(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識したホスホリルコリン（PC）を使用する、試料中のC反応性タンパク質（CRP）濃度のin vitro測定方法。
【請求項２】
CRPを含む試料がヒト由来の液体である、請求項１記載のCRP濃度の測定方法。
【請求項３】
(i)固相に抗−CRP抗体を結合し；
(ii)該固相に結合した抗体に試料溶液を反応させて、該試料中のCRPを該固相上の抗体に結合させ；
(iii)該固相上の抗体に結合したCRPに対して標識したPCを反応させ；そして
(iv)固相上に結合した標識PCからのシグナルを検出し；そして
(v)検出されたシグナルの強さから試料中のCRP濃度を求める；
工程からなる、試料中のCRP濃度のin vitro測定方法。
【請求項４】
PCが放射性標識手段、または非放射性標識手段により標識される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
非放射性標識手段がランタノイドである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ランタノイドによるPCの標識が、PCと結合している別の物質に対する標識により行われている、請求項５記載のCRP濃度の測定方法。
【請求項７】
ランタノイドがEu3+である、請求項５または６記載の測定方法。
【請求項８】
(i)抗−CRP抗体を固定化した固相；および
(ii)ランタノイドで標識したPC；
を含む、試料中CRP濃度の測定キット。
【請求項９】
ランタノイドがEu3+である、請求項８記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、C反応性タンパク質（以下、「CRP」という。）の新規な測定方法に関する。より具体的には、本発明は、標識されたホスホリルコリン（以下、「PC」という。）を用いたCRPの新規な微量定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
CRPは、肺炎双球菌の莢膜のC多糖体と反応するタンパク質であり、血清中のβグロブリン分画に存在し、分子量が約130kDaの同一ペプチド5個からなる。CRPは、正常ヒトの血中濃度は約350 ng/ml未満であるが、感染、炎症、組織損傷などの急性相反応の間、血中濃度が最大で0.1 mg/mlへと激増する、急性相タンパク質の１種として知られている（Agrawal, A, Kilpartrick, J.M., and Volanakis, J.E. (1994) in Acute Phase Proteins- Molecular Biology, Biochemistry and Clinical Applications- (Mackiewicz, A., Kushuner, I., and Baumann, H., Eds.), pp. 79-92, CRC Press, London）。このような特徴から、CRPは従来、細菌感染、炎症および手術予後の診断マーカーとして利用されてきた。
【０００３】
CRPは、その生物学的役割については、未だ完全には明らかになっていないものの、補体活性化（Richards, R.L., et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5672-5676; Richards, R.L., et al., (1979) J. Immunol. 122, 1185-1189; Miyazawa, K., and Inoue, K. (1990) J. Immunol. 145, 650-654; Jiang, H., et al., (1991) J. Immunol. 146, 2324-2330; Wolbink, G.J., et al., (1996) J. Immunol. 157, 473-479）およびリンパ球のオプソニン化（Mortensen, R.F., et al., (1976) J. Immunol. 117, 774; Edwards, W.M., et al., (1982) J. Immunol. 128, 2498; Szalai, A.J., et al., (1995) J. Immunol. 155, 2557-2563）を含む、さまざまな前炎症性の宿主防御活性を示すことが明らかになってきた。こうした活性はおそらく、炎症反応の前免疫相中の非特異的宿主防御に貢献している。
【０００４】
細菌感染、炎症および手術予後を診断するためには、急性相だけでなく正常状態での急性相タンパク質レベルを正確に測定することが重要である。CRPは、外部刺激に対して最も高い感度でそして劇的に反応する急性相タンパク質である（Morley, J. J., and Kushner, L. (1982) Ann. N.Y. Acad. Sci. 389, 406-418）。そのため、特に正常状態のCRPレベルを正確に測定することにより、急性相の初期状態をより正確に診断することが可能になる。したがって、療法をモニターし、予後を評価するためには、急性相の初期のCRPレベル増加を迅速かつ正確に検出する必要があり、正常範囲の血清CRPレベルが測定可能な高感度な方法が必要である。
【０００５】
