(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードする配列番号２で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＥによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
（ｂ）配列番号３で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードする配列番号４で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＢによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
（ｃ）配列番号５で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードする配列番号６で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＩによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
（ｄ）配列番号７で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードする配列番号８で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＹによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｅ）配列番号９で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードする配列番号１０で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＺ）又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＺによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
よりなる群から選択される１つ以上のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
（ａ）配列番号１で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードする配列番号２で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＥによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｂ）配列番号３で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードする配列番号４で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＢによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｃ）配列番号５で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードする配列番号６で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＩによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードする配列番号２で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＥによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｂ）配列番号３で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードする配列番号４で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＢによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｃ）配列番号５で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードする配列番号６で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＩによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｄ）配列番号７で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードする配列番号８で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＹによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
（ａ）配列番号１で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードする配列番号２で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＥによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｂ）配列番号３で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードする配列番号４で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＢによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｃ）配列番号５で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードする配列番号６で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＩによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｄ）配列番号７で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードする配列番号８で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）、又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＹによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｅ）配列番号９で示されるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードする配列番号１０で示されるＤＮＡ配列（ｃｒｔＺ）又はフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のｃｒｔＺによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列；
を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡに、アルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）を、更に含む請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３記載のＤＮＡに、アルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）を、更に含む請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項８】
請求項２記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項９】
請求項３記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項１０】
請求項４記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項１１】
請求項５記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項１２】
請求項６記載のＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項１３】
請求項４記載のＤＮＡと、アルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードする第二のＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）若しくはアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつアルカリゲネス株ＰＣ−１のｃｒｔWによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又はアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）若しくはアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつアルカリゲネス株ＰＣ−１のｃｒｔWによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む第二のベクターとにより形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項３記載のＤＮＡと、アルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードする第二のＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）若しくはアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつアルカリゲネス株ＰＣ−１のｃｒｔWによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又はアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｃｒｔＷ、配列番号１１）若しくはアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼのアミノ酸配列と比べた場合９０％を超える同一のアミノ酸を示し、かつアルカリゲネス株ＰＣ−１のｃｒｔWによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む第二のベクターとにより形質転換された細胞。
【請求項１５】
原核細胞である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
バチルス株である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
真核細胞である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１９】
酵母細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
真菌細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２１】
リコペン、β−カロテン、エキネノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニキサンチン若しくはアスタキサンチン又はこれらカロテノイドの混合物からなる群から選択されるカロテノイドを調製する方法であって、請求項７〜２０のいずれか１項記載の細胞を、適切な培養条件下で培養し、その細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知な方法によりそれを分離する、方法。
【請求項２２】
請求項８記載の細胞を培養することによりリコペンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項９記載の細胞を培養することによりβ−カロテンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
請求項１２または１４記載の細胞を培養することによりエキネノンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
請求項１２記載の細胞を培養することによりカンタキサンチンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
請求項１１または１３記載の細胞を培養することによりゼアキサンチンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
請求項１１または１３記載の細胞を培養することによりアドニキサンチンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
請求項１１記載の細胞を培養することによりアスタキサンチンを調製するための請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
食料又は飼料配合物を調製するための方法であって、
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法を実施した後に、そのカロテノイド又はカロテノイド混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野及び従来の技術】
細菌、酵母、真菌及び植物から見いだされるカロテン生成性微生物からの６００を越える異なるカロテノイド類が記載されている。現在のところ、それらの２つ、β−カロテン及びアスタキサンチンのみが、商業的に微生物中で産生され、食品及び飼料工業で用いられている。β−カロテンは、藻類から得られ、アスタキサンチンは、古典的突然変異により生成したパファフィア株（Pfaffia strains)中で産生されている。しかしながら、パファフィアでの発酵は、発酵周期が長いという欠点を有し、藻類からの回収は、やっかいである。したがって、良好な工業的適応性を有する製造システム、例えば増大した力価及び／又は短い発酵時間で取り扱うことができる製造システムを開発することが望まれている。エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola)及びエルウィニア・ウレドボーラ（Erwinia uredovora)からのその生合成の遺伝子を用いるそのような２つのシステムが、既にＷＯ９１／１３０７８及びＥＰ３９３６９０に、それぞれ記載されている。更に、３つのβ−カロテンケトラーゼ遺伝子（β−カロテンβ４−オキシゲナーゼ）が、海洋細菌のアグロバクテリウム・アウランチアカム（Agrobacterium aurantiacum)及びアルカリゲネス株（Alcaligenes strain）ＰＣ−１（ｃｒｔＷ）〔Misawa, Biochem. Biophys. Res. Com. 209, 867-876(1995)〕〔Misawa, J. Bacteriology 177, 6575-6584(1995)〕並びに緑藻類のヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis)（ｂｋｔ）〔Lotan, FEBS Letters 364, 125-128(1995)〕〔Kajiwara, Plant Mol. Biol. 29, 343-352(1995)〕からクローン化されている。Ｅ・ヘルビコーラ（E. herbicola）〔Hundle, MGG 245, 406-416(1994)〕又はＥ・ウレドボーラ（E. uredovora) のどちらかのカロテン生成遺伝子（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＹ及びｃｒｔＩ）を有し、かつＡ・アウランチアカム（A. auranticum)〔Misawa(1995)〕のｃｒｔＷ遺伝子又はＨ・プルビアリス（H. plivialis) 〔Lotan(1995）〕〔Kajiwara(1995)〕のｂｋｔ遺伝子で相補されているE. coli （大腸菌）は、β−カロテンの変換から出発し、中間体エキネノン（β，β−カロテン−４−オン）を経由して、カンタキサンチン（β，β−カロテン−４，４’−ジオン）を蓄積した。上述のカロテノイド生合成遺伝子に加えて、Ｅ・ウレドボーラ（E. uredovora) 〔Kajiwara(1995)〕〔Misawa(1995)〕のｃｒｔＺ遺伝子を有するE. coli 細胞への、上述の遺伝子（ｃｒｔＷ又はｂｋｔ）の導入は、両方の場合に、アスタキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン−４，４−ジオン）の蓄積をもたらした。ｂｋｔ遺伝子で得られた結果は、他者〔Lotan(1995）〕による、同じ実験装置を用いて、Ｅ・ヘルビコーラ (これは、上述のＥ・ウレドボーラの近縁である）のカロテノイド生合成遺伝子を有する、ゼアキサンチン（β，β−カロテン−３，３−ジオール）合成E. coli 宿主に、Ｈ・プルビアリスを導入して、アスタキサンチンの産生を観察しなかった、という観察とは異なっている。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、既知のｃｒｔＷ遺伝子と、本発明のカロテノイド生合成遺伝子との機能的に活性な組み合わせは、現在まで示されておらず、かつ更に重要であることには、工業的適用のための更により最適な発酵システムにおいて、変わらずに需要がある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）フラボバクテリウム属ｓｐ．（Flavobacterium sp.）Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；
（ｂ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；
（ｃ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；
（ｄ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｅ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＺ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；
よりなる群から選択される１つ以上のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ配列を提供することである。
【０００４】
本発明の目的は、また、そのようなＤＮＡ配列を含むベクターを、好適には発現ベクターの形で提供することでもある。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターにより形質転換された細胞、好適には原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株（Bacillus strain)である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞もまた、本発明の目的である。最後に、本発明は、また、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術で既知の方法によりそれを分離することを特徴とする方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド又はカロテノイド混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【０００５】
