(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
0004388600.tif 000030
（式中、ＣＨ基における水素またはＣＨ2基における２つの水素の個所において、次の置換基があってもよい：
１−２位において：２重結合があってもよい；
９位において：Ｆがあってもよい；
１６位において：ＣＨ3があってもよい；
Ｘ1は２価の結合手：
−    −ＹＯ−
（ここで、Ｙは、１〜２０の炭素原子を有する直鎖状もしくは可能なとき分枝しているアルキレンである）；
であり、ステロイド骨格を有する前駆体は、ヒドロコルチゾンおよびデキサメタゾンを含む）
の化合物またはそのエステルもしくは塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３】
医薬用途が抗関節炎剤である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬用途が免疫抑制剤である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬用途が血管新生抑制剤である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬用途が抗喘息剤である請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は、新規なコルチコイド化合物類の製造法に関するものである。
特に、抗炎症性、免疫抑制性および血管新生抑制（アンジオスタティック：angiostatic）活性を有するステロイド構造の化合物（いわゆる、ステロイド抗炎症剤）に関するものである。
この発明の化合物は、一般にコルチコステロイド（コルチコイド）製剤が使用される病理学的症状の治療に有用であるだけでなく、利点も多い。
これは周知のコルチコイド製品よりも予期できないほどの利点を示す。事実、特定の製品の種々定義された治療用途を考慮すると、本発明の新規な化合物で、公知のコルチコイド類に関する結果のより良い組み合わせを見出すことが常に可能である。
いかなる予想にも反して、本発明の物質は、低い副作用と結びついた高い活性という改善された治療上のプロフィールを示すという事実によって特徴づけられる。
コルチコイド類は、炎症性疾患の治療における薬理学的な手段の第一の選択肢としてよく知られている。例えば、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、フルドロコルチゾン、デスオキシコルチコステロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、パラメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、アセトキシプレグネロン等を含むこの種の薬剤は、さまざまな臓器に対して著しい薬物毒性作用を有している。そのため、それらの臨床上の使用や断続的な使用は、一連の副作用を引き起こし、それらの副作用のあるものは極めて重篤である。例えば、Goodman & Gilman:「The Pharmaceutical Basis of Therapeutics」第９版、1459〜1465頁,1996年参照。
これらの有毒な作用は以下のものを含む。
−変化した細胞代謝および高い頻度の骨粗しょう症を誘発する骨に対するもの；
−高血圧性の反応の原因となる循環器系に対するもの；
−胃の障害を引き起こす胃腸管に対するもの。
例えば、Martindale:「The Extrapharmacopoeia」第30版、712〜723頁、1993年参照。
上記の従来技術によれば、治療活性を副作用から分離することは殆ど不可能であることが分かる。上記のGoodmanらの1474頁参照。
この技術分野で知られているのは、酸性の末端を伴ったまたは伴わない非ステロイド抗炎症剤であり、非酸性の末端については特許ＷＯ９４／０４４８４、ＷＯ９４／１２４６３、ＷＯ９５／０９８３１、ＷＯ９５／３０６４１参照、そしてこれらの特許には酸性末端のものも記載されている。
ＤＥ−Ａ−２２２２４９１（１）は、２１位に基
0004388600.tif 000002
を有するプレグナン誘導体を開示している。
この化合物類には、抗炎症、抗アレルギーおよびカルディオトロピック活性がある言われている。その単一化合物は血管拡張剤である。
