(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２，配列番号12、配列番号14〜27及び配列番号36〜43の群より選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号15〜25のいずれかにより定義されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基３のアルギニン、アミノ酸残基７のセリン、アミノ酸残基８のリジン、アミノ酸残基10のリジン又はアミノ酸残基33のメチオニンのいずれかで始まるアミノ末端を有するポリペプチドをコードする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２，12，14〜25及び36〜42のいずれかにより定義されるアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸残基179、配列番号14〜25のアミノ酸残基159、配列番号36のアミノ酸残基157、配列番号37のアミノ酸残基153、配列番号38のアミノ酸残基150、配列番号39のアミノ酸残基159、配列番号40のアミノ酸残基157、配列番号41のアミノ酸残基152，配列番号42のアミノ酸残基127に相当するイソロイシンで終止するポリペプチドをコードする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号28〜35よりなる群から選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードする単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドまたはポリペプチドがキャリアーポリペプチドまたはその他のキャリアー分子と融合している請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに少なくとも90％、95％または99％同一であるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
次の作用可能に連結されたエレメントを含む発現ベクター：
転写プロモーター
請求項１〜６に記載のポリヌクレオチド；及び
転写ターミネーター。
【請求項８】
次の作用可能に連結されたエレメントを含む発現ベクター：
（ａ）転写プロモーター
（ｂ）キメラポリペプチドをコードするDNAセグメントにあって、該キメラポリペプチドが本質的にペプチド結合により結合した第１部分及び第２部分から成り、該第１部分が配列番号２，12，14〜43のアミノ酸配列である哺乳動物ポリペプチドを含み、該第２部が第２ポリペプチド又は蛋白質であって、このポリペプチド又は蛋白質がアフィニティータグであるもの、
（ｃ）転写ターミネーター。
【請求項９】
配列番号２，12，14〜27及び36〜43から成るアミノ酸配列の群より選択される単離されたZcyto７ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号15〜25により規定されるアミノ酸配列において、該アミノ酸配列のアミノ末端がアミノ酸残基３のアルギニン、アミノ酸残基７のセリン、アミノ酸残基８のリジン、アミノ酸残基10のリジンまたはアミノ酸残基33のメチオニンより始まるように修飾されている請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２，12，14〜25及び36〜42により定義されるアミノ酸配列において、アミノ酸配列の末端が配列番号２のアミノ酸残基179、配列番号14〜25のアミノ酸残基159、配列番号36のアミノ酸残基157、配列番号37のアミノ酸残基153、配列番号38のアミノ酸残基150、配列番号39のアミノ酸残基159、配列番号40のアミノ酸残基157、配列番号41のアミノ酸残基152、配列番号42のアミノ酸残基127に相当するイソロイシンで終止する、請求項10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号28〜35よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１３】
請求項９〜12に記載のペプチドまたはポリペプチドに少なくとも90％、95％または99％同一である単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１４】
請求項９〜12のいずれか１項に記載のポリペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸残基の付加、欠失及び／または置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、請求項９〜12いずれか１項に記載の該ペプチドまたはポリペプチドの生物活性を維持している単離されたペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１５】
請求項９〜14のいずれか１項に記載のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
ヒト以外の動物に請求項９〜14のいずれか１項に記載のペプチドまたはポリペプチドあるいは該ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を接種し、該動物が該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を産生し、該抗体を単離することを含む、請求項９〜14のいずれか１項に記載のペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体の製造方法。
【請求項１７】
該抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかである請求項15に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項15又は17に記載の抗体の抗体断片、単鎖抗体またはヒト型化抗体。
【請求項１９】
前記アフィニティータグが免疫グロブリンFcポリペプチドである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがアフィニティータグを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記アフィニティータグが免疫グロブリンFcポリペプチドである、請求項20に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
更にアフィニティータグを更に含む、請求項９〜11のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記アフィニティータグが免疫グロブリンFcポリペプチドである、請求項22に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
キャリアーポリペプチドまたはその他のキャリアー分子と融合している請求項12に記載のペプチドまたはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
多細胞生物の細胞増殖及び分化はホルモン及びポリペプチド性成長因子によりコントロールされている。これらの拡散性分子は細胞が互いに連絡しあい、協調して細胞と器官の形成に作用し、損傷を受けた組織の修復と再生を行うことを可能にする。ホルモンと成長因子の例は、ステロイドホルモン（例えば、エストロゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、濾胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（BGF）、顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、エリスロポイエチン（EPO）及びカルシトニンを含む。
ホルモン及び成長因子は蛋白質と結合して細胞の代謝に影響する。蛋白質は第二メッセンジャー系の様な細胞内のシグナル伝達経路とリンクした膜組み込み蛋白質であろう。その他のクラスの蛋白質は転写因子の様な可溶性分子であろう。
特に興味深いものは、細胞の増殖及び／または分化を促進するサイトカインである。サイトカインの例には、赤血球細胞の発達を刺激するエリスロポイエチン（EPO）、巨核細胞系列の細胞の発達を刺激するスロンボポイエチン（TPO）、及び好中球の発達を刺激する顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）がある。これらサイトカインは貧血またはガンのために化学療法を受けている患者の血液細胞のレベルを正常に戻すのに有益である。これらサイトカインのin vivoで示された活性から、その他のサイトカイン、サイトカイン  アゴニスト、及びサイトカインアンタゴニストに大きな臨床的可能性と要請を示された。
発明の要約
本発明は、サイトカイン様因子７と呼ばれ、今後はZcyto７と称する新規ポリペプチド及びその関連成分ならびに方法を提供することにより、上記の要請に応えるものである。
即ち、本発明の一つの観点は、次のアミノ酸配列を有する単離されたZcyto７ポリペプチドを提供することである。ヒトおよびマウスのcDNAは共に発見された。ヒトの配列は配列番号１及び２に定義される。マウスのヌクレオチド及びアミノ酸配列は配列番号１１及び１２に定義される。
配列番号１のヌクレオチド配列は、配列番号１及び配列番号２に見られるように、最初のMetを持つ約180アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。推定シグナル配列はアミノ酸残基１〜２０を含み、残りの推定の推定成熟Zcyto７ポリペプチドはアミノ酸残基２１から伸びるアミノ酸配列であり、グルタミンからアミノ酸残基180のフェニルアラニンを含み、同様に配列番号１４にも示されている。ペプチドマッッピングデータが示すところによれば、成熟Zcyto７は、配列番号３６にも定義されている、配列番号２のアミノ酸残基２３のアルギニンからアミノ酸残基180に達するアミノ酸配列；配列番号３７にも定義されている、配列番号２のアミノ酸残基２７セリンからアミノ酸残基180までを含むアミノ酸配列；配列番号３８にも定義されている、配列番号２のアミノ酸残基３０リジンからアミノ酸残基180までを含むアミノ酸配列；配列番号４１にも定義されている、配列番号２のアミノ酸残基２８のリジンからのびアミノ酸残基180までを含むアミノ酸配列；並びに配列番号４２にも定義されている、配列番号２のアミノ酸残基５３のメチオニンからアミノ酸残基180までを含むアミノ酸配列を含む、複数のＮ末端成熟変種があることを示している。Ｃ末端に観察された唯一の開裂は180に位置するフェニルアラニンで、開裂により外される。この開裂は、例えば配列番号４３に示す様な、上記規定の成熟Zcyto７ポリペプチド全てに起こり得る。その他のヒトZycyto７の変種は配列番号１５〜２５に規定される。別の実施態様では、該ポリペプチドは親和性タグを含む。
配列番号１１及び１２は、配列番号３９によっても定義されている、アミノ酸残基２１のヒスチジンからアミノ酸残基180のフェニルアラニンまで；あるいは別のスプライス部位として配列番号４０にも定義される、アミノ酸残基２３アルギニンからアミノ酸180までを含む成熟蛋白である成熟Zcyto７を定義している。本発明はまた、上に定義するZcyto７ポリペプチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。
本発明の別の実施態様は、上記のアミノ酸配列を有するZcytoポリペプチドのエピトープ部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明には、上記の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのエピトープを含むポリペプチドも含まれるが、本発明のZcyto７ポリペプチドのエピトープ部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは少なくとも９個、好ましくは１５個、より好ましくは３０から５０個のアミノ酸を有する上記ポリペプチドを含む。該ポリペプチドの例は、配列番号２５〜３５のアミノ酸配列により規定される。また別のポリペプチドまたはキャリアー分子と融合したこれらポリペプチドも特許請求される。
本発明はさらに、該ポリペプチドのアミノ末端が修飾され、アミノ酸残基３のアルギニン、アミノ酸残基７のセリン、アミノ酸残基８のリジン、アミノ酸残基１０のリジンまたはアミノ酸残基３３のメチオニンのいずれかから始まる配列番号１５〜２５に定義するポリペプチドを含む。
本発明はさらに、ポリペプチドが配列番号２，１２，１４〜２５及び３６〜４２に規定されるポリペプチドを含み、ここでアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基179のイソロイシン、配列番号３６ではアミノ酸残基157に相当し、配列番号３７ではアミノ酸残基153に相当し配列番号３８のアミノ酸残基150に相当し、配列番号３９ではアミノ酸残基159に相当し、配列番号406ではアミノ酸残基157に相当し、配列番号４２ではアミノ酸残基152に相当し、配列番号４２ではアミノ酸残基127に相当する、配列番号１４〜２５のアミノ酸残基159、で終止する。
本発明はさらに１つまたはそれより多くアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、該ペプチドまたはポリペプチドの生物活性を維持している上記ペプチドまたはポリペプチドの単離されたペプチドまたはポリペプチドを含む。
本発明の別の観点では、本質的にペプチド結合により連結された第一部分と第二部分を含むキメラポリペプチドが提供される。キメラポリペプチドの第一の部分は実質的には（ａ）上記Zcyto７ポリペプチドと（ｂ）上記ポリペプチドの対立遺伝子変種から成る。本キメラポリペプチドの第二部分は実質的にアフィニータグの様な別のポリペプチドから成る。ある実施態様では、アフィニティータグは免疫グロブリンＦｃポリペプチドである。本発明はまたキメラポリペプチドをコードする発現ベクター及びキメラポリペプチドを産生するトランスフェクトされた宿主細胞も提供する。
