(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかである可溶性レプチン受容体（OB-Re）ポリペプチド：
ａ）配列番号１０で定義されるOB-Re;
ｂ）配列番号１０のOB-ReのPro664からHis796までのＮ末端配列、及びHis796から後の配列番号１０のOB-ReのＣ末端配列を含むポリペプチド;
ｃ）Ｎ末端配列が
ｉ）配列番号１０のアミノ酸残基１〜７９６；
ii）配列番号１０のアミノ酸残基２３〜７９６；
iii）配列番号１０のアミノ酸残基２８〜７９６；
iv）配列番号１０のアミノ酸残基１３３〜７９６；又は
v）配列番号１０のアミノ酸残基７３３〜７９６であり、及び
Ｃ末端配列がHis796から後の配列番号15であるレプチン受容体；
ｄ）Ｎ末端Asp-Proジペプチドが前にある配列番号１０のアミノ酸残基２８〜７９６であるＮ末端配列と、His796から後の配列番号15であるＣ末端配列を含むレプチン受容体；
ｅ）i）Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420（配列番号77）→配列番号１０のAla421→Pro641;
ii）Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118（配列番号78）→配列番号１０のAla421→Pro641;又は
iii）Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123（配列番号79）→配列番号１０のAla421→Pro641;
の配列を有するレプチン受容体;
ｆ）i）配列番号１０のTyr4206Pro641;
ii）配列番号１０のSer1186Pro641;又は
iii）配列番号１０のLeu1236Val331;
ｇ）システインがセリン、トレオニン又はアラニンで置換されている上記ペプチドのいずれかであるレプチン受容体。
【請求項２】
天然マウスレプチン受容体である請求項１記載のレプチン受容体。
【請求項３】
化学部分に結合した請求項１又は２記載のレプチン受容体。
【請求項４】
該化学部分が水溶性ポリマーである請求項３記載のレプチン受容体。
【請求項５】
該水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項４記載のレプチン受容体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプチン受容体をコードしている単離した核酸。
【請求項７】
ａ）配列番号９のＤＮＡ分子；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補配列；又は
ｃ）上記分子のいずれかによってコードされたポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
である、レプチンに結合する能力を有する可溶性レプチン受容体ポリペプチドをコードしている単離した核酸。
【請求項８】
請求項６又は７記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
発現制御配列に作用的に結合した、請求項６又は７記載の核酸を含む発現ベクターである請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項６又は７記載の核酸又は請求項８又は９記載のベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトした単細胞ホスト。
【請求項１１】
組織培養内の、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞
である請求項１０記載の単細胞ホスト。
【請求項１２】
該単細胞ホストが、E.コリ（E.coli）細胞、シュードモナス（Pseudomonas）細胞、バシラス（Bacillus）細胞、ストレプトミセス（Streptomyces）細胞、サッカロミセス（Saccharomyces）細胞、ピチア（Pichia）細胞、カンジダ（Candida）細胞、ハンセヌラ（Hansenula）細胞、トルロプシス（Torulopsis）細胞、CHO細胞、R1.1細胞、B-W細胞、LM細胞、COS1細胞、COS7細胞、BSC1細胞、BSC40細胞、BMT10細胞又はSf9細胞である、請求項１１記載の単細胞ホスト。
【請求項１３】
レプチン受容体ポリペプチドの作製方法であって、
ａ）該レプチン受容体ポリペプチドを発現させる条件下で請求項１０，１１又は１２記載の細胞を培養する工程;及び
ｂ）発現したポリペプチドを回収する工程
を含む、前記作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体に特異的な抗体であって、Ob-Ra、Ob-Rb、OB-Rc、OB-Rd又は配列番号８４のレプチン受容体ポリペプチドのいずれも認識しない抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
検出可能な標識で標識された請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である請求項１４又は１５記載の抗体を産生する無制限細胞系。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体に特異的な抗体の作製方法であって、
ａ）ホスト動物をアジュバントと混合した及び／又はキャリヤタンパク質に結合した請求項１〜５のいずれか１項記載のレプチン受容体で免疫する工程;及び
ｂ）免疫したホスト動物から抗体を得る工程
を含む、前記方法。
【請求項１９】
試料中の請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体の存在を測定する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか１項記載のレプチン受容体を含む疑いがある試料と、請求項１〜４のいずれか１項記載の該レプチン受容体に特異的に結合する抗体とを、該抗体（該抗体は固相支持体に結合されていてもよい）と該レプチン受容体を含む反応複合体を形成させることができる条件下で接触させる工程;及び
ｂ）該試料中の該抗体とレプチン受容体を含む反応複合体の形成を検出する工程
を含み、反応複合体の形成の検出が試料中のレプチン受容体の存在を示す、
前記方法。
【請求項２０】
さらに以下の工程を含む請求項１９記載の方法。
ｃ）生成した反応複合体の量を評価し、その反応複合体の量が該生物試料中のレプチン受容体のレベルに対応する。
【請求項２１】
さらに、ｄ）評価工程で検出したレベルと正常な被検者又は初期の被検者に存在するレプチン受容体レベルとを比較する工程を含み、正常レベルと比べて高レベルのレプチン受容体が高レベルのレプチン受容体と関連がある疾患を示し、正常レベルと比べて低レベルのレプチン受容体が低レベルのレプチン受容体と関連がある疾患を示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
被検者において肥満を治療するための請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
被検者において肥満を治療するための医薬組成物の製造のための請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体の使用。
【請求項２５】
請求項２２記載の医薬組成物、及び糖尿病、高血圧又は高コレステロールの治療用医薬組成物を含むキット。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体及び許容しうる担体を含む、個体の体重を減少させる美容組成物。
【請求項２７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の可溶性レプチン受容体及び許容しうる担体を含む、身体の外観を改善する美容組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明をもたらす研究は米国国立健康協会からの助成金、ROI DK41096-07により一部支持された。それ故、米国政府は本発明に或る種の権利を有し得る。
発明の分野
本発明は体重ホメオスタシスに関与する安全因子のレセプターの同定に関する。このレセプターの突然変異は肥満表現型と関連する。特に、本発明はレプチン活性を調節し、特にレプチン活性に作用すると予想されるレセプターの天然産可溶性形態を含むレプチンのレセプターの同定及び特性決定に関する。更に、本発明はレセプターをコードする核酸、及び、例えば、レプチン類似体を同定するための治療上または診断上のレセプターの使用方法に関する。
発明の背景
脂肪のない生体塊に対する過剰の体脂肪として定義される肥満は重要な心理的病的状態及び医療上の病的状態と関連しており、後者は高血圧、上昇した生体脂質、及び型IIまたは非インスリン依存性真性糖尿病（NIDDM）を含む。米国にはNIDDMにかかっている600万〜100万の個人がおり、年齢65才の集団の18％を含む［Harrisら,Int.J.Obes.,11:275-283（1987）］。NIDDMにかかっている男性の約45％及び女性の70％が肥満であり、それらの糖尿病は体重減少により実質的に改善または排除される［Harris,Diabetes Care,14（3）:639-648（1991）］。以下に説明されるように、肥満及びNIDDMの両方が強い遺伝性である。
栄養エネルギーの同化、貯蔵、及び利用は後生動物の生存に主要な複雑なホメオスタシスの系を構成する。陸上哺乳類の中には、トリグリセリドとしての多量の代謝性燃料の脂肪組織中の貯蔵が食物枯渇の期間に耐えるのに重要である。生物のサイズ及び形状を絶えず変化しないで一定レベルのエネルギー貯蔵を維持することの要望はエネルギー摂取と消費の間のバランスの達成を必要とする。
脂肪症の個人のレベルは大きな程度で遺伝的に決定される。一卵性及び二卵性の双子または養子（adoptee）並びにそれらの生物学的親の間の体重及び脂肪症の一致率の試験は、肥満の遺伝率（0.4-0.8）が実質的な遺伝的成分、例えば、精神分裂症、アルコール中毒、及びアテローム硬化症を有すると普通考えられる多くのその他の形質の遺伝率を越えることを示唆していた［Stunkardら,N.Engl.J.Med.,322:1483-1487（1990）］。エネルギー消費の率の家系類似性がまた報告されていた［Bogardusら,Diabetes,35:1-5（1986）］。地理的に限界を定められた集団の遺伝子分析は、比較的少数の遺伝子が生体組成の変化の30-50％に原因し得ることを示唆していた［Mollら,Am.J.Hum.Genet.,49:1243-1255（1991）］。
肥満のげっ歯類モデルは７種の明らかに単一遺伝子の突然変異を含む。最も広範に研究されたマウス肥満突然変異はｏｂ（肥満）遺伝子及びｄｂ（糖尿病）遺伝子である。同じ遺伝子株バックグラウンドに存在する場合、ｏｂ及びｄｂは区別できない代謝表現型及び挙動表現型をもたらし、これらの遺伝子が同じ生理学的経路で機能し得ることを示唆する［Colemanら,Diabetologia,14:141-148（1978）］。いずれの突然変異についてもホモ接合のマウスは過食性かつ低代謝性であり、生後１ケ月で顕著である肥満表現型をもたらす。これらの動物の体重は60-70gで安定化する傾向がある（対照マウスの30-35gと比較して）。ｏｂ動物及びｄｂ動物は突然変異に起因する一次欠陥を同定することを困難にした多数のその他のホルモン変化及び代謝変化を発現する［Brayら,Am.J.Clin.Nutr.,50:891-902（1989）］。以下に注目されるように、ＯＢ遺伝子の同定が一つの分子要素の理解をもたらした。
げっ歯類肥満モデルの夫々はヒトの型II糖尿病の炭水化物代謝に近似する炭水化物代謝の変化により伴われる。或る場合、糖尿病の重度はバックグラウンドマウス系統に一部依存する［Leiter,Endocrinology,124:912-922（1989）］。ｏｂ及びｄｂの両方について、共通遺伝子系C57BL/Ksマウスは究極β細胞壊死及び島萎縮とともにひどい糖尿病を発生し、かなりのインスリン欠乏症（insulino-penia）をもたらす。逆に、共通遺伝子系C57BL/6J  ｏｂマウス及びｄｂマウスはβ細胞栄養過度により最終的に相殺される一過性インスリン耐性糖尿病（ヒト型II糖尿病に似ている）を発生する。
ｏｂマウス及びｄｂマウスの表現型は糖尿病の発生以外の点でヒト肥満に似ている。突然変異体マウスは脂肪のない対照よりも多くを食し、少ないエネルギーを消費する（肥満のヒトのように）。また、この表現型は視床下部腹内側部の病変を有する動物に見られる表現型に実に似ており、これは両方の突然変異が中枢神経系内の栄養情報を適当にとり込み、またはそれに応答する能力に干渉し得ることを示唆する。この仮説の支持は、ｏｂマウスが循環安全因子を欠乏しており、ｄｂマウスがｏｂ因子の効果に耐性である（おそらくｏｂレセプター欠損のために）ことを示唆するパラビオーゼ実験［Coleman,Diabetologia,9:294-298（1973）］の結果から得られる。これらの実験は、これらの突然変異体マウスの肥満が生体組成を調節する仮定されたフィードバックメカニズムの求心ループ及び／または組込み中心の異なる欠損により生じ得るという結論をもたらした。
分子遺伝子マーカー及び古典的遺伝子マーカーを使用して、ob遺伝子及びdb遺伝子が夫々近位の染色体６及び中間染色体（midchromosome）４にマッピングされた［Baharyら,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:8642-8646（1990）;Friedmanら,Genomics,11:1054-1062（1991）］。両方の場合、突然変異はヒトとシンテニックであるマウスゲノムの領域にマッピングし、ｏｂ及びｄｂのヒト同族体がある場合には、それらがおそらくヒト染色体７ｑ及び１ｐに夫々マッピングすることを示唆する。ｄｂ遺伝子中の欠損はその他の哺乳類種に肥満をもたらし得る。Zucker fa/faラットとBrown Norway+/+ラットの遺伝的交雑において、fa突然変異（ラット染色体５）はマウスでｄｂに隣接する同じ遺伝子座により隣接される［Truettら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7806-7809（1991）］。
肥満に関する分子基礎を理解する上での重大な進歩がｏｂ遺伝子のクローニングにより起こった。マウス肥満（ｏｂ）遺伝子は体重ホメオスタシスのための脂肪組織由来シグナリング因子をコードする［Zhangら,Nature,372:425（1994）;1994年８月17日に出願された米国特許出願第08/292,345号;1995年６月７日に出願された米国特許出願第08/483,211号;1996年２月22日に公開された国際特許公開WO 96/05309］。幾つかの最近の研究は、エシェリキア・コリから精製された組換えＯＢタンパク質（レプチン）が外投与される時にｏｂ／ｏｂマウスの肥満関連表現型を修正し得ることを示していた［Campfieldら,Science,269:546（1995）;Pellymounterら,Science,269:540（1995）;Halaasら,Science,269:543（1995）;Stephensら,Nature,377:530（1995）］。また、組換えレプチンの体重減少効果が正常なマウス及び食事誘導肥満のマウスで観察された。レプチンの効果を媒介する標的組織は未だ特定されていなかったが、本発明者らは脳をレプチン活性の標的として予想していた。実際、Campfieldら（上記文献）及びStephensら（上記文献）の研究は、側脳室または第三脳室に導入されたレプチンが低投与量で有効であり、レプチン分子の直接の主要な作用に反論することを実証する。
最近の研究は、肥満のヒト及びげっ歯類（ｏｂ／ｏｂマウス以外）がレプチンｍＲＮＡまたはタンパク質を生産し、一般に脂肪のない個体よりも高いレベルを生じるそれらの能力に欠陥のないことを示唆していた［Maffeiら,Nature Med.,1:1155（1995）;Considineら,J.Clin.Invest.,95:2986（1995）;Lonnqvistら,Nature Med.,1:950（1995）;Hamiltonら,Nature Med.,1:953（1995）］。これらのデータは、レプチンの正常レベルまたは上昇したレベルに対する耐性がヒト肥満に重要な因子であり得ることを示唆する。しかしながら、レプチンレセプターの同定の最近の論文はｏｂ対立遺伝子中の突然変異を同定していなかった［Tartagliaら,Cell,83:1263-1271（1995）］。
それ故、レプチンのレセプターを同定したいという要望が当業界にある。
レプチンレセプターの突然変異を特性決定したいという更なる要望がある。特に、それらは肥満と関連し得るからである。
レプチンレセプター、またはその変異体の機能を同定し、特性決定したいという更なる要望がある。
当業界におけるこれらの要望及びその他の要望が本発明により取り組まれる。
本明細書中の文献の引用は、このような文献が本件出願の従来技術として利用できるという許可と見なされるべきではない。
発明の要約
本発明はレプチンレセプター（OB-R）ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸、その遺伝子のコーディング配列に隣接する非コーディング核酸、このような核酸にハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチド、ポリペプチドの抗体、並びに診断用組成物、治療用組成物及び化粧用組成物並びにポリペプチド、核酸、もしくは抗体、またはこれらの組み合わせを使用する方法に関する。
こうして、本発明の第一局面において、レプチンレセプター（また、本明細書中ＯＢレセプターまたはOB-Rと称される）は生理学的条件下のレプチンへの特異的結合、視床下部の細胞中の高レベルの発現、及び脂肪組織、睾丸、心臓、及び脳中の低レベルの発現、並びにgp130サイトカインレセプターに対し配列類似性を有することにより特性決定される。別の実施態様において、レプチンレセプターはクローン７のプローブ（フォワードプライマー配列番号42及びリバースプライマー配列番号43）、クローン11のプローブ（フォワードプライマー配列番号44及びリバースプライマー配列番号45）、並びにクローン７及びクローン11の両方からなる群から選ばれたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プローブで同定できる核酸によりコードされる。特別な実施態様において、レプチンレセプターはクローン42のプローブ（フォワードプライマー配列番号26及びリバースプライマー配列番号46）、クローン46のプローブ（フォワードプライマー配列番号47及びリバースプライマー配列番号48）、クローン58のプローブ（フォワードプライマー配列番号49及びリバースプライマー配列番号50）、クローンS14のプローブ（フォワードプライマー配列番号51及びリバースプライマー配列番号52）、及びクローンS3のプローブ（フォワードプライマー配列番号53及びリバースプライマー配列番号54）からなる群から選ばれたPCRプローブで同定できる核酸によりコードされる。
下記の特別な実施例において、レプチンレセプターはOB-Ra（配列番号２）、OB-Rb（配列番号４）、OB-Rc（配列番号６）、OB-Rd（配列番号８）、及びOB-Re（配列番号10）、またはこれらの対立遺伝子変異体からなる群から選ばれる。また、レプチンレセプターは
Lys889を介するOB-Raに相当するＮ末端並びにLys889の後のOB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdからなる群から選ばれたＣ末端に相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-RbまたはOB-Rcに相当するＮ末端、及びLys889の後のOB-RaまたはOB-Rdに相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-Rdに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、またはOB-Rcに相当するＣ末端；
Pro664からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；並びに
Met733からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；及び
OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びPro664からHis796までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端、及びHis796からのOB-Re；
OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びMet733からLys889までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端、及びHis796からのOB-Re、またはこれらの対立遺伝子変異体
からなる群から選ばれた配列を有し得る。
別の実施態様において、レプチンレセプターは
アミノ酸残基1-889;
アミノ酸残基23-889;
アミノ酸残基28-889;
アミノ酸残基133-889;
アミノ酸残基733-889;
アミノ酸残基1-796;
アミノ酸残基23-796;
アミノ酸残基28-796;
アミノ酸残基133-796;及び
アミノ酸残基73-796;
からなる群から選ばれるＮ末端配列、並びに配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15からなる群から選ばれるＣ末端配列を有してもよく、そのナンバリングはシグナルペプチド、またはその対立遺伝子変異体を含む完全長転写マウスレプチンレセプターのアミノ酸配列に基く。
特別な実施態様において、レプチンレセプターは可溶性レセプターである。このような可溶性レセプターはOB-Re；OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びPro664からHis796までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端配列、及びHis796からのOB-ReであるＣ末端配列；並びにMet733からHis796までのOB-R、及びHis796からのOB-ReであるＣ末端配列；
アミノ酸残基1-796;
アミノ酸残基23-796;
アミノ酸残基28-796;
アミノ酸残基133-796;及び
アミノ酸残基733-796
からなる群から選ばれるＮ末端配列、並びに
配列番号15であるＣ末端配列からなる群から選ばれてもよく、そのナンバリングはシグナルペプチド、またはその対立遺伝子変異体を含む完全長転写マウスレプチンレセプターのアミノ酸配列に基く。特別な実施態様において、可溶性OB-Rは組換えバキュロウイルス発現系中で生産される。
以上の実施態様は、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその両方が非天然産アミノ酸残基、例えば、異種シグナルペプチドまたはシグナルペプチド開裂部位残基を含む実施態様を含む。例えば、特別な実施態様において、本発明はOB-Rの下記の可溶性形態を提供する。
0004285771.tif 000002
更に、本発明は種々の突然変異及び置換を意図している。例えば、一つの種（例えば、マウス）からの高度に分岐したアミノ酸残基が別の種（例えば、ヒト）中の相当する残基に代えて置換されて生物的または機能的に活性なレプチンレセプター、またはそのフラグメントを生じ得る。また、或る構造残基または推定構造残基がその構造上の傾向を増大または減少する残基で置換し得る。下記の特別な実施態様において、システイン残基またはシステイン対がセリン（または別の匹敵するアミノ酸残基、例えば、スレオニン、メチオニン、アラニン等）で置換されてジスルフィド結合を欠失し得る。下記の特別な実施態様において、Cys188と193、471と602、471と526、及び602と611の一つ以上がSerに突然変異され、こうしてジスルフィドを形成しないタンパク質を生じる。このような置換は遺伝子操作系中の発現中の不正確なジスルフィド架橋の形成を回避するかもしれず、また結晶化に好ましい。
また、レプチンレセプターはトランスメンブランドメインを含み、内在性膜タンパク質である。この実施態様において、レプチンレセプターは“ボックス１”、“ボックス２”、及び“ボックス１”と“ボックス２”から選ばれたJAK結合モチーフを更に含んでもよく、そのモチーフはトランスメンブランドメインの下流にある。
一つの特別な実施態様において、レプチンレセプターはヒトレプチンレセプターである。下記に例示される別の特別な実施態様において、レプチンレセプターはマウスレプチンレセプターである。更に別の特別な実施態様において、レプチンレセプターはマウスレプチンレセプターの相当する位置からの分岐アミノ酸置換を含むヒトレプチンレセプターである。別の実施態様において、レプチンレセプターは保存アミノ酸置換を含むヒトレプチンレセプターである。特別な実施態様において、マウスレプチンレセプターからの保存アミノ酸置換はヒトレプチンレセプター中でつくられる。更に別の実施態様において、二次構造、例えば、α−らせん傾向を増進する保存アミノ酸置換がつくられる。
更に、本発明はレプチンレセプターの抗原フラグメントを提供する。特別な実施態様において、抗原フラグメントは配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選ばれる。
更に、本発明は化学部分に結合されたレプチンレセプターの可溶性形態の誘導体に関する。化学部分は水溶性ポリマーであることが好ましい。水溶性ポリマーはポリエチレングリコールであることが更に好ましい。
別の局面において、本発明は特に上記のレプチンレセプターをコードする単離された核酸を提供する。下記の特別な実施態様において、本発明はマウスレプチンレセプターの種々のスプライス形態をコードするｃＤＮＡを提供する。特に、本発明は配列番号１、３、５、７、または９に相当する配列、または相補性の配列を有する核酸を提供する。
更に特別には、本発明は発現の際に
配列番号１、３、５、７、または９のＤＮＡ分子のポリペプチドコーディング配列；
（a）に定義されたＤＮＡ分子に相補性のＤＮＡ分子；
（a）または（b）のＤＮＡ分子にハイブリッドを形成するＤＮＡ分子、またはそのハイブリッドを形成することができるフラグメント；
クローン７のプローブ（フォワードプライマー配列番号42及びリバースプライマー配列番号43）、クローン11のプローブ（フォワードプライマー配列番号44及びリバースプライマー配列番号45）、及びクローン７及びクローン11の両方からなる群から選ばれたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プローブで同定できるＤＮＡ分子；及び
以上のＤＮＡ分子のいずれかによりコードされたポリペプチドを発現の際にコードするＤＮＡ分子
からなる群から選ばれたレプチンレセプターポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。
ＤＮＡ分子はヒトであることが好ましい。下記の特別な実施例において、ＤＮＡ分子はマウスである。特別な実施態様において、ＤＮＡ分子は発現の際にOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、OB-Rd、及びOB-Re、またはこれらの対立遺伝子変異体からなる群から選ばれたレプチンレセプター；
Lys889を介するOB-Raに相当するＮ末端並びにLys889の後のOB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdからなる群から選ばれたＣ末端に相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-RbまたはOB-Rcに相当するＮ末端、及びLys889の後のOB-RaまたはOB-Rdに相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-Rdに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、またはOB-Rcに相当するＣ末端；
Pro664からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；並びに
Met733からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；及び
OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びPro664からHis796までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端、及びHis796からのOB-Re；
OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びMet733からLys889までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端、及びHis796からのOB-Re、またはこれらの対立遺伝子変異体からなる群から選ばれたレプチンレセプター；
Ｎ末端配列が
アミノ酸残基1-889;
アミノ酸残基23-889;
アミノ酸残基28-889;
アミノ酸残基133-889;
アミノ酸残基733-889;
アミノ酸残基1-796;
アミノ酸残基23-796;
アミノ酸残基28-796;
アミノ酸残基133-796;及び
アミノ酸残基733-796;
からなる群から選ばれ、かつＣ末端配列が配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15（His796の後）からなる群から選ばれるレプチンレセプター（そのナンバリングはシグナルペプチド、またはその対立遺伝子変異体を含む完全長転写マウスレプチンレセプターのアミノ酸配列に基く）
からなる群から選ばれたポリペプチドをコードする。
更に別の実施態様において、本発明はＮ末端もしくはＣ末端、またはその両方が非天然産アミノ酸残基、例えば、異種シグナルペプチドまたはシグナルペプチド開裂部位残基を含む可溶性レプチンレセプターを発現の際にコードする単離された核酸、特にＤＮＡ分子を提供する。例えば、特別な実施態様において、本発明は
OB-Rの下記の可溶性形態をコードするＤＮＡを提供する。
0004285771.tif 000003
更に、本発明は先に説明された種々の突然変異及び置換を有するレプチンレセプターをコードするＤＮＡを意図している。例えば、システイン残基またはシステイン対がセリン（またはスレオニン、メチオニン、もしくはアラニン）で置換されてジスルフィド結合を欠失し得る。下記の特別な実施態様において、本発明はCys188と193、471と602、471と526、及び602と611の一つ以上がSerに突然変異され、こうしてジスルフィドを形成しないタンパク質を生じる可溶性OB-RをコードするＤＮＡ分子を提供する。
更に、本発明は、上記コーディング核酸の必然的帰結として、レプチンレセプターをコードする核酸分子、特に、ＤＮＡ分子にストリンジェント条件下でハイブリッドを形成することができるオリゴヌクレオチドを意図している。以下に例示される特別な実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、及び配列番号54からなる群から選ばれる。オリゴヌクレオチドは標識されてもよい。
