(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸を有効成分として含む抗炎症用薬剤組成物。
【請求項２】
Ｎ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸を有効成分として含む、サイトカイン産生反応の制御による請求項１記載の抗炎症用薬剤組成物。
【請求項３】
サイトカイン産生反応の制御が、インターロイキン−１０の産生促進である請求項２記載の抗炎症用薬剤組成物。
【請求項４】
サイトカイン産生反応の制御が、腫瘍壊死因子の産生抑制および／またはインターフェロン−γの産生抑制である請求項２記載の抗炎症用薬剤組成物。
【請求項５】
炎症性大腸炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、炎症性皮膚疾患、敗血症後の多臓器不全またはエイズのいずれかの疾患に伴う炎症に対して使用する請求項１〜４のいずれかに記載の抗炎症用薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｎ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸を有効成分とする抗炎症用薬剤組成物に関する。さらに詳しく言えば、本発明は、サイトカイン産生反応の制御、より具体的には炎症惹起性サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）並びにインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を抑制、または、これら炎症惹起性サイトカインの産生を抑制する作用を有するインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を促進するというサイトカイン産生反応の制御を誘因せしめる活性を有する下式、
【０００２】
【化１】
0004294120.tif 000002
【０００３】
で示されるＮ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸を有効成分として含む、炎症性大腸炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、ベーチェット病および全身性エリテマトーデス等の自己免疫性疾患、並びに痒疹・皮疹・狼疹・硬化を伴う炎症性皮膚疾患、敗血症後の多臓器不全等の炎症性疾患、エイズ等の感染性疾患に伴う炎症に有効な抗炎症用薬剤組成物に関する。
【０００４】
【従来の技術】
多岐にわたる疾患の病因あるいは症状の亢進には炎症反応が関与しており、従来炎症性疾患としては分類されていなかった疾患、たとえば動脈硬化やアルツハイマー病なども、最近の分子生物学的研究により、その発症過程において炎症反応が重要な役割を担うことが明らかとなってきている。従来炎症伝達物質として、ヒスタミン、補体成分、血小板活性化因子、ブラジキニン、ロイコトリエン、プロスタグランジンＥ２等のメディエーターが研究されてきたが、近年サイトカインやケモカインなどの蛋白液性因子の炎症反応惹起及び制御における重要性が明らかにされ、次々に新しい液性因子が発見されている。
【０００５】
これら液性因子が病因あるいは治癒に深く関わっている疾患のひとつに炎症性大腸炎（ＩＢＤ）がある。欧米で発症率が高く、本邦でも最近発症頻度が上昇しつつある炎症性大腸炎は、大別して潰瘍性大腸炎とクローン病に分類される。潰瘍性大腸炎は、非特異的炎症が慢性持続的に、あるいは再燃緩解を繰りして大腸に起こる疾患で、免疫異常、特にリンパ球の異常が挙げられている。クローン病は、若年成人に好発する消化管粘膜の異常により発症する肉芽腫性炎症性疾患で、主病変が小腸、大腸あるいはその両方に出現し、外科手術後の再発率が高く、内科的治療が主流とされるが、本症を長期的に寛解させうる決定的な治療法が存在しない難治性疾患である。
現在、これらの疾患治療剤として、スルファピリジン、５−アミノサリチル酸製剤（メサラジン）、サラゾスルファピリジン、副腎皮質ステロイドホルモン等が使用されており、特にサラゾスルファピリジンは、スルファピリジンと５−アミノサリチル酸がアゾ結合した化合物で、大腸内で腸内細菌によりアゾ結合が分解されて生じる５−アミノサリチル酸が両方のＩＢＤに有効性を発揮する。しかしながら副作用として、薬剤過敏症、吐き気、頭痛、男性不妊症が報告されており、５−アミノサリチル酸製剤の場合は、下痢などの副作用が問題となり、長期的に寛解させうる決定的治療薬はまだ無い。
【０００６】
