(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）リガンドまたはレセプターからなる結合対で標識され、そのことにより、除去するのが望ましい標的細胞の表面に存在する他方の結合対に抗体が結合でき；および
（b）細胞毒性薬剤のプロドラッグを細胞毒性薬剤に転化し得る酵素または前記標的細胞を破壊し得る免疫システムの細胞に結合でき、
酵素または免疫システムの細胞への抗体の結合が可逆的に阻害されるように光開裂性分子が結合している抗体。
【請求項２】
（a）除去するのが望ましい標的細胞の表面に存在するリガンドまたはレセプターからなる結合対に結合し得る第一抗体成分；および
（b）細胞毒性薬剤のプロドラッグを細胞毒性薬剤に転化し得る酵素または前記標的細胞を破壊し得る免疫システムの細胞に結合できる第二抗体成分
を含み、酵素または免疫システムの細胞への抗体の結合が可逆的に阻害されるように光開裂性分子が結合している二重特異性抗体である抗体。
【請求項３】
第一および第二抗体成分が、活性部位を保持するが、Fc領域のない抗体の部分である請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
光開裂性分子が、抗体に複合したニトロフェニルメチルアルコール、1-ニトロフェニルエタン-1-オールまたは1-（2-ニトロフェニル）エタノールである請求項１〜３のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項５】
標的細胞が腫瘍細胞である請求項１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項６】
酵素が、ホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-ラクタマーゼ、アミダーゼ、シトシンデアミナーゼまたはニトロリダクターゼである請求項１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項７】
免疫システムの細胞が、ナチュラルキラー細胞、T-細胞、細胞毒性T-細胞、マクロファージ、活性化末梢血液リンパ球、CD3+リンパ球、CD16+リンパ球、多形核白血球、大顆粒リンパ球、B-リンパ球、骨髄細胞、リンホカイン活性キラー細胞または単球である請求項１〜６のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体の、腫瘍の治療用の薬剤を製造するための使用。
【請求項９】
電磁エネルギーにさらされて光開裂性分子が除去され、抗体の酵素または免疫システムの細胞に結合する能力が活性化される請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
（a）除去するのが望ましい標的細胞；および
（b）ウイルス
に結合でき、ウイルスへの抗体の結合が可逆的に阻害されるように光開裂性分子が結合している二重特異性抗体。
【請求項１１】
標的細胞が腫瘍細胞である請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
（i）細胞毒性剤、放射活性アイソトープ、毒素またはホウ素の担体である細胞と、
（ii）
（a）除去するのが望ましい標的細胞の表面に存在するリガンドまたはレセプターからなる結合対；および
（b）細胞毒性剤、放射活性アイソトープ、毒素またはホウ素の担体である前記細胞
に結合し得る抗体であって、担体細胞への抗体の結合が可逆的に阻害されるように光開裂性分子が結合している抗体
とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
この発明は、可逆的に阻害される抗体、それらの製造及び使用に関する。より詳しくは、この発明は、結合対の部分及び高分子に結合し得る抗体、可逆的に阻害される高分子への結合、それらの製造、それらの使用に関する。
あるタンパク質は、光に不安定な分子で共有結合されており、このために光に不安定な分子が照射で開裂されるまで、その生活性の発現を妨げられることが、示されている［例えば、S Thompsonら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 201, 1213-1219（1994）及びS Thompsonら、Biochemical Society Transactions, 255S, 23（1995）］。
しかしながら、（a）抗体フラグメントが可逆的に阻害されること、又は（b）1以上のリガンドに結合し得る抗体が、1の活性のみに可逆的に阻害されること、のどちらも立証されていない。これらのことがなされているばかりでなく、診断治療で有用かつ驚くべき役割を果たしていることが、現在見出されている。
本発明は、（a）結合対の部分及び（b）高分子に結合でき、高分子への結合能力が光開裂性分子の存在下で可逆的に阻害される抗体を提供するものである。
この発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルに誘導され得る。
用語「結合対の部分（member of a binding pair）」は、接触時に互いに結合する一対の独立体（entity）の部分を意味する。当業者であれば、一般的で特に有用な結合対は抗体ならびに抗原対であることを正しく認識するであろう。しかし、リガンドが結合する多くの他のレセプターが知られている。つまり、この発明の抗体は、レセプターか、より一般的にはレセプターに結合するリガンドで標識されてもよく、例えばホルモンレセプターに結合するホルモンで標識されてもよい。レセプターとリガンドのリストを以下に示す。
抗体は、結合対の部分に対する抗体であるか、又は結合対の他の部分で標識されているため、結合対の部分に結合し得る。したがって、例えばエストラジオールで標識した抗体は、細胞上のエストラジオールレセプターに結合し得る。
考えらえている結合対のもっとも適切な部分は、腫瘍マーカーのような細胞結合レセプターである。
好ましい群では、この発明の抗体は2つの活性部位を有する。これはあらゆる適切な方法でなし得るが、2つの異なるエピトープに対して生じる2つの抗体を結合することが、もっとも好ましいと現在考えられている。このタイプの抗体を、二重特異性抗体としてしばしばここに引用する。通常、このタイプの抗体は二特異性を有し、二以上の抗体が考えられるが、これはあまり好ましくない。
好ましい態様では、この発明は、レセプターに結合し得る第一抗体成分と高分子に結合し得る第二抗体成分（第二抗体成分は光開裂性分子の存在下で可逆的に阻害される）からなる二重特異性抗体を提供する。
第一抗体成分は、全体として免疫グロブリン（例えばIgG）であってもよく、より適切には活性部位を保持するが、Fc領域（例えばFab又はFab12）のないそれらの一部であってもよい。
第二抗体成分は、全体として免疫グロブリン（例えばIgG）であってもよく、より適切には活性部位を保持するが、Fc領域（例えばFab又はFab12）のないそれらの一部であってもよい。
第一ならびに第二抗体成分は、ともに活性部位を保持するが、Fc領域（例えばFab又はFab12）のない抗体の一部であることが、もっとも適切である。
第一抗体成分は標的に対するもので、例えば腫瘍細胞マーカーに対する抗体がある。
第二抗体成分は、標的に局在することが望まれる高分子、例えば酵素に対するものである。
一の態様で、この発明は、腫瘍周辺で細胞毒性のプロドラッグを薬剤に転化することによる癌の治療方法を提供するので、もっとも適切な抗体（及び特に第二抗体成分）は、細胞毒性のない剤から細胞毒性剤を生じ得る酵素に対する抗体である。酵素とプロドラッグは、ADEPT（プロドラッグ酵素直接抗体治療）での使用に適切であることが知られているものが有利である［例えばNew Antibody Technology and the Emergence of Useful Cancer Therapy, Ed.Richard Begent及びAnne Hamblin, pub Royal Society of Medicine Press,特に75-77頁］。
このような酵素は当業者によく知られており、以下：
1.細胞毒性がないホスホリル化されたプロドラッグを薬剤に転化するのに使用できるホスファターゼ（特にアルカリホスファターゼ）、例えば脱ホスホリル化され、エトポシド（etoposie）、マイトマイシン及びドクソルビシン（doxorubicin）を産生し得るエトポシドホスフェート、マイトマイシンホスフェートならびにドクソルビシンホスフェート、
2.グルタミン酸残基が薬剤の不活化に用いられるプロドラッグからグルタミン酸残基を除去することができるカルボキシペプチダーゼ（特にG2）、
3.アミグダリンからシアン化物を産生するのに使用できるβ-グルコシダーゼ、
4.薬剤がセファロスポリンに結合しているプロドラッグのβ-ラクタム環を加水分解することにより、ビウブラスチン（viublastine）又はDAVLBHYDを産生するのに使用できるβ-ラクタマーゼ（特にペニシリナーゼ及びセファロスポリナーゼ）、
