(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなる実験用動物であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物。
【請求項２】
前記無菌動物が、マウスであることを特徴とする請求項１に記載された特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物。
【請求項３】
無菌動物に、予め用意された該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、定着させることを目的とする予め定められた複数種の属からなる腸内細菌の菌液とを経口投与した後、常法により飼育する実験用動物の作出方法であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定細菌を腸内菌叢として有する新規な実験用動物の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の腸内には、数100種にも及ぶ微生物が生息しており、互いに共生あるいは拮抗しながら腸内菌叢を構成している。この腸内菌叢は、加齢と共に変化するものの、宿主の健康が維持されている限りにおいては、その構成は極めて安定しているとされている。その反面、ストレスや疾病等の要因により健康が損なわれた場合には、腸内菌叢のバランスが崩れていることが少なくない。
【０００３】
一方で、無菌動物と通常動物との比較等から、この腸内菌叢が、宿主動物の栄養生理や感染防御、すなわち健康と疾病とに大きく影響することが明らかにされてきている。
【０００４】
近年では、この腸内菌叢の宿主への影響を積極的に利用することで、健康に寄与させることも試みられており、腸内菌叢を制御する目的で、宿主の有する常在菌叢の一員であり、かつ宿主に対して明確な有用性を示す微生物であるところの「プロバイオティクス」や、これらプロバイオティクスを含む腸内の有用微生物に選択的に利用され得る物質であるところの「プレバイオティクス」の探索が積極的に行われている。
【０００５】
また、各種薬剤が腸内環境に多大な影響を与えることも多く、場合により下痢等の様な副作用を誘発することも少なくない。これらの副作用は時として患者の容体に強く関わってくることがあるだけに、薬剤の安全性は腸内菌叢との関わりの面でも検討されている。
【０００６】
ところで、これらプロバイオティクス及びプレバイオティクスの検索や、薬剤の安全性の検討には、ヒトを用いて試験することが最も望ましいが、倫理上、或はコストの面で問題があった。そのため、これまでは試験管内でヒトの腸内細菌を連続培養した人工消化管モデルや、マウスやラット等の実験用動物が使用されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、試験管を用いたヒト消化管モデルで検討できる内容は腸内菌叢の応答にかぎられており、生体での応答を検討するには不十分であった。また、ヒトとマウスやラット等の実験用動物とでは保有する常在菌叢に差異があり、この動物実験で得られた結果がヒトでは再現されない場合も往々にして存在した。
【０００８】
これらの問題点を考慮した方法として、無菌条件下で飼育し、全く腸内菌叢の存在しない動物に、ヒト由来の腸内細菌を投与した実験用動物も考案されるが、腸内の菌叢はヒトのものであっても、腸の生理的及び環境的状態は無菌動物と同様未成熟のままであり、正常な腸内環境を反映するとは言い難いものであった。
【０００９】
本発明は、特定細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物及びその作出方法を得ることを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物は、無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなる実験用動物であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする特定細菌を腸内菌叢として有するものである。
【００１２】
請求項２に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物は、請求項１に記載された無菌動物が、マウスである。
【００１４】
