(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質による、脊椎動物の粘膜表面への刺激をモデル化するために好適な毒性試験方法であって、
腹足類の体の上皮の少なくとも一部または足の少なくとも一部を提供するステップを含み、腹足類は腹足綱の生物であり、さらに
腹足類の上皮の少なくとも一部または足の少なくとも一部を、試験する化学物質に露出するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記粘膜表面は、ヒトまたはその他の哺乳動物の粘膜表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腹足類から放出される物質に関する特徴を観察するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記露出するステップの前に腹足類を安定な重さにするステップをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記観察するステップは、腹足類から放出される粘液の色を観察するステップを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記観察するステップは、露出するステップの前後に腹足類の重さを測定するステップと、露出するステップの間および後に腹足類の足から放出される粘液の重さを測定するステップと、露出するステップの間および後に腹足類の足から放出されるタンパク質の量を測定するステップと、露出するステップの間および／または後に腹足類の足から放出される酵素または膜に関連する成分の量を測定するステップとのうちの１つを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記膜に関連する成分は、リン脂質もしくはコレステロールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素は、アルカリホスファターゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼのうちの１つである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、露出するステップの間および後に腹足類の足から放出された総タンパク質である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記腹足類は肺を有する腹足類である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記腹足類は陸生のナメクジである、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ナメクジはアリオンまたはライマックス種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記提供するステップは、腹足類から少なくとも内臓を取除き、かつ残った上皮および／または足の生理的な生存性を維持するステップを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記化学物質は化粧品または医薬品の組成物である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
第１および第２の化学物質において、請求項１から１４のいずれかに記載の方法を行なうステップと、
前記第１および第２の化学物質に対する腹足類の上皮の少なくとも一部または足の少なくとも一部の露出の結果に依存して、前記第１および第２の化学物質の順位を定めるステップとを含む、試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、特定的には動物、特にヒトの粘膜、より特定的にはヒトの腸、鼻、および呼吸器粘膜などの単層の粘膜表面、ならびに膣および口腔粘膜などのその他の粘膜表面に対する、化学物質の毒性を試験するための方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
