(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の第１プライマー〜第６プライマーからなる６つの核酸増幅用プライマーを含む、ＬＡＭＰ法によりヒトサイトケラチン１９を検出するための核酸増幅用プライマーセット：
Ａ）以下の１）〜４）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第１プライマー；
１）配列番号４２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
３）前記１）又は２）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｂ）以下の５）〜８）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第２プライマー；
５）配列番号３５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
６）前記５）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
７）前記５）又は６）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
８）前記５）〜７）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｃ）以下の９）〜１２）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第３プライマー；
９）配列番号３９２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１０）前記９）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１１）前記９）又は１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
１２）前記９）〜１１）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｄ）以下の１３）〜１６）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第４プライマー；
１３）配列番号４０４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１４）前記１３）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１５）前記１３）又は１４）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
１６）前記１３）〜１５）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｅ）以下の１７）〜２０）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第５プライマー；
１７）配列番号４１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１８）前記１７）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１９）前記１７）又は１８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
２０）前記１７）〜１９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｆ）以下の２１）〜２４）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第６プライマー；
２１）配列番号３７９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
２２）前記２１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
２３）前記２１）又は２２）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
２４）前記２１）〜２３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを使用することによる核酸検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸検出方法に使用する試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ヒトサイトケラチンを検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイトケラチン（以下、本明細書中では「CK」と記載する）は、細胞の繊維性骨格を形成するタンパク質の一つで、少なくとも20個の遺伝子群からなるファミリーを形成し、ヒトCK18、ヒトCK19及びヒトCK20等が公知である。CKは上皮細胞で発現される。
例えばヒトCK18は、乳腺、肺、大腸、胃などの正常組織だけでなくそれぞれの癌組織においても発現されることが報告されているが、ヒトCK18は上皮系組織ではないリンパ節では発現されないことが知られている。また、ヒトCK19は肺癌、胃癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等で発現されることが報告されており、正常組織と癌組織でのヒトCK19の発現量に差が認められる。ヒトCK20は大腸癌、胃癌、メルケル細胞癌、婦人科粘液癌、移行上皮癌、膵癌・胆管癌で発現されることが報告されており、やはり正常組織と癌組織でのヒトCK20の発現量に差が認められる。そこで、リンパ節等の組織においてヒトCK18、ヒトCK19及び／又はヒトCK20の発現の有無を調べることで癌の転移の有無を確認することができる、さらに上記正常組織と癌組織で発現量の差が認められるものを調べることでも癌の転移を確認することができる。
【０００３】
癌細胞は、原病巣部位を離れ、血流やリンパ系を経由して全身に転移する。癌の手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合に応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のリンパ節への癌転移診断は極めて重要な意義を有している。例えば乳癌の場合には、QOL向上のために郭清範囲を縮小化する傾向であるが、術中のリンパ節癌転移診断は、最小限のリンパ節郭清範囲を決定するための重要な指針となりうる。食道癌においては、リンパ節転移の部位を検出することにより、開腹、閉胸、頚部切開のうち、いずれの術式を選択するかの決定するための指針となりうる。前立腺癌においては、リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、ホルモン療法を行う等の意思決定の指標となり、さらに胃癌においても、術式及び術後の治療方針の選択の指針となりうる。又、患者への負担を考えると、術中の癌転移診断は、迅速に行うことが必要である。
【０００４】
リンパ節への癌転移診断の１手法として、癌マーカーとしてCKタンパク質を検出する方法がある。例えば、切除したリンパ節を凍結し、凍結した組織の切断面を染色する等により行われているが、このような手法では切断面の情報のみであるから微小癌転移を見落とす危険性がある。
【０００５】
近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカー遺伝子の発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった。例えばPCR法は、DNA鎖の１本鎖への解離、DNA鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、DNAポリメラーゼによるDNA合成反応を繰り返すことによって、目的のDNA断片を数十万倍にも増幅できる方法であり（特開昭61-274697号公報）、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能である。例えば、動物体液や組織由来の試料中の核酸の分析が可能であるため、感染症や遺伝病や癌の診断などに有用である。
【０００６】
RNAの検出には、RT-PCR法が利用できる。RT-PCR法とは、例えば腫瘍組織からRNAを抽出し、オリゴ(dT)又はランダムヘキサマーをプライマーにして逆転写酵素(RT)によりcDNAを合成し、このcDNAをPCR法で増幅し、検出する方法である。この方法を用いた線維芽細胞腫の診断の例が報告されている（北海道医学雑誌、p.135-141, Vol. 66(2),(1991)）。RT-PCRにより、切除した組織からCKのmRNA発現の検出が可能となり、癌転移の見落としの間題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第31版1314頁、金原出版株式会杜、1998年9月20日発行）。
しかし、PCR法では、鋳型DNAの２本鎖から１本鎖への変性の操作を必要とし、増幅反応は複数の温度条件で繰り返し行う必要があった。また、一般に検出可能な増幅産物を得るのに２時間程度かかり、迅速性を要求される術中に行う検査としては好ましいものではない。
【０００７】
PCR法以外のDNA増幅方法として、LAMP法が報告されている（特許文献１）。LAMP法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（FIP、RIP）と２種類のアウタープライマー（F3プライマー、R3プライマー）及び鎖置換型DNAポリメラーゼにより鋳型DNAから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の3'末端側から自己を鋳型としてDNAの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。  LAMP法は、鋳型DNAの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１、２）。鋳型がRNAの場合には、鋳型がDNAの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる(RT-LAMP法)。LAMP法では、30分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。又、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
LAMP法に適用されるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１及び特許文献２に記載されている。
【０００８】
ヒトCK18検出用のPCR用プライマー又はプローブについては既に報告されている（非特許文献３）。同様に、ヒトCK19検出用のPCR用プライマー又はプローブについても既に報告されている（特許文献３、非特許文献４）。また、同様にヒトCK20検出用のPCR用プライマー又はプローブについても既に報告されている（非特許文献５、６）。
しかしながら、ヒトCK検出用であって、LAMP法に適用されるプライマーの報告はなく、その開発が望まれている。また、その他の核酸増幅手段に適用されるプライマーでも、公知のプライマーのほかに新たなプライマー又は測定に有用なプライマーセットの構築が望まれている。
【０００９】
【先行文献】
【特許文献１】
国際公開WO 00/28082号公報
【特許文献２】
国際公開WO 02/24902号公報
【特許文献３】
米国US 6203992特許公報
【非特許文献１】
Bioベンチャー、Vol.1, No.1, p.109-115(2001)
【非特許文献２】
BIO INDUSTRY、Vol.18, No.2, p.15-29(2001)
【非特許文献３】
Gene, 159(1), p.43-47(1995)
【非特許文献４】
Breast Cancer Research and Treatment 60, p.143-151(2000)
【非特許文献５】
British J. of Cancer, 77(8), p.1327-1332(1998)
【非特許文献６】
British J. of Cancer, 82(1), p157-160 (2000)
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトCKを検出するための核酸増幅反応に用いる新規プライマーを提供することを目的とする。より具体的には、LAMP法による核酸増幅用のプライマーを提供することに関する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、LAMP法に効果的に適用されるヒトCKを検出するための核酸増幅用プライマーを構築することができた。
【００１２】
即ち本発明は、以下からなる。
１．以下の第１プライマー〜第６プライマーからなる６つの核酸増幅用プライマーを含む、ＬＡＭＰ法によりヒトサイトケラチン１９を検出するための核酸増幅用プライマーセット：
Ａ）以下の１）〜４）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第１プライマー；
１）配列番号４２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
３）前記１）又は２）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｂ）以下の５）〜８）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第２プライマー；
５）配列番号３５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
６）前記５）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
７）前記５）又は６）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
８）前記５）〜７）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｃ）以下の９）〜１２）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第３プライマー；
９）配列番号３９２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１０）前記９）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１１）前記９）又は１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
１２）前記９）〜１１）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｄ）以下の１３）〜１６）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第４プライマー；
１３）配列番号４０４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１４）前記１３）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１５）前記１３）又は１４）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
１６）前記１３）〜１５）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｅ）以下の１７）〜２０）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第５プライマー；
１７）配列番号４１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
１８）前記１７）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
１９）前記１７）又は１８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
２０）前記１７）〜１９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
Ｆ）以下の２１）〜２４）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用第６プライマー；
２１）配列番号３７９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
２２）前記２１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
２３）前記２１）又は２２）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
２４）前記２１）〜２３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
２．前項１に記載のプライマーセットを使用することによる核酸検出方法。
３．前項２に記載の核酸検出方法に使用する試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（プライマーの設計）
本発明は、ヒトCKの核酸増幅法、好ましくはLAMP法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。該プライマーは、例えば、公知の配列番号1, 342, 435等に表されるCKの塩基配列及び／又はその相補的な配列から連続する塩基を少なくとも5以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計することができる。
【００１４】
LAMP法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。具体的には、増幅すべき標的DNAの、3'末端側から順にF3c、F2c、F1cという領域を、5'末端側から順にR3、R2、R1という領域を規定し、少なくともこの6つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも4種のプライマーを設計する。
【００１５】
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、F2に対して実質的に同一な塩基配列とは、F2と全く同一な塩基配列に加えて、F2にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００１６】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる3'末端を提供することができる配列を意味する。
【００１７】
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には5〜200塩基、より望ましくは10〜50塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低5塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、10塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００１８】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
【００１９】
本発明において、標的DNAの塩基配列から選択されるプライマーは、各々FIP(forward inner primer)、F3プライマー(forward outer primer)、RIP（reverse inner primer）及びR3プライマー（reverse outer primer）のいずれかを構成する。
