(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階
Ａ）pH７未満で、核酸を含むと予測される細胞溶解物を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記細胞溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記細胞溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
を含み、
前記弱塩基性ポリマーが、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる、細胞溶解物から核酸を提供するための方法。
【請求項２】
下記段階
Ｄ）前記放出核酸を含む前記溶液のpHを６〜９に調節すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、第三アミンもしくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記弱塩基性ポリマーが、0.01〜0.5重量％の量で段階Ａ）で用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記弱塩基性ポリマーが、
ａ）15〜100重量パーセントの、酸性pHでプロトン化でき、かつアミノアルキル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニルからなる群より選ばれる基を少なくとも１つ有する、水溶性弱塩基性エチレン系不飽和重合性モノマー、
ｂ）０〜35重量パーセントの、非イオン性親水性エチレン系不飽和重合性モノマー、ならびに
ｃ）０〜85重量パーセントの、非イオン性疎水性エチレン系不飽和重合性モノマー、
の付加重合より誘導される反復単位からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水不溶性沈殿を50〜125℃で加熱することを伴って、段階Ｃ）で弱塩基が用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記水不溶性沈殿を加熱することなく、段階Ｃ）で強塩基が用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｉ）以下の段階：
Ａ）pH７未満で、標的核酸を含むと予測される細胞溶解物を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記標的核酸を包含する前記細胞溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記細胞溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記標的核酸を包含する前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
（前記弱塩基性ポリマーは、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる）
を用いて標的核酸を提供すること、
II）前記放出核酸中に存在する前記標的核酸を増幅すること、そして
III)前記増幅標的核酸を検出すること、
を含む標的核酸の増幅および検出方法。
【請求項９】
段階Ｃ）の後に、下記段階
Ｄ）前記放出核酸を含む前記溶液のpHを６〜９に調節すること、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの標識化プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸の鎖に特異的でありかつそれとハイブリッド可能なプライマーを用いて、HIV1、HIV2、プロウイルスHIV1、プロウイルスHIV2、サイトメガロウイルス、マイコバクテリウム spp. （Mycobacterium spp.）、ヒトパピローマウイルスもしくは肝炎ウイルスからの標的核酸又は遺伝子疾患と関連がある標的核酸の増幅および検出についての、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記弱塩基性ポリマーが、
ａ）15〜100重量パーセントの、酸性pHでプロトン化でき、かつアミノアルキル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニルからなる群より選ばれる基を少なくとも１つ有する、水溶性弱塩基性エチレン系不飽和重合性モノマー、
ｂ）０〜35重量パーセントの、非イオン性親水性エチレン系不飽和重合性モノマー、ならびに
ｃ）０〜85重量パーセントの、非イオン性疎水性エチレン系不飽和重合性モノマー、
の付加重合より誘導される反復単位からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記弱塩基性ポリマーが、20〜100重量パーセントの（ａ）由来の、０〜25重量パーセントの（ｂ）由来の、そして０〜80重量パーセントの（ｃ）由来の反復単位からなる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
モノマー（ａ）が、次式（Ｉ）
【化１】
0004354537.tif 000019
（上式中、
R3 は、水素もしくはメチルであり、
ｘは、オキシもしくはイミノであり、
R4 は、鎖中に１〜８個の炭素もしくはヘテロ原子を有し、かつ１つ以上のアルキレン基を含む二価炭化水素連結基であるが、但し、１つより以上のアルキレン基が存在するときは、それらは、R4 中、実施可能な組合せで１つ以上のカルボニル、オキシ、イミノ、エステルもしくはアミド基と連結されており、かつR4 は、カルボニル、オキシ、イミノ、エステルもしくはアミド基を末端基とすることができ、そして
R5 は、酸性pHでプロトン化できる、環状アミンもしくは第一、第二もしくは第三アミノアルキル基である）
で示される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノマー（ａ）が、次式（II）
【化２】
0004354537.tif 000020
（上式中、
Ｒは、水素もしくはメチルであり、そして
R1 は、炭素原子数１〜３個のアルキレンである）
で示される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
モノマー（ａ）が、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−メチル−１−ビニルイミダゾール、２−ビニルピリジン、１−ヒドロキシ−６−ビニル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド、２−アミノエチルアクリレートヒドロクロリド、１−ビニルピロリジノン、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、２−アミノエチルメタクリレート、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド、２−ビニルキノリン、Ｎ−（２−イミダゾリルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（イミダゾリルメチル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミドおよびそれらの酸付加塩からなる群より選ばれ、
モノマー（ｂ）が、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシ）エチルメタクリレート（２〜１０個のエチレンオキシ基を有する）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドからなる群より選ばれ、そして
モノマー（ｃ）が、メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、スチレン、ビニルトルエン、メチルアクリレートおよびブチルアクリレートからなる群より選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記弱塩基性ポリマーが、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−アクリルアミド〕、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ〔Ｎ−（１，１−ジメチル−３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド〕又はポリ（Ｎ−２−メチル−１−ビニルイミダゾール）である、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
別個に包装された、
ａ）１つ以上の増幅試薬を含む増幅反応混合物、および
ｂ）酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる弱塩基性水溶性ポリマー、ここで、当該弱塩基性水溶性ポリマーは、pH７未満で、核酸を含む細胞溶解物と接触した場合に、前記細胞溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させることができ、そして前記細胞溶解物から分離された前記水不溶性沈殿を溶液中で塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させた場合に前記核酸を放出させることが出来る、
を含む、標的核酸を増幅するための試験キット。
【請求項１９】
前記弱塩基性ポリマーが、
ａ）15〜100重量パーセントの、酸性pHでプロトン化でき、かつアミノアルキル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニルからなる群より選ばれる基を少なくとも１つ有する、水溶性弱塩基性エチレン系不飽和重合性モノマー、
ｂ）０〜35重量パーセントの、非イオン性親水性エチレン系不飽和重合性モノマー、ならびに
ｃ）０〜85重量パーセントの、非イオン性疎水性エチレン系不飽和重合性モノマー、
の付加重合より誘導される反復単位からなる、請求項18に記載の試験キット。
【請求項２０】
前記増幅反応混合物が、一組のプライマー、少なくとも１つの標識化されたもの、多数のdNTP、および熱安定性DNAポリメラーゼを含む、請求項18に記載の試験キット。
【請求項２１】
１つ以上のキット成分を含む試験装置を含む、請求項18に記載の試験キット。
【請求項２２】
Ｉ）細胞もしくはウイルス粒子を溶解して、標的核酸を放出させること、
II）以下の段階：
Ａ）pH７未満で、前記標的核酸を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記標的核酸を包含する前記溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記標的核酸を包含する前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
（前記弱塩基性ポリマーは、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる）
に前記標的核酸をかけること、
III)さらにpHの調節を行うことなく、前記放出標的核酸を増幅すること、そして
IV）前記増幅標的核酸を検出すること、
を含む標的核酸の増幅および検出方法。
【請求項２３】
前記弱塩基性ポリマーが、塩基性のpHでは水不溶性であり、かつ前記方法が、それから前記標的核酸を放出した後でありかつそれの増幅の前に、前記水不溶性ポリマーを取り除く段階をさらに含む、請求項22に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を捕捉して選択的に放出することにより試料を調製して検出する方法に関する。詳細には、核酸を捕捉して放出し、次の処理、例えば、増幅する方法に関する。また、本発明は、前記方法で用いられる試験キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
非常に精巧な増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する、微量の核酸を検出するための技法がこの２０年間で急速に進歩してきた。研究者らは、ヒトもしくは動物の試験被検体中の疾患および遺伝的特徴の指標である核酸を検出するためのそのような技術の価値を躊躇なく認めてきた。そのような技術でプローブおよびプライマーを使用することは、相補性の概念、すなわち、相補的核酸（ヌクレオチド対としても既知である）間の水素結合による二本鎖の核酸の結合に基づいている。
