(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えスフィンゴモナス属細菌の中で産生されるキサンタンガムの収率を増加させる方法であって、スフィンゴモナス属細菌の中でグリコシル転位酵素を不活性化することを含む前記方法。
【請求項２】
グリコシル転位酵素を不活性化するステップが、１つないしはそれ以上のグリコシル転位酵素遺伝子を削除することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリコシル転位酵素を不活性化するステップが、１つないしはそれ以上のグリコシル転位酵素遺伝子を突然変異させることを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
キサントモナス・カンペストリス細菌のゲノムの一部によりスフィンゴモナス属細菌を形質転換することを含んでなる、ラクトースからキサンタンガムを産生する方法であって、前記スフィンゴモナス属細菌はキサンタンガムの合成経路に入ることができる糖へとラクトースを変換することができ、前記のゲノムの一部がgumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL及びgumM遺伝子を含む方法。
【請求項５】
前記ゲノムの一部が、さらにgumA及びgumNを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
スフィンゴモナス属細菌におけるグリコシル転位酵素を不活性化することをさらに含む請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
キサントモナス・カンペストリスのゲノムの一部をスフィンゴモナス種の中に転移することを含む、組換えキサンタン産生スフィンゴモナス種菌株を作成する方法であって、キサントモナス・カンペストリスのゲノムの一部が、gumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL及びgumM遺伝子を含み、その遺伝子の転移がスフィンゴモナス種の中での組換えキサンタン産生を可能にすることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
前記ゲノムの一部が、さらにgumA及びgumNを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の遺伝子のうち、gumD、gumF、gumG及びgumLから成るグループの中にある遺伝子の少なくとも１つが除去又は不活性化されていることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記のゲノムの一部がプラスミドにあることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記のゲノムの一部がスフィンゴモナス種のゲノムの中に組み込まれることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
スフィンゴモナス菌株の１以上のsps遺伝子の削除あるいは突然変異によってスフィンゴモナス菌株の中での生来のスフィンガン産生を不活性化することをさらに含む請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１３】
キサントモナス・カンペストリスのゲノムにより形質転換された組換えスフィンゴモナス種菌株であって、前記ゲノムがgumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL及びgumM遺伝子を含み、組換えスフィンゴモナス種がその中で増殖する培地の中においてキサンタンガムを産生し分泌する前記組換えスフィンゴモナス種菌株。
【請求項１４】
前記ゲノムが、さらにgumA及びgumNを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の遺伝子がgumD、gumF、gumG及びgumLから成るグループの中にある遺伝子の少なくとも１つが除去又は不活性化されていることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の遺伝子がスフィンゴモナス菌株の細胞の中にある複製するプラスミドにあることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の組換え菌株。
【請求項１７】
前記の遺伝子がスフィンゴモナス菌株のゲノムの中に組込まれることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の組換え菌株。
【請求項１８】
キサントモナス・カンペストリスのゲノムのgumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL及びgumM遺伝子により形質転換された組換えスフィンゴモナス種菌株を、ラクトースを含む培地において培養することと、前記培地からキサンタンガムを回収することとを含む、ラクトースからキサンタンガムを産生する方法。
【請求項１９】
