(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、水性分散媒中で、架橋性単量体及び、親水性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で重合系に有機溶媒を添加し、
さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２】
親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、水性分散媒中で、架橋性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で、重合系に親水性単量体及び、有機溶媒を添加し、
さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項３】
親水性単量体が、イオン交換基含有単量体であることを特徴とする請求項１又は、２記載の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣと略記する）用充填剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
親水性のＬＣ用充填剤を用いたＬＣは、親水性物質の測定に極めて有益な測定方法であり、現在最も汎用されている分析手法の一つである。
特にその中でもイオン交換基を有するイオン交換用充填剤は、各種イオン性物質の分離に優れている。イオン交換基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、３級アミノ基や４級アミノ基などがあげられる。
親水性のＬＣ用充填剤は、無機系あるいは有機系高分子粒子に、親水性基を導入することにより得ることができる。無機系高分子としてはシリカ、セラミックス、ガラスなど；有機高分子としてはポリスチレン系高分子やアクリル系高分子などの合成高分子系、ポリアミノ酸や多糖類などの天然高分子系などがあげられる。
【０００３】
上記無機系充填剤の主流であるシリカ系充填剤は、全充填剤の中で最も汎用されている充填剤であるが、中性以上のｐＨ条件におけるシリカ自体の溶出や、残存するシラノール基による吸着などの欠点が報告されている。
また、有機高分子系の中でも天然高分子よりなる充填剤は、親水性が大きく非特異吸着が少ない優れた充填剤であるが、機械的強度に乏しいため、高流速での測定が行えず、従って測定時間が大幅に延長されるという問題がある。
一方、有機合成高分子系の充填剤は、上記欠点が少なく、簡便な方法により製造できる。
【０００４】
このような有機合成高分子からなるＬＣ用充填剤として、例えばイオン交換基含有充填剤の製造方法としては、以下の２つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、イオン交換基含有化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する架橋粒子に、該反応性官能基と反応する基およびイオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記架橋粒子にイオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、架橋粒子中の水酸基にカルボキシル基含有化合物、スルホン酸基含有化合物、アミノ基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００５】
（２）イオン交換基含有単量体を、架橋性単量体と共重合する方法。
例えば特公昭６３−５９４６３号公報には、親水性基であるカルボキシル基を含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して共重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性基含有単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら上記（１）の方法で得られたＬＣ用充填剤には、以下の問題点が指摘されている。
（１）の、後処理により親水性基を導入する方法においては、親水性基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、単量体由来の親水性基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography, 16(1) 7-12 (1995) ）。従って、ＬＣ用充填剤としての分離性能や、測定値がばらつくという欠点がある。また、後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
一方上記（２）の方法による充填剤には、このような欠点は少なく、親水性基含有単量体の添加量や重合条件を制御することにより、充填剤に対して定量的に親水性基を含有させることができ、また操作も簡便である。
【０００８】
しかし、イオン交換基含有単量体などの親水性単量体は、特に水系の分散媒を用いた重合系においては、分散媒中に溶解しやすいので、より疎水性である架橋性単量体と共重合しにくい。その結果、ＬＣ用充填剤とした場合に、測定試料との十分な相互作用を及ぼす官能基が導入できず、分離性能の低下を招くことになる。
そして、十分量の官能基を導入するために、親水性単量体の添加量を増やす方法が考えられるが、増やし過ぎると重合途中で凝集物を発生し、重合体が得られないという問題がある。
本発明は、上記問題点を解決すべく考案されたものであり、その目的は、重合反応の途中で凝集反応を起こすことなく、しかもＬＣ用充填剤として十分な官能基を有するよう親水性単量体を効率よく反応させる方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の本発明では、親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、架橋性単量体及び、親水性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で重合系に有機溶媒を添加し、さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
また、請求項２の本発明では、親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、架橋性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で、重合系に親水性単量体及び、有機溶媒を添加し、さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
