(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式の化合物又はその薬学的に許容な塩。
【化１】
0004212356.tif 000085
【請求項２】
血管新生疾患の治療又は予防処置のための薬剤の製造における化合物の使用であって、該化合物が下記構造又はその薬学的に許容な塩を含む使用。
【化２】
0004212356.tif 000086
【請求項３】
前記血管新生疾患が自己免疫疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記血管新生疾患が癌である、請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、2001年10月5日に提出され係属中の米国特許出願第09/972,772号の一部継続出願であり、2000年11月1日に提出され係属中の米国特許出願第09/704,251号の一部係属出願でもある。前述の各出願の内容全体は引用をもってこれを援用する。
【０００２】
発明の背景
血管新生は新しい血管を形成する基本的なプロセスで、正常な様々な身体活動（生殖、成長および創傷の修復）に必須である。このプロセスは完全に理解されてはいないが、毛細血管の主要細胞である内皮細胞の成長の刺激および阻害の両方を行う分子の複雑な相互作用が関与していると考えられている。通常の条件下では、これら分子は微小血管構造を数週間、または場合によっては数十年間にわたる長期間、休止状態（つまり毛細血管成長のない状態）に維持するように見える。しかし、必要時（たとえば創傷の修復中など）には、同じこれらの細胞は急激に増殖し5日以内に代謝回転することができる(Folkman, J. and Shing, Y., Journal of Biological Chemistry, 267(16): 10931-10934, and Folkman, J. and Klagsbrun, M. (1987) Science, 235: 442-447)。
【０００３】
血管新生は正常な状況下では高度に制御されたプロセスだが、多くの疾患（「血管新生疾患」として特徴づけられる）は、制御されていない持続的な血管新生に起因している。 他に定義されない限り、制御されていない血管新生は特定の疾患を直接引き起こすか、または既存の病理学的症状の悪化を引き起こす可能性がある。たとえば、眼の異常新生血管は失明の原因では最多であると示唆されており、約20種類の眼疾患がこれに起因する。関節炎など特定の既存の症状では、新しく形成された毛細血管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に新しく形成された毛細血管が硝子体に侵入し、出血して失明を引き起こす。充実性腫瘍の増殖および転移も血管新生に依存している(Folkman, J. (1986) Cancer Research 46: 467-473 and Folkman, J. (1989) Journal of the National Cancer Institute 82: 4-6)。たとえば、2mmを超える大きさに拡大した腫瘍は血液を得なければならず、新しい毛細血管の成長を誘導することによって血液を獲得する。このような新しい血管が腫瘍に埋まってしまうと、腫瘍細胞が循環器系に侵入し、肝、肺、または骨など遠方の部位に転移するための手段になる(Weidner, N., et al. (1991) The New England Journal of Medicine 324(1):1-8)。
【０００４】
フマジリンは抗菌薬および抗原虫薬として用いられる既知の化合物である。その物理化学的特性と生成方法は公知である(米国特許第2,803,586号、およびProc. Nat. Acad. Sci. USA (1962) 48:733-735)。フマジリンおよびフマジリン類似体の特定の種類も抗血管新生活性を示すことが報告されている。しかし、このような阻害物質（TNP-470など）の使用は、急速な代謝分解、血液値の異常、および中枢神経系（CNS）の副作用による用量制限によって制約を受けることもある。
【０００５】
したがって、いまだに、より強力で、神経毒性が少なく、安定で、および／または血清の半減期が長い血管新生阻害物質の必要性がある。
【０００６】
発明の概要
本願発明は、たとえばフマジリンコアなど、ペプチドに結合したメチオニンアミノペプチダーゼ2（MetAP-2）を阻害すると考えられているコアを有する、血管新生阻害化合物を提供する。本願発明は、MetAP-2阻害コアをアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体とカップリングさせると血管新生阻害化合物の代謝分解を防いで、優れた薬物動態学的プロフィールが得られ、血管新生阻害化合物の血液脳関門の通過能が変化して中枢神経系の副作用が抑制されるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。本願発明はまた、MetAP-2阻害コアを部位特異的な配列を含むペプチドと結合させると血管新生阻害化合物の細胞特異的送達が可能になり、血管新生阻害化合物の毒性が抑制されるという発見にも少なくとも部分的に基づいている。
【０００７】
従って、本願発明は以下の式I
【化１７】
0004212356.tif 000002
の化合物を提供する。
【０００８】
式Iにおいて、AはMetAP-2阻害コアであって、ＷはOまたはNR2であって、R1およびR2はそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、Xはアルキレンまたは置換アルキレン、好ましくは直鎖C1-C6アルキレンであって、nは0または1であって、R3およびR4はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール若しくはアリルアルキル、または置換若しくは非置換ヘテロアリール若しくはヘテロアルキルである。R3およびR4はまた、ともに炭素原子に結合して炭素環式または複素環式基を形成していてもよく、または、R1およびR4がともにアルキレン基を形成してもよく、Zは-C(O)-、アルキレン-C(O)-、またはアルキレンであって、Pは1乃至約100アミノ酸残基からりアミノ末端がZまたはOR5基またはN(R6)R7基に結合しており、ここでR5、R6、およびR7はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルである。R6およびR7はともに窒素原子に結合して、置換または非置換複素環構造を形成していてもよい。
【０００９】
式Iの化合物の別の実施態様では、W、X、n、R1、R3、およびR4は上述の通りの意味で、変数は以下に定義するとおりである。Zは-O-、-NR8-、アルキレン-O-、またはアルキレン-NR8-で、ここでR8は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、好ましくは直鎖または分岐鎖C1-C4アルキルまたは1乃至約100アミノ酸残基からなりカルボキシ末端でZに結合しているペプチドである。
【００１０】
式Iの化合物の場合、R1乃至R8のいずれかがアルキル基である場合、好ましいアルキル基は置換または非置換の直鎖、分岐鎖、または環状C1-C6アルキル基である。特に好ましいアルキル基は直鎖または分岐鎖C1-C4アルキル基である。置換アルキル基には、アミノ基、アルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、フッ化、塩化、臭化、もしくはヨウ化置換基などのハロゲン置換基、または水酸基などの少なくとも１つの非水素置換基が含まれる。
【００１１】
R3またはR4の少なくとも１つが置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基の場合、好ましい基は置換または非置換フェニル、ナフチル、インドリル、イミダゾリル、およびピリジルが含まれる。R3またはR4の少なくとも１つが置換または非置換アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである場合、好ましい基には置換または非置換ベンジル基、ナフチルメチル基、インドリルメチル基、イミダゾリルメチル基、およびピリジルメチル基が含まれる。アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、およびヘテロアリールアルキル基上にある好ましい置換基は、アミノ、アルキル置換アミノ、フッ化、塩化、臭化、ヨウ化基などのハロゲン化基、水酸基およびアルキル基、好ましくは直鎖または分岐鎖C1-C6アルキル基、最も好ましくはメチル基からなる群から、独立に選択される。Ｘは好ましくは直鎖C1-C6アルキレン、さらに好ましくはC1-C4アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。Zがアルキレン-C(O)-、アルキレン-O-、またはアルキレン-NR8である場合、アルキレン基は好ましくは直鎖C1-C6アルキレン、さらに好ましくはC1-C4アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。
【００１２】
アルキル、置換アルキルまたは水素に加えてR6およびR7もまた、それぞれ独立に置換若しくは非置換アザシクロアルキル基、または置換若しくは非置換アザシクロアルキルアルキル基であってもよい。適切な置換アザシクロアルキル基には、N-アルキル置換基、好ましくはN-C1-C4-アルキル置換基、さらに好ましくはN-メチル置換基を有するアザシクロアルキル基が含まれる。R6およびR7はともに窒素原子に結合して、置換または非置換の5員環または6員のアザまたはジアザシクロアルキル基などの複素環系を形成してもよい。好ましくは、ジアザシクロアルキル基にはN-C1-C4アルキル置換基、またはさらに好ましくはN-メチル置換基など、N-アルキル置換基が含まれる。
【００１３】
特に好ましい実施態様では、-N(R6)R7はNH2または以下に記載の基である。
【化１８】
0004212356.tif 000003
【００１４】
好ましくは、式Iの化合物には、Zが-O-、Pが水素、R3およびR4が両方とも水素、nが1、およびXがメチレンである化合物は含まれない。好ましくは、式Iの化合物には、Zがメチレン-O-、R3およびR4が両方とも水素、nが0である化合物は含まれない。
【００１５】
別の態様では、本願発明は式XVの血管新生阻害化合物に関し、
【化１９】
0004212356.tif 000004
ここでAはMetAP-2阻害コア、およびWはOまたはNRである。ある実施態様では、Zは-C(O)-またはアルキレン-C(O)-であり、ＰはNHR、ORまたは1乃至約100アミノ酸残基からなりN-末端でZに結合しているペプチドである。この実施態様では、Qは水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状アルキル、またはアリールであり、このときPが-ORである場合はＱは水素ではない。
【００１６】
別の実施態様では、Zはアルキレン-O-または-アルキレン-N(R)-で、Pは水素または1乃至約100アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でZに結合しているペプチドである。この実施態様では、Qは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキル、またはアリールであり、このときPが水素である場合Qは水素ではない。
【００１７】
式XVに記載の血管新生阻害化合物の場合、Ｒはそれぞれ独立に水素またはアルキルである。
【００１８】
別の態様では、本願発明は式Iまたは式XVに記載の血管新生阻害化合物を含む薬学的組成物、および薬学的に許容な担体を特徴とする。
【００１９】
さらに別の態様では、本願発明は、対象におけるたとえば癌（たとえば肺癌、脳癌、腎癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、黒色腫、および前述の癌の転移癌）などの血管新生疾患の治療方法を特徴とする。本願方法には、１種類以上の式Iまたは式XVの血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与するステップが含まれる。
【００２０】
本願発明のそのほかの特徴または利点は、後述の発明の詳細な説明、および前述の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
本願発明は血管新生阻害物質として有用な化合物、および血管新生疾患の治療におけるこの化合物の使用方法を提供する。理論によって制限されることを意図することなしに、本願発明の血管新生阻害化合物は、新規に合成したタンパク質のN-末端メチオニン残基を切断してそのタンパク質の活性型を生成する酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ2（MetAP-2）を阻害することによって血管新生を阻害すると考えられている。同時に、本願発明の血管新生阻害化合物にペプチドが存在するために、血管新生阻害化合物の代謝分解が抑制され、優れた薬物動態学的プロフィールが得られる。また、本願発明の血管新生阻害化合物にペプチドが存在することによって、血管新生阻害化合物の血液脳関門の通過能が変化し、たとえば中枢神経系の副作用（たとえば中枢神経系毒性）が抑制される。本願発明の血管新生阻害化合物に部位特異的配列を含むペプチドが存在すると、血管新生阻害化合物の部位特異的輸送達が可能となり、したがって血管新生阻害化合物の毒性が抑制される。
【００２２】
本願発明の血管新生阻害化合物は、MetAP-2阻害コアおよびそれに直接的または間接的に結合するペプチドを含む。ある実施態様では、本願発明は以下の式Iの血管新生阻害化合物を提供する。
【化２０】
0004212356.tif 000005
【００２３】
式Iでは、AはMetAP-2阻害コアであって、WはOまたはNR2であって、R1およびR2はそれぞれ独立に水素、またはアルキルであって、Xはアルキレンまたは置換アルキレンであって、好ましくは直鎖C1-C6アルキレンであって、nは0または1であって、R3およびR4はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール若しくはアリールアルキル、または置換若しくは非置換ヘテロアリール若しくはヘテロアルキルである。R3およびR4はまたともに炭素原子に結合して、炭素環基または複素環基を形成してもよく、またはR1およびR4はともにアルキレン基を形成してもよく、Zは-C(O)-、アルキレン-C(O)-、またはアルキレンであって、Pは1乃至約100アミノ酸残基からなりそのアミノ酸末端がZまたはOR5基もしくはN(R6)R7基に結合するペプチドであって、ここでR5、R6、およびR7はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルである。R6およびR7はともに窒素原子に結合して、置換または非置換複素環構造を形成してもよい。
