(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス含有試料中のウイルスを、下記理化学的性質を有するガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とするウイルスの精製方法：
（１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない；
（２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない；
（３）１．５Ｍの塩化ナトリウムの存在下、塩化セチルピリジニウムにより沈殿を形成する。
【請求項２】
ウイルス含有試料中のウイルスを、下記理化学的性質を有するガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とするウイルスの除去方法：
（１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない；
（２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない；
（３）１．５Ｍの塩化ナトリウムの存在下、塩化セチルピリジニウムにより沈殿を形成する。
【請求項３】
フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物が担体に固定化されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルスより選択される請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス含有試料が液体又は気体である請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
担体がゲル状担体、粒子状担体、薄膜状支持体または中空糸状支持体である請求項３記載の方法。
【請求項７】
下記理化学的性質を有するガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物が共有結合により担体に固定化されているウイルス吸着担体：
（１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない；
（２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない；
（３）１．５Ｍの塩化ナトリウムの存在下、塩化セチルピリジニウムにより沈殿を形成する。
【請求項８】
担体がゲル状担体、粒子状担体、薄膜状支持体または中空糸状支持体である請求項７記載のウイルス吸着担体。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、研究および医薬の分野で利用可能な簡便なウイルスの処理方法及び一連の発明を提供する。
従来の技術
マウス、牛、鳥、猿及びヒト等の動物の多くの疾病は、種々のウイルスにより引き起こされる。ヒトにおける代表的なウイルス性疾患としてはたとえばインフルエンザが挙げられるが、近年ではレトロウイルスであるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）により引き起こされる後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）が社会問題となっている。
一方、遺伝子工学の発展により、細胞に外来遺伝子を導入するための種々のウイルスベクターが開発されている。すでにヒトを含めた哺乳動物の細胞に遺伝子を導入するためのウイルスベクターとしてレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来するベクターが実用化されているが、さらにこの技術を利用してヒトの疾病を治療する遺伝子治療法が実用化されつつある。また、バキュロウイルスを利用して昆虫、あるいは昆虫細胞に導入した外来遺伝子を発現させ、所望のタンパクを大量生産する手法が注目されている。
発明が解決しようとする課題
ウイルスにより引き起こされる疾病の予防及び治療法の一つとしてワクチンがある。ワクチンには野生型ウイルスに不活化処理を施したものや病原性の低下した弱毒性ウイルス、あるいはウイルスの構成成分の一部（例えばウイルスの表面タンパク等）などが使用されるが、一般にはこれらのワクチンの製造には精製されたウイルスが原料として使用される。このため、工業的スケールで利用可能であり、かつ信頼性の高いウイルスの精製法が必要とされている。
細胞への遺伝子導入用のベクターとして使用されるウイルスは、使用される目的に応じて十分な純度、及び／あるいは濃度を維持している必要があり、簡便なウイルスの精製、濃縮法は利用価値が高い。
また、輸血用血液や血液由来製剤のような医薬品には血液の供給者が感染していたウイルスが混在している場合があり、患者へのこれらの医薬品の投与がウイルス感染症を引き起こしてしまう可能性がある。このようなウイルスの混在は治療上極めて重要な問題であり、可能ならばウイルスが完全に除去されていることが望ましい。このため、血液や製剤を６０〜８０℃で加熱するなどのウイルス不活化処理が施されることがあるが、熱処理はこれらの医薬品中に含まれる成分のうちの熱安定性の低いものを不活化してしまうおそれがあり、もっと温和で効果的なウイルスの除去方法の開発が望まれている。
本発明の目的は、上記のような種々の状況で利用できる効果的なウイルスの精製方法、及びウイルスの除去方法、ウイルス精製物、ウイルス除去物、及びウイルス吸着担体を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はウイルスの精製方法に関し、ウイルス含有試料中のウイルスをフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とする。
また、本発明の第２の発明はウイルスの除去方法に関し、ウイルス含有試料中のウイルスをフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とする。
また、本発明の第３の発明は第１の発明の方法で得られるウイルス精製物に関し、第４の発明は第２の発明の方法で得られるウイルス除去物に関する。
さらに、本発明の第５の発明はフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するウイルス吸着担体に関する。
本発明者らはウイルスを含有する試料より簡単な方法でウイルスのみを単離、精製する、あるいはウイルスのみを除去する方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物が種々のウイルスに対して高い親和性を有することを見出し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するアフィニティ担体を用いることにより、簡単な操作で、しかも高い純度、回収率でウイルスを精製または除去できることを見出し、本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の方法によるレトロウイルスの精製を示すものである。
図２はＦＦ−セルロファインと硫酸化セルロファインのレトロウイルス吸着能の比較を示すものである。
図３はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示すものである。
図４はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量分布を示すものである。
図５はフコース硫酸含有多糖−ＦのＩＲスペクトルを示すものである。
図６はフコース硫酸含有多糖−Ｆの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。
図７はエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素のｐＨと相対活性の関係を示すものである。
図８はエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示すものである。
図９はセルロファインＧＣＬ−３００を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖−Ｆをエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示すものである。
図１０はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量分布を示すものである。
図１１はフコース硫酸含有多糖−ＵのＩＲスペクトルを示すものである。
図１２はフコース硫酸含有多糖−Ｕの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。
図１３は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。
図１４は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。
図１５は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。
図１６は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図１７は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図１８は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図１９は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図２０は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図２１は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。
図２２は糖化合物（ａ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。
図２３は糖化合物（ｂ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。
図２４は糖化合物（ｃ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。
発明の実施の形態
以下、本発明に関して具体的に説明する。
本発明において、フコース硫酸含有多糖とは、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されている〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式会社、昭和８０年１２月１５日発刊、多糖類化学、第３１９頁、第３２１頁〕。なお褐藻植物由来のフコース含有多糖はフコイダン、フコイジン、フカンと通称されている。
本発明において使用するフコース硫酸含有多糖としては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。フコース含有多糖抽出液の調製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はない。
また、本発明に使用する、フコース硫酸含有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるものであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法を使用することができる。
また、本発明において使用するフコース硫酸含有多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許容される塩を包含する。フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂で処理することによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれらの分解物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の境に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それらの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用いられ、例えばカリウム、ナトリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、ピリジニウム等の有機塩基との塩、及びアンモニウム塩等が挙げられる。
フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、昭和５２年発刊の原色日本海藻図鑑、第２２〜５２頁に記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evanescens）、ガゴメ昆布（Kjellmaniella crassifolia）、マ昆布（Laminaria japonica）、ワカメ（Undaria pinnatifida）等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。
フコース硫酸含有多糖を含有するナマコとしては、例えば、特開平４−９１０２７号公報記載のナマコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus）、ニセクロナマコ（Holothuria leucospilota）等を使用することができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。
フコース硫酸含有多糖には、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを含むもの等がある。以下、本明細書においてはウロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多糖−Ｆとし、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフコース硫酸含有多糖−Ｕとし、両者の混合物をフコース硫酸含有多糖混合物と記載する。これらのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖混合物及びこれらの分解物を本発明に使用することができる。
フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フコース硫酸含有多糖含有粉体を調製することができる。
フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖抽出液を調製することができる。
フコース硫酸含有多糖含有物からの抽出温度、時間としては０〜２００℃、１〜３６０分の範囲から目的に応じ選択すれば良いが、通常１０〜１５０℃、５〜２４０分、好適には５０〜１３０℃、１０〜１８０分の範囲より選択して行うのが良い。
フコース硫酸含有多糖含有率を高めるための抽出物精製手段としては、塩化カルシウム、酢酸バリウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応じこれらを組合せて、精製を行うことができる。
フコース硫酸含有多糖の分解方法としては、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸含有多糖分解方法として公知の方法を使用することができ、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。
