(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことからなる高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の製造方法、
工程１）破骨細胞形成抑制因子を抗原として抗破骨細胞形成抑制因子抗体産生ハイブリドーマを取得する工程：
工程２）工程１で得られた複数のハイブリドーマの培養上清を、８０乃至９０％血清存在下で破骨細胞形成抑制因子と接触させ、当該条件下で破骨細胞形成抑制因子に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程。
工程３）選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により製造された、破骨細胞形成抑制因子との結合の解離定数が２×１０-10Ｍ以下であることを特徴とする高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体。
【請求項３】
請求項１の工程１において破骨細胞形成抑制因子としてホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子を使用し、さらに、工程２においてモノマー型破骨細胞形成抑制因子及びホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子の両方を使用し、ホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子のみに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することを特徴とする、請求項１に記載の高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により製造された、ホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子にのみ選択的に結合することを特徴とする高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体。
【請求項５】
請求項１の工程２においてモノマー型破骨細胞形成抑制因子及びホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子の両方を使用し、モノマー型破骨細胞形成抑制因子及びホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子に等しく結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することを特徴とする請求項１に記載の高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により製造された、ホモダイマー型破骨細胞形成抑制因子とモノマー型破骨細胞形成抑制因子に等しく結合することを特徴とする高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体。
【請求項７】
ＯＩ−２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４２１）により産生された抗体。
【請求項８】
ＯＩ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４１９）又はＯＩ−１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４２０）により産生された抗体。
【請求項９】
ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４１９）。
【請求項１０】
ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４２０）。
【請求項１１】
ハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４２１）。
【請求項１２】
請求項２，４，６，７及び８に記載の抗体の内少なくとも１つを含有する破骨細胞形成抑制因子濃度測定用キット。
【請求項１３】
骨代謝異常症の診断に用いられることを特徴とする請求項１２に記載の測定用キット。
【請求項１４】
高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の製造方法であって、高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の破骨細胞形成抑制因子との結合の解離定数が２×１０-10Ｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体の製造方法。
【請求項１５】
破骨細胞形成抑制因子との結合の解離定数が２×１０-10Ｍ以下であることを特徴とする請求項６に記載の高親和性抗破骨細胞形成抑制因子抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨代謝異常症、特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断方法に関する。
また、本発明はこの診断に用いるモノクローナル抗体、及びこの抗体を用いた診断用キットに関する。
本発明は骨代謝異常症、特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断方法、あるいは研究用分析試薬などに有用である。
背景技術
骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の、総合された活性に依存している。健常成人では骨吸収と骨形成の均衡が保たれ、骨量は一定に維持される。骨代謝異常は、この均衡が崩れることにより発生すると考えられている。骨代謝異常症として、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リウマチ及び変形性関節症等が知られている。これらの骨代謝異常症の代表として骨粗鬆症が挙げられる。骨粗鬆症は骨量の減少とそれが原因となって起こる骨折や腰背痛等の臨床症状を呈する病態と考えられている。骨量減少は、成長期以降の加齢や癌の骨転移及び甲状腺機能亢進等の疾病に伴って生じるなど、その原因は様々である。現在行われている骨粗鬆症の診断方法としては、骨のＸ線撮影（MD法）、ＤＰＡ（Dual photon absorptiometry）、ＤＥＸＡ（Dual Energy X-ray Absorptiometry）、ＣＸＤ（Computed X-ray Densitometry）及び低周波超音波等による物理学的骨量測定装置による、骨塩量、骨密度等の測定がある。現在これらの診断方法を用いた骨粗鬆症の診断基準は、技術革新に伴い常に改定が進められている。
