＩコート、コラーゲンタイプＩＶコート、ゼラチンコート、ポリーＬ−リジンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコート、プロテオグリカンコート、グリコプロテインコート、マトリゲルコート、シリコンコート等があげられるが、コラーゲンタイプＩコート、コラーゲンタイプＩＶコート、ゼラチンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコートが好ましく用いられる。また、プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ社製）などのように負の電荷を持つように処理することもできる。これらの処理を施した培養器も、本発明の製造方法に用いることができる。【００４５】１１．胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法
本発明の製造方法としては、具体的には、ビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養して神経細胞に分化誘導し、培養物中より神経細胞を採取する工程を包含する。【００４６】  本発明の製造方法においては、ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性（以下、「ＳＤＩＡ活性」と略記する。）を有する蛋白性因子等の特定の蛋白性因子を使用することなく、胚性幹細胞を神経細胞へ分化誘導させることができる。ＳＤＩＡ活性を有する蛋白性因子等の特定の蛋白性因子としては、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、「ＳＦＲＰ」と略記する。）１、ＳＦＲＰ１を構成する１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたポリペプチドで胚性幹細胞を外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有するもの等があげられる（ＷＯ０３／４２３８４）。【００４７】  胚性幹細胞を非凝集状態で培養するとは、細胞同士の接着を解除した単一細胞状態（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）で培養を開始し、継続して培養することである。また、単一細胞状態とは、酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞がバラバラになった状態をいう。【００４８】  本発明の製造方法における培養では、播種した細胞が凝集せず、エンブリオイドボディを形成しない。このような単一細胞状態で胚性幹細胞の培養を開始し、それを継続して培養するには、胚性幹細胞の培養において通常の胚性幹細胞の継代に用いられる細胞密度よりも低い細胞密度で播種し培養することが好ましい。具体的には、酵素消化等の処理を胚性幹細胞に施し、培地を用いて単一細胞状態の細胞懸濁液を調製し、その細胞懸濁液を、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在できる程度に培養する。このような培養は、細胞を積極的に凝集させ疑似胚状態を再現することで分化誘導を引き起こそうとするエンブリオボディを用いた培養方法とは異なる。ここで、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在できる程度の播種用胚性幹細胞の細胞密度としては、好ましくは数十〜数千細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは３０〜３００細胞／ｃｍ２である。【００４９】  単一細胞状態とした胚性幹細胞を得る方法としては、組織細胞培養で用いられる、公知の酵素消化の方法が挙げられる。具体的には、前日培地交換を行い、数十％〜ほぼコンフルエント状態にまで増殖した胚性幹細胞を培養している培養皿から培地を除いた後、リン酸緩衝化生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）を用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄する。洗浄後、胚性幹細胞の入った培養皿に適当な酵素消化液（例えば、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡおよび０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ）を加え、３７℃で数十分間、好ましくは５〜２０分間培養する。酵素反応後、胚性幹細胞の分化誘導に用いる培地に懸濁し、遠心分離（例えば、４℃、２００×ｇで５分間）を行ない、得られる細胞を再び培地に懸濁することで単一細胞状態とした胚性幹細胞を回収することができる。【００５０】  単一細胞状態に調製された胚性幹細胞は、上記９に記載の培地および上記１０���記載の培養器を用い、胚性幹細胞の分化誘導に適した培養法、具体的には、単層培養法、マイクロキャリア培養法、還流培養法、軟寒天培養法等で神経細胞に分化誘導させることができる。胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導するには、上述の工程を含む製造方法で適宜培地交換を行いながら培養を継続することで行うことが好ましい。【００５１】  本発明の製造方法により、胚性幹細胞は神経細胞に分化誘導され、本発明の製造方法に供した胚性幹細胞の５％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは４０％以上を神経細胞へ分化誘導させることができる。
１２．本発明の製造方法で製造された神経細胞の利用
本発明の製造方法で製造された神経細胞は、例えば神経細胞の細胞障害に基づく疾患の治療に用いることができる。【００５２】  神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えばアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、脊椎損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、ダウン症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患等があげられる。
