(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から分離したゲノム、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを用いて行う方法であって、
下記（１）又は（２）に記載の遺伝子の変異の有無を検出することを特徴とする慢性関節リウマチの発症またはその発症可能性の判定方法。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードする慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子。
（２）配列番号２に示される塩基配列からなり、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基挿入変異を持った遺伝子。
【請求項２】
被験者から分離したタンパク質を用いて行う方法であって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質の変異の有無を検出することを特徴とする慢性関節リウマチの発症またはその発症可能性の判定方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の変異の有無を検出する方法を利用した慢性関節リウマチの発症またはその発症可能性の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子、及びその利用に関し、具体的には、当該遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質の変異の有無を検出することを特徴とした慢性関節リウマチの発症またはその発症可能性の新たな判定方法および判定キット等を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００３】
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く利用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子の存在は、その陽性率が3ヶ月以内で33％、12ヶ月以上においても88％程度（治療、第73巻、第３号、第23〜27頁、1991年）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体IgM抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（特開平10-513257号参照）。
【０００４】
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【０００５】
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・憎悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な治療とを行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。ＲＡは、世界的には罹患率１％以下の疾患であるが（ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Engl.J.Med.）、第322巻、第1277〜1289頁、1990年）、患者の同胞では約８％以上が発症する（セル（Ce11）、第85巻、第311〜318頁、1996年）ことから、その原因因子として何らかの遺伝的要因が想定されている。また、環境が原因因子の１つと考えられていることから、あらかじめ発症可能性を知ることにより、日常生活において、例えば、食餌、ウイルス感染およびストレス等に注意することにより発症を遅らせたり防ぐことが可能である。さらに、診断を早め、早期に適切な治療を行うことによってＲＡの進行を遅らせることが可能であり、予後の改善が期待される。
【０００６】
国際公開WO98／51791号の開示内容によれば、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、慢性関節リウマチの疾患遺伝子が位置する3カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第1染色体の、マイクロサテライトマーカーD1S214および／またはDlS253がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第8染色体の、マイクロサテライトマーカーD8S556がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトX染色体の、マイクロサテライトマーカーDXSl001、DXS1047、DXS1205、DXS1227および／またはDXS1232がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子座は第１、第８、およびX染色体上に存在することが明らかにされている。このうち、第1染色体およびX染色体についてはこれまでにＲＡの疾患感受性遺伝子が同定されているものの、第８染色体においてはＲＡの疾患感受性遺伝子は未だ同定されていない。
【０００８】
そこで、本発明は、ヒト第8染色体上に存在する慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子を同定し、その遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の変異の有無を検出することにより、ＲＡの発症またはその発症可能性を高精度に判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キットを提供することを課題とするものである。さらに、本発明は、上記慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子に変異を持つＲＡ患者に対する有効な治療方法および治療薬剤を提供することを課題とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、上記課題に鑑み、ヒト第８染色体について複数のマイクロサテライトマーカーを用いた詳細な遺伝子マッピングを行い、ＲＡ関連遺伝子座位を決定した。さらに、その近傍に位置するAngiopoietin-1遺伝子についてＲＡ疾患感受性遺伝子としての可能性を検討したところ、当該遺伝子に３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在すること、３塩基欠失型ホモを変異なし、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモを変異ありとしたときＲＡ患者と健常者との間で有意差が認められたこと、および、ＲＡ患者では健常者に比べ有意にｍＲＮＡ発現量が低いこと、を各実験により明らかにした。
【００１０】
