(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を含有するインターロイキン−１８結合蛋白質。
【請求項２】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定すると、４０，０００乃至６０，０００ダルトンの分子量を示す請求項１に記載のインターロイキン−１８結合蛋白質。
【請求項３】
哺乳類の体液から得ることのできる請求項１又は２に記載のインターロイキン−１８結合蛋白質。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のインターロイキン−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表における配列番号３３に示す塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含有する請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
有効成分として、請求項１乃至３のいずれかに記載のインターロイキン−１８結合蛋白質を含有するインターロイキン−１８抑制剤。
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれかに記載のインターロイキン−１８結合蛋白質に対する抗体。
【請求項８】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体としての請求項７に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は新規なサイトカン結合蛋白質、とりわけ、インターロイキン−１８結合蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ−１８」と略記する。）は、免疫系における情報伝達物質であるサイトカインの１種である。特開平８−２７１８９号公報、特開平８−１９３０９８号公報及びハルキ・オカムラら『ネイチャー』、第３７８巻、第６，５５２号、８８乃至９１頁（１９９５年）に見られるように、ＩＬ−１８は、発見当初、「インターフェロン−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）」と呼称されていたが、その後、シンペイ・ウシオら『ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー』、第１５６巻、４，２７４乃至４，２７９頁（１９９６年）における提案にしたがって、「ＩＬ−１８（インターロイキン−１８）」と呼称されるようになった。アンガス・ダブリュ・トムソン編『ザ・サイトカイン・ハンドブック』、第３版、アカデミック・プレス・リミテッド発行、４６５乃至４８９頁に記載されているように、成熟型のＩＬ−１８は１５７個のアミノ酸からなり、免疫担当細胞において生理活性物質として有用なインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞そのものの生成を誘導する性質を兼備している。これらの性質ゆえに、ＩＬ−１８は抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などの医薬品として広範な用途が期待され、現在、その実用化を目指して鋭意研究が進められている。
【０００３】
前述のとおり、ＩＬ−１８にかぎらず、サイトカインは、本来、免疫系における情報伝達を担う物質として産生され、分泌される。したがって、ＩＬ−１８が哺乳類の体内で過剰に産生されたり、外部から過剰に投与されたりすると、免疫系のバランスに偏りを生じ、生体にとって有害な免疫反応を惹起する可能性がある。例えば、特開平１０−９６７３０号公報などにみられるように、最近の知見は、慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患の患者が、ＩＬ−１８の体液レベルにおいて、健常者より有意に高いことを示している。このことは、ＩＬ−１８がある種の疾患の発症に直接又は間接に関与していることを物語っている。したがって、斯界においては、ＩＬ−１８そのものの生理作用の解明や実用化に加えて、ＩＬ−１８の生理作用を抑制する物質が一刻も早く解明され、実用化されることが期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、ＩＬ−１８の生理作用を抑制する性質を有し、医薬品としてヒトを含む哺乳類に適用可能な物質を提供することにある。
【０００５】
この発明の第二の課題は、斯かる物質をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
この発明の第三の課題は、斯かる物質のＩＬ−１８抑制剤としての用途を提供することにある。
【０００７】
この発明の第四の課題は、斯かる物質の医薬品としての用途を提供することにある。
【０００８】
この発明の第五の課題は、斯かる物質に対する抗体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者がこれらの課題を解決すべく鋭意研究したところ、ＩＬ−１８に結合することによってその生理作用を抑制する物質が哺乳類の体液中に存在することを突き止めた。本発明者がこの物質を分離し、性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、単離された状態でもＩＬ−１８に結合し、その生理作用を顕著に抑制することを見出した。さらに、斯くして存在が確認されたＩＬ−１８結合蛋白質は、ヒトを含む哺乳類に投与すると、自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー疾患を含む、過剰な免疫反応に起因する諸種の疾患の治療・予防に効果を発揮することも見出した。また、斯かるＩＬ−１８結合蛋白質で哺乳動物を免疫感作し、この免疫感作動物を抗体の調製のための慣用の方法で処理したところ、当該ＩＬ−１８結合蛋白質に対する抗体が得られた。
【００１０】
すなわち、この発明は、前記第一の課題を、配列表における配列番号１及び２に示すいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部を含有するＩＬ−１８結合蛋白質を提供することにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第二の課題を、斯かるＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにより解決するものである。
【００１２】
この発明は、前記第三の課題を、有効成分として、斯かるＩＬ−１８結合蛋白質を含有するＩＬ−１８抑制剤を提供することにより解決するものである。
【００１３】
この発明は、前記第四の課題を、有効成分として、斯かるＩＬ−１８結合蛋白質を含有する抗感受性疾患剤を提供することにより解決するものである。
【００１４】
この発明は、前記第五の課題を、斯かるＩＬ−１８結合蛋白質に対する抗体を提供することにより解決するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態について説明すると、この発明の蛋白質は、ＩＬ−１８に結合することによってその生理作用を抑制する性質と、独特のアミノ酸配列により特徴付けられる。すなわち、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、ＩＬ−１８に作用させると、ＩＬ−１８の代表的な生理作用である、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する作用を抑制する。また、当該ＩＬ−１８結合蛋白質は、ＩＬ−１８に結合させると、ＩＬ−１８の生理作用によるキラー細胞の細胞障害性の増強や、キラー細胞の生成の誘導を抑制する場合がある。この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は配列表における配列番号１及び２に示すいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部を含んでなり、例えば、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質は、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号３乃至２３に示すアミノ酸配列の全部又は一部を、また、マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質は配列表における配列番号２４乃至３１に示すアミノ酸配列の全部又は一部をそれぞれ含有する。この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、尿や血液などの体液においては、通常、可溶性糖蛋白質として存在し、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）を適用すると、分子量約４０，０００乃至６０，０００ダルトンにＩＬ−１８結合能を伴う蛋白質のバンドを示す。
【００１６】
この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、斯かる特徴を指標にして、哺乳類の体液や細胞から得ることができる。個々の体液としては、血液、リンパ液、腹腔内液、尿などが挙げられ、また、細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、実質細胞、とりわけ、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、膵臓、胎盤、子宮、肺などの器官の実質細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、単球、顆粒球、リンパ球、神経細胞及び、これらを培養株化して樹立される細胞株や、これらが腫瘍化した細胞が挙げられる。細胞株としては、より詳細には、ヒトリンパ芽球様細胞株であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）、ヒト急性骨髄性白血病細胞由来の細胞株であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４６）、ヒト胚性横紋筋肉種由来の細胞株であるＲＤ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３６）、ヒト子宮内膜腺癌由来の細胞株であるＨＥＣ−１−Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１２）、ヒト膀胱癌由来の細胞株であるＨＴ−１１９７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４７３）などが挙げられる。経済性を問題にするのであれば、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡに組換えＤＮＡ技術を適用するのが有利である。この発明のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡは、配列番号１乃至３１に示すアミノ酸配列に基づき哺乳類の遺伝子を検索することにより得ることができる。例えば、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするヒト由来のＤＮＡは、通常、配列表における配列番号３２に示す塩基配列の全部又は一部を、また、マウス由来のＤＮＡは、通常、配列表における配列番号３３に示す塩基配列の全部又は一部をそれぞれ含有する。斯かるＤＮＡにより形質転換した動物及び微生物由来の宿主は、常法にしたがって培養することにより、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質を高収量で産生する。動物由来の宿主の具体例としては、例えば、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、ＭＯＰ−８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７０９）及びそれらの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞が挙げられる。微生物由来の宿主の具体例としては、例えば、細菌、真菌及び酵母が挙げられる。これらの宿主のうち、動物由来の宿主や酵母は、糖蛋白質としての形態の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の産生にとりわけ有用である。
