(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲを行い且つ温度サイクリング中リアルタイムで反応をモニターするためのシステムであって、
チャンバと、
１ミリリットル未満の試料を保持するための光学的に透明な材料を含む、ＰＣＲ試料を保持するための複数の試料容器と、
該チャンバ内に設けられ、該複数の試料容器を保持するために形成されている、回転可能なカルーセルであって、該試料容器を順次モニタリング位置に位置決めすることを特徴とするカルーセルと、
該カルーセル内の全ての試料を同時に加熱するための強制空気ヒーターと、
ＰＣＲ試料を冷却するための冷却手段と、
ＰＣＲ試料を熱サイクリングに付すために、該強制空気ヒーター及び該冷却手段を反復作動させるための制御手段と、
前記温度サイクリング中に、試料に蛍光を発光させるために、該モニタリング位置において該試料を光学的に励起するための手段と、
前記温度サイクリング中に、その励起した試料が該モニタリング位置にある時に、該試料の蛍光を検出するための手段と
を包含するシステム。
【請求項２】
増幅の進行をモニタリングしつつ核酸増幅を行う方法であって、
（a）核酸増幅を行う複数の生物学的試料を提供する工程と、
（b）前記生物学的試料を含む、回転可能なカルーセルを提供する工程であって、前記生物学的試料の各々は、別々の試料容器に含まれる工程と、
（c）全ての該試料容器を同時に熱い空気と接触させて、該生物学的試料の温度を第一の温度から第二の温度に移行させる第一の温度移行の工程と、
（d）全ての該試料容器を同時に冷却して、該生物学的試料の温度を第二の温度から第一の温度に移行させる第二の温度移行の工程と、
（e）第一又は第二の温度移行の間に、該生物学的試料から放射が放出されるように試料を励起する工程と、
（f）該試料を順次モニタリング位置に移動させるために、増幅の間に、該カルーセルを回転させる工程と、
（g）少なくとも一個の反応パラメータを決定するために、該試料容器の各々が該モニタリング位置にある時に、該試料から放出される放射を少なくとも一回検出する工程と、
（h）前記（c）〜（g）の工程を繰り返す工程と
を含む方法。
【請求項３】
核酸増幅を行いつつ流動性の生物学的試料を保持するための容器であって、
容器に入れられる生物学的試料を受入れるように構成された、第一の体積を有する受入れ部と、
一端が閉じており、０．２５ｍｍ〜１．０ｍｍの範囲から選択される内径を有している壁厚約０．１ｍｍのキャピラリチューブから成り、該受入れ部に入れられる生物学的試料が反応部に移動可能なように受入れ部との間に流動性連通があり、第二の体積以下の内部容積を有し、第二の体積は第一の体積未満で且つ１ミリリットル以下であって、式（ｃａｌ  ｃｍ）／（ｃｍ2ｓ  ℃）×１０4に基づき、約２０から約３５の範囲の熱伝導度を有する光学的に透明な材料を有する、反応部と、
を有する容器。
【請求項４】
第一及び第二の生物学的反応を行い且つその進行をモニターするためのシステムであって、
第一の生物学的試料を保持するための第一の試料容器と、
第二の生物学的試料を保持するための第二の試料容器と、
非モニタリング位置とモニタリング位置との間で、該第一及び第二の試料容器を移動させるための移動手段と、
第一の生物学的試料及び第二の生物学的試料の熱サイクリングを同時におこなうために、非モニタリング位置及びモニタリング位置の両方において、該第一及び第二の試料容器を反復的に加熱及び冷却するための熱サイクリング手段であって、強制空気ヒーター及びファンを含む熱サイクリング手段と、
生物学的試料がモニタリング位置にある時、該第一及び第二の試料容器における該第一及び第二の生物学的反応の進行を確認するためのモニタリング手段であって、該第一及び第二の試料容器が順次モニタリング位置にあるときに、該生物学的試料から放出される放射を検出するための手段を含むモニタリング手段と、
熱サイクリングがおこるにつれて該第一及び第二の生物学的反応の進行が検出されるように、移動手段、熱サイクリング手段、及びモニタリング手段の各作動を制御する制御手段と、
を含むシステム。
【請求項５】
核酸増幅を行う方法であって、
（ａ）核酸増幅を受ける複数の生物学的試料を含む、回転可能なカルーセルを提供する工程であって、前記生物学的試料の各々は、別々の試料容器に含まれ、前記核酸増幅の進行に関連づけられる第一の波長で放射を放出する物質を含む工程と、
（ｂ）該試料の温度を同時に、第一の温度から、第一の温度とは異なる第二の温度までの間の第一の範囲に渡って調整する工程と、
（ｃ）該試料を順次モニタリング位置に移動させるために該カルーセルを回転させ、該試料の温度が第一の範囲にある時、該試料が放出する放射を複数回検出する工程と、
（ｄ）該試料の温度を同時に、第二の温度から、第二の温度とは異なる第三の温度までの間の第二の範囲に渡って調整する工程と、
（ｅ）該試料を順次モニタリング位置に移動させるために該カルーセルを回転させ、該試料の温度が第二の範囲にある時、該試料が放出する放射を複数回検出する工程と、を含む方法。
【請求項６】
ＰＣＲ反応を行うための装置であって、
チャンバと、
該チャンバと空気流的に連通するように該装置に取付けられたファン及びヒーターと、
光学的に透明な材料と少なくとも第一及び第二のディメンジョンを有して容積を画定する壁とを含み、第一のディメンジョンが第二のディメンジョンより小さく且つ外表面積に対する体積の比が１ｍｍ未満である、複数の該試料容器と、
複数の試料容器を保持するためのカルーセルであって、該複数の試料容器を順次モニタリング位置に移動させるために前記チャンバ内に回転可能に取付けられ、該カルーセル内の該複数の試料容器がファンによって導かれた空気流によって同時に加熱又は冷却されるように位置決めされたカルーセルと、
該チャンバに取付けられ、且つ該試料容器の第二のディメンジョンに沿って壁と実質的に平行な軸に沿って少なくとも一個の試料容器を照射するように位置決めされた発光源と、
該チャンバに取付けられ、且つ該試料容器の第二のディメンジョンに沿って壁と実質的に平行な軸に沿って少なくとも一個の試料容器からの蛍光を測定するために位置決めされた光検出器と、
を含む装置。
【請求項７】
前記カルーセルが、ＰＣＲの間じゅう連続的に回転することを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記カルーセルが、前記試料容器の各々が前記モニタリング位置にある時に停止することを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
核酸増幅を行いつつ流動性の生物学的試料を保持するための容器であって、
容器に入れられる生物学的試料を受入れるように構成された、第一の体積を有する受入れ部と、
一端が閉じており、０．０２ｍｍ〜０．１ｍｍの範囲から選択される内径を有している壁厚約０．１ｍｍのキャピラリチューブから成り、該受入れ部に入れられる生物学的試料が反応部に移動可能なように受入れ部との間に流動性連通があり、第二の体積以下の内部容積を有し、第二の体積は第一の体積未満で且つ１ミリリットル以下であって、式（ｃａｌ  ｃｍ）／（ｃｍ2ｓ  ℃）×１０4に基づき、約２０から約３５の範囲の熱伝導度を有する光学的に透明な材料を有する、反応部と、
を有する容器。
【発明の詳細な説明】
１９９７年６月４日、受理官庁／アメリカ合衆国（ＲＯ／ＵＳ）に提出された同時係属中のＰＣＴ出願（発明の名称：「ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションのモニタリング」、出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ／ 、出願人：ユタ大学リサーチファウンデーション、アメリカ合衆国における発明者及び出願人：カール・Ｔ・ウィットワー（Carl T.Wittwer）、カーク・Ｍ・リリー（Kirk M.Ririe）、及びランディー・Ｐ・ラスムッセン（Randy P.Rasmussen））の全部を、本明細書の一部を構成するものとしてここに引用する。
発明の背景
１．発明の分野
本発明は一般に、ポリメラーゼ鎖反応等の生物学的プロセスを実行するために用いられる装置に関する。より詳細には、ポリメラーゼ鎖反応等の様々な生物学的反応の熱サイクリング及びモニタリングを実行する装置及び方法に関する。
２．背景技術
様々な産業、技術、および研究の領域において、試料を高い信頼性とよい再現性で熱サイクリングに付す必要が存在する。ある試料を繰り返し熱サイクリングに付す需要は、特にバイオテクノロジーのアプリケーションにおいて高い。バイオテクノロジーの分野では、材料の小さな試料を短時間で加熱、冷却を繰り返すことがしばしば望まれる。規則的に行われるそうした生物学的手続きの一つとして環状ＤＮＡの増幅がある。
熱安定性のあるＤＮＡポリメラーゼを用いた環状ＤＮＡ増幅は、プライマー特異的なＤＮＡの増幅の自動化を可能とし、これは「ポリメラーゼ鎖反応」あるいは「“ＰＣＲ”」として広く知られている。この手続きの自動化には、通常複数の容器の中に含有される反応混合物に対して制御された精密な熱サイクリングを行うことを必要とする。これまで好まれていた容器は、標準的なプラスチック製マイクロフュージチューブであった。
従来、試料の温度サイクリングをマイクロフュージチューブ中で行うにあたっては市販のプログラム可能な金属製熱ブロックが用いられてきたが、これは温度−時間の好ましいプロフィルを与えるものである。しかし、短時間で広い温度幅を通して、ヒートブロックの温度を迅速に正確に調整することが不可能であることから、ポリメラーゼ鎖反応等の手続きを実施するにあたり、熱制御システムとしてヒートブロック型装置を用いることは望ましくないとされてきた。
さらに、一般に用いられているマイクロフュージチューブは欠点を有する。即ち、マイクロフュージチューブの材質、壁の厚み、そしてマイクロフュージチューブの幾何学的形状が、その中に含まれる試料の迅速な加熱と冷却の障害となっている。マイクロフュージチューブのプラスチック材料と壁厚はその内部に含まれる試料とそれを取り巻く媒体の間で絶縁体として働き、その結果、熱エネルギーの移動を阻害する。また、マイクロフュージチューブの幾何学的形状は、どのような媒体を用いて熱エネルギーを移動させるにしても、小さい表面積しか呈しない。本技術分野において、最適とはいえない幾何学的形状を有するマイクロフュージチューブが継続的に使用されてきていることからみて、改良された熱移動の有利さ（一定量の試料に対する試料容器の表面領域を増加させることによる）はこれまで認識されていなかったといえる。
さらに、流体工学的スイッチ（または機械的トランスファー）を備えたウォーターバスを用いた装置もまた熱サイクラーとしてポリメラーゼ鎖反応に対して用いられてきた。反応を起こす上で好ましい温度−時間プロフィルを有することからウォーターバスがポリメラーゼ鎖反応混合物のサイクリングに用いられてきたとはいえ、水の高いサーマルマス（そしてプラスチックマイクロフュージチューブの低い温度伝導率）は、装置の性能と反応の特異性に関する限り、大きな制限となっていた。
ウォーターバスを用いた装置はその性能において限界がある。何故なら水のサーマルマスは、達成可能な温度−時間の最大勾配を大幅に制限するからである。またウォーターバス装置は、水を運ぶためのホースや水の温度を制御するための外部温度制御装置のサイズと数の点から、大変に不便であることが分かってきた。さらに、ウォーターバス装置におけるリークを検出するために、水回り取付け部品に対して余分な定期的メンテナンスと検査を行わなければならず、これらは面倒であり且つ時間がかかる。最後に、ウォーターバス装置においては望ましい精度で試料チューブの温度をコントロールすることは難しい。
レイ（Ray）の米国特許第３，６１６，２６４号は、空気を循環させて生物学的試料を一定の温度に加熱又は冷却する熱強制空気装置を示す。レイの装置が空気チャンバ内で一定温度を維持する上で幾らか効果があるとはいえ、この装置は、ポリメラーゼ鎖反応等の生物学的手続きに要求されるような温度−時間プロフィルに基づく循環方式で温度を迅速に調整する必要性については述べていない。
ホウ（Howe）の米国特許第４，４２０，６７９号とシスティ（Sisti）らの米国特許第４，２８６，４５６号は共にガスクロマトグラフィー式オーブンを開示している。ホウとシスティの特許に開示された装置はガスクロマトグラフィーの手続きを行うのに適しているが、これまでの文献に記載された装置のどれによって提供されるよりも実質的により迅速な熱サイクリングを提供するものではない。迅速な熱サイクリングは多くの手続きを行う上で有利である。ホウとシスティの特許に記載されたような装置は、熱サイクリングにおける反応を即座に効果的に且つ迅速に行う上では適していない。
特に、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、現代の分子生物学にとって不可欠な基礎的ＤＮＡ増幅技術である。その有用性と人気にも関わらず、ＰＣＲについての現在の理解はあまり進歩していない。増幅は試行錯誤で最適化されなければならず、またプロトコルについてはこれをただ闇雲に遵守していることが多い。本技術分野において見出される、ＰＣＲに対する浅い限定された理解は、いかに当業者が考察や深い理解なしに強力な技術を利用することに満足しているかを示す良い例である。
ＰＣＲ等の生物学的プロセスは試料の温度サイクリングを必要とする。上に説明したように、従来技術は温度サイクリングをゆっくりと行うだけではなく、ＰＣＲを作動せしめＰＣＲをより有益なものとするために用いられるべき原理の存在を軽視している。このように、迅速にＰＣＲを行い、起こっている反応を分析するのに（もし反応が起こっている時にそのような反応が分析される場合にはリアルタイムで）特に適した方法と装置を提供することは、技術に於ける大きな前進となるであろう。
発明の簡単な概要及び目的
上記の技術水準の観点から、本発明は、以下の目的及び利点の実現を探求するものである。
本発明の一つの目的は、生物学的試料の温度を正確に制御するための装置を提供することである。
本発明の他の目的は、所定の温度−時間プロフィルに従い、生物学的試料の温度を迅速かつ正確に変化させるための熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、多数の様々な生物学的試料を迅速な熱サイクリングに付すことに適した装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、サーマルマスの低い熱伝導媒体を有する熱サイクリング装置であって、対象試料を極めて短時間の間に大きな温度勾配に効果的に付することができる熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更なる目的は、空気を熱伝導媒体として使用する迅速熱サイクリングに生物学的試料を付すことができる装置を提供することである。
本発明の他の目的は、内蔵の流体チャンバ内に置かれた試料を、内部ヒータによって加熱した後、熱サイクルにおける適切な時点で、試料を冷却するために周囲の流体をチャンバ内へ移動させ、これにより試料を冷却する熱サイクリング装置を提供することである。
本発明の更に他の目的は、ＰＣＲを迅速に行い、同時にその反応をモニターするためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、ＰＣＲを迅速に行い、反応が進行している間、継続的にその反応をモニターするためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、反応が進行している間に反応パラメーターを調整しながら、ＰＣＲを迅速に行うためのシステム及び方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、核酸プローブを、合成核酸アナログ又は誘導体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）で置きかえることであるが、この場合後者は蛍光化合物で標識化できることを条件とする。
本発明の上記及びその他の目的及び利点は、以下の説明及びクレームから十分明らかとなり、あるいは、本発明を実施すればより完全に理解することができる。
本発明の一様相によれば、一以上の手続き又は工程を実行するため、生物学的試料を迅速な熱サイクリングに付すことに特に適した装置が提供される。その好適な一形態においては、装置は生物学的試料を保持する手段を含む。いくつかの好適な実施態様においては、試料チャンバとして言及されることもある生物学的試料を保持する構造が、熱エネルギーを維持するための断熱手段、及び試料チャンバの内部を加熱するための手段を備える。いくつかの好適な実施態様においては、白熱電球が、試料チャンバの内部を加熱するための手段として機能する。更に他の実施態様においては、熱風又は冷風が、生物学的試料を保持しているチャンバ内へ送られ、またチャンバから排出される。いくつかの好適な実施態様においては、試料チャンバの内部に沿って断熱材が設けられ、この断熱材が試料チャンバ内のランプが発生する熱を維持し、断熱手段としての役割を果たす。
試料チャンバを急速に冷却するため、好適な装置は、試料チャンバ内に空気を送る手段と、試料チャンバ内に送られた空気を分散させるための手段とを含む。いくつかの実施態様に含まれる好適な構造は、試料チャンバ内に空気を送るように機能する高速ファンと、試料チャンバ内に空気を分散させるように機能する回転パドルである。いくつかの実施態様においては、排気手段が、不要な熱を帯びた空気を試料チャンバの外へ逃がすことを可能にする。本発明は、試料の加熱及び冷却が迅速かつ均一に起こることを可能ならしめるものである。
本発明の方法及び装置によれば、コントロール構造が、所望の時間−温度プロフィルによってシステムを作動させるための手段を提供する。本発明は、特にポリメラーゼ鎖反応を自動的に行うために適している。
本発明のコントローラは、生物学的試料が、ポリメラーゼ鎖反応における変性、アニーリング及び伸長の各工程に対応する所定の温度サイクルを経るようにする。使用時においては、本発明の装置は、時間と温度の両方の面で変性、アニーリング及び伸長の各工程を迅速に最適化することができ、またある工程の温度から次の工程の温度に移るまでの時間（ランプ（ramp）時間）を短縮できる。
本発明は特に、従来の熱サイクリング装置に較べると、ポリメラーゼ鎖反応サイクルの完了に要する合計時間を短縮すると同時に、特異性及び収率を顕著に向上させる。
本発明の他の様相においては、本発明は、ＤＮＡ増幅手続きの進捗を追跡するために、ＤＮＡ増幅をモニタリングするための方法及び装置を提供する。特に、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応の手続きを継続的に蛍光モニターするための方法及び装置を提供する。本発明の好適な実施態様においては、様々な蛍光技術によりＤＮＡ増幅を継続的にモニターするため、光学的要素が迅速な温度サイクルを提供する構造と組合わされる。ガラス製の毛細管試料容器及び複合プラスチック／ガラス製の試料容器により、好適な熱伝導媒体からの迅速な熱伝達（空気等の気体を熱伝導媒体として使用した場合、１５分未満で３０サイクルの増幅を可能にする）と、これと同時的な反応の光学的モニタリングが可能となる。単一試料、若しくは回転するカルーセル上に置かれ迅速熱サイクリングに同時に付されている複数の試料から蛍光が継続的に検出される。
本発明の一様相によれば、反応の進行中に反応の進捗をモニターするために、光学的技術が用いられる。本発明のいくつかの好適な実施態様においては、蛍光プローブが反応混合物に加えられる。本発明では、温度移行の期間に少なくとも１回、蛍光体をモニターする。好ましくは、温度の移行中に２回以上、単一又は複数の試料から蛍光を得ることが好ましい。いくつかの好適な実施態様においては、全試料を同時に迅速な熱サイクリングに付しながら、試料を１つ１つ順次モニター位置に移動させるために、回転カルーセルが設けられる。本発明の実施態様では、増幅サイクル毎に１回蛍光をモニターするか、温度、時間、及び蛍光を各増幅サイクルを通して継続的にモニターすることが望ましい。
本発明を使用すると、温度、時間、及び蛍光から成る３次元プロットが得られる。ハイブリダイゼーションプローブの蛍光体−温度のプロットは、エキソヌクレアーゼ開裂の累積的な不可逆性信号と、これと隣接するプローブの温度依存的な可逆性ハイブリダイゼーションとを分別する。蛍光の温度依存性に追随し、生成物の配列における変化、即ち、多型現象と突然変異を検知できるので、ハイブリダイゼーションプローブは加水分解プローブよりも有用である。ニ重鎖ＤＮＡの存在下で発光する色素を使用すると、各サイクルで生成物の変性、再アニーリング、及び伸長を追跡できる。本発明は、ＤＮＡ増幅反応を迅速に実行するための装置及び方法を提供するが、本発明においては、１５分内、より好ましくは１５分内、最も好ましくは１０分内で、増幅と反応の分析とが組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
本発明に於ける上述の及びその他の利点と目的がどのように得られるのかについてより良い理解を得るために、上に簡略に説明した本発明を、以下、添付図中に描かれている具体的実施態様についてより詳細に説明する。これらの図は本発明の典型的な実施態様を記載するにとどまるものであり、従ってその範囲を限定すると考えてはならないとの理解の上に立って、本発明は、添付の図を用いて付加的な具体性と詳細とをもって描写、説明される：
図１は、本発明の着想に従って、生物学的試料の熱サイクリングに適用され、特に環状ＤＮＡ増幅に使用して適用される熱サイクリング装置の斜視図である。
図２は、図１の装置の流体チャンバ部の側面図である。
図３は、図１中に描かれた装置の流体チャンバ部の内部平面図である。
図４は、本発明の他の実施態様の流体チャンバの内部平面図である。
図５は、本発明の熱サイクリング装置を用いたポリメラーゼ鎖反応に対する最適化した温度−時間プロフィルを示す。
図６は、本発明の熱サイクリング装置の一例を用いた場合のポリメラーゼ鎖反応収率に及ぼす変性時間の影響を示すグラフである。
図７は、本発明の熱サイクリング装置を用いた場合のポリメラーゼ鎖反応特異性に及ぼすアニーリング時間の影響と収率とを示すグラフである。
図８Ａ−Ｂは、本発明の他の好ましい実施態様の、斜視図および縦断面図である。
図８Ｃは、図８Ａ−Ｂに記載の実施態様における生物学的試料を支持する毛細管と熱発生エレメントの関係の概念図である。
図９Ａは、４つの異なる温度／時間プロフィル（Ａ−Ｄ）の結果と、３０サイクル後に得られた増幅生成物（Ａ−Ｄ）を示す。
図９Ｂは、本発明によって用いられる他の好ましい温度／時間のプロフィルのサイクルを示す。図９Ｃ−Ｇは、本発明によって用いられる他の好ましい温度／時間のプロフィルのサイクル例を示す。
図１０は、本発明による温度傾斜制御回路のブロックダイアグラムを示す。
図１０Ａは、生成物変性温度からプライマーアニーリング温度への温度移行速度が反応生成物の特異性に与える効果を示すグラフである。
図１１は、本発明による蛍光検出を伴う好ましい迅速温度サイクラーの概略図を示す。
図１１Ａは、図１１の装置の或る好ましい操作を示した温度−時間チャートである。
図１２は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下での、Ｂ型肝炎ＤＮＡフラグメントの増幅中の、温度、時間、及び蛍光の３次元プロットを示したチャートである。
図１２Ａ−Ｃは、温度−時間、蛍光−時間、蛍光−温度の２次元プロット図を、図１２の３次元プロット図と共に示したものである。
図１３は、ＳＹＢＲグリーンＩの存在下での、ヒトβ−グロビン遺伝子の５３６塩基対フラグメントの増幅における、蛍光−温度のプロットである。