通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種類は特に限定されるものではなく、例えばヒバマタ由来のもの、ガゴメ昆布由来のもの、マ昆布由来のもの、ワカメ由来のもの、その他すべての褐藻類由来のものを使用することができる。
フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐藻類の水系溶媒による抽出液を得る。
また、抽出に供する褐藻類はそのまま抽出に供しても良いが、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にしたり、６０〜１００％のアルコールやアセトン等で洗浄したり、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に減少するため有利である。
また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可溶性の酢酸カルシウム、酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため後の精製が有利である。酢酸カルシウムを使用し抽出する際には、１ｍＭ〜１Ｍ程度の酢酸カルシウム溶液で５０〜１３０℃で抽出するのが好ましい。
褐藻類が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、最初から０．２Ｍ以上の酢酸カルシウムを用いると抽出効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したものに、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿を除去すれば良い。
しかしながらフコース硫酸含有多糖をアルギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネシウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クエン酸、リン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液のｐＨや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分子化が進行し易い。加熱温度、時間、ｐＨ等を調整することにより、任意の分解物を調製することができ、例えばゲルろ過処理、分子分画膜処理等により、分解物の平均分子量、分子量分布等を調整することができる。
すなわち本発明で使用するフコース硫酸含有多糖混合物、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ及びこれらの分解物の分子量及び糖組成はフコース硫酸含有多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸含有多糖の抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解され、アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量、分子量分布はその１例にすぎず、フコース硫酸含有多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で１００℃、１時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ３００の分子ふるい膜を使用すれば、分子量分布１０００から１万程度のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆが調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを調製できる。
上記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中性糖等を除くためには、例えば０．２〜０．６Ｍの濃度の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくなるまで塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を加え、沈殿を集めれば良い。必要に応じてこの沈殿を０．２〜０．６Ｍの濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、この沈殿を溶解後陰イオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理したり限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。フコース硫酸含有多糖−Ｆのみを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニウム等で凝集させる際に、０．２〜０．６Ｍの塩濃度ではなく、例えば２Ｍの塩濃度にすれば沈殿はフコース硫酸含有多糖−Ｆのみを含む。またフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液からフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離することができる。
まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に１種又は２種以上の境類を添加しその総濃度を０．６〜２Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。
通常フコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する場合１．５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる（後記図３の説明参照）。例えば上記塩類の塩濃度を１．５Ｍに調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫酸含有多糖−Ｆが沈殿を形成するので、沈殿を除去するとフコース硫酸含有多糖−Ｕの溶液が得られる。必要に応じてこの溶液を濃縮後、４倍量のエタノールなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖−Ｕを沈殿させ、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖−Ｕを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。
フコース硫酸含有多糖−Ｆは下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖であって、例えば後記参考例３〜５に記載のように得ることができる。以下、このフコース硫酸含有多糖−Ｆの理化学的性質を示す。
（１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
フコース硫酸含有多糖−Ｕは下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖であって、例えば後記参考例５、６に記載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質を示す。
（１）構成糖：ウロン酸を含有する。
（２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化する。
次に本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆ及びその製造方法について更に詳細に記載する。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際にはフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよく、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多糖−Ｕを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素はフコース硫酸含有多糖−Ｕを選択的に分解できる酵素であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例えば、ＷＯ９６／３４００４公報に記載のフラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が生産する上記のエンド型フコイダン分解酵素が挙げられる。
本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利に進むように基質濃度や温度、ｐＨ等を設定すればよいが、基質濃度は通常０．１から１０％程度、温度は２０から４０℃付近、ｐＨは６から９付近が望ましい。
また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地に添加し、フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物はフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよいが、具体的には上記記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）又はＷＯ９６／３４００４公報に記載のフコイダノバクター  マリナス（Fucoidanobacter marinus）ＳＩ−００９８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３）が挙げられる。
なお上記のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株はFlavobacterium ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２（国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日）として寄託されている。
また、上記のフコイダノバクター  マリナス  ＳＩ−００９８株はFucoidanobacter marinus ＳＩ−００９８と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１４８７３として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０３（国際寄託への移管請求日：平成８年２月１５日）として寄託されている。
前述のように０．６〜３Ｍの１種類又は２種類以上の塩類の存在下でフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示す。
従ってフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液からフコース硫酸含有多糖−Ｆを分離することができる。
まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６〜３Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こうして塩濃度を調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、沈殿を集めると本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆが得られる。
しかし上記塩濃度を２Ｍ超にすると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆが塩化セチルピリジニウムにより沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する目的では通常１．５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる。
フコース硫酸含有多糖−Ｆ、及びフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナトリウム濃度における、過剰量の塩化セチルピリジニウム存在下における沈殿形成性を図３に示す。
図３の縦軸は沈殿形成率（％）を示し、横軸は塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。図中、点線及び白三角はフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリウム濃度での沈殿形成率を示し、図３中、実線及び白丸はフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナトリウム濃度（Ｍ）での沈殿形成率を示す。
沈殿形成率の測定は、溶液温度８７℃にて、以下のように行った。
フコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれ２％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、これらを様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液を各１２５μｌずつ調製した。次に、塩化セチルピリジニウムを２．５％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した１．２５％の塩化セチルピリジニウム溶液を調製した。
水に溶解している２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．２５％の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿させるには容量で３．２倍必要であった。そこで、各濃度の塩化ナトリウムに溶解した２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各１２５μｌに対して各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解した塩化セチルピリジニウム溶液を４００μｌ添加後、十分かくはんし、３０分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Analytical Chemistry）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を算出した。
次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖−Ｆを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。
フコース硫酸含有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなる。すなわち、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオン源となる薬品を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１ｍＭ以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で十分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェントによりフコース硫酸含有多糖−Ｆを溶出させる。本方法を用いる場合、添加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。