細胞障害に基づく疾患の治療には、移植医療に利用可能な、障害を受けた細胞の機能と同じ機能を有する細胞、障害を受けた細胞の前駆細胞、障害を受けた細胞の機能を代償する細胞、障害を受けた細胞の再生を促進する機能を有する細胞等が用いられる。【００５３】  移植医療の目的に用いるためには、本発明の製造方法により製造された神経細胞を精製して使用することが好ましい。
細胞の精製方法は、公知の細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、具体的には、アンチボディイズ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）］、モノクローナルアンチボディイズ［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）］、アンチボディイエンジニアリング［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５，（１９９８）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２５，９７２，（１９９７）等に述べられているフローサイトメーターを用いた方法、モノクローナルアンチボディイズ、アンチボディイエンジニアリング、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７，（１９８８）等に述べられているパニング法、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）等に記載のショ糖濃度の密度差を利用した細胞分画法等をあげることができる。【００５４】  本発明により製造される神経細胞の純度を高める方法としては、上述のように、ビタミンＢ１２またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用いて胚性幹細胞を非凝集状態で培養した後、抗癌剤を含む培地中で培養する工程があげられる。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い神経細胞を得ることができる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする神経細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。【００５５】  本発明により製造される神経細胞の純度を高める方法において用いられる抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどがあげられる。これら抗癌剤は、分化誘導した神経細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。例えば、これら抗癌剤を生体に用いる場合の日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度が好ましい。【００５６】  胚性幹細胞を分化誘導して得られた神経細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程とは、具体的には、前日に培地交換を行った培養系に、適切な濃度の抗癌剤、例えば、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを添加し、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２〜３時間培養する方法があげられる。【００５７】  ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上記９に記載の培地等をあげることができる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、上記２（２）に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞または上記２（３）に記載の染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることにより、組織適合性抗原の違いによる拒絶を回避することができる。【００５８】  また、上記２（３）に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を分化誘導することで、体細胞を提供した個人の神経細胞を得ることができる。このような個人の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個人に有功か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個人のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。【００５９】  移植の方法としては、対象となる疾患に適した方法であればいずれの方法も用いることができ、疾患ごとにそれぞれの疾患に適した公知の方法が知られている。例えば、疾患患者の体細胞から上記２（２）または（３）の胚性幹細胞を作製し、該胚性幹細胞から神経細胞に分化誘導させたのちに、患者の疾患部位に移植することにより疾患を治療できる。具体的には、パーキンソン病患者に対して神経細胞を移植する方法として、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２，１１３７，（１９９９）等に記載の方法があげられる。【００６０】  以下に、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００６１】ヘパリンとビタミンＢ１２によるＥＳ細胞から神経細胞への分化誘導（１）
以下の実施例において、胚性幹細胞としては、ＥＳ細胞ＥＢ５［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４，３７２，（２０００）］を使用した。
