(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系のTh２活性のアップレギュレーションを有すると診断された個体における障害の治療用医薬組成物であって、
該治療は、該個体の免疫系の非−M．vaccae抗原に対するTh１活性のアップ−レギュレーションを伴わずに、非−M．vaccae抗原に対するTh２活性をダウン−レギュレートし、
該組成物は、マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）の死細胞を含むが、非−M．vaccae抗原、免疫原又はアレルゲンを全く含まず、そして
該障害は、慢性疲労症候群、湾岸戦争症候群、総合アレルギー症候群、喘息、花粉症又は湿疹である、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記細胞が、オートクレーブにかけることにより殺されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Th１活性からTh２活性への免疫系の活性シフトを特徴とする失調の治療に関する。マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）の調製物は、特に、Th１活性の随伴性アップ−レギュレーションを伴わない、Th２活性のダウン−レギュレーションにより、非特異的全身性Th１バイアスに影響を及ぼすことができるということが、驚ろくべき発見に基づき、確立されている。本発明が適用されることができるところの失調は、慢性疲労症候群（Chronic Fatigue Syndrome）、湾岸戦争症候群（Gulf War Syndrome）、及び総合アレルギー症候群（Total Allergy Syndrome）を含む。
慢性疲労症候群（CFS）（Turnberg et al．）を患う患者は、アレルギー現象のより高い発生率、２倍の数の、アレルギー性皮膚反応、及び低活性のNK細胞活性及び低生産IFNγ及びIL−２をもつことができる（Straus，1996）。いくつかのものは、高レベルの、EBウイルスに対する抗体をもち、これは、減少されたTh１活性をもつ個体の特徴でもある。彼（女）らは、気分の変化及び抑うつをももつ。これらの特徴は、全て、サイトカイン・プロフィールにおけるTh１〜Th２スイッチに適合する。このバイアスは、現代のライフ−サイクルの結果であることができ、これは、上記集団を、十分なTh１−誘導性刺激に晒すことに失敗し、そしてむしろ上記集団をTh２−誘導性免疫感作及びアレルゲンに晒す傾向にある。
本発明者らは、湾岸戦争症候群は、Th２−誘導性刺激が同定されることができるところのCFSの特別なケースを表していると信じている。なぜなら、湾岸戦争要員は、多数のTh−２−誘導性種痘を与えられたからである。種痘又は感染は、全身的効果を発揮することができ、そして他の無関係な抗原に対する応答のTh１／Th２サイトカイン・バランスを非特異的に増加又は減少させ（Shaheen et al．，1996，Shirakawa et al．，1996）、そして無関係な疾患からの生存に（正又は負に）影響を及ぼすことができる（Aaby，1996，Aaby et al．，1995）。湾岸戦争において使用された上記種痘が全身的Th２スイッチを引き起こしたという本発明者らの信念は、上記種痘プロトコールの４つの特徴により支持される：
（ｉ）百日咳（Pertussis）が、英国軍においてワクチンとして使用された。そしてそのアジュバント活性は、強力にTh２である（Mu & Sewell，1993，Ramiya et al．，1996，Smit et al．，1996）。
（ii）湾岸戦争軍隊は、疫病（plague）、炭疽（anthrax）、腸チフス（typhoid）、破傷風（tetanus）、及びコレラ（cholera）に対する、Th２−誘導性免疫原を与えられた。さらに、このような大きな抗原負荷は、Th２に対する応答を駆動させる傾向にある（Aaby，1995，Bretscher et al．，1992，Hernandez-Pando & Rook，1994）。
（iii）上記種痘は、上記戦争域内に軍隊を展開した後に与えられ、又は彼（女）らがそこに行く直前に、ストレス・レベルが高くなっているであろう時に、与えられた。高められたレベルのグルココルチコイド（すなわち、コルチゾール）の存在下での免疫感作は、Th２に対する応答を駆動する（Bernton et al．，1995，Brinkmann & Kristofic，1995，Ramirez et al．，1996）。
（iv）上記軍隊は、カーバメート及び有機リン殺虫剤にも晒され、そしてこれらは、正常なTh１の働きにとって不可欠なIL−２駆動された現象を阻害する（Casale et al．，1993）。この成分の重要性は明確ではない。しかしながら、上記殺虫剤が、しばしば湾岸における現地の源から得られ、それ故、純度は知られておらず、そしてさらに毒性の汚染物が存在していたかもしれないという噂がある。
従って、上記環境下で投与された多くの種痘が、長期間持続する全身的サイトカインの不均衡を引き起こしたかもしれない。同一の効果が、種痘又は他のTh２−誘導性の環境刺激及び感染に因り、一般集団内で散発的に生じるであろうし、そして慢性疲労症候群のかなりの発生を説明することができる。
上記の点を以下より詳しく説明する。
本発明者らは、（死んだ）マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）の調製物が、非特異的なやり方で全身的Th１→Th２バイアスを強力に改善することができるという驚ろくべき観察を行った。この効果は、注射されたM．vaccae調製物中に存在しない抗原に対する免疫応答を包含する方法で、Th２から遠くに、免疫系の活動をバイアスさせることである。
このことは、動物モデルとヒトの両者において実験的に証明されている。代表的な実験を、以下、詳細に説明する。特に、それらは、驚ろくべきことに、Th１活性のアップ−レギュレーションと共にあることはできない、Th２活性のダウン−レギュレーションを示す。
簡単に言えば、実験動物においては、M．vaccaeの投与に対するTh２活性から遠ざかる非特異的全身的バイアスは、Th２応答を確立するために事前に免疫感作されたマウスにおいて、卵白アルブミン（M．vaccae自体に無関係なアレルゲン）に対するIL−４（Th２）依存性抗体応答の力価における減少として、見られることができる。M．vaccaeの単一注射は、上記効果を引き起こすことができ、そしてさらなる注射は、それを強化することができる。この効果は、非特異的である。なぜなら、それは、注射された調製物中の卵白アルブミンのいずれの成分の存在をも必要としないからである。
