(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを提供し、該ｃＤＮＡはｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含し、
（ｂ）β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、
（ｃ）該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形質転換細胞を形成せしめ、
（ｄ）該形質転換細胞を親細胞から選別し、そして
（ｅ）該形質転換細胞を無血清培地に馴化させる
ことを包含する方法によって得られる形質転換細胞。
【請求項２】
該ｃＤＮＡが、配列表の配列番号４の塩基配列であることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項３】
該動物細胞が、ＲＫ１３細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換細胞を無血清培地で培養して、日本脳炎ウイルス様粒子を培養液に放出させ、
（ｂ）該培養液から培養上清を取得し、
（ｃ）該培養上清から該ウイルス様粒子を単離・精製する、
ことを包含する、日本脳炎ウイルス抗原の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、日本脳炎ウイルス抗原に関する。更に詳細には、日本脳炎ウイルス様粒子を包含してなる日本脳炎ウイルス抗原であって、該ウイルス様粒子は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であり、且つ該ウイルス様粒子は赤血球凝集活性を示すことを特徴とする日本脳炎ウイルス抗原に関する。更に本発明は、日本脳炎ウイルス様粒子を発現する形質転換細胞、日本脳炎ウイルス抗原の製造方法、日本脳炎ワクチン及び診断剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
日本脳炎は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルスによって引き起こされる重篤なウイルス感染症であり、その主症状は、発熱、髄膜刺激症状、脳炎症状である（Clinical Virology 13: 166-172, 1985）。感染しても大部分の人は不顕性感染で終わるが、一旦発症したら死亡率は高く、予後も中枢神経損傷による知能障害や運動障害等の後遺症が残る確率が高い。
【０００３】
日本脳炎ウイルスは、直径が約５０ｎｍの球型ウイルスであり、構造タンパク質はキャプシド（Ｃ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質と膜（Ｍ）タンパク質である。全長約１１ｋｂの（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムはＥタンパク質のスパイクで覆われている（Annu. Rev. Microbiol. 44: 649-88, 1990）。Ｅタンパク質は細胞への吸着に関与し、赤血球凝集能を持ち、中和抗体を誘導するなど、感染防御に重要な役割を果たしている（Virology 44(1): 108-24, 1971; J. Virol. 14(3): 631-9, 1974; J. Gen. Virol. 70 (Pt 8): 2037-49, 1989及びActa Virol. 26(5): 312-20, 1982）。
【０００４】
日本では近年流行の兆しを見せていないものの、１９６０年代には年間数千人の患者が日本脳炎を発症し、約千人が死亡し、社会問題にまで発展した難病である。最近は、主に中国、東南アジアで流行し、ＷＨＯも厳重に動向を監視している疾病のひとつである（Clinical Virology 13: 135-143, 1985）。日本脳炎に対する予防法は現在のところワクチン接種のみで、有効な治療法はない。
【０００５】
現在の日本脳炎ワクチンは、ウイルス感染マウスの脳乳剤を原材料とするものしか存在しない（“Japanese encephalitis vaccine” in Minimum requirements for biological products, Association of Biologicals Manufactures of Japan ed., pp. 99-101, 1993）。現行の日本脳炎ワクチンはこれまで何度か精製方法が検討された極めて安全性の高い不活化ワクチンであるが（Appl. Environ. Microbiol. 39: 54-7, 1980及びVaccine. 9(12): 865-7, 1991）、日本脳炎ウイルス感染マウスの脳が原材料であるため（BIKEN J. 11: 25-39, 1968）、残存しているかもしれない脳物質や、マウス由来の迷入ウイルスによる副反応のおそれがある。また、ウイルス自体を扱うため、製造工程には危険な作業が伴い、従って製造コストも高い（Vaccine. 18: 26-32, 2000及びLancet. 337(8748): 1044, 1991）。結果として、発展途上国ではワクチンの入手が難しいといった問題が生じている。このような状況を鑑みて、ＷＨＯはマウス脳を使わない、ウイルスを使わない、コスト安のワクチンの開発を緊急課題として要請した。これを受けて、世界中の研究室で、次世代日本脳炎ワクチンの開発研究が様々な手法によって進められている（Intervirology. 44(2-3): 176-97, 2001）。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術により、日本脳炎ウイルスの構造遺伝子を導入した組換え細胞に抗原を発現させるという方法がある。しかし、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質は細胞にとって毒性が強いため、動物細胞発現系では、産生したＥタンパク質によって発現細胞自身が死滅してしまうことがある（J. Virol. 75(5): 2204-12, 2001）。また、酵母発現系では粒子抗原が開裂してしまい、中和抗体を誘導できないという報告がある（Bull. World Health Organ. 65(3): 303-8, 1987）。ワクシニアウイルスのゲノム中に日本脳炎ウイルスの構造遺伝子を組み込み、この組み換えワクシニアウイルスに抗原を発現させる方法（特開昭６２−４４１７８と６４−７４９８２、特開平５−２７６９４１と６−１８１７９２及びJ. Virol. 64(6): 2788-95, 1990）や、バキュロウイルスの発現系を用いて抗原を発現させる方法（特許第２５１１４９４号と特開２０００−６０５６７号）も試みられたが、いずれも現行の不活化日本脳炎ウイルスに取って代わる抗原を発現することには成功していない。
【０００７】
特開２００１−２９９３３６号は、変異を導入したフラビウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）タンパク質遺伝子及びＥタンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡを動物細胞にトランスフェクトして得たウイルス様粒子を発現する動物細胞と、その動物細胞が発現するウイルス様粒子を開示している。フラビウイルスにおいては、ｐｒＭタンパク質がフリンによって切断されて膜（Ｍ）タンパク質に成熟することで、Ｅタンパク質の配置転換が起こり、赤血球凝集反応や膜融合活性が出現し、細胞障害性を示すと考えられている。特開２００１−２９９３３６号においては、ｐｒＭタンパク質遺伝子に変異を導入して、ｐｒＭタンパク質の切断を阻害することで、ウイルス様粒子によって生じる細胞障害を低減した。しかし、この公報の開示する細胞の抗原発現量は非常に低く、実用には適していない。
【０００８】
また、日本脳炎ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を用いた、非感染性の粒子抗原を産生するようなＤＮＡワクチンも開示されている（国際公開公報WO99/63095、J. Virol. 73(12): 10137-45, 1999、Vaccine 18(1-2): 68-75, 1999及びJ. Virol. 73(7): 5527-34, 1999）。この方法はマウスもウイルスも使わないものの、免疫誘導能や安全性に様々な議論があり、未だに国際的なコンセンサスが得られていない（Vaccine 19(2-3): 155-7, 2000）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＷＨＯの要請を受け、世界中で多種多様な次世代日本脳炎ワクチンの開発が進んでいる。その一つに、遺伝子組換え細胞に日本脳炎ウイルス様粒子を産生させる方法があるが、ウイルス様粒子自体が細胞障害性を有するため、高発現系の確立はこれまで不首尾であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製された、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含するｃＤＮＡを提供し、β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、そして該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形成した形質転換細胞は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であり、且つ赤血球凝集活性を示すウイルス様粒子を発現することを知見した。このウイルス様粒子は、不活化日本脳炎ウイルスの代わりにワクチンなどの有効成分として使用するのに十分な免疫原性を有していた。また、上述の形質転換細胞は、無血清培地に馴化し、無血清培地においても、培養上清１ｍｌ当たり６μｇを超える大量の抗原を５２代以上継代しても発現した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、現行の日本脳炎ワクチンの有効成分（抗原）として用いられている不活化日本脳炎ウイルスの代わりとなる、日本脳炎ウイルス様粒子を包含する日本脳炎ウイルス抗原を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の１つの目的は、日本脳炎ウイルス様粒子を大量且つ持続的に発現する形質転換細胞とそれを用いた日本脳炎ウイルス抗原の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の更なる１つの目的は、マウス脳を使わない、ウイルスを使わない、コスト安の日本脳炎ワクチン及び診断剤を提供することにある。
【００１４】
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
【００１５】
