(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン：ＩＧＦ-Ｉが、容量：容量比において１：１５から１５：１の割合であるＩＧＦ−Ｉとインスリンの混合物と、賦形剤として１００から３００ｍＭの濃度のアルギニンを含有する安定した液状組成物。
【請求項２】
インスリン：ＩＧＦ-Ｉが、容量：容量比において１：６から６：１の割合である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バッファーをさらに含有する請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
バッファーが７から７．５のｐＨである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
バッファーがヒスチジンである請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
リン酸緩衝食塩水をさらに含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
安定化剤をさらに含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ヒスチジンとフェノールをさらに含んでなる請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
５−２０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、２−１０ｍｇ／ｍｌのインスリン、１００−２００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７−７．５で５−２０ｍＭのヒスチジン及び１−５ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、３−４ｍｇ／ｍｌのインスリン、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
(ａ)有効量のＩＧＦ−Ｉとインスリンを含有する請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物を収容する容器と、
(ｂ)前記組成物が有効である疾患の治療に該組成物を使用するための使用説明書と、を含んでなるキット。
【請求項１２】
疾患が高血糖疾患である請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
成分(ａ)としてアルギニン中のＩＧＦ−Ｉを、成分(ｂ)としてインスリンを溶液として互いに混合することを含んでなる、請求項１に記載の組成物の調製方法。
【請求項１４】
３０−４０℃で所定時間、混合物をインキュベートすることをさらに含み、前記組成物がリン酸緩衝食塩水をさらに含有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
混合物を１５分間３７℃でインキュベートする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
(ａ)アルギニン中のＩＧＦ−Ｉを収容する容器と；
(ｂ)インスリンを収容する容器と；
(ｃ)容器(ａ)と(ｂ)の内容物を組合わせ、安定した液状組成物を調製するための使用説明書；
を含んでなる請求項１に記載の安定した液状組成物を調製するためのキット。
【請求項１７】
ＩＧＦ−Ｉとインスリンが組合わされるとき、組成物が製薬的に許容可能な製剤である請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
製薬的に許容可能な製剤が高血糖疾患を治療するためのものである請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
容器(ａ)が５−２０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１００−２００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７−７．５で５−２０ｍＭのヒスチジン及び１−５ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
容器(ａ)が１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、インスリン様成長因子(ＩＧＦ-Ｉ)及びインスリンのような逆の電荷を持つポリペプチド類の混合物を含有する製剤に関する。特に、この発明は、該製剤中で逆の電荷を持つタンパク質類の混合を可能にする選択された賦形剤を含む製剤を可能にし、賦形剤が通常溶液からタンパク質を沈殿させるタンパク質の相互作用を防止する。
【０００２】
（関連技術の説明）
ヒトＩＧＦ-Ｉは、成長ホルモン(ＧＨ)の作用を調節するインスリン様及び細胞分裂促進的生物活性を有するソマトメジンのファミリーに属する７６４９ダルトンのポリペプチドである(Rinderknecht及びHumbel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73：2365(1976)；Rinderknecht及びHumbel,  J. Biol. Chem., 253：2769(1978))。Van Wykら, Recent Prog. Horm. Res., 30：259(1974)；Binoux, Ann. Endocrinol., 41：157(1980)；Clemmons及びVan Wyk, Handbook Exp. Pharmacol., 57：161(1981)；Baxter, Adv. Clin. Chem., 25：49(1986)；米国特許第4,988,675号；国際公開第91/03253号；及び国際公開第93/23071号。ＩＧＦ-Ｉは３つのジスルフィド結合を含み、８．６５のｐＩと２７６ｎｍで０．６４５のモル吸光係数を有する。ＩＧＦ-Ｉはヒトの体液、例えば血液及びヒトの脳髄液中に天然に生じている。殆どの組織、特に肝臓は、特定のＩＧＦ結合タンパク質と共にＩＧＦ-Ｉを産生する。ＧＨと同様に、ＩＧＦ-Ｉは強力な同化タンパク質である。Tannerら, Acta Endocrinol., 84：681-696(1977)；Uthneら, J. Clin. Endocrinol. Metab., 39：548-554(1974)を参照。また、重度の病気における同化剤としてのＩＧＦ-Ｉ、成長ホルモン、インスリンの役割をレビューしているRossら, Intensive Care Med., 19 Suppl. 2：S54-57(1993)を参照されたい。
ＩＧＦ-Ｉは、天然源、例えばヒト血清から精製されるか(Rinderknecht及びHumbel,  J. Biol. Chem., 上掲)、又は組換え(例えば欧州特許第123,228号及び同128,733号)により調製することができる。ＩＧＦ-Ｉの様々な製剤法が開示されている。これらには、例えば強酸と共にＩＧＦ-Ｉを含有する溶液を乾燥させることを含む、ＩＧＦ-Ｉの乾燥組成物を調製するための方法を開示している欧州特許第440,989号、ｐＨ６のシトレートバッファー中でのＩＧＦ−Ｉの製剤化に関する国際公開第91/18621号、成長促進組成物におけるＩＧＦ-Ｉ及びＧＨの製剤化についての米国特許第5,374,620号、酢酸バッファー中でのＩＧＦ-Ｉの製剤化についての米国特許第5,681,814号、ｐＨ５．５から６．５をもたらす、５０ｍｍｏｌ以下の量のリン酸バッファー中にＩＧＦ-Ｉを含み、等張性であって注射に適した安定な溶液についてのPCT/SE94/00010、及び酸素濃度を低減させた水溶液中にＩＧＦ-Ｉを含有する溶液についての国際公開第95/34318号が含まれる。
【０００３】
ＩＧＦ-Ｉは、静脈ボーラス注射により投与された場合、ヒトにおいてインスリンと同様の低血糖効果を有するが、また正の窒素バランスを促進する。Underwoodら, Hormone Research, 24：166(1986)。ＩＧＦ-Ｉはレギュラーインスリンと類似していると記載されている時間経過をもって、正常な個体(Gulerら,  N. Engl. J. Med., 317：137-140(1987))と糖尿病の個体(Schoenleら, Diabetologia, 34：675-679(1991)；Zenobiら, J. Clin. Invest., 90：2234-2241(1992))の双方においてグルコース低下効果を働かせることが知られている(さらに、Sherwinら, Hormone Research, 41(Suppl.2)：97-101(1994)；Takanoら, Endocrinol. Japan, 37：309-317(1990)；Gulerら, Acta Paediatr. Scand.(Suppl.), 367：52-54(1990)を参照のこと)。また、ｒｈＩＧＦ-Ｉの投与に続いて低血糖症が増加することを報告しているKerrらの「低血糖症への反応とその認識に対するインスリン様成長因子Ｉの効果」American Diabetes Association(ＡＤＡ), 52nd Annual Meeting, San Antonio, Texas, June 20-23, 1992を参照のこと。さらに、ｒｈＩＧＦ-Ｉの単一投与により、ＩＤＤＭを有する青年の一夜のＧＨレベルとインスリン要求度が減少する。Cheethamら, Clin. Endocrinol., 40：515-555(1994)；Cheethamら, Diabetologia, 36：678-681(1993)。
Schalchら, J. Clin. Metab.により報告されているように、組換えヒトＩＧＦ-ＩのＩＩ型糖尿病への投与は、血清インスリンを低下させ、平行してＣペプチドレベルを減少させることを実証しており、これはＩＧＦ-Ｉ治療の５日後の膵臓インスリン分泌の低減を示している。この効果はFroeschら, Horm. Res., 42：66-71(1994)によって独立に確認されている。また、正常なラットにおけるインビボ実験では、ＩＧＦ-Ｉの注入が膵臓のインスリン放出を阻害することが示されている。Fursinnら, Endocrinology, 135: 2144-2149 (1994)。さらに、膵臓灌流製剤において、ＩＧＦ-Ｉがまたインスリン分泌を抑制する。Leahyら, Endocrinology, 126：1593-1598(1990)。ヒト及び動物でのインスリン分泌に対するＩＧＦ-Ｉのインビボ阻害効果が明らかになっているにもかかわらず、インビトロ実験では、このような一貫した結果が出ていない。
【０００４】
ＩＧＦ-Ｉとグルコースの双方を様々な濃度で使用するインビトロ実験では、インスリン分泌の様々な度合いの阻害性、例えば生理学的レベルのＩＧＦ-Ｉを利用するインスリン放出において効果なし(Sreradzeriら, J. Endocrinol., 117：59-62(1988))から３０％低減までといったことが示されている。Van Schravendijkら, Diabetologia, 33：649-653(1990)。ヒト膵臓小島を使用する最近の研究では、Eizirikら, Eur. J. Endocr., 133：248-250(1995)では、培地のインスリン蓄積又はグルコース刺激インスリン放出にはＩＧＦ-Ｉが効果を持たないことが見出されている。研究者は、インスリン分泌に対してインビボで見られるＩＧＦ-Ｉの効果が、膵臓へのその直接の効果というよりもむしろＩＧＦ-Ｉの膵臓外効果に二次的である可能性があると推測している。よって、インスリン分泌に対するＩＧＦ-Ｉの作用機序と部位は十分には理解されていない。
