(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程、ａ）酸と、次の一般式Ｉ、
0004371393.tif 000043
（式中、Ｚ１及びＺ２は相互に無関係にＯ，Ｓ及びＮＲ１２から選択され、Ｒ１２はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基及びアリールスルホニル基から選択され、Ｒ１は、酸によって除去され得る、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を有する基であり、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１は、相互に無関係に水素原子及び化学ルミネセンスの発生を阻害しない置換基から選択される）で表される化合物とを接触させて第１の反応生成物を生成させる工程と、ｂ）第１の反応生成物を塩基性の環境を提供するに充分な量の塩基と接触させる工程とを包含する反応に供し、これら工程の少なくとも１つに、化合物Ｉかまたは第１の反応生成物かいずれかとの反応のためのオキシダントを付与し、これにより第２の反応生成物を生成させ、塩基性環境下で光を発生させることを含むことを特徴とする化学ルミネセンスの発生方法。
【請求項２】
基Ｚ１及びＲ１が結合してホスフェート基ＯＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）を形成し、Ｒ’及びＲ”が、相互に無関係に、水素原子、１〜２０個の炭素原子を有する、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオン及びホスホニウム陽イオンから選択され、かつ、該化合物が下記式、
0004371393.tif 000044
で表される請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ’及びＲ”が、夫々２−シアノエチル基である請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｒ’及びＲ”が、夫々アルカリ金属イオンである請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｚ２がＯまたはＳであり、かつ、Ｒ２がフェニル及び置換フェニル基から選択される請求項２記載の方法。
【請求項６】
Ｒ４〜Ｒ１１が夫々水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｚ１及びＲ１が結合してホスフェート基−ＯＰＯ３Ｍ２を形成し、夫々のＭがアルカリ金属イオンであり、かつ、該化合物が下記式、
0004371393.tif 000045
で表される請求項５記載の方法。
【請求項７】
基Ｚ１及びＲ１が結合してアセトキシ基ＯＡｃを形成し、かつ、該化合物が、下記式、
0004371393.tif 000046
で表される請求項１記載の方法。
【請求項８】
Ｒ４〜Ｒ１１が夫々水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｚ２がＯまたはＳであり、Ｒ２がフェニル及び置換フェニル基から選択され、かつ、該化合物が、下記式、
0004371393.tif 000047
で表される請求項７記載の方法。
【請求項９】
オキシダントが過酸化水素、アルキルヒドロペルオキシド、過酸化水素の錯体、過マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、金属酸化物及び金属過酸化物から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
酸が鉱酸、有機酸及びルイス酸から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
鉱酸が塩酸、硝酸、硫酸及び過塩素酸から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
塩基が水酸化物塩、炭酸塩、塩基性金属酸化物及び有機塩基から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
水酸化物塩がアルカリ金属塩である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
オキシダントが酸との混合物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項１５】
酸が塩酸であり、オキシダントが尿素過酸化物であり、かつ、塩基が水酸化ナトリウムである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
オキシダントが塩基との混合物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
酸が硝酸であり、オキシダントが尿素過酸化物であり、かつ、塩基が水酸化ナトリウムである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程、ａ）化学式Ｉの化合物から化学ルミネセンスを発生させる工程と、ｂ）化学ルミネセンスを検出する工程と、ｃ）化学ルミネセンスとサンプル中のアナライトの量とを関係づける工程と、を含む、請求項１記載の方法によるサンプル中のアナライトの検定方法。
【請求項１９】
化学式Ｉの化合物がリポソームまたはラテックス粒子内に封入されている請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
さらに、ａ）化学ルミネセンス標識化化合物をゲル電気泳動に供する工程と、ｂ）ゲル中で化学ルミネセンスを生ぜしめる工程と、を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ゲルがアクリルアミドおよびアガロースのゲルから選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
基Ｒ１〜Ｒ１１の１個が式−Ｌ−ＲＧ（式中、Ｌは結合置換基、ＲＧは反応基である）で表される標識置換基を有し、化学式Ｉの化合物を最初に化学ルミネセンス発生前に特異的結合対の部分と結合させる請求項１記載の方法。
【請求項２３】
基Ｒ１〜Ｒ１１の１個が式−Ｌ−ＲＧ（式中、Ｌは結合置換基、ＲＧは反応基である）で表される標識置換基を有し、化学式Ｉの化合物を化学ルミネセンス発生前に最初に特異的結合対の部分と結合させる請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
アナライトが過酸化物であり、オキシダントとして作用する請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
アナライトがオキシダーゼ酵素およびデヒドロゲナーゼ酵素から選択され、さらにオキシダーゼ酵素またはデヒドロゲナーゼ酵素を該酵素に対する基質と反応させて過酸化物を発生させる工程を含み、この際、該過酸化物がオキシダントとして作用する請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
基Ｒ２が標識置換基を有し、かつ、特異的結合対の部分と結合する化学式Ｉの化合物が、下記式、
0004371393.tif 000048
で表され、ここで該特異的結合対の部分がアナライトの類似体またはアナライトに対する特異的結合対の部分から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
反応基がカルボキシル、カルボキシルエステル、酸無水物、酸塩化物、アシルアジ化物、アルデヒド、クロロホルメート、アミン、ヒドロキシ、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、トレシル、トシル、メタンスルホニル、マレイミド、ＮＨＳエステル、アジリジン、イミン、ジスルフィド
0004371393.tif 000049
（式中、Ｘは塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子から選択される）から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
反応基がＯＨ，ＮＨ２，ＣＯＯＨ，ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレイミド基から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
基Ｚ１及びＲ１が結合してホスフェート基ＯＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）を形成し、Ｒ’及びＲ”が、相互に無関係に、水素原子、１〜２０個の炭素原子を有する、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオン及びホスホニウム陽イオンから選択され、かつ、該化合物が下記式、
0004371393.tif 000050
で表される請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ’及びＲ”が、夫々２−シアノエチル基である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ’及びＲ”が、夫々アルカリ金属イオンである請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
Ｚ２がＯまたはＳであり、かつ、Ｒ２がフェニル及び置換フェニル基から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
基Ｒ４〜Ｒ１１が夫々水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｚ１及びＲ１が結合してホスフェート基−ＯＰＯ３Ｍ２を形成し、各Ｍがアルカリ金属イオンであり、かつ、該化合物が下記式、
0004371393.tif 000051
で表される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
基Ｒ２が標識置換基を有し、かつ特異的結合対の部分と結合する化学式Ｉの化合物が下記式、
0004371393.tif 000052
で表され、ここで該特異的結合対の部分はアナライトの類似体またはアナライトに対する特異的結合対の部分から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項３５】
アナライトが、医薬物質、ホルモン、農薬物質、代謝産物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、炭水化物、レクチンおよび受容体から選択される請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、市場で容易に入手しうる安価な試薬を用いた単純な化学的方法により、電子過剰（リッチ）アルケンから化学ルミネセンスを速やかに発生させるための新規な方法に関する。本発明は、また、化学ルミネセンス標識化合物、化学ルミネセンス標識化化合物の製造におけるその使用、および、検定方法における該標識化化合物の使用に関する。本発明は、さらに、特には電気泳動ゲル内における、アナライトの検出および化学ルミネセンス標識化アナライトの検出のための検定方法に関する。この方法は、免疫検定、核酸プローブ検定等において有用である。
【０００２】
従来技術
