(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメア反復配列を含み、一の端部にドナーを有し、他の端部にアクセプターを有する線状ポリヌクレオチドを、カリウムイオンを含有する溶液に添加して、カリウムイオンが配位したグアニン四分子水素結合体を形成させ、光学的検出を行うカリウムイオンの定量方法であって、
前記光学的検出は、前記ドナーと前記アクセプターとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を検出するものである、カリウムイオンの定量方法。
【請求項２】
前記グアニン四分子水素結合体が形成された状態においては、前記ドナーと前記アクセプターとの距離が１００Å以下である請求項１記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中に存在するカチオンの定量方法、及び定量に用いられる線状ポリヌクレオチド、並びにカチオン定量用指示薬、カチオン定量用装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カリウムイオン等のカチオン（陽イオン）は、人間や動物の生体内において重要な役割を持っている。例えば、カリウム代謝異常が起こると、細胞や血液中のカリウムが欠乏あるいは過剰となり、種々の疾病の原因となり得る。カリウムイオン以外にも、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン等のカチオンも生体内において重要な役割を持っている。このため、溶液中のカチオンを精度良くかつ簡便に定量するための方法の提供が、臨床検査等の医療分野等において望まれている。
【０００３】
従来から、ニュートラルキャリヤー液膜型電極を利用したカリウムイオンやアンモニウムイオンの定量方法が広く用いられている。この方法は、バリノマイシンが選択的にカチオンと錯体を形成する性質を利用したものである。バリノマイシンは環状構造をなしており、その内部にカチオンを特異的に配位して一定の平衡状態となる。この方法では、バリノマイシンを含むポリ塩化ビニルを電極膜とし、この電極膜がカチオンを選択的に透過させることを利用してカチオンを定量している。
【０００４】
また、最近では、バリノマイシンの代わりにクラウンエーテルを用いる定量方法も提案されている。この方法は、クラウンエーテルをカリウム含有溶液中に溶解させ、γ−シクロデキストリンとカリウムとの複合体を形成させて、蛍光強度を検出するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のバリノマイシンを用いる方法は簡便な方法ではあるが、電極膜の主要材料であるポリ塩化ビニルが塩素を多く含んでいるために、焼却処理に伴いダイオキシン類を発生し易いという問題がある。また、この方法では電極膜溶媒としてフタル酸エステル等のポリ塩化ビニル用可塑剤を用いるが、これらの可塑剤も環境ホルモン物質であるとの疑いがある。
【０００６】
一方、クラウンエーテルを用いる方法においては、クラウンエーテルの水に対する溶解度が低いために水中での測定が困難であり、検出条件が限定されてしまうため簡易に測定することができないという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明は上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、溶液中のカチオンを精度良く簡便かつ安全に定量するための方法、及び定量に用いられる線状ポリヌクレオチド、並びにカチオン定量用指示薬、カチオン定量用装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の線状ポリヌクレオチドを用いて光学的検出を行うことにより、極めて有効に溶液中のカチオンを定量できることを知見した。
【０００９】
すなわち、本発明に係るカチオンの定量方法は、テロメア反復配列を含み、一の端部にドナーを有し、他方の端部にアクセプターを有する線状ポリヌクレオチドを、カチオンを含有する溶液に添加して、光学的検出を行うことを特徴とする。
【００１０】
ここで、「テロメア反復配列」とは、真核生物の線状染色体の末端に存在する塩基配列であり、グアニン（Ｇ）を多量に含む単純な繰り返し配列である。テロメア反復配列は、１〜８個のグアニン残基を含む塩基配列が繰り返されて構成される。本発明の線状ポリヌクレオチドは、テロメア反復配列のみからなってもよく、あるいはテロメア反復配列とその他の配列とから構成されていてもよい。
【００１１】
ドナーとは電子供与体（電子供与分子ないしは電子供与基）であり、アクセプターとは電子受容体（電子受容分子ないしは電子受容基）である。ポリヌクレオチドは核酸であり、ＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明の線状ポリヌクレオチドは、真核生物の染色体から取り出したテロメアの両末端にドナー及びアクセプターを結合させて作成することが好ましい。あるいは、テロメア反復配列を合成してその両末端にドナー及びアクセプターを結合させて作成してもよい。
【００１２】
溶液とは、定量の対象となる血漿、血清、尿、その他の体液、又はこれを水、食塩水、生理的食塩溶液、緩衝溶液等により希釈したものである。
【００１３】
