(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養源および水を内部に包含し且つ表面に嫌気性微生物膜が存在する親水性固定化平板担体をバットの底部に配置させてなる平板型界面バイオリアクターをガス採集用バッグ内に装填し、該バッグを密閉した後に該バッグ内を脱気及び不活性ガス置換して嫌気状態とし、該固定化平板担体表面に増殖する嫌気性微生物を、予め脱気及び不活性ガス置換した、疎水性基質を含む有機溶媒層と接触させてなることを特徴とする嫌気性微生物による疎水性基質の微生物変換反応を行なうための嫌気型平板界面バイオリアクター。
【請求項２】
平板担体内部の液相を予め脱気及び不活性ガス置換する請求項１のバイオリアクター。
【請求項３】
還元剤として水素ガスを該バッグ内に一定量注入し、微生物的還元反応を行なう請求項１又は２のバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、平板型界面バイオリアクターをガス採集用バッグ内に装填し、該バック内の気相を脱気及び不活性ガス置換することによって嫌気状態にして嫌気性微生物を膜状に増殖させ、該微生物膜に重層する形で基質を溶解せしめた疎水性有機溶媒層を添加してなる、該増殖嫌気性微生物の作用によって添加基質を有用な物質に変換せしめるための嫌気型平板界面バイオリアクターに関する。
【０００２】
【従来技術およびその課題】
近年、地球環境問題、省資源および省エネルギー問題の高揚、光学活性化合物の需要拡大等を背景として、有機合成化学に生体触媒を利用するバイオコンバージョンの研究・開発が活発化してきている［太田博通、有機合成化学協会誌、41、1018（1983）；清水昌・山田秀明、有機合成化学協会誌、41、1064（1983）］。該バイオコンバージョン法は、精製酵素を用いる酵素法と微生物菌体そのものを生体触媒として利用する微生物変換法とに大別されるが、後者は生体触媒として安価であること、補酵素要求性反応である酸化還元反応に低コストで活用可能であること等の長所があり、多くの適用例が報告されている[Ohta, H., et al., Agric. Biol. Chem., 46、579 (1982); Oda, S., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56，1216 (1992)]。
【０００３】
これらバイオコンバージョン法を基質の溶解性の観点から見た場合、水溶性基質と水不（難）溶性基質のバイオコンバージョンに分類されるが、水不（難）溶性基質のバイオコンバージョンの場合、種々の問題点、例えば、基質の溶解性、生体触媒の安定性、産物の分離・精製等の問題があり、これらの問題を克服する手法として、本発明者らは界面バイオリアクターを提案してきた［特許第２５４２７６６号公報；小田忍・太田博通、色材協会誌、70, 538 (1997); Oda, S. and Ohta, H., Recent Res. Devel. in Microbiol., 1，85 (1997)]。該界面バイオリアクターはエステルの加水分解［Oda, S., et al., J. Ferment. Bioeng., 86，84 (1998); Katoh, O., et al., Tetrahedron: Asymmetry, 5，1935 (1994)］、アルコールと有機酸とエステル化［Oda, S. and Ohta, H., Biosci. Biotech. Biochem., 56，2041 (1992)］、酸化［Oda, S., et al., Ferment. Bioeng., 78，149 (1994); Oda, S., et al., J. Ferment. Bioeng., 80, 559 (1995): Oda, S., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 60，83 (1996)］、還元［Oda, S., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 62，1762 (1998); Sugai, T., et al., Tetrahedron, 51，11987 (1995)］、特異な酢酸エステル合成法としての代謝−微生物的アセチル化融合システム［Oda, S., et al., Appl. Environ. Microbiol., 62，2216 (1996); Oda, S., et al., J. Ferment. Bioeng., 83、 423 (1997)］等の多くの微生物変換反応に適用され、高産物収量、高エナンチオ選択性、長期実働性等で優れた成績を収めてきた。
