(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とするアドレノメデュリンの製造方法：
（Ａ）付加蛋白質としてＵｓｐＡ、リンカーペプチドとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列およびアドレノメデュリン前駆体から成る融合蛋白質を組換え体を用いて製造する工程、
（Ｂ）融合蛋白質をＢＬａｓｅにより限定分解し、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の溶液中でアドレノメデュリン前駆体を含む沈殿物を得る工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた沈殿物を、ｐＨ３．５〜４．５の変性剤を含まない溶解液に溶解することにより、アドレノメデュリン前駆体を抽出する工程。
【請求項２】
配列番号：７に記載の核酸配列を有するベクターにより形質転換された宿主を用いることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（Ｃ）のアドレノメデュリン前駆体の抽出を６０℃〜９０℃に加熱しておこなうことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
工程（Ｂ）の沈殿が、硫安沈殿により行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
工程（Ｃ）の溶解液が、酢酸ナトリウム溶液である請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
融合蛋白質が、配列番号：７２、配列番号：７４または配列番号：７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
融合蛋白質をコードする遺伝子が、配列番号：７１、配列番号：７３または配列番号７５のいずれかに記載の核酸配列を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アドレノメデュリン前駆体を、融合蛋白質を経由して製造する方法に関する。
背景技術
アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ；ＡＭ）は、ヒト褐色細胞腫組織より単離されたペプチドで、Ｃ末端のアミノ酸がアミド化された５２残基のアミノ酸（配列番号：２）からなる（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９２、５５３、（１９９３））。本ペプチドは血管拡張作用を有しており、高血圧・喘息・不妊治療薬あるいは循環器系の診断マーカーとして有用であることが期待されている。現在は、ヒト組織より精製し製造する又はペプチド合成機により製造する方法が取られているが、組織からの精製や合成機を用いた方法では工業的な大量のＡＭ製造は期待できない。
ＡＭは、比較的分子量の小さいペプチドであるため、遺伝子組換え技術を用いて生産する場合、酵母や昆虫細胞、枯草菌等の分泌系を利用するか、大腸菌等の非分泌系が考えられる。後者を利用する場合は微生物内で分解を受けやすい。従って、ＡＭのみを直接遺伝子組換え技術により製造することは困難である。
一方、目的とする蛋白質を得るために、保護蛋白質又は付加蛋白質と目的蛋白質からなる融合蛋白質を用いる方法は知られている。融合蛋白質をプロテアーゼを用いて限定分解することにより、目的蛋白質を得ることができる。この場合、目的蛋白質の精製にはクロマトグラフィーが用いられてきた（特開昭６２−２５９５９５実施例６、特開平１−１０９９９実施例７）。
該先行技術においては、下記工程により目的蛋白質であるα−型ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（αｈＡＮＰ）を得ている。
１）形質転換体の培養・破砕
２）遠心分離による融合蛋白質を含む画分の沈殿
３）沈殿した融合蛋白質を可溶化剤で抽出・溶解
４）融合蛋白質の限定分解
５）カラムクロマトグラフィーにより夾雑物質を吸着・除去
６）目的蛋白質の単離
しかし、限定分解した段階で、クロマトグラフィーにより目的蛋白質を精製しても、目的蛋白質以外の夾雑物質（特に、限定分解に由来する不特定多数のペプチド断片）が混在するため、クロマトグラフィーによる精製には処理量や回収率に限界があり、目的蛋白質の効率的な回収は期待できなかった。従って、従来技術では工業的規模での目的蛋白質の回収に困難が伴い、目的蛋白質の生産には適していなかった。
発明の開示
本発明者らは、ＡＭの効率的な大量生産を目的として研究した結果、本発明を見出し、これを完成した。
すなわち、本発明は、
（１）アドレノメデュリン前駆体を含む融合蛋白質を組換え体を用いて製造することを特徴とするアドレノメデュリンの製造方法；
（２）以下の工程を含むことを特徴とするアドレノメデュリンの製造方法：
（Ａ）付加蛋白質及びアドレノメデュリン前駆体を含む融合蛋白質を組換え体を用いて製造する工程、および
（Ｂ）融合蛋白質をプロテアーゼにより限定分解し、アドレノメデュリン前駆体を含む沈殿物を得る工程；
（３）以下の工程を含むことを特徴とするアドレノメデュリンの製造方法：
（Ａ）付加蛋白質及びアドレノメデュリン前駆体を含む融合蛋白質を組換え体を用いて製造する工程、
（Ｂ）融合蛋白質をプロテアーゼにより限定分解し、アドレノメデュリン前駆体を含む沈殿物を得る工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた沈殿物を溶解液に溶解することにより、夾雑物質を含まずにアドレノメデュリン前駆体を抽出する工程；
（４）工程（Ａ）の融合蛋白質が、付加蛋白質、リンカーペプチドおよびアドレノメデュリン前駆体から成ることを特徴とする上記（２）または（３）に記載の製造方法；
（５）工程（Ｂ）のプロテアーゼが、アドレノメデュリン前駆体内部に切断点を持たないアミノ酸またはアミノ酸配列を特異的に切断するプロテアーゼであることを特徴とする上記（２）から（４）のいずれかに記載の製造方法；
（６）工程（Ｂ）のプロテアーゼがグルタミン酸残基特異的プロテアーゼであることを特徴とする上記（２）から（５）のいずれかに記載の製造方法；
（７）グルタミン酸残基特異的プロテアーゼがＢＬａｓｅ、Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅである上記（６）に記載の製造方法；
（８）工程（Ｃ）の溶解液がｐＨ３．５〜４．５であることを特徴とする上記（３）から（７）のいずれかに記載の製造方法；
（９）工程（Ｃ）の溶解液が変性剤を含まないことを特徴とする上記（８）に記載の製造方法；
（１０）配列番号：７に記載の核酸配列を有するベクターにより形質転換された宿主を用いることを特徴とする上記（１）から（９）のいずれかに記載の製造方法；
（１１）宿主が大腸菌であることを特徴とする上記（１０）に記載の製造方法；
（１２）工程（Ｃ）のアドレノメデュリン前駆体の抽出を６０℃〜９０℃に加熱しておこなうことを特徴とする上記（３）から（１１）のいずれかに記載の製造方法；
（１３）工程（Ｂ）の沈殿が、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の溶液中で行われることを特徴とする上記（２）から（１２）のいずれかに記載の製造方法；
（１４）工程（Ｂ）の沈殿が、硫安沈殿により行われることを特徴とする上記（２）から（１２）のいずれかに記載の製造方法；
（１５）工程（Ｃ）の溶解液が、酢酸ナトリウム溶液である上記（３）から（１４）のいずれかに記載の製造方法；
（１６）工程（Ａ）の付加蛋白質が、チオレドキシン、セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼの部分配列、メチオニンγリアーゼの部分配列、マルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、ＨｄｅＢ、ＹｆｉＤ、ＵｓｐＡ、ＹｊｇＦ、ＹｇｉＮ、ＰｔｓＨからなる群より選択される上記（１）から（１５）のいずれかに記載の製造方法；
（１７）融合蛋白質が、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる上記（１６）に記載の製造方法；
（１８）融合蛋白質をコードする遺伝子が、配列番号：９に記載の核酸配列を含むことを特徴とする上記（１７）に記載の製造方法；
（１９）以下の工程を含むことを特徴とするアドレノメデュリンの製造方法：
（ａ）配列番号：７に記載の核酸配列を有するベクターにより形質転換された宿主を培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）で培養された宿主を破砕し、融合蛋白質を含む不溶画分を遠心分離により得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた不溶画分より可溶化剤を含む溶液で融合蛋白質を抽出する工程、
（ｄ）該融合蛋白質をＢＬａｓｅにより限定分解し、アドレノメデュリン前駆体を含む沈殿物を得る工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で得られた沈殿物を、変性剤を含まないｐＨ３．５〜４．５の溶解液に、６０℃〜９０℃で加熱して溶解することにより、夾雑物質を含まずにアドレノメデュリン前駆体を抽出する工程；
（２０）配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドとアドレノメデュリン前駆体を含む融合蛋白質；および
（２１）上記（２０）に記載のリンカーペプチドとアドレノメデュリン前駆体をコードする核酸配列を含む融合蛋白質をコードする遺伝子、に関する。
本発明において、「アドレノメデュリン」とは、ヒト由来のアドレノメデュリンを意味する。アドレノメデュリンは、５２アミノ酸残基（配列番号：２）からなり、そのＣ末端チロシン残基はアミド化されたペプチドである。
