(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、ガラクトースにＮ−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号２又は４に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示される塩基配列の1nt〜1203ntまで又は配列表の配列番号４に示される塩基配列の1nt〜1206ntの塩基配列を有する請求項４記載の核酸。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項８】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項９】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸。
【請求項１０】
請求項６記載の核酸中の部分領域と相補的な配列を有する請求項９記載の測定用核酸。
【請求項１１】
プローブ又はプライマーである請求項９又は１０記載の測定用核酸。
【請求項１２】
塩基数が１５塩基以上である請求項１１記載の測定用核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに酵素活性を測定するための核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガラクトースβ１−４N-アセチルグルコサミンβ１−３ガラクトースβ１−４N−アセチルグルコサミン−R（以下、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc(Nac)−R：所謂ポリラクトサミン構造）の還元末端のガラクトースにN-アセチルグルコサミンをβ１−６で転移する酵素として、ヒトでは一種類（IGnT）(Bierhuizen MF, Maemura K, Kudo S, Fukuda M. Glycobiology. 1995 5, 417-25.)、マウスでは二種類（IGnTAおよびIgnTB）(Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T. Glycobiology. 2000 10, 1001-11.)が知られていた。このポリラクトサミン構造の糖鎖は、糖脂質（例えば、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcβ１−１セラミド：Lacto-N-nor-hexaosylceramide）やタンパク質のアスパラギン酸のアミノ基に結合している糖鎖（N-結合型糖鎖）などに存在することが知られている。さらに、IGnTにより分岐している糖鎖構造が知られている（例えば：Galβ１−４GlcNAcβ１−３（Galβ１−４GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcβ１−１セラミド：Lacto-N-iso-octaosylceramide）など（FEIZI,T., Childs, A.R., Watanabe, K and Hakomori, S.  J.Exp.Med. 1979, 149, 975-980）がある。また、Ii血液型が知られている。このi（small i）血液型の抗原は、血球上のポリラクトサミンであり、I血液型の抗原は、血球上のポリラクトサミンにβ１−６結合でGlcNAcが分岐した構造である。すなわち、IGnTのような酵素によってI抗原が産生されていると考えられ、I合成酵素の絶対的または相対的欠損によりi(small i)血液型になると考えられる。最近、既知の酵素のIGnTの一塩基変異、または遺伝子の欠損によって起こることが報告された（Molecular basis of the adult I phenotype and the gene responsible for the exoression of the human blood group I antigen. Blood. 2001 98(13), 3840-3845, Yu LC, Twu YC, Chang CY, Lin M。しかし、赤血球上のI抗原を合成する酵素については、完全には同定されていない。すなわち、Ii血液型を決定する遺伝子である可能性があるガラクトースにβ-１,６結合でN-アセチルグルコサミンを転移する遺伝子および酵素を同定する必要がある。さらに、i(small i)血液型のヒトでは、先天性白内障の発症率が非常に高く、I合成酵素の欠損と先天性白内障の関連性が指摘されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,６結合で転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に基づく血液型等の診断が可能になる。既に１種類の酵素（IGnT）が同定されている。しかしながら、同じ転移活性を有する酵素が別にあるか、血液型を決定している遺伝子・酵素であるのか、今だ不明な点が多い。
【０００４】
従って、本発明の目的は、ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核酸および酵素タンパク質を発現する細胞を提供することである。また、発現該酵素タンパク質は、抗体作製用に利用でき、該酵素タンパク質の産生方法を提供するものである。さらに、発現該酵素タンパク質および該酵素タンパク質に対する抗体を用いたい免疫組織染色およびRIAやEIAなどの免疫測定法に利用できる。さらに、本発明の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の通り、目的とする酵素は、未だ不明な点が多いため、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではなく、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単離することは容易でないことが予想される。本願発明者は、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々の酵素遺伝子の塩基配列間に、もしも相同性の高い領域が存在していれば、目的とする酵素の遺伝子もその相同配列を有しているかもしれないと考えた。そして、公知のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子等の塩基配列を検索した結果、相同な領域が見つかった。そこで、バイオインフォマティクスの技術を用いて遺伝子領域を予測し、PCRを用いて該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、本発明に至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、ガラクトースにＮ−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１および３には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
【０００８】