ヒト（癌患者）においては、この効果は、IL−２（特徴的なTh１サイトカイン）を自発的に分泌するリンパ球の末梢血液中での出現、及びホルボール・ミリステート・アセテート及びカルシウム・イオノフォアによる刺激後にIL−４（特徴的なTh２サイトカイン）を分泌するＴ細胞における減少、により証明されてきた。この活性化されたTh１表現型を示すリンパ球のパーセンテージは、M．vaccaeの連続的な注射のそれぞれの後に、次第に増加し、109生物の３〜５回の注射後に（０，15，30日目、そしてその後、１回／日）、多くの個体においてプラトーに達する。
その上、有益な効果をもってM．vaccae調製物が投与されているところの慢性疲労症候群を患うヒト被験体の以下の報告が含まれる。
M．vaccaeは、結核（tuberculosis）（GB-A-2156673）、癌（ZA 95／2644）、HIV（WO 94／06466）、及び慢性炎症（GB-B-2252044）の治療における使用について本発明者らにより先に開示されている。（同じく本発明者らによる）WO 92／08488は、着目の抗原を投与するためのアジュバントとしてのその使用について開示しており、Th２パターンからTh１パターンへの抗原に対する応答のＴ−細胞成分の変化を述べている。WO 92／08488中には、M．vaccaeが免疫系の活性における非特異的Th２／Th１シフト、すなわち、M．vaccaeと共に投与された抗原に特異的に載せられた応答におけるシフト以下のいずれかのシフト、を引き起こすことができるという示唆は、全くない。さらに、それが、Th１を同時にアップ−レギュレートせずにTh２活性をダウン−レギュレートすることができるという示唆は、WO 92／08488又はその他のいずれにも存在しない。
Th１アジュバントとしてのM．vaccaeのレビューは、Abou-Zeid et al．（1997），Skinner et al．（1997a）、及びSkinner et al．（1997b）を含む。Th２細胞増殖に対する阻害効果をもつTh１サイトカインのアップ−レギュレートをレビューするMosmann and Sad（1996）をも参照のこと。
本発明は、一般に、特に、Th２活性のダウン−レギュレーションがTh１活性の同時アップ−レギュレーションを伴わずに有益である場合、特に、Th１からTh２活性への免疫系活性におけるシフトを特徴とする失調の治療において、Th１活性のアップ−レギュレーションを伴わずに個体の免疫系のTh２活性をダウン−レギュレートすることに関する。
１の側面においては、本発明は、マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）の抗原性及び／又は免疫調節性材料の個体への投与を含む、個体の治療方法に関する。
本発明のさらなる側面は、個体の治療のための医薬の製造におけるマイコバクテリウム・バカエの抗原性及び／又は免疫調節性材料の使用を提供する。
本発明の他の側面は、個体の治療における使用のための物質又は組成物であって、マイコバクテリウム・バカエの抗原性及び／又は免疫調節性材料を含む物質又は組成物を提供する。
好ましくは、M．vaccae調製物は、いずれの異質（extraneous）（“外来（foreign）”）抗原、免疫原又はアレルゲンを含まずに、提供される。
治療されるべき失調は、Th１活性からTh２活性への患者の免疫系の一般的な、非特異的バイアスを特徴とするものであることができる。これは、個体における減少されたIL−２生産又は増加されたIL−４又はIL−５生産を参照して、又はTh２サイトカインの代表としてのIL−13の検出、及びTh１サイトカインの代表としてのインターフェロン・ガンマ（IFNγ）の検出により、評価又は診断されることができる。他のTh１／Th２サイトカインも考慮されることができる。免疫系のTh１からTh２活性への非特異的シフトは、特定の抗原に個体を晒すこと、又は特定の病原体による感染に帰されることはできず又はそれにより引き起こされることはできない。
治療される個体は、結核又は他のマイコバクテリア感染を患っているものであってはならない。本発明に従って治療されることができる特定の失調は、慢性疲労症候群、湾岸戦争症候群、及び総合アレルギー症候群（Straus，1996）を含む。Th１のアップ−レギュレーションを伴わないTh２活性のダウン−レギュレーションが有益であるところの他の失調が、本発明に従って治療されることができる。
慢性疲労症候群は、例えば、いわゆる、1994 CDC基準（Fukuda et al．）又はいわゆるOxford基準（Sharpe et al．）を使用して、使用できるように（operationally）定められることができる。慢性疲労症候群についての最近の知識は、（1996年10月に公表された）Turnberg et al．中に要約され、そして討議されている。
マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）材料は、M．vaccaeの死細胞であることができ、又はそれを含むことができる。このような細胞は、例えば2.5メガラッドの線量における60コバルトからの照射を使用して、化学的に、又はいずれかの他の手段により、殺されることができる。但し、例えば、115〜125℃における10分間の69kPaでのオートクレーブが、好ましい。オートクレーブは、照射よりもより有効な調製物をもたらすことができる。
殺される前に、M．vaccae細胞は、好適な固体培地上で培養されることができる。修飾されたSauton’s液体培地が、好ましくあることができ（Boyden et al．）、寒天で、好ましくは、1.3％寒天で固化されることができる。一般に10日間32℃における、好気的インキュベーションの後、上記生物が収穫され、次に計量され、そして希釈剤中に懸濁され、投与を準備されることができる。使用前に要求される場合、保存は、４℃であることができる。
固体培地上で細胞を培養する代わりに、例えば、発酵槽内で、液体培地、例えば、修飾Sauton’s培地（Boyden et al．）を使用することができる。
希釈剤は、緩衝液化されていない生理食塩水、無発熱源であることができる。好ましくは、上記希釈剤は、好ましくは、界面活性剤、例えば、Tween 80▲Ｒ▼を含有するホウ酸塩−緩衝液化されている。好適なホウ酸塩バッファーは：Na2B4O7・10H2O−3.63ｇ、H3BO3−5.25ｇ、NaCl−6.19ｇ、Tween 80▲Ｒ▼  0.0005％であって１リッターに水で希釈したものである。これらの希釈剤は、医薬として許容されることができる。