非常に低濃度の標的核酸の検出を可能にするＰＣＲは、当該技術分野における重要な進歩である。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第 4,683,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）に記載されているとはいえ、この分野では文献が急増している。
【０００３】
効果的に標的核酸を増幅し検出するために、一般的には、細胞性および別の被検体破片由来のその核酸を単離する必要がある。種々の溶解方法が既知であり、それらは、凍結、消化酵素、例えば、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）での処理、煮沸、種々洗浄剤の使用（例えば、米国特許出願番号第 178,202号明細書，Higuchi により1988年 4月 6日に出願、およびEP-A-0 428 197，1991年 5月22日発行）、溶剤沈殿および加熱プロトコールを含む。
一度核酸は細胞もしくはウイルス粒子から抽出されるが、簡単で経費のかからない方法で溶解物中の別の物質からそれらを分離する必要が残る。核酸と複合することが知られている或る物質は、ポリエチレンイミンおよび種々の化学誘導体である。それは、酵素を単離する処理方法で汚染物質として核酸を沈殿させるために使用され、そして核酸を捕捉するためのアフィニティーカラムで使用されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
最近では、本発明者らの同僚は、陰イオン性リン酸エステル界面活性剤と組み合わせてポリエチレンイミンを用いて、核酸を捕捉して選択的に単離してきた。この技術は幾らか成功裏に用いられてきたが、一方それは異なる段階において注意深く調節された量の２種の別個の試薬の使用を要する。すなわち、用いられるリン酸エステル界面活性剤の量は、核酸との沈殿物中に存在するポリエチレンイミンの量に依存する。核酸の捕捉および単離に必要とされる段階および試薬の数を減少する改良が、探求されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、下記段階
Ａ）pH７未満で、核酸を含むと予測される溶解物を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
を含み、
前記弱塩基性ポリマーが、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる、
溶解物から核酸を提供するための方法で解決される。
【０００６】
また、本発明は、
Ｉ）以下の段階：
Ａ）pH７未満で、標的核酸を含むと予測される溶解物を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記標的核酸を包含する前記溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記標的核酸を包含する前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
（前記弱塩基性ポリマーは、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる）
を用いて標的核酸を提供すること、
II）前記放出核酸中に存在する前記標的核酸を増幅すること、そして
III)前記増幅標的核酸を検出すること、
を含む標的核酸の増幅および検出方法を提供する。
【０００７】
標的核酸を増幅するための試験キットは、別個に包装された、
ａ）１つ以上の増幅試薬を含む増幅反応混合物、および
ｂ）酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる弱塩基性ポリマー、を含む。
本発明は、さらなる処理、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイもしくは増幅処理方法のために、核酸を選択的に単離して提供するための迅速で簡単かつ有効な方法を提供する。本発明は、ポリエチレンイミンの使用を包含する、従来の単離手段に関係する前記課題を解決する。加えて、フッ素化リン酸エステル界面活性剤と組み合わせたポリエチレンイミンの使用により存在する課題も、界面活性剤を必要としないので回避される。本発明の試料調製方法は、煩雑ではなく、かつ最低限の段階のみを必要とするため、それはより容易に自動化される。通常それは、約１５分間以内（好ましくは１０分間以内）で実施できる。
【０００８】
これらの利点は、ポリエチレンイミンの代わりに、陽イオン性でありかつ酸性pHで水溶性であるが、しかしポリマーのpKa を相当上回る塩基性pHで脱プロトン化される、「弱塩基性」ポリマーを用いることにより提供される。「弱塩基性」とは、ポリマーのpKa が７未満であること、そしてより好ましくは６．５未満であることを意味する。従って、陽イオン性ポリマーと核酸の陰イオン性リン酸エステル主鎖との間のイオン性相互作用により、低いpHでポリマーを用いて核酸を沈殿させることができる。
非複合化物質を除去した後、塩基性条件にpH調節を行うと、沈殿物の弱塩基性ポリマーから核酸が放出（脱複合体化）され、そしてさらなる処理、例えば、増幅が可能になる。増幅処理方法は、塩基性条件下で実施できる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、動物、ヒト、環境もしくは微生物の被検体から採取したいずれかのタイプの試料中に存在する１つ以上の標的核酸の抽出および検出に特に適する。そのようにして得られた核酸は、従来のハイブリダイゼーションアッセイにかけてさらに処理することができる。前記処理方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第 4,994,373号明細書、ハイブリダイゼーション技術に関して引用することにより本明細書中に組み入れられる）。
しかしながら、簡潔のために、残りの討論は好ましい態様に向けられるので、核酸は増幅処理、特にＰＣＲにかけられるだろう。しかしながら、別の増幅技術（例えば、ＬＣＲ）を使用することもできるので、本発明の範囲がそれに限定されることを意味するものではない。
【００１０】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて核酸の増幅および検出をするための一般的な原理および条件は、極めて良く知られており、その詳細は、米国特許第 4,683,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）、米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）およびWO-A-91/12342 を包含する多数の文献に提供されている。言及した米国特許は、引用することにより本明細書中に組み入れられる。当該技術分野における教示およびここに提供される特別な教示を考慮すれば、当業者にとって、本発明の調製方法とポリメラーゼ連鎖反応方法とを、または当該技術分野で既知であるいずれかの別の増幅方法とを組み合わせることにより、本発明の実施に際して困難はないだろう。
本発明の実施に際して使用できる別の増幅方法は、限定されるものではないが、例えば、EP-A-0 320 308（1987年12月発行）およびEP-A-0 439 182（1990年 1月発行）に記載されるリガーゼ連鎖反応を含む。
【００１１】
試験被検体としては、細胞性もしくはウイルス性物質、髪、体液、または遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡあるいは検出できる感染性因子由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の物質が挙げられる。標的核酸は、いずれか適当なヒト、動物、微生物、ウイルスまたは植物源より抽出できる。加えて、標的核酸を、腫瘍原性細胞から単離してもよい。
検出できる細菌は、限定されるものではないが、血液中に見出される細菌、サルモネラ種（Salmonella spp. ）、ストレプトコッカス種（Streptococcus spp.）、クラミジア種（Chlamydia spp.）、ナイセリア種（Neisseria spp.）、マイコバクテリウム種（Mycobacterium spp.）〔例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）およびトリ型結核菌複合体（Mycobacterium avium complex ）〕、マイコプラズマ種（Mycoplasma spp. ）〔例えば、インフルエンザ・マイコプラズマ（Mycoplasma Haemophilus influenzae ）および肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma  pneumoniae）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、ボレリア・ブルグドルフェレイ（Borrelia burgdorferei ）、ニューモシスチス・カリニ肺炎（Pneumocystis carinii）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile ）、カンピロバクター種（Campylobacter spp.）、エルシニア種（Yersinia spp. ）、シゲラ種（Shigella spp. ）ならびにリステリア種（Listeria spp. ）を含む。検出可能なウイルスは、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex viruses）、ＥＢウイルス（Epstein Barr virus）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus ）、ヒトパピローマウイルス（human papilloma viruses ）、インフルエンザウイルス（influenza viruses ）、ＲＳウイルス（respiratory syncytial viruses ）、肝炎ウイルス（hepatitis viruses ）およびレトロウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）を含む。原生動物門の寄生動物および真菌（酵母およびかびを包含する）も検出可能である。別の検出可能な種は、当業者に容易に明らかであるだろう。本発明は、種々の細菌もしくはウイルスに関連した核酸の存在の検出に特に有用である。
【００１２】
好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、プロウイルスＨＩＶ１、プロウイルスＨＩＶ２、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、マイコバクテリア種、肝炎ウイルスまたは遺伝的疾患に関連した核酸の単離、増幅および検出に有用である。
本明細書中で定義した弱塩基性ポリマーと接触させる前に、核酸をいずれか適当な方法で被検体から抽出できる。種々の溶解方法が当該技術分野で既知であり、それらとしては、Laure 他，The Lancet, 538-540 ページ（1988年 9月 3日）、Maniatis他，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 280-281 ページ（1982）、Gross-Belland 他，Eur. J. Biochem., 36, 32（1973）および米国特許第 4,965,188号明細書（前記）に記載されるものが挙げられる。全血もしくはその成分からのＤＮＡの抽出は、例えば、EP-A-0 393 744（1990年10月24日発行）、米国特許第 5,231,015号明細書（Cummins 他）および米国特許第 5,334,499号明細書（Burdick 他）に記載されている（言及した特許は、引用することにより本明細書中に組み入れられる）。溶解方法は、核酸の源として用いられる被検体のタイプに依存するだろう。
【００１３】
