(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに、Ｆｍｏｃ基及びＢｏｃ基からなる群より選ばれる脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項２】
１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化１】
0004323139.tif 000016
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、請求項１記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、請求項１又は２記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項４】
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに、Ｆｍｏｃ基及びＢｏｃ基からなる群より選ばれる脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、ならびに
（ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項５】
１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化２】
0004323139.tif 000017
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、請求項４記載の糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項６】
工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、請求項４又は５記載の糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項７】
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに、Ｆｍｏｃ基及びＢｏｃ基からなる群より選ばれる脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去して糖鎖を得る工程、ならびに
（ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｄ’）工程（ｄ）で得られた糖鎖を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
を含む、糖鎖の製造方法。
【請求項８】
１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化３】
0004323139.tif 000018
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、請求項７記載の糖鎖の製造方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、請求項７又は８記載の糖鎖の製造方法。
【請求項１０】
一般式：
【化４】
0004323139.tif 000019
を有する糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項１１】
一般式：
【化５】
0004323139.tif 000020
を有する糖鎖アスパラギン。
【請求項１２】
一般式：
【化６】
0004323139.tif 000021
を有する糖鎖。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法および糖鎖アスパラギン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、糖鎖を糖加水分解酵素で分解して誘導体化する技術が糖鎖の構造解析など、数ミリグラムスケールの分析研究において利用されている。しかしながら、個々の糖鎖の誘導体を大量に得ることはできなかったため、グラムスケールでの研究技術の進展は遅れていた。そのため、糖鎖の誘導体を、薬品を製造するような合成研究に応用することは難しかった。
【０００３】
一方、卵黄より糖ペプチドが大量に得られることは知られていた (Biochimica et Biophysica Acta 1335 (1997) p23 〜32)。しかしながら、図１に示す化合物１ならびに該化合物１において分岐糖鎖の一方の非還元末端のシアル酸やガラクトースなど幾つかの糖残基が欠失した一連の化合物についてのフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化された糖鎖の誘導体を大量に得た例はない。また、人の血液中のタンパク質等から幾つかの種類の糖鎖が少量単離された例はあるが、当該糖鎖を薬品の製造に使用すると当該薬品に人体に有害なエイズウイルスや肝炎ウイルス等が混入する危険性があるため、当該糖鎖を薬品に応用する技術は問題視されていた。
【０００４】
ところで、分岐型糖鎖でその分岐部分の構造が同じものを有する糖鎖の製造例は数多くある。その従来技術としては、三種類の方法が存在する。一つ目は、天然に存在する糖タンパク質からアスパラギン結合複合型糖鎖を単離精製する方法である。その代表例としては、T. Tamura,et al. Anal.Biochem., 1994, 216, p335-344 、V. H. Thomas, et al. Carbohydr. Res., 1998, 306, p387-400 、K. G. Rice, et al., Biochemistry, 1993, 32, p 7264-7270 などに記載の方法がある。これらの方法の利点は、糖鎖を合成する必要がないということである。しかし、欠点が幾つか存在する。たとえば、前記糖タンパク質由来の糖鎖は、非還元末端部分において糖残基がランダムに幾つか欠失した糖鎖の混合物として得られ、当該混合物に含まれる糖鎖はその物理的・化学的性質が類似しており個々の糖鎖に分離することは非常に困難であるので、単一の糖鎖を大量に得ることは実質的に不可能であった。また、比較的大量に得るために、人血中のタンパク質（Fibrinogenからの単離：C. H. Hokke, et al, Carbohydr. Res., 305(1997), p463-468、Human Serum Transferrin からの単離：M. Mizuno et.al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, p284-290）から糖鎖を単離している例がある。前述したように、人血中のタンパク質には、エイズや肝炎ウイルスが混入している可能性があり、操作を慎重に行う必要がある。したがって、得られる糖鎖や、その誘導体を医薬品開発に利用するのは困難である。また、糖鎖が大量に得られたとしても、その構造は限られており、多種類の構造の糖鎖やその誘導体が得られた例は実質的に存在しない。
【０００５】
K. G. Rice, et al., Biochemistry, 1993, 32, p7264-7270、あるいはRice, et al., Neoglycoconjugate, Academic Press, 1994, ISBN 0-12-440585-1 p286〜321 では、糖加水分解酵素を用いて糖鎖の非還元末端から糖残基を除去しているが、原料となる単一構造の糖鎖を大量に得ることができていないので分析スケールでしか実施できていない。E. Meinjohanns（J. Chem. Soc. Perkin Trans1, 1998, p549-560 ）らは、Bovine Fetuin （ウシ由来の糖タンパク質) から図３に示す化合物５６を得た後、図２に示す化合物３３を経由して図１に示す化合物１０を合成している。最初の原料である化合物５６を得るためにヒドラジン分解反応を利用している。このヒドラジンは毒性が高く、得られる糖鎖の誘導体を医薬品に応用する場合、微量のヒドラジンの混入の可能性があるため安全性の点で問題がある。また、シアル酸が結合していない化合物５６、３３および１０の糖鎖の誘導体を少量にしか得ることができていない。
【０００６】
二つ目の方法は化学的に糖鎖を合成する方法である。現在、化学合成法により、単糖を組み合わせて１０糖程度に構築することは、J.Seifert et al. Angew Chem Int.Ed. 2000, 39, p531-534の報告例にあるように可能である。この方法の利点としては、あらゆる糖鎖の誘導体を得ることが理論的には可能なことである。しかし、その工程数が膨大なため、大量合成が困難という欠点がある。また、１０個程度の糖残基が結合した糖鎖を数ミリグラム合成する場合でも、１年近い期間が必要である。これまでに、幾つかの糖鎖が化学的に合成された例はあるが、その多くが、目的物である糖鎖を数ミリグラム合成できたというのが現状である。
【０００７】
三つ目の方法としては、酵素反応と化学反応を組み合わせて糖鎖を合成する方法である。その代表例としては、Carlo Unverzagt, Angew Chem Int.Ed. 1996, 35, p2350-2353のような報告がある。この方法は、化学的合成によりある程度の糖鎖を構築後、酵素反応により糖残基を糖鎖に付加させ、糖鎖を伸長していく手法である。しかし、糖を伸長する際に用いる酵素に基質特異性があるため、糖鎖に導入できる糖の種類に制限がある。また、化学合成の工程数が膨大なため大量合成が困難で、最終目的物を少量にしか得ることができない。また、C.H. Lin(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1995, p1625-1630)らは、M. Koketsuらが報告した方法（J. Carbohydrate Chemistry, 1995, 14(6), p833-841）を用いて、卵黄よりシアリルオリゴ糖ペプチドを得、そして、糖加水分解酵素、糖転移酵素を用いて、糖鎖の非還元末端部分の構造の改変を実施している。この論文中の図では、非還元末端部分にアスパラギン（Ａｓｎ）残基のみが１つ結合したような糖鎖が記載されているが、J. Carbohydrate Chemistry, 1995, 14(6), p833-841で報告されている方法によれば、糖鎖の非還元末端にアスパラギン以外にリシンなど幾つかのアミノ酸が平均２．５個結合したものの混合物が得られる。したがって、単一化合物として糖鎖の誘導体を得ることはできず、また、分岐型糖鎖の分岐糖鎖の糖残基が任意に欠失した化合物についての個々の誘導体を大量に得ることについての示唆もない。C.H. Linらの論文には、糖鎖ペプチドが単一生成物として得られたという根拠も示されていない。Y. Ichikawa は、Glycopeptide andRelated Compounds(Marcel Dekker, Inc., 1997, ISBN 0-8247-9531-8, p.79 〜205)の中で、３分岐型の複合型糖鎖を末端から順次糖加水分解酵素で処理すれば糖鎖の非還元末端から糖鎖を順次除去でき、様々な糖鎖の誘導体が得られると述べている。しかしながら、酵素処理後、どのようにして個々の糖鎖を分離するかについては述べられておらず、また、分枝が均一なもののみの合成である。従って、当該方法によっても分岐型糖鎖の分岐糖鎖の糖残基が任意に欠失した化合物についての個々の誘導体を大量に得ることはできないものと考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、医薬品開発等の分野において有用な種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法を提供することを目的とする。また本発明は、糖鎖アスパラギン誘導体と共に有用な種々の単離された糖鎖アスパラギンおよび糖鎖をそれぞれ従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体を製造する工程を介する、糖鎖アスパラギンの製造方法および糖鎖の製造方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
（１）  （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２）  （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３）  １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化８】
0004323139.tif 000002
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４）  脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５）  工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６）  （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７）  （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８）  １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化９】
0004323139.tif 000003
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９）  脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０）  工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１１）  （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去して糖鎖を得る工程、
を含む、糖鎖の製造方法、
（１２）  （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｄ’）工程（ｄ）で得られた糖鎖を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、をさらに含む、前記（１１）記載の糖鎖の製造方法、
（１３）  １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、
【化１０】
0004323139.tif 000004
および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１１）または（１２）記載の糖鎖の製造方法、
（１４）  脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（１１）〜（１３）いずれか記載の糖鎖の製造方法、
（１５）  工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１１）〜（１３）いずれか記載の糖鎖の製造方法、
（１６）  一般式：
【化１１】
0004323139.tif 000005
を有する糖鎖アスパラギン誘導体、
（１７）  一般式：
【化１２】
0004323139.tif 000006
を有する糖鎖アスパラギン誘導体、
（１８）  一般式：
【化１３】
0004323139.tif 000007
を有する糖鎖アスパラギン、ならびに
（１９）  一般式：
【化１４】
0004323139.tif 000008
を有する糖鎖、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
【００１１】
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった、図１に示す化合物２と６または化合物３と７のような似た構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
【００１２】
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。たとえば、本発明において好適に使用される脂溶性の保護基であるＦｍｏｃ基の脂溶性は非常に高い。すなわち、Ｆｍｏｃ基のフルオレニル骨格は、中心の五員環にベンゼン環が２つ結合した非常に脂溶性の高い性質の構造をとっており、たとえば、逆相系カラムの１つであるＯＤＳカラムのオクタデシル基と非常に強い相互作用を生み、似た構造の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能になったものと考えられる。
【００１３】