アナライトの化学ルミネセンス検出は、生物医学的分析、食物試験、病原同定、法廷調査および環境汚染物スクリーニング等の多くの分野で重要性を増してきていると考えられる。化学ルミネセンスの終点を試験または検定に取り入れるという手段により、種々の形態、例えば、酵素標識のための化学ルミネセンス物質や、ミセル、リポソームまたはラテックス粒子のような構造内に、若しくは、標識としての化学発光化合物を用いることにより保護された化学ルミネセンス化合物、が得られる。これらの目的のために、多数の化合物が考案されてきている（Ｒ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｈ．Ａｋｈａｖａｎ−Ｔａｆｔｉ，Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ，２０（４）３０２−３１２（１９９７））。小さな分子で検出すべき種を標識するために化学ルミネセンス化合物を使用することには、多数の標識を付与し、かつ、すばやく化学ルミネセンスを発生させるという能力のために、興味が集まっている。それにもかかわらず、全ての用途において優秀であることが証明されている単一の標識および検出構成はない。
【０００３】
化学ルミネセンス標識  ルミノール、イソルミノールおよび関連の環式ジアシルヒドラジドは、結合置換基を含むようその構造を変成させることにより直接標識として適合せられた最初の化学ルミネセンス化合物である。不十分な光の発生が検出感度を制限するため、それらの使用は、多くの用途に対して満足なものではない。０．１〜１％の低い化学ルミネセンス量子効率、および、全てのフォトンを放射するための数分程度の時間は、瞬間的な光強度を減ずる。
【０００４】
アクリジニウムエステルおよびアクリジニウムスルホンアミドは、化学ルミネセンス免疫検定において広範囲に用いられている（例えば、米国特許５，６５６，５００号明細書、米国特許５，５２１，１０３号明細書、およびこれらの中に列挙された参考文献を参照）。これらの標識の主な利点は、代表的に１〜２秒の短時間の放射とともに、化学ルミネセンスの高い収率（約１０％）である。かかる短いフラッシュにおける光エネルギーの開放により、高い光強度が生成する。しかしながら、これらの標識の使用は、ある一定の重大な不利益を有する。アクリジニウムエステルおよび極少量のスルホンアミドは、加水分解がアルカリ性ｐＨで促進されており、非ルミネセンス性カルボン酸にまで加水分解するという傾向がある。環の９−位置における水の作用に起因する疑似塩基形態というよく知られた問題は、アクリジニウム環の再生成への独立した反応段階を必要とする。
【０００５】
ルテニウムまたはオスミウム含有複合体は、犠牲アミン電子供与体の存在下で電気化学的に酸化されたときに化学ルミネセンスを発生させる。この反応は、電気化学的な工程と光検出工程とを同時に行うために、より高価で複雑な装置を必要とする。
【０００６】
酵素および光タンパク質であるエクオリン等の多くの巨大分子が標識として用いられているが、一方、これらの使用には、ターゲット種に対し結合しうる標識の数を制限し、また、担体および表面上に非特異的に付着する傾向を有する、という不利益がある。
【０００７】
検定分野の最終目標として残されていることは、水溶性の小さな分子であり、高い化学ルミネセンス効率を有し、単純な化学活性試薬による反応中ですばやく光を放射し、長期貯蔵において安定であり、かつ、副反応を受けない化学ルミネセンス標識化合物を開発することである。本発明は、かかる化合物を提供するものである。
【０００８】
標識の手法  有機および生物学的分子に対する化学結合標識のための幅広い多様な手法については、文献中に記載されている（例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，  リガンド−バインダー検定、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ．１５−５１およびＭ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ，「タンパク質の化学変成および開裂」タンパク質の免疫化学、第１章、Ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７７，ｐｐ．１−１６１、および、これらの中に記載された参考文献を参照）。抗体およびタンパク質は、タンパク質中に存在するある一定の求核性基（−ＳＨ，−ＯＨ．−ＮＨ2,−ＣＯＯＨ）と化学的に活性な基との反応によって都合よく標識される。適切に官能化された（functionalized）核酸およびＤＮＡプローブもまた、標識上の対応する反応基と反応することによって標識されうる。標識されうる多くの他のタイプの分子としては、抗体、酵素、タンパク質抗原、ペプチド、ハプテン、ステロイド、炭水化物、脂肪酸、ホルモン、ヌクレオシドおよびヌクレオチド等がある。
【０００９】
ゲル中の化学ルミネセンス検出  化学ルミネセンス基質を用いたゲル中の酵素アルカリホスファターゼの検出方法については、文献中に記載がある（Ｎ．Ｔｈｅｏｄｏｓｉｏｕ，Ｃ．Ｃｈａｌｏｔ，Ｃ．Ｚｉｏｍｅｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３（６），８９８−９０１（１９９２））。本出願人は、ゲル中における化学ルミネセンス標識化化合物の電気泳動分離および化学ルミネセンス検出についての報告は全く知らない。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、市場で容易に入手しうる安価な試薬を用いた単純な化学的方法により、化学ルミネセンス化合物から化学ルミネセンスを発生させるための方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、単純な化学ルミネセンス反応を用いた検定方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物（標識された化合物）の製造のための標識化合物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物を提供することにある。
【００１４】
本発明の目的は、下記式Ｉ（式中、Ｚ1およびＺ2は、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から相互に無関係に選択される）で表される標識化合物を提供することにもある。
0004371393.tif 000002
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、化学ルミネセンス標識それ自体、または、化学ルミネセンス標識化化合物から化学ルミネセンスを発生させるための方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、検出のための化学ルミネセンス標識化化合物を提供すること、それをゲル中で電気泳動分離に供すること、および、それをゲル中において直接化学ルミネセンス反応により検出すること、による、ゲル中のアナライトの検出方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらにまた他の目的は、化学ルミネセンス標識化化合物を用いた化学ルミネセンス検定方法を提供することにある。代表的な検定には、免疫検定、核酸ハイブリッド形成検定、他のリガンド−バインダー検定、食品、環境および工業サンプル中のアナライトの検出等がある。
【００１８】
一般的記述
現代の生物医学的分析は、サンプル中における低発生量のアナライトのためかまたは限定されたサンプル量のために、ごく少量の化合物を検出する能力を必要とする。加えて、非常に広範囲の濃度にわたって精確に化合物の量を検出することが可能でなければならない。化学ルミネセンス標識化合物およびその方法がこれらのタイプの分析に好適であることは、本明細書中で明らかにされる。
【００１９】
本発明は、一般に、化学ルミネセンスの発生方法およびこれらの方法において使用する化合物に関する。このような方法には、アクリダンアルケンおよび市場で容易に入手しうる単純で安価な試薬が用いられ、これらから化学ルミネセンスが発生する。光発生反応は、検定、信号法、緊急照明および新案物の分析的方法等の、多くの技術的に認められた目的のために用いることができる。
【００２０】
本発明は、また、検定を行う目的のために、化学結合により、または、物理的な相互作用を通じて有機および生物学的分子と結合しうる化学ルミネセンス標識化合物に関する。ここに記載する方法によれば、本発明の化学ルミネセンス化合物の反応は、可視光としての化学ルミネセンスを発生する。得られた化学ルミネセンスの強度は、化学ルミネセンス標識の、それゆえに、標識化化合物の量の直接的な基準を与える。
【００２１】
本発明は、さらに、生物学的分子の分離において用いられるタイプの電気泳動ゲル中での化学ルミネセンス標識化化合物の検出方法に関する。本発明の化学ルミネセンス標識化化合物は、ゲルに対して適用することができ、電気泳動的に分離され、また、ブロッティング膜組織を通過させる必要なしで、その後ゲル中で検出することができる。
【００２２】
本発明の方法において有用なアクリダン化合物は、下記式Ｉ、
0004371393.tif 000003
（式中、基Ｒ1〜Ｒ11の少なくとも１個は下記式、
−Ｌ−ＲＧ
（式中、Ｌは単結合または他の二価もしくは多価の基であってもよい結合基であり、ＲＧは化学ルミネセンス標識化合物を他の化合物と結合させることを可能にする反応基である）で表される標識置換基であってよく、Ｚ1およびＺ2はＯ、ＳおよびＮＲ12から相互に無関係に選択され、Ｒ12はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基およびアリールスルホニル基から選択され、Ｒ1は酸により除去しうる基であり、Ｒ2およびＲ3は１〜５０個の非水素原子を含む有機基であり、また、Ｒ4〜Ｒ11は夫々水素原子または非干渉置換基もしくは基である）で表される構造を有する。
【００２３】
発明を実施するための最良の形態
定義
酸  −  水に添加した際、生ずる溶液のｐＨを低下させる化合物。ここで使用される酸には、鉱酸、例えば塩酸、硝酸、硫酸及び過塩素酸、有機酸、例えばシュウ酸、酢酸及びプロピオン酸のようなカルボン酸や他の型の有機酸、例えばピクリン酸及び塩化アルミニウム、塩化鉄のようなルイス酸などがある。
【００２４】
アルキル基  −  分枝か、直鎖又は環状の、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルキル基を称する。
【００２５】
アルケニル基  −  分枝か、直鎖又は環状の、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルケニル基とは、８個以下の炭素原子を有するアルケニル基を称する。
【００２６】
アルキニル基  −  分枝又は直鎖の、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基。ここで使用する低級アルキニル基とは、８個以下の炭素原子を含有するアルキニル基を称する。
【００２７】
アナライト  −  検定によって試料中からその存在又はその量が測定される物質。アナライトには、特異的な結合親和力を持つ特異的な相手が存在する有機及び生物学的分子などがある。アナライトを例示すれば、以下のものに限定するものではないが、一本鎖、又は二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。その他のアナライトの例には、医薬物質、ホルモン及び農薬などがある。
【００２８】
アリール基  −  水素原子以外の１個以上の置換基で置換し得る１〜５個の芳香環を有する芳香環含有の基。
【００２９】
生物医学的分析  −  注目するアナライトの生物学的起源サンプルの分析。かかる分析とは、免疫検定、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＤＮＡハイブリッド形成検定、ＤＮＡ配列分析、コロニーハイブリッド形成法、遺伝子発現分析、高処理量医薬物質スクリーニング、伝染病薬剤又は病原体の検出などである。
【００３０】
グリコシル  −  六単糖及び五単糖を包含する炭水化物の残基で、１個以上の糖単位を含有する。例としては、果糖、ガラクトース、葡萄糖、グルクロネート、マンノース、リボース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどである。
【００３１】
