(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセル化動物細胞を提供するための生体適合性デバイスであって、
（ａ）（１）相互接続された複数の孔を有する網状熱可塑材又は熱可塑性エラストマー発泡体スカフォルドであって、
（Ａ）上記相互接続された複数の孔の少なくとも幾つかは、孔サイズが孔内に細胞を付着させるのに十分なように、直径20〜500μm細胞透過性孔であり、かつ
（Ｂ）上記相互接続された複数の孔の少なくとも幾つかは、孔サイズが孔内に細胞を付着させるのに不十分なように、直径10μm未満の細胞不透過性である、
前記発泡体スカフォルド、
（２）細胞透過性孔に分散した、生物学的活性分子を分泌する又は生物学的機能を提供することができる第１の生動物細胞集団、
を含むコア、
（ｂ）コアをカプセル化する生体適合性ポリマー又はハイドロゲルジャケットであって、
（１）50〜1000kDの分子量カットオフ（MWCO）を有する少なくとも１つの選択透過性膜表面を含み、かつ
（２）上記細胞に対して不透過性である、
前記ジャケット、
を含む、前記生体適合性デバイス。
【請求項２】
発泡体スカフォルドの空隙容積が30〜70％である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
発泡体スカフォルドが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリウレタン及びポリビニルアルコールからなる群より選択される材料から形成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
発泡体スカフォルドの空隙容積が20〜90％である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
発泡体スカフォルドがジャケット内に細胞外基質接着分子又はその接着ペプチドフラグメントで被覆されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
発泡体スカフォルドが、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリオルニチン、フィブロネクチン、エラスチン、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンからなる群より選択される１以上の細胞外基質分子で被覆される、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
発泡体スカフォルドの少なくとも一部が、細胞増殖または移動を抑制する材料に露呈されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
デバイスのコアがさらに第２の生細胞集団を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
デバイスが管状構造を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
ジャケットが熱可塑性ポリマーから形成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
選択透過性膜表面が50〜700kDのMWCOを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
選択透過性膜表面が70〜300kDのMWCOを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
ジャケットの厚みが5〜200ミクロンである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
ジャケットの厚みが10〜100ミクロンである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
ジャケットの厚みが20〜75ミクロンである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
少なくとも幾つかの孔の直径が50〜150μmである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
少なくとも幾つかの孔が円形である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１８】
少なくとも幾つかの孔が楕円形である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１９】
孔が円形である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
孔が楕円形である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
楕円形孔の直径が、短軸に沿って20〜500μmであり、かつ長軸に沿って1500μm以下である、請求項１８又は２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
コア網状発泡体スカフォルドの孔密度が20〜90％である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
ジャケットポリマーが50〜700kDの分子量カットオフを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
ジャケットポリマーが、ポリアクリレート、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル/ポリ塩化ビニル、並びにこれらの誘導体、共重合体及び混合物からなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
生物学的活性分子が、神経伝達物質、神経調節物質、ホルモン、栄養因子、成長因子、鎮痛剤、サイトカイン、リンフォカイン、酵素、抗体、血液凝固因子及び血管新生促進因子からなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
発泡体スカフォルドがポリビニルアルコールから形成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
細胞増殖または移動を抑制する材料が、陰イオンハイドロゲル及び固形ハイドロゲルからなる群より選択される、請求項７に記載のデバイス。
【請求項２８】
移植可能な生体適合性細胞カプセル化デバイスを製造する方法であって、
（ａ）透過性生体適合性材料を含むジャケットを形成すること、
（ｂ）発泡体の孔密度が20〜90％の範囲にある、相互接続された複数の孔を有する網状発泡体スカフォルドを含み、上記孔に分散した生哺乳動物細胞集団をさらに含むコアを、上記ジャケットに装填すること、
（ｃ）上記ジャケットを密閉すること、
を含み、上記ジャケットは、透過性膜を横切る哺乳動物細胞の通過を防ぐ一方で、前記透過性膜を横切る生物学的活性物質の通過を可能にする少なくとも１つの透過性膜表面を提供する、
前記方法。
【請求項２９】
発泡体スカフォルドが熱可塑材又は熱可塑性エラストマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発泡体スカフォルドが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリウレタン及びポリビニルアルコールからなる群より選択される材料から形成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
発泡体スカフォルドの空隙容積が20〜90％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
発泡体スカフォルドが細胞外基質接着分子又はその接着ペプチドフラグメントで被覆されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