上述のヒトの結果は、GMP調製物、SRL 172としてM．vaccaeの投与により得られており、これは、いくつかの検査者、連邦医薬局（the Federal Drug Administration）からのIND’s、及びUKにおける医薬管理局（the Medicines Control Agency）からのCTX’sの下、ヒト用途のために利用されることができる。GLPの急性毒物学は、ハンチングドン・リサーチ（Huntingdon Research）により行われている。フェーズ１とフェーズ２の安全性データは、米国内で得られており、そしてFDAに保管されている。SRL 172は、結核の免疫療法のためのフェーズ３試験におけるものである。SRL 172は、本発明における使用のために好ましいものであることができる。
SRL 172は、受託番号第11659号の下、1984年２月13日に、the National Collection of Type Cultures（NCTC）Central Public Health Laboratory，Colindale Avenue，London NW9 5HT，United Kingdomに、ブダペスト条約下に寄託されたR877Rと命名された株から得られたM．vaccae配合物である。R877Rは、Central UgandaのLango地方からの泥サンプルから元来単離されたものである（Stanford and Paul）。
他のM．vaccae株は、SRL 172の代わりに使用されることができる。生化学及び抗原の基準によりM．vaccaeに属するものとして１の生物を同定することができる（Bonicke et al．）。
本発明のためには、上記M．vaccae材料が、非−M．vaccae抗原性又は免疫調節性材料を含まずに、又は実質的に含まずに、投与されることが好ましい。換言すれば、投与されるべき医薬又は組成物は、M．vaccae抗原性及び／又は免疫調節性材料、例えば、死細胞、その抽出物又は誘導体、及び医薬として許容される希釈剤を含むことができ、又はそれらから本質的に成ることができる。
投与は、好ましくは、“治療的に有効な量”にあり、これは、患者に利益を示すために十分なものである。このような利益は、少なくとも１の徴候の少なくとも改善であることができる。実際の投与量、及び投与速度及び時間経過は、処理されているものの性質及び重度に依存するであろう。治療の処方、例えば、投薬についての決定等は、一般的実務者その他の医師の責任の範囲内にある。
（死細胞が投与される場合）単一投与量は、一般に、107〜1010の死んだM．vaccae微生物を含有するであろう。患者は、108〜109の死んだM．vaccaeの単一投与量を投与されることができるが、その投与は、必要な場合、例えば、２週間〜６ケ月間の間隔で、繰り返されることができる。
組成物は、治療される症状に依存して、単独で、又は同時に又は順番に、他の処置物と共に、投与されることができる。
本発明に係る医薬組成物、及び本発明に係る使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。このような材料は、非毒性でなければならず、そして活性成分の効果を妨害してはならない。上記担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存するであろう。これは、好ましくは、例えば皮膚（cutaneous）、皮下（subcutaneous）又は皮膚内（intra-dermal）での注射によるものである。
注射のためには、活性成分は、無発熱源であり、そして好適なpH、等張性、及び安定性をもつ非経口的に許容される水性溶液の形態にあることができるであろう。医薬として許容され、そして好ましいものであることができる好適な希釈剤は、既に先に討議されている。
その医薬組成物が錠剤、カプセル、粉末、又は液体の形態にある場合、経口投与を使用することができる。錠剤は、固体担体、例えば、ゼラチン又はアジュバントを含むことができる。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物又は植物油、鉱物油又は合成油を含む。生理学的生理食塩水溶液、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例えば、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールが含まれることができる。
M．vaccaeは、例えば、気道の適当な部分に届くサイズの粒子を含む、好適な配合物を使用して、気道へのエアロゾルにより投与されることができる。これは、水性懸濁液よりもむしろ乾燥粉末であることができる。
死んだ細胞の代わりに、M．vaccaeから得られる材料、特に、必要な活性をもつ抽出物又は合成分子を、使用することができる。
先に既に簡単に討議したように、多種痘（multiple vaccinations）、ストレス、その他の要因が、湾岸戦争の退役軍人における長期間持続性の全身的サイトカイン不均衡を引き起こすことができた。同一の効果が、種痘又は他のTh２−誘導性環境刺激及び感染に因る、一般集団内で散発的に生じるであろうし、そして慢性疲労症候群のかなりの発生を説明することができる。
強力な免疫原は、無関係な抗原に対する免疫応答の性質に対する全身性、長期間持続性の非特異的効果をもつことができる。例えば、はしか感染は、アトピーの発症を減少させ、そしてハウス・ダスト・ダニに対するアレルギー反応を発生率を減少させる（Shaheen et al．，1996）。同様に、ツベルクリン皮膚−テスト陽性である日本の子供は、ツベルクリン陰性である子供よりもアトピー性が低く、そして彼（女）らの、循環Th１／Th２サイトカインの比は、より高い。その上、BCGの繰り返された注射の後、ツベルクリン変換が生じている者は、彼（女）らのアトピー性徴候を喪失する高められた確率をもつ（Shirakawa et al．，1996）。
