(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の免疫動物に、プロテアーゼ処理により菌体表面タンパク質を除去したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を免疫して得られるか、あるいはヒト以外の免疫動物に、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を免疫して原料抗体を得、その後、プロテアーゼ処理により菌体表面タンパク質を除去したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体をアフィニティー精製担体として使用し、該担体に結合した抗体を回収するアフィニティー精製法より得られることを特徴とする、以下の性質を有するポリクローナル抗体：
(a)ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ1000倍以上である；
(b)免疫クロマトグラフィー法により、105個/mlの濃度の血清型c、e及びfのストレプトコッカス・ミュータンスが検出可能である；及び
(c)血清型c、e及びfのストレプトコッカス・ミュータンスに対する該ポリクローナル抗体の各反応性が2倍以内である。
【請求項２】
ポリクローナル抗体の製造方法であって、ヒト以外の免疫動物に、プロテアーゼ処理により菌体表面タンパク質を除去したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を免疫して得ることを含み、該ポリクローナル抗体が請求項１に記載されるポリクローナル抗体であることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
ポリクローナル抗体の製造方法であって、ヒト以外の免疫動物に、プロテアーゼ処理により菌体表面タンパク質を除去したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、及び/又はストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を免疫して原料抗体を得、その後、プロテアーゼ処理により菌体表面タンパク質を除去したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体をアフィニティー精製担体として使用し、該担体に結合した抗体を回収するアフィニティー精製法によって当該原料抗体から精製することを含み、該ポリクローナル抗体が請求項１に記載されるポリクローナル抗体であることを特徴とする、前記方法。
【請求項４】
被検体液中に含まれるストレプトコッカス・ミュータンスを、請求項１に記載のポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法により測定することを特徴とするストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
【請求項５】
免疫学的測定方法が免疫クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項４に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ミュータンスより得られる抗原抽出物が被検体液であることを特徴とする請求項５に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリクローナル抗体を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項８】
被検体液を一時的に吸収・保持するためのサンプルパッドと、標識抗体を一時的に保持するためのコンジュゲートパッドと、検出用抗体が固定化され、前記サンプルパッドに一時的に吸収・保持された被検体液および該被検体液に同伴されて前記コンジュゲートパッドより流出した標識抗体が展開される展開メンブレンとがこの順番で接合された免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、
前記標識抗体及び検出用抗体の一方または両方が請求項１に記載のポリクローナル抗体であることを特徴とする免疫クロマトグラフィーテストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なポリクローナル抗体、該ポリクローナル抗体の製造方法、ストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法、免疫学的測定試薬及び免疫クロマトグラフィーテストストリップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。
これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。
【０００３】
従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０5〜１０6個／ｍｌの場合には、齲蝕の危険あり、１０6個／ｍｌ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行うことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行って得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより一応知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。
【０００４】
近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題がある。
【０００６】
歯垢や唾液等の臨床検体からストレプトコッカス・ミュータンスを直接検出する方法としては、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告されている。これらの方法は培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある。
【０００７】
口腔内には様々なストレプトコッカス属に分類されるレンサ球菌が常在していることが知られている。口腔内の各部位により細菌叢中の存在比率は異なるが、齲蝕危険度の判定に使用する歯垢や唾液では、ストレプトコッカス属のレンサ球菌が細菌叢の約５０％近くを占めることが知られており（武笠英彦監修．う蝕細菌の分子生物学−研究の成果と展望−．２９―３７．第１版．クインテッセンス出版．１９９７年）、また、唾液１ｍｌ中の総菌数は１０8個／ｍｌ以上であると言われている。ミュータンスレンサ球菌数は一般的に１０7個／ｍｌ以下であるので、口腔内のレンサ球菌は大部分がミュータンスレンサ球菌以外のレンサ球菌であるといえる。ミュータンスレンサ球菌以外のレンサ球菌のなかでもストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスは口腔内細菌叢の主な菌である。通常これらの各菌は、唾液中に１０7個／ｍｌオーダーで存在するが、時には１０8個／ｍｌオーダー程度にまで達する場合がある。
【０００８】
従って、齲蝕危険度の判定のためには、１０8個／ｍｌオーダーのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌中に混在する１０5個／ｍｌオーダーのストレプトコッカス・ミュータンスを測定する、即ち、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していてもストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定する必要がある。このような測定のためには、１０5個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスとの反応性に比べて、１０8個／ｍｌのミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性は著しく低いという、高力価で且つ非常に特異性の高い抗体が必要になる。
【０００９】
モノクローナル抗体を用いた方法としては、酵素標識したストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体と検体を混合し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過することでストレプトコッカス・ミュータンスと結合した酵素標識抗体のみをフィルター上に保持し、酵素基質添加後の発色により検出する方法が提案されているが（安富豊ら．小児歯科学雑誌．３０：１８６−１９３．１９９２，特許第３０９３８３３号）、該方法で使用されているモノクローナル抗体は１０5個／ｍｌレベルのストレプトコッカス・ミュータンスの反応性と１０7個／ｍｌレベルのストレプトコッカス・サリバリウスとの交差反応性は同程度である。口腔内では、１０7〜１０8個／ｍｌレベルのストレプトコッカス・サリバリウスが存在する場合があり、この場合にはストレプトコッカス・ミュータンスが正確に測定できないという問題がある。
【００１０】
特開平１０−３６４００号公報において、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との反応性に着目し、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスと反応しないストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている。該モノクローナル抗体の特異性は、一定量（１０8個／ｍｌ）の上記３菌種とストレプトコッカス・ミュータンスの培養菌に対する抗体の反応性を該抗体の２倍希釈系列により調べて、評価されており、抗原抗体反応の容量−作用曲線がプラトーとなるような抗体過剰域においても、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、１０5個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性については調べられておらず、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明である。また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１１】