ＵＳ−Ａ−３４９４９４１（２）は、冠不全、狭心症のような心疾患の治療に血管拡張剤として有用な、エストラン−３−オールまたはエストロ−４−エン−３−オンからのステロイド誘導体を開示している。この化合物類は、１７位にナイトレート基に結合するエーテル結合手を有している。ナイトレート基は、ステロイド環の３位および１６位にもあり得る。
Arzneimittel Forschung,vol.19,n.4,1969,pp.584-685（３）は、アンドロスタン誘導体の３−および１７−硝酸エステル、アンドロステンの３−および１７−ジナイトレート誘導体、テストステロン誘導体の１７−硝酸エステルおよびデソキシコルチゾン、コルチゾンおよびプレドニゾンの２１−硝酸エステル誘導体を開示している。この文献には、デソキシコルチコステロンナイトレートが異なる臓器において蛋白質の同化作用を促進すると記述されている。
ＷＯ−Ａ−９７／３４８７１（４）は、（ｉ）ステロイド、β−アゴニスト、抗コリン作用薬、マストセルスタビライザー、少なくとも１つのＮＯまたはＮＯ2基あるいはin vivoでＮＯまたはＥＤＲＦ（endothelium-derived relaxing factor）の内因的生成を刺激する基が、酸素、硫黄、炭素および窒素のような位置を介して、直接または間接に結合しているＰＤＥ（phosphodiesterase）；（ｉｉ）臨床的に有効量のステロイド、β−アゴニスト、抗コリン作用剤、マストセルスタビライザー、あるいは少なくとも１つのＮＯもしくはＮＯ2部分またはin vivoでＮＯもしくはＥＤＲＦの内因的生成を刺激する基で置換されていてもよいＰＤＥインヒビターが、ナイトリックオキサイドを供与、転移または放出する化合物および／またはin vivoでＮＯもしくはＥＤＲＦの内因的生成を刺激する化合物と組み合わさってなる組成物を開示している。
しかしながら、ステロイド物質はＣＯＸと共有すべきものを有しておらず、まだ充分に説明されていない作用のより複雑な薬物毒性メカニズムを有しているのに対して、非ステロイド性物質の作用の薬物毒性メカニズムは、一つまたはそれ以上のシクロ−オキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害に基づいているので、ステロイド化合物類は非ステロイド化合物類とは化学的、薬理学的および生化学的に全く異なっているということが認識されるべきである。
これら二つの化合物群が国際的な薬局方において完全に分離されたカテゴリーに分類されているということはよく知られている。
本出願人は、驚くべきことにまた予期しないことに、きわめて有効であり、当該技術分野で知られていたものより優れてさえいて、しかも同時に、予期しないことにそれらが上記の副作用を引き起こさず、あるいは引き起こしたとしてもその副作用が軽微であるため、公知のコルチコイド類より高い忍容性を有するコルチコステロイド類（コルチコイド類）を見出した。
本発明の目的は、一般式：
Ｂ−Ｘ1−ＮＯ2
［式中、Ｂは次の構造：
0004388600.tif 000003
（ここで、一般式中に示されたＣＨ基における水素ＨまたはＣＨ2基における２つの水素Ｈ2の個所において、次の置換基があってもよい：
１−２位において：２重結合があってもよい；
２−３位において：次の置換基があってもよい；
0004388600.tif 000004
２位において：Ｃｌ、Ｂｒがあってもよい；
３位において：ＣＯ、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃｌ、ＯＨがあってもよい
４−５位において：２重結合があってもよい；
５−６位において：２重結合があってもよい；
６位において：Ｃｌ、Ｆ、ＣＨ3、−ＣＨＯがあってもよい；
７位において：Ｃｌがあってもよい；
９位において：Ｃｌ、Ｆがあってもよい；
１１位において：ＯＨ、ＣＯ、Ｃｌがあってもよい；
１６位において：ＣＨ3、ＯＨ、＝ＣＨ2があってもよい；
１７位において：ＯＨ、ＣＨ3、ＯＣＯ（Ｏ）ua（ＣＨ2）vaＣＨ3、もしくは
0004388600.tif 000005
（ここで、ｕａは０または１に等しい整数であり、ｖａは０から４の整数である）があってもよい；
１６−１７位において：次の基があってもよい
0004388600.tif 000006
（ここで、ＲおよびＲ’は互いに同一であるかまたは異なって、水素または１から４の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、好ましくはＲ＝Ｒ’＝ＣＨ3であってもよい；
