(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４０における２７番目のQから４７４番目のKで表されるアミノ酸配列からなる重鎖、および配列番号１４２における２３番目のAから２３５番目のCで表されるアミノ酸配列からなる軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号139で表されるポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号139における７９番目のCから１４２５番目のAで表されるポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号139で表されるポリヌクレオチド、および配列番号141で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項７】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項８】
移植拒絶の予防または治療に用いられる、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は免疫に関与する細胞膜分子であるＣＤ４０を認識する抗ＣＤ４０抗体に関する。さらに本発明はアゴニスティック、アンタゴニスティック活性を保ちつつ、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を低減するために、ヒト抗体定常領域に変異を導入した抗体、もしくはサブクラスの一部の構造を置換した抗体に関する。
【背景技術】１．ＣＤ４０
ＣＤ４０は分子量５０ｋＤａの細胞膜表面に存在する抗原であり、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ある種の癌細胞、そして胸腺上皮細胞に発現している。ＣＤ４０はＢ細胞やＤＣの増殖、分化に重要な働きをしていることが知られている。ＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定され（Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６，Ｉ．Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１４０３，１９８９）、アミノ酸配列の相同性から、ＣＤ４０は、低親和性ＮＧＦレセプターやＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０などが属しているＴＮＦレセプターファミリーの１つのメンバーとして考えられている。ヒトおよびマウスのＣＤ４０に対するリガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、近年遺伝子クローニングされ、ＩＩ型膜蛋白質であること、及び活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞に発現していることが分かった。ＣＤ４０Ｌは、強力な活性化シグナルをヒトおよびマウスのＢ細胞に導入することも分かっている。
また、樹状細胞にはＢ細胞よりも多くのＣＤ４０発現が確認されており、重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌと結合すると、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化、すなわちＣＤ８０（Ｂ７−１）やＣＤ８６（Ｂ７−２）などの補助刺激分子の発現、あるいはＩＬ−１２の産生が増強される（Ｃａｕｘ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣＤ４０  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１２６３，１９９４）、（Ｓｈｕ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｖｉａ  ＣＤ４０−ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１１２５，１９９５）。樹状細胞は強い抗原提示能を有し、強力なヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞活性化能を持っている。また、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔｈ細胞のＴｈ１又はＴｈ２細胞への分化を樹状細胞が制御していると考えられている。ミエロイド系樹状細胞である末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに培養してＣＤ４０Ｌにより成熟させた樹状細胞（ＤＣ１）はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ−１２産生能を有し、異系ｎａｉｖｅ  Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を誘導する（すなわちＴｈ１への分化を促す）。この作用は抗ＩＬ−１２抗体により阻害されることから、ＩＬ−１２を介した反応と考えられる。一方リンパ組織Ｔ領域や、末梢血に存在するｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｔ細胞をＩＬ−３、ＣＤ４０リガンドとともに培養したリンパ球系樹状細胞（ＤＣ２）は、ＩＬ−１２産生能は有さず、そして異系ｎａｉｖｅ  Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＬ−４産生Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ２への分化を促進することが示されている。Ｔｈ１細胞は細胞性免疫の活性化にかかわり、Ｔｈ２細胞は液性免疫能を高めると同時に細胞性免疫能の抑制に関与すると考えられている。Ｔｈ１細胞のヘルプで活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、細胞質内で増殖する病原体（多くのウイルス、リステリア菌、結核菌、およびトキソプラズマ原虫など）や腫瘍細胞を除去することができる。
膜表面に発現したＣＤ４０を認識する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、Ｂ細胞に対していろいろな生物活性を示すことは示されてきた。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用に対してアゴニスティックなものと、アンタゴニスティックなものとに大別される。
２．アゴニスティック抗体
アゴニスティック抗体の作用として、Ｂ細胞の活性化が知られている。たとえば、抗ＣＤ４０抗体が細胞接着を誘導する（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１７２２，１９９１；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８）、細胞の大きさを増進する（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８；Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９）、抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ２０抗体またはｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒのみで活性化されたＢ細胞の分裂を誘導する（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＥＵＣＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＩＩＩ．Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈｅａｌ  ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．４２６；Ｐａｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０，１９８９）、ＩＬ４存在下でＢ細胞の分裂を誘導する（Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５，１９８７）、ＩＬ−４刺激、Ｔ細胞除去培養細胞のＩｇＥ（Ｊａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１，１９９０；Ｇａｓｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）、ＩｇＧ、ＩｇＭ（Ｇａｓｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）の発現を誘導する、ＩＬ−４によるＢ細胞からの可溶性ＣＤ２３／ＦｃｅＲＩＩの分泌と（Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｇｕｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：３３９，１９８７；Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３４９，１９８８）細胞上の発現増強（Ｃｈａｌｌａ  Ａ，Ａｌｌｅｒｇｙ，５４：５７６，１９９９）をする、ＩＬ−６の生産を促進する（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１４００，１９９０）ことが報告されている。さらには、ＣＤｗ３２＋接着細胞存在下で、ＩＬ−４及び抗ＣＤ４０抗体を添加することにより、ヒト初代培養Ｂ細胞から、Ｂ細胞クローンを樹立することや（Ｂａｎｃｈｅｒａｕｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：７０，１９９１）、胚中心の中心細胞のアポトーシスが、抗原レセプターの働きにかかわらず、ＣＤ４０を介して阻害されること（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９２９，１９８９）が報告されている。以上のようにＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定されたため、単離された抗体の多くは、主にヒトＢ細胞に対する増殖分化誘導機能、癌細胞における細胞死誘導活性を指標に評価されてきた（Ｋａｔｉｒａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  Ｖ．Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｏｓｓｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．ｅｄｓ．ｐ．５４７．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗ．Ｃ．Ｆｌａｎｓｏｗ  ｅｔ．ａｌ．，ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  Ｖ．Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｏｓｓｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．ｅｄｓ．���．５５５．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：１１，１９９９，）。
抗ＣＤ４０抗体がＤＣを成熟させることが示された（Ｚ．Ｈ．Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１８：４７１  １９９９）。さらに、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞プライミングにおけるＣＤ４Ｔ細胞の役割は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌシグナリングを介したＤＣの活性化にあることが報告され、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、樹状細胞（ＤＣ）の活性化におけるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の役割を代替できることが示された（Ｓｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４８０，１９９８）。また、マウスにおいて抗ＣＤ４０抗体の投与によりＣＤ４０を発現する腫瘍細胞のみならず非発現腫瘍細胞からも生体を防御可能であることが示された（Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．：ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｖｏｋｅｓ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，１９９９）。
上述した機能に基づき、アゴニスティック抗ＣＤ４０抗体は、細菌、ウイルスなどの感染症の治療、癌の治療等に使用しうるものと考えられている。ＷＯ０２／０８８１８６には優れたアゴニスティック活性を有する抗ＣＤ４０抗体が記載されている。当該アゴニスティック抗体の代表例としてＫＭ３４１−１−１９抗体および２１０５抗体が挙げられる。ＫＭ３４１−１−１９抗体を産生するハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９は２００１年９月２７日、２１０５抗体を産生するハイブリドーマ２１０５は２００２年４月１７日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９（ＫＭ３４１−１−１９）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４（２１０５）である。
３．アンタゴニスティック抗体
一方、上記のように、ＣＤ４０が免疫反応において重要な役割を担っていることから、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害することで、臓器移植時の免疫抑制や自己免疫疾患の治療薬が開発できると期待される。Ｓａｗａｄａ−Ｈａｓｅらは、クローン病患者の末梢血中の単球ではＣＤ４０を強く発現する細胞の割合が上昇していることを報告している。しかしながら、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害する抗体については、まだ良く分かっていない。そのような阻害性抗体は、たとえば、ＣＤ４０の機能解析や、ＣＤ４０の活性化が必要な疾患の治療に有効である可能性がある。また、ＣＤ４０リガンドに対する阻害抗体も、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの結合が関与する疾患薬として有効である可能性が示されている。しかしながら、ＣＤ４０Ｌは活性化した血小板に発現するという報告（Ｖ．Ｈｅｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：５９１，１９９８）があるため、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を治療薬として使った場合、血栓を引き起こす危険性が存在することが報告されている（Ｔ．Ｋａｗａｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉ．６：１１４，２０００）。このような観点から、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害する抗体治療薬としては、抗ＣＤ４０Ｌ抗体よりも、むしろＣＤ４０に対する抗体の方が安全性に優れると期待できる。抗ＣＤ４０抗体としてはＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を抑制し、なおかつ、抗体自身がＣＤ４０を活性化しないことが必要とされる。
上述した機能に基づき、アンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体は、自己免疫疾患の治療、臓器、骨髄等の移植に際しての拒絶反応の抑制に使用しうるものと考えられている。ＷＯ０２／０８８１８６には優れたアンタゴニスティック活性を有する抗ＣＤ４０抗体が記載されている。当該アンタゴニスティック抗体の代表例として４Ｄ１１抗体が挙げられる。４Ｄ１１抗体を産生するハイブリドーマ４Ｄ１１は２００１年９月２７日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８である。
【特許文献１】  ＷＯ０２／０８８１８６号公報
【発明の開示】
本件発明は、ＷＯ０２／０８８１８６に開示された、治療効果が期待できる抗ＣＤ４０抗体について、医薬品としての最適化の図られた変異体を作製することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究の結果、従来知られている抗ＣＤ４０抗体に比して、より疾患への治療効果が高いと考えられる新規なアゴニスティック抗体、及びアンタゴニスティック抗体の変異体を作製することに成功し、本発明を完成した。本件発明における、抗ＣＤ４０抗体の改変についての基本的な考えかたを下記に詳述する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−４３１４０８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａ−１は、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体のＣＤ４０を配列を基に作製したペプチドへの結合部位を示した図である。
図１Ａ−２は、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体のＣＤ４０を配列を基に作製したペプチドへの結合部位を示した図である（図１Ａ−１の続き）。
図１Ｂ−１は、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体のＣＤ４０を配列を基に作製したペプチドへの結合部位を示した図である。
図１Ｂ−２は、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体のＣＤ４０を配列を基に作製したペプチドへの結合部位を示した図である（図１Ｂ−１の続き）。
図２Ａは、変異ＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合牲を示した図である。
図２Ｂは、変異ＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合性を示した図である。
図２Ｃは、変異ＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合性を示した図である。
