(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
【請求項２】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
【請求項３】
配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドまたはその塩。
【請求項４】
請求の範囲１から３のいずれか記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１に示す塩基配列の第１１７番目から第５２６７番目を有する請求の範囲４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３に示す塩基配列の第６６番目から第５１８９番目を有する請求の範囲４記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列の第１１７番目から５２６７番目または配列番号３に示す塩基配列の第６６番目から第５１８９番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲４から７のいずれか記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項９】
請求の範囲８記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項１０】
宿主が動物細胞株または大腸菌株である請求の範囲９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲９または１０に記載の形質転換体を培養する工程、および生産された組換えポリペプチドを培養培地から回収する工程を包含する、請求の範囲１から３いずれか記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲１から３のいずれか記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１３】
請求の範囲１から３のいずれか記載のポリペプチドを含有する細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
請求の範囲１から３のいずれか記載のポリペプチドを含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１５】
請求の範囲１から３のいずれか記載のポリペプチドを用いた、請求項１から３いずれか記載のポリペプチドの活性を特異的に調節する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、配列番号１記載のヒトまたは配列番号２記載のマウスグアニンヌクレオチド交換因子様配列を有するポリペプチド；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；本発明の発現ベクターを有する形質転換体；本発明の形質転換体を用いた製造方法；本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体；本発明のポリペプチドを含有する疾患治療剤；本発明のポリペプチドを用いた化合物のスクリーニング方法；本発明のスクリーニング方法により得られた化合物などに関する。
背景技術
グアニンヌクレオチド交換因子とはＧＴＰ結合タンパク質に結合しているＧＤＰ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をＧＴＰ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と交換し、ＧＴＰ結合タンパク質の活性化反応を促進するタンパク質の総称である。グアニンヌクレオチド交換因子が基質とするＧＴＰ結合タンパク質はＧＴＰおよびＧＤＰと特異的に結合し、結合したＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性を有するタンパク質の総称で、（１）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳因子、（２）Ｇタンパク質、（３）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および（４）微小管の構成成分チューブリンなどに分類される。例えば、Ｇタンパク質はＧタンパク質共役型レセプターと共役しており、それらの受容体の多くはＧＴＰ結合タンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行っている。Ｇ蛋白質共役型レセプターは生体中の各種細胞や臓器に存在し、それらの機能を調節するホルモンや生理活性物質等のレセプターとして生理的に重要な役割を担っており、生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルの伝達を受け細胞の機能の調節を行っている。Ｇタンパク質共役型レセプターは細胞膜上に存在し、ホルモンや神経伝達物質などが結合して細胞内にその情報を伝達する時に関与する。低分子量ＧＴＰタンパク質はＲａｓおよびＲｈｏタンパク質をはじめとするガン遺伝子産物で、細胞の増殖・分化やタンパク質の細胞内輸送・分泌に関与していることから、グアニンヌクレオチド交換因子は細胞の生理応答発現に関わる種々の情報伝達経路において、分子スイッチとして機能し、細胞骨格形成、小胞輸送、細胞増殖など細胞機能制御のシグナル伝達因子として重要な働きをしている。グアニンヌクレオチド交換因子は、ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節に関わっていることから、各種生体の細胞や臓器の機能調節において重要な役割を担っており、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質などによる細胞内へのシグナル伝達の調節、また、細胞増殖・分化、細胞内小胞輸送、核へのタンパク質輸送による細胞機能の調節など、非常に重要な役割を担っており、種々の疾患において治療薬の標的になり得る。
低分子量ＧＴＰタンパク質であるＲａｓおよびＲｈｏを基質とするグアニンヌクレオチド交換因子として、それぞれＳｏｓ（Ｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）およびＴｒｉｏが報告されている。また、Ｓｅｃ７は酵母の小胞輸送に異常を示す変異株から同定され、その後低分子量ＧＴＰタンパク質に属するＡＲＦ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を基質とするグアニンヌクレオチド交換因子であることが示された。ヒトを含む哺乳動物にもＳｅｃ７に相同性を示す種々のグアニンヌクレオチド交換因子、例えば、ＢＩＧ１、ＢＩＧ２、ＡＲＮＯ、サイトヘジン１およびＧＲＰ１などが同定され、これらも小胞輸送に関与することが報告されている。最近、哺乳動物のＳｅｃ７様グアニンヌクレオチド交換因子は、そのＢＦＡ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）感受性、分子サイズ、ドメイン構成によりサブグループに分類されている（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（２），６０−６７（２０００）．）。しかし、未だ報告されていないグアニンヌクレオチド交換因子も多いと思われる。
最近、急速に種々のゲノム解析が進行し、ヒトをはじめ、センチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などの全塩基配列解読が終了し、機能未知の予測タンパク質も多くデータベースに報告されている。その中にＳｅｃ７ファミリーに相同性を示しながら、明らかにこれまで知られているＳｅｃ７ファミリータンパクとは異なるものが存在する。例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋには、センチュウの配列情報としてＦ１１Ａ１０．４（アクセッション番号：ＣＡＡ９２８３０）が、ＮＣＢＩには、ショウジョウバエの配列情報としてＣＧ８６８３（アクセッション番号：ＡＥ００３６２０）がそれぞれ登録されているが、いずれのタンパク質も機能に関する報告はされていない。
グアニンヌクレオチド交換因子として種々の生物から同定されており、細胞内へのシグナル伝達に関与していることが報告されている。また、ガン遺伝子産物などがこれら交換因子のファミリーであることから生体内において重要な働きをしているばかりでなく、疾患治療のための標的分子となり得る。しかし、このような生理活性を調節する物質は全て見出されているわけではなく、新たなファミリーが存在する可能性もある。そのような新規物質を見出し、遺伝子をクローニングすることは医薬品開発において有用な手段となり得る。新たな生理活性調節物質はそれに関与する疾患の治療・予防薬や診断薬を開発するに際し活用することができる。また、新たなファミリーが見出されれば、新たな対象疾患や機能も解明され、従来に無い治療・予防薬や診断薬などの開発の探索に応用できる可能性がある。
発明の開示
本発明は、グアニンヌクレオチド交換因子様配列を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの部分ペプチド、該ポリペプチドまたは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転換体、該ポリペプチドまたは部分ペプチドの製造法、該ポリペプチドの活性を特異的に調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングにより得られる化合物、該化合物を含有する医薬、および該ポリペプチドまたはその部分ペプチドに対する抗体などを提供する。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、脂肪肝自然発生モデルマウスであるＦＬＳマウスの肝臓細胞で高発現している遺伝子をサブトラクションクローニング法で作成したｃＤＮＡライブラリーを基に、酵母グアニンヌクレオチド交換因子であるＳｅｃ７様配列を有するマウス新規ポリペプチドをコードする新規遺伝子を見出した。また、そのポリヌクレオチド配列を基に、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーより、マウス新規遺伝子に対応するヒト新規ポリペプチドをコードする新規遺伝子を見出した。さらに研究を進めた結果、本発明のポリペプチドが細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導に関与することを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；
（２）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；
（３）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドまたはその塩；
（４）前記（１）から（３）のいずれか記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩；
