(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトbcl-xをコードするRNAのスプライシングが改変され、それによりbcl-xアイソフォームの比が改変される、配列番号33、34、46、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65または66を含み、全体を2'-O-メトキシエチルまたは2'-ジメチルアミノオキシエトキシ糖で修飾されている、長さ30ヌクレオ塩基までの、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
発現されるbcl-xsに対するbcl-xlの比を減少させる、請求項1のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
第一および第二の選択的スプライシング部位を含有するbcl-xのRNA転写物を標的として、該転写物と接触した際、前記の第二のスプライシング部位でのスプライシングの相対頻度を減少させ、生じるRNAスプライシング産物の比が改変されることにより、bcl-xアイソフォームの比が改変される、SEQ ID NO: 33を含む、請求項1または2のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記の第二のスプライシング部位の5'側の60ヌクレオチド以内のRNA領域の少なくとも一部を標的とする、請求項3のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ヒトbcl-xをコードする核酸を標的とする、請求項3のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号1のヌクレオチド638ないし698の領域の少なくとも一部を標的とする、請求項5のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、それによりbcl-xアイソフォームの比が改変される、ヒト細胞または組織においてbcl-xのアイソフォームの比を改変するための医薬組成物。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか1項のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、それによりbcl-xアイソフォームの比が改変される、bcl-xと関連する疾患または異常を有するヒトを治療するための医薬組成物。
【請求項９】
（a）請求項1〜6のいずれか1項のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む組成物；そして
（b）癌の治療のための化学療法剤；
を含む、患者において癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1〜6のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、細胞をアポトーシス刺激に対し感作するための医薬組成物。
【請求項１１】
アポトーシス刺激が照射である、請求項10の医薬組成物。
【請求項１２】
照射が紫外線照射である、請求項11の医薬組成物。
【請求項１３】
アポトーシス刺激が癌化学療法薬剤である、請求項10の医薬組成物。
【請求項１４】
癌化学療法薬剤が、VP-16、シスプラチンまたはタキソールである、請求項13の医薬組成物。
【請求項１５】
アポトーシス刺激が細胞情報伝達分子である、請求項10の医薬組成物。
【請求項１６】
アポトーシス刺激がセラミドである、請求項15の医薬組成物。
【請求項１７】
前記アポトーシス刺激がミトコンドリア機能不全を引き起こす、請求項10の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ミトコンドリア機能不全がミトコンドリア膜電位の欠失である、請求項17の医薬組成物。
【請求項１９】
コロイド分散系をさらに含む、請求項7〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、1999年3月26日に提出された米国特許出願09／277,020および1998年10月7日に提出された米国特許出願09／167,921の一部継続出願である。米国特許出願09／277,020は、それ自体、米国特許出願09／167,921の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、bcl-xの発現をモジュレーションするための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ヒトbcl-xをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能な、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。こうしたオリゴヌクレオチドは、bcl-xの発現をモジュレーションすることが示されてきている。
【０００３】
発明の背景
プログラム細胞死、またはアポトーシスは、細胞数の調節が細胞増殖および細胞死の間の平衡であるため、成長および発生の本質的な特徴である。アポトーシスは受動的よりむしろ能動的な過程であり、いくつかの外部または内部シグナルのいずれでもよいものの結果として、細胞自殺を生じる。アポトーシス細胞死は、核凝縮、ヌクレオソームの間隔でのDNAのヌクレオチド鎖分解（「ラダー化（laddering）」）および形質膜の小疱化（blebbing）により特徴付けられる。プログラム細胞死は、例えば免疫系発展および神経系発生において、本質的な役割を果たす。前者では、自己反応性抗原受容体を提示するT細胞がアポトーシスにより除去される。後者では、神経構造のかなりの再成形は、部分的にアポトーシスを通じ、起こる。
【０００４】
アポトーシスに関連すると考えられる遺伝子および遺伝子産物の数は増加してきている。これらの1つがbcl-2であり、これはアポトーシスを遮断するまたは遅延させることが示された、細胞内膜タンパク質である。bcl-2の過剰発現は、過形成、自己免疫、および化学療法により誘導されるものを含むアポトーシスに対する耐性に関連することが示されてきている（Fangら, J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398）。bcl-2関連遺伝子のファミリーが記載されてきている。bcl-2ファミリーメンバーはすべて、2つの非常に保存されているドメイン、BH1およびBH2を共有する。これらのファミリーメンバーには、限定されるわけではないが、A-1、mcl-1、baxおよびbcl-xが含まれる。bcl-xは、bcl-2とのその配列相同性により、低ストリンジェンシーでbcl-2 cDNAプローブを用い、単離された。bcl-xは、アポトーシスのbcl-2独立制御因子として機能することが見出された（Boiseら, Cell, 1993, 74, 597-608）。bcl-xの2つのアイソフォームがヒトで報告された。bcl-xl（長）は、非常に保存されているBH1およびBH2ドメインを含む。IL-3依存細胞株にトランスフェクションすると、bcl-xlは、bcl-2と類似の方式で、増殖因子枯渇中のアポトーシスを阻害した。対照的に、選択的スプライシングにより産生され、そしてBH1およびBH2ドメインを含むエクソン1の63アミノ酸の領域を欠く、bcl-xの短いアイソフォーム、bcl-xsは、bcl-2またはbcl-xlのいずれかの抗アポトーシス効果に拮抗する。Boiseら, Cell, 1993 74： 597-608に列挙されるように、bcl-x転写物は、以下のように当業者に記載される領域に分類することが可能である：ヌクレオチド1-134、5'非翻訳領域（5'-UTR）；ヌクレオチド135-137、翻訳開始コドン（AUG）；ヌクレオチド135-836、コード領域、そのうち135-509はbcl-xs転写物の、より短いエクソン1であり、そして135-698は、bcl-xl転写物の、より長いエクソン1である；ヌクレオチド699-836、エクソン2；ヌクレオチド834-836、停止コドン；およびヌクレオチド837-926、3'非翻訳領域（3'-UTR）。成熟bcl-xl（長）mRNA転写物が産生される場合、エクソン1および2の間（ヌクレオチド698および699の間）で、プレmRNAのイントロンがスプライシングされる。509位から699位の選択的スプライシングは、長い転写物より189ヌクレオチド短く、bcl-xlより63アミノ酸短いタンパク質産物（bcl-xs）をコードする、bcl-xs（短）mRNA転写物を産生する。したがって、ヌクレオチド698位は、ときに、当該技術分野において、「5'スプライシング部位」と呼ばれ、そして509位は、「隠れた（cryptic）5'スプライシング部位」と呼ばれ、ヌクレオチド699は、ときに、「3'スプライシング部位」と呼ばれる。
【０００５】
アポトーシスと関連付けられてきている疾患および異常は、2つのカテゴリーに属し、これらは細胞生存の増加がある（すなわちアポトーシスが減少している）ものおよび細胞死の過剰がある（すなわちアポトーシスが増加している）ものである。細胞生存の増加のため、細胞の過剰な集積がある疾患には、癌、自己免疫障害およびウイルス感染が含まれる。最近まで、細胞傷害性薬剤は、何らかの生命維持機能に干渉することにより、直接標的細胞を殺すと考えられていた。しかし、最近、別個の作用機構を持ついくつかの細胞傷害性薬剤への曝露により、悪性および正常細胞両方でアポトーシスが誘導されることが示されてきている。栄養性（trophic）因子レベルの操作（例えば抗エストロゲン化合物または多様な増殖ホルモンのレベルを減少させるものによる）は、栄養性因子の枯渇がアポトーシスを誘導する可能性があるため、アポトーシスを促進する1つの臨床的アプローチとなってきている。アポトーシスはまた、発生中の自己反応性である可能性があるリンパ球の除去および免疫または炎症性反応の完了後の過剰な細胞の除去にも必須である。最近の研究は、不適切なアポトーシスが、異常な自己反応性リンパ球が生存するのを可能にすることにより、自己免疫疾患の病因形成の根底にある可能性があることを明確に立証してきている。不十分なアポトーシスが関与していると考えられる、これらおよび他の異常には、アポトーシスの促進が望ましい。これは、例えば、細胞アポトーシスを促進することにより、または内因性または外因性アポトーシス刺激、例えばTNFαまたは他のサイトカインなどの細胞情報伝達分子、細胞傷害性薬剤または照射に対する細胞の感受性を増加させることにより、達成することが可能である。アポトーシスの促進またはアポトーシスに対する感作（sensitization）は、例えば、癌細胞の化学療法薬剤または放射線照射に対する感作において、臨床的妥当性を有すると考えられる。また、腫瘍増殖に必要な血管形成を遮断するのにも相当すると考えられる。これは、腫瘍細胞が血管形成因子を放出し、血管形成性内皮細胞を腫瘍部位に補充するためである。これらの血管形成性内皮細胞を、アポトーシス刺激（化学療法薬剤、照射、または内因性TNFα）に対し感作し、血管形成を遮断し、そしてしたがって腫瘍増殖を遮断することが望ましいであろう。異常な血管形成はまた、多くの他の異常、例えば、すべて視力の損失を引き起こす可能性がある、黄斑変性、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症にも関連付けられる。異常な血管形成はまた、他の、目以外の異常にも関連付けられる。このように、「異常な」血管形成は、過剰なまたは不十分な血管形成、あるいは望ましくない血管形成（例えば腫瘍増殖を支持する血管形成の場合のように）と呼ぶことが可能である。したがって、血管形成性内皮細胞の、アポトーシス刺激に対する感作により、異常な血管形成を遮断することが望ましい。
【０００６】
第二のカテゴリーにおいて、AIDSおよび神経変性障害、例えばアルツハイマーまたはパーキンソン病が、アポトーシスの促進（または望ましくないアポトーシス）による細胞死の過剰が関連付けられてきている疾患を代表する。筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、および癲癇は、アポトーシスが関連付けられてきている他の神経障害である。アポトーシスは、虚血により特徴付けられる異常、例えば心筋梗塞および脳卒中で起こることが報告されてきている。アポトーシスは、閉塞性黄疸および毒素および薬剤による肝臓損傷を含む、いくつかの肝臓傷害にも関連付けられてきている。アポトーシスはまた、腎臓のいくつかの疾患、すなわち多嚢胞性腎臓と共に、糖尿病を含む膵臓の障害における重要な現象としても同定されてきている（Thatteら, Drugs, 1997, 54, 511-532）。望ましくないアポトーシスが関与していると考えられる、これら並びに他の疾患および異常には、アポトーシスの阻害剤が望ましい。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、bcl-2ファミリーのいくつかのメンバーの役割を解明するために用いられてきている。bcl-2を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた広範な研究が行われてきており、そしてヒトbcl-2を標的とするアンチセンス化合物（G3139、Genta Incorporated）がリンパ腫および前立腺癌の臨床試験に加わってきている。
【０００８】
Amarante-Mendesら, Oncogene, 1998, 16, 1383-1390は、bcrおよびbcl-xを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。後者はbcl-xlの発現を下方制御し、そしてスタウロスポリンに対するHL-60 Bcr-Abl細胞の感受性を増加させた。
【０００９】
米国特許5,583,034（Greenら）は、抗アポトーシス遺伝子の核酸配列、好ましくはbcr-ablの翻訳開始部位にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。
【００１０】
Wangらは、bcl-x翻訳開始部位を標的とし、ネズミWEHI-231リンパ腫細胞における、CD40L仲介アポトーシス救出（rescue）を遮断する、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いた（J. Immunol., 1995, 155, 3722-3725）。
【００１１】
Fujioらは、ネズミおよびラットbcl-x mRNAを標的とし、bcl-xlタンパク質発現を減少させるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いている（J. Clin. Invest., 1997, 99, 2898-2905）。試験された化合物は、Wangらのものと同一であった。オリゴヌクレオチド処置は、マウスおよびラット心筋における白血病阻害因子の細胞保護効果を阻害した。
【００１２】
Pollmanらは、ホスホロチオエートバックボーンを持ち、血管内膜細胞におけるbcl-xl発現を下方制御するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いた（Nature Med., 1988, 4, 222-227）。これは、アポトーシスの誘導および血管損傷の後退を生じた。アンチセンス配列は、マウス／ヒトbcl-xの翻訳開始コドン（保存配列）を標的とし、そしてウサギで用いた。Gibbonsら、米国特許5,776,905は、好ましくは抗アポトーシス遺伝子、より好ましくはbcl-x、そして最も好ましくはbcl-xlに特異的なアンチセンス分子を用い、血管疾患を持つ哺乳動物の血管系における内膜損傷細胞を標的とし、欠失させるための方法を開示する。
【００１３】
Thompsonら、米国特許5,646,008およびWO 95／00642は、脊椎動物のプログラム細胞死を促進するまたは阻害する、bcl-2以外のポリペプチドをコードする、単離されそして精製されているポリヌクレオチドを記載する。好ましくは、ポリペプチドはbcl-xl、bcl-xsまたはbcl-x1である。ポリペプチド、単離されそして精製されているポリヌクレオチドの一部と同一のまたは相補的なポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、抗体並びに療法および診断使用法もまた、提供される。
【００１４】
Yangら、WO 98／05777は、アンキリンドメインを含む、bcl-xファミリーの新規アイソフォーム、bcl-xγ（ガンマ）を開示する。本アイソフォームのポリペプチドおよび核酸配列と共に、とりわけアンチセンス法を含む、bcl-xγ活性をモジュレーションするための方法が開示される。
【００１５】
発明の概要
本発明は、bcl-xをコードする核酸を標的とし、そしてbcl-xの発現をモジュレーションする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む、薬剤組成物および他の組成物もまた提供される。さらに提供されるのは、細胞または組織においてbcl-xの発現をモジュレーションする方法であって、前記細胞または組織を、1つまたはそれ以上の、本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法である。さらに提供されるのは、療法的または予防的に有効な量の、1つまたはそれ以上の、本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、bcl-xの発現と関連する疾患または症状を有するあるいは該疾患または症状に対する傾向を有すると疑われる動物、特にヒトを治療する方法である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトbcl-xおよびそのアイソフォーム、bcl-xlおよびbcl-xsの発現をモジュレーションすることが可能なアンチセンス化合物を包含する。bcl-xlは、アポトーシスを阻害し、そしてしたがってbcl-xlの阻害剤、特にbcl-xlの特異的阻害剤、例えば本発明のアンチセンス化合物は、アポトーシスの促進因子（promoter）として望ましい。対照的に、bcl-xの短いアイソフォーム、bcl-xsは、抗アポトーシス効果に拮抗し、そしてしたがってアポトーシスを促進する。bcl-xsの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤として望ましい。bcl-xの特定のアイソフォーム、bcl-xlまたはbcl-xsいずれかの発現を特異的に阻害する、あるいはこれらの2つのアイソフォームの発現比を改変するアンチセンス化合物は、研究、および予防を含む療法的使用に特に有用である。
【００１７】
本発明は、bcl-xをコードする核酸分子の機能をモジュレーションし、究極的に、産生されるbcl-xの量をモジュレーションするのに使用するため、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これは、bcl-xをコードする1つまたはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより、達成される。本明細書において、「標的核酸」および「bcl-xをコードする核酸」という用語は、bcl-xをコードするDNA、こうしたDNAから転写されるRNA（プレmRNAおよびmRNAを含む）、およびまたこうしたRNAに由来するcDNAを含む。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能に干渉する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による、標的核酸の機能のこのモジュレーションは、一般的に「アンチセンス」と称される。干渉されるべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。干渉されるべきRNAの機能には、生命の維持に必要なすべての機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたはそれ以上のmRNA種を生じるRNAのスプライシング、およびRNAにおいて行われるまたはRNAにより促進される触媒活性が含まれる。標的核酸機能とのこうした干渉の全体的な効果は、bcl-xの発現モジュレーションである。本発明の文脈において、「モジュレーション」は、遺伝子産物の発現における増加（刺激）または減少（阻害）いずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害が遺伝子発現のモジュレーションの好ましい型であり、そしてmRNAが好ましい標的である。さらに、多くの遺伝子（bcl-xを含む）が多数の転写物を有するため、「モジュレーション」はまた、遺伝子産物間の比率の改変、例えばmRNAスプライシング産物の改変も含む。
【００１８】