請求項３に記載された発明に係る特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物の作出方法は、無菌動物に、予め用意された該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、定着させることを目的とする予め定められた複数種の属からなる腸内細菌の菌液とを経口投与した後、常法により飼育する実験用動物の作出方法であって、
前記無菌動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれ、
前記腸内細菌が、ヒト腸内菌叢由来のものであることを特徴とする方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、無菌動物に、該動物と同種の動物から得られたセグメント細菌と、ヒトを含む動物由来の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌とが投与されてなるものであるため、目的の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物を得ることができる。
【００１６】
本発明における無菌動物とは、目的の予め定められた複数種の属からなる腸内細菌を投与する際に、この腸内細菌を腸内菌叢として常在させることを妨げる腸内細菌が存在しない、更には、口腔、咽頭等の消化器官中に細菌が存在しない動物を指す。例えば、薬剤等で腸内細菌等の消化器官中の細菌を一掃した動物や、より好ましくは無菌飼育下で成育した動物など、通常、実験用動物に供される動物を指す。また、市販の動物はもとより、作出された新しい系統のものであってもよく、その系統、製造メーカー等に関係なく使用することができる。
【００１７】
無菌動物として、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れかから選ばれる。より好ましくは無菌飼育が容易なマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタから選ばれ、更に好ましくはコストの面又は汎用性から特にマウス及びラットが望ましい。
【００１８】
本発明で付言したセグメント細菌とは、繊維状の形態的特徴を有する動物の腸内に常在細菌の一つであり、本発明では宿主となる無菌動物と同種の動物から得られたセグメント細菌を用いる。より好ましくは、本発明者らが提案した方法（特開平８−２１４８７３号公報）を用いて単離、培養及び継代された、繊維状の形態的特徴を持つセグメント細菌を用いる。
【００１９】
尚、このセグメント細菌は、特定の動物の小腸上皮細胞を採取し、無菌の同種の動物に無菌的に投与し、飼育する操作を繰り返すことにより単離することができることが確認されている（特開平８−２１４８７３号公報）。しかしながら、生体外で培養するための有効な培養方法が確立されておらず、現行の寄託制度のもとでは寄託機関に寄託することが不可能である。
【００２０】
従って、株式会社ヤクルト本社中央研究所（所在地；東京都国立市谷保１７９６  電話番号；０４２５−７７−８９６０）において、マウス由来セグメント細菌を、セグメント細菌ＢＡＬ０１として、分譲可能な状態に保存されており、必要に応じて第三者が入手することができるようになっている。
【００２１】
また、セグメント細菌の調製法、あるいは動物への投与法は、本発明者らが提案した方法（特開平８−２１４９００号公報）に従えばよい。
【００２２】
本発明で用いる腸内細菌は、ヒトを含む動物由来のものであれば良い。従って、宿主動物と同種の動物以外の動物であっても、腸内菌叢を形成することが可能となる。特に、ヒト腸内菌叢由来の腸内細菌を用いることにより、マウス、ラット等の実験動物に投与して、ヒト腸内菌叢を腸内に有する実験動物を得ることが可能となり、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの検索や、薬剤の安全性の検討を図れる。
【００２３】
また、腸内細菌はどのような方法で得たものを使用しても良く、糞便の懸濁液、あるいは直接腸管から採取するなどの方法がある。また、目的に合わせて、特定の疾病患者から入手したものを使用しても良く、得られた菌株をすべて使用しても良いが、得られた菌株から特定の菌株を選択して使用することもできる。
【００２４】
本発明の実験用動物の作出方法は、無菌動物に、前記のセグメント細菌及び、定着させることを目的とする１種以上の腸内細菌の菌液を常法により経口的に投与した後、常法により飼育すれば良い。菌液投与後、約７〜14日後にヒト腸内細菌が最優勢な腸内菌叢を有する実験用動物を作成することができる。
【００２５】
