(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１と同様にクラスＩＭＨＣ分子の溝の部分への結合を示し、ＩＢ４レクチンと結合、及び、ヒトポリクローナル抗Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ抗体と結合するアミノ酸配列ＤＡＨＷＥＳＷＬ又はＤＬＨＷＡＳＷＶからなる、非自己ペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項２】
非自己ペプチドがアミノ酸配列ＤＡＨＷＥＳＷＬである、請求項１の癌ワクチン。
【請求項３】
非自己ペプチドがアミノ酸配列ＤＬＨＷＡＳＷＶである、請求項１の癌ワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずか１項のワクチンを含有する、癌の治療又は予防のための薬剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずか１項のワクチンを含有する、腺癌の治療又は予防のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
発明の属する分野
本発明は、抗−Galα（1,3）Gal抗体結合ペプチド、及び癌治療におけるそのようなペプチドの利用に関する。
発明の背景
癌免疫療法のためのワクチンを成功させるためには、適切な標的抗原を同定することと、細胞障害性Ｔ細胞反応を起こさせることである（２５）。癌ムチン、特に、ＭＵＣ１（２）はムチン発現が１０倍増加し、細胞表面における（極性よりむしろ）遍在的な分布、及び通常隠れたペプチド配列（特に抗ＭＵＣ１抗体が検知する抗原決定基）を見せる変化したグリコシル化する癌において適切な標的、すなわち、タンデム繰り返し領域（ＶＮＴＲ）の可変数からなるアミノ酸ＡＰＤＴＲ（２７）を提供する。正常なムチンには明らかに存在しないこれらの変化は、免疫療法において、新しい標的を生成する（２８）。ＡＴＤＴＲ配列はマウスでは抗原性があり、抗原が精製ムチン（ＭＨＦＧ）若しくはペプチドとして投与されると、抗体を生成させる（２９）。マウスにおける抗原性のそのような研究は、腫瘍特異ＣＴＬＰが乳ガン、卵巣癌、若しくは膵臓癌の患者のリンパ節に存在するという発見がなければ、人間との関連性は殆どなかったであろう（３０）。このように、理論的には、患者は、ＣＴＬＰを抗癌治療効果を有するＣＴＬＳに変換してＭＵＣ１ペプチド配列で免疫を有するようになる。
出願人は、以前に，マウスＭＵＣ１＋癌モデルにおいて、２０マーのＭＵＣ１ＶＮＴＲペプチド配列（ＧＳＴ融合蛋白質（ＦＰ）として作られた）が、酸化されたマンナンに結合すると（Ｍ−ＦＰ−酸化型）、ＭＵＣ１+マウス癌による感作から防御するＨ−２制限ＣＴＬＳを生成し、さらに、樹立したＭＵＣ１+癌の増殖を早く抑制に導くことを示した（Ｔ１Ｔ細胞の刺激）（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９４００７８９）（３１、３２）。前述のことを基礎にして、腺癌の患者をＭ−ＦＰで免疫し、抗体及び細胞性反応が生じる。それにもかかわらず、患者が自己ペプチドに対して、弱いが免疫反応を示し、Ｔ細胞、及びＢ細胞（免疫）寛容が破壊されるようであることは興味深いことである。免疫反応にもかかわらず、ＭＵＣ１は乳、腎、肺、卵巣のような組織に正常なムチンに存在する自己ペプチドである。それは、遍在するが抗ムチン反応はいずれの正常組織に対しても自己免疫反応を誘導する能力を有している。
驚くべきことに、超急性の移植拒絶反応の問題に関連した抗Galα（1,3）Gal抗体と結合するために開発されたペプチドの研究を進めているときに、ヒトムチンペプチド（表１のmuc 1-11として、muc 1−muc 4遺伝子からできる）もまた抗Galα（1,3）Gal抗体（豪州特許出願番号ＰＮ５６８０／９５を基礎にした、１９９６年９月２７日に出願した係属中の国際特許出願を参照）に結合することが本発明者等により発見された。抗Galα（1,3）Gal抗体に結合するように開発されたペプチドが、同様なヒトムチンペプチドに対する抗体結合特性を示すので、そのようなペプチドは腫瘍抗原に対する免疫反応を生じるのに有用であると仮定された。非自己ペプチドであるので、この免疫反応はＭＵＣ１のような自己ペプチドにより生じるものより大きい潜在力を有する。
従って、本発明の課題は新規な癌免疫療法ワクチン及び癌治療の方法を開発することにある。本発明の他の課題は以下の記述から明らかになるであろう。
発明の要約
本発明の一実施の態様に従って、ＭＵＣ１を擬似するペプチド、若しくは他の癌ペプチド、及び一、若しくはそれ以上の製剤学的に許容できる担体、希釈剤、任意に適切な担体ペプチド、若しくは他の治療薬とからなる癌ワクチンを提供する。
本発明の他の実施の態様によって、ヒト癌患者、若しくは癌に罹り易い患者を治療する方法を提供する。その方法は、当該患者に、ＭＵＣ１、若しくは他の癌ペプチドを擬似するペプチド、及び任意に、一以上の製剤学的に許容できる担体、希釈剤、任意に一以上の適切な担体ペプチド、若しくは他の治療剤とからなる有効量の癌ワクチンを投与することからなる。
発明の詳細な説明
本明細書では特に断らない限り、「からなる（comprise）」又は、その変化した言葉（comprises,comprising）は、記載された要素、又は完全体、又は要素若しくは完全体の群を含有することを意味すると解釈されると認識されるべきである。しかし、他の要素または完全体若しくは要旨または完全体の群を排除するものではない。
ｄ−ガラクトース、メリビオース、スタキオース、メチルーαーｄ−ガラクトピラノシド、Ｄ−ガラクトサミン及びそれらの誘導体のようなαーガラクトシル糖が抗−Galα（1,3）Gal抗体に結合することが、本出願の発明者等によって分かった。Galα（1,3）Gal抗原決定基が高等霊長類（ヒトや旧世界ザル）とは異なる動物の内皮細胞の表面に存在することもまた本発明者等により注目された。高等霊長類は、多数の層内停止コドン、多数の挿入及び欠失がありα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子内でのフレームシフトをもたらし、そのために、機能的なα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼを欠失しているのでGalα（1,3）Galを作らない。それが結果として機能のない疑似遺伝子になる（８、７）。しかしながら、全ての人類はGalα（1,3）Galに対する天然の抗体を持っており（１５、１８）、それはおそらく、リポ多糖の一部としてα結合したＧａｌを有する細菌により免疫されているためであろう。
Griffonia simplicifolia種からの植物糖蛋白質であるＩＢ４レクチンはGalα（1,3）Gal抗原決定基に結合することができることもまた知られている。従って、これらを基礎にして、本発明者等はＩＢ４レクチンと結合するペプチドをスクリーニングすることにより、抗Galα（1,3）Gal抗体に結合することができるペプチドを探し出すことを提唱した。多数のランダムなアミノ酸配列のオクタペプチドが合成し、ファージ陳列ライブラリーに示し，ＩＢ４レクチンに対する結合活性についてスクリーニングすることにより、驚くべきことに、その結果、多数の合成されたペプチドがＩＢ４レクチンとの結合することが示された。同様に、多の既知のペプチドについて、ＩＢ４レクチンとの結合活性についてスクリーニングしたが、さらに驚くべきことに、ＩＢ４レクチンは、腫瘍細胞の表面に非常に多く発現していて（２、１９）、またこのような状況から蛋白質コアの暴露（３）につながる変形グリコシル化を受けたヒトムチンペプチド（ＭＵＣ１−７）の蛋白質コアに結合することが判明した。ランダムペプチドライブラリーから得られたＩＢ４結合合成ペプチド（Gal pep 1 −Gal pep 7）及びムチンペプチドの両者とも抗Galα（1,3）Gal抗体に結合し、癌治療プロトコルに利用することができることが本発明者等によって示された。
