(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
研究中の試料の蛍光像を得るための広視野蛍光結像装置であって、
平行にされた白色光ビームを形成するためのリフレクタと結合された白色光源と、
励起周波数帯域を有している励起ビームを形成するために白色光ビームを濾波するための入力フィルタと、
蛍光を発生させるために、試料に励起ビームを投射するための凹面鏡の形態の単一の反射集光部材を含む、入力フィルタと試料との間の励起入力経路と、
試料の蛍光像を発生させるために、試料からの蛍光ビームを検知するためのアレイ検知器と、
試料からの蛍光をアレイ検知器上に結像させるための結像光学系と、
不所望の光を除去する一方で試料からの蛍光を透過させるために、試料とアレイ検知器との間に配設された出力フィルタと、
からなる装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、
ビームパターンを画成するために励起ビームを遮断するように配設された視野絞りを更に含み、凹面鏡が、試料上の照射面積を画成するために試料上に視野絞りの像を形成するように配設されている、装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置であって、
凹面鏡が球面ミラーである、装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、
凹面鏡が、試料上に励起ビームを鋭角の入射角で投射する、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、
アレイ検知器が荷電結合素子である、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、
結像光学系が、試料とアレイ検知器との間に配設された第１及び第２の結像レンズを含む、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であって、
出力フィルタが、第１の結像レンズと第２の結像レンズとの間に配設されている、装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であって、
入力フィルタが、フィルタホイールを回転させることによって選択可能な複数のフィルタを担持するためのフィルタホイール上に取り付けられている、
【請求項９】
請求項１に記載の装置であって、
出力フィルタが、フィルタホイールを回転させることによって選択可能な複数のフィルタを担持するためのフィルタホイール上に取り付けられている、装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の装置であって、
出力フィルタが、多数の蛍光透過帯域を有している、装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の装置であって、
励起ビームを凹面鏡に向けて向け直すために、視野絞りと凹面鏡との間に配設された平面鏡を更に含んでいる、装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の装置であって、
白色光ビームの赤外部分を除去するために、白色光源と入力フィルタとの間に配設された赤外フィルタを更に含んでいる、装置。
【請求項１３】
請求項１に記載の装置であって、
試料の結像高さを規定するための整合ストッパであって、各々、試料が取り付けられる試料スライドと接して結像動作中に試料を焦点面に保持するための結像光学系の焦点面に配設された端部を有する整合ストッパを更に含む、装置。
【請求項１４】
試料スライド上に取り付けられた試料の蛍光像を得るための広視野蛍光結像装置であって、
平行にされた白色光ビームを形成するためのリフレクタと結合された白色光源と、
励起周波数帯域を有している励起ビームを形成するために白色光ビームを濾波するための入力フィルタと、
蛍光を発生するために、試料に励起ビームを投射するための凹面鏡と、
試料の蛍光像を発生するために、試料からの蛍光ビームを検知するためのアレイ検知器と、
試料からの蛍光をアレイ検知器上に結像させるための結像光学系と、
不所望の光を除去する一方で試料からの蛍光を透過させるために、試料とアレイ検知器との間に配設された出力フィルタと、
各々、試料スライドと接して試料を焦点面に保持するための結像光学系の焦点面に配設された端部を有する複数の整合ストッパと、
を含む装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の装置であって、
試料スライドを支持するためのばねを有するスライドマウントと、