さらに本発明によれば、後述するように、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、また、得られた糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することにより種々の糖鎖を、容易かつ大量に得ることができる。
【００１４】
本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、具体的には、
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含むものである。
【００１５】
工程（ａ）において使用される１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物としては、アスパラギンの結合した状態の糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物であれば特に限定されるものではない。たとえば、アスパラギンが１または複数個結合した糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物であってもよい。中でも、入手の容易性の観点から、還元末端にアスパラギンが結合した糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物が好適である。なお、本明細書において「糖鎖」とは、任意の単糖が２以上結合したものをいう。
【００１６】
かかる糖鎖アスパラギンの混合物は、公知の方法により、好ましくは天然の原料、たとえば、乳汁、ウシ由来フュチュインまたは卵から糖タンパク質および／または糖ペプチドの混合物を得、当該混合物に、たとえば、タンパク質分解酵素、たとえば、プロナーゼ（和光純薬社製）、アクチナーゼ-E（科研製薬社製）や、一般のカルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼなどの酵素を添加して、公知の反応条件下に反応を行ってペプチド部分を切断し、当該反応後の反応液として、または反応液より糖鎖アスパラギン以外の成分を公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた精製法に従って除去することにより、得ることができる。調製の容易性の観点から、公知の卵由来の糖ペプチド〔Biochimica et Biophysica Acta 1335 (1997) p23 〜32；粗精製ＳＧＰ（卵黄中のタンパク質、無機塩等を含み、糖ペプチドが１０〜８０重量％程度含まれる混合物) 〕を使用して前記混合物を調製するのが好ましい。
【００１７】
また、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖アスパラギンを加水分解して一部糖残基を予め切断しておくのが好ましい。なお、当該切断の程度は、少なくとも本明細書にいう「糖鎖」としての構造を保持する範囲内であれば特に限定されるものではない。このようにして得られる混合物としては、たとえば、図２に示す化合物２４および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含む混合物をあげることができる。なお、かかる場合、該糖残基が欠失した化合物が、本明細書にいう「糖鎖」の構造を保持する観点から、糖残基の欠失は上限で９である。
【００１８】
たとえば、図２に示す化合物２５および２９は、化合物２４を含む糖鎖アスパラギンの混合物（以下、化合物２４混合物という）を以下のようにして酸加水分解することにより当該混合物中に効率的に得られ、延いては対応する糖鎖アスパラギン誘導体である図１に示す化合物２および６を効率的に得ることができる。
【００１９】
たとえば、化合物２４混合物に対し０．１規定程度の酸水溶液を適量加え、たとえば、４〜１００℃にて反応を行う。その際、加水分解反応の進行を薄層クロマトグラフィー（たとえば、シリカゲル  60F254（メルク社製）と、展開溶媒として酢酸エチル：メタノール：水＝４：４：３を用いる）で追跡しながら、化合物２５および２９がもっとも多く得られるところで反応を停止させる。たとえば、２５℃の条件では５〜１０時間程度で、１００℃の条件では数分程度で反応を停止させればよい。好ましくは、７０℃で反応を行い、反応開始後、３５分で反応を停止させて速やかに氷冷する。なお、反応は、反応液を中和することで停止させることができる。また、前記酸としては特に限定するものではなく、たとえば、塩酸、硫酸、硝酸、トリフルオロ酢酸などの無機酸および有機酸、陽イオン交換樹脂、不溶性の固体試薬などを使用することができる。
【００２０】
同様に、化合物２４から化合物３３を前記混合物中に効率的に得ることもできる。たとえば、化合物２４混合物に対し前記酸水溶液を適量加え、好ましくは８０℃で反応を行い、反応開始後、好ましくは６０分で反応を停止させる。
【００２１】
また、加水分解は酵素的に行うこともできる。その際に用い得る酵素としては、糖加水分解酵素が好適であり、エンド型、エキソ型いずれの反応様式の酵素も使用することができる。たとえば、前記同様、化合物２４から化合物２５および２９を得る場合、シアル酸を末端より切断する活性を有するシアル酸加水分解酵素を使用することができる。かかる酵素としては特に限定されるものではなく、当該活性を有するものであれば、市販の酵素、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。酵素反応は公知の条件に従えば良く、その際、前記同様に反応の進行を薄層クロマトグラフィーで追跡し、化合物２５および２９がもっとも多く得られるところで反応を適宜停止させればよい。
【００２２】
以上のようにして得られた糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、それに含まれる糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基の導入を行う。当該保護基としては特に限定されるものではなく、たとえば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカーボネート基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基などを使用することができる。得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸など比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6を参照）に従って行えばよい。
【００２３】
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンを含む混合物に対しアセトンを適量加えた後、さらに９- フルオレニルメチル-N- スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
【００２４】
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物が得られる。
【００２５】
次いで、工程（ｂ）において糖鎖アスパラギン誘導体混合物を公知のクロマトグラフィー、特に分取型のクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体に分離する。なお、かかる工程においては、前記工程（ａ）において得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物を直接使用することができるが、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解に供し一部糖残基を予め切断して得られる糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を使用してもよい。なお、糖残基の切断の程度は前記同様である。また、加水分解は前記と同様にして行うことができる。
【００２６】
たとえば、化合物３および７を得る場合、化合物２および６との混合物からそれらを分離するよりも、当該混合物をガラクトース加水分解酵素を用いる加水分解処理に供することにより、得られた混合物から化合物３および７をＨＰＬＣでさらに容易に分離でき、かつ大量にそれぞれの化合物を単一化合物として大量に得られる。
【００２７】
各糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
【００２８】
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ODS 、Phenyl系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノQ カラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。図４に本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法における工程の一例を模式的に示す。
【００２９】
さらに、工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる〔工程（ｂ’）〕。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
【００３０】
たとえば、ガラクトース残基の除去による化合物２と６の化合物３と７への変換（図５）は、化合物２と６を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、化合物２と６は、それらの混合物であっても、各々単離されたものであってもよい。この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は市販されている公知のエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：15) で行うのが好ましい。
【００３１】
N-アセチルグルコサミン残基の除去による化合物３と７の化合物４と８への変換（図５）は、化合物３と７を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってN-アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いてN-アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。また、N-アセチルヘキソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、化合物３と７は、それらの混合物であっても、各々単離されたものであってもよい。この反応で用いる各酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝65：35または50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82:15)で行うのが好ましい。
【００３２】
マンノース残基の除去による化合物４と８の化合物５と９への変換（図５）は、化合物４と８を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、化合物４と８は、それらの混合物であっても、各々単離されたものであってもよい。この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ(ODSカラム、展開溶媒は、10-200mM程度の酢酸アンモニウムなどの緩衝溶液とアセトニトリル、あるいはエタノール、あるいはメタノール、あるいはブタノール、あるいはプロパノールなどの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。ここに例示する場合、展開溶媒としては50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：18が好適である)で行うのが好ましい。
【００３３】
ガラクトース残基の除去による化合物１０の化合物１１への変換（図６）は、化合物１０を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、ＨＰＬＣ(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝85：15) で行うのが好ましい。
【００３４】
また、化合物１１をさらに任意の糖加水分解酵素を用いて加水分解することで種々の糖鎖アスパラギン誘導体（たとえば、化合物１１、１２、および１３等）へ変換することができる。
【００３５】
N-アセチルグルコサミン残基の除去による化合物１１の化合物１２への変換（図６）は、化合物１１を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってN-アセチルグルコサミン加水分解酵素等を用いてN-アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、ＨＰＬＣ(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝85：18) で行うのが好ましい。
【００３６】
マンノース残基の除去による化合物１２の化合物１３への変換（図６）は、化合物１２を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの各糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：18)で行うのが好ましい。
【００３７】
化合物３と７の化合物１４と１９への変換（図７）は、化合物３と７を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってシアル酸加水分解酵素を用いてシアル酸残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、化合物３と７は、それらの混合物であっても、各々単離されたものであってもよい。この反応で用いるシアル酸加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離は高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝85：15) で行うのが好ましい。
【００３８】
N-アセチルグルコサミン残基の除去による化合物１４と１９の化合物１５と２０への変換（図７）は、化合物１４と１９を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってN-アセチルグルコサミン加水分解酵素等を用いてN-アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの各糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：18) で行うのが好ましい。
【００３９】
マンノース残基の除去による化合物１５と２０の化合物１６と２１への変換（図７）は、化合物１５と２０を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの各糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：18) で行うのが好ましい。
【００４０】
ガラクトース残基の除去による化合物１６と２１の化合物１７と２２への変換（図８）は、化合物１６と２１を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの各糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝85：15) で行うのが好ましい。
【００４１】
N-アセチルグルコサミン残基の除去による化合物１７と２２の化合物１８と２３への変換（図８）は、化合物１７と２２を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、前記同様、公知の条件に従ってN-アセチルグルコサミン加水分解酵素等を用いてN-アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。反応後の反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）からの各糖鎖アスパラギン誘導体の分離は、たとえば、高速液体カラムクロマトグラフィー(ODSカラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝82：18) で行うのが好ましい。
【００４２】
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
【００４３】