また、請求項３の本発明では、請求項１又は、２記載の親水性単量体が、イオン交換基含有単量体であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
【００１０】
以下、本発明の詳細を説明する。
（１）架橋性単量体
本発明に用いられる架橋性単量体としては、１分子中に２個以上のビニル基を有する単量体であって、後述する親水性単量体よりも疎水性なものが好ましい。このような架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサジエン等の脂肪族ジエン化合物；および上記単量体の誘導体などが挙げられる。その中でも、特に（メタ）アクリレート誘導体が好ましい。これらは、２種以上が混合されて用いられてもよい。
なお、例えば上記（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステル、又は、メタクリル酸エステルを意味する。
【００１１】
また、架橋重合体をより親水性化し、かつ耐膨潤性を良好に保つためには、水酸基などの親水性基を含む架橋性単量体を用いてもよい。
上記架橋性単量体としては、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体が好ましく、例えば、１分子中に少なくとも１個の水酸基と２個以上のビニル基を有する架橋性単量体が挙げられる。このような単量体としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオールおよびこれらの誘導体類が挙げられる。これらは、２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１２】
これらの水酸基含有の架橋性単量体の使用量は、上記全架橋性単量体に占める割合が５０重量％以下であることが好ましい。これは、５０重量％より多くなると、重合体の親水性が増大し過ぎ、重合中に凝集が発生しやすくなるためである。
【００１３】
（２）親水性単量体
親水性単量体の親水性官能基は、架橋重合体の親水性を維持し、かつ測定試料と相互作用を及ぼし合う主要素となり、重合体表面の親水性官能基と測定試料の相互作用の結果、測定試料が各成分に分離される。
このため、用いられる親水性単量体は、本発明による充填剤を適用するＬＣの分離モードによって、以下のように選択される。
【００１４】
（２−１）イオン交換クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に１個以上のイオン交換基を含有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、下記のものが挙げられる。
【００１５】
(1) カルボキシル基含有単量体：
上記カルボキシル基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２- （メタ）アクリロイルオキシエチルコハク酸、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(2) リン酸基含有単量体：
上記リン酸基含有単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（2-（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（3-（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
(3) スルホン酸基含有単量体：
上記スルホン酸基含有単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン酸、2-（メタ）アクリルアミド-2- メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、（３−スルホプロピル）- イタコン酸、3-スルホプロピル（メタ）アクリル酸およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(4) ３級アミノ基含有単量体：
上記３級アミノ基含有単量体としては、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシ-3- ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、N,N-ジメチル（メタ）アクリルアミド、およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(5) ４級アミノ基含有単量体：
上記４級アミノ基含有単量体としては、例えば、2-（メタ）アクロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、2-（メタ）アクロイルオキシエチルトリエチルアンモニウムクロライド、2-ヒドロキシ-3- （メタ）アクロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１６】
（２−２）ゲル浸透クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に１個以上の水酸基等のイオン性親水基、又は、エポキシ基等の非イオン性親水基を含有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１７】
（２−３）順相クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に少なくとも１個の１〜２級アミノ基、シアノ基、水酸基などを有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、例えば、アリルアミン、（メタ）アクリルアミド、N-メチル（メタ）アクリルアミド、N-エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロニトリルおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１８】
上記親水性単量体は、２種以上が混合されて用いられてもよく、さらに、上記親水性単量体の及びその各種誘導体は、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、塩化物などであってもよい。
また、上記親水性単量体は、各分離モードに限定される訳ではなく、他のモードに使用したり、他のモードに挙げた単量体と混合して用いることも可能である。
【００１９】
