(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの発光を測定することにより該サンプル中のレニラルシフェラーゼの存在を検出する方法であって、
ａ．レニラルシフェラーゼを含有すると推測されるサンプルを、セレンテラジン、及びフリーラジカルスカベンジャーとしてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及びキレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又は、ＤＴＴ及びＥＤＴＡの機能的同等物を含有する試薬混合物と混ぜること；及び
ｂ．（ａ）の混合物により生ずる発光を測定すること、を含んでなり、
少なくとも１時間の延長されたグロー時間であって、時間に関して実質的に一次で変動するグロー時間を有する方法。
【請求項２】
多くのサンプルを同時に使用する多元的スクリーニング試験で使用される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルがレニラルシフェラーゼを産生する細胞を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（ａ）の試薬混合物が、各々１００ｍｌについて、約０．２〜３０ｍｇのセレンテラジン、約２００〜２０００ｍｇのＤＴＴ、及び０．０５〜１００ｍｇのＥＤＴＡを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ａ）の試薬混合物が更にプロテアーゼインヒビターを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
プロテアーゼインヒビターがフェニル酢酸又はシュウ酸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試薬が更に界面活性剤を含有する、請求項３記載の方法。
【請求項８】
界面活性剤がノニルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試薬が更に緩衝液を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
緩衝液がＨＥＰＥＳである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
サンプルの発光を測定することにより該サンプル中のホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼの両方の存在を検出する方法であって、
ａ．前記サンプルを、ホタルルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ホタルルシフェラーゼ活性に必要な補助因子、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はその機能的同等物、及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含有する第１試薬混合物であって、前記ホタルルシフェリン、ＡＴＰ、補助因子、ＤＴＴ又は同等物、及びＡＭＰの量が、少なくとも１時間の持続と時間に関して実質的に一次で変動する強度とを有する発光を生ずるのに充分である混合物と混ぜること；及び
ｂ．（ａ）の混合物により生ずる発光を測定すること；
ｃ．セレンテラジン、及び、キレート剤としてＥＤＴＡ又はその機能的同等物を含有する緩衝液を含んでなる第２試薬混合物を、前記（ｂ）の測定後に（ａ）の混合物に添加すること；
ｄ．（ｃ）の添加により生ずる発光を測定すること、を含んでなり、
前記発光が、少なくとも１時間の延長されたグロー時間であって、時間に関して実質的に一次で変動するグロー時間とを有する方法。
【請求項１２】
第１試薬混合物が、各々１００ｍｌについて、約０．２〜３０ｍｇのホタルルシフェリン、約２００〜２０００ｍｇのＤＴＴ、約０．２〜３０ｍｇのＡＭＰ、及び約１０〜３００ｍｇのＡＴＰを含有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
セレンテラジンが天然のセレンテラジン又はその類似体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
緩衝液が約１０μＭ〜１０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、かつ約６〜８．５のｐＨを有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが、ホタルルシフェラーゼ及び／又はレニラルシフェラーゼを産生する細胞を含んでなるサンプルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
第１試薬混合物が更に界面活性剤を含有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤がノニルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）の第１試薬混合物が、更にプロテアーゼインヒビターとしてフェニル酢酸又はシュウ酸又はそれらの機能的同等物を含んでなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