図３Ａは、ＫＭ３４１−１−１９抗体にＰ３３１Ｓの変異を導入しても、Ｒａｍｏｓ細胞への結合活性が同程度あることを示した図である。
図３Ｂは、ＫＭ３４１−１−１９抗体にＰ３３１Ｓの変異を導入しても、Ｒａｍｏｓ細胞へのＣＤ９５発現促進活性が同程度あることを示す図である。
図４Ａは、ＫＭ３４１−１−１９抗体にＰ３３１Ｓの変異を導入すると、ウサギ補体を使ったＣＤＣ活性が抑制されることを示す図である。
図４Ｂは、ヒト補体を使った場合、Ｇ２／４が低い補体活性があることを示す図である。
図５Ａ−１は、２１０５抗体のサブクラスをＩｇＧ２から他のサブクラスへ変換した場合、Ｒａｍｏｓ細胞への結合は変化しないことを示す図である。
図５Ａ−２は、ＫＭ３４１−１−１９抗体のサブクラスをＩｇＧ２から他のサブクラスへ変換した場合、Ｒａｍｏｓ細胞への結合は変化しないことを示す図である。
図５Ｂ−１は、２１０５抗体のサブクラスをＩｇＧ２から他のサブクラスへ変換した場合、Ｒａｍｏｓ細胞へのＣＤ９５発現促進活性が低下することを示す図である。
図５Ｂ−２は、ＫＭ３４１−１−１９抗体のサブクラスをＩｇＧ２から他のサブクラスへ変換した場合、Ｒａｍｏｓ細胞へのＣＤ９５発現促進活性が低下することを示す図である。
図６Ａ−１は、ＫＭ３４１−１−１９抗体のＲａｍｏｓ細胞への結合能は、ヒンジの構造に依存されないことを示す図である。
図６Ａ−２は、２１０５抗体のＲａｍｏｓ細胞への結合能は、ヒンジの構造に依存されないことを示す図である。
図６Ｂ−１は、ＫＭ３４１−１−１９抗体のＲａｍｏｓ細胞へのＣＤ９５発現促進活性は、アッパーヒンジ、ミドルヒンジが重要であることを示す図である。
図６Ｂ−２は、２１０５抗体のＲａｍｏｓ細胞へのＣＤ９５発現促進活性は、アッパーヒンジ、ミドルヒンジが重要であることを示す図である。
図７Ａは、Ｆ７２をＩｇＧ２サブクラスに変換すると、Ｒａｍｏｓ細胞への結合能は変化しないことを示す図である。
図７Ｂは、Ｆ７２をＩｇＧ２サブクラスに変換すると、ＣＤ９５発現促進活性は上昇することを示す図である。
図８Ａは、４Ｄ１１抗体のサブクラスをＩｇＧ１からＩｇＧ４へ変換した場合、Ｒａｍｏｓ細胞への結合は変化しないことを示す図である。
図８Ｂは、４Ｄ１１抗体のサブクラスをＩｇＧ１からＩｇＧ４へ変換した場合、ＣＤ４０ＬｉｇａｎｄによるＲａｍｏｓ細胞におけるＣＤ９５の発現上昇を同程度阻害することを示す図である。
図９は、４Ｄ１１抗体のサブクラスをＩｇＧ１からＩｇＧ４、ＩｇＧ４ＰＥに換えた場合、ＡＤＣＣ活性が低減したことを示す図である。
図１０は、４Ｄ１１抗体のサブクラスをＩｇＧ１からＩｇＧ４Ｐへ換えた場合、ＣＤＣ活性が低減したことを示す図である。
図１１は、４Ｄ１１Ｇ１、４Ｄ１１Ｇ４Ｐ、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥをｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスに投与した後の、血中Ｂ細胞数の変化（末梢血リンパ球中のＢ２２０陽性細胞）を示す図である。
図１２Ａは、抗ＣＤ４０抗体をｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスに投与した後の、脾臓Ｂ細胞のＣＤ２３の発現上昇（脾臓Ｂ細胞中のＣＤ２３陽性細胞）を示す図である。
図１２Ｂは、抗ＣＤ４０抗体をｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスに投与した後の、脾臓Ｂ細胞のＣＤ８６の発現上昇（脾臓Ｂ細胞中のＣＤ８６陽性細胞）を示す図である。
図１２Ｃは、抗ＣＤ４０抗体をｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスに投与した後の、脾臓Ｂ細胞のＣＤ９５の発現上昇（脾臓細胞中のＣＤ９５陽性細胞）を示す図である。
図１３Ａは、ｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスにおける４Ｄ１１、２８１−１−１０による抗原特異的抗体（ＩｇＧ１）産生抑制活性を示す図である。
図１３Ｂは、ｈｕｍａｎ  ＣＤ４０トランスジェニックマウスにおける４Ｄ１１、２８１−１−１０による抗原特異的抗体（ＩｇＭ）産生抑制活性を示す図である。
図１４Ａは、抗原特異的抗体産生抑制活性試験時の血中Ｂ細胞数（末梢血リンパ球中のＢ２２０陽性細胞）を示す図である。
図１４Ｂは、抗原特異的抗体産生抑制活性試験時の脾臓中Ｂ細胞数（脾臓リンパ球中のＢ２２０陽性細胞）を示す図である。
図１５は、カニクイザルに３０ｍｇ／ｋｇの４Ｄ１１Ｇ４Ｐ、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥを投与した場合の血中Ｂ細胞数（末梢血リンパ球中のＢ２２０陽性細胞）の変化を示す図である。
図１６は、図１５の試験時の血中ＩＬ−１２濃度を示す図である。
図１７は、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥのサルＤＴＨ抑制効果（雄カニクイサルにおける遅延型過敏症）を示す図である。
図１８は、図１７に結果を示す試験における抗テタヌストキシンＩｇＧの力値を示す図である。
図１９は、図１７に結果を示す試験における抗テタヌストキシンＩｇＭの力値をしめす。
図２０Ａは、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥと５Ｃ８（抗ＣＤ４０Ｌｉｇａｎｄ抗体）の血小板凝集に対する影響を示す図である。
図２０Ｂは、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥと５Ｃ８（抗ＣＤ４０Ｌｉｇａｎｄ抗体）の血小板凝集に対する影響を示す図である。
図２１は、４Ｄ１１Ｇ４Ｐ、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ、４Ｄ１１Ｇ２Ｓｅｒ、４Ｄ１１Ｇ４／２／４をｐＨ２．７、３７℃でインキュベートした後の、オリゴマー含有率の変化を示す図である。
図２２は、抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体による皮膚移植片拒絶抑制作用を示す図である。
図２３は、Ｒａｍｏｓ細胞を移植した担癌マウスに３４１Ｇ２Ｓｅｒを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図２４は、Ｔ２４細胞を移植した担癌マウスに３４１Ｇ２Ｓｅｒを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図２５は、Ｈｓ  ７６６Ｔ細胞を移植した担癌マウスに３４１Ｇ２Ｓｅｒを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
図２６は、Ｃａｐａｎ−２細胞を移植した担癌マウスに３４１Ｇ２Ｓｅｒを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】１．アゴニスティック抗体の改変
抗体は本来外来の微生物、ウイルスや癌に対する生体防御機能をつかさどる分子であるため、抗体が結合した細胞を殺傷し、取り除く作用を兼ね備えている。この殺傷機能は２種類あり、抗体依存性細胞性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ。以下、ＡＤＣＣと略記）、及び補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ。以下、ＣＤＣと略記）といわれている。
ＡＤＣＣは、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＮＫ細胞、好中球などの表面に発現しているＦｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒを介して、抗体の定常領域と結合することにより細胞を認識し、認識した細胞が活性化することにより誘導される、細胞障害活性のことを言う。一方、ＣＤＣは抗体が抗原と結合することによって、活性化された補体系によって引き起こされる細胞障害活性のことを言う。これらの活性は、抗体のサブクラスによって、その活性の強弱が異なることが解っており、それは、抗体の定常領域の構造の違いに起因することがわかっている（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．）。
抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体は、免疫活性化という作用メカニズムからＡＤＣＣ，ＣＤＣといった、ＣＤ４０発現細胞の細胞死を引き起こす活性を持たないものが、治療薬としてより好ましいと考えられる。もしも、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性によってＣＤ４０発現細胞が障害を受けてしまった場合、期待する免疫活性化とは反対の免疫抑制状態になる可能性が考えられ、疾患の増悪をもたらす可能性が考えられる。また、感染症の治療薬として使用する場合、もともと患者のＣＤＣ、ＡＤＣＣ活性が亢進している可能性が考えられ、正常のヒト血清や、末梢血を用いた場合、その活性が検出できなかったとしても、より強い活性を持つウサギ補体などを用いて安全性に関して、より慎重に評価する必要がある。そのため、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を持たない変異体や、組換え体を作製しその活性を調べた。
ＡＤＣＣ，ＣＤＣ活性は、抗体のサブクラスによって活性が異なることが知られているため、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の低減はサブクラスの変換によって可能であると考えられる。たとえば、一般的にヒトＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ４はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低いサブクラスとして知られており、ＩｇＧ２はＣＤＣ活性はあるが、ＡＤＣＣ活性は低く、ＩｇＧ１はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の両方とも高いことが報告されている（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．）。この特徴を生かし、特定のサブクラスを選択することにより細胞障害活性の少ない抗体にすることができる。また、特定のサブクラスの抗体と以下に示す点変異の組み合わせによって、目的の活性をもつ抗体を作ることができる。また、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させる方法としては、抗体定常領域に変異を導入することによって可能であることが報告されている。たとえば、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、Ｐ３２９（アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１  Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を示す。以下同様。）は、ヒトＩｇＧの補体活性化能に重要な役割を果たしていると考えられており、この部位を他のアミノ酸に置換することによって、ＣＤＣ活性を低減できる（Ｅｓｏｈｅ  Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１６４：４１７８−４１８４，Ｙｕａｎｙｕａｎ  Ｘｕ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：３４６９−３４７４，Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：２５４２，Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９５，８６：３１９，Ｌｕｎｄ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７：４９６３，Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３，１７８：６６１）。具体的には、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１をＡに置換することにより可能である。また、Ｐ３３１をＳやＧに変換することによっても可能である。
また、Ｇｌｕ２３３−Ｓｅｒ２３９、Ｇｌｙ３１６−Ｌｙｓ３３８、Ｌｙｓ２７４−Ａｒｇ３０１、Ｔｙｒ４０７−Ａｒｇ４１６、Ａｓｎ２９７、Ｇｌｕ３１８、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２はＩｇＧとＦｃＲの結合に関与していると考えられており（Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，５６３−５６４、Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｅｉｋｅｎ，Ｈ．，Ｔａｍｍ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｅ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６，２３１−２４８、Ｇａｖｉｎ，Ａ．，Ｈｕｌｅｔｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．（１９９８）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１１−３５，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｓａｕｔｅｓ，Ｃ．（１９９７）ｉｎ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓａｕｔｅｓ，Ｃ．，ｅｄｓ），ｐｐ．２９−６６，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ、Ｄａ’ｒｏｎ，Ｍ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２０３−２３４、Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，１４８３−１４９１、Ｃｈａｐｐｅｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｓｅｎｍａｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｍ．，Ｘｕ，Ｙ．−Ｙ．，Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｈ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，９０３６−９０４０、Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，３１９−３３０、Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５３１３−５３１８）、この領域に変異を導入することにより、ＡＤＣＣ活性の低減が可能であると考えられる。具体的にはＬ２３５をＥ、Ｇ２３７をＡに置換することにより、ＦｃＲとの結合能を低減させることは可能である。
本発明の抗体は、上記のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を低減させるアミノ酸の変異を１以上、好ましくは１〜２０個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１もしくは２個有する。
一部の抗ＣＤ４０抗体に関しては、強力なアゴニスト活性の発現に関してＩｇＧ２のヒンジ領域が重要であることが、本発明において示された。したがって、可変領域と、ヒンジ領域以外の定常領域を任意のサブクラスに置換することや、点変異を導入することによって、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の調整のみならず、抗体の生産性の向上、精製および保存時における安定性、血中動体の向上が期待できる。
抗体医薬の生産においては、抗体の精製および保存時の安定性は非常に重要なポイントとなる。いままで開発されている抗体はＩｇＧ１サブクラスが最も多いため、上述の抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の物性をより向上させるためには、可変領域とヒンジ領域以外はＩｇＧ１サブクラス由来の配列とすることも有効であろう。
本件発明は、以下のアゴニスティック抗ＣＤ４０抗体変異体等を提供する。
［１］  ヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有し、定常領域にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増加または低減を生じせしめる１以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは１以上のアミノ酸が付加されたアゴニスト活性を有するＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖。
［２］  定常領域がヒトＩｇＧである、［１］の重鎖。
［３］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、［２］の重鎖。
［４］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ２である、［２］の重鎖。
［５］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ３である、［２］の重鎖。
［６］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ４である、［２］の重鎖。
［７］  定常領域のアミノ酸の置換が、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される３３１位のプロリンのセリンへの置換である、［３］〜［５］のいずれかの重鎖。
［８］  ［１］〜［７］のいずれかの重鎖を含むモノクローナル抗体。
［９］  ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する、［１］〜［７］のいずれかの重鎖。
［１０］  ［９］の重鎖およびハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［１１］  配列番号３８で表されるポリペプチドの可変領域を有する、［１］〜［７］のいずれかの重鎖。
［１２］  ［１１］の重鎖および配列番号４０で表されるポリペプチドの可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［１３］  配列番号１３２で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなる［１］の重鎖。