本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆは例えば参考例３に記載のように得ることができる。以下、このフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆはこの例に限定されるものでは無い。
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量をセファクリルＳ−５００（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたとζろ、約１９万を中心とした分子量分布を示した（図４参照）。なお、図４において、縦軸はフェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション  ナンバーを示す。
また、ゲルろ過の条件を下記に示す。
カラムサイズ：３．０８×１６２．５ｃｍ
溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
流速：１．５ｍｌ／分
サンプル濃度：０．２５％
サンプル液量：２０ｍｌ
分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社製）
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの成分を分析した。
まず、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従いフコース量を定量した。
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キット（ともに宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）（宝酒造社製）
溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセトニトリル＝９：１
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
次に、アナリティカル  バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
次に、バイオケミカル  ジャーナル（Biochemical Journal）、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
以上の結果、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル比は約１０：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
１％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのＷＯ９６／３４００４公報に記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応による分解物の生成は認められず、その低分子化も認められなかった。
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆのカルシウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計  ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社製）により測定したところ図５に示すスペクトルが得られた。なお、図５において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ-1）を示す。
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆのナトリウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）により測定したところ、図６に示すスペクトルが得られた。
図６中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、1Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
５．３０（フコースの１位のＨ）、１．１９（フコースの５位のＣＨ3のＨ）
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−１３５度であった。
以上フコース硫酸含有多糖−Ｕと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆが提供される。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆは構成糖としてウロン酸を実質的に含有せず、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成はフコース硫酸含有多糖−Ｆをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｆを調製することができ、本発明において糖組成、還元末端等の理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース硫酸含有多糖−Ｆを使用することができる。
次にフコース硫酸含有多糖−Ｆのみを選択的に分解する酵素を使用することによりフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化分解物が提供される。
酵素源の微生物としてはエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、該エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば特願平８−２０４１８７号明細書に記載のアルテロモナス（Alteromonas）ｓｐ．ＳＮ−１００９株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素をフコース硫酸含有多糖−Ｆに作用させれば、フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素学的低分子化物を得ることができる。
本菌株はアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９と命名され、Alteromonas sp.  ＳＮ−１００９と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］に平成８年２月１３日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１５４３６として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７（国際寄託への移管請求日：平成８年１１月１５日）として寄託されている。
本発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。
該エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは６〜９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養でエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の生産量は最高に達する。
培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
上記のアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダン分解酵素を含まない純化されたエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を得ることができる。
また、上述の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。
（Ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｆに作用して、該フコース硫酸含有多糖−Ｆを低分子化させる。
（ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（ｂ）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用しない。
（ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｄ）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下記式（Ｉ）、（II）、（III）より選択される少なくとも一種以上の化合物が生成する。
0004223550.tif 000002
0004223550.tif 000003
（II）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近である（図７）。
すなわち図７は本酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた曲線であり、点線はネイティブのフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。
（III）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付近である（図８）。
すなわち図８は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた場合の曲線であり、点線はネイティブのフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。
（IV）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたところ、約１０万であった。
（Ｖ）酵素活性の測定方法：
エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素活性の測定は次のようにして行った。
まず、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖−Ｆ、及びＰＡ−ＦＦを下記（１）から（３）の工程により調製した。
（１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製
乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノール中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程をさらに３回繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％の塩化セチルピリジニウムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、８０％のエタノールで繰り返し洗浄し、塩化セチルピリジニウムを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇを得た。
（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇを６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじめ０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）のカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で十分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。
塩化ナトリウム濃度が０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥原品を、３．３ｇ得た。
（３）ＰＡ−ＦＦの調製
上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品１２ｍｇを水４８０μｌに溶解し、１２μｌずつ３６本に分注後、凍結乾燥しグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端をＰＡ化し、ＰＡ−ＦＦを得た。
得られたＰＡ−ＦＦを１５ｍｌの１０％のメタノールを含む１０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液に溶解し、セルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）のカラム（４０ｘ９００ｍｍ）によりゲルろ過し、高分子画分を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ３５００の透析膜を用いて十分透析して脱塩し、次にエバポレーターにより５ｍｌに濃縮してエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の基質用ＰＡ−ＦＦとした。
また、こうして得られたＰＡ−ＦＦを、市販のピリジル−（２）−アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）と比較することにより定量したところ約４０ｎｍｏｌであった。
上記（１）及び（２）の工程により得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆを用いてエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。
すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌのエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
対照として、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の代りに、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
｛（12×2.5）/（100×MF）｝×｛（MF/M）-1｝×｛0.12/（180×0.01）｝＝U/ml
（１２×２．５）／１００：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ）
ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
０．１２：反応液総量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４（８ｍｍ×３００ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
上記（１）〜（３）の工程により得られたＰＡ−ＦＦを用いてエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。
すなわち、８ｐｍｏｌ／μｌのＰＡ−ＦＦ溶液２μｌと、５μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１０μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、２３μｌの水と、５０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ８．２）と、１０μｌのエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、８０μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