FIPは、標的DNAのF2c領域と実質的に相補的なF2領域の塩基配列を3'末端にもち、5'末端に標的DNAのF1c領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、F2及びF1cの配列間に標的DNAに依存しない配列が介在していても良い。この標的DNAに依存しない配列の長さは0〜50塩基、好ましくは0〜40塩基であれば許容しうる。
F3プライマーは、標的DNAのF3c領域と実質的に相補的なF3領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
RIPは、標的DNAのR2c領域と実質的に相補的なR2領域の塩基配列を3'末端にもち、5'末端に標的DNAのR1c領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。RIPもFIPと同様に、R2及びR1cの配列の間に標的DNAに依存しない配列が介在していても良い。
R3プライマーは、標的DNAのR3c領域と実質的に相補的なR3領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
【００２０】
また、LAMP法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（特許文献２）。ループプライマーとは、ダンベル構造の5'末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばR1領域とR2領域の間、あるいはF1領域とF2領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることによりDNA合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、DNA合成過程でできたFIP又はRIPがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２１】
（ヒトCK18検出用のプライマーの設計）
ヒトCK18検出用のプライマーは、既知の配列番号1に表される1412塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも5以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号1に示す塩基配列はGenbank accession No. 4557887に基づく。
ヒトCK18検出用のプライマーも、上記プライマーの原理に従った領域を選択して設計する。
【００２２】
ヒトCK18検出用プライマーの領域は、塩基組成、GC含量、二次構造、Tm値などに注意し、DNA領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも5塩基以上、好ましくは10〜30塩基、より好ましくは17〜25塩基のものを選択することができる。Tm値は、一般的にNearest Neighbor法で求めることができる。DNA領域は、Tm値が55〜65℃、好ましくは58〜64℃のものを選択し、GC含量が40〜70％、好ましくは50〜65％のものを選択することができる。
【００２３】
このような条件により、本発明で選択されたプライマーの領域は、配列番号1で表される塩基配列の270〜1375番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは塩基配列の280〜580番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００２４】
ヒトCK18検出用プライマーは、1) 配列番号1で表される塩基配列の270〜1375番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも5以上のオリゴヌクレオチド、2) 配列番号2〜41で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、3) 前記1)又は2)に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、4) 前記1)〜3)のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、5) 前記1)〜4)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、から選択され、設計される。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製  Expedite Model 8909 DNA合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はPCR法を単独又は適宜組合せて、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、2版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［PCRテクノロジー、DNA増幅の原理と応用］、Ehrlich, HE.編、ストックトンプレス、1989年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばUlmerの技術(Science(1983)219:666)を利用することができる。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、50％ホルムアミド、5×SSC（150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム，pH7.6、5×デンハーツ溶液、10％デキストラン硫酸、及び20μg/mlのDNAを含む溶液中、42℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で2×SSC・0.1％SDS中で一次洗浄し、次いで、約65℃において0.1×SSC・0.1％SDSで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２７】
ここで増幅されるべき核酸の鋳型はヒトCK18のmRNAであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムDNAを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、ヒトCK18の遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムDNA由来の配列の増幅が排除され、ヒトCK18のmRNA由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
【００２８】
（ヒトCK19検出用のプライマーの設計）
ヒトCK19検出用のプライマーも、ヒトCK18検出用プライマーと同様に、設計することができる。ヒトCK19検出用プライマーは、既知の配列番号342に表される1360塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも5以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号342に示す塩基配列はGenbank accession No. 4504916に基づく。
ヒトCK19検出用プライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。
ヒトCK19検出用プライマーの領域は、配列番号342で表される塩基配列の270〜930番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは270〜560番目、370〜585番目、625〜854番目の領域若しくは655〜930番目及びそれらの相補鎖の領域に含まれる。
【００２９】
ヒトCK19検出用プライマーは、1) 配列番号342で表される塩基配列の270〜930番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、好ましくは270〜560番目、370〜585番目、625〜854番目若しくは655〜930番目の領域及び／又はそれら相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも5以上のオリゴヌクレオチド、2) 配列番号343〜382で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、3) 前記1)又は2)に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、4) 前記1)〜3)のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、5) 前記1)〜4)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００３０】
（ヒトCK20検出用のプライマーの設計）
ヒトCK20検出用のプライマーも、ヒトCK18検出用プライマーやヒトCK19検出用のプライマーと同様に、設計することができる。ヒトCK20検出用プライマーは、既知の配列番号435に表される1275塩基よりなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも5以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号435に示す塩基配列はGenbank accession No. 402644に基づく。
ヒトCK20検出用プライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。
ヒトCK20検出用プライマーの領域は、配列番号435で表される塩基配列の340〜1050番目の領域及びその相補鎖の領域、好ましくは340〜490番目若しくは495〜1050番目の領域及びそれらの相補鎖の領域、さらに好ましくは340〜490番目、495〜570番目若しくは790〜1050番目の領域及びそれらの相補鎖の領域に含まれる。
【００３１】
ヒトCK20検出用プライマーは、1) 配列番号435で表される塩基配列の340〜1050番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、好ましくは340〜490番目若しくは495〜1050番目の領域及び／又はそれらの相補鎖の領域、さらに好ましくは、340〜490番目、495〜570番目若しくは790〜1050番目の領域及び／又はそれらの相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも5以上のオリゴヌクレオチド、2) 配列番号436〜474で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、3) 前記1)又は2)に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、4) 前記1)〜3)のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、5) 前記1)〜4)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００３２】
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも2種を組合せてプライマーセットとして使用する。LAMP法では、少なくとも4種のプライマー(FIP、F3プライマー、RIP、R3プライマー)を組合せてプライマーセットとして使用する。さらに、1種以上のループプライマーを組合せて、プライマーセットとして使用することもできる。
【００３３】
（RT-LAMP法）
RT-LAMP法は、RNAを鋳型とするLAMP法であり、LAMP法の基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。RT-LAMP法では一つの溶液中で、鋳型RNAからcDNAを合成しながら、LAMP法の起点構造が合成される。具体的には次の1)のステップを経た後、2)〜5)ステップの繰り返しにより、DNAの伸長が繰り返され、標的DNAの増幅が行われる。
【００３４】
1) 鋳型RNA鎖にFIPが結合し、鋳型RNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばAMV由来の逆転写酵素等を用いる。
2) 上記1)で合成したFIPからのDNA鎖を、F3プライマーが鋳型RNAから剥がしながら、鋳型RNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長する。以降DNA鎖の伸長はDNAポリメラーゼによる。
3) 上記2)で剥がされたDNA鎖に、RIPが結合してDNA鎖が伸長する。
4) 上記3)で伸長したRIPからのDNA鎖をR3プライマーが剥がしながら、FIPからのDNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長し、LAMP法の起点構造が合成される。
5) 上記4)で剥がされたDNA鎖の両端の配列は、同じDNA鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばBcaDNA polymeraseのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
【００３５】
（検出方法）
LAMP法では、合成されたDNA鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBER GREEN I、あるいはPico Greenのような2本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でDNAの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である(臨床検査法提要、31版1318頁；特開2001-242169号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という)。
また、LAMP法では、増幅反応の過程で、副産物として不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成し、白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、あるいは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を検出する、または反応液を有色のフィルターでろ過し、フィルター上の残渣を確認することにより増幅生成物の有無を検出することができる（国際公開WO01/83817号参照）。
【００３６】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、必要があればRNaseインヒビターのように増幅反応を阻害する物質を除去するための薬剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
【００３７】
本発明は、核酸増幅用プライマー及びプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１−１）ヒトCK18塩基配列からの領域の選択
配列番号1に記載するヒトCK18の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてLAMP法に適切な領域の位置を検討した。F1c及びR1cはTm値が58.5〜63.5℃、F2及びR2はTm値が61.5〜62.5℃、F3及びR3はTm値が58.5〜62.5℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号1で表される塩基配列の270〜1375番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００４０】
F1c：配列番号1で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
442-420  tgaagtaatggctccagtctctg    （配列番号2）
439-418  agtaatggctccagtctctgac     （配列番号3）
443-421  ttgaagtaatggctccagtctct    （配列番号4）
419-403  acctggggtcccttctt          （配列番号5）
414-396  gggtcccttcttctccaag        （配列番号6）
413-394  ggtcccttcttctccaagtg       （配列番号7）
412-393  gtcccttcttctccaagtgc       （配列番号8）
411-392  tcccttcttctccaagtgct       （配列番号9）
410-392  cccttcttctccaagtgctc       （配列番号10）
409-390  ccttcttctccaagtgctcc       （配列番号11）
584-568  acagactggcgcatggc          （配列番号12）
620-602  tcaatgaccttgcggagcc        （配列番号13）
621-602  atcaatgaccttgcggagcc       （配列番号14）
622-603  catcaatgaccttgcggagc       （配列番号15）
623-603  tcatcaatgaccttgcggagc      （配列番号16）
666-648  agcctcgatctctgtctcc        （配列番号17）
743-726  gagctggcaatctgggct         （配列番号18）
742-725  agctggcaatctgggctt         （配列番号19）
741-724  gctggcaatctgggcttg         （配列番号20）
740-720  ctggcaatctgggcttgtagg      （配列番号21）
739-720  tggcaatctgggcttgtagg       （配列番号22）
738-719  ggcaatctgggcttgtaggc       （配列番号23）
756-740  cacggtcaacccagagc          （配列番号24）
795-777  gatcttggcgaggtcctga        （配列番号25）
809-789  cggatgtctgccatgatcttg      （配列番号26）
829-810  ccagctcgtcatattgggcc       （配列番号27）
913-894  cagcagactgtgtggtgacc       （配列番号28）
941-924  gtgagcgtcgtctcagca         （配列番号29）
1008-987 gctggccttcagatttctcatg     （配列番号30）
355-335  ccaggctcctcactctgtcca      （配列番号31）
430-410  tccagtctctgacctggggtc      （配列番号32）
588-569  ctccacagactggcgcatgg       （配列番号33）
769-748  gggcatctacctccacggtcaa     （配列番号34）
897-877  gaccactgtggtgctctcctc      （配列番号35）
925-904  cagctccaacctcagcagactg     （配列番号36）
1263-1242 ggtttgcatggagttgctgctg     （配列番号37）
【００４１】
F2 ：配列番号1で表される配列上の塩基位置の領域
376-392  gagagcaaaatccggga          （配列番号38）
377-393  agagcaaaatccgggag          （配列番号39）
378-394  gagcaaaatccgggagc          （配列番号40）
384-400  aatccgggagcacttgg          （配列番号41）
369-385  gaggctggagagcaaaa          （配列番号42）