確かに骨塩量、骨密度の低下は将来の骨折の危険性を予測させる。しかしながら、骨塩量、骨密度の低下が起こり得る全ての骨折の危険因子ではなく、多くは加齢に伴う現象、例えばコラーゲン線維の弾性低下、骨構造の質的劣化、筋力低下等によっても骨折の危険性は増大すると考えられている。現時点では筋力低下以外のこれらの因子を非侵襲的に計測できず、将来解決すべき重要な課題となっている。さらに骨塩量、骨密度の低下は骨代謝の破綻の結果を観察しているに過ぎず、その原因又は今後の病態の動向を示すものではないと言われている。このような骨密度測定の欠点を補うものとして、骨代謝調節因子（副甲状腺ホルモン（PTH）、活性型ビタミンＤ3、及びカルシトニンなど）、又骨代謝回転に伴って骨組織から遊離してくる種々の因子（骨型アルカリフォスファターゼ、酸性フォスファターゼ、ピリジノリン、デオキシピリジノリン、タイプ１プロコラーゲンペプチド、オステオカルシンなど）の血中濃度あるいは尿中排泄量を測定することで病態を把握しようとする試みがなされている。これらの因子は測定時点での骨代謝動態を示すものであり、骨量減少の有無及びその程度を早期から予測できると期待されている。しかしこのような骨代謝マーカーにも、局所的な骨代謝の変動を表さなかったり、食事等の影響や日内変動が大きかったり、上記諸因子が必ずしも骨代謝を反映して特異的に動いている訳ではないこと等の種々の問題が残されている。このような現状から、これらの問題の解決に止まらず、鋭敏かつ特異性の高い新しい骨代謝マーカーとその測定法の開発が骨粗鬆症を始めとする様々な骨代謝疾患の的確な診断法や予防・治療法の確立のために求められている。
本発明者らは、ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90（ATCC CC186）の培養液中に破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF）が存在することを発見し、その単離に成功した。更に、この蛋白質をコードするcDNAのクローニングにも成功し、遺伝子組み換えＯＣＩＦ（rOCIF）を用いたin vitro及びin vivo薬効評価を通して、骨代謝改善薬としてその有用性を確認した（WO 96/26217号公報）。引き続き、本発明者らは、ｒＯＣＩＦの投与は各種の骨代謝異常疾患動物において、骨密度及び骨強度を顕著に改善すること、又、正常動物へのｒＯＣＩＦの大量投与においても、用量依存的に骨密度及び強度を顕著に増強し、骨組織以外の各種臓器、血液生化学検査、血球系細胞のいずれにおいても全く副作用を発現しないことを確認した。これらのin vivo試験を通して、ＯＣＩＦは骨組織にのみ作用する極めて組織特異性の高いサイトカインであることが判明した。更に、本発明者らは、動物細胞においてＯＣＩＦは分子量約120kDaのホモダイマー型ＯＣＩＦとして分泌生産され、プロテアーゼ等のプロセッシングを受けて分子量約60kDaのモノマー型ＯＣＩＦになることを確認した。さらに、ヒト細胞培養液にはこの両タイプのＯＣＩＦの存在が確認されているように（Tsuda et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 137-142（1997））、ヒトを含む哺乳動物体液などには、この両タイプのＯＣＩＦの存在が予想される。従って、ＯＣＩＦが新しい骨代謝マーカーとなりうるかどうかを明らかにするためには、各種骨代謝異常疾患患者の体液中のそれぞれのタイプのＯＣＩＦの濃度あるいは両タイプの総濃度と各疾患の関係を精査することが必要である。そのためには、両タイプのＯＣＩＦを等しく認識できる抗体ならびにホモダイマーだけを特異的に認識する抗体が必要である。しかしながら、これまでこのような特徴を有する抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体は得られていない。
発明の開示
本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意探索の結果、ＯＣＩＦに極めて高い親和性（解離定数が10-9M以下）を有し、モノマー及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識するモノクローナル抗体、及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識するモノクローナル抗体を見出した。さらに、これらの抗体を用いて高感度の酵素免疫測定キット（サンドイッチＥＬＩＳＡ）を構築した。このサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて若年成人や高齢者の血清、及び骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症、癌を含む各種疾患患者の血清中のＯＣＩＦ濃度を測定した結果、血清ＯＣＩＦ濃度と骨密度の間に高い逆相関が見出された。また慢性関節リウマチ、変形性関節症、外傷、痛風発作といった各種関節疾患患者の関節液中のＯＣＩＦ濃度を測定した結果、関節破壊のより進んだ患者の関節液中のＯＣＩＦ濃度が低いことが見出された。以上の結果より、このサンドイッチＥＬＩＳＡは血清ＯＣＩＦ濃度を測定することにより骨密度の動態を、また関節液中のＯＣＩＦ濃度を測定することにより関節破壊の進行を、それぞれ的確に把握でき、ＯＣＩＦは骨量の減少と関節破壊を早期に予測できる新しい骨代謝異常症診断マーカーとして有用であることを見出した。従って本発明は、ヒト破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）濃度を測定することを特徴とする骨代謝異常症、特に骨粗鬆症及びリウマチ等による関節破壊の診断方法、これに用いるモノクローナル抗体、及び抗体を用いたＯＣＩＦ測定用キットを提供することを課題とする。
本発明は、採取した体液中の破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）の濃度を測定し、その濃度によって骨代謝異常を診断することによりなる骨代謝異常症の診断方法に関する。
本発明の診断は、特に骨粗鬆症、関節疾患の診断に有用である。体液としては、血清、関節液等が用いられる。骨粗鬆症の診断は、主に血清ＯＣＩＦ濃度を測定することにより行う。関節疾患の診断は、主に関節液中のＯＣＩＦ濃度を測定することにより行う。
本発明の診断は、特に骨粗鬆症の診断に有用である。体液としては、血清、関節液等が用いられる。
また本発明は、これらの診断に用いられるモノクローナル抗体に関する。
このようなモノクローナル抗体としては、モノマー型及びダイマー型のＯＣＩＦを等しく認識するモノクローナル抗体、ダイマー型のＯＣＩＦのみを選択的に認識するモノクローナル抗体等がある。さらにこれらのモノクローナル抗体には、ＯＣＩＦの異なるエピトープを認識し、抗原との解離定数が2×10-7M以下の高親和性を有するモノクローナル抗体がある。
さらに本発明は、これらのモノクローナル抗体を構成に含むＯＣＩＦ測定用キットに関する。
本発明における診断方法は、診断対象者から血液（血清）、関節液等の体液を採取し、これを前記モノクローナル抗体を用いたＯＣＩＦ測定用キットで評価することにより行なう。
