(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人に感染し発病させる全ての抗酸菌のうち、結核菌と牛型結核菌が増殖中に産生し、残りの殆どの抗酸菌が産生しない蛋白質のうちの一種であるＭＰＢ６４精製蛋白質に、前記ＭＰＢ６４精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至１００部重量比の割合で、かつ試薬全量に対し０．１乃至０．００２％の非イオン界面活性剤と共に混合してあることを特徴とする活動性結核診断用試薬。
【請求項２】
前記請求項１記載の試薬を第１試薬とし、これと人に感染し発病させる全ての抗酸菌のうち、前記結核菌は産生せず、前記牛型結核菌が増殖中に産生する蛋白質のうちの一種であるＭＰＢ７０精製蛋白質に、前記ＭＰＢ７０精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至７５部重量比の割合で、かつ試薬全量に対し０．１乃至０．００２％の非イオン界面活性剤と共に混合してある第２試薬よりなり、前記第１試薬と第２試薬との組合せよりなる請求項1記載の活動性結核診断用試薬。
【請求項３】
前記第１試薬と第２試薬と人に感染し発病させる全ての抗酸菌が増殖中に産生する蛋白質のうちの一種であるＭＰＢ５９精製蛋白質に、前記精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至７５部重量比の割合で、かつ試薬全量に対し０．１乃至０．００２％の非イオン界面活性剤と共に混合してある第３試薬よりなり、前記第１試薬、第２試薬及び第３試薬との組合せよりなることを特徴とする請求項２記載の活動性結核診断用試薬。
【請求項４】
前記非イオン界面活性剤はツイーン８０であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の活動性結核診断用試薬。
【請求項５】
試薬とパッチバンドとよりなり、前記試薬は前記請求項１又は４記載の試薬であって、前記パッチバンドには内面に織布、編布、不織布、合成樹脂製のスポンジのうちの一種であって、直径乃至１辺が７ｍｍ乃至１５ｍｍである親水性パットを備え、前記パッチバンド、親水性パットのうちの少なくとも一方背面は疎水性としてあるものであることを特徴とする活動性結核診断用試薬キット。
【請求項６】
試薬とパッチバンドとよりなり、前記試薬は前記請求項２又は４記載の第１試薬と第２試薬よりなる試薬、又は前記請求項３又は４記載の第１乃至第３試薬よりなる試薬であって、前記パッチバンドには内面に織布、編布、不織布、合成樹脂製のスポンジのうちの一種であって、直径乃至１辺が７ｍｍ乃至１５ｍｍである親水性パットを備え、前記パッチバンド、親水性パットのうちの少なくとも一方背面は疎水性としてあるものであることを特徴とする活動性結核診断用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は活動性（感染性）結核の診断薬、試薬キット及びその活動性結核症の検出乃至診断方法に関する。
特にこの発明は抗酸菌抗原を含むパッチからなり、活動性結核の検出と診断に充分な免疫応答を刺激する前記パッチの応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人類の伝染病は古代からはびこっており、結核は２５０年以前より古くから主な死亡原因であった。
抗酸菌症は今でも限られた医療設備しかない国々においては、主な病気又は死亡の原因であり、免疫力の弱まった患者では極めて強力な伝染力を持っている。
３７種を超える抗酸菌が発見されているけれども、人に感染するものの９５％以上は６つの種によって引き起こされる。即ち、結核菌（Ｍ．tuberculosis）、Ｍ．アビウムーイントラセルラーレ（Ｍ．avium−intracellulare）、Ｍ．カンサシー（Ｍ．kansasii）、Ｍ．フオルチュータム（Ｍ．fortuitum）、Ｍ．ケロネー（Ｍ．chelonae）、らい菌(Ｍ．leprae)である。
【０００３】
人にとって最も一般的な抗酸菌症は結核菌、牛型結核菌（Ｍ．bovis）、Ｍ．アフリカヌム(Ｍ．africanum)によって引き起こされる結核（ＴＢ）である（メルクマニュアル１９９２）、典型的な感染は、末端の通路に到達可能な感染粒子を吸い込むことから始まる。
続いて肺胞のマクロファージに取り込まれた菌は自由に増殖でき、その結果食細胞を破壊する。破壊は感染局所への更なるマクロファージや白血球が集積する原因となり、そこで最終的に破壊が起きる、というカスケード（連続反応）効果を確実にする。
【０００４】
病気は局部リンパ節や血流そして骨髄，脾臓、腎臓、骨そして中枢神経系統などの他の組織にまで移動する感染したマクロファージによって初期段階で更に広まる（マレー、他、メディカル  マイクロバイオロジー、[ Murray et. al．Medical Microbiology ]  ）。
【０００５】
ＷＨＯは免疫拡大計画（ＥＰＩ）や直接監視下短期治療（ＤＯＴＳ）のような計画を提案して，結核との戦いを推進している。結核撲滅のためには，診断，治療そして予防が同じくらい重要である。活動性の結核患者を早く発見できれば、早期治療につながり、それによっておよそ９０％の治癒が期待できる。それゆえ、早期診断が結核との戦いには不可欠である。
【０００６】
結核は有史以来ほとんどの期間人類にとって主要な病気であり続けた。病気の発生は少なくとも１９世紀中頃から生活水準の向上に伴って下降してきた。しかしながら、世界中の幾多の保健機関の努力にもかかわらず、結核の撲滅は達成されなかった。それどころか，撲滅は緊急の課題である。世界人口の３分の１近くが結核菌に感染しており、年間約８００万人が発症し、約３００万人が結核が原因で死亡している。
【０００７】
数十年間下降傾向が続いた後、結核は又増えている。米国では、１，０００万人が感染していると見られている。１９９０年には、新しい感染例として２８，０００件近い数字が報告されているが、これは１９８９年の９．４％増である。１９８５年から１９９０年の間、１６％の増加が見られた。
【０００８】
結核は活動性の感染者が生菌を含む " 核滴" を咳、或いはくしやみによって，空気中に撒き散らしたとき、これら核滴を含む空気を第三者が吸い込み，経気道的に結核菌が体内に取り込まれる。  従って、人口過密な生活環境や空間の共有が特に結核の蔓延の原因になっており、米国で観察された刑務所の同房人や大都市におけるホームレスにみられる結核感染の根底をなしている。
