(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親α−アミラーゼの変異体であって、当該親アミラーゼが、
（ｉ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列のα−アミラーゼ；及び
（ii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列のα−アミラーゼ；
から選択され、
そして、前記変異体が、配列番号：３におけるI181の欠失及びG182の欠失のみを有する変異体と少なくとも同程度のα−アミラーゼ活性を有し、且つ低pH条件下又は低カルシウム環境下でより高い安定性を有し、そして前記変異が、配列番号：３における又は前記（ii）に定義される他の親α−アミラーゼでの対応する位置における、I181の欠失、G182の欠失及びN193Fの置換、から成ることを特徴とする変異体。
【請求項２】
配列番号３における又は他の親α−アミラーゼでの対応する位置における位置E214Q の置換をさらに含んで成る請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体。
【請求項４】
請求項３に記載のDNA 構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNA 構造体又は請求項４に記載のベクターにより形質転換された細胞。
【請求項６】
微生物である請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
細菌又は菌類である請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus ）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus ）又はバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis)から選択されるグラム陽性細菌である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体を、無粉塵性粒質物、安定化された溶液または保護された酵素の形で含んで成る洗剤添加剤。
【請求項１０】
前記添加剤１ｇ当たり0.02〜200mg の酵素を含む請求項９に記載の洗剤添加剤。
【請求項１１】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素及びセルラーゼから選択される他の酵素をさらに含んで成る請求項９又は10に記載の洗剤添加剤。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
【請求項１３】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素及びセルラーゼから選択される他の酵素をさらに含んで成る請求項12に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動又は自動皿洗い機用洗剤組成物。
【請求項１５】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素及びセルラーゼから選択される他の酵素をさらに含んで成る請求項14に記載の皿洗い機用洗剤組成物。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動又は自動洗濯用組成物。
【請求項１７】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素及びセルラーゼから選択される他の酵素をさらに含んで成る請求項16に記載の洗濯用組成物。
【請求項１８】
洗濯又は皿洗いのための請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
【請求項１９】
織物デサイジングのための請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
【請求項２０】
澱粉液化のための請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、中でも、親テルマミル様α−アミラーゼの新規変異体（突然変異）、特に、産業用澱粉処理（たとえば、澱粉液化又は糖化）への前記変異体の適用に関して好都合である、酸性pHおよび/ 又は低Ca2+濃度て高められた熱安定性（親に比較して）を示す変異体に関する。
【０００２】
発明の背景：
α−アミラーゼ（α−1,4 −グルカン−4 −グルカノヒドラーゼ、EC3,2,1,1 ）は、澱粉、及び他の線状及び枝だ分かれ鎖の1,4 −グルコシド  オリゴ−及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
この産業的に非常に重要な種類の酵素に関して特許及び化学文献に非常に広範囲な主要部として存在する。多くのα−アミラーゼ、たとえばテルマミル−様α―アミラーゼ変異体は、たとえばWO90/11352、WO95/10603、WO95/26397、WO96/23873及びWO96/23874から知られている。
【０００３】
α−アミラーゼに関するつい最近の開示の中で、WO96/23874は、B.アミロリクエファシエンスα−アミラーゼの300 個のN −末端アミノ酸残基、及び前記アミノ酸を含んで成るB.リケニホルミスα−アミラーゼのC −末端のアミノ酸301 〜483 （後者は、商標Termamyl（商標）として市販されている）から成り、そして従って、産業的に重要なバチルスα−アミラーゼ（本明細書においては、用語“テルマミル−様α―アミラーゼの意味内に包含され、そして中でも、B,リケニホルミス、B.アミロリクエファシエンス及びB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼを包含する）に密接に関連する、テルマミル−様α−アミラーゼについての立体的X −線結晶構造を提供する。WO96/23874はさらに、親に比較して、変更された性質を示す親テルマミル−様αアミラーゼの変異体を、その親テルマミル−様α―アミラーゼの構造の分析に基づいて企画するための方法論を記載する。
【０００４】
WO95/35382（Gist Brocades B.V.）は、酵素の性能の損失を伴わないで、適用下でCa2+濃度の低下を可能にする改良された性質を有する、B.リケニホルミス由来のデンプン分解酵素を言及する。そのデンプン分解酵素は、B.リケニホルミスα−アミラーゼ配列の104, 128, 187, 188の群から選択された位置での１又は複数のアミの酸変更を含んで成る。
WO96/23873（Novo Nordisk）は、そこにおいて配列番号１として示される配列の領域R181* , G182* , T183* 及びG184* における対様式欠失により得られる高められた熱安定性を有するテルマミル−様α−アミラーゼ変異体を開示する。
【０００５】
発明の簡単な開示：
本発明は、テルマミル（Termamyl）−様α−アミラーゼの新規α−デンプン分解性変異体（突然変異体）、特に、澱粉の産業的処理（澱粉液化、糖化及び同様のもの）に関して好都合である高められた熱安定性（親に比較して）を示す変異体に関する。
【０００６】
本発明者は驚くべきことには、2, 3, 4, 5又は6 種の突然変異（下記に記載されるであろう）を組合せる場合、テルマミル−様α−アミラーゼの熱安定性が、単独の突然変異、たとえばWO96/23873（Novo Nordisk）に開示される突然変異、すなわちそこにおける配列番号１で示される配列の領域R181* , G182* , T183* 及びG184* における対様式欠失に比較して、酸性pH及び/ 又低Ca2+濃度で高められることを見出した。
本発明は、発明の変異体をコードするDNA 構造体、本発明の変異体を含んで成る組成物、本発明の変異体を調製するための方法、及び種々の産業処理、たとえば澱粉液化への本発明の変異体及び組成物の単独での及び他のα−デンプン分解酵素と組合しての使用にも関する。
【０００７】
発明の詳細な開示：
テルマミル−様α−アミラーゼ
バチルスspp.により生成される多くのα−アミラーゼはアミノ酸レベルに基づいて非常に相同であることがよく知られている。たとえば配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.リケニホルミスα−アミラーゼ（Termamyl（商標）として市販されている）は、配列番号５に示されるアミノ酸を含んで成るB.アミロリクエファシエンスと約89％相同であり、そして配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼと約79％相同であることが見出された。
【０００８】
さらに、相同α−アミラーゼは、バチルスsp．NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513又はDSM 9375の株に由来するα−アミラーゼ（それらのすべては、WO95/26397に詳細に記載される）、及びTsukamoto など., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31 により記載されるα−アミラーゼを包含する。
【０００９】
さらに、相同α−アミラーゼは、EP 0252666号に記載されるB.リケニホルミス（ATCC 27811）により生成されるα−アミラーゼ、及びWO91/00353及びWO94/18314に同定されるα−アミラーゼを包含する。他の市販のテルマミル−様B.リケニホルミスα−アミラーゼは、Optitherm （商標）及びTakatherm （商標）(Solvay から入手できる) 、Maxamyl （商標）(Gist-brocades/Genencor から入手できる) 、Spezym AA （商標）及びSpezyme Delta AA（商標）(Genencor から入手できる）、及びkeistase（商標） (Daiwa から入手できる) である。
それらのα−アミラーゼ間に見出される実質的な相同性のために、それらは同じ種類のα−アミラーゼ、すなわち“テルマミル−様α−アミラーゼ”の種類に属すると思われる。
【００１０】
従って、本発明においては、用語“テルマミル−様α−アミラーゼ”とは、アミノ酸レベルで、Termamyl（商標）, すなわち本明細書において配列番号4 で示されるアミノ酸を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼとの実質的な相同性を示す。換言すれば、テルマミル−様α−アミラーゼは、本明細書における配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 又は8 に示されるアミノ酸配列、及びWO95/26397の配列番号1 に示されるアミノ酸配列（本明細書において配列番号7 として示されるアミノ酸配列と同じである）又はWO95/26397の配列番号2 に示されるアミノ酸配列（本明細書において配列番号8 として示されるアミノ酸配列と同じである）、又はTsukamoto など., 1988 に示されるアミノ酸配列（本明細書において配列番号6 として示されるアミノ酸配列を有し、；又は
【００１１】
ｉ）配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 又は8 に示される前記アミノ酸配列の少なくとも1 つの配列と、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも85％、特に好ましくは少なくとも90％、さらに特により好ましくは少なくとも95％の相同性を示し、そして/ 又はii) 前記α−アミラーゼの少なくとも1 つに対して生ぜしめられた抗体と免疫学的交差反応性を示し、そして/ 又は
【００１２】
