(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＮＴＥＳ変異体であって、該変異体は、野性型ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１βに競合的に拮抗するか、あるいはＨＩＶウイルスとケモカインレセプターとの間の相互作用に拮抗する能力を有し、Ｔｈｒ４３からＡｓｎ４６の領域のうちのＡｒｇ４４及びＬｙｓ４５から選択される変異を含み、
変異は、ＧｌｕまたはＡｌａによるＡｒｇ４４の置換であるか、あるいはＧｌｕまたはＡｌａによるＬｙｓ４５の置換であるＲＡＮＴＥＳ変異体。
【請求項２】
ａ）ＡｌａによるＴｙｒ３；
ｂ）ＣｙｓによるＳｅｒ１；
ｃ）ＡｒｇによるＡｓｐ６；
ｄ）ＰｈｅによるＴｙｒ１４；
ｅ）ＡｌａによるＡｒｇ１７；
ｆ）ＧｌｕまたはＡｌａによるＬｙｓ４５；
から選択されるシングル変異をさらに含む請求項１に記載のＲＡＮＴＥＳ変異体。
【請求項３】
Ｎ末端に１つまたは２つの付加的アミノ酸をさらに含む請求項１又は２に記載のＲＡＮＴＥＳ変異体。
【請求項４】
付加的アミノ酸が、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＣｙｓおよびＴｒｐから選択される請求項３に記載のＲＡＮＴＥＳ変異体。
【請求項５】
付加的アミノ酸がＬｅｕである請求項４に記載のＲＡＮＴＥＳ変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＡＮＴＥＳ変異体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６記載の配列を含む真核または原核発現のためのベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＡＮＴＥＳ変異体を含むＨＩＶ阻害活性を有する医薬組成物。
【請求項９】
前記変異体をコードするＤＮＡ断片を含むベクターでトランスフェクトされた真核細胞を培養することを含む請求項１〜５のいずれか１つに記載のＲＡＮＴＥＳ変異体の製造方法。
【請求項１０】
前記ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターは、大腸菌(E.coli)発現ベクターである請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、炎症誘発活性が減少し、ＨＩＶ−抑制活性が増加し、かつ、野性型ケモカインに対する拮抗活性を有するＲＡＮＴＥＳ変異体を提供する。
【０００１】
ケモカインは炎症機構に関与し、また、造血細胞の生理学的循環に関与する小さなタンパク質である。いくつかの研究では、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患および自己免疫疾患において、あるいは喘息などのアレルギー性反応中において白血球を増加させる際のケモカインの重要な役割が示されている (Schall, T.J. The chemokines. In: The cytokine handbook, A Thompson 編、 Academic Press, New York, 1994, p.419-460)。さらに、いくつかのケモカインが最近、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の強力な天然阻害剤として同定されている(Science 270, 1811-1815, 1995)。ケモカイン活性は、異なった特異性を有するレセプターとの相互作用に起因し、細胞表面上に発現する。これらのレセプターのいくつかは、ＨＩＶウイルスのためのコレセプターとして機能する(Science 272,872-877, 1996; Science 272, 1955-1958, 1996) 。このようなコレセプター、特にＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのための特異的レセプターであるＣＣＲ５、およびＳＤＦ−１特異的レセプターであるＣＸＣＲ４の特異な使用は、ＨＩＶ株間の生物学的多様性の主要な決定要素を表す。一般的にウイルス伝達に関与し、感染の無症候性相中に優位を占める、連続的ＣＤ４＋Ｔ細胞系に感染できないＨＩＶ−１株は、コレセプターとして主としてＣＣＲ５を使用し、かつ、ＣＣＲ５結合性ケモカインによる阻害に対して常に感受性を有する(Nature Med., 3:1259-1265, 1997)。したがって、最も有効なこのようなケモカイン、ＲＡＮＴＥＳは、新規な抗ＨＩＶ治療の開発のために研究中である(Nature, 383:400, 1996) 。ＲＡＮＴＥＳは、Ｃ−Ｃ族に属するケモカインであり、６８個のアミノ酸長からなる。その配列は、J. Immunol.(1988)に報告されている。