慢性炎症性疾患の代表ともいえる関節リウマチ、変形性関節症の病因は未だ解明されていないが、関節周辺組織で、細菌やウイルス等の感染を発端とする自己免疫反応が持続的に惹起されることが原因とされている。開節リウマチの主たる病変は関節に発症し、発症初期には、滑膜内小血管が増生し、それに伴い、滑膜表面細胞の増殖促進、多層化が起こってパンヌス形成の経過をたどり、好中球、滑膜表面細胞や活性化されたマクロファージからコラゲナーゼが分泌され、組織コラーゲンの破壊を生じ、その結果として骨吸収亢進、軟骨破壊をもたらす。
従来、関節リウマチ、変形性関節症の治療方法として初期段階では、アスピリン、インドメタシン、プロピオン酸系製剤であるイブプロフェン、オキシカム系製剤としてピロキシカムなどの非ステロイド性の抗炎症鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）による治療を施し、十分な効果が得られない場合は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）である金製剤、スルファサラジン、Ｄ−ペニシラミン、メトトレキセート、あるいは、アザチオプリン、ミゾリビンが使用される。特に炎症症状が亢進した状態では、副腎皮質ステロイドホルモンの併用投与を行うことが治療の主流となっている。そして、これら抗リウマチ薬の薬効のメカニズムは、プロスタグランジンＥ２産生抑制、ＮＯや活性酸素、ロイコトリエン産生抑制、シクロオキシゲナーゼ阻害などの直接的抗炎症作用に基づくものであるが、ＮＳＡＩＤｓもＤＭＡＲＤもその投与により胃腸障害、腎障害、肝障害，肺障害の副作用が出現することが多く、従って本疾患の治療では、病態に最も適した薬剤の選択はもとより、副作用の発現を如何に軽減するかが常に問題となる。
【０００７】
関節リウマチや変形性関節症の病変部位では、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカイン産生が亢進していることが明らかにされ、特に関節滑膜では、種々の炎症メディエーターの連鎖的生成により、激しい炎症が引き起こされることが明らかとなっている。また、潰瘍性大腸炎とクローン病の病因としての抗原あるいは活性化物質は、十分には解明されていないが、細菌や化学物質、自己免疫異常などが挙げられ、最近の研究から、病因として、ＣＤ４Ｔリンパ球の異常活性化、ＴＮＦ−αやＩＬ−１などの炎症性サイトカインの過剰産生、あるいはＴＮＦ−α産生抑制性サイトカインである、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の欠損ないしは産生不全によるＴＮＦ−αの過剰産生が、深く関与していることが明らかにされた（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，４１，１７８６，１９９６）。
このように、関節リウマチにおいても、炎症性大腸炎においても、病因として炎症惹起性サイトカイン、特にＴＮＦ−αを代表とする炎症性サイトカインの関与が大きいことから、炎症性疾患の治療剤開発目的の１つとして、病態におけるサイトカイン産生制御活性を目指した薬剤の開発が盛んになってきた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この観点に立ち、すでに欧米では例えば、ＴＮＦ−α抗体や、可溶性ＴＮＦ−α受容体蛋白、あるいはＩＬ−１０のＴＮＦ−α産生制御活性に基づき、ＩＬ−１０の遺伝子組み替え（リコンビナント）蛋白製剤について臨床試験が行われ、それぞれに有効性が示されたが、これらの産生コスト等の大量生産上の問題や非常に短い生体内半減期の間題、およびこれらの蛋白に対する生体の免疫反応の結果としての抗体の生成が指摘され、まだいずれも実用化されるには至っていない。また、サイトカインは極微量で強い生物活性を示すものであり、そのものの投与では制御が難しく、更には、蛋白分子の反復投与は、重篤な副作用を誘発することも考えられる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
我々は、従来用いられている有機合成製剤の副作用の問題、あるいは各国の研究者が開発中の蛋白製剤の問題点を解決するためには、生体投与後、炎症惹起性サイトカインと拮抗あるいは産生抑制性活性を発揮する薬剤の開発が望ましく、リコンビナントＩＬ−１０そのものを投与するよりも、生体内でＩＬ−１０産生を誘導する薬剤の方が、最適投与経路、投与時期、投与量を決定することにより、より効果的かつ適切に炎症疾患部位においてＩＬ−１０の効果を発現せしめ、従来の問題点を解決し得ると考えた。そして、ＩＬ−１０産生誘導活性を有する薬剤の開発を開始し鋭意研究した結果、本発明で述べるＮ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸が、以下に述べる生物学的特性から本目的に優れた薬剤となることを見出し本発明を完成させた。