iii) 本出願の配列番号9, 10, 11, 12又は22（このコード配列は、それぞれ、本出願において、配列番号1, 2, 3, 4及び5 で示されるアミノ酸配列をコードする）から、WO95/26397の配列番号4 （このDNA 配列は、停止コドンTAA と共に、本明細書における配列番号13で示され、そして本明細書において配列番号8 で示されるアミノ酸配列をコードする）から、及びWO95/26397の配列番号5 （本明細書において配列番号14で示される）から、それぞれ明らかである上記特定されたα−アミラーゼをコードするDNA 配列にハイブリダイズするDNA 配列によりコードされるα−アミラーゼである。
【００１３】
性質ｉ）に関しては、“相同性”は、いづれかの従来のアルゴリズムの使用により、好ましくは3.0 のGAP 創造ペラルティ及び0.1 のGAP 延長ペナルティであるGAP ペナルティについてのデフォルト値（default values）を用いてGCG パッケージ  バージョン7.3 （June, 1993）からのGAP プログラムの使用により決定され得る（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）。
【００１４】
テルマミルとテルマミル−様α−アミラーゼとの間の構造的整列は、他のテルマミル−様α−アミラーゼにおける同等/ 対応する位置を同定するために使用され得る。前記構造的整列を得るための1 つの方法は、ギャップ  ペラルティのデフォルト値、すなわち3.0 のギャップ創造ペナルティ及び0.1 のギャップ延長ペナルティを用いて、GCG パッケージからのPile Up プログラムを使用することである。他の構造的整列方法は、疎水性クラスター分析（Gaboriaud など., (1987), FEB5 LETTERS 224, pp. 149-155）及びreverse threading (Huber, T; Torda, AE, Protein Science Vol. 7, No.1, pp. 142-149 (1998)を包含する。
【００１５】
α−アミラーゼの性質ii),すなわち免疫学的交差反応性は、相当するテルマミル−様α−アミラーゼの少なくとも1 つのエピトープに対して生ぜしめられた抗体、又はそのエピトープと反応性の抗体を用いてアッセイされ得る。モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得る抗体は、当業界において知られている方法、たとえばHudsonなど., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsにより記載されるような方法により生成され得る。免疫学的交差反応性は、当業界において知られているアッセイ、たとえばHudsonなど., 1989 により記載されるようなウェスターンブロット又は放射免疫拡散アッセイを用いて決定され得る。この点においては、それぞれ配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 又は8 のアミノ酸を有するα−アミラーゼ間での免疫学的交差反応性が見出された。
【００１６】
上記性質iii)のテルマミル−様α−アミラーゼの特徴化に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは適切には、問題のα−アミラーゼの十分な又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて調製され得る。
ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、5 ×SSC におけるプレソーキング、及び20％ホルムアミド、5 ×Denhardt's溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8 、及び50mgの音波処理された変性ウシ胸腺DNA の溶液における約40℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、続いて、100mM のATP により補充された同じ溶液における約40℃で18時間のハイブリダイゼーション、続いて、2 ×SSC 、0.2 ％のSDS の溶液において40℃（低緊縮性）、好ましくは50℃（中位の緊縮性）、より好ましくは65℃（高緊縮性）、さらにより好ましくは約75℃（非常に高い緊縮性）での30分のフィルターの3 度の洗浄を包含する。ハイブリダイゼーション方法についての一層の詳細は、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989に見出され得る。
【００１７】
本発明において、“〜に由来する”（又は〜由来の）とは、問題の生物の株により生成されるか又は生成できるα−アミラーゼのみならず、またそのような株から単離されたDNA によりコードされ、そして前記DNA 配列により形質転換された宿主生物において生成されるα−アミラーゼもまた示すことを意図される。最後に前記用語は、合成及び／又はcDNA起原のDNA 配列によりコードされ、そして問題のα−アミラーゼの同一特徴を有するα−アミラーゼを示すことを意図される。前記用語はまた、親α−アミラーゼが天然に存在するα−アミラーゼの変異体、すなわち天然に存在するα−アミラーゼの1 又は複数のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であり得ることを示す。
【００１８】
親ハイブリッドα−アミラーゼ
親α−アミラーゼは、ハイブリッドα−アミラーゼ、すなわち少なくとも2 種のα−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含んで成るα−アミラーゼであり得る。
親ハイブリッドα−アミラーゼは、アミノ酸相同性及び/ 又は免疫学的交差反応性及び/ 又はDNA ハイブリダイゼーション（上記で定義されるような）に基づいて、テルマミル−様α−アミラーゼに属することを決定され得るα−アミラーゼであり得る。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは典型的には、テルマミル−様α−アミラーゼの少なくとも1 つの部分、及び微生物（細菌又は菌類）及び/ 又は哺乳類起源のテルマミル−様α−アミラーゼ又は非−テルマミル−様α−アミラーゼから選択された1 又は複数の他のα−アミラーゼの部分から構成される。
【００１９】
従って、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少なくとも2 つのテルマミル−様α−アミラーゼ、もしくは少なくとも1 つのテルマミル−様及び少なくとも1 つの非テルマミル−様細菌α−アミラーゼ、又は少なくとも1 つのテルマミル−様及び少なくとも1 つの菌類α−アミラーゼに由来する一部のアミノ酸配列の組み合わせを含んで成る。部分アミノ酸配列が由来するテルマミル−様α−アミラーゼは、本明細書に言及されるそれらの特定のテルマミル−様α−アミラーゼのいずれかであり得る。
【００２０】
たとえば、親α−アミラーゼは、B.リケニホルミスの株に由来するα−アミラーゼのC −末端部分、及びB.アミロリクエファシエンスの株又はB.ステアロサーモフィラスの株に由来するα−アミラーゼのN −末端部分を含んで成る。たとえば、親α−アミラーゼは、B.リケニホルミスα−アミラーゼのC −末端部分の少なくとも430 個のアミノ酸残基を含んで成り、そしてたとえば、
【００２１】
ａ）配列番号5 に示されるアミノ酸配列を有するB.アミロリクエファシエンスα−アミラーゼの37個のN −末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号4 に示されるアミノ酸を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼの445 個のC −末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント、又はｂ）配列番号3 に示されるアミノ酸配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼの68個のN −末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号4 に示されるアミノ酸配列を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼの415 個のC −末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントを含むことができる。
【００２２】
非テルマミル−様α−アミラーゼはたとえば、菌類α−アミラーゼ、哺乳類又は植物α−アミラーゼ、又は細菌α−アミラーゼであり得る（テルマミル−様α−アミラーゼとは異なる）。そのようなα−アミラーゼの特定の例は、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA  α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger ）酸α−アミラーゼ、バチルス・スブチリスα−アミラーゼ、ブタ膵臓α−アミラーゼ及び大麦α−アミラーゼを包含する。それらのα−アミラーゼのすべては、本明細書において言及されるような典型的なテルマミル−様α−アミラーゼの構造とは著しく異なる、解明された構造を有する。
【００２３】
A.ニガー及びA,オリザエに由来する上記菌類α−アミラーゼは、アミノ酸レベルに基づいて高い相同性であり、そして一般的に、同じファミリーのα−アミラーゼに属すると思われる。アスペルギラス・オリザエに由来する菌類α−アミラーゼは、商標Fungamyl（商標）として市販されている。
【００２４】
さらに、テルマミル−様α−アミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）が特定のテルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の修飾（たとえば欠失又は置換）により、従来の態様において言及される場合、同等の位置において修飾されたもう1 つのテルマミル−様α−アミラーゼの変異体（それぞれのアミノ酸配列間での最良の可能なアミノ酸配列の整列から決定されるような）がそれにより包含さえることが理解されるべきである。
本発明の変異体の好ましい態様は、B.リケニホルミスα−アミラーゼ（親テルマミル−様α−アミラーゼのような）に由来するもの、たとえば上記に言及されたそれらの1 つ、たとえば配列番号4 で示されるアミノ酸配列を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼである。
【００２５】
本発明の変異体構成
興味ある変異体の構成は、変異体を生成の助けとなる条件下で変異体をコードするDNA 配列を含んで成る微生物を培養することによって達成され得る。次に、続いて変異体が得られる培養ブイヨンから回収され得る。これは下記に詳細に記載される。
【００２６】
本発明の変異体の変更された性質
次のことが、本発明の変異体に存在することができる突然変異と、それに起因する性質の所望する変更（それに比較して、親テルマミル−様α−アミラーゼ）との間の関係を議論する。
【００２７】
酸性pH及び/ 又は低Ca2+濃度での高められた熱安定性
酸性pH及び/ 又は低Ca2+濃度での高められた熱安定性を有する本発明の変異体を得ることに関しての特定の適切な突然変異は次の位置での突然変異を包含する（B.リケニホルミスα−アミラーゼに関する、配列番号４）：H156, N172, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211, Q264, N265。
本明細書において、用語“酸性pH”とは、7.0 より低いpH、特に、5.5 〜6.2 の間のpHである産業用澱粉液化工程が通常行われるpH範囲以下を意味する。
【００２８】
