(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された超らせん型プラスミドＤＮＡからなるＤＮＡ調製物を安定化する方法であって、ＥＤＴＡ、エタノールおよび緩衝剤を含む製剤に該ＤＮＡ調製物を導入し安定化されたＤＮＡ製剤を得ることを含む前記方法。
【請求項２】
ＤＮＡ調製物から金属イオンが除かれている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
製剤緩衝剤がＴｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸リチウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
製剤が塩を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
安定化したＤＮＡ製剤を光が存在しない条件下で保存することを更に含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
精製されたＤＮＡが、インフルエンザウイルスＤＮＡ、Ａ型肝炎ウイルスＤＮＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスＤＮＡ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＤＮＡ、ヒト免疫不全ウイルスＤＮＡ、水痘ウイルスＤＮＡ、ヘルペスウイルスＤＮＡ、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ，ロタウイルスＤＮＡ、流行性耳下腺炎ウイルスＤＮＡ、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項１〜６のいすれかに記載の方法。
【請求項８】
ａ）精製された超らせん型プラスミドＤＮＡ、
ｂ）３％ｖ／ｖまでの濃度で存在する、エタノールである非還元性フリーラジカル捕獲剤、
ｃ）５ｍＭまでの濃度で存在する、ＥＤＴＡである金属イオンキレート剤、
ｄ）塩および
ｅ）製剤緩衝剤、
を含む安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項９】
超らせん型プラスミドＤＮＡから金属イオンが取り除かれている請求項８に記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１０】
製剤緩衝剤がＴｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸リチウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項８又は９に記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１１】
塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌおよびこれらの組合わせから選択される請求項８〜１０のいずれかに記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１２】
（ａ）精製された超らせん型プラスミドＤＮＡ、
（ｂ）ｐＨが８．０から９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、
（ｃ）３％ｖ／ｖまでのエタノール、
（ｄ）濃度範囲が５ｍＭまでのＥＤＴＡ、および
（ｅ）５０ｍＭから５００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、
を含む安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１３】
超らせん型プラスミドＤＮＡから金属イオンが取り除かれている請求項１２に記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１４】
ＮａＣｌの濃度が１００ｍＭから２００ｍＭである請求項１２又は１３に記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１５】
緩衝剤のｐＨが８．５から９．０である請求項１２〜１４のいずれかに記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１６】
ＥＤＴＡが５００μＭまでの濃度で存在する請求項１２〜１５のいずれかに記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１７】
エタノールが２％までの濃度で存在する請求項１２〜１６のいずれかに記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【請求項１８】
精製されたＤＮＡがインフルエンザウイルスＤＮＡ、Ａ型肝炎ウイルスＤＮＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスＤＮＡ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＤＮＡ、ヒト免疫不全ウイルスＤＮＡ、水痘ウイルスＤＮＡ、ヘルペスウイルスＤＮＡ、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ，ロタウイルスＤＮＡ、流行性耳下腺炎ウイルスＤＮＡ、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項１２〜１７のいすれかに記載の安定化されたＤＮＡ製剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関し、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関する。開示の製剤は、ＤＮＡ医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を誘導する。
開示の背景
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、ＤＮＡ医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
ＤＮＡプラスミドワクチンは、医薬品としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型（open-circlular）および直鎖型（linear）に変換される。様々な保存条件（低ｐＨ、高温、低イオン強度）により、このプロセスは促進される可能性がある。本発明では、ＤＮＡプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを（コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって）除去および／またはキレート化することで、ＤＮＡプラスミドを安定化し、保存の期間にプラスミドＤＮＡを分解プロセスから守る。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからＤＮＡプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、ＤＮＡワクチンの安定性を最大化する製剤においては、緩衝液の種類、ｐＨ、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てを制御しなければならない。保存の間、プラスミドを安定化させるために、適切な製剤賦形剤を用いてＤＮＡワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型ＤＮＡプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の２つの異なる化学機構によって生じると考えられる（何故なら、これらの高度に精製されたＤＮＡ標本はヌクレアーゼを含まないため）：（１）脱プリンに続くβ脱離、および／または、（２）フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、ＤＮＡ鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、ＤＮＡ含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してＤＮＡが安定化されることを示す（Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照）。これらの報告および他の発表されている報告に基づけば、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、ＤＮＡ安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上したことになり、これはすでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドＤＮＡの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用される、ＥＤＴＡ、デスフェラール、エチレンジアミンジ（ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ））やジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤（例えば、ポリリン酸）であればどれでも、ＤＮＡの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がＤＮＡを安定化できるのに、なぜＥＤＤＨＡ、デスフェラール、及びＤＴＰＡではＤＮＡを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら４つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが（微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより）ＤＮＡの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、ＥＤＴＡとＡＴＰのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸（ＡＴＰの金属結合部分）がＤＮＡの安定性を向上させ、しかし、ＥＤＴＡではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。ＤＮＡ製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような経験主義的な試験が必要となろう。
保存中のＤＮＡ製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および／またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがＤＮＡの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、ＤＮＡの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元（最も損傷能力を持った）状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、ＤＮＡを安定化すると期待される（ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく）幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってＤＮＡの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとｐ−アミノ安息香酸（パラアミノ安息香酸）はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数（ｋ=１．１×１０10M-1ｓ-1;Freitas and Filipe, 1995, Biol. Ttace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照）を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはＤＮＡ安定性を促進できず、ｐ−アミノ安息香酸は事実上、ＤＮＡの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、フリーラジカルスカベンジャーを経験主義的に個別スクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてＤＮＡ安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、ｐＨ、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、ＤＮＡの凍結乾燥もＤＮＡの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところでは、最も安定したＤＮＡワクチンを提供する製剤とは、ｐＨが７から８の緩衝液（リン酸または重炭酸塩）、１００〜２００ｍＭの塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ）、金属イオンキレート化剤（コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸）、非還元フリーラジカルスカベンジャー（エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド）、及び最も高い適切な濃度のＤＮＡを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたＤＮＡを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
本発明製剤と方法について、インフルエンザウイルスに対するＤＮＡワクチンを例にとって述べる。この開示中のいかなる部分も、特異的ＤＮＡワクチンに関する製剤および方法を限定するものと解釈してはならない。
インフルエンザは急性の発熱性疾患であり、呼吸器を介してインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスに感染することによって引き起こされる。インフルエンザは世界的に勃発し、ほとんど毎年周期的に、また全国的に流行する。インフルエンザは顕著な全身的症状や、入院を必要とする深刻な状態（ウイルス性肺炎など）、また二次的細菌性肺炎などの合併症を引き起こすことがある。最近の米国に於ける流行病は毎年10,000人を越える（最大40,000人）死者を余計にもたらしていると考えられ、これに対して流行のない年の死者は5,000−10,000人である。インフルエンザの罹患率と死亡率を予防する最善の方法はワクチン接種である。現在の認可されたワクチンは卵内で増殖させたウイルスから得られ、これが不活化されたもので、３株のウイルス（２株のＡ型と１株のＢ型）について作られている。以下の３種類に対するワクチンが入手可能である：全ウイルス、サブビリオン、精製された表面抗原。この場合、全ウイルスを用いるワクチンでは発熱反応が増加するので、子供には後者２種だけが使用される。９歳以下の子供は２回の免疫が必要で、一方、大人は１回だけの免疫注射で十分である。しかし、年配の患者では、予防接種後の抗体力価が４カ月または４カ月未満で防衛可能なレベルよりも下がることが観察されていることから、「初秋に予防接種した患者は、冬や初春に行う２度目の接種用量から効果を得る」ことが示唆されている（Medical letter 32:89-90, Sept.17, 1993参照）。これらのワクチンは、最近のどのウイルス株が臨床的に循環しているのかを予測し、どの新しい毒性のある株が来たるべき風邪の季節に優勢となるのかを評価して、毎年再調製される。再接種は毎年、行うことが望ましい。
認可されたワクチンの限界は以下の通りである：
１）特にＡ型のインフルエンザは抗原が多様であるため、このウイルスは前回の接種（または前回の感染）で産生された抗体では中和されない。新しい株は、点変異（抗原のドリフト）、および表面糖タンパク質（赤血球凝集素［ＨＡ］とノイラミニダーゼ）をコードした遺伝子の再配列（抗原のシフト）によって生じるが、一方で、内部のタンパク質はドリフトした株とシフトした株の間で高度に保存されている。免疫接種は「ホモロガスな」株−特異抗体を介した免疫を誘導するが、「ヘテロロガスの」グループに共通な、細胞を介した免疫に基づいた免疫は誘導しない。
２）もし優勢な循環しているインフルエンザウイルス株のシフトやドリフトが、ある年から翌年に掛けて顕著でなかったとしても、抗体力価は減少するので、免疫は毎年、行われなければならない。血球凝集阻止反応（ＨＩ）と中和抗体の効力は数カ月から一年間持続して、以後徐々に低下すると報告されているが、免疫実務諮問委員会（Advisory Committee on Immunization Practices）は、主だった変動やシフトがない場合でも毎年の免疫が必要である理由として、予防接種に引き続いて一年間、抗体力価が減少し続けることを挙げている。（ＨＩ抗体はインフルエンザウイルスの赤血球を凝集させる能力を抑制する。中和抗体のように、それらは主としてＨＡ抗原に結合する。血球凝集阻止反応検査は簡単で、中和検定よりも費用も掛からず、したがって、あるインフルエンザ株に対して作られた抗体が、異なる株にも反応する能力を測定する方法としてしばしば用いられる。上に述べたように、「Medial Letter」誌は、特定の高い危険率を負った人や老人は、防衛に係る抗体力価が短期間で失われるため、１シーズンに予防接種を２度受けなければならないと示唆している。
３）ワクチンは有効性の最適状態が得られない。次のシーズンに対応したワクチンの開発は、訪れるであろう循環している株をどう予測するか（ウイルスを見張るためのサンプリングをアジアで行って）に掛かっているが、これは不正確であり、その結果、ワクチン製造に用いた株と実際に世間で循環している株でタイプがほとんど合わない事態を招く。さらに、１９９２から１９９３年の風邪のシーズンに起こったように、新しいＨ３Ｎ２株（A／Beijing／92）が風邪のシーズンの後半になって臨床的に明らかになることもある。この時は、初期のＨ３Ｎ２株（A／Beijing／89）によって作られた抗体と、A／Beijing／92の交叉反応性が、抗原シフトのせいで悪かったため、１９９３−１９９４年のワクチン組成を変える必要を促した。しかし、現在の認可されたワクチンを製造し、定式化するために長い時間が必要だったため、当時のワクチンには防衛力がないことが明らかで、新たに循環し出したＨ３Ｎ２株の毒性が高まっていたにも関わらず、新しいワクチン株は、１９９２−１９９３年のシーズンに導入することが出来なかった。
理想的な普遍的インフルエンザワクチンは以下の特性を有する：
１）グループに共通の（ヘテロロガスな）防衛力の創出
２）抗体反応の幅の拡大。何故なら、ＣＴＬは病気からの回復に役割を演じていると考えられるので、ＣＴＬの反応だけに基づいたワクチンは病気の持続期間を短縮化する（病気が無症状とみなされる所まで）と期待されたが、病気そのものを完全に防ぐことは出来なかった。
３）抗体反応の持続時間の延長。インフルエンザ感染の罹患率と生存率にある高い危険率を抱えているグループの一つ（老人）は、同時に年間の免疫に対して防衛的抗体力価が急速に減少して効力を失ってしまうグループでもあるので、改良されたワクチンは、長く効力を維持し防衛力となる力価を持つ抗体を産生するものでなければならない。
ポリヌクレオチド構築物、例えばタンパク質をコードしたＤＮＡプラスミドを筋肉内に接種すると、筋肉細胞中にin situでタンパク質を生産することが示されている。ウイルスタンパク質をコードしたｃＤＮＡプラスミドを用いると、抗体反応とＣＴＬ反応の両方が起こり、これは引き続く抗原曝露に対し同種株または交叉株を防衛することにより、それぞれホモロガスな防衛とヘテロロガスな防衛を提供する。これらの種類の免疫応答のそれぞれが、現行の予防接種の戦略よりも潜在的な有利さを提供する。抗体を産生させるためにＰＮＶ（ポリヌクレオチドワクチン）を使用すれば、抗体反応の期間の延長をもたらすことができるばかりでなく、臨床的に循環しているウイルス株の正確な配列を有すると共に野性タンパク質（組換えタンパク質に対峙するものとして）に固有な翻訳後修飾とコンフォメーションを有する抗原を供給することができるかもしれない。この手段によるＣＴＬ反応の生起は、交叉株に対する防衛に利点があり、生きた潜在的病原性ベクターまたは弱毒ウイルスを用いなくともよいという利点を提供する。
したがって、本発明では、核酸を生きた組織に導入してタンパク質を発現させる既知の方法のいずれをも対象とする。本発明は、ウイルス特異的なＣＴＬを産生するためにウイルスタンパク質を抗原処理経路に導入する方法を提供する。このように、ウイルス病原体に対して望ましい予防免疫応答を誘導できる特異的治療剤が必要とされているが、インフルエンザウイルスに対しては、本発明がその要求に応えるものである。この治療的アプローチに於いて特に重要なことは、Ｔ細胞免疫反応を誘導する能力であり、この能力によって、抗原遺伝子が得られた株に対してヘテロロガスなウイルス株であっても、その感染を予防できるのである。したがって、本発明は、次の各ウイルスタンパク質をコードしたＤＮＡ構築物を提供する：ヒトインフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＭ）、マトリクス（Ｍ）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１とＰＢ２＝基本ポリメラーゼ１と２；ＰＡ＝酸性ポリメラーゼ）、またはそれ以外のインフルエンザ遺伝子で、特異的なＣＴＬを生成する産物をコードするインフルエンザ遺伝子の全て。
発明の概要
本発明は、核酸医薬品の新しい製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、ＤＮＡ医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入され、ヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