短い期間のｒｈＩＧＦ-Ｉ投与により誘発される数々の生化学的変化が文献に記載されている。これらの中でも顕著なものは、オイグリセミッククランプ（euglycemic clamp）中の健康な被験者において報告されている組換えヒトＩＧＦ-Ｉ(ｒｈＩＧＦ-Ｉ)のホスフェート及びカリウム低下効果である。Boulwareら,「ヒトにおけるインスリン様成長因子Ｉのホスフェート及びカリウム低下効果：インスリンとの比較」The Endocrine Society, 74th Annual Meeting, San Antonio, Texas, 1992, 6月24-27日。また、Gulerら, Acta Paediatr. Scand.(Suppl.), 367, 上掲を参照。
組換えヒトＩＧＦ-Ｉ(ｒｈＩＧＦ-Ｉ)はインスリン感受性を改善する能力を有している。例えば、ｒｈＩＧＦ-Ｉ(１日２回の７０μｇ／ｋｇ)は、筋緊張性ジストロフィーを患っている非糖尿性インスリン耐性患者においてインスリン感受性を改善した。Vlachopapadopoulouら, J. Clin. Endo. Metab., 12：3715-3723(1995)。Saadらは、Diabetologia, 37：アブストラクト40(1994)において１５日間のｒｈＩＧＦ-Ｉ治療(１日２回の２５μｇ及び１００μｇ／ｋｇ)後に、肥満と障害性グルコース耐性を患っている成人において、インスリン感受性が用量依存的に改善されたことを報告している。また、ｒｈＩＧＦ-Ｉは重度のＡ型インスリン耐性の患者(Schoenleら, Diabetologia, 34：675-679(1991)；Morrowら, Diabetes, 42(Suppl.)：269(1993)(要約書)；Kuzuyaら, Diabetes, 42：696-705(1993))、又は非インスリン依存性の真性糖尿病を持つ他の患者において、インスリン感受性と糖血症の調節度合いを改善した。Schalchら,「ＩＩ型真性糖尿病における組換えヒトインスリン様成長因子Ｉ(ｒｈＩＧＦ-Ｉ)の短期間の代謝効果」Spencer EM 編, インスリン様成長因子の現代的概念(New York：Elsevier：1991)pp.705-715；Zenobiら, J. Clin. Invest., 90：2234-2241(1993)。
【０００５】
インスリン耐性がＩ型糖尿病の顕著な特徴であると考えられていないが、それがある個体には明らかに存在し、青年期においては臨床的にもっとも重要である。ＧＨはよく知られた抗インスリン効果を有しているので、青年期においてＧＨレベルが増加すると、かなりのこのインスリン耐性が媒介されうる。Pressら, 上掲；Defeoら, 上掲；Campbellら, N. Eng. J. Med., 上掲, Campbellら, Metabolism, 上掲；Ariasら, 上掲；Davidsonら, 上掲。
インスリン耐性を生じるいくつかの臨床的フェノタイプの病因と選択された代表的な被験者に対するＩＧＦ-Ｉ投与による可能性な効果の一般的な概要については、いくつかの文献に与えられている。例えば、「人におけるヒトインスリン様成長因子(ＩＧＦ-Ｉ)に対する血行力学及び代謝応答」：インスリン様成長因子の現代的概念(Spencer EM,編), Elsevier, New York, pp.219-224(1991)；Quinnら, New. Engl. J. Med., 323：1425-1426(1990)；Schalchら,「ＩＩ型真性糖尿病における組換えヒトインスリン様成長因子Ｉ(ｒｈＩＧＦ-Ｉ)の短期間の代謝効果」：インスリン様成長因子の現代的概念, (Spencer EM,編), Elsevier, New York, pp.705-714(1991)；Schoenleら, Diabetologia, 34：675-679(1991)；Usalaら, N. Eng. J. Med., 327：853-857(1992)；Liebermanら, J. Clin. Endo. Metab., 75：30-36(1992)；Zenobiら, J. Clin. Invest., 90：2234-2241(1992)；Zenobiら, J. Clin. Invest., 89：1908-1913(1992)；Kerrら, J. Clin. Invest., 91：141-147(1993)を参照されたい。国際公開第94/16722号には、少なくとも約７日の間、修飾有効量のＩＧＦ-Ｉに細胞を暴露することにより、細胞障壁特性を慢性的に修飾する方法、及びインスリン耐性の慢性的改善又は逆転の方法が開示されている。しかしながら、ＩＧＦ-Ｉが１２０-１６０μｇ／ｋｇの用量で毎日２回、診療所でＩＩ型の糖尿病患者の治療のために使用された場合、その副作用が治療の有益性を越えた。Jabriら, Diabetes, 43：369-374(1994)。また、ＩＧＦ-Ｉを用いた患者の治療の際に観察された副作用に関して、Wilton, Acta Paediatr., 383：137-141(1992)も参照されたい。
米国特許第4,988,675号には、ＩＧＦ-Ｉを用いたＩＩ型糖尿病の治療が記載されており、米国特許第5,466,670号には、ＩＧＦ-Ｉを用いたＩ型糖尿病の治療が記載されており、国際公開第91/03253号には重度のインスリン耐性糖尿病を治療するためにＩＧＦ-Ｉを使用することが報告されており、国際公開第96/01124号には糖尿病を予防し、糖尿病の臨床的発病を遅延し、かつ糖尿病に対する保護効果を提供するためにＩＧＦ-Ｉを使用することが記載されている。
【０００６】
ＩＩ型糖尿病において選択される治療法は併用療法となっている。このような併用療法は、歴史的に、様々な形態のインスリン、短時間作用するインスリン、中間作用及び長時間作用するインスリンの使用を含む。インスリン製剤の総括論文には、Kissel及びVolland, Deutsche Apotheker-Zeitung, 134：25(1994)及びCampbell, Pharmacy Times, 59：40(1993)が含まれる。より最近では、スルホニルウレア及びビグアナイド剤等の経口的に付与される他の抗糖尿剤とインスリンとの併用が一般化している。
ＩＧＦとインスリンとの併用については、Gennら, Biochem. Arch., 5：53-59(1989)にインスリンとＩＧＦ-ＩＩとの同化効果が開示されている。Jacobら, Am. J. Physiol., 260：E262-E268(1991)には、自然発症糖尿病ＢＢ／ｗラットにおけるＩＧＦ-Ｉとインスリンの代謝効果が開示されている；さらに米国特許第4,876,242号を参照。またさらに、インスリンとＩＧＦを用いた治療後の心臓タンパク質合成の刺激については、Fullerら, Biochem. Soc. Trans., 19：277S(1991)に開示されている。実験は新鮮に単離された心筋細胞を用いてインビトロにおいて実施されている。一晩絶食させたイヌにインスリンとＩＧＦとを用いて治療を施した後のタンパク質代謝に対する効果は、Umplebyら, Eur. J. Clin. Invest., 24：337-344(1994)により報告されている。Shojaee-Moradieらはイヌのグルコース代謝に対するＩＧＦ-Ｉ、インスリン及びそれらを組合せた注入物の効果の比較を開示している。Randazzo及びJarett, Exp. Cell Res., 190(1)：31-39(1990)には、ヒトインスリンレセプターを発現するマウス線維芽細胞の成長の特徴付け及びそのＤＮＡ合成に対するＩＧＦ-Ｉとインスリンの効果が開示されている。Tomasら, Diabetes., 45：170-177(1996)には、糖尿病のラットに対するＩＧＦ-Ｉとインスリンの組合わせ注入の効果が開示されている。Dungerら, Metabolism, 44：119-123(1995)では、インスリンと組み合わされてＩＧＦ-Ｉが、青年期におけるＩＤＤＭ治療へのさらなるアプローチを提供しうることが示唆されている。Mathe, Biomedicine及びPharmacotherapy, 49：221-224(1995)には、真性糖尿病の治療のための、インスリンに関連したＩＧＦの役割が開示されている。
【０００７】
特許文献については、米国特許第4,988,675号が、ＩＩ型糖尿病の治療のために、通常よりも少量のインスリンとのＩＧＦ-Ｉの組合わせを開示している。1996年1月18日に公開された国際公開第96/01125号には、窒素バランスの低減を相殺し、タンパク質合成の低減を相殺する医薬の製造においてインスリンとＩＧＦ-Ｉとを併用することが開示されており、これは糖質コルチコイド過多によるタンパク質異化作用の治療に使用することができる。米国特許第5,091,173号には、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ及びインスリンから選択されるＩＧＦファミリーのメンバーを一又は複数含有し、毛髪の成長を増加させるのに十分な真皮乳頭細胞の培養物からの無細胞上清を含有する、哺乳動物の皮膚又は毛髪への局所適用に適した組成物が開示されている。
作用の持続時間と作用の始まりが異なる様々な形態のヒトインスリンが市場に存在している。Jens Brange, インスリンのガレノス製剤、インスリンの物理化学及び製薬的側面及びインスリン製剤(Springer-Verlag, New York, 1987), 17-40頁。レギュラーインスリンは六量体インスリンを含む透明な中性溶液である。短時間で作用し、その作用開始は注射後０．５時間であり、作用の持続時間は約６−８時間である。イソフェンインスリンとも呼ばれているＮＰＨ[中性プロタミンハーゲドルン(Hagedorn)]インスリンはインスリン-プロタミン複合体の結晶懸濁液である。これらの結晶は、インスリン六量体当たり、約０．９分子のプロタミンと２個の亜鉛原子を含む。Doddら, Pharmaceutical Research, 12：60-68(1993)。ＮＰＨインスリンは中間作用インスリンであり；その作用開始は１．５時間で生じ、その作用の持続時間は１８−２６時間である。７０／３０インスリンは７０％のＮＰＨインスリンと３０％のレギュラーインスリンからなる。またセミレンテ(Semilente)インスリン(亜鉛インスリン複合体の非晶質沈殿物)、ウルトラレンテ(UltraLente)インスリン(亜鉛インスリンの結晶懸濁液)、及びレンテ(Lente)インスリン(非晶質及び結晶質インスリン粒子の３：７混合物)、並びに、最近イーライリリー社により市場に導入されたフマログ(Humalog)インスリン(速効作用の単量体インスリン溶液で、インスリンＢ鎖においてＬｙｓ(Ｂ２８)とＰｒｏ(Ｂ２９)アミノ酸とが転換した結果によるもの)がある。
【０００８】
ＮＰＨ-、７０／３０、及びレギュラーインスリンは最も広範囲に使用されているインスリンであり、1996年の処方箋において、それぞれ３６％、２８％及び１５％を占めると計算されている。これら３つの形態のインスリンを合計すると全てのインスリン処方箋の７９％になる。よって、ＩＧＦ-Ｉ製剤はレギュラー、ＮＰＨ-及び７０／３０インスリンと混合可能であることが必要であることが決定された。
