(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項３記載の組換えベクターを含む酵母。
【請求項６】
サッカロマイセス・セレビジェＹＳＡ７株である、請求項５記載の酵母。
【請求項７】
請求項４記載の形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源の存在下、水性媒体中でフェルラ酸を反応させ、水性媒体中に生成した４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸を採取することを特徴とする４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸の製造方法。
【請求項８】
酵素源が、請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の形質転換体の培養物、菌体、菌体処理物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
モロミ中に請求項４記載の形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源を添加することを特徴とする蒸留酒の製造方法。
【請求項１０】
酵素源が、請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の形質転換体の培養物、菌体、菌体処理物である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いることを特徴とする蒸留酒の製造方法であって、フェルラ酸脱炭酸酵素を増大させた酵母が請求項５記載の酵母である、方法。
【請求項１２】
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母がサッカロマイセス・セレビジェＹＳＡ７株である、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェルラ酸脱炭酸酵素遺伝子を導入した酵母を用いた香味の優れた蒸留酒の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
焼酎、ウイスキー、ブランデー、ウォッカ、ラム、ジン、白酒等の蒸留酒において、香味の優れたものの開発は常に望まれている。
優れた香味を有する蒸留酒には、４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸が多く含まれている。
【０００３】
バニリンおよびバニリン酸は、４−ビニルグアヤコールが酸化されて生成する［日本農芸化学会誌, 70, 684-686, (1996) ］。
香味の優れた蒸留酒を製造する方法として、ヒドロキシシナミック酸エステル加水分解酵素もしくは該酵素を高生産する麹菌（特開平７−１１５９５７号公報）、またはフェルラ酸エステラーゼ［日本農芸化学会誌, 70, 684-686 (1996)］を添加して、フェルラ酸をモロミ中に遊離させる方法が知られている。
【０００４】
また、細胞融合によりフェルラ酸脱炭酸酵素活性の高い酵母を取得する方法が、提案されている［平成７年度生物工学会大会要旨集, 41 (1995) ］。
しかし、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を高められた酵母は得られておらず、かかる酵母を用いて香味の優れた蒸留酒を製造する方法は知られていない。
フェルラ酸脱炭酸酵素は、フェルラ酸を脱炭酸して４−ビニルグアヤコールを生成する反応を触媒する酵素である。
【０００５】
フェルラ酸は、ケイ皮酸、クマル酸等とともにフェニルアクリル酸の一種であり、穀物等の植物の細胞壁を構成するヘミセルロース画分に含まれるアラビノキシランのアラビノース側鎖にエステル結合して存在する。
バチルス・プミルス（Bachillus pumilus ）［アプライド・アンド・エンバイロメンタル・ミクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. ）, 61, 326-332(1995) およびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J. Bacteriol.), 176, 5912-5918(1994) ］のフェルラ酸脱炭酸酵素は、単離精製されている。しかし、サッカロマイセス（Saccharomyces ）属等に属する酵母のフェルラ酸脱炭酸酵素は、該酵素活性の存在が知られているだけで、単離精製はなされていない。
【０００６】
バチルス・プミルス（B. pumilus ）のフェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＦＤＣ遺伝子という）［Appl. Environ. Microbiol., 61, 4484-4486 (1995) ］は知られている。また、サッカロマイセス・セレビジェ（S. cerevisiae）ではフェニルアクリル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＰＡＤ１遺伝子という）［ジーン（Gene）, 142 , 107-112 (1994)］が知られているが、ＦＤＣ遺伝子は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、香味の優れた蒸留酒の製造に有用なフェルラ酸脱炭酸酵素を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質または配列番号１で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質という）、該タンパク質をコードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子という）、該遺伝子を含有する組換えベクター（以下、本発明の組換えベクターという）、該組換えベクターを含む形質転換体（以下、本発明の形質転換体という）、該形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源の存在下、水性媒体中でフェルラ酸を反応させ、水性媒体中に生成した４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸を採取することを特徴とする、４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸の製造方法（以下、本発明の４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸の製造方法という）、モロミ中に該形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源を添加することを特徴とする蒸留酒の製造方法（以下、本発明のタンパク質を用いる蒸留酒の製造方法という）、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いることを特徴とする蒸留酒の製造方法（以下、本発明の酵母を用いる蒸留酒の製造方法という）、および上記の蒸留酒の製造方法により得られる蒸留酒に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質は、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を有しさえすれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、１個から数十個、特に１個から数個までのアミノ酸残基であることが好ましい。また、ＤＮＡＳＩＳver3.0（日立ソフトウエアエンジニアリング製）を用いて、全アミノ酸配列について配列番号１で示されるアミノ酸配列とシンプルホモロジー解析を行った場合に、２０％以上、特に４０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１０】
本発明の遺伝子の単離、該遺伝子の塩基配列の決定、本発明の組換えベクター、本発明の組換えベクターを含む形質転換体および本発明のタンパク質の製造を行うための遺伝子工学または生物工学の基本操作については、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル  講談社、高木康敬編  遺伝子操作実験法  講談社、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）(1982)、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning, 2nd ed.）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）(1989)、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol. ）, 194 (1991)、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法  羊土社(1994)等に記載された方法に従って行うことができる。
【００１１】
本発明の遺伝子は、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を有しない酵母または該酵素活性が著しく低い酵母（以下、併せてフェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しない酵母という）、例えばサッカロマイセス・セレビジェＫ９Ｈ１４株（以下、Ｋ９Ｈ１４株という）に該酵素活性を付与する遺伝子として単離することができる。すなわち、ＦＤＣ遺伝子をもつ酵母のＤＮＡライブラリーでＫ９Ｈ１４株を形質転換して、フェルラ酸脱炭酸酵素活性が付与された酵母からＤＮＡを取得することにより、ＦＤＣ遺伝子として単離することができる。
【００１２】
ＦＤＣ遺伝子を持つ酵母のＤＮＡライブラリーはフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵母、例えばワイン酵母であるサッカロマイセス・セルビジェＷ３株（以下、Ｗ３株という）の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を酵母中で保持することが可能なベクターと連結することによって作製することができる。
【００１３】
染色体ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、染色体ＤＮＡを切断できればいずれも用いることができるが、好ましくは１０Ｋｂｐ以下のＤＮＡ断片を生じさせる制限酵素が用いられる。なお、染色体ＤＮＡは制限酵素によって完全に切断しても、部分的に切断してもよい。
酵母中で保持することが可能なベクターとしては、ＹＣｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＩｐ型ベクターおよびＹＡＣ（酵母人工染色体）ベクター等があげられる。
【００１４】
ＤＮＡライブラリーのＫ９Ｈ１４株への形質転換は、スフェロプラスト法［例えばプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),  75, 1929-1933 (1978)］、酢酸リチウム法［例えばJ. Bacteriol.,  153 , 163-168 (1983)］、エレクトロポレーション法［例えばMethods in Enzymol., 194 , 182-187 (1991) ］等、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されている方法に従って行うことができる。
【００１５】
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を付与された酵母を選択する方法としては、例えば以下の方法があげられる。
上記方法により得られた形質転換株をＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）で一晩（２０〜２４時間）培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、一晩（２０〜２４時間）培養する。培養終了後、くん煙臭のする培養液を官能的に選択し、さらに高速液体クロマトグラフィー［日本農芸化学会誌, 69, 1587-1596, (1995) ］により４―ビニルグアヤコールが検出できる培養液を選択する。選択した培養液から形質転換株を回収し、回収して得られた株をフェルラ酸脱炭酸酵素活性が付与された酵母として選択する。
