(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変されたグルコノバクター属細菌であって、前記酵素が、下記（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかに示すタンパク質であるグルコノバクター属細菌。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記遺伝子の細胞内のコピー数を高めること、又は前記遺伝子の発現調節配列の機能が強化されることにより、同遺伝子の発現が増強されたことを特徴とする請求項１に記載のグルコノバクター属細菌。
【請求項３】
前記遺伝子が、下記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに示すＤＮＡである請求項１または２に記載のグルコノバクター属細菌。
（ａ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列と０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列と０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２０に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２０記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列と０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列と０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
さらに、キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を増強することによりキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコノバクター属細菌。
【請求項５】
グルコノバクター・オキシダンスである請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコノバクター属細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルコノバクター属細菌をキシリトールの生合成原料に作用させてキシリトールを生成せしめることを特徴とする、キシリトールの製造方法。
【請求項７】
前記生合成原料がＤ−キシルロースである請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規遺伝子、及びＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌に関する。本発明の細菌は、キシリトール等の有用物質の生産に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールの需要は今後増加することが予想される。キシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低く、蔗糖に匹敵する甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料として利用されている。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第4,008,825号に記載されるようなＤ−キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
また近年は、微生物を用いてキシリトールを製造する方法が開発されている。例えば、他のペンチトールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがＤ−アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて製造できる（Can.J.Microbiol.,31 (1985) 467-471、J.Gen.Microbiol.,139 (1993) 1047-1054）。そこで、Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法がいくつか開発されている。Applied Microbiology., 18 (1969) 1031-1035には、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC20121を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダとしてンス（Acetobacter suboxydance suboxydans）を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Candida guilliermondii var. soya）を同Ｄ−キシルロースに作用させキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００５】
さらに、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター（Acetobacter）属細菌、グルコノバクター（Gluconobacter）属細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次いで同キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている（ヨーロッパ特許出願公開第403392号および同第421882号）。また、同キシロース／キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００６】
しかし、上記Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法は、比較的高収率でキシリトールを生成することができるが、多段階の反応ステップを必要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかった。
【０００７】
これらの問題点を解決するものとして、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ微生物を見出し、該微生物をＤ−アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法を開発した（ヨーロッパ特許出願公開第1 026 254号）。前記微生物としては、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のグルコノバクター属細菌またはアセトバクター属細菌等が含まれる。
【０００８】
上記の方法は、発酵法によって、Ｄ−アラビトールを簡単な一段階のプロセスで効率よくキシリトールに変換できる優れた方法であるが、反応の安定性や、キシリトールの収率に改善の余地があった。そこで、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ菌を解析し、本変換反応においてはＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ活性が関与することを明らかにした。そしてＤ−アラビトールからキシリトールへの変換反応の際に炭素源又は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を添加して反応を行うことによって、安定して高収率でキシリトールが生産できることを見出している（ヨーロッパ特許出願公開第1 026 255号）。
【０００９】
一方、遺伝子操作技術によりキシリトール発酵菌の育種が試みられている。クレブジエラ属細菌由来のアラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびピヒア（Pichia）属酵母由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、アラビトール発酵菌（キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属またはチゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属に属する酵母）に導入した遺伝子組換え菌を用いて、グルコースからキシリトールの発酵生産が試みられている（WO94/10325号国際公開パンフレット）。
【００１０】
さらに、エシェリヒア属細菌等の還元力供給能を有する微生物にグルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入し、同微生物をＤ−キシルロースに作用させ、キシリトールを生成させる方法が開発されている（米国特許第6,242,228号）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、グルコノバクター属細菌等を用いてＤ−アラビトールからキシリトールを製造する方法が開発されているが、Ｄ−キシルロースを還元してキシリトールに変換する工程の収率には改善の余地があった。本発明者らは、この反応（キシリトールデヒドロゲナーゼ反応）には補酵素ＮＡＤＨが必要であることから、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨの供給能を上昇させることにより、キシリトール生産能が向上すると考えた。しかし、グルコノバクター属細菌は、一般的にＮＡＤＨ生成経路とされるＴＣＡ回路が不完全であることが知られており、ＮＡＤＨの生成経路は不明であった。
【００１２】
本発明は、上記観点からなされたものであり、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する酵素及び遺伝子を同定、取得し、さらにそれらの遺伝子を利用してグルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成能を強化させ、それによってキシリトール等の有用物質の生産能を向上させることを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系を構築し、キシリトール収率を向上させる因子を単離、同定することに成功した。さらにこれらの因子の一つをコードする遺伝子がオペロンを形成しており、オペロン中の他の遺伝子もキシリトール収率を向上させる因子であることを見出した。そして、これらの遺伝子の発現を強化することにより、キシリトール生産能を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（３）のＤＮＡ。