９位にＦがあり、１１にＯＨがあり、１−２位および４−５位に２つの二重結合があり、３位および２０位に２つのＣＯ基があり、１６位および１７位に基：
0004388600.tif 000007
があることのできないとき、
Ｂはコルチコステロイドの残基である；
Ｒ’’は−（ＣＯ−Ｌ）t−（Ｘ）t1−であり、
ここで、ｔおよびｔ１は１に等しい整数である；
２価の架橋基Ｌは、
（ＣＲ4Ｒ5）na（Ｏ）nb（ＣＲ4Ｒ5）n’a（ＣＯ）n’b（Ｏ）n’’b（ＣＯ）n’’’b（ＣＲ4Ｒ5）n’’a
から選択される。
（ここで、ｎａ、ｎ’ａおよびｎ’’ａは互いに同一であるかまたは異なって０から６の整数、好ましくは１から３の整数であり；
ｎｂ、ｎｂ’、ｎ’’ｂおよびｎ’’’ｂは互いに同一であるかまたは異なって０または１に等しい整数であり；
Ｒ4およびＲ5は互いに同一であるかまたは異なってＨ、１から５、好ましくは１から３の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状のアルキルから選択され；
ＸはＸ0＝０、ＮＨ、ＮＲ1C（ここでＲ1Cは１から１０の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状のアルキルである）に等しい；
Ｘ1は２価の結合手であり、次のものから選択される：
−ＹＯ
（ここで、ＹはＣ1−Ｃ20、好ましくは２から５の炭素原子を有する直鎖状もしくは可能なとき分枝しているアルキレン、または５から７の炭素原子を有する任意に置換されていてもよいシクロアルキレンである；
−Ｙ1は、
0004388600.tif 000008
（ここで、ｎ3は０から３の整数である）；
0004388600.tif 000009
（ここで、ｎｆ’は１から６、好ましくは２から４の整数である；
0004388600.tif 000010
（ここで、Ｒ1f＝Ｈ、ＣＨ3であり、ｎｆは１から６、好ましくは２から４の整数である）
から選択される］
を有するコルチコステロイド類およびそれらのエステル類および塩類、ならびにそれらの抗炎症剤、免疫抑制剤およびアンジオスタティック剤としての用途にある。
言及することができて好ましい化合物は、Ｂが当該技術分野で公知の製法により得られる、下記に列挙されたものである。
例えば、ここで参照として組み込まれるメルク・インデックス第１２版（１９９６年）に記載されている前駆物質および関連製法は、前駆物質および関連製法として言及され得る。
前駆物質（メルクの命名に従う）は次のものを含む。ここで、Ｈ2、Ｈ、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’は、以下に列挙された化合物において定義されたような意味を有する：ブデソニド、ヒドロコルチゾン、アルクロメタゾン、アルゲストン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、クロベタゾル、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾン、コルチコステロン、デフラザコルト、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、フルアザコルト、フルクロロニド、フルメタゾン、フルニゾリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、フォルモコルタール、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオネート、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ロテプレドノールエタボネート、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノアセテート、プレドニゾロンナトリウムフォスフェート、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、リメキソロン、トリアムシノロン、２１−アセトキシプレグネノロン、コルチバゾール、アムシノニド、フルチカゾンプロピオネート、マジプレドン、チクソコルトール、トリアムシノロンヘキサセトニド。