【００２４】
式Iに記載の化合物の別の実施態様では、W、X、n、R1、R3、およびR4は上述のとおりの意味で、変数は以下に定義するとおりである。Zは-O-、-NR8-、アルキレン-O-、またはアルキレン-NR8-であって、ここでR8は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、好ましくは直鎖または分岐鎖C1-C4アルキルまたは1乃至約100アミノ酸残基からなりカルボキシ末端でZに結合しているペプチドである。
【００２５】
式１に記載の化合物では、R1乃至R8のいずれかがアルキル基の場合、好ましいアルキル基は置換または非置換の直鎖、分岐鎖、または環状C1-C6アルキル基である。特に好ましいアルキル基は直鎖または分岐鎖C1-C4アルキル基である。置換アルキル基には、アミノ基、アルキルアミノ基、またはジアルキルアミノ基、フッ化、塩化、臭化、またはヨウ化置換基などのハロゲン基、または水酸基など少なくとも1つの非水素置換基が含まれる。
【００２６】
R3またはR4の少なくとも１つが置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基の場合、好ましい基には、置換および非置換フェニル、ナフチル、インドリル、イミダゾリルおよびピリジルが含まれる。R3またはR4の少なくとも１つが置換または非置換アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基の場合、好ましい基には置換および非置換ベンジル基、ナフチルメチル基、インドリルメチル基、イミダゾリルメチル基、およびピリジルメチル基が含まれる。アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、およびヘテロアリールアルキル基上の好ましい置換基は、アミノ、アルキル置換アミノ、フッ化、塩化、臭化、およびヨウ化基などのハロゲン基、水酸基およびアルキル基、好ましくは直鎖または分岐鎖C1-C6アルキル、最も好ましくはメチルからなる群から独立に選択される。Xは好ましくは直鎖C1-C6アルキレン、さらに好ましくはC1-C4-アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。Zがアルキレン-C(O)-、アルキレン-O-、またはアルキレン-NR8である場合、アルキレン基は好ましくは直鎖C1-C6アルキレン、さらに好ましくはC1-C4-アルキレン、および最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。
【００２７】
アルキル、置換アルキル、または水素に加えてR6およびR7も、それぞれ独立に置換若しくは非置換アザシクロアルキル基または置換若しくは非置換アザシクロアルキルアルキル基であってもよい。適切な置換アザシクロアルキル基には、N-アルキル置換基、好ましくはN-C1-C4-アルキル置換基、さらに好ましくはN-メチル置換基を有するアザシクロアルキル基が含まれる。R6およびR7はともに窒素原子と結合して、置換または非置換の5員環または6員環アザまたはジアザシクロアルキル基など、複素環系を形成してもよい。好ましくは、ジアザシクロアルキル基には、N-C1-C4-アルキル置換基またはさらに好ましくはN-メチル置換基などのN-アルキル置換基が含まれてもよい。
【００２８】
特に好ましい実施態様では、-N(R6)R7はNH2または以下に示す基
【化２１】
0004212356.tif 000006
のうちの１つである。
【００２９】
好ましくは、式Iに記載の化合物にはZが-O-、Pが水素、R3およびR4が両方とも水素、nが1、およびXがメチレンである化合物は含まれない。好ましくは、化1の化合物には、Zがメチレン-O-、R3およびR4が両方とも水素、nが0である化合物はさらに含まれない。
【００３０】
別の実施態様では、本発明は式XVに記載の血管新生阻害化合物を提供し、
【化２２】
0004212356.tif 000007
ここでAはMetAP-2阻害コアであって、WはOまたはNRである。ある実施態様では、Zは-C(O)-またはアルキレン-C(O)-であって、ＰはNHR、ORまたは1乃至約100アミノ酸残基からなりN-末端でZに結合しているペプチドである。この実施態様では、Qは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキル、またはアリールであり、このときPが-ORである場合はＱは水素ではない。Zは好ましくは-C(O)-またはC1-C4-アルキレン-C(O)-で、さらに好ましくは-C(O)-またはC1-C2-アルキレン-C(O)-である。Qは好ましくは直鎖、分岐鎖、または環状C1-C6-アルキル、フェニル、またはナフチルである。さらに好ましくは、Qはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである。
【００３１】
別の実施態様では、Zは-アルキレン-O-または-アルキレン-N(R)-で、ここでアルキレンは好ましくはC1-C6アルキレンで、さらに好ましくはC1-C4アルキレンで、最も好ましくはC1-C2アルキレンである。Pは水素または1乃至約100アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でZに結合しているペプチドである。この実施態様では、Qは水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状アルキル、またはアリールであり、このときPが水素である場合Qは水素ではない。Qは好ましくは直鎖、分岐鎖または環状C1-C6アルキル、フェニル、またはナフチルである。さらに好ましくは、Qはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである。
【００３２】
式XVに記載の化合物では、Rはそれぞれ独立に水素またはアルキルである。ある実施態様では、Rはそれぞれ独立に水素、または直鎖、分岐鎖、または環状C1-C6アルキルである。好ましくは、Rはそれぞれ独立に水素または直鎖、分岐鎖、または環状C1-C4アルキルである。さらに好ましくは、Rはそれぞれ独立に水素またはメチルである。最も好ましい実施態様では、Rはそれぞれ水素である。
【００３３】
式Iおよび式XVでは、AはMetAP-2阻害コアである。本願明細書に用いられる「MetAP-2阻害コア」には、たとえば新しく合成したタンパク質のN末端メチオニン残基を切断してタンパク質の活性型を生成するMetAP-2の能力など、メチオニンアミノペプチダーゼ2（MetAP-2）の活性を阻害することができる部分が含まれる。好ましいMetAP-2阻害コアはフマジリン由来構造である。
【００３４】
適切なMetAP-2阻害コアには式IIIのコアが含まれ、
【化２３】
0004212356.tif 000008
ここでR1は水素またはアルコキシであり、好ましくはC1-C4-アルコキシであり、さらに好ましくはメトキシである。R2は水素または水酸基である。R3は水素またはアルキルで、好ましくはC1-C4-アルキルで、さらに好ましくは水素である。Dは直鎖または分岐鎖アルキル、好ましくはC1-C6-アルキル、またはアリールアルキル、好ましくはアリール-C1-C4-アルキル、さらに好ましくはフェニル-C1-C4-アルキルであるか、またはDは
【化２４】
0004212356.tif 000009
のような構造で、ここで点線は単結合または二重結合を表す。
【００３５】
Aは式IIIのMetAP-2阻害コアでもよく、
【化２５】
0004212356.tif 000010
ここでR1、R2、R3およびDは式IIに記載されたものと同一の意味であり、Xはハロゲンなどの脱離基である。
【００３６】
適切なMetAP-2阻害コアの例には以下の化学式が含まれるが、これらに限定されない。
【化２６】
0004212356.tif 000011
【化２７】
0004212356.tif 000012
【化２８】
0004212356.tif 000013
【化２９】
0004212356.tif 000014
【化３０】
0004212356.tif 000015
【化３１】
0004212356.tif 000016
【００３７】
式IV乃至Xのそれぞれにおいて、炭素環上に表示した結合手は、式Iおよび式XVに記載の構造変数Ｗの結合箇所である。式IXにおいて、pは0乃至10、好ましくは1乃至4の整数である。式IV、V、およびVI乃至IXにおいて、R1は水素またはC1-C4-アルコキシ、好ましくはメトキシである。式IVおよびVにおいて、点線は結合が二重結合または単結合であってよいことを示す。式Vにおいて、Xはチオアルコキシ基、チオアリールオキシ基、ハロゲン基、またはジアルキルスルフィニウム基などの脱離基を表す。式IVおよびVにおいて、R2はH、OH、アミノ、C1-C4-アルキルアミノ、またはジ（C1-C4-アルキル）アミノ）、好ましくはHである。特定の立体中心の立体化学が表示されていない化学式では、その立体中心は、血管新生阻害化合物のMetAP-2活性阻害能に矛盾しない、考えられる立体化学のいずれかを有してもよい。
【００３８】
特に好ましい実施態様では、Aは下記の式X
【化３２】
0004212356.tif 000017
に記載のMetAP-2阻害コアである。
【００３９】
本願明細書で用いられる「P」および「ペプチド」という用語には、1乃至約100アミノ酸残基（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸残基）からなる化合物が含まれる。好ましい実施態様では、前記ペプチドには約90、80、70、60、50、40、30、20、または10アミノ酸残基未満、好ましくは約1乃至10、1乃至20、1乃至30、1乃至40、1乃至50、1乃至60、1乃至70、1乃至80、または1乃至90アミノ酸残基を含む化合物が含まれる。前記ペプチドは天然のものか、または合成されたものでもよい。前記アミノ酸残基は好ましくはαアミノ酸残基である。たとえば、前記アミノ酸残基は、天然に存在する20種類のアミノ酸残基、および20種類の天然アミノ酸残基のD型の鏡像異性体からなる群から独立に選択されてよく、および非天然アミノ酸残基（たとえば、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、β-アラニン、または3-アミノメチル安息香酸などのペプチド模擬体など）であってもよい。ある実施態様では、前記アミノ酸残基は式XI、式XII、及び式XIIIに記載の残基から独立に選択される。
【００４０】
【化３３】
0004212356.tif 000018
【化３４】
0004212356.tif 000019
【化３５】
0004212356.tif 000020
【００４１】
式XIにおいて、X1は水素、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちの1つの側鎖、直鎖、分岐鎖、もしくは環状C1-C8-アルキル基、フェニル基もしくはナフチル基などのアリール基、アリール-C1-C4-アルキル基、ピリジル基、チエニル基、ピロリル基もしくはフリル基などのヘテロアリール基、またはヘテロアリール-C1-C4-アルキル基であり、X2は水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状C1-C8-アルキル基、フェニル基もしくはナフチル基などのアリール基、アリール-C1-C4-アルキル基、またはX1について前述のヘテロアリール基である。好ましくは、X2は水素である。式XIIでは、Yはメチレン、酸素、硫黄またはNHであって、aおよびbはそれぞれ独立に0乃至4であってaとbの合計は1から4の間である。式XIおよびXIIはα炭素原子においてD型またはL型の立体化学のいずれかを有するα-アミノ酸残基を包含する。1つ以上の前記アミノ酸残基は、β-、γ-、またはε-アミノ酸残基など、α-アミノ酸残基以外のアミノ酸残基であってもよい。このようなアミノ酸残基の適切な例は式XIIIで、ここでqは2乃至約6の整数で、X1およびX2はそれぞれ独立に式XIの変数として前述の意味を有する。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明の血管新生阻害化合物に用いられるペプチドは、前記血管新生阻害化合物を目的の細胞表面に結合させる特異性を向上させるために、部位特異的配列を含む。本願明細書に用いられる「部位特異的配列」という用語は、血管新生阻害化合物が周辺に露出することを抑制する働きをする、および／または血管新生部位または異常な細胞増殖部位など目的の部位に血管新生阻害化合物を向かわせる働きをするいずれのアミノ酸配列（たとえば天然または非天然のアミノ酸残基からなる）を含むことを意図する。
【００４３】
本願発明の血管新生阻害化合物内に含まれるペプチドは、血管新生部位または異常な細胞増殖部位に発現する酵素のペプチド切断部位を含んでよく、細胞透過性の活性血管新生阻害化合物またはそのフラグメント（たとえば前記血管新生阻害化合物のMetAP-2阻害コアを含むフラグメント）の組織選択的な送達が可能になる。前記ペプチドはまた、血管新生部位または異常な細胞増殖部位で発現する細胞表面レセプタのリガンドである配列を含んで、血管新生阻害化合物を目的の細胞表面に向かわせてもよい。たとえば、本発明の血管新生阻害化合物内に含まれるペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼの切断部位、またはインテグリン結合RGD（Arg-Gly-Asp）配列、または血管新生阻害化合物を内皮細胞のメンバーに向かわせる働きをする酵素「切断」配列および細胞表面「リガンド」の両方の組み合わせを含んでよい。しかし、ペプチド配列の選択は、MetAP-2阻害が望ましい細胞への送達活を性血管新生阻害化合物ができるようでなければならない。
【００４４】
