(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象となる食品の試料を粉砕するステップと、
前記粉砕された試料からDNAを抽出するステップと、
前記抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズする二本鎖DNAプローブとハイブリダイゼーションするステップと、
前記ハイブリダイゼーションによって得られた産物を基板にアンカリングするステップと、
走査型プローブ顕微鏡を用いて前記基板上の前記産物を可視化するステップと、
前記可視化された前記産物がY字型である場合、前記DNAの末端が遺伝子組換えされていると判定するステップ
とからなることを特徴とする食品の検査方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーションするステップは、
前記抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズし、かつ磁性粒子と結合するビオチン化プローブとハイブリダイゼーションするステップと、
前記ビオチン化プローブに磁性粒子を結合させ、磁石により前記磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を抽出するステップ
とからなることを特徴とする請求項１に記載の食品の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、作物や食品中の細胞レベル、生体分子レベル、遺伝子レベルあるいは原子レベルのミクロな構造を検査する検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組換え食品（Genetically Modified Organisms、以下GMOと略す）を見分けるための検査方法が注目を集めている。今後、農水省と厚生労働省は31品目のGMOに対して表示を義務づけることを決めているので、食品会社や流通業者から依頼を受けて検査を代行するビジネスも立ち上がりつつある。食品が遺伝子組換え食品を使って製造されたものか否かを調べるには、人為的に導入された遺伝子の存在をチェックすれば良く、現在のところ、PCR法（polymerase chain reaction法）やELISA法（enzyme linked immunosorbent assay法）による検査が試みられている。
【０００３】
PCR法による検査方法は、プライマーと呼ばれる微細な遺伝子の断片を使用し、これを遺伝子組換えにより導入された特定の遺伝子と反応させ、目標とする遺伝子を数十〜数百万倍に増幅し、検査ができるようにするというものである。具体的には、まず、サンプルがGMOである場合にのみ導入された遺伝子が増幅するようにプライマーを選択し、そのプライマーを用いてサンプルをPCRにかける。そして、得られたPCR産物を電気泳動（エチジウムブロマイド染色）することで、PCRにより増幅されたDNAがあれば（すなわち、GMOであれば）、電気泳動のバンドとして検出される。サンプルが非遺伝子組換え食品（以下、nonGMOと略す）であれば、PCRにより特定の遺伝子が増幅されないため電気泳動のバンドとして検出されない。したがって、電気泳動のバンドの有無によりGMOであるかnonGMOであるかが検査できる（表１参照）。
【０００４】
【表１】
0004360763.tif 000002
一方、PCR法による検査方法が遺伝子組換えで新たに導入された遺伝子を直接調べるのに対して、ELISA法による検査方法は、その遺伝子により発現、生成された蛋白質の有無を抗原―抗体反応により検出する方法である。GMOに対する抗体（一次抗体）、酵素標識抗体（二次抗体）および発色溶液から構成される試験紙を用いて、その発色の違いを吸光度測定法によって測定しGMOの有無を判定することができる（表１参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記PCR法による検査方法は、検査精度は良いが、PCRを用いるためサンプル間のコンタミネイション（混入）やPCR阻害物質の確認が必要であること、また、PCRでは非常に短いDNAを増やすことができないため遺伝子が短く分解された加工食品や醤油・大豆油などは検査できないこと、高価であること、そして検査工程が複雑であり検査時間が長いなどといった種々の問題がある（表２参照）。
【０００６】
また、上記ELISA法による検査方法は、上述したPCR法による検査方法に比べて簡便な方法であり、また安価であり、検査時間も短いといった長所がある。しかしながら、蛋白質は熱により変性し易いため、この方法は加熱処理を施された加工品には用いられないといった問題がある。また、検出限界がPCR法による検査方法に比べて一桁悪いといった問題もある（表２参照）。
【０００７】
【表２】
0004360763.tif 000003