下記実施例で得られた本発明のタンパク質(「IGnT2」および「IGnT3」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用：  ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,６結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、１．UDP-N-アセチルグルコサミン  +  ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニルβ１−３ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R  →  UDP  +  ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニルβ１−３（N−アセチルグルコサミニルβ１−６）ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R（Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcβ１-R  ＋  UDP-GlcNAc  →  Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcβ１-R  +  UDP）。２．UDP-N-アセチルグルコサミン  +  N-アセチルグルコサミニルβ１−３ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R  →  UDP  +  N-アセチルグルコサミニルβ１−３（N−アセチルグルコサミニルβ１−６）ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R（GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcβ１-R  ＋  UDP-GlcNAc  →  GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcβ１-R  +  UDP）。などの反応を触媒する。
【０００９】
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１又は３に示されるアミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、ポリラクトサミンのガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する。なお、アミノ酸配列の相同性は、FASTAのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。
【００１０】
本発明は、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２および配列番号４に示されている。配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下(すなわち、5 x Denhardt's reagent, 6 x SSC,0.5% SDS又は0.1% SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう)において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
【００１１】
上記本発明の核酸は、下記実施例に詳述する方法により調製することもできるし、また、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、下記実施例で用いているヒト奇形癌細胞PA-1（American Type Culture collection 以下ATCC）を材料として用い、常法であるRT-PCR法を行うことにより容易に調製することができる。また、上記本発明のタンパク質は、例えば下記実施例に詳述するように、上記本発明の核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞中で発現させ、精製することにより容易に調製することができる。
【００１２】
上記本発明の核酸を、発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記核酸を発現させることができる組換えベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知であり、市販もされている。本発明では、このような市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。また、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等により宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知であり、上記組換えベクターを用いること等により容易に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定されず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いることができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例に詳述されている。
【００１３】
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
【００１４】
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわけ配列番号２又は４に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長（１２０６塩基または１２０９塩基）以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
【００１５】
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたNASBA法(3SR法、TMA法）を採用することもできる。NASBA法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００１６】
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。
【００１７】
本発明の酵素を、ポリラクトサミン糖鎖を有する糖タンパク質、オリゴ糖、糖脂質又は多糖等に作用させることにより、N−アセチルグルコサミンがβ-1,６結合される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾、糖脂質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１９】
１．遺伝子データベースの検索とIGnT２、IGｎT3の塩基配列決定
既存のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Gene  Bank）：M97347,  NM004751, NM001490, NM001491である。また検索は、Blast[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)]等のプログラムを利用した。
【００２０】
その結果、第六染色体のゲノム配列クローンのGene Bank Accetion No.AL139039およびNo.AL358777が見出された。さらに、この二つの配列を網羅した第六染色体のGene Bank accetion  No. NT_007291が見出された。この部分配列は、既知のIGnTと相同性が高く、ゲノム上で既知のIGnTの第一エクソンを挟むように存在していた。この新規の２つの配列について遺伝子領域解析ソフトのGeneScan、HMMgene等を用いて翻訳領域を解析した。その結果、新規の２つの配列は、別々な第一エクソンであり、この独立した第一エクソンは既知のIGnTのエクソン２、エクソン３を共用している可能性が認められた。そこで、ここの第一エクソンと第三エクソンにプラマーを設計して、トランスクリプトとして存在するか調べた。また、既知のIGnTを「IGnT1」とし、新規の２つを「IGnT2」と「IGnT3」と命名した。