更に、以下のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列は、本発明の目的である：
（ａ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｂ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｃ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列。
【０００６】
また、そのようなＤＮＡ配列を含むベクターを、好適には発現ベクターの形で提供することは、本発明の目的である。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターにより形質転換された細胞、好適には原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞もまた、本発明の目的である。最後に、本発明は、また、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはリコペンを製造する方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはリコペン、又はカロテノイド混合物、好適にはリコペン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【０００７】
更に、以下のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列も、本発明の目的である：
（ａ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｂ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｃ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｄ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列。
【０００８】
また、そのようなＤＮＡ配列を含むベクターを、好適には発現ベクターの形で提供することは、本発明の目的である。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターにより形質転換された細胞、好適には原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞もまた、本発明の目的である。最後に、本発明は、また、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはβ−カロテンの調製のためのそのような方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはβ−カロテン、又はカロテノイド混合物、好適にはβ−カロテン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【０００９】
更に、サブ配列（ａ）〜（ｄ）を含む上述のＤＮＡ配列又はそれを含むベクターと、アルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードする第二のＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列、又はアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列を含む第二のベクターとにより形質転換された細胞；並びに所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術で既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはエキネノンを調製する方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはエキネノン、又はカロテノイド混合物、好適にはエキネノン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法は、本発明の目的である。
【００１０】
更に、サブ配列（ａ）〜（ｄ）を含む上述のＤＮＡ配列及びアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列、及びそのようなＤＮＡ配列を含むベクターを、好適には発現ベクターの形態で提供することは、本発明の目的である。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターで形質転換された細胞、好適には、原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞も、また本発明の目的である。最後に、本発明はまた、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、特にエキネノン又はカンタキサンチンを製造する方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはエキネノン若しくはカンタキサンチン、又はカロテノイド混合物、好適にはエキネノン若しくはカンタキサンチン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【００１１】
更に、以下のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列は、本発明の目的である：
（ａ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のＧＧＰＰシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＥ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｂ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のプレフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＢ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｃ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のフィトエンデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＩ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｄ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のリコペンシクラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＹ）又は実質的に相同であるＤＮＡ配列；及び
（ｅ）フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＺ）又は実質的にその相同であるＤＮＡ配列。
【００１２】
また、そのようなＤＮＡ配列を含むベクターを、好適には発現ベクターの形で提供することは、本発明の目的である。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターにより形質転換された細胞、好適には原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞もまた、本発明の目的である。最後に、本発明はまた、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはゼアキサンチンを調製する方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはゼアキサンチン、又はカロテノイド混合物、好適にはゼアキサンチン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【００１３】
更に、サブ配列（ａ）〜（ｅ）と、更にアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列とを含む上述のＤＮＡ配列は、本発明の目的であり、そのようなＤＮＡを含むベクターを、好適には発現ベクターの形態で提供することは、本発明の目的である。更に、そのようなＤＮＡ配列又はベクターで形質転換された細胞、好適には原核細胞、更に好適にはE. coli 又はバチルス株である細胞を提供することは、本発明の目的である。真核細胞、好適には酵母細胞又は真菌細胞であるそのような形質転換された細胞も、また本発明の目的である。最後に、本発明は、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはゼアキサンチン、アドニキサンチン又はアスタキサンチンを製造する方法、及び食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはゼアキサンチン、アドニキサンチン若しくはアスタキサンチン、又はカロテノイド混合物、好適にはゼアキサンチン、アドニキサンチン若しくはアスタキサンチン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法に関する。
【００１４】
更に、サブ配列（ａ）〜（ｅ）を含む上述のＤＮＡ配列又はそのようなＤＮＡ配列を含むベクター、及びアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードする第二のＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列又はアルカリゲネス株ＰＣ−１のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列（ｃｒｔＷ）若しくは実質的に相同のＤＮＡ配列を含む第二のベクターにより形質転換された細胞は本発明の目的であり、所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を調製する方法であって、そのような細胞を、適切な培養条件下で培養し、そのような細胞又は培地から所望のカロテノイド又はカロテノイド混合物を単離し、そして単一のカロテノイドを所望する場合には、共存する可能性のある他のカロテノイド類から当技術での既知の方法によりそれを分離する方法、好適にはゼアキサンチン又はアドニキサンチンを製造する方法、並びに食料又は飼料配合物を調製する方法であって、そのような方法を実施した後に、そのカロテノイド、好適にはゼアキサンチン若しくはアドニキサンチン、又はカロテノイド混合物、好適にはゼアキサンチン若しくはアドニキサンチン含有混合物を食料又は飼料に添加することを特徴とする方法は、本発明の目的である。
【００１５】
この文脈において、「実質的に相同であるＤＮＡ配列」との表現は、ｃｒｔＥをコードするＤＮＡ配列に関して、フラボバクテリウム属ｓｐ．１５３４のｃｒｔＥのアミノ酸配列と比べた場合、４５％を越える、好適には６０％を越える、更に好適には７５％を越える、最も好適には９０％を越える同一のアミノ酸を示し、かつフラボバクテリウム属ｓｐ．１５３４のｃｒｔＥによりコードされる酵素と同一の型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を表す、と理解されるべきである。同様に、ｃｒｔＢに関して、これは、６０％を越える、好適には７０％を越える、更に好適には８０％を越える、最も好適には９０％を越えることを意味し；ｃｒｔＩに関して、これは、７０％を越える、好適には８０％を越える、最も好適には９０％を越えることを意味し；ｃｒｔＹに関して、これは、５５％を越える、好適には７０％を越える、更に好適には８０％を越える、最も好適には９０％を越えることを意味し；ｃｒｔＺに関して、これは、６０％を越える、好適には７０％を越える、更に好適には８０％を越える、最も好適には９０％を越えることを意味し；ｃｒｔＷに関して、これは、６０％を越える、好適には７０％を越える、更に好適には８０％を越える、最も好適には９０％を越えることを意味する。ｃｒｔＷに対して実質的に相同である配列は、例えばアグロバクテリウム・アウランチアカム又は緑藻のヘマトコッカス・プルビアリスのβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼ（ｂｋｔ）の形態で知られている。
【００１６】
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡの形態のＤＮＡ配列は、当技術で知られている方法〔例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press(1989)を参照されたい〕のように、又は実施例１、２若しくは７に具体的に記載されているようにして調製することができる。
【００１７】
このようなゲノムＤＮＡからの本発明のＤＮＡ配列のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。この方法の原理は、例えばＰＣＲ Protocols：A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.(1990) に概説されている。ＰＣＲは、異なるＤＮＡ配列の混合物から、決められた長さ及び配列の特定のＤＮＡを大量に調製するためのインビトロ法である。そのために、ＰＣＲは、この配列に特異的であり、かつ標的配列のその対の鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーに隣接する目的の特定のＤＮＡ断片の酵素的増幅に基づいている。このプライマーは、それらの３’末端が互いに向かうように方向づけられている。鋳型の熱変性、それらの相補配列に対するプライマーのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長のサイクルのくり返しにより、ＰＣＲプライマー間のセグメントの増幅がもたらされる。それぞれのプライマーの伸長生成物は、他方のための鋳型として働くことができるので、それぞれのサイクルにより、その前のサイクルで生成されたＤＮＡ断片の量が実質的に２倍になる。好熱性細菌、テルマス・アクアチカム（Thermus aquaticus)から単離された熱安定性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、それぞれの熱変性工程の後に酵素の添加を必要とするポリメラーゼの変性を避けることができる。この開発は、種々の簡便な温度サイクル装置によるＰＣＲの自動化をもたらした。更に、増幅反応の特異性は、プライマーのアニーリング及び伸長のために高い温度を使用することにより増進する。この増進した特異性は、酵素及びプライマーに対する非標的断片による競合を最小化することにより、増幅生成物の全収量を改善させる。この方法により、目的の特定の配列は、大量に増幅され、かつこの技術で既知の方法、例えばアガロースゲルでの分離により非特異的配列から容易に分離して、例えばHolten and Graham, Nucleic Acid Res. 19, 1156(1991), Kovalic et al., Nucleic Acid Res 19, 4560(1991), Marchuk et al., Nucleic Acid Res. 19, 1154(1991)又はMead et al., Bio/Technology 9, 657-663(1991)により記載されているようにベクターを用いる当技術で既知の方法によりクローン化することができる。
【００１８】
ＰＣＲ手順で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、当技術で既知であり、例えば Sambrook et al.（前掲）に記載されているようにして調製することができる。
【００１９】
次いで、増幅されたＤＮＡ配列は、当技術で既知の方法(Sambrook et al., 前掲）により又は実施例１及び２に詳細に記載されているようにしてＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。
【００２０】
本発明の完全なＤＮＡ配列が一度得られたならば、それらは、別の試料（供給源）からの実質的に相同のＤＮＡ配列のクローン化のための新しいＰＣＲプライマーを定義するための指針として用いることができる。更に、それら及びそのような相同のＤＮＡ配列は、適当な宿主系で、コードされたポリペプチドを発現又は過剰発現させるために、当技術での既知の方法により、例えば Sambrook et al.（前掲）に記載されているようにして、ベクターに挿入することができる。しかしながら、コードされたポリペプチドの過剰発現を得るために、このＤＮＡ配列それ自身を、本発明の適切な宿主系を形質転換するために用いることができることも、当業者に公知である。適当な宿主系は、例えば、E. coli のような細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)のようなバチルス、又はフラボバクター株である。用いることができるE. coli は、E. coli Ｋ１２株、例えばＭ１５〔Villarejo et al., J. Bacteriol. 120, 466-474(1974)によりＤＺ２９１として記載されている〕、ＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ  ３３６９４〕又はE. coli ＳＧ１３００９〔Gottesmann et al., J. Bacteriol. 148, 265-273(1981）〕である。適切な真核宿主系は、例えば、真菌、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)〔ＡＴＣＣ  ９１４２〕のようなアスペルギルス類、又は酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のようなサッカロマイセス類、又は、パストリス（pastoris）のようなピヒア（Pichia) 真菌であり、これらはすべてＡＴＣＣから入手できる。
【００２１】