従来の方法によれば、極限られた糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコストが必要であったが、本発明によれば、特別の装置や試薬を必要とすることなく、慣用のゲルろ過カラム、ＨＰＬＣカラムや、少なくとも３種類の糖加水分解酵素（たとえば、ガラクトース加水分解酵素、マンノース加水分解酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）等を使って、２週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を１グラム程度調製することが可能である。
【００４４】
以上の操作により、たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、
一般式：
【００４５】
【化１５】
0004323139.tif 000009
【００４６】
を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。かかる糖鎖アスパラギン誘導体としては、具体的には、たとえば、図１に示す各化合物をあげることができる。中でも、化合物１、化合物２〜９、１１〜２３、７０および７１は本発明において初めて製造された化合物である。本発明は当該化合物を包含する。
【００４７】
また、本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法の好ましい態様として、工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、該混合物に含まれる糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法を提供する。かかる製造方法によればさらに効率的に種々の型の糖鎖アスパラギン誘導体を大量に得ることができる。たとえば、図１に示す化合物２と６の分離効率を向上させ、両化合物の製造を効率的に行うことができる。すなわち、化合物２と６の混合物から直接的に両化合物を明確に分離することは効率的に不利であるが、本態様では、両化合物のシアル酸残基にベンジル基を導入し、一旦、以下の化合物７６と７７：
【００４８】
【化１６】
0004323139.tif 000010
【００４９】
の混合物として前記工程（ｂ）に供することになり、化合物７６と７７の分離は比較的容易に行うことができることから両化合物を分離でき、次いでベンジル基を後述する方法により脱離させれば化合物２と６の混合物から両化合物を効率的に分離して得ることができる。
【００５０】
化合物２と６の分離がやや困難である一方、それらのシアル酸残基にベンジル基を導入して得られる化合物７６と７７の分離が容易に行えるのは、シアル酸残基のカルボキシル基に脂溶性の高いベンジル基を導入し、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）の逆相カラムとの疎水性相互作用をさらに高めたことによると考えられる。従って、分離工程（ｂ）において好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して両化合物が分離されるようになったと推定される。
【００５１】
非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物としては、かかる構造を有する糖鎖アスパラギンを１種もしくは２種以上含む混合物であれば特に限定されるものではない。入手容易性の観点から、非還元末端にシアル酸残基を有し、還元末端にアスパラギンが結合した糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物が好適である。当該混合物としては、前記した、図２に示す化合物２４および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含む混合物が好適である。
【００５２】
また、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をさらに効率的に得る観点から、前記工程（ｂ’）を実施するのが好適である。
【００５３】
なお、本態様においては糖鎖アスパラギン誘導体はベンジル基とＦｍｏｃ基が導入されたもの、およびＦｍｏｃ基のみが導入されたものがそれぞれ得られることになる。
【００５４】
糖鎖アスパラギンのシアル酸残基へのベンジル基の導入は公知の方法（たとえば、Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6を参照）に従えばよい。
【００５５】
以上の操作により、たとえば、一般式：
【００５６】
【化１７】
0004323139.tif 000011
【００５７】
を有する、ベンジル基とＦｍｏｃ基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。かかる糖鎖アスパラギン誘導体としては、具体的に前記化合物７６および７７や、以下の化合物７８：
【００５８】
【化１８】
0004323139.tif 000012
【００５９】
が挙げられる。本態様により得られた糖鎖アスパラギン誘導体は糖ペプチドの固相合成に直接使用することができる。該糖鎖アスパラギン誘導体のシアル酸残基に存在するカルボキシル基はベンジル基により保護されていることから、ベンジル基を導入していない糖鎖アスパラギン誘導体と比べ、糖ペプチドの固相合成においては該カルボキシル基が関与する副反応が生ずることなく効率的に所望の糖ペプチドを得ることができる、という利点を有する。
【００６０】
また本発明は、種々の単離された糖鎖アスパラギンを大量に得ることができる糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に従う糖鎖アスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
【００６１】
すなわち、本発明の糖鎖アスパラギンの製造方法は、
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含むものである。
【００６２】
工程（ａ）および（ｂ）は、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法の場合と同様であり、使用される１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物および脂溶性の保護基も前記と同様である。
【００６３】
工程（ｃ）における糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6を参照)。たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、図９に模式的に示すように、N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、糖鎖アスパラギン誘導体にモルフォリンを加えて反応を行うことによりＦｍｏｃ基を除去することができる。また、Ｂｏｃ基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製することにより、糖鎖アスパラギンを得てもよい。
【００６４】
また、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法と同様、本発明の糖鎖アスパラギンの製造方法の好ましい態様として、工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、該混合物に含まれる糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。かかる態様においては工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ基の除去に加えて、ベンジル基の除去を行う。ベンジル基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6を参照）。
【００６５】
さらに、前記同様、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギンを効率的に得る観点から、工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解する、および／または工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを加水分解するのが好適である。なお、加水分解は前記同様にして行うことができる。所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギンをより効率的に得る観点から、 糖加水分解酵素を用いて加水分解する〔工程（ｂ’）および／または工程（ｃ’）〕のがより好ましい。
【００６６】
以上の操作により、たとえば、
一般式：
【００６７】
【化１９】
0004323139.tif 000013
【００６８】
を有する糖鎖アスパラギンを効率的に得ることができる。かかる糖鎖アスパラギンとしては、具体的には、たとえば、図２に示す各化合物をあげることができる。中でも、化合物２５〜３２、３４〜４６、７２および７３は本発明において初めて製造された化合物である。本発明は当該化合物を包含する。
【００６９】
さらに本発明は、種々の単離された糖鎖を大量に得ることができる糖鎖の製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギンの製造方法に従う糖鎖アスパラギンの製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギンからアスパラギン残基を除去する工程を含むものである。
【００７０】
すなわち、本発明の糖鎖の製造方法は、
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去して糖鎖を得る工程、
を含むものである。
【００７１】
工程（ａ）〜（ｃ）は、前記糖鎖アスパラギンの製造方法の場合と同様であり、使用される１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物および脂溶性の保護基も前記と同様である。
【００７２】
また、本発明の糖鎖の製造方法においても、その好ましい態様として、工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、該混合物に含まれる糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。かかる態様においては工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ基の除去に加えて、ベンジル基の除去を行う。ベンジル基の除去は、前記方法に従って行うことができる。
【００７３】
工程（ｄ）における糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去は、公知の方法に従って行うことができる。たとえば、図９に模式的に示すように、糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。また、糖鎖アスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、アセチル化することによってもアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。アスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製してもよい。
【００７４】
さらに、前記同様、所望の糖鎖構造を有する糖鎖を効率的に得る観点から、 工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解する、および／または工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを加水分解する、および／または工程（ｄ）で得られた糖鎖を加水分解するのが好適である。なお、加水分解は前記同様にして行うことができる。所望の糖鎖構造を有する糖鎖をより効率的に得る観点から、 糖加水分解酵素を用いて加水分解する〔工程（ｂ’）および／または工程（ｃ’）および／または工程（ｄ’）〕のがより好ましい。
【００７５】
以上の操作により、たとえば、
一般式：
【００７６】
【化２０】
0004323139.tif 000014
【００７７】
を有する糖鎖を効率的に得ることができる。かかる糖鎖としては、具体的には、たとえば、図３に示す各化合物をあげることができる。中でも、化合物４８〜５５、５７〜６９、７４および７５は本発明において初めて製造された化合物である。本発明は当該化合物を包含する。
【００７８】
このように、本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖（以下、３つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。
【００７９】
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
【００８０】
また、たとえば、糖タンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、その赤血球増殖能により貧血の治療薬として使われているが、このＥＰＯは糖鎖が結合していないと活性がでないことが判明している。このように、タンパク質には糖鎖の結合によって生理活性を発現するものがあるので、たとえば、糖鎖を結合させることができない大腸菌発現系によりタンパク質のみを大量に調製し、次いで所望の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより生理活性の発現を付与したり、また、任意のタンパク質に種々の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより、新たな生理活性を有する新規な糖タンパク質を合成することも可能である。
【００８１】
また、天然の糖タンパク質に存在する糖鎖を本発明により製造した糖鎖と置換することにより新たな生理活性を付与することも可能である。糖タンパク質が有する糖鎖を本発明により得られた糖鎖と置換する技術としては、たとえば、P.Sears and C.H. Wong, Science, 2001, vol291, p2344 〜2350に記載の方法をあげることができる。すなわち、糖タンパク質をβ-N- アセチルグルコサミニダーゼ (Endo-H) で処理してタンパク質表面のアスパラギン残基にはN-アセチルグルコサミン残基が１つだけ結合した状態にする。次いで、本発明により得られた糖鎖アスパラギン（たとえば、図２の各化合物）中の所望の糖鎖をβ-N- アセチルグルコサミニダーゼ (Endo-M) を用いて、前記N-アセチルグルコサミン残基に結合させるという方法があげられる。また、tRNAにN-アセチルグルコサミンを結合させておいて、大腸菌などの発現系を利用してN-アセチルグルコサミン残基を有する糖タンパク質を合成後、本発明により得られた糖鎖アスパラギン中の所望の糖鎖をEndo-Mを用いて導入することも可能である。
【００８２】
また、現在、糖タンパク質を治療薬として利用する際の問題として、投与された糖タンパク質の代謝速度が速いことがあげられる。これは、糖タンパク質の糖鎖末端に存在するシアル酸が生体内で除去されると直ちに当該糖タンパク質が肝臓により代謝されることによる。そのため、ある程度の量の糖タンパク質を投与する必要がある。そこで、本発明により糖鎖の末端に除去されにくいシアル酸を新たに組み込んだ糖鎖を製造し、対象タンパク質に当該糖鎖をEndo-Mを利用して導入すれば、生体内での糖タンパク質の代謝速度を制御することが可能となり、投与する糖タンパク質の量を低くすることも可能である。
【００８３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。各化合物の構造式および番号を図１〜３に示す。なお、1H-NMRのデータは、実施例１〜７については30℃でHODを4.8ppmとして、実施例８〜４５については30℃で内部標準としてアセトンのメチル基のシグナルを2.225ppm、HODを4.718ppmとして測定して得られた値である。また、Fmoc基が除去された化合物については測定溶媒中に５０mMの炭酸水素アンモニウムを共存させて測定した。
【００８４】
実施例１  化合物２４の合成
卵由来粗精製ＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）2.6gをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（TRIZMA BASE 0.05mol/l 、塩化カルシウム0.01mol/l 、pH7.5 ）100ml に溶解させた。これにアジ化ナトリウム58mg (772 μmol)とアクチナーゼ-E（科研製薬社製）526mg を加え、37℃で静置した。65時間後、再びアクチナーゼ-Eを263mg 加え、更に37℃で24時間静置した。この溶液を凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-25 、2.5 φ×1m、展開溶媒は水、流速は1.0ml/min・）で２回精製し、目的の図２に示す化合物２４を1.3g (555 μmol)得た。ＳＧＰに含まれる糖鎖の構造を以下に示す。