【０００２】
ＷＯ９６／１７９３５には、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ−１αのアンタゴニストとして、Ｎ末端にメチオニン、ロイシンまたはグルタミンなどのアミノ酸を付加することにより変異したＲＡＮＴＥＳ分子が開示されている。特に、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症または慢性関節リウマチの治療における、その利用が記載されている。
【０００３】
さらに、Elsner J. et al., "European Journal of Immunology, Vol. 27, 2892-2898 (1997)"およびＷＯ９６／１７９３４には、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳペプチドの拮抗活性が開示されている。
野性型ＲＡＮＴＥＳおよびその同じ族の他のケモカインをアレルギー性疾患の治療に使用することもまた、ＷＯ９４／０７５２１およびＷＯ９４／２１２７７に開示されている。
【０００４】
ＷＯ９７／２５３５０には、ＨＩＶ抑制活性を有するＭＩＰ−１αまたはＬＤ７８の分離変異体が開示されており、他方、ＷＯ９８／１３４９５には、生理学的イオン強度下に集合できず、抗ウイルス活性を示すヒトＲＡＮＴＥＳ変異体が開示されている。驚くべきことに、現在では、Ｎ末端に少なくとも１つのアミノ酸を付加および／またはヒトケモカインＲＡＮＴＥＳの成熟形のうち、１番〜１１番のアミノ酸からなるＮ末端領域、および／またはＴｈｒ４３からＡｓｎ４６につながる「４０’ｓループ」中の１つまたは２つ以上のアミノ酸を置換すると、野性型分子に比べて、一次単核血球中およびマクロファージ中の双方において異なったＨＩＶ単離体に対して著しく高い効力、減少した炎症誘発活性および強力な拮抗活性を示すことが見出された。特に、本発明の変異体は、野性型ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１βに、およびＨＩＶウイルスとケモカインレセプターとの間の相互作用に、類似する機構でもって、競合的に拮抗する。好ましくは、参照分子として、J. Immunol. 141:1018-1025, 1988 に記載されている野性型ヒト形において、アミノ酸：Ｓｅｒ１、Ｓｅｒ４、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ３、Ａｓｐ６、Ｔｙｒ１４、Ａｒｇ１７、Ａｒｇ４４、Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ４５およびＡｒｇ４６の１つまたは２つ以上を変異する。好ましくは、アミノ酸、Ｓｅｒ１、Ｓｅｒ４、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ３を中性または疎水性アミノ酸で置換し、Ａｓｐ６を陽性荷電アミノ酸で置換し、Ｔｙｒ１４を疎水性芳香族アミノ酸で、Ａｒｇ１７、Ｌｙｓ３３、Ａｒｇ４４、Ｌｙｓ４５およびＡｒｇ４６を小さな形の疎水性アミノ酸で置換する。
【０００５】
次の変異がより好ましい：ＣｙｓによるＳｅｒ１、ＣｙｓによるＳｅｒ４、ＣｙｓによるＳｅｒ５、ＡｌａによるＴｙｒ３、ＡｒｇによるＡｓｐ６、ＰｈｅによるＴｙｒ１４、ＡｌａによるＡｒｇ１７、Ｌｙｓ３３、Ａｒｇ４４、Ｌｙｓ４５およびＡｒｇ４６。本発明の変異体の第１群は、ａ）ＣｙｓによるＳｅｒ１；ＣｙｓによるＳｅｒ５；ＡｒｇによるＡｓｐ６、またはｂ）ＣｙｓによるＳｅｒ１；ＣｙｓによるＳｅｒ５；ＡｌａによるＡｒｇ１７、またはｃ）ＣｙｓによるＳｅｒ１；ＣｙｓによるＳｅｒ５；ＡｌａによるＡｒｇ４４またはＬｙｓ４５またはＡｒｇ４６から選択されたトリプル変異を特徴とする。