発泡体スカフォルドが、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリオルニチン、フィブロネクチン、エラスチン、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンからなる群より選択される１以上の細胞外基質分子で被覆される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
発泡体スカフォルドの少なくとも一部が、哺乳動物細胞増殖または移動を抑制する不透過性材料に露呈されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｂ）のジャケットの装填が、以下の工程：
（ｉ）発泡体の孔密度が20％〜90％の範囲にある、相互接続された複数の孔を有する網状発泡体スカフォルドを含むコアをジャケット内に形成すること、及び
（ｉｉ）生哺乳動物細胞集団を上記コアに装填すること、
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
神経系疾患、障害又は状態の治療又は予防用の医薬品の製造における、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【請求項３７】
神経系疾患、障害又は状態が、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、疼痛、癌及び腫瘍からなる群より選択される、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、発泡体スカフォルド（foam scaffold）を有する生体適合性デバイス、並びにこのようなデバイスの製造及び使用方法に関する。
発明の背景
本発明は、カプセル化した細胞或いは神経伝達物質、神経調節物質、ホルモン、栄養因子、成長因子、鎮痛剤、酵素、抗体又は他の生物学的活性分子などの物質を有する、病気や障害の治療用の移植可能なカプセル化デバイス（encapsulation device）に関する。特に、本発明は、内部支持された（internally-supported）生体適合性細胞カプセル化デバイスに関する。
これまでのカプセル化方法といえばマクロカプセル化（macroencapsulation）であったが、これは一般に、中空糸（又は他の好適な形状の）デバイスの中に生細胞を入れて、その先端を密閉する（seal）ことを含む。選択的に透過可能な、即ち「選択透過」膜によりこのような細胞をカプセル化することにより、細胞により生成及び分泌される生物学的因子を拡散させつつ、細胞を特定の場所の中に拘束する。また、カプセル化により、異種間（雑種間）または同種間の生体内移植の場合における受容者の拒絶反応（host rejection）を低減したり防いだりすることもできる。
様々なタイプの細胞デバイスが知られている。アービシャー（Aebischer）らの米国特許第4,892,538号（本明細書中に参考として組み込まれる）は、細胞カプセル化用の選択透過性中空糸膜を開示している。また、アービシャーらの米国特許第5,158,881号（本明細書中に参考として組み込まれる）は、細胞懸濁液の周りにチューブ状成形物を形成し、間隔毎にこのチューブ状成形物を密封して、重合体結合により連結された個別の細胞コンパートメント（cell compartment）を画定することにより、生存細胞をカプセル化するための方法を開示している。血管新生を促す１つの大きな孔の疎水性外側表面を有する、患者に生体内移植するための選択透過性細胞閉鎖可能膜管（a selectively permeable cell closeablemembrane tube）に関するマンデル（Mandel）らのWO91/00119も参照のこと。
カプセル化デバイスに使用する細胞型の多くは接着型であり、（分裂細胞であるか非分裂細胞であるかにかかわらず）凝集し、互いに接着する。これらの細胞クラスター又は凝集は、デバイスの中心に壊死コア（necrotic core）を形成し得る。このようなコアは、細胞クラスターの中心に達する一定の代謝産物の欠乏、又は毒性生成物の蓄積により、時間がたつと発達して、細胞を死滅させるおそれがある。死滅していく細胞が蓄積して分解し始めると、壊死性組織は、生存細胞に有害な因子（例えばマクロファージ又は他の免疫応答を誘発する因子など）を放出することもある。
壊死コアの形成を減らす１つの方法は、デバイスの中でマトリックス物質、例えばハイドロゲルマトリックスの中に細胞を固定化することを含む。例えばハイドロゲル又は細胞外基質コアを用いた生体適合性免疫隔離伝達体（biocompatibleimmunoisolatory vehicle）に関するディオン（Dionne）らのWO92/19195を参照のこと。
デバイス中の細胞の増殖を制御し、壊死コアの影響を低減するための他の公知の方法は、デバイスの中で細胞を次第に増殖させるためにポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−メチルメタクリレート）、或いは不織ポリエステル製スカフォルドを提供するものである。例えばスキンスチン（Schinstine）らのWO96/02646を参照のこと。このようなスカフォルドは、オープンセル構造（open cell structure）ではなく繊維網を形成する。
発明の概要
本発明は、内部発泡体スカフォルドを有する新しい生体適合性細胞デバイスを提供する。この発泡体スカフォルドはオープンセル構造、即ち相互接続された多孔を提供する構造を有する。細胞はこの多孔の壁に付着することができる。本発明のデバイスに使用するスカフォルド材料は、合成多孔ポリマー性オープンセル発泡体材料である。このスカフォルド材料に収容された細胞を、多孔性細胞不透過膜の中にカプセル化することによって、このスカフォルドから漏れるのを防ぐ。
【図面の簡単な説明】
図１は、PVA発泡体スカフォルドを有するデバイス（白抜きの丸）と、キトサンマトリックスを有するデバイス（白抜きの四角）とを経時的に比較した、PC１２細胞からのAlamar蛍光のグラフである。
図２は、PVA発泡体スカフォルドを有するデバイス（白抜きの丸）と、キトサンマトリックスを有するデバイス（白抜きの四角）とを経時的に比較した、PC１２細胞からの基礎（basal）L-ドーパ放出（pm/mL/30分）のグラフである。
図３は、げっ歯類に生体内移植する前の及び移植１ヶ月後の外植（explant）時の、PC１２細胞からの基礎L-ドーパ放出のグラフである。グラフは、PVA発泡体スカフォルドを用いたデバイス（「PVA」とラベル）と、キトサンマトリックスを用いたデバイス（「コントロール」とラベル）との比較を示す。斜線の入ったバーは生体内移植前のデータを示し、白いバーは外植時のデータを示す。デバイスには、最初に低密度（LD）の細胞又は高密度（HD）の細胞を入れた。
図４は、げっ歯類に生体内移植する前の及び移植１ヶ月後の外植時の、PC１２細胞からのK−誘発L-ドーパ放出のグラフである。グラフは、PVA発泡体スカフォルドを有するデバイス（「PVA」とラベル）と、キトサンマトリックスを有するデバイス（「コントロール」とラベル）との比較を示す。斜線の入ったバーは生体内移植前のデータを示し、白いバーは外植時のデータを示す。デバイスには、最初に低密度（LD）の細胞又は高密度（HD）の細胞を入れた。
発明の詳細な説明
本発明は、内部発泡体スカフォルドを有する生体適合性デバイスに関する。本発明のデバイスは少なくとも１つの選択的に透過可能な（選択透過性）表面を有し、該表面を通して生物学的活性分子を送達することが可能である。このような分子の送達は、デバイスから受容者へ、或いは受容者からデバイスへ行われることができる。このデバイスは、移植後にそれ自身の中に細胞を導入するための手段を含むことができる。例えばアービシャーらのWO93/00128を参照のこと。
本発明のデバイスは、（a）相互接続された孔からなる網状構造を有する発泡体スカフォルドを含み、前記孔は孔の壁に細胞が付着できるようなサイズであり、
（b）前記発泡体スカフォルドの中または表面に分散された生細胞を含み、及び
（c）生体適合性のある選択透過膜ジャケットを有する周囲又は周辺領域を含む。所望により、そのコアの中の細胞に対する受容者の免疫系の有害な影響を最小にするようにデバイスを作製することもできる。
細胞を固定化するために中空糸膜デバイスに使用する従来のマトリックスは、架橋したハイドロゲルであった。本発明の発泡体スカフォルドは、これらの伝統的なハイドロゲルマトリックスに比べて幾つかの利点を有する。
