(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度の生物学的または化学的アレイを支持するのに使用する基板であって、
モルパーセントで表して、67.6％のＳｉＯ2、11.4％のＡｌ2Ｏ3、8.53％のＢ2Ｏ3、5.2％のＣａＯ、4.31％のＢａＯ、1.31％のＭｇＯ、1.29％のＳｒＯおよび0.39％のＡｓ2Ｏ3からなり、かつ10ナノメートル未満の平均粗さを有する頂面を有するボロアルミノシリケートガラス材料、および
該材料の表面の少なくとも一部を覆う極性シランの官能化コーティング、
を備えた基板。
【請求項２】
前記コーティングの官能基が、１時間を超える期間に亘る熱湯中の浸漬後に維持されることを特徴とする基板。
【請求項３】
前記材料が0.5ナノメートル未満の平均粗さを有する頂面を有することを特徴とする請求項１または２記載の基板。
【請求項４】
前記極性シランがアミン基を含有することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の基板。
【請求項５】
前記極性シランが少なくとも１つのヒドロキシル基を含有することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の基板。
【請求項６】
前記極性シランが少なくとも１つのアルコキシ基を含有することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の基板。
【請求項７】
前記極性シランが少なくとも１つ塩素基を含有することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の基板。
【請求項８】
前記極性シランがアミノプロピルトリエトキシシランであることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の基板。
【請求項９】
共有結合または非共有結合により別の分子に対する特定の親和性を有する生物学的分子または合成分子から選択される少なくとも１つの結合物質をさらに含むことを特徴とする請求項１から８いずれか１項記載の基板。
【請求項１０】
前記結合物質が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、合成オリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、ペプチド、レクチン、修飾多糖類、合成複合高分子、機能性ナノ構造体、合成高分子、修飾／ブロックしたヌクレオチド／ヌクレオシド、修飾／ブロックしたアミノ酸、蛍光体、発色基、リガンド、キレートおよびハプテンより成る群から選択されることを特徴とする請求項９記載の基板。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高密度の生物学的または化学的アレイ、特に、それらのアレイが付着される改良基板材料に関する。
【０００２】
発明の背景
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、オリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列の核酸中の存在を決定するために広く用いられている。多くの場合、これにより、従来の塩基配列決定法に対して、簡単、迅速、かつ安価な代替案が提供される。ハイブリダイゼーションには、核酸のクローニングおよび精製、塩基特異的反応を行うこと、または退屈な電気泳動分離が必要ない。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、遺伝的多型の分析、遺伝病の診断、癌の診断、ウイルス病原体および微生物病原体の検出、クローンのスクリーニング、断片ライブラリーのゲノム遺伝地図作製および配列作製のような様々な目的のためにうまく用いられてきた。
【０００３】