ハロゲン  −  フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【００３２】
ヘテロアリール基  −  少なくとも１個の環の炭素原子が窒素、酸素又はイオウ原子で置換され、また水素原子以外の１個以上の置換基で置換され得る１〜５個の炭素環状芳香環を有する芳香環含有の基。
【００３３】
ルミネセンス  −  電子的励起状態に励起した場合に、発光できる能力。励起１重項状態からの壊変の場合は蛍光として、励起３重項状態からの壊変の場合はリン光として、いずれも発光できる。
【００３４】
過酸化物  −  Ｏ−Ｏ結合を有する化合物で、好ましくは過酸化水素又は過酸化水素の複合体、例えば、尿素過酸化物（ｕｒｅａ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過ホウ酸又は過炭酸。
【００３５】
サンプル  −  検定すべき１個以上のアナライトを含有し、又は含有すると思われる液体。化学ルミネセンス性反応法によって分析される標準的なサンプルは、生物学的サンプルで、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、セルリゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）、組織抽出物などである。別の種類のサンプルとしては、食品のサンプル及び土壌あるいは水のような環境関連のサンプルなどがある。
【００３６】
特異的結合対  −  相互に結合親和力を示す二つの物質。その例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｐＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などである。
【００３７】
置換  −  基における、少なくとも１個の水素原子を、他の原子又はＣ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ，Ｂ，Ｓｅ，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ及びＩから選択される１〜５０個の原子を有する基により置き換えることをいう。置換基に関しては、特に指示しない限り複数の置換位置が存在し得ることを意図するものであるということに留意を要する。
【００３８】
下記化学式Ｉで表される化学ルミネセンス化合物が、ある試薬との反応で短い強力な閃光としての化学ルミネセンスを発生するということは、予期し得ない発見であった。化学ルミネセンス検定において、例えば標識として、検出のために本化合物を使用することにより、アナライトの高感度検出が可能となる。本発明の化学ルミネセンス化合物は、次の一般式Ｉ、
0004371393.tif 000004
（式中、Ｚ1及びＺ2は相互に無関係にＯ，Ｓ及びＮＲ12から選択され、Ｒ12はアルキル基、アリール基、アルキルスルホニル基及びアリールスルホニル基から選択され、Ｒ1は酸によって除去され得る１〜約５０個の非水素原子を有する基であり、Ｒ2及びＲ3は、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を有する有機の基であり、Ｒ4〜Ｒ11は、相互に無関係に水素原子及び化学ルミネセンスの発生を妨害しない置換基から選択され、かつ、基Ｒ1〜Ｒ11の少なくとも１個は標識置換基となり得る）で表される。標識置換基が存在する場合には、Ｒ1又はＲ2のうちの１つであることが好ましい。
【００３９】
化学ルミネセンスの発生方法  本発明の化学ルミネセンスの発生方法においては、化学式Ｉの化合物は、
ａ）化学式Ｉの化合物を酸と接触させ、第１の反応生成物を生成する工程と、
ｂ）第１の反応生成物を塩基性の環境を提供するに充分な量の塩基と接触させる工程とを包含する反応に供し、これら工程の少なくとも１つに、反応のためのオキシダントを提供し、これにより第２の反応生成物を生成させ、塩基性環境下で光を発生させる。反応がアルカリ性ｐＨで実施される場合には、光の強度は室温で、急速に、多くは１秒或いはそれ以内で最高水準に達する。
【００４０】
第１工程で用いる酸は低ｐＨ環境、少なくとも３以下、好ましくは１以下を提供できるものでなければならない。鉱酸が、その低コストと優れた酸度とによって好ましいものである。若干の場合、酸化性の鉱酸、例えば硝酸が好ましい。酸は、代表的には０．００１Ｍ〜１Ｍの範囲内の濃度で用いられる。
【００４１】
オキシダントは、過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドとすることができる。好ましい過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物、過硫酸塩及び過ホウ酸塩などがある。オキシダントはまた、金属酸化物、例えばＣｒＯ3，ＭｎＯ2又は陰イオン性錯体、例えば過ヨウ素酸塩ＩＯ4-又は過マンガン酸塩ＭｎＯ4-、又は金属過酸化物、例えばＮａ2Ｏ2とすることができる。また、別のオキシダントとしては、ヘム又はヘモグロビンなどがある。例えば、酸が硝酸の場合には、酸も又若干オキシダントとして機能し得る。オキシダントを、第１工程で酸と組み合わせるか、あるいは第２工程で塩基と組み合わせるか、いずれが好ましいかの選択は、酸の選択と、塩基中でのオキシダントの安定性および反応性に左右される。一般に、酸が酸化性の酸である場合には、オキシダントを塩基と組み合わせるのが有利である。他の場合は、オキシダントを酸と組み合わせるのが有利である。
【００４２】
本発明の実用に有用な塩基性化合物は、水に添加した際に、得られる溶液のｐＨの上昇を起こす化合物である。これには、水酸化物塩で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウム、水酸化アンモニウム及び水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸塩及び塩基性金属酸化物などがある。有機塩基の使用も又期待される。好ましい塩基はアルカリ金属水酸化物である。
【００４３】
反応は、代表的には５℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で、通常は、室温で行われる。本発明の反応は、ペルオキシダーゼで被覆した固体支持体、例えばビーズ、管、膜、ミクロウェルプレート（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の表面と接触し得る水溶液で実施する。若干の検定フォーマットにおいては、緩衝溶液中で、結合反応を含む検定工程を遂行することが望ましい。酸は、緩衝能力を上回り、かつ溶液のｐＨを３以下に、好ましくは約１か、それ以下に下げるに充分な量および濃度で使用しなければならない。
【００４４】
化学ルミネセンス検定方法
本発明の他の側面は、アナライトを検出する方法に化学ルミネセンス反応を使用することであり、化学ルミネセンス反応により発光させ、生じた光を検出し、かつ定量が所望される場合には、発光量をアナライトの量と関係づけることを包含するものである。光の強さとアナライトの量との関係は、化学ルミネセンス化合物の既知の量で検量線を作ることによって容易に識別できるようになる。全体の化学ルミネセンス反応は、下記の反応によって示すことができる。
0004371393.tif 000005
【００４５】
若干の検定フォーマットでは、化学式Ｉで表される化合物が、標識置換基を有さずに、他の手段でアナライトと関係させてもよい。例えば、化学ルミネセンス化合物をリポソームまたはラテックス粒子内に封入してもよく、これらは順番に標識置換基または特異的結合パートナーを有する。後者の例には、リポソーム−抗体複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、リポソームオリゴヌクレオチド複合体、粒子−抗体、粒子抗原及び粒子ＤＮＡ複合体などがある。リポソーム又はラテックス粒子を酸と接触させると、化学ルミネセンスリポソーム又は粒子と酸化物及び塩基とが化学ルミネセンス反応を起こし、アナライトの検出を可能にする。
【００４６】
他の好ましい検定フォーマットでは、化学式Ｉで表される化合物は、アナライト又は特異的結合対の部分との結合を可能とする標識置換基を有する。
【００４７】
他の好ましい検定フォーマットでは、化学式Ｉで表される化合物は、検出すべき化合物に化学ルミネセンス標識を付与するために、化学ルミネセンス標識化合物として用いられる。これら検定では、化学式Ｉで表される化合物は更に化学式−Ｌ−ＲＧ（Ｌは任意である結合基）で表される標識置換基を有し、実際には化学ルミネセンス部分を反応性の基、ＲＧに結合させるためのものである。
【００４８】
化学ルミネセンス化合物  化学式Ｉで表される化合物において、基Ｒ1はＺ1置換二重結合に結合している場合には、酸によって除去し得る基であり、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を有する任意の基とすることができる。好ましい基は、１〜２０個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有する置換又は無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ（Ｃ1〜Ｃ8アルキル）シリル基、ＳＯ3-基、グリコシル基及び化学式  ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）で表されるホスホリル基であり、ここでＲ’及びＲ”は相互に無関係に、水素原子、１〜２０個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム及びホスホニウム陽イオンから選択される基である。好ましいＲ1基はリン酸塩の基ＰＯ3Ｍ2であり、Ｍはアルカリ金属イオンである。
【００４９】
基Ｒ2は、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を有する任意の基で、光を生成させる基とすることができる。後者の意味するところは、化学式Ｉで表される化合物を本発明の反応に供したとき、光を生じ、１種以上の化学ルミネセンス中間体の発生も伴い得るということである。Ｒ2は、好ましくは１〜２０個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有する置換又は無置換のアルキル若しくはアリールカルボニル基、トリ（Ｃ1〜Ｃ8アルキル）シリル基、ＳＯ3-基、グリコシル基及び化学式  ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）で表されるホスホリル基であり、ここでＲ’及びＲ”は相互に無関係に、水素原子、１〜２０個の炭素原子を有する、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換のアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム及びホスホニウム陽イオンから選択される基である。置換アルキル基の例には、シアノエチル基又はトリメチルシリルエチル基などがある。好適実施形態としては、Ｒ2は、化学式  −Ｌ−ＲＧで表される標識置換基で置換されたアリール基、好ましくはフェニル基である。
【００５０】
基Ｒ3は、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を有する有機基である。更に好ましくは、Ｒ3は、１〜２０個の非水素原子を有する。有機基は、好ましくはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基及びアラルキル基から成る群から選択される基である。Ｒ3として更に好ましい基には、置換又は無置換のＣ1〜Ｃ4アルキル基、置換又は無置換のベンジル基、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基及びアルキルスルホン酸基などがある。基Ｒ3は、Ｒ7又はＲ8と結合して５又は６員環を形成し得る。