【００１０】
ＩＬ−１０は免疫担当細胞であるＴリンパ球のＴｈ１とＴｈ２からなる細胞群のうち、Ｔｈ１細胞由来サイトカインであるＩＦＮ−γ、リンホトキシン（ＴＮＦ−β）の産生抑制因子として、おもにＴｈ２細胞から産生されるが、マクロファージやケラチノサイトからも産生されることが知られている。またＩＬ−１０はマクロファージのＴＮＦ−α産生を強力に抑制する生物活性をも有している。また反面、ＩＬ−１０はＴｈ１細胞やマクロファージに対しては抑制的に作用するが、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞、抗体産生細胞、肥満細胞に対しては促進的に作用する。このＩＬ−１０の主たる生物活性は、ＩＬ−１０遺伝子欠損マウスで、自然発生的に炎症性大腸疾患が発症すること［Ｒ．Ｋｕｈｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，７５，２６３（１９９３）］、ヒトの潰瘍性大腸炎やクローン病では血清中のＩＬ−１０が有意に低下していること［石田博，臨床免疫，２７（Ｓｕｐｐｌ．），１６，９７（１９９５）］からも、腸管系における免疫機構の制御作用が主であることがわかる。また、これらの炎症性大腸疾患では、その発症の機序にＴＮＦ−αやＩＬ−１、ＩＦＮ−γが関与していることが多くの研究者らにより報告されている。一方、これらのサイトカインは痛みの原因や穿孔性腹膜炎や、グラム陰性菌による敗血症からの予後不良の原因ともなるが、ＩＬ−１０はマクロファージによるＴＮＦ−αやＩＬ−１産生の抑制作用を有し、またＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γ産生を抑制することが既に確認された事実としてあり、よってＩＬ−１０産生を促進する本薬剤は、これら主としてマクロファージやＴｈ１細胞から産生される炎症惹起性サイトカインに起因する疾患、あるいはこれらのサイトカインにより増悪経過をたどる疾患に効果的に使用できる。
【００１１】
本薬剤のＮ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル」−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸は、古くからフロイント完全アジュバントに含有されることで知られる結核菌やＢＣＧなどの坑酸菌の細胞壁中に存在するアジュバント作用物質であるムラミルジペプチド誘導体を合成する目的でデザインされた化合物であるが、ムラミル基の代わりにフタルイミドエトキシアセチル基が、Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸のジペプチドに結合されている化合物で、米国特許５，５１４，６５４号に一連のＮ−アシルジペプチド誘導体とともに開示された公知の化合物である。米国特許５，５１４，６５４号は、免疫調節活性及び抗腫瘍活性を有するＮ−アシルジペプチド誘導体の作成を目的としたものであり、その化合物の免疫調節的特性として、アジュバント作用、すなわち免疫調節作用として本薬剤とは異なるＮ−（７−オキソオクタノイル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンによるマイトージェンによるリンパ球の活性化増強、マクロファージ活性化促進、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増大阻止という免疫反応促進活性を記載している。しかし、本薬剤のＩＬ−１０産生誘導活性、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＮＦ−γ産生抑制活性等の生物活性の特性発見と、その活性に基づく抗炎症作用については前期文献の存在にかかわらず新規である。
【００１２】
本発明の有効成分であるＮ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル」−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸は、下式、
【００１３】
【化１】
0004294120.tif 000003
【００１４】
で示される化合物であり、例えば次の方法により容易に製造することができる。すなわち、Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸ジベンジルエステルの塩酸塩と２−（２−フタルイミドエトキシ）酢酸をジメチルホルムアミドのような非プロトン性溶媒に溶解し、０℃に冷却し、ジフェニルホスホリルアジドとトリエチルアミンを添加することによって縮合させ、得られたＮ−［２−（２−フタルイミドエトキシ）アセチル］−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン酸ジベンジルエステルを氷酢酸中水素充填下、パラジウム／炭素により接触還元して収率よく得ることができる。