典型的には、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病を患っている患者は、血糖値を制御するために、毎日２回から４回の皮下注射を受ける。糖尿病を治療するためのインスリン以外の他の注射可能な薬剤、例えばＩＧＦ-Ｉを使用することは、最小回数の注射を投与することが糖尿病では望まれているために、おのずと制限される。既に１日当たり数回のインスリン注射が必要とされている投薬計画に、ＩＧＦ-Ｉ投与のために、毎日さらに２回の皮下注射を加えることは現実的ではない。さらに、ＩＧＦ-Ｉ及びインスリン等の２つのタンパク質を組合わせる場合、安定で、患者によく吸収され、中間の作用のインスリンを含有する製剤を得ることが必要となってくる。代謝環境の変化する要求に応じて、時間-及び標的-組織-依存的に調節された中間の作用のインスリンが、Lewittら, Endocrinology, 129：2254-2265(1991)により記載されている。
米国特許第5,788,959号には、例えばマトリックス溶液がポリマーとは異なる製薬的に活性な成分をそこに分散させているポリペプチドのような、逆の電荷を持つ水溶性ポリマーの単一相マトリックス溶液を含んでなる薬物送達体が開示されている。さらに、Burgessら, J. Pharm. Pharmacol., 43：232-236(1991)には、マイクロカプセル化の一般的な方法であるコアセルベーションを用いた、逆の電荷を持つアルブミンとアカシアの混合物の間の複合コアセルベーションが開示されている。Mauk及びMauk, Biochemistry, 21：4730-4734(1982)は、精製されたヒトメトヘモグロビンとウシ肝臓チトクロムｂ５のトリプシン（tyrptic）断片との間の複合体形成を開示しており、各ヘモグロビンサブユニットが、２つのタンパク質の逆の電荷を持つ基の間の相補的荷電作用により一つのチトクロムｂ５に結合するこれら分子間の相互作用モデルを報告している。さらに、欧州特許第615,444号には、逆の電荷のゼラチン又はゼラチン誘導体マトリックスに分散されたインスリンのような医薬を含むペプチド様医薬に対する経口的投与形態が開示されている。欧州特許第313,343号には、タンパク質と不純物が選択的結合が生じるような逆の電荷を有するようなｐＨで、イオン交換クロマトグラフィーにより、不純物から粗タンパク質を精製する方法が開示されている。
【０００９】
現在、糖尿病ではＮＰＨインスリン(中間作用中性プロタミンハーゲドルンインスリン)をレギュラーインスリンと混合している。同じシリンジ又は他の送達容器において別個のバイアルから、インスリン及びＩＧＦ-Ｉのような逆の電荷を持つポリペプチド類を混合し、直ちに混合物を注射又は他の方法で送達せしめることが望ましい。米国特許第5,783,556号には、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ-Ｉとを混合した製剤が開示されている。米国特許第5,756,463号には、ＩＧＦ-Ｉとインスリンとの組合せ、及び窒素バランス低減とタンパク質合成低減の相殺におけるその使用が開示されている。米国特許第4,608,364号には、糖尿病の治療用のインスリン誘導体と未変性のインスリン又はその特定の類似体の活性化合物の組合せが開示されている。この目的のために、あらゆる種類のインスリンをＩＧＦ-Ｉと混合すること、並びに、他のポリペプチド、例えば現在では沈殿複合体として販売されているプロタミンとインスリンとを混合することが望まし。
【００１０】
（発明の概要）
混合の際には、逆の電荷を持つ２つのポリペプチドは互いに結合して、凝集体を形成するか溶液から沈殿する傾向にある。ある種の製剤用賦形剤の使用により、ＩＧＦ-Ｉとインスリン及びプロタミンとインスリンを含む、このようなポリペプチドを混合した際の凝集と沈殿を防止することができる。塩類、バッファー、中性アミノ酸、ポリオール、糖類及び洗浄剤等の多くの賦形剤は沈殿の防止には効果がなかった。
従って、本発明は、一実施態様では、逆の電荷の製薬的に活性なポリペプチドの混合物と、アルギニン、リジン、グルタメート(グルタミン酸)、ドデシル硫酸ナトリウム、及びβ-ヒドロキシシクロデキストリンとアルギニンとの組合せからなる群から選択される賦形剤を含有する組成物を提供するものであり、ここでポリペプチドは組成物に可溶である。
この実施態様の好ましい側面では、組成物は約７〜７．５のｐＨでヒスチジン等のバッファーをさらに含有しうる。
さらなる実施態様では、本発明は：
(ａ)有効量のポリペプチドを含有する上述の組成物を収容する容器；及び
(ｂ)上述の組成物が有効である疾患の治療に該組成物を使用するための使用説明書；
を含むキットを提供する。
ポリペプチドがＩＧＦ-Ｉ及びインスリンである場合、疾患は好ましくは高血糖疾患である。
さらなる他の側面では、本発明は、アルギニン、リジン、グルタミン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、β-ヒドロキシシクロデキストリン、及びβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルからなる群から選択される賦形剤中に成分(ａ)として第１のポリペプチドを、成分(ｂ)として第１のポリペプチドとは逆の電荷の第２のポリペプチドを互いに混合することを含む、上述の組成物を調製するための方法を供給する。
好ましい側面では、前記方法は、約３０−４０℃で所定時間、好ましくは３７℃で約１５分間、混合物をインキュベートする工程をさらに含み、ここで該組成物はリン酸緩衝食塩をさらに含有する。さらなる他の実施態様では、本発明は：
(ａ)アルギニン、リジン、グルタミン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、及びβ-ヒドロキシシクロデキストリンとアルギニンとの組合せからなる群から選択される賦形剤中に第１のポリペプチドを含む容器；及び
(ｂ)第１のポリペプチドとは逆の電荷の第２のポリペプチドを含む容器；及び
(ｃ)容器(ａ)と(ｂ)の内容物を組合せるための使用説明書；
を含む、上述の組成物を調製するためのキットを提供する。
好ましくは、得られる混合物は製薬的に許容可能な製剤である。
さらなる他の側面では、本発明は、有効量の上述した組成物を、好ましくは注射又は注入により、哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における糖尿病等の高血糖疾患を治療する方法を提供する。
【００１１】
ＩＧＦ-Ｉ及びインスリン等の逆の電荷の２つのポリペプチドの混合には、双方のポリペプチドの物理的及び化学的特性が混合後に変化しないことが必要である。さらに、薬物動態学的及びグルコース薬力学的性質が混合の前と後で同じままであることが好ましい。ポリペプチドの一方がＩＧＦ-Ｉである場合は、製剤は最小で２年の使用期限を有するものであることが好ましい。別のポリペプチドとの混合を可能にするためには、第１のポリペプチドの製剤は透明な液状製剤、又はポリペプチド(例えばＩＧＦ-Ｉ)が結晶、非晶質の沈殿物又はタンパク質の乾燥パウダーの形態である懸濁製剤とすることができる。ここでの実施例には、インスリンと混合可能な透明な液状ＩＧＦ-Ｉ製剤の開発が記載されている。
ポリペプチドがＩＧＦ-Ｉ及びインスリンである場合、目標のＩＧＦ-Ｉの用量は１０、２０又は４０μｇ／ｋｇ／注射(又は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ製剤に対して１、２又は４μｌ／ｋｇ／注射)である。第ＩＩ相臨床試験においてＩ型及びＩＩ型患者に使用されるインスリン用量から、最大の可能な混合比率がレギュラーインスリン：ＩＧＦ-Ｉで６：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)に達することが可能であることが算出できる。最小の可能な混合比率はＮＰＨインスリン：ＩＧＦ-Ｉに対しては１：１５(ｖｏｌ：ｖｏｌ)まで達することができる。よって、ここに記載の実施例では、１：６〜６：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の範囲の混合比率がレギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉとの混合に対して実験され；１：１５〜１５：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の範囲の混合比率がＮＰＨインスリンとＩＧＦ-Ｉとの混合に対して実験され；１：１５〜６：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の範囲の混合比率が７０／３０インスリンとＩＧＦ-Ｉとの混合に対して実験された。
【００１２】
（好ましい実施態様の記載）
Ａ．定義
ここで用いられるところの「ポリペプチド」又は「関心あるポリペプチド」は、一般には約１０より多いアミノ酸を持つペプチド及びタンパク質を意味する。哺乳動物ポリペプチドの例としては、例えば、レニン、ヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子を含む成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α１-アンチトリプシン；インスリンＡ-鎖；インスリンＢ-鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及びβ；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮＡ分解酵素；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子；カージオトロフィン-１（ＣＴ-１）等のカージオトロフィン（心臓肥大因子）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含むＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ-３、ＣＤ-４、ＣＤ-８、及びＣＤ-１９等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；プロタミン；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１からＩＬ-１０；抗ＨＥＲ-２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；抗体；及び上に列挙したポリペプチドの任意のものの断片を含む。
【００１３】
好ましい関心あるポリペプチドは哺乳動物ポリペプチド、最も好ましくはヒトポリペプチドである。このような哺乳動物ポリペプチドの例は、ｔ-ＰＡ、ＶＥＧＦ、ｇｐ１２０、抗ＨＥＲ-２、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ＤＮＡ分解酵素、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、インスリン、プロタミン、脳ＩＧＦ-Ｉ、成長ホルモン、リラキシン鎖、ＬＨＲＨ類似体、コレシストキニン-８類似体、成長ホルモン放出因子、インスリン鎖又はプロインスリン、ウロキナーゼ、免疫毒素、ニューロトロフィン及び抗原を含む。特に好ましい哺乳動物ポリペプチドは、双方を含有する一回の注射又は投薬を与えることが望ましい十分な程度の頻度で哺乳動物に投与される組合せである。特に好ましいこのような組合せは、例えばインスリンとＩＧＦ、最も好ましくはＩＧＦ-Ｉ又はプロタミンとインスリン、又は成長ホルモンとＩＧＦ-Ｉ等のＩＧＦ、又はロイプロリド等のＬＨＲＨ類似体とＣＣＫ-８等のコレシストキニン-８類似体を含む。
