(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好適なアジュバントおよび／または許容可能な担体ならびに実質的に精製されたポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)免疫原１つを含んでなる、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)に対する免疫応答を生起させるのに使用する組成物であって、該免疫原が図１に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の25-293位のアミノ酸からなるＰ．ジンジバリスの抗原１であることを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
前記組成物がさらに別の１以上の精製されたポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)免疫原を含み、該免疫原が抗原２、抗原３、抗原４[但し、
抗原２はＰ．ジンジバリスの抗原であって、その内部アミノ酸配列がDNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAEDからなり；
抗原３はＰ．ジンジバリスの抗原であって、その内部アミノ酸配列がDVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTYLIDANTTIPKLKからなり；
抗原４はＰ．ジンジバリスの抗原であって、その内部アミノ酸配列がVYNASISAVGNTSAIDPVVQIIHHNからなる]からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原３が、受託番号NM97/049 74としてAGALに寄託されているクローンのオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原が図１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の25-293位のアミノ酸からなる、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物または請求項４に記載の抗原に対して生起する抗体を含む抗体製剤。
【請求項６】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体製剤。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体製剤。
【請求項８】
ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)感染症患者の治療において使用されるものである請求項５〜７のいずれか１項に記載の抗体製剤。
【請求項９】
前記抗体製剤の量がポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)の病原性作用を少なくとも部分的に抑制するのに有効な量である、請求項８に記載の抗体製剤。
【請求項１０】
洗口剤または歯磨き剤である、請求項８または９に記載の抗体製剤。
【請求項１１】
個体におけるＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)感染の罹り易さおよび／または疾病の程度を軽減するために使用される、個体にＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)に対する免疫応答を誘導するのに有効な請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
好適なアジュバントおよび／または許容可能な担体ならびにポルフィロモナス．ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)免疫原１つをコードする配列を含んでいるＤＮＡ分子を含んでなる、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)に対する免疫応答を生起させるのに使用する組成物であって、該免疫原が図１に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の25-293位のアミノ酸からなるＰ．ジンジバリスの抗原１であることを特徴とする前記組成物。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ分子が図１に示す塩基配列からなる、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ分子が、受託番号NM97/049 74としてAGALに寄託されているクローンのオープンリーディングフレーム中に存在する配列をさらに含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
図１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１６】
ＤＮＡ分子が図１に示す塩基配列からなる、請求項15に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項15または16に記載のＤＮＡ分子に相補的かつ特異的な配列の一部からなるヌクレオチドプローブ。
【請求項１８】
プローブが標識されている、請求項17に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項１９】
１以上のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原をコードし、適当な条件下で宿主細胞がその１以上の免疫原を発現するように制御配列に機能的に連結されたＤＮＡ配列で形質転換された組換え宿主細胞であって、該免疫原が図１に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の25-293位のアミノ酸からなるＰ．ジンジバリスの抗原１である組換え宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞が口内共生性である、請求項19に記載の組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は歯周疾患および心臓血管疾患に関係がある細菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)の病原作用を抑制するために使用する経口組成物および免疫原組成物に関する。また、本発明は歯肉下プラークサンプル中のポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)およびＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原に特異的な抗体の存在の診断試験に関する。該組成物はポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)の特異的抗原であるタンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはペプチドキメラを含む。組換えＤＮＡおよび／または生化学技術を使用するこの抗原、ペプチド成分およびペプチドキメラの調製方法もまた開示される。これに関連して、上記特異的抗原をコードするＤＮＡ配列、および主要エピトープを含有する抗原構築物の発現を目的とするのに有用な組換えベクターが開示される。また、これらの組換えベクターで形質転換された宿主細胞も開示される。これらのタンパク質、ペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドキメラは免疫応答を生起させるために使用する製剤中の免疫原として有用であり、また受動免疫のために有用で、かつ診断アッセイ用の試薬として有用なタンパク質特異的およびペプチド特異的抗血清を産生させるのに使用することができる。開示されたヌクレオチド配列は、Ｐ．ジンジバリス(P.gingivalis)遺伝物質の検出を目的とする診断アッセイにおける試薬して使用することができ、かつ遺伝学的ワクチン製剤として使用する発現ベクターに組み込むことができる、これに対応するオリゴヌクレオチドの合成のために提供される。
発明の背景
歯周病は細菌が関係する歯の支持組織の炎症疾患であり、歯肉組織の非特異的で可逆的な炎症である、比較的軽症の歯肉炎から歯の支持組織の破壊に特徴がある劇症の歯周炎までの範囲に及ぶ。歯周炎は特定のグラム陰性細菌の集合体の歯肉下の感染が関係し、歯周組織の破壊に至り、公衆衛生上大きな問題である。高い関心を呼んでいる細菌の一つはポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)である。なぜならば成人の歯周炎病変からのこの微生物の回収は歯肉下の嫌気的に培養可能なフローラの50％に上り、一方正常な部位からはＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)はほとんど回収されず、したがって少数だからである。歯肉下プラーク中のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)レベルの比例的な増加は歯肉炎の悪化に関係があり、培養可能な歯肉下の微生物集団の根絶にともなって病気が消失する。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の歯肉下植菌により非ヒト霊長類における歯肉炎病変が進行することが証明された。動物およびヒトの両方におけるこれらの知見は、成人歯周炎の発症においてＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)が重要な役割を担うことを示唆している。アテロームプラーク中のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の存在は心臓血管疾患の進行にも関連があった。
Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)は特定のアミノ酸の代謝からエネルギーを獲得する、黒色色素性、嫌気性、非糖分解性、タンパク質分解性グラム陰性桿菌である。この微生物は鉄、特にヘムまたはそのFe(III)酸化物のヘミンについて完全生育要求性であり、実験動物では過剰ヘミン条件下で生育させたとき、強い毒性となる。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の病原性については、莢膜、付着因子(adhesin)、細胞毒および細胞外加水分解酵素を含む多数の毒性因子が関係するとされてきた。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)のコロニー形成を防止するための有効で安全なワクチンを開発するには、中和用抗体の産生のための免疫原としての用途を有する、毒性に関与するタンパク質抗原を同定する必要がある。
発明の概要
本発明者らは、ＤＮＡプローブ分析によって示された、歯肉下にＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)を保有する健康な１被験者からの血清を使用して、４つの主要なＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原を精製し、特性決定した。これらの抗原(抗原1、抗原2、抗原3および抗原4)を下の表に示す。
0004358909.tif 000002
したがって、最初の態様において、本発明はポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)に対する免疫応答を生起させるのに使用する組成物から構成され、この組成物には好適なアジュバントおよび／または許容可能な担体、ならびに抗原1、抗原2、抗原3、抗原4およびそれらの断片を含有するエピトープからなる群から選択される、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原１つを含有する。
場合によっては、この組成物は抗原1、抗原2、抗原3、抗原4およびそれらの断片を含有するエピトープからなる群から選択される、追加の精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原１つ以上をさらに含有してもよい。
第２の態様において、本発明は以下の内部アミノ酸配列を有する、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原またはそれらの断片を含有するエピトープで構成される：
DLENKGEATLLVTFGSSYKAPRETYAKIEKTFAAAYPDQR。この抗原は図１に示すアミノ酸配列のものが好ましい。
第３の態様において、本発明は以下の内部アミノ酸配列を有する、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原またはそれらの断片を含有するエピトープで構成される：DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAED。
第４の態様において、本発明は以下の内部アミノ酸配列を有する、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原またはそれらの断片を含有するエピトープで構成される：DVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTYLIDANTTIPKLK。この抗原には、アミノ酸配列DVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTYLIDANTTIPKLKに対応する縮重プローブとハイブリダイズする、AGALに受託番号第NM97/04974号として寄託されたクローンのオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列が含まれることが好ましい。
第４の態様において、本発明は以下の内部アミノ酸配列を有する、実質的に精製されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)免疫原またはそれらの断片を含有するエピトープで構成される：VYNASISAVGNTSAIDPVVQIIHHN。
その他の態様において、本発明は抗原1、抗原2、抗原3および抗原4をコードするヌクレオチド配列ならびにそれらの配列とハイブリダイズするプローブで構成される。
抗原1をコードするヌクレオチド配列およびこれから導かれるヘム受容体タンパク質抗原1のアミノ酸配列を図１に示す。このヌクレオチド配列の開示には、この範囲内に縮重等価物およびＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)W50の抗原決定基に対応するアミノ酸配列をコードするサブ配列も含まれる。
抗原3からのヌクレオチド配列を含有するクローンの１つ、DnaKクローン#6はブダペスト条約の協約に基づいて、Australian Goverment Analytical Laboratories,1 Suakin Street,Pymble,NSW Australiaに1997年3月25日に寄託され、受託番号第NM97/04974号を与えられている。したがって、この寄託物を入手することによってこの抗原の別のヌクレオチド配列を得ることが可能である。この寄託物はブダペスト条約の協約および条件下で入手することができる。これによれば、この寄託物の利用のための入手は独立した専門家に限定される(EPC Rule 28(4),AU Reg.3.25(3))。
また別の態様において、本発明は、本発明の抗原に対して生起する抗体で構成される。