［１４］  ［１３］の重鎖および配列番号１３４で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［１５］  配列番号１３１で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［１］の重鎖。
［１６］  配列番号１３１で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３３で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［８］のモノクローナル抗体。
［１７］  ハイブリドーマ２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する、［１］〜［７］のいずれかの重鎖。
［１８］  ［１７］の重鎖およびハイブリドーマ２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖からなるモノクローナル抗体。
［１９］  配列番号４２で表されるポリペプチドの可変領域を有する、［１］〜［７］のいずれかの重鎖。
［２０］  ［１９］の重鎖および配列番号４４で表されるポリペプチドの可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［２１］  配列番号１３６で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなる［１］の重鎖。
［２２］  ［２１］の重鎖および配列番号１３８で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［２３］  配列番号１３５で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［１］の重鎖。
［２４］  配列番号１３５で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１３７で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［８］のモノクローナル抗体。
［２５］  配列番号１３１で表されるポリヌクレオチド。
［２６］  配列番号１３３で表されるポリヌクレオチド。
［２７］  ［２５］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［２８］  ［２６］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［２９］  ［２５］および［２６］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［３０］  ［２７］の発現ベクターを含む宿主。
［３１］  ［２８］の発現ベクターを含む宿主。
［３２］  ［２９］の発現ベクターを含む宿主。
［３３］  ［３０］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の重鎖を製造する方法。
［３４］  ［３２］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
［３５］  配列番号１３５で表されるポリヌクレオチド。
［３６］  配列番号１３７で表されるポリヌクレオチド。
［３７］  ［３５］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［３８］  ［３６］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［３９］  ［３５］および［３６］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［４０］  ［３７］の発現ベクターを含む宿主。
［４１］  ［３８］の発現ベクターを含む宿主。
［４２］  ［３９］の発現ベクターを含む宿主。
［４３］  ［４０］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の重鎖を製造する方法。
［４４］  ［４２］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
［４５］  ヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを、ヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジに置換する工程を含む、アゴニスト活性を有するＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
［４６］  ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチドを特定する工程を含む、該可変領域とヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
［４７］  ヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有していない抗体のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを、ヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジに置換する工程を含む、アゴニスト活性を有するＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［４８］  ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域のポリペプチドを特定する工程を含む、該可変領域とヒトＩｇＧ２のアッパーヒンジおよびミドルヒンジを有するモノクローナル抗体の製造方法。
［４９］  ［８］、［１０］、［１２］、［１４］、［１６］、［１８］、［２０］、［２２］および［２４］のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
［５０］  悪性腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる、［４９］の医薬組成物。
［５１］  ［４９］の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、悪性腫瘍、病原体または自己免疫疾患を予防または治療する方法。
［５２］  悪性腫瘍、病原体または自己免疫疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物を製造するための、［８］、［１０］、［１２］、［１４］、［１６］、［１８］、［２０］、［２２］および［２４］のいずれかのモノクローナル抗体の使用。
［８９］  配列番号１３１で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
［９０］  配列番号１３３で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
［９１］  配列番号１３５で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
［９２］  配列番号１３７で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
また、本件発明は、ヒトＩｇＧ２に属するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体に改変を加えた抗体であって、アッパーヒンジおよびミドルヒンジ領域以外の定常領域が他のサブクラス由来の配列に置換された変異体を提供する。好ましい他のサブクラスはＩｇＧ１である。また、本件発明は、ヒトＩｇＧ２に属するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体に改変を加えた抗体であって、ヒンジ領域以外の定常領域が他のサブクラス由来の配列に置換された変異体を提供する。好ましい他のサブクラスはＩｇＧ１である。
ここで、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が低下しているとは、上記変異体でない、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に比べて、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣが低下していることをいい、例えば、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）もしくは２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）が産生するモノクローナル抗体に比べてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣが低下していることをいう。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は公知の方法により測定することができ、例えば本明細書の実施例に記載の方法で測定すればよい。ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）もしくは２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）が産生するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下に示すとおりである。
ＫＭ３４１−１−１９抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
ＫＭ３４１−１−１９抗体  の重鎖塩基配列（配列番号３７）における、シグナル配列は５０番目のアデニン（Ａ）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は１０９番目の［アデニン］（［Ａ］）と１１０番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４９３番目のアデニン（Ａ）と４９４番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
ＫＭ３４１−１−１９抗体  の重鎖アミノ酸列（配列番号３８）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のセリン（Ｓ）と２１番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４８番目のセリン（Ｓ）と１４９番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、ＫＭ３４１−１−１９抗体  の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号３７における１１０番目のシトシン（Ｃ）から４９３番目のアデニン（Ａ）までである。また、ＫＭ３４１−１−１９抗体  の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３８における２１番目のグルタミン（Ｑ）から１４８番目のセリン（Ｓ）までである。
ＫＭ３４１−１−１９抗体の軽鎖塩基配列（配列番号３９）における、シグナル配列は、２９番目のアデニン（Ａ）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は８８番目の［アデニン］（［Ａ］）と８９番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４００番目のアデニン（Ａ）と４０１番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
ＫＭ３４１−１−１９抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号４０）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２４番目のリジン（Ｋ）と１２５番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。
以上より、ＫＭ３４１−１−１９抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号３９における８９番目のグアニン（Ｇ）から４００番目のアデニン（Ａ）までである。また、ＫＭ３４１−１−１９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４０における２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２４番目のリジン（Ｋ）までである。
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２１０５抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
２１０５抗体  の重鎖塩基配列（配列番号４１）における、シグナル配列は７０番目のアデニン（Ａ）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は１２６番目の［チミン］（［Ｔ］）と１２７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４９５番目のアデニン（Ａ）と４９６番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
２１０５抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号４２）における、シグナル配列と可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４２番目のセリン（Ｓ）と１４３番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、２１０５抗体  の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号４１における１２７番目のグアニン（Ｇ）から４９５番目のアデニン（Ａ）までである。また、２１０５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４２における２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４２番目のセリン（Ｓ）までである。
２１０５抗体の軽鎖塩基配列（配列番号４３）における、シグナル配列は、２８番目のアデニン（Ａ）から始まる。シグナル配列と可変領域の境界は８７番目の［アデニン］（［Ａ］）と８８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４０５番目のアデニン（Ａ）と４０６番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
２１０５抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号４４）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２６番目のリジン（Ｋ）と１２７番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。
以上より、２１０５抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号４３における８８番目のグアニン（Ｇ）から４０５番目のアデニン（Ａ）までである。また、２１０５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４４における２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２６番目のリジン（Ｋ）までである。
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３４１Ｇ２Ｓｅｒの重鎖塩基配列（配列番号１３１）における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目の［アデニン］（［Ａ］）と６１番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４４４番目のアデニン（Ａ）と４４５番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
３４１Ｇ２Ｓｅｒの重鎖アミノ酸列（配列番号１３２）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のセリン（Ｓ）と２１番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４８番目のセリン（Ｓ）と１４９番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、３４１Ｇ２Ｓｅｒの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１３１における６１番目のシトシン（Ｃ）から４４４番目のアデニン（Ａ）までである。また、３４１Ｇ２Ｓｅｒの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１３２における２１番目のグルタミン（Ｑ）から１４８番目のセリン（Ｓ）までである。
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３４１Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖塩基配列（配列番号１３３）における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目の［アデニン］（［Ａ］）と６１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は３７２番目のアデニン（Ａ）と３７３番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
３４１Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖アミノ酸列（配列番号１３４）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２４番目のリジン（Ｋ）と１２５番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。以上より、３４１Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１３３における６１番目のグアニン（Ｇ）から３７２番目のアデニン（Ａ）までである。また、３４１Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１３４における２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２４番目のリジン（Ｋ）までである。