ここで用いられる「逆の電荷を持つポリペプチド類」又は「逆の電荷のポリペプチド類」とは、与えられたｐＨにおいて一つのポリペプチドが負に荷電し、また一つのポリペプチドが正に荷電していることを意味している。電荷は、例えばゲル等電点電気泳動により測定されるその等電点(ｐＩ)により、又はポリペプチドのイオン性基のｐＫａ値に基づいて決定することができる。一般的に、負の電荷を持つポリペプチドは約ｐＨ６から８で正味の負電荷であるか、又は約５を越える負の電荷を持つ残基を有する。ポリペプチドが負の電荷を持つポリペプチドとして使用されるためには、それは正の電荷の数に比べてより多くの数の負の電荷を持たなくてはならない。逆に、正の電荷を持つポリペプチドは一般に約ｐＨ６から８で正味の正の電荷を持つか、又は約５を越える正の電荷を持つ残基を有する。ポリペプチドが正の電荷を持つポリペプチドとして使用されるためには、負の電荷の数に比べてより多く数のの正の電荷を持たなくてはならない。例えば、ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンは、ｐＨ７．２の溶液において、それぞれ８．７及び５．４のｐＩ値を有し、よって逆の電荷を持っている。さらに、ｐＨ７．４の溶液において、ロイプロリド(ＬＨＲＨ類似体)は正の電荷を持っている一方、コレシストキニン-８類似体(ＣＣＫ-８)は４未満のｐＩのために負の電荷を持つ。２つの逆の電荷を持つポリマーの電荷は静電的相互作用を引き起こすのに十分である。負の電荷を持つポリペプチドの他の例には、ヘパリン、アルブミン(ウシ血清アルブミンは、ｐＨ７．１で−１８の正味の負の電荷を持ち、ｐＩ４．８を有する)、及びβ-ラクトグロブリン(ｐＨ７．１で−５の正味の負の電荷を持つ、５．１のｐＩ)が含まれる。
ここで逆の電荷を持つポリペプチド類は天然ポリペプチド、又はそれらが「製薬的に活性」であるという前提で、誘導体化された又は合成のものである。「製薬的に活性」とは、免疫アッセイ及び細胞分裂促進アッセイを含む一又は複数の生物学的アッセイにおいて効力を有するポリペプチドを意味する。例えば、製薬的に活性なポリペプチドには、免疫学的又は生物学的な意味において作用する抗原並びに抗体、及びレセプター並びにリガンドが含まれる。
【００１４】
ここで用いられる「ＩＧＦ-Ｉ」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び好ましくはヒトを含む任意の種からのインスリン様成長因子を意味し、天然配列又は変異体であり、天然、合成、又は組換え生産の任意の供給源からのものである。ここで動物使用に好ましいのは、治療される特定の種からのＩＧＦ-Ｉの形態、例えばブタの治療のためのブタＩＧＦ-Ｉ、ヒツジの治療のためのヒツジＩＧＦ-Ｉ、ウシの治療のためのウシＩＧＦ-Ｉ等々である。ここでヒト使用に好ましいのは、ヒト天然配列、成熟ＩＧＦ-Ｉ、より好ましいくは、例えば、1987年8月5日に公開されたＥＰ230,869；1984年12月19日に公開されたＥＰ128,733；又は1988年10月26日に公開されたＥＰ288,451に記載された方法により調製されるＮ末端メチオニンの無いものである。より好ましくは、この天然配列ＩＧＦ-Ｉは組換え生産され、臨床研究のためにジェネンテク・インク，サウスサンフランスシコ，ＣＡから入手できる。
好ましいＩＧＦ-Ｉ変異体は、米国特許第5,077,276号；同5,164,370号；又は同5,470,828号；又は国際公開第87/01038に記載されたもの、すなわち、少なくとも成熟分子のＮ末端から３位のグルタミン酸残基を欠くもの、又はＮ末端において５個までのアミノ酸を欠失するものである。最も好ましい変異体は、Ｎ末端から最初の３個のアミノ酸を欠失している（脳ＩＧＦ、ｔＩＧＦ-Ｉ、ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ、又はｄｅｓ-ＩＧＦ-Ｉと様々に示される）。
【００１５】
ここで用いられる「インスリン」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び好ましくはヒトを含む任意の種からのインスリンの任意の形態を意味し、天然、合成又は組換え生産の任意の供給源からのものである。例えば、真性糖尿病-理論と実際、第4版, Harold Rifkin, MD, Ed.(Elsevier, New York, 1990), 第29章, 及びU.S. Pharmacist, 18(Nov. Suppl.)p.38-40(1993)に報告されている全てのインスリン薬剤がここで適切である。市場にある様々な形態のヒトインスリンの全て、例えばJens Brange, インスリンのガレノス製剤, インスリンの物理化学及び製薬的側面及びインスリン製剤(Springer-Verlag, New York, 1987), 17-40頁が含まれる。これらにはレギュラーインスリン、イソフェンインスリンとも呼ばれているＮＰＨ(中性プロタミンハーゲドルン)インスリン、７０％のＮＰＨインスリンと３０％のレギュラーインスリンからなる７０／３０インスリン、セミレンテインスリン、ウルトラレンテインスリン、レンテインスリン、及びフマログインスリンが含まれる。ここで動物使用に好ましいのは、治療される特定の種からのインスリンの形態、例えばヒトの治療のためのヒトインスリンである。
ここで用いられる「疾患」という用語は、一般に、ここでの組成物中の逆の電荷を持つポリペプチド類成分での治療により恩恵を受ける任意の状態を意味し、有効量のこれらのポリペプチドで治療可能な任意の病気又は疾患を含む。これは慢性及び急性疾患、並びに哺乳動物を当該疾患にかかりやすくする病理的状態を含む。限定されないが、ここで治療される疾患の例には、良性及び悪性腫瘍；白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質性及び胞胚腔の疾患；造血関連疾患；組織成長疾患；皮膚疾患；線維形成、線維性傷害；高血糖疾患；腎臓疾患；骨関連疾患；外傷、例えば火傷、切開及び他の創傷；異化状態；精巣関連疾患；及び動脈硬化症を含む炎症、血管原性及び免疫疾患が含まれる。ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンを用いた治療で恩恵を受け得る疾患の例には糖尿病が含まれる。
【００１６】
ここで用いられる「高血糖疾患」なる用語は、糖尿病の全ての形態、例えばＩ型及びＩＩ型糖尿病、並びに高インスリン血症及び高脂血症、例えば、肥満患者、及びインスリン耐性糖尿病、例えばメンデンホール症候群、ヴェルナー症候群、妖精症、脂肪組織萎縮性糖尿病、及び他の脂肪組織萎縮症を意味する。好ましい高血糖疾患は糖尿病、特にＩ型及びＩＩ型糖尿病である。「糖尿病」自体は、インスリンの不十分な生産又は利用を含む炭水化物代謝の進行性疾患を意味し、高血糖及び糖尿によって特徴付けられる。
ここで用いられる「治療する」なる用語は、治癒的処置、予防的療法又は防止的療法の両方を意味する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすい又は疾患を持つと診断されているもの又は疾患が防止されるべきものを含む。連続的治療又は投与は、少なくとも毎日のベースでの治療を意味し、一又は複数の日で治療が中断されない。間欠的治療又は投与、あるいは間欠形式での治療又は投与とは、連続的ではなく、むしろ周期的な性質の治療を意味する。ここでの治療措置は、連続的又は間欠的のいずれかとできるが、双方のタンパク質が調製され共に投与される場合は連続的であることが好ましい。
ここで用いられる治療目的の「哺乳動物」は哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜及び農場動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ等々を含む。ここでの好ましい哺乳動物はヒトである。「非成体」なる用語は、周産期年齢（出生時低体重乳児など）から思春期の年齢までの哺乳動物を意味し、後者は、可能な完全な成長にはまだ達していないものである。
ここで用いられる「血糖降下剤」なる用語は、インスリンを除く分泌促進薬、好ましくは経口薬を意味し、膵臓によるインスリンの分泌を起こす。ここでヒト使用により好ましいものはスルホニルウレア類の経口血糖降下剤である。この例には、グリブリド、グリピジド、及びグリクラジドが含まれる。さらに、インスリン感受性を増強する薬剤、例えばビグアナイドがこの定義に包含され、また好ましくもある。
【００１７】
ここで用いられるポリペプチドにおいての「複合化」とは、それらが共有結合するか、又は約１(ｍμ)−１を越える結合親和性を有する等を意味する。この例には、ＩＧＦ-Ｉと一又は複数のその結合タンパク質、又はリガンドとそのレセプター、又はメトヘモグロビンとウシ肝臓チトクロムｂのトリプシン断片の複合体、又はアルブミンとアカシアとのような複合コアセルベーションが含まれる。
ここで用いられる「可溶性」とは、水溶液中にあるとき完全に溶解し、目視で評価して、可視できる粒子がない透明からわずかに乳白色光の溶液になるポリペプチドを意味する。溶液の濁度のさらなるアッセイは、１ｃｍの路程セルを用い、３２０から３６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することより実施できる(Eckhardtら, J. Pharmaceutical Science and Technology, 48：64-70(1994))。
「安定化剤」は、製剤中に活性なポリペプチド、例えばインスリン及びＩＧＦ-Ｉを、それらが劣化したり、適度の期間後に不活性になったり、それらの使用を妨げる病原体や毒素が生育したりすることがないように、保護するように機能する任意の化合物である。安定化剤の例には、製剤中において細菌、ウイルス、及び真菌が増殖するのを防止する防腐剤、酸化防止剤、又は種々の方法で製剤の安定性を保持するように機能する他の化合物が含まれる。
ここで用いられる「バッファー」はＧＲＡＳである任意の適切なバッファーであり、一般的にポリペプチドがＩＧＦ-Ｉ及びインスリンである場合、約４．８から８、好ましくは約７から７．５、より好ましくは約７．２のｐＨを付与する。この例には、酢酸ナトリウム及び酢酸カリウムを含む酢酸の任意の塩である酢酸塩バッファー、コハク酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、又は所望の効果を得るために当該分野で公知の任意の他のものが含まれる。最も好ましいバッファーは、ｐＨ約７から７．５のヒスチジンである。
【００１８】
Ｂ．発明の実施の形態
一般的に、製剤は、それぞれ所望の度合いの純度を持つ逆の電荷のポリペプチド類を、一又は複数の次の賦形剤：アルギニン、リジン、グルタメート、又はドデシル硫酸ナトリウム、又は２つの賦形剤β-ヒドロキシシクロデキストリンとアルギニンの組合わせと均質かつ密に混合することにより調製される。場合によっては、組成物は非経口的投与用に、製薬的又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度及び用量において受容者に対して毒性がなく、製剤の他の成分と融和性のあるものをさらに含有してもよい。製剤は、好ましくは酸化剤及びポリペプチドに有害であることが知られている他の化合物を含有しない。担体は、好ましくは非経口用担体、より好ましくは受容者の体液と等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例には、水、生理食塩水又は緩衝溶液、例えばリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)、リンガー液、デキストロース溶液が含まれる。最も好ましくは、キャリアビヒクルはＰＢＳである。
