(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物有機分子の標識法において、式：
0004212652.tif 000006
（式中ＡおよびＤは同一または異なる反応性部分を表し、Ｘ１およびＸ２は同一もしくは異なる不活性部分を表す）で示されるトランス−白金を基本とする化合物の一方の反応性部分を標識物と反応させること、該化合物の他方の反応性部分を生物有機分子と反応させること、それらの反応を任意の順序で実施することを特徴とする生物有機分子の標識法。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２が同一または異なる非脱離リガンドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｘ１およびＸ２がＮＨ3、ＮＨ2Ｒ、ＮＨＲＲ’、およびＮＲＲ’Ｒ″基からなる群より選択されるものであり、Ｒ、Ｒ’およびＲ″は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表すことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
Ｘ１およびＸ２両方がＮ（ＣＨ3）3基を表すことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ａおよび/またはＤが酢酸基、ＮＯ3-、ＨＣＯ3-、ＣＯ32-、ＳＯ3-、Ｃｌ-、Ｉ-、および他のハロゲン類からなる群より選択されるものであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標識物および/または生物有機分子はスペーサーを介して白金に結合され、該スペーサーが少なくとも４個の原子を有する鎖を含み、該鎖が一端に電子供与部分、他端に反応性部分を含むこと、該トランス−白金を基本とする化合物の一方または両方の反応性部分を前記スペーサーの電子供与部分と反応させること、前記スペーサーの反応性部分を該標識物および/または生物有機分子と反応させること、それらの反応を任意の順序で実施することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
電子供与部分がアミン基またはチオレートアニオンであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
鎖がさらに少なくとも１個のヘテロ原子を含むことを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
スペーサーが該鎖に２０個を越えない炭素原子を有し、かつ、該鎖が本質的に非分枝鎖であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ａおよび/またはＤが１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
生物有機分子がタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、および（オリゴ）ヌクレオチド類からなる群から選択されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生物有機分子がヌクレオチドであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
標識物がビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、およびＣｙ（登録商標）−着色剤を含む蛍光色素からなる群から選択されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記請求項のいずれかに記載の生物有機分子の標識法に使用するためのトランス−白金を基本とする化合物において、該化合物は、下記式：
0004212652.tif 000007
（式中Ａは標識物に結合させるための反応性部分、Ｄは生物有機分子に結合させるための反応性部分、Ｘ１およびＸ２は同一もしくは異なる不活性部分をそれぞれ表す）で示され、化合物には、標識物が結合していることを特徴とするトランス−白金を基本とする化合物。
【請求項１５】
生物有機分子が結合していることを特徴とする請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
生物有機分子がヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
対象となる生物学的物質の検出、定量および/または所在決定のための診断キットにおいて、請求項１４または１５記載の化合物を含み、該化合物を任意には他の適切な検出手段とともに含むことを特徴とする診断キット。
【発明の詳細な説明】
本発明はトランス−白金を基本とする化合物、該化合物を含むことからなる診断キット、および該化合物を使用する場合のバイオ有機分子の標識法に関する。
