(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）Cdk5蛋白質、及び、配列番号14のDNAによりコードされるアミノ酸配列の28番目以降のアミノ酸配列を含む蛋白質に、被験物質を接触させる工程、及び、２）Cdk5阻害活性を有する物質を選択する工程を含む、Ａβ産生抑制剤をスクリーニングする方法
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬、殊にサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ：Ｃｄｋ）阻害活性を有する物質を有効成分とするβアミロイド（Ａβ）産生抑制用医薬組成物、Ｃｄｋ阻害活性を有する物質を細胞に接触させＡβ産生量を検出する方法、及び当該Ａβ産生抑制用医薬組成物を投与することからなる痴呆又はアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）治療法に関する。
背景技術
高齢化社会において痴呆は深刻な問題になってきている。痴呆とは記憶、判断力、理解力、言語、行為能力、認識、感情、意欲又は性格など諸々の精神機能が脳の器質的障害によって日常生活や社会生活を満足に送れなくなった状態である。その中でもＡＤは病理学的には神経細胞の脱落、シナプス数の減少、脳内の老人斑、又は神経原線維変化の蓄積などの変化を特徴とする（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４８，１０５８−１０６０、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８６）３１４，９６４−９７３及びＮｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，（１９９５）１６，３６５−３８０）。老人斑のアミロイド物質はＡβと呼ばれる蛋白質であり、アミロイド前駆体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）が代謝を受ける過程で生成される（Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５，７３３−７３６）。ＡＰＰの代謝には、Ａβドメインの中心でα−セクレターゼによる切断を受ける経路（アミロイド非産生経路）とβ−セクレターゼによりＡβドメイン保存的な切断を受け、さらにγ−セクレターゼによる切断を受けてＡβを生成する経路（アミロイド産生経路）の２通りの代謝経路が知られている（Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０，４１８−４２３、Ｓｉｎｈａ，Ｓ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１１０４９−１１０５３）。これらの二経路で代謝されるＡＰＰの比率、つまりＡβ産生量は外来性、あるいは内因性物質の影響によって変化することが知られている。例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化がＡＰＰ以外の分子のリン酸化を亢進することで、間接的にＡＰＰの代謝を変動させアミロイド非産生経路の比率を高めることが知られている（Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０，４１８−４２３）。
近年、Ａβの生成とその脳内での蓄積がＡＤの発症機構に深く関与していることがわかってきた。その主たる研究背景は、（１）Ａβが初代培養神経細胞において、神経細胞死を引き起こすこと、（２）老人斑の蓄積が、ＡＤにおける病理変化の初期的変化であると考えられること、及び（３）家族性ＡＤに認められる変異型ＡＰＰ遺伝子あるいは変異型Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １又は２遺伝子を宿主細胞に導入すると、それぞれ野生型ＡＰＰ遺伝子や野生型Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １又は２遺伝子を導入した場合と比べて、Ａβ産生の亢進、あるいはＡβ１−４０に対してよりアミロイド形成能が高いとされる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１，１８２９５−１８２９８）Ａβ１−４２の産生比率の上昇が認められること、などである（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１，１８２９５−１８２９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５，６３０−６３１及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，１１０４９−１１０５３）。
また、ＡＰＰはその細胞内ドメインでリン酸化されることが知られている（Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３，１１１−１２３）。末梢細胞（非神経細胞）ではＣｄｋの一種、Ｃｄｃ２（Ｃｄｋ１）がＡＰＰのＴｈｒ６６８（ＡＰＰの６６８番目のスレオニン残基、アミノ酸番号はＡＰＰ６９５に基づく：以下ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８））のリン酸化に関与することが示されている（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）１３，１１１４−１１２２）。近年、本残基が神経細胞やＰＣ１２細胞のような神経芽腫瘍細胞においてもリン酸化されていること、並びに本残基のリン酸化が神経におけるＡＰＰの機能発現に重要な役割を担っていることが明らかにされた（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９，４４２１−４４２７）。
前述のＣｄｋは、真核生物の細胞周期を制御するセリン／スレオニンキナーゼとして発見された。Ｃｄｋは単体では活性を示さず、活性化のためにサイクリンと呼ばれる制御サブユニットとの結合が必要である。ほ乳動物では、これまでに少なくとも８種類のＣｄｋの存在が知られている（蛋白質核酸酵素（１９９７）４２，１５５４−１５６１）。Ｃｄｋ５は、その一次構造上の類似性からＣｄｋの一種として発見されたが（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９２）１１：２９０９−２９１７）、その活性化のためにサイクリンは必要なく、代わりにｐ３５やｐ３９と呼ばれるサブユニットとの結合が必要であることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７１（６４９６）：４２３−４２６、及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２６８９７−２６９０３）。これらのサブユニットは神経細胞に特異的に発現しており、Ｃｄｋ５は神経細胞の機能、すなわち、神経細胞における突起伸展反応や発生過程における神経細胞の移動に関与することが知られている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９，６０１７−６０２６、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（１９９６）１０，８１６−８２５）。つまり、Ｃｄｋ５は細胞周期の制御に関与するのではなく、Ｃｄｋとして分類されるものの、その機能は他のＣｄｋとは異なるものである。Ｃｄｋ５の主な基質としてはＡＰＰ、タウ、及びニューロフィラメント等が知られている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２０００）７５，１０８５−１０９１、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９７）７６５，２５９−２６６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１，１４２４５−１４２５１、及びＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９３）３３６，４１７−４２４）。
Ｃｄｋを阻害する物質は細胞増殖制御に関与するものとして多数知られており、その作用機序から神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）に有用であるという報告はある。さらにそれらの報告にはタウ（ｔａｕ）のリン酸化にＣｄｋ５が関与するという推察からリン酸化タウを構成成分とする神経原線維変化の形成を抑制することでＡＤに当該物質が有用であるかもしれないと記載されている（国際公開ＷＯ９９／０７７０５、ＷＯ９９／０２１６２、ＷＯ９９／６５８８４，ＷＯ９９／３０７１０、ＷＯ９９／６２８８２、若しくはＷＯ００／２１５５０、及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９５）１１７，７４１−７４９）。
以上の如く、Ｃｄｋ特にＣｄｋ５並びに神経細胞、Ａβ並びにＡＤとの関係及びＣｄｋ５によるＡＰＰのリン酸化についてはいくつか報告はあるが、ＣｄｋがＡＰＰの代謝、特にＡβ産生量にどのような影響があるかについて示唆する報告はない。即ちＣｄｋ阻害活性を有する物質のＡβ産生量に及ぼす影響を示唆する報告はない。
発明の開示