１．日本脳炎ウイルス様粒子を包含してなる日本脳炎ウイルス抗原であって、該ウイルス様粒子は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であり、且つ該ウイルス様粒子は赤血球凝集活性を示すことを特徴とする日本脳炎ウイルス抗原。
【００１６】
２．該ウイルス様粒子が、以下の工程からなる方法で得られたことを特徴とする、前項１に記載の日本脳炎ウイルス抗原。
（ａ）日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを提供し、該ｃＤＮＡはｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含し、
（ｂ）β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、
（ｃ）該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形質転換細胞を形成せしめ、
（ｄ）該形質転換細胞を親細胞から選別し、
（ｅ）該形質転換細胞を培地中で培養し、該形質転換細胞に該ｃＤＮＡを発現させてウイルス様粒子を培地中に放出させ、そして
（ｆ）培地から該ウイルス様粒子を単離する。
【００１７】
３．該ｃＤＮＡが、配列表の配列番号４の塩基配列であることを特徴とする、前項２に記載の日本脳炎ウイルス抗原。
【００１８】
４．該動物細胞が、ＲＫ１３細胞であることを特徴とする、前項２又は３に記載の日本脳炎ウイルス抗原。
【００１９】
５．該培地が、無血清培地であることを特徴とする、前項２〜３のいずれかに記載の日本脳炎ウイルス抗原。
【００２０】
６．（ａ）日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを提供し、該ｃＤＮＡはｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含し、
（ｂ）β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、
（ｃ）該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形質転換細胞を形成せしめ、
（ｄ）該形質転換細胞を親細胞から選別し、そして
（ｅ）該形質転換細胞を無血清培地に馴化させる
ことを包含する方法によって得られる形質転換細胞。
【００２１】
７．該ｃＤＮＡが、配列表の配列番号４の塩基配列であることを特徴とする、前項６に記載の形質転換細胞。
【００２２】
８．該動物細胞が、ＲＫ１３細胞であることを特徴とする、前項６又は７に記載の形質転換細胞。
【００２３】
９．（ａ）前項６〜８のいずれかに記載の形質転換細胞を無血清培地で培養して、日本脳炎ウイルス様粒子を培養液に放出させ、
（ｂ）該培養液から培養上清を取得し、
（ｃ）該培養上清から該ウイルス様粒子を単離・精製する、
ことを包含する、日本脳炎ウイルス抗原の製造方法。
【００２４】
１０．前項１〜５のいずれかに記載の日本脳炎ウイルス抗原を、有効成分として免疫を奏する量含有してなる日本脳炎ワクチン。
【００２５】
１１．前項１〜５のいずれかに記載の日本脳炎ウイルス抗原を、有効成分として含有する診断剤。
【００２６】
以下、本発明について具体的に説明する。
「従来技術」の項で説明したように、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質はウイルス粒子の受容体結合や膜融合を担い、多くの抗原防御エピトープを有しており、分子集合して粒子構造を形成した時に初めて免疫原性を発揮する。成熟したウイルス粒子においては、粒子表面にＥタンパク質とＭタンパク質とが結合した形で存在し、この時の立体配置を取ったＥタンパク質が細胞障害を引き起こすことが知られている。一方、細胞内の未成熟のウイルス粒子においては、Ｅタンパク質はＭタンパク質のグリコシル化前駆体であるｐｒＭタンパク質とへテロダイマーを構成している。このような未成熟ウイルス粒子の感染性、赤血球凝集（ＨＡ）活性、融合活性などのウイルス生物活性は低い。細胞内に存在する酵素フリンによってｐｒＭタンパク質が切断されてＭタンパク質に成熟し、Ｅタンパク質の配置転換が起こると（即ち、ウイルス粒子が成熟すると）、ウイルス生物活性が発揮されると考えられている。
【００２７】
特開２００１−２９９３３６号においては、ｐｒＭタンパク質がＥタンパク質と結合している未成熟ウイルス粒子のウイルス生物活性が低い点に着目して、Ｅタンパク質抗原発現細胞株の樹立を試みた。具体的には、ｐｒＭタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入してｐｒＭタンパク質のＭタンパク質への切断を阻害して、Ｅタンパク質が細胞障害性を有する立体配置を取るのを抑制した。しかしながら、この細胞株が発現する抗原はｐｒＭタンパク質とＥタンパク質からなるものであるから、Ｍタンパク質とＥタンパク質からなる本来のウイルス粒子とは明らかに構造の異なる抗原であり、しかも、抗原の発現量は、５日間の培養での蓄積量が２００ｎｇ／ｍｌと非常に低い。
【００２８】
また、Huntらの研究（J. Virol. Methods 97: 133-149, 2001）においては、日本脳炎ウイルスのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質をコードする遺伝子を含有する組み換えＤＮＡでＣＯＳ−１細胞を形質転換し、形質転換細胞に組み換え粒子状抗原を発現させた。しかし、形質転換細胞が発現する抗原の抗原性は非常に低く、アジュバントなしでマウスを免疫することはできない。
【００２９】
本発明者らはこのような問題点を解決するために鋭意研究した結果、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製された、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含するｃＤＮＡを提供し、β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、そして該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形成せした形質転換細胞は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であり、且つ赤血球凝集活性を示すウイルス様粒子を大量且つ持続的に発現することを知見した。
【００３０】
本発明の日本脳炎ウイルス抗原に含まれるウイルス様粒子は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体である。本発明で用いるウイルス様粒子は、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡを含有しないタンパク質抗原であることから、感染の心配はない。このウイルス様粒子がＥタンパク質とＭタンパク質を包含することはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸配列の解析で確認されている。具体的には、全長Ｅタンパク質とその断片及び全長Ｍタンパク質とその断片を包含しており、ｐｒＭタンパク質は検出されなかった。このことから、ｐｒＭタンパク質はウイルス様粒子中に全く含まれていないか、又は含まれていても少量であると考えられる。上述したように、日本脳炎ウイルスにおいては、ｐｒＭタンパク質が切断されてＭタンパク質に成熟するので、ウイルス粒子表面にはＥタンパク質とＭタンパク質が存在する。本発明で用いるウイルス様粒子は、Ｅタンパク質とＭタンパク質を包含するものの、ｐｒＭタンパク質を包含していないと考えられるので、本来の日本脳炎ウイルスと同様にｐｒＭタンパク質が発現細胞の細胞内で処理されてＭタンパク質に成熟すると考えられる。
【００３１】
また、本発明の日本脳炎ウイルス抗原に含まれるウイルス様粒子は、赤血球凝集（hemagglutination, ＨＡ）活性を示す。ＨＡ活性とは、ウイルスや抗体などが赤血球を凝集させる活性である。ＨＡ活性は、赤血球凝集反応を認めた最も高い希釈倍数で表示され、単位はＨＡＵ（HA unit）である。本発明の日本脳炎ウイルス抗原は、タンパク質含量１μｇ／ｍｌに１５０ＨＡＵ以上、好ましくは５００ＨＡＵ以上のＨＡ活性を有する。このＨＡ活性は本願実施例２に記載の方法に基づき、至適ｐＨで測定した値である。具体的には、０．４％卵アルブミン加ホウ酸苛性ソーダ緩衝食塩液（ｐＨ９．０）で希釈したウイルス液を調製し、等量の０．３３％ガチョウ赤血球浮遊液（至適ｐＨのリン酸緩衝液で調製したもの）と混和し、３７℃、１時間静置した後、赤血球凝集の有無を判定した。なお、実施例２においては、ＨＡ活性の至適ｐＨは５．８〜６．０であったが、ウイルス様粒子産生細胞の株やその継代数によっても至適ｐＨは多少異なるので、上記のＨＡＵ値は、至適ｐＨで測定した値とする。
【００３２】
現行の日本脳炎ワクチンに含まれる抗原はホルマリンなどで不活化したウイルスであるが、不活化したウイルスはＥタンパク質とＭタンパク質を包含するものの、その表面構造が変化しているので、ＨＡ活性を示さない。本発明の抗原に含まれるウイルス様粒子は、Ｍタンパク質とＥタンパク質を包含し、ＨＡ活性を有することから、本来の日本脳炎ウイルスの表面構造に類似した構造と抗原性を有すると考えられる。
【００３３】
本発明の日本脳炎ウイルス抗原の免疫原性を検討するために、精製抗原を４週齢の雌ｄｄＹマウスに一週間隔で２回投与し、プラーク減少法でマウス血清中の中和抗体価を測定した。その結果、現行日本脳炎ワクチンと同等もしくはそれ以上、具体的には３．１５以上の中和抗体力価（log10）が認められた（本願明細書の実施例６を参照）。この結果から明らかなように、本発明の抗原は、現行ワクチンと同等かそれ以上の免疫原性を示すことが明らかになった。従って、Ｅタンパク質とＭタンパク質を包含するタンパク質集合体であり、且つＨＡ活性を示すウイルス様粒子を包含する本発明の抗原は、本来のウイルス由来の抗原と同様の免疫原性を有することから、不活化日本脳炎ウイルスの代わりにワクチンや診断様抗原として用いることができる。
【００３４】
更に本発明の抗原に含まれるウイルス様粒子は、以下の工程からなる方法で得られたウイルス様粒子が好ましい。（ａ）日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを提供し、該ｃＤＮＡはｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含し、（ｂ）β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、（ｃ）該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形質転換細胞を形成せしめ、（ｄ）該形質転換細胞を親細胞から選別し、（ｅ）該形質転換細胞を培地中で培養し、該形質転換細胞に該ｃＤＮＡを発現させてウイルス様粒子を培地中に放出させ、そして（ｆ）培地から該ウイルス様粒子を単離する。具体的には、後述する本発明の形質転換細胞を用いて調製したウイルス様粒子が好ましい。
【００３５】
