(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の単離した純粋な集団であって、前記ニューロン限定前駆体細胞が胎児性神経細胞接着分子を発現し、自己再生し得、集団培養およびクローン培養において複数の継代にわたって増殖し、かつ、ニューロンには分化するが、星状膠細胞および希突起膠細胞には分化しないものである、前記集団。
【請求項２】
ニューロン限定前駆体細胞が、ＦＧＦを含む培地では増殖するが、ＦＣＳを含む培地では増殖しない、請求項１に記載の哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の集団。
【請求項３】
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法であって、
（イ）ニューロンおよびグリア両方を生成し得る哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞集団を単離する工程、
（ロ）該多分化能ＣＮＳ幹細胞を、該細胞の分化の開始を誘導するように適合させた、ＦＧＦおよびＣＥＥを含む培地中でインキュベートする工程、
（ハ）胎児性神経細胞接着分子を発現し、自己再生し得、集団培養およびクローン培養において複数の継代にわたって増殖し、かつ、ニューロンには分化するが、星状膠細胞および希突起膠細胞には分化しない細胞の亜集団を分化細胞から胎児性神経細胞接着分子陽性に基づいて精製する工程、および
（ニ）該細胞の精製亜集団を、その接着増殖を支持するように適合させた、ＦＧＦとＮＴ−３とを含む培地またはＳｈｈとＮＴ−３とを含む培地中でインキュベートする工程、
を含む、前記方法。
【請求項４】
哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞が感覚上皮幹細胞であり、
（イ）神経管の閉塞後であるが、神経管内における細胞の分化前の胚発生段階で哺乳動物胚からＣＮＳ組織を取出すこと、
（ロ）哺乳動物胚から取出した神経管を含む細胞を解離すること、
（ハ）培養基板上において支持細胞非依存培養を行うために、解離細胞を、有効量の線維芽細胞増殖因子とニワトリ胚抽出物を含み、感覚上皮幹細胞の接着増殖を支持するように適合させた培地中に播種すること、および
（ニ）播種した細胞を感覚上皮幹細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートすること、
を含む工程により単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法であって、
（イ）神経管の閉塞後であるが、神経管内におけるグリアおよびニューロン細胞の分化前の胚発生段階で哺乳動物胚からＣＮＳ組織サンプルを取出す工程、
（ロ）哺乳動物胚から取出したＣＮＳ組織サンプルを含む細胞を解離する工程、
（ハ）解離細胞から、胎児性神経細胞接着分子を発現し、自己再生し得、集団培養およびクローン培養において複数の継代にわたって増殖し、かつ、ニューロンには分化するが、星状膠細胞および希突起膠細胞には分化しない細胞の亜集団を胎児性神経細胞接着分子陽性に基づいて精製する工程、
（ニ）培養基板上において支持細胞非依存培養を行うために、精製亜集団細胞をニューロン限定前駆体細胞の接着増殖を支持するように適合させた、ＦＧＦとＮＴ−３とを含む培地またはＳｈｈとＮＴ−３とを含む培地中に播種する工程、および
（ホ）播種した細胞をニューロン限定前駆体細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートする工程、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法であって、
（イ）哺乳動物胚幹細胞のサンプルを供給する工程、
（イ’）該哺乳動物胚幹細胞を神経分化条件に置く工程、
（ロ）胎児性神経細胞接着分子を発現し、自己再生し得、集団培養およびクローン培養において複数の継代にわたって増殖し、かつ、ニューロンには分化するが、星状膠細胞および希突起膠細胞には分化しない細胞の亜集団を該哺乳動物胚幹細胞から胎児性神経細胞接着分子陽性に基づいて精製する工程、
（ハ）培養基板上において、支持細胞非依存培養を行うために、精製亜集団細胞を、ニューロン限定前駆体細胞の接着増殖を支持するように適合させた、ＦＧＦとＮＴ−３とを含む培地またはＳｈｈとＮＴ−３とを含む培地中に播種する工程、および
（ニ）播種した細胞をニューロン限定前駆体細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートする工程、
を含む、前記方法。
【請求項７】
ニューロン限定前駆体細胞の接着増殖を支持するように適合させた培地が、ＦＧＦを含むがＦＣＳは含まない、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項３、４、５、６または７に記載の方法により単離された哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団。
【請求項９】