比濁イムノアッセイ（Yamamoto, S., et al., (1994) Vet. Quarterly 16, 74-77; Yamamoto, S., et al., (1993) Vet. Immunol. Immunophathol. 36, 257-264）およびラテックス凝集試験（Sarikaputi, M., et al., (1992) Jap. J. Vet. Res. 40, 1-12; Yamada, T., et al., (1993) Ann. Clin. Biochem. 30, 72-76）は簡便で、それぞれおよそ1-1000および10-400μg CRP/mlの範囲を測定することができることが知られている。これは典型的な急性相血清中（10-100μg CRP/ml）の範囲を十分に含むものである。しかしながら、前述の通りCRPの正常ヒト血中濃度は約350 ng/ml未満であるため、これらの方法では、正常レベルの血清中CRP濃度を測定することはできない。このため、これらの方法は、広く臨床検査で用いられてきたものの、急性相の初期のCRPレベル増加を検出できるほどの感度では測定できないため、解析結果は通常、単に「陰性」、「陽性」または「上昇」として判断されるのみである。しかし、急性相のピーク時だけでなく、正常レベルまたは急性相の開始時でのCRPレベルを精密に測定することは、診断の精度を高めるためにも極めて有用である。
【０００６】
蛍光イムノアッセイ（FIA）法（Siboo, R., and Kulisek, E.A. (1976) J. Immunol. Methods 23, 59-67）およびラジオイムノアッセイ（RIA）法（Claus, D.R., et al., (1976) J. Lab. Clin. Med. 87, 120-128）は、上記方法と比較して、相当に感度が向上している方法である。しかし正常人の血清中のCRPを測定するほどの感度には至っていない。
【０００７】
FIA法およびRIA法と原理を同じくするが、これらを発展させた酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）法（Lamb, W.R., et al., (1991) Med. Lab. Sci. 48, 201-205; Shields, M., et al., (1991) J. Immunol. Methods 141, 253-261; Yamamoto, S., et al., (1994) Vet. Quarterly 16, 74-77）は、一般にはRIA法より高い感度を有する、定量的方法である。しかしながら、ELISA法によりCRP濃度を測定した場合、RIA法と比較してもその測定範囲に大きな差が存在しなかった。すなわち、RIA法においては検出可能な範囲が8-800 ng CRP/mlである（Claus, D.R., et al., (1976) J. Lab. Clin. Med. 87, 120-128）のに対して、ELISA法では10-100 ng CRP/mlであった（Unten, S.K., and Hokama, Y. (1987) J. Clin. Lab. Anal. 1, 136-139））。この結果から、CRP測定のためのELISA法には大いに改良の余地が残されていることがわかる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、急性相における血清中CRP濃度のみならず、正常範囲の血清中CRPが測定可能な、迅速で感度が高い、試料中CRPの測定方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、さらに、ホスホリルコリン（PC）を用いて、血清中に存在するCRPと相同性の高いペントラキシンファミリーのタンパク質に影響を受けることなく、そして迅速かつ高感度にCRPを測定することができ、臨床診断においても利用可能な試料中のCRPの測定方法を開発することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、CRPの測定方法を種々検討したが、その研究においてヒト血清中にはアミロイドAおよびアミロイドP等のペントラキシンファミリーのタンパク質が存在し、それらのタンパク質が抗CRP抗体と反応していることを見出した。ELISA法によるCRP濃度の測定において、測定感度の上昇を阻害する要因の一つとして、上述のタンパク質が抗CRP抗体と反応することが考えられ、そのために、ヒト血清等の試料中のCRPを正確に測定することが非常に困難になっていることが予想される。
【００１１】
本発明者らは、CRPが肺炎双球菌の莢膜のC多糖体と反応し、その際にC多糖体のホスホリルコリン基と結合することに着目し、このようなCRPとホスホリルコリン基との特異的結合性を利用することにより、CRP濃度を高感度に測定することができるのではないかと考えた。
【００１２】
したがって、本発明においては、ホスホリルコリン（PC）とCRPとの特異的結合性を利用した、サンドイッチ型測定法による測定を実施する。好ましい態様では、PCは標識して使用する。かかる場合に、PCは、直接的に標識しても、または標識手段を媒介する他の分子をPCに結合することにより間接的に標識してもよい。また、PCは、放射性標識手段により標識されていても、または非放射性標識手段により標識されていてもよい。さらに、これらの標識手段は、現在利用可能な標識手段に限定されるものではない。
【００１３】
PCを標識する放射性標識手段としては、125I、32Pなどの慣用されている放射性同位元素などが利用可能である。PCを標識する非放射性標識手段としては、アルカリホスファターゼ（AP）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素を用いる方法、ルシフェリン-ルシフェラーゼによる発光を用いる方法、フルオロセイン、ランタノイドなどの蛍光色素を用いる方法のいずれにより標識してもよい。しかしながら、臨床現場における検査など、放射性物質の使用が好ましくない場合があるため、非放射性標識手段を用いることが好ましい。本発明の一態様として、特に、ランタン系列元素（ランタノイド）を蛍光物質として用いる。