白金（配位）化合物は長い間興味深い分子であると考えられてきた。これら化合物およびその用途についての総説として、我々はリーディジュク（Reedijk）らの文献（構造と結合（Structure and Bonding）、６７、５３〜８９頁、１９８７年）を引用する。とりわけシス−白金は抗腫瘍剤として多くの注目を集めてきた。白金化合物のこの抗腫瘍活性は、その化合物がもつ少なくとも２つの反応性基（好ましくは互いにシス配向である）に由来し、それがＤＮＡ分子の架橋を可能とし、それによってこれらＤＮＡ分子の複製を阻害する。
シス−白金化合物の異なる用途は欧州特許出願Ｎｏ．９５２０１１９７．１に記載されている。そこにはバイオ有機分子と標識物とをシス−白金化合物を介して結合させる方法が開示されており、該化合物の２つの配位部位はエチレンジアミン基など、安定化架橋の２つの末端により占拠されている。
これら既知シス−白金化合物は数種の生物有機分子に標識物を結合させるのに適している。その例は（ポリ）ペプチド、ポリ核酸およびヌクレオチドである。
ＤＮＡ分子など、ポリ核酸の標識は組換えＤＮＡ技術などの分野に応用するのが望ましい。しかし多くの場合、核酸高分子を標識せずに、ある種のヌクレオチドを標識してそれをポリ核酸中に酵素的に組込もうとする。この方法は、得られるポリ核酸上の標識位置が影響を受け、標識物が高分子に結合している場合には可能ではない。
しかし、シス−白金リンカーにより標識物に結合したヌクレオチドは、少しは可能としても、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ分子に十分には組込まれないことが判明した。したがって、標識ＤＮＡ分子を得るためにシス−白金リンカーを使用するためには、高分子を標識しなければならない。
ポリ核酸に組み入れることが可能であって、ヌクレオチドを標識するために利用可能な他の方法は、より簡便な標識法である。しかしまた、これらの簡便法はどのようなヌクレオチドを標識するにも適している訳ではないという大きな欠点を有する。ある場合には、例えば、あるヌクレオチドの２、３の残基のみが、あるポリ核酸に存在する場合、あるいはポリ核酸の終止ヌクレオチド残基が標識されるような場合には、いずれのヌクレオチドをも標識し得ることが望ましい。
かかる簡便法の一例がデイル（Dale）ら（Biochemistry、１４、（１９７５年）２４４７〜２４５７）により記載されているが、この方法は標識技法として直接共有結合による水銀化を要する。デイルらはシトシンとウラシルが温和な条件下Ｃ５位で水銀化されると報告している。しかしまた、彼らはアデニン、チミンおよびグアニン塩基では否定的な結果を得たと報告している。
このように、標識物とすべての異なるヌクレオチドを包含する生物有機分子とを結合させるすぐれた結合方式であって、かつ、前記結合方式によって標識したヌクレオチドを効率的な方法でポリ核酸に酵素的に組込むことを可能とするような普遍的な結合方式が必要である。
本発明はかかる普遍的な結合方式を提供する。下記式（Ｉ）で示されるトランス−白金を基本とする化合物が、生物有機分子を標識する方法に使用するための上記要件に適っていることが見出された。
0004212652.tif 000002
（ただし、式中Ａは標識物に結合させるための反応性部分、Ｄは生物有機分子に結合させるための反応性部分、そしてＸ１およびＸ２は同一もしくは異なる不活性部分をそれぞれ表す）
驚くべきことに、本発明化合物を使用して数種の生物有機分子に標識物を結合させると、少なくとも既知法並みの効果がある。さらに、本発明化合物による標識物に結合したヌクレオチドはポリヌクレオチドに非常に効率的に組込み得ることが判明した。
ヌクレオチドは２つのコンホメーション、すなわち、シン−コンホメーションおよびアンチ−コンホメーションをとると推定することができる。これらコンホメーションの定義は、センジャー（Saenger）「核酸構造の原理（Principles ofNucleic Acid Structures）」（スプリンガー−フェルラーク・インク（Springer−Verlag Inc.））（１９８４年）に見ることができる。ヌクレオチドを例えば、ＤＮＡ分子に十分に組込むためには、アンチ−配位としなければならないと信じられている。米国特許第４，７１１，９５５号には、ヌクレオチドの正常アンチ−コンホメーションは避けなければならない、その理由はそうしなければヌクレオチド誘導体がポリメラーゼ基質として受け容れられないからであると報告している。このように、シン−コンホメーションを有するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに酵素的に組込むには、組込まれるとしても効率的な方法ではない。
