(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト脂肪組織由来の分離された間質細胞と、
（ｂ）（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地とを含む単離された脂肪組織由来の間質細胞を誘導して軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現させるための組成物。
【請求項２】
前記抗生物質がペニシリンである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗生物質がストレプトマイシンである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペニシリンの濃度が約１０〜約２００単位／ｍｌである請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ストレプトマイシンの濃度が約１０〜約２００μｇ／ｍｌである請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルココルチコイドがヒドロコルチゾンである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記グルココルチコイドがデキサメタゾンである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記デキサメタゾンの濃度が約１〜約１００ｎＭである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ヒドロコルチゾンの濃度が約１〜約１００ｎＭである請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記トランスフォーミング成長因子βが、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質４、ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング成長因子β１）、ＴＧＦ−β２（トランスフォーミング成長因子β２）、ＴＧＦ−β３（トランスフォーミング成長因子β３）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＥＧＦ（表皮性成長因子）、ａＦＢＦ（酸性線維芽細胞成長因子）、ｂＦＢＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＫＧＦ（角膜実質細胞成長因子）、インヒビンＡ、軟骨形成刺激因子（chondrogenic stimulating factor）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記トランスフォーミング成長因子βの濃度が約１〜１００  ｎｇ／ｍｌである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＴＧＦ−β１の濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記コラーゲン性細胞外マトリックス分子がＩ型コラーゲンである請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ビタミンＡ類似体がレチン酸である請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記レチン酸の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ａ）培地を含有する無菌管中で、５０，０００〜５００万の間の細胞数で２〜２０分間、５００Ｘｇで遠心分離することにより、間質細胞をペレット化するステップと、
ｂ）分化用培地に５００〜２０，０００細胞／ｃｍ2の密度で分離された間質細胞を置くステップと、
ｃ）（ｉ）  グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、
（ｉｉ）  抗生物質と、
（ｉｉｉ）  １〜２０％のウシ胎児血清または１〜２０％のウマ血清、または、任意の他の生物学的なタンパク質類または合成タンパク質類の等価の組み合わせにより補給される栄養分と、
（ｉｖ）  アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、
（ｖ）  グルココルチコイドまたは細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができる他の化学的薬剤と
を該培地に補給するステップと、
ｄ）約３１℃〜３７℃にて約３〜４週間、５％のＣＯ2と１％から２０％の間の酸素との中で該細胞をインキュベーションするステップと、
ｅ）分離された該細胞の分化の程度を決定するステップと
を含む脂肪組織由来の間質細胞の軟骨細胞への分化方法。
【請求項１７】
ａ）カルシウムアルギナート中または、３次元形態において軟骨形成を支えることができる任意の他の生体適合性のある格子またはマトリックス中に、５０万〜１０００万細胞／ｍｌの密度で間質細胞と前脂肪細胞とを懸濁するステップと、
ｂ）３５ｍｍの培養皿に細胞を移し、
（ｉ）  グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、
（ｉｉ）  抗生物質と、
（ｉｉｉ）  １〜２０％のウシ胎児血清または１〜２０％のウマ血清、または、任意の他の生物学的タンパク質または合成タンパク質の等価の組み合わせにより補給される栄養分と、
（ｉｖ）  アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、
（ｖ）  グルココルチコイド、または細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができる他の化学的薬剤と
を有するかまたはこれらにより補給されている化学的に規定されている培養培地を含む分化用培地に、５００〜２０，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を置くステップと、
ｃ）約３１℃〜３７℃にて約３〜４週間、５％のＣＯ2と１％〜２０％の酸素との中で該細胞をインキュベーションするステップと
ｄ）分離された該細胞の分化の程度を決定するステップと
を含む脂肪組織由来の間質細胞の軟骨細胞への分化方法。
【請求項１８】
ａ）（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地を用いて、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現する分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞と、
ｂ）生体適合性マトリックスと
を含む、軟骨疾患の治療のための組成物。
【請求項１９】