前記ゲノムが、さらにgumA及びgumNを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記のゲノムがgumD、gumF、gumG及びgumLから成るグループの中にある遺伝子の少なくとも１つが除去又は不活性化されていることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地のラクトースがチーズ生産の乳清廃棄物副産物として供給されることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
gumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL及びgumM遺伝子を含むキサントモナス・カンペストリスのゲノムにより形質転換された組換えスフィンゴモナス種菌株を液内好気性発酵条件にさらすことと、該発酵により得られるキサンタンガムを回収することとを含むキサンタンガムの製造方法。
【請求項２３】
キサントモナス・カンペストリスのゲノムがgumA及びgumNをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
発酵が約30から33℃までの範囲にある温度で実施されることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
プラスミドXCc8を含むスフィンゴモナス・パウシモビリスであり、スフィンガンを生産する菌株ATCC 98479。
【請求項２６】
プラスミドXCc8を含むスフィンゴモナス菌株S88ΔTn358であり、スフィンガンを生産する菌株ATCC 98480。
【請求項２７】
キサントモナス・カンペストリスのゲノムによってスフィンゴモナス属細菌を形質転換することと、ここで、キサントモナス・カンペストリスのゲノムはgumA、gumB、gumC、gumD、gumE、gumF、gumG、gumH、gumI、gumJ、gumK、gumL、gumM及びgumNを含み、形質転換したスフィンゴモナス属細菌を増殖することと、キサンタンガムとスフィンゴモナス属細菌に固有の少なくとも１つの多糖とを収集することとを含む、組換えスフィンゴモナス属細菌において少なくとも２つのエキソ多糖を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
キサンタンガム（xanthan gum）は、通常キサントモナス・カンペストリスによって分泌される酸性エキソ多糖（exopolysaccharide:EPS）であって（Jeanes,A.ら、1961, J Appl Polymer Sci 5: 519−526）、また、低濃度で高い粘性、疑似塑性を示し、また広範囲の温度、pH、電解質の状態にわたって感受性の欠如を示すので、水性流動学的対照試薬として有用である（米国特許番号第5,194,386号、第5,472,870号、第5,279,961号、第5,338,841号、第5,340,743号を参照。それぞれの内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。その合成物をコードする遺伝子は、gumBからMまでの遺伝子である（Capage, MAら、1987, WO87/05938; Vanderslice, RWら、1989，これらは引用することにより本明細書の一部をなすものとする; V Cresceenzi, ICM Dea, S Paoletti, SSStivala, IW Sutherland編『工業用多糖における生物医学とバイオテクノロジーの進歩（Biomedical and biotechnological advances in industrial polysaccharides）』の中の「キサントモナス・カンペストリスにおける多糖構造の遺伝子工学（Genetic engineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris.）」、pp145−156, Gordon and Breach Science Publishers刊行，ニューヨーク）。
商業的に重要で、また機能的にさまざまに分岐している生体高分子の異なる源の１つは、スフィンゴモナス属である（Pollock,TJ、1993, J Gen Microbiol 139,1939−1945）。この属の異なる生物は異なる菌株−特異的なエキソ多糖のさまざまなものを分泌している。例えば、１つの種はGellan▲Ｒ▼を分泌し、一方、その他のウェラン、ラムサン（rhamsan）、S−88あるいはその他の多糖を分泌する（Moorhouse, Rの執筆部分、M Yalpani編『工業用多糖−遺伝子工学、構造/特性関係と適用法（Industrial polysaccharides: genetic engineering,structure/property relations and applications.）』の中の「細菌多糖ファミリーの構造/特性関係（Structure/property relationships of a family of microbial polysaccharides.）」、pp 187−206, Elsevier Science Publishers B.V.刊、アムステルダム）。