【０００９】
一時は減少傾向にあると思われていた結核感染が健康への深刻な脅威として又復活してきた。人が密集している地域や標準以下の住宅環境に住む人は、結核に感染している人がますます多くなっていることがわかっている。免疫力の弱っている人は抗酸菌に感染し、それが原因で死亡する危険が高い。人ごみの多いところ、例えば刑務所やスラム街は人から人へ伝染しやすい場所である。薬剤に対し抵抗力のある結核菌の出現で感染者に対する治療が一層難しくなった。
世界的にみれば抗酸菌に感染している人の多くは貧しい人か、医療施設が不充分な地域に住む人たちである。そうした人たちは抗酸菌感染の検査を受けるのは容易ではないし感染を発見するために安価で皮膚を損傷しない方法が必要である。
さらに，服役中やホームレスの人たちは医療設備が不充分で肉体的にも劣っているのが普通であるので，そうした人たちに拘わる結核対策は成功していない。
【００１０】
抗結核薬として最も効果のあるもののうち、少なくとも２つの薬剤であるリフアンピシン（ＲＦＰ）とイソニアジド(ＩＮＨ)に対し抵抗力を持つ結核の発生が病院の施設から報告され、ＨＩＶ陰性者への感染も警告されている。
米国ではエイズ（ＡＩＤＳ）患者のうち、約半数が抗酸菌に感染し、特に重い合併症になっている。その結果感染すると致命的な感染症に発展するものがしばしばである。
【００１１】
薬剤耐性結核菌（ＭＤＲ−Ｍ．tuberculosis
）の出現で極めて状況が悪化している。少なくとも一種の標準的薬剤に抵抗力のある新しい結核症例の率は１９８０年代前半の１０％から１９９１年には２３％に増えている。現在は，すべて結核症例の７％が少なくとも一種の薬剤に抵抗力があり、これは１９８０年前半の数の２倍を超えている。
さらに結核以外の抗酸菌もＡＩＤＳ患者を苦しめる日和見感染症の要因としてますます問題となっている。ＭＡＣ（マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラーレコンプレックスMycobacterium  avium−intracellulare  complex）からの菌、とくに血清型４と８は、ＡＩＤＳ患者からのミコバクテリア分離の６８％を占めている。
ＡＩＤＳ患者からは極めて多数のＭＡＣがみつかり（組織グラム当たり１０10 抗酸菌）、その結果感染したＡＩＤＳ患者の予後は悪い。
【００１２】
ミコバクテリウム．アビウム菌（Mycobacterium  avium）を含む抗酸菌はマクロファージのような宿主の中で生育できる細胞内寄生菌である。抗酸菌の生育は遅くエンドキシンを産生せず、そして非運動性である。
ミコバクテリウム．アビウム菌はマクロファージ内で増殖し、マクロファージを殺し、また新たなマクロフアージに取り込まれ、再びこの過程を繰り返す。
【００１３】
宿主の抵抗力はマクロファージの活性に依存する。
活性化したマクロファージは細胞内に宿るバクテリアを殺すことができる。この活性は抗酸菌の蛋白に対する細胞性免疫反応の結果として産生された特異的Ｔ細胞に影響される。
【００１４】
抗酸菌による感染はマクロファージ内での抗酸菌の生存能力と効率的なマクロファージを活性化する宿主の能力との間にある微妙なバランスにある消耗戦に例えられて来た。迅速に機能する抗感染物質があるときは治療の結果は宿主に味方するように傾く。
【００１５】
抗酸菌の毒性に関与する要因については、はっきりしたことが判っていない。コロニーの形態や毒性に関与するものとして多くの研究者が細胞壁やバクテリア表面の脂質を挙げている。研究結果によればある種の抗菌酸細胞の表面によるＣ−ミコサイド（Ｃ−mycosides）がマクロファージ内で菌の生存を促進するのに重要であると示している。コードファクターであるトレハロース６、６ジミコレート（Trehalose  ６、６' dimycolate）は他の抗酸菌に見られた。
【００１６】
ミコバクテリウム・アビウム菌は、いくつかの区別できるコロニー形態をつくる。通常の実験室用の培地で透明で粗いコロニーとして生育する菌は組織培養中のマクロファージ内で増殖し、感受性マウスに接種すると毒性を示し、抗生物質に抵抗力を示す。
実験室の培地で継代された粗く透明なコロニーを作る菌が野生型のくすみを帯びたコロニー形態を生じたときはしばしばマクロファージ内で生育できず、マウスに対して非毒性となり、抗生物質に対して非常に感受性となる。
【００１７】
ミコバクテリュウム・アビウム菌の透明で粗いコロニーを作る株と不透明なコロニーを作る株とのコロニー形態の違いは、ほぼ間違いなく防御カプセルとして作用する透明で粗い菌の表面を覆っている糖脂質のためである。このカプセルまたは被覆物は明らかに、リソゾーム酵素や抗生物質から有毒ミコバクテリウム・アビウム菌を守るＣ−ミコサイドから主に構成されている。対照的に無毒性の不透明なミコバクテリウム・アビウムの形態は表面に殆どＣ−ミコサイドが存在しない。抗生物質やマクロファージに殺されることに対する抵抗力は、両方ともミコバクテリウム・アビウム菌の表面にある障害物質によるものである。
【００１８】
結核診断は病原菌の分離と同定で確認されるが簡便な診断は喀痰塗抹、胸部X線検査や臨床的症状を基本とする。
【００１９】
培地上での抗酸菌の分離は４乃至8週間かかる。種の同定はさらに２週間を要する。迅速に抗酸菌を検査する方法は他にも幾つかある。例えばポリメラーゼチェーン反応（Polymerase  chain reaction [ＰＣＲ] ）、ＭＴＤ（Mycobacterium  tuberculosis  direct  test）、放射線ラベルを使う試験方法などがあるが、これらの方法は材料や機械器具に多額の費用がかかる。
広範囲に使用されている診断方法のひとつはツベルクリン皮膚試験である。種々の皮膚試験があるけれども，特に２つのツベルクリン抗原が使われている。
つまり旧ツベルクリンと精製ツベルクリン（ＰＰＤ）である。抗原を皮膚内に注射するか、抗原を局所に塗り付けて，多刺器具を使って皮膚内に経皮的に入れるタインテストの方法がある。
【００２０】
これら皮膚試験の診断法にはいくつかの問題がある。例えば前記タインテストは皮膚内の層へ注入される抗原量を正確にコントロールできないので、普通薦められない（マレー他、メディカル  ミクロバイオロジー、Ｃ．Ｖ．モビス・カンパニー[Murray  et.al.Medical  Microbiology  The  Ｃ．Ｖ．Mobsy  Comnpany]２１９−２３０「１９９０」参照）。