【００１５】
（５）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１６】
（９）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（１０）のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２０に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２０記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１２）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１１）のＤＮＡ。
【００１７】
（１３）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１４）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１５）下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである（１４）のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１６）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１５）のＤＮＡ。
【００１８】
（１７）グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応に還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを必要とし、かつ、前記細菌は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法。
（１８）前記酵素活性が、トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ複合体、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性である（１７）の方法。
（１９）前記酵素活性の増強が、それぞれの酵素をコードする遺伝子の発現の増強によるものである（１９）の方法。
（２０）前記遺伝子の細胞内のコピー数を高めること、又は前記遺伝子の発現調節配列の機能が強化されることにより、同遺伝子の発現が強化されたことを特徴とする（１９）の方法。
（２１）前記目的物質がキシリトールであり、前記還元反応がＤ−キシルロースからキシリトールへの変換反応である（１７）〜（２０）のいずれかの方法。
（２２）前記細菌は、さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２１）の方法。
（２３）前記細菌は、グルコノバクター・オキシダンスである（１７）〜（２２）のいずれかの方法。
（２４）トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現が強化されるように改変されたグルコノバクター属細菌。
（２５）さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２４）のグルコノバクター属細菌。
（２６）グルコノバクター・オキシダンスである（２３）又は（２５）のグルコノバクター属細菌。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
＜１＞本発明のタンパク質及びＤＮＡ
本発明の第一のタンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質（以下、「TAL-PGI」ともいう）であり、本発明の第一のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「tal-pgi」ともいう）である。同タンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の両方を有するタンパク質であることが好ましい。トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性を単一ペプチド上に有するタンパク質は今まで報告されておらず、新規な酵素である。尚、本明細書において、TAL-PGIは、トランスアルドラーゼ活性に言及するときは「TAL」、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性に言及するときは「PGI」ということがある。
【００２０】
本発明の第二のタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「6PGADH」ともいう）であり、本発明の第二のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「gnd」ともいう）である。
【００２１】
本発明の第三のタンパク質は、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「RK」ともいう）であり、本発明の第三のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「rk」ともいう）である。
【００２２】
本発明の第四のタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「G6PDH」ともいう）であり、本発明の第四のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「zwf」ともいう）である。
【００２３】
本発明のＤＮＡは、上記のタンパク質の１又はそれ以上をコードするものであってもよい。特に、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡから、本発明の第一のＤＮＡ及び第二のＤＮＡは、単一ＤＮＡ断片として取得され得る。
【００２４】
これらのＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系において、キシリトール収率を向上させる因子として単離された因子をコードする遺伝子、及びそれに隣接する遺伝子として取得されたものである。しかし、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
前記プライマーとしては、表６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
グルコノバクター属細菌としては、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・サブオキシダンス等が、具体的にはグルコノバクター・オキシダンスAJ2847株（ATCC621）、グルコノバクター・サブオキシダンスNRRL B-775株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America）及びアグリカルチュアル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL)）（1815 North University Street, Peoria, Illiois 61604, United States of America）から入手することができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡの取得、及び、後述する本発明の細菌の構築に際して、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)等に記載されている。
【００２７】
上記のようにして得られる本発明のtal-pgiを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を配列番号１６に示す。このＤＮＡ断片中には、TAL-PGIをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流及び下流のそれぞれに、別のＯＲＦが見出された。これらは、トランスケトラーゼ及び6PGADHをそれぞれコードしており、前記ＤＮＡ断片は、オペロンを形成していると推定された。トランスケトラーゼのアミノ酸配列を配列番号１７に、TAL-PGIのアミノ酸配列を配列番号１８に、6PGADHのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【００２８】
また、本発明のrk遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るRKのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
さらに、本発明のzwfを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るG6PDHのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
【００２９】
本発明の第一のＤＮＡは、コードされるタンパク質のトランスアルドラーゼ活性又はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、好ましくはこれらの両方の活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むTAL-PGIをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３０】
本発明の第二のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む6PGADHであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３１】