（１）一般にハイドロゲルは、細胞を拘束する物理的な表面を持たないため細胞の増殖及び移動を抑制しないが、発泡体（フォーム、foam）は、細胞が付着することができる表面（又は壁）を有する相互接続された孔を有する。これは、接触阻害を起こす細胞の増殖を抑制することができる。従って、接触阻害細胞系を増殖させるために、発泡体は表面領域が細胞で満たされれば安定した細胞数を提供することができるが、ハイドロゲルの中では細胞の増殖は制御されないままである。
（２）発泡体は、中空糸膜に非常に高い機械的強度及び弾性を提供し、更に曲げ耐性を提供することができるが、ほとんどのハイドロゲルは機械的に弱く、曲げ耐性を提供することができない。
（３）発泡体は、中空糸膜の中に直接形成し、予め組立てられたデバイスの一部として滅菌することができるため、別々の無菌ステップで細胞をマトリックスに注入する必要性を省く。
（４）発泡体は、細胞支持体として以前使用されていた液体コア物質を用いたときよりもカプセル化デバイスの中に細胞をより均一に分散させたまま維持することができるため、輸送特性の低下及び続いて起こり得るデバイスの管腔内の壊死コアにつながる細胞の凝集を防ぐことができる。
（５）合成発泡材料は、細胞又は酵素によって劣化することのあるハイドロゲルに比べて生物学的に非常に安定である。
（６）合成非劣化性発泡体（synthetic non-degradable foam）は膜を傷をつけないが、ハイドロゲルはデバイスに入れられて劣化すると膜の選択透過表皮の孔を傷つけるおそれがある。
（７）発泡体は小さな細胞クラスターを互いに物理的に分離するので、必要であればハイドロゲルマトリックス材料よりも細胞の密度をより高く保つことができる。
また、本発明の発泡体スカフォルドは、非発泡体スカフォルドに比べて幾つかの利点を有する。決められた特徴及び孔サイズを有する発泡体スカフォルドは、簡単に製造することができる。更に、従来のスカフォルドは一般に、相互接続された孔を有するオープンセル構造ではなく繊維網構造を有するので、細胞が付着できる表面が小さい。更に、複製可能な物理的特徴を有する繊維網スカフォルドを製造することは一般により難しく、膜ジャケットの外で予め製造することは一般にできない。更に、発泡体スカフォルドの網状多孔構造は、不透過性材料（例えば不透過性ハイドロゲルなど）で孔を充填することにより、デバイスの中に細胞透過性領域及び細胞不透過性領域を作成することを可能とする。
「生体適合性デバイス」とは、受容者となる哺乳動物に生体内移植しても、そのデバイスの拒絶反応に陥ったりデバイスを操作不能にしたりするのに十分有害な受容者反応を引き起こさない。このような操作不能は、例えばデバイスの周りに繊維構造が形成されることによりその中にある細胞への栄養素の拡散が制限されることなどにより、生じ得る。
「生物学的活性」とは、特定の細胞に対する分子の生物学的作用を意味する。本明細書で使用される「生物学的活性分子」とは、それが産生される細胞の中でその生物学的活性を発揮し得る分子（例えばアポトーシスを防ぐbcl-2など）、又は細胞の表面に発現してその細胞と他の細胞又は生物学的活性分子との相互作用に影響し得る分子（例えば神経伝達物質受容体又は細胞接着分子など）である。更に、生物学的活性分子は、それが産生される細胞から放出又は分泌されて、別の標的細胞にその効果を発揮することができる（例えば神経伝達物質、ホルモン、成長又は栄養因子、或いはサイトカイン）。
カプセル化デバイスのジャケットを製造するために様々なポリマーおよびポリマーブレンドを使用することができる。デバイスを形成する高分子膜には、ポリアクリレート（アクリル共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン（polyphosphazene）、ポリアクリロニトリル、及びPAN／PVC、並びにこれらの誘導体、共重合体、及び混合物が含まれる。
或いは、デバイスジャケットは、例えばハイドロゲルなどを含むあらゆる好適な生体適合性材料から製造することができる（例えばディオンらの（WO92/19195）を参照）。
またデバイスジャケットは、エチレン酢酸ビニル共重合体などの疎水性マトリックスや、ハイドロゲルなどの親水性マトリックスを含んでもよい。ジャケットは、製造後に被覆したり、或いはポリウレタン、エチレン酢酸ビニル、シリコン、又はアルギン酸などの不透過性外側コーティングで処理して細胞室（cellchamber）の一部をカバーしてもよい。ジャケットを製造するために使用される材料は、選択透過性且つ生体適合性のある周囲又は周辺領域となる。
ジャケットを形成する際に上記ポリマーと共に使用する溶媒は、膜材料として選ばれる特定のポリマーに依存する。好適な溶媒には、一般にアルコールやケトンなどの様々な有機溶媒、及びジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルアセトアミド（DMA）、及びジメチルホルムアミド（DMF）、並びにこれらの溶媒のブレンドが含まれる。一般に、水混和性有機溶媒が好ましい。
ポリマー溶液（即ち「ドープ」）には、多孔性チャンネルの形成を強化するための界面活性剤や、凝固過程の間に形成される酸化物を封鎖するための酸化防止剤などの、様々な添加剤も含まれる。界面活性剤の例としては、シグマケミカル社（Sigma Chemical Corp.）から入手可能なTriton−X100や、Pluronic P65、P32及びP18が挙げられる。酸化防止剤の例には、ビタミンＣ（アスコルビン酸）及びビタミンＥが含まれる。
ジャケットは所定サイズ以下の物質の通過を許すが、それより大きな物質の通過を妨げる。より詳細には、ジャケットは所定範囲のサイズの孔又は間隙を有するように製造される。特定のデバイスのために選択される分子量のカットオフ（molecular weight cutoff、MWCO）は、想定される用途によって部分的に決まる。本発明に最も有用な膜は、限外ろ過膜及び精密ろ過膜である。
１つの実施態様において、本発明者らは限外ろ過膜を想定する。これは、選択的に透過可能な膜、即ち選択透過膜としても知られている。この実施態様において、本発明者らは1000kD以下、好ましくは50〜700kDまたはこれ未満、最も好ましくは70〜300kDのMWCOを想定する。他の実施態様において、ジャケットを製造するために精密ろ過膜、即ち微孔性膜を想定する。
本発明の内部発泡体スカフォルドを有するデバイスを製造するために、あらゆる好適な膜を使用することができる。例えば、米国特許第4,892,538号（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されたような中空糸選択透過膜（例えばAMICON社（マサチューセッツ州、レキシントン）より入手可能なXM−50チューブなど）を使用することができる。或いは、米国特許第5,284,761号又は第5,283,187号、及びバエジェ（Baetge）らのWO95/05452（これらは全て本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されたように選択透過性中空糸膜を形成することができる。１つの実施態様において、ジャケットは米国特許第4,976,859号及び第4,968,733号（選択透過及び微孔性膜に関する）に記載されたタイプのポリエーテルスルホン膜から形成される（当該特許の開示内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。
透過性膜の様々な製造方法が当業界において公知である。１つの方法では、ポリマーキャスティング溶液（polymeric casting solution）及び凝集剤（生体組織断片、細胞器官、或いは細胞及び／又は他の治療薬の懸濁液が含まれる）の共押出しによって中空糸膜が形成される。このような方法については、米国特許第5,284,761号及び第5,283,187号（本明細書中に参考として組み込まれる）を参照されたい。