5.アセトアミド（例えばフェノキシアセトアミド、誘導体類）からメルファラン又はドクソルビシンを産生することができるアミダーゼ（例えばペニシリンアミダーゼ、フェノキシメチルペニシリンアミダーゼ）、
6.s-フルオロシチシンを5-フルオロウラシルに転化することができるシトシンデアミナーゼ、
7.CB1954を活性アキリル化（aklylating）剤に転化する（特に大腸菌由来の）ニトロリダクターゼ
を含む。
1以上の結合部位を有する酵素は、この発明の使用で所望により用い得ることが理解されるであろう。
当該技術は、細胞の標的化、マーカー、それらに対する抗体の生産に関する文献については充実している。このような細胞とマーカーならびに抗体を生じる方法は一般的に共通しているので、この発明の部分を構成しない。しかしながら、ヒトの結腸直腸癌で見出された癌胎児性抗原が、標準的な方法で108KDの糖タンパク質での免疫化に対してYPC2/12.1のようなモノクローナル抗体を生じることは、言及する価値のあることである。また、抗体は、リンパ腫で見出されるリンコサイト（lincocyte）の共通抗原CD45及び癌細胞により発現されるシトケラチン（cytokeratins）に対して生じ、例えば胸部癌患者のリンパ腺の排液管（draining）で見られる。
他の細胞腫瘍マーカーは、（i）ウイルス:CBVとHPV;（ii）変異又は改変遺伝子:ras、p53、コネキシン（connexin）37、フレームシフト変異（FAP）;（iii）正常なサイレント遺伝子:MAGE（メラノーマ）;iv  アンプレデュレイト（unpredulated）:PEM（MUCI生成物）;異なる抗原:チロシナーゼ、メラン（Melan）、マルト（Mart）1、gp 100、c-erb B2、CEA、HER2、EGFR、CA125、B細胞リンパ腫由来抗体、T-細胞レセプターを含む。
また、（i）抗CEA、例えば結腸直腸癌についてはJ Natl Cancer Inst 81, 688-696（1989）及びCancer Immun Immunother 25, 10-15（1987）, Cancer Res 45, 5769-80（1985）, Cancer 63, 1343-52（1989）;（ii）抗C14（LeY）についてはTen Feizi Biosci Rep 3, 163-170（1993）;（iii）抗791T/36（TAG72gp）についてはJ Cancer 43, 6153-60（1989）、Cancer Res 46, 5524-5528（1986）、Cancer Res 49, 6153-60（1989）（Xoma）;（iv）抗CEA（CEM231）についてはJ Immunol 141, 1053, 4060（1988）;（V）抗TAG72（CC49）についてはCancer Res 48, 4583-96（1988）, 50, 1291-98（1990）, 51, 2965-72, 46, 2325-38（1986）;（iv）抗KS1/4についてはCancer Res 50, 3540-44（1990）, 44, 681-87, Cancer Immun Immunther 28, 171-8;（vii）MAbB3についてはCancer Res 51, 3781-3787;（viii）C242についてはJ.Clin.Inves.90,405-11（1992）;（iv）P-糖タンパク質についてはPNAS 83、7785-89（1986）, Cancer Res 48, 1926-9（1988）及び（x）結腸直腸側方癌、胃癌及び卵巣癌に対する抗体についてはJ.National Cancer Institute 81, 688-696（1989）の引用を留意すべきである。
したがって、この発明の特に好ましい形態は、腫瘍細胞に結合し得る第一抗体成分と酵素に結合し得る第二抗体成分からなり、第二抗体成分は、光開裂性分子で可逆的に阻害されることが理解されるであろう。
用語「光開裂性（photocleavable）分子」は、電磁エネルギー（例えば、可視、UV、X-線等（例えばマイクロ波）の所望の様々な光エネルギー）にさらされて除去され得る抗体に結合するいずれかの剤を意味する。
適切な光開裂性分子は当該分野で周知のものであり、例えばBiological Applications of Photochemical Switches［Ed H Morrison］、Biorganic Photochemistry Series Volume2［J.Wiley & Sons］、特に第1章、第4項、34-50頁を参照としてここに導入する。
用いられる光開裂性分子は、主に選択的な問題であるが、抗体に存在するヒドロキシ又はアミノ残基に結合する試薬を使用するのは、特に容易であることが見出されている。したがって、ホスゲン、ジホスゲン、DCCI等は、光開裂性のエステル、アミド、カーボネート等を広範囲のアルコール類から生じるのに用いることができる。一般に、置換アリールアルカノール、特にニトロフェニルメチルアルコール、1-ニトロフェニルエタン-1-オール及び置換類似体が、用いられる。前記で引用したS Thompsonらの刊行物の方法を用いてもよい。一般に、抗体のクローキング（cloaking）は、環境温度で水性溶液中で生じる。所望により、ジオキサンのような補助溶剤を用いてもよい。このような化学は、抗体のような高分子を誘導する当業者によく知られている。所望により、前記援用刊行物で引用した引用例を考慮してもよい。
プロドラッグを使用した腫瘍の治療では、本発明の抗体を患者に投与し、かつ照射され、（非内因性酵素が用いられるべきであれば）酵素を患者に投与し、プロドラッグ（生体内でより細胞毒性の強い薬剤に転化される）を投与する。
本発明の抗体は、体内に投与及び分布後通常照射されず、例えば2時間〜10日後、例えば1〜8日後、例えば3又は4日後の後照射である。一般に、酵素は、ほとんど照射と同時か、照射の直前、同時もしくは直後（例えば照射から2時間以内）に投与する。プロドラッグは、照射後、例えば2時間〜7日後、例えば1又は4日後から通常投与される。抗体と酵素の投与後の時間のずれは、体の他の部分からの望ましくない腐骨物質の清浄化をさせる。この遅延は省略してもよいが、これは現在好ましいとは考えられていない。
照射領域は、腫瘍が局在するか又は部位が危険（例えばリンパ腺付近）な領域である。治療される腫瘍は、その局在性（例えば、直接的に光エネルギーの適切な源により、又は光ファイバーのような光ガイドを介して達し得る領域付近）のために照射しやすいものが、もっとも適切である。つまり、肺、胃腸管、尿路、精巣（testos）、卵巣及び体腔に生じる腫瘍は、特に適切な部位である。肺、胃、腸及び前立腺（prostrate）のような器官の腫瘍は、体に通す必要なしに容易に照射し得るが、肝臓及び腎臓のような他の領域は、可視又はUV光（例えば、UV-A）を用いて、侵襲性が最小限の外科的手法により利用できる。また、X-線は、治療すべき不透明な組織にも使用できる。
細胞毒性のないプロドラッグは、腫瘍の局部でのみ活性な細胞毒性剤に転化されて治療するので、この発明は、有効量の細胞毒性薬剤が生じるよりも毒性の少ない作用で、遠隔組織の癌組織を治療することを可能にしている。
選択的な観点からは、この発明は、光開裂性分子で可逆的に阻害されるFab又はFab12抗体フラグメントを提供する。
この発明において、光開裂性分子は、抗体の活性部位に又はその付近に局在していてもよい。これは、例えばP Mendelら［J.Am.Chem.Soc., 113, 275-2760（1991）］の方法による活性部位に単一分子を導入してなし得る。
好ましい方法では、光開裂性分子は、1以上、通常は2以上のこのような分子で抗体をコートすることにより、抗体に導入させてもよい。適切な方法には、前記で引用したS Thompsonらによる刊行物の方法が含まれる。つまり、この発明の好ましい抗体（フラグメントを含む）は、2以上、例えば2〜25、より適切には3〜15、例えば4〜8の光開裂性分子を含むものである。このような分子が1のみ含まれる場合には、それは一般的に活性部位に含まれる。
この発明の二重特異性抗体は、人の抗体、又は好ましくは人の抗体のFab又はFab12フラグメントから標準的な方法で製造してもよい。
リガンドをも含むこの発明の抗体は、光開裂性分子が抗体に結合する前又は後のどちらかにリガンドで抗体を標識して製造してもよい。
高分子に対する唯一の結合部位がコーティングにより行なわれる例では、コーティング方法は抗体に行なってもよい（これは、他の反応部位がないか、又は例えば免疫吸着カラムにおける吸着により反応部位が保護されている場合であってもよい）。コーティングが有効であるより一般的な場合、例えば二重特異性抗体の他の抗体成分では、コーティングは、二重特異性抗体を形成する結合前の1成分について行うのがもっとも良い。