本発明では、テロメア反復配列を有する線状ポリヌクレオチドが、カチオンを含有する溶液に添加されると、グアニン残基どうしが分子間水素結合により会合し、グアニン四分子水素結合体が形成される。これは、前記線状ポリヌクレオチドがカチオン存在下で安定化する性質を有しているためと考えられる。そして、本発明では、形成されたグアニン四分子水素結合体が有する光学的シグナル（例えば、蛍光強度）を検出する。具体的には、グアニン四分子水素結合体が形成された状態においては、線状ポリヌクレオチドの両端部に備えられたドナーとアクセプターとの距離が一定の間隔となるため、ドナーとアクセプターとの相互作用に基づく光学的シグナルが得られる。溶液中のカチオン濃度が高い場合には、グアニン四分子水素結合体の形成がより促進されるので、これによる光学的シグナルを検出することにより溶液中のカチオンを定量することができる。
【００１４】
前記光学的検出は、前記ドナーと前記アクセプターとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を検出するものである。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；Fluorescence Resonance Energy Transfer）とは、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動である。これは、ある励起状態の分子の近くにその分子が放出する光を吸収できる他の分子が存在すると、両者の光の吸収・放出の遷移双極子モーメント間の相互作用によって、光の吸収・放出を伴わない（無放射の）エネルギー移動が可能となる、というフェルスター機構に基づくものである。
【００１５】
前記グアニン四分子水素結合体が形成された状態においては、前記ドナーと前記アクセプターとの距離が１００Å以下であることが好ましい。ドナーとアクセプターとの距離はより好ましくは５０Å以下であることが好ましい。このように四分子水素結合体が形成されドナーとアクセプターとが所定の距離を保って近接することにより、蛍光共鳴エネルギーが効率的に移動するので、精度の高い定量が可能となる。
【００１６】
上記定量方法は、特に、カリウムイオンの定量に適している。これは、カチオンの中でも、とりわけカリウムイオンがグアニン四分子水素結合体を安定化させる作用に優れているためである。
【００１７】
本発明の線状ポリヌクレオチドは、テロメア反復配列を含み、一の端部にドナーを有し、他の端部にアクセプターを有し、カチオン存在下で、グアニン四分子水素結合体を形成することを特徴とする。
【００１８】
前記テロメア反復配列は、３個又は４個の連続するグアニン残基を含む塩基配列の反復配列であることが好ましい。ここで、３個又は４個の連続するグアニン残基を含む塩基配列の反復配列とは、ＧＧＧやＧＧＧＧを含む塩基配列（例えば、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＧＧＧＧ等）が繰り返されて構成された配列をいう。
【００１９】
このようにＧＧＧやＧＧＧＧを含む場合に、グアニン四分子水素結合体の形成が促進されるため、より精度の高いカチオン定量が可能となる。
【００２０】
上記線状ポリヌクレオチドにおいては、前記ドナーの各波長における蛍光スペクトルと、前記アクセプターの各波長における吸収スペクトルとが、互いに重なりを有することが好ましい。
【００２１】
このようにドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが互いに重なりを有することにより、ドナーの発光エネルギーの一部又は全部がアクセプターに移動し、これがアクセプターの励起エネルギーとして吸収される。このため、アクセプターの発光エネルギーを測定することにより、精度の高いカチオンの定量が可能となる。
【００２２】
前記ドナー／前記アクセプター（前者／後者）の組合せは、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬクロライド、又はフルオレセイン／フルオレセインであることが好ましい。
【００２３】
本発明のカチオン定量用指示薬は、上記の線状ポリヌクレオチドを含むものである。
【００２４】
本発明のカチオン定量用装置は、前記カチオン定量用指示薬と蛍光検出器とからなる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の定量方法及び定量に用いられる線状ポリヌクレオチドについて、さらに詳細に説明する。なお、以下は本発明の一実施形態であり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
（線状ポリヌクレオチド）
本発明の線状ポリヌクレオチドは、テロメア反復配列からなる部位と、ドナー部位と、アクセプター部位とから構成される。
【００２７】
好ましい線状ポリヌクレオチドの一例を、図１に示す。図１は、テロメア反復配列からなる部位が、ＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３  である場合を模式的に示したものである。
【００２８】
テロメア反復配列は、真核生物の線状染色体の末端に存在する塩基配列であり、グアニン（Ｇ）を多量に含む単純な繰り返し配列である。反復配列は、１〜８個のグアニンを含む塩基配列が繰り返されて構成される。
【００２９】