【００１６】
フェルラ酸としては、トランス−フェルラ酸、シス−フェルラ酸のいずれを用いてもよいが、トランス−フェルラ酸が好適に用いられる。
フェルラ酸脱炭酸酵素活性が付与された酵母からプラスミドを回収する方法および回収したプラスミドを大腸菌に形質転換する方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法を用いることができる。上記酵母からプラスミドを回収する方法としては、例えば実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社(1994)に記載されている方法が、回収したプラスミドを大腸菌に形質転換する方法としては、例えばMolecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) に記載されている方法があげられる。
【００１７】
上記方法により選択されたＤＮＡクローンを、適当な制限酵素、例えばＰｓｔＩなどで切断し、得られたＤＮＡ断片を、ダイデオキシ法およびＤＮＡシーケンサー（ファルマシアＬＫＢ社製、ＡＬＦ  ＤＮＡシークエンサーII）の解析を行うことにより、ＦＤＣ遺伝子の塩基配列を決定することができる。なお、Ｗ３株由来のＦＤＣ遺伝子の塩基配列は、酵母ゲノム・プロジェクトの結果［例えばインターネットhttp://genome-www.stanford.edu/sacchdb／］より得ることができる。
【００１８】
このようにして決定されるＦＤＣ遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号１で示される塩基配列があげられる。
配列番号１で示される塩基配列がフェルラ酸脱炭酸酵素をコードすることが一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)法によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００１９】
本発明の遺伝子は、上記により作製された遺伝子をさらに人為的に遺伝子の塩基配列の一部を改変、例えば欠失、置換または挿入することによっても得られる。なお、アミノ酸に対するコドンの選択は任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して決定することができる［例えばヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 9, 43-74 (1981) ］。また、塩基配列の改変は、サイトスペシフィック・ミュータジェネシス［例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666 (1984)］等の方法に従って行うことができる。
【００２０】
本発明の遺伝子は、例えばMethods in Enzymol., 194 , 594-597 (1991) に記載の方法を用いることにより、遺伝子の破壊、発現制御、発現量の改変等を行うこともできる。
本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素等を用いて調製した後に、該ＤＮＡ断片を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。
【００２１】
本発明の組換えベクターにおいては、本発明の遺伝子の塩基配列を宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、必要に応じて塩基を置換して用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００２２】
本発明の形質転換体は、上記の発現ベクターに適合する宿主細胞中に本発明の組換えベクターを導入することにより得られる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるもであれば、例えばEscherichia coli 、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens 、Brevibacterium flavum、Brevibacterium lactofermentum、Corynebacterium glutamicum 、Microbacterium ammoniaphilum 等のエシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する細菌、Saccharomyces cerevisiae 、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis 、Trichosporon pullulans 、Schwanniomyces alluvius等の酵母、ナマルバ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、タバコ細胞、ニンジン細胞等の植物細胞など、いずれを用いてもよい。
【００２３】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明の組換えタンパク質をコードする配列が転写できるようにプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の細菌を宿主細胞として用いる場合には、本発明の組換えベクターは該微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２４】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもBoehringer Mannheim 社製）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669-675 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)」、pBluescript （Stratagene社製）等が用いられる。