前記マトリックスが、軟骨形成を支持する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記マトリックスが、カルシウムアルギナート、アガロース、フィブリン、およびコラーゲンからなる群から選択される請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地を用いて、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現する分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞であって、外来核酸が導入されている間質細胞。
【請求項２２】
（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地を用いて、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現する分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞を含む合成軟骨パッチ。
【請求項２３】
前記パッチが、事前成形された培養ウェルで成長して特定の寸法のパッチを形成する請求項２２に記載の軟骨パッチ。
【請求項２４】
前記パッチが、軟骨形成細胞が該細胞と接触する表面に付着するのを阻止する分子でコートされている培養ウェルで成長する請求項２２に記載の軟骨パッチ。
【請求項２５】
前記コートしている分子が、ジクロロジメチルシランおよびポリテトラフルオロエチレンを主成分とする試薬からなる群から選択される請求項２４に記載の軟骨パッチ。
【請求項２６】
前記培養ウェルが、細胞を付着させない柔軟な生体適合性材料または成形可能な生体適合性材料から製造される請求項２３に記載の軟骨パッチ。
【請求項２７】
前記柔軟な生体適合性材料または成形可能な生体適合性材料が、アガロース、ガラス、未処理の細胞培地プラスチック、およびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される請求項２６に記載の軟骨パッチ。
【請求項２８】
前記培養ウェルが、約２５ｃｍ2の断面の表面積を有する請求項２３に記載の軟骨パッチ。
【請求項２９】
前記培養ウェルが、約０．３ｃｍの軟骨パッチを形成するのに十分な深さを有する請求項２４に記載の軟骨パッチ。
【請求項３０】
（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地を用いて、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現する分離された脂肪組織由来の間質細胞を含む組成物の、軟骨疾患を治療するための移植可能な組成物を調製するための使用方法。
【請求項３１】
（ｉ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される軟骨誘導薬剤であって、成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地を用いて、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を発現する分離されたヒト脂肪由来の間質細胞。
【請求項３２】
インビボで移植される請求項３１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明分野】
本発明は、軟骨系統の細胞に分化するよう、in vitroで培養された脂肪組織由来の間質細胞を方向付ける方法と成分に関する。さらに詳細には本発明は、ヒトおよびほかの種における病理学的状態の治療上の処置に関して、受容者または宿主に移植するに先立って、あるいは移植する時点でこうした方向付けをされた系統の誘導に関する。
【０００２】
【発明の背景】
間葉幹細胞（MSC）は、脂肪、骨、軟骨、弾性組織、筋肉、線維性結合を含む間葉性または結合組織の特定タイプに分化することが可能である、組織骨髄、血液、皮膚および骨膜でみられる生成多分化能性芽細胞または胚芽様細胞である。これらの細胞が入る特定の分化経路は、成長因子、サイトカイン、および／または宿主組織により確定される局所的な微小環境状態などの機械的影響または内在性の生物活性因子からのさまざまな影響、あるいはそれらの両方による。
【０００３】
出生前の生物体においては特殊化結合組織細胞への間葉幹細胞（MSC）の分化がうまく確立されている。例えば、胚芽性ニワトリ、マウスまたはヒト体肢芽間葉細胞は軟骨、骨およびそのほかの結合組織に分化する(S. Subtelney とU. Abbott編『第39回発生生物学会年次総会（39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology）』のなかのCaplan A. I.執筆部分、3768頁、ニューヨーク、Alan R Liss 社刊、1981年; Elmer ら、(1981) Teratology, 24:215-223; Hauschka S. D. (1974) Developmental Biology (1974) 37: 345-368; Solurshら (1981) Developmental Biology, 83:9-19; Swallaら(1986) Developmental Biology, 116:31-38)。さらに、クローンラット頭蓋冠細胞系統もまた、筋肉、脂肪、軟骨、骨に分化することを示している（Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-283）。出生後生物体における間葉幹細胞（MSC）の存在は、胚芽後細胞がいくつかの中胚葉表現型に分化するのを示す目的では広範には研究が行われてはこなかった。行われた数少ない研究には、拡散チャンバーで容器に入れることとin vivoでの移植と、その後の骨髄細胞による骨と軟骨の形成が含まれる（Ashtonら (1980) Clin  Orthop  Rel  Res.,151：294-307；Bruderら(1990) Bone Mineral,11:141-151, 1990）。最近では、ニワトリ骨膜由来の細胞が分離され、培養培地で増殖され、また、in vitroでの高密度状態下で軟骨と骨への分化を示した（Nakaharaら (1991) Exp Cell Res.,195:492-503）。ラット骨髄由来間葉細胞が、in vivoに移植された場合に、骨芽細胞と軟骨細胞に分化する能力を有していることが示されている（Dennisら(1991)Cell Transpl, 1:2332; Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-283）。米国特許第5,908,784号を付与されたJohnsoneらによる文献は、生物化学的にまた表現型的に軟骨細胞に類似している細胞に分化する、皮膚から得られた間葉細胞の能力を示している。
【０００４】