523-540  cgtcttgctgctgatgac         （配列番号43）
524-542  gtcttgctgctgatgactt        （配列番号44）
543-565  tagagtcaagtatgagacagagc    （配列番号45）
544-565  agagtcaagtatgagacagagc     （配列番号46）
546-566  agtcaagtatgagacagagct      （配列番号47）
588-604  gaacgacatccatgggc          （配列番号48）
660-676  cgaggctctcaaggagg          （配列番号49）
661-677  gaggctctcaaggagga          （配列番号50）
662-678  aggctctcaaggaggag          （配列番号51）
687-706  catgaagaagaaccacgaag       （配列番号52）
719-736  gcctacaagcccagattg         （配列番号53）
747-763  gttgaccgtggaggtag          （配列番号54）
768-784  ccccaaatctcaggacc          （配列番号55）
839-855  accgagaggagctagac          （配列番号56）
878-894  aggagagcaccacagtg          （配列番号57）
943-960  gagctgagacgtacagtc         （配列番号58）
295-314  gagaccatgcaaagcctgaa       （配列番号59）
369-388  gaggctggagagcaaaatcc       （配列番号60）
523-542  cgtcttgctgctgatgactt       （配列番号61）
708-729  ggaagtaaaaggcctacaagcc     （配列番号62）
837-857  gaaccgagaggagctagacaa      （配列番号63）
864-884  gtctcagcagattgaggagag      （配列番号64）
1202-1221 tggaagatggcgaggacttt       （配列番号65）
【００４２】
F3 ：配列番号1で表される配列上の塩基位置の領域
322-338  ctggcctcttacctgga          （配列番号66）
293-309  aggagaccatgcaaagc          （配列番号67）
470-489  tcttcgcaaatactgtggac       （配列番号68）
466-486  cagatcttcgcaaatactgtg      （配列番号69）
473-491  tcgcaaatactgtggacaa        （配列番号70）
476-495  caaatactgtggacaatgcc       （配列番号71）
523-540  cgtcttgctgctgatgac         （配列番号72）
546-566  agtcaagtatgagacagagct      （配列番号73）
624-643  caccaatatcacacgactgc       （配列番号74）
687-706  catgaagaagaaccacgaag       （配列番号75）
695-712  agaaccacgaagaggaag         （配列番号76）
747-763  gttgaccgtggaggtag          （配列番号77）
812-829  cccaatatgacgagctgg         （配列番号78）
845-864  aggagctagacaagtactgg       （配列番号79）
855-873  caagtactggtctcagcag        （配列番号80）
907-923  tctgctgaggttggagc          （配列番号81）
275-294  gaggcatccagaacgagaag       （配列番号82）
349-366  agcctggagaccgagaac         （配列番号83）
490-507  aatgcccgcatcgttctg         （配列番号84）
672-690  ggaggagctgctcttcatg        （配列番号85）
807-824  ccgggcccaatatgacga         （配列番号86）
840-859  ccgagaggagctagacaagt       （配列番号87）
1176-1193 tgagatcgccacctaccg         （配列番号88）
【００４３】
R1c：配列番号1で表される配列上の塩基位置の領域
444-463  gatcatcgaggacctgaggg       （配列番号89）
420-442  cagagactggagccattacttca    （配列番号90）
424-447  gactggagccattacttcaagatc   （配列番号91）
425-448  actggagccattacttcaagatca   （配列番号92）
426-450  ctggagccattacttcaagatcatc  （配列番号93）
427-451  tggagccattacttcaagatcatcg  （配列番号94）
428-451  ggagccattacttcaagatcatcg   （配列番号95）
429-453  gagccattacttcaagatcatcgag  （配列番号96）
430-454  agccattacttcaagatcatcgagg  （配列番号97）
431-454  gccattacttcaagatcatcgagg   （配列番号98）
432-456  ccattacttcaagatcatcgaggac  （配列番号99）
433-457  cattacttcaagatcatcgaggacc  （配列番号100）
587-605  agaacgacatccatgggct        （配列番号101）
588-606  gaacgacatccatgggctc        （配列番号102）
589-607  aacgacatccatgggctcc        （配列番号103）
590-607  acgacatccatgggctcc         （配列番号104）
598-614  catgggctccgcaaggt          （配列番号105）
632-649  tcacacgactgcagctgg         （配列番号106）
624-645  caccaatatcacacgactgcag     （配列番号107）
630-649  tatcacacgactgcagctgg       （配列番号108）
631-649  atcacacgactgcagctgg        （配列番号109）
685-708  ttcatgaagaagaaccacgaagag   （配列番号110）
739-756  agctctgggttgaccgtg         （配列番号111）
740-756  gctctgggttgaccgtg          （配列番号112）
741-757  ctctgggttgaccgtgg          （配列番号113）
742-758  tctgggttgaccgtgga          （配列番号114）
743-759  ctgggttgaccgtggag          （配列番号115）
744-760  tgggttgaccgtggagg          （配列番号116）
746-764  ggttgaccgtggaggtaga        （配列番号117）
747-767  gttgaccgtggaggtagatgc      （配列番号118）
748-767  ttgaccgtggaggtagatgc       （配列番号119）
749-767  tgaccgtggaggtagatgc        （配列番号120）
750-768  gaccgtggaggtagatgcc        （配列番号121）
751-768  accgtggaggtagatgcc         （配列番号122）
766-783  gcccccaaatctcaggac         （配列番号123）
812-831  cccaatatgacgagctggct       （配列番号124）
855-877  caagtactggtctcagcagattg    （配列番号125）
924-941  tgctgagacgacgctcac         （配列番号126）
947-966  tgagacgtacagtccagtcc       （配列番号127）
1016-1032 acagcctgagggaggtg          （配列番号128）
360-379  cgagaaccggaggctggaga       （配列番号129）
443-464  agatcatcgaggacctgagggc     （配列番号130）
592-611  gacatccatgggctccgcaa       （配列番号131）
778-799  caggacctcgccaagatcatgg     （配列番号132）
900-921  cacacagtctgctgaggttgga     （配列番号133）
928-948  gagacgacgctcacagagctg      （配列番号134）
1277-1296 ccacccgccggatagtggat       （配列番号135）
【００４４】
R2 ：配列番号1で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
540-523  gtcatcagcagcaagacg         （配列番号136）
541-523  agtcatcagcagcaagacg        （配列番号137）
494-475  gcattgtccacagtatttgc       （配列番号138）
493-474  cattgtccacagtatttgcg       （配列番号139）
492-473  attgtccacagtatttgcga       （配列番号140）
491-473  ttgtccacagtatttgcga        （配列番号141）
490-472  tgtccacagtatttgcgaa        （配列番号142）
489-470  gtccacagtatttgcgaaga       （配列番号143）
488-468  tccacagtatttgcgaagatc      （配列番号144）
487-467  ccacagtatttgcgaagatct      （配列番号145）
486-466  cacagtatttgcgaagatctg      （配列番号146）
678-662  ctcctccttgagagcct          （配列番号147）
677-661  tcctccttgagagcctc          （配列番号148）
676-660  cctccttgagagcctcg          （配列番号149）
675-659  ctccttgagagcctcga          （配列番号150）
673-657  ccttgagagcctcgatc          （配列番号151）
672-655  cttgagagcctcgatctc         （配列番号152）
667-651  gagcctcgatctctgtc          （配列番号153）
666-649  agcctcgatctctgtctc         （配列番号154）
665-649  gcctcgatctctgtctc          （配列番号155）
713-696  acttcctcttcgtggttc         （配列番号156）
721-702  ggccttttacttcctcttcg       （配列番号157）
714-696  tacttcctcttcgtggttc        （配列番号158）
762-746  tacctccacggtcaacc          （配列番号159）
809-792  cggatgtctgccatgatc         （配列番号160）
808-790  ggatgtctgccatgatctt        （配列番号161）
829-812  ccagctcgtcatattggg         （配列番号162）
877-858  caatctgctgagaccagtac       （配列番号163）
874-856  tctgctgagaccagtactt        （配列番号164）
922-906  ctccaacctcagcagac          （配列番号165）
985-969  agtccaggtcgatctcc          （配列番号166）
1006-987  tggccttcagatttctcatg       （配列番号167）
1011-994  caagctggccttcagatt         （配列番号168）
1086-1070 aaggtgcagcaggatcc          （配列番号169）
437-417  taatggctccagtctctgacc      （配列番号170）
515-496  tcaatctgcagaacgatgcg       （配列番号171）
669-649  gagagcctcgatctctgtctc      （配列番号172）
669-650  gagagcctcgatctctgtct       （配列番号173）
857-837  ttgtctagctcctctcggttc      （配列番号174）
857-838  ttgtctagctcctctcggtt       （配列番号175）
981-962  caggtcgatctccaaggact       （配列番号176）
1008-989  gctggccttcagatttctca       （配列番号177）
1350-1331 gctggcttaatgcctcagaa       （配列番号178）
【００４５】
R3 ：配列番号1で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
566-546  agctctgtctcatacttgact      （配列番号179）
541-523  agtcatcagcagcaagacg        （配列番号180）
540-523  gtcatcagcagcaagacg         （配列番号181）
721-702  ggccttttacttcctcttcg       （配列番号182）
713-696  acttcctcttcgtggttc         （配列番号183）
740-724  ctggcaatctgggcttg          （配列番号184）
786-769  gaggtcctgagatttggg         （配列番号185）
854-837  tctagctcctctcggttc         （配列番号186）
877-858  caatctgctgagaccagtac       （配列番号187）
922-906  ctccaacctcagcagac          （配列番号188）
910-894  cagactgtgtggtgacc          （配列番号189）
893-877  actgtggtgctctcctc          （配列番号190）
960-943  gactgtacgtctcagctc         （配列番号191）
1021-1005 ggctgttctccaagctg          （配列番号192）
1056-1039 catctgtagggcgtagcg         （配列番号193）
1141-1125 catactcctgggcctgg          （配列番号194）
476-458  gcgaagatctgagccctca        （配列番号195）
538-521  catcagcagcaagacggg         （配列番号196）
688-670  tgaagagcagctcctcctt        （配列番号197）
885-866  gctctcctcaatctgctgag       （配列番号198）
1008-989  gctggccttcagatttctca       （配列番号199）
1030-1012 cctccctcaggctgttctc        （配列番号200）
1370-1352 ccaaagggtaccctgcttc        （配列番号201）
【００４６】
loop F：配列番号1で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
419-403  acctggggtcccttctt           （配列番号202）
414-396  gggtcccttcttctccaag         （配列番号203）
413-394  ggtcccttcttctccaagtg        （配列番号204）
399-380  caagtgctcccggattttgc        （配列番号205）
398-380  aagtgctcccggattttgc         （配列番号206）
397-379  agtgctcccggattttgct         （配列番号207）
396-378  gtgctcccggattttgctc         （配列番号208）
395-377  tgctcccggattttgctct         （配列番号209）
394-376  gctcccggattttgctctc         （配列番号210）
567-544  cagctctgtctcatacttgactct    （配列番号211）
584-568  acagactggcgcatggc           （配列番号212）
709-688  cctcttcgtggttcttcttcat      （配列番号213）
916-898  cctcagcagactgtgtggt         （配列番号214）
913-894  cagcagactgtgtggtgacc        （配列番号215）
567-544  cagctctgtctcatacttgactct    （配列番号216）
743-726  gagctggcaatctgggct          （配列番号217）
1243-1224 tgtccaaggcatcaccaaga        （配列番号218）
1242-1222 gtccaaggcatcaccaagatt       （配列番号219）
【００４７】
loop R：配列番号1で表される配列上の塩基位置の領域
474-495  cgcaaatactgtggacaatgcc      （配列番号220）
466-489  cagatcttcgcaaatactgtggac    （配列番号221）
444-463  gatcatcgaggacctgaggg        （配列番号222）
626-646  ccaatatcacacgactgcagc       （配列番号223）
617-640  ttgatgacaccaatatcacacgac    （配列番号224）
632-649  tcacacgactgcagctgg          （配列番号225）
659-676  tcgaggctctcaaggagg          （配列番号226）
767-784  cccccaaatctcaggacc          （配列番号227）
970-986  gagatcgacctggactc           （配列番号228）
622-643  gacaccaatatcacacgactgc      （配列番号229）
621-643  tgacaccaatatcacacgactgc     （配列番号230）
623-644  acaccaatatcacacgactgca      （配列番号231）
810-829  ggcccaatatgacgagctgg        （配列番号232）