対照として、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の代りに、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びＰＡ−ＦＦ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
16×10-6×｛（MF/M）-1｝×｛1/（180×0.01）｝＝Ｕ／ml
１６ｘ１０-6：反応系中に添加したＰＡ−ＦＦ（μｍｏｌ）
ＭＦ：基質ＰＡ−ＦＦの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３（8mm x 300mm）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０％のジメチルスルホキシドを含む２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液
検出：蛍光検出器F-1150（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）をグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端を、ＰＡ化し、様々な分子量のＰＡ化プルランを得た。得られた様々な分子量のＰＡ化プルランを上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算した。
次にエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の作用機作を決定し、分解物を調製した。
（１）エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｆの分解及び分解物の調製
精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆにエンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を作用させ、分解物の調製を行った。
まず、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の生産を行った。すなわち、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン１．０％、酵母エキス０．０２％、前記のガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して十分透析し、６００ｍｌの粗酵素を得た。
こうして得られた粗酵素のうち４０ｍｌと、人工海水４４ｍｌと、前記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの５１０ｍｇと水８６ｍｌを混合し、ｐＨを８に調整し、２５℃で４８時間反応後、セルロファインＧＣＬ−３００によりゲルろ過を行い、４画分に分け、分子量の大きな方から順に、Ｆ−Ｆｄ−１（分子量２５０００超）、Ｆ−Ｆｄ−２（分子量２５０００〜１２０００超）、Ｆ−Ｆｄ−８（分子量１２０００〜６５００超）、及びＦ−Ｆｄ−４（分子量６５００以下）とした。これらの４画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ１７０ｍｇ、２７０ｍｇ、３０００ｍｇ、及び３４０ｍｇ得た。
フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物、すなわち低分子化物のセルロファインＧＣＬ−３００によるゲルろ過の結果を図９に示す。図９において縦軸は４８０ｎｍの吸光度（フェノール硫酸法による発色量）、横軸はフラクションナンバーを示し、１フラクション１０ｍｌである。カラムボリュームは１０７５ｍｌであり、溶出液は１０％のエタノールを含む０．２Ｍの酢酸アンモニウム溶液である。
図９中、白丸印はフコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれゲルろ過した結果を表す。
上記セルロファインＧＣＬ−８００の結果から、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の反応生成物の分子量分布は約１０００〜３万程度である。
（２）酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析
上記のＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の一部をグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端をＰＡ化し、得られた各ＰＡ化糖（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）を４規定の塩酸、１００℃、８時間処理により加水分解し、ＨＰＬＣにより還元末端糖を調べた。
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（4.6mm×150mm）（宝酒造社製）
溶離液：７００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９）：アセトニトリル＝９：１
検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。
流速：０．３ｍｌ／分
カラム温度：６５℃
この結果、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）の還元末端糖は総てフコースであった。
また、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の中性糖組成を下記の方法により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有多糖−Ｆを硫酸加水分解後グライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて構成糖の還元性末端をＰＡ化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を分析したときと同じＨＰＬＣ条件で分析したところ、フコースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立体配位はそれぞれＬ及びＤであったので生成物に関してもＬ−フコースとＤ−ガラクトースのみを測定した。
すなわち、構成糖の一つであるＤ−ガラクトースの含量を調べるためにＦ−キット  乳糖／ガラクトース（ベーリンガーマンハイム山之内社製）を用い、説明書に従ってＤ−ガラクトースのみを測定できる反応系を構築し、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。
更にもう一方の構成糖であるＬ−フコースを定量するために、クリニカル  ケミストリー（Clincal Chemistry）、第３６巻、第４７４〜４７６頁（１９９０）記載の方法に従って、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。
以上の結果Ｌ−フコースとＤ−ガラクトースの比率はＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４それぞれおよそ１００：４４、１００：２７、１００：５、及び１００：１であった。
以上の結果をまとめると、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｆに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量約１０００〜３万程度の低分子化物を生成し、その低分子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高い。なお、低分子化物の還元性末端はすべてＬ−フコースであった。
次に、本酵素の基質特異性を調べるためにフコース硫酸含有多糖−Ｕにフコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を作用させた。
すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌのエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（１．６ｍＵ／ｍｌ）とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
対照として、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素の代わりに、エンド型フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたものを用意し、同様にＨＰＬＣにより分析した。
なお、ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＫＢ−８０４（8mm×300mm）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
その結果、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕを全く低分子化しなかった。
以上、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素をフコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物に作用させることによって、フコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を調製することができる。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物としては、例えばフコース硫酸含有多糖−Ｆ精製品でもよく、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中のフコース硫酸含有多糖濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して選定すればよい。
フコース硫酸含有多糖−Ｆ溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性で、酵素反応は通常８０℃付近で行う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低分子化物の分子量を調整することができる。
次に低分子化物を分子量分画することによって、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｆ低分子化物を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本発明に使用するフコース硫酸含有多糖−Ｆの分解物の乾燥品を調製することもできる。
フコース硫酸含有多糖−Ｕは例えば参考例５、６に記載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質を示すが、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｕはこの例に限定されるものではない。なおフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質は前記フコース硫酸含有多糖−Ｆの理化学的性質の測定方法に順じ行った。
得られた本発明に使用するフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により求めたところ、約１９万を中心とした分子量分布を示した（図１０参照）。なお、図１０において、縦軸はフェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション  ナンバーを示す。
次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの成分を分析した。
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸であった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基はモル比で約１０：７：４：５：２０であった。
次に、フコース硫酸含有多糖−ＵのＩＲスペクトルを測定したところ図１１に示すスペクトルが得られた。なお、図１１において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ-1）を示す。
次に、フコース硫酸含有多糖−Ｕのカルシウム塩のＮＭＲスペクトルを測定したところ図１２に示すスペクトルが得られた。
図１２中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、1Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ５．２７（マンノースの１位のＨ）、５．０７（フコースの１位のＨ）、４．４９（フコースの８位のＨ）、４．３７（グルクロン酸の１位のＨ）、４．０４（フコースの４位のＨ）、３．８２（フコースの２位のＨ）、３．５４（グルクロン酸の３位のＨ）、３．２８（グルクロン酸の２位のＨ）、１．０９（フコースの５位のＣＨ3のＨ）
このフコース硫酸含有多糖−Ｕの凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−５３．６度であった。
フコース硫酸含有多糖−Ｕの構造は特願平８−４５５８３号明細書に記載の様に決定されている。
フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｕの分解及び分解物の精製
精製したフコース硫酸含有多糖−ＵにＷＯ９６／３４００４公報記載のエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。
すなわち、１％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応の進行と共に２３０ｎｍの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｕが分解されていることが判明した。この反応液をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦにより３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に分離精製した。
なお、上記のエンド型フコイダン分解酵素の生産に用いる菌株としては、該エンド型フコイダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例としては例えば、ＷＯ９６／３４００４公報記載のフラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が挙げられる。
酵素反応生成物の構造解析
上記のエンド型フコイダン分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕ中に存在するＤ−マンノースとＤ−グルクロン酸の間のα１→４結合を脱離的に分解する酵素であり、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用させると下記式（Ｉ）、（II）、及び（III）の構造を有するオリゴ糖が生成した。
0004223550.tif 000004
0004223550.tif 000005
以下、詳細に説明する。