物質の毒性試験を行なう際の試験動物としては、通常マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルなどの高等動物が用いられる。２年から２年半という長期間にわたり、注意深く制御された状態の下で繁殖を行なう必要がある。このためこうした毒性試験を行なうことは非常に時間がかかり、高価である。化学および製薬工業においては、さまざまな工業的および健康上の要求を満たすために，新たな化学物質が継続的に合成されている。加えて、公知の化学物質に対する新たな用途を見出すために、多くの研究が行なわれている。各々の場合において、これらの物質の毒性を試験するための迅速で安価な方法が確立されることが望ましい。
【０００３】
ヒトに対する生体異物の安全性を評価するための、脊椎動物を用いた毒性試験は、倫理的および財政上の考慮に基づいて厳しく批判されてきた。in vivo動物試験に対する原則的な代替法は、in vitro試験である。しかし単純な細胞培養モデルにおいては、神経制御、全身の血流、運動性の減少、および不均一な細胞数など多くの要素がなくなるため、in vitro試験の価値が減少する。たとえば、バクテリアは原核生物であって、より高レベルの生物組織を有する多細胞生物とはかなり異なる。したがってヒトの粘膜などの複雑なシステムを試験するためには、高等動物または高等動物の部分を用いる傾向がある。
【０００４】
代替法の有効化のためのヨーロッパ・センター（ＥＣＶＡＭ）によって組織された研究会「３つのＲ：前方への道（The Three Rs: The Way Forward）」（シェリンガム、ノーフォーク、ＵＫ、５／３０−６／３、１９９５）において、いくつかの代替法およびアプローチが提案された。たとえば、無脊椎動物、植物および微生物を含む、知覚力の限られた、および／または動物実験を制限する法律によって保護されていない「より下等な」生物の使用などである。しかし動物試験に対する具体的な代替案として提案されたのは、線虫、バクテリアまたは昆虫のみであった。毒性試験に対する線虫の用法はＵＳ４，４４４，８９１に記載されている。
【０００５】
ヒトの粘膜、特に鼻の粘膜は効果的に薬剤を吸収できることが研究によって示された。特にペプチド薬剤に対しては、鼻を通じた投与は非経口的投与の有効な代替法である。しかしペプチドは、その高分子量および生理的なｐＨ値における親水性の特性のために、疎水性の膜障壁を横切る輸送特性が低い。経鼻的に投与されるペプチドの吸収効率は、胆汁酸塩、ラウレス−９、フシジン酸誘導体またはタウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）などの吸収エンハンサを用いることによって改善できる。
【０００６】
こうした吸収エンハンサは、鼻を通じた薬剤投与に重要な役割を果たす。特にペプチドおよびタンパク質に対しては、吸収エンハンサの使用はしばしば鼻の粘膜からの効率的な吸収を行なうために必須である。残念なことに、これらの物質の副作用の可能性についてはほとんど知られておらず、このことが鼻用の薬剤組成物における吸収エンハンサの臨床的適用に対する障害となっている。鼻の粘膜における吸収エンハンサの吸収促進の基礎をなす効果および機構をより詳細に観察することによって、その効力および安全性についてより多くの情報が与えられる。エンハンサの影響下で鼻を通じた薬剤吸収を増加に導く機構はかなり多様であり、部分的にしか理解されていない。いくつかの場合においては、薬剤の溶解性または安定性が増加しても、吸収エンハンサが粘液層とも相互作用して粘液の特性を変えるおそれがある。さらに、上皮膜との相互作用によって鼻の上皮の浸透性も増加するおそれがある。
【０００７】
鼻を通じた薬剤投与を考えるとき、鼻の機能への薬剤および添加剤の影響は早い段階で試験すべきである。線毛上皮による鼻の自己洗浄能は、ヒトの鼻領域から埃、アレルゲンおよびバクテリアを除去するために極めて重要であるため、これが鼻を通じた投薬によって影響されてはならない。線毛の動きは、上側の気道における粘膜線毛のクリアランスに対する主要な要素である。「線毛不動症候群」の患者から、鼻の線毛を慢性的に拘束することによって再発性の気道の感染が起こることが公知である。多くの薬剤および添加剤が鼻の線毛の動きを阻害することが、in vitroで示されている。たとえば、脂肪親和性および水銀の保存剤、抗ヒスタミン、プロプラノロール、およびジヒドロキシ胆汁酸塩は線毛停止剤であり、これらはすべて短時間のうちに線毛のうなり周波数（beat frequency）を減少させる。さらに、薬剤の露出を中止した後に線毛停止効果が可逆的であるかどうかを調査することも重要である。鼻の吸収エンハンサはいかなる重大な線毛毒性もあってはならず、鼻を通じた薬剤投与の成否は、線毛のある上皮組織への影響に大きく依存し得る。