また、特開２００１−１７２２９９号公報において、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギスおよびポルフィロモナス・ジンジバリスと反応せず、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリヌスと対するモノクローナル抗体を用いた測定法が提案されている。該モノクローナル抗体に関して、一定量の培養菌（乾燥重量５μｇ）に対する反応性を調べた場合、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・フェルス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ラクトバチラス・カゼイ、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する交差反応性は検出されないこと、また、１０5個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスは測定可能であるが、１０6個／ｍｌのストレプトコッカス・サリバリウスに対する交差反応性は検出されないという性質が開示されている。しかし、この場合も、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌がストレプトコッカス・ミュータンスの１０００倍量程度存在していている場合にストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できるかどうか不明であり、また、その他の口腔内レンサ球菌のストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・オラリスとの反応性は全く検討していないという問題がある。
【００１２】
一方、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を利用した方法として、ガラススライド上でのラテックス凝集法を用いた方法が報告されている（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．、Ｔａｋｅｉ，Ｔ．Ａｒｃｈｓ．ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．３７：９９−１０４，１９９２．、特開平１−２５００６７．）。一般的に、ストレプトコッカス・ミュータンスは抗原性があまり高くなく、アフィニティー精製により交差反応の原因となる抗体を除去しても特異性の高いポリクローナル抗体を得ることは困難であることが知られているが（浜田茂幸編集．う蝕と歯周病．第１巻．１７―２３．第１版．日本歯科詳論社．１９８２年）、該方法においてはストレプトコッカス・ミュータンス菌体をウサギに免疫し作製したポリクローナル抗体をアフィニティー精製無しに使用している。従って、ここで使用しているポリクローナル抗体の特異性は低いことが考えられ、このため、該方法該方法に於いては、１×１０6個／ｍｌ以上の濃度の菌体試料溶液に於いてしか陽性反応が得られておらず、十分な感度が達成されていない。
【００１３】
さらに、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体に処理をして、他の菌との交差反応性を低減した抗体(以下「処理ポリクローナル抗体」ともいう)として血清型特異的ポリクローナル抗体が知られている。該血清型特異的ポリクローナル抗体は、ミュータンスレンサ球菌中の各血清型間の交差反応に着目し、免疫に使用した血清型以外のミュータンスレンサ球菌により吸収処理を行うことにより製造されている。
【００１４】
例えば、Ｂｒａｔｔｈａｌｌは、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型ｃの標準菌を動物に免疫して得られた抗体に、血清型ａまたはｂの菌による吸収処理を施して、血清型ｃおよびｅ特異的な抗体を取得している（Ｂｒａｔｔｈａｌｌ，Ｄ．，Ｏｄｏｎｔ．Ｒｅｖｙ．２３：１８１−１９６，１９７２）。また、Ｏｔａは、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型ｃ、ｅまたはｆの標準菌を免疫して得られた抗体に、抗ｃ型抗体の場合は血清型ａ、ｄ、ｅ、ｆの菌により、抗ｅ型抗体の場合は血清型ｃ、ｆ、ｇの菌により、また、抗ｆ型抗体の場合は血清型ｅの菌により、それぞれ吸収処理を行うことで特異的な抗体を取得している（Ｏｔａ，Ｆ．，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ａ２６５：３３０−３３９，１９８７）。
【００１５】
しかし、上記のＢｒａｔｔｈａｌやＯｔａが調製したポリクローナル抗体も含めて、これまで得られたポリクローナル抗体では、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サンギス等のミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌との交差反応性が詳細に検討されていなかった。
【００１６】
また、ポリクローナル抗体を用いた測定法として蛍光抗体法が知られているが（Ｗａｌｔｅｒ，Ｊ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．５５：Ａ８７−Ａ９３，１９７６．、Ｂａｂａａｈｍａｄｙ，Ｋ．Ｇ．，Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．３２：５１−５８，１９９８．）、該方法には蛍光顕微鏡で検出される蛍光強度の強弱を目視で判定しながら、蛍光強度の比較的高い菌体を計数するという煩雑な手技を必要とするという問題点がある。
【００１７】
このように唾液又は歯垢から直接調製した臨床検体中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定に関しては、齲蝕危険度の判定のためには検出限界が１０5個／ｍｌの簡便な測定法が望まれているが、この要求を満たすストレプトコッカス・ミュータンス測定方法は知られていない。
【００１８】
そこで、本発明は、口腔内から採取された唾液や歯垢中のストレプトコッカス・ミュータンスを、培養操作等の煩雑な操作を行なうことなく、簡便に高感度で測定することができるポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体の製造方法、ストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法、免疫学的測定試薬及び免疫クロマトグラフィーテストストリップを提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上述した問題点に鑑み、本発明者が鋭意検討した結果、被検体液中に存在するストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティスおよびストレプトコッカス・サンギスの各菌種に対する交差反応性を十分に低く抑え、ストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出、定量することが可能であるポリクローナル抗体を創出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスに対する反応性と比較してそれぞれ１０００倍以上であることを特徴とするポリクローナル抗体。
（２）免疫動物に、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体または当該菌体の抗原抽出物を免疫して得られることを特徴とする（１）に記載のポリクローナル抗体。
【００２１】
（３）ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体のプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物を用いてアフィニティー精製法によって精製されたものである（１）に記載のポリクローナル抗体。
（４）免疫動物に、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体または当該菌体の抗原抽出物を免疫して得ることを特徴とするポリクローナル抗体の製造方法。
【００２２】
（５）免疫動物に、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、当該菌体の抗原抽出物、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体及び当該菌体の抗原抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を免疫して原料抗体を得、その後、ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体のプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物を用いたアフィニティー精製法によって当該原料抗体から精製することを特徴とするポリクローナル抗体の製造方法。
（６）被検体液中に含まれるストレプトコッカス・ミュータンスを、（１）〜（３）の何れか一項に記載のポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法により測定することを特徴とするストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
【００２３】
（７）免疫学的測定方法が免疫クロマトグラフィー法であることを特徴とする（６）に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
（８）ストレプトコッカス・ミュータンスより得られる抗原抽出物が被検体液であることを特徴とする（７）に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法。
（９）（１）〜（３）の何れか一項に記載のポリクローナル抗体を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬。
【００２４】
（１０）被検体液を一時的に吸収・保持するためのサンプルパッドと、標識抗体を一時的に保持するためのコンジュゲートパッドと、検出用抗体が固定化され、前記サンプルパッドに一時的に吸収・保持された被検体液および該被検体液に同伴されて前記コンジュゲートパッドより流出した標識抗体が展開される展開メンブレンとがこの順番で接合された免疫クロマトグラフィーテストストリップにおいて、前記標識抗体及び検出用抗体の一方または両方が（１）〜（３）の何れか一項に記載のポリクローナル抗体であることを特徴とする免疫クロマトグラフィーテストストリップ。
【００２５】