好ましくは、本発明のデバイスは免疫隔離性である。「免疫隔離性デバイス」とは、受容者として哺乳動物に生体内移植する際に、そのコアの中の細胞に対する受容者の免疫系の悪影響を最小にし、in vivoで機能する時間が長いデバイスを意味する。免疫隔離性であるためには、デバイスの周囲又は周辺領域は、受容者の体の有害物質が伝達体のコアの中に入り込むのを防ぎ、カプセル化（隔絶された）細胞と受容者の免疫系との間の有害な免疫学的接触を防ぐのに十分な物理的障壁を提供することによって、そのデバイスが生体内移植される受容者の免疫系から細胞を保護しなければならない。この物理的障壁の厚さは変えることができるが、常に障壁の両側にある細胞及び／又は物質が直接接触するのを防ぐのに十分な厚みでなければならない。この領域の厚みは、一般には5〜200ミクロンであり、10〜100ミクロンが好ましく、20〜75ミクロンが特に好ましい。本発明の伝達体を用いて防ぐ又は最小にすることができる免疫学的攻撃のタイプには、マクロファージ、好中球、細胞性免疫応答（例えばナチュラルキラー細胞及び抗体依存性T-細胞媒介細胞障害（ADCC））、及び体液性免疫応答（例えば抗体依存性補体媒介細胞障害）による攻撃が含まれる。
免疫隔離性デバイスを使用することにより、付随して受容者を免疫抑制する必要なく、異種細胞又は組織の生体内移植が可能となる。伝達体のコアからIgGを排除しても、免疫隔離の試金石とはならない。なぜなら、多くの場合、標的細胞又は組織の細胞溶解を生じるためにはIgGのみでは不十分だからである。免疫学的攻撃の媒介に必要な危険な物質を免疫隔離性デバイスから取り除けば、免疫隔離性デバイスを用いることによって、必要な高分子量生成物を送達することまたは高分子量物質に関する代謝機能を提供することが可能である。これらの物質は、補体攻撃複合体成分Clqを含んでもよく、また、食細胞又は細胞障害性細胞を含んでもよい。この免疫隔離デバイスは、これらの有害物質と隔離された細胞との間に保護障壁を提供する。
発泡体スカフォルドは、多孔網を有するオープンセル又は多孔構造を有する生体適合性発泡体を形成するあらゆる好適な材料から製造することができる。オープンセル発泡体は、相互接続された複数の孔からなる網状構造である。発泡体スカフォルドは、接着性細胞を付着させるための、生分解性のない（non-biodegradable）安定なスカフォルド材料を提供する。本発明のデバイスの発泡体スカフォルドを製造するのに有用なポリマーには、熱可塑材及び熱可塑性エラストマーがある。
好適な発泡体スカフォルドを製造するのに有用な材料の幾つかの例が表１に列挙される。
0004212116.tif 000002
ポリスルホン及びポリエーテルスルホンから作られる熱可塑材製発泡体スカフォルド、並びにポリウレタン及びポリビニルアルコールから作られる熱可塑性エラストマー製発泡体スカフォルドが好ましい。
発泡体の幾つかの孔（全ての孔である必要はない）は、その孔の中の壁又は表面に細胞が付着することのできるサイズでなければならない。孔サイズ、孔密度、及び発泡体スカフォルドの空隙容量は、変えることができる。孔の形は、円形、楕円形、又は不規則な形でもよい。孔の形は大幅に変えることができるため、その寸法は測定する軸によって異なることがある。この発明の目的のために、発泡体の中の少なくとも幾つかの孔は、20〜500μｍ、好ましくは50〜150μｍの孔径を有しなければならない。好ましくは、前述の孔径は発泡体の平均孔サイズを表す。円形ではない場合、孔はその孔の内側の壁又は表面に接着性細胞が付着できるくらい十分なサイズである限り、様々な寸法を有することができる。１つの実施態様において、短軸に沿って20〜500μｍ及び長軸に沿って1500μｍ以下の径を有する幾つかの楕円形孔を有する発泡体を想定する。
前述の細胞を透過させる孔サイズに加え、発泡体内の孔の少なくとも一部は、細胞不透過性でありながら発泡体中の栄養素及び生物学的活性分子の輸送のためのチャンネルを提供するように、10μｍ未満でなければならない。
発泡体の孔密度（例えば先述のように細胞を収容することができる孔の、体積あたりの数）は20〜90％、好ましくは50〜70％の間で変えることができる。
同様に、発泡体の空隙容積は、20〜90％、好ましくは30〜70％の間で変えることができる。
孔の壁又は表面は、一般には細胞外基質分子（単数又は複数）、或いは他の好適な分子で被覆される。このコーティングは、孔の壁に細胞が付着し易くし、細胞を特定の表現型に保ち、及び／又は細胞分化を誘発するために使用することができる。
発泡体の孔の中の表面に付着することができる細胞外基質分子（ECM）の好適な例には、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリオルニチン、及びフィブロネクチンが含まれる。他の好適なＥＣＭ分子には、コンドロイチン硫酸（chrondroitin sulfate）、ヘパリン硫酸、ヒアルロン、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（HSPG）及びエラスチンなどの、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンが含まれる。
ECMは、ECMを沈殿させるものとして知られる細胞（間葉又は星状細胞由来の細胞を含む）の培養により得られる。シュワン細胞は、アスコルビン酸及びcAMPで処理すると、ECMを合成するよう誘導することができる（例えばバロン−バン  エバーコーレン（Baron-Van Evercooren）らの“Schwann CellDifferentiation in vitro:Extracellular Matrix Deposition and Interaction,”Dev.Neurosci.,8,pp.182-96（1986）を参照のこと）。
更に、接着性ペプチドフラグメント、例えば配列（ArgGlyAsp）を含むRGD、配列（TyrIleGlySerArg）を含むYIGSR、並びに配列（IleLysValAlaVal）を含むIKVAVは、細胞の付着を促進するのに有用であることが分かった。幾つかのRGD含有分子が市販されている（例えばPepTite-2000TM（Telios））。
この発明の発泡体スカフォルドは、デバイス内の細胞分布を強化する他の物質で処理することもできる。例えば、細胞の増殖又は移動を抑制する不透過性ハイドロゲルで発泡体の孔を充填することができる。このような改変により、発泡体スカフォルドへの接着性細胞の付着を改善することができる。好適なハイドロゲルには、電荷により細胞をはじくような陰イオンハイドロゲル（例えばアルギン酸やカラギーナン）が含まれる。或いは、“固形の”ハイドロゲル（例えばアガロースや酸化ポリエチレン）を使用して細胞により分泌された細胞外基質分子の結合を低下させることにより、細胞増殖を抑制することもできる。
不透過性材料の幾つかの領域で発泡体スカフォルドを処理することにより、デバイスの中の２個以上の別々の細胞集団を、一方の集団が他方の集団より過剰成長することなく、カプセル化することができる。このように、不透過性材料を発泡体スカフォルドの中に使用して、カプセル化した細胞の別々の集団を分離することができる。別々の細胞集団は、同じ又は異なる細胞型であってもよく、また同じ又は異なる生物学的活性分子を産生してもよい。１つの実施態様において、１つの細胞集団は、他の細胞集団の成長を助長する物質を産生する。他の実施態様において、複数の生物学的活性分子を産生する複数の細胞型をカプセル化する。これにより、受容者に治療用物質の混合物又は“カクテル”を提供する。
本発明のデバイスは、様々な形状を有することができることを理解されたい。デバイスは、生物学的活性を維持し且つ生成物又は機能を送達するためのアクセスを提供するのに適したいずれの構造であってもよく、例えば円筒形、矩形、ディスク型、パッチ型、卵形、星形、又は球形が含まれる。更に、デバイスをコイル又はラップで巻いてメッシュ状又は網状構造にすることもできる。デバイスを生体内移植した後に取り出す場合、デバイスが生体内移植の場所から移動するおそれのある構造（例えば患者の体内で移動するのに十分小さな球状デバイスなど）は好ましくない。矩形、パッチ形、ディスク形、円筒形、及びフラットシート状などの一定の形状は、構造的な一体性がより大きく、デバイスを取り出すことが望ましい場合は好適である。
発泡体スカフォルドは、デバイスにはめ込まれるように適宜調節される。チューブ（又は“中空糸”）の実施態様の場合、発泡体スカフォルドは、円筒形チューブ又はロッド、矩形チューブ又はロッド、或いは中空糸の管腔の中にフィットすることができるのであれば他のあらゆる傾斜形を形成することができる。幾つかの実施態様において、発泡体スカフォルドは、中空糸の内部壁に接触することができる隆起又は他の突起を有していてもよいことを理解されたい。
