(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)デロビブリオと他の微生物が混在する液を寒天培地上で継代培養することによってデロビブリオが除去された混在微生物のみのコロニーを得、これらの混在微生物を抗原とした抗体を作成する工程と、
b)作成した抗体を前記デロビブリオと他の微生物が混在する液に添加して混在微生物を不活性化させた後、段階希釈することにより、デロビブリオの純粋分離株を得る工程と、
を含むことを特徴とするデロビブリオの純粋分離方法。
【請求項２】
a)デロビブリオと他の微生物が混在する液を寒天培地上で継代培養することによってデロビブリオが除去された混在微生物のみのコロニーを得、これらの混在微生物を抗原とした抗体を作成する工程と、
b)作成した抗体を前記デロビブリオと他の微生物が混在する液に添加して混在微生物を不活性化させた後、段階希釈することにより、デロビブリオの純粋分離株を得、これを純粋培養することによりデロビブリオ生菌の純粋培養株を得る工程と、
c)純粋培養した宿主細菌の生菌あるいは死菌を塩分濃度を調整した滅菌液中に無菌的に懸濁した後、該懸濁液に前記デロビブリオ生菌の純粋培養株を無菌的に植菌して好気的条件下で培養する工程と、
を含むことを特徴とするデロビブリオの大量純粋培養方法。
【請求項３】
前記抗体を添加して段階希釈した後、純粋培養されたデロビブリオの宿主細菌を添加する、ことを特徴とする請求項２記載の培養方法。
【請求項４】
デロビブリオがデロビブリオ ストルピー サブスピーシーズ ＢＤ−４（微工研寄第１３４１７号）である、請求項１もしくは２記載の方法。
【請求項５】
宿主細菌がビブリオ ペネイシーダ ＰＪである、請求項２記載の大量純粋培養法。
【請求項６】
前記デロビブリオと宿主細菌が好塩性細菌であって、前記滅菌液の塩分濃度が０．３〜４％である、請求項２記載の大量純粋培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、デロビブリオを純粋分離する方法、及びデロビブリオを大量に純粋培養する方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
微生物の産業的な大量純粋培養は、通常、培養プラントに有機物と無機塩を溶解あるいは懸濁させた液体培地を入れ、この液体培地に対象となる微生物を植菌し、一定温度で培養することにより行われる。
しかし、デロビブリオのように、細菌に寄生する微生物（細菌寄生細菌）を産業的に利用できる程、大量に純粋培養した例はない。デロビブリオは、これまで実験室レベルで寒天培地を用いた培養が行われているが、それは他の微生物の混在した状態での培養であり、純粋培養ではない。また、試料中にデロビブリオ数が極めて少なく、寒天培地上での検出が困難なときに、寒天培地上での検出が可能なレベルにまでデロビブリオを他の混在微生物と共に宿主細菌懸濁液中で培養することも行われているが、これも純粋培養とは異なる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、デロビブリオの宿主域は、バクテリオファージと同様、かなり狭い範囲に限定されている。このため、デロビブリオを微生物資材として各種病原菌に対して使用する場合、その菌種ごとにデロビブリオを用意する必要がある。しかし、デロビブリオの純粋分離は、文献的にはバクテリオファージの純粋分離に準じた方法で行うことができるように報告されているものの、野生株の中には上記方法では純粋分離できない株も多数存在する。そのため、目的の細菌に寄生するデロビブリオを上記寒天培地上で検出できたとしても、それら野生株を必ずしも純粋分離できるわけではないし、通常の微生物培養法に基づく液体培地を用いて純粋培養できるわけでもない。
【０００４】
こうしたデロビブリオの純粋分離の困難なことが産業的な大量純粋培養を行うことの大きな障害ともなっている。また、上記したような他の微生物の混在下で培養液を用いて培養したとしても、デロビブリオを大量に培養するのは困難であり、またこの培養状態からデロビブリオだけを分離するのも難しい。