本発明の別の観点は、（ａ）上記Zcyto７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１４〜４０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
本発明の別の実施態様は、上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも９０％同一であり、より好ましくは９５％、９７％、９８％、あるいは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。本発明の別の核酸実施態様はZcyto７ポリペプチドのエピトープ部分のアミノ酸を有する単離された核酸分子である。
本発明の別の観点は、（ａ）転写プロモーター、（ｂ）上記ポリペプチドをコードするDNA断片及び（ｃ）転写ターミネーターを含み、該プロモータ、DNA断片、ターミネーターが作用可能に連結している発現ベクターを提供することである。
本発明の第三の観点は、上記の発現ベクターが導入されている培養真核生物細胞であって、DNA断片にコードされた蛋白ポリペプチドを発現するものを提供することである。
本発明の別の実施態様は、上記Zcyto７ポリペプチドに対し特異的に結合する単離された抗体である。Zycto７ポリペプチド又はZyctyo７エピトープを有するポリペプチドを動物に接種し、動物が該ポリペプチドに対する抗体を産生し、該抗体を単離することを含む、Zyto７ポリペプチドに結合する抗体を製造するための方法も特許請求される。
本発明のこれら観点および別の観点は以下詳細な説明を参照することで明らかになるだろう。
発明の詳細な説明
本書に引用される全ての参照物の教示は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書において、“アフィニティータグ”という語は、第二ポリペプチドの精製と検出の為に提供される、あるいは基質に対する第二ポリペプチドの付着の為の部位を提供する、第二のポリペプチドに結合できるポリペプチド断片を意味している。原則的には、抗体またはその他の特的結合剤が利用できるペプチドまたは蛋白はアフィニティータグとして利用することができる。アフィニティータグにはポリヒスチジントラクト、プロテインＡ［Nilssonら、EMBO J. ４：1075（1985）；Nilssonら、Methods Enzymol. 198：３（1991）］、グルタチオンＳトランスフェラーゼ［SmithとJohnson, Gene 67：31（1998）］、Glu-Gluアフィニティータグ［Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82：7952-4（1985）］、サブスタンスＰ、FLAGTMペプチド（Hoppら、Biotechnology ６：1204-10）1988）、ストレプトアビジン結合ペプチド、あるいはその他の抗原性エピトープあるいは結合ドメインを含む。一般にはFordら、Protein Expression and Purification ２：95-107（1991）を参照。アフィニティータグをコードするDNAsは市販されている（例えばPharmacia Biotech, Piscataway、NJ）。
“対立遺伝子バリアント”とは、同一染色体遺伝子座を専有する１つの遺伝子に１つ以上ある別の型のいずれかを意味する。対立遺伝子変種は天然には突然変異により生じ、集団内に表現形の多形を起こすことがある。遺伝子変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化を生じない）か、別のアミノ酸配列をコードを有するポリペプチドをコードする。ここでは、対立遺伝子バリアントは遺伝子の対立遺伝子変種によりコードされた蛋白質を表す目的でも利用される。
“発現ベクター”という語は、転写のために提供される追加の断片と作用可能な状態に連結した所望のポリペプチドをコードする断片を含む、線状または環状のDNA分子を意味する。この様な追加の断片は、プロモーター及びターミネーター配列を有し、１つ以上の複製起源、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を作用可能に含んでいる。発現ベクターは一般にはプラスミドまたはウイルスDNAに由来し、あるいは両エレメントを含む。
“単離された”という語は、ポリヌクレオチド分子に適用する場合には、そのポリペプチドが天然の遺伝的環境から取り出され、従ってその他外来性あるいは不要のコード配列を含まず、そして遺伝子工学的な蛋白生産系内での使用に好適な形状にあることを意味する。この様な単離された分子は、その天然環境から分離されたcDNA及びゲノムクローンを含むものである。本発明の単離されたDNA分子は、通常はそれに伴うその他の遺伝子を含まないが、プロモーターやターミネーターの様な天然に存在する５’および３’非翻訳領域を含む。関連領域の特定は当業者に明白であろう。例えば、Dynan及びTijan、Nature 316：774-78（1985）を参照のこと。蛋白に用いられる場合には、“単離された”と言う語は、その蛋白質がその元々の環境以外の状態、例えば血液や動物組織から分離された状態にあることを意味する。好適な形状では、単離された蛋白質は実質的にその他の蛋白質、特に動物起源のその他の蛋白質を含まない。より純化された形状の蛋白質、即ち純度が９５％以上の蛋白を提供することが好ましく、より好ましくは純度９９％以上である。
“作用可能に連結した”という語は、DNA断片を参照する場合には、その断片が意図する目的に関して機能する様に配置されていること、即ちプロモーターより転写が開始し、コーディング域からターミネーターまで進むことを意味している。
“ポリヌクレオチド”とは、５’から３’末端に読まれるデオキシリボニクレオチドまたはリボヌクレオチドの単鎖あるいは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはRNA及びDNAを含み、そして天然より単離され、in vitro合成され、又は天然と合成分子の組み合わせより調製される。
“ポリヌクレオチド分子の相補体”という語は、参照配列に比べた時、相補的な塩基配列で逆の配向を有するポリヌクレオチド分子を表す。例えば、配列５’ATGCACGGG ３’は５’CCCGTGCAT ３’に相補的である。
“縮重酸配列”という語は、１つ以上の縮重したコドン（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比べて）を含むヌクレオチド配列を表す。縮重コドンは異なるトリプレットヌクレオチドを含むが、同一のアミノ酸残基をコードする（例えば、GAUとGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
“プロモーター”という語は、RNAポリメラーゼが結合し、転写を開始するために提供されるDNA配列を含む遺伝子の一部を表す。プロモーター配列は一般的には遺伝子の５’非翻訳域にあるが、必ずしもそうではない。
“二次シグナル配列”という語は、より大きなポリペプチドの構成成分の一つとして、より大きなポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路を通過させるポリペプチド（分泌ポリペプチド）をコードするDNA配列を意味る。通常、分泌経路を移動中に、この大きなポリペプチドは開裂し分泌ポリペプチドが除かれる。
“レセプター”という語は、生体活性分子（即ちリガンド）に結合し、細胞にリガンドの作用を伝達する細胞関連蛋白を意味する。膜結合レセプターは、シグナル伝達に典型的に含まれる細胞外リガンド結合ドメインや細胞内エフェクタードメインを含む複数のドメイン構造により特徴付けされる。レセプターへのリガンドの結合の結果、レセプターに立体構造変化が起こり、細胞内のエフェクタードメインとその他の分子の間に相互作用が起こる。この相互作用は細胞の代謝に変化をもたらす。レセプター−リガンド相互作用と結び付く代謝事項には遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの移動、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解が含まれる。多くの核レセプターは、アミノ末端、トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメインを含む複数ドメイン構造も有している。一般に、レセプターは膜結合型で細胞質又は核にある、単量体（例えば甲状腺刺激ホルモンレセプター、ベータアドレナリン作動性レセプター）または多量体（例えば、PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、ＩＬ−３レセプター、ＧＭ−CSFレセプター、Ｇ−CSFレセプター、エリスロポイエチンレセプター及びＩＬ−６レセプター）である。
“相補体／抗相補体対”という語は、適当な条件の下非共有結合的に結合し、安定した対を形成する非同一成分を意味する。例えば、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジ）は相補体／構想補体対の基本メンバーである。その他の相補体／抗相補体対の例としては、レセプター／リガンド対、抗体／抗原（あるいはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンス−ポリヌクレトヂド対等が含まれる。引き続いて相補体／抗相補体対の解離が望まれる場合には、相補体／抗相補体対の結合親和性が＜１０9Ｍ-1であることが好ましい。
“可溶性蛋白質”とは細胞膜に結合しない蛋白ポリペプチドである。
本発明の好適な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは厳密条件下に配列番号１のDNA又はその相補的配列の同様の大きさの領域にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は規定のイオン強度とｐＨに於ける特異配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度が選ばれる。Ｔｍは、標的となる配列の５０％が、それに完全に適合したプローブとハイブリダイズする温度である（特定のイオン強度とｐＨで）。典型的なストリンジェント条件は、ｐＨ７の塩濃度が約0.02Ｍ以下であり、温度は少なくとも約６０℃である。上記の如く、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNA及びRNAを含む。DNAとRNAを単離する方法は当業者公知である。全RNAはグワニジンHCl抽出後、CsCl勾配中に遠心分離することで調整することができる［Chirgwinら、Biochemistry 18：52-94（19874）］。ポリ（Ａ）+RNAは全RNAからAvivとLeder、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：1408-142（1972）の方法を利用して調整される。相補的DNA（cDNA）は公知の方法を利用してポリ（Ａ）＋RNAから調整される。次いで、例えばハイブリダイゼーションまたはPCRを利用してZcyto７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特定し、単離される。
さらに、本発明のポリヌクレオチドはDNA合成装置を利用して合成することができる。現在、選択される方法はフォスフォルアミダイト法である。遺伝子または遺伝子断片の合成の様な応用に化学合成された二重鎖DNAが必要な場合には、各相補鎖は別々に合成される。短い遺伝子の製造（６０ないし８０ｂｐ）は技術的には直接実施でき、そう補鎖を合成しそれからアニーリングすることで達成できる。しかし、より長い遺伝子の場合（＞300ｂｐ）には化学的なDNA合成のサイクルの連結効率が100％にはならないことから、特別な方策をたてる必要がある。この問題を解決するためには、合成遺伝子（二重鎖）を長さが２０から100ヌクレオチドの単鎖断片を集つめてモジュラー型を形成する。この蛋白をコードする配列以外に、クローニングベクタの制限エンドヌクレアーゼ内への挿入を行うためのターミナル配列と適切な転写および翻訳の開始と終止のためのシグナルを含む配列を含めた合成遺伝子を設計することができる。
Glick、Bernard RとJack J、Pasterak、組換体DNAの原理と応用（Molecular Biotechnology、Principle & Applications of Recombinat DNA）（ASM Press, Washington, D.C. 1994）、Itakura, Kら、合成オリゴヌクレオチドの合成と応用（Sytnethesis and use of synthetic oligonucleotides）Annu. Rev. BIoche,. 53：323-356（1984）とClimie、Sら、チミジン化合成酵素遺伝子の化学合成（Chemical synthesis of the thymidylate synthase genb）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：633-637（1990）参照。
当業者は配列番号１及び２に開示された配列がヒトの単一対立遺伝子を表すことを認識するだろう。様々な位置で開裂するリーダー配列を有する数多くの天然の成熟Ｎ末端変種が存在する。これらには、配列番号１４，３６，３７及び３８に定義される配列が含まれる。これら配列の対立遺伝子変種は標準的な方法により、様々な個人のcDNAまたはゲノムライブラリーを作製することでクローン化することができる。ヒトZctyo７のバリアントの例は配列番号１５〜２５のポリペプチドにより示される。
マウスZcyto７のcDNA及び蛋白は配列番号１１及び１２により開示される。マウスZcyto７ポリペプチドは配列番号３９及び４０により定義される。