【００２１】
具体的には、株化細胞PA-1（奇形芽腫、ATCCより入手）より、総RNAを抽出し、常法に従ってｃDNAを合成した。このｃDNAを鋳型として使用した。用いたプライマーは、IGnT1はフォワードプライマー（5'−tgaggcatgcctttatcaatgcgttacc-3'）,リバースプライマー（5'−tgaatagctcaaaaatacctgctgggttgt-3':全て共通）、IGnT2はフォワードプライー（5'-tgaatgatgggctcttggaagcactgtc-3'）、IGnT3はフォワードプライー(5'-gtgaaaataatgaacttttggaggtactgctt-3')を用いてPCR（95℃30秒、60℃30秒、72℃2分を32サイクル）を行なった。
【００２２】
その結果、約1.2kbaseの増幅産物が得られた。このPCR増幅産物の配列を調べた。このPCR溶液をQIAquick PCR Purification kit(キアゲン)にてPCR増幅産物を精製した。この精製PCR産物を鋳型としてシークエンスを調べた。シークエンスの結果、IGnT2とIGnT3の配列（配列番号２、４）が得られた。また、IGnT1とIGnT3に関しては、pCRIIベクター（インビトロジェン社）に一般的なTAクローニング法により、サブクローニングした。
【００２３】
２．IGnT２およびIGnT３の発現ベクターへの組込み
IGnT2およびIGnT3の発現系を作成するため、まずIGnT2およびIGnT3をインビトロジェン社のGatewayシステムのpDONR201に組込み、さらにインビトロジェン社のBac-to-BacシステムによるBacmidを作製した。さらに、陽性対照対照としてIGnT1も同様に以下に詳細を述べる。
【００２４】
GatewayシステムによるpFastBacへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
pCRIIにサブクローニングしたIGnT１およびIGnT3を鋳型にした。IGnT2はMarathon cDNAを鋳型として、IGnT1に対するプライマーF１（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTAAATATCTCAGACCCTTTGAGGCTGACT-3'）,プライマーF2(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGCACATCTTTTATCAATGGAAAAACA-3')、
IGnT2に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAGGGCAGCTCTGTCCAATGCTTCA-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTCATCAGATTTTTGAGGGGAAAG-3'）、
IGnT3に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAACAGTTCCAGTGAAAGGTATTTTAG-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTAATCACGCCTTAGAGAAAATGCCA-3'）
と共通のプライマーR（5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaAAAATACCAGCTGGGTTGTATCGCAG-3'）を用いて、PCR（98℃10秒、55℃30秒、72℃1分を30サイクル）により再度DNA断片を得た。MicroSpin S-400 HR（アマシャムファルマシアバイオテク）にてDNA断片を精製し、精製後BP クロナーゼ 反応によってpDONR201へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするDNA断片１μl、pDONR201１μl（150ng）、反応緩衝液2μｌ、BP クロナーゼ mix 2μl、TE溶液４μlを25℃で1時間インキュベートして行った。プロテイナーゼKを１μl加えて37℃10分おき反応を終了させた。
【００２５】
その後上記mix全量（1μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pDONR−IGnT1-F1、pDONR-IGnT1-F2、pDONR-IGnT2-F1、pDONR-IGnT2-F2、pDONR-IGnT3-F1、pDONR-IGnT3-F2）を抽出・精製した。
【００２６】
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
【００２７】
まずエントリークローン１μl、ｐFBIHを１μl（100ng）、LR反応緩衝液2μl、TE4μl、LR クロナーゼmix 2μlを25℃で1時間反応させ、プロテイナーゼ Kを1μl加えて37℃10分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐFBIH-IGnT1-F1、ｐFBIH-IGnT1-F2、ｐFBIH-IGnT2-F1、ｐFBIH-IGnT2-F2、ｐFBIH-IGnT3-F1、ｐFBIH-IGnT3-F2、が生成される）。ｐFBIH は、pFastBac１にIgκシグナル配列（MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG）とHisタグ(His 6個)のシーケンスを加えたもので、OT５（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggacatcaccatcaccatcac-3'）を鋳型に、プライマーOT20  (5'-cgggatccat gcattttcaa gtgcag-3')と、OT22 （5'-ggaattcgtgatggtgatggtgatg -3'）を用いてPCRを行い、得られたDNA断片をBam H1 とEco R1 で挿入した。さらに、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Hisタグは精製のため挿入した。
【００２８】
その後上記混合液全量（5μl）をコンピテントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むLBプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクター（pFBIH-IGnT1-F1、pFBIH-IGnT1-F2、pFBIH-IGnT2-F1、pFBIH-IGnT2-F2、pFBIH-IGnT3-F1、pFBIH-IGnT3-F2、:同様の工程をする場合、pFBIH-IGnTsとする）を抽出・精製した。
【００２９】
またpFBIHに変えてｐFBIFでも同様に実験を行った。即ちｐFBIFはHisタグに変えて、精製用にFLAGペプチド（DYKDDDDK）を入れたもので、OT3（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggagattacaaggacgacgatgacaag-3'）を鋳型とし、プライマーOT20（上記と配列同じ）と、OT21 （5'-ggaat tcttgt catcg tcgtc cttg-3'）によって得られたDNA断片を上記と同様にBam H1 とEco R1 で挿入し、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conversion System（インビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入れた。