【００８５】
【化２１】
0004323139.tif 000015
【００８６】
また、得られた化合物２４の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(D２O、30℃)
5.15 (1H, s, Man4- H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1- H１), 4.95 (1H, s, Man4'- H１), 4.82 (1H, s, Man3- H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2- H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5, 5'- H１), 4.53 (2H, d, Gal6, 6'- H１), 4.34  (1H, d, Man3- H２), 4.27 (1H, d, Man4'- H２)， 4.19 (1H, d, Man4- H２), 3.03 (1H, dd, Asn-βCH), 3.00 (1H, dd, Asn- βCH), 2.76 (2H,dd, NeuAc7, 7'- H３ｅｑ), 2.15 (18H, s ×6, -Ac), 1.79 (2H, dd, NeuAc7, 7'-H３ａｘ)
【００８７】
実施例２  化合物１、２、６および１０の合成
実施例１で得られた化合物２４（609mg, 261μmol）を水20.7mlに溶解させ、さらに0.1 規定塩酸13.8mlを加えた。この溶液を70℃で35分間加熱した後速やかに氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えpH7 とした。これを凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-25 、2.5 φ×1m、展開溶媒は水、流速は1.0ml/min・）で精製したところ、図２に示す化合物２４、化合物２５および２９、化合物３３の混合物534mg を得た。この4 成分はそれぞれを単離することなく次の工程に進めた。
【００８８】
なお、得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
5.13 (s, Man4-H１), 5.12 (s, Man4- H１), 5.01 (d, GlcNAc1- H１ ), 4.94 (s, Man4'- H１ ), 4.93 (s, Man4'- H１ ), 4.82 (s, Man3- H１), 4.60 (d, GlcNAc2- H１ ), 4.58 (d, GlcNAc5, 5'- H１ ), 4.47 (dd,  Gal6, 6' - H１ ), 4.44 (d, Gal6, 6'- H１ ), 4.24 (d, Man3- H２ ), 4.19 (d, Man4'- H２ ) ，4.11 (d, Man4- H２ ), 2.97 (bdd, Asn-βCH), 2.72(dd, NeuAc7- H３ｅｑ, NeuAc7- H３ｅｑ), 2.64 (bdd, Asn-βCH), 2.15 (s×5, -Ac), 1.79 (dd, NeuAc7- H３ａｘ , NeuAc7'- H３ａｘ )
【００８９】
得られた糖鎖の混合物429mg をアセトン16.3mlと水11.2mlに溶解させた。ここに９−フルオレニルメチル-N- スクシニミヂルカーボネート（155.7mg ，461.7 μmol）と炭酸水素ナトリウム（80.4mg，957 μmol）を加え、室温で２時間攪拌した。この溶液をエバポレーターに供してアセトンを除き、残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-25 、2.5 φ×1m、展開溶媒は水、流速は1.0ml/min・）で精製したところ、図１に示す化合物１、化合物２および６、化合物１０の混合物309mg が得られた。この混合物をＨＰＬＣ（ODS カラム、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝65：35、2.0 φ×25cm、流速3ml/min ）を用いて精製したところ、51分後に化合物１が、67分後に化合物２および６の混合物が、93分後に化合物１０が溶出した。それぞれを取り分け凍結乾燥を行った後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-25 、2.5 φ×30cm、展開溶媒は水、流速は1.0ml/min・）で脱塩することで目的の化合物２および６の混合物150mg を得た。
【００９０】
なお、得られた化合物１の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
7.99 (2H, d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fmoc), 7.55 (4H, m, Fmoc), 5.15 (1H, s,Man4- H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1- H１), 4.95 (1H, s, Man4'-H１), 4.82 (1H, s, Man3- H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2- H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5,  5'- H１), 4.53 (2H, d, Gal6, 6'- H１), 4.34 (1H, d, Man3- H２), 4.27 (1H, d, Man4'- H２)， 4.19 (1H, d, Man4- H２), 3.03 (1H, bdd, Asn- βCH), 3.00 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (2H, dd, NeuAc7, 7'- H３ｅｑ ), 2.15 (18H, s ×6, -Ac), 1.79 (2H, dd, NeuAc7, 7'-H３ａｘ)；HRMS Calcd for C103H154N8NaO66[M＋Na+] 2581.8838, found 2581.8821.
【００９１】
また、得られた化合物２および６の混合物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
7.99 (d, Fmoc), 7.79 (d, Fmoc), 7.55 (m, Fmoc), 5.14(s,Man4-H１), 5.12 (s, Man4- H), 5.00 (d, GlcNAc1- H１), 4.94 (s, Man4'- H１ ), 4.93 (s, Man4'- H１ ), 4.82 (s, Man3- H１), 4.60 (d, GlcNAc2- H１ ), 4.58 (d, GlcNAc5, 5'- H１ ), 4.46 (dd, Gal6, 6' - H１), 4.44 (d, Gal6, 6'- H１), 4.24 (d, Man3- H２), 4.19 (d, Man4'- H２ ) ，4.11 (d, Man4- H２ ), 2.97 (bdd, Asn-βCH), 2.72 (dd, NeuAc7- H３ｅｑ , NeuAc7- H３ｅｑ), 2.64 (bdd, Asn-βCH), 2.15 (s×5, -Ac), 1.79 (dd, NeuAc7- H３ａｘ ， NeuAc7'- H３ａｘ )
【００９２】
また、得られた化合物１０の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
7.99 (2H, d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fmoc), 7.55 (4H, m, Fmoc), 5.12 (1H, s, Man4- H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1- H１), 4.93 (1H, s, Man4'- H１), 4.82 (1H, s, Man3- H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2- H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5,  5'- H１), 4.53 (2H, d, Gal6, 6'- H１), 4.34 (1H, d, Man3- H２), 4.27 (1H, d, Man4'- H２)， 4.19 (1H, d, Man4- H２), 3.03 (1H, bdd, Asn- βCH), 3.00 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.15 (12H, s ×4, -Ac)；HRMS Calcd for C81H120N6NaO50[M＋Na+] 1999.6930, found 1999.6939.
【００９３】
実施例３  化合物３および７の合成
実施例２で得られた化合物２および６の混合物（224mg ，97μmol)とウシ血清アルブミン24mgをHEPES 緩衝溶液（50mM,pH6.0）22mlに溶解させ、さらにDiplococcus pneumoniae由来β- ガラクトシダーゼ(1.35U) を加えた。この溶液を37℃で15時間静置した後、凍結乾燥を行った。残留物をＨＰＬＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝85：15、流速3ml/min)で精製したところ、129 分後に図１に示す化合物３が、134 分後に化合物７が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は最初の15分間が水、16分後から30分後までは水：アセトニトリル（容量比）＝10：0 から85：15、31分後から45分後までは水：アセトニトリル＝85：15から80：20になるようにグラジエントを掛けた。流速は3.0ml/min・) を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物３が81mg、化合物７が75mg得られた。
【００９４】
なお、得られた化合物３の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
7.99 (2H, d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fmoc), 7.55 (4H, m, Fmoc), 5.15 (1H, S, Man4-H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1-H１), 4.95 (1H, s, Man4'-H１), 4.82 (1H, s, Man3-H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2-H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5,5'-H１), 4.53 (1H, d, Gal6'-H１), 4.34 (1H, d, Man3-H２), 4.27 (1H, d, Man4'-H２)， 4.19 (1H, d, Man4-H２), 2.97 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (1H, dd, NeuAc7'-H３ｅｑ ), 2.61 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.15 (15H, s ×5, -Ac), 1.79 (1H, dd, NeuAc7'-H３ａｘ )；HRMS Calcd for C86H127N7NaO53 [M＋Na+] 2128.7356, found 2128.7363.
【００９５】
また、得られた化合物７の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(D２O、30℃)
7.99 (2H, d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fmoc), 7.55 (4H, m, Fmoc), 5.15 (1H, S, Man4-H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1-H１), 4.95 (1H, s, Man4'-H１), 4.82 (1H, s, Man3-H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2-H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5,5'-H１), 4.53 (1H, d, Gal6-H１), 4.34 (1H, d, Man3-H２), 4.27 (1H, d, Man4'-H２)， 4.19 (1H, d, Man4-H２), 2.97 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (1H, dd, NeuAc7-H３ｅｑ), 2.60 (1H,b dd, Asn-βCH), 2.15 (15H, s ×5, -Ac), 1.79 (1H, dd, NeuAc7-H３ａｘ)；HRMS Calcd for C86H125N7Na3O53[M＋Na+] 2172.6995, found 2172.7084.
【００９６】
実施例４  化合物４および８の合成
実施例３で得られた化合物３および７の混合物（90mg,47.3 μmol)をそれぞれ分離することなく、ウシ血清アルブミン8mg と共にHEPES 緩衝溶液（50mM,pH6.0）8.1ml に溶解させ、さらにBovine kidney 由来β- グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Bovine kidney）を2.88U 加えた。この溶液を37℃で18時間静置した後凍結乾燥し、残留物をＨＰＬＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝65：35、流速3ml/min)で精製したところ、117 分後に図１に示す化合物４が、127 分後に化合物８が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は最初の15分間が水、16分後から30分後までは水：アセトニトリル＝10：0 から85：15、31分後から45分後までは水：アセトニトリル＝85：15から80：20になるようにグラジエントを掛けた。流速は3.0ml/min・) を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物４が40mg、化合物８が37mg得られた。
【００９７】
なお、得られた化合物４の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
8.01 (2H, d, Fmoc), 7.80 (2H, d, Fmoc), 7.56 (4H, m, Fmoc), 5.22 (1H, s, Man4-H１), 5.08 (1H, d, GlcNAc1-H１), 4.94 (1H, s, Man4'-H１), 4.84 (1H, s, Man3-H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2-H１), 4.67 (1H, d, GlcNAc5-H１), 4.55 (1H, d, Gal6-H１), 4.33 (1H, dd, Man3-H２), 4.20 (1H, dd, Man4-H２), 4.15 (1H, dd, Man4'-H２), 2.97  (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (2H, dd, NeuAc7,7'-H３ｅｑ ), 2.62 (1H,bdd, Asn- βCH), 2.15 (12H, s ×4, -Ac), 1.79 (2H, dd, NeuAc7, 7'- H３ａｘ )；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M＋Na+] 1925.6562, found 1925.6539.