本発明の第三のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、リブロキナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むRKであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３２】
本発明の第四のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むG6PDHであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３３】
上記のようなTAL-PGI、6PGADH、RK、又はG6PDHと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、tal-pgi、gnd、rk、又はzwfの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、TAL-PGI、6PGADH、RK、又はG6PDHと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するTAL-PGI、6PGADH、RK、又はG6PDHをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列もしくは塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列、配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列、配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性グルタミンシンテターゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、TAL-PGI、6PGADH、RK、又はG6PDHと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
プローブとして、配列番号１６、２０又は２２の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３６】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎトランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を、例えば後述の実施例８に記載の方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別することができる。
【００３７】
TAL-PGIと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上の相同性を有し、かつTAL-PGI活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
また、6PGADHと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１９に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上の相同性を有し、かつ6PGADH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
RKと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上の相同性を有し、かつRK活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
また、G6PDHと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２３に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上の相同性を有し、かつG6PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
＜２＞ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌
本発明の細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌である。
本発明の細菌は、具体的には、細胞内の、ＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌である。本発明の細菌として、例えば、TAL、PGI、6PGADH、RK、G6PDHよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌が挙げられる。これらの酵素のうち、好ましくは２つの酵素、より好ましくは３つの酵素、さらに好ましくは４つ、最も好ましくは５つ全ての酵素活性が増強されることが望ましい。尚、TAL活性、PGI活性を有する酵素としては、TAL-PGI複合体が挙げられるが、TAL-PGIは、少なくともいずれか一方の活性を有していればよく、両方の活性を有していてもよい。TAL、PGI、6PGADH、RK、及びG6PDHは、いずれも触媒する反応によって直接ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成するか、あるいは、ペントースリン酸回路全体の活性あるいは速度を増加させるか、又は、ペントースリン酸回路に流入する炭素源を増加させる反応を触媒し、結果としてＮＡＤＨの産生に寄与する。
【００４２】
本発明のグルコノバクター属細菌として具体的には、ＮＡＤＨを必要とする還元反応を含む生合成経路によって生成する目的物質を産生する細菌が挙げられる。このような目的物質としては、その生合成に還元反応を含み、同反応にＮＡＤＨを必要とする限り特に制限されず、キシリトール等の糖類、光学活性アルコール類、糖アルコール類等が挙げられる。「目的物質を産生する」とは、本発明の細菌を培養したときに、目的物質を培地中、又は細菌の細胞内に蓄積すること、好ましくは培地中に目的物質を蓄積することをいう。この目的物質を産生する性質は、グルコノバクター属細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００４３】
「酵素活性が増強されるように改変された」とは、細胞当たりの遺伝子産物の活性が非改変株、例えば野生型のグルコノバクター属細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりの遺伝子産物の分子の数が増加した場合や、遺伝子産物の分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のグルコノバクター属細菌とは、例えばグルコノバクター・オキシダンスAJ2847株（ATCC621）である。
【００４４】
酵素活性の増強は、例えば、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。遺伝子の発現量の増強は、該遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、目的とする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを目的物質生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。また、目的物質生産能を有しないグルコノバクター属細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に目的物質生産能を付与してもよい。
【００４５】
導入する遺伝子は、エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００４６】
グルコノバクター属細菌で機能するベクターとは、例えばグルコノバクター属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的には、グルコノバクター・オキシダンスIFO3171株由来の内在性プラスミドpAG5、またはその誘導体が挙げられる（米国特許第6,127,174号）。また、これらのベクターからグルコノバクター属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びグルコノバクター属細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、pSG8、pSG6、及び実施例に記載したpSA19（Biosci. Biotech. Biochem., 58(10), 1899-1901, 1994）等が挙げられる。
【００４７】
なお、pSG8を保持するエシェリヒア  コリJM109株は、プライベートナンバーAJ13485が付与され、平成１９９８年７月２１日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６郵便番号）に寄託され、受託番号FERM P-16903が付与され、１９９９年６月１４日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6760が付与されている。
【００４８】
上記ベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４９】
目的遺伝子とグルコノバクター属細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００５０】
組換えＤＮＡをグルコノバクター属細菌に導入するには、通常の形質転換法、例えば電気パルス法等を用いることができる（米国特許第6,127,174号）。
目的遺伝子のコピー数を高めることは、該遺伝子をグルコノバクター属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。グルコノバクター属細菌の染色体DNA上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００５１】
遺伝子の発現の強化は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上の目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により目的遺伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５２】