コーディングＤＮＡに加えて、本発明はこのようなＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明のベクターはクローニングベクターであってもよく、またはそれは発現ベクターであってもよく、それは発現調節配列と操作により会合されたレプチンレセプターをコードするＤＮＡを含む。当然に、本発明は本発明のＤＮＡ分子、クローニングベクター、または発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた単細胞宿主に及ぶ。このような単細胞宿主は組織培養中のバクテリア、酵母、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞からなる群から選ばれてもよい。特別な実施態様において、宿主はE.coli、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ピチア（Pichia）、カンジダ、ハンセニューラ、トルロプシス、CHO、R1.1、B-W、LM、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、及びSf9細胞からなる群から選ばれてもよい。
更に、本発明は本発明の発現ベクターを含む宿主細胞をレプチンレセプターポリペプチドの発現を与える条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを特徴とするレプチンレセプターポリペプチドの組換え調製方法に関する。
更に、本発明はレプチンレセプターをコードするｍＲＮＡとハイブリッドを形成するアンチセンス核酸、及びレプチンレセプターをコードするｍＲＮＡを開裂するリボザイムを提供する。
別の実施態様において、本発明はレプチンレセプターをコードするＤＮＡ分子を含むトランスジェニックベクター、または本発明の発現ベクターを提供する。
別の局面において、本発明はレプチンレセプターに特異的な抗体を提供する。その抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体として、約10〜30アミノ酸残基の合成ポリペプチドフラグメントを含むレプチンレセプターの抗原フラグメントに対し産生された抗体が挙げられる。特別な実施態様において、抗体は検出できる標識で標識されてもよい。当然に、本発明はモノクローナル抗体を産生する不死細胞系に及ぶ。
特別な実施態様において、本発明は宿主動物をアジュバントと混合されたレプチンレセプターまたはその免疫原フラグメントで免疫し、免疫された宿主動物から抗体を得ることを特徴とするレプチンレセプターに特異的な抗体の調製方法を提供する。以下に例示される別の特別な実施態様において、レプチンレセプターに特異的な抗体の調製方法は配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選ばれた配列を有するペプチドをキャリヤータンパク質に接合し、宿主動物をアジュバントと混合された工程（a）のペプチド−キャリヤータンパク質接合体で免疫し、免疫された宿主動物から抗体を得ることを特徴とする。
本発明の抗体と合わせて、本発明はレプチンレセプターを含むと考えられるサンプルを抗体とレプチンレセプターを含む反応複合体の形成を可能にする条件下でレプチンレセプターに特異的に結合する抗体と接触させ、サンプル中の抗体とレプチンレセプターを含む反応複合体の形成を検出することを特徴とするサンプル中のレプチンレセプターの存在の測定方法を提供し、反応複合体の形成の検出はサンプル中のレプチンレセプターの存在を示す。特別な実施態様において、抗体が固相担体に結合される。サンプル中のレプチンレセプターの存在の測定方法の必然的帰結として、本発明は記載されるような生物学的サンプル中の反応複合体の形成を検出し、形成された反応複合体の量（その反応複合体の量は生物学的サンプル中のレプチンレセプターのレベルに相当する）を評価することを特徴とする生物学的サンプル中のレプチンレセプターのレベルのin vitro評価方法を提供する。更に、本発明は記載されるような被験者からの生物学的サンプル中のレプチンレセプターのレベルを評価し、工程（a）で検出されたレベルを正常な被験者または早期の被験者中に存在するレプチンレセプターのレベルと比較することを特徴とする被験者中のレプチンレセプターの上昇したレベルまたは減少したレベルと関連する疾患の存在のin vitro検出または診断方法に関するものであり、正常なレベルと比較してレプチンレセプターのレベルの増加はレプチンレセプターの上昇したレベルと関連する疾患を示し、また正常なレベルと比較してレプチンレセプターの減少したレベルはレプチンレセプターの減少したレベルと関連する疾患を示す。
また、本発明は可溶性レプチンレセプター、及び医薬上許されるキャリヤーを含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。また、本発明の医薬組成物は遺伝子治療のために被験者に投与するためにトランスジェニックベクター、例えば、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡを含んでいてもよい。このようなベクターは脳、更に好ましくは視床下部にターゲッティングされることが好ましい。更に、本発明は治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする被験者の肥満の治療方法を提供する。その治療方法は糖尿病、高血圧、及び高コレステロールの治療を施すことを更に含んでいてもよい。
別の実施態様において、本発明は可溶性レプチンレセプター、及び許されるキャリヤーを含むことを特徴とする個人の体重の減少のための生体外観改善化粧用組成物を提供する。更に、本発明は本発明の化粧用組成物を投与することを特徴とする個人の生体外観の改善方法を提供する。
それ故、本発明の主たる目的は哺乳類の脂肪及び脂肪分の調節及び変化と関連する或る特徴及び活性を示す精製形態の本明細書に定義された体重のモジュレーターを提供することである。
本発明の別の目的は生理状態の有効な診断及び監視の手段としての本明細書に示された体重調節のモジュレーターの検出方法及び測定方法を提供することであり、このようなモジュレーターのレベルの変化は特徴的な特質であり、または特徴的な特質であり得る。
本発明の更に別の目的はレセプターに結合するレプチンの活性を模擬または抑制するのに潜在的に有効である物質、例えば、薬物、薬剤等、例えば、哺乳類中の本発明のモジュレーターのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法及び関連アッセイ系を提供することである。
本発明の更に別の目的は哺乳類の体重及び脂肪分を調節し、かつ／または体重の異常な低下または上昇が特徴的な特質である或る種の病状を治療するための哺乳類の治療方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は匹敵する治療方法のための遺伝子治療プロトコル及び／または医薬組成物中の使用のための遺伝子構築物を調製することであり、それらはモジュレーター、結合パートナー、またはそれらの生産を調節し、またはそれらの活性を模擬または拮抗作用し得る薬剤の一種以上を含み、またはそれらをベースとする。
その他の目的及び利点が以下の図面を参考にして進行する以下の説明に鑑みて当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１．ｄｂ遺伝子の領域へのレプチンレセプターの局在化。ｄｂ突然変異を合計750減数分裂の二つの交雑で分離した。これらの交雑の子孫を地図に示されたマーカーでゲノタイピングすることにより遺伝子地図を作った。主要組換え動物を線上の数字として地図に表示する。染色体歩行をミクロディスセクション（microdissection）クローンD4Rck22で開始した。歩行は2.7メガベースをスパンし、YAC（太線）、BAC（イタリック体）及びP1バクテリオファージ（数字）を含んでいた。二つのSSLPマーカー、これらのゲノムクローンの末端からのD4Rck6及びD4Rck7による組換え動物のゲノタイピングはｄｂ遺伝子を動物324及び1028中の組換えイベントの間の約300kb間隔に局在化した。この間隔はBAC242及び43によりスパンされた。サザンブロット及びPCRは、レプチンレセプターの5’末端がBAC150Aにマッピングし、3’末端がBAC19にマッピングすることを明らかにし、その遺伝子がテロメアに向かって転写されることを示す。
図2A-B．レプチンレセプターの幾つかのスプライス変異体が存在する。（A）JAK結合及びシグナル伝達のための推定モチーフ、“ボックス１”及び“ボックス２”（陰影付きの領域）を有するレプチンレセプターの略図。“TM”は推定トランスメンブランドメインを示す。合計８のｃＤＮＡクローンをマウス脳から単離した。これらのｃＤＮＡはレプチンレセプターの５種の異なるスプライス変異体に相当することがわかった。（B）クローンのうちの６種はレプチンレセプターのリシン889の上流の部分的に同一の配列（OB-Ra、OB-Rb、OB-Rc及びOB-Rd）を有し、その位置で予想されたタンパク質が分岐した。これらのクローンの予想されたＣ末端アミノ酸配列が示される（夫々、配列番号11-14）。OB-Ra、b、c、及びdの全てがボックス１モチーフを予想する。また、OB-Rbはボックス２に潜在的に相同のペプチド配列（下線が施されている）を予想する。二つの独立のｃＤＮＡクローンはヒスチジン796の上流のレプチンレセプターに同一であり、その位置で配列が分岐した（OB-Re）（配列番号15）。ヌクレオチド配列は可溶性レセプターを予想する。
図3A-C．ｄｂ突然変異は異常なＲＮＡスプライシング及びスプライス変異体OB-RbからOB-Raへの変換をもたらす。（A）OB-Rb RNAに特異的なプライマー対（F1及びＲ3）を使用して、C57BL/Ks db/db及び野生型マウスからのRT-PCR産物を増幅した。電気泳動はこれらのｄｂマウスから増幅されたフラグメントが野生型動物からのものよりも大きいことを明らかにした。Pro890でOB-RbスプライスアクセプターをスパンするゲノムＤＮＡのPCR産物はC57BL/Ks db/dbマウス及び同腹子対照で同じサイズであった。（B）プライマーF2及びＲを使用してゲノムＤＮＡを増幅した。ベクトレット（vectorette）PCR及びBAC242を使用してP890でスプライスアクセプターの上流のゲノムＤＮＡの配列を得た後に、F2プライマープライマーを選択した。（C）RT-PCRのプライマーの局在化及びゲノムPCR増幅。
図4A-D．野生型マウスの視床下部ＲＮＡ。（A）OB-Ra、（B）OB-Re、（C）OB-Rd及び（D）OB-ReのＣ末端コーディング領域に関する視床下部RT-PCR産物はｄｂマウスで通常のサイズであった。スプライス結合を横切るＤＮＡ配列はこれらのRT-PCR産物の夫々で通常であった。これはLys889におけるスプライスドナーが野生型であることを示す。
図5A-C．ｄｂマウス中のスプライス突然変異の同定。（A）ＤＮＡ配列決定はLys889とPro890の間のスプライス結合で突然変異体OB-Rb RNA中の106bp挿入を同定した（配列番号16）。挿入の配列はOB-RAのＣ末端エクソンの最初の106bpと同じであった。挿入は早期終止コドンを予想し、OB-Rbのアミノ酸配列（配列番号17）をOB-Raに変化する。（B、C）OB-Ra及びOB-Rb 3’末端の推定ゲノム構成が示される。C57BL/K9db/dbマウス（配列番号18）及び同腹子対照（配列番号19）からのOB-RaエクソンのＤＮＡ配列決定がR890でスプライスアクセプター後のＧからＴへの突然変異106塩基対を明らかにした。この突然変異はコンセンサススプライスドナー部位、AGGTAAAの出現をもたらし、これがOB-RbのＣ末端エクソンへのOB-RaのＣ末端エクソンの106bpの挿入をもたらす。
図6A-F．オルタナチブスプライシングされたレプチンレセプターの組織分布。RT-PCRを示された組織源から行った。夫々の場合、共有されたヌクレオチド配列の領域からの一つのプライマーをオルタナチブスプライシングされたエクソンに特異的なプライマーと組み合わせて使用した。アクチンｍＲＮＡは対照として利用することができた。（B）脳、（H）視床下部、（L）肝臓、（H）心臓、（K）腎臓、（S）脾臓、（T）睾丸、（F）脂肪組織、（S）脾臓。
図７．NIH-肥満ラット（cp/cp）突然変異。肥満NIH facp/facpラット及び脂肪のないラットからのLeprのＤＮＡ配列が示される。肥満cp/cpラット及び脂肪のない同腹子の脳から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。PCR産物をゲル精製し、自動配列決定装置で上記プライマーで配列決定した。cp/cpラットはTyr763で終止コドンをもたらすヌクレオチド2289におけるＴ→Ａの塩基変化を有する。
図８．野生型マウス及びdb3J/db3JマウスからのLeprのPCR。129db3J/db3Jマウス及び野生型マウスからのＤＮＡを使用して、Leprの細胞外領域からのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方をPCR増幅した。両方の場合、PCR産物は突然変異体マウス中で短かった。全てのプライマーは3JR2以外のOb-Rコーディング領域からのものであり、3JR2はイントロンであり、その結果、ゲノムＤＮＡから増幅された産物はアガロースゲルで分割し得る。
図９．db3J/db3JマウスからのPCR産物を配列決定した。17bpの欠失をこの突然変異体中で同定した。同じ欠失をゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方中で同定した。
図10．レプチンレセプター突然変異の略図。Lepr対立遺伝子の夫々の予想されたタンパク質が示される。夫々のレセプターの最後の数字はカルボキシ末端のアミノ酸残基を表す。db3J/db3J線図の最後の短い直線はフレームシフトにより生じられるアミノ酸625後の11の付加的な残基を表す。
図11．OB-Re及びOB-Re突然変異体の増幅のためのPCRプライマー及び戦略。矢印はPCRプライマー（下記の表２）を表し、これらは数字で標識される。全ての１°PCR反応をOb-Re cDNA鋳型で行った。全ての２°PCR反応を、鋳型として相当する１°PCR産物からの等量の混合物を使用して行った。
図12．レプチン結合実験の略図。略図は遊離レプチンとのレプチン−セファロースに結合する組換えOb-Reの競合的抑制を示す。
発明の詳細な説明
本発明は本明細書中OBレセプター（OB-R）またはレプチンレセプターと称されるタンパク質、縮重変化、例えば、特別な発現系中の発現に最適のコドンを含む変化を含むOB-R遺伝子（また、本明細書中ＤＢと称される--全てのかしら文字が使用される場合、それは天然タンパク質または遺伝子を表すことが注目されるべきである；全ての下の場合は突然変異体タンパク質または遺伝子を表す；イタリック体は遺伝子または核酸分子を示す；また通常の型はタンパク質またはポリペプチドを示す）を含むそのタンパク質をコードする核酸の解明及び発見に関するものであり、そのタンパク質は哺乳類の体重の調節に関与する能力を示す。特に、のタンパク質はレプチンを結合する能力を示す。特別な実施態様において、そのタンパク質はレプチンへの結合後にシグナル伝達を媒介する。
本発明のＯＢレセプターは三つの重要な構造ドメイン：細胞外（または細胞質外）ドメイン、トランスメンブランドメイン、及び細胞質ドメインを含んでもよい。細胞外ドメインはレプチン、レプチン−タンパク質複合体（例えば、可溶性レプチンレセプターに結合されたレプチン）を結合すると仮定され、おそらくその他のタンパク質またはリガンドを結合し得る。実際に、本明細書に示されるように、細胞質外ドメインは非常に高いアフィニティーでレプチンを結合し、二つのレプチン結合部位を含む。特別な実施態様において、本発明のレセプターは細胞外ドメインのみを含み、即ち、それは可溶性レセプターである。トランスメンブランドメインは細胞膜の疎水性領域に局在化する高度に非極性のアミノ酸残基のストレッチを含む。これに関して、トランスメンブランドメインという用語は分子生物学及び細胞生物学に通常の意味を有する。最後に、本発明のＯＢレセプターの細胞質ドメインは“ボックス１”及び“ボックス２”と称されるJAK結合コンセンサス配列を含んでなくてもよく、またはその１個もしくは２個を含んでいてもよい。“ボックス１”及び“ボックス２”を有するレセプターはリガンド、例えば、レプチンを結合した後にJAK-Stat経路によりシグナル伝達に応答能があると考えられる。
更に、そのタンパク質は多数のスプライス形態を有するものとして同定された。一局面において、スプライス変化はＣ末端配列の分岐をもたらす。こうして、そのタンパク質はレプチン活性に作用すると仮定された分泌形態中に見られる。それは血液−脳関門を横切ってレプチン移入を促進し得るが、シグナル伝達に関係するドメインを欠いている内在性膜レセプターとして見られ、またそれはシグナル伝達に関係するドメインを含む内在性膜レセプターとして見られる。別の局面において、スプライス変化はＮ末端ポリペプチド配列の分岐をもたらす。
対象の核酸は動物、特別にはマウス及びヒトのOB-Rポリペプチドに相当するコーディング配列に相当し、これは、レプチンを結合する際にシグナル伝達を媒介することにより（または媒介することができないことにより）、体重及び肥満の調節に重要な役割を果たすものと仮定される。本明細書中に示されたデータは、本発明の核酸のポリペプチド産物の一つのスプライス変異体がそれを発現する細胞により分泌されてもよく、またはそれが内在性膜タンパク質として発現されてもよいことを示す。いずれの場合にも、ポリペプチドはレプチンに結合することによりレプチンレセプターとして機能する。追加の実験データは、OB-Rポリペプチドの天然産スプライス形態がｏｂ遺伝子の突然変異を有するマウスの肥満を治療するのに非常に有効であることを示唆する。
加えて、本明細書中の実施例は、また本明細書中“レプチンレセプター”と称されるOB-RポリペプチドをコードするｍＲＮＡが視床下部、睾丸、及び脂肪細胞中で発現されることを実証する。また、データは脈絡集網中のそのタンパク質の発現を実証する。
更に別の局面において、一つの種からのOB-Rポリペプチドは別の種中のOB-Rに密接に関係する（相同）。特に、ヒトOB-RポリペプチドはマウスOB-Rポリペプチドに高度に相同である。この観察は、ヒトレプチンがマウス中で活性であるこを示すデータと合致する。ホルモンが種間で活性であるためには、同様に異種からのレセプター間に高度の類似性または相同性が予想されるであろう。
主たる局面において、本発明は哺乳類の体重のモジュレーターとして機能する物質の同定に関する。特に、本発明はマウス及びヒトの両方中のOB-R遺伝子（また、本明細書中及び文献中でＤＢと称される）またはそのコーディング領域に相当する或る種の核酸、並びにこれらの核酸により発現される相当するポリペプチドの単離、精製、及び配列決定に関する。こうして、本発明は配列番号１、３、５、７、及び９に示されたヌクレオチド配列を有する核酸の発見を含み、またこれらの縮重変異体、対立遺伝子及びフラグメントについて、全てが体重及び肥満を調節する活性を有する。OB-R遺伝子に対する本核酸の一致は肥満並びに体重の異常が寄与因子である場合のその他の疾患及び機能障害の如き症状にそれらの有意なインパクトを予示する。本発明は本発明の核酸により発現されたタンパク質、特に配列番号２、４、６、８、及び10に示されたタンパク質並びに保存変異体及び活性フラグメントに及ぶ。
OB-Rの異なるスプライス変異体、例えば、OB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、OB-Rd、及びOB-Reにより代表されるような変異体が本発明によれば特に重要である。本発明は同様にその他のOB-Rスプライス変異体を予測する。
こうして、特別な実施態様において、OB-Rという用語は以下のスプライス変異体（アミノ酸ナンバリングはマウスOB-Rに適用されたナンバリング［Tartagliaら,Cell,83:1263（1995）］に相当し、これが本明細書に採用された）を表す。
Lys889を介するOB-Raに相当するＮ末端及びLys889後のOB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdからなる群から選ばれたＣ末端に相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-RbまたはOB-Rcに相当するＮ末端、及びLys889後のOB-RaまたはOB-Rdに相当するＣ末端；
Lys889を介するOB-Rdに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、またはOB-Rcに相当するＣ末端；
Pro664からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；
Met733からLys889までのOB-Rに相当するＮ末端、及びOB-Ra、OB-Rb、OB-Rc、及びOB-Rdに相当するＣ末端；
OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd、及びPro664からHis796までのOB-Rからなる群から選ばれたＮ末端、及びHis796からのOB-Re；及び
Met733からHis796までのOB-Rに相当するＮ末端、及びHis796からのOB-Re。
OB-Rの種々の形態［これらはアゴニスト（例えば、OB-Rの天然産分泌形態）またはアンタゴニスト（例えば、レプチンのみに結合するOB-Rのトランケート形態）として作用し得る］は、単独または癌もしくはエイズの如き不利な医療症状の一部として、体重または肥満の異常な変動を経験している患者に、その治療のために種々の手段による投与に有効な濃度で好適なキャリヤーとともに医薬組成物中で調製し得る。種々の投与技術、それらの中でも、経口投与、経粘膜投与の鼻内形態及びその他の形態、非経口技術、例えば、皮下注射、静脈内注射及び腹腔内注射、カテーテル法等が利用されてもよい。可溶性OB-R分子の適当な量は変化してもよく、特に適任の医師または獣医の推奨及び処方箋に基くべきである。
上記に従って、レプチンの活性を模擬または拮抗作用するのに有効な潜在的な薬物をスクリーニングのためのアッセイ系が調製し得る。有望な薬物はOB-Rの可溶性形態と接触されてもよく、またはOB-Rのレセプター形態を発現する細胞とともに使用されてもよく、それがOB-Rに結合し、または活性化（もしくは拮抗作用）するか否かを測定し得る。例えば、発現アッセイ系において、培養物が試験されて有望な薬物単独のため、または添加量の既知の体重モジュレーターレプチンの効果のための、細胞の活動の変化を観察し得る。
先に述べたように、本明細書に記載されたOB-R遺伝子の分子クローニングは哺乳類の体重を調節するように分子レベルで機能する物質のクラスの同定をもたらした。本発明のモジュレーターの発見は、肥満、癌と関連する体重損失を含むが、これらに限定されない栄養障害の診断及び治療並びに肥満と関連する疾患、例えば、高血圧、心臓疾患、及び型II糖尿病の治療に重要な意味を有する。加えて、動物の体重を調節したいと願う場合に遺伝子産物についての潜在的な農業用途がある。OB-R遺伝子を特に参考とする以下の説明は本発明の一部を構成するモジュレーターのクラスについて一般的な適用可能性を有し、それ故、解釈のこのような許容範囲及び範囲と適合されるべきである。
特別な実施態様において、OB-Rポリペプチドの機能活性はトランスジェニックで評価し得る。OB-R遺伝子はトランスジェニックマウスを使用する相補性研究に使用し得る。ウイルスベクターを含むトランスジェニックベクター、または候補遺伝子の野生型遺伝子座に相当するコスミドクローン（またはファージクローン）が、単離されたOB-R遺伝子を使用して構築し得る。コスミドは公表された操作［Jaenisch,Science,240:1468-1474（1988）］を使用してトランスジェニックマウスに導入し得る。構築物はC57BL/6J db/db X DBA異種交雑のF1子孫の間の異種交雑に由来する受精卵に導入される。コスミドトランスジェニック動物中のｄｂ遺伝子座の遺伝子型は、動物をタイトに連鎖したRFLPまたはその突然変異に隣接し、かつ前駆株の間で多形性であるミクロサテライトでタイピングすることにより決定し得る。相補性は、特別な構築物が遺伝的に肥満のF2動物（RFLP分析によりスコアを付けられたような）を脂肪のなく、かつ非糖尿病にする時に実証されるであろう。これらの環境下で、相補性の最終的な証拠は、トランスジーンを有するdb/db動物がdb/db卵巣移植体に交配されることを必要とするであろう。この交雑において、トランスジーンを有しない全てのN2動物は肥満かつインスリン耐性糖尿病であり、一方、トランスジーンを有する動物は脂肪がなく、しかも血漿中に正常なグルコース濃度及びインスリン濃度を有するであろう。遺伝の意味で、トランスジーンはサプレッサー突然変異として作用する。
また、OB-R遺伝子は野生型動物中でアンチセンス配向で発現された時にそれらの表現型効果を調べることにより試験し得る。このアプローチにおいて、野生型対立遺伝子の発現が抑制され、これが突然変異体表現型をもたらす。RNA・RNA二重鎖形成（アンチセンス−センス）はｍＲＮＡの通常の取扱いを阻止し、野生型遺伝子効果の部分または完全排除をもたらす。この技術が組織培養中にTK合成を抑制し、またショウジョウバエ中のクルッペル突然変異の表現型、及びマウス中のシベレー（Shiverer）突然変異の表現型を生じるのに使用されていた［Izantら,Cell,36:1007-1015（1984）;Greenら,Annu.Rev.Biochem.,55:569-597（1986）;Katsukiら,Science,241:593-595（1988）］。このアプローチの重要な利点は、遺伝子の小部分のみが全同族体ｍＲＮＡの発現の有効な抑制のために発現される必要があることである。アンチセンストランスジーンはそれ自体のプロモーターまたは正確な細胞型中で発現された別のプロモーターの制御下に置かれ、SV40 polyA部位の上流に置かれるであろう。このトランスジーンはトランスジェニックマウスをつくるのに使用し得る。また、トランスジェニックマウスは卵巣移植体に交配されて、ｏｂ異型接合体がアンチセンス構築物の効果に一層感受性であるか否かを試験し得る。
長期にわたって、OB-R遺伝子産物（OB-Rポリペプチドまたはタンパク質）はその活性に影響する小分子のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するのに有益である。
この明細書中に使用された種々の用語は、本明細書中、例えば、以下に示される定義を有するべきである。
“体重モジュレーター”、“モジュレーター”という用語、及び特別にリストされないあらゆる別型は本明細書中互換可能に使用され、また本件出願及び請求の範囲に使用されるように、或る場合にはヌクレオチド及びタンパク質物質の両方を表し、後者は単一タンパク質または多種タンパク質の両方を含む。更に詳しくは、上記用語はヌクレオチド並びに本明細書に記載され、配列番号１、３、５、７、及び９に示された配列を有するＤＮＡに及ぶ。同様に、本明細書に記載され、配列番号２、４、６、８、及び10に示されたアミノ酸配列データを有するタンパク質が意図されており、同様に、本明細書及び請求の範囲の両方の全ての物質に関して示された活性のプロフィールが意図されている。
レプチンへの特異的結合はレプチンがOB-Rのリガンドであることを意味する。何となれば、その用語がリガンド−レセプター結合を記載するのに使用されるからである。一般に、このような結合は1x107M-1より大きく、好ましくは1x108M-1より大きく、更に好ましくは1x109M-1より大きい会合定数により表されるアフィニティーを有するであろう。しかしながら、正確な会合定数は変化するかもしれない。
gp130との相同性は残基、特にシスティン残基、モチーフ、及びその他の重要な残基の保存を表す。“gp130”という用語は本明細書中一般にクラスＩサイトカインレセプターファミリー、特にインターロイキン-6（IL-6）レセプター、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）レセプター、毛様体神経栄養因子（CNTF）レセプター、及び白血病抑制因子（LIF）レセプターを表すのに使用される。
更に、実質的に均等または変化した活性を示すヌクレオチドが同様に意図されており、実質的に同様の類似体及び対立遺伝子変化を含む。同様に、計画的に、例えば、部位誘導突然変異誘発により、またはモジュレーターを生産する宿主中の突然変異により偶然に修飾されたタンパク質を含む、実質的に均等または変化した活性を示すタンパク質が同様に意図されている。
“対立遺伝子変異体”という用語は点突然変異を有し得る異なる個体中の相当する遺伝子を表す。例えば、種々のｏｂ突然変異はOB-Rの対立遺伝子変異体を表す。
“同族体”という用語は、その文法形態の全てにおいて、別の種からの相当する遺伝子またはタンパク質を特別に含む。特別な実施態様において、マウスOB-Rの同族体はヒトOB-Rである。また、その用語は、例えば、あたかも別の種からのような類似の遺伝子またはタンパク質に相当するように、別の種のポリペプチド中の或る種からの変異体アミノ酸残基の置換により、突然変異または変化された遺伝子またはタンパク質を含み得る。当業界で公知であるように、相同遺伝子は、二三このような方法を挙げると、配列類似性、別の種中の遺伝子に特異的なプローブによるハイブリダイゼーション、異種のプライマーを使用するPCR分析による検出、または染色体のシンテニック位置へのマッピングにより容易に同定し得る。タンパク質相同性は、同種タンパク質について公知の試験の幾つかを挙げると、抗体交差反応性、同様のプロテアーゼ消化プロフィール、匹敵する分子量及び等電点、並びに同様の二次構造または三次構造により検出し得る。
核酸配列またはアミノ酸配列に関して本明細書に使用される“実質的に同様”という用語は少なくとも50％の配列類似性、好ましくは少なくとも60％の配列類似性、更に好ましくは少なくとも70％の配列類似性、更に好ましくは少なくとも80％の配列類似性、最も好ましくは少なくとも90％の配列類似性を意味する。
本明細書に使用される“遺伝子”という用語は発現時にタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡを表す。特にことわらない限り、遺伝子はｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含んでもよい。
“Ａ”を含む組成物（“Ａ”が単一タンパク質である場合、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞等）は、組成物中のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター（Ａ及びＢが属する種のカテゴリーに応じて）の少なくとも約75重量％が“Ａ”である場合には“Ｂ”を実質的に含まない（この場合、“Ｂ”は一種以上の汚染タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含むが、Ａのラセミ形態を排除する）。“Ａ”は組成物中のＡ＋Ｂ種の少なくとも約90重量％を構成することが好ましく、少なくとも約99重量％を構成することが最も好ましい。また、汚染を実質的に含まない組成物は関係する種の活性または特性を有する単一分子量種のみを含むことが好ましい。
“BAC”はバクテリアの人工染色体である。“STS”は配列標識部位を表す。
“YAC”は酵母の人工染色体である。その他の用語は当業界で通常意図される通常の意味を有する。
OB-Rポリペプチド
天然産ポリペプチドを表す“タンパク質”、及び“ポリペプチド”という用語はOB-R遺伝子産物及びその変異体に関して本明細書中互換可能に使用される。更に特別には、OB-RはOB-R（ＤＢ）遺伝子産物、例えば、細胞質ドメイン中に二つのJAK結合ボックスを有する産物；細胞質ドメイン中に唯一のJAK結合ボックスを有する産物；ボックスを有しない産物；及び分泌された（可溶性）産物（これらに限定されない）のスプライス形態のいずれをも表す。また、OB-Rという用語は分岐Ｎ末端アミノ酸配列を有する種々のスプライス形態を表す。
OB-Rという用語は以下の形態を含むが、これらに限定されないポリペプチドの異なるスプライス形態を特に含む。
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OB-Rという用語は、例えば、先に記載されたような上記変異体からの異なる要素を含むスプライス変異体を特に意図している。