【００９８】
また、得られた化合物８の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
7.99 (2H ,d, Fmoc), 7.79 (2H, d, Fmoc), 7.55 (4H, m, Fmoc), 5.15 (1H, S, Man4- H１), 5.06 (1H, d, GlcNAc1- H１), 4.95 (1H, s, Man4'- H１), 4.82 (1H, s, Man3- H１), 4.69 (1H, d, GlcNAc2- H１), 4.67 (2H, d, GlcNAc5, 5'- H１), 4.53 (2H, d, Gal6, 6'- H１), 4.34 (1H, d, Man3- H２), 4.27 (1H, d, Man4'- H２), 2.97 (1H, bdd, Asn-βCH２), 2.76 (1H, dd, NeuAc7'- H３ｅｑ ), 2.61 (1H, bdd, Asn-βCH２), 2.15 (12H, s×4, -Ac), 1.79 (1H, dd, NeuAc7'- H３ａｘ)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M＋Na+] 1925.6562, found 1925.6533.
【００９９】
実施例５  化合物５の合成
実施例４で得られた化合物４（30mg, 473 μmol)とウシ血清アルブミン3mg をHEPES 緩衝溶液（50mM,pH6.0）6 mlに溶解させ、さらにJack Beans由来α- マンノシダーゼを10U 加えた。この溶液を37℃で21時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は最初の15分間が水、16分後から30分後までは水：アセトニトリル＝10：0 から85：15、31分後から45分後までは水：アセトニトリル＝85：15から80：20になるようにグラジエントを掛けた。流速は3.0ml/min・) を用いて精製したところ、目的とする図１に示す化合物５が20mg得られた。
【０１００】
なお、得られた化合物５の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
8.01 (2H, d, Fmoc), 7.80 (2H, d, Fmoc), 7.56 (4H, m, Fmoc), 5.00 (1H, d, GlcNAc1-H１), 4.95 (1H, s, Man4'-H１), 4.84 (1H, s, Man3-H１), 4.67 (1H, d, GlcNAc2-H１), 4.56 (1H, d, GlcNAc5-H１), 4.44 (1H, d, Gal6-H１), 4.11 (1H, dd, Man4'-H２), 4.07 (1H, dd, Man3-H２), 2.97 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (1H, dd, NeuAc7'-H３ｅｑ ), 2.62 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.15 (12H, s ×4, -Ac), 1.79 (2H, dd, NeuAc7'- H３ａｘ )；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M＋Na+] 1763.6034, found 1763.6074.
【０１０１】
実施例６  化合物９の合成
実施例4 で得られた化合物８(40 mg, 630 μmol)とウシ血清アルブミン5 mgをHEPES 緩衝溶液（50mM,pH6.0）7.8 mlに溶解させ、Jack Beans由来α- マンノシダーゼを38 U加えた。この溶液を37℃で63時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣＣ(ODSカラム、2.0 φ×25cm、展開溶媒は最初の15分間が水、16分後から30分後までは水：アセトニトリル＝10:0から85：15、31分後から４５分後までは85:15 から80:20 になるようにグラジエントを掛けた。流速は3.0 ml/min) を用いて精製したところ、目的とする化合物９が30 mg 得られた。
【０１０２】
なお、得られた化合物９の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (D２O 、30℃)
8.01 (2H, d, Fmoc), 7.80 (2H, d, Fmoc), 7.56 (4H, m, Fmoc), 5.23(1H, s, Man4-H１), 5.08 (1H, d, GlcNAc1-H１), 4.53 (1H, d, Gal6-H１), 4.32 (1H, dd, Man3-H２), 4.28 (1H, dd, Man4-H２), 2.81 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.76 (1H, dd, NeuAc7-H３ｅｑ), 2.59 (1H, bdd, Asn-βCH), 2.13 (12H, s ×4, -Ac), 1.80 (1H, dd, NeuAc7H３ａｘ )；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M＋Na+]  1763.6034, found 1763.6041.
【０１０３】
実施例７  Ｆｍｏｃ基の脱保護（化合物３３の合成）
実施例２で得られた化合物１０（10.5mg，5.27μmol)を50％モルホリン／N,N-ジメチルホルムアミド溶液1.4ml に溶解させ、室温・アルゴン雰囲気下で2 時間反応させた。この溶液にトルエン3ml を加え、35℃でエバポレーターに供した。この操作を三回繰り返し、反応溶媒を取り除いた。残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-25 、2.5 φ×30cm、展開溶媒は水、流速は1.0ml/min・）で精製したところ、目的とする図２に示す化合物３３が7mg 得られた（収率は76％）。なお、得られた化合物の構造は、実施例２から得られる化合物３３と1H-NMRスペクトルが一致したことから確認した。
【０１０４】
化合物３３の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR (30℃)
δ5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62 (d, 1H, J = 8.0 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.58 (d, 2H, J = 7.8 Hz, GlcNAc5,5'-H-1), 4.47 (d, 2H, J = 7.9 Hz, Gal6,6'-H-1), 4.24 (bd, 1H, Man3-H-2), 4.19 (bdd, 1H, J = 3.2 Hz, 1.4 Hz, Man4'-H-2), 4.12 (bdd, 1H, J = 3.2 Hz, 1.4 Hz, Man4-H-2), 2.93 (dd, 1H, J = 4.5 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.93 (dd, 1H, J = 6.8 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.08 (s, 3H, Ac), 2.05 (s, 6H, Ac×2), 2.01 (s, 3H, Ac)
【０１０５】
実施例８  化合物14の合成
化合物3(28mg, 21.3μmol)とウシ血清アルブミン1.0mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 454μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 198mU）を加えた。この溶液を37℃で20時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物14(17mg, 収率70％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１０６】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc),5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58 (d, 1H, J = 8.0 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.55 (d, 1H, J = 8.4 Hz, GlcNAc5'-H-1), 4.47 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6'-H-1), 4.34 (t, 1H, Fmoc), 4.24 (bd, 1H, J = 1.9 Hz Man3-H-2), 4.18 (bdd, 1H, J = 1.4 Hz, 3.3 Hz, Man4-H-2), 4.11 (bdd, 1H, J = 1.4 Hz, 3.5 Hz, Man4'-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 3.0 Hz, 15.7 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.7 Hz, 15.7 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 2.04, 1.89 (each s, each 3H, Ac); HRMS Calcd for C75H110N6NaO45[M＋Na+]  1837.6402, found 1837.6471
【０１０７】
実施例９  化合物19の合成
化合物7(20mg, 9.4μmol)とウシ血清アルブミン1.6mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 323μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 141mU）を加えた。この溶液を37℃で18時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。続いてHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS  No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物19(13mg, 収率76％)を得た。得られた化合物の構造は1H-NMRが標品と一致したことから確認した。
【０１０８】
実施例１０  化合物15の合成
化合物4(45mg, 24μmol)とウシ血清アルブミン1.7mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 820μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 134mU）を加えた。この溶液を37℃で14時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物15(28mg, 収率74%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１０９】
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.44 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1) 4.58 (d, 2H, GlcNAc2,5'-H-1), 4.47 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Gal6'-H-1), 4.35 (t, 1H, Fmoc), 4.24 (bd, 1H, J = 1.9 Hz,  Man3-H-2), 4.11 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.07 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.7 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.04, 1.89 (each s, each 3H, Ac); HRMS Calcd for C67H97N5NaO40[M＋Na+] 1634.5608, found 1634.5564
【０１１０】
実施例１１  化合物70の合成
化合物15(11mg, 6.8μmol)とウシ血清アルブミン1.5mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 269μL）に溶解させ、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、from Jack Beans, 11μL, 275mU）を加えた。この溶液を37℃で14時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物70(6.3mg, 収率64％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１１１】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.70 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.50 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.55 (d, 2H, GlcNAc2,5'-H-1), 4.32 (t, 1H, Fmoc),  4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.10 (bs, 1H, Man4-H-2), 4.06 (bs, 1H, J = 1.3 Hz, Man4'-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 14.0 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 9.5 Hz, 14.8 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C61H88N5O35[M＋H+]  1450.5, found 1450.4
【０１１２】
実施例１２  化合物20の合成
化合物8(47mg, 25μmol)とウシ血清アルブミン1.9mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 840μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 369mU）を加えた。この溶液を37℃で37時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物20 (26mg, 収率65%)を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１１３】
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5Hz, Fmoc), 5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.4 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.57 (bd, 2H, GlcNAc2,5'-H-1), 4.46 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Gal6'-H-1), 4.34 (t, 3H, Fmoc), 4.24 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.19 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 9.2 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac); HRMS Calcd for C67H97N5NaO40[M＋Na+]  1634.5608, found 1634.5644
【０１１４】
実施例１３  化合物71の合成
化合物20(12mg, 7.4μmol)とウシ血清アルブミン1.0mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 330μL）に溶解させ、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、from Jack Beans, 12μL, 297mU）を加えた。この溶液を37℃で46時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm。最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物71(6.6mg, 収率61％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１１５】
1H-NMR (30℃)
δ7.90 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.70 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.49 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.42 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.4 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.55 (d, 2H, GlcNAc2,5-H-1), 4.31 (b, 1H, Fmoc), 4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.18 (bs, 1H, Man4-H-2), 3.97 (dd, 1H, J = 1.8 Hz, 3.3 Hz, Man4'-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.0 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 1.88 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C61H88N5O35[M＋H+]  1450.5, found 1450.3
【０１１６】
実施例１４  化合物16の合成
化合物5(32mg, 18.4μmol)とウシ血清アルブミン2.5mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 713μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 134mU）を加えた。この溶液を37℃で17時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物16(13mg, 収率52%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１１７】
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.44 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.00 (d, 1H, J = 9.9 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.75 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58 (d, 2H, J = 7.5 Hz, GlcNAc2,5'-H-1), 4.47 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6'-H-1), 4.34 (t, 1H, Fmoc), 4.10 (bd, 1H, Man3-H-2), 4.07 (bs, 1H, Man4'-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 9.2 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C61H88N5O35[M＋H+]  1450.5, found 1450.3.