発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
本発明のグルコノバクター属細菌を用いてキシリトールを効率よく生産するには、ＮＡＤＨ生成能の強化と同時に、キシリトール生合成に関与する酵素の活性が上昇するにように改変されたた菌株を用いるのが好ましい。このような酵素としては、例えばキシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）が挙げられる。キシリトールデヒドロゲナーゼは、Ｄ−キシリトールからキシリトールを生成する反応を触媒するＤ−キシルロースリダクターゼ活性を有している。本発明においては、この活性を、XDH活性という。
【００５３】
XDH活性の増強は、例えば、XDHをコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。同遺伝子の発現量の増強は、XDHをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、XDHをコードする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをキシリトール生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。
【００５４】
XDHをコードする遺伝子としては、ピヒア・スティピティス（FEBS Lett., 324, 9 (1993)）及びモルガネラ・モルガニ（DDBJ/GenBank/EMBL accession No.L34345）由来の遺伝子、及び、グルコノバクター・オキシダンスのXDH1遺伝子、及びXDH2遺伝子（米国特許第6,242,228号）が挙げられる。発現容易の観点からは、グルコノバクター属細菌由来の遺伝子を用いることが好ましい。
【００５５】
グルコノバクター属細菌のXDHをコードする遺伝子（gdh遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（米国特許第6,242,228号）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば表１１に示すプライマーを用いて、グルコノバクター属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、XDH遺伝子を取得することができる。グルコノバクター属細菌等の他の微生物のXDHをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
【００５６】
XDH遺伝子のグルコノバクター属細菌への導入は、前記のＮＡＤＨ生成に関与する遺伝子と同様にして行うことができる。
【００５７】
＜３＞目的物質の製造法
本発明の方法は、グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とし、かつ、前記細菌はＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素の活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法である。
【００５８】
本発明のグルコノバクター属細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されており、生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とする目的物質を効率良く産生することができる。
【００５９】
目的物質の生合成原料としては、目的物質によって、本発明のグルコノバクター属細菌の培養に必要とするグルコース等の炭素源であってもよいし、目的物質の生合成の中間体であってもよい。例えば、目的物質がキシリトールである場合は、原料としてはＤ−アラビトール、Ｄ−キシルロースが挙げられる。
【００６０】
本発明のグルコノバクター属細菌を生合成原料に作用させるには、同細菌を培養する培地に前記原料を添加してもよいし、同細菌の菌体と原料を液体中で混合してもよい。さらに、本発明の細菌又はその処理物を固定化した担体を詰めたカラムに、原料溶液を通液してもよい。
【００６１】
以下に、目的物質としてキシリトールを製造する方法を例示する。
本発明の細菌を培養する培地は格別の制限はなく、該細菌によって利用される通常の炭素源、窒素源、リン源、無機イオン、更に必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、等が使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩その他が用いられる。リン源としてはリン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等が使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。
【００６２】
また、本発明の細菌が持つＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼまたはキシリトールデヒドロゲナーゼの誘導剤として、Ｄ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトールなどの糖類や糖アルコールを培地に添加することによって、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する反応に関与する酵素の活性が向上する場合がある。
【００６３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下pH5〜8及び温度25〜40℃の範囲内で、pH及び温度を適当に制限しつつ12〜72時間程度培養を行なえばよい。
【００６４】
かくして培養されたグルコノバクター属細菌を、Ｄ−アラビトールに接触反応させることにより、反応液中にキシリトールを生成することができる。本発明の方法において前記「グルコノバクター属細菌」は、菌体そのものであってもよいし、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する能力を有する限り菌体の処理物であってもよい。具体的には、菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体固定化処理物、アセトン処理または凍結乾燥等した菌体、菌体破砕液、Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを含む菌体破砕液の分画物もしくは精製酵素画分、又はこれらの処理物の固定化物等が挙げられる。
【００６５】
Ｄ−アラビトール濃度に格別の制限はなく、通常1〜50%(w/v)、好ましくは5〜40%(w/v)が好ましい結果を与える。また反応の際、基質のＤ−アラビトールを分割添加することにより収率が向上する場合がある。反応条件にも格別の制限はなく、通常は、好気的条件下で、反応温度20〜60℃、望ましくは30〜40℃で、反応pH3.0〜10.0望ましくはpH4.0〜7.0で好結果を与える。尚、反応液に炭酸カルシウムを例えば2%(w/v)となるように添加するなどして、反応時のpHの低下を防ぐと、キシリトールの収率を高めることができる場合がある。反応には、静置反応あるいは撹はん反応のいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、1〜100時間が望ましい。
【００６６】
本発明において、菌体を用いる場合には反応系に炭素源を添加することが、収率の点から好ましい。また、菌体処理物を用いる場合には反応系にさらにNADH又はNAD+を添加してもよい。
【００６７】
前記炭素源としては、代謝される際にNADHの生成を伴う炭素源であれば特に制限はないが、糖、糖の誘導体、アルコール類、アルデヒド類、および有機酸類等が挙げられる。糖としてはグルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースが挙げられる。糖の誘導体としてはソルビトール、マンニトール、グリセロール等の糖アルコール、グルコン酸等のアルドン酸等が挙げられる。また、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、1,4−ブタンジオール、2,3−ブタンジオールなどが、アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、グリセロアルデヒドなどが、また有機酸類としてはギ酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸などが挙げられる。これらの炭素源は、単独で使用してもよく、任意の２種または３種以上の炭素源を混合物として使用してもよい。これら炭素源の添加量は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、合計で0.2〜40%(w/v)、好ましくは0.5〜20%(w/v)が好ましい結果を与える。これらの炭素源の添加時期は格別の制限はなく、反応開始時から添加しても、反応途中で添加しても、また分割添加してもよい。
【００６８】
本発明の細菌を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応の進行には、Co2+イオンの存在が有効である。本発明の方法によるキシリトールの生産においては、前記変換反応は、0.1mM以上のCo2+イオンの存在下で行うことが好ましい。
【００６９】
上記のようにして培養液中に生成したキシリトールは、常法に従って反応液より採取分離される。具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その溶液から結晶化する方法が採用できる。
【００７０】
また、キシリトール以外の目的物質についても、目的物質に応じて採取分離方法を適宜選択すればよい。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７２】
【実施例１】
インビトロ再構成系でのアラビトール→キシリトール変換反応系の構築
G. oxydansの可溶性画分に存在するキシリトール収率向上因子を単離・精製するために、以下のアッセイ系を構築した。