【００１７】
上記のごとき給源を用いてこの発明のＩＬ−１８結合蛋白質を調製するには、体液又は細胞若しくは微生物の培養物を、必要に応じて、超音波などにより破砕した後、生理活性蛋白質を精製するための慣用の方法、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などを単独又は組合せて適用すればよい。
【００１８】
ところで、免疫系は、本来、有害な異物から生体を防御するためのものであるが、ときとして、その働きゆえに、却って、生体に有害な結果をもたらすことがある。哺乳類に、例えば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、骨髄などの臓器を移植すると、同種異系抗原に対する拒絶反応により、Ｔ細胞が活性化され、リンパ球が増殖したり、炎症が生じることがある。症状の程度こそ違え、同様の現象は、例えば、アレルゲンのように、宿主が固有のものと見做さない異種異系抗原が侵入した場合にも観察される。また、自己免疫疾患においては、本来、固有のものと見做されるべき成分がアレルギー反応を惹起する。
【００１９】
この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、免疫系を活性化するＩＬ−１８に結合することによってその生理作用を抑制するＩＬ−１８抑制剤として機能するので、ヒトを含む哺乳類に投与すると、上記のごとき免疫反応を抑制することが期待される。したがって、この発明でいう感受性疾患とは、拒絶反応及びアレルギー反応を含む免疫反応一般の亢進に起因する免疫疾患を含み、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質が直接又は間接に作用して治療及び／又は予防し得るすべての疾患ということになる。個々の感受性疾患としては、例えば、上記のごとき臓器移植に伴う拒絶反応に加えて、活動性慢性肝炎、萎縮性胃炎、自己免疫性溶血性貧血、バセドウ病、ベーチェット症候群、ＣＲＳＴ症候群、寒冷凝集素性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、グッドパスチャー症候群、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、若年性糖尿病、白血球減少症、多発性硬化症、重症筋無力症、発作性寒冷血色素尿症、悪性貧血、多発性結節性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、橋本病、シェーグレン症候群、クローン病、交換性眼炎、進行性全身性硬化症、ウェジナー肉芽腫症、ＨＩＶ感染症、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症及びハチ毒アレルギーを含む自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー性疾患一般が挙げられる。なお、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、ＩＦＮ−γの過剰産生や過剰投与などに起因する敗血症ショックの治療・予防にも有効である。また、生体内において、ＩＬ−１８がＦａｓリガンドの産生を増強したり、逆に、ＦａｓリガンドがＩＬ−１８の細胞からの分泌を誘導する場合があるので、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、Ｆａｓ及びＦａｓリガンドが関与する免疫疾患一般の治療・予防にも有効である。さらに、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、例えば、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、中毒性肝炎、劇症肝炎、ウイルス性肝硬変、アルコール性肝硬変、中毒性肝硬変、胆汁性肝硬変、脂肪肝、肝臓腫瘍及び肝血管障害などの肝疾患、胆管炎、胆嚢炎、原発性硬化性胆管炎、胆嚢腫瘍及び胆管腫瘍などの胆嚢・胆道疾患、急性膵炎、慢性膵炎、膵機能不全、膵臓腫瘍及び膵嚢胞などの膵疾患の治療・予防、さらには、それらの疾患に伴う、例えば、食欲不振、倦怠感、疲労感、腹痛、背痛、黄疸、発熱、肝性脳症、腹水、出血傾向などの肝機能障害及び肝機能不全を緩和又は解消する効果もある。その際、例えば、プロトポルフィリン、チオプリン、マロチラート、肝臓加水分解物、グリチルリチン、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン、メチルメチオニンスルホニウムクロリド、グルタチオン、タウリン、シアニダノール、インターフェロン、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、チオクト酸、小紫胡湯、大紫胡湯、紫胡桂枝湯、アスパラギン酸、甘草、メチオニン、チオプリン、グリチルリチンなどの肝細胞の機能を促進する薬剤を併用してもよい。加えて、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、虚血、虚血性心筋症、脳虚血、脳底動脈片頭痛、脳底部異常血管網症、脳卒中、脳底部動脈瘤、動脈硬、血管内皮障害、糖尿病、腸管膜血管閉塞症及び上腸管膜動脈症候群を含む循環器系疾患、パーキンソン��、脊髄筋肉萎縮症、筋萎縮性側策硬化症、アルツハイマー病、痴呆症、脳血管性痴呆症、エイズ痴呆症及び脳脊髄炎を含む神経系疾患の症状を緩和したり、予防する効果もある。斯くして、有効成分としてＩＬ−１８結合蛋白質を含有するこの発明の抗感受性疾患剤は、ヒトをはじめとする哺乳動物における上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗自己免疫疾患剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍剤、免疫抑制剤、増血剤、白血球増多剤、血小板増多剤、鎮痛剤、解熱剤、肝機能改善剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固状に調製され、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質を０．００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至２０％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２０】
この発明の抗感受性疾患剤は、ＩＬ−１８結合蛋白質単独の形態はもとより、ＩＬ−１８結合蛋白質とそれ以外の生理的に許容される、例えば、補助剤、増量剤、希釈剤、賦形剤、安定剤、防腐剤、免疫助成剤、着色剤、着香剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１又は複数との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、シュクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質及びクエン酸塩、燐酸塩若しくは炭酸塩を主体とする緩衝剤が、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、アスピリン、フルフェナム酸、メフェナム酸、ジクロフェナック、インドメタシン、トルメチン、イブプロフェン、ケトプロフェン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、消炎酵素剤、金製剤、クロロキン製剤などの抗炎症剤、ＦＫ５０６、シクロフォスファミド、アザチオプリン、メトトレキセート、サイクロスポリンＡ、副腎皮質ホルモンなどの免疫抑制剤、さらには、ＩＬ−１８及びＩＬ−１８以外のサイトカインの受容体アンタゴニスト、例えば、インターロイキン−１受容体蛋白質、インターロイキン−２受容体蛋白質、インターロイキン−５受容体蛋白質、インターロイキン−６受容体蛋白質、インターロイキン−８受容体蛋白質、インターロイキン−１２受容体蛋白質及びＩＬ−１８受容体蛋白質に対する、ヒト化抗体を含むそれぞれの抗体や、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−５受容体、インターロイキン−８受容体及びＩＬ−１８受容体に対するそれぞれのアンタゴニスト、さらには、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−５、インターロイキン−８、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２及びインターロイキン−１８に対する、ヒト化抗体を含むそれぞれの抗体が挙げられる。
【００２１】
さらに、この発明の抗感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、ＩＬ−１８結合蛋白質を、例えば、１回当りの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、補輸液、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤及びローション剤が挙げられ、必要に応じて、点鼻剤、鼻噴霧剤、下気道吸入剤、眼科用除法剤、口腔粘膜貼付剤及び浣腸剤としてもよい。この発明の抗感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与してもよく、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当り約１μｇ／回乃至１ｇ／回、通常、約１０μｇ／回乃至１００ｍｇ／回のＩＬ−１８結合蛋白質を１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至半年に亙って経口投与するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００２２】
ところで、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態でＩＬ−１８結合蛋白質に感受性を有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。斯くして、この発明のＤＮＡは、例えば、自己免疫疾患やアレルギー性疾患などの免疫疾患や、肝機能障害及び神経系疾患を含む各種疾患の遺伝子療法、さらには、臓器移植に伴う拒絶反応や過剰な免疫反応の抑制に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斉藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ  遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行にも詳述されている。
【００２３】
この発明はＩＬ−１８結合蛋白質に対する抗体を提供するものでもある。この発明の抗体は、当該ＩＬ−１８結合蛋白質と免疫反応するイムノグロブリン全般を包含し、その調製方法・起源・クラスや、抗原の起源・形態は問わない。この発明の抗体の具体的形態としては、ポリクローナル抗体や、キメラ抗体及びヒト化抗体を含むモノクローナル抗体などが挙げられ、斯かる抗体は、ＩＬ−１８結合蛋白質又はその抗原性フラグメントを抗原として用いて、慣用の方法を適用することにより得ることができる。抗原としてのＩＬ−１８結合蛋白質は、通常、完全精製又は部分精製した状態で用いられ、これらは、例えば、前述したＩＬ−１８結合蛋白質の調製方法により得ることができる。抗原性フラグメントを得るには、これらの完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、ペプチド合成すればよい。
【００２４】
この発明の抗体を調製するには、先ず、上記のような抗原で哺乳動物を免疫感作する。免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、抗原を単独又は適宜アジュバントとともに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所期の抗体を産生し得るかぎり、種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモットなどの齧歯類が用いられ、用いる抗原の起源や調製する抗体の形態・用途などを勘案して最適のものが選択される。用いる哺乳動物の種類や大きさにもよるが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至２０回に分けて接種する。そして、通常、免疫感作の期間中及び／又は終了後に、免疫感作に用いたのと同じ抗原を使用して蛍光抗体法など慣用の方法により感作動物の抗体価の上昇を確認する。