オリゴヌクレオチドアレイは、各々のオリゴヌクレオチドの位置が分かるように、異なる区域に１つずつある規則的なパターンで固体支持体の表面に束縛された多数の個々のオリゴヌクレオチド種からなる。アレイは、オリゴヌクレオチドの選択された集合体、例えば、遺伝病の全ての既知の配列マーカーに関する全ての既知の臨床的に重要な病原体または療法に特異的なプローブを含有することができる。そのようなアレイは、診断研究所の必要性を満たすことができる。あるいは、アレイは、所定の長さｎの全ての可能性のあるオリゴヌクレオチドを含有しても差し支えない。そのような多くのものを含むアレイにより核酸のハイブリダイゼーションにより、その成分であるｎ−量体(n-mers)の全てのリストが得られ、これは、明白な遺伝子同定のため（例えば、法医学研究における）、未知の遺伝子変異体および突然変異種の決定のため（それらの内の１つの配列が一度知られた場合の関連ゲノムの塩基配列決定を含む）、クローンの重複のため、および従来の方法により決定された配列の照合のために使用することができる。最後に、多くのものを含むアレイに対するハイブリダイゼーションによるｎ−量体を調査することにより、全体的に未知の核酸の配列を決定するための十分な情報を得ることができる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドアレイは、米国特許第5,510,270号に記載されたように位置指定マスクと組み合わせて固相化学合成方法を用いて、全てのオリゴヌクレオチドを並行して支持体上に直接合成することにより調製することができる。効率的なフォトリソグラフィー技法を用いて、平方センチメートルの面積当たりで105ほど多くの個々のオリゴヌクレオチドを含有する小型アレイが実施されてきた。
【０００５】
オリゴヌクレオチドアレイを作製するための別の技術には、米国特許第5,474,796号に記載されたように、圧電ポンプを用いた正確な滴下付着が含まれる。この圧電ポンプは、微少量の液体を基板表面に分配する。このポンプの設計は、インクジェット印刷に用いられるポンプのものに非常に似ている。この超小型ポンプは、3000Ｈｚまでで50マイクロメートルおよび65ピコリットルの液滴を分配することができ、250マイクロメートルの標的に正確に当てることができる。電圧が加えられると、微小液滴がポンプから排出され、アレイ板上に官能化された結合部位で付着される。
【０００６】
アレイを形成するためのさらなる手法は、液滴を保持する印刷ピンに基板表面を繰り返し接触させ、インクジェット印刷機構を用いて、アレイマトリクスを配置する各工程を含む。
【０００７】
オリゴヌクレオチドを付着させるための支持体として使用する基板を選択する上で、いくつかの特徴を考慮しなければならない。第１に、その表面は、ハイブリダイゼーションの検出方法に適合されなければならない。分光検出技法、化学ルミネセンス検出技法および蛍光検出技法が、高密度のアレイを含むＤＮＡ研究に選択される検出技法である。これらの技法を用いるために、その基板が光学的に透明であることが望ましい。第２の重要な特徴は、末位から２番目のオリゴヌクレオチドの前記表面への結合が、ＤＮＡ中のポリリン酸主鎖のものと少なくとも等しい、高い化学安定性を有することである。アレイを支持する基板は、ソーダ石灰ガラスから製造され、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成を固定して行わせる、特にＤＮＡ分子を架橋させるのに適したアミノ基を含有する極性シランにより被覆された、慣習的に１×３インチ（2.54×7.62ｃｍ）のスライドである。フォトレジストまたはマスキング技法により、この表面にパターンのある誘導を行ってもよい。このようにして、パターンのある湿潤部位を他の非湿潤表面上に形成したり、パターンのある官能化部位を他の非官能化表面上に形成することができる。
【０００８】
高密度のアレイを支持するための基板としてのソーダ石灰ガラスの従来の使用に関する問題点の１つは、そのようなグレードの低いガラスの製造によくある微粒子汚染物の存在である。微粒子汚染物は、スライド当たり10,000の標的部位のような小規模で試料を取り扱う間の特別な関心事である。さらに、ソーダ石灰ガラス中に含まれるナトリウムは、容易に移動させて、このガラスから排出させることができる。曇りは、ガラスの透明度に悪影響を及ぼし、その結果、前述した検出技法を妨げる効果である。最後に、アミノ官能性シランコーティングのような均一に官能化されたコーティングを、従来用いられているスライドの表面上に得ることは難しい。均一なコーティングがなければ、オリゴヌクレオチドの付着が不均一となり、検出結果が変動し、信頼できないものとなってしまう。
【０００９】
発明の概要
生物学的および化学的アレイの印刷または合成に使用する改良基板が開示される。この基板は、ホウケイ酸ガラスまたはボロアルミノシリケートガラスから製造された、実質的に平らな支持体である。
【００１０】
発明の詳細な説明
例えば、アミノ官能化アミンによるガラス基板表面の官能化コーティングは、高密度アレイ製造の主要事項である。上述したように官能化コーティングの実質的に均一なコーティングが必要とされる。特定の平滑性を得るための既知の方法により製造できる既知のガラスを使用することには、生物学的基板としての重要な用途があることが発見された。