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２１０５Ｇ２Ｓｅｒの重鎖塩基配列（配列番号１３５）における、シグナル配列と可変領域の境界は５７番目の［チミン］（［Ｔ］）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４２６番目のアデニン（Ａ）と４２７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
２１０５Ｇ２Ｓｅｒの重鎖アミノ酸列（配列番号１３６）における、シグナル配列と可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４２番目のセリン（Ｓ）と１４３番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、２１０５Ｇ２Ｓｅｒの重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１３５における５８番目のグアニン（Ｇ）から４２６番目のアデニン（Ａ）までである。また、２１０５Ｇ２Ｓｅｒの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１３６における２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４２番目のセリン（Ｓ）までである。
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２１０５Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖塩基配列（配列番号１３７）における、シグナル配列と可変領域の境界は６０番目の［アデニン］（［Ａ］）と６１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は３７８番目のアデニン（Ａ）と３７９番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
２１０５Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖アミノ酸列（配列番号１３８）における、シグナル配列と可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２６番目のリジン（Ｋ）と１２７番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。以上より、２１０５Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１３７における６１番目のグアニン（Ｇ）から３７８番目のアデニン（Ａ）までである。また、２１０５Ｇ２Ｓｅｒの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１３８における２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２６番目のリジン（Ｋ）までである。
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２．アンタゴニスティック抗体の改変
抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体に関しても、アゴニスティック抗体と同様に、その作用メカニズムからＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性がないことが医薬品としてより好ましいと考えられる。さらに、アンタゴニスティック抗体の場合、ＡＤＣＣ活性が検出できない場合においても、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒを介した抗体の架橋によって、シグナルを誘導する活性を回避することが重要となる。言い換えれば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて免疫を活性化しないことを確認することが必要となり、そのような活性をもつ抗体が医薬品としては、必要であると考えられる。抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体は、自己免疫疾患や臓器移植拒絶などの治療薬として期待されているが、もしも、抗体投与後に何らかの働きで、微弱でもアゴニスト活性を誘導してしまうことがあった場合、症状の増悪をもたらし、期待した治療効果の反対の結果となる可能性が考えられるため、アゴニスト活性が全くない抗体が医薬品としてはより好ましい。本発明においては、サルを用いた試験により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもアゴニスト活性をより低減させるためには、ＩｇＧ４に点変異Ｌ２３５Ｅ（２３５番目のＬをＥに置換することを意味する。以下同様。）を導入することが有効であることを示した。また、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低い抗体サブクラスとして、ＩｇＧ４が挙げられるが、ＩｇＧ４は組換え蛋白質としてＣＨＯなどの細胞で発現させる場合、重鎖間のＳＳ結合の形成が不十分で、半量体が分泌されることが報告されている（Ｒｏｂ  Ｃ．Ａａｌｂｅｒｓｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０５，９−１９，２００２）。このため、抗体定常領域に変異を導入することにより、ＳＳ結合の形成を促進できることが報告されており、この変異の有用性に関しても評価した。具体的には、２２８番目のＳをＰに置換する変異を導入した（Ｓ．Ａｎｇａｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ３０，ｎｏ１，１０５−１０８，１９９３）。
アゴニスト抗体と同様にアンタゴニスト抗体においても、抗体の精製保存時の安定性は非常に重要なポイントとなる。いくつかの方法により、アンタゴニスト活性を保持しつつ、より物性的に優れた抗体を作製することが可能であると考えられる。現在までに市販されている抗体医薬品は、ＩｇＧ１サブクラスに属するものがほとんどを占め、製剤上の問題点は特に報告されていない。このことから、抗体の定常領域がＩｇＧ１であることが物性的には有利である可能性が考えられる。しかし、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体の場合は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低減されたものが望ましい。このため、ＩｇＧ１の定常領域にいくつかの点変異を導入したものが望まれる。方法としては、上述した変異を導入することにより可能となる。例えば、Ｐ３３１Ｇ点変異を導入することにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を低減させた、ＩｇＧ１定常領域を作ることが可能であると考えられる。また、ＩｇＧ４に点変異Ｌ２３５Ｅを導入することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、微弱なアゴニスト活性が消失し、薬効的には優れた活性を示すが、物性面では低ｐＨにおける安定性が低下するという減少が見られている。このため、Ｌ２３５をＥ以外の別のアミノ酸に置換することにより、物性面での機能向上が期待できる。また、４Ｄ１１抗体については、その可変領域の構造が非常に類似している２Ｂ１１抗体がある。２Ｂ１１抗体は、アンタゴニスト活性は、４Ｄ１１抗体に劣るが、低ｐＨにおける安定性は４Ｄ１１抗体に勝る。このことを利用し、可変領域の２Ｂ１１由来のアミノ酸の一部を４Ｄ１１抗体に導入することによって、安定性を向上させることは可能であると考えられる。具体的には、重鎖のＬ３８Ｖ、Ｐ５８Ｒ、Ｇ６２Ｗ、Ｉ７９Ｍ、Ｋ８１Ｙ、Ｈ８７Ｙ、Ｓ９８Ａ、Ｋ１０９Ｒ、Ｖ１２０Ｍ、Ｔ１２４Ａおよび、軽鎖のＮ７５Ｓの点変異とその組み合わせによって、可能であると考えられる。具体的には、４Ｄ１１抗体重鎖可変領域の３８番目ＬをＶに置換した変異体（Ｌ３８Ｖと略記。以下同様）、Ｐ５８Ｒ変異体、Ｇ６２Ｗ変異体、Ｉ７９Ｍ変異体、Ｋ８１Ｙ変異体、Ｈ８７Ｙ変異体、Ｓ９８Ａ変異体、Ｋ１０９Ｒ変異体、Ｖ１２０Ｍ変異体、Ｔ１２４Ａ変異体、および、軽鎖のＮ７５Ｓ変異体、または前述の点変異の組み合わせによって、可能であると考えられる。
本発明の抗体は、上記のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を低減させるアミノ酸の変異を１以上、好ましくは１〜１５個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１もしくは２個有する。
本件発明は、以下のアンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体変異体等を提供する。
［５３］  定常領域にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増加または低減を生じせしめる１以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは１以上のアミノ酸が付加されたアンタゴニスト活性を有するＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖。
［５４］  定常領域がヒトＩｇＧである、［５３］の重鎖。
［５５］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、［５４］の重鎖。
［５６］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ２である、［５４］の重鎖。
［５７］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ３である、［５４］の重鎖。
［５８］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ４である、［５４］の重鎖。
［５９］  定常領域のアミノ酸の置換が、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３５位のロイシンからグルタミン酸への置換である、［５５］、［５７］および［５８］のいずれかの重鎖。
［６０］  定常領域に、重鎖どうしのＳＳ結合形成を促進させる１以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは１以上のアミノ酸が付加されている、［５３］〜［５８］のいずれかの重鎖。
［６１］  定常領域のアミノ酸の置換が、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２２８位のセリンからプロリンへの置換である、［６０］の抗体の重鎖。
［６２］  ［５３］〜［６１］のいずれかの重鎖を含むモノクローナル抗体。
［６３］  ハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する、［５３］〜［６１］のいずれかの重鎖。
［６４］  ［６３］の重鎖およびハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［６５］  配列番号４６で表されるポリペプチドの可変領域を有する、［５３］〜［６１］のいずれかの重鎖。
［６６］  ［６５］の重鎖および配列番号４８で表されるポリペプチドの可変領域を有するモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［６７］  配列番号１４０で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなる［５３］の重鎖。
［６８］  ［６７］の重鎖および配列番号１４２で表されるポリペプチドからシグナル配列を除いた部分からなるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
［６９］  配列番号１３９で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［５３］の重鎖。
［７０］  配列番号１３９で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号１４１で表されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生される［６２］のモノクローナル抗体。
［７１］  配列番号１３９で表されるポリヌクレオチド。
［７２］  配列番号１４１で表されるポリヌクレオチド。
［７３］  ［７１］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［７４］  ［７２］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［７５］  ［７１］および［７２］のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［７６］  ［７３］の発現ベクターを含む宿主。
［７７］  ［７４］の発現ベクターを含む宿主。
［７８］  ［７５］の発現ベクターを含む宿主。
［７９］  ［７６］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体の重鎖を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の重鎖を製造する方法。
［８０］  ［７８］の宿主を培養液中で培養し、該培養物及び／または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体を製造する方法。
［８１］  ［６２］、［６４］、［６６］、［６８］および［７０］のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含む医薬組成物。
［８２］  移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーまたは血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群の予防または治療に用いられる、［８１］の医薬組成物。
［８３］  ［８１］の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーまたは血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群を予防または治療する方法。
［８４］  移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーまたは血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群の予防または治療に用いられる医薬組成物を製造するための、［６２］、［６４］、［６６］、［６８］および［７０］のいずれかのモノクローナル抗体の使用。
［８５］  ヒト抗体の重鎖定常領域に１以上のアミノ酸の欠失または置換もしくは１以上のアミノ酸を付加する工程を含む、アゴニスティック活性が低減されたアンタゴニスト活性を有するＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体の重鎖の製造方法。
［８６］  定常領域がヒトＩｇＧである、［８５］の方法。
［８７］  ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ４である、［８６］の方法。
［８８］  定常領域のアミノ酸の置換が、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３５位のロイシンからグルタミン酸への置換である、［８５］〜［８７］のいずれかの方法。
［９３］  配列番号１３９で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
［９４］  配列番号１４１で表されるポリヌクレオチドからシグナル配列をコードする部分を除いた、ポリヌクレオチド。
その他、本発明は以下のものを提供する。
ハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）の産生するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の３８番目ＬのＶへの置換、５８番目ＰのＲへの置換、６２番目ＧのＷへの置換、７９番目ＩのＭへの置換、８１番目ＫのＹへの置換、８７番目ＨのＹへの置換、９８番目ＳのＡへの置換、１０９番目ＫのＲへの置換、１２０番目ＶのＭへの置換、１２４番目ＴのＡへの置換からなる群から選択される少なくとも一つの置換を含む上記のアンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体の変異体、ならびに４Ｄ１１抗体軽鎖可変領域の７５番目ＮをＳに置換した上記上記ののアンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体の変異体。
ここで、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が低下しているとは、上記変異体でない、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に比べて、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣが低下していることをいい、例えば、ハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）の産生するモノクローナル抗体に比べてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣが低下していることをいう。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は公知の方法により測定することができ、例えば本明細書の実施例に記載の方法で測定すればよい。ハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）の産生するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下に示すとおりである。
４Ｄ１１抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
４Ｄ１１抗体の重鎖塩基配列（配列番号４５）における、シグナル配列と可変領域の境界は９３番目の［シトシン］（［Ｃ］）と９４番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４５６番目のアデニン（Ａ）と４５７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