第２群は、ａ）ＣｙｓによるＳｅｒ１およびＳｅｒ５；またはｂ）ＣｙｓによるＳｅｒ１およびＳｅｒ４、またはｃ）ＣｙｓによるＳｅｒ１およびＡｌａによるＡｒｇ４４、またはｄ）ＡｒｇによるＡｓｐ６およびＡｌａによるＡｒｇ４４から選択されたダブル変異を特徴とする。第３群は、ａ）ＣｙｓによるＳｅｒ１、ｂ）ＡｌａによるＴｙｒ３、ｃ）ＡｒｇによるＡｓｐ６、ｄ）ＰｈｅによるＴｙｒ１４、ｅ）ＡｌａによるＡｒｇ１７、ｆ）ＡｌａによるＬｙｓ３３、ｇ）ＡｌａによるＡｒｇ４４、ｈ）ＡｌａによるＬｙｓ４５、ｉ）ＡｌａによるＡｒｇ４６から選択されたシングル変異を特徴とする。さらに、上記変異体に好ましくはＬｅｕ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｒｐから選択される２つまでのアミノ酸を、Ｎ末端に付加することができる。例えば、Ｓｅｒ４をＣｙｓで置換してもよく、また同時にＮ末端に付加的Ｃｙｓを加えてもよい。特に、遊離−ＳＨ基を含むシングル変異体Ｃｙｓ１または−１を、さらに化学修飾を行う最適な基質としてもよい。
【０００６】
他の観点において、本発明は内部アミノ酸変異を有しないが、Ｎ末端にさらにアミノ酸、好ましくはＣｙｓを有する野性型ＲＡＮＴＥＳを提供し、ここで該ＲＡＮＴＥＳ誘導体は、抗ＨＩＶおよび抗炎症活性が賦与され、またＮ末端にＬｅｕを付加した野性型ＲＡＮＴＥＳ（Ｌｅｕ（０）ＲＡＮＴＥＳ）の抗ＨＩＶ薬剤としての使用を提供する。
【０００７】
本発明のいくつかの変異体、特に、さらにＣｙｓを１つまたは２つ付加したものの性質は、新規なジスルフィド結合を形成することによる構造的変化によって、決定づけられる可能性がある。ＲＡＮＴＥＳ(Biochem. 1995, 34:9307-9314)の構造またはＳＤＦ−１(EMBO J., 16: 6996:7007, 1997) のような相同分子の構造を考慮すると、Ｎ末端またはＮループ領域は、特定の膜レセプターとの相互作用の３次元部位を形成することに寄与する可能性もある。
【０００８】
他の観点において、本発明はＮ末端、Ｎループおよび／または「４０’ｓループ」領域のＲＡＮＴＥＳ断片に対応するペプチドを提供する。該ペプチドは記述した変異を含み、野性型ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１βに、またはＨＩＶウイルスとケモカインレセプターとの間の相互作用に競合的に拮抗する。
【０００９】
他の観点において、本発明は記述した変異体をコードするヌクレオチド配列、このようなヌクレオチド配列を含む発現ベクター、本発明の変異体に対応する配列およびキャリヤ配列、例えば、活性ペプチドまたはタンパク質の動的薬理学的性質を改善することを目的とする配列を含むキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。さらに、本発明は抗ＨＩＶ薬剤ならびに抗炎症剤、抗アレルギー剤または抗喘息薬剤としてのこのようなＲＡＮＴＥＳ変異体の利用を提供する。
【００１０】
ＲＡＮＴＥＳとの用語は、ヒトＲＡＮＴＥＳと機能的に同等である任意のポリペプチド、ならびに交差反応性種から誘導される同等のタンパク質、ならびに、J. Immunol. 141:1018-1025, 1988 に報告された標準的配列とは異なるであろう、その変異体および対立遺伝子体を意味する。
本発明の変異体は、適当な合成オリゴヌクレオチドを使用して、例えば、部位特異的突然変異の技術を使用して、またはＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＤＮＡクローニング、組換え技術およびインビトロ発現の従来の技術によって調製してもよい。次いで、得られたＤＮＡを原核または真核宿主のための適当な発現ベクター中に挿入する。あるいはまた、ペプチド合成の従来の方法によって変異体を調製することもできる。
【００１１】
予見された治療目的のためには、本発明の変異体を、従来の技術によって調製した適当な医薬用組成物の形態で、ポリペプチドまたはタンパク質活性物質には好適である非経口、舌下、鼻腔内、吸入、または局所的投与経路によって投与する。
投与するポリペプチド量とは、ＨＩＶ感染または複製の有意な阻害、または慢性関節リウマチ、またはアテローム性動脈硬化症などの変性疾患、あるいは喘息、鼻炎および皮膚炎などのアレルギー性疾患において炎症性反応の減少を生じさせるに十分な量である。特定の用量は、臨床試験に基づいて決定され、患者の状態、性、年齢および体重、および状態の重症度などの多くの要因に依存するであろう。本発明の変異体は潜在的に感染に曝される個人におけるＨＩＶ感染の阻止にも使用される。