本発明において、「アドレノメデュリン前駆体」としては、アドレノメデュリンのＣ末端チロシン残基にグリシン残基を付加し、５３アミノ酸残基（配列番号：４）からなるペプチド（ＡＭ−ｇｌｙ）が例示される。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１位のＴｙｒから５１位のＧｌｙのＣ末端にアミノ酸残基１個を付加したペプチド（ＡＭ（１−５１）−ＡＡ：ＡＡは任意の１アミノ酸残基）も本発明の「アドレノメデュリン前駆体」に含まれる。
アドレノメデュリン前駆体がＡＭ−ｇｌｙの場合には、アミド化酵素によって、処理することにより、生理活性を有するＡＭを得ることができる。アドレノメデュリン前駆体がＡＭ（１−５１）−ＡＡの場合には、ＡＡをアミド化されたチロシン残基に置換することによって、生理活性を有するＡＭを得ることができる。
ＡＭ−ｇｌｙをコードする遺伝子は、配列番号：３または配列番号：５に記載の核酸配列からなる。
本発明において、「融合蛋白質」とは、付加蛋白質およびＡＭ前駆体を含むポリペプチドを意味する。好ましくは、付加蛋白質、リンカーペプチドおよびＡＭ前駆体からなるポリペプチドを意味する。付加蛋白質は、融合蛋白質のＮ末端側に位置する。ＡＭ前駆体は、融合蛋白質のＣ末端側に位置する。リンカーペプチドは、付加蛋白質とＡＭ前駆体との間に位置する。
「付加蛋白質」は、比較的分子量の小さなＡＭを分解から保護するために用いられる。従って、どのようなペプチドでも用いることができる。ただし、生産性の観点から、大腸菌由来のペプチドであり、Ｎ末端からアミノ酸５０残基以上、２００残基以下のペプチドが好ましい。付加蛋白質としては、チオレドキシン（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１８７−１９３（１９９３））、セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，２２２４−２２２９（１９９５））の部分配列、メチオニンγリアーゼ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，４２１−４２４（１９８４））の部分配列、マルトース結合蛋白質（Ｇｅｎｅ，６７，２１−３０（１９８８））、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｅ，６７，３１−４０（１９８８））、ＨｄｅＢ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，７７４７−７７４８（１９９３））、ＹｆｉＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，４７５６−４７６７（１９９４））、ＵｓｐＡ（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，３１８７−３１９８（１９９２））、ＹｊｇＦ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２１０５−２１１９（１９９５））、ＹｇｉＮ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），１４５３−１４７４（１９９７））、ＰｔｓＨ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，３１５０−３１５７（１９８８））などが例示できる。「セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼの部分配列、メチオニンγリアーゼの部分配列」とは、各分子のＮ末端部分配列よりなるペプチドを意味する。
本発明において「リンカーペプチド」とは、使用するプロテアーゼが認識するアミノ酸またはアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである。好ましくはＣ末端にグルタミン酸残基を有するペプチドを意味する。リンカーペプチドとしては、アミノ酸４残基以上、２０残基以下のペプチドが好ましい。配列番号：４０〜４６に記載するアミノ酸配列からなるペプチドが例示される。好ましくは配列番号：４４に記載のアミノ酸配列が例示される。「リンカーペプチド及びアドレノメデュリン前駆体」は、好ましくは、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなる。配列番号：８記載のアミノ酸配列は、配列番号：４４記載のリンカーペプチドのＣ末端に配列番号：４または配列番号：６記載のＡＭ前駆体を付加した配列からなる。「リンカーペプチド及びアドレノメデュリン前駆体をコードする遺伝子」は、好ましくは、配列番号：８記載のアミノ酸配列をコードする配列番号：７に記載の核酸配列からなる。
融合蛋白質としては、付加蛋白質としてチオレドキシン、リンカーペプチドとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列およびＡＭ前駆体からなるペプチドが例示される。該融合蛋白質の好ましいアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。配列番号：１０記載のアミノ酸配列は、配列番号：８記載のアミノ酸配列のＮ末端にチオレドキシンを付加した配列からなる。配列番号：１０記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、配列番号：９に示す。
更に、融合蛋白質としては、付加蛋白質としてＵｓｐＡ、リンカーペプチドとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列およびＡＭ前駆体からなるペプチドが例示される。該融合蛋白質の好ましいアミノ酸配列を配列番号：７２、７４、７６に示す。配列番号：７２、７４、７６記載のアミノ酸配列は、配列番号：８記載のアミノ酸配列のＮ末端にＵｓｐＡの一部または全部を付加した配列からなる。配列番号：７２記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号：７１に、配列番号：７４記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号：７３に、配列番号：７６記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号：７５に示す。
本発明において、「融合蛋白質を限定分解するプロテアーゼ」とは、融合蛋白質の酵素的な切断によりＡＭ前駆体を遊離することができるプロテアーゼを意味する。好ましくは「アドレノメデュリン前駆体内部に切断点を持たないアミノ酸配列を特異的に切断するプロテアーゼ」が例示され、更に好ましくは「グルタミン酸残基特異的プロテアーゼ」が例示される。
「グルタミン酸特異的プロテアーゼ」とは、グルタミン酸残基のＣ末端を特異的に切断するプロテアーゼである。このようなプロテアーゼとしては、ＢＬａｓｅ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０４，１６５−１７１（１９９２））、Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，６７２０−６７２６（１９７２））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，４５１−４５６（１９８８））などが例示される。
「変性剤」としては、尿素、塩酸グアニジン、ＳＤＳ、酢酸などが例示される。
「溶解液」としては、酢酸ナトリウム溶液を使用できるが、その他としてはグリシン−塩酸、りん酸水素ナトリウム−クエン酸、クエン酸−クエン酸ナトリウムなどの溶液が溶解液として例示できる。
「可溶化剤」としては、尿素溶液の他、ＳＤＳや塩酸グアニジンなどの試薬が例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ＡＭの製造は、以下の工程により行なうことができる。
１）形質転換体の培養・破砕
２）遠心分離による融合蛋白質を含む画分の沈殿
３）沈殿した融合蛋白質を可溶化剤で抽出・溶解
４）融合蛋白質の限定分解
５）ＡＭ前駆体のｐＨ調整による沈殿又は硫安沈殿
６）溶解液によるＡＭ前駆体の特異的抽出
７）ＡＭ前駆体のＣ末端アミド化
８）ＡＭの精製
以下において、各工程につき説明する。
１）ベクターの作製および形質転換体の培養・破砕
本発明の目的蛋白質であるＡＭ前駆体を含む融合蛋白質をコードする遺伝子を、適当なベクターに組み込むことにより、融合蛋白質を発現するための発現ベクターが作製される。融合蛋白質をコードする遺伝子は、付加蛋白質をコードする遺伝子、リンカーペプチドをコードする遺伝子及びＡＭ前駆体をコードする遺伝子からなる。ＡＭ前駆体をコードする遺伝子の入手源としては、例えばｐＨＡＭ−３（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９４，７２０−７２５，（１９９３））やヒトｃＤＮＡを使用することが出来る。生産性の向上を目的として、ＡＭ前駆体のアミノ酸配列には変化を与えないＡＭ前駆体合成遺伝子を使用することもできる。ＡＭ前駆体合成遺伝子としては、ＡＭ−ｇｌｙをコードする配列番号：５に記載の核酸配列を使用することもできる。付加蛋白質がセファロスポリン−Ｃデアセチラーゼである場合には、セファロスポリン−Ｃデアセチラーゼをコードする遺伝子の入手源としては、ｐＣＡＨ４３１やＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＨＳ  ０１３３株染色体ＤＮＡを使用することができる。付加蛋白質がチオレドキシンである場合には、チオレドキシンをコードする遺伝子の入手源としては、例えば、ｐＴｒｘＦｕｓやｐＴｈｉｏＨｉｓ（何れもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを使用することができる。ＨｄｅＢ、ＹｆｉＤ、ＵｓｐＡ、ＹｊｇＦ、ＹｇｉＮ、ＰｔｓＨについては例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを使用することができる。リンカーペプチドをコードする遺伝子としては、合成ＤＮＡを使用することが出来る。