【０００４】
これら種々の微生物変換反応のうち、還元反応については主に酵母を用いて検討を加えたきたが、標的とする産物あるいは利用する酵素反応の種類によっては、無酸素状態である嫌気性の要求が強い嫌気性微生物を使用しなければならない場合がある。しかるに、界面バイオリアクターに用いられるパラフィン類、中鎖エステルあるいはエーテル系有機溶媒は一般に水の１０倍程度の酸素溶解性があり、該有機溶媒を嫌気性微生物膜に重層した場合、溶存する酸素によって該嫌気性微生物は死滅してしまうという問題がある。
【０００５】
さらにまた、界面バイオリアクターの親水性担体内部に包含される水相にも当然酸素が溶解しており、これが徐々に担体表面から気相に拡散していく際、担体表面に成長した微生物膜中にも溶解し、結果として嫌気性微生物を死滅させてしまうという問題がある。
【０００６】
このように、従来の界面バイオリアクターは、好気性微生物およびそれを生体触媒として用いる好気性微生物反応には極めて有力な手法であったが、嫌気性微生物を用いた嫌気性反応、例えば還元反応には不適なシステムであった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、好気性微生物による微生物変換反応に好適な界面バイオリアクターを嫌気性微生物にも適用可能にするべく、鋭意検討を重ねた結果、今回、平板型界面バイオリアクターを極めてガス透過性の低いガス採集用バッグ内に装填し、該バック内の気相を脱気及び不活性ガス置換することにより、平板型界面バイオリアクターを容易に嫌気状態にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
かくして、本発明は、栄養源および水を内部に包含し且つ表面に嫌気性微生物膜が存在する親水性固定化平板担体をバットの底部に配置させてなる平板型界面バイオリアクターをガス採集用バッグ内に装填し、該バッグを密閉した後に該バッグ内を脱気及び不活性ガス置換して嫌気状態とし、該固定化平板担体表面に増殖する嫌気性微生物を疎水性基質を含む有機溶媒層と接触させてなることを特徴とする嫌気性微生物による疎水性基質の微生物変換反応を行なうための嫌気型平板界面バイオリアクターを提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図１を参照しつつ本発明の嫌気型平板界面バイオリアクターについてさらに詳細に説明する。
【００１０】
本発明の嫌気型界面バイオリアクターは、バット（７）の底部に設置された親水性固定化平板担体（５）の表面に位置する微生物膜に重層する形で基質を含んだ有機溶媒層（３）を添加し、好ましくは酸素消去触媒（１）が装着された蓋（９）を被せた後、その全体をガス採集用バッグ（２）内に装填してなるものである。ガス採集用バッグ（２）は例えばシーリングバー（８）で密閉し、該バック内部をエアフィルター（４）を介して脱気し不活性ガス（例えば窒素）と置換して、その内部を完全嫌気状態とする。なお、該バッグ内部の嫌気度はリアクター内部に酸素インジケーター（６）を装着することによって常時監視するようにすることができる。
【００１１】
本発明によれば、好気性微生物を用いた微生物変換反応に威力を発揮する平板型界面バイオリアクターを、酸素との接触を完全に絶った状態で維持することができ、該平板型リアクター表面に嫌気性微生物を増殖せしめて嫌気性微生物変換反応に供することができる。その際、嫌気性微生物として嫌気性要求度が高い微生物を用いる場合、すなわち、極少量の酸素の存在によっても死滅してしまう絶対嫌気性微生物を用いる場合には、本発明の嫌気型界面バイオリアクターの気相を脱気及び不活性ガス置換するだけでは不十分であることがあるが、その場合には、微生物を植菌する親水性平板内部の水相も脱気及び不活性ガス置換することが望ましく、さらに必要により、添加する基質含有有機溶媒をも脱気及び不活性ガス置換することができる。