第１試薬混合物が更に緩衝液を含有する、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
緩衝液がＨＥＰＥＳである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中のホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼを検出するためのアッセイキットであって、
ａ．ホタルルシフェラーゼ活性を検出するための前記サンプルに添加する第１試薬混合物であって、前記試薬混合物が、ホタルルシフェリン、ＡＴＰ、ホタルルシフェラーゼ活性に必要な補助因子、フリーラジカルスカベンジャーとしてジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はその機能的同等物、及びＡＭＰを、少なくとも１時間の持続と時間に関して実質的に一次で変動する強度とを有する発光を生ずるのに充分である量で含んでなる混合物；及び
ｂ．ホタルルシフェラーゼの活性を検出してから前記サンプルに添加する第２試薬混合物であって、前記第２試薬混合物が、セレンテラジン、及び、キレート剤としてＥＤＴＡ又はその機能的同等物を含有する緩衝液を含んでなる混合物、
を含んでなるアッセイキットであって、前記第２試薬混合物の存在下で、グロー時間が、少なくとも１時間の延長されたグロー時間であって、時間に関して実質的に一次で変動するグロー時間となるキット。
【請求項２２】
セレンテラジンが天然のセレンテラジン又はその類似体である、請求項２１記載のアッセイキット。
【請求項２３】
緩衝液が約１０μＭ〜１０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、かつ約６〜８．５のｐＨを有する、請求項２１記載のアッセイキット。
【請求項２４】
第１試薬混合物が、更にプロテアーゼインヒビターとしてフェニル酢酸又はシュウ酸又はそれらの機能的同等物を含んでなる、請求項２１記載のアッセイキット。
【請求項２５】
界面活性剤を更に含有する、請求項２１記載のアッセイキット。
【請求項２６】
界面活性剤がノニルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項２５記載のアッセイキット。
【請求項２７】
緩衝液を更に含有する、請求項２１記載のアッセイキット。
【請求項２８】
緩衝液がＨＥＰＥＳである、請求項２７記載のアッセイキット。
【請求項２９】
請求項２１記載のアッセイキットを用いることにより二元グローシグナルを検出することを含んでなる、Ｇタンパク質共役型結合反応を検出する方法。
【請求項３０】
請求項２１記載のアッセイキットを用いることにより、同じ細胞内の２シグナル形質導入経路を検出する方法。
【請求項３１】
請求項２１記載のアッセイキットを用いることにより、マイクロタイタプレートの同じウエル中にプレートしたか又は固体支持体に適用した２つの受容体に対する化合物又は薬物をアッセイする方法。
【請求項３２】
クローンを選択的アゴニストでスクリーニングする、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本発明は、生物材料の分析における発光の使用に関する。より特定的には、本発明は、ルシフェラーゼを含有する細胞を発現させ、次いで、発光を生ずる反応により検出するレポーター遺伝子手法を包含する方法に関する。
ルシフェラーゼは、中でも、ホタル、発光細菌、クラゲ、及びウミシイタケを含む多種の生物体において見られる。ルシフェラーゼはレポーター遺伝子を測定するために使用することができる。この技術においては、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドのようなレポーター遺伝子を、細胞発現系における遺伝子の転写及び翻訳についての指標として使用する。レポーター遺伝子は、細胞発現系により認識されるプロモーターに作動できるように連結している。典型的なレポーター遺伝子アッセイにおいては、レポーター遺伝子を含有するＤＮＡベクターを、そのレポーター遺伝子を発現することができる細胞内に形質移入する。そのレポーター遺伝子の発現に充分な時間が経過してから、その細胞膜を破壊して、発現した遺伝子産物を放出させる。次いで、レポーター遺伝子の酵素活性の測定が可能になるように、必要な試薬を添加する。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として使用する場合は、ルシフェリンと呼ばれる、基質の酸化により生ずる光子を測定する。
【０００２】