本発明に係るポリクローナル抗体によれば、被検体液中に存在するストレプトコッカス・ミュータンスの濃度が１０5個／ｍｌ程度でも高感度に検出、定量することが可能である。また、上記本発明に係るポリクローナル抗体を用いる場合には、免疫学的測定方法を適用して、唾液や歯垢中のストレプトコッカス・ミュータンスを培養すること無しにストレプトコッカス・ミュータンスを測定することが可能となる。このような測定が可能となったのは、本発明者によって高感度にストレプトコッカス・ミュータンスを検出する際に要求されるポリクローナル抗体の特性が明らかにされ、本発明に係るポリクローナル抗体が該特性を満足するためである。
【００２６】
また、本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法によれば、ストレプトコッカス・ミュータンス菌体表面に存在する交差反応の原因となる物質と考えられる菌体表面タンパク質をプロテアーゼ処理により除去した菌体（以下「プロテアーゼ処理菌体」ともいう）を使用して免疫を行うため、交差反応を引き起こす抗体の産生を抑えることができる。
【００２７】
さらに、本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法では、ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体のプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物を用いたアフィニティー精製法によって精製することが好ましい。この場合、上記ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体のプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物に対して結合した抗体成分を有するポリクローナル抗体を得ることができ、更に特異性の高いストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体が製造できる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
１．本発明に係るポリクローナル抗体
本発明に係るポリクローナル抗体は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性と、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギスの各菌体に対する反応性の比率がそれぞれ１０００以上のポリクローナル抗体である。すなわち、本発明に係るポリクローナル抗体は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性を、ストレプトコッカス・ゴルドニイに対する反応性、ストレプトコッカス・サリバリウスに対する反応性、ストレプトコッカス・オラリスに対する反応性、ストレプトコッカス・ミティスに対する反応性またはストレプトコッカス・サンギスに対する反応性で除した値（以下、「Ｍ／Ｓ反応性倍率」と称する場合もある。）が、全ての菌種について１０００以上となっているポリクローナル抗体である。
【００２９】
ストレプトコッカス・ミュータンスとは、ミュータンスレンサ球菌群の内で血清型がｃ、ｅ、およびｆ型に分類される菌体を意味する。血清型がｃ型の標準菌株としてＩｎｇｂｒｉｔｔ、ＭＴ６Ｒ等の菌株が、血清型がｅ型の標準菌株としてＬＭ７、Ｐ４等の菌株が、血清型がｆ型の標準菌株としてＳＥ１１、ＯＭＺ１７５等の菌株がそれぞれ例示される。
【００３０】
また、ストレプトコッカス・ゴルドニイの標準菌株としてＣｈａｌｌｉｓ、ＡＴＣＣ１０５５８等の菌株が、ストレプトコッカス・サリバリウスとしてＡＴＣＣ９２２２、ＩＦＯ１３９５６等の菌株が、ストレプトコッカス・オラリスの標準菌株としてはＡＴＣＣ１０５５７、ＡＴＣＣ３５０３７等の菌株が、ストレプトコッカス・ミティスの標準菌株としてはＡＴＣＣ１５９１０、ＡＴＣＣ１５９１１等の菌株が、ストレプトコッカス・サンギスの標準菌株としてはＡＴＣＣ１０５５６、ＡＴＣＣ１０５５７等の菌株が、それぞれ例示される。
【００３１】
ここで、ポリクローナル抗体（以下、単に「抗体」ともいう）とは、抗血清中に含まれる抗体画分のことであり、抗体のグロブリンクラスは限定されず、現在知られているどのようなグロブリンクラスのものも含まれる。また、ポリクローナル抗体は、通常の抗体分子のみならず、該抗体の部分分解物（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２等）、および該抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位）が存在する部分構造等も含む意味である。
【００３２】
また、抗体のＭ／Ｓ反応性倍率が１０００以上であるとは、酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ法」と略す場合もある。）、放射免疫測定法等の従来公知の免疫学的測定方法により、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、またはストレプトコッカス・サンギスを抗原として抗原抗体反応の検出を行った際に、ストレプトコッカス・ミュータンスを抗原として使用した場合に検出される反応が、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、およびストレプトコッカス・サンギス（以下、これらの菌をまとめて「その他レンサ球菌」ともいう）のそれぞれを抗原として使用した場合に検出される反応の１０００倍以上であることを指す。
【００３３】
抗体のＭ／Ｓ反応性倍率は、ストレプトコッカス・ミュータンス、およびその他レンサ球菌を抗原として使用した場合に、同一の反応値が検出される抗原量（菌体量）を比較して求めることができる。
【００３４】
抗体の各菌体に対する反応性は、標準菌株のリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と略すこともある）懸濁液を被検体液として使用するＥＬＩＳＡ法により測定することができる。具体的手順としては、まず、特定濃度の標準菌株のＰＢＳ懸濁液を９６穴イムノプレートの各ウェルに添加し吸着した後、ブロッキングを行い、次いで、イムノプレートにストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗体を添加後、例えば酵素標識した二次抗体を添加し、酵素活性を測定することにより抗体の反応性を評価することができる。
【００３５】
本抗体は、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスの全量を検出、定量するために、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ、ｅおよびｆに対する反応性は同等であることが好ましい。ここで、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ、ｅおよびｆとの反応性が同等であるとは、従来公知の免疫学的測定方法により、同一菌体量の血清型ｃ、ｅおよびｆのストレプトコッカス・ミュータンスを抗原とし、抗原抗体反応の検出を行った際に、これら３者から検出される反応が２倍以内、好ましくは１．５倍以内であることを指す。
【００３６】
さらに、本抗体のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性は、特に限定されないが、測定感度の観点から、ストレプトコッカス・ミュータンスのみを含む被検体液の各５０μｌを試料とし、９６穴イムノプレートの各ウェルに菌体を固定化後、１０ｎｇ〜５００ｎｇ／ウェルの抗体を用いて直接ＥＬＩＳＡ法により測定を行ったときの検出下限の菌体濃度が１０6個／ｍｌ以上（５×１０4個／ウェル）、好ましくは２×１０5個／ｍｌ以上（１０4個／ウェル）であることが好適である。
【００３７】
２．本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法
上述した本発明に係るポリクローナル抗体は、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体もしくはそのプロテアーゼ処理菌体、またはこれらの菌体の抗原抽出物を免疫してストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を得、次いで得られた該ポリクローナル抗体からストレプトコッカス・ミュータンスと反応する抗体（以下、「特異的抗体」ともいう）を回収することにより好適に得ることができる。
【００３８】
特に、抗原としてはストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物を免疫してストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を製造することが好ましい。すなわち、本発明に係るポリクローナル抗体の製造方法は、免疫動物に、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体または当該菌体の抗原抽出物を免疫する工程を含んでいる。
【００３９】
また、本発明に係るポリクローナル抗体は、特異的抗体を回収するに際して、ストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体または当該菌体の抗原抽出物を用いたアフィニティー精製を行って製造することが好ましい。すなわち、本発明に係るポリクローナル抗体の他の製造方法は、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体または当該菌体の抗原抽出物を用いたアフィニティー精製を行う工程を含んでいる。
【００４０】
以下、本発明の抗体の取得方法について詳細に説明する。
免疫用の抗原としては、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃ、ｅ、ｆの全菌体、またはそれら３種類のストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体が使用できる。これらの全菌体、若しくはプロテーゼ処理菌体からの抗原抽出物も使用できる。ストレプトコッカス・ミュータンスの各血清型由来の各抗原（全菌体、プロテアーゼ処理菌体、またはこれらの菌体の抗原抽出物）単独で免疫動物に免疫できるが、それらを混合して免疫しても良い。
【００４１】
全菌体としては生菌の他、ホルマリン処理、或いは加熱処理等された死菌、凍結保存された菌体が使用可能である。
プロテアーゼ処理菌体は、全菌体をプロテアーゼ処理することにより調製できる。プロテアーゼとしては、公知の各種プロテアーゼ、または、それら混合物が制限無く使用でき、例示すると、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