これらの知見より、被験者から得られた細胞における上記遺伝子およびその翻訳産物たるタンパク質の変異の有無を指標としたＲＡの発症またはその発症可能性の判定（診断）方法、および判定（診断）キットが有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな治療方法および治療薬剤としても有用である。
【００１１】
以下、本発明について詳述するが、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００１２】
本発明に係る遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質をコードする慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子である。本発明に係る遺伝子としては、具体的には、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基挿入変異を持ったAngiopoietin-1遺伝子を例に挙げることができる。上記第８０５〜８０７番目の塩基は、Angiopoietin-1遺伝子のｃＤＮＡとしてジェンバンクに登録されている塩基配列（アクセッション番号Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００１３】
上記「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドを含む意味であり、本発明に係る遺伝子としては、上記Angiopoietin-1遺伝子のｃＤＮＡのほか、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの転写元のゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、翻訳領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やプロモーター配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００１４】
本発明に係るタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシン挿入変異を持ったタンパク質である。このタンパク質は、上記Angiopoietin-1遺伝子の翻訳産物であり、さらに付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓタグ等によって当タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００１５】
上記Angiopoietin-1は、Angiopoietin・Familyに属する因子であり、血管の形成に重要な役割を果たすとされている。血管新生関連tyrosine kinase型レセプターにはVEGF receptor familyとTIE receptor familyとがあり、ＲＡ患者においてVEGF過剰産生が報告されている(Ann Rheum Dis: 59: i65-71, 2000参照)。Angiopoietin-1は、TIE2 receptorのリガンドであり、VEGFと相補的に機能して血管損傷および出血を抑制する効果をもつことが知られている(Nature Medicine:Vol.6:460-463:2000参照)が、病態との関連は不明な部分が多かった。
【００１６】
本願発明者は、前述のように詳細な遺伝子マッピングを行った結果、マイクロサテライトマーカーD8S556に連鎖性を見出し、これが以前行った連鎖解析の結果と一致したことより当位置がヒト第８染色体上ＲＡ疾患感受性遺伝子座位であると考えた。
【００１７】
上記D8S556はヒト第８染色体上長腕領域にマップされるが、この領域のマウスでの相同領域に当たる第15染色体上の領域には関節炎感受性遺伝子Paam1が存在することが報告されている(リウマチ  40(5):833-848,2000参照)。また、上記D8S556は584.52-584.72cRに位置することが明らかになっており(リウマチ  vol.39:P445,1999参照)、Angiopoietin-1はGB4 Mapで589.07cRにマップされることから、Angiopoietin-1は、疾患感受性遺伝子候補として染色体上位置からも妥当であると考えられる。
【００１８】
さらに、ＲＡ患者の滑膜および末梢血から単離した遺伝子解析の結果、上記Angiopoietin-1遺伝子に３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することを見出した。以下、遺伝子配列上のこの３塩基挿入位置および３塩基欠失位置を、単に「変異位置」という。同様に、この遺伝子配列上の変異位置に対応するアミノ酸配列上のグリシン挿入位置およびグリシン欠落位置を、単に「変異位置」という。
【００１９】
なお、上記３塩基欠失については、human cell line T98Gにおいても報告されている(Cell. Vol.87:1161-1169,1996参照)。
【００２０】
Angiopoietin-1は、VEGFと相補的に作用して血管網の形成を増強する。具体的には、VEGFは血管新生における重要な促進因子であり内皮細胞の遊走と増殖とを促す。一方、この内皮細胞の遊走と増殖とはAngiopoietin-1により調節される因子によって停止し、新しい血管基底膜が形成されることにより成熟した血管が構築される。事実VEGFのみによって実験的に誘導された血管は未熟で出血しやすく、ＲＡではVEGF過剰産生が報告されている(Ann Rheum Dis: 59: i65-71, 2000参照)がAngiopoietin-1についての知見はない。本願発明者は、Angiopoietin-1のmRNA発現量をＲＡ患者と健常者とで比較したところ、ＲＡ患者の末梢血中mRNA発現量が有意に低いことが明らかになった。これより、ＲＡでは未熟な血管の増殖が起こることよって、血中からの免疫細胞の漏出による慢性炎症展開に関与している可能性が考えられる。
【００２１】
本発明に係る遺伝子およびタンパク質は、以下詳述するように、ＲＡの発症またはその発症可能性を判定する新たな判定方法および判定キットに有用である。
【００２２】
（１）ＲＡの発症またはその発症可能性の判定方法
本発明に係るＲＡの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＲＡの診断方法）において、本発明に係る遺伝子として、▲１▼ゲノムＤＮＡを用いた場合、▲２▼ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いた場合を順番に説明し、その後、▲３▼本発明に係るタンパク質を用いた場合について説明する。
【００２３】
▲１▼ゲノムＤＮＡを用いた場合
ゲノムＤＮＡを用いた本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
【００２４】
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して使用することができる。