別個の側鎖を伴うが、共通の炭水化物主鎖構造（−x−グルコース−グルクロン酸−グルコース−、ここで、xはL−ラムノースあるいはL−マンノースのいずれかである）を有しているので、共通の属名にちなんで、このポリマーのグループを「スフィンガン類（sphingans）」と呼ぶ（1996年１月24日に提出された米国特許出願第08/592,874号と、1995年１月24日に提出された第08/377,440号を参照。これらのそれぞれの内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。スフィンガンS−88の合成を指示する23遺伝子の体制とDNA配列（図２）についての記載がある（Yamazaki,M,ら、1996,J Bactriol 178:2676−2687）。
粘性が高いキサンタンガムや他の細菌性多糖の商業的な製造では、生合成とプロセス工学の問題が複雑に絡み合う（Kennedy, JFら、1984, Prog Industrial Microbiol 19:319−371）。糖基質は第一義的に重要であるが、糖は生産性に影響を及ぼすので、糖のコストもまた重要でありうる。現在では、キサンタンガムは、コーンシロップ、ショ糖、あるいはスターチをキサントモナス・カンペストリスに供給することにより製造されている。しかしそれでも、３つか４つの典型的なチーズ工場があれば、キサンタン生産に関しては現存する世界中の需要のすべてを満たすのに十分な量の低価格ラクトース含有廃棄物である乳清を提供することができる。
グルコースを変換した分量に等しい分量で、ラクトースを安定的にキサンタンガムに変換できる組換え菌株は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第5,434,078号と第5,279,961号に開示されている。
より以上のコスト効率、利便性、より以上に求められる製品品質の向上とより以上の生産効率を達成するため、キサンタンガムの生産方法を改善することが所望されている。
従来の方法によって生産されるキサンタンガムに関して突き当たる問題は、キサンタンがセルロースポリマーと混ぜ合わされる、あるいは接触するような商業上の適用では非常に不都合なことになりうるセルラーゼによる汚染である。その結果はセルロースポリマーの劣化である。
セルラーゼ汚染を除去するため、液体培地から分離されたキサンタンガムを処理する公知の方法はある。しかし、こうした処理法にはキサンタンガムのプロセシングが必要であり、それが経費的に加算され、また生産プロセス全体を複雑にしてしまうことが付け加わる。
【図面の簡単な説明】
図１には、キサンタンガムとスフィンガンS−88の反復サブユニット構造を示す。
図２は、キサントモナス・カンペストリスガムとスフィンゴモナスS88の略地図である。
発明の概要
我々は、エキソ多糖類の生産のための新規な組換え細菌を発見した。加えて、組換え細菌を作り、また糖基質を利用して細菌の液内培養好気性発酵によりその細菌からエキソ多糖類を作り出す方法を我々は発見した。本発明の組換え細菌は、エキソ多糖類を生産し、また組換え細菌を得たその細菌により利用可能な糖基質を利用することができる。加えて、本発明の細菌から得られるエキソ多糖類は、改善された、より望ましい、あるいは組換え細菌が由来する非組換え細菌によって生産されたエキソ多糖類とは異なった特性を示す。
さらに、その液体培地で得られたようなセルラーゼ汚染の減少を示す新規なキサンタンガムを我々は発見した。本発明の１つの目的は、発酵により細菌性のエキソ多糖類を生産する方法であって、該エキソ多糖類が生来のものである細菌が利用することができない糖基質からそのようなエキソ多糖類を生産する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的の１つは、組換え細菌宿主の中で産生される非生来（non-native）の細菌性エキソ多糖類の収率を増加する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、チーズ製造の副産物である乳清廃棄物から発酵によってキサンタンガムを産生することである。
本発明の付加的な目的および長所は、一部は後続する記述の中で、また一部は本発明の例の記述から明らかになるであろうし、あるいは例から学び取られることであろう。その目的ならびに長所は、添付の請求項の中でとくに指摘される方法によって実現され、また達成されると考えられる。
この目的を達成するため、また本発明の目的により、組換え細菌宿主における非生来（non-native）の細菌エキソ多糖類の生産方法を説明する。
とくに、細菌宿主における生来（native）の多糖類産生を不活性化させることにより組換え細菌宿主の中で産生される非生来細菌エキソ多糖類の収率を増加できることを我々は発見した。
定義
本明細書においては、
「非組換え細菌宿主菌株」とは、外来遺伝子材料を含まない細菌菌株を意味する。
「組換え細菌宿主菌株」とは、外来遺伝子材料がその中に導入され、また維持される非組換え細菌宿主菌株を意味する。この菌株は「受容者」、あるいは「受容菌株」としてときに本明細書において言及される。
「外来遺伝子材料」とは、セグメント（あるいは複数）が導入される、あるいはセグメントがその中に導入されるべき組換え細菌宿主菌株のセグメントとは異なる細菌菌株のゲノムのセグメントを意味する。