請求項１、２または８に記載の哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の集団および許容し得る担体を含む単離した細胞組成物。
【請求項１０】
分裂終了ニューロンの取得方法であって、
（イ）請求項１、２または８に記載のニューロン限定前駆体細胞の集団を供給し、ＦＧＦとＮＴ−３とを含む培地またはＳｈｈとＮＴ−３とを含む培地を用いた増殖条件下でニューロン限定前駆体細胞を培養する工程、および
（ロ）ニューロン限定前駆体細胞の培養条件を増殖条件から分化条件に変更し、それによってニューロン限定前駆体細胞を分裂終了ニューロンに分化させる工程、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
神経学的活性化合物をスクリーニングする方法であって、
（イ）in vitroで培養した請求項１、２または８に記載のニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を供給する工程；
（ロ）該細胞を選択した化合物に種々の濃度で暴露する工程；および
（ハ）該細胞の該選択した化合物に対する応答を、選択した時間モニターする工程；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は１９９７年７月４日出願の米国特許出願連続番号０８／９０９，４３５の一部継続出願である。
連邦政府助成研究開発に関わる陳述
本発明は第一位奨学金および米国立保健研究所（ＮＩＨ）からの多領域基礎癌研究者養成奨学金給付大学院研究費による政府助成金により実施された。米国政府は本発明に応分の権利を有する。
発明の背景
本発明は系列限定中間前駆体細胞およびその調製と使用法に関する。さらに詳しくは、本発明は哺乳動物胚、感覚上皮幹（ＮＥＰ）細胞、または胚幹（ＥＳ）細胞から単離されたニューロン限定前駆体（ＮＲＰ）に関する。これらニューロン限定前駆体はニューロンへの自己再生および分化は可能であるが、グリア（神経膠）、すなわち、星状膠細胞および希突起膠細胞とはならない。かかるニューロン限定前駆体細胞の産生、単離、培養、移入および移植する方法もまた説明される。
幹細胞の特性をもつ多分化能細胞は中枢神経系のいくつかの領域において、また、いくつかの発生段階において同定されている。ゲイジ（F.H. Gage）ら、ＣＮＳからの幹細胞の単離、特性化と用途、１８ Ann. Rev. Neurosci. １５９〜９２（１９９５）；マービンおよびマッケイ（M. Marvin ＆ R. McKay）、脊椎動物ＣＮＳの多分化能性幹細胞、３ Semin. Cell Biol. ４０１〜１１（１９９２）；スコッフ（R.P. Skoff）、神経膠細胞の系列、２ The Neuroscientist ３３５〜４４（１９９６）。多くの場合、感覚上皮幹細胞（ＮＥＰ細胞）といわれるこれらの細胞は、自己再生を受け、ニューロン、希突起膠細胞および星状膠細胞に分化し、多分化能幹細胞となる能力を有する。デイビスおよびテンプル（A.A. Davis ＆ S. Temple）、胎児性ラット大脳皮質の自己再生多分化能性幹細胞、３６２ Nature ３６３〜７２（１９９４）；グリッティ（A.G. Gritti）ら、成体マウス脳からの多分化能幹細胞は塩基性線維芽細胞増殖因子に応答して増殖し、自己再生する、１６ J. Neurosci. １０９１〜１１００（１９９６）；レイノルズ（B.A. Reynolds）ら、多分化能ＥＧＦ−応答性線条胎児性始原細胞はニューロンと星状膠細胞を産生する、１２ J. Neurosci. ４５６５〜７４（１９９２）；レイノルズおよびワイス（B.A. Reynolds ＆ S. Weiss）、クローンおよび集団分析によると、ＥＧＦ−応答性哺乳動物胎児性ＣＮＳ前駆体は幹細胞である、１７５ Developmental Biol. １〜１３（１９９６）；ウイリアムズ（B.P. Williams）ら、共通前駆体細胞からのニューロンおよび希突起膠細胞の生成、７ Neuron ６８５〜９３（１９９１）。
神経系は限定分化潜在能力をもつ前駆体細胞も含んでいる。キルパトリックおよびバートレット（T.J. Kilpatrick ＆ P.F. Bartlett）、マウス大脳からのクローン化多分化能性前駆体はＦＧＦ−２を必要とし、一方、神経膠限定前駆体はＦＧＦ−２またはＥＧＦのいずれかにより刺激される、１５ J. Neurosci. ３６５３〜６１（１９９５）；プライス（J. Price）ら、レトロウイルス介在遺伝子伝達による脊椎動物神経系の系列分析、８４ Developmental Biol. １５６〜６０（１９８７）；レイノルズ（B.A. Reynolds）ら、上記；レイノルズおよびワイス（B.A. Reynolds ＆ S. Weiss）、上記；ウイリアムス（B. Williams）、大脳皮質の胚ゾーンにおける前駆体細胞型、１７ BioEssays ３９１〜９３（１９９５）；ウイリアムス（B.P. Williams）ら、上記。多分化能幹細胞と系列限定前駆体細胞の間の関係は未だ不明である。原理的には、系列限定細胞は多分化能細胞から誘導し得るが、神経系については直接の実験的証明がなく、今なお仮定上の可能性である。さらに、多分化能細胞からのかかる前駆体の精製法についても説明はされていない。