特定の溶解方法が本発明の実施に決定的なものではないが、好ましい溶解方法としては、適当な非イオン性界面活性剤（多数のものが当該技術分野で周知である）の存在下で被検体を加熱することが挙げられる。別の有用な溶解方法が、米国特許出願番号第 08/063,169 号明細書（Ekeze およびKerschner により1993年 5月18日に出願された）に記載されており、それによれば、全血の被検体は塩化アンモニウムの緩衝化溶液と混合され、続いて塩化アンモニウムと再び混合することを含むさらなる段階にかけられる。
次いで溶解物は、７未満（好ましくは５未満）のpHで、溶解物中に存在するすべての核酸と複合化するのに十分な量の弱塩基性ポリマー（下記）と混合されて、水不溶性沈殿が形成される。このポリマーは、酸性pHで水溶性である。一般的には、存在するポリマーの量は少なくとも約０．０１重量パーセントであり、約０．０５〜約０．５重量パーセントが好ましい。もちろん当業者は、どのようにポリマーの量を調節して核酸の量に適応させればよいのか知っているだろう。混合は、いずれか適当な方法で３０分間まで（一般的には５分間未満）いずれか適当な温度（一般的には１５〜３５℃）で実施できる。
【００１４】
弱塩基性ポリマーは、その水溶性遊離型で使用することができ、または水不溶性支持体、例えば、アフィニティーカラムに付着させることができ、あるいはポリマー、ガラスもしくは別の無機粒子に付着させることができる。従って、ポリマーは、従来の方法（例えば、吸着、共有結合もしくは特異的結合反応）を用いて、ガラス、ポリマーもしくは磁気粒子、フィルターまたはフィルムを包含する適当な支持体に付着させることができる。弱塩基性ポリマーが塩基性pHにおいてさえ水不溶性であるので、核酸を放出させた後に、濾過、遠心分離もしくは別の従来の手段でそれを除去することができる。
弱塩基性ポリマーに結合しているときは、しかしながら核酸は有用ではない。次いで、かなりの細胞破片および過剰のポリマーを含有する残りの試料から水不溶性沈殿を分離することが必要である。この分離は、遠心分離もしくは濾過を包含する種々の従来の方法のいずれかを用いて達成でき、その後、液体は廃棄される。遠心分離が、本発明の実施に際して好ましい。
【００１５】
分離段階の後、加熱しながらまたは加熱することなく沈殿を塩基と接触させることにより、核酸は弱塩基性ポリマーから脱複合化または放出できる。強塩基は加熱することなく使用可能であり、それらとしては、限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、第三アミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンおよびルチジン）、トリシン、バイシンまたは当業者に容易に明らかである別の有機もしくは無機塩基が挙げられる。有用な弱塩基は、塩基性緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（またはその酸付加塩）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシンおよび当該技術分野で周知の別のものを含む。弱塩基を用いるときは、加熱が必要である。
そのような加熱は、１５分間まで（一般的には５分間未満）少なくとも約５０℃の、そして好ましくは約９５〜約１２５℃の温度で適当な圧力下で実施できる。この段落で用いられる「約」は、±５℃を称する。
【００１６】
好ましい態様では、加熱処理を伴って弱塩基を使用して、沈殿から核酸を放出できる。これは、さらに処理することなく容易に増幅を行える核酸を含有する溶液を提供する。そのような弱塩基は、緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩でありうる。
幾つかの態様では、そのような態様で用いられるポリマーが塩基性pHにおいてさえも水不溶性であるもの（下記）である。そのようなポリマーは、所望であれば核酸の放出後でありかつ増幅の前に、系から取り除かれる。
放出核酸を含有する得られた溶液は、塩基性pHを有する。あるときには、pHをさらに調節することなく、核酸はさらに処理される。強塩基が用いられる別の態様では、溶液のpHが、いずれか適当な酸もしくは緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシンおよび当業者に容易に明らかな別のものを用いて、約６〜約９（好ましくは約７．５〜約９）に（一般的には下方へ）調節されるだろう。望ましいpHを達成するのに必要とされるそのような物質の量は、当業者に容易に明らかであるだろう。
【００１７】
塩基性pHでは、核酸を捕捉するために用いられるポリマーが水溶性であってもまたは水不溶性であってもよく、またそのような性質を提供するために必要とされるモノマーは以下に記載されている。
言及した本発明の核酸の捕捉および放出方法は、典型的には約２０分間以内で、そして好ましくは約１０分間以内で実施される。
本明細書中で用いられる修飾語句「約」は、特に断らないかぎり、記載された値の±１０％の変動を称する。pH値に用いられるときは、「約」は±０．５pH単位を称する。
本発明の好ましい態様では、標的核酸の増幅および検出方法は、
Ｉ）細胞もしくはウイルス粒子を溶解して、標的核酸を放出させること、
II）以下の段階：
Ａ）pH７未満で、前記標的核酸を、充分な量の水溶性弱塩基性ポリマーと接触させて、前記弱塩基性ポリマーと前記標的核酸を包含する前記溶解物中に存在するすべての核酸との水不溶性沈殿を形成させること、
Ｂ）前記水不溶性沈殿を前記溶解物から分離すること、そして
Ｃ）前記沈殿を塩基と接触させて、溶液のpHを７より上に上昇させ、それによって前記標的核酸を包含する前記核酸を前記弱塩基性ポリマーから放出させること、
（前記弱塩基性ポリマーは、酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より誘導される反復単位からなる）
に前記標的核酸をかけること、
III)さらにpHの調節を行うことなく、前記放出標的核酸を増幅すること、そして
IV）前記増幅標的核酸を検出すること、
を含む。
【００１８】
前記方法では、前記弱塩基性ポリマーが、塩基性のpHでは水不溶性であり、かつ前記方法が、それから前記標的核酸を放出した後であるがそれの増幅の前に、前記水不溶性ポリマーを取り除く段階をさらに含むことがより好ましい。
本発明の実施に際して用いられる弱塩基性ポリマーは、モノマーの少なくとも１つが酸性pHでプロトン化できるアミン基を有する、１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーの付加重合より調製される。従って、酸性pHでは、ポリマーがプロトン化されて、アミンの酸付加塩を形成する。塩基性pHでは、ポリマーは遊離塩基として存在する。
本発明に有用な重合性モノマーの一部でありうる特定の「弱塩基性基」は、限定されるものではないが、酸性pHでプロトン化できる、環状アミン基または第一、第二もしくは第三アミノアルキル基を含む。有用な環状アミン基は、限定されるものではないが、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニル基を含む。好ましい基は芳香族である環状基であり、そしてイミダゾリル基が最も好ましい。有用なアミノアルキルもしくは環状アミン基は、アルキレン、アミドもしくはエステル基を包含する従来の連結基を用いてモノマーのビニル基に結合され、そして複数のアルキレン基がイミノ、オキシ、アミド、カルボニルもしくはエステル基と共に結合できる。
【００１９】
核酸を捕捉するのに通常有用なポリマーは、
ａ）約１５〜１００重量パーセントの、酸性pHでプロトン化でき、かつアミノアルキル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニルおよびキナゾリニルからなる群より選ばれる基を少なくとも１つ有する、水溶性弱塩基性エチレン系不飽和重合性モノマー、
ｂ）０〜約３５重量パーセントの、非イオン性親水性エチレン系不飽和重合性モノマー、ならびに
ｃ）０〜約８５重量パーセントの、非イオン性疎水性エチレン系不飽和重合性モノマー、
の付加重合より誘導される反復単位からなる。
【００２０】
好ましくは、弱塩基性ポリマーが、約２０〜約１００重量パーセントの（ａ）由来の、０〜約２５重量パーセントの（ｂ）由来の、そして０〜約８０重量パーセントの（ｃ）由来の反復単位からなる。
前記（ａ）に有用なより特別な種類のモノマーは、次式（Ｉ）で示されるものである。
【００２１】
【化３】
0004354537.tif 000002
【００２２】
上式中、Ｒ3 は、水素もしくはメチルであり、そしてＸは、オキシもしくはイミノである。加えて、Ｒ4 は、鎖中に１〜８個の炭素もしくはヘテロ原子を有し、かつ１つ以上のアルキレン基（例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレンおよびｎ−ペンチレン）を含む二価炭化水素連結基であるが、但し、１つより以上のアルキレン基が存在するときは、それらは、Ｒ4 中、実施可能な組合せで１つ以上のカルボニル、オキシ、イミノ、エステルもしくはアミド基と連結されている。「実施可能な組合せ」とは、それらの基がいずれか化学的に可能な立体配置でアルキレン基と合わさることができること、そして化学的に可能な方法（例えば、オキシカルボニル、カルボナミドおよび当業者に容易に明らかな別のもの）で（相互に連結した）組合せで使用できることを意味する。また、Ｒ4 は、カルボニル、オキシ、イミノ、エステルもしくはアミド基を末端基とすること（またはＲ5 と連結すること）ができることを理解されたい。
【００２３】
Ｒ5 は、酸性pHでプロトン化できる、環状アミンまたは第一、第二もしくは第三アミノアルキル基である。
有用な（ａ）型のモノマーの具体例は、限定されるものではないが、１−ビニルイミダゾール、２−メチル−１−ビニルイミダゾール、２−ビニルピリジン、１−ヒドロキシ−６−ビニル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド、２−アミノエチルアクリレートヒドロクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、２−ビニルキノリン、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾリルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−Ｎ−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（イミダゾリルメチル）アクリルアミド、１−ビニルピロリジノン、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルメタクリレートおよび前記遊離塩基の酸付加塩を含む。
本発明の（ａ）型の新規モノマーのクラスは、ホモポリマーもしくはコポリマーのいずれかを調製するために使用できる。これらのモノマーは、構造（II）で定義される。
【００２４】
【化４】
0004354537.tif 000003
【００２５】
上式中、Ｒは、水素もしくはメチルである。好ましくは、Ｒがメチルである。加えて、Ｒ1 は、炭素原子数１〜３個の分枝鎖もしくは直鎖アルキレン（例えば、メチレン、エチレン、トリメチレンもしくはプロピレン）である。好ましくは、Ｒ1 が炭素原子数２〜３個のアルキレンである。より好ましくは、Ｒ1 がトリメチレンである。
構造（II）を有する特に有用なモノマーは、限定されるものではないが、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾリルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（イミダゾリルメチル）アクリルアミドおよびそれらの酸付加塩を含む。本明細書中に記載された新規モノマーのうち、第１の化合物が最も好ましい。
【００２６】
好ましい（ａ）型のモノマーは、１−ビニルイミダゾールおよびＮ−２−メチル−１−ビニルイミダゾールを含む。
（ａ）型のモノマーが低い水溶性を有するかまたは全く水溶性を有しない場合、それらはそれらの酸付加塩（例えば、塩酸塩もしくは臭化水素酸塩）の形状で重合できる。
【００２７】
（ｂ）型のモノマーとして定義されるモノマーは、ホモ重合されたときに、pH７以上で水溶性であるホモポリマーを提供するものを意味する、「親水性」として本明細書中で定義されるものである。一般的には、そのようなモノマーは親水性基、例えば、ヒドロキシ、アミン（第一、第二、第三および環状）、アミド、スルホナミドおよびポリエチレンオキシ基を有するが、しかし前記ホモポリマーの水溶性パラメーターが満たされれば、それらがそのような基を含む必要はない。