【００２５】
ゲノム上の変異の有無の検出方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法などが挙げられる。
【００２６】
例えば、ゲノムから、遺伝子上の上記変異位置を含む領域を増幅後、得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、これをダイレクトシークエンスすることによってゲノム上の変異の有無を検出できる。
【００２７】
また、遺伝子上の上記変異位置を含む領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、ゲノム上の変異の有無を検出できる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、上記変異位置を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを上記変異の有無の検出用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記変異位置を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００２８】
また、ゲノム上の変異の有無は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
【００２９】
このように、ゲノム上の変異を検出することにより、被験者のＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。具体的には、後述するように、３塩基欠失型ホモを変異なし、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモを変異ありとしたときＲＡ患者と健常者との間で有意差が認められたことから、３塩基欠失型ホモが検出された場合は、ＲＡを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、ヘテロおよび特に３塩基挿入型ホモが検出された場合は、ＲＡを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３０】
尚、上記判定方法により使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
【００３１】
▲２▼ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いた場合
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
【００３２】
上記変異位置を含む領域の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー：5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3'（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3（配列番号４）
このように、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異を検出することにより、上記と同様、被験者のＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【００３３】
▲３▼タンパク質を用いた場合
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号１のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、グリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
【００３４】
このように、上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出することにより、被験者のＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。具体的には、後述するように、３塩基欠失型ホモを変異なし、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモを変異ありとしたときＲＡ患者と健常者との間で有意差が認められたことから、グリシン挿入型タンパク質が検出されなかった場合（換言すれば、グリシン欠落型タンパク質しか検出されなかった場合）は、ＲＡを発症している可能性または将来発症する可能性は低く、一方、両方のタンパク質が検出された場合および特にグリシン挿入型タンパク質のみが検出された場合は、ＲＡを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。
【００３５】
（２）ＲＡの発症またはその発症可能性の判定キット
本発明に係るＲＡの発症またはその発症可能性の判定キット（換言すれば、ＲＡの診断キット）は、上記の変異を検出できる試薬、例えば、プライマー、プローブ、抗体などを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
【００３６】
例えば、ゲノム上およびｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異の有無を検出するキットとしては、上記変異位置を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記変異の有無を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００３７】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、上記変異位置を含む領域を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３および４に示される一組のプライマーセットを挙げることができる。
【００３８】
また、タンパク質上の変異の有無を検出するキットとしては、例えばグリシン挿入型タンパク質のみを認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００３９】
これらの判定キットを使用することにより、前記したように、ＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【００４０】
（３）ＲＡの治療方法および治療薬剤への正常型タンパク質などの利用
このように、Angiopoietin-1遺伝子上の３塩基挿入変異（および、これに対応するアミノ酸配列上のグリシン挿入変異）は、ＲＡの発症原因の一つと考えられ、したがって、Angiopoietin-1に上記グリシン挿入変異を持つＲＡ患者に正常型タンパク質（即ち、グリシン欠落型タンパク質）を補完することは、ＲＡの治療法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、以下のＲＡの治療方法および治療薬剤を提供するものである。