本発明者らは、痴呆特にＡＤ等の機序解明につき鋭意検討した結果、Ｃｄｋ阻害活性を有する物質が神経細胞におけるＡβの産生を抑制できることを見出した。具体的にはラット初代培養神経細胞にヒトＡＰＰ遺伝子を過剰発現させた系において、当該Ｃｄｋ阻害物質存在下、又はその非存在下でのＡβ産生量を比較検討した結果、Ｃｄｋ阻害活性を有する物質がＡβ産生量を低下させることを明らかにした。本発明により、Ａβ産生抑制が達成された結果、例えば痴呆やアルツハイマー病等の治療に有効である。
即ち、本発明はサイクリン依存性キナーゼ阻害活性を有する物質を有効成分とするβアミロイド産生抑制用医薬組成物であり、好ましくはサイクリン依存性キナーセ５阻害活性を有する物質を有効成分とするβアミロイド産生抑制用医薬組成物である。
また、本発明は抗痴呆薬又は抗アルツハイマー病薬であるβアミロイド産生抑制用医薬組成物である。
更に、本発明はアミロイド前駆体蛋白質スレオニン結合リン酸化阻害活性を有する物質を有効成分とするβアミロイド産生抑制用医薬組成物である。
別の態様として本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害活性を有する物質を細胞に接触させβアミロイド産生量を検出する方法であり、好ましくはサイクリン依存性キナーゼがサイクリン依存性キナーゼ５であるβアミロイド産生量を検出する方法である。またβアミロイド産生抑制剤をスクリーニングする方法である前記βアミロイド産生量を検出する方法やβアミロイド産生量を検出する方法を用いた痴呆又はアルツハイマー病診断用キットである。また、本発明はアミロイド前駆体蛋白質スレオニン結合リン酸化阻害活性を有する物質を細胞に接触させ、βアミロイド産生量を検出する方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明につき詳述する。
「サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）阻害活性を有する物質」とは、真核生物の細胞周期あるいは神経の突起進展反応や発生過程における神経細胞の移動などの神経細胞の機能を制御するセリン／スレオニンキナーゼ阻害機能を維持するものであり、Ｃｄｋサブタイプ間での選択性は特に必要としないが、少なくとも神経細胞で機能するＣｄｋサブタイプであるＣｄｋ５に対しては阻害機能を維持する物質である。例えばそのような化合物としては、国際公開公報ＷＯ９７／０８４２、ＷＯ９７／１６４４７、ＷＯ９８／３３７９８、ＷＯ９８／５０３５６、ＷＯ９９／０７７０５、ＷＯ９９／０２１６２、ＷＯ９９／０９０３０、ＷＯ９９／１５５００、ＷＯ９９／０３０７１０、ＷＯ９９／３４０１８、ＷＯ９９／６２５０３、ＷＯ９９／６５９１０、ＷＯ００／０１６９９、ＷＯ００／１２４９６、ＷＯ００／２１９２６、ＷＯ００／１８７３４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００），２２４，７７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００），２６７，５９８３、又はＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），７，１２８１等が挙げられる。代表的なものとしてロスコビチン（Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、アルステルパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）又はそれらの化学修飾体が挙げられる（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）４２，２９０９−２９１９、及びＴｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）６，３９３−３９７）。更に市販品又はケミカルファイルに登録されている公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、抗体やドミナントネガティブ体蛋白質が挙げられる。更に当該物質を当業者には常法である化学変換による置換基等修飾したものも挙げられる。
具体的には、下記一般式で示される縮合ヘテロ環誘導体（Ｉ）若しくはその製薬学的に許容される塩、及びアルステルパウロン（ＩＩ）若しくはその製薬学的に許容される塩から選択された化合物である上記Ａβ産生抑制用医薬組成物、
0004216503.tif 000002
（Ｒ１：Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、炭化水素基−Ｓ−、炭化水素基−Ｏ−、ＮＲ４Ｒ５、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいヘテロアリール、又は置換されてもよいヘテロ環基
Ｘ：Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）ｍ、ＣＨ又はＮＲ６
ｍ：１又は２
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６：同一又は異なってＨ、ＯＨ、ＳＨ、炭化水素基−Ｓ−、炭化水素基−Ｏ−、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−、置換されてもよいヘテロアリール、又は置換されてもよいヘテロ環基
Ｙ１：Ｎ又はＣＲ７
Ｙ２：Ｎ又はＣＲ８
Ｙ３：Ｎ又はＣＲ９
Ｒ７、Ｒ８及びＲ９：同一又は異なってＨ、ＯＨ、ＳＨ、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−、置換されてもよい炭化水素基−Ｓ−、置換されてもよい炭化水素基−ＣＯ−、置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−ＣＯ−、又はＲ１０Ｒ１１ＮＣＯ−
Ｒ１０及びＲ１１：同一又は異なってＨ、置換されてもよい炭化水素基、又は置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−）、
好ましくは下記一般式で示されるプリン誘導体（ＩＩＩ）又はその塩である上記Ａβ産生抑制用医薬組成物であり、
0004216503.tif 000003
（Ｒ１：Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、炭化水素基−Ｏ−、置換されてもよい炭化水素基−Ｓ−、ＮＲ４Ｒ５、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよいヘテロアリール、又は置換されてもよいヘテロ環基
Ｘ：Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）ｍ、ＣＨ又はＮＲ６
ｍ：１又は２
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６：同一又は異なってＨ、ＯＨ、置換されてもよい炭化水素基、置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−、置換されてもよいヘテロアリール、又は置換されてもよいヘテロ環基）であり、
更に好ましくは下記一般式で示される１−アミノプリン誘導体又はその塩である上記Ａβ産生抑制用医薬組成物
0004216503.tif 000004
（Ｒ１２：ＯＨ若しくはフェニルで置換されてもよい低級アルキル、又はアミノ若しくはＯＨで置換されてもよいシクロアルキル若しくはアリール
Ｒ１３：低級アルキル、又はシクロアルキル
Ｒ１４：低級アルキル、低級アルキル−Ｏ−低級アルキル、又はハロゲン、ＯＨ若しくは低級アルキル−Ｏ−で置換されてもよいアリール若しくはアラルキル）である。
但し、当該物質であってもＣｄｋ阻害活性に由来しない非選択的な細胞への影響を有する物質は除く。例えば当該物質が、ＰＫＣ阻害活性を併せ持つなど、Ａβ量を上昇させるような作用を有する場合である。
前記一般式中の記号は以下の通りである。
「ハロゲン」とはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子などがあげられる。
「炭化水素基」とはＣ１−１５、好ましくはＣ１−１０の直鎖又は分岐状の炭素及び水素からなる基であり、具体的にはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、シクロアルキル−アルキル、シクロアルケニル−アルキル、アリール−アルキル、シクロアルキル−アルキケニル、シクロアルケニル−アルケニル、アリール−アルケニル、シクロアルキル−アルキニル、シクロアルケニル−アルキニル、又はアリール−アルキニルを意味する。
「アルキル」とは直鎖又は分岐状飽和炭化水素基を意味し、好ましくはＣ１−１０アルキルであり、具体的にはメチル、エチル、イソプロピル、ヘキシル、又はデシル等が挙げられる。
「アルケニル」とは直鎖又は分岐状で且つ少なくとも１以上の二重結合を有する炭化水素基を意味し、好ましくはＣ２−１０アルケニルであり、具体的にはビニル、プロペニル、アリル、イソプロペニル、又はヘキセニル等が挙げられる。
「アルキニル」とは直鎖又は分岐状で且つ少なくとも１以上の三重結合を有する炭化水素基を意味し、好ましくはＣ２−１０アルキニルであり、具体的にはエチニル、プロピニル、又はブテニル等が挙げられる。
「シクロアルキル」並びに「シクロアルケニル」とは、単環式飽和並びに不飽和炭化水素基を意味し、好ましくは「Ｃ３−８シクロアルキル」並びに「Ｃ３−８シクロアルケニル」であり、具体的にはシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロペンテニル基等が挙げられる。
「アリール」とは芳香族炭化水素基を意味し、好ましくはＣ６−１４アリールであり、具体的には、フェニル、トリル、クメニル、キシリル、ナフチル、又はビフェニル等が挙げられる。