【００７３】
G. oxydans AJ2847株（ATCC621）をYPGプレート（3g/dl グルコース、0.5g/dl イーストエキストラクト、0.3g/dlペプトン、2g/dl 寒天末）で30℃、24hr、リフレッシュ培養したのちに、SR培地（2g/dl グルコン酸ナトリウム、0.5g/dl グルコース、0.3g/dl グリセロール、0.3g/dl イーストエキストラクト、0.2g/dl ペプトン、pH 6.5）を50ml入れた坂口フラスコに一白金耳接種し、30℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を50ml のSR培地を入れた坂口フラスコ４本に５％接種し、30℃で24時間振盪培養した。
【００７４】
上記培養液から遠心分離により集菌し、50mM リン酸カリウム緩衝溶液(pH6.5)（以下、KPBと略する）で洗浄した湿菌体2gを10mlのKPB (pH6.5)に懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。8000rpm、5分間の遠心分離を２回行って菌体残さを除いた上清を、50000rpmで30分間超遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として得た。一方沈殿をKPBで洗浄した後に2mlのKPBに溶解し、膜画分を調製した。
【００７５】
上記のようにして調製した膜画分と可溶性画分を用いて、以下の組成の反応液でアラビトール→キシリトール変換反応を行った。反応は1.5ml容エッペンドルフチューブ中で30℃で24時間行った。
【００７６】
〔反応溶液組成〕
0.5g/dl  D-アラビトール
20mM NAD (pH5.0)
50mM KPB (pH6.0)
1mg タンパク質／ml 膜画分
1mg タンパク質／ml可溶性画分
【００７７】
上記反応液200μｌをサンプリングし、10μｌの100% TCA（トリクロロ酢酸）を添加して、15000rpmで10分間遠心分離してタンパク質を沈殿させ、得られた上清に10μｌの6N KOHを添加して中和した後に、下記条件のHPLCにて生成キシリトール量を定量した。その結果、0.5g/dlのD-アラビトールから0.14g/dlのキシリトールが生成した。
【００７８】
〔HPLC分析条件〕
カラム：Shodex SC1211〔昭和電工社製品〕
移動層： 50ppm Ca-EDTA水溶液
流  速：1 ml/分
温  度：80℃
検  出：RI検出器
【００７９】
【実施例２】
アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果
50mM KPB (pH6.0)、1g/dl アラビトール、10mM NAD (pH5)、1mg タンパク質／ml膜画分、1mgタンパク質／ml可溶性画分からなる反応液に、以下に示す金属イオンを終濃度1mMとなるように添加して30℃で６時間反応を行い、アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果を検討した。
【００８０】
〔添加金属イオン〕
CaCl2、MgCl2、CoSO4、NiCl2、MnSO4、ZnSO4、EDTA
【００８１】
反応液中のキシリトール、Ｄ−キシルロース及びＤ−アラビトールをHPLCにより定量した結果を表１に示す。CoSO4添加区において、生成キシリトール量の増加が認められ、D-アラビトールからのキシリトール生産にCo2+が効果的であることが明らかとなった。
【００８２】
【表１】
0004333088.tif 000002
【００８３】
【実施例３】
G. oxydansの還元力供給因子の精製
G. oxydans AJ2847株（ATCC621）の可溶性画分から還元力供給因子の精製を以下の通り行った。還元力供給能は、インビトロのＤ−アラビトール→キシリトール変換反応系での生成キシリトールの増加で検出した。反応条件を示す。
【００８４】
〔反応溶液組成〕
50mM KPB (pH6.0)
1g/dl アラビトール
10mM NAD (pH5)
1mgタンパク質／ml膜画分
1mgタンパク質／ml可溶性画分
1mM CoCl2
【００８５】
〔反応条件〕
30μl酵素画分/200μl反応液、３０℃、16時間反応後、TCA処理・中和処理を行いHPLCにて定量した。
【００８６】
（１）可溶性画分の調製：
洗浄菌体約10g（1L培養分）を45mlの50mM KPB(pH 6.5)に懸濁し、４℃で20分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（×8000rpm、10分間×2回）により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（x50000rpm、30分間）し、得られた上清を可溶性画分とした。また、沈殿は適宜KPBに懸濁し、膜画分としてインビトロ再構成系での酵素源とした。
【００８７】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Q-Sepharose FF
上記の可溶性画分18mlをバッファーA（20mM Tris-HCl(pH7.6)）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose FF 26/10（ファルマシア社製、CV=20ml）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて吸着したタンパク質の溶出を行った（総溶出液量100ml）。各溶出画分についてインビトロ再構成系に供してキシリトール生成量の増加効果を検出したところ、350〜450mMに相当する位置と、550mMに相当する位置の２箇所にキシリトール生成活性（以下、「NRF活性」ということがある）のピークを検出した。以下、それぞれのピークを順に「NRF1」、「NRF2」ということがある。また、これらを総称してNRFと呼ぶことがある。
【００８８】
（３） ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephadex 200 HP）
NRF1、NRF2を含む画分をそれぞれ集めて、バッファーAに対して透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液（それぞれ30ml、6ml）を、限外ろ過膜centriprep 10（アミコン社製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーB(20mM Tris-HCl(pH7.6),0.1M KCl)で平衡化されたゲルろ過カラム（Sephadex 200 HP（ファルマシア社製））にアプライし、1ml/分の流速で溶出した。NRF1は２回に分けて、NRF2は１回で、それぞれ0.8mlずつ分離操作を行った。この操作によりNRF1及びNRF2は、それぞれ、69〜72ml、70〜74mlの画分に溶出された。
【００８９】
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー（Mono Q HR5/5）
得られた画分（NRF1:12ml、NRF2:4ml）を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーAで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Mono-Q HR 5/5（ファルマシア社製））に供した。この操作により、NRFは担体に吸着した。
【００９０】
バッファーAにより非吸着タンパク質を洗い流した後、KCl濃度を直線的に0mMから700mMへ変化させてタンパク質の溶出を行った（総液量15ml）。各溶出画分についてNRF活性を測定し、KCl濃度が300mM 、500mMの溶出位置にそれぞれNRF活性が認められた。
【００９１】
（５）疎水性クロマトグラフィー（Phenyl Superose HP HR 5/5）
活性が検出されたそれぞれの溶液をバッファーC（50mM  Tris-HCl(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH 7.0）に対して透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーCで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム（Phenyl Superose HP（ファルマシア社製））に供した。この操作によりNRFは担体に吸着した。
【００９２】
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーCを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を1Mから0Mまで直線的変化させてNRFを溶出をさせた。得られた各溶出画分についてNRF活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ200〜400mM、100〜200mMの溶出位置にNRF活性がそれぞれ認められた。
【００９３】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をそれぞれSDS-PAGEに供したところ、NRF1画分については約100kDaに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。またNRF2画分は約60kDaのバンドが検出された。
【００９４】
【実施例４】
NRF1、NRF2のN末アミノ酸配列の決定
精製したNRF1、およびNRF2について、タンパク量約10μg分をSDS-PAGEに供した後、ゲル中のNRF1およびNRF2をミリポア社ミニブロットを用いてPVDFフィルターに転写し、プロテインシーケンサー（ABI社製、モデル476A）によってアミノ酸配列をＮ末端から解析した。
【００９５】
また、NRF1の内部アミノ酸配列についても解析を実施した。SDS-PAGEゲル中の試料をリジルエンドペプチダーゼ処理し（pH8.5、35℃、20時間）、逆相HPLCに供して断片ペプチドを分離した。分取した画分のうち、１つのフラクションについてアミノ酸配列を決定した。結果を表２に示す。表中、カッコ内はアミノ酸配列決定において不明瞭であったアミノ酸残基を示す。