【００１２】
さらに、真核宿主中で組換タンパク質として産生され、さらに化学的修飾を必要としない、このような変異体をコードするＤＮＡは、治療を必要とする組織（すなわち、リンパ節、関節など）中に直接にその生産を可能とする遺伝子治療用ベクター（例えば、ＭｕＬＶまたはＨＩＶなどのマウスまたはヒトレトロウイルス、またはＨＨＶ−７などのヘルペスウイルス、またはアデノウイルス）中に挿入してもよい。
【００１３】
【実施例】
下記実施例は、本発明をより詳細に説明する。
［実施例１］
ＲＡＮＴＥＳ配列のクローニングと突然変異誘発
従来の技術(Maniatis)に従って、磁性ビーズに結合した抗ＣＤ８抗体(Sigma C7423) に吸収して精製したＣＤ８＋Ｔヒトリンパ球から全ＲＮＡを抽出した。プライマーとしてオリゴ−ｄＴを使用して、逆転写から得たｃＤＮＡを、ＲＡＮＴＥＳをコードする全領域（４３４ｂｐ）を増幅することができる２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）に供した。
【００１４】
Ｐ１＝５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧ；
Ｐ２＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴ
プライマーはＰ１およびＰ２配列中に下線で示した制限部位、５’側にＥｃｏＲＩ（Ｐ１）および３’側にＢａｍＨＩ（Ｐ２）をそれぞれ含むように設計した。増幅後、ＰＣＲ産物を制限酵素、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、ＱＩＡＥＸ(Promega) カラムによって、ゲルから精製し、同じ酵素でポリリンカー中で消化したｐＵＣ１８ベクターＤＮＡ(Promega) に再結合した。
【００１５】
次いで、再結合したＤＮＡを使用して、大腸菌(E.coli)コンピテント細胞（ＪＭ１０９）を形質転換した。いくつかのアンピシリン耐性クローンを選択した後、ＤＮＡを配列決定して、挿入物の同一性を確認した。「重複伸長(overlap extension)」(Gene, 1991, 67:70) と呼ばれる手法に従い、プラスミドＤＮＡをＰＣＲ突然変異誘発のために使用した。このような技術により、通常のプライマー（ベクターの配列にアニールする：Ａ、Ｂ、Ｃ）および種々の変異に特異的な一連のプライマーを使用して、同じ遺伝子中に単一および複数の変異を生じさせた。通常のプライマー配列としては、次のものがある：
プライマーＡ：５’−ＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＡＧＴＡＣＧＣＡＧＣ
プライマーＢ：５’−ＧＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧ
プライマーＣ：５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴ
ｐＶＵ５プラスミドの構築のために、特異的オリゴＣｙｓ１を使用した（５’−ＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧ）。このようなプライマーは１つの塩基変異（Ｇの代わりにＣ）を含み、これは位置１においてＣｙｓによるＳｅｒの置換を決定づける。
【００１６】
特異的オリゴＴｙｒ３をｐＶＵ１４プラスミドの構築のために使用した（５’−ＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧ）。このようなプライマーは２塩基置換を導入し（ＴＡの代わりにＧＣ）、これは位置３においてＡｌａによるＴｙｒの置換を決定づける。
オリゴＣｙｓ１−Ｃｙｓ５をｐＶＵ１５プラスミドの構築のために使用した（５’−ＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧ）。これはプライマーｃｙｓ１の置換（Ｇの代わりにＣ）に加えて、２塩基置換（ＣＧの代わりにＧＣ）を導入する。これは、位置１および５において、ＣｙｓによるＳｅｒのダブル置換を決定づける。
【００１７】
特異的オリゴＡｒｇ１７