本発明はさらに他の種の対応するタンパク質及びポリヌクレオチドを提供する（“種オルソログ”（Specles orthologs））。特に興味深いものには、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマやその他の霊長類を含む哺乳動物種に由来するZcyto７ポリペプチドである。ヒトZcyto７蛋白の種オルソログは、通常のクローニング技術と組み合わせた本発明により提供される常法及び成分を利用し、クローニングすることができる。例えば、cDNAは蛋白質を発現する組織または細胞から得たmRNAを利用しクローニングできる。好適なmRNA源はここに開示した配列より設計されるプローブを利用したノーザンブロトのプロービングにより特定できる。つぎに陽性組織または細胞株のmRNAよりライブラリーを調製する。それから完全な又は部分的なヒトもしくはマウスのcDNAによる、あるいは開示される配列に基づく縮重プローブあるいはそのセットによる、プロービングの様な各種方法を利用して、蛋白をコードしているDNAを単離することができる。cDNAはここに開示した配列より設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法、またはPCR（Mullis、米国特許番号4,683,202号）によってもクローン化できる。その他の方法では、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質導入あるいはトランスフェクションすることができ、所望のcDNAの発現を蛋白に対する抗体で検出することができる。同様の技術はゲノムクローンの単離に応用することもできる。使用されそして特許請求される場合、“ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドで、該ポリペプチドが配列番号２により規定される”という語には配列番号２のポリペプチドの全ての対立遺伝子バリアント及び種オルソログを含む。
本発明は、配列番号２の蛋白ポリペプチド及びその種オルソログの実質的相同体である単離された蛋白ポリペプチドも提供する。“単離された”と言う語は、その蛋白質またはポリペプチドがその元々の環境以外の状態、例えば血液や動物組織から分離された状態にあることを意味する。好適な形状では、単離されたポリペプチドは実質的にその他の蛋白質、特に動物起源のその他の蛋白質を含まない。より純化された形状のポリペプチド、即ち純度が９５％以上のポリペプヂドを提供することが好ましく、より好ましくは純度９９％以上である。ここに使用される“実質的相同体”という語は、配列番号２に示された配列、またはその種オルソログに５０％、好ましくは６０％、より好ましくは少なくとも８０％同一の配列を有するポリペプチドを意味する。これらポリペプチドは配列番号２あるいはその種オルソログに少なくとも９０％同一であることがより好ましく、最も好ましくは９５％以上同一である。配列の同一％は通常の方法うにより決定される。例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48：603-616（1986）とHenikoffとHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919（1992）を参照せよ。略記すると、２種類のアミノ酸配列をギャップオープニングペナルティーを１０とし、ギャップエクステンションペナルティーを１そして“HenikoffとHenikoff（上記）の“ブロッサム６２”スコアリングマトリックスを利用して表２に示すようにアラインメントスコアが最大になるように並べる（アミノ酸は通常の１文字コードで示されている）。％同一性は次のように計算される；
0004216343.tif 000002
0004216343.tif 000003
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は上記開示の比率を利用して同様の方法により決定される。
実質的に相同な蛋白及びポリペプチドは１つあるいはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することで特徴付けされる。これらの変化は、保存的なアミノ酸置換（表３参照）や蛋白あるいはポリペプチドの活性保持に実質的に影響しない置換；典型的には１ないし約３０アミノ酸までの小さな欠失；並びにアミノ又はカルボキシ末端への短い延長、例えばアミノ末端へのメチオニン残基、約２０〜２５残基までの短いリンカーペプチド、又は精製を容易にするための短い延長例えばポリ−ヒスチジントラクト、プロテインＡ［Nissonら、EMBO J. ４：1075（1985）；Nissonら、Methods Enzymol. 198；３（1991）］、グルタチオンＳトランスフェラーゼ［SmithとJohnson、Gene 67：31,（1988）］又はその他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインによる延長のごとき軟微な変更である。一般にはFordら、蛋白発現と精製２（Protein Expression and Purification ２：95-107（1991．親和性タグをコードするDNAsは市販されている（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を参照のこと。
0004216343.tif 000004
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン−スキャンニング突然変異誘発法［CunninghamとWells, Science 244：1081-1085；Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4498-4502（1991）］のごとき当業者公知の方法で特定することができる。後者の技術では、１個のアラニン変異を分子の全ての残基に導入し、得られた変異分子について生物活性（例えばリガンド結合やシグナル伝達）を調べて、分子の活性に重要なアミノ酸残基を特定する。リガンド−蛋白相互作用部位はまた、核磁気共鳴、結晶学あるいは光親和性標識法といった技術により決定された結晶構造の分析から決定することもできる。Voeら、Science 255；306-312（1992）；Smithら、J. Mol. Biol. 224：899-904、1992；Wlodaverら、FEBS Lett. 309：59-64（1992）参照。必須アミノ酸は、関連蛋白との相同性解析からも推論することができる。
Reidhaar-OlsonとSauer、Science 241：53-57（1988）、又はBowieとSauer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2152-2156（1989）に開示されている様な既知の突然変異誘導法を利用すると、複数の突然変異を誘導し試験することができる。略記すると、これら著者らはポリペプチド中に２ヶ所以上の場所を同時に無作為化（randomize）し、機能性ポリペプチドを選択し、ついで変異したポリペプチドの配列を解析することにより各場所に許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。別の利用可能な方法としてはファージディスプレー法、例えばLowmanら、Biochem. 30：10832-10837（1991）；Ladnerら、米国特許番号5,223,409；Huse, WIPO公開番号WO/92/06204号）や領域特的変異導入法、Derbyshireら、Gene 46：145（1986）；Nerら、DNA ７：127（1988）がある。
上記開示した突然変異誘発法を高処理能力スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞内のクローン化された、変異した蛋白質の活性を検出することができる。これに関する好適なアッセイは細胞増殖アッセイと以下に記すバイオセンサーを基本にしたリガンド結合アッセイを含む。活性蛋白質またはその一部（例えばリガンド結合断片）をコードする突然変異誘発されたDNA分子を宿主細胞から回収し、すぐに装置により配列解析を行う。これらの方法により、所望のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定し、未知の構造のポリペプチドに応用することができる。
上記の方法を利用し、当業者は配列番号２又はその対立遺伝子バリアントに実質相同であり、野生型蛋白質の特性を保持する各種ポリペプチドを調製することができる。個々に表し、特許請求されている様に、”配列番号２に定義されたポリペプチド”には、ポリペプチドの全ての対立遺伝子バリアントと種オルソログを含む。
本発明の別の実施態様は、本発明のポリペプチドのエピトープ部位を含むペプチド又はポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは本発明のポリペプチドの免疫原性あるいは抗原性エピトープである。抗体が結合できる蛋白部分は“抗原性エピトープ”と定義される。例えばGeysen, H.Mら、Proc. Natl. Acad Aci. USA 81；3998-4002（1984）を参照。
抗原性エピトープを有するペプチドあるいはポリペプチド（即ち、抗体が結合できる蛋白分子の部分を含む）の選択法として、蛋白質の配列の一部を模した比較的短い合成ペプチドを利用して、部分的に模した蛋白と反応する抗血清を誘導することができることは当業者公知である。Sutcliffe, J.Gら、Science 219；660-666（1983）参照のこと。蛋白反応性血清を誘導できるペプチドはしばしば蛋白の一次配列で表現され、簡単な化学的規則のセットによって特徴付けることができるものであり、未変性蛋白質の主要免疫領域（即ち、免疫原性エピトープ）又はアミノ末端もしくはカルボキシル末端に限定されるものではない。極端に疎水性であるポリペプチド、ならびに残基数が６以下のポリペプチドは一般に模倣蛋白に結合する抗体の誘導には効果が無い；より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むものが通常効果的である。
従って、本発明の抗原性エピトープを有するペプチドとポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体の生産に有効である。本発明の抗原性エピトープを有するペプチドとポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれるアミノ酸を少なくとも９つ、好ましくは１５ないし約３０の間の数含む。しかし、本発明のアミノ酸配列の一部を含み、３０ないし５０のアミノ酸を含むか、あるいは本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さを含むペプチドまたはポリペプチドも蛋白と反応する抗体の誘導に有用である。好ましくはエピトープを持つペプチドのアミノ酸配列は、実施的に水性溶媒中に溶解性を提供するものが選択される（即ち、相対的に親水性の残基を含む配列で、疎水性残基を避けることが好ましい）；及びプロリンを含む配列は特に好ましい。配列表に示すポリペプチドの全ては本発明により使用される抗原性エピトープを含むが、特に設計された抗原性エピトープは配列番号２７〜３５により定義されるペプチドを含む。
本発明のポリヌクレオチド、一般にはcDNA配列は、上記のポリペプチドをコードしている。本発明のポリペプチドをコードするcDNA配列は一連のコドンから成り、該ポリペプチドの各アミノ酸残基は１コドンによりコードされ、そして各コドンは３つのヌクレオチドより成る。アミノ酸残基はそれぞれ次の様なコドンによりコードされる。
アラニン（Ala）はGCA, GCC, GCG又はGCTによりコードされ；
シトシン（Cys）はTGCまたはTGTによりコードされ；
アスパラギン酸（Asp）はGACまたはGATによりコードされ；
グルタミン酸（Glu）はGAAまたはGAGによりコードされ；
フェニルアラニン（Phe）はTTCまたはTTTによりコードされ；
グリシン（Gly）はGGA, GGC, GGGまたはGGTによりコードされ；
ヒスチジン（His）はCACまたはCATによりコードされ；
イソロイシン（Ile）はATA, ATCまたはATTによりコードされ；
リジン（Lys）はAAAまたはAAGによりコードされ；
ロイシン（Leu）はTTA, TTG, CTA, CTC, CTGまたはCTTによりコードされ；
メチオニン（Met）はATGによりコードされ；
アスパラギン（Asn）はAACまたはAATによりコードされ；
プロリン（Pro）はCCA, CCC, CCGまたはCCTによりコードされ；
グルタミン（Gln）はCAAまたはCAGによりコードされ；
アルギニン（Arg）はAGA, AGG, CGA, CGC, CGGまたはCGTによりコードされ；
セリン（Ser）はAGC, AGT, TCA, TCC, TCGまたはTCTによりコードされ；
スレオニン（Thr）はACA, ACC, ACGまたはACTによりコードされ；
バリン（Val）はGTA, GTC, GTGまたはGTTによりコードされ；
トリプトファン（Trp）はTGGによりコードされ；そして
チロシン（Tyr）はTACあるいはTATによりコードされる。
本発明によれば、cDNAが上記の如く特許請求される場合には、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、ならびに対応する水素結合によりアニールされたセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を有する二本鎖としてのDNAについてクレームされていると理解される。また、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）、そして上記cDNAによりコードするmRNAも特許請求されてる。メッセンジャーRNA（mRNA）は、チミンヌクレオチド（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換される以外は上記と同じコドンを用いてポリペプチドをコードする。