【００２１】
ツベルクリン皮膚試験は通常大変早くかつ正確に結核感染者を見つけられるが、しばしば誤診となる。つまり陽性の結果には活動性結核患者のみならず、ＢＣＧ接種を受けた人や、結核菌に感染はしたが発病しなかった人々もふくまれるからである。
それゆえにツベルクリン皮膚試験によって活動性結核患者を他の陽性反応の人から区別する事は難しい。
更にツベルクリン皮膚試験は結核以外の抗酸菌（ mycobacteria  other than ＴＢ＝ＭＯＴＴ）に感染した人と交差反応を起こす。よって，現在利用できる皮膚試験を用いた診断はしばしば誤りや、不正確さの原因となる。
【００２２】
必要なのは、活動性結核の人と、抗酸菌に感染したが活動性の病気ではない人、あるいはＢＣＧ接種を受けた事のある人のような免疫的に影響を受けている人と区別する安価な方法である。さらに、活動性結核とその治癒の途上または以前羅患したことを区別できる試験のような、抗酸菌に感染した人に対してする薬物療法の効果を監視する方法がない。更に、必要なのは子供に簡単に適用できる試験方法である、というのは注射針や接種器具を含めて現在使われて皮膚試験には子供が特に恐怖を感じているからである。被接種者の皮膚表面を傷つける方法でない試験法は、保健従事者が被試験者の体液に接触することを最小限にし、被試験者中に存在するかもしれない伝染性病原の感染を少なくする。ホームレスや刑務所の結核患者を検査するとき、簡単に試験でき、結果が陽性か陰性かを簡単に決定できる試験方法が肝要である。
【００２３】
先願たる特開平８−３４２０９号には東京ＢＣＧ東京株と培養した培養済みの培地に含まれるＭＰＢ６４とＭＰＢ７０をそれぞれ分離精製し、これらをそれぞれ適量の軟膏に混合し、ＢＣＧ接種したモルモットと結核に感染したモルモットの双方の皮膚に塗布して実験したところＢＣＧ接種によるツベルクリン陽転したモルモットは共に陽性の反応を示し、結核菌に感染したものはＭＢＰ６４に対しては陽性であるがＭＰＢ７０に対しては陰性であった旨が記載されている。
更に本件発明者は実験を重ねたところ、ＭＰＢ６４の皮膚塗布テストはＢＣＧ接種によるツベルクリン陽転したモルモットにおいて、初期の凡そ１３週までは陽性を示すが、その後においては、疑陽性から陰性を示し変化し、２３週を過ぎればＭＰＢ６４が陰性になることを知見した。
【００２４】
ＭＰＢ６４は結核菌（Ｍ．tuberculosis）群に特異な抗酸菌抗原である。
最初にハーボエ（Harboe）など（Infect．Immun．１９８６）によってＭＰＴ６４として述べられていたが、 その後いろいろの研究所で研究され使われてきた。“ＭＰＢ６４”と“ＭＰＴ６４”は同じ抗原である。ＭＰＴ６４は結核菌（Ｍ．tuberculosis）の培養濾液から分離したもので、ヒト型結核菌の抗酸菌蛋白（mycobacterial protein of  tuberculosis）と名づけられた。ＭＰＢ６４はその後牛型結核菌（Ｍ.bovis）またはＢＣＧの培養濾液から分離されたので牛型の抗酸菌蛋白と名づけられた。その後、両方の蛋白は同じ物であることがわかった。従って、“ＭＰＢ６４”と“ＭＰＴ６４”は結核菌(Mycobacterium  tuberculosis）、牛型結核菌（Mycobacterium  bovis）、そしてある種のＢＣＧ株（Mycobacterium bovis  ＢＣＧ）から分泌されるものである。この蛋白はバクテリアの生育中に分泌され、モルモット、人及び牛で遅延型過敏症（ＤＴＨ）を引き起こす。
またＭＰＢ７０はＭ．ボビスは産生するが、結核菌及びＭ．アビウム．イントラセルラーレは産生しないことが既に知られている。
また、ＭＰＢ５９は、すべての抗酸菌が産生すること及びＭＰＢ４４及びＭＰＢ８３については、出願人会社内で非公開で実験したところ今般結核菌が産生することを知見した。
またこれらＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９、は前述したように、それぞれ少なくとも抗酸菌の一種から産生するものであるが、他の抗酸菌以外の病源菌が産生すると云う論文などの報告は本件発明者及び出願人会社が調査した範囲では全く聞いていない。
また、前記本件出願人が開発したＭＰＢ６４が活動性結核の動物に対して遅延型過敏症を発症することに着目し、又ＭＰＢ７０は前記遅延型過敏症を発症しないことに着目し、活動性結核の検出、及び活動性結核以外の非結核抗酸菌症かどうかの判断が可能となることを知見した。抗酸菌の種類と産生する蛋白質の一例を示せば表１の通りである。
【００２５】
【表１】
抗酸菌種と分泌蛋白一覧表
0004323600.tif 000002
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
発明の目的は、活動性結核を検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供する事である。
もうひとつの目的は、皮膚に局部貼付を行う方法によって活動性結核を検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、結核菌（Mycobacterium
tuberculosis ）によってひきおこされる活動性の病気を検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、牛型結核菌（Mycobacterium  bovies）によって引き起こされる活動性の病気を検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、抗酸菌によって引き起こされる活動性の病気を検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、局部に貼付けた抗原がＭＰＢ６４であり、抗酸菌によって引き起こされる活動性の病気を免疫学的な方法により検出するための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、試験法が易しい鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、治療効果を監視するため活動性結核検出の鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、結核菌（Ｍ．tuberculosis ）のような抗酸菌によって引き起こされる活動性の病気の診断と検出のための鋭敏な試薬の組み合わせ、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、家庭内の接触による抗酸菌によって引き起こされる活動性の病気を検出する鋭敏な試薬、