【００５１】
化学式Ｉで表される化合物において、基Ｒ4〜Ｒ11は相互に無関係に、Ｈ又は発光を生ぜしめる置換基であり、一般にはＣ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を有する。存在し得る代表的な置換基は、これに限定されるものではないが、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基、シアノ基及びスルホネート基などである。隣接した基の対、例えば、Ｒ4−Ｒ5又はＲ5−Ｒ6は、相互に結合して２個の基が結合している環に縮合している、少なくとも１個の５又は６員環を有する炭素環又はヘテロ環を形成し得る。かかる縮合ヘテロ環は、Ｎ，Ｏ又はＳ原子を含有でき、かつ、上掲のもののようにＨ以外の環置換基を含有できる。基Ｒ4〜Ｒ11の１個又はそれ以上が、化学式  −Ｌ−ＲＧで表される標識置換基となり得る。Ｒ4〜Ｒ11は水素原子、ハロゲン原子及びアルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基などから選択されることが好ましい。化合物の好適な基は、Ｒ5，Ｒ6，Ｒ9又はＲ10のうちの一つをハロゲン原子として有し、かつ、基Ｒ4〜Ｒ11のうちのその他のものが水素原子である。
【００５２】
置換基は、化合物の性能を変更し、あるいは合成の簡便さを得るために、種々の量で、かつ、アクリダン環における選択された環又は鎖上の部位に導入することができる。かかる性能とは、例えば、化学ルミネセンスの量子収量、酵素との反応速度、極大光の強度、発光の持続時間、発光の波長及び反応媒体への溶解性などである。特定の置換基とそれらの作用を下記に特定の実施例において示すが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
結合基（Ｌ）  結合基は結合、原子又は原子の直鎖または枝分れ鎖であって、その内の若干は環状構造の部分であってもよい。置換基は通常１〜約５０個の非水素原子を有し、より一般的には１〜約３０個の非水素原子を有する。鎖を構成する原子はＣ，Ｏ，Ｎ，Ｐ，Ｓ，Ｓｉ，Ｂ及びＳｅ原子から選択され、好ましくはＣ，Ｏ，Ｎ，Ｐ及びＳ原子である。ハロゲン原子は、置換基として鎖上又は環上にあってもよい。結合置換基を有する代表的な官能基には、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、過酸化物、ケトンとしてのカルボニル、エステル、カルボナートエステル、チオエステル又はアミド基、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミダート、カルボジイミド、ヒドラジン、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホナートエステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホネートエステル、サルフェートエステル、及びチオウレア基などがある。
【００５４】
反応基  反応基ＲＧは、その存在が共有結合又は物理的力によって他の分子との結合を促進する原子又は基である。若干の実施形態においては、他の化合物への本発明の化学ルミネセンス標識化合物の結合は、例えば反応基がハロゲン原子又はトジレート基のような離脱基である場合や、化学ルミネセンス標識化合物が求核置換反応によって他の化合物に共有結合している場合には、反応基からの１個又はそれ以上の原子の損失を伴う。他の実施形態においては、共有結合形成による他の化合物への化学ルミネセンス標識化合物の結合は、マイケル付加のような付加反応で起こるか、又は反応基がイソシアナート又はイソチオシアナート基である場合に起こるような反応基内の結合の再編成を伴う。更に他の実施形態では、結合が共有結合形成を伴わないで、むしろ物理的な力であり、その場合には反応基は変化することなくそのままである。物理的な力とは、引力、例えば水素結合、静電気的又はイオン的引力、塩基スタッキングのような疎水性引力、及び特異的親和性相互作用、例えばビオチン−ストレプトビオチン、抗原−抗体及びヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用を意味する。
【００５５】
有機および生物学的分子への標識の化学的結合のための反応基
0004371393.tif 000006
0004371393.tif 000007
【００５６】
好ましい反応基は、ＯＨ，ＮＨ2，ＣＯＯＨ，ＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3，Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル及びマレイン酸イミド基などである。
【００５７】
２官能の結合試薬も、適度な反応性基にて有機及び生物学的分子に標識を結合させるために用いることができる（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ａｓｓａｙｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，１８〜２０頁，表２．２及びＴ，Ｈ  Ｊｉ，“Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９１，５８０〜６０９頁（１９８３）参照）。２官能の試薬には２種類あり、最終の構造に組み込まれるものと、そうではなく、２個の反応物を結合させることにのみ作用するものとがある。
【００５８】
好ましい化合物の群は、化学式II、
0004371393.tif 000008
で表され、ここで、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも水素原子である。基Ｚ1，Ｚ2，Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は上記に定義したものと同じである。
【００５９】
他の好ましい種類の化合物は、化学式III、
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で表され、ここで、Ｒ1とともにＺ1はホスフェート基であり、Ｚ2はＯ，Ｓ及びＮＲ12から選択され、Ｒ2，Ｒ3およびＲ4〜Ｒ11は上記に定義したものと同じであり、かつ、Ｒ’及びＲ”は、相互に無関係に、アルキル基、置換アルキル基及びアルカリ金属イオンから選択される。
【００６０】
化学式IIIで表される好ましい化合物は、Ｒ4〜Ｒ11がいずれも水素原子であり、Ｒ3がアルキル基であり、更に好ましくは低級アルキル基である。更に好ましいのは化学式IV、
0004371393.tif 000010
で表される化合物である。
【００６１】
好ましい標識化合物は、化学式Ｖ〜Ｘ、
0004371393.tif 000011
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で表され、ここで、Ｒ”およびＲ’は、水素原子、アルキル基、シアノエチル基及びアルカリ金属イオンから選択され、好ましい反応基ＲＧには、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基（ＮＨ2）、マレイン酸イミド、ＮＨＳエステル及びトリフロロエタンスルホネート基（ＣＦ3ＣＨ2ＳＯ3）があり、また、ＡｃＯはアセトキシ基を表す。
【００６２】
他の面では、本発明は化学ルミネセンス標識化合物に関する。これは、検出すべき化合物と、標識置換基を有する化学式Ｉの化学ルミネセンス標識化合物との反応によって生成する複合体を意味する。化学式Ｖ、
0004371393.tif 000013
で表される標識化合物を用いて複合体を調製する場合には、化学ルミネセンス標識で標識すべき化合物は、Ｖの反応基ＲＧによって結合されることになる。結合の結果、反応基ＲＧの部分が置換される。例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルがＲＧである場合には、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの部分が失われて結合を生じる。別の場合として、例えば、ＲＧが、標識される化合物上の−ＳＨ基と反応するマレイン酸イミド基であるか、又はアミン若しくは−ＯＨ基と反応するイソシアナートである場合には、ＲＧはそのままである。更に他の場合として、全ＲＧが失われて結合を生じる場合がある。例としては、ＲＧが脱離基、例えばハライド、アジド、-Ｎ3又はｐ−トルエンスルホネートである場合である。
【００６３】
化学ルミネセンス標識化化合物を調製する場合には、代表的には、たとえ必要なくともモル過剰の化学ルミネセンス標識化合物を使用する。化学ルミネセンス標識化合物は、好ましくは標識すべき化合物の少なくとも５倍のモル過剰で、また通常は少なくとも１倍のモル比で使用される。化学ルミネセンス標識化化合物は、１種の標識基又はその基の多数のコピーで標識してもよい。一般に、発生し得る信号量を高めるために、多数の標識を含有せしめることが望ましい。
【００６４】
合成法  化学式Ｉで表される化合物は、種々の方法で調製できる。好ましい方法では、Ｚ1がＯであり、かつ、Ｚ2がＯ，Ｓ又はＮＲ12の場合は、化合物Ｉはエステル、チオエステル又はアミドのエノラートを化学式Ｚ1−ＬＧで表される試薬と反応させることによって調製できる。ここで、ＬＧは下記の式で例示されるような離脱基を表す。
0004371393.tif 000014
一般的な離脱基には、ハロゲン原子、例えばクロリド、ブロミド及びヨージド、スルホネート、例えばメタンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート及びトリフロロメタンスルホネート、カルボキシレート、例えばアセテート及びベンゾエート、特にはＺ1がアシル基の場合、Ｚ1−ＬＧは酸無水物、メトサルフェートのようなサルフェート、及び他の基、例えばイミダゾール、トリアゾール及びテトラゾール、マレイン酸イミド、コハク酸イミドキシ基などがある。
【００６５】
両方のＺ基がＳ原子である化学式Ｉで表される化合物を調製する方法には、下記の２種の式、
0004371393.tif 000015
に従う好適なカルボニル化合物へのリチオシラン化合物又はホスホラスイリドの求核付加などがある（Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７，１９２６〜２９頁，（１９７２））。
【００６６】
別の方法では、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ及びＡ．Ｐ．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，９２５−８頁，（１９７５）に開示され、下記式、
0004371393.tif 000016
に示されるように、エステルがビス（ジアルキルアルミニウム）ジチオール試薬との反応によってケテンジチオアセタールに転化する。
【００６７】
更に他の方法においては、活性メチレン基の陰イオンをＣＳ2と反応させ、またジチオカルボキシレートをＲ1基含有試薬Ｒ1−ＬＧと反応させ、ジチオエステルを生成する。後者の方法論の例は、Ｉ．Ｓｈａｈａｋ及びＹ．Ｓａｓｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４２０７〜１０頁（１９７３）に開示されている。チオエステルをエノラートに転化し、化学式Ｘ−ＬＧの試薬と反応させる。
【００６８】
化学ルミネセンス標識化合物の調製法は一般に、化学式Ｉの前駆物質の化合物を調製し、それを、当業者に一般に知られている１またはそれ以上の付加反応に供し、基Ｒ1〜Ｒ11、好ましくはＲ1又はＲ2の１つに結合する標識置換基を提供するものである。一般原理を説明するための多くの実施例を下記に示した。
【００６９】