E. coli での発現のために用いることができる適切なベクターは、例えば、 Sambrook et al.（前掲）又はFiers et al., Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium 〔Soc. Franc. de Microbiol., Paris (Durand et al., eds.), 680-697(1988) 〕又は Bujard et al., Methods in Enzymology, eds. Wu and Grossmann, Academic Press, Inc. Vol.155, 416-433(1987) 及びStueber et al., Immunological Methods, eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, Inc., Vol.IV, 121-152(1990) に述べられている。バチルスでの発現のために用いることができるベクターは、当技術で既知であり、例えば、ＥＰ４０５３７０、ＥＰ６３５５７２、 YansuraのProcd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439(1984)及びHenner, Meth. Enzym. 185, 199-228(1990) 又はＥＰ２０７４５９に記載されている。真菌での発現のために用いることができるベクターは、当技術で既知であり、例えばＥＰ４２０３５８に記載されており、そして酵母でのベクターは、ＥＰ１８３０７０、ＥＰ１８３０７１、ＥＰ２４８２２７、ＥＰ２６３３１１に記載されている。
【００２２】
そのようなＤＮＡ配列が、適切な媒体中で適当な宿主細胞で一度発現されたならば、そのカロテノイドは、当技術での既知の方法により、それらが媒体中に分泌される場合には媒体から、又は宿主微生物から、単離することができ、また、必要ならば、単一の特定のカロテノイドが所望の場合には、他のカロテノイドが存在する場合、それらから分離することができる（例えば、Carotenoids Vol.IA: Isolation and Analysis, G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander; Birkhaeuser Verlag, Basel(1995) を参照されたい）。
【００２３】
本発明のカロテノイドは、食品又は飼料を製造するための方法で用いることができる。当業者は、そのような方法に精通している。そのような複合の食品及び飼料は、添加剤、又はそのような目的で一般的に用いられ、かつ当技術の水準で知られている成分を、更に含むことができる。
【００２４】
以上に本発明を一般的に記述した後、以下の図及び実施例を、どのような内容においてもそれにより本発明を限定することなく、本発明の詳細を説明するために示す。
【００２５】
【実施例】
実施例１
用いた材料及び全般的方法
細菌株及びプラスミド：フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４ＷＴ株（ＡＴＣＣ  ２１５８８）を、クローニングする遺伝子のＤＮＡ源とした。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４ＷＴ株のＤＮＡの部分的ゲノムライブラリーを、ｐBluescriptII＋（ＫＳ）又は（ＳＫ）というベクター（Stratagene社、米国La Jolla市）で構築し、E. coli ＸＬ−１ブルー（blue）株（Stratagene社）又はＪＭ１０９株を形質転換した。
【００２６】
培地及び生育条件：形質転換したE. coli を、選択のため、１００μg/mlのアンピシリン（Ａｍｐ）を含むルリアブロス（ＬＢ）中で３７℃で増殖させた。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４ＷＴ株は、１％グルコース、１％トリプトン（Difco Laboratories社）、１％酵母エキス（Difco 社）、０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び３％ＮａＣｌを含有する培地中で、２７℃で増殖させた。
【００２７】
コロニーのスクリーニング：下記のプライマーを用い、基本的にはZon et al.が記載した方法〔Zon et al., BioTechniques 7, 696-698(1989)〕によるＰＣＲによって、E. coli 形質転換細胞のスクリーニングを実施した：
【００２８】
【表１】
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【００２９】
ゲノムＤＮＡ：フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の一晩培養物５０mlを、１０，０００Ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを溶菌緩衝液（５０mMＥＤＴＡ、０．１M ＮａＣｌ、pH７．５）１０mlで簡単に洗浄し、リゾチーム１０mgを添加した同じ緩衝液４mlに再懸濁させ、３７℃で１５分間インキュベートした。Ｎ−ラウリルサルコシン０．３ml（２０％）の添加後、３７℃でのインキュベーションを更に１５分間継続してから、フェノール、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムでＤＮＡを抽出した。０．３M 酢酸ナトリウム（pH５．２）の存在下、室温で２０分間ＤＮＡをエタノール沈澱した後、１０，０００Ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ（１０mMトリス、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）１mlに再懸濁させた。
【００３０】
サザンブロット解析及びクローニングの実験で用いた全てのゲノムＤＮＡは、コロジオンバッグ（Sartorius 社、ドイツ国）を用いて、Ｈ2 Ｏに対して４８時間透析し、０．３M 酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈澱し、Ｈ2 Ｏに再懸濁させた。
【００３１】
プローブの標識： Sambrook et al.（前掲）にしたがって、ランダムプライム法によって、（α−32Ｐ）ｄＧＴＰでＤＮＡプローブを標識した。
【００３２】
ミニライブラリーのスクリーニングに用いたプローブ：プローブ４６Ｆは、プライマー＃７及び＃８、ならびに鋳型としてフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって得られる１１９塩基対（bp）の断片である。このプローブは、他の種（例えばＥ・ウレドボーラ、Ｅ・ヘルビコーラ）のフィトエンシンターゼ遺伝子との有意な相同性を示すことから、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）遺伝子の断片であると提唱されている。「プローブＡ」は、クローン８５の挿入断片（インサート）の右腕に由来する１８４bpのＢｓｔＸＩ−ＰｓｔＩ断片である。「プローブＢ」は、クローン８５の挿入断片の左端から得られる３９７bpのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片である。「プローブＣ」は、クローン８５の挿入断片の右端からの５３６bpのＢｇｌII−ＰｓｔＩ断片である。「プローブＤ」は、クローン５９の挿入断片から単離される３７６bpのＫｐｎＩ−ＢｓｔＹＩ断片である。個々のプローブの位置を図６に示す。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの合成：ＰＣＲ反応又は配列決定に用いたオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems３９２というＤＮＡ合成装置で合成した。
【００３４】
サザンブロット解析：ハイブリダイゼーション実験のため、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡ（３μg)を適切な制限酵素で消化し、０．７５％アガロースゲル上で電気泳動した。Zeta−Probe ブロッティング膜（Bio-Rad 社）へのトランスファーは、記載のとおりに〔E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503(1975)〕実施した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ（画分Ｖ；Boehringer社）、０．５M Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH７．２中で６５℃で実施した。ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、室温で５分間で２回、そして０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、１５分間で２回、６５℃で膜を洗浄した。
【００３５】
ＤＮＡ配列解析：Sequenase Kit （United States Biochemical 社）を用い、ジデオキシ鎖終結法〔Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977) 〕によって、配列を決定した。両鎖とも完全に配列決定し、Genetics Computer 社によるＧＣＧ配列解析ソフトウエアパッケージ（バージョン８．０）を用いて、配列を解析した〔Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12, 387-395(1984)〕。
【００３６】
カロテノイドの分析：異なるプラスミド構築物を有するE. coli ＸＬ−１又はＪＭ１０９株の細胞（２００〜４００ml）を、振盪フラスコ内の１００μg/mlアンピシリンを添加したＬＢ中で、文中に示した時間、通常は２４〜６０時間、３７℃、２２０rpm で増殖させた。
【００３７】
回転ホモジナイザー（Polytron、Kinematica社、スイス国Luzern市）を用いて、微生物中に存在するカロテノイドを適量のアセトンで抽出した。ホモジネートを、吸引漏斗の焼結ガラスを通じて丸底フラスコへと濾過した。水流減圧を用いる５０℃の回転エバポレーターを用いて、濾液を蒸発させた。ゼアキサンチン検出のためには、残渣をｎ−ヘキサン／アセトン（８６：１４）に溶解してから、〔S. Weber，Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed ，H.E. Keller eds.，83-85(1988）〕に記載の順相ＨＰＬＣで分析した。β−カロテン及びリコペン検出のためには、蒸発させた抽出物をｎ−ヘキサン／アセトン（９９：１）に溶解し、〔Hengartner et al., Helv. Chim. Acta 75, 1848-1865(1992）〕に記載のＨＰＬＣによって分析した。
【００３８】
実施例２
フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のカロテノイド生合成遺伝子のクローニング
カロテノイド生合成経路の遺伝子を担持するＤＮＡ断片を同定かつ単離するため、ＤＮＡ断片４６Ｆ（方法を参照されたい）をプローブとして用いて、図２の異なる制限酵素で消化したフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の染色体ＤＮＡを担持するサザンブロットを調べた。プローブとハイブリダイズする２．４KbのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片が、出発点とするのに最も適切であると思われた。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡをＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで消化し、１％アガロースゲル上を泳動した。共に移動するＤＮＡマーカーにしたがい、約２．４Kbの領域をゲルから切り出し、ＤＮＡを単離した。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩミニライブラリーを、ｐBluescriptIIＳＫ（＋）のＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ部位で構築した。次いで、先に１１９bpの断片（４６Ｆ）を得るのに用いたのと同じプライマーである、プライマー＃７及びプライマー＃８を用いるＰＣＲで、E. coli ＸＬ１株の１００個の形質転換体をスクリーニングした。陽性の１つの形質転換細胞が見出され、クローン８５と名付けた。この挿入断片の配列決定から、エルウィニア属のヘルビコーラ及びウレドボーラの両種のフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）ばかりでなく、フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）にも相同である配列が明らかになった。プローブＡ及びプローブＢを用いた同じアプローチによって、クローン８５の左腕及び右腕のゲノム配列を得た。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡをＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII で二重消化し、プローブＡ及びプローブＢを用いたサザン解析に付した。プローブＡによって、約１．８KbのＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII 断片を同定し（図３Ａ）、単離し、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）のＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII 部位にサブクローニングした。プローブＡによるE. coli ＸＬ１株形質転換体のスクリーニングによって、６個の陽性のクローンを得た。これらの陽性クローンのうちの１つであるクローン４３−３の挿入断片を配列決定し、上記エルウィニア属の両種のｃｒｔＩ遺伝子のＮ末端とｃｒｔＹ遺伝子のＣ末端とに相同であることが示された。プローブＢによって、約９．２KbのＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII 断片を検出し（図３Ｂ）、単離し、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）にサブクローニングした。
【００３９】
形質転換体のスクリーニングによって、１つの陽性クローンであるクローン５１が得られた。この挿入断片の５’及び３’の配列決定によって、ＨｉｎｄIII 部位に近接する領域のみが、上記エルウィニア属の種のカロテノイド生合成の遺伝子（例えばｃｒｔＢ遺伝子及びｃｒｔＥ遺伝子）に対する適切な相同性を示すにすぎないことが明らかにされた。ＣｌａＩ部位周辺の配列は、カロテノイド生合成経路の公知の遺伝子との相同性を全く示さなかった。この情報に基づき、また、以後の配列決定及び構築の作業を容易にするために、クローン５１の４．２KbのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 断片をｐBluescriptIIＫＳ（＋）のそれぞれの部位にサブクローニングして、クローン２を得た。このクローンの挿入断片の配列決定によって、エルウィニア属ｓｐ．のｃｒｔＢ及びｃｒｔＥ遺伝子と相同である遺伝子の存在が確認された。これらの遺伝子は、ＨｉｎｄIII 部位から１．８Kb以内に位置していた。この挿入断片の残余の２．４Kbは、公知のカロテノイド生合成遺伝子とは全く相同性がなかった。
【００４０】
異なる制限酵素で消化したフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせるためにプローブＣを用いて、ＣｌａＩ部位の下流側のゲノム配列を更に検出した（図４を参照されたい）。
【００４１】
サザン解析によって同定された２．８KbのＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片を単離し、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）のＨｉｎｄIII ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。プローブＡによるE. coli ＸＬ１株形質転換体のスクリーニングによって、陽性の１クローンが得られ、クローン５９と名付けた。このクローンの挿入断片は、クローン４３−３の配列を確認し、他の公知のリコペンシクラーゼのｃｒｔＹ遺伝子のＮ末端と相同である配列をも含んでいた。推定される失われたｃｒｔＺ遺伝子を得るため、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のＳａｕ３ＡＩ部分消化ライブラリーを、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）のＢａｍＨＩ部位で構築した。プローブＤによるこのライブラリーのスクリーニングによって、いくつかの陽性クローンを得た。１つの形質転換体であるクローン６ａは、４．９Kbの挿入断片を有していた。この挿入断片の配列決定によって、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＹをコードしている既知配列に加えて、失われていたｃｒｔＺ遺伝子も明らかにされた。Ｒ１５３４株のＢｃｌＩ／ＳｐｈＩ断片を担持するミニライブラリーから、クローン７ｇを単離し（図５）、プローブＤでスクリーニングした。クローン７ｇの挿入断片の大きさは、約３Kbであった。
【００４２】
フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株ゲノムの約１４Kbを網羅する上記クローンの、独立した６系統の挿入断片を図６にまとめた。
【００４３】
ＢａｍＨＩ部位（第１位）から第８，６２５番塩基対までの決定済み配列を図７〜図３５に示す。
【００４４】
クローニングされたＲ１５３４株の配列の推定蛋白質コード領域
ＧＣＧパッケージのコドン選択（Codon Preference）プログラムは、与えられたコドン頻度表に対するコドンの用い方の類似により蛋白質コード領域を認識するものであり、これを用いたコンピュータ解析によって、推定される蛋白質をコードしている下記の８種類の開放読み枠（ＯＲＦ）が明らかにされた：４１，３８２Daより大きいポリペプチドをコードしている１〜１，１６５番の部分的ＯＲＦ（ＯＲＦ−５）；４０，０８１Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている１，１８０〜２，３５２番のＯＲＦ（ＯＲＦ−１）；３１，３３１Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている２，５２１〜３，４０５番のＯＲＦ（ｃｒｔＥ）；３２，６１５Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている４，３１６〜３，４０８番のＯＲＦ（ｃｒｔＢ）；５４，４１１Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている５，７９７〜４，３１６番のＯＲＦ（ｃｒｔＩ）；４２，３６８Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている６，９４２〜５，７９７番のＯＲＦ（ｃｒｔＹ）；１９，２８２Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている７，４４８〜６，９４２番のＯＲＦ（ｃｒｔＺ）；及び１９，３６８Daの分子量を有するポリペプチドをコードしている８，３１５〜７，７７０番のＯＲＦ（ＯＲＦ−１６）。ＯＲＦ−１とｃｒｔＥとは、互いに相反する転写方向を有する（図６）。