更に特別には、本発明は開裂されたＮ末端シグナル配列を有するOB-Rに関する。一つの実施態様において、アミノ酸残基1-22が開裂される。別の実施態様において、アミノ酸残基1-27が開裂される。
先に注目されたように、特別な実施態様において、本発明のポリペプチドは本明細書に示されたアミノ酸配列、例えば、配列番号２、４、６、８、及び10を有するものを含む。更に、その用語は保存アミノ酸置換で修飾されたポリペプチド、並びにその生物活性フラグメント、類似体、及び誘導体を含む。更に別の実施態様において、その用語は、一つ以上のシステイン残基またはシステイン対がセリン、または同様の極性もしくは中性のアミノ酸残基、例えば、スレオニン、メチオニン、またはアラニン（必ずしもこれらに限定されない）で置換されているポリペプチドを含む。
“生物活性”という用語は、例えば、レプチン、抗OB-R抗体、またはその他の認識分子への特異的結合；分子レベルにおけるシグナル伝達経路の活性化；及び／またはin vivoの天然レプチンにより媒介される生理作用の誘導（またはアンタゴニストによる抑制）を含むが、これらに限定されないポリペプチドの特定効果を表すのに本明細書に使用される。フラグメント、類似体、及び誘導体を含むOB-Rポリペプチドは、例えば、固相または液相のペプチド合成の公知技術を使用して合成により調製し得る。固相合成技術が使用されることが好ましい。また、本発明のOB-Rポリペプチドは、以下に記載されるような公知の遺伝子操作技術を使用して調製し得る。更に別の実施態様において、OB-Rポリペプチドの可溶性形態は、生物学的液体、例えば、血漿、血清、または尿、好ましくはヒトの血漿、血清、または尿、更に好ましくはポリペプチドを過剰発現する被験者からのもの（これらに限定されない）からイムノアフィニティー精製により精製し得る。
OB-Rポリペプチド、好ましくはヒトOB-Rポリペプチドの構造は、当業界で知られている種々の方法により分析し得る。タンパク質配列は親水性分析［例えば、Hoppら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:3824（1981）］により特性決定し得る。親水性プロフィールはOB-Rポリペプチドの疎水性領域及び親水性領域を同定するのに使用でき、これは折り畳まれたポリペプチドの内部に埋められた領域、トランスメンブランドメイン、及びポリペプチドの外部の接近可能な領域を示し得る。加えて、二次構造分析［例えば、Chouら,Biochem.,13:222（1974）］がまた行われて、特定の二次構造をとるOB-Rポリペプチドの領域を同定し得る。二次構造予測を含む予測され、または決定された構造の操作は、当業界で利用できるコンピューター・ソフトウェア・プログラムを使用して行い得る。
組換えOB-Rポリペプチドの豊富な源を用意することにより、本発明はポリペプチドの定量的構造決定を可能にする。特に、充分な物質が核磁気共鳴（NMR）、赤外（IR）、ラマン、及び紫外線（UV）、特に円二色性（CD）、分光分析に用意される。特に、NMRが溶液中の分子の非常に強力な構造分析を与え、これはそれらの自然環境を一層密接に近似する［Marionら,Biochim.Biophys.Res.Comm.,113:967-974（1983）;Barら,J.Magn.Reson.,65:355-360（1985）;Kimuraら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:1681-1685（1980）］。また、構造分析のその他の方法が使用し得る。これらとして、Ｘ線結晶学［Engstrom,Biochem.Exp.Biol.,11:7-13（1974）］が挙げられるが、これに限定されない。好ましい局面において、OB-Rの可溶性形態または膜結合形態がレプチンとともに同時結晶化されて両方の分子に関する構造情報を与える。更に好ましい実施態様において、一つ以上のシステイン架橋を欠いているOB-Rまたは可溶性OB-Rが結晶またはレプチンとの共結晶を生成するのに使用される。
更に別の実施態様において、OB-Rポリペプチドの類似体は、それが天然OB-Rポリペプチド、またはその特定のフラグメントに特異的な抗体と交差反応するか否かを測定するのに試験し得る。交差反応性の程度はタンパク質の構造相同性もしくは類似性、またはフラグメント特異性抗体を産生するのに使用されたポリペプチドの部分に相当する領域の接近可能性についての情報を与える。
OB-Rポリペプチドのフラグメント
特別な実施態様において、本発明はOB-Rポリペプチドの天然産フラグメント、またはトランケート形態が重要であり得ることを意図している。先に注目されたように、OB-Rの多数のスプライス形態が見出された。こうして、本発明はOB-Rの天然産可溶性形態、並びに０、１、または２個のJAKボックスコンセンサス部位を有する内在性膜形態を含む。ポリペプチドの天然産スプライスイソ型に加えて、本発明は、例えば、細胞質ドメイン；リシン-889までのトランスメンブランドメインからの細胞質コンセンサスドメイン；ボックス１もしくはボックス２、または両方の領域；リシン-889にＣ末端の細胞質ドメイン；トランスメンブランドメイン；リガンド結合ドメイン；細胞質外ドメイン；またはこれらの部分の一つ以上の欠失による組換え修飾イソ型を更に意図している。
特に、本発明はトランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインを欠いているOB-Rの可溶性トランケート形態を意図している。特別な実施態様において、OB-RフラグメントはOB-Reである。更に別の実施態様において、本発明のOB-Rフラグメントはレプチンを結合するOB-ReのＮ末端部分、例えば、約Leu123から約Val331までのOB-R；レプチンを結合するOB-ReのＣ末端部分、例えば、約Tyr420から約Pro641までのOB-R；非常に高いアフィニティーでレプチンを結合するOB-ReのＮ末端部分及びＣ末端部分を有するタンパク質、例えば、約Ser118またはLeu123から約Pro641までのOB-Rに相当する。
OB-Rポリペプチドキメラ
細胞質ドメインのスプライス形態の一種以上がレプチン結合を人工的にシグナルするための別のリガンド結合ドメインを有するキメラ構築物中に使用し得る［例えば、1994年10月25日に発行されたCaponらの米国特許第5,359,046号；Sanchezら,J.Exp.Med.,178:1049（1993）;Burkhardtら,Mol.Cell.Biol.,14:1095;国際特許公開WO 96/23814、WO 96/23881、及びWO 96/24671;Kotenkoら,J.Biol.Chem.271:17174（1996）］。別の実施態様において、細胞質外（レプチン結合）ドメインが異なる細胞質シグナル伝達ドメイン、またはグリコシル−ホスファリジルイノシトールリンカードメインに結合されてgp130による細胞の活性化を与え得る。
OB-Rポリペプチドの類似体
本発明はOB-Rポリペプチドの類似体の調製を特に意図しており、これらはOB-Rポリペプチドの生物活性を特徴とし、例えば、レプチンまたは抗OB-R抗体に結合することができることを特徴とする。一実施態様において、類似体はOB-R活性に作用する。OB-Rアゴニストは天然タンパク質よりも有効であることが好ましい。例えば、OB-Rアゴニスト類似体は高アフィニティーでレプチンに結合し、こうしてシグナルを増幅し得る。このような類似体は遺伝子治療に特に望ましいことがあり、この場合、増大されたシグナル伝達効率がレセプター発現のレベルの不足を補い得る。別の実施態様において、類似体はOB-R活性に拮抗作用する。例えば、レプチンに結合し、シグナル伝達応答能のあるOB-Rへのレプチン結合を抑制するOB-R類似体は、レセプターへの天然OBの結合を競合的に抑制し、こうしてin vivoのレプチン活性を減少することができる。このようなOB-Rアンタゴニスト類似体はOB-Rの可溶性形態であることが好ましい。
一実施態様において、OB-Rポリペプチドの類似体は構造または機能に必須ではないポリペプチドの位置でアミノ酸の置換により修飾されたOB-Rポリペプチドである。例えば、ヒトOB-Rポリペプチドはマウスで生物活性であることが予想されるので、マウスアミノ酸配列と較べてヒト配列中の分岐アミノ酸剤の置換はおそらくOB-Rポリペプチドの有益な類似体を生じるであろう。例えば、ヒトOB-R中の下記の残基［ヒトOB-Rアミノ酸に関するナンバリングはTartagliaら,Cell,83:1263（1995）で採用されたナンバリング取決めを使用する］がその位置にある分岐マウス残基、または非保存アミノ酸置換で置換し得る。例えば、Ser36に代えてPhe、Tyr44に代えてAsp、Leu49に代えてSer、Ser54に代えてPro、Ser6に代えてLeu、His63に代えてAla、Thr66に代えてAla、Pro70に代えてAla、Thr77に代えてIle、His78に代えてTyr、Ser80に代えてPro、Arg92に代えてGly、Asp96に代えてGly、Ala103またはIle106に代えてThr、Leu118に代えてSer、Asp124に代えてGly、Lys138に代えてThr、Ser146に代えてPro、Val164に代えてAsp、Gln177に代えてLeu、Gly179に代えてAsp、Glu192に代えてGly、Cys193に代えて欠失、Leu197に代えてHis、Ile221に代えてSer、Asn233に代えてLeu、Ser273に代えてLeu、Thr278に代えて欠失、Asp285に代えてAla、Lys286に代えてGlu、Gly310に代えてSer、Met370に代えてArg、Ser379に代えてIle、Phe394に代えてSer、Glu417に代えてAla、Glu459に代えてGly、Ile476に代えてSer、Ile482に代えてThr、Ile551に代えてThr、Tyr586に代えてHis、Ile648に代えてLys、Ser686に代えてAla、Cys687に代えてHis、Ile759に代えてThr、Asn776に代えてIle、Gly781に代えてAsp、Glu782に代えてGly、Ser827に代えてGly、Asp832に代えてAla、Pro892に代えてArg、Glu893に代えてThr、Thr894に代えてAsp、またはGlu896に代えてLeuの一つ以上。
また、保存アミノ酸置換を含む類似体が本発明により意図されている。例えば、配列内の一つ以上のアミノ酸残基が同様の極性の別のアミノ酸により置換でき、これは機能均等物として作用して、サイレント変化をもたらす。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスのその他の員から選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電される（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電される（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。或る場合には、一つの極性アミノ酸が別のアミノ酸で置換されて局所親水性を保存し得る。おそらく、電荷を保存し、または少なくとも反対の電荷を導入しない置換が必要とされる。このような変化はポリアクリルアミドゲル電気泳動、または等電点により測定して見掛分子量に影響しないと予想されるであろう。
更に別の実施態様において、アミノ酸残基は二次構造を形成する増進された傾向を示し、または更に安定な二次構造を形成するOB-Rポリペプチドの類似体を形成するための残基で置換し得る。例えば、Glu、Ala、Leu、His、Trpが天然OB-Rポリペプチドに見られるアミノ酸残基の置換基として導入される場合、α−らせん構造が好ましいであろう。例えば、アスパラギン酸を一つ以上のグルタミン酸（Glu）で置換し、一つ以上のイソロイシンをロイシンで置換し、グリシンもしくはバリン、または分岐アミノ酸（即ち、異種からのOB-Rの間で保存されないアミノ酸）をアラニンで置換し（例えば、ヒトOB-Rポリペプチドの位置273のセリンをアラニンで置換し）、アルギニンまたはリシンをヒスチジンである置換し、またチロシン及び／またはフェニルアラニンをトリプトファンで置換して、保存アミノ酸置換が使用されることが好ましい。α−らせん構造の程度、または更に重要には、その安定性を増大すると、更に大きな活性、増大された結合アフィニティー、または更に長い半減期を有するOB-R類似体を生じ得る。また、ポリペプチドフラグメントが安定な構造を欠く大きな傾向を補うために構造形成性、例えば、らせん形成性のアミノ酸残基を含むトランケートOB-Rポリペプチド類似体が意図されている。
別の実施態様において、OB-Rポリペプチド、好ましくはヒトOB-Rポリペプチドの類似体はそのポリペプチドのトランケート形態である。例えば、トランスメンブランドメインは必須ではないことが既に実証されていた。何となれば、ポリペプチドの天然産イソ型が可溶性タンパク質を発現するｃＤＮＡによりコードされるからである。同様に、ヒトOB-R（マウスOB-Rと比較して）中で分岐アミノ酸残基の一部または全部を欠失することが可能であるかもしれない。加えて、本発明は生物活性に必要な最小アミノ酸配列を有するOB-R類似体を提供することを意図している。これは、例えば、OB-Rのフラグメントの活性を、OB-R特異性抗体に結合し、天然レプチンの活性を抑制し（競合結合により）、または天然レプチンの活性に作用する能力について試験することにより容易に測定し得る。
本発明はレプチン活性に作用すると考えられるOB-Rの可溶性スプライス形態を提供することを特に意図している。特に、OB-Rd（本明細書に称されるとおり）はレプチンを結合し、OB-Rb（これはシグナル伝達に応答能があると考えられる）へのレプチン結合を促進するものと考えられる。こうして、この実施態様において、OB-Rはその他のレセプター系［Kishimotoら,Cell,76:253（1994）;DavisらScience,260:1805（1993）;Davisら,Science,259:1736（1993）］と同様に挙動することが明らかである。
上記フラグメントサイズは推定であり、例えば、一つから約五つまでの付加的なアミノ酸が含まれてもよく、または上記トランケート類似体の夫々の末端もしくは両端、またはポリペプチドもしくはフラグメントの内部から欠失されてもよいことが当業者により理解されるであろう。
類似体、例えば、フラグメントは、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、血栓融解性プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、プロテイナーゼＫ等によるOB-Rの消化により生成し得る。その他の類似体、例えば、突然変異タンパク質は体重モジュレーターペプチドコーディング配列の通常の部位誘導突然変異誘発により生成し得る。
レプチン類似体のスクリーニング
種々のスクリーニング技術がポリペプチドの類似体のスクリーニングについて当業界で知られている。薬品の種々のライブラリーが利用できる。それ故、本発明はこのようなライブラリー、例えば、長年の研究にわたって生成された合成化合物のライブラリー、天然化合物のライブラリー、及びレプチンの類似体について以下に詳しく記載されるような組み合わせライブラリーをスクリーニングすることを意図している。本発明は可溶性形態またはトランスメンブラン形態のOB-Rに結合する化合物に関するこのようなライブラリーをスクリーニングすることを意図している。このような分子はOB-Rによるシグナル伝達に作用または拮抗作用することが好ましい。こうして、本発明は小分子リガンドまたはリガンド類似体及び擬態に関するスクリーン、並びにin vivoでＯＢレセプターに結合し、作用し、または拮抗作用、活性化する天然リガンドに関するスクリーンを意図している。
レセプターの一次配列、及び既知の機能のタンパク質とのその配列の類似性の知識はタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストについて初期の手がかりを与えることができる。アンタゴニストの同定及びスクリーニングは、例えば、Ｘ線結晶学、中性子回折、核磁気共鳴分光法、及び構造決定のためのその他の技術を使用して、タンパク質の構造上の特徴を測定することにより更に促進される。これらの技術はアゴニスト及びアンタゴニストの合理的な設計または同定を与える。
別のアプローチは組換えバクテリオファージを使用して大きいライブラリーを生じる。“ファージ方法”［Scottら,Science,249:386-390（1990）;Cwirlaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382（1990）;Devlinら,Science,249:404-406（1990）］を使用して、非常に大きいライブラリーが構築し得る（106-108化学物体）。第二のアプローチは一次化学方法を使用し、そのうちのGeysen方法［Geysenら,Molecular Immunology,23:709-715（1986）;Geysenら,J.Immunologic Method,102:259-274（1987）］及びFodorら,Science,251:767-773（1991）の最近の方法が例である。その他の文献［Furkaら,14th International Congress of Biochemistry,5巻,Abstract FR:013（1988）;Furka,Int.J.Peptide Protein Res.,37:487-493（1991）;Houghton（1986年12月に発行された米国特許第4,631,211号）;及びRutterら（1991年４月23日に発行された米国特許第5,010,175号）］がアゴニストまたはアンタゴニストとして試験し得るペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
別の局面において、合成ライブラリー［Needelsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10700-10704（1993）;Lamら,国際特許公開WO 92/00252;Kocisら,国際特許公開WO 94/28028］等が本発明のＯＢレセプターリガンドについてスクリーニングするのに使用し得る。
特に、ＯＢレセプターリガンド結合ドメインの組換え形態を発現する細胞への可溶性リガンドの結合に関するアッセイが行い得る。可溶性リガンドは組換えまたは合成レプチンポリペプチドとして容易に用意し得る。
スクリーニングは、ＯＢレセプターを発現する組換え細胞を用いて、または例えば、上記のようにして組換え生産された精製レセプタータンパク質を使用して行い得る。例えば、その分子のリガンド結合部分を含む標識、可溶性、または可溶化ＯＢレセプターがリガンドを結合する能力が以上の文献に記載されるようなライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。
OB-Rポリペプチドの誘導体
一般に、本発明のポリペプチドの可溶性形態はポリペプチド部分への一つ以上の化学部分の結合により誘導体化し得る。化学的に修飾された誘導体は投与の動脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、静脈内経路、経口経路、鼻内経路、直腸経路、頬経路、舌下経路、肺経路、局所経路、経皮経路、またはその他の経路のために更に製剤化されてもよい。生物活性タンパク質の化学修飾は或る環境下で、例えば、治療タンパク質の安定性及び循環時間を増大し、また免疫原性を減少して付加的な利点を与えることがわかった［1979年12月18日に発行されたDavisらの米国特許第4,179,337号を参照のこと；総説について、Abuchowskiら,“Soluble Polymer-Enzyme Adducts”,Enzymes as Drugs,367-383頁,Holcenberg及びRoberts編集,Wiley-Interscience,New York,NY,（1981）を参照のこと］。タンパク質修飾及び融合タンパク質を記載する総説文献はFrancis,Focus on Growth Factors,3:4-10（1992）である。
誘導体化のための化学部分
誘導体化に適した化学部分は種々のポリマー、特に水溶性ポリマーの中から選ばれてもよい。選択されたポリマーは水溶性であることが好ましく、その結果、それが結合されるタンパク質は水性環境、例えば、生理環境中で沈殿しない。しかしながら、無極性ポリマーがまた使用でき、この場合、特別な適用が例えば水の接近可能性が制限される徐放性マトリックス中のそれらの使用により利益を得る。最終生成物調製の治療上の使用について、ポリマーは医薬上許されることが好ましいであろう。当業者はポリマー／タンパク質接合体が治療上使用されるか否か、そうである場合には、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、及びその他の考慮事項の如き考慮に基いて所望のポリマーを選択することができるであろ。本発明のタンパク質及びペプチドについて、本明細書に提示されたアッセイを使用して、これらが確かめられてもよい。
ポリマー分子
水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群から選ばれてもよい。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが水中のその安定性のために製造する際に利点を与え得る。
ポリマーはあらゆる分子量のものであってもよく、また分枝していてもよく、または分枝していなくてもよい。ポリエチレングリコールについて、好ましい分子量は取扱い及び製造の容易さのために約２kDa〜約100kDaである（“約”という用語はポリエチレングリコールの調製中に或る分子が上記分子量よりも大きいか、若干小さい分子量であることを示す）。その他のサイズが、所望の治療プロフィール（例えば、所望される徐放性の期間、生物活性に対する存在する場合の効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如及び治療タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールのその他の既知の効果）に応じて使用し得る。
ポリマー／タンパク質比
夫々のポリマーに結合されたポリペプチド分子の数は変化してもよく、当業者は機能に関するその効果を確かめることができるであろう。同じか、または異なる化学部分（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールの如きポリマー）を用いて、モノ誘導体化してもよく、またはジ誘導体化、トリ誘導体化、テトラ誘導体化または誘導体化の或る組み合わせを用意してもよい。ポリマー分子対タンパク質（またはペプチド）分子の割合は、反応混合物中のそれらの濃度と同様に変化するであろう。一般に、最適の比（過剰の未反応のタンパク質またはポリマーが存在しないという反応の効率に関して）は誘導体化の所望の程度（例えば、モノ、ジ、トリ等）、選択されたポリマーの分子量、ポリリンカーが分枝しているか、または分枝していないという点、及び反応条件の如き因子により決められるであろう。
タンパク質への化学部分の結合
ポリエチレングリコール分子（またはその他の化学部分）はタンパク質の機能性ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用できる幾つかの結合方法、例えば、EP 0 401 384（G-CSFへのPEGのカップリング）がある。また、Malikら,Exp.Hematol.,20:1028-1035（1992）（トレシルクロリドを使用するGM-CSFのペギル化（pegylation）を報告している）を参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノ基またはカルボキシル基の如き反応性基を介してアミノ酸残基により共有結合されてもよい。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る反応性基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基はリシン残基及びＮ末端アミノ酸残基を含んでいてもよい。遊離カルボキシル基を有するものはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ末端アミノ酸残基を含んでいてもよい。また、スルフヒドリル基がまた一つ以上のポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として使用されてもよい。アミノ基における結合、例えば、Ｎ末端またはリシン基における結合が治療目的に好ましい。レセプター結合が所望される場合、レセプター結合に重要な残基における結合が避けられるべきである。
Ｎ末端化学修飾タンパク質
Ｎ末端化学修飾タンパク質が特別に所望されることがある。本発明の組成物の例示としてポリエチレングリコールを使用して、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝等による）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子対タンパク質（またはペプチド）分子の割合、行われるペギル化反応の型、及び選択されたＮ末端ペギル化タンパク質を得る方法が選択し得る。Ｎ末端ペギル化製剤を得る方法（例えば、必要によりこの部分をその他のモノペギル化部分から分離する）はペギル化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペギル化物質の精製によるものであってもよい。選択的Ｎ末端化学修飾は特別なタンパク質の誘導体化に利用できる一級アミノ基の異なる型（リシン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用する還元アルキル化により行われてもよい。適当な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基のそれとのpKaの差を利用することを可能にするpHで反応を行うことによりタンパク質を選択的にＮ末端ペギル化し得る。このような選択的誘導体化により、タンパク質への水溶性ポリマーの結合が調節される。ポリマーとの結合は主としてタンパク質のＮ末端で起こり、リシン側鎖アミノ基の如きその他の反応性基の有意な修飾は起こらない。還元アルキル化を使用して、水溶性ポリマーは上記の型のものであってもよく、タンパク質へのカップリングのために単一反応性アルデヒドを有するべきである。単一反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが使用し得る。
OB-Rポリペプチドと会合した核酸
上記のように、本発明はOB-Rポリペプチドをコードするだけでなく、ゲノム非コーディング配列5’、3’に会合し、かつOB-R遺伝子に対しイントロンの核酸に関する。こうして、本発明によれば、当業界内の通常の分子生物学技術、微生物学技術、及び組換えＤＮＡ技術が使用し得る。このような技術が文献に充分に説明されている［例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２編,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York（1989）;Glover編集,DNA Cloning:A Practical Approach,I巻及びII巻,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.K.（1985）;Gait編集,Oligonucleotide Synthesis,Oxford University Press（1984）;Hamesら編集,Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag（1985）;Hamesら編集,Transcription And Translation,Oxford University Press（1984）;Freshney編集,Animal Cell Culture,Oxford University Press（1986）;Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press（1986）;Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning,Wiley,New York（1984）を参照のこと］。公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術に基いて遺伝子または核酸を単離し、クローニングし、配列決定し、分析し、特性決定するための戦略が本発明に特に適切である。
“レプリコン”はin vivoでＤＮＡ複製の自律単位として機能し、即ち、それ自体の制御のもとに複製することができるあらゆる遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
“ベクター”は、別のＤＮＡセグメントが結合されたセグメントの複製をもたらすように結合し得るプラスミド、ファージまたはコスミドの如きレプリコンである。
“カセット”は特定の制限部位でベクターに挿入し得るＤＮＡのセグメントを表す。ＤＮＡのセグメントは関係するポリペプチドをコードし、カセット及び制限部位は転写及び翻訳に適した読み取り枠中のカセットの挿入を確実にするように設計される。
“異種”ＤＮＡは細胞、または細胞の染色体部位に自然に位置されないＤＮＡを表す。異種ＤＮＡは細胞に外来の遺伝子を含むことが好ましい。
このようなＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより“トランスフェクト”された。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型変化に影響する場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより“形質転換”された。形質転換性ＤＮＡは細胞のゲノムをつくる染色体ＤＮＡに組込まれる（共有結合される）ことが好ましい。
“クローン”は有糸分裂により単細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。