並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、化学療法後の結核患者の臨床状況を監視する鋭敏な試薬
、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、活動性結核にかかっている子供達のための鋭敏な試薬、並びに検査乃至診断方法を提供することである。
もうひとつの目的は、人間の結核のみならず、牛の活動性結核の診断にも適応させる試薬及び診断方法を提供することである。
【００２７】
【課題を解決する手段】
前記課題を達成する為にこの発明は人に感染し発病させる全ての抗酸菌のうち、結核菌と他の抗酸菌たる牛型結核菌が増殖中に産生し、残りの殆どの抗酸菌が産生しない蛋白質と同種の精製蛋白質に、前記精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至７５部重量比の割合で、極少量の非イオン界面活性剤と共に混合してあることを特徴とする活動性結核診断用試薬とする。
また前記課題を達成する為にこの発明の活動性結核診断用試薬の前記精製蛋白質はＭＰＢ６４であることを特徴とすることが好ましい。
【００２８】
また前記課題を達成する為にこの発明の活動性結核診断用試薬の前記請求項１、２のうちのひとつの試薬を第１試薬とし、これと人に感染し発病させる全ての抗酸菌うち、前記結核菌は産生せず、前記請求項１記載の牛型結核菌が増殖中に産生する蛋白質と同種の精製蛋白質に、前記精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至１００部重量比の割合で、極少量の非イオン界面活性剤と共に混合してあることを特徴とする活動性結核診断用試薬を第２試薬とし、前記第１試薬と第２試薬との組合せよりなる活動性結核診断用試薬とする。
前記第２試薬の精製蛋白質はＭＰＢ７０であることを特徴とすることが好ましい。
【００２９】
また前記課題を達成する為にこの発明の活動性結核診断用試薬の前記第１試薬と第２試薬と人に感染し発病させる全ての抗酸菌が増殖中に産生する蛋白質と同種の精製蛋白質に、前記精製蛋白質が稀釈液１００部中に１乃至７５部重量比の割合で、極少量の非イオン界面活性剤と共に混合してあることを特徴とする活動性結核診断用試薬を第３試薬とし、前記第１試薬、第２試薬及び第３試薬との組合せよりなる活動性結核診断用試薬とする。
また前記課題を達成する為にこの発明の活動性結核診断用試薬の前記第３試薬の精製蛋白質はＭＰＢ５９であることを特徴とすることが好ましい。
【００３０】
また前記課題を達成する為にこの発明の請求項１、２、３、４、５又は６記載の活動性結核診断用試薬の前記非イオン界面活性剤はツイーン８０であり、その含有量は前記試薬に対し０．１乃至０．００２％であることを特徴とすることが好ましい。
【００３１】
また前記課題を達成する為にこの発明は試薬とパッチバンドとよりなり、請求項１、２又は７記載のうちのひとつの活動性結核診断用試薬とパッチバンドとよりなり、試薬は前記請求項１、２又は７記載のうちの一つの試薬であり、前記パッチバンドはその内面に織布、編布、不織布、合成樹脂製スポンジなどよりなる直径乃至１辺が７ｍｍ乃至１５ｍｍである親水性パットを備え、前記パッチバンド、親水性パットの背面のうちの少なくとも一方は疎水性としてあるものであることを特徴とする活動性結核診断用試薬キットとする。
【００３２】
また前記課題を達成する為にこの発明は前記第１試薬と第２試薬、第１乃至第３試薬のうちの１つの前記試薬キットとパッチバンドとよりなり、前記パッチバンドはその内面に織布、編布、不織布、合成樹脂製のスポンシ゛の１種よりなる直径乃至１辺が７ｍｍ乃至１５ｍｍである親水性パットを備え、前記パッチバンド、親水性パットの背面のうちの少なくとも一方は疎水性としてあるものであることを特徴とする活動性結核診断用試薬キットとする。
【００３３】
また前記課題を達成する為にこの方法発明は請求項１、２、７記載のうちの一種の試薬とパッチバンドを用い、前記パッチバンドまはその内面に織布、編布、不織布、合成樹脂製スポンジなどよりなる直径乃至１辺が７ｍｍ乃至１５ｍｍである親水性パットを備え、前記パッチバンド、親水性パットの背面のうちの少なくとも一方は疎水性としてあり、その親水性パットに前記請求項１又は２記載の試薬を５０μＬ乃至２００μＬ含浸させ、前記パッチバンドを被検体の皮膚に1日乃至７日間貼り付けて固定し、その後剥離して皮膚の遅延型過敏反応の有無を判定することを特徴とする活動性結核症検出方法とする。
【００３４】
また前記課題を達成する為にこの方法発明は前記請求項１０の方法において，試薬として請求項１、２記載の試薬に代え請求項３、４、７のうちの試薬の組合せよりなる一種のキットを用い、第１試薬と第２試薬をそれぞれ別のパッチバンドの前記親水性パットに含浸させ、これら前記パッチバンドをそれぞれ同時乃至経時的に皮膚に1日乃至７日間貼り付けて固定し、その後剥離してそれぞれのパッチバンドの皮膚の遅延型過敏反応の有無を判定することを特徴とする。
【００３５】
また前記課題を達成する為にこの方法発明は前記請求項１０の方法において，試薬として請求項１、２記載の試薬に代え請求項５、６、７または請求項９記載のうちの一種のキットを用い、
第１試薬と第２試薬と第３試薬をそれぞれ別のパツ チバンドの前記親水性パットに含浸させ、これら前記パッチバンドをそれぞれ同時乃至経時的に皮膚に1日乃至７日間貼り付けて固定し、その後剥離してそれぞれのパッチバンドの皮膚の遅延型過敏反応の有無を判定することを特徴とする。
【００３６】
発明の作用
前記請求項1、2または７記載の発明を用いる方法及請求項８記載の試薬とパッチバンドからなるキットを用い、請求項１０記載の検出方法を説明する。
まず、被検体（人、牛など）の皮膚の一部、人間の場合は前腕の一部の局所をアルコールなどの消毒剤で清潔にし、請求項１、２乃至７の試薬を用い、若しくは請求項８のキットのうちの試薬を用い、この試薬５０μL（マイクロリットル）乃至２００μＬを前記パッチバンドの親水性のパットに含浸させ、この含浸面を前記局所に貼付けしっかりと皮膚に固定する。
