(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドを含む、細胞のｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序論
本発明は研究の際にナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスによる援助を受けて成されたものである。米国政府は本発明について一定の権利を所有する。
【０００２】
発明の背景
過去何年もの間、良性又は悪性新形成疾患の主だった特徴は無秩序な有系分裂であると考えられていた。癌の発症は細胞周期を調節する細胞性手段の制御不能によるものと信じられている。
【０００３】
哺乳動物細胞の周期は様々なサイクリン／サイクリン特異的キナーゼ（ｃｄｋ）対の連鎖的活性化及び不活性化により駆動するものと信じられている（MacLachlanら (1995), Crit. Rev. in Eukary. Gene Ex. 5 : 127-56) 。原型的な細胞周期のキナーゼｃｄｃ２は最初に酵母において発見され、そしてＤＮＡ複製及び有系分裂の双方の調節に関与していることが見い出された。しかしながら、高等生物はこのような現象を誘導する一層複雑なシステムを保有していることが見い出された。
【０００４】
関与するいくつかのキナーゼの一つ、サイクリン特異性キナーゼ２（ｃｄｋ２）は哺乳動物細胞がその制限時点を通過してＤＮＡ複製に至るために必要とされる（Elledge, S.J. and Spottswood, M.R. (1991) EMBO J. 10 : 2653-2659) 。このキナーゼの活性化及び不活性化は、細胞が分裂し始める前のＳ期の正確な開始時期にとって重要である。サイクリンＡ又はＢとの過渡的な会合はキナーゼがいつ活性し、それ故ＤＮＡ複製に関与する基質をリン酸化するかを表わす。過去数年の間、ｃｄｋ活性を制御するサイクリン結合以外のいくつかのメカニズムが発見された。リン酸化状態及び補酵素結合における相違の他に、ｃｄｋキナーゼ活性に結合してその活性を阻害することのわかっている低分子量タンパク質の数が増えてきている（Xiong, Y. (1996) Biochim. Biophys. Act. 1288 : 1-5; Sherr, C.J. and Roberts, J.M. (1995) Genes Dev. 9 : 1149-63)。ｃｄｋインヒビターのＣＩＰ／ＫＩＰファミリー（ｐ２１，ｐ２７，ｐ５７）及びＩＮＫファミリー（ｐ１５，ｐ１６，ｐ１８，ｐ１９）はサイクリン又は直接ｃｄｋに結合し、そして細胞周期の進行が続行しうるまでそのキナーゼ活性を抑制する。ＩＮＫファミリーはＤ型サイクリンに複合した早期Ｇ１キナーゼｃｄｋ４及びｃｄｋ６に対する特異性を有し、一方ＣＩＰファミリーはサイクリンＡ又はＥのいずれかに結合したｃｄｋ２を優先する。様々な細胞タイプの中で過剰発現されると、これらのインヒビターは増殖を停止させ、細胞をＧ１期にとどめることができる。従って、これらは過渡的調節式タンパク質であり、Ｇ１サイクリン−ｃｄｋ対を潜在的に阻害する傾向を有する。このようないくつかのタンパク質の消失が腫瘍形成の重要な段階であることが見い出された。例えば、ｐ１６及びｐ１５遺伝子は共に、全黒色腫症例の７５％近くにおいて欠失していることが見い出された領域にある（Kambら (1994) Science 264 : 436-440; Nobori ら (1994) Nature 368 : 753-756) 。ｃｄｋ阻害は正常細胞周期の進行にとって必須である。
【０００５】
網膜芽腫ファミリーは、そのタンパク質が真核細胞周期ホメオスタシスにも関与する遺伝子の群から成る。このような遺伝子によりコードされるタンパク質は往々にして、その固有な三次元構造を理由に「ポケットタンパク質」と呼ばれている。この構造はかかる分子が関与する特異性及び機能性の関連するタンパク質−タンパク質相互作用のほとんどを司る。現在、このファミリーは、ｐＲｂと呼ばれるタンパク質をコードする網膜芽腫（ＲＢ）遺伝子、ｐ１０７と呼ばれるタンパク質をコードするｐ１０７、及びｐＲｂ２／ｐ１３０と呼ばれるタンパク質をコードするｐ１３０（ｐＲｂ２／ｐ１３０とも称される）を含む３つの構成員から成る。
【０００６】