たとえば、マトリックスメタロプロテイナーゼによって切断される配列は、MetAP-2阻害コア、カップリング基、およびペプチド断片を含有する生成物を生成する。配列は、たとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ切断によって生じる活性血管新生阻害化合物などの活性血管新生阻害化合物が細胞透過性であるように選択される。このましくは、前記活性血管新生阻害化合物は、切断後、遊離酸を含有しない。
【００４５】
ある実施態様では、前記ペプチドには、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2（MMP-2）、MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13、またはMMP-26などマトリックスメタロプロテイナーゼの切断部位が含まれる。このましくは、前記ペプチドにはMMP-2またはMMP-9の切断部位が含まれる。たとえば、前記ペプチドは配列-Pro-Leu-Gly-Xaa- (SEQ ID NO:1)を含み、ここでXaaはGly-Xaa結合におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）切断に一致する天然に存在するアミノ酸残基のいずれかである。Xaaは好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、およびバリンなどの疎水性アミノ酸残基である。
【００４６】
そのほかの適切な配列には、Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His (SEQ ID NO:2)、Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg (SEQ ID NO:3)、Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp (SEQ ID NO:4)、Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg (SEQ ID NO:5)、Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (SEQ ID NO:35)、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg (SEQ ID NO:6)、Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO:7)、 Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO:8)、Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO:9)、Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg (SEQ ID NO:10)、Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala (SEQ ID NO:11)、Pro-Leu-Ala-Nva (SEQ ID NO:12)、Pro-Leu-Gly-Leu (SEQ ID NO:13)、Pro-Leu-Gly-Ala (SEQ ID NO:14)、Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser (SEQ ID NO:15)、Pro-Cha-Ala-Abu-Cys(Me)-His-Ala (SEQ ID NO:16)、Pro-Cha-Ala-Gly-Cys(Me)-His-Ala (SEQ ID NO:17)、Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu (SEQ ID NO:18)、Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:19)、Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met (SEQ ID NO:20)、Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg (SEQ ID NO:21)、Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg (SEQ ID NO:22)、およびArg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp (SEQ ID NO:23)の１つ以上を含む配列が含まれる。これらの配列は、天然のアミノ酸残基を慣例的な3文字略語を用いて識別しており、以下の略語は非天然アミノ酸を表す。Abu=L-a-アミノブチリル、Cha=L-シクロヘキシルアラニン、Nva=L-ノルバリン。
【００４７】
ある実施態様では、PはAc-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ala (SEQ ID NO:24)、Gly-Pro-Leu-Gly-Met-His-Ala-Gly (SEQ ID NO:25)、Gly-Pro-Leu-(Me)Gly (SEQ ID NO:26)、Gly-Pro-Leu-Gly (SEQ ID NO:27)、Gly-Met-Gly-Leu-Pro (SEQ ID NO:28)、Ala-Met-Gly-Ile-Pro (SEQ ID NO:29)、Gly-Arg-Gly-Asp-(O-Me-Tyr)-Arg-Glu (SEQ ID NO:30)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (SEQ ID NO:31)、Gly-Arg-Gly-Asp (SEQ ID NO:32)、 Asp-Gly-Arg、Ac-Pro-Leu-Gly-Met-Ala (SEQ ID NO:33)、Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ala (SEQ ID NO:34)、Ac-Pro-Leu-Gly-Met-Gly (SEQ ID NO:36)、Met-Trp-Ala (SEQ ID NO:37)、 Met-Gly (SEQ ID NO:38)、Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ala-Gly (SEQ ID NO:39)、および Gly-Arg-(3-アミノ-3-ピリジルプロピオン酸) (SEQ ID NO:40) （前述の配列中のAcはアセチル基を表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【００４８】
前記ペプチドは、N末端またはC末端のいずれかにおいてMetAP-2阻害コアに結合してよい。前記ペプチドが、C末端でMetAP-2阻害コアに結合している場合、前記ペプチドのN末端は-NR2R3であってよく、ここでR2は水素、アルキル、またはアリールアルキルであり、R3は水素、アルキル、アリールアルキル、またはアシルである。前記ペプチドがN-末端においてMetAP-2阻害コアに結合している場合、C末端は-C(O)R4であってよく、ここでR4は-OH、-O-アルキル、-O-アリールアルキル、または-NR2 R3であって、ここでR2は水素、アルキル、またはアリールアルキルであって、R3は水素、アルキル、アリールアルキル、またはアシルである。この実施態様では、C末端残基は対応する1級アルコールなど、還元型であってもよい。
【００４９】
本発明はまた、本発明の血管新生阻害化合物の薬学的に許容な塩も含む。「薬学的に許容な塩」には、親血管新生阻害化合物の所望の生物学的活性を有していて、不必要な毒性学的作用を与えない塩が含まれる。このような塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸などの酸の塩、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、安息香酸、パモ酸、アルギン酸、メタンスルホン酸、およびナフタレンスルホン酸などの塩である。さらに、ナトリウム、カリウム、リチウム、亜鉛、銅、バリウム、ビスマス、およびカルシウムなどのカチオンの塩、またはトリアルキルアンモニウムなどの有機カチオンの塩も含まれる。前述の塩の組み合わせも有用である。
【００５０】
好ましい式Iに記載の血管新生阻害化合物
本発明の好ましい血管新生阻害化合物のあるセットには、Aが式Xに記載のMetAP-2阻害コアであって、WがOまたはNR2であって、構造
【化３６】
0004212356.tif 000021
が以下の構造によって表される化合物が含まれる。
【化３７】
0004212356.tif 000022
【化３８】
0004212356.tif 000023
【化３９】
0004212356.tif 000024
【化４０】
0004212356.tif 000025
【化４１】
0004212356.tif 000026
【化４２】
0004212356.tif 000027
【化４３】
0004212356.tif 000028
【化４４】
0004212356.tif 000029
【化４５】
0004212356.tif 000030
【化４６】
0004212356.tif 000031
【００５１】
好ましい式XVに記載の血管新生阻害化合物
式XVに記載の血管新生阻害化合物の好ましいサブセットは、以下の式XIVを含む。
【化４７】
0004212356.tif 000032
【００５２】
ある実施態様では、WはOまたはNRである。Zは-C(O)またはアルキレン-C(O)-であって、好ましくはC1-C4-アルキレン-C(O)-である。Rは水素またはC1-C4-アルキルである。Qは水素、直鎖、分岐鎖または環状C1-C6-アルキル、またはアリールである。R1は水素、C1-C4-アルコキシ、またはハロゲンである。PはNH2、OR、またはN末端でZに結合して、天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在するアミノ酸残基のD型の鏡像異性体、および非天然のアミノ酸残基から独立に選択された1乃至100アミノ酸残基からなるペプチドである。QがＨであるとき、PはNH2またはORではない。好ましい実施態様では、WはＯまたはNHであって、Qはイソプロピルであって、R1はメトキシであって、Pは1乃至15アミノ酸残基からなっていて、式XIVに記載の点線は二重結合である。特に好ましい実施態様では、WはOであって、Pは10以下のアミノ酸残基を含む。
【００５３】
式XIVに記載の化合物の別の実施態様では、WはOまたはNRである。Zはアルキレン-Oまたはアルキレン-NRであって、好ましくはC1-C4-アルキレン-OまたはC1-C4-アルキレン-NR-である。Rは水素またはC1-C4-アルキルである。Qは水素、または直鎖、分岐鎖または環状C1-C6-アルキル、またはアリールである。R1は水酸基、C1-C4-アルコキシまたはハロゲンである。Pは水素、またはC末端でZに結合し天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在するアミノ酸残基のD型の鏡像異性体、および非天然のアミノ酸残基から独立に選択された1乃至100アミノ酸残基からなるペプチドである。QがHのとき、PはHではない。好ましい実施態様では、WはOまたはNHであって、Oはイソプロピルであって、R1はメトキシであって、Pは1乃至15アミノ酸残基からなっていて、式XIVに記載の点線は二重結合である。特に好ましい実施態様では、WはOであって、Pは10以下のアミノ酸残基を含むか、またはPは水素である。
【００５４】
本発明の特に好ましい血管新生阻害化合物のあるセットは、以下の構造で表される。
【化４８】
0004212356.tif 000033
【化４９】
0004212356.tif 000034
【化５０】
0004212356.tif 000035
【化５１】
0004212356.tif 000036
【化５２】
0004212356.tif 000037
【化５３】
0004212356.tif 000038
【化５４】
0004212356.tif 000039
【化５５】
0004212356.tif 000040
【００５５】
血管新生疾患の治療のための血管新生阻害化合物の使用方法
別の実施態様では、本願発明は対象における血管新生疾患の治療方法を提供する。前記方法には、前記対象に本願発明の血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与し、前記対象における血管新生疾患を治療するステップが含まれる。
【００５６】
本願明細書に用いられる「血管新生疾患」という用語には、異常なまたは好ましくない、たとえば促進または抑制された血管の形成（血管新生）によって特徴づけられる、または引き起こされる疾患、障害、または症状が含まれる。異常または好ましくない血管新生は、ある特定の疾患を直接引き起こすか、または既存の病理学的症状を悪化させることがある。血管新生疾患の例には、たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性による網膜新生血管、低酸素症、感染症または外科的介入に伴う眼の血管新生、眼腫瘍ならびにトラコーマ、およびそのほかの眼における異常な血管新生症状などの眼障害であって、血管新生が失明を引き起こす眼障害、たとえば乾癬および化膿性肉芽腫などの皮膚障害、たとえば腫瘍細胞による血管新生が連続的に誘導されて進行性に成長する癌腫および肉腫など、肺癌、脳癌、腎癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、黒色腫、および前述のいずれかの癌の転移癌などの癌、たとえば血管線維腫、および血友病関節症などの小児疾患、たとえば血管腫およびアテローム斑の中での毛細管増殖などの血管疾患、たとえば肥厚性瘢痕、創傷肉芽形成および血管癒着などの外科手術に伴う障害、および、関節内に血管が新生して関節の軟骨を破壊することがあるリウマチ様免疫性変形性関節炎、および強皮症などの自己免疫疾患が含まれる。
【００５７】
血管新生疾患という用語にはさらに内皮細胞の過度のまたは異常な刺激によって特徴づけられる疾患も含まれ、その疾患には腸管癒着症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕すなわちケロイド、ネコ引っかき病（Rochele ninalia quintosa）および潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ菌）など病理学的な結果として血管新生が生じる疾患などがそれらに限定されずに含まれる。さらに、本願発明の血管新生阻害化合物は避妊薬としても有用であり（血管新生に依存する排卵および胎盤の確立を阻害する能力があるため）、また、出血を減少させるために手術前に対象に投与することも可能である。