ＥＢ５は、０．１％のゼラチンでコートしたディッシュに播種し、１％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、１０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、２０ｍｇ／ｍｌ  ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）、および２×１０３Ｕ／ｍｌＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＧ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下、「維持培地」という。）を用いて、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベータ中、３７℃で、未分化状態を維持しながら継代培養した。【００６２】  ＥＢ５を分化誘導する際には、０．１％のゼラチンでコートした２４ウェルプレートに２．５×１０３個のＥＢ５を播種し、維持培地から血清、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ、およびＥＳＧＲＯを除いた培地（以下、「分化誘導培地」という。）を各ウェルに１ｍｌずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートして細胞を接着させた。その後、種々の濃度のヘパリン（Ｓｉｇｍａ社製）またはビタミンＢ１２（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（以下「試験溶液１」という。）を５００μｌ添加して、３７℃で１４日間、培地を交換せずにインキュベートした。各実験条件は２連で実施した。なお、以下、ヘパリンおよびビタミンＢ１２の濃度は、試験溶液１における濃度を意味する。【００６３】  試験溶液１の添加後１４日目において、光学顕微鏡を用いて直径５０μｍ以上のコロニーをカウントして総コロニー数を求めた。また、該コロニーのうち神経突起が観察されたコロニーを神経細胞コロニーとし、神経細胞誘導率を以下の式により算出した。
神経細胞誘導率（％）＝神経細胞コロニー数／総コロニー数×１００
その結果、ビタミンＢ１２を添加した場合における総コロニー数は、ビタミンＢ１２の濃度によらず、ヘパリンの０％添加条件と０．０１％添加条件とで差は見られなかった（図１）。一方、ビタミンＢ１２を添加しても、ヘパリンの０％添加条件では神経細胞コロニーがほとんど全く誘導されず、ヘパリンの０．０１％添加条件ではビタミンＢ１２の濃度に依存して神経細胞が誘導されることが明らかとなった（図２）。【００６４】  また、ビタミンＢ１２を添加していない場合は、ヘパリン濃度によらず神経細胞はほとんど全く誘導されなかった（図３）。
以上の結果から、ヘパリンとビタミンＢ１２を組み合わせることより、胚性幹細胞が神経細胞へ分化誘導されることが明らかとなった。
【実施例２】
【００６５】ヘパリンとビタミンＢ１２によるＥＳ細胞から神経細胞への分化誘導（２）
上記実施例１において、試験溶液１に代えて、０．０１％のヘパリンおよび１００ｎｍｏｌ／ｌのビタミンＢ１２を含むＰＢＳ（以下「試験溶液２」という。）、試験溶液２に０．１μｇ／ｍｌのビオチン［（＋）−ビオチン、和光純薬社製］を含む試験溶液３、試験溶液２に０．４２μｇ／ｍｌのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］（ナカライテスク製）を含む試験溶液４、試験溶液２に０．０８１μｇ／ｍｌのプトレシン（Ｓｉｇｒｎａ社製）を含む試験溶液５、試験溶液２に０．１μｇ／ｍｌのビオチン、０．４２μｇ／ｍｌのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］および０．０８１μｇ／ｍｌのプトレシンを含む試験溶液６、０．０１％のヘパリン、０．１ｍｇ／ｍｌのビオチン、０．４２μｇ／ｍｌのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］および０．０８１μｇ／ｍｌのプトレシンを含む試験溶液７を使用する以外は実施例１と同様にして、神経細胞分化誘導率を調べた。【００６６】  その結果、試験溶液２の添加条件（カラム１）と比較して、試験溶液３の添加条件（カラム２）、試験溶液４の添加条件（カラム３）、試験溶液５の添加条件（カラム４）、試験溶液６の添加条件（カラム５）のいずれにおいても神経細胞分化誘導率が上昇し、特に、試験溶液６の添加条件において神経細胞分化誘導率が最も上昇した（図４）。なお、試験溶液７の添加条件（カラム６）では神経細胞は誘導されなかった（図４）。【００６７】  以上の結果から、ビオチン、プトレシン、または鉄含有化合物の添加により、ヘパリンとビタミンＢ１２の組み合わせによる胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導作用が増強されることが明らかとなった。
また、分化誘導された神経細胞の性質を調べるため、神経組織マーカーであるＮＣＡＭ（ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、成熟神経細胞マーカーであるクラスＩＩＩβチューブリン、およびカテコールアミン作動性神経細胞マーカーであるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）に対する各種抗体による神経細胞コロニーの免疫染色を以下のようにして行った。【００６８】  神経細胞への分化誘導後、２４ウェルプレートから培地を除去し、１ｍｌのＰＢＳで各ウェルの細胞を１回洗浄した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ  ０．２５ｍｌで室温、１５分間処理した。その後、０．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄後、メタノール０．２５ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間処理した。さらに、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）を含むＰＢＳを０．２５ｍｌ添加し、室温で２時間ブロッキングした。一次抗体として、ウサギ由来抗ＮＣＡＭ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）については１／４００、マウス由来抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＴｕＪ１、Ｃｏｖａｎｃ社製）については１／４００、ウサギ由来抗ＴＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）については１／２００の倍率で２％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＰＢＳを用いて希釈し、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体反応後、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ  ０．２５ｍｌで３回洗浄し、二次抗体として抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、希釈倍率１／１００）または抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、１／１００）を用いて室温で１時間反応させた。０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ  ０．２５ｍｌで３回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を用いて発色させた。【００６９】  その結果、いずれの神経細胞コロニーも、ＮＣＡＭ、βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ、およびＴＨに関して陽性であったことから、カテコールアミン作動性神経細胞が誘導されたことが明らかとなった。