同スライドマウントを支持するための台であって、試料スライドが整合ストッパの端部と接し且つスライドマウント上のばねが圧縮されて試料スライドを整合ストッパに押し付けて保持する、結像位置へとスライドマウントを移動させるように移動することができる台と、を更に含む装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の装置であって、
アレイ検知器が荷電結合素子である、装置。
【請求項１７】
請求項１４に記載の装置であって、
入力フィルタと凹面鏡との間に励起ビームを整形するための視野絞りを更に含み、凹面鏡は、照射面積を画成するために、視野絞りの像を試料上に結像させるように配設されている、装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して、蛍光励起及び蛍光検知に関し、より特定すると、研究中の試料の広視野蛍光像を集光するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光結像技術は、生物学的試料の研究において広く使用されてきた。試料の蛍光像を形成するために、試料内のある種の発蛍光団を励起するために選択された周波数帯域を有する励起光ビームによって試料が照射される。励起された発蛍光団によって発生される蛍光は、次いで、光検知器によって集光されて試料の像を形成する。
【０００３】
励起光を発生するために使用される光源のタイプにより、現存する蛍光結像装置は、一般に、レーザに基づく装置と白色光に基づく装置とに分けられる。レーザに基づく蛍光結像装置は、光源としてレーザを使用する。レーザに基づく結像装置に伴ういくつかの不利な点がある。概して、レーザは、蛍光励起のためにただ一つ又はせいぜい２〜３個の使用可能な周波数を提供し、従って、励起周波数の選択に自由度を提供しない。更に、蛍光励起のためのレーザの使用は比較的高価である。
【０００４】
白色光に基づく蛍光結像装置は、広い周波数スペクトルに亘る光を発光する光源を使用している。光源からの広い帯域の光（典型的には、白色光又は多色光と呼ばれる）は、濾波されて、選択された励起周波数の近辺の狭い帯域内に含まれる励起光を提供する。白色光源によって発生される光は、典型的には、光ファイバの束を介して試料に伝えられる。光ファイバの束の高い開口数のために、励起ビームは発散性が高く、これによって、試料への照射強度が低くなる。このような照射構造の別の不利な点は、結像装置が極めて大きく、実用に余り適さない傾向があることである。
【０００５】
蛍光像を形成するのに必要な時間は、蛍光結像装置の重大な性能パラメータである。像のデータ収集速度（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を向上させるためには、試料照射効率と蛍光検知効率とが最大とされなければならない。高い像のデータ収集速度は、試料上の比較的広い面積（典型的には、１平方センチメートル程度）の像が形成されるべきときに特に実現が難しい。いくつかの現存するレーザに基づく結像装置は、入力レーザビームを試料表面を横切って走査される小さいスポットに集光させて、試料の蛍光像を得る。このような装置は、例えば、Ｋａｉｎに付与された米国特許第５，６７２，８８０号に示されている。走査レーザビームを使用する結像装置の不利な点には、一つの像を得るのに必要な走査時間が長いこと、及び走査機構が複雑で且つコストが高いことが含まれる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記に鑑みて、本発明の目的は、これまでに公知の従来技術による装置によって得ることができるよりも短い像のデータ収集時間で、より高い品質の広視野の像を提供することができる広視野蛍光結像装置を提供することである。
【０００７】
励起周波数の選択に自由度を提供し且つ丈夫で信頼性が高く、効率が良く小型であり、比較的低コストで作ることができる光学的構造を有する広視野蛍光結像装置を提供することは、本発明の関連ある目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明のこれらの及びその他の目的に従って、高出力の白色光によって発生された励起ビームを試料面に結合して高い照射強度を提供するために反射光学系を使用し、且つこの高い照射強度をアレイ検知器の高検知効率と組み合わせて、高い像のデータ収集速度を提供する広視野の蛍光結像装置が提供される。光源によって発生された白色光は、平行光にされ且つ濾波されて励起ビームを提供する。励起ビームは、視野絞りを通過せしめられて、良好に画成されたビームパターンを形成し、次いで、凹面鏡によって試料面に投射される。凹面鏡は、結像光学系の視野に適合した照射面積を画成するために試料上に視野絞りの像を形成するように配設されている。試料内で発生された蛍光は、濾波され且つ結像光学系によってアレイ検知器上に結像されて、試料の蛍光像を形成する。
【０００９】