発光による分析において使用される最もよくあるルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼであるが、他のルシフェラーゼを使用してもよい。一つのそのようなルシフェラーゼは、花虫綱の海洋腔腸動物であるウミシイタケから由来するレニラルシフェラーゼである。本発明は、単独であるか又はホタルルシフェラーゼの存在下において、レニラルシフェラーゼの存在を確認する方法に関する。これまで、レポーターとしてのレニラルシフェラーゼの使用は、ホタルルシフェラーゼの場合にそうであったように、光の発生が短い時間であることにより限定されていた。
【０００３】
Packard Instrument Companyに譲渡された米国特許第５，６１８，６８２号には、一定の試薬組成物の使用を通じて、ホタルルシフェラーゼからの光の短時間の放出（フラッシュ）を数時間（グロー）に延長できることが示されている。光が放出される間の時間を延長することの利点は、光のフラッシュがほんの数秒又は数分しか続かない場合は実行できないところの、多数のサンプルのスクリーニングを同時に行うことが可能になる点である。そのような試薬組成物は、商標ＬｕｃＬｉｔｅ（登録商標）として商業的に大変成功している。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼでの生物発光による光の放出は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び酸素の存在下において、基質、すなわちルシフェリンを酸化して、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ピロリン酸、及び二酸化炭素を生ずることを包含する。
【０００５】
【化１】
0004242560.tif 000002
【０００６】
この反応は、クレアチンキナーゼにより触媒されＡＴＰを生ずるアデノシン二リン酸のクレアチンリン酸との反応を経てクレアチンキナーゼを測定する方法を開示する米国特許第４，２８６，０５７号に例示されている。生成物であるＡＴＰがホタル発光反応により測定されるので、間接的にクレアチンキナーゼの活性が測定される。‘６８２号特許における特許権者もそうであったように、‘０５７号特許における特許権者らは数時間のグロー時間を得たことを示さなかったが、光の持続の増加は反応生成物ＡＭＰを添加することに起因することが見出された。
レニラルシフェラーゼの反応は、基質がホタルルシフェリンではなくセレンテラジンという異なる分子であり、酸素だけが関与するという点において、ホタルルシフェラーゼの反応とは異なる。
【０００７】
【化２】
0004242560.tif 000003
【０００８】
ホタルルシフェラーゼの場合と同様に二酸化炭素が生ずるが、ＡＴＰもＡＭＰも必要としない。このように、使用される試薬は、ホタルルシフェラーゼ反応において使用されるＡＴＰ及びＡＭＰを含む必要がない。しかし、‘６８２号特許に教示されるホタルルシフェラーゼ反応において使用される試薬が、レニラルシフェラーゼを検出する際に存在する場合、ホタルルシフェラーゼに関して得られる延長されたグロー時間が、レニラルシフェラーゼに関しても同様に存在することが目下のところ発見されている。同時に、生ずる光の量は、二元アッセイシステムにおけるホタルルシフェラーゼの量に比較して１０の約数の割合だけ増加される。
【０００９】
Promega Corporationからの一つの商業的に入手可能なシステムにおいては、まずホタルルシフェラーゼでアッセイを行い、その後その第１反応を停止させ、レニラルシフェラーゼを使用して第２アッセイを行う、二元レポーター手法が使用される。両方のアッセイに必要とされる全時間は、約３０秒であると言われている。このように、その方法は長いグロー時間を維持することに依存しておらず、その短い時間はそのシステムの利点と考えられている。しかし、多くのサンプルを同時に使用する多元的スクリーニング試験には、そのような短い時間は望ましくない。その代わり、更に長いグロー時間が有利である。本発明は、その目的を達成する方法を提供することを意図している。
【００１０】
Promega Corporationに譲渡されたＷＯ９６／４０９８８号には、一元及び二元レポーターアッセイの両方が説明されている。それらは、多数の細胞サンプルプレートにおけるか又は二元アッセイにおける隣接したサンプルセル間の混信を防ぐために停止剤を使用して第１反応を停止させ、第２反応が行なわれ得るようにしたことにより特徴づけられる。この方法の使用によって、より正確な一元アッセイを達成することができ、単一のサンプル細胞において二元アッセイを行うことができると言われている。その特許権者らによると、約３０秒で二元アッセイを行うことが可能である。このように、本発明者らにより望まれる延長されたグロー時間は、これら２つの反応のいずれにも存在せず、望ましいとも考えられなかったと思われる。
【００１１】
【発明の要旨】