【実施例３】
【００７０】ヘパリンとビタミンＢ１２によるＥＳ細胞から神経細胞への分化誘導（３）
上記実施例１において、０．１％のゼラチンでコートした２４ウェルプレートの代りに０．００５％のポリ−Ｌ−オルニチン（ＳＩＧＭＡ社製）および５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でコートした８ウェルプレートを用い、試験溶液１に代えて、ＰＢＳ、０．０１％のヘパリンおよび１０ｎｍｏｌ／ｌのビタミンＢ１２を含むＰＢＳ（以下「試験溶液８」という。）、０．０１％のヘパリンおよび１０００ｎｍｏｌ／ｌのビタミンＢ１２を含むＰＢＳ（以下「試験溶液９」という。）、０．０１％のヘパリン、１０ｎｍｏｌ／ｌのビタミンＢ１２、０．３μｇ／ｍｌのビオチン、３μｍｏｌ／ｌのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］（ナカライテスク社製）および１．６μｇ／ｍｌのプトレシンを含むＰＢＳ（以下「試験溶液１０」という。）を使用する以外は実施例１と同様にして、ＥＢ５を分化誘導した。【００７１】  分化誘導開始より１４日後の細胞からＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、トータルＲＮＡを回収した。回収したトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＴＭ  ＩＩ  Ｒ  Ｎａｓｅ  Ｈ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。中脳のドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるＮｕｒｒ１遺伝子の転写産物の検出には、配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用い、またＴＨ遺伝子の転写産物の検出には、配列番号３および配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いた。また、コントロールとして、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の転写産物の検出には配列番号５および配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いた。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００Ｅｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いていずれも９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の反応を３０サイクル行った。反応液をアガロースゲル電気泳動法およびエチジウムブロマイド染色法により解析した。【００７２】  その結果、試験溶液８、９、１０の添加条件ではいずれも、Ｎｕｒｒ１およびＴＨ遺伝子が検出されたことから、ドーパミン作動性神経細胞が誘導されたことが明らかとなった。なお、ＰＢＳ添加条件ではＮｕｒｒ１およびＴＨ遺伝子は検出されなかった。
また、本実験条件で分化誘導した神経細胞のドーパミン産生量を測定するため、該細胞を以下の実験に供した。【００７３】  誘導開始より１４日後の細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｇ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え３７℃で２４時間インキュベートした。上清を回収し、終濃度０．１ｍｍｏ／ｌのＥＤＴＡおよび終濃度０．１ｍｏｌ／ｌの過塩素酸を添加した。４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を０．２２ｍｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＬＧＶ０１３ＮＬ）を通し、測定試料を調製した。ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳＵＰＥＲＯＤＳ（Ｔｏｓｏｈ社製）カラムを用い、カラムオーブン設定温度４０℃で、５ｍｍｏｌ／ｌオクタンスルホン酸ナトリウムおよび０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを添加した１００ｍｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液：メタノール（９７：３）溶液を溶離液として、流速１．２ｍｌ／分で測定試料を解析した。検出は電気化学検出器（Ｔｏｓｏｈ社製、ＥＣ８０２０）を使用した。標準試料として市販のドーパミン（ナカライテスク社製、Ｃａｔ．１４２１２−７１）を同様に分析し、各試料を分析して得られるピーク面積比からドーパミンを定量した。【００７４】  その結果、試験溶液８（カラム２）、９（カラム３）、１０（カラム４）の添加条件ではいずれも、ドーパミンが検出されたことから、ドーパミン作動性神経細胞が誘導されたことが明らかとなった（図５）。なお、ＰＢＳ添加条件（カラム１）ではドーパミンは検出されなかった（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００７５】  本発明により、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
0004219955.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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