(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪族ポリエステル１００重量部に対して、リン脂質を０．０１〜１００重量部含有し、平均繊維径が０．０５〜５０μｍであり、繊維表面の平均多孔化率が３％〜９０％であることを特徴とする繊維構造体。
【請求項２】
脂肪族ポリエステル１００重量部に対して、リン脂質を０．０１〜２０重量部含有した請求項１に記載の繊維構造体。
【請求項３】
脂肪族ポリエステルおよびリン脂質を含む溶液を静電紡糸法にて紡糸することにより得られたことを特徴とする請求項１に記載の繊維構造体。
【請求項４】
該脂肪族ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、およびこれらの共重合体からなる群から選択される少なくとも一つの高分子である請求項１に記載の繊維構造体。
【請求項５】
該リン脂質がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、プラズマローゲンおよびそれらの誘導体からなる群から選択されてなる請求項１に記載の繊維構造体。
【請求項６】
該リン脂質がホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項１に記載の繊維構造体。
【請求項７】
該リン脂質がＬ−α−ホスファチジルエタノールアミンジオレオイルまたはＬ−α−ホスファチジルコリンジオレオイルであることを特徴とする請求項６に記載の繊維構造体。
【請求項８】
脂肪族ポリエステルおよびリン脂質を揮発性溶媒に溶解した溶液を製造し、該溶液を静電紡糸法にて紡糸し、捕集基板上に累積される繊維構造体を得る段階を含む、請求項１に記載の繊維構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はリン脂質を含有する繊維構造体に関する。さらに好ましくは繊維表面に孔を有し細胞培養に適した基材となる繊維構造体に関する。
【背景技術】  再生医療分野においては、細胞を培養する際に基材として多孔体が用いられることがある。多孔体としては凍結乾燥による発泡体や繊維構造体が知られている。これら多孔体は細胞との親和性や生体内分解性、安全性などが必要とされる。
ポリ乳酸は、これら生体内分解性や安全性が知られている材料の中でも比較的安価に入手可能である。特に、Ｌ−乳酸成分を主とするポリ乳酸は、最近大量に製造されている。
例えば、生体内分解性、安全性が知られているポリ乳酸の多孔体を細胞培養基材に用いることが検討されている（例えば大野典也、相澤益男監訳代表「再生医学」株式会社エヌ・ティー・エス、２００２年１月３１日、２６２頁参照。）。
しかしながら、これら方法は、細胞が接着できる面積は不十分であり、より表面積の大きい多孔体が望まれており、その一つとして繊維径の小さい繊維構造体が検討されてきた。
繊維径の小さい繊維構造体を製造する方法として、静電紡糸法が知られている（例えば、特開昭６３−１４５４６５号公報および特開２００２−２４９９６６号公報参照）。静電紡糸法は、液体、例えば繊維形成物質を含有する溶液等を電場内に導入し、これにより液体を電極に向かって曳かせ、繊維状物質を形成させる工程を包含する。普通、繊維形成物質は溶液から曳き出される間に硬化させる。硬化は、例えば冷却（例えば、紡糸液体が室温で固体である場合）、化学的硬化（例えば、硬化用蒸気による処理）、または溶媒の蒸発などにより行われる。また、得られる繊維状物質は、適宜に配置した受容体上に捕集され、必要ならばそこから剥離することも出来る。また、静電紡糸法は不織布状の繊維状物質を直接得ることが出来るため、一旦繊維を製糸した後、さらに繊維構造体を形成する必要がなく、操作が簡便である。
静電紡糸法によって得られる繊維構造体を、細胞を培養する基材に用いることも知られている。例えばポリ乳酸よりなる繊維構造体を静電紡糸法により形成し、この上で平滑筋細胞を培養することにより血管の再生が検討されている（例えばＪｏｅｌ  Ｄ．Ｓｔｉｔｚｅｌ，Ｋｒｉｓｔｉｎ  Ｊ．Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｇａｒｙ  Ｅ．Ｗｎｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｂｏｗｌｉｎ著、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００１，１６，２２−３３参照）。
しかしながら、これまでの報告ではまだ要求を満たすほどの細胞接着効果は得られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、再生医療分野において細胞培養に適した基材を提供することにある。