【０００５】
本発明の目的は、こうした従来技術の問題点に鑑み、デロビブリオ野生株を効率良く大量純粋培養する方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、培養すべきデロビブリオを確実に純粋分離して大量純粋培養する、培養法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明方法は、上記した目的を達成するために次の構成を備える。
すなわち、本発明方法は、純粋培養した宿主細菌の生菌あるいは死菌が懸濁されると共に塩分濃度の調整された滅菌液に、純粋分離したデロビブリオ生菌の純粋培養株を無菌的に植菌した後、好気的条件下で培養する。
【０００７】
種菌としてデロビブリオを純粋分離し、かつ純粋培養するにあたっては、デロビブリオと他の微生物が混在する液に、デロビブリオの宿主細菌以外の上記混在微生物を抗原として作成した抗体を添加して混在微生物を不活性化させた後、段階希釈してデロビブリオの純粋分離株を得るようにする。
【０００８】
本発明方法では、先ず、指示菌として用いられる宿主細菌を大量に培養する。宿主細菌は、培養すべきデロビブリオの宿主になる菌であればどのような菌でも良い。宿主細菌の大量培養は、一般的な微生物と同様に通常の培養液を用いた方法によって行われる。培養された宿主細菌は遠心分離などの方法によってペレット状態で回収される。
【０００９】
次いで、塩分濃度を調整した滅菌液に宿主細菌を無菌的に投与して懸濁液を得る。この懸濁液は、一般細菌の培地に相当する。塩分濃度は、デロビブリオの棲息環境に合うものであれば別段制限されるものではないが、通常は、０．３から４．０％の間であることが好ましい。滅菌には、間欠滅菌法などが用いられる。
【００１０】
そして、宿主細菌の上記懸濁液に純粋培養したデロビブリオ生菌を無菌的に植菌する。デロビブリオの純粋分離は後述する手法によって行われる。無菌的に植菌するとは、空中浮遊微生物の混入を可及的に防止しつつ植菌することをいい、種々の公知の手法が採用される。また、デロビブリオの純粋分離株を宿主細菌の上記懸濁液にそのまま植菌するのではなく、該純粋分離株を一旦増殖させて純粋培養液（以下、純粋培養株という）を得、これを植菌するようにすると効率的である。純粋培養株を得るには、後述する手法を採用することができる。その後、好気的条件下で培養を行う。具体的には、例えば２５℃から２８℃（デロビブリオの種類によっても異なる）の温度環境下でエアレーションを適宜行うことにより、デロビブリオの大量培養を図る。
【００１１】
デロビブリオと他の微生物が混在した状態からデロビブリオのみを純粋分離するには、先ず、入手したデロビブリオと他の微生物が混在した試水を寒天培地などを利用して培養する。この条件では、デロビブリオは増殖できないので、出現したコロニーはすべて混在微生物由来のコロニーであると考えることができる。そこで、これら出現してきたコロニーを新しい寒天培地上に塗床し、数回培養を繰り返すと、デロビブリオが除去された混在微生物のみのコロニーが得られる。これら微生物を抗原とした抗体を作成する。抗体作成には、抗体作成用動物を用いる。作成された抗体は、上記デロビブリオと他の微生物が混在した試水に添加される。これにより、混在微生物は不活性化され、段階希釈によって培養液中から除去されてデロビブリオのみが分離されるので、これに宿主細菌を添加することにより、デロビブリオの純粋培養株が得られる。
【００１２】
【実施例】
請求項1記載の本発明の一実施例を図１のフローチャートを参照しつつ詳説する。
先ず、第１ステップとして、純粋培養すべきデロビブリオとその宿主細菌を選定し、これらの純粋分離株を入手する。本実施例では、デロビブリオとしてデロビブリオ ストルピー サブスピーシーズ ＢＤ−４、その宿主細菌としてビブリオ ペネイシーダ ＰＪを選定した。デロビブリオ ストルピー サブスピーシーズＢＤ−４は、出願人が特許第２，５８３，４７３号公報に開示し、微工研寄託NO.１３，４１７号として寄託した菌で、微工研より純粋分離株として入手可能である。宿主細菌も同様である。これらの菌は、純粋培養にあたり、種菌として利用される。