アナライト  検定法に本発明の化学ルミネセンス法を適用することによって検定できる物質には、多くの種類の有機及び生物学的分子などがある。かかる検定は一般に、少なくとも１対の特異的結合パートナー間の特異的結合反応の使用を伴う。特異的結合パートナーの少なくとも１個を、上記の方法で、化学式Ｉで表される化合物と会合させる。アナライトの例には、医薬物質、ホルモン、農薬物質、農薬物質代謝産物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、炭水化物、レクチン、受容体、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンなどがある。結合パートナーの例には、抗原−抗体、ハプテン−抗体若しくは抗体−抗体のペア、相補的オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、核酸−核酸結合タンパク質及び核酸−抗核酸抗体などがある。
【００７０】
過酸化物はオキシダントとして機能し得るため、本発明の化学ルミネセンス反応は、過酸化水素の検出法にも使用できる。本発明の方法が、酸素の還元と自生の基質の酸化によってＨ2Ｏ2を発生するオキシダーゼ酵素とデヒドロゲナーゼ酵素との検出にも使用できることは、当業者には明らかである。更に、アナライトに対する検定法において、生物学的分子又は特異的結合対の部分に対する複合体としてオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素を存在させてもよい。
【００７１】
検定法  本発明の方法による検定法では、化学ルミネセンス化合物をアナライト又は特異的結合対の部分と会合させる。化合物が標識置換基を有する場合には、該会合は共有結合形態を取り得る。一つの例は、化学ルミネセンス免疫検定法である。かかる検定法は、通常マニュアルのフォーマットと共に自動多試験免疫検定システムにも使用される。本発明の反応によって達せられる化学ルミネセンス発生の速度は、大容量迅速試験装置に用いるのに、特に有利に適合する。
【００７２】
代表的な免疫検定法において、アナライトのハプテン、抗原又は抗体は、該アナライトに対する化学ルミネセンス標識化特異的結合パートナー又はアナライトの標識化類似物（ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎａｌｏｇ）の存在又は量を検出することによって検定される。多くの検定法のフォーマットと免疫化学的手段遂行のためのプロトコルは業界でよく知られている。これらの検定法は概括的には二つの範疇に分かれる。競合検定法はアナライト及びアナライト類似物、例えば検出可能な標識化アナライト分子を持った特異的抗体の免疫学的結合を特徴とする。サンドイッチ検定法は、二つの内の一つが検出可能標識化されている当該二つの抗体を、アナライトと順次又は同時に結合させることによって得られる。このようにして形成された検出可能標識化結合ペアは、本発明の化合物及び方法で検定できる。業界で慣用されているようなビーズ、チューブ、ミクロウェル、磁性粒子、ラテックス粒子、シリカ粒子、試験ストリップ、膜及びフィルターなどの固体表面又は支持体に結合した標識化種を用いて測定を行うことができる。
【００７３】
本発明の方法により放射された光は、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、または、視覚的等、任意好適手段により検出され得る。検出装置の選択は、用途、および、価格、便宜性、スペクトルの感度および永久的な記録の必要性の考慮により決定される。
【００７４】
本発明の検出方法の特に有用な用途は、標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。標識化プローブを用いた核酸の分析および化学ルミネセンス検出のための方法、例えば、溶液ハイブリット形成検定、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ、ＤＮＡアミノ酸配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ハイブリッド形成およびプラークリフト法（ｐｌａｑｕｅ  ｌｉｆｔｓ）は、全て十分に確立された技術である。標識は、プローブオリゴヌクレオチドまたは捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）オリゴヌクレオチドとの直接複合化として存在することができ、または、当業者に公知の方法を用いた間接的な結合手段を通じて一体化させることができる。間接的な結合手段の例には、ハプテン標識化オリゴヌクレオチドおよびアンチハプテンＨＲＰ複合体、または、ビオチニル化オリゴヌクレオチドおよびアビジンＨＲＰ複合体を用いること等がある。かかる核酸検定法は、ブロッティング膜においてまたは溶液中で、当業者に公知であるようなビーズ、管、ミクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ）、磁性粒子または試験ストリップ等の固体表面に結合したオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
【００７５】
標識化アナライト、例えば、核酸、蛋白質または抗体の検出のための本発明の化学ルミネセンス反応の使用は、他の化学ルミネセンス標識方法以上の予期せぬ利益を与える。化学ルミネセンス標識化アナライトが、電気泳動を受けて、アクリルアミドおよびアガロースのようなゲル中で直接検出され得ることが、思いがけなく見出されている。驚くことに、標識化アナライトは、電気的ポテンシャル、および、従来技術に基づき予期されるような、工程中で適用される電流において、破壊または誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）されることはない。ゲル中で電気泳動的に分離された標識化アナライトの化学ルミネセンス検出は、本出願人の知る限りではこれまで成功しておらず、分離されたアナライトの化学ルミネセンスによる検出には、非標識化アナライトのブロッティング膜への移動および間接的な方法による膜における検出が必要であった。本化学ルミネセンス検出方法は、ゲル中で誘発する場合には適切な強度が得られ、従ってブロッティング工程と結合反応の必要性が排除される。膜移動工程の必要性が排除されることにより検出方法に有意な進歩をもたらす本新技術は、特にＤＮＡ系列ラダー（ｌａｄｄｅｒ）の検出によく適合している。
【００７６】
他の例示的使用法は、ゲル中か、又はウェスタンブロッティングの技術によるタンパク質の免疫学的検出である。アナライトとして注目されているタンパク質を含有する試料は、電気泳動的分離に供される。分離されたタンパク質は、ゲル中で直接検出されるか、又は毛細管作用又は電界の助けによってニトロセルロース又はＰＶＤＦの膜のようなブロッティング膜に移される。移したタンパク質は、特異的一次抗体及び認識しかつ一次抗体に結合する標識化二次抗体で検出される。標識の定量的測定は、アナライトタンパク質の存在を反映するものである。ウェスタンブロッティングに対して本発明の方法を適合させるには、本発明の化学ルミネセンス標識化合物で二次抗体を標識する。この技術の変形、例えばビオチン化抗体や化学ルミネセンス標識化アビジンの使用は、本発明の範囲内と考えられる。
【００７７】
多数アナライト検定法は、種々のアナライトを標識するために２個又はそれ以上の識別可能な化学ルミネセンス標識を同時に使用して行うことができる。適切に選択された化学ルミネセンス標識は、種々の発光波長にもとづいて相互に無関係に検出し得る。あるいはまた、２個又はそれ以上の異なる標識は、発光に要する時間によって識別可能とすることもできる。化学ルミネセンス多数アナライト検定法は、米国特許第５６５６２０７号明細書に開示されているが、その記載内容を本明細書に参考として取り入れる。多数アナライト検定法には、１の核酸の２種の異なる領域または１の抗原の２種の抗原決定基のような、同一アナライトにおける多数領域の検出も含まれる。この種の検定法は、例えば、遺伝子の並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の検出や、又は検出の特異性の増大に有用である。
【００７８】
本化学ルミネセンス反応に添加剤として界面活性剤を使用することは有利であり、分析感度の向上をもたらすことができる。本発明の実施に有用な非イオン界面活性剤には、一例としてポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルなどがある。陽イオン界面活性剤は、ＣＴＡＢのような４級アンモニウム塩化合物などで放射される化学ルミネセンスのレベルを高めるために用いるのに有利である。
【００７９】
他の実施形態として、蛍光エネルギー受容体を用いて、極大発光を長波長に移し（赤色シフト）かつ／又は放射されるルミネセンス量を増加させることができる。フルオレッサー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）は化学式Ｉで表される化合物と共有結合でき、あるいはまた分離種として反応溶液に添加するか、又はポリマーと結合するか、若しくはミセル或はポリマーと静電気的に会合させることができる。
【００８０】
実施例
１．アクリダンホスフェート化合物の合成  下記化合物１〜１３（Ｙ＝Ｎａ）及び１ａ〜１３ａ（Ｙ＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）の調製は、出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報に記載されている。
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【００８１】
２．アクリダン誘導体１４の合成
0004371393.tif 000018
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（２５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）2ＰＯＣｌ（２０５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）とピリジン（９４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、１５分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から２工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。１０％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2を用いた分取ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィの略、以下同じ）によって最終精製を行った。1Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ１．０８（ｔ，６Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．７６〜３．９７（ｍ，４Ｈ），６．７９〜７．９１（ｍ，１３Ｈ）．
【００８２】
３．アクリダン誘導体１５の合成
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ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（１．０ｇ、３ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。同時に、（ＥｔＯ）2ＰＯＣｌ（９５８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）とピリジン（２．５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、１５分間攪拌を継続した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣から２工程のクロマトグラフィで生成物を単離した。３０〜１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、青及び緑色の蛍光性不純物を含有する生成物の分離を行った。１２％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2を用いる分取ＴＬＣによって最終精製を行った。1Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ  １．０１（ｔ，６Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．７４−３．９６（ｍ，４Ｈ），６．９１−７．４５（ｍ，１１Ｈ）７．７８（ｄ，１Ｈ）７．９９（ｄ，１Ｈ）．