（５’−ＣＡＣＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＴＡＧ−ＧＣＡＡＡＧＣ）
をｐＶＵ２４プラスミドの構築のために使用した。このようなプライマーは位置１７においてＡｌａによるＡｒｇの置換を決定づける２塩基置換（ＣＧに代わりにＧＣ）を生じる。
【００１８】
特異的オリゴＡｓｐ６
（５’−ＣＡＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡ）
をｐＶＵ３８プラスミドの構築のために使用した。このようなプライマーは位置６においてＡｒｇによるＡｓｐの置換を決定づける２塩基置換（ＴＧの代わりにＣＧ）を生じる。
【００１９】
特異的オリゴＡｒｇ４４
【化１】
0004323094.tif 000002
をｐＶＵ２６プラスミドの構築のために使用した。このようなプライマーはＧｌｕによるＡｒｇ４４の置換を決定づける２塩基置換（ＣＧの代わりにＴＣ）を生じる。この位置での第２の変異（Ａｒｇ４４−Ａｌａ）は、二重下線のＴをＧに置換したことを除いて同じ配列を有する新規なオリゴを使用して作成した。
【００２０】
特異的オリゴＬｙｓ４５
【化２】
0004323094.tif 000003
をｐＶＵ４３プラスミドの構築のために使用した。このようなプライマーは位置４５においてＧｌｕによるＬｙｓの置換を決定づける１つの塩基置換（Ｔの代わりにＣ、下線部）を生じる。この位置での第２の変異（Ｌｙｓ４５−Ａｌａ）は、二重下線のＴをＧに置換したことを除いて同じ配列を有する新規なオリゴを使用して作成した。
【００２１】
特異的オリゴＬｅｕ−ＲをｐＶＵ１７変異体調製のために使用した（５’−ＡＴＡＴＧＧＧＧＡＴＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡ）。このプライマーには、第１の天然コドンの前に、分子の５’側に３つのヌクレオチド挿入が加えられている。アンチセンス・トリプレットは追加のＮ末端ロイシンをコードする。
【００２２】
特異的オリゴＴｙｒ１４
（５’−ＴＧＧＧＣＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧ）
をｐＶＵ２２プラスミドの構築のために使用した。このようなプライマーは位置１４においてＰｈｅによるＴｙｒ１４の置換を導入する。この位置での第２の変異（Ｔｙｒ１４−Ａｌａ）もまた作成された。
【００２３】
他の変異体は、下記オリゴを使用して調製した。
オリゴＣｙｓ１−Ｃｙｓ４：
５’−ＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧ；
２つのＣ（下線部）による２つのＧの置換は、２つのＣｙｓによる２つのＳｅｒの置換（位置１および４における）を生じる；
オリゴＣｙｓ０−Ｃｙｓ４：
ＣＣＧＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧ；
Ｃ（下線部）によるＧの置換は、ＣｙｓによるＳｅｒ（位置４における）の置換を生じ、他方、ＧＣＡの挿入は位置０において付加的なＣｙｓの挿入を生じる；
オリゴＬｅｕ−Ａｌａ：
５’−ＡＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡ；
Ｓｅｒ１のコドン上流の６ヌクレオチド（ＧＧＣＴＡＡ）の挿入は、それぞれ位置１および０において、ＬｅｕおよびＡｌａの挿入を生じる。
オリゴＴｙｒ１４：
５’−ＴＧＧＧＣＧＧＧＣＡＡＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧ；
Ｔ（下線部）によるＡの置換は、ＰｈｅによるＴｙｒ１４の置換となる。
【００２４】
ＰＣＲ産物を精製し、ｐＵＣ１８ベクターのＢＧｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位中へクローン化した。組換体を配列決定して、その同一性を確認し、クローン化工程中に導入した不所望な変異をチェックした。
［実施例２］
バキュロウイルスにおける組換分子の発現と精製
バキュロウイルス発現系は、数年間、公知である。それは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の発現機構に基づく。この系では、非本質的な遺伝子であるが、ウイルス感染の後期相の間に非常に高い程度に発現する多角体遺伝子プロモーターの制御下に、相同組換えによって目的の遺伝子を導入する。