この抗原に対する抗体は、抗原を中和することによって疾患を予防するために、歯磨きペーストおよび洗口剤などの口内組成物中に使用することができる。抗原特異的抗体は、診断用アッセイによる歯肉下プラークサンプル中のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の早期検出のためにも使用することができる。鼻腔スプレー、経口または注入によって送達されたこれらの抗原および好適なアジュバントをベースとするワクチンは、これらの抗原に対する特異的免疫応答を生じ、これによってＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)のコロニー形成および毒性を減少させ、それによって疾病を予防または軽快化する。本発明の抗原タンパク質および抗原ペプチド(ここでは「ペプチド」と称する)ならびに抗原オリゴペプチド(ここでは「オリゴペプチド」と称する)、そして別の抗原のエピトープと融合した１抗原のエピトープを含有する抗原キメラペプチド(ここでは「キメラペプチド」と称する)は、予防および／または治療用ワクチン製剤中の抗原として、またはＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)特異的抗体の血清中力価の上昇を測定することによるＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の感染の検出を目的とする診断用イムノアッセイにおける抗原として、使用することができる。また、本発明の抗原タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドおよびキメラペプチドを、受動免疫療法用に有用で、かつ歯肉下プラークサンプルなどの臨床検体中のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の存在を検出することを目的とする診断アッセイ用の試薬として有用な抗原特異的抗体を産生させるために使用することができる。ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラペプチドは化学的合成またはＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)培養物からの精製によって得るか、あるいは本明細書に開示された核酸配列を使用した組換えベクター発現システムから製造することができる。したがって、別の態様において、本発明は抗原1、抗原2、抗原3および抗原4の抗原のいずれか１つまたはそれらの組合せに対して生起した抗体を含有する歯磨きペーストおよび洗口剤を含んでなる口内組成物を提供する。別の態様において、本発明は、抗原1、抗原2、抗原3および抗原4の抗原のいずれか１つまたはそれらの組合せに対して生起した抗体の使用が関与する診断用アッセイを含む、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の早期検出方法を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に記載したＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原のいずれか１つに対する血清中の力価の上昇の測定を含む、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)感染の検出方法を提供する。
本発明のその他の態様は、抗原構築物、ならびに適当な宿主細胞中で抗原タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラペプチド発現させ、これによって発現したタンパク質またはペプチドを精製することを目的として使用することができる、プラスミドＤＮＡおよびヒトウイルス、動物ウイルス、昆虫ウイルスまたはバクテリオファージなどのウイルスＤＮＡを含むベクターが関与する、新規なＤＮＡ配列の構築を目的とする。
本発明の別の態様は、抗原1、抗原2、抗原3および抗原4の抗原をコードする遺伝子ならびに抗原ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラペプチドをコードする遺伝子断片の分子クローニングの方法を提供する。本発明の核酸配列を核酸のハイブリダイズによるＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の遺伝物質についての分子診断用アッセイにおいて使用することができる。この場合、核酸の増幅、および増幅した核酸の検出のためのプライマーおよび／またはプローブとして使用する抗原特異的オリゴヌクレオチドの合成が含まれる。その上、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の病原性菌株に対する予防および／または治療用ワクチン製剤における免疫原として、抗原タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、キメラペプチド、およびエピトープを含有する抗原性構築物を使用することができる。この場合、この免疫原は化学的に合成されるか、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)から精製されるか、または組換え発現ベクター系から精製されるか、のいずれでもよい。あるいは、それ自身が各抗原の１以上の免疫原性エピトープまたは別の抗原若しくは別の病原性微生物からの抗原の免疫原性エピトープと組み合わせて産生するように操作した組換え細菌またはウイルスを含む細菌またはウイルスワクチン中に、この抗原をコードする遺伝子、またはペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラペプチドをコードする１以上の遺伝子断片を組み込むことができる。その他、抗原をコードする遺伝子あるいはペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラペプチドをコードする１以上の遺伝子を１以上の調節要素に機能的に連結させて、ヒト中に直接導入し、抗原に関連するタンパク質、ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラペプチドを発現させ、予防的免疫応答を誘発させることもできる。ワクチンは、適当なベクター中に組み込んで、このベクターを含有する好適な形質転換宿主[例えば、大腸菌(E.coli)、バシルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、COS細胞、CHO細胞およびHeLa細胞]中で発現させた変異抗原の組換え成分をベースとするものでもよい。ワクチンは口内組換え細菌ワクチンをベースとするものでもよく、この場合抗原を発現する組換え細菌は口腔の共生常在菌である。全Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)細胞またはこれまで調製されたその他の抗原とは異なって、本明細書中に記載する４つの抗原はＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)が関係する歯周病の予防のためのワクチンの調製用の安全で有効な抗原である。
さらに別の態様において、本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)に対して特異的な免疫応答を生起させるのに使用するための、好適なアジュバントおよび／または許容可能な担体、ならびに抗原1、抗原2、抗原3、抗原4およびこれらの断片を含有するエピトープからなる群から選択されるＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原の１つをコードする配列が含まれるＤＮＡ分子を含む組成物で構成される。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)はFeについて絶対生育要求性であり、Feはヘム形態のものが好ましい。この点について、抗原１は、特異的抗体によるこのヘム受容体の中和がヘムの取り込みを阻害し、これによって生育および毒性を阻害するので、特に興味深い。動物モデルにおいて、ヘムを制限して生育させたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)は毒性が低い。
フィンブリエ(fimbriae)は細胞を完全に覆うかまたは極性的な細い繊維状構造をしている。少なくとも２つのフィンブリエタイプ、すなわち接合ブリッジの形成による遺伝物質の移動に関与するものと軟質および硬質組織への接着に関与するもの、が確認されている。接合に関与するフィンブリエは性線毛と称される。これらの線毛は遺伝的に適合する受容体細菌への付着のための特異的受容体を有している。第２のフィンブリエタイプ、すなわちこのタイプに特異的な線毛または共通の線毛、真正細菌同士の凝集および真核細胞への接着に関与し、食作用および宿主組織の侵入を防止するのに重要な役割を担う場合が多い。腸内細菌科においては、フィンブリエは約17〜21kDaのサブユニットタンパク質の反復で構成される。フィンブリエ構造の一部として、少数のタンパク質もある。特異的フインブリエ結合タンパク質(付着因子)は28〜30kDaであることが多く、フィンブリエの先または長さ方向に周期的に位置している。
最初にＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)上のフィンブリエの存在を証明したメンバーの中にYoshimuraらがおり、彼らは他のグラム陰性細菌からのフィンブリリン(fimbrilins)とはアミノ酸配列相同性がない43kDaのフィンブリリンサブユニットを精製した。Gencoおよび共同研究者らは、この43kDaフィンブリエタンパク質およびこのフィンブリリンのＣ−末端に相当する合成ペプチドにより、唾液でコーティングしたヒドロキシアパタイトへのＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の接着が低減することを示した。その後の研究において、彼らは組換えフィンブリリンが唾液のstatherinおよびプロリンに富むタンパク質に特異的に結合することを示した。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)381の感染によって誘導される歯肉組織の破壊が、この43kDaタンパク質でのラットの免疫感作によって防止された。さらに、挿入失活させた43kDaフィンブリリンをコードするfimA遺伝子を有するＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の同質遺伝子変異体は野性型菌株に比較して、ラットモデルにおける歯肉組織の破壊を引き起こすのが有意に低かった。しかし、この研究において、fimA変異体は偽感染動物において見られるよりもなお大きい歯肉組織破壊を引き起こしたことに注目すべきである。fimA変異体は、唾液コーティングヒドロキシアパタイトへの結合は低減したが、赤血球細胞を凝集する能力および他の口内細菌と共凝集する能力は損なわれなかった。別の独立した研究において、Hamadaらも、挿入失活させた遺伝子の相同組換えによってＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)ATCC 33277のfimA変異体を製造し、この変異体が(0.5〜1.0μmの)長いフィンブリエを発現できなかったが、電子顕微鏡によって、細くて短いフィンブリエ構造はなお観察されたことに注目し、第２のフィンブリエタイプの存在を示唆した。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の381株およびATCC 33277株について、この43kDaフィンブリンの同定ならびにこの43kDaタンパク質に関連する毒性および免疫感作の研究を実施した。これらの菌株は非侵入性に分類され、動物モデルにおける感染経過に関しては侵入性菌株よりも毒性が低いと考えられる。非侵入性菌株はチャレンジ部位での局所的膿瘍を生成し、一方侵入性菌株は同一の接種量で離れた部位まで拡散し、多数の膿瘍を形成する。さらに、Sundqvistらは、非侵入性菌株(381およびATCC 33277)は多形核白血球によって高度に食作用と殺傷を受けたが、一方侵入性菌株W50およびW83はわずかに食作用と殺傷を受けたことを示した。Naitoらが侵入性および非侵入性Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)株の間にフィンブリエの違いがあると示唆していることに注目すると、興味深い。これらの研究者は、非侵入性菌株のフィンブリエはコラーゲンコーティングヒドロキシアパタイト(HA)に多数結合するが、一方侵入性菌株から調製したフィンブリエはコラーゲンコーティングHAに弱く結合することを発見した。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の侵入性菌株、W50、W83およびAJW5は動物モデルにおいて高度に毒性であるが、免疫細胞化学およびウェスタンブロット分析によって示されるように、43kDaフィンブリンを発現しない。しかし、微細ネガティブ染色では、他の菌株よりも密度は低いものの、W50およびW83にはフィンブリエがある。W50およびW83は43kDaフィンブリリンを欠如することから、不活性fimA遺伝子を所有していると見られるが、この43kDaフィンブリリンを欠如しているにもかかわらず、これらの菌株はなお毒性で侵入性である。
抗原2は第２のフィンブリエタイプ、すなわちＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の主要な付着因子である。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)W50の細胞表面タンパク質抗原の精製および特性決定の研究の一部として、我々は、ＤＮＡプローブ分析で示された、歯肉下にＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)を保有している健康な被験者からの血清と血清反応性のある46kDaフィンブリエタンパク質(抗原2)の30kDa断片を精製した。この30kDa断片の内部アミノ酸配列はディケロバクター・ノドーサス[Dicherobacter nodosus(以前はBacteroides nodosusであった)]のフィンブリエタンパク質と相当の相同性(48％の同一性)を示した。
Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)30kDa断片配列  DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAED...
Ｄ．ノドーサス(D.nodosus)のフィンブリイタンパク質  KGPDANPASGVVGNKDTGKYVLAEI...
Ｄ．ノドーサス(D.nodosus)  フィンブリエタンパク質はバクテロイデス(Bacteroides)spp.、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)、アシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)、エイケネラ・コローデンス(Eikenella corrodens)、モラクセラ・ボビス(Moraxella bovis)、モノクセラ・ノンリクファシエンス(Moraxella nonliquefaciens)、およびＰ．エルジノーサ(P.aeruginosa)などのいくつかのシュードモナス(Pseudomonas)を含むグラム陰性菌の一群に共通するフィンブリエタイプである、タイプIVまたはmePhe線毛に分類される(Elleman,1988)。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)30kDa断片はＤ．ドノーサス(D.nodosus)のA-セットまたはクラスＩフィンブリエ(血清タイプA、B、C、E、FおよびGを含む)の中央ドメインの保存されたアミノアシル残基と最も高い相同性を示す。タイプIVフィンブリエの特徴の１つは真核細胞に接着し、赤血球を凝集させることである。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)46kDaフィンブリエタンパク質中にも存在する保存されたヘキサペプチドモチーフ-KYVLAE-が淋菌の線毛の受容体結合部位、またはその近辺に局在していたことに注目すると、興味深い。なぜならば、これらの残基に対する抗血清は異種線毛による真核細胞への細菌の付着をも阻害し、真核細胞に結合するさらに大きいペプチド断片を沈殿させるからである。中央ドメインの保存された残基は近傍にあるとき、真核細胞の表面のグリコプロテインの炭水化物部分と特異的に相互作用する裂溝を形成することが示唆された。
Ｄ．ドノーサス(D.nodosus)はヒツジの接触感染性疾患である指間皮膚炎または腐蹄症の病因作用物質であり、タイプIVフィンブリエは主要な血清学的および免疫保護作用毒性因子である。腐蹄症ワクチンは単純なバクテリンから高度に特異的な組換えＤＮＡフィンブリエワクチンへと発展してきた。初期の全細胞ワクチンは、免疫期間が短く、また限定された血清タイプのみが取り込まれたため、成功しなかった。多数の抗原が試験され、主要な保護性免疫原はタイプIVフィンブリエサブユニットタンパク質であった。組換えフィンブリエを基礎とする一価のワクチンは免疫性の長期持続をもたらす全能性である。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)46kDaフィンブリエタンパク質およびＤ．ドノーサス(D.nodosus)免疫保護性フィンブリエ間の相同性は、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)タンパク質(抗原2)がＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)が関係する歯周炎の診断および免疫予防性物質としての利用性があることを示すものである。
細胞の熱ショックまたはストレス応答は細胞が細胞タンパク質の変性の原因となり得る温度上昇などの環境ストレスに耐えることができるための恒常的機構である。DnaKファミリータンパク質は変性して異常に畳み込まれたタンパク質に結合して当初の配座と機能への再折畳みを促進する。DnaKまたはHeat Shock Protein(HSP)70は、構成細胞タンパク質の1〜5％を含む、細菌および真核細胞に共通の高度に保存された分子シャペロニンであり、大腸菌(E.coli)中のDnaKの15％は小嚢に結合している。ストレス中、DnaKは過剰発現されて全細胞タンパク質の30％を構成するまでになるので、このタンパク質は感度のよい免疫診断用試験のための理想的な候補とされる。対応するDnaKタンパク質の相同性を基礎とする、ハンセン病および結核のための特異的診断用試験が開発された。DnaKの全種相同体がタンパク質のN-末端部の半分で高度に保存され、C-末端部の半分が種特異的領域となっている。したがって、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)DnaK相同体(抗原3)はＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)が関係する歯周炎の診断および免疫予防性物質としての利用性があると考えられる。