また、本発明の日本脳炎ウイルス抗原に含まれるウイルス様粒子は無血清培地から単離したものがより好ましく、本発明の形質転換細胞のように無血清培地に馴化した細胞を無血清培地で培養し、その培養上清から単離したウイルス粒子であることが更に好ましい。通常、細胞を培養する際には、生存に必要な栄養素を補充するために培地に血清を添加して用いるが、血清は不純物として精製タンパク質に残留する可能性が高い。従って、無血清培地から単離したウイルス様粒子のほうが、通常の血清添加培地から単離したウイルス様粒子よりも純度の高いウイルス様粒子である。具体的には、無血清培地から単離したウイルス様粒子には、血清由来のタンパク質のみならず、血清に含まれる危険性のあるウイルスや異常プリオン等が混入する可能性は低く、ワクチンや診断剤として使用するときに精製及び品質管理が容易であり、しかも低いコストで生産することができる。
【００３６】
ウイルス様粒子の単離に用いる無血清培地としては、無血清培地に馴化した形質転換細胞の培地として後述する無血清培地を用いればよい。ウイルス様粒子を培地から単離する方法に特に限定はなく、一般的に用いられているタンパク質抗原の精製方法に準じて行えばよい。具体的な方法については、後述する本発明の日本脳炎ウイルス抗原の製造方法と共に説明する。
【００３７】
更に本発明は、（ａ）日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを提供し、該ｃＤＮＡはｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含し、（ｂ）β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに該ｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築し、（ｃ）該複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換して形質転換細胞を形成せしめ、（ｄ）該形質転換細胞を親細胞から選別し、そして（ｅ）該形質転換細胞を無血清培地に馴化させることを包含する方法によって得られる形質転換細胞を提供する。
【００３８】
上述したように、ｐｒＭタンパク質が切断されてＭタンパク質に成熟し、Ｅタンパク質の配置転換が起こると、ＨＡ活性や膜融合活性が出現し、細胞障害を引き起こす。このような現象が生じるために、Ｅタンパク質とＭタンパク質を包含する、本来の日本脳炎ウイルスの表面構造に近い構造を有するウイルス様粒子を動物細胞に発現させるのは難しいと考えられていた。また、Huntら研究のように、動物細胞による日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含する粒子状抗原の発現に成功しても、アジュバントなしではＰＢＳと同等の抗原価しか示さないほどに粒子状抗原の抗原性は低くかった。しかし、本発明においては、動物細胞を形質転換して、β−アクチンプロモーターの制御下で日本脳炎ウイルスのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現させると、驚くべきことに、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であって、赤血球凝集活性を示すことを特徴とするウイルス様粒子、即ち、本来の日本脳炎ウイルスの表面構造に類似した構造と抗原性を有するウイルス様粒子を大量に発現することに成功した。本発明の形質転換細胞は、図３から明らかなように、培養上清１ｍｌ当たり６μｇを超える（最大時には１２μｇを超える）ウイルス様粒子を産生し、ウイルス様粒子の産生量は、５２代以上継代しても低下することはなかった。例えば、特開２００１−２９９３６号における抗原発現量は２００ｎｇ／ｍｌなので、本願においては、その３０倍を超える抗原発現量を達成した。
【００３９】
本発明においては、日本脳炎ウイルスの表面構造と同様の構造を有するウイルス様粒子を得るために、日本脳炎ウイルスのゲノムＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであって、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で包含するｃＤＮＡを用いる。本発明で用いるｃＤＮＡは、その５’末端から３’末端の方向に、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を包含している。ｃＤＮＡの塩基配列に特に限定はないが、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片の上流（５’側）にシグナルペプチドをコードする塩基配列も包含することが好ましい。ＤＮＡの塩基配列は、日本脳炎ウイルスとして同定されているどのようなウイルス株の塩基配列でもよいが、抗原の安全性や有効性を考慮すると、現行の日本脳炎ワクチンに用いられている日本脳炎ウイルス株、例えば北京株、の塩基配列を用いることが好ましい。例えば、配列表の配列番号４に記載した日本脳炎ウイルス北京株のシグナルペプチド〜Ｅタンパク質までをコードするｃＤＮＡ配列を用いることができる。配列番号４の塩基配列においては、第１０〜７８番塩基が２３アミノ酸残基からなるシグナルペプチド（配列番号５）をコードし、第７９〜５７９番塩基が１６７アミノ酸残基からなるｐｒＭタンパク質（配列番号６）をコードし、このうち第３５５〜５７９番塩基がｐｒＭタンパク質の切断によって生じる７５アミノ酸残基からなるＭタンパク質（配列番号７）をコードし、第５８０〜２０７９番塩基が５００アミノ酸残基からなるＥタンパク質（配列番号８）をコードする。
【００４０】
次に、β−アクチンプロモーターを含む複製可能な発現ベクターに上述のｃＤＮＡを発現可能に組み込んでなる複製可能な組換えＤＮＡを構築する。組換えＤＮＡは、日本脳炎ウイルスのｃＤＮＡをβ−アクチンプロモーターの制御下で発現させる限りに特に限定はなく、β−アクチンプロモーターを含有する発現ベクターに日本脳炎ウイルスｃＤＮＡを挿入したり、発現ベクターの制御領域をβ−アクチンプロモーターと日本脳炎ウイルスＤＮＡを含む発現カセットなどで置き換えて作製することができる。このような組換えＤＮＡとしては、配列表の配列番号４に記載した塩基配列を包含する、図１の組み換え体プラスミドpCAGJ12bsrが挙げられる。この組み換え体プラスミドは、ブラストサイジン耐性を指標として形質転換細胞を選択するために、ブラストサイジン耐性遺伝子も含んでいる。
【００４１】
次に、上述の複製可能な組換えＤＮＡで動物細胞を形質転換する。本発明において形質転換する動物細胞は、血清濃度の低い培養液で培養可能であり、日本脳炎ウイルス感染に低感受性であり、且つタンパク質分泌能が高い細胞であれば特に限定はない。このような動物細胞としてはＲＫ１３細胞が挙げられる。ＲＫ１３細胞は、ウサギ正常腎細胞由来の細胞株であり、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手可能である（ATCC No. CCL-37）。ＲＫ１３細胞は、血清濃度の低い培養液で培養可能であり、更に長期間維持培養が可能な細胞株である。また、日本脳炎ウイルスの感染に低感受性であることから、Ｅタンパク質のもたらす細胞障害性に対して抵抗性であると考えられる。また、ラットの正常腎細胞においてはゴルジ装置が発達しており、タンパク質の分泌能が高いことが知られている（The Journal of Cell Biology，144，1135-1149，1999）ので、ウサギ正常腎細胞であるＲＫ１３細胞も同様にタンパク質分泌能が高いと考えられる。本願の実施例１においては、このような特徴を有するＲＫ１３細胞に、β−アクチンプロモーターの制御下で日本脳炎ウイルスのｃＤＮＡを発現させた。その結果として得られた形質転換細胞は、Ｅタンパク質による細胞障害を受けることなく、本来の日本脳炎ウイルスの表面構造に類似した構造と抗原性を有する日本脳炎ウイルス粒子を大量且つ持続的に発現した。
【００４２】
形質転換細胞を親細胞から選別するには、組換えＤＮＡに含まれる選択因子に基づいて行えばよい。本願の実施例１においてはブラストサイジン耐性を選択因子として用いたが、適当な選択因子、例えば薬物耐性や栄養要求性を付与するように組換えＤＮＡを構築し、それに基づいて形質転換細胞を選別することができる。
【００４３】
本発明の形質転換細胞を維持し、培養するための培地は、形質転換細胞が生育することが可能な培地であれば特に限定はなく、ＲＫ１３細胞の培養に通常用いられている培地を用いることができる。例えば、イーグルＭＥＭ（Eagle’s Minimal Essential Medium）に１０％のＦＢＳを添加したものを培地として用いることができる。細胞の培養温度は３５〜３８℃、好ましくは３６〜３７℃が適している。
【００４４】
更に形質転換細胞を無血清培地に馴化させる。通常、細胞を培養する際には、血清を添加した培地を用いるが、血清を培地に添加しないと、細胞の接着性が弱くなり、培地ｐＨ緩衝能、ＣＯ2保持能力、毒性物質から細胞を保持する力が低くなるため、細胞が分裂しなくなったり、抗原を産生しなくなるなどの障害が発生する。日本脳炎ウイルス抗原のように、抗原そのものに細胞障害性があるのでその発現さえも困難な場合には、形質転換細胞に多大なストレスを与える無血清培地での培養など考えられなかった。例えば、特開２００１−２９９３３６号においては、日本脳炎ウイルス抗原を産生する細胞株の培地に含まれる１０％ＦＢＳを０．１％ＢＳＡに変更したところ、抗原発現量が約１／３に低下した。
【００４５】
本発明においては、上記のような問題を生じることなく、無血清培地に馴化した形質転換細胞を得るために、５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含む培地の血清濃度を順次１／２ずつ減少させた培地に形質転換細胞を継代し、最終的には培地を完全に無血清培地に切り替えた。具体的には、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養した形質転換細胞を、１代〜８代を５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、９代〜１６代を２．５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、１７代〜１８代を１．２５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、１９代〜２０代を１．２５％ＦＢＳ−VP-SFM［VP-SFM（米国、Gibco BRL製）に１．２５％のＦＢＳを添加したもの］で培養した。次に血清を含まないVP-SFMで形質転換細胞を継代し、無血清培地馴化抗原発現細胞を得た。このようにして得られた無血清培地馴化細胞は、非馴化細胞に比べてウイルス様粒子の生産量が多少劣るものの、従来の日本脳炎ウイルス抗原産生細胞よりも大量にウイルス様粒子を産生し、しかもそのウイルス様粒子産生能は継代しても失われることはない（本願明細書の図２と図３を参照）。また、血清添加培地の場合、血清のロット間に違いがあることから均一な培地を大量に供給することは難しいが、無血清培地の場合にはそのような問題はない。