この発明の二機能性抗体は、二機能性抗体の製造技術に公知の方法で、第一抗体成分と可逆的に阻害される第二抗体成分を結合して製造できる［例えば「モノクローナル抗体」Production, engineering in clinical applications, Postgraduate Medical Science, Mary, A.Ritter及びHeather M.Ladyman編集、ケンブリッジ大学出版（1995）ISBN 0521473543の二機能性抗体の製造についての開示、特に121〜135頁のS Songsivilai及びP J Lachmannによる項目を参照］。
抗原を固体表面に捕捉し、次いで第二標識抗体を加えて捕捉抗原を検出する免疫アッセイでは、抗原は初期捕捉試薬として溶液中の抗抗原（anti-antigen）抗体と反応させ、次いで異なる第一捕捉抗体及び異なる被検体に対する異なる試験に用いられる標準的な第二捕捉試薬（例えば第二抗体）により、固体表面の複合体を捕捉させてもよい。問題は、捕捉抗体を抗原と反応させた後に、それが第二捕捉剤でコートした表面と接触させねばならないことである。これは、被検体と転移抗体の溶液又は加えられる固相のいずれかで、系の妨害を誘導する。しかしながら、この発明の抗体が以下のような形態で用いられるならば、このような妨害は不要である。というのは、コート表面が最初の反応と二次反応のあいだに存在し、抗体の活性が必要とされるまで遅らされ、次いでUV光にさらされることでスイッチされるからである。つまり、この発明の抗体は、免疫アッセイにも使用できる。
特異的な生物細胞の局在性は、ライフシステム及び工業的な方法にともに重要である。例えば、体の防御システムは、T-細胞、多形核細胞、マクロファージなどのような特異的な細胞を、外来剤又は異常性細胞が同定されている部位に局在化することにより働く。このような部位への細胞の親和性を増大させる発展的な方法、特に異常細胞が腫瘍細胞又は感染細胞（例えば、免疫不全ウイルスの感染細胞）の場合では、多くの重要なことが示されている［Bergら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88（11）:423-7,1991］。細胞膜、レセプター、酵素、付着分子、核酸及び抗体に結合するリガンド、例えばステロイド及び他の物質は、このような細胞の局在化に使用できる物質の全群である。
部位及び部位に局在する細胞にともに親和性を有する二重特異性試薬は、これらの特異的な結合パートナーから製造し得る。実際に、一方が腫瘍細胞、他方が局在性細胞に対する特異性抗体の能力の特異的な組合せは、この点に関しては既に用いられている。二重特異性（及び三重特異性［Tuttら、Journal of Immunology, 147（1）:60-69, 1991］）抗体は、このような局在化のためにつくられている。これらは、二重特異性の場合に、腫瘍部位で局在化する細胞タイプ（又はウイルス［Madyら、Journal of Immunology, 147（9）:3139-3144, 1991］）の抗原エピトープに対する他の抗体結合部位に結合する、腫瘍細胞の抗原エピトープに対する抗体結合部位からなる。したがって、用いられる抗体の特異性は、局在化をなし得るのに有用であるが、特異的に標的化した以外の部位で、細胞（例えば細胞毒性ならびに炎症性細胞）を最小限に局在させるのに重要である。抗体のみで得られるよりも大きな局在化を達成する方法は、このアプローチに顕著な利点を与える。これは、現在この明細書で開示するようになし得る。以下のとおりである。
局在化部位に対する結合部位及び部位の局在性細胞に対する第二結合部位を有する二重特異性試薬がつくられているが、これらの結合部位の少なくとも1つは、活性化されるまで結合が阻害される。このような阻害は、光分解的に開裂されるまで細胞の結合から部位を阻害する光分解開裂性残基で第二結合部位をコーティングする方法でなし得る。つまり、以下
（i）局在化が阻害されない部位に特異的な結合親和性を有するが、可逆的に阻害される局在性細胞に結合親和性を有する試薬、
（ii）局在化が阻害される部位に特異的な結合親和性を有し、かつ阻害されない局在性細胞に特異的な結合親和性を有する試薬、
（iii）局在性部位に特異的な結合親和性を有し、かつ可逆的に阻害される局在性細胞に特異的な結合親和性を有する試薬
のような形態の試薬は、この発明の方法に用いてもよい。
このような局在化試薬の使用の例は、以下のとおりである。
二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対する抗体部位と天然のキラー細胞のような細胞毒性細胞に対する可逆的に阻害される抗体部位からなり、二重特異性抗体が結合する腫瘍部位を有する人に生じる。これは、部位に局在させることができる。他の二重特異性抗体に共通して、他の画分は、網内皮系、特にそれが存在する脾臓、肝臓、腎臓などのようなどこかで非特異的にされるであろう。治療部位は光（例えばUV-A光）にさらされて、その位置で結合する二重特異性抗体の抗細胞抗体の結合部位の活性化を生じる。これらの細胞はその部位に局在し、それらの効果を示す。
このアプローチには多くの利点がある。治療目的の抗体は、望ましいように特異的でないことがよく知られている［Bagshaw K D, New Antibody Technology and the Emergence of Useful Cancer Therapy, Ed.Begent & Hamblin, 79頁、Royal Society of Medicine Press Ltd.1995年）。この明細書のアプローチは、この特異性からなる。二重特異性抗体が活性化されない部位では、細胞は抗体により特異的に局在化されないが、照射した部位内では抗体は活性化される。つまり重要なことに、照射した全部位は、等しくカバーした活性化抗体を必然的に含まないが、そこに見出される抗原エピトープの密度に関しては、部位に特異的に存在する。一定の非特異的な結合の程度は予期されるが、照射領域内でこれをなす抗体は活性化される。しかしながら、非阻害の二重特異性抗体が用いられるならば、非特異的な結合はその小画分である。この方法の別の利点は、従来の二重特異性抗体を用いて、それが（例えば静脈注射により）人に入るとすぐに、局在性細胞に結合できることである。これは、「抗-CD3の特異性を含む特異的な抗体は、全て末梢リンパ球により吸収されるので、ヒトにおける系統的な投与に適切でない」と述べているBarrら［Int.J.Cancer, 43, 501-597;1991］により、抗CD-3の特異性を含む抗体の使用における問題として強調された。これは、治療部位を通る抗体の能力を明らかに減少させる。
この明細書の局在性細胞は、ウイルスを含む。局在性細胞が関与する限り、それらは（i）通常存在する細胞か、例えば治療前に体の一領域に炎症を引き起こすことにより増加した細胞のどちらかの、人にすでに存在する細胞、又は（ii）別の免疫化もしくは非免疫した人から加えた細胞又は人自身から前もって採取した細胞及びそれらの有効性を増大させるために任意に培養処理した細胞、例えばリンホカイン活性キラー（LAK）細胞（Nipponら、Journal of the Nippon Medical School, 58（6）:663-672）;T-細胞のようなクローン細胞も用いてもよい。さらに、細胞は、細胞毒性剤の担体又は物質（例えば腺癌に対して標的化したヒト赤血球における組換えヒトIFNγの被包体）として用いてもよい［Chokriら、Research in Immunology, 143（1）:95-99, 1992）。同様に、放射活性アイソトープ、ジフテリア毒素のような毒素、ホウ素（boron）（連続的なホウ素捕捉処理）を有していてもよく、又は細胞自身がウイルス的に感染していてもよい。
外来剤及び局在性細胞に特異的な抗体は、標準的な方法で得てもよい。多くの例では、それら自身の本来の免疫原性は低いことが好ましい。したがって、人体に適応化した抗体は、二重特異性抗体の技術に良好な作用で用いることができる［Shalabyら、Journal of Experimental Medicine, 175:217-225, 1992］。それらはモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体を用いてもよい。腫瘍細胞の標的は、初期の特許出願（我々の出願を援用）に記載のものを含むが、それらの幾つかは、二重特異性抗体（卵巣癌-Segalら、Imuunobiology, 185;390-402,1992）;胸部癌［Shiら、Journal of Imuunological Methods, 141, （2）:165-75］;結腸癌（抗-CEA）［Jantscheffら、Journal of Imuunological Methods, 163, （1）:91-97,1993］;結腸癌［Beunら、Journal of Imuunological Methods, 150,（6）:2305-2315,1993］;白血病B-細胞［Bohlenら、Journal of Imuunological Methods, 173（1）:55-62,1994];肺癌小細胞［Azuma & Nitani, Japanese Journal of Thoracic Disease, 29（9）:1132-1137, 1991］;腺癌［Chokriら、Research in Imuunology, 143（1）:95-99, 1992］;卵巣及び胸部癌［Journal of Experimental Medicine, 175:217-225,1992］の標的化に既に用いられている。