【００３７】
このようにすると、前記皮膚と試薬は密着し、その貼付位置は移動せず試薬中に含まれるツイーン８０で代表される非イオン界面活性剤の作用により、皮膚は試薬を疎水することなく完全に密着し、時間の経過と共に皮膚内に浸透する。
前記親水パットの外側は、疎水性の膜乃至バンドで覆われているから、試薬が、これらの層を通して、外部に発散するのを制限し、有効に皮膚に継続的に供給する。
パッチバンドを貼付後１日乃至７日、好ましくは１日乃至５日後、通常3日後にパッチバンドを被検体の皮膚より剥離する。
この結果、活動性結核が発症している被検体においては、その部分の皮膚が遅延型過敏反応により、発赤、硬結、赤い小斑点が見られ、そうでないものは反応がない。
但し、モルモットにおいてはＢＣＧ接種後、１０週に満たないものは、同様な反応がみられたが、１３週を過ぎる頃より疑陽性となり２３週以後は全く陰性となった。
【００３８】
また、請求項３、４または７記載の試薬、他前記請求項９の試薬とパッチパンドキットを用い請求項１１記載の方法を説明する。
前述の請求項１０同様に、各試薬毎に別のパッチバンドを用い、前記と同様の量の試薬を含浸させ同様に皮膚に貼る。このとき異なる試薬のパッチバンドは同時に貼りつけても，或いは別々の時，即ち経時的に貼りつけてもこの発明としては同じである。即ち、一方のパッチテスト後、１時間後乃至数週間後であっても、この発明としては同じである。
【００３９】
また、請求項5、6または７記載の複数の試薬の他、前記請求項10の試薬とパッチバンドキットを用い請求項１2記載の方法を説明する。
前述の請求項１０同様に、各三種の試薬毎に別のパッチバンドを用い、前記と同様の量の試薬を含浸させ同様に皮膚に貼る。このとき異なる試薬のパッチバンドは同時に貼りつけても，或いは別々の時，即ち経時的に貼りつけてもこの発明としては同じである。即ち、一方のパッチテスト後、１時間後乃至数週間後に他のパッチテストを行っても、この発明としては同じである
【００４０】
【発明の実施の形態】
実施形態１
請求項1、2乃至請求項7記載の発明を含む試薬である。
ＭＰＢ６４蛋白としては人型結核菌、牛型結核菌若しくはＢＣＧ東京株、ＢＣＧロシヤ株、ＢＣＧスエーデン株、ＢＣＧモロー株（ブラジル）（これらは一般に結核菌コンプレックスと総称されている）のうちの一種のＢＣＧ株から分泌したＭＰＢ６４蛋白をそれぞれ精製したものを用いる。要するに、少なくともをＭＰＢ６４を産生するＢＣＧ株であればどれでもよい。前記のＢＣＧ東京株はその他ＭＰＢ４５、ＭＰＢ５１、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８３を産生するので、これより一括分離精製でき、作業性がよい。しかし結核菌、牛型結核菌、その他の抗酸菌からの製造も可能であるが、これら抗酸菌からの製造は感染の危険性があるので奨められない。
またこれらの菌株のうちよりＭＰＢ６４他ＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ４５又は／及びＭＰＢ８３などをを産生する遺伝子を抽出し、他の病原性の低い菌株であって増殖の旺盛な菌に遺伝子組替技術により組み込まれた菌株を作り、これを培養し、この菌株より産生するＭＰＢ６４などの蛋白質を用いても、この出願の発明の範囲である。
このＭＰＢ６４その他の前記蛋白質を稀釈液に混合する。稀釈液としてはリン酸緩衝液、生理的食塩水の一種を用いるが、一般にはリン酸緩衝液が好ましい。
前記ＭＰＢ６４と稀釈液の混合比は稀釈液１００部に対して、重量比で1乃至７５部が好ましい。稀釈液１００部に対して７５部乃至５０部として用いたが,前述の遅延型過敏反応が充分であれば、ＭＰＢ６４の混合比はもっと低くとも例えば５０部乃至２０部であっても、この発明の範囲である。
更に試薬には人体に無害な非イオン界面活性剤、好ましくはツイーン８０（Polyoxyethyelene  sorbitan  mono―oleate）が稀釈液に対して０．１乃至０．００５％の割合で混合してある。ツイーン８０の外、  ツイーン６０、ツイーン４０、ツイーン２０は勿論の事、他の非イオン界面活性剤であってもよい。
これら試薬は５０μL乃至２００μL（マイクロリットル）とし、或いは４乃至５人分を一つのプラスチック容器か、ガラスアンプルに密封してあり、一回の検査で全量使い切る。これらの容器に封入する量は、単一個人の検査用か、集団検査用かによって使い分ける。
前述のＭＴＢ６４は請求項１の発明においては一例であり、結核菌のみが産生する他の蛋白質と置き換えても請求項１記載の発明の実施の形態の一部である。
【００４１】
実施の形態２
前記請求項８、９のキット及び１０乃至１２の方法に用いられるパッチバンドとしては疎水性の粘着パッチバンドである。前記パッチバンドの中央部には直径または幅は７ｍｍ乃至１５ｍｍのガーゼなどの織布、不織布、編布、合成樹脂製のスポンジなどよりなる親水性パットが付着させてある。好ましくは４枚折り程度のガーゼ、若しくは厚さ０．５乃至１．５ｍｍの不織布がよい。
前記パッチバンドは疎水性である事が好ましいが、疎水性でない場合は、親水性パットのパッチバンドとの接着面
（ 境界面 ）が疎水性膜で覆われているものも,この発明のパッチバンドに含まれる。
パッチバンドの一例としては、トリイ（Toii's）バンドが好ましいが、これに限定されるものではない。要は汗や、水に濡れても剥離せずパッチバンドの粘着剤でアレルギー反応を起こさないものであればよい。
【００４２】
実施の形態３
請求項１０、１１、１２記載の検査方法の発明に関する実施の形態である。
本件発明の試薬の対照として、通常市販のツベルクリン（ＰＰＤ）を用いるが或いはＢＣＧ培養後の培地よりすべての蛋白をそのまま精製し、これを市販のツベルクリンと区別するためにＰＰＤ―ｅＴと命名したものを使用した。ＰＰＤ―ｅＴも市販のツベルクリンも同様の反応を示すものである。その他ＢＣＧ培養液培地より精製した活動性結核と反応としない他の蛋白質を用いることもできるが、実質上余り意味がない。
ＭＰＢ６４としては実施形態１のものを用い、パッチバンドとしては実施の形態２のものを用い行った。
この発明において、上記趣旨に反しない限り、試薬は中の精製してある前記蛋白質の濃度の変更、パッチバンドの形態種類の変更、診断手順の変更があっても、これら発明の範囲に含まれる。
【００４３】
【発明の効果】