【００４６】
形質転換細胞を馴化させる無血清培地は、本発明の形質転換細胞が増殖し、ウイルス様粒子を発現することができる限り特に限定はない。例えば、基礎培地としてイーグルＭＥＭを用い、添加血清の濃度を減らした培地で継代することができる。また、無血清培地馴化細胞を培養する無血清培地としては、イーグルＭＥＭに、血清に変わる添加物としてインシュリン、ヒドロコルチゾン等のホルモン、上皮増殖因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板由来増殖因子（platelet derived growth factor，PDGF）、線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor，FGF）などの成長因子、フィブロネクチン等の細胞接着・進展因子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トランスフェリン、リン脂質等を適宜添加した培地を用いることができる。これらの添加物はヒト及び動物由来でないことが望ましい。また、VP-SFM（米国、GIBCO BRL社製）、EX-CELL 525（米国、JRH Bioscience社製）等の合成培地を用いることも可能である。
【００４７】
また、組換えＤＮＡが外れて抗原を産生しなくなった細胞の生育を制限するために、形質転換細胞を培養する際には、組換えＤＮＡに導入してある選択因子で常に細胞を選択的に培養する必要がある。本願の実施例１で作製した形質転換細胞はブラストサイジン耐性遺伝子をマーカーとして導入した組換えＤＮＡで形質転換されているので、抗原産生性の細胞を維持するためには、ブラストサイジンをＳ塩酸塩を５μg/ｍｌ添加した培地で形質転換細胞を培養した。
【００４８】
更に本発明は、（ａ）本発明の形質転換細胞を無血清培地で培養して、日本脳炎ウイルス様粒子を培養液に放出させ、（ｂ）該培養液から培養上清を取得し、（ｃ）該培養上清から該ウイルス様粒子を単離・精製することを包含する、日本脳炎ウイルス抗原の製造方法を提供する。はじめに、無血清培地に馴化した形質転換細胞を無血清培地で培養する。本発明の形質転換細胞を培養する無血清培地は、形質転換細胞が増殖し、ウイルス様粒子を発現することができる限り特に限定はないが、形質転換細胞を無血清培地に馴化させる際に用いた培地を用いればよい。具体的には、イーグルＭＥＭに血清に代わる添加物（成長因子、細胞接着・進展因子など）を添加したものや、合成培地を用いることができる。形質転換細胞の培養は、動物細胞を培養する方法であれば特に限定はないが、培養温度は３５〜３８℃、好ましくは３６〜３７℃である。
【００４９】
次に培養液から細胞を除去して培養上清を取得する。培養上清の取得方法に特に限定はなく、通常用いられる方法、例えば遠心分離やろ過を用いることができる。
【００５０】
取得した培養上清からウイルス様粒子を精製する。ウイルス様粒子を精製する方法に特に限定はなく、抗原などのタンパク質の精製に用いる様々な手法を組み合わせて実施すればよい。日本脳炎ウイルスのＥタンパク質は分子集合して粒子構造を形成した時に初めて免疫原性を発揮することが知られており、本発明の抗原に含まれるウイルス様粒子もまた、日本脳炎ウイルス粒子と同様に遠心力・浸透圧などの物理的力、酸・アルカリなどの極端なｐＨ条件下、可溶化剤やＥＤＴＡ、有機溶媒などには不安定で、粒子構造を消失して抗原性を失ってしまう可能性がある。従って、温和な精製条件下で、簡便な方法でかつ高収率でウイルス様粒子を単離・精製できることが望ましい。具体的な精製方法としては、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、脱吸着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳導、カラムクロマトグラフィー、透析、塩析などを組み合わせて用いることができ、たとえば、培養上清を限外濾過膜で遠心濃縮し、ゲルクロマトグラフィーとショ糖密度勾配遠心法を組み合わせることができる。また、これらの手段の適用においては、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度等の物理化学的条件を適宜設定できる。
【００５１】
例えば、本願明細書の実施例３では、培養上清を限外濾過膜で遠心濃縮し、ゲルクロマトグラフィーとショ糖密度勾配遠心法を組み合わせた方法でウイルス様粒子を精製し、最終的に４０％以上の高い、抗原回収率を達成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質蛍光染色及びウェスタンブロットによる純度検定実験で、産生抗原は高度に精製されていることが明らかになり、また、精製された抗原を電子顕微鏡で観察したところ、精製したウイルス様粒子は小型球形粒子状の形態であることが判明した。このことからも、ウイルス様粒子の粒子構造を消失させることなく、高収率かつ簡便にウイルス様粒子を精製することができた。
【００５２】
更に本発明は、本発明の日本脳炎ウイルス抗原を、有効成分として免疫を奏する量含有してなる日本脳炎ワクチンを提供する。本発明の日本脳炎ウイルス抗原は、本願明細書の実施例６の中和抗体試験及び実施例７の防御試験などの結果から明らかなように、現行の日本脳炎ワクチンと同様にマウスに抗体を誘導し、日本脳炎ウイルスによる感染を防ぐことができる。従って、本発明の日本脳炎ウイルス抗原を有効成分として含有するワクチンは、不活化日本脳炎ウイルスを有効成分として含有する現行の日本脳炎ワクチンの代わりになるワクチンである。
【００５３】
日本脳炎ワクチンは、以下のようにして製造することができる。
精製した本発明の抗原を、等張の塩類溶液、緩衝液、組織培養液などの溶媒、例えばＰＢＳ（phosphate buffer saline）に浮遊し、ワクチン原液を調製する。必要であれば、ワクチン抗原を常用の固定化剤で固定することにより、その立体構造を固定化することもできる。固定化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β‐プロピオラクトン等があげられる。固定化剤は、ワクチン原液を調製する前に抗原に添加するか、又はワクチン原液に添加することができる。
【００５４】
次に、ワクチン原液を希釈して、ワクチン溶液を調製する。ワクチン原液は、例えば、ＰＢＳを用いて、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導して免疫を奏するのに必要な量、例えばタンパク質含量で１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌとなるように希釈する。例えば、タンパク質含量を１０μｇ／ｍｌに調製したときのＨＡ価は、１，５００〜２４，０００ＨＡＵ、好ましくは５，０００〜１０，０００ＨＡＵである。ワクチン溶液を調製する際に、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合してもよい。安定化剤としては、糖類やアミノ酸類が挙げられ、アジュバントとしては、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等が挙げられる。
【００５５】
ワクチン溶液を適当な容量の容器、例えば約０．５〜２０ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封した後に、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤として使用に供することもできる。
【００５６】
本発明のワクチンは、現行の日本脳炎ワクチンと同様に被接種者に接種すればよい。例えば、１ドーズ約０．２〜０．５ｍｌのワクチンを、約１〜４週間隔で１〜３回皮下接種すればよい。尚、乾燥製剤は接種前に滅菌蒸留水などで溶解してもとの体積に戻して使用する。
【００５７】
更に本発明の抗原は診断用の抗原として、従来用いられている抗原の代わりに用いることができる。本願明細書の実施例８に示したように、ＥＬＩＳＡ法などで実施する日本脳炎ウイルス感染の診断に本発明の抗原を用いることができる。具体的には、本発明の抗原は、ＥＬＩＳＡ法や赤血球凝集抑制（Hemagglutination Inhibition，ＨＩ）試験等に利用可能である。
【００５８】
診断用抗原の濃度に特に限定はないが、タンパク質含量が１μｇ／ｍｌの溶液が適当である。例えば、タンパク質含量を１μｇ／ｍｌに調製したときのＨＡ価は、１５０〜２，４００ＨＡＵ、好ましくは５００〜１，０００ＨＡＵである。
【００５９】
本発明のワクチン用の抗原や診断用の抗原は、無血清培地から単離したウイルス様粒子を包含する抗原が好ましい。上述したように、無血清培地から単離したウイルス様粒子は、血清由来のタンパク質のみならず、血清に含まれる危険性のあるウイルスや異常プリオン等の混入の可能性が低く、血清等のタンパク質を含んでいないので、ワクチンや診断剤として使用するときに精製及び品質管理が容易である。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００６１】
以下に本願におけるＥＬＩＳＡ法、総タンパク質の定量法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、プラーク法及び中和抗体価の測定の実施方法について記載する。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ（Enzyme linked immunosorbent assay）法
９６穴のイムノプレート（米国、CoasterR製）上に、日本脳炎ウイルスに高い中和活性を持つ抗Ｅタンパク質モノクローナル抗体（Group-8, Clone 503, IgG）(J. Immunol. 141(10): 3606-10, 1988；東京都神経科学総合研究所 保井孝太郎博士より分与）（以下、屡々、「５０３モノクローナル抗体」と称する）の１μｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに５０μｌずつアプライし、４℃で一晩インキュベートすることで抗体を固相化した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（8.0 gのNaCl、0.2 gのKCl、2.88 gのNa2HPO4/12H2O、0.2 gのKH2PO4、0.5 mlのTween20を蒸留水に溶解して得た、終容量１リットルの溶液）で４回洗浄し、１回の洗浄は約８秒間行った。洗浄後に、５０μｌ／ウエルの希釈抗原をアプライし、３７℃で１時間インキュベートした。希釈抗原としては、標準抗原としても使用する（財）阪大微生物病研究会より分与を受けた精製不活化ウイルス抗原（TJP**012）をＰＢＳ−Ｔで２倍に段階希釈したものを用いた。希釈倍率は、標準抗原希釈液で作成した検量線の直線領域に相当する倍率を用いた。
【００６３】
