(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の検出方法であって、
（ａ）（i）標的ポリヌクレオチド配列の第１領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、及び化学官能基を含んで成る第１オリゴヌクレオチドプローブ；並びに（ii）前記標的ポリヌクレオチド配列の第１領域に隣接する前記標的ポリヌクレオチド配列の第２領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基と化学結合を形成することができる化学官能基、及び前記標的ポリヌクレオチド配列又は第１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができない保護配列を含んで成る第２オリゴヌクレオチドプローブを供給し；ここで、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブが前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして、当該前記第１オリゴヌクレオチドプローブ及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合が可能になるように、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基は十分に接近して配置し、そして前記第２オリゴヌクレオチドの保護配列が、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされない場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合を妨げ；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドと、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブとを、前記標的ポリヌクレオチドの第１領域への前記第１オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列の、及び前記標的ポリヌクレオチドの第２領域への前記第２オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列のハイブリダイゼーションを可能にするのに適切な条件下で、接触せしめ、それにより、ハイブリダイズされた複合体を形成し；
（ｃ）前記ハイブリダイズされた複合体を、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基間の化学的相互結合のために適切な条件下でインキュべーションし；そして
（ｄ）段階（ｃ）の化学的相互結合に起因する生成物を検出し、それにより標的ポリヌクレオチド配列を検出することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記標的オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチド配列が変異配列を含んで成り、そして前記第１オリゴヌクレオチドプローブ及び/又は第２オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列が前記変異配列に対して相補的である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第１又は第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、求核基又は求電子基である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドが、RNA、DNA、cDNA又はゲノムDNAである請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記化学的相互結合が、求電子性脱離基のための求核基、ミカエル付加反応、ディールス−アルダー反応、マレイミド成分の二重結合へのチオール基の付加、光化学反応又は光シクロ二量体化反応によりもたらされる請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記化学連結の生成物の検出が、放射性検出、比色検出、蛍光測定検出、発光測定検出、電子顕微鏡、磁気検出、捕獲アッセイ、サイズ分離、DNAコンホメーション、又は近接エネルギー転移によりもたらされる請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記第２オリゴヌクレオチドプローブの保護配列が、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合に続いて放され得る標識成分を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、前記ターゲッティング配列と前記保護配列との間に位置する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列またはそれに対して相補的な配列の増幅方法であって、
（ａ）（i）標的ポリヌクレオチド配列の第１領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、及び化学官能基を含んで成る第１オリゴヌクレオチドプローブ；並びに（ii）前記標的ポリヌクレオチド配列の第１領域に隣接する前記標的ポリヌクレオチド配列の第２領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基と化学結合を形成することができる化学官能基、及び前記標的ポリヌクレオチド配列又は第１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができない保護配列を含んで成る第２オリゴヌクレオチドプローブを供給し；ここで、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブが前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして、当該前記第１オリゴヌクレオチドプローブ及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合が可能になるように、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基は十分に接近して配置し、そして前記第２オリゴヌクレオチドの保護配列が、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされない場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合を妨げ；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドと、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブとを、前記標的ポリヌクレオチドの第１領域への前記第１オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列の、及び前記標的ポリヌクレオチドの第２領域への前記第２オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列のハイブリダイゼーションを可能にするのに適切な条件下で、接触せしめ、それにより、ハイブリダイズされた複合体を形成し；
（ｃ）前記ハイブリダイズされた複合体を、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基間の化学的相互結合のために適切な条件下でインキュベーションし；
（ｄ）前記ハイブリダイズされた複合体を変性するための条件を提供し；そして
（ｅ）所望するレベルの増幅が生じるまで、段階（ａ）−（ｄ）を、予定された回数、反復することを含んで成る方法。
【請求項１１】
前記標的オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖である請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が変異配列を含んで成り、そして前期第１オリゴヌクレオチドプローブ及び/又は第２オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列が前記変異配列に対して相補的である請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記第１又は第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、求核基又は求電子基である請求項10記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ポリヌクレオチドが、RNA、DNA、cDNA又はゲノムDNAである請求項10記載の方法。
【請求項１５】
前記化学的相互結合が、求電子性脱離基による求核基の置換、ミカエル付加反応、ディールス−アルダー反応、マレイミド成分の二重結合へのチオール基の付加、光化学反応又は光シクロ二量体化反応によりもたらされる請求項10記載の方法。
【請求項１６】
前記第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、前記ターゲッティング配列と前記保護配列との間に位置する請求項10記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅が指数的増幅であり、そして前記方法がさらに、
（ａ）（iii）標的に対して相補的なポリヌクレオチド配列の第１領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、及び化学官能基を含んで成る第３オリゴヌクレオチドプローブ；並びに（iv）前記標的に対して相補的なポリヌクレオチド配列の第１領域に隣接する前記標的に対して相補的なポリヌクレオチド配列の第２領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、前記第３オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基と化学結合を形成することができる化学官能基、及び前記標的に対して相補的なポリヌクレオチド配列又は第３オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができない保護配列を含んで成る第４オリゴヌクレオチドプローブを供給し；ここで、前記第３及び第４オリゴヌクレオチドプローブが前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして、当該前記第３オリゴヌクレオチドプローブ及び第４オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合が可能になるように、前記第３オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基及び第４オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基は十分に接近して配置し、そして前記第４オリゴヌクレオチドの保護配列が、標的に対して相補的なポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされない場合、前記第３及び第４オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合を妨げ；
（ｂ）前記標的に対して相補的なポリヌクレオチドと、前記第３及び第４オリゴヌクレオチドプローブとを、前記標的に対して相補的なポリヌクレオチドの第１領域への前記第３オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列の、及び前記標的に対して相補的なポリヌクレオチドの第２領域への前記第４オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列のハイブリダイゼーションを可能にするのに適切な条件下で、接触せしめ、それにより、ハイブリダイズされた複合体を形成し；そして
（ｃ）前記ハイブリダイズされた複合体を、前記第３及び第４オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基間の化学的相互結合のために適切な条件下でインキュベーションする段階を含んで成る請求項10記載の方法。
【請求項１８】
前記第３及び第４オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基は、前記プローブがそれらのそれぞれの標的に対して相補的なポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズされる場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基から４Å又はそれ未満の距離に位置する請求項17記載の方法。
【請求項１９】
標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の検出のためのキットであって、
（ａ）標的ポリヌクレオチド配列の第１領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、及び化学官能基を含んで成る第１オリゴヌクレオチドプローブ；並びに
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチド配列の第１領域に隣接する前記標的ポリヌクレオチド配列の第２領域にハイブリダイズすることができるターゲッティング配列、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基と化学結合を形成することができる化学官能基、及び前記標的ポリヌクレオチド配列又は第１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることができない保護配列を含んで成る第２オリゴヌクレオチドプローブ；
ここで、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブが前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして、当該前記第１オリゴヌクレオチドプローブ及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合が可能になるように、前記第１オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基は十分に接近して配置し、そして前記第２オリゴヌクレオチドの保護配列が、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされない場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合を妨げ、前記第１及び/又は第２オリゴヌクレオチドが検出可能成分を有する；
を含んで成るキット。
【請求項２０】
前記第１又は第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、求核基又は求電子基である請求項19記載のキット。
【請求項２１】
前記第１及び/又は第２オリゴヌクレオチドプローブの検出できる成分が、放射性成分、発色団、発蛍光団、発光団、磁気成分、捕獲成分又は近接エネルギー転移成分である請求項19記載のキット。
【請求項２２】
前記第２オリゴヌクレオチドプローブの保護配列が、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプローブの化学的相互結合に続いて放され得る標識成分を含んで成る請求項19記載のキット。
【請求項２３】
前記第２オリゴヌクレオチドプローブの化学官能基が、前記ターゲッティング配列と前記保護配列との間に位置する請求項19記載のキット。
【請求項２４】
前記第１オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列及び前記第２オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列のそれぞれが、前記標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも６個のヌクレオチドを含む請求項19記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野及び背景
本発明は、テストサンプル中に存在する標的核酸配列を増幅及び検出するための非酵素的方法及びキットに関する。
更に詳しくは、本発明は、遺伝材料のサンプル中の特定の配列の存在を検出するための方法及びキットに関する。本発明の方法及びキットは、検査される配列における小さな変化に高い感度を有し、これにより例えば点変異、即ちDNA配列における一塩基対変換のような微小な配列変換の検出のために役立つ。
本方法及びキットは遺伝材料のサンプル中の外来遺伝子配列の存在を同定するため、例えば植物及び動物DNA中の特定のバクテリア又はウイルスヌクレオチド配列の存在を検出するためにも役立つ。本方法は、核酸の化学的増幅（Chemical Amplification of Nucleic Acids）と題され、ChAVAとして略記される。
ここ20年間、極めて多数のヒト遺伝子が単離され、十分に配列決定されており、例えば嚢胞性線維症、血友病、レッシュ−ナイハン症候群、βサラセミア、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ・サック（Tay−Sachs）、ゴーチャー（Gaucher）、デュヘン／ベッカー（Duchen／Becker）筋ジストロフィー及び多くの他のもののような多くの病気の遺伝的基盤が解明されている。多数の遺伝病は、異なる個体の遺伝子における周知の数のヌクレオチドの置換（例えば点変異）、又は欠失もしくは挿入のようなかわりの配列変換により引きおこされることが示されている。例えばCFTRにおける177の異なる点変異並びに66の異なる挿入及び欠失が、遺伝子に関連する病気である嚢胞性線維症のためのかわりの遺伝子源として同定されている（Darvasi, A. 及びKerem, B.（1994）Short tandem repeats and mutation in the region of human gene. in press）。このような点変異又は小さな配列変換の結果として、このような遺伝子によってコードされたタンパク質が産生されず、時期尚早に端が切り取られ、又はその機能に影響を与える修飾形態で産生される。多くの証拠は、変化しやすい浸透度の少くとも一部分、例えば始まる年齢及び激しさ、遺伝病の特徴的ないくつかのものはそれらの関連する遺伝子における配列変換の変化性のためである。更に、多くの癌は、特定の遺伝子における体細胞の変異と関連することが示されている。
個体から遺伝材料を得て、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）技術を用いて特定の遺伝子領域を増幅し、そして次にDNA配列決定により又は他の変異検出アプローチにより同定することが、個体がこの領域のいずれかの特定の部位に変異を有するか否かにかかわらず現在可能である。更に、このような個体の遺伝子型を決定すること、即ち個体が健康であるか否か、特定の病気を有するか否か又は個体が“キャリアー”であるか否か、即ちテストされる部位の変異について異型接合であるか否かを決定することも可能である。胎児細胞でこのような分析を行う場合、胎児が特定の遺伝病を有する可能性を決定することが可能になる。これは、特別の食事又は薬剤を用いて、又は遺伝療法を用いて生まれてからすぐに病気の治療を行うことを許容し得、又は治療が不可能ならば、妊娠を止めることを選択することも可能である。
このような技術は、いくつかの他の適用、例えば典型的にほんの少しのサンプルしか利用できない法医学において、父系の問題において、及び特定の病原体の核酸、例えばHIVのようなウイルス源の核酸の存在についてのサンプル分析においても重要になっている。
上述のように、多くの遺伝病が多種の変換遺伝子源を有する。これらの病気のいくつかは特定の集団においてからなり一般的である。例えば；β−サラセミアの原因であるβ−グロビン欠損対立遺伝子は特定の中東の集団に広範囲に広がっており；種々の欠損CFTR対立遺伝子は20人の個体に１人（５％の割合で異種接合形態であり、その病気は世界の白色人種系の約１／1600の個体に影響を与えている（Harrison’s Principles of Internal Medicine 9th Ed. Isselbacher, Adams, Braunwald, Petersdorf and Wilson Eds, McGraw-Hill Book company, N. Y., pp. 1233）。高頻度の嚢胞性線維症及び他の遺伝病のため、DNA配列変換の有効かつ正確な検出を可能にし、それを行うのに技術者を必要としない低費用の方法の必要性が広く認められ、それを有することは極めて有利であろう。
点変異を検出するための最も基本的な方法はDNA配列決定であり、最も広く用いられている配列決定法は、ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション法（Sanger F.（1981）, Science 214, 1205-1210）に基づく。DNA及びジデオキシヌクレオチド接合蛍光染料、並びに適切な検出システムの開発は、基本的なジデオキシ鎖ターミネーション技術の改良及び自動化を可能にした。
周知のDNA配列における変換の存在を測定するのに用いられている他の方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーション；逆−ASO；制限部位形成PCR（PG−PCR）；変性／温度勾配ゲル電気泳動（Ｄ／TGGE）；一本鎖コンホメーション多形性（RFLP）；PCR制限フラグメント長多形性（PCR−PELP）；ヌクレアーゼ保護アッセイ；化学開裂及び他のあまり頻繁に用いられていない方法を含む。
