(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子が挿入されたトランスファーベクターpFastBacHTを大腸菌DH10Bacに含まれるバクミドＤＮＡに挿入してなるグルコシルセラミド合成酵素発現用組換えバクミドでＳｆ９、Ｓｆ２１又はＨｉｇｈ５を形質転換した形質転換体。
【請求項２】
請求項１記載の形質転換体を培養し、該培養物からグルコシルセラミド合成酵素を採取することを特徴とするグルコシルセラミド合成酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はスフィンゴ糖脂質生合成の最初の段階に関与する酵素として重要なグルコシルセラミド合成酵素の新規な製造法及びこれに用いる発現用組換えバクミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコシルセラミド合成酵素は、ヒトを含む哺乳類の生体内でスフィンゴ糖脂質生合成の最初のグルコシル化に関与し、ウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）からセラミドへのグルコース転移を触媒し、グルコシルセラミドを合成する酵素である。当該グルコシルセラミド合成酵素は、他の糖転移酵素と異なり、細胞質側にその活性部位が存在するなど、特異な酵素であり、また精製中に失活しやすいため生体組織より活性の高い精製標品を得ることは困難であった。
【０００３】
最近市川らが、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子のクローニングに成功したことから、該酵素の大量生産が期待された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4638-4643(1996)及び特開平９−２４８号公報）。しかし、該報告によれば大腸菌及びＢ１６メラノーマ細胞で発現が試みられたが、その活性は僅かであり、活性についての定量的な記載はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的はグルコシルセラミド合成酵素の発現効率の良好な組換えベクターの構築及びこれを用いたグルコシルセラミド合成酵素の製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子のより効率のよい組換えベクターについて種々検討したところ、該遺伝子をトランスファーベクターであるpFastBacHTに挿入し、更にこれをバクミドＤＮＡに挿入して得られる組換えバクミドを用いれば、昆虫細胞中での発現が良好であり、天然の哺乳類組織に比べて約６０倍もの効率でグルコシルセラミド合成酵素が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子が挿入されたトランスファーベクターpFastBacHTをバクミドＤＮＡに挿入してなるグルコシルセラミド合成酵素発現用組換えバクミドを提供するものである。
また、本発明は上記組換えバクミドを保持する形質転換体を提供するものである。
更にまた、本発明は上記組換えバクミドを保持する形質転換体を培養し、該培養物からグルコシルセラミド合成酵素を採取することを特徴とするグルコシルセラミド合成酵素の製造法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の組換えバクミドは、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子をトランスファーベクターpFastBacHTに挿入し、更にこれをバクミドＤＮＡに挿入することにより得られる。
【０００８】
ここで、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子としては、例えばヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ等の哺乳類組織由来のグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。このうち、特開平９−２４８号公報記載のヒト由来のＤＮＡが好ましい例として挙げられる。また、かかる遺伝子は、これら公知のＤＮＡだけでなく、該塩基配列の１又は２以上の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
【０００９】
本遺伝子を導入するベクターpFastBacHTは、プラスミドであり、トランスポゾンｍｉｎｉ  ＴＮ７配列を含み、かつその両腕にゲンタマイシン耐性マーカー、バキュロウイルスプロモーター及び目的遺伝子挿入部位を含む。これは、例えばギブコビーアールエル社から入手可能である。
【００１０】
pFastBacHTへのグルコシルセラミド合成酵素遺伝子の挿入は、例えばグルコシルセラミド合成酵素遺伝子のＥｃｏＲＩ断片をpFastBacHTのＥｃｏＲＩ切断部位に挿入するのが好ましい。
【００１１】
かくして得られたpFastBacHTb 組換えプラスミドを挿入するためのバクミドＤＮＡとしては、ヘルパープラスミドとバキュロウイルスとのシャトルベクターとなるものであれば特に制限されないが、例えば大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに含まれているバクミドＤＮＡが好ましい。このバクミドには、コピー数を抑えるｍｉｎｉＦレプリコン、カナマイシン耐性マーカー及びｐＵＣ由来のｌａｃＺα遺伝子が含まれている。またこのｌａｃＺα中には、リーディングフレームを損なわないようにｍｉｎ−ａｔｔＴＮ７が挿入されている。
【００１２】
バクミドＤＮＡの組換えは、ＤＨ１０Ｂａｃのコンピテントセル中に前記pFastBacHTb 組換えプラスミドを導入すればよい。形質転換体の選択は、ｌａｃＺの欠失及びゲンタマイシン耐性獲得を指標にすればよい。
【００１３】