はしか種痘は他の例である。上記ワクチンは、標準的な投与量において使用されるとき、接種されていない集団内でのはしかの発生率により説明されることができるものよりもかなり高いものにより、死亡率を減少させた。ジフテリア、破傷風、及び百日咳ワクチン（Th２−誘導性）は、上記非特異的保護効果を示さない（Aaby et al．，1995）。しなしながら、高力価のはしかワクチンが使用されたとき、その死亡率は増加した。但し、はしか自体からの保護は維持された（Aaby，1995，Aaby et al．，1995）。死亡率における上記増加がTh２に対するスイッチを伴い、そしてTh２成分の誘導における投与量に関係した増加がいくつかの他の免疫原についてよく確立されているという証拠が存在する（Bretscher et al．，1992，Hernandez-Pando & Rook，1994）。湾岸戦争において使用されたワクチンは、Th２−誘導性（疫病、炭疽、腸チフス、破傷風、コレラ）であり、そして大きな抗原の負荷を累積的に構成され、さらにTh２を好むものであった。その上、この傾向は、アジュバントとして百日咳菌の使用により増加されるようになっていたであろう。なぜなら、それは、Th２の強力な誘導物質であるからである（Mu & Sewell，1993，Ramiya et al．，1996，Smit et al．，1996）。百日咳菌のこの特性は、最近、子供におけるその使用がアトピーの同時性の増加した流行に寄与するという可能性の討議を導いた（Nilsson et al．，1996，Odent et al．，1994）。
上記ワクチンが全身的Th２応答を駆動する生来の傾向は、種痘時に湾岸戦争の要員がそれに晒されたところのストレスに対して２次的な内分泌要因により大きく高められているであろう。
いくつかのステロイド・ホルモンは、Ｔ細胞応答を調節する。デヒドロエピアンドロステロン（Dehydroepiandrosterone（DHEA））又はDHEAの未知の代謝産物は、Th１パターンを促進する傾向がある。従って、DHEAは、年老いたマウスにおいて免疫機能を修復し、そして年とった動物に見られる調節不全のサイトカイン放出を正すことができる（Daynes et al．，1993，Garg & Bondada，1993）。年老いたヒトにおける同様の特性についてもテストされている（Morales et al．，1994）。それは、Th１サイトカイン、例えば、IL−２及びIFNγの生産を強化する（Daynes & Araneo，1989，Daynes et al．，1990，Daynes et al．，1995，Daynes et al．，1991）。DHEAは、ヒト末梢血液Ｔ細胞からのIL−２分泌をも高める（Suzuki et al．，1991）。
DHEAの上記効果は、Th２活性を強化し、そしてTh２サイトカインと共にシナジーを与える、グルココルチコイド、例えば、コルチゾールの効果の逆である（Fischer & Konig，1991，Guida et al．，1994，Padgett et al．，1995，Wu et al．，1991）。“未処置の（naive）”Ｔリンパ球の増殖が、非特異的刺激の存在下で（Brinkmann & Kristofic，1995）、又は抗原（以下のような種痘）により、駆動される場合、Th２サイトカイン特性をもつＴリンパ球が発達するであろう。これは、正常な状況下、少ない記憶細胞をもつ“クリーン（clean）な”実験げっ歯類からの脾臓細胞を用いて、むしろ明確に示されてきた（Ramirez et al．，1996）。概して、その“最終結果（bottom line）”は、コルチゾールが、未処置細胞からのTh２サイトカイン特性の発達を支持するということである（Brinkmann & Kristofic，1995）。この点は、確立されたTh２細胞のサイトカイン分泌活性がコルチゾールにより容易に阻害されるという事実により混乱されてはならない。従って、Th−２仲介疾患、例えば、湿疹（eczema）、喘息（asthma）、及び花粉症（hay fever）のための従来の治療のためのコルチゾール・アナログの使用は、抗−炎症効果を介して、そしてTh２細胞によるサイトカイン生産の減少により（Corrigan et al．，1995）、働くことができ、そしてさらに同時に、コルチゾールの使用は、新たに漸増された、Th２に対するＴ細胞を駆動することにより上記の根本的な問題の永続化を促進するであろう。
生理学的及び身体的ストレスは、視床下部−下垂体−副腎軸を活性化し、そしてそれ故、コルチゾールの高められた生産を含むさまざまな変化を導く。過度の運動並びに食物及び睡眠の欠乏は、DHEA対コルチゾールの低下した比（DHEA／コルチゾール比）をもたらした。これは、遅れた過敏症（delayed hypersensitivity（DTH））応答性（Th１マーカー）における低下に直接に相関し、そして血清IgEレベルにおける同時上昇が存在した。IgEは、Th２サイトカイン生産に全体として依存する（Bernton et al．，1995）。これは、先に概説したDHEAとコルチゾールの既知の、効果の点から予想されるはずである。
ストレスのTh１→Th２スイッチング効果のさらなる例は、生徒の試験に対して、ストレスと同様のやり方で反応する生徒における、EBウイルスに対する抗体の増加である。このウイルスは、通常、Th１応答及び細胞毒性Ｔ細胞によりコントロールされ、そしてコントロールの喪失は、ウイルスの複製及び増加した抗体をもたらす（Zwilling，1992）。同様に、試験期間の間の医学生からの末梢血白血球は、IFNγ、Th１サイトカインのためのより低いmRNAを示した（Glaser et al．，1993）。
同様の点が、動物におけるよりよくコントロールされたやり方で証明されることができる。押し込み（crowding）又は拘束（restraint）に因るストレスは、マウスにおける結核におけるマイコバクテリア増殖を高めることができる（Brown et al．，1993，Tobach & Bloch，1956）。これは、小さなTh２成分の存在に対して敏感に感受性であるモデルである（Rook & Hernandez-Pando，1996）。他の例も討議されている（Moynihan，1994）。
抑うつが、脳内の過剰なコルチゾール仲介効果に関係付けられることができ（（Raven et al．，1996）中にレビューされる）、そしてストレスが、抑うつを導くことができるという、かなりの証拠が在る。従って、（CFS及びGWSにおいて見られるような）抑うつは、Th２−仲介失調、例えば、喘息、湿疹と関係する傾向にあり、そしていくつかの内分泌変化は、Th２失調及び抑うつに一般的なものである（Holsboer et al．，1984，Rupprecht et al．，1995）。
結核においては、全身的Th２シフトが存在し（Rook & Hernandez-Pando，1996）、そして異常なパターンの、副腎ステロイドの代謝産物が、尿中に排泄される（Rook et al．，1996）。従って、コルチゾンの代謝産物に対してコルチゾールの高められた代謝産物が存在する。上記疾患の治療は、Th１優勢を修復し、そしてコルチゾールの代謝産物に対してコルチゾンの代謝産物が増加するようにステロイド代謝産物のパターンを正す（Rook et al．，1996）。
