(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料に含まれる分析対象物の定性、あるいは定量分析時に使用する免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定するものであって、
上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、
標識物それ自体が、分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持っていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項２】
全血試料に含まれる分析対象物の定性、あるいは定量分析時に使用する免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定するものであって、
上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、
反応終了後の標識物が、分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持っていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記全血試料に含まれる細胞成分を破壊する物質を保持する領域を有することを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項４】
請求項３に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
細胞成分を破壊する物質が、無機物、界面活性剤、あるいはサポニン類を含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記無機物が、塩化物を含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項６】
請求項４に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記界面活性剤が、非極性界面活性剤を含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析することを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記標識物が、金属ゾル、酸化金属粒子、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、あるいは酵素から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、
上記分析対象物が血漿蛋白質、細菌、ウイルスの少なくとも一つを含むことを特徴とする免疫クロマトグラフィー試験片。
【請求項１０】
免疫クロマトグラフィー試験片を用いたクロマトグラフ分析方法において、
上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を測定するものであって、
上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、
上記免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む全血試料を添加し、
上記試験片上の反応領域における呈色度合を、５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定する、
ことを特徴とし、
標識物それ自体が、上記分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持つことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１１】
免疫クロマトグラフィー試験片を用いたクロマトグラフ分析方法において、
上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を測定するものであって、
上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、
上記免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む全血試料を添加し、
上記試験片上の反応領域における呈色度合を、５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定する、
ことを特徴とし、
反応終了後の標識物が、上記分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持つことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載のクロマトグラフ分析方法において、
上記免疫クロマトグラフィー試験片は、全血試料中の細胞成分を破壊する物質が保持された領域を含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のクロマトグラフ分析方法において、
細胞成分を破壊する物質が、無機物、界面活性剤、あるいはサポニン類を含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のクロマトグラフ分析方法において、
上記無機物が、塩化物を含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載のクロマトグラフ分析方法において、
上記界面活性剤が、非極性界面活性剤を含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１６】
請求項１０ないし請求項１５のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、