「シクロアルキル−アルキル」、「シクロアルケニル−アルキル」並びに「アリール−アルキル」とは上記アルキルの任意の位置の水素が上記シクロアルキル、シクロアルケニル並びにアリールで置換された基であり、具体的にはシクロヘキシルメチル、ベンジル又はフェネチル等である。
「ヘテロアリール」とはＮ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子を１乃至４個含有する５乃至６員単環式ヘテロアリール、並びにベンゼン環と縮合した２環式ヘテロアリールであり、部分的に飽和されていてもよい。ここに、単環式ヘテロアリールとしては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジル、ピラジニル又はピリミジルが、二環式ヘテロアリールとしては、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、キノリル、又はキノキサリニルがあげられる。好ましくは、５乃至６員単環ヘテロアリールであり、中でも、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジルである。
「ヘテロ環基」とは窒素原子、酸素原子又は硫黄原子から選択されるヘテロ原子１乃至３個を含む３乃至７員飽和又は非芳香性不飽和環基を意味し、例えばオキサゾリジニル、テトラヒドロフラニル、１，４−ジオキサニル又はテトラヒドロピランである。
「アシル」とはＨＣＯ−、Ｃ１−１５炭化水素基−ＣＯ−、Ｃ１−１５炭化水素基−ＣＳ−、ヘテロアリール−ＣＯ−、ヘテロアリール−アルキル−ＣＯ−、ヘテロアリール−アルケニル−ＣＯ−、ヘテロアリール−アルキニル−ＣＯ−、ヘテロ環−ＣＯ−、ヘテロ環−アルケニル−ＣＯ−、ＨＣＳ−、ヘテロアリール−ＣＳ−、ヘテロアリール−アルキル−ＣＳ−、ヘテロアリール−アルケニル−ＣＳ−、ヘテロアリール−アルキニル−ＣＳ−、ヘテロ環−ＣＳ−、又はヘテロ環−アルケニル−ＣＳ−が挙げられる。好ましくはＣ１−１５炭化水素基−ＣＯ−であり、具体的にはホルミル、アセチル、プロピオニル、２−メチルブタ−２−エノイル又はベンゾイル等が挙げられる。
「炭化水素基−Ｏ−」とはアルコキシを意味し、メトキシ、エトキシ又はフェノキシ等が挙げられる。
「エステル化されたカルボキシル」とは「炭化水素基−Ｏ−ＣＯ−」を意味し、メトキシカルボニル又はエトキシカルボニル等が挙げられる。更に当該エステル化されたカルボキシルは、上記アシルで置換された基を含む。
「置換されてもよい炭化水素基」、「置換されてもよい炭化水素基−Ｏ−」、「置換基されてもよいヘテロアリール」又は「置換されてもよいヘテロ環基」における置換基としては、これらの環に置換可能な基であれば特に制限は無い。これらは、同一又は異なる任意の置換基１〜５個を有する。
具体的には、下記Ａ群から選ばれる基である
置換基Ａ群
ハロゲン；ＣＮ；ＮＯ２；アルコキシ；ＲａＲｂＮ−（Ｒａ、Ｒｂ：同一又は異なって、水素原子、炭化水素基、ヘテロアリール、ヘテロアリール−アルキル、ヘテロ環、ヘテロ環−アルキル、又はアシル（以下同様））；エステル化されたカルボキシル又はＲａＲｂＮ−で置換されてもよい炭化水素基；炭化水素基で置換されてもよいヘテロアリール；炭化水素基で置換されてもよいヘテロ環；アシル；
Ｄ１−Ｇ１−（Ｄ１：ヘテロアリール、ヘテロ環、又はＲａＲｂＮ−、Ｇ１：−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＯ−、又は−ＣＯ−Ｏ−、ｎ：０、１又は２）；
Ｄ２−Ｇ２−（Ｄ２：Ｈ、アシル−Ｃ１−６アルキル、ヘテロアリール−Ｃ１−６アルキル、又はヘテロ環−Ｃ１−６アルキル、Ｇ２：−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＯ−、又は−ＣＯ−Ｏ−）；
Ｄ３−Ｇ３−（Ｄ３：アルコキシ又はエステル化されたカルボキシルで置換されてもよい炭化水素基、Ｇ３：−Ｓ（Ｏ）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＯ−、又は−ＣＯ−Ｏ−）。
本発明有効成分は、二重結合を有するため幾何異性体や互変異性体が存在する。本発明にはこれらの異性体の分離したもの、あるいは混合物をも包含される。
また、置換基の種類によっては本発明化合物は不斉炭素原子を有する場合があり、不斉炭素原子に基づく異性体が存在しうる。本発明にはこれら光学異性体の混合物や単離されたものを包含する。また、本発明には、本発明化合物を放射性同位元素でラベル化した化合物も包含する。
更に、本発明有効成分は、酸付加塩又は置換基の種類によっては塩基との塩を形成する場合もあり、かかる塩が製薬学的に許容され得る塩である限りにおいて本発明に包含される。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、又はグルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。更に当該物質は水和物、エタノール和物等の各種溶媒和物として、あるいはそれらの結晶多形の物質として単離される場合もあり、本発明にはそれら各種の水和物、溶媒和物や結晶多形の物質も包含される。
また、本発明有効成分は、生体内で代謝され変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て包含される。本発明のプロドラッグを形成する基としては、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．，５，２１５７−２１６１（１９８５）や「医薬品の開発」第７巻（廣川書店，１９９０年）分子設計１６３−１９８に記載の基等が挙げられる。
「βアミロイド（Ａβ）」とは老人斑（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）を形成するアミロイド物質である。当該物質は、βプロテインともよばれ、ＡＰＰがプロテアーゼにより分解されること（プロセッシング）によって生成される（Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５，７３３−７３６）。具体的にＡβとはＡＰＰが生合成後の細胞内分泌過程、または細胞膜から取り込まれて代謝を受ける過程で、プロテアーゼにより分解（プロセッシング）され、β−セクレターゼによりＡβドメイン保存的に切断され、さらにγ−セクレターゼにより切断された断片を意味する（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９９）２０，４１８−４２３、及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，１１０４９−１１０５３）。主にアミノ酸残基が４０あるいは４２からなるＡβと呼ばれる蛋白質、それぞれＡβ１−４０（配列番号１）又はＡβ１−４２（配列番号２）であるがそれ以外にもそれらの１乃至複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入体が挙げられる。
「アミロイド前駆体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）」とは前述Ａβの前駆体であり、好ましくは４７アミノ酸からなる短い細胞質ドメイン又は当該細胞質ドメインの１乃至複数個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入されてもよいドメインを持つ１回膜貫通型の膜蛋白質である。具体的には、６９５個、７５１個又は７７０個のアミノ酸からなる蛋白質ＡＰＰ６９５（配列番号３）、ＡＰＰ７５１（配列番号４）、ＡＰＰ７７０（配列番号５）の３種のアイソフォームのそれぞれを意味する。
「ＡＰＰのリン酸化」とは、ＡＰＰの生体内、例えば細胞内分泌過程、細胞膜上、または細胞膜から取り込まれて代謝の際に起こるＡＰＰへのリン酸の付加を意味する。具体的なＡＰＰへのリン酸付加位置は、ＡＰＰの長さにもよるが、ＡＰＰ６９５の場合は、当該ＡＰＰ細胞内ドメインに位置する６６８番目のスレオニン残基（ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８））（アミノ酸番号はＡＰＰ６９５に基づく）がリン酸化されること（Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３，１１１−１２３）を意味する。
「ＡＰＰのリン酸化阻害活性を有する物質」とは、ＡＰＰ細胞内ドメインに位置する６６８番目のスレオニン残基のリン酸化を阻害する物質である。具体的には当該阻害活性があれば何れでもよいが市販品又はケミカルファイルに登録されている公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、抗体やドミナントネガティブ体蛋白質が挙げられる。更に当該物質を当業者には常法である化学変換による置換基等修飾したものも挙げられる。
「ドミナントネガティブ体」とは、蛋白質の活性部位、あるいは活性調節部位に変異を導入し、活性を失わせた蛋白質を使用して、当該蛋白質と基質、あるいは調節因子などとの結合を拮抗させることにより、当該蛋白質の活性を特異的に阻害させる物質をいい、具体的にＣｄｋ５の場合には、リン酸転移反応に重要な部位である１４４番目のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変異させたもの、及びＡＴＰ結合部位である３３番目のスレオニン残基をリジン残基に変異させたものが、ドミナントネガティブ体蛋白質として知られている（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，８１６−８２５（１９９６））。