“核酸分子”は一本鎖形態または二本鎖らせんのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；“ＲＮＡ分子”）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；“ＤＮＡ分子”）のリン酸エステルポリマー形態を表す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語はその分子の一次構造及び二次構造のみを表し、それを特別な三次形態または四次形態に限定しない。こうして、この用語はとりわけ直線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、及び染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特別な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を説明する際に、配列がＤＮＡの非転写ストランド（即ち、ｍＲＮＡと相同の配列を有するストランド）に沿って5’から3’の方向の配列のみを示す通常の便法に従って本明細書に記載し得る。“組換えＤＮＡ分子”は分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が温度及び溶液イオン濃度の適当な条件下で別の核酸分子にアニールすることができる場合に、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに“ハイブリッドを形成することができる”（Sambrookら,1989,上記文献）。温度及びイオン濃度の条件はハイブリダイゼーションの“ストリンジェンシー”を決定する。相同核酸に関する予備スクリーニングについて、55℃のＴmに相当する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が使用し得る（例えば、5x SSC、0.1％SDS、0.25％のミルク、及びホルムアミドなし；または30％ホルムアミド、5x SSC、0.5％SDS）。適度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は高いＴm、例えば、5xまたは6x SSCと一緒の40％ホルムアミドに相当する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最高のＴm、例えば、50％ホルムアミド、5xまたは6x SSCに相当する。ハイブリダイゼーションは２種の核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッドを形成するのに適したストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の程度、当業界で公知の変数に依存する。２種のヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きい程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴmの値が大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（高いＴmに相当する）は以下の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが100より大きいヌクレオチドのハイブリッドについて、Ｔmを計算するための数式が誘導されていた（Sambrookら,1989,上記文献,9.50-0.51）。短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置が更に重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrookら,1989,上記文献,11.7-11.8）。ハイブリッドを形成できる核酸の最小長さは少なくとも約10ヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも約15ヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも約20ヌクレオチドであることが最も好ましい。
特別な実施態様において、“通常のハイブリダイゼーション条件”という用語は、上記条件を使用して55℃のＴmを表す。好ましい実施態様において、Ｔmは60℃である。更に好ましい実施態様において、Ｔmは60℃である。
“相同組み合わせ”は染色体中のベクターの外来ＤＮＡ配列の挿入を表す。ベクターは相同組換えのために特定の染色体部位を標的とすることが好ましい。特定の相同組換えのために、ベクターは染色体の配列に相同の充分に長い領域を含んで相補結合及び染色体へのベクターのとり込みを可能にするであろう。相同性の長い領域、及び配列類似性の大きな程度が相同組換えの効率を増大し得る。
ＤＮＡ“コーディング配列”は適当な調節配列の制御下に置かれた時にin vitroまたはin vivoで細胞中でポリペプチドに転写、翻訳される二本鎖ＤＮＡである。コーディング配列の境界は5’（アミノ）末端の開始コドン及び3’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列として、原核生物配列、真核生物配列からのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。コーディング配列が真核生物細胞中の発現に意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列が通常コーディング配列に対し3’に位置されるであろう。
OB-Rコーディング配列及び隣接配列の単離
本発明により意図される核酸として、配列番号２、４、６、８、及び10に示されたペプチドの如きペプチドを発現時にコードする核酸が挙げられる。それ故、特定のＤＮＡがOB-R遺伝子に関して単離され、配列決定されると、動物細胞が本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の分子クローニングの核酸源として潜在的に利用することができる。ＤＮＡはクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー”）から当業界で知られている通常の操作により、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡ、またはそのフラグメントのクローニングにより得られてもよい［例えば、（Sambrookら,1989,上記文献;Glover,1985,上記文献を参照のこと］。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンはコーディング領域の他に調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含んでいてもよい。ｃＤＮＡから誘導されたクローンはイントロン配列を含まないであろう。どのような源であろうとも、遺伝子は遺伝子の増殖に適したベクターに分子クローニングされるべきである。
ゲノムＤＮＡからの分子クローニングにおいて、ｃＤＮＡ配列から選ばれたプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡが増幅し得る。また、ＤＮＡフラグメントが生成され、そのうちの或るものが所望の遺伝子をコードするであろう。種々の制限酵素を使用して、ＤＮＡが特定の部位で開裂し得る。また、マンガンの存在下でDNaseを使用してＤＮＡを断片化してもよく、またはＤＮＡが、例えば、音波処理により物理的に剪断し得る。次いで直線状ＤＮＡフラグメントがアガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない通常の技術によりサイズに従って分離し得る。
ＤＮＡフラグメントが一旦生成されると、所望のOB-R遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグメントの同定が幾つかの方法で行い得る。例えば、OB-R遺伝子の一部もしくはその特定のＲＮＡ、またはそのフラグメントの量が利用でき、かつ精製され、標識し得る場合、生成されたＤＮＡフラグメントは標識プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングし得る［Bentonら,Science,196:180（1977）;Grunsteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3961（1975）］。本発明はこのような核酸プローブ（これらは本明細書に開示された特定の配列から都合良く調製し得る）、例えば、配列番号１、３、５、７、及び９に示された配列の少なくとも10、好ましくは15、更に好ましくは少なくとも20ヌクレオチドフラグメントに相当するヌクレオチド配列を有するハイブリッドを形成できるプローブを提供する。本発明の核酸に高度に特有であるフラグメントが選ばれることが好ましい。プローブに対し実質的な配列類似性を有するＤＮＡフラグメント、例えば、相同ＤＮＡがハイブリッドを形成するであろう。上記のように、配列類似性の程度が大きい程、使用し得るハイブリダイゼーション条件はストリンジェントである。一実施態様において、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が相同レプチンレセプター核酸を同定するのに使用される。しかしながら、好ましい局面において、また本明細書で実験により実証されるように、本発明のポリペプチドをコードする核酸は適度にストリンジェントの条件下で配列番号１、３、５、７、及び９に示されるようなヌクレオチド配列を有する核酸、またはそのハイブリッドを形成できるフラグメントにハイブリッドを形成するであろう。更に好ましくは、それは高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成するであろう。
別の特別な実施態様において、エクソントラッピング及びｃＤＮＡ選択により得られたPCRプローブの一つを使用して、本発明のＤＮＡが同定し得る。例えば、実施例３に記載されたプライマー対が本発明のＤＮＡを増幅するのに使用し得る。
これらのプライマーは適度〜高いストリンジェンシー条件下で、例えば、迅速hyb緩衝液（Amersham Life Sciences）を使用する65°のプレハイブリダイゼーション、続いて65°で６時間のハイブリダイゼーション、続いて室温（RT）で30分間の2XSSC/0.1％SDSによる最初の洗浄、及び30分間のRTの0.3X SSC/0.1％SDSによる高ストリンジェンシーの２回目の洗浄を使用してＤＮＡを増幅することが好ましい。当業者に理解されるように、２回目の洗浄のストリンジェンシーは融通性であり、プローブの長さ及び夫々のプローブの配列類似性の程度に依存する。例えば、ヒト及びマウスのコーディング領域は約78％相同であるので、同じハイブリダイゼーション条件が低ストリンジェンシーの２回目の洗浄（例えば、2XSSC/0.1％SDS、RTで２回）で使用し得る。これがバックグラウンドのないシグナルを生じない場合、ハイブリダイゼーションは低温（低ストリンジェンシー）、例えば、42℃で試みられる。バックグラウンドがあまりに大きすぎる場合、２回目の洗浄のストリンジェンシーが増大し得る（例えば、0.5または0.3X SSC、0.1％SDS、RT）。本発明によれば、上記PCRプローブは同様のハイブリダイゼーション条件下でヒトだけでなく、マウスのＤＮＡライブラリーからOB-Rをコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡを特定するであろう。
また、遺伝子の存在はその発現産物の物理的性質、化学的性質、または免疫学的性質に基くアッセイにより検出し得る。例えば、本発明のOB-Rについて知られているのと同様または同一の電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、レプチン結合活性、または抗原性を有するタンパク質を生じるｃＤＮＡクローン、またはＤＮＡクローン（これらは適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択する）が選択し得る。例えば、本発明の抗体はその他の源からのOB-Rの同族体をスクリーニングするのに都合良く使用し得る。候補遺伝子からのタンパク質がレプチン結合について試験されることが好ましい。
また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はｍＲＮＡ選択、即ち、核酸ハイブリダイゼーション、続いてin vitro翻訳により同定し得る。この操作において、フラグメントがハイブリダイゼーションにより相補ｍＲＮＡを単離するのに使用される。このようなＤＮＡフラグメントは入手し得る精製モジュレーターＤＮＡに相当し得る。単離されたｍＲＮＡの産物のin vitro翻訳産物の免疫沈殿分析または機能アッセイ（例えば、レプチン結合活性）がｍＲＮＡ、ひいては所望の配列を含む相補ＤＮＡフラグメントを同定する。加えて、特定のｍＲＮＡがモジュレーターペプチドに対し特異的に誘導された固定化抗体への細胞から単離されたポリソームの吸着により選択し得る。
放射能標識モジュレーターペプチドｃＤＮＡは、選択されたｍＲＮＡ（吸着されたポリソームから）を鋳型として使用して合成し得る。次いで放射能標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡがプローブとして使用されて、その他のゲノムＤＮＡフラグメントの中から相同モジュレーターペプチドＤＮＡフラグメントを同定し得る。
上記のように、本明細書に開示された体重モジュレーターペプチドをコードするＤＮＡ配列はクローン化ではなく合成により調製し得る。ＤＮＡ配列はOB-Rアミノ酸配列に適したコドンで設計し得る。一般に、配列が発現に使用される場合、意図される宿主に好ましいコドンが選ばれるであろう。完全配列は通常の方法により調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから集合され、完全コーディング配列に集合される［例えば、Edge,Nature,292:756（1981）;Nambairら,Science,223:1299（1984）;Jayら,J.Biol.Chem.,259:6311（1984）］。
合成ＤＮＡ配列は上記のようにOB-R類似体を発現する遺伝子の好都合の構築を可能にする。また、類似体をコードするＤＮＡは天然OB-R遺伝子またはｃＤＮＡの部位誘導突然変異誘発によりつくられ、類似体が通常のポリペプチド合成を使用して直接つくられる。
タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的とり込みの一般的な方法がNorenら,Science,244:182-188（1989）に記載されている。この方法が非天然アミノ酸を含むOB-Rポリペプチドの類似体を生じるのに使用し得る。
ヌクレオチドコーディング配列の縮重のために、OB-R遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列が本発明の実施に使用し得る。これらとして、対立遺伝子、その他の種からの相同遺伝子、及び配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変化され、こうしてサイレント変化を生じるOB-R遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、本発明のOB-R誘導体として、一次アミノ酸配列として変化された配列（機能上均等のアミノ酸残基が配列内の残基に代えて置換され、OB-R類似体に関して上記されたような保存アミノ酸置換をもたらす）を含むOB-Rタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
非コーディング核酸
本発明は翻訳レベルでタンパク質の発現に干渉するのに使用し得るアンチセンスヌクレオチド及びリボザイムの調製に及ぶ。このアプローチはアンチセンス核酸及びリボザイムを利用して、そのｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクし、またはそれをリボザイムで開裂することにより特定のｍＲＮＡの翻訳を阻止する。
アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補性であるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である［Weintraub,Sci.Am.,262:40-46（1990）;Marcus-Sekura,Anal.Biochem.,172:289-295（1988）を参照のこと］。細胞中で、それらはそのｍＲＮＡにハイブリッドを形成して、二本鎖分子を生成する。細胞はこの二本鎖形態で複合体形成されたｍＲＮＡを翻訳しない。それ故、アンチセンス核酸はタンパク質へのｍＲＮＡの発現に干渉する。約15ヌクレオチドのオリゴマー及びAUG開始コドンにハイブリッドを形成する分子が特に有効であろう。何となれば、それらは合成し易く、またそれらを体重モジュレーターペプチド生産細胞に導入する時に大きな分子よりもおそらく少ない問題をもたらすからである。アンチセンス方法はin vitroの多くの遺伝子の発現を抑制するのに使用されていた［Marcus-Sekura,1988上記文献;Hamborら,J.Exp.Med.,168:1237-1245（1988）］。
リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに若干似た方法でその他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、或る種のｍＲＮＡがそれら自体のイントロンを切除する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することにより、研究者らはＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを開裂する分子を操作することができた［Cech,J.Am.Med.Assoc.,260:3030-3034（1988）］。リボザイムは配列特異性であるので、特別な配列を有するｍＲＮＡのみが失活される。
研究者らは二つの型のリボザイム、テトラヒメナ型及び“ハンマーヘッド”型を同定していた。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基配列を認識し、一方、“ハンマーヘッド”型は11〜18塩基配列を認識する。認識配列が長い程、それが標的ｍＲＮＡ種中で専ら生じることがおそらく多い。それ故、ハンマーヘッド型リボザイムが特定のｍＲＮＡ種を失活するのにテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、18塩基認識配列が短い認識配列よりも好ましい。
こうして、本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、体重モジュレータータンパク質及びそれらのリガンドのｍＲＮＡを開裂し、こうしてOB-R遺伝子の発現を抑制し、増加された体重獲得及び脂肪蓄積をもたらすリボザイムに対してアンチセンス分子を調製するのに使用し得る。
別の実施態様において、OB-R核酸のコーディングストランド及び相補ストランド、またはOB-R遺伝子5’、3’の非コーディング領域に相補性、またはコーディング領域に内部（イントロン）の短いオリゴヌクレオチドが本発明により提供される。このような核酸はob-r遺伝子中の突然変異の存在、またはOB-R mRNAの発現のレベルを評価するための直接標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとしてプローブとして有益である。本発明の非コーディング核酸はヒトOB-R遺伝子からのものであることが好ましい。
特別な実施態様において、非コーディング核酸はOB-R遺伝子に接近して増幅可能な遺伝子及び／またはその他の調節配列の組込みのための相同組換えを与え、例えば、OB-Rポリペプチドの高レベルの発現を与え、またはOB-Rポリペプチドの発現の適当なレベルを阻止するob-r遺伝子調節配列中の突然変異を解消する［Skoultchiによる1991年５月16日に公表された国際特許公開WO 91/06666;Chappelによる1991年７月11日に公表された国際特許公開WO 91/09955を参照のこと;また、Kucherlapati及びCampbellらによる1990年11月29日に公表された国際特許公開WO 90/14092を参照のこと］。
OB-Rポリペプチドの生産：発現及び合成
転写調節配列及び翻訳調節配列はＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等であり、これらは宿主細胞中のコーディング配列の発現を与える。真核生物細胞では、ポリアデニル化シグナルが調節配列である。
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写する時に細胞中で転写調節配列及び翻訳調節配列の“制御下”にあり、次いでこれがトランスＲＮＡスプライスされ、コーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される。
“シグナル配列”は細胞の表面で発現されるタンパク質のコーディング配列の最初に含まれる。この配列は宿主細胞にポリペプチドをトランスロケートするように誘導するシグナルペプチド（成熟ポリペプチドにＮ末端）をコードする。また、“トランスロケーションシグナル配列”がこの種のシグナル配列を表すのに本明細書で使用される。トランスロケーションシグナル配列は真核生物及び原核生物に自生の種々のタンパク質と会合して見られ、しばしば両方の型の生物中で機能性である。本発明によれば、マウス及びヒトのOB-Rポリペプチド（配列番号８、10を参照のこと）のアミノ酸残基1-27がシグナルペプチドを含む。別の実施態様において、アミノ酸残基1-22ががシグナルペプチドを含む［Tartagliaら,Cell,83:1263（1995）］。
ＤＮＡ配列は、発現調節配列がそのＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、調節する場合に発現調節配列に“操作により結合される”。“操作により結合される”という用語は、発現されるＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナル（例えば、ATG）を有し、正確な読み取り枠を維持して発現調節配列の制御下のＤＮＡ配列の発現及びＤＮＡ配列によりコードされた所望の生成物の生産を可能にすることを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入することが所望される遺伝子が適当な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルがその遺伝子とともに読み取り枠の上流（5’）及びその中に挿入し得る。
“プロモーター配列”は細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（3’方向）のコーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を特定する目的のために、プロモーター配列が転写開始によりその3’末端で結合され、上流（5’方向）に延びてバックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1によるマッピングにより都合良く形成される）だけでなく、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がプロモーター配列内に見られるであろう。
本発明の別の特徴は本明細書に開示されたＤＮＡ配列の発現である。当業界で公知であるように、ＤＮＡ配列は、それらを適当な発現ベクター中で発現調節配列に操作により結合し、その発現ベクターを使用して適当な単細胞宿主を形質転換することにより発現し得る。
発現調節配列への本発明のＤＮＡ配列のこのような操作による結合は、勿論のこと、既にＤＮＡ配列の一部ではない場合、ＤＮＡ配列の上流の正確な読み取り枠中の開始コドン、ATGの用意を含む。
多種の宿主／発現ベクター組み合わせが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに使用されてもよい。例えば、有益な発現ベクターは染色体配列、非染色体配列、及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなってもよい。好適なベクターとして、SV40及び既知のバクテリアプラスミドの誘導体、例えば、E.coliプラスミドcol E1、pCR1、pBR322、pmB9、pUCまたはpUCプラスミド誘導体、例えば、pGEXベクター、pETベクター、pmal-c、pFLAG等、並びにそれらの誘導体、プラスミド、例えば、RP4、ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、NM989、及びその他のファージＤＮＡ、例えば、M13及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその誘導体、真核生物細胞に有益なベクター、例えば、昆虫細胞または哺乳類細胞に有益なベクター、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、例えば、ファージＤＮＡまたはその他の発現調節配列を使用するように修飾されたプラスミド等が挙げられる。
多種の発現調節配列--それに操作により結合されたＤＮＡ配列の発現を調節する配列--のいずれもがこれらのベクター中に使用されて本発明のＤＮＡを発現し得る。このような有益な発現調節配列として、例えば、SV40、CMV、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルスまたはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、LTR系、ファージλの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、fd外殻タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Pho5）、メチロトローフ酵母のAOX1プロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、及び原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらおウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られているその他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。
また、種々の単細胞宿主細胞が本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有益である。これらの宿主として、公知の真核生物宿主及び原核生物宿主、例えば、E.coli、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセスの株、菌類、例えば、酵母（サッカロミセス、及びメチロトローフ酵母、例えば、ピチア、カンジダ、ハンセニューラ、及びトルロプシス）、並びに動物細胞、例えば、CHO細胞、R1.1細胞、BW細胞及びLM細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、COS1、COS7、BSC1、BSC40、及びMTT10）、昆虫細胞（例えば、Sf9）、及び組織培養中のヒト細胞及び植物細胞が挙げられる。例えば、ベクターpMelBac（Invitrogen;カタログNo.V1950-20）中でOB-Rシグナルペプチドを置換する昆虫シグナルペプチドによるバキュロウイルス中の発現が特に好ましい。
全てのベクター、発現調節配列及び宿主が本発明のＤＮＡ配列を発現するのに同等に機能するとは限らないことが理解されよう。全ての宿主が同じ発現系で同様に良く機能するとは限らないであろう。しかしながら、当業者は無用の実験をしないでも適当なベクター、発現調節配列、及び宿主を選んで、本発明の範囲から逸脱しないで所望の発現を達成することができるであろう。例えば、ベクターを選択する際に、宿主が考慮される必要がある。何となれば、ベクターがその中で機能する必要があるからである。また、ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、及び抗生物質マーカーの如きベクターによりコードされたその他のタンパク質の発現が考慮されるであろう。
発現調節配列を選ぶ際に、種々の因子が通常考慮されるであろう。これらとして、例えば、系の相対濃度、その調節可能性、及び特に潜在的な二次構造に関する、発現すべき特別なＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性が挙げられる。好適な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特性、タンパク質を正確に折り畳むそれらの能力、及びそれらの醗酵要件、並びに発現すべきＤＮＡ配列によりコードされた生産物の宿主に対する毒性、及び発現産物の精製の容易さを考慮して選ばれるであろう。
これらの因子及びその他の因子を考慮して、当業者は醗酵時または大規模の動物培養中に本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現調節配列／宿主組み合わせを構築することができるであろう。
特別な実施態様において、OB-R融合タンパク質が発現し得る。OB-R融合タンパク質はOB-Rポリペプチドの少なくとも機能活性部分に結合されたペプチドを介して結合された非OB-Rタンパク質の少なくとも機能活性部分を含む。非OB-R配列はOB-R配列に対しアミノ末端またはカルボキシ末端であってもよい。例えば、“人工”レセプターを調製する際に、レプチン結合（細胞質外）部分について5’位置でOB-Rをコードするコーディングドメインを結合すると、レプチンを結合し、非OB-Rタンパク質の活性に基いて或る種の別の作用を媒介するタンパク質を生じるであろう。逆に、異なるタンパク質（例えば、成長因子、サイトカイン、またはホルモンレセプター結合コーディングドメイン）をOB-R細胞質コーディングドメイン（“ボックス１”及び“ボックス２”を含む）に5’に結合すると、レプチンではなく異なるリガンドを結合した後にOB-Rによる活性化を可能にするであろう。別の実施態様において、キメラ構築物はOB-Rの発現を単に促進し得る。以下の特別な実施態様において、OB-Re及びそのフラグメントはＮ末端メリチンシグナルペプチドで発現される。
別の局面において、pGEXベクター［Smithら,Gene 67:31-40（1988）］が使用し得る。このベクターは日本住血吸虫グルタチオニンＳ−トランスフェラーゼｃＤＮＡを関係する配列に融合する。バクテリアタンパク質が回収され、組換えタンパク質が低下されたグルタチオンアフィニティーカラムで迅速に精製し得る。続いてそのGSTキャリヤーが部位特異性プロテアーゼによる消化により融合タンパク質から開裂し得る。開裂後に、キャリヤー及び未開裂融合タンパク質がグルタチオンアガロースによる吸収により除去し得る。その系による難点は、コードされたタンパク質が水溶液に不溶性である場合に時折生じる。
バクテリア系中の組換えタンパク質の発現は発現されたタンパク質の不正確な折り畳みをもたらすことがあり、再生を必要とする。組換えタンパク質は開裂の前または後に再生されて機能活性OB-Rポリペプチドを生成し得る。OB-Rポリペプチドは（i）タンパク質を還元剤を含む変性緩衝液中でインキュベートし、次いで（ii）そのタンパク質を酸化剤を含み、また好ましくはタンパク質安定剤もしくはカオトロピック剤、またはその両方を含む緩衝液中でインキュベートする工程により再生し得る。好適なレドックス（酸化／還元）剤の対として、還元されたグルタチオン／グルタチオンジスルフィド、シスチン／システイン、シスタミン／システアミン、及び２−メルカプトエタノール／２−ヒドロキシエチルジスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。特別な局面において、融合タンパク質は還元緩衝液中への交換の前に尿素の如き変性剤中で可溶化し得る。好ましい実施態様において、タンパク質がまた還元緩衝液中への交換の前に、例えば、イオン交換またはNi-キレート化クロマトグラフィーにより精製される。変性剤として、尿素及びグアニジン-HClが挙げられるが、これらに限定されない。次いで組換えタンパク質が酸化剤を含む酸化緩衝液、例えば、0.1M Tris-HCl、pH8.0、1mMのEDTA、0.15M NaCl、0.3M酸化グルタチオン（これに限定されない）中で少なくとも約10倍、更に好ましくは約100倍に希釈される。次いで融合タンパク質が酸化緩衝液中で室温で約１〜約24時間、好ましくは約２〜約16時間にわたってインキュベートされる。酸化緩衝液はタンパク質安定剤、例えば、糖、アルコール、または硫酸アンモニウムを含んでもよい。酸化緩衝液は低濃度のカオトロピック剤を更に含んでもよく、不正確な分子間相互作用を不安定にし、こうして適当な折り畳みを促進する。好適なカオトロピック剤として、洗剤、ポリオール、Ｌ−アルギニン、グアニジン-HCl及びポリエチレングリコール（PEG）が挙げられるが、これらに限定されない。充分に低い濃度のカオトロピック剤を使用してタンパク質の変性を避けることが重要である。再生されたタンパク質は少なくとも約10倍、更に好ましくはそれが酸化緩衝液で希釈された量だけ濃縮し得る。
また、本発明は本発明のタンパク質の細胞周辺発現を意図している。
また、バクテリア醗酵が許容できないレベルの内毒素を含む組換えタンパク質製剤をもたらし得る。それ故、本発明は、例えば、内毒素特異性抗体またはその他の内毒素結合分子を使用することによるこのような内毒素の除去を意図している。内毒素の存在は通常の技術、例えば、E-TOXATE試薬（シグマ、セントルイス、ミズーリー）の使用またはバイオアッセイにより測定し得る。