医薬メチラポン（metyrapone）による抑うつの治療は、ステロイド代謝産物におけるいくらかの変化を引き起こす（例えば、コルチゾールの代謝産物に対するコルチゾンの代謝産物の増加）（Raven et al．，1995）。M．vaccae調製物SRL 172は、結核の免疫療法において有効である。
先に討議したように、種痘は、Th１／Th２バランスにおける全身的非特異的変化、並びに通常、求められる抗原特異的免疫感作を誘導することができる。CFSのための治療は、正常な健康な個体に特徴的なTh２を超えるTh１の優勢を回復するために、全身的な非特異的Th１バイアスの誘導を要求することができる。これは、湾岸戦争において要員により受容された種痘により誘導されていることができたバイアスの反対側である。
本明細書中に提供する実験的証拠は、今般、驚ろくべきことに、マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）調製物は、湾岸戦争退役軍人において見られる有害なTh１〜Th２バイアスを低下させることができるということを示す。
本発明を、以下に、実験例及び以下の図面を参照して、限定を伴わずに、説明する：
図１は、46日目の値について計算された、卵白アルブミンで最初に免疫化された後の、各日におけるマウスにおける合計血清IgE（ng／ml±SD）における変化を示す。
閉じた円は、M．vaccae受容体に関するものであり；中空の四角は、生理食塩水対照に関するものである。便宜的に、卵白アルブミンによる免疫感作の日、及びM．vaccae又は生理食塩水の投与の日を示す。
図２は、卵白アルブミン・チャレンジマウスから採取された脾臓細胞からのインビトロにおける放出されたIL−５（pg／ml±SD）の計測値を示す。使用されたアッセイにより検出された最小濃度は、15.6pg／mlであった。
図３は、OVAにより前もって免疫化されたBALB／ｃマウスにおける、合計血清IgE（ng／ml）に対する、107のM．vaccae調製物（○）に比較した、生理食塩水の皮下注射（●）による治療の効果を示す。（図３Ａ）107非修飾M．vaccae（Mv）、（図３Ｂ）OVA−抱合M．vaccae（Mv-OVA）、又は（図３Ｃ）NaCl−洗浄及びペリオデート−処理対照M．vaccae（NaCl-Mv）。データは、42日目に採取されたサンプルを用いて得られた読みに対する変化、±SDとして表わされる。免疫感作及び処置スケジュールを、上記図面中に示す。
図４は、OVAで前もって免疫化されたBALB／ｃマウスにおける、OVA−特異的IgEに対する、107のM．vaccae調製物（○）に比較した、生理食塩水の皮下注射（●）による治療の効果を示す。（図４Ａ）非修飾M．vaccae（Mv）（O.D．405nm）、（図４Ｂ）OVA−抱合M．vaccae（MvOVA）（O.D．405nm）、又は（図４Ｃ）NaCl−洗浄及びペリオデート−処理対照M．vaccae（NaCl-Mv）（ng／ml）。データを、46日目に採取されたサンプルにより得られた読みに対する変化、±SDとして表す。免疫感作及び治療スケジュールを、上記図面中に示す。
図５は、OVAと共に培養された脾臓細胞によるIL−２の生産を示す。脾臓は、０日目、及び24日目にOVAで免疫化され、そして53日目、及び81日目に、107非修飾M．vaccae（Mv）、M．vaccae上に抱合されたOVA（Mv-OVA）、又は対応の対照NaCl−洗浄及びペリオデート処理対照M．vaccae（NaCl-Mv）で処理されていたマウスから109日目に得られた。培養上清を、24時間後に、IL−２測定のために集めた。これらのデータを、サイトカインの平均レベル±SD（pg／ml）として表す。
図６は、OVAと共に培養された脾臓細胞によるIL−５の生産を示す。脾臓を、０日目、及び24日目にOVAで免疫感作され、そして53日目と81日目に、107非修飾M．vaccae（Mv）、OVA抱合M．vaccae（Mv-OVA）、又は対応の対照NaCl−洗浄及びペリオデート処理M．vaccae（NaCl-Mv）で処理されていたマウスから109日目に得た。培養上清を、48時間後に、IL−５測定のために集めた。これらのデータを、IL−５の平均レベル±SD（pg／ml）として表す。
図７は、OVAで前もって免疫感作されたBALB／ｃマウスにおける血清IgEレベルに対する生理食塩水に比較したM．vaccaeの異なる投与量の単一の皮下注射による処理の効果を示す。血清IgEを、M．vaccae又は生理食塩水（平均±SE）による処理前の、32日目に採取されたサンプルを用いて得られた読みに対する変化（ng／ml）として表す。処理後血清サンプルを、52及び70日目（すなわち、42日目の生理食塩水又はM．vaccaeによる処理の10日後及び28日後）に集めた。免疫感作及び治療スケジュールを、実験方法において示す。異なる群間の比較を、Mann-Whitney U-testにより行った。
図８は、OVAを用いた脾臓によるIL−２（図８Ａ）とIL−４（図８Ｂ）の生産を示す。BALB／ｃマウスは、M．vaccaeの異なる投与量：107，108、又は109（pg／ml）に先立って、OVAを２回、与えられた。脾臓を、82日目に収穫し、そしてOVAと共に培養した。免疫感作と治療スケジュールを、実験方法中に示す。培養上清を、48時間後に、IL−４測定のために、そして24時間後にIL−２測定のために集めた。これらのデータを、サイトカインの平均レベル±SDとして表す。異なる群の間の比較を、スチューデントｔ−検定により行った。（生理食塩水：生理食塩水処理前のOVAによる２回の免疫感作：107Nv：107M．vaccae処理前のOVAによる２回の免疫感作）。
図９は、合計血清IgE（図９Ａ）とOVA特異的IgE（図９Ｂ）に対する、生理食塩水（●）に比較した、107M．vaccae（○）の２回の皮下注射（53日目と81日目）の処置の効果を示す。免疫感作と治療スケジュールを上記図面上に示す。血清IgEを、46日目に採取されたサンプルにより得られた読みに対する変化±SD（ng／ml）として表す。異なる群の間の比較を、Mann-Whitney U−テストにより行った。（OVA：卵白アルブミン免疫感作；Mv：M．vaccae免疫感作）。
図10は、OVA（ng／ml）と共に培養された脾臓細胞によるIL−５（図10Ａ）、IL−２（図10Ｂ）、及びIFN−γ（図10Ｃ）の生産を示す。脾臓細胞は、109日目に収穫され、そしてOVAと共に培養された。免疫感作及び治療スケジュールを図９上に示す。培養上清を、48時間後にIL−５測定のために、そして24時間後にIFN−γ及びIL−２測定のために、集めた。これらのデータを、サイトカインの平均レベル±SDとして表す。異なる群の間の比較を、スチューデントｔ−検定により行った。（生理食塩水：２回の生理食塩水処理前のOVAによる２回の免疫感作；107Mv：２回の107M．vaccae処理前のOVAによる２回の免疫感作）。