【００２５】
この発明によるポリクローナル抗体を得るには、上記のような免疫感作の終了後、通常、１乃至４週間程度経過した該動物から、その動物の種に応じて選択される適宜の部位より血清（抗血清）を採取すればよい。斯くして得られる抗血清を、さらに必要に応じて、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど所望のクラスのイムノグロブリンの精製のための慣用の方法に供すれば、精製されたポリクローナル抗体を得ることもできる。
【００２６】
この発明によるモノクローナル抗体の一形態としては、例えば、クローン化されたハイブリドーマから得られる抗体が挙げられる。斯かる形態のこの発明によるモノクローナル抗体を得るには、先ず、上記のような免疫感作の終了後、通常、３乃至５日程度経過後、該動物から脾臓を摘出し、分散して、抗体産生細胞としての脾細胞を得る。脾細胞は、必要に応じて生体外でさらに免疫感作することもできる。斯くして得られる脾細胞を次に哺乳類由来の無限増殖可能な細胞と融合させる。無限増殖可能な細胞としては、例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）、Ｙ３−Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−９）などのマウス又はラット骨髄腫由来の細胞株ないしはその変異株が挙げられ、上記脾細胞との適合性などを勘案して選択される。細胞の融合には、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が適宜採用される。次に、細胞融合産物を、常法にしたがってＨＡＴ培地などの選択用培地中で培養し、融合した細胞すなわちハイブリドーマを選択的に増殖させる。増殖したハイブリドーマを、慣用の方法にしたがって、その培養上清につき、当該ＩＬ−１８結合蛋白質との反応性に基づいて検索すれば、この発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択される。選択されたハイブリドーマに限界希釈法など慣用の方法を適用すれば、目的とするハイブリドーマのクローンが得られる。斯くしてクローンとして得られるハイブリドーマを、慣用の方法で生体内外で培養し、必要に応じて、培養物に抗体を採取・精製するための慣用の方法を適用すればこの発明によるモノクローナル抗体が得られる。
【００２７】
この発明によるモノクローナル抗体の別の形態としては、組換えＤＮＡ技術により調製される、いわゆる、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」が挙げられる。斯かる形態のこの発明によるモノクローナル抗体を得るには通常、先ず、上記のいずれかの形態のこの発明の抗体における可変領域をコードするＤＮＡをクローン化する。斯かるＤＮＡは、例えば、上記の免疫感作動物の脾細胞ないしはリンパ球や、上記のハイブリドーマなどから得られるＲＮＡを鋳型として調製されるｃＤＮＡを検索することによりクローン化することができる。検索には、例えば、抗体における可変領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列とのアニーリングに基づくＰＣＲ法や、ｃＤＮＡの発現産物の当該ＩＬ−１８結合蛋白質との反応性に基づく発現クローニング法などが挙げられる。前者の方法は、エス・タラン・ジョーンズら『バイオテクノロジー』、第９巻、８８乃至８９頁（１９９１年）などに、後者の方法は、エス・ポール監修、『メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー』、ヒューマナ・プレス発行、第５１巻、３５５乃至３９４頁（１９９５年）などに詳述されている。斯くしてクローン化されるＤＮＡで、公知のヒト起源の抗体をコードするＤＮＡから適宜選択されるＤＮＡにおける対応部分を、慣用の組換えＤＮＡ技術により置換すれば、この発明によるキメラ抗体をコードするＤＮＡが得られる。また、常法にしたがって、該可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する塩基配列をヒト起源の抗体をコードするＤＮＡの対応部分に移植すれば、この発明によるヒト化抗体をコードするＤＮＡが得られる。斯くして得られるＤＮＡを、通常、哺乳動物の細胞で発現させ、発現産物に抗体を精製するための慣用の方法を適用すれば、この発明によるキメラ抗体及びヒト化抗体が得られる。なお、キメラ抗体及びヒト化抗体作製の基本的手法は、エル・ライチマンら、『ネイチャー』、第３３２巻、３２３乃至３２７頁（１９８８年）などに詳述されている。
【００２８】
以上のようなこの発明による抗体は、当該ＩＬ−１８結合蛋白質と免疫反応する。免疫反応は比較的選択性の高い結合反応であるので、当該ＩＬ−１８結合蛋白質の精製のためのアフィニティークロマトグラフィーや、当該ＩＬ−１８結合蛋白質を検出するためのアッセイ（イムノアッセイ）に有用である。これら方法は、この発明の抗体に、アフィニティークロマトグラフィーやイムノアッセイにおける慣用の方法を適用して実施することができる。これら方法によるときには、当該ＩＬ−１８結合蛋白質を効果的に精製、検出することができる。また、この発明の抗体は、上記で説明したような当該ＩＬ−１８結合蛋白質の性質を中和する場合がある。斯かる中和能を有するこの発明の抗体は、生体内外における当該ＩＬ−１８結合蛋白質に対する中和剤の有効成分として有用である。生体内においては、過剰なＩＬ−１８結合蛋白質により生体機能の異常や障害がもたらされ、諸種の疾患を発症する場合がある。したがって、斯かる中和剤は、生体内での過剰なＩＬ−１８結合蛋白質が関連する諸疾患の治療・予防に奏効し得る。また、ＩＬ−１８の投与により治癒が期待される悪性腫瘍などのＩＬ−１８感受性疾患の患者において、その生体内に過剰なＩＬ−１８結合蛋白質が存在すると、ＩＬ−１８による治療効果が十分に発揮されない可能性がある。したがって、斯かる中和剤を、ＩＬ−１８を投与するのと同時か又はその前後のいずれかの時期、望ましくは投与前に、生体内のＩＬ−１８及びＩＬ−１８結合蛋白質の存在量を勘案して選ばれる適量を投与すれば、ＩＬ−１８による治療効果の改善・亢進に奏効し得る。とりわけ、キメラ抗体やヒト化抗体の形態にある、斯かる中和能を有する抗体は、ヒトに対して抗原性を示し難いので、ヒトへの投与を前提とする斯かる中和剤の医薬用途に有用である。
【００２９】
以下、実施例に沿ってこの発明の実施の形態を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれらの実施例のみに限定されないことは言うまでもない。なお、この発明による蛋白質のＩＬ−１８結合能は、後記実施例においては、次の結合アッセイにより決定される阻害率を指標にして判定した。
【００３０】
すなわち、ＩＬ−１８受容体をコードするＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８）に導入することによって、ＩＬ−１８受容体が細胞表面に過剰に発現した効果細胞を調製する。別途、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン及び１００ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ´−２−エタンスルホン酸をそれぞれ含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）を調製し、これをアッセイ用培地とする。次いで、試験区として、アッセイ用培地により適宜希釈した被検試料を５０μｌとり、これにアッセイ用培地により適宜希釈した125Ｉ標識ＩＬ−１８を５０μｌ加え、４℃で１時間振盪した後、アッセイ用培地に細胞密度１×１０7個／ｍｌになるように浮遊させた効果細胞を５０μｌ加え、４℃でさらに１時間振盪する。その後、１．５ｍｌ容遠心管にジブチルフタレート／ジオクチルフタレート混液（容積比１：１）を２００μｌとり、その上部に効果細胞の浮遊液を重層し、４℃で５分間遠心分離し、吸引により上清を除去した後、細胞残渣を遠心管ごと切り取り、ガンマカウンター（商品名『ＡＲＣ−３００型』、アロカ株式会社製造）により放射能強度を測定する。併行して、125Ｉ標識ＩＬ−１８とともに未標識ＩＬ−１８を５μｇ加える系（非特異的結合区）と、被験試料のみ省略する系（総結合区）をそれぞれ設け、これらを試験区と同様に処置する。そして、試験区、総結合区及び非特異的吸着区において得られた放射能強度を数１に示す式にそれぞれ代入して阻害率（％）を計算した。
【００３１】
【数１】
0004216950.tif 000002
【００３２】
【実施例１】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質〉
【００３３】
【実施例１−１】
〈ＩＬ−１８結合蛋白質の調製〉
人尿３ｌを膜濃縮した後、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で２０時間透析した。透析内液を採取し、これをあらかじめ２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化しておいたアフィニティークロマトグラフィー用ゲル（商品名『ウイート・ジャーム・レクチン・セファロース６ＭＢ』、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社販売）２３０ｍｌのカラムに負荷してＩＬ−１８結合蛋白質を吸着せしめ、カラムを２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により洗浄した後、０．５Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液しつつ、カラムからの溶出液を一定量ずつ採取した。
【００３４】
各溶出画分のＩＬ−１８結合能を前記結合アッセイにより調べた後、ＩＬ−１８結合能が認められた画分を合一し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で１６時間透析した。透析内液を採取し、適宜濃縮した後、あらかじめ２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化しておいたイオン交換クロマトグラフィー用ゲル（商品名『ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ』、東ソー株式会社製造）５４ｍｌのカラムに負荷し、塩化ナトリウムの濃度が１００分間で０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下にて２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２ｍｌ／分の流速で通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３５】
この画分を膜濃縮した後、あらかじめ２０ｍＭ燐酸−食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）により平衡化しておいたゲル濾過クロマトグラフィー用ゲル（商品名『ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００』、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社販売）１２０ｍｌのカラムに負荷し、カラムにＰＢＳを通液しつつ、ゲル濾過クロマトグラフィーにおける分子量が７０，０００ダルトン付近の画分を採取した。この新たに得られた画分をあらかじめ０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化しておいた逆相クロマトグラフィー用ゲル（商品名『Ｖｙｄａｃ  ２１４ＴＰ５４』、サイプレス・インターナショナル株式会社販売）４ｍｌに負荷し、アセトニトリル濃度が０％（ｖ／ｖ）から９０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下にてカラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を通液しつつ、カラムからの溶出液を一定量ずつ分画した。各溶出画分のＩＬ−１８結合能を前記結合アッセイにより調べた後、ＩＬ−１８結合能が確認された、アセトニトリル濃度が７０％（ｖ／ｖ）付近で溶出した画分を採取し、濃縮したところ、ヒト由来の精製ＩＬ−１８結合蛋白質が約３μｇ得られた。