本明細書において、用語“低カルシウム濃度”とは、産業用澱粉液化に使用される通常のレベル以下の濃度を意味する。通常の濃度は、トウモロコシにおける遊離Ca2+の濃度に依存して変化する。通常、トウモロコシにおけるレベルと一緒に、40〜60ppm の遊離カルシウムをもたらす、1mM （40ppm ）に対応する用量が、添加される。
本明細書において、用語“高温”とは、95℃〜160 ℃の温度、特に、95℃〜150 ℃の間である産業用澱粉液化工程が通常行われる温度範囲を意味する。
【００２９】
本発明者は、酸性pH及び/ 又は低Ca2+濃度での熱安定性が、上記で言及された突然変異及び/ 又はI201を包含する一定の突然変異をお互い組合すことによってさらに高められ得ることを見出した。
前記“一定の”突然変異は、次の位置で存在する（B.リケニホルミスに関して、配列番号4 ）：N190，D207, E211, Q264及びI201。
前記突然変異はさらに、WO96/23873に記載されるような1 、好ましくは2 又はさらに3 個の位置（すなわち、本明細書における配列番号1 における位置R181, G182, T183, G184）における欠失と組み合わされ得る。本発明によれば、上記位置中の2, 3, 4, 5又は6 個の位置において突然変異を含んで成る、α−アミラーゼ活性を有する親テルマミル−様α−アミラーゼの変異体が企画される。
【００３０】
下記に特異的に言及さえるテルマミル−様α−アミラーゼが企画されるのみならず、また他の商業的なテルマミル−様α−アミラーゼも企画されることが強調されるべきである。そのようなα−アミラーゼの列挙は次のものである：EP 0252666に記載されるB.リケニホルミス株（ATCC 27811）により生成されるα−アミラーゼ、及びWO91/00353及びWO94/18314に同定されるα−アミラーゼ。他の市販のテルマミル−様B.リケニホルミスα−アミラーゼは、Optitherm （商標）及びTakatherm （商標） (Solvayから入手できる) 、Maxamyl （商標） (Gist-Brocades/Genencorから入手できる) 、Spezym AA （商標）Spezyme Delta AA（商標）Spezyme Delta AA（商標） (Genencorから入手できる) 、及びKeistase（商標）(Daiwaから入手できる) である。
【００３１】
配列番号4 におけるそれぞれN190, I201, D207及びE211に対応する位置でのそれぞれのアミノ酸残基が、多数のテルマミル−様α−アミラーゼに保存されるアミノ酸残基を構成することがここに言及されている。従って、たとえばすでに言及された（上記を参照のこと）多くのテルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列におけるそれらの残基のそれらの対応する位置は次の通りである：
【００３２】
【表７】
0004358431.tif 000002
【００３３】
それらの観察されるアミノ酸残基の突然変異は、酸性pH及び/ 又は低カルシウム濃度での熱安定性の改良に関して非常に重要であり、そして次の突然変異がこれに関して特に興味あるものである（配列番号4 に示されるB.リケニホルミスアミノ酸配列の番号づけに関する）。
多くのテルマミル−様α−アミラーゼと整列される場合、配列番号5 におけるR179−G182に対応する位置での対様式アミノ酸欠失は、配列番号4 におけるギャップに対応する。従って、すでに言及されている（上記を参照にこと）多くのテルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列におけるそれらの残基のその対応する位置は次の通りである：
【００３４】
【表８】
0004358431.tif 000003
【００３５】
主鎖として（すなわち、親テルマミル−様α−アミラーゼとして）配列番号1 〜配列番号6 を用いる場合、本発明に従って、2, 3, 4, 5又は6 種の突然変異が、酸性pH及び/ 又は低Ca2+濃度での熱安定性を高めるために（親に比較して）、次の領域/ 位置において行われ得る：
【００３６】
（本明細書における配列番号1 に関して）：
【表９】
0004358431.tif 000004
【００３７】
（本明細書における配列番号2 に関して）：
【表１０】
0004358431.tif 000005
【００３８】
（本明細書における配列番号3 に関して）：
【表１１】
0004358431.tif 000006
【００３９】
（本明細書における配列番号4 に関して）：
【表１２】
0004358431.tif 000007
【００４０】
（本明細書における配列番号5 に関して）：
【表１３】
0004358431.tif 000008
【００４１】
（本明細書における配列番号6 に関して）：
【表１４】
0004358431.tif 000009
【００４２】
3, 4, 5 又は6 種の突然変異を組合すことが、本発明に従って企画される。
配列番号１〜配列番号6 を主鎖として用いての特定の二重突然変異が次に列挙される。
主鎖として配列番号１を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【００４３】
【表１５】
0004358431.tif 000010
【００４４】
【表１６】
0004358431.tif 000011
【００４５】
主鎖として配列番号2 を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【表１７】
0004358431.tif 000012
【００４６】
【表１８】
0004358431.tif 000013
主鎖として配列番号3 を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【００４７】
【表１９】
0004358431.tif 000014
【００４８】
【表２０】
0004358431.tif 000015
主鎖として配列番号4 を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【００４９】
【表２１】
0004358431.tif 000016
主鎖として配列番号5 を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【００５０】
【表２２】
0004358431.tif 000017
【００５１】
【表２３】
0004358431.tif 000018
主鎖として配列番号6 を用いて、所望する効果をもたらす次の二重突然変異が本発明に従って企画される：
【００５２】
【表２４】
0004358431.tif 000019
【００５３】
【表２５】
0004358431.tif 000020
上記に定義されるすべてのテルマミル−様α−アミラーゼは、本発明の変異体を調製するための主鎖として適切に使用され得る。
【００５４】
しかしながら、好ましい態様においては、変異体は、配列番号4 、またはもう1 つの親テルマミル−様α−アミラーゼにおける対応する位置において次の突然変異：N190F/Q264S を含んで成る。
もう1 つの態様においては、本発明の変異体は、配列番号3 （TVB146）、又はもう1 つの親テルマミル−様α−アミラーゼにおける対応する位置において次の突然変異：I181* /G182 * /N193Fを含んで成る。前記変異体はさらに、位置E214Q において置換を包含することができる。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、親テルマミル−様α−アミラーゼは、配列番号4 及び配列番号5 のハイブリッドα−アミラーゼである。特に、親ハイブリッド  テルマミル−様α−アミラーゼは、配列番号4 に示されるB.リケニホルミスα−アミラーゼの445 個のC −末端アミノ酸残基、及び配列番号5 に示されるB.アミロリクエファシエンスに由来するα−アミラーゼの37個のN −末端アミノ酸残基を含んで成るハイブリッドα−アミラーゼであり得、これは適切には、さらに次の突然変異を有することができる：H156Y ＋A181T ＋N190F ＋A209V ＋Q264S （配列番号4 における番号づけを用いての) 。後者の言及されたハイブリッドは、下記例に使用され、そしてLE174 として言及される。
【００５６】
本発明の変異体における一般的な突然変異
本発明の変異体は、上記で概略された修飾の他に、1 又は複数の修飾を含んで成ることが好ましい。従って、修飾されるα−アミラーゼ変異体の一部に存在する1 又は複数のプロリン残基は、可能性ある天然に存在する非プロリン残基のいずれかであり得、そして好ましくは、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン又はロイシンである、非プロリン残基により置換されることが好都合である。
【００５７】
同様に、親α−アミラーゼがそれにより修飾されるアミノ酸残基間に存在する1 又は複数のシステイン残基が、非システイン残基、たとえばセリン、アラニン、トレオニン、グリシン、バリン又はロイシンにより置換されることが好ましい。
さらに、本発明の変異体は、単独での修飾として又は上記で概略された修飾のいずれかと組合して、配列番号4 のアミノ酸フラグメント185 −209 に対応するアミノ酸フラグメントに存在する1 又は複数のAsp 及び/ 又はGlu がそれぞれAsn 及び/ 又はGln により置換されるように修飾され得る。Arg による、配列番号4 のアミノ酸フラグメント185 −209 に対応するアミノ酸フラグメントに存在する1 又は複数のLys 残基の、テルマミル−様α−アミラーゼにおける置換もまた、興味あるものである。
【００５８】
本発明は、上記で概略された修飾の複数の修飾を組み込む変異体を包含することが理解されるであろう。
さらに、本明細書に記載される変異体のいずれかに点突然変異を導入することも好都合である。
【００５９】
α−アミラーゼ変異体の調製方法
遺伝子中に突然変異を導入するためのいくつかの方法は、当業界において知られている。α−アミラーゼをコードするDNA 配列のクローニングの簡単な論議の後、前記α−アミラーゼをコードする配列内の特定部位で突然変異を生成するための方法が論じられるであろう。
【００６０】
α−アミラーゼをコードするDNA 配列のクローニング
親α−アミラーゼをコードするDNA 配列は、当業界においてよく知られている種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生成するいずれかの細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA 及び/ 又はcDNAライブラリーが、研究されるべきα−アミラーゼを生成する生物からの染色体DNA 又はメッセンジャーRNA を用いて構成されるべきである。次に、α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして問題の生物から調製されるゲノムライブラリーからα−アミラーゼをコードするクローンを同定するために使用され得る。他方では、既知のα−アミラーゼ遺伝子に対して相同の配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーション及び低緊縮性の洗浄条件を用いて、α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。
【００６１】
α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのされにもう1 つの方法は、発現ベクター、たとえばプラスミド中にゲノムDNA のフラグメントを挿入し、その得られるゲノムDNA ライブラリーによりα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、その形質転換された細菌を、α−アミラーゼのための、基質を含む寒天上にプレートし、それにより、α−アミロースを発現するクローンの同定を可能にすることを包含する。