４Ｄ１１抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号４６）における、シグナル配列と可変領域の境界は２６番目のセリン（Ｓ）と２７番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４７番目のセリン（Ｓ）と１４８番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、４Ｄ１１抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号４５における９４番目のシトシン（Ｃ）から４５６番目のアデニン（Ａ）までである。また、４Ｄ１１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４６における２７番目のグルタミン（Ｑ）から１４７番目のセリン（Ｓ）までである。
４Ｄ１１抗体の軽鎖塩基配列（配列番号４７）における、シグナル配列と可変領域の境界は１２４番目の［チミン］（［Ｔ］）と１２５番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４４２番目のアデニン（Ａ）と４４３番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
４Ｄ１１抗体の軽鎖アミノ酸列（配列番号４８）における、シグナル配列と可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアラニン（Ａ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２８番目のリジン（Ｋ）と１２９番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。
以上より、４Ｄ１１抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号４７における１２５番目のグアニン（Ｇ）から４４２番目のアデニン（Ａ）までである。また、４Ｄ１１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４８における２３番目のアラニン（Ａ）から１２８番目のリジン（Ｋ）までである。
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４Ｄ１１抗体Ｇ４ＰＥの重鎖塩基配列（配列番号１３９）における、シグナル配列と可変領域の境界は７８番目の［シトシン］（［Ｃ］）と７９番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は４４１番目のアデニン（Ａ）と４４２番目のグアニン（Ｇ）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
４Ｄ１１抗体の重鎖アミノ酸列（配列番号１４０）における、シグナル配列と可変領域の境界は２６番目のセリン（Ｓ）と２７番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１４７番目のセリン（Ｓ）と１４８番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。
以上より、４Ｄ１１抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１３９における７９番目のシトシン（Ｃ）から４４１番目のアデニン（Ａ）までである。また、４Ｄ１１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４０における２７番目のグルタミン（Ｑ）から１４７番目のセリン（Ｓ）までである。
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４Ｄ１１Ｇ４ＰＥの軽鎖塩基配列（配列番号１４１）における、シグナル配列と可変領域の境界は６６番目の［チミン］（［Ｔ］）と６７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は３８４番目のアデニン（Ａ）と３８５番目の［シトシン］（［Ｃ］）の間に位置する（遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）を使用）。
４Ｄ１１Ｇ４ＰＥの軽鎖アミノ酸列（配列番号１４２）における、シグナル配列と可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアラニン（Ａ）の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は１２８番目のリジン（Ｋ）と１２９番目の［アルギニン］（［Ｒ］）の間に位置する。
以上より、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥの軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１４１における６７番目のグアニン（Ｇ）から３８４番目のアデニン（Ａ）までである。また、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４２における２３番目のアラニン（Ａ）から１２８番目のリジン（Ｋ）までである。
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３．定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
本発明でいう「ＣＤ４０」とは、クラークら（Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６）又はスタメンコビックら（Ｉ．Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１４０３，１９８９）により示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、特にＢ細胞、ＤＣ、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞、あるいはそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリペプチドである。
「抗ＣＤ４０抗体」とは、細胞発現ＣＤ４０、全長ＣＤ４０又は部分長ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体のいずれをも意味する。
さらに、本発明で「抗体」とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と総称する）に由来するものである。ヒトのイムノグロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる５つの異なったクラスが存在する。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる４つのサブクラス、またＩｇＡはさらにＩｇＡ１およびＩｇＡ２からなる２つのサブクラスに分類することが出来る。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４はヒト染色体の１４ｑ３２．３３に位置する。イムノグロブリンの基本構造は、２本の相同なＬ鎖（軽鎖）と、２本の相同なＨ鎖（重鎖）から成り立っている。免疫グロブリンのクラスとサブクラスはＨ鎖によって決定される。本発明の抗体には、いずれのイムノグロブリンクラス・サブクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。本発明における抗体の「機能的断片」とは、前記で定義した抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合ＦＶ、一本鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）、およびこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）。
これまでに知られているＩｇＧ１としてはＪ００２２８、Ｚ１７３７０またはＹ１４７３７などが、ＩｇＧ２としてはＪ００２３０、ＡＪ２５０１７０、ＡＦ４４９６１６、ＡＦ４４９６１７、ＡＦ４４９６１８、Ｚ４９８０２またはＺ４９８０１などが、ＩｇＧ３としてはＭ１２９５８、Ｋ０１３１３、Ｘ１６１１０、Ｘ９９５４９、ＡＪ３９０２３６、ＡＪ３９０２３７、ＡＪ３９０２３８、ＡＪ３９０２４１、ＡＪ３９０２４２、ＡＪ３９０２４６、ＡＪ３９０２４７、ＡＪ３９０２５２、ＡＪ３９０２４４、ＡＪ３９０２５４、ＡＪ３９０２６０、ＡＪ３９０２６２、ＡＪ３９０２７２、ＡＪ３９０２７６またはＡＪ３９０２７９などが、ＩｇＧ４としてはＫ０１３１６、ＡＪ００１５６３、ＡＪ００１５６４などが挙げられる（以上の記号は遺伝子のアクセッション番号である）。
本発明における、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３とは、抗体重鎖定常領域の一部分を示しており、ＫａｂａｔらのＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１  Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に基づいている。ＣＨ１は、ＥＵインデックス１１８から２１５、ヒンジはＥＵインデックス２１６から２３０、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１から３４０、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１から４４６と定義される。
本発明で「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。
「アゴニスティック」とは、Ｂ細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するＣＤ４０に、そのリガンドが結合することを促進する作用、あるいは、ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を、ＣＤ４０を発現する細胞に与える作用を意味し、「アゴニスティック抗体」とは、そのようなアゴニスティック作用を有する抗体を意味する。ＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つとして、例えばＣＤ９５の発現促進が挙げられる。
「アンタゴニスティック」とは、Ｂ細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するＣＤ４０にそのリガンドが結合することを阻害する作用、あるいは、ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を中和する作用を意味し、「アンタゴニスティック抗体」とはそのような作用を有する抗体を意味する。ＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つとして、例えばＢ細胞増殖抑制あるいは抗体産生抑制が挙げられる。
本出願において、アミノ酸配列によって抗体またはその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域を明示しているが、１以上、好ましくは１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１もしくは２個のアミノ酸が欠失した、あるいは置換された、若しくは付加されたものも本発明の範疇に含まれる。
本出願において、塩基配列によって抗体またはその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子をを明示しているが、１以上、好ましくは１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１もしくは２個の塩基が欠失した、あるいは置換された、若しくは付加されたものも本発明の範疇に含まれる。
本発明においては、抗ＣＤ４０抗体は、抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、ベクターを適当な宿主細胞に導入し、細胞もしくは細胞の培養上清から回収、精製することにより得ることができる。
ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るか、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。
本発明において、「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、（ｃ）形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などが採用される。
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックブタを作製し、そのトランスジェニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８３０−８３４）。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
４．抗体の性質
（１）アゴニスティック抗体の場合
本発明のアゴニスティック抗体の変異体は、アゴニスティック活性を保持しつつ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性がオリジナルの抗体に比べ、同程度以下になっているため、免疫担当細胞を傷害することなく、免疫系を活性化することができると考えられる。そのため、オリジナル抗体に比べ同程度以上の免疫活性化作用と、同程度以下のＣＤ４０発現細胞への障害による毒性を示すことが期待される。
（２）アンタゴニスティック抗体の場合
本発明のアンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体の変異体は、ＣＤ４０Ｌによる免疫活性化シグナルを抑制する活性を保持しつつ、改変前の抗体に比べ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低減している。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、Ｆｃレセプターを介すると考えられるシグナル誘導活性の低下が期待される。
５．医薬組成物
また、本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような医薬組成物は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することに理再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
この場合、本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、アゴニスティック抗体については、免疫賦活化剤（抗ウィルス剤、抗感染症剤）であり、病原体としてはＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，またはＥ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、パピローマウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、トキソプラズマ、マラリア、トリパノソーマ、結核などが例示される。または抗腫瘍剤であり、対象腫瘍としてはＣＤ４０を発現した癌細胞を含む悪性腫瘍、例えば膵臓癌、膀胱癌、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫）、白血病、悪性黒色腫、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、頭頸部癌が挙げられる。または自己免疫疾患治療剤であり、対象疾患としてはリウマチが例示される。または、これらの疾患が複数併発してもよい。あるいは、ガン特異的ペプチドなどのワクチンとアジュバントとして併用することもできる。また、アンタゴニスティック抗体については、臓器移植時における免疫抑制剤（膵島移植や腎臓などの移植時における拒絶反応、ＧＶＨＤの予防又は治療剤）として、あるいは自己免疫疾患（例えば、リュウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリトマトーデス、多発性硬化症、筋無力症、強皮症、抗りん脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、特発性血小板減少性紫斑病、ベーチェット病、動脈硬化、腎炎、呼吸切迫症候群）の治療剤、喘息などアレルギーの治療剤、血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群の治療剤として有用であり、これらの疾患が複数併発してもよい。
６．エピトープ
優れたアゴニスト活性を有するＫＭ３４１−１−１９抗体および２１０５抗体、優れたアンタゴニスト活性を有する４Ｄ１１抗体のＣＤ４０に対する結合エピトープが決定された（実施例２）。本件発明は、上記抗体とは異なる可変領域配列を有し、かつ上記抗体のいずれかと同じエピトープを認識するアゴニスティックもしくはアンタゴニスティック抗ＣＤ４０抗体を提供する。このような抗体は下記の要領によって取得できる。
例えばＫＭ３４１−１−１９抗体と同じエピトープを認識するアゴニスティック抗ＣＤ４０抗体を取得する場合、ＣＤ４０をマウス等に免疫して得られたモノクローナル抗体の中から、ＣＤ４０への結合に際してＫＭ３４１−１−１９抗体と競合するものを常法により選抜する。選抜されたものについて実施例２に記載された方法に基づき、ペプチドに対する結合パターンがＫＭ３４１−１−１９抗体と同じものを選抜する。
以下、実施例を以って本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される形態のみに限定されるものではない。
【実施例１】  抗体、抗原蛋白質の発現精製
抗体発現細胞は、抗体の可変領域を含むベクタープラスミドを、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に遺伝子導入し、Ｇ４１８により選択することにより安定発現株を作製した。
また、変異型抗原の発現は、ベクターを一過性にＨＥＫ細胞（ＡＴＣＣ）に導入することによって実施した。
上記培養上清からの抗ＣＤ４０抗体の精製は以下の方法で行った。抗ＣＤ４０抗体を含む培養上清をＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（日本ガイシ製）あるいはマウスＩｇＧ１の精製にはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）あるいはＮａ２ＨＰＯ４溶液を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）あるいはＳＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌した。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４５ＯＤとして算出した。
【実施例２】  エピトープの決定