【００３０】
Bac-to-BacシステムによるBacmidの作成
続いてBac-to-Bacシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐFBIH- IGnTs又はｐFBIF-IGnTsとBacmidとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なBacmidにIGnTsにその他の配列を挿入した。このシステムはTn7の組換部位を利用して、Bacmidを含む大腸菌（DH10BAC）に目的遺伝子を挿入させたpFastBac（pFBIH-IGnTsまたはpFBIF-IGnTs）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がBacmidへとりこまれるというものである。またBacmidにはlacZ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
【００３１】
即ち、上記精製ベクター（ｐFBIH-IGnTs又はｐFBIF-IGnTs）をコンピテントセル（大腸菌DH10BAC）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Bluo-gal、及びIPTGを含むLBプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Bacmidを回収した。
【００３２】
３．  Bacmidの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたBacmidに目的配列が挿入していることを確認した後、このBacmidを昆虫細胞Sf21（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち35mmのシャーレにSf21 細胞9x105 細胞/2ml  （抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）を加え、27℃で１時間培養して細胞を接着した。（Solution A）精製した Bacmid DNA 5 μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。（Solution B）CellFECTIN Reagent(インビトロジェン社） 6μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ加えた。その後、Solution AおよびSolution Bを丁寧に混合して15〜45分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）2mlを加えた。Solution AとSolution Bを混合して作製した溶液(lipid-DNA complexes)に抗生物質を含まないSf900II 800μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したlipid-DNA complexes溶液を細胞に加え、27℃で5時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むSf-900SFM(インビトロジェン社）培養液2mlを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
【００３３】
T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml  Sf-900SFM(インビトロジェン社)（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを800μｌを添加して、27℃で48〜72時間培養した。培養終了後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
【００３４】
さらに、T75培養フラスコにSf21細胞 1x107 細胞/20ml  Sf-900SFM(インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着したらニ次ウイルス液1000μｌを添加して、27℃で72〜96時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
【００３５】
加えて、100ml用スピナーフラスコにSf21細胞６ｘ１０５細胞/ml濃度で100mlを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
【００３６】
三次のセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：20mM HEPES pH7.5、2 % Triton X-100）細胞粗抽出液 をH2Oで20倍にし、常法によりSDS-PAGEによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするIGnT1,  IGｎT2,  IGｎT3（3種類同時に示す場合IGnTs）のタンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたIGnTsにはモノクローナル抗体６−His（MMS-156P、COVANCE社）、FLAG配列のついたIGnTsには抗FLAG M2-ペルオキシダーゼ（A-8592、SIGMA社）を用いた。
【００３７】
FLAG-IGnTsは、４２Kまたは４１Kの位置にバンドが検出された。
【００３８】
四次感染のFLAG-IGnTs上清10mlにNaN3（0.05 %）、NaCl (150 mM)、CaCl2 (2 mM)、抗M1レジン（Sigma 社）(50 μｌ)を混合し、4℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（3000rpm 5分4℃）ペレットを回収し、2 mMのCaCl2・TBSを900μｌ加えて再度遠心分離（2000rpm 5分4℃）し、ペレットを50μｌ の1 mM CaCl2・TBS に浮遊させ活性測定のサンプル（IGnTs酵素液）とした。
【００３９】
５．  IGnT2およびIGnT3の受容体基質の探索
IGnT2およびIGnT3は、β1,６−N−アセチルグルコサミニル転移酵素である既知IGnT1と相同性が高く、IGnT1とそれぞれ73.4%、74.1%であった。そこで、第一に供与体基質（donor substrate）としてUDP-GlcNAcを用いて検討した。
【００４０】
以下の反応系を用いて、IGnTsの受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（LNnT：CALBIOCHEM）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（agalacto-LNnT）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃ（２L1:生化学工業）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（３L1：生化学工業）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（agalacto-3L1）を２−アミノベンズアミド（２AB）化したものを用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。２AB標識糖鎖は、HPLCを用いて蛍光検出器で検出した。
【００４１】
