(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクト−Ｎ−テトラオースとキャリアーとの結合物を有効成分とする非特異的ＩｇＥ産生促進剤。
【請求項２】
キャリアーがタンパク質である請求項１記載の非特異的ＩｇＥ産生促進剤。
【請求項３】
タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項２記載の非特異的ＩｇＥ産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非特異的ＩｇＥ産生促進剤、抗アレルギー剤及び自己免疫疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アレルギーを有する人の数は増加の一途をたどっており、アレルギーは大きな社会問題となっている。このアレルギーを発症させる要因として、遺伝的な背景の他に、環境的な背景、例えば、衛生状態、食生活、住環境、大気汚染、ストレスなどが大きく関与していると言われている。そして、アレルギー発症に密接に関係している分子のひとつとして、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）が知られており、このＩｇＥを産生するアレルギーモデル系を開発し、アレルギー疾患に関連する研究に役立てようとする研究が活発に行われている[Imaoka et al.,Exp. Anim., vol.42, No.1, pp.61-65, 1993]  。
【０００３】
花粉症、気管支喘息などはＩ型アレルギー病に分類される。これらのアレルギー病増加の原因としていろいろな修飾因子が考えられているが、寄生虫感染や、結核などの細菌感染の減少もその一因であると考えられている。これは、寄生虫に感染すると、寄生虫に特異的なＩｇＥのみならず寄生虫には無関係な非特異的多数の抗原に対するＩｇＥ抗体も同時に産生する。そして、寄生虫感染によってもたらされた多量の非特異的ＩｇＥ抗体が互いに競合しあい、肥満細胞や好塩基球上の高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃｅＲ−Ｉ）をすべて被いつくし、結果として個々のアレルギーに関与する特異的なＩｇＥ抗体のレセプターへの結合を阻害し、肥満細胞からヒスタミンなどの遊離を起こさせないようにしてアレルギーの発症を防いでいると考えられている。したがって、抗原特異的ＩｇＥに対して抗原非特異的ＩｇＥの比率を高めることによりアレルギーの発症を抑制できる。
【０００４】
一方、実験動物にＩｇＥを産生させる手段としては、百日咳菌アジュバント、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）あるいはアラムアジュバントなどを用い免疫する方法が一般的に行われている。百日咳菌アジュバントは、百日咳菌 (Bordetella pertussis) の菌体成分からなり、この菌体成分中のリポポリ多糖（ＬＰＳ）や百日咳菌毒素が免疫システムを非特異的に刺激する。また、ＦＣＡは、鉱物油、乳化剤及び結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の菌体成分からなり、この鉱物油及び乳化剤で抗原をエマルジョン化することにより、抗原を投与部位に長く滞留させ代謝による分解を受け難くすると共に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の菌体成分中のムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が免疫システムを非特異的に刺激する。これらのアジュバントでは、菌体成分が強力な免疫応答促進作用を示すため、アジュバント効果が非常に高い。しかし、菌体成分による副作用、例えば、ツベルクリン過敏症、肉芽腫、アジュバント関節炎などを引き起こし易く、これらのアジュバントの取扱いに際しては、吸引や粘膜との接触を避けるなど特別な注意を要する。
【０００５】
一方、アラムアジュバントは、抗原を吸着し沈澱物として存在する水酸化アルミニウムゲルからなり、抗原・水酸化アルミニウムゲル複合体が投与部位に長く滞留しアジュバント効果を示す。このアラムアジュバントは、上述したような百日咳菌アジュバントやＦＣＡなどで見られる副作用は殆ど認められず、ヒトに用いることのできる唯一のアジュバントとして知られている。また、このアラムアジュバントは、百日咳菌アジュバントと同時に用いられることもあり、百日咳菌アジュバントによる免疫システムに対する非特異的な刺激効果が付加されるが、百日咳菌 (Bordetella pertussis) の菌体成分による副作用が生じるという問題がある。