【００２５】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trp プロモーター（Ｐtrp ）、lac プロモーター（Ｐlac ）、P L プロモーター、P R プロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。Ｐtrp を２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tac プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等を用いてもよい。
【００２６】
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいずれも用いられるが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節して用いることが好ましい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110-2114 (1972) ］、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等、いずれの方法も用いられる。
【００２７】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115 ）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC37419 ）等が用いられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1 プロモーター等、いずれのものを用いてもよい。
【００２８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［Methods in Enzymol., 194, 182-187 (1990)］、スフェロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 1929-1933 (1978) ］、酢酸リチウム法［J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)］等、いずれの方法も用いられる。
【００２９】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社製）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであれば、例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early) 遺伝子のプロモーター等、いずれのものを用いてもよい。また、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
【００３０】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133(1990)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)］等、いずれの方法も用いられる。
【００３１】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＩ１２１［Nucleic Acids Res., 12, 8771-8721 (1984)］等が用いられる。この場合、プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであれば、例えば、カリフラワー・モザイク・ウィルスの３５Ｓプロモーター等、いずれのものを用いてもよい。
【００３２】
植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）法［Methods in Enzaymol., 118, 627-640 (1986) ］、高速微粒子法［プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant Molecular Biology ）, 11, 433-439 (1989)］、プロトプラスト法［ネイチャー（Nature）, 319, 791-793 (1986) ］等、いずれの方法も用いられる。
【００３３】
本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質の製造、４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸等のフレーバーの製造等に用いられる。また、宿主細胞が酵母である本発明の形質転換体は、香味の優れた蒸留酒の製造に好適に用いられる。
本発明のタンパク質は、本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該タンパク質を採取することにより製造することができる。
【００３４】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、該形質転換体の宿主細胞を培養するときに用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する場合、培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３５】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体またはその消化物等が用いられる。
【００３６】
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、１５〜４０℃で１６〜９６時間行う。培養期間中、ｐＨは３. ０〜９. ０に保持する。
【００３７】
培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trp プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３８】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する場合、動物細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよいが、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が通常用いられる。