本発明のモノクローナル抗体は、以下の方法により得ることができる。即ち、抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体の作製に必要な免疫用抗原であるヒトＯＣＩＦとしては、ＷＯ96/26217号公報記載の方法に従って、ヒト胎児肺繊維芽細胞、IMR-90の培養液から単離されたものが用いられる。又、免疫用抗原として、遺伝子組み換えヒトＯＣＩＦを用いることもできる。遺伝子組み換えヒトＯＣＩＦは、ヒトＯＣＩＦｃＤＮＡを常法に従って発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することにより得ることができる。モノマー及びダイマー型ＯＣＩＦは、Tsudaらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 137-142（1997））に従い、逆相クロマトグラフィーによりそれぞれ精製することができる。又、逆相クロマトグラフィーの代わりに、SPセファロース、硫酸化セルロファイン、及びリソースＳカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、両タイプのＯＣＩＦをそれぞれ精製することができる。これらの抗原により哺乳動物を免疫し調製した脾臓細胞か、あるいはin vitro法により免疫したリンパ球細胞を、骨髄腫細胞株（ミエローマ）などと融合させハイブリドーマを作製することができる、このハイブリドーマ培養液について、高度に精製されたモノマー型ＯＣＩＦあるいはホモダイマー型ＯＣＩＦをそれぞれ抗原として用い評価することによって、モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識するモノクローナル抗体、あるいはホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択、クローニングして樹立することができる。また、樹立した安定なハイブリドーマをそれぞれ培養することにより、目的とする抗体を得ることができる。
ハイブリドーマの作製にあたって哺乳動物を使用する場合は、特に限定されないが、マウスやラットなどの小動物を用いるのが一般的である。免疫は、抗原であるＯＣＩＦを生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与し、動物に１〜２週間の間隔で３〜４回程度投与する方法が一般的である。本発明におけるＯＣＩＦに高親和性（解離定数が2×10-7M以下）の抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体の作製に当たっては、目的のモノクローナル抗体が得られやすいように１週間間隔で３回免疫し、更に抗原とフロイント不完全アジュバントを併用して１週間間隔で４回追加免疫し、出来るだけ血中抗ＯＣＩＦタイターを高める。このようにして免疫された動物を最終免疫後３日目に解剖して、脾臓を摘出し、脾臓細胞を免疫細胞として使用するのが良い。免疫細胞と細胞融合するマウス由来のミエローマとしては、例えばp3/x63-Ag8、p3-U1、NS-1、MPC-11、SP-2/0、FO、P3x63 Ag8. 653及びS194などが例示できる。又、ラット由来の細胞としてはR-210などの細胞株がある。ヒト型の抗体を生産する場合には、ヒトＢリンパ球をin vitroで免疫し、ヒトミエローマ細胞やEBウイルスにより形質転換した細胞株と細胞融合させることにより、ヒト型の抗体を生産することができる。
免疫された細胞とミエローマ細胞株との融合は公知の方法、例えばKoehlerとMilsteinらの方法（Koehler et al., Nature, 256, 495-497, 1975）が一般的に使用されるが、電気パルスを利用した電気パルス法なども使用可能である。免疫リンパ球とミエローマ細胞株は、通常行われている細胞数の比率に混合し、一般に使用される細胞培養用培地（牛胎児血清、FCS不含）にポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、ＦＣＳ添加ＨＡＴ選択培地で培養を行い、融合細胞（ハイブリドーマ）を選別する。
モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体、及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体をそれぞれ生産するハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ、プラーク法、オクタロニー法、凝集法など通常抗体の検出に使用されている方法を用いて選択することができる。精製モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを用いたＥＬＩＳＡで、最も簡便且つ精度良く目的とする抗体を検定することができる。特に、本発明による高親和性抗体（解離定数が2×10-7Ｍ以下）を得るには、通常のソリッドフェーズＥＬＩＳＡでは困難であった。即ち、通常のソリッドフェーズＥＬＩＳＡでは、抗原を固相化した96ウェルイムノプレート（Nunc社）にハイブリドーマ培養液（50-100μl）を加え一次反応を行い、次いで酵素標識、例えば、パーオキシダーゼ（POD）標識した抗マウスIgG抗体を加えて第二次反応を行ない、酵素基質溶液（50-100μl）を加えて酵素反応後、各ウェルの吸光度を測定する。この際、高い吸光度を示すハイブリドーマ培養液は、そのハイブリドーマが抗原親和性が低い抗体を大量に生産している場合と、その生産性が低くても、極めて抗原親和性が高い抗体を生産している場合の両方が存在することを示しており、そのどちらであるかを容易に判別できない。そこで、本発明においては、後者の抗原親和性の高い抗体生産ハイブリドーマを比較的容易に識別できるように、以下のようにソリッドフェーズＥＬＩＳＡを改良した。即ち、抗原を固相化した96ウェルイムノプレートの各ウェルにヒト血清あるいは牛血清を添加し、次いでハイブリドーマ培養液を少量各ウェルに添加し、第一次反応を約80〜90％血清存在下で実施することにより、生産性が良好であるが、抗原親和性が低い抗体産生ハイブリドーマを排除でき、抗原親和性の高い抗体産生ハイブリドーマを選択的にスクリーニングすることが可能になった。この改良ソリッドフェーズＥＬＩＳＡにおいて、モノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを抗原として、両タイプのＯＣＩＦを等しく認識する抗体を生産するハイブリドーマ及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体を生産するハイブリドーマをそれぞれ選び、限界希釈法により３〜５回クローニングし、安定な抗体生産株として樹立する。このようにして樹立されたハイブリドーマは通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイブリドーマは常法により培養して、その培養液から回収することができる。また、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔内に移植することにより得られる腹水から抗体を回収することもできる。培養液あるいは腹水中の抗体は、塩析法、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡ又はＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、抗体の精製に通常用いられる方法により精製することができる。得られた抗体は、モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体、及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識できる抗体で、それぞれＯＣＩＦ量（モノマー型ＯＣＩＦ＋ホモダイマー型ＯＣＩＦ）及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみの測定に利用することができる。