【０００６】
すなわち、百日咳菌アジュバント、ＦＣＡあるいは百日咳菌アジュバント添加アラムアジュバントなどの菌体成分を用いたアジュバントは、いずれも強力なアジュバント効果を示すが、これらのアジュバントの使用に際しては、上述したような副作用を考慮しなければならない。また、アラムアジュバント単体でも、菌体成分を含む百日咳菌アジュバントあるいはＦＣＡなどと比べ副作用は弱いものの、最近ではアルミニウムの毒性も問題視されており、より安全性の高いアジュバントが望まれている。
【０００７】
一方で、寄生虫感染時には高ＩｇＥ血症、好酸球増多が見られ、これがＴ細胞のサブセットであるＴｈ２に大きく依存していることが明らかとなっている。すなわち、寄生虫感染において、寄生虫抗原がＴｈ２優位の反応を誘導していることが明らかになっている。ＩｇＥ産生の誘導活性にはサイトカインＩＬ−４やＩＬ−１３が、ＩｇＥ産生の増強活性や好酸球の増加や分化にはＩＬ−５のサイトカインがそれぞれ作用している。更に、このＴｈ２サブセットはＴｈ０と呼ばれる細胞集団から分化し、もう一つのサブセットであるＴｈ１とそれぞれが産生するサイトカインによって、拮抗することがわかっている。現在、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症をこれらの細胞のバランスによる細胞性調節機構の観点から解析することが進められている。すなわち、Ｔｈ１細胞が自己免疫疾患の発症に重要であり、Ｔｈ１細胞が自己免疫反応を押し進め、Ｔｈ２細胞がそれを調節していることが提唱されている（Trinchieri, G.: Immunol. Today. 14:335-338,1993)。このように、Ｔｈ２細胞を優位にすることができれば自己免疫疾患の発症を予防したり、抑えたりすることが可能であると考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、副作用が少なく、かつ、非特異的ＩｇＥ産生促進効果が高く、抗アレルギー剤、自己免疫疾患治療剤やアジュバントとして有用な物質を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、非特異的ＩｇＥ産生促進効果を有する物質を見出すべく、鋭意検討をおこなったところ、ＬＮＴ（lacto-N-tetraose:Galβ1-3GlcNAc β1-3Galβ1-4Glc）とキャリアーとの結合物が高い非特異的ＩｇＥ産生促進効果を有し、抗アレルギー剤、自己免疫疾患治療剤及びアジュバントとして有用であることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＬＮＴとキャリアーとの結合物を有効成分とする非特異的ＩｇＥ産生促進剤を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の非特異的ＩｇＥ産生促進剤、抗アレルギー剤及び自己免疫疾患治療剤に用いられるＬＮＴとキャリアーとの結合物（以下、「ＬＮＴ−Ｃ」と称する）におけるＬＮＴとは、ラクト−Ｎ−テトラオース（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) であり、例えば化学合成法（Chem. Pharm. Bullo, 28, 1804-1809(1980) ）、及びβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下、ラクトースにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを作用させてラクト−Ｎ−トリオースIIを合成し、さらにβ−ガラクトシダーゼの存在下、ラクト−Ｎ−トリオースIIにガラクトースを結合させる方法によって製造することができる。
【００１２】
一方、キャリアーとしてはタンパク質、ポリペプチド、多糖類、合成高分子が挙げられる。タンパク質としては、血清タンパク質（例えば血清アルブミン）が好ましい。当キャリアーは、抗アレルギー剤や自己免疫疾患治療剤のように医薬として用いる場合には、投与対象に対して抗原となり得ないタンパク質、例えばヒト用医薬の場合にはヒト由来タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が例示できる。ポリペプチド又は合成高分子としてはポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、（メタ）アクリレート系ポリマー等が挙げられる。形状は直鎖状でも分枝があっても、デンドリマーであってもかまわないが、キャリアー１分子あたりＬＮＴが１０〜２０個結合しているものが好ましい。また多糖類としては、デキストラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、キトサン等の天然多糖等が挙げられる。