（５）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる前記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩；
（６）前記（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドまたは部分ペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（７）配列番号１に示す塩基配列の第１１７番目から第５２６７番目を有する前記（６）記載のポリヌクレオチド；
（８）配列番号３に示す塩基配列の第６６番目から第５１８９番目を有する前記（６）記載のポリヌクレオチド；
（９）配列番号６に示す塩基配列を有する前記（６）記載のポリヌクレオチド；
（１０）配列番号１に示す塩基配列の第１１７番目から第５２６７番目または配列番号３に示す塩基配列の第６６番目から第５１８９番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハブリダイズし、かつ細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１１）前記（６）から（１０）のいずれか記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター；
（１２）前記（１１）記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体；
（１３）宿主が動物細胞株および大腸菌株である前記（１２）記載の形質転換体；
（１４）前記（１２）または（１３）記載の形質転換体を培養する工程、および生産された組換えポリペプチドを培養培地から回収する工程を包含する、前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドの製造方法；
（１５）前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドを特異的に認識する抗体；
（１６）前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドを含有する細胞増殖抑制剤；
（１７）前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドを含有するアポトーシス誘導剤；
（１８）前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドを含有する肝疾患治療剤；
（１９）前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドまたは部分ペプチドを用いた、前記（１）から（５）のいずれか記載のポリペプチドの活性を特異的に調節する化合物のスクリーニング方法；
（２０）前記（１９）記載のスクリーニング方法より得られる化合物、
に関する。
本発明のポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を包含する。塩としては酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩である。このような塩としては、例えば、塩酸、燐酸、硫酸などの無機酸、あるいは酢酸、蟻酸、クエン酸、蓚酸などの有機酸との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列のうち、１個若しくは数個の欠失、置換または付加から選ばれた変異を有するポリペプチドまたはその塩を包含する。このようなポリペプチドは細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するものである。１若しくは数個の欠失、置換または付加する変異とは部位特異的変異誘発法などによりできる程度の数のアミノ酸の変異であり、５０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を意味している。さらに、本発明のポリペプチドは欠失、置換または付加によっても細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドで有り得る。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドとしては、配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列のうち、それらの配列の一部から構成されるポリペプチドまたはその塩を包含する。このようなポリペプチドは細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するものでなくてもよい。また、それらの部分ポリペプチドは本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できるポリペプチドであれば良い。また、ポリペプチド自体が抗原性を有していないものであっても、他のタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンなどに結合することで抗体を作製できるものであればどのようなペプチドであってもよい。このようなペプチドはアミノ酸６個以上、好ましくは２０個以上、より好ましくは５０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドで、例えば、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１、３および６で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが例示される。また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれ得る。好ましくは、このヌクレオチドは細胞増殖抑制活性またはアポトーシス誘導活性を有するポリペプチドをコードし得る。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドまたはその一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法やプラークハイブリダイゼーション法などの各種ハイブリダイゼーションアッセイ方法を用いることにより得ることができるポリヌクレオチドである。具体的には、配列番号１または配列番号３で表される塩基配列またはその一部をプローブとして、６×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション反応を行った後、０．１×ＳＳＣ溶液中、６８℃で洗浄する条件である。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）やＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ１：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）．）などの実験書に記載された方法に準じて行うことができる。
本発明の「発現ベクター」とは、例えば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その５’末端側には翻訳開始コドンとしてＡＴＧを、３’末端側には翻訳終止コドンＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよく、発現ベクター中のプロモーターの５’末端側に連結することで構築することができる。ベクターとしては、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＶ．ＳＰＯＲＴ１、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１などが用いることができる。転写を制御するプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが用いることができる。また、発現ベクターには、エンハンサー、スプライシングシグナル、選択マーカー、複製オリジンや付加タンパク質をコードするＤＮＡ配列などを含有しているものを用いることもできる。
本発明の「形質転換体」とは、発現ベクターとその発現ベクターに適した細胞などの宿主を選び、宿主を発現ベクターで形質転換することで作製される。形質転換する宿主としては、例えば、大腸菌属などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、ハムスターなどの動物細胞、たばこなどの植物細胞およびヨトウガなどの昆虫細胞をはじめとする多細胞真核生物などが挙げられる。好ましくは、大腸菌属、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株、や動物細胞、例えば、ヒト胎児腎臓由来細胞２９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなどが用いられる。
本発明の「ポリペプチド、その部分ペプチドまたはその塩の製造方法」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターにより原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの宿主を形質転換して得られる形質転換体を、宿主に適した培養方法で培養し、本発明のポリペプチドを産生させ、培地または形質転換体より回収することにより、本発明のポリペプチドまたは部分ペプチドを製造する方法をいう。
本発明の「抗体」とは、本発明のポリペプチドまたは部分ペプチドと反応しうる免疫グロブリンで、そのフラグメント、誘導体、結合体、修飾体なども包含する。好ましくは、本発明のポリペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。そのような抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れでもよい。
本発明の「細胞増殖抑制剤」とは、本発明のポリペプチドが細胞増殖を抑制する作用を有することから、細胞増殖が関与する疾患の細胞増殖を抑制することにより予防または治療に用いることができるものである。また、本発明の「アポトーシス誘導剤」とは、本発明のポリペプチドがアポトーシスを誘導作用を有することから、アポトーシスを誘導することにより予防または治療できる疾患に用いれるものである。その様な予防または治療剤としては、好ましくは本発明のポリペプチド含有するもので、特定の疾患、例えば、癌などの予防または治療に用いることができる。
さらに、本発明の「肝疾患治療剤」とは、本発明のポリペプチドが肝臓で高発現していることから、肝臓機能に関連する疾患の予防または治療に用いることができる。その様な予防または治療剤としては、好ましくは、本発明のポリペプチド含有するもので、特定の疾患、例えば、肝臓癌などの予防または治療に用いることができる。
本発明の「活性を特異的に調節する化合物」とは、本発明のポリペプチドの生体内における機能を活性化または阻害する作用を有する化合物であり、例えば、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド等が挙げられる。その様な化合物として、本発明のポリペプチドに対する抗体、配列番号１、３、６で表されるポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いることができる。また、その様な化合物は新規な化合物または既知の化合物であってもよい。