明細書の中でペプチド”ＭＵＣ１、若しくは他の癌ペプチドを擬似する”という句は、クラスＩＭＨＣ分子の溝の部分に同様な結合を示す全てのペプチドを包含する。ＭＵＣ１を擬似する指標はＩＢ４若しくは抗Galα（1,3）Gal抗体へ結合することである。抗Galα（1,3）Gal抗体やＩＢ４に対するペプチドの相対的親和性はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセー）を用いて、レクチンや糖による抗体の結合を５０％阻害するのに必要なモル濃度を比較することにより計算できる。この技術の詳細は、”物質及び方法”の見出しのついた実施例でさらに詳述される。本発明のペプチドは二つのアミノ酸からなるペプチドから、２００を越えるアミノ酸からなるポリペプチドをも含む。後で詳述するように、本発明の好ましいペプチドは共通配列ＡｒＸＸＡｒＺ（後で定義される）及びGal pep 1からGal pep 7を含むが、これは本発明を決して限定するものではない。必要な癌ペプチド擬似を示す他のペプチド及び特にGal pep 1−Gal pep 7に類似するが、アミノ酸配列に一若しくはそれ以上の欠失、若しくは修飾を含むペプチドも本発明の範囲に入ると考えられるべきである。本発明を限定するものではないが、ランダムアミノ酸ライブラリーから得られた抗体結合活性を示すペプチドは以下の共通配列を有する：
ＡｒＸＸＡｒＺ：
ここでＡｒ＝トリプトファン（Ｗ），フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ）、
Ｘ＝例えば、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ），イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、若しくはアスパラギン（Ｎ）のような小さい脂肪族、若しくは極性アミノ酸残基、
Ｚ＝例えば、バリン（Ｖ），イソロイシン（Ｉ）、若しくはロイシン（Ｌ）のような分岐脂肪族アミノ酸、
をいう。
図１で、上記共通配列を有するGal pep 1からGal pep 7として示されるペプチドが特に好ましい。他の好ましい化合物はムチン糖蛋白質ＭＵＣ１からＭＵＣ７である（４）。
しかしながら、最も好ましいペプチドは、配列ＤＡＨＷＥＳＷＬを有し、かつ、ＭＵＣ１ＶＮＴＲペプチドＳＡＰＤＴＲＰＡＰ／ＡＰＤＴＲＰＡＰＧ（それぞれ、Ｈ−２Ｄd及びＨ−２Ｌdに結合する）の配置を疑似するGal pep 1ペプチドである。
本出願人は先に、マンナン-ＭＵＣ１-ペプチドで免疫されたマウスが細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）を作るが、抗体は殆ど作らないでＭＵＣ１+腫瘍増殖から保護されていることを示した。同じ特異的抗ＭＵＣ１反応は、本発明のペプチド、特にＫＬＨに結合したＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドで免疫することにより得られる。そこでは、抗ＭＵＣ１（及び抗ＤＡＨＷＥＳＷＬ）ＣＴＬ反応は誘導され、または、産生された抗体、特に特異的腫瘍抑制がマンナンＭＵＣ１ペプチド免疫で得られる以上、若しくは同程度の大きさで起こる。
本発明に適合する、上述のペプチドは他の種のものと結合してもよい。他の種の包含されるものとは、問題のペプチドと、Ｔ細胞によるペプチドの結合に影響を与えることなく、融合できる全ての化学種を含む。特定の例は、例えば、別々の免疫反応を誘導する他の抗原、吸着を支援したり、問題のペプチドをペプチドの有効な半減期を改善するために酵素作用から保護する担体分子である。他の可能性は診断、若しくは治療目的のための免疫アッセー用にペプチドを固体、若しくは液相への結合である。ペプチド結合の特定の例としては、他の血清蛋白質、若しくは高分子への結合である。
本発明は、本発明によるペプチドを包含する癌治療の方法に関する。特に、本発明によるペプチドを含有するワクチンは、癌患者に投与するこにより、腫瘍細胞の表面に著しく発現する異常なグリコシル化ムチンのムチンコアに免疫反応を誘導することができる。ムチンは乳、肝、結腸、前立腺若しくは他の癌の腺癌に発現する。癌を治療するときに、ペプチドを他の担体と結合することは、ガン細胞を認識し、破壊することができるＴ細胞を誘導するために有用である。
本発明は癌治療や自己免疫疾患の治療の方法として、ヒト患者にワクチンを打つ方法に関する。この方法で、本発明のワクチンを癌や自己免疫疾患を患っている、若しくは患いそうなヒト患者に投与することができる。
癌治療において、標的癌細胞を認識し、破壊することができるＴ細胞、若しくは別には、抗腫瘍活性を有する抗体を誘導する免疫反応を誘導するためにペプチドー担体結合体により免疫することができる。
本発明によるワクチンは本発明の単一のペプチド、または、異なる、若しくは類似する抗原決定基をカバーする一連のペプチドを含んでもよい。さらに、若しくは別には、単一のポリペプチドに多数の抗原決定基を供給してもよい。ワクチンの後者のタイプを多価ワクチンという。
本発明の好ましい実施の態様において、ペプチドは例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、若しくは酸化されたＫＬＨのような担体蛋白質と結合して，Ｔ細胞支援を促進する。
ワクチンの生成は一般的に知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USAに従って簡単に作ることができる。
例えば、一日、体重１ｋｇ当たり、約０．０５μｇから約２０ｍｇを投与することができる。投与の方法は、最適の治療反応を提供できるように調整することができる。例えば、一日に数回に分けて投与してもよいし、治療状況の要求により示されるのに比例して投与量を減じることもできる。活性化合物は例えば経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、若しくは座薬で又は埋込（例えば、腹腔内ルート、若しくは細胞、例えばin vitroで感作された単球若しくは樹状突起細胞を用いて徐放分子を用いて、受容者に選択的に運搬する）等のような簡便な方法で投与することができる。投与経路に依存して、ペプチドは酵素の作用、酸、及び当該成分を不活性化する他の天然の条件から保護されるために物質でコートされる必要がある。
例えば、ペプチドはそのの低い疎水性のため、消化管でペプチド結合を分解することのできる酵素により、および胃の中で酸による加水分解により破壊されるようになる。非経口投与（血管・組織内投与）投与以外の方法でペプチドを投与するために、それらはコートされているかその不活性化を防ぐ物質とともに投与される。例えば、アジュバントで、ペプチドは酵素阻害剤と一緒に若しくはリポソームで投与される。ここで意図されているアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン系表面活性剤を含む。酵素阻害剤としては膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＥＰ）、トラシロールを含む。リポソームには従来のリポソームのみならず水−油−水ＣＧＦ乳化液も含まれる。活性化合物は非経口的に、若しくは腹腔内にも投与できる。分散剤もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物及びオイルの中で調製することができる。保存や使用時の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。