好ましい賦形剤は使用されるポリペプチドの種類、組成物中における２つのポリペプチドのモル比、他の成分の存在、種類及び量等に依存する。例えば、ポリペプチドがＩＧＦ-Ｉ及びインスリンである場合、好ましい賦形剤は、１：１のｖｏｌ／ｖｏｌ比のＩＧＦ-１とインスリンに対して１００−２００ｍＭ、より好ましくは約１６０ｍＭ濃度のアルギニンである。さらにインスリンがＮＰＨインスリンである場合、賦形剤としてβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルを、単独で又はアルギニンと組合せて用いることはできないが、これはＮＰＨ部分にインスリンの再溶解化を引き起こし、ＮＰＨインスリン複合体を分離させてしまうからである。
ポリペプチドがインスリンとＩＧＦ-Ｉである場合、組成物は、好ましくはｐＨを約７−７．５にするバッファー、例えばヒスチジンをさらに含有する。
また、使用される賦形剤の濃度はポリペプチドの種類と比率に依存する。例えば、賦形剤がアルギニンであり、ポリペプチドが、インスリン濃度が３．８ｍｇ／ｍｌでＩＧＦ-Ｉ濃度が１０ｍｇ／ｍｌのレギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉである場合、ＩＧＦ-Ｉに対するインスリンの最大比率は、アルギニン濃度が１５０ｍＭならば、０．８５：１である。しかしながら、アルギニンの濃度を増加させると、ＩＧＦ-Ｉに対するレギュラーインスリンの比率も増加させられ、例えば２３０ｍＭのアルギニンで最大比率は２．５：１となる。賦形剤として２８０ｍＭのリジン又はグルタメートが使用される場合、最大比率は１：１である。さらに、０．５％のＳＤＳが使用される場合、混合比率は１：１ないし６：１とすることができる。５％のβ-ヒドロキシシクロデキストリンと１５０ｍＭのアルギニンが使用される場合は比率１．４：１未満、５％のβ-ヒドロキシシクロデキストリンと２３０ｍＭのアルギニンが使用される場合は６：１未満、１％のβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルが使用される場合は０．２５：１未満、１％のβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルと１５０ｍＭのアルギニンが使用される場合は１．２：１未満、５％のβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルと２３０ｍＭのアルギニン、又は２．５％のこのようなエーテルと２３０ｍＭのアルギニン、又は２％のこのようなエーテルと１５０ｍＭのアルギニンが使用される場合は１０：１未満で混合することができる。
【００１９】
ポリペプチドの容量：容量比は、ポリペプチドの種類、ポリペプチドの濃度、賦形剤(類)の種類、及び賦形剤(類)の濃度に依存する。ＮＰＨインスリンに対しては、インスリン：ＩＧＦ-Ｉの比率は、一般的に約１：１５から１５：１ｖｏｌ／ｖｏｌ、好ましくは１：１から１５：１の範囲にある。レギュラーインスリンに対しては、比率は、一般的に約１：６から６：１、好ましくは約１：１から１：６の間で変わる。７０／３０インスリンに対しては、好ましい比率は約１：１から約６：１の範囲にある。
ポリペプチドは、主としてポリペプチドのｐＩに依存して約４．５から８のｐＨでこのようなビヒクル中で、好ましくはｐＨレベルを維持するバッファーの存在下で典型的には調製される。ポリペプチドがＩＧＦ-Ｉとインスリンである場合、好ましくはＩＧＦ-Ｉは、インスリンと混合する前に、バッファーとしてヒスチジンを使用し、ｐＨ約７から７．５、より好ましくは約７．２で製剤される。最終製剤は安定した液体である。
糖尿病を治療するための一実施態様では、組成物は、約１５：１から１：１５(ｖ／ｖ)のインスリン：ＩＧＦ-Ｉの容量比で、ＩＧＦ-ＩとＮＰＨインスリンを含有する。この組成物中のＩＧＦ-Ｉとインスリンのより好ましい量は、ＩＧＦ-Ｉが約１から１０ｍｇ、インスリンが約０．２から２ｍｇである。請求項７に記載の組成物において、ＩＧＦ-Ｉ：インスリンの容量：容量比は約０．２：１から約１：１である。
またここで、組成物は安定化剤をさらに含有してよい。例えば、その分子構造の中心に４つの有機(通常はアルキル又はアリール)基に結合した窒素原子があり、負の電荷を持つ酸基を含む第４級アンモニウム塩が、有用な安定化剤である。これらの塩は、多くの病原性非胞子形成菌及び真菌に対する界面活性殺菌剤として、また安定化剤として有用である。この例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物)、及び塩化ベンズエトニウムが含まれる。他の種類の安定化剤には、芳香族アルコール、例えばフェノール及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、及びｍ-クレゾールが含まれる。ここで好ましい安定化剤はフェノール又はベンジルアルコールであり、最も好ましいものはフェノールである。
安定化剤は、安定した液体形態のインスリンとＩＧＦ-Ｉ製剤に含まれるが、凍結乾燥形態の製剤には含まれない。後者の場合、安定化剤は再構成のために使用される注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)中に存在する。
ＩＧＦ-Ｉとインスリンを含有する好ましい一組成物は、少なくともアルギニン並びにｐＨを約７ないし７．５にするバッファー、最も好ましくはヒスチジン、及びフェノールを、場合によってはＰＢＳと共に含む。より好ましくは、アルギニンは約１００から３００ｍＭの濃度で存在し、インスリン：ＩＧＦ-Ｉの比率は約０．１：１から１０：１、より好ましくは約０．２：１から約１：１である。他の好ましい実施態様では、１００ないし３００ｍＭのアルギニン、並びにバッファー、例えばヒスチジン及びフェノールを有するこの製剤は、賦形剤として約１−１０％濃度でβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルをさらに含有する。この種のより好ましい組成物は、約５−２０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、約２−１０ｍｇ／ｍｌのインスリン、約１００−２００ｍＭのアルギニン、ｐＨ約７−７．５での約５−２０ｍＭのヒスチジン、及び約１−５ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する。最も好ましい組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、約３−４ｍｇ／ｍｌのインスリン、約１６０ｍＭのアルギニン、約１０ｍＭのヒスチジン、及び約３ｍｇ／ｍｌのフェノールを、ｐＨ約７．２で含有する。
【００２０】
ＩＧＦ-Ｉとインスリンを含有する他の好ましい組成物は、賦形剤として約１−１０％濃度のドデシル硫酸ナトリウムを含み、インスリン：ＩＧＦ-Ｉの比率は約１：１から６：１である。
最終組成物は、液体である場合は、適切な期間、約２から８℃の温度で保存される。あるいは、製剤は凍結乾燥して、液体製剤に対して記載されたようにして保存される注射のための水との再構成用のパウダーとして提供することができる。
治療的投与に用いられるポリペプチドは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通した濾過によって容易に達成される。治療用組成物は、一般的に、無菌アクセスポート、例えば皮下注射針で貫通可能な止め具を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを備えた容器に入れられる。
ポリペプチド組成物は、通常、単位又は多数回用量容器、例えば封入アンプル又はバイアルに、水溶液として、又は再構成用の凍結乾燥製剤として貯蔵される。凍結乾燥製剤の例として、１０-ｍＬバイアルを５ｍＬの滅菌濾過した１％（w/v）のＩＧＦ-Ｉ水溶液で満たし、得られた混合物を凍結乾燥する。皮下注射溶液は、凍結乾燥インスリンを、静菌的注射用水を用いて再構成することにより調製される。次にこの溶液を同様に再構成されたインスリン溶液又は液体インスリン溶液と混合する。
ＩＧＦ-Ｉとインスリンの双方を含む製剤は、多くの異なる方法で調製することができる。一つの方法は、ＩＧＦ-Ｉ含有組成物(以下に記載する成分を含む)とインスリンを混合することを含む。
上述したインスリン溶液と共に投与するのに有用なＩＧＦ-Ｉ含有溶液は、好ましくはアルギニンを含有し、より好ましくはアルギニンと安定化剤を含有し、さらに好ましくはアルギニン、安定化剤、及びバッファーを含有し、より好ましくは以下のものである：約５−２０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、約１００−２００ｍＭのアルギニン、約ｐＨ７−７．５での約５−２０ｍＭのバッファー、及び約１−５ｍｇ／ｍｌのフェノール。この目的のために最も好ましい組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、約１６０ｍＭのアルギニン、約ｐＨ７．２での約１０ｍＭのヒスチジン、及び約３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する。
この発明ではキットも考慮される。典型的なキットは、上述した賦形剤中のＩＧＦ-Ｉ等の第１のポリペプチドのための容器、好ましくはバイアル；逆の電荷の第２のポリペプチドを収容する容器、好ましくはバイアル、及び使用者に２つの容器の内容物、すなわち２つの製剤を組合わせる旨を指示する使用説明書、例えば製品挿入物又はラベルを具備する。これは好ましくは製薬用製剤を提供する。ポリペプチドがＩＧＦ-Ｉとインスリンである場合、好ましくは製薬用製剤は糖尿病の治療用である。また、ＩＧＦ-Ｉを収容する容器は、好ましくはｐＨ約７．０から７．５のバッファー中に、ベンジルアルコール又はフェノール、もしくは双方の安定化剤をさらに含有する。好ましくは、使用者は即時注射のためのシリンジで、容器の内容物、すなわつ２つの製剤を組合わせるように指示される。
他の典型的なキットは、組成物が既に調製されて、それが一つの容器に収容され、キットが適切な疾患を治療するために組成物を使用する旨の使用説明書を具備しているものである。
【００２１】
ポリペプチドの組成物は、注入、注射、肺及び経皮的投与を含む任意の適した技術により哺乳動物に直接投与される。特定の投与経路は、例えば、何れかのポリペプチドを単独に使用する場合に知覚され又は予測されるあらゆる副作用を含む患者の病歴、使用されるポリペプチドのタイプ、及び直される特定の疾患に依存するであろう。非経口投与の例には、組成物の皮下、筋肉内、静脈内、動脈内又は腹膜内投与が含まれる。
全身作用性薬剤の一つの好ましい送達方法には、連続的注入（例えば、徐放デバイス又はミニポンプ、例えば浸透ポンプ又は皮膚パッチを用いる）、又は注射（例えば、単一ボーラス投与を使用する静脈内又は皮下手段を用いる）による投与が含まれる。例えば、ポリペプチドがインスリンとＩＧＦ-Ｉである場合、注射による組成物の送達は、糖尿病の治療のための好ましい投与形態である。
他の好ましい投与経路は局所又は全身療法のための経皮的イオン導入送達である。イオン導入法は電気化学的電位勾配の適用により、皮膚を通ってイオン性薬剤の流束を高める手段である。この送達方法に適した薬剤には、ＬＨＲＨ類似体、インスリン、成長ホルモン、及びコレシストキニン-８類似体が含まれる。例えば、Srinivasanら, J. Pharm. Sci., 79：588-591(1990)を参照されたい。