・上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有する慢性関節リウマチ患者に、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする慢性関節リウマチの治療方法。
・上記グリシン挿入変異を持ったタンパク質を有する慢性関節リウマチ患者の治療に用いられる治療薬剤であって、その変異を持たない正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、当該正常型タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とする慢性関節リウマチの治療薬剤。
【００４１】
正常型タンパク質の補完方法は特に限定されるものではなく、例えば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができ、具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法が挙げられる。また、前述のように、Angiopoietin-1は、TIE2 receptorのリガンドであることから、このTIE2 receptorのアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することもＲＡの治療法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質を含む。
【００４２】
また、上記正常型タンパク質または当該正常型タンパク質をコードするＤＮＡと、上記TIE2 receptorのアゴニストとしての低分子化合物とは、治療薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について、図１〜図５に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００４４】
（１）マイクロサテライトマーカーによる遺伝解析
患者２名、健常者１名を１家系とした３３家系において鎖長分析を行った。末梢血から抽出したＤＮＡから、第８染色体上の上記マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６近傍１０.８ｃＭ中にあるヘテロ接合度０.７以上のＤ８Ｓ１７６、Ｄ８Ｓ５２１、Ｄ８Ｓ１７３８、Ｄ８Ｓ５５６、Ｄ８Ｓ１８３０およびＤ８Ｓ５３９の各マイクロサテライトマーカーを、蛍光ラベルプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅し、ＡＢＩ３７７型シークエンサーで３０００Ｖ、２時間電気泳動した。そして、GeneScan(ver.2.0.2)を用いてマーカーのサイズを決定し、MAPMAKER/SIBS(ver.2.1) (Complete multipoint sib-pair analysis of quantitative and qualitative traits. Am. J. Hum.Genet.57:439, 1995参照)を用いて、罹患同胞対検索法にもとづいた２点解析によって最大連鎖性尤度(Maximum Lod Score)を算出した。
【００４５】
結果を図１の表に示す。同図に示すように、Ｄ８Ｓ５５６においてＬｏｄ値は最大単独頂値１．３５を示した。この結果より、本発明に係るＲＡ関連遺伝子は、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６との連鎖性が見出された。また、Ｄ８Ｓ５５６の近傍には、血管新生に関与する遺伝子Angiopoietin-1が位置すること等から、上記Angiopoietin-1がＲＡ疾患感受性遺伝子の候補遺伝子であると考えられた。
【００４６】
（２）Angiopoietin-1 ｃＤＮＡのシークエンス解析
ＲＡ患者の滑膜細胞および末梢血単核球分画より調製したトータルＲＮＡからOligo dT プライマーを用いた逆転写反応(GeneAmp RNA PCR Kit)(アプライドバイオシステムズ)によりｃＤＮＡを合成した。そして、Angiopoietin-1遺伝子領域１５０８ｂｐを増幅後、ダイターミネーター法によりシークエンス解析を行った。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーAngF1.5：5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3'（配列番号３）
アンチセンスプライマーAngR1.5：5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3（配列番号４）
また、上記センスプライマーAngF1.5および上記アンチセンスプライマーAngR1.5の設定位置については、図２中のＡ．に示すとおりである。なお、Angiopoietin-1分子内には、図２に示されるように、coiled-coilドメインおよびフィブリノーゲン様ドメインが存在する。
【００４７】
シークエンスにより決定したｃＤＮＡ配列は、Angiopoietin-1遺伝子の既報配列(アクセッション番号Ｕ８３５０８)と比較された。その結果、Angiopoietin-1遺伝子においては、前述のとおり、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することが見出された。配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示される。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【００４８】
図３には、変異位置を含む領域のシークエンス解析結果が示される。同図（ａ）は３塩基挿入型の解析結果であり、同図（ｂ）は３塩基欠失型の解析結果である。なお、図３は、各遺伝子配列の相補配列をシークエンス解析した結果を示すものである。したがって、同図（ａ）より、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入（相補配列では「ＡＣＣ」の３塩基挿入）が生じていることが確認でき、同図（ｂ）より、３塩基欠失型では、この３塩基が欠落していることが確認できる。
【００４９】
上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
【００５０】
（３）ＲＡ患者および健常者（ＲＡ未発症者）における上記変異の有無の検出患者本人以外の親族にＲＡ患者がいる家系（以下ＲＡ家系と称する）のＲＡ患者およびＲＡ家系の健常者、患者本人以外の親族にＲＡ患者がいない家系（以下孤発家系と称する）のＲＡ患者および孤発家系の健常者それぞれについて、上記３塩基挿入変異の有無の検出を行った。
【００５１】