成人骨髄微小環境は、こうした仮定的な中胚葉幹細胞の潜在的供給源である。成人の骨髄から分離された細胞は、間質細胞、間質幹細胞、間葉幹細胞(MSC)、間葉線維芽細胞、細網‐内皮細胞、Westen-Bainton細胞を含め、さまざまな名称で呼ばれている（Gimbleら (1996年11月) Bone 19(5):421-8）。In vitroでの研究では、これらの細胞が、複数の中胚葉または間葉系統経路に沿って分化できることが示されている。これらに限定されるわけではないが、これらの細胞には脂肪細胞が含まれる（Gimbleら (1992) J.Cell Biochem. 50:73-82, 軟骨細胞；Caplanら (1998) J Bone Joint Surg. Am 80 (12): 1745-57;造血支持細胞、Gimbleら (1992) J.Cell Biochem. 50:73-82; 筋細胞、Prockopら (1999) J. Cell Biochem. 72(4):570-85; 筋細胞、Charbordら (1999) Exp. Hematol. 27(12):1782-95; 骨芽細胞、Beresford ら (1993) J. Cell Physiol. 154:317-328）。骨髄は骨、軟骨、筋肉、脂肪細胞、そのほかの間葉誘導臓器再生のための間質幹細胞の供給源と考えられてきた。これらの細胞使用に対する制約があるが、その主なものは、骨髄生検の手法に伴う困難と危険と、この供給源から得られる幹細胞の産生量の少なさにある。
【０００５】
脂肪組織は、多分化能性間質幹細胞の供給源として骨髄に代わりうる潜在能力を提供する。脂肪組織は、容易に入手可能であり、また多くの個人に豊富にある。肥満は、米国においては1つの疫学的比率を有する状態にあり、成人の50％以上が体重をベースにした推奨BMI値を超過している。脂肪細胞は外来患者をベースにして実施される脂肪吸引法により収集できる。これは、広範な大多数の患者に受入れ可能である美容上の効果については比較的に非侵襲的な手法である。脂肪細胞は補充が可能な細胞集団であることがよく報告されている。脂肪吸引法またはほかの手法による外科的な除去後であっても、個人においては時間の経過に伴って脂肪細胞の再生が通常みられる。このことから、脂肪細胞には自己新生の能力がある間質幹細胞を含んでいることが示唆される。
【０００６】
病理上、脂肪由来の間質幹細胞が複数の間葉系統に沿って分化できることが示唆されている。もっとも一般的な柔組織腫瘍、脂肪肉腫は脂肪細胞様細胞から発生する。混合起源の柔組織腫瘍は比較的一般的である。これらには、脂肪組織、筋肉（平滑筋なしは骨格筋）、軟骨、および／または骨に関する要素が含まれている。骨髄内にある骨形成細胞が脂肪細胞または脂肪の細胞に分化できるのと同じように、骨髄外脂肪細胞は骨芽細胞を形成することができる（Halvorsen WO 99/28444）。
【０００７】
軟骨は、その重量の70％〜80％を構成する水により、高度に水和された構造になっている。残りの20％〜30％はII型コラーゲンとプロテオグリカンを含む。コラーゲンは通常、軟骨の乾燥重量の70％を占める（Rubin & Farber編『病理学(“Pathology”)』1369‐1371頁、J. B. Lippincott社刊、ペンシルバニア州、1988年）。プロテオグリカンは、そこから多糖類の長い鎖が伸びる中央タンパク質コアからなる。これらの多糖類は、グリコサミノグリカンと呼ばれ、これには以下のものが含まれる。すなわち、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、ケラタン硫酸である。軟骨は、内在的に産生され、かつ分泌された細胞外マトリックス内に分散している軟骨形成細胞からなる特徴的な構造的機構を有する。軟骨細胞を含むマトリックスにおける腔は軟骨小腔と呼ばれる。骨とは異なり、軟骨は神経化されておらず、また血管またはリンパ系が通っていない（Clemente『グレイ解剖学（“Gray's Anatomy”）』、第30版増補版、Lea & Febiger社刊、1984年）。
【０００８】
軟骨の3つのタイプが哺乳動物には存在しており、硝子軟骨、線維性軟骨、弾性軟骨が含まれている（RubinとFarber、同上）。硝子軟骨は、硬い、弾性成分を有する、筋張った塊からなり、半透明であってかつ色は真珠様の青みがかっているものである。硝子軟骨は関節の関節表面上で支配的にみられる。これはまた、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、鰓弓軟骨、鼻軟骨においてもみられる。線維軟骨は、引張強度を軟骨に与えているＩ型コラーゲンの原線維を含んでいる以外は基本的には硝子軟骨と同じである。コラーゲン線維は束になって並んでおり、その束の間に軟骨細胞が位置している。線維軟骨は椎間板の線維輪、腱および靭帯挿入、半月板、恥骨結合、関節包でよくみられる。弾性軟骨もまた、エラスチン線維を含んでいる以外は硝子軟骨とほぼ同じである。硝子軟骨よりもさらに不透明で、かつさらに柔軟で曲げやすい。これらの特性は、軟骨のマトリックスに埋め込まれている弾性線維により部分的に規定される。典型的には、弾性軟骨は耳、喉頭蓋、喉頭の翼に存在している。
【０００９】
哺乳動物関節の関節骨の表面は関節軟骨により覆われている。関節軟骨は、反対側の骨表面との直接接触を防ぎ、また互いに向かい合わせにある関節骨のほとんど摩擦のない動作が可能になる（Clemente、同上）。関節軟骨欠損の２つのタイプが哺乳動物ではよくみられ、全厚ならびに部分厚欠損がある。身体損傷の程度だけではなく、各病変のタイプが喚起する修復応答の性質においても異なる。
【００１０】
全厚関節軟骨欠損には、関節軟骨、その下に横たわっている肋軟骨下骨組織、関節軟骨と肋軟骨下骨の間に位置している軟骨の石灰化層に対する損傷が含まれる。全厚欠損は典型的には関節の重篤な損傷の間、または変性関節疾患の後期の間、例えば、骨関節炎の間に起こる。肋軟骨下骨へ損傷により引き起こされる修復反応は通常、全厚欠損の部位での線維軟骨の形成という結果を生じる。しかし、線維軟骨は関節軟骨の生物機械的特性を欠いており、基本的には長期間にわたって関節に存続することはない。
【００１１】
部分厚関節軟骨欠損は軟骨組織自体に限られる。こうした欠損には通常、軟骨の関節表面の裂溝、裂が含まれる。部分厚欠損は、関節内の軟骨組織の疲労を順次引き起こす関節の機械的配置により起こる。神経と血管がないため、部分厚欠損は修復反応を誘導せず、またしたがって治癒することが少ない。無痛ではあるが、部分厚欠損はしばしば、全厚欠損へと変性する。
【００１２】
本発明により、ヒト脂肪組織由来の間質細胞が3次元フォーマットにおいて関連付けられる場合には、ある種の軟骨誘導性薬剤または因子とin vitroで接触させるときに、軟骨生成経路に沿って関与しまた分化するように誘導できることが観察されている。3次元フォーマットは、本発明のin vitroでの軟骨生成には非常に重要であり、また細胞は好適には、例えば、固形化またはペレット化した細胞塊として、あるいはアルギナートマトリックスに一緒に濃縮される。本発明は、軟骨系統に沿って成人ヒト骨髄外脂肪組織間質細胞の分離、分化、特徴付けのための諸方法と成分の実施例を呈示する。本発明のin vitroでのプロセスは、in vivoに起こっていることを繰り返しているものと考えられ、また哺乳動物においてin vivoに軟骨の修復を促進するのに使用できる。
【００１３】
【発明の概要】
本発明は、皮下、乳房、性腺、または大網の脂肪組織から誘導された間質細胞を完全に機能的な軟骨細胞に定常的ならびに定量的に誘導するための方法と成分を提供する。本方法は、（１）成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分補給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができるグルココルチコイドまたはほかの化学的薬剤とを有するか、またはそれらにより補給された化学的に規定されている培養培地に500〜20,000細胞/cm2の密度で置かれた、分離された脂肪組織由来の間質細胞のインキュベーションを含む。