【０１１８】
実施例１５  化合物17の合成
化合物16(9mg, 6.2μmol)とウシ血清アルブミン1.6mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 613μL）に溶解させ、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、from Jack Beans, 186mU）を加えた。この溶液を37℃で32時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物17(5.4mg, 収率68％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１１９】
1H-NMR (30℃)
δ7.89 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.68 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.49 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.42 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc),  4.99 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.55 (d, 1H, J = 8.1 Hz, GlcNAc2,5'-H-1), 4.09, 4.07 (s, 1H, Man4'-H-2, Man3-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz Asn-βCH), 2.56 (bdd, 1H, J = 8.1 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C55H77N5NaO30[M＋Na+]  1310.5, found 1310.2
【０１２０】
実施例１６  化合物18の合成
化合物17(3.4mg, 2.6μmol)とウシ血清アルブミン1.1mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 257μL）に溶解させ、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(シグマアルドリッチ from Jack Beans, 144mU)加えた。この溶液を37℃で24時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm。最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物18(2.1mg, 収率75％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１２１】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, Fmoc), 5.00 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (d, 1H, J = 1.6 Hz, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58 (d, 1H, J = 7.8 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.34 (t, 1H, Fmoc),  4.07 (d, 1H, J = 2.7 Hz, Man4'-H-2), 3.97 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, 3.7 Hz, Man3-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 3.2 Hz, 15.1 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.9 Hz, 15.1 Hz, Asn-βCH), 2.07, 1.89 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C47H65N4O25[M＋Na+]  1085.4, found 1085.3
【０１２２】
実施例１７  化合物21の合成
化合物9(28mg, 16μmol)とウシ血清アルブミン1.7mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 624μL）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Viblio Cholerae, 117mU）を加えた。この溶液を37℃で17時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm。最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物21(14.6mg, 収率68%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１２３】
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.50 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.57 (d, 2H, J = 7.2 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.46 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6-H-1), 4.34(t, 1H Fmoc), 4.22 (bd, 1H, J = 2.7 Hz, Man3-H-2), 4.19 (b, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 9.8 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.05 (s, 6H, Ac×2), 1.89 (s, 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C61H88N5O35[M＋H+]  1450.5, found 1450.3
【０１２４】
実施例１８  化合物22の合成
化合物21(10mg, 6.9μmol)とウシ血清アルブミン1.6mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 672μL）に溶解させ、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、from Jack Beans, 205mU）を加えた。この溶液を37℃で20時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物22(5.6mg, 収率64％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１２５】
1H-NMR (30℃)
δ7.87 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.67 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.48 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.41 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.55 (d, 2H, J = 8.6 Hz, GlcNAc2,5-H-1), 4.26 (t, 1H, Fmoc), 4.22 (d, 1H, J = 2.2 Hz, Man3-H-2), 4.18 (bdd, 1H, J = 1.3 Hz, 3.3 Hz, Man4-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.54 (bdd, 1H, J = 9.5 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.05 (s, 6H, Ac×2), 1.88  (s, 3H, Ac)； MS(Fab) Calcd for C55H78N5O30[M＋H+]  1288.5, found 1288.3
【０１２６】
実施例１９  化合物23の合成
化合物22(3.6mg, 2.8μmol)とウシ血清アルブミン1.2mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 277μL）に溶解させ、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(シグマアルドリッチ from Jack Beans, 195mU)を加えた。この溶液を37℃で24時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物23(2.3mg,収率77％)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１２７】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.70 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.50 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.57 (d, 1H, J = 6.5 Hz, GlcNAc-H-1), 4.33 (t, 1H, Fmoc), 4.22 (d, 1H, J = 3.0 Hz, Man3-H-2), 4.07 (bdd, 1H, J = 2.1 Hz, Man4-H-2), 2.72 (bdd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.9 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C47H65N4O25[M＋H+] 1085.4, found 1085.3
【０１２８】
実施例２０  化合物11の合成
化合物10(123mg, 62μmol)とウシ血清アルブミン(1.1mg)をHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 2.5mL）に溶解させ、β-ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、from Jack Beans, 24μL, 612mU）を加えた。この溶液を37℃で61時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS  No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速3.5mL/min)で精製した。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm。最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物11(71mg, 収率70%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１２９】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.50 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (1H, d, J = 9.9 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.55 (d, 2H, J = 8.6 Hz, GlcNAc2,5-H-1), 4.34 (t, 1H, Fmoc), 4.24 (s, 1H, Man3-H-2), 4.18 (s, 1H, Man4-H-2), 4.10 (s, 1H, Man4'-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.51 (bdd, 1H, J  = 9.0 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.06 (s, 3H, Ac), 2.05 (s, 6H, Ac×2), 1.88 (s, 3H, Ac); HRMS Calcd for C69H100N6NaO40[M＋Na+] 1675.5873, found 1675.5841
【０１３０】
実施例２１  化合物12の合成
化合物11(50mg, 30μmol)とウシ血清アルブミン2.0mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 920μL）に溶解させ、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Jack Beans, 2.1U）を加えた。この溶液を37℃で48時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。反応溶液をHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS  No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製し、凍結乾燥を行った。この残留物をODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物12(25mg, 収率66%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１３１】
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.70 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.50 (dd,  2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (bd, 1H, J = 1.6 Hz, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58〜4.52 (b, 1H,  GlcNAc2-H-1), 4.33 (t, 1H, Fmoc), 4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.06 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, 3.2 Hz, Man4-H-2), 3.97 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, 3.5 Hz, Man4'-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.53 (bdd, 1H, J = 9.0 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.05, 1.88 (each s, each 3H, Ac)
【０１３２】
実施例２２  化合物13の合成
化合物12(10mg, 11μmol)とウシ血清アルブミン0.9mgをHEPES緩衝溶液（50mM, pH5.0, 440μL）に溶解させ、α-マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、from Jack Beans, 30μL, 3.2U）を加えた。この溶液を37℃で21時間静置した後、HPLC分析により反応終了を確認した。続いてHPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS  No. 2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝80：20、流速4mL/min)で精製を行った。更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物13(3mg,収率43％)を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１３３】
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.51 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.43 (dd, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.57 (1H, GlcNAc2-H-1), 4.06 (d, 1H, J = 3.2 Hz, Man3-H-2), 2.72 (bd, 1H, J = 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.52 (bdd, 1H, J = 8.3 Hz, 15.5 Hz, Asn-βCH), 2.05, 1.89 (each s, each 3H, Ac)
【０１３４】
（糖鎖アスパラギン誘導体のFmoc基の脱保護）
以下、全ての糖鎖アスパラギン誘導体において、以下の手順でFmoc基の脱保護を行った。まず、糖鎖アスパラギンFmoc体1μmolあたりに240μLのN,N-ジメチルホルムアミド、160μLのモルホリンを加え、室温・アルゴン雰囲気下で反応させた。TLC（展開溶媒として1M 酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の10倍量加えて15分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、35℃でエバポレートした。更にトルエンを3mL加えエバポレートするという操作を三回繰り返した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（コスモシール75C18-OPN、15×100mm、展開溶媒は水）により精製した。
【０１３５】
実施例２３  化合物33の合成
化合物10(10.5mg, 5.3μmol)を上記の操作で7時間反応させたところ、目的とする化合物33(7mg, 収率76%)が得られた。得られた化合物は1H-NMRが標品と一致したことから確認した。
【０１３６】
実施例２４  化合物26の合成
化合物3(8.0mg, 3.8μmol)を上記の操作で21時間反応させたところ、目的とする化合物26(6.3mg, 収率88%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１３７】
1H-NMR (30℃)
δ5.13 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.9 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.95 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.78 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62 (2H, GlcNAc2,5'-H-1), 4.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz, GlcNAc5-H-1), 4.52 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6'-H-1), 4.25 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.19 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.12 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.94 (dd, 1H, J = 4.5 Hz, 17.0Hz, Asn-βCH), 2.85 (dd, 1H, J = 6.8 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.68 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.4 Hz, NeuAc7'-H-3eq), 2.08, 2.07, 2.06, 2.04, 2.02 (each s, each 3H, Ac), 1.72 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, 12.1 Hz, NeuAc7'-H-3ax); MS(Fab) Calcd for C71H118N7O51[M＋H+] 1884.7, found 1884.5
【０１３８】
実施例２５  化合物27の合成
化合物4(11.0mg, 5.8μmol)を上記の操作で23時間反応させたところ、目的とする化合物27(8.5mg, 収率88%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１３９】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.08 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.95 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.78 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62 (d, 2H, GlcNAc2,5'-H-1), 4.45 (d, 1H, J = 7.6 Hz, Gal6'-H-1), 4.26 (bd, 1H, Man3-H-2), 4.12 (bd, 1H, Man4'-H-2), 4.08 (bdd, 1H, J = 1.6 Hz, 3.3 Hz,  Man4-H-2), 2.94 (dd, 1H, J = 4.0 Hz, 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.85 (dd, 1H, J = 7.2 Hz, 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.68 (dd, 1H, J = 4.1 Hz, 12.1 Hz, NeuAc7'-H-3eq), 2.09, 2.07, 2.04, 2.02 (each s, each 3H, Ac), 1.72 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, 12.1 Hz, NeuAc7'- H-3ax); MS(Fab) Calcd for C63H104N6NaO46[M＋Na+] 1703.6, found 1703.１