分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析することを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１７】
請求項１０ないし請求項１６のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、
上記標識物が、金属ゾル、酸化金属粒子、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、あるいは酵素から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【請求項１８】
請求項１０ないし請求項１７のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、
上記分析対象物が血漿蛋白質、細菌、ウイルスの少なくとも一つを含むことを特徴とするクロマトグラフ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原抗体反応を利用して、液体試料を定性あるいは定量分析するための免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法に関し、特に、血液などの有色試料を前処理することなく分析可能なものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、水質検査や尿検査などの液体試料の化学試験もしくは臨床試験を実施する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫クロマトグラフィーによる測定方法が汎用されている。一般にクロマトグラフィーとは、混合物をその構成成分に応じて分離し、同定する方法をいう。クロマトグラフィー試験片は、液体試料を添加する部分と、液体試料の浸透により移動可能であり、かつ、流れてきた液体試料に含まれる分析対象物に対し特異的に結合する物質を備えた標識試薬が保持された部分と、標識試薬と分析対象物との結合反応が行われる部分と、流れてきた試料を吸収する部分とを備える。クロマトグラフィー試験片に液体試料を添加し、放置しておくことにより、一定時間後に発色または変色をともなう呈色反応が起こり、目視的な検出様式によって定性的な判定を行うことができる。
【０００３】
免疫クロマトグラフ分析方法は、抗原抗体反応の特異性を利用して、抗原または抗体を同定し、検出するものである。免疫クロマトグラフィー試験片は、上述の一般のクロマトグラフィー試験片に対し、さらに、液体試料に含まれる分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こす抗体あるいは抗原の固定化された部分を備えたものである。免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む液体試料を添加すると、液体試料により標識試薬が溶解して、浸透方向に展開し、抗体あるいは抗原の固定化された測定領域に所定の呈色が生じる。したがって、測定領域の呈色の有無により、液体試料中に特定の分析対象物が含まれていたか否かを判断することができる。この分析結果は、呈色反応によって判定されるため、目視的な検出様式によって記録される。このように、免疫クロマトグラフ分析方法は、分析結果の判定が非常に容易であり、さまざまな分析対象物の分析に利用することができる。
【０００４】
一般に、免疫クロマトグラフィーによる分析は定性的なものであるが、定量的な分析方法も開発されている。特開平８−２４０５９１号公報には、免疫クロマトグラフィー試験片に試料を添加し、反応が行われた後に、検出計器を用いて試験片上の呈色部分の吸収や反射などの信号を測定することにより、呈色度合を定量化する方法が開示されている。また、特開平８−３３４５１１号公報には、呈色した免疫クロマトグラフィー試験片を、イメージセンサを用いて撮像し、画像変換された階調画像を解析処理することにより、呈色度合を定量的に測定する方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
一般的な免疫クロマトグラフィー試験片には、液体試料の浸透速度を機械的にコントロールする手段がなく、人為的に浸透速度を制御することができないために、上記浸透速度は試験片の浸透性に左右される。この試験片を用いて血液のような細胞成分を含む液体試料を分析する場合、液体試料の粘性や、細胞成分の存在が、反応層担体に目詰まりを生じて液体試料の浸透を妨げ、その結果、測定時間が大幅に長くなり、この間に液体試料の乾燥等が発生して反応の正確性や定量性能を欠くことになるという問題があった。
【０００６】
また、目視あるいは検出計器を用いて呈色度合を測定する免疫クロマトグラフ分析方法には、有色試料に含まれる色素、例えば血液成分の持つ血色素（赤色）が、抗原抗体反応によって生じた呈色反応の読み取りを妨げ、定量測定時の感度の低下と、測定誤差とを生じるという問題があった。
【０００７】
上記の問題点を解決するために、従来は、有色試料、特に全血の場合には、予め該試料に含まれる色素、すなわち血色素を含む血球成分を取り除く、遠心分離等の前処理が必要とされてきた。しかし、そのような前処理を行うことは、免疫クロマトグラフ分析方法を煩雑なものとし、また、コストの上昇と作業性の低下とを招くものであった。
【０００８】