【００１４】
ランタノイドは、近年、生物学的に活性な化合物（例えば酵素、レクチン、受容体など）を測定するためや組織化学的研究のための蛍光プローブとして注目を集めており、この様な蛍光を発するランタノイドとしては、サマリウム（Sm3+）、ユーロピウム（Eu3+）、そしてテルビウム（Tb3+）などが知られている（Saito, K., et al., (1998) Anal. Biochem., 258, 311-314; Elliot, C.T., et al., (1994) Analyst, 119, 2565-2569; Pettersson, K., et al., (1993) Clin. Chem., 39, 2084-2089; Rothlin, M.A., et al., (1993) Cancer, 71, 701-707; Samiotaki, M., et al., (1997) Anal. Biochem., 253, 156-161）。これらのランタノイドの蛍光を用いる利点の一つは、放射性アイソトープを用いる方法と比較して同等以上の感度を有することが挙げられる。
【００１５】
本発明においてランタノイドによりPCを標識するためには、これら蛍光を発するランタノイドのいずれを蛍光物質として用いてもよい。これらの中で、Eu3+を使用することが特に好ましい。これはEu3+の感度が高く、蛍光寿命が長く（FIAにおける平均的バックグラウンド蛍光よりはるかに長い）、Eu3+標識試薬の貯蔵寿命がRIAの試薬の貯蔵寿命よりもはるかに長いという利点を有するからである。以下、ランタノイドを使用する解離増感ランタノイド蛍光イムノアッセイ（Dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay, DELFIA）法（Guzaeva, T.V., et al., (1993) Immunology Lett. 35, 285-290）によるCRP濃度の測定方法であって、特にEu3+を用いた場合を例にして、本発明を説明する。
【００１６】
PCをEu3+で標識するには、Saito, K.らの論文（Saito, K., et al., (1998) Anal. Biochem. 258, 311-314）に記載されている方法を用いる。この方法によれば、タンパク質またはアミノ酸等をEu3+で標識するために、例えば、以下の式：
【００１７】
【化１】
0004242499.tif 000002
【００１８】
で表される、EDTAのフェニルイソチオシアネート誘導体であるN1-(p-イソチオシアネートベンジル) -ジエチレントリアミン-N1,N2,N3,N3-四酢酸（DETATA-ITC）、または
【００１９】
【化２】
0004242499.tif 000003
【００２０】
〔式中、Rは、以下の式：
【００２１】
【化３】
0004242499.tif 000004
【００２２】
で表されるアスパラギン結合型糖鎖を表す。〕
で表されるジエチレントリアミン-N1,N2,N3-五酢酸（DTPA）またはその二無水物（DTPAda）などのキレート物質を使用する。これらのキレート物質をその官能基を介してタンパク質等に結合させることにより、タンパク質をEu3+で標識することができる。
【００２３】
本発明においてPC（〔(CH3)3NCH2CH2OPO3H2〕+）をこれらのキレート物質で標識するために、まずPCに対して反応に影響しないタンパク質を結合させPC-タンパク質複合体を形成し、さらにこのタンパク質に対して上記キレート物質を結合させる。最初にタンパク質を標識した後にPCと結合させてもよい。タンパク質とPCとの結合は、タンパク質のアミノ基をPC基により置換することにより行う。アミノ基を有しない化合物であっても、ランタノイドキレート物質を導入することができる化合物であれば、どのようなものを使用してもよい。
【００２４】
PCに結合させるタンパク質は、Eu3+を一分子以上結合できること、および反応に影響を与えないことが必要である。これらの条件を満たすタンパク質であれば特に限定されず、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、卵白アルブミン（OVA）、ウサギ血清アルブミンなど、入手可能ないずれのタンパク質でも使用することができる。より好ましくは、BSA、KLHを使用する。最も好ましくは、BSAを使用する。当業者であればタンパク質以外にもこの目的に使用できる物質があることを容易に理解できる。
【００２５】
上述したキレート物質を使用して、以前に報告された方法（Kawasaki, N., and Lee, Y.C. (1997) Anal. Biochem. 250, 260-262）に従ってDTPAdaを用いてEu3+で標識したところ、PC35-BSAおよびPC58-BSA、およびBSAは、タンパク質あたりそれぞれ７、６および４分子のEu3+を結合した。ここでPC35-BSAとは、BSA 1分子当たり平均35分子のPCが結合した結合体を表し、PC58-BSAとはBSA 1分子当たり平均58分子のPCが結合した結合体を表す。この結合量は、IgGへのEu3+の結合量と同程度である。すなわち、慣用の方法によりタンパク質を標識すると、例えば抗hCRPポリクローナルウサギIgG（分子量160 kDa）の場合には、タンパク質当たり9原子のEu3+が結合する。