上記で定義されたＸ1結合手は、上記で示された当該技術分野における公知の方法を用いるか、あるいはこれらが列挙した特許に記載された結合手と異なるときは、上記の公知の方法を修正してＸ1結合手を導入することにより、当該技術分野における公知の方法により、得ることができる。一般に、ＢとＸ1との間の結合は、上記で示されたように、エステルまたはアミド型（Ｘに定義されたＮＨまたはＮＲ1c）である。これらの結合手を形成するためのような周知の合成経路も、この結合手を形成するのに採用され得る。
エステルの場合、最も直接的な合成経路は次のものを含む：
ＨＯ−Ｙa−Ｃｌ、ＨＯ−Ｙa−Ｂｒ、ＨＯ−Ｙa−Ｉ−型のハロゲンアルコール（ここで、Ｙａは酸素原子を除いてＹまたはＹ1に等しい）中、公知技術に属する試験条件での、アシルクロリド類Ｂ−ＣＯ−Ｃｌの反応。
式Ｂ−ＣＯ−Ｏ−Ｙ−Ｃｌ（Ｂｒ、Ｉ）の反応生成物は、塩の酸Ｂ−ＣＯ−ＯＨのナトリウムまたはカリウム塩を、一般式ＹaＣｌ2、ＹaＢｒaまたはＹaＩ2、ＣｌＹaＢｒ、ＣｌＹaＩ、ＢｒＹaＩのジハロゲン誘導体と反応させることによっても得られる。
反応生成物は、文献で知られている方法に従って、アセトニトリル中でＡｇＮＯ3と反応させることにより、最終生成物に変換され得る。
一般的な反応式は次のとおりである：
0004388600.tif 000011
（式中、Ｘ1＝ＹaＯ）
一般的な反応式は以下のとおりでもよい：
0004388600.tif 000012
（式中、Ｘ1＝ＹaＯ）
このアミドの場合、合成反応式は、公知の方法に従って、同じアシルクロライド類ＢＣＯＣｌと一般式ＮＨ2−Ｙa−ＯＨ、ＮＨＲ1c−Ｙa−ＯＨのアミノアルコール類を反応させて一般式：
Ｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙa−ＯＨおよびＢ−ＣＯ−ＮＲ1c−Ｙa−ＯＨのアミド類を得る反応を含む。
これらのアミド類と例えばＰＣｌ5、ＰＢｒ3、ＳＯＣｌ2等のハロゲン化剤との反応は、一般式：
Ｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙa−Ｂｒ（Ｃｌ）およびＢ−ＣＯ−ＮＲ1c−Ｙa−Ｂｒ（Ｃｌ）のハロゲン誘導体を与える。
後者は、文献で知られた方法に従って、アセトニトリル中でＡｇＮＯ3と反応させることにより、最終生成物ＢＸ1ＮＯ2を与える。
この反応式は次のように表される：
0004388600.tif 000013
（式中、ＹaＯはＸ1である）。
エステル形成への代替的な経路は、酸類のナトリウムまたはカリウム塩類と一般式：
ＮＯ2−Ｏ−Ｙa−Ｃｌ（Ｂｒ、Ｉ）
のハロゲンアルコール類の硝酸エステル類との反応により、本発明の物質を直接得るものである。
この反応式は次のとおりである：
0004388600.tif 000014
（式中、ＹaＯはＸ1である）。
上記の方法に類似の他の合成経路は、ジハロゲン誘導体Ｂｒ2Ｙaをエノレート類と反応させる方法を含む。反応生成物は、次いで上記の反応に従って、アセトニトリル中でＡｇＮＯ3と反応させることにより変換される。この一般的な反応式は、−ＣＨ2−ＯＨ、ＣＨ＝ＯＨ型の基Ｂ中の−ＯＨに対して次のように示される：
0004388600.tif 000015
これらのＸ1結合基を得るための方法は、特許出願ＷＯ９５／３０６４１号に記載されており、この特許出願はここに組み込まれる。
上述のように、式Ｂ−Ｘ1ＮＯ2の本発明の化合物類またはそれらの医薬組成物は、よく知られたコルチコイド製品が用いられている疾病の治療のために使用される。
具体的には、例えば抗喘息剤のような呼吸性の異常における使用、抗関節炎剤、抗掻痒剤、抗乾癬剤、抗湿疹剤としての使用；例えばアンジオスタティックとしての血管障害における使用、例えば免疫抑制剤としての免疫障害における使用が特筆される。
この発明の化合物類、またはそれらの組成物は、例えば経口、直腸（腸の障害）、非経口投与、または局部的（皮膚、局所、経皮、眼、吸入等）投与により適用され得る。
以下の実施例は、一つの説明として例示目的でなされたものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
化学合成：ヒドロコルチゾンニトロ誘導体（ＨＣＮ）の製造
0004388600.tif 000016
実施例１Ａ
ヒドロコルチゾン（４−クロロ）ブタノエートの製造
0004388600.tif 000017