本発明は、かかる問題点に鑑みてなされたものであり、細胞成分等により、液体試料の試験片への浸透が妨げられることを防止し、また、試料に含まれる有色成分、特に血色素に由来するバックグラウンドの影響を受けずに抗原抗体反応の結果である呈色度合を定量的に読み取り、さらに、添加する液体試料、特に血液に対する遠心分離等の前処理を必要としない、免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、請求項１にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、全血試料に含まれる分析対象物の定性、あるいは定量分析時に使用する免疫クロマトグラフィー試験片において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、標識物それ自体が、分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持っているものである。
【００１０】
また、請求項２にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、全血試料に含まれる分析対象物の定性、あるいは定量分析時に使用する免疫クロマトグラフィー試験片において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、反応終了後の標識物が、分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持っているものである。
【００１２】
また、請求項３にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項１または請求項２に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記全血試料に含まれる細胞成分を破壊する物質を保持する領域を有するものである。
【００１３】
また、請求項４にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項３に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、細胞成分を破壊する物質が、無機物、界面活性剤、あるいはサポニン類を含むものである。
【００１４】
また、請求項５にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項４に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記無機物が、塩化物を含むものである。
【００１５】
また、請求項６にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項４に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記界面活性剤が、非極性界面活性剤を含むものである。
【００１６】
また、請求項７にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項１ないし請求項６のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析するものである。
【００１７】
また、請求項８にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項１ないし請求項７のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記標識物が、金属ゾル、酸化金属粒子、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、あるいは酵素から選択される少なくとも一つを含むものである。
【００１８】
また、請求項９にかかる免疫クロマトグラフィー試験片は、請求項１ないし請求項８のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記分析対象物が血漿蛋白質、細菌、ウイルスの少なくとも一つを含むものである。
【００１９】
また、請求項１０にかかるクロマトグラフ分析方法は、免疫クロマトグラフィー試験片を用いたクロマトグラフ分析方法において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、上記免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む全血試料を添加し、上記試験片上の反応領域における呈色度合を、５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長おいて測定する、ことを特徴とし、標識物それ自体が、上記分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持つものである。
【００２０】
また、請求項１１にかかるクロマトグラフ分析方法は、免疫クロマトグラフィー試験片を用いたクロマトグラフ分析方法において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、上記免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む全血試料を添加し、上記試験片上の反応領域における呈色度合を、５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定する、ことを特徴とし、反応終了後の標識物が、上記分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持つものである。
【００２２】
また、請求項１２にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１０または請求項１１に記載のクロマトグラフ分析方法において、上記免疫クロマトグラフィー試験片は、全血試料中の細胞成分を破壊する物質が保持された領域を含むものである。
【００２３】
また、請求項１３にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１２に記載のクロマトグラフ分析方法において、細胞成分を破壊する物質が、無機物、界面活性剤、あるいはサポニン類を含むものである。
【００２４】