アンチセンスに関し、特定の核酸を標的とするのが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「標的化」は、多段階過程である。該過程は、通常、その機能をモジュレーションすべき核酸配列の同定で始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺伝子（または該遺伝子から転写されるmRNA）、または感染性病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明において、標的は、bcl-xをコードする核酸分子である。標的化過程はまた、望ましい効果、例えばタンパク質の発現の検出またはモジュレーションが生じるであろうように、アンチセンス相互作用が起こるための、本遺伝子中の1または複数の部位の決定も含む。本発明の文脈内で、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始または終始コドンを含む領域である。当該技術分野において知られるように、翻訳開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子では5'-ATG）であるため、翻訳開始コドンはまた、「AUGコドン」、「開始コドン」または「AUG開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGがin vivoで機能することが示されてきている。したがって、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各例のイニシエーターアミノ酸が、典型的にはメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）であっても、多くのコドン配列を含む可能性がある。真核および原核遺伝子が、2つまたはそれ以上の代替開始コドンを有してもよく、そのいかなる1つを、特定の細胞種または組織において、あるいは一連の特定の条件下で、翻訳開始に優先的に利用してもよい。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、こうしたコドンの（1または複数の）配列に関わらず、bcl-xをコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するのに、in vivoで用いられる1または複数のコドンを指す。
【００１９】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、3つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ、5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGAである）の1つを有する可能性があることもまた、当該技術分野において知られる。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち5'または3'）の約25ないし約50の隣接するヌクレオチドを含むmRNAまたは遺伝子の部分を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからどちらかの方向（すなわち5'または3'）の約25ないし約50の隣接するヌクレオチドを含むmRNAまたは遺伝子の部分を指す。
【００２０】
翻訳開始コドンおよび翻訳終始コドンの間の領域を指すことが当該技術分野において知られるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」もまた、効果的に標的化することが可能である領域である。他の標的領域には、翻訳開始コドンから5'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野において知られ、そしてしたがってmRNAの5'キャップ部位および翻訳開始コドンの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、5'非翻訳領域（5'UTR）、並びに翻訳終止コドンから3'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野において知られ、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンおよび3'端の間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、3'非翻訳領域（3'UTR）が含まれる。mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介し、mRNAの最も5'の残基に結合している、N7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体と共に、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むとみなされる。5'キャップ領域もまた、好ましい標的領域である可能性がある。
【００２１】
いくつかの真核mRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは1つまたはそれ以上の、翻訳前に転写物から切除される、「イントロン」として知られる領域を含む。残った（そしてしたがって翻訳される）領域は、「エクソン」として知られ、そして共にスプライシングされ、連続するmRNA配列を形成する。mRNAスプライシング部位、すなわちイントロン・エクソン接合部もまた、好ましい標的部位であり、そして異常なスプライシングが疾患に関連付けられている状況、または特定のmRNAスプライシング産物の過剰発現が疾患に関連付けられている状況で特に有用である。再編成または欠失による異常な融合接合部もまた好ましい標的である。イントロンもまた、例えばDNAまたはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物の、有効な、そしてしたがって好ましい標的領域である可能性があることもまた見出されてきている。
【００２２】
ひとたび1つまたはそれ以上の標的部位が同定されてきたら、標的に十分に相補的な、すなわち十分によく、そして十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する、望ましい効果を与える。
【００２３】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する相補的ヌクレオ塩基である。本明細書において、「相補的」は、2つのヌクレオチドの間に正確に対形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、DNAまたはRNA分子の同一位置のヌクレオチドと水素結合することが可能であれば、該オリゴヌクレオチドおよび該DNAまたはRNAは、その位置で、互いに相補的であると見なされる。各分子において、十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することが可能なヌクレオチドで占められていれば、該オリゴヌクレオチドおよび該DNAまたはRNAは相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA標的の間で、安定したそして特異的な結合が起こるような、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すのに用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸のものと100％相補的である必要はないことが当該技術分野において理解される。アンチセンス化合物は、該化合物の標的DNAまたはRNA分子に対する結合が、標的DNAまたはRNAの正常機能に干渉し、有用性の損失を引き起こし、そして特異的結合が望ましい条件下、すなわちin vivoアッセイまたは療法処置の場合には、生理学的条件下、またはin vitroアッセイの場合には、アッセイが行われる条件下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２４】
アンチセンス化合物は、一般的に研究試薬および診断剤として用いられる。例えば、完全な特異性で遺伝子発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するため、当業者により用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の多様なメンバーの機能の間の区別をするのに用いられる。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究使用のため、利用されてきている。
【００２５】
アンチセンスの特異性および感受性はまた、療法使用のためにも当業者に利用されてきている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける疾患状態の治療において、療法部分として使用されてきている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全にそして効果的にヒトに投与され、そして現在多くの臨床試験が進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物、特にヒトの治療処置計画に有用であるように設計することが可能である、有用な療法様式（modality）である可能性があることが確かめられている。本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）またはその擬似体（mimetics）のオリゴマーまたはポリマーを指す。本用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチドと共に、同様に機能する非天然のものではない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。こうした修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込み亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば、天然型より好ましい。
【００２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい型であるが、本発明は、以下に記載されるようなオリゴヌクレオチド擬似体を含む（限定されるわけではない）、他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。本発明にしたがったアンチセンス化合物は、好ましくは約8ないし約30ヌクレオ塩基を含む。特に好ましいのは、約8ないし約30ヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち約8ないし約30の結合したヌクレオシド）である。当該技術分野において知られるように、ヌクレオシドは塩基・糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、該糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれに結合してもよい。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合し、直線ポリマー化合物を形成する。次に、この直線ポリマー構造のそれぞれの端を、さらに結合させて環状構造を形成させてもよい。しかし、開環の直線構造が、一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。RNAおよびDNAの通常の結合またはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。
【００２７】
本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾バックボーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバックボーン内にリン原子を持たないものが含まれる。本明細書の目的のための、そして当該技術分野において時に引用されるような、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと見なすことが可能である。
【００２８】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、3'-アルキレンホスホネート類およびキラルホスホネート類を含む、メチルおよび他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、3'-アミノホスホロアミデート類およびアミノアルキルホスホロアミデート類を含む、ホスホロアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、並びにボラノホスフェート類であって、通常の3'-5'結合を有するもの、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'へ、または2'-5'から5'-2'へ結合する逆の極性を有するものが含まれる。多様な塩、混合塩および遊離酸型もまた、含まれる。
【００２９】
上記のリン含有結合の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 3,687,808； 4,469,863； 4,476,301； 5,023,243； 5,177,196； 5,188,897； 5,264,423； 5,276,019； 5,278,302； 5,286,717； 5,321,131； 5,399,676； 5,405,939； 5,453,496； 5,455,233； 5,466,677； 5,476,925； 5,519,126； 5,536,821； 5,541,306； 5,550,111； 5,563,253； 5,571,799； 5,587,361；および5,625,050であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００３０】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは1つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；並びに混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【００３１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,034,506； 5,166,315； 5,185,444； 5,214,134； 5,216,141； 5,235,033； 5,264,562； 5,264,564； 5,405,938； 5,434,257； 5,466,677； 5,470,967； 5,489,677； 5,541,307； 5,561,225； 5,596,086； 5,602,240； 5,610,289； 5,602,240； 5,608,046； 5,610,289； 5,618,704；5,623,070； 5,663,312； 5,633,360；5,677,437；および5,677,439であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００３２】
他の好ましいオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合両方、すなわちバックボーンは、新規の基と置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、維持される。こうしたオリゴマー化合物の1つは、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されてきているオリゴヌクレオチド擬似体であって、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子と、直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,539,082； 5,714,331；および5,719,262であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。PNA化合物のさらなる解説は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことが可能である。
【００３３】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオチド、特に上に引用される米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N（CH3）-O-CH2-（メチレン（メチルイミノ）またはMMIバックボーンとして知られる）、-CH2-O-N（CH3）-CH2-、-CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（CH3）-CH2-CH2-（天然ホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される）および上に引用される米国特許5,602,240のアミドバックボーンを持つオリゴヌクレオチドである。やはり好ましいのは、上に引用される米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つまたはそれ以上の置換糖部分も含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む：OH；F；O-、S-、またはN-アルキル、O-、S-、またはN-アルケニル；O、S-、またはN-アルキニル；あるいはO-アルキル-O-アルキルであって、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、置換または未置換のC1ないしC10アルキルまたはC2ないしC10アルケニルおよびアルキニルでもよいもの。特に好ましいのは、O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2）nOCH3、O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、O（CH2）nONH2、およびO（CH2）nON［（CH2）nCH3］］2であって、nおよびmが1ないし約10であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む：C1ないしC10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、挿入剤（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、アルコキシアルコキシ基、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メトキシエチル）または2'-MOEとしても知られる）（Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）が含まれる。さらなる好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られる、O（CH2）2ON（CH3）2基が含まれる。
【００３５】
他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）、および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上のまたは2'-5'結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でも行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬似体も有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 4,981,957； 5,118,800； 5,319,080； 5,359,044； 5,393,878； 5,446,137； 5,466,786； 5,514,785； 5,519,134； 5,567,811； 5,576,427； 5,591,722； 5,597,909； 5,610,300； 5,627,053； 5,639,873； 5,646,265； 5,658,873； 5,670,633；および5,700,920であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００３６】
オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基（当該技術分野において、しばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換も含んでもよい。本明細書において、「未修飾」または「天然」ヌクレオ塩基には、プリン塩基、アデニン（A）およびグアニン（G）、並びにピリミジン塩基、チミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、他の合成および天然ヌクレオ塩基が含まれ、例えば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニン類およびグアニン類、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシル類およびシトシン類、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン並びに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンである。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許3,687,808に開示されるもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kroschwitz, J.I.監修, John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されるもの、Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの、およびSanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.監修, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, 289-302ページに開示されるものが含まれる。これらのヌクレオ塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン類、6-アザピリミジン類およびN-2、N-6およびO-6置換プリン類が含まれ、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を、0.6-1.2℃増加させることが示されてきており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.監修, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, 276-278ページ）、そして現在好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、特により好ましい。