ＣＤ４０の細胞外領域の１７５アミノ酸（配列番号１）をカバーする、１３−ｍｅｒペプチドを２アミノ酸ずつ、ずらして合計８２種のペプチド（配列番号４９から１３０）をＣｅｌｌｕｌｏｓｅ膜上にＣ末端からスポット状に合成し、Ｎ末をアセチル化した（ＪＥＲＩＮＩ社：ドイツ）。以降の反応は常法のウェスタン解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｕ．ほか．（２００１）．“Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ＳＰＯＴ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）Ｅｄｓ．：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ／Ｄｕｂｅｌ，４３３−４５９．など参照）を元に実施した。解析はＬｕｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を使用し、各スポットの発色強度を数値化した（図１Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１、Ｂ−２）。
その結果、４Ｄ１１抗体は２０−２４番目と４１番目のペプチド、２１０５抗体は１２−２３番目と６４番目、ＫＭ３４１−１−１９抗体は４１，４２番目のペプチド、ＫＭ６４３−４−１１は４３番目のペプチド、Ｆ７２は７５番目、１１０は６４番目のペプチドを、Ｆ４−４６５は、３４、３５、５４、５５、６５、６６、７５番目のペプチドを、ＫＭ２８１−１−１０は２１、２４、６４、７５番目のペプチドを、２Ｂ１１（新規抗体）は２１、２４、６４番目のペプチドを、Ｆ７６（新規抗体）は２１、３５、５１、５２番目のペプチドを強く認識することがわかった。
抗ＣＤ４０抗体の結合部位を確定するため、変異を導入したＣＤ４０−ＦＣ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎを作製し結合能をＥＬＩＳＡにより調べた。抗ＣＤ４０抗体はマウスのＢ細胞に対して交差性を示さないため、マウスＣＤ４０のアミノ酸配列に部分的に変換した５種類のＣＤ４０Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎを作製し、この抗原に対する、抗体の結合を調べた。変異型ＣＤ４０−ＦＣ融合蛋白質の作製方法は以下に示す。変異部位は、抗体が強く結合するペプチドの配列の部分に、マウスＣＤ４０の配列を導入することにより作製した。ＣＤ４０ｍｕｔ１は、１５番ペプチドに相当する部位のＥＦＴＥをＡＬＥＫに、ＣＤ４０ｍｕｔ２は、２１番ペプチドに相当する部位のＬＤＴをＳＡＱへ、ＣＤ４０ｍｕｔ３は、２４番ペプチドに相当する場所のＴＨをＩＲへ、ＣＤ４０ｍｕｔ４は、４２番目ペプチドに相当する部位のＥＥＧＷをＫＥＧＱへ、ＣＤ４０ｍｕｔ５は、６４番目ペプチドに相当する部位をＶＳＳＡからＱＳＳＬへ変換した。変異体の作製は、遺伝子工学的手法に従って実施した（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）。解析の結果２１０５抗体は、ＣＤ４０ｍｕｔ１への結合能を著しく低下させていることがわかった。また、４Ｄ１１抗体、２Ｂ１１は、ＣＤ４０ｍｕｔ２への結合能を低下させていることがわかった。
【実施例３】  抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体のＲａｍｏｓ細胞に対する結合活性
２ｘ１０６／ｍｌの濃度でＲａｍｏｓ細胞株を０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳの染色バッファー（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒトＩｇＧ１抗体を用い、ハイブリドーマ培養培地で２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下１５分間インキュベートした。ＳＢで洗浄した後、２５０倍希釈したＲ−ＰＥ蛍光標識抗ヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）５０μｌを加え、氷温下１５分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００〜５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｏｒｔ、ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。
【実施例４】  抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアゴニスティック活性評価
５．０ｘ１０５個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した。ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体を２０μｇ／ｍｌに培地で希釈し、９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌの濃度で添加した。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＮＪ）を用い、ＦＡＣＳＣａｎあるいはＦＡＣＳｓｏｒｔ（ベクトンデッキンソン）を使って解析した。
【実施例５】  Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体によるＣＤ９５発現抑制
１．０ｘ１０６個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで播種した。ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体を２μｇ／ｍｌに培地で調整し、９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。可溶性ＣＤ４０リガンド（ＡＬＥＸＩＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を４μｇ／ｍｌと抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、シグマ）４μｇ／ｍｌとを培地に添加し、９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＮＪ）を用い、ＦＡＣＳを使って解析した。
【実施例６】  抗ＣＤ４０抗体ＣＤＣ活性の測定
ＣＤＣアッセイは、Ｃｒ５１ラベルしたターゲット細胞２０００個に対して、最終濃度５％のヒト血清由来補体（ＳＩＧＭＡ社製）もしくはウサギ血清由来補体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＬＩＭＩＴＥＤ、オンタリオ、カナダ）を、丸底９６ウェルプレート中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養した。
培養後、プレートを遠心して細胞を沈めた後、上清５０μＬを粉末シンチレーター含有の９６穴プレート（ＬｕｍａｐｌａｔｅＴＭ−９６：パッカード社製）に移し、５５℃、１．５時間で乾燥した。乾燥を確認後、専用カバー（ＴｏｐＳｅａｌＴＭ−Ａ：９６−ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ：パッカード社製）でプレートをカバーし、シンチレーションカウンター（トップカウント：パッカード社製）でγ線量を測定した。
【実施例７】  抗ＣＤ４０抗体のＡＤＣＣ活性測定
抗体を介した細胞傷害性活性は、ＮＫ細胞或いは好中球などのキラー活性を有する細胞と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性（抗体依存性細胞性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、以下、ＡＤＣＣ）、及び補体と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性（補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）以下、ＣＤＣ）の測定を実施した。コントロールとしてｈＩｇＧを用いた。
方法は簡単には、ターゲット細胞に放射性クロム（Ｃｒ５１）を細胞質内に取り込ませ、細胞死により培養液中に遊離されるＣｒ５１量をγ線量で測定した。
具体的には、ターゲット細胞としてバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）を１０６個を１５μＬのＦｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）に懸濁し、５０μＬ（３７ＭＢｑ／ｍＬ）のＣｒ５１ラベルされたクロム酸ナトリウム（パーキエルマー社製：以下Ｃｒ５１と書く）を添加し、１時間３７℃で培養した。次に、培地を１０ｍＬ添加し、遠心して培地を捨てることを３回繰り返すことで、細胞内に取り込まれていないＣｒ５１を除いた。
ＡＤＣＣアッセイは、Ｃｒ５１ラベルしたターゲット細胞２０００個に対して、実施例６記載の方法で取得した健常人末梢血単核球２０００００個を、丸底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した。
培養後、プレートを遠心して細胞を沈めた後、上清５０μＬを粉末シンチレーター含有の９６穴プレート（ＬｕｍａｐｌａｔｅＴＭ−９６：パッカード社製）に移し、５５℃、１．５時間で乾燥した。乾燥を確認後、専用カバー（ＴｏｐＳｅａｌＴＭ−Ａ：９６−ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ：パッカード社製）でプレートをカバーし、シンチレーションカウンター（トップカウント：パッカード社製）でγ線量を測定した。
【実施例８】  抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体Ｐ３３１Ｓ変異体の作製と活性評価
抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体ＫＭ３４１−１−１９および２１０５の遺伝子クローニングに関してはＷＯ０２／０９９１８６に記載されている。ＩｇＧ２定常領域の３３１番目ＰｒｏをＳｅｒに変換することによってＣＤＣ活性が低減するという報告がある。ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体に関してもＣＤＣ活性を低減するために、Ｐ３３１Ｓ変異をＩｇＧ２定常領域に導入した。
抗体発現ベクターＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：以下Ｎ５ＫＧ１と略記）の、ヒトＩｇＧ１定常領域をヒトＩｇＧ２に置き換えたもの（Ｎ５ＫＧ２）を作製し、ＩｇＧ２の３３１番目ＰｒｏをＳｅｒに変換した変異を作製した。ＩｇＧ２定常領域のｃＤＮＡクローニングは、ＫＭ３４１−１−１９ハイブリドーマを遠心によって集め，ＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加し、取扱説明書にしたがって、ＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付の説明書にしたがって行った。５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、１ｓｔＳｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。Ｐｒｉｍｅｒの配列は、ｔｎＩｇＧ３Ｎｈｅ：ａｔａｔＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣ（配列番号２）Ｇ、ｔｎＩｇＧ２Ｂａｍ：ａｔａｔｇｇａｔｃｃＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣ（配列番号３）を使い、ＺｔａｑＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて９８℃１秒、５５℃３０秒、７２℃１分ｘ３０ｃｙｃｌｅでＰＣＲを行い、遺伝子を増幅した。反応後、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、ＮｈｅＩ，ＢａｍＨＩでｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、Ｎ５ＫＧ１に組み込み配列の確認をおこなった。このベクターをＮ５ＫＧ２とした。
Ｎ５ＫＧ２Ｓｅｒ（３３１番目をＳｅｒに換えたもの）は、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＩｇＧ３Ｎｈｅ：ａｔａｔＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧ（配列番号４）、Ｇ２Ｓｅｒ２：ＧＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣ（配列番号５）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＩｇＧ２Ｂａｍ：ａｔａｔｇｇａｔｃｃＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣ（配列番号６）Ｇ２Ｓｅｒ１：ＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣ（配列番号７）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーＩｇＧ３Ｎｈｅ、ＩｇＧ２Ｂａｍを加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた（Ｎ５ＫＧ２Ｓｅｒ）。ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩで消化した抗体可変領域の配列を含む断片をＮ５ＫＧ２ｓｅｒベクターに組み込んだ。
上述の方法で発現精製した抗体を用いて、Ｒａｍｏｓ細胞に対する結合能（図３Ａ）、アゴニスティック活性（図３Ｂ）の評価を実施した。Ｐ３３１Ｓの変異の導入によって、活性の変動は見られなかった。
【実施例９】  抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体３３１ｓｅｒ変異体のＣＤＣ活性の測定
上述の方法によりＣＤＣ活性を測定した。ウサギ血清由来補体を使用し、Ｒａｍｏｓ細胞を標的細胞として使用した。その結果、ＫＭ３４１−１−１９抗体は１μｇ／ｍｌの抗体濃度ではＩｇＧ２に比べＩｇＧ２ｓｅｒが顕著にＣＤＣ活性が減少していることがわかった（図４Ａ）。一方ヒト補体を使用した場合は、変化は見られなかった（図４Ｂ）。
【実施例１０】  アゴニスト抗ＣＤ４０抗体定常領域変換体の作製と活性側定
ＷＯ０２／０８８１８６に記載の抗ＣＤ４０抗体のうち、最も強いアゴニスティック活性を示すもの２つ（ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体）は、ＩｇＧ２サブクラスであった。ＩｇＧ２サブクラスがＣＤ４０の活性化に重要であるかどうか調べるため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に抗体定常領域を変換した組換え蛋白質を作製し、抗原への結合能と、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＣＤ９５発現促進活性は、実施例実施例４、６に従って実施した。ＩｇＧ１型の発現に関しては、Ｎ５ＫＧ１をＩｇＧ２、ＩｇＧ３の発現に関しては、Ｎ５ＫＧ１の定常領域を、それぞれＩｇＧ２、ＩｇＧ３に置きかえた発現ベクター、Ｎ５ＫＧ２、Ｎ５ＫＧ３を用いた。ＩｇＧ３定常領域のｃＤＮＡクローニングはＩｇＧ２のクローニング方法を一部改変し、ＩｇＧ３特異的プライマーを使用することで実施した。ＩｇＧ４の発現にはＮ５ＫＧ４ＰＥ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた。
抗体蛋白質の発現は、実施例１にしたがって実施した。ヒトＣＤ４０を発現しているＲａｍｏｓ細胞への結合活性は、ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体ともＩｇＧ２からＩｇＧ１、３、４へ変換したことによる影響は見られなかったが（図５Ａ−１、図５Ａ−２）、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＣＤ９５の発現促進活性は、１／１０以上低下していることがわかった（図５Ｂ−１、図５Ｂ−２）。このことは、２１０５抗体、ＫＭ３４１−１−１９抗体の強いアゴニスティック活性は、抗体の結合領域を決定する可変領域の構造以外に、抗体の定常領域の構造も重要であることが示された。そこで、ＩｇＧ２の定常領域内のどの領域がアゴニスティック活性に重要であるかどうか調べるために、ＩｇＧ２とＩｇＧ４の構造を混ぜたｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔを作製し、活性を測定した。以下に述べる通り、ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔの作製においては、ヒンジ領域の置換を行うが、この場合の“ヒンジ領域”はＯｌｅ  Ｈ  Ｂｒｅｋｋｅ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９５，１６，８５−９０に記載の、アッパーヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２１６から）、ミドルヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２２６から）およびロウアーヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２３１から）を併せたものである。ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔはＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体のそれぞれに対して、ＩｇＧ２／４（ＣＨ１、ヒンジ領域はＩｇＧ２、それ以降はＩｇＧ４）、ＩｇＧ４／２／４（ヒンジ領域は、ＩｇＧ２、それ以外はＩｇＧ４）、ＩｇＧ２／４／４（ＣＨ１はＩｇＧ２、それ以外はＩｇＧ４）、ＩｇＧ４／２／２（ＣＨ１はＩｇＧ４、それ以外はＩｇＧ２）の４種類ずつ作製した。