一つの側面において、本発明は、ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼの一緒の存在について、又はレニラルシフェラーゼのみについて、生物サンプルをアッセイする方法を提供する。フラッシュ発光ではなく延長されたグローを生ずるために選択される諸化合物を含む試薬組成物を添加する。ホタルルシフェラーゼの検出については、ホタルルシフェリン、ＡＴＰ、及びＡＭＰを必要とする。レニラルシフェラーゼの検出については、対応するルシフェリンであるセレンテラジンを必要とする。加えて、その組成物は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のようなフリーラジカルスカベンジャー、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ−１０１（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）のような界面活性剤、ＨＥＰＥＳ、すなわちＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ1−［２−エタンスルホン酸］のような緩衝液、及び、フェニル酢酸（ＰＡＡ）及びシュウ酸（ＯＡ）のようなプロテアーゼインヒビターを含んでもよい。
【００１２】
一つの態様においては、レニラルシフェラーゼを含有すると推測されるサンプルを、セレンテラジン、フリーラジカルスカベンジャーとしてＤＴＴ、及びキレート剤としてＥＤＴＡ、又は、ＤＴＴ及びＥＤＴＡの機能的同等物を含有する試薬混合物と混ぜる。任意に、その混合物は、１又はそれ以上の界面活性剤、緩衝液、及びプロテアーゼインヒビターを含んでもよい。発光は、イリノイ州ダウナーズグローヴのPackard Instrument Company, Inc.から入手可能なＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）マイクロプレートシンチレーション及びルミネセンスカウンターのような当業者によく知られている方法によって測定される。好ましい態様においては、各々１００ｍｌの試薬混合物は、約０．２〜３０ｍｇのセレンテラジン、約２００〜２，０００ｍｇのＤＴＴ、及び約０．０５〜１００ｍｇのＥＤＴＡを含有する。セレンテラジンは、ｍ−、ｅ−、ｖ−、又はｆ−セレンテラジンのような天然のセレンテラジン又は類似体であってよい。その試薬は、任意に、フェニル酢酸（ＰＡＡ）又はシュウ酸（ＯＡ）のようなプロテアーゼインヒビター、及びノニルフェノキシポリエトキシエタノールのような界面活性剤を含有してもよい。
【００１３】
別の側面においては、本発明は、単一サンプル中のホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼの両方の存在を検出する方法である。ホタルルシフェラーゼは、そのサンプルに、ホタルルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｍｇ+2及びＣａ+2のようなホタルルシフェラーゼ活性に必要な補助因子、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はその機能的同等物、及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を、少なくとも１時間の持続と時間に関して実質的に一次で変動する強度とを有する発光を生ずるために選択される量で含有する試薬混合物を添加し、そして生ずる発光を測定することにより測定される。任意に、その混合物は、１又はそれ以上の界面活性剤、緩衝液、及びプロテアーゼインヒビターを含んでもよい。そのサンプル中のホタルルシフェラーゼの量の測定に続いて、セレンテラジン及びＥＤＴＡ又はその機能的同等物を含有する緩衝液を添加する。生ずる発光は前のように測定され、そのサンプル中に存在するレニラルシフェラーゼの量と関連している。セレンテラジンは、ｍ−、ｅ−、ｖ−、又はｆ−セレンテラジンのような天然のセレンテラジン又は類似体であってよい。ＥＤＴＡは約１０μＭ〜１０ｍＭのモル濃度で使用され、ｐＨは６〜８．５に維持される。好ましくは、セレンテラジンは、７．２〜８．０のｐＨを有する１〜１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中２〜５μＭの濃度で存在する。
【００１４】
別の側面においては、本発明は、本発明の方法を行うための試薬組成物及び試験キットに関する。一つの用途において、本発明は、ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼにより生ずる二元グローシグナルを用いてＧタンパク質共役型反応を検出するためのアッセイキットである。別の側面においては、そのアッセイキットを同じ細胞内の２シグナル形質導入経路の検出に使用して、例えば、選択的アゴニストでクローンをスクリーニングすることができる。また、そのアッセイキットを使用して、マイクロタイタプレートの同じウエル中にプレートされたか又は固体支持体に適用された２種のレセプターに対する化合物又は薬物をアッセイすることができる。
【００１５】
【例示的態様の説明】
発光反応