「痴呆」とは、記憶、判断力、理解力、言語、行為能力、認識、感情、意欲又は性格など諸々の精神機能が脳の器質的障害によって日常生活や社会生活を満足に送れなくなった状態を意味する。
「アルツハイマー病（ＡＤ）」とは、厳密には初老期に発症するＡＤと６５歳以上に発症するアルツハイマー型老年痴呆に分類されることもあるが、本明細書では両者を併せてＡＤとする。
従って、「抗痴呆薬」又は「抗アルツハイマー病薬」とは前述の疾患を治癒又は改善させる薬剤を意味する。
「サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）阻害活性を有する物質を細胞に接触させＡβ産生量を検出する方法」若しくは「アミロイド前駆体蛋白質のスレオニン結合リン酸のリン酸化阻害作用物質を細胞に接触させ、Ａβ産生量を検出する方法」とは、以下に詳述するが、当該物質のスクリーニング法、診断方法のためのキット、又はＡＤの機序解明の為の試験方法が挙げられる。好ましくは当該物質のスクリーニング方法である。
本発明Ａβ産生量の検出法につき詳述する。
ＡＰＰ遺伝子を発現するよう設計されたベクターＤＮＡの作製：
ＡＰＰ遺伝子は、ほ乳動物から昆虫にいたるまでその構造は広く保存されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９，１０７５８−１０７６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６，２４７８−２４８２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９８）３３０，２９−３３、及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，１２０４５−１２０４９）、本発明が実施可能ないかなる種のＡＰＰの１乃至複数個のＡＰＰ遺伝子あるいはそのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入した変異体も含まれる。家族性ＡＤに認められる変異型ＡＰＰ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３４９，７０４−７０６、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４，９７−９９、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５３，８４４−８４６、Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７，９７８−９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９１）１７８，１１４１−１１４６、Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７，１３４２−１３４３、及びＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９２）１，３４３−３４７）もこの中に含まれる。また、ＡＰＰ遺伝子からはスプライシングの違いによって配列の異なるＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０が産生されるが（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）７，１４７−１５３）、ここで言うＡＰＰとはＡＰＰ遺伝子から産生されるこれらすべての蛋白質を含むものである。
ベクターＤＮＡにはアデノウィルスベクター等ウィルス由来のものや（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５，２５０９−２５１４）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ｐＳＳＲ  α（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，４６６−４７２）等のほ乳動物細胞用発現ベクターなど、本発明の実施に影響しない公知のいかなる遺伝子導入ベクターも使用することができる。ＡＰＰの発現に用いるプロモーターも特に限定するものでない。
実験に用いる細胞や動物：
宿主細胞として、神経細胞初代培養系を用いることができる。好ましくは初代培養神経細胞が動物由来細胞、特にほ乳動物細胞である。例えば、通常実験動物として用いるほ乳動物、好ましくはラットやマウスの細胞であり、公知の方法に従い培養系の調製が行われる（Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．（１９８６）３０，４７−５６）。神経初代培養系の培養日数は、細胞が十分に分化する７日目以降が望ましく、好適には７−１０日目である。当該動物細胞は遺伝子操作を施した動物からの初代培養も含まれる。例えば、帯刀ら（１９９１）によって作製された温度感受性癌遺伝子導入トランスジェニックマウス（ＳＶ４０の自己プロモーターによってＳＶ４０温度感受性Ｔ抗原を発現したトランスジェニックマウス（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９７，５０−５６）から分離して樹立した細胞株も宿主細胞として挙げられる。また、ＰＣ１２細胞株（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７８）７８，７４７−７５５）などのすでに樹立された培養細胞株も挙げられる。使用できる細胞は特に神経由来細胞に限るものではない。またほ乳動物以外の細胞も使用でき、例えばショウジョウバエ由来の細胞が挙げられる。
遺伝子導入法として、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７３）５２，４５６−４６７）やＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、ＦＵＧＥＮＥＴＭ６法（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ社）などを用いることでＡＰＰ遺伝子を一過性にまたは安定的に細胞に発現させることもできる。
ＡＰＰの発現を何らかの刺激によって誘導可能に設計した発現ベクターを細胞に安定的に発現させることもできる。例えば、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９１，４６４７−４６５３）の場合、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を培地中に添加することでＡＰＰ蛋白質の発現を誘導できる。内在性のＡＰＰ発現量がＡβ産生量を測定するに十分である場合、特に外来性のＡＰＰを過剰発現することなく本発明を実施することが可能である。
さらにＡＰＰ遺伝子を導入したトランスジェニック動物も使用できる。トランスジェニック動物は、単離した遺伝子を受精卵に注入後、その受精卵を偽妊娠動物に移植し、個体まで発生させることで作製できる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）２１４，１２４４−１２４６）。この場合、被検化合物のＡβ産生抑制作用を個体レベルで観察することができる。これらのトランスジェニック動物はｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎやＣｄｋ５過剰発現トランスジェニック動物と掛け合わせ、被検化合物のＡβ産生抑制作用の検出に利用することもできる。また、ＡＰＰ遺伝子は、動物個体に直接ウィルスベクターなどによって導入することもできる。ウィルスベクターには、ヘルペス単純ウィルスやアデノウィルスなどのウィルス由来のものを用いることができる（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９６）１６，４８６−４９６，及びＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９９７）７１，７７−８４）。
Ａβ産生量測定：
Ａβは正常な状態においても生成され細胞外に放出されることが知られており（Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５９，３２２−３２５、及びＳｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５８，１２６−１２９）、ＡＤの脳においてもＡβの蓄積は細胞外に認められている。従って、Ａβ産生量測定法は培養細胞の場合、培養液中に遊離されたＡβ量を測定しＡβ産生量とすることが望ましい。また間接的ではあるが細胞内に存在するＡβ量を測定することも可能である。またヒトを含む動物個体を用いた実験の場合、脳脊髄液などの体液中や組織全体のＡβ量を測定することができる。従って、本発明医薬組成物を患者に投与してＡβ量を測定する診断用キットに本発明検出方法を用いることができる。