この他に、センジャーによる上記報文から知り得るのは、ヌクレオチドのＮ７位、すなわち、金属がもっとも容易に配位する位置に嵩高い基または置換基が存在するものはシン−コンホメーションを有するヌクレオチドをも含むことである。このように、Ｎ７位に白金化合物の配位したヌクレオチドはシン−配向にあることを予測させる。したがって、前記ヌクレオチドを好適な結果をもってポリヌクレオチドに組み入れることは不可能であると予測される。
それ故に、本発明によりトランス−白金を基本とする化合物によって標識物に結合したヌクレオチドが高効率的な方法でポリヌクレオチドに組み入れ得ることは非常に驚くべきことである。
式（Ｉ）におけるＸ１およびＸ２部分は不活性である。このことは、これらの部分が標識反応の間に白金核に結合したままでいるリガンドである、すなわち、それらは生理的条件下に安定であることを意味している。これらは異なっても同一であってもよく、また、それらと標識物、生物有機分子もしくは標識技法の適用に用いる他の化合物との間の相互作用に阻害を示さない基であればよい。
これらの部分Ｘ１およびＸ２において、シス−白金リンカーに比較して本発明では別の利点がある。安定なシス−白金化合物を得るためには、前記化合物が安定化用の架橋を含むことが必須である。トランス−白金化合物ではそのような安定化用架橋を必要としない。したがって、本発明トランス−白金化合物において構造上可能な変化はより多様である。このように、本発明によると、当業者は所望の化合物の性質を獲得するために自由に処理し得る多くの手段をもつ。
好適な態様において、Ｘ１およびＸ２は同一もしくは異なった非脱離リガンドである。このことはそれらの脱離基としての性質が非常に小さいことを意味する。最も好適なその例はＮＨ3、ＮＨ2Ｒ、ＮＨＲＲ’、およびＮＲＲ’Ｒ”基である（ただし、式中Ｒ、Ｒ’およびＲ”はいずれも１ないし６個の炭素原子を有するアルキル基を表し、これらの基は白金中心核に非常に安定な結合を形成する）。
特に好適なものはＸ１およびＸ２ともにＮ（ＣＨ3）3基である場合の態様である。メチル基の存在は、それらが例えば標識物または生物有機分子と不活性部分との水素結合による基質コンホメーションの変化を防止するポジティブな効果をもつ。
反応性部分ＡおよびＤは、それらがそれぞれ標識物または生物有機分子と容易に置き換えられる、または置換されるように選択される。好ましくは、ＡおよびＤは酢酸基、ＮＯ3-、ＨＣＯ3-、ＣＯ32-、ＳＯ3-、Ｃｌ-、Ｉ-、および他のハロゲン類からなる群より選択される。これらの基は良好な脱離基であり、したがって容易に置き換え得る。
非常に好適な態様において、スペーサー、例えば、オリゴリジンまたはポリリジンが用いられる。この態様によると、式（Ｉ）のＡおよび/またはＤはスペーサーを含むことからなり、該スペーサーは少なくとも４個の原子を有する鎖からなり、該鎖は一端に電子供与部分、また他端に反応性部分を含むことからなり、該鎖は電子供与部分を介して白金に結合している。標識物または生物有機分子はスペーサーに対して、白金から見てもっとも離れた鎖の末端との反応により結合させることが可能である。
スペーサーの使用は標識物と生物有機分子との間の距離を最適なものとして、立体因子が効率的な標識反応に障害とならないようにし得るという利点を有する。
スペーサーの電子供与部分は、好ましくはアミン基またはチオレートアニオンであるが、その理由はこれらの基が白金に対し非常に強い結合を形成し得るということが判明したからである。
さらに好適な態様において、スペーサーの鎖は少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは酸素原子を含み、これが鎖の親水性に好ましく影響し、このことは、生理システムにおいて重要な面である。
また、白金原子を含むスペーサーを用いることも可能である。この態様において、本発明は標識物と生物有機分子とを結合させるためのビス白金化合物を提供する。第２の白金はシス配向であってもトランス配向であってもよい。
該スペーサーは、好ましくは炭素原子２０個を越えない鎖であり、好ましくは、立体障害を起こさないように、非分枝鎖である。その理由は明らかであろう。
非常に好適なスペーサーは１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンであり、本明細書においてはこれをＤａｄｏｏと呼ぶ。Ｄａｄｏｏは非常にフレキシブルなスペーサーであり、２個の一級アミン基を有し、そのサイズは本発明によるスペーサーとして使用するのに非常に適したものとなっている。
本発明化合物により生物有機分子に結合する標識物は、重大ではない。原則として、生物有機分子に結合させ得るもので、これまで採用されてきた標識物のすべてが使用可能である。これらの標識物は、放射活性標識物、酵素（検出には基質との反応を必要とする）、例えばアビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンなどの特異結合ペア成分、ビオシチン、イミノビオチン、コロイド色素物質、Ｃｙ（登録商標）−着色料を含む蛍光色素（ローダミンなど）、還元性物質（エオシン、エリスロシンなど）、（着色）ラテックス・ゾル、ジゴキシゲニン、金属（ルテニウム）、金属ゾルまたは他の粒子化ゾル（セレン、炭素など）、ダンシルリジン、赤外色素、クマリン類（アミノメチルクマリン）、抗体類、プロテインＡ、プロテインＧ、などである。本発明ではビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニンなどの嵩高い標識物とするともっとも有益である。