【００１３】
ＬＮＴとキャリアーとの結合反応としては、ジカルボン酸無水物等を用いたカルボキシル基をもつリンカー；還元アミノ化法、ジアミン等のアミノ基をもつリンカー等が挙げられるが、例えばＬＮＴとキャリアーとを還元剤の存在下に反応させる、いわゆる還元アミノ化法等により行うのが好ましい。還元アミノ化法に用いる還元剤としてはナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＢＨ3ＣＮ）、等が挙げられる。
【００１４】
ＬＮＴ−ＣにおけるＬＮＴとキャリアーとの結合比率（ＬＮＴ：Ｃ）は、５：１〜５０：１、特に１０：１〜２０：１が好ましい。
【００１５】
ＬＮＴ−Ｃの好ましい例は、ＬＮＴ−ＨＳＡであり、市販品を用いることもできる。
【００１６】
かかるＬＮＴ−Ｃは後記実施例に示すように動物に投与したとき、抗原特異的ＩｇＥや抗原特異的ＩｇＧの産生能に比べて、抗原非特異的ＩｇＥの産生能が顕著に高い。従って、ＬＮＴ−Ｃは非特異的ＩｇＥ産生促進剤として有用である。
【００１７】
一方、前記の如く、抗原特異的ＩｇＥに対して抗原非特異的ＩｇＥの比率を増加させるとアレルギーの発症を抑制できるといわれており、本発明者はこのことをラット受身皮膚アナフィラキシー反応モデルを用いて確認した（後記実施例５）。ＬＮＴ−Ｃは、抗原特異的ＩｇＥに比べて抗原非特異的ＩｇＥを顕著に産生するので、ＬＮＴ−Ｃを投与すればアレルギー反応を抑制できることは明らかである。従って、ＬＮＴ−Ｃは抗アレルギー剤、特に花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等の他、インスリン保存性糖尿病、慢性関節リウマチ等に代表される自己免疫疾患等の治療薬として有用である。
【００１８】
本発明の医薬は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬など）のいずれでも投与できる。
【００１９】
経口用製剤を調製する場合、賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法による、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁液剤などとする。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロースなどが挙げられる。結合剤としては、たとえば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２０】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。これらの錠剤や顆粒剤には、糖衣、ゼラチン等により適宜コーティングしてもよい。
【００２１】
注射剤を調製する場合、必要により、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、多投与量を同一の容器に収納してもよい。
【００２２】
本発明の医薬の投与量は、ヒトの場合、ＬＮＴ−Ｃとして成人１日当たり通常０．０１〜１０００mg、好ましくは０．１〜１００mgの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
参考例１  β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの調製ウシ血液約１０Ｌを採取し、室温で約２．５時間放置し、凝固させた。上清を回収し遠心分離（８，０００rpm ，３０min ，４℃）により混入した血球成分を除去し、血清２．７Ｌを得た。２５％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、３時間放置した。さらに、５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、一晩放置した。
【００２５】
遠心分離（８，０００rpm ，３０min ，４℃）により沈殿を集め、少量のカコジル酸緩衝液（pH７．０）に溶解し透析後、凍結乾燥を行い、部分精製のβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（β−ＧｌｃＮＡｃＴ）を得た。
【００２６】
参考例２  ラクト−Ｎ−トリオースIIの合成