Ａβ量の定量には酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）など公知の方法を用いる。酵素免疫測定法では、例えば第一ステップとして６Ｅ１０（Ｗａｋｏ社）のような抗Ａβ抗体を採取した細胞培養液中のＡβ、あるいはスタンダードとなるＡβ１−４０若しくはＡβ１−４２と反応させ、第二ステップとして例えばＲ１６３若しくはＲ１６５（ＤＲ．ＰＤ  Ｍｅｈｔａ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のようなそれぞれＡβ１−４０若しくはＡβ１−４２と特異的に結合する抗体と反応させた後に、ペルオキシダーゼなどの酵素で標識した適当な抗ＩｇＧ抗体を反応させる。培養液中のＡβ量はペルオキシダーゼなどの酵素活性を測定することにより定量する（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７２）４７，８４６−８５１）。ＥＬＩＳＡ法にはＳｉｇｎａｌ  ＳｅｌｅｃｔＴＭ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）、あるいはＨｕｍａｎ  ａｍｙｌｏｉｄβ（１−４２）測定Ｋｉｔ（ＩＢＬ社）など、市販されているキットを用いることもできる。他にウェスタンブロッティング法やドットブロッティング法による定量法なども用いることができる（Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７，６８０−６８５、及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６，４３５０−４３５４）。
被検化合物の評価：
上記の方法によって、多数の被検化合物を用いてＣｄｋ好ましくはＣｄｋ５阻害活性に基づくＡβ産生抑制作用を検出する方法、若しくはＡＰＰのスレオニンリン酸のリン酸化を阻害することに基づくＡβ産生抑制作用を検出する方法が挙げられる。例えば被検化合物を最終的に１ｎＭから２００μＭとなるように細胞培養液中に加えて一定の時間の後に培養液を採取して前述の方法によってＡβ産生量を定量する。Ｃｄｋ５阻害活性は例えば免疫沈降や適当なカラムなどで動物細胞、動物組織から精製したＣｄｋ５や、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞に発現させ精製したリコンビナントＣｄｋ５及びｐ２５（ｐ３５又はｐ３９、あるいはそれぞれの活性部位断片、ｐ２１、Ｎ１４５、及びｐ３０などを用いることができる（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７１（６４９６）：４２３−４２６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：１２３１８−１２３２７、及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２６８９７−２６９０３））を、適当なバッファー中で放射性標識したＡＴＰ並びに適当な基質となる蛋白質あるいはペプチドと反応させた後に、基質に取り込まれた放射量をいわゆるｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ（ＳＰＡ法）やオートラジオグラフィーによって測定することで決定することができる（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４３，５２７−５３６、及びＢｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６８，３１８−３２９）。ＡＰＰリン酸化の程度は細胞を溶解剤にて可溶化した後に例えばＡＰＰのリン酸化状態に特異的に反応する抗体を用いたウェスタンブロッティング法により定量することができる（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９，４４２１−４４２７）。
本発明の方法により評価できる被検化合物として、市販品又はケミカルファイルに登録されている公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物なども用いることができる。また、抗体やドミナントネガティブ体蛋白質等も用いることができる。さらに、本発明の方法で見いだされた物質を化学的に修飾したものも用いることができる。
以下本発明Ａβ産生抑制用医薬組成物につき詳述する。
本発明Ａβ産生抑制用医薬組成物は、通常製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、注射剤、座剤、軟膏、貼付剤等に調製され、経口的（舌下投与を含む）または非経口的に投与される。
本発明Ａβ産生抑制用医薬組成物はヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年令、性別、投与ルート等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１人当たり、１日につき０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲で１日１回から数回に分け経口投与されるか、または成人１人当たり、１日につき０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲で、１日１回から数回に分け静脈内投与されるか、または、１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内持続投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もある。
本発明Ａβ産生抑制用医薬組成物の経口投与のための剤型としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような剤型においては、１つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも１つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有していても良い。錠剤または丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣又は胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで被膜しても良い。さらに当該剤型は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化乃至溶解補助剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していても良い。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の様な植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（商品名）等がある。この様な組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、可溶化乃至溶解補助剤のような添加剤を含んでも良い。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射溶媒に溶解して使用することもできる。
以下、本発明を更に具体的に開示するために、実施例を記載するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ラット海馬初代培養神経細胞におけるＡＰＰリン酸化量並びにＡβ産生量の測定系の構築：
（１）ＡＰＰアデノウィルスベクターの作製：
ＡＰＰ遺伝子には、ヒト由来の６９５個のアミノ酸をコードするＡＰＰ６９５遺伝子（配列番号６）を用いた。アデノウィルスベクターの作製は、ＡＤＥａｓｙシステム（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９８）９５，２５０９）に準じた。ＡＰＰ６９５遺伝子は、末端を平滑処理後、ＣＡＧプロモーターを付加するためにｐＣＡＧ−ｐＡ（Ｇｅｎｅ（１９９１）１０８，１９３−２００）のＨｉｎｃＩＩサイトへ一旦導入した後、ＣＡＧプロモーターとその下流のＡＰＰ遺伝子をＰｓｔＩとＸｈｏＩサイトを用いて切り出し、末端平滑後に、ＡＤＥａｓｙシステムのシャトルベクター、ｐＡＤＴｒａｃｋのＥｃｏＲＶサイトへ導入した。ＡＰＰ遺伝子を導入したシャトルベクターはＰｍｅＩにより直鎖状にし、ｐＡＤＥａｓｙ−２ベクターとともに大腸菌株ＢＪ５１８３に導入し、ウィルスゲノム組み換えプラスミドを作製した。
（２）アデノウィルスの調製：
ＡＰＰ遺伝子を含む組み換えアデノウィルスベクターは、Ｐａｃｌ処理により直鎖状にした後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）によりＨＥＫ２９３細胞に導入し、３−５日後、細胞がプレートから剥がれてきた時点で、すべての細胞を回収した。組み換えアデノウィルスは細胞の凍結融解操作を繰り返すことによって、その上清から取得した。得られた組み換えアデノウィルスはＨＥＫ２９３細胞に感染を繰り返し、大量調製した後、ＣｓＣｌ法により濃縮、精製したものを実験に使用した。
（３）ラット初代培養神経細胞の調製：
妊娠ラットをジエチルエーテルにて麻酔し、胸部（心臓）切開により失血死させた後、腹部を切開し子宮を摘出した。クリーンベンチ内で胎児を消毒用アルコールにより滅菌し、全脳を取り出し無血清培地（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト社）の入ったシャーレ中に回収し、実体顕微鏡下で精密ピンセットにより海馬を摘出した。海馬は５０ｍｌチューブに移し、静置により組織を沈降させ上清を吸引除去し、細胞分散溶液（１％ｐａｐａｉｎ、１５０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅｌ、０．０２％Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ、０．０２％ＢＳＡ、０．５％Ｇｌｕｃｏｓｅを含むＰＢＳ）を加え、３７℃にて１５分間インキュベートの後に、遠心した（１０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）。さらに上清を吸引除去し、無血清培地を１０ｍｌ加え、ピペッティング操作を数回行い、その後フィルターを用いて細胞塊を除き細胞浮遊液とした。トリパンブルーを用いて細胞数を計数し、１．５Ｘ１０５個の細胞を４８穴のｐｏｌｙ−Ｉ−ｌｙｓｉｎｅコートされた培養皿に播種した。十分に分化させるため、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０日間培養した後に、実験に使用した。