未結合のタンパク質を洗浄除去後、西洋ワサビパーオキシダーゼ（horse radish peroxidase）で標識した５０３モノクローナル抗体を各ウエルに５０μｌずつアプライし、３７℃で１時間インキュベートした。標識抗体を洗浄除去後、発色基質としてＴＭＢ+（デンマーク国、DAKO社製）を各ウエルに５０μｌずつ加えて１５分間室温に放置し、酵素反応を行った。酵素反応は、１ｍｏｌ／リットルの硫酸を各ウエルに５０μｌずつ加えて停止した。プレートリーダー（Multiskan MS）（米国、Thermo Labsystems Inc.製）を用いて４５０／６９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００６４】
標準抗原としては、精製不活化ウイルス抗原 (TJP**012) を用いた。この抗原を２倍に段階希釈したもののＥＬＩＳＡを上記と同様に実施し、検量線を求めた。検量線よりサンプルの抗原量（ＥＬＩＳＡ価）を算出した。
【００６５】
総タンパク質定量法
サンプルに等量の１０％（w/v）ＴＣＡ溶液を加えて混合後、氷中で１０分インキュベートした。４℃、１２，０００ｒｐｍの条件で２０分遠心し、上澄み液を取り除いた。残った沈殿に５％（ｗ／ｖ）のＴＣＡ溶液を加えて洗浄し、４℃、１２，０００ｒｐｍの条件で１０分遠心して沈殿を回収した。この沈殿を0.1NのNaOHで可溶化し、タンパク質の定量に用いた。定量には、BCA Protein Assay（米国、Pierce Chemical Company製）の発色系を用いた。マイクロプレート中でサンプル１２．５μｌと希釈試薬液１００μｌを混合し、３７℃中で３０分インキュベートした。プレートリーダーを用いて波長５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）（米国、Pierce Chemical Company製）を標準タンパク質として用いて検量線を作製し、検量線からサンプルのタンパク質濃度を算出した。
【００６７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルの電気泳動を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで行った。各サンプルを等量のサンプルバッファー［0.5M Tris-HCl (pH6.8)、 4% SDS、 14mM ２−メルカプトエタノールを含む溶液］と混合し、１００℃で１０分加熱して、サンプル中のタンパク質を変性させて泳動用の検体を得た。得られた検体を１０μｌ／レーンでゲルにアプライした。濃縮ゲル中では１０ｍＡ、分離ゲル中では２０ｍＡの定電流で泳動バッファー［25mM Tris-HCl (pH8.8)、192mM グリシン、0.1％ SDS］を用いて電気泳動を行った。標準抗原には、現行日本脳炎ワクチンに使用されている不活化精製抗原を用い、分子量マーカーにはPrestained SDS-PAGE Standards, low range（米国、BIO-RAD Laboratories製）を用いた。タンパク質はSYPROR Orange Protein gel stain （米国、Molecular Probes社製）を用いて蛍光染色した。具体的には、SYPROR Orange Protein gel stainを７．５％酢酸溶液で５，０００倍に希釈した染色液にゲルを浸漬し、４０分室温でインキュベートした。蛍光の検出にはイメージアナライザーLAS-1000（日本国、富士フィルム社製）を用いた。
【００６８】
ウェスタンブロット
上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルから泳動分離したタンパク質をpolyvinylidene difluoride（PVDF）膜に転写した。転写は、25 mM Tris-HCl (pH8.8)、192 mM グリシン−20％ メタノールを含むバッファー中、氷冷下で、１８０ｍＡの定電流を１時間通電することで行った。ＰＶＤＦ膜は、室温で１０分間メタノールによる前処理を施したImmobilonTM（米国、Millipore社製）を用いた。転写後の膜を２％スキムミルク−ＰＢＳでブロッキングした後、１次抗体として用いるウサギ抗−日本脳炎ウイルス（北京株）ポリクローナル抗体をＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈した溶液に浸し、室温で１時間振盪した。非特異吸着抗体をＰＢＳ−0.05％ Tween 20で洗浄除去後、Alkaline phosphatase標識抗-ウサギＩｇＧ抗体（ALI 3405）（米国、BioSource Interna-tional社製）をＰＢＳ−Ｔで５，０００倍〜１０，０００倍に希釈した溶液に浸漬し、さらに１時間室温で振盪した。発色基質系には、BCIP/NBT Phosphatase Substrate (3-Component system) (米国、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.製) を用いた。
【００６９】
プラーク法
培養したＶｅｒｏ細胞（１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養したもの）にウイルス液検体を接種し、ＣＯ2インキュベーター中で９０分インキュベートした。１５分毎にプレートを揺すり、細胞にウイルスを均等に吸着させた。検体液を除去した細胞上に２％メチルセルロースと２％ＦＢＳを含むＭＥＭを重層し、ＣＯ2インキュベーター中で３日間培養した。プラーク形成の有無を倒立顕微鏡下で確認後、培養４日目に１０％ホルマリン溶液で細胞を１時間処理し、ウイルスの不活化と細胞の固定を行った。冷水中でホルマリンとメチルセルロースを洗浄除去し、０．０３８％のメチレンブルーで染色した。ウイルスに感染して変性・壊死した細胞群は染色されないので、プラークとして測定される。
【００７０】
中和抗体価の測定
血清を段階希釈し、等量の日本脳炎ウイルス検体と混合した。３７℃で９０分間インキュベートして、日本脳炎ウイルス検体中のウイルスを抗体で処理した（即ち、中和反応を行った）。中和反応後の日本脳炎ウイルス検体に残存する感染性ウイルスの数をプラーク法で測定した。中和抗体価は、抗体非処理の日本脳炎ウイルスを感染させたプレートにおける、各ウェルの平均プラーク数を１００％とし、プラーク数を５０％に減少させるのに必要な最大の血清希釈倍率とした。
【００７１】
実施例１
日本脳炎ウイルス抗原を持続的に発現する形質転換細胞の樹立
（１）日本脳炎ウイルス ＲＮＡの調製
日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）（以下、屡々“ＪＥＶ”と略す）は、阪大微生物病研究会で日本脳炎ウイルスワクチンとして製造された精製ＪＥＶを用いた。
【００７２】
精製ＪＥＶ１００μｌを１．５ｍｌのサンプリングチューブに取り、この中にあらかじめ調製しておいたChaos/2ME Buffer （4.2 M グアニジンチオシアネート、0.5％ザルコシル及び25mM Tris-HCl (pH8.0) からなるChaos Buffer 400 μlに25 μlの２−メルカプトエタノールを加えたもの）４００μｌを加えてピペッティングで混和してウイルスサンプルを得た。
【００７３】
得られたウイルスサンプルのＲＮＡ抽出を以下のようにして行った。４００μｌのＴＥ飽和フェノール［フェノールをＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)）で飽和したもの］及び５０μｌのフェノール抽出バッファー［100mM Tris-HCl (pH8.0)、10mM EDTA及び1% SDS］を加え、Vortexで混合した。その後、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、６５℃で３０分静置した。さらに２００μｌのクロロフォルムを加えてVortexで混合し、１５、０００ｒｐｍで１０分遠心し、上層（ＲＮＡ含有ＴＥ層）と下層（フェノール・クロロフォルム層）に分離した。上層は別のサンプリングチューブに移した。残ったフェノール・クロロフォルム層にＴＥバッファー１００μｌを加えて混合物を得た。得られた混合物からＲＮＡを上記と同様に再抽出し、ＲＮＡ含有ＴＥ層を得た。１回目に得たＲＮＡ含有ＴＥ層と合わせて粗ＲＮＡサンプルとした。
【００７４】
粗ＲＮＡサンプルに対し、フェノール・クロロフォルム抽出を２回、クロロフォルム抽出を１回実施した。フェノール・クロロフォルム抽出は、サンプルに等量の１ｍＭ Tris-HCl（pH8.0）飽和フェノール/クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えてvortexし、１２，０００ｒｐｍで５分遠心した後、上層を別のサンプリングチューブに移した。クロロフォルム抽出は、サンプルと等量のクロロホルムを加えてvortexし、１２，０００ｒｐｍで５分遠心した後、上層を別のサンプリングチューブに移した。最後に得た上層に１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加えてvortexし、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心し、上清を捨てた。残った沈渣を８０％エタノールで洗浄し、１２，０００ｒｐｍで５分遠心した後に上清を捨て、沈殿したＲＮＡを風乾し、精製水に溶解してＪＥＶのＲＮＡとした。
【００７５】
（２）ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ及びクローニング
上記（１）の方法を繰り返し、合計で９００μｌの精製ＪＥＶからＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡの合成に用いた。
【００７６】
ｃＤＮＡの合成は、米国、Gibco BRL社製のｃＤＮＡ合成キット（superscript choice system for cDNA synthesis）を使用し、添付のマニュアルに従ってＰＣＲで行った。１ｓｔ鎖の合成には、キットに添付のランダムプライマーと共に、Virology 161: 497-510, 1987又はGenBank Accession No. NC001437 に公開されている日本脳炎ウイルスゲノムの全ＲＮＡ配列を基に、約５００塩基ごとに作成した合成プライマーを使用した。ＰＣＲは、ｃＤＮＡを１０μｌ（１回のｃＤＮＡ合成反応で得たものの１／２０）、プライマー濃度各１μｌで行い、反応条件は９４℃で１分、５５℃で４５秒、７２℃で２分を３５サイクル行った。
【００７７】
Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab．2001，9.66〜9.75に記載の方法に従って又はMegalabel（日本国、TaKaRa製）を利用して、合成したＪＥＶ ｃＤＮＡの５’末端をリン酸化し、それをpUC18（日本国、TaKaRa製）のSmaI部位またはpBlueScript SK(+)（米国、STRATAGEN社製）のSrfI部位にライゲーションして組換えプラスミドを得た。得られた組み換えプラスミドで大腸菌コンピテントセルを形質転換して形質転換菌を得、得られた形質転換菌を寒天プレートで生育し、Virology, 161: 497-510, 1987に報告された日本脳炎ウイルスの塩基配列をもとに作製した、以下の３本のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３）：
5'-GGGAGCCCTCTCAAAGCTTCTGCC-3'  （配列番号１）
5'-CCCCGCTCTTTGGAGGCACATTGC-3'  （配列番号２)
5'-CCCATCTTCCCTATACCCTTTCGC-3'  （配列番号３）
をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。陽性を示したコロニーの大腸菌を培養し、プラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、アガロース電気泳動でプラスミドに組み込まれていたＤＮＡのサイズを調べた。目的の大きさのクローニングされたＤＮＡの塩基配列を、配列番号１〜３のオリゴヌクレオチドをプローブに用いたサザンハイブリダイゼーションで確認した。
【００７８】
塩基配列の確認は、プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、32Ｐを使用したサンガー法（Sequenase V.2）（米国、Amersham Bioscience社製）あるいはＰＣＲ−蛍光シーケンサー法により実施した。ＪＥＶ ｃＤＮＡについて、独立にクローニングされている複数（１領域３クローン以上）のクローンの配列を調べた。シーケンス用のプライマーは、上記のＰＣＲに用いたものと同じ合成プライマーを使用した。
【００７９】
目的の日本脳炎ウイルスｃＤＮＡ、即ち、シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ断片、ｐｒＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片及びＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片をこの順序で連係し、日本脳炎ウイルス北京株のシグナルペプチド、ｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質をコードするJ12ｃＤＮＡを得た。
【００８０】
（３）複製可能な組換えＤＮＡの構築
上記で得たJ12ｃＤＮＡをpCAGGS発現ベクター（Gene 108: 193-199 1991）のXho Iサイトに挿入し、組み換えプラスミドpCAGJ12を得た。得られたpCAGJ12からCMV-IE、β‐アクチンプロモーター、イントロン及びJ12ｃＤＮＡを含む断片を回収し、pEFBOSbsr［pSV2bsr（日本国、科研製薬製）のbsr部位をFE-BOSプロモーターを有するプラスミドに挿入したもの；M. Tatsumiより分与］の制御領域の換わりに挿入し、ブラストサイジン耐性を有する組換えＤＮＡpCAGJ12bsrを得た。得られたpCAGJ12bsrを図１に示す。
【００８１】
（４）日本脳炎ウイルス様粒子持続発現性細胞（J12#26細胞）の作製
ＲＫ１３細胞（ATCC No: CCL-37）を３６〜３７℃において、１０％ ウシ胎仔血清（fetal bovine serum, FBS）添加イーグル最少培地（minimal essential medium, MEM）で単層になるまで培養し、FuGENE6（フランス国、Roche Diagnostic Co.製）を用いてpCAGJ12bsrで形質転換した。細胞を２日間培養し（途中で１回培地交換を行い）、次に培養液を除き、０．２％トリプシンを含むＰＢＳ（―）を培養液の約１／１０量加えて処理した。次にピペッティングにより細胞を剥離・分散させて浮遊させ、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（blasticidin）（日本国、科研製薬製）を含む培地で元の培養液量の６倍に希釈し、φ１０のプレートにおいて１０日間培養することでブラストサイジン耐性株を選択した。培地交換は、４日目と７日目に行った。１０日目には、２３株のブラストサイジン耐性株を選択して、培地０．５ｍｌを含む２４穴のプレートに移して培養した。培地は、上記と同じブラストサイジン含有ＭＥＭを用いた。２４穴のプレートでの培養開始から４日目には０．５ｍｌの新しい培地を加え、更に２日〜５日間培養した。各細胞株について、培養液の一部をサンプリングし、培地に抗原が含まれるか否かをＥＬＩＳＡ法で確認した。
【００８２】
また、２４穴のプレートで増殖した細胞から順次φ６又はφ１０のプレートに移して培養スケールを拡大して３日〜６日間培養し、続いてφ１０のプレートから７５ｃｍ2のフラスコに移して更に３日〜６日間培養した。培養スケールの拡大は、次の方法で行った。細胞が単層になったら培養液を除き、０．２％トリプシンを含むＰＢＳ（―）を培養液の約１／１０量加えて処理した。次にピペッティングにより細胞を剥離・分散させて浮遊させ、培地で元の培養液量の６倍に希釈し、新しい容器に移した。
【００８３】
培養した細胞は−８０℃で凍結保存した。この保存した細胞の一部を２５ｃｍ2のフラスコを用いて更に培養し、培養液を超遠心に付して培養上清を得、得られた培養上清に含まれる日本脳炎ウイルス抗原をウエスタンブロットで確認した。培養細胞についても、細胞溶解物を調製し、日本脳炎ウイルス抗原の存在をウエスタンブロットで確認した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡの結果及びウエスタンブロットの結果によると、２３株の形質転換体（＃１〜＃２３）のうち、＃１０と＃２０が大量の抗原を発現していた。
【００８５】
（５）形質転換体のクローニング
９６穴のマイクロプレートを用い、細胞株＃１０と＃２０をそれぞれ０．２細胞／１００μｌになるように培地で希釈し、それを各ウエルに１００μｌずつ分注して培養した。培養開始から４日目に新しい培地１００μｌを加え、培養開始から８日、１２日及び１５日目には培地の半分を新しい培地に交換した。培養開始から１２日〜２０日目には、増殖した細胞から順次２４穴のプレートに移して培養スケールを拡大し、細胞株＃１０については２０クローン、細胞株＃２０については２７クローン（J12#20.01〜J12#20.27）を得た。これらのクローンは、培養開始から１７日〜２９日にかけて、φ６のプレート、次いで７５ｃｍ2のフラスコに培養スケールを拡大した。培養スケールの拡大は上述の方法で行い、培養した細胞は−８０℃で凍結保存した。途中で培養液の抗原価をＥＬＩＳＡ法で確認した。細胞株＃２０のクローンであるJ12#20.14が最も高いＥＬＩＳＡ価を示したので、このクローンを２回目のクローニングに付した。
【００８６】
細胞株J12#20.14について、９６穴のマイクロプレートを用い、０．２細胞／１００μｌ培地で培養した。培養開始から８日目に新しい培地１００μｌを加え、培養開始から１４日、１９日及び２２日目には培地の半分を新しい培地に交換した。培養開始から１８日〜２７日目には、増殖した細胞から順次２４穴のプレートに移して培養スケールを拡大し、５１クローンを得た。更に培養開始から２３日〜３４日にかけて、φ６のプレート、次いでφ１０のプレートから７５ｃｍ2のフラスコに培養スケールを拡大し、培養した細胞は−８０℃で凍結保存した。培養開始から１９日目には培地を５０μｌサンプリングして抗原価をＥＬＩＳＡ法で確認した。また、培養途中の細胞の増殖状況と細胞形態を肉眼で観測した。その結果、J12#20.14の５１クローンのうち、クローン２６を抗原発現細胞として選択し、J12#26細胞と命名した。
【００８７】
（６）J12#26細胞の無血清培地への馴化
１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで３６代まで継代し、凍結保存したJ12#26細胞を以下の実験に用いた。凍結保存した細胞を解凍し、３６〜３７℃において、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養した。以下、馴化に用いた培地には５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを添加した。添加血清濃度を５％、２．５％、１．２５％と１／２ずつ順次減少させた培地を用いて細胞を継代することで、J12#26細胞を無血清培地に馴化させた。具体的には、１代〜８代を５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、９代〜１６代を２．５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、１７代〜１８代を１．２５％ＦＢＳ−ＭＥＭで培養し、１９代〜２０代を１．２５％ＦＢＳ−VP-SFM［VP-SFM（米国、Gibco BRL製）に１．２５％のＦＢＳを添加したもの］で培養した。次に血清を含まないVP-SFMでJ12#26細胞を継代し、無血清培地馴化抗原発現株であるJ12#26SF細胞を得た。
【００８８】
（７）ＥＬＩＳＡによる抗原産生量の確認
J12#26SF細胞の抗原産生量を確認するために、VP-SFMで継代し、その培養上清の抗原価をＥＬＩＳＡ法で測定した。対照として、非馴化細胞（１０％ ＦＢＳ−ＭＥＭで継代したJ12#26細胞）の培養上清の抗原価も同様に測定した。結果を図２及び図３に示す。
【００８９】
図２及び図３から明らかなように、無血清培地に馴化したJ12#26SF細胞（図３）は、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで継代した非馴化細胞J12#26細胞（図２）に比べて劣るものの、十分量の抗原を産生した。又、抗原産生量は、継代しても減衰しないことが明らかとなった。
【００９０】
実施例２
J12#26SF細胞の発現するウイルス様粒子のＨＡ価とＥＬＩＳＡ価の経時変化
J12#26SF細胞の発現する抗原がＨＡ活性を示すことを確認するために、ＨＡ価とＥＬＩＳＡ価を測定し、その経時変化について検討した。
【００９１】
ＨＡ価及びＥＬＩＳＡ価の測定には、５μｇ／ｍｌブラストサイジン含有VP-SFMで３８代継代したJ12#26SF細胞を用い、対照としては、培養後４日目のVero細胞に、日本脳炎ウイルス（北京株）を感染させたもの（ＪＥＶ感染Vero細胞）を用いた。J12#26SF細胞は５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むVP-SFMで培養し、培養開始から１日、２日、３日、４日、５日、６日、１０日、１４日及び１７日目に培養上清をサンプリングした。なお、１０日目には培地交換を行った。ＪＥＶ感染Vero細胞は２％牛血清を含むＭＥＭで培養し、培養開始から１日〜７日目までの毎日、培養上清をサンプリングした。
【００９２】
（１）ＨＡ価の測定