５４０mgのラクトースと９０mgのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、３mLの７５mMカコジル酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、これに、参考例１で得られたβ−ＧｌｃＮＡｃＴを加えて、４０℃にて３０時間反応を行った。反応液を活性炭−セライトのカラム（４．４×８７cm）に供し、０％から３０％のエタノールのグラジェント溶液を１５０mL／hrの流速で流し、４mLずつのフラクションを集めた。３糖のフラクションを集めて濃縮することにより、１７mgのラクト−Ｎ−トリオースII（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を得た。
【００２７】
参考例３  ラクト−Ｎ−テトラオースの合成
６０mgのＧａｌβ−ｏＮｐと３６mgのラクト−Ｎ−トリオースIIを４０mM酢酸緩衝液（pH５．５）３mLに溶解し、Bacillus criculans由来のβ−１，３−ガラクトシダーゼ（特開平９−３１３１７７）を２５０mU添加して、５０℃で１１時間反応させた後、１００℃で５分間加熱して反応を停止した。反応液を実施例３と同様の方法でＨＰＬＣにて分析したところ、ラクト−Ｎ−テトラオースの標準品の保持時間と一致する転移生成物のピークが検出された。
【００２８】
遠心分離（５０００×ｇ，１５min）により不溶物を除去後、上清を５％メタノールを含む水で平衡化したＯＤＳ Chromatorex  ＤＭ１０２０Ｔ（富士シリアル化学社製）クロマトグラフィー（φ１．１×５．７cm）に供した。最初に溶出した還元糖の画分を１５mLに濃縮し、活性炭−セライトクロマトグラフィー（φ２．２×２８cm）に供した。最初に水（１５０mL）、次いで７．５％エタノール（３００mL）により洗浄し、７．５％（１Ｌ）〜３５％（１Ｌ）のエタノールの直線濃度勾配法により溶出した結果、エタノールの濃度が１５％と２０％付近に、２１０nmの吸収を持つピークが２本検出された。２０％付近の画分は、本発明のラクト−Ｎ−テトラオース、及びβ１−６異性体と推定される生成物の混合物であることが推測されたために、本画分を、５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）で基質濃度０．１％に希釈し、β−ガラクトシダーゼ（大和化成社製Ｂｉｏｌａｃｔａ）を３２６Ｕ添加し、４０℃で２１時間反応を行った後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた。
【００２９】
遠心分離（５０００×ｇ，１５min）により不純物を除去後、上清を活性炭−セライトクロマトグラフィー（φ２．２×１０cm）に供した。水（１００mL）、次いで７．５％エタノール（６０mL）により洗浄し、７．５％（３００mL）〜３５％（３００mL）のエタノールの直線濃度勾配法により溶出した結果、エタノールの濃度が２０％付近に、２１０nmの吸収を持つピークが１本検出された。これを濃縮、凍結乾燥し、白色粉末（７．１mg）を得た。このものは、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲによる構造解析の結果、ラクト−Ｎ−テトラオースと構造決定された。
【００３０】
実施例１：ＬＮＴ−ＨＳＡの合成
ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、RAD Chemical社製) １５mg（0.000217mmol）、参考例３で合成したＬＮＴ３０mg(0.0424mmol)を０．２Ｍほう酸バッファー（pH 8.5）１．５mLに溶解し室温で撹拌した。この反応液にナトリウムシアノボロハイドライド（NaBH3CN) １５mg(0.2419mmol)を加え、５０℃にて撹拌した。反応液を１２時間後、２４時間後、９６時間後にそれぞれ０．５mLサンプリングした。
サンプリング後、反応液を８０％酢酸にて中和し、ULTRAFREE-MC（分子量カットオフ10000,１mL) ３つに分注し、遠心機（１５min 、15000rpm）にて脱塩を行った。２５０μL の水で希釈して再度遠心機にて脱塩を行った。同様の操作を２回繰り返した。得られた高分子量画分ＬＮＴ−ＨＳＡを水１mLに希釈後、動物実験に供するサンプルとした。
【００３１】
実施例２：ＬＮＴ−ＨＳＡのレクチン（ＲＣＡ１２０）結合活性