注射用に適切な製剤剤形は滅菌水溶液（水溶性の場合）、滅菌注射用溶液若しくは分散剤を必要に応じて調合するための分散剤及び滅菌粉剤が含まれる。全ての場合において、剤形は滅菌されていなければならないし、注射できるようにある程度の流動性がなければならない。製造や保存の条件下では安定でなければならないし、細菌や真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体としては、溶媒または分散媒体、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールのようなもの）、それらの適当な混合物、及び植物油を用いることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材の使用、分散剤の場合必要な粒子サイズの維持、界面活性剤の使用などにより維持する。微生物の作用は、例えばクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、テオマーサルのような抗細菌剤や抗真菌剤を用いるにより防止できる。多くの場合、蔗糖や塩化ナトリウムのような等張化剤を含有させることが好ましい。注射用組成物を持続的に吸収させるためには、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン等のような吸収遅延剤を組成物の中に使用する。
滅菌注射用溶液は、活性化合物を必要とされる量、適当な溶媒中に上述の他の成分と混ぜ合わせ、必要に応じて、濾過滅菌して調製する。一般に、分散剤は各種の滅菌活性成分を、分散基礎媒体、及び上述のものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビークルに混ぜ合わすことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉剤の場合、好ましい調製の方法としては、それらの滅菌濾過した溶液から、前もって活性成分及び必要とされるすべての付加的な成分の粉末を生成することのできる真空乾燥及び凍結乾燥技術を用いる。
ペプチドが上述したように適当に保護されている場合、活性化合物は、例えば不活性希釈剤や同化できる可食性担体とともに経口投与することができる。また、それは硬殻または軟殻ゼラチンカプセルに包含させもよく、圧縮成型して錠剤の形にしてもよく、直接食餌用の食物と混ぜ合わせていてもよい。経口投与治療のために活性化合物は賦活剤と混ぜ合わせ摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシール、懸濁剤、シロップ、ウェーファー等のようなモノの剤形で使用される。そのような製剤や組成物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有する。組成物及び製剤の％は、もちろん変化させることができ、約５％から約８０重量％の単位の間で使い易いようにできる。そのような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は適当な投与ができるような量である。本発明の好ましい組成物若しくは製剤は経口投与単位剤形が約０．１μｇから２０００ｍｇの活性化合物を含むように調製される。
錠剤、丸剤、カプセル等は以下のモノを含むことができる。すなわち、ガム、トラガカント、アカシア、とうもろこし澱粉、ゼラチンなどの結合剤；リン酸カルシウムのような賦形剤；とうもろこし澱粉、馬鈴薯澱粉、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；蔗糖、ラクトースやサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、冬緑油、チェリーフレーバーなどのような香味剤を添加することができる。投与単位剤形がカプセルの場合、上記のタイプの成分に加えて、液状担体を含有することができる。各種の他の物質がコーティングないしは他の方法で投与単位の物理的な形を修飾するのに存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、シェラック、蔗糖、若しくは両者でコーティングすることができる。シロップやエリキシルは活性化合物、甘味剤としての蔗糖、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、チェリー若しくはオレンジ香味のような色素や香味料を含むことができる。勿論、あらゆる投与単位剤形を調製するのに使用されるどのような物質も製剤学的には純粋で用いられる量では実質的に毒性を示さないものでなければならない。さらに、活性化合物は徐放性調合剤及び製剤に入れることができる。
ここで使用されている”製剤学的に許容しうる担体及び／若しくは希釈剤”には、全ての、いずれの溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などを含む。製剤学的活性物質のためのそのような媒体や薬剤の使用は当業者に良く知られている。活性成分に不適合な従来の媒体や薬剤を除いては、治療組成物中にそれらを使用することが意図されている。補足的な活性成分もまた組成物に含ませることができる。
投与のし易さ及び投与量の一様性のために、投与単位剤形に非経口投与組成物を成型するのが特に好都合である。ここで用いられる投与単位剤形は治療されるべき哺乳類の患者のために単一の投与剤として適した物理的に分離している単位をいう。各単位は、所望の治療効果が得られるよう計算され、予め決められた量の活性物質を必要とされる製剤学的担体と共に含有する。本発明の新規な投与単位剤形の特性は、（ａ）活性物質のユニークな特性、及び達成されるべき特定の治療効果及び、（ｂ）本明細書で詳述されるように肉体的健康が損なわれて病気の状態で生存している患者の病気の治療のための活性物質を調合する技術分野に固有の制約によって支配され、若しくは依存する。
主たる活性成分は前述の如く投与単位剤形の中に適切な製剤学的に許容できる担体とともに有効量を簡便で有効な投与のために調合される。単位投与剤形は、例えば、主要活性化合物を０．５μｇから２０００ｍｇの範囲の量含んでいる。比例的に表現すると、活性化合物は一般に、約０．５μｇ／ｍｌからの担体に存在する。補足的な活性成分を含有する組成物の場合には、投与量は当該成分の投与の通常の投与量及び方法を参考にして決められる。
さらに本発明の他の局面はペプチドに対する抗体に向けられる。そのような抗体はモノクロナルでもポリクロナルでもよく、ペプチドに対する天然の抗体から選択することができるし、ペプチドに対して特異的に作られたものでもよい。後者の場合は、ペプチドは最初に担体分子と結合させる必要がある。本発明の抗体及び／若しくはペプチドは免疫治療やワクチン化に特に有用で、感染症や、ワクチン化や治療レジメの進展を追跡する診断道具として用いることができる。
本発明の他の局面は、本発明の蛋白質をコードする核酸配列が提供される。好ましくはその核酸配列はGal pep 1をコードする。
核酸配列はＤＮＡ，ＲＮＡ、若しくはそれらの混合物でもよい。核酸配列、若しくは単離された核酸は、例えばプラスミド、ウイルスベクター等の当業者によく知られている複製するＤＮＡ，ＲＮＡ，若しくはＤＮＡ／ＲＮＡベクターに挿入される（Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manul、Coldspring Harbour Laboratory Press,NY、第２版、1989）。本発明の抗体をコードする核酸配列はプロモーター、エンハンサー及び、発現、転写、翻訳に必要な他の制御配列を含むことができる。そのような配列をコードするベクターは追加の遺伝子、及び／若しくは選択マーカー及び細胞内でベクターが増殖、維持できるために必要な要素の挿入のための制限酵素部位を含むことができる。