これら３つのポケットタンパク質は全て、主として細胞の核区画に局在する（Lee ら (1987) Nature 329 : 642-645; Ewenら (1991) Cell 66 : 1155-1164; Baldiら (1995) J. Cell. Biochem. 59 : 402-408) 。各タンパク質構造は基本的にＮ末端部分；ドメインＡ、スペーサー及びドメインＢへと更に分割されるポケット構造；並びにＣ末端部分（いわゆるドメインＣ）から成る。このポケット機能ドメインＡ及びＢが最も保存的であり、そして内因性タンパク質又はウィルス性腫瘍タンパク質（oncoprotein)のいずれかが関与する相互作用のほとんどを司るものと教示されている（Paggi ら J. Cell. Biochem. (1996) 62 : 418-430) 。
【０００７】
Ｒｂタンパク質はＥ２Ｆ転写因子との相互作用及びその阻害で最もよく知られる。Ｅ２Ｆはいくつかの遺伝子であってその生成物がＤＮＡ複製が起こるのに必要とされるものをトランス作用活性化するものと信じられている。しかしながら、ｐＲｂに結合すると、このトランス作用活性化能は失われる（Chellappanら (1991) Cell 65 : 1053-61)。ｐＲｂは網膜芽腫等のいくつかのタイプの癌においても失われていることが見い出されている。Ｒｂ関連タンパク質ｐ１０７及びｐＲｂ／ｐ１３０はｐＲｂと似たような、しかしながら異なる性質を有することが見い出されている（Ewenら (1991) Cell 66 : 1155-64; Mayolら (1993) Oncogene 8 : 2561-6; Li ら (1993) Genes Dev. 7 : 2366-77; 及びHannonら (1993) Genes Dev. 7 : 2378-91) 。ｐＲｂ，ｐ１０７又はｐＲｂ２／ｐ１３０過剰発現は癌細胞の増殖を阻害又は停止させることができるが（Huang ら (1988) Science 242 : 1563-1566; Booksteinら (1990) Science 247 : 712-715; Antelman ら (1995) Oncogene 10 : 697-704;  及びClaudio ら (1994) Cancer Res. 54 : 5556-5560) 、一定の腫瘍細胞はいずれのポケットタンパク質に対しても同等に応答性ではない。例えば、トランケーション化非機能性ｐＲｂ分子を保有するＳＡＯＳ−２ヒト骨癌細胞系はｐＲｂ及びｐ１０７の増殖抑制特性に対してもっぱら感受性である。他方、ｐＲｂ２／ｐ１３０過剰発現はＳＡＯＳ−２増殖を遅くするが、このタンパク質はＴ９８Ｇヒトグリア芽腫マルチフォーム及びＭＣＦ−７ヒト乳腺癌腫細胞系の増殖を阻害することもでき、一方、ｐＲｂもｐ１０７も阻害作用を全く示さない。Ｔ９８Ｇ及びＭＣＦ−７細胞系は共にｃｄｋ４及びｃｄｋ６インヒビターであるｐ１６INK4A のホモ接合欠失を示す。従って、ポケットタンパク質Ｒｂ及びｐ１０７は特異的サイクリン／ｃｄｋ複合体により相当にリン酸化され始め、かくして細胞周期のブロッキングにおいて機能的に不活性となり始める。しかしながら、ｃｄｋ２に複合していることの見い出されたｐＲｂ２／ｐ１３０はｐ１６INK4A ホモ接合欠失を解消し、このような細胞系における有効な増殖阻害を及ぼすことができることが見い出された（Paggi らJ. Cell. Biochem. (1996) 62 : 418-430)。
【０００８】
Ｒｂ及びｐ１０７タンパク質の機能性ドメインは遺伝子的及び生化学的手段の双方を通じてマッピングされている（Huら (1990) EMBO J. 9 : 1147-1155; Ewen ら (1991) Cell 66 : 1155-1164; Ewen ら (1992) Science 255 : 85-87)。Ｒｂポケットと称されるＲｂ及びｐ１０７の約４００個のアミノ酸フラグメントがこのようなタンパク質と、ＤＮＡ腫瘍ウィルス性腫瘍タンパク質及び細胞リガンドとの会合を司る。このドメイン内には相当な配列類似性の６つの領域がある。同様に、サイクリンは、「サイクリンボックス」と称される約８７個のアミノ酸にわたって広がる大きな配列類似領域を共有している（Pines ら (1989) Cell 58 : 833-846)。このドメインはＲｂ及びｐ１０７のタンパク質：タンパク質相互作用において重要であると信じられている。事実、このドメインの一部を含んで成る配列を有するペプチドが細胞増殖及び増殖のインヒビターであると唱えられている（米国特許第５，６２５，０３１号）。
【０００９】