ベクターとしては、ファージ又はプラスミドが使用される。この発現ベクターを宿主に導入することにより、形質転換体が作製される。宿主としては、細菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞が用いられる。本発明において、宿主としては、好ましくは細菌であり、さらに、好ましくは大腸菌が用いられる。
宿主が大腸菌の場合、目的の融合蛋白質を効率的に発現させるためには、宿主内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ，ｔａｃ，ｔｒｃ，ｔｒｐ，ＰＬなど）とＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を有する発現ベクター（ｐＫＫ２２３−３，ｐＢＳ，ｐＤＲ５４０，ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａなど）や、さらに翻訳開始コドンＡＴＧや制御配列を備えたＡＴＧベクター（ｐＴｒｃ９９Ａなど）に目的の融合蛋白質を含む遺伝子断片を挿入すれば良い。
発現ベクターを適切な宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０３，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，ＨＢ１０１，Ｃ６００，ＢＬ２１株など）に導入することによって形質転換体が得られる。この形質転換体を適当な条件で培養し、形質転換体を常法により破砕することにより、所望の融合蛋白質を得ることができる。
２）融合蛋白質を含む画分の回収
菌体内に封入体を形成した融合蛋白質を含む画分の回収は、遠心分離によって行なうことができる。遠心分離は、常法に従って行なうことができる。または、膜を用いて回収することも可能である。封入体を形成しない場合には等電点沈殿やイオン交換樹脂を使った方法等で精製することができる。この場合下記３）の操作は必要ない。
３）沈殿した融合蛋白質を可溶化剤で抽出・溶解
不溶画分の融合蛋白質は、可溶化剤で抽出することができる。可溶化剤としては４〜１０ｍｏｌ／ｌの尿素溶液の他、ＳＤＳや塩酸グアニジンなどの試薬が例示される。しかしながら、抽出液中にて、限定分解を行なうため、プロテアーゼの活性が失われない尿素溶液で抽出するのが好ましい。
４）融合蛋白質の限定分解
常法に従い、融合蛋白質をグルタミン酸残基特異的プロテアーゼにより切断し、目的蛋白質であるＡＭ前駆体を得る。限定分解を行なうための、グルタミン酸残基特異的プロテアーゼとしては、ＢＬａｓｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｇｌｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅなどが例示できる。限定分解は、上述の抽出液の尿素濃度を透析または希釈により調節した後におこなうことが好ましい。好ましい尿素濃度は、０ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌである。
５）ＡＭ前駆体のｐＨ調整による沈殿又は硫安沈殿
プロテアーゼで処理した溶液中には、ＡＭ前駆体のみならず、限定分解に起因する不特定多数のペプチドの断片やその他多様な夾雑物質が混在している。従って、ＡＭの効率的な生産には、夾雑物質の除去が不可欠である。従来技術においては、夾雑物質の除去が不十分なまま、クロマトグラフィーによる精製を行なっていたため、クロマトグラフィーの負担が高く、効率的に大量の純度の高い目的蛋白質を得ることが困難であった。
本発明においては、限定分解をｐＨを調整した溶液中で行うことで、夾雑物質を上清中に溶解させたまま、ＡＭ前駆体を沈殿させることにより、夾雑物質の除去に成功した。
ＡＭ前駆体であるＡＭ−ｇｌｙの等電点は、コンピューターによる計算では、１０．０である。しかしながら、実際には、ＡＭ−ｇｌｙはｐＨ８．０前後で効率的に沈殿させることが可能であった。一方、この条件では、付加蛋白質は沈殿しなかった。ｐＨ９．０以上では、ＡＭ−ｇｌｙ内部に切断が生じる。ｐＨ７．０以下では、ＡＭ−ｇｌｙの収率が低下する。したがって、ＡＭ−ｇｌｙを沈殿により夾雑物質から分離するためには、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の範囲、好ましくはｐＨ８．０になるように調節することでＡＭ−ｇｌｙを効率的に分離することができる。また、ＡＭ前駆体であるＡＭ（１−５１）−ＡＡも同様にｐＨ調節により分離することができる。
このＡＭ前駆体の沈殿による夾雑物質の除去方法としては、ｐＨの調整による沈殿以外にも、硫安沈殿やエタノール沈殿や有機ポリマーを用いた沈殿によっても行なうことができる。
硫安沈殿により行なう場合には、２０−３０％飽和硫安の添加によりＡＭ前駆体の沈殿形成を助けることができる。
６）ＡＭ前駆体の溶解液による抽出および夾雑物質の除去
上記ＡＭ前駆体の沈殿では、完全には夾雑物質を除去できない場合もある。本発明においては、ＡＭ前駆体をｐＨ４．０程度に調整した溶解液に特異的に溶解することで、夾雑物質を沈殿物として除去することができる。該夾雑物質の除去は、変性剤不存在でも効率的に行なうことができる。溶解液としては、酢酸ナトリウム溶液を使用できるが、その他としてはグリシン−塩酸、りん酸水素ナトリウム−クエン酸、クエン酸−クエン酸ナトリウムなどの溶液が溶解液として例示できる。抽出は、加熱処理して行なうことが好ましい。この時の温度は、６０℃〜９０℃であることが好ましい。
７）ＡＭ前駆体のＣ末端アミド化
生理活性を有するＡＭを製造するためには、ＡＭ前駆体であるＡＭ−ｇｌｙのＣ末端をペプチジルグリシンアルファーアミド化酵素（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１，５５１−５５９（１９９１））でアミド化するか、またはカルボキシペプチダーゼを使ってＡＭ（１−５１）−ＡＡ（ＡＡは適切なアミノ酸残基）のＣ末端アミノ酸残基をＴｙｒ−ＮＨ２と置換することができる。アミド化反応は、前述の抽出工程により得られたＡＭ−ｇｌｙ溶解液を使用して行なうことができる。ＡＭ−ｇｌｙのアミド化反応は、市販のアミド化酵素を用いることができる。アミド化酵素としては、ペプチジルグリシンアルファーアミド化酵素（和光純薬）などが例示できる。アミド化反応に必要な酵素量は、ＡＭ前駆体に対して１／１２００量（Ｗ／Ｗ）以上でも、反応副産物を生成することなく行なうことができる。また、ＡＭ（１−５１）−ＡＡの置換反応は、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，，４６，１２１−１２８（１９８１））、カルボキシペプチダーゼ−Ｗ−ＩＩ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５０，３０９−３２３（１９８５））、カルボキシペプチダーゼ−Ｍ−Ｉ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４８，２１７−２３０（１９８３））、カルボキシペプチダーゼ−Ｓ−Ｉ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５３，３０９−３２０（１９８８））などによって行なうことができる。
８）ＡＭの精製
アミド化されたＡＭは、各種クロマトグラフィーで精製することができる。精製したＡＭは、凍結乾燥により長期保存が可能である。
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とした発現
（１）発現プラスミドの作製
ＡＭ前駆体であるＧｌｙｃｉｎｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（以下ＡＭ−ｇｌｙ（配列番号：４）と略す）を培地中に分泌させることを目的として酵母用発現プラスミドを構築した。ＡＭ−ｇｌｙ構造遺伝子部分（配列番号：３）を次のように作製した。まず、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により、ｐＨＡＭ−３［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９４，７２０−７２５（１９９３）］を鋳型としてＡＭ−ｇｌｙ遺伝子を含むＳｎａＩ−ＳａｌＩ断片を増幅した（プライマーとしてＡＭＰＣＲ２及びＡＭＳａｌＲを使用）。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングしてｐＵＣ１８／ＡＭ−ｇｌｙとした。合成ＤＮＡプライマーはアマシャム・ファルマシア社製のＤＮＡ合成機（Ｇｅｎｅ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ）を用いて合成した。
0004332599.tif 000002
次に、ｐＵＣ１８／ＡＭ−ｇｌｙをＳｎａＩ−ＳａｌＩ消化し、ＡＭ−ｇｌｙ断片を取得し、ｐＵＣ１８上にクローニングしたｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  α  １（以下ＭＦ  α  １と略す）シグナル配列の下流ＮａｅＩ−ＳｎａＩ間に挿入して融合した。このＭＦ  α  １ｓｉｇｎａｌ−［ＫＲＥＡＥＡ］ＡＭ−ｇｌｙ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで切り出してｐＲＳ５４０２（第１図）のＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間に挿入し、ＡＭ−ｇｌｙ分泌発現プラスミドｐＡＭＧ２Ａ０１を構築した。