【００１４】
本発明はまた、DMEMまたはα-MEMまたはRPMI1640などの培地において間質細胞をペレット化することにより、あるいは（１）成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分補給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができるグルココルチコイドまたはほかの化学的薬剤とを培地に補給することにより、軟骨細胞の脂肪組織由来の間質細胞への分化方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、３次元構造において軟骨形成を支持することができるカルシウムアルギナート（calcium alginate）またはほかの生体適合性のある格子あるいはマトリックス中に細胞を懸濁することにより、軟骨細胞の脂肪組織由来の間質細胞への分化方法を提供する。
【００１６】
本発明は、間質細胞に調節遺伝子を運び入れるウイルスベクターの形質導入のため、間質細胞に調節遺伝子を運び入れるプラスミドベクターのトランスフェクションのため、これらの遺伝子によりコードされる機能的タンパク質の追跡と検出のため、生きている生物体中にこうした細胞の再導入するための生物機械的キャリアを開発するために、脂肪組織由来の間質細胞の分化と機能を方向付けるこうした培養状態と薬剤との能力を測定するための方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、こうした軟骨細胞を修復のために軟骨欠損領域に導入するための方法を提供する。
【００１８】
本方法と成分は、前十字靭帯裂傷、全厚関節軟骨欠損、部分厚関節軟骨欠損に限らないが、それらを含む分化細胞関連疾患状態および外傷に対して妥当性を備えた化合物およびタンパク質の薬剤発見に使用する方法を有する。
【００１９】
本発明は、軟骨細胞への脂肪組織由来の間質細胞の分化と培養のための方法と成分を提供する。本発明の方法により産生された細胞は、研究、移植、ヒトの疾患および外傷の修復と治療用の組織工学的産物開発のために完全に分化させた、また機能的な細胞の供給源を提供する際に有用である。したがって、1つの態様では、本発明は、増殖と、機能的な軟骨細胞への間質細胞の分化を支持することができる培地を含む組成中で間質細胞を培養することを含む軟骨細胞の脂肪組織由来の間質細胞への分化方法を提供する。本発明はさらに、修復のために軟骨欠損領域にこれら軟骨細胞を導入するための方法を提供する。
【００２０】
「脂肪間質細胞」とは、脂肪組織を起源とする間質細胞をいう。「脂肪」という言葉は、任意の脂肪の組織を意味する。脂肪組織は、茶色または白色脂肪組織であり、皮下、大網または内臓、乳房、性腺、またはほかの脂肪組織部位から誘導される。好適には、脂肪は皮下の白色脂肪組織である。こうした細胞は初代細胞培養または不死化細胞系統を含むことが考えられる。脂肪組織は脂肪組織を有する任意の生物体由来のものと考えられる。好適には、脂肪組織が哺乳動物のもので、もっとも好適には脂肪組織はヒト由来のものである。都合の良い脂肪組織の供給源は、吸引脱脂手術から得られるものであるが、脂肪組織の供給源または脂肪組織の分離の方法は本発明にとっては非常に重要なものではない。間質細胞を対象者に自家移植することを所望する場合には、脂肪細胞はその対象者から分離される。
【００２１】
「軟骨細胞（軟骨の細胞）」とは、II型コラーゲン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラチン、平滑筋の特性を有する形態学的マーカーに限らないがそれらを含め、培養において観察され、またII型コラーゲンを分泌することができる円形形態学的なもの（rounded morphology）を含むがそれに限定されず、in vitroでの軟骨の血行力学による組織またはマトリックスの生成を含むがそれに限定されない、軟骨細胞の特徴のある生物化学的マーカーの発現を可能にする細胞をいう。
【００２２】
組織培養での間質細胞を支持することができるいずれかの培地が使用される。線維芽細胞の増殖を支える培地調剤法には、それらに限らないが、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、α改変最少必須培地（α-MEM）、ローズウエルパーク記念研究所培地（Roswel Park Memorial Institute Media）1640（RPMI培地1640）などが含まれる。典型的には、0〜20％の胎児ウシ血清（FBS）または1〜20％のウマ血清が、間質細胞または軟骨細胞あるいはそれらの両方の増殖を支えるために上記の培地に加えられる。規定された培地も、間質細胞と軟骨細胞用のFBSのなかで必要な成長因子、サイトカイン、ホルモンがその増殖培地で適当な密度で同定され、また供給される場合には、使用することができるであろう。本発明の方法において有用な培地には、間質細胞に対して分裂促進する抗生物質または分化を可能にする化合物を含むがそれらに限定されない、関心の対象である1つまたはそれ以上の化合物が含みうる。細胞は湿り気を加えたインキュベータのなかで31℃〜37℃の間の温度で増殖される。二酸化炭素含有量が2％〜10％の間で維持され、また酸素含有量は1％〜22％の間で維持される。細胞は、4週間までの間、この環境におかれる。
【００２３】
培地中に補給することができる抗生物質には、ペニシリンとストレプトマイシンを含むがそれらに限定されない。化学的に規定された培養培地におけるペニシリンの濃度は、約10〜約200単位/mlである。化学的に規定された培養培地におけるストレプトマイシンの濃度は、約10〜約200 μg/mlである。
【００２４】
本発明で使用することができるグルココルチコイドには、ヒドロコルチゾンとデキサメタゾンを含むがそれらに限定されない。培地におけるデキサメタゾンの濃度は約1〜約100 nMである。培地におけるヒドロコルチゾンの濃度は約1〜約100 nMである。
【００２５】
本出願で用いられているように、「軟骨誘導薬剤」または「軟骨誘導因子」という用語は、in vitroの軟骨生成誘導または軟骨細胞の産生に効果を及ぼすように、ヒト脂肪組織由来の間質細胞に適用することができる、何らかの天然または合成の、有機または無機化学的、生物化学的化合物、それらの化合物の組み合わせまたは混合物または何らかの機械的、そのほかの物理的装置、容器、影響や力をいう。軟骨誘導製剤は好適には、(i)デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、(ii)骨形態形成タンパク質（bone morphogenic protein）（好適にはBMP-2またはBMP-4）、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFBF）、肝細胞成長因子(HGF)、角膜実質細胞成長因子（KGF）、骨形成タンパク質（OP-1、OP-2、OP-3）、インヒビンＡまたは軟骨形成刺激活性因子（CSA）、(iii)I型コラーゲンなどのコラーゲン性細胞外マトリックスの組成物（とくにゲルの形態で）、(iv)レチン酸などのビタミンＡ類似体から構成されるグループから個別に、あるいは組み合わせて、選択される。