Ｃｙ（登録商標）−着色料は本発明化合物により生物有機分子に結合させる好適な標識物である。これらの標識物は多重着色標識といわれる技術に非常に好適に使用することができる。その理由はこの種の異なる着色剤が、異なる着色を与える一方、化学構造的には非常によく似ているからである。
殆どすべての生物有機分子が、それが利用し得るイオウまたは窒素原子を含む限り、本化合物により標識物に結合させることができる。標識すべき非常に好適な化合物は、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、および（オリゴ）ヌクレオチド類である。
白金はヌクレオチドのＮ７位に非常に容易に結合する。この方法では、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は一本鎖であっても、他の状態にあっても容易に検出することができる。また、これはハイブリッド形成技術用のプローブの生産をも可能とし、その場合、未標識ＤＮＡ／ＲＮＡ分子は標識したプローブにハイブリッドする。白金化合物は、少しはあるにしても殆どハイブリッド形成を阻害することはない。
また、本発明の白金化合物は、生物有機分子をニトロセルロース、ナイロンフィルターまたはマイクロタイタープレートなどの固体表面に結合させるのにも非常に適している。
本発明によりリンカーを用い修飾したヌクレオチド、および該ヌクレオチドを組込んだオリゴ−およびポリヌクレオチド、あるいはこれら新規な白金化合物を用い直接修飾したオリゴ−およびポリヌクレオチドは、生物医学研究、臨床診断薬および組換えＤＮＡ技術におけるプローブとして使用し得る。
この多様な用途はポリペプチドと安定な複合体を形成する白金化合物の能力に基づいており、該複合体は順次それに結合する検出可能部分あるいはポリペプチドと作用し合う検出可能部分により検出することができる。その幾つかの用途は以下のとおりである。病因となる因子、例えば、バクテリアおよびウイルスなどを含む核酸の検出および同定；薬学上の効果に関係する遺伝子疾患のための動物スクリーニング；遺伝子疾患、例えば、２１−トリソミー、鎌状赤血球貧血などの遺伝子疾患の診断；染色体核型同定；および腫瘍細胞の同定。
また、本発明は対象となる生物学的物質の検出、定量および/または所在決定のためのキットを包含し、本発明の白金化合物を、任意には他の適切な検出手段とともに含むことからなる。該キットの白金化合物は１またはそれ以上のスペーサー、標識物および生物有機分子を含むことからなる。勿論、本発明はまた、これらの構成成分が別々に、すなわち、未結合の形態で存在する場合のキットをも包含する。
異なる態様において、本発明は上記開示の化合物を使用する場合の生物有機分子の標識法を目的とするものである。
この態様に従い生物有機分子を標識する方法においては、トランス−白金を基本とする化合物は、下記式（Ｉ）：
0004212652.tif 000003
（ただし、式中Ａ、Ｄ、Ｘ１およびＸ２は上記の意味を有する）で示され、該化合物の一方の反応性部分を標識物と反応させ、該トランス−白金を基本とする化合物の他方の反応性部分を生物有機分子と反応させる、またはその逆とする。
生物有機分子を標識する好適な方法においては、標識および/または生物有機分子はスペーサーを介して白金に結合させるが、該スペーサーは少なくとも４個の原子を有する鎖からなり、該鎖は一端に電子供与部分、また他端に反応性部分を含むことからなり、該鎖は電子供与部分を介して白金に結合している。本スペーサーは上記開示のいずれのスペーサーであってもよい。
勿論、スペーサー、標識物、生物有機分子およびトランス−白金は互いにどのような順序で結合していてもよい。例えば、スペーサーは先ず白金に結合させ、次いで得られた化合物を標識物および生物有機分子と反応させるが、白金化合物との反応の前にスペーサーを標識物および/または生物有機分子に先ず結合させることも可能である。
非常に好適な態様において、本発明は生物有機分子がヌクレオチドである場合の上記の方法を提供する。
本発明を以下の非限定的実施例により説明する。
実施例１：トランス−ジアンミンジクロロ白金（II）（trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2］）の調製