４部の４−クロロブタノイルクロライド（０．３２ｍｌ×４）とトリエチルアミン（０．３ｇ×４）をＣＨＣｌ3中のヒドロコルチゾン（１ｇ）の溶液に２４時間で加え、Ｐ2Ｏ5上で乾燥し、３日間攪拌した。この溶液を水で処理し、有機相を分離し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、減圧下に溶媒を除去した。粗残留物をヘキサンおよびＣＨ2Ｃｌ2で摩砕し、収率５３重量％で白色固体を得た。これは１５５℃の融点（ｍ．ｐ．）を有していた。
この生成物を質量分析によりその特性を評価した。
0004388600.tif 000018
ヒドロコルチゾン（４−ニトロキシ）ブタノエートの製造
ＡｇＮＯ3（０．２ｇ）を、上記で得られたヒドロコルチゾン−４クロロブタノエート（０．２３ｇ）のアセトニトリル（７０ｍｌ）溶液に加え、１６時間還流した。溶液から減圧下に溶媒を除去し、溶離剤としてエチルアセテートおよびＣＨ2Ｃｌ2（３：７）の溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーに付した。
コルチゾン４−ニトロキシブタノエートを最初のフラクションから回収した。
この生成物を1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ  ＣＤＣＬ3）にてその特性を評価した。
0004388600.tif 000019
実施例１Ｂ
実施例１Ａからの生成物を他の合成経路を用いて製造した。
ヒドロコルチゾン４−ブロモブタノエートの製造
0004388600.tif 000020
５部の４−ブロモブタノイルクロライド（０．３５ｍｌ×５）および炭酸カリウム（０．４ｇ×５）を、ＣＨＣｌ3中のヒドロコルチゾン（１ｇ）の溶液に２４時間で加え、Ｐ2Ｏ5上で乾燥し、５日間攪拌した。この溶液を水で処理し、有機相を分離し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、減圧下に溶媒を除去した。
ヒドロコルチゾン４−ニトロキシブタノエート（ＨＣＮ）の製造
ＡｇＮＯ3（０．２ｇ）を、上記で得られたヒドロコルチゾン４−ブロモブタノエート（０．２３ｇ）のアセトニトリル（７０ｍｌ）溶液に加え、室温で４８時間攪拌した。
この溶液から減圧下に溶剤を除去し、溶離剤としてエチルアセテートおよびＣＨ2Ｃｌ2（３：７）の溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーに付した。
コルチゾン４−ニトロキシブタノエートを最初のフラクションから回収し、その特性を質量分析：Ｍ+４９３により評価した。
そのスペクトルは実施例１Ａで示したものと同じであった。
実施例２
安全性および活性の評価
ｉｎ  ｖｉｖｏテストにおいて、生成物を２重量％カルボキシメチルセルロース懸濁液として投与した。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、０．１重量％のジメチルスルホキシド懸濁液を使用した。
試験グループは、十分な統計学的評価のため（実施例において異なる記述のある場合を除いて）、必要に応じて通常の統計学的手法に従って実施されるべき８サンプルを常に含んでいた。
実施例２Ａ
急性毒性試験
１群１０匹のスイス系マウスに試験化合物を単回経口投与することにより、実施例１Ａからの生成物の急性毒性を大まかに評価した。
死亡発生率および毒性兆候の出現を、化合物投与後１４日間にわたり観察した。
動物は、投与量５０ｍｇ／ｋｇの投与の後でさえ明らかな毒性の兆しを示さなかった。
実施例２Ｂ
抗関節炎活性試験
ミネラルオイル０．１ｍｌ中に懸濁したミコバクテリウムブチリカム（Ｄｉｆｃｏ）０．６ｍｇを体重１７０±１５ｇのルイス系雄性ラットに尾内注射して、アジュバント関節炎を誘発させた。これらの動物を、ミコバクテリウム接種後の初日から始めて、腹膜組織内（ｉ．ｐ．）のカルボキシメチルセルロースの２重量％水中懸濁液からなる賦形剤で、また投与量５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＨＣＮ（上記のような懸濁液）の腹膜組織内ヒドロコルチゾンで、処理した。
関節炎の発生をその後２１日間評価した。関節炎障害に対して、任意の評点を以下の基準に従って与えた。
−後ろ足：それぞれに０〜７（障害がないのに対して０、最も重篤な障害に対して７）
−前足：それぞれに０〜４．５（障害がないのに対して０、最も重篤な障害に対して４．５）
−尻尾：０〜５（障害がないのに対して０、最も重篤な障害に対して５）
−耳：それぞれに０〜２（障害がないのに対して０、最も重篤な障害に対して２）
−鼻および目：それぞれに０〜１（障害がないのに対して０、最も重篤な障害に対して１）