（２）発現菌株の評価
酢酸リチウム法によりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ１９９１，ＳＨ２６７６，ＳＨ２７７９株をｐＡＭＧ２Ａ０１で形質転換し、ＹＮＢ（−Ｌｅｕ）平板培地（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ０．６７％，ｇｌｕｃｏｓｅ  ２％，ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ  ０．００５％  ｅａｃｈ（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｅｕｃｉｎｅ），ａｄｅｎｉｎｅ  ０．００２５％，ｕｒａｃｉｌ  ０．００２５％，ｐＨ６．０，２％  ａｇａｒ）にストリークして形質転換体を得た。ＳＨ２６７６，ＳＨ２７７９株は大阪大学・原島俊先生より譲り受けた。これらの株をフラスコ培養し、生産性を調べた。培地はＹＰＳＧ（３−６−２−０．５％）（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ３％，ｐｅｐｔｏｎｅ  ６％，ｓｕｃｒｏｓｅ  ２％，ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ０．５％，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ０．０１％，ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ＃２，０００  ０．０１％，ｐＨ７．２）を用い、培養２４、３２、４８、５６時間にそれぞれ０．５、１、０．５、１％のｇａｌａｃｔｏｓｅを添加した。培養上清をウサギ抗ＡＭ抗血清（ペプチド研究所社製）によるドットブロットで分析した結果、ｐＡＭＧ２Ａ０１を保持するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ１９９１株に約５０ｍｇ／Ｌの生産性が認められた。
実施例２  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とした発現
（１）発現プラスミドの作製
ＡＭ−ｇｌｙを培地中に分泌させることを目的としてｐＰＩＣ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ間にＭＦ  α  １ｓｉｇｎａｌ−［ＫＲ］−ＡＭ−ｇｌｙを含むＢａｍＨＩ−ＥａｅＩ断片を挿入した。このプラスミドをｐＡＭＧＰｉ０１と名づけた。
（２）発現菌株の評価
エレクトロポレーションによりＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＫＭ７１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｔｕＩまたはＳａｃＩで切断したｐＡＭＧＰｉ０１で形質転換し、ＭＤ平板培地（１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ，４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ，１％  ｄｅｘｔｒｏｓｅ，２％  ａｇａｒ）にストリークした。得られた形質転換体を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを使って培養し、培養上清中のＡＭ−ｇｌｙをウサギ抗ＡＭ抗血清（ペプチド研究所社製）を使ったｄｏｔ  ｂｌｏｔによりｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｌｏｎｅを選択した。得られたクローンを２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ上で培養条件を変えて培養した結果、約１００ｍｇ／Ｌの生産性を持つ株が得られたことが確認できた。前培養にはＭＤ培地（１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ，４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ，１％  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を用い、本培養はＢＭＧＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，２％  ｐｅｐｔｏｎｅ，１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ，４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ，１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ６．０）で培養した後、ＢＭＭＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，２％  ｐｅｐｔｏｎｅ，１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ，４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ，１％  ｍｅｔｈａｎｏｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ６．０）に培地を交換して培養した。発現の誘導を維持するために約２４ｈ毎に培養中に１％  ｍｅｔｈａｎｏｌを添加した。
実施例３  大腸菌を宿主とした発現プラスミドの作製
（１）ＤＮＡプライマーの合成
ＡＭ−ｇｌｙを大腸菌で融合蛋白質として発現させるために、異種蛋白質全配列または部分配列とＡＭ−ｇｌｙを融合発現するプラスミドを構築した。融合蛋白質の限定分解法としては、グルタミン酸残基特異的プロテアーゼであるＶ８  ｐｒｏｔｅａｓｅやＢＬａｓｅを使った方法を想定し、Ｇｌｕを介して連結した。構築に用いた以下のＰＣＲ用オリゴヌクレオチドを合成した。
センス側プライマー
0004332599.tif 000003
0004332599.tif 000004
アンチセンス側プライマー
0004332599.tif 000005
（２）ＣＡＨ融合発現プラスミド構築
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ−Ｃ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（以下ＣＡＨと略す）の発現プラスミドであるｐＣＡＨ４３１［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７，４４６（１９９９）］の０．２ｋｂｐ  ＶｓｐＩ−ＸｂａＩ断片と０．２３ｋｂｐ  ＳｓｐＩ−ＤｒａＩ断片を除去してｐＣＡＨ４３１２を構築し、このプラスミドを基にした。まず、ｐＣＡＨ４３１２を鋳型として、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲにより４種類の長さのＣＡＨのＮ末端からの部分配列をコードする遺伝子を含むＨｐａＩ−ＮｓｐＶ断片を増幅した（プライマーとしてＨＰＡＩ−ＣＡＨとＥ４１ＲＥＶ、Ｅ９８ＲＥＶ、Ｅ１６２ＲＥＶ、Ｅ３０７ＲＥＶの何れかを使用）。次に、ｐＨＡＭ−３を鋳型として同様にＰＣＲによりＡＭ−ｇｌｙ遺伝子を含むＮｓｐＶ−ＸｂａＩ断片を増幅した（プライマーとしてＮＳＰＶ−ＡＭとＡＭ−ＸＢＡＩＲを使用）。これらの増幅断片は、それぞれｐＭＯＳＢｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・ファルマシア社製）にクローニングした。その後、ＨｐａＩ−ＮｓｐＶ断片とＮｓｐＶ−ＸｂａＩ断片を該当する制限酵素で切り出し、ｐＣＡＨ４３１２のＨｐａＩ−ＸｂａＩ間に挿入して４種類のプラスミドを作製した。ＨｐａＩ−ＮｓｐＶ断片としてＣＡＨ［１−３９］−［ＦＥ］遺伝子断片を使用したものをｐＡＭＥ１１０１とし、以下ＣＡＨ［１−９６］−［ＦＥ］、ＣＡＨ［１−１６０］−［ＦＥ］、ＣＡＨ［１−３０５］−［ＦＥ］を使用したものをそれぞれｐＡＭＥ１１０２（第２図）、ｐＡＭＥ１１０３、ｐＡＭＥ１１０５と命名した。
（３）Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ融合発現プラスミドの構築
合成ＤＮＡ（ＳＹＮＴＡＣＳ１、ＳＹＮＴＡＣＡ１）を用いてｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｏｒから開始コドンを含むＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を作製し、ｐＭＯＳＢｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にクローニングした。ｐＣＡＨ４３１２のｔｒｐ  ｐｒｏｍｏｔｅｒとＣＡＨ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を上記のプラスミドのｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｏｒを含むＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片と置換してｐＡＴＧ２１３１を得た。なお、本置換時にｐＣＡＨ４３１２のＥｃｏＲＩ末端をＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）で処理してＳｍａＩ切断末端とｌｉｇａｔｉｏｎした。使用した合成ＤＮＡの配列を示した。
0004332599.tif 000006