【００３９】
培養は、通常５％ＣＯ2 存在下、３５〜３７℃で３〜７日間行う。
培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する場合、植物細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよいが、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（White ）培地等が通常用いられる。
【００４０】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、１５〜４０℃で１〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは３. ０〜９. ０に保持する。
培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養終了後、本発明の形質転換体の細胞内または細胞外に生産される本発明のタンパク質を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。細胞内に本発明のタンパク質が生産される場合、該培養液を遠心分離した菌体を回収し、該菌体を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により菌体を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、硫安等による塩析、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースなどの陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることにより、本発明のタンパク質の精製酵素標品を得ることができる。細胞外に本発明のタンパク質が生産される場合、該培養液から無細胞抽出液から精製するのと同様の方法を用いることにより、本発明のタンパク質の精製酵素標品を得ることができる。
【００４１】
本発明の４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸の製造方法には、本発明の形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源として、上記方法により得られる粗精製または精製した本発明のタンパク質の他、本発明の形質転換体の培養物、菌体、菌体処理物等が用いられる。菌体処理物としては、洗浄菌体、凍結乾燥菌体、アセトン処理菌体等の物理化学的、生化学的に処理した菌体等があげられる。
【００４２】
酵素源は、水性媒体中にフェルラ酸脱炭酸酵素の酵素量単位として０．１〜１０００単位／ｍｌの濃度範囲で通常は用いられる。
なお、フェルラ酸脱炭酸酵素の酵素量単位は、フェルラ酸を基質として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で、３０℃、１時間反応を行った場合に１ｎｍｏｌの４−ビニルグアヤコールを生成する酵素量をそれぞれ１単位として表示する。
【００４３】
酵素源として培養物または菌体を用いる場合は、培養物または菌体をセチルピリジウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド等の界面活性剤またはトルエン、キシレン等の有機溶剤を添加してもよい。界面活性剤または有機溶剤を添加する場合には、その添加量はそれぞれ０．０５〜１．０％（ｗ／ｖ）または１〜２０％（ｖ／ｖ）であればよい。
【００４４】
フェルラ酸は、通常は水性媒体中に０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度範囲で用いられる。
反応は、培養物、菌体または菌体処理物の量およびフェルラ酸の量により異なるが、２０〜６０℃、ｐＨ２．５〜１０．０で、１〜７２時間行う。
このようにして得られる該水性媒体中には、４−ビニルグアヤコールが存在している。反応終了後、該水性媒体より、培養物、菌体または菌体処理物などを必要に応じて破砕後、沈澱物を遠心分離などの手段により除去し、得られる上清から、抽出、蒸留、各種クロマトグラフィー、再結晶等、通常の方法用いることにより、４−ビニルグアヤコールを単離、精製することができる。
【００４５】
バニリンまたはバニリン酸は、該水性媒体中または該水性媒体から単離、精製された４−ビニルグアヤコールを、例えばエアレーション等により強制酸化させるか、バチルス・サチルス（B. subtilis) 、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium  Glutamicum ）等の菌体により酸化させる［ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（J. Ind. Microbiol.）, 15, 457-471 (1995)］ことにより、バニリンまたはバニリン酸に変換することができる。
【００４６】
バニリンまたはバニリン酸は、４−ビニルグアヤコールを単離、精製する方法と同様な方法を用いることにより単離、精製することができる。
本発明のタンパク質を用いる蒸留酒の製造方法としては、本発明の形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源を、モロミ中にフェルラ酸脱炭酸酵素の酵素量単位として０．１〜５０単位／ｍｌとなるように添加する以外は、炭素源を麹菌または糖化酵素で糖化し、酵母を加えてアルコール発酵させた後に蒸留する、通常の蒸留酒を製造方法が用いられる。
【００４７】
本発明においてモロミとは、アルコール発酵を通じて得られる培養物をいう。本発明の酵母を用いる蒸留酒の製造方法としては、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いる以外は、炭素源を麹菌または糖化酵素で糖化し、酵母を加えてアルコール発酵させた後に蒸留する、通常の蒸留酒を製造方法が用いられる。
【００４８】
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母とは、宿主細胞または親株となる酵母に遺伝子組換え技術、突然変異技術等を施して得られる、宿主細胞または親株となる酵母に比べてフェルラ酸脱炭酸酵素活性が増大した酵母をいう。