本発明の１つの実施態様において、細胞デバイスは円筒形の内部発泡体スカフォルドを用いる中空糸膜から製造される。
また、デバイスはフラットシート状のデバイスであってもよい。フラットシートデバイスは、ディオンらのWO92／19195に詳細に記載されている。本発明のフラットシートデバイスは、第一の内側表面を有する第一フラットシート膜と、第二の内側表面を有する第二フラットシート膜とによって一般に特徴付けられており、前記２つの膜はその周辺部で密閉（seal）されて閉鎖（囲み）を作り、発泡体スカフォルドはこれら２つの膜の間で前記囲みの内側に配置されるようになっている。次に、細胞はアクセス孔を通って導入され、プラグがその孔の中に挿入されてシールが完成する。
本発明のデバイスは、あらゆる好適な方法に従って製造することができる。１つの実施態様において、発泡体スカフォルドを予め形成して、別のコンポーネントとして事前に組立てられたジャケット（例えば中空糸膜）の中に挿入することができる。
あらゆる好適な熱可塑材又は熱可塑性エラストマー発泡体スカフォルド材料を予め形成して、予め組立てたジャケットの中に挿入することができる。１つの実施態様において、発泡体スカフォルドとしてポリビニルアルコール（PVA）スポンジを好ましくは使用する。幾つかのPVAスポンジが市販されている。例えば、孔サイズ60μｍのPVA発泡体スポンジ＃D-3（リッペイ社、カネボウ（Rippey Corp,Kanebo））などが適している。同様に、ユニポイントインダストリーズ（Unipoint Industries,Inc.、ノースキャロライナ州トーマスビル）及びイバロン社（Ivaron Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）からPVAスポンジが市販されている。PVAスポンジは、通気したポリ（ビニルアルコール）溶液と、架橋剤としてホルムアルデヒド蒸気との反応により形成される非水溶性発泡体（フォーム、foam）である。PVA上の水酸基は、アルデヒド基と共有架橋して高分子網を形成する。発泡体は、濡れるとフレキシブル且つ弾性を持ち、乾燥すると半硬直する。
他の実施態様において、発泡体スカフォルドは予め組立てられたジャケットの中にin situで形成することができる。発泡体スカフォルドをin situで製造するためにあらゆる熱可塑材又は熱可塑性エラストマー発泡体前駆物質を使用することができる。スカフォルドをin situで製造するには、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスルホン、及びポリエーテルスルホンが、好ましい。
１つの好適な実施態様において、ポリウレタンを用いて発泡体スカフォルドをin situで製造することができる。ポリウレタンは、ポリイソシアネートとポリヒドロキシ化合物との反応により形成されるポリマーである。ポリウレタン発泡体マトリックス材料は、水溶液と接触すると重合して重合の生成物としてＣＯ2を生成する（末端にOHを有する線状重合体と過剰なジイソシアネートとの反応により末端にイソシアネートを有する重合体となる反応により形成される）プレポリマーを用いて中空糸膜内で形成することができる。生成されたCO2ガスは、マトリックス材料のオープンセル発泡体構造を形成する（例えば“High Performance Biomaterials:A Comprehensive Guide to Medical and Pharmaceutical Applications（Szycher,ed.）（Technomic Publishing,Lancaster,PA 1991）,pp.71-89”の中のハサーシ（Hasirci）の“ポリウレタン”を参照）。
発泡体の中の孔形成を容易にするために、界面活性剤を水溶液に加えてもよい。界面活性剤の例としては、シグマケミカル社（Sigma Chemical Corp.）から入手可能なTriton-X100、並びにPluronic P65、P32及びP18が挙げられる。ポリウレタン発泡体前駆物質、及び本発明に適した発泡体を形成するために好適な界面活性剤は、ハンプシャーケミカル社（Hampshire Chemical Corp.、マサチューセッツ州レキシントン）から市販されている。
更なる実施態様において、発泡体スカフォルドを予め形成し、次にこれを細胞不透過性ジャケットで被覆することができる。この場合も、発泡体スカフォルドをin situで製造するために、あらゆる熱可塑材又は熱可塑性エラストマー発泡体前駆物質を使用することができる。スカフォルドの周りのジャケットの形成は、ディオンらのＷＯ92／19195に詳細に記載されているような方法に従って実施することができる。
１つの好適な実施態様において、30〜60μｍの平均孔サイズを有する高密度ポリエチレン（HDPE）（Porex▲Ｒ▼）のビーズを焼結して形成したポリエチレン製発泡状ロッドを、ディップコーティング法（dipcoating）によって選択透過PAN／PVC膜と複合体形成することができる。例えばインターフロテクノロジー（Interflo Technologies、ニューヨーク、ブルックリン）からは、他の焼結熱可塑性材料が市販されている。DMSO溶媒に溶かしたPAN/PVCで発泡状ロッドをディップコーティングし、転相して非溶媒水浴の中に浸漬させることにより、膜を形成する。また、デバイスに細胞を注入する前に、発泡体材料への細胞付着を向上させるために、発泡状ロッドをポリ−オルニチンでコーティングすることもできる。
好ましくは、デバイスは、回収（retrieval）を助けるつなぎ（tether）を有する。このようなつなぎは、当業界で良く知られている。
本発明のデバイスは、用途によって好ましくは約1〜10μ1の最小体積のコアを有し、100μlを超える体積まで簡単に組立てられる（この体積は、発泡体スカフォルドを含まないで測定する）。
中空糸構造の場合、中空糸は、好ましくは1500ミクロン未満、より好ましくは約300〜600ミクロンの内径を有する。半透過性膜を使用する場合、水圧透過性（hydraulic permeability）は、好ましくは1〜100mls／分／M2/mmHg、より好ましくは25〜70mls／分／M2／mmHgの範囲である。ディオンらのASAIO Abstracts,p.99（1993）及びコルトン（Colton）らのThe Kidney（Brenner and Rector,eds.）（1981）,pp.2425-89に記載されているように決定、測定、及び計算を行ったデバイスのグルコース物質移動係数は、好ましくは10-6ｃｍ／秒より大きく、より好ましくは10-4ｃｍ／秒より大きい。
ポリマー接着剤の使用及び／又はクリンピング、節止め、及び加熱密閉を含む、デバイスを密閉するあらゆる好適な方法を使用することができる。これらの密閉技術は、当業界において公知である。更に、あらゆる好適な“乾燥”密閉方法を使用することもできる。このような方法では、固定乾燥シールを用いて膜カプセル化デバイスに取り付けられる実質的に無孔性のフィッティング部材が提供され、このようなフィッティング部材を介して細胞を含む溶液が導入される。充填後、無孔性フィッティングの開口部を閉じてデバイスを密閉する。このような方法は、ミルズらのWO94／01203（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されている。
本発明では、種々の細胞を使用することができる。これらの細胞には、良く知られている市販された不死化細胞系（条件付き不死化細胞を含む）、及び分裂一次培養細胞が含まれる。本発明の実施に適した市販されている細胞系の例には、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウスの繊維芽細胞（L-M）、NIHスイスマウス胚（NIH／３Ｔ３）、アフリカグリーンザル（African green monkey）の細胞系（COS-a、COS-7、BSC-1、BSC-40、BMT-10及びベロ（Vero）を含む）、ラットの副腎褐色細胞腫（ＰＣ12及びPC12A）、ラットのグリア細胞腫（C6）、RIN細胞、β−TC細胞、Hep−G2細胞、及び筋芽細胞系（C２C１２細胞を含む）が含まれる。