本発明の「スクリーニング方法」とは、本発明のポリヌクレオチドの活性を特異的に調節する化合物を選抜する方法で、バイオアッセイ、結合アッセイ、イムノアッセイ等が例示される。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明のポリヌクレオチドの調製、本発明のポリペプチドおよびその部分ペプチドの調製、発現ベクター、形質転換体、製造方法、抗体、特異的な活性調節物質のスクリーニング方法について説明する。
本発明において、特に記載のない場合は、当該分野で公知である遺伝子組換技術、大腸菌、分離精製を含む組換えタンパク質の産生方法、抗体作製方法が採用される。
肝組織より、当該分野において周知慣用である常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）などに記載された方法あるいは市販のキット、例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いる方法などが挙げられる。
本発明のＤＮＡ断片をベクターに挿入する。ベクターとしては、ｐＣＲ２、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社製）などを挙げることができる。その様にして得られたベクターを用い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。作製したｃＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクローンを以下の方法で選択する。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーから各クローンのプラスミドを精製し、塩基配列を解析することにより本発明のＤＮＡ断片を含むクローンを選択する。塩基配列解析方法としては、サンガーらのダイデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）．）あるいは市販の機器、例えば、ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ（アプライドバイオシステムズ社製）などを用いる方法などが挙げられる。
上記で得られたＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションにより、また、５’末端の翻訳領域のヌクレオチド得るために全ｍＲＮＡをＲａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法などによりスクリーニングを行うことで本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
上記で得られたＤＮＡ断片をプローブとし、放射性同位体などで標識しｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ｃＤＮＡライブラリーとして上記で作製したもの、あるいは市販のｃＤＮＡライブラリー、例えば、Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ、Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）、Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）、Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）などを用い、プラークハイブリダイゼーションを行うことにより本発明のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を取得することができる。また、当該分野において周知慣用である常法により全ｍＲＮＡを調製する。全ｍＲＮＡ調製方法としては、例えば、はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）などに記載された方法、あるいは市販キット、例えば、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いる方法などが挙げられる。ＲＡＣＥ法はＦｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．らの方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８５，８９９８（１９９８）．）などあるいは市販のキット、例えば、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（インビトロジェン社製）を用いる方法などが挙げられる。また、市販の全ｍＲＮＡ、例えば、ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）などを用いることもできる。
上記の方法で得られたＤＮＡ断片を必要により制限酵素などで処理した後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）などに記載の方法によりベクターに組込み、上記の塩基配列解析方法での塩基配列を解析することで本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明の方法により得られるポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号２または配列番号４で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどが挙げることができ、具体的には配列番号１および３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
上記のようにして取得したポリヌクレオチドは発現ベクターに組込み発現プラスミドを構築する。得られた発現ベクターを適当な宿主細胞に導入したものを培養し、培養液から回収する遺伝子工学的手法により本発明のタンパク質またはその塩を得ることができる。また、ヒトおよび哺乳動物の細胞または組織から当該分野において周知慣用の常法により分離・精製されるものでもよい。さらに、化学的なペプチド合成法に準じて得られるものでもよい。その様にして得られた本発明のタンパク質は細胞濃度、またはカスパーゼ活性を指標に細胞増殖抑制活性、アポトーシス誘導活性を有するかを調べることができる。
本発明の発現ベクターとしては、本発明のＤＮＡを含み、動物細胞で発現できるベクターであれば如何なる物でも用いることができ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、その５’末端側には翻訳開始コドンとしてＡＴＧを、３’末端側には翻訳終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡを有していてもよく、発現ベクター中のプロモーターの５’末端側に連結することで構築することができる。その様なベクターとしてはプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＶ．ＳＰＯＲＴ１、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１などが用いることができる。転写を制御するプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが用いることができる。また、発現ベクターには、エンハンサー、スプライシングシグナル、選択マーカー、複製オリジンや付加タンパク質をコードするＤＮＡ配列などを含有しているものを用いることもできる。付加タンパク質としては、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やチオレドキシンなどが用いられ、それら付加タンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’末端側に目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を連結し、融合蛋白質を発現するベクターが作製できる。融合蛋白質発現ベクターには、付加タンパク質と目的タンパク質の間に、プロテアーゼで切断可能なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有していてもよく、プロテアーゼとしては、例えば、トロンビンプロテアーゼ、Ｘａ因子およびＢＬａｓｅなどが用いられる。また、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を融合蛋白質発現ベクターに効率的に挿入するためのクローニング用ＤＮＡ配列を含有していてもよく、クローニング用のＤＮＡ配列としては、例えば、制限酵素で切断可能なＤＮＡ配列であって、好ましくは、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｍＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩなどで切断されるＤＮＡ配列である。
本発明の発現ベクターとその発現ベクターに適した宿主を選ぶことによって形質転換体を作製することができる。形質転換する宿主としては、例えば、大腸菌属などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、ヨトウガなどの昆虫細胞およびハムスターなどの動物細胞をはじめとする多細胞真核生物などが挙げられる。好ましくは、大腸菌属、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株、や動物細胞、例えば、ヒト胎児腎臓由来細胞２９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなどを挙げることができ、好ましくは、２９３細胞を用い得る。
宿主細胞を形質転換する方法は、例えば、前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）などの多くの教科書や文献に基づいて実施することができる。大腸菌を形質転換する場合、例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．などに記載の方法に従って行われる。動物細胞を形質転換する場合、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、りん酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻、４５６（１９７３）．）に記載の方法などの方法が挙げることができる。