【００３７】
上記の修飾ヌクレオ塩基の特定のものと共に他の修飾ヌクレオ塩基の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、上記の米国特許3,687,808と共に、米国特許： 4,845,205； 5,130,302； 5,134,066； 5,175,273； 5,367,066； 5,432,272； 5,457,187； 5,459,255； 5,484,908； 5,502,177； 5,525,711； 5,552,540； 5,587,469； 5,594,121； 5,596,091； 5,614,617； 5,681,941；および5,750,692であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを亢進させる、1つまたはそれ以上の部分または結合体を化学的に結合させることを伴う。こうした部分には、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309； Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauserら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118； Kabanovら, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330； Svinarchukら, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654； Sheaら, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crookeら, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-927）が含まれる。
【００３９】
こうしたオリゴヌクレオチド結合体の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 4,828,979； 4,948,882； 5,218,105； 5,525,465； 5,541,313； 5,545,730； 5,552,538；5,578,717； 5,580,731； 5,580,731； 5,591,584； 5,109,124； 5,118,802； 5,138,045； 5,414,077； 5,486,603； 5,512,439； 5,578,718； 5,608,046； 4,587,044； 4,605,735； 4,667,025； 4,762,779； 4,789,737； 4,824,941；4,835,263； 4,876,335； 4,904,582； 4,958,013； 5,082,830； 5,112,963； 5,214,136； 5,082,830； 5,112,963； 5,214,136； 5,245,022； 5,254,469； 5,258,506； 5,262,536； 5,272,250； 5,292,873； 5,317,098； 5,371,241； 5,391,723； 5,416,203； 5,451,463； 5,510,475； 5,512,667；5,514,785； 5,565,552； 5,567,810； 5,574,142； 5,585,481； 5,587,371； 5,595,726； 5,597,696； 5,599,923； 5,599,928および5,688,941であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００４０】
既定の化合物のすべての位置が均一に修飾されている必要はなく、そして実際、1つより多くの上述の修飾が、単一の化合物内に、またはオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオシドにさえ、取り込まれていてもよい。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであって、各々少なくとも1つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチド、からなる、2つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、該オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を与えるように、修飾されている、少なくとも1つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドを切断することが可能な酵素に対する基質として働く可能性がある。例として、RNase Hは、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化は、したがって、RNA標的の切断を生じ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に亢進させる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要な場合には、当該技術分野において知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出可能である。
【００４１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上の、上述のようなオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド擬似体の複合体構造として形成することが可能である。こうした化合物はまた、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマーと称されてきている。こうしたハイブリッド構造の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,013,830； 5,149,797； 5,220,007； 5,256,775； 5,366,878； 5,403,711； 5,491,133； 5,565,350； 5,623,065； 5,652,355； 5,652,356；および5,700,922であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００４２】
本発明にしたがい用いられるオリゴヌクレオチドは、好適にそして日常的に、固相合成の周知の技術を通じ、作成することが可能である。こうした合成のための装置は、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）を含む、いくつかの業者により、販売されている。さらにまたは代わりに、当該技術分野において知られるこうした合成のためのいかなる他の手段も、使用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を使用することもまた、知られる。
【００４３】
本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のin vivo合成を指示するよう設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００４４】
本発明の化合物はまた、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤のように、取り込み、分布および／または吸収を補助するため、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、これらにカプセル化し、これらと結合させ、または別の方法で関連させてもよい。こうした取り込み、分布および／または吸収補助製剤の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,108,921； 5,354,844； 5,416,016； 5,459,127； 5,521,291； 5,543,158； 5,547,932； 5,583,020； 5,591,721； 4,426,330； 4,534,899； 5,013,556； 5,108,921； 5,213,804； 5,227,170； 5,264,221； 5,356,633； 5,395,619； 5,416,016； 5,417,978； 5,462,854； 5,469,854； 5,512,295； 5,527,528； 5,534,259； 5,543,152； 5,556,948； 5,580,575；および5,595,756を含み、前記特許の各々は本明細書に援用される。
【００４５】
本発明のアンチセンス化合物は、いかなる薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際、生物学的に活性がある代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）提供することが可能な、いかなる他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、こうしたプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、並びに他の生物学的等価物にも関する。
【００４６】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学薬品および／または状態の作用により、体内または体の細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換される、不活性型で調製されている療法剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、WO 93／24510またはWO 94／26764に開示される方法にしたがったSATE（（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸）誘導体として調製される。
【００４７】
「薬学的に許容しうる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容しうる塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そしてその望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。
【００４８】
薬学的に許容しうる塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などである。適切なアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロへキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Bergeら, “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66：1-19を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、慣用的な方式で、十分な量の望ましい塩基と、遊離酸型を接触させ、塩を生じさせることにより、調製する。遊離酸型は、慣用的な方式で、酸と塩型を接触させ、そして遊離酸を単離することにより、再生してもよい。遊離酸型は、極性溶媒における可溶性などの特定の物理的特性において、それぞれの塩型と幾分異なるが、それ以外は、本発明の目的には、該塩は、それぞれの遊離酸と同等である。本明細書において、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の構成要素の1つの酸型の薬学的に許容しうる塩を含む。これらには、アミンの有機または無機酸塩が含まれる。好ましい付加塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩などの酸性塩である。他の適切な薬学的に許容しうる塩は、当業者に周知であり、そして多様な無機および有機酸の塩基性塩、例えば、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）を用い；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホまたはホスホ酸またはN-置換スルファミン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid）、ニコチン酸またはイソニコチン酸）を用い；そしてアミノ酸（例えば天然のタンパク質合成に関与する20のアルファ-アミノ酸などのアミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）を用い、そしてまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成で）を用い、あるいは他の酸性有機化合物（例えばアスコルビン酸など）を用いる塩基性塩が含まれる。化合物の薬学的に許容しうる塩はまた、薬学的に許容しうる陽イオンで調製してもよい。適切な薬学的に許容しうる陽イオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩または炭酸水素塩もまた、使用可能である。
【００４９】
オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、限定されるわけではないが、（a）陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミンおよびスペルミジン、などで形成される塩；（b）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成される酸付加塩；（c）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、などで形成される塩；並びに（d）塩素、臭素、およびヨードなど元素陰イオンから形成される塩が含まれる。
【００５０】
本発明のアンチセンス化合物は、診断剤、療法剤、予防剤のため、そして研究試薬およびキットとして、利用してもよい。療法剤では、bcl-xの発現をモジュレーションすることにより治療することが可能な疾患または障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより、治療する。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を、適切な薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーに添加することにより、薬剤組成物に利用することが可能である。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防するまたは遅延するために、予防的に有用である可能性もある。
【００５１】
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がbcl-xをコードする核酸にハイブリダイズし、サンドイッチおよび他のアッセイが、この事実を利用するために容易に構築されることを可能にするため、研究および診断剤に有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、bcl-xをコードする核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野において知られる手段により検出することが可能である。こうした手段は、オリゴヌクレオチドに対する酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射標識または他のいかなる適切な検出手段でもよいものを含んでもよい。試料中のbcl-xのレベルを検出するための、こうした検出手段を用いたキットもまた、調製してもよい。
【００５２】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む薬剤組成物および製剤も含む。本発明の薬剤組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうか、および治療しようとする領域に応じ、いくつかの方式で投与してもよい。投与は、局所（眼および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾル吸入（inhalation、insufflation）により、肺；気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入；あるいは頭蓋内、例えばくも膜下または脳室内、投与を含む。少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００５３】
局所投与のための薬剤組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。慣用的な薬剤キャリアー、水性、粉末または油性基剤、増粘剤（thickener）などが必要であるまたは望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用である可能性がある。
【００５４】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、サシェー剤（sachet）または錠剤が含まれる。増粘剤、香料（flavoring agents）、希釈剤、乳化剤、分散補助または結合剤が望ましい可能性もある。
【００５５】
非経口、くも膜下または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物、例えば限定されるわけではないが、浸透亢進剤、キャリアー化合物および他の薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤もまた含んでもよい、無菌水性溶液を含んでもよい。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物および／または製剤はまた、オリゴヌクレオチドの消化管送達を亢進するため、浸透亢進剤も含んでもよい。浸透亢進剤は、5つの広いカテゴリー、すなわち脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤および非界面活性剤の1つに属するとして、分類することが可能である（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192； Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7：1-33）。これらの広いカテゴリーの1つまたはそれ以上からの1つまたはそれ以上の浸透亢進剤が含まれてもよい。
【００５７】
浸透亢進剤として作用する、多様な脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレアート（recinleate）、モノオレイン（別名1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル-1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロへプタン-2-オン、アシルカルニチン類、アシルコリン類、モノ-およびジ-グリセリド類並びにそれらの生理学的に許容しうる塩（すなわちオレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が含まれる（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8：2, 91-192； Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7：1, 1-33； El-Haririら, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44：651-654）。いくつかの現在好ましい脂肪酸の例は、0.5ないし5％の濃度で、単一でまたは組み合わせて用いられる、カプリン酸ナトリウムおよびラウリル酸ナトリウムである。
【００５８】
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の助長が含まれる（Brunton, 第38章： Goodman ＆ Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第9版, Hardmanら監修, McGraw-Hill, New York, NY, 1996中, 934-935ページ）。多様な中性胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透亢進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁のいかなる天然に存在する構成要素と共にそのいかなる合成誘導体も含まれる。現在好ましい胆汁塩は、ケノデオキシコール酸（CDCA）（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）であり、一般的に0.5ないし2％の濃度で用いられる。
【００５９】
1つまたはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を用いてもよい。例えば、胆汁塩を脂肪酸と組み合わせて用い、複合製剤を作成してもよい。好ましい組み合わせには、カプリン酸ナトリウムまたはラウリル酸ナトリウム（一般的に0.5ないし5％）と組み合わせたCDCAが含まれる。
【００６０】
キレート剤は、限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サリチル酸塩類（例えばサリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸およびホモバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス（laureth）-9およびベータ-ジケトン類のN-アミノアシル誘導体（エナミン類）が含まれる（Leeら, Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8：2, 92-192； Muranishi, Critical Review Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7：1, 1-33； Buurら, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNAse阻害剤としても作用する、さらなる利点を有する。
【００６１】
界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92-191）；およびFC-43などのペルフルオロ化学薬品乳化剤（Takahashiら, J. Pharm. Phamacol., 1988, 40：252-257）が含まれる。
【００６２】
非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8：2, 92-191）；並びに非ステロイド抗炎症剤、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Yamashitaら, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39：621-626）が含まれる。
【００６３】
本明細書において、「キャリアー化合物」は、不活性である（すなわち、それ自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解するまたは循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるin vivo過程により、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指す。核酸およびキャリアー化合物の共投与は、典型的には、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体に対するキャリアー化合物および核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵器官に回収される核酸の量を実質的に減少させることが可能である。例えば、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの肝組織における回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または4-アセトアミド-4'-イソチオシアノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸と共投与された際、減少する（Miyaoら, Antisense Res. Dev., 1995, 5：115； Takakuraら, Antisense ＆ Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6：177-183）。
【００６４】
キャリアー化合物と対照的に、「薬学的に許容しうるキャリアー」（賦形剤）は、動物に1つまたはそれ以上の核酸を搬送するための、薬学的に許容しうる溶媒、懸濁剤またはいかなる他の薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許容しうるキャリアーは、液体または固体であってもよく、そして既定の薬剤組成物の核酸および他の構成要素と組み合わせた際、望ましい体積（bulk）、堅さ（consistency）などを提供するように、計画した投与方式と共に選択する。典型的な薬学的に許容しうるキャリアーには、限定されるわけではないが、結合剤（例えば、α化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えばラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、カルシウム硫酸、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアリン酸塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；分解剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれる。持続放出経口送達系および／または経口投与投薬型のための溶腸性被覆は、米国特許4,704,295； 4,556,552； 4,309,406；および4,309,404に記載される。
【００６５】
本発明の組成物は、さらに、薬剤組成物に慣用的に見られる他の付属構成要素を、当該技術分野において確立された使用レベルで、含んでもよい。したがって、例えば、組成物は、例えばかゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤などの、さらなる適合する薬学的に活性がある成分を含んでもよいし、あるいは、本発明の組成物の多様な投薬型を物理的に製剤化するのに有用である、さらなる成分、例えば色素、香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤（opacifier）、増粘剤および安定化剤などを含んでもよい。しかし、こうした成分は、添加される際、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を、過度に妨げてはならない。
【００６６】
本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法にかかわらず、コロイド分散系を送達ビヒクルとして用いて、化合物のin vivo安定性を亢進させおよび／または化合物を特定の器官、組織または細胞種に標的化してもよい。コロイド分散系には、限定されるわけではないが、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、および水中油乳化物、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび性質決定されていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質に基づく系、が含まれる。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二層立体配置に配置された脂質で構成される、1つまたはそれ以上の外層に囲まれる水性コアを有する顕微鏡的球体である（一般的には、Chonnら, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708を参照されたい）。
【００６７】
本発明の特定の態様は、（a）1つまたはそれ以上のアンチセンス化合物および（b）非アンチセンス機構により機能する、1つまたはそれ以上の他の化学療法剤、を含むリポソームおよび他の組成物を提供する。こうした化学療法剤の例には、限定されるわけではないが、抗癌薬剤、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MTX）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）が含まれる。一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第15版, Berkowら監修, 1987, Rahway, NJ, 1206-1228ページを参照されたい。限定されるわけではないが非ステロイド抗炎症薬剤およびコルチコステロイドを含む抗炎症薬剤、および限定されるわけではないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含む抗ウイルス薬剤もまた、本発明の組成物と組み合わせてもよい。一般的には、それぞれ、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第15版, Berkowら監修, 1987, Rahway, NJ, 2499-2506および46-49ページを参照されたい。他の非アンチセンス化学療法剤もまた、本発明の範囲内である。2つまたはそれ以上の組合せ化合物を、共にまたは連続的に用いてもよい。
【００６８】
別の関連する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸に標的化されている1つまたはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的に標的化されている1つまたはそれ以上のさらなるアンチセンス化合物を含んでもよい。2つまたはそれ以上の組合せ化合物を、共にまたは連続的に用いてもよい。
【００６９】
療法組成物の製剤化およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性に応じ、治療過程は数日から数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤蓄積の測定から計算することが可能である。一般の当業者は、容易に最適投薬、投薬方法論および反復率を決定することが可能である。最適投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対強度に応じ異なる可能性があり、そして一般的にin vitroおよびin vivo動物モデルで有効であることが見出されたEC50に基づき、概算することが可能である。一般的に、投薬は体重1 kg当たり0.01μgないし100 gであり、そして毎日、毎週、毎月または毎年1回またはそれ以上、あるいは2ないし20年ごとに1回、投与してもよい。当業者は、体液または組織における、薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づく投薬のための反復率を、容易に概算することが可能である。治療の成功後、患者に疾患状態の再発を防ぐ維持療法を受けさせることが望ましい可能性があり、ここで、オリゴヌクレオチドは、毎日1回またはそれ以上、ないし20年ごとに1回、体重1 kg当たり0.01μgないし100 gの範囲の維持用量で投与される。
【００７０】
本発明は特定のその好ましい態様と一致し、特異性を持って記載されているが、以下の実施例は、本発明を例示するためのみに提供され、そして本発明を限定することを意図しない。
【００７１】
【実施例】
実施例1
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシおよび2'-アルコキシアミダイト
2'-デオキシおよび2'-メトキシ・ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業的供給源（例えばChemgenes, Needam, MAまたはGlen Research, Inc., Sterling, VA）から購入した。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書に援用される米国特許5,506,351に記載されるように、調製する。2'-アルコキシアミダイトを用いて合成されるオリゴヌクレオチドに関しては、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を360秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドの標準的サイクルを利用した。
【００７２】
5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling, VAまたはChemGenes, Needam, MA）を用い、公表されている方法（Sanghviら, Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）にしたがい、合成した。
【００７３】
2'-フルオロアミダイト
2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用されるKawasakiら, J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841および米国特許5,670,633に以前記載されたように合成した。簡潔には、商業的に入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを出発成分として利用し、そして文献記載の方法を修飾することにより、保護化ヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンを合成し、2'-アルファ-フルオロ原子を、2'-ベータ-トリチル基のSN2置換により導入した。したがって、N6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体として、中程度の収量で、選択的に保護化された。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護化は、標準的方法論を用い、達成され、そして標準的方法を用い、5'-ジメトキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得た。
【００７４】
2'-フルオロデオキシグアノシン
2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル（TPDS）保護化された9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニンを出発成分として、そして中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換を用い、達成した。TPDS基の脱保護化に続き、ヒドロキシル基をTHPで保護化し、ジイソブチリル・ジTHP保護化アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的O-脱アシル化およびトリフラート化を行い、粗産物のフルオリドでの処理が続き、その後、THP基の脱保護化が続いた。標準的方法論を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得た。
【００７５】
2'-フルオロウリジン
2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、文献の方法の修飾により達成し、ここで2,2'-アンヒドロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシルウラシルを、70％フルオリド-ピリジン水素で処理した。標準法を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホスホールアミダイトを得た。
【００７６】
2'-フルオロデオキシシチジン
2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミノ化を介して合成し、それに続き、選択的保護化によりN4-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準法を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホスホールアミダイトを得た。
【００７７】
2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト
2'-O-メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、以下のように、あるいはMartin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法にしたがい、調製する。
【００７８】
2,2'-アンヒドロ［1-（ベータ-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン］
5-メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ・日本・銚子を通じ商業的に入手可能）（72.0 g、0.279 M）、炭酸ジフェニル（90.0g、0.420 M）および炭酸水素ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 ml）に添加した。混合物を攪拌しながら加熱して還流し、発生する二酸化炭素ガスが調節された方式で放出されることを可能にした。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮した。生じたシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産物はゴム状物質（gum）を形成した。エーテルをデカントし、そして残渣を最少量のメタノール（およそ400 ml）に溶解した。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、硬いゴム状物質を得た。エーテルをデカントし、そしてゴム状物質を真空オーブン（60℃、1 mmHgで24時間）で乾燥させ、固体を得て、該固体を粉砕して薄い褐色の粉末にした（57 g、85％粗収率）。NMRスペクトルは、構造と一致し、ナトリウム塩としてのフェノールが混入していた（およそ5％）。該成分を、そのままさらなる反応に用い、または酢酸エチル中のメタノールの勾配（10-25％）を用いたカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製し、白色固体、mp 222-4℃を得た。
【００７９】
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン
2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシエチル）ボレート（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を、2 lのステンレス圧力容器に添加し、そして160℃にあらかじめ加熱した油槽中においた。155-160℃で48時間加熱した後、容器を開き、そして溶液を蒸発乾固し、そしてMeOH（200 ml）で磨砕した（triturate）。残渣を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性塩をろ過し、アセトン（150 ml）で洗浄し、そしてろ過物を蒸発させた。残渣（280 g）をCH3CN（600 ml）に溶解し、そして蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を、0.5％Et3NHを含有するCH2Cl2／アセトン／MeOH（20：5：3）中で充填した。残渣をCH2Cl2（250 ml）に溶解し、そしてカラム上に装填する前に、シリカ（150 g）上に吸着させた。産物を装填溶媒で溶出し、160 g（63％）の産物を得た。不純分画を再処理することにより、さらなる成分を得た。
【００８０】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250 ml）と共蒸発させ、そして乾燥残渣をピリジン（1.3 L）に溶解した。塩化ジメトキシトリチル（94.3 g、0.278 M）の第一のアリコートを添加し、そして混合物を室温で1時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル（94.3 g、0.278 M）の第二のアリコートを添加し、そして反応物をさらに1時間攪拌した。その後、メタノール（170 mL）を添加し、反応を停止した。HPLCは、およそ70％の産物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、そしてCH3CN（200 mL）で磨砕した。残渣をCHCl3（1.5 L）に溶解し、そして2×500 mlの飽和NaHCO3および2×500 mlの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過し、そして蒸発させた。275 gの残渣を得た。0.5％Et3NHを含有するEtOAc／ヘキサン／アセトン（5：5：1）で充填しそして溶出する3.5 kgのシリカゲルカラム上で、残渣を精製した。純粋分画を蒸発させ、164 gの産物を得た。不純分画からさらにおよそ20 gを得て、総収量183 g（57％）を得た。
【００８１】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0.167 M）、DMF／ピリジン（562 mlのDMFおよび188 mlのピリジンから調製した3：1混合物、750 mL）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を合わせ、そして室温で24時間攪拌した。反応は、最初にtlc試料をMeOH添加で反応停止することにより、tlcによりモニターした。tlcにより判断した場合に反応の完了に際し、MeOH（50 mL）を添加し、そして混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3（800 mL）に溶解し、そして2×200 mlの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×200 mlの飽和NaClで抽出した。水層を200 mlのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして蒸発させ、122 gの残渣を得た（およそ90％の産物）。残渣を3.5 kgのシリカゲルカラム上で精製し、そしてEtOAc／ヘキサン（4：1）を用い溶出した。純粋産物分画を蒸発させ、96 g（84％）を得た。より後の分画からさらに1.5 gを回収した。