（ｂ）型の代表的なモノマーは、限定されるものではないが、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシ）エチルメタクリレート（２〜１０個のエチレンオキシ基を有する）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含む。好ましいモノマーはアクリルアミドである。
【００２８】
（ｃ）型モノマーとして定義されるモノマーは、それらが所有するかもしれないペンダント基の型にかかわらず、ホモ重合されたときに、pH７以上で水不溶性であるホモポリマーを提供するものを意味する、「疎水性」として本明細書中で定義されるものである。
（ｃ）型の代表的なモノマーは、限定されるものではないが、メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ｔ−ブミルメタクリルアミド、エチルアクリレート、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、メチルメタクリレート、スチレン、ビニルトルエンおよび別のビニル芳香族化合物ならびに当業者に容易に明らかな別のものを含む。好ましいモノマーは、２−ヒドロキシエチルメタクリレートである。
【００２９】
新規ではない（ａ）、（ｂ）および（ｃ）型のモノマーは、一般的には商業的供給源から容易に入手可能であるか、または従来の方法および出発物質を用いて調製される。
構造（II）の新規モノマーは、当業者に容易に明らかであろう適当な条件を用いて、１−（アミノアルキル）イミダゾールを（メタ）アクリロイルクロリドと縮合させることにより通常調製できる。好ましいモノマーの代表的な調製法は、実施例に先立って以下に提供する。そのようなモノマーについての詳細は、米国特許第 5,434,270号明細書に記載されている。
【００３０】
本明細書に記載されるホモポリマーおよびコポリマーは、当該技術分野で周知である従来の溶液重合技法を用いて調製できるとはいえ、実施例に先立って以下に提供される調製方法に具体的に示される所定の好ましい条件が存在する。種々モノマーの割合は、当業者が既知であるように調節して、そのようなポリマーが酸性pHで水溶性である限り、塩基性pHで水溶性であるかまたは水不溶性であるポリマーを提供できる。
一般的には、溶液重合は、適当な溶剤（水もしくは種々の水混和性有機溶剤を包含する）にモノマーを溶解し、そして適当な遊離ラジカル開始剤の存在下で重合させることを含む。得られるポリマーは酸性pHで水溶性であり、溶剤、例えば、アセトンを用いて沈殿されて精製され、そして将来使用するために水に再溶解される。
【００３１】
本明細書中に記載される特に有用なポリマーは、限定されるものではないが、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−アクリルアミド〕、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（１−ビニルイミダゾールヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ〔Ｎ−（１，１−ジメチル−３−イミダゾリルプロピル）アクリルアミド〕、ポリ（Ｎ−２−メチル−１−ビニルイミダゾール）および前記遊離塩基ポリマーの酸付加塩を含む。
好ましい態様では、用いられるポリマーは塩基性pHで水不溶性である。そのようなポリマーは、（ａ）型モノマーならびに（ｃ）型モノマーを用いるが、しかし塩基性pHにおけるポリマーの可溶化を防ぐために限定量（１５重量％未満）の（ｂ）型モノマーを用いて調製される。この型の代表的なポリマーは、限定されるものではないが、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）およびポリ（１−ビニルイミダゾールヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）を含む。
【００３２】
また、本発明は、前記のように放出された１つ以上の標的核酸中に存在する１つ以上の特異的核酸配列の増幅もしくは検出に向けられている。さらに、各特異的核酸についての対応する一組のプライマーおよび検出手段を用いて、複数の標的核酸を同時に増幅および検出することができる。また同じ核酸中の複数の配列も、増幅および検出できる。
「ＰＣＲ試薬」とは、一般的にＰＣＲに有用であると考えられるいずれかの試薬、すなわち、各標的核酸についての一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼコファクターおよび２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸（ｄＮＴＰ）を称する。
【００３３】
プライマーもしくはプローブについて本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」なる語は、４つ以上のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる分子を称しており、１０個以上のものが好ましい。その正確なサイズは臨界的ではないが、しかしオリゴヌクレオチドの最終用途もしくは機能を包含する多数のファクターに依存する。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知のいかなる方法で誘導してもよい。
「プライマー」なる語は、天然のものであろうと合成されたものであろうと、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物（すなわち、鋳型）の合成が誘発される条件下に置かれたとき、合成の開始点として作用することのできるオリゴヌクレオチドを称する。そのような条件は、核酸（例えば、４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸）、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼコファクターの存在、ならびに適当な温度およびpHを含む。通常、そのような条件は、非特異的増幅が最低限に抑えられるように、当該技術分野で「非常に厳しい」条件として知られているものである。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成を開始するのに十分な程長くなければならない。各プライマーの正確なサイズは、予測される用途、標的配列の複雑さ、反応温度およびプライマーの起源に依存して変化するだろう。一般的には、本発明に用いられるプライマーは、１０〜６０個のヌクレオチドを有するだろう。
【００３４】
本発明に有用なプライマーは、多数の供給源より入手可能でありかつ既知技法および装置例えば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより市販）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Series Synthesizer （Milligen-Biosearch, Inc.市販）およびそれらの既知使用方法（例えば、米国特許第 4,965,188号明細書に記載される方法）を用いて調製できる。また、生物学的供給源から単離された天然プライマーが有用である（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）。本明細書で用いられる「プライマー」なる語は、プライマーの混合物も称する。従って、所定の標的核酸についての各組のプライマーは、各々標的鎖に反する２種以上のプライマーを含むかもしれない。
【００３５】
一方または両方のプライマーを、増幅された生成物を検出または捕捉するために同一もしくは異なる標識で標識することができる。標識を付着される方法およびプライマーを調製する方法は、例えば、Agrawal 他，Nucleic Acid Res., 14, 6227-45ページ（1986）、ビオチン標識に関する米国特許第 4,914,210号明細書（Levenson他）、酵素標識に関する米国特許第 4,962,029号明細書（Levenson他）およびそこに言及された文献に記載されたように当該技術分野で周知である。また、有用な標識は、放射性同位体、高電子密度試薬、色原体、発蛍光団、リン光体部分、フェリチンおよび別の磁気粒子（Owen他の米国特許第 4,795,698号明細書およびPoynton 他の米国特許第 4,920,061号明細書）、化学ルミネセンス部分（例えば、ルミノール）、ならびに別の特異的結合種（アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、糖もしくはレクチン）を含む。好ましい標識は、酵素、放射性同位体および特異的結合種（例えば、ビオチン）である。有用な酵素は、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよび当該技術分野で既知のものを含み、それらは既知方法を用いてオリゴヌクレオチドに付着させることができる。そのような酵素を用いて比色もしくは化学ルミネセンス信号を提供するための試薬は周知である。
【００３６】
標識が酵素、例えば、ペルオキシダーゼであるときは、アッセイ中幾つかの時点で過酸化水素および適当な色素生成性組成物を添加して検出可能な色素を提供する。例えば、有用な色素提供性試薬は、テトラメチルベンジジンおよびその誘導体ならびにロイコ色素、例えば、水不溶性トリアリールイミダゾール・ロイコ色素（Bruschi の米国特許第 4,089,747号明細書に記載）またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を提供する別の化合物を含む。特に有用な色素提供性組成物は、EP-A-0 308 236（1989年 3月22日発行）に記載されている。また、適当な試薬を用いてペルオキシダーゼ標識に応じて化学ルミネセンス信号を発生させることができる。
一方もしくは両方のプライマーがビオチニル化されるときは、検出可能に標識されたアビジンもしくはその等価体（例えば、ストレプトアビジン）を用いて増幅された核酸を検出できる。例えば、アビジンは、酵素とコンジュゲートされてもよく、または既知技法を用いて放射性同位体を有することもできる。増幅された生成物上のビオチンはアビジンと複合化され、そして適当な検出技法を用いて放射性、比色もしくは化学ルミネセンス信号が検出される。
【００３７】
本明細書中で用いられる捕捉「プローブ」とは、標的核酸の１つ以上の鎖の核酸配列に実質的に相補的であり、かつ増幅された核酸を不溶化するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。プローブ・オリゴヌクレオチドは、一般的には適当な水不溶性支持体、例えば、ポリマーもしくはガラスビーズ、マイクロタイター・プレート・ウェル、薄型ポリマーもしくはセルロースフィルム、または当業者に容易に明らかな別の物質に付着される。一般的には、オリゴヌクレオチドは、約１２〜約４０個のヌクレオチドの長さであるとはいえ、長さは臨界的ではない。
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型との複合体中のプライマーの３′ヒドロキシ末端にデオキシリボクレオシド一リン酸分子を加える酵素であるが、しかしこの添加は、鋳型依存方式である（すなわち、鋳型に特異的なヌクレオチドに依存する）。多数の有用なＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野で既知である。好ましくは、ポリメラーゼが熱、特にＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温に安定であることを意味する、「熱安定性」である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるＰＣＲで用いられる高温によって実質的に不活性化されない。
【００３８】