また、請求項１４にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１３に記載のクロマトグラフ分析方法において、上記無機物が、塩化物を含むものである。
【００２５】
また、請求項１５にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１３に記載のクロマトグラフ分析方法において、上記界面活性剤が、非極性界面活性剤を含むものである。
【００２６】
また、請求項１６にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１０ないし請求１５のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析するものである。
【００２７】
また、請求項１７にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１０ないし請求項１６のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、上記標識物が、金属ゾル、酸化金属粒子、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、あるいは酵素から選択される少なくとも一つを含むものである。
【００２８】
また、請求項１８にかかるクロマトグラフ分析方法は、請求項１０ないし請求項１７のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、上記分析対象物が血漿蛋白質、細菌、ウイルスの少なくとも一つを含むものである。
【００２９】
【発明の実施の形態】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１による免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法について、図面を参照しながら説明する。
図１は、本実施の形態１による免疫クロマトグラフィー試験片１０を示す図である。
図１において、免疫クロマトグラフィー試験片１０は、反応層担体支持体１と、試料添加部２と、標識物保持部位３と、反応層４と、特異的タンパク固定化部５と、吸水部６とを備える。
【００３０】
反応層担体支持体１は、液体不透過性のプラスチックなどからなり、クロマトグラフィー材料を支持する。試料添加部２は、吸収性の大きい不織布などからなり、液体試料が添加あるいは塗布される。標識物保持部位３は、不織布などに溶解可能なように標識試薬を保持する。反応層４は、ニトロセルロースなどからなる。特異的タンパク固定化部５は、反応層４の領域上に、反応形式にあわせて、抗体あるいは抗原のような分析対象物に対して特異的に結合反応する特異的タンパク質を固定化する。吸水部６は、液体試料を最終的に吸収する。以上、試料添加部２、標識物保持部位３、反応層４、特異的タンパク固定化部５、及び吸水部６は、反応層担体支持体１の上部に形成されている。標識試薬、及び特異的タンパク質は、分析する試料、及び分析対象物に合わせて適切なものを選択する必要がある。
【００３１】
なお、標識物が産生する物質とは、例えば標識物が特異的タンパク固定化部５に産生する発光が可能な物質であり、反応終了後の標識物とは、例えば呈色反応により呈色した後の標識物であり、標識物による反応物とは、例えば標識物が酵素である場合に、その標識物が固定化された特異的タンパク固定化部５に基質を加えることなどにより呈色した後の物質である。その標識物保持部位３に保持される標識試薬としては、染料ゾル、水溶性色素、金コロイドなどの金属ゾル、セレニウムや炭素などの非金属ゾル、フェライトなどの酸化金属粒子、ラテックスなどの着色粒子、あるいは、酵素などを含む、分析対象物と特異的に結合する物質との複合体を用いる。
【００３２】
また、図１の免疫クロマトグラフィー試験片１０の構造は一例であり、クロマトグラフィーを行う構造であればいかなる構造をとってもよく、使用する部材も任意の担体や試薬によって構成されていてもよい。
また、免疫クロマトグラフィー試験片１０としては、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料からなる試験片が用いられる。
【００３３】
次に、本実施の形態１による免疫クロマトグラフィー試験片１０、及びクロマトグラフ分析方法について説明する。
図１において、液体試料が試料添加部２に添加されると、試料添加部２に浸透し、標識物保持部位３に達する。次に、標識物保持部位３の領域に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、液体試料とともに反応層４に浸透する。反応層４の領域上には、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク固定化部５がある。液体試料が分析対象物を含む場合は、特異的タンパク質が分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こし、特異的タンパク固定化部５の領域に何らかの呈色反応が見られる。液体試料が分析対象物を含まない場合は、抗原抗体反応は起こらず、呈色反応も見られない。最終的に、液体試料は吸水部６に吸収され、反応は終了する。
【００３４】
上記反応終了後に、任意の検出計器を用いて、呈色領域における標識物からの信号を測定する。試料が全血の場合は、例えば５８０ｎｍ以上の任意の波長において測定することが好ましい。これにより、呈色の有無と、呈色度合との定性的、あるいは定量的分析を行なうことができる。上記分析により、液体試料が分析対象物を含むか否かを検知することができ、また、含む場合にはその分量を測定することができる。なお、上述の「標識物からの信号」とは、具体的には、それ自体着色物である標識物の色、ＵＶの照射あるいは電圧の印加等による発光、あるいは呈色反応による呈色などを意味する。
【００３５】