【００３６】
その後、この精製ＩＬ−１８結合蛋白質につき、ジチオトレイトール存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を測定したところ、約４０，０００乃至６０，０００ダルトンにＩＬ−１８結合能を伴う蛋白質の単一バンドが観察された。また、大麦胚芽レクチンをリガンドとする『ウィート・ジャーム・レクチン・セファロース６ＭＢ』に吸着することは、本例のＩＬ−１８結合蛋白質が糖蛋白質であることを示している。
【００３７】
【実施例１−２】
〈Ｎ末端アミノ酸配列〉
実施例１−１の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を遠心濃縮機により乾固した後、８Ｍ尿素及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡをそれぞれ含有する０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）に溶解し、窒素気流下、５０℃で３０分間処理した。次いで、ジチオトレイトールを適量加え、窒素気流下、５０℃で２時間還元した後、反応物にモノヨード酢酸を適量加え、室温下、暗所にて３０分間反応させてＩＬ−１８結合蛋白質をアルキル化した。
【００３８】
得られたアルキル化物にジチオトレイトール存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを適用することによって分子量約４０，０００乃至６０，０００ダルトンに相当する蛋白質を分離し、以後、常法にしたがって、分離したＩＬ−１８結合蛋白質のバンドをＰＶＤＦ膜へ転写後、その膜をプロテインシーケンサー（商品名『４７３Ａ型』、アプライド・バイオシステムズ社製造）を用いるアミノ酸分析に供してＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、実施例１−１の方法により得たこの発明のＩＬ−１８結合蛋白質は、Ｎ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を含有していることが判明した（なお、「Ｘａａ」は未同定のアミノ酸であることを意味している）。
【００３９】
【実施例１−３】
〈ペプチドマッピング〉
ウルフ・ヘルマンら『アナリティカル・バイオケミストリー』、第２２４巻、４５１乃至４５５頁（１９９５年）に記載された『イン・ゲル・ダイジェスション法』により、実施例１−２の方法により還元アルキル化したＩＬ−１８結合蛋白質のトリプシン消化後及びトリプシン／ペプシン消化後のペプチドマップをそれぞれ作成するとともに、トリプシン消化により得られたペプチド断片１乃至８及びトリプシン／ペプシン消化により得られたペプチド断片９乃至２０のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。その結果、ペプチド断片１乃至２０は、それぞれ、配列表における配列番号４乃至２３に示すアミノ酸配列を有していることが判明した（なお、「Ｘａａ」は未同定のアミノ酸であることを意味している）。このとき得られたペプチドマップを図１に示す。
【００４０】
【実施例１−４】
〈ＩＬ−１８抑制作用〉
免疫担当細胞及びＩＬ−１８として、それぞれ、健常者のリンパ球及び組換え型ヒトＩＬ−１８を、また、ＩＦＮ−γの標準品として米国国立衛生研究所から入手した標準ヒトＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３０）をそれぞれ用いた以外は、後記実施例３−３におけると同様に試験した。
【００４１】
その結果、本例のＩＬ−１８結合蛋白質が共存すると、ヒトＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ産生の誘導が有意に抑制された。このことは、本例のＩＬ−１８結合蛋白質がＩＬ−１８の生理作用を抑制することを示している。
【００４２】
【実施例２】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡ〉
【００４３】
【実施例２−１】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡ〉
【００４４】
【実施例２−１（ａ）】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡ（クローンテック製）１０ｎｇに１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム２μｌ、０．１Ｍジチオトレイトール２μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌ、２００単位／μｌ逆転写酵素（商品名『スーパースクリプトＩＩ』、ライフテック・オリエンタル株式会社製造）１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマー１μｌをそれぞれ加え、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。この混合物を０．５ｍｌ容反応管にとり、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間、この順序で、それぞれインキュベートすることによって逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００４５】
この反応物に体積比で２．５倍量のエタノールと３Ｍ酢酸ナトリウム２μｌをそれぞれ加え、−２０℃で２時間静置してｃＤＮＡを沈澱させた。沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールにより洗浄した後、滅菌蒸留水に溶解し、２．５単位／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（商品名『クローンドＰｆｕポリメラーゼ』、ストラタジーン製造）０．５μｌ、専用緩衝液１０μｌ及び２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌをそれぞれ加え、さらに、センスプライマーとして、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＡＣＮＣＣＮＧＴＮＷＳＮＣＡ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドと、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＴＧＮＧＣＮＡＲＮＡＣＮＡＣＲＴＧ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０μＭ加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を９４℃、４０℃及び７２℃で、この順序で、それぞれ１分間インキュベートするサイクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００４６】
次いで、ＰＣＲ産物の一部をとり、常法にしたがって、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動することによってＤＮＡ断片を分画し、ナイロン膜に転写し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムにより固定し、２×ＳＳＣにより洗浄し、風乾した後、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡをそれぞれ含有するプレハイブリダイゼーション液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、常法にしたがって、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列に基づき５´−ＧＧＲＣＡＮＧＧＲＴＣＹＴＴ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これを［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同位体標識することによってプローブを調製した。前記ナイロン膜を浸漬したプレハイブリダイゼーション液にこのプローブを１ｐｍｏｌ加え、ナイロン膜を４０℃でさらに２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。その後、６×ＳＳＣによりナイロン膜を洗浄し、常法にしたがってオートラジオグラフィーした。その結果、プローブの特異的なハイブリダイゼーションを示すシグナルが認められ、上記ＰＣＲ産物が目的とするＤＮＡ断片を含むことが確認された。
【００４７】
その後、残りのＰＣＲ産物にプラスミドベクター（商品名『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ（＋）』、ストラタジーン社製造）を１ｎｇ加え、ＤＮＡライゲーション・キット（商品名『ＤＮＡライゲーション・キット／バージョン２』、宝酒造株式会社製造）を用いてプラスミドベクター内にＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を挿入した。反応物の一部をとり、大腸菌株（商品名『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』、ストラタジーン社製造）を形質転換した後、形質転換体をクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ｐＨ７．５）に接種し、３７℃で１８時間培養し、培養物から菌体を採取し、これを常法にしたがって処理してプラスミドＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、このプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片の塩基配列として、配列表における配列番号３４に示す塩基配列を含んでいた。その塩基配列がコードする、配列表における配列番号３４に併記したアミノ酸配列と、配列表における配列番号３乃至２３に示す、実施例１−２乃至１−３で決定した部分アミノ酸配列とを照合したところ、これらの部分アミノ酸配列は、いずれもその全部又は一部が配列番号３４に併記したアミノ酸配列に含まれていた。このことは、配列表における配列番号３４に示す塩基配列が、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部分をコードするものであることを示唆している。
【００４８】
【実施例２−１（ｂ）】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡ（クローンテック製）１０ｎｇを、市販の５´ＲＡＣＥキット（商品名『５´ＲＡＣＥシステム、バージョン２．０』、ギブコ・ビー・アール・エル製）を用いて、ＰＣＲの一変法である５´ＲＡＣＥに供した。すなわち、先ず、上記ＲＮＡを、配列表における配列番号３４に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＧＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる逆転写酵素反応に供し、引き続いてターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを作用させて、生成した第一ストランドｃＤＮＡの５´末端にＣテイルを付加した。この第一ストランドｃＤＮＡを、次に、センスプライマーとして、上記キットに添付の５´−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドと、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号３４に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＧＡ−３´とを用いてＰＣＲ反応させた。以上の５´ＲＡＣＥで得られた反応産物を一部とり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特定のＤＮＡ断片の増幅が確認された。実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号３５に示す塩基配列を含有していた。この塩基配列における第１６０乃至２１６番目の塩基からなる配列は、実施例２−１（ａ）で決定した、配列表の配列番号３４に示す塩基配列における第１乃至５７番目の塩基からなる配列と完全に一致した。このことは、配列表における配列番号３５に示す塩基配列が、配列番号３４に示す、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部をコードする塩基配列とオーバーラップし、かつ、その５´末端側上流域に相当する塩基配列を含んでいることを示唆している。