数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従来技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,965,188号明細書（前記）および米国特許第 4,889,818号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているものが包含される（引用することにより本明細書に組み入れられる）。特に有用なポリメラーゼは、種々のサーマス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus flavus）より得られるものである。別の有用な熱安定性ポリメラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のものを包含する種々の別の微生物源より得られる。幾つかの有用なポリメラーゼは市販されている。この段落で引用された従来技術文献に記載されるように、天然ポリメラーゼを生物体から単離して、組換え技法を用いて遺伝子工学酵素を生成するための数多くの技法が既知である。
【００３９】
ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称する。マンガン塩およびマグネシウム塩を包含する数多くのそのような物質が既知コファクターである。有用なコファクターは、限定されるものではないが、マンガンおよびマグネシウムの塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩（例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸およびラウリン酸の塩）を含む。より小さな塩、すなわち、塩化物、硫酸塩および酢酸塩が好ましい。
また、２種以上のデオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰが必要とされる。通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰはすべてＰＣＲに用いられる。類似体、例えば、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰが有用である。
【００４０】
また、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体が本発明の実施に際して有用であり、その抗体は、約５０℃以下の温度でその酵素活性を阻害するが、しかしその抗体はより高温では失活される。これらの性質を有する代表的なモノクローナル抗体は、米国特許第 5,338,671号明細書（Scalice 他により1992年10月 7日出願）に記載されており、これらは引用することにより本明細書に組み入れられる。抗体の断片が同じ性質を有するときは、完全な分子の代わりに抗体の断片を使用することができる。
本明細書中に記載されるＰＣＲ試薬は、標的核酸を増幅させるのに適する濃度でＰＣＲに用いられる。一般的にはＤＮＡポリメラーゼの最低量は少なくとも約１単位／ 100μＬ（溶液）であるが、約４〜約２５単位／ 100μＬが好ましい。「単位」は、３０分間に７４℃で総ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の１０ナノモル（nmole ）を伸長核酸鎖に組み入れるのに必要とされる酵素活性の量として本明細書で定義される。各プライマーの濃度は、少なくとも約０．０７５マイクロモル濃度であり、約０．２〜約１マイクロモル濃度が好ましい。すべてのプライマーがほぼ同量で存在する（各々１０％の変動範囲内）。一般的には、コファクターは約１〜約１５ミリモル濃度の量で存在し、そして各ｄＮＴＰは、一般的には反応混合物中約０．１〜約３．５ミリモル濃度で存在する。この段落で用いられるように、修飾語句「約」は記載値の±１０％の変動を表す。
【００４１】
ＰＣＲ試薬は、個別に供給することもできるし、またはいずれかの適当な緩衝剤を用いて約７〜約９の範囲のpHの緩衝化溶液に含めて供給することもできる。増幅および検出しようとする標的核酸は通常二本鎖型であるので、プライミングを実施する前に二本鎖を分離（すなわち、変性）しなければならない。これは抽出処理中に引き起こすことができるが、以降の別の段階で引き起こすことが好ましい。適当な温度（本明細書では「第１温度」もしくはＴ1 と示される）に加熱することが、好ましい変性手段である。一般的には、この第１温度は、約８５〜約１００℃の範囲内であり、適当な時間、例えば、１〜約２４０秒間（好ましくは１〜約４０秒間）保たれる。また、この初期変性段階は、第１増幅段階も含む。そのような場合は、変性は第１サイクル中において長いかもしれないが（例えば、２４０秒間まで）、一方後のサイクルの変性段階はかなり短くできる（例えば、３０秒間まで）。
【００４２】
次いで変性鎖は、反応混合物を、一般的には約５５〜約７０℃の範囲内である第２温度，Ｔ2 ，に冷却することにより、適当な数組のプライマーでプライミングされる。冷却ができるだけ速く行われることが望ましいが、しかし現在既知である装置を用いて、一般的には約５〜約４０秒間、そしてより好ましくは約５〜約２０秒間の時間に渡って実施される。
一旦変性鎖を冷却し、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を第３温度，Ｔ3 で一般的には１〜約１２０秒間、そして好ましくは１〜約８０秒間インキュベーションすると、プライマー伸長生成物の形成が達成される。一般的には、第３温度は約５５〜約７４℃の範囲内である。好ましくはそれが、約６２〜約７０℃の範囲内である。
最も好ましい態様では、第２および第３温度が同じであり、かつ約６２〜約７０℃の範囲内である。従って、プライミングおよびプライマー伸長は、好ましくは同じ段階で実施される。
【００４３】
従って、増幅サイクルは、前記変性段階、プライミング（もしくはアニーリング）段階およびプライマー伸長段階を含む。一般的には、少なくとも１５のそのような増幅サイクルが本発明の実施に際して行われるが、サイクルの最大数は特定の使用者の裁量範囲内である。ほとんどの場合、１５〜５０の増幅サイクルが該方法に用いられ、１５〜４０サイクルが好ましい。各増幅サイクルは、一般的には約２０〜約３６０秒間であり、約３０〜約１２０秒間のサイクル時間が好ましく、そして約３０〜約９０秒間がより好ましい。しかしながら、所望であればより長いまたはより短いサイクル時間を用いることができる。
増幅方法における所定の段階についての時間に関して用いられるとき、「約」なる語は、その制限時間の±１０％を表す。さらに、温度に関して用いられるとき、「約」なる語は、±５℃を表す。
【００４４】
本発明の増幅方法は、反応混合物を温度サイクルの調節された方法に所望の回数かけるために、好ましくは連続的自動方法で行われる。当業者が既知であるように、多数の機器がこの目的で開発されてきた。好ましくは、また用いられる機器が第１および第２の両方の増幅サイクルについてプログラム可能であるだろう。
この目的についてのそのような機器の１つが、米国特許第 4,965,188号明細書およびEP-A-0 236,069に幾らか詳細に記載されている。一般的には、この機器は、反応混合物を含有する多数の反応管を保持するための熱伝導性容器、加熱、冷却および温度維持手段、ならびに増幅配列、温度変化およびタイミングを調節するための信号を発生させるための計算手段（コンピューター）を含む。
【００４５】
EP-A-0 402 994には、米国特許第 5,089,233号明細書（Devaney, Jr.他）に記載される機器を用いて処理できる、有用な化学試験パックの詳細が提供されている（引用することにより、本明細書中に組み入れられる）。また、本発明方法に適する反復間隔（すなわち、サイクルの始めから終わりまで）で試験パックを加熱および冷却するための手段がそこに記載されている。有用なＰＣＲ処理装置に関するさらなる詳細は、この分野におけるかなりの文献から入手することができるし、当業者に容易に知られているだろう。
前記化学試験パックの他に、別の容器、例えば、米国特許第 4,902,624号明細書（Columbus他）、米国特許第 5,173,260号明細書（Zander他）および米国特許第 5,229,297号明細書（Schnipelsky 他）により詳細に記載されるもの（引用することによりすべて本明細書中に組み入れられる）、ならびに当業者に容易に明らかであるいずれか別の適当な容器で本方法は実施できる。また、そのような試験パックは、本発明方法に用いられる種々の試薬について別個の個室を有する自蔵式試験装置としても既知である。個室はそのような試薬に適当に接続されており、そしてアッセイ溶液は、装置を開くことなく適当な時間に捕捉試薬と接触することができる。
【００４６】
増幅生成物の検出は、米国特許第 4,965,188号明細書（前記）に記載のサザン・ブロッティング法を包含する既知方法を用いて、または当該技術分野で既知であるような標識プローブもしくはプライマーを用いることにより達成できる。
前記態様とは別に、増幅生成物は、プライマー伸長生成物の１つに相補的である標識化オリゴヌクレオチドを用いて検出できる。
本発明の不均一検出系では、増幅生成物が数種の水不溶性支持体上に捕捉され、そして反応混合物中のその他の物質が適当な方法、例えば、濾過、遠心分離、洗浄もしくは別の分離法で取り除かれる。
【００４７】
捕捉プローブは、水不溶性支持体に、既知付着技法（吸着および共有結合を包含する）を用いて付着させることができる。そのような技法の１つが、EP-A-0 439 222（1991年 9月18日発行）に記載されている。別の技法が、例えば、米国特許第 4,713,326号明細書（Dattagupta他）、米国特許第 4,914,210号明細書（Levenson他）およびEP-B-0 070 687号明細書（1983年 1月26日発行）に記載されている。有用な分離手段は、膜、例えば、Pall Corporation市販のポリアミド微孔質膜を介する濾過を含む。
しかしながら、いずれかの有用な固形支持体を使用して、捕捉プローブおよび最終ハイブリダイゼーション生成物を固定することができ、それらとしては、マイクロタイター・プレート、試験管、ビーカー、磁気もしくはポリマー粒子、金属、セラミックおよび数種のガラスウールが挙げられる。特に有用な物質は、捕捉プローブを共有結合するのに有用な反応性基を有する磁気もしくはポリマー粒子である。そのような粒子は、一般的には約０．００１〜約１０μｍである。そのような物質の具体例についてのさらなる詳細は、米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他）、米国特許第 5,147,777号明細書（Sutton他）、米国特許第 5,155,166号明細書（Danielson 他）および米国特許第 4,795,698号明細書（Owen他）に提供されている（引用することによりすべて本明細書中に組み入れられる）。
【００４８】
捕捉プローブは、平らな支持体、例えば、ポリマーフィルム、膜、濾紙もしくは樹脂コートまたは非コート紙に付着させることができる。ポリマー粒子に付着された捕捉プローブは、適当な方法、例えば、被覆物を乾燥させること、または加熱融解により付着させるかあるいは接着剤で付着させることで、そのような平らな支持体上に固定化できる。捕捉プローブは、例えば、本発明の自蔵式試験装置の平らな支持体に付着させることができる。そのような物質についての他の詳細な説明は、EP-A-0 408 738号明細書（1991年 1月23日発行）、WO 92/16659 （1992年10月 1日発行）および米国特許第 5,173,260号明細書（Sutton他）に提供されている。
捕捉プローブは、適当な支持体上にいずれかの立体配置、例えば、丸い被覆物もしくはストリップの列に配列できる。
また、本発明は、捕捉試薬を必要とすることなく標的核酸が検出される「均一」増幅方法として既知であるものに使用することもできる。そのようなアッセイについての詳細は、従来技術文献、例えば、EP-A-0 487 218（1992年 5月27日発行）およびEP-A-0 512 334（1992年11月11日発行）において知られている。
【００４９】
増幅反応組成物は、種々増幅アッセイに有用な試験キットの別個に包装された成分の１つとして含まれうる。キットは、水不溶性支持体上に固定化された捕捉試薬、洗浄溶液、溶解性溶液、検出試薬および当業者に容易に明らかな別の物質を包含する、本発明方法に有用な別の試薬、溶液、装置および使用説明書を含むことができる。加えて、試験キットは、別個に包装された前記弱塩基性ポリマー、緩衝剤、弱塩基もしくは強塩基、ならびに増幅および被検体試料調製のいずれかまたは両方に必要とされる別の試薬を含むことができる。また、試験キットは、１つ以上の別のキット成分を含有する試験装置を含むことができる。好ましくは試験装置が、当該技術分野で理解されているような、「自蔵式」である。別のキットは、本明細書に記載の弱塩基性ポリマーおよびハイブリダイゼーション・アッセイで用いられる１つ以上の試薬（例えば、検出もしくは捕捉プローブ）を含むことができる。