【００１５】
【発明の効果】
次に、本発明者らの研究結果より、本薬剤が病態モデル動物に投与されると、免疫増強作用を生じるメカニズムとは異なり、ＩＬ−１０産生を誘導し、ひいてはＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの産生抑制効果を生じること、また毒性及び変異原性が無いことが明らかとなった。
【００１６】
本事実に基づき、本発明では異なる疾患モデル動物に本薬剤を投与し、病態発症予防、改善、病態進行の阻止あるいは遅延に対する効果を観察するのみならず、薬効発現のメカニズムの解析も行い、本薬剤の製剤が抗炎症剤として有効であり、炎症性大腸炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、ベーチェット病および全身性エリテマトーデス等の自己免疫性疾患、並びに痒疹・皮疹・狼疹・硬化を伴う炎症性皮膚疾患、敗血症後の多臓器不全等の炎症性疾患、エイズ等の感染性疾患に伴う病態の治療剤として応用することの妥当性が示された。例えば、化学療法剤治療下のマウスに、本薬剤を皮下投与すると、ＩＬ−１０産生能の増強及びＩＦＮ−γ産生能の抑制が誘導され、ＩＬ−１０産生能力を有する細胞集団の増殖を促進することを示していると言える。潰瘍性大腸炎モデル動物では、顕著なＩＬ−１０産生能の低下が起こることが示され、本薬剤の皮下あるいは直腸内投与は、症状増悪の遅延あるいは症状の緩和を明らかにもたらし、また関節リウマチモデル動物に投与した場合には、発症遅延及び四肢関節の炎症症状の緩和が観察された。これらの実験結果は、本薬剤が大腸炎症病態におけるＩＬ−１０産生能低下を是正することにより、ＴＮＦ−α産生を抑制するというメカニズムで、病態の進行を遅延させることを示すものである。また本薬剤の安全性は、亜急性毒性試験並びに変異原性試験により確認された。従って本薬剤は、錠剤（大腸溶解性製剤を含む）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与、あるいは注射剤や坐剤及び注腸剤による非経口投与の医薬用製剤として用いることができ、適当な医薬用の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味矯臭剤等を用いて、通常の如何なる方法によっても製剤化可能である。処方に当たっては、本薬剤単独または薬学的に許容できる範囲内で塩の形、あるいは他の医薬品製剤との配合製剤としてもよい。その使用量は症状、年齢等により異なるが、注射剤の場合は１日１００μｇ〜１００ｍｇ、その他の投与形態の場合は１日１０〜１０００ｍｇを、好ましくは通常成人に対して、２０〜１００ｍｇを１日１回または数回に分けて投与することができる。
以下実施例を示して本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００１７】
【実施例１】
本薬剤皮下投与によるＩＬ−１０産生誘導並びにＩＦＮ−Ｔ産生抑制
８〜１２週令の（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに，サイクロフォスファマイド（２００ｍｇ／ｋｇ）を２日間腹腔内投与し、その後３日目から、生理食塩液に溶解した本薬剤１μｇ、５μｇあるいはマンニトールとともに溶解した５０μｇを１日１回４日間皮下注射により投与した。非治療対照群マウスには生理食塩液のみを、あるいはマンニトール溶液のみを皮下注射した。最終投与日の翌日各マウスより脾臓を採取し、それを二分し、片方からは全ＲＮＡを抽出、他方は単細胞にしてコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）あるいはエンドトキシン（ＬＰＳ）とともに２４〜４８時間５％炭酸ガス培養器中で培養し、培養上清中のサイトカイン濃度を酵素免疫反応法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。抽出したＲＮＡは、逆転写反応ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法試験に供した。