すなわち、本発明は、脂肪族ポリエステル１００重量部に対して、リン脂質を０．０１〜１００重量部含有し、平均繊維径が０．０５〜５０μｍであることを特徴とした繊維構造体に関するものである。本発明はさらに好ましくは繊維構造体の繊維表面の平均多孔化率が３％〜９０％である繊維構造体に関するものである。
発明の効果
本発明のリン脂質を含有する繊維構造体により、細胞接着性が向上した繊維構造体を提供することができ、再生医療分野においてとくに有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造方法のなかで、紡糸液を静電場中に吐出する静電紡糸法で用いる装置の一例である。
【図２】本発明の製造方法のなかで、紡糸液の微細滴を静電場中に導入する静電紡糸法で用いる装置の一例である。
【図３】実施例１で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図４】実施例２で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図５】実施例３で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図６】実施例４で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図７】実施例５で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図８】比較例１で得られた繊維構造体の走査型電子顕微鏡写真
【図９】実施例６と比較例２のＡｌａｍａｒｂｌｕｅの測定の結果である。
【符号の説明】
１．    ノズル
２．    紡糸液
３．    紡糸液保持槽
４．    電極
５．    繊維状物質捕集電極
６．    高電圧発生器
７．    ノズル
８．    紡糸液
９．    紡糸液保持槽
１０．  電極
１１．  繊維状物質捕集電極
１２．  高電圧発生器
発明の好ましい実施形態
以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
本発明は、脂肪族ポリエステル１００重量部に対して、リン脂質を０．０１〜１００重量部含有した繊維構造体である。脂肪族ポリエステル１００重量部に対してリン脂質の含有量は、好ましくは０．１〜２０重量部、さらに好ましくは０．１〜１０重量部である。リン脂質の含有量が１００重量部以上であると、繊維の安定性に欠ける場合がある。
本発明に用いる繊維構造体の平均繊維径は０．０５〜５０μｍであることが好ましい。平均繊維径が０．０５μｍより小さいと、細胞培養時や細胞培養後生体内に移植した際の分解が速すぎるため好ましくない。また、平均繊維径が５０μｍより大きいと、細胞培養に十分な表面積を得ることができず、好ましくない。平均繊維径は０．１〜２０μｍがより好ましい。
本発明に用いる繊維構造体の平均多孔化率は３〜９０％が好ましく、より好ましくは１１〜９０％であり、さらに好ましくは３０〜９０％である。
ここでいう平均多孔化率とは、繊維表面全体の面積に対する細孔面積の割合を意味し、繊維構造体の２万倍の走査型電子顕微鏡写真を画像処理ソフト（ｎｅｘｔ  Ｎｅｗ  Ｑｕｂｅ）を用いて２値化処理を行い、求めたものをいう。
平均多孔化率が３〜１１％の場合は、十分な細胞接着効果が得られない場合があるので、さらに表面に凹凸を持たせることで、好ましく十分な細胞接着効果を提供できる。平均多孔化率が１１％以上の場合も、さらに表面に凹凸を有するとさらに優れた細胞接着効果が得られ好ましい。
平均多孔化率が３０％より大きいと、より優れた細胞接着効果が得られる。
また平均多孔化率が９０％より大きいと、繊維としての強度を保つことができないことがある。
繊維構造体表面の凹み部の平均孔径（直径）は０．００１〜１０μｍであることが好ましい。より好ましくは、０．００５〜５μｍ、より好ましくは０．０１〜１μｍである。凹み部の平均孔径は走査型電子顕微鏡写真を撮影し、その写真からｎ＝２０にて、凹み部の直径を測定した平均値を算出することにより求めることができる。
本発明に用いる脂肪族ポリエステルとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、およびこれらの共重合体などが挙げられる。これらのうち、脂肪族ポリステルとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、乳酸−カプロラクトン共重合体が好ましく、特にポリ乳酸、ポリカプロラクトンが好ましい。
脂肪族ポリエステルの重量平均分子量は２万〜１００万であることが好ましい。より好ましくは重量平均分子量は５万〜５０万である。
本発明に用いるリン脂質は、動物組織から抽出したものでも、また人工的に合成して製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。リン脂質としてはホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびそれらの誘導体からなる群から選択されてなるものを利用することが望ましい。好ましくはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンである。さらに好ましくはＬ−α−ホスファチジルエタノールアミンジオレオイル、またはＬ−α−ホスファチジルコリンジオレオイルである。