図１４は、本発明の一様相によって得られた蛍光−サイクル数のプロットである。
図１４Ａは、図１４及びこれに続く各図に用いる符号を説明し、異なる初期テンプレートコピー数を示す。
図１５は、本発明の一様相によって得られた蛍光−サイクル数のプロットである。
図１６は、本発明の一様相によって得られた蛍光比−温度のプロットである。
図１７は、本発明の一様相によって得られた蛍光比−温度のプロットである。
図１８Ａは、平衡ＰＣＲパラダイムを示すグラフである。
図１８Ｂは、動力学的ＰＣＲパラダイムを示すグラフである。
図１８Ｃは、アニーリング温度近くでの、異なる時間／温度プロフィルを示すグラフである。
図１９は、試料の連続モニタリング用に構成された、本発明の他の好適な実施態様を示す。
図１９Ａ乃至図１９Ｄは、様々な試料容器の構造を示す図である。
図１９Ｅは、図１９Ａ−Ｄに示す様々な試料容器形状が、試料自体の温度レスポンスに与える影響を示すチャートである。
図１９Ｆ及び図１９Ｇは、本発明による好適な試料容器の、側面図及び底面図である。
図１９Ｈ及び図１９Ｉは、試料の蛍光を検出する際の長方形の毛細管における、２つの可能な向きを示す。
図２０は、ＤＮＡ増幅進行中の試料を連続的にモニタリングするための、本発明による他の好適な実施態様の光学的レイアウトである。
図２１は、試料容器の先端で蛍光検出する迅速温度サイクラーである、本発明の他の実施態様の該略図である。
図２１Ａ−Ｄは、生物学的試料の入った複合プラスチック／ガラス容器を示す。
図２２は、蛍光ハイブリダイゼーションモニタリングのための、有用な温度−時間のセグメントを例示する。
図２２Ａは、毛細管試料容器の側面ではなくむしろ先端を見ることによる、光パイピングの効果を示したチャートである。
図２２Ｂは、試料毛細管の異なる２種類のサイズによる、光パイピング効率を示したチャートである。
図２２Ｃは、エピ蛍光検出を伴う迅速な温度サイクラーを含む本発明の好適な一実施態様によって実行されるタスクを示す、高レベルブロック図である。
図２２Ｄは、反応パラメータを制御するために蛍光フィードバックを用いた、ＰＣＲ反応のための温度−時間のプロットである。
図２２Ｅは、反応パラメータを制御するために蛍光フィードバックを用いた、ＰＣＲ反応のための蛍光−時間のプロットである。
図２３は、温度と蛍光との逆関係を示す蛍光−時間のプロットである。
図２４は、温度と蛍光との逆関係を示す温度−時間のプロットである。
図２５は、生成物融解温度を通る、秒速０．２度の温度移行において得られた、ＳＹＢＲグリーンＩ存在下での３つの異なるＰＣＲ産物に関する蛍光−温度のプロットである。
図２６は、ＳＹＢＲグリーンＩ存在下の異なるＰＣＲ産物濃度における生成物アニーリングを示す、蛍光−時間のプロットである。
図２７Ａ及び図２７Ｂは、それぞれラン・モード及びロード・モードにおける図２８の実施態様の概略断面図である。
図２８は、試料容器の先端で蛍光検出を行う迅速温度サイクラーであり、かつ検出を最適化するため２次元方向で蛍光に対し位置決めをすることを含む、本発明の他の実施態様の概略図である。
図２９は、図２８の概略図に示した部品を含む、本発明の実施態様の外観斜視図である。
図３０Ａ乃至図３０Ｖは、本発明の好適な一実施態様における電気部品の詳細な概念図である。
図３１Ａ及び図３１Ｂは、本発明による試料ハンドリングシステムの、それぞれ斜視図及び断面図である。
図３２は、複数試料ハンドリングトレイを収納する、本発明の他の実施態様の概略図である。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、生物学的反応の熱サイクリングとモニタリングを実行するための装置と方法に関する。本発明の一実施態様においては、少なくとも第一の生物学的試料を迅速熱サイクルに付す方法について述べる。その方法は、次の各段階：
（ａ）第一の生物学的試料を少なくとも第一の容器に加え；
（ｂ）第一の生物学的試料の温度を第一の温度（Ｔ1）から第二の温度（Ｔ2）へ、セ氏スケールで表わしたＴ2−Ｔ1の値未満の秒数で昇温し；
（ｃ）第一の生物学的試料を、少なくとも第二の温度と同じ高さの温度で、１０秒以下の第一の保持期間以下の時間保持し；
（ｄ）第一の生物学的試料の温度を第二の温度から少なくとも第一の温度へ、セ氏スケールで表現したＴ2−Ｔ1の値未満の秒数で降温し；更に
（ｅ）第一の生物学的試料を、少なくとも第一の温度と同じ低さの温度で、２０秒以下の第二の保持期間以下の時間保持する；
を含む。
一実施態様においては、第一の生物学的試料を少なくとも第一の容器に加える段階は、約１０，０００μｌ以下の体積の第一の生物学的試料を第一の容器に加える段階を含む。あるいは第一の生物学的試料を少なくとも第一の容器に加える段階は、約１０，０００μｌ以下の容積を有する第一の容器に第一の生物学的試料を加える段階を含む。一実施態様においては、第一の容器は少なくとも一部がガラス製である。
一実施態様においては、第一の生物学的試料を昇温する段階が、第一の生物学的試料の温度を第一の温度（Ｔ1）から第二の温度（Ｔ2）へ、（Ｔ2−Ｔ1）／４の値未満の秒数で昇温する段階を含む。あるいは第一の生物学的試料の温度を第一の温度（Ｔ1）から第二の温度（Ｔ2）へ、（Ｔ2−Ｔ1）／１０の値未満の秒数で昇温することができる。一実施態様においては、第一の生物学的試料を昇温する段階が、第一の生物学的試料の温度を第二の温度と少なくとも２０℃異なる第一の温度から第二の温度へ、１秒あたり少なくとも１℃の速さの第一の速度で昇温する段階を含む。あるいは、第一の生物学的試料の温度を第一の温度から第二の温度へ昇温する段階は、１秒あたり少なくとも１０℃の速さの第一の速度で行われ、ここで第一の温度は第二の温度と少なくとも２０℃異なる温度である。他の一実施態様においては、第一の生物学的試料を昇温する段階が、第一の生物学的試料の温度を第一の温度から第二の温度へ、１秒あたり少なくとも２０℃の速さの第一の速度で昇温する段階を含む。
一実施態様に従えば、少なくとも第一の生物学的試料を迅速熱サイクリングに付す方法を行うにあたり、第一及び第二の保持期間は約１０秒以下である。より好ましくは、第一及び第二の保持期間は約１秒以下である。一実施態様に従えば、生物学的試料は、複数の生物学的試料を複数の容器に加える段階を更に含む迅速熱サイクルリングに付される。
一実施態様に従えば、温度サイクリング中リアルタイムでＰＣＲを行い且つ反応をモニタリングするためのシステムは、
複数のＰＣＲ試料を入れるための複数の試料容器であって、該試料容器は光学的に透明な毛細管を含み、該毛細管は１ミリリットル未満の試料を保持し且つ、封止された端部と封止可能な閉止部を他端に有する開放端とを有するものである容器と；
複数の試料容器を保持する手段であって、該手段は試料容器を保持する回転可能なカルーセルを有するものである手段と；
熱液体を複数の試料容器に接触させる手段と、
冷液体を複数の試料容器に接触させる手段と、
ＰＣＲ試料を熱サイクリングに付すために熱液体を接触させる前記手段及び冷液体を接触させる前記手段を反復作動させる手段と；
試料を光学的に励起して試料に蛍光を発生させる手段と；
該励起試料の蛍光を第一の波長と第二の波長とで検出する手段と；更に、
検出された蛍光に応じた少なくとも一個の反応パラメータを決定し且つ該反応パラメータを視覚的に認知可能な方法でリアルタイムで表示する手段と；
を含む。
該システムは、反応がリアルタイムで調整されるように、反応パラメータに応じて反復作動させる前記手段を調整する手段を更に含むことができる。一実施態様においては、検出された蛍光に応じた少なくとも一個の反応パラメータを決定し且つ該反応パラメータを視覚的に認知可能な方法でリアルタイムで表示する前記手段は、変性温度及び時間と、プライマーアニーリング温度及び時間と、プローブアニーリング温度及び時間と、酵素伸長温度及び時間と、サイクル数と、からなる群より選択される反応パラメータを決定する手段を含む。
本発明の一実施態様において核酸増幅を行う方法を述べる。その方法は、次の各段階：
生物学的試料を提供し；
該試料の温度を第一の温度に昇温し；
該試料の冷却を、第一期間以下の時間以内に開始し、ここで前記第一期間は１秒であり；
該試料の温度を第一の温度より低い第二の温度へ降温し；
該試料を、第二の温度で第一期間以下の時間保持し；更に
該試料の温度を第二の温度から第二の温度より高い第三の温度に昇温する；
を含む。
一実施態様に従えば、核酸増幅を行う方法は次のように行われる。即ち、試料の温度を第一の温度に昇温する段階及び試料の温度を第二の温度へ降温する段階を２０分間に少なくとも３０回行う。一実施態様においては、第一期間は０．２秒以下である。
本発明はまた、試料を保持し且つ分析のために試料を試料容器に配送するためのカルーセルに関する。一実施態様においては該カルーセルは、
上面と底面とそれらの間に延在する外端部とを有するディスクと、上面中の試料受入れポートと、外端部中の試料容器ポートと、試料受入れポートと試料容器ポートとを連通する試料通路と；
を含み、該試料容器ポート及び試料通路は試料容器を該ディスクに受容・固定するように形成されている。
該カルーセルは、該試料受入れポートの閉止部を更に含んでもよい。更に、該カルーセルの通路は、該液体試料に偏向力が印加されない場合に、試料受入れポートを経由して配送される液体試料が試料容器ポートに流れ込むことを防止するバリアーを有してもよい。
該カルーセルは、更に該試料容器ポートに受容される試料容器を更に含んでもよく、一実施態様においては該試料容器は、表面積に対する容積が１ｍｍを越える毛細管である。一実施態様においては該カルーセルの試料通路は、試料容器ポート、試料受入れポート及び前記上面における少なくとも一個の付加的ポートを連通している。一実施態様に従えば、該カルーセルは試料受入れポートと試料容器ポートとの間の通路に所定の試薬混合物を更に含む。
本発明はまた生物学的試料のハンドリングシステムに関する。該ハンドリングシステムは、試料デリバリーポートを有する容器と該容器を充填するための漏斗キャップとを含むものであって、該容器は光学的に透明な材料の壁を含み、該壁は該容器の外表面積に対する容器容積の比が１ｍｍ未満となるような容積を画定し、該漏斗キャップは、第一の試料受入れポートおよび第二の試料トランスファーポートを有し、且つ該漏斗キャップの試料トランスファーポート及び該容器の試料デリバリーポートが整列するように該漏斗キャップを取り外し可能に容器に固定するための手段を含む。該試料ハンドリングシステムは、該漏斗キャップの試料受入れポートと摩擦嵌め合いシール係合のためのプラグを更に含んでもよい。一実施態様においては、該容器は毛細管であり、更に好ましくは、該容器の容積の外表面積に対する比が０．２５ｍｍ未満である。
本発明は、液体試料を毛細管試料容器に添加する方法にも関する。該方法は次の各段階：
上面と底面とそれらの間に延在する外端部とを有するディスクと、上面中の試料受入れポートと、外端部中の試料容器ポートと、試料受入れポートと試料容器ポートとを連通する試料通路とを含み、該試料容器ポート及び試料通路は試料容器を該ディスクに受容・固定するために形成されている、該サンプルを受入れ且つ該試料容器を保持するカルーセルを選択し；
該液体試料を試料受入れポートに配送し；
毛細管試料容器を試料容器ポート内に位置決めし；更に
カルーセルを回転して毛細管試料容器に試料を配送する；
を含む。
一実施態様においては、該方法は試料容器を試料容器ポート内に位置決めする前に、所定の混合物を該試料容器に添加する段階を更に含む。更に、液体試料を試料受入れポートに配送する前に、所定の混合物を該試料通路に位置決めしてもよい。該所定の混合物は、一実施態様においては、液体試料の分析を行うための試薬類を含む。
液体試料を毛細管試料容器に添加する他の実施態様においては、該方法は次の各段階：
上面と底面とそれらの間に延在する外端部とを有するディスクと、上面中の試料受入れポートと、外端部中の試料容器ポートと、試料受入れポートと試料容器ポートとを連通する試料通路とを含み、ここで該試料通路は該液体試料に偏向力が印加されない場合に試料受入れポートを経由して配送される液体試料が試料容器ポートに流れ込むことを防止するバリアーを有し、該試料容器ポート及び試料通路は試料容器を該ディスクに受容・固定するために形成されている、該サンプルを受入れ且つ該試料容器を保持するカルーセルを選択し；
該液体試料を試料受入れポートに配送し；
毛細管試料容器を試料容器ポート内に位置決めし；更に
カルーセルを回転して毛細管試料容器に試料を配送する；
を含む。
該試料通路が試料容器ポート、試料受入れポート及び該上面に形成された少なくとも一個の付加的ポートを連通する一実施様態においては、該方法は、カルーセルを回転させる前に第二の液体を該付加的ポートを経由して該試料通路に配送し、該カルーセルが回転して該液体試料及び第二の液体に偏向力が提供された場合、これらが該毛細管容器に配送される途上で混合される付加的段階を含む。一実施態様においては、該試料通路は付加的バリアーを含み、この付加的バリアーは、前記付加的ポートを経由して試料通路に配送される該第二の液体に偏向力が印加されない場合に、前記第二の液体が該試料容器ポートに流れこむことを防止する。一実施態様においては、該第一の試料を毛細管試料容器へ配送する所定の回転速度で該カルーセルが回転する時、該付加的バリアーは第二の液体が該試料容器ポートに流れこむことを防止する。該カルーセルは次いで、第二の液体を該毛細管容器に配送する第二のより高い回転速度で回転する。
前記方法は、毛細管試料容器を該試料容器ポートに位置決めする前に所定の混合物を該試料容器に添加する段階を更に含んでもよい。一実施態様においては、該カルーセルは、該カルーセルを回転させるためのステッパーモーターに連結される。一実施態様に従えば、該所定の混合物は試料の分析を行うための試薬類を含む。
本発明は、また試料中の標的核酸配列の存在を検出するためのシステムに関する。該システムは、
一対のプローブの一方がアクセプター蛍光体で標識され、他方が蛍光エネルギートランスファーペアのドナー蛍光体で標識される、標的核酸配列の隣接領域にハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ドナー蛍光体の発光とアクセプター蛍光体の吸光とのオーバーラップが２５％未満であり、アクセプター蛍光体のピーク吸光係数が１００，０００Ｍ-1ｃｍ-1を越え且つ標的配列と二つのプローブのハイブリダイゼーションに際して該ドナー蛍光体及びアクセプター蛍光体が互いに１５ヌクレオチド以内であるシステムである。
一実施態様に従えば、共鳴エネルギートランスファーペアはドナーとしてフルオレセインを含み、且つＣｙ５はアクセプター蛍光体である。一実施態様においては、該プローブが標的核酸配列にハイブリダイズするに際し、該ドナー蛍光体及びアクセプター蛍光体は互いに０〜５ヌクレオチド以内である。
次に、図を参照しつつ本発明を説明するが、図中、同一の構造には同一の符号を用いる。
図１に示すように、好適な一例である熱サイクリング装置１０は、全体を符号１１で示す閉ループ流体（最も好ましくは空気）チャンバを含む。このチャンバは、排気ドア１４を通してサイクル処理に付される試料を受け入れるようにされている。この閉ループ流体チャンバ１１は複数のコンパートメントを含むが、それぞれについては追って説明する。装置１０はまた、コントローラ１２を含む。このコントローラは、チャンバ１１が所定の時間に亘って一連の温度を通過してサイクル処理に付されるように、入力キー２５及びディスプレイ２６を用いてプログラムできる。チャンバ１１の熱サイクリングが使用されうる処理は無数にあるが、以下に説明するように、反応混合物を含む試料から得られるプライマー特異的ＤＮＡの増幅に特に適合する。
閉ループ流体チャンバ１１は、ハウジング１３によって概ね箱型の形状に包囲される。ブロワ取付け板１６は、必要に応じ、チャンバ１１の小さい長方形部分を区切るように配置してもよく、略円筒状の下部ハウジング１５を保持し、チャンバに固定するよう機能する。あるいは、ブロワ２８のファンを、チャンバハウジング１３内に一体化して収納してもよい。
ブロワハウジング１５の内部には、ブロワのブレードとシャフトが内包される。ブロワモータ（図示せず）はブロワハウジング１５の外側に位置し、従って、内包されたチャンバ１１の外部に位置する。この配置では、ブレード及びシャフトが、チャンバ１１内で熱い循環流体に曝されることになるブロワの唯一の部分となる。チャンバ内にモータを取り付けることは、モータを温度変化に曝露し、またモータのサーマルマスを加熱・冷却に付される試料のサーマルマスに付加することになるので好ましくない。チャンバ１１内の流体に曝されるサーマルマスを減少させることは、試料を内部に置いて、所定のプロフィルを使用しながら、あるいは反応継続中における１以上の反応パラメータを変更しながら、所望の温度−時間プロフィル（以下、より詳細に説明される）に付すという装置１０の総合的な機能の点から重要である。
ブロワ２８は、通常「インライン」タイプのブロワとして知られる公知タイプのブロワである。このブロワは、通常サーマルマスが低いため、プロペラタイプのファンを採用していることが好ましい。あるいは、必要であれば、リス籠タイプのファンにしてもよい。この場合のファンは、７５立方フィート／分の性能を有することが好ましい。
ソレノイドプラットフォーム１７には、ソレノイド１８が固定される。ソレノイド電機子１９はロッド２０の上端２１に装着される。このロッドは排気ドア１４に固定され、かつ排気ドア１４の上方及び下方の部分においてハウジング１３に対し回転自在に装着される。従って、ロッド２０により、排気ドア１４が、ロッドの長手方向軸を中心にハウジング１３に対し自由に回転することが可能となる。
スプリング２２は、支柱２３によって、ハウジング１３のいずれかの端に取付けられる。スプリング２２の反対側の端は、ロッド２０の上端２１にソレノイド電機子１９取付け部分に隣接して取付けられる。スプリング２２は、上記２箇所の取付けポイントの間で、張力を保つように引伸ばされる。従って、スプリング２２は、上端２１を支柱２３の方向に引っ張るようになる。そのため、この支柱は、排気ドア１４を閉鎖位置にまで回転させるようになる。ソレノイド１８が作動すると、電機子１９が、ロッド２０の上端２１をソレノイド１８の方向に引っ張ることになる。この方向は、スプリング２２が引っ張る方向とは逆の方向であり、また排気ドア１４を開く方向でもある。
全体を符号１２で示すコントローラは、トランスミッションケーブル２４によって、チャンバ１１に電気的に取付けられる。このケーブル２４はまた、ブロワモータ（非図示）及び加熱コイル３１に電力を供給する。また、コントローラ１２は、温度データに対応する信号を受信するための熱電対センサ３５、及びソレノイド電機子を作動させるためのソレノイド１８にも接続される。
コントローラ１２は、加熱コイル３１、排気ドア１４、及びブロワを制御して、チャンバ１１内を時間を関数とした所定の温度にするようにプログラムでき、かつ所定の時間及びチャンバの温度レベルでソレノイドを動作させるためのリレー出力を作動させるようにプログラムできるものであれば、公知のいかなるタイプの温度コントローラユニットであってもよい。図１乃至図３の実施態様において使われている好ましい温度コントローラ１２は、Ｐａｒｔｌｏｗ ＭＩＣ−６０００比例制御式温度コントローラである。このコントローラは、型番Ｎｏ．ＣＮ８６００のプロセスコントローラとして、コネチカット州スタンフォードのＯｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．から入手可能である。
図２及び図３に示すように、チャンバ１１の内部は、４つの主要コンパートメントに区切られている。ブロワコンパートメント２８は、ブロワハウジング１５及びブロワ取付け板１６から形成される。ブロワコンパートメント２８の全体は、上述のように、ブロワのファンとシャフト部分で満たされる。ブロワは、上述のように多くの既知のデザインによるものでよいので、解り易くするために図３では省略した。本発明においては、ブロワコンパートメント２８内に位置するファンにより、流体が吸気口３６を介してブロワコンパートメント２８内に引き込まれ、また排気口３７から押し出されることが理解されれば十分である。
流体は、ブロワにより７５立方フィート／分以上の速度で駆動されることが好ましい。ただし、本発明に関して重要なことは、チャンバ１１内に位置する流体がブロワのファン及び駆動シャフトの一部のみと接触し、ブロワモータ自身はチャンバ１１内の流体との接触を避けるためにブロワハウジング１５の外側に位置することを理解することである。上記の配慮は、チャンバ１１内の流体と接触する材料をできるだけ少なくして、サイクリング処理中に加熱され及び／又は冷却されるべき材料のサーマルマスを極小化するという、本発明動作スピードの達成に貢献する。流体によって加熱又は冷却されるべきサーマルマスを極小化することにより、チャンバ１１の内包物を均一な温度にするのに要する応答時間が大幅に短縮される。
ブロワコンパートメント２８内に存在する流体は、排気口３７を通って加熱コンパートメント２９に流入する。加熱コンパートメント２９に入りこむ流体は、加熱コイル３１の傍を通過しなければならない。この加熱コイル３１が加熱コンパートメント２９内を通過する流体より熱くなると、流体は、コンパートメントを通過させられる際にコイルによって熱せられる。加熱コイルは、マイクロサポートの周りに巻かれた１０００ワット（１２５ＶＡＣ）のニクロム線コイルであることが好ましい。ただし、チャンバ内に存在するタイプの流体を加熱するのに適した加熱ユニットであれば、どのようなものでも使用できる。図１乃至図３の実施態様における具体的な加熱コイルは、オレゴン州ポートランドのＪｏｈｎｓｔｏｎｅ Ｓｕｐｐｌｙが製造している。
加熱コイルは、コントローラ１２に含まれる出力リレーによって作動する。好ましいリレーは、型番Ｏｍｅｇａ ＳＳＲ ２４０ Ｄ２５のプロセスコントローラとして、コネチカット州スタンフォードのＯｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．が製造している、２５Ａ、１２５ＶＡＣのソリッドステートリレーである。
加熱コンパートメント２９を通過する流体は、反応コンパートメント３０に流入する前に、バッフル３２及び３３に当たる。バッフル３２及び３３は、流体の層流を破壊し、流体中に乱流を起こして効果的に流体を攪拌する結果、流体が反応コンパートメント３０内に到達するときには均一な温度となる。
熱電対３５は、反応コンパートメント３０内の流体の温度に呼応した電気的入力信号をコントローラ１２に提供する。熱サイクリング装置１０作動中の温度のモニタリングは、３０ゲージの鉄−コンスタンタン「Ｊタイプ」熱電対を用いて行うことが好ましい。この後すぐに説明するように、コントローラはこの情報を利用し、プログラム入力されている所定の熱−時間プロフィルに従い加熱コイル３１を調節し、ソレノイド１８を作動させる。
反応コンパートメント３０からリターン空気コンパートメント３４に流入する流体は、まず（点線で示す）試料コンパートメント２７を通過しなければならない。試料コンパートメント２７についても、この後すぐに説明する。
リターンコンパートメント３４内の流体は、試料コンパートメント２７内に置かれた試料への熱移動により、わずかに冷却されている。リターンコンパートメント３４内の流体は、吸気口３６を介してブロワコンパートメント２８に引き込まれ、そこから排気口３７を介して加熱コンパートメント３９へと再び送られる。即ち、流体チャンバ１１は、排気ドア１４が閉じられた状態で作動すると、閉ループ流体チャンバとなる。このチャンバでは、内包物を均一な温度にするため、流体が、内部の各コンパートメントを通る閉ループ経路に沿って連続的に再循環させられる。空気チャンバ１１内での空気の連続的循環により、試料コンパートメント２７内の試料が、可能な限り迅速に所定の温度に到達することが可能となり、次いで、必要であればその温度を維持することもできる。