【００４５】
ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ及びｃｒｔＺのＯＲＦの翻訳開始部位は、シャイン・ダルガルノ（Ｓ／Ｄ）〔Shine and Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-1346(1974)〕のコンセンサス配列ＡＧＧ−−６〜９Ｎ−−ＡＴＧ（図３８）と相同である適切に位置する配列と、Ｅ・ヘルビコーラ及びＥ・ウレドボーラのそれぞれの酵素のＮ末端配列との相同性とに基づいて、明確に決定できた。ｃｒｔＢのＯＲＦの翻訳は、潜在的には、短い間隔をおいたＡＴＧ（４３１６）、ＡＴＧ（４２４１）及びＡＴＧ（４２１１）の３つのコドンから開始できる可能性がある。最初のものは、３コドンのうちで最良のＳ／Ｄ配列を有するわけではないが、Ｅ・ヘルビコーラ及びＥ・ウレドボーラのｃｒｔＢ蛋白質のＮ末端に対して最高の相同性を有する翻訳産物を与え、したがって、最も可能性の高い翻訳開始部位である。ｃｒｔＥのＯＲＦの翻訳は、潜在的には、１５０bpの内に見出される異なる５つの開始コドン、すなわちＡＴＧ（２３８９）、ＡＴＧ（２４４６）、ＡＴＧ（２４７３）、ＡＴＧ（２４９７）及びＡＴＧ（２５２１）から開始できる可能性がある。本発明者らは、下記の所見に基づいて、ＡＴＧ（２５２１）が、ｃｒｔＥの最も可能性の高い翻訳開始部位であると確信している：このＡＴＧ開始コドンには、言及した推定される５つの開始部位の全てのうちで最良のＳ／Ｄ配列が先行しており；コードされている蛋白質の推定Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｅ・ヘルビコーラ及びＥ・ウレドボーラのｃｒｔＥ酵素のＮ末端に対して最高の相同性を有する。
【００４６】
ｃｒｔの翻訳開始部位及び遺伝子産物の特徴
５個のカロテノイド生合成遺伝子の翻訳開始部位を下記に示し、可能なリボソーム結合部位に下線を施してある。遺伝子ｃｒｔＺ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＢは、非常に密接な一群になっているために、先行遺伝子のＴＧＡ終止コドンは、後続遺伝子のＡＴＧと重複している。５つの遺伝子のうち３個のみ（ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ及びｃｒｔＺ）が、最適Ｓ／Ｄ配列のコンセンサスに適合する。矩形で囲んだＴＧＡ配列は、先行遺伝子の終止コドンを示す。
【００４７】
【表２】
0004252632.tif 000003
【００４８】
フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の個々のｃｒｔ遺伝子のアミノ酸配列フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の、他種の公知のカロテノイド生合成遺伝子との相同性を有する５つのＯＲＦは全て、約５．２Kbの配列中にクラスターになっている（図７〜図３５）。
【００４９】
ＧＧＰＰシンターゼ（ｃｒｔＥ）
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥの遺伝子産物）のアミノ酸（ａａ）配列は、２９５ａａからなり、これを図３６に示す。この酵素は、ファルネシル（farnesyl）ピロリン酸とイソペンテニルピロリン酸とを１’−４で縮合する。
【００５０】
フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）
この酵素は、２つの酵素的段階を触媒する。第一に、２個のゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０）をＣ４０カロテノイドのプレフィトエンへと、頭対頭反応で縮合する。第二に、プレフィトエンのシクロプロピル環をフィトエンへと再配置する。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のｃｒｔＢ遺伝子によりコードされる３０３ａａを、図３７に示す。
【００５１】
フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）
図３８に示した４９４ａａからなる、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のフィトエンデサチュラーゼは、Ｅ・ヘルビコーラ及びＥ・ウレドボーラのｃｒｔＩ酵素のように、４段階の不飽和化を遂行して、無色のカロテノイドであるフィトエンを赤色のリコペンへと変換する。
【００５２】
リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）
フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のｃｒｔＹ遺伝子産物は、リコペンの両側にβ−イオノン環を導入して、β−カロテンを得るのに充分である。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のリコペンシクラーゼは、３８２ａａからなる（図３９）。
【００５３】
β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）
ｃｒｔＺの遺伝子産物は、１６９ａａからなり（図４０）、β−カロテンをヒドロキシル化して、キサントフィルであるゼアキサンチンを生じる。
【００５４】
ＯＲＦ（ｏｒｆ−１、ｏｒｆ−５及びｏｒｆ−１６）の推定される酵素機能
ｏｒｆ−１は、異なる生物（例えばカンジダ・トロピカリスCandida tropicalis、ヒト、ラット）のアセトアセチルＣｏＡチオラーゼに対してアミノ酸レベルで４０％を上回る同一性を有する。したがって、この遺伝子は、２分子のアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡへと縮合する推定アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ）の遺伝子である可能性が最も高い。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼによるアセトアセチルＣｏＡの、第三のアセチルＣｏＡとの縮合により、β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）が形成される。この化合物は、ステロールに加えて、多様な細胞性機能を有する数多くの種類のイソプレノイドも生成するメバロン酸経路の一部である。細菌及び植物では、イソプレノイド経路は、カロテノイド、成長調節剤（例えば、植物でのジベレリン類及びアブシジン酸）のようないくつかの独特の生成物や、フィトアレキシンのような二次代謝生成物を合成することも可能である〔Riou et al., Gene 148, 293-297(1994)〕。
【００５５】
ｏｒｆ−５は、異なるストレプトミセス属〔例えばＳ・ビオラセオルーベル（S. violaceoruber）、Ｓ・シンナモネンシス（S. cinnamonensis）〕のポリケチドシンターゼのアミノ酸配列に対して、約３０％という低い相同性を有する。抗生物質を合成するこれらの酵素（ポリケチドシンターゼ）は、二群に分類されている。Ｉ型ポリケチドシンターゼは、大型の多機能性蛋白質であり、これに対して、II型ポリケチドシンターゼは、ポリケチド合成の下位反応に関与するいくつかの個別蛋白質で構成される複数蛋白質の複合体である〔Bibb et al., Gene 142, 31-39(1994)〕。
【００５６】
ｏｒｆ−１６にコードされる推定蛋白質は、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica)の可溶性ヒドロゲナーゼのサブユニットと比較すると、アミノ酸レベルで４２％の同一性を有する。
【００５７】
カロテノイド生合成経路の酵素活性に対するＯＲＦ（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ及びｃｒｔＺ）の機能配分
フラボバクテリウム属ｓｐ．の遺伝子クラスターの欠失変異体で形質転換され、したがって、ｃｒｔ遺伝子の全てを発現してはいないE. coli の宿主株でのカロテノイドの蓄積を分析することによって、異なるＯＲＦの遺伝子産物の生化学的配分を明らかにした（図４１）。
【００５８】
異なる３種類のプラスミド、すなわちｐＬｙｃｏ、ｐ５９−２及びｐＺｅａ４を構築した。プラスミドｐ５９−２は、クローン２のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ断片をクローン５９のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングすることによって得た。ｐ５９−２は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＹ遺伝子のＯＲＦを担持しており、β−カロテンの産生を導くはずである。ｐＬｙｃｏは、ｃｒｔＹ遺伝子の約半分（Ｎ末端）をコードしているＫｐｎＩ／ＫｐｎＩ断片をｐ５９−２プラスミドから欠失させることによって得た。ｐＬｙｃｏで形質転換され、したがって、短縮された非機能的ｃｒｔＹ遺伝子を有するE. coli 細胞は、β−カロテンの前駆体であるリコペンを産生するはずである。ｐＺｅａ４は、ｐ５９−２の、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、及びｃｒｔＹの遺伝子の大半を含むＡｓｃＩ−ＳｐｅＩ断片と、クローン６ａの、ｃｒｔＹ遺伝子を完全にする配列及びｃｒｔＺ遺伝子を含むＡｓｃＩ／ＸｂａＩ断片とを連結することによって構築した。したがって、ｐＺｅａ４〔完全な配列については、図６７〜図７８を参照されたい；ヌクレオチド１〜６８３はｐBluescriptIIＫＳ（＋）を、ヌクレオチド６８４〜８，９６１はフラボバクテリウム属Ｒ１５３４ＷＴ株ゲノムを、ヌクレオチド８，９６２〜１１，２３３はｐBluescriptIIＫＳ（＋）を起原とする〕は、ゼアキサンチン生合成経路の５つのＯＲＦを全て有する。プラスミドｐＺｅａ４は、１９９５年５月２５日に、ＤＳＭ、すなわちドイツ微生物・細胞培養物収集会社（ドイツ国）に受託番号第ＤＳＭ−１００１２号のもとに寄託してある。したがって、この後者のプラスミドで形質転換したE. coli 細胞は、ゼアキサンチンを産生するはずである。産生されたカロテノイドを検出するため、形質転換体を振盪フラスコ中で４８時間増殖させ、次いで、方法の節に記載したとおりにカロテノイド分析に付した。図４１に、上記のプラスミドの異なる挿入断片、及び該細胞中に検出された主なカロテノイドを要約する。
【００５９】
予測されたとおり、ｐＬｙｃｏ担持E. coli 細胞はリコペンを産生し、ｐ５９−２を担持する細胞はβ−カロテン（all-E, 9-Z, 13-Z）を産生し、ｐＺｅａ４構築物を有する細胞はゼアキサンチンを産生した。このことは、ゼアキサンチン又はそれらの前駆体（フィトエン、リコペン及びβ−カロテン）の合成に必要なフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の全遺伝子が、クローニングされたことを確認する。
【００６０】
実施例３
カロテノイドを合成する酵素の発現に用いた材料及び方法
細菌株及びプラスミド：異なるE. coli 株、例えばＸＬ−１ブルー（Stratagene社）、ＴＧ１又はＪＭ１０９でのクローニングには、ベクターｐBluescriptIIＫＳ（＋）又は（−）（Stratagene社、米国La Jolla市）及びｐＵＣ１８〔Vieira and Messing, Gene 19, 259-268(1982); Norrander et al., Gene 26, 101-106(1983)〕を用いた。全てのB. subtilis の形質転換には、１０１２株を用いた。プラスミドｐＨＰ１３〔Haima et al., Mol. Gen. Genet. 209, 335-342(1987) 〕及びｐ６０２／２２〔S.F.J. LeGrice, Gene Expression Technology, D.V. Goeddel eds., 201-214(1990)〕は、B. subtilis 及びE. coli 細胞で複製できるグラム（＋）／（−）シャトルベクターである。プラスミドｐ２０５は、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングされたｖｅｇＩプロモーターを有する。プラスミドｐＸＩ１２は、B. subtilis での遺伝子の構成的発現のための組込みベクターである〔Haiker et al., 7th Int. Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, June 26-Jul. 1(1994), カナダ国ケベック州Montreal市(1994)〕。プラスミドｐＢＥＳＴ５０１〔Itaya et al., Nucleic Acids Res. 17, (11) 4410(1989)〕は、黄色ブドウ球菌（S. aureus)のプラスミドｐＵＢ１１０（GenBank 登録：第Ｍ１９４６５号）を起原とするネオマイシン耐性遺伝子カセットを有する〔McKenzie et al., Plasmid 15, 93-103(1986); McKenzie et al., Plasmid 17, 83-84(1987）〕。このネオマイシン遺伝子は、B. subtilis のゲノム中に単一コピーで存在する場合、選択マーカーとして働くことが示されている。プラスミドｐＣ１９４（ＡＴＣＣ  ３７０３４、GenBank 登録：第Ｌ０８８６０号）は、S. aureus を起原とし、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む〔Horinouchi and Weisblaum, J. Bacteriol. 150, 815-825(1982)〕。
【００６１】
培地及び生育条件：E. coli を、選択のため、１００μg/mlのアンピシリンを含むルリアブロス（ＬＢ）中で３７℃で増殖させた。B. subtilis 細胞は、エリスロマイシン（１μg/ml）、ネオマイシン（５〜１８０μg/ml）又はクロラムフェニコール（１０〜８０μg/ml）のいずれかを添加したＶＹ培地中で増殖させた。
【００６２】
形質転換：Bio-Rad 社（米国カリフォルニア州Hercules市）のGene-pulser という装置を下記のパラメータ（２００Ω、２５０μFD、２．５Ｖ）で用いる電気穿孔法によって、E. coli の形質転換を実施した。B. subtilis の形質転換は、基本的には、Cutting and Vander Horn, Molecular Biological Methods for Badillus, C.R. Harwood and S.M. Cutting eds., John Wiley & Sons,  英国Chichester市, 61-74(1990）に記載された標準操作法２．８番にしたがって実施した。
【００６３】
コロニーのスクリーニング：細菌コロニーのスクリーニングは、Zon et al.（前掲）によって記載されたとおりに実施した。
【００６４】
オリゴヌクレオチドの合成：ＰＣＲ反応又は配列決定に用いたオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems３９２というＤＮＡ合成装置で合成した。
【００６５】
ＰＣＲ反応：ＰＣＲ反応は、ＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus社）又はＰｆｕ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（New England Biolabs 社）のいずれかを用い、製造者の教示にしたがって実施した。代表的な５０μl でのＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡ  １００ng、それぞれ１０pMのプライマー、４種類全てのｄＮＴＰ（最終濃度３００μM)、ＭｇＣｌ2 （ＵｌＴｍａポリメラーゼを用いる場合、最終濃度２mM）、１×ＵｌＴｍａ反応緩衝液又は１×Ｐｆｕ緩衝液（製造者により供給）を含有した。ＤＮＡポリメラーゼ以外の全ての反応液の成分を９５℃で２分間インキュベートし、その後、それぞれの節（下記を参照されたい）に示したサイクルを実施した。全ての反応で、７２℃での伸長段階の際に、サイクルの一巡目にポリメラーゼを加えることによって、ホットスタートを実施した。ＰＣＲ反応の終点で、アリコートを１％アガロースゲル上で分析してから、フェノール／クロロホルムで１回抽出した。水相中の増幅した断片を、１／１０量の３M 酢酸ナトリウム液及び２容のエタノールで沈澱させた。１２，０００rpm で５分間の遠心分離の後、ペレットを適量（代表的には４０μl)のＨ2 Ｏに再懸濁させてから、所定の制限酵素による消化を実施した。消化後、混合物を１％の低融点アガロース上で分離した。期待された大きさのＰＣＲ生成物をアガロースから切り出し、断片が４００bpを上回る場合には、ガラスビーズ法（GENECLEAN KIT ：Bio 101 社、米国カリフォルニア州 Vista市）を用いて精製し、あるいは断片が４００bpより短かい場合には、Heery et al., TIBS 6, (6) 173(1990) にしたがって、ゲルから直接回収した。
【００６６】
遺伝子増幅及び部位特異的突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチド：異なるプラスミドの構築を可能にするために実施した全てのＰＣＲ反応を下記に示す。用いた全てのプライマーを図４２〜図４３に要約した。
プライマー＃１００及び＃１０１は、ＳｐｅＩ制限部位、及び人工リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を遺伝子の転写開始部位の上流に有する完全なｃｒｔＥ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応に用いた。増幅された断片の３’末端に、２個所の単独の制限部位、すなわちＡｖｒII及びＳｍａＩ部位を導入して、以後のクローニングの工程を容易にした。ＰＣＲ反応は、増幅のために下記の条件を用い、ＵｌＴｍａポリメラーゼを用いて実施した：９５℃、１分／６０℃、４５秒／７２℃、１分の方式で５サイクル；及び９５℃、１分／７２℃、１分の方式で２０サイクル。プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン２を鋳型ＤＮＡとして利用した。最終ＰＣＲ生成物をＳｐｅＩ及びＳｍａＩで消化し、GENEKLEAN KIT を用いて単離した。断片の大きさは約９１０bpであった。
【００６７】
プライマー＃１０４及び＃１０５は、翻訳開始点から、この遺伝子のコード配列中に位置するＳａｌＩ制限部位までのｃｒｔＺ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応に用いた。ｃｒｔＺ遺伝子の５’末端に、ＥｃｏＲＩ部位、合成ＲＢＳ及びＮｄｅＩ部位を導入した。ＰＣＲ条件は、上記のとおりであった。プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン６ａを鋳型ＤＮＡとして利用し、最終ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化した。約４８０bpの断片の単離は、GENEKLEAN KIT を用いて実施した。