本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した宿主細胞に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＹＴ培地、ＢＥＭ培地などが用いられる。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクトおよび塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地などにウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したものなどが用いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよく、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシン（ＩＰＴＧ）などを用いることができる。
培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、ウシ胎児血清、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。培養はｐＨ６．０〜８．０、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下などの条件で行う。
本発明の形質転換体から産生された組換えタンパク質は、当該分野において周知慣用の常法により培養培地から回収する。
上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離し、組換えタンパク質が菌体中に存在する場合は、細胞または菌体を採集し、ＳＴＥ溶液などの適当な緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波などで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により回収することができる。分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などを含んでいてもよい。得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の精製・分離方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー法などの各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの各種電気泳動などが用いられる。また、目的タンパク質を融合蛋白質として発現させている場合は、付加タンパク質に特異的な抗体を用いて融合蛋白質を分離し、プロテアーゼなどで付加タンパク質を切断することで目的タンパク質を精製することができる。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）に記載の部位特異的変異誘発法やＰＣＲ法などの方法を用い、本発明のＤＮＡ配列に変異を導入し、適当なベクターおよび宿主を用い、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）に記載の方法により、変異を導入したＤＮＡを遺伝子工学的に発現させることにより得ることができる。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドもしくは部分ペプチドを含むポリペプチドなどを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って作製することができる。抗体は、例えば、本発明のタンパク質、その部分ペプチドもしくは部分ペプチドを含むポリペプチドを抗原とし哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などなどに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギなどを用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．）などに従って作製することができる。哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。精製は各種クロマトグラフィーや遠心分離、塩析、透析などを組合わせることで行うことができる。
モノクローナル抗体は、上記で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従って作製することができる。
本発明のポリペプチドを含有する細胞増殖抑制剤、アポトーシス誘導剤および肝疾患治療剤としては、本発明のポリペプチド単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる方法において製造した医薬製剤として提供されることが望ましい。
投与経路としては疾患に対し最も効果的な方法を採用するのが望ましく、経口投与、静脈内、皮下、腹腔内などの非経口投与を挙げることができる。投与形態としては疾患に対し効率的かつ効果的に有効成分を輸送できる形態が望ましく、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、粉剤、注射剤、経皮剤、座剤、乳剤などが挙げられる。
本発明のポリペプチドの活性を特異的に変化させる化合物のスクリーニング方法としては、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドもしくはその塩、または組換えタンパク質発現系を構築し、該発現系を用いたアッセイ系を用いることによって行うことができる。本発明のスクリーニング方法は本発明のタンパク質の活性を変化させる物質、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、非ペプチド化合物などをスクリーニングすることができ、アゴニストおよびアンタゴニストなどが含まれる。本発明のポリペプチドの活性を変化させる物質（試験化合物）を、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における本発明のポリペプチドの活性を測定し、比較することを特徴とする本発明の物質のスクリーニング方法を提供する。また、本発明のポリペプチドを発現する哺乳動物細胞または形質転換体を培養し、発現した本発明のポリペプチドに試験物質を接触させた場合における本発明のポリペプチドの活性、形質転換体の細胞数、ｍＲＮＡ発現量などを測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドもしくはその塩の活性を変化させる物質のスクリーニングすることが可能である。
本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドまたはその塩の活性を変化させる作用を有する化合物であり、例えば、本発明のポリペプチドまたはその塩に結合し、阻害活性を有する化合物またはその塩、あるいは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合し、該タンパク質の発現を抑制する活性を有する化合物またはその塩である。該化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド、核酸などが挙げられるが、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体および配列番号１または／および配列番号３に記載されているＤＮＡ配列またはその部分配列に相補的な配列を有する塩基配列を用いることができる。また、これらの化合物は新規な化合物または既知の化合物であってもよい。
実施例
本発明を以下の実施例でより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
マウスＳＦ２１ｃＤＮＡの単離
（１）ＦＬＳマウス肝臓からｃＤＮＡサブトラクション（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）法により発現上昇を示す遺伝子の単離
１５週齢のＦＬＳマウスおよびＤＳマウスの肝臓からＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄ）法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６−１５９（１９８７）．）により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。ＦＬＳマウス由来のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをテスター、ＤＳマウス由来のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをドライバーとして、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、添付のマニュアルに従いＤＮＡサブトラクションを行った。得られたｃＤＮＡをＱＩＡＥＸ−ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）で精製し、ｐＣＲ２ベクター（インビトロジェン社製）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用い、１６℃で４時間反応させて挿入した。構築したベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換を行った後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（４０μｇ／ｍｌ）およびＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１００μＭ）を含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。培養後、プレートに出現したコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養を行った後、遠心分離により菌体を採集した。採集した菌体から組換えＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い抽出し、精製した。得られたｃＤＮＡライブラリーはＤＮＡシークエンサー３７３Ｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ダイターミネーター法で塩基配列を決定した。得られたｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を解析ソフトＢＬＡＳＴで解析した結果、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）機能未知遺伝子ＣＧ８６８３がコードするアミノ酸配列の１０２６〜１１２６領域と６６％およびセンチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）機能未知遺伝子Ｆ１１Ａ１０．４がコードするアミノ酸残の１０２３〜１１１８領域と４３％の相同性を有する、配列番号７で表される３２９塩基からなる塩基配列（ＳＦ２１Ａ）を有するクローンｐＳＦ２１Ａを得た。
（２）マウスＳＦ２１全長ｃＤＮＡの単離