上記の検出は、各被験者よりゲノムＤＮＡを抽出し、上記変異位置を含む領域を適当なプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅し、得られたＰＣＲ産物をシークエンス解析することにより実施した。なお、上記適当なプライマーとしては、上記３塩基挿入変異を含む領域を増幅することが可能なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを任意に使用することができる。また、上記適当なプライマーの長さは、ミスマッチによる標的領域以外の増幅が起こらない限りにおいて特に限定されない。一般には、１５から２５ヌクレオチドの範囲内の長さプライマーが用いられる。その一例として、上記センスプライマーおよび上記アンチセンスプライマーには、以下に示すオリゴヌクレオチドが挙げられる。
センスプライマー：5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3'（配列番号５）
アンチセンスプライマー：5'-ACACCTTTTTGGGTTCTGGC-3（配列番号６）
上記の方法による変異の検出結果を、図４に示す。なお、図４の表中において、Familial RAはＲＡ家系のＲＡ患者、Familial not RAはＲＡ家系の健常者、Sporadic RAは孤発家系のＲＡ患者、Sporadic not RAは孤発家系の健常者を示す。また、ｎは各種被験者の全体数を示し、正常型遺伝子をホモで有する者（図中では「nt805（del３）ホモ」と示す）、変異型遺伝子をヘテロで有する者（図中では「nt805（del３）ヘテロ」と示す）、変異型遺伝子をホモで有する者（図中では「nt805ホモ」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【００５２】
図４に示すように、ＲＡ家系および孤発家系ともに、ＲＡ患者のみが上記３塩基挿入型遺伝子をホモで有することが確認された。また、３塩基欠失型ホモを変異なし、ヘテロおよび３塩基挿入型ホモを変異ありとしたとき、孤発家系ＲＡ患者と孤発家系健常者との間、および、孤発家系ＲＡ患者とＲＡ家系健常者との間でそれぞれ有意差が認められた。このことから、上記変異の有無は、ＲＡ発症に関係することが確認された。
【００５３】
したがって、上記の方法を利用して上記ＲＡ関連遺伝子に３塩基挿入変異が生じているか否かの判定を行うことにより、ＲＡを発症しているか、あるいは、ＲＡの発症可能性を有しているかの判定を行うことができる。具体的には、例えば、ある被験者について上記のような方法により上記３塩基挿入変異の検出を行い、変異型遺伝子のみが検出された場合（すなわち、変異型遺伝子をホモで有する場合）および変異型遺伝子および正常型遺伝子の両方が検出された場合は、ＲＡを発症している可能性が高いと判定することができる。また、上記の検出の結果、変異型遺伝子が検出されなかった場合（すなわち、正常型遺伝子をホモで有する場合）は、ＲＡを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。なお、本発明に係る判定方法は、上述の方法に限定されるものではなく、上記の検出データに基づいて適宜選択することができる。
【００５４】
（４）上記ＲＡ関連遺伝子のｍＲＮＡの定量
ＲＡ患者２１名、健常者１８名を対象にしてTaqMan EZ  RT-PCRキット(アプライドバイオシステムズ)を用い、ABI7700で定量RT-PCRを行って、末梢血中におけるAngiopoietin-1 ｍＲＮＡの発現量を測定した。プライマーおよびプローブには以下のものを使用し、GAPDHを内部標準とした。なお、下記プライマーおよびプローブの設定位置は、図２中のＢ.に示すとおりである。
センスプライマーAngF272：5'-TTTGCGAGAGGCACGGAA-3'（配列番号７）
アンチセンスプライマーAngR389：5'-TATATCTTCTCCCACTGTTT-3'（配列番号８）
プローブTaq Man Probe：5'-TTCCTCGCTGCCATTCTGACTCACATA-3'（配列番号９）
定量結果は、対内部標準比の相対量として算出し、Welch's t testにより統計処理した。図５は、健常者（control）およびＲＡ患者の末梢血より抽出され、定量されたｍＲＮＡの発現量の平均値および標準偏差を示すグラフである。この結果を平均値±標準偏差として以下に示す。
健常者    ：0.3372±0.2421
ＲＡ患者  ：0.0986±0.0937
上記の結果より、ＲＡ患者は、健常者と比較してAngiopoietin-1 ｍＲＮＡの発現量が有意に低いということが確認された。
【００５５】
したがって、上記の方法を用いてｍＲＮＡの発現量を測定することにより、ＲＡを発症しているか否かの判定を行うことができる。具体的には、例えば、上記ｍＲＮＡの発現量に対して２つの閾値（閾値１・閾値２）を設け、上記ｍＲＮＡの発現量が上記閾値１以下であれば、ＲＡを発症している可能性が高い、または将来発症する可能性が高いと判定し、上記閾値２以上であれば、ＲＡを発症している可能性は低い、または将来発症する可能性は低いと判定することができる。なお、上記閾値１の値は、ＲＡ患者における平均値以下（すなわち0.0986以下）の値に設定されることが好ましい。また上記閾値２の値は、健常者における平均値以上（すなわち0.3372以上）の値に設定されることが好ましい。
【００５６】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、変異を有する遺伝子またはタンパク質を利用して、その変異の有無を検出することにより、慢性関節リウマチの発病またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に判定することができ、有用である。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな予防法、治療法および治療薬剤としても有用である。
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本実施例において、６種のマイクロサテライトマーカーを用いて行った遺伝解析の結果を示す表である。
【図２】図２は、本発明に係るＲＡ関連遺伝子を模式的に示した概略図である。また、図２Ａ．および図２Ｂ．には、本実施例において使用されるプライマーおよびプローブの設定位置を示す。
【図３】図３は、本実施例において、ＲＡ関連遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域のシークエンス解析を行った結果を示す図である。図３（ａ）は、３塩基挿入型のシークエンス解析結果であり、図３（ｂ）は、３塩基欠失型のシークエンス解析結果である。
【図４】図４は、本実施例において、ＲＡ患者および健常者において、３塩基挿入変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【図５】図５は、本実施例におけるｍＲＮＡの発現量の定量結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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