そこで、本発明は上記問題に鑑みてなされたもので、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することにより、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に試料のミクロな構造を検査することを可能とする食品の検査方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは、生体分子可視化・計測技術を応用して、新規なGMO検査法（HVM法：hybridization visible method）を確立した。
【０００９】
本発明の第１の特徴は、検査対象となる試料を粉砕するステップと、粉砕された試料からDNAを抽出するステップと、抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズする二本鎖DNAプローブとハイブリダイゼーションするステップと、ハイブリダイゼーションによって得られた産物を基板にアンカリングするステップと、その基板を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化するステップと、可視化された産物がY字型である場合、DNAの末端が遺伝子組換えされていると判定するステップとからなることにある。「ミクロな構造を判定する」とは、原子レベルや生体分子レベルの構造を判定することであり、たとえば試料が遺伝子組換え食品であるか否かを判定することを意味する。
【００１０】
また、本発明の第２の特徴は、検査対象となる試料を粉砕するステップと、前記粉砕された試料からDNAを抽出するステップと、抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズし、かつ磁性粒子と結合するビオチン化プローブとハイブリダイゼーションするステップと、そのビオチン化プローブに磁性粒子を結合させ、磁石により前記磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を抽出するステップと、抽出されたハイブリダイゼーション産物を基板にアンカリングするステップと、その基板を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化するステップと、可視化された産物がY字型形状にさらに磁性粒子の形状が加わったものである場合、DNAの末端が遺伝子組換えされていると判定するステップとからなることにある。このような遺伝子組換え食品の検査方法によれば、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することにより、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に遺伝子組換え食品であるか否かを検査することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（本発明の要旨）
本発明の食品の検査方法(HVM法)は、検査すべきサンプルDNAを特異的な形状に変化させるためにサンプルDNA をプローブDNA とハイブリダイゼーションさせ、そのハイブリダイゼーション産物を可視化して、そのDNA形状情報から生体分子レベルのミクロな構造の判定を行う、簡便で素性のよい検査方法である。
【００１２】
本発明の食品の検査方法(HVM法)の検査工程は、図１に示すように、基本的に次のように実施する。
【００１３】
（イ）ステップＳ１０１において、サンプルを粉砕する。
【００１４】
（ロ）ステップＳ１０２において、DNAを抽出する。
【００１５】
（ハ）ステップＳ１０３において、GMOと相同性のあるプローブDNA（nonGMO）と測定サンプルDNA（GMO）をハイブリダイゼーションさせる。
【００１６】
（ニ）ステップＳ１０４において、ハイブリダイゼーション産物を基板にアンカリングさせる。
【００１７】
（ホ）ステップＳ１０５において、可視化・計測法でハイブリダイゼーション産物を可視化する。
【００１８】
（ヘ）ステップＳ１０６において、可視化画像の形状から試料のミクロな構造としてGMOの有無を判定する。
【００１９】
以上のように、６段階の工程からなる。
【００２０】
次に、図面を参照して、本発明の第１乃至第２の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分は同一又は類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。従って、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００２１】
（第１の実施の形態）
図２は、本発明の第１の実施の形態に係る食品の検査方法の一例として遺伝子組換え食品の検査方法(HVM法)の詳細を示すフローチャート図である。以下、各ステップを追って説明する。
【００２２】