次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（宝酒造社製）より染色体ＤＮＡを抽出・精製後、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ反応によりｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子（ｔｒｘＡ）を含むＸｂａＩ−ＮａｅＩ断片を増幅した（プライマーとしてＰＣＲＴＲＸＳ１とＰＣＲＴＲＸＡ１を使用）。ｐＭＯＳＢｌｕｅＴ−ｖｅｃｔｏｒ上にクローニングした。ｐＵＣ１８／ＡＭ−ｇｌｙのＡＭ−ｇｌｙ遺伝子の直前に合成ＤＮＡリンカー（５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡ−３’）（配列番号：２４）を挿入してＸｂａＩ−ＡＭ−ｇｌｙ−ＳａｌＩ間の配列をＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＮａｅＩ−［ＧＳＧＳＧＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ−ＳａｌＩとした後、ＸｂａＩ−ＮａｅＩ間にｔｒｘＡを含むＸｂａＩ−ＮａｅＩ断片をサブクローニングしてＸｂａＩ−ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ−ＳａｌＩとした（ＮａｅＩ部位は遺伝子内に含まれる）。一方、ｐＡＴＧ２１３１のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間にマルチクローニングサイト（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩ−ＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ）（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＣ−３’）（配列番号：２５）を挿入してｐＡＴＧ２１３１Ｍとした。このプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ間にＸｂａＩ−ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ−ＳａｌＩを挿入してｐＡＭＥ３２０１とした（第３図）。なお、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位は切断後、ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社製）により平滑化処理し、ｌｉｇａｔｉｏｎした。また、ＳａｌＩとＸｈｏＩ部位は末端部位が同じであるためｌｉｇａｔｉｏｎが可能である。
実施例４  各種融合蛋白質発現プラスミド保持株の評価
プラスミドｐＡＭＥ１１０１，ｐＡＭＥ１１０２，ｐＡＭＥ１１０３，ｐＡＭＥ１１０５またはｐＡＭＥ３２０１を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株について１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＢあるいはＣＡＨ−Ａ培地を用いて試験管培養した。
ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＢ培地
１２ｇ／Ｌ          Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ
２４ｇ／Ｌ          Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
４０ｇ／Ｌ          ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１２．５ｇ／Ｌ      Ｋ２ＨＰＯ４
２．３ｇ／Ｌ        ＫＨ２ＰＯ４
０．２ｇ／Ｌ        ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ＃２，
０００（Ｐ−２０００）
ｐＨ７．２
ＣＡＨ−Ａ培地
６０ｇ／Ｌ          ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１０ｇ／Ｌ          ｃａｓｅｉｎ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ
６ｇ／Ｌ            Ｎａ２ＨＰＯ４
２．６ｇ／Ｌ        Ｋ２ＳＯ４
２ｇ／Ｌ            Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
１ｇ／Ｌ            ＮＨ４Ｃｌ
１ｇ／Ｌ            ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ／Ｌ        ＮａＣｌ
１３．２ｍｇ／Ｌ    ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
５ｍｇ／Ｌ          ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ
０．２ｇ／Ｌ        ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ＃２，
０００（Ｐ−２０００）
４０．７ｍｇ／Ｌ    ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
ｐＨ７．１
培養は２８℃あるいは３７℃、振とう数３００ｍｉｎ−１で実施した。得られた菌体を超音波破砕し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。この結果、それぞれの形質転換体の発現量は表１の通りであった。
0004332599.tif 000007
このようにＣＡＨ［１−９６］−［ＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ発現プラスミドであるｐＡＭＥ１１０２を導入した株に比較的高い生産量を持ち、また分子量も小さいため生産には適していると考えられた。これらの生産株は融合蛋白質を封入体として生産したので、ｐＡＭＥ３２０１及びｐＡＭＥ１１０２保持株の生産する封入体について尿素濃度（２，４，８ｍｏｌ／Ｌ）、ｐＨ（６．０，６．５，７．０，７．５，８．０）を変化させ、溶解条件を調べた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ３２０１が生産するｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ融合蛋白質は比較的溶解しやすいことが分かったが、多くの類縁体蛋白質を生産した。また、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ１１０２が生産するＣＡＨ［１−９６］−［ＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙは８ｍｏｌ／Ｌ尿素条件下で溶解可能であった。
実施例５  クロマトグラフィーによるＡＭ前駆体の分離
（１）組換えＡＭ−ｇｌｙの調製
従来技術であるクロマトグラフィーを用いた場合、目的蛋白質がどの程度の収率で得られるかを確認するため、以下の試験を行なった。
３台の３０−Ｌ  ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ１１０２を培養し（ｔｏｔａｌ  ６０Ｌ  ＣＡＨ−Ａ培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）３７℃，ｐＨ７．０）、菌体を遠心分離により回収した後、ＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ３０ＣＤを用いて破砕した。遠心分離により封入体を含む画分を回収し、６ｍｏｌ／Ｌ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｉｄｅ，ｐＨ９．０で溶解した。次に酢酸でｐＨを３．０に調整し、蒸留水で２倍に希釈して不溶化させた後、沈殿物を１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８で洗浄した。８ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に再溶解した後、ＣａＣｌ２を２ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、ｐＨを８．０に調整して溶液中の蛋白質の１／１０００重量のＢＬａｓｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｇｌｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を添加して３７℃で２４ｈ反応させた。この結果、融合蛋白質はほぼ完全に限定分解され、ＡＭ−ｇｌｙが遊離した。尿素存在下で２回Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムクロマトグラフィーを行ない（４ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０で吸着、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ８．０でＮａＣｌ濃度を上げて溶出）、続いて逆相ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  １５Ｃ１８ＭＳ  ５０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×５００ｍｍ（ナカライテスク社製））を使用し１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ，ｐＨ２．５でアセトニトリル濃度２３％−３０％の濃度勾配により溶出した。精製したＡＭ−ｇｌｙは逆相ＨＰＬＣ（第４図）、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を用いたペプチドマッピング、またアミノ酸配列解析により分析した。逆相ＨＰＬＣによる分析はＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製）を使用し０．０５％  ＴＦＡを含む系で溶出液のアセトニトリル濃度２４％−３２％／３０ｍｉｎの濃度勾配により溶出し、波長２２０ｎｍにおける吸光度（Ａ２２０）で検出した。この精製方法による収率はＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムクロマトグラフィー２２．７％、逆相ＨＰＬＣ８．６％であった。ｔｏｔａｌの精製収率は２％であった（表２）。