本発明の抗体をコードする核酸配列は当業者によく知られているホモロガス組換技術に用いることができる。その技術とは、Capechi M R,Altering the Gene by Homologous Recombination,Science 244:1288-1292;Merleno G T,Trannsgenic Animals in Biomedical Research,FASEB J 5:2996-3-001,1992;Cosgrove等、Mice Lacking MAHC class II Cell 66:1051-1066,1991;Zijlstra等,Germ-Line Transmission of a Disrupted B2-Microglobulin Gene Produced by Homologous Recombination in Embryonic Stem Cells,Nature 342:435,1989）。そのような技術において、本発明のペプチドをコードする核酸配列は１から約５００細胞からなる幹細胞、卵、若しくは新たに受精した細胞の染色体配列に組換えられる。ホモロガス組換で用いられる核酸配列は単離された核酸配列の形で、若しくはベクターの環境のなかにある。形質転換による新規な活性遺伝子の挿入も含まれる。
本発明を、以下の限定するわけではない図や実施例を参考にして説明する。
図について
図１．ＩＢ４レクチンで処理することにより単離されたファージのアミノ酸配列。アミノ酸配列は、２００ｍＭ  α−メチルガラクトシドとともにＩＢ４レクチンから溶出したファージからのｐIIIのアミノ末端のオクタペプチドをコードするＤＮＡ配列から演繹される。
図２．赤血球凝集反応のペプチドによる阻害。Gal pep 1（○）、若しくはCD48 pep 1（◆）（横軸はｍＭで示されている）の濃度を変化させて、ブタＲＢＣを標的として、そして（Ａ）ＩＢ４レクチン（１μｇ／ｍｌ）、若しくは（ｂ）NHS（最終希釈１／３２）のいずれかを用いて赤血球凝集アッセーで検査した。
図３、Gal pep 1により引き起こされる阻害の細胞蛍光グラフィック分析，（Ａ）；PIEC細胞をＩＢ４レクチン（１μｇ／ｍｌ）で染色する。（Ｂ）PIEC細胞をNHS（最終希釈１／５０）と抗ヒトＩｇで染色する。（Ｃ）ＰＢＬをＩＢ４レクチン（μｇ／ｍｌ）で染色する。ペプチドは、５ｍＭ（ＡとＣ）及び２０ｍＭ（Ｂ）で用いられる。各パネルで、プロフィル”ａ”はGal pep 1存在下での結合を示し、プロフィル”ｂ”はCD48 pep 1の存在下での結合を表す。ＩＢ４レクチンとＮＨＳの両者のペプチド無しの結合プロフィルは、各パネルのプロフィル”ｂ”と同一である（明快なため示さず）。
図４、天然抗体及び細胞障害性の阻害及びGal pep 1による補充。Gal pep 1（○）、若しくはCD48 pep 1（◆）の濃度（横軸はｍＭを示す）を変化させながら、ＮＨＳ（最終希釈１／２５）及びＰＩＥＣ細胞を標的として用いて、細胞障害性アッセイで検査した。縦軸は％溶解；細胞が９５％以上生存して、補充対象が１０％以下
図５、ＩＢ４とGalα（1,3）Gal−ＢＳＡに対する抗Galα（1,3）Gal抗体との結合のオリゴ糖、若しくはペプチドによる阻害。阻害剤の濃度を変えて（横軸はｍＭで示されている）、ＩＢ４（１６μｇ／ｍｌ）（Ａ，Ｂ）、若しくは抗Galα（1,3）Gal IgG抗体（７５μｇ／ｍｌ）（Ｃ，Ｄ）の阻害をＥＬＩＳＡで分析した。用いられた阻害剤：オリゴ糖ーグルコース（◆）、Galα（1,3）Gal（○）及びメリビオース（●）（ＡおよびＣ）；ペプチドーGal pep 1（○）若しくはCD48 pep 1（◆）（Ｂ及びＤ）。横軸は４０５ｎｍでのＯＤ値を示す。
図６、ブタ内皮細胞に対する、ＩＢ４レクチン結合のペプチドによる阻害。ペプチドの濃度（横軸はｍＭで示されている）を変えながら細胞蛍光グラフィック分析を用いて、ＰＩＥＣ細胞へのＩＢ４レクチン（１μｇ／ｍｌ）の結合の阻害能について調べた。（ａ）Gal pep 1（□）、Muc pep 1（○）、（ｂ）Muc pep 2（□）、Muc pep 3（■），Muc pep 4（○）、Muc pep 5（●）。
図７、ブタ内皮細胞へのＩＢ４レクチンの結合のムチンペプチドによる阻害。全てのペプチドは５ｍＭで用い、細胞蛍光グラフィック分析を用いた。阻害は非ペプチド対照に対して相対的に計算した。
図８、ＩＢ４レクチンと抗Galα（1,3）Gal IgGのGalα（1,3）Gal−ＢＳＡへの結合のムチンペプチドによる阻害。５ｍＭのペプチドでＩＢ４（１６μｇ／ｍｌ）（ａ）、若しくは抗Galα（1,3）Gal IgG抗体（７５μｇ／ｍｌ）（ｂ）の阻害をＥＬＩＳＡで分析した。縦軸は用いペプチドを示し、横軸は４０５ｎｍでのＯＤ値を示す。
図９、Gal pep 1による、抗MUC 1モノクロナル抗体の阻害。ペプチドの濃度（横軸はｍＭで示されている）を変化させながら細胞蛍光グラフィックを用いて、ＭＯＲ５細胞への抗MUC 1モノクロナル抗体の結合の阻害能を分析した。用いたペプチド：Gal pep 1（□），Muc pep 1（◆）。
図１０、MUC 1 cDNAクローンによるＣＯＳ細胞トランスフェクションの細胞表面染色。（Ａ）ＶＡ１モノクロナル抗体で染色，（Ｂ）３Ｅ１．２モノクロナル抗体で染色、（Ｃ）ＩＢ４レクチンで染色。
図１１、ＩＢ４レクチンによる悪性ヒト組織の組織学的分析。ビオチン化したＩＢ４レクチンはホルマリン固定し、パラフィン包埋された組織（Ａ，Ｂ，Ｃ）、若しくは新鮮な凍結組織（Ｄ，Ｅ，Ｆ）への免疫パーオキシダーゼ染色に用いた。Ａ：正常乳、Ｂ：適当に分化、浸潤した乳ガン、Ｄ：僅かに、分化、浸潤した乳ガン、Ｅ：適当に分化、浸潤した乳ガン、Ｆ：結腸腺癌。拡大倍率：ｘ  ２００。
図１２Ａ及びＢ、種々の製剤で（図参照）免疫したマウスの抗体力価はＧａｌペプチドをコートしたプレート（図１２Ａ）、若しくはＭＵＣ１ーペプチド（ＣＰ13ー３２ペプチド）をコートしたプレート（図１２Ｂ）上で検査した。
図１３、ＤＢＡ２++マウスは腹腔内より３回免疫され、マウスはｐ８１５腫瘍細胞上のｐ８１５ＭＵＣ１+でチャレンジされた。マウスはＧａｌ−ＫＬＨ，Ｇａｌ−ＫＬＨ−ＦＣＡ及びＧａｌ−ＫＬＨーマンナンで免疫され、ｐ８１５ＭＵＣ１+でチャレンジされた。
図１４、ｐ８１５ＭＵＣ+（Ｔｍ２）若しくはｐ８１５標的を用いた直接ＣＴＬアッセー。ＤＢＡ／２マウスはＭＦＰ、若しくはＧａｌ−ＫＬＨで免疫された。
図１５、ＤＢＡ／２Ｇａｌ−ＫＬＨで免疫したマウスからのＣＴＬｓを用いて、ペプチド（ＭＵＣ１  ＶＮＴＲの中の重複９マー）パルスしたｐ８１５標的細胞上でのＣＴＬアッセー。
図１６、ＭＦＰ若しくはＧａｌ−ＫＬＨで免疫したマウスＨＬＡ−Ａ２／ＫｂからのＣＴＬｓを用いたＣＴＬアッセー。標的細胞はパルスした細胞で自系の脾臓ｐＨＡ−ブラストしたペプチド（ＭＵＣ１）、若しくはＨＬＡ−Ａ２ｐＨＡブラストした、パルスしたＰＢＭＣペプチド（ＭＵＣ１）。
図１７、抗Galα（1,3）Gal抗体による、悪性ヒト組織の組織学的分析。ヒト抗Galα（1,3）Gal抗体をホルマリン固定でパラフィン包埋組織の免疫パーオキシダーゼ染色に用い（Ａ）、抗Galα（1,3）Gal抗体を除去したヒト血清で検査した（Ｂ）。
実施例１．抗Galα（1,3）Gal抗体による、ペプチドの認識
材料及び方法
ペプチドライブラリーからのペプチドの単離
ランダムオクタマーライブラリーを構築し、Griffonia simplicifoliaからのＩＢ４レクチン（シグマ社）を用いて、アフィニティー精製によりスクリーニングした。そのレクチンはGalα（1,3）Gal結合する（５）。３ラウンドのスクリーニングの後で、ＩＢ４に特異的に結合するファージクローンを増幅し、そのＤＮＡの配列を分析した。
細胞
ブタ内皮細胞株，PIEC、はKen Welsh博士（Churchill病院、オクスフォード、英国）より、入手した。抹消血リンパ球（ＰＢＬ）、及び赤血球（ＲＢＣ）は新鮮なブタの血より得られた（１４）。
