(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維素溶解活性酵素が固定化されている抗血栓性材料の表面を、アミノグリコシド系抗生物質を含む溶液で処理することを特徴とする固定化線維素溶解活性酵素の活性安定化法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体に固定化された線維素溶解活性酵素の活性安定化法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、各種血栓症や塞栓性疾患の治療等にフィブリン（線維素）および血栓の溶解酵素である線維素溶解活性酵素が広く用いられており、優れた臨床効果をもたらしている。また、線維素溶解活性酵素の優れた血栓の溶解力を利用して高分子材料表面にこの酵素を固定化した抗血栓材料の開発も行われてきた。しかし、線維素溶解活性酵素は活性安定性が必ずしも良好でなく、線維素溶解活性酵素を固定化して抗血栓性材料として医療に使用する場合、酵素固定化材料の保存時および体内留置時の経時失活は大きな問題となっていた。
また、線維素溶解活性酵素を固定化し、抗血栓性材料として医療に使用する場合には、この酵素を固定化した材料の滅菌が必要である。通常、酵素は滅菌により活性の消失、低下を伴う。従って、滅菌時における酵素の失活も抗血栓性材料として使用する場合の大きな問題であった。
【０００３】
固定化線維素溶解活性酵素の活性安定化法としては、線維素溶解活性酵素が固定化された担体表面を塩基性アミノ酸で処理することにより、保存、滅菌時の線維素溶解活性酵素の活性を安定化できることが報告されている（特公平4-56591 号公報参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、非常に深刻な問題であるにも関わらず、線維素溶解活性酵素を固定化した抗血栓性材料を生体へ実際に使用した際の酵素の経時失活を防ぐ方法は全く知られていなかった。
【０００５】
本発明は、担体に固定化された線維素溶解活性酵素の活性を生理条件下においても安定に保持する方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、担体に固定化された線維素溶解活性酵素の保存、滅菌さらには生体への使用に際し、線維素溶解活性酵素が固定化された担体をアミノグリコシド系抗生物質で処理することにより線維素溶解活性酵素の保存時、滅菌時さらには使用時の失活、変性を防止できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、線維素溶解活性酵素が固定化されている抗血栓性材料の表面を、アミノグリコシド系抗生物質を含む溶液で処理することを特徴とする固定化線維素溶解活性酵素の活性安定化法を要旨とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明における抗血栓性材料に用いられる担体は、固体であればどのようなものでもよいが、好ましい担体としては、例えばガラス、カオリナイト、ベントナイト、活性炭などの無機物質、天然ゴム、セルロース、澱粉、コラーゲン、アガロース、デキストラン、タンパク質などの天然高分子、ポリスチレン、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸エステル、エチレン酢酸ビニル共重合体、シリコン樹脂などの合成高分子などの単独、又は、これらの組み合わせからなる担体が挙げられる。
担体の形状は、特に限定されず、例えば繊維、中空糸、チューブ、フイルム、皮膜、透過性膜、ビース、粉末など目的に応じて種々の形状のものを用いることができる。
【０００９】
本発明における線維素溶解活性酵素とは、線維素の溶解に関与する酵素を意味する。このような酵素としては、例えばプラスミン、プリノラーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターなどが挙げられる。
【００１０】
これら線維素溶解活性酵素を担体に固定化する方法としては、周知の酵素の固定化方法が利用でき、例えば特開昭53-88390号公報、特開昭54-26394号公報、「固定化酵素」（千畑一郎編、講談社発行）などに記載されている方法が利用できる。
【００１１】
上記の担体に線維素溶解活性酵素が固定化された抗血栓性材料は、主として体内への留置または体内からの抜去操作が行われる、例えば、ＩＶＨカテーテル、サーモダイリューションカテーテル、血管造影用カテーテル、血管拡張用カテーテル、ダイレーター、留置針、ガイドワイヤーなどの血管内に挿入ないし留置される医療用具に好適に用いることができる。
【００１２】
本発明の活性安定化法は、上記のような抗血栓性材料の表面をアミノグリコシド系抗生物質を含む溶液で処理するというものである。
【００１３】
本発明に用いられるアミノグリコシド系抗生物質としては、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ネチルマイシン、トブラマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ストレプトマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸ベカナマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸リボスタマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸ジベカシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミクロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン等が挙げられ、それらのアミド、エステル、塩等の誘導体であってもよい。