【００５８】
本願明細書で用いられる「対象」という用語には、温血動物であって、好ましくはヒトを含む哺乳動物が含まれる。好ましい実施態様では、前記対象は霊長類である。さらに好ましい実施態様では、前記霊長類はヒトである。
【００５９】
本願明細書で用いられる対象への「投与」という文言には、たとえば薬学的剤形状の血管新生阻害化合物（前述）などの血管新生阻害化合物を、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈注射、口腔内投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻腔内、または呼吸器経路による投与など非経または経口経路のいずれかによる送達法など、対象における望ましい部位へ前記化合物を送達するための適切な経路によって、前記対象に提供、送達、または適用することが含まれる。
【００６０】
本願明細書に用いられる「有効な量」という文言には、たとえば対象の血管新生疾患を治療するのに十分など、望ましい結果を得るために有効な用量および期間であることが含まれる。本願明細書に定義される血管新生阻害化合物の有効な量は、対象の疾患の病期、年齢、および体重、ならびに血管新生阻害化合物が対象において望ましい反応を誘導する能力などの因子によって変化することがある。投与方法は最良の治療反応が得られるように調整されることがある。有効な量はまた、血管新生阻害化合物の治療上の有益な作用が毒性作用または有害作用（たとえば副作用）を上回る場合の量でもある。
【００６１】
血管新生阻害化合物の治療上有効な量（すなわち有効な投与量）は、体重1kgにつき約0.001乃至30mg、好ましくは体重1kgにつき約0.01乃至25mg、さらに好ましくは体重1kgにつき約0.1乃至20mg、さらにより好ましくは体重1kgにつき約1乃至10mg、2乃至9mg、3乃至8mg、4乃至7mg、5乃至6mgの範囲内であってよい。当業者は、対象の疾患または障害の重度、過去の治療、全般的な健康状態および／または年齢、ならびにそのほかに罹患している疾患などであるがそれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な容量に影響を与える可能性があることを理解するだろう。さらに、治療上有効な量の血管新生阻害化合物を用いた対象の治療には単回治療を含んでもよく、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。ある実施例では、対象に、体重1kgにつき約0.1乃至20mgの範囲内の血管新生阻害化合物を約1乃至10週、好ましくは約2乃至8週、さらに好ましくは約3乃至7週、よりさらに好ましくは約4、5、または6週の期間中週１回投与する。治療に使用した血管新生阻害化合物の有効な投与量は特定の治療の経過に伴って増加または減少してもよいことも、理解されよう。
【００６２】
本願発明の方法には、さらに、治療上有効な量の血管新生阻害化合物を、たとえばタクソール、パクリタキセル、またはアクチノマイシンDなどの化学療法薬またはトルブタミドなどの抗糖尿病薬などの血管新生疾患を治療することが知られている薬学的に活性な別の化合物、またはヘパリンもしくは硫酸化シクロデキストリンなどの血管新生阻害化合物の血管新生阻害活性が増強されていると考えられる化合物とともに、対象に投与するステップが含まれる。使用が可能なそのほかの薬学的に活性な化合物は、その内容全体を引用することによってここに援用するHarrison's Principles of Internal Medicine, Thirteenth Edition, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NYと、the Physicians Desk Reference 50th Edition 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.に見つけることができる。前記血管新生阻害化合物および前記薬学的に活性な化合物は、対象に同一の薬学的組成で投与されてもよく、または異なる薬学的組成で（同時に、または異なる時期に）投与されてもよい。
【００６３】
血管新生阻害化合物の薬学的組成
本願発明はさらに、1種類以上の血管新生阻害化合物を含む薬学的に許容な調剤を提供する。このような薬学的に許容な調剤には、一般に、1種類以上の血管新生阻害化合物とともに薬学的に許容な担体および／または賦形剤が含まれる。本願明細書に用いられる「薬学的に許容な担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および生理学的に適合する同等物が含まれる。このような薬理学的に活性な物質用の溶媒または薬剤の使用は当業に公知である。従来の溶媒または薬剤が血管新生阻害化合物に適合しない場合でない限り、薬学的組成物にそれらを使用することが意図される。
【００６４】
たとえばタクソール、パクリタキセル、もしくはアクチノマイシンＤなどの化学療法薬、またはトルブタミドなどの抗糖尿病薬など血管新生疾患を治療することが知られている補助的な薬学的に活性な化合物、またはヘパリンまたは硫酸化シクロデキストリンなどの血管新生阻害化合物の血管新生阻害活性が増強されている化合物を、本願発明の組成に組み込んでもよい。使用してもよい適切な薬学的に活性な化合物は、Harrison's Principles of Internal Medicine（同上）で見つけることができる。
【００６５】
本願発明の薬学的な組成物は、意図する投与経路に適合するように調剤される。投与経路の例には、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与などの非経口経路が含まれる。非経口、皮内、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液には、以下の組成物、水などの注射用滅菌希釈剤、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはそのほかの合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透張力調整剤が含まれてもよい。pHは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整してよい。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入されていてよい。
【００６６】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性）また分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合用滅菌パウダーが含まれる。静脈内投与用に適切な担体には、生理学的食塩水、静菌水、クレモホールELTM（BASF社、ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。すべての場合において、薬学的組成物は滅菌性でなければならず、注射器への装填がある程度容易であるように流体であるべきである。製造および保存状況下において安定でなければならず、細菌または真菌などの微生物の混入活性から防御されていなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物などを含有する溶媒、または分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。微生物の活性は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメローサルなどの各種抗菌剤および抗真菌剤によって防御することができる。多くの場合、たとえば糖、マニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなど、等張剤が組成物に含まれることが好ましい。注射用組成物の吸収は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延する薬剤を組成物に含むことによって持続させることができる。
【００６７】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒に溶解した必要量の前記血管新生阻害化合物を上述の成分の１つまたは組み合わせに組み入れて、滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、前記血管新生阻害化合物を塩基性分散媒および上述の成分から選択されたそのほかの必要な成分を含有する滅菌賦形剤に組み入れて調製する。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌パウダーの場合、好ましい調製方法は真空乾燥または凍結乾燥であって、その結果、血管新生阻害化合物と前もって滅菌濾過された溶液から得られたもう１つの望ましい成分の混合物のパウダーが得られる。
【００６８】
経口用組成物は一般に不活性希釈剤、または食用担体を含む。その組成物は、ゼラチンカプセルに封入されていてもよいし、または圧縮して錠剤にしてもよい。治療用経口投与の目的のために、前記血管新生阻害化合物を賦形剤に組み入れて、錠剤、トローチ、またはカプセルの形状で使用してもよい。経口用組成物には腸溶コーティングも含まれてよい。経口用組成物は、洗口液として使用するための流体状担体を用いて調製してもよく、その場合、流体状担体中の前記血管新生阻害化合物は口腔内に適用され、吐き出すか、または燕下する。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバントを前記組成物の一部として含んでもよい。錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有してもよい。それは、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの香料添加剤などである。
【００６９】
吸入による投与のために、前記血管新生阻害化合物は、加圧容器、またはたとえば二酸化炭素などの気体などの適切な推進剤を含有するディスペンサ、またはネブライザからのエアゾールスプレー状で送達する。
【００７０】
全身投与は経粘膜または経皮手段によって行ってもよい。経粘膜または経皮投与のために、障壁を透過させるのに適した浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は一般に当業に公知で、たとえば経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬を用いて行うことができる。経皮投与の場合、前記血管新生阻害化合物は、一般に当業に公知の軟膏（ointments）、軟膏（salves）、ゲル、またはクリームに調製する。
【００７１】
前記血管新生阻害化合物は坐薬（たとえばカカオバターおよびそのほかのグリセリドなど従来の坐薬の基剤を用いて）または直腸への送達の場合は停留浣腸の形状で調製することもできる。
【００７２】
ある実施態様では、前記血管新生阻害化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達システムなど制御放出製剤など、化合物が体内から急速に排出されないように保護する担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はアルザコーポレーション社およびノバファーマシューティカルズ社から購入することができる。リポソーム懸濁液も薬学的に許容な担体として用いることができる。これらは、たとえば引用によりその内容を援用する米国特許第4,522,811号、米国特許第5,455,044号、 米国特許第5,576,018号、および米国特許第4,883,666号に記載の通り、当業に公知の方法によって調製する。
【００７３】
本願発明の血管新生阻害化合物は、前記血管新生阻害化合物を対象に少なくとも数週間から1ヶ月以上の間、持続的に送達できるような薬学的組成物に組み入れることもできる。このような製剤は、引用によりその内容を援用する米国特許第5,968,895号に記載されている。
【００７４】
投与の簡便化と投与量の均等化のために、経口または非経口用組成物を単回投与剤形に調剤するのは特に有用である。本願明細書で用いる単回投与剤形とは、治療する対象に適切な単回投与量を物理的に離散させたユニットを意味する。各ユニットは、望ましい治療効果を生じさせるために計算してあらかじめ決定した量の血管新生阻害化合物を必要な薬学的担体と併せて含有する。本発明の単回投与剤形の詳細は、前記血管新生阻害化合物の固有の特徴、および特定の治療効果、ならびにこのような血管新生阻害化合物を個別の治療用に混合する技術に特有の限界によって決定され、また直接的に依存する。
【００７５】
このような血管新生阻害化合物の毒性および治療上の有効性は、たとえばLD50（集団の50%を死亡させる投与量）およびED50（集団の50%に治療上の有効性が見られる投与量）を決定するなど、細胞培養および実験動物において標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療上の有効性が見られる投与量の比は治療指数といい、LD50/ED50の比で表すことができる。大きい治療指数を示す血管新生阻害化合物が好ましい。毒性の副作用を示す血管新生阻害化合物が用いられることもあるが、罹患していない細胞に与えるダメージを最小限に抑えて副作用を減少させるために、このような血管新生阻害化合物で罹患組織の部位を狙うデリバリーシステムの設計は慎重に行うべきである。
【００７６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を決定するために用いることができる。このような血管新生阻害化合物の投与量は、毒性が少ないかまたは皆無のED50を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。前記投与量は剤形および投与経路に依存するこの範囲内で変化してもよい。本願発明の方法に用いられるいずれの血管新生阻害化合物の場合にも、治療上有効な用量の推定はは、まず細胞培養アッセイから始めることができる。動物モデルでは、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の50%を阻害する前記血管新生阻害化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲に達するように決定してよい。このような知見を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿濃度は、たとえば高性能液体クロマトグラフィで測定してもよい。