上記のＤＥＡＥ−セファロースＦＦで分離精製した３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）をそれぞれ一部だけグライコタッグ及びグライコタッグ  リージェント  キットを用いて還元性末端を、ピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、各ＰＡ化糖（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）を得た。（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）をＨＰＬＣにより分析した。
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
（ア）分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ分析
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＳＨＯＤＥＸ  ＳＢ−８０３（４、６×２５０ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：０．２Ｍ塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシド＝９：１
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０πｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：５０℃
（イ）逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：Ｌ−カラム（４．６×２５０ｍｍ）〔（財）化学薬品検査協会〕
溶離液：５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．５）
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
図１３、１４、及び１５には各々ピリジル−（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）のＨＰＬＣの各溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。
下記に式（Ｉ）、式（II）、及び式（III）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の物性を示す。
図１６に（ａ）の、図１７に（ｂ）の、図１８に（ｃ）のマスのスペクトルを示し、図１９に（ａ）の、図２０に（ｂ）の、図２１に（ｃ）のマスマスのスペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、横軸はｍ／ｚ値を示す。
更に図２２は（ａ）の、図２３は（ｂ）の、図２４は（ｃ）の1Ｈ−ＮＨＲスペクトルを示し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
なお、1Ｈ−ＮＨＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
（ａ）の物性
分子量  ５６４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６８〔Ｍ−Ｈ+〕-
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ4〕-、１５７〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ2Ｏ−Ｈ+〕-、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ+〕-、２２５〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ2Ｏ−Ｈ+〕-、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ+〕-、３１９〔不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ2Ｏ−Ｈ+〕-、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ+〕-、４８３〔Ｍ−ＳＯ3−Ｈ+〕+
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１−Ｈ）、５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，５．８Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．８６（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．０，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ2のＨ2）、３．６５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，６．１Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ3のＨ3）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸塩  １分子（Ｌ−フコースの３位）
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（IV）の通りである。
0004223550.tif 000006
（ｂ）の物性
分子量  ７２４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ７２３〔Ｍ−Ｈ+〕-、３６１〔Ｍ−２Ｈ+〕2-
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ4〕-、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ+〕-、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ+〕-、３２１〔Ｍ−ＳＯ3−２Ｈ+〕2-、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−ＳＯ3−Ｈ+〕-、４１７（Ｍ−Ｌ−フコース−２ＳＯ3−２Ｈ+〕+
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１″−Ｈ）、５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，′−Ｈ）、５．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１．８，１１．０Ｈｚ，５−ＣＨのＨ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝５．８，１１．０Ｈｚ、５−ＣＨのＨ）、３．９９（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、８．８２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｂｒ−ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ3のＨ3）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝１：１：１（各１分子）
硫酸塩  ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マンノースの６位）
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである
0004223550.tif 000007
（ｃ）の物性
分子量  １１２８
ＭＳ  ｍ／ｚ  １１２７〔Ｍ−Ｈ+〕-
ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７〔ＨＳＯ4〕-、１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ+〕-、２２５〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ2Ｏ−Ｈ+〕-、２４３〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ+〕-、３７１〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｌ−フコース−ＳＯ3−２Ｈ+〕2-、４０５（硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ+〕-、７２１〔Ｍ−Ｄ−マンノース−Ｌ−フコース−ＳＯ3−Ｈ2Ｏ−Ｈ+〕-
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ５．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｓ，（１）−Ｈ）、５．１６（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．４７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，（３）′−Ｈ）、４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（２）−Ｈ）、４．１４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（３）″−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．０４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｍ，（４）′−Ｈ），３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８５（１Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．７０（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ2のＨ2）、３．７０（２Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ2のＨ2）、３．６７（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，４″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３″−Ｈ）、３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ3のＨ3）、１．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ3のＨ3）
糖組成  Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルクロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子）
硫酸塩  ２分子（各Ｌ−フコースの３位）
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（VI）の通りである。
0004223550.tif 000008
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに上記エンド型フコイダン分解酵素を作用させると反応の進行と共に脱離反応が起こって２８０ｎｍの吸光度が増加するが、脱離反応の生成物となる不飽和ヘキスロン酸基が主要反応生成物のすべてにることから得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子内にヘキスロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖の多くはフコースであるためフコース硫酸含有多糖−Ｕは一般の多糖より酸に分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している糖鎖中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレート  リサーチ（Carbohydrate Research）、第１２５巻、第２８８〜２９０頁（１９８４）の方法を参考にして、まずフコース硫酸含有多糖混合物を０．３Ｍのシュウ酸に溶解し１００℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が８０００以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後４Ｎの塩酸で酸加水分解し、ｐＨ８に調整後、ＰＡ化し、ＨＰＬＣによりウロン酸の分析を行った。なおＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＮ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（宝酒造社製）
溶離液：２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５
検出：蛍光検出器  Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
なお、ＰＡ化ヘキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィカ（Acta Chemica Scandinavica）、第１５巻、第１３９７〜１３９８頁（１９６１）記載の方法に従い、和光純薬社製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分離したものをＰＡ化することにより得た。
この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合物の糖鎖中に含まれるヘキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。
更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖混合物をあらかじめ上記のエンド型フコイダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合したポリマーは検出されなかった。このことから、上記のエンド型フコイダン分解酵素が脱離反応により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造はＤ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。
更に、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマーをＮＭＲ分析した。