【０００８】
化学物質の細胞毒性または粘膜線毛クリアランス時間を定めるために、以下の方法が提案されてきた。すなわち、ラットの鼻上皮におけるインサイチュー試験、新生ヒヨコ気管の線毛の線毛うなり周波数に対するエンハンサの影響のin vitroにおける決定、および断頭したカエルのカエル口蓋モデルを用い、上側の口蓋を露出し特定の物質を用いて視覚的に試験する方法である。
【０００９】
薬剤または薬剤投与の開発における早い段階において、理想的にはヒトに対する臨床試験の前に、鼻の機能だけでなく負の副作用も判断されるべきである。一例として、ヒトの頬の粘膜を介した、β−遮断剤プロプラノロールＨＣｌの投与がある。この化学物質は臨床試験において、治るのに数週間を要するような深刻な潰瘍をヒトに起こした。ヒトにこうした深刻な問題を起こす化学物質を信頼性高く選抜できるスクリーニングテスト法を有することが望ましい。
【００１０】
腹足類は、カタツムリおよびナメクジを含む軟体動物である。これらは一般的に単一の貝を有するか、または貝を全く有さず、しばしば非対称の体を有する。腹足類に関するより広範な考察はブリタニカ百科事典に見出されるであろう。今までに腹足類、たとえばカタツムリは主に医療用の産物およびプロセスに用いられており、それらはたとえばＵＳ５，５３８，７４０、ＵＳ４，４７３，６４０、ＵＳ４，３１４，９９２、ＵＳ３，８８９，００６、ＵＳ４，８５５，２８５、ＵＳ３，８８５，０１２などに記載されている。
【００１１】
マリゴメス（Marigomez）らによる、Arch. Environ. Contam. Toxicol.１９９６、３１（１）、頁５４−６２の記事においては、土壌の品質評価における標識生物としてのナメクジの使用（「ナメクジ監視（“Slug Watch”）」）が説明される。土壌における金属汚染物質への露出のバイオマーカとしてナメクジを用いることができる。ナメクジの水銀に対する反応のみが言及されており、ナメクジをヒトの粘膜に対するモデルとして用い得ることは示されていない。
【００１２】
この発明の目的は、動物およびヒトの膜に対する物質の毒性を容易に、迅速に、正確にかつ安価に試験可能な試験方法を提供することである。
【００１３】
この発明の目標は、脊椎動物の代わりに無脊椎動物を用いて物質の毒性を試験するための方法を提供することである。
【００１４】
この発明の別の目標は、結果の統計的な解釈を改善するために、試験の容易な反復を可能にする試験を提供することである。
【００１５】
【発明の概要】
この発明は、毒性試験に対する腹足類の使用を含む。この発明は、化学物質による、脊椎動物の粘膜表面、特にヒトまたはその他の哺乳動物の粘膜表面に対する刺激をモデル化するための毒性試験方法を含み、この方法は
腹足類の体の上皮の少なくとも一部分または足の少なくとも一部分を与えるステップを含み、腹足類は腹足綱の生物であり、さらに
その上皮の部分または足の部分を、試験する化学物質に露出するステップを含む。
【００１６】
特に、化学物質は腹足類の肌および／または足に接触させてもよい。この発明は、腹足類の全体を用いるin vivo試験、または腹足類の一部に対するin vitro試験の両方を含む。化学物質は化粧品または医薬品の化学組成物に制限されず、塗料、ラッカー、接着剤およびヒトまたは動物の粘膜に接触する可能性のある溶剤などの家庭用品または工業用品であってもよい。
【００１７】
この試験に従うと、粘膜の刺激を、たとえば腹足類の足から遊離する粘液の色の視覚的な観察によって、またはその増加量によって、定性的に、容易かつ迅速に定めることができる。機械的な振動およびその他の刺激は、腹足類の粘液生成に影響するおそれがある。他の影響による混乱を避けるために、この発明に従うと、腹足類は試験中に試験する化学物質以外のストレス形態または攪拌を受けないことが好ましい。この発明の毒性試験方法に従うと、粘膜の損傷は足からの粘液の放出によって、腹足類の体重の損失によって、または足からのマーカ物質、タンパク質もしくは酵素の放出によって定量的に、容易に定めることができる。特に、物質の毒性は化学物質による処理の後に腹足類の足の粘膜から放出される総タンパク質量、および／または乳酸デヒドロゲナーゼ、および／またはアルカリホスファターゼ、および／またはコレステロール、および／またはリン脂質、および／またはその他の膜成分の量を測定することによって定量的に定めることができる。