ホタルルシフェラーゼに付随する発光は、基質であるルシフェリンが、Ｍｇ+2のような補助因子の存在下でＡＴＰ及び酸素と反応して、ルシフェリンの酸化型、ＡＭＰ、ピロリン酸、二酸化炭素、及び光を生ずる反応を包含する。光の量を測定して、存在するルシフェラーゼの量を測定する。光が短時間のフラッシュとして現れるのがこの反応の典型である。それを測定することができるが、多数のサンプルを同時にスクリーニングする多くの場合においてはそうすることは便利ではない。米国特許第５，６１８，６８２号において、Scheirerは、光のフラッシュを延長するという利益を有し、その結果、１時間又はそれ以上の間続くグローとなる反応混合物についての最適な組成物を開示した。この組成物は、Packard Instrument Companyから商標ＬｕｃＬｉｔｅ（登録商標）として商業的に入手可能であり、かなりの成功を達成している。その反応混合物には、延長されたグロー時間を提供するＡＭＰ及び他の諸化合物、特に、フリーラジカルスカベンジャーであるジチオスレイトール（ＤＴＴ）、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び、フェニル酢酸又はシュウ酸のようなプロテアーゼインヒビターが含まれる。これらの化合物の機能的同等物を使用してもよい。細胞を溶解すべきである場合は界面活性剤が存在してもよく、ＨＥＰＥＳのような緩衝薬も使用してもよい。今回、この組成物は、二元アッセイを行う際、ホタルルシフェラーゼにより触媒される第１反応及びレニラルシフェラーゼにより触媒される第２反応で、延長されたグロー時間を生ずることが見出された。
【００１６】
レニラルシフェラーゼにより触媒される光発生反応について基質として役立つルシフェリン化合物は、ホタルルシフェラーゼの影響下で反応するルシフェリンとはその化学構造において異なる。この化合物についての通常使用される名前はセレンテラジンである。セレンテラジンも酸化させて、光及び二酸化炭素を生ずる。しかし、それはＡＴＰの存在を必要とせず、副産物としてのＡＭＰ及びピロリン酸を生じない。従って、Scheirer特許において開示された反応混合物が、レニラルシフェラーゼにより触媒されるセレンテラジンと酸素との反応において生ずる光に有益な作用を与えることは予測できないであろう。本発明者は、そのような組成物の存在下でセレンテラジンと酸素との反応を行うことができること、及び少なくとも１時間の延長されたグロー時間が達成されることを見出した。そのうえ、そのグローの強さは、時間に関して実質的に一次で変動する。このことは、二元アッセイを行う際に有用である。しかし、セレンテラジンと酸素との反応だけを行って、レニラルシフェラーゼの存在を確認しようとする場合は、全ての組成物が必要という訳ではない。そのような場合においては、延長されたグロー時間は、以下に見られるように、一定の有効量のＤＴＴ及びＥＤＴＡ、又はそれらの機能的同等物のみを含むことにより得ることができる。
【００１７】
光を発する時間の延長
これまで述べたように、ホタルルシフェラーゼにより触媒される酸化反応において光を発する間の時間は、一次消失特性を伴って何時間にも延長することができるので、Packard Instrument Companyから入手可能なＶｉｅｗＰｌａｔｅ（登録商標）のようなマルチウェルサンプルプレートにおいて多くのサンプルの分析が可能となる。上で説明したPromega特許出願において示唆されているように、このことはそれらサンプル細胞間で望ましくない混信を引き起こしそうだと思われるが、補正をしてそれら結果から混信作用を取り除くことも可能である（そして商業的な装置においては典型的である）ことに注目すべきである。
【００１８】
ホタルルシフェラーゼを含む発現された遺伝子産物を含有するサンプルに、一例として、各々１００ｍｌについて：
ホタルルシフェリン              約０．２〜３０ｍｇ
ＤＴＴ                          約２００〜２０００ｍｇ
ＥＤＴＡ                        約０．０５〜１００ｍｇ
ＡＭＰ                          約０．２〜３０ｍｇ
ＡＴＰ                          約１０〜３００ｍｇ
ＰＡＡ（任意）                  約１〜６ｍｇ
ＯＡ（任意）                    約０．５〜１ｍｇ
ＨＥＰＥＳ（任意）              約５０〜１０００ｍｇ
ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１（任意）  約５０〜１００ｍｇ
（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）
を含むことができる試薬混合物を添加する。
【００１９】
これらのうち、ＤＴＴ及びＡＭＰの存在は延長されたグロー時間を提供することにおいて最も重要であると考えられている。これらの化合物の各々は文献に報告されているが、‘６８２号特許の組成物は、少なくとも１時間の延長されたグロー時間とかつて可能ではなかった実質的に一次の光出力とを可能にしたという点で独特であった。いっそう長いグロー時間が可能である。