（４）初代培養神経細胞へのアデノウィルスの感染：
アデノウィルスの感染は、培養１０日目に行った。１．５Ｘ１０８粒子のウィルスを適当に希釈し、１．５Ｘ１０５個の細胞に対してＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が１０００となるように培地中に添加した。感染４日目にサンプルの回収を行った。
（５）ＡＰＰリン酸化測定：
１．５Ｘ１０５細胞当たり５０μｌの細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、２．７Ｍ  ｕｒｅａ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ）を加えチューブに回収し、約５秒間超音波破砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により得られた上清をサンプルとした。サンプルの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）により分離した後、セミドライブロッティング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（第一化学薬品社）に転写した。得られたＰＶＤＦ膜は４℃で一晩ブロックエース（第一化学薬品社）中に浸し、ブロッキング操作を施した。ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）のリン酸化を検出するためのポリクローナル抗体（抗リン酸化ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）抗体）はＡＰＰの細胞内領域に対応するアミノ酸配列ＮＨ２−ＡＡＶＴＰＥＥＲＨＣ（配列番号７）のＴ残基にリン酸基を導入したペプチドを作製し、ＫＬＨと結合させた後にウサギに免疫することで作製した（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４４２１−４４２７（１９９９））。免疫により得られた抗血清はリン酸基を導入していない免疫原のペプチドを用いて吸着処理を行い、さらに免疫原であるリン酸基を導入したペプチドでアフィニティ精製した物を使用した。また、ｔｏｔａｌ  ＡＰＰ量（リン酸化状態のＡＰＰと非リン酸化状態のＡＰＰを併せたＡＰＰ量）の定量には抗ＡＰＰモノクローナル抗体、２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を使用した。ブロッキング操作後のＰＶＤＦ膜はＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４））にて軽く洗浄した後、１０００倍希釈した一次抗体（抗リン酸化ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）抗体、あるいは２２Ｃ１１）溶液中に浸し、室温にて１時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔによる室温、１０分間の洗浄操作を４回繰り返した後に、二次抗体との反応に供した。二次抗体には２００００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ及びマウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。一次抗体反応と同様に、室温で１時間反応させた後、同様にＰＢＳ−Ｔによる洗浄操作を行った。反応の検出には、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い、化学発光の解析はＳｔｏｒｍ８６０  Ｉｍａｇｅａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びオートラジオグラフィーにより行った。図１には、野生型ＡＰＰ６９５アデノウィルスを初代培養神経細胞に感染させ、ｔｏｔａｌ  ＡＰＰ量並びにＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）のリン酸化の程度をそれぞれ２２Ｃ１１抗体あるいはリン酸化ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析したものである。対照としてＧＦＰ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｅｕｒｏｎ（１９９６）１６，２５５−２６０）（配列番号８）を組み込んだアデノウィルスを感染させたが、野生型ＡＰＰ６９５アデノ��ィルスの感染によって、ｔｏｔａｌ  ＡＰＰ量およびＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）のリン酸化の有意な増加が観察された。
（６）Ａβ産生測定：
Ａβ産生測定用のサンプルには、被検化合物の添加２４時間後に回収した培養上清を用いた。上清中のＡβ量はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。まず、ＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社）に１００ｍＭリン酸緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈した抗Ａβモノクローナル抗体６Ｅ１０（Ｗａｋｏ社）を１ウェル当たり５０μｌずつ添加し、一晩４℃にて放置することで６Ｅ１０抗体をプレートに付着させた。次の日に抗体を回収し、ブロックエースを１ウェル当たり２００μｌ添加して、さらに一晩以上、４℃にてブロッキング操作を行った。プレートウォッシャー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社  Ｍｏｄｅｌ  １２５０Ｉｍｍｕｎｏ  ｗａｓｈ）を用いて、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ））によりプレートを４回洗浄後、ブロックエースにて２倍に希釈したサンプルあるいは検量線作製用のＡβを添加し、４℃にて一晩反応させた。検量線作製用のＡβは、以下のように調製した。Ａβ１−４０（配列番号１）とＡβ１−４２（配列番号２）はＣａｌｆｏｒｎｉａ  ｐｅｐｔｉｄｅ社より購入し、ｈｅｘａｆｕｌｕｏｒｏ−２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（ＨＦＩＰ、関東化学社）により１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したものを保存溶液とした。この保存溶液１０μｌをチューブに移し、ＨＦＩＰを吸引濃縮機により気化させ、ＤＭＳＯ１０μｌにＡβが１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように再溶解した。Ａβの検量線測定用の溶液の希釈系列は、０．２−１０ｎｇ／ｍｌの範囲で調製した。サンプルあるいは検量線作製用のＡβと反応させたプレートは、プレートウォッシャーにて４回の洗浄操作を行った後、一次抗体と反応させた。一次抗体には、ＡβのＣ末端を特異的に認識するポリクローナル抗体、Ｒ１６３（Ａβ１−４０特異的抗体）とＲ１６５（Ａβ１−４２特異的抗体）を用いた。Ｒ１６３及びＲ１６５はＤＲ．ＰＤＭｅｈｔａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）より購入し、ＩｇＧ画分として精製したものを用いた。それぞれの抗体は２５％ブロックエースを含むＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈し、プレートに１ウェル当たり６０μｌずつ添加し、室温にて２時間反応させた。反応後、プレートウォッシャーにて４回の洗浄操作を行い、二次抗体との反応を行った。二次抗体には、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、２５％ブロックエースを含むＴＢＳ−Ｔにて８０００倍に希釈したものを１ウェル当たり６０μｌずつ添加して、さらに室温で２時間の反応を行った。反応終了後、プレートウォッシャーにて４回洗浄後、ＰＯＤ発色試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）による化学発光をＭＬ３０００プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により測定した。図２には、０．２−１０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したＡβの溶液を用いて作製したＡβ１−４０とＡβ１−４２の検量線を示した。
（実施例２）
Ｃｄｋ５活性測定法及びＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ、ＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅのＣｄｋ５阻害活性の評価
（１）Ｃｄｋ５、ｐ２５の取得：