【００８２】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン
CH3CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）を溶解することにより、第一の溶液を調製し、そして取り置いた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）を、CH3CN（1 L）中のトリアゾール（90 g、1.3 M）の溶液に添加し、-5℃に冷却し、そしてオーバーヘッド攪拌装置を用い、0.5時間攪拌した。POCl3を、30分かけて、0-10℃に維持した攪拌溶液に一滴ずつ添加し、そして生じた混合物をさらに2時間攪拌した。第一の溶液を、45分かけて、後者の溶液に一滴ずつ添加した。生じた反応混合物を低温室に一晩保存した。反応混合物から塩をろ過し、そして溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc（1 L）に溶解し、そして不溶固体をろ過により除去した。ろ過物を、1×300 mlのNaHCO3および2×300 mlの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。EtOAcで残渣を磨砕し、表題化合物を得た。
【００８３】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
ジオキサン（500 mL）およびNH4OH（30 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）の溶液を室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、そして残渣をMeOH（2×200 mL）との共沸した。残渣をMeOH（300 mL）に溶解し、そして2リットルのステンレス圧力溶液に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH（400 mL）を添加し、そして容器を100℃に2時間加熱した（tlcは変換が完了したことを示した）。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残渣をEtOAc（500 mL）に溶解し、そして飽和NaCl（200 mL）で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして溶媒を蒸発させ、85 g（95％）の表題化合物を得た。
【００８４】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.134 M）をDMF（800 mL）に溶解し、そして安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を攪拌しながら添加した。3時間攪拌した後、tlcは反応がおよそ95％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、そして残渣をMeOH（200 mL）と共沸した。残渣をCHCl3（700 mL）に溶解し、そして飽和NaHCO3（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）で抽出し、MgSO4上で乾燥させ、そして蒸発させ、残渣（96 g）を得た。0.5％Et3NHを含有するEtOAc／ヘキサン（1：1）を溶出溶媒として用い、1.5 kgのシリカカラム上で残渣をクロマトグラフィーした。純粋産物分画を蒸発させ、90 g（90％）の表題化合物を得た。
【００８５】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3'-アミダイト
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシ-テトラ-（イソプロピル）ホスファイト（40.5 mL、0.123 M）を、窒素大気下で、攪拌しながら添加した。生じた混合物を室温で20時間攪拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混合物を飽和NaHCO3（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）で抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2（300 mL）で逆抽出し、そして抽出物を合わせ、MgSO4上で乾燥させそして濃縮した。EtOAc／ヘキサン（3：1）を溶出溶媒として用い、1.5 kgのシリカカラム上で、得られた残渣をクロマトグラフィーした。純粋産物分画を合わせ、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
【００８６】
実施例2
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換ホスホジエステル（P＝O）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素による酸化を伴う標準的ホスホールアミダイト化学反応を用い、自動化DNA合成装置（Applied Biosystems モデル380B）上で合成した。
【００８７】
ホスホロチオエート（P＝S）は、ホスファイト結合の段階的チア化（thiation）のため、標準的酸化ビンを、アセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの0.2 M溶液により置き換えた以外、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に、合成する。チア化待ち工程を68秒に増やし、そして続いてキャッピング工程を行った。CPGカラムからの切断および55℃での濃水酸化アンモニウム中の脱ブロッキング後、0.5 M NaCl溶液から2.5体積のエタノールで2回沈殿させることにより、オリゴヌクレオチドを精製した。
【００８８】
ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,508,270に記載されるように調製する。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許4,469,863に記載されるように調製する。
【００８９】
3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,610,289または5,625,050に記載されるように調製する。
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,256,775または米国特許5,366,878に記載されるように調製する。
【００９０】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、国際公開されたPCT出願PCT／US94／00902およびPCT／US93／06976（それぞれWO 94／17093およびWO 94／02499として公開）に記載されるように調製する。
【００９１】
3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,476,925に記載されるように調製する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,023,243に記載されるように調製する。
【００９２】
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、共に本明細書に援用される、米国特許5,130,302または5,177,198に記載されるように調製する。
【００９３】
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（MMI結合オリゴヌクレオシドと同一）、メチレンジメチル-ヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（MDF結合オリゴヌクレオシドと同一）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド-3結合オリゴヌクレオシドと同一）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド-4結合オリゴヌクレオシドと同一および、例えば交互にMMIおよびP＝OまたはP＝S結合を有する混合バックボーン化合物を、すべて本明細書に援用される、米国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240および5,610,289に記載されるように調製する。
【００９４】
ホルムアセチルおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される、米国特許5,264,562および5,264,564に記載されるように調製する。
【００９５】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される、米国特許5,223,618に記載されるように調製する。
【００９６】
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸（PNA）は、Peptide Nucleic Acids （PNA）： Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry, 1996, 4,5-23に引用される多様な方法のいずれにしたがって、調製してもよい。これらはまた、本明細書に援用される、米国特許5,539,082、5,700,922および5,719,262に従って、調製してもよい。
【００９７】
実施例5
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものである可能性がある。これらには、結合しているヌクレオシドの「ギャップ」部分が、結合しているヌクレオシドの5'および3'「ウィング」部分の間に置かれる第一のタイプ、並びに「ギャップ」部分がオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第二の「オープン端」タイプが含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において「ヘミマー（hemimer）」または「ウィングマー」としても知られる。
【００９８】
［2'-O-Me］--［2'-デオキシ］--［2'-O-Me］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上述のように、Applied Biosystems自動化DNA合成装置、モデル380Bを用い、合成する。オリゴヌクレオチドは、自動化合成装置並びにDNA部分のための2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイト並びに5'および3'ウィングのための5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを用い、合成する。テトラゾールおよび塩基の送達後の待ち工程を600秒に増やし、RNAではこれを4回繰り返し、2'-O-メチルでは2回に増やすことにより、標準的合成周期を修飾する。完全に保護化されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そしてリン酸基を、3：1のアンモニア／エタノール中、室温で一晩、脱保護化し、その後凍結乾燥する。その後、すべての塩基を脱保護化するため、メタノール性アンモニア中で室温で24時間処理し、そして試料を再び凍結乾燥する。THF中の1 M TBAFに、室温で24時間、ペレットを再懸濁し、2'位を脱保護化する。その後、1M TEAAで反応を停止し、そしてその後、G25サイズ排除カラム上で脱塩する前に、rotovacにより、試料を1／2体積に減らす。その後、回収したオリゴを、収量および純度に関し、キャピラリー電気泳動により、そして質量分析により、分光光度的に解析する。
【００９９】
［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［2'-O-（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［2'-O-メトキシエチル］--［2'-デオキシ］--［2'-O-メトキシエチル］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-（メトキシエチル）アミダイトを置換し、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記の方法にしたがい、調製した。
【０１００】
［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチオエート］--［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチオエート］--［2'-O-（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-（メトキシエチル）アミダイトを置換して、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上述の方法にしたがい調製し、ヨウ素で酸化することによりキメラ構造のウィング部分中にホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成し、そして3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage Reagent）を利用して硫化することにより中央ギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成する。
【０１０１】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される、米国特許5,623,065にしたがい、合成する。
【０１０２】
実施例6
オリゴヌクレオチド単離
調節孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの切断および濃水酸化アンモニウム中での55℃、18時間の脱ブロッキング後、2.5体積のエタノールを用い、0.5 M NaClからの2回の沈殿により、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを精製した。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、そして全長成分が少なくとも85％であると判断された。合成で得られるホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、31P核磁気共鳴分光により、定期的に確認し、そしていくつかの研究では、オリゴヌクレオチドを、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載されるように、HPLCにより精製した。HPLC精製成分で得られた結果は、非HPLC精製成分で得られたものと同様であった。
【０１０３】
実施例7
オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレート形式
オリゴヌクレオチドは、標準的96ウェル形式で、同時に96の配列を組み立てることが可能な自動化合成装置上で、固相P（III）ホスホールアミダイト化学反応を介し、合成する。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化により、得られる。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2 ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage Reagent）を利用した硫化により、生成する。標準的塩基保護ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業的供給者（例えばPE-Applied Biosystems, Foster City, CA、またはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入する。非標準的ヌクレオシドは、既知の文献または特許の方法にしたがい、合成する。これらは、塩基保護化ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして利用する。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃NH4OHを用い高い温度（55-60℃）で12-16時間、脱保護化し、そしてその後、遊離した産物を真空で乾燥させる。その後、乾燥産物を無菌水に再懸濁し、マスタープレートを得て、ここからその後、すべての解析および試験プレート試料を、ロボットピペッターを利用し、希釈する。
【０１０５】
実施例8
オリゴヌクレオチド解析-96ウェルプレート形式
各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度は、試料の希釈およびUV吸収分光により、評価する。個々の産物の全長完全性（integrity）は、96ウェル形式（Beckman P／ACETM MDQ）で、または個々に調製された試料に関しては商業的CE装置（例えばBeckman P／ACETM 5000、ABI 270）上で、キャピラリー電気泳動（CE）により、評価する。塩基およびバックボーン組成物は、エレクトロスプレー質量分光法を利用した化合物の質量解析により、確認する。すべてのアッセイ試験プレートは、単一または多チャンネルロボットピペッターを用い、マスタープレートから希釈する。プレート上の少なくとも85％の化合物が少なくとも85％全長である場合、プレートは許容しうると判断する。
【０１０６】
実施例9
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物の標的核酸発現に対する効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、様々な細胞種のいずれにおいて試験してもよい。これは、例えばPCR、RNase保護アッセイ（RPA）またはノーザンブロット解析を用い、日常的に測定することが可能である。以下の4つのヒト細胞種は、例示目的のため提供されるが、他の細胞種も日常的に用いることが可能である。
【０１０７】
T-24細胞：
移行上皮膀胱癌細胞株T-24は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（Manassas, VA）から得る。T-24細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびストレプトマイシン100マイクログラム／ml（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補った、完全McCoyの5A基本培地（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で日常的に培養する。細胞は、90％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈により日常的に継代する。RT-PCR解析に使用するには、細胞を96ウェルプレート（Falcon-Primaria ＃3872）に、7000細胞／ウェルの密度で蒔く。
【０１０８】
ノーザンブロッティングまたは他の解析には、細胞を、100 mmまたは他の標準的な組織培養プレートに蒔き、そして適切な体積の培地およびオリゴヌクレオチドを用い、同様に処理してもよい。
【０１０９】
A549細胞：
ヒト肺癌細胞株A549は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（Manassas, VA）から得る。A549細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびストレプトマイシン100マイクログラム／ml（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補った、DMEM基本培地（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で日常的に培養する。細胞は、90％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈により日常的に継代する。
【０１１０】
NHDF細胞：
ヒト新生皮膚線維芽細胞（NHDF）は、Clonetics Corporation（Walkersville, MD）から得る。NHDFは、供給者により推奨されるように補った、線維芽細胞増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で日常的に維持する。細胞は、供給者により推奨されるように、10継代まで維持する。
【０１１１】
HEK細胞：
ヒト胚性角化細胞（HEK）は、Clonetics Corporation（Walkersville, MD）から得る。HEKは、供給者により推奨されるように製剤化された、角化細胞増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で日常的に維持する。細胞は、供給者により推奨されるように、10継代まで維持する。