【００２５】
このような系の選択は、多くの利点を含み、主たるものは、１）高発現レベル；２）正しくプロセッシングされ、かつ、折り畳まれる組換タンパク質の機能性（ほとんどの変更は、哺乳動物細胞によって導入されたものに対応する）；３）シグナルペプチドによる細胞外への分泌(O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, "Baculovirus expression vectors - A laboratory manual", Oxford University Press, 1994)である。
【００２６】
この系でＲＡＮＴＥＳおよびその変異体を発現するためには、対応するＤＮＡをｐＵＣ１８から切り出し、多角体プロモーターの制御下に、ｐＶＬ１３９２プラスミド・ポリリンカー領域(Pharmingen)のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。このプラスミドもまた、クローン化挿入物の下流に、相同組換えのためのＡｃＮＰＶ相同領域を含む。オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)連続セルライン（ＳＦ９、Pharmingen)に、リン酸カルシウム共沈殿法を使用して、組換プラスミドのＤＮＡをトランスフェクトし、致死欠失を含むバキュロウイルスＤＮＡ(BaculoGoldTM DNA, Pharmingen)をトランスフェクトした。多角体遺伝子を目的変異体のＤＮＡにより置換する相同組換えのみが、生体ウイルス粒子を提供する(Gruenwald S, Heitz J, "Baculovirus expression vectors: procedures and methods manual", Pharmingen, 1993)。次いで、トランスフェクトした培養物の上清を３日目に集めて、希釈し、新規なＳＦ９培養物に感染させるために使用し、それによって、１つの感染性粒子からウイルス系統(viral lineage)を得た（エンドポイント希釈）。予測されたように、ＲＡＮＴＥＳタンパク質およびその変異体は分泌され、その発現レベルは市販のＥＬＩＳＡテスト（Ｒ＆Ｄ）によって評価され得る。ウイルス性ＤＮＡをＥＬＩＳＡで検出したように強力な組換体から抽出し、ＰＣＲ(Cycle Sequencing, Amersham)によって配列決定して、変異体もまた、ウイルス系統中に生じたことを確認した。引き続いて、選択されたウイルスストック(stock)はＳＦ９細胞中で感染と増幅を繰り返し行うことに供し、高力価の上清を得た。これらの上清を大規模に組換キモカインの産生に使用して、連続トリコプルシア(Trichoplusia)株化細胞(High Five, Invitrogen)に感染させた。これらの細胞は無血清培地で成長可能であり、次のタンパク質精製工程を簡略化することができる。１．５×１０8個の細胞に最終容量２００ｍｌにて１．５×１０9個の生体ウイルス粒子を感染した。第４回感染の日に、上清を収集し、濾過し（０．４５ｕ）、変異体をヘパリンカラム上で精製した。ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、カラムを１０ｍｌのＰＢＳ＋１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。溶出物のアリコートをアクリルアミド・ゲル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動にかけて、クーマシーブルーで染色し、これにより組換タンパク質の９０％純度を評価した。引き続いて、この溶出物を完全に濾過して現存する塩を除去し、濃縮した(Centricon, cut-off 3000, Millipore)。ＲＡＮＴＥＳおよびその変異体の最終定量化は、ＲＡＮＴＥＳの定量測定用ＥＬＩＳＡキット(R&D)によって実施し、ウエスタン・ブロットおよびキャピラリー電気泳動法によって確認した。
【００２７】
［実施例３］
ウイルス感染の阻害