テロメア反復配列の具体例としては、(ＴＴＡＧＧＧ)４  、ＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３  、(ＴＴＧＧＧＧ)４  、ＧＧＧＧ(ＴＴＧＧＧＧ)３  、(ＴＴＡＧＧＧＧＧ)４  、ＧＧＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧＧＧ)３  、ＧＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧＧＧ)３  、ＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧＧＧ)３  、(ＴＡＧＧＧ)４  、ＧＧＧ(ＴＡＧＧＧ)３  、(ＴＴＴＡＧＧＧ)４  、ＧＧＧ(ＴＴＴＡＧＧＧ)３  、(ＴＴＴＴＡＧＧＧＧ)４  、ＧＧＧＧ(ＴＴＴＴＡＧＧＧＧ)３  、(ＴＴＴＧＧＧ)４  、ＧＧＧ(ＴＴＴＧＧＧ)３  、ＧＧ(ＴＧＧ)３  、ＧＧＧ(ＴＧＧＧ)３  、ＧＧ(ＣＧＧ)３  、ＧＧＧ(ＣＧＧＧ)３  、(ＴＴＡＧＧＧ)２  、(ＴＴＧＧＧＧ)２  、(ＴＴＡＧＧＧＧＧ)２  、(ＴＡＧＧＧ)２  、(ＴＴＴＡＧＧＧ)２  等が挙げられるが、その他真核生物の線状染色体の末端に存在する各種のテロメア反復配列、さらにはグアニン四分子水素結合体を形成し得るようなテロメア反復配列を適宜合成したものも含まれる。
【００３０】
特に、３個の連続するグアニン残基を含む塩基配列の反復配列を有するテロメア反復配列の中でもＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３  やＧＧＧ(ＴＴＴＴＧＧＧ)３  、４個の連続するグアニン残基を含む塩基配列の反復配列を有するテロメア反復配列の中でもＧＧＧＧ(ＴＴＴＴＧＧＧＧ)３が、精度の高いカチオン定量（とりわけカリウムイオン定量）に適している。
【００３１】
なお、線状ポリヌクレオチドにおけるテロメア反復配列は、テロメア反復配列のみからなってもよく、あるいはテロメア反復配列とその他の配列とから構成されたもの（例えば、ＣＣＴＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３のようにＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３にＣＣＴが結合したもの）であってもよい。
【００３２】
ドナー／アクセプターの組合せとしては、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが互いに重なりを有するものを選択する。特に、ドナーの発光エネルギーとアクセプターの励起エネルギーとが等しくなる組合せを選択することが好ましい。この詳細については後述する。
【００３３】
ドナー／アクセプター（前者／後者）の組合せとしては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）／６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−イオドアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸ナトリウム塩）／ＤＡＢＣＹＬクロライド（４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド）、又はフルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（Molecular Probes社商品名）／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（Molecular Probes社商品名）、フルオレセイン／ＱＳＹ−７（Molecular Probes社商品名）、テトラメチルローダミン／Ｃｙ５（アマシャム・ファルマシア社商品名）が好適に挙げられる。
【００３４】
これらの構造式を以下に示す。
【００３５】
【化１】
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（グアニン四分子水素結合体）
上述の線状ポリヌクレオチドを、カチオンを含有する溶液に添加すると、グアニン残基どうしが以下に示すように分子間水素結合によって会合し、カチオンが配位したグアニン四分子水素結合体が形成される。
【００３６】
【化２】
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図２に、図１に示す線状ポリヌクレオチドがカリウムイオン存在下にてグアニン四分子水素結合体を形成した状態を模式的に示す。図２に示すように、グアニン四分子水素結合体においては、グアニン（Ｇ）−グアニン（Ｇ）間が水素結合によりそれぞれ会合してＧＧＧの４本鎖が形成されている。このグアニン四分子水素結合体は、線状ポリヌクレオチドの鎖の５’→３’の方向が交互に配置され４本鎖をなしており、いわゆるアンチパラレル型構造をなしている。このグアニン四分子水素結合体は、その内部に形成された空孔内にカリウムイオンが配位する（物理的に嵌まり込んだ状態となる）ことによって安定化されている。ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）とが、１００Å以下（より好ましくは５０Å以下）の間隔で近接して配置されている。
【００３７】
なお、図２においては、分子内で４本鎖を形成するアンチパラレル型構造の場合について説明したが、本発明のグアニン四分子水素結合体はこれに限定されない。２つあるいは４つの線状ポリヌクレオチドが集まって、分子間で４本鎖形成を行ってもよく、また線状ポリヌクレオチドの鎖の５’→３’の方向が同一に配置され４本鎖をなすパラレル型構造であってもよい。アンチパラレル型構造とパラレル型構造の選択性は、カチオンの種類、テロメア反復配列を構成する塩基配列によって支配される。
【００３８】
（カチオンの定量）