「グリコシル転移酵素」とは、エキソ多糖類生合成に関連するイソプレニルリン酸塩キャリヤーへの糖−リン酸分子の付着を触媒する、あるいは事前にイソプレニルリン酸エステルキャリヤーに取り付けられた糖への糖の取付けを触媒する、関連酵素グループのうちのいずれか１つを意味する。
「sps遺伝子」とは、スフィンゴモナス細菌種のゲノムに存在するいくつかの遺伝子のうちの１つであり、あるいはスフィンゴモナス細菌から分離することができるいくつかの遺伝子のうちの１つであり、また、それらの遺伝子が生合成経路における化学的反応を触媒する酵素をコードするという点で、あるいはそれらの遺伝子が細胞増殖培地に存在するスフィンガンエキソ多糖類の分量を調節するタンパク質あるいはDNA制御部位をコードするという点で、スフィンガンエキソ多糖類の生合成に関連しているいくつかの遺伝子のうちの１つを意味する。
「非生来（non-native）エキソ多糖」とは、非組換え細菌宿主菌株によっては産生されず、また排出されないが、しかし非組換え細菌宿主菌株から得られる組換え細菌宿主菌株により産生され、また排出される細菌のエキソ多糖を意味する。
「生来（native）プロデューサー細菌」とは、所望される細菌のエキソ多糖を産生する非組換え細菌を意味する。
「gum遺伝子」とは、キサントモナス細菌種のゲノムに存在するいくつかの遺伝子のうちの１つ、あるいはキサントモナス細菌から単離することができるいくつかの遺伝子のうちの１つ、また生合成経路での化学的反応を触媒する酵素をコードするという点で、あるいは細菌増殖培地に存在するキサンタンエキソ多糖類の分量を調節するタンパク質あるいはDNA制御部位をコードするという点で、キサンタンエキソ多糖類の生合成に関連している、いくつかの遺伝子のうちの１つを意味する。
２つのエキソ多糖類、キサンタンガムとスフィンガンS−88の例（Jansson, P−Eら、1975, Carbohydr Res 45:275−282, Jansson, P−Eら、1986, Carbohydr Res 156:165−172）は、それらの反復糖サブユニット構造により図１に示す。矢印は各反復の還元末端の方向を指している。キサンタンガムに関しては、IPキャリヤーがその側鎖を欠くグルコース残基へのホスホジエステル結合により還元末端に取り付けられる（Ielpi,Lら、1993, J Bacteriol 175:2490−2500）。略語：Glc,グルコース; Man,マンノース;GlcA,グルクロン酸; Rha,ラムノース；Ac,アセチルエステル；Pyr,アセタール結合ピルビン酸。S−88におけるAcの位置および結合は分かっていない。
好適な実施様態の説明
本発明は、糖源は利用できるのだが、細菌宿主菌株中のエキソ多糖類の産生を確立するのに必要な生来プロデューサー細胞由来の遺伝子ではエキソ多糖類は産生できない細菌宿主菌株を形質転換することにより、そのエキソ多糖類の生来プロデューサー細胞には利用不可能な糖源から細菌エキソ多糖類を産生する方法を提供する。細菌エキソ多糖類はその場合には、糖源と一緒に組換え細胞宿主を発酵させることにより産生することができる。例えば、キサントモナス・カンペストリス菌株B1459由来の遺伝子gumB、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、Mは、とくに突然変異スフィンゴモナス受容者の中に形質転換されて導入され、廉価な廃棄物乳清ラクトースを入れて発酵させることによって、キサントモナス・カンペストリス菌株B1459により産生される量に匹敵する大量の分泌キサンタンガムを得た。アセチル側基を欠くキサンタンガムの産生に関しては、キサントモナスのgumFとgumG遺伝子は、キサントモナスから得られた外来遺伝子材料から取り除くことができる。同様に、ピルビル側基を欠くキサンタンガムの産生に関しては、gumL遺伝子は取り除くことができる。
「組換え細菌宿主菌株」がすでに「非生来エキソ多糖」の産生に必要となる遺伝子機能を発現させている場合には、その機能を「外来遺伝子材料」の中に含める必要はない。例えば、外来遺伝子材料がスフィンゴモナス細菌の中に導入され、またイソプレノイド脂質キャリヤー上の非生来多糖類の反復サブユニット構造を組み立てる際の最初のステップが、そのキャリヤーへのグルコース−Pの転移である場合には、同じ特異的な酵素反応を実施するいくつかの遺伝子機能のいずれかは代用することができる。例えば、キサントモナス種のgumD遺伝子の代わりに、スフィンゴモナス種由来のspsB遺伝子、あるいはRhizobium種由来のpssA遺伝子、あるいはその他の細菌由来の類似遺伝子で代用することができた。
本発明はさらに、細菌宿主菌株に固有のエキソ多糖類の産生を不活性化することにより組換え細菌宿主菌株で産生される非生来エキソ多糖類の収率を増加する方法を提供する。好適には、その不活性化は細菌宿主菌株のゲノムの中での削除あるいは突然変異によって達成される。もっとも好適には、その削除あるいは突然変異によりグリコシル転移酵素活性を不活性化する。