実施例１で得られた反応時間が異なる３種類の合成ＬＮＴ−ＨＳＡ（反応時間；１２、２４、９６時間）、そして市販しているＬＮＴ−ＨＳＡ (Accurate Chemical & Scientific Corp.) を、０．５Ｍ炭酸バッファー：pH９．５で０．１：０．３、１．０、３．０、１０．０μg/mLの濃度に調製し、５０μL/wellずつ９６穴プレート(Nunc Immnomodule plate,polysorp F8 ）に分注して３７℃、1 時間インキュベートした。プレートから溶液を除去し、洗浄液（10mMトリス-HCl,0.15NaCl,0.05%Tween-20, pH7.5）で３回洗浄後、1 ％牛血清アルブミン（Sigma A-6003)/ＰＢＳ（リン酸バッファー生理食塩水， pH 7.4)で２００μL/wellずつ分注して３７℃、1 時間ブロッキングした。プレートを洗浄液で1 回洗浄後、ＨＲＰ標識ＲＣＡ−１２０ (生化学工業）を０．１％牛血清アルブミン／洗浄液で２，０００倍に希釈し、５０μL/wellずつ分注して３７℃、１時間反応させた。反応終了後、洗浄液でプレートを５回洗浄し、ＴＭＢ発色試薬（DAKO）を５０μL/wellずつ添加し、室温で１０分反応させた後、３Ｎ硫酸溶液を５０μL/wellずつ加えて反応を停止させた。Ｓ４５０nm／Ｒ６００nmで各wellの吸光度を測定した（TOSOH ;A4i MICRO PLATE READER ) 。
【００３２】
ＲＣＡ−１２０は末端にβ−ガラクトースを持つ糖鎖と結合するため、ＬＮＴにも反応し、この結合反応によってＬＮＴ−ＨＳＡ分子中のＬＮＴ分子の相対的な量が比較できる。その結果を図１に示した。市販品のＬＮＴ−ＨＳＡは検討した全てのＬＮＴ−ＨＳＡの中で最もＲＣＡ−１２０との結合量が多かった。次いで反応時間が最も長い９６時間のＬＮＴ−ＨＳＡであった。ＨＳＡ量を基準として、ＬＮＴとＨＳＡの反応時間を１２、２４、９６時間にしたＬＮＴ−ＨＳＡを比較すると、明らかに反応時間の長い方がＬＮＴ量が多い。この反応条件における反応時間とＬＮＴ−ＨＳＡ中のＬＮＴ量は直線的であった（例えばＨＳＡのコーティング濃度１０μg/mLでの１２、２４、９６時間反応させた場合でのＬＮＴ量との関係はｙ＝０．０１１ｘ＋０．００８；ｒ２＝１．０００であった）。従って少なくとも９６時間の反応時間までは、ＨＳＡ分子中の反応基の飽和は起こっていないと考えられる。
【００３３】
実施例３：合成したＬＮＴ−ＨＳＡのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動には、ノベックス社のＮｕＰＡＧＥ電気泳動システムを用いた。
合成反応の各時間（１２、２４、９６時間）において分取したＬＮＴ−ＨＳＡ、１ないし０．５μL と蒸留水６．５μL 、ＳＤＳサンプルバッファ−（４Ｘ）を混合し、ノベックス社製ＮｕＰＡＧＥ３−８％トリス酢酸ゲルにそれぞれ負荷した。コントロールとして、ＨＳＡ（０．７μg ／μL ）を１ないし２μL を同様に処理しゲルに負荷した。泳動終了後、ゲルを染色液（５０％メタノール、１０％酢酸、０．１％クマシーブリリアントブルー）に浸漬し、３０分振盪した。その後、ゲルを脱色液に浸し、適当な時間振盪した。
【００３４】
ＨＳＡに対し、結合するＬＮＴが経時的に増加すると考えられるため、分子量の増加がゲル上で観察されることが予想された。図２に示すとおり、合成したＬＮＴ−ＨＳＡは、反応１２時間において、すでにＨＳＡよりも高い分子量を示し、反応時間の延長に従い、さらに分子量が高く変化した。このことから本反応においては、時間に従いＬＮＴとＨＳＡが結合し、その結果、反応時間が長いものほどより多くのＬＮＴが結合したＬＮＴ−ＨＳＡが得られた。
【００３５】
実施例４：抗体産生能の検討
6 週齡で購入し、約１０日間予備飼育したＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（日本エスエルシー株式会社）に生理食塩水で調製したＬＮＴ−ＨＳＡ、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) とＨＳＡの結合物，Accurate chem.）１０μg を０．２mLの液量で腹腔内に2 回（１回i.p.〜２回i.p.１４日間隔）および３回（１回i.p.〜２回i.p.１４日間隔、２回i.p.〜３回i.p. 7日間隔）投与した。また、陽性対照群および陰性対照群には、ＨＳＡ１０μg にアジュバントとしてImject Alum(PIERCE)を等量加えた懸濁液および生理食塩水を投与した。最終投与７日後に眼窩血管叢より採血し、血清中の総ＩｇＥおよびＨＳＡ特異的ＩｇＥをＥＩＡ法により測定した。血清中総ＩｇＥ、ＨＳＡ特異的ＩｇＥは以下の方法で測定した。９６穴プレート（Nunk; polysorp) に０．１Ｍ炭酸緩衝液、pH８．２で調製した２μg/mL濃度のＲａｔ抗マウスＩｇＥ抗体（PharMingen; Cat.