【００７７】
血管新生阻害化合物の活性を検出するアッセイ
本願発明の血管新生阻害化合物は、たとえばラット大動脈輪血管新生阻害アッセイ（本願明細書例２７に記載）など多種の公知のアッセイ、または漿尿膜（CAM）アッセイにおいて、血管新生を調節（阻害または刺激）する能力についてテストしてもよい。
【００７８】
CAMアッセイは、基本的には、引用によってその内容を援用するLiekens S. et al. (1997) Oncology Research 9: 173-181に記載の通り行ってよい。簡単に説明すると、新鮮な受精卵を37℃で3日間インキュベートする。3日目に殻を割り、卵を組織培養プレートに置いて38℃でインキュベートする。このアッセイのために、テストの対象である血管新生阻害化合物をナイロンメッシュにのせたコラーゲン基質上に付着させる。このメッシュを用いて漿尿膜を覆い、卵を37℃でインキュベートする。血管新生が生じる場合、24時間以内に新しい毛細管が形成され前記メッシュを通って成長する。そこで、血管新生阻害化合物がFGF誘導血管新生などの血管新生を、たとえば阻害など調節する能力を決定できる場合もある。
【００７９】
本願発明の血管新生阻害化合物は、ヒト内皮細胞の成長を調節（たとえば阻害または刺激）する能力についてもテストすることができる。ヒト臍静脈内皮細胞（HUVE）は、臍静脈をトリプシン含有培地で灌流して分離することができる。ついで、HUVEを、2.5%ウシ胎児血清および2.0 ng/mlの組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（rbFGF、武田バイオ技術研究所、大阪）を添加したGIT培地（Diago Eiyou Kagaku社、日本）で、5%CO2および7%O2下、37℃で培養してもよい。その後、HUVEを96穴マイクロタイタープレート（Nunc、1-67008）に細胞密度が培地100μlあたり2x103になるように蒔いてもよい。翌日、rbFGF（最終濃度2ng/ml）を含有する培地100μlおよび各種濃度の血管新生阻害化合物を各ウエルに加えてもよい。前記血管新生阻害化合物をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、培養培地を最終DMSO濃度が0.25%を超えないように希釈する。5日間の培養後、培地を取り除き、1mg/ml MTT（3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド）100μlをウエルに加え、マイクロタイターを4時間37℃に維持する。その後、10%ドデシル硫酸ナトリウム100μlをウエルに加えて、マイクロタイターを5乃至6時間37℃に維持する。前記血管新生阻害化合物が細胞数に及ぼす作用を決定するために、各ウエルの吸光度（590μm）を吸光度計で測定する。
【００８０】
本願発明の血管新生阻害化合物がin vitroにおける毛細血管内皮細胞遊走を調節する能力を、ボイデンチャンバーアッセイを用いてテストしてもよい（引用によりその内容を援用するFalk et al. (1980) J. Immunol. Meth. 33:239-247に記載の通り）。簡単に説明すると、ウシ毛細血管内皮細胞を無血清DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）に1ウエルあたり1.5x104個蒔き、フィブロネクチン（PBS1mlにつきフィブロネクチン7.3μg）であらかじめコーティングしたヌクレオポアフィルターの片側に置く。血管新生阻害化合物をエタノールに溶解してDMEMで希釈し、最終エタノール濃度が0.01%を超えないようにする。細胞を200μg/mlエンドセリアル・マイトジェン（Endothelial Mitogen、バイオメディカル・テクノロジーズ社、マサチューセッツ州）および各種濃度の無血清DMEM中の血管新生阻害化合物に、37℃で4時間暴露する。このインキュベーションの終了時に、前記フィルターの8μ孔を通り抜けて遊走する細胞の数を、100倍の接眼グリッドを用いて4回計数して決定した。
【００８１】
本願発明の血管新生阻害化合物が腫瘍増殖を調節する能力を、in vivoにおいてテストしてもよい。マウス細網肉腫（M5076）を腹腔内に移植したC57BL/6Nなどの動物モデルを使用してもよい。腹水中の腫瘍細胞を遠心分離して収集し、食塩水に懸濁させる。この細胞懸濁液（2x106細胞/100μl/マウス）をマウスの右側腹に接種する。腫瘍を有するマウスの皮下に前記血管新生阻害化合物（エタノール1%を含有する5%アラビアゴム溶液に各種濃度で懸濁させた）を、腫瘍接種の１日後から12日間投与する。腫瘍の増殖は、数日ごとにノギスで腫瘍の2方向を測定して決定する。
【００８２】
最後に、本願発明の血管新生阻害化合物がMetAP2活性を調節する能力は、以下のようにテストしてもよい。組み換えヒトMetAP2は、Li and Chang, (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:152-159に記載の昆虫細胞から発現させて精製してもよい。様々な量の血管新生阻害化合物を1nM精製組み換えヒトMetAP2を含有するバッファH（10mM Hepes、pH 7.35、100 mM KCl、10%グリセロール、および0.1M Co2+）に加え、37℃で30分間インキュベートする。酵素反応を開始するために、たとえばMet-Gly-Metなどのメチオニン残基を含有するペプチドを反応混合物に加える（濃度が1mMになるまで）。その後、放出されたメチオニンを、Zou et al. (1995) Mol. Gen Genetics 246:247-253の方法を用いて、各時点（たとえば0、2、3、および5分の時点）において計量する。
【００８３】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、特許、および公開された特許出願、ならびに図および配列リストは、引用によりここに援用される。
【００８４】
【実施例】
合成方法
本願発明の化合物は以下に記載の１つ以上の一般方法を用いて調製することができる。
【００８５】
一般手順A：カルボン酸 -(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ -4-[(2R, 3R)-2-メチル -3-(3-メチル -ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ -スピロ [2.5]オクト-6-イルエステル4-ニトロ -フェニルエステル 1 (1, 0.47 mmol; Han, C. K.; Ahn, S. K.; Choi, N. S.; Hong, R. K.; Moon, S. K.; Chun, H. S.; Lee, S. J.; Kim, J. W.; Hong, C. I.; Kim, D.; Yoon, J. H.; No, K. T. Biorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 39-43) およびアミン(2.35 mmol) の EtOH (9 mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（2.35 mmol）を滴下して加えた。3乃至18時間後、エタノールを減圧除去し、粗材料をEtOAc（10mL）に溶解してH2O（2 x 5 mL）で洗浄し、その後食塩水（5mL）で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧除去した。フラッシュクロマトグラフィ（2-5% MeOH/CH2Cl2）で精製し、生成物を得た。
【００８６】
一般手順BパートＩ：(3R, 4S, 5S, 6R) -5-メトキシ -4-[(2R, 3R)- 2-メチル -3-(3-メチル -ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ)-酢酸 2 (2, 0.11 mmol; 米国特許第6,017,954号) のDMF (1 mL)溶液を膨潤させたPS-DCC（0.28 mmol）を入れた10mLの丸底フラスコに加えた。別の容器で、ペプチド（0.04mmol）をDMF（0.5mL）に溶解し、NMM（0.04mmol）で中和した。1時間後、前記ペプチド溶液を、前もって活性化させてある酸に加え、反応を5乃至18時間続けた。濾過によって樹脂を除去し、DMF（0.5 mL）で洗浄して、溶媒を減圧除去した。HPLC（CH3CN/H2O）で精製し、生成物を得た。
【００８７】
一般手順ＢパートII：  パートIで得られた生成物の溶液（0.009mmol）をMeOH（1mL）に溶解し、Pd/C（2mg）で処理してから、H2雰囲気下（38 psi）に24時間おいた。その混合物をセライトを通して濾過し、MeOH（0.5mL）で洗浄してから、溶媒を減圧除去した。HPLC（CH3CN/H2O）で精製して、白色固体状の生成物を得た。
【００８８】
一般手順C：  (1-ヒドロキシメチル -メチル -プロピル)-カルバミン酸(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ -4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルエステル (例7, 189 mg, 0.46 mmol)、酸(0.46 mmol) およびDMAP (0.69 mmol) を無水CH2Cl2 (5 mL) に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド(0.46 mmol)で処理した。7乃至18時間後、溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ（MeOH/CH2Cl2）で精製して生成物を得た。
【００８９】
例１
2-{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ }-3-メチル-ブチル酸メチルエステル
【化５６】
0004212356.tif 000041
【００９０】
1 (31 mg, 0.07 mmol)、 L-バリンメチルエステル塩酸塩 (58 mg, 0.35 mmol)、およびDIEA (60 μL, 0.35 mmol) のEtOH (2 mL)溶液を用いて、一般手順A に従った。フラッシュクロマトグラフィ(1% MeOH/CH2Cl2)で精製し、無色油状の生成物を得た; Rf = 0.60 (20% EtOAc/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 440.3 (C23H38NO7の計算値, 440.3)。
【００９１】
例２
2-{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ -4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト -2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ }-3-メチル-ブチル酸メチルエステル
【化５７】
0004212356.tif 000042
【００９２】
1 (41 mg, 0.09 mmol) およびD-バリンメチルエステル塩酸塩(77 mg, 0.45 mmol)、およびDIEA (80 μL, 0.45 mmol) のEtOH (2 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ(1% MeOH/CH2Cl2)で精製し、無色油状の生成物を得た(18 mg, 0.04 mmol、収率45%); Rf = 0.39 (20% EtOAc/CH2Cl2; LRMS (m/z) [M+1]+ 440.3 (C23H38NO7の計算値、440.3)。
【００９３】
例３
2-{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ}-4-メチル-ペンタン酸メチルエステル
【化５８】
0004212356.tif 000043
【００９４】
1 (23 mg, 0.05 mmol)、D-ロイシンメチルエステル塩酸塩 (47 mg, 0.25 mmol)、およびDIEA (45 μL, 0.25 mmol)のEtOH (2 mL)を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ(1% MeOH/CH2Cl2) で精製し、無色油状の生成物を得た (19 mg, 0.04 mmol、収率83%); Rf = 0.22 (15% EtOAc/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 454.3 (C24H40NO7の計算値, 454.3)。
【００９５】
例４
{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ}-フェニル-酢酸メチルエステル
【化５９】
0004212356.tif 000044
1 (37 mg, 0.08 mmol)、 D-フェニルグリシン メチルエステル塩酸塩(83 mg, 0.40 mmol)、およびDIEA (72 μL, 0.40 mmol)のEtOH (2 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ(1% MeOH/CH2Cl2) で精製し、無色油状の生成物を得た(32 mg, 0.07 mmol、収率82%); Rf = 0.41 (2% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 474.3 (calculated for C26H36NO7, 474.3)。
【００９６】
例５
(1-カルバミル-2-メチル-プロピル)-カルバミン酸-(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R ) -2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト -6-イルエステル
【化６０】