【００６８】
プライマーＭＵＴ１及びＭＵＴ５は、完全なｃｒｔＹ遺伝子を増幅するのに用いた。５’末端に、ＳａｌＩ部位を含むｃｒｔＺ遺伝子の最後の２３ヌクレオチドが存在し、ｃｒｔＹ遺伝子の翻訳開始部位に先行する人工ＲＢＳがそれに続く。形成された人工ＲＢＳは、ＰｍｌＩ制限部位を含む。増幅された断片の３’末端は、ｃｒｔＩ遺伝子の２２ヌクレオチドを有し、ＭｕｎＩ制限部位を有する新たに形成された人工ＲＢＳがそれに先行する。ＰＣＲ反応に用いた条件は、上記のとおりであって、下記のサイクルを用いた：９５℃、４５秒／６０℃、４５秒／７２℃、７５秒を５サイクル、その後、９５℃、４５秒／６６℃、４５秒／７２℃、７５秒の方式で２２サイクル。プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４をＰｆｕ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの鋳型として利用した。１，２２５bpのＰＣＲ生成物を平滑にし、Sure-Clone Kit（Pharmacia 社）を用いて、製造者にしたがって、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。
【００６９】
プライマーＭＵＴ２及びＭＵＴ６は、完全なｃｒｔＩ遺伝子を増幅するのに用いた。５’末端に、ｃｒｔＹ遺伝子の最後の２３ヌクレオチドが存在し、ｃｒｔＩ遺伝子の翻訳開始部位に先行する人工ＲＢＳがそれに続く。形成された新たなＲＢＳは、ＭｕｎＩ制限部位を含む。増幅された断片の３’末端は、ＢａｍＨＩ制限部位を含むｃｒｔＢ遺伝子の上流に、人工ＲＢＳを有する。ＰＣＲ反応に用いた条件は、基本的には上記のとおりであって、下記のサイクルを含んだ：９５℃、３０秒／６０℃、３０秒／７２℃、７５秒を５サイクル、その後、９５℃、３０秒／６６℃、３０秒／７２℃、７５秒の方式で２５サイクル。プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４をＰｆｕ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの鋳型として利用した。その後のクローニング工程のために、１，５４１bpのＰＣＲ生成物をＭｕｎＩ及びＢａｍＨＩで消化した。
【００７０】
プライマーＭＵＴ３及びＣＡＲ１７は、ｃｒｔＢ遺伝子のＮ末端を増幅するのに用いた。５’末端に、ｃｒｔＩ遺伝子の最後の２８ヌクレオチドが存在し、ｃｒｔＢ遺伝子の翻訳開始部位に先行する人工ＲＢＳがそれに続く。この形成された新たなＲＢＳは、ＢａｍＨＩ制限部位を含む。ＰＣＲ−Ｆと名付けられた増幅された断片は、ｃｒｔＢ遺伝子のＮ末端に位置するＨｉｎｄIII 制限部位も有する。ＰＣＲ反応に用いた条件は、文中に別途記載したとおりであって、下記のサイクルを含んだ：９５℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２０秒を５サイクル、その後、９５℃、３０秒／６０℃、３０秒／７２℃、２０秒の方式で２５サイクル。プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４をＰｆｕ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの鋳型として利用した。約１６０bpのＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化した。
【００７１】
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチド：プライマーＣＡＴ３及びＣＡＴ４は、S. aureus で発見されたＲプラスミドであるｐＣ１９４（ＡＴＣＣ  ３７０３４）〔Horinouchi and Weisblum 、前掲〕のクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するのに用いた。ＰＣＲ反応に用いた条件は、前述のとおりであって、下記のサイクルを含んだ：９５℃、６０秒／５０℃、６０秒／７２℃、２分を５サイクル、その後、９５℃、６０秒／６０℃、６０秒／７２℃、２分の方式で２０サイクル。プラスミドｐＣ１９８をＰｆｕ  Ｖｅｎｔポリメラーゼの鋳型として利用した。約１，０５０bpのＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＡａｔIIで消化した。
【００７２】
リンカーを生成するのに用いたオリゴヌクレオチド：２種類の対応するプライマーそれぞれ９０ngをエッペンドルフ管に加えることによって、リンカーを得た。混合物を減圧乾燥器（Speed Vac)中で乾燥し、ペレットを１×連結緩衝液（Boehringer社、ドイツ国Mannheim市）に再懸濁した。溶液を５０℃で３分間インキュベートしてから、室温まで冷却して、プライマーを適正にハイブリダイズさせた。こうして、リンカーは、適切な部位に連結させる用意が整った。リンカーを生成するのに用いた全てのオリゴヌクレオチドを図４４に示す。
【００７３】
プライマーＣＳ１及びＣＳ２は、下記の制限部位、すなわちＨｉｎｄIII 、ＡｆｌII、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ、ＰｍｅＩ及びＥｃｏＲＩを有するリンカーを形成するのに用いた。
プライマーＭＵＴ７及びＭＵＴ８は、制限部位ＳａｌＩ、ＡｖｒII、ＰｍｌＩ、ＭｌｕＩ、ＭｕｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII を有するリンカーを形成するのに用いた。
プライマーＭＵＴ９及びＭＵＴ１０は、人工ＲＢＳをｃｒｔＹの上流に導入するのに用いた。
プライマーＭＵＴ１１及びＭＵＴ１２は、人工ＲＢＳをｃｒｔＥの上流に導入するのに用いた。
【００７４】
ＲＮＡの単離：〔Maes and Messens, Nucleic Acids Res. 20, (16) 4374(1992)〕が記載した方法にしたがって、対数増殖期のB. subtilis から総ＲＮＡを調製した。
【００７５】
ノーザンブロット解析：ハイブリダイゼーション実験のため、３０μg までのB. subtilis ＲＮＡを、１×ＭＯＰＳ及び０．６６M ホルムアルデヒド中の１％アガロースゲル上で電気泳動した。Zeta-Probeブロッティング膜（Bio-Rad 社）へのトランスファー、ＵＶ架橋結合、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、J.R.E. Farrell, RNA Methodologies, A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, Academic Press, 米国 San Diego市（1993）に別途記載のとおりに実施した。用いた洗浄条件は、６５℃で、２倍×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで２０分×２回の後、０．１％ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで２０分×１回であった。次いで、Phosphorimager（Molecular Dynamics社）を用いるか、又は、Kodak 社のＸ線フィルムでのオートラジオグラフィーによるかのいずれかによって、ノーザンブロットを解析した。
【００７６】
ゲノムＤＮＡの単離：〔１３〕によって記載された標準操作法第２．６番にしたがって、B. subtilis のゲノムＤＮＡを一晩培養物２５mlから単離した。
【００７７】
サザンブロット解析：ハイブリダイゼーション実験のため、B. subtilis のゲノムＤＮＡ（３μg)を、適切な制限酵素で消化し、０．７５％アガロースゲル上で電気泳動した。Zeta-Probeブロッティング膜（Bio-Rad 社）へのトランスファーは、記載（E.M. Southern 、前掲）のとおり実施した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ（画分Ｖ：Boehringer社）、０．５M Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH７．２中で６５℃で実施した。ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで室温で５分間を２回、及び０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間を２回、６５℃で膜を洗浄した。次いで、Phosphorimager（Molecular Dynamics社）を用いるか、又は、Kodak 社のＸ線フィルムでのオートラジオグラフィーによるかのいずれかによって、サザンブロットを解析した。
【００７８】
ＤＮＡ配列解析：配列は、Sequenase Kit バージョン１．０（United States Biochemical 社）を用い、ジデオキシ鎖終止法（Sanger et al. 、前掲）によって決定した。配列解析は、Genetics Computer 社によるＧＣＧ配列解析ソフトウエアパッケージ（バージョン８．０）（Devereux et al. 、前掲）を用いて実施した。
【００７９】
B. subtilis での遺伝子増幅：B. subtilis 形質転換体でＳＦＣＯのコピー数を増幅するため、１．５％グルコース、及び増殖可能な構造（結果及び考察を参照されたい）中に存在する抗生物質耐性遺伝子に応じて、０．０２mg/ml のクロラムフェニコール又はネオマイシンを添加したＶＹ培地１５mlに、単一コロニーを接種した。翌日、この培養物７５０μl を用いて、ｃａｔ耐性突然変異体に対しては６０、８０、１２０及び１５０μg/ml、又はネオマイシン耐性突然変異体に対しては１６０及び１８０μg/mlの抗生物質を添加した、１．５％グルコースを含有するＶＹ培地１３mlに接種した。培養物を一晩増殖させ、翌日、異なる希釈（１：２０、１：４００、１：８，０００、１：１６０，０００）の５０μl を、適切な抗生物質濃度を有するＶＹ寒天平板にプレーティングした。次いで、大きな単一コロニーを更に分析して、コピー数、及び産生されたカロテノイドの量を決定した。
【００８０】
カロテノイドの分析：E. coli 又はB. subtilis の形質転換体（２００〜４００ml）を、振盪フラスコ内の抗生物質を添加したそれぞれＬＢ培地又はＶＹ培地中で、文中に示した時間、通常は２４〜７２時間、３７℃、２２０rpm で増殖させた。
【００８１】
微生物が産生したカロテノイドを、回転ホモジナイザー（Polytron、Kinematica社、スイス国Luzern市）を用いて、適量のアセトンで抽出した。ホモジネートを、吸引漏斗の焼結ガラスを通じて丸底フラスコへと濾過した。水流減圧を用いる回転エバポレーターを用いて、５０℃で濾液を蒸発させた。ゼアキサンチンの検出のためには、残渣をｎ−ヘキサン／アセトン（８４：１４）に溶解してから、S. Weber（前掲）に記載のとおり、順相ＨＰＬＣで分析した。β−カロテン及びリコペンの検出のためには、蒸発させた抽出物をｎ−ヘキサン／アセトン（９９：１）に溶解し、Hengartner et al.(前掲）に記載のとおり、ＨＰＬＣで分析した。
【００８２】
実施例４
E. coli でのカロテノイド産生
フラボバクテリウム属ｓｐ．の遺伝子クラスターの欠失を有するプラスミドで形質転換され、そのためにいくつかのｃｒｔ遺伝子産物を欠くE. coli 宿主株でのカロテノイドの蓄積を分析することによって、フラボバクテリウム属ｓｐ．のカロテノイド生合成クラスターの異なる開放読み枠（ＯＲＦ）の遺伝子産物の生化学的配分を明らかにした。E. coli での同様の機能的検定法は、他の著者らによって記載されている〔Misawa et al.,  前掲; Perry et al., J. Bacteriol. 168, 607-612(1986); Hundle et al., Molecular and General Genetics 254, (4) 406-416(1994)〕。異なる３種類のプラスミドｐＬｙｃｏ、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２及びｐＺｅａ４を、３種類のゲノム単離体ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン２、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９及びｐＢIIＫＳ（＋）−クローン６ａから構築した（図４５〜図４６を参照されたい）。
【００８３】
プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２は、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン２のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ断片をｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングすることによって得た。得られたプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＹ遺伝子の完全なＯＲＦを担持しており、β−カロテンの産生を導くはずである。ｐＬｙｃｏは、ｃｒｔＹ遺伝子の約半分（Ｎ末端）をコードしているＫｐｎＩ／ＫｐｎＩ断片をプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２から欠失させることによって得た。ｐＬｙｃｏで形質転換され、したがって短縮された非機能的ｃｒｔＹ遺伝子を有するE. coli 細胞は、β−カロテンの前駆体であるリコペンを産生するはずである。ｐＺｅａ４は、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２の、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、及びｃｒｔＹの遺伝子の大半を含むＡｓｃＩ−ＳｐｅＩ断片と、クローン６ａの、上記の短縮ｃｒｔＹ遺伝子を完全にする配列及びｃｒｔＺ遺伝子を含むＡｓｃＩ／ＸｂａＩ断片とを連結することによって構築した。したがって、ｐＺｅａ４は、ゼアキサンチン生合成経路の５つのＯＲＦを全て有する。したがって、この後者のプラスミドで形質転換したE. coli 細胞は、ゼアキサンチンを産生するはずである。産生されたカロテノイドを検出するため、形質転換体を振盪フラスコ中で４３時間増殖させ、次いで、方法の節に記載したとおりにカロテノイド分析に付した。図４５〜図４６に、上記のプラスミドの構築を要約する。
【００８４】
予測されたとおり、ｐＬｙｃｏ担持E. coli 細胞はリコペンを産生し、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２を担持する細胞はβ−カロテン（all-E, 9-Z, 13-Z）を産生し、ｐＺｅａ４構築物を有する細胞はゼアキサンチンを産生した。このことは、本発明者らが、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株の、ゼアキサンチン又はそれらの前駆体（フィトエン、リコペン及びβ−カロテン）の合成に必要な全遺伝子をクローニングしたことを確認する。得られた産生レベルを第１表に示す。
【００８５】
【表３】
0004252632.tif 000004
【００８６】
第１表：振盪フラスコで４３時間培養後の、プラスミドｐＬｙｃｏ、ｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２及びｐＺｅａ４を担持するE. coli 形質転換体のカロテノイド含量。表示した値は、カロテノイド含量を、総乾燥細胞質量（２００ml）に対する％で示す。ＮＤ＝検出不能。
【００８７】
実施例５
B. subtilis でのカロテノイド産生
B. subtilis でカロテノイドを産生させる最初のアプローチでは、フラボバクテリウム属のカロテノイド生合成遺伝子を、ｐ６０２／２０の誘導体である、グラム（＋）／（−）シャトルベクターｐ６０２／２２（S.F.J. LeGrice et al. 、前掲）にクローニングした。最終構築物ｐ６０２−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅの組み立ては、ｐＺｅａ４（del ６５４〜３０２８）のＰｖｕII−ＡｖｒII断片、及びプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン６ａからのＡｖｒII−ＥｃｏＲＩ断片の、ベクターｐ６０２／２２のＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩ部位への三重連結で開始した。プラスミドｐＺｅａ４（del ６５４〜３０２８）は、ｐＺｅａ４をＳｃａＩ及びＥｓｐＩで消化することによって得てあった。突出及び陥入末端は、クレノウ酵素で平滑にし、再結合した。構築物ｐＺｅａ４（del ６５４〜３０２８）は、ｃｒｔＥ遺伝子の上流の配列の大半が欠失しているが、それらはカロテノイド生合成には必要とされない。プラスミドｐ６０２−ＣＡＲは、５個のカロテノイド遺伝子の全て（約４．９Kb）に加えて、ｃｒｔＺの翻訳開始部位の上流に位置する１．２Kbの追加的ゲノムＤＮＡ、及びｃｒｔＥの翻訳開始部位の上流に位置する２００bpを更に含む、フラボバクテリウム属Ｒ１５３４株の約６．７KbのゲノムＤＮＡを有する。ｃｒｔＺ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＢ遺伝子を、B. subtilis で機能する、ｌａｃオペレーター要素に融合した調節可能なE. coli バクテリオファージＴ５のプロモーター誘導体である、ＰN25/0 プロモーター（S.F.J. LeGrice、前掲）の下流にクローニングした。ｐ６０２ＣＡＲ構築物では、ＰN25/0 プロモーターとｃｒｔＺの転写開始部位との１，２００bpを超える距離は、最適でないことが明白であり、その後の段階で改良されることになる。ｐ６０２ＣＡＲの構築の概略を図４７〜図４８に示す。B. subtilis でのｃｒｔＥ遺伝子の転写を確実にするため、ｖｅｇＩプロモーター〔Moran et al., Mol. Gen. Genet. 186, 339-346(1982); LeGrice et al., Mol. Gen. Genet. 204, 229-236(1986)〕をこの遺伝子の上流に導入して、プラスミド構築物ｐ６０２−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅを得た。ｖｅｇＩプロモーターは、LeGrice et al.（前掲）が記載したｖｅｇプロモーター複合体の部位Ｉに由来し、E. coli で機能することが示されている（Moran et al.、前掲）。この新規構築物を得るため、プラスミドｐ６０２ＣＡＲをＳａｌＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、完全なｃｒｔＥ遺伝子、及びｃｒｔＢコード配列の大半を含む断片を、プラスミドｐ２０５のＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII 部位にサブクローニングした。得られたプラスミドｐ２０５ＣＡＲは、ＰｖｅｇＩプロモーターのすぐ下流にｃｒｔＥ遺伝子を有する。フラボバクテリウム属ｓｐ．のカロテノイド遺伝子クラスターを再構成するため、下記の３片、すなわちｐ２０５ＣＡＲのＰｍｅＩ／ＨｉｎｄIII 断片、ｐ６０２ＣＡＲのＨｉｎｃII／ＸｂａＩ断片及びＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 断片を単離し、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位に結合して、構築物ｐＢIIＫＳ（＋）−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅを得た。この後者のプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の単離、ならびにｐ６０２／２２のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位への連結から、ｐ６０２ＣＡＲに似てはいるが、ＰｖｅｇＩプロモーターに支配されるｃｒｔＥ遺伝子を有する���ラスミドが得られる。プラスミドｐ６０２−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅを得るための全ての構築工程の概略を、図４９〜図５０に示す。このプラスミドで形質転換したE. coli ＴＧ１細胞は、ゼアキサンチンを合成した。対照的に、同じ構築物で形質転換したB. subtilis １０１２株は、いかなるカロテノイドも産生しなかった。何種類かのゼアキサンチン陰性のB. subtilis 形質転換体の分析から、形質転換されたプラスミドは、重大な欠失を生じていたことが常に明らかにされた。この不安定性は、構築物の巨大な大きさに起因する可能性がある。