ＨＡ価の測定には、ガチョウ赤血球を用いた。ガチョウ血液に、血液とＡＣＤ（acid-citrate-dextrose）の割合が１０：１．５となるようにＡＣＤを加えた。そこに２．５容量のＤＧＶ（dextrose-gelatin-veronal）を加えて混合し、得られた混合物を１，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。上清を廃棄し、残った沈渣に上記と同量のＤＧＶを加えて縣濁し、再度遠心分離を行った。この操作を計４回繰り返して沈渣を得た。得られた沈渣を生理食塩水に縣濁して８％赤血球浮遊液を得た。
【００９３】
Ｕ字型マイクロプレートのウエルに０．４％卵アルブミン加ホウ酸苛性ソーダ緩衝食塩液（ｐＨ９．０）を５０μｌずつ分注した。希釈系列の隣のウエルにはサンプリングした培養上清１００μｌ入れ、マルチチャンネルオートピペットを用いて原液試料から順に隣の穴に向かって５０μｌずつ移動とピペッティングを繰り返して希釈し、２倍に段階希釈した測定用サンプルを得た。至適ｐＨ（J12#26SF細胞の培養上清の場合はｐＨ６．０、ＪＥＶ感染Vero細胞の場合はｐＨ６．２）のリン酸緩衝液で調製した０．３３％赤血球浮遊液を各ウエルに５０μlずつ添加し、直ちにマイクロミキサーで混和した。３７℃で１時間静置した後、凝集反応の判定を行った。ウエルの底の中心に赤血球が沈降し、赤い点の塊のように見えるものを陰性とし、赤血球が底全体に広がって沈降し、傾けても赤血球が流れ出さないものを陽性とした。ＨＡ価は、赤血球凝集が陽性であるウイルス液の最高希釈倍数で表した。
【００９４】
（２）ＥＬＩＳＡ価の測定
J12#26SF細胞（３８代継代）の培養上清とＪＥＶ感染Vero細胞の培養上清は、ＰＢＳ−Ｔを用いて２倍に段階希釈し、それぞれをサンプルとした。ＥＬＩＳＡ価は、５０３モノクローナル抗体を用いて測定した。ＥＬＩＳＡ価の基準として、精製不活化ウイルス抗原であるTJP**012も同様に測定し、TJP**012のＥＬＩＳＡ価を１００としてサンプルのＥＬＩＳＡ価を換算した。また、７８代継代したJ12#26SF細胞の培養上清についても、同様にＥＬＩＳＡ価を測定した。ＪＥＶ感染Vero細胞のＨＡ価及びＥＬＩＳＡ価を表１及び図４に示し、J12#26SF細胞のウイルス粒子のＨＡ価及びＥＬＩＳＡ価を表２及び図５に示す。
【００９５】
ＪＥＶ感染Vero細胞の培養上清については、１０倍に段階希釈したサンプルを用い、プラーク法により感染価を測定し、その結果を表１に示した。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
【表２】
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【００９８】
Vero細胞を用いたウイルス培養では、ＥＬＩＳＡ価及びＨＡ価は共に培養４日目に最高値を示し、５日目以降はウイルスによる細胞変性効果（cytopathic effect，CPE）が進み、ＥＬＩＳＡ価、ＨＡ価とも低下した。一方、J12#26SF細胞の培養においては、４日目以降もウイルス様粒子を発現し続け、ＥＬＩＳＡ価、ＨＡ価とも上昇した。また、１０日目に培養上清を回収し、新しい培地を添加するとウイルス様粒子の発現は継続した。従って、適当な時期に培地交換することで、１回の細胞培養で大量のウイルス様粒子を発現させることが可能である。上記の結果から明らかなように、J12#26SF細胞の産生する抗原はＨＡ価を示し、図５に見られるように、ＨＡ価とＥＬＩＳＡ価の間にはほぼ直線的な相関関係が見られた。また、表２から明らかなように、J12#26SF細胞は、日本脳炎ウイルスをVero細胞で増殖させた時の培養液に含まれる抗原量の２〜３倍量の抗原を産生することが判明した。本発明の形質転換細胞株であるJ12#26SF細胞は大量且つ持続的に抗原を発現しており、このような大量且つ持続的な抗原の発現は細胞の継代が進んでも（７８代でも）衰えることはなかった。
【００９９】
実施例３
無血清培地からのウイルス様粒子の精製
J12#26SF細胞を、直径１５ｃｍの培養ディッシュを用いて、無血清培地中で７２時間大量培養した。抗原精製用無血清培地としては、VP-SFMに５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを添加して用いた。
【０１００】
３，０００ｒｐｍで１０分培養液を遠心し、培養上清を回収した。回収した培養上清をBiomax-100限外濾過膜（MWCO100,000）（米国、Millipore社製）を装着したセントリコンプラス80を用いて３，０００×ｇ、４℃で３０分の遠心を３回行い、容積を１／１１４まで濃縮した。
【０１０１】
濃縮液をSephacryl S-300を充填したHiprep 16/60カラム（１．６×６０ｃｍ）（スウエーデン国、Pharmacia Biotech AB製）にアプライし、ＴＢＳバッファー［50mM Tris-HCl (pH7.5)、150mM NaCl］を用いて流速１ｍｌ／分で分子ふるいクロマトグラフィーを行い、１画分が３．７５ｍｌとなるように分画した。各画分の抗原価をＥＬＩＳＡ法で測定し、ピークフラクションを回収した。目的の抗原は、排除限界域で単一のピークとして溶出された。
【０１０２】
次に、このピーク画分を上部５％（w/w）、底部３０％（w/w）となるように、Gradient MasterTM（model 106）（カナダ国、BIOCOMP Instruments, Inc.製）で調整したショ糖密度勾配液に重層し、SW28ローターおよび超遠心機 L8-70M（いずれも米国、Beckman Instruments, Inc.製）を用いて、４℃、２６，５００ｒｐｍの条件で２時間のショ糖密度勾配遠心分画を行った。遠心後、チューブ底部中央に１９ゲージの穴をあけ、滴下法で１画分が２ｍｌとなるように分画した。各画分の抗原価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗原のピークフラクションを回収した。目的の抗原は単一のピークを形成して分画していた。各フラクションのショ糖濃度はほぼ単調減少直線を描いていた。
【０１０３】
最後に、ショ糖や低分子物質を除くために、このピーク画分をSephadex G-25を充填したHiprep desalting 26/10カラム（２．６×１０ｃｍ）（スウエーデン国、Pharmacia Biotech AB製）にアプライし、ＰＢＳ（−）を用いて流速５ｍｌ／分で分子ふるいクロマトグラフィーを行い、１画分が５ｍｌとなるように分画した。この操作で抗原をショ糖や低分子物質から完全に分離し、同時に溶媒をＰＢＳ（−）に交換した。ショ糖の除去とバッファー交換を行った抗原画分を最終精製物であるウイルス様粒子とした。精製したウイルス様粒子は、J12#26抗原と命名した。なお、高速液体クロマトグラフィーシステムには、AKTA explorer 10S（スウエーデン国、Pharmacia Biotech AB製）を使用した。
【０１０４】
抗原の精製の各段階において、タンパク質量とＥＬＩＳＡ法による抗原量の測定を行った。結果を表３にまとめた。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
表３においては、無血清培地を用いた培養上清中の総抗原量をそれぞれ１００％とし、各ステップにおける収量を基に回収率を算出した。タンパク質の回収率は６．３％であったが、ウイルス様粒子の回収率は４３．５％だった。電気泳動の結果およびウェスタンブロットの結果と併せると、高精製度・高収率で抗原を精製することができた。
【０１０７】
各精製段階のサンプルの抗原量またはタンパク質量を等しくしてそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。泳動後、銀染色と同等の感度を持つ蛍光色素のSYPRO-Orangeで泳動分画されたタンパク質を染色した。結果を図６に示した。抗原量を等しく泳動した場合には、精製過程が進むにつれ、同等のシグナル強度を示す分子量５３ｋＤａのタンパク質バンドが等しく観察されたのに対して、その他の混入タンパク質のバンドは減少した。タンパク質量を等しくして泳動した場合には、精製が進むにつれ、上記５３ｋＤａのタンパク質バンドが徐々に強く観察された。更に、５３ｋＤａの主要なタンパク質バンドが日本脳炎ウイルスに特異的な中和抗原のＥタンパク質であるか否かをウェスタンブロットで調べた。結果を図７に示した。日本脳炎ウイルスに対する特異的な抗体によって、５３ｋＤａの主要なタンパク質が認識された。
【０１０８】
J12#26抗原液のタンパク質濃度とＨＡ価を測定した。その結果、タンパク質濃度は４４μｇ／ｍｌであり、ＨＡ価は２５，６００ＨＡだった。従って、J12#26抗原のＨＡ活性は、１μｇ／ｍｌ当たり５８２ＨＡだった。
【０１０９】
実施例４
抗原粒子を構成するタンパク質のＮ末端アミノ酸解析
J12#26抗原がＥタンパク質のみならず、Ｍタンパク質も包含することを確認するために、Ｅタンパク質に相当する５３ｋＤａのバンドの下流に存在するタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を解析した。
【０１１０】
上記で精製したウイルス様粒子に、終濃度が５％になるように５０％トリクロロ酢酸を加えて攪拌し、室温で３０分間静置した。３，０００gで３０分低速遠心後に上清を捨て、残った沈殿を風乾し、１００μlの0.1% NaOHで溶解し、泳動用サンプルとした。泳動用サンプルの抗原量が２０μｇ／レーンとなるようにゲルにアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。電気泳動後のゲルに銀染色を施し、タンパク質のバンドを視覚化した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルからタンパク質のバンドをＰＶＤＦ膜に転写した。結果を図８に示す。
【０１１１】
図８はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜への転写を行った結果であり、左側が銀染色したポリアクリルアミドゲルであり、右側がＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した転写象である。Ｅタンパク質に相当する５３ｋＤａのバンドの下流に存在するバンドのうち、ＪＥＶに由来すると思われる３本のバンド（図８のＪＥＶＬＰ０１〜ＪＥＶＬＰ０３）、即ち、１６．５ｋＤａ、１４．９ｋＤａ及び６．８ｋＤａのバンド、を転写膜から切り出し、メタノール、超純水、メタノールの順番でバンドを洗浄した。各バンドを構成するタンパク質のＮ末端から５残基のアミノ酸配列をシークエンサーを用いて解析した。プロテインシークエンサーにはＧ１０００Ａ（米国、Hewlett Packard Company製）、ＰＴＨアナライザーには１０９０型（米国、Hewlett Packard Company製）、分析プログラムにはRoutine 3.1 PVDFを用いた。結果を表４に示す。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