1296-1315 tggcaaagtggtgtctgaga        （配列番号233）
【００４８】
（実施例１−２）CK18検出用プライマーの設計
実施例１−１で選択された領域の配列から、LAMP法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００４９】
FIP：（領域F1c及びとF2の塩基配列を連結した塩基配列からなるプライマー）
09FA971-376 tgaagtaatggctccagtctctggagagcaaaatccggga (配列番号234)
09FA971-377 tgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccgggag (配列番号235)
09FA971-378 tgaagtaatggctccagtctctggagcaaaatccgggagc (配列番号236)
09FA971-384 tgaagtaatggctccagtctctgaatccgggagcacttgg (配列番号237)
09FA974-376 agtaatggctccagtctctgacgagagcaaaatccggga  (配列番号238)
09FA974-377 agtaatggctccagtctctgacagagcaaaatccgggag  (配列番号239)
09FA974-378 agtaatggctccagtctctgacgagcaaaatccgggagc  (配列番号240)
09FA974-384 agtaatggctccagtctctgacaatccgggagcacttgg  (配列番号241)
09FA970-376 ttgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccggga (配列番号242)
09FA970-377 ttgaagtaatggctccagtctctagagcaaaatccgggag (配列番号243)
09FA970-378 ttgaagtaatggctccagtctctgagcaaaatccgggagc (配列番号244)
09FA970-384 ttgaagtaatggctccagtctctaatccgggagcacttgg (配列番号245)
09FA999-369 gggtcccttcttctccaaggaggctggagagcaaaa     (配列番号246)
09FA994-369 acctggggtcccttcttgaggctggagagcaaaa       (配列番号247)
09FA1000-369 ggtcccttcttctccaagtggaggctggagagcaaaa   (配列番号248)
09FA1002-369 tcccttcttctccaagtgctgaggctggagagcaaaa   (配列番号249)
09FA1004-369 ccttcttctccaagtgctccgaggctggagagcaaaa   (配列番号250)
12FA829-523 acagactggcgcatggccgtcttgctgctgatgac      (配列番号251)
12FA829-524 acagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgactt     (配列番号252)
13FA793-543 tcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc(配列番号253)
13FA793-544 tcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (配列番号254)
13FA793-546 tcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct  (配列番号255)
13FA792-543 atcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc(配列番号256)
13FA792-544 atcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (配列番号257)
13FA792-546 atcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct  (配列番号258)
13FA791-543 catcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc(配列番号259)
13FA791-544 catcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (配列番号260)
13FA791-546 catcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct  (配列番号261)
13FA790-543 tcatcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc(配列番号262)
13FA790-544 tcatcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (配列番号263)
13FA790-546 tcatcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct (配列番号264)
14FA747-588 agcctcgatctctgtctccgaacgacatccatgggc       (配列番号265)
18FA675-660 ggcaatctgggcttgtaggccgaggctctcaaggagg      (配列番号266)
18FA670-660 gagctggcaatctgggctcgaggctctcaaggagg        (配列番号267)
18FA670-662 gagctggcaatctgggctaggctctcaaggaggag        (配列番号268)
18FA674-660 tggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagg      (配列番号269)
18FA674-662 tggcaatctgggcttgtaggaggctctcaaggaggag      (配列番号270)
18FA675-661 ggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagga      (配列番号271)
18FA675-662 ggcaatctgggcttgtaggcaggctctcaaggaggag      (配列番号272)
19FA657-687 cacggtcaacccagagccatgaagaagaaccacgaag      (配列番号273)
21FA618-719 gatcttggcgaggtcctgagcctacaagcccagattg      (配列番号274)
21FA604-747 cggatgtctgccatgatcttggttgaccgtggaggtag     (配列番号275)
23FA584-768 ccagctcgtcatattgggccccccaaatctcaggacc      (配列番号276)
27FA500-839 cagcagactgtgtggtgaccaccgagaggagctagac      (配列番号277)
29FA472-878 gtgagcgtcgtctcagcaaggagagcaccacagtg        (配列番号278)
32FA405-943 gctggccttcagatttctcatggagctgagacgtacagtc   (配列番号279)
ek 335-295 ccaggctcctcactctgtccagagaccatgcaaagcctgaa   (配列番号280)
ek 410-369 tccagtctctgacctggggtcgaggctggagagcaaaa      (配列番号281)
ek 569-523 ctccacagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgac      (配列番号282)
ek 748-708 gggcatctacctccacggtcaaggaagtaaaaggcctacaagcc(配列番号283)
ek 877-837 gaccactgtggtgctctcctcgaaccgagaggagctagacaa  (配列番号284)
ek 904-864 cagctccaacctcagcagactggtctcagcagattgaggagag (配列番号285)
ek 1242-1202 ggtttgcatggagttgctgctgtggaagatggcgaggacttt(配列番号286)
【００５０】
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結した塩基配列からなるプライマー）
09RA444-873 gatcatcgaggacctgaggggtcatcagcagcaagacg      (配列番号287)
09RA444-872 gatcatcgaggacctgagggagtcatcagcagcaagacg     (配列番号288)
09RA420-927 cagagactggagccattacttcacacagtatttgcgaagatctg(配列番号289)
09RA420-925 cagagactggagccattacttcatccacagtatttgcgaagatc(配列番号290)
09RA420-923 cagagactggagccattacttcatgtccacagtatttgcgaa  (配列番号291)
09RA420-921 cagagactggagccattacttcaattgtccacagtatttgcga (配列番号292)
09RA420-919 cagagactggagccattacttcagcattgtccacagtatttgc (配列番号293)
09RA424-927 gactggagccattacttcaagatccacagtatttgcgaagatctg(配列番号294)
09RA424-923 gactggagccattacttcaagatctgtccacagtatttgcgaa (配列番号295)
09RA424-921 gactggagccattacttcaagatcattgtccacagtatttgcga(配列番号296)
12RA598-737 catgggctccgcaaggtcctccttgagagcctcg          (配列番号297)
12RA587-746 agaacgacatccatgggctgagcctcgatctctgtc        (配列番号298)
12RA588-737 gaacgacatccatgggctccctccttgagagcctcg        (配列番号299)
12RA588-746 gaacgacatccatgggctcgagcctcgatctctgtc        (配列番号300)
12RA588-748 gaacgacatccatgggctcgcctcgatctctgtctc        (配列番号301)
12RA590-737 acgacatccatgggctcccctccttgagagcctcg         (配列番号302)
12RA590-746 acgacatccatgggctccgagcctcgatctctgtc         (配列番号303)
12RA590-748 acgacatccatgggctccgcctcgatctctgtctc         (配列番号304)
12RA598-740 catgggctccgcaaggtccttgagagcctcgatc          (配列番号305)
12RA598-746 catgggctccgcaaggtgagcctcgatctctgtc          (配列番号306)
13RA632-700 tcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc        (配列番号307)
13RA632-692 tcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg      (配列番号308)
13RA632-699 tcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc       (配列番号309)
13RA624-700 caccaatatcacacgactgcagacttcctcttcgtggttc    (配列番号310)
13RA624-699 caccaatatcacacgactgcagtacttcctcttcgtggttc   (配列番号311)
13RA624-692 caccaatatcacacgactgcagggccttttacttcctcttcg  (配列番号312)
13RA631-700 atcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc       (配列番号313)
13RA631-699 atcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc      (配列番号314)
13RA631-692 atcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg     (配列番号315)
13RA630-700 tatcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc      (配列番号316)
13RA630-699 tatcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc     (配列番号317)
13RA630-692 tatcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg    (配列番号318)
14RA685-651 ttcatgaagaagaaccacgaagagtacctccacggtcaacc   (配列番号319)
18RA743-604 ctgggttgaccgtggagcggatgtctgccatgatc         (配列番号320)
18RA743-605 ctgggttgaccgtggagggatgtctgccatgatctt        (配列番号321)
18RA747-604 gttgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc     (配列番号322)
18RA749-604 tgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc       (配列番号323)
18RA751-604 accgtggaggtagatgcccggatgtctgccatgatc        (配列番号324)
18RA749-605 tgaccgtggaggtagatgcggatgtctgccatgatctt      (配列番号325)
18RA751-605 accgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatctt       (配列番号326)
19RA766-584 gcccccaaatctcaggacccagctcgtcatattggg        (配列番号327)
21RA812-536 cccaatatgacgagctggctcaatctgctgagaccagtac    (配列番号328)
23RA855-491 caagtactggtctcagcagattgctccaacctcagcagac    (配列番号329)
27RA924-428 tgctgagacgacgctcacagtccaggtcgatctcc         (配列番号330)
29RA947-402 tgagacgtacagtccagtcccaagctggccttcagatt      (配列番号331)
29RA947-407 tgagacgtacagtccagtcctggccttcagatttctcatg    (配列番号332)
32RA1016-327 acagcctgagggaggtgaaggtgcagcaggatcc         (配列番号333)
ek 360-417  cgagaaccggaggctggagataatggctccagtctctgacc   (配列番号334)
ek 443-496  agatcatcgaggacctgagggctcaatctgcagaacgatgcg  (配列番号335)
ek 592-649  gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtctc   (配列番号336)
ek 592-650  gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtct    (配列番号337)
ek 778-837  caggacctcgccaagatcatgggaaccgagaggagctagacaa (配列番号338)
ek 900-962  cacacagtctgctgaggttggacaggtcgatctccaaggact  (配列番号339)
ek 928-989  gagacgacgctcacagagctggctggccttcagatttctca   (配列番号340)
ek 1277-1331 ccacccgccggatagtggatgctggcttaatgcctcagaa   (配列番号341)
【００５１】
F3プライマー：（各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー）
F309-322（配列番号66）、F309-293（配列番号67）、
F312-470（配列番号68）、F312-466（配列番号69）、
F312-473（配列番号70）、F312-476（配列番号71）、
F313-523（配列番号72）、F314-546（配列番号73）、
F319-624（配列番号74）、F321-687（配列番号75）、
F321-695（配列番号76）、F323-747（配列番号77）、
F327-812（配列番号78）、F329-845（配列番号79）、
F329-855（配列番号80）、F332-907（配列番号81）、
F3 8    （配列番号82）、F3 13   （配列番号83）、
F3 14   （配列番号84）、F3 16   （配列番号85）、
F3 23   （配列番号86）、F3 29   （配列番号87）
F3 37   （配列番号88）
【００５２】
R3プライマー：（各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー）
R309-847（配列番号179）、R309-872（配列番号180）、
R309-873（配列番号181）、R312-692（配列番号182）、
R312-700（配列番号183）、R313-673（配列番号184）、
R314-627（配列番号185）、R318-559（配列番号186）、
R319-536（配列番号187）、R321-491（配列番号188）、
R321-503（配列番号189）、R321-520（配列番号190）、
R323-453（配列番号191）、R327-392（配列番号192）、
R329-357（配列番号193）、R332-272（配列番号194）、
B3 8    （配列番号195）、B3 13   （配列番号196）、
B3 14   （配列番号197）、B3 19   （配列番号198）、
B3 21   （配列番号199）、B3 35   （配列番号200）、
B3 37   （配列番号201）
【００５３】
ループプライマー：（各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー）
LF09-994 （配列番号202）、LF09-999 （配列番号203）、
LF09-1000（配列番号204）、LF09-1014（配列番号205）、
LF09-1015（配列番号206）、LF09-1016（配列番号207）、