請求項１、２及び７記載の試薬並びに請求項８記載のキット中の試薬においては、前述の通りの構成であり、特に非イオン界面活性剤が、前述の通り混合してあり、試薬の主成分たる蛋白質は活動性結核と反応するものであり、特にＭＰＢ６４は水溶性蛋白であることと、相俟って均質的な材質となり、且つ全体が水溶性であるから皮膚から浸透し易く、テスト結果にバラツキが少なく、また被検体皮膚との親和性があり、試薬は皮膚から分泌された脂肪分で撥じかれることなく密着し、試薬は除々に毛穴や汗腺を通って体内に入る。このとき試薬の量はわずかであるが、パット内の試薬は１乃至３日の間は継続的にパットから供給されることにより少ない試薬でも充分な反応が得られ、特に、抗酸菌症のものと特異的反応を起こし、活動性結核被検体を迅速に選別できる。特にＢＣＧワクチン接種後、活動性結核となったものは従来のツベルクリンテストだけでは単なるツベルクリン陽転者と見分けができなかった者も、この試薬によるテストのみで簡単に区別することができる。
【００４４】
特に請求項２記載の発明においては蛋白質としてＭＰＢ６４を用いるから、人に結核を引き起こす前記結核菌はＭＰＢ６４を産生するから、結核菌に感染しているものは、本件試薬と確実に前記の反応を起こし、これを検出する事が出来る。同様に牛型の結核はＭ．ボビス(Ｍ．bovis)により起り、牛型結核症であることも検出でき、被検体を牛にも活用し得る。
またこれら試薬は請求項１０記載の検査方法に使用でき、この方法は前記の試薬をパッチバンドに含浸させて、単に貼り付けるだけの方法であるから、充分な医療設備のないところでも使用でき、また注射のように被検体、特に患者を傷つけることなく、子供にも恐怖を与えずに実施可能となる。
また、この検査乃至診断方法を実施する側のものは患者や自分を傷つける恐れのある道具例えば、メスや注射器を使用せず、感染のおそれのある患者の体液に触れる必要がないから、検査または診断従事者を結核感染から遠ざける効果を有する。
レントゲン検査や、その他の検査に比較して費用も格段に安くでき、殊に幼稚園、小学校などの生徒、刑務所の囚人、ホームレス者などの集団の中から感染の危険性のある活動性結核患者を迅速に選別でき、結核の蔓延を阻止乃至縮小することに寄与するものである。
【００４５】
医師や看護人でなくとも、正確にさえ貼付すれば補助者でも貼付でき、後剥離し,判定を受けるときにのみ医療機関に出頭すればよく、交通不便な土地や、発展途上国において、極めて、利用価値の高いものである。
また、この発明の試薬及び請求項１０記載の検査方法は、一旦活動性結核となった患者が、治療の結果、病気が治癒した場合は、この試薬によって陰性反応となるので治療効果を確かめることができ、隔離病棟に入院している患者の隔離の解放や、退院の時期の判定資料となし得る。
【００４６】
請求項３、４、７の試薬を用い、或いは請求項７のキットを用い、第１試薬と第２試薬を同時若しくは経時的に行い請求項１１記載の方法によって、その前記反応の陰陽の組み合わせにより、人型の結核、牛型の結核の区別がつく効果を奏する（表１参照）。請求項３記載の第２試薬の蛋白質としては必ずしもＭＰＢ７０でなくとも牛型結核菌のみが産生する蛋白質であれば他の蛋白質でもこの請求項１１記載の発明の範囲である。
請求項５、６及び７記載の発明の試薬を用い、或いは請求項９記載の試薬とパッチバンドよりなるキットを用い請求項１２記載の方法の実施により、前記反応の陰陽の組み合わせにより、人型の結核、牛型の結核の区別がつく効果を奏する（表１参照）。併せて他の抗酸菌症かの区別がつく効果を奏する。前記請求項５記載の発明において、第３試薬の蛋白質は全ての抗酸菌が産生する蛋白質であればＭＰＢ５９でなくとも何でも同じである。
第一段階で結核患者を検出し、そうでないものに従来のツベルクリン反応テストを行えばより安全である。ツベルクリンテストもパッチテストとすればより安全かつ簡単となる。
【００４７】
前述のパッチバンドを用いることにより、試薬は皮膚の所定位置にパッチバンドを外すまで固定され、また試薬には界面活性剤が少量含浸しているから、皮膚との馴染みもよく、より少ない試薬であっても、前記パッチバンドを通しての外方への発散は少なく充分に皮膚から浸透し、かつ１日乃至３日間継続的に浸透し所期の効果を発揮する。
また仮にツベルクリンテストを皮内注射する場合でも、先ずこの発明のパッチテスト後行えば被検体の皮膚を注射器などで傷つける事になるが,これら被検体は活動性結核ではないからこれらの被検体の体液と触れたり、飛沫を医師またはこれら検査に従事する者が経口的に吸い込むことがあっても、感染のおそれはなく、従来の活動性結核患者も含むツベルクリンテストより遥かに安全である。
【００４８】
【実施例】
ステップ１
活動性結核の新しく、簡単、かつ早期診断方法の開発を目標に,試験対象者にパッチテスト法によるＭＰＢ６４抗原に対する皮膚反応試験を実施した。
活動性結核患者５３人、ＰＰＤ陽性健常者４３人に対して、ＭＰＢ６４に対する反応が活動性結核患者に対してのみ陽性かどうかを決定する試験が実施された
。
フイリッピンのマニラ近郊の４クリニック、アワ・レデイ・オブ・グレイス区（Our  Lady  Of  Grace  Parish）、セント・ニーニョ・デ・トンド区（Sto  Nino  de  Tondo  Parish）  、カノッサ・ヘルス・アンド・ソーシャル・センター（Canossa  Health  and  Social  Center）、ヘルス・ケア・デベロプメントセンター（Health  Care  Development  Center）、からの結核患者にパッチテストが行われた。
【００４９】
活動性結核患者５３人中５２人がＭＰＢ６４に対して陽性を示したが、ＰＰＤ陽性健常人４３人中１人も陽性を示さなかった。活動性結核に対するＭＰＢ６４の特異性は１００％、感度は９８．１％、試験有効度は９８．９％であった。
ＭＰＢ６４を用いたパッチテストは、ＢＣＧワクチン接種対象者及び、結核に感染しているが発病していない対象者と活動性結核患者を区別する意味において
、活動性結核の診断に有効で正確な方法であるといえる。この発見に関する実験の詳細はステップ２で述べる。
【００５０】
ステップ２
パッチテスト法を用いた活動性結核の診断に対する特異的抗原としてのＭＰＢ６４の信頼性を評価するために、試験対象者を３つのカテゴリーに分けてその比較試験を行った。
（１）活動性結核患者
（２）ツベルクリン陽性の健常人
（３）家庭内結核接触者