この試験の利点は、刺激物質による粘液の生成を簡単に測定できることである。この発明に従った方法は、物質の毒性に対する簡単なスクリーニング試験を提供する一方で、ヒトの腸、鼻および呼吸器粘膜などの単層の粘膜表面、ならびに膣および口腔粘膜などのその他の粘膜表面に対するモデルも提供し、これによって正確な定量的分析が可能となる。よってこの発明の試験方法は、たとえば処理された上皮からのタンパク質、酵素または膜成分の放出などの、定性的および定量的な試験結果の両方を与えることができ、スクリーニング試験および正確な定量的毒性試験の両方に適し得る。
【００１８】
この発明について、以下に図面を参照しながら説明する。従属請求項は、この発明の個々の分離した実施例を定める。
【００１９】
【好ましい実施例の説明】
この発明について、特定の実施例を参照しながら説明するが、この発明はこれらに制限されるものではなく、請求項によってのみ制限される。この発明について、主に腹足類の２つの種を参照しながら説明するが、この発明はこれらの種に制限されるものではない。また、この発明は主にあるクラスの物質、たとえば薬剤吸収エンハンサおよび歯科において用い得る局所麻酔剤を参照しながら説明するが、この発明はこのタイプの物質に制限されるものではない。さらに、この発明の以下の例において試験される化学物質のタイプおよび形に対しては、実験室環境下での飼育および観察が容易な陸生のナメクジ、すなわち肺を介して呼吸する腹足類（有肺の腹足類）が好ましい。しかし、この発明はこれらのタイプの物質およびこれらのタイプの腹足類に制限されるものではない。たとえば、他の化学物質は水または塩水などの溶剤中で、液体の形で試験されることが好ましいかもしれず、この場合には海中のナメクジを含む水生のカタツムリまたはナメクジが好ましい試験生物であり得る。この発明に従うと、腹足類の足は特に重要である。なぜなら、それが提供する粘膜表面はこの発明に従った毒性試験に有利に用いることができ、かつたとえば脊椎動物、特にヒトおよびその他の哺乳動物などの高等動物の粘膜の好適なモデルを提供し得るためである。
【００２０】
この発明に従った毒性試験の終点は、以下の１つまたはそれ以上を含んでもよい。すなわち、粘液の生成、粘液の色の変化、体重の損失、および生化学マーカ物質の放出である。これらの終点の各々、またはこれらすべてが、刺激の程度の定性的または定量的な順位を提供し得る。「毒性」という語はアレルギー反応を含むことが理解されるべきであり、したがってこの発明に従った毒性試験は、物質に対するアレルギー反応の試験をも含む。こうした反応は粘膜において共通である。
【００２１】
この発明の実施例の１つに従うと、雌雄同体の陸生の空気呼吸ナメクジ、アリオン（Arion）種などの生きた腹足類を試験生物として使用できる。こうしたナメクジの体壁は、結合組織の上にある上皮および粘液分泌細胞から構成される外側の単層の上皮からなる。ナメクジの足は、別個の機能的役割を有する異なる上皮細胞タイプからなる。足の横向きの帯は、他の動物システムにおける吸収面のものに似た微絨毛上皮細胞で構成される。中央の帯は線毛細胞で構成され、移動のために分化している。ナメクジの肌は柔らかく、角質化またはクチクラの生成は見られない。この発明に従って、ナメクジの足の上皮は、脊椎動物および特にヒトを含む哺乳動物などの高等動物の吸収性の上皮に対する良いモデルであることが見出された。
【００２２】
最初に、ナメクジは安定な体重に達するまで温度および湿度の制御された状態下で培地の上に保たれる。安定な体重を達成することの目的は、結果の再現性を改善するためであり、特にナメクジからの物質の放出をその体重によって簡便に測定できるためである。次いでナメクジを培地から分離して、湿ったペーパータオルで内側を覆った穴の開いたプラスチックの箱の中に入れ、実験を始める前の７日間、２０℃および相対湿度９５％にしておく。そのナメクジは特別なやり方で繁殖させたものではなく、すなわちそれらは野生のナメクジであった。ナメクジの選択的な繁殖によって、より一層正確で再現性のある結果が得られることが予期されるが、試験結果が示すとおり、このことはこの発明において正確かつ有用なデータを得るために必ずしも必要とされるものではない。
【００２３】