テトラクロロ白金（II）酸カリウム１ｇをミリ−Ｑ ２０ｍｌに溶かし、濃塩酸（ＨＣｌ）０．６ｍｌを加えた。混合物を沸騰するまで加熱し、２５％ＮＨ4ＯＨ溶液２．５ｍｌを攪拌しながら滴下した。得られる溶液を約１０ｍｌまで蒸発させた。得られる淡黄色残渣に６Ｎ ＨＣｌ １００ｍｌを加え、混合物を上記のように１５〜２０ｍｌの容量となるまで蒸発させた。トランス−ジアンミンジクロロ白金（II）が微細黄色粉末として析出した。氷冷後、混合物を濾過し、氷冷水１０ｍｌずつで３回、エタノールおよびエーテルで洗浄して風乾した。トランス−ジアンミンジクロロ白金（II）を最少量の沸騰０．１Ｎ ＨＣｌから結晶化させた。生成物を赤外分光法により特性化した。
実施例２：トランス−白金ジアンミン−ＤｉｇＤａｄｏｏクロライド（trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3））の調製
trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2］（０．１ｍｍｏｌ）３０ｍｇをＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド２５ｍｌに懸濁し、ＡｇＮＯ3 １７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を該混合物に加え、遮光下に室温で１６時間反応させた。沈殿したＡｇＣｌを濾去し、濾液から３．４ｍｌのtrans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（Ｃｌ）（ＮＯ3）］（３．９ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ））を採り、８ｍｇのＤｉｇＤａｄｏｏ（ジゴキシゲニン−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン、０．０１４ｍｍｏｌ、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）から購入）とともに遮光下、４０℃で４８時間インキュベーションした。Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミドを減圧下で除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2中で攪拌し、それによって黄色粉末を沈殿させた。沈殿した粉末を濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、乾燥させた。生成物を高分解能1Ｈ−ＮＭＲにより特性化した。
実施例３：トランス−白金ジアンミン−ＤｉｇＤａｄｏｏ−２’−デオキシグアノシン−５’−トリホスフェート（trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）（ｄＧＴＰ−Ｎ７）］2-）の調製
trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3）１２ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）をミリ−Ｑ ２ｍｌに溶かし、２’−デオキシグアノシン−５’−トリホスフェート３ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物のｐＨを０．１Ｎ ＮａＯＨで〜６に調整し、遮光下に５０℃で２４時間反応を実施した。混合物を凍結乾燥し、残渣を調製用アニオン交換クロマトグラフィー・カラム（Ｑ−セファロース２６/１０、ファルマシア・バイオテク（Pharmacia BioTech）に付し、グラジエントは１００％ ミリ−Ｑから始めて１００％ ＮＨ4ＨＣＯ3までとして適用した。適切なフラクションを採取し、濃縮、凍結乾燥し、ＮＨ4ＨＣＯ3を除去した。生成物は高分解能1Ｈおよび31Ｐ−ＮＭＲ、分析的ＦＰＬＣ−法、アニオン交換（モノＱ５/５、ファルマシア・バイオテク）、および逆相（ＰｅｐＲＰＣ５/５、ファルマシア・バイオテク）により分析した。生成物をダウエックス（Dowex）カチオン交換カラムに通しテトラリチウム塩に変換した。
実施例４：トランス−白金ジアンミン−Ｃｙ５（登録商標）クロライド（trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（Ｃｙ５（登録商標）−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3））の調製