ポリマーのＮＭＲの測定結果を以下に示す。但し、1Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を１．１３ｐｐｍに、13Ｃ−ＮＭＲではトリエチルアミンのメチル基の化学シフト値を９．３２ｐｐｍとして表した。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ５．２５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．００（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、３．７１（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、３．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６８（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、３．５７（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）．、３．５３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、２′−Ｈ）13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）
δ１７５．３（５′−ＣＯＯＨのＣ）、１０２．５（１′−Ｃ）、９９．６（１−Ｃ）、７８．５（２−Ｃ）、７７．９（４′−Ｃ）、７７．０（３′−Ｃ）、７６．７（５′−Ｃ）、７３．９（５−Ｃ）、７３．７（２′−Ｃ）、７０．６（３−Ｃ）、６７．４（４−Ｃ）、６１．０（５−ＣＨ2ＯＨのＣ）
なお、ピークの帰属の番号は下記式（VII）の通りである：
0004223550.tif 000009
Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はそのビシナル結合定数が７．６Ｈｚであることからβ−Ｄ−グルクロン酸であると決定した。
また、マンノースの１位の立体配置はその化学シフト値から５．２５ｐｐｍであることからα−Ｄ−マンノースであると決定した。
構成糖の結合様式は1Ｈ検出異極核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。1Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、13Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
ＨＭＢＣスペクトルにより１−Ｈと４′−Ｃの間及び４′−Ｈと１−Ｃの間、１′−Ｈと２−Ｃの聞及び２−Ｈと１′−Ｃの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合でＤ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。
上記の結果を考え併せると、（ａ）は、還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｂ）は硫酸基が結合した還元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、２個の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つこと、（ｃ）は還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合し、更にそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つことが判明した。
以上、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕは、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を持ち、少なくとも１つ以上のＤ−マンノースにＬ−フコースが結合している構造を有する。
また、下記一般式（VIII）で表される部分構造を有する（但し、式中の少なくとも１つのアルコール性水酸基は硫酸エステル化しており、またｎは１以上の整数を表す）。
0004223550.tif 000010
以上フコース硫酸含有多糖−Ｆと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｕが提供される。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｕは構成糖としてウロン酸を含有し、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも上記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物より選択される１種以上の化合物が生成する。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明で使用するフコース硫酸含有多糖−Ｕをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｕを調製することができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコース硫酸含有多糖−Ｕを提供することができる。
このフコース硫酸含有多糖−Ｕを化学的、物理的、酵素学的に処理することによりその分解物を調製することができ、例えば上記式（Ｉ）、（II）、（III）等の構造を有するオリゴ糖も本発明に使用することができる。
本発明に使用するフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物はウイルスに高い親和性を有し、これらのフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物をウイルス吸着担体として利用することにより、ウイルスの精製やウイルスの除去が簡便に達成される。
フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するウイルス吸着担体としてはフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の有効量を含有すれば良く、使用する目的により、任意のウイルス吸着担体を作製すれば良い。
本発明のウイルス吸着担体をウイルスを含有する試料に接触させ、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に目的のウイルスを吸着させた後、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を選択的に分別することにより、ウイルスの除去又は精製を簡便に行うことができる。ウイルス吸着後のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の分別方法としては、例えば前述のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の分別方法が使用できる。こうして試料からフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を分別することにより、試料からのウイルスの除去が達成される。ウイルスの精製が目的の場合には、分別されたフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物から吸着されたウイルスを適当な方法で溶離、回収すればよい。
また、本発明のウイルス吸着担体は、適当な修飾を施されたフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物に適当な修飾を施されたものを含有したものでも良い。たとえば、ビオチンを結合させたフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するウイルス吸着担体を使用する場合には、試料との分別操作にアビジンを固定化した担体を用いることにより、ウイルスを吸着したフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物をアビジン固定化担体上に回収することができる。なお、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の修飾方法としては、公知の化学的、あるいは酵素的修飾方法を使用することができる。
一方、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を担体に固定化したウイルス吸着担体を作製することができる。特に不溶性の担体を用いて作製されたウイルス吸着担体は特別な分別操作を行うことなく液体試料や空気中などのウイルスの精製、除去に用いることができる。
フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の固定化に用いられる担体には特に制限はなく、たとえばゲル、あるいは粒子状の担体を使用することができる。なお、粒子状の担体としては粒子の表面積の大きな多孔性のものが好適である。また薄膜状支持体や中空糸状支持体を固定化用担体として用いても良い。固定化に用いる担体の材質はアガロース、セルロース、デキストラン等の多糖類、ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジビニルベンゼンボリマー、ポリメタクリレート等の合成高分子、シリカゲル、ガラス等の無機高分子等から使用の目的、方法に応じて適当なものを選択すればよい。
フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の固定化は、利用する担体に応じ、常法（例えば、「新生化学実験講座・タンパク質Ｉ」第２２７〜２８７頁、１９９０年、東京化学同人発行等）に従って実施されるが、例えば、多糖類ゲルを固定化用担体として用いる場合には、多糖類ゲルの有する導入基にフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物中の官能基を共有結合させることにより行われる。
多糖類ゲルへのフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の固定化に当っては、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物中の官能基との結合に適した導入基を有する多糖類ゲルを選択することが必要である。例えば、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物中に存在するカルポキシル基を利用する場合には導入基としてω−アミノアルキル基、あるいはチオール基を有する多糖類ゲルを、また、水酸基を利用する場合には導入基としてエポキシ基を有する多糖類ゲルを使用することにより固定化を実施できる。多糖類ゲルが適当な導入基を有していない場合には、まず公知方法により適当な導入基を付加したうえで固定化に使用すればよい。
こうしてフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物が共有結合によって担体に固定化されたウイルス吸着担体は物理、化学的に安定であり、ウイルス吸着操作、および／あるい溶出操作時においてフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物の試料中への脱離は見られない。このため該担体は、例えば医薬品の製造等へも支障なく使用することができる。
以上のようにして作製されたフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するウイルス吸着担体を用いてウイルスの精製、あるいはその除去を行うことができる。本発明の方法に適用されるウイルス含有試料としては、例えばウイルス感染培養細胞の上清や細胞の破砕物、血液や血清のような生体物質、医薬品、飲料水等の液体試料が挙げられる。また、気体、例えば空気中に浮遊するウイルスを本発明の方法によって除去することも可能である。
本発明のウイルス吸着担体は各種のウイルスに対して結合能を有しており、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス等のウイルスを本発明の方法により精製、あるいは除去することが可能である。
以上、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有するウイルス吸着担体はウイルス除去用の担体、ウイルス精製用の担体として有用である。
本発明の方法はウイルスの精製方法として有用であり、研究を目的として、あるいはワクチンの製造のために高純度のウイルスが必要とされる場合に効果を発揮する。ウイルス濃度の希薄な試料ではウイルスの濃縮手段としても重要である。また、細胞の培養に用いられる培地のような研究用試薬や医薬品などのようにウイルスの混在が望ましくないものについては、ウイルスの除去に本発明の方法を利用することができる。更に、試料中のウイルスの検出を行う場合には、本発明の方法を利用したウイルスの濃縮操作を組み合わせることにより、検出感度を向上させることもできる。
試料中のウイルスを検出する際、その感度を決定する最大の要因は試料中のウイルスの濃度である。本発明を利用することにより、従来法に比べて高感度なウイルスの検出が可能になる。すなわち、検出対象となる試料中のウイルスを本発明のウイルス吸着担体上に捕集した後、担体をそのまま、あるいは担体上のウイルスを適当な操作で回収した後にウイルス検出操作に供することにより、ウイルスを高感度に検出することができる。ウイルス検出の対象となる試料には特に限定はなく、組織、血液、尿といった生体由来試料のほか、医薬品、食品、飲料水、排水、空気、あるいは自然環境中の様々な試料について本発明の方法を適用できる。また、ウイルスの検出方法にも特に限定はなく、検出しようとするウイルスを認識する抗体を使用する方法や、ウイルスの持つ核酸を検出する方法などを適宜選択して使用すればよい。例えば、本発明のウイルス吸着担体を含有する溶液でうがいをした後、うがい液よりウイルス吸着担体を回収し、該担体、あるいは該担体より溶離、回収された濃縮ウイルス試料をウイルス検出操作に用いることにより、口腔中に存在するウイルスの有無やその量を調べることができる。
ウイルスの精製、例えばフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を多糖類ゲルに固定化して作製されたウイルス吸着担体を用いたカラムクロマトグラフィー法による液体試料中のウイルスの精製は以下のようにして行われる。まず上記の担体を充てんしたカラムを調製し、適当な開始緩衝液を用いてカラムを平衡化する。次にウイルスを含有する試料を上記カラムに負荷した後、開始緩衝液等を用いて非吸着物質を洗浄する。必要であれば吸着したウイルスが溶離しない条件で緩衝液の組成を変化させてカラムを洗浄し、ウイルス以外の吸着物を減らすことができる。その後に適当な溶出操作、例えば高濃度の塩を含む緩衝液の使用により吸着したウイルスを溶出液中に回収する。ゲルあるいは粒子状のウイルス吸着担体は上記のカラムクロマトグラフィー法の他、バッチ法による精製にも利用できる。また、薄膜状、あるいは中空糸状支持体を用いて作製されたウイルス吸着担体はそれぞれの担体に適した使用方法で、例えば適当な装置に装着した上で使用することができる。
本発明のウイルス精製方法は簡便、かつ生理的条件に近い状態でのウイルスの精製、及び除去を可能にする。
従来のウイルス精製方法としてはポリエチレングリコールや硫酸アンモニウムを用いた沈殿法があるが、この方法ではウイルスの感染能の低下が大きな問題であり、特に腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）ウイルスでは感染能力が全く失われてしまう。また超遠心分離法や限外ろ過膜を用いた膜濃縮によるウイルス精製法も知られているが、これらの方法は操作が煩雑であり、また、ある程度の感染能の低下は免れない。本発明の方法では試料中のウイルスを不活化させることなく精製、濃縮することが可能となり、ワクチンの製造やウイルスに関する研究を行う上で有用である。