特別な例に加えて、本発明者らはｏｂタンパク質を発現するためのバキュロウイルス発現系、哺乳類発現系、及び酵母発現系の使用を意図している。例えば、バキュロウイルス発現系では、非融合移入ベクター、例えば、pVL941（BamH1クローニング部位;Summers）、pVL1393（BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII、及びPstIクローニング部位;Invitrogen）、pVL1392（BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoR1、XbaI、SmaI、及びBamH1クローニング部位;Summers及びInvitrogen）、及びBlueBacIII（BamH1、BglII、PstI、NotI、及びHindIIIクローニング部位、青色／白色組換え体スクリーニング可能;Invitrogen）（これらに限定されない）、並びに融合移入ベクター、例えば、pAc700（BamH1及びKpnIクローニング部位（BamH1認識部位は開始コドンで開始する）;Summers）、pAc701及びpAc702（読み取り枠を異にする以外はpAC700と同じ）、pAc360（ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流のBamH1クローニング部位;Invitrogen（195））、及びpBlueBacHisA,B,C（BamH1、BglII、PstI、NotI、及びHindIIIクローニング部位、プラークのProBond精製、及び青色／白色組換え体スクリーニングのためのＮ末端ペプチドを含む３種の異なる読み取り枠）;Invitrogen（220））（これらに限定されない）の両方が使用される。下記の特別な実施態様において、pMelBac発現ベクター（Invitrogen）が使用される。
本発明における使用に意図される哺乳類発現ベクターとして、誘導プロモーター、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）プロモーターを有するベクター、例えば、DHFR発現ベクター、またはDHFR/メトトレキセート同時増幅ベクター、例えば、pED（PstI、SalI、SbaI、SmaI、及びEcoRIクローニング部位、そのベクターはクローン化遺伝子及びDHFRの両方を発現する［Kaufman,Current Protocolsin Molecular Biology,16.12（1991）を参照のこと］）を含むあらゆる発現ベクターが挙げられる。また、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター、例えば、pEE14（HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、及びBclIクローニング部位（そのベクターはグルタミンシンターゼ及びクローン化遺伝子を発現する）;Celltech）が挙げられる。別の実施態様において、エプスタインバールウイルス（EBV）の制御下でエピソーム発現を誘導するベクター、例えば、pREP4（BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及びKpnIクローニング部位、構成的RSV-LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー;Invitrogen）、pCEP4（BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及びKpnIクローニング部位、構成的hCMV即時初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー;Invitrogen）、pMEP4（KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamH1クローニング部位、誘導メタロチオネインIIa遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー;Invitrogen）、pREP8（BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI、及びKpnIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー;Invitrogen）、pREP9（KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及びBamH1クローニング部位、RSV-LTRプロモーター、G418選択マーカー;Invitrogen）、及びpEBVHis（RSV-LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ProBond樹脂により精製可能で、エンテロキナーゼにより開裂されるＮ末端ペプチド;Invitrogen）が使用し得る。本発明における使用に選択可能な哺乳類発現ベクターとして、pRc/CMV（HindIII、BstXI、NotI、SbaI、及びApaIクローニング部位、G418選択;Invitrogen）、pRc/RSV（HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部位、G418選択;Invitrogen）、その他が挙げられる。本発明による使用のためのワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター［Kaufman,1991,上記文献を参照のこと］として、pSC11（SmaIクローニング部位、TK選択及びβ-gal選択）、pMJ601（SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、及びHindIIIクローニング部位；TK選択及びβ-gal選択）、及びpTKgptF1S（EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHI、及びHpaクローニング部位、TK選択またはXPRT選択）が挙げられるが、これらに限定されない。
また、酵母発現系が本発明に従ってＯＢポリペプチドを発現するのに使用し得る。例えば、二つだけ言えば、非融合pYES2ベクター（XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1、及びHindIIIクローニング部位;Invitrogen）または融合pYESHisA,B,C（XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、Kpn1、及びHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂で精製され、エンテロキナーゼで開裂されるＮ末端ペプチド；Invitrogen）が本発明に従って使用し得る。
体重モジュレーターポリペプチド及び類似体は本発明の範囲内で誘導されたヌクレオチド配列から調製し得ることが更に意図されている。
OB-Rポリペプチドの組換え発現に加えて、本発明は固相ペプチド合成の公知かつ高度に開発された技術を使用してOB-Rポリペプチド、またはそのフラグメントの調製を考えており、充分に可能にする。本発明はｏｂポリペプチドまたはそのフラグメントを調製するのに一般のBoc及びFmocの両方だけでなく、その他の保護基戦略を使用することを意図している。システイン側鎖を再生し、酸化してジスルフィド結合を形成するための種々の技術がまた当業界で公知である。
OB-Rポリペプチドの抗体
本発明によれば、組換えまたは化学合成により生産されたOB-Rポリペプチド、及びそのフラグメントまたはその他の誘導体もしくは類似体（融合タンパク質を含む）はOB-Rポリペプチドを認識する抗体を産生するための免疫原として使用し得る。このような抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
分子は免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原レセプターと特異的に相互作用することができる場合、それは“抗原性”である。抗原性ポリペプチドは少なくとも約５、好ましくは少なくとも約10のアミノ酸を含む。分子の抗原性部分は抗体またはＴ細胞レセプター認識に免疫優性であるその部分であってもよく、またはそれは抗原性部分を免疫化のためのキャリヤー分子に結合することによりその分子の抗体を産生するのに使用される部分であってもよい。抗原性である分子はそれ自体で免疫原性である必要はなく、即ち、キャリヤーなしに免疫応答を誘発することができる必要はない。
“抗体”は、特定のエピトープを結合するあらゆる免疫グロブリン（抗体及びそのフラグメントを含む）である。その用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体（最後に挙げられたものは米国特許第4,816,397号及び同第4,816,567号に更に詳しく記載されている）、並びにFab、F（ab’）2及びF（v）（一本鎖抗体を含む）を含む抗体の抗原結合部分を含む、それ故、本明細書に使用される種々の文法形態の“抗体分子”という用語は無傷免疫グロブリン分子及び抗体結合部位を含む免疫グロブリン分子の免疫活性部分の両方を意図している。“抗体結合部位”は抗原を特異的に結合するＨ鎖及びＬ鎖可変領域及び超可変領域を含む抗体分子のその構造部分である。
例示抗体分子は無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子及びパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分（Fab、Fab’、F（ab’）2及びF（v）として当業界で知られている部分を含む）であり、その部分は本明細書に記載された治療方法における使用に好ましい。
抗体分子のFab部分及びF（ab’）2部分は、公知である方法により実質的に無傷の抗体分子に対するパパイン及びペプシンの夫々のタンパク質分解反応により調製される。例えば、Theofilopolousらの米国特許第4,342,566号を参照のこと。Fab’抗体分子部分はまた公知であり、F（ab’）2部分から続いてメルカプトエタノールによるような二つのＨ鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元、続いてヨードアセトアミドの如き試薬による得られたタンパク質メルカプトのアルキル化により生成される。
種々の文法形態の“モノクローナル抗体”という用語は特別な抗原と免疫反応することができる抗体結合部位の唯一の種を有する抗体を表す。こうして、モノクローナル抗体は、それが免疫反応する抗原に対し単一結合アフィニティーを典型的に示す。それ故、モノクローナル抗体は異なる抗原に夫々免疫特異性の複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。
“アジュバント”という用語は抗原に対する免疫応答を増進する化合物または混合物を表す。アジュバントは抗原そしてまたリンパ系アクチベーター（免疫応答を非特異的に増進する）を徐々に放出する組織デポー剤として利用することができる［Hoodら,Immunology,384頁,第二編,Benjamin/Cummings,Menlo Park,California（1984）］。しばしば、アジュバントの不在下の抗原単独による一次抗原投与は体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発することができないであろう。アジュバントとして、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルションまたは炭化水素エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG（カルメット・ゲランウシ型）及びコリネバクテリウム・パルブムが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントは医薬上許されることが好ましい。
当業界で知られている種々の操作がOB-Rポリペプチド、またはそのフラグメント、誘導体もしくは類似体のポリクローナル抗体の産生に使用し得る。抗体の産生について、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギを含むが、これらに限定されない種々の宿主動物がOB-Rポリペプチド、またはその誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）による注射により免疫し得る。一実施態様において、OB-Rポリペプチドまたはそのフラグメントが免疫原キャリヤー、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合し得る。特定のOB-R抗原フラグメント（配列番号32、33、34）が以下の実施例２に開示される。別の実施態様において、抗体がOB-RのOB-Re形態のＣ末端部分、例えば、配列番号10のアミノ酸残基約420-641に相当するポリペプチドに対し産生される。フロイント（完全及び不完全）、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG（カルメット・ゲランウシ型）及びコリネバクテリウム・パルブムを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントが、宿主種に応じて、免疫応答を増大するのに使用し得る。
OB-Rポリペプチド、またはそのフラグメント、類似体、もしくは類似体に対して誘導されるモノクローナル抗体の調製について、培養中の連続的継代細胞系による抗体分子の産生を与えるあらゆる技術が使用し得る。これらの技術として、Kohlerら,Nature,256:495-497（1975）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozborら,Immunology Today,4:72（1983）］、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術［Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,77-96頁,Alan R.Liss,Inc.,（1985）］が挙げられるが、これらに限定されない。不死の抗体産生細胞系が融合以外の技術、例えば、オンコジーンＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バールウイルスによるトランスフェクション［例えば、M.Schreierら,“Hybridoma Techniques”（1980）;Hammerlingら,“Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas”（1981）;Kennettら,“Monoclonal Antibodies”（1980）を参照のこと;また米国特許第4,341,761号;同第4,399,121号;同第4,427,783号;同第4,444,887号;同第4,451,570号;同第4,466,917号;同第4,472,500号;同第4,491,632号;及び同第4,493,890号を参照のこと］によりつくられる。
本発明の追加の実施態様において、モノクローナル抗体は無菌動物中で産生し得る［1989年12月28日に公表された国際特許公開WO 89/12690］。本発明によれば、ヒト抗体が使用されてもよく、ヒトハイブリドーマ［Coteら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-2030（1983）］を使用することにより、またはヒトＢ細胞をin vitroでEBVウイルスで形質転換することにより（Coleら,1985,上記文献）得られる。実際に、本発明によれば、適当な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にｏｂポリペプチドに特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより“キメラ抗体”の産生に開発された技術［Morrisonら,J.Bacteriol.,159-870（1984）;Neubergerら,Nature,312:604-608（1984）;Takedaら,Nature,314:452-454（1985）］が使用し得る。このような抗体は本発明の範囲内にある。このようなヒトまたはヒト化キメラ抗体がヒトの疾患または障害（以下に記載される）の治療における使用に好ましい。何となれば、ヒト抗体またはヒト化抗体は異種抗体よりも免疫応答、特にアレルギー反応それ自体を誘発しそうにないからである。
本発明によれば、一本鎖抗体の産生について記載された技術（Hustonの米国特許第5,476,786号及び同第5,132,405号；米国特許第4,946,778号）がOB-Rポリペプチド特異性一本鎖抗体を産生するのに採用し得る。本発明の追加の実施態様はFab発現ライブラリー［Huseら,Science,246:1275-1281（1989）］の構築について記載された技術を利用して、ｏｂポリペプチド、またはその誘導体、もしくは類似体に対し所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントが既知の技術により生成し得る。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により産生し得るF（ab’）2フラグメント;F（ab’）2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成し得るFab’フラグメント、及び抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより生成し得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
抗体の産生において、所望の抗体に関するスクリーニングは当業界で知られている技術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノスルベント検定法）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、イミノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等により行い得る。一実施態様において、抗体結合は一次抗体の標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、一次抗体は一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。更に別の実施態様において、二次抗体が標識される。多くの手段がイムノアッセイにおいて結合を検出するのに当業界で知られており、本発明の範囲内にある。例えば、OB-Rポリペプチドの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含むOB-Rポリペプチドフラグメントに結合する生成物について生成したハイブリドーマを分析し得る。動物の特別な種からのOBポリペプチドに特異性の抗体の選択について、動物の種の細胞により発現され、またはその細胞から単離されたＯＢポリペプチドとのポジチブ結合に基いて選択することができる。
以上の抗体はOB-Rポリペプチドの局在化及び活性に関する当業界で知られている方法、例えば、ウェスタンブロッティング、in situのOB-Rポリペプチドの像形成、適当な生理学的サンプル中のそのレベルの測定、OB-Rの発現の検出等に使用し得る。
特別な実施態様において、OB-Rポリペプチドの活性に作用または拮抗作用する抗体が産生し得る。このような抗体は、リガンドを同定するのに以下に記載されるアッセイを使用して試験し得る。
特別な局面において、抗体はウサギをタンパク質配列により予想された合成ペプチドまたはバクテリア発現ベクターを使用してつくられた組換えタンパク質で免疫することにより発生される。合成ペプチドの選択は上記のように予想されたタンパク質構造の慎重な分析後になされる。特に、推定開裂部位の間のペプチド配列が選択される。合成ペプチドがカルボジイミドを使用してKLHヘモシアニンまたはBSAの如きキャリヤーに結合され、フロイントアジュバント中に使用されてウサギを免疫する。組換えタンパク質を調製するために、pGEXベクターがポリペプチドを発現するのに使用し得る［Smithら,1988,上記文献］。また、疎水性ドメインのみを使用して融合タンパク質を生成することができる。発現されたタンパク質は或る量で調製され、フロイントアジュバント中でウサギを免疫するのに使用されるであろう。
以下の特別な実施態様において、アミノ酸残基145-158、465-484、863-881、及び420-641に相当するペプチド（配列番号８、10のいずれか一つに示されたマウスOB-Rポリペプチドから）は固相ペプチド合成または発現により生成され、必要によりKLHの如きキャリヤーに結合されて、ウサギ、ラット、ヤギ、ニワトリ等を免疫するのに使用される。
別の実施態様において、組換えOB-Rポリペプチドがニワトリを免疫するのに使用され、ニトトリ抗OB-R抗体が、例えば、OB-Rカラムによるアフィニティー精製により卵黄から回収される。免疫化に使用されるニワトリは特定の無病原体（SPF）条件下に保たれることが好ましい。
更に別の実施態様において、組換えOB-Rポリペプチドがウサギを免疫するのに使用され、ポリクローナル抗体が更なる使用の前に免疫精製される。精製抗体は特に血清または血漿中のOB-Rポリペプチドの一種以上の循環（可溶性）スプライス形態の存在を検出するために半定量的アッセイに特に有益である。
モジュレーターペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは種々の性質、即ち、インタイプ、エピトープ、アフィニティー等についてスクリーニングし得る。モジュレーターペプチドの活性を中和するモノクローナル抗体が特に重要である。このようなモノクローナルは体重モジュレーターに関する活性アッセイで容易に同定し得る。また、高アフィニティー抗体は、天然または組換えポリペプチドのイムノアフィニティー精製が所望される場合に有益である。
本発明の診断方法及び治療方法に使用される抗モジュレーター抗体はアフィニティー精製されたポリクローナル抗体であることが好ましい。抗体はモノクローナル抗体（mAb）であることが更に好ましい。加えて、ここに使用される抗モジュレーター抗体分子は全抗体分子のFab、Fab’、F（ab’）2またはF（v）部分の形態であることが好ましい。
診断薬
また、本発明は、本発明のOB-Rポリペプチドにより媒介される活性を誘発するそれらの能力を参考にして、体重の異常または肥満に影響する症状及び／または刺激の存在の検出方法を含む種々の診断用途に関する。先に記載したように、ペプチドは種々の既知技術によりそれ自体の抗体を産生するのに使用でき、次いでこのような抗体が単離され、疑わしい標的細胞中の特別な転写活性の存在に関する試験に使用し得る。また、本発明の核酸は診断に使用し得る。
抗体をベースとする診断薬
先に示唆したように、本発明に有益な診断方法は細胞サンプルまたは培地を有効量のOB-Rポリペプチド結合パートナー、例えば、抗モジュレーター抗体またはレプチン、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、更に好ましくはmAbを含むアッセイにより試験することを特徴とする。加えて、ここに使用される抗体分子はFab、Fab’、F（ab’）2もしくはF（v）部分または全抗体分子の形態であることが好ましい。既に説明したように、この方法から利益を受けることができる患者として、癌、エイズ、肥満または異常な体重が症状の要素であるその他の症状を患っている患者が挙げられる。
また、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む抗体は或る種の診断用途を有することがあり、例えば、体重の異常が発生しており、または発生しそうである症状を検出し、かつ／または測定する目的に使用し得る。
診断方法は個人からの生物学的サンプル中にOB-Rを検出するのに使用し得る。生物学的サンプルは生物学的液体、例えば、血液、血清、血漿、腸液、複数の浸出液、尿、脳脊髄液等であってもよいが、これらに限定されない。可溶性OB-Rが血清または尿中で検出されることが好ましく、これらは両方とも容易に得られる。また、OB-Rは細胞源、例えば、脳組織バイオプシー、脂肪細胞、睾丸、心臓等（これらに限定されない）から検出し得る。例えば、細胞がバイオプシーにより個人から得られ、例えば、凍結−解凍サイクル、または温和な細胞溶解洗剤、例えば、トリトンX-100▲Ｒ▼ポリオキシエチレンエステル、ジギトニン、イゲパール／ノニデットP（NP）-40▲Ｒ▼（オキシフェノキシ）−ポリエトキシエタノール、サポニン等（これらに限定されない）、またはこれらの組み合わせによる処理により溶解される（例えば、1992年５月29日に公表された国際特許公開WO 92/08981を参照のこと）。更に別の実施態様において、細胞及び体液の両方を含むサンプルが使用し得る（同文献を参照のこと）。
細胞中または生物学的液体中のOB-Rの存在はこのような測定に適用可能な通常の免疫学的操作により確かめられる。幾つかの有益な操作が知られている。特に有益である三つのこのような操作は検出可能な標識で標識されたOB-R（特に分泌されたスプライス形態）、検出可能な標識で標識された抗体Ab1、または検出可能な標識で標識された抗体Ab2を使用する。
これらの操作及びそれらの適用は全て当業者に良く知られており、それ故、本発明の範囲内で使用し得る。例えば、“競合”操作が米国特許第3,654,090号及び同第3,850,752号に記載されている。“サンドイッチ”操作が米国再発行特許第31,006号及び米国特許第4,016,043号に記載されている。更に別の操作、例えば、“二重抗体”、または“DASP”操作が知られている。
これらの研究に普通に使用される標識は放射性元素、酵素、紫外線に暴露された時に発光する薬品等である。
幾つかの蛍光物質が知られており、標識として使用し得る。これらとして、例えば、フルオレセイン、ローダミン、及びオーラミンが挙げられる。特別な検出物質はヤギ中で調製され、イソチオシアネートによりフルオレセインと結合された抗ウサギ抗体である。
放射能標識は現在利用できるカウンティング操作のいずれかにより検出し得る。好ましい放射性同位元素は3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、99Tc、125I、131I、及び186Reから選ばれてもよい。
酵素標識が同様に有益であり、現在使用される比色技術、分光分析技術、蛍光分光分析技術、電流滴定技術または気体定量技術のいずれかにより検出し得る。酵素はブリッジ分子、例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等との反応により結合される。これらの操作に使用し得る多くの酵素が知られており、使用し得る。好ましいのはペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第3,654,090号、同第3,850,752号、及び同第4,016,043号が別の標識物質及び方法のそれらの開示の例として参考にされる。
本発明の更に別の実施態様において、医療スペシャリストによる使用に適した試験キットが疑わしい標的細胞または生物学的液体中のOB-Rの存在または不在を測定するのに調製し得る。先に説明した試験技術によれば、このようなキットの一つのクラスは標識されたOB-Rポリペプチドまたはその結合パートナー、例えば、それに特異性の抗体そして、勿論、選択された方法、例えば、“競合”、“サンドイッチ”、“DASP”等に応じた指示を少なくとも含むであろう。また、キットは周辺の試薬、例えば、緩衝剤、安定剤等を含んでもよい。
核酸をベースとする診断薬
以下の実施例に実証されるように、本発明の核酸は肥満表現型と関連するOB-Rポリペプチド中の欠陥と関連する欠陥を検出するのに使用し得る。例えば、核酸プローブ（例えば、ノーザン分析またはRT-PCR分析において）は、肥満表現型がｄｂ／ｄｂマウス（欠陥が有効なレプチンレセプターの欠如により生じる場合）または突然変異が非転写ｍＲＮＡを生じる場合のようにOB-R mRNAの発現の欠如、または非機能性OB-R mRNAの発現と関連するか否かを測定するのに使用し得る。更に、本発明の核酸をベースとする診断技術は抗体をベースとする技術と協力して使用されて肥満表現型または食欲減退表現型の分子上の理解を更に発展し得る。
ヒトｃＤＮＡクローンが配列決定し得る。これはヒト遺伝子の完全配列の測定を促進する。こうして、ヒトOB-R遺伝子のイントロンからのＤＮＡ配列が得られ、これらがPCRプライマーを調製するのに使用されて、OB-R遺伝子の突然変異または対立遺伝子変異体を同定するようにヒトゲノムＤＮＡからのOB-R遺伝子のコーディング配列をPCR増幅し、これらの全てが本明細書に先に記載されたプロトコルに従う。
現在の仮説は、ＤＢ遺伝子中の異型接合突然変異が軽度／中間の肥満と関連し、一方、同型接合突然変異が重度の肥満と関連することである。これは肥満の発生のおそれのある人々の確認を可能にし、増加した体重が充分に発生する前に薬剤治療の適用及び／またはライフスタイルの変化を可能にするであろう。
また、ヒトob-rの突然変異体形態とともに分離するミクロサテライトの存在が診断に使用し得る。種々のPCRプライマーがこれに関して使用し得る。
また、OB-R遺伝子は栄養障害におけるそのコードされたＲＮＡ及びタンパク質の測定について診断上有益であり得る。OB-R RNA及びそのコードされたタンパク質がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされるのかを知ることは、特に栄養障害で重要であろう。こうして、肥満の人がOB-Rのレベルを増加した場合、その問題がOB-Rの下流であることが明らかであり、一方、OB-R発現が減少される場合、OB-Rの不当に低いレベルが肥満の原因であり得ることが明らかであろう（その欠陥がOB-R遺伝子にあるか否かを問わない）。逆に、体重を失った癌患者またはエイズ患者がOB-Rのレベルを上昇した場合、OB-Rの不当に高い発現が体重損失の原因であると結論し得る。
本発明はOB-Rの発現の不適当なレベルに関するだけでなく、非機能性または機能不全のスプライス形態の発現に関する。本発明の核酸診断薬は、主として発現される形態が、例えば、シグナル伝達について機能不全であるか否かの測定を与える。以下の実施例に実証されるように、ｄｂ突然変異体マウス（C57BL/Ks db/db）は長いOB-R mRNAを発現する（RT-PCRにより測定されたように）。
治療薬
本発明のポリペプチド、核酸、及び抗体は有意な治療潜在性を有する。治療有効量のこのような薬剤（例えば、そのタンパク質の可溶性形態、もしくは遺伝子治療のためのＤＮＡ、またはレプチン活性に拮抗作用するためのアンチセンス核酸）が医薬上許されるキャリヤー、希釈剤、または賦形剤中で投与される。
“医薬上許される”という用語は、生理学的に寛容され、典型的にはヒトに投与された時にアレルギー反応または同様の不利な反応、例えば、胃の不調、目眩等を生じない分子物体及び組成物を表す。一実施態様において、本明細書に使用される“医薬上許される”という用語は連邦政府もしくは州政府の規制当局により認可され、または動物、更に特別にはヒトにおける使用について米国薬局方またはその他の一般に認められている薬局方にリストされることを意味し得る。“キャリヤー”という用語は、化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを表す。このような医薬キャリヤーは無菌液体、例えば、水及び油（石油、動物、植物または合成源の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む）であってもよい。水または溶液の食塩液及び水性のデキストロース液及びグリセロール液が、特に注射液用のキャリヤーとして使用されることが好ましい。好適な医薬キャリヤーがMartin,Remington’s Pharmaceutical Sciences,18編,Mack Publishing Co.,Easton,PA（1990）に記載されている。