【００１２】
担体中の水相の脱気及び不活性ガス置換は、寒天平板を担体として用いる場合には、例えば、高圧蒸気滅菌後、寒天平板が凝固する前に減圧して脱気し、窒素ガスを封入することによって容易に行うことができる。また、ポリビニルアルコールに代表される合成樹脂担体を用いる場合には、例えば、嫌気性微生物を植菌する前に予め、所定の時間ガス採集用バッグ内に装填して脱気及び不活性ガス置換し、ゲル内部の酸素を窒素に置換することにより行うことができる。なお、セルロース材等の多孔性担体の場合には、その内部の脱気及び不活性ガス置換は極めて容易であるため、嫌気性微生物を植菌した後にガス採集用バッグ内で急速脱気及び不活性ガス置換するだけで十分である。さらに、より完全な嫌気状態を達成するためには、市販の酸素消去用触媒をガス採集用バッグ内に投入することが望ましく、また、ガス採集用バッグ内の気相の嫌気度をチェックするために、市販の酸素インジケーターを投入しておくことが好ましい。
【００１３】
有機溶媒層の脱気及び不活性ガス置換は、例えば、該有機溶媒層に極少量の沸石を添加して減圧し（これにより常温下でも容易に脱気することができる）、次いで不活性ガスを封入することにより容易に達成することができる。沸石を投入せずに、有機溶媒を加温下減圧することによって、あるいは直接窒素を導入することによっても、該有機溶媒層の不活性ガス置換は可能であるが、操作の容易さや完全性等の観点より、沸石投入下での減圧脱気及び不活性ガス置換が好ましい。
【００１４】
本発明の嫌気型界面バイオリアクターにおいて使用される平板型界面バイオリアクターは、これまでに提案されてきた通常のタイプのものでよく、通常、栄養寒天平板を担体とするもので十分である。該寒天平板型界面バイオリアクターは、調製が極めて容易であり、安全上も全く問題がなく、さらには、寒天ゲル内部の水層の脱気及び不活性ガス置換が極めて容易であり好適である。なお、寒天ゲルの強度を引き上げるために、市販のゲル強化剤、例えばアガーメイト［タイホー（株）製］を添加したり、メチルセルロース製の濾過板［アドバンテック・トーヨー（株）製］をゲル内部に包含せしめることができる。また、担体を収容するためのバットとしては、ガラス製、耐有機溶媒性合成樹脂製あるいはステンレス鋼製のバット類を挙げることができる。
【００１５】
また、本発明の嫌気型界面バイオリアクターの嫌気性保持のために使用されるガス採集用バッグは、ガス透過性が極めて低い材質のものが望ましく、市販のガス採集用袋、例えば、テドラーバッグ等を使用することができる。このガス採集用バッグの１辺を開封し、この中に嫌気性微生物を平板表面に植菌した平板型界面バイオリアクターを装填した後、例えばシーリングバーを用いて密閉して脱気及び不活性ガス置換すれば、嫌気性微生物の増殖に必要な嫌気性雰囲気の維持が可能である。かくして該嫌気性微生物が増殖し、平板表面が該微生物膜によって十分に覆われた後、一旦該ガス採集用バッグを開封して平板型界面バイオリアクターを取り出し、基質含有有機溶媒層を重層し、再びガス採集用バッグ内に装填し、脱気及び不活性ガス置換することにより、目的の微生物変換反応を実施することができる。
【００１６】
該嫌気型界面バイオリアクターからの反応途中でサンプリングは、例えば、ガス採集用バッグに小口径のノズル口を設け、そのノズル口から、長針のカテラン針を装着したシリンジを用いて嫌気環境を維持したまま容易に行うことができる。
【００１７】
本発明の嫌気型界面バイオリアクターに使用可能な嫌気性微生物は、クロストリジウム（Clostridium）やユウバクテリウム（Eubacterium）属等の偏性もしくは絶対嫌気性細菌に限られるものではなく、多くの酵母や発酵能を有する通性嫌気性微生物も使用することができる。
【００１８】
該嫌気型界面バイオリアクターを用いて行なう微生物変換反応に供しうる疎水性基質は、反応溶媒に対する溶解性や、目的とする生成物を利用する微生物変換反応との関連を踏まえて合成戦略的に選定することができる。
【００１９】