（ａ）まず、ステップＳ２００において、検査対象となるサンプルのDNA抽出及び標的となる遺伝子組換え体とハイブリダイズするDNAプローブの調製を行う。上記検査対象となるサンプルの形態はDNAを含むものであれば特に限定されず、原料（ダイズ、コーン、ジャガイモなど）から加工品（加熱処理を施されたものなど）まで用いることができるが、サンプルDNAとプローブDNAとのハイブリダイズ可能となるためには、サンプルからDNAを抽出する必要がある。そこで、サンプルを適宜に粉砕し（図１のステップＳ１０１）、蛋白質、脂質、その他の細胞成分を除去してDNAを抽出する（図１のステップＳ１０２）。抽出されたサンプルDNAは緩衝液に懸濁させた試料とするのが好ましい。上記DNAプローブは、目的のDNAに特異的にハイブリダイズするように作製する。そのプローブDNAはクローニングによって得るか、あるいは短いものなら化学的に合成することが可能である。プローブDNAの長さは１２〜数千塩基までさまざまであるが、プローブDNAが検出すべきDNAに完全に相補的である必要はなく、検出すべきDNAプローブと特異的に結合するのに有効的な長さであれば、DNA分子の一部だけが相補的であってもよい。一般に、DNAプローブには固有の標識（放射性標識あるいは化学標識）をして、ハイブリダイゼーションによって二本鎖DNAに取り込まれるのを追跡できるようにするが、本発明に用いるDNAプローブは無標識のままでよい。
【００２３】
（ｂ）上記サンプルDNAとDNAプロ−ブとの混合は、混合試料中のサンプルDNAとDNAプロ−ブの高次構造が解消され、相補的配列同士がハイブリダイズする必要がある。このため、ステップＳ２１０における加熱変性前にサンプルDNAとDNAプローブとを混合するか、あるいはサンプルDNAとDNAプローブとをそれぞれ加熱変性した後に混合すればよい。したがって、ステップＳ２１０において、上記DNAプローブとサンプルDNAの混合試料を加熱変性、あるいは高いpH（pH>=13）にさらすことによって、DNAプローブ及びサンプルDNAの二重らせんの二本鎖を結びつけている相補的塩基対をこわし、二重らせんを一本鎖に解離する。ステップＳ２１０にける混合試料の加熱変性は、混合試料中の核酸分子高次構造を解消して一本鎖に解離するものであれば、特に限定されず、例えば、PCR用の温度コントローラや恒温糟などを使用し、８０〜１００℃の間、好ましくは１００℃で行う。加熱変性に要する時間は、混合試料中のサンプルDNA及びDNAプロ−ブの性質により決定されるが、少なくとも３分間、より好ましくは１０分間で行う。
【００２４】
（ｃ）次に、サンプルDNA中のその配列と上記DNAプロ−ブとをハイブリダイズさせる（図１のステップＳ１０３）ために、ステップＳ２１０において加熱変性された混合試料の温度を下げる。サンプルDNAとDNAプローブがハイブリダイズすると、両端または末端が一本鎖であるような一本鎖と二本鎖の混合試料が形成される。ハイブリダイゼーションの温度低下の条件（温度の下げ方、最終低下温度など）は、ハイブリダイズするDNAプローブとサンプルDNAとの相同性の程度、DNAプローブ濃度およびDNAプローブと相補的なサンプルDNAの濃度に応じて決定される。その条件は、ハイブリダイズの際の塩濃度などで調節することができる。ハイブリダイゼーションに関するその他の条件としては、ハイブリダイズするDNAが自由に構造変化することが可能であることが必要であり、DNA中のハイブリダイズしない部分が高次構造をとることを許容するものでなくてはならない。
【００２５】
（ｄ）上記ハイブリダイゼーションによって得られる混合試料は、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化する（図１のステップＳ１０４におけるアンカリングする）。固定化するための基板は、固定化されるDNAの形状及び構造変化を著しく阻害しないものであれば、特に限定されず、シリコン基板、ガラス基板などの、走査型プローブ顕微鏡での観察に用いられ、なお且つプロ−ブの固定化を許容するものであればよく、好ましくは表面に劈開面を有するマイカ（雲母基板）を用いるとよい。例えば、基板としてマイカを用いた場合、マイカの新鮮剥離面に試料懸濁液をピペットで滴下するだけで基板面に吸着される。より好ましくは、劈開したマイカ表面上はマイナス電荷を有しているので、DNAのリン酸基からのマイナス電荷を静電結合するため、試料吸着前にマイカを２価カチオン（Mg(II)）等の溶液中に浸しておくとよい。
（ｅ）上記のようにして得られる試料を固定化した基板を可視化・計測する技術として、走査型プローブ顕微鏡を用いる。ここで、「走査型プローブ顕微鏡」とは、微細なプローブを対象物の表面に走査して原子レベルの分解能でその表面を観察する走査型顕微鏡の総称であり、走査型トンネル顕微鏡（scanning tunneling microscopy；STM）、原子間力顕微鏡（atomic force microscopy；AFM）が含まれる。AFMは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、デジタルインスツルメント社の登録商標）等に大別される。この分野の研究は著しく進展している最中であり、摩擦力顕微鏡（Lateral force microscopy；LFM）、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡（magnetic force microscopy；MFM）、フォトン走査型トンネル顕微鏡等の新しい顕微鏡が開発されつつある。本発明における走査型プローブ顕微鏡とは、その趣旨に鑑み、現在知られているものに限らず、原子レベルの分解能を有する顕微鏡であれば将来開発されるものをも含むものである。