ペプチド合成
ペプチドは、標準的なメリフィールド固相合成法（ｉｉ）を基礎にしたApplied Biosystem Model 430A自動合成機を用いて合成し（フォスター市、カリフォルニア）、逆相高速液体クロマトグラフィー（Waters Associates,Milford、マサチューセッツ州）で、C-8 A-quapore P-300カラムで０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液の勾配溶媒系を利用して精製した（９０％以上）。全ての合成用試薬はApplied Biosystemから購入した。
試薬
正常ヒト血清（NIIS）は、１０人の健康なボランティアから入手し、プールし、使用前に、５６℃で３０分間、加熱不活性化した。ヒト抗Galα（1,3）Gal IgG抗体はＮＨＳから、最初に蛋白質Ｇ−セファロースカラム（Pharmacia I.KB Biotechnology、ウプサラ、スウェーデン）で分画し、次にGalα（1,3）Galβ（１、４）ＧｌｕＮＡｃ結合ガラスビーズ（Syntesome、プリンストン、ニュージャージー）によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＦＩＴＣ結合羊抗ヒトＩｇＭ、羊抗マウスＩｇＧ、及びホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合羊抗ヒトＩｇＭ，若しくはＩｇＧはSilenus（メルボルン、豪州）から入手した。ＨＲＰ結合ストレプトビジンはアマーシャム・インターナショナルから入手した。（アマーシャム、英国）。抗ＣＤ４８モノクロナル抗体はAustin Reseach Instituteで作られた（２０）。ＩＢ４レクチンはＦＩＴＣ、若しくはビオチンでラベルした（１４、９）。メリビオース［Galα（1,6）Glc］とグルコースはシグマ社から入手し、フリーの、若しくはＢＳＡ結合したGalα（1,3）GalはDextra Laboratories（Reading、英国）から入手した。
血清学
ブタ細胞表面へのレクチン、若しくは抗体の結合は血液凝集反応（１４）、細胞傷害性（２１）、ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター（Becton Dickinson、マウンテインビュー、カリフォルニア）を用いたフローサイトメトリー（１４）により検出した。ＩＢ４レクチン及びヒト天然抗体に対する糖やペプチドの相対的親和性は、ＥＬＩＳＡを用いて、抗体若しくはレクチンの結合を、糖若しくはペプチドによる50％阻害に必要なモル濃度を比較することにより算出した。即ち、５０μｌのpH9.6，０．２Ｍ炭酸緩衝液に１０μｇ／ｍｌの濃度のGalα（1,3）Gal−BSA（Dextra Laboratories）をＥＬＩＳＡプレート（Greiner,Fickenhausen，ドイツ）のウエルに加え、加湿条件下で３７℃で２時間インキュベートし、非特異的結合部位は２％ＢＳＡで３７℃、１時間でブロックした。精製した抗Galα（1,3）Gal IgG抗体、若しくはビオチン化したＩＢ４レクチンのいずれか、５０μｌをウエルに加え、４５分間、２２℃でインキュベートしＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０℃で洗浄し、５０μｌの関連するＨＲＰコンジュゲートを加え、さらに、４５分間インキュベートし、洗浄し、５０μｌの基質（２、２ーアジノージーＢ−エチルベンツチオゾリン（Ｚｙｍｅｄ，サンフランシスコ、カリフォルニア））を添加し，ＯＤ４５０値を読みとった。
結果
ＩＢ４レクチンと結合するペプチドの単離
ペプチドライブラリー、１．４ｘ１０9独立した組換ファージからなるが、３サイクルの固定化ＩＢ４に対して、ふるいにかけ、溶出及び増幅でスクリーニングした。ふるいかけの３サイクル後、９つのランダムに選択したファージ単離物が、ＩＢ４特異的結合を示した。これらのクローンからのＤＮＡの配列を分析し推定されるアミノ酸配列を図１に示す（Ｎ．Ｂ．一配列，ＤＧＨＷＤＳＷＬ、が３つの別のファージの単離物に見られた）。これらのペプチドは、共通配列ＡｒＸＸＡｒＺ、ここでＡｒ＝Ｗ，Ｆ若しくはＹ、Ｘは小さい脂肪族、若しくは極性残基で、Ｚは分岐脂肪族アミノ酸である。これらの配列の一つ，ＤＡＨＷＥＳＷＬ（Gal pep 1）は、さらなる研究のために合成され、５ｍＭの濃度（示さず）で、ＩＢ４のガラクトマンナン（Cassia alata、カワラケツメイ）との反応を５０％阻害することが判明した。
ブタＲＢＣのＩＢ４レクチン及びＮＨＳ血液凝集反応のペプチドによるブロック
Gal pep 1を用いた、ブタＲＢＣのＩＢ４による血液凝集反応の阻害は確実に観察された（図２）。ＩＢ４誘導血液凝集反応の完全な阻害は、５ｍＭから０．１５６ｍＭの範囲のGal pep 1を用いたときに観察された。対照ペプチドＣＤ４８  ｐｅｐ  １（ＹＴＦＤＱＫＩＶＥＷＤＳＲＫＳＫＣ）（図２Ａ）を用いたときは阻害がなかった。同様に、ＮＨＳを用いた血液凝集反応の部分的阻害が５ｍＭ  Gal pep 1で観察されたが、CD48 pep 1では観察されなかった（図２Ｂ）。
ブタ内皮細胞、及びリンパ球へのＩＢ４レクチン、及びＮＨＳの結合に対するペプチドによるブロック
ＩＢ４のＰＩＥＣ及びブタＢリンパ球への結合の阻害についてペプチドを検査した。即ち、Gal pep 1は５ｍＭ（図３Ａ）から、０．６２５ｍＭ（示されていない）の範囲でＩＢ４のＰＩＥＣへの結合を完全に阻害した。Gal pep 1は、それから、ヒト天然抗体のＰＩＥＣへの結合をブロックするのに使用した。阻害は２０ｍＭ（図３ｂ）の濃度で起こったが、より低い濃度では起こらなかった（データは示さず）。CD48 pep 1を２０ｍＭの濃度で用いたときも阻害は観察されなかった（図３Ａ及びＢ）。Gal pep 1は、５ｍＭのペプチド濃度でＩＢ４の抹消血Ｂリンパ球との結合をもブロックした（図３Ｃ）、対照ペプチドは効果がなかった。Gal pep 1がヒト抹消血Ｂリンパ球への抗CD48モノクロナル抗体の結合に影響を及ぼさない（データは示さず）ので、これらの反応の特異性が示された。
ブタ内皮細胞でのＮＨＳ細胞傷害性のペプチドによるブロック
ヒト細胞傷害性抗体が、ブタからヒトへ異種移植したブタ内皮細胞を損傷する。従って、Gal pep 1のin vitroでのPIECへのヒト抗体の細胞傷害性の阻害能を検査した。Gal pep 1はNHSの細胞傷害性を阻害したが（１０ｍＭから２．５ｍＭ）、CD48 pep 1は効果がなかった（図４）。
ＩＢ４レクチン、若しくは抗−Galα（1,3）Gal抗体に対するGal pep 1とαーガラクトシル糖との相対的”親和性”
Gal pep 1のＩＢ４レクチン、及びヒト抗Galα（1,3）Gal抗体に対する相対的”親和性”計算し、これらをαーガラクトシル糖との親和性を比較するために、ＥＬＩＳＡが確立された。ビオチン化したＩＢ４レクチンと精製抗Galα（1,3）Gal抗体のGalα（1,3）Gal−ＢＳＡに対する力価を測定し、そしてブロック実験のために最大ＯＤ405値の５０％になるのに必要な濃度より低い二つの希釈で用いた。ＩＢ４レクチン、若しくは精製抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の両方の、グルコース、メリビオース、Galα（1,3）Gal pep 1による阻害結果は図５に示す；ＩＢ４レクチン（図５ＡおよびＢ）、若しくは精製抗Galα（1,3）Gal IgG抗体（図５Ｃ及びＤ）であり、そこではメリビオースやGalα（1,3）GalやGal pep 1により阻害されるが、グルコースやCD48 pep 1では阻害されない。抗体、若しくはレクチンの結合を50%阻害するペプチド、若しくは糖の濃度は相対的親和性の測定値として計算した（表１）。０．３ｍＭ Gal pep 1は、０．３ｍＭのメリビオース、若しくは０．０３ｍＭ以下ののGalα（1,3）Galと比較してＩＢ４の結合を阻害した。１０ｍＭのGal pep 1は抗Galα（1,3）Gal IgGの結合を０．１２５ｍＭ−０．３ｍＭのメリビオース、及び０．０３ｍＭのGalα（1,3）Galと比較して阻害する。CD48 pep 1もグルコースも抗体やレクチンの結合に効果ががなかった。