完全長蛋白質、蛋白断片（例えばレセプター結合断片）及び融合ポリペプチドを含む本発明の蛋白ポリペプチドは通常の技術により遺伝子に操作され宿主細胞中で産生することができる。好適な宿主細胞は、外来性のDNAにより形質転換された、あるいはトランスフェクトされ、培養中に増殖するタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞、高等真核生物細胞を含む。真核生物細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好適である。クローン化DNA分子の操作するための技術及び外来性DNAを各種宿主細胞に導入するための技術はSambrookら、Moolecular Cloning：A Laboratory Manual,（第２版）（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY, 1989）とAusubelら、上記に開示されている。
一般には発現ベクター内では、Zcyto７ポリペプチドをコードするDNA配列は、転写プロモーター及びターミネイターを含み、その他の発現に必要な遺伝子エレメントと作用可能な状態に連結している。当業者は、特定のシステムでは選択可能なマーカーが別のベクター上で提供されることもあり、外来性のDNAの複製が宿主細胞ゲノム内に組み込まれて提供されてもよいと認識するであろうが、ベクターはまた一般には１つまたはそれより多くの選択マーカー、及び１つまたはそれより多くの複製開始点を含む。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及びその他のエレメントの選択は当業者のレベル内の通常の作業である。これらエレメントの多くは文献に記載されており、また販売会社より入手可能である。
Zcyto７ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列とも、プレポロ配列あるいはプレ配列としても知られる）が発現ベクター内に提供される。分泌シグナル配列は、その蛋白のシグナル配列であり、又は別の分泌される蛋白に由来する（例えばｔ−ＯＡ）かあるいは新たに合成されたものである。分泌シグナル配列はZcyto７ DNA配列と正確な読みとり枠内に結合される。特定のシグナル配列は所望のDNA配列中の別の場所に位置することもあるが、通常分泌シグナル配列は所望のポリペプチドをコードするDNA配列の５’に位置している（例えばWelchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照）。
本発明では培養哺乳動物細胞が好適な宿主である。外来性DNAを哺乳動物宿主細胞内に導入するための方法には、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、Wiglerら、Cell 14：725（1978）；CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics ７：603（1981）GrahamとVan der Eb、Virology 52：456（1973）、エレクトロポレーション法、Neumannら、EMBO J. １：841-845（1982）、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション法、Ausubelら、編集、Current Protocols in Molecular Biology（John WileyとSons、Inc., NY, 1987）とリポソーム介在トランスフェクション（Hawley-Nelsonら、Focus 15：73（1993）；Ciccaroneら、Focus 15：80（1993）を含む。培養哺乳動物細胞内での組換え体ポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；とRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。好適な培養哺乳動物細胞は、COS−１（ATCC番号CRL1650）、COS−７（ATCC番号、CRL1651）、BHK（ATCC番号CRL1550）BHK570（ATCC番号CRL10314）、293（ATCC番号CRL1573；Grahamら、J. Gen. Virol. 36：59-72（1977））とチャイニーズハムスター卵巣（例えばCHO−KA；ATCC番号CRL61）細胞株を含む。別の好適な細胞株は当業者公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Marylandの様な公的保存施設より入手できる。一般に、SV40またはサイトメガロウイルスのプロモーターの様な強力な転写プロモーターが好適である。米国特許第4,956,288号を参照。その他の公的なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（米国特許第4,579,821号や4,601,978号）とアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。
一般に薬剤選択は、外来DNAを挿入された培養哺乳動物細胞の選択に利用される。この様な細胞は通常は“トランスフェクタント”と呼ばれる。細胞は選択薬剤存在下に培養され、所望の遺伝子をその子孫に伝えることができるものは“安定なトランスフェクタント”と呼ばれる。好適な選択マーカーは抗生物質であるネオマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子である。選択はＧ−418等のネオマイシン型薬剤の存在下に行われる。選択システムを利用して、所望の遺伝子の発現レベルを増加する、“増幅”と呼ばれる工程も実施できる。増幅は、トランスフェクタントを低レベルの選択薬剤存在下に培養し、続いて選択薬剤の量を増加し導入遺伝子の産物を高いレベルで産する細胞を選択することで行われる。好適な増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、本酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する。他の薬剤耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も利用できる。
昆虫細胞、植物細胞、鳥細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として利用できる。昆虫細胞の形質導入と外来ポリペプチドの産生はGuarinoら、米国特許第5,162,222号；Bangら、米国特許第4,775,624号とWIPO公開番号WO94/06463に開示されている。Agrobacteriumrhizogenesの植物細胞での遺伝子発現ベクターとして利用はSinkarら、J. Biosci（Ganalore）11：47-58（1987）にレビューされている。
酵母細胞を含む真菌細胞、特にSaccharomyces属もまた、本発明による蛋白断片またはポリペプチド融合体産生のための利用できる細胞である。酵母細胞を外来DNAより形質転換し、それより組換え体ポリペプチドを産生することは、例えばKawasaki、米国特許第4,593,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Wlchら、米国特許第5,037,743号とMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換細胞は選択可能マーカー、通常は薬剤耐性または特定栄養素欠乏下（例えばロイシン）での増殖能により決定される。酵母での利用に好適なベクター系はKawasakiら、米国特許第4,931,373に開示されたPOT１ベクター系で、形質転換された細胞はグルコース含有培地中での増殖により選択される。酵母での利用に好適なプロミーターとターミネイターは、糖分解酵素遺伝子（例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；とBitter、米国特許第4,977,092号）とアルコール脱水素酵素遺伝子を含む。米国特許第4,990,446；5,063,154；5,139,936と4,661,454号を参照。Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kouyveromyces lactis、Kluyveromyces gragilis、Ustilago maydis、Pichia pastoris, Pichiamethanolica, Pitchia guillermondiiとCandida maltosaを含む他の酵母のための形質転換系は当業者公知である。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132：3459-3465（1986）とCregg、米国特許第4,882,279号を参照。Aspergillus細胞はMcKnightら、米国特許第4,935,349号の方法により利用できる。Acremonium chrysogenumを形質転換する方法はSuminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。Neurosporaを形質転換する方法はLabmowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。
形質転換あるいはトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養素と選択された宿主細胞の増殖に必要なその他の成分を含む培養培地中に、通常の方法に従い培養される。限定培地や複合培地を含む各種好適な培地は当業者公知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸とミネラルを含む。培地はまた、成長因子あるいは血清を必要に応じて含むことがある。一般に成長培地は、例えば発現ベクター上に運ばれる、あるいは宿主細胞内にコトランスフェクトされた選択可能なマーカーによって補われる薬剤選択または必須栄養素の欠損によって、外来性のDNAを含む細胞を選択する。
本発明の一つの観点では、新規多パク質は培養細胞により産生され、この細胞は天然レセプターならびに天然リガンドのアゴニストとアンタゴニストを含む蛋白に対するレセプターのスクリーニングに利用される。
蛋白単離：
発現した組み換え体ポリペプチド（あるいはキメラポリペプチド）は、分画及び／又は通常の精製法及び媒体を利用して精製することができる。硫安沈殿法及び酸又はカオトロープ抽出はサンプルの分画法に利用できる。代表的な抽出ステップは、ヒドロキシアパタイト、分子量排除、FPLCや逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むだろう。好適な陰イオン交換媒体は誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊珪素等を含む。PEI, DEAE, AQEやＱ誘導体も好適であり、DEAE高速セファロース（Pharmacia、Piscataway. NJ）は特に好適である。代表的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル−セファロースＦＦ（Pharmacia）、トヨパールブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−セファロース（Pharmacia）等の様なフェニル、ブチル、オクチル基で誘導された媒体であり、あるいはAmberchrom CG71（Toso Hass）等のポリアクリル樹脂を含む。好適な固相支持体はガラスビーズ、ケイ酸をベースとした樹脂、セルロース樹脂、アガロース樹脂、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂等の使用時の条件下で不溶性であるものである。これら支持体は反応基により修飾され、アミノ基、カルボキシル基、スルフィジル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分により蛋白質を結合することができる。結合化学の例は、ブロモシアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポシド活性化、スルフィジル活性化、ヒドラザイド活性化及び、カルボジイミド結合化学の為のカルボキシルおよびアミノ誘導体がある。これらならびにその他の固相媒体は当業者公知であり広く利用されている。支持体へのレセプターポリペプチドの結合方法は当業者公知である。特定の方法の選択は通常の事項であり、選択される支持体の特性によりその一部は決定される。例えばアフィニティークロマトグラフィー（A ffintiy Chromatography）：Principles & Methods（Pharmaica LKB BIotechnology、Uppsala, Sweden, 1988）を参照のこと。
本発明のポリペプチドはその特性を探索することで単離することができる。例えば、固相化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーを利用して、ヒスチジンに富む蛋白質を精製することができる。略記すると、ゲルにまず２価の金属イオンを加えてキレートを形成する［E. Sulkowaski, Trends in Biochem. ３：1-7（1985）］。ヒスチジンに富む蛋白質は使用した金属イオンの種類に応じて様々な親和度でこのマトリックスに吸着し、競合的溶出液、ｐＨの低下、あるいは強キレート剤の使用により溶出されるだろう。その他の精製方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーによる糖蛋白の精製を含む［Methods in Enzymol., Vol. 182：529-39、“蛋白精製の指針”、M. Deutacher、（編）.（Acad. Press. San Diego、1990］。あるいは所望のポリペプチドと親和性タグの融合体（例えばポリヒスチジン、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）を構築して、精製を容易にすることができる。さらに、分泌されたレセプターポリペプチドの精製を促すために、ポリヒスチジンタグ、素不スタンスＰ、PLAGRペプチド［Hopeら、Bio/Technology ６：1204-1210（1988）；Eastman Kodak Co., New Haven, CTより入手可能］、Glu-Glu親和性タグ［Grussenmeyerら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82；7952-4（1985）］、あるいは抗体またはその他の特異的結合剤が利用できるためのポリペプチドあるいは蛋白の様なアミノあるいはカルボキシル末端への増設体をZyto７に融合して、精製の補助とすることができる。