装置１０により、反応コンパートメント２７内に置かれた材料を加熱するだけでなく、その後可能な限り迅速に冷却し周囲の流体（空気）温度まで下げなければならない場合には、ソレノイド１８を作動させて排気ドア１４を開け、加熱された内部の流体を同時に放出しながら大量の常温の流体をコンパートメント１１内に直ちに流入させるように、コントローラ１２をプログラムすることができる。
排気ドア１４を開けながらブロワの作動を継続させつつ加熱コイル３１を停止することにより、周囲の流体がリターンコンパートメント３４内に引き込まれ、今度はそこからブロワコンパートメント２８に送られる。次にブロワは、周囲の流体を加熱コンパートメント２９に押し込む。流体はコイル３１で熱せられることなくそこを通過し、直接反応コンパートメント３０内に流入する。周囲の流体は、試料コンパートメント２７を通過し、排気ドア１４を介してチャンバ１１から出る。チャンバ１１内に置かれた材料のサーマルマスが最小であるため、またブロワのファンの作用により、大量の周囲の流体が試料コンパートメント２７を通過させられ、そこからチャンバ１１の外に放出される。従って、反応コンパートメント２７内に置かれた試料又は材料に対する迅速な冷却が達成できる。
試料コンパートメント２７は、各試料を入れた細長い中空ガラスチューブ等の複数の試料を、間隔を置いて同じ向きに容易に置けるようなサイズとされ、流体が各試料の周りに一様に配分される。必要に応じ、試料コンパートメント２７は、均一な間隔を置いて配置された複数の試料を収納できるように設計された、ラックやバスケット等の挿入が可能となるサイズや形状に形成して、試料チャンバ２７への試料の載荷を簡単にすることもできる。
試料コンパートメント２７へのアクセスは、排気ドア１４を開放位置まで回転させることにより達成される。排気ドア１４が、一旦その閉鎖位置から約９０度回転させられると、試料コンパートメント２７はそのドアを通じて容易にアクセス可能となる。また、図１〜図３から解るように、排気ドア１４がその閉鎖位置から約９０度回転させられると、リターン流体コンパートメント３４が反応コンパートメント３０からほぼ遮断される。従って、本発明の装置１０が「冷却」モードにある時は、周囲の流体は直接リターン流体コンパートメント３４に流入し、上記の閉ループ流体流路と実質的に同じ経路に沿って、ブロワコンパートメント２８、加熱コンパートメント２９、反応コンパートメント３０、そして試料コンパートメント２７に送られる。流体は次に、空気チャンバ１１から押し出されるが、排気ドア１４を試料コンパートメント２７とリターンコンパートメント３４との間に位置させることにより、流体が空気リターンコンパートメント３４に戻ることが阻止される。
従って、排気ドア１４は、周囲の流体がチャンバ１１内に流入することを可能とするだけでなく、周囲の流体がチャンバ１１内をループ式に再循環することをも阻止する。その代わり、流体は、試料コンパートメント２７を通過させられた後、チャンバ１１の外に出され、内部の試料及びチャンバ１１の迅速な冷却を助ける。
本発明の装置１０が環状ＤＮＡ増幅のために用いられる場合、異なる温度を経る繰返しサイクリングが必要となる。ポリメラーゼ鎖反応のための反応混合物を含む試料は、通常、増幅過程における変性、アニーリング、及び伸長の段階に対応した温度変化を受けつつ、約３０回サイクル処理に付される。
本発明の装置１０は、上述のその新規な特徴のため、従来技術に較べて著しく短い時間で試料をサイクル処理に付することができる。例えば、図に示す実施態様に係るＤＮＡ増幅アプリケーションは、温度−時間プロフィルのサイクルを３０〜６０秒内で通過できる（図５参照）。従来技術の装置を用いた同じサイクルでは、約５〜１０倍も長い時間がかかるであろう。こうした短いサイクル時間は、従来技術によるサイクル処理に較べ、ポリメラーゼ鎖反応の収率及び特異性を向上させることが証明された。
実施例１
５０ｍＭトリス（Tris）・ＨＣｌ（ｐＨ８．５、２５℃）、３．０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭＫＣｌ、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンから成る反応緩衝液中に、５０ｎｇのヒトゲノムテンプレート（鋳型）ＤＮＡ、０．５ｍＭの各デオキシヌクレオチド、各５００ｎＭの二つのオリゴヌクレオチドプライマーＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号５）とＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧ（配列番号６）を入れ、ポリメラーゼ鎖反応を容量１０μｌにて行った。サーマス・アクアティックス（“thermus aquatics”）ＤＮＡポリメラーゼ（０．４μ）を加え、試料を８ｃｍ長の薄壁毛細管（Ｋｉｍｂｌｅ製、Ｋｉｍａｘ  ４６４８５−１）の中に置き、各チューブの両端に空泡ができるように、両端を実験室用ガスバーナーで融着させた。
次に毛細管を、厚さ１ｍｍの「予め穴を開けたパネル板」（Ｒａｄｉｏ  Ｓｈａｃｋ製）のホルダーに垂直に立てた。変性（９０〜９２℃）、アニーリング（５０〜５５℃）、及び伸長（７２〜７５℃）から成るサイクルに混合物を３０回付して図５の温度−時間プロフィルを得た。毛細管の温度モニタリングは、脱イオン水（１０μｌ）中に設置され、熱電対モニター（ＢＡＴ−１２、Ｓｅｎｓｏｒｔｅｋ）に連結された小型熱電対（ＩＴ−２３、Ｓｅｎｓｏｒｔｅｋ製、ニュージャージー州クリフトン）を用いて行った。増幅生成物は１．５％アガロースゲルで電気泳動によって分画した。特異的増幅生成物が良い収率で得られた。
本発明装置１０は、水の代わりに空気を熱移動溶媒として循環させるので、非常に迅速に温まる低熱容量溶媒（空気）を介して熱移動が起こるという利点をこの装置は持っている。
先行技術プロセスでこれまで用いられてきたプラスチックのマイクロフュージチューブの代わりに薄壁ガラス毛細管チューブを試料保持のために用いることにより、またチャンバ１１（図５参照）内部の材料の熱量を極小化することにより、試料を冷却するためのレスポンス時間は非常に速められる。このようなレスポンス時間により、ポリメラーゼ鎖反応における変性及びアニーリング、並びに伸長過程の時間と温度における最適化が可能となる。
さらに、「ランプ」（ramp）時間が短縮される。即ち、増幅過程の各段階に対応して、試料の温度をある温度レベルから次の温度レベルへ移すのに要する時間が短縮される。これにより、増幅の完了に要する時間が短縮し、ポリメラーゼ鎖反応プロトコルにおけるアニーリング、変性、及び酵素動態学の具体的な研究を可能にする。
試料コンパートメント２７内部で改善された温度均一性を達成することが必要であれば、バッフル３２と３３（図３に示す）が使用されるであろう。本実施態様に見られるように、バッフル３２と３３は、反応コンパートメント３０中の温度変動を約１０℃から約２℃まで減少させる。もし必要であれば、反応コンパートメント３０に於ける温度変動をさらに減少させるためにさらに（またはより複雑な）バッフルを使用する場合もある。或いは、図４に見られるように、一層均一な混合を達成するために、ファンをヒーティングコイル３１の下流の、試料コンパートメントの前方に設けることもできる。
装置１０を用いて得られた増幅生成物は、手動ウォーターバスサイクリング法によって得られた生成物と少なくとも定性的および定量的には同じである。しかし、反応混合物を迅速熱コントロールすることで特異性と収率に有利点をもたらすことができる。
図６は、熱サイクリング装置１０を用いた場合の、特異性（即ち、複数の同様のまたは「影の」生成物に対する一つの特異的生成物の収率）に対する図５の温度−時間プロフィルの効果を示している。ランプとアニーリング時間を短くすると、生成物の特異性が高くなる。装置１０の迅速温度反応は、従来技術のシステムでは不可能だった特異性と収率を改善することを可能にしている。
図７は、熱サイクリング装置１０を用いた場合の、ＤＮＡ増幅収率に及ぼす、図５の温度−時間プロフィルの変性時間の変化の効果を示す。明るい垂直な線の各々は、変性温度における特定の時間に対応する。変性時間を可能な範囲で最も短縮した場合に収率が最大になる。そのような結果は従来技術のシステムでは得られない。
図示したように、装置１０の熱容量（熱量）を減少させることによって、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応に必要な全時間を驚くほど減少させることが出来る。加えて、少量の試料を用いれば、反応に必要な合計時間を短縮でき、使用しなければならない高価な試薬の量を最大９０％減らし、これにより本発明を用いた手続きを行うコストをさらに削減できる。例えば、図１〜図３の実施態様では内径が約０．２５ｍｍから約１．０ｍｍの毛細管チューブ１０８を使用できる。幾つかの応用においては、内径が約０．０２ｍｍから約０．１ｍｍの毛細管チューブ１０８も使用できる。
本発明の装置１０は、どのような材料からのＤＮＡ増幅にも役立つ。本発明の特定の構成と配置を、本発明の教示に従って構成された熱サイクリング装置１０の具体的な実施態様との関連で議論してきたが、他の配置と構成も利用できるであろう。例えば、空気以外の一般に低熱量の様々な液体も装置１０に使用できる。
本発明のもう一つの実施態様を、図８Ａ−Ｃに示す。図８Ａは斜視図であり、図８Ｂは本実施態様の縦断面図である。前に述べたコンポーネントと教示の多くが、図８Ａ−Ｃに図示された実施態様に適用できることは理解されよう。したがって、本実施態様についての関連する追加の情報のみを以下に記載する。重要なことは、図８Ａ−Ｃの実施態様中で、熱発生エレメントが生物学的試料容器に隣接しており、下記に説明するように、生物学的試料の加熱と冷却をより迅速に行うことを可能としていることである。
直ぐに分かるであろうが、図８Ａ−Ｃの装置は、従来技術に比べて、例えば３０分、１５分、１０分、あるいはさらに少ない分で、１５または３０サイクルのＤＮＡ増幅の熱サイクリングを行うことが出来る速度に於いて、非常に大きな改善が計られている。さらに、装置１００は、以前に可能であったものよりも試料全体を通してさらに良好な熱均一化を提供する。
図８Ａには、本実施態様のハウジング１０２の全体的な構成を示す。ハウジング１０２は、脚１０４（図８Ｂに於いて最も良く見える）の上に位置しており、記述された他の構造体を所定位置に支持するように機能し、熱くなる構造体を周囲の環境から隔離する働きがある。図８Ａに示す実施態様１００には、入力キー２５と、前述した装置１０で用いられたようなディスプレイ２６が含まれる。前述のコントロール構造体は容易に変更でき、また、図８Ａ−Ｃに示す実施態様における使用に係るコントロール手段のためのパターンとして使用できる。
図８Ｂの断面図に最も良く示されるように、試料チャンバはブラケット１０６によって具体的に示される。ヒンジ１３１によってハウジング１０２に連結される蓋１３８は、これを開くことにより、試料チャンバ１０６に接近することが出来る。試料チャンバ１０６は円筒形であることが好ましいが、特定の応用で必要とされる任意の形状又はサイズとすることができる。
試料チャンバ１０６は、黒色の発泡材料１１０によってライニングされていることが好ましく、この泡材料１１０の表面は光吸収特性を有し、その厚さにより断熱特性を有する。黒色の発泡材料は、本技術分野で容易に入手可能でプラスチック材料から作られるものとすることができる。発泡体１１０は、その上を通過する空気によって簡単に冷却できる材料であることが望ましく、それは熱伝導性が低く多孔性表面を有する材料である。
材料の暗色又は黒色の多孔性表面は、表面に衝突する短い波長の放射（radiation）を長い波長の放射、即ち熱に変換する。この熱は試料チャンバに放射される。
発泡体１１０は、ハウジング内の周囲を取り巻く空間から試料チャンバを熱的に隔離し、ランプ１１２から発光される光を熱エネルギーに変換する機能を有する。発泡体１１０は、他の構造体と置き換えることもできる。例えば、片側の表面が黒く塗られたポリカーボネートの薄いシートなどの、黒色、暗色、または他の非反射性の表面を有する材料を、断熱性の材料、例えばファイバーグラスまたは発泡材料によって裏打ちすることができる。多数の異なる基材上に塗布された黒または暗色の表面は、その表面に衝突する短い波長の放射を熱放射に変換し、その一方で、断熱材料は試料チャンバを周囲の環境から熱的に隔離する。このように、ここで示された教示を用いて、当業者は、多くの異なる材料と構造体を試料チャンバのライニングとして利用することができる。
ランプ１１２は出来れば５００ワットのハロゲンランプであることが好ましい。適当なコントロール装置を用いれば、高パワーランプまたは複数のランプ、例えば、４つの５００ワットハロゲンランプなどを使用することが出来る。ランプソケット１１２Ａはサポート１１２Ｂによってハウジング１０２に取り付けられている。ランプ１１２は、試料チャンバ１０６を望ましい温度まで、非常に迅速に、かつ均一的に加熱することができる。すでに述べたニクロム線素子などの、熱即ち赤外線放射のための他のソースも、本発明の範囲の中で用いることが出来る。
図８Ｂに示すのは、すでに説明したような２つの薄壁毛細管チューブ１０８である。２つの薄壁毛細管チューブ１０８が示されているが、試料チャンバ１０６は多くのそうしたチューブを支持することが出来る。薄壁毛細管チューブ１０８は、前述した以前から用いられている装置を上回る幾つかの重要な利点があり、また試料チャンバ１０６と共に、生物学的な試料を支持する手段の一つの好適な例として機能する。
同等又は類似の機能を持つ多くの他の構造もまた用いることができることが理解されよう。薄壁毛細管チューブ１０８の一部を試料チャンバの貫通孔１４０から外方に延出して接近を容易にすることが好ましい。しかし、特定の応用に適している数多くの他の液体支持構造体のように、試料チャンバ１０６の内部に完全に収容されるようにしてもよい。好ましい薄壁毛細管チューブ１０８は、１０μｌの容量を有する。理解されるであろうが、試料の体積を小さくし、試料支持構造体の表面領域を比較的大きくし、それら全体が比較的小さな熱量を示すようにしなければならない。また、試料支持構造体はどこでも約１ｐｌから約１０，０００μｌまでの容積を有するのが望ましい。しかし当業者であれば、構造体の異なる熱量を考慮するならば、他の容積の試料も使用可能であり、本発明の範囲に含まれることは分かるであろう。
ランプ１１２と断熱発泡体１１０は共に、薄壁毛細管チューブ１０８の中の試料と試料チャンバ１０６内の空気の迅速で均一的な加熱を提供する。熱電対１３４は、チャンバ内の温度を検出するために試料チャンバ１０６内に設けられており、前述のように試料チャンバ内部を望ましい温度に維持するために使用するものである。
好ましくは、熱電対１３４は、生物学的試料とそれを支持する容器の熱応答性と実質的に適合する熱応答性を備えた当技術分野で入手可能なものである。そのような熱電対は、金属シース付きＪ−タイプ熱電対と呼ばれる熱電対製品群を製造しているＩｄａｈｏ  Ｌａｂｓのような販売元から購入できる。好ましくは、下記のようにして熱電対の熱応答性が生物学的試料と容器の熱応答性と整合される。当技術分野で知られているようにＰｈｙｓｉＴｅｍｐから購入できるモデルＩＴ−２３熱電対などのミクロ熱電対を選択された容器に支持されている典型的な生物学的試料に挿入し、試験中の試料と熱電対を同じ温度変化に付する。試験中の熱電対、または他の外部基準は、熱電対の熱応答性が、試料とその容器の熱応答性に一致するまで変えることが出来る。
図８Ｂに示す配置は、以前に利用可能だった装置よりも、試料をより一層均一に加熱、冷却できるものを示している。従前利用可能だった装置では、試料全体を通しての熱の伝達は、試料を通した対流によって行われる。試料を支持するために用いられるものが何であっても、対流による試料の運動は、一般に小さな生物学的試料（例えば、１０−１００μｌ）内の温度勾配または温度差によって起こる。
試料内の温度勾配の効果は、試料のための熱サイクル時間が短くなるにつれてより顕著になり、コントロールを難しくする。試料内の温度が不均一であること、そして、特に従来技術の装置が依存している試料内の「対流による混合」への依存は一般に一試料に対するサイクル時間を増加させ、生物学的試料に有害な影響をもたらしているようである。装置１００は、１０μｌ試料内の温度差が、３０秒サイクルの間、どの時点でも±１℃よりも大きくならないように維持するように、加熱と冷却を行うことができる。
均一的な加熱と冷却を促進するために、薄壁毛細管チューブ１０８が熱源、例えば装置１００中のランプ１１２から少なくとも幾分は均一に離間されていることが望ましい。図８Ｃは、図８Ａ−Ｂ中に示した装置１００の中に配置されたランプ１１２と複数の薄壁毛細管チューブ１０８の図式化した平面図である。
図８Ｃ中に示す配置において、ランプ１１２から最も離れた（線Ｆで示す）薄壁毛細管チューブ１０８とランプ１１２との間の距離は、ランプ１１２に最も近い（線Ｎで示す）薄壁毛細管チューブ１０８とランプ１１２との間の距離に対して実質的に４０％以上、より望ましくは実質的に２５％以上長くないことが好ましい。例えば、線Ｎで示された距離は約７．３ｃｍで、線Ｆで示された距離は約８．５ｃｍである。
薄壁毛細管チューブ１０８の配置は図に示すものでなくともよく、例えば、円形又は半円形に配置してもよいことが理解されよう。また、熱生成要素と試料容器との間の距離を測定する起点は、熱生成要素のタイプやサイズの変化に対応して変更される。例えば、熱生成要素は、形状及びサイズが異なる複数のランプ又は電気抵抗要素を含んでもよい。いくつかの実施態様においては、試料容器が位置決めされる試料チャンバ壁からの距離を考慮することが重要となる場合がある。例示された実施態様では、アパーチャ１４０（図８Ａ参照）が試料容器の保持手段として機能するが、同等の機能を果たす他の構造を本発明に従って用いてもよい。
また装置１００は、毛細管チューブ１０８内に入れられた試料を、極めて迅速かつ均一に冷却する。試料チャンバ１０６を冷却するため、ハウジング１０２の外部から、下部ハウジングポータル１１４を介してハウジングの内部にファン１１６を用いて空気が引き込まれる。このファン１１６は、モータ１１８によって駆動されるモータシャフト１２２に接続されている。試料チャンバの迅速な冷却が望まれるので、直ぐ後で説明されるように、モータ１１８とファン１１６は、十分な容量の空気を試料チャンバ１０６内に送った後、試料チャンバ１０６内の空気を分散させることができることが好ましい。図８Ｂに例示されるモータ１１８とファン１１６以外の構成も、本発明の範囲内で採用することができる。
熱移動媒体としての空気の使用には、他の気体や液体とは対照的に、廉価で、入手が容易であり、攪拌しやすく、汚れが付かないといった利点がある。ここで説明される実施態様の場合、試料の入った毛細管チューブの表面積対体積の高い比により、熱移動媒体として空気を使用した迅速な熱移動が得られる。
熱サイクルにおける冷却段階の際、ファン１１６の作用により、周囲の空気がハウジング１０２内に引き込まれる。排気ドア１２８は、ヒンジ１２９に接合されて設けられる。この排気ドア１２８は、ハウジング１０２の内部が上部ハウジングポータル１３０から遮断されるように、ソレノイド１３２により自動的に開かれる。いくつかの実施様態においては、ソレノイド１３２を、本技術分野で知られているステッパーモータに置き換えることが好ましい。ステッパーモータの使用により、排気ドア１２８が、試料の加熱及び冷却の必要に応じて正確にかつ少しずつ開閉することが可能となる。当業者であれば、ステッパーモータのための適切な制御機構は、例えば、当業界では既知のＳＣ−１４９ステッパーモータコントローラ（Ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）等を本明細書に開示される情報を利用して構成できるであろう。
下部試料チャンバポータル１２０の配置、及び上部試料チャンバポータル１２６の増加させた断面積と位置により、室温の空気は試料チャンバ１０６に送られた後、モータシャフト１２２に接続されたパドル１２４を用いて、試料チャンバ１０６内で分散及び攪拌される。このパドル１２４は、比較的高い速度、例えば、好ましくは約２５０ｍ／分、より好ましくは約５００ｍ／分、最も好ましくは約１０００ｍ／分の試料チャンバ１０６内での空気速度をもたらすのに十分な速度で回転させられる。この高速回転する単翼又は多翼のパドル１２４により、空気が移動し、試料チャンバ１０６内に引き込まれた後、点線１３６で示された経路に沿って試料チャンバ１０６から排気される。パドル１２４の回転はまた、試料チャンバ１０６に入って来る空気の攪拌をも促進し、薄壁毛細管チューブ１０８の表面から試料チャンバ１０６内を通過する空気への熱エネルギーの最も効率的な移動を確実にする。本明細書に例示されるもの以外の構造でも、同様の機能が発揮できることが理解されよう。
ソレノイド１３２が作動して排気ドア１２８が開くと、試料チャンバ１０６内に送られていた室温の空気全てが、試料チャンバ上部ポータル１２６を介し、次に上部ハウジングポータル１３０を介して排気され、試料チャンバ１０６内の熱が周囲の大気に放出される。試料チャンバ１０６内を通過し、その中に分散される空気を迅速に攪拌する結果、試料の迅速かつ均一な冷却が実行される。
実施例２
図９Ａは、４つの異なる温度／時間プロフィル（Ａ〜Ｄ）と、３０サイクル実施後に得られた増幅生成物を示す。図９ＡのプロフィルＡ及びＢは、従来技術のマイクロフュージチューブを用いた従来技術の加熱ブロック装置を使用して得た。図９Ａに見られるように、異なる温度間の移行は遅く、多くの非特異的バンドがプロフィルＡ及びＢの中に存在している。プロフィルＢでは、各試料が各温度に留まる時間を制限することにより、（プロフィルＡとは対照的に）一部の非特異的バンドが除去され改善されている。これは、前記時間がより短ければ、より多く所望の結果が得られることを示唆するものである。
プロフィルＣ及びＤは、図８Ａ及び図８Ｂに示す装置を使用して得た。図９Ａに見られるように、増幅は特異的であり、好ましいことには、収率はプロフィルＣ（６０秒伸長）で最大であるが、プロフィルＤ（１０秒伸長）においても全体としては適切である。
ヒトのゲノムＤＮＡから採取したβ−グロブリンの５３６ｂｐフラグメントの増幅に関する最適時間及び最適温度もまた決定された。増幅における収率及び生成物特異性は、変性（９３℃）及びアニーリング（５５℃）を１秒未満行った時に最適となった。これより長時間の変性又はアニーリングには、いかなる利点も見出せなかった。伸長（７７℃）時間を長くすると収率は増加するが、１０〜２０秒を超える伸長時間ではほとんど変化が見られなかった。これらの予期し得ぬ結果は、ＤＮＡ増幅に用いられる従来から入手可能であった装置が、反応の物理的及び酵素的な要件を最適化するのに必要な条件を最大にするものでないことを示唆している。
更なる情報は、以下の文献から得られる：カール・Ｔ・ウィットワー（Wittwer,Carl T.）、ブルース・Ｃ・マーシャル（Marshall,Bruce C.）、ガドラン・Ｂ・リード（Reed,Gudrun B.）、及びジョシュア・Ｌ・チェリー（Cherry,Joshua L.）らの「嚢胞性繊維症ΔＦ50B遺伝子座を用いた迅速な対立遺伝子特異的増幅サイクル（Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF50B Locus）」39 Clinical Chemistry 804（1993）、並びにカール・Ｔ・ウィットワー（Wittwer,Carl T.）、ガドラン・Ｂ・リード（Reed,Gudrun B.）、及びカーク・Ｍ・ライア（Rire,Kirk M.）らの「迅速なＤＮＡ増幅（Rapid DNA Amplification）」The Polymerase Chain Reaction 174（1994）。これら両文献を、本明細書の一部を構成するものとしてここに引用する。