ヒトにおけるＭＰＢ６４の皮膚反応と臨床症状（CLINICAL  STATUS）の相関関係を観察した。なぜなら、この試験の目的は活動性結核に対する特異抗原としてのＭＰＢ６４の信頼性を評価するものであり、活動性結核患者の選択が最も重要である。
診療所に来る外来患者の診療記録を調べた。
【００５１】
これらの中で喀痰塗抹陽性であり、異常な胸部Ｘ線検査結果を示し、活動性結核の兆候を示す臨床症状を有する対象者はグループ１に分類される。培養結果はほとんどの場合において得られなかった。化学療法をはじめて間もない患者に対してのＭＰＢ６４の皮膚反応は望ましいが長期の化学療法に対してはＭＰＢ６４皮膚反応の効果はあきらかでない。しかしながら、６ケ月間治療を受けた何人かの患者がグループ１にいる。
かれらは最近の検査において塗抹陽性であったので、活動性結核患者とみなされている。
【００５２】
患者たちは診療所の近隣に暮らしていて、そこの社会経済環境は劣悪であった。試験判定をするために彼らに３日後に戻ってきてもらうためには、彼らの住まいの地理的位置は重要であった。試験した１０５人のうち試験判定に戻ってこなかったのはわずか１２人であった。戻ってきた患者の中で５３人が最終判定に有効であった。判定結果はステップ１に記載した。残りの対象者は除外された。彼らのパッチは判定時に移動してしまったり，
剥がれ落ちてしまったりしたためである。
患者は診療記録によって篩い分けられ、塗抹陽性であり、異常な胸部Ｘ線検査結果を示し、結核を示唆する咳、熱、体重減少などの兆候を示す患者のみが活動性結核患者として選定された。
培養陽性患者が望ましかったが、 培養結果は僅かに７例しか有効ではなかった。活動性結核患者の大半は化学療法による治療を１から４ケ月間受けている人たちであった。幾人かは、試験開始時点で６ケ月間の化学療法による治療中であった。
ツベルクリン陽性の健常人のボランテイアはフイリッピン人や日本人であった
。
彼らは結核の兆候を示さなかった。試験の時点で、何家族かは結核患者と一緒に診療所を訪ねていた。彼らは結核患者に接触した家族として試験をした。すべての試験対象者に試験のアウトラインを説明し。試験に対する同意を得た。３グループにおける試験対象者の内訳は以下のとおりである。
グルーブ１：活動性結核患者５３人
グループ２：健常人（コントロール）４３人
グループ３：結核患者に接触した家族４１人
【００５３】
ＭＰＢ６４はＭボビスＢＣＧ東京株（日本ビーシージー製造株式会社から供与）の8日間培養濾液から単離した。精製された蛋白質はＰＢＳに懸濁し、−２０℃で保存した。蛋白定量はローリー法で測定した。その培養液を硫安沈殿した総タンパクをツベルクリンＰＰＤと区別するためにＰＰＤ−ｅＴと命名し、パッチテストのコントロールとして用いた。結核菌青山Ｂ株から調整したＰＰＤは日本ビーシージー製造株式会社から０．１mlの再構成バッファーに懸濁した５ＴＵのＰＰＤを用いて皮内注射によるマントーテストを行った。
【００５４】
パッチテストの材料
直径１５ｍｍガーゼサイズのトリイパッチバンド（ガーゼが中心部に予めつけてあるパッチバンド）を使用した。本件発明の試薬たる抗原溶液（０．００５％Tween８０を含む１００μLのＰＢＳに７５μｇの抗原を含む）をガーゼに染み込ませパッチを対象者の前腕に貼付した。
【００５５】
パッチテストスケジュール
活動性結核患者とツベルクリン陽性健常人の右腕にＭＰＢ６４パッチテストを
、ＰＰＤ−ｅＴパッチテストを左腕に行った。それぞれのパッチは７５μｇの抗原を含んでいる。ＰＰＤは右の前腕パッチとは異なった場所に皮内注射した。ＰＰＤ−ｅＴパッチはタンパク抗原が皮膚を通して体内に入り込む事の確認のために用いた。
もし、ＰＰＤテストが陽性でＰＰＤ−ｅＴパッチテストが陰性であれば、皮膚を通しての投与は不完全であり、この場合は試験結果から除外した。貼付のパッチは３日（７２時間）後に剥がし、反応を陽性か陰性か判定した。皮膚の部位に何も変化がなければ陰性、抗原に応答して発赤，硬結、赤い小斑点が部位に認められた場合は陽性である。前腕と上腕でパッチを貼付し比較した。パッチは判定前に、前腕（１７．６％）よりも上腕（４１．２％）の方がより剥がれ易すかった。よって、成人に対して行う試験は前腕がよい。
【００５６】
統計値
ヒトにおけるＭＰＢ６４パッチテストの結果を評価するために２×２の分割表で分析を行った。
活動性結核患者とツベルクリン陽性健常者
表２はグループ１と２におけるＭＰＢ６４に対する陽性と陰性の実際の人数を示した。全ての対象者においてＰＰＤマントーテストとＰＰＤーeＴパッチテスト陽性であった。これらの結果から以下の数値が計算される。
感度：９８．１％、特異性：１００％、疑陽性度：０％、疑陰性度：１．９％、陽性反応適中度：１００％、陰性反応適中度：９７．７％、試験有効度：９８．９％。これらの結果は、ＭＰＢ６４パツチテストが活動性結核とツベルクリン健常者を区別するのに有効な方法であることを示唆するものである。
【００５７】
【表２】
グループ１とグループ２の２×２分割試験
0004323600.tif 000003
【００５８】
結核患者に接触した家族グループ３の結核患者に接触した家族は４１人でそのうち男性１２人、女性２９人であった。パツチテストの結果を表３に示した。対象者のうち２６人が、ＰＰＤーeＴパッチテスト、ＭＰＢ６４パッチテストに対して陽性であった（６３．４％）。そして対象者の９人はＰＰＤ―eＴ陽性であつたが、ＭＰＢ６４パッチテストに対して陰性であった（２２．０％）。６人はＰＰＤーeＴパッチテスト、ＭＰＢ６４パッチテストに対して陰性であった。これら両パッチテスト陰性の対象者はＰＰＤマントーテストに対しても陰性であった。
グループ３の対象者は診療所において結核患者として登録されてなかった。それぞれのヒトは結核を示唆するいくつかの兆候が観察されたにもかかわらず、臨床上の症状は解らなかった。
【００５９】
【表３】
家族に活動性結核患者がいる人々のＭＰＢ６４とＰＰＤ−ｅＴパッチテスト
0004323600.tif 000004
【００６０】
この検査からＭＰＢ６４パッチテストが活動性結核の早期診断の有望なツールになることが強く示唆された。ＭＰＢ６４パッチテストは結核患者とＢＣＧワクチンを接種したヒト、あるいは結核感染を起こしているが発症していないヒトを、感度：９８．１％、特異性：１００％で区別することができる。パッチテストはまた技術的簡便さにおいて皮内注射より優れ、その実用性において安全である。理論付けはされていないが、パッチテストでは患者に対する反応のため抗原を連続的に供給することができると考えられている。