尚、セグメント細菌と、定着させることを目的とする複数種の属からなる腸内細菌との投与する順番も特に規定されず、同時に投与しても良いが、好ましくは先にセグメント細菌を投与し、定着を確認した後に、目的とする複数種の属からなる腸内細菌を投与する順番が良い。
【００２６】
また、ラクトバチルス属菌などの定着し難いとされる細菌の場合は、セグメント細菌の定着後、まず目的とする１種以上の腸内細菌群から単離したラクトバチルス属菌などの定着し難いとされる細菌のみを定着させ、その後目的とする他の複数種の属からなる腸内細菌を投与する順番が良い場合がある。
【００２７】
【実施例】
次に試験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物の作出）
雌１６〜１７週齢の無菌マウス（BALB／c）１６匹に、予め調製されたセグメント細菌およびヒト腸内細菌を経口投与した。投与後１４、３０日後に糞便の塗抹標本を作成し、セグメント細菌およびヒト腸内細菌の定着を確認した。
【００２８】
該無菌マウス糞便中のセグメント細菌の菌数の測定は、上記により作成した糞便の塗抹標本をグラム染色し、直接鏡検によって行った。また、ヒト腸内細菌の菌数の測定は、各種選択培地を用いて行った。投与後１４日後の結果を次の表１に示す。尚、３０日後の結果は１４日後の結果と同様であった。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１に示した通り、投与後14日後で、糞便中にセグメント細菌、およびヒト腸内細菌の定着を確認した。
【００３１】
詳しくは、ヒト腸内細菌としては、バクテロイデス群（Bacteroidaceae）、ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacteria）、大腸菌群（Enterobacteriaceae）、腸球菌（Enterococci）、クロストリジウム属菌（Clostridia）が確認できた。通常、ビフィドバクテリウム属菌は、人糞便中では他の菌に比べて優勢であるが、逆にマウス糞便中では劣勢である。一方、クロストリジウム属菌は人糞便中では劣勢であるが、逆にマウス糞便中では優勢であるとされている。
【００３２】
本試験においても、各種選択培地を用いて測定したバクテロイデス群およびビフィドバクテリウム属菌は優勢であり、クロストリジウム属菌は劣勢を示し、人と同様の傾向を示した。また、糞便の塗抹標本をグラム染色し、直接鏡検した結果からも投与したマウス由来のセグメント細菌が定着していることが確認された。
【００３３】
実施例２（ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物の生理作用）
ヒト型腸内菌叢を有するマウスの生理作用を検証した。実施例１で得られたヒト型腸内菌叢を有するマウスを断頭放血して開腹し、腸を取り出した。パイエル板、腸間膜を除き、腸を切り開いて、冷ＰＢＳで内容物を充分に洗浄した。小腸を１〜1.5 ｃｍに切り刻み、0.45ｍＭジチオスレイトール（dithiothreitol）を含むカルシウムおよびマグネシウム不含ハンクス平衡塩類溶液（ハンクス液；シグマ社製）を２０ｍｌ／ｈｅａｄ加えて往復型シェーカー（１００ｒｐｍ、２５℃）で振盪し、５分毎に５回培地を交換した。
【００３４】
その後、２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した上記培地に加えて、３７℃、１３０ｒｐｍで１０分毎に３回振盪した。その後の腸上皮細胞を含む上部液を集めて１０００ｒｐｍ、１０分の遠心を行った。沈殿物を５％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して３７℃で２時間加温した。大きな凝集物を除き、残りを綿カラム（０．１５ｇ／ｔｕｂｅ）で濾過した。３０％パコール密度勾配遠心を行い、沈殿物を回収し再度密度勾配遠心を行い、４４／７０％の界面に腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）を回収した。
【００３５】
表面抗原の解析は、フローサイトメトリーにより行った。調製した腸上皮細胞間リンパ球（ＩＥＬ）標品を顕微鏡下で計測した後、２×１０５ の細胞を抗−ｐａｎαβＴＣＲ（H57-597，Pharmingen社，USA）、抗−ｐａｎγδＴＣＲ（GL3，Pharmingen社，USA）、抗マウスＣＤ８α（Pharmingen社，USA）、抗マウスＣＤ８β（Pharmingen社，USA）で０℃で３０分反応後、ハンクス液を加えて遠心し、必要な場合はその沈殿物にアビジン−ＦＩＴＣ、アビジン−ＰＥ、又はアビジン−サイクローム等の標識化合物（抗体）を加えて０℃、３０分反応させた。
【００３６】