LF09-1017（配列番号208）、LF09-1018（配列番号209）、
LF09-1019（配列番号210）、LF12-846 （配列番号211）、
LF13-829 （配列番号212）、LF18-704 （配列番号213）、
LF29-497 （配列番号214）、LF29-500 （配列番号215）、
LF 14    （配列番号216）、LF 20    （配列番号217）、
LF 371   （配列番号218）、LF 372   （配列番号219）
LR09-474 （配列番号220）、LR09-466 （配列番号221）、
LR09-444 （配列番号222）、LR12-626 （配列番号223）、
LR12-617 （配列番号224）、LR12-632 （配列番号225）、
LR13-659 （配列番号226）、LR18-767 （配列番号227）、
LR29-970 （配列番号228）、LB 14    （配列番号229）、
LB 151   （配列番号230）、LB 152   （配列番号231）、
LB 371   （配列番号232）、LB 372   （配列番号233）
【００５４】
（実施例２−１）ヒトCK19塩基配列からの領域の選択
配列番号342に記載するヒトCK19の遺伝子の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてLAMP法に適切な領域の位置を検討した。F1c及びR1cはTm値が58.5〜63.5℃、F2及びR2はTm値が61.5〜62.5℃、F3及びR3はTm値が58.5〜62.5℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号342で表される塩基配列の270〜930番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００５５】
F1c：配列番号342に記載する配列の相補鎖における領域
426-405 5'-tgtagtagtggctgtagtcgcg-3'   （配列番号343）
429-407 5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcg-3'  （配列番号344）
479-458 5'-ggagttctcaatggtggcacca-3'   （配列番号345）
716-700 5'-ttggcccctcagcgtac-3'        （配列番号346）
752-735 5'-agcggaatccacctccac-3'       （配列番号347）
747-728 5'-aatccacctccacactgacc-3'     （配列番号348）
746-728 5'-atccacctccacactgacc-3'      （配列番号349）
745-728 5'-tccacctccacactgacc-3'       （配列番号350）
【００５６】
F2：配列番号342に記載する配列上の領域
352-370 5'-agctagaggtgaagatccg-3'      （配列番号351）
364-380 5'-agatccgcgactggtac-3'        （配列番号352）
360-376 5'-gtgaagatccgcgactg-3'        （配列番号353）
417-437 5'-actactacacgaccatccagg-3'    （配列番号354）
658-674 5'-aagagctggcctacctg-3'        （配列番号355）
690-709 5'-gaggaaatcagtacgctgag-3'     （配列番号356）
【００５７】
F3：配列番号342に記載する配列上の領域
275-293 5'-gctaaccatgcagaacctc-3'      （配列番号357）
375-392 5'-tggtaccagaagcagggg-3'       （配列番号358）
628-645 5'-acctggagatgcagatcg-3'       （配列番号359）
658-674 5'-aagagctggcctacctg-3'        （配列番号360）
661-677 5'-agctggcctacctgaag-3'        （配列番号361）
【００５８】
R1c：配列番号342に記載する配列上の領域
460-479 5'-gtgccaccattgagaactcc-3'     （配列番号362）
485-505 5'-tgtcctgcagatcgacaacgc-3'    （配列番号363）
486-506 5'-gtcctgcagatcgacaacgcc-3'    （配列番号364）
727-744 5'-aggtcagtgtggaggtgg-3'       （配列番号365）
764-783 5'-tctcgccaagatcctgagtg-3'     （配列番号366）
766-785 5'-tcgccaagatcctgagtgac-3'     （配列番号367）
772-793 5'-agatcctgagtgacatgcgaag-3'   （配列番号368）
【００５９】
R2 ：配列番号342に記載する配列の相補鎖における領域
533-516 5'-ggttcggaagtcatctgc-3'       （配列番号369）
545-526 5'-cgtctcaaacttggttcgga-3'     （配列番号370）
547-528 5'-tccgtctcaaacttggttcg-3'     （配列番号371）
790-773 5'-cgcatgtcactcaggatc-3'       （配列番号372）
841-824 5'-caggcttcagcatccttc-3'       （配列番号373）
848-832 5'-ggtgaaccaggcttcag-3'        （配列番号374）
847-831 5'-gtgaaccaggcttcagc-3'        （配列番号375）
845-828 5'-gaaccaggcttcagcatc-3'       （配列番号376）
843-827 5'-accaggcttcagcatcc-3'        （配列番号377）
【００６０】
R3 ：配列番号342に記載する配列の相補鎖における領域
556-540 5'-agagcctgttccgtctc-3'        （配列番号378）
584-567 5'-gttgatgtcggcctccac-3'       （配列番号379）
841-824 5'-caggcttcagcatccttc-3'       （配列番号380）
916-900 5'-tcggacctgctcatctg-3'        （配列番号381）
925-908 5'-tcagtaacctcggacctg-3'       （配列番号382）
923-907 5'-agtaacctcggacctgc-3'        （配列番号383）
921-905 5'-taacctcggacctgctc-3'        （配列番号384）
【００６１】
loop F：配列番号342に記載する配列の相補鎖における領域
395-381 5'-aggcccctgcttctg-3'         （配列番号385）
393-379 5'-gcccctgcttctggt-3'         （配列番号386）
392-376 5'-cccctgcttctggtacc-3'       （配列番号387）
392-375 5'-cccctgcttctggtacca-3'      （配列番号388）
393-376 5'-gcccctgcttctggtacc-3'      （配列番号389）
395-380 5'-aggcccctgcttctgg-3'        （配列番号390）
394-379 5'-ggcccctgcttctggt-3'        （配列番号391）
457-440 5'-agaatcttgtcccgcagg-3'      （配列番号392）
456-440 5'-gaatcttgtcccgcagg-3'       （配列番号393）
699-680 5'-tgatttcctcctcatggttc-3'    （配列番号394）
698-679 5'-gatttcctcctcatggttct-3'    （配列番号395）
694-676 5'-tcctcctcatggttcttct-3'     （配列番号396）
734-718 5'-actgacctggcctccca-3'       （配列番号397）
724-710 5'-cctcccacttggccc-3'         （配列番号398）
【００６２】
loop R：配列番号342に記載する配列上の領域
493-510 5'-agatcgacaacgcccgtc-3'      （配列番号399）
495-512 5'-atcgacaacgcccgtctg-3'      （配列番号400）
495-509 5'-atcgacaacgcccgt-3'         （配列番号401）
496-509 5'-tcgacaacgcccgt-3'          （配列番号402）
506-520 5'-ccgtctggctgcaga-3'         （配列番号403）
507-520 5'-cgtctggctgcagatga-3'       （配列番号404）
508-525 5'-gtctggctgcagatgact-3'      （配列番号405）
509-526 5'-tctggctgcagatgactt-3'      （配列番号406）
752-767 5'-tccgggcaccgatctc-3'        （配列番号407）
756-771 5'-ggcaccgatctcgcca-3'        （配列番号408）
755-769 5'-gggcaccgatctcgc-3'         （配列番号409）
757-771 5'-gcaccgatctcgcca-3'         （配列番号410）
805-822 5'-tcatggccgagcagaacc-3'      （配列番号411）
806-821 5'-catggccgagcagaac-3'        （配列番号412）
【００６３】
（実施例２−２）CK19検出用プライマーの設計
実施例２−１で選択された領域の配列から、LAMP法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
各プライマーを、本発明のRT-LAMP法において使用するプライマーセットとして示し、領域ごとにＡ〜Ｄの４つのグループに分類した。Ａグループの各プライマーは、配列番号342で表される塩基配列の270〜560番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、Ｂグループの各プライマーは、同様に370〜585番目の領域及びその相補鎖の領域、Ｃグループの各プライマーは、同様に625〜854番目の領域及びその相補鎖の領域、Ｄグループの各プライマーは、同様に655〜930番目の領域及びその相補鎖の領域の各領域から選択される。
【００６４】
（Ａグループ）
FIP：（領域F1c及びF2の塩基配列を連結したもの）
FA-401  5'-tgtagtagtggctgtagtcgcgagctagaggtgaagatccg-3' (配列番号413)
（配列番号343及び351に示す塩基配列を連結したもの）
FA-403  5'-tgtagtagtggctgtagtcgcgagatccgcgactggtac-3'   (配列番号414)
（配列番号343及び352に示す塩基配列を連結したもの）
FA-404  5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagctagaggtgaagatccg-3'(配列番号415)
（配列番号344及び351に示す塩基配列を連結したもの）
FA-405  5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcggtgaagatccgcgactg-3'  (配列番号416)
（配列番号344及び353に示す塩基配列を連結したもの）
FA-406  5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagatccgcgactggtac-3'  (配列番号417)
（配列番号344及び352に示す塩基配列を連結したもの）
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結したもの）
RA-401  5'-gtgccaccattgagaactccggttcggaagtcatctgc-3'    (配列番号418)
（配列番号362及び369に示す塩基配列を連結したもの）
F3プライマー： （F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3-401  5'-gctaaccatgcagaacctc-3'                       (配列番号357)
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-401  5'-agagcctgttccgtctc-3'                         (配列番号378)
ループプライマー：(loop F領域又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
LPF-401 5'-aggcccctgcttctg-3'                          （配列番号385）
LPF-402 5'-gcccctgcttctggt-3'                          （配列番号386）
LPF-403 5'-cccctgcttctggtacc-3'                        （配列番号387）
LPF-404 5'-cccctgcttctggtacca-3'                       （配列番号388）
LPF-405 5'-gcccctgcttctggtacc-3'                       （配列番号389）
LPF-406 5'-aggcccctgcttctgg-3'                         （配列番号390）
LPF-407 5'-ggcccctgcttctggt-3'                         （配列番号391）
LPR-401 5'-agatcgacaacgcccgtc-3'                       （配列番号399）
LPR-402 5'-atcgacaacgcccgtctg-3'                       （配列番号400）
LPR-403 5'-atcgacaacgcccgt-3'                          （配列番号401）
LPR-404 5'-tcgacaacgcccgt-3'                           （配列番号402）
【００６５】
（Ｂグループ）
FIP：（領域F1c及びF2の塩基配列を連結したもの）
FA1-EK 5'-ggagttctcaatggtggcaccaactactacacgaccatccagg-3'(配列番号419)
（配列番号345及び354に示す塩基配列を連結したもの）
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結したもの）
RA2-EK  5'-tgtcctgcagatcgacaacgccgtctcaaacttggttcgga-3' (配列番号420)
（配列番号363及び370に示す塩基配列を連結したもの）
RA6-EK  5'-gtcctgcagatcgacaacgcctccgtctcaaacttggttcg-3' (配列番号421)
（配列番号364及び371に示す塩基配列を連結したもの）
F3プライマー：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3-EK     5'-tggtaccagaagcagggg-3'                      (配列番号358)
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-EK     5'-gttgatgtcggcctccac-3'                      (配列番号379)
ループプライマー：(loop F領域又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
LPF1-EK   5'-agaatcttgtcccgcagg-3'                      (配列番号392)
LPF2-EK   5'-gaatcttgtcccgcagg-3'                       (配列番号393)
LPR1-EK   5'-ccgtctggctgcaga-3'                         (配列番号403)
LPR2-EK   5'-cgtctggctgcagatga-3'                       (配列番号404)
LPR3-EK   5'-gtctggctgcagatgact-3'                      (配列番号405)
LPR4-EK   5'-tctggctgcagatgactt-3'                      (配列番号406)
【００６６】
（Ｃグループ）
FIP：（領域F1c及びF2の塩基配列を連結したもの）
FA-1101  5'-ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3'       (配列番号422)
（配列番号346及び355に示す塩基配列を連結したもの）
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結したもの）
RA-1101  5'-aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3'     (配列番号423)
（配列番号365及び372に示す塩基配列を連結したもの）
F3プライマー：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3-1101  5'-acctggagatgcagatcg-3'                       (配列番号359)
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-1101  5'-caggcttcagcatccttc-3'                       (配列番号380)
ループプライマー：(loop F領域又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
LPF-1101 5'-tgatttcctcctcatggttc-3'                     (配列番号394)
LPF-1102 5'-gatttcctcctcatggttct-3'                     (配列番号395)
LPF-1103 5'-tcctcctcatggttcttct-3'                      (配列番号396)
LPR-1101 5'-tccgggcaccgatctc-3'                        （配列番号407）
LPR-1102 5'-ggcaccgatctcgcca-3'                        （配列番号408）
LPR-1103 5'-gggcaccgatctcgc-3'                         （配列番号409）
LPR-1104 5'-gcaccgatctcgcca-3'                         （配列番号410）
【００６７】
（Ｄグループ）
FIP：（領域F1c及びF2の塩基配列を連結したもの）
FA-601  5'-agcggaatccacctccacgaggaaatcagtacgctgag-3'   （配列番号424）