ウイルスの精製に利用可能なクロマトグラフィー用担体としては、硫酸化セルロースが知られており、日本脳炎ウイルス（特公昭６２−３３８７９号公報）、インフルエンザウイルス（特公昭６２−３０７５２号公報）、狂犬病ウイルス（特公昭６２−３０７５３号公報）、レトロウイルス（米国特許５４４７８５９号公報）、アデノ随伴ウイルス［ヒューマン  ジーン  セラピー（Human Gene Therapy）、第７巻、第５０７〜５１３頁（１９９６）］等の精製に利用できることが知られている。しかしながら、下記実施例に示すように本発明のウイルス吸着担体は硫酸化セルロースに比べて高いウイルス吸着容量を有している。また、担体上に存在する硫酸基当たりのレトロウイルス吸着量を比較した場合も本発明のウイルス吸着担体は硫酸化セルロースに比較して優れている。このため、本発明のウイルス吸着担体を使用することにより、より効率的にウイルスの精製、濃縮、あるいは除去を行うことができる。さらに、アデノウイルスは硫酸化セルロースには吸着しないが［バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、第１１巻、第１７３〜１７８頁（１９９３）］、本発明のウイルス吸着担体はアデノウイルスに対しても吸着能を有しており、より広範なウイルス種に対して適用することができる。
また、本発明のウイルス吸着担体を利用することにより、試料中の有効成分を損なうことなく混在するウイルスを除去することも可能であり、医薬品等の製造において特に有用である。
実施例
以下に本発明を実施例をもって更に具体的に示すが、本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例１
ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出
ガゴメ昆布を十分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。
参考例２
ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の精製
参考例１で得られたろ液に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食境を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は９０ｇであった。
参考例３
フコース硫酸含有多糖−Ｆの製造方法
参考例２で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１．２ｇ秤量し、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液に終濃度０．２％となるように溶解し、１．２５％の塩化セチルピリジニウムの１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により集め、この沈殿を５００ｍｌの１．５Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を８回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水５００ｍｌに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は７１０ｍｇであった。
参考例４
フコース硫酸含有多糖−Ｆの培養的精製方法
参考例２で得られたフコース硫酸含有多糖は２種のフコース硫酸含有多糖の混合物であるが、これを６０ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２００ｇと酵母エキス４ｇを加え、３０リットル容のジャーファーメンターに入れ滅菌後、前記ＷＯ９６／３４００４号公報記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を植菌して２５℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離し菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は３６ｇであった。
参考例５
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆの分別精製
参考例２記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を７ｇ秤量し、０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解した。次に、これを０．２Ｍの塩化カルシウムで平衡化した４０００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）のカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムで十分洗浄し、次に、０〜４Ｍの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出を行った。溶出面分のうち塩化ナトリウム濃度が０．０５〜０．８Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｆと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｕを２．１ｇ得た。
また、上記溶出画分のうち塩化ナトリウム濃度が０．９〜１．５Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｕと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｆを４．７ｇ得た。
参考例６
ガゴメ昆布を十分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残漣を得た。この残渣を３６リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。
このろ液を排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器により２リットルに濃縮し、次に、終濃度が１．５Ｍとなるように食塩を添加し５％の塩化セチルピリジニウムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過により１リットルに濃縮し、４リットルのエタノールを添加し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に１００ｍｌの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水２リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥したフコース硫酸含有多糖−Ｕの重量は１５ｇであった。
またこのフコース硫酸含有多糖−Ｕは、前記エンド型フコイダン分解酵素を作用させると上記式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるオリゴ糖が生じた。
実施例１
ＦＦ−セルロファインの調製
参考例３記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ  ８４０ｍｇを５０ｇ（湿重量）のアミノセルロファイン（生化学工業社製）とともに５００ｍｇのＮａＣＮＢＨ4を含む８０ｍｌの反応溶液（０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に添加し、６０℃、６０時間の縮合反応を行った。得られた反応生成物を純水で洗浄した後、４２０ｍｇのグルコースと２１０ｍｇのＮａＣＮＢＨ4を含む８０ｍｌの反応溶液（０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）を加えてさらに６０℃、６０時間縮合反応を行った。得られた反応生成物を３Ｍ  ＮａＣｌ、次いで純水で洗浄した。以下この反応生成物をＦＦ−セルロファインと呼ぶ。
上記のＦＦ−セルロファインは３８μｍｏｌ／ｍｌの硫酸基を有していた。
実施例２
（１）ウイルス上清液の調製
マウス白血病ウイルス由来の組換えレトロウイルスを含有する上清液は以下のようにして調製した。レトロウイルスプラスミド、ＰＭ５ｎｅｏベクター〔エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Exp. Hematol.）、第２３巻、第６３０〜６３８頁（１９９５）〕を含有するＧＰ＋Ｅ８６産生細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４２）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ社製）並びに５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（共にギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨバイオサイエンス社製）中で培養した。なお、実施例２〜４において使用したＤＭＥＭはすべて５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだものである。ウイルス含有上清液は上記産生細胞をセミコンフルエントに生育させたプレートに１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを添加し、一夜培養した後に採集して調製した。採集した培地上清を０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過してレトロウイルス上清液とし、使用するまでは−８０℃で保存した。
上清液のウイルス力価はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を使用して標準的な方法〔ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J. Virol.）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８）〕に従って測定した。すなわち、６ウエルの組織培養プレートの１ウエルあたりに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭを添加し、一夜培養させた後、系列希釈したウイルス上清液と終濃度７．５μｇ／ｍｌのヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）とを各ウエルに加えた。これを３７℃で２４時間インキュベートした後、培地をＧ４１８（終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌ、ギブコ社製）を含有するものと交換してさらにインキュベートを続けた。１０〜１２日後に生育したＧ４１８耐性（Ｇ４１８r）コロニーをクリスタルバイオレットで染色しその数を記録した。各ウエルのコロニー数と添加されたウイルス上清液の希釈倍率をもとに上清１ｍｌ当りに含まれる感染性粒子数（ｃｆｕ／ｍｌ）を算出し、力価を求めた。
（２）ＦＦ−セルロファインを用いたレトロウイルスの精製
実施例２で調製したＦＦ−セルロファイン３ｍｌを脱気し、ディスポーザブルカラム（セパコールミニ、生化学工業社製）に充てんしてベッド体積３ｍｌのカラムを作製した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）でカラムを十分に平衡化した後、実施例１で調製したレトロウイルス上清液３ｍｌをカラムにアプライした。次にカラムを３０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、溶出緩衝液Ａ（３６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）１５ｍｌ、溶出緩衝液Ｂ（８６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）１５ｍｌ、溶出緩衝液Ｃ（１８６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）１５ｍｌを順に添加して吸着物質を溶出させた。カラムからの溶出液はウイルス上清液のアプライ時のものを含めて３ｍｌずつ分取した。
分取された溶出液について２８０ｎｍにおける吸光度を測定すると共に、そこに含まれるウイルス量の測定を行った。ウイルス量の測定には実施例１に記載のウイルス力価の測定法を用いた。分取された溶出液より２００μｌを取り、これに８００μｌのＤＭＥＭ、及び終濃度７．５μｇ／ｍｌのヘキサジメトリン・ブロミドを加えたものを系列希釈したウイルス上清液の代りに用いて、上記同様の操作で出現するＧ４１８耐性コロニーの数を調べた。
得られた結果を図１に示す。ウイルス上清液に含まれる２８０ｎｍに吸収を持つ物質のほとんどはカラムへの添加直後に溶出されているが、ウイルスのほとんどは溶出緩衝液Ａで溶出を行ったところで溶出さ討ている。このことはウイルスがＦＦ−セルロファインカラムに特異的に吸着し、これによって試料中の多くの夾雑物との分離が可能であることを示している。
（３）ＦＦ−セルロファイン、硫酸化セルロファインのレトロウイルス吸着能の比較
ＦＦ−セルロファインと硫酸化セルロースとの性能を比較を以下に示す操作により行った。なお、硫酸化セルロースとしては硫酸化セルロファイン（生化学工業社製）を使用した。この硫酸化セルロファインは８μｍｏｌ／ｍｌの硫酸基を有していた。
ＦＦ−セルロファインと硫酸化セルロファインのそれぞれを用いて実施例２−（２）に記載のレトロウイルスの精製操作を行った。ただし溶出緩衝液Ｂ、およびＣによる溶出操作は省略した。結果を図２に示す。ＦＦ−セルロファインカラムを用いた場合には非吸着画分（素通り、およびＰＢＳ洗浄による溶出画分）にはウイルスが検出されないが、硫酸化セルロファインではこの面分にウイルスの漏出が見られる。また、カラムに吸着した後、溶出緩衝液Ａにより回収されるウイルス量、および両担体に存在する硫酸基当りのウイルス回収量を表１に示す。総回収ウイルス量、硫酸基当りの回収ウイルス量のどちらを比較した場合も、ＦＦ−セルロファインでの値が硫酸化セルロファインを上回っている。このことからＦＦ−セルロファインは硫酸化セルロファインに比較して高いレトロウイルス吸着容量を有していることがわかる。
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実施例３
（１）組換えアデノ随伴ウイルスの作製
以下に示す操作に従い、レポーター遺伝子として大腸菌のｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えアデノ随伴ウイルスを作製した。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム全長を含むプラスミドｐＡＶ１〔ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３７２１５、ジーン（Gene）第２３巻、第６５〜７３頁（１９８３）参照〕にはベクター（ｐＡ１１Ｐ）に由来する２カ所のＸｂａＩ部位が存在する。まずこれらを除くためにｐＡＶ１をＸｂａＩ（宝酒造社製）で消化し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてセルフ−ライゲーションさせた。こうして得られた組換えプラスミド（ｐＡ１１Ｐ由来のＸｂａＩ−ＸｂａＩ小断片が除かれたもの）について、ＡＡＶゲノム上のタンパクをコードする領域と、末端配列（ＩＴＲ）とを容易に分離できるようにＸｂａＩリンカーの導入を行った。すなわち、上記のプラスミドをＮｃｏＩ（宝酒造社製）で部分消化した後、配列表の配列番号１で示される塩基配列を有するＸｂａＩリンカーと混合してライゲーションを行った。得られたプラスミドのうち、ＡＡＶゲノムの５’末端より４４８１塩基の位置に存在するＮｃｏＩサイトに上記のリンカーが挿入されたものを選び、さらにこのプラスミドをＡｖａII（宝酒造社製）で部分消化した後、配列表の配列番号２、３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成されるＸｂａＩリンカーと混合してライゲーションを行った。こうして作製されたプラスミドのうち、ＡＡＶゲノムの５’末端より１９０塩基の位置に存在するＡｖａIIサイトに上記のリンカーが挿入されたものを選んだ。こうして得られた、新たに２カ所のＸｂａＩサイトが導入されたプラスミドをｐＡＶ１ｘと命名した。