【００４９】
【実施例２−１（ｃ）】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡ（クローンテック製）１０ｎｇを、斎藤隆監訳、『ＰＣＲ実験マニュアル』、ＨＢＪ出版発行（１９９１年）、２５乃至３３に記載の方法にしたがって、ＰＣＲの一変法である３´ＲＡＣＥに供した。すなわち、先ず、上記ＲＮＡを、５´−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡ（Ｔ）17−３´で表される塩基配列のヌクレオチドをプライマーとして用いる逆転写酵素反応に供し、得られた第一ストランドｃＤＮＡを、実施例２−１（ａ）で決定した、配列表における配列番号３４に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＡ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、５´−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いてＰＣＲ反応させた。以上の３´ＲＡＣＥで得られた反応産物を一部とり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特定のＤＮＡ断片の増幅が確認された。実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号３６に示す塩基配列を含有していた。この塩基配列における第１乃至６０番目の塩基からなる配列は、実施例２−１（ａ）で決定した、配列表の配列番号３４に示す塩基配列における第３５２乃至４１１番目の塩基からなる配列と完全に一致した。このことは、配列表における配列番号３６に示す塩基配列が、配列番号３４に示す、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部をコードする塩基配列とオーバーラップし、かつ、その３´末端側下流域に相当する塩基配列を含んでいることを示唆している。
【００５０】
以上に示したように、実施例２−１（ａ）乃至２−１（ｃ）で、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードする、互いにオーバーラップする塩基配列として、配列表における配列番号３４乃至３６に示す塩基配列を決定した。互いにオーバーラップする部分の塩基配列を勘案すると、これらの塩基配列は、配列表における配列番号３７に示す一連の塩基配列に由来する部分配列と考えられた。
【００５１】
【実施例２−１（ｄ）】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
実施例２−１（ａ）の方法にしたがって、ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡを逆転写酵素反応させた後、センスプライマーとして、配列表における配列番号３７に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号３７に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例２−１（ｂ）におけると同様にしてＰＣＲ反応させた。このＰＣＲ産物の一部をとり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特定のＤＮＡ断片の増幅が確認された。引き続き、実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号３７に示す塩基配列を有していた。これにより、実施例２−１（ａ）乃至２−１（ｃ）で決定した、配列表における配列番号３４乃至３６に示す塩基配列が、配列番号３７に示す一連の塩基配列の、それぞれ部分配列であることが裏付けられた。
【００５２】
一方、配列表における配列番号３７に示す塩基配列によりコードされる、そこに併記したアミノ酸配列と、配列表における配列番号４乃至２３に示す、実施例１−３で決定した部分アミノ酸配列とを照合したところ、これらの部分アミノ酸配列は、すべて配列番号３７に併記したアミノ酸配列における第１乃至１６４番目のアミノ酸からなる部分に含まれていた。また、配列表における配列番号３に示す、実施例１−２で決定したＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号３７に併記したアミノ酸配列における第１乃至２２番目のアミノ酸からなる配列とよく一致した。したがって、以上のことは、配列表の配列番号３７に示す塩基配列における第１６０乃至６５１番目の塩基からなる配列がヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得るものであり、そして、当該ＩＬ−１８結合蛋白質が、全体としては、斯かる塩基配列に併記した第１乃至１６４番目のアミノ酸からなる配列を有する場合があることを示唆している。なお、以上のごとく示唆された、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は、配列表における配列番号１及び３２にそれぞれ別記している。
【００５３】
【実施例２−２】
〈形質転換体によるヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質の産生〉
【００５４】
【実施例２−２（ａ）】
〈組換えＤＮＡの調製〉
０．５ｍｌ反応管に、実施例２−１（ｄ）の方法で得た、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得るＤＮＡを１ｎｇとり、これに、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス及び２．５単位／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（商品名『クローンドＰｆｕポリメラーゼ』、ストラタジーン製造）を加え、センスプライマーとして、配列表における配列番号３２に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号３２に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ適量加えて、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした。この混合物を、９４℃で１分間、４２℃で２分間及び７２℃で３分間インキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに９４℃で１分間、６０℃で２分間及び７２℃で３分間インキュベートするサイクルを３５回繰り返してＰＣＲ反応させた。実施例２−１（ａ）におけると同様にしてＰＣＲ産物中に目的とするＤＮＡ断片が存在することを確認する一方、実施例２−１（ａ）におけると同様にして当該ＤＮＡ断片を挿入してなるプラスミドベクターを採取した。引き続き実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べ、このプラスミドＤＮＡが、配列表における配列番号３２に示す塩基配列を含むことを確認した。
【００５５】
常法にしたがって、上記で得たプラスミドＤＮＡに制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを作用させて得たＤＮＡ断片１００ｎｇに、エス・ミズシマら、『ニュークレイック・アシッド・リサーチ』、第１７号、第１８巻、５，３３２頁（１９９０年）に記載された方法に準じて調製し、予め制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断しておいたプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を１０ｎｇ加え、ＤＮＡライゲーション・キット（商品名『ＤＮＡライゲーション・キット／バージョン２』、宝酒造株式会社製造）を用いてプラスミドベクター内にＤＮＡ断片を挿入した。実施例２−１（ａ）におけると同様にして、ライゲーション反応産物で大腸菌株を形質転換し、得られた形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、この組換えＤＮＡを『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』と命名した。常法にしたがって分析したところ、図３に示すように、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』においては、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得る、配列表における配列番号３２に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡ『ＥＦＨ１８ＢＰＨ６  ｃＤＮＡ』が、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００５６】
【実施例２−２（ｂ）】
〈形質転換体によるヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質の産生〉
実施例２−２（ａ）で得た、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』を含む形質転換大腸菌株を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した後、培養物から常法にしたがいプラスミドＤＮＡを採取して、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』を得た。この組換えＤＮＡを２０μｇとり、予め常法にしたがい増殖させておいた、１×１０7個のアフリカミドリザルの腎臓由来の繊維芽細胞株ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）に、エレクトロポレーション法により導入して、この発明のＤＮＡが導入された形質転換体を得た。
【００５７】
平底培養瓶に培地（商品名『ＡＳＦ１０４』、味の素製）をとり、これに、上記で得た形質転換体を１×１０5個／ｍｌの割合で接種し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物から培養上清を採取し、アフィニティークロマトグラフィー用ゲル（商品名『Ｎｉ−ＮＴＡ』、キアジェン製）のカラムに負荷した。このカラムに、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液して非吸着画分を除去した後、２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳを通液し、カラムからの溶出液を一定量ずつ分画採取した。それぞれの画分におけるＩＬ−１８結合蛋白質の有無を前記結合アッセイにより調べ、当該蛋白質の存在の確認された画分を採取し、合一して、１×１０7個の当該形質転換体より、約２ｍｌの精製ＩＬ−１８結合蛋白質の水溶液を得た。この水溶液の蛋白質含量は約１０μｇ／ｍｌであった。この水溶液を、実施例１−２の方法にしたがって処理し、Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号３と同一のアミノ酸配列が得られた。なお、対照として、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』に代えてプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を用いて、本実施例と同様に処置したところ、ＩＬ−１８結合蛋白質の存在は確認されなかった。以上の結果は、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質が配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有する場合があり、そして、当該蛋白質が、配列番号３２に示す塩基配列によりコードされ得ることを裏付けている。