【００２６】
本発明の方法において、蛍光の測定のためEu3+は、初めにもとのキレート物質から解離し、1-（β-ナフチル）-3,3,3-トリフルオロアセトン（β-NTA）を形成する。この複合体が界面活性剤の存在下において強い蛍光を発する（以下、この蛍光を単にEu3+の蛍光という）。Eu3+の蛍光は、ポリスチレンおよび他のプラスチックやガラス材料と比較して減衰時間が104倍長く継続する。したがって、Eu3+の時間分解蛍光（time-resolved fluorescence）を時間分解蛍光マイクロプレートリーダー（Victor, Model 1420、Wallac社、Gaithersburg, MD）を用いてマイクロタイタープレート中で測定することができる（時間分解蛍光測定法）。すなわち、一定時間励起光を照射した後、固相から放出される蛍光が十分に減衰した後にEu3+の蛍光を測定できるので、バックグラウンドの蛍光の悪影響を排除できる。
【００２７】
タンパク質に結合したキレート物質から解離するEu3+による蛍光カウント（cps）の具体的条件は適宜定めてよいが、一例を示せば、単光子カウントにより、200μl／ウェルの増感溶液（Hemmila, I., et al., (1984) Anal. Biochem. 137, 335-343）中で15分間室温でインキュベーションした後、キセノンフラッシュランプ（1000 Hz）を用いて、総測定時間１秒間、フラッシュあたり、遅延時間50μ秒、カウント時間250μ秒（λex=340 nm、λem=615 nm）で測定する。時間分解蛍光イムノアッセイ（TR-FIA）法によるCRP測定およびPC結合アッセイにおけるバックグラウンドとしては、20 mM EDTA-TBSTのCRP濃度測定値を用いる。
【００２８】
Eu3+とキレート物質との結合が強固なためにEu3+の解離が起こりにくい場合には、標識した試料をプレート上から回収し、該試料を燃焼させて、すべての有機物質を無機塩の状態に灰化した後にEu3+濃度を測定してもよい。灰化によりEu3+濃度を測定する場合には、基本的には有機リン酸を測定するために確立された方法を使用する（Ames, B.N. and Dubin, D.T., (1960) J. Biol. Chem., 235, 769-758）。このように灰化した試料を1.5 mlの0.1 M酢酸中で55℃、30分間インキュベートすることにより再び溶解する。適量の溶解試料（20〜200 fmol Eu3+に相当）中のEu3+の蛍光は、上述のDELFIA法を用いて測定する。この結果から、灰化によってもEu3+濃度を正確に測定することができる（Saito, K., et al., (1998) Anal. Biochem. 258, 311-314）。
【００２９】
種々の標識手段を使用して試料中のCRP濃度を測定するサンドイッチ型測定方法としては、大きく分けて、二抗体サンドイッチ型測定法である抗体−抗体法（A）およびPCを用いたサンドイッチ型測定法（（B）および（C））が考えられる（図1を参照）。
【００３０】
抗体−抗体法（A）によるCRP濃度の測定方法は、i)プラスチックプレート上に抗CRP抗体を固定化し、ii)CRP濃度を測定したい試料溶液を反応させ、そしてiii)これに標識化した抗CRP抗体を反応させることにより、試料中CRP濃度を測定するものである（図1（A））。
【００３１】
しかしながら、本発明者らは、抗体−抗体法(A)でCRP測定を行うと、ヒト由来の試料、特に血清中のCRPを正確に測定できないことを見出した。その理由は、おそらくペントラキシンファミリーに属するヒト血清アミロイドA（hSAA）およびP（hSAP）が抗CRP抗体と反応する可能性があるためと考えられる。すなわち、hSAAおよびhSAPはヒトCRPとかなりの相同性を示し（それぞれ66％および70％）（Agrawal, A, et al., (1994) in Acute Phase Proteins- Molecular Biology, Biochemistry and Clinical Applications- (Mackiewicz, A., et al., Eds.), pp. 79-92, CRC Press, London; Shrive, A.K., et al., J. (1996) Nature Struc. Biol. 3, 346-354; Kilpatrick, J., and Volanakis, J. (1991) Immunol. Res. 10, 43-53）、そのため、アッセイにおいて使用する抗CRP抗体に結合する可能性がある。特に抗CRPポリクローナル抗体を用いると、血清中に含有されるペントラキシンによる影響を除去することが困難である。
【００３２】
したがって、本発明においては、上述した欠点を有さない測定法を提供するため、抗CRP抗体の使用は一種類のみとし、他方の抗体の代わりにPCを用いるサンドイッチ型測定法を行う。本発明には、PCを用いるサンドイッチ型測定法として抗体−PC法（B）またはPC−抗体法（C）の２種類が存在する。抗体−PC法（B）は、i)プラスチックプレート上に抗CRP抗体を固定化し、ii)CRP濃度を測定したい試料溶液を反応させ、iii)これに標識化PCを反応させ、固相に結合した標識の量を調べることにより、試料中CRP濃度を測定するものである（図1（B））。一方、PC−抗体法（C)は、i)プラスチックプレート等の固相上にPCを固定化し、ii)CRP濃度を測定したい試料溶液を反応させ、iii)これに抗CRP抗体を反応させることにより、固相に結合した標識の量を調べて、試料中CRP濃度を測定するものである（図1（C））。