【００１４】
本発明においては、上記のアミノグリコシド系抗生物質を、水に溶解して使用するが、必要に応じて、この溶液に水と混合する有機溶媒を添加して使用してもよい。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
【００１５】
処理する際のアミノグリコシド系抗生物質の濃度としては、希薄な溶液でも効果はあり、好ましくは0.００１〜５０重量％、さらに好ましくは0.０１〜１０重量％である。
【００１６】
抗血栓性材料の表面をアミノグリコシド系抗生物質で処理するには、上記のアミノグリコシド系抗生物質を含む溶液を抗血栓性材料に接触させればよい。接触させる具体的な方法としては、アミノグリコシド系抗生物質を含む溶液をスプレーする方法、また、カテーテルのような管状の医療用具の場合には、管内にこの溶液を循環させる方法なども用いられるが、最も簡便な方法は、抗血栓性材料をアミノグリコシド系抗生物質を含む溶液に浸漬する方法であり、必要に応じて攪拌や振とうを行えばより効果的である。
【００１７】
接触させる際の温度としては、０〜５０℃であり、好ましくは１０〜４０℃である。
また、接触させる時間としては、２４時間以下であり、好ましくは１分〜１０時間、さらに好ましくは５分〜１時間である。
【００１８】
本発明によって固定化線維素溶解活性酵素が安定化された材料は、種々の方法で滅菌して使用することができる。滅菌法としては、例えばエチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、ホルムアルデヒド、β−プロピオンラクトン、メチルブロマイド等の滅菌ガスを用いるガス滅菌あるいはＸ線、α線、高速電子線、ベータ線などを用いる放射線滅菌が挙げられる。滅菌ガスの圧力及び温度、放射線の線量及び時間などは、線維素溶解活性酵素固定化担体の付着細菌数に応じて任意でよい。また、滅菌容器としては、滅菌ガスの出入りができ微生物の侵入ができないものあるいは放射線が透過できるものであればよく、形状は袋状に限らず、筒状、チューブ状、箱状などいかなる形でもよい。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
なお、実施例における活性測定および安定性試験は以下のようにして行った。
【００２０】
〔活性測定１〕
ウロキナーゼの活性は、蛍光物質含有合成ペプチドを基質として酵素反応に供し、遊離した蛍光物質を分光蛍光光度計により定量する方法（Morita et al., J. Biochem., 82, p1495 (1977 ）参照）により測定した。
【００２１】
〔活性測定２〕
ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターの線維素溶解活性は、円形に切り取った試料片（直径５mm）をフィブリン平板上に置き、３７℃で２４時間放置した後、試料片のまわりのフィブリンの溶解の程度を溶解円の面積（mm2 ）として表す金井らの方法（「臨床検査法提要」改訂第27版、金原出版、VI-110参照）により測定した。
【００２２】
〔保存安定性１〕
材料を３０℃、湿度５５％の恒温槽内に放置し、所定の期間放置した後、活性を測定した。
〔保存安定性２〕
材料を室温（２５℃）で放置し、所定の期間放置した後、活性を測定した。
【００２３】
〔生理条件下での安定性〕
材料をダルベッコ生理食塩水１０ｍｌに浸漬し、３７℃で所定の期間振とうした後、活性を測定した。
【００２４】
実施例１、比較例１
ポリウレタンチューブ（内径0.97mm、外径1.52mm、長さ50cm）を、分子量約67,000の無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体２(wt/v)％と分子量4,000 のポリエチレングリコール0.１(wt/v)％を溶解したアセトン溶液に、室温で１０分間浸漬し、次いで７０℃で２０時間加熱した。加熱後のチューブをアセトンで洗浄した後乾燥した。
次に、このチューブをウロキナーゼの生理食塩水（1,000 単位／ml）溶液中に室温で２４時間浸漬した後、水洗した。次いで、１mg/ml の硫酸ジベカシン水溶液中に室温で１時間浸漬した後、水洗し、チューブを乾燥した（実施例１）。
比較のために、硫酸ジベカシン処理を行わなかった以外は上記と全く同様にしてウロキナーゼ固定化ポリウレタンチューブを作製した（比較例１）。
【００２５】
これらのポリウレタンチューブについて、ガス滅菌処理での安定性を試験した。ガス滅菌処理は、ポリウレタンチューブを市販の滅菌袋（ホギ製滅菌バッグ）に収納し、完全シールした後、滅菌ガス（エチレンオキサイドガス２０％、炭酸ガス８０％）を用いて、１Kg/cm2G 、４０℃、４０％RH、２時間の条件で行った。本発明により作製したポリウレタンチューブのウロキナーゼ活性は、滅菌処理の前後で全く変わらず４．９単位／cm2 であったのに対し、比較例１のポリウレタンチューブのウロキナーゼ活性は、滅菌処理により４．９単位／cm2 から３．２単位／cm2 へ大きく低下した。なお、両者とも無菌状態であった。
【００２６】
ガス滅菌処理された実施例１、比較例１それぞれのポリウレタンチューブについて、上記の保存安定性１の方法により、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月および１２ヶ月後の安定性を調べた。結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