これらの親水性単量体の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して１０〜２００重量部が好ましい。１０重量部以下では、測定試料との十分な相互作用が発揮できず、その結果分離能が低下し、２００重量部以上では、親水性が大きくなり過ぎ耐圧性・耐膨潤性が低下する。また溶離液の切り替え時などには平衡化に長時間を要し、結果測定時間が延長される。
【００２０】
上記親水性基含有単量体は、上記単量体のほかに、化学反応により親水性基に変換しうる官能基を有する単量体を用い、重合終了後に、該化学反応を行い、親水性基に変換することでも、同様の親水性基含有重合体を調製し得る。
上記、化学反応としては、公知の反応を用いることができ、例えば、加水分解反応や転移反応などが用いられる。
また、上記化学反応によって変換し得る官能基としては、例えば、加水分解反応によってイオン交換基に変換し得る、エステル基などが挙げられる。
具体的には、例えばメチルメタクリレートを単量体として用い、重合後、アルカリ性下で加温する事により、エステル結合が分解してカルボキシル基に変化されることで、カチオン交換充填剤が調製し得る。
【００２１】
（３）充填剤の重合方法
（３−１）重合開始剤
本発明における重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベインゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘイサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、  ４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。
上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。
【００２２】
（３−２）有機溶媒
本発明で該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲で添加する有機溶媒は、用いる架橋性単量体および親水性単量体によって異なるが、親水性単量体に対して良溶媒であることが好ましく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【００２３】
上記有機溶媒の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対し、２０〜５００重量部が好ましい。有機溶媒の使用量が２０重量部未満になると、効果がなくなり、５００重量部を越えると、重合中に凝集しやすくなる。
【００２４】
（３−３）重合反応
本発明では、上記単量体を用いて、上記重合開始剤の存在下において重合反応を行う。
本発明における重合反応は、公知の重合方法、例えば乳化重合法、懸濁重合法などにより行われる。
例えば懸濁重合法を用いる場合には、水溶性分散剤を溶解した水性分散媒に、上記重合開始剤を溶解した上記架橋性単量体および親水性単量体の混合物を分散させ、攪拌後、窒素雰囲気下で昇温することにより重合反応を行わせることができる。
また重合反応において、まず架橋性単量体のみを用いて重合開始剤の存在下で重合を行い、重合反応の途中で、親水性単量体を添加しても良い。親水性単量体の途中添加の場合、その添加時期は、架橋性単量体混合物の重合率が８９〜９４％の範囲にある段階である。但し後述する有機溶媒と同時期に添加する必要はない。
【００２５】
また、本発明のＬＣ用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。
すなわち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った均一粒径重合体粒子に、上記単量体、または、これらの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がより均一化される。ここでいう均一粒径重合体粒子とは、例えば上記非架橋性単量体などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子などが挙げられ、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などである。
【００２６】
また、上記の粒径均一重合体粒子として、上記非架橋性単量体と上記架橋性単量体との共重合体である架橋共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体の割合を全単量体の１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２７】
上記の粒径均一重合体粒子の製造方法は公知の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
上記の粒径均一重合体粒子の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ値）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。
【００２８】
上記の粒径均一重合体粒子を本発明方法の重合反応に用いる場合の量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して０．５〜１００重量部が好ましい。
上記の粒径均一重合体粒子を用いる場合には、該重合体粒子に、架橋性単量体（必要に応じて、非架橋性単量体も含む）と重合開始剤を吸収させて重合を進めることが好ましい。
【００２９】
また本発明に用いられる単量体は、必要に応じて、上記架橋性単量体以外の非架橋性単量体が構成単位の一部として混合されていてもよい。
上記非架橋性単量体としては、上記親水性単量体以外の、例えば、スチレン、α- メチルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００３０】
上記非架橋性単量体の量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して１００重量部以下が好ましい。非架橋性単量体の量が１００重量部より多くなると、膨潤、収縮などがおこりやすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液への平衡化に長時間を要するようになるためである。
【００３１】
また本発明の製造方法による充填剤は、通常、多孔質であるが、その孔径をより大きくするために、その重合反応時に多孔質化剤が用いられて製造されてもよい。