もっとも好適には、その削除あるいは突然変異により、グリコシル転移酵素、多糖ポリメラーゼ、分泌装置、あるいは必須ヌクレオチド−糖前駆体の合成に必要な酵素の活性を不活性化する。例えば、スフィンゴモナスでは、キャリヤーC55−イソプレニルリン酸エステルに取り付けられたサブユニット糖反復構造の合成に必要であるspsB、Q、K、Lなどの必須基質−特異的グリコシル転移酵素の１つないしはそれ以上の不活性化により、スフィンゴモナスによって産生される多糖の合成が排除される。同様に、多糖ポリメラーゼ、あるいは分泌装置での突然変異により、生来の多糖類のプロデューサー細菌によるエキソ多糖類の産生が排除される。生来の多糖類の産生についてはまた、前駆体DdTDT−L−ラムノースを合成するのに必要な４つの酵素：RhsA、RhsB、RhsC、あるいはRhsDなどの前駆体ヌクレオチド−糖の合成に必須となる酵素を不活性化する突然変異により排除することができる。こうした酵素ないしはタンパク質の活動を排除する突然変異ないしは削除により、こうした酵素をその構造と酵素の活性を改変することで直接不活性化するか、あるいは間接的に、こうした酵素ないしはタンパク質をコードする遺伝子の発現を遮断する、あるいは調節することによりそうした酵素を不活性化するかのいずれかが可能である。
本発明ではまた、組換えスフィンゴモナス種菌株はスフィンゴモナス種でのキサンタンガム産生を確立するのに必要となるキサントモナス・カンペストリスのゲノム由来の遺伝子で形質転換されるが、その組換えスフィンゴモナス種菌株を発酵させることにより産生されたキサンタンガムにおいて汚染セルラーゼ活性を最小限度にするための方法を提供する。
すべての実施様態で、以下の細菌菌株、組換えDNA手順、増殖培地を使用している。すなわち、
菌株X59（ATCC 55298−米国特許第5,194,386号、第8〜9欄）は、野生型キサントモナス・カンペストリスB1459から得たリファンピシン耐性の自然突然変異体の１つである（Thorne, Lら、1987, J Bacteriol 169:3593−3600）。染色体欠失に特異的なクーロン化DNAセグメントと部位を図２に図示する。プラスミドXCc8はコスミドライブラリーの構成メンバーの１つであり（Thorne, Lら、1987, J Bacteriol 169:3593−3600）、染色体DNAの約24キロベース対（kbp）のセグメントを菌株X59から可動広範囲宿主領域プラスミドベクターpRK311の中に挿入することにより得られた（Ditta, Gら、1985，プラスミド13：149−153）。プラスミドXC600（gumB〜M）により運ばれるDNAセグメントは、DNA単離の標準的な方法、制限エンドヌクレアーゼによる加水分解と結合によってプラスミドXCc8から得られた（Maniatis,Tらの執筆部分、『分子クローニング-ラボマニュアル［第１版］（Molecular cloning: a laboratory manual.）』、1982年、Cold Spring Harbor Laboratory刊、Cold Spring Harbor）。プラスミドXC600の中への挿入は、この文書の中では配列番号１で示されているGenBank受託番号U22511のgum配列のヌクレオチド919〜15400に対応するXCc8のNde−Sallセグメントにまたがっている（GenBank、国立医学図書館内の国立バイオテクノロジー情報センター、メリーランド州郵便番号20894ベセスダ市、www.ncbi.nlm.gov/web/genbank）。プラスミドXC1483には、ヌクレオチド3460（BamHＩ）から7959まで（BamHＩ）が含まれる（Pollock, TJら、1994, J Bacteriol 176:6229−6237）。プラスミドS88c1、S88c3は、S88染色体DNAのSall酵素による部分的な加水分解と、その後のベクターpRK311への結合から得られたコスミドライブラリーの構成メンバーである（Yamazaki,Mら、1996, J Bacteriol 178: 2676−2687）。菌株S88ΔTn358の中で削除されたヌクレオチドには、S88配列の中の4485（BamHＩ）から24646（EcoRＩ）までが含まれる（GenBank受託番号U51197、この文書中では配列番号２）。菌株S88m265にはspsBに欠陥がある（Yamazaki, Mら,1996, J Bacteriol 178:2676−2687）。
E.coliの中でのDNA形質転換、広範宿主領域プラスミドの三親接合体をスフィンゴモナスあるいはキサントモナス・カンペストリスの中に導入することと選択方法については記載がある（Yamazaki, Mら、1996, J Bacteriol 178:2676−2687）。
ルリア-ベルターニおよびM9塩が標準的な培地である（Pollack, TJら、1994,J Bacteriol 176: 6229−6237）。M9+YEは0.05％w/v酵母抽出物で補足したM9である。YM培地には、脱イオン化水１リットル当たり3gのバクト酵母抽出物、3gの麦芽抽出物、5gのバクトペプトン、10gのD−グルコースが含まれる。1/4 YM−G培地は３倍容積の水で希釈され、グルコースは加えられない。使用された抗生物質の分量は以下の通りである。すなわち、リファンピシン50mg/L；ストレプトマイシン50mg/L；カナマイシン50mg/L；テトラサイクリン6〜15mg/L（Sigma Chemical Co.）。低粘性カルボキシメチルセルロース（1％w/v最終、Sigma Chemical Co.）はTSA血液アガー素地（Difco）により混合され、その後、培養がその培地の表面上にスポットされ、30℃で4〜7日間増殖させた。カルボキシメチルセルロースの加水分解ゾーンは、30分間0.1％（w/v）コンゴ赤色染料でプレートをゆるやかに溢れさせ、その後1M NaClで30分間脱染することで観察された。その後、そのゾーンの直径がさまざまな培養の相対セルラーゼ活性を比較するために測定された。