これらの方法は、相当に化学的に重要であるが、多くの個体における種々のDNA変換の広範囲のスクリーニングに適用できる方法にする１以上の以下の点を欠くので、それらの機械的操作を制限する欠点がある。これらの点は、（１）（ａ）その多くがいくつかの複雑なステップ、特にゲル電気泳動及び／又は複雑なブロッティング及びハイブリダイゼーション手順を含む手順の正確な実行、並びに（ｂ）結果を解釈することのために高度の技術者が必要とされ；（２）いずれかの新しいDNA変換の検査前に厳密な較正ステップが必要とされ；（３）理論的に上述の手順のいくつかは全ての変換の検出に適しておらず；（４）いくつかのものはその手順自体及び／又はそれらの結果の解釈に関して時間及び労力を消費し；（５）その手順のいくつか、特にゲル電気泳動に関するものは自動化が難かしく；とりわけ（６）これらの方法は全て、高価であることに加えて、不要なヌクレアーゼ汚染物の活性及び濃縮において一組ごとのバリエーションを示す、DNA及びRNAポリメラーゼ制限エンドヌクレアーゼ、並びに一本鎖特異的エンド−及びエキソヌクレアーゼ等に基づくことを含む。このようなバリエーションはこれらの方法の信頼性を減少させる。
上述のように、ここ20年にわたる分子生物学の分野の進展は、患者及び他の被検体から得られたテストサンプルにおける特定の核酸配列の検出を可能にした。このようなテストサンプルは血清、尿、便、唾液、羊膜液、及び他の体液を含む。特定の核酸配列の検出は、遺伝病、並びにヒト及び他の種における病原性バクテリア及びウイルス病原因体の存在を同定するのに用いることができる。
関心の多くの場合において、要求される核酸配列に検査されるサンプル中に極めて低い濃度で存在する。このような場合、アッセイ感度を上げることができないなら、要求される分子の存在は検出することができない。
標的核酸配列を増幅し、検出するための標準的な方法は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）である（Saikiら、Science 239,487（1988）及びMullisら（米国特許4,683,195号）を参照のこと）。PCRでの問題は、擬似的バックグラウンドシグナルを導く非特異的重合である。
PCR法は、特定の核酸配列の増幅を目的とする。それは、増幅されるべき配列のいずれかの鎖各々に対して相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて要求される特定の核酸配列を繰り返しの複製を可能にする。これらのプライマーが組み込まれた伸長した生成物は、次に後の複製ステップのテンプレートとなる。その方法は、増幅の前に配列が精製されず、特定のサンプル中に一つの複製しか存在しない場合でさえ幾何学的比率で要求される核酸配列の濃度を選択的に増加させる。PCR法は、一本鎖又は二本鎖DNA又は相補的DNA（cDNA）を増幅するのに用いることができる。
PCR技術は、ポリヌクレオチド分子の迅速かつ大規模な増幅を行う点で役立つ。しかしながら、PCR法を標的核酸配列の増幅に適用する場合に２つの実際の問題がある；（１）増幅プライマーとの、検査される核酸中の外来配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションは、不適切な配列の同時増幅を引きおこし得る。更に、増幅のレベルが増加するにつれて、それらの同時増幅生成物の最も増加する；（２）各々の開始テンプレートについて数百万の複製を直ちに形成するためのPCRの能力のため、先の反応の最終生成物の他のサンプルへの偶発的な導入が誤った陽性の結果を導く。
PCRの出現は、更なる増幅方法の発達を導いた。１つのこのようなかわりの方法は、標的核酸配列を増幅するためのリガーゼ鎖反応（LCR）として知られるBackmanら（EP320308）によって開示される。LCRにおいて、４つのオリゴヌクレオチドプローブを過剰に用いた。第１及び第３のプローブは、相補的オリゴヌクレオチドプローブ対を形成する。第２及び第４のプローブは他の相補的オリゴヌクレオチド対を形成する。第１及び第２のプローブは、標的核酸配列の第１鎖において隣接する配列とハイブリダイズする。ハイブリダイズする場合、第１及び第２プローブは、リガーゼが２つのプローブを融合産物に連結され得るように、５’ホスフェート−３’ヒドロキシ関係において互いに隣接する。また、第３及び第４のプローブは、標的核酸配列の第２の鎖において隣接している配列とハイブリダイズする。ハイブリダイズした時、第３及び第４のプローブは、リガーゼが２つのプローブを第２の融合した産物に連結し得るように５’ホスフェート−３’ヒドロキシル関係において互いに隣接する。
第１及び第２の融合産物を、サンプル中の標的集団を二倍化することにおいて標的鎖から分離する。次にその融合産物を相補的プローブとハイブリダイズさせることにより、更なるLCR反応のためのテンプレートとして供した。ハイブリダイゼーション連結及び変性のサイクルを繰り返すことにより、融合したプローブの集団は幾何学的割合で増加する。その融合したプローブを標準的方法により検出した。
それらの増幅は、材料の最初の量が極めて少い場合でさえ関心の配列の迅速な分析又はキャラクタリゼーションを許容する。しかしながら、標的シグナルに伴う標的でない配列の増幅は増幅過程の信頼性を損なうので、増幅過程が極めて特異的であることが重要である。
LCRに関連する１つの問題は、定義により、その手順は４つのオリゴヌクレオチドプローブ及びリガーゼを要求し、オリゴヌクレオチドプローブの非特異的“平滑断端連結”を生じ得る。このような起こるべくしておこる非特異的“平滑断端連結”は、融合した産物の標的と独立した幾何学的増幅を引きおこす。これは、誤った陽性結果の高バックグラウンドシグナルを導き得る。これらの標的と独立した産物は、要求される増幅された標的配列から区別がつかない。
PCR及びLCRの両方は、増幅を行うために、各々ポリメラーゼ又はリガーゼの要求による更なる欠点を有する。高価であることに加えて、このような酵素は、不要なヌクレアーゼ汚染物の活性及び濃度において多くのバリエーションを示す。このようなバリエーションは、これらの方法の信頼性を更に減ずる。
増幅過程における酵素の使用を克服するために、Segev（国際PCT出願VS94/06690）は、いずれかの特定の核酸配列の非酵素的増幅を目的とした新しい化学的方法を開示した。化学的増幅反応（CAR）と命名されたこの方法においては、以下の２つのオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対が用いられる：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対は、オリゴヌクレオチドプローブ１及びオリゴヌクレオチドプローブ１’からなり、第２のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対は、オリゴヌクレオチドプローブ２及びオリゴヌクレオチドプローブ２’からなる。
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブ１は、長い配列Ｈ及び短い配列Ｉを含み、オリゴヌクレオチドプローブ１’は長い配列Ｈ’及び短い配列Ｉ’を含み；オリゴヌクレオチドプローブ２は、長い配列Ｊ及び短い配列Ｋを含み；オリゴヌクレオチド２’は長い配列Ｊ’及び短い配列Ｋ’を含む；
（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブ１及び２は第１のオリゴヌクレオチド対を形成し、他方オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’は第２のオリゴヌクレオチド対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ１の長い配列Ｈ及びオリゴヌクレオチドプローブ２の長い配列Ｊは標的配列の隣接部分と相補的であり；そしてオリゴヌクレオチドプローブ１’の長い配列Ｈ’及びオリゴヌクレオチド２’の長い配列Ｊ’に標的配列の隣接部分と相補的である；
（ｄ）オリゴヌクレオチドプローブ１の短い配列Ｉはオリゴヌクレオチドプローブ２の短い配列Ｋと相補的であり、オリゴヌクレオチドプローブ１’の短い配列Ｉ’はオリゴヌクレオチドプローブ２’の短い配列Ｋ’と相補的であり；短い配列は標的配列とハイブリダイズしない；
（ｅ）短い配列を構成する核酸の糖及び塩基成分は、化学的官能基Ｘ及びＹ（ここでＸ及びＹ基は化学的結合を形成することができる）で修飾される。CARのために用いられるオリゴヌクレオチドプローブは、その垂直線が長い配列と短い配列との間の境界を画定する図１に示す。
（ｆ）これらのオリゴヌクレオチドプローブを標的配列及び標的相補配列から構成される二本鎖配列と接触させて作る場合、図２に示すハイブリダイゼーションが起こる。
CAR法において、長い配列は標的に向けられたハイブリダイゼーションに役立ち、短い配列は次二重の機能に役立つ：（ａ）それらは、長い配列が標的配列とハイブリダイズしない場合に互いに相互作用することから化学的活性基Ｘ及びＹを保護し、それゆえ制限する；（ｂ）それらは、化学活性基Ｘ及びＹを近くにし、そして長い配列が標的配列とハイブリダイズした時のそれらの相互作用を容易にし、短い配列間のハイブリダイゼーションを導く。
しかしながら、この方法は、熱力学的安定性の高い（図３に示される）交差様構造を形成し得、増幅に基づいて、テンプレートにおいて、独立した誤った陽性増幅生成物を生じ得るので主な欠点を有する。
上述の方法の他の欠点は、点変異、即ち一塩基対変換のような微小な配列変換により異なる標的核酸配列の中で識別することができないことである。それゆえ、CAR法は、点変異のような微小な配列変換の検出には適していない。
本発明の目的は、ポリメラーゼもリガーゼも用いず、にせのバックグラウンドシグナルを削減し、そしてそれゆえ核酸の化学的増幅反応の信頼性を改良する標的配列を増幅及び検出する簡単、迅速かつ極めて正確な方法を提供することである。
本発明の他の目的は、例えば一塩基変換、即ち点変異のような微小な配列変換によって異なる核酸配列を識別して増幅するのに十分にセンシティブである核酸を化学的に増幅するためのセンシティブな方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、その場で検出することができ、増幅に関連した検出可能なシグナルを発し、増幅後の反応容器を再び開ける必要なく、前の増幅生成物による汚染の問題を削減し、それにより誤った陽性の結果を削減する上述の本発明の方法を行うために用いられるべき診断キットを提供することである。
発明の概要
本発明は、テストサンプル中に存在し得る標的核酸配列を検出するための方法及びキットに関する。本方法は、例えば点変異、即ち一塩基対変換のような微小な配列変換により異なる配列間を識別するのに十分にセンシティブである。本方法は、増幅手順及び検出手順の両方を用いることができる。当業者に明らかになるであろうこれら及び他の目的は、サンプル中で、標的配列から構成される一本鎖核酸標的分子、又は標的配列及び標的相補配列から構成される二本鎖核酸標的分子を増幅及び検出するための方法を提供することにより達成される。
増幅は、最少で２つのオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対を用いて行われ、ここでオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対の両方の対からのメンバーオリゴヌクレオチドプローブは、テンプレートとして作用する存在するべき標的核酸配列及び標的核酸相補配列の所定の部分に相補的である２つのオリゴヌクレオチドプローブ対を形成する。オリゴヌクレオチドプローブの各々の対のメンバーのヌクレオチド配列は、各々のオリゴヌクレオチドプローブ対が非接触様式で予め決められた標的配列のヌクレオチドの広がりを本質的に覆うように、標的核酸配列の異なる部分と相補的となるように選択される。これらの特有のオリゴヌクレオチドプローブ対により行われる増幅のモードは以下のステップからなる：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対及び第２のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対を、関心の核酸中に存在するヌクレオチド塩基の広がりに接触させ、ここで
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対がオリゴヌクレオチドプローブ１及びオリゴヌクレオチドプローブ１’からなり、第２のオリゴヌクレオチドプローブ相補鎖対はオリゴヌクレオチドプローブ２及びオリゴヌクレオチドプローブ２’からなり；
（ii）オリゴヌクレオチドプローブ１は長い部分α及び短い部分α’を含むターゲッティング配列Ａ、並びに保護配列Ｂからなり；オリゴヌクレオチドプローブ１’はターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂからなり；
（iii）オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃからなり；オリゴヌクレオチドプローブ２’は長い部分γ及び短い部部γ’を含むターゲッティング配列Ｃ’からなり；
（iv）オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａのα部及びオリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’は互いに相補的であり；
（ｖ）オリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃ及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’のγ部は互いに相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’のγ’部及びオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａのα’部は互いに相補的であり；
（vi）オリゴヌクレオチドプローブ１及び２は、オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃが標的配列の隣接部分に相補的である第１のオリゴヌクレオチド対を形成し；
（vii）オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’は、オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’が標的相補配列の隣接部分に相補的である第２のオリゴヌクレオチド対を形成し；
（viii）保護配列Ｂは、ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃが標的配列とハイブリダイズする場合に標的配列とハイブリダイズせず、
（ix）保護配列Ｂ’は、ターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’が標的相補配列とハイブリダイズする場合に標的相補配列とハイブリダイズせず、
（ｘ）ターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂの結合において、化学官能基Ｘ１はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａの最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合し；オリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃの最後のヌクレオチドの糖及び塩基成分は化学官能基Ｙ１で修飾され；化学官能基Ｘ１は化学官能基Ｙ１と反応性があり；
（ｘｉ）ターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’の結合において、化学官能基Ｘ２はオリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合され；オリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分は化学官能基Ｙ２で修飾され；化学官能基Ｘ２は化学官能基Ｙ２と反応性を有し、
（ｘii）ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃが標的配列とハイブリダイズする場合、化学官能基Ｘ１は化学官能基Ｙ１と反応して化学結合を形成し、結合したオリゴヌクレオチドの相補鎖（即ち増幅）生成物が形成され；ターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’が標的相補配列とハイブリダイズする場合、化学官能基Ｘ２は化学官能基Ｙ２と反応して化学結合を形成し、増幅生成物の相補鎖を形成し；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃが標的配列の隣接部分とハイブリダイズすることができ、オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’が標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズすることができるためのハイブリダイゼーション条件を供し；
（ｃ）化学官能基Ｘ１及びＹ１の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ１及びオリゴヌクレオチドプローブ２が互いに標的配列の隣接部分に連結し、それにより標的相補配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｄ）化学官能基Ｘ２及びＹ２の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ１’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’が互いに標的相補配列の隣接部分に連結し、それにより標的配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｅ）前記サンプルを変性条件下に処理し；
（ｆ）要求される回数、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返し；
（ｇ）前記連結したオリゴヌクレオチド生成物を検出する
本発明の方法は、標的核酸配列における例えば点変異、即ち一塩基対変換のような微小な配列変換の検出にも適している。これにより、４つのオリゴヌクレオチドプローブの２つのセットがデザインされる。第１のセットは、野生型標的核酸、及び野生型標的核酸相補配列の増幅を目的とし、他方第２のセットは、変異標的核酸配列及び変異標的核酸相補配列の増幅を目的とする。オリゴヌクレオチドプローブのセットは次のステップに従って用いられる：
（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブセットを関心の核酸中に存在するヌクレオチド塩基の広がりに接触させ、ここで
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブセットは野生型配列を増幅するようデザインされ、上述のものの構築において似た１，１’２及び２’で示された４つのオリゴヌクレオチドプローブを含み；オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’は第１のオリゴヌクレオチドプローブ相補対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ２及び２’は第２のオリゴヌクレオチドプローブ相補対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ１及び２は第１のオリゴヌクレオチドプローブ対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’は第２のオリゴヌクレオチドプローブ対を形成し；
（ii）第２オリゴヌクレオチドプローブセットは変異配列を増幅するようデザインされ、第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ１，１’，２及び２’各々の構築において似た３，３’４及び４’で示される４つのオリゴヌクレオチドプローブを含み；オリゴヌクレオチドプローブ３及び３’は第３のオリゴヌクレオチドプローブ相補対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ４及び４’は第４のオリゴヌクレオチドプローブ相補対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ３及び４は第３のオリゴヌクレオチドプローブ対を形成し；オリゴヌクレオチドプローブ３’及び４’は第４のオリゴヌクレオチドプローブ対を形成し；
（iii）オリゴヌクレオチドプローブ１及び３は各々、長い部分α及び短い部分α’を含むターゲッティング配列Ａから、並びに保護配列Ｂ及びＤから構成され；オリゴヌクレオチドプローブ１’及び３’は各々ターゲッティング配列Ａ’並びに保護配列Ｂ’及びＤ’から構成され；
（iv）オリゴヌクレオチドプローブ２及び４は各々ターゲッティング配列Ｃから構成され；オリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’は各々、長い部分γ及び短い部分γ’を含むターゲッティング配列Ｃ’から構成され；
（ｖ）オリゴヌクレオチドプローブ１及び３のターゲッティング配列Ａのα部並びにオリゴヌクレオチドプローブ１’及び３’のターゲッティング配列Ａ’は各々互いに相補的であり；
（vi）オリゴヌクレオチドプローブ２及び４のターゲッティング配列Ｃ並びにオリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’のターゲッティング配列Ｃ’のγ部分は各々互いに相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’のターゲッティング配列Ｃ’のγ’部分並びにオリゴヌクレオチドプローブ１及び３の配列Ａのα’部分は各々互いに相補的であり；
（vii）第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ３’及び４の配列は第１のオリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２の配列と同一か又は極めて類似しており；第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ３及び４’の配列は、オリゴヌクレオチドプローブ１及び２’がその位置で各々野生型標的配列及び野生型標的相補配列と十分に相補的であり、オリゴヌクレオチドプローブ３及び４’がその位置で各々変異標的配列及び変異標的相補配列と十分に相補的であるように、決められた配列変換の位置で第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ１及び２各々のそれと異なり；