実施例２ー抗Galα（1,3）Gal抗体によるヒトムチンの認識
材料及び方法
細胞
ブタＥＣ細胞株（PIEC）はKen Welsh博士（チャーチル病院、オクスフォード、英国）から入手した。ＭＵＣ１＋３Ｔ３（ＭＯＲ５細胞）は、マウス３Ｔ３細胞にヒトＭＵＣ１をコードするｃＤＮＡを導入することにより作られたが、Daniel Wreschner博士（テルアビブ大学、Ramat Aviv、イスラエル）から入手した。
抗体、レクチン及び糖
正常のヒト血清（ＮＨＳ）は１０人の健康なボランティアから得、プールして使用前に５６℃で、３０分間、加熱不活性化した。精製したヒト抗Galα（1,3）Gal IgG抗体をＮＨＳから、最初に、蛋白質Ｇ−セファロースカラム（Pharmacia LKB Biotechnology、スウェーデン）で分画し、次にGalα（1,3）Galβ（1,4）GluNAc結合ガラスビーズ（Syntesome、ニュージャージー）によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＦＩＴＣ結合羊抗ヒトＩｇＭ、羊抗マウスＩｇＧ、及びホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）結合羊抗ヒトＩｇＭ，若しくはＩｇＧはSilenus Pty（豪州）から入手した。ＨＲＰ結合ストレプトビジンはアマーシャム・インターナショナル（英国）から入手した。ＢＣ２ｍＡｂがヒトＭＵＣ１分子のＡＰＤＴＲ抗原決定基を認識することは、他のところでも説明した（２３、２４）。Griffonia simplififoliaからのＩＢ４レクチンは、Galα（1,3）Galに結合するが（２２）、シグマ社（米国）から入手して，ＦＩＴＣ、若しくはビオチンで標識化した（１４、９）。メリビオース（Galα（1,6）Glc）及びグルコース（シグマ社）は、９９％以上の純度であった。フリーの、若しくはＢＳＡに結合しているGalα（1,3）Gal２糖はDextra Labortories（英国）から入手した。
ペプチド合成
ペプチドは、標準的なメリフィールド固相合成法（２５）を基礎にしたApplied Biosystem Model 430A自動合成機（Applied Biosystems,米国）を用いて合成した。全ての合成用試薬はApplied Biosystemsから購入した。粗ペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー（Waters Associates,米国）で、C-8-Aquapore P-300カラムで０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液の勾配溶媒系を利用して精製した。合成ペプチドの純度はＨＰＬＣ分析で判断すると９０％以上であった。ペプチドは血清学的アッセーで使用する前に、リン酸食塩緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した。この研究で使用されたペプチドは表１に挙げられている。
血清学的アッセー
ペプチドや炭水化物はＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター（Becton Dickinson、米国）を用いて、細胞表面への抗体／レクチンの結合に対する阻害能を細胞蛍光グラフィックで検査した（２０）。即ち、２５μｌの阻害剤を２５μｌの抗体、若しくはレクチンと混合し、適当な標的を添加する前に、２２℃で、３時間（ペプチド）、若しくは４℃で、１６時間（炭水化物）（１４）、インキュベートした。ＩＢ４レクチンや抗体に対する糖やペプチドの相対的親和性を計算するのにＥＬＩＳＡアッセーが使用され、レクチン若しくは抗体の最大結合の５０％阻害になる阻害剤のモル濃度として特定された。
トランスフェクション研究
ＣＯＳ細胞トランスフェクション実験は、ＤＥＡＥデクストラン（１３）及びヒトＭＵＣ１（６）をコードするｃＤＮＡクローン、若しくはブタα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ（１６）をコードするｃＤＮＡクローンを用いて行われた。さらなる対照として、ＣＯＳ細胞が挿入部分を欠失しているベクターたでトランスフェクトされた（擬似トランスフェクション）。間接的な免疫蛍光分析が蛍光ＩＢ４レクチン（Galα（1,3）Galにのみ結合する）、若しくは抗ＭＵＣ１モノクロナル抗体，３Ｅ１．２（４）及びＶＡ１（２８）及び抗体結合を検出するために、免疫精製された羊抗ーマウスＩｇＭ、若しくはＩｇＧを用いて、６ウエル組織培養プレートで細胞単層上で行われた。
組織学的分析
新鮮な、若しくはホルマリン固定したヒト組織をビオチン化ＩＢ４レクチン（１００μｇ／ｍｌで）とともに２２で５０分間インキュベートし、洗浄しストレプタビジン−ＨＲＰと１時間インキュベートした。続いて、ジアミノベンジジン（アマーシャム・インターナショナル、英国）で１．５ｍｇ／ｍｌで０．０５％Ｈ2Ｏ2とともに５分間、処理し、３分間出し放しの水道水で洗浄することにより過剰の基質を除去した。切片をヘマトキシリンで染色しスライドに載せ顕微鏡で観察した。組織染色は二人の研究者により独立して０（染色されていない）から４（非常に強い染色）の等級をつけさせ、採点させた：。
結果
我々の先の研究では以下のことを示した：
（ａ）ＩｇＭ及びＩｇＧクラスの天然ヒト抗体はブタの単一の抗原決定基Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌと結合した（ＩＢ４レクチンは同じ抗原決定基と結合する（１５、１６、１７）
（ｂ）抗体及びＩＢ４レクチンは合成ペプチドＤＡＨＷＥＳＷＬに結合できた。これらの研究や、ペプチド結合の特異性を検査している間に、抗ーGalα（1,3）Gal試薬（抗体、若しくはＩＢ４レクチン）もまた、他のペプチドー注目すべきはいくつかのムチンの蛋白質コアのそれらと結合したことが明らかとなった。
Galα（1,3）Gal発現ブタ細胞へのＩＢ４結合に対するムチン由来のペプチドによるブロック
ＭＵＣ１  ＶＮＴＲ由来のMuc pep 1はＯＩＥＣ細胞の細胞表面へＩＢ４レクチンが結合するのをブロックすることができた（図６）。事実，０．１２５ｍＭの濃度まで、殆ど完全な阻害をし、ＭＵＣ１  ＶＮＴＲペプチドによる阻害は以前に同定されたＩＢ４レクチン結合ペプチドGal pep 1で見られたより、大きかった（図６ａ）。ＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域由来の他のペプチドを試験したとき（配列は表２参照）、Muc pep 2及びMuc pep 3では完全な阻害、Muc pep 4及びMuc pep 5では部分的な阻害が観察された（図６ｂ）。データは、結合が比較できるように５ｍＭでの阻害％として再整理した。二つの他の濃度でも同じ傾向が認められた（データは示されていない）。Muc pep 6は、ＶＮＴＲアミノ末端配列由来であるが、部分的な阻害を示した。それとは反対に、Muc pep 7は、同じ領域由来であるが、阻害を示さなかった（図７）。ＶＮＴＲカルボキシ末端配列由来のMuc pep 8もまた、ＰＩＥＣ細胞へのＩＢ４結合を阻害した（図７）。他のヒトムチン分子のＶＮＴＲ由来のペプチドはいろいろな結果を示した。Muc pep 9はＭＵＣ２のＶＮＴＲ領域由来であるが、結合阻害を示さなかった。しかし、ＭＵＣ３、及びＭＵＣ４由来のMuc pep 10及びMuc pep 11の両者ともにＩＢ４結合を阻害した（図７）。このように、ＶＮＴＲ及びＭＵＣ１のどこか由来のペプチドはＩＢ４のそのリガンド，Galα（1,3）Gal、との相互作用を阻害できる。これらのペプチドは抗原性のあるペプチドを特異的に認識する抗ムチンモノクロナル抗体を産生するのに使用されてきて、配列が類似しているのにもかかわらず、他のペプチドと抗体の交叉反応をしなかったことに着目すべきである（２３）。