また、呈色領域における標識物からの信号の測定においては、任意の一波長で吸光度あるいは吸光度分布の積分値を測定する場合の他、任意の幅を持った波長領域で吸光度を測定してもよく、その場合には吸光度を特定の波長領域で積分し、定量分析することも可能である。
【００３６】
以上のように、本実施の形態１による免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法によれば、免疫クロマトグラフィー試験片１０上の呈色領域における標識物からの信号を、例えば５８０ｎｍ以上の任意の波長で測定することにより、有色成分、特に血液中の血色素を含む試料の分析において、血液の吸収波長である２００〜５８０ｎｍ以外の波長で呈色度合を測定することになる。したがって、液体試料に含まれる有色成分、特に血色素によるバックグラウンドの影響を受けない呈色度合の定性的、あるいは定量的測定を行うことが可能となり、測定誤差を低減でき、より高感度で、より高性能な免疫クロマトグラフィーによる定性、あるいは定量分析を実現できる効果がある。また、使用する標識試薬によっては、有色試料の目視によるクロマトグラフ定性分析も可能となる。
【００３７】
なお、本実施の形態１では、測定形式が標識物複合体と分析対象物との結合反応と、この反応体と固定化物との結合反応からなるサンドイッチ反応を例に説明したが、分析対象物と標識物複合体が競争的に固定化物と反応する競合反応でも測定が可能である。
【００３８】
また、本実施の形態１では、試料が全血の場合には、標識物からの信号を５８０ｎｍ以上の任意の波長で測定するとしたが、好ましくは、５８０ｎｍから７００ｎｍの間の任意の波長にて測定を行なう。
【００３９】
また、本実施の形態１のクロマトグラフ分析方法では、免疫クロマトグラフィー試験片１０の呈色度合を測定する検出計器として、例えば、反射型分光光度計を用いることも可能であり、本実施の形態１と同様の効果に加え、反応層４を支持する反応層担体支持体１として不透明な材料を使用することが可能となるため、材料選択の幅が広がり、さらに、反応層４の裏面状態を気にすることなく測定することが可能となる効果がある。
【００４０】
また、本実施の形態１のクロマトグラフ分析方法では、免疫クロマトグラフィー試験片１０の呈色度合を測定する検出計器として、例えば、透過型分光光度計を用いることも可能であり、本実施の形態１と同様の効果に加え、反応層４の深部の呈色度合をも測定することが可能となるため、より高感度で、より高性能な定性、あるいは定量分析が可能となる効果がある。また、標識試薬として、低濃度のものを用いることが可能となる。
【００４１】
また、本実施の形態１では、有色成分を含む試料として、特に血液を用いたが、これは一例であって、血液以外の有色成分を含む試料も分析可能である。例えば、尿、便潜血、食品の破砕液などが挙げられる。この場合、分析する試料、及び分析対象物に合わせて、標識試薬、及び特異的タンパク質を選択する必要がある。すなわち、呈色反応に特異的な波長での吸収係数が、試料の同じ波長での吸収係数より、十分に高いものである必要がある。また、検出計器による呈色度合の測定においては、呈色反応に特異的な波長で測定すればよい。なお、上述の「特異的な波長」とは、有色試料が持つ最大波長領域を除く、任意の一波長、もしくは、任意の幅を持った広範な波長領域を意味する。また、上述の「十分に高い」とは、呈色反応による標識物からの信号が、定性、あるいは定量分析に対して信頼できる結果が得られる程度に高いことを意味する。
【００４２】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２による免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法について、図面を参照しながら説明する。
図２は、本実施の形態２による免疫クロマトグラフィー試験片１０を示す図である。
図２において、免疫クロマトグラフィー試験片１０は、反応層担体支持体１と、試料添加部２と、標識物保持部位３と、反応層４と、特異的タンパク固定化部５と、吸水部６と、細胞成分破壊物質保持部位７とを備える。
【００４３】
反応層担体支持体１は、液体不透過性のプラスチックなどからなり、クロマトグラフィー材料を支持する。試料添加部２は、吸収性の大きい不織布などからなり、液体試料が添加あるいは塗布される。標識物保持部位３は、不織布などに溶解可能なように標識試薬を保持する。反応層４は、ニトロセルロースなどからなる。特異的タンパク固定化部５は、反応層４の領域上に、反応形式にあわせて、抗体あるいは抗原のような分析対象物に対して特異的に結合反応する特異的タンパク質を固定化する。吸水部６は、液体試料を最終的に吸収する。細胞成分破壊物質保持部位７は、細胞成分を破壊する物質を保持する。以上、試料添加部２、標識物保持部位３、反応層４、特異的タンパク固定化部５、吸水部６、及び細胞成分破壊物質保持部位７は、反応層担体支持体１の上部に形成されている。標識試薬、及び特異的タンパク質、及び細胞成分破壊物質は、分析する試料、及び分析対象物に合わせて適切なものを選択する必要がある。
【００４４】
なお、標識物が産生する物質とは、例えば標識物が特異的タンパク固定化部５に産生する発光が可能な物質であり、反応終了後の標識物とは、例えば呈色反応により呈色した後の標識物であり、標識物による反応物とは、例えば標識物が酵素である場合に、その標識物が固定化された特異的タンパク固定化部５に基質を加えることなどにより呈色した後の物質である。その標識物保持部位３に保持される標識試薬としては、染料ゾル、水溶性色素、金コロイドなどの金属ゾル、セレニウムや炭素などの非金属ゾル、フェライトなどの酸化金属粒子、ラテックスなどの着色粒子、あるいは、酵素などを含む、分析対象物と特異的に結合する物質との複合体を用いる。
【００４５】