この他の目的及び利点は、図面と組み合わせて以下の詳細な説明を参照すると明らかとなるであろう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
図面を参照すると、図１は、本発明に従って構成された広視野蛍光結像装置１０の一つの実施形態を示している。研究されるべき試料１２は、結像光学系の下方の支持台１４上に置かれる。本発明の特徴に従って、試料１２の比較的広い面積（１平方センチメートル程度以上）が励起ビーム１６によって照射されて試料内の蛍光作用を励起する。照射された試料からの蛍光は、アレイ検知器１８によって集光されて、試料の蛍光像を形成する。
【００１１】
励起ビーム１６は、広いスペクトルに亘る光を形成する高出力白色光源２０によって発生される。本明細書において使用されているように、用語”白色光”は、可視光領域に亘る広いスペクトルを包含する光のことである。白色光の周波数分布は、単一か又は連続的である必要はなく、この光は、必ずしも人間の知覚による白色である必要はない。白色光はまた、通常は、”多色である”と呼ばれる。光源２０によって発生された白色光は、リフレクタ２２によって平行にされて白色光ビーム２３とされる。
【００１２】
本実施形態の一つの実施においては、光源２０は、電流を供給されると光を生成するキセノンアークランプであり、１７５ワット以上の出力を有する。このアークランプによって発光された白色光を平行光にするリフレクタ２２は、放物面鏡である。アークランプと放物面鏡とは、例えば、カルフォルニア州、サニーヴェールにあるＩＬＣテクノロジーコーポレーションからモデルＬＸ１７５として組立体状態で入手可能である。
【００１３】
白色光源２０の使用は、多くの利点を有する。白色光は入手が容易で且つレーザよりも遙かにコストが低い。白色光源の高い出力は、像のデータ収集時間を短くする改良された試料照射強度を提供する。もう一つ別の重要な利点として、白色光の広いスペクトルは、白色光源が多くの種類の発蛍光団に対して種々の励起周波数帯域の光を提供するために使用されるのを可能にする。
【００１４】
リフレクタ２２によって平行光にされた白色光ビームは、蛍光励起に使用可能なエネルギを有する光を透過させる一方で白色光の赤外波長部分を遮断して、下流の光学要素及び試料の加熱を防止する”ホットミラー”２４を通過せしめられる。本実施形態の実施においては、ホットミラー２４は、例えば、ＩＬＣテクノロジーコーポレーションからモデルＡ２００ＨＭＰとして市販されている静電コーティングを施された耐熱ガラス板である。ホットミラー２４によって濾波された光ビームは、次いで、入力フィルタ２６を通過して、試料１２内の特定の発蛍光団を励起するための選択された周波数帯域内に含まれる励起光ビーム１６を形成する。フィルタ２６は、典型的的には、２０ｎｍ程度の比較的狭い透過周波数帯幅と、１平方インチ程度の比較的大きいサイズとを有するのが好ましい。このようなフィルタは、例えば、バーモント州、ブラトルバロにあるクロマ・テクノロジー・インク（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）によって市販されている。
【００１５】
図１の好ましい実施形態においては、種々の発蛍光団を励起するための種々の透過周波数帯域を有する複数の入力フィルタが、フィルタホイール２８上に装着されている。蛍光像を得るためにどのフィルタが使用されるかは、試料内の発蛍光団に依る。フィルタホイール２８上での望ましい励起周波数帯域を備えたフィルタの選択は、フィルタホイールを特定の向きまで回転させて光ビームの経路内に選択されたフィルタを配置させることによってなされる。フィルタ２６からの励起ビーム１６は、次いで、視野絞り３０の開口部を通過せしめられる。視野絞り３０は、照射面積を規定するために、励起ビーム１６の周辺部分を遮断して試料１２上に投射される明確に規定されたビームを形成するために使用される。
【００１６】
本発明の特徴に従って、白色光源によって発生された励起光は、極めて簡単で且つ効率の良い反射光学系によって試料面に直接結合される。反射光学系は、広い面積を照射するために、励起ビーム１６を試料面に投射する凹面鏡３２を含んでいる。図１の実施形態の実施においては、凹面鏡３２は、直径が約５０．８ｍｍ（２インチ）で２５０ｍｍの曲率半径を有する球面鏡である。入力フィルタ２６からの励起ビームは、励起ビームを凹面鏡３２に向けて向け直す平面鏡３４によって反射される。凹面鏡３２は、次いで、励起ビームを鋭角の入射角度で試料１２の上向きの面に投射する。凹面鏡３２は、明確に確定された照射領域３６を形成するために、試料１２上に視野絞り３０の像を結像させるように位置決めされている。照射面積は、結像光学系の視野よりも若干大きいのが好ましいが、視野絞り３０の開口部を調節することによって望ましい大きさに調整することができる。凹面鏡３２上への励起ビーム１６の入射角は、試料上の視野絞り３０の像の歪みが許容可能であるほど十分に小さくなければならない。