【００６２】
他方では、酸素をコードするDNA 配列は、確立された標準的方法、たとえばS.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) により記載されるホスホロアミジット方法、又はMatthes など., (1984) により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミジット方法においては、オリゴヌクレオチドが、たとえば自動DNA 合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切のベクターにおいてクローン化される。
【００６３】
最終的に、DNA 配列は、標準的技法に従って、合成ゲノム又はcDNA起源のフラグメント（適切な場合、完全なDNA 配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することによって調製される、混合されたゲノム及び合成起源のもの、混合された合成及びcDNA起源のもの又は混合されたゲノム及びcDNA起源のものであり得る。DNA 配列はまた、たとえばアメリカ特許第4,683,202 号又はR.K. Saikiなど., (1988) に記載されるように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応（PCR ）により調製され得る。
【００６４】
部位特定の突然変異誘発
α−アミラーゼをコードするDNA 配列が単離され、そして突然変異のための所望する部位が同定されるとすぐに、突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。特定の方法においては、α−アミラーゼをコードする配列を架橋するDNA の一本鎖ギャップが、α−アミラーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて創造される。
【００６５】
次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNA の相同部分にアニーリングされる。次に、残るキャップがDNA ポリメラーゼI(クレノウ  フラグメント) により満たされ、そしてその構造体がT4リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例が、Morinagaなど.,(1984)に記載される。アメリカ特許第4,760,025 号は、カセットの少々の変更を実施することによって、複数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、さらに多くの種類の突然変異がMorinagaの方法によりいずれかの時点で一度に導入され得る。
【００６６】
α−アミラーゼをコードするDNA 配列中に突然変異を導入するためのもう1 つの方法が、Nelson and Long (1989)に記載されている。それは、PCR 反応におけるプライマーの1 つとして化学的に合成されたDNA 鎖を用いることによって導入される所望する突然変異を含むPCR フラグメントの3 −段階生成を包含する。PCR −生成されたフラグメントから、突然変異を担持するDNA フラグメントが、制限エンドヌクレアーゼによる分解により単離され、そして発現プラスミド中に再挿入され得る。
【００６７】
ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異は、問題の示される、又は完全な遺伝子内に示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3 種の部分における局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発として適切に実施される。
親α−アミラーゼをコードするDNA 配列のランダム突然変異誘発は、便利には、当業界において知られているいずれかの方法の使用により実施され得る。
【００６８】
上記に関して、本発明のさらなる観点は、親に比較して、変更された又は高められた熱安定性を示す、親α−アミラーゼの変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）前記親α−アミラーゼをコードするDNA 配列をランダム突然変異誘発にゆだね、
（ｂ）段階（ａ）で得られた突然変異誘発されたDNA 配列を宿主細胞において発現し、そして
（ｃ）親α−アミラーゼに比較して、変更された性質（すなわち、熱安定性）を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーンする；
ことを含んで成る。
【００６９】
本発明の上記の方法の段階（ａ）は好ましくは、ドープされたプライマーを用いて実施される。
たとえば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA 配列をPCR 生成された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により実施され得る。突然変異誘発剤は、たとえばトランジション、トランスバージョン、逆位、スクランブリング、欠失、及び/ 又は挿入を誘発するものであり得る。
【００７０】
本発明のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）光、ヒドロキシルアミン、N −メチル−N'−ニトロ−N −ニトロソグアニジン（MNNG）、O −メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発される親酵素をコードするDNA 配列を、生ぜしめる突然変異誘発のための適切の条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下でインキュベートし、そして所望する性質を有する突然変異誘発されたDNA を選択することによって実施される。
【００７１】
突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により実施される場合、オリゴヌクレオチドは、変更される予定である位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、3 種の非−親ヌクレオチドにより刺激され又はスパイクされ得る。刺激又はスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるように行われ得る。刺激された又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、適切であると思われるようなPCR 、LCR 又はいずれかのDNA ポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれかの公開された技法により、α−アミラーゼ酵素をコードするDNA 中に組み込まれ得る。
【００７２】
好ましくは、ドーピングは、個々の位置における野生型及び突然変異の百分率が予備定義されている“一定のランダムドーピング”を用いて実施される。さらに、ドーピングは、一定のヌクレオチドの導入のための選択、及びそれにより、１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に対して向けられ得る。ドーピングは、たとえば個々の位置における90％の野生型及び10％の突然変異の導入を可能にするために行われ得る。ドーピングスキームの選択における追加の考えは、遺伝子の及びタンパク質構造の抑制に基づかれている。ドーピングスキームは、中でも、停止コドンの導入が回避されることを確保するDOPEプログラムを用いることによって行われ得る。
【００７３】
PCR −生成された突然変異誘発が使用される場合、親α−アミラーゼをコードする、化学的に処理された又は処理されていない遺伝子のいずれかが、ヌクレオチドの誤った導入を高める条件下でPCR にゆだねられる（Deshler 1992; Leung など., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15 ）。
【００７４】
E.コリのミューテーター株（Fowlerなど., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191 ）、S.セレビシアエ又はいずれかの他の微生物が、たとえば親グリコシラーゼを含むプラスミドを用いてミューテーター株を形質転換し、前記プラスミドと共にミューテーター株を増殖せしめ、そしてミューテーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、α−アミラーゼをコードするDNA のランダム突然変異誘発のために使用さえ得る。続いて、突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができる。
【００７５】
突然変異誘発されるべきDNA 配列は便利には、親α−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。他方では、DNA 配列は、突然変異誘発剤と共にそれ自体インキュベートされるが、又は他方では、その剤に暴露され得る適切なベクター、たとえばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在することができる。突然変異誘発されるべきDNA はまた、宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって、又は宿主細胞に含まれるベクター上に存在することによって、その宿主細胞にも存在することができる。最終的に、突然変異誘発されるべきDNA は、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異誘発にゆだねられるべきDNA 配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA 配列であることが理解されるであろう。
【００７６】
多くの場合、発現段階ｂ）又はスクリーニング段階ｃ）を実施する前、突然変異誘発されたDNA 配列を増幅することは便利である。そのような増幅は、当業界において知られている方法に従って実施され得、ここで現在好ましい方法は親酵素のDNA 又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCR −生成される増幅法である。
【００７７】
突然変異誘発剤とのインキュベーション又はその剤への暴露に続いて、突然変異誘発されたDNA は、DNA 配列を担持する適切な宿主細胞を、発現を生ぜしめる条件下で培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞は、任意にベクター上に存在する突然変異誘発されたDNA 配列により形質転換されている細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA 配列を担持する細胞であり得る。
【００７８】
適切な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、たとえばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）; 及びグラム陰性細胞、たとえばE.コリ。
突然変異誘発されたDNA 配列はさらに、突然変異誘発されたDNA 配列の発現を可能にする機能をコードするDNA 配列を含んで成る。
【００７９】
局在化されたランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発は、好都合には、問題の親α−アミラーゼの一部に局在化され得る。これは、たとえば酵素の一定の領域が酵素の所定の性質のために特に重要であることが同定されている場合、及び修飾が改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される場合、好都合であり得る。そのような領域は、親酵素の三次構造が誘発され、そして酵素の機能に関連している場合に通常同定され得る。