大孔径に多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒を重合反応系に添加して重合する、公知の方法を用いることができる。このような多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
【００３２】
上記多孔質化剤の使用量は、多くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるので、上記架橋性単量体１００重量部に対して、０〜１００重量部が好ましい。
本発明方法における重合反応の温度および時間は、使用する単量体および重合開始剤の種類や量などによって異なるが、４０〜１００℃、０．３〜２４時間程度である。
【００３３】
（３−４）重合率８９〜９４％での有機溶媒、親水性単量体の添加
本発明においては、上記架橋性単量体及び、親水性単量体の混合物を用いて重合開始剤存在下で重合反応を開始し、一定時間経過後、すなわち重合率が８９〜９４％の範囲にある段階で有機溶媒を添加する。
また、本発明においては、上記架橋性単量体を用いて重合開始剤存在下で重合反応を開始し、一定時間経過後、すなわち重合率が８９〜９４％の範囲にある段階で親水性単量体及び、有機溶媒を添加する。
【００３４】
重合率が７０％以下の段階で添加すると、未反応の単量体に溶解して細孔径を必要以上に大きくしたり、重合途中で凝集物が発生する可能性が大きくなるので好ましくない。また重合率が９８％以上の段階での添加は、重合反応が進行しすぎて、これらの添加の効果が現れにくい。
ここでの重合率の算出方法は、所定の重合時間経過後重合物を取り出し、水および有機溶媒で洗浄した後乾燥して、その乾燥重量を測定し、以下の式により求めることができる。
重合率（％）＝（得られた重合物の重量／単量体仕込量）×１００
【００３５】
本発明の有機溶媒の添加方法は特に限定されず、重合系に添加分を一括して添加しても良いし、数分〜数時間かけて添加してもよい。また添加時に重合系の温度を一度室温まで下げるなど、温度を変化させてもよい。
【００３６】
上記親水性架橋重合体を得るためには、有機溶媒、親水性単量体の添加を開始した後、あるいは添加終了後、さらに重合を継続する。この重合反応の温度および時間は、使用する単量体および重合開始剤の種類や量などによって異なるが、４０〜１００℃、０．３〜５０時間程度である。有機溶媒添加前と後で、これらの条件を変更してもよい。
以上の重合工程を経て得られた重合物を、水および有機溶媒等で洗浄して乾燥することにより親水性架橋重合体が得られる。
【００３７】
（４）親水性架橋重合体をＬＣ用充填剤とする
（４−１）充填剤の粒径
上記の重合工程により得られた親水性架橋重合体を、ＬＣ用充填剤とするには、粒径および粒度分布を一定の範囲となるよう調節する。
本発明のＬＣ用充填剤の好ましい平均粒径は０．５〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜２０μｍである。また粒径のばらつきはＣＶ値として４０％以下が好ましい。
また、得られた親水性架橋重合体の平均粒径および粒度分布が上記の範囲を逸脱する場合には、親水性架橋重合体粒子を、必要に応じて分級することにより、上記範囲に調節する。分級方法は、乾式又は湿式の公知の方法が用いら得る。
【００３８】
（４−２）本発明方法によるＬＣ用充填剤のカラムへの充填
本発明で得られたＬＣ用充填剤は、ステンレス製などのカラムに充填されてＬＣ測定に適用される。カラムへの充填に際しては、適宜に公知の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００３９】
（４−３）測定対象物質
本発明により得られるＬＣ用充填剤は、従来のＬＣ測定の手法における各種モードに適用させ得る。主な測定対象物質としては、従来から親水性充填剤により分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類、糖類、多糖類などの生体関連物質が好適である。
また本発明により得られた充填剤は、上記以外にも各種前処理用カラムや、リガンドを固定化してアフィニティクロマトグラフィー用担体とすることもできる。
【００４０】
（４−４）ＬＣ装置
本発明により得られる充填剤が充填されたカラムを適用できるＬＣ装置は公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成され得る。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００４１】
（４−５）溶離液
本発明の充填剤を用いたＬＣ分析には、公知の溶離液が用いられ得る。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩類；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩類又はハロゲン化物類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ヘキサンなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。さらに公知の溶離液に添加される各種の化合物を添加することもできる。
【００４２】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
（カチオン交換用充填剤）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（架橋性単量体：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合反応を行った（この時点での重合率は９３％であった）。重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（親水性単量体：東京化成工業社製）の５０％水溶液４００ｇおよびメタノール４００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、再び８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００４３】
（性能評価）
実施例１で得られた充填剤について、以下のように性能を評価した。
（１）ＬＣ用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、ＬＣ用カラムを製造した。
【００４４】
（２）タンパク質混合物の測定
実施例１で得られた充填剤を充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。
0004268730.tif 000002
【００４５】
（測定試料）