ＤＮＡプラスミドワクチンは、医薬としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型（open-circlular）および直鎖型（linear）に変換される。このプロセスは、様々な保存条件（低ｐＨ、高温、低イオン強度）によって促進される場合がある。本発明では、ＤＮＡプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを（コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって）除去、および／またはキレート化することで、ＤＮＡプラスミドを安定化し、保存中にプラスミドＤＮＡが分解されないようにする。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからＤＮＡプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、ＤＮＡワクチンの安定性を最適化する製剤においては、緩衝液の種類、ｐＨ、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てが制御されなければならない。保存中、プラスミドを安定に保つために、適切な製剤賦形剤を用いてＤＮＡワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型ＤＮＡプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の２つの異なる化学機構によって生じると考えられる（何故なら、これらの高度に精製されたＤＮＡ標本はヌクレアーゼを含まないため）：（１）脱プリンに続くβ脱離、および／または、（２）フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、ＤＮＡ鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、ＤＮＡ含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してＤＮＡが安定化されることを示す（Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照）。これらの報告および他の発表されている報告に基づくと、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、ＤＮＡ安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上した点について、すでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドＤＮＡの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用されるＥＤＴＡ、デスフェラール、エチレンジアミンジ（ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ））やジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤（例えば、ポリリン酸）であればどれでも、ＤＮＡの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がＤＮＡを安定化できるのに、なぜＥＤＤＨＡ、デスフェラール、及びＤＴＰＡではＤＮＡを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら４つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが（微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより）ＤＮＡの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、ＥＤＴＡとＡＴＰのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸（ＡＴＰの金属結合部分）がＤＮＡの安定性を向上させ、一方、ＥＤＴＡではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。ＤＮＡ製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような経験主義的な試験が必要となろう。
保存中のＤＮＡ製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および／またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがＤＮＡの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、ＤＮＡの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元（最も損傷能力を持った）状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、ＤＮＡを安定化すると期待される（ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく）幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってＤＮＡの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとｐ−アミノ安息香酸（パラアミノ安息香酸）はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数（ｋ=１．１×１０10M-1ｓ-1;Freitas and Filipe, 1995, Biol. Ttace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照）を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはＤＮＡ安定性を促進できず、ｐ−アミノ安息香酸は事実上、ＤＮＡの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、多くのフリーラジカルスカベンジャーを実験的にスクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてＤＮＡ安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、ｐＨ、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、ＤＮＡの凍結乾燥もＤＮＡの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところによれば、最も安定したＤＮＡワクチンを提供する製剤とは、ｐＨが７から８の緩衝液（リン酸または重炭酸塩）、１００〜２００ｍＭの塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ）、金属イオンキレート化剤（コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸）、非還元フリーラジカルスカベンジャー（エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド）、及び最も高い適切な濃度のＤＮＡを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたＤＮＡを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
その他の幾つかのＤＮＡワクチン製剤を例証したデータを本明細書に記載する。より具体的には、本発明は、ｐＨが少なくとも約8.0よりも大きく約9.5よりも小さい範囲にある生理学的に許容しうる緩衝液と；約300ｍＭまでの塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌを含むがこれらに限定されない）と；金属イオンキレート化剤ＥＤＴＡ（約５ｍＭまでの範囲において）とフリーラジカルスカベンジャーとしてのエタノール（約３％までの範囲において）との組み合わせと；さらに最も高い適切な濃度のＤＮＡと；を含有する脱金属化溶液を滅菌ガラスバイアル中に封入された形態で含有し、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製された上記ＤＮＡを光から保護すると共に生理学的に許容される緩衝液中に保存するための包装が施されたＤＮＡワクチン製剤に関する。
本発明は、その一具体的側面においては、前記ＤＮＡワクチン製剤は、ＥＤＴＡとエタノールの組み合わせを含むと共に、約100ｍＭから約200ｍＭのＮａＣｌ、約１μＭから約１ｍＭの範囲にあるＥＤＴＡ、及び約２％までのエタノールを含み、これら全ては最も高い適切なＤＮＡ濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製された上記ＤＮＡを光から保護し且つ生理学的に許容される緩衝液中に保存するための包装が施されたものとされる。
ＥＤＴＡとエタノールの組み合わせを含有する上記ＤＮＡワクチン製剤の他の実施態様においては、ＮａＣｌを約100ｍＭから約200ｍＭ、ＥＤＴＡを約１μＭから750μＭ含み、エタノールを約0.5％から約2.5％の濃度で含み、これら全ては最も高い適切なＤＮＡ濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製された上記ＤＮＡを光から保護する包装がなされ、生理学的に許容される緩衝液中、好ましくはｐＨが約8.0から約9.0のトリス−塩酸とｐＨが約9.0から約9.5のグリシンの緩衝液中に保存される。ｐＨ8.0から9.5などの様々なｐＨ範囲で緩衝能力を有する他の既知の緩衝液も本発明の各種ＤＮＡワクチン製剤に用いることが出来ることは理解されるであろう。
本発明の特に好ましい側面においては、ＥＤＴＡとエタノールの組み合わせを含有する上記ＤＮＡワクチン製剤は、ＮａＣｌ濃度が約100ｍＭから約200ｍＭであり、ＥＤＴＡが約500μＭ存在し、エタノールが約1.0％存在し、これら全ては最も高い適切なＤＮＡ濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製されたＤＮＡを光から保護する包装がなされ、生理学的に許容される緩衝液中、好ましくはｐＨが約8.5から約9.0のトリス−塩酸緩衝液中に保存される。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄは、保存中のインフルエンザＤＮＡワクチン、ＨＡ（Georgia／93）の超らせん含有量に及ぼす容器の種類の効果を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は生理食塩水中ＤＮＡが１００ｍｃｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。図Ａ−ガラス；図Ｂ−シリコーン処理ガラス；図Ｃ−加圧蒸気滅菌プラスチック；図Ｄ−γ−プラスチック。
図２は、ＤＮＡプラスミドの濃度が３７℃で保存中のインフルエンザＤＮＡワクチン、ＨＡ（Georgia／93）の超らせん含有量に対して及ぼす影響を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は２０−１８００ｍｃｇ／ｍＬの濃度で調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図３は、濃度範囲０−２００ｍＭのＮａＣｌ溶液を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に保存されたプラスミドＤＮＡのＵＶ−融解曲線を示す。検体は各々１００ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと、以下の濃度のＮａＣｌを含んでいた：（ａ）０ｍＭ、（ｂ）５ｍＭ、（ｃ）２０ｍＭ、（ｄ）５０ｍＭ、（ｅ）１００ｍＭ、（ｆ）２００ｍＭ。
図４は、ＮａＣｌ濃度を増加させた条件下でのプラスミドＤＮＡの安定性を示す。全ての検体は６０℃で４８時間インキュベート処理され、次にアガロースゲル電気泳動によって解析した。時間０において各検体は超らせんＤＮＡを９０％含有していた。
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃは、それぞれＴＥ（図Ａ）、ＰＢＳ（図Ｂ）、生理食塩水（図Ｃ）中における、２価陽イオンの存在下でのプラスミドＤＮＡの安定性を示す。全ての検体は１００ｍｃｇ／ｍＬの濃度で６０℃で４８時間加熱し、次いでアガロースゲル電気泳動によってその分解を解析した。時間０に於いて、各検体は超らせんＤＮＡを９０％含んでいた。
図６は、ｐＨ範囲４．５から１０に於けるＤＮＡのＵＶ−溶解曲線を示す。各検体は２０ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドを含有し、各々、以下のｐＨ緩衝液に溶解されている：（ａ）クエン酸緩衝液ｐＨ４．５、（ｂ）リン酸緩衝液ｐＨ６．０、（ｃ）リン酸緩衝液ｐＨ６．５、（ｄ）リン酸緩衝液ｐＨ７．０、（ｅ）リン酸緩衝液ｐＨ７．５、（ｆ）リン酸緩衝液ｐＨ８．０、（ｇ）ホウ酸緩衝液ｐＨ１０。
図７Ａは、ｐＨ範囲６．０から８．５までのＰＢＳおよびＴＥ（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液中での、プラスミドＤＮＡのコンフォメーション安定性を示す。各検体は１００ｍｃｇ／ｍＬに調製し、６０℃で４８時間インキューベート処理し、次いで電気泳動法によって分解を解析した。時間０に於いて各検体は超らせんＤＮＡを９０％含有していた。
図７Ｂは、３７℃で保存中のインフルエンザＤＮＡワクチンの超らせん含有量（ＤＮＡ安定性）に及ぼす、緩衝液の種類と溶液のｐＨの影響を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は２０ｍｃｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＤＮＡは生理食塩水のみ、またはトリス、ヘペス、リン酸、あるいは重炭酸塩ナトリウム緩衝液と生理食塩水を組み合わせた溶液中に溶解した。緩衝液のｐＨは時間０（室温）と３カ月（３７℃）で測定した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図８Ａ及び図８Ｂは、２５℃（図Ｂ）と３７℃（図Ａ）、それぞれの温度で保存したインフルエンザＤＮＡ（HA−Georgia／93）の超らせん含有量に対する、ＰＢＳと生理食塩水（０．９％w／v  ＮａＣｌ）のそれぞれの影響を比較して示す。ＤＮＡプラスミド溶液は２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図９は、インフルエンザＤＮＡワクチンHA（Georgia／93）をＰＢＳまたは生理食塩水を用いて製造し、ＰＢＳと生理食塩水によるこれら両製剤を比較して、単一注射によって誘導されたマウス免疫反応をＨＩ力価を指標として示す。ＤＮＡプラスミド溶液は様々な用量で調製し、各ワクチンは２００μｌづつ各マウスに注射した（一製剤、一用量につき１０匹のマウス）。
図１０は、２５℃で保存中のインフルエンザＤＮＡワクチンの超らせん含有量に対して光への曝露が及ぼす影響を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は生理食塩水中１００ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡの濃度となるように調製した。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図１１は、３７℃で保存中のインフルエンザＤＮＡワクチンの超らせん含有量に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は生理食塩水中１００ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡの濃度となるように調製した。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図１２は、３７℃で保存中のインフルエンザＤＮＡワクチンの超らせん含有量に対する凍結乾燥の効果を示す。ＤＮＡプラスミド溶液は、示された糖を含む、リン酸緩衝液またはリン酸で緩衝された生理食塩水（ｐＨ７）のいずれかを用いて２０ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡに調製した。製造されたＤＮＡ溶液の約０．７ｍＬをガラスバイアルに加え、凍結乾燥を行った。凍結乾燥されたＤＮＡ製剤は、液状コントロール（凍結乾燥なし）ＤＮＡと比べて、０日目ではプラスミドの超らせん含有量に変化を生じなかった。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。Ａ−ＰＢＳ（液状コントロール；凍結乾燥なし）；Ｂ−５％マンニトールを含むＰＢＳ、凍結乾燥；Ｃ−５％マンニトールを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥；Ｄ−５％ラクトースを含むＰＢＳ、凍結乾燥；Ｅ−５％スクロースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥；Ｆ−４％マンニトールと１％ラクトースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥；Ｇ−４％マンニトールと１％スクロースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥。製剤は３７℃で１カ月間保存した。
図１３は、５０℃で、２０ｍＭ  ビス−トリス−プロパン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で維持した２週間後のＤＮＡ安定性に対するｐＨの効果を示す（最初の超らせんプラスミドＤＮＡで残存しているものの割合（％））。コントロールはＰＢＳ中でｐＨ７．１に維持したＤＮＡである。
図１４は、５０℃、ＤＮＡ濃度２０ｍｃｇ／ｍＬの条件下での、ＤＮＡ安定性に対する緩衝液の種類とｐＨの効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図１５は、５０℃、ｐＨ７．２、ＤＮＡ濃度２ｍｃｇ／ｍＬの条件下での、ＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図１６は、５０℃、ｐＨ８．０、ＤＮＡ濃度２ｍｃｇ／ｍＬの条件下での、ＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図１７は、コハク酸塩とエタノールを含んだ製剤に於けるＤＮＡの安定性に対する脱金属化の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図１８は、重炭酸塩とホウ酸を含んだ製剤に於けるＤＮＡの安定性に対する脱金属化の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図１９は、３０℃で、ＰＢＳと重炭酸塩を用いた製剤に於けるＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２０は、５０℃、ＰＢＳ中で、ｐＨ７．２の条件下でのＤＮＡ安定性に対するＥＤＴＡとエタノールの効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２１は、５０℃、ＰＢＳ中で、ｐＨ８．０の条件下でのＤＮＡ安定性に対するＥＤＴＡとエタノールの効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２２は、ＥＤＴＡとエタノールを含む製剤で、５０℃の条件下でのＤＮＡ安定性に対する鉄の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２３は、ＰＢＳ中で、ｐＨ８．０の条件下でのＤＮＡ安定性に対する金属鉄キレート化剤の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２４は、エタノール存在下のＰＢＳ中で、ｐＨ８．０の条件でのＤＮＡ安定性に対する金属鉄キレート化剤の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２５は、１％エタノールを含むＰＢＳ中でのＤＮＡ安定性に対するＥＤＴＡ濃度の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２６は、凍結乾燥ＤＮＡ製剤（製剤Ｎｏ．１から６）と液状ＤＮＡ製剤（製剤Ｎｏ．７から９）における、５０℃、４カ月後のＤＮＡの安定性を示す。製剤Ｎｏ．１は５％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ4；製剤Ｎｏ．２は、５％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ4、脱金属化；製剤Ｎｏ．２は、５％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；製剤Ｎｏ．４は、５％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、脱金属化；製剤Ｎｏ．５は、４％  マンノース、１％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ4；製剤Ｎｏ．６は、４％  マンノース、１％  スクロース、５ｍＭ  ＮａＰＯ4、脱金属化；製剤Ｎｏ．７は、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％  エタノール、ｐＨ８．０；製剤Ｎｏ．８は、２０ｍＭ  トリス、１５０  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  コハク酸塩、２％  エタノール、ｐＨ８．２；製剤Ｎｏ．９は、２０ｍＭ  グリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  コハク酸塩、２％  エタノール、ｐＨ９．０である。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２７は、鉄とＥＤＴＡを含む製剤に於けるＤＮＡ安定性に対する光の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２８は、鉄とＥＤＴＡとエタノールを含む製剤に於けるＤＮＡ安定性に対する光の効果を示す。ＤＮＡの安定性は超らせん（ＳＣ）ＤＮＡ残存率の初期値に対する％で測定している。