【００４２】
プロテアーゼ処理法は、例えば、使用するプロテアーゼの反応至適ｐＨ付近になるよう調製した緩衝液等に全菌体を懸濁し、プロテアーゼを加え、良く混合しながら１５〜５０℃にて１０分〜１２０分保温することで実施できる。反応終了後、例えば、反応液を遠心分離、または濾過することで、プロテアーゼを除去しプロテアーゼ処理菌体を回収する。プロテアーゼの混入を避けるために、上記の遠心または濾過等で回収した菌体をＰＢＳ等の緩衝液に懸濁し、同様の操作により菌体を回収することで洗浄操作を３〜５回実施することが好適である。
【００４３】
全菌体またはプロテアーゼ処理菌体からの多糖抗原の抽出は、菌体懸濁液を加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸により抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）等の従来公知の方法により行なうことができる。抽出された多糖抗原は、そのままで抗原として使用することも可能であるし、更に精製して使用することもできる。
【００４４】
これらの抗原抽出物等は、抗原としてそのまま使用することも可能であるし、免疫用担体と結合させて使用することも可能である。担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の従来公知の担体が好適に使用可能である。
【００４５】
本発明の抗体を作製するための抗原としては、作製の容易さと、得られる抗体の力価が高いということから、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体を直接免疫するのが特に好適である。
【００４６】
上記のような抗原を免疫する動物としては、抗体取得のために一般的に使用される動物が使用可能であるが、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット等の哺乳動物を用いるのが好適である。
これら動物に抗原を免疫する方法としては、従来公知の方法が制限なく採用でき、菌体または菌体抽出物を直接免疫してもよいし、アジュバントを添加混合して免疫してもよい。例えば、菌体を直接免疫する場合には、ストレプトコッカス・ミュータンスをブレインハートインフージョン（以下ＢＨＩと略す）液体培地等で培養後に得られる菌体の懸濁液をそのまま使用することも可能である。また、アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の従来公知のアジュバントが好適に使用可能である。
【００４７】
これら動物に抗原を免疫後、採血し血清を調製することで、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を含む液体（以下、該液体を「抗血清」と表記する場合もある）が得られる。
得られた抗血清は、該抗血清中に含まれるポリクローナル抗体の上記Ｍ／Ｓ反応性倍率が１０００以上であればそのままでも本発明に係るポリクローナル抗体とすることができ、免疫学的測定方法に使用可能であるが、通常抗血清中にはアルブミン等の抗体以外のタンパク質が含まれているため、高感度且つ特異的な測定を行なうためには、得られた抗血清を塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、電気泳動法等の方法により処理することでポリクローナル抗体画分を分取することが好ましい。例えば抗原としてストレプトコッカス・ミュータンスの菌体をウサギに免疫すると、約４週間後以降に抗血清が得られ、例えばプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法によりポリクローナル抗体画分（ＩｇＧ画分）が得られる。
【００４８】
この様にして得られたポリクローナル抗体について上記Ｍ／Ｓ反応性倍率を測定し、その値が１０００以上であれば、そのまま本発明の測定方法に使用できる。また、Ｍ／Ｓ反応性倍率が１０００未満である場合には、得られたポリクローナル抗体（以下、「原料抗体」ともいう）からストレプトコッカス・ミュータンスと反応するポリクローナル抗体（特異的抗体）を精製すればよい。
【００４９】
一般に、ポリクローナル抗体は多種の抗体の混合物であり、前記のようにして取得したポリクローナル抗体の中には、その他レンサ球菌にも反応する抗体が同時に存在し、そのため全体としてのＭ／Ｓ反応性倍率が低下している場合もある。従って、Ｍ／Ｓ反応性倍率が１０００以上となるまで原料抗体から特異的抗体を選択的に回収すれば良い。
【００５０】
原料抗体から特異的抗体を精製する方法は、アフィニティー精製法を採用するのが好ましい。アフィニティー精製法により特異的抗体を精製する場合には、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、当該菌体の抗原抽出物、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体及び当該菌体の抗原抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を固定化した不溶性担体（「抗原固定化担体」という場合もある）に特異的抗体を吸着させて該不溶性担体を回収した後に、該不溶性担体から特異的抗体をｐＨ、イオン強度又は誘電率を変化させる等従来公知の方法で溶出すれば良い。
【００５１】
或いは、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、当該菌体の抗原抽出物、ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体及び当該菌体の抗原抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を、不溶性担体を使用せずにそのまま使用し原料抗体と接触させ、特異的抗体を吸着させて分離し、その後、特異的抗体を溶出しても良い。この場合には、不溶性担体を使用せずに特異的抗体を吸着させて分離する必要があるため、プロテアーゼ処理したストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体を用いることが好ましい。
【００５２】
これらの方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性が低い或いは反応性を有さない抗体は、抗原固定化担体、またはストレプトコッカス・ミュータンス全菌体若しくはプロテアーゼ処理菌体に吸着されないので、吸着された抗体のＭ／Ｓ反応性倍率は高くなる。
【００５３】
抗原固定化担体を用いてアフィニティー精製する方法において、不溶性担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、塩化ビニル、ガラス、シリコーンラバー、又は多孔性シリカビーズ等の従来公知の担体が何ら制限無く使用可能である。
また、これら担体に前記抗原を固定化する方法としては、臭化シアン活性化法等の化学的結合法や、物理化学的吸着性を利用した方法が何ら制限無く使用可能である。
【００５４】
ストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体またはプロテアーゼ処理菌体をそのままアフィニティー精製に使用する方法は、操作が簡便であり、またストレプトコッカス・ミュータンスの菌体表面に存在する複数種の抗原と反応する複数種の抗体を同時に回収することが可能であるということから、より好適である。
アフィニティー精製に使用するストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体、またはプロテアーゼ処理菌体は、免疫用抗原の場合と同様の方法にて調製できる。
【００５５】
アフィニティー精製法における抗原固定化担体と原料抗体の接触および分離法としては、バッチ法およびクロマトグラフィー法の何れの方法も使用可能である。また、両方法を組み合わせて実施することも可能である。
【００５６】
クロマトグラフィー法では、抗原固定化担体をカラムに充填後、原料抗体をカラムに添加し、カラムに吸着されず溶出する画分を廃棄した後に、吸着した抗体を回収すれば良い。また、バッチ法においては、抗原固定化担体を懸濁した液と原料抗体を混合し、抗原抗体反応を十分行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収し、この沈殿から抗体を溶出する。
【００５７】
ストレプトコッカス・ミュータンス全菌体或いはプロテアーゼ処理菌体をそのまま使用する場合の原料抗体との接触および分離法は、上記バッチ法と同様であり、すなわち、菌体懸濁液と原料抗体を混合し、抗原抗体反応を十分に行わせた後に、例えば遠心処理により沈殿を回収することで実施できる。
【００５８】
Ｍ／Ｓ反応性倍率が１０００以上となるような、免疫に使用する抗原とアフィニティー精製の手法との好適な組み合わせとして、
ａ）免疫をストレプトコッカス・ミュータンスのプロテアーゼ処理菌体またはその抗原抽出物で行い、アフィニティー精製をストレプトコッカス・ミュータンスの全菌体もしくはそのプロテアーゼ処理菌体、またはこれらの菌体の抗原抽出物を用いて行う組合せ、および
ｂ）免疫をストレプトコッカス・ミュータンス全菌体またはその抗原抽出物で行い、アフィニティー精製をプロテアーゼ処理菌体またはその抗原抽出物を用いて行う組合せ、が挙げられる。
【００５９】
３．本発明に係るストレプトコッカス・ミュータンスの測定方法
上述した本発明に係るポリクローナル抗体を用いることによって、被検体液中に含まれるストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に、且つ高感度に測定することができる。すなわち、上述した本発明に係るポリクローナル抗体を用いることによって、被検体液中に他のレンサ球菌が存在していても、１０5個／ｍｌ程度の濃度のストレプトコッカス・ミュータンスを検出することができる。
【００６０】
特に、本測定方法においては、上記のようにして取得した各種ポリクローナル抗体をそれぞれ単独で使用することもできるが、性質の異なるポリクローナル抗体を混合して使用する事もできる。例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型ｃに対する反応性が血清型ｅ、ｆに対する反応性の２倍以上のポリクローナル抗体、血清型ｅに対する反応性が血清型ｃ、ｆに対する反応性の２倍以上のポリクローナル抗体、さらに血清型ｆに対する反応性が血清型ｃ、ｅに対する反応性の２倍以上のポリクローナル抗体を適宜混合して、血清型ｃ、ｅおよびｆに対する反応性を同等として用いることも可能である。
【００６１】