治療に使用されることになる組成物は、個々の患者の臨床的状態（特に単一の薬剤としてのポリペプチドでの治療の副作用）、組成物の送達部位、使用するポリペプチドの種類、投与方法、投与計画、及び実務者に知られた他の要因を考慮して、良好な医療実務に合致する形で製剤され投薬される。ここでの目的のための各成分の「有効量」は、従って、そのような考慮により決定され、哺乳動物に対する薬剤の生物学的利用能を生じる量でなければならない。
【００２２】
一般的な提案として、非経口投与されるポリペプチドの投薬当たりの全製薬的有効量は、患者の体重ｋｇに基づき、約１０μｇ／ｋｇ／日から約１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲とされる。ＩＧＦ-Ｉとインスリンの組合せに対しては、用量当たりの非経口量は、患者の体重ｋｇに基づき、ＩＧＦ-Ｉが約１０から２００μｇ／ｋｇ／日、インスリンが約０．５ないし５００単位／日であるが、上述したように、多くの治療的裁量に制約されるであろう。ヒトの糖尿病の治療において好ましくは、ＩＧＦ-Ｉの用量は約１から１０ｍｇを１日当たり２回、より好ましくは約２０から８０μｇ／ｋｇ／注射(すなわち約１．５から６ｍｇ)を皮下に１日当たり２回、インスリンの用量は約５から５０単位／注射(すなわち約０．２から２ｍｇ)を皮下に１日当たり２回である。この製剤における用量でのＩＧＦ-Ｉに対するインスリンの比率は上述したとおりである。
注射が好ましいが、連続的皮下（ＳＣ）注入用に注入装置も用いられる。また、静脈内バッグ溶液も用いられる。適切な投薬の選択において鍵となる要因は、糖尿病の場合には、正常な範囲を近似するように血中グルコースの低下により、又は医療実務者が適当であると認めるここで記載の糖尿病の治療の測定のための他の基準により測定される結果である。インスリン投与に対するさらなる情報は、真性糖尿病-理論と実際, 上掲, 29及び30章に見出すことができる。
また、ここでの製剤は、所望の薬理効果を生じる他の薬剤、例えばＩＧＦ-Ｉとインスリンの場合にはＩＧＦ結合タンパク質、例えば現在公知のものの一つ、例えばＩＧＦＢＰ-１、ＩＧＦＢＰ-２、ＩＧＦＢＰ-３、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＧＦＢＰ-５又はＩＧＦＢＰ-６、又はＩＧＦ結合複合体のＡＬＳと共に適切に投与される。ここでＩＧＦ-Ｉのための好ましい結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ-３であり、これは米国特許第5,258,287号及びMartin及びBaxter, J. Biol. Chem., 261：8754-8760(1986)に記載されている。このグルコシル化ＩＧＦＢＰ-３タンパク質は、ＧＨにより調節され、内因性ＩＧＦのほとんどを担持する、ヒト血漿に見出される１２５−１５０Ｋｄの糖タンパク質複合体の非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上の約５３Ｋｄの酸安定成分である。
ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンと共にＩＧＦ結合タンパク質を投与することは、米国特許第5,187,151号に記載の方法により達成される。簡単には、ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＢＰは、約０．５：１から３：１、好ましくは約１：１のモル比で、皮下ボーラス注射により有効量が投与され；インスリンはＩＧＦ-Ｉと共に既に存在している。
【００２３】
さらに、製剤は、適切には、スルホニルウレア等の血糖降下剤の有効量と共に投与される。血糖降下剤は、非経口、経鼻、経口、又は他の任意の有効な経路を含む適切な技術によって哺乳動物に投与される。最も好ましくは、投与は経口経路による。例えば、Upjohnから１．２５、２．５、及び５ｍｇ錠剤濃度で市販されているMICRONASE(商標)錠剤（グリブリド）は経口投与に適している。この治療に配されたＩＩ型糖尿病のための通常の維持用量は、一般的に１日当たり約１．２５から２０ｍｇの範囲であり、これは、適当と考えられる形で１回の投薬として又は１日を通して分割して与えられる(Phisician's Desk Reference, 2563-2565 (1995))。処方に利用可能なグリブリドをベースとする錠剤の他の例は、GLYNASE(商標)ブランド薬（Upjohn）及びDIABETA(商標)ブランド薬（Hoechst-Russel）を含む。GLUCOTROL(商標)（Pratt）は、５及び１０ｍｇ強度で利用可能なグリピジド(１-シクロヘキシル-３-(ｐ-(２-(５-メチルピラジンカルボキサミド)エチル)フェニル)スルホニル)ウレア)錠剤に対する商標であり、食事制限に続いて血糖降下治療を必要とするＩＩ型糖尿病又は他のスルホニルウレアに対する反応が止まった患者に対しても処方される(Phisician's Desk Reference, 1902-1903 (1995))。スルホニルウレア以外の他の血糖降下剤、例えばビグアナイド（例えばメトホルミン又はフェンホルミン）又はトログリトゾン（troglitozones）、又はインスリン作用に影響を及ぼす他の薬剤も用いられる。
本発明は以下の実施例を参照するとより十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。ここに述べた全ての文献と特許引用文献は、出典明記により明示的に取り込まれる。
【００２４】
実施例１
材料と方法
組換えヒトＩＧＦ-Ｉはジェネンテク，インクから入手した。レギュラーインスリン(HUMULIN(商標)Ｒ)及び７０／３０インスリン(HUMULIN(商標)７０／３０)は、イーライリリー社から入手した。０．５-ｃｃ及び１-ｃｃインスリンシリンジはベクトンディキンソンから入手し、ＰＤ１０カラム(SEPHADEX(商品名)Ｇ２５Ｍ)はファーマシア(カタログ番号17-0851-01)から入手した。
表１にはレギュラー、ＮＰＨ-、及び７０／３０インスリンの製剤投薬形態を列挙する。
【００２５】
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【００２６】
製剤スクリーニングのためのＩＧＦ-Ｉの調製
０．２Ｍシトラート、２６ｍｇ／ｍｌにＩＧＦ-Ｉを入れたものを出発物質として使用した。シトラートはＩＧＦ-Ｉ溶液から取り除くことが困難であった。よって、２工程のダイアフィルトレーション法をシトラートが除去し、同時にＩＧＦ-Ｉ濃度を増加させるために設計した。ダイアフィルトレーションは接線流濾過装置を使用して達成された。プロセス工程は以下の通りであった：
(ａ)２００ｍＭのシトラートを含有するＩＧＦ-Ｉ溶液を２００ｍＭのＮａＣｌ、２３０ｍＭのアルギニン及び１０ｍＭのヒスチジン中、ｐＨ７．２で第１のダイアフィルトレーションした。
(ｂ)ついで、ＩＧＦ-Ｉ溶液を２３０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのヒスチジン中、ｐＨ７．２でダイアフィルトレーションした。ＩＧＦ-Ｉを２８．６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
ｐＨ７．２において、高濃度で溶液中にＩＧＦ-Ｉを保持する能力のために、アルギニンを双方の工程で使用した。よって、シトラートの除去とＩＧＦ-Ｉの濃縮は、ＩＧＦ-Ｉを沈殿させないで達成された。次に上述のＩＧＦ-Ｉ溶液をＰＤ-１０(商標)カラムを使用し、種々の試験製剤中にバッファー交換した。
【００２７】
アッセイ方法
(１)視診：色、外観及び透明度；
(２)ｐＨ；
(３)ＩＧＦ-Ｉ濃度：０．６４６ｃｍ−１(ｍｇ／ｍｌ)−１を使用し２７６ｎｍでのＵＶ吸光度により測定；
(４)溶液濁度：３４０から３６０ｎｍのＵＶ吸光度により測定；
(５)溶液中のＩＧＦ-Ｉとインスリンの定量：酸性ｐＨ逆相ＨＰＬＣ(ｒｐ-ＨＰＬＣ)法により測定。
カラム：      ＶＹＤＡＣ(商標)、Ｃ１８、３００Å、２５ｃｍ
流速：        ０．５ｍｌ／分
注射量：      ２５μｌ／注射
検出波長：    ２１４ｎｍ
カラム温度：  ５０℃
溶媒Ａ：      Ｈ２Ｏに０．１％のトリフルオロ酢酸
溶媒Ｂ：      アセトニトリルに０．１％のトリフルオロ酢酸
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図１にはＩＧＦ-Ｉ試料の酸性逆相ＨＰＬＣを示す。図２にはレギュラーインスリンの酸性逆相ＨＰＬＣを示す。図３にはレギュラーインスリン：ＩＧＦ-Ｉの１：１（vol：vol）混合物の酸性逆相ＨＰＬＣを示す。
【００２８】
これらの図を比較しレビューすることから、ＩＧＦ-ＩとレギュラーインスリンがこのＨＰＬＣ法により良好に分離されることが明らかになった。ＩＧＦ-Ｉとインスリンの双方の定量はＩＧＦ-Ｉとインスリンのピークのピーク領域を利用することで達成できる。例えば、溶液中に残存するＩＧＦ-ＩのパーセントはＩＧＦ-Ｉをインスリンと混合する前及び後のＩＧＦ-Ｉピーク領域を比較することにより得ることができる。
ＩＧＦ-Ｉとインスリンとを混合するための手順
(１)ＩＧＦ-Ｉの用量に等しいインスリンシリンジに空気を吸引。ＩＧＦ-Ｉバイアルに針を挿入し、ボトルに空気を注入。ＩＧＦ-Ｉ溶液を全く取り出すことなく、ＩＧＦ-Ｉバイアルから針／シリンジを除去。
(２)ＮＰＨ及び７０：３０インスリンに対しては、使用前に数回、インスリンバイアルをゆっくりと転倒。レギュラーインスリンを混合する必要なし。インスリンバイアルに空気を注入。
(３)インスリンバイアルに針がある状態で、インスリンボトルとシリンジを転倒。
(４)針の先端が溶液中にあることを確認し、シリンジ内に適切な量のインスリンを取り出す。
(５)インスリンバイアルから針を取り出す前に、シリンジの気泡をチェック。気泡が存在する場合は、シリンジを真っ直ぐ上に向けて、気泡が上部に浮かんでくるまでその側部を軽くたたく。プランジャーで押し出して、適切な用量のインスリンを引き出す。
(６)インスリンバイアルから針を取り出し、ＩＧＦ-Ｉバイアル中に挿入。ＩＧＦ-Ｉボトルとシリンジを転倒。針の先端が溶液中にあることを確認し、シリンジ内にＩＧＦ-Ｉを所望の量取り出す。
(７)ＩＧＦ-Ｉバイアルから針／シリンジを除去し、清浄なガラス製遠心管にインスリン／ＩＧＦ-Ｉ混合物を注入。
インスリン／ＩＧＦ-Ｉ混合物の分析手順
ＩＧＦ-Ｉ／インスリン混合物を０．２μＭフィルターを通して濾過するか、又は２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に、可溶性ＩＧＦ-Ｉとインスリンの含有量についてアッセイした。いくつかの場合には、まずＩＧＦ-Ｉとインスリンとの混合物を、混合物を分析のために濾過又は遠心分離する前に、１０分間３７℃でリン酸緩衝食塩水でインキュベートした。
【００２９】
結果及び議論
インスリンとアセテート緩衝されたＩＧＦ-Ｉ製剤の混合可能性
ここで標準として使用されるアセテート緩衝ＩＧＦ-Ｉ製剤は透明な液体であり、１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、９ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコール、５０ｍＭのアセテートを含有し、ｐＨ５．４である。この製品は、２８日間までの使用のための複数使用を目的として意図されたものである。使用期限は２−８℃の貯蔵で６０ヶ月にした。まず、インスリンとアセテート緩衝ＩＧＦ-Ｉ製剤の混合可能性を評価した。このＩＧＦ-Ｉ製剤が投与中にインスリンと混合するために使用されるのが、最も望ましい。