利用
Zcyto７の発現のノーザンブロット解析からはZcyto７は脊索に特異的に発現していることが示された。脊髄のin situハイブリダイゼーションからは、この発現が神経と背根神経節に局在することが示された。従って、Zcyto７はグリア細胞または神経を含む脊髄の維持に役割を持つだろう。このことは、Zcyto７が萎縮性側索硬化症（ALS）あるいは多発性硬化症を含む脱ミエリン疾患の様々な神経変性疾患の治療に利用できることを示している。Zcyto７発現の組織特異性は、Zcyto７が脊髄内の成長と／または維持因子であることを示唆している。
Zcyto７遺伝子は第５染色体上に局在していることから、Zcyto７は免疫系の細胞の活性の調整に利用できるサイトカインであることを示している。Zcyto７はまた脊椎中の好中球の化走性物質として利用すこともできる。このことは脊椎中の感染に対する抗感染剤としても有用であろう。さらに脊髄中のその他のサイトカインの制御の助けに利用することもできるだろう。Zcyto７を投与して、Zcyto７と同じ染色体の５ｑ域に局在するCharco-Marie-Tooth（CMT）病の様な末梢神経疾患の治療に利用することもできるだろう。
以下実施例１１及び１２に見られるように、Zcyto７がGAF−３及びＴＦ−１細胞の増殖を阻害するという事実は、Zcyto７が自己免疫疾患の治療にも、そして白血病の様なガンの治療にも利用できることを示す。
本発明はまた、診断応用に利用される試薬も提供する。例えば、Zcyto７遺伝子は脊髄中に強く発現している。Zcyto７ DNAまたはRNAを含む、あるいはその部分配列を含むプローブを利用して、Zcyto７遺伝子が第５染色体上に存在するか、あるいは変異が起きているかを決定することができる。
本発明はまた、有意な治療的価値のある試薬も提供する。Zcyto７ポリペプチド（天然のもの又は組換え体）、その断片、それに対する抗体と抗イディオタイプ抗体、Zcyto７ポリペプチドに対する結合親和性を有するものとして同定された化合物は、例えば癌性状態又は退行性状態の様な異常な増殖を含む異常生理あるいは発生を伴う状態の治療に有用であろう。例えば、Zcyto７ポリペプチドにより異常発現又は異常シグナル伝達を伴う病気あるいは異常は、Zcyto７ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの好適な標的になるだろう。
具体的には、Zcyto７は炎症の治療に利用できる。炎症は感染に対する免疫反応あるいは自己抗原に対する自己免疫反応の結果である。
治療用量をタイトレートし安全性及び有効性を最適化する。投与方法は静脈、腹腔内、筋肉内、硬膜下、髄液内あるいは経皮的投与を含む。薬剤として許容されるキャリアーは水、生理食塩水、緩衝液等を含む。投与範囲は通常は0.1μｇないし１ｍｇ／ｋｇ体重／日と推定される。好ましくは、１μｇないし100μｇ／ｋｇ体重／日である。しかし、通常の技量を有する医師による決定により投与量は増減できる。薬剤処方と用量域の完全は考察については、RemigtonのPharmaceutical Siences、17版.,（Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1990）とGoodman and Gilmanの：ThePharmacological Bases of Therapeutics, ９版（Pergamon Press）を見よ。
骨および軟骨の増殖を促進するためのZcyto７の利用
Zcyto７は実施例７と９それぞれに見られるように、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖を刺激することが発見されている。さらに、Zcyto７はまた実施例８に示す様に軟骨細胞培養体中に存在するグリコサミノグリカンの定常状態レベルも刺激する。即ち、Zcyto７を利用すると様々な治療条件下に骨と軟骨の両方の刺激に利用できる。
Zcyto７は哺乳動物の体内に移植しZcyto７を骨芽細胞に接触せしめ、その結果骨芽細胞の増殖と骨成長を刺激することができる。例えば、Zcyto７をマトリックス［骨形成蛋白質（BMP）有り無しの条件で］内に置くことができる。BMPは間充識性骨芽細胞前駆体の特定部位への移動を誘導し、さらに間充識細胞の骨芽細胞への分化も誘導する。それからZcyto７は骨芽細胞を更に増殖させる。好適なマトリクッスは多孔性材料の粒子より形成される。孔は子孫の細胞の移動と、続く分化と増殖が可能である大きさでなければならない。理想の粒子サイズは７０〜850ｍｍの範囲で、150〜420ｍｍが好ましいい。Zcyto７を含むマトリックスは欠損した骨の形状に合わせて整形することができる。マトリックス材料の例は粒子状の脱塩したグアニジン抽出、種特異的な骨である。その他利用性の高いマトリックス材料には、コラーゲン、グリコール酸と乳酸のホモポリマー及びコポリマー、ヒドロキシアパタイト、リン酸３カルシウム及びその他のリン酸カルシウムが含まれる。Zcyto７は骨芽細胞の増殖を促進するに十分な濃度、好ましくは少なくとも１μｇ／ｍｌマトリックス、でマトリクッス内に適用することができる。Zcyto７の液は直接骨折部位あるいは骨が退行した領域を含む欠損部に注射して、骨折または欠損部位の治癒を促進することもできる。BMPsとマトリックスを利用した操作の例はPCT出願公開第WO92/07073号、公開第WO91/05892号、米国特許第5,645,591号と米国特許第5,108,753号に開示されている。
Zcyto７はさらに個人に対してzcyto７の治療効果量を投与することによる骨粗鬆症の治療にも利用できる。好適は用量は１μｇ Zcyto／ｋｇ体重／日であろう。
上記の如く、Zcyto７を利用して、その軟骨細胞の増殖を刺激する能力により軟骨の産生を促進することができる。Zcyto７は軟骨が成長する部位に直接注射することができる。例えば、Zcyto７は骨リューマチに侵された関節あるいはその他の軟骨が破壊された障害を持つ関節に直接注射することができる。成長のために追加の軟骨を必要とする例としては障害を受けた運動選手の肩や膝がある。
軟骨はまた、まず個人の軟骨細胞を取り出し、この軟骨細胞をZcyto７と培養してこれを増殖させ、それから軟骨の産生を必要とする個人にこの軟骨を移植し戻すことでも増殖できる。
Zcyto７を利用して、歯周病により消失した象牙質あるいは骨の再生を刺激することもできる。この為には、周囲の組織を完全に清浄し、Zcto７の液を象牙質の再生が望まれる部位に投与し、好ましくは注射する。
Zcyto７ポリペプチドに対する抗体を精製し、次にこれを患者に投与することができる。これら試薬は治療の目的のために別の活性あるいは不活性賦形剤、例えば生理学的に、無害である安定化剤と賦形剤と共に医薬品として許容されるキャリアーあるいは希釈液と組み合わせることができる。これら組み合わせば無菌的に濾過し、投与バイアルの中で凍結乾燥することで投与形状に、あるいは安定化溶液調整品として保管することができる。本発明はまた抗体、その結合断片あるいは補体と結合しない形状を含む抗体の単鎖抗体の利用も含む。
効果的治療に必要な試薬量は、投与方法、対象部位、患者の生理的状態、大役品の投与を含む多くのファクターに依存する。従って、治療用量は滴定して安定性と有効性を最適化しなければならない。典型的には、in vitroで使用される用量は、それら試薬のin vivo投与にとって有用な量の有用な指針を提供する。特定の疾患の治療に関する有効量の動物試験は、ヒト向け用量の予測指針も提供するだろう。投与方法は経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、あるいは経皮投与を含む。医薬品として許容されるキャリアーには、水、生理食塩水、緩衝液等が含まれるだろう。投与範囲は通常は１μｇないし1000μｇ／ｋｇ体重／日と推定される。しかし、通常の技量を有する医師による決定により投与量は増減できる。薬剤処方と用量域の完全は考察については、RemigtonのPharmaceutical Siences、17版.,（Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1990）とGoodman and Gilmanの：The Pharmacological Bases of Therapeutics, ９版（Pergamon Press）を見よ。
核酸をベースとした治療法
哺乳度物が変異しあZcyto７遺伝子を持つか、これを欠く場合には、Zcyto７遺伝子を哺乳動物の細胞内に導入することができる。１つの実施態様では、Zcyto７ポリペプチドをコードする遺伝子はウイルスベクター内に導入される。この様なベクターは、単純ヘルペスウイルス（HSV）、パピローマウイルス、エプシュタインバーウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノアソシエイテッドウイルス（AAV）等の弱毒あるいは欠損DNAウイルスを含むが、、もとよりこれに限定されるものではない。ウイルス遺伝子の全部あるいはほとんど全てを欠損した欠損ウイルスが好適である。欠損ウイルスは細胞導入後には感染性ではない。欠損ウイルスベクターの利用は、ベクターが他の細胞に感染することを考慮しないｍ特定の局在部位への細胞投与を可能にする。具体的ベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス１（HSV１）ベクター［Kaplittら., Molec. Cell. Neurosci., ２：320-330（1991）］、Stratford-Perricaudetら、J. Clin. Invest., 90：626-630（1991）に記載されている様な弱毒化アデノウイルスベクター、欠損アデノアソシエイテッドウイルスベクター［Samulskiら、Virol., 61：3096-3101（1987）；Samulskiら、J. Virol., 63：3822-3828（1989）］を含むが、もとよりこれに限定されるものではない。
別の実施態様では、遺伝子は、例えばAndersonら、米国特許第5,399,346号；Mannら、Cell、33：153（1983）；Teminら、米国特許第4,650,764号；Teminら米国特許第4,980,289号；Markowitzら、J. Virol., 62：1120（1988）；Teminら、米国特許第5,124,263号；国際特許出願第WO95/07358号、公開1995年、３月16日、Dougheryら、とBlood、82：845（1993）に記載の如くにしてレテロウイルスベクター中に導入できる。
あるいは、ベクターはリポゾームを利用してin vivoでリポフェクションにより導入できる。合成陽イオン脂質を利用すると、マーカーをコードする遺伝子のin vivoでのトランスフェクション用のリポソームを調製することができる［Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84：7413-7414（1987）；Mackeyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85：8027-8031（1988）］。リポフェクションを利用した外来遺伝子の特定臓器へのin vivoでの導入は、ある実務的利点を有している。特定細胞にリポゾームを分子的に狙いを付けることは、利点の１領域である。特定の細胞に向けてトランスフェクションすることは、膵臓、肝臓、腎臓及び脳の様な細胞的に均一でない組織に置いて特に有益であることは明らかである。狙い付けを目的として脂質に他の分子を化学的に結合することができる。標的ペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質及び抗体の様な蛋白質、あるいは非ペプチド分子は、リポゾームに化学的に結合することができる。
体から細胞を取り出し、裸のDNAプラスミドとしてベクターを導入し、それから形質変換した細胞を体に戻すことが可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは公知技術、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子癌の利用あるいはDNAベクタートランスポーターの利用といった技術を利用して、所望の宿主細胞に導入することできる［例えばWuら、J. Biol. Chem., 267：963-967（1992）；Wuら、J. Biol. Chem., 263：14621-14624（1998）を参照］