0004212356.tif 000045
1 (55 mg, 0.12 mmol)、D-バリンアミド塩酸塩 (93 mg, 0.62 mmol)、およびDIEA (110 μL, 0.62 mmol)のEtOH (2 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ(2% MeOH/CH2Cl2)で精製し、無色油状の生成物を得た。 (42 mg, 0.10 mmol, 収率80%); Rf = 0.19 (2% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 425.5 (C22H37N2O6の計算値425.5)。
【００９７】
例６
(1-カルバモイル-2-メチル-プロピル)-カルバミン酸-(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R )-2-メチル-3-(3-メチル-ブチル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化６１】
0004212356.tif 000046
【００９８】
例４に記載の化合物 (18 mg, 0.04 mmol) を無水MeOH (1.5 mL) に溶解し、H2雰囲気下でPd-C (2 mg) で処理した。12時間後、その反応物をセライトを通して濾過し、溶媒を減圧除去して、無色油状の生成物を得た (18 mg, 0.04 mmol, 収率100%); Rf = 0.21 (2% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 427.5 (C22H39N2O6の計算値, 427.5)。
【００９９】
例７
(1-ヒドロキシメチル-2-メチル-プロピル)-カルバミン酸-(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R )-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化６２】
0004212356.tif 000047
【０１００】
1 (290 mg, 0.65 mmol)、D-バリノール (337 mg, 3.25 mmol)、およびDIEA (560 μL, 3.25 mmol)のEtOH(5 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ (2% MeOH/CH2Cl2)で精製し、無色油状の生成物を得た(200 mg, 0.49 mmol, 収率75%); Rf = 0.26 (2% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 412.5 (C22H38NO6の計算値, 412.5)。
【０１０１】
例８
2-{(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ}-3,3-ジメチル -ブチル酸メチルエステル
【化６３】
0004212356.tif 000048
【０１０２】
1 (65 mg, 0.15 mmol)、D-tBu グリシンメチルエステル塩酸塩 (132 mg, 0.73 mmol)、およびDIEA (127 μL, 0.73 mmol) の EtOH (8 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ (10% EtOAc/CH2Cl2) で精製し、無色油状の生成物を得た。 (10 mg, 0.02 mmol, 収率15%); Rf = 0.22 (10% EtOAc/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 454.5 (C24H40NO7の計算値, 454.5)。
【０１０３】
例９
シクロヘキシル-2-{(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル -ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ}-酢酸メチルエステル
【化６４】
0004212356.tif 000049
【０１０４】
1 (65 mg, 0.15 mmol)、D-シクロヘキシルグリシンメチルエステル塩酸塩(207 mg, 0.73 mmol)、および DIEA (127 μL, 0.73 mmol) のEtOH (7 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ (10% EtOAc/CH2Cl2)で精製し、 無色油状の生成物を得た(20 mg, 0.04 mmol, 収率28%); Rf = 0.22 (10% EtOAc/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 480.3 (C26H42NO7の計算値, 480.3)。
【０１０５】
例１０
2-{(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-3-メチル-ブト-2-エニル]-オキシラニル}-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニルアミノ}-3-メチル-ペンタン酸メチルエステル
【化６５】
0004212356.tif 000050
1 (65 mg, 0.15 mmol)、D-イソロイシンメチルエステル塩酸塩(132 mg, 0.73 mmol)、およびDIEA (127 μL, 0.73 mmol) のEtOH (7 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。フラッシュクロマトグラフィ (10% EtOAc/CH2Cl2)で精製し、 無色油状の生成物を得た。(20 mg, 0.04 mmol, 収率30%); Rf = 0.20 (10% EtOAc/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 454.5 (C24H40NO7の計算値, 454.5)。
【０１０６】
例１１
[1-(1-カルバモイル-2-ヒドロキシ-エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピル]-カルバミン酸 -(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化６６】
0004212356.tif 000051
1 (74 mg, 0.17 mmol)、H-D-vS-NH2・TFA (262 mg, 0.83 mmol)、およびDIEA (140 μL, 0.83 mmol) のEtOH (5 mL)溶液を用いて、一般手順Aに従った。HPLC (60% CH3CN/H2O) で精製し、白色固体状の生成物を得た(34 mg, 0.07 mmol, 収率40%); Rf = 0.21 (5% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 512.5 (C25H42N3O8の計算値, 512.3)。
【０１０７】
例１２
2-{3-(3R, 4S, 5S, 6R )-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イル}-ウレイド)-3-メチル-ブチラミド
【化６７】
0004212356.tif 000052
(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルアミン (3; PCT公報第WO 99/59987号) を公告済みの手順に基づいて調製した。0 oCに冷却した粗 3 (29 mg, 0.1 mmol)、DIEA (21 mL, 0.1 mmol) およびDMAP (2 mg) のCH2Cl2 (1.5 mL) 溶液にp-NO2 フェニルクロロホルム酸塩(25 mg, 0.12 mmol)を加えた。45分後、その反応物を室温まで暖め、H-D-val-NH2・HCl (40 mg, 0.15 mmol) のEtOH (1 mL) 溶液およびDIEA (35 μL, 0.2 mmol)を加えた。
【０１０８】
その反応を１時間続けた後、減圧濃縮してEtOAc (15 mL)に溶解し、希釈 HClaq(2 x 15 mL), H2O (2 x 15 mL) および食塩水(15 mL)で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィ (5% MeOH/CH2Cl2) で精製し、白色固体状の生成物を得た (6 mg, 0.014 mmol, 3からの収率13%); Rf = 0.12 (5% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 424.4 (C22H38N3O5の計算値, 424.4)。
【０１０９】
例１３
N-カルバモイル (ID#31) 3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブチル)-oオキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化６８】
0004212356.tif 000053
2 (41 mg, 0.11 mmol)、PS-DCC (256 mg, 0.28 mmol) のDMF (1 mL)溶液およびH-RGD(Bn)S(OBn)P-NH2・2TFA (37 mg, 0.04 mmol)、NMM (4 μL, 0.04 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順BパートIに従った。HPLC (70%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色蛍光固体状の生成物を得た(9.3 mg, 0.009 mmol,収率17%)と、 LRMS (m/z) [M+1]+ 1075.4 (C53H75N10O14の計算値, 1075.5)。
【０１１０】
一般手順パートIの生成物(9.3 mg, 0.009 mmol) およびPd/C (2 mg) のMeOH (1 mL)溶液を用いて、H2雰囲気下(38 psi)で24時間かけて、一般手順パートIIに従った。HPLC (55%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(5 mg, 0.006 mmol, 収率65%); LRMS (m/z) [M+1]+ 897.3 (C39H65N10O14の計算値, 897.5 )。
【０１１１】
例１４
N-カルバモイル (ID#30) 3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブチル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化６９】
0004212356.tif 000054
2 (38 mg, 0.10 mmol) およびPS-DCC (238 mg, 0.25 mmol) のDMF (1 mL)溶液、H-RGD(Bn)Y(OMe)RE(Bn)-NH2・3TFA (35 mg, 0.03 mmol) およびNMM (3 μL, 0.03 mmol)のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順パートIに従った。HPLC (70%CH3CN/H2O/0.075% TFA)で精製し、 白色蛍光固体状の生成物を得た(4.0 mg, 0.002 mmol, 収率8%); LRMS (m/z) [M+2/2]+ 677.6 (C66H92N14O17の計算値, 677.8)。
【０１１２】
一般手順パートIの生成物(3.0 mg, 0.002 mmol)およびPd/C (2 mg) のMeOH (1 mL)溶液を用いて、H2雰囲気下(38 psi)で24時間かけて、一般手順パートIIに従った。, HPLC (55%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(3.3 mg, 0.0027 mmol, 収率94%); LRMS (m/z) [M+2/2]+ 588.5 (C52H82N14O17の計算値, 588.7)。
【０１１３】
例１５
N-カルバモイル (ID#32) 3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブチル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化７０】
0004212356.tif 000055
2 (38 mg, 0.10 mmol)、PS-DCC (238 mg, 0.25 mmol)、および HOBt (29 mg, 0.25mmol) のDMF (1 mL)溶液、およびH-RGD(Bn)NH2・TFA (29 mg, 0.04 mmol)およびNMM (4.8 μL, 0.04 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順Bに従った。HPLC (60%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(35 mg, 0.04 mmol, 44%yield); LRMS (m/z) 801.2 (C38H57N8O11の計算値, 801.4)。
【０１１４】
一般手順パートIの生成物(35 mg, 0.04 mmol)およびPd/C (2 mg) のMeOH (1 mL)溶液を用いて、H2雰囲気下(38 psi)で24時間かけて、一般手順パートIIに従った。 HPLC (50%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た (22 mg, 0.03 mmol, 71% yield); LRMS (m/z) 713.2 (C31H53N8O11の計算値, 713.4)。
【０１１５】
例１６
N-カルバモイル (ID#40) 3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化７１】
0004212356.tif 000056