図９Ａに提示した情報から、本発明の実施態様では、そこに置かれた試料が、好ましくは少なくとも０．５℃／秒を超える速度で試料の温度が増減される迅速な熱サイクルに付されることが解る。ポリメラーゼ鎖反応を行う本発明の場合には、温度の変化が、好ましくは約３０℃から５０℃の範囲にわたり行われることである。熱サイクルは、少なくとも３０サイクルを４０分以内で行えるだけ十分に迅速に行うことが望ましく、さらに好ましくは３０サイクルを２０分以内で行うことであり、最も好ましくは３０サイクルを１０分以内に行うことである。
装置１００は、好ましくは少なくとも１．０℃／秒の速度で試料の温度を増加減少させ、より好ましくは少なくとも４．０℃／秒の速度で増加減少させ、最も好ましくは少なくとも１０．０℃／秒の速度で増加減少させる。厳密には、周囲の媒体および／または試料容器ではなく、生物学的試料も、特定の熱変化を行わなければならない。本発明ほど迅速な熱変化を行うことができない欠点を有する以前に利用可能であった装置も、周囲の媒体と容器の温度ではなく、試料の温度を迅速にかつ均一に変化させる問題を認識していなかった。
次に図９Ｂの図を参照すると、本発明の方法は好ましくは少なくとも１０℃／秒の速度、より好ましくは少なくとも２０℃／秒の速度で、約２０℃以上の温度範囲、より好ましくは約３０℃以上の温度範囲、最も好ましくは約４０℃の温度範囲に渡って熱サイクリングを達成することができる。図９Ｂは、生物学的試料の熱サイクルが始まってからの、周囲の空気や容器ではなく、生物学的試料の温度を℃で示したものである。図９ＢはＰＣＲ試料の温度変化を示す。約７４℃から始まり、Ｄで示す変性温度（９２℃）まで２秒で加熱される。次に試料はＡで示すアニーリング温度（５５℃）まで２秒で冷却される。変性温度とアニーリング温度の遷移（３７℃の範囲）は４秒以下であり、少なくとも１０℃／秒の速度を達成している。次に、図９Ｂ中のＥに示すように、試料を５秒で７４℃の伸長温度まで加熱する。変性温度、アニーリング温度、そして伸長温度を通した試料のサイクリングは３０回繰り返すか、あるいは望みの回数だけ繰り返す。
図９Ｃ〜Ｇは、本発明によって達成された他の望ましい温度／時間プロフィルの例示的なサイクルを示している。これから、当業者であれば、本発明に従って特異的なプロセスを行うために代表的な温度／時間プロフィルを変更できることは理解されるだろう。また当業者であれば、以前に利用可能であった装置と方法、例えば固体または液体を介して試料に熱を伝導し、試料から熱を伝導する装置は、ここで示した温度／時間プロフィルを提供できないことが分かるであろう。さらに、当業者であれば、以前に利用可能であった装置と方法は、ここで示した温度／時間プロフィルを示唆も教示もしていないことが分かるであろう。さらに、当業者であれば、以前に利用可能であった、空気と転移媒体を使用する装置と方法、例えば以前に利用可能だったクロマトグラフィーオーブンは、本明細書に示され、本発明を実施することで得られる温度／時間プロフィルを提供できず、又示唆も教示もしていないことが分かるであろう。
最も速い熱サイクリング時間を提供するために、ランプ（図８Ａと８Ｂの１１２）の定格が２０００ワットであるか、または同様の出力を提供する複数のランプを設けることが好ましい。コネティカット州、ＤａｒｉａｎのＡｌｐｈａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能なクロックと高性能プログラムインタプリター付き８０５２マイクロコントローラーボードを用いたＡ−バスコントローラー／アクイジションシステム（モデル番号ＳＰ−１２７）と関連して図１０に示した温度勾配制御回路を含むことも好ましい。好ましいマイクロコントローラーと関連して用いられるプログラミングコードの例は、添付のプログラミングコード付表Ａに含まれ、これを本明細書の一部として掲載する。付表Ａのプログラミングコードは、マイクロコントローラーへのシリアルでダウンロードのためのＢＡＳＩＣ５２のファイルであり、熱サイクリングの間の例示的熱勾配コントロールを提供する。２０００ワット熱発生装置と上記の制御構造を使用することによって、好ましい２０℃／秒の速度で温度サイクルを行なうことができる。
次に、図１０に示す温度勾配制御回路の好ましい構成を説明する。なお、図１０中に明示的に描かれていない他の必要な部品は、当業者が容易に提供できるものである。
図１０に示す温度勾配制御回路は、すでに説明されたように試料の温度応答性に適応した熱電対２００を含む。熱電対２００は集積回路２０６に連結されている。この集積回路２０６は、望ましくはＡＤ５９５として知られているものであり、その出力は、カットオフ周波数が１００Ｈｚの４次ローパスフィルター２０８に運ばれ、そして１２ビットＡ／Ｄ変換器２１０へ運ばれる。このＡ／Ｄ変換器２１０の出力は、温度のデジタル表示を提供するために用いられる。
回路２０６の出力は測定勾配回路２１２へも運ばれる。この測定勾配回路２１２は、望ましくは３５３演算増幅器２１８、１００ＫΩのポテンシオメーター２１４、１ＭΩのポテンシオメーター２３０、そして２２μＦのコンデンサを含む。測定勾配サーキット２１２は、３５３演算増幅器２４６の反転入力へ信号を出力する。
勾配設定回路２２２は、正勾配設定ＤＡ変換器２２６と、負勾配設定ＤＡ変換器２２４とを含む。ＤＡ変換器２２４と２２６は、当技術分野でＤＡ１４７と呼ばれる８ビットＤＡ変換器であることが好ましい。勾配設定回路は、パーソナルコンピュータのような他のデジタル装置（図１０中に描かれていない）からの命令を受け得るようになっているのが好ましい。勾配設定回路２２８の出力は、加算回路２４０に送られる。
加算回路２４０は、１００ＫΩの抵抗２３６、２３８、２４４と、３５３演算増幅器２４２を含んでいるのが好ましい。加算回路２４０の出力は、演算増幅器２４６の非反転入力へ運ばれるが、これは温度変化の好ましい勾配を示す。演算増幅器２４６の出力は、パワースイッチング回路２６２の内に含まれるトランジスタ２４８に供給される。
パワースイッチング回路２６２は、５ＶのＤＣ電源２５０を有し、これはトランジスタ２４８に電流を供給する。トランジスタ２４８のエミッタは、好ましくは抵抗値が３３０Ωである抵抗２５２を介して３０１０回路２５４に接続されている。３０１０回路２５４の出力には、好ましくは抵抗値が１８０Ωである抵抗２５６が直列に接続されている。好ましくは、ＡＣ電流源２６０からランプ２６２又は他の熱発生装置に供給される電流を制御するためにトライアック２５８が用いられる。
図１０に示された温度勾配制御回路は、他の既に述べたシステムの構成要素と協力して、生物学的試料全体を通しての均一性を維持しながら、温度範囲３０℃に渡って、最も好ましくは４０℃の温度範囲に渡って、２０℃／秒の速度で生物学的試料の熱サイクリングを行う。
本明細書に記載した装置は、ポリメラーゼ鎖反応過程、サイクルシークエンシング、及びリガーゼ鎖反応のようなその他の増幅プロトコルなどの多くの異なるアプリケーションのために容易に使用できる。本発明はまた、試料チャンバ中に置かれた試料の温度を正確にコントロールし、所定の温度−時間プロフィルに従って、迅速に正確にチャンバ内に置かれた試料の温度を変化させるための装置を有利に提供する。
前に示したように、従来技術の教示に比べてポリメラーゼ鎖反応を迅速に行うことができる。本明細書に記載された方法と装置を用いることにより、必要な回数の温度サイクルを、従来技術で可能であった時間よりも遥かに短時間で、例えば１５分未満で完了できる。変性とアニーリングの時間を最短にすることで、サイクルを早くした増幅の特異性と収率も以前には可能ではなかったレベルまで改善される。さらに、迅速な熱移動に加えて、透明な毛細管などの光学的に透明な試料容器を使用することで、本発明に従ったＤＮＡ増幅の継続的な蛍光モニタリングが可能となる。
図１０Ａは本発明の装置を使用した場合のＰＣＲ反応の特異性と収率に及ぼす温度移行速度の影響を図式的に示すものである。図１０Ａの結果は、５０ｍＭトリス（Tris）（ｐＨ８．３）、２ｍＭ塩化マグネシウム、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、及び０．４Ｕの未変性（native）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを加えた１０μｌの反応液を用い、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから増幅したベータグロビン遺伝子の５３６塩基対フラグメントを使用して得た。ヒトベータグロビンプライマーＲＳ４２とＫＭ２９（５３６塩基対）は、Ｃ．Ｔ．ウイットワー（C.T.Wittwer），Ｇ．Ｃ．フィルモア（G.C.Fillmore），Ｄ．Ｒ．ヒリヤード（D.R.Hillyard）による「熱い空気を用いた毛細管内での自動化されたポリメラーゼ鎖反応（Automated Polymerase Chain Reaction in Capillary Tubes with Hot Air）」Nucl.Acids.Res.１７：４３５３−４３５７に記載されている。温度サイクリングのパラメータは、９４℃は０秒、５５℃は０秒、７２℃は１０秒であった。全温度間において、記載の速度での増幅サイクルを３５回行なった。試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムにて染色した。温度移行速度が減少するに従って特異性も収率も低下した。
ＤＮＡ増幅を検出及びモニターするために蛍光プローブを使用できる。当業者には知られているように、有用なプローブには、二本鎖ＤＮＡ特異的色素、及び配列特異的プローブがある。インターカレーター臭化エチジウムにより、紫外線励起赤色蛍光は増幅の後に増加した。ＤＮＡ増幅のための試料容器としてマイクロフュージチューブが使用されてきたが、本明細書に記載の本発明の実施態様においては、毛細管チューブと本明細書に記載する構造的特徴の多くを備えた試料容器を利用することが有利である。
本明細書に記載した試料容器を使用することにより、後でより完全に説明するように、試料が容器中に保持された状態で蛍光の検出が可能となる。当業者であれば、ＤＮＡ増幅の蛍光検出については現在利用可能な多くの異なった方式があることを知っているであろう。例えば、配列特異的蛍光検出は本発明とオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用することで容易に可能となる。他の例としては、二重標識フルオレセイン／ローダミンプローブは、ポリメラーゼ伸長の間、５’−エキソヌクレアーゼ活性によって開裂することが可能で、蛍光体を分離し、フルオレセイン／ローダミンの蛍光比を増加させる。
以下に記載する本発明の実施態様を使用することにより、蛍光の測定を、温度サイクリングが完了した後で、生成物の堆積のモニターとしてサイクル毎に一回、温度遷移の間に二回以上、又は各サイクル内で連続的に行なうことができる。本発明と異なり、従来使用可能であった方法はサイクルを回すのが比較的遅く、又、温度変化中において蛍光を収集／分析することは教示していない。
本発明により、初期テンプレートコピー数の数量化のためのサイクル毎のモニターが可能となる。そのようなサイクル毎のモニターを行なうために、各サイクルの伸長段階又はアニーリングと伸長を組み合わせた段階の間における蛍光が収集され、生成物の濃度と関連付けられる。例えば、インターカレーターＹＯ−ＰＲＯ−１TMを使用したＣ型肝炎ＲＮＡのための量的アッセイが当技術分野で知られており、本発明に従って使用できる。より詳細な情報は、イシグロ  Ｔ．（Ishiguro,T.）、Ｊ．サイッチ（J.Saitch）、Ｈ．ヤワタ（H.Yawata）、Ｈ．ヤマギシ（H.Yamagishi）、Ｓ．イワサキ（S.Iwasaki）、及びＹ．ミトマ（Y.Mitoma）による１９９５年発行の「蛍光インターカレーター存在下におけるポリメラーゼ鎖反応によるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの均質な量的アッセイ（Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater）」、Anal.Biochem.２２９：２０７−２１３を参照のこと。本発明以前は、各サイクル内の温度遷移の間における連続的な蛍光モニターは試みられなかった。
本発明の一つの様相によれば、本明細書に記載の一実施態様は、連続的な蛍光モニタリングを提供する２色蛍光光学装置と一体化された迅速温度サイクラーである。下記においてより十分に検討するように、ＤＮＡ増幅をモニターするための異なった望ましい蛍光技術を、本発明の一つの様相を実施する具体例として本明細書に示す。当業者であれば、本発明に従って使用できる蛍光技術におけるエチジウムブロマイドの使用に親しんでいるであろう。下記に記載した現時点での好ましい実施態様においては、当技術分野でよく知られ、オレゴン州、ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手できるＳＹＢＲ▲Ｒ▼ＧｒｅｅｎＩを二重鎖特異的色素として用いることが望ましい。
本発明の現時点での望ましい実施態様においては、時間、温度、蛍光が増幅反応の間、２００ｍｓｅｃごとに収集される。反応中の定期的なデータの収集によって、今まで利用可能であった装置と方法では得られなかった、生成物の変性、再アニーリング、伸長の細部がそのようなデータの収集で明らかとなる。
当業者であれば分かるように、ＤＮＡ増幅が行われている多数試料の一サイクルに一度のモニタリングは、強力な定量化ツールである。重要なことは、本開示を理解することによって分かるように、サイクル内の連続的なモニタリングは、プローブ蛍光の性質を同定することができ、当技術分野では今まで利用できなかったＤＮＡ増幅機構への洞察を提供し、また増幅生成物と突然変位を同定するためにＰＣＲ生成物とプローブ融解曲線を評価することができることである。
次に図１１を参照すると、全体を３００で示す、蛍光検出付の望ましい迅速温度サイクラーの概略図が示されている。強制空気熱空気源３０２は、好ましくは、１６００ワットの加熱コイルとファンを含む市販の装置である。強制空気冷空気源３０４も提供されることが望ましい。この強制空気冷空気源３０４は、イリノイ州、ＮｉｌｅｓのＤａｙｔｏｎから入手可能な２２００ｒｐｍのシェード付きポールブロワ、モデル番号４Ｃ００６Ｂである。冷空気源３０４が常温の空気を提供することが好ましいが、周囲の空気温度よりも低い温度の流体を提供する手段を利用することも本発明の範囲に入るものである。
図１１の実施態様では、ダクト３０６と３０８が、強制熱空気源３０２と強制冷空気源３０４のそれぞれを試料チャンバ３１０に連結している。このダクト３０６と３０８は、２．５ｃｍの直径を持つ波形黒色ナイロンチュービングである。ダクト３０６はポート３０６Ａを介して試料チャンバ３１０に接続され、ダクト３０８はポート３０８Ａを介して試料チャンバ３１０に接続されている。ベント３１２と排出ファン３１４は試料チャンバ３１０から空気を外に出すように機能する。さらに、試料チャンバ３１０の内部を周囲光から遮蔽するための手段が試料チャンバ３１０と一体的に設けられている。
試料チャンバ３１０内部の試料の温度は、アイダホ州、Ｉｄａｈｏ  ＦａｌｌｓのＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な、管状の金属シース付き熱電対（モデル番号１８４４）３１６によってモニターされる。この熱電対は、好適な試料容器、例えば毛細管チューブ内に保持された試料と熱応答性が適合している。重要なことは、試料チャンバ３１０内部の温度均一性は、試料チャンバ３１０内の空気を混合することによって達成されることである。この試料チャンバ３１０内の空気の混合は中央試料チャンバファン３１８によって行なわれることが好ましい。この試料チャンバファンは、好ましくはＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な１．７ｘ１１ｃｍのファンブレード（モデル番号１８６２）、およびＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能なモータ（モデル番号１８６１）を含むのが好ましい。このモータは、試料チャンバ３１０内に於いて少なくとも８００から１０００ｍ／分の空気速度を作り出す。このような速い空気速度は、本発明の全てのアプリケーションに必要ではないかもしれないが、速い空気速度は試料チャンバ３１０内における十分な混合と温度の均一性を促進する。
試料チャンバ３１０内部に於いて、複数の試料が毛細管チューブに支持され、そのうちの幾つかが３２０で示されており、回転するカルーセル３２２に垂直に置かれている。カルーセル３２２は、望ましくは１４ｃｍの直径であり、マイクロステッピングドライブモジュール３２６によって制御される、一回転当たり４００ステップのステッパーモーター３２４によって回転される。ステッパーモーター３２４は、好ましくは、マサチューセッツ州ＬａｗｒｅｎｃｅのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なステッパーモーター（モデル番号２１９８３６４）であり、マイクロステッピングドライブモジュール３２６は、同じくＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なマイクロステッピングドライブモジュール（モデル番号ＭＤＭ７）である。このモジュールは、カルーセル３２２の１回転当たり１２，８００ステップを提供する。
また図１１を参照すると、蛍光励起源３２８が配置されている。本発明による一つの好ましい励起路の装置を、この後に記載する本発明による一つの好ましい集光路の装置と共に説明する。蛍光励起源３２８は好ましくは楕円形レフレクタ３２８Ｂで集光させた７５ワットのキセノンアーク光源３２８Ａを含む。キセノンアーク光源３２８Ａは好ましくはフォトンテクノロジーインターナショナル（サウスブルンズウィック、ニュージャージー州）から入手でき、ｆ／２．５楕円形レフレクタ３２８Ｂを有するＮｏ．Ａ１０１０型である。その蛍光励起源３２８を作動するために必要な電源及びその他の部品は当業者には公知である。別法として発光ダイオードを蛍光励起源として用いることができる。当業者は、多くの異なる励起源が本発明の範囲内で使用できることを理解する。
蛍光励起源３２８によって発せられる放射線を、ロリン（コヴィナ、カリフォルニア州）から産業界に提供されるＮｏ．７５．０１２５型のような、調節可能アイリス３３４を用いて約２ｍｍに集光させる。蛍光励起源３２８からの発光はコールドミラー３３０（これは好ましくはロリンから提供されるＮｏ．６０．４４００型である）に突き当たり、熱吸収ガラス３３２（これもロリンから市販されるＮｏ．６５．３１３０型であるのが好ましい）を通過する。平凸レンズ３３６（ロリンから市販されるＮｏ．１０．０２６０型が好ましい）による視準後、４５０−４９０ｎｍバンドパス干渉フィルター３３８（オメガオプティカル（ブラットルボロ、バーモント州）から入手可能なＮｏ．４７０ＲＤＦ４０型が好ましい）、集束平凸レンズ３４０（ロリンから入手できるＮｏ．１０．０２６０型が好ましい）及び１ｍｍシリカウィンドウ３４２（オメガから入手できるものが好ましい）を通過させて、温度サイクル中のこれら光学的部品へのコンデンセーションを阻止する。上記の励起路を用いて１本のキャピラリサンプルチューブ３２０Ａの５−７ｍｍ部分が照明される。
また図１１を参照し、サンプル３２０Ａから発せられる蛍光を集めるための集光路を次に説明する。集光路の光学系には、その他の光学的部品上のコンデンセーションを阻止するために光路に置かれた１ｍｍのシリカウィンドウ３４４を含む。対置される２つの非球面レンズ３４６Ａ及び３４６Ｂ（ロリンから入手できるＮｏ．１７．１１７５型が好ましい）は発せられた蛍光を２×１０ｍｍスリット３４８に集束するようにはたらく。このスリット３４８は好ましくは露光Ｘ線フィルムを切ることによって作ることができ、そのスリット３４８は空間フィルターとしてはたらく。スリット３４８（空間フィルターとして作用する）の後は、発せられた蛍光は電子シャッタ制御部３５２を介して作動する３５ｍｍの電子シャッタ３５０に与えられる。３５ｍｍの電子シャッタ３５０は好ましくはUniblitzシャッター、ＶＳ３５型であり、電子シャッター制御部３５２は好ましくはドライバーＤ１２２型であり、両方共ヴィンセントアソシエーツ（ロチェスター、ニューヨーク州）から入手できる。視準非球面レンズ３５４（好ましくはロリンから入手できるＮｏ．１７．１１７５型）も配置される。
ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩ放射の検出が所望であるときは、フィルター３５６も含める。フィルター３５６は好ましくはオメガから５５０ＲＤＦ６０型として提供される５２０−５８０ｎｍバンドパスフィルターである。これは単一波長を受け取るために好適に用いられる。その他の放射を検出するために、例えば、ダイクロイックフィルター３５８と波長フィルター３５８Ａ及び３５８Ｂとの組み合わせを用いることができる。例えばフルオレセイン及びローダミンの放射を分離する場合、ダイクロイックフィルター３５８は、フルオレセイン検出用の５６０ｎｍダイクロイックフィルター（好ましくはオメガから入手できるＮｏ．５６０ＤＲＬＰ型）、及び５２０−５５０ｎｍバンドパスフィルター３５８Ａ（好ましくはオメガから入手できるＮｏ．５３５ＤＦ３０型）と、ローダミン検出用の５８０−６２０ｎｍバンドパスフィルター３５８Ｂ（好ましくはオメガから入手できるＮｏ．６００ＤＦ４０型）とからなるのが好ましい。フルオレセイン及びＣｙ５放射を分離するためには、ダイクロイックフィルター３５８は好ましくは５９０ｎｍダイクロイックフィルター（オメガから入手できるＮｏ．５９０ＤＲＬＰ型）であり、フィルター３５８Ａ及び３５８Ｂは、フルオレセイン検出用の５２０−５５０ｎｍバンドパスフィルター３５８Ａ（オメガから入手できるＮｏ．５３５ＤＦ３０型）、及びＣｙ５検出用の６６０−６８０ｎｍバンドパスフィルター３５８Ｂ（オメガから入手できるＮｏ．６７０ＤＦ２０型）からなるのが好ましい。その他の蛍光波長に合わせるために、本明細書に明らかにされる情報を用いてその他の部品を容易に使用し得ることは当業者には理解できる。
また図１１により、発せられた蛍光は、それぞれのフィルター３５８Ａまたは３５８Ｂにかけられた後、２つの平凸レンズ３６０Ａ及び３６０Ｂ（これらそれぞれのレンズは好ましくはエドムンド（バリントン、ニュージャーシー州）からのＮｏ．３２９７０型である）を通って集束され、それぞれ光電子増倍管３６２Ａ及び３６２Ｂに至る。光電子増倍管（ＰＭＴ）３６２Ａ及び３６２Ｂは、好ましくはハママツ（ミドルセックス、ニュージャーシー州）から入手できるＮｏ．Ｒ９２８型であり、アナログ取得能力を有する、適切な回路（好ましくはフォトンテクノロジーインターナショナル製のＮｏ．７１４型）を含む適したハウジングにそれぞれ入っている。好ましくは、ＰＭＴ及びデータ取得制御モジュール３６４も備え付けられる。当業者には公知のように、手動ＰＭＴシャッタ３６６Ａ及び３６６Ｂも配置される。
前記の光学的部品類は好ましくは直径５ｃｍであり、５ｃｍ共通レンズ取り付け器、例えばロリンから入手できるＮｏ．９０．０１９０型など、に取り付けられる。当業者が行っているように、必要な構造的部品の多くは黒色デルリン（Delrin）TMから、産業界で公知の技術を用いて機械加工された。