以下の実施例は、本発明の実施を具体的に説明するために含めるものであり、そしていずれにしても限定することを意味するものではない。すべてのパーセンテージは、特に断らない限り重量パーセントである。
【００５０】
実施例についての材料および方法：
Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドの調製：
この方法は、前記構造（Ｉ）の新規モノマーの調製を示すものであるが、しかし該調製は、本発明の範囲内の別のモノマーが容易に調製できるような代表的なものである。
水酸化ナトリウム（１２．８ｇ，０．３２モル）を含有する水（１００mL）および１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（３７．５ｇ，０．３モル）を含有するジクロロメタン（２００mL）を混合することにより溶剤混合物を調製し、そして氷浴中で冷却した。この冷却した混合物に、すべて一度に、ジクロロメタン（１００mL）中の塩化メタクリロイル（３４．８ｇ，０．３モル）を窒素雰囲気下で激しく攪拌しながら添加した。加熱して混合物の温度を約６０℃に上げ、そして混合物をさらに１０分間激しく攪拌し、次いで有機層を分離した。水層をジクロロメタン（各回１００mL）で２回抽出した。合わせた有機溶液（有機溶剤層および抽出物）を飽和塩化ナトリウム（１００mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥状態にし、濾過し、そして溶剤を除去した。残渣をクロロホルム（５０mL）に溶解し、続いてエチルエーテル（５０mL）を曇点まで添加した。
【００５１】
得られた反応生成物を約０℃で結晶化し、そして濾過すると融点４５〜４６℃を有する白色固体が得られた。収率は７０％であった。
分析データ：ｍ／ｅ（Ｍ−１９３），１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ  ｄ６）１．８（ｍ，２Ｈ，Ｃ−ＣＨ2 −Ｃ，ＣＨ3 ），３．０２（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2 ），３．９５（ｔ，２Ｈ，ｉｍ−ＣＨ2 ），５．２５および５．６（ＡＢ，２Ｈ，ビニル−ＣＨ2 ），６．８２および７．１５（ＡＢ，２Ｈ，４，５−Ｈ  ｉｍ），７．６（ｓ，１Ｈ，２−Ｈ  ｉｍ），７．９５（ｍ，１Ｈ，ＮＨ）。
【００５２】
ホモポリマーの調製：
本明細書に記載される新規モノマーから調製される好ましいホモポリマーは、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（３００mg）を、窒素雰囲気下を維持して水（９０mL）およびイソプロパノール（１０mL）中にＮ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド（１２．５ｇ，０．０６５モル）を含む溶液に添加することにより調製した。得られた溶液を攪拌しながら水浴中で３時間６５〜７０℃に加熱した。その時点から約１．５時間後、濃ＨＣｌ（３mL）を添加し、そして窒素下で残りの時間攪拌を続けた。次いで溶液をロータリー・エバポレーターで約２５mLに濃縮し、そして得られたポリマー生成物をアセトン（４リットル以上）中で沈殿させ、濾過し、そしてイオン交換水（８０mL）に溶解した。溶液は、１２％固体を含有していた。
【００５３】
第１コポリマーの調製：
ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド−コ−アクリルアミド〕（重量比９０：１０）は、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（４００mg）を、窒素雰囲気下を維持してイオン交換水（１２０mL）およびイソプロパノール（１５mL）中にＮ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド（１８ｇ，０．０９モル）およびアクリルアミド（２ｇ，０．０２８モル）を含む溶液に添加することにより調製した。溶液を攪拌しながら４時間６５〜７０℃に加熱し、続いて希ＨＣｌを添加してpHを約２に低下させた。攪拌および加熱をもう１時間続け、次いで溶液を一晩室温で放置した。
溶液をロータリー・エバポレーターを用いて約７５mLに濃縮し、そして得られたポリマーをアセトン（約４リットル）中で沈殿させ、濾過し、そしてイオン交換水（１５０mL）に溶解した。約１２５mLまでさらに濃縮して、残りのアセトンを除去した。ポリマーは、１５．５％固体で存在した。
【００５４】
第２コポリマーの調製：
ポリ〔２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕（重量比２０：８０）は、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（４００mg）を、窒素雰囲気下を維持してイオン交換水（１８０mL）およびエタノール（２０mL）中に２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド（４ｇ，０．０２モル）および２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１６ｇ，０．０２モル）を含む溶液に添加することにより調製した。溶液を攪拌しながら４時間６５〜７０℃に加熱した。攪拌および加熱をもう１時間続け、次いで溶液を一晩室温で放置した。
得られたポリマーをアセトン（約４リットル）中で沈殿させ、濾過し、そしてイオン交換水（１５０mL）に溶解した。約１２５mLまでさらに濃縮して、残りのアセトンを除去した。ポリマーは、５．６％固体で存在した。
【００５５】
第３コポリマーの調製：
ポリ〔１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕（重量比５０：５０）は、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（３５０mg）を、窒素雰囲気下を維持してＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０mL）中に１−ビニルイミダゾール（１０ｇ，０．１モル）および２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１０ｇ，０．０７７モル）を含む溶液に添加することにより調製した。溶液を攪拌しながら７時間６５〜７０℃に加熱した。
室温で一晩攪拌した後、ポリマーをアセトン（約４リットル）中で沈殿させ、濾過し、そして濃ＨＣｌ（８．５mL）を含有するイオン交換水（２００mL）に溶解した。さらに濃縮して、残りのアセトンを除去した。ポリマーは、１２．４％固体で存在した。
【００５６】
第４コポリマーの調製：
ポリ（１−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（重量比２５：７５）を、「第３コポリマー」のように調製した。得られた溶液は、１３．７％の固体を含んでいた。
従来の方法を用いて、タンパク質１mg当たり約２５０，０００単位の活性を有する、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼを調製した。
以下のプライマーおよびプローブは、既知出発物質および方法を用いて、Applied Biosystems Model 380B ＤＮＡ合成機および標準ホスホラアミダイト化学ならびにＡＢＩ  １マイクロモル濃度スケール、急速サイクルプロトコールを用いて調製した。ヌクレオシド−３′−ホスホラアミダイトおよびヌクレオシド誘導調節化孔質ガラス支持体は、Applied Biosystemsより入手した。
【００５７】
ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡの主要カプシドタンパク質領域に相補的なプライマーおよびプローブは、以下の通りである。
配列番号：１：
5′-X-CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT-3′
配列番号：２：
5′-X-TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT- 3′
配列番号：３：
5′-GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT-Y- 3′
【００５８】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡの６５kD抗原領域に相補的なプライマーおよびプローブは、以下の通りである。
配列番号：４：
5′-X-GAGATCGAGC TGGAGGATCC GTACG-3′
配列番号：５：
5′-X-AGCTGCAGCC CAAAGGTGTT GGACT-3′
配列番号：６：
5′-CGAAATCGCT GCGGTGGCCG CAATCTGCTC-Y- 3′
【００５９】
ＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡのｇａｇ領域に相補的なプライマーおよびプローブは、以下の通りである。
配列番号：７：
5′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC- 3′
配列番号：８：
5′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT- 3′
配列番号：９：
5′-ATCCTGGAAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-Y-3′
【００６０】
プライマー配列では、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細書（Levenson他）の教示（引用することにより本明細書に組み入れられる）を用いて２つのテトラエチレングリコール・スペーサー単位を介して配列に付着したビオチンホスホラアミダイト部分（DuPont）を表す。すべての精製を、核酸精製カラムを用い、続いて逆相ＨＰＬＣ技法を用いて実施した。
捕捉プローブ配列では、Ｙは、Levenson他の前記特許の方法を用いて調製された３−アミノ−１，２−プロパンジオール部分およびホスフェート連結基で接続された２つのテトラエチレングリコール・スペーサーを含む。
【００６１】
低コピーＨＩＶ１標的プロウイルスＤＮＡを、８Ｅ５／ＬＡＶセルライン（ＨＩＶ−Ｉゲノムの単一組込みコピー（single integrated copy）を含む）から従来の方法を用いて抽出した。細胞溶解およびタンパク質消化に続いて、フェノール／クロロホルム抽出により核酸を精製した：トリス飽和フェノール（７５０μＬ）を細胞懸濁液に添加し、そしてファノール／溶解物溶液を混合して遠心分離により分離した。次いで水性相を新しい２mL管に移した。クロロホルム  イソアミルアルコールを用いてこの処理方法を繰り返した。水性層を酢酸ナトリウムで０．３モル濃度へ導いた。９５％冷エタノールを添加することにより核酸を沈殿させ、そして−７０℃で１時間保存した。次いでＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡの濃度をＡ260 で測定し、そしてコピーの数を変化させる一連の希釈を、「ＴＥ」緩衝剤〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１ミリモル濃度）および（エチレンジニトリロ）四酢酸（０．１ミリモル濃度）〕で実験に使用するために行った。試料（５〜１０μＬ）を、捕捉するためのＤＮＡ溶液に添加した。
【００６２】
対照ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９（ＡＴＣＣ  ＶＲ５３８）を、特性細胞変性効果が明らかに単層の＞９０％となるまで、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）中で増殖させた。細胞培養液を収穫し、最終容量の２０％のウシ血清を添加し、そして細胞をペレット化した。遊離ウイルスを含有する上清を−８０℃で凍結した。対照ＤＮＡ増幅については、この保存調製物の１：１０の連続希釈液を緩衝溶液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル濃度，pH８）およびツイーン（TWEEN ，商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）〕で調製した。次いで連続希釈液を５分間沸騰してウイルス粒子を溶解し、そしてこれらの試料のアリコートをＰＣＲ反応混合物に添加した。