（viii）オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃは野生型標的配列の隣接部分と相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ３のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ４のターゲッティング配列Ｃは変異標的配列の隣接部分と相補的であり；
（ix）オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’は野生型標的相補配列の隣接部分と相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ３’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ４’のターゲッティング配列Ｃ’は変異標的相補配列の隣接部分と相補的であり；
（ｘ）ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃがそれらの標的配列とハイブリダイズする場合、保護配列Ｂ及びＤは各々野生型又は変異標的配列とハイブリダイズせず、
（ｘｉ）ターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’がそれらの標的相補配列とハイブリダイズする場合、保護配列Ｂ’及びＤ’は各々野生型又は変異標的相補配列とハイブリダイズせず、
（ｘii）オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂの連結において化学官能基Ｘ１は配列Ａの最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合し；オリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃの最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分は化学官能基Ｙ１で修飾され；化学官能基Ｘ１は化学官能基Ｙ１と反応性を有し；
（ｘiii）オリゴヌクレオチドプローブ３のターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｄの連結において、化学官能基Ｘ３は配列Ａの最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合し；オリゴヌクレオチドプローブ４のターゲッティング配列Ｃの最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分は化学官能基Ｙ３で修飾され；化学官能基Ｘ３は化学官能基Ｙ３と反応性を有し；
（ｘiv）オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’の連結において、化学官能基Ｘ２は配列Ａ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合し；オリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分は化学官能基Ｙ２で修飾され；化学官能基Ｘ２は化学官能基Ｙ２と反応性を有し；
（ｘｖ）オリゴヌクレオチドプローブ３’のターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｄ’の連結において、化学官能基Ｘ４は配列Ａ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分に結合し；オリゴヌクレオチドプローブ４’のターゲッティング配列Ｃ’の最後のヌクレオチドの糖又は塩基成分は化学官能基Ｙ４で修飾され；化学官能基Ｘ４は化学官能基Ｙ４と反応性を有し；
（ｘvi）オリゴヌクレオチドプローブ１及び２の各々のターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃは、野生型標的配列にハイブリダイズし、化学官能基Ｘ１は化学官能基Ｙ１と反応して化学結合を形成し、そして野生型連結オリゴヌクレオチド生成物の相補鎖が形成され；オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’のターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’は野生型標的相補配列とハイブリダイズし、化学官能基Ｘ２は化学官能基Ｙ２と反応して化学結合を形成し、そして野生型連結オリゴヌクレオチド生成物の鎖が形成され；
（ｘvii）オリゴヌクレオチドプローブ３及び４の各々のターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃは、変異標的配列にハイブリダイズし、化学官能基Ｘ３は化学官能基Ｙ３と反応して化学結合を形成し、そして変異連結オリゴヌクレオチド生成物の相補鎖が形成され；オリゴヌクレオチドプローブ３’及び４’のターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’は各々変異標的相補配列とハイブリダイズし、化学官能基Ｘ４は化学官能基Ｙ４と反応して化学結合を形成し、そして変異連結オリゴヌクレオチド生成物の鎖が形成され；
（ｂ）次のこと：
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃが野生型標的配列の隣接部分とハイブリダイズし；
（ii）オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’が野生型標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズし；
（iii）オリゴヌクレオチドプローブ３のターゲッティング配列Ａ及びオリゴヌクレオチドプローブ４のターゲッティング配列Ｃが変異標的配列の隣接部分とハイブリダイズし；
（iv）オリゴヌクレオチドプローブ３’のターゲッティング配列Ａ’及びオリゴヌクレオチドプローブ４’のターゲッティング配列Ｃ’が変異標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズすること；
を可能にする条件を供し、
（ｃ）化学官能基Ｘ１及びＹ１の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ１及びオリゴヌクレオチドプローブ２が互いに野生型標的配列の隣接部分に連結し、それにより野生型標的相補配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｄ）化学官能基Ｘ２及びＹ２の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ１’及びオリゴヌクレオチドプローブ２’が互いに野生型標的相補配列の隣接部分に連結し、それにより野生型標的配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｅ）化学官能基Ｘ３及びＹ３の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ３及びオリゴヌクレオチドプローブ４が互いに変異標的配列の隣接部分に連結し、それにより変異標的相補配列を有する第１の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｆ）化学官能基Ｘ４及びＹ４の間に化学結合を形成することにより、ステップ（ｂ）後にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ３’及びオリゴヌクレオチドプローブ４’が互いに変異標的相補配列の隣接部分に連結し、それにより変異標的配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することを可能にする条件を供し；
（ｇ）前記サンプルを変性条件下に処理し；
（ｈ）要求される回数、ステップ（ｂ）〜（ｇ）を繰り返し；そして
（ｉ）前記連結したオリゴヌクレオチド生成物を検出する。
また、本発明によれば、サンプル中で特定のヌクレオチド配列を増幅するための診断キットであって、２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対及び少くとも１の緩衝液からなる診断キットも提供する。
増幅後にテストチューブを開けることを含まない検出手順である増幅生成物のその場での検出を達成するための直進的試みは、それらが化学結合がそれらの間に形成される時に検出可能な化合物を形成するような、Ｘ型及びＹ型の化学官能基をデザインすることである。
検出可能な化合物は、例えばＯ．Ｄ．ユニットで比色的に、又は化合物の化学的性質によって蛍光的に検出され得る。その化合物は、その化合物に対する直接的又は間接的標識抗体、例えばモノクローナル抗体によっても検出され得る。
上述の増幅手順を行う間、少くとも２の一本鎖生成物Ｂ及びＢ’及び／又はＤ及びＤ’が形成される。これらの一本鎖配列は連結オリゴヌクレオチド生成物に特有であり、それゆえそのいくつか又は全てが２つの他の検出手順に従って、連結オリゴヌクレオチド生成物を検出するために用いられる。簡明さの問題として、検出手順は第１のオリゴヌクレオチドプローブセットについて本明細書に記載されよう。もちろん第２のオリゴヌクレオチドプローブにも同様の試みがなされ得る。
第１の検出手順においては、近接エネルギー転移ラベリング（proximity energy transfer labeling）に関する検出方法において２つの標識検出オリゴヌクレオチドプローブが用いられる。第１の検出において、オリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドプローブ１及び１’の各々保護配列Ｂ及び／又はＢ’を供する、第１の検出のために、オリゴヌクレオチドプローブは近接標識成分Ｒ１に接合される。第２の検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及び／又はＢ’１接合されるのは対応する第２の近接標識成分Ｒ２である。第２の検出、オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ’１は直接又は間接的にも連結され得、連続分子Ｂ１−Ｂ’１も形成し得る。第２の検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ’１は各々保護配列Ｂ及びＢ’に相補的である。第１及び第２標識検出オリゴヌクレオチドプローブは、互いにハイブリダイズし、それゆえ近接ラベル成分Ｒ１及びＲ２を、検出可能なシグナルを形成するためにそれらの相互作用のために十分に近位に運ぶ。２つの標識検出オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした場合、近接ラベル成分Ｒ１及びＲ２はそれらの間のエネルギー転移反応がおこることを可能にする近位にまで運ばれ、その結果、測定可能なエネルギー放射を生ずる。
増幅生成物の第２の検出手順は、連結したオリゴヌクレオチド生成物に組み込まれた一本鎖Ｂ及び／又はＢ’配列に接合したラベル成分Ｌの放離、並びにオリゴヌクレオチドプローブ１及び／又は１’に接合したアフィニティー分離成分Ｓを通しての、テスト容器からの、それらに接合したラベル成分と一緒の全ての二本鎖Ｂ及びＢ’配列の除去に基づく。一本鎖Ｂ及びＢ’配列は、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いることにより、又は適切な化学的手順により、増幅後に核形成（nucleated）され得、それらの接合したラベル成分を周囲の溶液に遊離させる。増幅反応に用いられる１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブの１又は複数の位置に、１又は複数のアフィニティー分離成分Ｓが接合される。アフィニティー分離成分Ｓは、高アフィニティーで対の片方Ｓ’に結合する能力を特徴とする。対の一方のアフィニティー分離成分Ｓ’は好ましい固体支持体に付着される。増幅の後、一本鎖特異的核酸分解法は、連結したオリゴヌクレオチド生成物に組み込まれた一本鎖配列Ｂ及びＢ’を分解するのに用いられる。核酸分解の結果は、増幅のレベルに比例した量のラベル成分Ｌの溶液への遊離である。これにより遊離されない場合、これらは連結オリゴヌクレオチド生成物に組み込まれない配列Ｂ又はＢ’に接合されたラベル成分であるラベル成分Ｌは、アフィニティー分離によって除去される。遊離したラベル成分Ｌはこれにより検出され得る。
また本発明によれば、サンプル中の特定のヌクレオチド配列の存在を検出するための診断キットであって、（ａ）２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対；（ｂ）近接ラベル成分に接合した２以上の検出オリゴヌクレオチドプローブ；及び（ｃ）少くとも１の緩衝液を含むキットを提供する。
あるいは、（ａ）２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対であってその１以上が分離成分に接合され、そしてその１以上がラベル成分に接合されているもの；（ｂ）一本鎖特異的ヌクレアーゼ；及び（ｅ）連結したオリゴヌクレオチドプローブのアフィニティー分離のための固体支持体からなる診断キットを提供する。
図面の簡単な記載
本発明は、添付の図面を参照して、実例としてのみ本明細書に記載される。
図１は、先行技術の化学的増幅反応（CAR）法に用いられるオリゴヌクレオチドプローブの概略図である。
図２は、標的核酸配列及び標的核酸相補配列に接触した時のCAR法のハイブリダイゼーションを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの概略図である。
図３は、それに基づく増幅がテンプレート独立性の誤った陽性増幅生成物を生じ得るCAR法下に用いられる高い熱動力学的安定性を特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの交差様構造の概略図である。
図４は、本発明の方法に従って核酸配列の増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプローブ対の概略図である。
図５は、本発明の方法に従って、核酸配列の増幅のために用いられる12の他のオリゴヌクレオチドプローブ対の概略図である。
図６は、本発明の方法に従って、核酸配列の増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプローブの構築の概略図である。
図７は、標的核酸配列及び標的核酸相補配列に接触した時の本発明の方法のハイブリダイゼーションを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブの概略図である。
図８は、本発明の方法下で用いられる高熱動力学的安定性のオリゴヌクレオチドプローブの構造の概略図である。
図９は、本発明の方法に従って、核酸配列の増幅の間の連結したオリゴヌクレオチド生成物の形成の概略図である。
図10は、化学官能基Ｚで修飾されたアデニン誘導体Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を示す。
図11は、化学官能基Ｚで修飾されたシトシン誘導体Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４を示す。
図12は、化学官能基Ｚで修飾されたグアニン誘導体Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３及びＧ４を示す。
図13は、化学官能基Ｚで修飾されたチミジン誘導体Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３及びＴ４を示す。
図14は、化学官能基Ｚで修飾されたウリジン誘導体Ｖ１，Ｖ２，Ｖ３及びＶ４を示す。
図15は、例えばオリゴヌクレオチドプローブ１，１’，３及び３’において、化学官能基Ｘとして機能するDieneを形成するようＣ−５位置においてウリジンが修飾されているシステムのDiels−Alder反応についての好ましい実施形態を示す。他方ターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の終りにおいて、その糖は、例えば化学官能基Ｙとして機能する２−ブテンジオール酸によりＣ−２’位置で修飾される。
図16は、ヌクレオチド塩基に付着した化学官能基と共に、標的核酸配列又は標的核酸相補配列に対する、ハイブリダイズしたターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃ、又はターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’の概略図を示す。
図17は、二本鎖標的分子とハイブリダイズし、そして化学官能基により連結して第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するオリゴヌクレオチドプローブの概略図を示す。
図18は、オリゴヌクレオチドプローブの、標的配列及び標的相補配列へのハイブリダイゼーション並びに連結オリゴヌクレオチドプローブを形成するための化学官能基を通してのオリゴヌクレオチドプローブの連結を含む二本鎖配列の増幅手順における第１のサイクルの概略図である。
図19は、化学官能基を通しての連結オリゴヌクレオチドプローブの形成の後の、標的配列及び標的相補配列各々からの第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物の変性の概略図である。
図20は、第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物が増幅過程の第２及びその後の全てのサイクルの間に、更なる第２及び第１の連結オリゴヌクレオチド生成物各々の形成のためのテンプレートとして作用する能力の概略図を示す。
図21は、Ａ→Ｇ点変異により異なる核酸配列の選択的増幅を目的とした第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドプローブの中の類似性及び差を示す。
図22は、同じ長さのものであるオリゴヌクレオチドプローブ相補対の使用を可能にする許容される程度まで、ハイブリダイズした配列の３次構造を保存（distore）する究極の化学官能基が、化学官能基が接合した修飾ヌクレオチド自体が増幅選択的配列として作用するのに用いられる場合を示す。
図23は、本発明の方法の増幅手順の間に形成された一本鎖Ｂ及びＢ’保護配列の概略図である。
図24は、近接エネルギー転移ラベリングに関するその場での検出方法に用いられる標識検出オリゴヌクレオチドプローブの概略図である。
図25は、ハイブリダイズがＢ１−Ｂ’１分子を通して互いに結合した種々の数の連結オリゴヌクレオチド生成物から構成される凝集物の形成を導く近接エネルギー転移を含むその場での検出方法に用いられる標識検出オリゴヌクレオチドプローブの概略図である。
図26は、一本鎖特異的ヌクレアーゼの活性を通して一本鎖Ｂ及びＢ’保護配列からのラベル成分の遊離及び検出並びにこれによりアフィニティー分離によって遊離されないラベル成分Ｌの除去に関するその場での（in situ）検出方法の概略図である。
図27は、アフィニティー分離に役立つ反応チューブの概略図である。
好ましい実施形態の記載
本発明は、テストサンプル中に存在する標的核酸配列を増幅及び検出するための新規の非酵素的方法に、並びに該方法を行うのに用いるためのキットに関する。本発明の方法は、増幅手順及び検出手順の両方に用いることができ、点変異、即ち一塩基対変換のような微小な配列変換の検出にも役立つ。
本発明による方法の原理及び作用は、図面及びそれに伴う記載を参照してよりよく理解され得る。
本発明は、検査されるサンプル中の標的核酸配列の存在を同定するための方法、及びその変換が遺伝病に関連する遺伝子における微小な配列変換を同定するための方法を強調して詳細に記載されよう。後者の本発明の方法の適用が好ましいが、これは、当業者に疑う余地なく認められようが、本発明の唯一の適用を意味するものではない。例えば、本発明は、種々の他の適用、例えばこれらに限定されないが、例えばHLA座におけるもののような特定の遺伝子多形性に関連したもののようなサンプル中の特定の遺伝子配列の検出；父性及び法医学におけるテスト；並びに特定の癌の診断に用いられる。
本明細書に用いる場合、以下の用語は、以下に示される定義を有する。
標的核酸配列
本発明の方法は、ヌクレオチド配列の少くとも一部が相補オリゴヌクレオチドプローブ対が合成できるのに十分に詳しく知られているならば、標的核酸配列の幾何学的増幅を行うことができる。本発明の方法によって行われる“増幅”は、反応容器中に存在する要求される核酸分子の量の増加をいう。“実質的増幅”とは、約100倍超の増幅をいう。本発明の方法によって増幅される標的核酸配列は、一本鎖もしくは二本鎖DNA、一本鎖もしくは二本鎖RNA、一本鎖もしくは二本鎖タンパク質核酸（PNA）又はDNA, RNA及び／又はPNAのハイブリッドであり得る。本発明の増幅過程に酵素は用いられないので、それゆえ標的配列は精製又は非精製形態であり得る。核酸のサンプルは、いずれかのソースから得ることができ、天然又は合成であり得る。核酸のサンプルは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、もしくはデオキシリボ核酸及びリボ核酸のコポリマー又はそれらの組み合わせから作られ得る、関心の核酸は、試験管内で酵素的に合成され得、又は非酵素的に合成され得る。関心の核酸を含むサンプルは、生物からのゲノム外DNA、そのRNA転写物、又はそのRNA転写物から調製されたcDNAも含み得る。また、関心の核酸は、ポリメラーゼ又はリガーゼ鎖反応によって合成され得る。
標的核酸配列を含む細胞は、本方法を行うのに用いられる試薬の存在下で溶解される。典型的には、サンプルは、さもなければ核酸の増幅を妨害し得る外来材料が除去されるのに十分な程度に処理される。例えば、本発明の方法を用いる分析のための血清サンプルの調製は、25mlのMOPS（pH6.5）、2.5mMのEDTA及び0.5％のSDS中で2.5mg／mlの濃度でプロティナーゼＫの存在下で70℃で１時間の血清サンプルのインキュベーションからなり得る。
核酸サンプルは、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする特定のヌクレオチド配列を含む。標的配列が二本鎖であるなら、それは標的配列及び標的相補配列と呼ばれるその相補鎖を含む。標的配列は12ヌクレオチド程度短くあり得るが、好ましくは、少くとも16ヌクレオチド、より好ましくは少くとも20ヌクレオチドを含む。核酸サンプルの一部又は全核酸サンプルのいずれかを構成し得る標的配列又は標的相補配列におけるヌクレオチドの最大数はない。