同様に、多くの異なる抗体が、適切な局在性細胞、例えばT-細胞（前記参照、Bolhuisら、Journal of Cellular Biochemistry, 47:306-310, 1991）;細胞毒性T-細胞クローン［Hagenら、Clinical and Experimental Immunology, 90（3）:368-75（1992］;細胞毒性T-細胞及び活性化末梢血液リンパ球［van Ravenswaayら、Gynecological Oncology, 52（2）:199-206, 1994］;CD3+リンパ球［Malyginら、Immunology, 81（1）, 92-95, 1994］;CDl6+リンパ球［Nittaら、Immunology Letters, 28（1）:31-37, 1991］;FcガンマR111、多形核白血球、マクロファージ及び大顆粒リンパ球に対する低親和性Fcガンマレセプター［Garcia de Palazzoら、International Journal of Biological Markers, 8（4）:233-239, 1993］;B-リンパ球マーカー［Demanetら、International Journal of Cancer-Supplement, 7:67-68, 1992］;骨髄細胞［BAllら、Journal of Hematotherapy, 1（1）:85-94, 1992］;Tリンパ球CD2、CD3、CD4、CD8［Tuttら、Journal pf Immunoloogy, 147（1）:60-69, 1991］;デングウイルス［Madyら、Journal of Immunoloogy, 147（9）:3139-3144, 1991］;リンホカイン活性キラー（LAK）細胞［Nipponら、Journal of the Nippon Medical School, 58（6）:663-672］;NK細胞又は単球［Curnowら、Scandinavian Journal of Immunology, 36（2）:221-231, 1992］に対してつくられている。
いわゆる二重特異性抗体の「フォーク（fork）」は、Ringら［Cancer Immunol. Immunotherapy, 39 41-48;1994］に記載されている。これらは、腫瘍細胞の2つの異なるマーカーに二特異性を有する抗体である。結合のためのフォークについては、腫瘍細胞は、単一の部位が要するよりも大きな特異性を要し、また細胞に対する抗体の親和力は、単一の結合より高い。
本明細書のコーティング技術を用いて、フォークの局在化を阻害し得る1又は両方の結合部位をコートし、腫瘍細胞の局部でのみそれをコートしないことができる。それは、抗体が、腫瘍細胞に対する単一の特異性に結合する結合細胞により除去される機会を減少させる。
二重特異性抗体は、多くの方法でつくられる。例えば、このような結合に利用できる化学的に広範囲な方法のいずれか（例えばグルタルアルデヒド、又は好ましくはSPDP-（N-スクシニミジル-3-［2-ピリジルジチオ］プロピオネートのような多くのより特異的な架橋剤の1つ）で、ある特異性抗体を他の特異性抗体に化学的に結合させることによりつくられる。この明細書で、抗体は、結合部位及びFc領域又は抗原結合部位（例えばFv、Fab、（Fab’））を含むそれらのいずれかのフラグメントを通常の数含有する完全な抗体を意味する。二重特異性抗体の生産に適切な方法は、H.Paulus, Behring Inst. Mitt., 78, 118-132, 1985に記載されている。小さい抗体フラグメントは特に利点を有し、Holligerら［Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90（14）:6444-6448:1993］に記載されているように製造してもよい。
さらに、二重特異性抗体は、抗抗体（anti-antibody）のような架橋結合剤、レクチン又はタンパク質Aのような試薬の方法により、2以上の抗体を結合して生産することができる［Ghetie & Mota, Mol. Immunol. 17, 395-401;1980］。
抗体の軽重鎖は分離でき、かつ互いに組合わせることができるため、それにより幾つかの鎖を他の抗体の鎖に組合わせ、二重特異性抗体を形成する［Paulus,Behring Inst.Mitt., 78, 118-132, 1985;Lebegueら、C.R.Acad.Sci.Paris, Serie 111, 310, 377-382,1990］。
二重特異性抗体が要される2つの抗体の合成は、2つのハイブリドーマからのクアドローマの形成による［Sureshら、Methods in Enzymology, 121, 211, 1986;Bos R,Nieuwenhuitzen W, Hybridoma, 11（1）:41-51,1992］。
二機能性のマウス、ヒトのキメラ抗体の産生は、COS-1細胞において記載されているような遺伝子組換え方法による［De Sutter & Fiers, Molecular Immunology, 31（4）:261-267］。
二重特異性試薬は、その特異性のいずれか1つとしていずれかの特異的な結合パートナーを有していてもよい。この発明の方法に有用な特異的な結合パートナーにより要される特徴は、以下のとおりである；それは、別の結合パートナーに結合し、依然としてその結合対の他の部分に有為に特異的な結合親和性を保持することができる；又は結合する結合パートナーが、それ自身の結合対の部分への結合から可逆的に阻害されてもよい。
このように特異的な結合パートナーの群は、例えば抗体、酵素、リガンド及びビオチンならびにアビジンを含むレセプター、付着分子（例えばICAM-1、E-Selectin、VCAM-1、1-SELECTINならびにEndothelin-1）、レクチン、核酸（例えばDNA & RNA）の範囲内である。
コートした試薬は、可逆的に阻害される1以上のいずれかの数の部位を有していてもよい。1以上の部位が阻害されないままであれば、これは、非阻害部位との連続的な結合前に阻害部位を処理することにより、又は天然に形成する異なる部位か、もしくは阻害物質の添加により部位が阻害される可能性をその部位の特異的な結合パートナーの存在下で特異的に減少させる異なる部位のどちらかによる阻害感受性の相違を考慮することにより、なされる。例えば、二重特異性試薬が、腫瘍細胞マーカーに対するＫ特異性とT-細胞に対するＬ特異性（Ｌ特異性は阻害を要するが、Ｋは要しない）間で必要な場合に、二重特異性抗体は、当該方法のいずれかでつくることができ、抗原Ｋと結合するがＬに対する部位を阻害する。部位の阻害を生じるのに用いた試薬の使用をやめ、二重特異性抗体を抗原Ｋから分離し、所望の種を得ることができる。
この発明の形態の分子は、上で概説した治療上の使用のみならず、大量の細胞の産生方法（例えばバイオ産物）のような工業的な方法における細胞の遠隔（remote）局在をさせるのに、多くの有用性がある。二重特異性試薬は最初にシステムに加えられ、特定の領域に局在させることができ、条件が安定しているときに特定の細胞濃度に達することができる。
また、この技術の多くの診断用の使用を検討が考えられる。例えば、細胞タイプのような特定の被検体を測定する例では、細胞に結合しているあいだに二重特異性抗体を（好ましくは速い反応キネティクスが存在する）溶液に分散したままにし、次いで終了させるべき分析のために、必要な位置（例えば固体表面）に細胞を置いて活性化させることができる利点がある。同様に、特定の試薬がアッセイに用いられる例では、この性質の連続的な結合を導入することが有利である。例えば、単一の試薬混合物（例えば、可逆的に阻害された特定表面に対する活性及び被検体に対する別の活性を有する二重特異性抗体；活性化されるときに二重特異性抗体が結合する特異的な表面；被検体に対する標識抗体）をサンプルに加え、これにより溶液中の二重特異性試薬でサンプルの結合を進め（反応は固体表面より速い傾向がある）、次いで特定表面に対する結合活性を活性化し、その後に特定表面を分離し、標識を決定することができる。
この形態のアッセイの例は、以下のとおりである：
1.  二重特異性抗体は、被検体Ａ及び抗原エピトープＢで標識したラテックス粒子に結合できるが、Ａに対するその活性は、可逆的に阻害される。