【００３３】
本発明においては、サンドイッチ法において少なくとも１回はCRPとPCとの反応が行われる。PCは抗CRP抗体のように他のペントラキシンファミリーとの反応性を持たないので、上記抗体−抗体法で問題となるhSAAやhSAPとの望ましくない反応の影響が防止できる。
【００３４】
本発明においては、PCを用いたサンドイッチ型測定法のいずれを用いてもよい。測定感度を高めるためには、抗体−PC法（B）を用いることがより好ましい。PC−抗体法（C）においては、固相上のPCと血清試料中のCRPを反応させる段階において、血清中のレシチンがカルシウムの存在下でCRPのPC結合部位をブロックして、測定感度が低下するという欠点が存在するのに対して、抗体−PC法（B）においては、固相に結合した抗CRP抗体と血清試料中のCRPとを結合させた後、固相を洗浄してからPCを反応させることにより、血清中のレシチンとカルシウムによる反応の阻害を防止できるからである。したがって、固相上の抗CRP抗体と血清試料の反応後、固相をEDTA溶液で洗浄することが好ましい。抗体−PC法（B）を用いることにより、最小検出限界を試料中CRP濃度にして420 fmolにすることができる。なお、抗体−PC法（B）の場合には、PCは標識して用いられることは容易に理解されよう。
【００３５】
【効果】
本発明のCRPの新規な測定方法により、感染、炎症、組織損傷などの急性相反応時における血清中CRP濃度のみならず、正常範囲の血清中CRPを、高感度で正確に測定することができる。本発明のCRPの新規な測定方法により、さらに、正常範囲の血清中CRPを、臨床診断においても高感度で、かつ、迅速に検出できる。また、検査に必要な試料の量が少ない（ウェルあたり100μl）ため、大切な血清試料を節約でき、それによって正確を期するための複数回測定が可能となる。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例で用いた材料は、次の通りである。
大腸菌（Escherichia coli）中で発現された組換えヒトC反応性タンパク質（rhCRP）および抗hCRP（18、19）ポリクローナルウサギIgGはオリエンタル酵母株式会社（日本）より入手した。塩化ホスホリルコリン（PC）（カルシウム塩）、L-α-ホスファチジルコリン（卵黄由来のL-α-レシチン）、フタル酸水素カリウム、Triton X-100およびヒトAB型女性血清は、Sigma Chem.社（St. Louis, MO）より入手した。ラット血清はPel-Freeze社（Rogers, AR）より入手した。Chelex 100樹脂（ナトリウム型）はBio-Rad（Hercules, CA）より入手した。N1-(p-イソチオシアネートベンジル) -ジエチレントリアミン-N1,N2,N3,N3-四酢酸（DETATA-ITC）はWallac（Gaithersburg, MD）より、96穴マイクロプレート（カタログ番号#21-377-204）はFisher Scientific（Springfield, NJ）より入手した。硝酸ユーロピウム、1-(β-ナフトイル)-3,3,3-トリフルオロアセトン、トリオクチルホスフィンオキシド（TOPO）、ジエチレントリアミン-N1,N2,N3-五酢酸（DTPA）およびその二無水物（DTPAda）はAldrich Chem.社（Milwaukee, WI）より入手した。ポリビニルベンジルラクトノイルアミド（PVLA）はKazukiyo Kobayashi博士（名古屋大学、日本）より寄贈された。PC結合体であるPC7-、PC35-およびPC58-BSA、およびウシ血清アルブミン（BSA）は以前に報告された方法で製造したものを使用した（Stults, N., et al., (1987) Anal. Biochem. 161, 567-573）。
【００３７】
実施例１：抗体−抗体法、PC−抗体法、抗体−PC法のそれぞれを用いた血清中CRP濃度の測定の対比
緩衝液および解離増感溶液
CRP測定に用いた２つの緩衝液は、i）TBS（0.15 M NaClおよび10 mM CaCl2を含む20 mM Tris-HCl, pH 7.6）、およびii）TBST（0.02% Tween 20を含むTBS緩衝液）である。
【００３８】
解離増感溶液は、フタル酸水素カリウムでpH 3.2に調整した0.1 M酢酸を15μMβ-NTA、50μM TOPOおよび0.1%（w/v） Triton X-100になるように調製した（Hemmila, I., et al., (1984) Anal. Biochem. 137, 335-343）。
【００３９】
マイクロタイタープレートのコーティング
抗CRP IgG抗体は、IgG濃度が５μg/mlまでは、濃度の増加に伴ってプレート上にコーティングされる量が増加した。これ以上のレベルではコーティングの増加は見られなかった。したがって、マイクロプレート上の測定および結合アッセイのためには、500 ngの抗体をウェル中で静置し、コーティングした。
【００４０】
PC-BSAはそのままでは固定化が困難であったので、PVLA法（Suzuki, N., et al., (1997) Anal. Biochem. 247, 412-416）を用いてマイクロタイタープレートのウェルに固定した。PVLA（2 mg）は水1 mlに超音波で懸濁し、PVLA懸濁液40μlを各ウェルに加え、4℃で1晩インキュベーションした。1 mM NaIO4溶液を50μlずつ各ウェルに加え、プレートを暗所で１時間、室温でインキュベーションした。プレートを洗浄した後、PC-BSA溶液（40μlの水にタンパク質100 ng）を各ウェルに加え、5μlの2%（v/v）ボラン-ピリジン複合体と混合し、37℃で2時間インキュベーションした。1 Mグリシルグリシン（40μl）で37℃、4時間インキュベーションしてウェルをブロッキングし、その後2%（w/v）BSAを含むTBS 200μl中で、4℃、1晩インキュベーションした。次の方法のそれぞれの段階で、適用された溶液を除いた後、200μlのTBSでウェルを6回洗浄した。