（配列番号347及び356に示す塩基配列を連結したもの）
FA-602  5'-aatccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3' （配列番号425）
（配列番号348及び356に示す塩基配列を連結したもの）
FA-603  5'-atccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3'  （配列番号426）
（配列番号349及び359に示す塩基配列を連結したもの）
FA-604  5'-tccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3'   （配列番号427）
（配列番号350及び356に示す塩基配列を連結したもの）
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結したもの）
RA-601  5'-tctcgccaagatcctgagtgcaggcttcagcatccttc-3'   （配列番号428）
（配列番号366及び373に示す塩基配列を連結したもの）
RA-602  5'-tctcgccaagatcctgagtgggtgaaccaggcttcag-3'    （配列番号429）
（配列番号366及び374に示す塩基配列を連結したもの）
RA-603  5'-tctcgccaagatcctgagtggtgaaccaggcttcagc-3'    （配列番号430）
（配列番号366及び375に示す塩基配列を連結したもの）
RA-604  5'-tctcgccaagatcctgagtggaaccaggcttcagcatc-3'   （配列番号431）
（配列番号366及び376に示す塩基配列を連結したもの）
RA-605  5'-tctcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatcc-3'    （配列番号432）
（配列番号366及び377に示す塩基配列を連結したもの）
RA-606  5'-tcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatccttc-3'   （配列番号433）
（配列番号367及び373に示す塩基配列を連結したもの）
RA-607  5'-agatcctgagtgacatgcgaagcaggcttcagcatccttc-3' （配列番号434）
（配列番号368及び373に示す塩基配列を連結したもの）
F3プライマー：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3-601  5'-aagagctggcctacctg-3'                        （配列番号360）
F3-602  5'-agctggcctacctgaag-3'                        （配列番号361）
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-601  5'-tcggacctgctcatctg-3'                        （配列番号381）
R3-602  5'-tcagtaacctcggacctg-3'                       （配列番号382）
R3-603  5'-agtaacctcggacctgc-3'                        （配列番号383）
R3-604  5'-taacctcggacctgctc-3'                        （配列番号384）
ループプライマー：(loop F領域又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
LPF-601 5'-actgacctggcctccca-3'                        （配列番号397）
LPF-602 5'-cctcccacttggccc-3'                          （配列番号398）
LPR-601 5'-tcatggccgagcagaacc-3'                       （配列番号411）
LPR-602 5'-catggccgagcagaac-3'                         （配列番号412）
【００６８】
（実施例３−１）ヒトCK20塩基配列からの領域の選択
配列番号435に記載するヒトCK20の塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてLAMP法に適切な領域の位置を検討した。F1c及びR1cはTm値が58.5〜63.5℃、F2及びR2はTm値が61.5〜62.5℃、F3及びR3はTm値が58.5〜62.5℃の条件により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号435で表される塩基配列の340〜1050番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる。
【００６９】
F1c：配列番号435に記載する配列の相補鎖における領域
920-900  5'-ttcatgctgagatgggactgg-3'           （配列番号436）
915-895  5'-gctgagatgggactggagttc-3'           （配列番号437）
436-416  5'-caatttgcaggacacaccgag-3'           （配列番号438）
F2 ：配列番号435に記載する配列上の領域
847-865  5'-gaggttcaactaacggagc-3'             （配列番号439）
850-869  5'-gttcaactaacggagctgag-3'            （配列番号440）
855-872  5'-actaacggagctgagacg-3'              （配列番号441）
370-388  5'-attgaagagctgcgaagtc-3'             （配列番号442）
F3 ：配列番号435に記載する配列上の領域
345-367  5'-cgactacagtgcatattacagac-3'         （配列番号443）
805-822  5'-cagcaacaggtcacagtg-3'              （配列番号444）
【００７０】
R1c：配列番号435に記載する配列上の領域
940-958  5'-ctagaggagaccaaggccc-3'             （配列番号445）
939-958  5'-tctagaggagaccaaggccc-3'            （配列番号446）
947-966  5'-agaccaaggcccgttacagc-3'            （配列番号447）
452-472  5'-ctgctgaggacttcagactga-3'           （配列番号448）
R2 ：配列番号435に記載する配列の相補鎖における領域
1004-987 5'-agagagctcaacagcgac-3'              （配列番号449）
1007-990 5'-tccagagagctcaacagc-3'              （配列番号450）
994-978  5'-acagcgactggaggttg-3'               （配列番号451）
1000-984 5'-agctcaacagcgactgg-3'               （配列番号452）
523-505  5'-cttggagatcagcttccac-3'             （配列番号453）
R3 ：配列番号435に記載する配列の相補鎖における領域
556-535  5'-gtagggttaggtcatcaaagac-3'          （配列番号454）
1044-1027  5'-gcgttccatgttactccg-3'            （配列番号455）
【００７１】
loop F：配列番号435に記載する配列の相補鎖における領域
409-389 5'-gcagttgagcatccttaatct-3'            （配列番号456）
891-875  5'-ctcaaggctctgggagg-3'               （配列番号457）
loop R：配列番号435に記載する配列上の領域
480-499  5'-gactgagagaggaatacgtc-3'            （配列番号458）
968-985  5'-gccagttagccaacctcc-3'              （配列番号459）
970-985  5'-cagttagccaacctcc-3'                （配列番号460）
【００７２】
（実施例３−２）CK20検出用プライマーの設計
実施例３−１で選択された領域の配列から、LAMP法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００７３】
FIP：（領域F1c及びF2の塩基配列を連結したもの）
KFA-5   5'-ttcatgctgagatgggactgggaggttcaactaacggagc-3' （配列番号461）
（配列番号436及び439に示す塩基配列を連結したもの）
KFA-5a  5'-ttcatgctgagatgggactgggttcaactaacggagctgag-3'（配列番号462）
（配列番号436及び440に示す塩基配列を連結したもの）
KFA-5b  5'-ttcatgctgagatgggactggactaacggagctgagacg-3'  （配列番号463）
（配列番号436及び441に示す塩基配列を連結したもの）
KFA-5d  5'-gctgagatgggactggagttcgaggttcaactaacggagc-3' （配列番号464）
（配列番号437及び439に示す塩基配列を連結したもの）
KFA-5e  5'-gctgagatgggactggagttcgttcaactaacggagctgag-3'（配列番号465）
（配列番号437及び440に示す塩基配列を連結したもの）
KFA-5f  5'-gctgagatgggactggagttcactaacggagctgagacg-3'  （配列番号466）
（配列番号437及び441に示す塩基配列を連結したもの）
AFA     5'-caatttgcaggacacaccgagattgaagagctgcgaagtc-3' （配列番号467）
（配列番号438及び442に示す塩基配列を連結したもの）
【００７４】
RIP：（領域R1c及びR2の塩基配列を連結したもの）
KRA-5   5'-ctagaggagaccaaggcccagagagctcaacagcgac-3'    （配列番号468）
（配列番号445及び449に示す塩基配列を連結したもの）
KRA-5a  5'-tctagaggagaccaaggccctccagagagctcaacagc-3'   （配列番号469）
（配列番号446及び450に示す塩基配列を連結したもの）
KRA-5c  5'-tctagaggagaccaaggcccacagcgactggaggttg-3'    （配列番号470）
（配列番号446及び451に示す塩基配列を連結したもの）
KRA-5d  5'-agaccaaggcccgttacagcagagagctcaacagcgac-3'   （配列番号471）
（配列番号447及び449に示す塩基配列を連結したもの）
KRA-5e  5'-agaccaaggcccgttacagctccagagagctcaacagc-3'   （配列番号472）
（配列番号447及び450に示す塩基配列を連結したもの）
KRA-5f  5'-agac caaggcccgttacagcagctcaacagcgactgg-3'   （配列番号473）
（配列番号447及び452に示す塩基配列を連結したもの）
ARAf    5'-ctgctgaggacttcagactgacttggagatcagcttccac-3' （配列番号474）
（配列番号448及び453に示す塩基配列を連結したもの）
【００７５】
F3プライマー：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
AF3     5'-cgactacagtgcatattacagac-3'                  （配列番号443）
KF3-5   5'-cagcaacaggtcacagtg-3'                       （配列番号444）
【００７６】
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
AR3     5'-gtagggttaggtcatcaaagac-3'                   （配列番号454）
KR3-5   5'-gcgttccatgttactccg-3'                       （配列番号455）
【００７７】
ループプライマー：(loop F又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
LPF2    5'-gcagttgagcatccttaatct-3'                    （配列番号456）
K-LPF2  5'-ctcaaggctctgggagg-3'                        （配列番号457）
LPR6    5'-gactgagagaggaatacgtc-3'                     （配列番号458）
K-LPR1  5'-gccagttagccaacctcc-3'                       （配列番号459）
K-LPR2  5'-cagttagccaacctcc-3'                         （配列番号460）
【００７８】
【実験例】
上記で取得したCK18、CK19又はCK20検出用の各種プライマーを用いてRT-LAMP法を実施した場合の効果を、実験例１〜３により測定し、確認した。
【００７９】
（実験例１−１）増幅の確認
ヒトCK18検出用の各種プライマーを次の組合せでRT-LAMP法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【００８０】
１）ヒトCK18RNA試料の調製方法
ヒトCK18の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてRT-PCRを行うことにより、KATOIII（胃癌細胞）由来トータルRNAから、ヒトCK18cDNAを単離した。pBluescript（STRATAGENE社製プラスミド）にクローニングしたヒトCK18cDNAから、in vitroでの転写システム（Riboprobe in vitro transcription system（Promega社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のRNA濃度を260nmでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトCK18のRNAコピー数が60000、6000、600、60、6及び0（対照）となるように50 ng/μL yeast RNA（Amibon社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【００８１】
２）ヒトCK18検出用プライマーセット
各種プライマーを（表１）の組合せで用いた。
0004386671.tif 000002
【００８２】
３）反応液組成
dNTPs  (GIBCO社製)                                   0.4 mM
MgSO4                                                  2 mM
ジチオトレイトール(dithiothreitol)                     5 mM
ベタイン(betaine)(Sigma社製)                         640 mM
Thermopol buffer  (New  England  BioLabs)
AMV 逆転写酵素  (Promega社製)                         1.25U
Bst DNA ポリメラーゼ (New England BioLabs社製)          16U
エチジウムブロマイド(ethidium bromide)           0.125 mg/mL
プライマー
FIP          40pmol,    RIP          40pmol,
F3プライマー  5pmol,    R3プライマー  5pmol,
ループプライマー(loop F, loop R)  各 20pmol
【００８３】
４）RT-LAMP法
上記６種のプライマーを含む反応液23μlに、ヒトCK18のRNA試料を2μl添加し、65℃で１時間加温して行った。
【００８４】
５）増幅の確認
増幅産物は２本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加 (Rn) をABI社製PRISM7700を用いてリアルタイム法により測定した。
【００８５】
６）結果
I〜IVの各プライマーセットを用いた場合の結果を各々図１〜４に示した。その結果、各セットについてヒトCK18の鋳型の量が多いほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。プライマーセットI及びIIIでは、600コピーの場合でも20分以内に増幅が確認され、プライマーセットIIでは6000コピーの場合に約20分で増幅が確認され、プライマーセットIVの場合は6000コピーの場合に約20分で増幅が確認され、600コピーの場合でも約30分で増幅が確認された。
【００８６】
（実験例１−２）ループプライマーの効果
実験例１−１で検討したプライマーセットのうち、増幅の確認に要する時間が短かったプライマーセットIを選択し、ループプライマーを用いた場合と用いない場合での感度を調べることを目的として実験を行った。
【００８７】
１）ヒトCK18RNA試料の調製方法
実験例１−１と同様の操作を行い、コピー数が60000、6000、600及び0（対照）となるよう試料を調製した。
【００８８】
２）プライマーセット
表１に示すプライマーセットI 及びプライマーセットI から各ループプライマーを除いたプライマーセットを用いた。
【００８９】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用し、ループプライマーのないセットについては、ループプライマーを添加しなかった。
【００９０】
４）RT-LAMP法
6種又は4種のプライマーを含む反応液23μlに、ヒトCK18のRNA試料を2μlとなるよう添加し、65℃で１時間加温して行った。
【００９１】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【００９２】
６）結果
測定結果を図５及び図６に示した。その結果、ループプライマーを用いたほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし、ループプライマーを用いない場合でも、60000コピーの場合で約50分でヒトCK18の増幅が確認された。
【００９３】
（実験例１−３）ヒトCK18に対する増幅特異性
プライマーセットI を用いて測定した場合のヒトCK18に対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（CK）には、ヒトCK18のほかにヒトCK19，20等のアイソフォームが知られており、これらはヒトCK18と約60％のホモロジーを有する塩基配列からなる。上記プライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトCK19又は20と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【００９４】
１）RNA試料の調製方法