2.  ラテックス粒子、二重特異性試薬ならびに溶液中の被検体に対する標識抗体の懸濁液を被検体Ａと接触させ、溶液中の二重特異性試薬と標識抗体を結合させる。
3.  二重特異性抗体の阻害活性を活性化し、ラテックス粒子に結合させる。
4.  ラテックス粒子を分離し、標識を決定し、被検体濃度に関連させる。
活性の有効性が、それらの局在部位への細胞の結合を生じるのに十分高いことは、特に驚くべきことである（低い有効性は、細胞に対して不十分な付着部位を生じる）。
本発明は、結合対の部分及び高分子に結合でき、高分子（高分子は、抗体が細胞に接合し得るように細胞に存在する）への結合能力が、光開裂性分子の存在下で可逆的に阻害される抗体を提供するものである。
また、結合対の部分は細胞であってもよい。したがって、特に適切なこの発明の具体例は、第一細胞及び第二細胞に結合でき、第二細胞への結合能力が、光開裂性分子の存在下で可逆的に阻害される抗体を提供する。
第一細胞は、除去又は少なくとも減少することが好ましい通常の細胞で、例えば腫瘍細胞、マラリアの寄生体等のような寄生体細胞などである。第一細胞は、例えば前記の腫瘍細胞がもっとも好ましい。
第二細胞は、第一細胞の周囲に局在するときに第一細胞を不利にし得る通常の細胞である。細胞の用語は広範囲なもので、ウイルスをも含むが、細胞は原核又は真核細胞が適切であり、哺乳類細胞、ことにヒト細胞がもっとも好ましい。第二細胞は、望ましくない細胞を破壊するヒト免疫システムの細胞、例えば前記のキラー細胞を含むことがもっとも好ましい。
結合対の部分は、細胞結合レセプター（例えば抗体が腫瘍細胞に結合してマーカーを処理するような腫瘍マーカー）の1つであることがもっとも好ましい。
好ましい群では、この発明の抗体は2つの活性部位を有する。これは、いずれかの従来法でなし得るが、2つの異なるエピトープに対して生じる2つの抗体を結合することが、もっとも好ましいと現在考えられている。このタイプの抗体を、しばしば二重特異性抗体として言及する。通常このタイプの抗体は二特異性を有するが、二以上、例えば三特異性も研究されているが、これは好ましくない。
好ましい態様では、この発明は、第一細胞結合レセプターに結合し得る第一抗体成分と、第二細胞結合レセプターに結合できる第二抗体成分からなり、第二抗体成分が光開裂性分子の存在下で可逆的に阻害される二重特異性抗体を提供する。
第一細胞結合レセプターは、腫瘍細胞上のレセプター（適切には腫瘍マーカー）がもっとも適切である。第二細胞結合レセプターは、局在性細胞のレセプター（適切には前述のキラー細胞）がもっとも適切である。
第一抗体成分は、全体に免疫グロブリン（すなわちIgG）であってもよく、より適切には活性部位を保持するがFc領域（例えばFab又はFab12）のないそれらの一部であってもよい。
実施例Ａ
腫瘍細胞の破壊局部を特定するための、可逆的に阻害された二重特異性抗体の使用
T-細胞に対するモノクローナル抗体抗-CD-3 OKT3（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を採取し、以下のように1-（2-ニトロフェニル）エタノール（NPE）で処理する。
まずNaBH4の存在下、0.66gの2-ニトロアセトアセトフェノンを工業メタノール7mlに丸底フラスコ中で溶解する。内容物を連続的に攪拌し、60分間混合させる。次いで、1M HClを一滴滴加したフラスコに10mlの水を加える。10mlのエチルアセテートを加え、混合物を分液ろうとで完全に混ぜる。下層の水相を取出し、捨てる。別の10mlの水で洗浄を繰り返す。上層を回収し、MgSO4を含有する蒸発フラスコに置き、残った水をすべて除去する。調製物をろ紙に通し、透明なNPE溶出物を回収する。次いで、メタノールを60℃でロータリーエバポレーターで除去し、少量の粘性物質を得る。これを、有毒ガス排出装置付実験容器に一晩置く。NPE 44mgと乾燥ジオキサン1ml中のピリジン20.6μｌ溶液に、31.3μlのジホスゲンを加える。すぐに白色沈殿物が生じ、反応を15分で終了させる。次いで、反応混合物を45分間窒素気流中で蒸発させ、未反応物質を除去し、オフワイト色のニトロベンジルオキシカルボニルクロライド（NPE-COCl）をジオキサン1mlに再懸濁する。この実施例の以下の工程は、光感受性試薬を光から保護して行う。次に、pH8.3の0.1M NaHCO3に対して0.5mg／ml濃度で透析した抗-CD-3 OKT3抗体15mlにこの100μlを加え、4時間穏やかに攪拌する。次いで、溶液を0.9％NaClで透析した。次いで、T-細胞に結合を保持している抗体を処理した抗体を4℃のT-細胞懸濁液にさらして除去し、インキュベートし、上清溶液を除去し、HPLCクロマトグラフィーで精製する。次いで、ヘテロ二官能性架橋剤（例えばN-スクシニミジル-3-［2-ピリジジチオ］プロピオネート、SPDP）を用いる標準的な処理で、抗体をヒト結腸癌細胞のLoVoに対するモノクローナル抗体と複合させ、さらに精製してHPLCで1：1複合体の精製調製物を得る。
Barr［Int.J.Cancer, 43, 501-507;1991］によるアプローチの後、Brunnerら［In:B.Bloom & J.R.David（eds）］、In vitro methods in cell-mediated and tumour-immunity［423頁、Academic Press, New York（1976）］の標準的な細胞毒性アッセイにより、51Cr-標識LoVo細胞に対する二重特異性抗体の細胞毒性をマイクロタイタープレートで評価する。細胞毒性T-細胞、標識LoVo細胞、NPE-阻害二重特異性抗体を有し、15分間スペクトルラインEN-16/F UVランプ（Spectronics Corporation, Westbury, New York）にさらしてUV-A光で照射したそれらのウェルは、照射のない同じ混合物又は15分間照射する以外はNPE-阻害抗体のない混合物よりも大きい細胞毒性を示す。また、二重特異性抗体が、細胞毒性試験のウェルに添加する前に、石英グラスのキュベットで最初に15分間UV-A源にさらされる場合、対照より増大した細胞毒性が観察される。
実施例Ｂ
水サンプル中の低レベルの微生物の急速な測定における、可逆的に阻害された二重特異性抗体の使用
2つのモノクローナル抗体（ＰとＱ）を、同時に微生物に結合し得ることが示されている微生物の大腸菌に対する標準的な方法により得る。これは、要約すれば（1）モノクローナル抗体Ｐでマイクロタイタープレートをコーティングし、（2）微生物の懸濁液を加えてインキュベートし、次いで未結合物質を洗浄し、（3）モノクローナル抗体Ｑ［Pierce & Warriner（UK）Maleimide Alkaline Phosphatase Conjugation Kit（1995年  カタログ番号 31492）の方法によりアルカリホスファターゼを適切に標識］を加えて結合させ、未結合物質を洗浄し、かつ（4）残存するアルカリホスファターゼを決定することからなる標準的な方法でなされる。実質的な酵素の反応性をプレートフォーマットを用いる他の免疫アッセイと比較したところ、2つの抗体が同時に微生物に結合できることが分かった。
次いで、この実施例の以下の部分は、光から光感受性試薬を保護して行う。ウシ血清アルブミン（BSA）に対してモノクローナル抗体Ｒを得、この明細書の実施例1のNPEと複合させる。依然としてBSAと反応し得る抗体は、免疫吸着、BSA-ビーズアガロース（Sigma Chemical Co.Ltd.,1995年  カタログ番号 A3790）にさらす方法で除去する。次いで、残存する複合体をSPDPを用いてモノクローナル抗体に結合させ、この明細書の実施例1にあるとおり、再度HPLCで1：1の複合体に精製する。次いで、この複合体Ｚを以下のように試験に用いる。
厚さ1cm、幅2cm及び高さ5cmのポリプロピレンキュベットを用い、50mMの重炭酸塩（pH9.3）のコーディング緩衝液中のBSA 1％溶液1mlをキュベットの底に加え、5分間置いてコーティングさせる。次いで、パスツールピペットを用いて溶液を回収し、0.02％のツイン20を加えた50mMトリス（pH7.4）の洗浄溶液を用いてキュベットを6回洗浄する。複合体Ｚの20μg/ml溶液0.2ml、次いで試験サンプルの水8ml、公知の大腸菌数を含む標準物をキュベットに入れて混合する。次いで、混合物を室温で5分間インキュベートし、存在する大腸菌と複合体Ｚを結合させる。この後、上述の同じ強度のUV-A光に広面積のキュベットをさらし、さらに15分間おだやかに攪拌する。次いで、光保護を不要とする。溶液を除去し、キュベットを洗浄溶液で6回洗浄する。3.3mM MgCl2を含む50mMの重炭酸塩緩衝液（pH10.3）中の10mMの基質パラニトロフェノールホスフェート溶液2mlを次いで加え、405nmの吸光度で適切な変化がもっとも高い標準でキュベットに生じるまで、キュベットをインキュベートする。標準の大腸菌量に対する吸光度の変化をグラフにプロットし、これに対する未知のサンプルを読取る。結果は、非阻害の二重特性抗体が加えられる同時実施例から得られる結果より優れている。というのは、この場合には、望ましい溶液環境で大腸菌の結合が生じるのに十分な時間溶液に残存している阻害された二重特異性抗体と対照的に、幾つかの二重特異性抗体が、キュベット中で大腸菌より前にBSAと結合しているためである。