結核菌ＤＮＡは、結核菌培養物、無発病性菌株Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ  ２５１７７）をMacFarland #1 標準と同じ濁度に希釈することにより入手した。これは、約３×１０8 コロニー形成性単位／mL（cfu ）に対応する。ＤＮＡ増幅については、この保存調製物の１：１０連続希釈液を前記緩衝溶液で調製した。次いで連続希釈液を３０分間沸騰して細菌を溶解した。１．８×１０4 cfu に対応する標的核酸のレベルが、各々３００μＬの反応混合物に用いられた。
【００６３】
実施例３の臨床試料は、Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital (Houston, Texas)のDr. Gregory J. Buffoneから入手した。これらの試料は、ｈＣＭＶ  ＤＮＡ「培養陽性」もしくは「培養陰性」であることが予め測定されていた。培養陽性試料は、さらに目視的に観察される培養陽性結果を得るのに要する時間の長さで評点を付けた（初期に目視的に陽性である試料は、一般的により培養可能なウイルスを含有すると考えられる）。
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤および凍結乾燥化子ウシ胸腺ＤＮＡは、Sigma Chemical Co.より入手した。
ゾニル（ZONYL,商標）FSP 陰イオン性フッ素化リン酸エステル界面活性剤は、DuPontより入手した。
ツイーン（TWEEN,商標）２０非イオン性界面活性剤は、ICI Americas, Inc.より入手した。
【００６４】
言及したＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体は、米国特許第 5,338,671号明細書（前記）に記載されるように調製した。
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲート溶液は、市販（Zymed Laboratories, Inc.）のストレプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート（１３１ng/mL ）、カゼイン（０．５％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（１０ミリモル濃度）ならびにメルチオレート（０．５％）をリン酸緩衝溶液（２５ミリモル濃度のリン酸ナトリウムおよび７５ミリモル濃度の塩化ナトリウム）に含むものであった。最終コンジュゲート濃度は３１２ng/mL であった。
洗浄溶液（pH７．４）は、リン酸ナトリウム，一塩基性一水和物（２５ミリモル濃度）、塩化ナトリウム（３７３ミリモル濃度）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル濃度）、エチルマーキュリチオサリチル酸ナトリウム塩（２５マイクロモル濃度）およびデシル硫酸ナトリウム（３８ミリモル濃度）を含むものであった。
【００６５】
色素提供性組成物（pH６．８）は、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（２５０マイクロモル濃度）、ポリ（ビニルピロリドン）（１１２ミリモル濃度）、過酸化水素（０．０３％）、ジエチレントリアミン五酢酸（１００マイクロモル濃度）、３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびリン酸ナトリウム，一塩基性一水和物（１０ミリモル濃度）を含むものであった。
水性色素信号停止溶液は、アジ化ナトリウム（０．１％）を含むものであった。
【００６６】
捕捉試薬は、前記配列番号：３、配列番号：６もしくは配列番号：９のオリゴヌクレオチドを、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５，平均直径１μｍ）に以下の方法で付着させることにより調製した。水への粒子の懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（０．１モル濃度，pH６）で２回洗浄し、そして約１０％固体となるように懸濁させた。緩衝剤（０．１モル濃度）で３．３３％固体となるように希釈した、洗浄した粒子の試料（３．３mL）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（８４mg/mL 水，２．１mL）および適当なプローブ（４４．４４OD/mL ナノピュア水，２２μＬ）と混合した。得られた懸濁液を水浴中５０℃で約２時間、断続的に混合しながら加熱し、そして遠心分離した。粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．００１モル濃度）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（０．０１モル濃度，pH８）で３回洗浄し、そしてそして４％固体となるようにそれに再懸濁した。
【００６７】
ＰＣＲ反応混合物（１００mL）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル濃度，pH８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度）、ゼラチン（０．０１％）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（実施例２および３では各々１．５ミリモル濃度、そして実施例４では各々１．０ミリモル濃度）、グリセロール（９．５％）、プライマー（特に断らない限り、各々０．４マイクロモル濃度）、前記ＤＮＡポリメラーゼ（１６単位／１００μＬ）ならびに前記ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体（実施例２および４でのみＤＮＡポリメラーゼに対するモル比５０：１）を含むものであった。
下記実施例２では、個々の試薬および溶液についての部屋（chamber)を有する、使い捨て化学試験パックもしくは装置を用いてＰＣＲによる増幅を実施した。これらの部屋および装置は、ポリエチレン（3M Co.市販のスコッチ・パック（SCOTCH PAK，商標））で被覆されたポリエステルのシート（厚さ０．０１cm）から形成され、折り重ねて、直径約１．３cmの円形の部屋を得た。開口部を提供してＰＣＲ試薬混合物を添加できるようし、それを真空により部屋に流し入れた。次いで開口部をヒートシールした。増幅後、部屋の角を切断し、そして生成物を含有する反応混合物を微小管（０．５mL）に移して、生成物の検出を実施するまで４℃で保存した。米国特許第 5,089,233号明細書に詳細に記載されている従来の自動ＰＣＲ処理機を用いて（引用することにより本明細書中に組み入れられる）、ＰＣＲプロトコールを実施した。
【００６８】
実施例３および４における増幅は、従来のパーキン・エルマー・ジェネアンプＰＣＲシステム9600サーモサイクラー（Perkin Elmer GENEAMP（商標） PCR System 9600 thermocycler ）を用いて、０．２mLのミクロアンプ（MICROAMP，商標）反応管で実施した。
ＰＣＲ増幅プロトコールは、以下のそれぞれの実施例に記載する。
スレセル（SURECELL，商標）試験装置を用いて、増幅生成物を検出した。これらの装置は、Eastman Kodak Company （Clinical Diagnostics Division ）より市販されており、そして各々ロプロジン（LOPRODYNE,商標）微孔質膜（Pall Corp.，平均孔径５マイクロメートル）を備えた３つの試験ウェルを含む。０．２５％の希釈液に、各捕捉試薬（１．２μＬ）を、試験装置の試験ウェル中の膜の一定領域に配置して乾燥した。これらの試験装置は、米国特許第 4,948,561号明細書（Hinckley他）により詳細に記載されている（引用することにより本明細書中に組み入れられる）。
【００６９】
以下のように、検出を実施した。最終増幅反応混合物の一部（５μＬ）を緩衝溶液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル濃度，pH８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度）およびゼラチン（０．０１％）〕（９５μＬ）と混合し、そして９５℃で５分間インキュベーションして核酸を変性した。次いで、増幅した標的核酸を５０℃で捕捉プローブとハイブリダイズできるように、得られた溶液をスレセル（商標）試験装置に移した。
次いで、試験デバイスの試験ウェルを、５５℃で緩衝溶液〔リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル濃度）、塩化ナトリウム（１５０ミリモル濃度）、デシル硫酸ナトリウム（１％）およびエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）〕（２５０μＬ，pH７．４）で洗浄した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲート溶液（５０μＬ）を各試験ウェルに添加し、そして室温で膜を介して流出させた。２分後、試験ウェルを２回洗浄した。
【００７０】
次いで色素提供性組成物（１００μＬ）を各試験ウェルに添加し、続いて室温で２分間インキュベーションした。次いで色素停止溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに添加して色素発色を停止し、そして得られた色素信号を０〜１０（最高濃度）の濃度スケールで目視的に採点した。バックグラウンドの読み取りは、捕捉試薬が全く配置されていない膜上の領域から得た。
増幅生成物混合物（６．７５μＬ）を予め臭化エチジウム（最終濃度０．４mg/mL ）で染色されたアガロースゲル（２．５％）に添加することにより、ゲル電気泳動を実施した。臭化エチジウム（最終濃度０．４mg/mL ）を含有する電気泳動緩衝剤（６００mL）を用いて約１時間約８ボルト／cmでゲルを電気泳動した。緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、硼酸塩およびエチレンジアミン四酢酸の混合物であった。得られたバンドは従来の分子量マーカーを含んでおり、そして生成物バンド強度を、０が検出可能な信号なしを表しかつ５が最高信号を表す、０〜５のスケールで採点した（ＨＩＶ１については１１５−mer であり、そして結核菌については３８３−mer である）。
別の試薬および材料は、市販のものであるか、または容易に入手可能な出発物質および従来の方法を用いて調製した。
【００７１】
【実施例】
実施例１  弱塩基性ホモポリマーを用いたＤＮＡの捕捉および放出
この実施例は、ポリ（１−ビニルイミダゾール）を用いて核酸を捕捉および放出する、本発明の実施を具体的に示すものである。
様々な量のポリ（１−ビニルイミダゾール）〔２．４％保存溶液の１：１０希釈液（pH２．３）〕を、子ウシ胸腺ＤＮＡ（１００μＬ，０．５μg/μL ）と混合し、そしてボルテックスで渦巻混合して核酸とポリマーとの沈殿を形成した。次いで１分間遠心分離を行った。追加量のポリマー（２．４％保存溶液，１０μＬ）を各上清に添加し、そして残りの混合物をボルテックスで渦巻混合して遠心分離して、第１の沈殿が定量的であったかどうか求めた。下記第Ｉ表に、用いたポリマーの量および各試料について観察された沈殿のタイプを示す。
【００７２】
【表１】
0004354537.tif 000004
【００７３】
沈殿が酸性条件下（pH２．３）で生じたこと、およびポリマー保存溶液の１：１０希釈液５０μＬを用いて子ウシ胸腺ＤＮＡ溶液（０．５μg/μL ）１００μＬをほぼ定量的に沈殿させることができたことが認められた。また、この観察は、従来のゲル電気泳動方法を用いて確認された。
どのようにして沈殿を可溶化し、それによって後で使用する際に核酸を放出させるか求めるために、実験を行った。下記第II表に、試みた種々のペレット可溶化条件および得られたペレットサイズを示す。最も有用な技法は、塩基性pHと合わせて加熱を使用することであった（ペレットなし）。従来のゲル電気泳動は、塩基性pHで、ポリマーおよび核酸が遊離物質として存在したことを明瞭に示した。従って核酸は、後の使用、例えば、ＰＣＲで利用可能である。
