(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのカルシトニンの位置（１７）と位置（２１）に、アミノ酸の間のブリッジを有するカルシトニンまたはカルシトニン誘導体において、アミノ酸は、前記位置（１７）と位置（２１）に、該ブリッジにより１８または１９員環が形成されるように配列されることを特徴とするカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【請求項２】
前記位置（１７）と位置（２１）のアミノ酸の前記ブリッジの形成は、ラクタムブリッジにより行われることを特徴とする請求項１に記載のカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【請求項３】
前記位置（１７）と位置（２１）のアミノ酸の前記ブリッジの形成は、所望の連結体により行われることを特徴とする請求項１に記載のカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【請求項４】
前記位置（１７）と位置（２１）には、アスパラギン酸とオルニチン、または、オルニチンとアスパラギン酸が存在することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【請求項５】
前記位置（１７）と位置（２１）には、アスパラギン酸とα，γ−ジアミノブチル酸、α，γ−ジアミノブチル酸とアスパラギン酸、グルタミン酸とα，γ−ジアミノブチル酸、α，γ−ジアミノブチル酸とグルタミン酸、２−アミノアジピン酸とセリン、セリンと２−アミノアジピン酸、グルタミン酸とセリン、または、セリンとグルタミン酸の対が存在することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【請求項６】
位置（１）と位置（７）のシステイン残基は、α−アミノスベリン酸残基により置換されることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のカルシトニンまたはカルシトニン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低カルシウム血症作用を有するカルシトニン類縁体（カルシトニン、およびカルシトニンの誘導体）に関するものである。この種のカルシトニン、およびカルシトニンの誘導体は、例えば、骨多孔症、ページェット病、または高カルシウム血症の治療用として、特に、製薬業界の分野で、および医療の分野で用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
カルシトニンは、３２個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモンである。カルシトニンの低カルシウム血症作用、およびカルシトニンによる骨粗鬆の進行抑制のために、カルシトニンは、薬理学上、非常に重要である。カルシトニンは、骨多孔症、ページェット病、または高カルシウム血症の治療手段として用いられる。ここでは、特に、ヒトカルシトニン（ｈＣｔ）、豚カルシトニン（ｐＣｔ）、または、鮭カルシトニン（ｓＣｔ）や鰻カルシトニン（ｅＣｔ）のような鰓後種のカルシトニンが用いられる。
【０００３】
鰓後種のカルシトニンまたはカルシトニンの誘導体のイン・ビボ活性は、ヒトのカルシトニンの２０〜５０倍である。従って、この種のカルシトニンは、治療を目的として、奨んで用いられる。しかし、鰓後種のカルシトニンは、アミノ酸の配列の点で、ヒトのカルシトニンのペプチドとかなり異なる。例えば、鮭のカルシトニンは、３２個のアミノ酸のうち１６個に関して、ヒトのカルシトニンと異なる。しかしながら、活性がかなり大きいために、治療を目的とした投薬量を少なくすることが可能なので、これまで用いられている。
【０００４】
しかし、鰓後種のカルシトニンは、アミノ酸の相異のために、ヒトに対して、免疫反応を引き起こすという問題点がある。つまり、抗体形成の促進作用が大きいため、投与後、６ヶ月経過した後でさえ、特定の治療用カルシトニンに対する抗体が形成されてしまうことがよくある。更に引き続いて、このように大きな抗体形成促進作用により、使用カルシトニンに対して、副次的抵抗性を呈すようになり、反応感度が低下する。これにより、他方で、投与量を増加させる必要性が生じ、結局、抗体形成が促進されるため、副次的抵抗力が発生し、更に、副作用（禁忌）も生じてしまう。