関連Ｒｂタンパク質、ｐＲｂ２／ｐ１３０の阻害活性はこのサイクリンボックスを介して起こるのではなく、異なる且つ独立のスペーサー領域ドメインを介して起こることがこの度見い出された。更に、様々な細胞プロセスの際のｐＲｂ２／ｐ１３０の発現の増大は、ｃｄｋ２のキナーゼの低下に伴うものと実証された。例えば、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質レベルは筋細胞の分化に依存して上昇し、ｃｄｋ２キナーゼ阻害と一致する。これは関連ｐ１０７タンパク質であってそのレベルが低下することが示されたものとかなり相違する。従って、ｐＲｂ２／ｐ１３０はＥ２Ｆ活性体に結合してそれを改変するだけでなく、その他のＲｂタンパク質とは異なる態様でｐ２１と協奏してｃｄｋ２キナーゼ活性も阻害するものと信じられている。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害するｐＲｂ２／ｐ１３０のアミノ酸６４１〜７１１もしくはそのフラグメントを含んで成るペプチド、又はその突然変異体もしくは相同アミノ酸配列の提供にある。
【００１１】
本発明のその他の目的は、細胞を、ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害するｐＲｂ２／ｐ１３０のアミノ酸６４１〜７１１もしくはそのフラグメントを含んで成るペプチド、又はその突然変異体もしくは相同アミノ酸配列と接触させることを含んで成る、ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害する方法の提供にある。
【００１２】
発明の詳細な説明
癌は細胞が増殖制御不能となり、その結果異常且つ侵襲性の周囲組織が大量に増加する異種病理状態の群である。これは通常、急速且つ無秩序な細胞分裂、増強した細胞生存能力、並びに脱分化及び遺伝子改変の蓄積の付随を特徴とする。無秩序な細胞分裂は細胞数を増やすだけでなく、癌細胞において見い出される一般的な現象である遺伝子改変の蓄積にも寄与する。蓄積する改変は損傷を受けた細胞周期制御機能を更に劣悪にしうる。
【００１３】
ｃｄｋ２はヒト細胞周期の重要な調節因子であり、染色体１２ｑ１３上にマッピングされている。この遺伝子座は、限定することなく、子宮平滑筋腫、唾液腺の腺腫及びヒト急性骨髄芽球性白血病等の多数の腫瘍において往々にして改変又は転位していることが示された。腫瘍における１２ｑ１３座の改変はｃｄｋ２遺伝子の調節における変化に関与するものと信じられている。より詳しくは、ｃｄｋ２タンパク質の活性が増大し、腫瘍細胞が増殖する。従って、ｃｄｋ２活性を阻害する化合物の同定は癌細胞の増殖の調節及び制御において有用であろう。
【００１４】
細胞周期制御機構と相互作用するその能力及びその増殖抑制効果を理由に、ポケットタンパク質は腫瘍増殖の制御において有用であると考えられている（Paggi らJ. Cell. Biochem. (1996) 62 : 418-430)。ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子生成物は核タンパク質であり、そのリン酸化は細胞周期調節されている（Baldi ら (1995) Journal of Cellular Biochemistry 59 : 402-408)。Ｇ０特異的転写因子Ｅ２Ｆ５との会合及び分化又は休止細胞における高い発現率に基づき、ｐＲｂ２／ｐ１３０は主に早期Ｇ１期において作用すると考えられている。Ｅ２Ｆタンパク質機能の潜在的な修飾に加えて、ｐＲｂ２／ｐ１３０は、細胞のＳ期への移行を可能にするｃｄｋ２の如きキナーゼの活性を低下させることによりＧ０／Ｇ１停止に寄与することがこの度見い出された。
【００１５】
高度に相同性のｐ１０７タンパク質もｃｄｋ２に対してこの効果を有することが示されたが、ｃｄｋ２に対するｐＲｂ２／ｐ１３０の効果はいくつかの点で相違する。例えば、ｃｄｋ２キナーゼアッセイに加えるｐ１０７の量を増やすと、ｐＲｂ及びヒストンＨ１基質のリン酸化は低下し、ｐ１０７自体のリン酸化が高まり始める。このことは、ｐ１０７がインヒビターというよりは基質として作用することを示唆する。対照的に、ｐＲｂ２／ｐ１３０はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイではリン酸化されず、それ故択一的な基質として作用せず、むしろ阻害特性を有する結合タンパク質として作用する。更に、ｐ１０７はｃｄｋインヒビターほどには作用せず、むしろｃｄｋ２／サイクリンＡをその基質Ｅ２Ｆ４からマスキングする。対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系のモデルでは、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の増加はｃｄｋ２阻害と一致し、ｐＲｂ２／ｐ１３０がＥ２Ｆ活性を調節するように作用するだけでなく、キナーゼ活性を調節するようにも作用しうることを示唆する。