2 (65 mg, 0.17 mmol)、PS-DCC (405 mg, 0.43 mmol)、および HOBt (34 mg, 0.26 mmol) のDMF (1 mL)溶液、および H-RG(ピリジル)D-OMe (43 mg, 0.06 mmol) およびNMM (7 μL, 0.06 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順BパートIに従った。HPLC (50% CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(15 mg, 0.02 mmol, 収率34%); LRMS (m/z) 773.2 (C34H55N4O10の計算値, 773.4)。
【０１１６】
一般手順パートIの生成物(11 mg, 0.01 mmol) をTHF:MeOH:H2O (2:1:1, 500 μL) に溶解し、LiOH・H2O (1.2 mg, 0.02 mmol) で2時間処理した。粗材料をEtOAc (5 mL)で希釈し、 希塩酸 (10 mL)で酸化させた。その水相をEtOAc (2 x 5 mL)を加えて洗浄し、混合有機抽出物をNa2SO4 で乾燥し、溶媒を減圧除去した。HPLC (30% CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(2 mg, 0.003 mmol, 収率19%). LRMS (m/z) 745.3 (C33H53N4O10の計算値, 745.4)。
【０１１７】
例１７
N-カルバモイル (ID#39)( 3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化７２】
0004212356.tif 000057
2 (25 mg, 0.07 mmol) およびPS-DCC (155 mg, 0.16 mmol) のDMF (1 mL)溶液、およびH-PLGMWAG-NH2 (20 mg, 0.03 mmol) およびNMM (3 μL, 0.03 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順BパートIに従った。HPLC (70%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た。 (1.4 mg, 0.001 mmol, 収率5%); LRMS (m/z) [M+1]+ 1095.6 (C53H79N10O13Sの計算値, 1095.6)。
【０１１８】
例１８
N-カルバモイル (ID#26) (3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化７３】
0004212356.tif 000058
2 (69 mg, 0.18 mmol)、PS-DCC (429 mg, 0.45 mmol) およびHOBt (21 mg, 0.18 mmol) のDMF (1 mL)溶液、ならびにH-PL(N-Me)G-OMe (31 mg, 0.07 mmol) およびNMM (8 μL, 0.07 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順BパートIに従った。HPLC (70%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(27 mg, 0.04 mmol, 59%yield); LRMS (m/z) [M+1]+ 679.4 (C34H55N4O10の計算値, 679.4)。
【０１１９】
パートIの生成物 (27 mg, 0.04 mmol) をTHF:MeOH:H2O (2:1:1, 1.5 mL) に溶解し、LiOH・H2O (4 mg, 0.10 mmol) で1時間処理した。0.1 N HCl を用いてこの溶液をpH 3に酸化させ、MeOH およびTHFを減圧除去した。HPLC (60% CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(6 mg, 0.01 mmol, 収率23%)。LRMS (m/z) 665.4 (C33H53N4O10の計算値, 665.4)。
【０１２０】
例１９
N-カルバモイル (ID#27) (3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルエステル
【化７４】
0004212356.tif 000059
2 (44 mg, 0.12 mmol)、PS-DCC (276 mg, 0.29 mmol) およびHOBt (27 mg, 0.23 mmol) のDMF (1 mL)溶液、ならびにH-PLG-OMe (20 mg, 0.05 mmol) およびNMM (5 μL, 0.05 mmol) のDMF (0.5 mL)溶液を用いて、一般手順BパートIに従った。HPLC (90%CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た (13 mg, 0.02 mmol, 収率43%); LRMS (m/z) [M+1]+ 664.4 (C34H52N4O10の計算値, 664.4)。
【０１２１】
パートIの生成物 (27 mg, 0.04 mmol) をTHF:MeOH:H2O (2:1:1, 790 μL) に溶解し、LiOH・H2O (1.2 mg, 0.03 mmol)で２時間処理した。この溶液を0.1 N HCl を用いてpH 3 に酸化させ、MeOHおよびTHFを減圧除去した。HPLC (90% CH3CN/H2O/0.075% TFA)で精製し、白色固体状の生成物を得た (1.8 mg, 0.003 mmol, 収率15%)。LRMS (m/z) 650.4 (C32H50N4O10の計算値, 650.4)。
【０１２２】
例２０
(ID#24)-(2R-{(3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル -3-(3-メチル-ブト -2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル} アミノ-3-メチル-ブタノール) エステル
【化７５】
0004212356.tif 000060
例7に記載の化合物 (189 mg, 0.46 mmol)、Ac-PLGMWA-OH (329 mg, 0.46 mmol)、DMAP (84 mg, 0.69 mmol) およびDIC (72 μL, 0.46 mmol) のCH2Cl2 (5 mL)溶液を用いて、一般手順C従った。１８時間後、その溶媒を減圧除去してフラッシュクロマトグラフィ(2% MeOH/CH2Cl2)で精製し、 白色固体状の生成物を得た(357 mg, 0.32 mmol, 収率70%); Rf = 0.18 (5% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 1110.3 (C56H85N8O13Sの計算値, 1110.3)。
【０１２３】
例２１
(ID#36)-(2R-{(3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル}アミノ-3-メチル-ブタノール) エステル
【化７６】
0004212356.tif 000061
例7に記載の化合物 (61 mg, 0.15 mmol)、Ac-PLGMG-OH (92 mg, 0.18 mmol)、DMAP (22 mg, 0.18 mmol) およびDIC (28 μL, 0.18 mmol)のCH2Cl2 (2 mL)溶液を用いて、一般手順Cに従った。７時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ (3% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色固体状の生成物を得た (61 mg, 0. mmol, 収率45%); Rf = 0.20 (5% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 909.7 (C44H73N6O12Sの計算値, 909.5)。
【０１２４】
例２２
(ID#36)-(2R-{(3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル}アミノ-3-メチル-ブタノール) エステル
【化７７】
0004212356.tif 000062
例7に記載の化合物(79 mg, 0.19 mmol)、Fmoc-MWA-OH (121 mg, 0.19 mmol) およびDMAP (4 mg, 0.03 mmol)およびDIC (30 μL, 0.19 mmol)のCH2Cl2 (2 mL)溶液を用いて、一般手順Cに従った。１１時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ (2% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色固体状の生成物を得た (128 mg, 0.12 mmol, 収率65%); LRMS (m/z) [M+1]+ 1022.9 (C44H73N6O12Sの計算値, 1022.5)。
【０１２５】
一般手順Cの生成物 (上述) (54 mg, 0.05 mmol) を0 oCに冷却した無水CH2Cl2 (3 mL) に溶解し、ゆるいNH3(g) 流で１５分間処理した。この反応物を密封して、36時間0℃に維持した。その溶媒を減圧除去し、粗残留物をCH3CN/H2O(0.075% TFA) (5 mL)で処理した。HPLC (70% CH3CN/H2O/0,075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た (2 mg, 0.003 mmol, 収率5%); LRMS (m/z) [M+1]+ 800.6 (C41H62N5O9Sの計算値, 800.5)。
【０１２６】
例２３
(ID#38)-(2R-{(3R, 4S, 5S, 6R) 5-メトキシ-4-[(2R,3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ [2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル}アミノ-3-メチル-ブタノール) エステル
【化７８】
0004212356.tif 000063
例７に記載の(76 mg, 0.18 mmol)、Fmoc-MG-OH (79 mg, 0.18 mmol)およびDMAP (4 mg, 0.03 mmol) およびVDIC (29 μL, 0.18 mmol) のCH2Cl2 (2 mL)溶液を用いて、一般手順Cに従った。１０時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ(2% MeOH/CH2Cl2)で精製して、白色固体状の生成物を得た(128 mg, 0.12 mmol, 収率65%); LRMS (m/z) [M+1]+ 822.6 (C44H60N3O10Sの計算値, 822.5)。
【０１２７】
一般手順Ｃの生成物（上述） (42 mg, 0.05 mmol) を0 oCに冷却した無水CH2Cl2 (3 mL) に溶解し、ゆるいNH3(g) 流で１５分間処理した。その反応物を密封し、36時間0℃に維持した。その溶媒を減圧除去し、その粗残留物をCH3CN/H2O(0.075% TFA) (5 mL)で酸化させた。HPLC (70% CH3CN/H2O/0.075% TFA) で精製し、白色固体状の生成物を得た(2 mg, 0.003 mmol, 収率5%); LRMS (m/z) [M+1]+ 600.4 (C29H50N3O8Sの計算値, 600.4)。
【０１２８】
例２４
2-{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル}-3-メチル-ブチル酸
【化７９】
0004212356.tif 000064
例2に記載の化合物 (9 mg, 0.02 mmol)をTHF:MeOH:H2O (1 mL) に溶解し、LiOH・H2O (2 mg, 0.05 mmol)で処理した。２時間後、その反応物をEtOAc (5 mL) および希塩酸 (5 mL)に分割した。その有機相をNa2SO4 で乾燥させ、その溶媒を減圧除去した。HPLC (85% CH3CN/H2O/0.075% TFA)で精製し、白色固体状の生成物を得た (0.58 mg, 0.001 mmol, 収率6% ); LRMS (m/z) [M+1]+ 426.4 (C22H36NO7の計算値, 426.5)。
【０１２９】
例２５
(ID#34)-2-{(3R, 4S, 5S, 6R)-5-メトキシ-4-[(2R, 3R)-2-メチル-3-(3-メチル-ブト-2-エニル)-オキシラニル]-1-オキサ-スピロ[2.5]オクト-6-イルオキシカルボニル}アミノ-3-メチル-ブタノール）エステル
【化８０】
0004212356.tif 000065
例7に記載の化合物 (41 mg, 0.10 mmol), Ac-PLGMG-OH (63 mg, 0.12 mmol)、DMAP (15 mg, 0.12 mmol) およびDIC (19 μL, 0.12 mmol) のCH2Cl2 (2 mL)溶液を用いて、一般手順Cに従った。７時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ(3% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色固体状の生成物を得た(43 mg, 0.05 mmol, 収率47%); Rf = 0.21 (5% MeOH/CH2Cl2); LRMS (m/z) [M+1]+ 923.7 (C45H75N6O12Sの計算値, 923.5)。
【０１３０】
例２６
本願発明の血管新生阻害化合物を、ヒト内皮細胞成長の調節能力、およびMetAP2の活性の調節能力についてテストした。MetAP2酵素アッセイは、基本的に、その内容全体を引用することにより援用するTurk, B. et al. (1999) Chem. & Bio. 6: 823-833に記載の通り行った。ウシ大動脈内皮細胞成長アッセイ（Baecアッセイ）は、基本的に、その内容全体を引用することにより援用するTurk, B. et al. (同上) に記載の通り行った。
【０１３１】