本測定方法で使用する被検体液は、被検者から採取した原被検体液、当該原被検体液に何らかの処理を行ったもの等、ストレプトコッカス・ミュータンスを含むものであれば特に限定されない。原被検体液としては、例えば、唾液、歯垢、菌体培養液、培養菌体懸濁液等が使用できるが、齲蝕リスクを検査するための検体として、唾液、歯垢を含む体液が特に好適に使用される。なお、唾液および歯垢は、原被検体液中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。
【００６２】
例えば歯垢のみを含む原被検体液は、口腔内をうがい等により洗浄し唾液成分を除去した後に採取した歯垢を用いて調製すればよい。歯垢の採取は、口腔内の特定部位の歯垢を爪楊枝、綿棒、スパチュラ等の従来公知の方法で採取することもできるし、口腔内より無作為に採取することもできる。このように採取された歯垢を緩衝液等の液体に懸濁し原被検体液とすればよい。例えば、歯垢と唾液の混合物を原被検体液とする場合は、パラフィンペレット等の咀嚼物を30秒〜10分間噛ませ、分泌された唾液を吐き出させることにより採取できる。
【００６３】
また、唾液のみを含む原被検体液は、例えば、スポイト、ピペット等の従来公知の方法で採取された唾液を用いて調製することができる。採取された唾液は、そのまま或いは、緩衝液で適宜希釈して原被検体液とすればよい。これらの原被検体液は、そのままでも被検体液としてストレプトコッカス・ミュータンスの測定に使用可能であるが、原被検体液に含まれる不溶物を分散させる目的で超音波処理を施す、ガラスビーズ等の破砕剤と混合し攪拌する等の従来公知の処理によって被検体液を調製し、分析に供することが好適である。
【００６４】
また、上記の原被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスに抽出処理を施して調製した抗原抽出物の含有液を被検体液として測定することもできる。抗原の抽出法としては、例えば、加熱処理する方法（Ｒａｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１３：２９０−２９１，１９５５．）、亜硝酸、アルカリ、塩、キレート剤、カオトロピックイオン、界面活性剤を使用して抽出する方法（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）、菌体細胞の膜構造を破壊する酵素により処理する方法（特開平９−１７８７５２公報）等公知の方法が制限無く利用できる。このような抗原抽出物の含有液を被検体液とする方法は、より高感度にストレプトコッカス・ミュータンスを測定することが可能になり、特に好適な方法である。
【００６５】
なお、原被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度（濃度の単位：個／ｍｌ）は、培養法等の従来公知の細菌学的手法に従い、ストレプトコッカス・ミュータンスを計数することによって測定できる。例えば、培養法により濃度測定をする場合には、原被検体液を適宜希釈して得た懸濁液に超音波処理等の菌体の分散処理を施した後、ＢＨＩ培地プレート上に塗布し生じるコロニー数を計数し、原被検体液の希釈倍率を乗じることにより、原被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度（濃度の単位：個／ｍｌ）を測定することができる。
【００６６】
但し、このとき、原被検体液中には、ストレプトコッカス・ミュータンス以外にもストレプトコッカス・ソブリヌス、或いは他の口腔内細菌が含まれるので、培地プレート上に生じたコロニーはストレプトコッカス・ミュータンスのコロニーとそれ以外のコロニーに正確に分類され、ストレプトコッカス・ミュータンスだけを正確に計数する必要がある。コロニーの分類は、培地プレート上に生じたコロニーについて、糖発酵試験等の生化学的手法、特異的抗体を利用した免疫学的手法、ＤＮＡプローブを利用した遺伝学的手法により行うことができる。
【００６７】
本測定方法では、上記のような被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを、上述したポリクローナル抗体を用いて、免疫学的測定方法により測定する。抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法は、夾雑物が存在する被検体液中の抗原を迅速・簡便に測定することのできる方法である。
【００６８】
免疫学的測定方法は特に限定されず、抗原抗体反応により抗原を測定する方法として知られている免疫凝集法、光学免疫測定法、標識免疫測定法、およびこれらの組合わせ等の従来公知の免疫学的測定方法が制限無く使用できる。これらの免疫学的測定法を実施するための測定試薬は、本発明の抗体を含む免疫学的測定試薬であればその形態は特に限定されず、本発明の抗体を含む溶液；本発明の抗体を粒子、メンブレン等の不溶性担体に固定化したもの、或いはその懸濁液；本発明の抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種着色粒子等の標識物質を結合させたもの、或いはそれらの溶液や懸濁液；又はこの様な標識された本発明の抗体を粒子やメンブレン等の不溶性担体に固定化したもの或いはそれらの懸濁液；およびこれらを組み合わせたもの等、様々な形態をとり得る。
以下、これら免疫学的測定試薬を用いた測定方法について説明する。
【００６９】
[免疫凝集法]
該方法は、抗原抗体反応に基づく不溶性担体の凝集反応を利用して、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを検出、定量する方法である。半定量的方法としてはラテックス凝集法、マイクロタイター法等が、定量的測定法としてはラテックス定量法等がある。
【００７０】
例えばラテックス凝集法を利用して被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを免疫学的に測定する場合には、ラテックスビーズに本発明に係るポリクローナル抗体を固定化した抗体感作粒子を含む測定試薬を作製後、該測定試薬と被検体液を混合し、抗原抗体反応後における感作粒子の凝集の度合を、目視、或いは光学的測定法等により検出することで測定することができる。
【００７１】
[光学免疫測定法]
該方法は、本発明に係るポリクローナル抗体と被検体液とを接触させて抗原抗体反応を行った場合に、抗原抗体反応の結果生じる凝集物の濁度の変化を検出する方法、本発明に係るポリクローナル抗体を透明な支持体上に固定化した測定試薬に被検体液を接触させ、抗原抗体反応の結果粒子状の菌体が透明支持体上に結合することによる透過度の変化を検出する方法、又は本発明に係るポリクローナル抗体を固定化した薄層（以下、抗体層ともいう。）に被検体液を接触させ、抗原抗体反応の結果生じる抗体層の屈折率の変化を透過光や表面プラズモン波等の変化として検出する方法等、抗原抗体反応の有無を光学的に検出する方法のことである。
【００７２】
[標識免疫測定法]
該方法は、本発明に係るポリクローナル抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種粒子等の各種標識物質を結合させてなる標識抗体を含む測定試薬と、被検体液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、被検体液中の抗原に結合した標識抗体を検出する、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色等を測定することによって、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを検出、定量する方法である。
【００７３】
該方法では、例えば本発明に係るポリクローナル抗体を固定化した不溶性担体（粒子、メンブレン、ＥＬＩＳＡプレート等）を含む測定試薬と被検体液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、本発明に係るポリクローナル抗体を標識物質で標識した標識抗体を含む別の測定試薬を接触させて更に抗原抗体反応を行った後に、標識物質の量を測定することによって、又は被検体液と標識物質で標識したストレプトコッカス・ミュータンスの菌体または菌体表面抗原とを混合し、本発明に係るポリクローナル抗体を固定化した不溶性担体を含む測定試薬に接触させて抗原抗体反応を行った後に、本発明に係るポリクローナル抗体に結合した標識物質の量を測定することによって被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを検出、定量することができる。
【００７４】
標識物質としては、放射性物質として放射性ヨード、放射性炭素等が、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が、各種色素類として、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色素類が、コロイドとして金コロイド、炭素コロイド等が、各種粒子としては着色ラテックス粒子等が使用できる。
【００７５】
なお、酵素標識を行う場合は、チオール基とマレイミド基、アミノ基とアルデヒド基等の共有結合により直接標識する、或いはビオチン−アビジン複合体を介し標識する等の方法が使用可能である。また、標識酵素としてアルカリホスファターゼを用いた場合にはジオキセタン誘導体等の化学発光物質を、またパーオキシダーゼを用いた場合にはルミノール誘導体等の化学発光物質を酵素の基質として使用し、該基質の発光を検出することもできる。
【００７６】
これら各種標識免疫測定法において、一般に採用されている操作、手順等は適宜適用でき、公知の非競合法や競合法、サンドイッチ法等に準じることができる。また、本発明に係るポリクローナル抗体と共に、上記の各標識物質で標識した二次抗体、プロテインＡ等の本発明に係るポリクローナル抗体に結合可能な物質を使用してストレプトコッカス・ミュータンスの検出・定量に用いることもできる。
【００７７】
また、必要に応じて複数の抗体を組み合わせてストレプトコッカス・ミュータンスの検出・定量に用いることもできる。例えば、サンドイッチ法の原理に基づく免疫学的測定法に於いて、固相に固定化する抗体としてストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体を使用し、標識抗体として本発明に係るポリクローナル抗体を使用することもできる。
【００７８】
該標識免疫測定法では、用いる標識に応じて従来使用されている方法が特に限定無く使用できるが、中でも放射性物質を標識として使用する放射免疫測定法、酵素を標識として使用する酵素免疫測定法、色素、特に蛍光色素を標識として利用する蛍光免疫測定法、酵素の基質としての化学発光物質を標識として利用する化学発光免疫測定法等は定量性が高いので、高精度の定量測定を行なう場合にはこれら測定方法を採用するのが好適である。また、コロイドまたは各種粒子を標識として使用するフロースルー免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、並びにラテックス凝集法は、操作が簡便であるという特徴がある。