【００７４】
【表２】
0004354537.tif 000005
【００７５】
＊    「ＴＥ」緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル濃度，pH８）にエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）を含む。
＊＊  「ＴＷ」緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル濃度，pH８）にツイーン（TWEEN,商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）を含む。
下記第III 表に、ポリマー（保存溶液の１：１０希釈液，５０μＬ）と子ウシ胸腺ＤＮＡ（０．５μg/μL 溶液，１００μＬ）との間の沈殿の形成におけるpHの影響を示す。酸性pHは、沈殿（ペレット）の形成による核酸の効果的な捕捉に明らかに必要とされていた。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
実施例２  ＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡの捕捉および放出ならびにＨＩＶ１  ＤＮＡおよびゲノム結核菌ＤＮＡの増幅
この実施例は、非標的核酸の存在下で標的核酸を捕捉および放出し、続いて単離された標的核酸を増幅する、本発明の実施を具体的に示すものである。
子ウシ胸腺ＤＮＡ（非標的ＤＮＡ，２５０μＬ，０．５μg/μL ）を、１００コピーのＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡと共にまたは含めないで、ポリ（１−ビニルイミダゾール）（２．４％溶液の１：１０希釈液，１２５μＬ）と混合し、そしてボルテックスで渦巻混合して沈殿を形成し、そして１分間遠心分離を行って沈殿を単離することにより、実験の試料を調製した。
沈殿を、水（２５μＬ）への水酸化ナトリウム溶液（１８７．５μＬ，５０ミリモル濃度）かまたは水性水酸化ナトリウムおよびゾニル（ZONYL,商標）FSP 陰イオン性フッ素化リン酸エステル界面活性剤（２５μＬ）に再懸濁し、続いて１００℃で１０分間加熱した。次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（３７．５μＬ，０．５モル濃度）を各溶液に添加して、最終ＤＮＡ濃度を０．５μg/μL にした。陰イオン性界面活性剤を幾つかの沈殿に添加して、ＤＮＡの放出および増幅におけるその効果を求めた。
【００７８】
各々得られた混合物（６０もしくは１５０μＬ）に、前記ＰＣＲ増幅反応混合物（２４０もしくは１５０μＬ）を添加して最終反応混合物３００μＬを得て、そして以下のプロトコールを用いて増幅を４０サイクル実施した。
１）９５℃で１５秒間変性（第１サイクルについては８０秒間）、および
２）標的ＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡについて６２℃で３０秒間プライマー・アニーリングおよびプライマー伸長。
結核菌ＤＮＡ（１００コピー）を同時に増幅（段階２において６４℃でプライマー伸長）したが、それをＰＣＲ反応混合物に直接添加した。それは、弱塩基性ポリマーにかけなかった。これは、ポリマーが、非捕捉標的核酸の増幅に悪影響を与えないであろうことを具体的に示した。
【００７９】
増幅後、２つの方法を用いて増幅された標的ＤＮＡの存在を検出した。
（ａ）ゲル電気泳動：各増幅生成物溶液のアリコート（１２μＬ）を従来の試料追跡色素４μＬに添加した。臭化エチジウム（最終濃度０．４mg/mL ）で予め染色した２．５％アガロースゲル上に、得られた混合物を充填した。電気泳動を１．５時間１２０ボルト（volt）で実施した。ゲルバンドを紫外線光下で透視して、前記のように採点した。
（ｂ）スレセル（SURECELL，商標）試験装置の色素信号を前記のようにして得た。
下記第IV表に、様々な条件下における幾つかの試料についてのゲル電気泳動および色素色スコアの結果を示す。これらの結果は、ＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡ標的核酸が、弱塩基性ポリマーを用いて捕捉および放出された後に首尾よく増幅されたことを示す。加えて、結核菌ＤＮＡも増幅され、これは、反応混合物中のポリマーが外来的に添加された核酸の増幅を阻害しなかったことを示す。
標的レベルが３０μｇおよび７５μｇにおける色素信号およびゲル電気泳動の結果は、同量の煮沸もしくは非煮沸子ウシ胸腺ＤＮＡ（試料１７〜２０）または非煮沸ヒト胎盤ＤＮＡ（試料２１〜２３）で得られたものと一致した。ゾニル（ZONYL,商標）FSP 陰イオン性界面活性剤のすべてのレベルで、増幅は激しく阻害され、いずれの検出技法についても観察された信号は全くなかった。試料１および２は、ＨＩＶ１プロウイルスＤＮＡ（それぞれ、反応混合物３００μＬあたり２４および６０コピー）についての最も有効な増幅を具体的に示した。
【００８０】
【表４】
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【００８１】
実施例３  ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡの試料調製および増幅
この実施例は、医療センターから入手した９つのｈＣＭＶ「培養陽性」および３つの「培養陰性」尿検体を用いて、本発明の実施を具体的に示すものである。また、本実施例は、本発明を、常用される試料調製方法、すなわち、試料を１００℃で１０分間非イオン性界面活性剤の存在下で加熱することと比較するものである。
各尿検体の２つのアリコート（各々１５０μＬ）を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル濃度，pH８）にツイーン（TWEEN,商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）および子ウシ胸腺ＤＮＡ（１０μｇ）を含有する緩衝溶液（１５０μＬ）と混合した。
【００８２】
混合物を、各々１００℃で１０分間加熱した。一組の被検体に、弱塩基性ポリマー，ポリ（１−ビニルイミダゾール）（２．４％の１：１０希釈液，１２５μＬ）を添加して、ポリマーおよび核酸の沈殿を形成した。得られた懸濁液を、１４，０００rpm で５分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを水酸化ナトリウム（８３μＬ，５０ミリモル濃度）に再懸濁し、そして１００℃で１０分間加熱して核酸を放出させた。次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（１７μＬ，０．５モル濃度，pH７）を添加して溶液を中和した。
第２組目の被検体は、さらなる処理を全く行わなかった。
【００８３】
各溶液（両方の処理済被検体）のアリコート（２０μＬ）を、言及したｈＣＭＶプライマーを含有する前記ＰＣＲ試薬混合物（８０μＬ）に添加し、そしてＰＣＲサイクルを以下のプロトコールを用いて４０サイクル実施した。
１）９４℃で３０秒間変性、および
２）６４℃で３０秒間プライマー・アニーリングおよびプライマー伸長。
増幅された生成物の検出は、実施例２に先に記載されたように捕捉プローブと色素色信号発生を用いて達成され、そして培養により求めた結果を比較した（臨床被検体のみ）。
【００８４】
図１および下記第Ｖ表に、培養結果と比較した、両方の方法の結果を示す。この実施例では、培養結果と比較したとき、本発明が８９％の感度（９つの培養陽性被検体中８つ）、および１００％の感度（３つの培養陰性被検体中３つ）を具体的に示したことは、明らかである。対照試料調製方法（非イオン性界面活性剤の存在下における加熱）は、培養結果と比較したとき、３３％の感度（９つの培養陽性被検体中３つ）、および１００％の感度（３つの培養陰性被検体中３つ）を示した。
この実施例は、臨床被検体中に存在するかもしれないインヒビターから標的核酸を取り除く利点を具体的に示している。当該技術分野で用いられる別の方法は同様の結果を達成できるが、しかしより煩雑で、時間がかかりかつ環境を不安全にする方法である。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
実施例４  標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡの捕捉および放出ならびに数種のポリマーを用いた増幅
この実施例は、本発明の範囲内の数種の弱塩基性ポリマーを用いて前記実施例３と同様に実施した。
種々のｈＣＭＶ  ＤＮＡ希釈液（１０μＬ）を、ボルテックスで渦巻混合することにより、１．５mLの微小遠心管中で、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル濃度，pH８）およびツイーン（TWEEN,商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）を含有する緩衝溶液（７０μＬ）と、そして子ウシ胸腺ＤＮＡ（２０μＬ，０．５μg/μL ）と混合した。希釈したポリマー（１００μＬ，約０．２４％固体）を各管に添加し、そして得られた混合物をボルテックスで渦巻混合した。
【００８７】
ポリマー１は、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド  ヒドロクロリド〕（１２％固体）であり、ポリマー２は、ポリ〔Ｎ−ビニルイミダゾール−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート〕（重量比５０：５０，５．３％固体）であり、そしてポリマー３は、ポリ〔Ｎ−（３−イミダゾリルプロピル）メタクリルアミド  ヒドロクロリド−コ−アクリルアミド〕（重量比９０：１０，１５．５％固体）であった。標的核酸を全く含有しない陰性対照を、同様に調製して処理した。別の対照は、標的核酸を含有したが、しかしポリマーの代わりに蒸留水（１００μＬ）を被検体と混合した。
得られた混合物を１４，０００rpm で３０秒間遠心分離して、沈殿を上清から分離して上清を捨てた。得られたペレットに緩衝剤（１００μＬ，ツイーン（TWEEN,商標）２０非イオン性界面活性剤を含有する前記のもの，pH１０）を添加し、続いてボルテックスで渦巻混合して１００℃で５分間加熱した。
【００８８】
標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡ保存溶液の希釈レベルは、以下の通りであった。
レベル１：  １：５００
レベル２：  １：５，０００
レベル３：  １：５０，０００
レベル４：  １：５００，０００
捕捉して放出された標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡの増幅および検出を、プロトコールを４０サイクル用いて実施例３に記載したものと同様に実施した。
１）９５℃で３０秒間変性（第１サイクルについては１８０秒間）、および
２）６８℃で３０秒間プライマー・アニーリングおよびプライマー伸長。
【００８９】
結果を、図２および下記第VI表に示す。図２では、初めの三組の棒は、３種の弱塩基性ポリマーの各々について捕捉され次いで増幅されたｈＣＭＶ  ＤＮＡレベル由来の本発明により得られた色素色スコアを示す。最終組の棒は、核酸を単離するためにポリマーを全く使用しなかったときの結果を示す。第VI表の色素スコアは、前記実施例３に記載のように求めた。
これらの結果は、標的核酸が最低レベルのときを除いて、増幅に際して、３種の弱塩基性ポリマーが標的核酸を効果的に捕捉および放出したことを示す。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
本発明をその好ましい態様を特に引用して詳細に記載してきたが、しかし変更および修正が本発明の精神および範囲内で可能であることは理解されるだろう。
【００９２】
【配列表】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３で得られたデータを棒グラフで示したものである。
【図２】図２は、実施例４で得られたデータを棒グラフで示したものである。
【図１】
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【図２】
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