プラスミドｐＡＶ１ｘをＸｂａＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行い、ＡＡＶゲノム由来のタンパクをコードする領域を含む約４．３ｋｂのＤＮＡ断片と、ＡＡＶ末端配列を含む約４．４ｋｂのＤＮＡ断片とをそれぞれゲルより回収した。
プラスミドベクターｐＣＭＶβ（クロンテック社製）をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII（ともに宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行ってＣＭＶ（サイトメガロウイルス）immediate early promoter、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、およびＳＶ４０ポリＡシグナルを含む約４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。該断片、および上記のプラスミドｐＡＶ１ｘ由来の約４．４ｋｂ  ＤＮＡ断片の末端をそれぞれＤＮＡブランティングキットを用いて平滑化した後、これらを混合してライゲーションを行い、組換えプラスミドを作製した。該プラスミドをＡＡＶベクタープラスミドと命名した。
一方、プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）をＸｂａＩで消化し、これと上記のプラスミドｐＡＶ１ｘ由来の約４．３ｋｂ  ＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、組換えプラスミドを作製した。該プラスミドをＡＡＶヘルパープラスミドと命名した。
（２）アデノ随伴ウイルス上清液の調製
ヒトアデノウイルス５型（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５）を感染させた２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）にＡＡＶベクタープラスミド、およびＡＡＶヘルパープラスミドをリン酸カルシウム法によって導入した。この細胞を１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で２〜３日間培養した後、遠心分離を行って上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、５６℃、３０分間の加熱処理によって混在するアデノウイルスを不活化し、これをアデノ随伴ウイルス上清液として以下の実験に用いた。
アデノ随伴ウイルス上清液のウイルス力価は以下の操作に従って測定した。コラーゲンコートされた２４ウエルのプレート（岩城硝子社製）を用い、この１ウエルにつき１５０００個の２９３細胞と、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭとを添加して培養した。翌日、培地を除き、新たに１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ  ０．５ｍｌと系列希釈したウイルス上清液０．１ｍｌとを添加し、３７℃で一晩培養した。プレートより培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、０．５％グルタルアルデヒド溶液を加えて室温で３０分間放置し、細胞を固定した。プレートをＰＢＳで洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ溶液（０．０４％Ｘ−Ｇａｌ、５ｍＭ  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ  Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を添加して３７℃で一晩放置した。ｌａｃＺ遺伝子上にコードされるβ−ガラクトシダーゼの活性によって青く染まっている細胞の数を顕微鏡下で計数し、これとウエルに添加されたウイルス上清液の希釈倍率をもとに上清１ｍｌあたりに含まれる感染性粒子数（ｐｆｕ／ｍｌ）を算出してこれを上清液の力価とした。
（３）ＦＦ−セルロファイン、および硫酸化セルロファインを用いたアデノ随伴ウイルスの精製
ＦＦ−セルロファイン、および硫酸化セルロファインカラムを脱気し、それぞれディスポーザブルカラム（セパコールミニ）に充てんしてベッド体積０．５ｍｌのカラムを作製した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）でカラムを十分に平衡化した後、上記のアデノ随伴ウイルス上清液３０ｍｌづつをアプライした。次にカラムを９ｍｌのＰＢＳで洗浄し、溶出緩衝液Ａ（３６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）９ｍｌ、溶出緩衝液Ｂ（８６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）９ｍｌ、溶出緩衝液Ｃ（１８６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）９ｍｌを順に添加して吸着物質を溶出させた。この際、溶出緩衝液Ａ〜Ｃでの溶出液をそれぞれ３ｍｌずつ分取した。
得られた溶出液に含まれるウイルス量を実施例３−（２）に記したアデノ随伴ウイルスの力価測定法に従って定量した。なお、このとき各溶出液の希釈は行わなかった。ＦＦ−セルロファイン、硫酸化セルロファインのどちらの溶出液でも、溶出緩衝液Ａで溶出を行った最初の画分にのみウイルスが存在しており、該面分の感染細胞の数はそれぞれＦＦ−セルロファインが１２６、硫酸化セルロファインが３３であった。このことからＦＦ−セルロファインは硫酸化セルロファインと比較してアデノ随伴ウイルスに対して高い吸着容量を有していることが明らかとなった。
実施例４
（１）アデノウイルス上清液の謂製
ヒトアデノウイルス５型を含有する上清液は以下のようにして調製した。５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で５０〜７０％コンフルエントとなるまで培養した２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７８）にヒトアデノウイルス５型（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５）を感染させ、１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを添加して２〜８日間培養してウイルス粒子を生産させた。培養終了後、回収した２９３細胞を凍結融解を３回繰り返すことによって破砕し、さらに遠心分離を行って上清を回収した。こうして得られた上清をアデノウイルス上清液とし、使用するまでは−８０℃で保存した。
アデノウイルス上清液のウイルス力価は、２９８細胞を使用したプラークアッセイによって測定した。すなわち、２４ウエルの組織培養プレートを用い、この１ウエルにつき２０００００個の２９３細胞と、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭとを添加して２日間培養した。ウエルを１％のＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄した後、１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで系列希釈したウイルス上清液１００μlを添加し、３７℃で１．５時間培養し感染を成立させ、さらに１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを１ｍｌ／ウエル添加して培養を続けた。３〜５日間培養を続けた後に顕微鏡観察によりウエルあたりのプラークの数を数え、ウエルに添加されたウイルス上清液の希釈倍率をもとに上清１ｍｌあたりに含まれる感染性粒子数（ｐｆｕ／ｍｌ）を算出し、これを上清液の力価として用いた。本発明において使用されたアデノウイルス上清液は２．４×１０9ｐｆｕ／ｍｌの力価を有していた。
（２）ＦＦ−セルロファインへのアデノウイルスの吸着
ＦＦ−セルロファインカラムは実施例２−（２）と同様の方法で作製した。上記のアデノウイルス上清液を１×１０5ｐｆｕ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、そのうちの１ｍｌをカラムにアプライした。次にカラムを３０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、続いてカラムに吸着した物質を溶出緩衝液１（８６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）１５ｍｌ、および溶出緩衝液２（１５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ）１５ｍｌを用いて順次溶出させた。
カラムからの溶出液を３ｍｌづつ分取し、そのそれぞれについて実施例４−（１）に記載の方法でウイルス粒子数を計数した。その結果、非吸着面分（素通り、およびＰＢＳ洗浄による溶出画分）には１×１０4ｐｆｕのウイルス粒子が含まれており、アプライされたアデノウイルスの９０％がカラムに吸着したことが示された。また、溶出緩衝液１による溶出画分には２×１０4ｐｆｕ、溶出緩衝液２による溶出画分には３×１０3ｐｆｕのウイルス粒子がそれぞれ含まれていた。
一方、ＦＦ−セルロファインにかえて硫酸化セルロファインを用いてカラムを作製し、上記のとおりのウイルス吸着〜溶出の操作を行った。この場合には、アプライしたウイルスのほとんどすべてが非吸着画分に回収されており、アデノウイルスの硫酸化セルロファインへの吸着は見られなかった。
実施例５
（１）ＦＦ−セルロファインへのバキュロウイルスの吸着
オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa carifornica）マルチヌクレオキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）について本発明のウイルス吸着担体への吸着を調べた。ウイルスの基本的な取り扱い操作はＷ  Ｈ  フリーマン  アンド  カンパニー社、１９９２年発行、オレイリー（O’Reilly）ら著、バキュロウイルス  エクスプレッション  ベクター（Baculovirus Expression Vector）に記載の方法に準じて行った。
実施例２−（２）に記載の方法に準じてベッド体積２ｍｌのＦＦ−セルロファインカラムを作製し、３０ｍｌのＰＢＳでカラムを平衡化した。野生型ＡｃＭＮＰＶ高力価ストック（インビトロジェン社製）を１×１０7pfu／ｍｌになるようにＳＦ９００II培地で希釈し、そのうちの１ｍｌをカラムにアプライした。次にカラムを１６ｍｌのＰＢＳで洗浄し、この際のカラムからの溶出液を４ｍｌずつ分取した（このそれぞれを画分Ａ〜Ｄとした）。さらに２０ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄し、この溶出液を画分Ｅとした。次にカラムに吸着した物質を２００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ、７００ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ、１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳそれぞれ４ｍｌずつを用いて順次溶出した。なお、溶出操作に使用したＰＢＳには終濃度０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した。各ＮａＣｌ濃度のＰＢＳで回収された溶出液を分取し、それぞれを画分Ｆ〜Ｊとした。画分Ａ〜Ｊより２ｍｌずつを取り、それぞれをＳＦ９００II培地に対して透析した後、０．２μｍのフィルターでろ過した。３５ｍｍ径のウエルに３ｍｌのＴＣ  １００培地（ギブコ社製）および１．５×１０5個／ｃｍ2の細胞密度のＳｆ９Ｍ細胞［ウイスコンシン大学、ディーン  モシャー（Deane Mosher）博士より恵与］を添加したものを準備し、このそれぞれに上記のろ液１ｍｌずつを加えて培養した。また、ポジティブコントロールとして２．５×１０6ｐｆｕのウイルスを含む１ｍｌのＳＦ９００II培地を加えたウエル、およびネガティブコントロールとして１ｍｌのＳＦ９００II培地を加えたウエルを用意して同様に培養した。４、７、１１日後にウエルを観察し、プラークの出現、およびプラーク内での多角体の形成からウイルス感染の有無を調べた。結果を表２に示す。表中、（＋）はウイルスの感染が見られたことを、また（−）は感染が認められなかったことを示す。
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表２に示されるように、培養７日後には画分Ｉ、Ｊのウエルのみにウイルス感染が認められたが１１日後では画分Ａ、Ｇ〜Ｊのウエルに感染が見られた。この結果より、バキュロウイルスはＦＦ−セルロファインに吸着されること、およびカラムに吸着されたパキュロウイルスの大部分が７００ｍＭ以上の濃度のＮａＣｌを含むＰＢＳによって溶出されることが示された。
発明の効果
以上詳細に説明したように、本発明によれば、効果的なウイルスの精製又は除去を行うことができ、その各方面における利用は極めて有用である。
本発明の方法では試料中のウイルスを不活化させることなく精製、濃縮することが可能となり、ワクチン等のウイルス由来の生理活性物質、逆転写酵素等の製造やウイルスに関する研究を行う上で有用である。
また、試料中の有効成分を損なうことなく混在するウイルスを除去することも可能であり、ウイルスフリーの血液製剤等の医薬品などの製造において特に有用である。
またウイルスの簡便な濃縮が可能となり、ウイルスの検出等、診断の分野においても極めて有用である。
更に、本発明のウイルス吸着担体を使用することにより、空気中のウイルス除去が高度に可能になり、インフルエンザウイルスの予防、清浄空気の作成において特に有用である。
配列番号：１
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：２
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：２
配列の長さ：７
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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配列番号：３
配列の長さ：７
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：その他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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