実施例1：
アルカリホスファターゼ及びCEAに対する阻害抗体
a）標準的な方法及びアルカリホスファターゼ親和性カラムクロマトグラフィーの方法で最終的に精製したアルカリホスファターゼ（Sigma Chem. Co.Ltd., 1994年カタログ 5521頁）に対するポリクローナル抗体
b）1-（2-ニトロフェニル）エタノールをジオキサン中のジホスゲンで処理してニトロフェネチルオキシカルボニルクロライドを得た（S Thompsonら、Biochem.Biphys.Res.Comm., 201, 1213-1219（1994））。
c）腫瘍抗原CEAに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系から標準的な方法で得た。
d）ニトロフェニルエチルオキシカルボニルクロライドのアリコートを、0.1M NaHCO3溶液の1ml中の精製した抗アルカリホスファターゼ1mgに加えた。得た物質は0.9％塩化ナトリウム溶液で透析した。
e）以下のとおり、ヘテロ二官能性架橋剤3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル（SPDP-Sigma Chemical Co.Ltd.1994年カタログ、3415頁）を用いて、腫瘍抗原CEAに対するモノクローナル抗体を、可逆的に阻害された抗アルカリホスファターゼ抗体に結合させた：抗アルカリホスファターゼ抗体（2mg、12mg／ml）とモノクローナル抗体（4.6ml、5.2mg／ml）を、それぞれ0.1Mリン酸カリウム、0.1MNaCl（pH7.5）（結合緩衝液）で透析し、8倍のモルの過剰なSPDP（エタノール中3.2mg／mlのSPDP溶液125μlを各サンプルに加えた）と室温で2時間別々にインキュベートした。モノクローナル抗体を結合緩衝液で再度透析し、抗アルカリホスファターゼを0.1Mの酢酸ナトリウム、0.1M NaCl（pH4.5）に再度透析した。次いで、ジチオスレイトールを抗アルカリホスファターゼに加え、最終濃度を0.02Mにした。室温で30分後、結合緩衝液で平衡化したファルマシアPD10カラムに抗アルカリホスファターゼを通し、すぐにモノクローナル抗体を加えた。室温で4時間インキュベート後、ヨードアセトアミド1mgを加え、タンパク質を硼酸塩緩衝含塩水（pH8.5）中で2.5x90cmのウルトラゲルAcA 22カラムで溶出した。重合物を2画分に溶出し、ミリポアCX-100の浸水性のメンブレンを用いて濃縮した。
実施例2：
腫瘍細胞の生育力の減少
ヒト癌腫から得た細胞系を成長させ、その一部を10,000細胞の密度で10％の胎ウシ血清を有するダルベコ（Dulbecco）の修飾培地（IMDM）のウェルの2つのマイクロタイタープレートに置いた。次いで、IMDMのみを入れたもの（「ゼロの対照」）とは別に、両プレートのウェルにIMDM中のcAbの5μg/ml溶液200μlを入れた。次いで、4℃で1時間プレートをインキュベートし、培養培地を3回変えて未結合抗体を除去した。次いで、S Thompsonら［Biochem. Biophys.Res.Com., 201, 1213-1219（1994）］に記載の方法に類似した方法でUV-A光をプレートにさらした。Senter,PD., Saulner MG., Schrelber GJ.,Hirschberg DL.,Brown JP.,Helstorm KE.［Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 4842-4846（1988）］が記載しているように、ウェルの群に一定範囲以上の濃度を加え、37℃で6時間インキュベートした元のエトポシド化合物（Sigma Chemical Co.Ltd. 1994年カタログ番号E 1383）から、プロドラッグのエトポシドホスフェートを合成し、次いで細胞をさらに12時間洗浄した。次いで、個々のウェル中の細胞をその生育力について評価したところ、UV-A光で前もって照射したウェル中の細胞には、生育力が認められなかった。つまり、これは、照射したウェル中のアルカリホスファターゼの結合による作用であり、この結果、それらのウェル中のプロドラッグのより大きな活性化は、UV-Aの露光後に生育力を残しているゼロの対照細胞により例証された。
実施例3
Glennie MJ、Brennand DM、Bryden F、Stirpe F、Woth AT & Stephenson GT（1987）が記載している方法［Preparation and performance of bispecific F（ab’γ）2 antibody containing thloether-lined Fab’γ fragments, Journal of Immunology, 139, 2367-2375］にしたがって、両方の抗体のF（ab’）2フラグメントから二重特異性F（ab’）2複合体をつくる実施例1を繰り返した。
実施例4
SPDPの代わりに、リンカーM2C2H（Pierce and Warriner 1995年カタログ（カタログ番号 22304）を用いて、実施例1の方法を繰り返した。
実施例5
SPDPの代わりに、リンカーM2C2H（Pierce and Warriner 1995年カタログ（カタログ番号 22304）（すなわち、4-（N-マレイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシヒドラジン）を用いて、実施例3の方法を繰り返した。
実施例1Ａ
酵素の結合能力が紫外線照射で調節可能である二重特異性抗体による結腸癌細胞におけるアルカリホスファターゼの会合
二重特異性抗体の複合体の調製
癌胎児性抗原（CEA）とアルカリホスファターゼ（AP）（Zymed Laboratories Inc.クローン番号ZAP1 カタログ番号 03-2200）に対するモノクローナル抗体を得た。
モノクローナル抗APは、最初にNPEでコートした。0.5mg／ml濃度で、抗体を0.lM NaHCO3で一晩透析した。透析のあいだに容量を3〜4mlに増加した。1mlを対照として保持し、2つの1.5ml画分を採取した。ジオキサン中のジホスゲンとNPEで処理して、ニトロベンジルカルボニルクロライドを調製し［Senter, PD, Tansey, MJ,Lambert, JM & Blattler, WA（1985）, Phtochem. Photobiol., 42, 231-237］、この10μlを1つの1.5ml画分に加え、20μlを他に加えた。サンプルを4時間穏やかに回転して反応させ、次いで0.9M NaClで透析した。対照サンプルの最終濃度は0.21mg／mlであり、処理サンプルの最終濃度は0.135及び0.105mg／mlであった。サンプルは、ほぼ同じ程度（抗体分子当たり平均8〜12NPE残基）で結合し、その結果混合していることが見出された。コートした抗体をさらに精製せずに用いた。NPE-コート抗AP抗体と0.18ml／mlの抗CEA抗体をともにSPDPで誘導した。両抗体の1mlアリコートを、0.1M NaCl、25μl SPDP（エタノール中0.63ml／ml）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に対し0.1ml／ml濃度で透析し、各抗体に加えた。次いで、抗体を30分間置いて反応させた。0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）で抗CEA抗体と抗APを透析し、室温に30分間置いた。調製物を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）の2つのバッチで透析した。次いで、抗CEA抗体を減少させ、NPE-抗AP抗体に加え、24時間20℃で反応させた。次いで、複合体を蒸留水で透析し、望ましくない反応生成物を除去した。収率は、複合抗体の約80％、少なくとも75％であることが電気泳動により示された。
CEA-コートELISAプレートに対するAPのターゲット化