【００８０】
局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発は、上記のようなPCR 生成される突然変異誘発技法、又は当業界において知られているいずれか他の適切な技法の使用により便利には実施される。他方では、修飾されるべきDNA 配列の部分をコードするDNA 配列は、たとえば適切なベクター中への挿入により単離され得、そして続いて、前記部分が上記で論じられた突然変異誘発方法のいずれかの使用により突然変異誘発にゆだねられる。
【００８１】
α−アミラーゼ変異体を提供するための他の方法
本発明の変異体を提供するための他の方法は、たとえばWO95/22625（Affymax Technologies N.V. からの）及びWO96/00343（Novo Nordisk A/Sからの）に記載される方法を包含する、当業界において知られている遺伝子シャフリング方法（gene shuffling method ）を包含する。
【００８２】
α−アミラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上記方法、又は当業界において知られているいずれか他の方法により生成される変異体をコードするDNA 配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む。
【００８３】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には、組換えDNA 方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外要素、ミニクロモソーム又は人口染色体であり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【００８４】
ベクターにおいて、DNA 配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に結合されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA 配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同であるタンパク質コードの遺伝子に由来することができる。
【００８５】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列の転写を、特に細菌宿主において方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリのlac オペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor ）アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス  マルトジェン性アミラーゼ遺伝子のプロモーター（amyM）、バチルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼのプロモーター（amyQ）、バチルス・スブチリスxylA及びxylB遺伝子のプロモータ、等である。
【００８６】
菌類宿主における転写に関して、有用なプロモーターの例は、A.オリザエTAKA  アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
【００８７】
本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び真核生物においては、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列に操作可能的に連結されるポリアデニル化配列を含んで成ることができる。終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ源に適切には由来することができる。
ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA 配列を含んで成ることができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1,及びpIJ702の複製の起点である。
【００８８】
ベクター又は、選択マーカー、たとえば1 つの遺伝子（ここでその生物が宿主細胞における欠陥を補充する）、たとえばB.スブチリス又はB.リケニホルミスからのdal 遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテロラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。さらに、ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、たとえばamdS, argB, niaD及びsC、ヒグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ、又はその選択はたとえばWO91/17243に記載のようにして同時−形質転換により達成され得る。
【００８９】
細胞内発現は、いくつかの観点においては、たとえば宿主細胞として一定の細菌を用いる場合、好都合であるが、一般的に発現は細胞外であることが好ましい。一般的に、本明細書において言及されるバチルスα−アミラーゼは、培養物培地中への発現されたプロテアーゼの分泌を可能にするプレ領域を含んで成る。所望する場合、このプレ領域は、異なったプレ領域又はシグナル配列により置換され得、便利には、それぞれのプレ領域をコードするDNA 配列の置換により達成される。
【００９０】
それぞれ、α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をコードする本発明のDNA 構造体を連結し、そしてそれらを、複製のために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するため使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照のこと）。
【００９１】
上記で定義されたような本発明のDNA 構造体又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生成において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA 構造体（１または複数のコピーにおける）を組み込むことによって、変異体をコードする本発明のDNA 構造体により形質置換され得る。この組み込みは一般的には、DNA 配列が細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色体中へのDNA 構造体の組み込むは、従来の方法、たとえば相同又は非相同組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に関して上記に記載されるようにして、発現ベクターにより形質転換され得る。
【００９２】
本発明の細胞は、高等生物、たとえば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しかし好ましくは、微生物細胞、たとえば細菌又は菌類（酵母を包含する）細胞である。
適切な細胞の例は、グラム陽性細菌、たとえばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス; 及びグラム陰性細胞、たとえばE.コリである。細菌の形質転換は、原形質形質転換により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。
【００９３】
酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces ）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces ）の種、たとえばサッカロミセス・セレビシアエから選択される。糸状菌は好都合には、アスペルギラスの種、たとえばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーに属することができる。菌類細胞は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続いて、それ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238,023 号に記載されている。
【００９４】
さらにもう1 つの観点においては、本発明は本発明のα−アミラーゼ変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、上記のような宿主細胞を、変異体の生成の助けとなる条件下で培養し、そして細胞及び/ 又は培養培地から変異体を回収することを含んでなる。
細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適切ないずれかの従来の培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されたレセピーに従って調製され得る（たとえば、American Type Culture Collectionのカタログに記載のようにして）。
【００９５】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は便利には、良く知られている方法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして培地中のタンパク質成分を、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いてクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものを使用することによる方法により、培養物培地から回収され得る。
【００９６】
産業上の用途
本発明のα−アミラーゼ変異体は、種々の産業上の用途を可能にする価値ある性質を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗濯、皿洗い及び硬質表面清浄洗剤組成物における成分として適用できる。多くの変異体は、澱粉からの甘味剤及びエタノールの生成において、及び/ 又は織物デサイジングのために特に有用である。従来の澱粉−転換方法、たとえば澱粉液化及び/ 又は糖化方法のための条件は、たとえばアメリカ特許第3,912,590 号及びヨーロッパ特許公開第252730号及び第63909 号に記載されている。
【００９７】
澱粉からの甘味剤の生成
フルクトースシロップへの澱粉の転換のための“従来の”方法は、通常、3 種の連続的酵素工程、すなわち液化工程、続いて糖化工程及び異性化工程から成る。液化工程の間、澱粉は、5.5 〜6.2 のpH値で、及び95〜160 ℃での温度で約2 時間、α−アミラーゼ（たとえばTermamyl（商標））処理することによりデキストリンに分解される。それらの条件下で最適の酵素安定性を確保するためには、1 mMのカルシウム（40ppm の遊離カルシウムイオン）が添加される。
【００９８】
液化工程の後、デキストリンは、グルコアミラーゼ（たとえば、AMG （商標））及び枝だ切り酵素、たとえばイソアミラーゼ又はプルラナーゼ（たとえば、Promozyme （商標））の添加によりデキストロースに転換さえる。この段階の前、pHは4.5 以下の値に低められ、高温（95℃以上）を維持し、そして液化α−アミラーゼ活性が変性される。温度が60℃に低められ、そしてグルコアミラーゼ及び枝だ切り酵素が添加される。糖化工程は、24〜72時間、進行する。
【００９９】