【００２６】
トランスフォーミング成長因子βの濃度は、約1〜約100 ng/mlである。レチン酸の濃度は、約0.1〜約1 μg/mlである。
【００２７】
間質細胞分裂促進因子である化合物の例としては、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞成長因子、骨形態形成タンパク質、間質細胞分化因子を含むがそれらに限定されず、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞成長因子、骨形態形成タンパク質などを含むがそれらに限定されない。
【００２８】
好適には、脂肪組織由来の間質細胞は最終的に分化した細胞が導入される対象者の脂肪組織から分離される。しかし、間質細胞は対象者と同じかまたは異なる種のいずれかの生物体から分離されうる。脂肪組織を有するいずれかの生物体であれば、潜在的な候補となることができる。好適には、その生物体は哺乳動物であり、もっとも好適な生物体はヒトである。
【００２９】
本発明はまた、３次元構造において軟骨形成を支持することができるカルシウムアルギナートまたは別の生体適合性のある格子あるいはマトリックス中に細胞を懸濁することにより、軟骨細胞中に脂肪由来の間質細胞を分化させて入れるための方法を提供する。格子の材料の例としては、（１）1％〜4％の濃度でのカルシウムアルギナート、架橋されたLグルクロン酸およびDマンヌロン酸の多糖類、（２）フィブリン、（３）II型コラーゲン、または（４）アガロースゲルが含まれる。細胞を含む格子またはマトリックスは、（１）成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分補給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができるグルココルチコイドまたはほかの化学的薬剤とを含む培養培地に移される。
【００３０】
脂肪組織由来の間質細胞は、プラスミド、ウイルス、または代替的ベクターの方法を使用して、関心の対象である核酸に、安定的にまたは一時的にトランスフェクションまたは形質導入されることが考えられる。関心の対象となっている核酸には、軟骨にみられる細胞外マトリックス組成物の産生を向上させるこれらのコード遺伝子産物を含むがそれに限定されない。例としては、トランスフォーミング成長因子β、骨形態形成タンパク質、アクチビン、インスリン様成長因子を含む。
【００３１】
間質細胞に調節遺伝子を運び入れるウイルスベクターの形質導入は、10：1〜2000：1の間の複合感染（ウイルス単位：細胞）で塩化セシウムバンディングまたはほかの方法により精製されるウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、またはほかのベクター）により行うことができる。細胞は、1時間〜24時間の間、ポリエチレンイミンまたはリポフェクタミンTMなどのカチオン界面活性剤の非存在下または存在下で、無血清培地または血清を含む培地でウイルスに曝される（Byk ら(1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. ら (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49）。
【００３２】
間質細胞に調節遺伝子を運び入れるプラスミドベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウムDNA沈殿法またはカチオン界面活性剤法（リポフェクタミンTM、DOTAP）または生体適合性ポリマー中に直接プラスミドDNAベクターの組込みによる3次元培養を使用することにより、単層培養の細胞中に導入することができる（Bonadio J. (1999) Nat. Med. 5:753-759）。
【００３３】
これらの遺伝子によりコードされる機能的なタンパク質の追跡と検出のために、ウイルスまたはプラスミドDNAベクターには、緑色蛍光タンパク質またはβガラクトシダーゼ酵素のように容易に検出可能なマーカー遺伝子などが含まれ、緑色蛍光タンパク質とβガラクトシダーゼ酵素は両方とも組織化学的手段により追跡することが可能である。
【００３４】
生きている生物体への間質細胞再導入用の生物機械的なキャリアの開発に関して言うと、キャリアには、カルシウムアルギナート、アガロース、I、II、IV型コラーゲン、またはほかのコラーゲンイソ型タンパク質、フィブリン、ポリ格子またはポリグリコール酸、ヒアルロン酸誘導体、あるいはその他の物質（Perka C. ら(2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VFら (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR ら(1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DAら (1994) Orthop. Res. 12:485-497）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
本発明のもう1つの目的は、軟骨細胞への脂肪組織由来の間質細胞の分化を促進させる化合物の同定法と研究法を提供することである。分化を促進する化合物は、部分または全軟骨欠損、骨関節炎、外傷性軟骨、口蓋裂または中隔偏位を含む先天性欠損の形成外科の治療において価値を有するものであると考えられる。諸方法には、その後に関心の対象となっている新規な化合物に曝すことができる軟骨細胞として脂肪組織由来の間質細胞を維持する3次元でのin vitro培養の開発が含まれるが、それに限定されない。
【００３６】
あらゆる化合物が軟骨細胞への脂肪組織由来の間質細胞の分化に影響を与える能力について調査されうる。調査される化合物に適合可能な適当なビヒクルは、当業者には公知のものであり、また、現時点の最新版の『レミントンの薬学科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）』(1995年、Mack Publishing社刊、ペンシルバニア州イーストン市)にみることができるが、その内容は本出願に引用することにより本発明の一部をなすものとする。
【００３７】
本発明の特徴と長所は、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない以下の実施例を参照することでさらに明確に理解されることであろう。
【００３８】
［実験］
［軟骨細胞への脂肪組織由来の間質細胞の分化］
［実施例1：デキサメタゾンを使用したin vitroでの軟骨形成］
間質細胞は、1999年1月29日に出願された米国特許出願第09/240,029号「ヒト前脂肪細胞から脂肪細胞への分化の方法と成分（“Methods and Composition of the Differentiation of Human Preadipocytes into Adipocytes”）」に説明されている方法によりヒト皮下脂肪細胞から分離される。これらの細胞は500〜20,000細胞/cm2の密度で置かれる。本発明は、in vitroでの前軟骨濃縮の創成がヒト脂肪細胞から誘導された間葉前駆体細胞における軟骨形成を促進することを企図している。これは、以下の方法を含む方法により達成されるがそれらに限定されない。