【００２６】
（ｆ）ステップＳ２２０〜Ｓ２５０は、上記の走査型プローブ顕微鏡を用いて、ハイブリダイゼーション産物を可視化・計測した場合の代表的な可視化画像を示す（図１のステップＳ１０５）。
【００２７】
（ｆ−１）ステップＳ２２０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNA末端に位置しており、そのDNA末端にDNAプローブがハイブリダイズした場合である。DNAプローブとハイブリダイズしたGMOのDNA末端の塩基対と相補的な一本鎖が遊離しており、DNA末端の形状がＹ字型の可視化画像が得られる。
【００２８】
（ｆ−２）ステップＳ２３０においては、ステップＳ２２０と同様であるが、GMOのDNA末端にDNAプローブとハイブリダイズしない塩基配列が数塩基あった場合に、それらが相補的に結合した場合である。末端のDNA形状に注目すると、DNAプローブがハイブリダイズした部分が球状の可視化画像が得られる。
【００２９】
（ｆ−３）ステップＳ２４０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNAの中間に位置しており、そのDNAの中間にDNAプローブがハイブリダイズした場合である。DNAプロ−ブと特異的にハイブリダイズしたGMOのDNAは、ハイブリダイズした二本鎖部分とハイブリダイズしていない一本鎖部分とを有している。この一本鎖部分は一本鎖特有の球状構造をとるため、DNAプロ−ブとハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、ハイブリダイズした線状部分とハイブリダイズしなかった球状部分とからなる可視化画像が得られる。
【００３０】
（ｆ−４）サンプルDNAがnonGMOであった場合に、ハイブリダイズしなかった一本鎖DNAプロ−ブ及びハイブリダイズしなかったサンプルDNAの形状は、全体が球状となる。ステップＳ２５０では、ハイブリダイズした二本鎖DNAプロ−ブ及びハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、全体が線状となる可視化画像を示す。
【００３１】
このように、本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法によれば、DNAプロ−ブとのハイブリダイゼーションによって生じる、分子の特異的な形状を画像化して、その情報からプロ−ブと相補的な配列を有するGMOのDNAがサンプル中に存在するか否かを決定することが可能である。従って、本発明に係る遺伝子組換え食品の検査方法は、従来の検査方法と比較して、一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測する高感度な検査方法であり、かつ精度の高い検査方法である。
【００３２】
以下に本発明の第１の実施の形態に係る実施例を示す。
【００３３】
測定サンプルDNAの調製：
遺伝子組換えダイズ（GMOダイズ）（ラウンドアップ・レディーダイズ：モンサント社製）と非遺伝子組換えダイズ（nonGMOダイズ）を乳鉢と乳棒で粉砕し、適当な緩衝液、例えば100mMトリス緩衝液（pH8.0）に懸濁し、蛋白質変性剤を加え、DNAを抽出した。このGMOダイズには除草剤抵抗性遺伝子のCP4EPSPS領域に20merの配列RR01：tggcgcccatggcctgcatg（配列番号：１）とP-E35S領域に24merの配列RR02：ccttcgcaagacccttcctctata（配列番号：２)が入っている。抽出したDNAはエタノールやイソプロパノールを加えることによって濃縮や緩衝液交換が可能である。このような操作を経て測定サンプルDNA60ng/mlを得た。
【００３４】
DNAプローブの作製：
まず、20merの配列RR01：tggcgcccatggcctgcatg（配列番号：１)と上記GMOダイズの配列RR02：ccttcgcaagacccttcctctata（配列番号：２)をプライマーとし、遺伝子組換えダイズDNAを鋳型としてPCRを行う。次に、PCR後の反応液に含まれるプライマー、酵素、基質などを除去するために、アマシャムファルマシアのGFX PCRDNA and Gel Band Purification Kitを用いてカラムクロマトグラフィーを行い、RR01およびRR02で挟まれた領域の遺伝子断片509bp(RR102)を得た。本DNAを緩衝液に溶解してDNAプローブとした。
【００３５】
ハイブリダイゼーション：
このようにして得られるGMOと相同性のあるDNAプローブと上記測定サンプルDNAのハイブリダイゼーションは、10mMトリス緩衝液（pH7.6）にて100℃10分間加熱してDNAを十分に一本鎖化し、次に、60℃に急冷してこのまま30分間インキュベートして二本鎖を形成させた。さらに、インキュベーション後の反応液は解析まで４℃に保存した。これら一連の行程はいかなる装置を用いても良いが、市販のPCR温度コントローラ（プログラムサーマルコントローラ：フナコシ製）が便利である。
【００３６】
サンプル基板の作製：