【００４１】
PVLA法を用いてPC-BSAを固定する場合、コーティングレベルはPC-BSAの使用量が100 ng／ウェルになるまでは、使用量に応じて増加した。したがって、PVLA法にはルーチンにPC-BSA 100 ngを用いた。
【００４２】
予備試験を行った後、バックグラウンドカウントが最小になるように、Eu3+標識した抗CRP IgG（20 ng IgG、1 pmol Eu3+／ウェル）またはPC35-BSA（20 ng BSA、1.8 pmol Eu3+／ウェル）レベルを選択した。
【００４３】
DELFIA法によるCRP測定
３つのアッセイ法の原理を図１に示した。他の言及がない限り、記載された各段階で、試薬溶液を除いた後、200μlのTBSTでウェルを6回洗浄した。Eu3+の蛍光は、以前に報告されたDELFIA法に従って（Guzaeva, T.V., et al., (1993) Immunol. Lett. 35, 285-290）、最後に測定した。
【００４４】
（A）抗体−抗体法
抗CRP抗体（500 ng）を含むTBS 100μlを各ウェルに加え、4℃で１晩インキュベーションした。ウェルは2%（w/v）BSA（TBS中）200μl中、室温で2時間インキュベーションしてブロッキングし、BSA溶液を除いた後、200μlのTBSで6回洗浄した。異なる量のCRPを含むTBST中の試料100μlを、抗体でコーティングしたウェルに適用し、室温で2時間インキュベーションした。CRP溶液を除いた後、20 ngのEu3+標識抗CRP抗体（IgGあたり９Eu3+）を含む100μl TBST緩衝液を加え、その後プレートを室温で2時間インキュベーションし、Eu3+蛍光を測定した。
【００４５】
（B）抗体−PC法
抗CRP抗体でコーティングし、BSAでブロッキングしたマイクロタイタ―プレートを上述のように調製した。異なる量のCRPを含むTBST 100μlをウェル中に静置し、室温で2時間インキュベーションした。CRP溶液をウェルから除いた後、Eu3+標識したPC-BSAを含むTBST 100μlを加え、室温で2時間インキュベーションした。20 mM EDTAを含むTBSTで処理したCRPおよびEu3+標識したBSAをコーティングしたウェルに加え、バックグラウンドおよび基準とした。
【００４６】
（C）PC−抗体法
水中のPC58-またはPC7-BSA溶液（100μgのタンパク質および約120 pmolまたは15 pmolのPCを含む40μl）を固定するため、PVLAコーティングしたウェル上で静置した。ウェルをPC-BSAでコーティングし、BSAでブロッキングした後、TBS（200μl）で6回洗浄し、さまざまな濃度のCRPを含むTBST 100μlを導入して室温で2時間インキュベーションした。CRP溶液を除いた後、Eu3+標識した抗CRP抗体（TBST 100μl中に20 ng）を加え、プレートを室温で2時間インキュベーションした。
【００４７】
CRP濃度測定値の比較
抗体−抗体法（A）およびPC−抗体法（C）によるCRP測定は二相性標準曲線（10-60 ngおよび100-200 ng）を示した（図2b）。一方、抗体−PC法（B）は5-500 ng CRP/mlの範囲で直線になった（図2a）。この範囲は図2bに示したものよりずっと広かった。
【００４８】
抗体−抗体法（A）も抗体−PC法（B）も血清の存在による影響は受けなかった。しかし、PC−抗体法（C）では血清に添加したrhCRPを正確に測定できなかった（図３）。BSAまたはPdCを含む場合または含まない場合での、100倍希釈した血清中の既知量のrhCRPについては、抗体−抗体法（A）でも抗体−PC法（B）でも期待通りの結果が得られたが、抗体−抗体法（A）において干渉が無視でき、許容できるのは限られた範囲でだけだった（図４）。
【００４９】
DELFIA技術により、CRP測定に関する高感度定量法の開発が可能になった。抗CRP抗体でコーティングしたプレートとEu3+標識したPC-BSAを用いる抗体−PC法（B）の感度と正確さは非常に高く、400 fmolのEu3+（すなわちCRP 420 fmol）を検出することができる。特異的結合は、総結合カウントから非特異的結合カウントを除いて得られる（図８）。この感度は5-500 ng CRP/mlの範囲に相当し（図２）、ラジオイムノアッセイ（8-800 ng CRP/ml）に匹敵する（Claus, D.R., et al., (1976) J. Lab. Clin. Med. 87, 120-128）。3回ずつの解析で示された標準偏差は3％未満だった。さらに通常のELISA法と比べると、本発明の方法による検出可能な直線範囲ははるかに広かった（ELISA法では10-100 ng CRP/ml（Unten, S.K., and Hokama, Y. (1987) J. Clin. Lab. Anal. 1, 136-139））。抗体−PC法（B）は、二次抗体を使用する代わりに、Eu3+標識したPC-BSAを直接使用するため、より単純である。上述の測定感度により、さらに、10-100倍希釈した血清試料を用いて血清中の正常レベルCRP（350 ng/ml未満）を測定することもできる。
【００５０】