（１）増殖平板細胞とともに使用されるために開発されたペレット培養システム（Katoら(1988) PNAS 85: 9552-9556; Ballock と Redi, J. Cell Biol. (1994) 126 (5): 1311-1318）であって、培養培地に置かれた軟骨細胞の軟骨表現型の発現を維持するのに使用されてきたペレット培養システム（Solursh (1991) J. Cell Biochem. 45: 258-260）。
（２）細胞と細胞との接触を防ぎ、軟骨細胞の表現型の維持または獲得を促進する特徴を有する円形形態を維持するためにカルシウムアルギナートの中で細胞を維持するアルギナート懸濁法。
【００３９】
ヒト脂肪細胞由来の細胞は、上述されているように分離される。ペレット培養に関しては、10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEMを入れた滅菌された15 ml円錐形のポリプロピレン試験管で、200,000細胞のアリコートが、10分間、500 gで遠心分離された。その後3週間、5％のCO2中で、37℃にてインキュベーションされる。アルギナート培養に関しては、細胞は1.2％のカルシウムアルギナートに入れた100万細胞/mlの密度で懸濁され、10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEMで維持される。その後に3週間、5％のCO2中で37℃にてインキュベーションされる。2〜4週間後に、細胞は分離され、適当な抗体試薬で免疫組織化学により、または、細胞外マトリックスにおける硫酸化プロテオグリカンの存在を検出するためにトルイジン青により染色することにより軟骨細胞系統マーカーに関して固定され、分析される。
【００４０】
代表的な軟骨細胞マーカータンパク質、コラーゲンIIを検出する抗体により得られた結果を図１〜３に示す。細胞は、コラーゲンIIタンパク質の細胞内の存在について免疫蛍光法により陽性に染色されたペレット培養（図2）またはカルシウムアルギナート（図３）で維持される。これらの結果は、図1に示されるように、単層培養において3週間の間維持されている脂肪組織由来の細胞の同定分析と対照されるが、ここでは染色されたものは全くみつかっていない。軟骨細胞マーカータンパク質、コラーゲンVIを検出する抗体試薬による免疫組織化学的な結果を図４に示す。脂肪組織由来の間質細胞は、1.2％のカルシウムアルギナートのなかで維持され、またトランスフォーミング成長因子β（10ng/ml）の存在下または非存在下で、10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEMのなかで維持される。その後２週間、5％のCO2中で37℃にてインキュベーションされる。免疫組織化学法により、トランスフォーミング成長因子βの存在下では維持されているこれらの細胞を取り囲むコラーゲンVIタンパク質が濃縮されて析出しているが、トランスフォーミング成長因子βの非存在下ではそのような現象がないことが明らかになった。
【００４１】
軟骨形成に関連する代表的な遺伝子マーカーを検出するポリメラーゼ連鎖反応の結果を、図5に図示する。脂肪組織由来の間質細胞は、1.2％のカルシウムアルギナート（Alg）で、または単層（単一）培養で維持され、また、4週間の間、トランスフォーミング成長因子β（10 ng/ml）に関してTGFβマイナスの非存在下、またはTGFβプラスの存在下で10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEM中で維持される。全てのRNAは個々の培養株から分離され、I型またはVI型コラーゲン、プロテオグリカンリンクタンパク質、アグレカン、またはアクチンに対して特異的なプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応において使用された。コラーゲンマーカーとアクチンはすべての増殖条件下で検出された。しかし、リンクmRNAは、アルギナート懸濁液条件下でもっとも豊富であり、またアグレカンはTGFβの存在下のアルギナート条件下でのみ存在した。
【００４２】
これらの結果から、in vitro細胞凝縮を作成する組み合わせにより、また適当な許容因子を加えることにより、われわれは皮下脂肪組織由来の細胞における軟骨形成と合致する軟骨細胞マーカーの発現を産生することができることが示されている。
【００４３】
［実施例2：合成軟骨パッチの作成］
増殖後、軟骨形成潜在能力をまだ有している軟骨形成細胞は、軟骨特異的な細胞外マトリックス成分の分泌を刺激するため、固定に依存しない様式（anchorage-independent manner）で、すなわち、細胞接触表面、細胞接着表面を有するウェルのなかで培養されることが考えられる。
【００４４】
これまでは、固定依存様式（anchorage-dependent manner）で増殖的に拡張された軟骨形成細胞は通常、軟骨特異的II型コラーゲンと硫酸化プロテオグリカンを分泌するそれらの能力を脱分化し、また喪失する。（Mayne ら(1984) Exp. Cell. Res. 151(1):171-82; Mayne ら(1976) PNAS 73(5):1674-8; Okayama ら(1976) PNAS 73(9):3224-8; Pacificiら (1981)J. Biol. Chem. 256(2):1029-37; Pacificiら (1980) Cancer Res. 40 (7): 2461-4; Pacificiら (1977) Cell 4:891-9; von der Markら (1977) Nature 267 (5611):531-2; Westら (1979) Cell 17(3):491-501; Oegama ら(1981) J. Biol. Chem. 256(2):1015-22; Benyaら (1982) Cell 30(1):215-24）。
【００４５】
細胞接触表面への細胞の接着を阻止する細胞接触表面を有するウェルに接種し、またそのなかで培養された場合には、未分化軟骨形成細胞はその細胞が再分化し、軟骨特異的コラーゲンと硫酸化プロテオグリカンを分泌することを開始し、それにより、in vitroにおける合成軟骨のパッチを形成することがみつかっている（米国特許第5,902,741号と第5,723,331号）。
【００４６】
さらに、事前形成したウェル中で細胞を培養することにより、所定の厚さと容量を有する合成軟骨パッチを製造することができることが判明している。しかし、結果的に生じる軟骨のパッチの容量はウェルの容量だけではなく、そのウェルに接種された軟骨形成細胞の数にも依存することが分かっている。最適所定容量の軟骨は、前述のいずれか、または両方のパラメータを変更することにより、ルーチンの実験を行うことによって作成することができる。
【００４７】
［Ａ．事前形成ウェルの作成］
細胞接触表面、細胞接着表面に事前形成ウェルを作成するいくつかのアプローチが使用可能である。
【００４８】