本明細書中に言及する文献の全てを、引用により取り込む。
実施例１
実験動物へのM．vaccaeの投与、及びその免疫系のTh２活性において得られる非特異的減少の証明
６〜８週齢のBalb／ｃマウスを、０日目と24日目に、油中に乳化した50μｇの卵白アルブミン（不完全Freund’sアジュバント）で免疫感作させた。これは、IgE生産を伴い、そして２つのTh２サイトカイン、IL−４とIL−５の放出をプライムする、強いTh２パターンの応答を引き起こすことが知られている。
動物は、次に、（皮下注射により）53日目と81日目に、生理食塩水又は107のオートクレーブされたM．vaccaeを受容した。
血清サンプルを、46日目に（すなわち、生理食塩水又はM．vaccaeによる処理前に）、そして67日目、91日目、及び109日目に、採取した。
脾臓細胞を、次に、インビトロ培養系における卵白アルブミンによる攻撃のために収穫した。これら培養物の上清を、ELISAによるサイトカインのアッセイのために48時間目に収穫した。
Pharmingenからの抗体対を用いた、捕獲アッセイを使用した。
IL−５ #18051D捕獲；#18062D（ビオチニル化）検出。この検出抗体の結合は、ストレプトアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ抱合物（Dako P0397）を用いて現われ、そしてその色素原はABTS（Sigma A-1888）であった。
IgE #02111D捕獲；#02122D（ビオチニル化）検出。この検出抗体の結合は、アビジン−アルカリ・ホスファターゼ抱合体（Sigma E-2636）を用いて現われ、そしてその色素原は、pNPP（Sigma N-2770）であった。
IgEレベルの結果を、46日目の血清濃度（処置前の最後の値）に比較して、ng／mlにおける変化として表す。従って、46日目の値を、各その後の採血における値から差し引く。
結  果
M．vaccaeの注射は、卵白アルブミンを用いた免疫感作により引き起こされたIgEレベルにおける上昇を減少させた。M．vaccaeによる処置により引き起こされた減少は、テストされたすべての時点で有意であった。これらの結果を図１中に示す。
同様に、免疫化された動物からの脾臓細胞は、ドナー動物がM．vaccaeで処理される場合、卵白アルブミンに対する応答においてインビトロにおいてIL−５を放出することに失敗した。一方、生理食塩水で処理された免疫化された動物からの脾臓細胞は、卵白アルブミンに対する応答において多量のIL−５を放出した。これらの結果を図２中に示す。IL−５は、卵白アルブミンなしで培養された対照ウェル内では、全く検出されなかった（データを示さず）。
結  論
M．vaccaeは、
（ｉ）強力なアレルゲン（この場合、卵白アルブミン）による免疫化後、及び
（ii）Th２−誘導性分子のエピトープを用いずに、与えられた時でさえ、Th２の応答パターンを減少させるであろう。
それ故、アレルゲン自体に対する直接的アジュバント効果に依存しない、Th２応答パターンの非特異的、全身的ダウンレギュレーションが存在する。
実施例２
血清IgEに対する異なるM．vaccae調製物の効果
血清IgE力価に対する抱合M．vaccae-OVAの効果を測定するためのさらなる実験において、BALB／ｃマウスを、IgE応答を誘導するために２回IFA中のOVAで免疫化し、次に、生理食塩水、非修飾M．vaccae、抱合M．vaccae-OVA又は対応のOVA−非含有“擬似（mock）”−抱合調製物、NaCl洗浄、ペリオデート処理M．vaccae（NaCl-Mv）で２回処理した。46日目に、OVA免疫化マウスは、非免疫化動物における55.4±1.7（S.E.）ng／mlに比較して、112.9±10（S.E.)ng／ml IgEをもっていた（ｐ＜0.01）。各マウスにおいて、46日目の値を、データを、０の出発（すなわち、46日目の）値に正規化するために使用し、そして各々のその後の値から差し引いた。それ故、プロットされた値は、46日目に対するng／mlにおける変化である。
（生理食塩水で処理された）対照マウスにおける合計血清IgEは、その実験の経過時間にわたり安定して（steadily）増加した（図３Ａ−Ｃ）。非修飾M．vaccaeで処理されたマウスにおける合計IgEの抑制が存在した（図３Ａ）。これに反して、NaCl−洗浄、ペリオデート処理された調製物は、OVAに抱合されるか（図３Ｂ）又はされないかに拘らず（図３Ｃ）、IgE−阻害において有効でなかった。但し、対照NaCl-Mvの１の投与量は、合計血清IgEの過渡的抑制を示した（ｐ＜0.05）（図３Ｃ）。これらの結果は、IgEをダウンレギュレートする能力が、NaCl洗浄により又は抱合手順により、抑止されたことを示した。
これに反し、非修飾M．vaccaeと対照NaCl-Mvのいずれも、OVA−特異的IgEをダウンレギュレートしなかった（図４Ａと４Ｃ）。その上、OVA−特異的IgE応答は、抱合されたMv-OVAによる処理により実際に強化された（図４Ｂ）。
実施例３
脾臓細胞によるIL−２生産に対する異なるM．vaccae調製物の効果
OVAで免疫化されたマウスからの脾臓細胞を、109日目に収穫し、そしてインビトロにおいてOVAと共に培養した。生理食塩水処理を受けたOVA感作マウスからの脾臓細胞は、インビトロにおいてOVAに対する応答においてIL−２を生産することに失敗した。OVA成分を含有していなかったM．vaccae調製物で処理された免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、OVAに対する応答においてIL−２の検出可能なレベルを作り出したが、その増加は、有意ではなかった。これに反し、抱合OVA含有M．vaccae調製物で処理されたマウスからの脾臓細胞は、OVAに対する応答において高レベルのIL−２を放出した（生理食塩水受容体に比較してｐ＜0.05）（図５）。これらの結果は、M．vaccae上のOVAの抱合が、OVAに対する応答においてIL−２生産を増加させたことを明らかにした。
従って、卵白アルブミンがM．vaccaeに含まれない（抱合されない）場合、卵白アルブミン（ovalbumin）に対するTh１応答における有意な増加は存在しない。その上、上記のように、卵白アルブミンが含まれるとき、その後Th１応答が高く有意になるけれども、Th２の抑制は、改善されず、そして減少されることができる（本明細書中の他の実験を参照のこと）。