発光ダイオード（ＬＥＤｓ）及び光ダイオードを図１１に示す同じ機能の部品の代わりに用いて、蛍光検出装置３００を含む高速温度サイクラーを好都合に作ることができることは、当業者には理解できる。よって、蛍光励起源３２８は発光ダイオードによって機能する。光電子増倍管３６２Ａ及び３６２Ｂも光ダイオードに代えることができる。適切な発光ダイオード及び光ダイオードに関するその他の情報を本明細書に以後提供する。技術感度がバックグラウンドの蛍光によって制限されることは理解される。バックグラウンドの蛍光の大部分は検出システムでなく、プローブに由来するものである。重要なことは、一般的に絶対的感度よりも安定性の方がより重要であるということである。
当業者は、図１１に示される蛍光検出部３００をもつ高速温度サイクラーが高速温度制御を備えた蛍光測定装置（この技術分野ではどこにも示唆または教示されていない組み合わせ）の好都合な特徴を含むことを理解する。１０から２０分間の温度サイクル中にＰＣＲを実施し、分析することができる。本発明の（１）各温度サイクル内における蛍光モニタリングと、（２）雑種化の温度及び時間との依存性の分析との組み合わせは、これ以外では得られない利点を提供する。
本発明は単色蛍光法を可能にし、生成物の純度をモニターし、ＰＣＲ中のテンプレートを定量することもできる。本発明の実施形態により、ＤＮＡ鎖の状態をモニターする色素をＰＣＲ反応に加えて、温度サイクル中に観察する。
本発明で得られるいくつかの利点を説明するために、図１１に示す装置を用いた特殊の例を提供する。以下の例では、その他の記載がない限り５μｌサンプルあたり、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３（２５℃）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸及び０．２ＵのＴａｇポリメラーゼを含む媒体中でＤＮＡ増幅を行った。下記の例では、ヒトゲノムＤＮＡ（１分間の煮沸により変性）または精製増幅生成物もＤＮＡテンプレートとして用いた。精製増幅生成物はフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿（ワラス（D.M.Wallace）（１９８７）、「核酸の大及び小規模のフェノール抽出及び沈殿（Large-and Small-Scale Phenol Extractions and Precipitation of Nucleic Acids）」を参照）、（バーガー（S.L.Berger）及びキンメル（A.R.Kimmel）（編集）、「分子クローニング技術ガイド（Guide to Molecular Cloning Techniques）」-酵素学における方法（Methods in Enzymology）-、１５２巻）、Academic Press、オルランド、３３−４８ページに記載されている））及び、その後のセントリコン３０ミクロコンセントレータ（アミコン（デンバー、マサチュセッツ州）から入手）の反復洗浄によるプライマーの除去によって得た。テンプレート濃度は２６０ｎｍにおける吸光度によって決定した。テンプレートのＡ260／Ａ280比は１．７より大きかった。
これらの例ではプライマーは、当業者には公知のように、すなわちファルマシアバイオテクジーンアセンブラプラス（ピスカタウェイ、ニュージャーシー州）を用いて、標準ホスホアミダイト法によって合成した。Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の１８０塩基対断片を、プライマーの５’−ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（遺伝子バンク（Genebank）配列ＨＶＨＥＰＢ）を用いて増幅した。ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩ染料はモレキュラープローブス（ユーゲン、オレゴン州）から入手した。β−アクチンプライマー及びフルオレセイン／ローダミン二重プローブはパーキンエルマー（フォスターシティー、カリフォルニア州）から得た（Ｎｏ．Ｎ８０８−０２３０）。ヒトβ−グロブリンプライマーＲＳ４２／ＫＭ２９（５３６塩基対）及びＰＣ０３／ＰＣ０４（１１０塩基対）は、ウィットワー（C.T.Wittwer）、フィルモア（G.C.Fillmore）及びヒルヤード（D.R.Hillyard）著、「熱空気を含むキャピラリチューブ中における自動ポリメラーゼ連鎖反応（Automated Polymerase Chain Reaction in Capillary Tubes with Hot Air）」Nucl.Acids.Res.１７巻、４３５３−４３５７ページに記載されている。これは本願に引用して援用する。単一標識プローブ、
0004281877.tif 000002
をフルオレセインホスホアミダイト（グレンリサーチ（スターリング、バージニア州）から入手、Ｎｏ．１０−１９６３）、Ｃｙ５TMホスホアミダイト（ファルマシアから入手、Ｎｏ．２７−１８０１−０２）、及び化学的リン酸化試薬（グレンリサーチから入手、Ｎｏ．１０−１９００）を用いて合成した。これらの隣接するプローブは、同じＤＮＡ鎖上のＰＣ０３／ＰＣ０４ β−グロビンプライマー対に内部雑種化し、１個の塩基対によって分離されている。プローブは逆相Ｃ−１８高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、均質性をポリアクリルアミド電気泳動及び吸光度（Ａ260及び蛍光体の最大吸光度）によってチェックした。雑種化プローブ（β−アクチン及びβ−グロビン）は各々０．２μＭを用いた。
ここに記載される適切な例において、増幅サンプル５μｌをキャピラリサンプルチューブに装填した。そのチューブの幾つかは図１１の３２０であらわされている。好適キャピラリサンプルチューブはアイダホテクノロジーから入手できる１７０５型で、外径１．０２ｍｍ及び内径０．５６ｍｍの寸法をもつものである。装填後、キャピラリサンプルチューブをブタン炎で封止した。キャピラリサンプルチューブの表面を光学的グレードのメタノールで清浄にした後、蛍光検出部３００を備えた高速温度サイクラーのカルーセル３２２に入れる。
図１１に示される部品のコントロールは、時計速度１２０ＭＨＺで作動するインテル▲Ｒ▼８０４８６マイクロプロセッサを用いるＰＣ互換コンピュータ３６８に、LabViewとして知られているグラフ式プログラミング言語（ナショナルインスツルメンツ（オースチン、テキサス州）から入手できる）、及び１２ビット多機能式入力/出力カード３６８Ａ（ナショナルインスツルメンツからＡＴ−ＭＩＯ−Ｅ２の名称で提供される）を用いることよって行った。入力/出力カード３６８Ａのアナログ出力チャンネルを用いて各光電子増倍管３６２Ａ及び３６２Ｂの感度、すなわちＰＭＴ電圧をコントロールした。入力/出力カード３６８Ａのアナログ入力チャンネルは光電子増倍管３６２Ａ及び３６２Ｂの各々からシグナルを受け取る。ＰＣ互換コンピュータ３６８は、入力/出力カード３６８Ａを介してカルーセル３２２の位置、運動速度及び方向を制御する。例えば、多数のキャピラリサンプルチューブを装填するとき、カルーセル３２２は１０−１００ｍｓｅｃの取得期間に速やかに各キャピラリサンプルチューブ３２０をモニター位置（キャピラリサンプルチューブ３２０Ａであらわされる位置）に次々に定置させる。単一のキャピラリサンプルチューブの連続モニターのためには、キャピラリサンプルチューブをモニター位置に保持し、その間データが２００ｍｓｅｃごとに得られ、公知の方法によって平均化される。時間、温度及び蛍光の好ましくは２つのチャンネルが、コンピュータ３６８と連結するモニター３６８Ｂによって、蛍光  対  サイクル数及び蛍光  対  温度のプロットとして連続的にあらわされる。
カルーセル３２２は、最大蛍光及びシグナルが得られる場所に位置しなければならない。キャピラリサンプルチューブ３２０Ａのような単一キャピラリサンプルチューブをモニターするとき、シグナルは２００ｍｓｅｃごとに受け取られ、積分時間定数は光電子増倍管３６２Ａまたは３６２Ｂ、またはその両方に５０ｍｓｅｃで設定される。多数サンプルチューブの場合、時間定数は０．５ｍｓｅｃに設定され、カルーセルを一度回転して、各キャピラリサンプルチューブ３２０が２チャンネルの各々に最大蛍光を提供する正確な場所に置かれる。キャピラリサンプルチューブ３２０Ａを最大蛍光が得られる場所に置いた後、各ＰＭＴ３６２Ａ及び３６２Ｂの感度を調節し、カルーセルを再び回転してカルーセル３２２におけるすべてのキャピラリサンプルチューブ３２０の位置をカウントし、置く。伸長（extension）中、各増幅サイクル後にシグナル蛍光取得のみが所望の場合は、各キャピラリサンプルチューブ３２０を逐次カルーセル３２２のモニター場所に１００ｍｓｅｃにて、置く。カルーセルの連続的回転によって、多数チューブのための連続取得も行うことができる。温度コントロールプログラミングは、シストロニクス（ソルトレークシティー、ユタ州）から供給され、ＢＣＩ５１と呼ばれる８０５１クロスコンパイラとダラス開発システム（これもシストロニクスから供給され、ＤＰＢ２の名称である）とを用いるアイダホテクノロジーから商標ラピッドサイクラーTMとして入手できる市販の高速温度サイクラーを基礎にし、それから改変したものである。
実際、蛍光検出部３００をもつ高速温度サイクラーの温度応答性は、図８Ａ及び８Ｂに開示された本発明の実施形態で得られる応答性に類似しており、図１１Ａの温度  対  時間チャートにあらわされるように２０−３０秒サイクル（１０−１５分に３０サイクル）を可能にする。（図１１Ａは一つの好ましい温度プロフィールの数サイクルを示す）。増幅中に２本鎖特異的蛍光染料が存在するとき、より多く２本鎖生成物が作られるにつれて、一般的に蛍光は増加する。ヒグチ（R.Higuchi）、ドリンジャー（G.Dollinger）、ウェルシュ（P.S.Walsh）、グリフィス（R.Griffith）、１９９２、「特異的ＤＮＡ配列の同時増幅及び検出（Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences）」Bio/Technology、１０巻、４１３−４１７ページを参照。
その上、例えば臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩなどの２本鎖特異的染料を増幅の一般的インジケータとして用いることができることも理解される。ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩ染料は、多くの用途において臭化エチジウムより好ましい。それはフルオレセインに近い最大励起を有し、ＤＮＡに関して臭化エチジウムの可視励起よりもより強いシグナルを提供することが多いためである。
蛍光は温度にも依存する。温度は、蛍光を一定の伸長温度において１サイクル１回と考えることによって、普通は除去される温度サイクル中の交絡効果である。しかし、温度、時間及び蛍光が高速サイクル増幅中２００ｍｓｅｃごとに得られるならば、三次元らせんが図１２に示すように、モニター３６８Ｂ上にあらわれる。図１２に示される三次元プロットは、温度  対  時間の二次元プロットとして図１２Ａに投影され、蛍光  対  温度の二次元プロットとして図１２Ｂに投影され、蛍光  対  温度として図１２Ｃに投影される。図１２Ａの温度  対  時間の投影は各サイクルを反復し、図１１Ａに示されるものと実質上同じ情報を与える。蛍光は温度によって逆に変化するから、初期サイクルで図１２Ｂに示される蛍光  対  時間の投影は、温度  対  時間プロットの目盛りつき鏡像である。生成物が蓄積するにつれて、蛍光は２本鎖生成物が存在するすべての温度で増加する。しかし変性温度では、１本鎖ＤＮＡのみが存在するために、蛍光はベースラインに戻る。
図１２Ｃに示される蛍光  対  温度の投影は時間軸を排除し、ＤＮＡ増幅中の鎖状態が温度に依存することを示す。図１２Ｃに示される蛍光  対  温度の投影は、Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡの１８０塩基対断片のものである。
もう一つの蛍光  対  温度の投影を図１３に示す。図１３に示される投影はヒトβ−グロビンＤＮＡの５３６塩基対断片のものである。図１３に示される初期サイクルは、低温における蛍光の非直線性増加に関して同一であるようにみえる。増幅が進むにつれて、その後のサイクルはアニーリング及び変性温度間の顕著なヒステリシスを示す上昇ループとしてあらわれる。すなわち加熱中に認められる蛍光は冷却中に認められる蛍光より大きい。サンプルを加熱するとき、蛍光は、変性が起きる（蛍光の急激な低下としてあらわれる）までは高い。図１３に見られるように、サンプルが変性温度からアニーリング温度に冷やされると、２本鎖シグナルは急速に増加する。やはり図１３に見られるように、蛍光は伸長中増加し続け、その間温度は一定に保たれる。
２本鎖特異的染料は本発明の種々の態様にしたがって用いることができる。ＰＣＲ生成物の鎖状態を、ｄｓＤＮＡの存在下で蛍光を発する染料で追跡することができる。増幅中にＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩが存在するとき、さらにｄｓＤＮＡの生成につれて蛍光は増加する。しかし温度サイクルは交絡効果をもたらす。なぜならば図２６Ａ及び２６Ｂに示すように蛍光は温度に逆比例するからである。生成物が蓄積するにつれて、変性温度の場合を除いて蛍光は増加する。変性温度では蛍光は図１２Ｃに示すようにベースラインに戻る。
蛍光検出部３００をもつ高速温度サイクラーを用いて多数のサンプルをＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩを有する各サイクルごとに１回、モニターするとき、図１４にあらわされるように、１０7−１０8の最初のテンプレート濃度範囲が識別される。図１４Ａは、図１４の異なるプロットに付けられた記号の説明、及びその後の図の異なる最初のテンプレートコピー数の説明である。データを、各キャピラリサンプルチューブ３２０の最大蛍光パーセントとして標準化するとき、１００の最初のコピーは１０のコピーとは明らかに区別される。しかし１コピーと１０コピーとの差はわずかであり、キャピラリサンプルチューブ３２０あたり平均ゼロ及び平均１コピーとの間には差は認められない。
２本鎖染料は増幅プライマーに固有の特異性に依存する。当業者には明らかなように、高サイクル数における非特異的増幅は、検出感度を約１００の最初のテンプレートコピーに制限し得る（図１４を参照）。本発明によって教示される高速サイクルでは、増幅特異性がさらに改善され、全体的なＤＮＡ増幅性能もさらに改善される。
配列特異的プローブを用いる定量は、２本鎖ＤＮＡ染料と類似の動的範囲を有するが、図１５Ａ及び１５Ｂのプロットに示されるように１個の最初のテンプレートコピーさえ、陰性対照と区別するようにみえる。
低コピー数検出及び定量が必要なときは、シグナル発生のための雑種化を必要とする蛍光プローブによって特異性が追加される。図１５によって示されるように、二重標識エクソヌクレアーゼプローブの切断は、単一テンプレートコピーを陰性対照から区別できる一つの方法である。図１５は、図１４Ａに記載された説明によって、異なる初期テンプレートコピー数ごとに、蛍光比  対  サイクル数のプロットを示したものである。
５’−エクソヌクレアーゼプローブによるシグナル発生はＤＮＡ合成に依存するのみならず、二重標識プローブの蛍光体間の雑種化及び加水分解を必要とする。この加水分解は発光消滅を減らし、ローダミンの放射に対するフルオレセインの蛍光比は増加する。この方法に関するこれ以上の情報に関しては下記を参照されたい。リー（L.G.Lee）、コネル（C.R.Connell）及びブロック（W.Bloch）、１９９３、「蛍光発生プローブに関するニック−トランスレーションＰＣＲによる対立遺伝子識別（Alleic Discrimination by Nick-translation PCR with Fluorogenic Probes）」、Nucl.Acids Res.、２１巻、３７６１−３７６６ページ。または、リヴァク（Livac、K.J.）、フルード（S.J.A.Flood）、マルマロ（J.Marmaro）、ギウスチ（W.Giusti）及びディッツ（K.Deetz）、１９９５、「蛍光染料を対側末端に有するオリゴヌクレオチドはＰＣＲ生成物及び核酸雑種化の検出に有用な発光消滅したプローブシステムを提供する（Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Opposite Ends Provide a Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Product and Nucleic Acid Hybridization）」、PCR Meth.Appl.、４巻、３５７−３６２ページ。
図２５はフルオレセイン及びローダミン標識の間に５個の介在塩基を有するプローブからの蛍光ＰＣＲの結果を示す。図１１の蛍光検出部３００を有する高速温度サイクラーを用い、４５サイクル増幅が２０分間で完了した。１サイクル１回の蛍光比をモニターすることによって、最初のテンプレート濃度の１０9倍の範囲を見分けることができた。増幅曲線は最初のテンプレート濃度の１０倍変化ごとに約３−４サイクル、シフトする。
低コピー数が増幅するとき最終蛍光シグナルは減少する（おそらく低下する増幅効率のため）とはいえ、ゼロと１００コピーとの間の定量は容易にできる。エクソヌクレアーゼプローブによって生じるシグナルは累積的で、生成物濃度には間接的に関係するに過ぎない。そのため蛍光シグナルは生成物量がプラトーに達した後も増加し続ける。本明細書に含まれる情報を用いて、当業者は増幅効率及び切断をコントロールする適切な標準を作成し、絶対的定量を行うことができる。
５’−エクソヌクレアーゼプローブの蛍光  対  温度のプロットから、プローブの加水分解がシグナル発生のメカニズムであることが確認される。図１６には、二温度サイクルの蛍光  対  温度プロットをβ−アクチンエクソヌクレアーゼプローブで示す。各サイクルにおいて、蛍光比は温度と共に直線的に変化し、ヒステリシスは、あったとしてもごくわずかである。プローブの加水分解が起きるアニーリング／伸長期中は、シグナルは各サイクルで増加する。フルオレセイン及びローダミンの蛍光は両方共、温度増加と共に減少するとはいえ（データは図には示されていない）、変化率はローダミンの方が大きく、結果として温度上昇と共に比は増加する。温度非依存性の雑種化効果は５’−エクソヌクレアーゼプローブで明らかである。
これに対して、蛍光シグナルが雑種化のみに依存するとき、蛍光比  対  温度のプロットは、図１７にプロットされているように、二温度サイクル中のヒステリシスに関して異なるパターンを示す。図１７のプロットは、存在する２つの隣接した雑種化プローブ、３’をフルオレセインで標識した上流プローブ及び５’をＣｙ５TMで標識した下流プローブを用いて得られる結果をあらわす。これらのプローブは１塩基対ギャップによって分離されている。反応のアニーリング／伸長期中、これらのプローブは雑種化し、その結果生成物が蓄積し、Ｃｙ５TM対フルオレセインの蛍光比は増加する。生成物変性温度まで加熱中に、プローブは６５℃ないし７５℃の間で分解し、蛍光比はバックグラウンドレベルに戻る。雑種化中の蛍光比の変化は、共鳴エネルギー伝達からのＣｙ５TM蛍光の増加によるところが大きい。雑種化の温度依存性を利用して溶融曲線のシフトによる突然変異を検出することができる。隣接する雑種化プローブも図１５Ｂに見られるように、定量のために非常に有用である。
上記の議論から、ＤＮＡ増幅中の蛍光モニタリングは驚くべき強力な分析法であることが理解されるだろう。蛍光検出部３００を備えた高速温度サイクラーを用いて、生産的、費用効果的実時間モニタリング、配列特異的検出、及び定量が、存在する最初のテンプレートコピー数に応じて、５ないし２０分間で実現される。
さらに、図１１−１７に示されるシステム及び結果は、蛍光染料を用いる生物学的反応の連続モニタリングに特に適する。例えば、正確な温度コントロール及び２本鎖特異的染料を用いて、生成物の純度を溶融曲線から推定できる。本発明によってもたらされる高速温度コントロールを用いて、絶対的生成物濃度がリアニーリング動力学によって決定できる。本発明は有利なことに、先行技術では得られない高速温度変化及び厳密なサンプル内温度均一性を提供する。先行技術とは異なり、本発明は容量に対する表面積比が高いサンプル容器を用い（例えば図１１の好適キャピラリサンプルチューブ３２０を用いる）、サンプル温度を、他の方法では得られない程速やかにコントロールする熱伝達媒体として空気を用いる。例えば、本発明のサンプル容器中のサンプルを処理するときに得られるサンプル温度  対  時間のプロットは、変性及びアニーリング温度で鋭いスパイクを示す（速やかな温度反応を示す）。これはサンプルすべてが熱平衡に達するために数秒を必要とする先行技術の円錐形プラスチックチューブの場合とは異なる。その上、本発明のサンプル容器は、サンプル容器としてエッチングしたシリコンまたはガラスチップを用いるのに比べてすぐれた結果を与える。なぜならば本発明の熱サイクル時間及び熱均質性が、そのような他の構造を用いて可能になる熱サイクル時間及び熱均質性よりもすぐれているからである。
本発明を用いることにより、これまでほとんど理解されなかったＤＮＡ増幅の多くの面が認識される。例えば、生成物変性は１秒以内におきるが、先行技術では変性に１０秒ないし１分かかる。本発明により２本鎖染料で実時間蛍光をモニターすることによって生成物の溶融を観察すると（図１２及び１３参照）、より短い変性時間の使用が非常に効果的であることがわかる。別の例として、公知の「プラトー効果」の多くの原因が提案されているが、他と区別するために使用できるデータはほとんどない。図１３に示すように、生成物リアニーリングは非常に速い。実際、その後の増幅サイクル中、生成物の大部分は、プライマーアニーリング温度に達する前の冷却中、各サイクルでリアニーリングする。これは本発明により行われる５−１０℃／秒の冷却速度でおきる。より緩徐な、先行技術の時間サイクラーでおきる生成物リアニーリングはさらに大きくなるだろう。なぜならば変性及びアニーリング温度間の移行のためにより多くの時間が必要だからである。この不都合な効果は生成物収率を制限し、この技術における「プラトー効果」の主原因である。
さらに、本発明は商売上の用途に用いることができ、高速サイクル増幅中の蛍光を連続モニターする安価な機器を提供する。本発明の熱サイクラーはわずか１０ないし２０分でＤＮＡ増幅を行うことができ、本発明の光学的検出部品は１、２、３またはそれ以上の蛍光体を識別する。本発明の好適実施形態は多数の個々のサンプル、例えば２４サンプル（図１１のキャピラリサンプルチューブ３２０）を数秒に１回、好ましくは１秒で１回、より好ましくは１秒に１０回もモニターする。
公知の９６個の井戸を有する装置及びキャピラリサンプルチューブ３２０を用いて処理し、その後、熱サイクル及び分析のために、本発明の好適実施形態の一つ、例えば蛍光検出部（図１１の３００）を備えた高速温度サイクラー、に装填するためのサンプルを調製することも本発明の範囲内である。
本発明の好適実施形態が例えばＤＮＡ増幅などの生物学的プロセスの、プロセス進行中における実時間コントロール及び最適化のために、蛍光フィードバックを利用することが好都合である。例えば、本明細書に開示した好適実施形態により、検出される蛍光を用いて温度サイクルをコントロールする。ここに開示される本発明の実施形態を用い、ｄｓＤＮＡ特異的染料による好適連続モニタリング法を用いて、検出された蛍光が増加しなくなった後の各熱サイクルで伸長は打ち切られるだろう。さらに本発明により、生成物が完全に溶融するまでにのみ、温度を高めることにより、変性条件もコントロールされる。さらに、本発明により、フルオレセイン及びＣｙ５−標識オリゴヌクレオチド間の共鳴エネルギー伝達によってプライマーアニーリングをモニターする。さらに、本発明を用いて、あらかじめ決めた生成物量が生成した後、サンプルの温度サイクルが自動的に打ち切られる。