【００８８】
B. subtilis で安定な構築物を得るために、カロテノイド遺伝子を、Haima et al.（前掲）が構築したグラム（＋）／（−）シャトルベクターｐＨＰ１３にクローニングした。安定性の問題は、（１）カロテノイド遺伝子を担持するクローニングされた挿入断片の大きさを減らすこと、及び（２）ｃｒｔＥ遺伝子の配向を逆転させ、こうして、これまでの構築物のように、５つの遺伝子全ての発現に、２つでなく１つのプロモーターを必要とするのみとさせること、によって解消されると考えられた。更に、合成フラボバクテリウム属カロテノイドオペロン（ＳＦＣＯ）を担持するそのようなプラスミドによって形質転換された細胞がカロテノイドを産生できる能力は、モジュールによるアプローチが実行可能か否かという疑問に答えるものと思われた。図５１〜図５２に、最終構築物ｐＨＰ１３−２ＰＮＺＹＩＢ−ＥＩＮＶを得るために実施される、全ての構築工程及び中間プラスミドを要約する。
【００８９】
略述すると、その後の構築を容易にするために、プライマーＣＳ１及びＣＳ２を用いて得られた合成リンカーをシャトルベクターｐＨＰ１３のＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ部位間に導入することによって、ベクターｐＨＰ１３−２を作成した。中間構築物ｐＨＰ１３−２ＣＡＲＶＥＧ−Ｅは、ｐ６０２−ＣＡＲＶＥＧ−ＥのＡｆｌII−ＸｂａＩ断片をｐＨＰ１３−２のＡｆｌII及びＸｂａＩ部位にサブクローニングすることによって構築した。次の工程は、本来のｃｒｔＥ遺伝子を有するＸｂａＩ及びＡｖｒII断片を除去し、それをプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＰＣＲＲＢＳｃｒｔＥのＸｂａＩ−ＡｖｒII断片で置き換えることによる、ｃｒｔＥの転置にあった。得られたプラスミドをｐＨＰ１３−２ＣＡＲＺＹＩＢ−ＥＩＮＶと名付けたが、これは、機能的ＳＦＣＯを有する最初の構築物を表すものであった。上記の中間構築物ｐＢIIＫＳ（＋）−ＰＣＲＲＢＳｃｒｔＥは、プライマー１００番及び１０１番で生成されたＰＣＲ産物をＳｐｅＩ及びＳｍａＩで消化し、ｐBluescriptIIＫＳ（＋）のＳｐｅＩ及びＳｍａＩ部位に連結することによって得た。ｃｒｔＺ翻訳開始点をプロモーターＰN25/0 に近付けるため、ｐＨＰ１３−２ＣＡＲＺＹＩＢ−ＥＩＮＶのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（５個のカロテノイド遺伝子のうち４個を有する）、同じプラスミドの、ＰN25/0 プロモーターを有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片、及びｐＢIIＫＳ（＋）−ＰＣＲＲＢＳｃｒｔＺの、合成ＲＢＳに先行されるｃｒｔＺの大半を有するＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片による三重連結を実施した。上記プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＰＣＲＲＢＳｃｒｔＺは、プライマー１０４番及び１０５番で増幅したＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐBluescriptIIＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位に連結することによって得た。得られたベクターｐＨＰ１３−２ＰＮ２５ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶでは、ＳＦＣＯはバクテリオファージＴ５のプロモーターＰN25/0 によって支配されるが、それは、該構築物に機能的ｌａｃレプレッサーが存在しないために、構成的に発現されるはずである〔Peschke and Beuk, J. Mol. Biol. 186, 547-555(1985)〕。この構築物で形質転換されたE. coli ＴＧ１細胞は、ゼアキサンチンを産生した。ところが、このプラスミドでB. subtilis を形質転換した場合、カロテノイド産生を全く検出できなかった。これらの形質転換体のプラスミドの解析は、前述のプラスミドでなされた観察と同様に、不安定性の問題を指し示す重大な欠失を示した。
【００９０】
実施例６
染色体組込み構築物
これまでの構築物で観察された不安定性のため、組込み／発現ベクターｐＸＩ１２を用いて、フラボバクテリウム属ｓｐ．のカロテノイド生合成遺伝子をB. subtilis のゲノム内に組み込むことにした。このベクターは、B. subtilis ゲノムのレバン−スクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）への組込み後に、全オペロンの構成的発現を可能にする。この構成的発現は、ｖｅｇＩプロモーターによって支配され、中程度のレベルの発現を生じる。
【００９１】
合成フラボバクテリウム属カロテノイドオペロン（ＳＦＣＯ）を有するプラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４を、下記のとおりに構築した：ｐＢIIＳＫ（＋）−ＰＣＲＲＢＳｃｒｔＺのＮｄｅＩ−ＨｉｎｃII断片をｐＸＩ１２のＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位にクローニングし、得られたプラスミドをｐＸＩ１２−ＰＣＲｃｒｔＺと名付けた。次の工程では、ｐＨＰ１３−２ＰＮ２５ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶのＢｓｔＥII−ＰｍｅＩ断片を、ｐＸＩ１２−ＰＣＲｃｒｔＺのＢｓｔＥII−ＰｍｅＩ断片に連結した（図５３〜図６０を参照されたい）。
【００９２】
得られた構築物ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４で形質転換したB. subtilis は、キャンベル型反応又は相互的組換えのいずれかによって、ＣＡＲ遺伝子を組み込むことができる。レバン−スクラーゼ遺伝子へのカロテノイド生合成遺伝子の相互的組換えを有する１つの形質転換体、すなわちＢＳ１０１２：：ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４を、更に解析した（図６１〜図６２）。この株は、カロテノイドは合成しないが、ノーザンブロットによるＲＮＡ分析は、プローブＡとハイブリダイゼーションした場合、５．４Kb及び４．２Kbの特異的な多シストロン性ｍＲＮＡの存在を示した（図６１〜図６２、パネルＢを参照されたい）。大きい方のｍＲＮＡが、予測されたメッセージサイズを有するのに対し、短い方のｍＲＮＡの由来は不明であった。プローブＢとの同じノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、大きい方のｍＲＮＡ断片のみを検出したにすぎず、ｃｒｔＢ遺伝子の末端での転写の未成熟な終結を示した。この位置での終結シグナルの存在は、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株ゲノムでの本来のオペロン構成では、ｃｒｔＥ及びｃｒｔＢ遺伝子が互いに向かい合っていることから、意味をなすものと考えられた。この配置によれば、ｃｒｔＢの５’末端の転写終結シグナルは、ｃｒｔＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に干渉し得るアンチセンスＲＮＡの合成を避けるためには、意味をなすものと考えられた。この領域は、野生型の状況に対して著しく変化しているため、このターミネーターを構成する配列も変化していて、「漏出性（不完全）」ターミネーターを形成している可能性がある。カロテノイド経路の異なるｃｒｔ酵素に対する抗血清を用いたウエスタンブロット解析は、リボソーム結合部位がカロテノイド合成の欠如の原因であり得る可能性を示した。導入された５つの遺伝子のうち、ｃｒｔＺの産物であるβ−カロテンヒドロキシラーゼのみが、検出可能であった。これは、B. subtilis で機能することが公知であるｐＸＩ１２ベクター由来のＲＢＳ部位より後方にある唯一の遺伝子である。
【００９３】
ｍＲＮＡのシャイン−ダルガルノ配列（Shine and Dalgarno、前掲）と、リボソームが適正な開始部位を選ぶのを可能にする１６ＳｒＲＮＡとのbp形成相互作用は、McLaughlin et al., J. Biol. Chem. 256, 11283-11291(1981)によって、グラム陽性生物（B. subtilis)での方がグラム陰性生物（E. coli ）でよりはるかに安定であると提唱されている。高度に安定である複合体を得るため、グラム陰性のフラボバクテリウム属ｓｐ．の、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ及びｃｒｔＥの各々に先行するＲＢＳ部位を、B. subtilis １６ＳｒＲＮＡの３’末端と相補的なように設計した合成ＲＢＳと交換した（第２表を参照されたい）。この交換は、B. subtilis で異なるカロテノイド遺伝子の効果的な翻訳開始を可能にするはずであった。この、変化した４部位を全て有するｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２Ｃを構築するのに選んだ戦略を、図５３〜図６０に要約する。ｐBluescriptIIＫＳ（＋）での以後のクローニング工程を容易にするため、プライマーＭＵＴ７及びＭＵＴ８で得られ、該ベクターのＳａｌＩ部位とＨｉｎｄIII 部位との間にクローニングされたリンカーを用いて、追加的な制限部位を導入した。得られた新規構築物ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８は、下記の制限部位：ＡｖｒII、ＰｍｌＩ、ＭｕｌＩ、ＭｕｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩが導入されている。
【００９４】
異なるカロテノイド遺伝子の上流に合成ＲＢＳを形成するのに選んだ全体的アプローチは、ＰＣＲに基づく突然変異誘発の組合せを用いて実施した。これは、改変されたＲＢＳ部位を担持する規定されたプライマーを用いるか、又はそのような配列を有する合成リンカーを用いて、遺伝子を再構築するものであった。ｃｒｔＩ及びｃｒｔＢ遺伝子に先行するＲＢＳの再構成は、変化させた適切なＲＢＳ部位を含むプライマーＭＵＴ２及びＭＵＴ６でｃｒｔＩ遺伝子を増幅することによって、実施した。得られたＰＣＲ−Ｉ断片を、ＭｕｎＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８のＭｕｎＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結した。得られた中間構築物をｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＩと名付けた。ｃｒｔＢ遺伝子に先行するＲＢＳの再構成は、変化させたＲＢＳ部位をｃｒｔＢの上流に担持するプライマーＭＵＴ３、及びプライマーＣＡＲ１７で得られた小さなＰＣＲ断片を用いて実施した。増幅したＰＣＲ−Ｆ断片を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII 部位にサブクローニングして、構築物ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦを得た。
【００９５】
ＢａｍＨＩ及びＳａｐＩで、ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＩからＰＣＲ−Ｉ断片を切り出し、ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦのＢａｍＨＩ及びＳａｐＩ部位に連結した。得られたプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦＩは、ＰＣＲＩ断片がＰＣＲ−Ｆ断片に融合している。この構築物をＳａｌＩ及びＰｍｌＩで切断し、プライマーＭＵＴ９及びＭＵＴ１０のアニーリングによって得られた合成リンカーを導入した。この後者の工程は、やがて行なう上記構築物中の本来のフラボバクテリアＲＢＳの置き換えを容易にするために実施した。得られたプラスミドをｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦＩＡと名付けた。
【００９６】
ｃｒｔＹ及びｃｒｔＩに先行する合成ＲＢＣの組立ては、プライマーＭＵＴ１及びＭＵＴ５を用い、ＰＣＲによって実施した。増幅した断片ＰＣＲ−Ｇを平滑端にしてから、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングして、構築物ｐＵＣ１８−ＰＣＲ−Ｇを得た。次の工程は、ＰＣＲ−ＡとＰＣＲ−Ｉとの断片間へのＰＣＲ−Ｇ断片のクローニングであった。この目的のために、ＭｕｎＩ及びＰｍｌＩで消化することによって、ｐＵＣ１８−ＰＣＲ−ＧからＰＣＲ−Ｇを単離し、ｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦＩＡのＭｕｎＩ及びＰｍｌＩ部位に連結した。この構築物は、互いに隣接して組み立てられ、４つの人工ＲＢＳ部位のうち３つ（ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＢ）を含む、ＰＣＲ−Ｆ、ＰＣＲ−Ｉ、ＰＣＲ−Ｇ及びＰＣＲ−Ａの４つの断片を全て有する。遺伝子ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＢに先行するフラボバクテリウム属ＲＢＳの、合成のそれらとの交換は、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ断片をプラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＬＩＮＫＥＲ７８ＰＣＲＦＩＧＡのＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ断片で置き換えることによって、実施した。次いで、得られたプラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳＣで、E. coli ＴＧ１細胞及びB. subtilis １０１２株を形質転換した。これらの細胞によるゼアキサンチンの産生から、ＰＣＲで増幅した遺伝子が機能的であることが確認された。得られたB. subtilis 株を、ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯ１と名付けた。
【００９７】
交換すべき最後のフラボバクテリウム属ＲＢＳは、ｃｒｔＥ遺伝子に先行するそれであった。これは、プライマーＭＵＴ１１及びＭＵＴ１２を用いて得られたリンカーを用いて実施した。ＮｄｅＩ及びＳｐｅＩで、ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳから野生型ＲＢＳを除去し、上記のリンカーを挿入した。構築物ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２Ｃでは、全てのフラボバクテリウム属ＲＢＳが、コンセンサス配列ＡＡＡＧＧＡＧＧ−７〜８Ｎ−ＡＴＧという合成ＲＢＳで置き換えられている（第２表を参照されたい）。この構築物で形質転換されたE. coli ＴＧ１細胞は、この最後のＲＢＳ置換も、ゼアキサンチンを産生する能力に干渉していなかったことを示した。
【００９８】
【表４】
0004252632.tif 000005
【００９９】
第２表：構築物ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２Ｃ、ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴ及びｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯ中の合成リボソーム結合部位のヌクレオチド配列。B. subtilis の１６ＳｒＲＮＡの３’末端に相補的な個々のカロテノイド遺伝子に先行するシャイン−ダルガルノ配列のヌクレオチドを太字で示す。E. coli の１６ＳｒＲＮＡの３’末端も、比較のために示す。下線を施したＡＵＧは、言及した遺伝子の翻訳開部位である。
【０１００】
新たに導入された合成ＲＢＳを含む全ての領域を配列決定によって確認した。B. subtilis 細胞をプラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２で形質転換し、相互的組換えによってＳＦＣＯが染色体のレバン−スクラーゼ遺伝子に組み込まれている１つの形質転換体を選んだ。この菌株をＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯ２と名付けた。この菌株のカロテノイド産生の分析は、産生されたゼアキサンチンの量が、B. subtilis 形質転換体を得るのに用いたプラスミドで形質転換したE. coli 細胞が産生したゼアキサンチンの約４０％であることを示した。ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯ１株を、それと対応するE. coli 株と比較したときの所見（３０％）も同様であった。E. coli 細胞は、１８倍も多くのカロテノイド遺伝子を有するのに、カロテノイド産生はわずか２〜３倍高いにすぎない。ｐＺｅａ４構築物を約２００コピー担持するE. coli 細胞と、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２Ｃを１８コピーで担持するE. coli 細胞との間で観察されたカロテノイド含量の差は、より顕著であった。第一の形質転換体は、後者より４８倍も多量のゼアキサンチンを産生した。認められたこの差は、これらの形質転換細胞に存在する、ほぼ１１倍多いカロテノイド生合成遺伝子にのみ帰すことはできない。この差には、おそらく、合成ＲＢＣを導入するために野生型フラボバクテリウム属オペロンの重複している遺伝子が分離されている、新たに構築されたＳＦＣＯの最適に達しない性能も寄与している。これが、再建された合成オペロンの、より低い翻訳効率（例えば、野生型オペロンに存在する、推定される翻訳対合効果の除去による）を招いた可能性がある。