“治療有効量”という用語は宿主の活性、機能及び応答の臨床上重大な欠陥を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも90％減少し、最も好ましくは阻止するのに充分な量を意味するために本明細書に使用される。また、治療有効量は宿主の臨床上重大な症状の改善を生じるのに充分である。OB-R活性の調節は体重を減少し（その活性を増大することにより）、または体重を増加する（その活性を低下することにより）のに有益であり得る。
OB-Reに相当する組換え可溶性OB-Rポリペプチドの投与は体重損失、特に脂肪組織の減少をもたらすものと予想される。可溶性型OB-Reポリペプチドは通常のバクテリア発現ベクター及び／または哺乳類発現ベクターを使用して調製でき、合成により調製でき、または血漿もしくは血清から精製でき、全てが本明細書に先に詳しく述べたとおりである。また、天然可溶性OB-Rポリペプチドの増大された発現は上記文献に記載されたような相同組換え技術により誘導し得る。
レプチン活性の低下（アンタゴニスト、インヒビター、中和抗体の使用、またはアンチセンス分子を開発することによる）は、癌、エイズまたは神経性食欲不振と関連する体重損失の治療に望ましいような体重獲得をもららすべきである。一実施態様において、シグナル伝達または増進に必要な部分を欠いている可溶性OB-Rのレプチン結合形態が使用し得る。
ポリペプチドをベースとする治療措置
最も簡単な分析において、OB-R遺伝子は動物、特にマウス、ラット、イヌ、及びヒトの体重の測定と緊密に関連している。OB-R遺伝子産物、ひいては同族体分子は、脂肪組織が脳及びその他の臓器と連絡するシグナリング経路の一部であることが明らかである。OB-Rポリペプチドの少なくとも一種のスプライス形態（例えば、OB-Rb）はそれ自体シグナリング分子、即ち、ホルモンレプチンのレセプターであると考えられる。
可溶性OB-Rポリペプチド、またはその機能活性フラグメント、もしくはそのアンタゴニストは経口投与または非経口投与でき、好ましくは非経口投与し得る。代謝性ホメオスタシスは連続プロセスであるので、可溶性OB-Rポリペプチド（OB-Re）の徐放性投与が好ましい。例えば、ポリペプチドは静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、またはその他の投与様式を使用して投与し得る。一実施態様において、ポンプが使用し得る［Langerら編集,Medical Applications of Controlled Release,CRC Pres.,Boca Raton, Florida（1974）;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.,14:201（1987）;Buchwaldら,Surgery,88:507（1980）;Saudekら,N.Engl.J.Med.,321:574（1989）］。別の実施態様において、ポリマー物質が使用し得る［Langer,1974,上記文献;Sefton,1987,上記文献;Smolenら編集,Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Wiley,New York（1984）;Rangerら,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.,23:61（1983）;また、Levyら,Science,228:190（1985）;Duringら,Ann.Neurol.,25:351（1989）;Howardら,J.Neurosurg.,71:105（1989）を参照のこと］。更に別の実施態様において、徐放性系が治療標的、即ち、脳に接近して置かれ、こうして全身投薬量の一部のみを必要とする［例えば、Goodson,Medical Applications of Controlled Release,2巻,115-138頁（1984）を参照のこと］。その他の徐放性系がLanger,Science,249:1527-1533（1990）により総説に説明されている。別の実施態様において、治療化合物が小胞、特にリポソーム中で送出し得る［Langer,1990上記文献;Treatら,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein及びFidler編集,Liss,New York,353-365頁（1989）;Lopez-Berestein同文献,317-327頁を参照のこと;一般に同文献を参照のこと］。
更に別の局面において、OB-R cDNAの可溶性スプライス形態（例えば、レプチンの可溶性OB-Rアゴニストを表すのに本明細書で使用されるOB-Re）で形質転換され、高レベルのポリペプチドを発現する組換え細胞がレプチン活性の増進を要する被験者に移植し得る。OB-Reで形質転換されたオートロガス細胞が移植されて拒絶を避けることが好ましい。また、免疫認識及び拒絶を阻止するポリマーマトリックス内に可溶性因子を生産する非オートロガス細胞を遮蔽するための技術が利用できる。
OB-Reポリペプチドは投与の静脈内経路、動脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、または皮下経路により送出し得る。また、適当に製剤化されたOB-Reポリペプチドが鼻内投与または経口投与により投与し得る。OB-Reの一定の供給が治療有効投与量（即ち、被験者中で代謝変化を誘発するのに有効な投与量）を必要な間隔、例えば、毎日、12時間毎、等で与えることにより確実にし得る。これらのパラメーターは治療される症状の重度、その他の作用、例えば、実施される食事変更、被験者の体重、年齢、及び性別、並びに当業者による通常の良好な医療慣例に従って容易に決められるその他の基準に依存するであろう。
あらゆる可溶性OB-Rポリペプチド、例えば、レプチンアンタゴニストがまたOB-Reについて上記されたように投与し得ることが当業者により容易に理解し得る。
医薬組成物
本発明の更に別の局面において、上記の医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は注射による投与、または投与の経口形態、肺形態、鼻内形態またはその他の形態のためであってもよい。一般に、医薬上許される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／またはキャリヤーと一緒に有効量の本発明のタンパク質または誘導体産物を含む医薬組成物が本発明により包含される。このような組成物は種々の緩衝剤内容物（例えば、トリス-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pH及びイオン濃度の希釈剤、添加剤、例えば、洗剤及び可溶化剤（例えば、トゥイーン80、ポリソルベート80）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）及び増量剤物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリマー化合物、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の粒状製剤またはリポソームへの物質の混入を含む。ヒアルロン酸またはその他の陰イオンポリマーがまた使用し得る。このような組成物は物理的状態、安定性、in vivo放出の速度、及び本発明のタンパク質及び誘導体のin vivoクレアランスの速度に影響し得る［例えば、Martin,Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18編,（1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042）1435-1712頁を参照のこと］。組成物は液体形態で調製されてもよく、または凍結乾燥形態の如き乾燥粉末であってもよい。
経口送出
経口固体投薬形態が本発明における使用に意図されており、これらは一般にMartin,Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18編,（1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042）89章に記載されている。固体投薬形態として、錠剤、カプセル、ピル、トローチまたはロゼンジ、カシエ剤もしくはペレットが挙げられる。また、リポソームカプセル化またはプロテイノイドカプセル化が本発明の組成物を製剤化するのに使用し得る（例えば、プロテイノイド微小球体として［米国特許第4,925,673号］）。リポソームカプセル化が使用されてもよく、リポソームは種々のポリマーで誘導体化し得る［例えば、米国特許第5,013,556号］。治療用に可能な固体投薬形態の記載がMarshall,Modern Pharmaceutics,10章,Banker及びRhodes編集,（1979）により示され、その製剤はタンパク質（または化学修飾タンパク質）、及び不活性成分（これらは胃環境に対する保護、及び腸中の生物活性物質の放出を可能にする）を含むであろう。
上記誘導体化タンパク質の経口投薬形態がまた特に意図されている。タンパク質は誘導体の経口送出が有効であるように化学修飾し得る。一般に、意図される化学修飾はタンパク質（またはペプチド）分子それ自体への少なくとも一つの部分の結合であり、この場合、前記部分は（a）タンパク質分解の抑制、及び（b）胃または腸から血流への摂取を可能にする。また、タンパク質の総合安定性の増大及び生体中の循環時間の増加が所望される。このような部分の例として、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる［Abuchowskiら,1981,上記文献;Newmarkら,J.Appl.Biochem.,4:185-189（1982）］。使用し得るその他のポリマーはポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカンである。ポリエチレングリコール部分が先に示されたような医薬上の使用に好ましい。
タンパク質（または誘導体）について、放出の位置は胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってもよい。当業者は胃中に溶解しないが、十二指腸または腸中のいずれかに物質を放出する利用可能な製剤を有する。放出はタンパク質（または誘導体）の保護または胃環境を越え、例えば、腸中の生物活性物質の放出により胃環境の有害な作用を避けることが好ましい。
充分な胃液抵抗性を確実にするために、少なくともpH5.0に不浸透性の被覆物が必須である。腸溶剤皮として使用される普通の不活性成分の例はセルロースアエテートトリメリテート（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、HPMCP50、HPMCP55、ポリビニルアセテートフタレート（PVAP）、エウドラギットL30D、アクアテリック、セルロースアセテートフタレート（CAP）、エウドラギットＬ、エウドラギットＳ、及びシェラックである。これらの被覆物は混合フィルムとして使用されてもよい。
また、被覆物または被覆物の混合物が錠剤に使用でき、これらは胃に対する保護を目的としていない。これは糖被覆物、または錠剤を飲み易くする被覆物を含むことができる。カプセルは乾燥治療薬、例えば、粉末の送出のために硬質シェル（例えば、ゼラチン）からなってもよい。液体形態について、軟質ゼラチンシェルが使用し得る。カシエ剤のシェル材料は濃厚澱粉またはその他の食用紙であってもよい。ピル、ロゼンジ、成形錠剤、または錠剤粉砕物について、湿式塊状化（massing）技術が使用し得る。
治療薬は約１mmの粒径のグラニュールまたはペレットの形態の微細な多粒状物として製剤中に含まれる。カプセル投与用の物質の製剤は粉末、軽度に圧縮されたプラグとして、または錠剤としてであってもよい。治療薬は圧縮により調製し得る。
着色剤及び矯味矯臭薬が全て含まれてもよい。例えば、タンパク質（または誘導体）が製剤化され（例えば、リポソームまたは微小球体カプセル化による）、次いで食用製品、例えば、着色剤及び矯味矯臭薬を含む冷凍飲料中に含まれる。
治療薬の容積を不活性物質で希釈または増大してもよい。これらの希釈剤として、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、蔗糖、変性デキストラン及び澱粉が挙げられる。また、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含む或る種の無機塩が充填剤として使用されてもよい。幾つかの市販の希釈剤はファスト−フロ、エムデックス、STA-Rx1500、エムコンプレス及びアビセルである。
崩壊剤が固体投与形態への治療薬の製剤中に含まれてもよい。崩壊剤として使用される物質として、澱粉をベースとする市販の崩壊剤を含む澱粉、エクスプロタブが挙げられるが、これらに限定されない。ナトリウム澱粉グリコレート、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトが全て使用し得る。崩壊剤の別の形態は不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ガムが崩壊剤及びバインダーとして使用されてもよく、これらは粉末ガム、例えば、アガー、カラヤまたはトラガカントを含んでもよい。また、アルギン酸及びそのナトリウム塩が崩壊剤として有益である。
バインダーが治療薬を一緒に保持して硬質錠剤を形成するのに使用されてもよく、天然製品からの物質、例えば、アカシア、トラガカント、澱粉及びゼラチンを含む。その他はメチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）及びカルボキシメチルセルロース（CMC）を含む。ポリビニルピロリドン（PVP）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）の両方がアルコール溶液中に使用されて治療薬をグラニュール化し得る。
減摩剤が製剤化プロセス中の粘着を阻止するために治療薬の製剤中に含まれてもよい。滑剤が治療薬とダイ壁の間の層として使用されてもよく、これらとして、ステアリン酸（そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液体パラフィン、植物油及びワックスが挙げられるが、これらに限定されない。また、可溶性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、並びにカルボワックス4000及び6000が使用されてもよい。
製剤化中に薬剤の流動性を改善し、また圧縮中の転移を助けるためにグライダント（glidant）が添加されてもよい。グライダントは澱粉、タルク、熱分解法シリカ及び水和シリコアルミネートを含んでもよい。
水性環境への治療薬の溶解を助けるために、表面活性剤が湿潤剤として添加されてもよい。表面活性剤は陰イオン系洗剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート及びジオクチルナトリウムスルホネートを含んでもよい。陽イオン系洗剤が使用されてもよく、ベンザルコニウムクロリドまたはベンゼトミウムクロリドを含んでもよい。表面活性剤として製剤中に含まれる潜在的なノニオン系洗剤のリストはラウロマクロゴル400、ポリオキシ40ステアレート、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油10、50及び60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート40、60、65及び80、蔗糖脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの表面活性剤は単独または異なる比の混合物としてタンパク質または誘導体の製剤中に存在し得る。
タンパク質（または誘導体）の摂取を潜在的に増進する添加剤は、例えば、脂肪酸オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
徐放性製剤が望ましい場合がある。薬剤は拡散または浸出メカニズム、例えば、チューインガムにより放出を可能にする不活性マトリックスに混入し得る。また、徐々に崩壊するマトリックスが製剤に混入されてもよい。この治療薬の徐放の別の形態はオロス治療系（Alza Corp.）に基く方法によるものであり、即ち、薬剤が半浸透性膜に封入され、この膜が浸透圧作用のために単一の小さい開口部を通して水を侵入させ、薬剤を押し出させる。また、幾つかの腸溶剤皮が遅延放出効果を有する。
その他の被覆物が製剤化に使用されてもよい。これらとして、被覆パン中に適用し得る種々の糖が挙げられる。また、治療薬はフィルム被覆錠剤中に与えられる。この場合に使用される物質は二つのグループに分けられる。最初のグループは非腸物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリウムカルボキシ−メチルセルロース、プロビドン及びポリエチレングリセロールを含む。第二グループは普通フタル酸のエステルである腸物質からなる。
物質の混合が最適フィルム被覆物を与えるのに使用し得る。フィルム被覆はパンコーターもしくは流動床中で、または圧縮被覆により行われてもよい。
肺送出
本発明の可溶性タンパク質（またはその誘導体）の肺送出がまたここに意図されている。タンパク質（または誘導体）が吸入の間に哺乳類の肺に送出され、肺上皮ライニングを横切って血流に移動する。これのその他の論文として、Adjeiら,Pharmaceutical Research,7（6）:565-569（1990）;Adjeiら,International Journal of Phamaceutics,63:135-144（1990）（ロイプロリドアセテート）;Braquetら,Journal of Cardiovascular Pharmacology,13（補遺5）:143-146（1989）（エンドセリン-1）;Hubbardら,Annals of Internal Medicine,3（3）:206-212（1989）（α1-アンチトリプシン）;Smithら,J.Clin.Invest.,84:1145-1146（1989）（α1-プロテイナーゼ）;Osweinら,“Aerosolization of Proteins”,Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II,Keysotone,Colorado,（1990年３月）（組換えヒト成長ホルモン）;Debsら,J.Immunol.,140:3482-3488（1988）及びPlatzらの米国特許第5,284,656号（顆粒細胞コロニー刺激因子）が挙げられる。治療薬製品の肺送出に設計された広範囲の機械装置（ネブライザー、投薬量計量吸入装置、及び粉末吸入装置が挙げられるが、これらに限定されない）が本発明の実施における使用に意図されており、これらの全てが当業者に良く知られている。
本発明の実施に適した市販装置の幾つかの特別な例はマリンクロット社（ミズーリー、セントルイスにある）により製造されたウルタラベント・ネブライザー、マークエスト・メディカル・プロダクツ（コロラド、エングルウッドにある）により製造されたアコーンIIネブライザー、グラクソ社（ノースカロライナ、リサーチ・トライアングル・パークにある）により製造されたベントリン投薬量計量吸入装置、及びフィソンズ社（マサチューセッツ、ベッドフォードにある）により製造されたスピンハラー粉末吸入装置である。
全てのこのような装置がタンパク質（または誘導体）の分配に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、夫々の製剤は使用装置の型に特別であり、治療に有益な通常の希釈剤、アジュバント及び／またはキャリヤーに加えて適当な噴射剤の使用を伴い得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたは微小球体、封入複合体、またはその他の型のキャリヤーの使用が意図されている。また、化学修飾タンパク質が化学修飾の型または使用装置の型に応じて異なる製剤中で調製されてもよい。
ジェットまたは超音波のネブライザーと一緒の使用に適した製剤は典型的には溶液１ml当たり生物活性タンパク質約0.1〜25mgの濃度で水に溶解されたタンパク質（または誘導体）を含むであろう。また、製剤は緩衝剤及び簡単な糖（例えば、タンパク質安定化及び浸透圧の調節のため）を含んでもよい。また、ネブライザー製剤はエアロゾルを生成する際に溶液の噴霧化により生じるタンパク質の表面誘発凝集を減少または阻止するために表面活性剤を含んでもよい。
投薬量計量吸入装置と一緒に使用するための製剤は一般に表面活性剤の助けにより噴射剤中に懸濁されたタンパク質（または誘導体）を含む微細な粉末を含むであろう。噴射剤はこの目的に使用される通常の物質、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む）、またはこれらの組み合わせであってもよい。好適な表面活性剤として、ソルビタントリオレエート及び大豆レシチンが挙げられる。また、オレイン酸が表面活性剤として有益であり得る。
粉末吸入装置から分配するための製剤はタンパク質（または誘導体）を含む微細な乾燥粉末を含み、また装置からの粉末の分散を促進する量、例えば、製剤の50〜90重量％の増量剤、例えば、ラクトース、ソルビトール、蔗糖、またはマンニトールを含んでもよい。タンパク質（または誘導体）は遠位の肺への最も有効な送出のために10μm（またはミクロン）未満、最も好ましくは0.5〜５μmの平均粒径の粒状形態で最も有利に調製される。
鼻内送出
タンパク質（または誘導体）の鼻内送出がまた意図されている。鼻内送出は、肺中の製品の付着を必要としないで、治療製品を鼻に投与した直後に血流へのタンパク質の流入を可能にする。鼻内送出用の製剤として、デキストランまたはシクロデキストランを含む製剤が挙げられる。
治療方法、薬物の調製方法
本発明の更に別の局面において、治療方法及び薬物の製造が提供される。本発明の誘導体の投与により軽減または調節される症状は先に示された症状である。
投薬量
上記分子の全てについて、更なる研究が行われるので、種々の患者の種々の症状の治療に適した投薬量レベルに関する情報が現れ、当業者はレシピエントの治療状況、年齢及び全般の健康を考慮して適当な投薬量を確かめることができるであろう。一般に、注射または注入について、投薬量は体重１kg当たり0.01μgの生物活性タンパク質（化学修飾しないで、タンパク質単独の質量を計算する）〜10mg/kg（同じ基準）の間であろう。投薬スケジュールは、使用したタンパク質または誘導体の循環半減期、ポリペプチドが巨丸投与または連続注入のいずれにより送出されるのか、及び使用した製剤に応じて変化し得る。
その他の化合物との投与
肥満と関連する治療について、本発明の可溶性タンパク質（または誘導体）を肥満のその他の臨床合併症を治療するのに使用される一種以上の組成物、例えば、糖尿病（インスリン）、高血圧、高コレステロール、及び肥満にありがちなその他の不利な症状の治療に使用される組成物と一緒に投与し得る。また、その他の食欲低下剤、例えば、アンフェタミンが同時投与されてもよい。投与は同時（例えば、本発明のタンパク質とインスリンの混合物の投与）であってもく、または連続であってもよい。
核酸をベースとする治療措置
シグナル伝達を媒介することができるOB-R遺伝子、例えば、OB-Reがヒト視床下部細胞に導入されて肥満の遺伝子治療を生じる。このような治療は体重を減少するものと予想されるであろう。逆に、脳細胞、特に視床下部（そしてまた脈絡集網を含む）、またはOB-Rが発現されるその他の細胞へのアンチセンス構築物の導入は活性OB-Rポリペプチドのレベルを減少し、体脂肪蓄積を増大するものと予想されるであろう。
一実施態様において、OB-Rポリペプチドをコードする遺伝子がウイルスベクターにin vivoで導入される。このようなベクターとして、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）、パピオーマウイルス、エプスタインバールウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）等（これらに限定されない）が挙げられる。ウイルス遺伝子を全くまたは殆ど欠いている欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後に感染性ではない。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターがその他の細胞を感染し得ることに関心をもたないで、特定の局在化領域の細胞への投与を可能にする。こうして、脳組織が特異的に標的とし得る。特別なベクターの例として、欠損ヘルペスウイルス１（HSV1）ベクター［Kaplittら,Molec.Cell.Neurosci.,2:320-330（1991）］、弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetら,J.Clin.Invest.,90:626-630（1992）により記載されたベクター、及び欠損アデノ関連ウイルスベクター［Samulskiら,J.Virol.,61:3096-3101（1987）;Samulskiら,J.Virol.,63:3822-3828（1989）］が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施態様において、遺伝子はレトロウイルスベクターに導入し得る［例えば、Andersonらの米国特許第5,399,346号;Mannら,Cell,33:153（1983）;Teminらの米国特許第4,650,764号;Teminらの米国特許第4,980,289号;Markowitzら,J.Virol.,62:1120（1988）;Teminらの米国特許第5,124,263号;Doughertyらにより1995年３月16日に公表された国際特許公開WO 95/07358;及びKuoら,Blood,82:845（1993）］。
また、ベクターはリポフェクションによって生体内に導入される。ここ10年間に核酸を試験管内で封入及びトランスフェクトするためのリポソームの使用が増えてきた。マーカーをコードしている遺伝子を生体内でトランスフェクトするリポソームを調製するために、リポソーム仲介トランスフェクションで直面する困難や危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質が用いられる［Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417（1987）;Mackeyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8027-8031（1988）］。陽イオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の封入を促進しかつ負に荷電した細胞膜との融合を促進させることができる［Felgnerら,Science,337:387-388（1989）］。外来遺伝子を特定の器官に生体内で導入するためのリポフェクションの使用は、ある実用的利点をもつ。特定の細胞をリポソームの分子標的にすることはある面の利点を示す。膵臓、肝臓、腎臓及び脳のような細胞異質性のある組織において具体的な種類の細胞に対してトランスフェクトすることが特に有利であることは明らかである。標的にするために脂質を他の分子に化学結合させることができる（上記Mackeyら,1988参照）。標的にしたペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質、及び抗体のようなタンパク質、又は非ペプチド分子はリポソームに化学結合される。
裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターを生体内で導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当該技術において既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクター輸送体の使用によって所望のホスト細胞へ導入される［例えば、Wuら,J.Biol.Chem.,267:963-967（1992）;Wuら,J.Biol.Chem.,263:14621-14624（1988）;Hartmutら,1990年３月15日出願のカナダ特許出願第2,012,311号を参照されたい］。
農業用途
OB-R遺伝子は家畜からも単離され、対応するOB-Rポリペプチドが得られる。マウスOB-R遺伝子に由来するプローブは、多数の動物種からの対応する相同コード配列に対してハイブリッド形成することが予想される。ヒト治療について述べたように、組換えタンパク質が作製され、家畜に投与される。牛、豚、家禽、羊等の赤身の食肉動物を生産するために可溶性ポリペプチドの投与が実施される。自己OBポリペプチドが投与されることが好ましいが、本発明は非自己ポリペプチドの投与も企図する。可溶性OB-Rポリペプチドは約８００個のアミノ酸残基からなるので、高度に免疫原性がある。従って、自己ポリペプチドの投与が好ましい。
また、クローン化遺伝子をトランスジェニック家畜に導入するとOB-Rトランスジーンを過剰発現することにより体重や脂肪蓄積を潜在的に減少させることができる。これを達成する最も簡便な手段はそれ自体又は他の脳特異的プロモーターを用いて脳をOB-Rトランスジーンの標的にすることである。
逆に、神戸牛又はフォアグラをつくる肥大した肝臓の開発に対する他の場合においては体脂肪の増加が望ましい。これは、脳をアンチセンスOB-Rトランスジーンの標的にするか又は遺伝子ノックアウト技術を用いることにより達成される。また、％脂肪での体重増加が所望される場合にはOB-Rポリペプチドのインヒビター又はアンタゴニストが投与される。かかるインヒビター又はアンタゴニストとしては、該ポリペプチドと反応性の抗体、及びOB受容体を結合するが活性化しないポリペプチドの断片、即ち、レプチンのアンタゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。
美容用途
OB-Rポリペプチドは、健康のためのほかに美容用途にも著しく有用である。特に、本発明のOB-Rポリペプチド、その誘導体又はアゴニスト類縁体は動物における脂肪細胞付着の速度と量をモジュレートするのに有効であるので、必ずしも肥満状態になるとは限らないが見苦しい脂肪組織、例えば、腹部、ヒップ、腿、首及び顎の脂肪付着物を減らすのに有効であり、しかも個体の外観を損ねない。脂肪減少効果は、一部には、食欲の低下、即ち、食物摂取の低下、基礎代謝の増加、又はその両方によって達成されると思われる。従って、本可溶性OB-Rポリペプチド、又はその誘導体又はアゴニスト類縁体は、脂肪付着のモジュレート、食欲の低下、又はその両方による脂肪組織付着物の美容変化を引き起こすために被検者に投与するのに有用である。
更に、本組成物及び方法は、身体の全体の外観を変えるように設計された美容整形手術（例えば、脂肪組織の吸引又は切除することによる体重を減少させるように設計された脂肪吸引）、運動（特にランニングやウェートトレーニング）、低脂肪ダイエット、催眠術、バイオフィードバック、脂肪組織の割合を下げ身体の外観を改善することを試みる方法のような様々な方法と共に用いられる。
従って、本発明は、個体において美容上の脂肪組織をモジュレートする方法であって、可溶性OB-Rポリペプチド、又はその誘導体又はアゴニスト類縁体の脂肪をモジュレートする量を全身の外観を改善するために美容上の脂肪組織のモジュレーションを希望する個体に投与することを特徴とする、前記方法に関する。具体的な態様においては、脂肪組織のモジュレーションは食欲抑制の結果である。好ましくは、脂肪組織のモジュレーションは脂肪組織の減少である。