#02111D ) を０．１mL/wellずつ入れて４℃一晩放置した。抗体溶液を除去した後、２５０μL/wellの洗浄液（0.05％Tween-20, 0.15M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH7.5) で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液２００μL/wellでブロッキング（室温、３０分）した後、溶液を除去して洗浄液で３回洗浄した。マウス血清検体は、検体を１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳで至適に希釈した後、１００μL/wellとして室温で１時間反応させた。プレートを洗浄後、血清中総ＩｇＥ抗体を測定する場合はビオチン化抗マウスＩｇＥ抗体（PharMingen; Cat.#02132D ）、ＨＳＡ特異的ＩｇＥ抗体を測定する場合はビオチン化ＨＳＡ（HSA 10mgとNHS-Biotin５mgを４℃２時間反応させ、ゲルろ過で脱塩して得た）を加えて室温で１時間反応させた。洗浄後ストレプトアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼ（Pierce) を加えて室温で３０分反応させ、溶液を除去後、６回洗浄し、ＴＭＢ発色剤(DAKO)で室温で３０分反応させた後３Ｎ硫酸で反応を停止して４５０nmの吸光度を測定した（対照600nm)。血清中総ＩｇＥを測定する場合は、マウス抗ジニトロフェニルＩｇＥ（Yamasa）を５００ng／mL〜７．８１ng/mLまで２倍希釈系列を作製してＩｇＥの標準品として吸光度を測定し、この吸光度からマウスの検体血清の総ＩｇＥ濃度を決定した。
【００３６】
血清中のＨＳＡ特異的ＩｇＧ抗体の測定は、９６穴プレート（Nunk; polysorp) に０．５Ｍ炭酸緩衝液、pH９．５で調製した１０μg/mL濃度のＨＳＡを５０μL/wellづつ入れて４℃一晩放置した。ＨＳＡ溶液を除去した後、２５０μL/wellの洗浄液で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液２００μL/wellでブロッキング（室温、１時間）した後、溶液を除去して洗浄液で洗浄した。マウス検体血清を至適希釈率で希釈し、５０μL/wellとして室温で２時間反応させた。血清溶液を除去後、５回洗浄を行ない、西洋ワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ(Jackson Immuno Research Labratories Inc.)を加えて室温で１時間反応させた。溶液を除去して５回洗浄後、ＴＭＢ発色剤(DAKO)で室温で１５分反応させた後３Ｎ硫酸で反応を停止して４５０nmの吸光度を測定した（対照600nm)。
【００３７】
ＬＮＴ−ＨＳＡ、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＨＳＡ、ＨＳＡ／Ａｌｕｍ、そしてコントロールとして生食を腹腔内投与した日を０日とし、１４日後に再度同量を投与した。２０日後にマウスから採血してこれらの投与による抗体産生に及ぼす影響を比較検討した。測定結果を図３〜図５に示す。図３は総ＩｇＥの血清濃度を測定した結果であり、ＬＮｎＴ−ＨＳＡは有意に総ＩｇＥ抗体価を産生させた。一方、ＬＮＴ−ＨＳＡも有意差はなかったが総ＩｇＥ抗体価を増加させる傾向を示した。これらはアラムアジュバンドより強い総ＩｇＥ抗体価の上昇をもたらした。図４はＨＳＡ特異的なＩｇＥ抗体価を測定した結果であり、総ＩｇＥ抗体価と同じような傾向を示した。すなわち、ＬＮｎＴ−ＨＳＡが最も強くＨＳＡ特異的ＩｇＥ抗体を産生させ、次いでＬＮＴ−ＨＳＡも有意差は示さなかったが産生増加傾向を示した。ところが図５で示したように、ＨＳＡ特異的ＩｇＧ抗体価の産生誘導能ではＬＮｎＴ−ＨＳＡがこれらの中で最も強い産生誘導活性を示したのは同じであるが、２番目に強いのはアラムアジュバンドと共にＨＳＡを投与した方がＬＮＴ−ＨＳＡ投与よりも強いＩｇＧ産生誘導能を示した。
【００３８】