【０１０１】
カロテノイド産生を高めるため、２種類の新規構築物、すなわちｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯ及びｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴを作成した。これらは、染色体のレバン−スクロース部位へのＳＦＣＯの組込み後に、Janniere et al., Gene 40, 47-55(1985) に記載されたような増幅可能な構造を有する菌株を生じる。プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯは、１９９５年５月２５日付けで、ＤＳＭ−ドイツ微生物・細胞培養物収集会社（ドイツ国）に、受託番号第ＤＳＭ１００１３号の下に寄託されている。そのような増幅可能な構造は、耐性マーカー（例えばクロラムフェニコール、ネオマイシン、テトラサイクリン）と連関すると、１染色体あたり２０〜５０コピーへと増幅できる。増幅可能な構造は、ｓａｃ−Ｂ３’遺伝子の同方向反復に接している、ＳＦＣＯ、耐性遺伝子及びｐＸＩ１２配列からなる（図６３を参照されたい）。増加した数のＳＦＣＯを有する新規菌株は、こうして、抗生物質に対する上昇したレベルの耐性を有する形質転換体を選択することによって、得ることができる。
【０１０２】
プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯを構築するため、ネオマイシン耐性遺伝子を、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩでプラスミドｐＢＥＳＴ５０１から単離し、ｐＵＣ１８ベクターのＰｓｔＩ及びＥｃｏＯ１０９１部位にサブクローニングした。得られた構築物をｐＵＣ１８−Ｎｅｏと名付けた。最終構築物を得るため、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣのＰｍｅＩ−ＡａｔII断片を、ｐＵＣ１８−Ｎｅｏのネオマイシン耐性遺伝子を有するＳｍａＩ−ＡａｔII断片で置き換えた。
【０１０３】
プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴは、下記のとおりにして得た：ｃａｔ３及びｃａｔ４のプライマー対を用いて、ＰＣＲによってｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子を単離した。断片を、ＥｃｏＲＩ及びＡａｔIIで消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ及びＡａｔII部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ＣＡＴと名付けた。最終ベクターは、ｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣのＰｍｅＩ−ＡａｔII断片を、ｐＵＣ１８−ＣＡＴのクロラムフェニコール耐性遺伝子を担持するＥｃｏＲＩ−ＡａｔII断片で置き換えることによって得た。図６４〜図６６に、上記構築物を得るための異なる工程を要約する。
【０１０４】
両プラスミドを用いて、B. subtilis １０１２株を形質転換し、キャンベル型組込みにより得られた形質転換体を選択した。以後の増殖のため、ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯＮＥＯ１及びＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯＣＡＴ１の２菌株を選んだ。両株の個々のコロニーを、方法の節に記載したとおりに、異なる濃度の抗生物質中で増殖させることによって、独立に増殖させた。ｃａｔ遺伝子担持株については、クロラムフェニコールの濃度は、６０、８０、１２０及び１５０μg/mlであった。ｎｅｏ遺伝子担持株については、ネオマイシンの濃度は、１６０及び１８０μg/mlであった。いずれの菌株でも、ＳＦＣＯを小規模に増幅する菌株のみが得られたにすぎない。ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯＮＥＯ１株から発生した娘株では、より高いネオマイシン濃度に対する耐性は、染色体中のＳＦＣＯの数の増加、及びこれらの細胞が産生する、より高レベルのカロテノイドと相関した。ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯＣＡＴ１株から得られた娘株では、異なる結果が得られた。これらの菌株では、予測されたとおり、１５０μg/mlまでのクロラムフェニコールの増加が、染色体中のより多数のＳＦＣＯコピーをもたらした。
【０１０５】
実施例７
ｃｒｔＷ含有プラスミドの構築、及びカロテノイド産生への利用
ポリメラーゼ連鎖反応に基づく遺伝子合成：アルカリゲネスＰＣ−１株のβ−カロテンβ４−オキシゲナーゼをコードしている人工ｃｒｔＷ遺伝子のヌクレオチド配列を、ＧＣＧウィスコンシン配列解析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package)、バージョン８．０（Genetics Computer Group 社、米国ウィスコンシン州 Madison市）のBackTranslate プログラム、及びE. coli のコドン頻度参照表（Bach Translate Program社により供給）を用い、Misawa（1995）に概説されたアミノ酸配列を復帰翻訳することによって得た。Ye（1992）が記載した方法に基本的にしたがって、７２６ヌクレオチドからなる合成遺伝子を構築した。合成に必要な１２オリゴヌクレオチド（ｃｒｔＷ１〜ｃｒｔＷ１２）の配列を図７９に示す。略述すると、オリゴヌクレオチドの伸長のためのプライマーとして働く１５〜２０塩基の短い重複を有するように、長いオリゴヌクレオチドを設計した。４サイクルの後には、数コピーの完全な長さの遺伝子が存在するはずであり、次いで、これを、２個の末端オリゴヌクレオチドであるｃｒｔＷ１５及びｃｒｔＷ２６を用いて増幅した。これらの短い２つのオリゴヌクレオチドに関する配列は、フォワードプライマーｃｒｔＷ１５（5'-TATATCTAGAcatatgTCCGGTCGTAAA  CCGG-3'）及びリバースプライマーｃｒｔＷ２６（5'-TATAgaattccacgtgTCA  AGCACGACCACCGGTTTTACG-3'）に関するものであって、ここで、ＤＮＡ鋳型に合致する配列には下線を施してある。小文字は、のちのｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２発現ベクターへのクローニングのために導入した制限部位を示す（フォワードプライマーについてはＮｄｅＩ、リバースプライマーについてはＥｃｏＲＩ及びＰｍｌＩ）。
【０１０６】
ポリメラーゼ連鎖反応：長い１２オリゴヌクレオチドの全て（ｃｒｔＷ１〜ｃｒｔＷ１２、各７nM）及び両端のプライマー（ｃｒｔＷ１５及びｃｒｔＷ２６、各０．１mM）を混合し、Expand（商品名）High Fidelity ポリメラーゼ（Boehringer社、Mannheim市）（３．５単位）及びｄＮＴＰ（各１００mM）を含有するＰＣＲ反応混合物に加えた。下記の方式で、ＰＣＲ反応を３０サイクル実施した：９４℃で１分、５０℃で２分及び７２℃で３分。ＰＣＲ反応物を１％アガロースゲル上で分離し、約７００bpのバンドを切り出して、ガラスビーズ法を用いて（Geneclean Kit 、Bio101社、米国カリフォルニア州 Vista市）精製した。次いで、Sure-Clone Kit（Pharmacia 社、スエーデン国 Uppsala市）を用いて、断片をプラスミドｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。得られたｃｒｔＷ合成遺伝子の配列は、Sequenase Kit 、バージョン１．０（United States Biochemical 社、米国オハイオ州 Cleveland市）を用いた配列決定によって確認した。この方法によって構築したｃｒｔＷ遺伝子は、些細な誤りを有することが判明し、次いで、部位特異的突然変異誘発によってこれを修正した。
【０１０７】
プラスミドの構築：プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅ（実施例５も参照されたい）（図８０）は、B. subtilis ｖｅｇプロモーター〔LeGrice(1986）、８０６番〕の部位Ｉを担持する改変されたｐBluescriptIIＫＳ（＋）ベクター（Stratagene社、米国La Jolla市）にクローニングされた、グラム（−）細菌であるフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４ＷＴ株（ＡＴＣＣ第２１５８８号）〔Pasamontes(1995)、７３２番〕のカロテノイド生合成遺伝子（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＺ）を有する。この構成的プロモーターは、E. coli で機能することが示されている。プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅを担持するE. coli ＴＧ１株の形質転換体は、ゼアキサンチンを合成する。合成ｃｒｔＷ遺伝子のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片を、プラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２（Promega 社、米国ウィスコンシン州 Madison市）の対応する部位にクローニングすることによって、プラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷを構築した。プラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２は、ｐ１５ａという複製起点を有する低コピープラスミドであって、それが同じ宿主中でＣｏｌＥ１ベクターと共に維持されるのを可能にする。ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷのＨｉｎｄIII −ＰｍｌＩ断片を、ＨｉｎｄIII 、及び、〔Sambrook(1989)、５０５番〕に別途記載されたとおり、クレノウ酵素での充てん反応によって平滑端にしたＭｌｕＩ部位にクローニングすることによって、プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷ（図８０）を得た。２８５bpのＮｓｉＩ−ＮｓｉＩ断片を欠失させた後、充てん反応及び再連結して、ｃｒｔＺ遺伝子を不活性化し、プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺ〕Ｗを得た。プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺ〕ＷをＮｄｅＩ及びＨｐａＩで消化し、次いで、これらの部位をクレノウ酵素によって充てんした後に、プラスミドを自己再連結させることによって、非機能的遺伝子であるｃｒｔＷ及びｃｒｔＺを担持するプラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺＷ〕を構築した。このプラスミドで形質転換したE. coli は、β−カロテンの蓄積のために、黄橙色を呈した。プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕は、上記に概説のとおり、プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷのＮｄｅＩ−ＨｐａＩ断片を欠失させることによって得られた、短縮されたｃｒｔＷ遺伝子を有する。ｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺＷ〕及びｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕から、それぞれＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングすることによって、プラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺＷ〕及びｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕を得た。ｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷをＮｓｉＩ及びＳａｃＩで消化し、クレノウ酵素でＤＮＡの突出部分を後退させた後に、プラスミドを自己再連結させることによって、プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＷを構築した。
【０１０８】
カロテノイド分析：異なるプラスミド構築物を担持するE. coli ＴＧ−１株形質転換体を、振盪フラスコ中で、抗生物質（アンピシリン：１００μg/ml、テトラサイクリン：１２．５μg/ml）を添加したルリアブロス中で２０時間、３７℃、２２０rpm で増殖させた。アセトンでカロテノイドを細胞から抽出した。減圧下でアセトンを除去し、残渣をトルエンに再溶解した。この有色の溶液を、Hewlett-Packard シリーズ１０５０という機器で実施する高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した。カロテノイドを、２００×４mm、３ｍのNucleosil Ｓｉ−１００シリカカラムで分離した。溶媒系は、ヘキサン（Ａ）、及びヘキサン／ＴＨＦ、１：１（Ｂ）の２溶媒を含有した。１５分以内に１３〜５０％の（Ｂ）へと移行する直線勾配を適用した。流速は、１．５ ml/分であった。光ダイオードアレイ検出器を用いて、４５０nmでピークを検出した。化学合成によって調製し、ＮＭＲ、ＭＳ及びＵＶスペクトルによって特徴付けた化学的に純粋なカロテノイドの参照試料と比較しての、その吸収スペクトル及び代表的保持時間によって、個々のカロテノイド色素を同定した。フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のカロテノイド生合成遺伝子に加えて、アルカリゲネス属ＰＣ−１株のβ−カロテンケトラーゼをコードしているｃｒｔＷ遺伝子〔Misawa（1995）、６７０番〕をも担持するプラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷで形質転換したE. coli 細胞から単離した色素（ピグメント）のＨＰＬＣ分析は、保持時間、及び与えられた化学的に純粋なカロテノイドの参照試料との吸収スペクトルの比較に基づいて、下記の、β−クリプトキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン及びゼアキサンチンとして同定された主ピークを示した。ｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷを担持するE. coli 形質転換体に蓄積された色素の相対量（面積％）を第３表に示す〔ＣＲＸ：クリプトキサンチン、ＡＳＸ：アスタキサンチン、ＡＤＸ：アドニキサンチン、ＺＸＮ：ゼアキサンチン、ＥＣＭ：エキネノン、ＭＥＣＨ：３−ヒドロキシエキネノン、ＣＸＮ：カンタキサンチン〕。同定された全てのカロテノイドのピーク面積の総和を１００％と定義した。第３表に示した数字は、各形質転換体について独立した４つの培養物の平均値を表す。前述の結果とは対照的に、同じ遺伝子を、２つのプラスミド、ｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕及びｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷ上に担持するE. coli 形質転換体は、アドニキサンチン色素の顕著な低下及びアスタキサンチン色素の完全な欠如を示した（第３表）のに対して、ゼアキサンチンの相対量（％）は増加していた。エキネノン、ヒドロキシエキネノン及びカンタキサンチンのレベルは、全てのｃｒｔ遺伝子を同じプラスミド（ｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷ）上に担持する形質転換体と比較して、不変のままであった。プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕は、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４株のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＺの機能的遺伝子ならびにｃｒｔＷ遺伝子の短縮された非機能的形態を担持する高コピープラスミドであるのに対して、ｃｒｔＷ遺伝子の機能的コピーは、低コピープラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷ上に位置して��る。ｃｒｔＺ遺伝子に対してのｃｒｔＷ遺伝子の過剰発現の効果を分析するため、高コピープラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＷ上にｃｒｔＷ遺伝子を担持するプラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＷ、及びフラボバクテリウム属のｃｒｔ遺伝子をコードしている低コピー構築物ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＥＢＩＹＺ〔ΔＷ〕で、E. coli 細胞を同時形質転換した。ＨＰＬＣによるこれらの形質転換体の色素分析によって、β−カロテン、クリプトキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、ならびに痕跡量のエキネノン及びカンタキサンチンの存在が観測された（第３表）。
【０１０９】
低コピープラスミドｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷ上にｃｒｔＷ遺伝子を、そして高コピープラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺＷ〕上に遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＹ及びｃｒｔＩを収容する形質転換体は、少量にすぎないカンタキサンチン（６％）と高レベルのエキネノン（９４％）を発現したのに対し、高コピープラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＷ上にｃｒｔＷ遺伝子を、そして低コピー構築物ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＥＢＩＹ〔ΔＺＷ〕上にその他のｃｒｔ遺伝子を担持する細胞は、それぞれ７８．６％及び２１．４％のエキネノン及びカンタキサンチンを有した（第３表）。