【００１１】
好ましくは１インチ×３インチ（2.54ｃｍ×7.62ｃｍ）のスライドの形態をとる、本発明の主題である基板は、ホウケイ酸ガラスまたはボロアルミノシリケートガラス、より好ましくは、モルパーセントで表して、67.6％のＳｉＯ2、11.4％のＡｌ2Ｏ3、8.53％のＢ2Ｏ3、5.2％のＣａＯ、4.31％のＢａＯ、1.31％のＭｇＯ、1.29％のＳｒＯおよび0.39％のＡｓ2Ｏ3から実質的になる、コーニング社の1737ＬＣＤガラスから製造される。このスライドは、好ましくは、ここに引用する米国特許第3,338,696号および同第3,682,609号に開示された溶融ドロー工程(fusion draw process)により形成されたガラスシートから切断してもよい。この工程により、ホウケイ酸ガラスまたはボロアルミノシリケートガラスのような高液相線粘度のガラスが極度な平滑性を有するシートに製造される。このホウケイ酸シートまたはボロアルミノシリケートシートは、他の方法により製造し、その後研磨してもよいが、製造における研磨段階により、基板表面上に微粒子汚染物が生じる可能性が出てくるので、溶融ドロー工程を使用することが好ましい。別の好ましい実施の形態において、スライドをコーニング社の7059ＬＣＤガラスから製造する。いずれにせよ、基板スライドの好ましいガラス組成は、15重量％未満の酸化ナトリウム、または任意の他のアルカリ金属酸化物を有する。いくつかの適切なガラス組成が、米国特許第5,374,595号に列記されている。
【００１２】
さらに、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた20マイクロメートル×20マイクロメートルの走査により測定された、頂面の平均粗さ（Ｒａ）が10ナノメートル未満、好ましくは、10オングストローム未満となるような均一な表面平滑性を有することが好ましい。この頂面は、結合実体（entity）アレイが好ましくは合成され、付着され、または他の方法で取り付けられるスライドの部分である。さらにいっそう好ましくは、平均粗さは５オングストローム未満である。例えば、1737ＬＣＤガラスを製造するために用いた場合、米国特許第3,338,696号および同第3,682,609号に開示された溶融ドロー平板ガラス形成方法により、５オングストローム未満の好ましい平均粗さを有する表面が得られる。あるいは、その好ましい平均粗さは、研磨により達成してもよい。この表面の平滑性は、均一な表面コーティングの施用を可能にするのに役立つ。
【００１３】
オリゴヌクレオチドの固定化に用いられるホウケイ酸基板またはボロアルミノシリケート基板に好ましく施されるコーティングは、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成を固定して行わせるのに、特に、ＤＮＡ分子を架橋させるのに適したアミノ基を含有する極性シランである。あるいは、この極性シランは、加水分解後にヒドロキシルを含んでもよい（加水分解の前には、この基は好ましくはアルコキシ基である）。適切なコーティングとしては、それによって前記シランが１から３までのアルコキシ基または塩素基を有する、官能化アルコキシシランまたはクロロシランが挙げられる。さらに、前記頂面は、例えば、フォトレジストまたはマスキング技法を使用することにより、パターンのある誘導を有していてもよい。
【００１４】
ホウケイ酸基板またはボロアルミノシリケート基板の使用は、オリゴヌクレオチドアレイを支持するためのアミン官能化コーティングに関する使用に限定されない。この基板は、共有結合または非共有結合により、別の分子に関する特定の親和性を有する任意の生物学的分子または合成分子を含む、様々な結合実体のいずれにとっての固体支持体として用いてもよい。好ましくは、特定の結合実体は、これを基板の表面にある普通の官能基と共有的に反応させるまたは非共有的に結合させる、（本来のまたは修飾のいずれかによる）官能化学基（第１アミン、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシル、アクリル等）、一般配列（核酸）、エピトープ（抗体）、ハプテン、またはリガンドを含む。特定の結合実体としては、限定されるものではなく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、合成オリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、ペプチド、レクチン、修飾多糖類、合成複合体高分子、官能化微細構造(functionalized nanostructure)、合成高分子、修飾／遮断(blocked)ヌクレオチド／ヌクレオシド、修飾／遮断アミノ酸、蛍光体、発色基、リガンド、キレートおよびハプテンが挙げられる。