ＩｇＧ２／４抗体発現のためのベクターＮ５ＫＧ２／４は、Ｚｔａｑ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて作製した。Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＩｇＧ３Ｂａｍ：ａｔａｔｇｇａｔｃｃＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣ（配列番号８）、２４Ｃｈｉ４：ＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号９）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ４（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を鋳型として、プライマー２４Ｃｈｉ３：ＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴ（配列番号１０）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号１１）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーＩｇＧ３Ｂａｍ、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号１２）を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
ＩｇＧ４／２／４発現のためのベクターＮ５ＫＧ４／２／４は、Ｎ５ＫＧ４を鋳型として、ｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号１３）、Ｇ２Ｈｉｎ３：ＴＴＴＧＣＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧ（配列番号１４）、とｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号１５）、Ｇ２Ｈｉｎ４：ＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧ（配列番号１６）を用いてそれぞれ、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、これを鋳型として９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、ｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２プライマーを加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
ＩｇＧ２／４／４発現のためのベクターＮ５ＫＧ２／４／４は、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号１７）、Ｇ４ＣＨ１−２：ＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＧ（配列番号１８）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ４を鋳型として、プライマーＧ４ＣＨ１−１：ＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号１９）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号２０）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
ＩｇＧ４／２／２発現のためのベクターＮ５ＫＧ４／２／２は、Ｎ５ＫＧ４を鋳型として、プライマーｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号２１）、Ｇ４ＣＨ１−２：ＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＧ（配列番号２２）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＧ４ＣＨ１−１：ＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号２３）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号２４）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体に関してそれぞれ４種のｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔの結合活性を調べた結果では、オリジナルのＩｇＧ２との違いは認められなかったが（図６Ａ−１、図６Ａ−２）、アゴニスティック活性に関しては、ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体の両者ともＩｇＧ２／４／４のみが活性が著しく低下していた（図６Ｂ−１、図６Ｂ−２）。この結果からは、ＩｇＧ２のヒンジ領域がアゴニスティック活性に重要であることが解った。
さらにヒンジ領域のなかで、どの配列が重要であるか調べた。ヒンジ領域はアッパーヒンジ、ミドルヒンジ、ロウアーヒンジの３つの部位に分けられるが（Ｏｌｅ  Ｈ  Ｂｒｅｋｋｅ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９５，１６，８５−９０）、そのうちそれぞれ、ＩｇＧ２に特異的は配列をＩｇＧ４のものに置換した。アッパーヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２１６から）、ミドルヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２２６から）、ロウアーヒンジ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｃｏｄｅ  ２３１から）に変異を導入した抗体をＩｇＧ２ＵＨ４、ＩｇＧ２ＭＨ４、ＩｇＧ２ＬＨ４とし、それぞれの発現ベクターは、Ｎ５ＫＧ２ＵＨ４、Ｎ５ＫＧ２ＭＨ４、Ｎ５ＫＧ２ＬＨ４とした。なお、Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１  Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに基づけば、“ヒンジ”はＥＵインデックス２１６から２３０と定義されている。
Ｎ５ＫＧ２ＵＨ４は、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号２５）、ＵＨ４−２：ＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴｇｇａＣＴＣＡＡＣＴｃＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣ（配列番号２６）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＵＨ４−１：ＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡｇＡＧＴＴＧＡＧｔｃｃＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧ（配列番号２７）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号２８）を用いて、９８℃ｌ秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
Ｎ５ＫＧ２ＭＨ４は、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号２９）、ＵＭ４−２：ＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡｔｇｇｇｇｇａｃｃａｔａＴＴＴＧＣＧＣＴＣ（配列番号３０）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＵＭ４−１：ＧＡＧＣＧＣＡＡＡｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣ（配列番号３１）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号３２）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
Ｎ５ＫＧ２ＬＨ４は、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーｌｉｎｋＨ：ｇｇｇｔａｃｇｔｃｃｔｃａｃａｔｔｃａｇｔｇａｔｃａｇ（配列番号３３）、ＵＬ４−２：ＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣＣｃｃｃｃａｇｇａａｃｔｃＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡ（配列番号３４）で９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。同時に、Ｎ５ＫＧ２を鋳型として、プライマーＵＬ４−１：ＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡｇａｇｔｔｃｃｔｇｇｇｇＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣ（配列番号３５）、ｌｉｎｋＨ２：ｔｇａｔｃａｔａｃｇｔａｇａｔａｔｃａｃｇｇｃ（配列番号３６）を用いて、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を１５回行った。増幅したＤＮＡ断片をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製し、２つの精製ＤＮＡ断片を等量混合したのち、９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の反応を５回行い、プライマーｌｉｎｋＨ、ｌｉｎｋＨ２を加えて、１５回反応した。増幅したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、Ｎ５ＫＧ１ベクターのＩｇＧ１定常領域と置き換えた。
ＫＭ３４１−１−１９抗体、２１０５抗体に関して、それぞれ３種類のｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔの抗原にたいする結合活性を調べたが、同等であった（図６Ａ−１、図６Ａ−２）。一方Ｒａｍｏｓ細胞に対するアゴニスティック活性に関してはＩｇＧ２ＵＨ４、ＩｇＧ２ＭＨ４で著しく低下していた（図６Ｂ−１、図６Ｂ−２）。以上のことから、抗ＣＤ４０抗体ＫＭ３４１−１−１９、２１０５のＩｇＧ２サブクラス依存のアゴニスティック活性は、ヒンジ領域のうち、アッパーヒンジ、ミドルヒンジの構造が重要であることがわかった。
ＩｇＧ２サブクラスがアゴニスティック活性に重要であることが判明したため、ＩｇＧ２以外のサブクラスの抗体をＩｇＧ２サブクラスに変換してアゴニスティック活性が増強するかどうか調べた。数個のクローンについて調べたうち、Ｆ７６は、ＩｇＧ１からＩｇＧ２にサブクラスを変換することによって、アゴニスティック活性を増強することが出来た（図７Ａ、Ｂ）。
【実施例１１】  抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体変異体の作製
もともとのサブクラスはＩｇＧ１である、ＷＯ０２／０８８１８６に記載の４Ｄ１１抗体遺伝子の重鎖、軽鎖を含むＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩで消化、精製した後、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ、Ｎ５ＫＧ４Ｐ、Ｎ５ＫＧ４ベクター（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）につなぎ換えた。Ｎ５ＫＧ４ＰＥはＩｇＧ４定常領域に、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、Ｎ５ＫＧ４ＰはＳ２２８Ｐの点変異をそれぞれ含む。抗体蛋白質の発現、精製は上述の方法によって実施した。精製抗体はＲａｍｏｓ細胞への結合を指標に、上述の方法に従って実施した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Ｐ、ＩｇＧ４ＰＥのＲａｍｏｓ細胞への結合活性の変化は見られなかった（図８Ａ）。また上述の方法によってアンタゴニスティック活性の比較を行ったが、ＩｇＧ１とＩｇＧ４各種変異体との間には、アンタゴニスティック活性に関しては、差は見出されなかった（図８Ｂ）。
【実施例１２】  抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体変異体のＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性評価
抗ＣＤ４０変異抗体のＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性は、上述の方法によって実施した。
ヒトＭＮＣをエフェクター細胞として、ＣＤ４０発現Ｄａｕｄｉ細胞を標的として使用した場合、４Ｄ１１抗体のもとのサブクラスであるＩｇＧ１と比較して、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ＰＥの２つの変異体はそれぞれＡＤＣＣ活性の著しい低下が観察された（図９）。
ＣＤＣ活性に関しては、ＩｇＧ１とＩｇＧ４Ｐの活性の比較を、Ｄａｕｄｉ細胞を標的として測定した。ＩｇＧ１に比べて、ＩｇＧ４ＰはＣＤＣ活性が顕著に低下していることがわかった（図１０）。
【実施例１３】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体のＢ細胞に及ぼす影響
マウス内因性ＣＤ４０破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、かつ、ヒトＣＤ４０遺伝子のトランスジーンを有しているマウス（Ｙａｓｕｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｖｏｌ１４：３１９）に４Ｄ１１抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ４ＰおよびＩｇＧ４ＰＥをそれぞれ１００μｇ尾静脈内投与した。投与２４時間後に眼窩静脈叢より採血し、０．１６ｍｏｌ／Ｌの塩化アンモニウムにて溶血後、ＦＩＴＣ標識抗Ｂ２２０抗体を用い、ＦＡＣＳを用いて解析した。図１１に結果を示す。図中縦軸は全リンパ球中のＢ細胞の割合を示す。Ｂ細胞割合の減弱の程度はＩｇＧ１＞ＩｇＧ４Ｐ＞ＩｇＧ４ＰＥの順に大きかった。また、投与２４時間後に脾臓を摘出し、スライドガラスですりつぶすことにより細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液を溶血後、ＰＥ標識抗Ｂ２２０抗体とＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２３、ＣＤ８６またはＣＤ９５抗体を用い、ＦＡＣＳを用いて解析した。図１２Ａ、Ｂ、Ｃに結果を示す。図中縦軸は全リンパ球中の各表面マーカーを発現しているＢ細胞の割合を示す。４Ｄ１１Ｇ１はいずれのマーカーも市販抗体であるマウス抗ヒトＣＤ４０アゴニスティック抗体５Ｃ３（ファーミンジェン）と同等の発現上昇がみられた。ＩｇＧ４ＰＥはＩｇＧ１およびＩｇＧ４Ｐに比して各活性化表面マーカーの発現上昇の程度は低かった。
【実施例１４】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体による抗原特異的抗体産生抑制作用およびＢ細胞数の変化
マウス内因性ＣＤ４０破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、かつ、ヒトＣＤ４０遺伝子のトランスジーンを有しているマウス（Ｙａｓｕｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｖｏｌ１４：３１９）に４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｃｈｉｋｅｎ  γ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＮＰ−ＣＧＧ：大阪大学微生物病研究所  菊谷  仁教授より分与）とアラム（Ａｌｕｍ：水酸化アルミニウムゲル）の複合体を１００μｇ（ＮＰ−ＣＧＧ量として）腹腔内注射することにより感作した。各抗体は抗原感作直前に５０または１００μｇの量を尾静脈内投与した。陰性対照として抗ヒトアルブミンヒトＩｇＧ４ＰＥ抗体１００μｇを投与した。感作７および１４日後、眼窩静脈叢より採血し、血清中のＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法はＮＰを結合したウシ血清アルブミン（ＮＰ−ＢＳＡ：２．５μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、４℃でインキュベートし、ＮＰ−ＢＳＡを吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキキング試薬（スーパーブロック、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加え室温でインキュベートしブロッキングした後、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。次いで、各ウェルに１０％ブロックエース含有ＰＢＳ−Ｔで希釈した各血清（５０μｌ／ウェル）を加え、３７℃で２時間インキュベートし反応させた。マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体またはＩｇＭ抗体（コスモバイオ、１０７０−０４または１０２０−０４）を１０％ブロックエース含有ＰＢＳ−Ｔで１，０００倍に希釈した溶液（５０μｇ／ウェル）を、各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（５０μｌ／ウェル、Ｓｉｇｍａ１０４、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を各ウェルに加え、波長４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。その結果を図１３Ａ、Ｂに示す。図中縦軸はＮＰ−ＣＧＧをＣ５７ＢＬ／６マウスに２回注射した後採血してプールした血清について、ＩｇＧ１の場合は１０，０００倍希釈したものを、ＩｇＭ抗体の場合は１００倍したものをそれぞれ１ユニットとして換算した値を示す。４Ｄ１１抗体および２８１のＩｇＧ４ＰまたはＩｇＧ４ＰＥ抗体はＮＰ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体産生を同等に強く抑制した。
抗体産生抑制作用の検討に用いたマウスの末梢血中および脾臓中のＢ細胞数の変化を実施例１と同様の方法で測定した。その結果を図１４Ａ、Ｂに示す。４Ｄ１１および２８１のＩｇＧ４Ｐ抗体はＩｇＧ４ＰＥ抗体に比して末梢血中Ｂ細胞割合の減少がより顕著であった。また、抗原感作１４日後に摘出した脾臓中Ｂ細胞の割合についてもＩｇＧ４ＰＥ抗体１００μｇの投与では変化がみられなかったのに対し、ＩｇＧ４Ｐの投与では減少または減少傾向がみられた。
【実施例１５】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体のカニクイザルにおける作用