【０１１０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のＤＮＡ配列によりコードされている酵素的活性を説明する、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のカロテノイドの生成のための生合成経路の図である。
【図２】  それぞれのレーンの上部に示された制限酵素で切断し、プローブ４６Ｆとハイブリダイズさせたフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のゲノムＤＮＡのサザンブロット（矢印は、単離された２．４kbのＸｈｏｌ／ＰｓｔＩ断片を示す）の図である。
【図３】  ＣｌａＩ、又はＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII で切断したフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のゲノムＤＮＡのサザンブロットの図である。パネルＡ及びＢで示されたブロットは、それぞれプローブＡ又はＢとハイブリダイズさせた（実施例参照）。１．８kb及び９．２kbの両方のＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII 断片が示されている。
【図４】  それぞれのレーンの上部に示された制限酵素で切断し、プローブＣとハイブリダイズさせたフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のゲノムＤＮＡのサザンブロット（矢印は、単離された２．８kbのＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片を示す）の図である。
【図５】  それぞれのレーンの上部に示された制限酵素で切断され、プローブＤとハイブリダイズさせたフラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のゲノムＤＮＡのサザンブロット（矢印は、約３kbの単離されたＢｃｌＩ／ＳｐｈＩ断片を示す）の図である。
【図６】  得られたゲノムクローンから演繹された、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスターの構成の物理地図である。スクリーニングのために用いたプローブの位置を、それぞれのクローン上に棒で示す。
【図７】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図８】  図７のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図９】  図８のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１０】  図９のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１１】  図１０のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１２】  図１１のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１３】  図１２のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１４】  図１３のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１５】  図１４のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１６】  図１５のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１７】  図１６のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１８】  図１７のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図１９】  図１８のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２０】  図１９のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２１】  図２０のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２２】  図２１のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２３】  図２２のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２４】  図２３のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２５】  図２４のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２６】  図２５のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２７】  図２６のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２８】  図２７のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図２９】  図２８のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３０】  図２９のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３１】  図３０のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３２】  図３１のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３３】  図３２のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３４】  図３３のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３５】  図３４のつづきであり、フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４中のカロテノイド生合成クラスター及びそのフランキング領域のヌクレオチド配列を示す図である。このヌクレオチド配列は、示された最初のヌクレオチドから番号付けされている（図６のＢａｍＨＩ部位を参照されたい）。ＯＲＦ（ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−１、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ及びｏｒｆ−１６）の演繹されたアミノ酸配列を、一文字のアミノ酸コードで示す。矢印は、転写の方向を示し、星印は、停止コドンを示す。
【図３６】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４の分子量３１，３３１DaのＧＧＰＰシンターゼ（ｃｒｔＥ）のタンパク配列を示す図である。
【図３７】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４の分子量３２，６１５Daのプレフィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）のタンパク配列を示す図である。
【図３８】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４の分子量５４，４１１Daのフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）のタンパク配列を示す図である。
【図３９】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４の分子量４２，３６８Daのリコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）のタンパク配列を示す図である。
【図４０】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４の分子量１９，２８２Daのβ−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）のタンパク配列を示す図である。
【図４１】  フラボバクテリウム属ｓｐ．Ｒ１５３４のカロテノイド生合成遺伝子クラスターの欠失を有する組換えプラスミドの図である。
【図４２】  ＰＣＲ反応のために用いられたプライマーの図である。下線を付した配列は、指定した制限酵素の認識部位である。小文字は、突然変異誘発により導入されたヌクレオチドを示す。四角は、B. subtilis で認識される人工ＲＢＳを示す。太線の小文字は、後続の遺伝子の転写開始部位（ＡＴＧ）を形成する初めのアデニンの位置を示す（初めのオペロンを参照されたい）。初めのフラボバクターカロテノイド生合成遺伝子の全てのＡＴＧは、再構成された転写開始点と干渉しないように破壊されねばならない。矢印は、指定したフラボバクテリウム属Ｒ１５３４ＷＴのカロテノイド遺伝子の初めと終わりを示す。
【図４３】  図４２のつづきであり、ＰＣＲ反応のために用いられたプライマーの図である。下線を付した配列は、指定した制限酵素の認識部位である。小文字は、突然変異誘発により導入されたヌクレオチドを示す。四角は、B. subtilis で認識される人工ＲＢＳを示す。太線の小文字は、後続の遺伝子の転写開始部位（ＡＴＧ）を形成する初めのアデニンの位置を示す（初めのオペロンを参照されたい）。初めのフラボバクターカロテノイド生合成遺伝子の全てのＡＴＧは、再構成された転写開始点と干渉しないように破壊されねばならない。矢印は、指定したフラボバクテリウム属Ｒ１５３４ＷＴのカロテノイド遺伝子の初めと終わりを示す。
【図４４】  異なる構築物のために用いられたリンカーを示す図である。下線を付した配列は、指定した制限酵素の認識部位である。小文字は、合成プライマーにより導入されたヌクレオチドを示す。四角は、B. subtilis で認識される人工ＲＢＳを示す。矢印は、指定したフラボバクテリウムのカロテノイド遺伝子の初めと終わりを示す。
【図４５】  プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２、ｐＬｙｃｏ及びｐＺｅａ４の構築を示す図である。
【図４６】  「＊」で接続する、図４５のつづきであり、プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−クローン５９−２、ｐＬｙｃｏ及びｐＺｅａ４の構築を示す図である。
【図４７】  プラスミドｐ６０２ＣＡＲの構築を示す図である。
【図４８】  「＊」で接続する、図４７のつづきであり、プラスミドｐ６０２ＣＡＲの構築を示す図である。
【図４９】  プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅ及びｐ６０２ＣＡＲＶＥＲＧ−Ｅの構築を示す図である。
【図５０】  「＊」で接続する、図４９のつづきであり、プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ＣＡＲＶＥＧ−Ｅ及びｐ６０２ＣＡＲＶＥＲＧ−Ｅの構築を示す図である。
【図５１】  プラスミドｐＨＰ１３−２ＣＡＲＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ及びｐＨＰ１３−２ＰＮ２５ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶの構築を示す図である。
【図５２】  「＊」で接続する、図５１のつづきであり、プラスミドｐＨＰ１３−２ＣＡＲＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ及びｐＨＰ１３−２ＰＮ２５ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶの構築を示す図である。
【図５３】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＡ）。
【図５４】  「＊」で接続する、図５３のつづきであり、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＡ）。
【図５５】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＢ）。
【図５６】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＣ）。
【図５７】  「＊」で接続する、図５６のつづきであり、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＣ）。
【図５８】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＤ）。
【図５９】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＤ）。
【図６０】  図５８及び図５９のつづきであり（各々ａ＊、ｂ＊で接続する）、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶＭＵＴＲＢＳ２Ｃの構築を示す図である（パネルＤ）。
【図６１】  図６２に表すB. subtilis 株ＢＳ１０１２：：ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４のノーザンブロットを説明するための、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４の B. subtilisのレバン−スクラーゼ遺伝子中への相互組込みの模式図である（パネルＡ）。
【図６２】  プローブＡ（ＣＡＲ５１及びＣＡＲ７６で得られ、ｃｒｔＺの３’末端及びｃｒｔＹの５’末端とハイブリダイズするＰＣＲ断片）で得られたノーザンブロット（パネルＢ）、及びプローブＢ（プラスミドｐＢIIＫＳ（＋）−ｃｒｔＥ／２から単離され、ｃｒｔＥ遺伝子の５’部分にハイブリダイズするＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片）で得られたノーザンブロット（パネルＣ）を表す図である。
【図６３】  ３つの形質転換された B. subtilis株、ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯ、ＢＳ１０１２：：ＳＦＣＯＣＡＴ１及びＢＡ１０１２：：ＳＦＣＯＮＥＯ１の組込み部位の模式図である。合成フラボバクテリウムカロテノイドオペロン（ＳＦＣＯ）の増幅は、増幅可能な構造を有する株においてのみ得ることができる。プローブＡは、組込まれたＳＦＣＯのコピー数を決めるために用いた。エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、B. subtilis のｃｒｔＴ遺伝子のターミネーター（ｃｒｔＴ）、レバン−スクラーゼ遺伝子（ｓａｃ−Ｂ５’及びｓａｃ−Ｂ３’）、ｐＸＩ１２のプラスミド配列（ｐＸＩ１２）、ｖｅｇプロモーター複合体のＩ部位由来のプロモーター（Ｐｖｅｇｌ）。
【図６４】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯ及びｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴの構築を示す図である。
【図６５】  プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯ及びｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴの構築を示す図である。
【図６６】  図６４及び図６５のつづきであり（各々ａ＊、ｂ＊で接続する）、プラスミドｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＮＥＯ及びｐＸＩ１２−ＺＹＩＢ−ＥＩＮＶ４ＭＵＴＲＢＳ２ＣＣＡＴの構築を示す図である。
【図６７】  プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図６８】  図６７のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図６９】  図６８のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７０】  図６９のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７１】  図７０のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７２】  図７１のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７３】  図７２のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７４】  図７３のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７５】  図７４のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７６】  図７５のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７７】  図７６のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７８】  図７７のつづきであり、プラスミドｐＺｅａ４の完全ヌクレオチド配列を示す図である。
【図７９】  アルカリゲネスＰＣ−１の合成ｃｒｔＷ遺伝子を示す図である。転写されたタンパク配列を、二本鎖ＤＮＡ配列の上に示す。ＰＣＲ合成のために用いた１２個のオリゴヌクレオチド（ｃｒｔＷ１〜ｃｒｔＷ１２）に、下線を付してある。
【図８０】  プラスミドｐＢIIＫＳ−ｃｒｔＥＢＩＹＺＷの構築を示す図である。合成ｃｒｔＷを有するｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２−ｃｒｔＷのＨｉｎｄIII −Ｐｍ１Ｉ断片を、ＨｉｎｄIII 及びＭｌｕＩ（平滑）部位にクローン化した。ＰｖｅｇＩ及びＰｔａｃは、２つのオペロンの転写のために用いるプロモーターである。このプラスミドのＣｏｌＥ１複製起点は、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２構築物に存在するｐ１５Ａ起点に匹敵する。
【図８１】  実施例７で構築した全てのプラスミドの関連挿入断片を示す図である。破壊された遺伝子を／／で示す。制限部位：Ｓ＝ＳａｃＩ、Ｘ＝Ｘｂａｌ、Ｈ＝ＨｉｎｄIII 、Ｎ＝Ｎｓｉｌ、Ｈｐ＝Ｈｐａｌ、Ｎｄ＝Ｎｄｅｌ。
【図８２】  本発明の方法によりβ−カロテンから得られる反応生成物（カロテノイド類）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【配列表】
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