種々のサイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを比較するために、ＲＴ−ＰＣＲの場合は寒天ゲル電気泳動後のバンドを、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔの場合は、ナイロン膜に転写され、プローブで検出されたバンドの濃さを、自動デンシトメーターにより測定した。ＲＴ−ＰＣＲ試験結果を図１（生理食塩液、本薬剤１μｇ、５μｇ）および図２（マンニトール液、本薬剤５０μｇ）に示すように、本薬剤を各用量投与されたマウスの脾臓の全ＲＮＡ中には、対照群に比較してＩＬ−１０のｍＲＮＡがより高く発現していることが明らかとなった。一方、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡのレベルは、本薬剤投与群の方が対照群より低く、特に５０μｇ投与群でその低下はより顕著であった。形質転換性成長因子（ＴＧＦ−β）のｍＲＮＡレベルも、本薬剤投与群でやや低下傾向を示した。本薬剤によるＩＬ−１０のｍＲＮＡ産生促進効果をさらに確認するために、これらのＲＮＡサンプルについて、ＩＬ−１０プローブを用いたＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行い、その結果を図３に示す。本薬剤５及び５０μｇ投与群では、それぞれの対照群に比較し、明らかにより高いＩＬ−１０のｍＲＮＡの産生誘導が生じたことが確認された。
【００１８】
【図１】
【００１９】
【図２】
【００２０】
【図３】
【００２１】
次に本薬剤投与が、ＩＬ−１０蛋白の産生促進にも効果を有することを示すために、２４時間および４８時間Ｃｏｎ  Ａで刺激された脾臓胞の培養上清中に分泌されたＩＬ−１０蛋白量をＥＬＩＳＡにより測定した。図４（２４時間）と図５（４８時間）にその結果を示す。本薬剤１μｇ投与はＩＬ−１０産生促進効果を全く生じなかったが、５μｇおよび５０μｇ投与は対照群に比較し、脾細胞におけるＩＬ−１０蛋白産生を強く誘導することが明らかとなった。これらの結果は、本薬剤がＩＬ−１０産生能力を有する細胞集団の増殖を促進することを示している。
【００２２】
【図４】
【００２３】
【図５】
【００２４】
【実施例２】
潰瘍性大腸炎疾患モデル動物における、本薬剤によるＩＬ−１０産生増強及びその治療効果
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の３〜５％水溶液をマウスやラットに連続摂取させると、急性の大腸炎症および糜爛・潰瘍が発症することが知られている（Ｏｋａｙａｓｕ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８，６９４，１９９０）。
８〜１２週令、体重１９．５〜２１．５ｇｇ）Ｂａｌｂ／ｃ  ＣｒＳＬｃ雌マウスに、５％ＤＳＳ（分子量５，０００）水溶液を飲水として与えると共に、生理食塩液に溶解した本薬剤５μｇを、２ないし３日毎に２週間皮下注射した。体重測定と便潜血により病状の進行を観察した。２週間後に脾臓を採取し、単細胞にしてＣｏｎ  ＡあるいはＬＰＳとともに２４〜４８時間５％炭酸ガス培養器中で培養し、培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。８日目までに、本薬剤投与を受けなかった対照群のマウスすべてに、体重減少と、スコア２以上の便潜血が認められ、平均便潜血スコアは３．５であった。１４日目には１０匹中９匹が最高の便潜血スコア４を、残り１匹はスコア３を示す重篤な症状を呈した（図６）。スコア２以上の便潜血を示したマウスの割合も、７日目で９０％、１１日目では１００％であった（図７）。それに対して、本薬剤投与マウスでは対照群に比較し症状の進行が遅延され、平均便潜血スコア及びスコア２以上の便潜血マウス出現割合、最高便潜血スコアを示すマウス数ともに、対照群に比し明らかに低かった。
【００２５】
【図６】
【００２６】
【図７】
【００２７】
ＤＳＳの摂取による大腸炎の発症は、脾細胞よりのＩＬ−１０産生を顕著に低下させることが明らかとなった。ＤＳＳを７日間、１０日間、あるいは１４日間摂取したマウスより脾臓を摘出し、単細胞懸濁液を調製し、Ｃｏｎ  ＡあるいはＬＰＳ刺激下に培養した。図８に示すように、ＤＳＳ摂取マウスの脾細胞培養上清中のＩＬ−１０サイトカイン濃度は、非摂取マウスのそれと比較し著しく低かった。ＩＬ−６の濃度は、ＤＳＳ摂取マウスの脾細胞培養上清中の方が、ＣｏｎＡ刺激では有意に低く、ＬＰＳ刺激では非摂取マウス群とほぼ同一レベルであった。このＤＳＳ摂取によるＩＬ−１０産生能の低下は本薬剤投与により是正されることが、次に述べる実験で明らかとなった。すなわち、図９に示す実験結果からも明らかなように、ＤＳＳ摂取生理食塩液投与マウス群の脾細胞のＩＬ−１０産生能が著しく低下しているのに比し、ＤＳＳ摂取本薬剤投与マウス群の脾細胞のＩＬ−１０産生能は、正常マウス群の産生能レベルに回復していた。また、これらのマウスより採取した腹腔マクロファージをＬＰＳ存在下に２時間培養し、その培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定したところ、本薬剤投与群マウス由来の培養上清中のＴＮＦ−αは、ＤＳＳ摂取生理食塩液投与群のそれに比較し有意に低かった（図１０）。