例えば、脂肪族アルコール類を目的生成物とする場合には、対応するケトン類の微生物的還元反応を利用することができるが、その際の反応溶媒はデカン、ドデカン等のノルマルパラフィンで十分である。また、ステロイド類のようにパラフィン類に対する溶解性に難がある場合は、適当な低極性共溶媒、例えば酢酸ドデシル等の脂肪族エーテル類やジベンジルエーテル等の芳香族エーテル類を微生物に対する毒性が発現しない範囲で添加するが、あるいはジヘキシルエーテル等の低毒性、低極性溶媒を単独で用いることによって解決することができる。
【００２０】
疎水性基質の添加量は、反応溶媒に対する溶解性と微生物に対する毒性発現濃度によって決定されるが、該嫌気型界面バイオリアクターにおいても、公知の好気型界面バイオリアクターと同様に、固／液界面における毒性緩和現象［Oda, S. and Ohta, H., Biosci. Biotech. Biochem., 56，1515 (1992)］が発現するため、その添加限界量は従来の水素反応法と比較して１０倍〜１０００倍と飛躍的に向上する。
【００２１】
また、本発明の嫌気型界面バイオリアクターに適用可能な微生物変換反応としては、まず微生物的還元反応が挙げられる。特に、クロストリジウムやユウバクテリウム属等の嫌気性の要求性が極めて高い腸内細菌を用いた水不溶性もしくは難溶性基質の微生物的還元に本発明のバイオリアクターは大きな威力を発揮する。酵母のような通性嫌気性微生物による還元反応においても、本発明の嫌気型界面バイオリアクターを用いることにより、好気条件下に比べてより効率的に反応を進行させることができるが、還元剤として水素ガスを要求する場合、例えば、ブタノール発酵や多くのステロイド類の還元反応を実施する場合、少量の水素ガスを該ガス採集用バッグ内に注入することにより高成績が得られる場合が多い。その際、少量の水素ガスは密閉バッグ内に注入され、かつ微生物還元反応によって消費されるので、その安全性の確保が容易である。また、本発明の嫌気型界面バイオリアクターを利用すれば、エステル類の加水分解反応やエステル交換反応、アルコールと有機酸とのエステル合成反応やアミノ化反応等、酸化反応を除く多くの反応を嫌気性微生物を用いて効率的に実施することができる。
【００２２】
本発明の嫌気型界面バイオリアクターは、好気型界面バイオリアクターと同様に、基質および産物の反応溶媒に対する溶解性、固／液界面における毒性緩和現象［Oda, S. and Ohta, H. Biosci. Biotech. Biochem., 56，1515 (1992)］に基づく高基質添加濃度ならびに高産物蓄積濃度、有機溶媒中での微生物増殖に伴う補酵素再生系の作動、反応後の産物回収の容易さ、極めて広い汎用性等、従来法に比較して多くの長所を有している。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
縦２６０ｍｍ、横３４０ｍｍ及び高さ５０ｍｍのステンレス鋼製バットに、凝固前に脱気−窒素置換したＡＢＣＭ寒天培地（栄研化学製、寒天２％添加）５００ｍｌを分注し、窒素ガス雰囲気下で凝固させ、寒天平板型界面バイオリアクター本体を調製した。この寒天平板表面に、ユウバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium aerofaciens）ＪＣＭ  ７７９０の細胞懸濁液８ｍｌ（８ループ／８ｍｌ−液体培地に懸濁）を植菌し、市販の酸素消去触媒２個および酸素インジケーター１枚とともに、１辺を開封したテドラーバッグ（２０ｌｉｔｅｒ容）内に装填した。開封した１辺を長さ５５０ｍｍのシーリングバーにて閉じ、バッグに装着してある小口径ノズル口より脱気−窒素置換を５回繰り返した。
【００２５】
３７℃で１日間静置培養して該腸内細菌を増殖させて微生物膜を発達させた後、一旦ガス採集用バッグを開封した。担体表面に窒素ガスを緩やかに吹きかけることによって表面の過剰な水分を除去した後、脱気−窒素置換した１％メチル７−ケトリトコレート／ジヘキシルエーテル溶液を１００ｍｌ重層し、再びガス採集用バッグ内に装填して、密閉、脱気−窒素置換し、少量の水素ガスを封入した後、同じく３７℃で静置培養した。該嫌気性界面バイオリアクター内の有機溶媒層より、２日おきに所定量の溶媒層を小口径ノズル口よりシリンジを用いてサンプリングし、シリコンＯＶ−２１０を充填したカラムを装着したガスクロマトグラフィにより、基質であるメチル７−ケトリトコレートと産物であるメチルウルソデオキシコレートを定量した。メチルウルソデオキシコレートの蓄積は反応開始後２日目より認められ、８日間の反応で９．８ｇ／ｌの産物蓄積が認められた。