同定された４つの抗原(抗原1、抗原2、抗原3および抗原4)は中和性抗体を含有する経口組成物による受動免疫およびワクチンの開発による診断および中和について、特に興味深い。特に、抗原を発現する組換え細菌が遺伝的に操作された口腔の共生常在菌である場合の口内組換え細菌ワクチンの開発は興味深い。以前開示されたＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原に対するこれらの４つの抗原の有利な点は、これらが主要な毒性関連因子であること、および侵入性菌株上に保存されたエピトープを含有することであり、このため、これらは診断用および免疫予防用物質の開発のために理想的である。
発明の詳細な説明
本発明のいくつかの態様を実施するための限定するわけではないが代表的な方法である特定の好ましい実施態様を引用して、本発明をここにさらに詳細に記載する。
４つの抗原 抗原1、抗原2、抗原3および抗原4はＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)細胞からクロロホルム抽出、続いてアニオン交換、ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーによって精製することができる。次に、この精製した抗原を使用し、標準的な技術を使用して、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる。抗体産生のために使用する動物はマウス、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、ウシその他が可能である。イムノアッセイによってこの抗原に対する高い抗体力価が検出された場合、その動物から採血するかまたはその卵もしくはミルクを採取し、血清を調製し、そして／または標準的な技術を使用して抗体を精製するか、あるいは標準的な技術を使用して脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させることによってモノクローナル抗体を作製する。培養液または腹水液、血清、ミルクもしくは卵から塩析、ゲル濾過、イオン交換および／またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって抗体(イムノグロブリン画分)を分離することができるが、塩析をともなうものが好ましい。塩析法において、抗血清またはミルクを硫酸アンモニウムで飽和させ、沈殿を生成させ、続いて沈殿物を生理食塩水に対して透析して、特異的抗体を含む精製されたイムノグロブリン画分を得る。ウマ抗血清およびウシ抗血清ならびにミルクから好ましい抗体が得られる。本発明においては、抗原で動物を免疫感作することによって得られた抗血清およびミルク中に含まれる抗体を経口組成物に配合することができる。この場合、抗血清およびミルクから分離および精製した抗体と同様に、抗血清およびミルクを使用することもできる。これらの物質をそれぞれ単独で、または２以上を組み合わせて使用することができる。Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)を中和することによって疾病を予防するため、抗体を歯磨きペーストおよび洗口剤などの経口組成物中に使用することができる。この抗体は、チェアサイド(chairside)酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)による歯肉下プラークサンプル中のＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)の早期検出のために使用することもできる。
経口組成物のためには、投与する上記の抗体の量が0.0001〜50g/kg/日で、上記の抗体の含有量が組成物の0.0002〜10重量％、好ましくは0.002〜5重量％とするのが好ましい。上記の血清またはミルク抗体を含有する本発明の経口組成物を調製して、歯磨きペースト、歯磨き粉および液体歯磨き剤を含む歯磨き剤、洗口剤、トローチ、チューインガム、歯科用軟膏、歯肉マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品ならびにその他の食料品などの口内に適用し得る各種の形態で使用することができる。本発明にしたがう経口組成物に、特定の経口組成物のタイプおよび形態に応じて、その他の周知の成分をさらに含有させることができる。
本発明のいくつかの高度に好ましい形態において、経口組成物は実質的に洗口剤またはすすぎ剤などに適した液体とすることができる。こうした製剤において、媒体(vehicle)は典型的には、望ましくは下記の湿潤剤を含む水−アルコール混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約1:1〜約20:1の範囲である。このタイプの製剤における水−アルコール混合物の総量は典型的には製剤の約70〜99.9重量％の範囲である。アルコールは典型的にはエタノールまたはイソプロパノールであり、エタノールが好ましい。
本発明のこうした液体およびその他の製剤のｐＨは一般的に約4.5〜約9の範囲であり、典型的には約5.5〜8の範囲である。ｐＨは好ましくは約6〜約8.0の範囲、好ましくは7.4である。ｐＨを酸(例えばクエン酸もしくは安息香酸)または塩基(例えば水酸化ナトリウム)で制御するか、あるいは(クエン酸、安息香酸、炭酸、または炭酸水素のナトリウム塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、その他などで)緩衝化することができる。
本発明のその他の望ましい形態として、経口組成物を実質的に、歯磨き粉、歯科用錠剤または歯磨きペースト(歯科用クリーム)もしくはゲル状歯磨き剤などの適当な固体またはペーストとすることができる。こうした固体またはペースト経口製剤の媒体は一般的に歯科用に許容可能な研磨剤を含有する。研磨剤の例は非水溶性メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、二水和リン酸カルシウム、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、アルミナ水和物、焼成アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびこれらの混合物である。その他の好適な研磨剤として、メラミン−、フェノール−、および尿素−ホルムアルデヒド、ならびに架橋ポリエポキシドおよびポリエステルなどの粒子状熱硬化性樹脂が含まれる。好ましい研磨剤として、粒子サイズが約5ミクロンまで、平均粒子サイズが約1.1ミクロンまでで、表面積が約50,000cm2/gmまでの結晶シリカ、シリカゲルまたはコロイド状シリカ、および非晶質アルミノケイ酸アルカリ金属塩複合体が含まれる。
視覚的に透明なゲルを使用する場合、Syloid 72およびSyloid 74などの商標名SYLOIDとして販売されているコロイド状シリカ、またはSantocel 100などの商標名SANTOCELとしてのアルミノ−ケイ酸アルカリ金属塩複合体が特に有用である。なぜならばこれらは普通歯磨き剤に使用されるゲル化剤−液体(水および／または湿潤剤を含む)系の屈折率に近似した屈折率を有するからである。
いわゆる“非水溶性”研磨剤の多くは適度なアニオン性であり、少量の水溶性剤をも含有する。こうして、不溶性メタリン酸ナトリウムをThorpe’s Dictionary of Applied Chemistry,Volume 9,4th Edition,pp.510-511に説明されているような任意の好適な方法で形成させることができる。Mardrell塩およびKurrol塩として知られている不溶性メタリン酸ナトリウムの形態も好適な物質の別の例である。これらのメタリン酸塩は水に対してごくわずかな溶解性を示すだけなので、普通不溶性メタリン酸塩(IMP)と称される。この中には、不純物として少量、通常4重量％までの程度の数％の水溶性リン酸塩物質が存在する。不溶性メタリン酸塩の場合では水溶性トリメタリン酸ナトリウムが含まれるものと考えられるが、この水溶性リン酸塩物質の量は、所望ならば水で洗浄することによって減少または除去することができる。不溶性メタリン酸アルカリ金属塩は典型的には37ミクロンを超えるものが物質の1％以下であるような粒子サイズの粉末形態で使用される。
研磨剤は一般的に約10％〜約99％の重量濃度で固体またはペースト組成物中に存在する。好ましくは、歯磨きペースト中に約10％〜約75％、および歯磨き粉中に約70％〜約99％の量で存在する。歯磨きペースト中、研磨剤がシリカ質で存在する場合、一般的に約10〜30重量％存在する。他の研磨剤は典型的には約30-75重量％存在する。
歯磨きペースト中、液体媒体は典型的には製剤の約10％〜約80重量％の範囲の量の水および湿潤剤を含む。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールおよびポリプロピレングリコールが好適な湿潤剤／担体の例である。水、グリセリンおよびソルビトールの液体混合物も有用である。屈折率が重要な考慮点となる透明ゲルにおいては、約2.5〜30％w/wの水、0〜約70％w/wのグリセリンおよび約20〜80％w/wのソルビトールを使用するのが好ましい。
歯磨きペースト、クリームおよびゲルは典型的には約0.1〜約10、好ましくは約0.5〜約5％w/wの割合で天然または合成の増粘剤またはゲル化剤を含有する。好適な増粘剤は合成ヘクトライト(hectorite)、例えば、Laporte Industries Limitedによって市販されているLaponite(例えばCP，SP2002，D)として入手可能な合成コロイドケイ酸マグネシウムアルカリ金属塩複合クレイである。Laponite Dは、重量で約58.00％のSiＯ2、25.40％のMgＯ、3.05％のNa2Ｏ、0.98％のLi2Ｏ、およびいくらかの水と微量の金属からなっている。その真の比重は2.53であり、水分8％で見かけのかさ密度が1.0g/mlである。
その他の好適な増粘剤として、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、ガムトラガカント、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース(例えばNatrosolとして入手可能)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および微粉砕Syloid(例えば24 4)などのコロイド状シリカが含まれる。プロピレングリコール、ジプロピレングリコールおよびヘキシレングリコールなどの湿潤剤ポリオール、メチルセロソルブおよびエチルセロソルブなどのセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油およびペトロラタムなどの直鎖中に約12以上の炭素数を含有する植物油およびワックス、ならびに酢酸アミル、酢酸エチルおよびベンジルベンゾエートなどのエステル、などの可溶化剤を含ませることもできる。
通常のように、経口製剤は好適なラベルをつけた包装品で販売またはそれ以外で配布されるべきものと理解される。したがって、うがい剤の容器にうがい剤または洗口剤としての大略の説明と使用のための指示があるラベルをつけ、歯磨きペースト、クリームまたはゲルは通常、歯磨きペースト、ゲルまたはクリームとしての大略の説明があるラベルをつけた、典型的にはアルミニウム、ライニングされた鉛またはプラスチックの押し出しチューブ、あるいは内容物を計り出すための押し出し式、ポンプ式または加圧式のディスペンサーに入れられる。
予防作用を増強し、口腔内への活性剤の十分で完全な拡散の達成を補助し、現状の組成物を審美上さらに受け入れられやすくするために、本発明の組成物中に有機表面活性剤を使用する。該有機表面活性剤物質は好ましくは本発明の抗体を変性させない、アニオン、非イオンまたは両性の性質であり、表面活性剤として、組成物に抗体を変性させないで洗浄および発泡特性を付与するような洗浄剤を使用するのが好ましい。アニオン表面活性剤の好適な例は、水素化ココナッツオイル脂肪酸の一硫酸モノグリセリドナトリウム塩などの高級脂肪酸モノグリセリド一硫酸の水溶性塩、硫酸ラウリルナトリウムなどの高級硫酸アルキル、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムなどの硫酸アルキルアリール、高級アルキルスルホ−アセテート、1,2-ジヒドロキシプロパンスルホネートの高級脂肪酸エステル、および脂肪酸、アルキルまたはアシルラジカルの中に12〜16炭素を有するものなどの、低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミド、などである。最後に記載したアミドの例は、N-ラウロイルサルコシン、および実質的にセッケンまたは類似の高級脂肪酸物質を含まないN-ラウロイル、N-ミリストイル、またはN-パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウムおよびエタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト化合物の使用は特に有利である。なぜならば、これらの物質は酸溶液中での歯エナメルの溶解性をいくらか減少させることで、炭水化物の分解による口腔内での酸形成の阻害について延長された著しい効果を示すからである。抗体とともに使用するのに好適な水溶性非イオン界面活性剤の例は、疎水性長鎖(例えば約12〜20炭素原子の脂肪族鎖)を有するものとも反応し得る各種の反応性水素含有化合物とエチレンオキサイドとの縮合生成物であり、この縮合生成物(「エトキサマー」)は疎水性ポリオキシエチレン部分分子を含有し、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、多価アルコール(例えばソルビタンモノステアレート)とポリ(エチレンオキサイド)の縮合生成物およびポリプロピレンオキサイド(例えばPluronic物質)などである。
表面活性剤は典型的には約0.1〜5重量％の量存在する。表面活性剤は本発明の抗体の溶解を補助するようであり、それによって必要とする可溶化湿潤剤の量を減少させることに注目すべきである。
本発明の経口製剤中に、ホワイトニング剤、保存剤、シリコーン、クロロフィル化合物および／または尿素、リン酸二アンモニウムなどのアンモニア化物質、およびこれらの混合物などの各種のその他の物質を組み込むことができる。これらのアジュバントを存在させる場合、所望の性質および特徴に実質的に逆効果を与えない量を製剤中に組み込む。
任意の好適な香味料または甘味料もまた使用することができる。好適な香味料成分の例は、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、クローブ、セージ、ユーカリプタス、マジョラム、シナモン、レモン、およびオレンジのオイルなどの香味油、ならびにサリチル酸メチルである。好適な甘味料として、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、ナトリウムチクラメート、ペリラルチン、AMP(アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル)、サッカリン、などが含まれる。好適には、香味料および甘味料はそれぞれまたはともに製剤の約0.1％〜5％以上含ませることができる。
本発明の好ましい実用において、本発明の組成物を含有する洗口剤または歯磨き剤などの本発明に従う経口組成物を、ｐＨ約4.5〜約9、一般的には約5.5〜約8、好ましくは約6〜8で、毎日、または２日もしくは３日毎、あるいは好ましくは１日に１回〜３回、少なくとも２週間〜８週間、または一生、規則的に歯肉および歯に適用するのが好ましい。
本発明の組成物は、所望ならば通常の可塑剤または軟化剤、糖またはその他の甘味剤、あるいはグルコース、ソルビトールなどとともに、例としてジェルトング(jelutong)、ゴムラテックス、ビニライト樹脂、その他が示される、温かいガムベース中に混ぜこむかまたはガムベースの外部表面にコーティングするなどによって、トローチ、またはチューインガム、あるいはその他の製品中に組み込むことができる。