【００１６】
最大の阻害効果を発揮するｐＲｂ２／ｐ１３０の領域は２種類のタンパク質の間でほとんど保存されていないものである。相同性の低いこの領域はＲｂファミリーのタンパク質の機能的多彩性を担っているものと信じられている。ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の固有のドメインはこの度ｃｄｋ２キナーゼ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害できるものと同定された。このドメインは推定Ｅ２Ｆ結合部位及びＣ末端に非常に近い。
【００１７】
ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質濃度とｃｄｋ活性との間には反比例の関係があることをいくつかのモデルが示唆している。例えば、ＭＬ１ミエローマ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化すると、末端分化によりｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の著しい増大を示し、一方、関連のｃｄｋ２キナーゼ活性は基底レベルにまで低下する。ネズミ造血始祖細胞系ＦＤＣ−Ｐ１も早期Ｇ１期において大量のｐＲｂ２／ｐ１３０を示し、それには関連のｃｄｋ２ヒストンＨ１キナーゼ活性の低下が伴う。タンパク質レベルが後期Ｇ１において低下すると、キナーゼ活性体はｃｄｋ２に回復する。
【００１８】
ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質濃度とｃｄｋ２活性との関係を筋芽細胞系Ｃ２Ｃ１２において調べた。２％のウマ血清を含む培地の中で培養すると、Ｃ２Ｃ１２細胞は細胞周期の休止となり、隣りの細胞と融合し、そして完全に分化した多核筋繊維へと伸長する。この分化培地の中で５日経過した後、細胞は完全な筋管状の形態を帯びるに至った。従来の研究はｐ１０７タンパク質が筋肉分化の間に減少することを示していた（Kiess ら (1995) Cell Growth Diff. 6 : 1287-1298)。対照的に、これらの細胞の２４時間の時点でのタンパク質抽出物のイムノブロッティングはｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の量が２倍以上に増加していることを示した。ｐＲｂ２／ｐ１３０複合体もこれらの抽出物から免疫沈殿させ、そして基質としてヒストンＨ１を利用するキナーゼアッセイにかけて関連のｃｄｋ２活性を評価した。ｃｄｋ２キナーゼ活性は分化経路の終了時には半分以下に減少していた。ｃｄｋ２のタンパク質レベルはキナーゼ分析を行ったサンプル全てにおいて等しいことが確認された。これらの結果をまとめると、一致して、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質レベルが上昇すると、関連のｃｄｋ２活性が低下し、ｐＲｂ２／ｐ１３０がこのキナーゼの活性の阻害に一役担っていることがあることを示唆する。更に、ｐＲｂ２／ｐ１３０は結合性細胞周期機構に関し、ｐ１０７との機能的類似性において異なるようである。
【００１９】
ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質レベルとｃｄｋ２キナーゼ活性との間に関係があるため、ｃｄｋ２を直接阻害するｐＲｂ２／ｐ１３０の能力を調べた。ｐＲｂ２／ｐ１３０及びｐ１０７の様々な領域を代表する突然変異体のパネル、並びにコントロールとしてのｐＲｂを開発し、そしてＧＳＴ融合タンパク質として発現させた（図１参照）。ｃｄｋ２複合体を対数増殖中のＭＬ１ミエローマ細胞のリゼートから免疫沈殿させた。次いで２０μｇのＧＳＴ−融合タンパク質をこの沈殿物に加え、そしてその混合物を基質としてヒストンＨ１を利用するキナーゼアッセイにかけた。ポケットのＡ及びＢドメイン並びにｐＲｂ２／ｐ１３０のＣ末端領域は、ＧＳＴのみで処理した沈殿物と比べｃｄｋ２のキナーゼ活性に対してほとんど又は全く影響を及ぼさず、一方Ｎ末端は中程度の阻害活性を有していた。しかしながら、アミノ酸配列がｐＲｂ２／ｐ１３０に特異的であるスペーサー領域はｃｄｋ２特異的ヒストンリン酸化を著しく低下させた。更に、ｃｄｋ２活性に対するスペーサー領域の阻害効果は用量依存性であることが見い出された。