溶液中のカチオンの定量は、上述の線状ポリヌクレオチドを用いて上述のようなグアニン四分子水素結合体を形成させ、これを光学的に検出して行う。具体的には、ドナーとアクセプターとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出する。ＦＲＥＴとは、ある励起状態の分子の近くにその分子が放出する光を吸収できる他の分子が存在すると、両者の光の吸収・放出の遷移双極子モーメント間の相互作用によって、光の吸収・放出を伴わない（無放射の）エネルギー移動が可能となる、というフェルスター機構に基づくものである。
【００３９】
一般に、ドナーとアクセプターが異なる分子である場合、ＦＲＥＴはアクセプターの蛍光増大やドナーの蛍光消光によって検出され、一方、ドナーとアクセプターが同じ分子である場合、ＦＲＥＴは蛍光の偏光解消によって検出される。
【００４０】
本実施形態においては、ドナーとアクセプターとの距離が１００Å以下であるので、蛍光共鳴エネルギーがドナーからアクセプターへ効率的に移動する。
【００４１】
本実施形態においては、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが少なくとも一部において互いに重なりを有する。
【００４２】
図３に、ドナーとアクセプターの蛍光スペクトルを模式的に示す。図３に示すように、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが互いに重なりを有していると、ドナーの発光エネルギーが効率良くアクセプター側へ移動し、移動したエネルギーがアクセプターの励起エネルギーとして吸収される。これによりアクセプターの発光エネルギーを測定することにより、精度の高いカチオン定量が可能となる。
【００４３】
特に、ドナーの励起エネルギーをνａ(1)、発光エネルギーをνｂ(1)、アクセプターの励起エネルギーをνａ(2)、発光エネルギーをνｂ(2)とした場合、ドナーの発光エネルギーνｂ(1)＝アクセプターの励起エネルギーνａ(2)となるようにドナー／アクセプターを選択することが好ましい。この場合、グアニン四分子水素結合体にドナーの励起エネルギーνａ(1)を与えることにより、νｂ(1)はそのままνａ(2)として吸収されるので、νｂ(2)を測定することによって、極めて精度の高いカチオン定量が可能となる。
【００４４】
（実施例）
ヒトテロメア反復配列ＧＧＧ(ＴＴＡＧＧＧ)３  の一端にドナーとして６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）を結合させ、他端にアクセプターとして６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）を結合させ、以下に示すような線状ポリヌクレオチドを得た。
【００４５】
【化３】
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用いた６−ＦＡＭの励起エネルギーは492ｎｍ、発光エネルギーは513ｎｍ、６−ＴＡＭＲＡの励起エネルギーは551ｎｍ、発光エネルギーは570ｎｍである。
【００４６】
バッファー（５ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７）２ｍｌに上記の線状ポリヌクレオチドを添加し、これに１Ｍ  ＫＣｌを０〜５０μｌ添加し、次いで492ｎｍの励起光を照射して、蛍光検出器（日立社製  F-4500）を用いて蛍光スペクトルを得た。
【００４７】
この結果を図４に示す。図４に示すように、カリウムイオンの場合は、515ｎｍ付近及び584ｎｍ付近においてピークを示した。この515ｎｍ付近のピークはドナーの励起エネルギーに起因するものであり、584ｎｍ付近のピークはアクセプターの発光エネルギーに起因するものである。
【００４８】
次に、バッファー（５ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７）２ｍｌに上記の線状ポリヌクレオチドを添加し、これにＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＲｂＣｌ、ＣｓＣｌをそれぞれ０〜０．０３Ｍ添加し、上記同様に励起光を照射して蛍光スペクトルを得た。
【００４９】
この結果を図５に示す。図５に示すように、584ｎｍ付近と515ｎｍ付近の強度比（Ｉ５８４／Ｉ５１５）から、各カチオン（Ｋ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、Ｒｂ＋  ）を定量できることが分かる。特に、本定量方法がＫ＋の定量に適していることが分かる。一方、Ｃｓ＋の定量には適していないことが分かる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、溶液中のカチオンを精度良く簡便かつ安全に定量することができる。本発明は、臨床検査等の医療分野や、その他のカチオン定量が必要な分野に広く利用することができる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】    好ましい線状ポリヌクレオチドの一例を模式的に示した図である。
【図２】    図１の線状ポリヌクレオチドがカリウムイオン存在下にてグアニン四分子水素結合体を形成した状態を模試的に示した図である。
【図３】    ドナーとアクセプターの蛍光スペクトルを模式的に示した図である。
【図４】    実施例における蛍光スペクトルを示す測定結果である。
【図５】    実施例における蛍光スペクトルを示す測定結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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