【００１７】
図示した実施形態においては、平面鏡３４は、主として、光源からの水平な励起ビームを凹面鏡３２へと向け直すために使用される。励起ビーム１６の初期の方向は、光源２０とリフレクタ２２との配向によって決定される。光源２０及びリフレクタ２２が凹面鏡３２に直接ねらいを定めることができるほぼ垂直のビームを発生するように位置決めされている場合には、平面鏡３４は必要とされないであろう。
【００１８】
試料１２に励起ビーム１６を投射するために反射光学系を使用することは多くの利点を有する。このことは、光学的形態を簡素化し且つ反射による損失が起こる経路内の面の数を減らすことによって装置の効率を上げる。試料を照射するために、入射光を試料に近い位置へと導くために、光ファイバの束等を使用する必要性を避ける。このことによって、結像装置は、実用に適したコンパクトな大きさと丈夫な構造を有することが可能になる。本実施形態の一つの実施においては、結像装置は、３５．５６センチ（１４インチ）高さ×１６．５１センチ（６．５インチ）幅×５８．４２センチ（２３インチ）深さのハウジング内に嵌合させることができる。更に、反射光学系を使用することによって、レンズ、ファイバ光学系、及び反射光学系に伴う光伝達損失及び色彩の不完全性が避けられる。このことは、特に、一色以上の蛍光像が得えられなければならない用途においては特に重要である。反射光学系を使用するもう一つ別の利点は、蛍光を発生する傾向があるレンズ又はプリズムのような光学要素を励起光が通過するのを防止することである。
【００１９】
好ましい実施形態においては、視野絞り３０は、リフレクタ２２、ホットミラー２４及び入力フィルタ２６の光軸に直角の線から小さな角度だけ傾斜して離れている。この構造は、視野絞り３０の開口部の端縁が凹面鏡３２によって試料１２上に鮮明に集光されるのを可能にする。照射面積３６を結像光学系の視野にぴったりと適合するように画成することによって、迷光の量及び結像光学系へのバックグラウンド蛍光が減じられる。
【００２０】
結像光学系は、試料内の励起された発蛍光団によって発光された蛍光を集光して、アレイ検知器１８上に蛍光像を形成する。図１の実施形態においては、結像光学系は、一対の結像レンズ３８及び４０を含んでいる。顕微鏡と似た方法により、第１の結像レンズ３８は対物レンズとして機能し、第２の結像レンズ４０は接眼レンズとして機能する。結像レンズの各々は、大きい開口数、広い視野及び小さい収差を有するのが好ましい。本実施形態の実施においては、レンズは、株式会社ニコンによって作られた５０ｍｍＦ／１．２のカメラレンズである。
【００２１】
好ましい実施形態においては、結像レンズ３８及び４０の光軸は、相互に整合され且つ試料面に直角に整合される。凹面鏡３２によって反射された励起ビーム１６は、試料１２の表面を鋭角αで照射するような向きとされ、励起ビームは、約（１８０°−α）の角度で試料から反射される。この照射／集光幾何学は、反射された励起ビームが集光レンズ３８及び４０を透過するのを防止し、それによって、結像レンズ内にバックグラウンド蛍光を発生するのを防止する。結像レンズ３８の作動距離は、凹面鏡３２からの入射励起ビームを遮断しないように十分に大きくなければならない。
【００２２】
図示された実施形態においては、結像レンズ３８と４０との間に配置されている出力フィルタ４２は、試料からの蛍光は透過させるが、試料によって反射され又は散乱せしめられた如何なる励起光及び試料からの他の望ましくない光も遮断する。試料表面は、レンズ３８の焦点位置に配置されて、レンズ３８によって集光された蛍光が出力フィルタ４２の小さい受光角に適応するように平行にされる。この配列は、フィルタの変更によって起こる集光の問題を減じる。
【００２３】
出力フィルタ４２の大きさは、第１のレンズ３８によって平行にされた蛍光を受け入れるのに十分な大きさでなければならない。一つの実施形態においては、出力フィルタ４２は、直径が約５０．８ｍｍ（２インチ）である。この好ましい実施形態においては、出力フィルタ４２は、蛍光のための複数の透過帯域を有している。従って、同じ出力フィルタを異なる色の蛍光像を得るために使用することができる。多数の透過帯域を備えたフィルタは、例えば、クロマ・テクノロジー・インク（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）から入手可能である。図示の実施形態における出力フィルタ４２は、所望のフィルタを蛍光光路内に配置するために、回転することによって選択可能な多数の出力フィルタを担持しているフィルタホイール４４上に取り付けられている。
【００２４】