Ｃｄｋ５遺伝子（ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（８）、２９０９−２９１７（１９９２））及びｐ３５遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ３７１（６４９６），４１９−４２３（１９９４））の活性部位即ちｐ２５に相当する領域はヒト型のものをＲＴ−ＰＣＲ法により取得した。ヒトＣｄｋ５遺伝子の全長は、５’−ＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１０）のプライマーセットにより、ヒト神経芽細胞腫であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡから増幅した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、１Ｘ１０６個の細胞当たり、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を加え、細胞を溶解後、１／５容のクロロホロムを添加し撹拌し、１５０００回転、１０分間遠心して得られた上清に、１／２容の２−プロパノールを加え、さらに１５０００回転、２０分間遠心して取得した。得られたＲＮＡは、水に溶解し、濃度を測定後、ＰＣＲ反応（ＴｉｔａｎＴＭ  ｏｎｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社））に供した。また、ヒトｐ３５遺伝子の活性部位即ちｐ２５に相当する領域は、５’−ＴＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号１２）のプライマーセットにより同様に増幅した。両遺伝子ともに、プライマー内に設計したＨｉｎｄＩＩＩ、及びＢａｍＨＩサイトを利用して、Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇが付加されるように設計されているＢａｃｍｉｄ作製用ベクター、ｐＦＡＳＴＢａｃ−ＨＴａ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に導入した。ｐＦＡＳＴＢａｃに導入された遺伝子はＤＨ１０Ｂａｃへ導入し、大腸菌内にて組み換えを行い、それぞれの組み換えＢａｃｍｉｄを取得した。得られたＢａｃｍｉｄはＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を用いてＳｆ９細胞に導入し、バキュロウィルスを取得した。得られたバキュロウィルスをＳｆ９細胞へ感染させることにより、バキュロウィルスにより産生される組み換えＣｄｋ５蛋白（配列番号１３：Ｃｄｋ５由来の配列はアミノ酸２８番目以降）及びｐ２５蛋白（配列番号１４：ｐ２５由来の配列はアミノ酸２８番目以降）を取得した。組み換え蛋白の精製は、Ｎ末に付加した６Ｘ  Ｈｉｓのｔａｇを利用して行った。
すなわち、バキュロウィルスを感染させたＳｆ９細胞を細胞溶解液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ２−ＭＥ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％ＮＰ−４０）にて溶解、超音波破砕を施した後、遠心分離（１００００Ｘｇ、３０ｍｉｎ）により得た上清をカラム緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に通した。緩衝液Ａにより十分に洗浄した後、さらに緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により洗浄した。最後に、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により溶出された分画を回収し、サンプル溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にて透析したものを精製標品とした。
（２）Ｃｄｋ５活性測定：
キナーゼ活性測定時の酵素源としては、先に得られた精製Ｃｄｋ５蛋白と精製ｐ２５を１対１に混合した物を使用した。基質には、ヒストンＨ１（Ｓｉｇｍａ社）をビオチン化したものを使用した。ヒストンのビオチン化は、ヒストンに対してモル比で１０倍量のビオチン（Ｅｚ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム存在下で室温にて６時間反応させることにより作製した。ＴＢＳにて透析処理を行い、フリーのビオチンを除去したものを保存溶液とした。キナーゼ活性測定はＳＰＡ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に準じて行った。基質、酵素、及びγ３３Ｐ−ＡＴＰをキナーゼ反応液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、５μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）中で室温１時間反応させ、その後に、３倍量の反応停止液（５０ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＳＰＡ  ｂｅａｄｓを含むＰＢＳ）を加え撹拌することで反応を停止させた。さらに室温で１５分間放置し、遠心処理（１７００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）を行った後に、基質に取り込まれたアイソトープ量をＴｏｐｃｏｕｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）により測定した。（３）Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのキナーゼ阻害活性の測定：
ＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅとＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅはその化学構造は互いに全く異なるが、いずれもＣｄｋに対して選択的な阻害剤であることが知られている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９９）５９，２５６６−２５６９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）４２，２９０９−２９１９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４３，５１８−５２６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４３，５２７−５３６、及びＷＯ９９／６５９１０）。化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤはＣｄｋ阻害剤であることが知られている（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）９，９１−９６、ＷＯ９７／１６４５２、ＷＯ９９／４３６７５）。発明者らは、前述の方法により当該化合物のＣｄｋ５阻害活性を確認した。
0004216503.tif 000005
（実施例３）
Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのＡＰＰリン酸化量に及ぼす影響：
培養１０日目の海馬初代培養神経細胞に野生型ＡＰＰ６９５アデノウィルスを感染させ、その３日後に適当な濃度のＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ（ＤＭＳＯ溶液）あるいはＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（ＤＭＳＯ溶液）を添加した培地と交換した。さらに１日間培養した後、細胞溶解液にて細胞を回収し、ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）リン酸化の程度を実施例１に示した方法により定量した。例えばＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅは１０μＭで、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅは５０μＭで、それぞれＡＰＰリン酸化抑制作用が確認された。この時、抗ＡＰＰ抗体２２Ｃ１１で検出したｔｏｔａｌ  ＡＰＰの発現量には変化は認められなかった。また、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤも同様にＡＰＰリン酸化抑制作用が確認された。更に前述の化合物とは構造が全く異なる化合物Ｅ又はＦでも当該作用が確認された。
（実施例４）
ＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅのＡβ産生量に及ぼす影響：
培養１０日目の海馬初代培養神経細胞に野生型ＡＰＰ６９５アデノウィルスを感染させ、３日後に適当な濃度のＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ（ＤＭＳＯ溶液）を添加した培地に交換した。さらに１日間培養した後、培養上清を回収し上清中のＡβ量を実施例１に示した方法により定量した。ＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅはＡβ１−４０産生量（図３）及びＡβ１−４２産生量を抑制した（図４）。コントロールとして、Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅの代わりに、ＤＭＳＯを使用した。
（実施例５）