【０００５】
周知のカルシトニンのうちで、更に、天然の形態よりも高い活性を有する誘導体が知られている。例えば、ｈＣｔのポテンシャルα−螺旋状領域（８−２２）の疎水性を有する側の３〜５個のアミノ酸残基を、ロイシンで置換すれば、より活性度の高いカルシトニン類縁体が得られる。この場合には、カルシトニン誘導体の活性は、アミノ酸残基８〜２２個の間のポテンシャルアンフィフィリック（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）α−螺旋状領域と、その分子の生物学的活性との間の緊密な関連性により生じる一方で、多様な分子領域の配列自由度および空間的相互作用にも起因する。
【０００６】
しかし、ｓＣｔ、およびα−アミノスベリン酸−１，７−ｅＣｔは別として、このような類縁体は、これまで、上述の疾病の治療に対して臨床的に用いられているにすぎない。
【０００７】
治療手段として用いられるカルシトニンは蛋白質加水分解速度（イン・ビボ半減期）が大きいために、今のところ、かなり多くの投与量が必要とされることにより、上述のように、急激な抗体形成（副次的抵抗性）、および副作用（禁忌）の可能性が起こるので、生物学的活性または蛋白質加水分解抵抗性を増大させることは非常に重要である。
【０００８】
この種のｈＣｔに関して、低カルシウム血症の活性が高められた配列的に安定な類縁体が、独国特許（ＤＥ４４３１１２１Ａ１）に開示されている。この明細書では、ｈＣｔの誘導体が記載されており、位置１７と位置２１にあるアミノ酸の間に、共有結合のラクタムブリッジを付加することにより、２０員環が形成される。ここで、例えば、位置１７のアミノ酸は、アスパラギン酸、位置２１のアミノ酸は、リジンである。このようなｈＣｔ類縁体は、配列安定性と低カルシウム血症の活性が高められている。
【０００９】
しかし、上述の疾病の治療に対して、ｈＣｔ類縁体を使用可能にするためには、この程度の低カルシウム血症の活性では、尚、不十分である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、配列安定性と生物学的活性が大きなカルシトニン、またはカルシトニンの誘導体を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項１の前提部分と特徴部分に記載されているようなカルシトニン、およびカルシトニンの誘導体により達成される。
【００１２】
本発明によるカルシトニン、およびカルシトニンの誘導体は、ヒトのカルシトニンに関して、位置１７と位置２１に対応する位置のアミノ酸の間にブリッジを有する。これらの位置では、この種のアミノ酸は、ブリッジにより、１８または１９員環が形成されるように混合される。従来例から知られている２０員環と比べて、本発明によるカルシトニンは、配列安定性が大きいので、蛋白質加水分解速度の進行を遅らせることができる。更に、本発明によるカルシトニン、およびカルシトニンの誘導体は、非常に大きな活性を有するので、投与量を減少させることができる。これらの配列は、ヒトの分子に非常に類似しているので、免疫反応（副次的抵抗性）は全く起こらない。概して、環収縮により、従来例と比べ、活性が非常に大きくなるので、例示している類縁体よりも大きなポテンシャルを有するカルシトニン類縁体の基幹構造として、１９または１８員環が適切である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によるカルシトニン、およびカルシトニンの誘導体に関する有益な実施例を従属請求項に記載している。
【００１４】
所望の連結体により、または、アミノ酸の適切な選択により、ラクタムブリッジを介して、位置１７と位置２１にあるアミノ酸の間にブリッジが架けられる。ヒトのカルシトニンのアスパラギンとトレオニンの代わりに、上記の位置に、アスパラギン酸とオルニチンが存在するカルシトニンは、特に有益な性質を有する。マウスのイン・ビボ試験では、このようなカルシトニンの活性は、ヒトが本来備えるカルシトニンの３６０倍であり、更に、鮭（ｓＣｔ）のカルシトニンの３倍である。
【００１５】