このマイクロタイタープレートを10μg/ml CEA（Calbiochem 1994/5年  カタログ番号 219368）でコートした。次いで、UV光で6分間照射するか又はしていない二重特異性抗体の複合体10μg/mlの各50μlを、0.05％ツインを含むトリス緩衝液（pH7.4）で1mlに希釈し、プレートを通じて、2倍希釈をウェルに加えた。天然の抗CEA及び抗AP抗体は、ともに対照として同様に処理した。2時間後にプレートを洗浄し、100μlの2μg/ml AP、又は対照のウェルのアルカリホスファターゼ（1:1000希釈）で標識した抗マウスIgGをトリス-ツイン緩衝液に加えた。正の対照としてCEA、抗IgG（AP）に結合する活性複合体の存在を検出して、プレートのCEAに結合するSPDPコート抗-CEA抗体（複合体又はそれ以外のどちらか）を確認するために、AP（Biogenesisカタログ番号 0300-1004）を加えた。標準条件下でニトロ-フェノールホスフェートの基質を全ウェルに加えてAPを可視化し、405nmの分光光度計で反応をモニターした。これにより、二重特異性抗体の照射は、非照射の二重特異性抗体との結合よりも、マイクロタイタープレートに結合するより多くのAPを生じることが示された。
CEAを発現する結腸癌細胞に対するAPのターゲット化
CEAを産生する結腸癌細胞は、今回10％胎ウシ血清を含むウェル当たり200μlのDMEM培地で、約90％に密集するまでマイクロタイタープレートに成長させた。次いで、培地100μlを取り出して無血清無培地に1時間置換し、無血清培地（SFM）に細胞を慣れさせた。次いで全培地を除去したところ、SFM 100μlは、2.5μg/mlの二重特異性抗体の複合体（照射がないか、又はスペクトルラインEN/16/F UVランプ（Spectronics Corporation,Westbury, New York）から0.5cmはなした石英キュベットで6分間塩水中で365nmの放射ピークで照射した2mlの二重特異性抗体の複合体サンプルで照射後のどちらか）を含む。アッセイは、各ケースとも10個の複製ウェルで行った。2時間後に全培地を再度除去し、AP（2μg/ml）を含むSFM 100μlを加えた。最終的な2時間のインキュベーション後に、細胞を塩水緩衝液で何度も洗浄（5回）し、APの基質のpNPPを含む基質緩衝液100μlを加え、次いで405nmのマイクロタイタープレートリーダーでAP活性をモニターした。二重特異性複合体を加えていない対照と、二重特異性複合体は加えているが、APのない対照を加えた。これにより細胞のAPの天然レベルの測定が可能になり、またAPを加えた細胞が、十分に洗浄されて非特異的に吸収したAPを全て除去することが示された。
結果は、非照射の二重特異性複合体のみを含むウェルが、APのバックグランドレベル（二重特異性抗体を有しないか、又はAPを加えたウェルと同じ）であることを示した。逆に、照射した二重特異性抗体の複合体を有するウェルは、活性な二重特異性抗体の複合体を通して、CEA産生細胞に結合する結果としてより高いレベルのAP活性を決定づけた。
実施例2Ａ
培養培地における照射
パラ-ニトロフェノールホスフェートの代わりに容易に同定可能な赤色を生じ、二重特異性抗体の複合体の照射のあいだに培養培地の潜在的な影響を調らべるマイクロタイタープレートアッセイ（Dako Diagnostics Ltd. U.K.）におけるAPの検出用の製造者の指示にしたがって、AMPAKキットを用いる酵素増幅システムで実施例1Ａ（前項）を繰り返した。この複合体において、40μg/mlを6分間0.9％塩水又はSFM中の石英キュベットで照射した。次いで、抗体をSFM又は10％FCS含有培地のどちらかで5μg/mlに希釈し、その後CEA産生結腸癌細胞を含む10倍の複製ウェルに加えた。表Ｉは、照射がSFM又は塩水で行われたかどうかに関わらず、非照射の二重特異性抗体の複合体の有するウェルよりも、照射した二重特性抗体の複合体を有するウェルにより、より多くのAPが結合していることが明らかであったこの形態を視覚的に測定した結果を示す。
0004212111.tif 000002
実施例3Ａ
照射時間
実施例2Ａのように酵素増幅システムを用い、2.5μg/ml及び5.0μg/ml濃度の非照射の二重特異性抗体の複合体をプレートの全ウェルに直接加え、その後に細胞を0、3、6、9及び12分の以下の時間で照射した以外は、実施例1Ａ（前項）を繰り返した。表2の結果に示すように、プラスチックプレートによる照射の変性でさえ、APの捕捉の増加は照射時間の増加に強く関連している。
0004212111.tif 000003
実施例3Ｂ
Haismaら［Cancer Immunol. Immunother.（1992）34:343-348］に記載のように、ホスホリル化エトポシドを得る。酵素増幅システムの代わりにHaismaらに記載されるようなエトポシドホスフェートを加えた以外は、実施例2Ａを繰り返した。腫瘍細胞の死は、非照射の二重特異性複合体にさらしていない培地よりも、照射した二重特異性複合体にさらしていない培地で多い。
CEA産生細胞をフラスコで成長させ、実施例1Ａの無血清培地に慣れさせた。次いで、それらをマイクロタイタープレートで培養し、無血清培地中の100μg/ml溶液をウェルの半分に加えた。他の半分には、スペクトルラインランプから0.5cmはなした石英キュベット中で6分間無血清培地中で照射したNPE-コート二重特異性抗体のサンプル2mlで照射した以外は同じ二重特異性抗体の調製物を与えた。細胞を37℃で1時間インキュベートし、その後それらを穏やかに遠心分離して洗浄し、培地を変えた。2μg/mlのアルカリホスファターゼを含むSFM 100μlを各ウェルに加えて37℃で30分間インキュベートし、その後それらを穏やかに遠心分離して洗浄し、SFM中の100μlのエトポシドホスフェート溶液（10μM）［Senterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1988）85:4842により調製］を各ウェルに加え、3時間37℃でインキュベートした。細胞を再度洗浄し、3日間成長させ、その生存能力をスルホルホダミン（sulphorhodamine）B-アッセイで評価した。照射した二重特異性抗体を有するそれらのウェルは、非照射抗体を有するウェルよりも低い細胞の生育力を示すことが見出された。
イン-サイトウ照射
CEAの産生細胞をフラスコで成長させ、実施例1Ａの無血清培地に慣れさせた。次いで、それらをマイクロタイタープレートで培養し、無血清培養液中10μg/ml濃度の実施例1のように調製した100μlのNPE-コート二重特異性抗体の溶液を、ウェルに加えた。ウェルの半分を実施例3Ａに記載のとおり照射した。細胞を37℃で1時間インキュベートし、その後穏やかに遠心分離してそれらを洗浄して培地を変えた。2μg/mlのアルカリホスファターゼを含む100μl SFMを各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートし、その後再度洗浄し、Senterら［Proc.Natl.Acad.Sci. USA（1988）85:4842］により調製したSFM中の100μlのエトポシドホスフェート（10μM）溶液を各ウェルに加え、3時間37℃でインキュベートした。細胞を再度洗浄して3日間成長させ、それらの生育力を評価した。また、NPE-二重特異性抗体、アルカリホスファターゼ又はエトポシドホスフェート又はそれら3つの組合せを有しない対照のウェルをセットした。細胞の生育力をSkehanら［（1990）New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, J. Natl.Cancer Inst. 82:1107］に記載のとおりにスルホルホダミンB-アッセイで評価したとき、NPE-二重特異性抗体、アルカリホスファターゼ及びエトポシドホスフェートを有し、次いでUV光にさらされたウェルは、非照射のウェル又は照射もしくは非照射の対照ウェルよりも多くの死細胞を示す。
実施例4Ａ
二重特異性抗体が紫外線の照射で阻害されていない後に、胎癌性抗原を有する細胞でアルカリホスファターゼの結合する特定のビーズを局在させるための、アルカリホスファターゼに対して可逆的に阻害された結合部位を有し、胎癌性抗原に結合親和性を有する二重特異性抗体の使用
二重特異性抗体の複合体の調製
胎癌性抗原（CEA）及びアルカリホスファターゼ（AP）［Zymed Laboratories Inc.クローン番号ZAP1、カタログ番号03-2200］に対するモノクローナル抗体を得た。