遺伝子組換え技術を用いる場合、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母は、フェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子、例えば本発明に用いる遺伝子、バチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子等を含有する組換えベクターを上記方法により作製し、これを上記方法により宿主細胞に形質転換することにより製造することができる。
【００４９】
突然変異技術を用いる場合、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母は、親株に紫外線照射やエチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤を処理する等、通常の変異手段により変異させ、得られた変異株を上記のフェルラ酸脱炭酸酵素活性を付与された酵母を選択する方法と同様の方法を用いて親株に比べて４−ビニルアヤコール生産性が向上した株を選択することにより製造することができる。親株を変異処理した後、親株が十分に生育できないような濃度のフェニルアクリル酸を含む培地、例えばフェルラ酸を１ｍＭ以上含む培地で、親株に比べて有意に生育可能な変異株を選択すれば、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母が効率的に製造することができる。
【００５０】
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を製造するために用いる宿主細胞または親株としては、蒸留酒の製造に用いられる酵母であればいずれの酵母も用いられるが、好ましくはサッカロマイセス属に属する酵母、さらに好ましくはサッカロマイセス・セレビジェに属する酵母が用いられる。また、宿主細胞としては、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しないサッカロマイセス・セレビジェに属する酵母、例えば日本醸造協会７号、日本醸造協会９号、Ｋ９Ｈ１４株（以上、清酒、焼酎酵母）、ＩＦＯ２１１２、ＩＦＯ２１１４、ＩＦＯ２１１５（以上、ウイスキー酵母）を用いると顕著な効果が得られる。
【００５１】
例えば、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しない酵母を宿主細胞とした場合には、本発明の形質転換体の作製方法と同様の方法を用いて作製した形質転換体に基質としてフェルラ酸を添加し、官能的にあるいは高速液体クロマトグラフィー等の機器を用いて定量的に４―ビニルグアヤコールを検出し、４―ビニルグアヤコールの生成が確認できた株を選択することにより、本発明の酵母を作製することができる。
【００５２】
上記の方法によって作製された本発明の酵母としては、例えばサッカロマイセス・セレビジェＹＳＡ７株（以下、ＹＳＡ７株という）があげられる。ＹＳＡ７株は、ブダペスト条約に基づいて平成８年１２月１１日付で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ  ＢＰ−５７７２として寄託されている。
【００５３】
ＹＳＡ７株が、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母であることを以下に示す。
【００５４】
試験例１  フェルラ酸脱炭酸酵素活性能試験
１０ｍｌのＹＰＤ培地の入った試験管にＹＳＡ７株、その親株であるＫ９Ｈ１４株、Ｋ９Ｈ１４株にＹＥｐ２４を導入した形質転換体であるＫ９Ｈ１４−Ｃ株を、それぞれ１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２２時間振とう培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養した。培養終了後、培養液上清中の４―ビニルグアヤコール含量を以下に示す条件で高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
【００５５】
カラム：Wakosil 5C 18-200(i.d.4.6 ×250mm)
カラム温度：５０℃
移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液(pH2.5) ／メタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）
検出器：蛍光検出器(Ex 280nm, Em 320nm)
試料：培養液上清を移動相で１０倍希釈し、１０μｌ注入
結果を第１表に示す。
【００５６】
【表１】
0004252120.tif 000002
【００５７】
上記方法により作製されたフェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いた、本発明の蒸留酒の製造方法を以下に示す。
炭素源としては、いかなる糖質および澱粉質も用いられるが、好ましくは米、麦、あわ、とうもろこし、こうりゃん、ひえ、きび等の穀類、イモ類、そば、ブドウ、リンゴ等の果実またはこれらの麹が、さらに好ましくは穀類またはこれらの麹が用いられる。
【００５８】
麹菌としては、米麹、麦麹、ふすま麹等に用いられる糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）属、リゾップス（Rhizopus）属に属する微生物等が用いられる。
糖化酵素としては、麦芽に含まれる酵素、麹菌が生産する酵素、またはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ等の酵素剤等が用いられる。
【００５９】
アルコール発酵としては、以下の方法が例示される。穀類を用いる場合には、穀類である澱粉質をまず糖化酵素により糖類に分解し、ついで酵母を加えて発酵させる並行複発酵を行う。例えば焼酎の製造においては、発酵の開始時に麹を仕込み、発酵の経過とともに残りの炭素源を追加する、１次仕込み、２次仕込みと呼ばれる段仕込みを一般に行う。ウイスキーの製造においては、麦芽に温水を加えて糖化し、得られた麦汁を発酵させる方法を一般に行う。果実、糖蜜、グルコース等の糖質を用いる場合は、直接酵母を加えて発酵させる単発酵を行う。