本発明の別の重要な形態は、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)に対して特異的な免疫応答を誘発するために使用する、４つの抗原および好適なアジュバントおよび／または担体を基礎とする組成物である。これは、例えば鼻噴霧、経口、または注射などの多数の経路によって送り込まれて、この抗原に対する特異的な免疫応答を生成させ、それによってＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)のコロニー形成を減少させ、そして毒性を減少させ、それによって疾病を予防することができる。容易に理解されるように、この組成物は、適当なベクター中に組み込み、このベクターを含有する好適な形質転換宿主[例えば大腸菌，バシルス・スブチルス、サッカロミセス・セレビシエ、COS細胞，CHO細胞およびHeLa細胞]中で発現させた組換え抗原を基礎とするものでもよい。全Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)細胞またはこれまでに調製されたその他の抗原とは異なって、本明細書に記載する抗原、またはペプチド、オリゴペプチド若しくはキメラペプチドは、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)が関係する歯周病の予防用のワクチンを調製するための安全で有効な抗原である。本発明の抗原タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドおよびキメラペプチドは本明細書中で説明する組換えＤＮＡ法を使用して製造することができ、あるいは本発明で開示されたアミノ酸配列から化学的に合成することができる。その他、精製した抗原の酵素的または化学的切断によって、ペプチドを製造することができる。歯周病予防において、各種のワクチン製剤中の免疫原として、免疫原性エピトープと組み合わせた抗原タンパク質、ペプチドおよびオリゴペプチドを使用することができる。その他、歯周病およびＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)に起因する感染症に対する受動免疫に有用なＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗血清を産生させるため、本発明にしたがって製造された抗原タンパク質および関連するペプチドまたはキメラを使用することもできる。抗原自体を使用して免疫応答を誘発するのとは対照的に、抗原の１つまたは断片(群)を含有するエピトープをコードする配列を含むＤＮＡ分子の投与によってこれを達成することができる。
本発明はさらに、これらの抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、および単離した遺伝子から導かれるアミノ酸配列を提供する。本発明の特に好ましい１態様にしたがって、組換えＤＮＡ技術を使用し、抗原をコードする遺伝子または免疫原性エピトープを有する１以上のペプチド若しくはキメラをコードする遺伝子断片をある発現ベクター中に組み込み、その組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、それによってその特定の宿主細胞中でこれらの配列の発現を導く。宿主細胞に導入した組換えベクターを含む発現系を以下のように使用することができる(ａ)抗原タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを製造し、精製してワクチン製剤の免疫原として使用する；(ｂ)抗原タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを製造し、診断用イムノアッセイのための抗原として使用するかまたは治療および／もしくは診断用の価値のあるＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)特異性抗血清の産生のための抗原として使用する；(ｃ)あるいは、組換え発現ベクターがワクシニアウイルスなどの生ウイルスの場合、ベクター自体を抗原タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラの発現のために宿主細胞に導入する生または不活化ワクチン製剤として使用することもできる；(ｄ)生弱毒化細菌細胞または遺伝子加工した共生口内細菌中に導入し、個体に免疫を与えるためにこれを使用して抗原タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを発現させる；(ｅ)あるいは、直接個体に導入して、コードされ発現した抗原タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラに対して免疫感作させる。ワクチンが動物の歯周病を予防するものである場合、特に組換え細菌ワクチンはヒト口腔または動物の共生常在菌を基礎とすることができる。抗原を発現する組換え細菌ワクチンを使用して口腔、歯肉上または歯肉下プラークにコロニー形成させることができる。歯周炎の患者から口内細菌を単離し、抗原、ペプチドまたはキメラを発現するように遺伝子操作することができる。口腔内でのＰ．ジンジバリス(P. gingivalis)抗原の生成は口内粘膜組織に対して毒性とはならない。しかし、発現した抗原は粘膜に連結するリンパ組織(MALT)を刺激して、Ｐ．ジンジバリス(P. gingivalis)の毒性を中和および減少させる特異的抗体を生成させる。
以下の例は本発明の性質をさらに説明するものであるが、本発明はこれらに限定されるものではないと理解されるべきである。本文および添付する請求の範囲に記載するすべての量およびパーセントは特に示さないかぎり、重量である。
実施例１
抗原1の調製
Ag1の抽出および精製
O.D.-650nm 0.18の時期のP.gingivalisの細胞を、4℃で20分間の5,000×gの遠心分離によって回収した。この細胞ペレットを最初の培養液１リットル当たり緩衝液Ａ(50mM NaCl，10mM Tris，10mM EDTA，pH8.0)50mlおよび当初の培養液1L当たり10mlのクロロホルムとともに室温で15分間緩やかに振盪しながらインキュベートした。サンプルを6,000×gで20分間遠心分離して相を分離させた。水性相を取り出して、さらに10,000×gで30分間遠心分離して、混入している細胞の砕片を除去した。FPLCTM System(Pharmacia)を使用して4℃でQセファロースアニオン交換クロマトグラフィーカラム(XK16/10)にかける前に、上清を0.22μmフィルターを通過させた。10mM Tris，10mM EDTA，pH8.0中50mM NaClから500mM NaClの直線勾配を使用し、2ml/分で180分かけて、タンパク質をカラムから溶離させた。溶出液を280nmでモニターした。6mL画分ずつ回収し、これらをSDS-PAGEおよび健康な被験者の血清を使用したELISAによって分析し、抗原性を評価した。最も抗原性の強い画分を10,000 NMWCOセントリコン濃縮機で200μlに濃縮した後、Superose 12(Pharmacia)サイズ排除カラムにかけた。
150mM NaCl，20mM Tris，10mM EDTA，pH8.0中でサイズ排除カラムを平衡化し、0.3mL/分で分離を実施した。得られたサンプルのピークのサイズを比較するため、タンパク質標準物質についても実施した。溶出液を280nmでモニターした。500μl画分ずつ回収し、これらをSDS-PAGEおよびELISAによって分析した。60kDaの溶出ピークが、P.gingivalisを保有するが歯周炎の兆候は示していない被験者からの血清に対して抗原性であることがわかった。この画分を逆相クロマトグラフィーによってさらに精製した。
C8RP300カラム(Applied Biosystems)および0.1％ TFA中の0％-80％アセトニトリルの直線勾配を使用して、逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)を40分にわたって実施した。SDS-PAGE分析でＭrが28kDaの単一バンドを含有する単一のピークが溶出した。Hewlett Packard 1005A自動タンパク質シークエンサーを使用するN-末端配列分析によって、このピークを特性決定した。
この配列分析から、この抗原はおそらくP.gingivalisのヘム受容体と考えられ、以下のN-末端アミノ酸配列を有する。
DLENKGEATLLVTFGSSYKAPRETYAKIEKTFAAAYPDQR
SDS-PAGE分析
12％分離用ゲルおよび4％濃縮用ゲルで、不連続系を使用してSDS-PAGE分析を実施した。サンプル緩衝液に4％SDSおよび70mMβ-メルカプトエタノールを含ませた。サイズの比較のため、各ゲルにタンパク質標準物質を含ませた。色素の先端部が濃縮用ゲルの底部近くに達するまで、ランニング緩衝液中のサンプルを160ボルトの定電圧で送り込んだ。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーR-250mで可視化し、水中40％MeOH，7％HACで脱色した。
ウエスタンブロット分析
歯周病の被験者(D50)およびＤＮＡ分析によって歯肉下にP.gingivalisを保有することが示された健康な被験者(H10)からの血清抗体によって認識されたタンパク質を同定するために、ウエスタンブロットを実施した。転移の完結を判定することができるように、前染色した標準物質(BioRad)を含有させた以外は、上記のSDS-PAGE操作にしたがって、ブロットすべきタンパク質を分離した。SDS-PAGE後、ゲル装置部を取り外し、ゲル、PVDF膜(ProBlott，Applied Biosystems)、ブロット用紙およびファイバーパッドを転移用緩衝液(10％CAPS，10％MeOH)で５分間平衡化した。60ボルトの定電圧で90分間、SDS-PAGEゲル内のタンパク質をPVDF膜に転移させた。転移後、PVDF膜を5％脱脂粉乳で室温で１時間ブロックした。その後、膜を一次抗体(TN緩衝液(25mM Tris，0.5M NaCl，pH7.5)中のヒト血清H10 1/10またはD50 1/50希釈物)とともに4℃で一晩インキュベートした。膜をTN緩衝液中で10分ずつ３回洗浄し、次に二次抗体(TN緩衝液で1/1000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと複合体化したヤギ抗ヒトIgG)とともに室温で２時間インキュベートした。再び膜をTN緩衝液中で10分ずつ３回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGの抗原性タンパク質への結合を4-クロロ-1-ナフトール6mg、MeOH 2mL、TN緩衝液10mLおよびH2O2 6μlで可視化した。酵素反応を水で停止させた。
ウエスタンブロット分析によって、28kDa抗原は健康な被験者(H10)によって認識されるが歯周炎に罹患した患者(D50)によっては認識されないことが示された。
ELISA
歯周病の被験者(D50)およびＤＮＡ分析によって歯肉下にP.gingivalisを保有することが示された健康な被験者(H10)からの血清抗体を使用して、ELISAを実施した。50mM Tris，200mM NaCl，pH7.4(TBS)で希釈した28kDaタンパク質または陰性対照としての2％ w/v脱脂粉乳でマイクロタイタープレートをコーティングした。0.05％ Tween-20を含有するTBS(TBST)および2％ w/v脱脂粉乳の添加によってプレートをブロックした。ウェルをTBSTで３回洗浄し、次に2％ w/vポリビニル−ピロリドン-40および1％ w/vＮＧＳを含有するTBST(抗体希釈用緩衝液、ADB)で1／50に希釈したヒト血清とともに室温で２時間インキュベートした。ウェルをTBSTで３回洗浄し、次にADBで1／3000に希釈したヤギ抗ヒトIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼとともに室温で２時間インキュベートした。抗ヒトIg-HRPのP.gingivalis細胞表面タンパク質への結合を、0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液pH6.0で1：100に希釈したジメチルスルホキシドおよび0.004％ w/v H2O2に溶解させた10mg/mL 3,3’,4,4’テトラメチルベンジジンで可視化した。2M H2SO4によって酵素反応を停止させ、450nmでの吸光度の測定によって、反応生成物の呈色強度を分光光度計で定量した。
ELISAによって、28kDa抗原はP.gingivalisを保有する健康な被験者(H10)によって認識されるが歯周炎に罹患した患者(D50)によっては認識されないことが示された。
実施例２
Ag1遺伝子のクローニングおよび配列分析
28kDa抗原(Ag1)のN-末端配列から誘導した縮重オリゴヌクレオチドプローブを使用して、BamHIで消化したP.gingivalisゲノムＤＮＡのλGEM 12ライブラリーをスクリーニングした。プローブ陽性クローンを同定したところ、4.6kbpのP.gingivalisゲノムＤＮＡインサートを含んでいた。このインサートをフェノール抽出によって精製し、pUC18中にサブクローン化した。この遺伝子のＤＮＡ配列は、オープンリーディングフレームが予測質量32,709のタンパク質をコードすることがわかった。サンガージデオキシ法を使用して配列を決定し、そのヌクレオチド配列およびこれから推定したAg1のアミノ酸配列を図１に示す。推定したアミノ酸配列は分子量32,709のタンパク質を示している。
実施例３
Ag1遺伝子を使用したＤＮＡワクチンの構築
PCRによる32kDa抗原(Ag1)をコードする遺伝子の増幅のための鋳型として、4.6kbpのP.gingivalis ＤＮＡを含有するプラスミドを使用した。以下の配列を有する特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCRを実施した。
N-末端
0004358909.tif 000003
C-末端
0004358909.tif 000004
PCR混合物の内容：鋳型ＤＮＡ 100ng，MgCl2：1mM，オリゴＡ：800ng，オリゴＢ：800ng，250mM dNTP，3U Ultma ポリメラーゼ(Perkin Elmer)。
熱サイクルの内容：変性：94℃，30s，アニーリング：52℃，30s，および伸長：70℃，60s。
特定のオリゴヌクレオチドプローブを使用したサザンブロット分析によって、正しいアンプリコンが確認された。このバンドを1.0％アガロースゲルからフェノール抽出によって精製した。増幅した断片をSma 1でpUC18中に平滑末端連結し、配列分析によって、抗原１の完全長配列をコードする遺伝子(Ag1)の存在が確認された。次にこの遺伝子をpcＤＮＡ３(Invitrogen)中にサブクローン化した。このクローンは完全長Ag1遺伝子(949塩基対)を含有していた。精製pcＤＮＡ３(Invitrogen)プラスミド約2μgおよびpUC18クローン2.2からのＤＮＡをMulticore緩衝液(Promega)中のHindIII(Promega)およびEcoRI(Promega)制限酵素で、37℃で１時間消化した。消化したプラスミドＤＮＡを1％Nusieve低融解アガロースに通し、P.gingivalis挿入ＤＮＡをゲルから切り取り、Bresacleanキット(Bresatech)を使用し、製造元の取扱説明書にしたがって、精製した。精製した挿入ＤＮＡをTE緩衝液20μl中に再懸濁させた。T4リガーゼ(Promega)を使用し、通常の技術によって、室温で２時間で、切断したpcＤＮＡベクター中にpUCクローンからの精製挿入ＤＮＡを連結した。アンピシリンを含有するアガープレート上に播種したTop10F’E.coli細胞(Invitrogen)中に、連結したpcＤＮＡ３を転移させた。生成したクローンを培養液3ml中に拡散させ、プラスミドを精製し、制限酵素消化および1％アガロースゲル上の電気泳動によって、適当なサイズに切断された断片のインサートをスクリーニングした。
正しい挿入サイズを示すクローンを選択し、挿入が正しいことを確認するため、さらに制限酵素消化物を調製した。これは、制限酵素HindIII単独、HindIIIおよびEcoRIの両方、およびNdeI単独でのクローンの消化で構成された。１つのクローンとして完全長Ag1遺伝子を含有する5.1を選択した。Sp6およびT7普遍プライマーを使用し、通常の手法にしたがう部分ＤＮＡ配列分析によって、このクローンを確認した。5’および3’末端のＤＮＡ配列分析によって、クローン5.1中のpcＤＮＡ３-Ag1構築物の同定を確認した。これらは以下の通りである。
N-末端
0004358909.tif 000005
C-末端
0004358909.tif 000006
クローン5.1から、そしてインサートを含まないpcＤＮＡ3からもプラスミドＤＮＡの大スケール(1L)調製物を製造した。150μg/mlアンピシリンを含有するTerrificブロス中で増殖させたTop10F’E.coliの一晩培養物からプラスミドＤＮＡを精製するため、Qiagen Mega Prepsを使用した。ＤＮＡの挿入サイズおよび精製度を確認するため、制限酵素分析によって精製プラスミドＤＮＡをチェックした。280nm／260nmでの吸光度を測定することによって、ＤＮＡ／ＲＮＡの濃度を分光測光法によって計算した。
インサート(5.1)を含むpcＤＮＡ3-Ag1およびpcＤＮＡ3(インサートを含まない)からの精製プラスミドＤＮＡを無菌水中0.9％ NaCl中に希釈して動物への注入用の0.5mg/mlＤＮＡとした。
実施例４
マウス病変モデルにおけるP.gingivalisのチャレンジを防御するAg1 ＤＮＡワクチン構築物の能力