ＳＦ２１Ａが全翻訳領域を含んでいないことから、全長ｃＤＮＡの単離を試みた。まず、プラスミドｐＳＦ２１Ａから全長ｃＤＮＡ単離に用いるプローブを調製した。５μｇのプラスミドｐＳＦ２１Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）２０ユニットで消化し、０．８％  アガロースゲル電気泳動にて分画後、ＤＮＡ断片を抽出し、ＱＩＡＥＸ−ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いて精製を行った。得られたＤＮＡはＲＴＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で添付のマニュアルにしたがって放射性同位体［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で標識し、それをプローブとした。
マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーＭｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を一晩培養した大腸菌株Ｙ１０９０−培養液に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。これに、予め５０℃に温めたＬＢ−トップアガロース（１リットルあたり：１０ｇトリプトン、５ｇイーストエキストラクト、５ｇＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、７．２ｇアガロース）を加え、ＬＢ−アガープレートに均一になるように播き、３７℃で５時間培養した。プラークの形成されたプレートを４℃で１時間冷却した後、プラークをナイロンメンブランＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社製）にトランスファーした。このメンブランを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む）溶液でアルカリ変性し、ＤＮＡを固定化後、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２（１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む）で中和し、２×ＳＳＣで洗浄した。このメンブランに上記で作製したプローブを用い、５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。そのメンブランを２×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳを含む）溶液で、室温にて１０分間を２回、０．１×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳを含む）溶液で、５５℃にて１５分間を２回により洗浄した後、オートラジオグラフィーにより目的とするプラークの検出を行った。
放射活性の検出された陽性シグナルに対応するプラークを含むプラーク群をプレートから単離し、１ｍｌのＳＭ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％  ｇｅｌａｔｉｎ、５０ｍＭ）に懸濁し、４℃にて１６時間でファージを溶出した後、１３，０００回転、１０分間の遠心により、上清にファージを回収した。このファージ溶液を出現プラークが１０、１００、１０００個になるようにＬＢ−ＭｇＳＯ４プレートに塗布し、上記と同様の方法で陽性プラークをスクリーニングした。この結果、完全に単離されたプラークとして陽性プラークを単離することに成功し、当該単一クローンを増殖させ、ファージ粒子よりＤＮＡを抽出し、精製した。これらの操作は全て自体公知の方法に従った。精製したＤＮＡを、制限酵素、ＥｃｏＲＩで消化し、同様にＥｃｏＲＩで切断したベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、１６℃にて４時間ライゲーション反応を行った。それらのプラスミドで大腸菌株ＪＭ１０９株を形質転換し、自体公知の方法で培養後、菌体を収集した後、ＤＮＡを抽出・精製した。塩基配列の決定は前述の方法と同様に行った。その結果、配列番号８で表される２４０２塩基からなる塩基配列（ＳＦ２１Ｂ）を有するクローンｐＳＦ２１Ｂを単離した。
次に、上記と同様の方法でクローンｐＳＦ２１Ｂから放射同位体標識プローブを調製し、マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、配列番号９で表される２０１６塩基からなる塩基配列（ＳＦ２１Ｃ）を含むクローンｐＳＦ２１Ｃおよび配列番号１０で表される２４１４塩基からなる塩基配列（ＳＦ２１Ｄ）を含むクローンｐＳＦ２１Ｄを得た。得られたＳＦ２１Ａ〜Ｄの各塩基配列を基に解析を行った結果、４６６１塩基（配列番号３：第７９８番目〜第５４５９番目）からなるｃＤＮＡを得た。
さらに、翻訳領域の５’末端周辺の塩基配列を決定するためにＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法で５’末端配列を単離した。５’末端のＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法はＢａｌｂ／ｃマウスの肝臓より調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作した。
プライマーとして上記で得られた４６６１塩基からなるｃＤＮＡ配列を基に、３種類を合成した。
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アンカープライマーとしては５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍに付属の試薬、５’ＲＡＣＥ  Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＰ）およびＡｂｒｉｄｇｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＵＡＰ）を用いた。
Ｂａｌｂ／ｃマウス肝臓から自体公知の方法で取得した全ＲＮＡ１μｇに蒸留水を１４．０μｌ、２．５μＭのＳＦ２８プライマー（配列番号１９）を１μｌ添加し、７０℃で１０分間インキュベートし、５０℃に保温した溶液Ａを調製した。また、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４；５００ｍＭ  ＫＣｌを含む）を２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２．５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘを１μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴを２．５μｌそれぞれ混合し、５０℃で保温した溶液Ｂを調節した。溶液Ａと溶液ＢとＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１μｌ混合し、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間インキュベートした後、氷上に５分間静地した。ＲＮａｓｅ  ｍｉｘ（ＲＮａｓｅ  Ｈ＋ＲＮＡｓｅ  Ｔ１）を１μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
上記で得られたｃＤＮＡはキット付属のＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）で精製を行った。上記反応液にｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６Ｍ  ＮａＩ）を２２５μｌ添加し、ＧｌａｓｓＭＡＸ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓにかけ、５０μｌの蒸留水で溶出し、精製ｃＤＮＡを得た。１０μｌの精製ｃＤＮＡに蒸留水を４μｌ、５×ｔａｉｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４；１２５ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）を５μｌ、１ｍＭ  ｄＣＴＰを５μｌそれぞれ添加し、９４℃で２分間処理し、氷上に１分間放置した。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｒＴｄＴ）を１μｌ添加し、３７℃で１０分間、６５℃で１０分間インキュベートした後、氷上に５分間放置し、５’ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡを得た。
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法はＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社製）を用いて行った。上記で得られた５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡ２．５μｌに、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘを４μｌ、１０μＭ  ＡＡＰプライマーを１μｌ、１０μＭ  プライマーＳＦ２９（配列番号２０）を１μｌ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、蒸留水を１３．７５μｌずつ混合した溶液を、９４℃で２分間を１回、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３０回、７２℃で２分間を１回で１回目のＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ反応液を５０倍希釈した溶液２．５μｌに、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘを４μｌ、１０μＭ  ＡＵＡＰプライマーを１μｌ、１０μＭ  ＳＦ３０プライマーを１μｌ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、蒸留水を１３．７５μｌ混合した溶液を、９４℃で２分間を１回、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを２０回、７２℃で２分間を１回で２回目のＰＣＲを行った。２回目のＰＣＲ反応液を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、約９００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＱＩＡＥＸ−ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで精製した。精製したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ２（インビトロジェン社製）に挿入し、前述の方法で塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号１１で表される８９１塩基からなる塩基配列（ＳＦ２１Ｅ）を得た。