４Ｄ１１抗体のＩｇＧ４ＰまたはＩｇＧ４ＰＥの３０ｍｇ／ｋｇをカクニイザルの前腕橈側皮静脈内に投与し、一定時間後に大腿静脈より採血した。末梢血リンパ球サブセット解析は各細胞浮遊液をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ２０抗体およびＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体を用い、ＦＡＣＳを用いて陽性細胞比率の計測を行い、ＣＤ４５陽性細胞における比率を算出した。その結果を図１５に示す。図中縦軸は抗体投与前のＣＤ２０陽性細胞比率に対する各時間でのＣＤ２０陽性細胞比率の割合を示す。ＩｇＧ４Ｐ抗体投与個体では抗体投与１〜７日後の間にＣＤ２０陽性細胞は約４０％減少したが、ＩｇＧ４ＰＥ抗体投与個体では４日後に約２０％減少するのみであった。
血清中のＩＬ１２濃度はＥＬＩＳＡ法にて測定した。大腿静脈より採取した血液を室温で２０〜６０分間静置後、室温で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して得られた血清をｍｏｎｋｅｙ  ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）を用いて測定した。その結果を図１６に示す。ＩｇＧ４ＰＥ抗体はいずれの採血ポイントにおいてもＩＬ１２の産生増加は認められなかったが、ＩｇＧ４Ｐ抗体は４日目をピークにＩＬ１２産生がみられた。
【実施例１６】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体のカニクイザル遅延型過敏症モデルにおける作用
テタヌス毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ：ＴＴｘ）（１０Ｌｆ／ｍｌ；デンカ生研株式会社）を雄カニクイザル９匹に皮内及び筋肉内に感作し、ＴＴｘに対する遅延型過敏症を誘発させるとともに、感作開始の１０分前に０．１及び１０ｍｇ／ｋｇ  ４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ抗体の静脈内投与を各３匹に３回（１週間毎に１回）実施し、４Ｄ１１Ｇ４ＰＥの遅延型過敏症に対する作用を検討した。ケタミンの筋肉内投与による麻酔下で、感作は背部皮内（５０μＬ／ｓｉｔｅ×１２部位）及び大腿部筋肉内（０．６ｍＬ／ｂｏｄｙ）に、惹起は感作の２１日後に胸部皮内（１０μＬ／ｓｉｔｅ、３ヵ所ずつ：０〜１０Ｌｆ／ｍｌ）にＴＴｘを投与した。惹起後２４及び４８時間に投与部位の皮膚反応を観察し、Ｄｒａｉｚｅの皮膚障害判定基準に従い評価した。なお、ＴＴｘ各濃度３ヵ所における結果は、それぞれを平均したものを用いた。その結果を図１７に示す。４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ抗体の投与により、２４及び４８時間後にみられる遅延型過敏症反応は明らかに抑制された。
ＴＴｘ特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体価に及ぼす影響を検討した。経時的に大腿静脈より採取した血液を室温で２０〜６０分間静置後、室温で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して得られた血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。ＥＬＩＳＡ法はＴＴｘ（０．５Ｌｆ／ｍｌ）１００μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートし、ＴＴｘを吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（０．５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）を加え室温でインキュベートしブロッキングした後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。次いで、各ウェルに０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈した各血清（１００〜８１９２００倍希釈、希釈倍率＝２；１００μｌ／ウェル）を加え、室温で２時間インキュベートし反応させた。マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗サルＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで３，０００倍に希釈した溶液（１００μｇ／ウェル）を、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（１００μｌ／ウェル、０−フェニレンジアミン塩酸塩＋過酸化水素水）を各ウェルに加え、波長４９２ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。抗ＴＴｘ抗体価は吸光度が０．１以上となる最大希釈倍率とし、１００倍希釈においても吸光度が０．１に達しない場合は０とした。その結果を図１８及び１９に示す。４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ  １ｍｇ／ｋｇの投与により、ＴＴｘ特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体価は約１／１０に抑制された。また、１０ｍｇ／ｋｇの投与ではいずれの採血ポイントでも抗体価は検出感度以下であった。
【実施例１７】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体の血小板血栓形成に与える影響
正常ヒトより採取した血液を４等分し（各６ｍｌ）、それぞれ１００μｇ／ｍｌの濃度となるようにコントロールヒトＩｇＧ４ＰＥ，コントロールマウスＩｇＧ２ａ，ヒト抗ヒトＣＤ４０  ＩｇＧ４ＰＥ（４Ｄ１１）、マウス抗ヒトＣＤ１５４  ＩｇＧ２ａ（５Ｃ８）を加え３７℃で１０分間インキュベートした。Ｆｌａｔ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ社）およびコラーゲンコートペトリデッシュを付属の説明書に従い組み立て、そのチャンバーに各種抗体で処理した血液を１５００／ｓのずり応力が加わる速度で７分間流した。その後４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を同じく１５００／ｓのずり応力が加わる速度で１０分間流し、ペトリデッシュ上に形成された血小板凝集塊を固定し、さらに血小板特異的ＰＥ標識抗ＣＤ４１ａ抗体で染色したうえ蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図２０Ａ、Ｂに示す。ヒト抗ヒトＣＤ４０  ＩｇＧ４ＰＥ（４Ｄ１１）で処理した血液は、コントロール抗体で処理した血液と同様に、コラーゲンコートペトリディッシュ上に血小板凝集塊を形成したが、マウス抗ヒトＣＤ１５４  ＩｇＧ２ａで処理した血液は血小板凝集塊を形成しなかった。
【実施例１８】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体の安定性の評価
４Ｄ１１抗体の定常領域改変抗体の安定性を比較検討した。方法としてはＧ４Ｐ、Ｇ４ＰＥ、Ｇ２ＳｅｒおよびＧ４／２／４をＨＥＫ２９３細胞で一過性発現することにより得られた培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ２．７）により溶出した後３７℃で１分間および１０分間インキュベートした。その後５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）により中和した。得られた抗体溶液のオリゴマー含有率をゲルろ過カラム（東ソー社）を用いて測定した。その結果インキュベート時間に応じてオリゴマー含有率が増加し、Ｇ４／２／４＞Ｇ４ＰＥ＞Ｇ２Ｓｅｒ＞Ｇ４Ｐの順にオリゴマーが生成しやすいことが判明した（図２１）。
【実施例１９】  抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体による皮膚移植片拒絶抑制作用
マウス内因性ＣＤ４０破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、かつ、ヒトＣＤ４０遺伝子のトランスジーンを有しているＣ５７ＢＬ／６背景マウス側胸背部にＤＢＡ／２マウス尾部より採取した移植片を植え込み絆創膏で７日間固定した。被験物質４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ  １００μｇまたはｖｅｈｉｃｌｅは皮膚移植当日から０、２、４、７、９、１１、１４日後にそれぞれ尾静脈内投与した。ＮＫ細胞による移植片拒絶を抑えるため、手術の３日前及び術後１、４、９日後にそれぞれ抗アシアロＧＭ１抗体１００μｇを全頭に腹腔内投与した。図２２に結果を示す。４Ｄ１１Ｇ４ＰＥ投与群において、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して有意な移植片拒絶遅延が観察された。
【実施例２０】  ヒト腫瘍細胞株におけるＣＤ４０の発現解析
バーキットリンフォーマ細胞株Ｒａｍｏｓ、膀胱癌細胞株Ｔ２４（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−４）、膵臓癌細胞株Ｈｓ  ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３４）およびＣａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−８０）におけるＣＤ４０の発現は、３４１Ｇ２Ｓｅｒを用いたＦＡＣＳ解析により確認した。
各細胞株をＴ２４、Ｈｓ  ７６６Ｔ、Ｃａｐａｎ−２については−トリプシン消化後、Ｒａｍｏｓについてはそのまま回収し、ＰＢＳで洗浄後、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １μｇ／ｍｌを含む染色用緩衝液に再懸濁した。染色用バッファーは、ＰＢＳに０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、５％非動化済みウシ血清を添加して作成した。４℃で１５分間インキュベーション後、細胞を染色用バッファーで２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）を染色用バッファーで１：２５０に希釈した溶液に再懸濁した。４℃で１５分間インキュベーション後、細胞を染色用バッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社製）で分析した。陰性コントロールには、等量のヒト抗２，４ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体を用いた。データ解析ソフトはＣｅｌｌｑｕｅｓｔ（ＢＤバイオサイエンス社製）で行い、平均蛍光強度を算出した。
その結果、Ｒａｍｏｓ、Ｔ２４、Ｈｓ  ７６６Ｔ、Ｃａｐａｎ−２では、３４１Ｇ２Ｓｅｒで染色した場合の平均蛍光強度が陰性コントロールと比較して明らかに高く、ＣＤ４０の発現が確認された。
【実施例２１】  ヒト腫瘍細胞株に対する抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体の効果
Ｒａｍｏｓは２．５×１０３個、Ｔ２４は２．５×１０２個、Ｈｓ  ７６６ＴおよびＣａｐａｎ−２は５×１０３個を培地に懸濁し、平底９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）中で全体容量１００μＬで、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度とともに３７℃、５％ＣＯ２存在下で、ＲａｍｏｓおよびＨｓ  ７６６Ｔは６６時間、Ｃａｐａｎ−２は９０時間、Ｔ２４は１１４時間培養した。１０μＬ（３．７ＭＢｑ／ｍＬ）の３Ｈラベルされたチミジン（アマシャムバイオサイエンス社製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で６時間培養した。Ｒａｍｏｓは、９６Ｍｉｃｒｏ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ（パーキンエルマー社製）に細胞を回収し、サンプルバッグ（パーキンエルマー社製）でカバーし、ベータプレートシンチ（パーキンエルマー社製）１２ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンター（ファルマシア１２０５ベータプレート：ファルマシア社製）でβ線量を測定した。Ｈｓ  ７６６Ｔ、Ｔ２４およびＣａｐａｎ−２は、ハーベスター（パーキンエルマー社製）を用いてユニフィルター（パーキンエルマー社製）に細胞を回収し、裏に専用のシールを貼り、マイクロシンチ２０（パーキンエルマー社製）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、シンチレーションカウンター（トップカウント：パッカード社製）でβ線量を測定した。データは、３つの独立した実験で得られた３重反復測定値の平均を、非処理対照の値で除して細胞生存率（％）として表した。
その結果、全ての細胞株で３４１Ｇ２Ｓｅｒの濃度依存的に細胞生存率が低下した（表１）。３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １００ｎｇ／ｍｌ添加時の細胞生存率は、Ｒａｍｏｓにおいては５８％、Ｔ２４においては２２％、Ｈｓ  ７６６Ｔにおいては１５％、Ｃａｐａｎ−２においては７７％であり、３４１Ｇ２ＳｅｒがＲａｍｏｓ、Ｔ２４、Ｈｓ  ７６６ＴおよびＣａｐａｎ−２の細胞増殖を抑制する活性をもつことが明らかとなった。
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【実施例２２】  マウス担癌モデルに対する抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体の効果
（１）Ｒａｍｏｓ細胞
６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）に、３Ｇｙの放射線を照射し、背部皮下にＲａｍｏｓを２×１０７個／マウス個体で移植した。移植１６日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが５０〜１７０ｍｍ３の担癌マウスを５匹１群として群分けした。担癌マウスの静脈内に、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清を含むＰＢＳに溶解したもの）を１６日目に１回投与し、４７日目まで腫瘍大きさを測定した。陰性コントロールとしてヒト抗ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）抗体を使用した。
（２）Ｔ２４細胞
ヌードマウス背部皮下にて継代を３回繰り返したＴ２４細胞塊を摘出し、６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に移植した。移植する腫瘍細胞塊は３ｍｍ四方程度が適当である。移植１０日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが８０〜２００ｍｍ３の担癌マウスを５匹１群として群分けした。担癌マウスの静脈内に、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清を含むＰＢＳに溶解したもの）を１０日目に１回投与し、２９日目まで腫瘍大きさを測定した。陰性コントロールとして、等量のヒト抗ＤＮＰ抗体を使用した。
（３）Ｈｓ  ７６６Ｔ細胞
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に、Ｈｓ  ７６６Ｔ  ７×１０６個／マウス個体で移植した。移植１６日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが５０〜１４０ｍｍ３の担癌マウスを５匹１群として群分けした。担癌マウスの静脈内に、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清を含むＰＢＳに溶解したもの）を１６日目に１回投与し、３２日目まで腫瘍大きさを測定した。陰性コントロールとして、等量のヒト抗ＤＮＰ抗体を使用した。
（４）Ｃａｐａｎ−２細胞
６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア（株）社より購入）の背部皮下に、Ｃａｐａｎ−２  ２×１０６個／マウス個体で移植した。移植１３日後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが３０〜１３０ｍｍ３の担癌マウスを５匹１群として群分けした。担癌マウスの静脈内に、３４１Ｇ２Ｓｅｒ  １０または１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清を含むＰＢＳに溶解したもの）を１３日目から週２回投与し、３４日目まで腫瘍大きさを測定した。陰性コントロールとして、ヒトポリクローナル抗体（ｈＩｇＧ）（シグマ社製）を使用した。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩＲ）は以下の式で計算した。
１００−〔｛（３４１Ｇ２Ｓｅｒ投与群の最終測定日の平均腫瘍体積  −  ３４１Ｇ２Ｓｅｒ投与群の抗体投与開始日の平均腫瘍体積）／  （陰性コントロール投与群の最終測定日の平均腫瘍体積  −  陰性コントロール投与群の抗体投与開始日の平均腫瘍体積）｝×１００〕
その結果、Ｔ２４、Ｈｓ７６６ＴおよびＣａｐａｎ−２担癌マウスではＴＧＩＲが１００％を超え、腫瘍体積の退縮が観察された。一方、Ｒａｍｏｓ担癌マウスでもＴＧＩＲ  ７３．４％であり、腫瘍体積の増大が大幅に抑制された（表２）。図２３から２６にそれぞれ、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｔ２４細胞、Ｈｓ  ７６６Ｔ細胞およびＣａｐａｎ−２細胞を移植した担癌マウスに３４１Ｇ２Ｓｅｒを投与した場合の細胞移植後の腫瘍体積の変化を示す。
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抑制率は、各細胞株とも測定最終日における値を示す。
【産業上の利用可能性】  実施例に示すように、定常領域に変異を導入した本発明の抗ＣＤ４０抗体およびサブクラスの一部の構造を他のサブクラスのものに置換した抗ＣＤ４０抗体は、その活性を保持しつつ、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が低減されている。従って、本発明の抗体を治療用抗体として被験体に投与した場合、ＣＤ４０発現細胞に対する細胞障害活性が弱く、安全に用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】配列番号２から３６：合成ＤＮＡ
配列番号４９から１３０：合成ペプチド
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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