Ｒｏｓｏｃｏｖｉｔｉｎｅ、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのＡβ１−４０産生量に及ぼす影響：
実施例４と同様にして、上清中のＡβ１−４０量を定量した。ＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅのＡβ産生抑制効果が確認された（図５）。また化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤも同様にＡβ産生抑制効果が確認された。更に前述の化合物Ｅ又はＦも当該効果が確認された。
以上のように、化学構造が全く異なるＣｄｋ阻害作用を有する物質を用いた実験から、当該物質がＡβ産生量を低下させることを見出した。さらにこれらの実験結果及び神経細胞において生理的な機能を有することが知られているＣｄｋアイソザイムはＣｄｋ５である（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９，６０１７−６０２６、及びＧｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（１９９６）１０，８１６−８２５）ことから、当該物質はＣｄｋ５の活性を阻害することによりＡβ産生抑制作用を発揮したことが証明された。
（実施例６）
Ｃｄｋ５ドミナントネガティブ体アデノウィルスのＡβ産生量に及ぼす影響
（１）Ｃｄｋ５ドミナントネガティブ体アデノウィルスベクターの作製
Ｃｄｋ５のドミナントネガティブ体（１４４番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に変換したもの：以下Ｃｄｋ５  Ｄ１４４Ｎ（配列番号１５））は、Ｎｉｋｏｌｉｃらの記載（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，８１６−８２５（１９９６））をもとに作製した。変異の導入には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を使用し、実際の操作は説明書に準じて行った。変異を導入する準備として、５’−ＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号１６）、及び５’−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＧＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１７）のプライマーセットにより、実施例２に記載のＣｄｋ５遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法により再増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に導入した。ｐＧＥＭ  Ｔ  Ｅａｓｙベクターに導入したＣｄｋ５遺伝子を鋳型として、５’−ＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号１８）、及び５’−ＣＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１９）のプライマーセットにより、ＰＣＲ法により増幅し、その産物をＤｐｎＩにて３７℃、３時間処理した後、大腸菌株ＪＭ−１０９に導入し、変異が導入された遺伝子を取得した。塩基配列を確認後、開始メチオニンを再付加するために、変異遺伝子を鋳型として、５’−ＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧ−３（配列番号２０）、及び５’−ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＧＣＧＧＡＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２１）のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅後、プライマー内に設計されたＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩサイトを用いて切り出し、ＡＤＥａｓｙシステムのシャトルベクター、ｐＳｈｕｔｔｌｅへ導入した。ｐＳｈｕｔｔｌｅには、実施例１に記載のｐＣＡＧ−ｐＡベクターのＣＡＧプロモーターからポリＡ付加シグナルまでの領域（ＰｓｔＩサイトからＸｈｏＩサイト）をあらかじめ導入したものを使用した。導入に際しては、ＣＡＧプロモーターとポリＡ付加シグナルの間にあるＨｉｎｃＩＩサイトに、ｐＢｕｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＫＳ（ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）由来のマルチクローニングサイト（ＢｓｓＨＩＩで切り出される領域）を導入し、遺伝子の挿入を容易にした。ドミナントネガティブ体Ｃｄｋ５を導入したシャトルベクターはＰｍｅＩにより直鎖状にし、ｐＡＤＥａｓｙ−２ベクターとともに大腸菌株ＢＪ５１８３に導入し、ウィルスゲノム組み換えプラスミドを作製した。アデノウィルスの調整は、実施例１に示したＡＰＰアデノウィルスと同様に実施した。
（２）Ｃｄｋ５  Ｄ１４４ＮアデノウィルスのＡβ産生量に及ぼす影響
培養７日目の海馬初代培養神経細胞に野生型ＡＰＰ６９５アデノウィルスと同時に、Ｃｄｋ５  Ｄ１４４Ｎアデノウィルスを感染させ、２日後の培養上清を回収し、上清中のＡβ量を定量した。コントロールと比較して、Ｃｄｋ５  Ｄ１４４ＮはＡβ１−４０産生量を抑制した。コントロールとしては実施例１と同様にＧＦＰを組み込んだアデノウィルスを感染させたものを用いて比較した。以上のように、Ｃｄｋ５の機能を特異的に抑制することができるＣｄｋ５のドミナントネガティブ体で、Ｃｄｋ阻害剤で認められたのと同様なＡβ産生阻害活性が認められたことから、Ｃｄｋ５の活性を阻害することによりＡβ産生を抑制できることが証明された。
産業上の利用可能性
本発明医薬組成物によりＡβの産生抑制が達成される。当該産生抑制に基づく疾患、例えばＡＤは病理学的には神経細胞の脱落、シナプス数の減少、脳内の老人斑、又は神経原線維変化の蓄積などの変化を特徴とし、その内ＡＤ脳内の老人班、即ち老人班のアミロイド蛋白の主要構成分子であるＡβの蓄積がＡＤの発症機構に深く関与しているので、本発明は抗痴呆薬や抗アルツハイマー病薬等に有用である。
また、本発明を利用して、Ｃｄｋ好ましくはＣｄｋ５阻害活性を有する物質、ＡＰＰのスレオニン結合リン酸のリン酸化阻害活性を有する物質を細胞に接触させ、Ａβ産生量を検出することにより、例えばＡβ産生抑制作用を有する物質をスクリーニングすることや痴呆又はアルツハイマー病等の診断用キットに使用できる。
さらに本発明医薬組成物を投与することで痴呆又はアルツハイマー病等の治療にも有用である。
【配列表】
0004216503.tif 000006
0004216503.tif 000007
0004216503.tif 000008
0004216503.tif 000009
0004216503.tif 000010
0004216503.tif 000011
0004216503.tif 000012
0004216503.tif 000013
0004216503.tif 000014
0004216503.tif 000015
0004216503.tif 000016
0004216503.tif 000017
0004216503.tif 000018
0004216503.tif 000019
0004216503.tif 000020
0004216503.tif 000021
0004216503.tif 000022
0004216503.tif 000023
0004216503.tif 000024
0004216503.tif 000025
0004216503.tif 000026
0004216503.tif 000027
0004216503.tif 000028
0004216503.tif 000029
0004216503.tif 000030
0004216503.tif 000031
0004216503.tif 000032
【図面の簡単な説明】
図１はｔｏｔａｌ  ＡＰＰ量並びにＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）のリン酸化の程度をそれぞれ２２Ｃ１１抗体あるいはリン酸化ＡＰＰ（Ｔｈｒ６６８）抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析したものである。
図２は０．２−１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＡβの溶液を用いて作製したＡβ１−４０とＡβ１−４２の検量線を示したものである。
図３はＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ添加処理した場合のＡβ１−４０産生量の程度を示したものである。
図４はＡｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ添加処理した場合のＡβ１−４２産生量の程度を示したものである。
図５はＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ添加処理した場合のＡβ１−４０産生量の程度を示したものである。
【図１】
0004216503.tif 000033
【図２】
0004216503.tif 000034
【図３】
0004216503.tif 000035
【図４】
0004216503.tif 000036
【図５】
0004216503.tif 000037