【０１１２】
アンチセンス化合物での処理：
細胞が80％集密に達したとき、オリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレートで増殖させた細胞に関しては、ウェルを200μlのOPTI-MEMTM-1血清減少培地（Gibco BRL）で1回洗浄し、そしてその後、3.75μg／mlのLIPOFECTINTM（Gibco BRL）および最終濃度150 nMの望ましいオリゴヌクレオチドを含有する、130μlのOPTI-MEMTM-1で処理する。処理4時間後、培地を新鮮な培地で置き換える。細胞は、オリゴヌクレオチド処理16時間後に採取する。
【０１１３】
実施例10
bcl-x発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
bcl-x発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる多様な方法でアッセイすることが可能である。例えばbcl-x mRNAレベルを、ノーザンブロット解析、RNase保護アッセイ（RPA）、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCR（RT-PCR）により、定量化してもよい。RNA解析は、総細胞RNAまたはポリ（A）+ mRNAに対し、行ってもよい。RNA単離の方法は、例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1993, pp.4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3に解説される。ノーザンブロット解析は、当業で日常的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1996, 4.2.1-4.2.9に解説される。リアルタイム定量的PCRは、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから入手可能な、商業的に入手可能なABI PRISMTM 7700配列検出系を用いて好適に達成して、そして製造者の指示にしたがって用ることができる。PCRの他の方法もまた、当該技術分野において知られる。
【０１１４】
bcl-xタンパク質レベルは、当該技術分野において周知の多様な方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、ELISA、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分取（FACS）で定量化することができる。bcl-xに対する抗体を同定し、そして多様な供給源、例えばPharMingen Inc., San Diego, CAから得てもよく、または慣用的な抗体生成法を介し、調製してもよい。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は、例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1997, pp.11.12.1-11.12.9に解説される。モノクローナル抗体の調製は、例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1997, pp.11.4.1-11.11.5に解説される。
【０１１５】
免疫沈降法は、当業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1998, pp.10.16.1-10.16.11に見出すことが可能である。ウェスタンブロット（イムノブロット）解析は、当業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1997, pp.10.8.1-10.8.21に見出すことが可能である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、当業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1991, pp.11.2.1-11.2.22に見出すことが可能である。
【０１１６】
実施例11
ポリ（A）+ mRNA単離
ポリ（A）+ mRNAは、Miuraら, Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764にしたがい単離する。ポリ（A）+ mRNA単離のための他の方法は、例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1993, pp.4.5.1-4.5.3に解説される。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、そして各ウェルを200μlの冷PBSで洗浄する。60μlの溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5％NP-40、20 mM バナジル・リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、そしてその後、室温で5分間インキュベーションする。55μlの溶解物をオリゴd（T）被覆96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine, CA）に移す。プレートを室温で60分間インキュベーションし、200μlの洗浄緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl）で3回洗浄する。最後の洗浄の後、プレートの水分を紙タオル上で吸い取り、過剰な洗浄緩衝液を除去し、そしてその後5分間風乾する。あらかじめ70℃に加熱した60μlの溶出緩衝液（5 mM Tris-HCl、pH 7.6）を、各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレート上で5分間インキュベーションし、そして溶出物をその後、新鮮な96ウェルプレートに移す。
【０１１７】
100 mmまたは他の標準的プレート上で増殖させた細胞は、すべての溶液を適切な体積で用い、同様に処理してもよい。
【０１１８】
実施例12
総RNA単離
総mRNAは、Quiagen Inc.（Valencia, CA）から購入したRNEASY 96TMキットおよび緩衝液を用い、製造者の推奨する方法にしたがい、単離する。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、200μlの冷PBSで洗浄する。100μlの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、そしてプレートを20秒間、激しく攪拌する。その後、100μlの70％エタノールを各ウェルに添加し、そして上下に3回ピペッティングすることにより、内容物を混合する。その後、廃水収集トレーを取り付けそして真空供給源につないだQIAVACTMマニホールドにつないだRNEASY 96TMウェルプレートに試料を移す。真空を15秒間適用する。1 mlの緩衝液RW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、そして再び真空を15秒間適用する。その後、1 mlの緩衝液RPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、そして真空を15秒間適用する。その後、緩衝液RPE洗浄を繰り返し、そして真空をさらに10分間適用する。その後、プレートをQIAVACTMマニホールドから除き、そして紙タオルで水分を吸い取る。その後、プレートを再び、1.2 mLの収集試験管を含有する収集試験管ラックを取り付けたQIAVACTMマニホールドにつなぐ。その後、60μLの水を各ウェルにピペッティングすることによりRNAを溶出し、1分間インキュベーションし、そしてその後、真空を30秒間適用する。さらに60μLの水で、溶出段階を繰り返す。
【０１１９】
実施例13
bcl-x mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR解析
bcl-x mRNAレベルの定量は、製造者の指示にしたがい、ABI PRISMTM 7700配列検出系（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、リアルタイム定量的PCRにより、測定する。これは、閉鎖試験管のゲルに基づかない蛍光検出系であり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のハイスループット定量化を可能にする。増幅産物がPCRの完了後に定量化される、標準的PCRと対照的に、リアルタイム定量的PCRの産物は、蓄積するにつれ、定量化される。これは、PCR反応中に、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニーリングし、そして2つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことにより、達成される。リポーター色素（例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA、またはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのいずれかから得られる、JOEまたはFAM）をプローブの5'端に結合させ、そしてクエンチャー色素（例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA、またはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのいずれかから得られる、TAMRA）をプローブの3'端に結合させる。プローブおよび色素が無傷の場合、レポーター色素発光は、3'クエンチャー色素が近接することにより、消光される。増幅中、プローブが標的配列にアニーリングすることにより、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により、切断することが可能な基質が生成される。PCR増幅周期の伸長期中、Taqポリメラーゼによるプローブの切断は、残りのプローブから（そしてしたがってクエンチャー部分から）リポーター色素を遊離させ、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各周期で、さらなるレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断され、そしてABI PRISMTM 7700配列検出系に取り付けられたレーザー光学系により、蛍光強度が規則正しい間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理コントロール試料由来のmRNAの一連の希釈を含有する一連の平行反応は、標準曲線を生成し、それを使用して試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後、阻害パーセントを定量化する。
【０１２０】
PCR試薬は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから得る。RT-PCR反応は、25μlのPCRカクテル（1×TAQMANTM緩衝液A、5.5 mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTPおよびdGTP、600μMのdUTP、各100 nMのフォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブ、20単位のRNase阻害剤、1.25単位のAMPLITAQ GOLDTM、および12.5単位のMuLV逆転写酵素）を、25μlのポリ（A）mRNA溶液を含有する96ウェルプレートに添加することにより、行う。RT反応は、48℃で30分間インキュベーションすることにより、行う。95℃で10分間インキュベーションし、AMPLITAQ GOLDTMを活性化した後、40周期の2段階PCRプロトコルを行う：95℃で15秒間（変性）の後、60℃で1.5分間（アニーリング／伸長）。bcl-xプローブおよびプライマーは、配列番号1として本明細書に取り込まれる、公表された配列情報（Boiseら, Cell,1993, 74：597-608；GenBank寄託番号L20121；遺伝子座名（locus name）HSBCLXL）を用い、ヒトbcl-x核酸配列にハイブリダイズするよう設計する。
【０１２１】
実施例14
bcl-x mRNAレベルのノーザンブロット解析
アンチセンス処理18時間後、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、そして1 mlのRNAZOLTM（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）で溶解した。製造者が推奨するプロトコルにしたがい、総RNAを調製した。20マイクログラムの総RNAを、MOPS緩衝系（AMRESCO, Inc., Solon, OH）を用い、1.1％ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロースゲルを通じた電気泳動により、分画した。ノーザン／サザントランスファー緩衝系（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）を用い、一晩、キャピラリートランスファーすることにより、RNAをゲルからHYBONDTM-N+ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）にトランスファーした。RNAトランスファーはUV視覚化により確認した。STRATALINKERTM UV Crosslinker 2400（Staratagene Inc., La Jolla, CA）を用いたUV架橋により、膜を固定した。
【０１２２】
QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液（Staratagene Inc., La Jolla, CA）を用い、ストリンジェントな条件に関し、製造者の推奨にしたがい、ヒトbcl-x配列の塩基33-855（Boiseら, 1993, Cell, 74：597-608；GenBank寄託番号第L20121号）からPCRにより調製した、822塩基対のbcl-x特異的プローブにより膜を探査した（probed）。装填およびトランスファー効率における変動に関し規準化するため、膜を剥がし、そしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNAに関し、探査した（Clontech, Palo Alto, CA）。ハイブリダイズした膜を、PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTMソフトウェアV3.3（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用い、視覚化し、そして定量化した。データは、非処理コントロールにおけるGAPDHレベルに対し、規準化した。
【０１２３】
実施例15
mRNAレベルの解析のためのRNase保護アッセイ
リボヌクレアーゼ（RNase）保護アッセイは、発現レベルを定量化するための感度の高いそして特異的な方法である（Zinnら, Cell, 1983, 34：865-79）。該方法は、DNAテンプレートからのin vitro転写32P標識アンチセンスRNAプローブに対する標的RNAのハイブリダイゼーションに基づく。RNase処理に続き、一本鎖RNAおよび過剰なプローブの分解が生じる。プローブおよび標的RNAを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーまたはベータ画像化装置を用い、「保護化」プローブを視覚化する。各々異なる長さを持ち、そして異なるmRNA種における配列に相当する、一連の生物学的に適切なテンプレートを含有する、テンプレートセットを購入してもよい（PharMingen Inc., San Diego, CA）。各テンプレートセットは、単一の反応混合物において、内部コントロールとして利用可能である、1つまたはそれ以上のハウスキーピング遺伝子、L32およびGAPDHに加え、11までの特有の遺伝子メッセージを検出することが可能である。これらのテンプレートセットは、単一の試料から多数の測定を行うことを可能にする。多プローブRPAは、標準法により得られる総RNA調製物に対し、ポリ-A+ RNAのさらに精製することなしに、行うことが可能である。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドは、RIBOQUANTTM RNase保護キット（Pharmingen, San Diego, CA）を用い、総bcl-x mRNAレベルに加え、bcl-xsおよびbcl-xl mRNAレベルに対するそれぞれの影響に関し、評価した。すべてのアッセイは、製造者のプロトコルにしたがい、行った。簡潔には、多プローブDNAテンプレートセットを用い、dUTP-32Pで放射標識したアンチセンスRNA転写物を生成した。アポトーシス遺伝子に関し、用いられるテンプレートセットは、ヒトhAPO-2セットであった。これらの放射標識プローブを、典型的には10μgの総細胞RNAと一晩ハイブリダイズさせた。その後、反応混合物を一本鎖RNaseで消化し、保護化断片を生成し、該断片を5％アクリルアミド／尿素ゲルを通じ、電気泳動した。PhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用い、保護化バンドを視覚化し、そして定量化した。
【０１２５】
実施例16
bcl-x発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
本発明に従って、公表された配列（Boise, L.H.ら, Cell,1993, 74, 597-608；GenBank寄託番号第L20121号、またGenbank寄託番号第Z23115号としても記載される；遺伝子座名「HSBCLXL」、本明細書に配列番号1として取り込まれる）を用い、ヒトbcl-x RNAの異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。該オリゴヌクレオチドを表1に示す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源参考文献（Genbank寄託番号第L20121号）に提供されるようなヌクレオチド番号により示される。表1中のすべての化合物は、全体的にホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を持つ、オリゴデオキシヌクレオチドである。
【０１２６】
表1
ヒトbcl-xホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
【０１２７】
【表１】
0004223687.tif 000002
【０１２８】
1すべての結合はホスホロチオエート結合である。
2Genbank寄託番号第L20121号、遺伝子座名「HSBCLXL」、配列番号1由来の位置（coordinate）
3エクソン1Lと示されている箇所では、オリゴヌクレオチドはbcl-xの長いmRNA転写物を標的とするが、短いmRNA転写物を標的としない。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドは、実施例14に記載されるように、ノーザンブロット解析により、試験した。オリゴヌクレオチドは、400 nMの濃度で、A549細胞において、試験した。結果を表2に示す。
【０１３０】
表2
ヒトbcl-xを標的とするアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、bcl-x mRNAレベルに対する影響
【０１３１】
【表２】
0004223687.tif 000003
【０１３２】
配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11および12は、bcl-xmRNAレベルを50％以上阻害した。これらのうち、配列番号3、4、5、7、8および11はbcl-x mRNAレベルを85％以上阻害した。
【０１３３】
実施例17
ISIS 11219（配列番号3）およびISIS 11224（配列番号8）の用量反応解析
用量反応実験を行い、ISIS 11219および11224を用いたオリゴヌクレオチド処理後、ノーザンブロットにより、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化した。これらの化合物に関し得られたIC50は、それぞれおよそ250 nMおよび175 nMであった。
【０１３４】
実施例18
bcl-x発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
ヒトbcl-xを標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチド配列を表3に示す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源参考文献（Genbank寄託番号第L20121号）に提供されるようなヌクレオチド番号により示される。
【０１３５】
表3中のすべての化合物は、長さ20ヌクレオチドで、5ヌクレオチドの「ウィング」が両端（5'および3'方向）に隣接する、10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成される、キメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエート（P＝S）である。2'-MOEウィング中のシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