ヒト内皮細胞成長アッセイのために、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）をクロンティクス(Clonetics)社製内皮成長培地（EGM）に入れ、37℃の加湿したインキュベータで維持した。細胞をトリプシンで剥がし、300 x gで５分間室温で遠心分離器にかけてペレットにした。HUVECを96穴プレートに5,000細胞／ウエル入れた。6時間インキュベーションした後、その培地を、0.5 nM bFGFを添加した新鮮EGM 0.2 mlおよび所望の濃度のテスト用血管新生阻害化合物に交換した。テスト用血管新生阻害化合物を、まずストック濃度が10mMまたは0.1mMのエタノールに溶解し、次いでEGM中で最終濃度が1 pM乃至0.1 mMになるように希釈した。37℃で48時間維持した後、その培地を新鮮bFGF添加EGMおよびテスト用血管新生阻害化合物に交換した。37℃でさらに48時間インキュベーションした後、MTT(3-[4,5-ジメチル値アゾー-2-イル]-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド)を1mg/mlになるまで加えた。37℃で2乃至4時間経過後、その培地を0.1ml/ウエルのイソプロパノールに交換した。そのプレートを室温で15分間振盪器にかけ、ラブシステムズ（Labsystems）社製マルティスキャン（Multiskan）プレートスペクトロフォトメータで吸光度570nmにおいて解析した。
【０１３２】
表I乃至IIIに記載のこのアッセイの結果は、本願発明の血管新生阻害化合物が、優れたMetAP2阻害活性を有し、ピコモル台で内皮細胞の成長を阻害することができることを示している。
【表１】
0004212356.tif 000066
【表２】
0004212356.tif 000067
【表３】
0004212356.tif 000068
【０１３３】
各実験に用いた血管新生阻害化合物の特性を表IVおよびVに示す。
【表４】
0004212356.tif 000069
【表５】
0004212356.tif 000070
【０１３４】
例２７
本発明の血管新生阻害化合物を、ラット大動脈輪アッセイ（RARA）を用いて、血管新生を調節する能力についてもテストした。このアッセイのために、体重125乃至150gのオスSD系（Sprague-Dawley）ラットにカテミン（catemine）を筋肉内注射後に心臓内注射し、エタノールに浸してから滅菌培養フードに移して解剖した。中腹部から胸郭まで切開してから、肋骨を切除して胸腔を露出させた。心臓および肺を脇へよけて胸部大動脈の位置を特定した。大動脈弓から遠位の部分から横隔膜までのびている大動脈の一部分を取り出し、ただちに4mM L-グルタミンおよび50μg/mlゲンタマイシン（バッファA）を含有するMCDB-131培地中においた。ピペットマンで静かに大動脈からバッファAを吸い取り、血液を除去した。大動脈を取り巻く線維組織を慎重に除去し、その大動脈を滅菌カミソリで1乃至2 mmの切片にスライスした。その切片を50mlの円錐管に収集し、新鮮なバッファAで５回洗浄した。
【０１３５】
24穴培養プレートに、オートクレーブした1.5%アガロースをバッファAに溶解したものをコーティングした。アガロースが凝固した後、そのウエルをバッファA 1mlで満たした。各ウエルに大動脈を1片ずつ浸し、35.5℃／5% CO2の加湿インキュベーターに入れて10日間インキュベートした。バッファAは２日ごとに交換した。その大動脈片を50 mlの円錐管に収集して、新鮮なバッファAで5回洗浄した。
【０１３６】
オートクレーブした1.5%アガロース1 mlをバッファAに溶解したものを、24穴培養プレートの各ウエルに加え、凝固させた。凝固したアガロースからエタノールで滅菌したコルク穿孔器でアガロースウエルを切り出し、12穴培養プレートに入れた。コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社製ラット尾部タイプIコラーゲンと、1N NaOH約0.2mlでpH7に調整した7.5 Xダルベッコ変法イーグル培地2 mlを混合して、コラーゲン溶液を調製した。コラーゲン溶液100 μlをアガロースウエルの基質に加えて、35.5℃／5% CO2の加湿インキュベーターに入れた。0.5nM bFGFおよび所望の濃度のテスト化合物を添加したコラーゲン溶液300mlを加え、大動脈片をコラーゲン上層に浸した。テスト化合物は、最初にストック濃度0.1mMのエタノールに溶解し、次いでバッファA、最後にコラーゲン溶液で希釈して、最終濃度を0.1nM乃至100nMにした。コラーゲンをセットした後、アガロースウエルを0.5nM bFGFおよび所望の濃度のテスト血管新生阻害化合物を添加したバッファA 1.5mlで取り囲んだ。48時間ごとにウエルを取り囲んでいるバッファを交換した。7日後、大動脈輪から飛び出した血管を顕微鏡で計数した。
【０１３７】
本願明細書の図１に記載のこのアッセイの結果は、本願発明の血管新生阻害化合物は優れた（TNP-470の血管新生阻害活性と比較してはるかに優れた）血管新生阻害活性を有することを示している。
【０１３８】
例２８
ヒト血漿における本願発明の血管新生阻害化合物の血漿安定性も、37℃でテストした（血管新生阻害化合物の濃度は20μM）。テスト血管新生阻害化合物を加えていない基質を37℃で3分間平衡化した。このアッセイは、まずテスト化合物を加えることから始め、その反応混合物を振盪するウォーターバスに入れ37℃でインキュベートした。100μLずつを３回、0、60、および120分経過時点に取り除き、氷冷したアセトニトリル200μLと混合して反応を停止させた。この上清を、液体クロマトグラフィ／質量分光法（LC/MS）で４点標準曲線を用いて分析し、回収率（%）を求めた。
【０１３９】
インキュベーション混合物中の親化合物の残量（時間点が0の時と比較して）を時間の関数としてプロットし、観測データを一次の指数方程式にフィットし、テスト用血管新生阻害化合物の消失に関する消失半減期を求めた。結果を表VIに示す。
【０１４０】
【表６】
0004212356.tif 000071
【０１４１】
肝ミクロソーム中の血管新生化合物の安定性もテストした。濃度が3μMのテスト血管新生阻害化合物を、pH7.4の100mMリン酸塩バッファに入れたNADPH再生システム（1 mN NADP、10 mM G6P、1U/mL G6PdH2、3 mM MgCl2）の存在下で、オスラット肝ミクロソームと共に37℃でインキュベートした。インキュベーションは、1mMエポキシドヒドロラーゼ（EH）阻害物質N-シクロヘキシル-N’-(3-フェニルプロピル)尿素の存在下および不在下において行い(M. Morisseau et al.  (1999) PNAS 96:8849-54)、定量解析はLC/MS/MSを用いて行った。
【０１４２】
インキュベーション混合物中の親化合物の残量（時間点が0の時と比較して）を時間の関数でプロットし、観測データを一次指数方程式にフィットして、テスト化合物の消失に関する消失半減期を求めた。結果を表VIIに示す。
【０１４３】
【表７】
0004212356.tif 000072
【０１４４】
例２９
例５に記載の化合物の有効性を、コラーゲン誘導関節炎モデルを用いて評価した。簡単に説明すると、同系の8週齢メスルーバンラットを、第０日にエーテル麻酔して、0.1M酢酸に溶解して不完全フロイントアジュバント（ディフコ社、ミシガン州デトロイト）に乳化したヒヨココラーゲンII（ゲンザイム社、マサチューセッツ州ボストン）0.5mgを皮下注射して免疫した。この方法を用いると、一般に、免疫してから10乃至14日後に、90%を超えるラットの両後脚に滑膜炎が生じる。関節炎の発症が確定したラット（合計47匹）を本研究に繰り入れ、４種類のプロトコルのうちの１つに無作為に割り付けた。例５に記載の化合物をエタノールと蒸留水の混合液に溶解させた。ラットへの投与は免疫後の第１０日から以下のように開始した：（１）対照群：賦形剤のみを毎日静脈注射（iv）で投与、（２）高用量群：例５に記載の化合物30mg/kgを１日おきにivで投与（ラット12匹）、（３）低用量群：例５に記載の化合物15mg/kgを毎日ivで投与（ラット12匹）、（４）経口群：例５に記載の化合物100mg/kgを１日おきに強制経口投与（ラット11匹）。
【０１４５】
各脚の毎日の臨床評価は０から４までの整数スケールで評価し、０点の場合は正常で病変のない脚を示し、４点は重度の関節破壊を示す。臨床点数は４本の脚の合計点数で、最大で16点になりうる。コラーゲン誘導関節炎は一般に後脚にしか発生せず、従って6乃至8点は重度の関節炎である。
【０１４６】
後脚の放射線学的評価は、治療プロトコルを知らされていない試験担当医師が行った。各脚の点数は、（１）軟組織の膨潤度、（２）関節間の空間の狭窄度、（３）骨膜の新しい骨の形成度、（４）びらんまたは強直の存在に基づいて決定した。各脚は１乃至３の点数で評価され、１点は正常脚を示し、３点は重度の関節破壊を示す。したがって各ラットの放射線学的評価の点数は最大で6点（両後脚の合計）になりうる。
【０１４７】
本研究の結果を図２に記載する。図２は臨床関節炎の誘導（第１０日）後から１９日間の、ラットの４群それぞれにおける平均１日臨床点数を示す。この結果は、各治療群とも例５に記載の化合物から有意な治療上の利益（ベネフィット）を受けたことを示している。この観察に一致して、平均放射線学的評価点数は、対照群では2.2点、高用量群では0.6点、低用量群では0.6点、および経口投与群では1.6点だった。したがって、例５に記載の化合物を投与された各群は、対照群と比較して、関節破壊に関しては有意な利益を受けた。
【０１４８】
例３０
例５に記載の化合物を癌細胞株パネルに対しても評価した(Alley, M.C. et al. (1998) Cancer Research 48: 589-601と、 Grever, M.R., et al. (1992) Seminars in Oncology, Vol. 19, No. 6, pp 622-638と、 Boyd, M.R., and Paull, K.D. (1995) Drug Development Research 34: 91-109)。癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞株を、5%ウシ胎仔血清および2mM L-グルタミンを含有するRPMI 1640培地で増殖した。細胞を100μLずつ96穴マイクロタイタープレートに播種した。プレーティング濃度は、各細胞株の倍加時間によって5,000乃至40,000細胞／ウエルの範囲内であった。細胞の播種後、そのマイクロタイタープレートを37℃、5% CO2、95%空気、相対湿度100%で、実験用薬物を添加する前の24時間インキュベートした。
【０１４９】
24時間のインキュベーション時間後、２プレートの各細胞株をTCAとともにin situで固定し、薬物を添加する時点（Tz）における各細胞株の細胞数の測定とした。実験用薬物をジメチルスルホキシドに溶解し、所望の最終最大テスト濃度の400倍の濃度にして、使用前に凍結保存した。薬物を添加する時点において凍結させた濃縮液の一部を解凍し、50mg/mlゲンタマイシンを含有する完全培地で所望の最終最大テスト濃度の２倍まで希釈した。さらに４倍、１０倍または1/2log連続希釈を行い、5種類の薬物濃度と対照を作製した。これら異なる薬物希釈液100μlずつを、すでに100μlの培地を含有する適切なマイクロタイターウエルに添加し、所要の最終薬物濃度を得た。
【０１５０】
薬物の添加後、そのプレートを37℃、5% CO2、95%空気、相対湿度100%で、さらに48時間インキュベートした。接着細胞のために、冷TCAを加えてこのアッセイを停止させた。50%(w/v)の冷TCA50μl（最終濃度、10%TCA）を静かに加えて、細胞をin situで固定し、4℃で60分間インキュベートした。その上静を廃棄し、プレートを水道水で5回洗浄し、空気乾燥させた。0.4%（w/v）のスルホローダミンB（SRB）1%酢酸溶液（100μl）を各ウエルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートした。染色後、結合しなかった色素を、1%酢酸で５回洗浄して除去し、このプレートを空気乾燥させた。次に、結合した色素を10mMトリズマベース（trizma base）で溶解し、自動化プレートリーダーで波長515 nmの吸光度を測定した。細胞を懸濁させるために用いた方法は同一であるが、アッセイを終了するには50mlの80% TCA（最終濃度は16% TCA）を静かに加え、定着した細胞をウエルの底に固定した。７つの吸光度測定値（ゼロ時点（Tz）、対照の増殖（C）、および5種類の濃度の薬物が存在する場合のテスト増殖）を用いて、増殖率（%）を各薬物濃度において計算した。
【０１５１】
成長阻害率は、
濃度がTi>/=Tzの場合  [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100
濃度がTi<Tzの場合  [(Ti-Tz)/Tz] x 100
で計算した。
【０１５２】
50%増殖阻害（GI50）は[(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 = 50で計算した。これは、薬物インキュベーションの間に対照細胞中の純タンパク増加量（SRB染色によって測定）が50%減少する薬物濃度である。各細胞株のGI50は、活性レベルに到達する場合に計算した。しかし、その効果に達していなかったり超過している場合には、そのパラメタについての値は最大（10-4M）または最小濃度（10-8M）よりも大きいまたは小さいと表現する。
【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
表VIIIに示した細胞株スクリーニングの結果は、例５に記載の化合物が多様な腫瘍細胞株に有意な阻害作用を与えることを示している。また、この結果から、特定の細胞株が他のものよりも例５に記載の化合物に対して感受性がはるかに高いことが明らかであり、この化合物には特定の細胞株に対して選択性があることを示唆している。
【０１５５】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施例の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、上述の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【図１】    本願発明の血管新生阻害化合物が血管新生を阻害する能力をテストするために用いたラット大動脈輪アッセイ（RARA）の結果を示すグラフである。
【図２】  臨床関節炎を導入後19日間テストしたラット４群のそれぞれにおける平均1日臨床点数を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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