図２９は、１％エタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４のＰＢＳ中での、脱プリンのアレニウスプロットを示す。
図３０は、１％エタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４のＰＢＳ中での、β脱離のアレニウスプロットを示す。
図３１は、刊行物記載のｋ1値とｋ2値、または測定したｋ1値とｋ2値を用いて予測した５０℃でのＤＮＡ安定性の予測値を示す。
図３２は、ｐＨ７．４に於いて測定されたｋ1値とｋ2値に基づいて計算した、３０℃に於けるＤＮＡ安定性の予測値を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、ＤＮＡ医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
ＤＮＡプラスミドワクチンは、医薬品としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型（open-circlular）および直鎖型（linear）に変換される。様々な保存条件（低ｐＨ、高温、低イオン強度）により、このプロセスは促進される可能性がある。本発明では、ＤＮＡプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを（コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって）除去および／またはキレート化することで、ＤＮＡプラスミドを安定化し、保存の期間にプラスミドＤＮＡを分解プロセスから守る。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからＤＮＡプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、ＤＮＡワクチンの安定性を最大化する製剤においては、緩衝液の種類、ｐＨ、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てを制御しなければならない。保存の間、プラスミドを安定化させるために、適切な製剤賦形剤を用いてＤＮＡワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型ＤＮＡプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の２つの異なる化学機構によって生じると考えられる（何故なら、これらの高度に精製されたＤＮＡ標本はヌクレアーゼを含まないため）：（１）脱プリンに続くβ脱離、および／または、（２）フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、ＤＮＡ鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、ＤＮＡ含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してＤＮＡが安定化されることを示す（Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照）。これらの報告および他の発表されている報告に基づけば、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、ＤＮＡ安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上したことになり、これはすでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドＤＮＡの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用される、ＥＤＴＡ、デスフェラール、エチレンジアミンジ（ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ））やジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤（例えば、ポリリン酸）であればどれでも、ＤＮＡの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がＤＮＡを安定化できるのに、なぜＥＤＤＨＡ、デスフェラール、及びＤＴＰＡではＤＮＡを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら４つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが（微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより）ＤＮＡの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、ＥＤＴＡとＡＴＰのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸（ＡＴＰの金属結合部分）がＤＮＡの安定性を向上させ、しかし、ＥＤＴＡではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。ＤＮＡ製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような実験的な試験が必要となろう。
保存中のＤＮＡ製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および／またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがＤＮＡの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、ＤＮＡの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元（最も損傷能力を持った）状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、ＤＮＡを安定化すると期待される（ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく）幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってＤＮＡの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとｐ−アミノ安息香酸（パラアミノ安息香酸）はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数（ｋ=１．１×１０10Ｍ-1ｓ-1；Freitas and Filipe, Biol. Trace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照）を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはＤＮＡ安定性を促進できず、ｐ−アミノ安息香酸は事実上、ＤＮＡの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、多くのフリーラジカルスカベンジャーを実験的にスクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてＤＮＡ安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、ｐＨ、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、ＤＮＡの凍結乾燥もＤＮＡの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところでは、最も安定したＤＮＡワクチンを提供する製剤とは、ｐＨが７から８の緩衝液（リン酸または重炭酸塩）、１００〜２００ｍＭの塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ）、金属イオンキレート化剤（コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸）、非還元フリーラジカルスカベンジャー（エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド）、及び最も高い適切な濃度のＤＮＡを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたＤＮＡを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
インフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は動物の体内で防御免疫反応を誘発する。動物体内の免疫反応には、マウスに見られる抗体とＣＴＬの産生、フェレットと霊長類に見られる抗体産生、マウスとフェレットに見られるインフルエンザのホモロガスな、ドリフトおよびシフトされたウイルス株によるウイルス曝露からの防御などがある。ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡによる免疫で最も注目すべき結果は、ウイルスの全く別個の亜型（サブタイプ）に対しても防御能力を持つことであろう。このことからＣＴＬ−誘発成分をワクチンに加えることで新しいバリアントがインフルエンザの流行中に発生したり、翌年のワクチン株を選択する時点では全く予期されていなかったような新しいバリアントが発生してもその衝撃を緩和できる。重要なことは、フェレットにおいてＨＡ、ＮＰ、ＭＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡベクターによる免疫の方が、認可ワクチンよりもより効果的にウイルスのドリフトした株に対して防御できたことである。このことからＩＤＶ（インフルエンザＤＮＡワクチン）中の内部遺伝子をコードする構築物の使用が正当化される。
一実施例においては、ドリフトおよびシフトした抗原に対する防御を各グループに共通して与えるためにワクチン製品を、例えばA/H1N1（A/Texas/91）、A/H3N2（A/Georgia/93）、B（B/Panama/90）のそれぞれのウイルスを代表する３種の広く流布している臨床株から採取したＨＡをコードする別個のＤＮＡプラスミド、及びA（Beijing/89; H3N2）とBの両株から採取された内部保存タンパク質ＮＰとＭ１（マトリックス）をコードするＤＮＡ構築物から構成している。ＨＡ  ＤＮＡはＨＡを産生しＨＡに対する中和抗体をもたらす働きをする。これはタイプ特異的であり、現在認可されているタンパク質をベースとしたワクチンに比べてドリフトした株に対する防御幅が広くなると考えられる。ＮＰとＭＩ構築物の方は、ＣＴＬ産生をもたらすが、これはより少量のウイルス負荷でより早い病状の回復が望める交叉株防御を提供するであろう。（筋肉細胞中で非複製的、非組込み的な形態のエピソーム状で）ＤＮＡ構築物は持続的存続が予想されるので、現在のワクチンと比べより長期に渡り防御が持続することが期待される。
現在認可されているワクチンより優れていると予想される利点として、ＣＴＬ反応による防御幅の拡大±抗体幅の拡大、および防御持続性の長期化などが挙げられる。ＩＤＶアプローチによって新しいＤＮＡ構築物は臨床上の分離株からより直接的に作ることが可能なため、現在認可されているワクチンに対して行っている再配列体の作製、選択、増殖の必要が無くなる。リンパ球反応。
インフルエンザAの保存された内部タンパク質をコードするＤＮＡ発現ベクターを筋肉内（i.m.）注射した結果、その後のウイルス攻撃に対する防御免疫が有意に発現した。特にNP-特異的抗体および一次性のCTLが産生された。NP  ＤＮＡ免疫化の結果、対照群に比べウイルス肺力価が減少し、体重減少が抑制され、生存率が上昇した。NP抗体のみでは有効にウイルス感染と戦うことが不可能であったこと（実施例４参照）から示されるように、防御免疫反応はNP-特異的抗体によって媒介されておらず、従ってNP-特異的細胞性免疫による可能性が高い。しかもNPに対抗する一次性CTLが有意なレベルで産生された。その防御はＤＮＡがクローン化された株とは異種のインフルエンザAの毒性株に対するものであった。またチャレンジ（攻撃ウイルス）株はA/PR/8/34株後３０年以上も経ってから発生した。このことは保存タンパク質に対する免疫反応は可変外膜（エンベロープ）タンパク質の抗原シフトやドリフトにもかかわらず有効であることを示している。インフルエンザウイルス遺伝子の各産物は何らかの程度の保存を示し、また細胞内発現およびMHCプロセシングに反応してCTLが産生される可能性があることから、他のインフルエンザウイルス遺伝子によって、NPに対する反応と類似した反応が生じると予測できる。免疫エピトープを見つける方法は今では当分野でよく知られている（例、Shiraiら、1992、J. Immunol 148:1657-1667; Choppinら、1991、J. Immunol 147: 575-583; Calin-Laurensら、1992、Vaccine 11: 974-978参照）。従って発現ベクターにおいてクローン化された塩基配列が明らかにされたジャンクションに示されるように（後記参照）これらの遺伝子の多くがこれまでにクローン化され、これらの構築物は入手可能な予防薬となっている。
ＤＮＡ構築物を調製し精製する標準的な分子生物学の技術により、本発明のＤＮＡ治療薬は調製可能である。従って本発明の製品製造には標準的な分子生物学の技術で十分であるが、ここに開示される特定の構築物は、驚くべきことに異種の株に対しても防御する新規な治療薬を提供するが、これは標準的な不活性化された全ウイルスまたはサブユニットタンパク質に対するワクチンではこれまで達成不可能であった。
ワクチン被接種者に導入されるべき発現可能なＤＮＡ量はそのＤＮＡ構築物に使用される転写・翻訳プロモータの能力および発現された遺伝子製品の免疫原性によって変わる。一般に免疫学的あるいは予防的に有効な量である約１μｇから１ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇが筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮内注射、経皮インプレッション、また腹腔内・静脈内投与、吸入など他の投与方法も考えられる。追加ワクチン接種を提供することも考えられる。
用いられるＤＮＡは裸である。すなわち被接種者の免疫システムに影響を与えるいかなるタンパク質、アジュバント、他の薬剤によっても修飾されない。この場合、ＤＮＡは生理学的に許容しうる溶液中、例えば滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水中に存在することが望ましいがこれらに限定されない。あるいはＤＮＡ−リポソーム混合物としてリポソーム、例えばレシチン・リポソームや当業者に既知の他のリポソームなどがＤＮＡに会合していてもよい（例、WO93/24640参照）。また免疫反応を高めるために本技術分野で知られているアジュバント、例えばタンパク質や他の担体などのアジュバントがＤＮＡに会合していてもよい。ＤＮＡの細胞内への取り込みを補助する物質には例えばカルシウムイオン、ウイルスタンパク質、他のトランスフェクション促進剤などがあり、これらを有利に使用してもよい。ただしＤＮＡの細胞内での取り込みを補助する物質はこれらに限定されない。これらの物質は一般にトランスフェクション促進剤または薬学的に許容しうる担体と呼ばれる。ここで遺伝子という語は離散ポリペプチドをコードする核酸の染色体部分を指す。また医薬という語とワクチンという語は同じ意味の語として互いに置き換え可能に使用されており、免疫反応を誘発するのに有用な成分を指す。構築物とプラスミドも同じ意味を持つ語として使用されている。ベクターという語は本発明の方法に従って使用するために、内部にクローン化された遺伝子を組み込んだＤＮＡを指す。
本発明の別の態様ではＤＮＡワクチンはヒトインフルエンザウイルス核タンパク質、赤血球凝集素、マトリックス、非構造またはポリメラーゼ遺伝子産製物をコードしている。この実施例の特定の例が後に説明されるが、そこではヒトインフルエンザウイルス遺伝子が、ヒトインフルエンザウイルス分離株A/PR/8/34の核タンパク質、基本ポリメラーゼ１、非構造タンパク質１、赤血球凝集素、マトリックス１、および基本ポリメラーゼ２；ヒトインフルエンザウイルス分離株A/Beijing/353/89の核タンパク質；ヒトインフルエンザウイルス分離株A/Texas/36/91の赤血球凝集素遺伝子；ヒトインフルエンザウイルス分離株B/Panama/46/90赤血球凝集素遺伝子；のいずれかをコードしている。
本明細書に提示されているデータにより、その他いくつかのＤＮＡワクチン製剤が例示される。特に本発明は、最低ｐＨが約8.0以上、最高ｐＨが約9.5以上の範囲にある生理学的に許容しうる緩衝液、約300mM以下の塩（例、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＬｉＣｌ；ただしこれらに限定されない）、フリーラジカルスカベンジャーエタノール（約３％以下）と組み合わせた金属イオンキレート化剤ＥＤＴＡ（約5mM以下）および最適の濃縮ＤＮＡを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌されたガラス製のバイアルに入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のＤＮＡが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液中に入れられたＤＮＡワクチン製剤に関する。
本発明の具体的一面においては、ＤＮＡワクチン製剤はＥＤＴＡとエタノールの組み合わせ、濃度が約100mMから約200mMのＮａＣｌ、約１μMから約1mMのＥＤＴＡ、約２％以下添加されたエタノール、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮ＤＮＡの中に入れられ、高純度に精製されヌクレアーゼを含まないＤＮＡが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液中にある。
ＥＤＴＡとエタノールの組み合わせを含む本発明のＤＮＡワクチン製剤の別の実施例では、ＮａＣｌが約100mMから約200m、ＥＤＴＡが約１μMから約750μM、エタノールが約0.5％から約2.5％存在し、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮ＤＮＡの中に入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のＤＮＡが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液-好ましくはｐＨが約8.0から9.0のＴｒｉｓ−ＨＣｌ-中にある。様々なｐＨ範囲内-例えばｐＨ8.0から9.5-の緩衝能を持つ他の既知の緩衝液もまた本発明の様々なＤＮＡワクチン製剤に使用できることが理解されるであろう。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌはおよそｐＨ9.0まで有効であるが、グリシン緩衝液はｐＨが約9.0以上約9.5以下で有効である。
本発明の特に好ましい側面においては、ＤＮＡワクチン製剤がＥＤＴＡとエタノールの組み合わせ、濃度が約100mMから約200mMのＮａＣｌ、約500μMのＥＤＴＡ、約1％添加されたエタノール、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮ＤＮＡの中に入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のＤＮＡが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液（好ましくはｐＨが約8.5から9.0のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）中に置かれる。
提示されたデータによれば、製剤のｐＨはＤＮＡの安定性に影響を与え、最適ｐＨは≧8.5である。図１４に示すようにテストされた製剤のうち最もｐＨの高い製剤（ｐＨ9.0）が最大のＤＮＡ安定性を示した。緩衝液のタイプがＤＮＡの安定性に与える影響も調べ、そのデータが本明細書に開示されている。簡潔に言うと、ＤＮＡの安定性に対する最大の緩衝液効果が見られたのはグリシンとビストリスプロパンを比較した時であった。ｐＨ９ではグリシン緩衝液の方が同ｐＨでビストリスプロパン製剤より有意に優れていた。逆にトリス、ビシン、トリシンの各緩衝液はｐＨ8.2で12週間にわたりほぼ同レベルのＤＮＡ安定性を示した。緩衝とＤＮＡ安定性の相関性を調べたデータから、ＤＮＡのフリーラジカル酸化を抑制することによりＤＮＡの安定性が全体的に向上し、その後製剤のｐＨによって抑制されることが示される。
光がＤＮＡの安定性に与える影響について本明細書で開示されている。光の有害な影響はその大部分が製剤にＥＤＴＡとエタノールを添加することにより排除できる可能性が示されている。これらの製剤成分を添加することにより、光曝露または遮光して保存したサンプル中のＤＮＡはいずれの場合も安定する。従ってＥＤＴＡとエタノールを含有するＤＮＡワクチン製剤は、これら２種類の安定剤のいずれも含有しない製剤に比べ光や微量金属イオンの有害な影響をはるかに受けにくいと思われる。