対照群（媒体だけで処理された動物）で得られた数値と比較した阻止パーセントとして結果を表示した。
その結果を表１に示す。
0004388600.tif 000021
表１の結果に見られるように、試験物質はミコバクテリウムにより引き起こされる関節炎プロセスの進展を同様に抑制することができた。しかしながら、ＨＣＮの認容性はヒドロコルチゾンのそれよりも極めて高い（次の実施例２Ｃ参照）ので、活性の面からの結果はＨＣＮの場合極めて良好である（比較のため、１０ｍｇ／ｋｇ  ＨＣＮで得られた６２％に関して、５ｍｇ／ｋｇのヒドロコルチゾンで得られた抗関節炎活性４０％を参照）。
実施例２Ｃ
胃の認容性（安全性）試験
２４時間絶食させたスプラグ−ドウリー系ラットを、腹膜内のヒドロコルチゾンまたはＨＣＮ５〜１０ｍｇ／ｋｇで処理した。
２４時間後、動物を殺し、胃を取り出し、組織をDel Soldatoら：“The influence of fasting and cimetidine on the relationship between ulcerogenic and anti-inflammatory properties of cimetidine″、Br.J.Parmacol.67,33-37,1979に記載された障害の存在について全体的に調べた。疾病の重篤度を通常の方法に従って評価し、任意の評点として表わした。その結果を表２に示す。
0004388600.tif 000022
次の基準に従った任意の数値としてデータを表示する：０＝なし、１＝軽微な障害、２＝中程度の障害、３＝点状の潰瘍、４＝激しい多くの潰瘍。＊Ｐ＜０．０５（ここで、Ｐは確率）ヒドロコルチゾンで処理された群における対応数値と比較して。
表２に示されるように、ヒドロコルチゾンで処理されたラットは、粘膜浸食から筋肉層、壁癒着、腹水、腹膜炎を含む潰瘍へ強烈に変化する胃腸管における顕著な疾病を示した。媒体のみまたはＨＣＮで処理された他の群においては、障害は極めて低いか、ほとんどなかった。
実施例２Ｄ
ニトロキシシンセターゼ活性試験
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）により誘発されるニトロキシ−シンセターゼ阻害活性を、試験化合物の１つを投与した後のラットの好中球および胃において判定し、懸濁媒体のみで処理して得られた結果と比較した。処理前２４時間絶食したウィスター系ラットに、試験化合物の１つを腹腔内に（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＬＰＳを静脈（尾の静脈）に（５ｍｇ／ｋｇ）投与した。４時間後に動物を殺した。好中級分離のための血液および胃を採取した。
酵素的活性をAssreuyら：″Feedback inhibition of nitric oxide synthetase activity by nitric oxide″,Br.J.Pharmacol.108,833-7,1993に記載の方法に従って測定した。その結果を表３に示す。
0004388600.tif 000023
表３で見られるように、媒体のみで処理された群と比較してどちらの試験物質もニトロキシシンセターゼ阻害において極めて有効であることが分かった。
実施例２Ｅ
骨の毒性試験
Dohertyらの（″The effect of glucocorticoids on osteoblast function.The effect of corticosterone on osteoblast,expression of beta-I integrins″Journal of Bone and Joint Surgery,Series A77/3,396-404,1995）に記載の方法に従って、試験管内で成長させた骨の組織（ラット胎仔からの頭頂骨）を使用した。ヒドロコルチゾンまたはＨＣＮまたは媒体を１００ｎｍｏｌ濃度で一定の温度に保った。
９６時間後、カルシウム含量および骨の乾燥重量を測定した。
その結果を表４に示す。
0004388600.tif 000024
表４で見られるように、組織の乾燥重量の著しい増加および増加したカルシウムが、媒体またはＨＣＮとともに培養した後に観察された。ヒドロコルチゾンとともに培養した後では、カルシウム含量が減少し、骨の乾燥重量も増えなかった。これは、ヒドロコルチゾンを用いたこの処理が骨の成長に悪い影響を与えたことを示している。
実施例２Ｆ