試験手順は簡単かつ迅速である。試験する化学物質は、試験物質を含有するペトリ皿にナメクジを個々に置くことによって、ナメクジの粘膜、たとえば足に直接適用される。リン酸緩衝塩水で処理したナメクジがネガティブコントロールとして用いられる。ポジティブコントロールとしては、公知の毒性物質、塩化ベンザルコニウムで処理したナメクジが用いられた。
【００２４】
目的の粘膜上皮はナメクジの外側に位置するため、物質の影響を簡単に観察できる。刺激物質はナメクジの粘液生成を増加させることがあり、これは視覚的に観察可能である。またこのことは、化学物質によるナメクジの処理の前後に（各々の場合にナメクジを取除いた状態で）ペトリ皿の重量を量ることによって、簡単に測定できる。加えて、化学物質による上皮の損傷に対する間接的な応答は、損傷を受けた足の表面を通じた体液の漏洩による、ナメクジの体重の減少によって定めることができる。
【００２５】
処理の後、ナメクジはリン酸緩衝塩水を含む新しいペトリ皿に個々に移される。適切な露出時間の後、たとえば１時間後にリン酸緩衝塩水は回収され、タンパク質および／または、たとえば乳酸デヒドロゲナーゼおよび／またはアルカリホスファターゼなどの酵素、またはナメクジの足もしくは上皮から放出されるその他のマーカ物質、たとえばリン脂質またはコレステロールなどの膜に関連する成分などの存在が分析される。試験化学物質による細胞損傷の可逆性を定めるために、数時間後にこの手順を繰返してもよい。試験する化学物質の濃度または量を変化させてもよく、その濃度の影響を簡単に調べることができる。必要に応じて露出時間も変えられる。足粘膜への物質の亜慢性効果を調べるために、ナメクジを継続的な数日間にわたって処理してもよい。
【００２６】
例１
実験開始の７日前に、内側を湿ったペーパータオルで覆ったプラスチックの箱の中にナメクジを分離し、２０℃および相対湿度９５％にしておいた。試験物質として、ジデカニオール−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）およびデオキシコラートナトリウム（ＳＤＣ）を選択した。リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、ＳＤＣ（１％ ｗ／ｖ）およびＤＤＰＣ（１％ ｗ／ｖ）を調製した。ナメクジを５日間にわたり、試験溶液とともに１日１５分間インキュベートした。インキュベート期間の後、ナメクジをペトリ皿中の５００μＬ  ＰＢＳの上に置いた。処理後６時間にわたって、毎時間ごとにＰＢＳをサンプリングし、５００μＬ  ＰＢＳによって新しくした。試験中はナメクジを一般的に静かで正常な状態に保ち、粘液の生成に影響し得る機械的振動または機械的もしくは電気的な妨害を受けないようにすることが好ましい。
【００２７】
ＰＢＳ中に放出された酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））および総タンパク質を定めた。ナメクジの体重の変化を定めるために、インキュベート期間の前後にナメクジの重さを量った。試験物質の処理の前後にペトリ皿の重さを量ることによって、粘液の生成を測定した。その結果を表１および図１から図５のグラフに示す。
【００２８】
図３から図５のグラフに示す結果において、タンパク質放出総量およびＬＤＨ放出総量は、コントロール（ＰＢＳ）およびＤＤＰＣの安定な結果と比較して、着実に上昇している。また、コントロールまたはＤＤＰＣを伴うときよりも多くＡＬＰを放出している。これらの結果は、ＰＢＳまたはＤＤＰＣによる処理はほとんどまたは全く損傷を起こさないのに対し、塩化ベンザルコニウムまたはＳＤＣは深刻な膜損傷を起こすという、明確に確認可能な指標を与える。これらの結果が、他の方法によって定められたこれらの物質に対する発表されたデータと一致するだけでなく、この発明に従った試験方法は、他の方法によって定められたものと同じオーダで試験物質を定量的に順位付けする。したがってこの発明が提供し得る試験方法は、変化が深刻であるときにヒトの粘膜に対する変化の可能性を定めるだけでなく、薬剤中の脂質部分に対する水性部分、ｐＨ、薬剤溶液のイオン強度または浸透性、緩衝種の電荷および濃度、ならびに調剤の形による影響などの物理化学的要素を含む、より微妙な感受性を評価するために精密化し得る分析ツールも提供できる。試験は簡単に行なうことができるため、選択を狭くするために初期スクリーニングを用いた後、多様なパラメータを用いた試験を経済的に実行可能な時間内に行なうことが可能である。これに関して用いられるのは、速くかつ簡単であるがやや定量性に欠ける体重の損失および粘液の生成（図１および図２）の試験であり、これも信頼性のある毒性情報を与えることができる。このことは、複雑な試験装置、複雑な化学分析を必要とせず、また完了に長時間を必要としないという利点を有するこれらのより簡単な分析試験を用いて、迅速なスクリーニング試験を行ない得ることを示す。驚くべきことに、野生のナメクジを用いても最低限の試験前の調節によって正確な結果が与えられ、このことは長期間の繁殖、養育および生育ステップが避けられるために驚異的に迅速に結果が与えられることを意味する。