本明細書では他の様々なデータも開示されているが、ＤＮＡワクチン製剤を生成する前の脱金属化緩衝液の影響についても調べた。脱金属化によってグリセリン含有製剤のＤＮＡ安定性はわずかに向上するが、エタノール製剤ではＤＮＡの安定性に影響は無いことが本明細書に開示されている。このデータからフリーラジカル酸化をコハク酸エステルとエタノールで抑制するか、あるいは脱金属化で微量金属イオンを除去するかのいずれによっても同程度のＤＮＡの安定性が得られることがわかる。
データからはまた脱金属化によって幅広い温度領域や保存期間においてＤＮＡの安定性が向上することがわかる。
またエタノールがＥＤＴＡの存在下で有効なフリーラジカルスカベンジャーであることを示すＤＮＡ安定性実験も行われた。
エタノールとＥＤＴＡの組み合わせにより（ｐＨ7.2で）ＤＮＡの安定性は４週間まで大きく向上する。しかしその後第８週までは安定性はわずかしか向上しない。これらの結果からエタノールはＥＤＴＡの非存在下よりもその存在下でフリーラジカルスカベンジャーとして有効であることがわかる。またこれらの結果からエタノールの非存在下でＥＤＴＡ単独の場合はＤＮＡの安定性が悪くなるのに対し、エタノールの存在下ではＤＮＡの安定性が向上することも示されている。これらの結果から強く示唆されるのはエタノールはＥＤＴＡの存在下でより有効なスカベンジャーであり、それはＥＤＴＡがＤＮＡと結合している金属イオンを除去し、その結果、ＤＮＡに結合する鉄によってラジカルが産生されるのとは反対に、バルク溶液中にヒドロキシルラジカルを産生させるためである。本発明を例証するために提示されたデータからはまたエタノールとＥＤＴＡ／ＥｔＯＨのＤＮＡ安定効果はｐＨ7.2よりもｐＨ8.0でより大きいことがわかる。またコハク酸エステルとエタノールの組み合わせでも同程度の防御効果が得られることも示されている。
さらに別の例示として本発明は、代替金属イオンキレート化剤、例えばＮＴＡ（アンモニア三酢酸）やＤＴＰＡ（ジエチレントリアミペンタアセテート酸）（但しこれらに限定されない）を開示する。提示されたデータによるとＮＴＡとＤＴＰＡのいずれもがエタノールの非存在下でもＤＮＡの安定性を向上させるが、ＤＴＰＡの方が好ましい。
本発明は液体または凍結乾燥のＤＮＡワクチン製剤に関する。提示されたデータによると最も優れた凍結乾燥製剤は液体製剤よりも短期間ではより安定していたが、長期間では液体製剤はよく安定していた。またこれらの結果から脱金属化によって製剤１と２の凍結乾燥ＤＮＡの安定性は向上するが、別の凍結乾燥製剤中の％ＳＣ  ＤＮＡには脱金属化の影響はほとんどないことがわかる。従って凍結乾燥はＤＮＡワクチン安定化に有効な方法であり、製剤緩衝液の脱金属化は一部の製剤中では凍結乾燥ＤＮＡの安定性を向上させる。
本発明をさらに定義するため、以下に実施例を示す。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ｖ１Ｊ発現ベクター：  Ｖ１ＪプラスミドはＶ１プラスミド及び市販のｐＵＣ１８プラスミドから得られる。このＶ１をＳｓｐＩとＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、２つのＤＮＡ断片を得た後、小さいほうの断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。なお、このＤＮＡ断片はヘテロロガス遺伝子発現を制御するＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終止エレメントを含んでいる。次に、“両端がブラントエンドされた”他のＤＮＡ断片との連結を促進するため、このＤＮＡ断片の両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、ブラントエンドとした。
発現ベクターの“バックボーン”として、ｐＵＣ１８プラスミドを選んだ。理由はこのプラスミドが大量のプラスミドを産生することで良く知られており、そのＤＮＡ塩基配列及び機能も良く調べられており、かつ、プラスミドのサイズが最小であるためである。このベクターに存在しているｌａｃオペロン部分は本発明の目的には不要であり、さらに、プラスミド収率やヘテロロガスな遺伝子発現に有害であるかもしれないため、Ｈａｅ  ＩＩ制限酵素による部分消化によって、ｌａｃオペロン部分すべてをこのベクターから取り除いた。残っているプラスミド断片はアガロースゲル電気泳動で精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素でブラントエンドとし、子ウシ腸アルカリフォスファターゼ酵素処理を行い、上述のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨエレメントを含むＤＮＡ断片と連結した。ｐＵＣバックボーン内でこのプロモーターがそれぞれ別々の方向を持つものを得たが、これらのプラスミドのうち一つのタイプが大腸菌でより高いプラスミドＤＮＡ収率を示し、このプラスミドをＶ１Ｊと名付けた。プロモーター断片とｐＵＣバックボーンの結合部位のＤＮＡ塩基配列決定により、Ｖ１Ｊベクターの構造は予想通りであることが分かった。そして、ヘテロロガスな遺伝子発現レベルに関する実験では、Ｖ１ベクターに較べ、このベクターは同等もしくはより高い発現を示すことが証明された。
実施例２
Ｖ１Ｊ発現ベクター内のインフルエンザウイルス遺伝子構築物：  インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株の色々な遺伝子をＶ１Ｊ発現ベクターでクローニングした。Ｖ１ベクターの場合と較べ、Ｖ１Ｊは同等もしくはより高い発現を与える。なお、ＰＲ８株に存在している遺伝子のＤＮＡ塩基配列は決定されており、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースより入手可能である。以下に記載するクローニングした遺伝子それぞれのＤＮＡ断片の大きさはサイジング・ゲルを用いて確認した。また、これらの部分ＤＮＡ塩基配列と比較した遺伝子のＧＥＮＢＡＮＫ受託番号を示す。ウイルス株、例えばＡＴＣＣから入手したウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４はＡＴＣＣ  ＶＲ−９５である。また、他の多くの株もＡＴＣＣに寄託されている）、からこれらの遺伝子を得る方法は、次の通りである。
Ａ．様々なＰＲ８遺伝子のＶ１Ｊベクターへのサブクローニング
１．  ＮＰ：  ＮＰ遺伝子はｐＡＰＲ５０１からサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３））。この遺伝子をＥｃｏＲＩでｐＡＲ５０１から切り出し、その切り出した断片を精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにした。そして、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切り、その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドとしたＶ１Ｊにその断片の長さを挿入した。なお、このクローニングした断片は１．６キロベースであった。
２．  ＮＳ：  ＮＳ遺伝子はｐＡＰＲ８０１からサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３）。この遺伝子をＥｃｏＲＩでｐＡＲ８０１から切り出し、ゲル電気泳動法で精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにした。このブラントエンド化した断片を、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切りＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドとしたＶ１Ｊに挿入した。なお、このクローニングした断片は０．９キロベース長であった（完全長ＮＳコーディング領域はＮＳ１とＮＳ２を含んでいる）。
３．  ＨＡ：  ＨＡ遺伝子はｐＪＺ１０２よりサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３）。この遺伝子をＨｉｎｄ  ＩＩＩでｐＪＺ１０２から切り出し、ゲル電気泳動法で精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにしたのち、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切りＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドとしたＶ１Ｊに挿入した。クローニングした断片は１．７５キロベースであった。
４．  ＰＢＩ：  ＰＢＩ遺伝子はｐＧｅｍ１−ＰＢ１からサブクローニングした（クローニングした遺伝子がＧｅｍ１−ＰＢ１であるかどうかはサブクローニングしたＤＮＡの５’及び３’部分とベクターとの結合部域を塩基配列決定により確かめた）（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３）を参照）。このＤＮＡをｐＧｅｍ−ＰＢ１をＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化により切り出し、電気泳動法で精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにした。そして、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切りＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドとしたＶ１Ｊに挿入した。クローニングした断片は２．３キロベース長であった。
５．  ＰＢ２：  ＰＢ２遺伝子はｐＧｅｍ１−ＰＢ２からサブクローニングした（これら遺伝子の５’及び３’部分とベクターとの結合部域は塩基配列決定により確かめた。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３）を参照）。このＤＮＡをｐＧｅｍ−ＰＢ２のＢａｍＨ  Ｉ消化により切り出した。電気泳動法で精製された付着末端を有する断片を、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切ったＶＪ１に挿入した。クローニングした断片は２．３キロベース長であった。
６．  Ｍ１：  Ｍ１遺伝子はＰＣＲによりプラスミドｐ８９０１ＭＩＴＥより得た。そして、このプラスミドのＭ塩基配列部分はｐＡＰＲ７０１をＰＣＲに付すことにより得た（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ著Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐ１２９−１３８（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８３）。ＰＣＲにより得たＭ１断片を電気泳動法で精製し、Ｂｇｌ  ＩＩで切った後、Ｖ１ＪプラスミドをＢｇｌ  ＩＩで切断したＶ１Ｊ断片とライゲーションした。クローニングしたＭ１遺伝子断片は０．７キロベースであった。Ｍ１タンパク質のアミノ末端は、上に“ＡＴＧ”コドンとして示されている“センス”プライマーにコードされている。一方、Ｍ１の翻訳停止コドンはセンス方向では停止コドンである“ＴＧＡ”となる、対応する“ＴＣＡ”コドンによりコードされている。
Ｂ．Ｖ１Ｊでのインフルエンザ遺伝子発現構築物
５’プロモーター領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）とクローニングした各遺伝子との間の結合部位の塩基配列を示す。この結合部位の境界点は“／”で示されているが、これは塩基配列が不連続であるということを意味しているのではない。これら構築物を調製する方法については、以下に示すすべての塩基配列の後にその概要を述べる。それぞれ示されている塩基配列は対応インフルエンザ遺伝子の完全長で、かつ、入手可能であり、発現することの出来るＤＮＡ構築物である。
それぞれの構築物を培養ヒト横紋筋肉腫細胞株ＲＤ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１３６）にトランスフェクションして一過性に発現させた。トランスフェクション４８時間後、細胞を回収し、溶解した後、ウエスタンブロッテングを行った。（但し、Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ構築物の場合は、マウスでテストしたため、抗ＨＡ特異抗体をウエスタンブロッテングを行う前に使用した。これはインビボで既に発現されているためウエスタンブロットで解析する必要を省くためである。）ＰＢ１、ＰＢ２、そしてＮＳタンパク質に対する特異抗体はＳｔｅｐｈｅｎ  Ｉｎｇｌｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）により提供された。彼はβガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現された、精製タンパク質からポリクローナル抗血清を作製した。抗ＮＰポリクローナル抗血清はＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスをまるごとウサギに免疫することにより作製した。抗Ｍ１抗体は市販のものでＢｉｏｄｅｓｉｇｎよりヤギ由来抗ｆｌｕＡ抗血清、カタログナンバーＢ６５２４５Ｇとして入手できる。それぞれの構築物に関しては、予測された大きさのタンパク質が観察され、コードされているインフルエンザタンパク質がインビトロで発現されていることを確かめた。
これらの構築物の呼称は現行法に従い、“ベクター名−インフルエンザ株名−遺伝子名”とした。どの場合においても、それぞれの塩基配列は既に知られているＧＥＮＢＡＮＫにあるクローニングされ塩基配列決定されたＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子塩基配列を用いてチェックした。
Ｃ．Ｖ１ｊｎｓ産生
ＤＮＡの組込み研究を促進させるために、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉ  Ｉサイトを一つ加えた。これは市販されている１３塩基対からなるＳｆｉ  Ｉリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）をベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎ  Ｉサイトに加えることによりなされた。即ち、Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎ  Ｉで線状化し、ゲル電気泳動で精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにした後、ブラントエンドのＳｆｉ  Ｉリンカーと連結した。単離したプラスミドクローンを制限酵素によるマッピングによって選択した後、リンカー部全域を含む部分の塩基配列決定により確かめた。この新しいベクターをＶ１Ｊｎｓと命名した。なお、Ｓｆｉ  Ｉを有するＶ１Ｊｎｓを用いてのヘテロロガスな遺伝子発現レベルはＫｐｎ  Ｉのみを有するＶ１Ｊｎｅｏでの発現レベルと同程度であった。
実施例３
微生物細胞の増殖、細胞可溶化、及び清澄化（クラリフィケーション）：  １リットルの凍結大腸菌細胞スラリーを、ＳＴＥＴバッファー（８％スクロース、０．５％ＴＲＩＴＯＮ、５０ｍＭＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に加え、８リットルの細胞サスペンジョンを作製した。６００ｎｍでのこのサスペンジョンの吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。サスペンジョンの均一性を保つため、絶えず撹拌し続けた。その粘稠度は室温（２４℃）で１．９４ｃｐと測定された。この細胞サスペンジョンをポンプにより、８１ｍＬ／ｍｉｎの速度で熱交換器を通過させた。なお、細胞液の熱交換器滞在時間は大体３５秒に相当する。熱交換器の浴温度を９２℃に保った。細胞液の流入口、流出口での温度はそれぞれ約２４℃、約８９℃（平均）であった。約１リットルのサンプルを熱交換器に付したが、使用チューブに明らかな目詰まりは観察されなかった。ただ、溶解産物は原料に較べいくらか粘稠であった。室温まで冷やしたこの溶解産物の粘稠度は約４０ｃｐであった。細胞溶解産物はＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ−２１を用いて、９０００ＲＰＭ、５０分間のバッチ式遠心により清澄化した。この上清の解析から、この方法は細胞の可溶化及び産物の回収において効果的であることが分かった。このフロースルー熱可溶化によって得た産物の回収率はＱｕｉｇｌｅｙとＨｏｌｍｅｓによる沸騰法の場合の収率と少なくとも同程度であった。ただ、後者の方法はバッチ法で実験室レベルのスケールでしか行なえず、大規模（５リットルもしくはそれ以上）のサンプル処理には適当でない。一方、熱交換プロセスはフロースルーであるため、処理できる細胞サスペンジョンの量に上限が存在しない。従って、この処理方法は高純度のプラスミドＤＮＡを大量に得ることを目的とした非常に大規模に培養したバクテリアの場合に適用することが出来る。
次に、清澄化した溶解産物は、細かい砕片物を取り除くため、０．４５ミクロンの孔径のフィルターを通し、この濾過液をさらにカットオフ値分子量約１００、０００の膜を用いて透析した。
実施例４
熱交換器を用いた細胞可溶化のコントロール及び再現性：  細胞スラリーをポンプで熱交換器を通過させる時の流速（その滞在時間）を調整することにより細胞を可溶化させる温度、即ち流出口での温度、を精密に制御することが出来る。細胞スラリー液を実施例３に記載のように調製し、ポンプで熱交換器を１６０〜８５０ｍＬ／ｍｉｎの範囲内の流速で通過させた。これに対応した流出口温度はそれぞれ９３℃、６５℃であった。スラリーの温度は最初２４℃であり、浴の温度は９６℃の定温に保った。さらに、流出口温度目標値を８０℃として、実験を多数回繰り返した。これらの実験から、清澄化上清１リットルあたり２４ｍｇの閉環状ＤＮＡの収率という一貫した結果を得た。このことはこの一連の過程が再現性を有することを証明している。
実施例５
プラスミドＤＮＡの精製：  大腸菌及びその溶解産物を既に述べたように調製し、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ添加が、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ添加に較べ、超らせんプラスミドＤＮＡの比率を増加させることを示すため、そして超らせんＤＮＡの収率とにらみ合わせた許容範囲内の流出口温度（即ち、可溶化温度）範囲を決定するため、次のような実験をおこなった。プラスミドＤＮＡの超らせん形は弛緩環状（ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｌｅ）ＤＮＡよりもより安定であるため、超らせん形のプラスミドＤＮＡを得ることがより望ましい。超らせん形を開環状ＤＮＡに変換する一つの方法はＤＮａｓｅでニックを入れることである。本発明者らはＳＴＥＴ緩衝液のＥＤＴＡを５０ｍＭから１００ｍＭとすることにより、開環状プラスミド形成を最小限に抑えることが出来ることを見いだした。細胞サスペンジョンは既述のように調製した。これらの実験に使用した流速は約１８６ｍｌ／ｍｉｎであり、流入時、流出時及び浴の温度はそれぞれ２４℃、９２℃、９６℃であった。
可溶化温度の許容範囲は各実験で得た超らせんプラスミドの百分率を測定することにより決定した。超らせんプラスミドの濃度は流出時の温度の関数として表わすことが出来ることが分かった。可溶化温度の許容範囲は７５℃と９２℃の間の温度である。７５℃未満の温度では、弛緩環状プラスミド形成が増加した。これはおそらＤＮａｓｅ活性が増加するためである。９３℃よりも高い温度では、おそらく熱変性のために、超らせんプラスミドのレベルは減少するようである。
連続的な熱可溶化及び遠心の後、清澄化した溶解産物１ｍｌを５μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅで２時間インキュベートするもの、しないものに分け、これらのサンプルを陰イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  Ｑ／Ｍ４．６Ｘ１００）にかけた。なお、このカラムは前もって溶剤Ａ及びＢの５０：５０混合液で平衡化しておいたものである（ＨＰＬＣ溶剤Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｂｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ８．０；溶剤Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｂｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ８．０）。カラムは１００カラム容量以上の溶剤Ｂの５０％〜８０％の勾配で溶出した。開環状プラスミドは約６８％Ｂ溶剤で溶出し、超らせんプラスミドは７２％溶剤Ｂで溶出する。
既に述べたように、陰イオン交換クロマトグラフィーに先立ち透析することにより、カラムにかけることができる溶解産物の量を著しく増加させることが出来る。
陰イオン交換カラムから溶出したプラスミドＤＮＡを逆相ＨＰＬＣによりそれぞれのＤＮＡ形に分離した。このＤＮＡ形としては超らせんプラスミド（フォーム１）、そしてニックの入った環状プラスミド（フォーム２）がある。これらの２つのフォームは容易に分離することができるため、それぞれのフォームのプラスミドを単離することが出来た。
実施例６
クロマトグラフィーに基づくプロセスにより得た高純度プラスミドＤＮＡ：