ミオグロビン（図１のピーク１）、α−キモトリプシノーゲン（ピーク２）、リボヌクレアーゼＡ（ピーク３）、リゾチーム（ピーク４）（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００４６】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図１に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００４７】
（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定
実施例１で得られた充填剤を充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
（測定条件）
システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いたシステムと同様。
溶離液  ：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む３種類の緩衝液によるステップグラディエント法で溶出した。
溶離液Ｃ：５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｄ：７０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｅ：２５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
流    速：１．５ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
【００４８】
（測定試料の調製）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。これに以下の処理を行い、ａ）糖負荷血試料；ｂ）カルバミル化Ｈｂ（ＣＨｂ）含有試料；ｃ）アセチル化Ｈｂ（ＡＨｂ）含有試料を調製した。
ａ）グルコースを５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血試薬（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料ａ）とした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させて、測定試料ｂ）とした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、室温で３時間反応させて、測定試料ｃ）とした。
【００４９】
（測定結果）
試料ａ）を測定した結果、得られたクロマトグラムを図２−ａ）に示す。
図２−ａ）中の各ピークは、ヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ：ピーク１１）；ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ：ピーク１２）；不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１３）；安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）；ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０：ピーク１５）を示す。
ＨｂＦ（ピーク１２）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク１４）の良好な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要があるが、図２−ａ）ではこの順序通りに各ピークが溶出し、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１３）を、安定型ＨｂＡ１ｃから良好に、しかも短時間に分離できた。
試料ｂ）およびｃ）を測定した結果を、それぞれ図２−ｂ）およびｃ）に示す。図２−ｂ）およびｃ）中において、各ピークはＣＨｂ（ピーク１６）；ＡＨｂ（ピーク１７）を示す。いずれのピークも安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離された。
【００５０】
（４）重合ロット間差の評価：
実施例１の重合条件において、重合ロット毎の性能差を以下のようにして確認した。
上記と同様の重合条件にて３０回（３０ロット）重合を行い、得られた充填剤３０ロット間の性能のバラツキをみた。上記（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を、それぞれのロットについて行い、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）の保持時間を調べた。
３０ロットの平均保持時間は、０．９分、標準偏差は０．０８分であり、ＣＶ値（％）＝８．９％であり、実施例１の製造方法は、製造再現性に優れていることが判った。
【００５１】
（実施例２）
（アニオン交換用充填剤）
ジエチルアミノエチルメタクリレート（親水性単量体：和光純薬社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：キシダ化学社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で重合反応を行った。２時間後（重合率９０％）、メタノール１００ｇを反応系に添加してさらに８０℃で３時間重合反応を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５２】
（タンパク質混合物の測定）
実施例２で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。
0004268730.tif 000003
【００５３】
（測定試料）
ミオグロビン（ピーク１）、α−キモトリプシノーゲン（ピーク２）、リゾチーム（ピーク４）（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００５４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図３に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００５５】
（実施例３）
（ＧＰＣ用充填剤）