【００６０】
アルコール発酵は、通常、ｐＨ３．５〜５．０、温度５〜２５℃、仕込み終了から焼酎で７〜１４日間、ウイスキーで３〜４日間、ブランデーで７〜１４日間行う。
アルコール発酵終了後、得られたモロミはそのまま蒸留してもよいが、モロミを圧搾濾過、遠心分離等の処理により発酵残物、酵母菌体等を分離して得られる液を蒸留してもよい。モロミまたはモロミを圧搾濾過、遠心分離等の処理して得られる液を、蒸留することによりエタノールを濃縮させて、原酒を調製する。原酒をそのまま蒸留酒としてもよいが、原酒を混合、希釈、アルコール添加等の調整を行い、これを蒸留酒としてもよい。
【００６１】
以下に実施例を示す。
【００６２】
【実施例】
実施例１  フェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子のクローニング
（１）Ｋ９Ｈ１４株へのｕｒａ３変異の付与
清酒（焼酎）酵母であるサッカロマイセス・セレビジェ日本醸造協会９号（日本醸造協会）の一倍体株であり、かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しない株であるＫ９Ｈ１４株に、プラスミドを導入するためのマーカーとして、ボーク(Boeke) らの方法［モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゼネティクス(Mol. Gen. Genet.), 197, 345-346 (1984) ］に従って、ｕｒａ３変異を付与した。すなわち、Ｋ９Ｈ１４株をＹＰＤ培地に１白金耳植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液１００μｌをＦＯＡプレート［０．６７％イーストナイトロジェンベースＷ／Ｏアミノ酸（ディフコ社製）、０．１％５−フルオロオロチン酸、０．００５％ウラシル、２％グルコース、２％寒天］  に塗布し、３０℃で３日間培養した。培養終了後、生じたコロニーのうち、ウラシル要求性であり、ＵＲＡ３をマーカーとして持つプラスミドＹＣｐ５０で形質転換した場合にウラシル要求性が相補され、かつフェルラ酸脱炭酸活性のない１菌株を選抜し、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株とした。なお、発酵能等の性質についてＫ９Ｈ１４−３ｕ株はＫ９Ｈ１４株と同等の性質を示した。
【００６３】
（２）クローニング
ワイン酵母Ｗ３株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで部分分解したＤＮＡ断片を、プラスミドＹＣｐ５０のＢａｍＨＩ部位に挿入し、遺伝子ライブラリーを作製した。遺伝子ライブラリーを用いて、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株を形質転換し、ウラシル非要求性で形質転換体を選抜した。得られた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地で３０℃で一晩振とう培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養した。培養終了後、培養液のにおいを嗅ぎ、くん煙様の香の強い培養液を選抜し、培養液上清を高速液体クロマトグラフィーを行い、４―ビニルグアヤコールの生成を確認した。
【００６４】
該培養液から得られた株を、フェルラ酸脱炭酸活性が付与された株として分離し、その株から組換体のプラスミドｐＳＡ１１を抽出した。
プラスミドｐＳＡ１１には、ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩの約４ＫｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていた。プラスミドｐＳＡ１１を各種の制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を電気泳動により分離して分子量を測定し、図１に示すとおり制限酵素地図を作成した。
【００６５】
（３）塩基配列の決定
プラスミドｐＳＡ１１に挿入されているＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩの４ＫｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をダイデオキシ法およびＤＮＡシーケンサー（ファルマシアＬＫＢ社製、ＡＬＦ  ＤＮＡシークエンサーII）を用いて決定した。その結果、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子（以下、ＦＤＣ１遺伝子という）をオープン・リーディング・フレームとして含む、配列番号２で表される塩基配列が決定された。決定された塩基配列より予想されるＦＤＣ１遺伝子のコードするタンパク質は、５０３アミノ酸残基からなるものであった。配列番号１で表されるこの塩基配列は、酵母ゲノムプロジェクト［例えばインターネットhttp://genome-www.stanford. edu/sacchdb/］により公開されている塩基配列のうち、第ＩＶ番染色体の配列１５１２１４０〜１５１３６５１に位置している塩基配列と同一のものであった。ＦＤＣ１遺伝子とバチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子［Appl. Environ. Microbiol., 61, 4484-4486 (1995) ］およびサッカロマイセス・セレビジェのフェニルアクリル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＰＡＤ１遺伝子という）［Gene, 142 , 107-112 (1994)］とを、ＤＮＡＳＩＳver3.0（日立ソフトウエアエンジニアリング製）を用いてシンプルホモロジー解析を行った結果、全塩基配列でそれぞれ３０％および４１％、塩基配列を翻訳して得られる全アミノ酸配列でそれぞれ１１．２５％および１０．３７％のホモロジーしかなかった。また、ＢＬＡＳＴ法によるホモロジー検索［例えば、ゲノムネットのデータベース利用法、共立出版（1996）］を行った結果、ＦＤＣ１遺伝子とバチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子およびＰＡＤ１遺伝子とは、有意なホモロジーが見いだせなかった。