【０１４０】
実施例２６  化合物28の合成
化合物5(7.0mg, 4.0μmol)を上記の操作で21時間反応させたところ、目的とする化合物28(5.3mg、収率87%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１４１】
1H-NMR (30℃)
δ5.07 (d, 1H, J = 9.4 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.94 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.59 (each d, each 1H,  GlcNAc2,5'-H-1), 4.44 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6'-H-1), 4.10, 4.07 (each 1H, Man4',3-H-2), 2.93 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 17.5 Hz, Asn-βCH), 2.85 (dd, 1H, J = 7.0 Hz, 17.5 Hz, Asn-βCH), 2.67 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.2Hz, NeuAc7'-H-3eq), 2.08, 2.06, 2.02, 2.01 (each s, each 3H, Ac), 1.71 (2H, dd, J = 12.2 Hz, 12.2 Hz, NeuAc7'- H-3ax); MS(Fab) Calcd for C57H94N6NaO41[M＋Na+] 1541.5, found 1541.3
【０１４２】
実施例２７  化合物30の合成
化合物7(13.9mg, 6.6μmol)を上記の操作で7時間反応させたところ、目的とする化合物30( 8.0mg, 収率64% )を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１４３】
1H-NMR (30℃)
δ5.13 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.9 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.60 (each d, each 1H, J = 8.0 Hz, GlcNAc2,5-H-1), 4.55 (d, 1H, J = 8.4 Hz, GlcNAc5'-H-1), 4.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Gal6-H-1), 4.24 (bd, 1H, Man3-H-2), 4.19 (bdd, 1H, J = 1.3 Hz, 3.2 Hz, Man4'-H-2), 4.10 (bdd, 1H, J = 1.4 Hz, 3.2 Hz, Man4-H-2), 2.90 (dd, 1H, J = 4.5 Hz, 16.7 Hz, Asn-βCH), 2.80 (dd, 1H, J = 7.5 Hz, 16.7 Hz, Asn-βCH), 2.66 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.4 Hz, NeuAc7-H-3eq), 2.07, 2.06, 2.05, 2.02, 2.01 (each s, each 3H, Ac), 1.71 (dd, 1H, J = 12.4 Hz, 12.4 Hz, NeuAc7- H-3ax); MS(Fab) Calcd for C71H117N7NaO51[M＋Na+] 1906.7, found 1906.1
【０１４４】
実施例２８  化合物31の合成
化合物8( 8.0mg, 4.2μmol )を上記の操作で12時間反応させたところ、目的とする化合物31( 6.0mg, 収率86% )を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１４５】
1H-NMR (30℃)
δ5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.59 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.43 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Gal6-H-1), 4.24 (bd, 1H, Man3-H-2), 4.18 (bdd, 1H, Man4'-H-2), 2.91 (bd, 1H, J = 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.81 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.66 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.6 Hz, NeuAc7-H-3eq), 2.06, 2.06, 2.02, 2.00 (each s, each 3H, Ac), 1.70 (dd, 1H, J = 12.6 Hz, 12.6 Hz, NeuAc7-H-3ax); MS(Fab) Calcd for C63H104N6NaO46[M＋Na+] 1703.6, found 1703.0
【０１４６】
実施例２９  化合物32の合成
化合物9( 7.7mg, 4.4μmol )を上記の操作で23時間反応させたところ、目的とする化合物32( 5.2mg, 収率78% )で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１４７】
1H-NMR (30℃)
δ5.14 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.4 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.78 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4,60 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Gal6-H-1), 4.23 (d, 1H, J = 3.0 Hz, Man3-H-2), 4.19 (bdd, 1H, J = 1.3 Hz, 2.9 Hz, Man4-H-2), 2.92 (dd, 1H, J = 4.1 Hz, 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.83 (dd, 1H, J = 7.5 Hz, 12.7 Hz, Asn-βCH), 2.67 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.7 Hz, NeuAc7-H-3eq), 2.06 (s, 6H, Ac×2), 2.03, 2.01 (each s, each 3H, Ac) 1.71 (dd, 1H, J = 12.7 Hz, 12.7 Hz, NeuAc7- H-3ax); MS(Fab) Calcd for C57H94N6NaO41[M＋Na+] 1541.5, found 1541.2
【０１４８】
実施例３０  化合物37の合成
化合物14(9.1mg, 5.0μmol)を上記の操作で13時間反応させたところ、目的とする化合物37 (6.5mg, 収率77%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１４９】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.75 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.57, 4.55 (each d, each 1H, J = 7.5 Hz, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.46 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Gal6'-H-1), 4.23 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.18 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.10 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.87 (dd, 1H, J = 4.8 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.76 (dd, 1H, J = 7.2 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.07 (s, 3H, Ac), 2.04 (s, 6H, Ac×2), 2.00 (s, 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C60H100N6NaO43[M＋Na+] 1615.6, found 1615.0
【０１５０】
実施例３１  化合物42の合成
化合物19( 9.8mg, 5.4μmol )を上記の操作で13時間反応させたところ、目的とする化合物42( 8.0mg, 収率88% )で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１５１】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.60, 4.57, 4.55 (each d, each 1H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.46 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6-H-1), 4.28 (s, 1H, Man3-H-2), 4.18 (s, 1H, Man4'-H-2), 4.10 (s, 1H, Man4-H-2), 2.88 (dd, 1H, J = 4.0 Hz, 16.6 Hz, Asn-βCH), 2.77 (dd, 1H, J = 7.5 Hz, 16.6 Hz, Asn-βCH), 2.07 (s, 3H, Ac), 2.04 (s, 6H, Ac×2), 2.00 (s, 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C60H101N6O43[M＋H+] 1593.6, found 1593.8
【０１５２】
実施例３２  化合物38の合成
化合物15(5.1mg, 3.2μmol)を上記の操作で11時間反応させたところ、目的とする化合物38(4.0mg, 収率91%)が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１５３】
1H-NMR (30℃)
δ5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.4 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.57 (each d, each 1H, J = 7.8 Hz, GlcNAc2,5'-H-1), 4.47 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal6'H-1), 4.24 (d, 1H, J = 2.3 Hz, Man3-H-2), 4.10, 4.06 (each bd, each 1H, Man4',4-H-2), 2.90 (dd, 1H, J = 4.2 Hz, 16.8 Hz, Asn-βCH), 2.81 (dd, 1H, J = 7.3 Hz, 16.8 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.04, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C52H88N5O38[M＋H+] 1390.5, found 1390.1
【０１５４】
実施例３３  化合物72の合成
化合物70(4.0mg, 2.8μmol)を上記の操作で13時間反応させたところ、目的とする化合物72(2.9mg, 収率85%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１５５】
1H-NMR (30℃)
δ5.09 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.8 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.54 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1 ), 4.24 (s, 1H, Man3-H-2), 4.10, 4.06 (each bs, each 1H, Man4,4'-H-2),  2.87 (dd, 1H, J = 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.76 (dd, 1H, J = 6.5 Hz, 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.04, 2.00 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C46H78N5O33[M＋H+] 1228.5, found 1228.3
【０１５６】
実施例３４  化合物43の合成
化合物20 (5.4mg, 3.3μmol)を上記の操作で11時間反応させたところ、目的とする化合物43(4.1mg, 収率87%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１５７】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.57 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.46 (d, 1H, Gal6-H-1), 4.24 (s, 1H, Man3-H-2), 4.18 (bs, 1H, Man4-H-2) 2.90 (dd, 1H, J = 4.0 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.80 (dd, 1H, J = 7.3 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.04, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C52H88N5O38[M＋H+] 1390.5, found 1390.2
【０１５８】
実施例３５  化合物73の合成
化合物71(4.0mg, 2.8μmol)を上記の操作で13時間反応させたところ、目的とする化合物73(2.9mg, 収率85%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１５９】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.9 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.60, 4.54 (each d, each 1H, J = 7.9 Hz, GlcNAc2,5- H-1), 4.24 (s, 1H, Man3-H-2), 4.18 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, 1.6 Hz, Man4-H-2), 3.96 (1H, dd, J = 1.6 Hz, 1.6 Hz, Man4-H-2), 2.88 (dd, 1H, J = 4.3 Hz, 16.8 Hz, Asn-βCH), 2.77 (dd, 1H, J = 7.2 Hz, 16.8 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.04, 2.00 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C46H78N5O33[M＋H+] 1228.5, found 1228.3
【０１６０】
実施例３６  化合物39の合成
化合物16(2.2mg, 1.5μmol)を上記の操作で7時間反応させたところ、目的とする化合物39(1.6mg, 収率84%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１６１】
1H-NMR (30℃)
δ5.07 (d, 1H, J = 9.7Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.75 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62, 4.58 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.09, 4.08 (each s, each 1H, Man3,4'-H-2), 2.91 (dd, 1H, J = 4.1 Hz, 16.9 Hz, Asn-βCH), 2.81 (dd, 1H, J = 6.8 Hz, 16.9 Hz, Asn-βCH), 2.08, 2.04, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C46H77N5NaO33[M＋Na+] 1250.4, found 1250.3
【０１６２】
実施例３７  化合物40の合成
化合物17(1.5mg, 1.2μmol)を上記の操作で14時間反応させたところ、目的とする化合物40(1.1mg, 収率89%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１６３】
1H-NMR (30℃)
δ5.07 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62, 4.55 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.10, 4.07 (each s, each 1H, Man4',3-H-2 ), 2.89 (dd, 1H, J = 3.7 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.79 (dd, 1H, J = 7.0 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.05, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C40H67N5NaO28[M＋Na+] 1088.4, found 1088.2
【０１６４】
実施例３８  化合物41の合成
化合物18(1.3mg, 1.2μmol)を上記の操作で14時間反応させたところ、目的とする化合物41(0.8mg, 収率80%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１６５】
1H-NMR (30℃)
δ5.07 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.62 (d, 1H, J = 7.8 Hz, GlcNAc2-H-1),  4.08 (d, 1H, J = 2.9 Hz, Man3-H-2), 2.92 (dd, 1H, J = 3.9 Hz, 17.3 Hz, Asn-βCH), 2.83 (dd, 1H, J = 7.0 Hz, 17.3 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C32H55N4O27[M＋H+] 863.3, found 863.2
【０１６６】
実施例３９  化合物44の合成
化合物21(2.3mg, 1.6μmol)を上記の操作で7時間反応させたところ、目的とする化合物44(1.6mg, 収率84%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１６７】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.8 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.57 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.46 (d, 1H, J = 7.8 Hz, Gal-H-1), 4.22, 4.18 (each bs, each 1H, Man3,4-H-2), 2.91 (dd, 1H, J = 4.1 Hz, 17.3 Hz, Asn-βCH), 2.82 (dd, 1H, J = 7.0 Hz, 17.3 Hz, Asn-βCH), 2.05, 2.04, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C46H78N5O33[M＋H+] 1228.5, found 1228.3
【０１６８】
実施例４０  化合物45の合成
化合物22(1.6mg, 1.3μmol)を上記の操作で14時間反応させたところ、目的とする化合物45(1.1mg, 収率85%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１６９】
1H-NMR (30℃)
δ5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61, 4.54 (each d, each 1H, GlcNAc2,5-H-1), 4.22 (d, 1H, J = 2.5 Hz, Man3-H-2), 4.18 (dd, 1H, J = 1.4 Hz, 3.0 Hz, Man4'-H-2),  2.89 (dd, 1H, J = 4.3 Hz, 16.9 Hz, Asn-βCH), 2.78 (dd, 1H, J = 7.5 Hz, 16.9 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C40H67N5NaO28[M＋Na+]  1088.4, found 1088.3.