これらの抗体は放射性アイソトープや酵素ラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ（RIA）やエンザイム��ムノアッセイ（ELISA）として知られている測定系に用いることができ、ＯＣＩＦ量（モノマー＋ホモダイマー型OCIF量）やホモダイマー型ＯＣＩＦのみの量を測定することができる。特に本発明によるホモダイマー型ＯＣＩＦを特異的に認識する抗体の存在は、モノマー型ＯＣＩＦとホモダイマー型ＯＣＩＦには異なるエピトープが存在することを明らかにすると共に、この抗体はモノマー型ＯＣＩＦには存在せずホモダイマー型ＯＣＩＦのみに存在するエピトープを認識する抗体であることを示している。本発明によって得られるモノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体を固相化抗体として、又放射性アイソトープあるいは酵素標識した第二次抗体としてそれぞれ他の共通エピトープでモノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体を用いれば、ＯＣＩＦ量及びホモダイマー型ＯＣＩＦ量をそれぞれ測定することができるという特徴を有する。さらに、ホモダイマー型ＯＣＩＦのみを測定したい場合、固相化抗体として、以下の実施例６（第１表）に開示するホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識するOI-26抗体、標識抗体としてモノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識するOI-19あるいはOI-4抗体を使用することもできる。これらの測定系を用いることにより、血液、尿、及び関節液などの生体試料や細胞培養液中のＯＣＩＦ量及びホモダイマー型ＯＣＩＦ量のみを容易に且つ高感度で測定することができる。
本発明のヒトＯＣＩＦを測定するためのキットは、（i）第１次抗体または第２次抗体のいずれか一方の抗体がOI-19あるいはOI-26抗体であり、且つ（ii）他の抗体がOI-4抗体であることを除いて、通常のサンドイッチ法における試薬（reagent）の組合せに基づいてキットが構成される。すなわち、本発明の免疫学的測定キットは、（1）不溶性担体に固定化された第１次抗体、（2）標識化された第２次抗体、（3）溶解剤、（4）洗浄剤および（5）標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定するための基質および反応停止剤を含んでいる。不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックス、ラテックスに金属等をメッキした磁性微粒子などの高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組合せなどを例示することができる。また不溶性担体の形状としては、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管、多孔性フィルターなどの種々の形状であることができる。また、標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質および放射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、インベルターゼ等を、蛍光物質としては、フルオレッセインイソチオシアネート、フイコビリプロテイン等を、発光物質としては、イソルシノール、ルシゲニン等を、そして放射性物質としては、I125、I131、C14、H3等を用いることができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。
標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質としてＨ2Ｏ2を用い、発色剤として2，2’-アジノジ-〔3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩（ABTS）、5-アミノサリチル酸、o-フェニレンジアミン、4-アミノアンチビリン、3，3’，5，5’-テトラメチルベンジジン、ホモセバニリン酸、チラミン等を、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてo-ニトロフェニルフォスフェート、4-メチルウンベリフェリルリン酸等を、酵素にβ-D-ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン-ジ-（β-D-ガラクトピラノシド）、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド等を用いることができる。前記免疫学的測定のキットにおいて（3）溶解剤としては、免疫学的測定に通常使用されるものであればよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだpHが6.0〜8.0の範囲のものが好適な例として示される。さらに（4）洗浄剤としては、同様に免疫学的測定に一般的に使用されているものがそのまま使用される。その例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液およびこれらの混合液が挙げられる。これらの洗浄剤にはさらにTriton X-100、Tween 20またはBrij35の如き非イオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、CHAPSの如きイオン系界面活性剤を加えてもよい。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例７のOI-19抗体とOI-4抗体によるＥＬＩＳＡの検量線を示す。
〔符号の説明〕
○：ホモダイマー型OCIF
●：モノマー型OCIF
第２図は、実施例７のOI-26抗体とOI-4抗体によるＥＬＩＳＡの検量線を示す。
〔符号の説明〕
○：ホモダイマー型OCIF
●：モノマー型OCIF
第３図は、実施例８の骨粗鬆症患者及び健常人の血中ＯＣＩＦ濃度を示す。
第４図は、実施例８の尿中ピリジノリンと血中ＯＣＩＦ濃度の関係を示す。
第５図は、実施例８の尿中デオキシピリジノリンと血中ＯＣＩＦ濃度の関係を示す。
第６図は、実施例９の関節腫張を認めた患者の関節液中のＯＣＩＦ濃度を示す。
〔符号の説明〕
RA:  慢性関節リウマチ
OA:  変形性関節症
Tr:  外傷
G:   痛風発作
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
抗原用モノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦの精製