本発明の方法を用いて増幅され得る分子の中には、いずれかの天然の原核生物、例えば病原性又は非病原性バクテリア、例えばこれらに限定されないが、大腸菌、サルモネラ（Salmonella）、クロストリジウム（Clostridium）、クラミジア（Chlamydia）等；真核生物、例えば原生動物及び寄生虫、真菌、イースト、高等植物、低級及び高級動物、例えば哺乳動物及びヒト並びに組織培養における細胞；又はウィルス、例えばヘルペスウィルス、HIV、インフルエンザウィルス、エプスタイン・バールウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス等から得られたDNA又はRNAの形態の遺伝材料が含まれる。核酸分子は、化学的又は酵素的に合成されている又は合成され得るいずれかの核酸分子でもあり得る。
これらのソースからのDNA又はRNAは、例えば、ヒトを含む動物からの体液、例えばこれらに限定されないが血液、尿、リンパ液、滑液、胆汁、粘液質、唾液、月経液及び精液のサンプル中に見い出され得る。更に、DNA又はRNAを含むサンプルは、例えば植物からの液体、例えばこれらに限定されないが、木質液、篩部液、植物滲出液中に見い出され得る。DNA又はRNAを含むサンプルは、例えば、生きていないソース、例えばこれらに限定されないが食物、下水汚物、法医学サンプル、湖、貯水所、川、及び海洋においても見い出され得る。
本発明の方法によって増幅されるべき核酸標的分子は、二本鎖又は一本鎖形態であり得るが、拡散標的分子が二本鎖である場合、加熱、アルカリ処理、又は酵素法のような当該技術で周知である方法により、増幅反応の始めにおいて、変性剤により二本鎖を一本鎖に、又は部分的に一本鎖の形態にすることにより、最初に処理することが好ましい。この処理を行うための一般的な方法は、Sambrook, Jら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY（1989））により供される。
相補性
本明細書に用いる場合、逆平行二本鎖核酸構造を形成することができるなら、２つの配列は互いに“ハイブリダイズ”すると呼ばれる。２つの核酸分子は、少くとも慣用的な“低ストリンジェンシー”条件下で互いにアニールされるのを許容するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができるなら、“相補的”であると呼ばれる。
これにより、２つの相補分子に正確な相補性を示す必要はないが、少くとも安定な二本鎖構造を形成することができるのに十分な配列の相補性が必要とされる。それゆえ、完全な相補性から離れることは、二本鎖構造を形成するためのハイブリダイゼーションを完全に排除するのに十分でない限り、許容される。
オリゴヌクレオチドプローブ相補対
本明細書に用いられる“オリゴヌクレオチド相補対”という用語は、例えば図４に示されるようなオリゴヌクレオチドプローブ１とオリゴヌクレオチドプローブ１’又はオリゴヌクレオチドプローブ２とオリゴヌクレオチドプローブ２’として示される２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブをいう。詳細に短い示されるであろうように、オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’、オリゴヌクレオチドプローブ２及び２’、オリゴヌクレオチドプローブ３及び３’並びにオリゴヌクレオチドプローブ４及び４’は、相補的である配列領域を分けあう。オリゴヌクレオチドプローブの相補対の各々のオリゴヌクレオチドプローブは等しいか、又は図に示されるようにその同じメンバーに対して長さが異なる。標的配列又は標的相補配列当りの２つのオリゴヌクレオチドプローブ相補対が、本発明の方法を行う間に用いられ得ることがより理解されるはずである。
オリゴヌクレオチドプローブ対
本明細書に用いられる“オリゴヌクレオチドプローブ対”という用語は、第１の“オリゴヌクレオチドプローブ対”としてオリゴヌクレオチドプローブ１及び２のグルーピング、第２の“オリゴヌクレオチドプローブ対”としてオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’のグルーピング、第３の“オリゴヌクレオチドプローブ対”としてオリゴヌクレオチドプローブ３及び４のグルーピング、並びに第４の“オリゴヌクレオチドプローブ対”としてのオリゴヌクレオチドプローブ３’及び４’のグルーピングをいう。
オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、デオキシリボヌクレオチドから構成されるが、リボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ、例えばこれらに限定されないが、タンパク質核酸（PNA）が許容される基質である。
図４の第１のオリゴヌクレオチドプローブ相補対を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；そしてオリゴヌクレオチドプローブ２’はターゲッティング配列Ｃ’を有する。Ｘ及びＹは化学官能基であり、ここでＸ及びＹ基は化学結合を形成し得る。長円形は、簡単にいうと、一本鎖ループアウトであり、ターゲッティング配列Ａの一部であり、そしてターゲッティング配列Ｃ’の一本鎖配列部分であろう。
当業者に理解されるように、20の少し異なる型がこれらのオリゴヌクレオチドプローブの中の配列アレンジメントについて存在する。これらの型は図５に示され、（１）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａより短いターゲッティング配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより長いターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（２）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａより長いターゲッティングの配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより短いターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（３）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａと同じ長さであるターゲッティング配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃと同じ長さのターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（４）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａより短いターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより長いターゲッティングの配列Ｃ’を有し；（５）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａより長いターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより短いターゲッティング配列Ｃ’を有し；（６）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａと同じ長さのターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃと同じ長さのターゲッティング配列Ｃ’を有し；（７）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１の配列Ａよ���短いターゲッティング配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより長いターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（８）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１の配列Ａより長いターゲッティング配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより短いターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（９）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１の配列Ａと同じ長さのターゲッティング配列Ａ’を有し；オリゴヌクレオチド２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃの長さと同じターゲッティング配列Ｃ’及び保護配列Ｂ’を有し；（10）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティングの配列Ａより短いターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより長いターゲッティング配列Ｃ’を有し；（11）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａより長いターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃより短いターゲッティング配列Ｃ’を有し；（12）オリゴヌクレオチドプローブ１はターゲッティング配列Ａを含み；オリゴヌクレオチドプローブ１’はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａと同じ長さのターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ２はターゲッティング配列Ｃ及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２’はオリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃと同じ長さのターゲッティング配列Ｃ’を有するものを含む。オリゴヌクレオチドプローブ３がオリゴヌクレオチドプローブ１に類似し；オリゴヌクレオチドプローブ４がオリゴヌクレオチドプローブ２に類似し；オリゴヌクレオチドプローブ３’がオリゴヌクレオチドプローブ１’に類似し；そしてオリゴヌクレオチドプローブ４’がオリゴヌクレオチドプローブ２’に類似するオリゴヌクレオチドプローブ３，３’，４及び４’について同様の型が存在することが理解される。
便利さのため、後の全ての記載は、オリゴヌクレオチドプローブ１がターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂを有し；オリゴヌクレオチドプローブ１’がターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’を有し；オリゴヌクレオチドプローブ２がターゲッティング配列Ｃを有し；そしてオリゴヌクレオチドプローブ２’がターゲッティング配列Ｃ’を有する上述のオプション４に関して行われよう。
図６に更に詳説するように、オリゴヌクレオチド１のターゲッティング配列Ａは、長い部分α及び短い部分α’を含み（α部分とα’部分との間の境目は図の垂直線で示される）；オリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’は長い部分γ及び短い部分γ’を含み（γ部分γ’部分との間の境目は図の垂直線で示される）；オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａのα部分及びオリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’は互いに相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａのα’部分及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’のγ’部分は互いに相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃ及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’のγ部分は互いに相補的であり；オリゴヌクレオチドプローブ２’のターゲッティング配列Ｃ’及びオリゴヌクレオチドプローブ１の配列Ａのα’部分は互いに相補的である。Ｘ及びＹは化学官能基であり、ここでＸ及びＹ基は化学結合を形成し得る。同様の構造がオリゴヌクレオチドプローブ３，３’，４及び４’を特徴づける。簡明さのため、本明細書の記載のいくつかは、オリゴヌクレオチドプローブ１，２，１’及び２’のみに言及するであろうが、これらの記載は特に示さなければ、オリゴヌクレオチドプローブ３，４，３’及び４’にも適する。
図７に示すように、標的核酸配列がテストサンプル中に存在するなら、ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃは選択されたハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成するために標的配列の隣接領域に対して全体的に相補的又は十分に相補的のいずれかである。標的核酸配列に相補的な鎖がテストサンプル中に存在するなら、ターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’は、選択されたハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成するために、標的相補配列に対して全体的に相補的であるが又は標的相補配列の隣接領域に対して十分に相補的であるかのいずれかである。
本明細書に用いられる“標的配列の隣接領域”又は“標的相補配列の隣接領域”という用語は、好ましくは直ちに隣接して互いに並列するか、又は１もしくは２ヌクレオチド塩基だけ離れているこれらの核酸分子中の配列をいう。
本明細書に用いられる“隣接（abutting）”という用語は、酵素的連結のようにそれらの３’端と５’端位置の間に化学結合を形成しないが、Ｘ及びＹ化学官能基（ここでＸ及びＹ基は以下に詳細に示されるであろうように化学結合を形成し得る）の間に化学結合を形成し得るターゲッティング配列Ａ及びＣ又はＡ’及びＣ’をいう。
関連するオリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列Ａ及びＡ’並びにターゲッティング配列Ｃ及びＣ’のヌクレオチドの最小数は、本発明の増幅及び検出方法において十分な選択性を供する最も少い数である。例えばこれらの配列は、少くとも６、好ましくは少くとも12、そしてより好ましくは少くとも20のデオキシリボヌクレオチド又はそれらのアナログを含み得る。
関連するオリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列Ａ及びＡ’並びにターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の最大長は、テストサンプル中の標的核酸配列の長さのみによって制限される。これらの長さは、標的配列と安定なハイブリッドを形成するのに十分な長さのものであるはずであるが、好ましくは長すぎて過剰なハイブリダイゼーション時間を要求しないものである。これらの配列のいくつかの適切な最大長は、200ヌクレオチド、好ましくは150ヌクレオチド、そしてより好ましくは100ヌクレオチドである。これらの配列のいくつかの適切な長さは、６〜100ヌクレオチド、好ましくは10〜70ヌクレオチド、より好ましくは16〜50ヌクレオチド、そして最も好ましくは18〜30ヌクレオチドである。
保護配列Ｂ及びＢ’は、互いに相補的でなくともよいが、互いに相補的であることが好ましい。保護配列Ｂ及びＢ’は好ましくは、検査される核酸サンプル中に存在するいずれかの核酸配列にも相補的でない。保護配列Ｂ及びＢ’は、ランダムな万能配列からなり得るが、それらは１のオリゴヌクレオチドプローブ分子から他のものに対して配列において異なり得る。
保護配列Ｄ及びＤ’は、互いに相補的でなくともよいが、互いに相補的であることが好ましい。保護配列Ｄ及びＤ’は好ましくは、検査される核酸サンプル中に存在するいずれかの核酸配列にも相補的でない。保護配列Ｄ及びＤ’は、ランダムな万能配列からなり得るが、それらは１のオリゴヌクレオチドプローブ分子から他のものに対して配列において異なり得る。本明細書に記載されるいくつかの適用において、保護配列Ｂ及びＤ並びに保護配列Ｂ’及びＤ’は同一であり得る。
いずれかのオリゴヌクレオチドプローブの保護配列は、オリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列が標的配列又は標的相補配列とハイブリダイズする場合に標的配列とハイブリダイズしないように、デザインされる。それゆえ、例えば保護配列Ｂは、ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃが標的配列の隣接部分にハイブリダイズする場合にハイブリダイズしない。同様に、保護配列Ｂ’はターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’から標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズする場合にハイブリダイズしない。これらのハイブリダイズしない一本鎖配列は、本明細書で強調されるであろうようにその場での検出方法に役立つ。
オリゴヌクレオチドプローブ構築のデザインは、好ましくは、ターゲッティング配列Ａ及びＣの化学官能基の間の反応点が、ターゲッティング配列Ａ’及びＣ’の化学官能基の間の反応点から離れて位置するように作製される。ターゲッティング配列Ａのα’部分及びターゲッティング配列Ｃ’のγ’部分は、それらの間の化学結合の形成の後に化学官能基自体によるハイブリダイズした配列の３次構造のゆがみによる増幅の失敗を避けるのに十分に長いべきである。それゆえ究極の化学官能基は、同じ長さのものである、即ちターゲッティング配列Ａの長さがターゲッティング配列Ａ’のそれと等しく、ターゲッティング配列Ｃの長さがターゲッティング配列Ｃ’の長さに等しいオリゴヌクレオチドプローブ相補対の使用を可能にする許容される程度まで、ハイブリダイズした配列の３次構造をゆがめるものであろう。これらのオリゴヌクレオチドプローブにおいて、α’及びγ’部分のヌクレオチド成分は０に等しい。
ターゲッティング配列Ａのα’配列及びターゲッティング配列Ｃ’のγ’配列の最大長は、各々αとα’配列及びγとγ’配列の間の長さの比による。長すぎるα’及びγ’配列は、図８に示される型の安定な構造の形成を通してテンプレート独立性の増幅生成物の不要な形成を導き得るだろう。
保護配列Ｂ，Ｂ’，Ｄ及びＤ’に関して長さの制限はない。これは、本明細書に記載されよう連結オリゴヌクレオチド生成物の検出のためのこれらの配列の用途の広い使用を可能にする。
ターゲッティング配列Ａの端において、オリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂ並びにターゲッティング配列Ａ’の端の間の結合において、オリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’の間の結合において、各々Ｘ１及びＸ２で示される化学官能基が位置する。オリゴヌクレオチドプローブ２のターゲッティング配列Ｃ及びオリゴヌクレオチドプローブ２’のＣ’の各々に、各々Ｙ１及びＹ２で示される化学官能基が付着する。これらの化学官能基は、各々の配列のヌクレオチドの１つの糖及び／又は塩基成分に共有結合する。オリゴヌクレオチドプローブ１及び２各々のターゲッティング配列Ａ及びＣ、又はオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’各々のターゲッティング配列Ａ’及びＣ’が標的核酸配列又は標的核酸相補配列にハイブリダイズする場合、化学官能基Ｘ１及びＹ１、並びにＸ２及びＹ２各々は化学的に反応して、オリゴヌクレオチドプローブ１と２、及びオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’各々を連結する化学結合を形成し、図９に示される形態の第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成する。オリゴヌクレオチドプローブ３及び４並びにオリゴヌクレオチドプローブ３’及び４’は、同様に連結オリゴヌクレオチド生成物を形成する。
標的核酸配列及び標的核酸相補配列が検査される核酸サンプル中に存在しない場合、化学官能基Ｘ１及びＸ２が結合するヌクレオチド及び関連するオリゴヌクレオチドプローブ中の隣接するヌクレオチドは、各々他のオリゴヌクレオチドプローブ上のＹ１及びＹ２化学官能基と反応することから、化学官能基を保護する。
オリゴヌクレオチドプローブ対は当該技術で周知の方法によって、全体的又は部分的に４つのオリゴヌクレオチドから化学的に合成することができる。このような方法は、Caruthers（Science 230, 281-285（1985）及びBeaucageら（Tetrahedron Letters 22, 1859-1862（1981）により記載されるものを含む。
テンプレート配列
本明細書に用いられる“テンプレート配列”という用語は、複数のオリゴヌクレオチドプローブ対又は複数の検出オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする核酸配列をいう。本明細書に詳説されるであろう増幅手順の第１のサイクルにおいて、標的核酸配列及び標的核酸相補配列はテンプレート配列として作用する。本明細書に詳説されるであろう増幅手順及び検出手順の後のサイクルにおいては、連結オリゴヌクレオチドプローブはなおテンプレート配列として作用する。
増幅生成物
本明細書に用いられる“増幅生成物”という用語は、連結配列を形成するために互いに化学的に連結するオリゴヌクレオチドプローブ対から形成される核酸配列をいう。
“擬似的増幅副産物”
本明細書に用いられる“擬似的増幅副産物”という用語は、独立した標的核酸配列又は標的核酸相補配列ハイブリダイゼーションである、連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するための、オリゴヌクレオチドプローブ対に属するオリゴヌクレオチドプローブの連結を導く、Ｘ及びＹ化学官能基の間の反応から生ずる生成物である。
“近接ラベル”