【００５８】
【実施例３】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質〉
【００５９】
【実施例３−１】
〈ＩＬ−１８結合蛋白質の調製〉
コリネバクテリウム・パルバム（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して得た死菌体を８週齢の雌ＣＤ−１マウス６００匹の腹腔内に１ｍｇ／匹の割合で注射投与し、通常の方法で７日間飼育した後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１μｇ／匹の割合で注射投与した。２時間後、マウスの心臓から血液を採取し、これを常法にしたがって処理して血清２００ｍｌを得た。その後、この血清を実施例１−１の方法により精製したところ、マウス由来の精製ＩＬ−１８結合蛋白質が約３μｇ得られた。
【００６０】
その後、この精製ＩＬ−１８結合蛋白質につき、ジチオトレイトール存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を測定したところ、約４０，０００乃至６０，０００ダルトンにＩＬ−１８結合能を伴う蛋白質の単一バンドが観察された。なお、大麦胚芽レクチンをリガンドとする『ウィート・ジャーム・レクチン・セファロース６ＭＢ』に吸着することは、本例のＩＬ−１８結合蛋白質が糖蛋白質であることを示している。
【００６１】
【実施例３−２】
〈ペプチドマッピング〉
実施例３−１の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質につき、実施例１−３におけると同様にしてペプチドマップを作成するとともに、トリプシン消化により得られたペプチド断片１乃至５及びトリプシン／ペプシン消化により得られたペプチド断片６乃至８のアミノ酸配列を調べたところ、ペプチド断片１乃至８は、それぞれ、配列表における配列番号２４乃至３１に示すアミノ酸配列を有していた（なお、「Ｘａａ」は未同定のアミノ酸であることを意味している）。このとき得られたペプチドマップを図２に示す。
【００６２】
【実施例３−３】
〈ＩＬ−１８抑制作用〉
１４週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスから脾臓を摘出し、分散し、付着細胞を除去した後、脾細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０7個／ｍｌになるように浮遊させ、免疫担当細胞とした。次いで、脾細胞及び２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡをマイクロプレートにそれぞれ０．１５ｍｌ／ウェル及び０．０５ｍｌずつ分注し、組換え型マウスＩＬ−１８を２５ｎｇ／ｍｌと、ＩＬ−１８に対して過剰量の、実施例３−１の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質とを含む新鮮な同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩＦＮ−γを通常の酵素免疫法により測定した。併行して、ＩＬ−１８結合蛋白質及びマウスＩＬ−１８のいずれかを省略した系をそれぞれ設け、これを上記と同様に処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γの標準品には、米国国立衛生研究所から入手した標準マウスＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を用い、国際単位（ＩＵ）に換算して表示した。
【００６３】
その結果、ＩＬ−１８結合蛋白質を省略した対照におけるＩＦＮ−γの産生量が約６００ＩＵ／ｍｌであり、また、マウスＩＬ−１８を省略した対照におけるＩＦＮ−γの産生量が０ＩＵ／ｍｌであったのに対して、ＩＬ−１８結合蛋白質を加えた系においては、僅かに６０ＩＵ／ｍｌ前後であった。このことは、本例のＩＬ−１８結合蛋白質がＩＬ−１８の生理作用を抑制することを示している。
【００６４】
【実施例４】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡ〉
【００６５】
【実施例４−１】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡ〉
【００６６】
【実施例４−１（ａ）】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
コリネバクテリウム・パルバム（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱し、得られた死菌体を８週齢の雌ＣＤ−１マウスの腹腔内に１ｍｇ／匹の割合で注射投与した。７日間飼育した後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１μｇ／匹の割合で注射投与し、２時間後、頚椎を脱臼させて屠殺し、肝臓を摘出した。摘出した肝臓を湿重で３ｇとり、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーにより破砕した。次いで、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含有する０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を２５ｍｌずつ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍｌずつ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離した。その後、ＲＮＡ画分を採取し、これを１５ｍｌ容遠心管にとり、等量のクロロホルム／イソブタノール混液（体積比４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍでさらに１０分間遠心分離した後、水層部を採取した。採取した水層に２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置することによって全ＲＮＡを沈澱させた後、沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄し、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解した。
【００６７】
以後、この全ＲＮＡを実施例２−１（ａ）におけると同様にして逆転写酵素反応させ、得られた第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を、センスプライマーとして、配列表における配列番号２７に示すアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＮＧＴＮＣＣＮＡＣＮＡＡ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号３０に示すアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＹＴＴＮＡＲＮＣＣＲＴＣ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた以外は実施例２−１（ａ）におけると同様にしてＰＣＲ反応させた。その後、プローブの調製に、配列表における配列番号２４に示すアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＳＷＮＧＴＲＴＧＮＣＣＹＴＣＹＴＴ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は、実施例２におけると同様にしてＰＣＲ産物中に目的とするＤＮＡ断片が存在することを確認する一方、実施例２−１（ａ）におけると同様にして当該ＤＮＡ断片の塩基配列を調べたところ、当該ＤＮＡ断片は配列表における配列番号３８に示す塩基配列を有していた。配列表における配列番号３８に併記したアミノ酸配列と、配列表における配列番号２４乃至３１に示す、実施例３−２で決定した部分アミノ酸配列とを照合したところ、これらの部分アミノ酸配列は、いずれもその全部又は一部が配列番号３８に併記したアミノ酸配列に含まれていた。このことは、配列表における配列番号３８に示す塩基配列が、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部分をコードするものであることを示唆している。
【００６８】
【実施例４−１（ｂ）】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
実施例４−１（ａ）の方法にしたがって、コリネバクテリウム・パルバムの死菌体とリポ多糖で処理した雌性ＣＤ−１マウスより採取した全ＲＮＡ１μｇを、市販の５´ＲＡＣＥキット（商品名『５´ＲＡＣＥシステム、バージョン２．０』、ギブコ・ビー・アール・エル製）を用いて、ＰＣＲの一変法である５´ＲＡＣＥに供した。すなわち、先ず、上記全ＲＮＡを、配列表における配列番号３８に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる逆転写酵素反応に供し、引き続いてターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを作用させて、生成した第一ストランドｃＤＮＡの５´末端にＣテイルを付加した。この第一ストランドｃＤＮＡを、次に、センスプライマーとして、上記キットに添付の５´−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドと、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号３８に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧ−３´とを用いてＰＣＲ反応させた。以上の５´ＲＡＣＥで得られた反応産物を一部とり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特定のＤＮＡ断片の増幅が確認された。実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号３９に示す塩基配列を含有していた。この塩基配列における第３０７乃至３３６番目の塩基からなる配列は、実施例４−１（ａ）で決定した、配列表の配列番号３８に示す塩基配列における第１乃至３０番目の塩基からなる配列と完全に一致した。このことは、配列表における配列番号３９に示す塩基配列が、配列番号３８に示す、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部をコードする塩基配列とオーバーラップし、かつ、その５´末端側上流域に相当する塩基配列を含んでいることを示唆している。
【００６９】
【実施例４−１（ｃ）】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
実施例４−１（ａ）の方法にしたがって、コリネバクテリウム・パルバムの死菌体とリポ多糖で処理した雌性ＣＤ−１マウスより採取した全ＲＮＡ１μｇを、斎藤隆監訳、『ＰＣＲ実験マニュアル』、ＨＢＪ出版発行（１９９１年）、２５乃至３３に記載の方法にしたがって、ＰＣＲの一変法である３´ＲＡＣＥに供した。すなわち、先ず、上記ＲＮＡを、５´−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡ（Ｔ）17−３´で表される塩基配列のヌクレオチドをプライマーとして用いる逆転写酵素反応に供し、得られた第一ストランドｃＤＮＡを、実施例４−１（ａ）で決定した、配列表における配列番号３８に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、５´−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いてＰＣＲ反応させた。以上の３´ＲＡＣＥで得られた反応産物を一部とり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特異的なＤＮＡ断片の増幅が確認された。実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号４０に示す塩基配列を含有していた。この塩基配列における第１乃至６３番目の塩基からなる配列は、実施例４−１（ａ）で決定した、配列表の配列番号３８に示す塩基配列における第２８９乃至３５１番目の塩基からなる配列と完全に一致した。このことは、配列表における配列番号４０に示す塩基配列が、配列番号３８に示す、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質の少なくとも一部をコードする塩基配列とオーバーラップし、かつ、その３´末端側下流域に相当する塩基配列を含んでいることを示唆している。