以下のエキソ多糖類の化学的また物理的分析が例中で使用された。すなわち、
細胞外キサンタンガムあるいはスフィンガンS−88は、イソプロピルアルコール2−3倍容積を加えた液体培養培地から沈澱させて、その後秤量前に80℃で乾燥させた。加水分解混合物は高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）の水の中に多糖0.5〜5mgと130〜260μl 2M（v/v）トリフルオロ酢酸を含んでおり、また95℃で16時間保温培養された。サンプルは100μl HPLC水に懸濁されて真空下で乾燥され、再び乾燥、また最終的には100μl HPLCの水の中に懸濁された。サンプルと糖標準試料はCarbPacPA−1陰イオン交換カラム上で分離され、また糖組成がDionex DX500 HPLCシステムにより前出に説明された通りに定量化された（Clark, AJら、1991, Anal Biochem 199:68−74）。アセチル基（Hestrin, S 1949, J Biol Chem 180:249−261）とピルビル基（Duckworth, Mら、1970, Chem Ind 23: 747−748）の測定については記載がある。
多糖のサンプル（10mg、粉末）は、イナゴマメガムとプロムフェノール青色染料（100g/ml）の同じ重量を入れたガラス試験管にて60分間80℃で脱イオン化水2mlの中で溶解された。２時間冷却後、その試験管を写真撮影のため、水平方向に回転させた。ゲル化に失敗したため、その結果、混合スラリーの水平方向移動が起こった。
商業的なキサンタンガム（Keltrol, Kelco Company）が、物理的また化学的比較試験のために使用された。
キサンタンガム混合物に関しては、各多糖は100mM KClの中で0.1％w/vで溶解され、また溶液粘性がBrookfieldLVTDV−II粘度計と紡錘体18により、20〜25℃数rpmで測定された。
寄託
本発明に関連して以下の寄託がなされた。すなわち、
1.  プラスミドXCc8を含むSphingomonas paucimobilis（ATCC 29837）
ATCC指定番号98479、
2.  プラスミドXCc8を含むSphingomonas菌株S88ΔTn358
ATCC指定番号98480。
上記の寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約によりバージニア州郵便番号20110−2209マナサス市ユニバーシティ大通り10801番地に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにおいてなされた。寄託された材料の入手についてのすべての制約はそれについての特許証の発行時点で不可逆的に解除される。
ここに言及されているすべての他の微生物および/またはDNAセグメント、プラスミドなどは、バージニア州マナサス市にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから公に入手可能である。
例１
多糖の生合成をコードする遺伝子の属間発現
図２について言及すると、キサントモナス・カンペストリスgum遺伝子とスフィンゴモナスS88 sps遺伝子の地図、プラスミドの中でクローン化された特定のセグメントの境界、また細菌染色体の欠失が示されている。遺伝子上の矢印は転写の方向を示す。水平線は、括弧内の包含遺伝子と一緒に各プラスミドの中に包含されたクローン化DNAの範囲を示す。点線は突然変異体染色体から削除された領域を示す。gumBからMまでの遺伝子（GenBank受託番号U22511）は約14kbpにまたがり、またspsGからurf34までの遺伝子（GenBank受託番号U51197）には約29kbpが含まれている。
元のコスミドクローンおよび特定のサブクローン化セグメント（図２に図示）はキサントモナス・カンペストリスとスフィンゴモナス受容菌株の中に接合して導入することにより転移された。培地の中に分泌されるESPの型は、コロニーと液体培養の外観から、また物理的特性と回収した多糖類の炭水化物組成から判定した。
表１とその凡例に記載、記述されているように、キサントモナス・カンペストリスX59（Gum+）とスフィンゴモナスS88（Sps+）、多糖−陰性突然変異体S88m265（Sps-）は液体培養の中で容易に区別できるコロニーの形態と特徴を有している。視覚的な検査から、何らかのESPが分泌されているかどうかだけではなく、そのESPがスフィンガンS−88か、あるいはキサンタンガムかどうかも判定できる。EPSサンプルは加水分解された酸であり、また単糖（あるいは複数）の同定とその分量が求められた。キサントモナス・カンペストリスから分泌されたキサンタンガムは、HPLCクロマトグラム上の中性糖に関するピーク領域の合計が約67％を示すグルコースとマンノース約33％である、２種の中性糖を含んでいた。対照的に、スフィンガンS−88は約18％ラムノース、59％グルコース、23％マンノースを含んでいた。糖組成からスフィンガンS−88とキサンタンガムが区別された。