得られた各種ＳＦ２１塩基配列の配置図を第１図に示しす。それを基にマウスＳＦ２１の全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、マウスＳＦ２１は配列番号３で表される全長５１２４塩基および配列番号４で表される１７０８アミノ酸残基からなるタンパク質であることが明らかになった。
実施例２
ヒトｈＳＦ２１ｃＤＮＡの単離
マウスＳＦ２１とホモロジーを示すヒト遺伝子のクローニングを試みた。マウスＳＦ２１がコードするアミノ酸残基Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号４：第１０３５番〜第１０４４番）およびＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（配列番号４：第１１０２番〜第１１１１番）を基にＰＣＲ用のプライマーとして縮重オリゴヌクレオチド２種類を合成した。
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ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーＨｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型に、２種類のプライマーＳＦ−Ｄ３およびＳＦ−Ｄ４を用いてＰＣＲを行った。
まず、上記ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（２×１０７ＰＦＵ／μｌ）０．５μｌにＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（宝酒造社製）１．２５ユニットにＳＦ−Ｄ３およびＳＦ−Ｄ４のプライマーを各５０ｐｍｏｌ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）を５μｌおよびｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍ）を最終濃度２００μＭに成るよう添加し、蒸留水を全量が５０μｌに成るよう添加しＰＣＲ用試料を調製した。９４℃で４分間を１回、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３５回、７２℃で３分間を１回で、ＤＮＡサーマルサイクラーとして、Ｏｍｎｉ  Ｇｅｎｅ（サーモハイベイド社）を用いてＰＣＲを行った。増幅された約２５０塩基のＤＮＡ断片をｐＣＲ２ベクター（インビトロジェン社製）にクローニングし、前述の方法と同様にして塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号１２で表される２３０塩基から成る塩基配列（ｈＳＦ２１Ａ）を有するプラスミドｐｈＳＦ２１Ａを単離した。得られたｃＤＮＡはマウスＳＦ２１の相当領域と塩基配列で９５％、アミノ酸配列で１００％の相同性を有していた。このことから単離したｃＤＮＡはマウスＳＦ２１のヒトに相当する遺伝子の一部と考えられた。
ヒトｈＳＦ２１全長ｃＤＮＡを得るために、ｈＳＦ２１ＡをプローブとしてＨｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡをプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。プラークハイブリダイゼーションはマウスＳＦ２１全長ｃＤＮＡの取得した時の方法に準じて行った。この方法により配列番号１３で表される１１６６塩基からなる塩基配列（ｈＳＦ２１Ｃ）を有するクローンｐｈＳＦ２１Ｃ、配列番号１４で表される２８２５塩基からなる塩基配列（ｈＳＦ２１Ｅ）を有するクローンｐｈＳＦ２１Ｅおよび配列番号１５で表される３１３９塩基からなる塩基配列（ｈＳＦ２１Ｆ）を有するクローンｐｈＳＦ２１Ｆの３種のクローンを得た。得られたヒトｈＳＦ２１ＡからＦの塩基配列を基に解析を行った結果、５５１７塩基（配列番号１：第２５０番目〜第５７６７番目）からなるｃＤＮＡを得た。
マウス同様にヒトにおいても翻訳領域の５’末端周辺の塩基配列を決定するためにＲＡＣＥ法で５’末端配列を単離した。操作は前述の方法に従って行った。
５’ＲＡＣＥにはＨｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーとして上記で得られた５５１７塩基からなるヒトｃＤＮＡ配列を基に１種類を合成した。
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また、クローニングベクターλｇｔ１１配列に特異的なプライマーとしてＧＴ１１−ＬＤＦを合成した。
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ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーＨｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ５’−ＳＴＲＥＣＨ  ＰＬＵＳ  ｃＤＮＡを蒸留水で１００倍に希釈した溶液０．５μｌに、ＫｌｅｎＴａｑ  ＬＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（クロンテック社製）を１．２５ユニット、上記各プライマーを５０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）を５μｌおよびｄＮＴＰｓを最終濃度が２００μＭになるように添加し、全量が５０μｌになるよう蒸留水を添加しＰＣＲ用の試料を調製した。試料は９４℃で４分間を１回、９４℃で３０秒間、６８℃で３分間の反応サイクルを２５回、６８℃で３分間を１回でＤＮＡサーマルサイクラーＯｍｎｉ  Ｇｅｎｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液を、１．２％アガロースゲルで電気泳動し、約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＣＲ２ベクターに挿入し、ＤＮＡシークエンサー３７３Ｓを用い、ダイターミネーター法で塩基配列を決定した。その結果、配列番号１６で表される４３３塩基からなる塩基配列（ｈＳＦ２１Ｇ）を得た。
得られた各種ｈＳＦ２１塩基配列の位置を第１図に示す。それを基にヒトｈＳＦ２１の全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、ヒトｈＳＦ２１はそれぞれ配列番号１で表される全長５８８３塩基からなる塩基配列および配列番号２で表される１７１７アミノ酸残基からなるタンパク質であることが明らかになった。単離したヒトの塩基配列はマウスの塩基配列と８２％の相同性を示すことから、得られたヒト遺伝子はマウス遺伝子に相当するものであると考えられた。
ヒト全長ｈＳＦ２１ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列について公開データベースＧｅｎＢａｎｋをＢＬＡＳＴ検索したところ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）機能未知遺伝子ＣＧ８６８３（１６６９残基）と４３％、センチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）機能未知遺伝子Ｆ１１Ａ１０．４（１６４６残基）と２９％、分裂酵母（Ｓｃｈｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）機能未知遺伝子Ｃ２３Ｄ３．１３Ｃ（１６１６残基）と１７％のホモロジーをそれぞれ示した。また、ヒトｈＳＦ２１のアミノ酸残基第２１３目〜第３９７目および第６３９目〜第９３１目の領域がそれぞれＳｅｃ７／ＢＩＧ１ファミリーに属するヒトｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ阻害グアニンヌクレオチド交換因子１タンパク質（ＢＩＧ１）のアミノ酸残基第４２１目〜第５９１目および第９８９目〜第１３０６目と２３％のホモロジーを示した。また、ヒトｈＳＦ２１のアミノ酸残基第１７８目〜第３９２目および第７４６目〜第９１９目の領域がそれぞれ酵母（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳｅｃ７ｐのアミノ酸残基第４７０目〜第６７１目および第１２７０目〜第１４４３目と２２％および１９％のホモロジーを示した。しかし、ヒトｈＳＦ２１はＢＩＧ１およびＳｅｃ７ｐの基質であるＡＲＦに対する触媒ドメインであるＳｅｃ７ドメインに相当する領域のホモロジーは低く、ＡＲＦに対するＧＥＦ活性に必要とされているＳｅｃ７ドメインに保存されたアミノ酸配列が認められないことから、Ｓｅｃ７／ＢＩＧ１ファミリーと異なる新規タンパク質をコードする遺伝子と考えられた。よって、ヒトｈＳＦ２１タンパク質をコードする遺伝子は上記のような特徴を持つことから、Ｓｅｃ７  Ｌｉｋｅ−１（ＳｅｃＬ−１）遺伝子と命名した。
実施例３
ヒトの各種組織におけるＳｅｃＬ−１の発現
ヒトの各種組織（脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、白血球）におけるＳｅｃＬ−１遺伝子発現の有無を調べた。
各種ヒト組織由来のｍＲＮＡとしてＨｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮＴＭ）  Ｂｌｏｔ（クロンテック社製）を、また、プローブとしてヒトＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで消化することで得られる、配列番号１記載の第４５０３番目〜第５２０７番目で示される７０５ｂｐの塩基配列を前述と同様の方法で放射性同位体［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）標識したものを用いてノーザンブロット解析を行った。
ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）１０ｍｌに上記で作製したプローブ５μｌ添加し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。その様にして調製したハイブリダイゼーション溶液中でＭＴＮ  Ｂｌｏｔを、６８℃で１６時間インキュベーションし、ハイブリダイゼーションを行った。そのメンブランを２×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳを含む）溶液で、室温にて１５分間を４回、０．１×ＳＳＣ（０．１％  ＳＤＳを含む）溶液で、５０℃にて２０分間を２回行って洗浄した後、−７０℃で５日間オートラジオグラフィーを行った。その結果、全ての組織でＳｅｃＬ−１の発現が見とめられ、特に脳、心臓、腎臓、肝臓、胎盤では強いシグナルが認められた。ｍＲＮＡのバンドのサイズが、単離されたｃＤＮＡより長いことから、ＳｅｃＬ−１のｍＲＮＡは長い非翻訳部分を持つと考えられた。
実施例４
ヒトＳｅｃＬ−１発現ベクターの構築
ヒトＳｅｃＬ−１遺伝子の機能解析を行うために、哺乳動物細胞での発現ベクターを構築した。ヒトＳｅｃＬ−１全長ＤＮＡ配列を基に６種類のプライマーを合成した。なお、プライマーの５’末端側にＨＳＦ５３、ＨＳＦ６２およびＨＳＦ６６はＸｈｏＩが認識する配列を、ＨＳＦ６３はＢｓｔＸＩが認識する配列を、ＨＳＦ６７はＡｐａＩが認識する配列を、ＨＳＦ６９はＫｐｎＩが認識する配列を付加した。