【００７９】
これら各種免疫学的測定方法のなかでも、ラテックス定量法や酵素免疫測定法は、自動分析装置を用いて多数の被検体液を処理することが可能であるので、集団検診等の検査法として好適である。また、フロースルー免疫測定法、免疫クロマトグラフィー法、およびラテックス凝集法は簡便性に加えて特別な知識や装置を必要とすることなく迅速な測定が可能であり、歯科医院や家庭においても実施可能であるため、汎用的な検査方法として好適である。
【００８０】
免疫クロマトグラフィー法は、歯科医院や家庭においても実施可能な方法であるが、本発明者らは、該方法で一般的に使用される免疫クロマトグラフィーテストストリップ（単に、「ストリップ」とも言う）と呼ばれる測定試薬に本発明の抗体を用いることによりその検出限界を高め、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを高感度で測定することができることを見出した。このことにより、上記本発明に係るポリクローナル抗体を用いたストリップを使用した免疫クロマトグラフィー法（以下、「本発明に係る免疫クロマト法」ともいう）は、優れた汎用的な齲蝕危険度の判定検査方法となり得る。そこで、以下に図を参照して該方法について詳しく説明する。
【００８１】
図１および図２に本発明に係る免疫クロマト法で好適に使用できる代表的なストリップ１の構造を示す。該ストリップ１は、従来のストリップと同様に、それぞれ目的に応じた多孔性支持体からなる各部材、すなわち被検体液を一時的に吸収、保持するためのサンプルパッド２、標識抗体を一時的に保持するためのコンジュゲートパッド３、検出用抗体が固定化される展開メンブレン４、およびサンプルパッド２より展開された被検体液或を吸収するための吸収パッド５がこの順番で接合された構造からなる。
【００８２】
ストリップ１におけるコンジュゲートパッド３には、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを標識するための抗体（以下、「標識抗体」という）が塗布・乾燥することにより保持されている。該標識抗体としては、例えば金コロイド等の標識物質で標識した抗体が使用される。また、上記展開メンブレン４上の検出ライン６には、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスを捕捉するための検出用抗体が固定化されている。上記標識抗体と上記検出用抗体としては、両方に本発明に係るポリクローナル抗体を使用してもよいし、本発明に係るポリクローナル抗体とストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノクローナル抗体を組み合わせて使用してもよい。すなわち、ストリップ１においては、上記標識抗体と上記検出用抗体のうち少なくとも一方に本発明に係るポリクローナル抗体を用いる。
【００８３】
上記各部材を構成する多孔性支持体に用いる材料は特に限定されず、各部材の目的に応じて吸湿性材料、多孔質材料、繊維質材料等から適宜選択される。例えば、サンプルパッド２としては、濾紙、吸取紙等を用いるのが好適であり、コンジュゲートパッド３としてはガラス繊維布、ポリプロピレン不織布、ガラスフィルター等を用いるのが好適である。また、展開メンブレン４としてはニトロセルロース、或いは酢酸セルロースを含むニトロセルロース等を用いるのが好適であり、吸収パッド５としては濾紙、吸取紙等を用いるのが好適である。
【００８４】
なお、検出用抗体およびコントロール抗体の展開メンブレン４への固定化方法は特に限定されず、従来公知の物理的吸着法や共有結合法が何ら制限無く使用できるし、他のタンパク質等と混合して固定化することもできる。また、展開メンブレン４への被検体液成分の非特異的吸着を抑制する、或いは展開メンブレン４への被検体液の湿潤性を向上するため抗体固定化後の展開メンブレン４を公知の方法によりタンパク質、脂質、高分子化合物等によりブロッキング処理することもできる。このブロッキング処理に用いるタンパク質等は特に限定されるものではないが、一般的な免疫学的測定法において、非特異的反応を抑制する目的で使用されているＢＳＡ、スキムミルク等が好適である。また、被検体液が展開メンブレン４を均一に展開するように、展開メンブレン４の吸水性を調整するために、展開メンブレン４の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆または含浸させることもできる。
【００８５】
なお、コンジュゲートパッド３については、被検体液を添加したときに、ストレプトコッカス・ミュータンスと標識抗体との複合体が、この部分から容易に脱離するように、水溶性重合体、またはサッカロース等の糖類で予めブロッキングした後標識抗体を添加してから乾燥させる、或いは標識抗体を予め水溶性重合体、またはサッカロース等の糖類と混合してからコンジュゲートパッド３に塗布し乾燥させるのが好ましい。
【００８６】
上記水溶性重合体としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、セルロースエーテル（メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、オキシエチルセルロース、シアンエチルセルロース等）、ゼラチン等が使用できる。
【００８７】
また、標識抗体を調製するための標識物質としては、金コロイド、炭素コロイド、着色ラテックス等の目視によって確認できる標識物が使用できる他、放射性物質や蛍光物質も使用可能である。また、標識物質として酵素を利用し、抗原抗体反応の後に基質を添加して、酵素反応により生じる化合物を検出することもできる。本発明に係るポリクローナル抗体の標識化は特に限定されず、従来一般的に採用されている方法により行なうことができる。
【００８８】
本発明に係る免疫クロマト法では、前記ストリップ１のコンジュゲートパッド３の近傍に位置するサンプルパッド２に被検体液を添加し、室温で１〜３０分間放置することにより被検体液とともに標識抗体を検出ライン６まで展開し、サンドイッチ法の原理に基づいて、展開液中の標識抗体と結合したストレプトコッカス・ミュータンスを検出用抗体にて検出ライン６上に捕捉し、捕捉されたストレプトコッカス・ミュータンスに結合した標識抗体を検出することにより、被検体中のストレプトコッカス・ミュータンスの有無またはその多寡を測定することができる。このときに標識抗体が被検体液と共に正常に展開されていることは、上記検出ライン６の下流のコントロール判定ライン７に標識抗体と反応する抗体を固定化しておき、この位置で標識抗体が検出されることにより確認することができる。
なお、図１に示される展開メンブレン４上の検出ライン６およびコントロール判定ライン７の位置、順、形状、数等は一例であり特に限定されるものではない。
【００８９】
以上、標識抗体を予め塗布して乾燥させたストリップ１を用いた免疫クロマト法について説明したが、標識抗体を予め被検体液と混合し抗原抗体反応を行わせた後に、該混合液を検出用抗体が固定化された多孔性支持体の一端に添加するという方法でも測定可能である。
【００９０】
本免疫クロマト法による測定においては、例えば以下のような手順で測定を行なうことにより、迅速簡便に被験者の口腔内に存在するストレプトコッカス・ミュータンスの量を知ることができ、齲蝕危険度を診断判定することができる。
【００９１】
即ち、まず、▲１▼口腔内より歯垢、唾液を原被検体として採取し（スパチュラ、又は綿棒で歯垢を採取、或いはパラフィンガムを噛ませ唾液を採取）、▲２▼原被検体液が唾液である場合にはそのまま、或いは検体希釈液に懸濁させ被検体液を調製するか、また、原被検体液が歯垢である場合には検体希釈液に懸濁させた後必要に応じて超音波を当てる等の歯垢の分散処理を施して被検体液を調製するか、或いは、原被検体液に抽出処理を施して被検体液を調製し、▲３▼被検体液（例えば１００〜２００μｌ）を分取し、前記ストリップのサンプルパッドに添加し、所定時間（例えば１〜３０分）静置した後、該ストリップの検出ライン６およびコントロール判定ライン７の着色の有無あるいはその状態により判定することによりストレプトコッカス・ミュータンスが存在するか否か、或いはその量を知ることができる。
【００９２】
例えば、金コロイドを標識物質として用いた場合には、被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスの濃度により検出ライン６の金コロイドによる着色の程度は表１に示す様に変化するので、表２の基準に従い齲蝕危険度を診断判定することができる。
【００９３】
【表１】
0004268358.tif 000002
【００９４】
【表２】
0004268358.tif 000003
【００９５】
このようにして本発明に係る免疫クロマト法により、齲蝕原因菌として特に重要であるストレプトコッカス・ミュータンスの量を迅速簡便に測定することができ、被験者の齲蝕危険度を診断判定することができる。
【００９６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
実施例１［ポリクローナル抗体の作製、抗体の反応性評価］
（１）［菌体懸濁液の調製］
ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ2：Ｈ2：ＣＯ2＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
【００９７】
次いで、沈殿物を５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ600＝１．０に調整し菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０9個／ｍｌであった。
【００９８】
同様の操作により、Ｐ４（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｅ）、ＯＭＺ１７５（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｆ）、Ｃｈａｌｌｉｓ（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）、ＩＦＯ１３９５６（ストレプトコッカス・サリバリウス）、ＡＴＣＣ３５０３７（ストレプトコッカス・オラリス）、ＡＴＣＣ１５９１１（ストレプトコッカス・ミティス）、ＡＴＣＣ１０５５６（ストレプトコッカス・サンギス）の菌体濁液を調製した。なお、ここでＩｎｇｂｒｉｔｔ、Ｐ４、ＯＭＺ１７５、Ｃｈａｌｌｉｓ等は標準菌株の菌株名を、ＡＴＣＣ３５０３７、ＩＦＯ１３９５６等は標準菌株の寄託番号を示す。