マウス10匹に上記のAg1遺伝子を含有するpcＤＮＡ3-Ag1構築物を投与し(試験グループ)、別のマウス10匹にpcＤＮＡ3ベクターを投与した(対照グループ)。6週令の雌Balb/cマウス20匹の各脛筋肉内にＤＮＡ25μg(合計ＤＮＡ50μg／マウス)を注射した。この１ヵ月後に、各脛筋肉内にＤＮＡ25μgを追加した。これらのマウスの背中の尾の付け根から約3.5cmの皮下に、P.gingivalis W50 3.4×109cfuをチャレンジした。これらのマウスの体重減少、病変サイズおよび挙動を14日間、毎日モニターした。この期間の最終日に、14日間で20％以上体重減少したマウスを殺した。屠殺時に、心臓穿刺によって採取した血液から血清を調製した。各マウスについて14日間、毎日病変サイズデータを取った。これらを図２に示す。２つの(試験および対照)グループについての病変サイズをANOVA(単一因子)およびMann-Whitney非パラメーター統計テストによって分析した。これによれば、両テストを使用したとき、試験および対照グループ間の病変サイズの差は有意(p＝0.027およびp＝0.019)であった。これらの結果によって、Ag1遺伝子を含有するＤＮＡワクチン構築物はP.gingivalis W50でのチャレンジに対してマウスを保護することが示された。
実施例５
抗原1のC-末端領域に相当する合成ペプチドの免疫原性
予測されるB-細胞エピトープの存在を基礎として、Ag1のC-末端に相当する次のペプチド、CIRNIWLKHMKATSARを調製した。ジフテリアトキソイドと複合体化したこの16merペプチドでの免疫感作によって、オランダウサギ2匹およびニュージーランド白ウサギ１匹中にポリクローナル抗血清を生起させた。
TBS(50mM Tris，200mM NaCl，pH7.4)に溶解し、同容量のフロイント不完全アジュバントで乳化したペプチド78μgでウサギを免疫した。背中の４ヵ所にこの調製物を皮下注射した。４週間後、これを繰り返し、２週間後、試験用に採血し、ビオチン化形態のこのペプチドに対するELISAによって、血清の応答を観察した。２週間後、同一の操作法を使用して、ウサギを再度免疫した。最終免疫後２週間目に、心臓穿刺によってウサギから採血し、ELISAおよびウエスタンブロットによって血清の応答を判定した。
ビオチン化16merに対するポリクローナル抗血清を使用して、ELISAを実施した。マイクロタイタープレートを2.54μg/mLストレプトアビジンでコーティングした。ウェルをTBS(50mM TrisＨCl pH7.4，200mM NaCl)で３回洗浄し、TBSで希釈したビオチン複合体化ペプチド0.2μg/mLとともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを0.05％ v/v Tween-20を含有するTBS(TBST)で３回洗浄し、室温で１時間、2％ w/v脱脂粉乳でブロックした。ウェルをTBSTで３回洗浄し、抗体希釈用緩衝液(Antibody Diluting Buffer)(ADB)[2％ w/v脱脂粉乳を含有するTBST]での1／100希釈物からの５倍希釈ポリクローナル抗血清とともに室温で２時間インキュベートした。ウェルをTBSTで３回洗浄し、ADBで1／3000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化ヤギ抗ウサギIgGとともに室温で２時間インキュベートした。ウェルをTBSTで３回洗浄し、P.gingivalisへの抗血清の結合を上記のように可視化した。特異的応答が証明され、これによって特異的抗ペプチド抗体が産生されたことが示された。P.gingivalis細胞表面タンパク質を使用して実施したELISAでも特異的応答が生成し、このペプチドがP.gingivalisの細胞表面抗原１を認識することができる抗体を産生したことが示された。
この抗ペプチド抗体によって認識されたP.gingivalis細胞表面抽出物の成分を同定するために、ウエスタンブロットを実施した。P.gingivalis細胞表面抽出物のSDS-PAGE後、タンパク質をPVDF膜に転移させ、前述のようにブロックした。膜をTN緩衝液中の抗血清の1／100希釈物とともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をTN緩衝液中で３回洗浄し、TN緩衝液で1／1000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと複合体化したヤギ抗ウサギIgGとともに室温で２時間インキュベートした。膜をTN緩衝液中で３回洗浄し、血清抗体のP.gingivalis細胞表面タンパク質抽出物の成分への結合を上記のように可視化した。30，33.9，37，40.1，45.9，48.8，51.8，56.8および60.3kDaのはしご状のバンドが得られた。
これらの結果によって、この抗ペプチド抗体がP.gingivalisの抗原1を特異的に認識することが示され、また抗原が多分LPSと結合した多様な形態でP.gingivalisの表面に存在することが示された。
実施例６
抗原2，3および4(Ag2，Ag3およびAg4)の調製
P.gingivalis W50を溶解ウマ血液アガー上および1μg/mlヘミンを含有する改変BM培地中、37℃で嫌気的に増殖させた。細菌を定期的継代培養(＜10継代)によって溶菌ウマ血液プレート上に維持し、これを使用してバッチ培養物に接種した。分光光度計(295E,Perkin-Elmer)を使用して、650nmで、脳心臓浸出液培地中でのバッチ培養物の増殖をモニターした。グラム染色、顕微鏡試験、および各種の生化学的試験を使用して、培養物の純度を定期的にチェックした。原液を凍結乾燥培養物として維持した。P.gingivalisの培養物を後期対数期まで増殖させ、遠心分離(5,000×g，20分，4℃)によって細胞を回収した。細胞ペレットにクロロホルムを添加し、緩やかに混合した後、懸濁液を室温で15分放置した。クロロホルム処理後、50mM NaClを含有するTMC緩衝液[20mM Tris-ＨCl pH8.0，50mM 2-メルカプトエタノールおよび5mM CaCl2]を添加し、緩やかに混合した。混合物を遠心分離(100,000×g，30分，4℃)し、アニオン交換FPLCの前に、上清を濾過(0.22μm)した。このクロロホルム抽出物を、50mlスーパーループ(Pharmacia-LKB)を使用する多重注入で、4℃に冷却したアニオン交換カラム(Hiload XK 16/10 Ｑセファロース、Pharmacia-LKB)にかけた。0-100％緩衝液Ｂの直線勾配を使用し、90分でサンプルを溶離させた。溶出液を280nmでモニターし、回収した。緩衝液Ａは50mM NaClを含有するTMC緩衝液であり、緩衝液Ｂは500mM NaClを含有するTMC緩衝液である。アニオン交換画分を洗浄し、次に150mM NaClを含有するTMC緩衝液中で濃縮した。次に、150mM NaClを含有するTMC緩衝液を使用して、画分をゲル濾過カラム(Superose 12)にかけた。溶出液を280nmでモニターし、ピークを回収した。高分子量および低分子量ゲル濾過標準(Pharmacia-LKB)を使用して、溶出ピークのＭr値を測定した。次に、回収したピークをＣ8RP-300 Brownleeカラムを使用する逆相(RP)HPLCにかけ、アセトニトリル勾配で溶出させた。標準物質としてBSAを用いるBradfordタンパク質アッセイ(BioRad)を使用して、画分および精製サンプルのタンパク質濃度を測定した。SDS-PAGE、およびＤＮＡプローブ分析によって歯肉下にP.gingivalisを有することが示された被験者からの血清を使用するウエスタンブロッティングによって、クロマトグラフィー画分および精製タンパク質を分析した。血清H10は歯肉下にP.gingivalisを保有するが歯周病の臨床的兆候は示さない被験者からのものである。血清D50は歯肉下プラークサンプル中にP.gingivalisを保有する歯周炎患者からのものである。アニオン交換、ゲル濾過および逆相HPLCからのクロマトグラフィー画分のELISAおよびウエスタンブロット分析の組合せから、H10血清によって認識されるがD50血清によってはわずかに認識されるだけかまたは全然認識されない３つの精製抗体が同定された。
第１の抗原は以下のN-末端アミノ酸配列を有する30kDaタンパク質である：
DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAED。
この抗原は分子量が約46kDaのさらに大きなタンパク質(下記参照)の断片であり、配列相同性から、P.gingivalisの推定上のフィンブリエサブユニット(fimbrial subunit)タンパク質またはアドヘジンである。
第２の抗原は以下のN-末端アミノ酸配列を有する30kDaタンパク質である：
DVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTYLIDANTTIPKLK。
この抗原は、配列相同性から、P.gingivalis 70kDa DnaK相同体のC-末端断片である。
H10血清によって認識された第３の抗原は分子量が約10kDaであり、以下のN-末端アミノ酸配列を有する。
VYNASISAVGNTSAIDPVVQIIHHN
配列相同性から、このタンパク質はP.gingivalisのS-層タンパク質であると想定される。
実施例７
Porphyromonas gingivalisのAg3(DnaK)をコードする遺伝子のクローニングおよび配列分析
Ag3のアミノアシル配列から誘導したオリゴヌクレオチドの混合物を使用して、バクテリオファージベクターλGEM 12中に構築した部分的BamHI P.gingivalisゲノムライブラリー(W50菌株)をスクリーニングした。Ag3のための精製タンパク質配列のセグメント、70kDa DnaK相同体GIETMGG用に製造された縮重オリゴヌクレオチドプローブの混合物とのin situハイブリダイゼーションによって、ゲノムライブラリーをスクリーニングした。
6×SSC，5×Denhardt溶液、ニシン精子ＤＮＡ 50μg，1％SDS，pH7.0中、39℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。フィルターを2×SSC，0.1％SDS中39℃で洗浄し、-80℃で一晩Amersham Ｘ-ray Hyperfilmに暴露した。プレートライゼート法(AmershamのｃＤＮＡ Cloning System-λgtプロトコルブックレット参照)によって、単一陽性ファージクローンからバクテリオファージＤＮＡを調製した。陽性ハイブリダイズした制限断片をプラスミドpUC18中にサブクローン化した。次に、ジデオキシ−鎖終結法を使用する配列用鋳型として、二重鎖プラスミドＤＮＡを使用した(BresatecおよびUSBよりキットを入手した)。
Ag3をコードするヌクレオチド配列を含有するクローン(DnaKクローン＃6)を単離し、Australian Goverment Analytical Laboratoryに受け付け番号NM/04974で寄託した。
実施例８
抗原2の内部配列(フィンブリエペプチド(fimbrial peptide))に相当する合成ペプチドの免疫原性
Porphyromonas gingivalis W50菌株からの抗原2(フィンブリエタンパク質)中のペプチドH-DNPDENPLEGDITQTHTEKYVLAEDC-NH2(DNP-EDC)を合成し、6-マレイミドカプロン酸アシルN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して破傷風トキソイド(TT)とチオエステル結合を形成させて連結した。不完全フロイントアジュバントで乳化したこのタンパク質担体と連結したペプチド100mgをオランダ白ウサギの４ヵ所に皮下接種した。最初の注射後35日目に、第２次投与量をウサギに接種した。第１接種から10日目および84日目に、ウサギの耳の周縁部静脈から採血した。次に回収したウサギ血清をELISAおよびウエスタンブロット分析に使用した。
固相酵素免疫検定法(ELISA)によるフィンブリエペプチド特異的抗体の検出
TBS中のフィンブリエペプチド溶液(5μg ml-1のペプチド50μl)を使用して、加湿雰囲気中、室温で一晩、平底ポリビニルマイクロタイタープレート(Microtiter,Dynatech Laboratories,VA.,U.S.A.)のウェルをコーティングした。コーテイング溶液を除去した後、0.05％ Tween 20を含有するTBS(TBST)中の1％ゼラチン溶液(250μl)を添加して、コーティングされないで残っているプラスチックをブロックした。37℃で1.5時間後、プレートをTBSTで４回洗浄した。0.5％ゼラチンを含有するTBS中の適切な抗体の1:100希釈物を調製し、プレート全体にわたって(across the plate)連続希釈し、加湿雰囲気中、37℃で３時間インキュベートした。プレートを６回洗浄(TBST)し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)−抗ウサギIgヤギイムノグロブリン(Ig)(BioRad,USA)の1/4000希釈物50μlを添加した。37℃で1.5時間後、プレートを６回洗浄(TBST)することによって、遊離の抗体−HRPO複合体を除去した。基質(DMSO中の49mMテトラメチルベンジジンを0.01％、およびH2O2を0.004％含有する0.1M酢酸緩衝液pH6)100μlの添加によって、結合抗体を検出した。2M H2SO4の添加によって、呈色反応を停止させた。BioRadプレートリーダー(BioRad,USA)を使用して455nmでの光学密度(O.D.)を測定した。
DNP-EDC-複合体に対して生起した抗血清のDNP-EDCペプチドを結合したプレートへの結合を評価した。免疫前の血清はフィンブリエペプチドに結合しなかったが、DNP-EDC-複合体で免疫したウサギからの抗血清は高力価の抗ペプチド抗体を誘導した。これは、ペプチド配列DNP-EDC内に１以上のB-細胞エピトープが存在することを意味している。
抗DNP-EDC(フィンブリエペプチド)抗体でプローブしたP.gingivalis W50菌株細胞の音波処理物のウエスタンブロット分析
低分子量標準物質(Amrad-Pharmacia,Australia)、予備染色低分子量標準物質(BioRad,USA)およびPorphyromonas gingivalis W50細胞音波処理物(20μg)を含有するSDS-ポリアクリルアミドゲルを調製し、以下の手法を使用してProBlott(ABI,USA)上に転移させた。ProBlottをメタノールで2,3秒湿潤させ、エレクトロブロッティング用緩衝液(10％メタノールを含有する10mM 3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸,pH11)を含有するトレーに入れた。Porphyromonas gingivalis W50細胞音波処理物のSDS-ポリアクリルアミドゲルもエレクトロブロッティング用緩衝液に５分間浸漬した。これらからトランスブロット用サンドイッチを形成し、60ボルトの定電圧で90分間エレクトロブロットした。ProBlottを取り出し、染色の前にmilli-Q水でリンスした。このProBlottをメタノールに2,3秒浸漬し、1％酢酸を含有する40％水性メタノール中0.1％クーマシーブルーR-250で標準物質を染色した。このProBlottを50％水性メタノールで脱色し、milli-Q水でリンスした。非特異的結合を防止するため、このProBlottを0.5M NaCl中の25mM Tris／ＨCl，pH7.5(TN緩衝液)中の5％(w/v)脱脂粉乳中に４℃で一晩浸漬した。ウエスタンブロットをTN緩衝液中の抗血清の1/200希釈物とともに室温で２時間インキュベートした。次に、0.1％トリトンX-100を含有するTN緩衝液(TNT緩衝液)でウエスタンブロットを４回洗浄し、TN緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化ヤギ抗ウサギIgG(BioRad,USA)の1/2000希釈物とともに１時間インキュベートした。次にこのウエスタンブロットをTNT緩衝液で４回洗浄し、タンパク質バンドをTN緩衝液中0.05％4-クロロ-1-ナフトール、16.5％氷冷メタノールおよび0.05％ H2O2で検出した。発色を脱イオン水で停止させ、２枚の濾紙の間でウエスタンブロットを空気乾燥した。
フィンブリエペプチド複合体に対して生起した抗血清を使用する免疫染色によって、P.gingivalisからの完全なフィンブリエタンパク質(アドヘジン)が検出された。分子量41および46kDaの２つのバンドのみが検出された。このことは、P.gingivalis W50の完全フィンブリエタンパク質(アドヘジン)が分子量46kDaであり、41kDaバンドは46kDaタンパク質の先端が切り取られた形態であることを示唆している。
実施例９
抗体の調製
ウマ、ウサギ、ヒツジまたは乳牛をAg(1-4)で免疫することによつて、血清抗体を得ることができる。
免疫感作は標準的手法を使用して実施する。初回免疫感作は抗原およびフロイント不完全アジュバントの混合物を使用する。標準的手法を使用して、動物の血清またはミルクから抗体を回収することができる。
実施例10