【０１７０】
実施例４１  化合物46の合成
化合物23(1.6mg, 1.5μmol)を上記の操作で14時間反応させたところ、目的とする化合物46(1.1mg, 6.4μmol, 収率85%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１７１】
1H-NMR (30℃)
δ5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 5.06 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1- H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61 (d, 1H, J = 7.3 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.22 (d, 1H, J = 2.4 Hz, Man3-H-2), 4.07 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, 3.0 Hz, Man4'-H-2), 2.90 (dd, 1H, J = 4.3 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.80 (dd, 1H, J = 7.0 Hz, 17.2 Hz, Asn-βCH), 2.05, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C32H55N4O23[M＋H+]  863.3, found 863.3
【０１７２】
実施例４２  化合物34の合成
化合物11(12.4mg, 7.5μmol)を上記の操作で11時間反応させたところ、目的とする化合物34(９.2mg, 収率86%)で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１７３】
1H-NMR (30℃)
δ5.11 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 10.0 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.77 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61 (d, 1H, J = 6.8 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.55 (d, 2H, GlcNAc5,5'-H-1), 4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.18 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.10 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.80 (dd, 1H, J = 3.8 Hz, 15.6 Hz, Asn-βCH), 2.63 (dd, 1H, J = 8.2 Hz, 15.6 Hz, Asn-βCH), 2.07 (s, 3H, Ac), 2.05 (s, 6H, Ac×2), 2.01 (s, 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C54H90N6NaO38[M＋Na+]  1453.5, found 1453.2
【０１７４】
実施例４３  化合物35の合成
化合物12(12.0mg, 8.4μmol)を上記の操作で11時間反応させたところ、目的とする化合物35(7.0mg, 収率81% )で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１７５】
1H-NMR (30℃)
δ5.10 (s, 1H, Man4-H-1), 5.07 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.91 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.78 (s, 1H, Man3-H-1), 4.61 (d, 1H, J = 8.0 Hz, GlcNAc2-H-1), 4.25 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.06 (bs, 1H, Man4'-H-2), 3.97 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.79 (dd, 1H, J = 5.0 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.61 (dd, 1H, J = 7.3 Hz, 17.0 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.01 (each s, each 3H, Ac); MS(Fab) Calcd for C38H65N4O28[M＋H+]  1025.4, found 1025.2
【０１７６】
実施例４４  化合物76、77の合成および単離
化合物2、6(5.0mg, 2.2μmol)を220μLの水に溶解させ、22mMの炭酸セシウム水溶液を100μL加え、pH7.0とした。この溶液を凍結乾燥した。乾燥後の固形物にN,N-ジメチルホルムアミドを430μL加え、更に6.6μmolのベンジルブロマイド／N,N-ジメチルホルムアミド溶液を20μL加えた。この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。48時間後、TLC（展開溶媒は１M NH4OAc：イソプロパノール＝２：１を用いた）にて原料の消失を確認した後、4.4mLのジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させた。沈殿した糖鎖を濾過し、残った糖鎖を水に溶解させ凍結乾燥した。凍結乾燥後の残留物を分取HPLC(YMC Packed Column  D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、展開溶媒は50mM酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝78：22、流速4.0mL/min)で精製したところ、88分後に化合物77が、91分後に化合物76が溶出した。それぞれを取り分け、更にODSカラム(コスモシール75C18-OPN、15×100mm、最初にH2Oを50mL流し、次に25％アセトニトリルを流して溶出させた)で脱塩したところ、目的とする化合物76が1.6mg、化合物77が1.8mg得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
【０１７７】
化合物76のデータ
1H-NMR (30℃)
δ7.92 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.53-7.40 (m, 9H, Fmoc, -CH2-Ph), 5.38 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -CH2-Ph), 5.31 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -CH2-Ph), 5.12 (s, 1H,  Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.5 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.92 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58 (m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.47 (d, 1H, J = 7.9 Hz, Gal6'- H-1), 4.33 (d, 1H, J = 7.9 Hz, Gal6-H-1), 4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.19 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.11 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bd, 1H, Asn-βCH), 2.68 (dd, 1H, J = 4.6 Hz, 12.7 Hz, NeuAc7-H-3eq), 2.52 (dd, 1H, J = 8.7 Hz, 15.0 Hz, Asn-βCH), 2.07, 2.04, 2.03, 2.02, 1.89 (each s, each 3H, Ac) 1.84 (dd, 1H, J = 12.7 Hz, 12.7 Hz, NeuAc7-H3ax); MS(Fab) Calcd for C99H143N17NaO58[M＋H+] 2380.8, found 2380.0.
【０１７８】
化合物77のデータ
1H-NMR (30℃)
δ7.91 (d, 2H, J =7.5 Hz, Fmoc), 7.71 (d, 2H, J = 7.5 Hz, Fmoc), 7.53-7.41 (m, 9H, Fmoc, -CH2-Ph), 5.37 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -CH2-Ph), 5.31 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -CH2-Ph), 5.12 (s, 1H, Man4-H-1), 4.99 (d, 1H, J = 9.8 Hz, GlcNAc1-H-1), 4.93 (s, 1H, Man4'-H-1), 4.76 (s, 1H, Man3-H-1), 4.58 (m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.46 (1H, d, J = 7.8 Hz, Gal6-H-1), 4.33 (d, 1H, J =7.8 Hz, Gal6'-H-1), 4.24 (bs, 1H, Man3-H-2), 4.19 (bs, 1H, Man4'-H-2), 4.11 (bs, 1H, Man4-H-2), 2.72 (bd, 1H, Asn-βCH), 2.68 (dd, 1H, J = 4.8 Hz, 13.0 Hz, NeuAc7-H-3eq), 2.52 (bdd, 1H, J = 9.7 Hz, 14.1 Hz, Asn-βCH), 2.06, 2.05, 2.04, 2.02, 1.89 (each s, each 3H, Ac), 1.84 (dd, 1H, J = 13.0 Hz, 13.0 Hz, NeuAc7-H-3ax); MS(Fab) Calcd for C99H143N7NaO58[M＋H+] 2380.8, found 2380.5
【０１７９】
実施例４５  化合物78の合成
４℃に冷やしたDowex-50Wx8(H+)のカラム（φ0.5 cm x 5 cm）に化合物１（20mg）の冷水溶液を流し、溶出した水溶液を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を４℃の冷水に溶かし、これにCs2CO3水溶液(2.5mg/1ml)を加え水溶液のpHが5〜６になるよう調整し、その後、該水溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後のFmoc-ジシアロ糖鎖試料をDryDMF（1.3ml）に溶かし、ベンジルブロミド（5.1μl）を加えてアルゴン気流下室温で45時間攪拌した。TLCで反応終了を確認後、反応溶液を0℃に冷やしジエチルエーテル10mlを加え目的物を析出させた。これをろ紙でろ過した。残った目的物に蒸留水を加えろ液として溶出させ、続いてこれを減圧濃縮した。得られた残渣をODSカラム(φ 1.6cm x 14cm, 溶出液：H2O →４０％MeOH水溶液)にかけ精製し化合物78(18.2mg, 収率85% )を得た。得られた化合物78の物理的データは以下の通りである。
【０１８０】
1H-NMR ( 30℃ )
7.90 (d, 2H, Fmoc), 7.70 (d, 2H, Fmoc), 7.53-7.40 (m, 9H, Bn, Fmoc), 5.36 (d, 2H, J = 11.6 Hz, CH2), 5.30 (d, 2H, J = 11.6 Hz, CH2), 5.12 (s, 1H, Man4- H1), 4.99 (d, 1H, J = 9.7 Hz, GlcNAc1- H1), 4.93 (s, 1H, Man4'- H1), 4.75 (s, 1H, Man3- H1), 4.57 (m, 3H, GlcNAc2- H1, GlcNAc5, 5'- H1), 4.32 (d, 2H, Gal6, 6'- H1), 4.24 (d, 1H, Man3- H2), 4.18 (d, 1H, Man4'- H2), 4.10 (1H, d, Man4- H2), 2.72 (bd, 1H, Asn-βCH),  2.67 (dd, 2H, NeuAc7, 7'- H3eq), 2.51 (bdd, 1H, Asn-βCH ), 2.06 (s, 3H, Ac), 2.03, 2.01 (each s, each 6H, Ac x 2), 1.89 (s, 3H, Ac), 1.83 (2H, dd, J = 12.2, 12.2 Hz, NeuAc7, 7'-H3ax)；HRMS Calcd for C117H165N8Na2O66[M＋Na+]  2783.9597, found 2783.9501
【０１８１】
【発明の効果】
本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する、様々な糖鎖類を非常に容易かつ大量に得ることができる。従って、癌、炎症、インフルエンザなどの治療薬への利用が期待される。特に、本発明により得られ得る糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンは製造工程における毒性成分の混入等の危険性はなく安全性に優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明により得られ得る糖鎖アスパラギン誘導体の一群の構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明により得られ得る糖鎖アスパラギンの一群の構造を示す図である。
【図３】図３は、本発明により得られ得る糖鎖の一群の構造を示す図である。
【図４】図４は、本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法における工程の一例を示す図である。
【図５】図５は、種々の糖加水分解酵素を用いた糖鎖アスパラギン誘導体の変換工程の一例を示す図である。
【図６】図６は、種々の糖加水分解酵素を用いた糖鎖アスパラギン誘導体の変換工程の一例を示す図である。
【図７】図７は、種々の糖加水分解酵素を用いた糖鎖アスパラギン誘導体の変換工程の一例を示す図である。
【図８】図８は、種々の糖加水分解酵素を用いた糖鎖アスパラギン誘導体の変換工程の一例を示す図である。
【図９】図９は、糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基（Ｆｍｏｃ基）の除去工程および糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去工程の一例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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