ＩＢ４及びGalα（1,3）Galに対する抗Galα（1,3）Gal抗体の結合に対するムチンペプチドによる阻害
ＩＢ４レクチン及びＥＬＩＳＡ試験に利用するマイクロプレートに結合したオリゴ糖抗原決定基であるGalα（1,3）Gal−ＢＳＡに対する抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の結合のブロック能についてムチンペプチドを試験した（図８）。５ｍＭのペプチド濃度でＩＢ４結合の完全な阻害がMuc pep 1、Muc pep 3、Muc pep 4、Muc pep 5、Muc pep 6、及びMuc pep 11で観察された（図８ａ）。反対に、Muc pep 7及びMuc pep 9については結合阻害が見られなかった。Gal pep 1は以前に説明した通り、阻害したし、対照ペプチドCD48 pep 1、CD4 pep 1及びTNF pep 1はＩＢ４結合を阻害しなかった（図８ａ）。
先のヒト抗体で得られた阻害結果に一致して、より高い濃度のGal pep 1が、ＩＢ４レクチンでよりも、精製ヒト抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の結合を阻害するのに必要であった（図８ｂ）。ヒトＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域由来で試験した３つのペプチド、すなわち、Muc pep 1、Muc pep 3、及びMuc pep 11は抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の結合を阻害した（図８ｂ）、Muc pep 4では部分的阻害であった。３つの対照ペプチド（CD48 pep 1、CD pep、FcR pep 1）は効果がなかった（図８ｂ）。
Galα（1,3）Galに対するムチンペプチドの相対的親和性
ＩＢ４レクチンやヒト抗Galα（1,3）Gal抗体に対するムチンペプチドの相対的親和性を計算し、これらを、αーガラクトシル糖に対する親和性を比較するためにＥＬＩＳＡ結果を利用した。ビオチン化したＩＢ４レクチン及び精製抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の力価を測定し、また親和性実験のためには最大ＯＤ405値の５０％になるのに必要な量より少ない二つの希釈で用いた。抗体やレクチンの結合を５０％阻害するペプチドや糖の濃度が相対的親和性の測定値として計算した（表３）。研究の結果、０．３ｍＭのGal pep 1がＩＢ４の結合を０．０３ｍＭ以上のGalα（1,3）Galと比較して阻害した；０．０７８ｍＭのMuc pep 1、０．６２５ｍＭのMuc pep 3、０．９７５ｍＭのMuc pep 4、０．５ｍＭのMuc pep 5、１．２５ｍＭのMuc pep ６及び０．１５６ｍＭのMuc pep 11はＩＢ４結合を阻害し、０．０３ｍＭのGalα（1,3）Galは２．５ｍＭのMuc pep 1、３．７５ｍＭのMuc pep 6、０．１５６ｍＭのMuc pep 11と比較して、抗Galα（1,3）Gal IgG抗体の結合を阻害した（表３）。全てのムチンペプチドはGal pep 1（１０ｍＭ）よりも低い濃度で阻害した。CD48 pep 1、Scram pep 1（Gal pep 1配列のランダムペプチド）、グルコースのいずれも抗体、若しくはレクチンの結合に効果がなかった。
ムチン１への抗ムチン１モノクロナル抗体の結合に対するGal pep 1によるブロック
これらの観察結果を拡大させ、抗ＭＵＣ１モノクロナル抗体，ＢＣ１に対するGal pep 1の阻害能について検査した。ＢＣ１モノクロナル抗体は以前に特異的にＭＵＣ１  ＶＮＴＲのＡＰＤＴＲ配列を認識することが示されていた（２３）。ＢＣ１のＭＵＣ１＋３Ｔ３細胞への結合は、Muc pep 1と同じように、０．１５６ｍＭの濃度までのGal pep 1により阻害された（図９）。これらの結果は、アミノ酸配列において類似性がないのにもかかわらず、Muc pep 1もGal pep 1もモノクロナル抗体により認識されることを示しており、２次、若しくは３次構造の認識を示唆している。
細胞表面にＭＵＣ１を発現しているＣＯＳ細胞へのＩＢ４の結合
我々は以前に旧世界ザル由来のＣＯＳ細胞がＩＢ４レクチンと反応しない（即ち、Galα（1,3）Galを発現しない）こと、及びGalα（1,3）Gal抗原決定基がブタやマウスのα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡでトランスフェクトした後のみにこれら細胞表面に発現することができることを示した（１６、１７）。ヒトＭＵＣ１の発現がＩＢ４結合につながるかどうかを調べるために、、ＣＯＳ細胞の全長のヒトＭＵＣ１ｃＤＮＡクローンによるトランスフェクションを行った。ＭＵＣ１はＭＵＣ１モノクロナル抗体の結合によりＣＯＳ細胞表面で検出することができ（図１０ａとｂ）、これらの細胞もまたＩＢ４レクチンに反応した（図１０ｃ）．このように、天然のＭＵＣ１ポリペプチドがＩＢ４が結合できるアミノ酸配列をコードしている。ブタα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡクローンによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞が抗ＭＵＣ１−１モノクロナル抗体により調べたとき、僅かな染色が観察された（データは示されていない）。
ヒト組織のＩＢ４反応性の組織学的分析
ＩＢ４及び抗Galα（1,3）Gal抗体がムチンペプチドに結合するので、ヒト正常、若しくは悪性の組織についてビオチン化したＩＢ４を用いて組織学的研究を行った。ホルマリン固定した組織を用いた実験では、正常な乳組織は、反応性であった１３乳ガンの内の３つと比較してＩＢ４レクチンと反応性を示した。５つのホルマリン固定した結腸癌試料はＩＢ４-ビオチンと結合しなかった。新鮮な組織試料を用いた実験結果ではＩＢ４レクチンとの強い結合を示した、即ち、３つの正常乳組織試料のいずれもＩＢ４レクチンと結合をしなかったが、４つの乳ガン組織は４つとも陽性であった。結腸癌組織では７つのうち３つが反応性であったが、正常組織では６つに１つであった。ヒト悪性組織の組織学的分析の代表的な試料を示す（図１１）。ＩＢ４ービオチンと反応しないホルマリン固定した正常乳組織（図１１ａ）、浸潤している管の乳ガン組織（図１１ｂ，ｃ）である。図１１ｂ，ｃでは、明らかにＩＢ４ービオチンによる細胞質の染色が見られ（図１１ｂ），管腔及び腺細胞の細胞表面の染色（図１１ｃ）。ＩＢ４−ビオチンの結合は新鮮な凍結ヒト悪性組織でも示された。僅かに分化した、浸潤管乳ガン組織はＩＢ４レクチンで強い細胞質染色を示されるが（図１１ｄ）、腺細胞の管腔への分泌（物）の染色が適度に分化した、浸潤管乳ガン組織で見ることができる（図１１ｅ）。凍結結腸組織試料にも、分泌（物）や細胞質の強い染色が見られる。
ＩＢ４レクチンで得られたのと同様な結果が精製ヒト抗Galα（1,3）Gal抗体についても得られた（図１７Ａ）。強い細胞質及び細胞表面の染色が殆どの試料に認められた−管腔分泌についてもそれらは陽性であった（図１７Ａ）。染色は、ヒト血清をGalα（1,3）Gal固定ビーズで吸収することにより、これは最早抗Galα（1,3）Gal抗体を含んでいないと云うことであるが、殆ど完全になくなった。どちらの研究からも、乳ガンの染色は抗Galα（1,3）Gal抗体によるものであることを明らかに示している。