実験例１−１と同様の操作を行い、コピー数が60000のヒトCK18のRNA試料を調製した。ヒトCK19及びヒトCK20のRNAについても同様に試料を調製した。
【００９５】
２）プライマーセット
表１に示すプライマーセットI を用いた。
【００９６】
３）反応液組成
組成は実験例１−１と同様のものを使用した。
【００９７】
４）RT-LAMP法
実験例１−１と同様の条件で行った。
【００９８】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【００９９】
６）結果
その結果を図７に示した。その結果、プライマーセットI を用いると、ヒトCK18RNAは増幅するが、ヒトCK19RNA及びヒトCK20RNAについては全く増幅せず、プライマーセットIはヒトCK18RNAに特異性があることが確認された。
【０１００】
（実験例２−１）ヒトCK19検出用プライマーセット（Ａグループ）の効果
実施例２−２で示されたＡグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトCK19のRNAをRT-LAMP法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１０１】
１）プライマーセット（Ａグループ）
FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3-401及び R3: R3-401の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらに各種ループプライマー：LPF-401とLPR-401、LPF-401とLPR-402、LPF-401とLPR-403、又はLPF-401とLPR-404を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１０２】
２）ヒトCK19RNA試料の調製方法
ヒトCK19の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてRT-PCRを行うことにより、KATOIII（胃癌細胞）由来トータルRNAから、ヒトCK19cDNAを単離した。pBluescript(STRATAGENE社製プラスミド)にクローニングしたヒトCK19cDNAから、in vitroでの転写システム(Riboprobe in vitro transcription system (Promega社製))を用いて転写産物を合成した。得られた原液のRNA濃度を260nmでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトCK19のRNAコピー数が60000、6000、600及び0 (対照)となるように50 ng/μL yeast RNA（Amibon社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【０１０３】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用した。ループプライマーのないセットについては、ループプライマーは添加しなかった。
【０１０４】
４）RT-LAMP法
上記のうちループプライマーを含まない4種、又はループプライマーを含む6種のプライマーを含む反応液23μLに、ヒトCK19のRNA試料を2μL添加し、65℃で1時間加温して行った。
【０１０５】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【０１０６】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット、及び各種ループプライマーを用いたプライマーセットによる結果を図８〜１２に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合には、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は試験開始後約40分であった。一方、図９〜１２に示すように、ループプライマーを加えた系では、約10分から20分の間に増幅を確認することができた。
【０１０７】
（実験例２−２）ヒトCK19検出用プライマーセット（Ｃグループ）の効果
実施例２−２で示されたＣグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトCK19のRNAをRT-LAMP法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１０８】
１）プライマーセット（Ｃグループ）
FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101及びR3: R3-1101の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらに各種ループプライマー：LPF-1101とLPR-1101、LPF-1101とLPR-1102、LPF-1101とLPR-1103、LPF-1101とLPR-1104、LPF-1102とLPR-1101、又はLPF-1103とLPR-1101を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１０９】
２）ヒトCK19RNA試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、60000、6000、600、60及び0 (対照)となるように調製した。
【０１１０】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１１１】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット、及び各種ループプライマーを用いたプライマーセットによる結果を図１３〜１９に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合には、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は試験開始後約30分であった（図１３）。一方、ループプライマーを用いた系では、LPF-1101とLPR-1101（図１４）、LPF-1101とLPR-1102（図１５）、LPF-1101とLPR-1104（図１７）、LPF-1102とLPR-1101（図１８）又はLPF-1103とLPR-1101（図１９）を組合せた場合に約10分から20分の間に増幅を確認することができ、LPF-1101とLPR-1103（図１６）を組合せた場合には約20分で増幅を確認することができた。
【０１１２】
（実験例２−３）ヒトCK19検出用プライマーセット（Ｄグループ）の効果
実施例２−２で示されたＤグループから選択されるプライマーセットを用いてヒトCK19のRNAをRT-LAMP法で測定した場合の増幅パターンを調べることを目的として実験を行った。
【０１１３】
１）プライマーセット（Ｄグループ）
FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3-601及びR3: R3-601の各プライマーからなるプライマーセット、並びにさらにループプライマー：LPF-601とLPR-601を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１１４】
２）ヒトCK19RNA試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、60000、6000、600、60及び0 (対照)となるように調製した。
【０１１５】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１１６】
６）結果
ループプライマーを用いないプライマーセット及び用いたプライマーセットによる結果をそれぞれ図２０及び図２１に示した。その結果、ループプライマーを用いない場合は、核酸の増幅が確認できるまでに要する時間は約70分であった。また、コピー数が0でも非特異的な増幅が起こり若干特異性が低かった。一方、ループプライマーを用いた場合は、約20分程度で増幅が確認でき、かつコピー数が0で非特異増幅は起こらなかった。ループプライマーを用いることにより特異性は向上した。
【０１１７】
（実験例２−４）測定感度
実験例２−１〜２−３で示されたＡ、Ｃ、Ｄの各グループから選択された各プライマーセット及びＢグループから選択されたプライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトCK19RNAの測定感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１１８】
１）プライマーセット：
Ａグループ：FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3-401, R3: R3-401,
ループプライマー：LPF-401, LPR-404
Ｂグループ：FIP: FA1-EK, RIP: RA6-EK, F3: F3-EK, R3: R3-EK,
ループプライマー：LPF1-EK, LPR2-EK
Ｃグループ：FIP: FA-1101, RIP: RA-1101,
F3: F3-1101, R3: R3-1101,
ループプライマー：LPF-1101, LPR-1101
Ｄグループ：FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3-601, R3: R3-601,
ループプライマー：LPF-601, LPR-601
【０１１９】
２）ヒトCK19RNA試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、60000、20000、6000、2000、600、200、60、20及び0 (対照)となるように調製した。
【０１２０】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例２−１と同様の手法により行った。
【０１２１】
６）結果
結果を図２２〜２５に示した。その結果、各グループのプライマーセットについて、ヒトCK19RNAのコピー数が大きい方が核酸の増幅が確認できるまでに要する時間が短かく、コピー数が60000の場合に15〜25分程度で増幅が認められた。また、Ａグループについてはコピー数が200以上の場合に20〜30分（図２２）、Ｂグループについてはコピー数が200以上の場合に15〜25分（図２３）、Ｃグループについてはコピー数が600以上の場合に15〜25分（図２４）及びＤグループについてはコピー数が200以上の場合に25〜35分（図２５）で増幅が認められた。
【０１２２】
（実験例２−５）ヒトCK19RNAに対する増幅特異性
実験例２−４で示された各プライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトCK19RNAに対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（CK）には、ヒトCK19のほかにヒトCK18，20等のアイソフォームが知られており、これらはヒトCK19と約60％のホモロジーを有する塩基配列からなる。上記プライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトCK18又は20と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【０１２３】
１）プライマーセット
実験例２−４と同じプライマーセットについて調べた。
【０１２４】
２）RNA試料の調製
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が60000、6000、600及び0 (対照)となるようにヒトCK19RNA試料を調製した。ヒトCK18及びヒトCK20のRNAについては同様に各々コピー数が60000の試料を調製した。
【０１２５】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例２−１の手法によりおこなった。
【０１２６】
６）結果
実験例２−４で示された各プライマーセットによる結果を図２６〜２９に示した。その結果、いずれのグループのプライマーセットも、ヒトCK19RNAに特異的に増幅が認められたが、ヒトCK18RNA及びヒトCK20RNAについては増幅を認めなかった。
【０１２７】
（実験例２−６）ヒトCK19RNAに対する増幅の確認（濁度の測定）
１）プライマーセット（Ｃグループ）
FIP: FA-1101、RIP: RA-1101、F3: F3-1101、R3: R3-1101及び各ループプライマー：LPF-1101とLPR-1101を組合せて用いたプライマーセットの場合について調べた。
【０１２８】
２）ヒトCK19RNA試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、100000、10000、1000及び0 (対照)となるように調製した。
【０１２９】
３）反応液組成
0004386671.tif 000003
【０１３０】
４）RT-LAMP法は実験例２−１と同様の手法により行った。反応は0.2mlのチューブ内で65℃で1.5時間行った。
【０１３１】
５）増幅の確認
RT-LAMP反応物の濁度を、波長500nmにおける吸光度により経時的に測定した。測定装置はテラメックス社製のLA-200を使用した。
【０１３２】
６）結果
その結果を図３０に示した。鋳型コピー数に応じて、測定開始後11〜13分の間で、増幅開始が認められた。
【０１３３】
（実験例２−７）ヒトCK19RNAに対する増幅の確認（濁度の測定）
１）プライマーセット（Ｃグループ）
FIP: FA-1101、RIP: RA-1101、F3: F3-1101、R3: R3-1101及び各ループプライマー：LPF-1101とLPR-1101を組合せて用いたプライマーセット及びRNaseインヒビターを加えた場合について調べた。
【０１３４】
２）ヒトCK19RNA試料の調製、
実験例２−１と同様の操作を行い、コピー数が、100000、10000、1000及び0 (対照)となるように調製した。
【０１３５】
３）反応液組成
さらに、RNase Inhibitor（東洋紡社製）を25U加える他は、実験例２−６と同様の反応組成液を使用した。
【０１３６】
４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例２−６と同様に行った。
【０１３７】
６）結果
その結果を図３１に示した。鋳型コピー数に応じて、測定開始後10〜12分の間で、増幅開始が認められた。RNase inhibitorを添加することによって、増幅反応を阻害する物質の影響が低減され、増幅の確認に要する時間を短くすることができた。
【０１３８】
（実験例３−１）
実施例３−２に示される各種プライマーから、次の組合せによりRT-LAMP法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【０１３９】
１）ヒトCK20RNA試料の調製方法
ヒトCK20の塩基配列を基に設計したプライマーを用いてRT-PCRを行うことにより、KATOIII（胃癌細胞）由来トータルRNAから、ヒトCK20cDNAを単離した。pBluescript(STRATAGENE社製プラスミド)にクローニングしたヒトCK20cDNAから、in vitroでの転写システム(Riboprobe in vitro transcription system (Promega社製))を用いて転写産物を合成した。得られた原液のRNA濃度を260nmでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトCK20のRNAコピー数が600000となるように 50 ng/μL yeast RNA（Amibon社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【０１４０】
２）プライマーセット
各種プライマーを（表２）の組合せで用いた。
【０１４１】
0004386671.tif 000004
【０１４２】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用し、ループプライマーは添加しなかった。
【０１４３】
４）RT-LAMP法
上記4種のプライマーを含む反応液23μlに、ヒトCK20のRNA試料を2μl添加し、65℃で1時間加温して行った。
【０１４４】
５）増幅の確認
実験例１−１と同様にリアルタイム法により測定した。
【０１４５】
６）結果
各プライマーセットにより反応させた場合の
増幅が確認できるまでに要する時間を表２に示した。その結果、最大で40分であり、ほとんどのプライマーセットで、30分以内で確認された。
【０１４６】
（実験例３−２）
実験例３−１で検討したプライマーセットのうち、増幅の確認に要する時間が短いプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを用いた組合せのプライマーセットによりRT-LAMP法で測定した場合の感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１４７】
１）ヒトCK20RNA試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が各々0、190、960、4800、24000、120000、600000となるよう試料を調製した。
【０１４８】
２）プライマーセット
次の各組合せのプライマーセットについて検討を行った。
0004386671.tif 000005
【０１４９】
３）反応液組成
実験例１−１と同様のものを使用した。
【０１５０】
４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は実験例３−１と同様の手法により行った。
【０１５１】
６）結果
プライマーセット１について検討した結果を図３２に示した。その結果、ヒトCK20のRNAの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし鋳型の量が190コピーの場合でも30分以内にDNAの増幅が認められ、鋳型の量が600000コピーの場合でも10分程度でDNAの増幅が確認された。プライマーセット２を使用した場合にも同様の結果が得られた。
【０１５２】
（実験例３−３）ヒトCK20RNAに対する増幅特異性
実験例３−２で選択したプライマーセットを用いて測定した場合のヒトCK20のRNAに対する増幅特異性を調べた。サイトケラチン（CK）には、ヒトCK20のほかにヒトCK18，19等のアイソフォームが知られており、これらはヒトCK20と約60％のホモロジーを有する塩基配列からなる。本発明のプライマーセットを用いて測定した場合に、ヒトCK18又は19と識別して検査可能か否かを調べることを目的として実験を行った。
【０１５３】
１）RNA試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数600000のヒトCK20のRNA試料を調製した。ヒトCK18及びヒトCK19のRNAについても同様試料を調製した。
【０１５４】
２）プライマーセット
実験例３−２で選択したプライマーセット１及びセット２を用いた。
【０１５５】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１５６】
６）結果
プライマーセット１について検討した結果を図３３に示した。選択したプライマーセットではヒトCK20RNAは増幅するが、ヒトCK18RNA及びヒトCK19RNAは全く増幅せず、ヒトCK20RNAに特異性があることが確認された。プライマーセット２についても同様の結果が得られた。
【０１５７】
（実験例３−４）
プライマーセットを用いて測定した場合の、ヒトCK20RNAの測定感度を調べることを目的として実験を行った。
【０１５８】
１）ヒトCK20RNA試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が各々0、190、960、4800、24000、120000及び600000となるように試料を調製した。
【０１５９】
２）プライマーセット