本発明により、また本発明の装置を用いて可能になるように、最小のアニーリング及び変性時間で高速温度サイクルを行うことにより、定量的ＰＣＲは改善され、対立遺伝子特異的増幅の識別が高まる。サイクル配列決定のための高速サイクルは配列決定のあいまいさを減らし、ジヌクレオチド反復増幅における「shadow banding」を最小にする。本発明によると、３５ｋｂまでの長いＰＣＲでは、サンプルを高い変性温度にできるだけさらさないようにすると収量は改良される。
ＰＣＲを３種類の反応、すなわち変性、アニーリング、伸長（その各々が３つの異なる温度でおきる）として処理するこれまでのＰＣＲのアプローチに対して、本発明の態様により、ＰＣＲのための動力学的例が重要な改善をモータらす。ＰＣＲのための動力学的例（図１８Ｂに示される）を用いると、温度  対  時間曲線は重複する諸反応の連続的移行からなる。本発明の方法及び装置は、動力学的例の下でＰＣＲを行う場合に特に効率的である。図１８Ｃはアニーリング温度５５℃近辺における異なる時間／温度プロフィールをあらわすグラフである。図１８Ｃでは、実線が中心に位置する「スパイク」を示す。これは１０μｌサンプルの反応温度をあらわす。これに対して図１８Ｃの短い及び長い線分であらわされる曲線はヒートブロック機器を用いて得たサンプルの温度反応を示す。図１８Ｃからわかるように、本発明の実施形態はアニーリング部分「スパイク」を生じる。これは一般的技術による温度の「プラトー」に比べ、ここに述べた利点をもっている。
検出のために用いるこれまでに提供された機器類は多くの欠点をもっていた。本明細書に記載される本発明のシステムによって、これまでに利用された５ないし１０倍も遅い機器に比較して、速やかで正確な温度サイクルが得られる。やはり本発明のシステムによってもたらされる連続蛍光モニタリングによって、雑種化の温度依存性を辿ることができる。温度サイクル中の雑種化を辿ることによって、必要なプローブ及び／またはスペクトルカラーの数を最小にすることができる。すなわち種々の生成物及び突然変異をそれらの動力学的溶融特性によって検出でき、検出すべき各ＤＮＡ種ごとに異なる蛍光体標識プローブを合成するという面倒なことをせずにすむ。
最も費用効果的な本発明の実施形態を提供するために、キセノンアーク光源またはレーザーの代わりに、高強度発光ダイオードを用いてサンプルを照射する。また、光ダイオードをサンプル検出のために用いる。加熱封止を必要としない９６個の井戸を有するフォーマットでサンプルをガラスキャピラリサンプルチューブ、または複合ガラス／プラスチックのサンプル容器（図２１Ａ−Ｄ）に装填する。本発明ではこうして実時間蛍光分析を費用効率的に行うことができる。温度サイクルの実時間蛍光コントロールは増幅の質を改善する。例えば、もしもサンプル温度が、変性がおきるまでだけに増加するならば、生成物が高温にさらされる時間は最小になる。この結果、生成物及び酵素分解は制限されて収率は高まり、高溶融温度における生成物増幅を制限することによって特異性は増す。
次に図１９を参照されたい。これは単一サンプルの連続モニタリングのために構成された本発明のもう一つの好適実施形態の線図である。しかし、図１９及び２０に示される構造も多数のサンプルを自動的に処理するシステム、例えば図１１に示す装置などに組み込むことができることは当然である。これをここに簡単に説明する。図１９の実施形態では、１個のサンプルホルダー４０２が、温度制御された気流と直線光路との交差点におかれた支持ブラケット４０４に入れられる。サンプルホルダー４０２は、キャピラリチューブの所望特性を多くもつチューブ４０２Ａを含む。本発明により、異なる形態のキャピラリチューブを用いることができ、チューブ４０２Ａは好ましくは矩形の横断面を有する。生物学的サンプルは好ましくは４０２Ｂで示されるように、チューブ４０２Ａの底端部に保持される。サンプルホルダー４０２にはキャップ４０２Ｃも取り付けるのが好ましい。
次に図１９Ａ−１９Ｅを参照されたい。これはサンプル容器の種々の形がサンプルそのものの温度反応に与える影響を比較するものである。図１９Ｅに示される温度−時間曲線は、それぞれ図１９Ａ−Ｃに示されるサンプル容器の形を用いて得られる反応に対応する。図１９Ｄは、本発明に使用するにはあまり好ましくないサンプル容器を示し、比較のために含めるものである。ここに示される情報を用いて、当業者は本発明の特定の用途のために最適のサンプル容器に到達することができる。図１９Ａ−Ｄに示されるサンプル容器形の各々に関するその他の情報を下に示す。
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図１９の装置において、励起放射線源４１８、好ましくはＬＥＤ、最も好ましくはブルーＬＥＤ、が取り付けられ、サンプルホルダー４０２に照射する。励起放射線源４１８によって発射される放射線は非球面集束レンズ４２０及び励起バンドパスフィルター４２２を通り、放射線はサンプルホルダー４０２上に焦点を結ぶ。
図１９に示される光学的部品は好ましくは光学的ハウジング４１２に入っている。ハウジング４０６も備え付けられている。ファン４０８が取り付けられ、空気を、空気ダクト４１４から、サンプルブラケット４０４に入れられているサンプルホルダー４０２上へと動かす。温度ユニット４１０が気流路に置かれ、サンプルホルダー４０４上を通過する空気を加熱するか、または加熱し冷却する。ノズル４１６は空気を効果的にサンプルホルダー４０４上に向ける。
サンプルによって発せられる放射は２個以上の非球面レンズ４２０及び放射バンドパスフィルター４２４を通過し、光検出器４２６（好ましくは光ダイオードである）によって受け取られる。当業者はここに示される情報を用いて、図１９に示される装置を好都合に作動させるために必要なコントロール部品を容易に得ることができる。
図１９Ｆ及び１９Ｇは、矩形キャピラリチューブ４０３Ａを用いる一つの好適サンプル容器４０３のそれぞれ側面図及び端面図である。キャピラリチューブ４０３Ａはヴィトロダイナミックス社から得られる１ｍｍ×３ｍｍ×５０ｍｍの寸法のものであることが好ましい。第一のキャップメンバー４０３Ｂ及び第二のキャップメンバー４０３Ｃはスクリュー４０３Ｄによって一つに固定され、スクリュー４０３Ｄもキャピラリチューブ４０３Ａのホルダーとして機能する。
図１９Ｈ及び１９Ｉは、中に含まれるサンプルの蛍光を検出するとき、矩形キャピラリチューブ４０３Ａのとり得る２方向をそれぞれ示す。図１９Ｈは、矩形キャピラリチューブ４０３Ａが、その端が励起及び検出光学系の光軸と並ぶような方向に置かれていることを示す（「端励起及び検出」）。図１９Ｉは、矩形キャピラリチューブ４０３Ａが、その面が励起及び検出光学系の光軸に並ぶような方向に置かれていることを示す（「面励起及び検出））。驚くべきことに、図１９Ｈに示される端検出方向から得られる蛍光シグナルは図１９Ｉに示される面検出方向で得られるものよりも約３倍ないし約５倍大きい。図１９Ｈに示される端検出方向を用いる好ましい特性は、少なくとも一部は、キャピラリチューブ４０３Ａにあらわれる総内部反射による。これは蛍光シグナルをキャピラリチューブ４０３Ａの端部に集める。
図２０は本発明のもう一つの態様による他の好適実施形態の光学的部品を示す。図２０に示される光学的部品は図２１に示される熱サイクル及びサンプル操作構造に組み込まれるのが好ましいが（これについては後でより詳細に記述する）、多くの異なる装置に用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を受けるサンプルのモニター（最も好ましくは連続モニター）を行うこともできる。
これまでにここに開示した装置とは異なり、図２０及び２１の実施形態では光学的励起及び検出路が組み合わせられている。この場合直線路というよりむしろエピ蛍光路と呼ぶことにする。図２０及び２１の実施形態において、励起及び発せられる放射線は同じ光路の、キャピラリチューブと、励起路に用いるダイクロイック要素との間を通る。キャピラリチューブは、励起及び放射強度両方を増加するために開発されたキャピラリサンプルチューブの、長さに沿ってあらわれる総内部反射（「ライトパイピング」とも言われる）によって、図２０及び図２１の実施形態に特に適用するようになっている。
図２０及び２１の実施形態において、最大ライトパイピングを提供するために、光軸はキャピラリチューブの長さに平衡であり（近軸）、キャピラリチューブの先端が焦点に位置する。検出するサンプルの屈折率が約１．３３と仮定すると、発射される光の約１２．３％が先端にまで導かれる。遠心分離作用を用いてサンプルをキャピラリチューブの先端に動かすことができることは当然である。
図２２Ａは、キャピラリチューブの先端で蛍光を検出するときのライトパイピングの有効性を図にしたものであり、キャピラリサンプル容器の側面（白丸）よりも先端（黒ひし形）を見ることによってシグナル強度が１０倍増加することを示す。また図２２Ｂに示されるように、２種類のサイズをもち、ＳＹＢＲ▲Ｒ▼グリーンＩで染色したｄｓＤＮＡを異なる長さまで充填したキャピラリサンプルチューブを用いて得られた結果がプロットされている。図２２Ａ及び２２Ｂから推測できるように、より多くのサンプルをチューブに加えるにつれて観察されるエピ蛍光は増加する。ただし蛍光効率は減少する。
キャピラリからの放射の光学特性を、フルオレセイン溶液を充填したキャピラリの蛍光を４７０ｎｍで刺激することによって測定した。キャピラリの尖っていない端からの放射はキャピラリの面全体に均一であるように見えた。これは放射が一過性波の蛍光の結果である場合に期待されたように、ガラスへの集中とは異なっている。
図２０にあらわされる光学的部品はキャピラリ先端の近軸エピ蛍光照射を行う。これは、それ以外では得られない好都合な結果をモータらす。図２０では励起放射線源４６８は好ましくはブルーＬＥＤである。例えば産業界ではスーパーブライトＬＥＤとして公知のもので、ＬＥＤトロニクスから入手できるものなどである。放射された蛍光シグナルは、光検出器４６６Ａ及び４６６Ｂによって捕捉される。励起放射線源４６８及び光検出器４６６Ａ及び４６６Ｂは取り付け板４６８上に支持される。取り付け板は必要な回路も含み、フィルターを光検出器４６６Ａ及び４６６Ｂと共に一体化している。０．５インチ干渉フィルターを高性能シリコン光ダイオードと共にＴＯ５パッケージ内に含む好適取り付け板は、イーリングエレクトロオプチクスから入手できる。励起及び検出部品は関連エレクトロニクスと共に取り付け板４６８に直接支持される。光学的部品は直径が好ましくは１．０インチ以下であるのが好ましい。視準レンズ４５４、２枚のダイクロイックフィルター４５６Ａ及び４５６Ｂ、鏡４５８、干渉フィルター４６０Ａ−Ｃ、及び非球面焦点レンズ４６２Ａ−Ｃが放射線をサンプルに向かって、及びサンプルから離れる方に方向づける。
図２０に示される本発明の実施形態では、分析を行うとき２種類の色／波長のみを用いるが、当業者はその実施形態を３種類またはそれ以上の色分析を行えるように容易に改変することができる。３種類以上の色の分析を行うために、図２０に示される装置に付加的ダイクロイックフィルター及び光検出器を備えることができる。その上、産業界で利用されている線型光検出器アレーに諸波長を同時に分離して、多色取得を行うことも本発明の範囲内である。本発明により線型光検出器アレーを用いるとき、プリズムまたは回折格子をレンズ及び光検出器アレーまたはＣＣＤと協働して用い、多数の波長を検出することが好ましい。産業界で使用できる一つの好適線型光検出器アレーは各１０−２０ｎｍの波長の１５−３０個のビン（区分け）を５００ないし８００ｎｍ間に集める。光学的部品の種々の構成、例えば大部分のモノクロメータに用いる格子のためのリットロー（Littrow）自動視準構成などは、本明細書に示される情報を用いて集光効率、スペクトル分析及び立体的条件において最適に調節することができる。図２１に示す自動熱サイクル装置に組み込まれた図２０の装置をここでより詳細に説明する。
図２１は、本発明のもう一つの好適な実施形態４００の略図である。これは高速温度サイクル部品、サンプル操作部品、及び図２０に示される光学的部品を含み、これらすべてが一緒に作動してサンプル容器の先端で蛍光検出を行う（エピ蛍光）。図２１に示されるエピ蛍光検出部４００を有する高速温度サイクラーは特に好都合である。記載されたこの実施形態は本発明の例に過ぎず、当業者はここに請求する発明を実施するために多くの異なる装置で達成し得ることは当然である。
図２１に示す実施形態において、空気は開口４７０から取り入れられ、一般には線４７２によって示される流路に従う。空気温度、したがってプラスチック／ガラスのサンプル容器４５０の温度は好ましくはレヒート社（Reheat,Inc.）から入手できる４００ワット加熱カートリッジ４７４を用いて調節するのが好ましい。加熱カートリッジ４７４は中心ダクト４７６のなかに置かれる。ファン４９８が配置され、空気を指示された路４７２に移動させる。ファンは軸４９６及びモータ４９４を介して駆動される。モータ４９４は好ましくはエスカップ社から提供され、１５，０００の最大ｒｐｍを有するＤＣ希土類ブラシモータである。プラスチック／ガラスのサンプルチューブ４５０を加熱するとき、加熱カートリッジは比例的にコントロールされ、ファンが比較的低速度で作動し（１２ｖｏｌｔｓ、１．４ａｍｐｓ）、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０のすべての温度を均一にする。プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０を冷やすときは、加熱カートリッジ４７４を作動させず、ファンを高速度で作動する（例えば上記の好適モータでは２７ｖｏｌｔｓ、１．４ａｍｐｓをかけることによって最高速度が得られる）。ファン４９８は空気を開口４７０に送り、排出口４７１から外に出す。
エピ蛍光検出部４００を有する好適高速温度サイクラーでは、２４個のプラスチック／ガラスのサンプル容器４５０（それらのうちの２個が図２１に示されている）を加熱カートリッジ４７４及び中心ダクト４７６の周囲に対称的に配置する。プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０はスリーブ４５１に入れられる。スリーブは（それらのオフセット構造によって）円形カルーセル４８０における個々のプラスチック／ガラスのサンプル容器４５０の位置を正確に合わせることができる。スリーブ４５１は好ましくは真鍮から作られる。スリーブ４５１の軸外し（off-axis）構造のため、エピ蛍光検出部４００を有する高速温度サイクラーの作製時には、各スリーブ４５１を、ガラス／プラスチックのサンプル容器４５０の先端が図２１に示される光学的焦点に存在するように横方向にも長手方向にも正確に合わせることができるように配置することができる。
カルーセル４８０はハウジング４９０の上方のベアリング４８２上に支承される。カルーセル４８０は、軸４８６を介してモータ４８８に連結した駆動歯車４８４を備えたステッパモータ４８８によって位置決めされる。ステッパモータ４８８はミクロステップ（microstep）され（ニューイングランドアフィリエイテドテクノロジーズからのコントローラー（図２１には明確には示されていない）を用いる）、カルーセル４８０の一回転につき１０，０００以上のステップを生じ、各プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０を正確に置くことができる。ハウジング４９０の内部には、好ましくは既述の絶縁材料と同様の絶縁材料４９２が取り付けられる。隔壁４７６は排出口４７１を形成し、周囲光を遮断するようにはたらく。
図２１Ａ−Ｄはプラスチック／ガラスのサンプル容器４５０のその他の詳細な図であり、これを用いる好適方法の説明のためのものである。プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０は一端が閉じているキャピラリチューブ部分４５０Ｂを含む。キャピラリチューブ部分４５０Ｂは多くの異なる構成をとることができ、キャピラリチューブ型構造のみに限定されるものではない。しかし、サンプル温度の均一性及び高速熱サイクルを促進するためには、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０に保持される液量は１ｍｌより多くないことが好ましい。例えば、キャピラリチューブ部分４５０Ｂを作る材料は熱伝導度が、
式      ｛（cal cm）／（cm2s degree C）｝×１０
に従い、約２０から約３５の範囲であることが好ましい。異なるガラスの熱伝導度に関するその他の情報はウィスト（R.C.Weast）及びアッスル（M.J.Astle）の「化学及び物理ハンドブック（Handbook of Chemistry and Physics）」、Ｅ−６ページ、１９８２、ＣＲＣPress）から得られ、本願に引用して援用する。プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０には貯蔵器部分４５０Ｃも備えられ、それは好ましくは適切なプラスチックで作られ、キャピラリチューブ部分４５０Ｂの開放端に結合する。貯蔵器部分には多くの異なる材料を使用できるが、プラスチック材料が漏斗状に形成され、キャピラリチューブ部分４５０Ｂに取り付けられるのが好ましい。
サンプル（Ｓ）はピペット（Ｐ）または他の適切な器具を用いて、用手法かまたは自動プロセスを用いて複合プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０に装填される。サンプルの容量は約０．０１μｌから約１０，０００μｌまでの範囲、より好ましくは０．０１μｌから約１００μｌまでの範囲、最も好ましくは約０．０１μｌから約１０μｌの範囲で、約５μｌが最も好適な容量である。ひとたびサンプルを各プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０に加えたならば、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０は低速で遠心分離し、そのサンプルをキャピラリ部分４５０Ｂの閉鎖端の先端に集める。サンプルは図２１Ｂに最もよく示されるように０．２−２．０ｃｍの液柱４５０Ａを形成する。それから図２１Ｃに最もよく示されるように、貯蔵器部分４５０Ｃに栓４５０Ｄ（これは好ましくはプラスチックプラグのような形態である）をして、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０を封止し、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０をエピ蛍光検出部４００を備えた高速温度サイクルのスリーブ４５１に入れる。異なる構造を与えてキャピラリチューブ部分４５０Ｂを封止することも本発明の目的の範囲内である。
ガラス／プラスチック サンプル容器４５０のキャピラリチューブ部分４５０Ｂは好ましくは内径０．８ｍｍ、外径１．０ｍｍを有する、産業界で入手し得るガラスキャピラリチューブで、一端は閉鎖あるいは封止され、他端は開いて、プラスチック貯蔵器４５０Ｃを受け入れる。ガラス／プラスチック サンプル容器４５０は容易かつ経済的に作られる。キャピラリチューブ部分４５０Ｂの先端４５０Ｅの形は光学的効率のために最適化されている。平らな先端も、種々の外側湾曲及び内側湾曲の先端もすべて本発明の目的の範囲内である。当業者は最も効率的な先端の形を選択することができる。
図２１Ａ−Ｄからわかるように、プラスチック製装填及び封止構造をキャピラリチューブに加えることは大きい利点となり、ガラスキャピラリチューブの効率的使用を可能にし、一方それらの所望な熱特性を維持する。サンプルをプラスチック／ガラスのサンプル容器４５０に加え、そのサンプルを９６−ウェル フォーマットで遠心分離にかけることは本発明の目的の範囲内であることは当然である。更に、プラスチック／ガラスのサンプル容器を個々にエピ蛍光検出部４００を備えた高速温度サイクルに装填することも本発明の目的の範囲内であり、プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０を９６ウェルフォーマットまたは他のいくつかのフォーマットで装填する本発明の実施形態を提供することも本発明の目的の範囲内である。
好都合なことに、複合プラスチック／ガラスのサンプル容器４５０は便利で安価なサンプルホルダーとなる。図２１の実施形態では、蛍光を単一サンプルから毎秒１ないし１０回受け取るのが好適である。多数のサンプルから好適速度で蛍光を受け取るとき、サンプルはカルーセル４８０の回転によって比較的速やかに正しい場所に移動しなければならない。好適ステッパモータ４８８及び適切なコントロール装置（これは本明細所に含まれる情報を用いて選択できる）を用いることにより２４サンプルの各々を図２１に示されるモニター位置に速やかにかつ正確に移動できる。
各サンプルからの蛍光シグナルを１００ｍｓｅｃ取得するとき、シグナル変動（再配置の場合の）は＜１％である。シグナル取得時間を減らし、移動速度を高め、反復サンプリングからの変動係数を観察することも本発明の目的の範囲内であることは当然である。２４サンプルを処理するとき、且つカルーセルが毎秒１ないし１０回転の一定速度で停止することなく回転するとき、各サンプルの励起及び検出は０．３７−３．７ｍｓｅｃである。
ここに示す情報を用いて、当業者は蛍光シグナルをソフトウェアによって積分するか、ハードウェアによって積分するかどちらかを選択できる。好適な一実施形態において、エピ蛍光検出部４００をもつ高速温度サイクルと組み合わせてグラフ式プログラミング言語、例えば産産業界ではLabView（ナショナルインスツルメント）として知られているものなど、が用いられる。それはピーク検出及び積分のためのサブプログラムを有する。もう一つの好適実施形態では、積分は変動する積分時間を有するハードウェア（ユーザー調節可能の感度コントロール）で、シグナルがアナログ−デジタル変換のための最適レベルとなるように行われる。
図２１に示されるエピ蛍光検出部４００を有する高速温度サイクルを用いて、反応の進行中にサンプルを連続モニターすることにより、アニーリング、伸長、及び変性の観察に基づいて増幅中の温度サイクル要求数を決めることができる。これは、増幅開始前にすべてのサイクルパラメーターを決めてプログラミングする先行技術とは対照的である。先行技術では、最も低い融点を有するプライマーに匹敵する相補的オリゴヌクレオチドを用いて、アニーリング効率を初期サイクル中に制御する。多くの場合、伸長及び変性は十分な生成物が作られた後期サイクル中にｄｓＤＮＡ染料によってのみモニターすることができる。重要なことは、そのような必要は普通は問題でないということである。なぜならば変性及び伸長条件は、大部分の生成物を増幅するほど十分大目に見られ、最初の増幅からのデータを用いてその後の行程を最適化できるからである。
再び図２１により、ユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００は本明細書中に図１１の実施形態に関して述べた情報を用いて作ることができる。ユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００の好適な一実施形態として、１２ビット多機能入力/出力カードでLabViewプログラミング言語（ナショナルインスツルメントから入手可能）を処理するＰＥＮＴＩＵＭ？マイクロコンピューターがデータ取得及び制御をモータらす。アナログ出力シグナルを用いて光検出器４６６Ａ及び４６６Ｂと結合した増幅器を調節することが好ましい。アナログ入力チャンネルは、熱電対４９９を介してサンプル温度を、並びに光ダイオードによってサンプルから検出される蛍光を測定する。図２１にあらわされるユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００は、励起放射線源４６８、ステッパモータ４８８の方向、加熱カートリッジ４７４、及びファン４９８、のデジタルＩ／Ｏコントロールも行う。