ＷＯ96/26217号公報記載のＯＣＩＦ生産CHO細胞を、EX-CEll 301培地（JRHバイオサイエンス社）に１×105cells/mlとなるように播種し、細胞培養用ジャー（２リットル容量）を用いて37℃で７日間培養した。得られた培養液に0.1％になるようにCHAPS（3-[（3-cholamidopropyl）-dimethylammonio]-1-propanesulfonate、シグマ社）を加え、酢酸でpH6.0に調整した後、0.22μmのフィルター（ミリディスク、ミリポア社）で濾過した。培養液を、予め0.1％CHAPSを含む50mMビストリス-塩酸緩衝液、pH6.0で予め平衡化したＳＰセファロースHPカラム（2.6×10cm、ファルマシア社）に負荷し、同緩衝液で洗浄した後、流速4ml／分、100分間でNaCl濃度が１Ｍになる直線勾配で溶出を行い、8mlずつフラクショネーションした。WO96/26217号記載の方法に従い各フラクションのＯＣＩＦ活性を測定し、ＯＣＩＦ画分を得た。このＯＣＩＦ画分を0.1％CHAPSを含む50mMビストリス−塩酸緩衝液、pH6.0で10倍希釈した後、予め50mMビストリス−塩酸緩衝液、pH6.0で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（2.6×10cm、生化学工業社）に負荷した。このカラムを、0.1％CHAPSを含む50mMビストリス−塩酸緩衝液、pH6.0で洗浄した後、流速4ml/分、100分間でNaCl濃度が1.5Ｍになる直線勾配で溶出を行い、8mlずつフラクショネーションした。各フラクションのＯＣＩＦ活性を、前記と同様の方法で測定した。又、各フラクションの一部を非還元条件下でSDS-PAGEにかけ、ＯＣＩＦ活性を有し、その分子量が約60kDaを示す分画を集め、画分１とした。又、ＯＣＩＦ活性を有し、非還元条件下でSDS-PAGEで約120kDaの分子量を示す分画を集めて、画分２とした。画分１及び２をそれぞれ0.1％CHAPSを含む50mMトリス−塩酸緩衝液、pH7.0で10倍に希釈した。希釈して得られた両画分をそれぞれ、予め0.1％CHAPSを含む50mMトリス−塩酸緩衝液、pH7.0で予め平衡化したリソースＳカラム（0.64×3cm、ファルマシア社）に負荷し、0.01％ polysorbate 80を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で洗浄した後、流速1ml/分、15分間でNaCl濃度が0.6Ｍになる直線勾配で溶出を行い、0.5mlずつフラクショネーションした。画分１及び画分２をそれぞれ負荷することによって得られた各フラクションのＯＣＩＦ活性を前記同様に測定し、ＯＣＩＦ活性を有するフラクションを集めて、面分１からモノマー型ＯＣＩＦ、画分２からホモダイマー型ＯＣＩＦを得た。
〔実施例２〕
マウスの免疫及びハイブリドーマの作製
実施例１記載の方法で精製されたモノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを、それぞれ100μg/mlになるように生理食塩水に溶解した。このようにして調製した両タイプのＯＣＩＦを等量含む混合液に、同容量のフロイント完全アジュバントを加え良く乳化した後、Balb/cマウス１匹当たり腹腔内に200μlずつ１週間間隔で３回投与し、マウスを免疫した。次に、両タイプのＯＣＩＦをそれぞれ25μg/ml含む混合液に、同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し充分乳化したものを、上記Balb/cマウス１匹あたり200μlずつ、１週間間隔で４回追加免疫した。４回目の追加免疫の１週間後、両タイプのＯＣＩＦをそれぞれ100μg/ml含む混合液をBalb/cマウス1匹当たり100μlずつ静脈内に投与した。最終免疫後３日目に脾臓を摘出、脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞P3x63-AG8.653（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）と公知の方法（Koehler,G. and Milstein, C., Nature, 256, 495（1975））に従い細胞融合した。融合終了後、細胞懸濁液をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むＨＡＴ培地中で10日間培養した。ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマが出現した後、HAT培地からアミノプテリンを除いたHT培地に培地交換し培養を継続した。
〔実施例３〕
ハイブリドーマの選択及びクローニング
融合10日後にハイブリドーマの出現を認めたので、上記に記載した改良ソリッドフェーズＥＬＩＳＡにより、モノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する高親和性抗体及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する高親和性抗体生産ハイブリドーマの選択を行った。即ち、予めモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦをそれぞれ５μg/mlになるように0.1M炭酸水素ナトリウム溶液（pH9.6）に溶解し、それぞれの抗原溶液を50μlずつ96ウェルイムノプレート（Nunc社）の各ウェルに加え、４℃で一晩静置しそれぞれの抗原を固相化した。各ウェル中の抗原溶液を捨て、0.1％ polysorbate 20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS-P）で洗浄し、各ウェルに40μlの牛胎仔血清（ハイクローン社）を加えた。次いで、各ウェルに10μlのハイブリドーマ培養上清を加え、80％血清濃度下、室温で２時間反応させた。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄し、25％ブロックエースを含む生理食塩水で5000分の１に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG（KPL社）を各ウェルに50μl加え、室温で２時間反応させた。プレートをPBS-Pで洗浄した後、各ウェルに50μlの酵素基質溶液（TMB, ScyTek社）を加えて発色させた後、反応停止液（stopping reagent, ScyTek社）50μlを加えて酵素反応を停止した。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノリーダーNJ2000、日本インターメッド社）を用いて測定し、抗体生産ハイブリドーマを選択した。特に高い吸光度を示し、しかもモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体あるいはモノマー型ＯＣＩＦを認識せず、ホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体生産ハイブリドーマを選択し、それぞれのハイブリドーマから限界希釈法により３〜５回クローニングを繰り返すことにより、安定な抗体生産ハイブリドーマを樹立した。得られた抗体生産株の中から、さらに目的抗体の生産性が高いハイブリドーマ株を選別した。
このようにしてモノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識するOI-19抗体あるいはOI-4抗体を産生するハイブリドーマOI-19及びOI-4を得た。またホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識するOI-26抗体を産生するハイブリドーマOI-26を得た。これらを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、OI-4には受託番号FERM BP-6419、OI-19には受託番号FERM BP-6420、OI-26には受託番号FERM BP-6421がそれぞれ付与されている。
〔実施例４〕
モノクローナル抗体の生産及び精製
実施例３で得られた目的の抗体、即ち高親和性でモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体及びホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体生産ハイブリドーマをそれぞれ培養し、マウス一匹当たりそれぞれのハイブリドーマを1x106細胞ずつ、予めプリスタン（アルドリッチケミカル社）を投与しておいたBalb/c系マウスの腹腔内に移植した。２週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のモノクローナル抗体を含む腹水を得た。プロテインＡカラム（ファルマシア社）クロマトグラフィーにより、腹水から精製抗体を得た。
〔実施例５〕
モノクローナル抗体の解離定数（Kd値）の測定
Betrand Friguetらの方法（Journal of Immunological Methods, 77, 305-319, 1986）に従い、モノクローナル抗体の解離定数を測定した。即ち、実施例４で得られた精製抗体を、5ng/mlに40％ブロックエース（雪印乳業社）、0.1％ polysorbate 20を含む0.2M Tris-HCl pH7.4（１次バッファー）で希釈し、これに実施例１記載の精製モノマー型あるいはホモダイマー型の遺伝子組み換えＯＣＩＦ（rOCIF）を6.25ng/ml〜10μg/mlになるように１次バッファーで希釈したものを等容量混ぜ、４℃で15時間静置することによりＯＣＩＦとモノクローナル抗体を結合させた。15時間後、ＯＣＩＦと未結合の抗体をモノマー型あるいはダイマー型のｒＯＣＩＦ（10μg/ml、100μl/ウェル）を固相化したソリッドフェーズELISAにて測定することにより、モノクローナル抗体のモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦに対する解離定数を算定した。
〔実施例６〕
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの検定
本発明のモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キット（アマシャム社）を用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従い実施した。実施例５及び６で得られた結果を第１表に示す。
0004268684.tif 000002
これらの結果より、抗体OI-4及びOI-19はモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦをほぼ同等に認識する抗体であり、抗体OI-26はホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体であることが確認された。又、全ての抗体はIgG1に属し、モノマー型あるいはホモダイマー型ＯＣＩＦに対する解離定数は2×10-7Ｍ以下の、極めて親和性の高い抗体であることが明らかとなった。
〔実施例７〕
ＯＣＩＦのＥＬＩＳＡによる測定
上記方法により得られた３種の抗体OI-4、OI-26及びOI-19をそれぞれ固相抗体と標識抗体として、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。抗体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて行った。モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく測定するＥＬＩＳＡにはOI-19抗体を１次抗体として、あるいはホモダイマー型ＯＣＩＦを特異的に測定するＥＬＩＳＡにはOI-26抗体を１次抗体として、それぞれ10μg/mlになるよう0.1M炭酸水素ナトリウム溶液（pH9.6）に溶解し、100μlずつ96ウェルイムノプレート（Nunc社）の各ウェルに加え、４℃で一晩静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、50％濃度のブロックエース（雪印乳業社）300μlを加え、室温で２時間静置しブロッキングした。ブロッキング後、プレートを0.1％ polysorbate 20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS-P）で洗浄した。モノマー型ＯＣＩＦ及びホモダイマー型ＯＣＩＦをそれぞれ40％ブロックエース（雪印乳業社）及び0.1％ polysorbate 20を含む0.2M Tris-HCl（pH7.4）（一次バッファー）に溶解、希釈し、種々の濃度の両タイプＯＣＩＦ溶液を調製した。種々の濃度に調製したモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦ溶液それぞれを100μlずつ各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。２時間後、プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄し、25％ブロックエース（雪印乳業社）及び0.1％ polysorbate 20を含む0.1M Tris-HCl（pH7.4）（２次バッファー）で希釈したＰＯＤ標識OI-4抗体をモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体として各ウェルに100μl加え、室温で２時間反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｐで洗浄した後、各ウェルに100μlの酵素基質溶液（TMB, ScyTek社）を加えて発色させた後、反応停止液（stopping reagent, ScyTek社）を100μlずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止した。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。第一次抗体としてモノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦをほぼ等しく認識する抗体、OI-19を使用した時の結果を第１図に、又ホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体OI-26を用いた時の結果を図２に、それぞれ示す。この結果、第１図に示したように、モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦをほぼ等しく認識する抗体、OI-19を固相抗体とし、両タイプのＯＣＩＦを等しく認識する抗体、OI-4をＰＯＤ標識抗体とした時のサンドイッチＥＬＩＳＡの測定感度は約25pg/mlで極めて微量のＯＣＩＦを測定することができることが明らかになった。又、第２図に示したように、ホモダイマー型ＯＣＩＦのみを特異的に認識する抗体OI-26を固相抗体とし、モノマー型及びホモダイマー型ＯＣＩＦを等しく認識する抗体OI-4をＰＯＤ標識抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡの測定感度は50pg/mlで、高感度でホモダイマー型ＯＣＩＦのみを測定できることを認めた。