【００７０】
以上に示したように、実施例４−１（ａ）乃至４−１（ｃ）で、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードする、互いにオーバーラップする塩基配列として、配列表における配列番号３８乃至４０に示す塩基配列を決定した。互いにオーバーラップする部分の塩基配列を勘案すると、これらの塩基配列は、配列表における配列番号４１に示す一連の塩基配列に由来する部分配列と考えられた。
【００７１】
【実施例４−１（ｄ）】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列〉
実施例４−１（ａ）の方法にしたがって、コリネバクテリウム・パルバムの死菌体とリポ多糖で処理した雌性ＣＤ−１マウスより採取した全ＲＮＡを逆転写酵素反応させた後、センスプライマーとして、配列表における配列番号４１に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＴＧＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号４１に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例４−１（ｃ）におけると同様にしてＰＣＲ反応させた。このＰＣＲ産物の一部をとり、常法にしたがい１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供したところ、特異的なＤＮＡ断片の増幅が確認された。引き続き、実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べたところ、このＤＮＡ断片は、配列表における配列番号４１に示す塩基配列を有していた。これにより、実施例４−１（ａ）乃至４−１（ｃ）で決定した、配列表における配列番号３８乃至４０に示す塩基配列が、配列番号４１に示す一連の塩基配列の、それぞれ部分配列であることが裏付けられた。
【００７２】
一方、配列表における配列番号４１に示す塩基配列によりコードされる、そこに併記したアミノ酸配列と、配列表における配列番号２４乃至３１に示す、実施例３−２で決定した部分アミノ酸配列とを照合したところ、これらの部分アミノ酸配列は、すべて配列番号４１に併記したアミノ酸配列における第１乃至１６５番目のアミノ酸からなる部分に含まれていた。また、配列表における配列番号１に示す、ヒト由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質のアミノ酸配列と、配列表における配列番号４１に併記したアミノ酸配列における第１乃至１６５番目のアミノ酸からなる配列とを、慣用のコンピュータ・プログラムを用いて両者間で一致するアミノ酸の数が最大となるように並べたときの一致したアミノ酸の数に基づいて両者間の相同性を求めた。その結果、両者の間には約６１％の相同性が認められた。したがって、以上のことは、配列表の配列番号４１に示す塩基配列における第２３５乃至７２９番目の塩基からなる配列がマウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得るものであり、そして、当該ＩＬ−１８結合蛋白質が、全体としては、斯かる塩基配列に併記した第１乃至１６５番目のアミノ酸からなる配列を有する場合があることを示唆している。以上のごとく示唆された、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は、配列表における配列番号２及び３３にそれぞれ別記している。
【００７３】
【実施例４−２】
〈形質転換体によるマウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質の産生〉
【００７４】
【実施例４−２（ａ）】
〈組換えＤＮＡの調製〉
０．５ｍｌ反応管に、実施例４−１（ｄ）の方法で得た、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得るＤＮＡを１ｎｇとり、これを、配列表における配列番号３３に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、また、配列表における配列番号３３に示す塩基配列に基づき化学合成した５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は実施例２−２（ａ）におけると同様に処置してＰＣＲ反応させた。実施例４−１（ａ）におけると同様にしてＰＣＲ産物中に目的とするＤＮＡ断片が存在することを確認する一方、当該ＤＮＡ断片を挿入してなるプラスミドベクターを採取した。引き続き実施例２−１（ａ）におけると同様にして塩基配列を調べ、このプラスミドＤＮＡが、配列表における配列番号３３に示す塩基配列を含むことを確認した。
【００７５】
上記で得たプラスミドＤＮＡを、実施例２−２（ａ）におけると同様にしてプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』に挿入して組換えＤＮＡとし、得られた組換えＤＮＡを『ｐＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２』と命名した。常法にしたがって分析したところ、図４に示すように、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２』においては、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質をコードし得る、配列表における配列番号３３に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡ『ＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２  ｃＤＮＡ』が、延長因子１プロモーター『ＥＦ１αＰ』の下流に連結されていた。
【００７６】
【実施例４−２（ｂ）】
〈形質転換体によるマウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質の産生〉
実施例４−２（ａ）で得た組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２』を含む形質転換大腸菌株の培養物より、常法にしたがいプラスミドＤＮＡを採取して、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２』を得た。この組換えＤＮＡを２０μｇとり、実施例２−２（ｂ）におけると同様にしてＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）に導入して、この発明のＤＮＡが導入された形質転換体を得た。
【００７７】
引き続き実施例２−２（ｂ）におけると同様にして、上記で得た形質転換体を培養し、培養物から培養上清を採取し、アフィニティークロマトグラフィー用ゲル（商品名『Ｎｉ−ＮＴＡ』、キアジェン製）のカラムを用いてこの培養上清を分画し、ＩＬ−１８結合蛋白質の存在が確認された画分を採取・合一し、１×１０7個の上記形質転換体より約２ｍｌの、精製ＩＬ−１８結合蛋白質を含む水溶液を得た。この水溶液の蛋白質含量は約１μｇ／ｍｌであった。この水溶液を、実施例１−２の方法にしたがって処理し、Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号２におけるＮ末端部分のものと同一のアミノ酸配列が得られた。なお、対照として、組換えＤＮＡ『ｐＥＦＨ１８ＢＰＨ６』に代えてプラスミドベクター『ｐＥＦ−ＢＯＳ』を用いて、本実施例と同様に処置したところ、ＩＬ−１８結合蛋白質の存在は確認されなかった。以上の結果は、マウス由来の当該ＩＬ−１８結合蛋白質が配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有する場合があり、そして、当該蛋白質が、配列番号３３に示す塩基配列によりコードされ得ることを裏付けている。
【００７８】
以下、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質を有効成分として含有する感受性疾患剤の実施例を具体的に説明する。
【００７９】
【実施例５】
〈液剤〉
安定剤としてパイロジェン除去した結晶性トレハロース粉末（商品名『トレハオース』、株式会社林原商事販売）を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に実施例１−１又は実施例２−２の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、常法にしたがって除菌して、２種類の液剤を得た。
【００８０】
安定性に優れた本品は、いずれも、自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー性疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、点鼻剤などとして有用である。
【００８１】
【実施例６】
〈乾燥注射剤〉
安定剤としてパイロジェン除去したシュクロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例１−１又は実施例２−２の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を１００ｍｇ溶解し、それぞれ、常法にしたがって除菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。
【００８２】
安定性に優れた本品は、いずれも、自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー性疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００８３】
【実施例７】
〈軟膏剤〉
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、和光純薬工業株式会社製造）及びパイロジェンを除去した結晶性トレハロース粉末（商品名『トレハオース』、株式会社林原商事販売）をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例１−１又は実施例２−２の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を均一に混合した後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当りＩＬ−１８結合蛋白質を約１ｍｇ含む２種類のペースト状物を得た。
【００８４】
延展性と安定性に優れた本品は、いずれも、自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー性疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００８５】
【実施例８】
〈錠剤〉
パイロジェンを除去した無水結晶α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原商事販売）に実施例１−１又は実施例２−２の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質及び細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られた混合物を常法にしたがって打錠して、製品１錠（約２００ｍｇ）当りＩＬ−１８結合蛋白質及びルミン（日本感光色素株式会社製）をそれぞれ約１ｍｇ含む２種類の錠剤を得た。
【００８６】
摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も兼備する本品は、いずれも、自己免疫疾患、炎症性疾患及びアレルギー性疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００８７】