試料１２の蛍光像を集光するためのアレイ検知器１８は、結像レンズ４０の焦点に配置されている。像の倍率は、レンズ３８と４０との有効焦点距離の比によって決まる。この好ましい実施形態においては、アレイ検知器１８は、大きなグリッドの画素を備えた荷電結合素子（ＣＣＤ）である。視野の大きさと解像度との均衡は、ＣＣＤの画素の大きさ、ＣＣＤの全結像面積及び像の倍率によって得られる。
【００２５】
アレイ検知器４４を備えた結像光学系を使用することによって、数平方センチメートル程度の比較的大きい視野の像のデータ収集が可能である。試料上への高い照射強度とアレイ検知器の多チャンネル検知との組み合わせによって、像のデータ収集時間が著しく短くなる。このことは、走査レーザビームを使用する従来技術による結像素子に必要とされる正しい位置決め機構の必要性をも排除する。
【００２６】
この好ましい実施形態においては、入力フィルタホイール２８、出力フィルタホイール４４及び試料台１４の位置決めの動作は、コンピュータ５０によって制御される。コンピュータ５０は、更に、集光された蛍光強度データを受け取り且つこれを分析するために、荷電結合素子１８に接続されている。ユーザーは、像のデータ収集において使用されるべき入力及び出力フィルタ及び結像される試料の位置を特定するために、キーボード５２又はマウス５４のような入力装置を使用する。このコンピュータは、次いで、入力フィルタホイールと出力フィルタホイールとを回転させて、選択された入力及び出力フィルタを各々の作動位置へと移動させる。コンピュータはまた、試料台１４のＸ、Ｙ及びＺ方向の動きをも制御する。
【００２７】
本好ましい実施形態の特徴に従って、正しい結像高さすなわちレンズ３８の焦点面への試料１２の位置決めは、整合ストッパ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｔｏｐ）の使用によって容易に且つ信頼性高く行われる。図２を参照すると、結像装置は、結像光学系に対して固定された３つ又は４つの整合ストッパ５６を含んでいる。ストッパ５６の先端は、全て、結像レンズ３８の焦点面に配設されている。試料１２は、台１４上に固定されたスライドマウント６２上に取り付けられる試料スライド６０上に支持されている。スライドマウント６２の取り付け面は、試料スライドの下側を支持するためのばね６６を含んでいる。スライドマウント６２上に試料スライドを装荷するために、台１４は、降ろされてマウントの支持ばね６６上にスライドを配置するための空隙を提供する。台１４は、次いで、試料スライド６０が整合ストッパ５６の先端と接触し且つばね６６が十分に圧縮される位置まで上方に移動せしめられる。この位置で、試料は、結像のためのレンズ３８の焦点面内にある。圧縮されたばね６６は、試料スライド６０を整合ストッパ５６の先端に当接させて信頼性高く保持するための付勢力を提供する。スライドマウント上へのばねによる装荷方法を使用しているために、スライドマウントは、正しい結像焦点合わせを達成するために正確に位置決めする必要がない。整合ストッパの固定された位置によって、試料は、従来の焦点合わせ設定において必要とされる如何なる試料高さの細かい調節の必要もなく、いつでも迅速且つ容易に結像レンズ３８の焦点面に配置することができる。
【００２８】
上記の詳細な説明に鑑みると、本発明は、著しく改良された結像速度で高品質の蛍光像を提供することができる広い視野の蛍光結像装置を提供することが理解できる。この結像装置は、高出力の白色光源を採用し且つ励起ビームを試料面に結合させるために反射光学系を使用することによって、高い照射強度を達成する。結像効率は、簡単な結像光学系と、試料からの蛍光を平行にして集光するためのアレイ検知器と、を使用することによって高められる。光源として１７５ワットのキセノンアークランプを備えた図１の実施形態の実施においては、１２．５ｃｍ2の視野で試料の高品質の蛍光像が、典型的には約２秒で得ることができる。白色光源を使用することによって、結像装置のコストを下げることができ且つ励起周波数の選択に自由度を付与することができる。本発明の光学的形状はまた、結像装置をコンパクトで丈夫な構造とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の広い視野の蛍光結像装置の実施形態の光学的構成要素を示す構成図である。
【図２】試料の取り付け及び位置決め配列を示す構成図である。
【符号の説明】
１０  蛍光結像装置、    １４  支持台、    １８  アレイ検知器、
２０  白色光源、    ２２  リフレクタ、    ２４  ホットミラー、
２６  入力フィルタ、    ２８，４４  フィルタホイール、
３０  視野絞り、    ３２  凹面鏡、    ３４  平面鏡、
３８，４０  結像レンズ、    ５０  コンピュータ、
５６  整合ストッパ、    ６０  試料スライド、
６２  スライドマウント、    ６６  ばね
【図１】
0004323609.tif 000002
【図２】
0004323609.tif 000003