また、細胞成分破壊物質保持部位７に保持される細胞成分破壊物質としては、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムなどの塩化物、トライトン系あるいはツイーン系などの非極性界面活性剤、極性界面活性剤、あるいはサポニン類などを使用する。
【００４６】
また、図２の免疫クロマトグラフィー試験片１０の構造は一例であり、細胞成分破壊物質保持部位７を含んだ、クロマトグラフィーを行う構造であればいかなる構造をとってもよく、使用する部材も任意の担体や試薬によって構成されていてもよい。
【００４７】
また、免疫クロマトグラフィー試験片１０としては、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料からなる試験片が用いられる。
【００４８】
次に、本実施の形態２による免疫クロマトグラフィー試験片１０、及びクロマトグラフ分析方法について説明する。
図２において、液体試料が試料添加部２に添加されると、試料添加部２に浸透して細胞成分破壊物質保持部位７の領域に達し、この領域に含まれる細胞成分破壊物質の作用により、液体試料中の細胞成分が破壊される。この細胞成分の破壊された液体試料が、標識物保持部位３に達する。次に、標識物保持部位３の領域に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、液体試料とともに反応層４に浸透する。反応層４の領域上には、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク固定化部５がある。液体試料が分析対象物を含む場合は、特異的タンパク質が分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こし、特異的タンパク固定化部５の領域に何らかの呈色反応が見られる。液体試料が分析対象物を含まない場合は、抗原抗体反応は起こらず、呈色反応も見られない。最終的に、液体試料は吸水部６に吸収され、反応は終了する。
【００４９】
上記反応終了後に、任意の検出計器を用いて、呈色領域における標識物からの信号を測定する。試料が全血の場合は、例えば５８０ｎｍ以上の任意の波長において測定することが好ましい。これにより、呈色の有無と、呈色度合との定性的、あるいは定量的分析を行なうことができる。上記分析により、液体試料が分析対象物を含むか否かを検知することができ、また、含む場合にはその分量を測定することができる。なお、上述の「標識物からの信号」とは、具体的には、それ自体着色物である標識物の色、ＵＶの照射あるいは電圧の印加等による発光、あるいは呈色反応による呈色などを意味する。
【００５０】
また、呈色領域における標識物からの信号の測定においては、任意の一波長で吸光度あるいは吸光度分布の積分値を測定する場合の他、任意の幅を持った波長領域で吸光度を測定してもよく、その場合には吸光度を特定の波長領域で積分し、定量分析することも可能である。
【００５１】
以上のように、本実施の形態２による免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法によれば、免疫クロマトグラフィー試験片１０上の呈色領域における標識物からの信号を、例えば５８０ｎｍ以上の任意の波長で測定することにより、有色成分、特に血液中の血色素を含む試料の分析において、血液の吸収波長である２００〜５８０ｎｍ以外の波長で呈色度合を測定することになる。したがって、液体試料に含まれる有色成分、特に血色素によるバックグラウンドの影響を受けない呈色度合の定性的、あるいは定量的測定を行うことが可能となり、測定誤差を低減でき、より高感度で、より高性能な免疫クロマトグラフィーによる定性、あるいは定量分析を実現できる効果がある。
【００５２】
また、細胞成分を破壊する物質を保持する部分を設けたことで、細胞成分を含む液体試料の分析時に、細胞成分が破壊され反応層４上の浸透がスムーズになり、測定時間が短縮され、より正確に定量分析できる効果がある。さらに、血液など、細胞成分を有する試料に対する遠心分離等の前処理が不要になるため、コストの低下と作業性の向上を実現できる効果もある。
また、使用する標識試薬によっては、有色試料の目視によるクロマトグラフ定性分析も可能となる。
【００５３】
なお、本実施の形態２では、測定形式が標識物複合体と分析対象物との結合反応と、この反応体と固定化物との結合反応からなるサンドイッチ反応を例に説明したが、分析対象物と標識物複合体が競争的に固定化物と反応する競合反応でも測定が可能である。
【００５４】
また、本実施の形態２では、試料が全血の場合には、標識物からの信号を５８０ｎｍ以上の任意の波長で測定するとしたが、好ましくは、５８０ｎｍから７００ｎｍの間の任意の波長にて測定を行なう。
【００５５】
また、本実施の形態２のクロマトグラフ分析方法では、免疫クロマトグラフィー試験片１０の呈色度合を測定する検出計器として、例えば、反射型分光光度計を用いることも可能であり、本実施の形態２と同様の効果に加え、反応層４を支持する反応層担体支持体１として不透明な材料を使用することが可能となるため、材料選択の幅が広がり、さらに、反応層４の裏面状態を気にすることなく測定することが可能となる効果がある。
【００５６】
また、本実施の形態２のクロマトグラフ分析方法では、免疫クロマトグラフィー試験片１０の呈色度合を測定する検出計器として、例えば、透過型分光光度計を用いることも可能であり、本実施の形態２と同様の効果に加え、反応層４の深部の呈色度合をも測定することが可能となるため、より高感度で、より高性能な定性、あるいは定量分析が可能となる効果がある。また、標識試薬として、低濃度のものを用いることが可能となる。
【００５７】