実施例３ー    マウスＭＵＣ１+腫瘍における、Gal pep 1及びＭＵＣ１の反応及び抗腫瘍活性
ＢＡＬＢ／ｃ、若しくはＤＢＡ／２（Ｈ２d）マウスをＫＬＨに結合したＤＡＨＷＥＳＷＬペプチド、若しくは酸化マンナンに結合したＭＵＣ１融合蛋白質で免疫した。即ち、１週間に３回腹腔内に注射した。マンナンＭＵＣ１は多数の（５０ｘ１０6）の腫瘍細胞によるチャレンジから保護する免疫反応を基礎にした非常によいＣＴＬを産生することは着目される重要なことである。酸化マンナン−ＭＵＣ１は高親和性ＣＴＬｓを生成し、抗体を殆ど産生しないが、これは典型的なＴ1反応で、そのような反応が確認された（図１２Ａ）。ＭＵＣ１+腫瘍でチャレンジしＤＡＨＷＥＳＷＬ−ＫＬＨで免疫したマウスは同程度の保護を受け、これは、全く，ＭＵＣ１+Ｐ８１５細胞に特異的であった。Ｐ８１５単独、若しくは他の腫瘍に対しては免疫の効果はなかった（図１２Ｂ及び１４）。即ち抗腫瘍免疫はＭＵＣ１+細胞に向けられているようである。
本発明者等は、以前に、ＭＵＣ１ペプチド（マンナンに結合していない）で免疫したマウスでは対照より早く消失するより小さい腫瘍により、ある種の保護を立証した。マンナンーＭＵＣ１で免疫したマウスでは、殆ど、若しくは全く腫瘍増殖がなく、即ち、マウスはこの様式の免疫で完全に保護されている。同様に，ＤＡＨＷＥＳＷＬ−ＫＬＨで免疫されたマウスでも殆ど、若しくは全く腫瘍増殖がなく、即ちマンナンーＭＵＣ１ペプチドと同程度にＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドで免疫されているようである。その効果は明らかに、ｐ８１５細胞の正常な増殖を有するＤＡＨＷＥＳＷＬで免疫したものに特異的である（図１３）。二つの他のＭＵＣ１+腫瘍株（ＭＵＣ１+３Ｔ３、若しくはＭＵＣ１+Ｐ８１５）が保護実験に使用され同様な程度の保護が認められた（示されていない）。
次に、樹立したＭＵＣ１+腫瘍を有するマウスをＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドで免疫できるかどうかを次に検討した。腫瘍増殖の早い抑制が見られ（示されていない）、これがＭＵＣ１に特異的であった。
ＤＡＨＷＥＳＷＬに対する免疫反応の性質についてさらに調べた。研究は、ＭＵＣ１ペプチドがクラスＩ制限ＣＴＬ反応を誘導し、ーＭＵＣ１抗原決定基がマップ化され、典型的なＫd、Ｄd、若しくはＬd結合モチーフを含まないにもかかわらず、それらは高親和性でＨ−２クラスＩ分子と十分に結合することが分かった上で行われた。ＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドで免疫されたＤＢＡ／２マウスは抗ＤＡＨＷＥＳＷＬ、及び抗ＭＵＣ１抗体及びＣＴＬｓを産生した。さらに、抗−ＭＵＣ１  ＣＴＬｓが産生され、ＭＵＣ１・マンナン結合体により産生されるものと、同等、若しくはそれ以上の活性を有するようであった（図１４）。明らかに、ＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドはクラスＩＨ２分子と結合することができた。抗−ＭＵＣ１抗原決定基が抗ーＤＡＨＷＥＳＷＬ  ＣＴＬｓと反応するかどうかを分析するために、抗原決定基のマップ化が、それぞれ前のものとアミノ酸が一つずつ異なるプライマーペプチドで全部の２０アミノ酸ＶＮＴＲ配列がスキャンできるように、９マーペプチドを使用して行った。結果は明確で（図１５）、配列ＳＡＤＴＲＰＡＰ、若しくはＡＰＤＴＲＰＡＰＧを含んだペプチドのみ標的細胞溶解につながることができた。適当な特異性対照を用いて、ＶＮＴＲ（図１５）からの他の１８のペプチドには標的細胞の溶解はなかった。このように、ＤＡＨＷＥＳＷＬで免疫されたマウスは、我々が以前に、Ｈ−２Ｄd及びＨ−２ＬdクラスＩ分子にそれぞれ結合することを示した同じＳＡＤＴＲＰＡＰ／ＡＰＤＴＲＰＡＰＧ配列に精確に反応するＣＴＬｓを誘導することができた。さらに、同じ配列が、ＤＡＨＷＥＳＷＬで免疫された後で、Ｈ−２Ｋdマウスで認識することができる。
しかしながら、これらの配列はＨＬＡ−Ａ２分子では認識することができず、ＭＵＣ１−ＨＬＡ−Ａ２複合体を認識するためには、ＤＬＨＷＡＳＷＶ、若しくは提供された共通配列由来の関連配列で免疫することが必要である。
分子モデルの研究を行い、ＭＵＣ１及びＤＡＨＷＥＳＷＬ配列が同じ形を持つことができたかどうかを調べた。モデル研究はＨ−２Ｄd及びＨ−２Ｌdでの結晶化から得られた知識により行った。コンピューターモデルにより、Ｈ−２Ｄd及びＨ−２Ｌd分子はＤＡＨＷＥＳＷＬ／ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ及びＤＡＨＷＥＳＷＬ／ＡＰＤＴＲＰＡＰＧでそれぞれ、モデル化し、ＤＡＨＷＥＳＷＬ／ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ／ＡＰＤＴＲＰＡＰＧペプチドが、この時点でペプチドを含むクラスＩ分子での結晶化がこれを確認することが必要であるが、同じ形を仮定することができる。ＤＡＨＷＥＳＷＬ及び（Ｓ）ＡＰＤＴＲＰＡＰ（Ｇ）ペプチドは完全に異なるアミノ酸配列であることは着目されるべきであり、このように形が重要である。
ＨＬＡ−Ａ２由来のＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドがＨＬＡ−Ｈ２により呈示され、ＨＬＡ−Ａ２に呈示されたＭＵＣ１ペプチドを免疫することができるかどうかを次に研究した。発明者等は以前に（Ｓ）ＡＰＤＴＲＰＡＰ（Ｇ）ペプチド配列もまたＨＬＡ−Ａ２（上述のようにＨ−２Ｄd及びＨ−２Ｌdに加えて）により呈示されることを発見した。しかしながら、ＤＡＨＷＥＳＷＬ−ＫＬＨで免疫したＨＬＡ−Ａ２／Ｋbマウスは、マウス自系のブラスト標的が陽性であっても（ここでの制限要素はＫb）、ＨＬＡ−Ａ２クラスＩくぼみにいるときにＭＵＣ１  ＨＬＡ結合ペプチドと反応するＣＴＬｓを生成することができなかった（図１６）。これは驚くべきことではなく、Ｈ−２ｄくぼみの中でのＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドの形がペプチド配列及びクラスＩ配列のいずれもにより決まっていることを明確に示している。このように、ＤＡＨＷＥＳＷＬペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子により呈示されるヒトＭＵＣ１ペプチドを対象とすると思われる非常に特異的な免疫反応をおこす。しかしながら、われわれは、ＤＬＨＷＡＳＷＶはＭＵＣ１陽性腫瘍からマウス／ヒトを保護し、その露出し、“突き出している”“Ｗ”は、Ｔ細胞による配列の認識に重要であることを示唆するものであることを予測する。
このように、クラスＩ分子，Ｈ−２Ｄd，Ｈ−２Ｌd，Ｈ−２Ｋb及びＨＬＡ−Ａ２により呈示された例を用いて、既知のペプチド配列、既知の共通配列及びコンピューターモデルを用いて、われわれは、クラスＩ分子によって提示されるＭＵＣ１ペプチドに対する免疫反応をすることができるペプチド配列を擬似することができる。これらの例を基礎にして、ヒトの他のクラスＩ分子と結合するペプチドを推定することができる。
本発明は実施例のみで説明してきたが、この技術分野の熟練者であれば、本明細書での説明に基づいて自明である修飾、変化は添付した請求の範囲で特定している本発明の範囲及び意図に含まれると考えられるべきである。
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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