位置１７と位置２１のアスパラギンとトレオニンの代わりに、グルタミン酸とα，γ−ジアミノブチル酸を用いることにより、１９員環と活性が大きい類縁体も形成される。
【００１６】
本発明によるカルシトニン誘導体は、１８員環を有しており、位置１７と位置２１のアスパラギンとトレオニンのアミノ酸を、各々、アスパラギン酸とα，γ−ジアミノブチル酸で置換することにより得られる。このカルシトニン誘導体は、ヒトが本来備えるカルシトニンの約３０倍である。
【００１７】
活性が大きく、１９または１８員環を有する環状体を含有する類縁体の他の数例も、以下に示すカルシトニンの位置１７と位置２１のアミノ酸対を含めて、本発明に記載している：２−アミノアジピン酸とセリン、セリンと２−アミノアジピン酸、グルタミン酸とセリン、または、セリンとグルタミン酸。
【００１８】
しかし、本発明による１８または１９員環を用いて、上述のように安定性と活性を高めることにより、ヒトのカルシトニンの場合だけでなく、豚のカルシトニン、または、鮭や鰻等の鰓後種のカルシトニン、または、これまでに知られているこれらのカルシトニンの類縁体の場合にも導かれる。例えば、位置１と位置７がα−アミノスベリン酸残基で置換される周知の高活性類縁体の活性は、上記のように、１８または１９員環を用いることにより、更に高められる。従って、既知の類縁体の場合であっても、本発明による１８または１９員環を用いて、安定性と活性を向上させることができる。
【００１９】
本発明によるカルシトニン、およびカルシトニン誘導体に関する数例、および調合剤を以下に示す。
【００２０】
図１は、ヒトのカルシトニンの主要構造を示す。位置１７と位置２１には、各々、アスパラギンとトレオニンが存在する。
【００２１】
図２は、位置１７と位置２１のアミノ酸が、各々、アスパラギン酸とオルニチンにより置換された本発明によるヒトのカルシトニンを示しており、それらの側鎖は、ラクタムブリッジを介して、共有結合で連結され、１９員環を形成する。この場合には、アミノ酸配列が単独文字コードで記述されているが、位置１７と位置２１のアミノ酸が、より明確に例示するために、３文字コードで示されており、ラクタムブリッジを介して連結された側鎖は構造式で示されている。更に、Ｃｙｓ1とＣｙｓ7の間のＳ−Ｓブリッジが示されている。
【００２２】
マウスのイン・ビボ試験では、本発明によるカルシトニンの活性度は、図１で示されているヒトのカルシトニンの活性の３６３倍である。その結果、図２で示されているカルシトニンは、高活性と高配列安定性を有するので、治療のための投与量を減じることができるという利点がある。これにより、副次的抵抗性の発生が抑制される。更に、この場合、治療用として十分に大きな活性を有する最初のヒトのカルシトニンである。アスパラギン酸によるアスパラギンの置換を除く主要構造は、更に、アミノ酸において（トレオニンの代わりにオルニチンが用いられる）、ヒトが本来備えているカルシトニンの主要構造と僅かに異なるだけなので、極めて僅かな免疫反応しか認められず、その結果、副作用（例えば、副次的抵抗性等）発生が大いに抑制される。
【００２３】
位置１７と位置２１のアスパラギン酸とオルニチンの代わりに、各々、対応する位置に、グルタミン酸とα，γ−ジアミノブチル酸を用いることにより、１９員環も得られるので、高活性と高安定性を有し、且つ、極めて僅かな免疫反応を有するヒトのカルシトニン誘導体が得られる。
【００２４】
１８員環の例として、ここでは、位置１７と位置２１に、各々、アスパラギン酸とα，γ−ジアミノブチル酸が配列されるカルシトニン誘導体が提示されている。この方法により、１８員環を有するヒトのカルシトニン誘導体が得られ、高活性と高配列安定性も有し、ヒトが本来備えているカルシトニンの主要配列との相異点が少ないために、僅かの免疫反応しか起こらない。
【００２５】
上記のような活性と安定性の向上は、例えば、鮭、鰻、豚、または、これらの既知の類縁体等の既知のカルシトニンで行うこともできる。
【００２６】
本発明によるカルシトニンおよびカルシトニン誘導体は、基本的に、ペプチド合成により調合される。
【００２７】
図１に示しているｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔに関して、合成と純化、特徴、および、生物学的活性の試験を以下に記述する。
合成と純化