【００８３】
４．アクリダン誘導体１６の合成
0004371393.tif 000020
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（３１１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡ溶液に滴下した。−７８℃で３０分後、無水酢酸（１６１．３ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）をスポイトで添加して、ドライアイス浴を取り除いた。１時間後、揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、白色固体としての９０ｍｇの純分の画分および若干の出発物質を含有する第２画分（２５０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ２．０４（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），６．８２〜７．６５（ｍ，１３Ｈ）．
【００８４】
５．アクリダン誘導体１７の合成
0004371393.tif 000021
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（１．０５ｇ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。１０ｍＬのＴＨＦ中の無水酢酸（０．４５ｍＬ）を滴下して、ドライアイス浴を取り除き、一夜、攪拌を継続した。揮発分を除去して、残渣からクロマトグラフィで生成物を単離した。５〜２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィ精製で、１．１５ｇの化合物４０を灰白色固体として得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １．８９（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），６．９５〜７．０６（ｍ，４Ｈ），７．２０〜７．３４（ｍ，５Ｈ），７．４０〜７．４４（ｍ，２Ｈ），７．６２（ｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ）．
【００８５】
６．アクリダン誘導体１８の合成
0004371393.tif 000022
ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（３３３．４ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃で３０分間ＬＤＡにより脱プロトン化した。濃橙色の溶液を、１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２５３．４ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ）で処理した。ドライアイス浴を取り除いて、さらに２時間攪拌を継続した。揮発分を除去して、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、生成物を油状物質（２１２ｍｇ）として残渣から単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  −０．１２（ｓ，６Ｈ），０．７７（ｓ，９Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），６．７５〜７．３８（ｍ，１２Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８６】
７．アクリダン誘導体１９の合成
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ＴＨＦ中フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（３２２．３ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）溶液を、−７８℃でＬＤＡにより脱プロトン化した。５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２７０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を迅速に加えて、ドライアイス浴を取り除き、９０分間攪拌を継続した。揮発分を除去して、５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィで、３３０ｍｇの生成物を油状物質として残渣から単離し、これを放置して固化させた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  −０．０９（ｓ，６Ｈ），０．７３（ｓ，９Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），６．８４〜７．０１（ｍ，４Ｈ），７．１６〜７．４７（ｍ，７Ｈ），７．７３〜７．７６（ｍ，１Ｈ），７．９０〜７．９３（ｍ，１Ｈ）．
【００８７】
８．アクリダン誘導体２０の合成
0004371393.tif 000024
フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート１．０ｇを、−７０℃で６０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中ＬＤＡによりエノラートに転化した。温度を−７０℃で１時間維持した後、０．７６ｇのメチルトリフラートを加え、反応混合物を室温まで加温した。この混合物を４日間放置した。ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を添加して、溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2，７０／３０の溶離剤での分取ＴＬＣによって粗製物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ３．５３（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｓ，３Ｈ），６．９３〜７．４５（ｍ，１１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ）．
【００８８】
９．アクリダン誘導体２１の合成
0004371393.tif 000025
１０−メチル−Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルホンアミド）−アクリダン−９−カルボキシアミドを、米国特許５４９１０７２号明細書に記載のように調製した。スルホンアミドを乾燥ＴＨＦ中にてＬＤＡによりエノラートに転化し、かつ、メチルトリフラートを用いてメチル化して、化合物２１を製造した。
【００８９】
１０．アクリダン誘導体２２の合成
ａ）アクリダン−９−カルボン酸クロリド（４．０ｇ）を、ピリジン（２．９４ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）との溶液中４−ヒドロキシチオフェノール（２．８ｇ）により、一夜、室温にてエステル化した。混合物を濾過し、濾液を蒸発乾燥した。残渣を反応からの沈殿と結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）して、水とＣＨ2Ｃｌ2とで洗浄し、不純物を除去してチオエステル３．８ｇ（７０％）を得た。
【００９０】
ｂ）チオエステル（２．０ｇ）を、アルゴン雰囲気下で３時間、室温にてＣＨ2Ｃｌ2中亜鉛（３．９ｇ）と酢酸とで還元した。不溶生成物を濾過して、ＣＨ2Ｃｌ2にて洗浄し、アセトンに溶解してそれを無機物から分離し、蒸発させ、アクリダンチオエステル１，７ｇ（８５％）を得た。
【００９１】
ｃ）アクリダンチオエステルを窒素気流上ＣＨ2Ｃｌ2中メチルトリフラート（３．３ｇ）によって、一夜、室温にてメチル化した。蒸発・乾燥し、ＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、乾燥して粗製生成物を得、３０％酢酸エチル／ヘキサンによるカラムクロマトグラフィで精製して１．５５ｇ（８８％）のＮ−メチル化チオエステルを得た。
【００９２】
ｄ）２ｇのチオエステルを、ピリジン０．９１ｇを含有する２０ｍＬのＴＨＦ中１．２５ｇのトリメチルシリルクロリドと、一夜、室温にて反応させることによって、フェノール性の基をＴＭＳエーテルとして保護した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発・乾燥した。粗製生成物を２５％酢酸エチル／ヘキサンによるカラムクロマトグラフィで精製した。
【００９３】
ｅ）チオエステルを、シリル保護基の除去を伴いながら、エノールビス（シアノエチル）ホスフェートに転化した。−７８℃でＴＨＦ中２ｇのチオエステルとＬＤＡとの反応によって生成したチオエステルエノラートを、更にＴＨＦ中ＰＯＣｌ3（０．８７ｇ）とピリジン（０．４５ｇ）とに反応させた。室温で１時間後、３−ヒドロキシプロピオ−ニトリル（１．５６ｇ）をピリジン溶液として加え、混合物を一夜攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発して酢酸エチルによる精製用カラムにかけ、わずかに不純な生成物を得た。生成物を更に水で洗浄して残存する３−ヒドロキシプロピオニトリルを除去し、乾燥し蒸発して生成物０．９２ｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ２．５５（ｍ，４Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｍ，２Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，２Ｈ），７．０６（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．８７（ｄｄ，２Ｈ）．
0004371393.tif 000026
【００９４】
１１．アクリダン誘導体２３の合成
ａ）６−アミノヘキサノール（０．５ｇ）を、２０ｍＬのＴＨＦ中０．５５６ｇのトリメチルシリルクロリドと０．７２ｍＬのトリエチルアミンにより、一夜、シリル化した。混合物を濾過し、残渣を蒸発・乾燥した。シリルエーテルをＣＨ2Ｃｌ2中フェニルクロロホルメート（０．７３５ｇ）と１ｍＬのピリジンとを反応させることにより、フェニルカルバメートに転化した。溶液をＣＨ2Ｃｌ2中に希釈して、水洗し、乾燥した。シリルエーテル基を、ＴＨＦ中希釈ＨＣｌで切り離した。化合物Ａをカラムクロマトグラフィにより単離した。
【００９５】