【０１３６】
表3
ヒトbcl-xキメラオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【０１３７】
【表３】
0004223687.tif 000004
【０１３８】
1太字の残基は2'-MOE残基（他は2'-デオキシ）。2'-MOEシトシンは、5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。
2Genbank寄託番号第L20121号、遺伝子座名「HSBCLXL」、配列番号1由来の位置。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドは、実施例14に記載されるように、ノーザンブロット解析により、試験した。キメラオリゴヌクレオチドは、200 nMの濃度で、A549細胞において、試験した。結果を表2に示す。存在する箇所では、「N.D.」は、「測定されない」を示す。
【０１４０】
表4
ヒトbcl-xを標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドの、bcl-x mRNAレベルに対する影響
【０１４１】
【表４】
0004223687.tif 000005
【０１４２】
試験したキメラオリゴヌクレオチドのうち、配列番号35以外はすべて、少なくとも60％、bcl-x mRNAレベルを阻害した。これらのうち、配列番号20-27、31、32、37、3および2は、80％またはそれ以上、bcl-x mRNAレベルを阻害した。
【０１４３】
実施例19
A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 15999およびミスマッチの用量反応効果：
用量反応実験を行い、ISIS 15999およびISIS 15999配列に基づくが、15999配列との2、4、6または8のミスマッチを持つ化合物を用いたオリゴヌクレオチド処理後、ノーザンブロットにより、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化した。ISIS 15999に関し得られるIC50は、試験した最低のオリゴヌクレオチド用量、25 nMで、bcl-x mRNAレベルのおよそ70％の減少が得られ、そして50 nMないし200 nMのオリゴヌクレオチド用量が90％を超える阻害を生じ、最高用量でbcl-x mRNAのほとんど完全な除去を生じたため、25 nMよりはるかに下であると概算された。2または4のミスマッチを持つオリゴヌクレオチドは、試験した最高用量、およそ200 nMのIC50を有し、そして6または8のミスマッチを持つオリゴヌクレオチドは、コントロールレベル以下にmRNAレベルを阻害しなかった。
【０１４４】
実施例20
A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 16009およびミスマッチの用量反応効果：
用量反応実験を行い、ISIS 16009およびISIS 16009配列に基づくが、16009配列との2、4、6または8のミスマッチを持つ化合物を用いたオリゴヌクレオチド処理後、ノーザンブロット解析により、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化した。ISIS 16009に関し得られたIC50は、40-50 nMであると概算された。試験したいかなる用量（25-200 nM）でもmRNAレベルの50％阻害が達成されなかったため、ミスマッチオリゴヌクレオチドに関しては、IC50は得られなかった。
【０１４５】
実施例21
ISIS 15999および16009の最適化
ISIS 15999（配列番号21）およびISIS 16009（配列番号31）のいくつかの類似体を調製した。これらは、2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）修飾の多様な配置、および均質なホスホロチオエート（P＝S）バックボーン、または2'-O-メトキシエチルウィングがホスホジエステル（P＝O）バックボーンを有し、そしてデオキシギャップがホスホロチオエート（P＝S）バックボーンを有するキメラバックボーンのいずれかを有した。これらの化合物を表5に示す。すべての2'-MOEシトシンは、5-メチル-シトシン（5-meC）である。
【０１４６】
表5
ISIS 15999および16009の類似体
【０１４７】
【表５】
0004223687.tif 000006
【０１４８】
1太字の残基は2'-MOE残基である（他は2'-デオキシである）。2'-MOEシトシンはすべて、5-メチル-シトシンであった；結合はホスホロチオエート（P＝S）結合に関しては「s」と示され、そしてホスホジエステル（P＝O）結合に関しては「o」と示される。
【０１４９】
実施例22
A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 16009および類似体の用量反応効果：
用量反応実験を行い、ISIS 16009および表5に示される類似体を用いたオリゴヌクレオチド処理後、ノーザンブロット解析により、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化した。オリゴヌクレオチドは、50、100、150および200 nMの濃度で試験した。得られたIC50は表6に示す。ISIS 17619（P＝S、完全デオキシ）に関しては、200 nMまでの用量で、bcl-x mRNAの50％減少が達成されなかったため、IC50は得られなかった。
【０１５０】
表6
配列番号31の類似体に関するIC50
【０１５１】
【表６】
0004223687.tif 000007
【０１５２】
実施例23
bcl-xタンパク質レベルのウェスタンブロット解析
標準法を用い、ウェスタンブロット解析（イムノブロット解析）を行った。一般的には、オリゴヌクレオチド処理16-20時間後、細胞を採取し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液に懸濁し（100μl／ウェル）、5分間煮沸し、そして16％SDS-PAGEゲル上に装填した。ゲルを150 Vで1.5時間泳動し、そしてウェスタンブロットのため、膜にトランスファーした。bcl-xに対する、適切な一次抗体を用い、一次抗体種に対する放射標識または蛍光標識二次抗体を用いた。PHOSPHORIMAGERTM（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用い、バンドを視覚化した。
【０１５３】
A549において、bcl-xタンパク質レベルを減少させる能力に関し、ISIS 15999および16009を試験した。両化合物は、用量依存方式で、bcl-xタンパク質レベルを減少させることが見出された。
【０１５４】
実施例24
SEM-K2細胞におけるbcl-xタンパク質レベルに対するISIS 15999の影響
SEM-K2は、t（4；11）急性リンパ芽球性白血病を患う患者由来のヒト細胞株である。Pocock, C.F.E.ら, Br. J. Haematol.（1995）, 90（4）, 855-67。増殖の指数期にあるSEM-K2細胞は、10％ウシ胎児血清、2 mM グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補ったRPMI 1460培地（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）中で、5％CO2／95％空気中、37℃で維持した。およそ1-5×106細胞／mlの体積1 mlの細胞を、24ウェルプレートに移した。1時間後、10μMのISIS 15999またはスクランブル化コントロール15691（GACATCCCTTTCCCCCTCGG；配列番号41）を、陽イオン性脂質なしで、ウェルに添加した。24および48時間に、5μMオリゴヌクレオチドの反復用量を添加した。細胞は72時間で解析した。
【０１５５】
ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリータンパク質解析には、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、そして1200 rpm、5分間の遠心分離により沈殿させ、そして細胞溶解緩衝液（5 M NaCl、0.1 M HEPES、500 mM スクロース、0.5 M EDTA、100 mM スペルミン、1 mg／ml アプロチニン、10％Triton X-100）に再懸濁し、氷上に15分間置いた。総タンパク質を分光光学的に（BioRad）定量化し、そして100μgの溶解物を15％ポリアクリルアミドゲル上に装填し、そして200Vで45分間泳動した。ニトロセルロース膜にタンパク質をトランスファーした後、マウスモノクローナルbcl-x抗体（Transduction Laboratories, Lexington, KY）でブロットを免疫染色し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）で免疫染色した。タンパク質は、ECL（Amersham, Piscataway, NJ）により定性的に視覚化し、そして写真フィルムに曝露した。フローサイトメトリーのための細胞は、氷上で、70％エタノール中で30分間固定することにより、浸透させた。2段階免疫染色は、bcl-xl抗体（Jackson ImmunoResearch Lab., Westr Grove, PA）に続き、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウス抗体を使用した。細胞は、FACScaliburTM作動Cellquestソフトウェア（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用い、解析した。50,000事象の獲得のため、リンパ球濃縮ゲートを用いた。FITC蛍光検出のため、対数増幅と共に、蛍光検出装置1を用いた。
【０１５６】
bcl-x染色SEM-K2細胞の蛍光強度中央値は、WINMIDI 2.5ソフトウェアを用い、測定した。SEM-K2は、免疫蛍光により検出されるように、相対的に高レベルでbcl-xを発現する。10μMのISIS 15999で処理した集団に関する蛍光強度中央値を、それぞれ陽性および陰性コントロール試料と比較し、そしてbcl-x発現における減少パーセントを計算した。10μM ISIS 15999を用い、最初の処理から48時間後に、bcl-xの50％減少を測定した。
【０１５７】
実施例25
SCID-ヒト白血病モデルおよびin vivo bcl-xlアンチセンス処理
増殖の指数期にある107のSEM-K2細胞を8匹のSCID-NODマウスに多量（bolus）（無菌生理食塩水に懸濁）として皮下注射した。移植および腫瘍形成は、2-3週間の期間に渡り起こった。14日かけて、連続皮下注入を送達することが可能なMicro Alzetポンプ（Alza, Newark, DE）を用い、100μg／日の用量（5 mg／kgと等量）のISIS 16009およびスクランブル化コントロールISIS 15691を、それぞれ3匹の動物の2つの群に送達した。残った2匹の動物には、ビヒクル（無菌生理食塩水）のみを投与した。
【０１５８】
SCID-hu異種移植片由来のSEM-K2細胞で測定したbcl-xの発現は、ISIS 16009の5 mg／kg／日等量（100μg／日）の14日の注入により、劇的に減少することが示された。定量的フローサイトメトリーを用い、コントロールに比べ、平均およそ90％の発現減少（n＝3）（p＜0.01）が測定された。これは、スクランブル化コントロールオリゴヌクレオチドISIS 15691による、統計的に有意でない（n＝3）（＜20％、p＜0.3）bcl-xの発現減少に比較された。
【０１５９】
実施例26
アポトーシスの刺激および測定
屠殺後に異種移植片を取り出し、そして大量の培地中に機械的に分散させた。密度勾配遠心分離により白血球を精製し、そして培地で洗浄した後、1-5×106細胞／mlで1 mlの体積に再懸濁した。95％加湿空気／5％CO2中で、37℃で2時間、細胞をインキュベーションした後、20μg／mlのVP-16（エトポシド）で24時間に渡りアポトーシスを誘導した。VP-16で処理した各異種移植片細胞懸濁物を、それぞれの陰性コントロールと対にした。アポトーシスは、光散乱変化の定量化を用い、非特異的に評価した；側方散乱の減少（クロマチン凝縮による）および前方散乱の減少（細胞収縮による）は、アポトーシスと関連する初期変化である。アポトーシスおよび非アポトーシス細胞からなる双峰集団分布をそれぞれ処理および陰性コントロールのアポトーシス指標の概算を可能にするように測定してもよい。それらの比から、アポトーシスの倍増加を計算した。アポトーシスのより特異的な測定は、Apo-Alertカスパーゼ-3比色アッセイキット（Clontech, Palo Alto, CA）を用い、達成した。これはカスパーゼ-3の活性に関する定量的アッセイDEVD特異的カスパーゼアッセイで、このカスパーゼ-3とはほとんどの哺乳動物細胞種においてアポトーシスを仲介すると考えられるカスパーゼファミリーのメンバーである、である。本アッセイは、蛍光分子、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン（AFC）、または比色分子、p-ニトロアニリド（pNA）いずれかで標識した、合成テトラペプチド、Asp-Glu-Val-Asp（DEVD；配列番号42）を基質として利用する。DEVD依存プロテアーゼ活性は、基質から切断された遊離AFCまたはpNAの検出により、評価する。CPP32（カスパーゼ-3）により切断され、そして405 nmでの比色分光測光を用い検出可能な比色基質である、パラニトロアニリドに結合したDEVDと細胞溶解物をインキュベーションした。OD405nmの倍増加を用い、正味VP-16誘導アポトーシスを測定した。
【０１６０】
DEVD-パラニトロアニリド切断により測定されるCPP32活性化の配列特異的増加を検出した。ISIS 16009処理SCID-huモデル（n＝3）に関し、コントロール異種移植片よりも、OD405nmの46％の増加が検出された。スクランブル化コントロールオリゴヌクレオチド処理異種移植片は、VP-16誘導アポトーシス（n＝3）においてほとんど変化を生じず、これはオリゴヌクレオチドで処理しない異種移植片のものと量的に同様であった。CPP32活性の倍増加に対するbcl-x発現の散乱プロット（scatter plot）（8匹の動物すべてのプール）は、正の相関（rs＞8）を明らかにし、bcl-x発現およびVP-16に対するアポトーシス感受性の間の明確な関係を示唆した。同様の変化プロフィールが、アポトーシスの光散乱測定値において検出された。アポトーシス指標における配列特異的増加は、ISIS 16009と関連し；これはISIS 15691（コントロール）処理群または非処理コントロール群では見られなかった。再び、プールされた散乱プロットは、アポトーシスに対するbcl-xに関し正の相関（rs＞8）を示し（光散乱）、強い関係を示唆した。
【０１６１】
実施例27
細胞生存率およびクローン原性（clonogenicity）の測定
ヨウ化プロピジウム（20μg／ml）をPBS洗浄細胞に添加し、そして側方散乱に対し蛍光検出装置3を用い、フローサイトメトリーを行った。この荷電色素は生存細胞から排除され、そしてヨウ化プロピジウムが容易に取り込まれるようになった、死んだまたは後期アポトーシス細胞を検出するのに用いることが可能である。生存および非生存細胞を計数し、そして生存分画を計算した。陰性コントロール生存度に対するVP-16の比を測定し、生存度におけるVP-16誘導減少の測定値を得る。生存細胞はテトラゾリウム塩MTT（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolice, IN）を、分光測光により検出可能であり、したがって定量化の手段を提供する、紫のフォルモザン（formozan）産物に代謝する（還元させる）。細胞生存度の倍減少は、96時間に測定した。細胞増殖は、in vitroでMTT代謝能力を増加させ、したがってクローン原性増殖の指標を提供する。陰性コントロール細胞に対するVP-16処理の倍減少を測定し、クローン原性に対する正味細胞傷害性効果の測定値を提供した。
【０１６２】
MTT生存率の減少を観察し、そして配列特異的であることが示された。代謝生存率における倍減少に対するbcl-x発現のプールされた散乱プロット（n＝8）は負の相関（rs＝-5）を示し、これはVP-16によりアポトーシスを経験するよう刺激された細胞を生存させるための利点を提供する、bcl-xの役割と一致する。
【０１６３】
実施例28
bcl-xsおよびbcl-xl転写物の発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
ヒトbcl-xのエクソン1およびエクソン2の特定の領域、特にエクソン1／エクソン2スプライシング部位の周り、およびbcl-xlに存在するがbcl-xsに存在しない配列領域中を標的とする、さらなるオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを表7に示す。すべてのバックボーン結合は、ホスホロチオエートであり；すべての2'MOEシトシンは、5-メチルシトシンである。
【０１６４】
表7
ヒトbcl-xのエクソン1／エクソン2を標的とするオリゴヌクレオチド
【０１６５】
【表７】
0004223687.tif 000008
【０１６６】
ヒトbcl-xは2つの型、bcl-xlとして知られる長い型、およびbcl-xsとして知られる短い型を有する。これらは、選択的にスプライシングされたmRNA転写物から生じる。bcl-xlのタンパク質は、大きさおよび構造がbcl-2と類似であり、そして増殖因子枯渇に際し細胞死を阻害することが可能であった。bcl-xsのタンパク質はbcl-xlより63アミノ酸短い。これはbcl-2機能を阻害し、したがってプログラム細胞死（アポトーシス）を促進することが可能である。オリゴヌクレオチドは、RIBOQUANTTM RNase保護キット（Pharmingen, San Diego, CA）を用い、総bcl-x mRNAレベルと共に、bcl-xsおよびbcl-xl mRNAレベルに対するそれぞれの影響に関し評価した。すべてのアッセイは、製造者のプロトコルにしたがい、行った。結果を表8に示す。
【０１６７】
表8
bcl-xsおよびbcl-xlに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
【０１６８】
【表８】
0004223687.tif 000009
【０１６９】
*オリゴヌクレオチドを含まないコントロール細胞において、bcl-xs／bcl-xl mRNA比は17.56である。本欄は、この数字からの変化を示す（すなわち、bcl-xs／bcl-xl mRNA比が17.56である場合、本欄は「1」と示される）。
【０１７０】
**「ND」と示される場合、ゲル上のRNAは定量化することが不可能であった。
ISIS 22783は、bcl-xl転写物（bcl-xs転写物ではない）のエクソン1を標的とした、完全に2'-MOE、完全にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、A549細胞において、総bcl-x mRNAレベルを減少させることなく、bcl-xlに対するbcl-xsの比を17％から293％に変化させることが可能である。すなわち、該オリゴヌクレオチドは、bcl-xl型を減少させたが、bcl-xs型を劇的に増加させた。
【０１７１】
別のアポトーシス遺伝子であるbaxを阻害する能力に関し、RNase保護アッセイにより、ISIS 22783を試験した。該オリゴヌクレオチドはbax mRNAレベルに対しいかなる影響も持たなかった。ISIS 22783はまた、ネズミbcl-x mRNAに完全に相補的であり、これにより動物研究に有用となる。
【０１７２】
実施例29
他の細胞株におけるbcl-xスプライシング産物のアンチセンス再指示（redirection）
先の実施例に示されるA549細胞におけるその活性に加え、ISIS 22783はまた、ヒト293T胚性腎臓癌細胞、ヒトC8161黒色腫細胞およびHeLa細胞においても、bcl-xl／xsスプライシング産物比を、同様に改変することが可能であった。
【０１７３】
実施例30
ISIS 22783配列のさらなる修飾
標的に対するアンチセンス化合物の緊密な結合およびヌクレアーゼに対する耐性を提供する修飾もまた、スプライシング部位の標的化において、特に有用であると考えられる。1つのこうした修飾は、2'-メトキシエトキシ（2'-MOE）修飾である。こうした修飾の他の例は、限定されるわけではないが、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ（2'-DMAOE）および2'-アセトアミドを含む糖修飾；モルホリノ、MMIおよびPNAバックボーンなどのバックボーン修飾；およびC-5プロピンなどの塩基修飾を含む。
【０１７４】
ISIS 22783配列および各糖に2'-DMAOE修飾を有するアンチセンス化合物を、bcl-xスプライシング産物の比を改変する能力に関し、その2'-MOE類似体に比較した。結果を表9に示す。
【０１７５】
表9
bcl-xs／bcl-xl比に対する影響に関する、ISIS 22783配列の2'-MOEおよび2'-DMAOE類似体の比較
【０１７６】
【表９】
0004223687.tif 000010
【０１７７】
こうして2'-MOE化合物に比較すると、2'-DMAOE化合物は、定性的に同様であるが、定量的にはわずかに低い、bcl-xlに対するbcl-xsスプライシング産物の比を改変する能力を示した。
【０１７８】