【００９９】
（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１００ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、５時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ600＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔの菌体懸濁液を調製した。
【０１００】
または、ＢＨＩ培地にて培養したＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ600＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ600＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔのプロテアーセ処理菌体懸濁液を調製した。
【０１０１】
免疫は以下のように実施した。
第１週は菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液それぞれ０．５ｍｌを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は該菌体懸濁液または該プロテアーゼ処理菌体懸濁液それぞれ１．０ｍｌを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は菌体懸濁液またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液それぞれ２．０ｍｌを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【０１０２】
（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
（２）の方法に従い、１ＬのＢＨＩ液体培地で培養したＩｎｇｂｒｉｔｔまたはプロテアーゼ処理ＩｎｇｂｒｉｔｔをＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄し、菌体懸濁液、またはプロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ600＝１２．５）を調製した。
【０１０３】
次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗血清０．５ｍｌとを混合するか、菌体懸濁液と（２）で調製したプロテアーゼ処理菌体懸濁液を免疫して得られた抗血清０．５ｍｌとを混合するか、または、プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した菌体懸濁液を免疫して得られた抗血清０．５ｍｌとを混合するかして、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、各菌体を回収した。この各菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【０１０４】
次いで、０．５ｍｌの０．１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に各菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【０１０５】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ280を測定することで確認した。
【０１０６】
以上により、プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−１」を、０．２ｍｇ得た。また、プロテアーゼ処理菌体懸濁液を抗原として得た抗血清（０．５ｍｌ）を菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−２」を、１ｍｇ得た。さらに、菌体懸濁液を抗原として得た抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体「Ｍ−３」を、１ｍｇ得た。
【０１０７】
（４）〔直接ＥＬＩＳＡ法によるストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の評価〕
上記（３）で精製したストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体（Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３）と、各菌体との反応性評価は、以下の直接ＥＬＩＳＡ法により行った。
【０１０８】
すなわち、先ず、上記（１）の方法で得られた菌体懸濁液を、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて１×１０4〜１０9個／ｍｌとなるよう希釈したものを、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに５０μｌずつ添加し、４℃、１２時間放置し固定した後、イムノプレートから溶液を除去し、各ウェルを３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【０１０９】
次いで、イムノプレートの各ウェルに、２％ＢＳＡ−０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３００μｌ添加し、３７℃、２時間放置した後、イムノプレートから２％ＢＳＡ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を除去し、３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０１１０】
次いで、Ｍ−１、Ｍ−２、或いはＭ−３を、１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて１．０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに５０μｌ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０１１１】
次いで、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（ヤギ）（カッペル社）を、１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに５０μｌ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０１１２】
次いで、発色基質溶液として、ｐ−ニトロフェニルリン酸の２−エタノールアミン水溶液（ＢＩＯＲＡＤ社）を各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温下２０分反応した。反応後、０．４ＭのＮａＯＨを各ウェルに５０μｌずつ添加し反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｍ−１の結果を表３に、Ｍ−２の結果を表４に、Ｍ−３の結果を表５に示す。
【０１１３】
【表３】
0004268358.tif 000004
【０１１４】
【表４】
0004268358.tif 000005
【０１１５】
【表５】
0004268358.tif 000006
【０１１６】
表３〜５より、Ｍ−１，Ｍ−２、Ｍ−３は、５×１０7個／ウェルのその他レンサ球菌を抗原として使用した場合に検出される反応と同一の反応が検出されるストレプトコッカス・ミュータンスの抗原量は５×１０4個／ウェル以下であることから、これらの抗体のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性は、その他レンサ球菌の１０００倍以上であることが分かる。また、プロテアーゼ処理Ｉｎｇｂｒｉｔｔは少なくとも、免疫用の抗原または精製のどちらか一方に使用すれば、両方に使用した場合と同様の効果が得られることも明らかとなった。また、ｃ型以外のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性も、ｃ型に対する反応性の１／２以内であることが分かる。
【０１１７】
比較例１［吸収法によるポリクローナル抗体の作製、抗体の反応性評価］
（１）［ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製と精製］
ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製は実施例１（２）と同様の方法にて行った。
【０１１８】
実施例１（１）の方法に従って、Ｃｈａｌｌｉｓ、ＩＦＯ１３９５６、ＡＴＣＣ３５０３７をそれぞれ約２×１０12個／ｍｌ含む菌体懸濁液３０ｍｌを調製した。次いで該菌体懸濁液と、抗血清０．５ｍｌを混合し４℃、６０分反応した。混合液を４０００ｇ、５分遠心処理後上清を分取し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１１９】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロースを充填したカラムに上清試料を添加し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ280を測定することで確認した。０．５ｍｌの抗血清より、約５ｍｇのＩｇＧを回収した。
【０１２０】
（２）〔直接ＥＬＩＳＡ法によるストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の評価〕
実施例１（４）と同様の方法にて上記（１）で吸収法で精製したストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体と各菌体との反応性評価を行った（表６）。
【０１２１】
【表６】
0004268358.tif 000007
【０１２２】
表６から明らかなように、従来技術である吸収法により精製した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体のストレプトコッカス・ミュータンスに対する反応性は、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サンギスに対する反応性の１００倍以上になったが、１０００倍未満であった。
【０１２３】
実施例２〔ストレプトコッカス・ミュータンス測定用免疫クロマトグラフィテストストリップの作製、評価〕