従って、ＡＭの工業的製造においては、従来技術であるカラムクロマトグラフィーによる精製法を改良することにより高い収率を得ることは困難が伴うと予想された。
0004332599.tif 000008
実施例６  類縁体蛋白質生産能の排除
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ１１０２はＣＡＨ［１−９６］−［ＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙの他に類縁体の蛋白質を高分子量側に少なくとも２つ生産することが分かった。宿主大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０３，ＪＭ１１０，ＤＨ５，ＤＨ５  α，ＤＨ５  α  Ｆ’ＩＱ，ＢＬ２１の各株に変更して問題の解決を試みたところ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を用いることで類縁体の生産量が低下した。次に、ｍＲＮＡの２次構造をコンピューター予測した結果、終止コドンを中心とした９塩基よりなるｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔがあり、２次構造が形成される可能性が強いことが明らかとなった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ（ＴＧＡ）を部位特異的変異導入によりＴＡＡまたはＴＡＧに置換し２次構造を破壊した。また、同時にプロセスの精製操作を簡単にする目的で、ＣＡＨ［１−９６］部分に存在するＧｌｕ（１７，２６，３３，３４）をＬｙｓあるいはＧｌｎに置換した。これらの株を試験管培養（１０ｍＬ  ＣＡＨ−Ａ培地、３７℃、振とう数３００ｍｉｎ−１）し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで菌体の蛋白質を分析した結果、ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎをＴＡＡに置換した変異プラスミド保持株では類縁体蛋白質を生産しなくなった。ＴＡＧに置換した場合では２つの内１つの類縁体を生産しなくなり、１つの生産量が多くなった。ｐＡＭＥ１１０２のＧｌｕ（１７，２６，３３，３４）をＧｌｎに、ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎをＴＡＡに置換したプラスミドをｐＡＭＥ１１０２Ｑとした。
実施例７  ＢＬａｓｅによる限定分解効率の改良
（１）発現プラスミドの構築
融合蛋白質ＣＡＨ［１−９６］（Ｅ１７，２６，３３，３４Ｑ）−［ＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙのＢＬａｓｅによる限定分解の効率は高くないことが分かったため、融合蛋白質のＡＭ−ｇｌｙ直前にペプチドを挿入し、ＢＬａｓｅによる限定分解効率を高める検討をした。ＢＬａｓｅの基質特異性は切断部位であるグルタミン酸残基（Ｐ１）からＮ末端方向にＰ２がＰｈｅ、Ｐ３がＡｌａ、Ｐ４がＡｓｐである場合に比較的切断反応が比較的速いことが報告されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６，１０３（１９９２）］。ここではＡｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＧｌｕのＮ末端に性質の異なる配列を接続したペプチドを中心に種々のリンカーペプチドを挿入して反応に適した配列を選択した。ｐＡＭＥ１１０２ＱのＡＭ−ｇｌｙ遺伝子の直前にあるＮｓｐＶ部位に合成ＤＮＡリンカーを挿入し、７種類のＡＭ−ｇｌｙ直前の配列の異なる融合蛋白質生産プラスミドを構築した（ｐＡＭＥ１１０２Ｑ−Ｉ１〜７）。それぞれに使用した合成ＤＮＡは順に以下の通りである。
0004332599.tif 000009
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（２）ＢＬａｓｅによる切断反応
ｐＡＭＥ１１０２Ｑ−Ｉ１〜７を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を１０ｍＬのＣＡＨ−Ａ培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）で試験管培養（３７℃）し、集めた菌体を超音波破砕して不溶性画分を遠心分離により回収した。８ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ，２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で蛋白質濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、２μｇ／ｍＬのＢＬａｓｅを添加して試験管中で３７℃で２時間反応させた。３０分および２時間にサンプリングしてＢＬａｓｅの反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた結果、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ配列の挿入によりＢＬａｓｅの反応速度は高まり、ＣＡＨ［１−９６］（Ｅ１７，２６，３３，３４Ｑ）−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙが最も切断されやすかった（表３参照）。数値はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クイック−ＣＢＢ（和光純薬社製）で染色の後、デンシトメーターの測定値より算出した。
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実施例８  ＡＭ−ｇｌｙ合成遺伝子を使用した高発現株の造成
（１）発現プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ１１０２の融合蛋白質の発現量は０．２−０．５ｇ／Ｌ程度であるので、さらなる改良を行った。ヒト由来ＡＭ−ｇｌｙ遺伝子は大腸菌でのｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎをいくつか保有しており、翻訳効率を下げる原因となっている可能性があった［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４９４（１９９５）］。この理由から、これらのアミノ酸コドンを高頻度で使われるコドンに置き換えたＡＭ−ｇｌｙ合成遺伝子（配列番号：５）を用いてプラスミドを構築、発現させた。置換したコドンは、Ｌｅｕ１１（ＣＴＣ，１２．１％→ＣＴＧ，５３．７％）、Ａｒｇ１２（ＣＧＧ，９．６％→ＣＧＣ，４０．４％）、Ｇｌｙ１９（ＧＧＧ，１２．３％→ＧＧＣ，４５．６％）、Ａｌａ１７（ＧＣＡ，１９．３％→ＧＣＧ，３４．３％）、Ｔｈｒ３４（ＡＣＡ，１１．５％→ＡＣＣ，４５．３％）、Ｐｒｏ４３（ＣＣＣ，１３．３％→ＣＣＧ，５４．４％）、Ａｒｇ４４（ＡＧＧ，３．２％→ＣＧＣ，４０．４％）、Ｐｒｏ４９（ＣＣＣ，１３．３％→ＣＣＧ，５４．４％）である。使用頻度の高いコドンはＧＣ含量が高くなる傾向があるため、ｍＲＮＡの２次構造形成を促進する。これを防止するため、その他にもＡｒｇ２，Ｇｌｙ１０，Ａｒｇ１７のアミノ酸コドンを置換した。また、終止コドンもＴＡＡに置換した。ＣＡＨ［１−９６］−［ＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙは溶解性が低く、精製操作において尿素等の変性剤の添加を必要とした。このため付加蛋白質はＣＡＨ［１−９６］（Ｅ１７，２６，３３，３４Ｑ）−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］と、溶解性が高いｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎに［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］を付与したものにした。まず［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ合成遺伝子（配列番号：７）を含むＮａｅＩ−ＳａｌＩ遺伝子を下に示す４本の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応により作製し、ｐＵＣ１８上にクローニングした（［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ／ｐＵＣ１８）。次に、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子内部のＣｌａＩ部位をアミノ酸置換を伴わない点変異の導入により消去したＨｉｎｃＩＩ−ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ＮａｅＩ断片を（［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ／ｐＵＣ１８）のＥｃｏＲＶ−ＮａｅＩ間に挿入し、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ／ｐＵＣ１８とした。最終的にｐＡＭＥ３２０１のＣｐｏＩ−ＸｂａＩ断片をｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ／ｐＵＣ１８のＣｐｏＩ−ＸｂａＩ断片と交換してｐＡＭＥ３２０２を得た（第５図）。一方、ｐＡＭＥ１１０２Ｑ−Ｉ５のＮｓｐＶ−ＡＭ−ｇｌｙ−ＸｂａＩ断片をｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ／ｐＵＣ１８のＮｓｐＶ−ＡＭ−ｇｌｙ−ＸｂａＩ断片と交換してｐＡＭＥ１１１１とした（第６図）。ｐＡＭＥ１１１１の全融合蛋白質遺伝子を含むＣｌａＩ断片をｐＡＭＥ３２０２と互いに交換してｐＡＭＥ３１０５（第７図）とｐＡＭＥ１２０１（第８図）を得た。プラスミドの構築で使用した合成ＤＮＡの配列は以下の通りである。下線部分は互いに相補する配列部分である。