22783配列を持つモルホリノバックボーン化合物を用いた予備実験は、RPAにより測定されるように優れた活性を示した。化合物は米国特許5,034,506にしたがい調製し、そして掻爬装填（scrape-loading）により、HeLa細胞にトランスフェクションした。Summertonら, 1997, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 63-70。
【０１７９】
ISIS 22783配列（配列番号33）を有するペプチド核酸（PNA）オリゴヌクレオチドを、上述の実施例4に記載されるように合成した。該オリゴヌクレオチド（ISIS 32262）は、PNAバックボーンで全体的に均質に修飾した。5塩基ミスマッチ化合物（ISIS 32263、配列番号52）もまた、全長PNA同様合成した。BTX Electro Cell Manipulator 600（Genetronics, San Diego, CA）を用い、200Vパルスでのエレクトロポレーションにより、これらの化合物でHeLa細胞をトランスフェクションし、そしてRNAを24時間後に単離した。bcl-xスプライシングに対するPNA化合物の影響を表10に示す。
【０１８０】
表10
【０１８１】
【表１０】
0004223687.tif 000011
【０１８２】
bcl-xs／bcl-xl転写物比に対するISIS 22783配列のPNA類似体の影響
したがって、PNA化合物もまた、bcl-xスプライシング産物を改変することが可能であり、そしてしたがって好ましい。
【０１８３】
実施例31
初代角化（皮膚）細胞におけるbcl-xl RNAおよびタンパク質のアンチセンス阻害
初代角化細胞である、正常ヒト新生角化細胞（hKn）細胞（Cascade Biologics, Inc., Portland, OR）をISIS 16009で処理し、そしてbcl-xl mRNAおよびタンパク質レベルを解析した。細胞は、70-70％集密まで、100 mm組織培養プレート中で増殖させた。細胞は、陽イオン性脂質の存在下で、以下のように、オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。LipofectinTM（Gibco／BRL）を10μg／ml Opti-MEMTM（Gibco／BRL）の濃度で用いた。5 mlのOpti-MEMTM、LipofectinTM、および多様な量のオリゴヌクレオチドの混合物を、室温で30分間平衡化した。細胞をOpti-MEMTMで2回洗浄し、そしてその後、Opti-MEMTM／LipofectinTM／オリゴヌクレオチド混合物で4時間、処理した。その後、混合物を正常増殖培地と置き換えた。示される時間、24時間後に、細胞を採取しまたは解析した。アンチセンスまたはスクランブル化オリゴヌクレオチドは、50、100、200または300 nMの濃度でトランスフェクションした。RNAeasyTM法（Qiagen, Valencia, CA）を用い、細胞から総RNAを採取した。等量のRNA（10-20μg）を、1.1％ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロースゲル中で分離し、そしてナイロン膜に一晩トランスファーした。膜を32P標識bcl-xl、bcl-2またはG3PDH cDNAで探査した。放射能プローブは、Strip-EZTMキット（Ambion, Austin, TX）を用い、生成し、そしてQuikHybTM溶液（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、膜にハイブリダイズさせた。Molecular Dymnamics PhosphorImagerを用い、RNAの量を定量化し、そしてG3PDH mRNAレベルに対し規準化した。
【０１８４】
ISIS 15999および16009は、200 nMスクリーニング用量で、bcl-xl mRNA発現のかなりの（＞90％）阻害を示した。ISIS 16009は、およそ50 nMのIC50で、濃度依存方式で、hKn細胞におけるbcl-xl mRNAを減少させることが見出された。ISIS 16009、ISIS 20292のスクランブル化コントロールオリゴヌクレオチド（CGACACGTACCTCTCGCATT；下線＝2'-MOE、残りは2'-デオキシ；バックボーンはホスホロチオエートである；配列番号51）はいかなる影響も持たなかった。他のアポトーシス遺伝子（A1、Bad、Bak、bcl-2、RiboQuantTMヒトApo-2プローブセットおよびプロトコル（Pharmingen, San Diego, CA）を用いたRNase保護アッセイにより検出されるようなもの）またはG3PDH（ノーザンブロット解析により検出されるようなもの）のRNA発現は、ISIS 16009または15999により影響を受けなかった。
【０１８５】
ISIS 16009および15999は、bcl-xlおよびbcl-xs両方に存在するbcl-x遺伝子の領域にハイブリダイズするが、HUVEC、hKnまたはA549細胞においてbcl-xsの有意な発現はなく、したがってこれらの化合物は、影響に対しbcl-xsの有意でない貢献が示されるため、bcl-xl阻害剤とみなされる。
【０１８６】
アンチセンス処理hKn細胞におけるbcl-xlタンパク質のレベルは、ウェスタン解析により、調べた。全細胞抽出物は、細胞をRIPA緩衝液（完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Boehringer Mannheim）を含有する1×PBS、1％NP40、0.1％デオキシコール酸、0.1％SDS）中で溶解することにより、調製した。細胞抽出物中のタンパク質濃度は、BioRadキット（BioRad, Hercules, CA）を用いBradfordアッセイにより、測定した。その後、等量のタンパク質（10-50μg）を10％SDS-PAGEゲル（Novex, San Diego, CA）上で分離し、そしてPVDF膜（Novex）にトランスファーした。0.1％Tween-20および5％粉乳を含有するPBS中で、膜を1時間ブロッキングした。1：500希釈のマウスモノクローナルbcl-x抗体（Transduction Labs, Lexington, KY）と、室温でインキュベーションした後、膜を0.1％Tween-20を含むPBSで洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中の1：5000希釈のヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベーションした。膜を洗浄し、そして化学発光増強（ECL）検出系（Amersham, Piscataway, NJ）を用い、発行させた。
【０１８７】
処理24時間後、bcl-xlタンパク質レベルは、濃度依存方式で減少した。処理は、bcl-xlタンパク質の70％以上の阻害を生じた。この減少はトランスフェクション後48時間に渡り、低いままだった。
【０１８８】
実施例32
A549およびhKn細胞の紫外線照射
A549およびhKn細胞がおよそ70-80％集密である、またはオリゴヌクレオチド処理後24時間たったとき、UV-B光を照射した。UV-B処理直前、細胞をPBSで2回洗浄し、そしてその後、5-15ワットの312 nm電球を含有する、Stratalinker UV Crosslinker 1800モデル（Stratagene, La Jolla, CA）中で、UV-B光に曝露した。細胞を50 mJ／m2、100 mJ／m2または200 mJ／m2のUV-B照射に曝露した。UV-B照射の用量は、UVX照射測定装置（UVP）を用い、較正した。UV照射後、細胞をさらに24時間、標準的培地中でインキュベーションした。UV-B処理に関するコントロールプレートは、単にPBSで3回洗浄し、そして標準的培地中でさらに24時間、インキュベーションした。ヨウ化プロピジウムでエタノール固定細胞核を染色し、そしてフローサイトメトリーによりDNA含量を検査することにより、アポトーシスに関し、細胞を調べた。アポトーシス細胞は、その二倍体以下のDNA含量により、同定した。細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして1 mlの70％エタノールに再懸濁した。室温で1時間インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄し、そして1 mlのヨウ化プロピジウム染色溶液（50μg／mlヨウ化プロピジウム、0.5 U／ml RNase A、2000 U／ml RNase T1）に再懸濁した。室温で30分置いた後、Becton Dickinson Calibur FACS解析装置を用いたフローサイトメトリーにより、細胞周期解析を行った。FACScanフローサイトメトリー装置を用い、10,000の細胞の個々の核の蛍光を測定した。結果をアポトーシス細胞パーセントとして示した。
【０１８９】
実施例33
UV誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作
A549細胞を100 nMのISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080（CTGGTTACACGACTCCAGGT；配列番号52）で処理し、そして紫外線（UV）照射に曝露した。アポトーシス細胞パーセントは、標準的方法にしたがい、ヨウ化プロピジウム染色により、定量化した。結果を表11に示す。
【０１９０】
表11
ISIS 22783およびUV照射の組み合わせ
【０１９１】
【表１１】
0004223687.tif 000012
【０１９２】
したがって、アポトーシス刺激（照射）に対する反応は、アンチセンス処理後変化し、アポトーシスの増加を生じた。
【０１９３】
実施例34
UV誘導細胞死に対する初代角化細胞のアンチセンス感作
UV照射および他のDNA損傷剤に対する皮膚の曝露は、DNA損傷に対する保護反応を誘発する。我々は、UV-B誘導アポトーシスに対する角化細胞の耐性におけるbcl-xlの役割を調べた。A549細胞に関してと同様、ISIS 16009でのhKn細胞の処理は、UV-B照射により誘導されるアポトーシスに対し、細胞を感作した。オリゴヌクレオチドで処理せずまたはコントロールオリゴヌクレオチドで処理し、そして100 mJ／m2のUV-B照射で照射した細胞の7％未満が、アポトーシスを経験した。対照的に、細胞を300 nMのbcl-xl阻害剤ISIS 16009でトランスフェクションし、そして等用量のUV照射で処理した場合、35％を超える細胞がアポトーシスとなった。
【０１９４】
実施例35
A549およびhKn細胞のシスプラチン処理
シスプラチンは、DNA損傷を引き起こし、そしてアポトーシスを誘導することが可能なアルキル化剤である。GillおよびWindebank, 1998, J. Clin. Invest. 101：2842-2850。A549およびhKn細胞がおよそ70-80％集密である、またはオリゴヌクレオチド処理後24時間たったとき、これらの細胞をシスプラチンで処理した。シス-ジアミンジクロロ白金II（シスプラチン、Sigma, St. Louis, MO）を、1 mg／mlの濃度で再蒸留水に溶解し、そして0.5ないし10μg／mlの用量範囲で、標準的培地に添加し、そして細胞と24時間インキュベーションした。
【０１９５】
実施例36
シスプラチン誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作
A549細胞を100 nM ISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080および多様な用量のシスプラチンで処理した。アポトーシス細胞パーセントを、標準法にしたがい、ヨウ化プロピジウムにより、定量化した。結果を表12に示す。
【０１９６】
表12
ISIS 22783およびシスプラチンの組み合わせ
【０１９７】
【表１２】
0004223687.tif 000013
【０１９８】
したがって、細胞は、アンチセンス処理後、アポトーシス刺激（この場合、化学療法薬剤）に感作され、アポトーシスの増加を生じた。
【０１９９】
実施例37
シスプラチン誘導細胞死に対するhKn細胞のアンチセンス感作
オリゴヌクレオチドでトランスフェクションしない、またはコントロールオリゴヌクレオチドISIS 26080でトランスフェクションしたhKn細胞を、0.5μg／ml シスプラチンで処理した場合、10％未満の細胞がアポトーシスとなった。hKn細胞を、bcl-xl阻害剤ISIS 16009および等用量のシスプラチンの組み合わせで処理すると、25％以上の細胞で死が引き起こされた。
【０２００】
実施例38
タキソール誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作
A549細胞を、100 nM ISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080および多様な用量のタキソールで処理した。アポトーシス細胞パーセントは、標準法にしたがい、ヨウ化プロピジウム染色により、定量化した。結果を表13に示す。
【０２０１】
表13
ISIS 22783およびタキソールの組み合わせ
【０２０２】
【表１３】
0004223687.tif 000014
【０２０３】
したがって、アポトーシス刺激（ここでは細胞傷害性化学療法薬剤）に対する反応は、アンチセンス処理後変化し、アポトーシスの増加を生じた。
【０２０４】
実施例39
bcl-xに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはアポトーシス刺激でのヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の処理
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）は、Clonetis（San Diego, CA）から得て、そして10％ウシ胎児血清を補った内皮細胞増殖培地（EGM）中で培養した。細胞は継代2および5の間で用い、そしておよそ80％集密で用いた。細胞を、あらかじめ温めた（37℃）Opti-MEMTMで3回洗浄した。50 nM ISIS 16009の濃度で、オリゴヌクレオチドを、Opti-MEMTM中の10μg／ml LipofectinTMとあらかじめ混合した。細胞をオリゴヌクレオチドと37℃で4時間インキュベーションし、その後、培地を除去し、そして標準的増殖培地と置き換えた。C6-セラミド（Calbiochem, San Diego, CA）、スタウロスポリン（Calbiochem）、またはz-VAD.fmk（Calbiochem）での処理は、行うとすれば、オリゴヌクレオチド処理の24時間後に行った。bcl-xl mRNAレベルは、ノーザンブロット解析により測定し、そしてコントロールのおよそ5％に減少することが見出され、見かけのIC50は20 nM未満であった。bcl-xlタンパク質レベルは、ウェスタン解析により測定し、そしてコントロールのおよそ5％であることが見出された。断片化DNAを持つアポトーシス細胞は、二倍体以下細胞のフローサイトメトリー解析により、同定した。bcl-xタンパク質（これらの細胞においては、実質的にすべてbcl-xlである）の阻害は、細胞集団の10-25％にアポトーシスを経験させた。
【０２０５】
実施例40
bcl-xl阻害剤ISIS 16009によるアポトーシス刺激に対するHUVEC内皮細胞の感作
スタウロスポリン（タンパク質キナーゼ阻害剤）およびC6-セラミド（脂質二次メッセンジャー）は、多くの細胞種においてアポトーシスを誘導することが示されてきている。低用量のスタウロスポリン（2 nM）またはC6-セラミド（5μM）単独でのHUVECの処理は、細胞DNA断片化（アポトーシスの測定）において、10-25％のアポトーシス細胞の文脈より、有意な増加を引き起こさなかった。しかし、ISIS 16009で処理し、bcl-xのレベルが減少した細胞は、これらの用量のアポトーシス刺激に対し、より感受性が高く、ISIS 16009およびスタウロスポリンで処理した試料において、50％を超えるアポトーシス細胞が、そしてISIS 16009およびセラミドで処理した細胞において、40％を超えるアポトーシス細胞が生じた。したがって、bcl-xの阻害は、細胞をこれらのアポトーシス刺激に対し感受性にする。bcl-x阻害、またはbcl-xに加えスタウロスポリンまたはセラミドにより引き起こされたアポトーシスは、カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmkまたはz-DEVD.fmk（Calbiochem, San Diego, CA）での細胞の処理により、妨げられた。
【０２０６】
実施例41
ミトコンドリア機能不全の測定
ミトコンドリア膜内外電位（通常Δψmと略される）を評価するため、細胞を150 nMの濃度の陽イオン性親油性色素MitoTracker Orange CMTMRos（Molecular Probes, Eugene, OR）と、37℃で15分間、暗所でインキュベーションした。コントロール細胞は、同時に、ミトコンドリア膜間電位を破壊する、プロトノホア、カルボニルシアニド m-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）（Calbiochem, San Diego, CA）50μMで処理した。付着および浮遊細胞を共に収集し、1×PBS／2％BSAで1回洗浄し、そして4％パラホルムアルデヒドを含有する1 mlのPBS中で、震蘯しながら15分間室温で固定した。固定細胞を暗所で、4℃で1日保存した後、フローサイトメトリーにより解析した。
【０２０７】
実施例42
ミトコンドリア完全性に対するbcl-x阻害の影響
細胞がアポトーシスから保護される、提唱される機構の1つは、ミトコンドリア機能の保護によるものである。bcl-x阻害剤ISIS 16009でHUVECを処理すると、ミトコンドリア膜内外電位の減少が生じ、これはスタウロスポリンまたはセラミドいずれかにより強力にされた。bcl-xアンチセンス阻害剤単独またはアンチセンスにスタウロスポリンを加えた場合いずれかにより引き起こされる（が、アンチセンスにセラミドを加えた場合は引き起こされない）ミトコンドリア完全性の喪失は、カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmk（Calbiochem, San Diego, CA）でのHUVECの処理により、妨げられた。
【０２０８】
実施例43
ヒトbcl-xlのスプライシングを改変するよう設計された、さらなる2'-MOEオリゴヌクレオチド
ヒトbcl-xlのヌクレオチド699の5'スプライシング部位の上流または該部位に重複する領域を標的とする、さらなる一連の均質な2'-MOEオリゴヌクレオチドを設計した。本オリゴヌクレオチドの目的は、スプライシング産物に対する影響を最適化し、産生されるbcl-xs／bcl-xl転写物の比を増加させることであった。オリゴヌクレオチドを表14に示す。バックボーンはすべてホスホロチオエートである。スプライシング部位を架橋し、そしてスプライシングされないヒトbcl-x（bcl-x-ベータ）をコードする、Genbank寄託番号第U72398号のヌクレオチド555-574にハイブリダイズする、ISIS 105751を除き、すべてのヌクレオチド番号はGenbank寄託番号第Z23115号のものに対応する。本標的配列は、5'スプライシング部位の上流の10ヌクレオチド（Genbank寄託番号第Z23115号の689-698位）およびイントロンの10ヌクレオチドに対応する。
【０２０９】
表14
ヒトbcl-xlのスプライシングを改変するために設計された、さらなる2'-MOEオリゴヌクレオチド
【０２１０】
【表１４】
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【０２１１】
これらのオリゴヌクレオチドを、RPA解析により検出されるように、A549細胞におけるbcl-xlおよびbcl-xs mRNAレベルに対するその阻害効果に関し試験した。結果を表15に示す。オリゴヌクレオチド濃度は200 nMであった。
【０２１２】
表15
bcl-xsおよびbcl-xlに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
【０２１３】
【表１５】
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【０２１４】
上の表に示されるオリゴヌクレオチドはすべて、少なくとも12倍、bcl-xs／bcl-xl比を増加させることが可能であり、そしていくつか（106249-106253、26066、22783および105751）は、表8に示される先の最大値、およそ17倍に比べ、比を増加させた。ISIS 105751および26066は、bcl-xs／bcl-xl比を、それぞれ45倍および37倍増加させるため、非常に好ましい。この効果は、50ないし400 nMの用量でISIS 26066に関し測定されるように、用量依存であった。ISIS 26066を、bcl-x-ベータ（スプライシングされないもの）レベルに関し試験し、そしてまったく影響を持たなかった。
【０２１５】
興味深いことに、bcl-xlの5'スプライシング部位のおよそ15-54ヌクレオチド上流の領域を標的とするすべてのオリゴヌクレオチドはすべて、スプライシングの非常に強力な再指示因子（redirector）であり、この領域がスプライシング部位選択に重要である可能性があることを示す。これは、マウス、ラットおよびブタbcl-x配列が、ヌクレオチド654（Genbank寄託番号第Z23115号のヒト配列の番号付けを用いる）からヌクレオチド698の5'スプライシング部位に同一である事実により、支持される。したがって、ヌクレオチド698のスプライシング部位からおよそ60ヌクレオチド上流（5'方向）に伸長する領域を標的とするオリゴヌクレオチドが好ましい。スプライシング部位にまたがるオリゴヌクレオチドもまた、好ましい。
【配列表】
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