次の各組合せのプライマーセットについて検討を行った。
セット３：FIP(AFA)、RIP(ARAf)、F3プライマー(AF3)、R3プライマー(AR3)、
ループプライマー(LPF2, LPR6)
【０１６０】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１６１】
６）結果
その結果を図３４に示した。その結果、ヒトCK20のRNAの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。しかし鋳型の量が190コピーの場合でも30分以内にDNAの増幅が認められ、鋳型の量が600000コピーの場合でも10分程度でDNAの増幅が確認された。
【０１６２】
（実験例３−５）
実験例３−４で選択したプライマーセットを用いて測定した場合のヒトCK20RNAに対する増幅特異性を調べることを目的として実験を行った。
【０１６３】
１）RNA試料の調製方法
実験例３−１と同様の操作を行い、コピー数が600000のヒトCK20のRNA試料を調製した。ヒトCK18及びヒトCK19のRNAについても同様に試料を調製した。
【０１６４】
２）プライマーセット
実験例３−４で選択したプライマーセット（セット３）を選択した。
【０１６５】
３）反応液組成、４）RT-LAMP法及び５）増幅の確認は、実験例３−２と同様の手法により行った。
【０１６６】
６）結果
その結果を図３５に示した。選択したプライマーセットではヒトCK20RNAは増幅するが、ヒトCK18RNA及びヒトCK19RNAについては全く増幅せず、ヒトCK20RNAに特異性があることが確認された。
【０１６７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセットを用いてLAMP法を行うと、効果的にヒトCK18RNA、CK19RNA及びCK20RNAを特異的に増幅させることができることがわかった。このことから、本発明のプライマーを用いると、短時間にヒトCK18RNA、CK19RNA及びCK20RNAを検出することが可能となり、核酸増幅手段を用いたリンパ節への癌転移診断に要する時間の短縮化が可能となった。
【０１６８】
【配列表】
0004386671.tif 000006
0004386671.tif 000007
0004386671.tif 000008
0004386671.tif 000009
0004386671.tif 000010
0004386671.tif 000011
0004386671.tif 000012
0004386671.tif 000013
0004386671.tif 000014
0004386671.tif 000015
0004386671.tif 000016
0004386671.tif 000017
0004386671.tif 000018
0004386671.tif 000019
0004386671.tif 000020
0004386671.tif 000021
0004386671.tif 000022
0004386671.tif 000023
0004386671.tif 000024
0004386671.tif 000025
0004386671.tif 000026
0004386671.tif 000027
0004386671.tif 000028
0004386671.tif 000029
0004386671.tif 000030
0004386671.tif 000031
0004386671.tif 000032
0004386671.tif 000033
0004386671.tif 000034
0004386671.tif 000035
0004386671.tif 000036
0004386671.tif 000037
0004386671.tif 000038
0004386671.tif 000039
0004386671.tif 000040
0004386671.tif 000041
0004386671.tif 000042
0004386671.tif 000043
0004386671.tif 000044
0004386671.tif 000045
0004386671.tif 000046
0004386671.tif 000047
0004386671.tif 000048
0004386671.tif 000049
0004386671.tif 000050
0004386671.tif 000051
0004386671.tif 000052
0004386671.tif 000053
0004386671.tif 000054
0004386671.tif 000055
0004386671.tif 000056
0004386671.tif 000057
0004386671.tif 000058
0004386671.tif 000059
0004386671.tif 000060
0004386671.tif 000061
0004386671.tif 000062
0004386671.tif 000063
0004386671.tif 000064
0004386671.tif 000065
0004386671.tif 000066
0004386671.tif 000067
0004386671.tif 000068
0004386671.tif 000069
0004386671.tif 000070
0004386671.tif 000071
0004386671.tif 000072
0004386671.tif 000073
0004386671.tif 000074
0004386671.tif 000075
0004386671.tif 000076
0004386671.tif 000077
0004386671.tif 000078
0004386671.tif 000079
0004386671.tif 000080
0004386671.tif 000081
0004386671.tif 000082
0004386671.tif 000083
0004386671.tif 000084
0004386671.tif 000085
0004386671.tif 000086
0004386671.tif 000087
0004386671.tif 000088
0004386671.tif 000089
0004386671.tif 000090
0004386671.tif 000091
0004386671.tif 000092
0004386671.tif 000093
0004386671.tif 000094
0004386671.tif 000095
0004386671.tif 000096
0004386671.tif 000097
0004386671.tif 000098
0004386671.tif 000099
0004386671.tif 000100
0004386671.tif 000101
0004386671.tif 000102
0004386671.tif 000103
0004386671.tif 000104
0004386671.tif 000105
0004386671.tif 000106
0004386671.tif 000107
0004386671.tif 000108
0004386671.tif 000109
0004386671.tif 000110
0004386671.tif 000111
0004386671.tif 000112
0004386671.tif 000113
0004386671.tif 000114
0004386671.tif 000115
0004386671.tif 000116
0004386671.tif 000117
0004386671.tif 000118
0004386671.tif 000119
0004386671.tif 000120
0004386671.tif 000121
0004386671.tif 000122
0004386671.tif 000123
0004386671.tif 000124
0004386671.tif 000125
0004386671.tif 000126
0004386671.tif 000127
0004386671.tif 000128
0004386671.tif 000129
0004386671.tif 000130
0004386671.tif 000131
0004386671.tif 000132
0004386671.tif 000133
0004386671.tif 000134
0004386671.tif 000135
0004386671.tif 000136
0004386671.tif 000137
0004386671.tif 000138
0004386671.tif 000139
0004386671.tif 000140
0004386671.tif 000141
0004386671.tif 000142
0004386671.tif 000143
0004386671.tif 000144
0004386671.tif 000145
0004386671.tif 000146
0004386671.tif 000147
0004386671.tif 000148
0004386671.tif 000149
0004386671.tif 000150
0004386671.tif 000151
0004386671.tif 000152
0004386671.tif 000153
0004386671.tif 000154
0004386671.tif 000155
0004386671.tif 000156
0004386671.tif 000157
0004386671.tif 000158
0004386671.tif 000159
0004386671.tif 000160
0004386671.tif 000161
0004386671.tif 000162
0004386671.tif 000163
0004386671.tif 000164
0004386671.tif 000165
0004386671.tif 000166
0004386671.tif 000167
0004386671.tif 000168
0004386671.tif 000169
0004386671.tif 000170
0004386671.tif 000171
0004386671.tif 000172
0004386671.tif 000173
0004386671.tif 000174
0004386671.tif 000175
0004386671.tif 000176
0004386671.tif 000177
0004386671.tif 000178
0004386671.tif 000179
0004386671.tif 000180
0004386671.tif 000181
0004386671.tif 000182
0004386671.tif 000183
0004386671.tif 000184
0004386671.tif 000185
0004386671.tif 000186
0004386671.tif 000187
0004386671.tif 000188
0004386671.tif 000189
0004386671.tif 000190
0004386671.tif 000191
0004386671.tif 000192
0004386671.tif 000193
0004386671.tif 000194
0004386671.tif 000195
0004386671.tif 000196
0004386671.tif 000197
0004386671.tif 000198
0004386671.tif 000199
0004386671.tif 000200
0004386671.tif 000201
0004386671.tif 000202
0004386671.tif 000203
0004386671.tif 000204
0004386671.tif 000205
0004386671.tif 000206
0004386671.tif 000207
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトCK18のプライマーセットIを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図２】ヒトCK18のプライマーセットIIを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図３】ヒトCK18のプライマーセットIIIを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図４】ヒトCK18のプライマーセットIVを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−１）
【図５】ヒトCK18のプライマーセットI（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−２）
【図６】ヒトCK18のプライマーセットI（ループプライマーなし）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例１−２）
【図７】ヒトCK18のプライマーセットIを用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例１−３）
【図８】ヒトCK19のプライマーセットＡ（ループプライマーなし）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図９】ヒトCK19のプライマーセットＡ（ループプライマーなし）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１０】ヒトCK19のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１１】ヒトCK19のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１２】ヒトCK19のプライマーセットＡ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−１）
【図１３】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーなし）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１４】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１５】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１６】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１７】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１８】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図１９】ヒトCK19のプライマーセットＣ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−２）
【図２０】ヒトCK19のプライマーセットＤ（ループプライマーなし）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−３）
【図２１】ヒトCK19のプライマーセットＤ（ループプライマーあり）を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−３）
【図２２】ヒトCK19のプライマーセットＡを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２３】ヒトCK19のプライマーセットＢを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２４】ヒトCK19のプライマーセットＣを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２５】ヒトCK19のプライマーセットＤを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−４）
【図２６】ヒトCK19のプライマーセットＡを用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２７】ヒトCK19のプライマーセットＢを用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２８】ヒトCK19のプライマーセットＣを用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図２９】ヒトCK19のプライマーセットＤを用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例２−５）
【図３０】ヒトCK19のプライマーセットＣを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−６）
【図３１】ヒトCK19のプライマーセットＣを用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例２−７）
【図３２】ヒトCK20のプライマーセット１を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例３−２）
【図３３】ヒトCK20のプライマーセット１を用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例３−３）
【図３４】ヒトCK20のプライマーセット３を用いてLAMP法を行った場合の結果を示す図である。（実験例３−４）
【図３５】ヒトCK20のプライマーセット３を用いてLAMP法を行った場合の増幅特異性を示す図である。（実験例３−５）
【図１】
0004386671.tif 000208
【図２】
0004386671.tif 000209
【図３】
0004386671.tif 000210
【図４】
0004386671.tif 000211
【図５】
0004386671.tif 000212
【図６】
0004386671.tif 000213
【図７】
0004386671.tif 000214
【図８】
0004386671.tif 000215
【図９】
0004386671.tif 000216
【図１０】
0004386671.tif 000217
【図１１】
0004386671.tif 000218
【図１２】
0004386671.tif 000219
【図１３】
0004386671.tif 000220
【図１４】
0004386671.tif 000221
【図１５】
0004386671.tif 000222
【図１６】
0004386671.tif 000223
【図１７】
0004386671.tif 000224
【図１８】
0004386671.tif 000225
【図１９】
0004386671.tif 000226
【図２０】
0004386671.tif 000227
【図２１】
0004386671.tif 000228
【図２２】
0004386671.tif 000229
【図２３】
0004386671.tif 000230
【図２４】
0004386671.tif 000231
【図２５】
0004386671.tif 000232
【図２６】
0004386671.tif 000233
【図２７】
0004386671.tif 000234
【図２８】
0004386671.tif 000235
【図２９】
0004386671.tif 000236
【図３０】
0004386671.tif 000237
【図３１】
0004386671.tif 000238
【図３２】
0004386671.tif 000239
【図３３】
0004386671.tif 000240
【図３４】
0004386671.tif 000241
【図３５】
0004386671.tif 000242