（１）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１０ｍｌに１００ｍＭＫ2ＣＯ3を８８μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ520＝１．０であった。
【０１２４】
次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整したＭ−２の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ520＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識Ｍ−２」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【０１２５】
（２）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの作製〕
図１及び２に示したような、ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ７５、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン４上の検出ライン６およびコントロール判定ライン７上に、それぞれ１ｍｇ／ｍｌのＭ−３および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【０１２６】
また、コンジュゲートパッド３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ520＝１．０に調整した金コロイド標識Ｍ−２を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド２（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
このように調製した、図１に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。
【０１２７】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップの特異性、感度評価〕
実施例１（１）で調製した菌体懸濁液をＰＢＳで適宜希釈して被検体液とした。免疫クロマトグラフィーテストストリップのサンプルパッド２上に、被検体液１００μｌを添加し、１０分後にスポットの有無を判定した。判定は、検出用抗体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を前記表１に示した基準に基づき４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に目視で識別し、感度および定量性を評価した。結果を表７に示す。その他レンサ球菌は１０8個／ｍｌの濃度であっても判定ラインに着色は認められず、１０5個／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが特異的に検出できた。
【０１２８】
【表７】
0004268358.tif 000008
【０１２９】
比較例２〔吸収法で精製したストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を用いた免疫クロマトグラフィーテストストリップの評価〕
Ｍ−２、Ｍ−３の代りに比較例１で作製したストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体を使用した以外は実施例２（１）（２）に記載に方法と同様の方法で免疫クロマトグラフィーテストストリップを作製し、実施例２（３）記載の方法に従って菌体との反応性、感度を評価した。結果を表８に示す。
【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
表８から明らかなように、従来技術の吸収法で精製したポリクローナル抗体を使用した場合は、１０5／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスを検出することは出来なかった。
これは、吸収処理により交差反応の原因となる抗体が除去されるが、それと同時にストレプトコッカス・ミュータンスと特異的に反応する抗体も除去されてしまうためであると考えられる。このため、吸収処理により製造したポリクローナル抗体では、被検体液中にストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サンギス等の、ミュータンスレンサ球菌以外の口腔内レンサ球菌が１０8個／ｍｌオーダーで混在する場合、１０5個／ｍｌ程度の濃度のストレプトコッカス・ミュータンスを正確に測定できなかった。
【０１３２】
実施例３〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによる歯垢からのストレプトコッカス・ミュータンスの検出〕
（１）〔歯垢を含む被検体液の調製〕
被験者にパラフィンペレットを約１分間噛ませ、分泌された唾液を採取し、２０秒間、６０Ｗで超音波処理することで歯垢を含む被検体液を得た。
【０１３３】
（２）〔培養法による歯垢試料溶液中のストレプトコッカス・ミュータンスの定量〕
上記（１）の方法に従い得られた歯垢を含む原被検体液を適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上およびＢＨＩ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、２４〜４８時間培養した。ＭＳＢおよびＢＨＩ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、被検体液の希釈率から、ミュータンスレンサ球菌濃度を個／ｍｌとして算出した。
【０１３４】
ＭＳＢおよびＢＨＩ培地上のストレプトコッカス・ミュータンスの識別は、コロニーの形態学的分類、および形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法および、糖発酵試験等の生化学的方法によりストレプトコッカス・ミュータンスの同定を行った。
【０１３５】
（３）〔免疫クロマトグラフィーテストストリップによる歯垢を含む被検体液中のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例２の（２）と同様の方法で作製した免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いて歯垢を含む被検体のストレプトコッカス・ミュータンスの測定を実施した。免疫クロマトグラフィーテストストリップに於ける１０分後のスポット発色強度を前記表１に示した基準に基づき識別し、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（２）の培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンス菌数とを比較した。結果を表９に示す。
【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
表９に示したように、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。本発明の免疫クロマトグラフィーテストストリップにより、被検体液中の１０6個／ｍｌ以上のストレプトコッカス・ミュータンスを濃度依存的に、特異的に検出可能であった。
【０１３８】
実施例４［免疫クロマトグラフィーテストストリップによる歯垢からの抽出抗原を被検体液中とした場合のストレプトコッカス・ミュータンスの測定］
（１）［抗原抽出液の調製］
実施例３（１）で採取した唾液１００μｌを遠心分離し上清を除去した。沈殿を５００μｌの０．１ＭＮａＯＨに懸濁し、遠心分離により上清を除去した。次いで沈殿を５００μｌのＰＢＳに懸濁し、遠心分離にて上清を除去した。ＰＢＳによる同様の操作を再度実施した後、沈殿に１０μｌの４Ｍ酢酸と５μｌの２Ｍ亜硝酸ナトリウムを添加し、良く混合後室温で１０分間放置した。４５μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１Ｍトリス（ｐＨ未調製）と４０μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、抗原抽出液を調製した。
【０１３９】
（２）〔免疫クロマトグラフィテーストストリップによる抽出抗原を被検体液中とした場合のストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
ストリップに使用するニトロセルロースメンブレンがＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０である以外は実施例２の（２）と同様の方法で作製した免疫クロマトグラフィーテストストリップを用いて上記（１）で調製した抗原抽出液を被検体液としてストレプトコッカス・ミュータンスの測定を実施した。免疫クロマトグラフィーテストストリップに於ける１０分後のスポット発色強度を前記表１に示した基準に基づき識別し、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（２）の培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンス菌数とを比較した。結果を表１０に示す。
【０１４０】
【表１０】
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【０１４１】
表１０から明らかなように、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。また、抽出処理により１０5／ｍｌのストレプトコッカス・ミュータンスが検出できた。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明に係るポリクローナル抗体を用いることにより、その他レンサ球菌が混在する唾液、歯垢を含む被検体液から培養すること無しに、直接ストレプトコッカス・ミュータンスを高感度に測定することが可能となる。本発明により、新たな齲蝕危険度の診断システムを構築することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの側面図である。
【符号の説明】
１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン
７・・・コントロール判定ライン
【図１】
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【図２】
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