本発明に従って使用することができる一次細胞には、哺乳動物のCNS由来の神経前駆幹細胞（リチャードらのProc.Natl.Acad.Sci.USA,89:8591-95（1992）、レイ（Ray）らのPNAS,90:3602-06（1993）を参照）、一次繊維芽細胞、シュワン細胞、星状細胞、乏突起膠細胞及びこれらの前駆体、筋芽細胞、並びに副腎性クロム親和細胞などが含まれる。
細胞の選択は、意図する用途に依存する。細胞は、所望の生物学的活性分子を天然に産生してもよく、又はそうするように遺伝子操作されてもよい。
対象遺伝子（即ち適切な生物学的活性分子をコードする遺伝子）は、標準的な組替えＤＮＡ技術を用いて好適な発現ベクターのクローニング部位の中に組み込むことができる。好適な発現ベクターの中に１個以上の遺伝子を組み込むことができることを理解されたい。これらの技術は、当業者に良く知られている。
次に、対象遺伝子を含む発現ベクターを使用して所望の細胞系をトランスフェクトすることができる。リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラントランスフェクション又はエレクトロポレーションなどの標準的なトランスフェクション技術を使用することができる。市販されている哺乳動物のトランスフェクションキットは、例えばStratagene（カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla））などから購入することができる。
種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを用いて、生物学的活性分子をコードする遺伝子を発現させることができる。好適なプロモーターには、例えばＳＶ40又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、及び遺伝子の発現を制御することができる他の公知の非レトロウイルスプロモーターが含まれる。有効な発現ベクターは、例えば、ＳＶ40及び公知のバクテリアプラスミド（例えばpUC、pBlueScriptTM、pBR322、pCR1、pMB9、pUC、pBlueScriptTM及びこれらの誘導体など）の様々な誘導体などの、染色体、非染色体、及び合成DNA配列のセグメント等からなる。ゲネチシン（geneticin）（Ｇ418）又はハイグロマイシン薬剤選択遺伝子（例えばSouthern,P.J.,In Vitro,18:315（1981）and Southern,P.J.and Berg,P.,J.Mol.Appl.Genet.,1:327（1982）を参照）を含む発現ベクターも有用である。ゼオシン（zeocin）薬剤選択遺伝子を含む発現ベクターも想定される。市販されている使用可能な発現ベクターの例としては、pRC／CMV、pRC／RSV及びpCDNAINEO（In Vitrogen）が挙げられる。薬剤選択及び対象の生体遺伝子の転写を指令するこのようなベクターのウイルスプロモーター領域は、ＣＮＳ内のウイルスプロモーターによって経験されるダウンレギュレーションに支配されない上記プロモーター配列のうちの１つと取り替えても有効である。例えば、GFAPプロモーターを星状細胞及び星状細胞系のトランスフェクションに使用したり、THプロモーターをPC12細胞に使用したり、又はMBPプロモーターを乏突起膠細胞に使用したりしてもよい。
１つの実施態様において、pNUT発現ベクターを使用する（バエジェらのPNAS,83:5454-58（1986）を参照）。更に、DHFRコード配列がG418又はハイグロマイシン薬剤耐性をコードする配列に置き換えられるように、pNUT発現ベクターを改変することができる。pNUT発現ベクターの中のSV40プロモーターを、先に述べたようなあらゆる好適な構成的発現哺乳動物プロモーターで置き換えることもできる。pNUTベクターは、突然変異DHFRのcDNA、及びポリリンカー（polylinker）を含む全pUC18配列（Baetge et al.,上記）を含む。DHFRの転写ユニットは、SV40プロモーターにより駆動され、その３’末端でＢ型肝炎ウイルス遺伝子のポリアデニル化シグナル（およそ200bpの3’非翻訳領域）と融合し、効率の良いポリアデニル化及び成熟化シグナルを確保する。
カプセル化細胞によってあらゆる好適な生物学的活性分子を産生することができる。想定される生物学的活性分子には、神経伝達物質が含まれる。一般に、これらは非常に小さな分子（1,000ダルトン未満の分子量）であり、ニューロン間の連絡の化学的手段として働く。このような神経伝達物質には、ドーパミン、γアミノ酪酸（GABA）、セロトニン、アセチルコリン、ノルアドレナリン、エピネフリン、グルタミン酸、及び他のペプチド神経伝達物質が含まれる。同様に、例えばブロモクリプチン（ドーパミンアンタゴニスト）及びL-ドーパ（ドーパミン前駆体）を含む、活性な神経伝達物質のアゴニスト、類似体、誘導体又はフラグメントの産生を想定する。
考えられる他の生物学的活性分子には、ホルモン、サイトカイン、成長因子、栄養因子、血管新生促進因子、抗体、血液凝固因子、リンフォカイン、酵素、鎮痛剤、及び他の治療薬、或いはこれらのアゴニスト、前駆体、活性類似体、又は活性フラグメントが含まれる。これらには、エンケファリン、カテコールアミン（例えばノルエピネフリン及びエピネフリン）、エンドルフィン、ダイノルフィン、インシュリン、VIII因子、エリスロポエチン、サブスタンスＰ、神経成長因子（NGF）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、上皮増殖因子（EGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン−３（NT-3）、ニューロトロフィン−４／５（NT−4／5）、一連の繊維芽細胞増殖因子、及び毛様体神経栄養因子（CNTF）が含まれる。
或いは、カプセル化細胞は、デバイスの中に送達される物質に対して作用する生物学的活性分子を産生することができる。例えば、デバイスは、コレステロール又は他の望ましくない分子を受容者から「取り除く（scavenge）」１個以上の細胞或いは物質を含む。このような場合、デバイスは患者に対して生物学的機能を提供する。
本発明の幾つかの態様において、細胞は同種（即ちそれが生体内移植される患者と同じ種の他の個体から）、自己由来又は同系（即ち同じ個体から）、或いは異種（即ち異なる種の他の個体から）である。
デバイスは、受容者に生体内移植するために設計される。受容者は、あらゆる好適な動物であってもよく、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト患者である。あらゆる好適な外科移植技術を使用することができる。カプセル化デバイスを生体内に移植するための好適なシステムが、米国特許第5,487,739号（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されている。
あらゆる好適な生体内移植部位を使用することができる。１つの実施態様において、インシュリンの送達による糖尿病の治療を想定する。この実施態様では、腹腔内移植が好ましい。
他の実施態様において、中枢神経系（CNS）内への移植を想定する。種々の神経系疾患、障害又は状態の治療若しくは予防で、本発明のデバイスを使用することができる。これらには、ハンチントン、パーキンソン、筋萎縮性側索硬化症、及び疼痛、並びに癌又は腫瘍が含まれる。CNSの中の好適な部位には、脳室、柔組織、脳脊髄液（CSF）、線条、大脳皮質、視床下核及びマイネルト基底核（nucleus Basalis of Maynert）が含まれる。１つの好適なCNS部位はCSFであり、最も好ましくはクモ膜下腔である。
生物学的活性分子の投与量は、当業界で知られているあらゆる方法によって変えることができる。これは、生物学的活性分子の細胞性産生の変更を含み、これは、形質導入した細胞の中の生物学的活性分子をコードする遺伝子のコピー数を変えたり、必要により効率の高い又は低いプロモーターを用いて生物学的活性分子の発現を操作するなどの、あらゆる従来方法によって達成される。更に、デバイスの容積及び細胞装填密度は、少なくとも３桁分にわたり、簡単に変えることができる。好適な装填範囲は、デバイスあたり細胞が１０3〜１０7個である。更に、投与量は、生体内移植するデバイスの数を増減することによって制御することができる。好ましくは、患者一人あたり１〜１０個のデバイスを移植する。