コロニーの外観（Sps+）と、プラスミドS88c1を運ぶ受容菌株S88m265により分泌される多糖類由来の中性糖の組成は、正常spsB遺伝子を運ぶそのプラスミドがスフィンガンS−88合成を突然変異体に戻したことを示した。キサントモナス・カンペストリスgumD遺伝子を伴うプラスミドXC1483はまた、スフィンガンS−88合成をS88m265に戻した。
とくに興味があるのは、約1/4スフフィンガンS−88と3/4キサンタンガムから構成される中性糖の混合物は、gum遺伝子を運ぶプラスミドXCc8がS88m265の中に導入されたときに得られたということである。この組換え菌株は、菌株S-88で両方のエキソ多糖類を作成するのに必要な遺伝子のすべてを有している。したがって、本発明により、同じ生物から同時に２つの異なったエキソ多糖類を得ることが可能である。
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S88染色体から一定のsps遺伝子を削除することによって、我々はキサンタンガムのみのスフィンゴモナスにおいて合成物を得た。プラスミドS88c3（sps遺伝子）はスフィンガンS-88の合成物を欠失突然変異体S88ΔTn358に戻し、プラスミドXCc8とXC600（gum遺伝子）はキサンタンの中性糖パーセントに釣り合い、またラムノースを欠いた多糖類の合成物を生じた。
プラスミドXCc8は、グルコシル-IP転移酵素（SpsB-）および必須dTDP-ラムノース基質（RfbD-）の合成物において欠陥を有するスフィンゴモナス（S88m134）の二重突然変異体にあるキサンタンガムのみの合成物を生じる。我々はまた、そうではなければ何らかの多糖類を分泌することはない、S.paucimobilis属、ATCC 29837に関する型の菌株においてキサンタンガム合成を観察した。例３に詳述されているこの多糖類に関する物理学的な研究では、それはキサンタンガムであったことが確認された。
例２
組換えにおける遺伝子機能の検出
キサントモナス・カンペストリスのアセチラーゼ（gumFおよびG）およびピルビラーゼ（gumL）遺伝子がスフィンゴモナスにおいて機能していたかどうかを判定するために、我々は、組換えおよび市販されているキサンタンガムのサンプルに関して各組成物の分量を測定した。組換えサンプル（プラスミドXCc8を伴うS88ΔTn358）のアセチル化の範囲は、市販されているキサンタンガムのそれを数パーセント越え、また、組換えスフィンゴモナスと同じ条件下で増殖したが、キサントモナス・カンペストリスX59によって作り出されたキサンタンガムについてのアセチル化の範囲と類似していた。組換えサンプルは市販されているキサンタン（KeItrol）とキサントモナス・カンペストリスX59によって作り出されたキサンタンの5〜6％に比較してピルビン酸エステルとして重量で4〜6％であった。
例３
組換えキサンタンガムの物理学的分析
組換えおよび市販されているキサンタンガムの３つの物理学的特性が比較された。まず第一に、キサンタンとグアールガムの混合物に想定された粘性の相乗作用が組換えサンプルについて観察された（表２）。溶液粘性は付加グアールガムを伴う、また伴わないサンプルに関して測定された。市販のキサンタンガム、あるいは組換えサンプルのいずれかとグアールガムとの混合物の粘性は、混合されなかった多糖類の粘性の合計よりも高かった。第二に、キサンタンガムは、イナゴマメガムが存在する場合、硬いゲルを形成する際にユニークである。硬いゲルは、市販のキサンタンガムと、あるいは３つの組換えサンプルのいずれか１つと、イナゴマメガムを混合することにより形成される。すなわち、S88m265、S88ΔTn358あるいはS. paucimobilis ATCC 29837のいずれかの中にあるプラスミドXCc8である。第三に、各組換えキサンタンサンプルの粘性は市販のキサンタンガムのように非常に低かった。これらの３つの物理学的試験では、組換えスフィンゴモナス菌株によって分泌されたESPはキサンタンガムに匹敵することが確認された。
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例４
代替的な培養条件
表３の結果は、組換えスフィンゴモナス菌株は、キサントモナス・カンペストリスとは対照的に、キサンタンガムにラクトースか、あるいはグルコースのいずれかを同様の範囲で変換することを示している。
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大規模なキサンタン発酵に関連する産生率と収率は、温度と空気混和に敏感に反応する。高度に粘性のある液体培地では最大生産性を達成するためにはかなりのかき混ぜと、冷却が必要である。キサントモナス・カンペストリスは約28℃で最適にキサンタンガムを生産するが、スフィンゴモナス菌株は約37℃までの温度で増殖することは公知のことである。
図３に示したように、組換えスフィンゴモナス菌株は30℃と33℃で増殖した。組換えATCC29833にXcC8を加えた場合には、ガムの収率は1/4YM−G培地でともに30℃と33℃で負のガムプロデューサーX−59にほぼ同じであった。しかし、1/4YM−G培地で組換えS88ΔTn358にXCc8を加えた場合は、ガムの収率は両方の温度で負のガムプロデューサーX59の収率よりも有意に上であった。