いくつかの心血管パラメータ試験
Gardinerら：″Influence of dexamethasone on the regional haemodynamic responses to lipopolysaccharide in consciousrats:effect of the non-selective endothelin antagonist:SB209670″,Br.J.Pharmacology 117,49p,1996に記載のようにして、いくつかの心血管パラメーターに対する試験物質の効果を、適当な監視下にある正常なロング・エバンス系ラットで試験した。
動物を媒体（生理食塩水、０．９％塩化ナトリウム、ｓ．ｃ．）、皮下のヒドロコルチゾンまたはＨＣＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。心拍および血圧を処理後４時間記録した。
表５は、得られたデータをコントロール値からの変動パーセントとして示している。
0004388600.tif 000025
表５の結果は、本発明の物質ＨＣＮが測定された心血管パラメーターに影響を与えていないことを示している。反対に、従来技術において用いられているヒドロコルチゾンは、有意な圧力とともに心臓の変化を示している。
実施例２Ｇ
ラットにおけるアンジオスタティック活性試験
Andradeら：″Quantitative in vivo studies on angiogenesis in a rat sponge model″,Brit.J.Exp.Pathol.68,755-766,1987に記載の方法に従って、体重１８０〜２００ｇのウィスター系雄性ラットを用いた。小さいスポンジを１４日間皮下組織に移植し、133Ｘｅクリアランスを判定することにより、血流との関連でネオ血管新生を評価した。簡単に言えば、１０μｌに等しい量の133Ｘｅを小さいポリエチレンカニューレを用いてスポンジに注入した。移植後の残留放射能をガンマ線検出器を用いて測定し、６分間の133Ｘｅクリアランスを初期値の％として測定した。ネオ血管新生を測定するこの方法の有効性は、HUら：″Correlation of 133Xe clearance,blood flow and history in the rat sponge model for angionenesis.Further studies with angiogenic modifiers″,Lab.Invest.72,601-610,1995により、最近実証された。
移植後、第１日から第１３日にかけて、試験化合物を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下経路により投与した。皮下移植から第１４日に133Ｘｅを測定し、動物を殺し、胸腺および脾臓の重量を記録した。
表６は、ネオ血管新生ならびに脾臓および胸腺の重量に対する、試験物質の効果に関して得られたデータを示している。
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明らかなように、ＨＣＮは、参照物質とは異なって、脾臓および胸腺の重量の変化を伴わないで、顕著なアンジオスタティック効果を発揮できることを証明している。
表１〜６に示されたデータの全てから明らかなように、ニトロ誘導体の薬理学的活性−抗関節炎、免疫抑制および抗アンジオゲニック活性−ならびに認容性が、公知技術からのコルチコイドのそれらよりも優れている。
実施例３
デキサメタゾン２１−（４−ブロモブチレート）［ＩＩ］
デキサメタゾン［Ｉ］            ３．５ｇ      ８．９ミリモル
４−ブロモブチリルクロライド    ４．０６ｍｌ  ３５ミルモル
炭酸カリウム                    ４．９ｇ      ３５ミリモル
テトラヒドロフラン              ７０ｍｌ
化合物Ｉのテトラヒドロフラン溶液を少しずつ、４−ブロモブチルクロライド（０．８１ｍｌ×５）および炭酸カリウム（０．９８ｇ×５）で７時間処理する。この混合物を一晩攪拌し、溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物をエチルエーテルおよび水で処理する。有機層を分離し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を蒸発させた後、残留物をｔ．ブチルメチルエーテル−ヘキサン１−１で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して：