Zcyto７ポリペプチドはZcyto７ポリペプチドに特異的に結合する抗体の調整にも利用できる。次にこれら抗体を利用して、抗イディオタイプ抗体を作ることができる。ここに利用する“抗体”という語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、F（ab’）2やFab断片の様なそれらの抗原結合断片と、遺伝子工学的に作られた抗体等を含む。抗体がZcyto７ポリペプチドと107／Ｍ以上のＫａで結合する場合に、抗体は特異的に結合すると定義される。モノクローナル抗体の親和性は当業者により容易に決定できる［例えばScatchard、上記を参照］。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調整方法は当業者公知である（例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,（第２版）（Cold Spring Harbor, NY、1989）；とHurrell, J.G.R.,編、Monoclonal Hybridoma Antibodies：TechniquesとApplications（CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982を参照）。当業者にとって明らかにな様に、ポリクローナル抗体はウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ラットの様な各種温血動物から作ることができる。Zcyto７ポリペプチドの免疫原性はフレンドの完全あるいは不完全アジュバントの様なアジュバントを利用することで高めることができる。当業者公知のアッセイを利用して、Zcyto７ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる。例示的アッセイはAnt ibodies：A Laboratory Manual、HarlowとLane（編）、（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に記載されている。この様なアッセイの代表例には、交叉免疫電気泳動法、ラジオ免疫アッセイ、ラジオ免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロットアッセイ、阻害あるいは競合アッセイとサンドイッチアッセイを含む。
当業者公知の様に、ポリクローナル抗体はウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ラットの様な各種温血動物にZcyto７ポリペプチドあるいはその断片を摂取させて作ることができる。Zcyto７ポリペプチドの免疫原性は、明礬（水酸化アルミニウム）あるいはフレンドの完全あるいは不完全アジュバントの様なアジュバントを利用することで高めることができる。免疫感作に有用なポリペプチドはまた、Zcyto７あるいはその一部と免疫グロブリンポリペプチドとの、あるいはマルトース結合蛋白との融合体の様な融合ポリペプチドも含む。ポリペプチド免疫源は前兆の分子あるいはその一部である。ポリペプチド部分が“ハプテン様”である場合、その部分は巨大分子キャリアー（スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）あるいは破傷風トキソイド）と結合または連結すると免疫感作に有利である。
ここに使用する“抗体”という語には、ポリクローナル抗体、親和性精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、F（ab’）2やFab断片の様なそれらの抗原結合断片と、キメラ抗体、Ｆｖ断片、単鎖抗体の様な遺伝子工学的に作られた抗体等と合成抗原結合ペプチドとポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は非地ヒトCDRsをヒトフレームワークと不変域上に継ぎ足し、あるいは全非ヒト可変域を取り込むことによりヒト化される（必要に応じて外に出ている残基を交換することでそれらをヒト様表面に“仮装”し、得られたものは“化粧された”抗体である）。ある場合では、ヒト化抗体は非ヒト型残基をヒト型可変域フレームワークドメイン内に維持し、適当に結合特性を高めることもある。抗体のヒト化により、生物学的半減期は増加し、ヒトへの投与時に起こる有害免疫反応の可能性は低くなる。
ここで言うような抗体の産生または選択に関する別の技術は、Zctyo７蛋白質またはペプチドに対するin vitroでのリンパ細胞の暴露及びファージあるいは同様のベクターでのライブラリーの抗体ディスプレーの選択（例えば、固定化された、あるいは標識かされたZcyto７蛋白またはペプチドの利用による）を含む。潜在的なZcyto７ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレー）あるいは大腸菌の様な最近上に提示された無作為なペプチドライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘導法やランダムポリヌクレオチド合成法といった多くの方法により得ることができる。これらランダムディスプレーライブラリーを用いて、リガンドあるいはレセプター、生物あるいは合成巨大分子、または有機あるいは無機基質の様な蛋白質あるいはポリペプチドである既知標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。ランダムペプチドディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニング技術は当業者公知であり（Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Ladnerら、米国特許第4,946,778号；Ladnerら、米国特許第5,403,484号とLadnerら、米国特許第5,571,698号）、そしてランダムペプチドディスプレーライブラリーとこれらライブラリーをスクリーニングするためのキットは市販されており、例えばClontech（Palo Alto、CA）、Invitrogen Inc.（San Diego, CA）、New England Biolabs, Inc.（Beverly, MA）やPharmacia LKB Biotechnology Inc.（Piscataway, NJ）がある。ランダムペプチドディスプレーライブラリーは個々に開示されたZcyto７の配列を利用してスクリーニングし、Zcyto７と結合する蛋白質を特定することができる。これらZcyto７ポリペプチドと相互作用する“結合蛋白質”を利用して細胞に狙いを付けるために利用できる；例えば相同的なポリペプチドを親和性精製により単離する事ができる；これらは薬剤、毒素、放射核種等で直接または間接に標識できる。これら結合蛋白質はまたスクリーニング発現ライブラリーや活性中和といった分析方法に利用することもできる。結合蛋白質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定する；病理あるいは病気の基礎となるマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出あるいは定量するための診断アッセイにも利用できる。これら結合蛋白質はまたZcyto７“アンタゴニスト”としても機能し、in vitroとin vivoに於けるZcyto７結合とシグナル伝達を遮断できる。
抗体も遺伝子治療で作られる。動物にZcyto７あるいその免疫原性断片をコードするDNAあるいはRNAを投与し動物細胞に核酸をトランスフェクトし、蛋白を発現させて、それによって免疫原性反応を惹起する。そうして動物により産生された抗体はポリクローナルあるいはモノクローナルとして単離される。
Zcyto７に対する抗体はまた蛋白質を発現している細胞を標的化するため、親和精製するため、診断アッセイ内での可溶性蛋白質の循環レベルを決定する為、そしてアンタゴニストとしてin vitroやin vivoでのリガンド結合とシグナル伝達を遮断するために利用される。
放射ハイブリッドマッピングは哺乳動物の染色体の高解像度の近接マップを作成するために開発された体細胞遺伝子技術である。［Coxら、Science 250：245-250（1990）］。遺伝子配列の一部または全部が既知であれば、染色体の放射ハイブリッドマッピングパネルへの利用に好適なPCRプライマーを設計することができる。市販されているヒトゲノム全体をカバーしているStanford G3 RHパネルやGeneBridge ４ RHパネル（Research Genetics, Inc., Huntswille, AL）のような放射ハイブリッドマッピングパネルが使用できる。これらのパネルにより迅速にPCRに基づき、染色体局在や遺伝子の順番、配列のタグサイト（STSs）や目的の領域内の他の非多形あるいは多形マーカーを知ることができる。この中には新規に発見された所望の遺伝子と、既知マッピングされた遺伝子との間に直接比例する物理距離を決めることも含む。正確な遺伝子の位置に関する知識は次の様な場合に有益である：１）配列が既知コンチグの一部であるかを決め、そしてYAC−、BAC−、あるいはcDNAクローンといった多様な中で別の周辺遺伝子配列を得る場合、２）同一染色体域への連鎖を示す遺伝子病の候補遺伝子を提供する、そして３）特定の遺伝子の持つ機能の決定を支援するのに有益であろうマウスの様な相互参照モデルに有益である。
本発明はまた、診断応用に利用される試薬も提供する。例えばZcyto７遺伝しは染色体5q31上にマップされる。Zcyto７核酸プローブを利用して、染色体５上の異常を見つけることができる。例えば、Zcyto７ DNAまたはRNAあるいはその一部を含むプローブを用いて、Zcyto７遺伝子が染色体5q31上にあるか、あるいは変異が起きているかを決定することができる。Zcyto７遺伝子座に検出される染色体異常は異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限酵素部位の変化と再配置を含むが、これに限定されるものではない。この様な異常は本発明のポリヌクレオチドを利用し、制限酵素断片長多形（RFLP）分析、PCR技術を利用したショートタンデムリピート（STR）分析やその他の当業者公知の遺伝的連鎖解析技術により検出することができる［Sambrookら、上記；Ausbelら、上記；Marian, A.J. Chest、109：255-265（1995）］。
Zcyto７はサイトカインやサイトカインレセプターのグループが含まれる“遺伝子クラスター”である5q31領域にマップされる。ここに集まるサイトカインは、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＧＭ−CSFとＭ−CSFを含む。この結果は、zcyto７がサイトカインであることを証明している。
本発明を以下の非限定的実施例によりより詳細に例示する。
実施例１．Zcyto７のクローニング
Zcyto７はインターロイキン１７との相同性により配列番号３に規定された発現配列タグ（EST）から同定された。cDNAクローンはヒト胎児心臓cDNAライブラリーから得た。cDNAを含むプラスミドをＬＢ 100μｇ／ｍｌアンピシリンと100μｇ／ｍｌメチシリンプレート上に線状に塗りつけた。cDNA挿入体の配列を決定した。挿入体は717塩基対長で、180アミノ酸オープンリーディングフレームと推定２０アミノ酸シグナルペプチドを持つと決定された。
実施例２．ノーザンブロット解析
ヒトの複数の組織のブロット１，２，３（Clontech）をプローブして、Zcyto７の組織の分布を決定した。全Zcyto７コーディング域を含むEcoRＩ／NotＩ断片をEST582069クローンから作成し、プローブとして利用した。EST582069のプラスミド調整は３７℃で一晩培養した５ｍｌのＬＢ 100μｇ／ｍｌアンピシリンをQIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）を利用し行った。100μｌより１２μｌをＨ緩衝液５μｌ（Boehringer Mannheim）、12.5単位のEoRI（Gibco BRL）と12.5単位のNotＩ（New England Biolabs）を含む５０μｌの反応液中で３７℃、２時間処理し消化した。消化体を0.7％ TBEアガロースゲル上に電気泳動し、断片を切り出した。追加の材料を得るために、EST582069を２４μｌ用いた以外は上記と同一条件の消化を繰り返し行った。２回目の消化体を0.7％ TBEアガロースゲル上に電気泳動し、断片を切り出した。DNAは両ゲルスラブからQI Aquickゲル抽出キット（Qiagen）により抽出した。このDNA 135ｎｇをMultiprime DNA Labeling System（Amersham）を用いてＰ32で標識し、取り込まれなかった放射活性体はNucTrap Probe Purification Column（Stratagene）で除去した。複数の組織をノーザンし、ヒトRNAマスターブロットを５分間煮沸し、それから１分間氷冷し、１０ｍｌのEspressHyb液に加え、混合してブロットに加えられた１ｍｇのサケ精子DNAを含む１０ｍｌのExpressHyb液（Clontech）と３時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは一晩６５℃で行われた。最初の洗浄条件は以下の通りである：２×SSC, 0.5％ SDS RTで４０分間、数回液交換した後0.1×SSC, 0.1％ SDS、５０℃で４０分間、１回液交換する。それからブロットを−８０℃で５時間感光させる。交叉ハイブリダイゼーション／バックグランドがあったので、ブロットをさらに５５℃、次に６５℃で0.1％×SSC, 0.1％ SDSで各１時間づつ洗浄した。脊髄に強いZcyto７ mRNAの発現が認められ、気管では弱いmRNAの発現が認められた。転写体の大きさはおよそ0.75ｋｂであった。
実施例３
Zcyto７の所属染色体と位置
Zcyto７は市販の“GeneBridge４放射ハイブリッドパネル”（Research Genetics、Inc., Huntswille, AL）を利用し、第５染色体にマップされた。GeneBridge４放射ハイブリッドパネルは９３の放射ハイブリッドクローンからのPCR可能なDNAと２種類のコントロールDNAs（HFLドナーとA23レシピエント）を含んでいる。公的に利用可能なWWWサーバー（http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl）により、GeneBridge４放射ハイブリッドパネルで構築されたWhitehead Institute/MITゲノム研究センターのヒトゲノムの放射ハイブリッドマップ（“WICGR”ヒトゲノム放射ハイブリッドマップ）に対しマッピングできる。