発酵は発熱反応であり、主にエネルギーが必要とされるのは液体培地の冷却であるので、これは本発明の１つの重要な実施様態である。本発明により、発酵は高めの温度、約30℃から33℃の範囲で実施することができる。このことは、冷却は少なめにすることが要求されることになり、また本発明により、キサンタンガム生産に使用されている従来の発酵条件と比較すると、実質的なエネルギーコストの低減が実現できる。
例５
キサンタンガムにおけるセルラーゼ汚染の低減
キサンタンガムに汚染セルラーゼが存在する場合、キサンタンがセルロースポリマーと混合される、あるいは接触するような商業的な適用では不利である。カルボキシメチルセルロースを含むアガープレート上にスポットされた培養周囲の加水分解ゾーンを測定することによって判断されるが、本発明のスフィンゴモナス組換えが、キサントモナス・カンペストリス菌株X59で観察されるセルラーゼ活性の1/8以下を示すことを我々は発見している。このことは、X59から得られたキサンタンガムと比較すると、この本発明の菌株から生産されたキサンタンガムには有意に低減した汚染セルラーゼの分量しか含まないことを意味する。ここで使用されている「製造された」という表現は、そこからセルラーゼを除去するという処理あるいは手順をとった後は何らのステップもとらずに液体培地から直接得たキサンタン製品のことを意味する。したがって、増加するコストとセルラーゼ内容物を除去あるいは減少させるために従来のキサンタン製品に通常要求されるステップを回避しているので、本発明により得られた、製造されたキサンタンガムには利点がある。
例６
大きなセグメントのサブセットをいかに構築し、また使用するかを示す予言的な例
アセチラーゼ（gumFとgumG）、ピルビラーゼ（gumL）あるいはグリコシル転移酵素（gumD）を欠くキサントモナスゲノム由来の外来遺伝子材料の構築法と使用法
gumB、C、D、E、gumH、I、J、K、gumM遺伝子を含むDNAの３つのセグメントは、キサントモナスのゲノムのXC600部分を運ぶ組換え遺伝子から単離することができる。同様に、gumB、CとgumE、F、G、H、I、J、K、L、M遺伝子を含む２つのセグメントは単離することができる。その遺伝子は、特定の制限エンドヌクレアーゼによるXC600セグメントの切断、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用しての増幅により、作成することができ、また、その後にアガロースゲル中を電気泳動にかけることにより精製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応を使用する場合には、そのプライマーセグメントには制限エンドヌクレアーゼに特異的な配列が含まれることになる。３つのセグメントは、遺伝子オペロンの中にある遺伝子の接触セットとして、DNA結合によって組み立てられることになり、また、スフィンゴモナスの中に導入することができるプラスミドベクターの中に、DNA結合によって挿入することができる。gum領域のDNA配列（GenBank受託番号U22511、配列番号１）は、個々のgum遺伝子の位置、入手可能な制限ヌクレアーゼ部位と、ポリメラーゼ連鎖反応に特異的なプライマーを合成するのに必要な配列を提供する。上述の組換えDNA法のすべては当技術分野において平均的な技術を有する者にとっては、日常的なものである。そのプラスミドは、いくつかの広範な宿主範囲可動ベクターの１つ、例えば、pRK311となることができる。代替的には、外来遺伝子は、スフィンゴモナスによっては自律的に複製できないベクタープラスミドを使用することによりスフィンゴモナス染色体の中に挿入することができる。代替DNA配列は、RNAポリメラーゼに対する遺伝子調節配列、プロモーター配列、あるいはリボソーム結合配列などの遺伝子発現を修飾あるいは刺激する組み立てられたセグメントの中に挿入することができる。これらの方法を部分的に変更して使用することによって、gumF、gumG、gumL、あるいはgumD遺伝子のいずれか１つないしはその組合せの１つを欠く異なったセグメントを組み立てることができ、またそれによってアセチルおよび/またはピルビル側基を欠くキサンタンガム、あるいは、外来グリコシル転移酵素遺伝子がGumD機能を代替する、グリコシル転移酵素GumDを欠くキサンタンガムを産生することができる。
代替的には、タンパク質の特定アミノ酸配列を改変するために、部位特異的突然変異原によってgumF、gumG、gumL、あるいはgumD遺伝子のいずれか１つ、あるいはいずれかの組合せを不活性化することができる。この突然変異原に対して入手可能な方法には、挿入配列あるいはトランスポゾンなどのDNA配列あるいは外来DNAに対する化学的な変化が含まれる。
前出の例は本発明の例示的また説明的なもののみであり、本発明に関して制約的なものではないと理解されるべきである。以下の請求項により定義されているように、本発明の範囲から逸脱することなく当業者により、さまざまな変更が上述の実施様態に対してなされることであろう。
配列表
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【図１】
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【図２】
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