本明細書に用いられる“近接ラベル”という用語は、近接ラベルがもたらす検出可能なシグナルを形成するために互いに相互作用する少くとも２つのラベルの１つである。典型的には、２つの近接ラベルが互いに近位にある条件下で検出可能なシグナルを形成するために、第１の近接ラベルに対応する第２の近接ラベルと組み合わせて用いられる。
化学官能基
化学官能基Ｘ及びＹ（Ｘ＝Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３又はＸ４及びＹ＝Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３又はＹ４）は、ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃの、標的核酸配列へのハイブリダイゼーションにより、又はターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’の、標的核酸相補配列へのハイブリダイゼーションにより、それらが互いに近接した場合に化学結合を形成するための互いに（Ｘ１とＹ１；Ｘ２とＹ２；Ｘ３とＹ３；及びＸ４とＹ４）反応する原子及び／又は基の対である。化学官能基の対（例えばＸ１とＹ１）の間の距離は約４Å以下であり、基間の化学反応がおこるための適切な方向であるべきである。
Ｘ１型の化学官能基はオリゴヌクレオチドプローブ１のターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｂの連結部分に位置したヌクレオチドの塩基又は糖成分に結合され；Ｘ２型はオリゴヌクレオチドプローブ１’のターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｂ’の連結部分に位置したヌクレオチドの塩基又は糖成分に結合され；Ｘ３型はオリゴヌクレオチドプローブ３のターゲッティング配列Ａ及び保護配列Ｄの連結部分に位置したヌクレオチドの塩基又は糖成分に結合され；Ｘ４型はオリゴヌクレオチドプローブ３’のターゲッティング配列Ａ’及び保護配列Ｄ’の連結部分に位置したヌクレオチドの塩基又は糖成分に結合され；Ｙ１及びＹ２型は各々オリゴヌクレオチドプローブ２及び２’のターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の端に結合され；そしてＹ３及びＹ４型は各々オリゴヌクレオチドプローブ４及び４’のターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の端に結合される。
関連するオリゴヌクレオチドプローブのターゲッティング配列Ａ及びＣ並びにＡ’及びＣ’がハイブリダイズして各々標的核酸配列及び標的核酸相補配列とハイブリダイズした時に、化学官能基対のメンバー（例えばＸ１及びＹ１）がそれらの間に化学結合を形成し得る限り、化学官能基Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３及びＸ４は、同じ又は異なる化学的性質のものであり得；そして化学官能基Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３及びＹ４は、同じ又は異なる化学的性質のものであり得る。
化学官能基は、オリゴヌクレオチドプローブ１及び３並びにオリゴヌクレオチドプローブ２及び４のターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃ各々の標的配列へのハイブリダイゼーション、又はオリゴヌクレオチドプローブ１’及び３’並びにオリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’のターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’各々の標的相補配列へのハイブリダイゼーションを大きく妨害しないで結合できるヌクレオチド塩基又は糖成分上の位置として規定される立体的に許容される部位においてヌクレオチドに共有結合する。立体的に許容される部位には、プリン及びピリミジン塩基上の位置並びに塩基の多価ヘテロ原子又はヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログのリボース部分を含む。
立体的に許容される部位の例は、チミジンのＣ−５位に結合したメチル基、アデニン又はシチジンのＣ−６位、アゼニン又はグアニンのＣ−８位、各々の型のヌクレオチドのリボース環のＣ−２’位に結合したアミノ基、及びリボヌクレオチドのリボース環のＣ−２’位に結合したヒドロキシル基を含む。
プリン及びピリミジン塩基の修飾は、例えばEP135587でRuthにより記載されたもののような当該技術で周知である方法に従って行われる。リボヌクレオチドのリボース環のＣ−２’位におけるリボヌクレオチドの修飾は、例えばYamana, Kら（Bioconjugate Chemistry 1, 319-324（1990））により記載される方法に従って行われ得る。
上述の立体的に許容される部位の各々における化学官能基で修飾されたヌクレオチドの例を図10〜14に示す。デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドが図10〜14に示されるが、リボヌクレオチドが許容される基質であることが理解される。修飾ヌクレオチドの記号のリストを以下に示す。
Ａ１は、Ｃ−６位に位置したアミノ基からの水素を置換した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
Ａ２は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基に結合した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
Ａ３は、Ｃ−８に位置した水素を置換した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
Ａ４は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基を置換した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
Ｃ１は、Ｃ−６位に位置したアミノ基からの水素を置換した化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
Ｃ２は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基に結合した化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
Ｃ３は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基を置換した化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
Ｇ１は、Ｃ−８位に位置した水素を置換した化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
Ｇ２は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基に結合した化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
Ｇ３は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基を置換した化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
Ｔ１は、Ｃ−５位に位置したメチル基からの水素を置換した化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
Ｔ２は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基に結合した化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
Ｔ３は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基を置換した化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
Ｕ１は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基を置換した化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
Ｕ２は、リボース環のＣ−２’位に位置したヒドロキシル基に結合した化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
Ｚは、化学官能基Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３又はＹ４を表す。
化学官能基Ｘ及びＹはそれらの各々のヌクレオチド上の同じ位置に結合する必要はないことに注意することが重要である。例えば、限定することなく、基ＸはＡ／Ｂ配列の連結部のヌクレオチド上のＣ−５位のウリジンに結合され得、基Ｙは、ターゲッティング配列Ｃの端における適切なヌクレオチド上のＣ−２’位に結合され得よう。
例えばヌクレオチドへの、化学官能基Ｙの１つに結合するための好ましい位置は、ヌクレオチドのリボース環のＣ−２’位である。例えば、Moffattら（J. Org. Chem, 36, 250（1971）に記載されるプロトコルにより、又はIoannididら（Nucleosides and Nucleotides, 11：1205（1992）により記載されるアミノメチル基により、リボース環のＣ−２’位のヒドロキシル基をアミノ基で置換することが便利であり、他方第２の化学官能基Ｘは、例えばピリミジン塩基のＣ−５位に結合される。例えばRuth（EP135587）を参照のこと。アミノ基は、化学官能基又はリボース環への化学官能基の結合のための橋かけ基のいずれかとして作用し得る。
化学官能基は、必要に応じて、それを通してヌクレオチドに結合した橋かけ基を含むことができる。橋かけ基の例は、必要に応じて、これらに限定されないが、アミド、カルボニル、カルボキシ、アミノ及びチオのような基を、いずれかの位置に有するアミノ、アミド、チオ、カルボニル、カルボキシ、アルキル基、アリール、アルキルアリール、及びアリールアルキル基を含む。アルキル基はその全体又は一部が環式であり得る。アルキル基の例は、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル等を含む。アリール基の例は、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、イミダゾリル、インジル等を含む。
所定のオリゴヌクレオチドプローブの対において、その対の１つのメンバーは求核性化学官能基であり、その対の他のメンバーは求電子性化学官能基である（即ちＸが求核性であるなら、Ｙは求電子性であり、そしてその逆でもある）。
求核基のいくつかの例は、−SH, −NH2, −NHA（ここでＡはアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル等又はアリール基、例えばフェニル、ナフチル、イミダゾリル、インジル等である）を含む。求電子基は、求核基からの電子転移によって、単結合又は二重結合を形成することができる。求核基と求電子基との間の反応は、電子受容基に結合した二重結合を通しての求核基の付加及び求核基の求電子脱離基への置換を含み得る。
二重結合を通しての求核基の付加の一例は、マレイミド成分の二重結合へのチオール基の付加のようなMichael付加である。
化学官能基間の他のタイプの反応は、例えばDiels−Alder反応は１以上の新しい化学結合を形成するいずれかのペリサイクリック反応である。
Diels−Alder反応についての好ましい実施形態は、ウリジンが、例えばオリゴヌクレオチドプローブ１，１’，３及び３’において化学官能基Ｘとして機能するジエン（Diene）を形成するようＣ−５位において修飾される。ターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の端において、糖は、例えば図15に示されるように、化学官能基Ｙとして機能する２−ブテンジオール酸によりＣ−２’位において修飾される。
この特定の例のコンピューターモデリングは、Diels−Alder反応がおこるために、Ｃ−２’位のアミノ基が四面体形状を有する１以上の原子を伸長することを示した。例えばメチレン基はこの要求を満たす。
〔２＋２〕光−シクロ二量化又は他のタイプの光環化のような光化学的反応により化学結合を形成する化学官能基も選択することができる。
標的核酸配列の欠損下で互いに反応することからの化学官能基の保護
本発明に従うDNAオリゴヌクレオチドプローブ増幅の最も重要な特徴の１つは、擬似的増幅副産物を除去することである。本発明は、テンプレートと独立した様式で互いに反応することから化学官能基（Ｘ及びＹ）を保護する用途の広い方法を供する。好ましい実施形態において、Ｘ及びＹ基の間の化学結合は、Diels−Alder反応によって形成される。この反応は、その性質により領域制御され、立体特異的であるので、好ましい。例えば、Diene及びEne基のπ電子がペリサイクリック反応において相互作用するために正確にオーバーラップするはずである。
サンプル中の核酸配列の存在の検出のための本発明の方法の化学的増幅方法の記載
本発明の方法の第１の実施形態において、それはサンプル中の核酸配列の存在を検出するために用いられる。
標的核酸配列の増幅は、標的核酸配列の各々の鎖についての２以上の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを連結して連結オリゴヌクレオチド生成物を形成することにより、本発明において行われる。本発明の方法によって行われて増幅は、反応容器中に存在する要求される核酸分子の量の増加をいう。“実質的な増幅”とは、約100倍超の増幅をいう。形成された後、連結オリゴヌクレオチド生成物は、連結オリゴヌクレオチド生成物の更なる生産のためのテンプレートとして作用する。本方法のステップは、連結オリゴヌクレオチド生成物の検出可能な量を生成するのに十分な回数、繰り返される。本発明の方法のステップの各々の繰り返しはサイクルとして言及される。検出可能な量の連結オリゴヌクレオチド生成物を生成するのに要求されるサイクルの数は、検査される核酸サンプル中に最初に存在する標的分子の数に、かなりの程度、依存する。サンプル中の標的分子の数が大きくなれば、検出可能な量の連結オリゴヌクレオチド生成物を生産するのに必要とされるサイクルの数は少くなる。要求される量の連結オリゴヌクレオチド生成物が形成される場合、それは検出される。本発明の新しい観点は、オリゴヌクレオチドプローブが連結してオリゴヌクレオチド生成物を形成する方法である。連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するために本発明において、DNAポリメラーゼもDNAリガーゼも用いられない。
オリゴヌクレオチドプローブ１，１’，２及び２’は、以下のように、一本鎖又は二本鎖核酸分子において標的配列を増幅するために、本発明の方法において用いられる。
上述のように、標的核酸配列が、注意深く制御されたハイブリダイゼーション条件下でテストサンプル中に存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブ１及び２の各々ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃのみが標的配列の隣接領域にハイブリダイズする。これは、標的配列にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドプローブ１の保護配列を残す。ターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃが標的配列との安定なハイブリッド複合体を形成したなら、化学官能基Ｘ１及びＹ１は化学結合を形成するのに十分に近くに来る。化学官能基Ｘ１及びＹ１の間の結合は、オリゴヌクレオチドプローブ１をオリゴヌクレオチドプローブ２に連結して第１の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成する。形成された後、第１の連結オリゴヌクレオチド生成物の２つの配列は、“標的相補配列”を構成し、標的配列の隣接配列と相補的である。
同様に、オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’各々のターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’が標的相補配列の隣接領域にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドプローブ１’の保護配列Ｂ’はハイブリダイズしないままである。次にこれは、ターゲッティング配列Ａ’の化学官能基Ｘ２及びターゲッティング配列Ｃ’の化学官能基Ｙ２を、オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’を一緒に連結して第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するのに十分に近くに運ぶ。形成した後、第２の連結オリゴヌクレオチド生成物の２つの配列は“標的配列”を構成し、標的相補配列の隣接配列に相補的である。
オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’上の化学官能基Ｘ１及びＸ２は隠されて、それゆえ一方で保護配列Ｂ及びＢ’のヌクレオチドにより、他方でターゲッティング配列Ａ及びＡ’のヌクレオチドにより、各々化学官能基Ｙ１及びＹ２との相互作用から保護される。
更に、オリゴヌクレオチド１及び１’上の化学官能基Ｘ１及びＸ２は隠され得、それゆえ化学官能基Ｙ１及びＹ２との相互作用から保護される。それは、ターゲッティング配列Ａ及びＡ’にパリンドローム様式で相補的である配列を保護配列Ｂ及びＢ’に供することにより、化学官能基が塩基対を形成し、それゆえ保護されるようにステムが位置するステム及びループ構造を形成することによる。同様に、保護配列Ｄ及びＤ’に、ターゲッティング配列Ａ及びＡ’にパリンドローム様式で相補的である配列を供することは、それらが溶液中に遊離する場合に、オリゴヌクレオチドプローブ４及び４’上の化学官能基Ｙ３及びＹ４との相互作用がオリゴヌクレオチドプローブ３及び３’上の化学官能基Ｘ３及びＸ４を保護するだろう。
オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’上の化学官能基Ｘ１及びＸ２、並びにオリゴヌクレオチドプローブ２及び２’上の化学官能基Ｙ１及びＹ２は、化学官能基が位置する領域内で、オリゴヌクレオチドプローブ１，２，１’及び２’各々に相補的であるオリゴヌクレオチド１．１，２．１，１．１’及び２．１’により隠され、保護される（等価のオリゴヌクレオチド３．１，４．１，３．１’及び４．１’は各々化学官能基Ｘ３，Ｙ３，Ｘ４及びＹ４を保護するのに用いられ得る）。
オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’各々の化学官能基Ｘ１及びＸ２の保護の結果として、各々の化学官能基は他のオリゴヌクレオチドプローブの対応する化学官能基との反応から保護される。化学官能基は、オリゴヌクレオチドプローブ１及び２各々のターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション、又はオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’のターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’の標的核酸相補配列へのハイブリダイゼーションにより、十分に近くに運ばれる。
ハイブリダイズしたターゲッティング配列Ａ及びターゲッティング配列Ｃ、又はヌクレオチド塩基に結合した化学官能基での標的核酸配列又は標的核酸相補配列に対するターゲッティング配列Ａ’及びターゲッティング配列Ｃ’の全般的図が図16に示される。図に見られ得るように、化学官能基Ｘ及びＹは、リボース環のＣ−２’位又はヌクレオチド塩基のいずれかに結合され得る。
二本鎖標的分子にハイブリダイズし、化学官能基により連結されて第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するオリゴヌクレオチドプローブの両方の対の全般的図を図17のボールド線で示す。いくつかの適用において１又は２のヌクレオチドのギャップが許容されるが、本発明の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ間にギャップはない。
一本鎖標的分子を含むサンプルにおいて、第２の連結オリゴヌクレオチド生成物が第１のサイクル後に形成される。標的相補分子の欠如下で第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するために、第１の連結オリゴヌクレオチド生成物はその過程の第１のサイクルで形成されなければならない。第１の連結オリゴヌクレオチド生成物は標的相補配列であり、オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’がハイブリダイズするテンプレートとして機能する。オリゴヌクレオチドプローブ１’及び２’は、第２のサイクル及び後の過程のサイクルにおいて、標的配列を有する第２の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成する。
第１の連結オリゴヌクレオチド生成物がその過程の第１のサイクルで形成された後、その生成物は変性によって標的配列から分離される。本明細書に用いられる“変性する”又は“変性”という用語は、高次構造の可逆的損失をいい、例えば酵素、pH、温度、塩又は有機溶媒のような生理的又は非生理的条件によって作られるハイブリダイズした核酸の一本鎖への分離をいう。
形成された後の第２の連結オリゴヌクレオチド生成物も、変性によって、標的相補配列又は第１の連結オリゴヌクレオチド生成物から分離される。標的分子並びに第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物は、その過程の繰り返しのサイクルのためのテンプレートとして作用する。
二本鎖配列のための本発明の増幅過程の第１のサイクルの全般的な図を図18〜20に示す。
図18に示す通り、二本鎖配列の増幅手順は、標的配列及び標的相補配列へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション及び連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するための化学官能基によるオリゴヌクレオチドプローブの連結を含む。