【００２０】
このスペーサー領域の阻害活性もｐＲｂ２／ｐ１３０にとって固有である。全てのＲｂタンパク質ファミリー構成員由来のスペーサー領域をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、そしてｃｄｋ２のキナーゼアッセイに大過剰量で加える実験を実施した。しかしながら、ｐＲｂ２／ｐ１３０のみがこの領域を介して有意にｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害できた。
【００２１】
ｃｄｋ２に対するこのスペーサー領域の特異性を確認した。これらの実験において、ｃｄｃ２，ｃｄｋ２，ｃｄｋ４及びｃｄｋ５等のｃｄｃ２ファミリー構成員をＭＬ１細胞から免疫沈殿させ、そして基質としてヒストンＨ１又はＲｂのいずれかを用いるキナーゼアッセイにかけた。ｐＲｂ２／ｐ１３０のスペーサー領域はｃｄｋ２キナーゼ活性のみ低下させることができ、ｐＲｂ２／ｐ１３０に関連する阻害活性が、細胞内で安定的に結合できるキナーゼ、ｃｄｋ２に対して特異的であることが実証された。
【００２２】
ｃｄｋ２の活性を阻害するものと実証された領域はアミノ酸６１６〜８２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対応するｐＲｂ２／ｐ１３０のスペーサー領域の一部を含んで成る。更なる実験は、アミノ酸６１６〜７１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びアミノ酸６４１〜７１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含んで成るペプチドがこの阻害効果を保持していることを特定した。アミノ酸６１６〜６４２，６４１〜６６６，６６３〜７１１、及び６１６〜６６６から成るペプチドは阻害効果を保持できなかった。従って、本発明の課題に関し、「ペプチド」とはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はそのフラグメントもしくはその突然変異体を含んで成るペプチド、又は類似のｃｄｋ２阻害活性を有する相同アミノ酸配列を意味する。相同アミノ酸配列とは、ｃｄｋ２阻害活性を有するものと決定されたペプチドの規定の長さにわたって少なくとも約８５％、そして好ましくは９０〜９５％のアミノ酸一致を有する配列である。「ペプチド」とは、アクセプター分子との相互作用においてペプチドの代替物として機能する構造であるペプチド擬似体を含むことも意味する（ペプチド擬似体についてはMorganら (1989) Ann. Reports Med. Chem. 24 : 243-252を参照のこと) 。ペプチド擬似体には、限定することなく、アミノ酸及び／又はペプチド結合を含む又は含まないが、ペプチドリガンドの構造及び機能的特徴を保持する合成構造体が含まれる。この用語の中に更に含まれるのは、Ｎ−置換化アミノ酸のペプチド又はオリゴマーであるペプトイド及びオリゴペプトイドである。ペプチド擬似体とは、特定のアミノ酸の長さとなるようにデザインされ、且つ考えられる全ての対応のアミノ酸配列であるペプチドの集団であるペプチドライブラリーを含むことも意味する。ペプチドライブラリーを作製する方法は当業者に周知である。
【００２３】
この阻害活性を発揮できる本発明のペプチドは全長タンパク質のＣＯＯＨ末端から始まって欠失突然変異体を作製することにより決定できる。このような突然変異配列に対応するキメラ融合ペプチドを次にＰＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター系を利用して実施例１及び２に従って作製する。阻害活性を保持するｐＲｂ２／ｐ１３０のペプチド配列はかくして固相又は液相ペプチド合成の如き周知の方法に従って合成的に調製できる。他に、本発明のペプチドは組換合成できうる。本発明のペプチドを特性決定するのに利用されるアッセイを実施例４において記載した。
【００２４】
ｃｄｋ２活性を阻害する本発明のペプチドは、ｃｄｋ２の活性化を物理的に妨害することにより細胞周期のＧ１／Ｓ期の細胞増殖進行を阻害するうえで有用であろう。ｃｄｋ２のキナーゼ活性を阻害することにより細胞周期の進行を制御するこれらのペプチドは腫瘍増殖の停止を招くものと期待できる。悪性腫瘍の進行段階及び／又はタイプは、効果を奏するのに必要なペプチドの投与量及びルートを特定するであろう。
【００２５】
更に、これらのペプチドは細胞周期のＧ１／Ｓ期の調節におけるｃｄｋ２の正常な機能の研究において有用であろう。