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ＨＥＫ２９３細胞より調製したｍＲＮＡを鋳型にし、６種類のプライマーをＨＳＦ５３およびＨＳＦ６３、ＨＳＦ６２およびＨＳＦ６７、ＨＳＦ６６およびＨＳＦ６９で組合わせ、ヒトＳｅｃＬ−１が３分割されるようＰＣＲ法を行った。
まず、ＨＥＫ２９３細胞からの全ＲＮＡ調製にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲｎａｓｅＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡ０．５μｌにＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社製）１．２５ユニットにプライマーを上記の組合わせで各５０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．７５；２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）を５μｌおよびｄＮＴＰｓを最終濃度２００μＭに成るよう添加し、全量が５０μｌに成るよう蒸留水を添加し試料を調製した。試料は９９℃で２分間を１回、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７５℃で３分間のサイクルを３５回、７２℃で７分間を１回で、ＤＮＡサーマルサイクラーＯｍｎｉ  Ｇｅｎｅを用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応液を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、目的のＤＮＡ断片を回収し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。これらの各種ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）に挿入し、プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ６６−６９、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ６２−６７およびｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ５３−６３を構築し、各ＤＮＡ断片の塩基配列の決定をおこなった。
次に、上記で得られたプラスミド３種類を制限酵素で消化し、各ＤＮＡ断片を哺乳類細胞発現用ベクターに組込み、全長ヒトＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡを再構築し、発現ベクターを構築した。
プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ６６−６９を制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化後、１．２％アガロースゲルによる電気泳動で分画し、目的の断片を回収した。回収したＤＮＡ断片はＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で添付のマニュアルに従って操作して精製した。ｐＢＫ−ＣＭＶベクター（ストラタジーン社製）も同様の制限酵素で消化し、ＨＳＦ６６−ＨＳＦ６９断片を組込み、プラスミドｐＫＢ−ＣＭＶ／ＨＳＦ６６−６９を得た。同様にして、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ６２−６７を制限酵素ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化後、１．２％アガロースゲルによる電気泳動で分画し、目的の断片を回収・精製した。ｐＫＢ−ＣＭＶ／ＨＳＦ６６−６９を同様の制限酵素で消化し、ＨＳＦ６２−６７断片を組込み、プラスミドｐＫＢ−ＣＭＶ／ＨＳＦ６６−６９・ＨＳＦ６２−６７を得た。次いで、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ／ＨＳＦ５３−６３を制限酵素ＸｈｏＩおよびＢｓｔＸＩで消化後、１．２％アガロースゲルによる電気泳動で分画し、目的の断片を回収・精製した。ｐＫＢ−ＣＭＶ／ＨＳＦ６６−６９・ＨＳＦ６２−６７を同様の制限酵素で消化し、ＨＳＦ５３−６３断片を組込み、発現プラスミドｐＫＢ−ＣＭＶ／ＨＳＦ６６−６９・ＨＳＦ６２−６７・ＨＳＦ５３−６３（ｐＫＢ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１）を得た。
ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）をバイオコート  ポリＤリシン（Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）６ウェルマイクロテストプレート（ベクトンディッキンソン社製）に５×１０５個／ウェルで分注し、Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（インビトロジェン社製）（１０％  ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を含む）を適量添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で一晩培養を行った。２μｇのｈＳｅｃＬ−１発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（１×）溶液（インビトロジェン社製）で最終容量１００μｌに成るよう調製し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）を１０μｌ添加し良く混和した後、室温で５〜１０分間インキュベーションしＳｕｐｅｒＦｅｃｔ−ＤＮＡ複合体を形成した。同様の操作で発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶを細胞に導入したものを対照として用いた。これらの各ベクターにＤ−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳを含む）を６００μｌ添加し、ピペッティングで良く混和した後、上記で培養した２９３細胞培養液から培養液を吸引除去し、ＰＢＳ溶液で１回洗浄した細胞に添加した。この細胞培養液は５％  ＣＯ２中、３７℃で３時間培養した後、培養液を吸引除去し、ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。このようにして形質転換した細胞にＤ−ＭＥＭ培地（１０％  ＦＢＳを含む）を２ｍｌ添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で４８時間培養することでｈＳｅｃＬ−１発現組換え細胞を得た。
実施例５
ｈＳｅｃＬ−１抗体の作製
抗原として配列番号５で表されるヒトＳｅｃＬ−１のアミノ末端１４６残基からなるポリペプチドを用いた。抗原ペプチドはＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって操作し、ＧＳＴ融合タンパク質を作製し、次いでＧＳＴ除去組換えタンパク質を作製した。
まず、上記で得られた発現プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１を鋳型とし、配列番号６記載の塩基配列を基に２種類のＰＣＲ用プライマーを合成した。ＨＳＦＳ１は配列番号６記載の第１番目から第２６番目の塩基配列に５’末端側にＥｃｏＲＩが認識する配列を、ＨＳＦＳ２は第４１３番目から第４３８番目の塩基配列に３’末端側にストップコドンおよびＸｈｏＩが認識する配列を付加した。
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０．５μｌのｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１にＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社製）１．２５ユニット、プライマーＨＳＦＳ１およびＨＳＦＳ２を各５０ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）を５μｌおよびｄＮＴＰｓを最終濃度２００μＭに成るよう添加し、全量が５０μｌに成るよう蒸留水を添加しＰＣＲ用試料を調製した。試料は９９℃で２分間を１回、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で９０秒間のサイクルを３５回、７２℃で７分間を１回でサーマルサイクラーＯｍｎｉ  Ｇｅｎｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液を１．２％アガロースによる電気泳動にて分画後、４５２ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片はＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した。
キット付属のＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、上記で得られたＤＮＡ断片を挿入し、融合タンパク質発現プラスミドｐＧＥＸ−ＨＳＦＳを得た。得られた発現プラスミドｐＧＥＸ−ＨＳＦＳを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を１００ｍｌの２×ＹＴ培地に添加し、３７℃で１８時間の前培養を行った。前培養液２５ｍｌを２．５Ｌの２×ＹＴ培地に加え、ＯＤ値が０．８になるまで培養を行い、その後、培養液にイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が０．１５ｍＭに成るよう添加し、３０分間培養することでタンパク質の発現誘導を行った。培養液を８，０００回転で遠心分離して採集した菌体にＳＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む）を１００ｍｌ添加して懸濁し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（シグマアルドリッチ社製）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を１ｍｌ加え、氷中に３０分間放置した。これに１０％サルコシル（シグマアルドリッチ社製）を含むＳＴＥ溶液１５ｍｌを添加した後、菌体を超音波処理したものを９，０００回転で遠心分離することで融合タンパク質を含む上清を得た。この上清から融合タンパク質をアフィニティー精製するためにＧｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲル（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を１０ｍｌ加えて３０分間ゆっくりと混和し、融合タンパク質を担体に吸着させた。この担体をカラムに充填し、ＳＴＥ溶液２０ｍｌで３回洗浄した後、溶出バッファー（７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  還元型ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、５ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２％  Ｎ−ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含む）でＧＳＴ−ｈＳｅｃＬ−１融合タンパク質を溶出した。溶出した融合タンパク質はＰＢＳ溶液中で一晩透析し、ＰＢＳ置換を行った後、試料にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ溶液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を２５０μｌ加え４℃で１時間処理した。この試料をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添加し、ＧＳＴを担体に吸着させることでＧＳＴを除去した。このようにして得られたｈＳｅｃＬ−１部分ペプチドはＰＢＳ溶液中で一晩透析し、ＰＢＳ置換を行った。培養液１５Ｌから約４ｍｇのｈＳｅｃＬ−１部分ペプチドが得られた。