ＰＣＲの連続蛍光モニターにおいて、ｄｓＤＮＡ染料ＳＹＢＲグリーンＩまたは蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含むサンプルを用いて個々の増幅サイクル中に雑種化及び溶融をモニターすることができる。この情報を好適装置においてユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００のために利用して、改善された特別に指定される熱サイクリング条件をモータらすことができる。温度サイクルのための雑種化情報を利用する利点は次のものを含める。
（Ａ）ＰＣＲ生成物の完全変性が各サイクルで確実におき、その間、
過度に高い変性温度への露出を最小にし、それによって増幅生成物及びポリメラーゼの熱による損傷を回避する。
選択する変性温度を最小にすることによって、目的の増幅生成物より高いＴmを有する生成物ができないように、反応特異性を高める。
（Ｂ）各サイクルで生成物の伸長のための時間を適切にすることによって増幅効率を最大にし、その間、
生成物伸長が完全になるために必要な時間より長く許容しないことによって、増幅のために要求される時間量を最小にする。
目的の増幅生成物より長い生成物を排除するように選択することによって反応特異性を高める。
（Ｃ）各サイクルの生成物伸長時間を適切にすることによって増幅効率を最大にし、その間、
生成物伸長が完全になるために必要な時間より長く許容しないことによって、増幅のために要求される時間量を最小にする。
目的の増幅生成物より長い生成物を排除するように選択することによって反応特異性を高める。
これらは生成物の伸長を完全にするために割り当てられた時間より長い時間を必要とするかも知れない。
（Ｄ）最初の熱サイクルは、得られる蛍光レベルまたはその時の増幅効率に依存して変化する。例えば、過剰増幅及び非特異的反応生成物は、熱サイクルの停止によって（その時、効率は或るレベルまで低下する）最小にすることができる。もう一つの例では、蛍光が検出可能になるとき、温度サイクルを改変して溶融曲線を得るためのより遅い温度傾斜（temperature ramps）を開始することができる。これは時間を節約する、なぜならばより遅い傾斜は比較的初期のサイクルでは用いる必要がないからである。その他の所望の変化は本発明のその後の実施で明らかになる。
（Ｅ）ＰＣＲ生成物に対する過剰増幅損傷を最小にし、及び／または過剰増幅前に溶融曲線取得を開始すると、非特異的反応生成物のバックグラウンドは既に増加している。
本発明により、ユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００はあらかじめプログラムした時間／温度セットポイントを辿ることができ、及び／または、好都合なことに、検出された蛍光値を取得でき、それから、受け取った検出蛍光値を使用して１つ以上の反応パラメーターを実時間で変更または調節し、得られた結果を最適化することができる。ここに用いる用語「反応パラメーター」は、反応を制御するための基礎として用いられるあらゆるパラメーターであるが、これに制限されるものではない。このような反応パラメーターは変性温度及び時間、プライマーアニーリング温度及び時間、プローブアニーリング温度及び時間、酵素エクステンション温度及び時間、及びサイクル数を含める。
一般的に反応のコントロールは最初は蛍光データからの反応パラメーター推定値に基づく。元々の蛍光データは、時間の経過につれての蛍光の変化として得られるか（変性の温度特異速度、アニーリング速度、及び伸長速度）、または温度に対する蛍光の変化として（生成物またはプローブＴm）、または増幅程度の変化として（増幅収量及び効率）得られるかのいずれかである。これらの速度、Ｔmｓ、及びそれらの第一及び第二導関数を用いて最適反応パラメーター、例えば変性温度及び時間、プライマーアニーリング温度及び時間、プローブアニーリング温度及び時間、酵素エクステンション温度及び時間、及びサイクル数を決定する。
図２２Ｃの高レベルブロックに描写されているように、作業は、ユーザーインターフェース及びインスツルメントコントロール５００（好ましくはここに示す教示に基づくプログラミングを用いるＩＢＭ互換型コンピューターである）の一部（図２２Ｃのブロック５００Ａ−５００Ｅ）によって行われるものと、エピ蛍光検出部４００をもつ高速温度サイクルの残りの部品（図２２Ｃのブロック５００Ａ、及び５００Ｇ−５００Ｓ）によって行われるものとに分けられる。図２２Ｃのブロック図は単に説明のためのものであって、多くの異なる配置を用いて本発明を実施することができると理解されなければならない。
図２２Ｃに示される装置の長所の一例として、生成物溶融コントロールについて述べる。溶融ピーク蛍光値は目的のＰＣＲ生成物のためにで得られる。そしてベースライン蛍光は、生成物の完全な溶融が見られる温度で、反応混合物を含むサンプルのために得られる。反応の各サイクルはこの蛍光値を標的として用いる。この例で言及するアプローチは、タイムラグを与えて、離れたＰＣコンピューターにその蛍光値を送る要求に応じる二つの行程を用いる。各生成物溶融段階で、蛍光が或る中間値に達するまで温度を高め、それから毎秒約３℃の温度傾斜がかかるように加熱装置に与えるパワーを低下させて、蛍光を分析し、生成物変性が起きている他の部品に送るのに十分な時間を、ＰＣコンピューターが有するようにする。得られる時間／温度プロットを図２２Ｄに示す。図２２Ｄは、増幅生成物濃度の増加につれて、２０サイクル後に溶融温度の特徴的増加がおきることを示す。これは、生成物Ｔmが生成物濃度の関数であるという事実による。
図２２Ｃに示される装置のその他の利点の一例として、生成物アニーリング／伸長について述べる。アニーリング／伸長の組み合わせの温度で時間を延長して保持している間に、サンプルの蛍光をモニターし、この情報を用いて、十分だが過剰ではない時間が生成物伸長のために確実に使われるようにする。蛍光は１０秒間隔でモニターする。そしてもし蛍光があらかじめ決めた比（一般的には１．００ないし１．０５）より増加したならば、アニーリング／伸長段階を続ける。さもなくば次の生成溶融段階を開始する。１０秒の間隔を選択し、アニーリング／伸長の組み合わせの温度で少なくとも２０秒は与えるようにする。
図２２Ｅは増幅生成物濃度の増加するに従い、アニーリング／伸長の組み合わせの温度においてドエル時間が特徴的に増加することを示した蛍光／時間プロットである。これはプライマー濃度及びポリメラーゼが制限的になるにつれて、各サイクルで生成物伸長を完了するためにより多くの時間が必要になるという事実による。
図２２Ｃに示される装置の利点のもう一つの例として、増幅プラトーについて述べる。各アニーリング／伸長の各段階の終わりに、蛍光値を受け取り、且つ保存する。この数値が最低エンド−サイクル蛍光値の１．２倍に増加し、その後ユーザーの設定可能比（一般的には１．００−１．０２）未満のところで増加を停止したとき、熱サイクルは終わる。或いは、溶融曲線告発（accusation）段階は、生成物Ｔmを介し緩徐な毎秒０．１℃ないし０．２℃の温度傾斜に入り、サンプルの蛍光を連続的にモニターすることによって開始される。図２２Ｄに示される生成した蛍光／時間プロットは、２５サイクルの増幅後、サイクルごとの蛍光増加比は１．００未満に低下し、反応は終わることを示す。このアプローチを用いて各サンプルの高分解溶融曲線が得られることが理解できる。サンプルがその増幅プラトーに達すると、そのサンプルのため溶融曲線を得ることができ、もう一つの反応がその増幅プラトーに達するまで、再び規則的温度サイクルが始まる。
図２２Ｅは、蛍光雑種化をモニターするために役立つ温度の時間に対する関係を説明する。生成物溶融曲線は温度が緩徐に上昇して変性に至るまでの間に得られる。変性後の温度を一定温度に速やかに低下させることによって、生成物、プローブ、またはプライマーアニーリングを検出することができる。プローブ溶融曲線は、プローブＴm周辺の温度を徐々に加熱することによって得られる。当業者は図２１に示される装置を容易に使用し、所望ならば実時間で、必要な分析を温度サイクル中に行って、生成物、プローブ及びプライマーの特徴に関するこれまで入手できなかった情報をここに記載したハードウェア及びソフトウェアを用いて得ることができる。
本発明により、生成物の絶対的定量においても有利に生成が行われる。２本鎖ＤＮＡ形成の連続モニターは、リアニーリング速度論による直接的絶対的ＤＮＡ定量を可能にする。サンプル温度は変性温度から速やかに低下し、プライマーアニーリングを阻止するにはまだ十分高いものの、比較的低い温度に維持される。生成物リアニーリング速度はそれから二次反応速度論を辿る。異なる濃度のＤＮＡを試験するとき、リアニーリング曲線の形はＤＮＡ濃度において特徴的である（図２６参照）。与えられたＰＣＲ生成物及び温度で、二次速度常数を測定することができる。速度常数がわかったならば、実験的リアニーリングデータから未知のＤＮＡ濃度を決定することができる。その曲線を、LabViewプログラミング環境（既に説明した）を用いて、実時間の温度サイクル中の非線型最小二乗回帰によってフィットさせることができる。冷却は瞬間的ではなく、そして若干のリアニーリングが一定温度に達する前におきるが、本発明において回帰分析がこれを容認する。その技術は純粋なＰＣＲ生成物を要求するが、これも温度サイクル中に得られる溶融曲線によって確認することができる。リアニーリング曲線による定量は、シグナルレベルには無関係であり、サンプル容量の差によっても影響されない。
図２８は、図２１の実施形態に含まれた構造体の多くを含む本発明の別の実施形態を示す概略図である。図２８の実施形態を簡潔に説明するために、当業者が本発明の実施形態を組立てるために、本願に含まれている情報を容易に活用できるという理解の下で、図２１に示した部品と図２８に示した部品との間の主たる相違のみを説明する。図２７Ａ及び図２８Ｂは、図２８に示した実施形態をそれぞれ、ランモードとロードモードにおいて示す概略断面図である。
図２８の実施形態は、一般に５０２において設計された高速温度サイクラーであり、サンプルから得られる蛍光信号を改善する２つの寸法にサンプル容器を自動的に配置することで、サンプル容器の先端において蛍光を検出する。図２９は、図２８の概略図に示した部品を含む本発明の実施形態の外形を示す透視図である。
図２８及び２９の双方において分かるように、取出し可能な環状サンプルトレー４８３は、３２個のサンプルを保持する。取出し可能な環状サンプルトレー４８３は、高速温度サイクラー５０２内に配置され、モータ４８８により駆動されるカルーセル４８１に係合する。カルーセル４８１が回転するにつれて、ホール効果位置ロケータは、カルーセル４８１を厳密に位置決めするために用いられて、各サンプルは、蛍光測定器アセンブリ４５９の上に厳密に配置される。蛍光測定器アセンブリ４５９は、好ましくは、ＬＥＤソース４５９Ａ、３つのフォトダイオード４５９Ｂ、焦点調節レンズ４５９Ｃ、及びフィルタアセンブリ４５９Ｄを備える。蛍光測定器アセンブリ４５９は、図２０に示されたものと構造及び機能において同様である。
最も有利には、蛍光測定器は、横のステッパモータ４９１により移動されるスライダベアリング４９３に装着される。カルーセル４８１が回転するにつれて、プラスチック／ガラス複合体サンプル容器４５０は、カルーセルの方向に蛍光測定器アセンブリ４５９の上で厳密に配置され、その位置は、ホール効果位置ロケータ４９５を介して装置により記録される一方で、横のステッパモータ４９１は、第二の寸法に調節される蛍光測定器アセンブリ４５９の位置を調節し、その位置は記録される。従って、高速温度サイクラー５０２は、取出し可能な環状サンプルトレー４８３を用いて、装置内に複数のサンプルを改善して配置すると共に、サンプルからの蛍光信号の検出を改善する。
図３０Ａ−３０Ｖにおいて、図２８及び２９に表した高速温度サイクラー５０２の電気部品の好ましい構成を表す詳細な概略図を示した。図３０Ａ−３０Ｖの線図が本発明の特定の態様を実施するための好ましい単なる１つの構成であり、これらの線図が本発明の範囲を制限することを意図するものではないことを理解するべきである。線図を更に明確にするために、業界で一般に用いられる符号をこれらの線図に維持し、以下に示した対応する部品リストにおいて参照する。
0004281877.tif 000004
0004281877.tif 000005
0004281877.tif 000006
0004281877.tif 000007
0004281877.tif 000008
0004281877.tif 000009
図２８、２９及び３０Ａ−３０Ｖの部品に関連して使用されるプログラミングコードの例は、本願に添付した附属書Ｂ、「プログラミングコード」に入れ、本願に引用して援用する。
本発明の別の実施形態によれば、液体サンプル、特に、放射された蛍光の検出により分析されるサンプルで、小容量のサンプル容器を装填するための操作システムが提供される。サンプル容器は、代表的には、１ｍｌ未満の容量を有し、チューブ（すなわち、キャピラリチューブ）もしくはキャピラリ空間を端に沿ってシールされた２つの離れたプレートまたはシートにより形成する「フラットキャピラリ」の形をとりうる。サンプル容器は、代表的には約１ｍｍ、更に代表的には約０．５未満の外表面積に対する容量の比を有する。１ｍｍ未満の内径を有するキャピラリチューブは、０．２５ｍｍ未満の表面積に対する容量の比を有する。本発明により用いられる容器は、好ましくは、光学的に透過性の材料から形成される。好ましい材料は、約４００から約８００ｎｍの範囲の波長を有する光に対して光学的に伝送可能である。こうした材料を使用すると、容器により保持される液体サンプル内で発生する蛍光信号の検出が可能になる。更に、蛍光サンプルから蛍光を分析するために、表面積に対する容量の比が小さい容器を使用すると、全内部反射を高めるゆえに蛍光のより効率的な検出を可能にする。
容量に対する表面積の比が大きい（または逆に、表面積に対する容量の比が小さい）容器は、液体サンプルで装填するのが困難でありうる。有利なことに、本発明のサンプル操作システムは、こうした困難を克服するのに役立つ。１つの実施形態によれば、容量に対する表面積の比が大きく、開放端を有する容器は、容器の開放端上に嵌合するファンネルキャップを形成されて、液体サンプルを容器内に装填するのを容易にする。ファンネルキャップは、第一のサンプル受け口、第二のサンプル移送口及び容器上にファンネルキャップを解放可能に固定する手段を備えて、ファンネルキャップのサンプル移送口及び容器の開放端は整列する。１つの実施形態において、ファンネルキャップはプラスチックまたはゴム構造のものであると共に、サンプル移送口の内径が開放端に近い容器の外径に摩擦係合するように形成される。但し、ファンネルキャップを容器に結合するその他の手段は、当業者に公知であり、接着剤、クランプ及び留め金等の使用を含め、本発明の範囲内である。１つの実施形態において、サンプル操作システムは、ファンネルキャップのサンプル受け口と摩擦密着した密封係合のためのプラグを更に含む。但し、ファンネルの開口を効果的にシールして、装填されたサンプルの汚染または蒸発を防止するいずれの装置または材料も本発明で用いるのに好適である。
有利なことに、本発明の容器は、蛍光体を含むサンプルにおける蛍光の獲得の検出及び効率を高めるための方法に用いることができる。その方法は、光学的に透過性の材料から構成される壁を有すると共に、少なくとも第一及び第二の寸法を有する容量を形成する容器内にサンプルを入れるステップを含む。第一の寸法は、第二の寸法より小さく、容器の外表面積に対する容量の比は１ｍｍより小さい。サンプルから発生した蛍光の捕捉の検出及び効率の向上は、容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿って、蛍光を検出することにより達成される。１つの実施形態において、サンプルの蛍光は、サンプルの蛍光体励起照射により引き起こされる。この場合、サンプルは、容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿って照射される。好ましい実施形態において、蛍光捕捉の最適効率は、蛍光検出軸（エピ蛍光検出）に沿ったサンプルの蛍光体励起照射により達成され、蛍光は、最小表面積を有する容器の壁を通る軸に沿って、好ましくは、容器の底を通る軸に沿って検出される。
１つの実施形態において、生物学的サンプルの蛍光は、温度依存性である。例えば、容器は、核酸配列からなるサンプルを含んでもよく、蛍光実体は、２本鎖特殊染料からなってもよい。サンプルの温度が変性温度に上昇するにつれて、蛍光強度は減少する。変形例において、蛍光実体は、標的核酸配列の隣接領域に対して雑種を作る一対のオリゴヌクレオチドプローブからなってもよい。この場合、前記プローブの一方は、アクセプタ蛍光体で標識され、他方のプローブは、蛍光エネルギー伝達対のドナー蛍光体で標識される。この実施形態において、容器及びサンプルは、蛍光エネルギー伝達対の少なくとも１つの蛍光体の蛍光を監視しながら加熱することができる。
１つの実施形態によれば、容器は、サンプルの熱サイクルを必要とする手順、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による標的核酸配列の増幅において有利に用いることができるキャピラリチューブ及びフラットキャピラリの形をとる。１つの実施形態において、キャピラリ容器は、熱サイクルのために用いられる装置または蛍光検出のために用いられる装置のサンプルホルダー内に挿入されるように形成される。装置のサンプルホルダーは、単一の容器のみを保持してもよく、またはサンプルホルダーは、複数のサンプル容器を保持するためのカルーセルの形をとってもよい。
本発明により用いるのに適したカルーセルは、図３１Ａ及びＢに示した。カルーセル１は、一般に、上面３、底面４及びそれらの間で延びる外縁５を有するディスク２の形をとる。ディスク２は、上面３における半径方向に整列したサンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃの複数の組、外縁５におけるサンプル容器口７、サンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃとサンプル容器口７とを連通するサンプル通路８を有する。カルーセル１は、その幾つかを９で示した固定サンプル容器と共に示した。サンプル容器口７及びサンプル通路８は、サンプル容器９をディスク２に受けると共に固定するために形成される。１つの実施形態において、サンプル容器９は、カルーセル１に解放可能に固定され、サンプル容器の取出し及び他のサンプル容器との取替を可能にして、カルーセル１の繰返し使用を可能にする。変形例の実施形態において、サンプル容器９は、ディスク２に恒久的に固定され、ディスク２の不可欠な構成部分として形成される。１つの実施形態において、サンプル容器９は、サンプル容器９と前記サンプル容器口７に隣接したサンプル通路８の少なくとも１部分との間で、摩擦接触によりディスク２に固定される。サンプル容器と連通してサンプル容器を固定するその他の従来の手段を用いることができる。例えば、補助ねじをサンプル通路８の表面上、及びサンプル容器９の外面上に形成することができる。更に、接着剤または当業者に公知のその他のいずれの固定手段も、サンプル容器９をディスク２に固定するために本発明により用いることができる。本発明のカルーセルの上面及び底面は、好ましくは、複式カルーセルを相互に積重ねることを可能にするように形成され、複式カルーセルの積重ねはモータドライブシャフトと解放可能に係合できる共に、図３２に示した様に一体として同時に回転することができる。
図３２に示した実施形態には、一般に１で示したカルーセルを保持し回転させるように機能するステッパモータ５０４及びドライブシャフト５０６が含まれる。チャンバファン５０８は、矢印５１２で示した空気流を発生させるために用いられる。加熱装置５１０は、サンプル容器９を通る空気を加熱するように機能する。蛍光測定器アセンブリ５１４は、ＬＥＤソース５１４Ａ、フォトダイオード５１４Ｂ、焦点調節レンズ５１４Ｃ及びフィルタアセンブリ５１４Ｄを備える。蛍光測定器ステッパモータ５１６は、矢印５１８の方向に蛍光測定器アセンブリ５１４を移動させるように機能する。当業者は、本願に記載した情報を用いて、図３２に示した装置に従って形成された本発明の実施形態を容易に組立てることができる。
別の実施形態（図示していない）において、カルーセルは、上面、底面、それらの間で延びる外縁、上面におけるサンプル受け口、底面におけるサンプル容器口、前記サンプル受け口及びサンプル容器口と連通するサンプル通路を有するディスクからなる。サンプル容器口及びサンプル通路は、サンプル容器をディスクに受けると共に固定するために形成される。好ましくは、サンプル容器をディスクの底面を基準に半径方向に広がる鋭角で保持する。
１つの実施形態において、ディスクのサンプル通路は、ディスクの上面及び底面に実質的に平行な中心軸を有する第一の部分及びディスクの上面及び底面と鋭角を形成する中心軸を有する第二の部分からなる。この実施形態において、サンプル容器口及びサンプル通路は、サンプル容器をディスクに受けると共に固定するために形成され、サンプル容器は、ディスクの底面を基準に鋭角でディスクから広がる。
カルーセル１は、サンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃを閉鎖するための手段を更に備える。閉鎖手段は、サンプル受け口６の開口を効果的にシールして、装填されたサンプルの汚染及び蒸発を防止するような、サンプル受け口６に嵌合すると共に、サンプル通路の隣接壁と摩擦係合するプラグ（図示していない）または、例えば、上面に付着させる接着剤裏打ちテープでありうる。カルーセル１は、ドライブシャフトと解放可能に係合して回転する。摩擦係合、もしくはねじ、ボルト、錠ピンまたはクランプの使用を含め、当業者に公知のいずれの適切な係合手段も使用できる。１つの実施形態において、ディスク２は、ドライブシャフトを受けるために形成される中心穴を有するリングとして形成される（図３２における５０６参照）。ドライブシャフトの端には、好ましくは、ディスク２を所定の位置で保持するための構造体が形成される。
本発明のカルーセル１は、サンプル容器９に液体サンプルを送出するために用いることができる。１つの実施形態において、サンプル容器９は、導入されたサンプルの２種以上の成分と相互作用する所定の混合物（例えば、試薬混合物）を含むキャピラリ容器である。１つの実施形態によれば、所定の混合物は、キャピラリサンプル容器をサンプル容器口内に配置する前にサンプル容器に添加される。変形例において、サンプル容器は、所定の混合物と前もって一緒にしておく。所定の混合物は、サンプルと反応または相互反応して、検出可能な信号を生じるか、または誘導生成物を生じる試薬を含んでもよい。
カルーセル１のサンプル通路８は、サンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃを通って送出される液体サンプルが、前記液体サンプルへのバイアス力が存在しないサンプル容器口７に流れるのを防止する１つ以上のバリア１０を任意に形成される。「バリア」という用語は、本願において、サンプル受け口内に送出された液体サンプルのサンプル容器口への自由な流れを妨害するいずれの構造体も含むように用いられる。本発明のカルーセルのサンプル通路で用いるのに適切なバリアの例には、サンプル通路に形成される窪みまたは竪穴、サンプル通路を狭める突起、サンプル通路の表面から延びる環状リム、多孔性膜、指向性バルブ、または閉位置でバイアスされるフラップが挙げられる。