【００２９】
表１
酵素および総タンパク質の放出量におけるＰＢＳ、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、ＳＤＣ（１％ ｗ／ｖ）およびＤＤＰＣ（１％ ｗ／ｖ）の影響を示す。データは総合平均値（各ナメクジに対して７サンプル／日）として表わす。
【００３０】
【表１】
0004358443.tif 000002
【００３１】
ここで、
％ＷＬは、その日の最初の体重に対する％として示された、１５分間の処理による体重の減少（重さの損失）を表わし、
％ＭＰは、処理前の１日の始まりにおける体重に対する％として示された、粘液の生成を表わす。
【００３２】
例２
例２においても、実験開始の７日前にアリオン種のナメクジを分離し、２０℃および９５％ＲＨにて保った。試験物質として、β−遮断剤のプロプラノロールＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）を用いた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）およびプロプラノロール（１％ ｗ／ｖ）を調製した。ナメクジを４日間にわたり、試験溶液とともに１日１５分間インキュベートした。インキュベート期間の後、ナメクジをペトリ皿中の５００μＬ  ＰＢＳの上に置いた。処理後３時間にわたって、毎時間ごとにＰＢＳをサンプリングし、５００μＬ  ＰＢＳによって新しくした。
【００３３】
ＰＢＳ中に放出された酵素（ＬＤＨ、ＡＬＰ）および総タンパク質を定めた。この処理による体重の変化および粘液の生成を調べた。その結果を表２および図６から図１０のグラフに示す。
【００３４】
表２
酵素および総タンパク質の放出量におけるＰＢＳ、塩化ベンザルコニウム（ＢＺＫ）（１％ ｗ／ｖ）およびプロプラノロールＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）の影響を示す。データは総合平均値（各ナメクジに対して３サンプル／日）として表わす。
【００３５】
【表２】
0004358443.tif 000003
【００３６】
ここで、％ＷＬは、１５分間の処理による体重の減少として示された重さの損失を表わし、
％ＭＰは、処理前の１日の始まりにおける体重に対する％として示された粘液の生成を表わす。
【００３７】
この試験の結果、１％プロプラノロールＨＣｌはかなりの刺激を起こすことが示される。すべての標識（図６から図１０）が、塩化ベンザルコニウムに比較して刺激が増加したことを示す高い値を示した。１％プロプラノロールＨＣｌによる４日間の処理の後、すべてのナメクジは死んだ。これらの結果は、１％プロプラノロールが深刻な膜損傷を起こすことを示す。このことは、プロプラノロールＨＣｌを用いたヒトにおける臨床試験が深刻な潰瘍を起こしたという、発表されたデータと一致する。この結果から、この発明に従った毒性試験はヒトの粘膜に深刻な損傷を与える化学物質を信頼性高く選抜できるため、医薬従事者に、ヒトに害を与える臨床研究を避けるために有用なツールを提供できることが確かとなる。プロプラノロールＨＣｌの刺激能は、処理中の体重の減少および粘液の生成によっても示される。この試験においては、ナメクジが死ぬまで刺激物質との接触を維持したが、この試験方法が通例のベースで用いられるときには、こうした極端な場合にはもっと早く終了させてもよい。ナメクジが排出した粘液は橙色であったが、これは通常無色である。したがって橙色の粘液の生成は深刻な刺激を示すものであり、ナメクジへの不必要な苦痛を避けるために、この橙色の粘液が観察されるときには通常短い期間内にこの試験を中止してもよい。
【００３８】
例３