得られたクローンからバクミドＤＮＡを抽出すれば本発明の組換えバクミドが得られる。なお、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子のバクミドＤＮＡへの挿入の有無はＰＣＲにより確認できる。
【００１４】
本発明組換えバクミドを導入するための宿主細胞としては、バキュロウイルスが感染する細胞であれば特に制限されないが、通常Sphodptera fragiperda又はTrichoplusia ni等の昆虫細胞が用いられる。中でもＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ５等が好ましく、それ自体強いグルコシルセラミド合成酵素を産生しない点でＳｆ９が特に好ましい。導入手段としてはセルフェクチンを用いたリポソーム法が好ましい。感染培養細胞からバキュロウイルスを得、このウイルスを宿主細胞に再度感染させれば、グルコシルセラミド合成酵素を発現する形質転換体が得られる。
【００１５】
得られた形質転換体を培養し、該培養物からグルコシルセラミド合成酵素を採取すれば、グルコシルセラミド合成酵素が大量に生産できる。形質転換体の培養は、用いた宿主細胞が増殖する条件であれば特に制限されない。また該培養物からのグルコシルセラミド合成酵素の採取は、例えば硫安分画、塩析、各種クロマトグラフィー等を適宜組合わせて行うことができる。
【００１６】
かくして大量生産されたグルコシルセラミド合成酵素は、ＵＤＰ−Ｇｌｃとセラミドからグルコシルセラミドの合成に利用できるとともに、他の糖転移酵素と併用することにより、より複雑な糖脂質の合成を行うことができる。
【００１７】
【実施例】
実施例１
（１）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子
特開平９−２４８号公報記載のヒト由来グルコシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡより目的とする配列をＰＣＲ反応により増幅させた。すなわち、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡ断片を、両端のプライマーを用いることにより増幅させた。
【００１８】
得られた増幅ＤＮＡをＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）を用いてｐＣＲ２．１ベクター中へクローニングした。
【００１９】
（２）pFastBacHTへの挿入
得られた遺伝子をＥｃｏＲＩで切断し、pFastBacHTもまたＥｃｏＲＩで切断し、ホスファターゼ処理後ライゲーション反応を行った。遺伝子を挿入したプラスミドは、大腸菌中に形質転換した後、個々のクローンについてプラスミドを抽出し、挿入方向を確認した。挿入されたプラスミドをpFastBacHTbGCSとする。
【００２０】
（３）バクミドＤＮＡへの挿入
pFastHTbGCS を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（ギブコＢＲＬ社）を形質転換すると、このプラスミドは大腸菌中に含まれるバクミドＤＮＡに挿入される。
これにより得られた形質転換体をαコンプリメンテーションアッセイにより選択した。すなわち、基質としてハロゲン化インドリル−β−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ、ギブコビーアールエル社）を使用し、寒天培地にはＬＵＲＩＡＡＧＡＲ（ギブコビーアールエル社）を使用した。この寒天培地には５０μｇ／mLカナマイシン、７μｇ／mLゲンタマイシン、１０μｇ／mLテトラサイクリン、１００μｇ／mLＢｌｕｏ−Ｇａｌ、４０μｇ／mLイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して使用した。この培地に形質転換体を植菌後３７℃で２４時間培養し、更に４℃で２日間培養した後カラーセレクション、すなわち、出現したブルー及びホワイトコロニーのうち、ホワイトコロニーを採取した。
【００２１】
（４）組換えバクミドの採取
得られたコロニーを、５０μｇ／mLカナマイシン、７μｇ／mLゲンタマイシン、１０μｇ／mLテトラサイクリンを含む２×ＹＴ１４培地を用いて培養を行った。１．５mLの培地から集菌を行い、３００μＬ  ＳｏｌＩ（１５mM  トリス−ＨＣｌ（pH８．０）、１０mM  ＥＤＴＡ、１００μｇ／mL  ＲＮａｓｅＡ）に菌体を懸濁した後、３００μＬ／Ｓｏｌ II（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加え穏やかに攪拌し５分間室温で静置した。更に、３００μＬのＳｏｌ III（３Ｍ酢酸カルシウムをゆっくり加え、穏やかに攪拌した後、氷上に１０分静置した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の上清にイソプロパノール８００μＬを加え穏やかに攪拌、−２０℃で一晩放置した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の沈殿物を、冷７０％エタノールでよくリンスして自然乾燥後、穏やかに１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ（ＴＥ）中に溶解した。
【００２２】
（５）昆虫細胞の形質転換
振盪培養のＳｆ９細胞（対数増殖期のもの）９×１０5（５０ｕｎｉｔ／mLペニシリン、５０μｇ／mLストレプトマイシンを含む２mLのＳＦ９００ II ＳＦＭ培地中）を３５mmウエル上にまいた。１時間以上２７℃で静置し、細胞が付着することを確認した。
（４）により得たバクミドＤＮＡ５μＬを抗生物質を含まないＳＦ９００ II ＳＦＭ培地１００μＬ中に希釈し、これをＡ液とした。６μＬのセルフェクチン試薬を同様に抗生物質を含まないＳＦ９００ II ＳＦＭ培地１００μＬ中に希釈しこれをＢ液とした。２つの溶液Ａ、Ｂを穏やかに混合し、室温で３０分放置した。この混合液全量を、８００μＬのＳＦ９００ II ＳＦＭ培地を含むチューブ中に添加し、Ｃ液とした。