〔実施例８〕
健常人及び骨粗鬆症患者の血清中ＯＣＩＦの測定
健常人及び骨粗鬆症患者（日本骨代謝学会の診断基準に基づく）の血清中のＯＣＩＦ濃度を、実施例７記載のＯＣＩＦのＥＬＩＳＡ系（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）を一部改良して測定した。即ち、ＯＣＩＦ濃度（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）の測定には、両タイプのＯＣＩＦを等しく認識する抗体OI-19を実施例７と同様に96ウェルイムノプレートに固相化し、各ウェルに精製マウスIgG（カペル社）を20μg/mlになるよう加えた１次バッファー（40％ブロックエース及び0.1％ polysorbate 20を含む0.2M Tris-HCl, pH7.4）を50μl加え、次いで１次バッファーで４倍希釈した各ヒト血清を50μl加え、室温で２時間静置した。0.1％ polysorbate 20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS-P）で６回洗浄後、両タイプのＯＣＩＦを等しく認識する抗体OI-4のＰＯＤ標識体を精製マウスIgGを10μg/mlになるように加えた２次バッファー（25％ブロックエース及び0.1％ polysorbate 20を含む0.1M Tris-HCl, pH7.4）で3000倍に希釈した溶液を100μlずつ各ウェルに加えて、室温で２時間静置した。ＰＢＳ−Ｐで６回洗浄後、酵素基質溶液（TMB, ScyTek社）を100μlずつ各ウェルに加え、室温で20分間反応させた後、反応停止液（stopping reagent, ScyTek社）を100μlずつ各ウェルに添加して、反応を停止した。各ウェルの450nmの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。既知量のＯＣＩＦを含む１次バッファーについても同様に操作し、第１図と同様にＯＣＩＦの検量線を作製し、血清試料の吸光度から血清中のＯＣＩＦ濃度を求めた。
骨粗鬆症患者及び健常人の、血清中のＯＣＩＦ（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）濃度の試験結果を第３図に示す。第３〜５図に示す結果の有意差検定は、Student’s non-paired t検定にて行った。この結果、骨粗鬆症患者と健常人との間には、血清ＯＣＩＦ（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）濃度に有意な差異が認められ、骨粗鬆症患者の血清ＯＣＩＦ濃度は、健常人のそれよりも有意に高かった。よって、血清ＯＣＩＦ濃度を測定することにより、骨粗鬆症患者の病態を把握できることから、ＯＣＩＦは骨粗鬆症を判定する新しい骨代謝マーカーになり得ることが明らかとなった。
又、健常人と骨粗鬆症患者の血清ＯＣＩＦ（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）濃度と尿中ピリジノリン濃度の関係を第４図に、尿中デオキシピリジノリン濃度との関係を第５図に、それぞれ示す。ここで、ピリジノリン濃度42pmol/μmol Cr（クレアチニン1μmol当りのピリジノリンpmol量）、デオキシピリジノリン濃度6.2pmol/μmol Crは、それぞれ日本人の正常値の上限値である。この結果、ピリジノリン、デオキシピリジノリン濃度が高値を示す患者の血清ＯＣＩＦ濃度は、有意に高かった。ピリジノリン及びデオキシピリジノリンはコラーゲンの架橋分子であり、コラーゲンが骨基質に取り込まれた後に骨基質内で生成され、骨吸収時の骨破壊により放出される。これらの分子は骨吸収マーカーとしての特異性が高いとされており、臨床検体の評価に幅広く利用されているものである。ＯＣＩＦ濃度とこの二つのマーカーとの相関が認められたことにより、血清中ＯＣＩＦ濃度は骨代謝マーカーとして有用であることが明らかとなった。
〔実施例９〕
関節腫張を認めた患者の関節液中ＯＣＩＦ濃度の測定
関節疾患の治療を目的として病院を訪れ、診察の結果明らかな関節腫張を認めた慢性関節リウマチ（RA）患者43例、変形性関節症（OA）患者６例、外傷（Tr）患者３例、および痛風発作（G）患者６例よりインフォームドコンセントを得た上で関節液を採取した。これらの関節液中のＯＣＩＦ濃度を、実施例８に記載したＯＣＩＦのＥＬＩＳＡ系（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）を一部改変して測定した。即ち、関節液は１次バッファーで１６倍希釈した後、その50μlを抗体OI-19を固相化した96ウェルイムノプレートの各ウェルに加えた。この操作以外の全ての操作は、実施例８の方法と同様に実施した。
関節腫張を認めた患者関節液中ＯＣＩＦ（モノマー型OCIF＋ホモダイマー型OCIF）濃度の試験結果を第６図に示す。また、第６図に示したデータの統計解析にはKruskal-Wallis TestおよびMann-Whimey Testを使用した。この結果、関節液中のＯＣＩＦ濃度は、痛風発作（G）例に比しＲＡ患者の方が有意に低値を示した（p=0.0023）。また、６例のOA患者の関節液中のＯＣＩＦ濃度の最低値は4.79ng/mlであった一方、関節液中のＯＣＩＦ濃度が、4.0ng/ml以下の低値を示したRA患者は43例中15例に達した。これらの結果から、関節液中のＯＣＩＦ濃度が低値を示した一部のＲＡ患者の関節において、ＯＣＩＦの不足により破骨細胞の形成と活性が抑制されていない可能性が示唆された。また、OCIF-ELISAが慢性関節リウマチ（RA）、変形性関節症（OA）、外傷（Tr）、および痛風発作（G）の病態の診断に有用であることが示された。
〔実施例１０〕
慢性関節リウマチ（RA）患者の膝関節液中ＯＣＩＦ濃度と病態の関係
関節液中のＯＣＩＦ濃度と関節破壊の進行との相関を検討するため、retrospective cohort studyを慢性関節リウマチ（RA）患者２例につき、実施した。
（症例１、66才、男性）
1982年（50才時）、多関節痛を自覚。1983年、病院で初診を受け、American College of RheumatologyのＲＡの分類基準を満たしＲＡと診断された。以後、抗リウマチ薬（メルカプターゼ）により一時寛解となり、抗リウマチ薬の投与を中止した。1990年、ＲＡを再発し、抗リウマチ薬の投与を再開した。1992年３月18日、右膝関節が腫張し、穿刺により関節液を採取した。この時の関節液中のＯＣＩＦ濃度は23.6ng/mlであり、高値を示した（実施例９で示した43例のRA患者の関節液中のＯＣＩＦ濃度の中央値は約6ng/ml）。この時の血漿のＣＲＰは5.4mg/dlであり、明らかに炎症反応を呈した。ＣＲＰは完全には陰性化はせず、1997年まで3mg/dl前後を呈していた。膝Ｘ-pは1983年から1997年まで確認されているが、変形性関節症（OA）の変化が主体であり、手指関節および手関節においても骨糜爛は認められなかった。