【００６６】
実施例２  フェルラ酸脱炭酸酵素活性を付与した焼酎酵母の作製
（１）ＦＤＣ１遺伝子発現用プラスミドの調製
プラスミドｐＳＡ１１約５μｇをＨ緩衝液［５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ塩化ナトリウム］２０μｌに溶解し、１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを加え、３７℃で一晩反応させた。反応生成物を０．８％アガロース電気泳動により分離し、約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II キット（バイオ１０１社製）を用いて抽出精製した。また、プラスミドｐＳＡ１１を酵母―大腸菌シャトルベクターＹＥｐ２４に代える以外は上記と同様な方法を用いて約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。プラスミドｐＳＡ１１由来の約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片１μｇとＹＥｐ２４由来の約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片０．１μｇをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造）を用いて１６℃で一晩連結反応を行った。反応終了後、反応液５μｌを用いてコンピテント・セルＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を形質転換した。得られた形質転換株をアンピシリンＬＢ寒天培地［１％バクトトリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、５０μｇ／ｍｌアンピシリン］に塗布し、３７℃で２０時間培養を行った。培養終了後、生じたコロニーを単離し、これを培養して得られたプラスミドＤＮＡを抽出精製した。得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断し、約３．６ＫｂｐのＤＮＡ断片が確認できたものを発現用プラスミドｐＳＡ８とした（図２）。
【００６７】
（２）ＦＤＣ１遺伝子の焼酎酵母への導入と発現
Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株をＹＰＤ培地１００ｍｌの入った三角フラスコへ接種し、３０℃で２〜４×１０7細胞／ｍｌになるまで振とう培養した。培養終了後、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分）で集菌し、得られた菌体を酢酸リチウム法によりプラスミドｐＳＡ８に接触させた。プラスミドｐＳＡ８に接触させたＫ９Ｈ１４−３ｕ株をＳＤ寒天培地（０．６７％イースト・ナイトロジェン・ベースＷ／Ｏアミノ酸、２％グルコース、２％寒天）上に接種し、３０℃で２〜５日間培養した。培養終了後、生じたコロニーのうちの一つから、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株のウラシル要求性が相補された形質転換株であるＹＳＡ７株を取得した。
【００６８】
ＹＳＡ７株、Ｋ９Ｈ１４株およびＫ９Ｈ１４−Ｃ株をそれぞれＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で一晩培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養した。培養終了後、培養液上清中の４―ビニルグアヤコール含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量したところ、Ｋ９Ｈ１４株、Ｋ９Ｈ１４−Ｃ株では４―ビニルグアヤコールの生成はほとんど見られなかったが、ＹＳＡ７株では４―ビニルグアヤコールの生成が確認された。
【００６９】
実施例３  米焼酎の製造
ＹＳＡ７株、Ｋ９Ｈ１４株およびＫ９Ｈ１４−Ｃ株について、それぞれ総米８４０ｇで米焼酎の小仕込製造を行った。
仕込配合を第２表に示す。
【００７０】
【表２】
0004252120.tif 000003
【００７１】
アルコール発酵を２０℃で２次仕込後１０日間行った後、得られたモロミを蒸留して米焼酎を製造した。
製造した米焼酎は、国税庁所定分析法に従って成分分析を行った。それぞれの酵母を用いて製造した米焼酎について、高速液体クロマトグラフィーを用いてエタノール含量および４―ビニルグアヤコール含量を測定し、パネラー７名により官能評価を行った。
【００７２】
結果を第３表に示す。なお、官能評価の評点は、７名の平均点とした。
【００７３】
【表３】
0004252120.tif 000004
【００７４】
第３表に示されるとおり、ＹＳＡ７株を用いて製造した米焼酎は、その親株であるＫ９Ｈ１４株を用いて製造した米焼酎よりも４―ビニルグアヤコール含量が有意に高く、官能的にも特徴のある香味を有していた。
【００７５】
【発明の効果】
本発明によれば、香味の優れた蒸留酒の製造に有用なフェルラ酸脱炭酸酵素を提供することができる。
【００７６】
【配列表】
0004252120.tif 000005
0004252120.tif 000006
0004252120.tif 000007
0004252120.tif 000008
【００７７】
0004252120.tif 000009
0004252120.tif 000010
0004252120.tif 000011
0004252120.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＦＤＣ１遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図、ならびにＦＤＣ１遺伝子の特定のために行ったサブクローニングの結果および得られたＤＮＡ断片のＦＤＣ活性の有無を示す図である。
【図２】  ＦＤＣ１遺伝子発現用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図１】
0004252120.tif 000013
【図２】
0004252120.tif 000014