ｂ）フェノールをホスホリル化するため、化合物２２をＰＯＣｌ3及びピリジンで処理した。ＣＨ2Ｃｌ2中室温で３．５時間化合物Ａ（下記）と反応させ、反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配し、乾燥して、２０〜５０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2でクロマトグラフィにかけ、化合物２３を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １．１７〜１．４８（ｍ，８Ｈ），２．４０〜２．４４（ｍ，４Ｈ），３．０１〜３．０４（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．８２〜３．９６（ｍ，６Ｈ），５．６０（ｂｔ，１Ｈ），６．８９〜７．２９（ｍ，１５Ｈ），７．７６〜７．８４（ｍ，２Ｈ）．
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【００９６】
１２．アクリダン誘導体２４の合成
ａ）化合物２３（９０ｍｇ）を、ＮａＯＨ／アセトン水溶液中室温で１日間溶液を攪拌することによって加水分解し、カルバメート基及びシアノエチル基を除去した。溶液を蒸発し、ゴム状の固体をメタノールにより粉末化して生成物を結晶化し、６４ｍｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ  １．０１〜１．４６（ｍ，８Ｈ），２．４６〜２．９０（２ｔ，２Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．７７〜３．８３（ｍ，２Ｈ），６．８９〜７．３（ｍ，１０Ｈ），７．８０〜７．８３（ｄ，１Ｈ），８．１４〜８．１７（ｄ，１Ｈ）．
【００９７】
１３．アクリダン誘導体２５の合成
ａ）化合物２４（１５ｍｇ）を８００μＬのＤ2Ｏに溶解し、ミクロ遠心分離管に入れた６−マレインイミドヘキサン酸ＮＨＳエステル（８．４ｍｇ）の７５μＬのｐ−ジオキサン−ｄ8中溶液に加えた。管を短時間回転させ、混合した。溶液をメタノールで希釈して、蒸発、乾燥した。橙色の固体をメタノール／アセトンから結晶化し、アセトンで洗浄、乾燥して、１７ｍｇの薄橙色固体を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ  １．２５〜１．５８（ｍ，１４Ｈ），２．１１（ｔ，２Ｈ），３．０９（ｔ，２Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｔ，２Ｈ），３．８３〜３．８５（ｍ，２Ｈ），６．７６〜７．１６（ｍ，１２Ｈ），７．８７〜７．８９（ｄ，１Ｈ），８．４４〜８．４６（ｄ，１Ｈ）．
0004371393.tif 000028
【００９８】
１４．アクリダン誘導体２６の合成
ａ）６−マレインイミドヘキサン酸ＮＨＳエステル（２２．７ｍｇ）のＴＨＦ中溶液を、６−アミノヘキサノールと反応させた。３０分後、溶液を遠心分離し、液体をデカントした。固体をＴＨＦで洗浄し、上澄み液を結合した。ＴＨＦを蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水とで分配した。有機層を乾燥し、蒸発して化合物Ｂを得た。
【００９９】
ｂ）化合物２２（５７ｍｇ）を、ＰＯＣｌ3（１８ｍｇ）、ピリジン（１６８ｍｇ）及び１．５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2の溶液中０℃でホスホリル化した。約９０分後、２．５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中Ｂ（４０ｍｇ）の溶液を０℃で加え、混合物を４．５時間化攪拌した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、水洗し、乾燥し、濃縮した。化合物２６を、粗製物から、分取ＴＬＣによって、単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １．１８〜１．５３（ｍ，１４Ｈ），２．０３（ｔ，２Ｈ），２．２８（ｂｓ，１Ｈ），２．５１（ｍ，４Ｈ），３．０４〜３．０５（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，２Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３，８９〜３．９７（ｍ，６Ｈ），６．２８（ｂｓ，１Ｈ），６．６２（ｓ，２Ｈ），６．８９〜７．３４（ｍ，１０Ｈ），７．７５〜７．７８（ｄ，１Ｈ），７．８１〜７．８４（ｄ，１Ｈ）．
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【０１００】
１５．アクリダン誘導体２７の合成
ａ）化合物２２（０．２ｇ）を、９３ｍｇのＡｇＯ及び０．２ｇのＮＨＳヨードアセテートとアセトニトリル中アルゴン雰囲気下、室温で１時間反応させた。混合物を濾過し、固体をアセトンで洗浄して、結合した有機溶液を蒸発した。結合した生成物を５０〜７５％酢酸エチル／ヘキサンを用いたクロマトグラフィによって粗製物から精製し、６４ｍｇの化合物２７を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ２．４８〜２．５５（ｍ，４Ｈ），２．７７（ｓ，４Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），３．８８〜４．００（ｍ，４Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），６．９９〜７．９４（ｍ，１２Ｈ）．
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【０１０１】
１６．アクリダン誘導体２８の合成
ａ）ＤＭＦ中３−メルカプトプロパン酸（１１８ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１９２ｍｇ）及びＤＣＣ（２５２ｍｇ）をアルゴン気流下に攪拌した。４５分後、沈殿を濾過しＴＨＦで洗浄した。固体をアセトンに懸濁し、アセトン溶液を４０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィ精製のため分取ＴＬＣプレートにかけた。結合した生成物Ｃを油状物（９０ｍｇ）として単離した。
ｂ）化合物２５（２．５ｍｇ）をｐＨ６の１：１メタノール／ホスフェート緩衝溶液１ｍＬに溶解し、次いで蒸発・乾燥し二ナトリウムホスフェート基をモノアシッド型に転化した。この化合物及び化合物Ｃを、ともにＤＭＦ−ｄ6に溶解して１０分間保持した。ＤＭＦを減圧下除去した。
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【０１０２】
１７．アクリダン誘導体２９の合成
ａ）シリル基で保護された実施例１３の（シリル化前の前駆物質５ｇから調製した）チオエステル中間体（下記）を、ＬＤＡにより脱プロトン化し、本質的に上記のような手順を用いてＰＯＣｌ3でホスホリル化した。エタノール（４．７５ｍＬ）をジクロロホスフェート中間体に添加して、一夜攪拌を続けた。固体を濾別し、濾液を蒸発乾固し油状物を得た。油状物を３０〜５０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけ、エノールジエチルホスフェート中間体２．３７ｇを薄黄色の固体として得た。
【０１０３】
ｂ）エノールジエチルホスフェート中間体（２８８ｍｇ）をＣＨ2Ｃｌ2中ＰＯＣｌ3／ピリジンで約３時間攪拌して、フェノール基においてホスホリル化した。ＣＨ2Ｃｌ2中化合物Ａ（１４１ｍｇ）を添加して、溶液を室温で一夜攪拌した。溶液を水洗、乾燥、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣによって分離して、カルバメート保護された中間体（８２ｍｇ）を得た。
【０１０４】
ｃ）カルバメート保護された中間体（８２ｍｇ）を、水性ＮａＯＨ／アセトン中、アルゴン雰囲気下室温で６時間溶液を攪拌することによって加水分解して、カルバメート基を除去した。溶液をメタノール／アセトン中に希釈して生成物を結晶化し、化合物２３の２１ｍｇの第一粗生成物を得た。濾液を蒸発し、残渣を（２５〜５０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2）クロマトグラフィにかけ、更に生成物４０ｍｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １．１２（ｓ，６Ｈ），１．３４〜１．７２（ｍ，８Ｈ），２．８２（ｂｔ，２Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．７４〜３．９７（ｍ，６Ｈ），６．８９〜７．３４（ｍ，１０Ｈ），７．７６〜７．７８（ｄ，２Ｈ），８．２５（５ｓ，１Ｈ）．
【０１０５】
0004371393.tif 000032
【０１０６】
１８．アクリダン誘導体３０の合成
ａ）フェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシレート（０．５ｇ）を、−７８℃でＴＨＦ中ＬＤＡにより脱プロトン化し、−７８℃〜室温でＰＯＣｌ3／ピリジンで処理してエノールジクロロホスフェートを生成した。ＴＨＦ中Ａの溶液を添加して、一夜攪拌を続けた。溶液を蒸発し、残渣を酢酸エチルと水との間で分配した。乾燥し酢酸エチルを蒸発して橙色の固体を得、これをヘキサンで洗浄して残ピリジンを除去した。固体を溶解し、５〜５０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2を用いてカラムクロマトグラフィにかけた。不純物とともに所望の生成物を含有する若干の留分を結合し、蒸発した。この物質を更に１５％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2で分取ＴＬＣによって精製して、カルバメート保護された純粋な生成物を得た。
【０１０７】
ｃ）カルバメート保護された生成物（１７ｍｇ）を、ＮａＯＨ／アセトン水溶液中、アルゴン雰囲気下室温で一夜溶液を攪拌することによって加水分解して、カルバメート基を除去した。溶液を蒸発し残渣をクロマトグラフィ（２５〜５０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2）にかけ、化合物３０の８ｍｇを製造した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １．０７〜１．３３（ｍ，８Ｈ），２．３９（ｔ，２Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．４０〜３．４２（ｍ，２Ｈ），６．８５〜７．３７（ｍ，１１Ｈ），７．６８〜７．７０（ｄ，１Ｈ），８．１２〜８．１４（ｄ，１Ｈ）．
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【０１０８】
１９．アクリダン誘導体３１の合成
ａ）ｐ−ヒドロキシフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（米国特許５４９１０７２号明細書に記載の調製法）（１．１ｇ）を、ＴＨＦ中０．４６ｍＬのクロロトリメチルシランと１．０２ｍＬのトリエチルアミンとで一夜攪拌してシリル化した。混合物を濾過して、溶液を蒸発・乾燥した。
【０１０９】
ｂ）工程ａのシリルエーテル化合物を、−７８℃でＴＨＦ中ＬＤＡによりエノラートに転化した。３０分後、ＴＨＦ中無水酢酸（０．５ｍＬ）の溶液を滴下した。反応を−７８℃で３０分間持続し、室温に加温した。揮発分を除去して、残渣を５〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけた。出発物質のｐ−ヒドロキシフェニルエステルとともに所望のエノールアセテートを含有する留分を得た。
【０１１０】
ｃ）工程ｂからの生成物の混合物（１００ｍｇ）を、室温で１時間、ＣＨ2Ｃｌ2中トリフロロエタンスルホニルクロリド（７２ｍｇ）とピリジン（６２ｍｇ）とを反応させた。混合物を蒸発・乾燥し、１０〜５０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンを用いてクロマトグラフィにかけた。化合物３１（７０ｍｇ）を分離した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ２．０９（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．９５〜４．０３（ｑ，２Ｈ），６．８５〜７．５８（ｍ，１２Ｈ）．