この実施例では、抗原またはそれらの部分をコードするヌクレオチド配列をファージベクターを含む各種のベクターおよびプラスミド中に挿入して発現させることができることを説明している。タンパク質およびペプチドがうまく発現するためには、遺伝子若しくは遺伝子断片を含むインサート、またはベクター自身のいずれかが、発現のために使用される特定の宿主システムに適合し、そしてこれによって認識される、転写および翻訳に必要なエレメントを含有しなければならない。ここに説明する方法および配列を使用して、抗原、関連ペプチド若しくはオリゴペプチド、またはキメラペプチドをコードするＤＮＡを合成または単離して、配列決定することができる。抗原、関連ペプチド若しくはオリゴペプチド、またはキメラを発現させるためには、種々の宿主システムを利用することができる。これらとして、限定するわけではないが、バクテリオファージベクター、プラスミドベクターまたはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌；酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；およびプラスミド若しくはウイルス発現ベクターをトランスフェクトした、または組換えウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスその他)を感染させた哺乳動物細胞系が含まれる。
上記の方法を含む、分子生物学分野で既知の方法を使用して、ベクターあるいは抗原のアミノ酸配列、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラをコードするＤＮＡ配列中に各種のプロモーターおよびエンハンサーを組み込んで、抗原アミノ酸配列の発現を増強させることができる。ただし、これはそのアミノ酸配列の増強された発現が、使用する特定の宿主細胞系に適合性(例えば非毒性)である場合である。すなわち重要なことは、ＤＮＡ配列を抗原をコードする遺伝子、またはそのタンパク質の機能性エピトープをコードする遺伝子セグメント若しくはセグメントの組合せで構成することができる。さらに、改良されたワクチン組成物として使用するため、このＤＮＡを他の細菌の外膜タンパク質、または別の細菌、真菌、寄生虫若しくはウイルスの抗原などの別の抗原をコードするＤＮＡと融合させて、遺伝子融合した(共通のペプチド骨格を共有する)多能性抗原を作製することができる。プロモーターの選択は使用する発現系によって決まる。プロモーターは強度、すなわち転写を促進する能力において異なっている。一般的に、クローン化した遺伝子を発現させる目的のためには、高レベルの遺伝子の転写および遺伝子産物の発現を得るため、強力なプロモーターを使用することが望ましい。例えば、E.coliを含む宿主細胞系において高レベルの転写が観察された、当業界で既知の細菌、ファージ、またはプラスミドプロモーターとして、lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、ＰRおよびＰLプロモーター、LacUV5，ompF，bla，lppなどが含まれる。これらを使用して、抗原アミノ酸配列をコードする挿入されたＤＮＡ配列の転写を提供することができる。
その他、抗原、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラが宿主細胞に対して致死性または障害性である場合は、特異的に誘導されるまではプロモーターの作用が阻害されるような宿主細胞株／系および発現ベクターを選択することができる。例えば、ある種のオペロンにおいては、挿入ＤＮＡの効果的な転写のために特定のインデューサーの添加が必要である(例えば、lacオペロンはラクトースまたはイソプロピルチオ−ベータ-D-ガラクトシドの添加によって誘導される)。trpオペロンなどの各種のオペロンは異なる調節機構下にある。trpオペロンは増殖培地にトリプトファンが欠如しているときに誘導される。ＰLプロモーターは温度感受性ラムダリプレッサーを含有する宿主細胞の温度の上昇によって誘導することができる。このように、プロモーター特異的転写の95％以上が未誘導細胞中で阻害されるようである。こうして、抗原アミノ酸配列をコードする挿入されたＤＮＡからの発現を制御するプロモーターが誘導されないような条件下で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養し、細胞が増殖培地中で好適な密度に達したとき、挿入されたＤＮＡの発現のためにプロモーターが誘導されるようにすることによって、組換え抗原タンパク質、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラの発現を制御することができる。
効果的な遺伝子の転写またはメッセージの翻訳のためのその他の制御エレメントとしてエンハンサーおよび調節シグナルが含まれる。エンハンサー配列は、近傍の遺伝子に対する位置および方向には比較的無関係な様相で転写効果を増強することが明らかなＤＮＡエレメントである。こうして、使用する宿主細胞発現ベクター系に応じて、転写効率を増大させるため、抗原アミノ酸配列をコードする挿入ＤＮＡ配列の上流または下流のいずれかに、エンハンサーを置くことができる。この実施例ですでに説明したように、抗原および関連ペプチドまたはキメラをコードする遺伝子からの発現に影響を与えるその他の特異的調節配列が同定された。これらの、または転写若しくは翻訳開始シグナルなどの他の調節部位を使用して、抗原をコードする遺伝子またはそれらの遺伝子断片の発現を調節することができる。これらの調節エレメントは、ＤＮＡ配列の挿入について本明細書中に記載した組換えＤＮＡ法を使用して、抗原アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列または近辺のベクターＤＮＡ配列中に挿入することができる。
したがって、抗原、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラをコードする領域を含むP.gingivalisヌクレオチド配列を発現ベクターのプロモーター、制御および調節エレメントとの関連上特異的な部位に連結させて、組換えベクターが宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞中でP.gingivalis特異的ＤＮＡ配列が発現されるようにすることができる。例えば、それ自身の調節エレメントを含有している抗原特異的ＤＮＡ配列を発現ベクター中に、そのベクターのプロモーターおよび制御エレメントが２以上の抗原の同時発現を可能にする位置または方向で連結することができる。次に、この組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、宿主細胞を選別し、組換えベクターを含有する細胞についてスクリーニングする。選別およびスクリーニングは当分野で既知の方法で実施することができる。これには、プラスミド中に存在するマーカー遺伝子(例えば薬剤耐性マーカー)の発現の検出、特異的抗原に対して産生された抗血清を使用する特異的エピトープの生成についてのイムノスクリーニング、ならびに本明細書中に記載した１以上のオリゴヌクレオチドおよび方法を使用する抗原特異的ヌクレオチド配列についての宿主細胞のＤＮＡのプローブ(proving)、が含まれる。
コードされた抗原ペプチドまたはタンパク質の特性決定、改変および／または応用のため、遺伝子工学技術を使用することもできる。例えば、保護ドメイン外の領域でタンパク質を改変するための部位特異的突然変異は、そのサブ断片の安全性および溶解性を増加させて、より容易な精製および安全な使用を可能にするために望ましいことがある。さらに、遺伝子工学技術を使用して、抗原のアミノ酸配列の一部分をコードするＤＮＡ配列を産生させることができる。生成するペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラの免疫力を破壊しないように、制限酵素の選択を実施することができる。タンパク質の抗原部位のサイズは異なるが、約7から約14アミノ酸で構成させることができる。こうして、抗原タンパク質が多数の別個の抗原部位を含有することになる。したがって、多くの部分遺伝子配列が抗原エピトープをコードすることになる。このように、複数のエピトープを含有するように配列を構築して、抗原性が強いキメラペプチドまたはオリゴペプチドまたはタンパク質を産生する発現系において使用することができる。２以上のタンパク質またはペプチドの組合せの結果、免疫原性が増大することがある。抗原の組合せを使用する場合、これらの抗原は関連性がある(すなわち、同一の遺伝子配列または同一の生物からの密接に関係がある遺伝子からの)ものでもよい。あるいは、これらの抗原を関連性のある生物(すなわち、歯肉下プラーク中に存在する別の口内細菌)から、またはもっと離れた関係の生物から産生させてもよい。特に、抗原関連遺伝子および構築物を含有するベクターの宿主生物を口腔の共生常在菌、例えば、歯肉下プラーク、歯肉上プラークの常在菌、または口内粘膜に関係する細菌、とすることができる。口内共生細菌の例をあげると、Streptococcus種およびActinomyces種、例えばStreptococcus salivarius，Streptococcus sanguis，Streptococcus gordonii，Actinomyces naeslundiiである。これらの生物を歯周炎患者から単離し、その後P.gingivalis抗原、ペプチドまたはキメラを発現するように遺伝子操作することができる。抗原、ペプチドまたはキメラをコードするＤＮＡをこれらの口内共生細菌の細胞外タンパク質のリーダー配列をコードするＤＮＡに連結してもよい。抗原、ペプチドまたはキメラをコードするＤＮＡを細胞外タンパク質をコードするＤＮＡに連結またはこの中に挿入して、分泌融合タンパク質を生成させることもできる。抗原、ペプチドまたはキメラとの融合タンパク質を生成させるために使用ることができる細胞外タンパク質の例はグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)またはフルクトシルトランスフェラーゼ(FTF)である。次に、この組換え生物を患者の口腔に再度導入し、これが口内粘膜または歯でコロニー化すれば、P.gingivalis抗原、ペプチド、キメラまたは融合物を発現して、粘膜に連結するリンパ組織を刺激して、中和性抗体が生成される。
ある抗原をコードするＤＮＡ断片を別のＤＮＡ配列と融合させて、改善された発現および／または精製操作を可能にすることもできる(すなわち、ベクターpTrxFus中にクローン化したＤＮＡ配列をE.coliタンパク質、チオレドキシンとの融合物として発現させる)。この連結によって、融合タンパク質に、普通は不溶性または発現が困難なタンパク質を水溶性発現させるというチオレドキシンの特性が与えられる。精製後、エンテロキナーゼでの消化による全チオレドキシンの除去によって、本来のタンパク質を放出させる。その他、発現されたタンパク質またはペプチドが免疫原性がない場合は、免疫原性を増強させる別の配列との融合によって、抗原をハプテンとして使用することもできる。あるいは、ベクター中にクローン化される挿入ＤＮＡ配列がその遺伝子の本来のプロモーター配列を含有していてもよい。したがって、目的とするタンパク質またはペプチドの転写は、ベクター配列自体の中に含まれるプロモーターよりもインサート内に含まれるプロモーターによって主として誘導される。
記載するプラスミド発現系はInvitrogenのpUC-誘導pTrcHis発現ベクターを使用する。このベクターはTrcプロモーター(lacプロモーターの-10領域とともにTrpプロモーターの-35領域を含有)およびrrnB抗転写終結エレメントを存在させることによって、高レベルのＤＮＡ配列の発現が可能になる。このpTrcHisベクターはlacリプレッサータンパク質をコードするlaclq遺伝子のコピーをも含有する。したがって、組換えタンパク質／ペプチドは中期対数期まで増殖したE.coliに1mM IPTGを添加(抑制解除)することによって誘導される。ＤＮＡ断片をN-末端融合ペプチドをコードする配列の下流でこれを有するフレーム内に位置する多数のクローン化部位中に挿入する。N-末端融合ペプチドをコードする配列は(5’から3’へ)、ATG翻訳開始コドン、翻訳されるタンパク質中の金属結合ドメインとして機能する一連の6ヒスチジン残基、ファージT7の遺伝子10からの配列を安定化する転写物、およびエンテロキナーゼ切断認識配列、である。P.gingivalis抗原、ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターpTrcHisに連結する。非組換えベクターが再構築されるのを防止するため、仔ウシ腸ホスファターゼでこのベクターを前処理した。この連結混合物を使用し、熱ショック形質転換方法によって、E.coli TOP10株を形質転換させた。アンピシリン含有LB培地上で、組換えベクタープラスミドを保有する細胞を選別した。アンピシリン耐性コロニーから精製したプラスミドＤＮＡを、プローブとして抗原特異的オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ断片を使用するＤＮＡ制限分析およびハイブリダイゼーション手法によって、組換えインサートの存在について分析した。融合ペプチドの金属結合ドメインによって、Immobilised Metal Affinity Chromatographyによる組換えタンパク質の１段階精製が可能である。組換えプラスミドを保有する細胞の細胞培養物溶解液中の組換え抗原をProbondJ樹脂(Invitrogen)への高親和性結合によって精製する。ProbondJはポリヒスチジン結合ドメインを含有する組換えタンパク質を精製するために使用される、ニッケルが充填されたセファロース樹脂である。ProbondJ樹脂から、低pH緩衝液またはイミダゾール若しくはヒスチジンとの競合のいずれかによって、結合したタンパク質を溶離させる。次に、組換え発現したタンパク質のエンテロキナーゼによる消化によって、ポリヒスチジンリーダーペプチドを取り出すことができる。エンテロキナーゼは、目的とするタンパク質からポリ-Hisの尾部を切断することができるように、ベクター中のポリ-His親和性タグと多重クローン化部位との間に遺伝子工学的に挿入されたエンドペプチダーゼ認識配列を認識する。精製した組換え抗原を、その後、本明細書に記載する抗体、ワクチンの産生、ならびに診断アッセイ用製剤に使用することができる。
実施例11
P.gingivalisの検出のための分子診断アッセイにおける抗原特異的ヌクレオチド配列の使用方法
本明細書に記載された抗原をコードする遺伝子の保存性によって、本発明の核酸配列をP.gingivalis遺伝物質の検出のための分子診断アッセイにおいて使用することができる。特に、P.gingivalisからの核酸を増幅し、そして増幅した核酸を検出する際にプライマーおよび／またはプローブとして使用するために、抗原配列特異的オリゴヌクレオチドを合成することができる。分子生物学の最近の進歩によって、核酸配列の酵素による増幅について、いくつかの方法が提供されている。現在最も普通に使用される方法であるPCRTM(ポリメラーゼ連鎖反応、Cetus Corporation)にはプライマーとして既知の配列、Taqポリメラーゼの使用、および複製するデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)鎖を分離し、目的の遺伝子を指数的に増幅させる加熱サイクルが関与する。現在開発中の別の増幅方法として、ＤＮＡリガーゼおよび増幅すべきＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡセグメントの半分ずつの２つからなるプローブを利用するLCRTM(リガーゼ連鎖反応、BioTechnica International)；酵素QBレプリカーゼ(Gene-Trak Systems)および相補的ＲＮＡの指数的製造のためのＤＮＡ鋳型を作製するために使用する、コピーすべきＤＮＡに相補的なプローブに接続させたリボ核酸(ＲＮＡ)配列鋳型；ならびに増幅すべき核酸配列としてＲＮＡまたはＤＮＡ上で実施することができるＮＡＳＢＡTM(核酸配列基準増幅、Cangene Corporation)が含まれる。
１試料当たり103−104生物数に近い感度レベルで、生物試料中の特定の病原体を検出するため、特異的遺伝子配列とハイブリダイズすることができる核酸プローブを使用して成功した(1990,Gene probes for Bacteria,eds.Macario and deMacario,Academic Press)。特異的標的ＤＮＡ配列の増幅を可能にする方法と連結させることによって、種特異的核酸プローブは臨床試料中の生物の検出の感度レベルを非常に増強させることができる。これらのプローブの使用によって、前培養および／または通常の生化学的同定方法を必要とせずに直接の検出も可能である。本発明のこの態様は、本明細書に記載されたP.gingivalisの主要な抗原をコードする遺伝子の種特異的配列を増幅するプライマー、およびこれらの増幅されたＤＮＡ断片と特異的にハイブリダイズするプローブを目的としている。本発明の核酸配列を使用し、そして本発明の方法に従うことによって、10ug/mlの外来ＤＮＡが存在すれば、わずか１個のP.gingivalis生物を検出することもできる。