【００２８】
【図８】
【００２９】
【図９】
【００３０】
【図１０】
【００３１】
【実施例３】
クローン病モデル動物における本薬剤の治療効果
アルコールに溶解したトリニトロベンゼンスルフォン酸（ＴＮＢＳ）をラット直腸内に注入すると、１０日以内に大腸に肉芽腫性炎症が惹起され、クローン病の動物モデルとして汎用されている（ｎｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９６，７９５，１９８９）。本発明者らは、このクローン病モデル動物において、本薬剤が有効であるか否かを検討するため、Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＴＮＢＳ  ３０ｍｇを腸注し、翌日より１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に懸濁した本薬剤を、２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で８日間直腸内投与した。９日目に大腸を肛門より１０ｃｍの部位まで採取し、腸内内容物を洗浄除去後、その湿重量測定、大腸肥大、潰瘍形成の有無、そのサイズ、病理所見などを観察した。図１１（大腸重量）、図１２（Ｍｏｒｒｉｓスコア）、図１３（腸管内壁の変化−黒変部位の長さ、腸管展開時の最大幅）に示すように、ＴＮＢＳによる腸内感作は、正常群ラット腸に比較して、典型的な潰瘍性炎症症状を誘発し、腸重量の顕著な増加、腸粘膜肥厚を伴う潰瘍を惹起した。本薬剤のＴＮＢＳ腸炎惹起ラットへの直腸内投与は、腸重量増加抑制、腸管肥大抑制、潰瘍形成及び壊死の抑制など、観察所見の全てで大腸肉芽腫性炎症を抑制する効果を示した。
【００３２】
【図１１】
【００３３】
【図１２】
【００３４】
【図１３】
【００３５】
【実施例４】
関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症における本薬剤の有効性
関節リウマチの病態モデル作成法の１つとして、特定の遺伝的背景を有する純系マウスを、フロイント完全アジュバントに懸濁したタイプＩＩコラーゲンで感作する方法が用いられている（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．，Ｍｅｄ．，１５４，６８８，１９８１）。本発明者らも、この病態モデルを用いた。
すなわち、８週令のＤＢＡ／１雄マウスの尾根部位に、フロイント完全アジュバントに懸濁したタイプＩＩウシコラーゲン１５０μｇを皮内投与し、３週間後に再感作すると、再感作後、５〜６日目より四肢の一部で関節の発赤・腫脹が現れ、徐々に四肢の関節へと広がり、３〜４週目頃より指関節の変形が発症してきた。各病変をスコア化し、１匹のマウスにおけるスコアの集計で、そのマウスの病状を記録した。第１回目の実験では、生理食塩液に溶解した５μｇの本薬剤を、初期感作の翌日より２〜３日毎に、全観察期間皮下投与した。図１４に示すように、本薬剤を投与したマウス群の平均発症スコアは、常に対照マウス群の平均スコアを下回り、また体重は対照群よりも高い増加率を示した（図１５）。第２回目の実験では、０．２ｍｇ、５ｍｇ／ｋｇの２用量を毎日皮下投与した。陽性対照既知医薬品として、４−アセチルアミノフェニール酢酸（アクタリット）３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。図１６及び図１７に示されるように、本薬剤５ｍｇ／ｋｇを投与されたマウス群は、対照群に比較して個体別関節炎スコア及び全マウス四肢における、のべ四肢関節炎発症率共に低く、発症の遅延及び症状の軽減化作用が観察された。アクタリットの経口投与は、初期段階の発症の遅延と関節炎スコアを減少させたが、その作用は本薬剤５ｍｇ／ｋｇ皮下投与の作用よりも弱く、中期及び後期では対照群に比較して症状を軽減化させる作用は示さなかった。これらの結果は、本薬剤が関節リウマチの治療薬としてアクタリットよりも高い有効性を発揮し得る可能性を示すものである。
【００３６】
【図１４】
【００３７】
【図１５】
【００３８】
【図１６】
【００３９】
【図１７】
【００４０】
【実施例５】
本薬剤の安全性