【００２０】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は好ましいラジカルスカベンジャーである。機能的同等物と考えられる他のものには、ジチオエリトリトール、グルタチオン、システイン、−ＳＨを含有するアミノ酸、補酵素Ａ、β−メルカプトエタノールなどのようなヒドロスルフィジル（hydrosulphydryl）化合物が含まれる。そのような化合物は検出可能な光子発光の期間を増加させ、そして‘６８２号特許に示されるように、ＤＴＴは発される光を実際に増加させることができる。
【００２１】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は好ましいキレート剤である。機能的同等物と考えられる他のものには、中でも、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）及びＮ，Ｎ，Ｎ1，Ｎ1−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）が含まれる。そのような化合物は、ホタルルシフェラーゼ活性のために必要な補助因子であるＭｇ+2、Ｃａ2+、及び他の二価の陽イオンと結合する傾向がある。本発明において使用されるＥＤＴＡ又は同等物の量は、多量のＥＤＴＡがホタルルシフェラーゼ反応を停止させ得ることが示される上で説明したPromegaの特許出願により示唆されるより有意に少ない。
【００２２】
フェニル酢酸（ＰＡＡ）及びシュウ酸（ＯＡ）は好ましいプロテアーゼインヒビターである。機能的同等物と考えられる他のものには、モネンシン、アセチルフェニルアラミン、ロイペプチン、塩化アンモニウム、及びオプロチニン（oprotinin）が含まれる。そのような化合物は、細胞溶解物からの内因性プロテアーゼによるルシフェラーゼの失活を制限し、それによって光を発する時間を長くする。
【００２３】
ノニルフェノキシポリエトキシエタノールのような界面活性剤を使用して細胞を溶解する。それらを本発明の試薬中に使用してもよいが、ルシフェラーゼが細胞から発現されるのではなく遊離している場合は、界面活性剤は必要ではない。
サンプルのｐＨは、ルシフェリンの酸化における因子である。従って、ｐＨを望ましい範囲内に維持するために、ＨＥＰＥＳ、すなわちＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ1−［２−エタンスルホン酸］のような緩衝薬を含んでもよい。
【００２４】
【実施例】
ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬及びレニラルシフェラーゼアッセイ試薬からなるホタルルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの逐次的検出のためのキットを調製した。
ホタルルシフェラーゼ試薬は、米国特許第５，６１８，６８２号に最初に記載されたように、ＡＭＰ、ＥＤＴＡ、ホタルルシフェリン、ＡＴＰ、ＤＴＴ、フェニル酢酸、及びシュウ酸からなるものであった。
レニラルシフェラーゼ試薬は、ｐＨ７．５を有する２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の５μＭのセレンテラジンからなるものであった。
【００２５】
ホタル又はレニラルシフェラーゼレポータータンパク質（ＣＲＥ−ｆｉｒｅｆｌｙ及びＣＲＥ−ｒｅｎ）のいずれかを含有するｃ−ＡＭＰ応答性レポーター遺伝子で形質移入された安定な哺乳類の細胞系を発生させた。
次に、ＣＲＥ−ｆｉｒｅｆｌｙ細胞を、更にヒトバソプレシンＶ２レセプターで形質移入し、そしてＣＲＥ−ｒｅｎ細胞をヒトβ−２アドレノセプターで形質移入した。これらのレセプターは、刺激性Ｇタンパク質αユニットと相互作用するＧタンパク質共役型レセプターのスーパーファミリーのメンバーである。
【００２６】
ホタルルシフェラーゼ及び／又はレニラルシフェラーゼ産性ＣＨＯ（成体チャイニーズハムスター卵巣）細胞を組織培養フラスコ中で培養し、９０％集密度まで増殖させる。アッセイの２４時間前に、それら細胞を１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有する無血清培地中で休止させる。アッセイの直前に、細胞をＨＢＳＳ／ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡを含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液）を用いて取り除き、遠心分離し、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを補充した１０ｍｌのフェノールレッドを含まず血清を含まない培地中に再懸濁させる。次に、それら細胞を９６ウエルマイクロタイタプレート中に９０μｌ／ウエルでまき、インキュベーターに戻す。１時間後、水又はフェノールレッドを含まない培地のいずれかの中に調合した１０μｌの試験化合物を添加する。次いで、それらマイクロプレートを更に４時間インキュベートする。最後に、ホタルルシフェラーゼ検出試薬を調合し、１００μｌのこの検出溶液を各ウエルに添加する。１０分後、そのマイクロプレートをホタルルシフェラーゼ活性についてカウントする。次に、各ウエルに、２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中の５μＭのセレンテラジンを１００μｌ／ウエルで添加する。そのプレートを１５分間暗所に置いて、レニラルシフェラーゼ活性についてカウントする。