実施例４
脾臓細胞によるIL−５生産に対する異なるM．vaccae調製物の効果
OVA感作マウスからの脾臓細胞は、OVAに対する応答において高レベルのIL−５を作り出した（図６）。しかしながら、M．vaccaeで処理されていたOVA免疫化マウスからの細胞は、非修飾、NaCl洗浄対照、又はOVA抱合であるかに拘らず、全て、OVAに対する応答において有意に少ないIL−５を放出した。従って、IgEが計測されたときに見られた結果とは対照的に、上記抱合手順自体、又はM．vaccaeに抱合されたOVAの存在のいずれも、IL−５放出のダウンレギュレーションに対する効果をもっていなかった。どちらかといえば、IL−５をスイッチ・オフする能力は、M．vaccae上へのアレルゲンの抱合により減少された。なぜなら、Mv-OVAのための関連対照がNaCl-Mv（擬似抱合物）であったからである。
実施例５
動物における血清IgEに対するM．vaccaeの異なる投与量の効果
合計血清IgEに対するM．vaccaeの異なる投与量の効果を測定するために、BALB／ｃマウスを、IgE応答を誘導するために２回（０日目と21日目に）IFA中のOVAで免疫化した。それらを、32日目に採血し、そして次に、42日目に、生理食塩水で、又は107，108、又は109のM．vaccaeで処理した。
32日目に、OVA免疫化マウスは、非免疫化動物における69.27±6.09（S.D.)に比較して、117.09±35.81（S.D.)ng／ml IgEをもっていた（ｐ＜0.001）。各マウスについて、32日目の値を、データを０の出発（すなわち、32日目の）値に正規化するために使用し、そしてそれぞれのその後の値から差し引いた。それ故、プロットされた値は、32日目に対するng／mlにおける変化である。
（生理食塩水により処理された）対照マウスにおけるIgE応答は、さらなるサンプルが採取されたとき（すなわち、42日目の処理の10日後と28日後）に、52日目及び70日目まで、さらに増加した（図７）。反対に、IgEレベルにおける増加は、107，108、及び109におけるM．vaccaeで処理されたマウスにおいて抑制された（図７）。全てのｐ値は、生理食塩水及び異なる投与量のM．vaccaeで処理されたマウスの間で、0.01未満である。
実施例６
脾臓細胞によるサイトカイン生産に対するM．vaccae処理の効果
BALB／ｃマウスを、実施例５のために使用したものと同一のプロトコールに供した。次に、82日目に、それらの脾臓細胞を収穫し、そしてインビトロにおいて、OVA，M．vaccae、及びConAで培養した。生理食塩水処理群からの脾臓細胞は、OVAに対する応答において、IL−２ではなく、IL−４を生産した（図８Ａ／Ｂ）。107のオートクレーブされたM．vaccaeで処理されていたOVA免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、OVAに対する応答において、IL−２合成を示し、そしてIL−４生産を減少させた。OVAに対する応答におけるIL−２合成は、108又は109のM．vaccaeで処理されたマウスからの脾臓細胞を使用しても見られた。
M．vaccae処理マウスにおけるIL−２生産における増加は有意ではなく（そのSDは、その応答よりも大きなものであり）、その群内のマウスのいくつかだけを含んでいた。処理されたマウスのほとんどが、IL−２を作り出さなかった。
実施例７
血清IgEに対するM．vaccaeの２つの投与量の効果
107のM．vaccaeが、それ自身の抗原に対してTh１応答を引き起こすための最適な投与量であることが先に示されており、そしてパイロット実験において最も有効な投与量であったので（図７）、この投与量を、さらなる試験のために選択した。BALB／ｃマウスを、IgE応答を誘導するために０日目と24日目に２回OVAで免疫化し、そして次に53日目と81日目に、生理食塩水、又は107のM．vaccaeで２回処理した。46日目に、OVA免疫化マウスは、非免疫化動物における55.4±1.7（S.E.)ng／mlに比較して、112.9±10（S.E.)ng／ml IgEをもっていた（ｐ＜0.01）。各マウスについて、46日目の値を、データを０の出発（すなわち、46日目の）値に正規化するために、使用し、そしてそれぞれのその後の値から差し引いた。それ故、プロットされた値は、46日目に対するng／mlにおける変化である。
（生理食塩水で処理された）対照マウスにおける合計血清IgE応答は、上記実験の経過の間安定的に増加した。反対に、IgEにおける増加は、107のオートクレーブされたM．vaccaeで処理されたマウスにおいて抑制された（図９Ａ）。一方、M．vaccaeの処理による抗−OVA IgEの抑制は、上記アッセイにより有意なものではなかった（図９Ｂ）。しかしながら、さらなる実験は、M．vaccaeを４回受容したOVA−感作BALB／ｃマウスが有意に低いOVA特異的IgE力価をもっていたことを示している。
OVAに対するIgG1及びIgG2a抗体は、M．vaccae処理により影響されなかった。
実施例８
脾臓細胞によるIFN−γ，IL−２、及びIL−５に対するM．vaccae処理の効果
BALB／ｃマウスを、実施例７のために使用したものと同じプロトコールに供した。次に、109日目に、それらの脾臓細胞を収穫し、そしてインビトロにおいてOVAと共に培養した。生理食塩水処理群からの脾臓細胞は、OVAに対する応答において、高レベルのIL−５を作り出したが、IL−２は作り出さなかった。しかしながら、107のオートクレーブ処理されたM．vaccaeで２回処理されていたOVA免疫化マウスからの細胞は、OVAに対する応答においてIL−５を放出することに失敗した（図10Ａ）。107のM．vaccaeの２つの投与量を受容していたマウスからの脾臓細胞による、OVAに対する応答におけるIL−４生産は、減少されたようであったが、このサイトカインのレベルは、イムノアッセイの検出限界にあまりに近いので信頼性がなかった。先に示したように（図８Ａ）、OVA誘導IL−２生産は、統計的に有意ではないけれども、M．vaccaeで処理されたいくつかのマウスの脾臓細胞からの上清中で再び検出されることができた（図10Ｂ）。減少されたTh２が、増加されたIL−２を示さなかった動物において見られた。異なる群からの脾臓細胞によるOVA−誘導IFN−γ合成における差異は全く存在しなかった（図10Ｃ）。
討  議