本発明に用いる繊維構造体とは、１種または複数種の繊維が積層され、織り、編まれ若しくはその他の手法により形成された３次元の構造体を指すが、短繊維であるフィラメントおよびフィラメントを複数集めたヤーンも包含するものとする。具体的な繊維構造体の形態としては、例えば不織布、織布、編布、チューブ、メッシュ、などが好ましく挙げられる。より好ましい形態は、不織布である。
リン脂質を含有する繊維と、リン脂質を含有しない繊維の複合体も含む。
繊維構造体の平均見掛け密度は１０〜３５０ｋｇ／ｍ３であることが好ましい。ここで平均見掛け密度とは、繊維構造体の面積、平均厚、質量から割り出した密度を意味する。
平均見掛け密度が３５０ｋｇ／ｍ３より大きいと、細胞培養時に栄養分などを含む溶液が繊維構造体の内部まで十分に浸透しないため繊維構造体表面にしか細胞が培養されない場合がある。また、平均見掛け密度が１０ｋｇ／ｍ３より小さいと、細胞培養時に必要な力学強度を保つことが出来ない場合がある。好ましい平均見掛け密度は１０〜２５０ｋｇ／ｍ３である。
本発明の繊維構造体を製造する方法としては、静電紡糸法、スパンボンド法、メルトブロー法、フラッシュ紡糸法等が挙げられる。その中でも、静電紡糸法が操作性や簡便性から好ましい。以下静電紡糸法により製造する方法について詳細に説明する。
本発明で用いる静電紡糸法では脂肪族ポリエステルを、揮発性溶媒に溶解した溶液を電極間に形成された静電場中に吐出し、溶液を電極に向けて曳糸し、形成される繊維状物質を捕集基板に累積することによって繊維構造体を得ることができる。繊維状物質とは既に溶液の溶媒が完全に留去されて繊維構造体となっている状態のみならず、いまだ溶液の溶媒を含んでいる状態も示している。
まず静電紡糸法で用いる装置について説明する。本発明で用いられる電極は、金属、無機物、または有機物のいかなるものでも導電性を示しさえすれば良い。また、絶縁物上に導電性を示す金属、無機物、または有機物の薄膜を持つものであっても良い。本発明における静電場は一対又は複数の電極間で形成されており、いずれの電極に高電圧を印加しても良い。これは例えば電圧値が異なる高電圧の電極が２つ（例えば１５ｋＶと１０ｋＶ）と、アースにつながった電極の合計３つの電極を用いる場合も含み、または３本を越える数の電極を使う場合も含むものとする。
次に静電紡糸法による本発明の繊維構造体の好ましい製造手法について詳細に説明する。まず脂肪族ポリエステル、リン脂質、および揮発性溶媒からなる溶液を製造する段階がある。本発明の製造方法における溶液中の脂肪族ポリエステルの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。脂肪族ポリエステルの濃度が１重量％より小さいと、濃度が低すぎるため繊維構造体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より大きいと溶液の粘度が増大するために、電極間により高電圧をかける必要が生じるため好ましくない。より好ましい脂肪族ポリエステルの濃度は２〜２５重量％である。
本発明の揮発性溶媒としては、脂肪族ポリエステルを溶解することができれば特に限定されない。揮発性溶媒としては、例えば非水溶性である塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン元素含有炭化水素や、任意の割合で水を溶解することができるアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、水、１，４−ジオキサン、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどが挙げられる。これらのうち、繊維表面の多孔化を促進させるには、特に揮発性の高い塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフランが特に好ましい。
これらの溶媒は単独で用いても良く、複数の溶媒を組み合わせても良い。また本発明の目的を損なわない範囲で、他の溶媒を併用しても良い。
次に前記溶液を静電紡糸法にて紡糸する段階について説明する。該溶液を静電場中に吐出するには、任意の方法を用いることが出来る。例えば、一例として図１を用いて以下説明する。溶液２をノズルに供給することによって、溶液を静電場中の適切な位置に置き、そのノズルから溶液を電界によって曳糸して繊維化させる。このためには適宜な装置を用いることができ、例えば注射器の筒状の溶液保持槽３の先端部に適宜の手段、例えば高電圧発生器６にて電圧をかけた注射針状の溶液噴出ノズル１を設置して、溶液をその先端まで導く。接地した繊維状物質捕集電極５から適切な距離に該噴出ノズル１の先端を配置し、溶液２が該噴出ノズル１の先端を出るときにこの先端と繊維状物質捕集電極５の間にて繊維状物質を形成させる。