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を記載した。これらの実施例は例示目的のみのためであって、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
実施例
実施例１  ポリビニルアルコール（PVA）製発泡体スカフォルドを有する中空糸膜の中にカプセル化したPC12細胞
発泡体及び中空糸の作製方法
カバッソ（Cabasso）の湿・乾式紡糸技術（Encyclopedia of Chemical Technology,12:492-517（1980））を用いて選択透過性中空糸を作製した。ジメチルスルホキシド（ｗ／ｗ）（DMSO）溶媒中の12.5％ポリアクリロニトリルポリ塩化ビニル（PAN／VC）共重合体から、非対称中空糸を鋳型成形した。この方法を用いて単膜の中空糸を生成した。この中空糸を非溶媒水浴の中に紡糸して、25％のグリセリンに一晩浸漬してから乾燥した。この実験セットにおいて、使用した中空糸膜は、内径680μｍ及び壁厚85μｍの単膜PAN／PVC共重合体であった。
幾つかの市販されているPVAスポンジを用いて本発明のデバイスの中に発泡体スカフォルドを形成した。これらは、以下の製造会社から市販されているPVAスポンジを含む。
（１）リッペイ社（カネボウ）製の＃D−３PVA。この発泡体は、60μｍの平均孔サイズ、0.094g／cm3の見掛け比重、及び破壊時において5.9kg／cm2の引張強度を有し、水を含むと柔らかくなって僅かに膨れる（例えば「PVAスポンジ材料技術マニュアル（PVA Sponge Material Technical Manual）、リッペイ社」を参照）。
（２）ユニポイントインダストリーズ社（ノースキャロライナ州、トーマスビレ）製の、リッペイ社の発泡体と実質的に似た特性を有するPVA発泡体。この発泡体は、米国特許第2,609,347号（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されている。
（３）イバロン社（カリフォルニア州、サンディエゴ）製の、リッペイ社の発泡体と実質的に似た特性を有するPVA発泡体。
中空糸膜（HFM）の中にカプセル化するために、ミクロトームを用いて発泡体を矩形の「マッチ棒型」にカットするか、或いはスチール製の微孔穴あけ器を用いて発泡体をくり貫いて円筒形（シリンダ）にした。これらの発泡体シリンダは、使用する中空糸膜の直径より小さい（乾燥時で）約50〜100ミクロンの直径を有するようにくり貫かれる。長さは約1ｃｍにした。
次に、このPVA発泡体シリンダを、PBS緩衝液の中で調製した１mg／mLのコラーゲン溶液の中に一晩浸漬して、ヒトの胎盤から得られたIV型コラーゲン（シグマケミカル社（Sigma Chemical）、＃C5533）でコーティングした。次にこれらの発泡体をコラーゲン溶液から取り出して、層流フードの中でUVランプのもとで完全に乾燥させた。
次に、滅菌及び細胞の装填を行う前に、発泡体シリンダを中空糸膜の中に挿入した。細胞を装填するためのアクセスを有する中隔ハブアセンブリ（septal hubassembly）を、発泡体／HFM複合体に結合した。このようなハブアセンブリは、例えばミルズらの（WO94/01203）に記載されている。エタノール浸漬により、或いは酸化エチレン（ETO）ガス殺菌により、発泡体／HFM複合体デバイスを滅菌した。
PVA発泡体は、濡れると体積が約20％膨張する。従って、細胞を装填する前に、まず中空糸の管腔の中に細胞培地を注入し、管腔を充填するよう十分発泡体を湿らせて発泡体と膜との間の隙間を取り除いた。
本発明者らは、この実験においてPC12細胞を使用した。PC12接着細胞をかき集めて培養フラスコからこれらを取り出した。この細胞を培地に再び懸濁し、1000rpmで２分間遠心分離によりペレット化した。次に、培地に細胞を再び懸濁し、最終濃度を50,000細胞／μLにした。
本発明者らは、本発明の内部発泡体スカフォルドを有するデバイスと、ハイドロゲルマトリックスコアを有する従来のデバイスとを比較した。ガラス製のハミルトンシリンジを用いて長さ１ｃｍの中空糸デバイスの中に細胞を装填した。発泡体スカフォルドデバイスには、培地に懸濁した細胞２μLを装填した。従来のハイドロゲルマトリックスコアデバイスには、細胞／キトサンスラリー（細胞懸濁液で１：２に希釈する前の２％キトサン溶液）２μLを装填した。
細胞を装填した後、装填ハブの中隔を破り、光硬化した（light-cured）アクリレート（Luxtrak LCM 24,ICI Resins US、マサチューセッツ州、ウィルミントン）でアクセス口を密封した。
上記方法で、以下の中空糸カプセル化デバイスを作製した。
（１）細胞密度50,000細胞／μLのキトサンマトリックス
（２）細胞密度100,000細胞／μLのPVA発泡体マトリックス
デバイスを６週間in vitroに保った。カプセル化細胞を装填したデバイスを、湿度の高い３７℃のインキュベータの中に維持し、週３度の割合で細胞培地を補充した。
Alamar Blue▲Ｒ▼アッセイを用いて細胞の増殖速度を毎週モニターした。Alamar Blueアッセイは、ヒト及び動物の細胞系増殖の定量測定法であり、代謝活性の検出に基づいた蛍光／比色増殖指示体を加えている。Alamarのデータ（図１）は、キトサンマトリックスのデバイスでは経時的にほぼ直線的な増加が見られるのに対し、PVA発泡体マトリックスを有するデバイスの中の細胞増殖は、実験過程中きわめて遅いことを示している。実験の終了時点で、Alamarのデータに基づくと、従来デバイスの中の細胞数は、本発明の発泡体スカフォルドデバイスの細胞数の約２倍であった。
カプセル化細胞の基礎及びカリウム誘発性カテコールアミンの放出を、毎週テストした。図２が示すように、基礎L−ドーパ放出は、キトサンマトリックスのデバイスの中にカプセル化された細胞よりも発泡体スカフォルドデバイスの中の細胞の方が、特に実験終了時点で、カテコールアミンを多く産生したことを示す。
２週間目に代表例のデバイスを固定して切片とし、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。残りの全てのデバイスは、６週間目に固定し染色した。組織学的切片により、PVA発泡体マトリックスでカプセル化したPC１２細胞は、主に平坦な分化された形態を有することが分かった。これに比して、キトサンマトリックスデバイス中のPC１２細胞は、より丸みを帯びた形態を有していた。
２週間後in vitroで、キトサンマトリックスデバイスの中に大きな細胞クラスタが見られた。これに比べ、PVAマトリックスデバイス中の細胞は、発泡体の孔の中でおおむね平坦な単層となっており、中空糸膜全体に非常に均一に分布されていた。
６週間後in vitroで、キトサンマトリックスのデバイスで、大きな壊死コアが見られた。これに比べ、５週間後のPVA発泡体デバイスには幾つかの小さな壊死領域が見られた。しかし、発泡体デバイスの中のこれらの壊死領域は、デバイスの中心には集中せずに、デバイスの中にランダムに分散されていた。
実施例２  PVA発泡体マトリックスを有する中空糸膜の中にカプセル化されたPC12細胞の、ホストげっ歯類への体内移植
また、上記のin vitroの例に加え、従来のマトリックスコアデバイスと比較して発泡体スカフォルドデバイスのin vivo性能を評価するために、ホストげっ歯類（Sprague-Dawleyラット）の体内にもデバイスを移植した。
デバイスは、脳の線条の中に埋め込んだ。両側にデバイスを埋め込み、各ホストは１つのPVA発泡体デバイス及び１つのキトサンマトリックスデバイス（どちらもPC12細胞を装填）を受容した。デバイスは、以下の細胞装填密度以外は実施例１と同じように作製した。
（１）細胞密度50,000細胞／μLの沈降キトサンマトリックス
（２）細胞密度50,000細胞／μLのPVA発泡体マトリックス
（３）細胞密度100,000細胞／μLの沈降キトサンマトリックス
（４）細胞密度100,000細胞／μLのPVA発泡体マトリックス
カプセル化細胞の基礎及びカリウム誘発カテコールアミン放出を、カプセル化から１週間後（移植前）、及び外植後すぐにテストした。その結果を図３及び図４に表す。