この態様は、歯肉下プラーク、痰、血液、膿瘍およびその他の液体を含む臨床試料から抽出したＤＮＡから、P.gingivalis ＤＮＡが存在する場合にこれを増幅し、増幅が生じた場合、続いてこれを判定するために使用することができる、種特異的オリゴヌクレオチドを目的としている。本発明の１態様において、一対のP.gingivalis特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、臨床試料から抽出したＤＮＡ中に存在するかも知れないP.gingivalisゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせ、酵素による合成および温度サイクルを使用して２つのフランキングプライマーの間のゲノムＤＮＡの特異的セグメントを増幅させる。プライマーの各対は本発明のP.gingivalisヌクレオチド配列とのみハイブリダイズするように設計され、その１つが二重鎖ＤＮＡの一方の鎖に相補性になるように合成されている。こうして、その反応はマイクログラムの量の異種ＤＮＡの存在下でも特異的である。この説明の目的のため、陽性(遺伝子)ＤＮＡ鎖の配列に由来するプライマーを「陽性プライマー」と命名し、陰性(相補性)鎖の配列に由来するプライマーを「陰性プライマー」と命名する。
ＤＮＡの増幅は市販のどの方法によっても実施することができる。例えば、ＤＮＡを増幅するため、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することができる。プライマーが標的ＤＮＡの反対鎖とハイブリダイズした後、温度を上昇させて、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによって２つのプライマー間にまたがる領域の特異的ＤＮＡセグメントの複製を起こさせる。その後、反応を熱サイクルさせて、各サイクルにおいて２つのプライマー間の配列を表すＤＮＡの量を２倍になるようにし、そしてP.gingivalisＤＮＡ配列が存在する場合には、これが特異的に増幅する結果となる。増幅したＤＮＡ断片を液体ハイブリダイゼーションによってP.gingivalisＤＮＡ由来のものとしてさらに同定を進めることもできる。この試験では、P.gingivalisＤＮＡの増幅されたセグメントと特異的にハイブリダイズするプローブとして、１以上の標識オリゴヌクレオチドを利用する。増幅された配列特異的ＤＮＡの有無の検出はオートラジオグラフィーでのゲル遅延アッセイなどの当分野で既知のいくつかの方法のいずれかを使用して実施することができる。このように、本発明のヌクレオチド配列はP.gingivalisの検出のための診断用キットにおける商業的用途があるオリゴヌクレオチドの合成の基礎を提供する。関連する１態様において、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを直接標識するかまたは標識を組み込むように合成することができる。使用する標識如何によって、その後、増幅された生成物を親和性マトリックスに結合させた後、同位体または比色検出を使用して検出することができる。
当分野で既知の方法を使用して、P.gingivalisを含有すると考えられる臨床試料からＤＮＡを抽出することができる。例えば、試料中の細胞をTE緩衝液中で洗浄し、遠心分離によってペレット化することができる。次に、界面活性剤およびプロテイナーゼKを含有する増幅反応用緩衝液100ulに細胞を再懸濁させる。ポリメラーゼ連鎖反応を使用する場合、生成サンプルを10mM Tris pH8.3，50mM ＫCl，1.5mM MgCl2，0.01％ゼラチン，0.45％NP40TM，0.045％ Tween 20TMおよび60ug/mlプロテイナーゼK中の細胞で構成する。サンプルを55℃湯浴中で１時間インキュベートする。インキュベート後、サンプルを95℃で10分インキュベートして、プロテイナーゼKを熱失活させる。その後、前記のようなポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルにしたがって、サンプルを増幅させることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅のためのいくつかのプロトコルのいずれを使用してもP.gingivalisＤＮＡを増幅することができる。この態様の１形式において、以下の条件を使用してP.gingivalisの臨床単離物からDnaKをコードする遺伝子を増幅することができる。増幅するＤＮＡ(ゲノムＤＮＡ 1μg)を0.5mlマイクロフュージ管に分注し、0.2mM dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，陽性および陰性オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ0.25ug，TaqIポリメラーゼ１単位、TaqI 10×緩衝液(5ul)、1mM MgCl2(最終濃度)、および総容量にするための無菌蒸留水を含む反応混合物を添加することによって、容量を50ulに調整する。TaqIポリメラーゼは使用の直前に反応混合物へ添加し、ボルテックスは使用しないで緩やかに混合する。各管に約2滴の鉱物油の層を添加し、その後管をサーマルサイクラー中に入れる。細菌ＤＮＡの増幅については、一般的に30から35サイクルで十分である。１サイクルは95℃で１分、37℃で１分、および72℃で１分からなる。最初のサイクルでは完全な変性を確実にするため、95℃で12分のインキュベートを含む。
プライマーまたはP.gingivalisのDnaKをコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブとして有用で、またＤＮＡの増幅および／または検出で使用するオリゴヌクレオチドは、本発明で開示されたヌクレオチド配列から当分野で既知の方法を使用して、生化学的に合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドのP.gingivalisに対する特異性を、それぞれ個別の配列について、ジーンバンク(genebank)データベース(Genbank)探索によって、チェックすることができる。一般的に、低G-C含量のオリゴヌクレオチドを選択すべきである。検出の目的のためには、本発明のオリゴヌクレオチドを放射性同位体で末端標識してもよい。遺伝子配列の増幅のために使用した２つのプライマーの内部のプローブ配列はT4ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ32Ｐ ATPを使用して末端標識してもよい。キナーゼ緩衝液(50mM Tris,pH7.6，10mM MgCl2，5mMジチオトレイトール，0.1mMスペルミジン-ＨCl，0.1mM EDTA，pH8.0)中のプローブＤＮＡ 20pmolとγ32Ｐ ATP 120uCiを混合し、37℃で１時間インキュベートする。室温でTris Borate EDTA(TBE)緩衝液中、200ボルトで１時間の8％アクリルアミドゲル処理で、標識されたプローブと取り込まれなかった標識とを分離する。まず、アクリルアミドゲルをＸ線フィルムに３分間露出することによって、標識されたプローブの位置を決める。次に、生成したオートラジオグラフをゲルの下に置き、標識プローブを含有するバンドをゲルから切り出す。このゲル切片を無菌蒸留水1ml中で粉砕し、37℃で一晩の振盪インキュベートによって、プローブを溶出させる。溶出したプローブをクロマトグラフィー分離用カラムを使用する遠心分離によって、ゲル断片から分離する。グラスファイバーフィルター上の標識プローブ1μlを液体シンチレーションによって計数することによって、プローブの放射活性を測定する。こうしたプローブ配列として、そのプローブ配列が本発明で開示された所望のヌクレオチド配列の増幅に使用される２つのプライマーの間にあるものであれば、本明細書に開示された配列のどれを選択してもよい。
本発明の組成物および方法に従う増幅された標的配列の検出を改良するため、当分野で既知の別法を使用してもよい。増幅されたＤＮＡ配列を液体ハイブリダイズ操作することによって、この配列の検出感度を改善させることができる。ゲル電気泳動ならびにサザンハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーと組み合わせたゲル電気泳動の他に、本発明の組成物および方法に使用することができる当分野で既知の別法として以下のものが含まれる：ゲル電気泳動と組み合わせた制限酵素消化：標識オリゴヌクレオチドプローブでのスロットブロット(slot-blot)ハイブリダイゼーション：放射性標識オリゴヌクレオチドプローブでの増幅：ゲル電気泳動、サザンハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーと組み合わせた放射性標識プライマーでの増幅：ドットブロットおよびオートラジオグラフィーと組み合わせた放射性標識プライマーでの増幅：親和性タグ群(例えばビオチンまたはビオチンを組み込んだプライマーおよびＤＮＡ結合タンパク質に特異的な配列を有する別のプライマー)を含有するオリゴヌクレオチドでの増幅、ならびにこれに続く親和性を基礎とするアッセイ(例えばELISA)での検出：ならびに発蛍光団(fluorophore)を含有するオリゴヌクレオチドでの増幅、およびこれに続く蛍光検出。
非同位体検出の１態様として、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーにビオチンを組み込むものが含まれる。プライマーの5’アミノ基をスルホ-NHS-ビオチンでビオチン化(biotinylate)するか、あるいはプライマーをビオチン標識dNTPの存在下で合成することによってプライマー中にビオチンを直接取り込ませることもできる。次に、臨床試料からのＤＮＡを増幅する際にこの非同位体標識プライマーを使用する。増幅された標的配列の存在または非存在についての検出は、アビジンを結合しているアフィニティーマトリックスを使用して増幅された標的配列を捕捉した後、その後の基質の変化にともなって複合体を可視化することができるような酵素を含有するアビジン複合体とともにインキュベートする。あるいは、対応する標的配列のプローブをマトリックス上に固定させておいて、増幅された標的配列をこのプローブとハイブリダイズさせることによって固定することができる。検出は、その後の基質の変化にともなって複合体を可視化することができるような酵素を含有するアビジン複合体を使用して実施することができる。
実施例12
診断イムノアッセイにおける抗原タンパク質、ペプチドまたはキメラペプチドの使用方法
本明細書に記載されたP.gingivalis抗原、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを、ワクチン製剤の免疫原として、そして治療用および／または診断用価値があるP.gingivalis特異的抗血清の診断アッセイまたはその産生のための抗原として使用するために、精製することができる。ある発現ベクター系から作成されたP.gingivalisからの抗原、あるいはオリゴペプチド若しくはペプチドまたはそれらのキメラ、あるいは組換えタンパク質、または組換えペプチドまたは組換えオリゴペプチドを、界面活性剤抽出、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、イムノアフィニティーまたは限外濾過および分別(sizing)カラム)分画遠心分離、分別溶解度(differential solbility)、またはその他のタンパク質の精製のための標準的手法を含む当分野で既知の方法によって精製することができる。
この態様の別の説明において、組換え抗原1またはヘム受容体タンパク質(HRP)をポリヒスチジン発現プラスミドから精製した。この方法によって組換えHRPを精製するために、HRPコード遺伝子(図１)を、発現時にHRPのアミノ末端にいくつかのヒスチジン残基(「ポリヒスチジン尾部」)が付加されるように、プラスミドpRSETA(Invitrogen Corporation)などのポリヒスチジン発現ベクター中にクローン化した。HRPコード遺伝子を含有する断片を、あらかじめ適当なエンドヌクレアーゼで制限した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理した発現ベクターに連結した。この連結混合物を使用してE.coli BL21(DE3)株の細胞にエレクトロポレートし、プラスミドプロモーターについて正しい方向のHRPコード遺伝子を含有する組換えプラスミドについて、形質転換体を分析した。こうしたクローンの１つが単離され、E.coli宿主菌株中に導入されたとき、これがHRPを発現することも示された。
組換えHRPを以下のようにして精製した。この形質転換体を含む形質転換体培養物15ml容量をLBアンピシリンブロス(broth)中、37℃で一晩増殖させた。翌朝、一晩培養物をブロス135mlに接種し、37℃で１時間増殖させた。5,000×g、4℃で10分間の遠心分離によって細胞を除去した。10kDa分画(cut off)膜での限外濾過によって、上清を10mlに濃縮した後、樹脂上のニッケルを介して組換えHRPのポリヒスチジン尾部に結合するような樹脂(例えばProBondTM,Invitrogen)1.6mlと室温で10分間混合した。次に、この樹脂を遠心分離によって単離した。最初に、樹脂を変性洗浄緩衝液(8M 尿素、20mM リン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.8)4mlで2回洗浄することによって、樹脂からHRPを溶離させた。次に、樹脂をpH6.0の変性洗浄緩衝液4mlで2回洗浄した。これに続いて、pH4.0の変性洗浄緩衝液4mlで2回洗浄した。それぞれの画分1mlずつを集め、界面活性剤(0.1％ Triton X-100)を含有する燐酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析した。ゲル電気泳動およびクーマシーブルー染色による溶出タンパク質の分析の結果は単一のバンド(single band)であった。この方法では95％の精製度のタンパク質が調製されるものと評価される。得られた精製組換えHRPは天然のタンパク質を認識する抗体に免疫反応性であった。
本明細書全体で使用される場合、抗原オリゴペプチドはここでは、１つのものとして合成されるか化学的に連結される配列の中に包括されて開示されている、本明細書に記載された抗原のアミノ酸配列の一部分に相当する一連のペプチドとして定義される。こうしたペプチドまたはオリゴペプチドは当分野で既知のいくつかのペプチド合成法の中の１つを使用して合成することができる。これらとして、tertブチルオキシカルボニルアミノ酸を使用する(Mitchellら、1978,J.Org.Chem.43:2845-2852)か、またはポリアミド支持体上の9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸を使用する(Drylandら、1986,J.Chem.So.Perkin Trans.I,125-137)標準固相ペプチド合成；ペプスカン(pepscan)合成(Geysenら、1987,J.Immunol.Methods 03:259；1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998)による；標準液相ペプチド合成による；または組換え発現ベクター系による；ものが含まれる。
ペプチドまたはオリゴペプチドの免疫特性を実質的に低下させることなく、アミノ酸の欠失または置換(ならびにアミノ酸の伸長および添加を含む)、そしてその他の方法などによってペプチドまたはオリゴペプチドの修飾をすることができる。特に、本明細書に記載された抗原、あるいはペプチド若しくはオリゴペプチドまたはそれらのキメラのアミノ酸配列を、そのタンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラの物理化学的挙動における見かけの差異(observed difference)の面で無変化な変更をもたらす、機能的に等価なアミノ酸での１以上のアミノ酸の置換によって、変更することもできる。機能的に等価なアミノ酸とは、関連性があり、かつ／または極性または電荷について類似しているアミノ酸として当分野で知られている。したがって、実質的に本明細書の配列リストに挙げたアミノ酸配列であるアミノ酸配列とは、タンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラの元来の生物学的機能を変更しない、機能的に等価なアミノ酸での置換を含むアミノ酸配列を称する。
フィンブリエタンパク質(FP)およびHRPのエピトープを含有するキメラペプチドの製造の説明において、対応する遺伝子の一定の領域をある構築物中に連結し、その後、プラスミド発現ベクター(pGEX2T)が、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、Schistosoma japonicumからの26キロダルトンのタンパク質、との融合ペプチドとして、E.coli中での外来ポリペプチドの合成を誘導する、ある発現系中で発現させることができる。この形態の態様において、鋳型としてP.gingivalisＤＮＡを使用するとき、FP-HRPコード遺伝子の選択された領域を選択されたオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。このオリゴヌクレオチドは、増幅されるキメラ断片がpGEX2T中に方向的に正しくクローン化されるために、連結後に生成する増幅遺伝子断片がその5’末端にBamHI制限部位と3’末端にEcoRI制限部位を含有するように設計される。各組換えプラスミドの配列をジデオキシ配列決定によって確認する。各組換えペプチドを精製するため、キメラ遺伝子断片を含有する対応する組換えプラスミドをE.coli JM 109中に形質転換させる。アンピシリン25μg/mlを含有し、ブロス360mlに一晩培養物40mlを添加することによるLBブロス400ml中で、37℃で1.5時間振盪しながらインキュベートすることによって、形質転換物を増殖させる。IPTGを0.01mMになるように添加し、培養物をさらに３時間インキュベートする。細胞を5000×gで遠心分離し、細胞ペレットをPBS 5ml中に再懸濁させる。細胞を超音波処理し、混合物を10,000×gで10分間遠心分離する。予備湿潤させたグルタチオン−アガロースビーズ0.5mlを上清に混合する。室温で２分間混合した後、1％ トリトン-X-100を含有するPBSで(グルタチオンに結合した融合ペプチドを有する)ビーズをさらに２回洗浄する。次にこのビーズを0.05M Tris(pH8.0)で１回洗浄する。グルタチオン-S-トランスフェラーゼからFP-HRPキメラペプチドを切断するため、洗浄したビーズをTris緩衝液中(最終濃度)0.25％ヒトトロンビン中で室温で１時間インキュベートする。次に、プロテアーゼインヒビター、PMSFを濃度100μg/mlになるように添加する。遠心分離によってビーズを取り出すと、上清には精製FP-HRPキメラペプチドが含まれている。イムノブロットアッセイによって、この融合ペプチドが抗原1-および抗原2-特異的ウサギポリクローナル抗血清に対して免疫反応性であることが確認される。