−極性の低い化合物  １．０ｇ
−誘導体ＩＩ        １．５ｇ（ｍ．ｐ．１８４−１８７℃；収率３１％）
ＴＬＣ：ｔ．ブチルメチルエーテル−ヘキサン２−１。
デキサメタゾン２１−（４−ニトロオキシブチレート）［ＩＩＩ］（化合物ＤＸＮ）
化合物ＩＩ            １．５ｇ    ２．７ミリモル
硝酸銀                ２．４ｇ  １４．１ミルモル
アセトニトリル        ２５０ｍｌ
アセトニトリル中の化合物ＩＩおよび硝酸銀の混合物を７時間加熱還流する。無機の塩を濾過した後、溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物をエチルエーテルで処理する。有機層を水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に蒸発させる。残留物をエチルエーテル中に注ぎ、濾過して、白色固体として純粋な化合物ＩＩＩ１．２７ｇを得る（ｍ．ｐ．１８３−１８５℃；収率９０％）
ＴＬＣ：ｔ．ブチルメチルエーテル−ヘキサン  ２−１。
次のフォームが納められている：
−合成式；
−ＮＣＸ１００５バッチ１；
−ＮＣＸ１００５／１分析。
デキサメタゾン２１−（４−ニトロオキシブチレート）製造のための合成式
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実施例４
白血球の蓄積に対する活性試験
標準的なペレット状の餌および随意の飲み水で維持されたスイス系白変種雄性マウス（２７−３３ｇ）を使用した。Perrettiら（Perretti M.,Solito E.,Parente L.,″Evidence that endogenous interleukin-1 is involved in neuttrophil migration in acute experimental inflammation in rats and mice″,Agents Actions,35,71,1992）に既に記載されているようにして、実験を行った。動物をザイモサン（１ｍｇ／０．５ｍｌ）ｉ．ｐ．で０時に前処理した。２時間後、デキサメタゾン（１ｍｇ／ｋｇ）（Ｅｘ３−Ｉ）、ＤＸＮ（Ｅｘ３−ＩＩＩ）（１ｍｇ／ｋｇ）またはホスフェートで緩衝された食塩水（ＰＢＳ）を静脈内に投与した。４時間後および２４時間後に動物を殺し、洗浄液を集め、ディファレンシャル・セル・カウントを行い、Ｔｕｒｋ’ｓで着色した。
表７は、マウスにおけるザイモサン−誘発白血球遊走に対する試験化合物の抑制効果について得られた結果を報告している。見られるように、ニトロ誘導体ステロイドはデキサメタゾンよりはるかに活性である。
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実施例５
ヒトの気道平滑筋細胞における抗増殖活性試験
ヒトの気道平滑筋細胞を標準的な組織移植方法により培養した。ＰＢＳおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを入れた滅菌ポットに組織を集めた。滅菌組織培養条件の下に、組織を小片に切断し（重量約１ｍｇ）、２０％仔牛血清（ＦＣＳ）を含む標準的な培地中に数日間（２−４日ごとに培地を変える）置く。3Ｈ−チミジンを、４８のウェル・プレート中で培養された細胞のＤＮＡフラクション中で測定した。細胞を１０％ＦＣＳ含有培地中で培養して密集させた。異なった濃度のステロイド類と共に１０％ＦＣＳを加える２４時間前に、細胞から血清を取り去った。２４時間後、細胞に3Ｈ−チミジンを４時間加えた。細胞をフォスフェートで緩衝された食塩水およびエタノールで洗浄した。ＤＮＡを水酸化ナトリウム溶液で抽出し、3Ｈ物質をシンチレーションにより数えた。データは、健康な肺のドナーから培養された平滑筋からの、３倍のウェルにおいて行われた観察を表わす。表８は、ヒトの気道平滑筋細胞増殖に対する試験化合物の抑制効果について得られた結果を報告している。見られるように、ニトロ誘導体ステロイドはデキサメタゾンよりはるかに活性が強い。
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結論
上記に報告された結果から見られるように、新規なニトロ誘導体の活性および安全性は、前駆体ステロイド類の有するそれらよりも優れている。