【００９６】
【表２】
0004333088.tif 000003
【００９７】
【実施例５】
nrf1、nrf2遺伝子のクローニング
G. oxydans ATCC621株をYPG培地を用いて30℃で一晩培養した。この培養液5mlを種菌として、100mlの YPG 培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液100mlを遠心分離操作（12000×G、４℃、15分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
【００９８】
決定したNRF1、NRF2それぞれのN末端アミノ酸配列およびNRF1の内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマーを合成した（表３）。
【００９９】
【表３】
0004333088.tif 000004
【０１００】
作製したミックスプライマーを用いて、カセットPCR法によるnrf1,nrf2遺伝子断片の取得を行った。カセットPCR法はTaKaRa LA PCR インビトロ Cloning Kit（宝酒造社）を使用し、本キットに添付に添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。
【０１０１】
塩基配列の決定は、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用いたPCR反応により行った。また電気泳動は、DNA Sequencer model 373もしくはmodel 311（ABI社製）を用いて行った。
【０１０２】
カセットPCRで増幅したDNA断片の一部を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。DNAプローブの作製はDIG High Prime（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに37℃で一晩インキュベートしてプローブの標識を行った。プローブとして用いたDNA断片の増幅に用いたPCRプライマーの配列を表４に示す。
【０１０３】
【表４】
0004333088.tif 000005
【０１０４】
サザン解析は、染色体DNA 1μgを各種制限酵素で完全に消化し、0.8％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下キットに添付のマニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、50℃ で1時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、O/Nでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。
【０１０５】
コロニーハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。染色体DNAを適当な制限酵素で処理後、サザン解析にて検出されたバンド長に相当する大きさの断片を回収してpUC18又はpUC118に連結し、連結反応液でE. coli JM109を形質転換してライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Hybond-N、アマシャム社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、42℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作製した標識プローブを添加し、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。SSCでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出を、DIG Nucleotide Detection Kit（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。
【０１０６】
（１）nrf1（tal-pgi）およびgnd遺伝子のクローニング
nrf1のクローニングは、以下のようにして行った。まず決定したN末アミノ酸配列の情報を基にカセットPCR法でコード領域を取得した。次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約8.5kbpのDNA断片を取得した。
【０１０７】
カセットPCR法によるnrf1遺伝子断片の取得はTaKaRa LA PCR インビトロ Cloning Kit（宝酒造社）を使用し、本キットに添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。まず、染色体DNA 5μgをHindIIIで消化した。次に、制限酵素断片にHindIII Cassetteを連結し、Primer C1とPrimer NRF1-N1を使用して１回目のPCRを行った。PCR反応は、PCR Thermal PERSONEL（宝酒造社製）を用いて行い、以下の条件で30サイクル行った。94℃  30秒、55℃  2分、72℃  1分。
【０１０８】
次に、この反応液を100倍に希釈して、Primer C2及びPrimer  NRF1-N2を新たに加えて２回目のPCRを行った。条件は１回目と同じであった。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約2.2kbのDNA断片の増幅が確認された。このDNA断片をpUC18にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したDNA断片から推定されるアミノ酸配列が、NRF1のN末端アミノ酸配列と一致しており、目的のnrf1遺伝子が取得されたことが確認された。
【０１０９】
nrf1遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したnrf1遺伝子の内部を表３に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、それぞれプローブと強くハイブリダイズする約3.6kbpのXhoI/EcoRI断片（上流域）と、約4.8kbpのXhoI/BamHI断片（下流域）を検出した。そこで、定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれらの断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号１６）。
【０１１０】
nrf1遺伝子をクローニングした結果、本遺伝子のコード領域は2871bpで、957アミノ酸残基からなる103kDaのタンパク質をコードしていた。推定されるアミノ酸配列（配列番号１７）を相同性検索にかけたところ、N末側の17〜381番残基はトランスアルドラーゼ(TAL)との相同性が認められ、Nostoc punctiforme由来TALと46%の相同性を有していた。また、C末側の434〜769番残基はグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(PGI)との相同性が認められ、Thermotoga maritima由来PGIと27%の相同性を有していた。
【０１１１】
また、nrf1の周辺領域をクローニングした結果、nrf1の上流、下流に１つずつorfが存在しており、これら３つの遺伝子はオペロンを形成していると推定された。上流のorf1は685アミノ酸残基からなる73.5kDaのタンパク質をコードしており（配列番号１８）、トランスケトラーゼ(TKT)との相同性を有していた。また、下流のorf2は332アミノ酸残基からなる35.9kDaのタンパク質をコードしており（配列番号１９）、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（「6PGADH」または「GND」と省略する。またこれをコードする遺伝子を「gnd」と略す。）との相同性を有していた。具体的には、Methylobacillus flagellatus由来NAD-NADP型GNDと43%の相同性を示した。このことから、nrf1オペロンは、ペントースリン酸回路の遺伝子をコードしているものと推定された。一般的に、GNDはNAPD型であることが広く知られているが、orf2はNAD-NADP型GNDとより高い相同性が認められられたことから、本遺伝子産物がNAD-NADP型GNDである場合には、還元力（NADH）供給遺伝子としての効果を有する可能性が考えられた。
【０１１２】
（２）nrf2（RK）遺伝子のクローニング
nrf2のクローニングは、以下のようにして行った。まず、遺伝子の上流領域をカセットPCRで取得し、次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約4.2kbpのDNA断片を取得した。
【０１１３】
nrf1遺伝子断片のクローニングと同様に、カセットPCR法により、Primer NRF2AS1とNRF2AS3を用いてnrf2遺伝子上流域の増幅を行ったところ、約1.5kbのDNA断片の増幅が確認された。このDNA断片をpUC18にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したDNA断片から推定されるアミノ酸配列が、NRF2のN末端アミノ酸配列と一致しており、目的のnrf2遺伝子の上流領域が取得されたことが確認された。
【０１１４】
nrf2遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したnrf2遺伝子の内部を表４に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、プローブと強くハイブリダイズする約4.2kbpのEcoRI断片を検出した。そこで定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれら断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号２０）。
【０１１５】