図19に示す通り、化学官能基による連結オリゴヌクレオチドプローブの形成の後、標的配列及び標的相補配列からの各々第１及び第２連結オリゴヌクレオチド生成物の変性を行う。
その過程の第１のサイクルが終わった後、標的配列の更なる増幅は、連結オリゴヌクレオチド生成物の変性、オリゴヌクレオチドプローブ対の、連結オリゴヌクレオチド生成物へのアニーリング及び化学官能基間の化学結合の形成の、より多くの連結オリゴヌクレオチド生成物を形成するための繰り返しのサイクルにより達成される。それゆえ、第１のサイクルの後の全てのサイクルは、必然的に標的配列及び標的相補配列を有する。
第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物が、一本鎖又は二本鎖標的配列についての増幅過程の第２及び後の全てのサイクルの間に、各々更なる第２及び第１の連結オリゴヌクレオチド生成物の形成のためのテンプレートとして作用する能力の概略図を図20に示す。
先のステップに記載されるように形成された第１及び第２の連結オリゴヌクレオチド生成物の標的配列及び標的相補配列へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション及びオリゴヌクレオチドプローブの連結はより多くの連結オリゴヌクレオチド生成物を形成する。
本発明の他の実施形態において、標的配列又は存在するなら標的相補配列の直線的な増幅は、上述の過程において各々プローブ１及び２又はプローブ１’及び２’のみを用いることによって行うことができる。
本発明の好ましい実施形態において、例えば水（vol／vol）、0.54Ｍ NaCl, 30mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.3mM EDTA, ５％デキストランスルフェート500K m. w.（Sigma）（ｗ／vol）及び0.1％Triton Ｘ−100（vol／vol）中の30％脱イオンホルムアミドのような標準的ハイブリダイゼーション緩衝液が、６〜100ヌクレオチドのいずれかの長さのオリゴヌクレオチドプローブと共に用いられる。変性の温度及びハイブリダイゼーションの温度のみが、オリゴヌクレオチドプローブの長さ（より正確には、融点Ｔm）が変化すると共に変えられる。ハイブリダイゼーション温度及び変性温度は両方ともオリゴヌクレオチドプローブの長さ（又はＴm）の関数である。
一般に、オリゴヌクレオチドプローブ対は、核酸標的配列又は標的相補配列当り約105〜1015、好ましくは109〜1015モル過剰に存在するだろう。診断目的に用いられるべき対の正確な量は、サンプル中の核酸標的の量についての不正確さのため知ることができない。しかしながら、1015のオリゴヌクレオチドプローブ対の平均量を用いることが、典型的な診断アッセイ形態で適用できる。本発明の方法の効能を改良するいずれの場合においても大量のモルの過剰が好ましい。
化学官能基は、両方のオリゴヌクレオチドプローブの標的ハイブリダイジング配列が標的配列とハイブリダイズしなかったならオリゴヌクレオチドプローブと一緒に反応すること及び連結することから妨げられるので、標的独立性の連結オリゴヌクレオチド生成物の形成が避けられる。
配列変換の検出のための本発明の方法の化学的増幅過程の記載
本発明の方法の第２の実施形態において、それは標的核酸配列の中のヌクレオチド変換の検出のために用いられる。簡潔に記載されるように、本発明の方法は、標的核酸配列中のヌクレオチド変換の検出のために用いられる場合、例えば点変異、例えば一塩基対変換のような単一の塩基変換を検出するのに十分にセンシティブである。
本発明の方法の配列変換を検出するための能力は、標的官能基配列中の点変異のような単一塩基変換の検出について本明細書に記載されよう。
これにより、２セットの４つのオリゴヌクレオチドプローブがデザインされる。第１のセットは野生型配列を増幅するようにデザインされ、１，１’，２及び２’で示される４つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、テストサンプル中の標的核酸の存在の検出のために用いられる上述のものに、それらの構築、即ち保護及び標的配列の配置において類似している。第２のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、３，３’，４及び４’で示されるオリゴヌクレオチドプローブからなる。第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ３，３’４及び４’の構築は第１のオリゴヌクレオチドプローブセットの各々オリゴヌクレオチドプローブ１，１’２及び２’の構築に似ている。第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ３’及び４の配列は、各々第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２の配列に類似し、他方第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ３及び４’は、標的核酸配列又は標的核酸相補配列各々における決められた配列変換に相補的である位置において、第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブ１’及び２からそれらの配列において異なる。これらの位置において、オリゴヌクレオチドプローブ３及び４’は、各々変異標的配列及び変異標的相補配列に十分に相補的である。更に、オリゴヌクレオチドプローブ３，３’４及び４’の同学の位置に、化学官能基Ｘ３，Ｘ４，Ｙ３及びＹ４が位置し、ここでＸ３及びＹ３化学官能基はオリゴヌクレオチドプローブ３及び４が変異標的核酸配列にハイブリダイズした時に化学結合を形成することができ、そしてＸ４及びＹ４はオリゴヌクレオチドプローブ３’及び４’が変異標的核酸相補配列にハイブリダイズした時に化学結合を形成することができる。第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブセットを構成するオリゴヌクレオチドプローブの中でのこれらの類似性及び差は、野生型及び変異（標的核酸配列からみて、Ａ→Ｇの点変異）標的核酸配列及び相補配列と共に図21に概略的に示される。
本発明の方法のその最も簡単な形態における第２の実施形態に従う微小な配列変換検出手順の実行のために、２つの反応容器が用いられる。第１の反応容器には、核酸サンプル、上述の増幅過程を行うための適切な緩衝液及び第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれ、これらのプローブはオリゴヌクレオチドプローブ１，１’２及び２’である。第２の反応容器には、核酸サンプル、適切な緩衝液及び第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれ、これらのプローブはオリゴヌクレオチドプローブ３，３’，４及び４’である。先に概説されるように、適切な回数の増幅サイクルが行われ、増幅の後、容器の各々の中の増幅生成物の存在又は欠如を決定するための検出手順が行われる。
検査される核酸サンプル中に含まれる標的核酸配列が野生型ヌクレオチドについてホモ接合であるなら（上述の例におけるＡ）、増幅生成物は、検査されるヌクレオチド部位において各々野生型標的核酸配列に、及び野生型標的核酸相補配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ１，２，１’及び２’を含む第１の反応容器中にのみ蓄積するであろう。他方増幅生成物は、検査されるヌクレオチド部位において、各々野生型標的核酸配列に、及び野生型標的核酸相補配列に相補的でないオリゴヌクレオチドプローブ３，４，３’及び４’を含む第２の反応容器内に蓄積しないだろう。他方、検査される核酸サンプル中に含まれる標的核酸配列が変異ヌクレオチドについてホモ接合であるなら（上述の例におけるＧ）、増幅生成物は、検査されるヌクレオチド部位において各々変異標的核酸配列に、及び変異標的核酸相補配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ３，４，３’及び４’を含む第２の反応容器中にのみ蓄積するであろう。他方増幅生成物は、検査されるヌクレオチド部位において、各々変異標的核酸配列に、及び変異標的核酸相補配列に相補的でないオリゴヌクレオチドプローブ１，２，１’及び２’を含む第１の反応容器内に蓄積しないだろう。検査される核酸サンプル中に含まれる標的核酸配列が異型接合であるなら、即ち検査される核酸サンプルが野生型及び変異核酸配列並びにそれらに対応する核酸相補配列の両方を含むなら、増幅生成物は両方の反応容器に蓄積するだろう。それゆえ、検査される核酸配列が特定の個体から得られるなら、変異部位における個体の遺伝子型（即ち個体が野生型又は変異配列についてホモ接合であるか否か、又は個体がヘテロ接合であるか否か）を決定することができる。
本発明の方法の第２の実施形態に従う微小な配列変換検出手順の実行のためのより精巧な形態において、野生型配列から得られた増幅生成物が変異配列から得られた増幅生成物から区別できるなら、１つの反応容器を用いることができる。
上述の本発明の方法の第２の実施形態に従う微小な配列変換検出手順が行われる場合、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３及びＸ４化学官能基は、全て又はいくつかが互いに同一であり得るが、上述のより精巧な形態に従って１つの反応容器中で反応が行われる場合、Ｘ１及びＸ２化学官能基がＸ３及びＸ４化学官能基と異なることが好ましい。全ての場合、Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３及びＹ４化学官能基はＸ１，Ｘ２，Ｘ３及びＸ４の対応する化学官能基との化学結合を形成することができるように選択される。
本発明の方法の第２の実施形態が上述のように点変異のような微小な配列変換の検出に役立つためには、オリゴヌクレオチドの構築及び化学官能基の型におけるいくつかの限定が、開示される選択的増幅を可能にするために行われるはずである。オリゴヌクレオチドプローブ１及び３のα’部分並びにオリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’のγ’部分は、１つのヌクレオチド不適正の場合でさえ化学官能基の位置においてハイブリダイズした配列の３次構造にゆがみを生じさせるのに要求される程度に短いべきである。他方、オリゴヌクレオチドプローブ１及び３のα’部分並びにオリゴヌクレオチドプローブ２’及び４’のγ’部分は、それらの間に化学結合を形成した後に化学官能基自体によって生ずる３次構造のゆがみのための増幅の失敗を避けるのに十分に長いべきである。化学官能基はこれらの詳細に適合するように選択されるべきである。それゆえ究極の化学官能基は、同じ長さであるオリゴヌクレオチドプローブ相補対の使用を可能にする許容される程度まで、ハイブリダイズした配列の３次構造をゆがめるものであろう。図22に概略的に示されるように、この場合、化学官能基が接合した（図において、Ｔ１，Ｔ２，Ａ１，Ａ２，Ｃ１，Ｃ２，Ｇ１及びＧ２、並びにＴ３，Ｔ４，Ａ３，Ａ４，Ｃ３，Ｃ４，Ｇ３及びＧ４で示される）修飾ヌクレオチド自体が増幅選択的配列として機能する。
本発明の他の実施形態において、標的配列又は存在するなら標的相補配列の直線的増幅は、上述の過程においてプローブ１，２，３及び４又はプローブ１’，２’，３’及び４’のみを用いることにより行われ得る。
増幅生成物の検出
十分な量の連結オリゴヌクレオチド生成物を形成した後、それは、例えば連結オリゴヌクレオチド生成物の１つのオリゴヌクレオチドプローブメンバー（即ちオリゴヌクレオチドプローブ（又は１’）を固定化し、他のメンバー（即ちオリゴヌクレオチドプローブ２又は２’）を、例えば１以上の放射能、色原性、化学ルミネセンス、又は蛍光成分で標識することにより、又はゲル上での連結オリゴヌクレオチドのサイズ決定を行うことにより、当該技術の慣用的方法によって検出することができる。
オリゴヌクレオチドプローブを標識するための方法は、例えばLearyら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1983）80：4045）；Renz及びKurz（Nucl. Acids res.,（1984）12：3435）；Richardson及びGumport,（Nucl. Acids Res.（1983）11：6167）；Smithら（Nucl. Acids Res.（1985）13：2399）；並びにMeinkoth及びWahl（Anal. Biochem.（1984）138：267）に記載される。
ラベルは放射能であり得る。役立つ放射能ラベルのいくつかの例は、32Ｐ，33Ｐ，125Ｉ，131Ｉ及び3Ｈである。放射能ラベルの使用はU. K. 2,034,323, U. S. 4,358,535及びU. S. 4,302,204に記載される。
非放射能ラベルのいくつかの例は、酵素、発色団、電子顕微鏡によって検出することができる原子及び分子、並びにそれらの磁気特性により検出することができる金属イオンを含む。
いくつかの有用な酵素標識は、基質中で検出可能な変換を引きおこす酵素を含む。いくつかの有用な酵素及びそれらの基質（括弧）は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピロガルロール及びＯ−フェニレンジアミン）、β−ガラクトシダーゼ（フルオレセインβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）及びアルカリホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブル−テトラゾリウム）を含む。酵素標識の使用はU. K. 2,019,404, EP63,879に、及びRotman（Proc. Natl. Acad. Sci., 47, 1981-1991（1961））に記載されている。
有用な発色団は、例えば蛍光、化学ルミネセンス、及び生物発光分子、及び染料を含む。本発明に役立ついくつかの特定の発色団は、例えばフルオレセイン、ロダミン、Texasレッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン及びルミノールを含む。
連結オリゴヌクレオチド生成物の検出は、放射能標識又は非放射能捕獲アッセイのような当該技術で周知である方法によって行われる。例えば、放射能標識を有する連結オリゴヌクレオチド生成物はゲル上の連結オリゴヌクレオチド生成物のサイジングの後のオートラジオグラフィーによって検出される。あるいは、連結オリゴヌクレオチド生成物は、例えばビオチンのようなレセプターをオリゴヌクレオチドプローブ１に結合させ、並びに熱安定性アルカリホスファターゼのような酵素標識をオリゴヌクレオチドプローブ２に結合させることにより、非放射能捕獲アッセイにおいて検出される。例えばアビジンのようなレセプターのためのリガンドでコードされたマイクロタイタープレートは、プローブに結合したビオチンを通してオリゴヌクレオチドプローブ１を捕獲するのに用いられる。オリゴヌクレオチドプローブ２に結合した酵素標識は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブル−テトラゾリウムのような色原物質に露出され、そして例えば、基質中の比色変化は、例えば溶液の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより検出される。
ラベルは、当該技術で公知である方法によってオリゴヌクレオチドプローブに接合され得る。ラベルは、オリゴヌクレオチドプローブ上の官能基を通して直接結合することができる。適切な基のいくつかの例は、例えば、アミノ、カルボキシ、スルフィドリル、メラミド、イソシアネート及びイソチオシアネートを含む。
あるいは、酵素及び発色団分子のようなラベルは、ジアルデヒド、カルボジイミド等のようなカップリング剤によってオリゴヌクレオチドプローブに接合することができる。
ラベルは、上述の方法によりオリゴヌクレオチドプローブに結合したリガンド並びにラベルに結合したリガンドのためのレセプターによってもオリゴヌクレオチドプローブに接合され得る。周知のリガンド−レセプターの組み合わせのいずれも適している。いくつかの適切なリガンド−レセプター対は、例えばビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジン、並びに抗原−抗体を含む。ビオチン−アビジンの組み合わせが好ましい。
連結オリゴヌクレオチド生成物を検出するためにラベルが用いられるなら、ラベルは、１以上のオリゴヌクレオチドプローブの一部分又は配列に結合され得る。
増幅生成物のその場での検出
十分な回数のサイクルの後、検出可能な量の増幅生成物が形成され、上述の本発明の検出手順に従って検出され得る。しかしながら、好ましくは増幅過程を始める前又は増幅過程が完了した後の、単に反応容器への検出試薬の添加により、形成された増幅生成物の検出を可能にする有効なその場での検出手順を有することが非常に有利である。
増幅生成物をその場で検出するための真っすぐな試みは、それらの間に化学結合が形成された時にそれらが検出可能な化合物を形成するように化学官能基Ｘ１及びＹ１，Ｘ２及びＹ２，Ｘ３及びＹ３及び／又はＸ４及びＹ４をデザインすることである。
検出可能な化合物は、例えばＯ．Ｄ．ユニットにおいて比色的に、又は化合物の化学的性質によって蛍光的に検出され得る。その化合物は、その化合物に対する直接的又は間接的に標識された抗体、例えばモノクローナル抗体によっても検出され得る。
増幅生成物のその場での検出は、本明細書に記載されるようにも行うことができる。
上述の増幅手順を行う間、一本鎖配列Ｂ及びＢ’、及び／又はＤ及びＤ’が得られる。これらの一本鎖配列は増幅手順に特有であり、それゆえ本明細書に記載される２つの検出手順に従って、増幅生成物の存在を検出するために１つ又は全てを用いることができる。
簡明にする目的のために、以下の記載は、主に第１のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの保護配列Ｂ及びＢ’に言及する。同じ記載が第２のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの保護配列Ｄ及びＤ’についても正しいことが理解されるはずである。
保護配列Ｂ及びＢ’のヌクレオチド配列が、それらを互いに相補的であるように選択されるなら、増幅過程が完了した後、増幅生成物内に組み込まれていない全てのＢ及びＢ’保護配列が、オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’のターゲッティング配列Ａ及びＡ’と共に、最後に互いにハイブリダイズし他方増幅生成物内に組み込まれたＢ及びＢ’保護配列は図23の厚い線で示されるように一本鎖のままである。
保護配列Ｂ及びＢ’が配列において万能（Universal）であるように選択される場合、それらは、本発明の第３及び第４の実施形態について本明細書に記載されるであろうように、いずれかの要求される標的核酸配列を検出するのに用いられ得る。
本発明の方法の第３の実施形態において、近接エネルギー転移ラベリングを含むその場での検出過程において２つの標識された検出オリゴヌクレオチドプローブが用いられる。第１の検出オリゴヌクレオチドプローブとして、オリゴヌクレオチド１及び１’の各々保護配列Ｂ及び／又はＢ’が機能する。第１の検出オリゴヌクレオチドプローブは近接ラベル成分Ｒ１に接合される。第２の検出オリゴヌクレオチドＢ１及び／又はＢ’１に対応する第２の近接ラベル成分Ｒ２に接合される。図24に示すように、第２の検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ２は各々保護配列Ｂ及びＢ’に相補的である。本発明の好ましい実施形態において、第２の検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ’１は図25に示すように直接又は間接的に連結されて連続分子Ｂ１−Ｂ’１を形成する。
２つの標識検出オリゴヌクレオチドプローブは互いにハイブリダイズして、それゆえそれらの相互作用について検出可能なシグナルを形成するのに十分に近くに近接ラベル成分Ｒ１及びＲ２を運ぶ。検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ’１が各々個々の分子である場合、図24に示される種類のハイブリダイゼーションが形成され、他方検出オリゴヌクレオチドプローブＢ１及びＢ’１が連結して連続分子Ｂ１−Ｂ’１（図25の−・−）を形成するなら、ハイブリダイゼーションは、図25に示されるようなＢ１−Ｂ’１を通して互いに結合した種々の数の増幅生成物から構成される凝集物を形成させる（ここで・・・は、付加的増幅生成物の連結位置を示す）。
２つの標識検出オリゴヌクレオチドプローブ、例えばＢ及びＢ１がハイブリダイズした場合、近接ラベリング成分Ｒ１及びＲ２はそれらの間にエネルギー転移反応がおこることを可能にする近位に運ばれ、結果として測定可能なエネルギーが放射される。
例えば、第１の近接ラベルＲ１はエネルギー供与体であり得、第２の近接ラベルＲ２はエネルギー受容体であり得る。例えば、蛍光又は化学ルミネセンス化合物のようなエネルギー供与体は、第２の近接ラベルとして利用されるロダミンのようなエネルギー受容体と共に１つの近接ラベルとして用いられ得る。
上述の検出手順は、それが要求する全てが付加的オリゴヌクレオチドプローブ（Ｂ１及び／又はＢ’１又はＢ１−Ｂ’１）及びハイブリダイゼーションの１つの付加的サイクルであるので、増幅手順と組み合わせて比較的簡単に用いられる。
Ｒ２近接ラベリング成分が結合する第２の検出オリゴヌクレオチドプローブは、増幅過程を始める前に、全ての他の試薬と共に反応容器に添加され得、又は増幅過程が完了した後、反応容器に添加され得る。
次に、標的核酸が検査されるサンプル内に含まれないなら、増幅はおこらず、全てのＢ及びＢ’配列はオリゴヌクレオチドプローブ１及び１’の各々ターゲッティング配列Ａ及びＡ’と共に互いにハイブリダイズし、それゆえ第２の近接ラベリング検出オリゴヌクレオチドプローブはそれらとハイブリダイズせず、シグナルが形成されない。
その実施形態が微小な配列変換の検出を目的とする本発明の方法の第２の実施形態が行われるなら、オリゴヌクレオチドプローブセットの各々での異なる近接ラベリング成分（即ち適切に近位に運ばれた時に異なるシグナルを発するもの）の使用は、シグナル反応容器中の野生型又は変異核酸配列の配列識別的増幅を行うことができよう。