実施例２：抗体−抗体法、PC−抗体法、抗体−PC法のそれぞれを用いたPC結合アッセイ
緩衝液および解離増感溶液
PC結合アッセイに用いた２つの緩衝液、および解離増感溶液は、CRP測定に使用したものと同様に調製した。
【００５１】
マイクロタイタープレートのコーティング
PC結合アッセイに用いたマイクロタイタープレートは、抗CRP IgG抗体またはPC-BSAにより、CRP測定に用いたものと同様に調製した。
【００５２】
CRPの定量的沈殿
定量的沈殿反応は以下のとおり行った。TBS中のCRP（50μg）に、異なる量のPC58-BSAを含むTBSを添加して最終容積を50μlとした。37℃で１時間インキュベーションした後、混合物を４℃に48時間置き、遠心分離した（10000 g x 5分）。沈殿を冷TBSで３回洗浄し、0.5 M NaOH（50μl）に溶解した。
【００５３】
沈殿のタンパク質濃度は、Pierce（Rockford, IL）のキットで、rhCRPをCRPの標準として用いるかまたはBSAをPC-BSAの標準として用いて、二シンコニン酸（bicinchoninic acid, BCA）検定により測定した（Smith, P.K., et al., (1985) Anal. Biochem. 193, 76-85）。BSAをCRP測定の標準として使用した場合、BCA法により、正確なCRP濃度を得るには、係数0.84を用いるべきである。リン酸は、ホスホリルコリンを標準として用い、Amesら（Ames, B. N., and Dubin, D.T. (1960) J. Biol. Chem. 235, 769-758）の有機リン酸解析法により測定した。
【００５４】
BSA、レシチン（PdC）およびヒト血清による干渉
上述の3つの方法、すなわち、抗体−抗体法（A）、抗体−PC法（B）およびPC−抗体法（C）を用い、TBSTで100倍に希釈した血清中のCRP測定を行った。希釈した血清にrhCRP（10-40 ng/ウェル）を加え、混合物をウェル中で静置し、解析した。これらの方法に対して、血清が存在することの影響を、rhCRP（10 ng）を標準として比較した。同様に、BSA（10 mg/ml）またはPdC（1 mg/ml）を含むTBSTも、その干渉を調べるため、異なる量のrhCRP溶液を含む溶液に加えた。ブランクとして、CRPを20 mM EDTAを含むTBSTで希釈した。
【００５５】
DELFIA法によるPC結合アッセイ
PC結合アッセイにより使用した3つのアッセイ法は、CRP測定において示した3つの方法と同一である。Eu3+の蛍光は、CRP測定と同様に、DELFIA法に従って最後に測定した。
【００５６】
PC結合アッセイ
CRPのモル濃度は五量体で示されている（分子量118,000）。
（i）沈殿法
10-80μgのPC58-BSAと50μgのCRPを用いて、CRPのPC結合活性を定量的沈殿により測定し、沈殿中のタンパク質およびリン酸を定量してCRP結合活性を測定した（図５）。沈殿はPC-BSAレベルが20μgのときプラトーに達し、沈殿70μg（BSAとして）に10 nmolのリン酸が見られた。
【００５７】
（ii）マイクロタイタープレート法
抗体−PC法（B）およびPC−抗体法（C）を用いて、CRPがウェルあたり5-100 ngの範囲のとき、PC結合活性をEu3+標識プローブ20 ngを使用して測定した。プラスチックのウェルにPC-BSAまたはPdCを直接コーティングした場合には、Eu3+蛍光プローブを用いても、CRP結合活性を測定するに十分な高いレベルのコーティングされた材料（PC-BSAもPdCも）が得られなかった（データは示していない）。したがってPVLA法を用いてPC-BSA固定化プレートを調製した。
【００５８】
BSA（10 mg/ml）が存在する場合には、抗体−PC法（B）もPC−抗体法（C）も影響を受けなかったが、1 mM PdC（血清中のPdC濃度）または希釈血清が存在する場合には、PC−抗体法（C）は影響を受けたが、抗体−PC法（B）は受けなかった（図３）。
【００５９】
血清構成要素によるPC−抗体法（B）の干渉は、主にPdCがCRPのPC結合部位と反応するためであると考えられる（図３）。実際、CRPはカルシウムの存在下でレシチンと沈殿することが知られている（Hokama, Y., et al., (1974) Clin. Chem. Acta 50, 53-62）。したがって、PdCによる干渉を防ぐために、PC結合活性と関係がない抗CRP抗体により血清試料からCRPを捕獲することができる抗体−PC法（B）を使用するのが好ましいことがわかった。また、CRPを含む試料をプレートに適用した後、プレートをEDTA溶液で洗浄する方がよい。これはPC結合部位から血清中の阻害物質を除くためである（データは示していない）。
【００６０】
実施例３：PCに対するCRP結合活性
Caを含まないPCの調製
塩化ホスホリルコリン（カルシウム塩）を100 mlのChelex 100（ナトリウム型）と共に水に懸濁し、懸濁液を室温で１晩震蕩した。樹脂を吸引ろ過により除き、フィルター上で水で洗浄した。PC（ナトリウム塩）水溶液の有機リン酸を解析し、凍結乾燥により粉末にした。
【００６１】
PCによるPC結合活性阻害
さまざまな量のPCを、2、5、10、50および100 ngのCRPを含む総体積100μlのTBST溶液中で37℃、2時間インキュベーションした。混合物をPC58-BSAで固定したウェル上に静置し、室温で2時間インキュベーションした。CRPのPC結合活性は上述のように抗CRPを用いて測定した。
【００６２】
固定化PC-BSAに対するCRP結合活性