また、ガス滅菌処理された実施例１、比較例１それぞれのポリウレタンチューブについて、生理条件下での安定性を試験した。結果を図１に示した。
【００２９】
実施例２、比較例２
分子量約67,000の無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体２(wt/v)％と分子量4,000 のポリエチレングリコール0.０５(wt/v)％を溶解したアセトン溶液に、ナイロン６フィルムを室温で１分間浸漬し風乾した後、９０℃で２時間減圧加熱した。加熱後のフィルム片をアセトンで洗浄した後乾燥した。
このフィルム片をストレプトキナーゼの生理食塩水溶液（600 単位／ml）中に４℃で24時間浸漬後、水洗した。洗浄後、１０mg／mlの硫酸ゲンタマイシン水溶液中に室温で10分間浸漬した後、フィルムを風乾した（実施例２）。
比較のために、硫酸ゲンタマイシン処理を行わなかった以外は上記と全く同様にしてストレプトキナーゼ固定化ナイロン６フィルムを作製した（比較例２）。
【００３０】
これらのストレプトキナーゼ固定化フィルム片の線維素溶解活性を測定したところ、両者とも直径２４mmの円形状にフィブリンを溶解しており、溶解円の面積は４５２mm2 であった。
【００３１】
これらのフィルムについて、保存安定性２の方法により、１２ヶ月放置した後の安定性を調べた。その結果、実施例２のフィルムの活性は４５０mm2 であり、保存時の活性の低下はほとんど見られなかったのに対し、比較例２のフィルムの活性は２７１mm2 へ大きく低下していた。
【００３２】
また、これらのフィルムについて、生理条件下での安定性を調べた。円形のフイルム片（直径５mm）を上記した条件に２８日間置いた後活性を測定したところ、実施例２のストレプトキナーゼ活性は２２５mm2 であったのに対し、比較例２のそれは１１mm2 へ大きく低下していた。
【００３３】
さらにこれらのフィルムについて、滅菌処理による安定性を調べた。滅菌処理は、フイルムを市販の滅菌袋（ホギ製滅菌バッグ）に収納し、完全シールした後、放射線（Ｃｏ−６０、２．５Ｍｒａｄ）により行った。滅菌後のストレプトキナーゼ活性を測定した結果、実施例２のフィルムのストレプトキナーゼ活性は４４８mm2 であり、滅菌処理による活性の低下はほとんど見られなかったのに対し、比較例２のフィルムのストレプトキナーゼ活性は２６２mm2 へ大きく低下した。なお、フィルム片は共に無菌状態であった。
【００３４】
実施例３、比較例３
ポリ塩化ビニルを１７０℃で押出成形して厚さ約４００μｍのフィルムを得た。次に分子量67,000の無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体２(wt/v)％と分子量400 のポリエチレングリコール１(wt/v)％を溶解したアセトン溶液に得られたポリ塩化ビニルフィルムを室温で５分間浸漬した後、７０℃で２４時間加熱した。
このフイルムを、ヒトメラノーマ細胞株（human melanoma cellline ）から分離精製した組織プラスミノーゲンアクチベーターの生理食塩水溶液（600 単位／ml）に浸漬して７℃で２４時間放置した後、水洗した。洗浄後、0.１mg／mlの硫酸アルベカシン水溶液中に室温で５分間浸漬した後、フィルムを風乾した（実施例３）。
比較のために、硫酸アルベカシン処理を行わなかった以外は上記と全く同様にして組織プラスミノーゲンアクチベーター固定化フィルムを作製した（比較例３）。
【００３５】
これらの組織プラスミノーゲンアクチベーター固定化フィルムの線維素溶解活性を実施例２と同様に測定したところ、両者とも４００mm2 であった。
【００３６】
これらのフィルムについて、滅菌処理における安定性を調べた。滅菌処理は実施例１と同様なガス滅菌処理を行った。その結果、実施例３のフィルムの活性は４００mm2 であり、滅菌処理による活性の低下は全く見られなかったのに対し、比較例３のフィルムの活性は２４８mm2 へ大きく低下した。なお、両方のフィルムは共に無菌状態であった。
【００３７】
滅菌処理したこれらのフィルムについて、保存安定性１の条件により１２ヶ月後の安定性を調べた。その結果、実施例３のフィルムの活性は３９０mm2 であり、保存時の活性の低下はほとんど見られなかったのに対し、比較例３のフィルムの活性は２４８mm2 から１５６mm2 へさらに大きく低下していた。
【００３８】
また、滅菌処理したこれらのフィルムについて、生理条件下での安定性を試験した。円形のフイルム片（直径５mm）を用い、２８日後の活性を測定した。その結果、実施例３のフィルムの活性は２００mm2 であったのに対し、比較例３のフィルムの活性は２４８mm2 から６mm2 へ大きく低下していた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、担体に固定化された線維素溶解活性酵素活性の保存時、滅菌時の安定性を著しく高めるのみならず、生理条件下での線維素溶解活性の維持安定性が著しく向上する。さらに、本発明により作製された材料は、抗血栓性を有しているのみならず、アミノグリコシド系抗生物質に基づく抗菌活性をも有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１と比較例１で得られたポリウレタンチューブの生理条件下での安定性を示す図である。
【図１】
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