大量培養したバクテリアペーストを改良ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、バッチ法で熱可溶化した。一方で、同じバクテリアペーストを改良ＳＴＥＴバッファーに再懸濁し、上述したフロースルー処理により可溶化した。溶解産物は上述のように遠心し、その上清２０ｍｌを上述したように濾過し、上述したバッファーＡとＢの５０：５０混合液で前もって平衡化した陰イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  Ｑ／Ｍ  ４．６ｘ１００）にのせ、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで５０倍のカラム容量の５０％〜８５％バッファーＢの勾配液で溶出した。カラムによる分画は１画分あたり２．５ｍｌで行った。超らせんプラスミドＤＮＡは７２％バッファーＢで溶出した。
次に、あらかじめｐＨ８．０の１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（Ｐｏｒｏｓ  Ｒ／Ｈ）に陰イオン交換によって得たサンプルをのせ、０〜８０％勾配のメタノールで結合物質を溶出した。高純度超らせんプラスミドは２２％メタノールで溶出した。
アガロースゲル電気泳動、比色定量、上述したＨＰＬＣ解析によると、図９に示すように、最終産物は非常に純度が高く、９０％を超える超らせんプラスミド、１０％未満の開環状プラスミドからなっていた。ＲＮＡは検出限界以下であった。ゲノムＤＮＡ及びタンパク質の混入もまた用いたアッセイの検出限界以下であった。最終段階における超らせんプラスミドの総収率は清澄化した溶解産物の超らせんプラスミド量の約６０％であった。
実施例７
数グラムスケールでのプラスミドＤＮＡの精製：  ４．５リットルの凍結大腸菌細胞スラリーに、２５００ユニット／ｍｌのリゾチームを含むＳＴＥＴバッファー（８％スクロース、２％Ｔｒｉｔｏｎ、５０ｍＭＴｒｉｓバッファー、５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に加えて３３．７リットルの細胞懸濁液を得た。この懸濁液の６００ｎｍでの吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。懸濁液を均一な懸濁液にするために、室温で１５分撹拌し、３７℃で連続的に撹拌しながら４５分間インキュベートした。その後、室温で連続的に撹拌しながら、ポンプにより、細胞懸濁液を５００ｍｌ／ｍｉｎの流速で、熱交換器を通した。浴の温度を１００℃に保ち、細胞懸濁液の流入口、流出口での温度はそれぞれ２４℃、７０〜７７℃であった。熱交換器を出た細胞の溶解産物をＢｅｃｋｍａｎ遠心管に集め（それぞれ５００ｍｌづつ）、速やかにＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ−２１遠心機で９０００ＲＰＭの速度で５０分間遠心した。遠心後、その上清はリゾチーム無しのインキュベーションに較べ、４−５倍量のプラスミドを含んでいることが分かった。遠心後の上清産物を３倍量のＴＥバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて、素早く透析し、２０ｘ１０5ユニットのＲＮａｓｅを加えて、室温で２〜４時間インキュベートした。インキュベーションを終えた後、さらに６倍量のＴＥバッファーを用い、産物を１００ｋＤ  ＭＷＣＯ膜で透析し、この後、残存砕片を取り除くため０．４５ミクロンのフィルターで濾過した。陰イオン交換カラムに付すために、このろ過した溶解産物を０．７Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ−ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で希釈した。この陰イオン交換カラム（３．６リットルのＰＯＲＯＳ  ＰＩ／Ｍ）は前もって２０ｍＭ  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ、０．７Ｍ  ＮａＣｌの液で平衡化したものである。ろ過した溶解産物はカラムの許容量までのせた。この場合、５グラムの超らせんプラスミドを陰イオン交換カラムに付した。サンプルを加えた後、カラムを２〜４倍量の２０ｍＭ  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅと０．７Ｍ  ＮａＣｌの液で洗った。１０倍量のカラム容量の０．７Ｍ  ＮａＣｌ〜２．０Ｍ  ＮａＣｌ勾配をもつ２０ｍＭ  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅバッファーで溶出した。これにより、ほとんどの大腸菌由来タンパク質、ＲＮＡそしてエンドトキシンを超らせんプラスミドから分離除去できた。超らせんプラスミドを含む分画は１．４Ｍと２．０Ｍ  ＮａＣｌの間で溶出した。この分画は４グラムの超らせんプラスミドを含んでいた。次に、この分画を非パイロジェン水で２〜３倍希釈し、ＩＰＡを１．２％、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで８．５に調整した。この希釈した陰イオン交換超らせんプラスミド分画を７リットルの逆相カラム（ＰＯＲＯＳ  Ｒ２／Ｍ）に付した。なお、このカラムはあらかじめ１．２％ＩＰＡを含む１００ｍＭ  炭酸水素アンモニウムで平衡化しておいた。この場合、３．２グラムの超らせんプラスミドを逆相カラムに付し、不純物を取り除くために、６〜１０倍量のカラム容量の１．２％ＩＰＡを含む１００ｍＭ  炭酸水素アンモニウムで洗った。次に、５倍量のカラム容量の１．２％ＩＰＡ���１１．２％ＩＰＡ勾配液で溶出した。超らせんプラスミド分画は約４％ＩＰＡの所で溶出した。この逆相カラムで得た超らせんプラスミド画分を濃縮し、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を用い、生理的食塩水に対してダイアフィルトレーションし、この最終産物を０．２２ミクロンフィルターで濾過した。この処理による産物の総収率は、陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを用いての解析で示したように、清澄化細胞溶解産物に存在していた超らせんプラスミド量に比して５０％を超える収率であった。
実施例８
霊長類へのポリヌクレオチドワクチン接種
アカゲザルのＮＰ抗体：  アカゲザル（００６ＮＰ、００９ＮＰ、コントロール１０１及び０２１）に、１日目、１ヵ所当たり１ｍｇのＲＳＶ−ＮＰを３ヵ所に筋内注射した。同じ時に、ホタルのルシフェラーゼ  レポーター遺伝子発現を見るための構築物ＲＳＶ−ＬＵＸ及びＣＭＶ−ｉｎｔ−ＬＵＸをそれぞれ１ｍｇ、別々の箇所に注射した。１５日目に、それぞれ同じ量のＤＮＡを再び注射した。同時に、また、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ・レポーター遺伝子発現を見るための構築物ｐＤ５−ＣＡＴを１ｍｇ各１ヵ所に注射した。レポーター遺伝子を注射した筋肉箇所を生検し、レポーター遺伝子活性を見るための解析を行った。血清は最初の注射後、３、５、９、１１、１３、そして１５週間目に採取した。抗ＮＰ抗体をもつ最初の陽性サンプルは１１週目に採取したものであり、１３週目、１５週目のものも陽性であった。抗ＮＰ抗体の存在はＥＬＩＳＡによって決定した。
アカゲザル中の血球凝集阻害（ＨＩ）抗体：  １日目に、ＶｌＪ−ＰＲ−ＨＡをサルに筋内注射した。２匹のサルそれぞれの大腿四頭筋に１ｍｇ、１００μｇもしくは１０μｇのＤＮＡをそれぞれ注射した。注射量は各０．５ｍｌであった。なお、１日目の注射以前にサルから血液を採取した。すべてのサルに１５日目にＤＮＡを再び注射し、この後、２〜４週間間隔で血液を採取した。Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに対する血球凝集阻害（ＨＩ）のタイターは、Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ  ＤＮＡを最初に注射した後、５週目、９週目で陽性であった。
実施例９
ＤＮＡ濃度及び保存容器タイプがＤＮＡ安定性に及ぼす影響：  ＤＮＡを試験管に保存している際に起きる主たる物理化学的変化は超らせんプラスミドＤＮＡから開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡへの変換である。実施例９〜１６では、色々な保存条件がプラスミドの安定性にどのような影響を及ぼすかを検討した。これはフォスフォジエステル骨格が化学的切断により超らせんプラスミドＤＮＡから開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡへとコンフォメーション変換することをモニターすることによって行った。この検討を行うために、プラスミドＤＮＡ（インフルエンザＤＮＡワクチンＨＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３））を製剤化し、必要な場合は滅菌フィルターで滅菌した後、滅菌したキャップ付ガラスバイアルに入れ（３ｍｌバイアルに０．８ｍｌ）、異なる温度でインキュベートした。インキュベーション時間終了後、特定のＤＮＡ製剤について一バイアルをインキュベータから取り出し、−７０℃に凍結した。この後、それぞれのバイアルのサンプルを融解し、２０ｎｇのＤＮＡを１％アガロースゲルに付し、９０分間、電気泳動した。ゲルはエチジウムブロマイドで染色し、脱染色の後、ＵＶ光線下で写真撮影した。超らせんＤＮＡ、開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡを定量化するためにゲルの写真のネガをＢｉｏ−ＲＡＤ（ＧＳ−６７０）デンシトメータでスキャンした。ゲル上の各レーンの吸光度データを同じゲル上の一連の超らせんＤＮＡ、開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡのスタンダードサンプルの吸光度と、コンピュータプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔバージョン１．３、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて比較した。これらの標準ＤＮＡの吸光度から超らせんＤＮＡ、開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡ、それぞれの標準曲線を得た。各フォームにつき、７つの標準ＤＮＡサンプルをゲルにのせた（超らせんＤＮＡの場合は１〜３０ｎｇ、開環状ＤＮＡ及びリニアＤＮＡの場合はそれぞれ０．１８７５〜１５ｎｇ）。ＤＮＡの時間経過による安定性を調べる場合は、ゼロ時間の超らせんＤＮＡ量を１００％とした（このゼロ時間における総ＤＮＡに対する超らせんＤＮＡの割合は通常９０〜1００％であった）。そして、このＤＮＡサンプルの安定性は、ある時間インキュベーションした後に残っている超らせんＤＮＡのゼロ時間に対する百分率として表わした。この一連のサンプルのそれぞれは一つのバイアルから採取したが、通常、色々な時間インキュベートして、時間経過とともに減少する超らせんＤＮＡ量の百分率を観察した。５０℃でインキュベートしたサンプルの場合、通常、１、２、４、６、及び８週目にサンプルを採取し、一方、４、２５、３７℃の場合、１、２、３ヵ月目、時として、６ヵ月目にサンプルを採取した。
種々の保存条件下でのインビトロ保存の間に、プラスミドＤＮＡが分解してゆく潜在的メカニズムを探るために、クロマトグラフィー法で精製したプラスミドＤＮＡを用いて製剤前段階実験をおこなった。種々の容器に曝露した場合のインフルエンザＤＮＡワクチン（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）の安定性を調べるために、プラスミドＤＮＡ（１００ｍｃｇ／ｍｌ生理的食塩水）を色々な容器に入れ、６ヵ月間、５、２４、及び３７℃でインキュベートした。結果（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、そして１Ｄ）は、処理しないガラスバイアルがシリコーン化処理したガラスバイアル、オートクレーブしたプラスチックバイアル、そしてガンマ線照射したプラスチックバイアルに較べ、ＤＮＡ安定化に関して圧倒的に優れていることを示した。ＤＮＡ濃度の安定性に対する影響を調べるために、２０、１００、１８００ｍｃｇ／ｍｌ生理的食塩水のプラスミドＤＮＡを３７℃で６ヵ月間インキュベートした。超らせんＤＮＡの量を解析した結果、その安定性は用量依存性を示した。即ち、３７℃で保存した場合、プラスミド濃度が濃くなればなるほど、ＤＮＡはより安定化した（図２）。ＤＮＡ濃度の安定性についてさらに調べたところ、ＤＮＡを生理的食塩水もしくはＰＢＳで製剤化した場合、いずれも、２〜８℃（表１Ａ）そして−７０℃（表１Ｂ）でＤＮＡ濃度が濃い方がより安定であることが明らかとなった。
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ＤＮＡ安定性実験はガラスバイアル容器のキャップ内部にゴムのストッパーを使用することはＤＮＡ安定性に有害であることを示した。表２は、３つのタイプのストッパーが２つの異なったＤＮＡワクチン製剤に対するＤＮＡ安定性に対して及ぼす影響を示す。この実験では２μｇ／ｍｌのＤＮＡ液が入っているバイアルを５０℃でインキュベートした。なお、この場合、ストッパーのＤＮＡ安定性に対する影響を見るため、バイアルを通常行うように直立させてインキュベートした場合とバイアルを倒立させてインキュベートした場合の影響を見ている。いずれのストッパーの場合も、バイアルを逆さにせず、正常の形でインキュベートした場合、ＤＮＡはより安定であった。さらに、エタノール添加はＤＮＡ安定性を促進させ、かつ、用いたストッパーによる分解効果を減少させた。ストッパー＃３の場合（表２）、エタノール添加はＤＮＡ安定性に対するストッパーによる分解効果を完全に除去した。これらの結果は保存の際、ストッパーがＤＮＡ分解に寄与していることを示唆している。また、ＤＮＡのストッパーによる分解効果を制御するためにエタノールを使用することが出来ることを示唆している。
ガラスバイアルに保存されているＤＮＡの安定性にストッパーがどのくらい影響を及ぼすかを決定するために、一つの実験を行った。３つの異なったタイプのストッパーを使用したガラスバイアル、そして密封したガラスアンプルを８週間にわたり５０℃でインキュベートした。表３はコハク酸塩（ＤＮＡ安定性向上剤）を含む製剤、そして含まない製剤を示す。この実験で、テストしたストッパーのいずれと比較しても、密封ガラスのＤＮＡが有意により安定であった。また、３つの異なったタイプのストッパーを使用したバイアル間では、ＤＮＡ安定性に関してはほんの小さな差しか見られなかった。これらのデータは４つの異なったＤＮＡ製剤（表２及び３）を用いた異なったタイプのストッパーがＤＮＡ分解に有意に寄与していることを示している。ガラスバイアルを用いての最適なＤＮＡ安定性を決定するためには、様々なタイプのストッパーをテストすることが必要であり、そして、また、ストッパーの分解作用を制御するために、エタノールのようなフリーラジカルを取り除くことの出来るものを添加することも要求されるであろう。
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実施例１０
ＤＮＡ安定性に対する塩濃度の効果  −  ＤＮＡ安定性に対する塩濃度の効果を調べる目的で、０〜200ｍＭのＮａＣｌ濃度範囲に於けるＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を測定する初期実験を行った。ＮａＣｌの各濃度に於けるＴｍ値を決定するため、10ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ6.0）中で製造したプラスミドＤＮＡ（10ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡ）について、加熱条件下で、260ｎｍでのＵＶ吸収を測定した。その結果（図３）、ＮａＣｌ濃度の０、５、20、50ｍＭに対するＴｍ値はそれぞれ、72℃、73℃、78℃、82℃を示した。100および200ｍＭのＮａＣｌに対するＴｍ値は、塩による強い安定化効果によって90℃を越える大きなＴｍ値となったため決定することはできなかった。これらの結果はＤＮＡの熱安定性を最大にするために必要な最小のＮａＣｌ濃度が、100ー200ｍＭの範囲にあることを示唆している。
保存中のＤＮＡが超らせん型から開環型へ変換する比率に対するＮａＣｌ濃度の効果を調べるために、１〜320ｍＭまでの様々な濃度のＮａＣｌを含んだ10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.2）中でプラスミドＤＮＡ（100ｍｃｇ／ｍＬ）を製造した。溶液は60℃で48時間インキュベート処理を行い、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。その結果（図４）、ＮａＣｌ濃度が１〜160ｍＭに増加する間、ＤＮＡ安定性も増加することが示され、ＮａＣｌが160〜320ｍＭの間では、ＤＮＡ安定性は顕著な違いを示さなかった。これらの結果は図３に於ける結果と一致しており、ＤＮＡの安定性を最大にするために必要な最小のＮａＣｌ濃度は100ー200ｍＭであることを示唆している。
ＤＮＡ安定性に対する２価陽イオンの効果を調べるために、それぞれ、ＴＥ、リン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）、または、ＺｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＭｎＣｌ2またはＭｇＣｌ2の存在下の生理食塩水（0.9％ＮａＣｌ）中で、プラスミドＤＮＡを製造した。ＤＮＡ溶液（100ｍｃｇ／ｍＬ）は60℃で48時間インキュベート処理を行い、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。その結果（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ）、亜鉛イオンはＤＮＡ安定性を増加させないことがわかった。しかし、カルシウムイオンの効果は条件によって変化した。カルシウムイオンは、ＴＥと生理食塩水中ではＤＮＡ安定性を増加させ、一方、ＰＢＳ中ではカルシウムイオンはＤＮＡ安定性を増加させなかった。マンガンイオンはＴＥ中で安定性を増加させたが、これは低い濃度範囲に於いてのみ観察された。マンガンイオンはＰＢＳと生理食塩水中ではＤＮＡ安定性を増加させなかった。マグネシウムイオンは３つの全ての製剤中でＤＮＡ安定性を増加させたが、生理食塩水中では高濃度のイオンが含有された場合のみ安定性を増加させた。
実施例１１
ＤＮＡ安定性に対する緩衝液の種類とｐＨの効果  −  歴史的に、プラスミドＤＮＡはＴＥ緩衝液（10ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0）中に保存され、日常的な分子生物学的手技は生理食塩水と蒸留水を用いて行われてきた。したがって、更なる製剤実験、プラスミドＤＮＡの保存という両方の目的で適切な緩衝液を明らかにして、調べる必要があると我々は考えた。初期的研究として、ＤＮＡを様々なｐＨ値を持つ異なる緩衝液中に組み入れて、異なる温度条件下で保存を行った。プラスミドＤＮＡを、500ｍｃｇ／ｍＬでｐＨ4.5、7.2、9.0のＰＢＳ中、ｐＨ8.0、10のＴＥ中、蒸留水（ｐＨ6.0）、生理食塩水（ｐＨ6.0）、およびｐＨ2.0のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸；0.1％）中で製造した。検体はそれぞれ４℃と24℃で保存し、その１、４、12週間後に、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。
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表4は様々なｐＨ条件下で保存されたプラスミドＤＮＡのコンフォメーションの安定性を示したものである。検体はアガロースゲル電気泳動法によって解析された；（＋）超らせん、（＋/−）超らせん/開環型、（−）主として開環型（ニックの入ったプラスミド）。これらのデータは、低いｐＨ（2.0-4.5）においてＤＮＡは急速に分解し、一方で高いｐＨ（7.2-9.0）ではほとんど分解は観察されないことを示している。たとえば、７〜10の高いｐＨを持つTEとPBSの両方に保存されたプラスミドＤＮＡは４℃で12週間まで安定であった。ＤＮＡのコンフォメーションの安定性に対するこのｐＨの効果をさらに検討するために、UV融解曲線をｐＨの範囲4.5-10について作製した（図６）。融解点遷移（Tm）は、塩基対の解離の結果として起こり、260nmにおける紫外光吸収を増加させるが、上記の技術は、融解点遷移（Tm）を測定することで様々なｐＨにおけるＤＮＡの相対安定性を決定できる。その結果、より低い温度条件下では、ｐＨが減少するにつれてＤＮＡの260nmにおける吸収は増加することが観察され、したがって低いTm値が得られた。これは、低いｐＨ条件下では二重鎖ＤＮＡは構造が不安定となり、分子内で解離している塩基対の部分は低いｐＨ条件下でいっそう分解されやすい部分となることを示している。もう一つ強調すべきことは、プラスミドＤＮＡがこれらの条件下で熱変性に対しては強い抵抗力があることである。90℃まで加熱した条件で二重鎖ＤＮＡは完全な変性を生じなかったので、精密なTm値は測定できなかった。
長期ＤＮＡ保存に最も適した保存条件を迅速に調べるためには、加速安定性研究法があり、この研究法は、検体を60℃で48時間保存して、次にアガロースゲル電気泳動法で解析を行うものである。以前の結果（表１）では、ｐＨ6.0以下での保存は、ＤＮＡの安定性に問題を生じやすく、特にコンホーメーションの分解を安定化させるためには、塩またはＥＤＴＡ（またはその両方）が必要であることを示している。したがって２種類の緩衝液、ＰＢＳとＴＥ（トリスーＥＤＴＡ）について、ｐＨ範囲が6.0−8.5でのプラスミド安定化能力の解析を行った。プラスミドＤＮＡ検体を、適切な緩衝液中で、100ｍｃｇ／ｍＬの濃度で製造した。実験開始時の検体は超らせんＤＮＡを90％含んでいた。その結果は図７Ａに示す通りである。60℃で48時間、インキュベート処理を行った後、ｐＨ7.5−8.5のＴＥに保存した検体は、10−25％の超らせんプラスミド残存率を示したが、一方、ＰＢＳ（ｐＨ7.5−8.5）で保存した検体では超らせんプラスミド残存率が50％であった。さらに、ＴＥではｐＨ6.5−7.0の範囲に於いて、ＤＮＡに対して顕著な安定化効果は見られなかったが、一方、ＰＢＳでは同じｐＨ範囲に於いて僅かな安定化効果が観察された。どちらの緩衝液もｐＨ6.0に於ける分解を阻止することはできなかった。