次に、４℃に保存されたインキュベーション後の反応液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、得られたサンプル懸濁液をマイカ（雲母基板）の綺麗な劈開面に50μｌ滴下する。そして、室温にて５分間静置後、滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで乾燥して測定サンプルとした。
【００３７】
測定サンプルの可視化・計測：
上記で得られた測定サンプルを走査型プロ−ブ顕微鏡（米国、デジタル・インスツルメンツ社製、ナノスコープIIIa）のサンプル台に固定し、柔らかいサンプルの測定に最適なタッピングモードで画像化（可視化）した。その可視化例を図３に示す。得られた可視化像は、図２のステップＳ２３０のハイブリダイゼーションDNA画像と同じ形状になっているので、遺伝子組換えされたDNAがGMOダイズの末端に入っていることがわかる。もし、遺伝子組換えされたDNAがGMOダイズの中心部分にある場合は、図２のステップＳ２４０の画像になり（DNA両端に固まりのある画像）、遺伝子組換えされていなければ、図２のステップＳ２５０のような二本鎖DNA画像となる。このように、可視化画像から、GMOであるか、どの領域が遺伝子組換えされているか、nonGMOの区別ができる。
【００３８】
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法は、本発明の第１の実施形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法と比較して、本発明の第１の実施形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法において使用したDNAプローブの代わりにビオチンでラベル化したDNAプローブを使用し、そのビオチンを介して磁性粒子を結合させ、磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を磁石により選択的に抽出する点が異なる。
【００３９】
図４は、本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法(HVM法)の詳細を示すフローチャート図である。以下、本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法と異なる点についてのみ、各ステップを追って説明する。
【００４０】
（ａ）まず、ステップＳ３００において、検査対象となるサンプルのDNA抽出及び標的となる遺伝子組換え体とハイブリダイズするビオチン化DNAプローブの調製を行う。上記ビオチン化DNAプローブは、ビオチンを介して磁性粒子と結合できるように、DNAプローブの末端にビオチンをラベル化（標識）したものである。磁性粒子は、ビオチン化DNAプローブのビオチンと結合するストレプトアビジン（又はアビジン）でコートされた磁性粒子を用いる。
【００４１】
（ｂ）上記サンプルDNAとビオチン化DNAプロ−ブとの混合は、混合試料中のサンプルDNAとDNAプロ−ブの高次構造が解消され、相補的配列同士がハイブリダイズする必要がある。このため、ステップＳ３１０における加熱変性前にサンプルDNAとDNAプローブとを混合するか、あるいはサンプルDNAとDNAプローブとをそれぞれ加熱変性した後に混合すればよい。したがって、ステップＳ３１０において、上記DNAプローブとサンプルDNAの混合試料を加熱変性、あるいは高いpH（pH>=13）にさらすことによって、DNAプローブ及びサンプルDNAの二重らせんの二本鎖を結びつけている相補的塩基対をこわし、二重らせんを一本鎖に解離する。
【００４２】
（ｃ）次に、ステップＳ３１０において加熱変性された混合試料の温度を下げ、サンプルDNA中のその塩基配列と上記DNAプロ−ブとをハイブリダイズさせる（図１のステップＳ１０３）。
【００４３】
（ｄ）続いて、上記ハイブリダイゼーションによって得られる混合試料をストレプトアビジン（又はアビジン）でコートされた磁性粒子と十分に混和し、ビオチン化DNAプローブのビオチンと磁性粒子のストレプトアビジンがビオチン・アビジン結合するようにインキュベートする。
【００４４】
（ｅ）上記ハイブリダイゼーション産物から磁石により選択的に磁性粒子が結合いているハイブリダイゼーション産物のみを抽出する。
【００４５】
（ｆ）上記抽出された磁性粒子結合のハイブリダイゼーション産物は、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化する（図１のステップＳ１０４におけるアンカリングする）。
【００４６】
（ｇ）ステップＳ３２０〜Ｓ３５０は、上記基板上に固定化されたハイブリダイゼーション産物を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化・計測した場合の代表的な可視化画像を示す（図１のステップＳ１０５）。
【００４７】