GeneBridge４放射ハイブリッドパネル”でZcyto７をマッピングするために、２０μｌの反応液をPCR可能な９６ウエルのマイクロタイタープレート（Stratagene, La Jolla, CA）内に準備し、“RoboCycler Gradient 96”サーマルサイクラー（Stratagene）で利用した。９５のPCR反応液は２μｌのKlenTaq PCR反応緩衝液（LONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto、CA）、1.6μｌ dNTPs混合液（各2.5ｍＭ、PERKIN-ELMER、Foster City、CA）、１μｌの配列番号４のセンスプライマー、１μｌの配列番号５のアンチセンスプライマー、２μｌ“RediLoad”（Research Genetics, Inc., Huntswille, AL）、0.4μｌ  ５０×Advantage KlenTaqポリメラーゼミックス（Clontech Laboratories, Inc.）、２５ｎｇの個々のハイブリッドクローンあるはコントロールのDNAと、合計２０μｌになる様にするためのｘμｌのddH2Oを含む。反応液に等量のミネラルオイルを重層し密封した。PCRサイクラーの条件は次の通りである：初回１サイクルは９５℃変性５分、９５℃変性１分、５２℃アニーリング１分、７２℃伸長１分を３５サイクル、最後に７２℃７分の伸長１サイクル。反応液は３％NuSieve GTGアガロースゲル（FMC Bioproducts, Rockland, ME）上で電気泳動して分離した。
結果より、Zcyto７はWICGR放射ハイブリッドマップ上のヒト第５染色体連鎖群の端部から490.89cRの位置にマップされることが示された。セントロメアーとに対して最も近い近位部マーカーはD5S413であり、最も近い遠位部マーカーはＷＩ−5208であった。周辺マーカーを利用すると、Zcyto７は集積されたLDB第５染色体マップ（Genetic Location Database, University of Southhampton、WWWサーバー:http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public＿html/）上の5q31.3−q32域にマップされた。
実施例４
Zcyto７発現ベクターの構築
FLAGアミノ酸配列（配列番号１０）中に作成された２つのZcyto７構築体ベクターをZcyto７ポリペプチオのＮ末端あるいはＣ末端に挿入した。FLAGアミノ酸配列がZcyto７のＮ末端に付着したものを構築するために、実施例２のEST582069プラスミド調整体の１／４に希釈したもの１μｌと配列番号６のプライマー２０ピコモル（ｐｍ）と配列番号７のプライマー２０ｐｍで473ｂｐのZcyto７のPCR DNA断片を作成した。PCR反応体を９４℃で１分間反応し、それから９４℃２０秒、６４℃２分から成るサイクルを５サイクル行った。続いて各サイクルが９４℃２０秒、７４℃２分からなるサイクルを２２回繰り返した。７４℃１０分の反応で反応を終了した。PCR反応混合液５０μｌを３０単位のBamHＩ（Boehringer Mannheim）と120単位のXho１（Boehringer Mannheim）で２時間、３７℃で消化した。消化された反応混合液を１％ TBEゲル上に電気泳動した；DNAバンドをカミソリで切り出し、DNAをQuaquikRゲル抽出キット（Qiagen）でゲルから抽出した。切り出されたDNAをBamとShoで切断されたプラスミドnfpzp９にサブクローニングした。Nfpzp９はマウスメタロチオネイン−１プロモーターと、組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）リーダーとFLAGペプチド（配列番号１０）を含む発現カセットと複数の制限酵素サイトを含む哺乳動物細胞発現ベクターである。これらにヒト成長ホルモンターミネーター、大腸菌複製起源、SV40プロモーター、エンハンサーと複製起源を含むほ乳動物選択可能マーカー発現ユニット；ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）とSV40ターミネーターが続く。
Ｃ末端FLAGがzcyto７ポリペプチドのＣ末端に挿入されたzcyto遺伝子を構築するために、実施例１記載のEST582069プラスミド調整体の１／４に希釈したもの１μｌと配列番号８と配列番号９のプライマー各２０ｐｍで543ｂｐのZcyto７のPCR DNA断片を作成した。PCR反応体を９４℃で１分間反応し、それから９４℃２０秒、５５℃２分から成るサイクルを５サイクル行った。続いて各サイクルが９４℃２０秒、７４℃２分からなるサイクルを２２回繰り返した。最後に７４℃１０分の反応で反応を終了した。全て１％ TBEゲル上に走らせ、DNAをカミソリで切り出し、DNAをQuaquikRゲル抽出キット（Qiagen）でゲルから抽出した。回収液３５μｌ中の２０μｌを１０単位のBamH１（Boehringer Maaheim）と１０単位のEcoR１（Gibco BRL）で２時間、３７℃で消化した。消化したPCR混合液を１％ TBEゲル上で電気泳動した。DNAバンドをカミソリで切り出し、DNAをQuaquikRゲル抽出キット（Qiagen）でゲルから抽出した。抽出されたDNAをEcoR１とBamH１で切断したプラスミドnfpzp９にサブクローニングした。Nfpzp９はマウスメタロチオイン−１プロモーターを有する発現カセットと、コーディング配列挿入の為の複数の制限酵素サイト、FLAGペプチド、配列番号１０をコードする配列、ストップコドン、ヒト成長ホルモンターミネーター、大腸菌複製起源、SV40プロモーター、エンハンサーと複製起源を含むほ乳動物選択可能マーカー、DHFR遺伝子とSV40ターミネーターを含む哺乳動物発現ベクターである。
FLAGポリペプチドに対する抗体を利用すると、細胞上清液からFLAGが付いたZcyto７ポリペプチドを分離することができる。
実施例５
マウスZcyto７のクローニング
マウスZcyto７はヒトZcyto７に対する相同性より配列番号１４に特定された。cDNAクローンは13.5から14.5日齢のマウス胚のマウス胚cDNAライブラリーより発見された。このcDNAは所望のcDNAを有するプラスミドでトランスフェクトされた大腸菌を含むアガースラブとして供給され、これをＬＢ 100μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌメチシリンプレートに線状に塗りつけた。EST660242内のcDNA挿入体の配列を決定した。挿入体は785塩基対長で、180アミノ酸オープンリーディングフレームと推定２０アミノ酸シグナルペプチドを持つと決定された。配列は配列番号１１と１２に規定されている。
実施例６
マウスZcyto７の組織分布
マウス複数組織ノーザンブロット（Clontech、Palo Alto、CA）、マウスノーザンドットブロット（Clontech）、マウス胚ノーザンブロットとマウス脊髄ドットブロットをプローブして、マウスZcyto７の組織の分布を決定した。
マウス胚RNAは受精後６日ないし９日のマウス胚よりPOLY（APURER単離キット（Ambion）を利用して単離した。各マウス胚100ｍｇを１ｍｌの溶解緩衝液で溶解し、ホモジェナイズし、メーカーのプロトコールに従いバッチ法で処理した。ノーザンブロット用には、２μｇのRNAを1.5％アガロース、2.2％フォルムアルデヒドゲルに乗せた。ゲルは６０Ｖで４時間３０分泳動した。RNAを前もって２０×SSCで湿らせておいたNytran膜に転写した。RNAsはＵＶにより膜に架橋し、８０℃で１時間焼いた。
マウスの脊髄RNAもPOLY（Ａ）PURER mRNA単離キット（Ambion）で調製した。マウスの脊髄のドットブロットは、１μｇ RNA／μｌの濃度のRNAを１，２そして３μｌ Nytran膜上に点状にスポッティングして行った。
全Zcyto７コーディング域を含むNot１／EcoR１断片を配列番号１２のクローン（以後配列番号１２クローンと称す）から作成し、プローブとして利用した。配列番号１２クローンのプラスミドは３７℃で一晩培養した５ｍｌのＬＢ 100μｇ／ｍｌアンピシリンを、QIAPREP SPIN MINIPREP Kit（Qiagen）を利用し行った。4.66ｇを８μｌの高緩衝液（Boehringer Mannheim）、２０単位のNotＩ（Biolabs）と２０単位のEoRＩ（Gibco BRL）を含む８０μｌの反応液中で３７℃、２時間処理し消化した。消化体を1.0％ TBEアガロースゲル上に電気泳動し、断片を切り出した。DNAは両ゲルスラブからQIAQUICKゲル抽出キット（Qiagen）により抽出した。この断片98.9ｎｇをMULTIPRIMER DNA Labeling system（Amersham）を用いてＰ32で標識し、取り込まれなかった放射活性体はNUCTRAPR Probe purification column（Stratagene）で除去した。
２つのノーザン調製体と２つのドットブロット調整体を次のようにして３時間、６５℃でプレハイブリダイズした。１ｍｇのサケ精子を５分間煮沸し、それから１分間氷冷し、１０ｍｌのEXPRESSHUBR液に加え、混合してブロットに加えた。ハイブリダイゼーションは一晩６５℃で行われた。最初の洗浄条件は以下の通りである：２×SSC, 0.1％ SDSで４０分間、室温で行われ、次いで0.1×SSC, 0.1％ SDS、で４０分間、５０℃。ブロットを−８０℃で一晩フィルムに感光させた。ノーザンブロットとマウスドットブロットはバックグランドを除くために、さらに0.1％×SSC, 0.1％ SDS、６０℃で洗浄した。マウス背傷のドットブロットはさらにより高い厳密性で0.1×SSC, 0.1％ SDS、６５℃で洗浄し、初期の結果を確認した。
結果：マウスZcyto７の発現が精髄、顎下腺と精巣上体に見られた。マウス胚は受精後１２日目よりZcyto７を発現し、１６日目にピークを形成して１７日目に終了した。転写体の大きさはおよそ１ｋｂであった。
実施例７
Zcyto７を利用した軟骨細胞の増殖
軟骨細胞の増殖アッセイを行い、Zcyto７が軟骨細胞の増殖対する効果を調べた。アッセイは２０％の集密培養体で行った。コントロール賦形剤として、Zcyto７の代わりにウシ血清アルブミンを培養体に加えた。アッセイは軟骨細胞内の新生DNAへの3Ｈ−チミジンの取り込みを測定した、Wahlら、Mol. Cell. Biol. 8：5016-5025（1988）。
結果：軟骨細胞培養体を１μｇ／ｍｌのzcyto７に暴露すると3.5−９倍の一次軟骨細胞増殖の刺激が見られた。zcyto７による軟骨細胞刺激は複数の蛋白調整体に見られ、種をまたいでも見られた。これに対し、BSAを用いたコントロール実験では、軟骨細胞刺激は起きなかった。
実施例８
Zcyto７処理軟骨細胞によるグリコサミノグリカンの産生
軟骨細胞の２０％の集密培養体を調製し、zcyto７を１μｇ／ｍ１濃度で適用した。第２実験では、zcyto７に加えて、ＩＬ−１βを細胞培養体に加えた。それから軟骨細胞培養体によるグリコサミノグリカン（GAG）産生を１，９−ジメチルメチレン青色素結合アッセイ、Fardaleら、Biochem. Biophys. Acta 888：173-177（1987）を用いて決定した。
結果：zcyto７と共に培養した軟骨細胞は、軟骨細胞培養体中のGAGの定常状態量が５０％増加した。さらに、軟骨細胞をzcyto７とインターロイキン−１β（ＩＬ−１）と共培養すると、軟骨細胞によるGAG産生はzcyto７あるいはＩＬ−１β単独との軟骨培養に比べて2.5倍増加した。これに対しBSAを加えられた培養細胞ではGAGの産生増加は見られなかった。
実施例９
Zcyto７による骨芽細胞刺激
CCC4茶房株はｐ53ノックアウトマウスに由来する骨芽用細胞株である。CCC4株はルシフェラーゼの発現を駆動する誘導血清反応エレメント（SRE）を含むプラスミドがトランスフェクトされている。SREの刺激と、それによるルシフェラーゼの発現により化学物質が骨芽細胞を刺激に適当であるかが示される。
CCC4細胞は１μｇのzcyto７／ｍｌの培地中で培養された。コントロールとしてBSA、繊維芽細胞増殖因子（FGF）と血小板由来増殖因子（PDGF）をそれぞれ別々のCCC4細胞の培地に加えた。BSAは陰性コントロールであり、FGFとPDGFは骨芽細胞の増殖を促進することが知られていることから陽性コントロールとした。ルシフェラーゼ活性は、４０μｌのPromegaルシフェラーゼ基質を加え、LabsystesのLUMINOSKACRで２秒間、積算測定した。
結果
Zcyto７およびFGFとPDGFは本アッセイに於いてルシフェラーゼの発現を促進し、これらが骨芽細胞を刺激することを示した。BSA賦形剤コントロールは本アッセイでは陰性であった。
実施例１０
繊維芽細胞の増殖に及ぼすZcyto７の作用
ヒトの皮膚、肺と胎児肺の繊維芽細胞の集密培養体にZcyto７を接種して、繊維芽細胞の増殖に及ぼすZcyto７の作用を決定した。
FGFを陽性コントロールとして、そしてBSAを陰性コントロール賦形剤として用いた。
結果：Zcyto７は繊維芽細胞の増殖に影響を示さなかった。
実施例１１
BaF３細胞の増殖に及ぼすZcyto７の作用
BaF３細胞は、ＩＬ−３に依存し増殖するマウスＢ前駆細胞株を数回基礎培地で洗浄し、それから各ウエルが約5500細胞／ウエルを含む９６ウエルプレートに撒いた。細胞を１μｇ／ｍｌのZcyto７あるいは１−２ｐｇ／ｍｌのＩＬ−３、もしくはZcyto７とＩＬ−３の両方の組み合わせにより処理された。また別の実験では、0.1−１０ｎｇのTGFβをZcyto７の代わりにウエルに加えた。アッセイプレートを３７℃、５％ CO2で３−６日間培養した後、２０μｌのALAMAR青を各ウエルに加え、そしてプレートを３７℃で１５−２４時間培養した。それからプレートを励起波長544ｍ、放射波長590ｍの蛍光測定装置で測定した。アッセイはALMAR青を加える前に、細胞増殖に対する刺激あるいは阻害について肉眼によってもスコア化した。基本培地はRPMI1640＋１０％ HIA−FBS＋Ｌ−グルタミン＋Ｎａピルビン酸を含んでいた。
結果：Zcyto７とTGFβは有意にＩＬ−３によるBaF３細胞の増殖を阻害した。しかし、TGFβに対する中和抗体をZcyto７とともに加えると、BaF３細胞の増殖のZyto７阻害は取り除かれた。
実施例１２
ＴＦ−１細胞の増殖に及ぼすZyto7の作用