加速研究から得られた結果は、保存中のＤＮＡを安定化させるための最適化には、ｐＨと塩が重要なパラメータであることを示していた。これらの予備試験の結果は、ＰＢＳがＴＥよりも優れた安定化能力を持っていることを示唆している。しかし、ＰＢＳの安定化効果がリン酸イオンの存在によるものなのか、またはＮａＣｌの存在によるものなのかは明らかではない。さらに、金属イオンキレート化剤がＤＮＡを安定化させるのかどうかについては、より適切な調査を行う必要がある。これらの疑問に答えるために、60℃、48時間、100ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡの条件下で、ＥＤＴＡまたはリン酸をさらに添加したＰＢＳを用いて、あるいはＮａＣｌまたはリン酸を添加したＴＥを用いて、加速安定性研究を実施した。表３に示す結果は、ＥＤＴＡまたはリン酸をＰＢＳに添加しても、ＤＮＡの分解に対する安定性は向上しないことを示している。しかし、150ｍＭのＮａＣｌをＴＥに添加した場合、ＮａＣｌをＴＥに添加しなかった検体と比べて、ＤＮＡ安定性の増加が観察された。これらの結果は、ＴＥよりもＰＢＳが安定化効果に優れている理由はＰＢＳ中には150mMのＮａＣｌが含まれていることによるものであることを示唆している。
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表５は様々な緩衝液中で48時間、60℃で処理した場合のプラスミドＤＮＡのコンフォメーション安定性を示している。時間0において、検体は90％の超らせんＤＮＡを含有していた。TEと比べて、PBS中のNaClの存在がＤＮＡの安定性を改善する理由であるようなので、PBSに対して生理食塩水を比較するもう一つの研究を行った。これらの実験のために、プラスミドＤＮＡ（クロマトグラフィー上で純粋であることが確認されたもの）を直接、0.9％NaCl中で高い濃度（2.0-2.5ｍｇ/ｍＬ）で製造した。このＤＮＡを用いたプローブ安定性研究は、PBS緩衝液中またはｐＨ6、7、8に調製された0.9％NaCl中のいずれかで調製した低い濃度のプラスミド（2mcg/mL）を用いて実施した。プラスミドの超らせん含有量を、25℃と37℃で、3ヶ月間にわたり、アガロースゲル電気泳動法によって調査した。図8A（37℃）と図８B（37℃）に示すように、生理食塩水で調製された検体の初期状態におけるｐＨが減少するにつれ超らせんプラスミドＤＮＡの消失速度は増加した。
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生理食塩水で製造された検体は、時間経過につれｐＨを維持しなかった。例えば、生理食塩水で製造したプラスミド（初期条件はｐＨ６、７、８）は、37℃、２カ月後のｐＨ値がそれぞれ、5.9、6.0、6.3に低下した。これとは対照的に、ＰＢＳで製造した検体は、同じインキュベート処理期間の間、ｐＨ値（7.1−7.2）を維持した。ＰＢＳで製造した検体は、同時に、超らせんプラスミドの含有量の比率が高く、25℃、３カ月後に於いても、ほぼ同じ高いレベルの超らせんプラスミドを含んでいた。
プラスミドの超らせん含有量が減少するにつれて、それに一致して開環型プラスミドが増加することがアガロースゲル電気泳動法によって観察された。長期の間に、開環型プラスミドは直鎖型プラスミドＤＮＡに変換される。例えば、ｐＨ６とｐＨ７の生理食塩水で製造した検体（初期状態で超らせんプラスミドＤＮＡを92〜93％含有する）は、37℃、３カ月後には、初期状態の超らせん含有率が０％となり、開環型プラスミドＤＮＡの含有率が〜36％、直鎖型プラスミドＤＮＡでは〜64％となる。
非加速保存条件下の検体に対応して、加速条件下で生理食塩水とＰＢＳで調製した検体を比較した場合に、何か特別な傾向が観察されるかどうかを測定する目的で安定性研究を行った。
プラスミドＤＮＡを、低、中間、高の３種類の用量で、生理食塩水（２、20、および2200ｍｃｇ／ｍＬ・プラスミド）とＰＢＳ（２、20、1000ｍｃｇ／ｍＬ・プラスミド）中で、それぞれ製造した。そして、２−８℃と−70℃での保存期間の間、両方の溶液のｐＨ、および超らせん含有量を測定した。表１に示すように、ＰＢＳで調製した検体は、３カ月後まで、ｐＨと超らせんプラスミドＤＮＡの含有量のいずれに於いても、非加速条件下の研究結果と、よく一致していた。
ＤＮＡ安定性に対する異なる緩衝液イオンとｐＨの効果を調べるために、数種類の異なる緩衝液／ｐＨの組み合わせで、数種類のプラスミドのロットを製造し、37℃で３カ月間、インキュベート処理を行った。インキュベート処理に引き続き、初期状態に於ける超らせんＤＮＡ含有量の比率を、アガロースゲル電気泳動法によって測定した。表６に示す結果は、安定性はロットごとに大きく変動すること、酸性ｐＨは安定性に悪影響を与えること、高濃度のＤＮＡで製造したものはより安定していることを示している。ロットごとに安定性が変動するのは、微量金属イオンの含有量が各々のロットで異なるためと考えられる。表６の結果は、特定の緩衝液／ｐＨの組み合わせが、さらに研究を進めるために必要であることを示唆している。この研究に於いて同定された最も有望な組み合わせは、重炭酸塩ナトリウム（ｐＨ7.2）、ＰＢＳ（ｐＨ7.2−8.0）とコハク酸ナトリウム（ｐＨ7.2）である。
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生理食塩水に緩衝液を添加することが、ＤＮＡの安定性を向上させるかどうかを明らかにするために、生理食塩水のみに対して、生理食塩水に４つの緩衝液を組み合わせて添加した場合の効果を比較する研究を行った。この研究のために、ＤＮＡは20ｍｃｇ／ｍＬに製造され、37℃で３カ月間、インキュベート処理を行った。初期状態の超らせんＤＮＡの比率をアガロースゲル電気泳動法によって測定した。図７Ｂに示した結果は、重炭酸塩ナトリウム、リン酸、ヘペス、またはトリス緩衝液の内、どれを添加しても、生理食塩水のみに比べて、ＤＮＡの安定性を向上させることを顕著に示している。またデータは、緩衝液イオンの安定化効果には、互いに主たる違いがあることを示唆している。さらにこの結果は、ＤＮＡの安定性がｐＨの維持に関連していることを示唆している。図７Ｂに見られるように、トリス／生理食塩水の組み合わせと、特に生理食塩水のみの場合は、ＤＮＡに対してほとんど安定化効果がなく、インキュベート処理の３カ月間に一定のｐＨを維持できなかった。したがって、ＤＮＡの安定化に関する緩衝液の機能の一つは、ｐＨを中性からやや塩基性の範囲に維持することであることが分かる。緩衝液のもう一つの機能がＤＮＡを分解過程から保護することであるとはいえ、異なる緩衝液はＤＮＡ安定化のための異なる能力を持っており、最大の安定化効果を持つ特定の緩衝液を同定するためには、さらに進んだ研究が必要であることを示している。その意味で、これらの結果は、重炭酸塩ナトリウムが保存中のＤＮＡを安定化させることを示した最初のデータであるといえる。
添加する緩衝液／ｐＨの組み合わせによるＤＮＡ安定性に及ぼす効果は表７に示してある。この研究では、ＤＮＡを様々な緩衝液／ｐＨの組み合わせで製造し、５℃、24℃、37℃でそれぞれ１カ月間、インキュベート処理を行った。インキュベート処理に引き続き、初期状態に於ける超らせんＤＮＡ含有量の比率を、アガロースゲル電気泳動法によって測定した。その結果、最善の緩衝液／ｐＨの組み合わせは、ｐＨ7.5のトリシンであることが示された。しかし、幾つかの他の組み合わせも、コハク酸ナトリウム（ｐＨ6.2）、リンゴ酸ナトリウム（ｐＨ6.2）、トリス（ｐＨ7.5）、およびｐＨ7.5のリン酸ナトリウムのいづれの安定化効果よりも大きな安定化効果をもたらした。また、最も有望な緩衝液／ｐＨの組み合わせが、４℃、25℃、37℃、および50℃に於いても同じように最も有望な組み合わせであるかどうかを比較するための追加実験が現在進行中である。
ＤＮＡワクチン製剤に於ける緩衝液イオンが免疫反応に影響を与えるかどうかを測定する目的で、インフルエンザＤＮＡワクチン、ＨＡ（Georgia／93）に対する誘導免疫反応について、数種類のＤＮＡ用量を用いて、ＨＩ力価を指標として測定を行った。図９に示す結果は、ＰＢＳ中で調製したＤＮＡワクチンに対する免疫反応が、生理食塩水中で調製されたＤＮＡワクチンによる反応よりも優れていることを示していた。
ＤＮＡの安定性に対する広い範囲のｐＨの効果を測定するために、150ｍＭ  ＮａＣｌを含んだｐＨ6.0〜9.0の20ｍＭ  ビスートリスープロパン中で安定性試験を行った。50℃（２ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡ）で、２週間のインキュベーション後に得られた安定性試験の結果を図13に示した。結果は、製剤のｐＨがＤＮＡの安定性に大きく影響すること、および最適なｐＨが8.5以上であることを顕著に示している。試験結果は、ｐＨ7.1のＰＢＳコントールに於けるＤＮＡの安定性が、ｐＨ7.5のビスートリスープロパンのＤＮＡの安定性とほぼ同じであることから、各々のｐＨに於いて緩衝液の種類もＤＮＡの安定性に影響することを示唆している。
ＤＮＡ安定性に対する緩衝液の種類による効果を明らかにする目的で、20ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡについて７つの異なる製剤によって安定性試験を行った。以前の試験が、緩衝液の純度がＤＮＡ安定性に影響を与えることを示したので、フリーラジカルによるＤＮＡの酸化を抑制するために、各製剤に10ｍＭコハク酸と２％エタノールを添加した（実施例１４と１５に於けるデータで、コハク酸とエタノールのそれぞれがＤＮＡ安定性を増加させる）。その結果（図14）、最大のＤＮＡ安定性をもたらす製剤は、同時に最も高いｐＨ（ｐＨ9.0）を用いた製剤であることが明らかになった。しかし、他の幾つかの緩衝液の効果も顕著であった。最大の緩衝液の効果はグリシンとビスートリスープロパンの中間にあり、データは、ｐＨ９のグリシン製剤が、同じｐＨに於けるビスートリスープロパン製剤よりも顕著に優れていることを示していた。これとは対照的に、ｐＨ8.2のトリス、ビシン、トリシン緩衝液はほとんど同じＤＮＡ安定性を12週間まで維持した。データはまた、２つのリン酸製剤（ｐＨ7.7と8.0）を用いた場合に、ＤＮＡ安定性が最も低下することを示し、同時にこれらの製剤は最も低いｐＨの製剤であることが試験から判明した。ｐＨ8.0以上ではリン酸緩衝液は緩衝能力が低下するため、リン酸製剤を用いる場合は、ｐＨを8.0か、または8.0以下に制限しなければならなかった。これらの結果は、キレート化剤（実施例１５参照、データはどのキレート化剤がＤＮＡ安定性を向上させ、どのような条件下であるかを示している）とフリーラジカルスカベンジャー（実施例１４参照、データはエタノールによってＤＮＡ安定性が向上することを示している）の添加によって、一度、フリーラジカルによるＤＮＡの酸化が抑制されれば、ＤＮＡの安定性は主として製剤のｐＨによって支配されることを示唆している。
実施例１２
ＤＮＡ安定性に対する光の効果  −  もし特別な手技過程が必要であったり、遮光ガラス瓶が長期間の保存に必要であるかもしれないので、まず第一に、物質の光感受性を見積もった。光感受性を測定した実験結果（図10）は、アガロースゲル電気泳動法によって測定したところ、生理食塩水中の100ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡに対する露光が、超らせんＤＮＡプラスミドを開環型へ変換する過程を促進することを示した。開環型への変換は、ＤＮＡが透明なガラス瓶に保存された場合と、同じものを遮光ガラス瓶に保存した場合では、期待されたように、反対の結果がより顕著に観察された。２−４週間の露光が顕著な分解を引き起こすとはいえ、一日目の８時間までは顕著な分解は観察されなかった。遮光ガラス瓶は、長い時間放置しておくと微量金属イオンを水分中に浸出させる可能性があり、微量金属イオンはＤＮＡのフリーラジカル酸化を触媒するので、長期の保存のためには、光感受性に対するプラスミドの専用パッケージ溶液が必要である。
Ｆｅ+3、金属イオンキレート化剤、およびフリーラジカルスカベンジャーを含む製剤での、ＤＮＡ安定性に対する光の効果を測定する目的で、30℃で９週間に渡って、可視光（2000Ｌｕｘの蛍光）の存在下、非存在下に於いて、安定性研究が行われた。ＤＮＡ濃度は20ｍｃｇ／ｍＬに調整され、製造緩衝液には、150ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ8.0の10ｍＭリン酸ナトリウム溶液を用いた。下記の図27と図28に見られる通り、その結果は、ＰＢＳコントロール、500ｐｐｂのＦｅ+3を含むＰＢＳ、または0.5ｍＭのＥＤＴＡと500ｐｐｂのＦｅ+3を含むＰＢＳのいづれの中でも、光は顕著にＤＮＡ安定性を減少させた。結果はまた、0.5ｍＭのＥＤＴＡの存在は、500ｐｐｂのＦｅ+3の存在下でのＤＮＡ安定性に対する光の悪影響を減少させることができないことを示していた。図16に於ける結果は、ＥＤＴＡとエタノールを含む製剤でのＤＮＡ安定性に対する光の効果を示している。その結果は、図15のコントロール製剤と比較して、光照射検体と暗検体のどちらに於いても、ＥＤＴＡとエタノールの存在がＤＮＡを大きく安定化させることを示していた。この結果はさらに、ＤＮＡ安定性への光の悪影響がＥＤＴＡとエタノールの存在によって大きく減少することを示し、500ｐｐｂのＦｅ+3を含む製剤に於いてでさえ、減少効果を示していた。したがって、これらの結果は、ＥＤＴＡとエタノールを含むＤＮＡワクチン製剤は、これら２つの安定化剤のどちらも含まない製剤よりも、光、および微量金属イオンが及ぼす有害な効果に対して、感受性が遥かに少ないことを示唆している。
実施例１３
ＤＮＡ安定性に対する脱金属化および脱酸素化の効果：ＰＢＳの脱金属化方法  −  脱金属化ＰＢＳを調製するために、２０．０グラムのチェレックス１００樹脂（Chelex 100 resin；バイオラッド・ラボラトリーズ［BIO-RAD Laboratories］）を４００ｍＬのＵＳＰ水で、真空ろ過法により酢酸セルロース膜（孔サイズ：０．２２マイクロメーター）を通して洗浄した。洗浄した樹脂を約１リットルのＰＢＳに加え、スラリーを含む１リットル瓶の中に磁気攪拌棒を置き、最低攪拌速度に設定した磁気スターラーを用いて２〜８℃で一晩ゆっくり攪拌した。翌日、酢酸セルロース膜（コーニング［Corning］社、孔サイズ：０．２２ミクロン）を用いて、真空滅菌ろ過により樹脂を取り除いた。最終ろ過生成物を集める前に、脱金属化スラリー１０ｍＬを２回使用して注意深く膜を予備洗浄した。このステップは、膜から金属イオンが浸出して脱金属化生成物を汚染しないようにするために行なわれた。
プラスミドＤＮＡの脱金属化方法−プラスミドＤＮＡを含む溶液を脱金属化するために、脱金属化したＤＮＡをＰＢＳで稀釈し、最終容量を約２ｍＬとした。次いで、予め５ｍＬの脱金属化ＰＢＳで洗浄することにより平衡化した１ｍＬのチェレックス１００カラムにＤＮＡを通した。溶出した脱金属化ＤＮＡを採取し、引き続き、追加の脱金属化ＰＢＳ６ｍＬを添加して残ったＤＮＡをカラムから洗い流した。次に、脱金属化したＰＢＳを用いて全溶出物を最終容量１２．０ｍＬに稀釈し、ミリポア・ミレックス［Millipore Millex］−ＧＶ  ２５ｍｍシリンジ・フィルタ（孔サイズ：０．２２ミクロン）を使用して滅菌ろ過した。本発明者らの当初の実験では、１ｍＬカラムを使用してわずか４８マイクログラムのＤＮＡを脱金属化しただけであったが、チェレックス１００樹脂の容量であれば、同じサイズのカラムを使用してさらに多量のＤＮＡを脱金属化できるであろう。
ＰＢＳおよび脱金属化ＰＢＳの脱酸素化方法−脱酸素（脱気）化ＰＢＳ、または脱酸素化・脱金属化ＰＢＳを調製するために、２５０ｍＬの緩衝液をパイレックス瓶中で加熱し、沸騰させた。次にその溶液を連続ヘリウム噴霧下で室温まで冷却し、密栓した。
脱酸素化または脱酸素化・脱金属化プラスミドＤＮＡの調製方法−安定性研究のための脱酸素化ＤＮＡ溶液を調製するために、インフルエンザワクチンＤＮＡ、ＨＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を、滅菌した脱酸素化ＰＢＳ中に稀釈した。インフルエンザワクチンＤＮＡの最初のストックについては脱酸素化しなかったが、これはこのストックを１０００倍に稀釈（２．５５ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｃｇ／ｍＬ）したためである。脱酸素化ＤＮＡ溶液を次に滅菌ガラス瓶中に入れ、フィルターろ過した窒素で頭部空間を充満させたあと、密栓した。安定性研究に用いる脱酸素化・脱金属化ＤＮＡ溶液を調製するために、インフルエンザワクチンＤＮＡ、ＨＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）をまず脱金属化・脱酸素化ＰＢＳ中に稀釈した。次に、この溶液を１ｍＬのチェレックス１００カラムに通してＤＮＡの脱金属化を行なった。次に、この溶液を追加の脱酸素化・脱金属化ＰＢＳで稀釈し、瓶に詰める直前に滅菌ろ過およびヘリウム噴霧を行った。それぞれの瓶の頭部空間は、密栓前にフィルターろ過した窒素を充満させた。
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表６は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）および脱金属化ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡの安定性を測定するための実験結果を示している。この結果は、脱金属化ＰＢＳ中のＤＮＡの安定性は対照条件下におけるものよりも改善されることを示しており、またＤＮＡワクチンの安定性は脱金属化した緩衝液中に貯蔵した場合に著しく高まることを示唆している。さらに、脱金属化ＰＢＳ中に貯蔵されたＤＮＡは、公表されている脱プリンおよびβ脱離の速度定数を用いて予測されるものよりはるかに安定であった。脱プリンおよびβ脱離はＤＮＡのリン酸ジエステル骨格の破壊ステップをなす２つの連続した化学反応であり、これは水溶液中で起きる。第１のステップでは、［Ｈ+］がＤＮＡからプリン塩基の消失を触媒し、アプリン部位（ＡＰサイト）を残す。加水分解の第２ステップにおいては、［ＯＨ-がβ脱離反応を触媒し、デオキシリボースの３’炭素に結合している酸素原子と３’炭素原子の間の結合を切断する。水溶液中で脱プリンおよびβ脱離は完全に防止することができない自然プロセスであるため、他のすべてのＤＮＡ分解源が排除されるとした場合、脱プリンおよびβ脱離の自然速度がＤＮＡの安定性を規定することになると考えられる。ｐＨ７．４（７０℃、＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）における脱プリンの公表速度定数（ｋ）と活性化エネルギー（Ｅａ）はそれぞれ４．０×１０-9ｓ-1及び３１ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｌｉｎｄａｈｌら、１９７２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：３６１０−３６１８参照）である。したがって、７０℃におけるマグネシウムの効果を考えると、５０℃におけるＰＢＳ中の脱プリン速度はマグネシウムの存在下で約２．３×１０-10ｓ-1、またマグネシウムの非存在下では３．３×１０-10ｓ-1である。β脱離ステップにおける公表速度定数（７０℃、マグネシウム非存在）およびＥａは、２．４×１０-5ｓ-1および２４．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｌｉｎｄａｈｌら、１９７２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：３６１０−３６１８参照）である。したがって、５０℃におけるβ脱離ステップの速度定数は約２．６×１０-6ｓ-1となる。したがって、鎖切断（ＳＢ）形成速度は［ＡＰサイト］ｋ2と等しくなる。ただし下記に示すように、ｋ1は脱プリンの速度定数、ｋ２はβ脱離の速度定数であり、［ＡＰサイト］はＤＮＡ中のアプリン部位の濃度である。
プラスミドＤＮＡ----ｋ1----＞［ＡＰサイト］----ｋ2----＞
超らせん切断（ＳＢ）
したがって、５０℃におけるインキュベーション期間後の任意の時点における鎖断形成の速度を求めるためには、
速度＝６，６００プリン（ＩＤＶ、ＨＡ、Ｇｅｏｒｇｉａ／９３に関して）×３．３×１０-10ｓ-1×ｋ2
速度＝２．２×１０-6ｓ-1×ｋ2
速度＝２．２×１０-6ｓ-×２．６×１０-6ｓ-1
速度＝５．７×１０-12ｓ-2
任意の時間におけるＳＢ形成速度＝５．７×１０-12ｓ-2×（時間：秒）となる。
ゆえに、任意の時点ｔにおいて存在するＳＢの数は、５．７×１０-12（ｔ）のｔ＝０からｔ＝任意の時点の間の積分値、に等しくなる。
ゆえに、任意の時点ｔにおいて存在するＳＢの数＝１／２（５．７×１０-12）ｔ2を示す。したがって、任意の時点ｔにおいて存在するＳＢの数＝２．８５×１０-12（ｔ2）となる。
もし、５０℃、２８日間のインキュベート処理後のインフルエンザＤＮＡワクチンの鎖切断数を求めるために上記の公表速度定数を用いれば、１プラスミドＤＮＡ当たり１６．７の鎖切断数が見られることになる。プラスミド母集団の中で１プラスミド分子当たり１６．７の鎖切断がランダムに分布するということは、超らせんＤＮＡがまったくない組成物を得ることになる。しかしながら、表６のデータでは脱金属化サンプル中では２８日後に、超らせんＤＮＡの初期状態の６５％が残存していることを示している。これらのデータは、水溶液中では脱金属化が脱プリンおよび／またはβ脱離の速度を著しく減少させることを示唆している。微量金属イオンがどのようにして脱プリンまたはβ脱離反応にこの程度の影響を及ぼすかは明らかとなっていない。
表８の結果はまた、脱酸素化がＤＮＡの安定性を改善することを示しているが、これはおそらくフリーラジカルを含む酸素の生成を減らすことによるものであろう。本研究において最も安定であった製剤は、脱金属化・脱酸素化サンプルであり、５０℃で４２日後に、初期状態の３７％の超らせんＤＮＡが残存していた。