糖化工程の後、pHが6 〜8 の範囲の値、好ましくは7.5 に高められ、そしてカルシウムがイオン交換により除去される。次にデキストロースシロップがたとえば固定されたグルコースイソメラーゼ（たとえば、Sweetzyme （商標））を用いて、高フルクトースシロップに転換される。
【０１００】
この工程の少なくとも1 つの酵素改良点、すなわち液化α−アミラーゼのカルシウム依存性の低下が認識され得た。遊離カルシウムの添加は、α−アミラーゼの適切に高い安定性を確保するために必要とされるが、しかし遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害し、そして遊離カルシウムのレベルを3 〜5ppm以下に低める程度まで、高価なユニット操作により除去される必要がある。そのような操作が回避され、そして液化工程が遊離カルシウムイオンの添加を伴わないで行われるなら、費用の節約が得られる。
【０１０１】
それを達成するためには、低濃度の遊離カルシウム（40ppm 以下）下で安定し、そして非常に活性的である、低いカルシウム−依存性テルマミル−様α−アミラーゼが必要とされる。そのようなテルマミル−様α−アミラーゼは、4.5 〜6.5 の範囲のpH、好ましくは4.5 〜5.5 の範囲のpHでの最適なpHを有するべきである。
【０１０２】
洗剤組成物
上記で言及されたように、本発明の変異体は、洗剤組成物に適切に導入され得る。低カルシウム濃度、すなわちアルカリ領域での高められた熱安定性は、洗剤におけるアミラーゼ性能のために非常に有益であろう。洗剤組成物（たとえば洗濯又は皿洗い用洗剤）の相当する成分、そのような洗剤組成物に変異体を配合するための適切な方法、及び相当する型の洗剤組成物の例に関する追加の詳細については、WO96/23874及びWO97/07202を参照のこと。
【０１０３】
本発明の変異体を含んで成る洗剤組成物はさらに、1 又は複数の酵素、たとえばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、又はテッカラーゼ、及び/ 又はもう1 つのα−アミラーゼを含んで成ることができる。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、通常使用される濃度で洗剤中に導入され得る。本発明の変異体は、洗剤の通常の用量レベルを用いて、洗浄/ 皿洗い用液体1l当たり0.00001 〜1mg （純粋な活性酵素タンパク質として計算される）のα−アミラーゼに対応する量で導入され得ることが現在、企画される。例えば、本発明の洗剤添加剤は、添加剤１ｇ当たり0.02〜200mgのα−アミラーゼ変異体酵素を含む。
【０１０４】
本発明はまた、配列番号3 に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼに由来する本発明の1 又は複数の変異体（親テルマミル−様α−アミラーゼとして）、及び配列番号4 に示される配列を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼに由来するテルマミル−様α−アミラーゼの混合物を含んで成る組成物にも関する。
【０１０５】
さらに、本発明はまた、配列番号3 に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼに由来する本発明の1 又は複数の変異体（親−テルマミル−様α−アミラーゼとして）、及び配列番号5 に示されるB.アミロリクエファシエンスα−アミラーゼの一部及び配列番号4 に示されるB.リケニホルミスα−アミラーゼの一部を含んで成るハイブリッドα−アミラーゼの混合物を含んで成る組成物にも関する。
【０１０６】
後者の言及されたハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼは、配列番号4 に示されるB.リケニホルミスα−アミラーゼの445 個のC −末端アミノ酸残基、及び配列番号5 に示されるB.アミロリクエファシエンスに由来するα−アミラーゼの37個のN −末端アミノ酸残基を含んで成る。前記後者の言及されたハイブリッドα−アミラーゼは適切には、次の突然変異を含んで成る：H156Y ＋A181T ＋N190F ＋A209V ＋Q264S （配列番号4 における番号づけを用いての）。下記例においては、前記ハイブリッド親テルマミル−様α−アミラーゼは、本発明の組成物に使用され得る、本発明の変異体と組合して使用される。
【０１０７】
本発明の特定の態様においては、組成物は、たとえば2:1 〜1:2 の比、たとえば1:1 の比でのTVB146/LE174の混合物を含んで成る。
本発明のα−アミラーゼ変異体又は本発明の組成物は、本発明の観点においては、洗濯及び/ 又は皿洗い；織物デサイジング又は澱粉液化のための使用され得る。
【０１０８】
材料及び方法：
酵素：
BSG α−アミラーゼ：配列番号3 に示されるB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ。
TVB146α−アミラーゼ変異体：次の突然変異を有する、配列番号3 に示されるB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ変異体：位置I181−G182＋N193F において欠失を有する。
【０１０９】
LE174 ハイブリッドα−アミラーゼ変異体：LE174 はテルマミル配列に同一のハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼ、すなわち配列番号4 に示されるバチルス・リケニホルミスα−アミラーゼであるが、但しN −末端の35個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）がBAN のN −末端の33個の残基（成熟タンパク質）により置換されており、すなわち次の突然変異をさらに有する、配列番号5 に示されるバチルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼ：H156Y ＋A181T ＋N190F ＋A209V ＋Q264S （配列番号4 における番号づけを用いての）。LE174 は、SOE −PCR （Higuchi など., 1988, Nucleic Acids Research 16:7351 ）により構成された。
【０１１０】
α−アミラーゼ変異体の発酵及び精製：
−80℃の原液からの、相当の発現プラスミドを有するB.スブチリス株を、10μg /ml のカナマイシンを含むLB−寒天プレート上に画線培養し、そして37℃で一晩増殖せしめる。コロニーを、10μg/mlのカナマイシンにより補充された、500ml の振盪フラスコにおける100ml のBPX 培地上に移す。
【０１１１】
BPX 培地の組成：
ジャガイモ澱粉            100g/l
大麦粉末                   50g/l
BAN 5000 SKB              0.1g/l
カゼイン酸ナトリウム       10g/l
大豆ミール                 20g/l
Na2HPO4 ・12H2O             9g/l
Pluronic（商標）          0.1g/l
【０１１２】
培養物を37℃で、5 日間、270rpmで振盪する。
細胞及び細胞残骸を、4500rpm での20〜25分間遠心分離により発酵ブイヨンから除去する。その後、上清液を濾過し、完全に透明な溶液を得た。濾液を濃縮し、そしてUF−フィルター（1000のカットオフ膜）上で洗浄し、そして緩衝液を20mMの酢酸塩（pH5.5 ）に変える。UF−濾液を、S −Sepharose F.F.上に適用し、そして溶出を、同じ緩衝液中、0.2MのNaCl溶液による段階的溶出により実施する。溶出物を10mMのトリス（pH9.0 ）に対して透析し、そしてQ −Sepharose F.F.上に適用し、そして6 カラム体積にわたって0 〜0.3MのNaClの線状グラジエントにより溶出する。活性（Phadebasアッセイにより測定される）を含む画分をプールし、pHを7.5 に調節し、そして残存する色を、0.5 ％（w/v ）の活性炭による5 分間の処理により除去する。
【０１１３】
活性の測定−（KNU ）：
1 キロα−アミラーゼ単位（1 KNU ）は、次の条件に基づいてα−アミラーゼの決定のためのNovo Nordisk's標準方法において1 時間当たり5.26g の澱粉（Merck, Amylum Solubile, Erg. B6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である：
基質                            可溶性澱粉
溶媒中のカルシウム含有率        0.0043M
反応時間                        7 〜20分
温度                            37℃
pH                              5.6
Novo Nordisk's分析方法（AF9 ）の詳細な記載は、請求次第で入手できる。
【０１１４】
BS−アミラーゼ活性測定−KNU(S)：
１．適用分野：
この方法は、発酵及び回収サンプル、並びに配合された及び粒質化された生成物におけるα−アミラーゼ活性を決定するために使用される。
【０１１５】
２．原理：
BS−アミラーゼは、基質（4, 6−エチリデン(G７) −ｐ−ニトロフェニル(G1)−α, D −マルトプタオシド）（エチリデン−G7−PNP として記載される）を、中でも、G2−PNP 及びG3−PNP （ここでG はグルコースを示し、そしてPNP はｐ−ニトロフェノルを示す）に分解する。
G2−PNP 及びG3−PNP は、過剰に添加されるα−グルコシダーゼにより、グルコース及び黄色のｐ−ニトロフェノールに分解される。
色彩反応は、現場モニターされ、そして時間にわたっての吸光度の変化が反応の速度の表示及び従って、酵素の活性の表示として計算される。さらなる詳細については、Boehringer Mannheim 1442309 ガイドラインを参照のこと。
【０１１６】
２．１  反応条件
反応：
温度                              ：37℃
pH                                ：7.1
プレーインキュベーション時間      ：2 分
検出：
波長                              ：405nm
測定時間                          ：3 分
【０１１７】
３．単位の定義：
バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ（BS−アミラーゼ）活性が、言明された活性の標準に対して決定され、そしてKilo Novo Units （ステアロサーモフィラス) 又はKNU (S）で示される。
４．特異性及び感受性：
決定の限界：約0.4 KNU (S) /g
【０１１８】
５．装置：
Cobas Fara分析機、
希釈剤（たとえば、Hamilton Microlab 1000）、
化学天秤（たとえば、Mettler AE 100）、
撹拌機プレート。
【０１１９】
６．試薬/ 基質：
既製のキットが、α−アミラーゼ活性を決定するためにこの分析に使用される。基質及びα−グルコシダーゼのために特定される試薬は、Boehringer Mannheim ガイドラインに記載されるようには使用されないことを注意すること。しかしながら、名称“緩衝液”、“ガラス１”、“ガラス１a ”及び“ガラス2 “は、それらのガイドラインに言及される通りである。
【０１２０】
６．１  基質
4, 6−エリデン(G7)−ｐ−ニトロフェニル(G1)−α, D −マルトヘプタオシド（エチリデン−G7−PNP として記載される）、たとえばBoehringer Mannheim 1442309.
６．２  α−グルコシダーゼ補助試薬
α−グルコシダーゼ、たとえばBoehringer Mannheim 1442309.