また当業者には自明の方法で該溶液の微細滴を静電場中に導入することもできる。一例として図２を用いて以下に説明する。その際の唯一の要件は液滴を静電場中に置いて、繊維化が起こりうるような距離に繊維状物質捕集電極１１から離して保持することである。例えば、ノズル７を有する溶液保持槽９中の溶液８に直接、直接繊維状物質捕集電極１１に対抗する電極１０を挿入しても良い。
該溶液をノズルから静電場中に供給する場合、数個のノズルを用いて繊維状物質の生産速度を上げることもできる。電極間の距離は、帯電量、ノズル寸法、紡糸液流量、紡糸液濃度等に依存するが、１０ｋＶ程度のときには５〜２０ｃｍの距離が適当であった。また、印加される静電気電位は、一般に３〜１００ｋＶ、好ましくは５〜５０ｋＶ、一層好ましくは５〜３０ｋＶである。所望の電位は任意の適切な方法で作れば良い。
上記説明は、電極が捕集基板を兼ねる場合であるが、電極間に捕集基板となりうる物を設置することで、電極と別に捕集基板を設け、そこに繊維構造体を捕集することが出来る。この場合、例えばベルト状物質を電極間に設置して、これを捕集基板とすることで、連続的な生産も可能となる。
本発明において、ノズルと捕集基板の間の相対湿度を２０％以上に維持すると、上記表面構造を有する繊維を簡便に得ることができ、好ましい。より好ましい相対湿度は２５〜９５％である。
最後に捕集基板に累積される繊維積層体を得る段階について説明する。本発明においては、該溶液を捕集基板に向けて曳糸する間に、条件に応じて溶媒が蒸発して繊維状物質が形成される。通常の室温であれば捕集基板上に捕集されるまでの間に溶媒は完全に蒸発するが、もし溶媒蒸発が不十分な場合は減圧条件下で曳糸しても良い。また、曳糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は、０〜５０℃である。
本発明の繊維構造体は、上記繊維構造体単独で構成されていても良いが、他の部材と組み合わされていても良い。また、本発明の細胞培養基材は、その特徴を損なわない範囲であれば、細胞成長因子や細胞増殖因子などの蛋白質や、コラーゲン等の細胞外マトリクス等を組み合わせても良い。
【実施例】  以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の発明を制限するものではない。
平均多孔化率は、得られた繊維構造体の２万倍の走査型電子顕微鏡写真を画像処理ソフト（ｎｅｘｔ  Ｎｅｗ  Ｑｕｂｅ）を用いて２値化処理を行い、求めた。繊維表面の孔径は、得られた繊維構造体の２万倍の走査型電子顕微鏡写真からｎ＝２０にて、孔の直径を測定した平均値を算出した。
実施例１
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１００重量部とホスファチジルエタノールアミン  ジオレオイル（和光純薬）０．５重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）８９９．５重量部に室温（２９℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１５分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は２０ｃｍ、相対湿度３９％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は１０μｍ、平均多孔化率は３６．７％、平均孔径は０．５２μｍ、見かけ密度は２０９ｋｇ／ｍ３であった。図３に走査型電子顕微鏡写真を示す。
実施例２
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１００重量部とホスファチジルエタノールアミン  ジオレオイル（和光純薬）１０重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）８９０重量部に室温（２６℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１５分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は２０ｃｍ、相対湿度３９％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は１０μｍ、平均多孔化率は６６．１％、平均孔径は０．９８μｍ、見かけ密度は２１２ｋｇ／ｍ３であった。図４に走査型電子顕微鏡写真を示す。
実施例３