表２はレギュラーインスリンとアセテート緩衝ＩＧＦ-Ｉ製剤を混合した結果を示す。１：１(ｖｏｌ／ｖｏｌ)の混合比率で、溶液は混合時に非常に濁った。溶液から４３％のインスリンと１４％のＩＧＦ-Ｉが沈殿した。
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アセテート製剤中のレギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉの外観を、これらの溶液のｐＨを０．１ＮのＨＣｌ又はＮａＯＨを添加することにより調節しながらモニターした。溶液を「透明」又は「濁り」のいずれかとして特徴付け、溶液の透明度対ｐＨを図４にプロットした。ｐＨ７．２のレギュラーインスリンは透明な溶液であり、ｐＨ６．４を越えて透明なままであり；ｐＨ６．３２又はそれ以下でレギュラーインスリン溶液は濁ってくる。ｐＨ５．４のアセテート製剤中のＩＧＦ-Ｉは透明な溶液であり、ｐＨ６．３４以下で透明なままである。ＩＧＦ-Ｉ溶液はｐＨ６．３９を越えると濁り、続いて沈殿したＩＧＦ-Ｉが透明なゲルになる。これらの観察は、タンパク質の溶解性が、タンパク質の等電点(ｐＩ)にｐＨが近づくにつれて減少するという一般的な理解と一致している。ＩＧＦ-Ｉとインスリンの等電点は、それぞれ８．７と５．４である。図４に示すデータでは、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンの双方が溶液中に存在可能な適切なｐＨ範囲は存在しないことが示唆される。従って、アセテートＩＧＦ-Ｉ製剤のｐＨを調整して透明なＩＧＦ-Ｉ／インスリン混合物をつくることは簡単には可能ではない。
【００３０】
表３には、種々の混合比率におけるＮＰＨインスリンとのＩＧＦ-Ｉアセテート製剤の混合結果を示している。ＮＰＨ：ＩＧＦ-Ｉ混合比率が１：１及び１４：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)では、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ-Ｉの双方が混合の前後で変化しなかった。全てのＩＧＦ-Ｉが溶液中に残り、全てのＮＰＨは、溶液中に可溶インスリンがない状態でＮＰＨ結晶として残った。しかしながら、ＮＰＨとＩＧＦ-Ｉを１：１４(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の比率で混合した場合は、１００％のインスリンがＮＰＨ結晶から放出されたが、ＩＧＦ-Ｉは変化しないで残った。
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【００３１】
インスリンと混合可能な新規なＩＧＦ-Ｉ製剤の開発：
ＩＧＦ-Ｉアセテート製剤がインスリンと混合不能であるために、次の基準に合致する新規な製剤を開発した：(１)ｐＨ７．２で製剤された透明なＩＧＦ-Ｉ溶液。これはＩＧＦ-Ｉとインスリンとを広範囲の混合比率で混合した場合に、ｐＨが激しくシフトすることを防止するためである。(２)インスリン及び／又はＩＧＦ-Ｉの沈殿を回避するために、混合時におけるインスリンとＩＧＦ-Ｉとの相互作用を防止するＩＧＦ-Ｉ製剤。(３)混合時にＮＰＨ結晶からインスリンを解離させないＩＧＦ-Ｉ製剤。このようなＩＧＦ-Ｉ製剤の開発中、表４に列挙した種々の賦形剤、例えば塩類、バッファー、金属イオン、糖類、アミノ酸、ポリオール、界面活性剤及びシクロデキストリンをスクリーニングした。
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【００３２】
ｐＨを６．４以上に調節した場合、対照となるアセテート緩衝ＩＧＦ-Ｉ製剤は濁った。表４に列挙した多くの賦形剤により、ｐＨ７．２でＩＧＦ-Ｉは透明溶液になった。これらの賦形剤には、アミノ酸(グリシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート)、塩類(塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム)、シクロデキストリン誘導体(β-ヒドロキシシクロデキストリン及びβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテル)、ＳＤＳ、及びグリセロールが含まれる。しかしながら、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンとの混合時に、上述した賦形剤の殆どではインスリンとＩＧＦ-Ｉの沈殿を防止できなかった。
混合時におけるレギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉの沈殿を防止において有効であることが分かった賦形剤は、アルギニン、リジン、グルタメート、ＳＤＳ、β-ヒドロキシシクロデキストリン及びβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルであった。これらの賦形剤を使用して混合した結果を表５に示す。０．５％のＳＤＳは、透明なインスリンとＩＧＦ-Ｉとの混合物を達成するのに非常に有効であった。しかしながら、０．５％のＳＤＳを１：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の比率でＮＰＨインスリンに添加した場合、溶液が透明化し、これはＮＰＨ結晶の溶解を示す。リジンとグルタメートの双方を２８０ｍＭの濃度で使用した場合、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンとの１：１(ｖｏｌ／ｖｏｌ)混合時に沈殿を防止した。
【００３３】
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(ａ)表に列挙した賦形剤に加えて、全てのＩＧＦ-Ｉ製剤は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-ＩとｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジンを含有する。
(ｂ)レギュラーインスリンを１５０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジンに、１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉを２００ｍｌゆっくりと添加した。１７０ｍｌのレギュラーインスリンを添加するまで、溶液は透明なままであった。１７０ｍｌ：２００ｍｌ＝０．８５：１の混合比率。
(ｃ)混合を(ｂ)に記載したものと同様にして行った。
(ｄ)これらの条件下、レギュラーインスリンを２００ｍｌのＩＧＦ-Ｉにゆっくりと添加した。２ｍｌのレギュラーインスリンを添加した後でさえ、混合した溶液は透明なままであった。
【００３４】
アルギニンは、溶液状態にインスリンとＩＧＦ-Ｉを維持する点において、リジン又はグルタメートよりも効果的であった。表５に示されるように、１５０ｍＭのアルギニン濃度で、レギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉは０．８５：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)までの混合比率で混合することができた。混合比率が０．８５：１を越えると、ＩＧＦ-Ｉとインスリンの双方の沈殿が生じる。２３０ｍＭのアルギニン濃度では、２．５：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)の混合比率まで、より多くのレギュラーインスリンをＩＧＦ-Ｉと混合して、透明な混合物が形成された。
如何なる理論にも限定されるものではないが、アルギニンにより提供される沈殿からの保護は、ｐＨ７．２でインスリン分子が負の電荷を持ち、正の電荷のアルギニン分子が負の電荷を持つインスリンと相互作用し、よって正の電荷を持つＩＧＦ-Ｉと負の電荷を持つインスリンとの間の相互作用及び続く沈殿を遮蔽するという事実によると考えられる。インスリン：ＩＧＦ-Ｉの比率が高い混合に対しては、高濃度のアルギニンが必要となる。
表５に示すように、１％のβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルにより、０．２５：１以下の混合比率で、レギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉの混合が可能になる。５％のβ-ヒドロキシシクロデキストリンの使用では如何なる比率での混合も可能にはならなかった。シクロデキストリンとアルギニンの双方の使用は、混合時におけるインスリンとＩＧＦ-Ｉの沈殿防止に極めて効果的である。１５０ｍＭから２３０ｍＭの濃度で使用されるアルギニンと共に、２％から５％の濃度で使用されるβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルにより、１０：１(インスリンｖｏｌ：ＩＧＦ-Ｉｖｏｌ)までの非常に広範囲な混合比率でレギュラーインスリンとＩＧＦ-Ｉとを混合することができる。如何なる理論にも限定されるものではないが、これはｐＨ７．２で、正の電荷を持つアルギニンが負の電荷を持つインスリンと相互作用し、負の電荷を持つβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルが正の電荷を持つＩＧＦ-Ｉと相互作用し、よってインスリンとＩＧＦ-Ｉとの相互作用と続く沈殿を防止すると考えられる。しかしながら、β-シクロデキストリンスルホブチルエーテルの存在下では、ＮＰＨ-インスリン結晶は溶解した。如何なる理論にも限定されるものではないが、これは、おそらくはβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルと正の電荷を持つプロタミンとの強い相互作用により、これがプロタミン-インスリン複合体を破壊するためであると思われる。よって、β-シクロデキストリンスルホブチルエーテル及び／又はＳＤＳ及びアルギニンの双方をＩＧＦ-Ｉ製剤に使用することは、レギュラーインスリンとの混合に非常に効果的であることが分かったが、ＮＰＨインスリンとの混合に使用することはできない。
【００３５】
上述した賦形剤のスクリーニング実験の結果、レギュラーとＮＰＨインスリンの双方と混合するための、ＩＧＦ-Ｉ製剤用に好ましく選択される賦形剤はアルギニンであると特定された。ついで、インスリンと混合されるＩＧＦ-Ｉの能力に対するアルギニン濃度の効果を評価するための実験を行った。この実験で試験されたＩＧＦ-Ｉ製剤は、１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．２、３ｍｇ／ｍｌのフェノール、及び量を変えてアルギニンを含有する。インスリンとＩＧＦ-Ｉを種々の混合比率で混合した。可溶性ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンのパーセントを酸性逆相ＨＰＬＣ法によりアッセイした、表６の結果には、レギュラーインスリンとの混合に対しては、高濃度のアルギニンが必要であることが示されている。８０ｍＭのアルギニン濃度では、１：１比(ｖｏｌ：ｖｏｌ)で混合した場合に、３９％のＩＧＦ-Ｉと６８％のインスリンが沈殿した。２３０ｍＭのアルギニン濃度では、１：１の比率で混合した場合に、全てのインスリンと全てのＩＧＦ-Ｉが溶液のまま残った。しかしながら、２３０ｍＭのアルギニン濃度では、５：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)比でＩＧＦ-Ｉ：ＮＰＨを混合した場合に、ほぼ５０％のＮＰＨが可溶性インスリンに溶解した。１６０ｍＭのアルギニンがレギュラー及びＮＰＨインスリンの双方と混合するための最善の結果を生じるように思われる。１：１(Ｒ-インスリン：ＩＧＦ-Ｉ)の混合比率では、本質的に、レギュラーインスリン及びＩＧＦ-Ｉのいずれも溶液のままではない。１：１(ＮＰＨインスリン：ＩＧＦ-Ｉ)の混合比率では、ほぼ１００％のＮＰＨインスリンが溶解しており、全てのＮＰＨ結晶はそののままであった。