【００６１】
実験例１
皮膚へのパッチ法を用いた活動性結核に対する特異的診断抗原としての信頼性を決めるために、モルモツトを用いた比較検討実験を行った。
試験開始時に３００−４００ｇのモルモット（Female  albino  Ｈartley）を東京の日本医科学動物資材研究所から購入した。モルモットは日本ビーシージー製造株式会社においてＳＰＦ環境下で飼育管理した。
抗原
抗原は前記ステップ２で設定した方法と材料に従って調製した。
モルモットの免疫法
ＢＣＧ生菌ワクチン（日本ビーシージー製造株式会社製）を取扱説明書に従って再構成し、モルモット１匹あたり０．５ｍｇを、アジュバントなしで皮下注射した。モルモットはＢＣＧ注射後、４−２５週の間に試験した。
パッチテストの材料
直径７ｍｍガーゼサイズのトリイパッチバンドを使用した。抗原溶液（０．００５％ツイーン８０を含む１５μＬのＰＢＳに７５μｇの抗原を含む）をガーゼにしみ込ませそれぞれのモルモットの体毛を剃った部位に貼付した。ＭＰＢ６４を表４に示したように様々な量でパットにしみ込ませ、そのパッチバンドを、ＢＣＧで免疫したモルモットの左右の脱毛した脇腹に貼付した。
【００６２】
【表４】
モルモットパッチテストの容量依存反応
0004323600.tif 000005
【００６３】
パッチテストスケジュール
パッチは２４時間後にはがし、直ちに反応を観察した。局所の皮膚に何も変化がない場合は陰性、抗原に応答して発赤、硬結、赤い小斑点が局所に認められた場合には陽性として記録した。
ＢＣＧで免疫したモルモットにおけるパッチテストのＭＰＢ６４のドーズレスポンス（容量依存）
予め４週間ＢＣＧ東京株によって免役されたモルモットを、抗原の様々な量によるＭＰＢ６４パッチテストに使用した。パッチテストの最高投与量は７５μｇ／パッチであった。モルモットはＭＰＢ６４を２．３から７５μｇ／パッチまで様々に含んだパッチで試験した。パッチを２４時間後にはがし、反応が陽性か陰性か判定した。モルモットがＢＣＧで感作されていることを確かめるため、バッファー０．１ｍｌに溶かしたＰＰＤ０．０５μｇを皮内に注射し、皮膚反応を２４時間後に観察した。表４に容量依存実験の結果を示した。ＭＰＢ６４の反応は４．７μｇ／パッチあるいはそれより高い量で陽性であった。２．３μｇ／パッチにおいては陽性反応は観察されなかった。ＰＢＳだけを含む陰性コントロールのパッチではＢＣＧで免役したモルモットに対して何の皮膚反応も引き起こさなかった。何も免疫されていないモルモツトはＰＰＤやＭＰＢ６４に対して何の反応も示さなかった。
【００６４】
ＢＣＧ免疫モルモットのＭＰＢ６４に対する皮膚反応の時間経過
ＢＣＧ免疫モルモットのＭＰＢ６４を皮内注射によって試験した場合、ＢＣＧ免疫後１５週するとＭＰＢ６４に対する皮膚反応が消失する事が知られている。このことが真実かどうかを確認するために、モルモットをＢＣＧで免疫し、ＢＣＧ注射後さまざまな時間に於いて、ＭＰＢ６４パッチで試験を行った。個々のモルモットはブースター効果を避けるために一回の使用とした。コントロールとして、ＰＰＤ−ｅＴパッチテストを同時に各々のモルモットに対して行った。結果は図１に示した。遅延型過敏（ＤＴＨ）反応は３＋、２＋のように表した。なぜなら反応の直径は抗原量によってではなく、パッチのサイズによって規定されるからである。ＭＰＢ６４パッチテストの皮膚反応は、ＢＣＧ注射後１３週まではすべてのモルモットに対して陽性であった。それ以後は、検出困難となった。そして２３週目に完全に反応は陰性となった。これとは対称的に、ＰＰＤ−ｅＴパッチテストに関する反応は、ＢＣＧ注射後２５週の最終時点まで陽性であった。
ＭＰＢ６４やＰＰＤ−ｅＴに関する遅延型過敏（ＤＴＨ）反応はＢＣＧ注射後さまざまな時間において試験された。図１のそれぞれの点は、３匹のモルモットの遅延型過敏反応を表している。
３＋：発赤、硬結
２＋：硬結
１＋：小斑点
０  ：反応なし
モルモットにおけるパッチテストではヒトで用いられた抗原量の１／１６でも陽性を検出することが確認された。
【００６５】
前記の反応において、活動性結核に感染したもの、或いはＢＣＧ接種した場合これらが体内で増殖している限りにおいて、ＭＰＢ６４は分泌され、これに対応する免疫細胞たるＴ−細胞の活動が活発になる。
従って、その後外部から、ＭＰＢ６４が注入されると、前記Ｔ−細胞が反応し、遅延型過敏反応を起こすと考えられている。
よって、ＢＣＧ接種後しばらくするとＢＣＧの活動は停止し、前記免疫細胞も活動を停止、その後ＭＰＢ６４の侵入には何の反応も起こさない。同様に活動性結核菌も活動を停止乃至死滅すればＭＰＢ６４を分泌せずＭＰＢ６４との遅延型過敏反応は起こさないことになる。
つまり、細胞の細胞性免疫反応を利用したものである。
【００６６】
この反応のメカニズムは先ず抗原が抗原提示細胞によって感作Ｔ細胞に示され
感作Ｔ細胞から放出したサイトカインが次の細胞群を活性化し、更にその細胞から出る前記のサイトカインが、また別の細胞群を活性化し，と言う何段階もの細胞性の反応が関与し、実際の局所反応が見られるまでに時間がかかると推測される。
遅延型過敏反応では先ずＴ細胞からＩＬ−２（インターロイキンー２）が出て、これより単球や、内皮細胞のＩＬ−１、ＴＮＦ−αの産生が促進すると考えられる。
【００６７】
ＩＬ−１はマクロファージから出るが、同時にマクロファージを活性化し、ＩＬ−８やＩＬ−１２などのサイトカインを出させる。
ＩＬ−８は好中球を誘引し、ＩＬ−１２はＴ細胞やＮＫ細胞やマクロファージを活性化する。更にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６などが他の細胞を活性化し、局所へと誘引する働きをする。
【００６８】
反応時間と共に局所への細胞の集合が強まり、この反応を強めるものと推測される。
この反応は通常７２時間から９６時間まで続き、その後は抗原が局所から消失するため反応は終息し、皮膚は元の状態に戻る。反応の終息にはＴＧＦ−βの関与もあるものと考えられる。
従って活動性結核に感染している者はこの結核菌が活動している限り、ＭＰＢ６４を産生し続けるから、ＭＰＢ６４を含む試薬に対し、反応する事になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＢＣＧを接種したモルモットのＰＰＤーｅＴとＭＰＢ６４に対する遅延型過敏反応の時間経過との関係を示すグラフである。
【図１】
0004323600.tif 000006