【００２６】
以下の非限定的な実施例を本発明の更なる説明のために提供する。
【００２７】
実施例
実施例１：構築体の調製
原核発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Stratagene, La Jolla, CA) 及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をキメラグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの構築のために用いた。ｐＧＥＸ−２ＴにサブクローニングしたＰＣＲフラグメントを増幅するのに用いたプライマーはｐＲｂ２／ｐ１３０のＮＨ2 の５′及び３′末端、Ａ、スペーサー、Ｂ及びＣＯＯＨドメイン、並びにｐＲｂ及びｐ１０７のスペーサードメインに由来した。作製したｐＧＥＸ−２Ｔ融合タンパク質を図１に示す。
【００２８】
実施例２：ＧＳＴ融合タンパク質の調製
ｐＧＥＸ−２Ｔベクターを担持するＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌を中対数増殖期にまで増殖させ、次いでＩＰＴＧを培地に０．２５mMの濃度に添加することによりタンパク質の発現を誘導した。この培養物を数時間振盪させた。次いで細菌をペレットにし、そしてＮＥＮＴバッファー（２０mMのトリス、pH８、１００mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ４０）に再懸濁した。細胞懸濁物を音波処理し、ペレットにし、そして上清液を回収した。次いで残りの細菌をＮＥＮＴ＋２％のＮ−ラウリル−サルコシンに再懸濁し、ペレットにし、そしてその上清液を再び回収した。合わせた上清液をグルタチオンアガロース（Pharmacia, Piscataway, NJ)と４℃で一夜インキュベーションした。次いでアガロースをペレットにし、そしてＮＥＮＴバッファーの中で３回洗った。
【００２９】
実施例３：イムノブロッティング
細胞リゼートはペレットにした細胞を２００μｌの溶解バッファー（５０mMのトリス、５mMのＥＤＴＡ、２５０mMのＮａＣｌ、５０mMのＮａＦ、０．１％のトリトン、０．１mMのＮａ3 ＶＯ4 、プロテアーゼインヒビター）の中に再懸濁することにより調製した。５０μｇのタンパク質を７％のポリアクリルアミドゲルに泳動させた。ポリアクリルアミドゲル内のタンパク質をＣＡＰＳバッファー（１０mMのＣＡＰＳ、２０％のメタノール、pH１１）中のＰＶＤＦ膜（Millipore Corp., Bedford, MA) に転写した。この膜をＴＢＳ−Ｔバッファー（２mMのトリス、１３．７mMのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、pH７．６）中の５％のミルクでブロッキングし、次いでＴＢＳ−Ｔで洗った。第一抗体を３％のミルク内でこの膜とインキュベーションし、次いでＴＢＳ−Ｔで洗った。この膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Amersham, Arlington Hts, IL)に複合した抗ウサギとインキュベーションし、そしてＴＢＳ−Ｔで洗った。膜に結合した第二抗体の存在をＥＣＬシステム（Dupont NEN, Boston, MA) を利用して検定した。
【００３０】
実施例４：キナーゼアッセイ
細胞リゼートはペレットにした細胞を２００μｌの溶解バッファー（５０mMのトリス、５mMのＥＤＴＡ、２５０mMのＮａＣｌ、５０mMのＮａＦ、０．１％のトリトン、０．１mMのＮａ3 ＶＯ4 、プロテアーゼインヒビター）の中に再懸濁することにより調製した。各フラクションにつき等量のタンパク質を特異的なＡｂで免疫沈殿させた。ヒストンＨ１キナーゼ活性の存在の検定の前に、各サンプルを等量の前述のＰＧＥＸ−２７構築体と４℃で３０分インキュベーションした。タンパク質キナーゼアッセイはGiordanoら（1991) Science 253 : 1271-5に記載の手順に従って実施した。キナーゼアッセイは少なくとも３回繰り返し、タンパク質量を標準化してアッセイ間標準偏差が１０％以内となるようにした。
【図面の簡単な説明】
【図１】  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ｐＲｂ，ｐ１０７及びｐＲｂ２／ｐ１３０融合タンパク質の模式図。
【図１】
0004323716.tif 000002
【配列表】
0004323716000001.app