【００３６】
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(ａ)この実験において試験したＩＧＦ-Ｉ製剤は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン、３ｍｇ／ｍｌのフェノール、及び種々の量のアルギニンを含有する。
(ｂ)皮下沈着物をシミュレートするために、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンを混合した後に、まず１ｍｌの混合物を、可溶性インスリンとＩＧＦ-Ｉの量を分析する前に、２ｍｌのリン酸緩衝食塩水と共に３７℃で１５分間インキュベートした。
(ｃ)ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンが十分に混合可能であるならば、得られた混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと１００％の可溶性インスリンを有すべきである。
(ｄ)ＩＧＦ-ＩとＮＰＨインスリンが十分に混合可能であるならば、得られた混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと０％の可溶性インスリンを有すべきである。
【００３７】
従って、インスリンと混合するために好ましいＩＧＦ-Ｉ製剤は、１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン、及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールであると定義された。種々の混合比率でのレギュラー、ＮＰＨ及び７０／３０インスリンとこの製剤の混合可能性を評価し、結果をそれぞれ表７、８及び９にまとめた。
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(ａ)新規なＩＧＦ-Ｉ製剤は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する。
(ｂ)皮下沈着物をシミュレートするために、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンを混合した後に、まず１ｍｌの混合物を、可溶性インスリンとＩＧＦ-Ｉの量を分析する前に、２ｍｌのリン酸緩衝食塩水と共に３７℃で１５分間インキュベートした。
(ｃ)ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンが十分に混合可能であるならば、得られた混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと１００％の可溶性インスリンを有すべきである。
【００３８】
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(ａ)新規なＩＧＦ-Ｉ製剤は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する。
(ｂ)ＩＧＦ-ＩとＮＰＨインスリンが十分に混合可能であるならば、得られた混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと０％の可溶性インスリンを有すべきである。
【００３９】
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(ａ)新規なＩＧＦ-Ｉ製剤は１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する。
(ｂ)ＩＧＦ-Ｉと７０：３０インスリンが十分に混合可能であるならば、得られた混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと２２％ないし３０％の可溶性インスリンを有すべきである。理論的には、７０／３０インスリンは３０％の可溶性インスリンを含有すべきである。しかしながら、ＮＰＨインスリンへの可溶性インスリンの吸着のために、可溶性インスリンの実際の量は酸性逆相ＨＰＬＣ法で２２％である。
【００４０】
好ましいＩＧＦ-Ｉ製剤が、１：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)比でレギュラーインスリンと混合された場合、溶液は濁った。混合後に直接アッセイしたところ、６５％のＩＧＦ-Ｉと９３％のインスリンが溶液状態であった。しかしながら、皮下沈着物条件をシミュレートするために、この混合物をリン酸緩衝食塩水中、３７℃で１５分間インキュベートした後に、溶液を清澄化し、９５％のＩＧＦ-Ｉと９９％のインスリンが溶液状態であった。表７には、混合物をリン酸緩衝食塩水中、３７℃で１５分間インキュベートした後の、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンの混合結果を示している。１：１、２：１、６：１(レギュラーインスリン：ＩＧＦ-Ｉ)比で混合した場合、最初に沈殿が生じた。しかしながら、リン酸緩衝食塩水とインキュベートすることで混合物は清澄化し、可溶性ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンのパーセントはほぼ９０％又はそれ以上であった。よって、ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンの薬物動力学的性質は、混合の前後であまり変化しないという結果になった。
好ましいＩＧＦ-Ｉ製剤が、１：１５から１５：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)比の混合比率でＮＰＨインスリンと混合された場合、溶液は濁ったままであり、そのままのＮＰＨインスリンの存在が示された。表８に示すように、１：１から１５：１(ＮＰＨ：ＩＧＦ-Ｉ)の間の混合比率では、全てのＩＧＦ-Ｉは溶液状態にあり、全てのＮＰＨはインスリン-プロタミン複合体のままであった。ＮＰＨ：ＩＧＦ-Ｉの混合比率が低い場合は、好ましい製剤中の十分な量のアルギニンにより、ＮＰＨが解離し始めた。ＮＰＨの解離量は混合比率１：１５の極値でさえ、比較的低かった(２４％)。よって、殆どの混合比率では、ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンの薬物動力学的性質は、混合の前後であまり変化しないという結果になった。表９には、好ましいＩＧＦ-Ｉ製剤を７０／３０インスリンと混合した結果を示している。理論的には、７０／３０インスリンは３０％の可溶性インスリンを含有すべきである。しかしながら、可溶性インスリンはＮＰＨインスリン結晶に吸着する傾向があった。７０／３０インスリン中の可溶性インスリンの実際の量は酸性逆相ＨＰＬＣ法によれば２２％であった。ＩＧＦ-Ｉ及び７０／３０インスリンが十分に混合可能である場合、得られる混合物は１００％の可溶性ＩＧＦ-Ｉと２２％ないし３０％の可溶性インスリンを有するべきである。表９の結果には、可溶性ＩＧＦ-Ｉとインスリンのパーセントが、７０／３０とＩＧＦ-Ｉを１：１から６：１(ｖｏｌ：ｖｏｌ)比で混合した場合も変化しなかったことが示されている。７０／３０：ＩＧＦ-Ｉの混合比率が低い場合、ＮＰＨの一部は可溶性インスリンに溶解した。
【００４１】
上述の全ての実験において、ＩＧＦ-Ｉ又はインスリンのいずれにも、酸性逆相ＨＰＬＣアッセイにより、混合の結果として何の化学的劣化も見られなかった。
結論
注射の頻度を減らし、患者のコンプライアンスを改善するために、逆の電荷のポリペプチドを混合し、次にそれらを同時投与することが好ましい。この実施例において、まず、対照となるアセテート緩衝製剤中のＩＧＦ-Ｉとインスリンとの融和性を評価した。アセテート製剤中のＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンを混合して直ぐに、混合物は透明な溶液から濁った懸濁液になり、ＩＧＦ-Ｉとインスリンの双方の沈殿を示した。ＮＰＨインスリンと混合した場合に、アセテート緩衝ＩＧＦ-Ｉ製剤は、低いＮＰＨ／ＩＧＦ-Ｉ混合比率で、ＮＰＨインスリン-プロタミン複合体を解離させた。
賦形剤のスクリーニング実験は、ＩＧＦ-Ｉとインスリンとの間の融和性を増加させるために実施された。好ましいＩＧＦ-Ｉ製剤はインスリンと混合するために開発された。それは１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ-Ｉ、１６０ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２で１０ｍＭのヒスチジン、及び３ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有している。このアルギニン製剤が、種々の混合比率でレギュラー、ＮＰＨ及び７０／３０インスリンと混合する能力を評価した。この製剤がレギュラーインスリンと混合される場合、可溶性ＩＧＦ-Ｉ及びインスリンのパーセントは、全ての可能な混合比率に対して、ほぼ９０％又はそれ以上であった。殆どの混合比率で、このＩＧＦ-Ｉ製剤とＮＰＨインスリンとを混合しても、混合の前後でＩＧＦ-Ｉとインスリンに変化はなかった。非常に低いＮＰＨ／ＩＧＦ-Ｉの混合比率では、ＮＰＨインスリン-プロタミン複合体の一部が解離した。
賦形剤、例えばアルギニン、リジン、グルタメート、ＳＤＳ、及び／又はある種のシクロデキストリンは、混合時におけるＩＧＦ-Ｉとインスリンの静電的相互作用とそれに続く沈殿を防止するのに有効であることが示された。ＩＧＦ-Ｉ製剤においてアルギニンと共にＳＤＳ及びβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルを使用すると、ＩＧＦ-Ｉとレギュラーインスリンとを非常に広範囲の混合比率で混合可能とするのに極めて効果的であることが証明された。しかしながら、それらはＳＤＳ及びβ-シクロデキストリンスルホブチルエーテルの存在下でＮＰＨインスリン-プロタミン複合体が解離するために、ＮＰＨインスリンと混合させるためには使用できない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＩＧＦ-Ｉ試料の酸性ｐＨでの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】  レギュラーインスリンの酸性ｐＨでの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】  ＩＧＦ-Ｉとインスリンとの混合物の酸性ｐＨでの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】  ０．１ＮのＨＣｌ又はＮａＯＨの添加により調節された、溶液ｐＨの関数としての、ここで対照（丸）として使用されたアセテートバッファー製剤におけるＩＧＦ-Ｉ又はレギュラーインスリン(三角)の溶液透明度のグラフを表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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