抗生物質を含まないＳＦ９００ II ＳＦＭ培地約２mLで２回細胞を洗浄した後、Ｃ液をウエル中に加え、２７℃で５時間放置した後、抗生物質を含むＳＦ９００ II ＳＦＭ培地２mLに置換した。ＤＮＡを摂取して７２時間後、培養上清を回収しこれをウイルス液とした。
２×１０6ｃｅｌｌｓ／mLの振盪培養細胞に１／１００量の上記ウイルス液を加え、３日間培養した上清を標準ウイルス液とした。以下の実験ではこの標準ウイルス液のタイターを２×１０7ＰＦＵと仮定して使用量などを計算し、順次Ｓｆ９細胞を感染させ、グルコシルセラミド合成酵素を発現させた。
【００２３】
（６）昆虫細胞の培養法及びホモジェネートの作成
Ｓｆ９細胞は、１００ｕｎｉｔ／mLペニシリン、１００μｇ／mLストレプトマイシンの抗生物質を含むＳＦ９００ II ＳＦＭ培地に馴化し、主に振盪培養で培養した。振盪培養は２７℃、振盪速度１３０rpmで、２×１０5〜４×１０6cells／mLの範囲内で行った。培養した細胞は、２，０００rpm 、１０分間遠心して収穫し、約１０倍量のホモジェネートバッファー（１mM  ＥＤＴＡ、０．２５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１mMフェニルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含む５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．４）に懸濁し、更に１０mLのガラスホモジェナイザーを使用して１，０００rpm 、１０ストロークのホモジェナイズを行った。これを電気泳動や活性測定のサンプルとした。
【００２４】
（７）ウエスタンブロッティング
Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（Nature, ２２７，６８０−６８５（１９７０））により、ＳＤＳ化、電気泳動したサンプルは、トランスブロットＳＤセミドライトランスファーセル（バイオラッド社）により、セミドライ法により、ニトロセルロースメンブレン（サポーター付き）上に転写した。蛋白質の分子量マーカーとしてプレステインドマーカーを使用した。各サンプルは１レーン５μｇずつロードした。転写は定電圧で、２０Ｖ４０分間通電することにより行った。転写緩衝液には２５mMトリス、１９２mMグリシン、１％ＳＤＳ、２０％メタノールpH８．３を使用した。
メンブレンは０．５％、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で１０分×２回以上洗浄した。ブロッキングは３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間以上行い、１次抗体、２次抗体ともに１時間以上反応させ、それぞれ洗浄を行った。発現蛋白質の確認には１次抗体として抗Ｃ末ペプチド抗体をＰＢＳ中に１／５００希釈して用い、２次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギ抗体を１／５００希釈で用いた。なお、発色にはＲＥＮＡＩＳＳＡＮＣＥ  ＴＭ  ４ＣＮ  Ｐｌｕｓ（デュポン社製）を用いた。その結果、組換えバクミドで形質転換されたＳｆ９細胞は、グルコシルセラミド合成酵素を発現していることが確認された。
【００２５】
（８）グルコシルセラミド合成酵素の活性測定法
酵素のサンプル溶液に基質となるセラミドを界面活性剤と共に添加して酵素反応を行った。セラミド２０μｇと界面活性剤３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）１mgは有機溶媒に溶解し、リピッドフイルムの状態としてからバッファーに溶解した。更に、ＵＤＰ−〔Ｕ−14Ｃ〕グルコース２．１nmol（２３．１kBq）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（pH６．４）５．０μmol、ＭｎＣｌ2 ５００nmol、ＭｇＣｌ2 ２５０nmol、ＤＴＴ５００nmol、酵素（ホモジェネート）２５μＬを加え、反応容量１００μＬとした。反応はＵＤＰ−〔Ｕ−14Ｃ〕グルコースを添加することにより開始し、３７℃にて１０〜６０分間インキュベーションした。反応はメタノール添加により停止した後、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，９１１（１９５９））により抽出、窒素気流下で乾固した。抽出物はクロロホルム：メタノール＝１：１の溶媒に溶かし、ＨＰＴＬＣにより分離した。展開はカマグ社製の水平展開層を用いた。展開溶媒にはクロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４を用いた。ＴＬＣプレート上の生成物の検出は富士写真フィルム（株）製のバイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ２０００を用いて行った。
【００２６】
以上の如くして、組換えバクミドで形質転換されたＳｆ９細胞のホモジェネートには２０〜７０pmol／mg／minのグルコシルセラミド合成酵素活性が確認された。この活性は、ラット脳の膜画分の比活性と比べ十数倍高いものであった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によればスフィンゴ糖脂質の合成に有用なグルコシルセラミド合成酵素を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明形質転換細胞が生産するグルコシルセラミド合成酵素の比活性を示す図である。
【図１】
0004300331.tif 000002