P.gingivalisが原因となる感染症であると推定される個体の体液中に存在するP.gingivalis特異的抗血清を検出するためのイムノアッセイにおける抗原として、精製抗原、ペプチド、オリゴペプチドおよびキメラを使用することができる。イムノアッセイにおける抗原(1-4)または関連ペプチドの検出には、当業界で既知のいずれのイムノアッセイも含まれ、これらとしては限定するわけではないが、放射性イムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、「サンドイッチ」アッセイ、沈降反応、凝集反応、蛍光イムノアッセイおよび化学発光を基礎とするイムノアッセイが含まれる。
実施例13
抗原(1-4)および関連ペプチドならびにキメラに関係する製剤化のための方法および配合物
本発明のこの態様は、P.gingivalisが原因となる感染症の予防または治療のための能動免疫用の予防および／または治療用組成物中の免疫原として使用する、抗原および／またはペプチド若しくはオリゴペプチドあるいはこれらのキメラに関する。ワクチンを目的とする場合は、ある細菌タンパク質を含有するP.gingivalisの抗原が免疫原性で、完全な細菌の表面に露出した１以上のエピトープ(この場合、これらのエピトープ(群)はP.gingivalis間で保存されている)に対して特異的な機能性抗体を誘導するものである必要がある。
ワクチン抗原として所望の性質を有する本発明の１例である、抗原4において、このタンパク質は本明細書の実施例６に記載した方法を使用してP.gingivalisから精製することができる。アジュバント(QS21 20μg)を含む精製抗原4タンパク質(25μg)でマウスを４週間間隔で２回免疫する。最後の免疫後の32日目に、免疫したマウスから血液を採取し、免疫血清をプールした。プールした免疫血清を酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によって細菌全体(P.gingivalis W50株)に対してアッセイした。全細胞ELISAについては、細菌の一晩培養物を綿棒で収穫し、600nmの吸光度が0.1になるように、PBS中に懸濁する。96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに細菌懸濁物のアリコート(100μl)を添加し、室温で一晩乾燥させる。プレートをPBS中0.1％(w/v)ゼラチン100μlでブロックする。この、およびその後のインキュベーションはすべて室温で１時間とする。ブロック溶液を除去し、0.1％(w/v)ゼラチンを含むPBSで希釈した免疫血清100μlをウェルに添加してインキュベートする。PBSで３回洗浄した後、アルカリホスファターゼと複合体化した組換えタンパク質G(0.1％(w/v)ゼラチンを含むPBS中1：1500)100μlとともにインキュベートすることによって、結合した抗体を検出する。プレートを洗浄し、p-ニトロフェニルホスフェート(ジエタノールアミン中2mg/ml)100μl／ウェルの添加によって発色機能を与える。30分後、3M NaＯＨ 50μlの添加によって反応を停止させる。ELISAリーダーを使用して492nmでの吸光度を読み取る。吸光度がブランクウェルよりも大きくなった点の希釈率の逆数として最終の力価を決定する。
W50からの抗原がワクチン抗原としての所望の性質を保有していることをさらに説明するものとして、プールしたW50菌株に対して形成された免疫血清が異型菌株と交差反応性を有することが示された。
ワクチンの開発のため、抗原または関連するペプチド若しくはキメラを発現する組換えベクターを含有する宿主から抗原特異的アミノ酸配列を精製することができる。こうした宿主としては、これらに限定するわけではないが、抗原アミノ酸配列をコードするベクターで感染またはトランスフェクトさせた細菌形質転換体、酵母形質転換体、糸状菌形質転換体、および培養細胞が挙げられる。抗原の部分に相当するペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラを抗原の化学的または酵素的切断によって製造するか、あるいは抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸を参照して、当分野で既知の方法を使用して化学的に合成することができる。あるいは、組換えベクターからペプチドを作製してもよい。タンパク質、ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラ免疫原は免疫応答を誘導するため、適切な免疫原物質としてワクチン製剤中に治療上有効な量が含まれる。接種するヒトまたは動物にワクチン製剤を導入するためには多くの方法が知られている。これらとしては、これに限定するわけではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼内、鼻内および経口投与が挙げられる。ワクチンはさらに溶液、ポリマーまたはリポソームなどの生理的担体；およびアジュバント、ならびにそれらの組合せを含むこともできる。
ワクチン製剤と組み合わせて、各種のアジュバントを使用する。アジュバントは免疫応答をモジュレートすることによって、ワクチン抗原のみを投与する場合よりも、少量のワクチン抗原量または少投与回数を使用して、より永続性でより高レベルの免疫力を達成するのに役立つ。アジュバントの例として、不完全フロイントアジュバント(IFA)、アジュバント65(ピーナツ油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含有)、油エマルジョン、Ribiアジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、Avridine、Quil A、サポニン、MPL、QS-21、およびアルミニウム塩などのミネラルゲルが含まれる。他の例として、SAF-1，SAF-0，MF-59，Seppic ISA720などの水中油型エマルジョン、およびISCOM類ならびにISCOMマトリックスなどのその他の粒状アジュバントが含まれる。アジュバントのその他の例の広範囲の、しかし全部ではないリストがCox and Coulter 1992[In:Wong WK(ed.)Animals parasite control utilising technology.Bocca Raton;CRC press,1992;49-112]に掲載されている。アジュバントの他に、ワクチンに通常の製剤学上許容可能な担体、賦形剤、充填剤、緩衝液または希釈剤を適当に含ませることができる。歯周炎の予防またはすでに存在する歯周炎の治療のために、アジュバントを含有するワクチンの１以上の用量を投与することができる。
本発明のこのモードの別の態様として、ハプテン、すなわちそれ自身では免疫応答を引き出すことができない分子としての抗原特異的アミノ酸配列の製造が挙げられる。この場合、ハプテンを担体またはその他の免疫原性分子に共有結合させて、連結したハプテンが免疫系に露出したとき、免疫原性を与えるようにすることができる。こうして、担体分子に連結されたこのような抗原特異的ハプテンをワクチン製剤中の免疫原とすることができる。
この態様の別のモードは、P.gingivalisが原因となる感染に対して防御するために使用される、組換えウイルス生ワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化細菌ワクチン、または不活化組換えウイルスワクチンを提供する。ワクシニアウイルスは他の生物から誘導されたワクチン抗原を発現するように操作される感染ウイルスの当業界で最もよく知られた例である。宿主を免疫感作するため、弱毒化するか、またはそれ自身が疾病の原因にならないように別の処理をした組換え生ワクシニアウイルスを使用する。これに続く宿主内での組換えウイルスの複製が抗原(1-4)タンパク質、関連ペプチドまたはキメラなどのワクチン抗原を含む免疫系の継続的な刺激を提供し、それによって長期の免疫を提供する。
その他の生ワクチンベクターとして以下のものが含まれる：アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ならびに好ましくはワクシニア(Paoletti and Panicali,米国特許第4,603,112号)などのボックスウイルスおよび弱毒化サルモネラ株(Stockerら、米国特許第5,210,035号；第4,837,151号；および第4,735,801号；ならびにCurtissら、1988,Vaccine 6:155-160)。生ワクチンは免疫系を継続的に刺激し、実質的に長期の免疫を与えるので、特に有利である。免疫応答がその後のP.gingivalis感染を防御するものの場合、生ワクチン自体をP.gingivalis予防用ワクチン中で使用することができる。特に、生ワクチンを口腔の共生常在菌である細菌を基礎とすることができる。この細菌を組換え抗原(1-4)、ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラペプチドを保有するベクターで形質転換し、その後これを使用して口腔、特に口内粘膜に移入することができる。口内粘膜に移入された後、この組換えタンパク質、ペプチドまたはキメラの発現が粘膜に連結しているリンパ組織を刺激して中和抗体を生成させる。
このモードの態様をさらに説明するため、実施例12で説明したような分子生物学的技術を使用して、ワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中の、ワクシニアウイルスベクターの増殖または複製に悪影響を与えないでエピトープを発現させるような部位に、抗原(1-4)をコードする遺伝子または１以上のペプチド若しくはキメラをコードする遺伝子断片を挿入することもできる。生成した組換えウイルスをワクチン製剤の免疫原として使用することができる。組換えウイルスを免疫原として使用する前に、当業界で知られた化学的方法などによって、発現される免疫原の免疫原性に実質的に影響を与えずに不活性化する以外は同一の方法を使用して、不活化組換えウイルスワクチン製剤を構築することができる。異なるエピトープを発現する不活化ウイルスの混合物を使用して多能性不活化ウイルスとすることもできる。それぞれの場合において、ワクチン抗原に対する免疫応答を強化するため、不活化組換えワクチンまたは不活化ウイルスの混合物を好適なアジュバントとともに製剤化することができる。
この態様の別の変法において、遺伝物質を直接ワクチン製剤として使用する。１以上の調節要素を機能的に連結した抗原(1-4)、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラをコードする配列を含有する核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を直接導入して、個体にP.gingivalisの病原性株に対する予防接種とすることができる(「直接遺伝子導入」)。予防接種する個体に直接遺伝子導入を実施し、その結果として予防接種した個体の血管内皮細胞および主要臓器の組織などの細胞によってその遺伝物質が発現することは、発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体の静脈内注射などの当業技術によって証明されている(Zhuら、1993,Science 261:209-211)。ベクターＤＮＡを標的細胞に送り込むためのその他の有効な方法は当業界で知られている。１例として、ウイルス遺伝子を含有する精製組換えプラスミドＤＮＡを使用してワクチンを接種(腸管外、粘膜、または遺伝子ガン(gene-gun)による免疫感作)し、防御性免疫応答を誘導したものがある(Fynanら、1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11478-11482)。別の例において、個体から取り出した細胞に当業界で知られた標準的な操作によってトランスフェクトまたはエレクトロポレートし、その結果、標的細胞中に組換えベクターＤＮＡを導入することができる。その後、組換えベクターＤＮＡを含有する細胞を、ベクター中に発現した選択マーカーによるなどの当業界で知られた方法を使用して選択し、つぎにその選択した細胞を個体中に再導入して抗原タンパク質、関連ペプチド若しくはオリゴペプチドまたはキメラを発現させることができる。
遺伝物質を使用する免疫感作の好ましい１方法は、１以上の抗原(1-4)、関連ペプチド、若しくはオリゴペプチドまたはキメラをコードする配列を含み、発現に必要な１以上の制御配列に機能的に連結された核酸分子を個体に投与する段階を含む。この核酸分子は直接に投与するか、または最初にウイルスベクター中に導入してそのベクターを経由して投与することができる。核酸分子は製薬上許容可能な担体または希釈剤中に含ませて投与することができ、またワクチンの効力を増強し得る化合物を含有させてもよい。これらの添加用化合物として、これに限定するわけではないが、免疫応答を増強するアジュバント、および「免疫モジュレーター」と総称される、例えばサイトカインなどの免疫応答をモジュレートすることを目的とする化合物；または「核酸取り込み(uptake)エンハンサー」と称される、細胞による核酸の取り込みを増大させるその他の化合物が挙げられる。核酸分子による免疫はいずれの非経口経路(静脈内、腹腔内、皮内、皮下、若しくは筋肉内)によっても、または鼻咽腔、気管若しくは胃腸管の粘膜表面との接触によっても可能である。
能動免疫の変法として、免疫を受動性とすることもできる。すなわち、抗原(1-4)エピトープに対する抗体を含有する精製イムノグロブリン投与を含む免疫である。
実施例14
以下は提案する抗抗原1抗体を含有する歯磨きペースト製剤の１例である。
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実施例15
以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。
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実施例16
以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。
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実施例17
以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。
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実施例18
以下は提案する液体歯磨きペースト製剤の１例である。
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実施例19
以下は提案する洗口剤製剤の１例である。
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実施例20
以下は提案する洗口剤製剤の１例である。
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実施例21
以下は提案するトローチ剤の１例である。
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実施例22
以下は提案する歯肉マッサージクリーム剤の１例である。
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実施例23
以下は提案するチューインガム剤の１例である。
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当業者は、本明細書に概括した発明の精神または範囲から離れることなく、特定の実施態様で示した本発明に対して多数の変更および／または改変をすることができると判断するはずである。したがって、ここに示した実施態様はすべての点で例示のためであって、限定するものではないことを考慮されるべきである。
【図１】
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【図２】
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