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（10 nmol）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）(50mM) 、EDTA(35 mM) 、UDP-GlcNAC (10mＭ) 、Triton-X100(0.5%)、牛血清アルブミン（2mg/ml）から成り、これにIGnTs酵素液を2.5 μｌ加えて、さらにH2Oを加えて全量10μｌとした。
【００４２】
上記反応混合液を37℃で一昼夜反応させ、反応終了後、９７℃５分間過熱して軽く遠心後上清を取得した。この反応溶液５０μlをHPLCにて分析した。HPLCの分析条件は、カラムはTSKgel ODS-80Ts QAカラム(4.6ｘ250 mm; Tosoh)、溶媒（移動相）は７％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、または受容体基質として３L1の場合のみ５％メタノールを含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、流速は1ml/min、励起波長：330nm、蛍光測定波長：420nmで行なった。
【００４３】
その結果、陽性対照として用いたIGnT1は、受容基質LNｎT（溶出時間１８．６分）を用いた場合、生成物は１７分にピークが認められた。すなわち、この１７分の生成物は、LNnTにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンが結合したGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。IGnT2およびIGnT3に関しても全く同様の結果が得られた。すなわち、IGnT2およびIGnT3は、ポリラクトサミン構造（Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcのような構造で基本的には「Galβ１−４GlcNAc」の繰り返し構造をポリラクトサミン構造とする）の還元末端ではないガラクトースにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンを転移する酵素であることを確認した。そこで、他の基質についても検討した。その結果を以下の表１にまとめた。agalacto-LNnTを基質とした場合の生成物はGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。2L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。agalacto-3L1を基質としたときは、生成物はGlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。３L1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃ、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃおよびGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃである。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
８．種々株化細胞での発現
各種株化細胞より総RNAを抽出し、常法によりcDNAを作製した。このｃDNAを用いてPCRにより発現を確認した。使用したプライマーは、IGnT3はBFF1(5'-caagggactctgctaacttcgtcc-3')、GP-60（5'-ggaatcctgttgagtgtcacccag-3'）である。使用した酵素はAdvantage cDNA polymerase(クロンテック社)を使用した。反応は、94℃30秒、68℃120秒、72℃30秒を30サイクルで行い、2％ アガロースゲル電気泳動で確認した。予想PCR増幅産物は、115塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。また、幾つかの増幅産物については、制限酵素処理を行ない、IGnT3遺伝子由来の増幅産物であることを確認している。結果は以下の表２に示した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
９．正常組織での発現
ヒト正常組織での発現について各組織のMarathon cDNA(クロンテック社)を用いて発現を確認した。使用したプライマーは、IGnT3は、No.2863(5'-atagttcagcatctgaaagga-3')、No.2846（5'-tgcatttggcatagagccagg-3'）である。使用した酵素はLA Taq(TakaRa)を使用した。反応は、94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒を30サイクルで行い、1％ アガロースゲル電気泳動で確認した。予想PCR増幅産物は、346塩基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。結果は以下の表３に示した。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅産物が認められなかった。この条件で発現している組織は、骨髄、結腸、心臓、であった。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
１０．正常組織での発現（IGｎT1,２および３の発現量の違い）
ヒト正常組織での発現について各組織のMarathon cDNA(クロンテック社)を用いて発現を確認した。使用したプライマーは、IGnT1は、IGnT-1F1:  5'-gatctggctgtaatatcggcac-3'、IGnT-1R1:  5'-aagacttctcatggatcattag-3'、  IGnT2は、IGnT-2F1:  5'-caacctagtggtaagtgaagag-3'、IGnT-2R1:  5'-tagcttcatcaagggtagttttc-3'、IGnT3は、IGnT-3F1:  5'-cagaccaaagtgagagagggac-3'、IGnT-3R1:  5'-ggacacttcgcaaaggtgatgg-3'である。使用した酵素はLA Taq(TakaRa)を使用した。反応は、94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒を3５サイクルで行い、1.5％ アガロースゲル電気泳動で確認した。予想PCR増幅産物は、約４５０塩基であり、このサイズの増幅産物が認められたバンドの濃さでを“＋＋＋”、“＋＋”、“＋”の三段階とし、増幅産物が認められない場合“−”で示した。結果は以下の表４に示した。予想される大きさの増幅産物が認められた。特に大きな差が認められた部分は、IGnT1およびIGnT2に比較してIGnT3は、骨髄および心臓で強く発現していた。このことから、I血液型抗原の合成には、IGnT3の関与が示唆される。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
【配列表】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６３】
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【００６５】
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【００７９】
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