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１００重量部とホスファチジルコリン  ジオレオイル（和光純薬）０．５重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）８９９．５重量部に室温（２９℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１５分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は２０ｃｍ、相対湿度３９％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は８μｍ、平均多孔化率は２５．８％、平均孔径は０．１１μｍ、見かけ密度は２０８ｋｇ／ｍ３であった。図５に走査型電子顕微鏡写真を示す。
実施例４
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１００重量部とホスファチジルエタノールアミン  ジオレオイル（和光純薬）０．５重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）４４９．７５重量部、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４４９．７５重量部に室温（２９℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１５分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は１０ｃｍ、相対湿度３９％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は０．７μｍ、平均多孔化率は３％、平均孔径は０．０３２μｍ、見かけ密度は２１０ｋｇ／ｍ３であった。図６に走査型電子顕微鏡写真を示す。
実施例５
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１００重量部とホスファチジルエタノールアミン  ジオレオイル（和光純薬）０．１重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）８９９．９重量部に室温（２９℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１３分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は２０ｃｍ、相対湿度３３％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は８μｍ、平均多孔化率は３５．４％、平均孔径は０．６３μｍ、見かけ密度は２１４ｋｇ／ｍ３であった。図７に走査型電子顕微鏡写真を示す。
比較例１
ポリ乳酸（島津製作所：商品名「Ｌａｃｔｙ  ９０３１」、重量平均分子量１６８，０００）１０重量部を塩化メチレン（和光純薬工業、特級）９０重量部に室温（２２℃）にて溶解し、溶液を作成した。図１にしめす装置を用いて、該溶液を繊維状物質捕集電極５に１３分間吐出した。噴出ノズル１の内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズル１から繊維状物質捕集電極５までの距離は２０ｃｍ、相対湿度３６％であった。得られた繊維構造体を走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−２４００）で測定したところ、平均繊維径は３μｍ、平均多孔化率は１０．５％、見かけ密度は２１５ｋｇ／ｍ３であった。図８に走査型電子顕微鏡写真を示す。
実施例６：細胞培養評価
実施例１で得られた繊維構造体を直径１２ｍｍの円形に切り出し、滅菌のために７０％エタノール水溶液（和光純薬工業）に浸漬し風乾させた後、細胞培養器内で０．２５×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌでＰＡＥ（豚大動脈由来血管内皮細胞）を播種し、６ウェルプレート内に収め、５％ＣＯ２、３７℃の条件でインキュベーター内で培養を行った。細胞増殖能をＡｌａｍａｒｂｌｕｅにて１日目および４日目に測定した。測定は、波長５３０ｎｍの励起光を用いて出現した蛍光５９０ｎｍを検出した。
結果を図９に示す。
比較例２
比較例１の繊維構造体を使用した以外、実施例６と同様の操作を行った。結果を図９に共に示す。
２標本による有意差検定を行った結果、培養後１日間経過では、実施例６は比較例２との２標本間において、０．００１％の危険率で統計的有意差をもって接着性及び増殖性がよいとの結果が得られた。培養後４日間経過では実施例６は比較例２との２標本間において０．００１％の危険率で統計的有意差をもって接着性及び増殖性がよいとの結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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