Ｃｙ５モノ官能反応性色素（０．０１ｍｍｏｌ）７．９ｍｇを乾燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶かし、不活性ガス（アルゴン）中過剰量のエチレンジアミンと室温で４時間反応させた。Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミドおよび過剰のエチレンジアミンを減圧下で除去した。残渣をＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに再溶解し、trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（Ｃｌ）（ＮＯ3）］３ｍｇ（０．００９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を遮光下に５０℃で１６時間攪拌した。Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミドを減圧下で除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2中で攪拌し、それによって生成物を沈殿させた。沈殿を濾過、減圧下で乾燥させた。生成物を高分解能1Ｈ−ＮＭＲにより特性化した。
実施例５：trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）（ｄＧＴＰ）］のｐＢＲ３２２ＤＮＡへの酵素的取込み
以下の混合物を３７℃で一夜インキュベーションすることにより酵素的取込みを実施した。
0004212652.tif 000004
インキュベーションを０．２Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）２μｌの添加により停止させ、混合物の容量を滅菌脱塩水添加により４０μｌに調整した。フィルター・ハイブリッド形成をプローブ濃度２５ｎｇ/ｍｌで実施し、その際、以下の希釈範囲で変性相同ＤＮＡをフィルター片に点着させたものを用いた：１００ｐｇ、３０ｐｇ、３ｐｇ、１ｐｇ、０．３ｐｇ、０．１ｐｇ、０．０３ｐｇ、０．０１ｐｇおよび０ｐｇ。検出は抗−Ｄｉｇ−Ａｐ（ヒツジからの抗ジゴキシゲニン抗体のＦａｂフラグメントをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合させたもの）（１：１０，０００）およびＣＤＰ−スター（化学発光基質）により実施した。結果として、０．３ｐｇのハイブリッド形成を認めた。
実施例６：末端トランスフェラーゼによるtrans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）（ｄＧＴＰ）］のオリゴテーリング
以下の混合物を３７℃で１５分間インキュベーションすることによりテーリング反応を実施した。
0004212652.tif 000005
グリコーゲン１μｌおよび０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２００μｌの混合物（ｐＨ８．０）２μｌを加え、インキュベーションを停止させた。次いで、エタノールから沈殿させることにより精製を実施し、実施例５に記載のフィルター・ハイブリッド形成と同様にハイブリッド形成を実施した。結果として１０ｐｇのハイブリッド形成を認めた。
実施例７：trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3）による正常ＤＮＡの標識
異なる比率の範囲を試験する標準ＱＣ手法から、以下のプロトコールを実施した。
ＤＮＡ ２μｌ（２μｇ）、trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3）２μｌ（０．１ｍｇ/ｍｌ）および滅菌脱塩水１６μｌの混合物を８５℃で３０分間インキュベーションした。１％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム５μｌを添加してインキュベーションを停止させた。フィルター・ハイブリッド形成を実施例５に記載のフィルター・ハイブリッド形成と同様に行い、３ｐｇのハイブリッド形成を認めた。
実施例８：それぞれに標識したペインティングプローブを混合することによるＤＮＡ標識率
同一のペインティングプローブをフルオレッセイン（Ｆｌｕ）およびローダミン（Ｒｈｏ）を用い、それぞれの反応で標識した。標識後、それぞれのプローブを１：９、１：５、１：１、５：１および９：１の割合で混合し、スポット・ブロットおよびフィルター・ハイブリッド形成により試験した。検出は、ＦｌｕおよびＲｈｏに対してそれぞれ作製したアルカリホスファターゼ結合抗体により実施した。検出後、標識ペインティングプローブの比率はインプットしたマーカー分子の比と比較して一致しているように思われた。
実施例９：trans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3）マーカー複合体の一反応規定混合インプットによるＤＮＡ標識率
実施例８に記載したものと同様の割合を用いプローブを標識したが、ただし、プローブＤＮＡはtrans−［Ｐｔ（ＮＨ3）2（ＤｉｇＤａｄｏｏ−ＮＨ2）Ｃｌ］（ＮＯ3）マーカー（ＦｌｕおよびＲｈｏ）複合体の混合物と一反応管中でインキュベーションした。接合した抗体による検出の後、標識の分布は等モルで起こり、異なるマーカー分子は互いに阻害することがなく、また、互いに否定的に影響することもないことが明らかとなった。すべての結果は顕微鏡下の分析により確認した。