また、本実施の形態２では、有色成分、及び細胞成分を含む試料として、特に血液を用いたが、これは一例であって、血液以外の有色成分、及び細胞成分を含む試料も分析可能である。例えば、体液、細菌を含む液体、食品の破砕液などが挙げられる。この場合、分析する試料、及び分析対象物に合わせて、標識試薬、及び抗体を選択する必要がある。すなわち、呈色反応に特異的な波長での吸収係数が、試料の同じ波長での吸収係数より、十分に高いものである必要がある。また、検出計器による呈色度合の測定においては、呈色反応に特異的な波長で測定すればよい。なお、上述の「特異的な波長」とは、有色試料が持つ最大波長領域を除く、任意の一波長、もしくは、任意の幅を持った広範な波長領域を意味する。また、上述の「十分に高い」とは、呈色反応による標識物からの信号が、定性、あるいは定量分析に対して信頼できる結果が得られる程度に高いことを意味する。
【００５８】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。
（血液中ｈＣＧの定量）
ニトロセルロース膜中に抗ｈＣＧ−β抗体固定化ライン、及び抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体の広いバンドを含む免疫クロマトグラフィー試験片を製造した。この試験片を図２に示す。図中、試験片は、抗体固定化部５と、それよりも前にある抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体が含有された領域である標識物保持部位３と、試料添加部２とを含む。これらの試験片は、次のようにして製造した。
【００５９】
実施例１．
クロマトグラフィー試験片の調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ｈＣＧ−β抗体溶液を準備した。この抗体溶液を溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化ラインが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にてさらに１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行なった。２度洗浄を行った後に、膜を洗浄液から取り出して、室温で乾燥させた。
【００６０】
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を加えることによって調製した。還流を３０分間続けた後に、冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ｈＣＧ−α抗体を加えて数分間攪拌した後に、１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液ｐＨ９を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調製して、４℃で貯蔵した。
【００６１】
前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、抗ｈＣＧ−β抗体固定化乾燥膜上の抗体固定化位置から離れた位置に塗布した後に、膜を乾燥させた。これによって、固定化膜上に標識抗体保持部位が得られた。
【００６２】
こうして調製された標識抗体保持部位を含む抗体固定化膜を、反応層担体支持体上に貼付け、溶血剤として界面活性剤を含浸した後に乾燥させた不織布を試料添加部として、ガラス繊維ろ紙を吸水部として、付け加えてから０．５ｃｍ幅の細片に切断して、試験片を作製した。
【００６３】
実施例２．
試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液をヘマトクリット値４５％になるように調製した。この血液に既知濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度のｈＣＧ溶液を調製した。
【００６４】
実施例３．
吸光度を測定する波長の検討
試験片上の試料添加部にｈＣＧを含む血液を２００μｌ以上添加して、吸水部方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせて抗体固定化部における呈色反応を行った。この試験片への試料添加から５分後の呈色状況を反射型分光光度計（ＣＳ９３００；島津製作所製）を用いて計測して、呈色度を演算処理した。
【００６５】
０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｌのｈＣＧを含有する血液（ヘマトクリット値４５％）を試験片に添加して展開処理した。各ｈＣＧ濃度の血液に対する試験片上の抗体固定化部の呈色状況を反射型分光光度計で測定した。５２０ｎｍと６１０ｎｍの波長における吸光度を計測して、予め作成しておいたｈＣＧ濃度と吸光度との関係を示す検量線に代入した。その結果を図３に示す。本来、例えば１０００Ｕ／ｌのｈＣＧを含有する血液の吸光度を計測し、その吸光度を検量線に代入すると、ｈＣＧ濃度は１０００Ｕ／ｌとなるはずであるが、実際には、少しずれる。そのずれの大きさにより、その測定の正確さを知ることができる。
【００６６】
図３は、クロマトグラフィー定量測定における吸光度を、５２０ｎｍの波長で測定した場合（ａ）と、６１０ｎｍの波長で測定した場合（ｂ）との定量性能を示す図である。横軸は、試験片に添加した試料のｈＣＧ濃度を表す。縦軸は、試験片上の呈色領域における標識物からの信号を検量線に代入して求めた抗原濃度の換算値を表す。
【００６７】
以下、クロマトグラフィー定量測定において、５８０ｎｍ以下の波長で測定した場合と、５８０ｎｍ以上の波長で測定した場合について、その効果を説明する。
図３において、免疫クロマトグラフィー試験片に液体試料を添加し、５分後の呈色度合の測定値をもとに、分析対象物の濃度を換算した結果を表している。この際に使用した標識試薬は、（ａ）、（ｂ）共に同じ抗体−金コロイド複合体を使用している。まず、６１０ｎｍで測定した場合（図３（ｂ））は、ＣＶ値（変動係数）が０〜１５％であるのに対して、５２０ｎｍで測定した場合（図３（ａ））は、血球色素の影響を受け、ＣＶ値が３５〜４５％と、大きなばらつきを示し、定量性能が悪いことがわかる。
【００６８】