モノクローナル抗APをNPEで最初にコートした。まず、0.5mg／ml濃度の抗体を0.lM NaHNO3で一晩透析した。透析のあいだに容量を3〜4mlに増加した。1mlを対照として保持し、2つの1.5ml画分を採取した。NPEをジオキサン中のジホスホゲンで処理して、ニトロベンジルカルボニルクロライドを調製し［Senter,PD.Tansey, MJ,Lambert,JM & Blattler, WA（1985）, Photochem. Photobiol.,42, 231-237］、この10μlを1.5mlの1つの画分に加え、20μlを他に加えた。サンプルを4時間穏やかに回転させて反応させ、次いで0.9M NaClで透析した。対照サンプルの最終濃度は0.21mg／mlで、処理したサンプルの最終濃度は0.135ならびに0.105mg／mlであった。サンプルは、ほぼ同程度（抗体分子当たり平均8〜12 NPE残基）に結合し、連続的に混合していることが分かった。コートした抗体をさらに精製をせずに用いた。0.18mg／mlのNPE-コートした抗AP抗体と抗-CEA抗体をともにSPDPで誘導した。両抗体の1mlのアリコートを0.1M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に0.1mg／mlの濃度で透析した。次いで、SPDP（エタノール中の0.63mg／ml）24μlを各抗体に加えた。次いで、抗体を30分間反応させた。0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に抗APを透析し、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）に抗-CEAを透析し、ともに4℃で一晩透析した。透析後、0.5M DL-ジチオスレイトール（DTT）100μlを抗-CEA抗体に加え、室温で30分間放置した。調製物を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）の2つのバッチで透析した。抗-CEA抗体を次いで減少させ、NPE-抗-AP抗体に加え、20℃で24時間反応させた。次いで、複合体を蒸留水で透析し、望ましくない反応生成物を除去した。収率は、複合抗体の約85％、少なくとも75％であることが電気泳動で示された。
ビーズの調製
3つの異なる大きさの濃青色ポリスチレンビーズを改変したカルボキシレート（0.22mm、0.4mm及び0.8mm）を得た。ビーズを3回まず洗浄し、蒸留水1mlに10％ビーズの100mlを懸濁して、ビーズをアルカリホスファターゼ（AP）と結合させ、10分間10000RPMの遠心分離でペレット化した。次いで、蒸留水770ml中のMES緩衝液120mlに、蒸留水中の50mg／ml N-ヒドロスクシニム（NHS）230mlとビーズを懸濁し、50mM/mlの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（EDAC）を調製し、すぐに100μlをビーズの調製物に加えた。次いでビーズを2時間放置し、一旦0.lM MES緩衝液（pH4.7）で、次いで0.1M炭酸塩（pH8.4）で洗浄した。次いで、2mg/mlのAP500μlをペレット化したビーズに加えた。容量を同じ緩衝液で1mlに調整し、一晩反応させた。翌日、ビーズを3回洗浄し、マイクロ遠心分離チューブで遠心分離し、次いで1mlのリン酸緩衝塩水で懸濁した。
タンパク質濃度は、ビーズの各セットについて算出した。加えたAPの80％は、各セットに結合を有することが示された。
活性二重特異性抗体の複合体による細胞上のAP標識ビーズの捕捉
今回、10％胎ウシ血清を含むウェル当たり200μのDMEM培地中で、CEA産生結腸癌細胞を約90％の密度までマイクロタイタープレートで成長させた。次いで、100μの培地を除去して1時間無血清無培地で置換し、細胞を無血清培地（SFM）に慣れさせた。次に、全培地を除去したところ、SFM 100μlは、2.5μg/mlの二重特異性抗体の複合体（照射がないか、又はスペクトルラインEN/16/F UVランプ（Spectronics Corporation,Westbury, New York）から0.5cmはなした石英キュベットで6分間塩水中で365nmの放射ピークで照射した2mlの二重特異性抗体の複合体サンプルで照射後のどちらか）を含む。アッセイは、各ケースとも10個の複製ウェルで行った。2時間後に全培地を再度除去し、10μlの各ビーズ懸濁液、次いで無血清培地90μlをそれらのウェルに加えて24時間放置した。プレートを空にし、リン酸緩衝塩水で5回洗浄し、3.3M MgCl2緩衝液を含む50mMの二炭酸緩衝液（pH10.3）中の5mMパラ-ニトロフェノールホスフェート100μlを加え、マイクロタイタープレートリーダーを用いて405nmで酵素の生成物を測定した。これは、全部で3つの大きさを有するビーズのアルカリホスファターゼ活性の測定により確認され、照射していない複合体を有するウェルよりも、照射した複合体を有するウェルに、より大きな活性が関連していることが見出された。
実施例5Ａ
抗CD-3（Tリンパ球活性マーカー）モノクローナル抗体をNPEでコートし、実施例1Ａの抗アルカリホスファターゼ抗体である抗-CEAモノクローナル抗体に結合させた。次いで、これを2つのアリコートに分け、一方を実施例1Ａのように照射し、他方を照射しなかった。次いで、上記実施例1Ａ（CEA発現結腸癌細胞に対するAPのターゲット化）に記載する抗体の複合体濃度を用いる以外はBarrら［Int.J.Cancer（1989）, 43, 501-507］に記載される、得られたT-細胞をターゲット化し、ヒトの癌細胞の溶解を生じる能力についてそれらを比較した。より多くの死細胞が、二重特性抗体を照射していない画分よりも照射した画分で得られた。
イン-サイトウのターゲット化
NPE-コート抗CD3-抗-CEAの二重特異性抗体の複合体を、以下のようにイン-サイトウの活性化に用いる:Barrらに記載されるように、得られたT-細胞をターゲット化し、ヒトの癌細胞の溶解を生じる能力についてそれらを比較する。CEA-を有する細胞を培養し、上記実施例1Ａ（CEA発現結腸癌細胞に対するAPのターゲット化）に記載する無血清培地に慣れさせる。抗体の複合体を2.5μg/ml濃度で無血清培地（SFM）に加えて2時間37℃でインキュベートする。他のウェルは対照ウェルで、抗体の複合体を有しない。ウェルを実施例3Ａに記載するように照射し、細胞をSFMで洗浄する。加えられたT-細胞のCEA-発現細胞の溶解能力は、Barrらのようにして評価した。非照射のウェル又は照射の有無に関わらず二重特異性抗体を有しない対照ウェルよりも照射ウェルにおいて、より多くの細胞溶解が得られた。
レセプターとリガンドのリスト
レセプターは、以下：
神経伝達物質レセプター、
胃レセプター（例えばエンテロガストロン、コレシストキニン、パンクレオチミン及びセクレチン  ヒスタミンレセプター、セロトニンレセプター）、
α及びβ−アドレナリンレセプター、
アルドレナリン（aldrenalin）レセプター、ノルアドレナリンレセプター、
エンケファリスレセプター、エンドルフィンレセプター、メラニン刺激ホルモンレセプター、
アセチルコリンレセプター、
他のホルモンレセプター（例えばインシュリンレセプター及び成長ホルモンレセプター）、
チロキシン、チロトロピン、グルカゴン、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、卵胞（folcile）刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、オキシトシン、バソプレッシン、エリトロポエチン、レニン及びアンギオテニン（angiotenin）、ACTHレセプター、
コルチコステロン、コルチゾル、5α-ジヒドロテストステロン、アルドステロン、1.25-ジヒドロキシコレカルシフェロール、甲状腺ホルモン及びカルシノニン（calcinonin）レセプター、
副腎皮質刺激ホルモン（corticorophin）放出因子レセプター、
サイトカインレセプター（例えば腫瘍壊死因子レセプター）、
免疫レセプター（例えば組織適合性抗原レセプター、T-細胞レセプター及びB-細胞レセプター）、
特異的な薬剤レセプター（例えばジエチルスチルベストロール（エストラジオール-17βレセプター））、
特異的な炭水化物構造物、
レセプターとして使用可能な酵素、
累計的につくられる合成レセプター
であってもよい。
リガンドは、
胃のホルモン及び因子（例えばエンテロガストロン、コレシストキニン、パンクレオチミン、ヒスタミン及びセクレチン）、
神経伝達物質（例えばセロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エンケファリン、エンドルフィン、メラニン刺激ホルモン、アセチルコリン、インシュリンレセプター及び成長ホルモン、チロキシン、チロトロピン、グルカゴン、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、オキシトシン、バソプレッシン、エリトロポエチン、レニン及びアンギオテンシン、ACTH、コルチコステロン、コルチゾル、5α-ジヒドロテストステロン、アルドステロン、1.25-ジヒドロキシコレカルシフェロール、甲状腺ホルモン及びカルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子）、免疫剤（例えば組織適合性抗原）、T-細胞因子及びB-細胞因子及び抗原、特異的な薬剤（例えばジエチルスチルベストロール（エストラジオール-17βレセプター））、
酵素基質、特に可逆的な阻害剤、
合成レセプター用リガンド、
（リガンド又はレセプターであってもよい）特異的な炭水化物結合剤（例えば小麦芽アグルチン（agglutin））、アメリカヤマゴウボウ分裂促進因子
であってもよい。