バリアは、サンプル通路に存在すると共に、バリアにより妨害される液体サンプルにバイアス力を加えることにより、液体サンプルがバリアを克服できるように形成される。液体サンプルへのバイアス力は、好ましくは、カルーセルの回転により発生した求心力により加えられる。従って、上面にサンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃの複数の組を有して、各組が対応するサンプル通路及びサンプル容器口を有するカルーセルにおいて、サンプルは、種々のサンプル受け口に個々に添加することができると共に、バリアは、液体サンプルを特定の場所に集めると共に、サンプルが各サンプル容器口に流れるのを防止する。サンプルの全部が各受け口内に送出された後、カルーセルは回転されて、サンプルを各サンプル容器口に、及び付属したサンプル容器内に送出する。
１つの実施形態によれば、カルーセルの各サンプル通路は、単一のサンプル容器口及び複数のサンプル受け口と連通している。この実施形態において、サンプル通路は、複式サンプル受け口と連通するために分岐する中央通路を任意に備えることができ、もしくは変形例において、図３１Ａ及びＢに示したように、複式サンプル受け口６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、ディスクの中心から半径方向に延びる共通軸に沿って整列され、前記サンプル受け口の各々は、サンプル容器口で受けられたサンプル容器と１つの通路を通して連通している。サンプル通路には、複数のサンプル受け口のいずれか１つに添加されたサンプルが、前記液体サンプルへのバイアス力が存在しないサンプル容器口に流れるのを防止する１つ以上のバリア９Ａを形成できる。更に、各サンプル通路には、多数のバリアを形成することができ、その各々は、バリアを越えてサンプルを移送するために異なった量のバイアス力を必要とする。この実施形態によれば、各サンプル受け口にサンプルを送出した後、個々のサンプルは、カルーセルの回転速度を制御することによりサンプル容器口及びサンプル容器内に選択的に移送できる。
例えば、第一のサンプルを第一のサンプル受け口内に送出でき、第二のサンプルを第二のサンプル受け口内に送出できる。この場合、第一及び第二のサンプル受け口は共通の通路と連通すると共に、第一及び第二のサンプル受け口には、それぞれ、各第一及び第二のサンプルの流れを防止するバリアが形成される。バリアは、ディスクをキットの一部として供することを可能にし、所定量の選択された試薬、触媒、酵素、油等は１つ以上のサンプル受け口を介してサンプル通路内に前もって装填される。
１つの実施形態において、第二のサンプル受け口に対するバリアは、サンプルを第二のサンプル受け口に送出してその関連バリアを通すために、サンプルを第一のサンプル受け口に送出してその関連バリアを通すのに必要なバイアス力よりも、大きなバイアス力を加える必要があるように形成される。この実施形態によれば、第一の速度におけるカルーセルの回転は、第一のサンプルをサンプル容器口に及びサンプル容器内に送出する一方で、第二のサンプルがサンプル容器口に及びサンプル容器内に流れるのを防止する。その後、増速された第二の速度における回転は、第二のサンプルへの求心力を高めると共に、第二のサンプルをサンプル容器口に及びサンプル容器内に送出する結果をもたらす。この原則に基づいて、異なったサンプルを共通の通路と連通する複式サンプル容器口に送出できると共に、すべてのサンプルを装填した後、カルーセルの回転速度の制御により、個々のサンプルを一度に１つまたは同時にサンプル容器口に及びサンプル容器内に送出できる。１つの実施形態において、蛍光体を含む第一のサンプルは、第一のサンプル容器口に添加され、油を含む第二のサンプルは、第二の容器口に送出される。カルーセルは回転されて、第一のサンプルをサンプル容器内に送出し、油がその後に送出される。油（またはサンプル容器内で第一のサンプルを効果的にシールする別の液体）は、第一のサンプルの蒸発を減少させると共に、第一のサンプルの汚染の危険性を低下させるように機能する。
１つの例において、複式サンプルカルーセルを用いて、同時に複式サンプルを処理する。カルーセルは、ディスク構造体の上面に多数のサンプル受け口を有するディスク様構造体であり、ディスクに装着された対応するサンプル容器と連通している。サンプル受け口に添加されるサンプルは、カルーセルの回転により、それらの対応するサンプル容器に移送される。カルーセルは、各個々のサンプル容器と連通する複式サンプル受け口も有しうる。使用者は、サンプル容器と連通している第二のサンプル受け口内に試薬を入れて、第一のサンプル受け口に添加された別のサンプルと共に容器に送出することができる。変形例において、製造者が所定の試薬を第二のサンプル受け口に入れてもよい。すなわち、この場合、カルーセル、サンプル容器及び所定の試薬は前もって一緒にされた形態をとる。サンプルと共に試薬は、カルーセルの回転によりサンプル容器に送出される。水性サンプルにかぶせるための油は、サンプル容器（ならびに第一及び第二のサンプル受け口）と連通している第三のサンプル受け口内に入れてもよい。または、製造者が油をカルーセルに添加してもよい。
変形例において、サンプル、試薬及びサンプルにかぶせるための油を単一のサンプル受け口に送出できる。カルーセルを回転させて、第二または後続のサンプルもしくは他の組成物をサンプル受け口に送出する前に、各組成物またはサンプルを各容器に送出できる。
本発明の１つの好ましいサンプル容器カルーセルは、好ましいが任意に、半径方向に整列して配置され、共通のサンプル容器と連通している３つのサンプル受け口を備える。この実施形態によれば、約１から約５μｌの油オーバーレイ、好ましくは黒色で染色されており、前もって一緒にされた形態で存在するか、または半径方向に最も内側のサンプル受け口に送出される。油オーバーレイは、鉱油及びＷａｘｏｌｉｎｅ▲Ｒ▼ブラックＯＢＰ（ゼニカ（Ｚｅｎｉｃａ Ｉｎｃ．）社製、ウイルミントン、デラウェア州）の様な約０．０１から約１％の有機黒色染料からなる。約１から約９μｌの試薬マスタミックスは、前もって一緒にされた形態で存在するか、または半径方向に最も外側のサンプル受け口に送出される。試薬マスタミックスは、必要な反応成分の一部または全部を含む。試験されるテンプレート核酸を含む液体サンプルは、半径方向に中間のサンプル受け口に手動または機械で送出される。ディスクは、その後、サンプルを試薬区画に移送する速度であるが、混合物をサンプル容器内に送出するには足りない回転速度で回転される。サンプル及び試薬は、任意に、ディスクの回転速度の急速な変更により混合される。ディスクは、その後、サンプル及び試薬の混合物（但し、オイルは除く）をサンプル容器内に移動させる高速で回転される。ディスクは、その後、更に高速で回転されて、油オーバーレイをサンプル容器に送出する。油は、低密度のゆえに水性サンプルにかぶさり、その染料含有率のゆえに光通路を妨害する。カルーセルの回転速度を変えることによる油、試薬及びサンプルの選択的な移送は、１）連通した通路の直径を変える、２）連通した通路に存在する物理的なバリアのサイズまたは形状を変えることの組合せ、及び３）ディスクの中心からの各サンプル受け口の距離（半径方向）を変えることに対する遠心力の依存性を用いることにより達成される。
本発明のカルーセルは、ドライブシャフト及びモータ（図３２における、それぞれ５０６及び５０４）と解放可能に係合されて、回転することができる。更に、本発明の個々のカルーセルは、相互に積重ねられ、ドライブシャフトと係合されて同時回転が可能である（図３２に示した様に）。本発明の別の態様によれば、サンプル容器内に保持されたサンプルの蛍光を監視するための装置が提供される（図３２における５１４参照）。サンプル容器は、光学的に透過性の材料を含むと共に、少なくとも第一及び第二の寸法を有する容積を形成する壁を有する。但し、第一の寸法は第二の寸法より小さく、容器の外表面積に対する容積の比は、１ｍｍ未満である。１つの実施形態において、装置は、チャンバと、サンプル容器ホルダーと、前記チャンバ内に設けられると共に容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿ってサンプル容器を照射するために定置された光放射源と、前記チャンバ内に設けられると共に容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿ってサンプル容器からの蛍光を測定するために定置された光検出器とからなる。１つの実施形態による光放射源及び光検出器は、昇降（図３２において矢印５１８により示した）可能なプラットホーム上に装着される。この実施形態において、光放射源及び光検出器は、個々のカルーセルが相互に積重ねられ、ドライブシャフトと係合されて同時回転が可能である時に、複式カルーセルの（容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿って）サンプル容器からの蛍光を測定するために定置されることが可能である（図３２参照）。
１つの実施形態において、サンプル容器ホルダーは、複数のキャピラリチューブを保持するためのカルーセルを含むと共に、カルーセルは、前記チャンバに回転可能に装着される。光放射源は、チューブの底を通してキャピラリチューブを照射するために定置されると共に、光検出器は、キャピラリチューブの底を通して蛍光を検出するために装着される。更に、装置は、前記カルーセルを回転させるためのステッパモータ及びカルーセルをモータに結合するための手段を設けられる。
１つの好ましい実施形態によれば、蛍光検出器のチャンバは、前記装置に装着され、チャンバと連通しているヒータ（図３２における５１０参照）及びファン（図３２における５０８参照）及びそれらのためのコントローラを更に設けられて、少なくとも当初は所定の時間及び温度パラメータを用いてチャンバの温度を高速に循環させる。装置は、カルーセルにより保持されたサンプル容器内でポリメラーゼ連鎖反応を実施することが可能である。特に、装置は、反応の進行がリアルタイムで監視されることが可能であるため、ＰＣＲ反応を実施する改善された方法を可能にし、従って、反応の進行中に温度及び時間パラメータの調節を可能にして、増幅された標的核酸配列の収率及び純度を最適化する。
更に、本発明によれば、生物学的サンプルの標的核酸配列を増幅する改善された方法が提供され、この方法は、標的配列の隣接領域に雑種を作り、標的配列に対する２つのプローブの雑種形成と同時に、ドナー及びアクセプタ蛍光体がお互いの０−１５ヌクレチオド内、更に好ましくは１−５ヌクレチオド内にするような有効量の２つの核酸プローブ（但し、前記プローブの一方は、アクセプタ蛍光体で標識され、他方のプローブは、蛍光エネルギー伝達対のドナー蛍光体で標識される）を生物学的サンプルに添加するステップ、ポリメラーゼの連鎖反応を用いて標的核酸配列を増幅するステップ、前記サンプルからの蛍光放射を監視するポリメラーゼの連鎖反応中に前記ドナー蛍光体により吸収される光の選択された波長で生物学的サンプルを照射するステップ、及び監視ステップから発生したデータにより温度及び時間パラメータを調節するステップからなる。
従って、本発明によれば、ＰＣＲ反応を実施するための改善された装置が提供される。装置は、チャンバ、ヒータ、前記装置に装着されかつチャンバと連通しているファン、及び複数のサンプル容器を保持するカルーセルとからなる。この装置と一緒に用いられるサンプル容器は、光学的に透過性の材料及び少なくとも第一及び第二の寸法を有する体積を形成する壁からなる。但し、第一の寸法は第二の寸法より小さく、容器の外表面積に対する容積の比は、１ｍｍ未満である。カルーセルはチャンバ内で回転可能に設けられる。更に装置は、前記チャンバ内に設けられる共に容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿って少なくとも１つのサンプル容器を照射するために定置された光放射源と、前記チャンバ内に設けられると共に容器の第二の寸法に沿った壁に実質的に平行な軸に沿って少なくとも１つのサンプル容器からの蛍光を測定するために定置された光検出器とからなる。更に、装置には、カルーセルを回転させるためのステッパモータが装備されて、照射及び蛍光の検出のために前記カルーセルにより保持された各キャピラリチューブを定置することを可能にする。検出された蛍光により、リアルタイムでＰＣＲ反応を監視し、少なくとも１つの反応パラメータを決めることにより、反応条件の調節は、反応を最適化することができる。好ましい実施形態において、反応の状態を代表する１つ以上の値は、リアルタイムで可視的に認識できる方法で表示される。
本発明のカルーセルは、液体サンプルをキャピラリサンプル容器に送出するためにも使用されることが可能である。カルーセルは、上面、底面及びそれらの間で延びる外縁を有するディスクと、上面におけるサンプル受け口と、外縁におけるサンプル容器口と、サンプル受け口及びサンプル容器口と連通しているサンプル通路とからなる。サンプル容器口及びサンプル通路は、サンプル容器をディスクに受けると共に固定するために形成される。液体サンプルをキャピラリサンプル容器に送出するためにカルーセルを用いる方法は、液体サンプルを受けるため及びサンプル容器を保持するためにカルーセルを選択するステップと、液体サンプルをカルーセルのサンプル受け口内に送出するステップと、キャピラリサンプル容器をサンプル容器口内に定置するステップと、サンプルをキャピラリサンプル容器内に送出するためにカルーセルを回転させるステップとからなる。
本発明は、サンプル中に標的核酸配列が存在することを検出するためのシステムにも関連する。システムは、標的核酸配列の隣接領域に雑種を作る一対のオリゴヌクレチオドプローブを含む。但し、前記プローブの一方は、アクセプタ蛍光体で標識され、他方のプローブは、蛍光エネルギー伝達対のドナー蛍光体で標識される。好ましくは、ドナー蛍光体の放射及びアクセプタ蛍光体の吸収は、２５％未満が重なり、アクセプタ蛍光体は、１００，０００Ｍ-1ｃｍ-1より大きい最大吸光係数を有すると共に、標的配列に対する２つのプローブの雑種形成と同時に、ドナー及びアクセプタ蛍光体は、お互いの１５ヌクレチオド内である。別の実施形態において、ドナー蛍光体の放射及びアクセプタ蛍光体の吸収は、２０％未満が重なると共に、標的配列に対する２つのプローブの雑種形成と同時に、ドナー及びアクセプタ蛍光体は、お互いの５ヌクレチオド内、更に好ましくは、お互いの３ヌクレチオド内である。
前記したことに鑑みれば、本発明が、生物学的サンプルを熱サイクルに正確に適用させると共に、生物学的サンプルの温度を迅速且つ正確に変えるための、最も好ましくは、リアルタイムでまたは所定の温度対時間分布により１つ以上の反応パラメータを有利に調節するための装置を提供することが認められるであろう。本発明は、多数の異なった生物学的サンプルを高速熱サイクルに適用するのに適した装置も提供すると共に、サンプルを極めて短時間かつ大きな温度勾配に対して効果的に適用させることが可能な小さい熱質量の熱伝導媒体を有する熱サイクル装置も提供する。
更に、本発明は、生物学的サンプルを、熱伝導媒体として空気を用いて、高速熱サイクルに適用することが可能であると共に、ＰＣＲを迅速に実施し、反応を同時に監視するためのシステム及び方法を可能にする装置を提供する。なお更に、本発明は、ＰＣＲを迅速に実施すると共に、反応が進行している間、反応を連続的に監視し、反応パラメータを調節するためのシステム及び方法も提供する。
高速熱サイクルを有するオンラインＤＮＡ分析システムに関する情報は、１９９５年１月３１日出願の米国特許出願第０８／３８１，７０３号に見られ、その全体を本願に引用して援用する。
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、その他の特定の形態をとって具現されることが可能である。説明した実施形態は、あらゆる点で、単に例示するものであって制限するものとはみなされない。従って、本発明の範囲は、前記した説明によってではなく、添付したクレームによって指示されるものである。クレームの等価物の意味及び範囲内に入るあらゆる変更は、クレームの範囲に包含されるべきものである。
以下、プログラミングコードリストＡに続く
0004281877.tif 000010
0004281877.tif 000011
0004281877.tif 000012
次に、プログラミングコードＢに続く
（温度プロセッサ（ＩＣ ２）hexファイル（Temp24a.hex）：）
0004281877.tif 000013
0004281877.tif 000014
0004281877.tif 000015
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0004281877.tif 000017
0004281877.tif 000018
0004281877.tif 000019
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0004281877.tif 000027
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0004281877.tif 000029
0004281877.tif 000030
0004281877.tif 000031
0004281877.tif 000032
0004281877.tif 000033
0004281877.tif 000034
0004281877.tif 000035
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0004281877.tif 000037
0004281877.tif 000038
0004281877.tif 000039
0004281877.tif 000040
【図１】
0004281877.tif 000041
【図２】
0004281877.tif 000042
【図３】
0004281877.tif 000043
【図４】
0004281877.tif 000044
【図５】
0004281877.tif 000045
【図６】
0004281877.tif 000046
【図７】
0004281877.tif 000047
【図８Ａ】
0004281877.tif 000048
【図８Ｂ】
0004281877.tif 000049
【図８Ｃ】
0004281877.tif 000050
【図９Ａ】
0004281877.tif 000051
【図９Ｂ】
0004281877.tif 000052
【図９Ｃ】
0004281877.tif 000053
【図９Ｄ】
0004281877.tif 000054
【図９Ｅ】
0004281877.tif 000055
【図９Ｆ】
0004281877.tif 000056
【図９Ｇ】
0004281877.tif 000057
【図１０】
0004281877.tif 000058
【図１０Ａ】
0004281877.tif 000059
【図１１】
0004281877.tif 000060
【図１１Ａ】
0004281877.tif 000061
【図１２】
0004281877.tif 000062
【図１３】
0004281877.tif 000063
【図１４】
0004281877.tif 000064
【図１４Ａ】
0004281877.tif 000065
【図１５】
0004281877.tif 000066
【図１６】
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【図１７】
0004281877.tif 000068
【図１８Ａ】
0004281877.tif 000069
【図１８Ｂ】
0004281877.tif 000070
【図１８Ｃ】
0004281877.tif 000071
【図１９】
0004281877.tif 000072
【図１９Ａ】
0004281877.tif 000073
【図１９Ｂ】
0004281877.tif 000074
【図１９Ｃ】
0004281877.tif 000075
【図１９Ｄ】
0004281877.tif 000076
【図１９Ｅ】
0004281877.tif 000077
【図１９Ｆ】
0004281877.tif 000078
【図１９Ｇ】
0004281877.tif 000079
【図１９Ｈ】
0004281877.tif 000080
【図１９Ｉ】
0004281877.tif 000081
【図２０】
0004281877.tif 000082
【図２１】
0004281877.tif 000083
【図２１Ａ】
0004281877.tif 000084
【図２１Ｂ】
0004281877.tif 000085
【図２１Ｃ】
0004281877.tif 000086
【図２１Ｄ】
0004281877.tif 000087
【図２２】
0004281877.tif 000088
【図２２Ａ】
0004281877.tif 000089
【図２２Ｂ】
0004281877.tif 000090
【図２２Ｃ】
0004281877.tif 000091
【図２２Ｄ】
0004281877.tif 000092
【図２２Ｅ】
0004281877.tif 000093
【図２３】
0004281877.tif 000094
【図２４】
0004281877.tif 000095
【図２５】
0004281877.tif 000096
【図２６】
0004281877.tif 000097
【図２７Ａ】
0004281877.tif 000098
【図２７Ｂ】
0004281877.tif 000099
【図２８】
0004281877.tif 000100
【図２９】
0004281877.tif 000101
【図３０Ａ】
0004281877.tif 000102
【図３０Ｂ】
0004281877.tif 000103
【図３０Ｃ】
0004281877.tif 000104
【図３０Ｄ】
0004281877.tif 000105
【図３０Ｅ】
0004281877.tif 000106
【図３０Ｆ】
0004281877.tif 000107
【図３０Ｇ】
0004281877.tif 000108
【図３０Ｈ】
0004281877.tif 000109
【図３０Ｉ】
0004281877.tif 000110
【図３０Ｊ】
0004281877.tif 000111
【図３０Ｋ】
0004281877.tif 000112
【図３０Ｌ】
0004281877.tif 000113
【図３０Ｍ】
0004281877.tif 000114
【図３０Ｎ】
0004281877.tif 000115
【図３０Ｏ】
0004281877.tif 000116
【図３０Ｐ】
0004281877.tif 000117
【図３０Ｑ】
0004281877.tif 000118
【図３０Ｒ】
0004281877.tif 000119
【図３０Ｓ】
0004281877.tif 000120
【図３０Ｔ】
0004281877.tif 000121
【図３０Ｕ】
0004281877.tif 000122
【図３０Ｖ】
0004281877.tif 000123
【図３１Ａ】
0004281877.tif 000124
【図３１Ｂ】
0004281877.tif 000125
【図３２】
0004281877.tif 000126