【００２７】
実施例１
レニラルシフェラーゼ発光の安定性
ＣＲＥ−ｒｅｎ細胞を、アデニルシクラーゼを直接活性化させて細胞内のｃＡＭＰのレベルの増加を引き起こす化合物である１０μＭのフォルスコリンで刺激した。フォルスコリン応答の性質を検査するため、ＣＲＥ−ｆｉｒｅｆｌｙ及びＣＲＥ−ｒｅｎ細胞を混合し、黒色の９６ウエルＶｉｅｗＰｌａｔｅ（登録商標）（Packard Instrument Company）の個々のウエルにまいた。フォルスコリン−用量応答曲線を作図し、ホタルルシフェラーゼ検出試薬又はレニラルシフェラーゼ検出試薬のいずれかを用いて細胞をアッセイした。それらアッセイプレートを、試薬添加後１５分又は１６０分においてＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）ルミネセンスカウンター（Packard Instrument Company）でカウントした。ｃＡＭＰレポーター遺伝子のフォルスコリン活性についてのＥＣ５０（５０％活性を生ずるための有効濃度）は、全ての時点においてホタル及びレニラルシフェラーゼレポーターの両方と同様であった。図１ａ〜ｄに示すように、ホタル発光の性質は、試薬添加後１５分及び１６０分において同一であり、これはホタルルシフェラーゼ検出試薬の安定性を証明するものである。これらのプレートへレニラ検出試薬を添加すると、ホタルルシフェラーゼ応答が部分的に停止して、レニラルシフェラーゼ応答が現れる。レニラルシフェラーゼ発光応答は１５分における３．５×１０6から１６０分における１．８×１０6に減衰する一方、アデニルシクラーゼのフォルスコリン刺激についてのＥＣ５０は同様のままである。そのうえ、本発明の組成物を用いて発生されるレニラ発光は、ホタルルシフェラーゼが生ずる光シグナルよりも１０倍明るい。
【００２８】
実施例２
レセプターシグナルを特徴づけるためのホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ検出試薬の使用
ＣＲＥ／ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｖ２及びＣＲＥ／ｒｅｎ／β２細胞を混合し、黒色の９６ウエルＶｉｅｗＰｌａｔｅの個々のウエルにまいた。Ｖ２アゴニストバソプレシン及びβ２アゴニストイソプレナリンに対する用量応答曲線をホタルルシフェラーゼを用いて作成し、イソプレナリン活性を出した。ホタルルシフェラーゼ検出試薬を添加した後、バソプレシンは１１ｎＭのＥＣ５０でＶ２レセプターを活性化させることが分かった（図２ａ）。図２ｂに示すように、バソプレシンはレニラ発光を刺激しなかった。続いてそれら同じ細胞へレニラ検出試薬を添加した後、バソプレシンに対する応答曲線は平らになり（図２ｃ）、イソプレナリンに対する用量応答曲線で０．１１ｎＭのＥＣ５０を有することが明らかとなった（図２ｄ）。
【００２９】
実施例３
ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼの複合グロー発光測定を用いる化合物スクリーニング
ＣＲＥ／ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｖ２及びＣＲＥ／ｒｅｎ／β２を混合し、黒色の９６ウエルＶｉｅｗＰｌａｔｅの個々のウエルにまき、ある範囲の化合物をそれら細胞に適用した。ホタルルシフェラーゼ検出試薬によるアッセイの後、Ｖ２レセプターアゴニストのバソプレシン及びデスモプレシンで応答を得た。期待されたように、ホタルルシフェラーゼ応答をフォルスコリンで得て、そしてチロカルシトニン（ＣＨＯ細胞が内因性カルシトニンレセプターを発現する）で得た。レニラルシフェラーゼ検出試薬を添加した後、バソプレシン及びデスモプレシンにより発生した発光シグナルは、有意に基底を超えるものではなかった。発光シグナルは、フォルスコリン及びチロカルシトニンで維持され、目下のところ、イソプレナリンでの刺激後も見られた。このことから、そのアッセイは、バソプレシン及びデスモプレシンはＶ２レセプターにおけるアゴニストであること、イソプレナリンはβ２アドレノセプターアゴニストであること、及びフォルスコリン及びチロカルシトニンはＣＨＯ細胞に作用して内因性応答を発生させることを正確に証明するものである。グルタミン、ノシセプチン（nociceptin）、及びセロトニンは、これら細胞において活性のあるアゴニストではない。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１ａ〜ｄは、フォルスコリンで刺激された細胞のレニラ及びホタル発光の図である。
【図２】  図２ａ〜ｄは、イソプレナリン及びバソプレシンで刺激された細胞のレニラ及びホタル発光の図である。
【図１】
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【図２】
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