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【０１１１】
２０．アクリダン誘導体３２の合成
ａ）３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパン酸を、Ｔａｇａｗａ（Ｈ．Ｔａｇａｗａ，Ｋ．Ｕｅｎｏ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２６（５）１３８４〜９３頁，１９７８年）の方法を適用することによって、３−（ｐ−メルカプトフェニル）プロパン酸に転化した。簡単にいえば、出発物質の酸をエタノール、フェノール基でエステル化し、ジエチルキサンテートに転化し、異性体のキサンテートに転位させ、鹸化してメルカプト置換の酸を生じさせた。
【０１１２】
ｂ）この酸のメチルエステルを、アクリジン−９−カルボキシリックアシッドクロリドと、その−ＳＨ基を介して縮合させた。アクリジン環を亜鉛／酢酸で対応するアクリダン化合物に還元して、これをメチルトリフラートで窒素原子をメチル化した。
【０１１３】
ｃ）チオエステルを、エノールビス（シアノエチル）ホスフェートに転化した。チオエステルエノラートを、−７８℃でＴＨＦ中ＬＤＡと１ｇのチオエステルの反応により生じさせ、更にこれと、ＴＨＦ中ＰＯＣｌ3（０．６４ｇ）とピリジン（１．９ｇ）とを反応させた。室温で１時間後、ピリジン１ｍＬ中３−ヒドロキシプロピオニトリル（１．１４ｍＬ）と混合物を一夜攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発して酢酸エチルにより精製のためのカラムにかけ、ビス（シアノエチル）ホスフェートを得た。
【０１１４】
ｄ）室温でアセトン／ＮａＯＨ水溶液中での反応でホスフェートとカルボキシレートエステルの鹸化を起こさせ、化合物３２（１００ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ  ２．３３（ｔ，２Ｈ），２．７０（ｔ，２Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），６．８９〜７．３４（ｍ，１０Ｈ），７．７０〜７．８０（ｄ，１Ｈ），８．１８〜８．１９（ｄ，１Ｈ）．
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【０１１５】
本出願人のＰＣＴ出願ＷＯ９７／２６２４５号公報及び米国出願番号０８／９２８，７９３号明細書に記載したものから誘導して、標識置換基を付与することにより、多くの他のアクリダンホスフェート標識化合物を調製することができる。
【０１１６】
２１．アクリダンホスフェート５の化学ルミネセンス強度のカイネティックプロフィール  ｐＨ８．８のトリス緩衝液０．１Ｍ（１０μＬ）中３．３ｘ１０-4Ｍのアクリダンホスフェート５を含有する試薬を０．４ＭのＨＮＯ3中３．６％の尿素過酸化物５０μＬと混合し、２分間インキュベートした。０．２５ＭのＮａＯＨ溶液１００μＬを注入して化学ルミネセンスを誘発した。混合により即時発光が起こり、５秒間積算した。化学ルミネセンス放射の時間経過を図１に描いた。
【０１１７】
２２．異なる酸の使用  アクリダンからの化学ルミネセンス発生方法における各種酸性化合物使用の可能性を表１及び２に示した。ｐＨ８．８のトリス緩衝液０．１Ｍ（１０μＬ）中アクリダンホスフェート５（８ｎＭ又は２μＭ）を各種の酸溶液０．４Ｍ中３．６％の尿素過酸化物５０μＬと混合し、２分間インキュベートした。０．２５ＭのＮａＯＨ溶液１０μＬを注入して化学ルミネセンスを誘発した。下記に要約したように、各酸は本発明方法に有効であり、迅速に発光した。光強度の値は任意単位である。合計強度は１０秒間にわたって測定した。
【０１１８】
【表１】
アクリダンホスフェート５の８ｎＭ溶液での誘発
0004371393.tif 000036
【０１１９】
【表２】
アクリダンホスフェート５の２μＭ溶液での誘発
0004371393.tif 000037
【０１２０】
２３．過酸化物／塩基の溶液による誘発
過酸化物が塩基溶液中にある誘発反応を用いることにより本発明の化合物から化学ルミネセンスを発生した。ｐＨ８．８のトリス緩衝液０．１Ｍ（１０μＬ）中アクリダンホスフェート５の溶液２μＭを０．４Ｍの酸５０μＬと混合し、２分間インキュベートした。０．２５ＭのＮａＯＨ溶液中３．６％の尿素過酸化物１００μＬの添加によって化学ルミネセンスを開始した。下記に要約したように各酸は本発明方法に有効であった。合計強度は１０秒間測定した。
【０１２１】
【表３】
0004371393.tif 000038
【０１２２】
２４．酸インキュベート時間の効果
アクリダンホスフェート５の溶液（０．４ＭのＨＣｌ中１μＭ）を、ＨＣｌ／過酸化物インキュベート工程の長さを変えて実施例２２に記述したように処理した。
【０１２３】
【表４】
0004371393.tif 000039
【０１２４】
２５．アクリダン誘導体５の検出感度
１０-11〜１０-17モルを含有するアクリダンホスフェート５の溶液（１０μＬ）を、各々０．４ＭのＨＣｌ中３．６％の尿素過酸化物５０μＬに添加し、２５℃で２分間インキュベートした。これらの溶液の各々に０．２５ＭのＮａＯＨ１００μＬを添加することによって化学ルミネセンスを開始した。最大及び合計光強度を単一決定（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）によって測定した。バックグラウンドの光のレベルはこれらの条件下で０．０３８（最大）及び０．０１９（合計）であった。データを表５及び図２に示す。
【０１２５】
【表５】
0004371393.tif 000040
【０１２６】
２６．各種例示化合物の検出  表６の各化合物を０．５μＭ原液として調製した。１０μＬアリコートを別々に０．４ＭのＨＣｌ中３．６％の尿素過酸化物５０μＬに添加し、２５℃で２分間インキュベートした。０．２５ＭのＮａＯＨ１００μＬの添加によって化学ルミネセンスを誘発した。化学ルミネセンスを１０秒間測定した。各化合物について有意なレベルを生じた。この実施例並びに実施例２２及び２３の条件下で誘発した場合、化合物２〜４，６〜１３，１８〜１９及び２１〜３２も化学ルミネセンスを生じた。
【０１２７】
【表６】
0004371393.tif 000041
【０１２８】
２７．タンパク質への標識化合物の結合  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（フルカ（Ｆｌｕｋａ））をリデュース−Ｉｍｍ（登録商標）（Ｒｅｄｕｃｅ−Ｉｍｍ）キット（ピアース，ロックフォード（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ），  ＩＬ）を用いて希釈（ｒｅｄｕｃｅ）し、遊離スルフヒドリル基を製造元の指示に従って遊離させた。
【０１２９】
リデュース−Ｉｍｍキットからの平衡緩衝液＃２の２００μＬ中２７０μｇのＢＳＡ含有画分をメタノールに溶解したアクリダン誘導体２５の溶液５０μＬで室温で一夜インキュベートした。この溶液を０．０１ＭのホスフェートｐＨ７．５と共にセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムに通した。画分を２８０ｎｍで分光光度的に、また、上記のように尿素過酸化物およびＨＮＯ3を用い、続いてＮａＯＨを用いて化学ルミネセンス検定法によって分析した。標識及びタンパク質の両方を含有する画分をプールした。生成物をＢＳＡ−ＡＰＮａ2と命名した。
【０１３０】
２８．アクリダン誘導体２６へのＢＳＡの結合  化合物２６による希釈ＢＳＡの標識化をメタノールの代わりにＤＭＦを用いて前記実施例の方法によって実施した。これにより、ＢＳＡはビス（シアノエチル）ホスフェートアクリダン化合物で標識された。生成物をＢＳＡ−ＡＰＣＮ2と命名した。
【０１３１】
２９．化学ルミネセンス標識化ＢＳＡの検出
ＢＳＡ−ＡＰＮａ2及びＢＳＡ−ＡＰＣＮ2のサンプルを（Ｗａｒｂｕｒｇ及びＣｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｚ．，３１０，３８４（１９４１））に記載された方法によってタンパク質含量を検定した。貯蔵溶液をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２２７，６８０（１９７０）参照）中に希釈し、７％のアクリルアミド−ビスアクリルアミドのゲル上に載せた。タンパク質を、室温で１〜１．５時間、１２０〜１３０ＶでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを取り出し、ペトリ皿と透明なフィルムの縁辺から構成されるプラスチックの枠の中ヘ置いた。
【０１３２】
ゲル中の標識化タンパク質を、簡単な化学ルミネセンス検定法によって検出した。ゲルホルダーを安全灯の下、Ｘ線フイルムのシートの尖端に置いた。０．４ＭのＨＮＯ3中尿素過酸化物（３．６％）の溶液をホルダー中のゲル上に積層し、２０分間放置した。溶液をホルダーから吸引蒸発（ａｓｐｉｒａｔｅｄ）させ、０．２５ＭのＮａＯＨ１５ｍＬを加えて発光を開始させた。ゲルを１５分間Ｘ線フイルムに暴露した。図３Ａ及び３Ｂは、ゲル中それぞれ直接に標識化タンパク質ＢＳＡ−ＡＰＮａ2及びＢＳＡ−ＡＰＣＮ2の検出を示す。発光は、数秒間にわたって増大し、極大まで上昇し、数分にわたって減衰した。
【０１３３】
３０．標識化タンパク質の検出感度
１０-11〜１０-17モルの標識化タンパク質を含有する標識化タンパク質ＢＳＡ−ＡＰＮａ2及びＢＳＡ−ＡＰＣＮ2の溶液をｐＨ８．８の０．１Ｍトリス緩衝液中で調製した。１０μＬアリコートをそれぞれ０．４ＭのＨＣｌ中３．６％の尿素過酸化物５０μＬに添加し、２５℃で２分間インキュベートした。これらの各溶液に０．２５ＭのＮａＯＨ１００μＬを添加することによって化学ルミネセンスを開始した。合計光強度の値を単一決定によって測定した。バックグラウンドの光のレベルは、これらの条件下でＢＳＡ−ＡＰＣＮ2及びＢＳＡ−ＡＰＮａ2の両方に対して０．０１７であった。
【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
上記の説明並びに実施例は、本発明の説明に資するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。特別な化合物や方法が開示されていないものでも本発明の技術思想、技術範囲から外れるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲から判断されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  アクリダンホスフェート５の反応に起因する化学ルミネセンスの時間分布を示すグラフである。光の生成は、混合に続いて起こり、また、１秒以内で、最大強度に達している。
【図２】  化合物の量と、室温で誘発されるアクリダンホスフェート５により放射される最大化学ルミネセンス強度との関係を示すグラフである。化学ルミネセンス放射は、０．２５ＮａＯＨ溶液１００μＬを添加することにより、開始される。
【図３】  化学ルミネセンス反応が始まってすぐ２０分間、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルをＸ線フィルムに爆露させることによりゲル中の化学ルミネセンス標識化タンパク質を検出したＸ線フィルム像である。図３ＡはＢＳＡ−ＡＰＮａ2の検出を示し、図３ＢはＢＳＡ−ＡＰＣＮ2の検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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