染色終了後の細胞は２％パラホルムアルデヒドで固定後、ハンクス液で２倍稀釈して、分析まで４℃で保存した。蛍光分析はＥＰＩＣＳ−Ｅｌｉｔｅ（COULTER社、USA）を用いて前方散乱と側方散乱でリンパ球区分にゲートを設定して（２カラー又は３カラー）分析を行った。
【００３７】
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスII分子の解析は、免疫組織染色法によりおこなった。回盲部より約５ｃｍの回腸、または遠位結腸をテッシュマウントを用いて−８０℃で包埋し、クライオトームで５μｍの凍結切片を作成した。組織片を冷アセトンで５分固定し、１％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで５〜１０分処理した後、牛血清アルブミンで３０分ブロッキングを行い、ビオチン化モノクローナル抗体抗Ｉ−Ａｂ  （Ｉ−Ａｋ  に交差）とＩ−Ｅｄ  （Ｉ−Ｅｋ  に交差）の混合液、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで反応させ、3,3'ジアミノベンチジンで発色させた。
【００３８】
ＩｇＡ産生細胞数の解析は、免疫染色法によりおこなった。回盲部より約５ｃｍの回腸をテッシュマウントを用いて−８０℃で包埋し、クライオトームで５μｍの凍結切片を作成した。組織片を冷アセトンで５分固定した後、牛血清アルブミンで３０分ブロッキングを行い、ビオチン化抗マウスＩｇＡ抗体（Pharmingen，USA）、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで反応させ、3,3'ジアミノベンチジンで発色させた。染色後、顕微鏡下で一定面積あたりの陽性細胞数を測定した。結果を次の表２に示す。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
表２に示した通り、回腸を調べると投与後３０日目には、αβＴ細胞受容体を持った腸上皮細胞間リンパ球（αβ  ＩＥＬ）の割合がコンベンショナル群と同等の値にまで増加することが分かった。また、上皮細胞におけるＭＨＣ  classIIもコンベンショナル群と同様に発現し、ＩｇＡ産生細胞数もコンベンショナル群と同等の値にまで増加することがわかった。
【００４１】
一方、ヒト腸内菌叢投与群の結腸上皮にはＭＨＣクラスII分子が発現しており、炎症様状態を呈していたが、セグメント細菌およびヒト腸内菌叢投与群ではコンベンショナル群と同様に発現は認められなかった。
【００４２】
尚、本実施例では、ヒト型腸内菌叢を有する実験用動物を作出したが、他の動物由来の１種以上の腸内細菌においても同様に腸内菌叢を形成することができる。
【００４３】
また、本実施例では、マウスについて行ったが、その他、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、又は、ヒツジの何れの動物についても、この動物と同種の動物からセグメント細菌を得た上で、無菌の宿主動物に複数種の属からなる腸内細菌と共に投与することで各動物についての特定細菌を腸内菌叢として有する実験用動物を得ることが可能である。
【００４４】
まとめ
以上に詳述したように、作出されたヒト型腸内菌叢を有する実験用動物では、次のような効果が得られる。
（１）ヒト型腸内菌叢が定着し、かつ腸が生理的および環境的に成熟した実験用動物を簡便に作出し得る。
（２）本実験用動物を用いることにより、細菌や物質などの外部からの直接的な影響や、ストレス等の間接的な影響による、腸内菌叢及び腸の生理活性について基礎研究に有用な実験用動物を作出し得る。
（３）本実験用動物を用いることにより、ヒト腸内菌叢を改善する生菌製剤、食品等の開発、効果、及び安全性等を、よりヒトに近い環境で検討し得る。
（４）本実験用動物を用いることにより、食品及び医薬品等の素材の検索、効果及び安全性等を、よりヒトに近い環境で検討し得る。
（５）本方法を用いることにより、個人の腸内菌叢を有する実験動物を作出することができ、個人間の違いに起因する食品及び医薬品等の素材の効果の違いを検討することができる。
（６）本方法を用いることにより、特定疾患患者の腸内菌叢を有する実験動物を作出することができ、トランスジェニック動物や疾患モデル動物と組合せることにより、特定の疾患に対する食品及び医薬品等の素材の効果を検討することができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、特定細菌を腸内菌叢として常在させる実験用動物及びその作出方法を得ることができるという効果がある。