ウェルの細胞接触表面は、細胞接触表面への軟骨形成細胞の接着を阻止する分子で被膜される。好適な被膜試薬には、シリコンをベースにした試薬、ジクロロジメチルシランまたはポリテトラフルオロエチレンを主成分とした試薬、例えば、Teflon.RTMが含まれる。シリコンを主成分とした試薬、とくにジクロロジメチルシランによる被膜材料に関する手順は当業者には周知である。これについては、例えば、Sambrookら『分子クローニング：ラボマニュアル（“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”）』、Cold Spring Harbor Laboratory Press社刊、1989年を参照のこと。これは本出願に引用することにより本発明の一部をなすものとする。 ウェルの表面に細胞が付着するのを防ぐほかの生体適合性を有する試薬であれば、本発明の実施において有用であると考えられる。
【００４９】
代替的には、ウェルは細胞それ自体の付着は許容しない柔軟で型作成可能な生体適合性を有する材料から型をとることが可能である。こうした細胞の付着を防ぐ好適な材料には、アガロース、ガラス、未処理細胞培養プラスチックとポリテトラフルオロエチレン、すなわち、Teflon.RTMが含まれるがそれらに限定されない。未処理細胞培養プラスチック、すなわち静電気電荷を有する材料により処理されていない、またはそうした材料で作られていないプラスチックは市販されていて入手可能であり、例えば、Falcon Labware社、Becton Dickinson社、Lincoln Park社（ニュージャージー州）から購買可能である。しかし、前述の材料に限定することは意図していない。軟骨形成細胞の付着を本質的に阻止する生体適合性を有する柔軟または型を作成することが可能な、いずれかのほかの材料は本発明の実施に有用であると考えられる。
【００５０】
ウェルの大きさと形状は、修復される関節軟骨欠損の大きさと形状により決めることができる。例えば、ウェルは25 cm2の断面の表面積を有することが企図されている。これは、成人、ヒト大腿軟骨の平均的な断面の表面積である。したがって、合成軟骨の単一断片は、大腿軟骨全体を再び表面加工するために、本発明により作成することが予期される。ウェルの深さは好適には約0.3 cmよりも深く、また好適には深さ約0.6 cmである。成人関節にある天然の関節軟骨の厚さは通常約0.3 cmである。したがって、ウェルの深さは、約0.3 cmの軟骨パッチが形成可能となるのに十分な寸法とすべきである。しかし、ウェルはその軟骨パッチを覆う増殖培地を包み込むのに十分な深さのものとすべきである。
【００５１】
本発明により作成される軟骨の大きな断片は、損傷を受けた軟骨の外科的修復を行う外科医により事前に選択された大きさと形状に「トリミング（採寸して切断する）」することが企図されている。トリミングは、当業者には周知の手順を使用して、鋭利な切断用具、すなわち、小刀、ハサミ、または断端に適する関節鏡装置を使用することにより行われる。
【００５２】
事前形成ウェルは好適には、無菌状態下でアガロースゲルの塊になかで型取りされる。アガロースは、事前形成ウェルを素早くかつ容易に型取りするのに使用することができる経済的で、生体適合性があり、柔軟かつ型を作成することが可能な材料である。上述されているように、ウェルの寸法は、所望され、結果的に決まった軟骨栓の大きさによる。
【００５３】
自然形成ウェルは、溶解したLTアガロース（BioRad社、カリフォルニア州リッチモンド市）の高温溶液を、シリンダーを含む組織培養株に注ぎ込むことにより、作成することが考えられる。シリンダーは形成されるウェルの形状を映す寸法を有する。ウェルの大きさと形状は熟練した技術者により選択され、修復される関節軟骨欠損の形状による。一旦アガロースがシリンダーのまわりで冷やされ、固形化されると、そのシリンダーが鉗子により注意深く外される。シリンダーの除去により露呈される組織培養皿の表面は溶解アガロースにより覆われる。これによりウェルの底を密封し、またウェルの基底部にある細胞接着表面を提供する。新たに加えられた溶解したLTアガロースが冷却されて、固形化されると、その結果生じる事前形成ウェルは培養ならびに増殖された軟骨形成細胞の再分化を刺激するのに適当なものとなる。しかし、代替的な方法が、本発明の実施においては有用である事前形成ウェルを作成するのに使用できることが分かっている。
【００５４】
［Ｂ．軟骨パッチの増殖］
懸濁液中の増殖軟骨形成細胞は事前形成ウェルに接種され、またそのなかで培養される。細胞は細胞培養培地を加えることによって希釈され、約1ｘ105〜1ｘ109軟骨形成細胞/mlの細胞密度にされる。1つの好適な細胞培養培地は、10％のウシ胎児血清により補給されるDMEMを含む。
【００５５】
ウェルに軟骨形成細胞を接種してから約4時間以内に、それらの細胞は細胞の凝縮栓を形成するために融合される。約4〜10日後に、細胞は軟骨特異的硫酸化プロテオグリカンとII型コラーゲンを分泌しはじめる。培養期間を延長した後、ウェルのなかで軟骨形成細胞により発現したコラーゲンは主にII型コラーゲンである。しかし、4時間以内に形成された細胞の凝縮栓はウェルから取り除かれ、軟骨欠損に外科的に移植される。未分化軟骨形成細胞が引き続き、生体内で再分化されて、それによって合成軟骨がその関節内で形成されることが期待される。
【００５６】
軟骨細胞分化または刺激因子を、プロテオグリカンまたはコラーゲンあるいはそれらの両方に特異的な関節軟骨の産生を向上させるため、または刺激するために、事前形成ウェル中の軟骨形成細胞に加えることが企図されている（『軟骨細胞の生物学的調節（“Biological Regulation of the Chondrocytes”）』、CRC Press社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 1992のなかのLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）。好適な成長因子には、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成長因子(PDGF)、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFBF）、肝細胞成長因子（HGF）、角化細胞成長因子(KGF)、骨形態形成因子(BMPs)、すなわち、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6と、骨形成タンパク質(OPs)、すなわち、OP-1、OP-2、OP-3が含まれるが、それらに限定されない。TGF-β、IGF、PDGF、EGF、 aFBF、bFBF、HGF、KGF、BMPsの好適な濃度は約1〜100 ng/mlの範囲である。DMPとOpsの好適な濃度は、約1〜約500 ng/mlの範囲である。
【００５７】
しかし、これらの特定の成長因子は限定的なものではない。軟骨特異的プロテオグリカンとコラーゲンの産生を刺激または誘導することができるいずれかのポリペプチド成長因子は本発明の実施において有用である。
【００５８】
さらに、軟骨特異的プロテオグリカンとコラーゲンの産生を向上するかまたは刺激するために、事前形成ウェルのなかの軟骨形成細胞に、アスコルビン酸を加えることが企図されている。アスコルビン酸の好適な濃度は、約1〜約1000 μg/mlの範囲である。