６．３  BRIJ 35 溶液
BRIJ 35 (30 ％ (w/v) Sigma 430AG−6)               1000m
脱イオン化された水                                2,000mL まで
６．４  安定剤
Brij 35 溶液                                         33mL
CaCl2 ・2H2O(Merck 2382)                            882g
脱イオン化された水                                2,000mL まで
【０１２１】
７．サンプル及び標準：
７．１  標準曲線
例：BS−アミラーゼ標準曲線の調製
相当する標準を次のようにして、0.60 KNU (S) /mLに希釈する。計算された量の標準を計量し、そして2/3 の印近くまで脱イオン水により満たされた200mL のメスフラスコに添加する。フラスコの体積の１％に相当する安定剤を添加し、そしてフラスコを脱イオン水により印まで満たす。
Hamilton Microlab 100 を用いて、下記に示される希釈溶液を調製する。１％安定剤と共に脱イオン水を、希釈剤として使用する。
【０１２２】
【表２６】
0004358431.tif 000021
【０１２３】
７．２  レベル対照
Novo Nordisk A/S BS アミラーゼ  レベル対照は、Cobas Faraを用いるすべての試験において包含される。前記対照を、最終希釈度が標準曲線の範囲内にあるように１％希釈剤により希釈される。すべての重量及び希釈度は研究目録に示される。
【０１２４】
７．３  サンプル溶液
単一測定：
生製からの発酵サンプル（最終サンプルではない）、パイロットプラントからのすべての発酵サンプル及び貯蔵安定性サンプルを計量し、そして1 度だけ分析する。
1 回の試験につき2 回の測定：
加工サンプル、生成からの最終発酵サンプル、GLP 研究からのサンプル及びR & D サンプルを計算し、そして2 度分析する。
2 回の試験につき2 回の測定：
【０１２５】
最後生成物サンプルを計量し、そして2 回の別々の試験において2 度分析する。
粉末形でのサンプルの最大濃度：5 ％。
試験サンプルを、それらの予測される活性に基づいて、1 ％の希釈剤と共に脱イオン水により約0.037KNU（S ）/mL に希釈する。最終希釈溶液は、サンプルカップ中に向けられる。
【０１２６】
８．手順：
８．１  Cobas メニュープログラム
−Cobas メニュープログラムを用いて、サンプルの重量/ 希釈度及び使用されるレベル対照を示す。
−サンプルを、独特の識別コードを有するプログラム中に入力し、そして研究目録を打ち出す。
−サンプル及び対照を計量し、そして研究目録上に言及されるようにして希釈し、そして手書きの重量データを、BS−アミラーゼ分析記録誌中に挿入する。
−結果を、項目9 に記載されるようにCobas Faraにより自動的に計算し、そして標準曲線にそって打ち出す。
−研究目録及び結果の打ち出しを、BS−アミラーゼ分析記録誌中に挿入する。
【０１２７】
８．２  Cobas Fara設定
−サンプルをサンプルラックに配置する。
−5 種の標準を、位置1 〜5 （位置5 で最強の標準）で検量ラックに配置し、そして対照を位置10で同じラックに配置する。
−基質を30mLの試薬容器に移し、そして位置2 （ホルダー１）でその試薬ラックに配置する。
−α−グルコシダーゼ助力試薬を、50mLの試薬容器に移し、そして位置2 （ホルダーC ）で試薬ラックに配置する。
【０１２８】
８．３  Cobas Fara分析
この分析の主要原理は次の通りである：
20μL のサンプル及び10μL のすすぎ水をピペットにより、250 μL のα−グルコシダーゼ助力試薬と共にキュベット中に入れる。キュベットを10分間、回転せしめ、そして試薬を水平キュベット中に捨てる。25μL の基質及び20μL のすすぎ水をピペットで取る。37℃の温度を確保するために1 秒間待った後、キュベットを再び回転せしめ、そして基質を水平キュベット中に混合する。最初に、吸光度を120 秒後に測定し、そして次に5 秒ごとに測定する。吸光度を、個々のサンプルについて合計37回、測定する。
【０１２９】
９．計算：
サンプルの活性を、Novo Nordisk A/S標準に対して計算する。
標準曲線を分析機によりプロットする。曲線は、標準番号5 に関して、なだらかに湾曲し、0.25近くの吸光度まで絶え間なく上昇する。
KNU (S）/mL でのサンプルの活性を、分析機により標準曲線から読み取る。
使用される重量/ 希釈度を可能にする最終計算は次の式を使用する：KNU (S)/g での活性＝S ×V ×F/W （ここで、S はKNU (S）/mL を読み取る分析効果であり、V はmLで使用されるメスフラスコの体積であり、F は第2 希釈についての希釈因子であり、W はｇでの酵素サンプルの重量である）。
【０１３０】
９．２  平均値の計算
結果は3 有効数字により示される。しかしながら、10KNU (S）/ ｇ以下のサンプルについては、2 有効数字が与えられる。
次の規則が平均値の計算に適用される：
1 ．平均値からの2 標準偏差以上逸脱するデータは計算に包含されない。
2 ．1 回の試験での1 回及び2 回の測定：平均値は、標準曲線活性領域内にある結果に基づいて計算される。
3 ．2 回の試験での2 回の測定：すべての値は、平均値に含まれる。本体を離れた値は除外される。
【０１３１】
１０．正確度及び精度：
変動係数は、多くの最終生成物及びレベル対照についての分析結果のこれまでの有効性に基づいて2.9 ％である。
α−アミラーゼ活性についてのアッセイ
α−アミラーゼ活性を基質としてPhadebas(r) 錠剤を用いての方法により決定する。Phadebas錠剤（Pharmacia Diagnosticから供給されるPhadebas(r) Amylase Test）は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合され、そして錠剤化された、架橋された不溶性の青色澱粉ポリマーを含む。
【０１３２】
1 回の測定ごとに、1 つの錠剤を、5mL の50mMのBritton −Robinson緩衝液（50mMの酢酸、50mMのリン酸、50mMの硼酸、0.1mM のCaCl2 ；NaOHにより興味ある値に調節されているpH）を含む管において懸濁する。試験を、興味ある温度で、水浴において行う。試験されるα−アミラーゼを、5ml の50mMのBritton −Robinson緩衝液により希釈する。このα−アミラーゼ溶液1ml を、5ml の50mMのBritton −Robinson緩衝液に添加する。澱粉をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性の青色フラグメントを付与する。620nm で分光光学的に測定される前記の得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。
【０１３３】
10分又は15分のインキュベーション（試験時間）の後の測定された620nm での吸光度は、620nm での0.2 〜2.0 の吸光度単位の範囲に存在することが重要である。この吸光度範囲においては、活性と吸光度との間に直線性が存在する（Lambert −Beer法則）。従って、酵素の希釈は、この基準を満たすために調節されるべきである。特定された組の条件（温度、pH、反応時間、緩衝条件）下で、1mg の与えられたα−アミラーゼが一定の量の基質を加水分解し、そして青色が生成されるであろう。色の強度を620nm で測定する。測定された吸光度は、与えられた組の条件下で、問題のα−アミラーゼの比活性（純粋なα−アミラーゼタンパク質1mg 当たりの活性）に直接的に比例する。
【０１３４】
例
例１．BSG α−アミラーゼ（配列番号3 ）の変異体の構成
BSG をコードする遺伝子、すなわちamySは、プラスミドpPL1117 中に存在する。このプラスミドはまた、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子及び複製起点を含み、ここで前記両者は、プラスミドpUB110（Gryczan, T.J. など(1978)J. Bact. 134：318-329 ）から得られた。
AmySの成熟部分のDNA 配列は配列番号11として示され、そしてその成熟タンパク質のアミノ酸配列は配列番号3 として示される。
【０１３５】
成熟タンパク質におけるアミノ酸I181−G182に対応する6 個のヌクレオチドの欠失を含むBSG 変異体TVB145を次の通りにして構成する：
ポリメラーゼ鎖反応（PCR ）を用いて、DNA プライマーBSG １（配列番号15）とBSGM2 （配列番号18）との間に位置するamyS遺伝子の一部（プラスミドpPL1117 からの）を増幅することができる。BSG １はamyS遺伝子の一部と同一であり、そしてBSGM2 は6bp のヌクレオチド欠失を含む。標準のPCR 反応を、製造業者、すなわちBoehringer Mannheim Gmbhにより推薦されるような条件下で、Pwo ポリメラーゼを用いて、94℃で5 分間、25サイクルの（94℃で45秒間、50℃で45秒間、72℃で90秒間）、72℃で7 分間実施する。
【０１３６】
得られる約550bp の増幅されたバンドを、約1080bpのDNA フラグメントをもたらす鋳型としてpPL1117 を用いての第2PCRにおいて、メガプライマー（Barik, Sand Galinski, MS(1991), Biotechniques 10 : 489-490）として使用した。
このDNA フラグメントを、制限エンドヌクレアーゼAcc65I及びSalIにより消化し、そして得られる約550bp のフラグメントを同じ酵素により消化されたプラスミドpPL117中に連結し、そしてプロテアーゼ−及びアミラーゼ−欠失されたバチルス・スブチリス株SHA273（WO92/11357及びWO95/10603に記載される）を形質転換する。
【０１３７】
カナマイシン耐性及び澱粉分解性形質転換体を、所望する突然変異（遺伝子におけるHind IIIの導入を確かめるための制限消化物）の存在について分析した。制限部位Acc65IとSalIとの間のDNA 配列を所望する突然変異のみの存在を確かめるために、DNA 配列決定により確かめた。