脱金属化の効果に関する別の検討結果（表９）もまた、ＰＢＳ緩衝液とＤＮＡの脱金属化および脱酸素化が、非脱金属化ＰＢＳコントロールに比べて５０℃におけるＤＮＡ安定性を著しく改善したことを示している。貯蔵のためのガラス容器から残存金属イオンを除去するために、いくつかの容器を１ｍＭ  ＥＤＴＡと脱イオン水を含むＰＢＳ溶液で洗浄し、使用前にオートクレーブにかけた。洗浄した容器と未洗浄容器とのＤＮＡ安定性の比較では、加速条件下では、容器の洗浄はＤＮＡの安定性を著しく高める効果がないことを示している。しかしながら、表面の金属イオン含有量を減らすための容器の洗浄はＤＮＡワクチンの長期安定性を改善することになるであろう。
脱金属化ＰＢＳの場合に観察される安定性の増加は、プラスミドＤＮＡの脱金属化ＰＢＳへの添加に先立つプラスミドＤＮＡの脱金属化を必要とするものであるかどうかを判断するために、脱金属化ＰＢＳへ非脱金属化プラスミドＤＮＡを１０００倍稀釈して入れた場合のＤＮＡ安定性に及ぼす効果を調べる研究を実施した。その結果（表１０、条件Ｃ１〜Ｃ３）は、ＤＮＡを脱金属化しなかった場合に安定性が減少したことを示しており、最大の安定性を得るためにはＤＮＡとＰＢＳを脱金属化する必要があることを示唆している。
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脱金属化条件下での安定性の増加がＤＮＡ中の残存微量ヌクレアーゼ活性の不活化（金属イオン除去によるもの）によるものかどうかを判断するために、本発明者らはＤＮＡ安定性に対して微量ヌクレアーゼ活性の除去または変性の効果を判定する実験を実施した。その結果（表１１）は、ＰＢＳコントロールと比べて、０．１％ＳＤＳの添加は安定性を著しく高めなかったことを示している。さらに、１ｍｃｇのプロテアーゼＫを用いて１時間、２４℃でＤＮＡを処理し、マイクロピュア［Micropure］ＥＺ膜を使用して酵素を除去しても安定性を強化することはなかった。マイクロピュアＥＺ膜処理だけの場合もまた安定性を改善することはなかった。さらに、ＤＮＡのフェノール抽出およびエタノール沈降も安定性にはまったく効果がなかったことを確認した。これらの結果は、脱金属化ＰＢＳ中で観察される安定性の増進が残存ヌクレアーゼ活性の不活化によるものではなく、ＤＮＡのフリーラジカル酸化を触媒する能力のある金属イオンの除去によるものであることを明確に示している。
ＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果をさらに調べるために、微量金属イオンの効率的な除去が確実にでき、かつ緩衝液ｐＨを変化させない改良型のバッチ結合式脱金属化法（batch binding demetalation procedure）で脱金属化した緩衝液を用いて一連のＤＮＡ安定性実験を行なった。緩衝液は脱金属化しようとする緩衝液〜７５ｍＬ中に５ｇのチェレックス樹脂を入れることにより脱金属化した。この溶液を磁気スターラー上で中程度の速度で攪拌しながら、緩衝液として望ましいｐＨに調節するために１Ｎ  ＨＣｌをスラリーに滴下した。次いで、スラリーのｐＨが望ましいｐＨで安定するまで１５〜３０分間追加の１Ｎ  ＨＣｌを添加した。ｐＨが安定した後スラリーをフィルターろ過し、洗浄し、ｐＨが調節されたチェレックス樹脂を回収した。洗浄された樹脂の全量５グラムを次に脱金属化しようとする２５０ｍＬの緩衝液（２５０ｍＬ密栓瓶）中に入れ、２〜８℃で一晩ゆっくり攪拌した。次に、この緩衝液を、０．２２ｍｍ酢酸セルロース膜を有するコーニング社製真空ろ過装置を使用して、ろ過滅菌した。ろ過した緩衝液を回収する前に、コーニングのろ過装置の膜をそれぞれ５〜１０ｍＬのスラリーで２回洗浄し、酢酸セルロース膜から微量金属イオンを取り除き、またポリスチレン容器を洗浄した。滅菌脱金属化された緩衝液は使用するまで２〜８℃で貯蔵した。
ＤＮＡ安定性に対する試薬の純度と脱金属化の効果を判定するために、２ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを、異なるメーカーの２つの試薬で調製したＰＢＳ中で、５０℃、ｐＨ７．２で６週間インキュベート処理を行った。その結果（図１５）は、Ｂ試薬を用いたＰＢＳについてはこの処方緩衝液の脱金属化がＤＮＡ安定性を著しく強化したが、Ａ試薬によるＰＢＳ中ではＤＮＡの安定性に対してほとんど効果がなかったことを示している。これらの結果は処方緩衝液試薬中の微量の金属イオン不純物が貯蔵中のＤＮＡに分解をもたらし、また純度のより低い処方緩衝液の脱金属化はＤＮＡ安定性を改善することを示している。
高ｐＨ製剤中でのＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を判定するために、ｐＨを８．０に調節したＰＢＳおよび脱金属化ＰＢＳに２ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを入れて安定性試験を５０℃で６週間行なった。その結果を図１６に示すが、この処方緩衝液の脱金属化もまたｐＨ８．０のＰＢＳ中でＤＮＡ安定性を改善したことを示している。
フリーラジカルスカベンジャーと金属イオンキレート化剤を含む処方中でのＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を判定するために、２ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを用いて５０℃で６週間ＤＮＡ安定性実験を行なった。脱金属化したものおよび非脱金属化状態の２つの製剤を試験した。ＰＢＳを緩衝液として使用し、１０ｍＭコハク酸ナトリウムをキレート化剤として使用した。エタノールとグリセリンをそれぞれ２％（ｖ／ｖ）で、フリーラジカルスカベンジャーとして使用した。その結果を図１７に示すが、グリセリンを含む製剤中では脱金属化がＤＮＡ安定性をわずかに改善したが、エタノール製剤中ではＤＮＡ安定性に関してはまったく効果がなかったことを示している。これらの結果は、同じレベルのＤＮＡ安定性がコハク酸エステルおよびエタノールを用いることによるフリーラジカル酸化の制御か、あるいは脱金属化による微量金属イオンの除去のいずれかにより達成できることを示唆している。しかしながら、コハク酸エステルおよびエタノールの添加は、ＤＮＡワクチンの製造および充填中に入り込む微量金属イオンからＤＮＡを保護することが期待される。脱金属化は、脱金属化処理後に入り込む金属イオンからＤＮＡを防御することはないが、製造時の微量金属イオン負荷を減らし、また長期保存中のＤＮＡ安定性を高めることが期待される。
その他の種類の緩衝液のＤＮＡ安定性に対する脱金属化の効果を調べるために、プラスミドＤＮＡを重炭酸塩またはホウ酸塩のいずれかを含む緩衝液中に入れ、２ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡ、５０℃で６週間、ＤＮＡ安定性実験を行なった。その結果を図１８に示すが、脱金属化がそれぞれの製剤中でのＤＮＡ安定性を著しく高めた。したがって、このデータは脱金属化がさまざまな処方緩衝液の広いｐＨ範囲でＤＮＡ安定性を効果的に高めるものであることを示唆している。
ＤＮＡワクチンの処方緩衝液の脱金属化が低温および長期貯蔵の場合にＤＮＡ安定性を高めるかどうかを判定するために、２つの処方中で２ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを用いて３０℃で９カ月のＤＮＡ安定性実験を行なった。その結果を図１９に示すが、ＰＢＳ製剤および重炭酸塩含有製剤の脱金属化がＤＮＡ安定性を顕著に高めたことを示している。これらの結果は、脱金属化によるＤＮＡ安定性の強化が、広い温度範囲ならびに長期間の貯蔵において、効果的であることを示唆している。
実施例１４
ＤＮＡ安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果−ＤＮＡ分解のメカニズムの１つに、ヒドロキシルラジカルなどの分子によるフリーラジカル酸化があることは今日広く知られている。フリーラジカルによるＤＮＡ損傷を防いだり、あるいはその程度を少なくする１つの方法は、ＤＮＡの溶液にフリーラジカルスカベンジャーを添加することである。これらの分子はフリーラジカルに対しＤＮＡと競合することにより、ＤＮＡを保護する目的に役立つ。スカベンジャーはフリーラジカルに対して反応性が高い化合物が選択され、またしばしばＤＮＡの反応性の高い部分（通常、デオキシリボース糖）より高濃度で存在して効果的にＤＮＡを損傷から保護する。
フリーラジカル酸化が果たして貯蔵中に起きているかどうかを判定するため、またいくつかのフリーラジカルスカベンジャーの効果を試験するために、インフルエンザＤＮＡワクチン、ＨＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、４％（ｖ／ｖ）グリセリン、５ｍＭメチオニンまたは１０ｍＭアジ化ナトリウム（公知のフリーラジカルスカベンジャー）を含む生理食塩水中に入れ、３７℃で３カ月間インキュベート処理をした。３つの時点でＤＮＡをアガロース・ゲル電気泳動に付して初期状態の超らせんＤＮＡの残存割合を求めた。図１１の結果は、生理食塩水、グリセリン、メチオニンおよびアジ化ナトリウム中では、生理食塩水コントロールと比較して、ＤＮＡを安定化させたことを示している。これらの初期の実験結果は、フリーラジカル酸化が貯蔵中に起きていること、および３つの異なるフリーラジカルスカベンジャーがＤＮＡの効果的な安定剤であることを示唆している。
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フリーラジカルスカベンジャーであるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、還元剤であるアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムおよびチオグリセリンのＤＮＡ安定性に対する効果を調べるように設計された別の研究の結果を表１２に示す。この実施例においては、ＤＮＡはＰＢＳ（ｐＨ７．２）に２０ｍｃｇ／ｍＬで調製され、５、２４、および３７℃でインキュベート処理を行った。この結果はＰＢＳコントロールと比較して、これらの還元剤が存在する場合はすべてＤＮＡの劇的な破壊があり、０．２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの場合は安定性が強化されたことを示している。本実験の結果は図１１の結果と一致しており、試験した非還元型フリーラジカルスカベンジャーのほとんどがＤＮＡを安定化させた。
ＤＮＡ安定性に対する１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１０ｍＭメチオニンおよび２％（ｖ／ｖ）エタノールの効果を調べるために、フリーラジカルスカベンジャーの再試験を行なった。本実験においてはＤＮＡをＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で２０ｍｃｇ／ｍＬに調製し、５、２４および３７℃でインキュベート処理をした。図１３に示されている結果は、ＰＢＳ中２％のエタノールが最も効果的な安定剤であったことを示している。しかしながら、グリセリンおよびメチオニンもまたいくらかの安定化効果を示した。本検討におけるもう１つの結果は、ＰＢＳ製剤は生理食塩水製剤よりもかなり安定であったことである。これはおそらくは、ｐＨが時間の経過につれて生理食塩水処方中では徐々に低下し、分解速度を速めたことによるものであろう。
ＤＮＡ安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーであるペントキシフィリン、第三級ブチルヒドロキノンおよびｐ−アミノ安息香酸の効果を調べるための１つの実験の結果を表１４に示す。この検討においてはＩＤＶ、ＨＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１０ｍＭ濃度のスカベンジャーの存在下、２．０ｍｃｇ／ｍＬに調製した。この検討におけるサンプルは５０℃でインキュベート処理を行い、アガロース・ゲル電気泳動により超らせんＤＮＡの含有量を調べた。その結果は、試験したスカベンジャーはいずれもＤＮＡの安定性を改善はせず、実際にはそれらは著しくＤＮＡの分解を加速させたことを示している。エタノール、ＤＭＳＯ、グリセリンおよびメチオニンが安定性を強化したのに対し、これらのスカベンジャーがなぜＤＮＡの分解を加速させたかは明らかではない。
ＤＮＡを安定化させるためのエタノールの能力についても、脱金属化ＰＢＳ、ならびに脱金属化・脱酸素化ＰＢＳ中で調べた。これら２つの研究では、ＤＮＡは２．０ｍｃｇ／ｍＬに調製し、５０℃でインキュベートした。表９および１０に示した結果は、５％（ｖ／ｖ）エタノールがＰＢＳ中、および脱金属化したいずれかの処方中でＤＮＡを安定化したことを示している。
長期安定性検討における第１時点（１カ月）の最近の結果もまた、５％エタノールが脱金属化ＰＢＳ中２．０ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを含む処方を３７℃において安定化させたことを示している。この１カ月時点では、ＰＢＳコントロールは、初期状態の超らせんＤＮＡの９３％が残存していたのに対し、脱金属化サンプルは９６．１％、また５％エタノールを含む脱金属化サンプルでは１００％残存していたことを示している。
ＤＮＡ安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果を調べるために、ｐＨ７．２およびｐＨ８．０のＰＢＳ中に２０ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを入れ、５０℃で８週間、２つのＤＮＡ安定性実験を行なった。エタノールはヒトに使用できる効果的なフリーラジカルスカベンジャーであることが認められているため、ＥＤＴＡの存在下および非存在下でスカベンジャーとして２％（ｖ／ｖ）エタノールで試験した。第１の実験（ｐＨ７．２）の結果を下記の図２０に示す。この結果は、エタノール単独のものがＤＮＡ安定性を強化したのに対し、ＥＤＴＡ単独ではＤＮＡ安定性を減少させたことを示している。エタノールとＥＤＴＡの組み合わせは、４週間まではＤＮＡ安定性を大幅に高めたが、第８週までには安定性の増加はごくわずかとなった。これらの結果は、エタノールはＥＤＴＡが共存しない場合よりも共存した方が、より有効なフリーラジカルスカベンジャーとなることを示唆している。さらに、これらの結果は、エタノールの非存在下でＥＤＴＡは単独ではＤＮＡ安定性を減少させたが、エタノールの存在下ではＤＮＡ安定性を高めたことを示している。これらの結果は、エタノールはＥＤＴＡの存在下でより効果的なスカベンジャーとなることを明白に示唆しているが、これはＥＤＴＡがＤＮＡに結合している金属イオンを除去し、それによりＤＮＡに結合している鉄によるラジカルの生成に拮抗して、溶液中に水酸基ラジカルを生成するからである。バルク溶液中で水酸基ラジカルが生成すると、エタノール分子はより多くの時間、ラジカルを捕捉することができる。なぜならば、ラジカルの平均自由行程はＤＮＡとの相互作用距離よりも長いからである。ＤＮＡに結合した鉄分子によって生成される水酸基ラジカルはＤＮＡの極めて近くにある。したがって、エタノールがＤＮＡの“表面”に生成されたラジカルを捕捉する能力は著しく減殺される。これらの結果はまた、ＥＤＴＡ以外のキレート化剤が、ＤＮＡにすでに結合している金属イオン類（鉄および銅）を除去する能力がある場合には、有効なＤＮＡ安定剤になることを示唆している。
ｐＨ８．０での第２の安定性研究の結果を下記の図２１に示す。本実験によるデータは、エタノールとＥＤＴＡ／ＥｔＯＨのＤＮＡ安定化効果が、ｐＨ７．２よりもｐＨ８．０の方が大きいことを明確に示している。
コハク酸エステルおよびエタノールの組み合わせが、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組み合わせで観察されるのと同一程度のＤＮＡ安定化をもたらすかどうか、またこれらの組み合わせのいずれがＦｅ+3の存在からＤＮＡを保護するのかを判定するために、２０ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．０の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で、５０℃で６週間にわたる安定性実験を行なった。その結果は、コハク酸エステル／ＥｔＯＨの組み合わせはＥＤＴＡ／ＥｔＯＨと同一のＤＮＡ安定化をもたらさなかったことを示している。しかしながら、コハク酸エステルとエタノールの組み合わせは、５００ｐｐｂのＦｅ+3の添加によって発生する大量のフリーラジカルからほぼ完全にＤＮＡを保護した。図２２に示す結果もまた、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組み合わせが総体的に最大のＤＮＡ安定化をもたらし、５００ｐｐｂのＦｅ+3添加による影響からの完全な保護を示している。これらの結果は、ＥＤＴＡとエタノールの特定の組み合わせはＤＮＡ安定性を著しく強化するが、コハク酸エステルとエタノールの組み合わせを使用しても同一程度のＤＮＡ安定性は達成できないことを示唆している。
実施例１５
ＤＮＡ安定性に対する金属イオンキレート化剤の効果−ＤＮＡ安定性に対する緩衝液イオン類、ｐＨおよび塩の効果を調べるように考案された予備研究において、本発明者らはＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のＤＮＡに対する１ｍＭおよび１０ｍＭのＥＤＴＡ添加の効果も調べた。これら初期の実験においてはプラスミドＤＮＡは１００ｍｃｇ／ｍＬに調製し、６０℃で４８時間インキュベート処理を行った。次に超らせんＤＮＡ含有量をアガロース・ゲル電気泳動によって測定した。表５に示した結果は、ＥＤＴＡがＤＮＡの安定性に対して全く効果を有さないことを示している。この初期の段階では、我々が観察したＤＮＡ分解プロセスでは微量金属イオンが必要とされなかったことを示唆している。
その他の実験でも、ＤＮＡ安定性に対するＥＤＴＡの効果についての試験が行われた。たとえば表１２に示す結果は、５０℃でインキュベート処理を行った場合、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）または５％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ中で、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡは、２．０ｍｃｇ／ｍＬで調製されたＤＮＡの安定性に顕著な効果をもたらさないことを示している。
ＤＮＡ安定性に対する鉄キレート化剤デスフェラール（Desferal；１ｍＭ）の効果を調べるために考案された初期の実験では、分解の速度増大が示された。この研究においてはＤＮＡはＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で２０ｍｃｇ／ｍＬに調製し、５、２５および３７℃でインキュベート処理を行った。分解の速度増大の理由は明らかではない。
その後の実験でも、ＤＮＡ安定性に対するデスフェラールの有害な作用が確認された。たとえば表１５に示されている結果は、０．５ｍＭのデスフェラールがＰＢＳ中のＤＮＡの急速な分解を引き起こし、これはＰＢＳをＤＮＡとの混合前にデスフェラールで処理した場合でも起きることを示している。この実験はまた、脱金属化ＰＢＳ中に稀釈する前にＤＮＡを一晩１．０ｍＭのデスフェラールで処理した場合にも、ＤＮＡを急速に分解させることを示した。これらデスフェラールを用いた最新の実験では、ＤＮＡはＰＢＳ中２．０ｍｃｇ／ｍＬに調製し、５０℃でインキュベート処理を行った。
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ＤＮＡ安定性に対する特性が判明しているいくつかの金属イオンキレート化剤の効果を調べるための実験結果が表１４に示されている。これらの検討では、ＤＮＡをＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２．０ｍｃｇ／ｍＬに調製し、５０℃でインキュベート処理を行った。４つの異なるキレート化剤をそれぞれ０．５ｍＭで試験した。その結果は、ヘキサリン酸イノシトール（ＩＨＰ）および三リン酸塩（ＴＰＰ）がＤＮＡの安定性を改善したことを示している。しかしながら、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ））およびジエチレントリアミンペンタ−酢酸（ＤＴＰＡ）は安定性を高めることはなかった。これらの結果は、ＩＨＰおよびＴＰＰは、脱金属化ＰＢＳ、およびエタノールをフリーラジカルスカベンジャーとして含む脱金属化ＰＢＳ中のＤＮＡをさらに安定化させるのに有用であることを示唆している。ＩＨＰおよびＴＰＰの安定化効果は脱金属化に伴う安定性の増強、ならびにエタノールの安定化効果（金属イオン触媒によるフリーラジカル酸化というＤＮＡ分解メカニズムに基づいて）とも整合するが、なぜその他の金属イオンキレート化剤がＤＮＡを安定化させないかは明確にはなっていない。既刊の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、３６２０−３６２４；１９８４）では、ＩＨＰ、ＥＤＤＨＡ、ＤＴＰＡおよびデスフェラールは鉄に配位する場合に、金属面フリー配位部位を有しないことを示唆している。したがって、これら４つのキレート化剤は鉄と錯体を作るときにＥＤＴＡの場合のようには水酸基ラジカルを生成しないことが報告されている。こうした化学的な理解ではＤＮＡ安定性に対するこれらキレート化剤の異なる効果を説明するのは難しい。しかしながら、本発明者らの結果は多価リン酸リガンドを含むキレート化剤は、ＤＮＡを金属イオン触媒による酸化から保護するのに最も効果的なキレート化剤であることを示唆している。さらに、多価リン酸リガンドを有するその他のキレート化剤としてはポリリン酸などのさまざまな塩類が挙げられる。