本実施例では、金コロイドを標識物として用いて結果を説明したが、金コロイドは５８０ｎｍ以上の波長での吸収を持つ粒径が好ましい。また、それ以外の標識物では、着色粒子や水溶性色素であれば、着色された色素の最大吸収波長、例えば、青色粒子または青色色素であれば６５０ｎｍ周辺の波長で、カーボンブラックであれば、５８０ｎｍ以上の任意の波長で測定を行なうことが望ましく、測定波長はその反応呈色物の持つ吸収波長に由来する。
【００６９】
【発明の効果】
請求項１または請求項２、請求項８、及び請求項９の免疫クロマトグラフィー試験片によれば、全血試料に含まれる分析対象物の定性、あるいは定量分析時に使用する免疫クロマトグラフィー試験片において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、標識物それ自体、あるいは反応終了後の標識物が、分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持っているものとしたことで、有色成分を含む全血試料の分析において、上記有色成分によるバックグラウンドの影響を受けない呈色度合の定性、あるいは定量分析が可能となり、高感度で、高性能なクロマトグラフ分析を実現できる効果がある。
【００７０】
請求項３ないし請求項６の免疫クロマトグラフィー試験片によれば、請求項１または請求項２に記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、上記全血試料に含まれる細胞成分を破壊する物質を保持する領域を有するものとしたことで、上記請求項１または請求項２の効果に加え、細胞成分を含む全血試料の分析時に、上記細胞成分が破壊されて、上記全血試料の試験片への浸透がスムーズになり、測定時間が短縮され、より正確に定量分析できる効果がある。また、細胞成分を有する全血試料に対する遠心分離等の前処理が不要になるため、コストの低下と作業性の向上を実現できる効果もある。
【００７１】
請求項７の免疫クロマトグラフィー試験片によれば、請求項１ないし請求項６のいずれか一つに記載の免疫クロマトグラフィー試験片において、分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析するものとしたことで、上記請求項１ないし請求項６の効果に加え、反射型分光光度計を用いた場合には、反応層を支持する支持体として不透明な材料を使用することができ、さらに、反応層の裏面状態を気にすることなく測定を行なうことが可能となり、また、透過型分光光度計を用いた場合には、反応層の深部の呈色度合をも測定することが可能となり、高感度で、高性能な定性、あるいは定量分析が可能となる効果がある。
【００７２】
請求項１０または請求項１１、請求項１７、及び請求項１８のクロマトグラフ分析方法によれば、免疫クロマトグラフィー試験片を用いたクロマトグラフ分析方法において、上記クロマトグラフィー試験片は、反応領域における呈色反応によって生じた標識物からの信号を測定するものであって、上記標識物からなる標識試薬は、上記クロマトグラフィー試験片上に溶解可能なように保持されており、上記免疫クロマトグラフィー試験片に分析対象物を含む全血試料を添加し、上記試験片上の呈色度合を、５８０ｎｍから７００ｎｍの任意の波長において測定する、ことを特徴とし、標識物それ自体が、あるいは反応終了後の標識物が、上記分析対象物を含む全血試料の吸収波長と異なる吸収波長を有する、あるいは同じ吸収波長であっても全血試料の吸収係数よりも十分に高い吸収係数を有する、波長領域を持つものとしたことで、有色成分を含む全血試料の分析において、上記有色成分によるバックグラウンドの影響を受けない呈色度合の定性、あるいは定量分析が可能となり、高感度で、高性能なクロマトグラフ分析を実現できる効果がある。
【００７３】
請求項１２ないし請求項１５のクロマトグラフ分析方法によれば、請求項１０または請求項１１に記載のクロマトグラフ分析方法において、上記免疫クロマトグラフィー試験片は、全血試料中の細胞成分を破壊する物質が保持された領域を含むものとしたことで、上記請求項１０または請求項１１の効果に加え、細胞成分を含む全血試料の分析時に、上記細胞成分が破壊されて、上記全血試料の試験片への浸透がスムーズになり、測定時間が短縮され、より正確に定量分析できる効果がある。また、細胞成分を有する全血試料に対する遠心分離等の前処理が不要になるため、コストの低下と作業性の向上を実現できる効果もある。
【００７４】
請求項１６のクロマトグラフ分析方法によれば、請求項１０ないし請求項１５のいずれか一つに記載のクロマトグラフ分析方法において、分光光度計により、呈色度合を定性、あるいは定量分析するものとしたことで、上記請求項１０ないし請求項１５の効果に加え、反射型分光光度計を用いた場合には、反応層を支持する支持体として不透明な材料を使用することができ、さらに、反応層の裏面状態を気にすることなく測定を行なうことが可能となり、また、透過型分光光度計を用いた場合には、反応層の深部の呈色度合をも測定することが可能となり、高感度で、高性能な定性、あるいは定量分析が可能となる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１による免疫クロマトグラフィー試験片を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態２による免疫クロマトグラフィー試験片を示す図である。
【図３】本発明の実施例による呈色領域を５２０ｎｍの波長で測定した場合（ａ）と、６１０ｎｍの波長で測定した場合（ｂ）との定量性能を示す図である。
【符号の説明】
１  反応層担体支持体
２  試料添加部
３  標識物保持部位
４  反応層
５  特異的タンパク固定化部
６  吸水部
７  細胞成分破壊物質保持部位
１０  免疫クロマトグラフィー試験片
【図１】
0004223163.tif 000002
【図２】
0004223163.tif 000003
【図３】
0004223163.tif 000004