nrf2遺伝子のコード領域は1644bpであり、548アミノ酸残基からなる59kDaのタンパク質（配列番号２１）をコードしていた。アミノ酸配列の相同性検索を行ったところ、RK、リビトールキナーゼやキシルロキナーゼなどのシュガーキナーゼとの高い相同性が認められた。具体的には、E. coli由来リビトールキナーゼと44%の相同性を示した。
【０１１６】
【実施例６】
G. oxydansのNAD-NADP型G6PDHおよびNAD-NADP型6PGADH活性の検出
以上の結果より、G. oxydansのペントースリン酸回路を強化することにより還元力（NADH）が得られることが示された。そこで、以下の方法で、G. oxydansのペントースリン酸回路の酵素活性を測定したところ、G. oxydansにおいてNADHを供給する酵素として、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）と６-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGADH）を新たに見出した。
【０１１７】
〔グルコース-6-リン酸 (G6P)デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
100mM Tris-H2SO4 (pH8.2)
0.5mM NAD(P)
15mM グルコース-6-リン酸
【０１１８】
〔6-ホスホグルコン酸 (6PGA)デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
100mM Tris-H2SO4(pH8.2), 0.5mM NAD(P), 15mM 6-ホスホグルコン酸
【０１１９】
ともに、G. oxydansの可溶性画分を酵素源とし、340nmの吸光度の増加を測定した。また、それぞれの酵素活性のpHプレフィールを測定した。ｐHプレフィール作成には、酢酸ナトリウム(pH 5.0〜6.5)、Tris-HCl (pH 7.0〜8.5)、グリシン-NaOH（pH 9.0〜10.5）の各バッファーを用いた。結果を図１及び図２に示す。
【０１２０】
以上の検討により、G. oxydansにおいて、G6PDHと6PGADHの２つの酵素が、NADとNADPのいずれも補酵素とし得るNAD-NADP型酵素であることを見出した。
広く一般的には、これらの酵素はNADP特異的酵素として知られているが、G6PDHについては、ある特定の種においては（例えばLeuconostoc mesenteroides）、NAD-NADP型活性を示すことが報告されている（J. Bacteriol., 169, 334 (1987)）。しかし、酢酸菌においてはG6PDHはNADP型とされており(Microbiol. Rev. 55, 35 (1991); Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 1377 (1996))、酢酸菌G6PDHがNADにも活性を示すことを今回はじめて見出した。
【０１２１】
なお、Acetobacter xylinumにおいては、NADP型酵素に加えて、NAD型の酵素が報告されている (J. Biological. Chemistry, 248, 1603 (1973); Arch. Biochem. Biophys., 310, 360 (1994))。ただし、このNAD型の酵素はG6Pだけでなくグルコースも基質とし、しかもｐH5.6に至適を持つ特異な酵素である。しかし、今回G. oxydansに見出されたNAD型活性の至適pHは約9.5であり、また、NADを補酵素とした場合、グルコースを基質としたときには活性が検出されなかった。従って、G. oxydansにはAcetobacter xylinumのような特異な酵素は存在せず、G6PDHがNAD-NADP型の活性も示すと考えられる。一方、6PGADHについては、酢酸菌においてはこれまで全く報告が無く、こちらも新規な酵素である。
【０１２２】
【実施例７】
G6PDH遺伝子（zwf）のクローニング
E. coli W3110株の染色体DNAを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表５に示すプライマーを用いて、E. coliのG6PDH遺伝子（zwf）の一部を増幅した。得られた断片をプローブとして使用し、G. oxydansの染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、バンドが検出された。このうち、約4kbのBamHI切断断片について、pUC18をベクターとして約5000クローンよりなるライブラリーを構築した。このライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーションにより目的クローンを選抜した。挿入断片の塩基配列を決定し（配列番号２２）、zwf遺伝子と推定される読み取り枠を見出した。この読み取り枠は、488アミノ酸残基よりなるタンパク質をコードしており（配列番号２３）、そのタンパク質はE. coliのG6PDHと43.6％の相同性を示した。
【０１２３】
【表５】
0004333088.tif 000006
【０１２４】
【実施例８】
tal-pgi、rk、NAD-NADP型G6PDH(zwf)およびNAD-NADP型6PGADH(gnd)のE. coliでの発現と酵素活性測定
nrf1、nrf2遺伝子をクローニングした結果、相同性検索からNRF1はトランスアルドラーゼとグルコースリン酸イソメラーゼの２機能酵素であることが、NRF2はリブロキナーゼであることが示唆され、また、nrf1の下流にNAD型6PGADHの相同遺伝子が存在することが判明した。そこで、これらの遺伝子産物の機能を特定するために、E. coliでの発現と酵素活性の測定を行った。
【０１２５】
まず、nrf1（tal-pgi）、nrf2（rk）をE. coliで発現させるために、それぞれの遺伝子のC末に6×His-Tagを連結したものをpUC18のlacプロモーターの下流に挿入したプラスミドpUCTAL-His、pUCSK-Hisを構築した。プラスミドの構築に先立ち、G. oxydans ATCC621株の染色体DNAを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表６に示すプライマーを用いてそれぞれの遺伝子断片をPCRで増幅した。
【０１２６】
tal-pgiおよびrk発現プラスミド構築の際に使用したPCRプライマーは、5'側はSD配列の上流に制限酵素部位を導入し、3'側はtal-pgiおよびrkについては6×His-Tagを連結後に、終止コドンと制限酵素部位を導入するようにそれぞれ設計した。プライマーTal5'-SalおよびTal3'-His-Sphを用いてG. oxydans ATCC621染色体DNAより増幅した断片をSalI/SphI消化し、pUC18のSalI/SphIサイトに挿入したプラスミドpUCTAL-Hisを構築した。また、プライマーRK5'-EcoおよびRK3'-His-Bamを用いてG. oxydans ATCC621染色体DNAより増幅した断片をEcoRI/BamHI消化し、pUC18のEcoI/BamHIサイトに挿入したプラスミドpUCSK-Hisを構築した。
【０１２７】
また、nrf1の下流に見出されたgnd相同遺伝子およびzwf遺伝子についても表６記載の配列のプライマーを用いて増幅し、pUC18のlacプロモーター下流のEcoRI/BamHIに連結したプラスミドpUCGND、pUCZWFをそれぞれ作製した。
【０１２８】
【表６】
0004333088.tif 000007
【０１２９】
構築した発現プラスミドをそれぞれE. coli JM109に導入した。形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地で一昼夜37℃で振盪培養した。前培養液を50mlのLB培地に1％シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、5mlの50mM KPB (pH6.5)に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１３０】
トランスアルドラーゼ（TAL）、グルコースリン酸イソメラーゼ(PGI)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6PGDH） シュガーキナーゼの酵素活性の測定法は、以下に示す方法で行った。一分間に1μmolのNADHを生じる活性を1Uとした。なおNADH、NADPHの340nmにおける分子吸光係数はε＝6.3×103として算出した。
【０１３１】
〔TAL活性測定〕
50mM    KPB (pH7.6)
5mM    フルクトース-6-リン酸
5mM    エリスロース-4-リン酸
0.5mM  NADH
2U/ml   グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ
30℃での340mMの吸光度の減少を測定
【０１３２】
〔PGI活性測定〕
50mM    KPB (pH7.0)
5mM    フルクトース-6-リン酸
1mM    NADP
5U/ml  グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
30℃での340mMの吸光度の増加を測定
【０１３３】
〔6PGADH活性測定〕
50mM    Tris-HCl (pH8.0)
10mM    6-ホスホグルコン酸
1mM    MgCl2
1mM    NAD／NADP
30℃での340mMの吸光度の増加を測定
【０１３４】
〔G6PDH活性測定法〕
50mM    グリシン-NaOH (pH9.5)
10mM    グルコース-6-リン酸
1mM    NAD／NADP
30℃での340mMの吸光度の増加を測定
【０１３５】
〔シュガーキナーゼ活性測定〕
50mM    Tris-HCl (pH7.0)
5mM      MgCl2
1mM    ATP
8.3U/ml ラクテートデヒドロゲナーゼ
8.3U/ml ピルビン酸キナーゼ
0.3mM   NADH
1mM    ホスホエノールピルビン酸
5mM    基質糖
30℃での340mMの吸光度の減少を測定
【０１３６】