【００１５】
実施例
比較研究を行って、３種類の異なるガラス：ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、およびボロアルミノシリケートガラスから製造された、同一のコーティングが施された１インチ×３インチ（2.54ｃｍ×7.62ｃｍ）のスライドの耐久性を決定した。ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシランのコーティングを試験すべきスライドの各々に施した。次いで、これらのスライドを0.5から５時間に及ぶ期間に亘り熱湯中に浸漬した。アミノ化されたコーティングが、ある環境応力（この場合には、熱湯）への露出後にスライドの表面上に維持された場合、その表面の官能性は、その官能性を支持したと言われ、耐久性の試験結果は陽性である。
【００１６】
アミノ化コーティングの耐久性は、Ａｕ／Ａｇ成長工程に基づく汚染試験を用いることにより測定した。この工程により、基板表面上のアミン官能基の存在が示される。Ａｕ／Ａｇ成長が生じる場合、この試験は、アミン官能基の存在に関して陽性である。陽性試験は、密で均一な金属的な灰色のコーティングを目視により観察することによって示される。アミン官能性のない基板は、着色されず、透明なままである。
【００１７】
この汚染工程試験は以下のように行った。スライドを１時間に亘りAURODYE FORTE RPN 490（Amersham Life Science, Amersham International）中に浸漬した。次いで、スライドを純粋で濯いだ。次いで、これらのスライドをＮ2により乾燥させた。次に、スライドを５分間に亘りINTENSE BL SILVER ENHANCEMENT SOLUTION RPN 492（Amersham Life Science, Amersham International）中に浸漬した。次いで、スライドを再度純粋で濯ぎ、Ｎ2により乾燥させた。金属的な灰色のコーティングの存在または不在は、目視により観察することにより決定した。
【００１８】
前述したように、３種類の異なる材料、すなわち、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、およびボロアルミノシリケートガラスから製造した基板を試験した。表１は、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン被覆スライドの、そのアミン官能性を失わせるのに必要とされた熱湯中の露出長さ（陰性と判断するのに汚染試験に必要とされる時間）を示している。
【００１９】
【表１】
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表１に示された結果は、ホウケイ酸ガラスまたはボロアルミノシリケートガラス上のガンマ−アミノプロピルトリエトキシシランのコーティングの耐久性が、ソーダ石灰ガラス上の同一のコーティングの耐久性よりもずっと優れていることを表している。
【００２０】
説明により拘束することを意図するものではないが、ホウケイ酸ガラスまたはボロアルミノシリケートガラスの試料中の酸化ナトリウムのレベルが小さいか存在しないと、試験に示された有利な耐久性特徴が得られると考えられる。好ましくは、高密度アッセイ基板に用いられるガラス材料は、12モルパーセント未満、より好ましくは、８モルパーセント未満の酸化ナトリウム含有量を有し、さらにより好ましくは、酸化ナトリウムを全く含まない。この理由に関して、代替案として、例えば、アルミノケイ酸塩ガラスを含む、この必要な酸化ナトリウム含有量を有する任意のガラスを使用することも考えられる。
【００２１】
ソーダ石灰ガラスの組成が表２に例として示されている。この実施例に用いたホウケイ酸ガラスの組成が表３に示されている。この実施例に用いたボロアルミノシリケートガラスである、1737ＬＣＤガラスの組成は先に示されている。
【００２２】
【表２】
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【表３】
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説明を目的として本発明を詳細に説明してきたが、そのような詳細はその目的のためのみであり、前述した請求項により定義された本発明の精神および範囲から逸脱せずに当業者により変更が行われることが理解されよう。