実施例２で得た変異体の原始型マクロファージ−向性ウイルス性株、ＨＩＶ−１ＢａＬによる感染阻止能力を、活性化末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の初代培養物中で測定した。ＰＢＬに感染し、ｐ２４抗原産生を評価するために使用した方法は、既に文献(Scarlatti 等、Nature Medicine, 1997)に記載されている。ウイルス増殖を９０％阻害する用量（ＩＤ９０）は、ＩＤ９０が９６ｎｇ／ｍｌ（図１）である野生型ＲＡＮＴＥＳに比べて、ｐＶＵ１５では著しく低かった。ｐＶＵ５、ｐＶＵ１４、ｐＶＵ１５、ｐＶＵ２４およびｐＶＵ３８の抑制活性は、無症候性感染に罹患した患者から単離した他のＨＩＶ株（ＨＩＶ−１  ６３６６）にて確認し、末梢血単核細胞中に１回のみ培養した（図２）：ＢａＬ株に関しては、この単離体はＣＣＲ５コレセプターの用法に依存していた（同書）。本発明のポリペプチドの抗ウイルス活性は、野生型ＲＡＮＴＥＳに対する相対的効能（ＩＤ９０ＲＡＮＴＥＳ／ＩＤ９０変異体）として、下記表１に示す。
【００２８】
【表１】
0004323094.tif 000004
【００２９】
*ｐＶＵ２６およびｐＶＵ４３変異体の抗ウイルス活性は、野生型ＲＡＮＴＥＳに対する相対的効能（ＲＡＮＴＥＳＩＤ５０／変異体ＩＤ５０）として表わした。
［実施例４］
炎症誘発活性
Ｇ−タンパク質結合レセプターの活性化によって誘導され、かつ種々のリガンドのシグナル形質導入効果に関連する、細胞内カルシウムを移動させるＲＡＮＴＥＳ変異体の能力を検討した。
【００３０】
細胞にＦｕｒａ−２を１時間、負荷させて、異なった濃度の変異体で刺激した。その効果を蛍光定量計を用いて測定し、細胞内カルシウムの増加％として計算した。野生型ＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ５を発現するＵ８７−ＣＤ４細胞において、用量依存性カルシウム移動を誘発したが、コントロールとして使用したＣＣＲ５陰性細胞においては誘発しなかった。試験した変異体、ｐＶＵ５、ｐＶＵ１４、ｐＶＵ１５、ｐＶＵ２４、ｐＶＵ３８、ｐＶＵ２６およびｐＶＵ４３の内で、ｐＶＵ３８、ｐＶＵ１５およびｐＶＵ１７のみが、カルシウム移動を誘発しなかった。ｐＶＵ５、ｐＶＵ１４およびｐＶＵ４３は、図３に示すように、野生型ＲＡＮＴＥＳよりも低い効果を有していた。
【００３１】
一次ヒトリンパ球および単球の走化作用を誘発する、本発明のポリペプチドの能力もまた測定した。その能力は異なったＲＡＮＴＥＳレセプター、特にＣＣＲ１によって仲介され得る。
単核移動は、ボイデン・チャンバー（４８穴トランスウェル(Transwell)(TM），Costar）の変法を使用してアッセイした。様々な濃度の変異体の存在下に２時間、インキュベートした後、フィルターを除去し、ＦＡＣＳで移動した細胞を計数した。走化指数を、変異体の存在下に移動した細胞数の自然発生移動による数に対する割合でもって表す。ｐＶＵ５およびｐＶＵ１４を除く全ての変異体は、単核走化作用を誘発するが、しかし１００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲内の高濃度では、ｐＶＵ３８変異体が野生型ＲＡＮＴＥＳよりも明らかに低い効果を示した（図４）。
【００３２】
すなわち、ＰＢＭＣにおける９０％ＨＩＶ抑制用量に対する最小走化用量の割合は、変異体において８〜５０であったが、野生型ＲＡＮＴＥＳにおいては１．０〜２．９であった。
［実施例５］
ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニスト効果
野生型ＲＡＮＴＥＳによるＣＣＲ３−レセプターおよびＣＣＲ５−レセプターの活性化に拮抗する変異体ｐＶＵ１５およびｐＶＵ１７の能力を、細胞内カルシウム移動の面から検討した。
【００３３】
野生型分子の直前に付加した場合、ｐＶＵ１５は用量依存効果を伴なって野生型ＲＡＮＴＥＳへの応答を減少した。ＣＣＲ５については、濃度５００ｎｇ／ｍｌで野生型ＲＡＮＴＥＳ活性への最も高い阻害を示し、他方、ＣＣＲ３については、レセプターの脱感作が不完全であった（図５および６参照）。
細胞内Ｃａ++の変化によって誘発する蛍光シグナルを、蛍光光度計によってモニターした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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