【００５９】
［実施例3：関節軟骨欠損の外科的修復］
哺乳動物における軟骨欠損は関節鏡検査時に、または関節の開放手術時に視覚的に容易に確認可能である。軟骨欠損はまた、コンピュータ補助断層撮影法（CATスキャン）、Ｘ線検査、磁気共鳴画像(MRI)、滑液または血清マーカーの分析により、あるいはほかの当業者には公知の手法により推論的に同定できる。その欠損の治療は、本出願に開示されている諸方法と成分を使用して関節鏡または開放手術手順時に効果を発揮できる。
【００６０】
したがって、一旦欠損が確認されたら、その欠損は以下のステップにより治療できる。すなわち、（1）本出願で開示されている方法により作成された合成関節軟骨の移植片が所定の部位に外科的に移植され、（2）所定の部位に合成関節軟骨を一体化できる。
【００６１】
合成軟骨パッチは最適には、パッチが欠損部に移植される場合には、移植される組織の各端部がその欠損部の各端部に直接接触するような大きさと形状を有する。さらに付け加えると、合成軟骨パッチは、外科手術時に所定の箇所に固定される。これは、生体内で分解可能な縫合、すなわち、(Ethicon、Johnson＆Johnson社)により、またはそのパッチとその欠損部の間の領域に生体接着剤を適用することにより、あるいはそれらの両方により、その欠損部中にパッチを外科的に固定することでその効果を発揮する。好適な生体接着剤には、フランス特許第2,448,900号、フランス特許第2,448,901号、スペイン特許出願第88401961.3号に開示されているものに類似のフィブリン‐トロンビン接着剤、および米国特許第5,197,973号に開示されているものに類似の合成生体接着剤が含まれるが、それらに限定されない。しかし、縫合の代替的なタイプと生体適合性のある接着剤は本発明の実施において有用である。
【００６２】
いくつかの例では、損傷を受けた関節軟骨は合成軟骨パッチ移植の前に外科的に切除されることが考えられる。さらに、関節軟骨欠損に対する合成軟骨パッチの接着は、トランスグルタミナーゼによる欠損の治療により促進される（Ichinoseら(1990)J. Biol. Chem. 265(3):134411-13414; 『トランスグルタミナーゼ（“Transglutaminases”）』、Martinuse‐Nijhoff社刊、ボストン、のなかのNajjarら(1984)の執筆部分）。最初に、軟骨欠損部を例えば、綿様のものを使用することにより、またトランスグルタミナーゼの溶液を充填することにより乾燥させる。その溶液はその後に例えば、吸引により除去されるが、軟骨上にトランスグルタミナーゼを含んでいるフィルムをおいて置く。合成軟骨パッチは上述の方法によりその欠損部中にその後に移植される。
【００６３】
さらに、合成軟骨はヒト関節軟骨欠損の修復に有用である。したがって、軟骨形成細胞は、ヒト脂肪組織由来の間質細胞、すなわちヒト皮下脂肪組織から分化されることが考えられる。
【００６４】
関節軟骨欠損の修復に効果を発揮する外科手術は、当業者には周知のものである。これについては、例えば、その内容開示が本出願に参考文献として組み入れられている『軟骨細胞の生物学的調節（“Biological Regulation of the Chondrocytes”）』、CRC Press社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 1992、のLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）を参照のこと。
【００６５】
上記の部分には、ヒト脂肪組織由来の間質細胞が肥厚性軟骨細胞に分化する培養システムを示している。すべての構成要素が規定されるため、そのシステムは、軟骨形成の進行に関して、成長因子などの効果を研究するために使用することができる。In vitroシステムは、これらの細胞集団が骨形成ならびに脂肪細胞の潜在能力を有することを示すために、われわれならびにほかの人々により使用されてきた。われわれはここでこの集団が軟骨形成能力を有していることを示す。これは臨床上の軟骨修復に適用可能である。
【００６６】
本発明はまた、間質細胞が3次元フォーマットにおいて関連性を有しているin vitroでの軟骨誘導性薬剤をこうした細胞に接触させることにより、ヒト脂肪組織由来間質細胞における軟骨形成を誘導するためのプロセスを提供する。
【００６７】
本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物の軟骨組織の修復において脂肪誘導間質細胞からin vitroで分化させた軟骨細胞を使用するためのプロセスを提供する。
【００６８】
上記の方法において、間質細胞は好適に分離され、化学的に規定された環境において増殖ヒト脂肪組織由来の間質細胞を培養し、また、3次元細胞塊、例えば、パッケージ細胞または遠心分離細胞ペレットの形態などで、密に細胞が互いに接近する状態に濃縮される。さらに、その接触は好適には10％の血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、10‐7Mのデキサメタゾンを加えたDMEMを含む化学的に規定された培地のなかで、ヒト脂肪組織由来の間質細胞のペレットを培養することを含む。分化細胞はその後に、軟骨を修復するために外科手術部位に導入される。そのシステムのすべての構成要素は規定されているため、このシステムは、ヒトならびにウマを含む哺乳動物における軟骨修復用製品として、使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、単層培養由来のヒト脂肪間質細胞におけるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは位相差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫蛍光法が使用されている。
【図２】ペレット培養由来のヒト脂肪間質細胞におけるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは位相差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫蛍光法が使用されている。
【図３】アルギナート培養由来のヒト脂肪間質細胞におけるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは位相差顕微鏡法が使用されている。下のパネルでは免疫蛍光法が使用されている。
【図４】図４は、TGF‐βの非存在下（対照実験）、TGF‐βの存在下で2週間アルギナートマトリックス中で細胞が培養されたときのVI型コラーゲン発現を示す。
【図５】図５は、細胞が単層として増殖された場合、またはVI型コラーゲン、リンクタンパク質、アグレカン、I型コラーゲン、アクチンを含む、異なったタンパク質の発現のためのアルギナートにおいて増殖された場合のウエスタンブロットの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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