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（２）発現菌株の評価
上記の各種発現プラスミドｐＡＭＥ３２０２，ｐＡＭＥ１１１１，ｐＡＭＥ３１０５，ｐＡＭＥ１２０１をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株及びＢＬ２１株に導入し、形質転換体を培養後、各株の融合蛋白質生産性を試験管培養で調べた。培地には１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＢまたはＣＡＨ−Ａ培地を１０ｍＬ使用し、２８℃または３７℃、３００ｓｐｍで培養した。誘導型プロモーター（ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を用いた場合には波長６５０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６５０）の値が２−３の時にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した。この結果、宿主にＢＬ２１を用い、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ（配列番号：１０）をｔｒｐｐｒｏｍｏｔｅｒの支配下で発現させた場合（ｐＡＭＥ３１０５）にＣＡＨ−Ａ培地、３７℃の条件で培養すると最も高い発現量が得られた。一方このプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株をは生産量が低かった。ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎをｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓの高いｃｏｄｏｎに置換した合成遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＡＭＥ３２０２株はヒト由来の遺伝子を導入したｐＡＭＥ３２０１形質転換株と比較して顕著に発現量が増大していた。またＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を宿主とした場合でも培養温度を３７℃に上げるとｐＡＭＥ３２０１保持株にはほとんど生産性がなくなるのに比べ、ｐＡＭＥ３２０２保持株は生産性を維持することができる。
実施例９  発現菌株の培養
前培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＡＭＥ３１０５を２−Ｌ  ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中の１．２Ｌ  ＣＡＨ−Ａ培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）に植菌し、３７℃、ｐＨ６．２５、通気１ｖｖｍ、攪拌６００ｒｐｍで培養を開始、培養８時間で攪拌数を８００ｒｐｍに上げた。培養２４時間で菌体を破砕後、遠心分離により回収、洗浄した封入体中には培養液当たり２．５ｇ／Ｌの蛋白質が存在した。得られた封入体中の融合蛋白質の純度が８０％を超えていることから融合蛋白質の発現量は２ｇ／Ｌ以上となる。
実施例１０  効率的なＡＭ−ｇｌｙ粗精製法の構築
（１）沈殿化によるＡＭ−ｇｌｙの分離
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＡＭＥ３１０５を培養し、集菌後破砕、遠心分離により封入体を含む画分を回収した。次に中性ｐＨ域の緩衝液で洗浄した後、６ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ，２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で溶解した。透析によりｕｒｅａ濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌまたは１ｍｏｌ／Ｌにした後、蛋白質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ＢＬａｓｅによる限定分解反応を行った。この結果、反応の進行と共に溶液が白濁する現象が認められた。ＨＰＬＣによる分析の結果、ＡＭ−ｇｌｙが特異的に不溶化、析出していることが明らかとなった。１ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ存在下でＢＬａｓｅ反応時の蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに上げ、反応後５℃で１６ｈ静置することで収率は８７％まで上昇した（表４）。また同条件で溶解後、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いた希釈によりｕｒｅａ濃度を１ｍｏｌ／Ｌに調整し、終濃度２ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度で処理した場合でも同等の効率でＡＭ−ｇｌｙを回収することができた。同様にｐＨの検討を７−１０の範囲で行った結果、ｐＨ９以上ではＡＭ−ｇｌｙ内部での切断が認められ、またｐＨ７では収率が低下した（第９図）。また低濃度尿素存在下でＢＬａｓｅ反応することができるようになったことからＢＬａｓｅの使用量も大幅な削減が可能になり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果から蛋白質濃度１０ｍｇ／ｍＬで１／５０００（ｗ／ｗ）のＢＬａｓｅ添加により１ｈの反応で限定分解はほぼ終了した。融合する相手の蛋白質であるｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎも分子内に５個のグルタミン酸残基を持つが、２ｍｏｌ／Ｌ以下のｕｒｅａ濃度条件下ではこれらの部位での切断速度は極めて遅い。また、硫安の添加によりＡＭ−ｇｌｙの沈殿形成を助けることができた。２０−３０％硫安の添加により９５％以上のＡＭ−ｇｌｙを回収することができた（表４）。遊離されたｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎはこの条件で溶解性を保つことができる。
（２）抽出によるＡＭ−ｇｌｙの粗精製
沈殿したＡＭ−ｇｌｙ析出物について溶解条件を調べた。変性剤非存在下でもｐＨ２．５またはｐＨ４．０で効率的に溶解することが可能であり（第１０図）、ｐＨ４．０で溶解した場合には多量の夾雑物を除くことができた。さらに、加熱抽出（８０℃，３０ｍｉｎ）することで溶解効率を高めることができ、ＢＬａｓｅの失活、及びその他の夾雑蛋白質の除去に効果があった。同じ方法を使ってｐＨ２．５で溶解した溶解液の吸光度と比べると、溶解されたＡＭ−ｇｌｙ量が同じなのに対してＡ２８０は２２％，Ａ２６０は１３％であり、顕著な精製効果が認められた。５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ４．０で抽出した溶液（６ｍｇ／ｍＬ  ＡＭ−ｇｌｙ）を逆相ＨＰＬＣで分析（Ａ２２０）したところ（第１１図）、この溶解液中のＡＭ−ｇｌｙ純度は約９０％であった。分析条件は実施例５に示した方法を使用した。また、得られたＡＭ−ｇｌｙは全て分子内Ｓ−Ｓ結合が架かった酸化型として得られた。この方法による回収率は８３％であり、抽出操作を繰り返すことにより、さらに回収率を上げることができた（表４、２回で回収率９３％）。一方、この析出物は弱アルカリ性の緩衝液（２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）や蒸留水では溶解せず、沈殿に混入したｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ分子や尿素、硫安を洗浄により除去することができた。これらの結果から、本方法を用いた場合には従来のカラムを用いた方法や通常の等電点沈殿では通常期待できない程高い収率で純度の高いＡＭ−ｇｌｙ溶液が調製できた。この方法はカラム精製に比べ操作が単純であるため工業的スケールへのスケールアップが容易である。また、製造期間が短縮でき、さらに、高価なカラム樹脂を必要としないことからも製造コストを大幅に削減することが可能であると考えられる。
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実施例１１  他の付加蛋白質の検討