同様に、０日、１４日後と２２日後と３回ＬＮＴ−ＨＳＡ、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＨＳＡ、ＨＳＡ／Ａｌｕｍ、そしてコントロールとして生食を腹腔内投与し、２９日後にマウスから採血してこれらの投与による抗体産生に及ぼす影響を測定した結果を図６〜図８に示す。図６は総ＩｇＥの血清濃度を測定した結果であり、図３とほぼ同じ傾向を示したがＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＬＮＴ−ＨＳＡ、そしてＨＳＡ／Ａｌｕｍではその濃度は２回投与に比べ２倍以上であった。総ＩｇＥ抗体価の高い順番は２回投与と同じで、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＬＮＴ−ＨＳＡ、そしてＨＳＡ／Ａｌｕｍの順番であり、やはりＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＬＮＴ−ＨＳＡはアラムアジュバントより強い総ＩｇＥ抗体価の上昇をもたらした。図７はＨＳＡ特異的なＩｇＥ抗体価を測定した結果であり、ＬＮｎＴ−ＨＳＡとＬＮＴ−ＨＳＡがほぼ同じような産生誘導を示したのに比べ、ＨＳＡ／Ａｌｕｍが２回投与に比較すると３回投与することにより、一挙に抗体価の上昇が認められた。図８で示したＨＳＡ特異的ＩｇＧ抗体価の産生誘導能では２回投与とほぼ同じ傾向を示した。すなわち、ＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＨＳＡ／Ａｌｕｍ、ＬＮＴ−ＨＳＡ投与の順番であった。
【００３９】
総ＩｇＥ抗体価を除いて、ＨＳＡ特異的ＩｇＥ、ＨＳＡ特異的ＩｇＧの抗体価は吸光度で示した相対的な価であるために、これら抗体間の産生誘導能を比較するのは難しい。そこでＨＳＡ／Ａｌｕｍを１．０として各抗体の産生能の比較を図９及び図１０に示す。２回投与の実験系を比較したのが図９、３回投与の比較が図１０である。２回投与と３回投与での結果は、傾向としては同じであるがその差が顕著であったのは２回投与であった。ＬＮｎＴ−ＨＳＡ、ＬＮＴ−ＨＳＡ共に総ＩｇＥとＨＳＡ特異的ＩｇＥの産生誘導はアジュバントと共にＨＳＡを投与した群に比べ著しく強い。ところがＬＮＴ−ＨＳＡとＬＮｎＴ−ＨＳＡで差が認められた点は、ＨＳＡ特異的ＩｇＧ産生において、ＬＮＴ−ＨＳＡはＨＳＡ／Ａｌｕｍと比較しても著しく低く、ましてＬＮｎＴ−ＨＳＡはＨＳＡ／Ａｌｕｍより高い誘導活性を有しているため、ＬＮＴ−ＨＳＡとは顕著な差として認められた。この傾向は差が少なくはなっているが、３回投与でも傾向は認められた（図１０）。
【００４０】
アレルギー反応を抑えるための医薬としては、総ＩｇＥ量を増加させ、かつＨＳＡ特異的なＩｇＥやＩｇＧの産生を抑える特性を持っている必要があり、この観点からＬＮＴ−ＨＳＡが最も優れていることが確かめられた。
【００４１】
実施例５：受身皮膚アナフィラキシー反応（PCA ; passive cutaneous anaphylaxis reaction)
皮膚、組織の特定の細胞に親和性をもつ抗体が、それらの細胞上のレセプターに固着している状態のところ（皮膚、組織が感作の状態にあるという）に、対応する抗原が投与されると、それら細胞膜上で抗原抗体反応が起こり、それが引き金になって、ヒスタミン、セロトニン、ＳＲＳ−Ａ（slow reacting substance of anaphylaxis) などが放出されて、血管の透過性亢進や平滑筋の収縮などを特徴とするアナフィラキシーの症状を呈する。正常な動物の皮内に抗体を注射して皮膚を受け身に感作し、一定時間後に抗原と色素（エバンスブルー）を静注すると、抗体の固着した部位の血管透過性亢進の結果、色素が血管外に漏出して青色のスポットが観察される。これがＰＣＡ反応である。モルモットやラットの皮膚を用いて異種抗体を検出する方法と、同種の動物の皮膚を用いて同種の細胞にのみ親和性を持つ抗体の検出を行う場合とがある。非常に鋭敏な方法で、特に同種皮膚のＰＣＡ反応はきわめて微量の抗体の検出が可能である。即時型アレルギーのうち、いわゆるＩ型のアナフィラキシーで最も問題になるＩｇＥ抗体は、同種の細胞にのみ親和性を持つ抗体で、ヒトの場合にはＰ−Ｋ（Prausnitz-Kuster) 反応で検出され、マウス、ラットなどの実験動物では同種の動物の皮膚を用いたＰＣＡ反応で検出される。ただし、マウスのＩｇＥ抗体は、ラットの皮膚をも感作できる。しかも、ＩｇＧ１抗体はラット皮膚に結合してもすぐ離れてしまうので、感作時間を２時間以上にすればＩｇＥ抗体のみが検出できることがわかり、以来マウスのＩｇＥ抗体の検出にはほとんどラットを用いるＰＣＡ反応が行われている。同種の皮膚を感作する抗体はＩｇＥのほかにも、モルモットではＩｇＧ１、マウスでもＩｇＧ１、ラットではＩｇＧ２などが知られているので、同じくＰＣＡ反応でも、どの抗体をみているのかを識別することが肝要である。ＩｇＥとＩｇＧ１との識別は、抗体を皮内に注射してから、惹起の抗原静脈注射までの時間の差、抗体の熱に対する抵抗性などで行っている。この点、ラットの皮膚でマウス抗体を検出する組み合わせは、マウスＩｇＥ抗体検出には非常に良い方法である。