【００１３】
第２ステップとして、宿主細菌の種菌培養を行う。
滅菌海水で調製した肉汁培地に、宿主細菌（ビブリオ ペネイシーダ ＰＪ）の種菌を無菌的に植菌し、２５〜２８℃で一夜培養することにより、その純粋培養株を得た。
【００１４】
第３ステップとして、宿主細菌の純粋培養株の大量培養を行う。
第２ステップで行ったと同様な方法で培地調製された大型醗酵槽（２００リットル）に、第２ステップで得られた宿主細菌純粋培養株の生菌を無菌的に接種し、第２ステップと同様な温度で４８時間培養することにより、宿主細菌の大量純粋培養液を得た。
【００１５】
第４ステップとして、デロビブリオの植菌と培養を行う。
本ステップは、デロビブリオの大量純粋培養に先立ってデロビブリオの純粋培養株を得ることを目的とする。
最初に、第２ステップで得られた宿主細菌（ビブリオ ペネイシーダ ＰＪ）を１０8細胞／ｍｌになるように無菌的に滅菌海水に懸濁した後、デロビブリオの種菌を０．１％植菌し、２８度Ｃで通気培養を行って、デロビブリオ培養液を調整した（第４−１ステップ）。
【００１６】
次いで、デロビブリオ培養液中に混在する微生物を抗原とした抗体を次の要領で作成した（第４−２ステップ）。なお、抗体作成用動物には、５週令マウス（メス）を使用した。
５週令マウスを１週間予備飼育した。
市販の肉汁寒天培地を海水に溶かして作成した寒天平板にデロビブリオ培養液を滴下して生育させたコロニーを３回上記培地で継代したものを生理的食塩水で十分遠心洗浄した後、１０８細胞／ｍｌになるように０．２％ホルマリン含有の生理的食塩水に懸濁し、その０．１ｍｌを予備飼育したマウスに週１回の割合で３回腹腔投与した。
４回目に尾部静脈よりブースター注射を行った。
１週間飼育後、心臓採血を行い、回収した血液を滅菌したポリプロピレンチューブに移し、傾斜させた状態で、５℃に一夜放置した。
血清を回収した後、５６℃で３０分間非動化処理を行った。
凝集法により抗体価の測定を行った。
【００１７】
こうして作成された抗体を上記デロビブリオ培養液に添加し（第４−３ステップ）、段階希釈した（第４−４ステップ）後、再びビブリオ ペネイシーダ ＰＪを１０８細胞／ｍｌになるように懸濁した滅菌海水に無菌的に植菌し、培養することによってデロビブリオの純粋分離株を得た（第４−５ステップ）。
【００１８】
第５ステップとしてデロビブリオの大量純粋培養を行う。
デロビブリオの大量純粋培養は、第３ステップで得られた宿主細菌の大量純粋培養液の塩分濃度を３．２％に調整し、これに第４ステップで得られたデロビブリオの純粋培養株を無菌的に植菌し、２５〜２８℃で好気的に培養することによって行った。
【００１９】
第６ステップとして、上記大量純粋培養されたデロビブリオの生菌数を測定したところ、１０８細胞／ｍｌであった。
生菌数の確認後、最終ステップとしてデロビブリオを回収し、保存する。
【００２０】
なお、第１ステップに代わり、第４ステップのデロビブリオの種菌を海水に置き換えてを行うことで、例えば海水中からのデロビブリオの純粋分離を行うことができるので、これを種菌として使用するようにしても良い。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、塩分調整され、かつ滅菌された液に宿主細菌を無菌的に懸濁し、この懸濁液にデロビブリオ生菌の純粋培養株を植菌して好気的に培養するようにしたので、デロビブリオを効率良く大量に純粋培養することができる。
【００２２】
また、本発明によれば、他微生物の混在するデロビブリオ培養液中に抗体を投与して混在微生物を不活性化させ、これによりデロビブリオの純粋分離株を得るようにしているので、デロビブリオの純粋分離とその大量増殖を確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例に係る大量培養法を示すフローチャート。
【図１】
0004363603.tif 000002