本発明に記載された配列的に安定しているカルシトニン類縁体の合成のために、ペプチド合成の固相法が、環式ペプチドの調合法と組み合わせて用いられ、Ｆｅｌｉｘ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  ３２（１９８８），４４１−４４５を参照）による重合支持体（樹脂）に直接、側鎖によりラクタムブリッジが施される。ｈＣｔ類縁体ｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔの合成に関して、以下に詳細に記述する。
【００２８】
固相ペプチド合成の慣例的な方法によれば、まず、ペプチド樹脂（１）（Ｎ−Ｂｏｃ−（ｈＣｔ（２２−３２））−ＭＢＨＡ）が以下に示すように調合される。
【００２９】
反応容器内で、ＨＣＬ塩の形態で存在するｐ−メチルベンジドリルアミン（ｐ−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ）樹脂４ｇが、０．６５ｍｍｏｌ／ｇの置換段階で、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）内のトリエチルアミンを用いて、まず中和され、ＤＭＦとジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄される。この後、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨとＤＣＣが、３倍の濃度（７．２ｍｍｏｌ）で、ジクロロメタン（３０ｍｌ）に加えられ、反応懸濁液が１８時間振り動かされる。次に、重合体は、ＤＣＭ、ｉＰｒｏＯＨ、ＤＣＭとＤＭＦで洗浄され、樹脂の装填は、ピクリン酸法（０．６２ｍｍｏｌ／ｇ）により決定される。残存する自由アミノ群は、ＤＣＭ（３０ｍｌ）内で、１時間、無水酢酸（２６ｍｍｏｌ）とピリジン（２６ｍｍｏｌ）によりアセチル化が行われ、慣例的になっているように洗浄される。その後のペプチド鎖の伸展のために、ＤＭＦ内のＴＢＴＵ法（保護アミノ酸の３倍の濃度）が用いられる。カイゼル試験により、カップリングの完了が確認される。ｌｌｅ27とＰｈｅ22に対しては、ダブルカップリングが行われる。アミノ酸誘導体は、Ｎ−Ｂｏｃ保護が施され、Ｔｈｒが、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ）として用いられる。Ｂｏｃ群の除去のために、３０分間、ＤＣＭ内の５０％ＴＦＡ（トリフルオル酢酸）が用いられる。上記のように得られるペプチド樹脂１は、０．５７ｍｍｏｌ／ｇの置換体を有し、ペプチド樹脂の一部の小部分からペプチド樹脂を除去した後のアミノ酸分析とＦＡＢ−ＭＳにより特徴づけられる。上記のように得られるペプチド樹脂の一部（５００ｍｇ；０．１７ｍｍｏｌ）は、Ｂｏｃ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）（１ｍｍｏｌ）とカップリングが行われた後、ピリジン（１ｍｍｏｌ）の存在下で、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）を用いて、アセチル化が行われる。この時、ここで得られる「希薄」（樹脂の０．２１ｍｍｏｌ／ｇの置換段階）ペプチド樹脂は、アミノ酸残基Ａｓｐ17（１として記載されているカップリング法）まで伸展される。この場合、Ｎ−Ｂｏｃ保護アミノ酸誘導体が用いられ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）とＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＢＯＭ）として、Ｈｉｓ20とＬｙｓ18が用いられる。Ｏｒｎ21のＮα−Ｆｍｏｃ群、および、Ａｓｐ17のβ−カルボキシルのフルオレニルメチル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）エステル（ＯＦｍ）保護は、Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．の方法（ＦｅｌｉｘＡ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２（１９８８）４４１−１５４）によるＤＭＦの濃度２０％ピペリジン溶液を用いて処理（１×１分；１×２８分）を行うことにより除去される。