（ｇ−１）ステップＳ３２０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNA末端に位置しており、そのDNA末端に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした場合である。磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブとハイブリダイズしたGMOのDNA末端の塩基対と相補的な一本鎖が遊離しており、図２のステップＳ２２０におけるDNA末端のＹ字型形状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００４８】
（ｇ−２）ステップＳ３３０においては、ステップＳ３２０と同様であるが、GMOのDNA末端に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブとハイブリダイズしない塩基配列が数塩基あった場合に、それらが相補的に結合した場合である。末端のDNA形状に注目すると、磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした部分が、図２のステップＳ２３０における球状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００４９】
（ｇ−３）ステップＳ３４０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNAの中間に位置しており、そのDNAの中間に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした場合である。磁性粒子結合のビオチン化DNAプロ−ブと特異的にハイブリダイズしたGMOのDNAは、ハイブリダイズした二本鎖部分とハイブリダイズしていない一本鎖部分とを有している。この一本鎖部分は一本鎖特有の球状構造をとるため、磁性粒子結合のビオチン化DNAプロ−ブとハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、図２のステップＳ２４０におけるハイブリダイズした線状部分とハイブリダイズしなかった球状部分とからなる形状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００５０】
（ｇ−４）サンプルDNAがnonGMOであった場合に、ハイブリダイズしなかった磁性粒子結合の一本鎖ビオチン化DNAプロ−ブの形状は、全体が球状の可視化画像を示す。
【００５１】
以下に本発明の第２の実施の形態に係る実施例を説明する。
【００５２】
HVM法をさらに高感度するため、図４に示すように、DNAプロ−ブの末端をビオチンでラベル化して磁性粒子を結合させ、磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を磁石により拾い上げれた。DNAプロ−ブの末端をビオチンでラベル化して磁性粒子を結合させ可視化した画像の模式図を図５および図６に示す。
【００５３】
以上の実施例により、本発明に係る遺伝子組換え食品の検査方法（HVM法）によれば、PCRでDNAを増幅する必要がないので、
１）サンプル間のコンタミやPCR阻害物質の確認が不必要である。
【００５４】
２）短く分解された加工食品や醤油・大豆にも用いられ、原理的にはすべてのGMOの検査ができる。
【００５５】
３）検出限界もPCR法と同等であり、かつ、安価である。
【００５６】
４）HVM法は従来法に比べて、工程数が少なく、検査時間も短い。
【００５７】
といった効果が得られた。
【００５８】
【発明の効果】
本発明の食品の検査方法によれば、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することができる。
【００５９】
このため、本発明の食品の検査方法によれば、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に遺伝子組換え食品であるか否か等のミクロな構造を検査することが可能である。
【配列表】
0004360763.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理説明図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る組換え食品の検査方法の詳細を示すフローチャート図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した例である。
【図４】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法の詳細を示すフローチャート図である。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した画像の模式図である。
【図６】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した画像の模式図である。
【図１】
0004360763.tif 000005
【図２】
0004360763.tif 000006
【図３】
0004360763.tif 000007
【図４】
0004360763.tif 000008
【図５】
0004360763.tif 000009
【図６】
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