【実験】
〈急性毒性試験〉
常法にしたがって、５週齢のｄｄｙマウス（体重２０乃至２５ｇ）に実施例１−１、２−２、３−１及び４−２の方法により得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を経口投与するか、腹腔内又は静脈内に注射投与した。その結果、これらの精製ＩＬ−１８結合蛋白質のＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても、約１ｍｇ／マウス１匹体重以上であった。ことことは、この発明のＩＬ−１８結合蛋白質がヒトを含む哺乳類に投与する医薬品に配合して安全であることを物語っている。
【００８８】
【実施例９】
〈ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質に対する抗体〉
【００８９】
【実施例９−１】
〈ハイブリドーマの調製〉
実施例２−２の方法により得たヒト由来の精製ＩＬ−１８結合蛋白質を抗原として用いて、９週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを以下のスケジュールで免疫感作した。初回免疫として、常法により完全フロイントアジュバントとともに抗原を１００μｇ／匹の用量で腹腔内に注射投与した。その後２週間おきに、追加免疫として、この手順に準じて計２回の注射投与を行い、さらに２週間後に最終免疫として、アジュバントを用いないこと以外は初回免疫に準じて注射投与を行った。以上の免疫感作の終了後３日めに該マウスより脾臓を摘出し、分散して脾細胞を得た。
【００９０】
この脾細胞の約３×１０7個とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）の約１×１０8個を、３７℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）（以下、単に「無血清培地」という。）の適量に浮遊させ、両細胞を十分に混和した。この細胞浮遊液を遠心分離し、上澄液を十分に除去した。沈澱部の細胞に、平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む無血清培地１ｍｌを１分間かけて滴々加え、その後３７℃で１分間インキュベートして細胞融合に供した。これに、無血清培地を全量が５０ｍｌになるまで滴々加え、細胞融合の反応を停止した。この細胞融合産物を遠心分離して上澄液を十分に除去した後、沈澱部にＨＡＴ培地を加え、細胞密度約２×１０5個／ｍｌの細胞浮遊液とした。この細胞浮遊液を９６ウェルプレートに１５０μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で約１０日間インキュベートしてハイブリドーマを選択的に増殖させた。
【００９１】
各ウェルの上澄液を、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質との免疫反応の有無について、実施例２−２の方法で得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を用いて通常のエンザイムイムノアッセイにより試験して、所期のハイブリドーマを含むウェルを選択した。選択されたウェルより細胞を採取し、それぞれを常法にしたがって限界希釈法に供したところ、６種類のハイブリドーマのクローンが得られた。
【００９２】
【実施例９−２】
〈モノクローナル抗体の調製〉
実施例９−１で得た６種類のハイブリドーマを、それぞれ別々に以下のとおり操作してモノクローナル抗体を調製した。先ず、常法にしたがい、ハイブリドーマを細胞密度約１×１０5個／ｍｌになるように５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で所期の細胞密度に達するまで培養した。１１週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタンを０．５ｍｌ／匹の用量で腹腔内に接種した。上記培養物よりハイブリドーマを採取し、プリスタン処理したマウスの腹腔内に約１×１０7個／匹の用量で接種した。その後マウスを通常の方法で１週間飼育した。
【００９３】
プロテインＡ固定化ゲル『プロテインＡ−セファロース  ＣＬ−４Ｂ』（ファルマシア社製）をＰＢＳに膨潤させた後、カラムに充填した。このカラムに、３Ｍ  塩化ナトリウムを含む１．５Ｍ  グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９）（以下、「平衡化緩衝液」という。）を通液して平衡化した。上記の飼育後のマウスから腹水を採取し、平衡化緩衝液で２倍希釈した後、平衡化したカラムに負荷した。引き続きこのカラムに十分量の平衡化緩衝液を通液して洗浄した後、適量の０．１Ｍ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）を通液し、カラムに吸着した抗体を溶出させた。溶出液を採取し、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析した後、透析内液を採取した。斯くして６種類のハイブリドーマに由来する６種類のモノクローナル抗体を、ＰＢＳを含む水溶液として得た。
【００９４】
上記で得た６種類のモノクローナル抗体を、実施例９−１と同様に、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質との免疫反応の有無についてエンザイムイムノアッセイにより試験した。その結果、いずれも当該ＩＬ−１８結合蛋白質と免疫反応した。斯くして、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質に対する６種類のこの発明のモノクローナル抗体を、いずれも、マウス１匹当たり約４ｍｇの収量で得た。
【００９５】
上記の６種類のモノクローナル抗体を、常法にしたがって、属するクラス、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質を検出するウェスタンブロッテイングへの利用性、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質の精製に有用な該蛋白質との免疫沈降への利用性について試験した。また、前記結合アッセイに準じて、ヒト由来ＩＬ−１８結合蛋白質に対する中和能の有無を調べた。その結果、本実施例で得たモノクローナル抗体は、ＩｇＧ1又はＩｇＧ2aのいずれかのクラスに属し、ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質の検出、精製及び／又は中和に有用であることが確認された。
【００９６】
【実施例１０】
〈マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質に対する抗体〉
【００９７】
【実施例１０−１】
〈ハイブリドーマの調製〉
実施例４−２の方法により得たマウス由来の精製ＩＬ−１８結合蛋白質を抗原として用いて、１４週齢の雌性ＢＮラットを以下のスケジュールで免疫感作した。初回免疫として、常法により完全フロイントアジュバントとともに抗原を２０μｇ／匹の用量で腹腔内に注射投与した。その後２週間おきに、追加免疫として、この手順に準じて計２回の注射投与を行い、さらに２週間後に最終免疫として、初回免疫と同量の抗原を、常法によりアジュバントを用いず静脈内に注射投与した。以上の免疫感作の終了後３日めに該ラットより脾臓を摘出し、分散して脾細胞を得た。
【００９８】
この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）又はラット骨髄腫由来のＹ３−Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）との組合わせで、実施例９−１の方法に準じて細胞融合を実施した後、ハイブリドーマを選択的に増殖させた。
【００９９】
ハイブリドーマが増殖した後の各ウェルの上澄液を、マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質との免疫反応の有無について、実施例４−２の方法で得た精製ＩＬ−１８結合蛋白質を用いて通常のエンザイムイムノアッセイにより試験して、所期のハイブリドーマを含むウェルを選択した。選択されたウェルより細胞を採取し、それぞれを常法にしたがって限界希釈法に供したところ、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）と融合したハイブリドーマ２種類と、Ｙ３−Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）と融合したハイブリドーマ１種類のクローンが得られた。
【０１００】
【実施例１０−２】
〈モノクローナル抗体の調製〉
実施例１０−２で得た３種類のハイブリドーマを、それぞれ常法にしたがって、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を用いて、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で、所期の細胞密度に達するまで培養した。それぞれの培養物の上澄液を採取し、上記エンザイムイムノアッセイにより試験したところ、いずれもマウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質と免疫反応する抗体を含んでいることが確認された。また、常法にしたがい分析したところ、これら抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭのクラスに属することが確認された。斯くして、マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質に対する３種類のこの発明のモノクローナル抗体を、ハイブリドーマの培養上澄液として得た。なお、いずれの培養上澄液も、当該抗体を約１０μｇ／ｍｌ含有していた。
【０１０１】
本実施例によるモノクローナル抗体は、マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質の精製、検出及び／又は中和に用いることができる。また、実施例１０−１で得たハイブリドーマを上記に準じて生体外で培養するか又は常法にしたがい生体内で培養し、培養物に抗体の精製のための慣用の方法を適用すれば、精製されたこの発明のモノクローナルが得られる。精製された斯かるモノクローナル抗体は、上記用途にとりわけ有利に用いることができる。
【０１０２】
【発明の効果】
以上説明したとおり、この発明はＩＬ−１８に結合する新規な蛋白質の発見に基づくものである。この発明の蛋白質は、ヒトを含む哺乳類において、免疫系を活性化するＩＬ−１８の生理作用を抑制する性質を有するので、臓器移植に伴う拒絶反応の緩和や、過剰な免疫反応に起因する種々の疾患の治療・予防に著効を発揮する。
【０１０３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質のペプチドマップである。
【図２】マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質のペプチドマップである。
【図３】ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードする塩基配列を含む組換えＤＮＡの構造を示す制限酵素地図である。
【図４】マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードする塩基配列を含む組換えＤＮＡの構造を示す制限酵素地図である。
【符号の説明】
ＥＦＨ１８ＢＰＨ６ ｃＤＮＡ         ヒト由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡ
ＥＦＭ１８ＢＰＨ−ＭＫ２ ｃＤＮＡ   マウス由来のＩＬ−１８結合蛋白質をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡ
ＥＦ１αＰ                          延長因子１プロモーター
Ａｍｐ                              アンピシリン耐性遺伝子
ｏｒｉ                              複製起点
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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