その後、保護群により束縛されていないＡｓｐ17の側鎖とＯｒｎ21の側鎖の間に、ＤＭＦ（５０ｍｍｏｌ）内のＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ（ｙｌｏｘｙ）−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸）（０．３ｍｍｏｌ）、および、ＤＩＥＡ（０．３４ｍｍｏｌ）を、ペプチド樹脂に付加し、振り混ぜる（４時間）ことにより、ラクタムブリッジが施される。カイゼル試験により、環化の追跡監視が行われる。
【００３０】
カップリングの試薬除去の後、上記のように、ペプチド樹脂のアセチル化が行われる。このように、Ｎ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いて得られたペプチド樹脂が、ＴＢＴＵカップリング法により、更なる伸展が施される。３機能アミノ酸の側鎖は、保護され、Ａｓｐ（β−ＯｃＨｚ）、Ｃｙｓ（Ｓ−ｐ−Ｍｂ）、Ｇｌｕ（γ−ＯＢｚｌ）、およびＴｙｒ（２ＢｒＺ）である。ここで得られるＮＨ2−ｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔ−ＭＨＢＡの１００ｇは、ＨＦ／ａｎｓｉｏｌｅ／ジメチル硫化物／ｐ−チオクレゾールの混合物（各比率は、１０／１／１／０．２（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ））で処理され（−２０℃で３０分間、および、０℃で１時間）、０．２７Ｍの最終濃縮では、システインも含有している。保護群により拘束されておらず、樹脂から除去された未処理品は、エーテルを付加することにより沈殿させられ、エーテルで３回洗浄され、１０％の酢酸（４×２０ｍｌ）内に抽出され、凍結乾燥される。二硫化物のブリッジを閉鎖するための未処理品の空気酸化は、０．１ＭのＮＨ4ＨＣＯ3溶液内で、暗室（２４時間）で、かなり希釈（１０-4Ｍ）されて行われる。その後、溶液は凍結乾燥される。このようにして得られた未処理品は、Ｃ18コラム上で、予備の逆相ＨＰＬＣにより純化される。３０〜７０％の傾度Ｂが３０分以上用いられ、Ａは水内の０．０５８％ＴＦＡから成り、Ｂは９０％のアセトニトリル内の０．０５％ＴＦＡから成る。ペプチドの検出は、２２０ｎｍで行われる。
【００３１】
１９または１８員環を有する他のｈＣｔ類縁体の合成と純化は、ほぼ同様な方法で行われる。
特徴
ここで得られるｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔの浄化度は、アミノ酸分析により決定される。同一性を実証するために、更に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法や電気噴射質量分析法が用いられる。類縁体の配列の決定は、円偏光二色性の分光偏光法により行われる。
生物学的活性の試験
類縁体の生物学的活性は、ＢＡＬＢ／ｃのマウスに関する低カルシウム血症のイン・ビボ試験により決定される。
【００３２】
表１は、ヒトの本来から備わっているカルシトニン（ｈＣｔ）、および、鮭（ｓＣＴ）からのカルシトニンと比較されたｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔの低カルシウム血症の作用の投与−応答の決定値を示す。生物学的活性は、２μｇのｈＣｔで達成されるように、この試験で最大限に達成され得る低カルシウム血症の作用の活性の比率（％）で示されている。
【００３３】
【表１】
0004358325.tif 000002
【００３４】
【発明の効果】
本発明の構成によれば、配列安定性と生物学的活性が大きなカルシトニン、またはカルシトニンの誘導体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アミノ酸に関する単独文字コードによるヒトのカルシトニンの主要構造である。
【図２】アミノ酸に関する単独文字コードによるｃｙｃｌｏ17,21−［Ａｓｐ17，Ｏｒｎ21］−ｈＣｔの主要構造である。
【符号の説明】
１７  位置
２１  位置
【図１】
0004358325.tif 000003
【図２】
0004358325.tif 000004