ＧＭ−CSFあるいはＩＬ−１βに依存するヒト白血病細胞株であるし増殖するＴＦ−１細胞を数回基礎培地で洗浄し、それから各ウエルが約7000細胞／ウエルを含む９６ウエルプレートに撒いた。細胞を１μｇ／ｍｌのZcyto７あるいは100〜200ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βと共培養した。また別の実験では、TGFβをZcyto７の代わりにウエルに加えた。アッセイプレートを３７℃、５％ CO2で３−６日間培養した後、２０μｌのALAMAR青を各ウエルに加え、そしてプレートを３７℃で１５〜２４時間培養した。それからプレートを励起波長544ｎｍ、放射波長590ｎｍの蛍光測定装置で測定した。アッセイはALMAR青を加える前に、細胞増殖に対する刺激あるいは阻害について肉眼によってもスコア化した。基本培地はRPMI1640＋１０％ HIA−FBS＋Ｌ−グルタミン＋Ｎａピルビン酸を含んでいた。
結果：ＴＦ−１のＩＬ−１β刺激はZcyto７とTGFβの両方に阻害された。増殖阻害が起こるZcyto７の濃度は200ｎｇ／ｍｌ以上でり；そして増殖阻害が起こるTGFβ濃度はおよそ５０ｇ／ｍｌであった。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ZymoGenetics, Inc.
1201 Eastlake Avenue East
Seattle
WA
USA
98102
（ii）発明の名称：哺乳類サイトカイン様因子７
（iii）配列の数：43
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：736塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY：コード配列
（Ｂ）位置：57...596
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0004216343.tif 000005
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：180アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（ｖ）フラグメント型：中間
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0004216343.tif 000006
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：397塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0004216343.tif 000007
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13265
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004216343.tif 000008
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13266
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0004216343.tif 000009
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13326
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0004216343.tif 000010
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13330
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0004216343.tif 000011
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13325
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0004216343.tif 000012
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：その他
（vii）直接の由来：
（Ｂ）クローン：ZC13327
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0004216343.tif 000013
（２）配列番号：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：10アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：10：
0004216343.tif 000014
（２）配列番号：11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：692塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY：コード配列
（Ｂ）位置：50...589
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号：11：
0004216343.tif 000015
（２）配列番号：12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：180アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（ｖ）フラグメント型：中間
（xi）配列の記載：配列番号：12：
0004216343.tif 000016
（２）配列番号：13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：479塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（xi）配列の記載：配列番号：13：
0004216343.tif 000017
（２）配列番号：14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：14：
0004216343.tif 000018
（２）配列番号：15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：15：
0004216343.tif 000019
（２）配列番号：16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：16：
0004216343.tif 000020
（２）配列番号：17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：17：
0004216343.tif 000021
（２）配列番号：18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：18：
0004216343.tif 000022
（２）配列番号：19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：19：
0004216343.tif 000023
（２）配列番号：20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：20：
0004216343.tif 000024
（２）配列番号：21の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：21：
0004216343.tif 000025
（２）配列番号：22の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：22：
0004216343.tif 000026
（２）配列番号：23の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：23：
0004216343.tif 000027
（２）配列番号：24の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：24：
0004216343.tif 000028
（２）配列番号：25の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：25：
0004216343.tif 000029
（２）配列番号：26の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：97アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：26：
0004216343.tif 000030
（２）配列番号：27の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：100アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：27：
0004216343.tif 000031
（２）配列番号：28の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：28：
0004216343.tif 000032
（２）配列番号：29の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：17アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：29：
0004216343.tif 000033
（２）配列番号：30の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：16アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：30：
0004216343.tif 000034
（２）配列番号：31の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：19アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：31：
0004216343.tif 000035
（２）配列番号：32の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：47アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：32：
0004216343.tif 000036
（２）配列番号：33の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：70アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：33：
0004216343.tif 000037
（２）配列番号：34の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：61アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：34：
0004216343.tif 000038
（２）配列番号：35の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：73アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：35：
0004216343.tif 000039
（２）配列番号：36の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：158アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：36：
0004216343.tif 000040
（２）配列番号：37の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：154アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：37：
0004216343.tif 000041
（２）配列番号：38の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：151アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：38：
0004216343.tif 000042
（２）配列番号：39の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：160アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：39：
0004216343.tif 000043
（２）配列番号：40の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：158アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：40：
0004216343.tif 000044
（２）配列番号：41の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：153アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：41：
0004216343.tif 000045
（２）配列番号：42の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：128アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：42：
0004216343.tif 000046
（２）配列番号：43の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：157アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：43：
0004216343.tif 000047