（症例２、60才、女性）
1987年（49才）、多関節痛を自覚。1993年８月17日、病院で初診を受け、American College of RheumatologyのＲＡの分類基準を満たしＲＡと診断された。このとき右膝関節が腫張しており、穿刺により関節液を採取した。この時の関節液中のＯＣＩＦ濃度は3.0ng/mlと低値を示し、また血漿のＣＲＰは13.7mg/dlと強い炎症反応を呈していた。その後、抗リウマチ薬（メソトレキセート）の投与によりＣＲＰは徐々に低下し、1994年３月18日には4.1mg/dl、同年６月27日には1.1mg/dlにまで低下した。しかし膝Ｘ-pは、Larsen分類（Laresen A. et al., Acta Radiol. Diag. 18, 481-491,1977）によると、1993年９月１日にはgrade III、1994年３月18日にはgrade IV、同年６月27日にはgrade Vと、関節破壊は確実に進行し、同年10月４日には、人工関節置換術を施行された。
上記２例、即ち関節破壊の進行が穏やかであった症例１と関節破壊が進行した症例２での関節液中のＯＣＩＦ濃度の測定結果から、リウマチによる関節破壊の危険度の評価や関節破壊の治療効果の評価に関節液中のＯＣＩＦ濃度測定が有用であることが示された。
〔実施例１１〕
モノマー型およびダイマー型ＯＣＩＦ型定用キット1（80検体）
▲１▼  OI-19抗体を実施例７の方法で固相化し、予めBlock Aceでブロッキングした96ウェルプレート：１枚
▲２▼  実施例７の方法でＰＯＤ標識化したOI-4抗体: 10μl（1000倍濃度）
▲３▼  遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ（モノマー型）標準品: 0.5ng/ml 400μl
▲４▼  検体の希釈液（0.01% Tween 20と40% BlockAceを含む0.2M Tris-HCl緩衝液、pH7.4）: 10ml
▲５▼  標識抗体の希釈液（0.01% Tween 20と25% BlockAceを含む0.1M Tris-HCl緩衝液、pH7.4）: 10ml
▲６▼  96ウェルプレート洗浄のための洗浄液（0.1% Tween 20を含むPBS（-））: １リットル
▲７▼  標識化酵素活性を測定するための基質溶液（ここではTMB溶液）および反応停止液（TMB stop reagent）: 各10ml
ダイマー型ＯＣＩＦ測定用キット2（80検体）
▲１▼  OI-26抗体を実施例７の方法で固相化し、予めBlock Aceでブロッキングした96ウェルプレート: １枚
▲２▼  実施例７の方法でPOD標識化したOI-4抗体: 10μl（1000倍濃度）
▲３▼  遺伝子組み換え型OCIF（ダイマー型）標準品: 0.5ng/ml 400μl
▲４▼  検体の希釈液（0.01% Tween 20と40% BlockAceを含む0.2M Tris-HCl緩衝液、pH7.4）: 10ml
▲５▼  標識抗体の希釈液（0.01% Tween 20と25% BlockAceを含む0.1M Tris-HCl緩衝液、pH7.4）: 10ml
▲６▼  96ウェルプレート洗浄のための洗浄液（0.1% Tween 20を含むPBS（-））:１リットル
▲７▼  標識化酵素活性を測定するための基質溶液（ここではTMB溶液）および反応停止液（TMB stop reagent）：各10ml
測定方法（キット１およびキット２）
プレート▲１▼の各ウェルに希釈液▲４▼で希釈した検体及びヒト遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ標準品▲３▼を段階希釈した溶液を100μlづつ加える。室温にて約２時間放置した後、洗浄液▲６▼300μlでプレートの各ウェルを5〜6回洗浄する。この洗浄操作には自動プレートウオッシャーを用いてもよい。洗浄したプレートの各ウェルにPOD標識したOI-4抗体▲２▼を希釈液▲５▼で1000倍希釈した溶液100μlづつを加え、再び室温にて約２時間放置する。洗浄液▲６▼でプレートの各ウェルを５〜６回洗浄する。この洗浄操作には自動プレートウオッシャーを用いてもよい。酵素基質溶液▲７▼を各ウェルに100μlづつ加え、室温にて20〜30分放置する。各ウェルに反応停止液▲７▼を100μl加えることにより酵素反応を停止する。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定する。ヒト遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ標準品▲３▼を段階希釈したものを加えた各ウェルの450nmの吸光度よりヒト遺伝子組み換え型ＯＣＩＦ濃度の検量線を作製し、この検量線から各検体のＯＣＩＦ濃度を求める。
産業上の利用の可能性
本発明により、採取した体液（血液、関節液等）中のヒト破骨細胞形成抑制因子（OCIF）濃度を測定することにより、骨代謝異常症、特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断を簡易的にかつ正確に行うことができる。本発明の診断には、前記モノクローナル抗体、及びそのモノクローナル抗体を用いたＯＣＩＦ測定用キットが用いられるので、骨代謝異常、特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断を前記のように簡易的かつ正確に行うことができるものである。本発明は、骨代謝異常症、特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断方法、あるいは研究用分析試薬などに有用である。
微生物への言及
当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住    所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託機関に寄託した日付：平成９年（1997）年10月16日
寄託機関の寄託について付した寄託番号：FERM BP-6419
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住    所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託機関に寄託した日付：平成９年（1997）年10月16日
寄託機関の寄託について付した寄託番号：FERM BP-6420
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住    所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託機関に寄託した日付：平成９年（1997）年10月16日
寄託機関の寄託について付した寄託番号：FERM BP-6421
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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