前述の方法で、E. coli JM109／pUCTAL-His及びpUCSK-Hisを1Lづつ培養した。集菌、洗浄して得られた湿菌体3gから組換え酵素を精製した。精製はHiTrapキレートカラム（アマシャムファルマシア製）を用いて、プロトコル通りに行った。500mMのイミダゾールを含む溶出画分を20mM Tris-HCl (pH7.6)に透析して酵素溶液とした。その結果、それぞれ、100kDa、60kDaに相当するバンドがSDS-PAGE上で確認された。さらに可溶性画分よりNiカラム（HiTrap Chelate カラム、アマシャムファルマシア製）で精製することによって、SDS-PAGE上でほぼ単一のバンドとしてそれぞれのタンパク質が精製された。
【０１３７】
調製した組換え酵素を用いて遺伝子の相同性が認められたTAL、PGIおよびシュガーキナーゼの活性を測定した。その結果（表７）、NRF1についてはTAL活性およびPGI活性の両方が検出され、本酵素がTAL-PGIの２機能酵素であることが明らかとなった。
【０１３８】
【表７】
0004333088.tif 000008
【０１３９】
また、NRF2(シュガーキナーゼ)については基質特異性の特定のために、以下の基質について反応性を検討した。Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビトール、キシリトール、リビトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−グリセロール、Ｄ−ソルビトール。その結果（表８）、NRF2はＤ−リブロースにのみ作用したことから、リブロキナーゼであることが明らかとなった。
【０１４０】
【表８】
0004333088.tif 000009
N.D.：検出限界以下
【０１４１】
また、nrf1の下流に見出したgnd相同遺伝子についてもE. coliで発現させて酵素活性を測定し、補酵素特異性について検討した。その結果（表９）、対照株ではNADP依存的6PGADH活性のみ検出されたが、pUCGND導入株においてはNAD依存的6PGADH活性も検出された。また、NAD依存的活性（1.3U/mg）をNADP依存的活性の増加分（0.49U/mg）と比較することにより、本遺伝子はNADPとNADの双方を補酵素とする6PGADHであること、およびNADPよりNADに対してより高活性（約2.5倍）なNAD-NADP型GNDであることが明らかとなった。
【０１４２】
【表９】
0004333088.tif 000010
【０１４３】
また、zwf遺伝子についてもE. coliで発現させたところ、NAD-NADP型のG6PDH活性が検出され、クローニングした遺伝子が、NAD-NADP型zwfであることが示された（表１０）。
【０１４４】
【表１０】
0004333088.tif 000011
【０１４５】
TAL-PGI、RKが目的とする還元力供給因子であることを確認するために、調製した組換え酵素をインビトロ再構成系に添加してキシリトール生成量の増加効果について検討した。
【０１４６】
調製したTAL-PGIを0.1mg/ml、又はRKを0.05mg/ml添加した区をそれぞれ設定し、30℃で40時間下記の反応液で反応を行って、生成キシリトール量を定量した。
【０１４７】
〔反応溶液〕
100mM KPB (pH6.0)
10mM NAD
1g/dl アラビトール
1mgタンパク質／ml膜画分
0.5mgタンパク質／ml可溶性画分
1mM CoCl2
【０１４８】
その結果（図３）、アラビトールからの生成キシリトール量が、TAL-PGI添加区（0.1mg/ml)、RK添加区(0.05mg/ml)ともにコントロール区と比較して増加しており、これらの酵素がインビトロ再構成系における還元力供給因子であることが確認された。尚、図３中、「sol X3」は、反応系の可溶性画分量を1.5mgタンパク/ml可溶性画分に増加した区を示す。
【０１４９】
【実施例９】
tal-pgi、NAD-NADP型zwf、NAD-NADP型gndおよびrkのG. oxydansでの増幅効果検討
tal-pgi、zwf、gnd、rkの各遺伝子とxdh（米国特許第6,242,228号に記載のxdh2）との共発現株を作製するために、それぞれの遺伝子をE. coliとGluconobacterのシャトルベクターであるpSA19に連結した発現プラスミドを構築した。pSA19は外内らによってBiosci. Biotech. Biochem., 58(10), 1899-1901, 1994にその構築方法が記載されている。具体的には、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）BPR2001株の内在性プラスミドであるpAH4を定法（アルカリ-SDS法）に従って単離し、pAH4においてユニークな制限酵素であるHindIIIで消化後、pUC18のHindIIIサイトに連結してシャトルベクターpSA19を得た。尚、BPR2001株は、現在はグルコノバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  スクロファーメンタンス（Gluconacetobacter xylinus subsp. sucrofermentans）ATCC700178と命名されている。
【０１５０】
発現プラスミド構築のために作製したプライマーの配列を表１１に、構築方法の模式図を図４〜６に示す。
【０１５１】
【表１１】
0004333088.tif 000012
【０１５２】
pSA19にそれぞれの遺伝子を連結したプラスミドpSATAL、pSAZWF、pSAGNDと、共発現プラスミドpSAGND-XDHをそれぞれ構築し、G. oxydans AJ2847株に導入した。得られた形質転換体を、50μg/mlアンピシリンを含むYPG（YPG-Amp）プレートでリフレッシュ後、50mlのSR培地に接種して、30℃で24時間培養した。集菌・洗浄後、前述の方法にしたがって菌体を破砕し、酵素活性を測定した。
【０１５３】
その結果、zwf発現プラスミド導入株では、NAD型G6PGH活性が親株の4.3倍に増加しており、発現量の増加が認められた(表１２)。
gnd発現プラスミド導入株では、NAD-NADP型6PGADH活性が親株の約3倍に増加しており、発現量の増加が認められた（表１３）。さらに、gndの下流にxdh遺伝子を連結した共発現プラスミド（pSAGND-XDH）の導入株においては6PGADH活性、XDH活性ともに増加しており、共発現株が作製できた。
【０１５４】
また、TAL-PGI発現プラスミド導入株では、PGI活性で親株の約1.3倍発現していた（表１４）。
【０１５５】
【表１２】
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【０１５６】
【表１３】
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【０１５７】
【表１４】
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【０１５８】
【実施例１０】
ペントース系遺伝子発現プラスミド導入株でのアラビトール→キシリトール変換反応の検討
YPG-Ampプレート上で30℃、24時間リフレッシュ培養した菌体を3mlのYPG-Ampに１白金耳植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた培養液を50mlのシード培地を含む坂口フラスコに5%シードし、30℃で24時間振盪培養した。遠心分離で集菌後、50mlの変換培地に懸濁し、30℃で振盪させてアラビトール→キシルロース変換反応を開始した。変換開始16時間後に25mlずつ坂口フラスコに分注し、キシルロース→キシリトール変換反応を行った。後段の反応は2g/dlグルコース添加区及び無添加区を設定し、振とう反応にて実施した。
【０１５９】
〔シード培地〕
5g/dl グリセロール、0.3g/dl KH2PO4、0.1g/dl K2HPO4、0.05g/dl MgSO4、0.5g/dl YE、0.5g/dlカザミノ酸、1g/dl Ｌ−グルタミン酸酸ナトリウム、金属混合物、ビタミン混合物。
【０１６０】
〔変換培地〕
10g/dlアラビトール、0.3g/dl KH2PO4、0.1g/dl K2HPO4、0.05g/dl MgSO4、0.5g/dl YE、0.5g/dlペプトン、金属混合物、ビタミン混合物、2g/dl 炭酸カルシウム。
【０１６１】
10g/dlのアラビトールを含む変換培地にシード培養で得た菌体全量を接種し、30℃で16時間振盪反応によってキシルロースへと変換し、さらに2g/dlのグルコースを添加して反応を行った。その結果（表１５）、還元力供給遺伝子導入株においては、グルコース添加区・無添加区ともにキシリトール生成量の増加が認められた。グルコース添加区においては、10g/dlのアラビトールからのキシリトール収率がコントロール株で12%であるのに対して、tal-pgi、zwf、gndおよびgnd-xdh導入株ではそれぞれ18%、17%、15%、24%とキシリトール蓄積の増加が認められた。
【０１６２】
【表１５】
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【０１６３】
【発明の効果】
本発明により、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規酵素及びそれらをコードする遺伝子が提供される。
本発明のグルコノバクター属細菌は、同細菌を用いた目的物質の製造に好適に用いることができる。特に、本発明の方法は、キシリトールの製造に好適である。
【０１６４】
【配列表】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  NADP（●）又はNAD（黒三角）を補酵素としたときのG6PDH活性（相対活性）を示す図。
【図２】  NADP（●）又はNAD（黒三角）を補酵素としたときの6PGDH活性（U/mg）を示す図。
【図３】  インビトロ再構築系によるアラビトール→キシリトール変換反応におけるTAL-PGI及びRKの効果を示す図。
【図４】  tal-pgiを含むプラスミドpSATALの構築を示す図。
【図５】  gnd、又はgnd及びxdhを含むプラスミドpSAGND及びpSAGND-XDHの構築を示す図。
【図６】  zwfを含むプラスミドpSAZWFの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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