ｈＳｅｃＬ−１部分ペプチド１００μｇをフロインドの完全アジュバント（インビトロジェン社製）１ｍｌと十分混和し、ニュージーランドホワイトウサギに注射した。この操作を数週間に数回行ったウサギより血液を採取し、ｈＳｅｃＬ−１部分ペプチドに対する抗体を含む血清を得た。得られた抗血清と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてＴｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）．）の方法と同様にしてウェスタンブロット分析を行った。
まず、上記で得られたｈＳｅｃＬ−１発現組換え細胞を培養液から回収し、Ｅｘｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ（カルビオケム社製）を含む）を０．１ｍｌ添加し、細胞抽出液を調製した。その様にして調製した細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（３−８％）で電気泳動により分画後、ゲルからＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）に蛋白質を電気泳動法で転写し、そのメンブランをＰＢＳ（５％  スキムミルク、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）でブロッキングした。次に、上記で得られた抗血清をＰＢＳ（５％  スキムミルク、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で４０００倍希釈した抗体溶液中にブロッキング後のメンブランを浸し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で１５分間、２回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社製）をＰＢＳで４０００倍希釈した標識抗体溶液に洗浄後のメンブランを浸し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で１５分間、２回洗浄し、洗浄後のメンブランはＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ）法で発光させたシグナルをエックス線フィルムに感光させ、抗体と結合する蛋白質を検出した。その結果、ｈＳｅｃＬ−１発現ベクターを導入した細胞から調製した試料はヒトＳｅｃＬ−１から予測される１９０ｋＤａのバンドが検出され、得られた抗血清が組換えヒトＳｅｃＬ−１タンパク質と特異的に反応を示したことが判明した。
実施例６
ヒトＳｅｃＬ−１の細胞増殖およびアポトーシスに及ぼす影響
上記同様にヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）をｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１で形質転換したヒトＳｅｃＬ−１発現組換え細胞および対照としてｐＢＫ−ＣＭＶを導入した細胞に各ウェル２ｍｌのＤ−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳを含む）培地を添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で培養を行った。培養後１日目および５日目の細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａ  Ｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）で添付のマニュアルにしたがって実施した。この結果、ヒトＳｅｃＬ−１高発現細胞株は対照細胞株に比べて細胞増殖の低下が認められた（第２図）。
この細胞増殖抑制へのアポトーシスの関与を検討した。Ｃａｓｐａｓｅ−３がアポトーシス誘導時に特異的に活性化されることが知られている（Ｃｅｌｌ，８８，３５５−３６５（１９９７）．）。そこで、ｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１導入細胞およびｐＢＫ−ＣＭＶ導入細胞のＣａｓｐａｓｅ−３活性を測定した。Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性測定はＣａｓｐＡＣＥＴＭ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（プロメガ社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって実施した。その結果、ヒトＳｅｃＬ−１高発現細胞では対照細胞に比べ約３倍のＣａｓｐａｓｅ−３活性上昇が認められた（第３図）。
次に、ヒトＳｅｃＬ−１高発現細胞でアポトーシスを誘導した際に内在性のＳｅｃＬ−１遺伝子の発現上昇が認められるが検討した。過酸化水素水はアポトーシス誘導を刺激することが知られている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，４８８，１２３−１３２（２００１）．）。そこで、過酸化水素水を細胞培養液中に添加し、ｈＳｅｃＬ−１遺伝子発現量としてそのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で経時的に定量することにより検討した。ＰＣＲ用のプライマーとしてＨＳＦ２８およびＨＳＦ２９の２種類を合成した。
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まず、ヒトＳｅｃＬ−１発現細胞培養液に０．１μＭ、０．３μＭ、０．６μＭおよび０．９μＭの４段階の濃度で調製した過酸化水素水を添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養した後、生細胞数およびヒトＳｅｃＬ−１のｍＲＮＡ量を測定した。対照として過酸化水素水を添加していない細胞を同様の条件で培養した。各細胞からの全ＲＮＡ調製にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって調製した。調製した全ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲｎａｓｅＨ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡ０．５μｌにＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社製）１．２５ユニット、１０μＭの各プライマーを２μｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓを４μｌ、蒸留水５０μｌを混合し、９９℃で２分間を１回、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３５回、７２℃で５分間を１回で、ＤＮＡサーマルサイクラーＯｍｎｉ  Ｇｅｎｅを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、約４８０ｂｐのバンドとして確認した。その結果、対照区と比較して、過酸化水素添加した細胞は濃度に反比例して生細胞数の減少が認められた（第４図）。また、ヒトＳｅｃＬ−１のｍＲＮＡ量は過酸化水素を処理することで著しい増加が認められた。
以上の結果から、ヒトＳｅｃＬ−１はアポトーシス誘導を伴う細胞増殖抑制に関与していると考えられた。
産業上の利用可能性
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、およびそれらをコードする塩基配列は新規生理機能の探索、抗体の作製、組換え体発現系の構築、同発現系を用いた生理活性調節物質アッセイ系および医薬品候補化合物のスクリーニング系の開発、診断に有用な試薬作成のための試薬、予防および治療薬などの医薬品の開発等に用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１  ヒトおよびマウスからクローニングされた各種ＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡ断片の配置を示している。
図２  ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞にヒトＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡを挿入した発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１を導入し形質転換したヒトＳｅｃＬ−１発現細胞株（□）およびベクターｐＢＫ−ＣＭＶを導入した対照細胞株（●）における細胞増殖率の培養時間（日）における経時的変化を示している。
図３  ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞にヒトＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡを挿入した発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１を導入し形質転換したヒトＳｅｃＬ−１発現細胞株（■）およびベクターｐＢＫ−ＣＭＶを導入した対照細胞株（□）における各細胞株のＣａｓｐａｓｅ−３活性を示している。
図４  ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞にヒトＳｅｃＬ−１ｃＤＮＡを挿入した発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ／ｈＳｅｃＬ−１を導入し形質転換したヒトＳｅｃＬ−１発現細胞株における細胞増殖への各種濃度での過酸化水素の影響を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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