PC58-BSAまたはPC7-BSAでコーティングされたウェルには、抗CRP抗体（IgG）がそれぞれ、ウェル当たり5.6 fmolおよび2.2 fmol結合した（図６）。PCのCRP結合活性に対する阻害能を、さまざまな量のCRPで測定した。PC−抗体法（C）を用いた際、CRPが2、5、10、20、50および100 ngのとき、50%阻害（IC50）時のPC濃度はそれぞれ、5、11、16、17、27および37μMだった（図７）。
【００６３】
抗体−PC法（B）にはさらに利点がある。現存するCRP測定法のほとんどは、抗hCRP抗体のみに頼っている。血清中に含まれるヒト血清アミロイドA（hSAA）およびP（hSAP）タンパク質は、ペントラキシンファミリーであり、hCRPとかなりの相同性を示す（それぞれ66%および70％）（Agrawal, A, et al., (1994) in Acute Phase Proteins- Molecular Biology, Biochemistry and Clinical Applications- (Mackiewicz, A., et al., Eds.), pp. 79-92, CRC Press, London; Shrive, A.K., et al., J. (1996) Nature Struc. Biol. 3, 346-354; Kilpatrick, J., and Volanakis, J. (1991) Immunol. Res. 10, 43-53）ため、アッセイにおいてポリクローナル抗体を一次抗体として使用すると、抗hCRP抗体はこれらペントラキシンと反応する可能性がある。一方、PC-BSAと反応できるのはCRPのみであり（Eriksen, N., et al., (1994) in Acute Phase Proteins ？Molecular Biology, Biochemistry and Clinical Applications- (Mackiewicz, A., et al., Eds.), pp. 93-106, CRC Press, London）、したがって抗体−PC法（B）は、方法の最終段階でEu3+標識したPC-BSAと特異的に反応することにより、CRPのみを測定する。
【００６４】
飽和沈殿では、20μgのPC58-BSAを添加したとき、沈殿は0.17 nmolのPC58-BSA（すなわち総PC 10 nmol）および0.37 nmolのCRPを含み、結合化学量はPC58-BSA：CRP= 1: 2.2だった（図５）。さらに、PVLA法により固定されたPC-BSAは、PC−抗体法（C）で、複合体中のPC-BSA：CRP：抗CRP IgGを1：1：1と仮定して、Eu3+カウントからウェルあたり5-6 fmol（2.4-2.6 x 105 cps）と概算された（図６）。
【００６５】
CRPによるPC結合親和性は、放射標識PCを用いた15℃の平衡透析、および21℃でのキャピラリー電気泳動により測定し、それぞれ、Kd=6.3μM（Anderson, J.K., et al., (1978) Fed. Proc. 37, 1495）およびKd=17.7μM（Heegaard, N.H.H., and Robey, F.A. (1993) J. Immunol. Methods 166, 103-110）という結果を得た。37℃でPC−抗体法（C）を用いることにより、PCが0.2、0.4、0.9、1.7、4.2および8.5 pMのCRP阻害をすることから、PCに対するIC50値はそれぞれ、5、11、16、17、27および37μMという結果が得られた（図７）。50％阻害のリガンド濃度は、受容体およびリガンド濃度がどちらも実際のKdの１％未満であるとき、解離定数を近似するためにしばしば用いられる（Chang, K.-J., et al., (1975) Biochem. Biophys. Acta 406, 294-303）。ウェルに固定されたPC-BSA量は不明であるが、仮にPC-BSAの全量が固定されたとしても、報告されたKd値のわずか0.2%でしかない。CRP濃度もまたKd値の0.01%未満である。したがってIC50値は結合定数（Kd）を近似することができる。この場合、このように概算されたKd値（5-37μM）は平衡透析およびキャピラリー電気泳動の結果と一致している（6.3-17.7μM）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Eu3+標識プローブを用いたCRP測定法を図示したものである。（A）は抗体−抗体法により、（B）は抗体−PC法により、（C）はPC−抗体法によりそれぞれCRP濃度を測定した結果を示す。
【図２】  図２は、抗体−抗体法（A）、抗体−PC法（B）、およびPC−抗体法（C）を用いたCRP測定の標準曲線を示す。
【図３】  図３は、異なる方法を用いた100倍希釈ヒト血清のCRP測定の結果を示す。
【図４】  図４は、抗体−抗体法（A）および抗体−PC法（B）による100倍希釈血清中のCRP測定の結果を示す。
【図５】  図５は、CRPとPC58-BSAの定量沈降を示す。
【図６】  図６は、PC58-およびPCγ-BSAのCRP結合活性の比較を示す。
【図７】  図７は、CRPによるPC結合活性に対する水溶性PCの阻害を示す。
【図８】  図８は、抗体−PC法（B）の特異的および非特異的CRP結合について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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