実施態様においては、本発明は、更に、美容上の脂肪組織を減少させる方法であって、身体の外観を変化させる方法と、可溶性OB-Rポリペプチド、又はその誘導体又はアゴニスト類縁体の脂肪をモジュレートする量を全身の外観を改善するために美容上の脂肪組織のモジュレーションを希望する個体に投与することとを組合わせることを特徴とする、前記方法に関する。
本発明は、本発明を例示し制限するものではない下記の実施例によって更に理解される。
実施例１:DBｃＤＮＡクローンの単離
マウスdb遺伝子の突然変異により、病的ヒト肥満に似ている症状の致命的な肥満及び糖尿病が生じる［Hummelら,Science,153:1127（1966）］。以前のデータから、db遺伝子がレプチンとして知られるob部位の遺伝子産物の受容体をコードすることが示された［Coleman,Diabetologia,14:141（1978）;Zhangら,Nature,372:425（1994）］。最近、レプチン受容体を脈絡叢からクローン化する報告が出た。このクローンはdbと同じ領域の染色体４にマッピングしていることがわかった［Tartagliaら,Cell,83:1263（1995）］。この受容体はJAKチロシンキナーゼと関連がある受容体ファミリーの一種である。しかしながら、この受容体の突然変異はC57BL/6J db/dbマウスでは同定されてなく、これらのマウスでの突然変異はこの遺伝子のスプライス変異体であることが示された［上記Tartagliaら］。
本実施例は、レプチン受容体がdbと同じマウス染色体４の300kBの間にマッピングしていることを示すものである。この領域からのｃＤＮＡ選択とエキソントラッピングにより、レプチン受容体と同じ配列をもつ数種のESTが同定された。マウス脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した対応するｃＤＮＡクローンの確認により、各々アミノ及び／又はカルボキシ末端に差がある少なくとも５種の代替的にスプライシングされた形のレプチン受容体があることがわかった。スプライス変異体の１種は、視床下部では高レベルで発現し、他の組織では低レベルで発現する。この転写物は、C57BL/Ks db/dbマウスの変異体である。この突然変異はＲＮＡの３′末端へ106bpを挿入することになる正常でないスプライシングの結果であり、JAKタンパク質と相互作用することが既知のタンパク質部位、“ボックス２”を欠失している端を切り取った細胞質領域を得る［Murakamiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:11349（1991）;Fukunagaら,EMBO,10:2855（1991）］。シグナルトランスダクションが欠損していると思われる［Baharyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:8642（1990）;Modlら,Dytogenetics Cell Genetics,67:232（1995）］。これらのデータから、レプチンの重量減少作用が視床下部、恐らく他の組織において受容体と相互作用することによって仲介されることが示される。
材料及び方法
ゲノムクローンの単離．YACクローンをＰＣＲスクリーニングによって単離し、チェフマッパー（Bio-Rad）で分子量を決めた［Greenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1213（1996）;Kasumiら,Mammalian Genome,4:391（1993）］。YAC端をベクトレットＰＣＲ及びプラスミド端レスキューを用いて回復させた［Rileyら,Nucl.Acids Res.,18:2887（1990）;Hermansonら,Nucl.Acids Res.,19:4943（1991）］。個体マウスP1クローンを単独で選ぶゲノムシステム社（ミズーリ州セントルイス）にＰＣＲプライマーの特定対合を送付することによりP1クローンを単離した［Sternsberg,Trends Genet.,8:11（1992）］。P1端をベクトレットＰＣＲを用いて回復させた［Hartlら,Bio Techniques,15:201（1993）］。BACを記載されたように単離した［Shizuya,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:8794（1992）］。プライマー選択とＰＣＲ増幅を記載されたように行った:94°で３分間最初の変性、94°で１分間、55°で２分間及び72°で３分間を25サイクル［上記Zhang,1994］。プライマーは、下記のものとした。
0004285771.tif 000005
dbクローンの単離．出発物質としてマウス脳視床下部ＲＮＡを用いて記載されたようにｃＤＮＡ選択を行った［Morganら,Nucl.Acids Res.,20:5173（1992）］。ライブラリースクリーニング、エキソントラッピング及びＤＮＡシークエンシングを記載されたように行った［上記Zhangら,1994（実施例３参照）］。OB-Ra、OB-Rb、OB-Rd及びOB-ReのＣ末端配列が異なるｃＤＮＡクローンに見られた。OB-RbのＣ末端配列は全長ではなかった。この変異体のＣ末端は、ゲノムＤＮＡをシークエンシングすることにより最初に完了した。ｃＤＮＡ29からのプライマーと共にBAC242のベクトレットＰＣＲを用いて鋳型を作製した［Rileyら,Nucl.Acids Res.,18:2887（1990）］。RT-PCR産物をシークエンシングすることにより配列を確認した。
db内の突然変異の同定．記載されたようにRT-PCRとシークエンシングを行った。OB-Rbのスプライス受容体のゲノム配列をOB-Rb逆プライマーと共にBAC242のベクトレットＰＣＲによって得た。OB-Ra、OB-Rb、OB-Re及びOB-RdのRT-PCRについては、前向きプライマーは同じ下記の配列とした。
0004285771.tif 000006
逆向き（r）プライマーは下記の配列とした。
0004285771.tif 000007
OB-Rbのイントロンプライマー（図3Cの標識F2）は下記の配列とした。
0004285771.tif 000008
代替的にスプライシングされたレプチン受容体の組織分布．記載されたようにRT-PCRを行った。OB-Ra、OB-Rb、OB-Rc及びOB-Rdのプライマー配列は上に示されている。OB-Reのプライマーは下記の配列とした。
0004285771.tif 000009
結果及び検討
dbを分離する一連の遺伝子交雑を確立した。C57BL/Ks db/db×Mus spretus相互交配の50の肥満（db/db）後代及びC57BL/Ks db/db×Mus castaneus相互交配の350の肥満（db/db）後代を含めた。db部位としての遺伝子型の帰属は以前に記載されたように行った［Baharyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,37:8642（1990）］。
各動物からのＤＮＡを分類するためにdbに隣接する数種のミクロサテライトマーカーを用いた。遠位マーカーD4Mit3１と近位マーカー１fnαを含めた。これらの及び他の部位を用いてdb領域の遺伝地図を編集した（図1）。db領域:JAK1とPDE4Bに２つの以前にクローン化したヒト遺伝子のマウス相同が見られた。これらの遺伝子は共にヒト染色体1p31にマッピングし、ヒトdb遺伝子がこの染色体領域にマッピングすることを示した［Modlら,Cytogenetics Cell Genetics,69:232（1995）;Milatovichら,Somatic Cell Mol.Gen.,20:75（1994）］。
顕微解剖クローンD4Rck22は３匹の動物においてはdb及び組換え体の末端であることがわかった［Baharyら,Mammalian Genome,4:511-515（1993）］。酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）及びP1バクテリオファージクローンを用いる染色体歩行の出発点としてD6Rck22を用いた［上記Zhangら,1994;Steinberg,Trends Genet.,8:11（1994）;Shizuya,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:8794（1992）］。このマーカーから染色体歩行によって2.7mBの隣接物を構築した。有効なマウスYACライブラリーにおいては約200kB領域は同定されなかった（〜12ゲノム等価物がスクリーニングされた）ことに留意。隣接物のこのギャップは一連のBACとP1クローンによる染色体歩行後に閉鎖され、続いてこの領域に近い方に500kBを伸長されたYACを単離した。個々のゲノムクローンの末端に由来する遺伝子マーカー（RFLPとSSLPの双方）により組換え動物を分類した。動物内の遠い組換え位置324と動物内の近い組換え位置1028間にdb突然変異が位置した。７つの他の近い組換えは50kBで認められ、これは組換えのホットスポットであることを示した。全非組換え間は、〜300kBのＤＮＡに相当し、２つのBAC、43と242にかかっていた（図１）。
マウス視床下部からのエクソントラッピングとｃＤＮＡ選択を用いてBAC43と242からdbの候補遺伝子を単離した［Churchら,Nature Genetics,6:98（1994）;Morganら,Nucl.Acids.Res.,20:5173（1992）］。マウス脳ｃＤＮＡライブラリーを推定遺伝子断片でスクリーニングした。８個の脳ｃＤＮＡクローンの解析により、ｃＤＮＡ選択の６個の独立した産物とトラッピングしたエキソンを用いて同定した２個のｃＤＮＡがオーバーラップ転写物上に存在することが示された。各ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、マウスレプチン受容体と少なくとも部分的に同じＮ末端配列が予想された（OB-R）。各BACのSTS含量によってOB-R RNAの５′端と３′端からの配列の位置を求め、物理的地図に示す（図１）。これらのデータから、遺伝子が〜100kBでありかつテロメアの方に転写されることが示される。
これらのｃＤＮＡクローンは、カルボキシ末端で分かれる。４つの場合には、予想配列はレプチン受容体のリシン889まで少なくとも部分的に同じであり、トランスメンブランドメインが含まれる。この点を超えるｃＤＮＡは細胞質ドメインが異なるタンパク質が予想され、OB-Ra（配列番号11）、OB-Rb（配列番号12）、OB-Rc（配列番号13）及びOB-Rd（配列番号14）と称する（図2B）。OB-ReはHis796後に異なるアミノ酸配列が予想され（配列番号15）、可溶性受容体をコードすると思われる（図2B）。OB-Ra、OB-Rb及びOB-ReのクローンはＮ末端で分かれた。全ての場合において、分散的配列はBAC隣接物に対してマッピングされる。OB-Raは通常はマウスOB-Rに対応する［Tartagliaら,Cell,83:1263（1995）］。
OB-RbのＣ末端は、ヒトOB受容体と78％が同じであり、マウス相同体であることが示された［上記Tartagliaら］。レプチン受容体は、JAKタンパク質キナーゼと相互作用する受容体のgp-130ファミリーの一種である。gp-130受容体の細胞質ドメインは、通常はJAK結合及びシグナルトランスダクションに必要である［Kishimotoら,Cell,76:253（1994）］。OB-RbｃＤＮＡ配列によりJAKタンパク質キナーゼと結合するのに必要とされるタンパク質モチーフ、潜在的“ボックス2”配列（図2Bの下線部分）が予想される［上記Kishimoto］。“ボックス2”は、多くのこの受容体ファミリーの中で保存され、GCSF受容体とIL6受容体のシグナルトランスダクションに必要とされる［Murakamiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:11349（1991）;Fukunagaら,EMBO J.,10:2855（1991）］。他の転写物はいずれも“ボックス2”配列が予想されない。確認した８個のｃＤＮＡクローンのうちOB-Raを３個、OB-Reを２個単離した。OB-Rb、OB-Rc及びOB-Rdは各１個単離した。他のスプライス変異体も同定されると思われる。
C57BL/Ks db/dbマウスは、野生型同腹仔より視床下部ＲＮＡからのOB-Rb特異的RT-PCR産物が長い断片長をもつ（このＰＣＲは３′核酸を増幅するので、OB-OB-Rbの細胞質ドメイン特性をもつ全てのスプライス変異体に特異的であるが、細胞外ドメインについてのデータはないことに留意すべきである）。しかしながら、Pro890のスプライス受容体に及ぶゲノムＤＮＡを増幅したＰＣＲは野生型と比べてC57BL/Ks db/dbが正常なサイズを有した（図3B）。この断片のＤＮＡシークエンシングにより、スプライス受容体のゲノム配列がdbマウスの野生型であることが確認された。更に、他の３′端に対応するRT-PCR産物のサイズとヌクレオチド配列は共にdbマウスの標準であり、Lys889のスプライス供与体も正常であることが示された（図4）。これらのデータから、C57BL/Ks db/dbマウス由来の長いOB-Rb特異的断片は正常でないスプライシングの結果であることが示された。
変異体マウス由来のOB-RbのRT-PCR産物のシークエンシングにより、スプライス供与体とPro890のスプライス受容体間に106bpの挿入がわかった。挿入ＤＮＡの配列は、Ar890のスプライス受容体の下流のユニークなOB-Raエキソンの最初の106bpと同一であった（図5A）。C57BL/Ks db/dbマウスのOB-Raの３′非翻訳領域からのゲノムＤＮＡとRT-PCR産物のシークエンシングによりスプライス受容体後のg→t突然変異の106bpが同定された（図5Bと図5Cを比較されたい）。この突然変異により共通スプライス供与部位、AGGTAAA（図5C）の出現が生じる［Lodishら,Mol.Cell.Biol.,Scientific American Books:ニューヨーク,pp.1-1344（1986）］。この変異スプライス供与体によりOB-Ra末端エキソンの106bpのOB-Rb RNAのPro890のスプライス受容体へのスプライシングが生じる。得られた変異OB-Rbタンパク質は、スプライス後に終結コドンの５アミノ酸とOB-Raと同じアミノ酸配列をもっている。変異受容体は、潜在的“ボックス2”モチーフを含むほとんどの細胞質領域を消失している。RT-PCRにより他の３′端のサイズがC57BL/K9 db/dbマウスでは正常であったことが証明され、この代替的エキソンも他の転写物に挿入されることが可能である。
OB-Rbレプチン受容体は、他の組織に相対して視床下部では高レベルで発現する（図6）。精巣では低レベルの発現が見られ、脂肪組織では更に低レベルである。視床下部の例を含むいくつかの組織では他の代替的にスプライシングされたｍＲＮＡが発現する（図6）。推定可溶性受容体をコード化するOB-Reは脂肪組織では高度に発現し、脳、心臓及び精巣では低レベルで発現する（図6E）。
C57BL/Ks db/db突然変異は、類似遺伝子型であり、OB-Rbに対応する細胞質ドメインのOB-Raによる機能上の置換が生じる。レプチン受容体のdbと同じ染色体領域への局在化と組合わせたこれらのデータからOB-Rbがdbの対立遺伝子であることが強く確認される。dbの他の２つの有効な対立遺伝子内の突然変異の同定は、更に、タンパク質の構造−機能関係についての情報を与える。C57BL/Ks db/db突然変異がOB-RbのユニークなＣ末端に見られるという事実は、OB-Ra配列がC57BL/Ks db/dbマウスにおいてなぜ変化しなったかということ及びレプチンの脈絡叢への結合がこれらのマウスにおいては正常であったことを説明する。C57BL/Ks db/dbマウスにおけるレプチン結合は、全ての位置において正常であると思われる。むしろ肥満表現型はOB-RbのＣ末端の代わりに発現した場合にOB-RaＣ末端がシグナルトランスダクションを開始することができないことに起因すると思われる。シグナルトランスダクション経路及びこの受容体の細胞質領域へのJAK結合の可能な部位の同定の解明が予想される。
これらの結果から、体重を調節するのに重要な役割を果たすことが既知の脳領域、視床下部においてOB-RbのＣ末端（細胞質）ドメイン特性をもつOB-Rb受容体と相互作用することによって少なくとも部分的にレプチンの重量減少作用が仲介されることが示される。これは、CSF内に直接投与された場合にレプチンの効力の増強及び視床下部ニューロンの電気活性に対するレプチンの影響によって支持される。レプチンは、NPY、GLP-1及び視床下部と脳においてフィーディング挙動に働きかけることが既知の他のペプチドの活性をモジュレートすることができる［上記Stephensら;Tartonら,Nature,379:69（1996）］。また、脂肪を含むレプチン受容体を発現する他の組織に作用することもできる。精巣で発現した受容体、おそらくOB-Ra又は同じＣ末端を共有するスプライス変異体は、インスリン受容体によるインスリンの輸送に提唱されたものと同じメカニズムであるタンパク質をCSFへ輸送するために働くことができる［上記Baharyら,1990;Partridgeら,Neurochem.,44:1771（1985）;Van Houten & Posner,Nature,282:623（1979）;Wood & Park,Am.J.Physiol.,233:E331-E334（1979）］。
OB-Reの推定可溶性受容体は、循環中にレプチンに結合するらしい。レプチン活性を作動させる輸送タンパク質として機能することができる［例えば、Davisら,Science,259:1736（1993）;上記Kishimotoら;Davisら,Science,260:1805（1993）参照］。
実施例２:OBポリペプチドに対する抗体の調製
ポリクローナル抗体を作成するための組換えタンパク質の使用のほかに、演繹した全長マウスOB-R配列（即ち、配列番号２、４、６、８、10）からの３つのペプチド配列セットを同定した。４つの内部ペプチド断片は下記の配列である。
0004285771.tif 000010
標準固相ペプチド合成を用いてこれらのペプチドを作製した。精製した合成ペプチドをKLHに結合し、そのペプチド-KLH複合体を用い、標準法を用いてウサギを免疫する。そのウサギから各ペプチドに特異的なポリクローナル抗血清を回収する。
実施例３:ｃＤＮＡ選択クローン及びエキソントラッピングクローンからＰＣＲプローブの作製
本実施例は、OB-Rに対応するように同定されたｃＤＮＡ選択クローンを記載するものである。これらのクローンからのＰＣＲプライマーをOB-RｃＤＮＡ及びゲノムクローンのプローブとして用いた。OB-R DNAの同定及び異なるOB-Rスプライス変異体の確認に有効である。
５個のｃＤＮＡ選択クローンがプローブとして有効であることがわかった:クローン7（配列番号35）、クローン11（配列番号36）、クローン42（配列番号37）、クローン46（配列番号38）及びクローン58（配列番号39）。エキソントラッピングクローンとハイブリッド形成することにより確認された２個のｃＤＮＡ選択クローンが有効なプローブであることがわかった:クローンS3（配列番号40）及びクローンS14（配列番号41）。
OB-R DNAを同定するのにプローブとして有用な上記の各クローンからＰＣＲプライマーを作製した。表１に各クローンの前向き及び逆向きプライマーを示し、OB-Rのスプライス変異体、及び各プローブが標識する予想コード領域を示す。
0004285771.tif 000011
表に示されるように、クローン７とクローン11からのプローブは現在までに同定されたOB-Rの全てのスプライス形を同定するのに有効であった。プローブ42は、OB-Rbに対応する細胞質ドメインを有するスプライス変異体を同定するのに有効である。即ち、推定上シグナルトランスダクションコンピテントである。プローブ46及びプローブS14は、OB-Rd及びOB-Reに対応するＮ末端アミノ酸配列（これらのタンパク質について同定されたＣ末端スプライス部位までの発表されたマウスOB-RのＮ末端と同一である）を有するスプライス変異体を同定するのに有効である。プローブ58は、非コード領域である、OB-Rbスプライス変異体のｃＤＮＡに見られるユニークな５′領域を含むOB-Rを同定するのに有効である。S3は、変異体ａ、ｂ及びｅ（発表されたマウスOB-R細胞外ドメインに対応する）に見られる細胞外ドメインをコード化する核酸を同定する。
マウス脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするハイブリッド形成条件は次のようにした。長さが約150〜300bp長のプローブを、ホットＰＣＲを用いて32P-dCTPで標識した。フィルターをまずRAPID-HYBバッファー（Amersham LIFESCIENCES）を用いて65℃で少なくとも１時間、前ハイブリッド形成した。標識プローブを最終濃度106cpm/mlのRAPID-HYB溶液に加え、ハイブリッド形成を65℃で少なくとも６時間行った。フィルターを２×SSC/0.1%SDS,RTで1/2時間洗浄し、続いて0.3×SSC/0.1%SDS,RTで1/2時間ストリンジェント洗浄した。
従って、本実施例に記載されるプローブは、OB-Rの同定及びユニークなスプライス変異体の同定に有効である。例えば、OB-Ra又はOB-Rc/d/eに対応する細胞外ドメインを有するスプライス変異体がOB-Rbに対応する細胞質ドメインと結合されると思われる。
実施例４:129DB3J/DB3Jマウス及びNIH FACP/FACPラットにおけるレプチン受容体の突然変異
マウスdb遺伝子及びそのラット相同体faの突然変異により、病的ヒト肥満に似ている症状の一部としての肥満や糖尿病が生じる。現在まで、レプチン受容体（Lepr）の突然変異はC57BL/Ks db/dbマウスや13M fa/faラットでは報告されてきた。本実施例は、NIH faCP/faCPラットのアミノ酸のTyr763にナンセンス突然変異がありかつ129db3J/db3Jマウスが17塩基対欠失や636個のアミノ酸の切断型タンパク質を生じるフレームシフトがあることを示すものである。これらのデータから、db遺伝子とLeprが対立遺伝子であるという事実が確認される。更に、全てのLeptに欠損がある129db3J/db3JマウスとOB-Rbのみ欠けているC57BL/Ks db/dbマウスの表現型は同一である。これらのデータから、他の代替的にスプライスされたレプチン受容体（OB-Ra、OB-Rc、OB-Rd、OB-Re）はOB-Rbに依存して機能するらしいことが示される。
レプチン及びその受容体のクローニングは、体重調節に重要な新規なシグナルトランスダクション経路の同定をもたらした。実施例１のデータから、db遺伝子はob遺伝子産物、レプチンのいくつかの代替的にスプライシングした受容体をコードすることが示される。これらのスプライス受容体のうち唯一のOB-Rbのみがシグナルトランスダクションに含まれるモチーフが含まれる長い細胞質ドメインを含んでいる。OB-Rbは視床下部では高度に発現し、C57BL/Ks db/dbマウスでは正常でなくスプライシングされ、OB-Rbイソ型の切断、及びシグナルトランスダクション能の消失をきたす［上記実施例１; Ghitardiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:632-635（1996）;Vaisseら,Nature Genetics,14:95-97（1996）］。最近、脂肪ラット（dbと対立遺伝子である）でのミスセンス突然変異が脂肪（fa/fa）Zucherラットにおいて同定された［Chuaら,Diabetes 45:1141-1143（1996）］。この突然変異はおそらく細胞表面におけるレプチン結合を変化させる［上記Chuaら,（1996）;Philipsら,Nature Genetics 13:18-19（1996）］。
マウスdb部位及びそのラット相同体、脂肪の突然変異は、独立して何度も生じる［Truettら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7806-7809（1991）;Hummelら,Science 153:1127-1128（1966）;Aubertら,Journal of Nutrition 115:327-333（1985）;Koletsky,Experimental & Molecular Pathology 19:53-60（1973）;Leiterら,Diabetologia 19:58-65（1980）］。これらの他の変異株の分子に基づく突然変異は、レプチンとLeprの構造−機能関係についての情報を与えることができる。本実施例は、変異体129db3J/db3JラットとNIH faCP/faCPラット由来のLeprのコード領域の分子に基づく突然変異を示すものである。
材料及び方法
マウスとラットLepr（OB-R）の配列決定．グアニジンHCl法を変更して脳と視床下部ＲＮＡを単離した［Chirgwinら,Biochemistry 18:5294-5299（1979）］。合計10μgのＲＮＡを鋳型として用いて製造業者の推奨に従ってMo-MuLV逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した［上記Leeら（1996）］。TaqＤＮＡポリメラーゼ及びマウス又はラットLeprｃＤＮＡ配列に基づくプライマーと共に変異体及び野生型動物由来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いてLeprＤＮＡ断片を増幅させた。試料をプライマー43 M137R 5′-CTCACTGTGTAGTGTGAGGAGG-3′（配列番号43）及びA83’R 5′-CCTTGTGCCCAGGAACAATTC-3′（配列番号55）で増幅した。増幅した断片をアガロースゲルから精製し、記載されたようにABI DNAシークエンサーを用いて配列決定した［Zhangら,Nature 372:425-432（1994）］。アガロースゲルを記載されたように行った［上記Zhangら,（1994）］。
ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡのＰＣＲ．Leprの細胞外領域由来のｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの双方をＰＣＲ増幅した。129db3J/db3J及び野生型マウスからＤＮＡを入手した。プライマー配列は次の通りである。ｃＤＮＡについては前向きプライマーは3JF1 5′GAGAATAACCTTCAATTCCAGATTC3′（配列番号56）とし、逆向きプライマーは3JR1 5′CCCAAGCTTAAGGCCCTCTCATAGGAAC 3′（配列番号57）とした。ゲノムＤＮＡについては前向きプライマーは3JF2
5′GACCTCTCTGCAGTCTATGTGGTCCA3′（配列番号58）とし、逆向きプライマーは3JR2 5′GAAAGGTTTTCAGTCACGCTTGAAG3′（配列番号59）とした。
結果及び検討
肥満のNIH肥満症ラット（cp/cp）は、高血糖持続を出現する前の肥満と高インスリン血症の漸次増加を特徴とする非インスリン依存性糖尿病の同系遺伝子モデルである［上記Koletsky（1973）］。cp突然変異は、fa突然変異を保有するラットとcp突然変異を保有するラットとの交雑が肥満の子孫を生じるのでfa対立遺伝子（facp/facp）であることが以前に示されている［Yenら,Heredity 38（1977）］。ｃＤＮＡをやせたラットと肥満のラットの視床下部から作製し、Leprの完全コード領域の配列を比較した。ヌクレオチド2289のＴ→Ａの一つの塩基変化が肥満症ラットに同定され、Tyr763の終止コドンへの変換を生じる（図7）。これを確認するために、突然変異に密接に隣接する特定のプライマー、corp-F及びcorp-Rを用いてやせたラットと肥満のラットからのゲノムＤＮＡを増幅した。ゲノムＤＮＡのシークエンシングによりＴ→Ａの変化が確認された。このナンセンス突然変異は、トランスメンブランドメインの翻訳アミノ末端の終結を生じる。結果として、cp/cpラットのLeprイソ型はトランスメンブランドメインにもシグナルトランスダクションに必要なモチーフのいずれも含んでいない。
db3Jの突然変異は、ジャクソン研究所の129/J株では自発的に起こった。致命的な肥満と、高血糖ではなくむしろ低血糖と共に存在する変異動物により、顕著な高インスリン血症と大きく肥大したランゲルハンス島が考えられた［上記Leiterら（1980）］。db3Jの突然変異を同定するために、db3Jと野生型マウスの視床下部から作製した。アガロースゲル電気泳動により、db3J受容体マウスのアミノ末端からのRT-PCR産物が129+/+マウスからのものより小さいことがわかった。この受容体領域からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物は変異マウスでは短かった（図8）。ＰＣＲ産物のシークエンシングにより変異マウスでは塩基Ｇ1874（Ser625）から始まる17ヌクレオチド欠失が同定され、リーディングフレームシフトを生じた（図9）。db3J/db3Jマウスでは、OB-Rの翻訳は欠失部位後の11番目のアミノ酸で停止する。結果として、トランスメンブランドメインを含まない切断型タンパク質が合成される。イムノブロットにより、受容体タンパク質バンドはこの変異体に存在しないことが確認される。従って、この突然変異は、Leprスプライス変異体全てに働きかける切断型受容体となる。
肥満症（cp/cp）ラットのナンセンス突然変異及び129J（db/db）マウスのフレームシフトdb突然変異により、レプチン受容体の欠損がレプチン−Lepr経路と肥満表現型の異常を生じることが確認される。更に、全てのLepr型に欠損のある129db3J/db3Jマウスの表現型とOB-Rbのみ欠けているC57BL/Ks db/dbマウスは同一である（図10）。これらのデータから、他の代替的にスプライシングされたレプチン受容体型（OB-Ra、OB-Rc、OB-Rd、OB-Re）はOB-Rbに依存して機能するらしいことが示される。
実施例５:バキュロウイルス系を用いるマウス可溶性OB受容体とOBレセプター変異体の発現
バキュロウイルス伝達構築物の作成．pMelBac（Invitrogen;Cat.no.V1950-20）バキュロウイルスプロモーター系伝達クローニングベクターに基づいて可溶性OB受容体（OB-Re）とOB-Re変異体の発現用構築物を全て作成した。そのベクターは、組換えタンパク質を分泌経路を介して細胞外媒質に直接発現するように設計される。該ベクターは、SF9細胞、昆虫細胞系によって高度に発現し効率よく分泌されるミツバチメリチン（HBM）のシグナル配列を含む。組換えタンパク質の内在性シグナル配列がpMel BacのHBMシグナル配列に置き替わる。クローニング初期段階でＰＣＲを用いて連結反応の挿入断片を作成した。OB-ReｃＤＮＡはＰＣＲ鋳型として働いた（配列番号10）。ＰＣＲの開始オリゴヌクレオチドはOB-ReｃＤＮＡの必要領域を増幅するように設計され、所望の点突然変異及び必要な場合には終止コドンを導入しかつpMelBacベクターへのクローニングに必要とされる制限酵素認識配列を作成した（図11、表２）。
0004285771.tif 000012
pMelBacＡ、Ｂ又はＣクローニングベクター間の選択は、オープンリーディングフレームに基づき、組換えタンパク質の分泌のためのメリチンシグナル配列による組換え遺伝子インフレームを挿入することができる。ＰＣＲ産物とクローニングベクターを対応する制限酵素（New England Biolabs）で消化した後に連結反応し、T4リガーゼ（Gibco BRL）を用いて16℃で一晩保持した。連結反応混合液をDH5a細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含むLBプレート上で一晩増殖した。挿入断片を存在させるためのインビトロジェン製の組換えバキュロウイルスＰＣＲプライマー（Cat.N610-04）を用いてクローンをＰＣＲで分析した。ＰＣＲで同定した陽性クローンをインビトロジェン製のポリヘドリンフォワード（Cat.N598-02）及びバキュロウイルス（+15）リバース（Cat.N615-02）シークエンシングプライマーで配列決定して組換え遺伝子がメリチン分泌シグナルに正しく配向及び融合されたことを確認した。