２−ヒドロキシエチルメタクリレート（親水性単量体：和光純薬社製）１００ｇ、メチルメタクリレート（非架橋性単量体：和光純薬社製）１００ｇ、テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トルエン（多孔質化剤）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。  窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で重合反応を行った。１．５時間後（重合率８９％）、エタノール１５０ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で２時間重合反応を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５６】
（ポリエチレングリコール類の測定）
実施例３で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、糖類混合物を測定した。
0004268730.tif 000004
（測定試料）
各分子量を有するポリエチレングリコール（以上、いずれも和光純薬社製）
【００５７】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図４に示す。
図中のピークは、分子量２００〜７５００のポリエチレングリコール（ピーク３１〜３７）；エチレングリコール（ピーク３８）を示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００５８】
（実施例４）
（順相クロマトグラフィー）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（架橋性単量体：共栄社化学社製）１００ｇ、メチルメタクリレート１００ｇ、テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合反応を行った（重合率９４％）。重合後、反応系を３０℃に冷却した後、アクリルアミド（親水性単量体：和光純薬社製）の２００ｇおよびメタノール３００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、再び８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５９】
（糖類混合物の測定）
実施例４で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、糖類混合物を測定した。
（測定条件）
システム：実施例３に同じ
溶離液  ：アセトニトリル：水＝７５：２５の混合液
流    速：１．２ｍｌ／分
試料注入：１０μｍ
【００６０】
（測定試料）
フルクトース（ピーク４１）、グルコース（ピーク４２）、シュークロース（ピーク４３）、マルトース（ピーク４４）（以上、いずれも和光純薬社製）の混合物
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図５に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００６１】
（比較例１）
（実施例１において、有機溶媒を添加しなかった例）
実施例１において、メタノールを用いなかった以外は、同様に操作を行い、平均粒径６μｍの充填剤を得た。
実施例１と同様にタンパク質混合物の測定を行った結果を図６に示す。また実施例１と同様にヘモグロビン類の測定を行った結果を図７に示す。親水性単量体の重合率が低いため十分な保持力が得られず、各ピークが分離しなかった。この低分離能は、溶離液の溶出力を弱めて、各ピークを図１あるいは図２と同様の保持時間に溶出させた場合でも解消されなかった。
【００６２】
（比較例２）
（親水性単量体の添加量を増やした例）
比較例１において、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の５０％水溶液４００ｇを用いた代わりに、同水溶液を８００ｇ用いた以外は、同様に操作を行った。
比較例１において、親水性単量体の重合率が低かったため、親水性単量体の添加量を増やして重合反応を行ったところ、重合の途中で凝集物が発生し、生成物を得ることができなかった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、上記構成よりなるので、重合反応の途中で凝集反応を起こすことがないため、製造時の歩留まりの低下がなくなるだけでなく、しかもＬＣ用充填剤として十分な官能基を有するよう親水性単量体を効率よく反応できるため、均一な性能を持つ充填剤微粒子を得られる。
また、重合反応が一連の操作で完了するため、従来の後処理によるイオン交換基導入方法と比べ操作が簡便なだけでなく、導入率の制御も容易であり、良好な再現性が得られる。
さらに必要なイオン交換基を充填剤表面に均一にかつ十分に導入することができるため、何れのＬＣ測定のモードにおいても適度な保持力が得られ、分離性能に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１により得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、ポリエチレングリコール類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例４により得られた充填剤を用いて、単糖類混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１  ミオグロビンのピーク
２  α−キモトリプシノーゲンのピーク
３  リボヌクレアーゼＡのピーク
４  リゾチームのピーク
１１  ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
１２  ＨｂＦのピーク
１３  不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１４  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１５  ＨｂＡ０のピーク
１６  ＣＨｂのピーク
１７  ＡＨｂのピーク
３１〜３７  ポリエチレングリコールのピーク
３８  エチレングリコールのピーク
４１  フルクトースのピーク
４２  グルコースのピーク
４３  シュークロースのピーク
４４  マルトースのピーク
【図１】
0004268730.tif 000005
【図２】
0004268730.tif 000006
【図３】
0004268730.tif 000007
【図４】
0004268730.tif 000008
【図５】
0004268730.tif 000009
【図６】
0004268730.tif 000010
【図７】
0004268730.tif 000011