また脱金属化状態のさまざまな緩衝液を調べるための本研究者らの最新の研究結果（実施例１６参照）もまた、特定の金属イオンキレート化剤が貯蔵中のＤＮＡの安定化に重要であることを示唆している。コハク酸エステルまたはリンゴ酸エステルを含む脱金属化ＰＢＳが脱金属化ＰＢＳ単独より優れていることから、安定化効果はコハク酸エステルおよびリンゴ酸アニオンによる金属イオンの結合によるものと考えられる。しかしながら、本研究者らのデータはまた、クエン酸塩がコハク酸エステルよりも金属イオンに対する高い親和性を有し、広く使用されている緩衝剤であるにもかかわらず、まったくＤＮＡの安定化をもたらさないことを示している。さらに、ＥＤＴＡ、デスＤＴＰＡはすべて金属イオンに対する極めて高い親フェラール、ヘキサリン酸イノシトール、ＥＤＤＨＡおよび和性を有するが、これらは貯蔵中のＤＮＡを安定化させることはない。したがって、ＤＮＡ組成物を安定化させるための金属イオンキレート化剤の能力は、金属イオンに対するキレート化剤の結合親和性には関係しないのである。この結論は、有効なキレート化剤の選定には多価リン酸リガンドを有する分子の実験的な選択または、コハク酸またはリンゴ酸と化学的に似た分子を実験的に選定する必要があることを示唆している。
ＤＮＡ安定性に対する金属イオンキレート化剤の効果を調べるために、一連のＤＮＡ安定性実験を行なった。第１の実験の目的は、エタノール非存在下で、ｐＨ８．０におけるＰＢＳ中でのＤＮＡ安定性に対するいくつかの異なるキレート化剤の効果を判定することにあった。この実験は２０ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを用い、５０℃で２週間にわたり実施した。図２３に示されている結果はＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）およびＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）だけがエタノールの非存在下でＤＮＡ安定性を高めたことを示している。図２３のデータは、ＥＤＴＡがエタノールの非不存在下でＤＮＡの安定性を減ずるという点において、図２１および図２２に示されている従前の結果と整合している。これらの結果は、これらのキレート化剤の中ではＤＴＰＡだけがエタノール不在下での効果的なＤＮＡ安定化剤であることを示唆している。
エタノール存在下でのＤＮＡ安定性を増強させる金属イオンキレート化剤の能力を調べるために、ｐＨ８．０でＰＢＳ中に５つの異なるキレート化剤を入れて、５０℃で１２週間にわたる実験を行なった。図２４に示されている結果は、ＤＴＰＡとＥＤＴＡだけが１％ＥｔＯＨを含むＰＢＳ対照に比べてＤＮＡ安定性を著しく高めたことを示している。しかしながら、２００ｍＭのＤＴＰＡもまたエタノールの存在下および不存在下でＤＮＡ安定性を同量まで高めた。これらの結果は、鉄−ＤＴＰＡ錯体は水酸基ラジカルの発生を促進せず、したがってスカベンジャーとしてエタノールは必要とされないであろう、という既報（Ｇｒａｆら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：３６２０−３６２４）と整合するものである。
１％ＥｔＯＨを含むｐＨ8.0のＰＢＳ中でのプラスミドＤＮＡの安定性を最適化するＥＤＴＡ濃度を決定する目的で、20ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを用いて、50℃で６週間に渡って安定性試験を行った。その結果、図25に示すように、10μＭのＥＤＴＡには、同じ条件下の500μＭのＥＤＴＡと同じ安定性増加効果があることが示された。これらの結果は、ＥＤＴＡが定式化緩衝液の中またはＤＮＡ検体の中に存在する低い濃度の微量金属イオンと結合することで、ＤＮＡ安定性を増加させることを示唆している。これらのデータに基づくと、20ｍｃｇ／ｍＬから1.0ｍｇ／ｍＬまでＤＮＡ濃度を増加させた場合でも、ＥＤＴＡはおそらく10μＭから500μＭの濃度の増加で十分であると考えられる。したがって、ＤＮＡワクチン製剤を安定化させるＥＤＴＡとエタノールの使用は、１ｍＭ以下のＥＤＴＡ濃度で十分であり、ＤＮＡ濃度が２ｍｇ／ｍＬのＤＮＡワクチンであっても、それ以上の濃度のＥＤＴＡは必要とされないはずである。
実施例１６
ＤＮＡ安定性に対する脱金属化緩衝液の効果  −  緩衝液イオンの効果についての本発明者らの初期研究は、脱金属化されていない緩衝液を用いて行った。しかし、緩衝液中に含有される微量金属イオンの量は恐らく緩衝液の純度に応じて変化するので、非脱金属化緩衝液中のＤＮＡの安定性は微量金属イオンの含有量でほぼ決定すると言ってよいであろう。したがって、ＤＮＡ安定性に対する緩衝液イオンの真の影響を決定するためには、脱金属化緩衝液の効果を比較することが必要であろう。
安定性に対する異なる緩衝液イオンの影響を調べるために、４つの異なる脱金属化緩衝液を用意した。コントロール緩衝液は、ｐＨ7.2の脱金属化ＰＢＳである。試験に供せられた他の緩衝液は、10ｍＭコハク酸ナトリウムを含む脱金属化ＰＢＳ（ｐＨ7.2）、10ｍＭリンゴ酸ナトリウムを含む脱金属化ＰＢＳ（ｐＨ7.2）、150ｍＭ  ＮａＣｌ、10ｍＭトリスーＣｌ、150ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ7.8）を含む重炭酸塩ナトリウム（10ｍＭ）、および、10ｍＭトリシン、150ｍＭ  ＮａＣｌを含む重炭酸塩ナトリウム（10ｍＭ、ｐＨ7.8）である。トリスとトリシンの緩衝液は脱金属化が行われなかったが、これは緩衝イオンが陽イオン性なので、Ｃｈｅｌｅｘ100カラムに結合してしまうためである。脱金属化緩衝液のこの研究のために、インフルエンザＤＮＡワクチンを20.0ｍｃｇ／ｍＬで製造し、50℃でインキュベート処理を行った。最初の時点（２週間）での結果は、ＰＢＳコントロールの初期状態での超らせんＤＮＡの残存率が75％であったのに対し、コハク酸、リンゴ酸、重炭酸ナトリウム、トリス、トリシンの緩衝液は、それぞれ、初期状態での超らせんＤＮＡの残存率が、98％、94％、100％、31％、65％であった。これらの結果は、コハク酸とリンゴ酸を含んだ脱金属化緩衝液が脱金属化ＰＢＳよりも優れていることを示しており、150ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ重炭酸ナトリウム脱金属化緩衝液が最も安定な製剤であることを示す。なぜ重炭酸ナトリウムがＰＢＳよりも優れているのかは明かではないが、コハク酸とリンゴ酸を含んだＰＢＳの安定性効果はこれら化合物の金属イオンをキレート化する能力によってもたらされるもののようである。コハク酸とリンゴ酸は、薬品の中でも安全に用いることができる化合物として知られており、比較的高い濃度でも使用できるので、これらの化合物は微量金属イオンをキレート化してＤＮＡを安定化させる上で最も効果的なものかもしれない。
実施例１７
ＤＮＡ安定性に対する凍結乾燥の効果  −  ＤＮＡは水溶液中で、フリーラジカル酸化、脱プリン、β脱離反応を含む、様々な異なる種類の分解過程に敏感である。これらの過程の反応率を最小に抑える方法は、ＤＮＡを凍結乾燥することであり、その結果、水分含有量が減少し、分子運動が抑制される。保存中のＤＮＡ安定性に対する凍結乾燥の効果を測定する目的で、６つの異なる凍結乾燥製剤を用意した。凍結乾燥検体に於けるＤＮＡの安定性を、20ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡで調整された液体ＰＢＳ製剤による安定性と比較するため、一ヶ月間、37℃でインキュベート処理を行った後、それぞれアガロースゲル電気泳動法によって解析された。凍結乾燥検体を作製するため、インフルエンザＤＮＡワクチンが適切な安定化剤を用いて20ｍｃｇ／ｍＬで製造され、0.8ｍＬの溶液が３ｍＬのガラスバイアルの底に置かれた。次に検体は、凍結乾燥機の中に定置されて、冷却庫で、-45℃で４時間、凍結された。次に、庫内は真空状態（20ｍＴｏｒｒ）にされ、一方、庫内の温度は-30℃から-20℃の間に26時間、維持された。庫内の温度は次に０℃に上げられ、この状態で２時間放置し、次に、25℃まで６時間一定の速度で温度の上昇を行った。次に真空状態を解除し、ガラスバイアルは気体窒素の中で密栓した。
凍結乾燥研究の結果、図１２に示すとおり、６つの凍結乾燥製剤の内、４つのＤＮＡが、液体ＰＢＳコントロール中のものよりも遥かに安定であることが示された。これは凍結乾燥がＤＮＡワクチンを安定化する上で非常に効果的な方法であることを示唆している。興味深いことに、スクロースやラクトースのような非結晶性の糖を含むＤＮＡワクチン製剤は、液体コントロール（ＰＢＳ）に比べて、ＤＮＡを大きく安定化させた。凍結乾燥ＤＮＡ検体を作製するために、脱金属化緩衝液を用いた研究を早速行った。金属イオンは溶液中でのＤＮＡ安定性に対して非常に有害であるため、脱金属化と凍結乾燥によるＤＮＡ製剤が、液体製剤に比べて、大きく安定性を向上させるかもしれない。
凍結乾燥されたＤＮＡの安定性と、凍結乾燥されたＤＮＡの安定性に対する脱金属化緩衝液を用いた製剤の効果を測定する目的で、凍結乾燥された検体について、50℃、４カ月間の条件下で安定性研究を行った。３つの製剤について試験を行い、それぞれ、脱金属化された状態と脱金属化されない（非脱金属化）状態について行った。凍結乾燥に先立って、ＤＮＡの濃度は20ｍｃｇ／ｍＬに調整した。凍結乾燥の条件は、この実施例に記されたものと同一である。４カ月間、インキュベート処理を行った後、検体は滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動法で、ＳＣ、ＯＣ、直鎖型ＤＮＡの％を測定した。その結果は、図26に示すように、最も良い凍結乾燥製剤から得られた安定性は、液体製剤で得られた安定性を遥かに凌ぐ。しかし、最も良い液体製剤による４カ月後に予測された安定性は、凍結乾燥製剤の１番、５番、６番を凌いでいた。液体製剤から得られた４カ月後の安定性データは、50℃、20ｍｃｇ／ｍＬ・ＤＮＡの条件下で３カ月後（製剤８番と９番）、または６カ月後（製剤７番）の安定性データから外挿された値に基づいている。結果はまた、脱金属化が、製剤１番と２番に於いて凍結乾燥ＤＮＡの安定性を向上させること、しかし、他の凍結乾燥製剤では、％ＳＣ・ＤＮＡに対してほとんど効果がなかったことを示している。これらの結果は、凍結乾燥がＤＮＡワクチンを安定化させるために効果的な方法であること、そして、定式化緩衝液の脱金属化は、幾つかの製剤に於いて、凍結乾燥ＤＮＡの安定性を向上させることを示唆している。
実施例１８
脱プリンとβ脱離の速度定数に対するＥＤＴＡとエタノールの効果
ここで開示されたＤＮＡ安定性研究の結果は、フリーラジカルスカベンジャーと金属イオンキレート剤が存在しない条件下で、保存中のＤＮＡを分解する主たる機構は、フリーラジカル酸化であることを示唆している。データは同時に、定式化緩衝液中の微量金属イオンと、溶解している酸素が、ＤＮＡのフリーラジカル酸化を引き起こすという仮説を支持している。この仮説に基づくと、（ＥＤＴＡとエタノールによって）フリーラジカル酸化が効果的に制御できる製剤に於ける、ＤＮＡ分解の主たる機構は、脱プリンとβ脱離の過程であろうと考えられ、この反応は水溶液中でＤＮＡに対して起こる（Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610-3618）。もし、脱プリンとβ脱離が、保存中のＤＮＡを分解させる主たる機構であるとすれば、すでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数と、これらの反応が起こる活性化エネルギー（Ｅａ）値を用いて、時間経過中の％ＳＣ・ＤＮＡ値を迅速に予測することが可能である。しかし、エタノールとＥＤＴＡ／ＥｔＯＨを含むＤＮＡワクチン製剤に関する、幾つかのＤＮＡ安定性研究の結果は、これらの製剤に於けるＤＮＡが、発表されている速度定数に基づいて予測した値よりも、遥かに安定であることが示唆されてきた。エタノールを含む製剤に於いて、ＤＮＡ安定性が予測値よりも安定性が高い理由は、おそらくフリーラジカル酸化の速度がかなり低いレベルに抑えられているからであろう。この仮説は、ヒドロキシルラジカルに対する効果的なスカベンジャーとして知られているエタノールの開示されている技術内容と一致する。したがって、水溶液中のＤＮＡの固有の安定性を決定する目的で、100ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡを用いて、１％ＥｔＯＨと0.5ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだｐＨ7.4のＰＢＳ中で安定性試験を行った。ＤＮＡのフリーラジカル酸化をさらに制御するために、密栓されたガラスアンプル中に溶液は保存された。アンプルは40、50、60、80℃で、それぞれインキュベート処理を行った。プラスミド当たりのＡＰ（アプリン／塩基の脱落）部位の数を決定し、脱プリン（ｋ１）とβ脱離（ｋ２）の速度定数を決定するために、様々な時間経過後に、アンプルはインキュベート装置から取り出された。E.coliのエクソヌレアーゼIIIの存在下、非存在下で、溶液の％ＳＣ・ＤＮＡを測定した。ＡＰ部位測定法の記述と、脱プリン（ｋ１）とβ脱離（ｋ２）の速度定数を決定する方法を以下に記載する。
ＡＰ測定法の記述  −  測定の原理は、エキソヌクレアーゼIIIで処理した後に超らせん型プラスミドＤＮＡ（ＡＰ部位を含んでいる）が、開環型に変換する現象に基づいている。E.coliのエクソヌレアーゼIIIは、ＡＰーエンドヌレアーゼの活性に付随しており、ＡＰ-エンドヌレアーゼはＤＮＡ骨格をＡＰ部位で切断して、ＡＰ部位を失ったＤＮＡを完全な超らせん状態から解く酵素である。プラスミド当たり、ただ１つのＡＰ部位を持つ超らせん型プラスミドＤＮＡは、Exo IIIによって完全に開環型ＤＮＡに変換されるため、この測定法は、５〜10％のＤＮＡ分子が、ただ１カ所のＡＰ部位を含むだけでも、ＡＰ部位の存在を検出できるだけの十分な感度を持っている。
この測定は、総量35ｍＬ系で100ｎｇのプラスミドＤＮＡについて、0.25ユニットのExo IIIの存在下、非存在下に於いて、37℃で30分間、インキュベート処理を行い、実施した。次に、検体からＤＮＡの一用量（18ｎｇ）を、アガロースゲル電気泳動法とエチジウムブロマイド染色法によって測定した。次いでゲルのネガティブコントロールの写真を測定し、それぞれの型のＤＮＡの定量ができるように同じゲルに、超らせん、開環型、直鎖型のそれぞれのスタンダード（標準品）が泳動された。そして、検体の結果をこれらと比較した。ＤＮＡ検体中のＡＰ部位の数を決定するために、本発明者らはExo IIIで処理した前後の超らせんＤＮＡの百分率（％）で表現したデータを用いた。例えば、あるＤＮＡ検体が処理の前に90％の超らせんを含み、処理後に50％の超らせんを含んでいれば、ＡＰ部位の計算は下記のように行われる。まず第一に、過去の研究に基づいて、本発明者らは脱プリンの速度がＤＮＡ配列と独立であると仮定して、ＡＰ部位の導入はポワソン分布に基づくと仮定した。次に、ＤＮＡ分子（ＳＢ）の母集団に於ける鎖の切断数を、超らせん状態（ｆ１）であるＤＮＡの分数の関数として表現する方程式を用いた。
ＳＢ＝−ｌｎ  ｆ1
90％が超らせんであるＤＮＡに対して、プラスミド当たりの鎖の切断数は、平均して：
ＳＢ＝−ｌｎ（.90）  または  0.105
50％が超らせんであるＤＮＡに対しては：
ＳＢ＝-ln（.50）  または  .693
したがって、.693と0.105（.588）の違いは、ＡＰ部位に於いてＤＮＡを切断することで導入された鎖の切断数であり、したがってこれはＤＮＡのＡＰ部位の数と等しい。
脱プリン（ｋ1）とβ脱離（ｋ2）の速度定数を決定する方法  −  脱プリン（ｋ1）とβ脱離（ｋ2）の速度定数を決定するためには、まずこれらの速度定数と、幾つかの簡単に測定できるＤＮＡ安定性パラメータとの数学的関係を定める方程式が必要である。今回の場合、本発明者らは、ｋ1値とｋ2値を含んだ、プラスミド（ＳＢ）当たりの鎖の切断数と、プラスミド当たりのＡＰ部位の数の関係を定めた方程式を得た。本発明者らはすでに、ＳＢと％ＳＣ・ＤＮＡの関係を表現（上記）したので、次に、ＤＮＡ安定性データ（時間経過中に％ＳＣ・ＤＮＡを測定したもの）、および、ＥＤＴＡとエタノールを含むＤＮＡワクチン製剤に於けるｋ1値とｋ2値を決定するＡＰ部位測定法を用いるのが適切であろう。
分子の母集団に於いて、各時点でのプラスミド（ＳＢ）当たりの鎖の切断数は、その時点までに生産されたＡＰ部位の総数（ＴＡＰ）から、プラスミド当たりのＡＰ部位の数（ＡＰ）を差し引いた残値と等しい、という仮定から、本発明者らは出発することができる。計算を簡単にするために、本発明者らはさらに、出発時のＤＮＡがＡＰ部位を全く含まない、または０時間に於ける鎖の切断数は全くない、ことを仮定する。そうすると、
ＳＢ＝ＴＡＰ−ＡＰ
ＴＡＰ＝ｋ1（ＰＢ）t  であるので、ｋ1を脱プリン速度定数、
ＰＢ＝プリン塩基の数、ｔ＝時間、として、
ＳＢ＝ｋ1（ＰＢ）t−ＡＰ
しかし、ＡＰはｋ1、ｋ2、ＰＢの関数として表現されなければならない。したがって、ＡＰの変化率は、ＡＰ部位の生産率から、鎖切断への変換率を差し引いたものと同等であると定められる。次に、積分によってＡＰが解かれる。
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ＡＰ初期値がゼロであると仮定すると、
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ここで、ＡＰの形式を、ＳＢについての方程式に代用して、各時点でのプラスミド当たりの鎖の切断数を示す方程式が得られる。
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あるいは、ＡＰから関算してＳＢと算出し得る
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ｋ1とｋ2の決定の結果  −  上記の方程式を用いて導かれたｋ1とｋ2が、ＥＤＴＡとエタノールを含む40、50、60、80℃に於けるＤＮＡワクチン製剤のために決定された。その結果を表16に示す。また表16は、同じｐＨと温度条件下に於ける、すでに発表されているｋ1とｋ2と、測定されたｋ1とｋ2との比較も示してある。50℃では、製剤から得られたｋ1値は、同じｐＨ、温度条件下で発表されている値に比べて、ほぼ７分の１で、かなり小さい値である。この結果は、この製剤でｋ1とｋ2が、発表されている速度定数（Lindahl et al.,1972,Biochemistry 11:3610-3618）に比べてかなり小さいことを明らかに示している。この結論は、もしＤＮＡのフリーラジカル酸化が効果的に制御されれば、すでに脱プリンとβ脱離の速度定数として発表されている値に基づいて予測されたものより、ＤＮＡはずっと安定であることを示唆している。さらに、この結果は、発表されている速度定数は、フリーラジカル酸化が制御されていないために、間違いであるかのように数値が大きいことを示唆している。
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ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨ存在下での、脱プリン（ｋ１）とβ脱離（ｋ２）の活性化エネルギーを決定するために、また、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨを含むＰＢＳ中でのＤＮＡの分解機構が主として脱プリンとβ脱離によるものかどうかを調べるために、上記のデータを用いて、アレニウスプロットの作製を行った。その結果、図29と30に示してある。その結果から、脱プリンとβ脱離の活性化エネルギーは、それぞれ28.4と25.2kcal/molであることが明らかになった。これらの値は脱プリンに対して発表されている値、31±2kcal/molと28kcal/mol（Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610-3618 ; Greer and Zamenhof, 1962, J. Mol. Biol. 4: 123）と、β脱離に対して発表されている値、24.5kcal/mol（Lindahl and Andersson, 1972, Biochemistry 11: 3618）に、非常に正確に一致する。これらの結果は、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨを含むＰＢＳ中でのＤＮＡの分解機構が、主として脱プリンとβ脱離によるものであること、そして、これらの反応の機構は、ＥＤＴＡとエタノールの存在によって変化しないことを示唆している。これらのデータは同時に、他の温度条件下（ｐＨ7.4）で行った場合の、ＤＮＡ安定性研究での超らせんＤＮＡ残存率を予測することを可能にし、製剤に於いて、フリーラジカル酸化を効率的に制御することを可能にする。
100ｍＭ  ＥＤＴＡと１％エタノール（ｐＨ7.4）を含むＤＮＡワクチン製剤に於けるＤＮＡ安定性が、発表されている速度定数によって予測した値よりも遥かに大きいことを示すために、２つの安定性予測について、ＤＮＡ安定性データをプロットして、下記に示した（図３１）。その結果は、この製剤中のＤＮＡが、発表された速度定数が示唆する値よりも遥かに良く安定していることを顕著に示している。さらに、この結果は、実験的に得られた速度定数が、発表された速度定数を使うよりも、良い予測値を与えることを示している。
実験的に得られた速度定数（ｋ1とｋ2）、および速度定数と％ＳＣ・ＤＮＡついて得られた関係を用いて、室温に於ける長期安定性を確保するために必要である製剤のｐＨを予測することも可能である。これらの予測（図３２参照）によれば、ガラスアンプル中で、30℃で２年間に渡ってＳＣ・ＤＮＡを50％以上、維持するためには、ＤＮＡワクチン製剤（ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨを含む）のｐＨを約8.0にするのが望ましいことを示唆している。
これらの結果は、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨが効果的にＤＮＡワクチン製剤に於けるフリーラジカル酸化を制御することを示しており、それによって、脱プリンとβ脱離について発表されている速度定数からは予測できないほど高いレベルまで、ＤＮＡ安定性を向上させることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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