TVB145と同じ6 個のヌクレオチド欠失、及びフェニルアラニンによるアスパラギン193 の追加の置換、すなわちN193F を含むBSG 変異体TVB146を、第１PCR において、プライマーBSGM3 （配列番号19）を用いて、TBS145に類似する手段で構成した。
【０１３８】
T181−G182の欠失、N193F 及びL204F を含むBSG 変異体TVB161を、2 種の前記変異体と類似する手段で構成するが、ただしPCR 反応のための鋳型はプラスミドpTVB146 （amyS内のTVB146−突然変異を含むpPL1117 ）であり、そして第1 のPCR のための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドはBSGM3 である。
I181−G182の欠失、N193F 及びE210H を含むBSG 変異体TVB162を、TVB161と類似する手段で構成するが、但し突然変異誘発性オリゴヌクレオチドはBSGM4 （配列番号20）である。
【０１３９】
I181−G182の欠失、N193F 及びE214Q を含むBSG 変異体TVB163を、TVB161と類似する手段で構成するが、但し突然変異誘発性オリゴヌクレオチドはBSGM5 （配列番号21）である。
次に、上記構成されたBSG 変異体を、上記“材料及び方法”セクションで記載したようにして、発酵し、そして精製した。
【０１４０】
例２．カルシウム−及びpH−依存安定性の測定
通常、産業用液化工程は、95℃〜105 ℃での安定性を改良するために、液化pHとして6.0 〜6.2 のpHを用い、そして40ppm の遊離カルシウムの添加を伴って運転している。本明細書で提案された置換体のいくつかは、
1 ．6.2 よりも低いpHで、及び/ 又は
2 ．40ppm の遊離カルシウムよりも低い遊離カルシウムレベルで、
安定性を改良するために行われる。
下記2 種の異なった方法が、B.ステアロサーモフィラスからのα−アミラーゼにおける異なった置換により得られる安定性の改良性を測定するための使用された：
【０１４１】
方法  １：5ppmの遊離カルシウムの存在下で、低められたpH、すなわちpH5.0 での安定性を測定する1 つのアッセイ。10μg の変異体を次の条件下でインキュベートした：5ppmのカルシウム及び5 ％（w/v ）の通常のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含む、pH5.0 に調節された0.1Mの酢酸塩溶液。インキュベーションを95℃で30分間、水浴において行った。
方法  ２：遊離カルシウムの不在下で安定性を測定し、そしてpHが6.0 で維持されているアッセイ。このアッセイはカルシウム感受性の低下を測定する：10μg の変異体を次の条件下でインキュベートした：5 ％（w/v ）通常のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含む、pHを6.0 に調節された0.1Mの酢酸塩溶液。インキュベーションを95℃で30分間、水浴において行った。
【０１４２】
安定性の測定
すべての安定性試験1, 2は、同じ設定を用いて行われた。その方法は次の通りであった：
酵素を適切な条件（1 〜4 ）下でインキュベートした。サンプルを、0, 5, 10, 15及び30分で採取し、そしてアッセイ緩衝液（50mMのBritton 緩衝液、pH7.3 ）により25倍に希釈し（すべての採取されたサンプルに関しては同じ希釈度）、そして活性を、標準条件（pH7.3 ，37℃）下で、Phadebasアッセイ（Pharmacia ）を用いて測定した。
インキュベーションの前に測定される活性（0 分）を、対照（100 ％）として使用した。％低下を、インキュベーション時間の関数として計算した。表は、30分のインキュベーション後の残存する活性を示す。
【０１４３】
【表２７】
0004358431.tif 000022
【０１４４】
【表２８】
0004358431.tif 000023
【０１４５】
【表２９】
0004358431.tif 000024
【０１４６】
比活性の測定
比活性を、活性/mg 酵素として、Phadebasアッセイ（Pharmacia ）を用いて決定した。この活性を、上記の材料及び方法のセクションに記載されるα−アミラーゼアッセイを用いて決定した。
親酵素及び単一及び二重突然変異体の比活性は、下記の通りであることが決定された：
【０１４７】
【表３０】
0004358431.tif 000025
【０１４８】
例３．α−アミラーゼ変異体TVB146によるパイロットプラント  ジュット調理
/ 及び液化
パイロットプラント液化実験を、pH5.5 で、50NU（S ）/gのDSの用量を用いてミニジェット  システムにおいて実施し（5ppmのCa2+が添加されている）、配合されたBSG α−アミラーゼ変異体TVB146（位置I181−G182での欠失＋N193F を有する配列番号3 ）の性能と、親BSG α−アミラーゼ（配列番号3 ）の性能とを比較した。反応を、DE上昇率（Neocuproine 方法）を時間の関数として測定することによってモニターした。
脱イオン水に11.8kgのCerestar C*  Pharm GL03406（89％澱粉）を懸濁し、そして30kgに近づけることによって、コーンスターチのスラリーを調製した。0.55のCaCl2 ・2H2Oの添加の後、PHを、周囲温度で5.5 に調整した。
【０１４９】
次の酵素を使用した：
【表３１】
0004358431.tif 000026
【０１５０】
50NU（SM9 ）/gのDSに相当する量の酵素を添加し、そして伝導度をNaClを用いて300mS に調節した。標準条件は次の通りであった：
【表３２】
0004358431.tif 000027
【０１５１】
ジェット調理の後、液化された澱粉を集め、そしてパイロットプラントから実験室に、密封されたThermos フラスコにおいて輸送し、ここで二次液化を95℃で続けた。
10mlのサンプルを、15〜90分、15分間隔で採取した。１N のHCl の2 滴を添加し、酵素を不活性化した。それらのサンプルから、0.3 〜0.1g（予測されるDEに従って）を計量し、そして100ml に希釈した。次に、還元糖を、Neocuproine 方法に従って決定し、（改良された精度での還元糖の決定、Dygert, Li, Florida and Thomas (1965), Anal. Biochem 13, 368）、そしてDE値を決定した。時間の関数としてのDEの上昇性を、次の表に与える：
【０１５２】
【表３３】
0004358431.tif 000028
【０１５３】
上記に見られるように、α−アミラーゼ変異体TVB146は、親BSG α−アミラーゼよりも、低カルシウムレベルで産業的に適切な適用条件下で、有意に良好な性能を示した。
【０１５４】
例４．α−アミラーゼ変異体（TVB146及びLE174 ）の組み合わせによるジェット調理及び液化
α−アミラーゼ変異体、TVB146及びLE174 （1:1 の割合）の組み合わせを用いてのジェット調理及び液化を次の条件下で行った：
基質：A.E. Staley 食品品種の粉末化されたコーンスターチ（100 lbs ）；
D.S.：DI水を用いて35％；
遊離Ca2+：pH5.3 で2.7ppm（添加されなかった；澱粉のみから）；
初期pH：5.3
【０１５５】
個々の酵素変異体のためのAF9 用量単位（AF9 は請求次第で入手できる）は、56NU／g の合計用量に対して28NU／g 澱粉dbであり；
一次液化における温度：105 ℃；
一次液化における保持時間；5 分；
二次液化における温度：95℃。
二次液化の15分で、1.5gの加水分解物を、500cc のDI水及び1ml の１N のHCl を含む1lのメスフラスコ（容器の重量は引かれている）に添加し、そして添加された正確な重量を記録した。これを90分間（127 分での追加の点を伴う）、15分間隔で反復した。それらを1lに希釈し、そしてDygert, LI, Florida and thomas. Determination of reducing sugar with improved precision (1965), Anal. Biochem 13, 368 により記載されるようなNeocuproine 方法によりデキストロース当量を決定した。
【０１５６】
結果は次の通りであった：
【表３４】
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【０１５７】
引用された文献：
Klein, C.,など., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746.
Mizuno, H.など., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283.
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【０１５８】
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S.D. Erlich, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, pp. 1680-1682.
Boelなど., 1990, Biochemistry.
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明における6 種の親テルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列の整列である。最左端上の番号は、次のようなそれぞれのアミノ酸配列を示す：
１：配列番号2,
２：Kaoamyl,
３：配列番号1,
４：配列番号5,
５：配列番号4,
６：配列番号3 。
【図１】
0004358431.tif 000070
0004358431.tif 000071
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