IFA中のOVAによる２回の免疫感作を受容したBALB／ｃマウスは、典型的なTh２型の応答を顕出した。上昇したレベルの血清IgEが存在し、そしてこれらのマウスからの脾臓細胞は、インビトロにおけるOVAに対する応答においてIL−２ではなくIL−５を放出した。最も驚ろくべき発見は、BALB／ｃマウスにおけるこの進行性のアレルゲン特異的応答が、M．vaccae調製物中のOVA又はOVAエピトープのための必要性を伴わずに、低投与量の殺されたM．vaccaeによる処理によりダウンレギュレートされたということである。
同様に、我々の実験は、OVAにより誘導された高レベルの血清IgEが、M．vaccaeの広いレンジの投与量により抑制されたことを現わした。これは予想外のことである。なぜなら、マウスにおける先の投与量−応答試験は、検出可能なTh２成分を含まずに、M．vaccae中に含まれるマイコバクテリア抗原に対するTh１応答を誘導するための最適値として107を同定し、一方、109が、混合Th１＋Th２応答を引き起こすからである。上記理由の全てのために、上記モデルにおけるM．vaccaeの効果は、Th１サイトカインの抑制的効果を介して働くことができないようである。IgEレベルの調節のさらなるレベルが、IgE結合性因子の誘導に帰されることができる。
卵白アルブミンがM．vaccaeに含まれ（それに抱合されない場合、卵白アルブミンに対するTh１応答における有意な増加は全くなく、そしてそれが含まれるとき、Th１応答は高く有意になるけれども、Th２の抑制は、改善されず、そして減少されることができる。
実施例９
Th１とTh２サイトカイン特性の計測
CFSと湾岸戦争症候群におけるサイトカイン特性についていくつかのデータが在るが、それらは、相反するものであり、そして信頼できる方法を使用していない。但し、全体的な臨床像は、上記のような高められたTh２／Th１比を示唆している（Straus，1996）。
これを証明するための最適な技術は、自然にIL−２（Th１）又はIL−４又はIL−５（両者共Th２）を分泌し、又はカルシウム・イオノフォア及びフォルボール・ミリステート・アセテート（PMA）によるインビトロにおける刺激後に上記サイトカインを分泌することを誘導されることができる、末梢血液からのＴ細胞の正確な数及びパーセンテージを計数するためのフロー・サイトメトリーである。（分泌は、実際、サイトカインが細胞内に集積するように阻害剤（モネンシン（monensin））によりブロックされ、それは、（固定化及び透過化処理後に）適当な蛍光色素−標識されたモノクローナル抗体を用いて検出される。）
この技術を使用すると、Th２細胞は、正常なドナーの末梢血液中では極めて稀であるが、慢性感染又は癌をもつ患者の循環中では一般的なものであることができる（公表されていない観察）。
第２の技術は、血漿又は血清中のサイトカイン・レベルの直接的な計測である。インターロイキン13（IL−13）は、Th２サイトカインの代表として検出されることができ、そしてインターフェロン・ガンマ（IFNγ）は、Th１サイトカインの代表として検出されることができる。
湾岸戦争退役軍人のサイトカイン特性は、上記技術の中の１を使用して調べられる。Th１→Th２バイアスの測定は、上記徴候の改善のためのM．vaccae投与の利用可能性を示す。
実施例10
投与のためのM．vaccaeの調製
M．vaccaeを、1.3％寒天で固化させた修飾Sauton’s培地（Boyden et al）を含む固体培地上で培養する。上記培地に、上記微生物を接種し、そしてその微生物の成長が生じることができるように32℃で10日間、好気的にインキュベートする。次に、これらの微生物を収穫し、そして計量し、そして希釈剤中に懸濁させて、100mgの微生物／１mlの希釈剤を得る。次に、この懸濁液を、さらに、緩衝液化生理食塩水で希釈して、10mgの湿重量（約1010細胞）の微生物／１mlの希釈剤を含有する懸濁液を得て、そして５mlの多投与（multidose）バイアル内に小分けする。次に生きた微生物を含むバイアルを、69kPaで10分間オートクレーブ（115℃〜125℃）にかけて、上記微生物を殺す。こうして作った治療剤を、使用前に４℃で保存する。
実施例11
Th１／Th２サイトカイン・シフトを特徴とする失調の治療におけるM．vaccaeの使用
１mg湿重量（約109細胞）のM．vaccaeを含有する、実施例３に従って調製された懸濁液0.1mlを、激しく振とうし、そしてその直後に、左三角筋（deltoid muscle）上の皮膚内注射により投与する。
上記患者におけるTh１とTh２サイトカイン・レベルを、Th２からTh１へのシフト、特にTh２活性のダウン−レギュレーションを確認するために、その患者の徴候の改善を観察しながら、定期的に計測することができる。
実施例12
M．vaccaeを使用した慢性疲労症候群をもつ患者の治療
（１）扁平上皮細胞肺癌のためにSRL-172で処置され、そして慢性疲労症候群の同時存在診断が行われている70歳の患者は、驚ろくべきことに、SRL-172の２回の注射後に、後者の徴候が取り除かれること（lifting）を報告した。彼女は、彼女自身気分がかなりよくなり、そして彼女の“精神的苦痛は晴れていた”。オルガンの先生として、彼女は、数人の追加の生徒を引き受けており、これは、彼女の改善を示している。この患者は、１年以上にわたりSRL 172で治療されており、そして引き続きよい生活状態を報告している。
（２）一般的疲労、偏頭痛、抑うつ、食品アレルギー、及びリンパ節症を含む徴候をもつ患者は、７〜８年間、CFSの病歴をもつ。SRL 172の２回の注射後、彼女は改善を報告した。彼女の痛みを感じるのど、及びはれた腺、及び食品アレルギーは、かなり改善され、そして彼女は、より少ない投与量のサイロキシン（Thyroxin）を必要とした。彼女は、かなり気のきいた方法で話しをし、そして彼女がより少なく抑うつであると言った。
（３）ある患者の徴候は、頭痛、抑うつ、及び多食品アレルギーの形態を呈した。SRL 172による処置の前、処置の多くの他の形態が、効果を伴わずに試みられた。彼女の徴候をコントロールする試みにおいて、多量のナルクロン（Nalcron）が規則的に摂取された（毎日、食前食後Nalcron 100mgの80カプセル）。彼女は、２ケ月の間隔で（at 2-monthly intervals）SRL 172を受容していたので、彼女のCFSの徴候、及び彼女の食品アレルギーは、かなり改善され、そして彼女は、彼女が彼女の規則的な注射を続ける限り、彼女自身がひじょうによい状態であると信じている。
文  献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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