アリオンおよびライマックス（Limax）種のナメクジを実験の７日前に分離し、２０℃および９５％ＲＨにおいて保った。ライマックス種のナメクジは、肺と小さな内部の貝とを有する陸生のナメクジである。試験物質として、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）およびデオキシコラートナトリウムを選択した。リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、ＨＰβＣＤ（５％ ｗ／ｖ）、ＳＴＤＨＦ（１％ ｗ／ｖ）およびＳＤＣ（１％ ｗ／ｖ）を調製した。ナメクジを５日間にわたり、試験溶液とともに１日１５分間インキュベートした。インキュベート期間の後、ナメクジをペトリ皿中の５００μＬ  ＰＢＳの上に置いた。処理後６時間にわたって、毎時間ごとにＰＢＳをサンプリングし、５００μＬ  ＰＢＳによって新しくした。
【００３９】
ＰＢＳ中に放出された酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ならびに総タンパク質を定めた。この処理による体重の変化および粘液の生成を調べた。その結果を表３および表４に示し、この処理による体重の減少を図１１および図１２に示す。
【００４０】
ＰＢＳおよびＨＰβＣＤによる処理は粘液の生成を起こさず、タンパク質および酵素の放出量は低い。ＳＴＤＨＦは、両方の種に対して粘液生成の増加、体重の減少、およびＬＤＨ放出のわずかな増加を起こした。塩化ベンザルコニウムとＳＤＣとは深刻な膜損傷を起こし、体重を最初の体重の約５０％まで減少させた。ＳＤＣで処理したアリオン種の結果は表１（例１）に示す。
【００４１】
アリオンおよびライマックスの両方の種に対して、毒性の増加についての同じ順位が得られた。すなわち、ＰＢＳ、５％ＨＰβＣＤ＜１％ＳＴＤＨＦ＜１％ＳＤＣおよび１％ＢＡＣであった。これらの結果は、他の方法によって定められた、これらの物質に対する発表されたデータと一致する。
【００４２】
表３
アリオン種のナメクジを用いた、酵素および総タンパク質の放出量におけるＰＢＳ、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、ＨＰβＣＤ（５％ ｗ／ｖ）およびＳＴＤＨＦ（１％ ｗ／ｖ）の影響を示す。データは総合平均値（各ナメクジに対して７サンプル／日）として表わす。
【００４３】
【表３】
0004358443.tif 000004
【００４４】
ここで、％ＭＰ＝処理前の１日の始まりにおける体重に対する％として示された、粘液の生成である。
【００４５】
表４
ライマックス種のナメクジを用いた、酵素および総タンパク質の放出量におけるＰＢＳ、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、ＨＰβＣＤ（５％ ｗ／ｖ）、ＳＴＤＨＦ（１％ ｗ／ｖ）およびＳＤＣ（１％ ｗ／ｖ）の影響を示す。データは総合平均値（各ナメクジに対して７サンプル／日）として表わす。
【００４６】
【表４】
0004358443.tif 000005
【００４７】
ここで、％ＭＰ＝処理前の１日の始まりにおける体重に対する％として示された、粘液の生成である。
【００４８】
例４
実験開始の７日前にアリオン種のナメクジを分離し、２０℃および９５％ＲＨにて保った。試験物質として以下の局所麻酔剤を用いた。すなわち、プロカインＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、プリロカインＨＣｌ、テトラカインＨＣｌおよびブピバカインＨＣｌである。すべての試験物質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１％ ｗ／ｖの濃度で調製した。ナメクジを５日間にわたり、試験溶液とともに１日１５分間インキュベートした。インキュベート期間の後、ナメクジをペトリ皿中の１ｍｌ  ＰＢＳの上に置いた。処理後３時間にわたって、毎時間ごとにＰＢＳをサンプリングし、１ｍｌ  ＰＢＳによって新しくした。
【００４９】
ＰＢＳ中に放出された総タンパク質を定めた。この処理による体重の変化および粘液の生成を調べた。その結果を表５および図１３に示す。ＰＢＳ、プロカイン、リドカインおよびプリロカインによる処理はほとんど、または全く損傷を起こさない。テトラカインおよびブピバカインは粘液生成の増加およびタンパク質放出の増加をもたらした。これらの結果は発表されたデータに一致する。
【００５０】
表５