そこで、マウス抗ＯＶＡ−ＩｇＥとマウス抗ＤＮＰ−ＩｇＥ競合によるＰＣＡ反応を行った。具体的には、ＬＮＴ−ＨＳＡを投与した際に増加する非特異的ＩｇＥにより、抗原特異的ＩｇＥにdilutionがかかるか否かを、抗原特異的ＩｇＥとして抗ＯＶＡ−ＩｇＥを、非特異的ＩｇＥとして抗ＤＮＰ−ＩｇＥを用いたラットによるＰＣＡ反応により検討した。
【００４２】
動物は、ＳＤ−ＩＧＳ雄性ラットを７週齡で購入し、１４日間の予備飼育後に使用（９週齡）した。抗ＯＶＡ（ovalbumin ; 卵白アルブミン）−ＩｇＥ（12mg/mL ）は、ＯＶＡ１０mgをアジュバントとしてＡｌｕｍとともに腹腔内に２週間隔で３回投与したマウスの血清を用いた。また、抗ＤＮＰ（2,4-dinitrophenol ;2,4- ジニトロフェノール）−ＩｇＥ（1mg/mL）は、ヤマサ醤油；code：7676、lot ：07117 、惹起抗原としてはＯＶＡ（9.124mg/mL）をそれぞれ用いた。
【００４３】
（方法）
1)受動感作
抗ＯＶＡ−ＩｇＥを生理食塩液で３００(40ng/mL) 、６００(20ng/mL) 、１２００(10ng/mL) 倍に希釈した。希釈した抗ＯＶＡ−ＩｇＥそれぞれに、抗ＤＮＰ−ＩｇＥが３０(1:30)、１００(1:100) 、３００(1:300) 、１０００(1:1000)倍濃度になるように等量加えた。剪毛したラットの背部に麻酔下で上記試料を１００mLずつ皮内注射した。
2)惹起抗原の調整
ＯＶＡを生理食塩液に溶解させて１０mg/mL に調製した後、等量の０．５％エバンスブルー/ 生理食塩液と混合した。
3)惹起処置
受動感作処置の２４時間後に惹起抗原１mLをラットの陰茎静脈より注射した。
4)漏出青色斑の測定
惹起抗原投与の３０分後にラットをエーテル麻酔下で放血致死させ、背部皮膚を剥離して漏出青色斑の長径(mm)と短径(mm)を計測し、この積を青色スポットの面積(mm2)として算出した。
【００４４】
（結果）
結果を図１１に示す。ＣＯＮＴ（抗ＯＶＡ−ＩｇＥのみ) においては希釈により漏出青色斑面積が減少した。また、抗ＯＶＡ−ＩｇＥに対して抗ＤＮＰ−ＩｇＥを加えた場合、漏出青色面積の減少がみられた。特に、抗ＤＮＰ−ＩｇＥを３００および１０００倍量加えた場合においては、抗ＯＶＡ−ＩｇＥの希釈にかかわらず漏出青色斑が消失した。以上から抗原非特異的ＩｇＥを特異的ＩｇＥに対して大量に投与すれば、競合反応が起こり、アレルギーの発生を抑制することが判明した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の非特異的ＩｇＥ産生促進剤を用いれば、抗原特異的ＩｇＥに比べて抗原非特異的ＩｇＥの産生が顕著に促進される。従って、各種アレルギー反応、例えば花粉症、気管支喘息等の他、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ等に代表される自己免疫疾患等の予防及び治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＮＴ−ＨＳＡとＲＣＡ１２０レクチンとの結合量を示す図である。○：ＡＣＣ社製ＬＮＴ−ＨＳＡ、△、□および●はそれぞれ実施例１の方法で合成したＬＮＴ−ＨＳＡで反応時間はそれぞれ１２、２４および９６時間である。
【図２】実施例１の方法で合成したＬＮＴ−ＨＳＡのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動図である。バンドは、左からＬＮＴ−ＨＳＡ（９６hr）、ＬＮＴ−ＨＳＡ（２４hr）、ＬＮＴ−ＨＳＡ（１２hr）、分子量マーカー、ＨＳＡを示す。
【図３】試料を２回投与した場合の総ＩｇＥの血清濃度を示す図である。
【図４】試料を２回投与した場合のＨＳＡ特異的なＩｇＥ抗体価を示す図である。
【図５】試料を２回投与した場合のＨＳＡ特異的なＩｇＥ抗体価を示す図である。
【図６】試料を３回投与した場合の総ＩｇＥの血清濃度を示す図である。
【図７】試料を３回投与した場合のＨＳＡ特異的なＩｇＥ抗体価を示す図である。
【図８】試料を３回投与した場合のＨＳＡ特異的なＩｇＧ抗体価を示す図である。
【図９】試料を２回投与した際の抗体量比を示す図である。
【図１０】試料を３回投与した際の抗体量比を示す図である。
【図１１】マウス抗ＯＶＡ−ＩｇＥとマウス抗ＤＮＰ−ＩｇＥ競合によるＰＣＡ反応の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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