上記の表４から明らかなように、ＪＥＶＬＰ０１はＭタンパク質（またはその断片）とＥタンパク質断片の混合物であり、ＪＥＶＬＰ０２はＥタンパク質断片であり、ＪＥＶＬＰ０３はＭタンパク質であった。この結果から、J12#26抗原は、Ｅタンパク質と共にＭタンパク質が含まれていることが明らかとなった。
【０１１４】
実施例５
ウイルス様粒子の電子顕微鏡観察
J12#26抗原の形状を電子顕微鏡で観察した。精製したJ12#26抗原を遠心濃縮し、前固定なしでネガティブ染色した。染色したウイルス様粒子を電子顕微鏡下で観察した。電子顕微鏡写真を図９に示す。
【０１１５】
ウイルス様粒子はほぼ均一なサイズの球型粒子状であり、平均直径は２５ｎｍであった。この結果から、精製の完了した抗原が粒子状構造を形成していることが直接的に証明された。また、一般に電子顕微鏡下では、不純物やウイルス様粒子の破壊によって生じた細かな不定形のゴミ様混在物が観察されるが、そのようなものがほとんど見られないことから、精製度はかなり高いものと考えられる。
【０１１６】
実施例６
日本脳炎ウイルス抗原による中和抗体誘導試験
４週齢雌ｄｄＹマウスを１群１０匹に分け、ＰＢＳで希釈した精製J12#26抗原をマウス一匹に付き、総タンパク量で３００ｎｇを腹腔投与免疫した。免疫は１週間おきに２回繰り返した。対照群には５匹のＰＢＳ（−）接種群および現行ワクチン接種群をおいた。２回目の投与から７日目に半数のマウスから、１４日目には残りマウスから無菌的に心臓全採血を行い、血液を３７℃中に１時間放置して凝固させた。血餅を取り除いた後、４℃、５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、血清を分離した。血清を回収し、５６℃で３０分血清の非働化を行った。５匹のマウスそれぞれの血清から５０μｌの非働化済み血清をプールして、中和抗体価の測定に用いた。結果は表５に示した。
【０１１７】
【表５】
0004268384.tif 000006
【０１１８】
表５から明らかなように、J12#26抗原を現行ワクチンと同様に接種した群において、現行ワクチンより約３倍高い中和抗体価を誘導した。以上の結果から、本発明の日本脳炎ウイルス抗原は、現行ワクチンと同等の免疫原性を示すことが明らかになった。
【０１１９】
実施例７
日本脳炎ウイルス抗原による感染防御
実施例６と同様に、４週齢雌ｄｄＹマウスを１群１０匹に分け、ＰＢＳで希釈した日本脳炎ウイルス抗原を腹腔投与免疫した。日本脳炎ウイルス抗原には、ＰＢＳで希釈したJ12#26抗原を用い、一匹につき抗原量（ＥＬＩＳＡで求めた量）で３００ｎｇを投与した。対照群にはＰＢＳ（−）接種群および現行ワクチン接種群をおいた。免疫したマウスが６週齢になった時点で、２×１０6ＰＦＵの日本脳炎ウイルス［（財）阪大微生物病研究会から分与を受けた日本脳炎ワクチン生産用の種ウイルス株（北京−１株、ＪＷＳ−Ｐ−４）］を腹腔内接種した。腹腔内接種と同時に、マウスに２０μｌのＰＢＳを脳内注射し、血液脳関門を破壊した。接種後２１日間にわたり、マウスの生存または死亡を調査し、生存率（％）を算出した。結果を表６に示した。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
表６から明らかなように、本発明の抗原粒子で免疫したマウスは、現行のワクチンで免疫したマウスと同じように１００％の生存率を示した。従って、本発明の抗原様粒子は日本脳炎ワクチン用抗原として十分な感染防御能を有していた。
【０１２２】
実施例８
日本脳炎ウイルス抗原を用いた日本脳炎の診断
J12#26抗原及び組織培養日本脳炎ウイルス精製抗原（ＢＭ３）をそれぞれタンパク質量が１．０μｇ／ｍｌとなるように、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、固相化抗原とした。抗原をＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウエルずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原を固相化した。ＰＢＳ−Ｔでウエルを洗浄し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳを２００μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で２時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔでウエルを洗浄し、２００倍に希釈したヒトの血清を各ウエルに１００μｌ加え、３７℃で６０分インキュベートした。ヒト血清には、日本脳炎ウイルス北京株に対する中和抗体価が陰性の血清２検体（Ｓ１とＳ２）と陽性の血清２検体（Ｓ３とＳ４）を用いた。
【０１２３】
ＰＢＳ−Ｔでウエルを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した標識抗体であるHRPO-anti human IgG goat IgG［米国、Rockland Immunochemicals社製（米）］を各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で６０分インキュベートした。洗浄後、各ウエルに１００μｌの発色液を加えて２０分間放置して反応させた。発色液は、基質となる３０％過酸化水素２５μｌと発色剤であるＡＢＴＳ [2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) Diammonium Salt]（米国、Sigma社製）２０ｍｇを１００ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した溶液を用いた。次に、１．５％のシュウ酸を各ウエルに１００μｌ加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が０．２以上のものを陽性と判定した。結果は表７に示した。
【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
本発明の抗原を用いてヒト血清中の日本脳炎ウイルスに対する抗体との反応性の有無を試験したところ、中和抗体価及び組織培養日本脳炎ウイルス精製抗原を用いた試験結果の両方と相関した結果が得られた。従って、本発明の抗原は診断剤用の抗原としても利用可能である。
【０１２６】
【発明の効果】
本発明によれば、日本脳炎ウイルス様粒子を包含してなる日本脳炎ウイルス抗原であって、該ウイルス様粒子は、日本脳炎ウイルスのＭタンパク質及びＥタンパク質を包含するが、該粒子中にはＲＮＡを含有していないタンパク質集合体であり、且つ該ウイルス様粒子は赤血球凝集活性を示すことを特徴とする日本脳炎ウイルス抗原が提供される。本発明の抗原を用いることにより、現行の日本脳炎ワクチンに用いられている不活化日本脳炎ウイルスの代わりとなる、マウス脳を使わない、ウイルスを使わない、コスト安の日本脳炎ワクチンおよび診断剤の製造が可能となる。
【０１２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、組換えＤＮＡpCAGJ12bsrの模式図である。
【図２】図２は、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭで継代した無血清培地非馴化細胞（Ｊ１２＃２６細胞）の継代数と、培養上清中に発現されたウイルス様粒子量の関係を示すグラフであり、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したウイルス様粒子量（μｇ／ｍｌ）であり、横軸は継代数である。
【図３】図３は、ＶＰ−ＳＦＭ（無血清培地）で継代した無血清培地馴化細胞（Ｊ１２＃２６ＳＦ細胞）の継代数と、培養上清中に発現されたウイルス様粒子量の関係を示すグラフであり、縦軸はＥＬＩＳＡ法で測定したウイルス様粒子量（μｇ／ｍｌ）であり、横軸は継代数である。
【図４】図４は、日本脳炎ウイルス感染Vero細胞の培養上清のＨＡ価及びＥＬＩＳＡ価の経時変化を示すグラフであり、左の縦軸は精製不活化ウイルス抗原であるTJP**012のＥＬＩＳＡ価を１００とした培養上清のＥＬＩＳＡ価であり、右の縦軸はＨＡ価（ＨＡ活性が認められた最大希釈率）であり、横軸は培養日数であり、○はＥＬＩＳＡ価を表し、◆はＨＡ価を表す。
【図５】図５は、３８代培養したＪ１２＃２６ＳＦ細胞の培養上清のＨＡ価及びＥＬＩＳＡ価の経時変化を示すグラフであり、左の縦軸は精製不活化ウイルス抗原であるTJP**012のＥＬＩＳＡ価を１００とした培養上清のＥＬＩＳＡ価であり、右の縦軸はＨＡ価（ＨＡ活性が認められた最大希釈率）であり、横軸は培養日数であり、○はＥＬＩＳＡ価を表し、◆はＨＡ価を表す。
【図６】図６は、ウイルス様粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図中、レーン２〜６は等しい抗原量をアプライした結果であり、レーン８〜１２は等しいタンパク質量をアプライした結果であり、レーン１と７は分子量マーカー、レーン２と８は限外ろ過で濃縮した培養上澄、レーン３と９はSephacryl S-300クロマトグラフィーのピークフラクション、レーン４と１０はショ糖濃度勾配遠心法で得たピークフラクション、レーン５と１１はSephadex G-25クロマトグラフィーのピークフラクション、そしてレーン６と１２は市販の日本脳炎ワクチンである。
【図７】図７は、図６のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対してウサギ抗ＪＥＶ抗血清を用いたウエスタンブロットの結果である。図中、レーン２〜６は等しい抗原量をアプライした結果であり、レーン８〜１２は等しいタンパク質量をアプライした結果であり、レーン１と７は分子量マーカー、レーン２と８は限外ろ過で濃縮した培養上澄、レーン３と９はSephacryl S-300クロマトグラフィーのピークフラクション、レーン４と１０はショ糖濃度勾配遠心法で得たピークフラクション、レーン５と１１はSephadex G-25クロマトグラフィーのピークフラクション、そしてレーン６と１２は市販の日本脳炎ワクチンである。
【図８】図８は、ＴＣＡで処理したウイルス様粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画したタンパク質のバンドをＰＶＤＦ膜に転写した結果であり、右側が銀染色したポリアクリルアミドゲルであり、左側がＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した転写象であり、左端の数字は分子量マーカーであり、２０．９ｋＤａのバンドの下流に３本のバンド（ＪＥＶＬＰ０１〜ＪＥＶＬＰ０３）が存在する。
【図９】図９は、ネガティブ染色したウイルス様粒子を撮影した電子顕微鏡写真であり、スケールを示す横線は１００ｎｍに相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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