更に、本発明の方法の第４の実施形態において、増幅生成物のその場での検出は、増幅生成物へ組み込まれた一本鎖Ｂ及び／又はＢ’配列に接合したラベル成分Ｌの遊離、並びにオリゴヌクレオチドプローブ１及び／又は１’に接合したアフィニティー分離成分Ｓによる、テスト容器からの全ての二本鎖Ｂ及びＢ’配列並びにそれらに接合したラベル成分の除去に基づく。
上述のように、増幅過程を終えた後、増幅生成物内に組み込まれた保護配列Ｂ及びＢ’は、反応容器中で唯一のＢ及びＢ’一本鎖配列である。なぜなら、増幅生成物内に組み込まれていないオリゴヌクレオチドプローブ１及び１’の保護配列Ｂ及びＢ’は上述のように互いにハイブリダイズするからである。これらの一本鎖Ｂ及びＢ’配列は、例えば一本鎖特異的ヌクレアーゼの使用又は適切な方法によりヌクレアーゼ処理され（nucleated）得、結果として周囲の溶液に、それらに接合したラベル成分Ｌを遊離させる。
本発明の方法の増幅反応に用いられる１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブの１又は複数の位置に、例えばオリゴヌクレオチドプローブ１及び１’各々のターゲッティング配列Ａ及びＡ’に沿った種々の位置に、１又は複数のアフィニティー分離成分Ｓが接合される。アフィニティー分離成分Ｓは、高アフィニティーで対の一方の成分Ｓ’に結合する能力を特徴とする。アフィニティー分離成分Ｓは、例えばハプテン又はビオチンであれば、その対の他方の成分はそれゆえ各々適切な抗体又はアビジンもしくはストレプトアビジンであり得る。対の他方のアフィニティー分離成分Ｓ’は好ましくは、固体支持体、例えばプラスチック、デキストラン、ガラスもしくは磁気ビーズ、又は好ましくは反応容器の頂部に、例えばスクリューキャップに結合される。
増幅の後、上述の機能を行うのに適したヌクレアーゼである一本鎖特異的ヌクレアーゼ、例えば一本鎖DNAの３’及び５’端の両方から作用するプロセッシブ一本鎖エンドヌクレアーゼである大腸菌からのエキソヌクレアーゼVII（例えばBerk A. J.ら（Cell 12：721-732（1977））及びGoff Sら（Proc. Natl. Sci. USA 75：1763-1767（1978）））が、適切な緩衝液と共に反応容器に添加される。あるいは、一本鎖配列の特異的デグラデーションを目的とする適切な化学的過程が用いられる。その混合液は、増幅生成物に組み込まれる一本鎖配列Ｂ及びＢ’を分解するために、適切な条件（例えばヌクレアーゼが用いられるなら、30分；37℃）でインキュベートされる。増幅生成物に組み込まれないＢ及びＢ’配列は、オリゴヌクレオチド１及び１’各々のＡ及びＡ’ターゲッティング配列と共に互いにハイブリダイズし、それゆえ、例えばヌクレアーゼにより分解（nuleated）されない。核酸分解の結果は、増幅のレベルに比例する量における溶液へのラベル成分Ｌの遊離である。核酸分解の結果を図26に示す。これにより遊離されるラベル成分Ｌ、即ち増幅生成物中に組み込まれない配列Ｂ又はＢ’に接合したラベル成分は、アフィニティー分離により、例えば180°だけ反応容器を回転させることにより除去され、ビオチンのような分離成分Ｓ、所定の例におけるアビジンのようなアフィニティー分離の対の他方の分子Ｓ’でコートされたスクリューキャップに吸着される。例えばフルオレセインのような遊離されたラベル成分Ｌはこれにより、所定の例において、蛍光測定により検出され得る。好ましい実施形態において、対の他方Ｓ’は、180°だけ反応容器を回転させることにより反応から除去され得る磁気ビーズに結合し、図27に示されるような容器のキャップ内に埋め込まれた磁石へのビーズの吸着を導く。
次に、標的核酸が検査されるサンプル中に含まれないなら、増幅はおこらず、全てのＢ及びＢ’配列は互いにハイブリダイズし、一本鎖特異的ヌクレアーゼの添加によって検出可能なラベル成分Ｌの遊離がおこらず、それゆえ、固体支持体へのアフィニティー分離成分の吸着の後、反応容器内にラベルが検出されない。
簡明さの目的のために、上述の増幅及び検出手順とは一本鎖核酸の増幅及び検出をいうが、サンプルの核酸当りにより多くのオリゴヌクレオチドプローブが、種々の標的核酸配列変換を検出するため、及び上述のように１つの反応容器を用いて配列変換を検出するために、本発明の方法に用いることができることが理解されるはずである。同じサンプルの核酸の異なる配列からの連結したオリゴヌクレオチドプローブは、例えば異なるラベル、検出法、又は明らかに異なる長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、互いから区別され得る。各々の標的核酸配列が２セットのオリゴヌクレオチドプローブによってテストされ得ることも理解されるはずである。この場合、検出は、二重チェックとして２回、モニターされる。
先行技術と比較した本発明の方法の利点
本発明の好ましい実施形態による方法は、核酸増幅及び配列変換の検出を目的とした先行技術の方法に対していくつかの利点を有する。
酵素ベースの方法、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ASO）ハイブリダイゼーション；逆−ASO；制限部位発生性PCR（PG−PCR）；変性／温度勾配ゲル電気泳動（Ｄ／TGGE）；一本鎖コンホメーション多形性（SSCP）；ヘテロ二本鎖分析；制限フラグメント長多形性（RFLP）；PCR制限フラグメント長多形性（PCR−RFLP）；ヌクレアーゼ保護アッセイ；化学開裂及び他のほとんど用いられない方法が考えられる限り、本発明の方法は、標的核酸配列の選択的増幅のための酵素無含有システムとして機能し、いくつかの利点を有する。
第１に、本発明の方法は、（ａ）１〜２の簡単なステップを含み、ゲル電気泳動及び／又は複雑なブロッティング及びハイブリダイゼーション手順のような複雑なステップを含まない増幅及び検出手順の正確な実行、並びに（ｂ）結果を解釈するために、高度な技術者を要求しない。
第２に、いずれかの新しい、DNA変換の検査の前に、厳密な較正ステップが要求されない。
第３に、理論的に、本発明の方法は、全ての配列変換の検出のために適している。
第４に、本発明の方法は自動化が容易である。
第５に、本発明の方法は、高価であることに加えて、不要なヌクレアーゼ汚染の活性及び濃度における多くのバリエーションを示すDNA及びRNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ一本鎖特異的エンド−及びエキソヌクレアーゼ等のような酵素の使用に基づかない。
化学的増幅反応（CAR）（国際PCT出願US94/06690）が考えられる限り、以下のことがある。
第１に、上述のように、CAR法は、高い熱動力学的安定性の架橋構造（図３）が形成され得、増幅に基づいてテンプレート独立性の誤った陽性増幅生成物を生じ得る主な欠点を有する。本発明の方法のオリゴヌクレオチドプローブ構築は、図３に示されるもののような標的核酸配列独立性の安定なハイブリダイゼーション構造の形成を避けるように注意深くデザインされた。しかしながら、本発明に用いられる保護配列はそれらの長さによって制限されない。この特徴は、上述の検出手順について有利となる。
第２に、本発明の方法は、点変異のような微小な配列変換により異なる配列を十分に選択的に増幅することができ、他方CAR法は、微小な配列変換により異なる標的核酸配列間を識別するのに役立たない。それゆえ、本発明の方法は、種々の遺伝病に関連した変異の分析、並びに病原体のそれを含むサンプル中のいずれかの標的核酸配列の存在を検出するのに適している。本発明の方法の点変異を検出する能力は、標的核酸配列の検査される部位の近く、即ちターゲッティング配列Ａ及びＡ’並びに各々保護配列Ｂ又はＤ及びＢ’又はＤ’の間、並びにターゲッティング配列Ｃ及びＣ’の端における化学官能基の位置のためである。CAR法における化学官能基の位置は標的核酸配列から離れており、それゆえこの方法は点変異のような微小の配列変換により異なる配列間を識別するのに十分にセンシティブでない。
第３に、本発明の方法の好ましい実施形態のいくつかにおいて、本増幅及び検出過程のために要求される全ての試薬は増幅の前にテスト容器内に含まれる。それゆえ、本発明は、テスト容器を開ける必要なく陽性又は陰性シグナルを発生するその特有の能力のため特に有利である。検出方法の簡単さは、本発明の方法によって形成される増幅生成物に特有である一本鎖保護配列Ｂ及びＢ’及び／又はＤ及びＤ’の形成のためである。
本発明による方法は、上述のような手順により、関心の核酸中の特定の位置の各々の異なる対立遺伝子においてヌクレオチド塩基の同一性を決定するのに用いることができる。
本発明による方法は、核酸を含むサンプルの型を検出するのにも用いることができる。このような方法は、１又は複数の特定の位置の各々においてヌクレオチド塩基を同定することを含み、ここでその各々のヌクレオチド塩基は上述の異なるオリゴヌクレオチドプローブセットを用いて同定される。
本発明による方法は、核酸を含むサンプル中で異なる対立遺伝子を同定するのに更に用いることができる。このような方法は、１又は複数の特定の位置の各々に存在するヌクレオチド塩基を同定することを含み、ここでそれらヌクレオチド塩基の各々は上述の方法によって同定される。
本発明による方法の他の適用は、１又は複数の特定の遺伝子座において生物の遺伝子型の決定においてである。このような方法は、ゲノム、ミトコンドリア又は葉緑体DNA又はRNAを含むサンプルを生物から得ることを要求する。関心の核酸における１又は複数の特定の位置の各々に存在するヌクレオチド塩基は上述の方法によって同定される。この方法において、異なる対立遺伝子が同定され、次に生物の遺伝子型は１又は複数の特定の遺伝子座において決定される。
本発明は、核酸のサンプルの型を検出する方法であって、該方法が１又は複数の特定の位置の各々に存在する塩基を同定することからなり、ここで全ての前記ヌクレオチド塩基が上述の方法を用いて同定され、関心の核酸中の各々の特定の位置が異なるオリゴヌクレオチドプローブセットを用いて決定される方法も提供する。各々の位置における各々のヌクレオチド塩基の同一性は個々に決定され得、又は好ましくは、異なる位置におけるヌクレオチド塩基の同一性は、例えば異なるラベル成分について同時に用いて決定され得る。
本発明は、核酸のサンプルの型を検出する方法であって、上述の１又は複数の特定のヌクレオチド配列の存在又は欠損を決定することを含む他の方法も提供する。
本発明は、核酸を含むサンプルの型を検出する更なる方法も提供する。第１に、１又は複数の特定のヌクレオチド配列の存在又は欠如が上述のように決定される。第２に、１又は複数の特定の位置の各々に存在するヌクレオチド塩基が上述のように同定される。
本発明は、核酸を含むサンプル中の異なる対立遺伝子を同定するための方法であって、上述のように１又は複数の特定の位置の各々に存在する塩基を同定することを含む方法を更に提供する。
上述のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、核酸を診断し、又はその型を検出するためのキットとして、適切なハイブリダイゼーション条件下で用いることができる。そのキットは、上述の増幅生成物の検出を目的とした適切な試薬、及びハイブリダイゼーション溶液のような適切な緩衝液を含む。
表１は、特定のタンパク質又は酵素をコードする遺伝子における１又は複数の変異の存在から生ずることが知られている種々の病気の例を列記する。これらの病気のほとんどは劣性の病気である。即ち病気の個体は両方の対立遺伝子に変異を有し、ここでその変異はタンパク質の欠如（遺伝子が発現されない）；不活性状態（変化したアミノ酸配列を有する）；又は要求される量より少く存在する（遺伝子発現が大きく削減される）。
0004216333.tif 000002
病気のための遺伝的基礎を決定するための現在の調査及びポリメラーゼ鎖反応（PCR）のような技術の出現は、構造タンパク質又は酵素生成物をコードするより多くの遺伝子、遺伝子生成物の無発現又は質的もしくは量的に損なわれた生成物の発現のいずれかを導き、それにより病気を生ずるであろう変異の発見及び完全な配列決定を可能にした。これにより、本発明の上述の方法の適用にはかなり広い分野がある。
本発明の方法は、周知の遺伝子領域における特定の病気に関連した変異の診断に用いられる他、血液型、組織分類−HLA型、性別決定又は特定の病気に対する個体の感受可能性に関連する特定の配列の存在をテストするのに用いることもできる。組織分類は、例えば特定の個体に特異的である多形性を同定することによって決定することができる。本方法によりこれらの周知のHLA遺伝子配列をスクリーニングすることも、問題の個体が、個体が有する特定のHLA遺伝子と相関する特定の病気、例えば特定の自己免疫病に対する感受性があるか否かを決定するための診断具として用いられ得る。
上述のように、本発明の方法は、特定の遺伝子、例えばβ−グロビン遺伝子クラスター及び種々の周知の繰り返し配列における多形性が、例えば犯罪の現場において得られた血液又は精子サンプルにおいて決定され得る法医学の分野にも適用することができ、その結果は、特定の容疑者が犯罪に関係するか否かを示すのに用いられる。同様に、上述の決定は、父性が争われた場合に特定の雄性個体が父であるか否かを決定するのにも用いることができる。
特定の癌が特定の遺伝子の配列における特定の点変異の結果であり得るという証拠があり、従って、本方法は、これらの癌を最も進行させやすいと考えられる一般的集団又は個体をスクリーニングするための早期診断具として用いられ得る。
上述のような本発明の他の適用は、サンプル中の特定の配列の存在に基づくサンプル中の微生物の検出である。例えば、バクテリア又はウイルスのような微生物により感染した疑いのある個体を、個体中に存在する配列なしで、特定のバクテリア及び／又はウイルスDNA配列のみとアニールするオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを用いることによりテストすることができる。このような適用の一例は、AIDSウイルスの存在についての個体のスクリーニングである。同様に、サンプル中のバクテリアの異なる種又は株は互いに区別することができる。例えば普通の方法によって互いを区別するのが難かしいシゲラ（Shigella）対サルモネラ（Salmonella）バクテリアである。
先の表１に示される全てに対応する遺伝子領域及び多くの他のものは、遺伝子領域内のいずれかの数の部位における１以上の点又は他の変異の存在、又はいずれかの特定の対立遺伝子についての多形性の存在、又はテストされるべき個体が特定の変異についてホモ接合であるかヘテロ接合であるか（即ち保有者）、又は個体がこの特定の位置において通常であるか（即ち２つの通常の対立遺伝子を有する）について分析することができる。
本方法は、放射能材料、各々の変異についての異なるハイブリダイゼーションもしくはPCR条件、特定のゲル又は高価な自動シーケンサーを用いる古典的な変異検出法の極めて有効な代替物であり得る。本方法は、短い時間で多くの異なるサンプルをスクリーニングする可能性を有する大規模診断手順を可能にする。更に、本方法は、広範囲の遺伝病及び遺伝子性癌等のような遺伝子異常について集団スクリーニングするための手段を供し、HLA遺伝子におけるもののような多形性をスクリーニングすること、又は病原性RNAもしくはDNAの存在又は異なる株のバクテリアもしくはウイルスの差について検出するのに容易に適合させることができる。
本発明は、以下の実施例により更に詳説されよう。
実施例１
ヒトパピローマウイルスタイプ16ゲノム中に含まれる54塩基対DNA配列を増幅及び検出するための本発明の増幅及び検出方法の使用
増幅及び検出されるべき領域は、次の配列（配列番号：１）：
0004216333.tif 000003
を有するヒトパピローマウイルスタイプ16（HPV−16）ゲノムのヌクレオチド塩基番号800〜854（Seedorf, Kら（Virology 145, 181-185（1985）に従う番号））にわたる二本鎖配列である。
１，１’，２及び２’として示される４つのオリゴヌクレオチドプローブを、上述の標的配列を増幅するのに用いる。オリゴヌクレオチドプローブは次の配列を有する。
0004216333.tif 000004
スラシュラインは単に、オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’各々のターゲッティング配列Ａ及びＡ’並びに保護配列Ｂ及びＢ’の間の境界を示す。一本の縦線は、オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’各々のターゲッティング配列Ａ及びＡ’並びに保護配列Ｂ及びＢ’の連結部分間のターゲッティング配列Ａ及びＡ’の端に位置したウリジン残基上の置換基に化学官能基Ｘ１及びＸ２を結合する化学結合を示す。
この例において、Ｘ及びＹ化学官能基間のDiels−Alder反応が示される。更に、この例において、Ｘ１及びＸ２化学官能基は同じであり、Ｙ１及びＹ２化学官能基も同じであり、それゆえそれらはこの例においてＸ及びＹ化学官能基として言及されよう。
上述のオリゴヌクレオチドプローブに見られ得るように、Ｘ及びＹ化学官能基は、ウリジン残基に結合される。Diels−Alder反応においてジエノフィルとして機能するＹ基は、各々リボース成分のＣ−２’位を通して２’アミノメチルウリジンに結合され、他方ジエンとして機能するＸ基は各々ウリジン塩基成分のＣ−５位に結合される。
ウリジン残基の２’位によるプローブ２及び２’へのＹ基の結合のための２’−トリフルオロアセタミドメチルウリジンホスホルアミジト誘導体の合成
要求される化学官能基が後にそれに共有結合するように、ウリジン残基を修飾し、その後慣用的方法を用いて段階的にオリゴヌクレオチドプローブを合成し、修飾ウリジンをいずれかの要求される位置に配する。オリゴヌクレオチドプローブを合成した後、Ｙ化学官能基を修飾ウリジン残基に結合させる。この例において、プローブ２及び２’のＹ化学官能基は２−ブテンジオール酸誘導体である。
１．２’−デオキシ−２’−Ｃ−トリフルオロアセタミドメチルウリジンの合成
ヌクレオシド２’−ジオキシ−２−アジドメチルウリジンは、Ioannidisら（Nucleosides & Nucleotides, 11：1205（1992））に記載される手順に従って調製することができる。これにより、メタノール（200ml）中10mmolのアジド化合物（2.83グラム）を含む溶液を調製し、60分，10％パラジウム−オン−カーボン触媒（1.4グラム）と共に、水素雰囲気中で激しく撹拌する。その混合液をろ過してエバポレートし、そしてアミノメチルウリジンを油状粗物として残す。これにより調製されたアミノ生成物を、更なる精製なしに以下のステップに用いる。
０℃に冷やした酢酸エチル中10mmolのＣ−２’−アミノメチルウリジン（2.5ｇ）及び10mmolのトリエチルアミン（1.1ｇ）を含む溶液に、酢酸エチル（30ml）中11mmolのトリフルオロ酢酸無水物（2.31ｇ）を含む溶液を滴下して加える。その混合液を３時間、撹拌し、次に酢酸エチル−水での抽出を行う。その有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。その溶媒をエバポレートして乾燥させる。更なる精製のために、その生成物はシリカゲルカラムで分離することができる。
２．５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−トリフルオロアセタミド−メチルウリジンの調製
乾燥ピリジン中に10mmolの４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（3.38ｇ）を含む溶液を、10mmolのトリフルオロアセタミドウリジン（3.54グラム）を含む乾燥ピリジン（100ml）の冷やした（０℃）溶液に滴下して加える。その混合液を３時間、撹拌し、そのピリジンを乾燥するまでエバポレートする。油状の生成物を酢酸エチル中に溶かし、水、ブラインで洗浄して、その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。その混合液をエバポレートして乾燥させ、そしてその生成物は更にシリカゲルカラムで精製し得る。
３．５’−ジメトキシトリチル−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミジト−２’−Ｃ−トリフルオロアセタミド−メチルウリジンの調製
10mmolの５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｃ−トリフルオロアセタミド−メチルウリジン（6.56グラム）及び20mmolのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（2.60グラム）をアルゴン下で乾燥ジウロロメタン（50ml）中に溶かし、そしてその溶液を０℃に維持する。この溶液に、25mlの乾燥ジクロロメタン中の10mmolの２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミジド（Aldrich）（2.36グラム）を滴下して加える。その反応を10分間、撹拌し、更に10分間、室温に維持する、その混合液に酢酸エチル（250ml）を加え、ブラインで３回抽出する。その溶媒を真空下で除去して、トルエン（50ml）を加え、その混合液を凍結乾燥させて白色粉体を残し、アルゴン下で収集する。
ウリジンホスホルアミジト誘導体によるＸ化学官能基のプローブ１及び１’への結合のためのＣ−５位におけるウリジンの誘導体化
この例において、プローブ１及び１’のＸ化学官能基は、各々ウリジン塩基のＣ−５位への二重結合Ｃ＝Ｃの結合から誘導されるジエンである。いくつかのジエンが結合することができた。ウリジンのＣ−５位への二重結合の結合は、Bergstromら（J. Amer. Chem. Soc., 100：8106（1977））により記載される。好ましい例は、この文献に従うＣ−５位へのプロピレンの結合である。
５’−ジメトキシトリチル−（−５−プロピレン−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎジイソプロピル）ホスホルアミジトの調製をRuth J. Rら（DNA 4：93,（1985））及びEP135 587に従って、並びに上述のように行った。
上述のオリゴヌクレオチドの全ては以下の手順によって合成され、精製される。
１．自動合成手順
２−シアノエチルホスホルアミジトをApplied Biosystems Inc.から購入する。自動合成手順は、Applied Biosystems Inc.からのタイプ380B−02DNAシンセサイザンを用いる、30mgのヌクレオシド誘導体化制御孔ガラス（CPG）ビーズ支持体（500オングストローム孔径）へのヌクレオシドホスホルアミジトの結合を含む。そのサイクル（各々30分）は、ジクロロメタン中の２％トリクロロ酢酸での脱トリチル化；活性プロトン供与体としてテトラゾールを用いる縮合；無水酢酸及びジメチルアミノピリジンでのキャッピング、ジクロロメタン中２％トリクロロ酢酸を用いる脱トリチル化；及び0.1ＭのＩ2／H2O／ルチジン／テトラヒドロフランでの亜リン酸塩のリン酸塩への酸化を含む。各々のステップにおける収量は本質的に定量的であり、脱トリチル化の間に遊離されたジメトキシトリチルアルコールを収集し、それを分光光度的に検査することによりモニターされる。