ここまでに示した方法を用いたＡＭ−ｇｌｙの調製方法がのチオレドキシン分子以外の付加蛋白質を用いて可能であることを確認するために他の付加蛋白質の検討を行った。まず大腸菌用ＡＴＧベクターを作製した。ｐＣＡＨ４３１２を鋳型としてｔｒｐｐｒｏｍｏｔｅｒを含む部分をＰＣＲにより増幅し、ｐＭＯＳｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・ファルマシア社製）にクローニングした。ｐＣＡＨ４３１２のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間にクローニングされたｔｒｐｐｒｏｍｏｔｅｒを含むＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片を挿入し、ｐＡＴＧ１１３１とした。ＥｃｏＲＩ切断末端はＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで平滑化処理の後、ＳｍａＩ切断末端と連結した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を示す。
センス側プライマー
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アンチセンス側プライマー
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大腸菌由来で、菌体内での生産量が比較的多くて分子量が小さく、やや等電点の低いタンパク質をターゲットとし、ＨｄｅＢ、ＹｆｉＤ、ＵｓｐＡ、ＹｊｇＦ、ＹｇｉＮ、ＰｔｓＨを検討に用いた。ＨｄｅＢに関しては分泌シグナルが存在するのでシグナルを除いた形での断片取得も行った。いずれもＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより該当遺伝子部分を増幅し、得た断片をｐＵＣ１８上で［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ遺伝子（実施例８）の５’末端に融合した後、ｐＡＴＧ１１３１のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間にクローニングした。ＥｃｏＲＩ切断末端はＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅで平滑化処理し、また連結する各蛋白質の遺伝子側の５’側も必要なものはＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ＮｕｃｌｅａｓｅまたはＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑化処理して野生型の５’配列を持つ遺伝子として組込んだ。付加蛋白質遺伝子の３’側の連結にはＮａｅＩ切断配列を使った都合上Ａｌａ残基が付与された。ＰＣＲに用いたＤＮＡの配列を以下に示す。
センス側プライマー
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アンチセンス側プライマー
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構築した発現プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を試験管培養（１０ｍＬ  ＣＡＨ−Ａ培地（５μｇ／ｍｌ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、３７℃、振とう数３００ｍｉｎ−１）した。培養終了液の菌体総蛋白質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色した結果、分泌シグナルを残したＨｄｅＢを用いた場合以外はいずれも［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙと融合したタンパク質の生産が確認できた。中でもＵｓｐＡを用いた場合の発現量は高く、このプラスミド名をｐＡＭＥ９１０１とした。
実施例１２  低分子化したＵｓｐＡを用いたＡＭ−ｇｌｙの融合発現
ＵｓｐＡ−［Ａ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ発現プラスミドｐＡＭＥ９１０１と同様の方法を用いてＵｓｐＡのＮ末端部分配列を使用したプラスミドを作製した。発現量が大幅に低下しない範囲で付加蛋白質の分子量を下げれば生産効率を上げることが可能となる。部分配列としてはＵｓｐＡ［１−８４］、ＵｓｐＡ［１−６５］、ＵｓｐＡ［１−５９］、ＵｓｐＡ［１−５７］を用い、これらの領域のＰＣＲに用いたプライマーの配列を以下に示す。
センス側プライマー（共通）
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アンチセンス側プライマー
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各プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を実施例１１と同じ方法で試験管培養したところ最も分子量を小さくしたＵｓｐＡ［１−５７］−［Ａ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ（配列番号：７１、７２）でも発現可能であり、さらに封入体の溶解性を高めるためにＡｓｐを導入して等電点を低くしたＵｓｐＡ［１−５６］−［ＤＤ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ（配列番号：７３、７４）もまた発現可能であった。２−Ｌ  ｊａｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒを用いてｐＡＭＥ９１０５（ＵｓｐＡ［１−８４］−［Ａ］−ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ発現プラスミド）、ｐＡＭＥ９１０７（ＵｓｐＡ［１−５６］−［ＤＤ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ発現プラスミド）をそれぞれ保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株について培養したところ、前者が２．２ｇ／Ｌ、後者が１．６ｇ／Ｌの生産性を示した。生産量の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルをＣＢＢ染色し、ＢＳＡを標準としてデンシトメーターで測定した。培養は１．２ＬのＣＡＨ−Ａ培地（５μｇ／ｍｌ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）を用い、３２℃、通気１ｖｖｍ、攪拌８００ｒｐｍで行った。
実施例１３  ＡＭ−ｇｌｙ生産確認
実施例１２の培養液より調製したＵｓｐＡ［１−８４］−［Ａ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙ（配列番号７５、７６）、ＵｓｐＡ［１−５６］−［ＤＤ］−［ＧＳＧＳＧＤＡＦＥ］−ＡＭ−ｇｌｙの封入体画分を用いて実施例９、１０と同様の方法を用いてＡＭ−ｇｌｙの生産を試みたところ、生産可能であることが確認できた。封入体は溶解性の問題から８ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８を用いて溶解し、２５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に調製した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８を用いて２．５ｍｏｌ／Ｌ  ｕｒｅａまで希釈してＢＬａｓｅ反応を行った。反応終了後、２０％硫安を添加して一晩４℃に保存し、遠心分離によりＡＭ−ｇｌｙを含む沈殿物を回収した。ＡＭ−ｇｌｙの抽出は５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ４．０を用いて８０℃、１５分行った。実施例９、１０ではＢＬａｓｅ切断後付加蛋白質は上清中に残存したが、この場合ではＢＬａｓｅによって分解されてＡＭ−ｇｌｙと共に沈殿化した。しかしながら調製されたＡＭ−ｇｌｙ溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色でＵｓｐＡ部分配列に由来する断片の存在は確認されず、このような場合にでもＢＬａｓｅ消化・ＡＭ−ｇｌｙの沈殿化・抽出よりなる当生産方法は応用できることが確認できた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＡＭを遺伝子組換え技術により、効率的に大量生産することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ｐＲＳ５４０２の構造を示す。
第２図は、ｐＡＭＥ１１０２の構造を示す。
第３図は、ｐＡＭＥ３２０１の構造を示す。
第４図は、実施例５で調製したＡＭ−ｇｌｙの逆相ＨＰＬＣ溶出パターンを示す。
第５図は、ｐＡＭＥ３２０２の構造を示す。
第６図は、ｐＡＭＥ１１１１の構造を示す。
第７図は、ｐＡＭＥ３１０５の構造を示す。
第８図は、ｐＡＭＥ１２０１の構造を示す。
第９図は、種々のｐＨ条件でのＡＭ−ｇｌｙの不溶化による回収率の変化を示した。
第１０図は、種々のｐＨ条件でのＡＭ−ｇｌｙ沈殿物からのＡＭ−ｇｌｙの抽出効率を示した。
第１１図は、ＡＭ−ｇｌｙ抽出液の逆相ＨＰＬＣ溶出パターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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