タンパク質放出総量におけるＰＢＳ、塩化ベンザルコニウム（１％ ｗ／ｖ）、プロカインＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）、リドカインＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）、プリロカインＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）、テトラカインＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）およびブピバカインＨＣｌ（１％ ｗ／ｖ）の影響を示す。データは総合平均値（各ナメクジに対して３サンプル／日）として表わす。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
ここで、
％ＭＰ＝処理前の１日の始まりにおける体重に対する％として示された、粘液の生成である。
【００５３】
例１から例４を参照して説明した前述の試験は、この発明に従った試験の網羅的な一覧ではない。この発明の範囲内にはその他の試験が含まれる。たとえば、線毛のうなり周波数および線毛の不動性（immotility）の始まり、ならびに不動性の可逆性を腹足類の足において視覚的に観察することができ、これをこの発明および添付の請求項の範囲内にある試験として含んでもよい。
【００５４】
また、この発明はin vivoの試験に制限されるものではなく、in vitroの試験に対する腹足類の少なくとも一部分の使用を含む。in vitro試験を行なうためには、腹足類の内臓を取除いて一塊の筋肉および上皮を残す。腹足類の足および／またはその他の上皮部分に化学物質を適用する試験を行なう間、これらを生理食塩水中で生存可能に保ってもよい。しかし、生きた腹足類を用いることの利点の１つは、試験を数日間にわたって行なって腹足類の粘液の排出の定量的な測定ができることであり、一方in vitro試験はより速い試験、たとえば線毛のうなり周波数または不動性の試験に最適である。この発明に従ったin vitro毒性試験の利点の１つは、生きた動物はしばしば試験環境中で用いるのが困難であるのに対し、より広範囲の腹足類種を便利に用い得ることである。
【００５５】
前述の試験およびその結果は、この発明に従った方法がヒトの腸、膣、口腔、鼻および呼吸器粘膜を含む、たとえばヒトおよびその他の哺乳動物などの脊椎動物の粘膜のモデルを提供できることを示しており、これによってこれらのヒトまたはその他の動物の粘膜に関する化学物質の毒性についての定性的および定量的なデータを正確に、迅速にかつ経済的に得ることができる。この発明に従った試験方法の特別の利点は、同じ基本的な試験方法および試験装置を、迅速なスクリーニング試験およびより正確な定量試験の両方に用い得ることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明の第１の実施例に従った試験例１の結果（表１）を示す図である。
【図２】  この発明の第１の実施例に従った試験例１の結果（表１）を示す図である。
【図３】  この発明の第１の実施例に従った試験例１の結果（表１）を示す図である。
【図４】  この発明の第１の実施例に従った試験例１の結果（表１）を示す図である。
【図５】  この発明の第１の実施例に従った試験例１の結果（表１）を示す図である。
【図６】  この発明の第１の実施例に従った試験例２の結果（表２）を示す図である。
【図７】  この発明の第１の実施例に従った試験例２の結果（表２）を示す図である。
【図８】  この発明の第１の実施例に従った試験例２の結果（表２）を示す図である。
【図９】  この発明の第１の実施例に従った試験例２の結果（表２）を示す図である。
【図１０】  この発明の第１の実施例に従った試験例２の結果（表２）を示す図である。
【図１１】  アリオン種のナメクジに対する、異なる試験物質による体重の減少（最初の体重に対する％）（例３、表３）を示す図である。
【図１２】  ライマックス種のナメクジに対する、異なる試験物質による体重の減少（最初の体重に対する％）（例３、表４）を示す図である。
【図１３】  異なる試験物質による体重の減少（最初の体重に対する％）（例４、表５）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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