２．オリゴデオキシリボヌクレオチド脱保護及び精製手順
固体支持体をカラムから除き、閉じたチューブ内で60℃で16時間、１mlの農水酸化アンモニウムに露出する。アンモニアを除去して、その残留物をTris−ボレート−EDTA（TBE）緩衝液（pH8.0）を用いる７Ｍ尿素を含む、調製用12％ポリアクリルアミドゲルに適用する。電気泳動を20ボルト／cmで５時間、行った後、生成物を含むバンドを蛍光プレートのUV投影により同定する。そのバンドを切除し、室温で一晩、１mlの２回蒸留水で溶出する。この溶液をろ過し、その上清をｎ−ブタノールで抽出する（３×300マイクロリッター）。その水性相をSephadex G 50カラム（Pharmacia）（１×10cm）の頂上に置き、２回蒸留水で溶出する。その溶出液を260nmにおけるUV吸光度によりモニターし、適切な画分を収集し、固定量におけるUV吸光度により定量して、真空遠心機において室温で乾燥するまでエバポレートする。
プローブ２及びプローブ２’のＹ化学官能基を調製するためのウリジン残基に結合したアミノメチル基との無水マレイン酸の反応
5.0（5.0 Ｏ．Ｄ．）の光学密度を有する２’−アミノメチル−２’−デオキシウリジンを含む、オリゴヌクレオチドプローブ２及び２’のアリコートを1.5ml使い捨てエッペンドルフチューブ内に各々凍結乾燥して乾燥させる。各々のプローブ調製物を、１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.3）200μｌ中に再構成する。Ｙ化学官能基に結合するために、20ng／mlの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶かされた無水マレイン酸（Aldrich）の200μｌ溶液を、各々のバイアルに加え、次にそれを約12時間、室温（RT）で撹拌する。その混合液の各々を脱塩し、Pharmacia Sephadex NAP−10カラムを通しての遠心により、過剰な化学官能基試薬から精製する。生じた溶液の各々をSephadex G 50カラム（Pharmacia）（１×10cm）で精製する。各々の溶出液を260nmのUV吸光度によりモニターし、適切な画分を収集して、固定量におけるUV吸光度により定量する。プローブ２及び２’の各々を凍結乾燥して乾燥させ、使用するまで４℃に保存する。
増幅
HPV−16配列は、例えば、ブルースクリプトベクター（Stratagene）中で、Seedorfら（Virology 145, 181-185（1985））により開示されるHPV−16配列をクローニングすることにより調製されるプラスミド内に含まれ、20ng／mlの濃度で２回蒸留水中に溶かされる。
本発明の方法に従う上述のHPV−16配列（配列番号：１）の増幅手順は以下のステップを含む。
オリゴヌクレオチドプローブ（１，１’，２及び２’）の各々の1011分子を100μｌの最終容量でハイブリダイゼーション緩衝液中で再構成する。そのハイブリダイゼーション緩衝液は、水中30％の脱イオンホルムアミド（vol／vol）（任意）、0.54ＭのNaCl, 30mMのリン酸ナトリウム（pH7.4）, 0.3mMのEDTA, ５％のデキストランスルフェート500Ｋ m. w.（Sigma）（ｗ／vol）及び0.1％Triton Ｘ−100を含む。
上述のHPV−16標的配列の１μｌサンプルを含むエッペンドルフチューブ（Perkin Elmer）に、４つのオリゴヌクレオチドプローブ１，１’，２及び２’を含むハイブリダイゼーション緩衝液99μｌを加える。対照としての第２のチューブは、全ての試薬を含むが標的配列は100μｌの最終容量である。各々のチューブ中の溶液を静かにボルテキシングする。増幅反応の繰り返しの加熱サイクルの間のエバポレーションを防ぐため、各々のチューブに100μｌの鉱油を加える。
そのチューブをDNA熱サイクラー（Perkin Elmer, Cetus）に入れ、30の加熱及び冷却サイクルにかける。各々のサイクルは、90℃での65秒インキュベーション及び40℃の240秒インキュベーションからなる。
サイクリングの後、各々の溶液20μｌを、ブロモフェノールブルー染料を含む１×TBE（pH8.0）中40％グリセロール２μｌと混合し、３時間、20ボルト／cmで１×TBE緩衝液（pH8.0）を用いる12％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、そのゲルを室温で45分間、臭化エチジウム（水中0.5mg／ml）の100ml溶液中に浸漬する。
そのゲルを、有効な紫外（UV）光源（72,500mW／cm2）下でｆ８において0.5秒間、Polaroid写真フィルムタイプ57又は667（ASA3000）に露出し、これにより10ng程度の少量の連結オリゴヌクレオチド生成物のバンドが検出され得る。
実施例２
エキソヌクレアーゼVIIを用いる増幅生成物のその場での非放射能的検出
エキソヌクレアーゼVIIを用いる増幅された生成物のその場での非放射能的検出のために、実施例１におけるものとしてオリゴヌクレオチドプローブ２及び２’を用い、オリゴヌクレオチドプローブ１の５’端にフルオレセイン分子を、オリゴヌクレオチドプローブ１’の５’端にビオチン分子を以下に示す通り結合させる。
0004216333.tif 000005
オリゴヌクレオチドプローブ１及び１’各々の５’端にフルオレセイン及びビオチンを結合させるために、各々試薬フルオレセインホスホルアミジト及びビオチンホスホルアミジト（Glenn Research）を用いる。
オリゴヌクレオチドプローブ合成及び精製を実施例１に例示されるように行う。
増幅のために、反応チューブを以下の通り作製する。
破壊可能な仕切りにより分離された２つの区画に分割されたプラスチック透明チューブであって、その区画が１つが他の頂部上にあるよう位置し、内部の仕切りが下の区画に面する側面上にアビジン（Sigma）がマートされているチューブを用いる。下の区画は反応混合液を含んでおり、上の区画は10mM Tris Cl, pH8.0；8mM EDTA；10mM β−メルカプトエタノール；及び50μｇ／ml BSAからなる緩衝液中に0.4ユニットのエキソヌクレアーゼVIIを含む。
増幅の後、反応チューブを37℃に維持し、上の区画の成分を、破壊可能仕切りを通して押しつぶして増幅生成物を含む下の区画の成分と混合させる。その反応混合液を、一本鎖Ｂ及びＢ’保護配列を開裂するために、30分間、インキュベートする。
エキソヌクレアーゼVII処理の後、反応チューブを180℃回転させて、10分間、逆さに維持してビオチン化二本鎖DNAをアビジンコートキャップに捕獲させる。その反応チューブを180℃再び回転させ、ヌクレアーゼ活性により一本鎖βフラグメントから溶液に遊離されたフルオレセインを、フルオロメーター（Perkin Elmer）により検出する。
実施例３
ヒトｐ53遺伝子のコドン245（GGC→GAC）点変異を検出するための本発明の増幅及び検出法の使用
ヒトｐ53遺伝子の58bpフラグメントを増幅するために、２つのオリゴヌクレオチドプローブセットをデザインする。第１のオリゴヌクレオチドプローブセットは以下の配列（配列番号：６）：
0004216333.tif 000006
を有する遺伝子の野生型配列を増幅するようデザインする。
第２のオリゴヌクレオチドプローブセットは、次の配列（配列暗号：７）：
0004216333.tif 000007
を有する遺伝子の変異配列を増幅するようデザインされる。
第１のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、次のもの：
0004216333.tif 000008
を含む。
第１のオリゴヌクレオチドプローブセットを用いて増幅された野生株配列のための検出方法は近接エネルギー転位ラベリングである。第１の検出オリゴヌクレオチドプローブとしてオリゴヌクレオチドプローブ１の保護配列Ｂが機能する。第１の検出オリゴヌクレオチドプローブはフルオレセイン近接ラベルに接合される。第２の検出オリゴヌクレオチドプローブＢ．１（以下に示す配列番号：12）は、対応する第２のロダミン近接ラベル成分に接合される。２つのラベル検出オリゴヌクレオチドプローブは互いにハイブリダイズし、それゆえ近接ラベル成分フルオレセイン及びロダミンを、それらの相互作用のために十分に近くに運び、検出可能なシグナルを発生する。２つの標識検出オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした場合、近接ラベル成分フルオレセイン及びロダミンは、それらの間のエネルギー転移反応がおこるのを可能にする近位に運ばれ、結果として蛍光測定（励起472nm読み出し577nm）によって測定され得る測定可能なエネルギー放射を生ずる。
0004216333.tif 000009
第２のセットのオリゴヌクレオチドプローブは次のもの：
0004216333.tif 000010
を含む。
第２のオリゴヌクレオチドプローブセットを用いて増幅される変異配列のための検出方法は、増幅生成物内に組み込まれる一本鎖Ｄ配列に接合したイソルミノールラベル成分の遊離、並びにオリゴヌクレオチドプローブ４に接合したアフィニティー分離成分ビオチンによるテスト容器からの、それらに接合したイソルミノールラベル成分を伴う全ての二本鎖Ｄ配列の除去に基づく。一本鎖Ｄ配列は、一本鎖特異的ヌクレアーゼである大腸菌からのエキソヌクレアーゼVIIの核酸分解活性により増幅後に分解される（nucleated）。これは、一本鎖Ｄ配列に接合したイソルミノールラベル成分を周囲溶液へ遊離させる。これにより遊離されないイソルミノールラベル成分、即ち増幅生成物に組み込まれない配列Ｄに接合したラベル成分はアフィニティー分離によって除去される。これにより、遊離したイソルミノールラベル成分は発光測定によって検出され得る。
オリゴヌクレオチドプローブ合成及び精製は本質的に実施例１に例示される通りに行われる。
本実施例下に記載される実験は、検査される個体のｐ53遺伝子のコドン245における遺伝子型の決定を目的とし、検査される個体に存在するゲノムDNAが決定される野生型及び変異配列の両方の同時検出手順と組み合わせた同時増幅手順に基づく。
増幅及び検出反応の組み合わせのために、チューブは以下のように作製される。
図27に示されるような、それらのキャップ内に埋め込まれた磁石を有する透明のチューブが、実施例１では１つのセットのみが用いられるが、この例における各々のチューブにおける２つのオリゴヌクレオチドプローブセットの使用を除いて実施例１下に本質的に記載されるように行われる実験及び対照増幅反応のための容器として用いられる。
実験チューブは、遺伝子型が決定されるべき個体から得られたゲノムDNAを含む。この増幅及び検出手順の組み合わせの対照として、４つの更なる同様のチューブを用いる。第１のものは、標的DNA配列を含まず、それゆえ陰性対照として機能し、いずれの検出方法によって得られたシグナルも生じないはずである。第２のものは、野生型対立遺伝子へのホモ接合が先に示される個体からのゲノムDNAを含み、それゆえ第１の検出方法のための陽性対照としてなり第２の検出法のための陰性対照として機能し、第１の検出法で検出可能なシグナルを生ずるが、第２の検出法では生じないはずである。第３のものは変異対立遺伝子にホモ接合であることが先に示されている個体からのゲノムDNAを含み、それゆえ第２の検出方法のための陽性対照として、そして第１の検出法のための陰性対照として機能し、第２の検出方法において検出可能なシグナルを生ずるが、第１の検出方法においては生じないはずである。第４のものは、野生型及び変異対立遺伝子にヘテロ接合であることが先に示されている個体からのゲノムDNAを含み、それゆえ第１及び第２の検出法のための陽性対照として機能し、第１及び第２の検出法の検出可能なシグナルを生ずるはずである。
増幅後、上述の第２の検出、オリゴヌクレオチドプローブＢ．１を反応チューブに加え、いずれか存在するなら第１の検出オリゴヌクレオチドプローブとして機能する増幅生成物内に組み込まれる一本鎖配列とハイブリダイズさせる。
近接ラベルシグナルの検出の後、反応チューブを37℃にして、70mMのTris Cl, pH8.0；８mMのEDTA；10mMのβ−メルカプトエタノール；50μｇ／mlのBSAからなる緩衝液中0.4ユニットのエキソヌクレアーゼVIIをチューブに加える。その反応混合液を、一本鎖Ｄ保護配列を開裂するために、30分間、インキュベートする。エキソヌクレアーゼVII処理後、アビジンコート磁気ビーズを反応チューブに加え、10分間、振とう株において、ビオチン化二本鎖DNAをアビジン分子に捕獲させる。その反応容器を180℃回転させて磁気ビーズをキャップに接着させ、その後反応チューブを180℃回転させて、ヌクレアーゼ活性により、一本鎖Ｄフラグメントから溶液に遊離されたイソルミノールを、ルミノメーター（Perkin Elmer）により検出する。
第１の検出法が陽性シグナルを発するなら、検査した核酸は野生型配列を含み、他方第１の検出法がシグナルを生じないなら、検査した核酸は野生型配列を含まない。第２の検出法が陽性シグナルを発するなら、検査した核酸は変異配列を含み、他方第２の検出法がシグナルを生じないなら、検査した核酸は変異配列を含まない。
これは次の３つの異なる結合を生ずる；（１）第１の検出法が陽性結果であるが第２のものがそうでないなら、検査したDNAサンプルはヒトｐ53遺伝子のコドン245（GGC）についてホモ接合であり；（２）第２の検出法が陽性結果であるが第１のものがそうでないなら、検査したサンプルはヒトｐ53遺伝子のコドン245（GAC）点変異についてホモ接合であり；（３）他方、第１及び第２の検出法の両方とも陽性シグナルを生ずるなら、検査したDNAサンプルはヒトｐ53遺伝子のコドン245において異種であり、即ち１つの対立遺伝子が野生型で第２の対立遺伝子が変移配列を有する。
実施例４
先に詳説される本発明のよる方法の好ましい実施形態を行うための診断キットは次の構成物を含み得る。
サンプル中の特定のヌクレオチド配列のための診断キットは、２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対及び少くとも１の緩衝液からなる。
サンプル中の特定のヌクレオチド配列の存在を検出するための１つの診断キットは、（ａ）２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対；（ｂ）２以上の、近接ラベル成分に接合した検出オリゴヌクレオチドチューブ；及び（ｃ）少くとも１の緩衝液からなる。
サンプル中の特定のヌクレオチド配列の存在を検出するための第２の診断キットは、（ａ）１以上が分離成分に接合し、そして１以上がラベル成分に接合する２以上のオリゴヌクレオチドプローブ相補対；（ｂ）一本鎖特異的ヌクレアーゼ；及び（ｃ）増幅生成物のアフィニティー分離のための固体支持体からなる。
キットが種々の周知の遺伝病、例えば先の表１に列記されるものの１つ又は全ての存在についてスクリーニングするのに用いられる場合、それは特定の病気関連の遺伝子における変異をスクリーニングするためのいずれかの適切な組み合わせにおいて、いずれかの適切な数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定の病気関連遺伝子が１又は複数の変異体、例えばCFTR遺伝子を有し得る場合、キットは、異なる意図した集団について異なり得るより共通の変異をスクリーニングするための特定のオリゴヌクレオチドプローブを含むべきである。キットが血液又は組織型検出分析に用いられる場合、それは特定の血液又は組織型を同定するよう各々デザインされたオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの組み合わせを含み得る。状況により、キットの全ては、病原体の存在、例えばAIDSウイルス又はこのようなウイルス、例えばHIV−Ｉ，HIV−II、もしくはHIV−IIIの特定の株の存在に特異的に対応する核酸配列の存在又は欠損を決定するための更なるオリゴヌクレオチドプローブも含み得る。従って、１つのキットは、単一遺伝子内のいずれかの数の遺伝子部位をテストするために用いることができ、そしてこれは、キットがいくつかの特定のオリゴヌクレオチドプローブを含むことのみを要求し、ここでそのキットの全ての他の構成物は全ての場合、同じである。
本発明は限定された数の実施形態に関して記載されているが、本発明の多くのバリエーション、改良及び他の適用が行われ得ることが認められよう。
配列表
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：54
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１
0004216333.tif 000011
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：34
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２
0004216333.tif 000012
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３
0004216333.tif 000013
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：34
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４
0004216333.tif 000014
（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：27
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５
0004216333.tif 000015
（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：58
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：６
0004216333.tif 000016
（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：58
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：７
0004216333.tif 000017
（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：39
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：８
0004216333.tif 000018
（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：９
0004216333.tif 000019
（２）配列番号：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：39
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：10
0004216333.tif 000020
（２）配列番号：11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：11
0004216333.tif 000021
（２）配列番号：12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：10
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：12
0004216333.tif 000022
（２）配列番号：13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：39
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：13
0004216333.tif 000023
（２）配列番号：14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：14
0004216333.tif 000024
（２）配列番号：15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：39
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：15
0004216333.tif 000025
（２）配列番号：16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：29
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：16
0004216333.tif 000026
【図１】
0004216333.tif 000027
【図２】
0004216333.tif 000028
【図３】
0004216333.tif 000029
【図４】
0004216333.tif 000030
【図５】
0004216333.tif 000031
0004216333.tif 000032
0004216333.tif 000033
【図６】
0004216333.tif 000034
【図７】
0004216333.tif 000035
【図８】
0004216333.tif 000036
【図９】
0004216333.tif 000037
【図１０】
0004216333.tif 000038
【図１１】
0004216333.tif 000039
【図１２】
0004216333.tif 000040
【図１３】
0004216333.tif 000041
【図１４】
0004216333.tif 000042
【図１５】
0004216333.tif 000043
【図１６】
0004216333.tif 000044
【図１７】
0004216333.tif 000045
【図１８】
0004216333.tif 000046
【図１９】
0004216333.tif 000047
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
0004216333.tif 000050
0004216333.tif 000051
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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