組換えウイルスの作製．SF9昆虫細胞を組換えウイルスの作製と増幅に用いた。グレース昆虫増殖培地をギブコBRL（Cat.11605）から入手し、10％ウシ胎児血清（Gibco BRL,Cat.26140）、１μg/mlのゲンタマイシン（Gibco BRL,Cat.15710）及び625ng/mlフンギゾーン（Gibco BRL,Cat.15295）で補足した。F-68プルロン酸（Sigma,Cat.P-1300）を0.2%（w/v）の懸濁細胞培養液に加えた。組換え構築物を線状Bac-N-BlueＤＮＡと共にインビトロジェン（Cat.BK855-01）製のBac-N-Blueトランスフェクションキットを用いて製造業者の説明書に従ってSF9細胞へ同時トランスフェクトした。組換え及び野生型ウイルス粒子の混合物を含む増殖培地をトランスフェクションの72時間と120時間後に集めた。SF9細胞にトランスフェクション株の希釈液を感染させかつ感染の病巣点（プラーク）をアガロース重層（プラークアッセイ）から単離することにより推定組換えウイルス単離物を精製した。pMelBac伝達ベクター中のlacZ遺伝子の存在によるX-gal上に青色プラークを形成する能力によって組換えウイルスを同定した。推定組換えプラークを増幅して約２×106 SF9細胞に感染させかつ感染の５〜７日後に増殖培地を集めることにより少量P1ウイルス株を少量力価測定した。上記の組換えバキュロウイルスＰＣＲプライマーを用いるウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析により推定組換えウイルス中の組換え遺伝子挿入断片の存在と組換えプラークの純度を確認した。
OB-Reアミノ酸配列由来のペプチドに対して生じたウサギポリクローナル抗体（上記実施例２）を用いる増殖培地のウェスタンブロット分析により組換えタンパク質の発現を確認した。更に、OB-ReＣ末端部分（アミノ酸420〜641）を用いてウサギを免疫した。約２×108SF9細胞の懸濁培養液に感染させかつ感染の５〜７日後に増殖培地を集めることにより、ＰＣＲ及びウェスタン分析陽性P1ウイルス株を高力価少量P2株へ更に増殖させた。ウイルス株の連続希釈液からプラークアッセイを行いかつプラーク数を計数することによりP2株のウイルス力価を求めた。SF9細胞の懸濁培養液に既知のウイルス力価のP2株を感染多重度0.5（1個のSF9細胞あたり0.5感染ウイルス粒子）で感染させることによりウイルスを高力価多量マスター株へ更に増幅させた。得られたマスター株を力価測定し、組換えタンパク質発現実験に用いた。
組換えタンパク質の発現．種々の細胞系、異なるMOIを試験しかつタンパク質収集の時点を最適化することにより、組換えタンパク質の発現レベルを最適化した。典型的には、SF9細胞での発現レベルに比べてハイファイブ細胞（Cat.B855-02,Invitrogen）では全OB-R由来組換えタンパク質がかなり高レベルで発現した。３μg/mlのゲンタマイシン及び1.25μg/mlフンギゾーンで補足したEX-CELL405増殖培地（JRH Biosciences,Cat.14405-79P）をハイファイブ細胞の無血清増殖に用いて分泌組換えタンパク質の精製を促進した。最適MOIは５〜10の範囲であった。最適タンパク質収集時間は、通常、感染約72時間後であった。
組換えタンパク質の多量発現については、ハイファイブ細胞の懸濁培養液をシェーカー上で約100〜120rpm,27℃で約２×106細胞/ml（対数増殖期）の密度まで増殖した。細胞にマスター組換えウイルス株を最適MOIで感染させ、増殖培地を最適時点で集めた。細胞片を5,000gで10分間遠心分離することにより除去し、硫酸アンモニウムを加えて分泌したタンパク質を沈降させた。組換えタンパク質の精製にFPLC系プロトコールを用いる。
生物活性の分析（レプチン結合）．セファロースビーズに結合したレプチンを結合する能力によって組換えOB-ReとOB-Re変異体の生物活性を試験した。分泌した組換えタンパク質を含む増殖培地をレプチン−セファローズビーズと一晩インキュベートした。ビーズを洗浄し、ＳＤＳと沸騰させ、結合したタンパク質をウェスタンブロットで分析した。分析した全ての組換えタンパク質がレプチンに結合することができた。OB-ReがＳＤＳ、尿素又はグアニジニウム塩酸塩のようなカオトロピック剤を用いた室温のレプチン−セファロースカラムから溶離されないので組換え全長OB-Reのレプチンへの結合は非常に強い。組換えタンパク質−レプチン相互作用の特異性を競合阻害分析により評価した（図12）。組換えタンパク質を含む媒質を可溶性レプチンと前インキュベートした後、レプチン−セファロースとインキュベートした。可溶性レプチンは、組換えOB-Reタンパク質のレプチン−セファロースビーズへの結合を濃度依存方法で阻害することがわかった（表３）。
0004285771.tif 000013
本発明は、本明細書に記載する個々の実施態様によって範囲が制限されない。実際に、本明細書に記載されるもののほかに本発明の種々の変更が上記説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる変更は下記の請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の長さ、又は分子量が示される場合、それらは近似値である。
様々な論文が本明細書に引用されており、それらの論文の記載は本願明細書に含まれるものとする。特に、［Tartagliaら,Cell,83:1263-1271（1995）］の記載は本願明細書に含まれるものとする。
配列表
（2）配列番号１に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：2529塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：A15（OB-Ra）
（xi）配列の記載：配列番号１
0004285771.tif 000014
0004285771.tif 000015
（2）配列番号２に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：842アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Ra
（xi）配列の記載：配列番号２
0004285771.tif 000016
0004285771.tif 000017
0004285771.tif 000018
（2）配列番号３に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：2848塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：A40（OB-Rb）
（xi）配列の記載：配列番号３
0004285771.tif 000019
0004285771.tif 000020
（2）配列番号４に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：581アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rb
（xi）配列の記載：配列番号４
0004285771.tif 000021
0004285771.tif 000022
（2）配列番号５に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：961塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：A6（OB-Rc）
（xi）配列の記載：配列番号５
0004285771.tif 000023
（2）配列番号６に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：319アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rc
（xi）配列の記載：配列番号６
0004285771.tif 000024
（2）配列番号７に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：2703塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：A8（OB-Rd）
（xi）配列の記載：配列番号７
0004285771.tif 000025
0004285771.tif 000026
（2）配列番号８に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：900アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rd
（xi）配列の記載：配列番号８
0004285771.tif 000027
0004285771.tif 000028
0004285771.tif 000029
0004285771.tif 000030
（2）配列番号９に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：2461塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：A20（OB-Re）
（xi）配列の記載：配列番号９
0004285771.tif 000031
0004285771.tif 000032
（2）配列番号10に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：805アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Re
（xi）配列の記載：配列番号10
0004285771.tif 000033
0004285771.tif 000034
0004285771.tif 000035
（2）配列番号11に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：8アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：Ｃ末端
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Ra
（xi）配列の記載：配列番号11
0004285771.tif 000036
（2）配列番号12に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：276アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：Ｃ末端
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rb
（xi）配列の記載：配列番号12
0004285771.tif 000037
（2）配列番号13に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：7アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：Ｃ末端
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rc
（xi）配列の記載：配列番号13
0004285771.tif 000038
（2）配列番号14に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：14アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：関連なし
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：Ｃ末端
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rd
（xi）配列の記載：配列番号14
0004285771.tif 000039
（2）配列番号15に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：13アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：Ｃ末端
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Re
（xi）配列の記載：配列番号15
0004285771.tif 000040
（2）配列番号16に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：8アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：中間部
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Ra/db/db
（xi）配列の記載：配列番号16
0004285771.tif 000041
（2）配列番号17に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：6アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：中間部
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：OB-Rb/wt
（xi）配列の記載：配列番号17
0004285771.tif 000042
（2）配列番号18に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：12塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号18
0004285771.tif 000043
（2）配列番号19に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：12塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号19
0004285771.tif 000044
（2）配列番号20に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号20
0004285771.tif 000045
（2）配列番号21に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号21
0004285771.tif 000046
（2）配列番号22に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号22
0004285771.tif 000047
（2）配列番号23に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号23
0004285771.tif 000048
（2）配列番号24に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号24
0004285771.tif 000049
（2）配列番号25に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号25
0004285771.tif 000050
（2）配列番号26に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号26
0004285771.tif 000051
（2）配列番号27に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号27
0004285771.tif 000052
（2）配列番号28に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号28
0004285771.tif 000053
（2）配列番号29に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号29
0004285771.tif 000054
（2）配列番号30に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号30
0004285771.tif 000055
（2）配列番号31に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号31
0004285771.tif 000056
（2）配列番号32に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：14アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号32
0004285771.tif 000057
（2）配列番号33に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号33
0004285771.tif 000058
（2）配列番号34に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：関連なし
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（v）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号34
0004285771.tif 000059
（2）配列番号35に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：166塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：7
（xi）配列の記載：配列番号35
0004285771.tif 000060
（2）配列番号36に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：320塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：11
（xi）配列の記載：配列番号36
0004285771.tif 000061
（2）配列番号37に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：158塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：42
（xi）配列の記載：配列番号37
0004285771.tif 000062
（2）配列番号38に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：192塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：46
（xi）配列の記載：配列番号38
0004285771.tif 000063
（2）配列番号39に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：168塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：58
（xi）配列の記載：配列番号39
0004285771.tif 000064
（2）配列番号40に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：259塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：S3
（xi）配列の記載：配列番号40
0004285771.tif 000065
（2）配列番号41に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：250塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（vii）直接の起源：
（B）クローン名：S14
（xi）配列の記載：配列番号41
0004285771.tif 000066
（2）配列番号42に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号42
0004285771.tif 000067
（2）配列番号43に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号43
0004285771.tif 000068
（2）配列番号44に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号44
0004285771.tif 000069
（2）配列番号45に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：19塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号45
0004285771.tif 000070
（2）配列番号46に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号46
0004285771.tif 000071
（2）配列番号47に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号47
0004285771.tif 000072
（2）配列番号48に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号48
0004285771.tif 000073
（2）配列番号49に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号49
0004285771.tif 000074
（2）配列番号50に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号50
0004285771.tif 000075
（2）配列番号51に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号51
0004285771.tif 000076
（2）配列番号52に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号52
0004285771.tif 000077
（2）配列番号53に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号53
0004285771.tif 000078
（2）配列番号54に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号54
0004285771.tif 000079
（2）配列番号55に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号55
0004285771.tif 000080
（2）配列番号56に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号56
0004285771.tif 000081
（2）配列番号57に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号57
0004285771.tif 000082
（2）配列番号58に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号58
0004285771.tif 000083
（2）配列番号59に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号59
0004285771.tif 000084
（2）配列番号60に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号60
0004285771.tif 000085
（2）配列番号61に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号61
0004285771.tif 000086
（2）配列番号62に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号62
0004285771.tif 000087
（2）配列番号63に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号63
0004285771.tif 000088
（2）配列番号64に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号64
0004285771.tif 000089
（2）配列番号65に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号65
0004285771.tif 000090
（2）配列番号66に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号66
0004285771.tif 000091
（2）配列番号67に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号67
0004285771.tif 000092
（2）配列番号68に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号68
0004285771.tif 000093
（2）配列番号69に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：45塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号69
0004285771.tif 000094
（2）配列番号70に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：45塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号70
0004285771.tif 000095
（2）配列番号71に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号71
0004285771.tif 000096
（2）配列番号72に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：34塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号72
0004285771.tif 000097
（2）配列番号73に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：35塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号73
0004285771.tif 000098
（2）配列番号74に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：40塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号74
0004285771.tif 000099
（2）配列番号75に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：40塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号75
0004285771.tif 000100
（2）配列番号76に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：33塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／desc=”PCRプライマー”
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号76
0004285771.tif 000101
（2）配列番号77に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：6アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号77
0004285771.tif 000102
（2）配列番号78に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：6アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号78
0004285771.tif 000103
（2）配列番号79に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：6アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：No
（xi）配列の記載：配列番号79
0004285771.tif 000104
（2）配列番号80に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：33塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号80
0004285771.tif 000105
（2）配列番号81に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：33塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号81
0004285771.tif 000106
（2）配列番号82に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号82
0004285771.tif 000107
（2）配列番号83に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：32塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：１本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル配列：No
（iv）アンチセンス：No
（xi）配列の記載：配列番号83
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0004285771.tif 000109
0004285771.tif 000110
0004285771.tif 000111
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
0004285771.tif 000115
【図４Ａ】
0004285771.tif 000116
【図４Ｂ】
0004285771.tif 000117
【図４Ｃ】
0004285771.tif 000118
【図４Ｄ】
0004285771.tif 000119
【図５Ａ】
0004285771.tif 000120
【図５Ｂ】
0004285771.tif 000121
【図５Ｃ】
0004285771.tif 000122
【図６】
0004285771.tif 000123
【図７】
0004285771.tif 000124
【図８】
0004285771.tif 000125
【図９】
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【図１０】
0004285771.tif 000127
【図１１】
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【図１２】
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