【００２６】
実施例２
直径２１０ｍｍのガラスシャーレに、凝固前に脱気−窒素置換したＧＡＭ寒天培地（日水製薬製、寒天２％添加）５００ｍｌを分注し、窒素雰囲気下で凝固させた。この平板表面にクロストリジウム・アブソナム（Clostridium absonum）ＡＴＣＣ  ２７５５５の１日嫌気性培養液を３ｍｌ植菌し、実施例１と同様にしてガス採集用バッグ内に装填し、嫌気条件下で１日間前培養した。その後、増殖・肥厚化した微生物膜に重層する形で２％メチル７−ケトリトコレート／ジヘキシルエーテル−酢酸ドデシル（７：３）溶液５０ｍｌを添加して、実施例１と同様にして嫌気型界面バイオリアクターを組み立てた。密閉−嫌気条件下に静置培養することにより、反応開始５日目に、メチルウルソデオキシコレート５．７ｇ／ｌ、メチルケノデオキシコレート９．８ｇ／ｌが産物として蓄積した。
【００２７】
実施例３
直径２１０ｍｍのガラスシャーレに、凝固前に脱気−窒素置換したブタノール発酵用培地（酢酸アンモニウム２．２ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二カリウム・７水塩０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ、酵母エキス５．０ｇ、グルコース５０．０ｇ、ｐ−アミノ安息香酸１ｍｇ、ビオチン０．０１ｍｇ、蒸留水１．０  ｌｉｔｅｒ、寒天２０．０ｇ、ｐＨ５．０）５００ｍｌを分注し、窒素雰囲気下で凝固させた。この寒天平板表面にクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＩＦＯ  １３９４８の１日嫌気培養液を３ｍｌ植菌し、実施例１と同様にしてガス採集用バッグ内に装填し、嫌気性条件下に１日間前培養した。その後、増殖・肥厚化した該微生物膜に重層する形で５０ｍｌのデカンを添加し、３５℃で４日間培養した。培養開始初期の時点では、大量の水素ガスの発生により、該ガス採集用バッグが大きく膨張したため、過剰な内部ガスを放出した。発酵産物のプロフィールは、培養初期の段階では酪酸の蓄積が優勢であったが、その後１−ブタノールの蓄積が優勢となり、反応開始４日目には酪酸６．７ｇ／ｌ、アセトン８．４ｇ／ｌ、１−ブタノール１６．５ｇ／ｌが蓄積した。
【００２８】
実施例４
直径２１０ｍｍのガラスシャーレに、凝固前に脱気−窒素置換した酵母用培地（ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス３．０ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩１．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、寒天２０．０ｇ、蒸留水１．０ｌｉｔｅｒ、ｐＨ６．０）５００ｍｌを分注し、窒素雰囲気下で凝固させた。この寒天平板表面にロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）ＩＦＯ  ０９２０の細胞懸濁液（３ループ／３ｍｌ−液体培地）を３ｍｌ植菌し、実施例１と同様にして嫌気条件下１日間前培養した。その後、増殖・肥厚化した該微生物膜に重層する形で５０ｍｌの２％シトロネラール／ドデカン溶液を添加し、ガス採集用バッグ内に装填後脱気−窒素置換した上で３０℃で２日間培養した。その後、ガス採集用バッグを開放して有機溶媒層を全量回収し、シリカゲルカラムクロマトによってデカン除去した後、同カラムにヘキサン−酢酸エチル（９：１から５：５）を流して還元産物であるシトロネラール及び原料であるシトロネロールを分離・分取した。脱溶媒後、両者の重量を秤量したところ、シトロネロール０．８ｇ、シトロネラール０．２ｇであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の嫌気型平板界面バイオリアクターの１例を示す概略図である。
【符号の説明】
（１）酸素消去触媒
（２）ガス採集用バッグ
（３）有機溶媒層
（４）エアーフィルター
（５）親水性固定化平板担体
（６）酸素インジケーター
（７）バット
（８）シーリングバー
（９）蓋
【図１】
0004268719.tif 000002