細胞の数（K+誘発ドーパミン放出によって示される）は、高密度（100,000細胞／μL）と低密度（50,000細胞／μL）の初期細胞装填どちらの場合でも、PVA発泡体デバイスでは比較的一定のままであるように思われた。これに比べ、従来のキトサンマトリックスデバイスのK+ドーパミン分泌は、高密度デバイスでは著しく減少した（図４を参照）。この理由の１つとして、これらのデバイスが、移植前１週間の保存期間内で、それらのデバイスが支持することができる細胞数の上限まで増殖してしまったことが考えられる。また、K+ドーパミンの分泌データはまた、低密度で接種されたキトサンデバイスは、外植してもなお細胞数を増大させていたこともほのめかしている。
これらのin vivoでの結果は、実施例１に報告されたin vitroでの結果と一致する。
実施例３  PVA発泡体マトリックス又は細胞不透過性ハイドロゲルを有する中空糸膜の中にカプセル化したBHK−hCNTF細胞
この実験では、ヒトの毛様体神経栄養因子（hCNTF）を分泌するようにトランスフェクトされたベビーハムスター腎臓（BHK）細胞をカプセル化した。バエジェらのWO95/05452に記載されたような標準的なリン酸カルシウム媒介性トランスフェクション法を用いて、pNUT−hCNTF−ＴＫ構築物をBHK細胞に取り込んだ。10％牛胎仔血清及び２ｍＭのL−グルタミンを有するDMEM中で細胞を増殖させ、トリプシンを用いて収穫して、カプセル化のためにPC1培地中に単一細胞懸濁液として再び懸濁した。実施例１に記載したように、PVA発泡体マトリックスを含むデバイスの中に細胞をカプセル化した。
PVA発泡体デバイス（実施例１に記載したように作製）を培地中２μL細胞懸濁液で装填した後、発泡体の孔を、カルシウム及びマグネシウムを含まないHBSS溶液中で調製した２％のアルギン酸ナトリウムで充填し、次に１％の塩化カルシウムで５分間架橋した。アルギン酸ゲルは細胞不透過性領域を提供するが、細胞はデバイス中の発泡体の壁に対して平らなままであり、細胞が凝集するのを防いでいる。
実施例４  PVA発泡体マトリックスを有する中空糸膜の中にカプセル化したマウスC2C12筋芽細胞
この実施例では、C2C12筋芽細胞を、実施例１で記載したように作製した発泡体スカフォルドを含むデバイスの中にカプセル化した。C2C12筋芽細胞を１０％の牛胎仔血清を含むDMEM培地の中で増殖させた。PC1培地中で、実施例１に記載したような中空糸膜デバイスの中に細胞を装填した。保持培地から血清を取り除くことにより、カプセル化後、筋芽細胞の後分裂状態への分化が生じた。
実施例５  ポリエチレン発泡体マトリックスを有する中空糸膜の中にカプセル化した神経幹細胞
30〜60μｍの平均孔サイズを有する高密度ポリエチレン（HDPE）（Porex▲Ｒ▼）のビーズを焼結して作製したポリエチレン発泡体ロッドを、ディップコーティング法により選択透過性PAN／PVC膜と複合体形成した。この発泡体ロッドを、DMSO溶媒中に溶かしたPAN/PVC（DMSO中12.5％ポリマーw/w）でディップコーティングし、転相して、非溶媒水浴中の浸漬により膜を形成した。PAN/PVC外膜コーティングを有する発泡状ロッドデバイスを、エタノールに浸漬して滅菌した。次に、デバイスに細胞を注入する前に、発泡体材料への細胞接着を向上させるためにこの発泡状ロッドをポリ−オルニチンでコーティングした。
この実験において、マウス由来の神経幹細胞（例えばリチャードらのProc.Natl.Acad.Sci.USA,89:8591-95（1992））をカプセル化した。細胞を上記発泡体ロッド／膜複合体デバイスの中に装填し、in vitroで保持した。１週間後及び３週間後に、フルオレセインジアセテート／ヨウ化プロピジウム（FDA/PI）で染色して細胞の生存度及び分布を調べると、（良い）から（非常に良い）の間（70〜90％）であることが分かった。これに比べ、VitrogenTMハイドロゲルマトリックスデバイスの中のマウスの幹細胞生存度は、非常に低かった（約50％）。
実施例６  ポリウレタン発泡体マトリックスを有する中空糸膜の中にカプセル化したC2C12筋芽細胞
この実験では、予め形成された0.2μｍポリエーテルスルホン製中空糸膜（AG Tech、マサチューセッツ州）の管腔の中にポリウレタン製発泡体スカフォルドを作製した。ポリウレタンプレポリマー（HypolTM、ハンプシャーケミカル社（Hampshire Chemical Corp.）、マサチューセッツ州、レキシントン）を用いて中空糸膜の中にポリウレタンの発泡体スカフォルドを形成した。発泡体は、その製造会社の指示に従って作製した。簡単にまとめると、発泡体は、末端にOHを有する直線状ポリマーと過剰なジイソシアネートとの反応によりポリオキシエチレン中に末端にイソシアネートを有するポリマーを多く含むようにして形成した。これを水性添加剤と反応させると、不溶性生体適合性エラストマーが形成された。ポリイソシアネートとポリヒドロキシ化合物との間の反応における第一ステップは、カルバミン酸の不安定な形成となる。次に、この酸はアミンとCO2に分解する。反応が続くと、アミン及びイソシアネートの鎖は尿素基を形成する。生成されたCO2ガスは、マトリックス材料の所望のオープンセル発泡体構造を形成する。孔を形成し易くするために、水溶液に界面活性剤を加えても良い。この例では、前記製造会社が提供する界面活性剤を使用した。
中空糸膜内で発泡体材料がポリマー化されたら、膜をカットし、（実施例１に記載したように）中隔装填ハブ（septal loading hub）を加えることによってカプセル化デバイスを形成した。
ハミルトンシリンジを用いてC2C12筋芽細胞（20μLの20,000細胞／μL懸濁液）を、ポリウレタン発泡体スカフォルドが管腔中に有する中空糸膜デバイスに装填した。デバイスをすぐに切開し、MTT細胞生存度染色法で染色して、生存度及び細胞分布を可視化した。細胞の分布は、1.5cmの長さに沿って優れていた。これは、形成された孔構造が十分に相互接続されており、中空糸膜デバイスの全長に沿って細胞が注入されるのを可能にしていることを示した。
実施例７  発泡体マトリックスの中にカプセル化した他の細胞
様々な生物学的活性分子を分泌する他の細胞型を用い、実施例１の手順に従って、他の細胞カプセル化デバイスを作製した。
実施例３に記載したのと実質的に同じ方法を用いて、毛様体神経栄養因子（CNTF）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、CNTF及びNT−4／5の両方、並びにグリア細胞由来栄養因子（GDNF）を産生するように、C2C12筋芽細胞を形質転換した。実施例１に記載した方法で、このような細胞を含むPVA発泡体マトリックスコアを有する中空糸デバイスを作製した。これらのデバイスをブタ及び羊に移植した。全体として、これらのデバイスは良好な細胞生存度及び生物学的活性分子の産生を示し、対照となる細胞カプセル化デバイスと比較したとき（全ての実験で比較を行ったわけではない）、液体コア又はコラーゲンコアを有する比較用デバイスよりも、（これらの規準において）、発泡体スカフォルドデバイスのほうが優秀な機能を発揮した。
また、NT−４／５を分泌するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞も、PVA発泡体マトリックスコアを有する中空糸デバイスの中にカプセル化した。in vitroで１ヶ月後、これらのデバイスは特定培地（definedmedia）の中で優れた生存度を示した。PVA発泡体コアは、アガロース又はビトローゲン（vitrogen）に比べて２倍から３倍良好に、細胞増殖を制御した。NIH3T3繊維芽細胞を用いてこのin vitro実験を繰り返すと、血清を含む培地の中で優れた細胞生存度を示していた。また、Hs27ヒト包皮繊維芽細胞を用いてこのin vitro実験を繰り返した。予備データは、ビトローゲンマトリックスコアを有する対照デバイスよりも、２倍高い細胞生存度を示した。
先述の開示内容によって、当業者により他の実施態様が提案されるであろう。このような自明の実施態様は、以下の請求の範囲で規定される本発明の概念に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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