本薬剤の安全性を、亜急性毒性試験と変異原性試験を行って確認した。亜急性毒性試験は、本薬剤をオイル（ａｒａｃｈｉｓ  ｏｉｌ）に懸濁し、２．５，２５および２５０ｍｇ／ｋｇ／日の３用量を９１日間雄ラット（Ｈａｎ．−Ｗｉｓｔａｒ）に腹腔内投与して行い、体重測定、摂餌量、血液学的検査、血液生化学的検査、尿検査を行った。屠殺後、解剖学的および病理学的検査も行い、その結果を表１に示す。いずれの用量でも、ラットの死亡例は無く、これらのラットの臓器の病理学的検査の結果より、無毒性用量は２．５ｍｇ／ｋｇ／日より２５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲と決定した。また第二回目の亜急性毒性試験を、２５ｍｇ／ｋｇ／日の９０日間投与、それに続く４５日間観察期間を置いて実施した。この試験においてもラットの死亡例は無く、血液検査および血液生化学的検査において、投与による本質的変化は認められなかった。また個々のラットの剖検、および各臓器切片の病理組織学的検査においても、対照群のラットの各試験結果と比較して、投与と関連する臓器変化は観察されなかった。
【００４１】
【表１】
0004294120.tif 000004
【００４２】
また変異原性試験は、本薬剤をジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）に試験直前に溶解し、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ９８、ＴＡ９７Ａ、ＴＡ１００、およびＴＡ１９３５とサッカロマイセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｄ７に対して、１プレート当たり５〜５０００μｇの濃度で菌代謝活性下状態及び不活性下状態で作用させ、生じたリバータントのコロニー数を検出することにより試験した。変異原性陽性対照薬物としてサルモネラ・ティフィムリウムを被験菌とした場合は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を、サッカロマイセス・セレビジア  Ｄ７に対しては、Ｎ−メチルニトロソウレア（ＨＮＵ）およびシクロフォスファマイドを用いた。いずれの菌種に対しても変異原性は認められなかった（表２）。
【００４３】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における本薬剤投与時のＲＴ−ＰＣＲ試験によるサイトカインｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
【図２】実施例１における本薬剤投与時のＲＴ−ＰＣＲ試験によるサイトカインｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
【図３】実施例１におけるＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ試験によるＩＬ−１０  ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
【図４】実施例１における脾細胞２４時間培養上清中のＩＬ−１０濃度を示すグラフである。
【図５】実施例１における脾細胞４８時間培養上清中のＩＬ−１０濃度を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるＤＳＳ誘発大腸炎マウスの平均便潜血スコアを示すグラフである。
【図７】実施例２におけるＤＳＳ誘発大腸炎マウスの便潜血スコア２以上のマウスの割合を示すグラフである。
【図８】実施例２における無処置及びＤＳＳ摂取マウス脾細胞培養上清中のサイトカイン濃度を示すグラフである。
【図９】実施例２における無処置、ＤＳＳ摂取生理食塩液投与及びＤＳＳ摂取本薬剤投与マウス脾細胞培養上清中のＩＬ−１０濃度を示すグラフである。
【図１０】実施例２における無処置、ＤＳＳ摂取生理食塩液投与及びＤＳＳ摂取本薬剤投与マウス腹腔マクロファージ培養上清中のＴＮＦ−α濃度を示すグラフである。
【図１１】実施例３におけるＴＮＢＳ誘発大腸炎ラットの大腸重量を示すグラフである。
【図１２】実施例３におけるＴＮＢＳ誘発大腸炎ラットの大腸Ｍｏｒｒｉｓスコアを示すグラフである。
【図１３】実施例３におけるＴＮＢＳ誘発大腸炎ラットの大腸黒変壊死部分の長さと、病変腸管最大幅を示すグラフである。
【図１４】実施例４における第１回関節炎実験の個体別平均関節炎スコアを示すグラフである。
【図１５】実施例４における第１回関節炎実験の平均体重の推移を示すグラフである。
【図１６】実施例４における第２回関節炎実験の個体別平均関節炎スコアを示すグラフである。
【図１７】実施例４における第２回関節炎実験の、のべ四肢関節炎発症率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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