「感覚上皮幹細胞の生成、特性化および単離と系列限定中間前駆体」の名称で１９９７年５月７日付け出願された米国特許出願連続番号０８／８５２，７４４（その全文を参照により本明細書に組込む）に示されているように、ＮＥＰ細胞はフィブロネクチン上で増殖し、線維芽細胞増殖因子とニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）に存在する未同定の成分を要求して、培地中未分化の表現型を増殖し、維持する。ＮＥＰ細胞の増殖要件はＥ１４．５皮質性脳室ゾーン細胞から単離した神経球体（neurospheres）とは違っている。レイノルズ（B.A. Reynolds）ら、上記；レイノルズおよびワイス（B.A. Reynolds ＆ S. Weiss）、上記；ＷＯ９６１５２２６；ＷＯ９６１５２２４；ＷＯ９６０９５４３；ＷＯ９５１３３６４；ＷＯ９４１６７１８；ＷＯ９４１０２９２；ＷＯ９４０９１１９。神経球体は懸濁培地中で増殖し、ＣＥＥもＦＧＦも必要としないが、生存のために上皮増殖因子（ＥＧＦ）依存性である。ＦＧＦそれ自体は神経球体の長期増殖にとって十分ではないが、一過性にはその増殖を支えている。しかし、接着性培地で増殖するＮＥＰ細胞はＦＧＦ依存性であり、検出可能レベルのＥＧＦレセプターを発現せず、神経球体を単離することが可能となる前に胎児発生の段階で単離される。このように、ＮＥＰ細胞は脳幹と脊髄の特性を有する多分化能前駆体に相当する一方、神経球体は皮質の特性をより有する幹細胞に相当する。それでもなお、ＮＥＰ細胞は中枢神経系の多分化能幹細胞または前駆体細胞からの系列限定の原理研究モデル系を提供する。ＮＥＰ細胞の研究から解明された原理は、ニューロンとグリア（神経膠）両方を生成するのに十分多分化能なすべてのＣＮＳ前駆体細胞に広く適用され得ることが期待される。このように、本出願はＣＮＳ前駆体細胞がニューロンとグリア細胞両方に分化することの可能な限り、その誘導部位にかかわらず、ＣＮＳ前駆体細胞に適用し得るように企図されている。
アンダーソンおよびステンプル（D.J. Anderson and D.L. Stemple）に付与された米国特許第５，５８９，３７６号は、哺乳動物神経冠幹細胞およびその単離とクローン増殖法を開示しているが、培養ＮＥＰ細胞、培養系列限定前駆体細胞、およびその生成、単離、培養法については開示していない。神経冠幹細胞は末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロンとグリアに分化するが、一方、感覚上皮細胞は中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンとグリアに分化する。
「系列限定ニューロン前駆体の単離」として１９９７年７月４日付け出願された米国特許出願連続番号０８／９０９，４３５（その全文を参照により本明細書に組込む）は、ニューロンには分化し得るがグリア細胞には分化しないニューロン限定前駆体（ＮＲＰ）細胞について記載している。ＮＲＰ細胞はＮＥＰ細胞から、また同様に胎児脊髄から直接単離することができる。
「中枢神経系からの系列限定神経膠前駆体」として１９９７年１１月２９日出願の米国特許出願連続番号０８／９８０，８５０（その全文を参照により本明細書に組込む）は、希突起膠細胞、Ａ２Ｂ５+工程担持星状膠細胞、およびＡ２Ｂ５-線維芽細胞様星状膠細胞に分化し得るが、ニューロンには分化しないグリア限定前駆体（ＧＲＰ）細胞を記載する。ＧＲＰ細胞は分化途上ＮＥＰ細胞ならびにＣＮＳ組織から単離し得るが、増殖因子の要件、形態学および後代において、希突起膠細胞−タイプ２星状膠細胞（Ｏ−２Ａ）始原細胞とは異なる。
「ＣＮＳおよびＰＮＳにとっての共通神経祖先」として１９９８年５月６日出願の米国特許出願連続番号０９／０７３，８８１（その全文を参照により本明細書に組込む）においては、ＮＥＰ細胞が、神経冠細胞ならびに他のＣＮＳおよびＰＮＳの細胞に分化するように誘導され得ることが示されている。
本明細書に記載されたニューロン限定前駆体細胞は、他に記載されているＮＥＰ細胞、ＧＲＰ細胞、神経球体、および神経冠幹細胞とは別個のものである。ＮＥＰ細胞はニューロンまたはグリアに分化し得るが、そこでＮＲＰはグリアではなくニューロンに分化し、ＮＥＰ細胞とＮＲＰは別個の細胞マーカーを呈示する。ＧＲＰ細胞はグリアに分化し得るが、ニューロンには分化しない。上述のように、神経球体は懸濁培地中で増殖し、ＣＥＥまたはＦＧＦを必要としないが、生存はＥＧＦ依存性である。一方、ＮＲＰ細胞は接着性培地で増殖し、検出可能レベルのＥＧＦレセプターを発現しない。さらに、神経冠細胞は末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロンとグリアに分化するが、一方、ＮＲＰ細胞は中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンに分化する。ＮＲＰ細胞はポリシアル化または胎児性神経細胞接着分子（Ｅ−ＮＣＡＭ）を発現するが、ＮＥＰ細胞、神経球体、ＧＲＰ細胞、および神経冠細胞は発現しない。したがって、ＮＲＰ細胞はその増殖潜在能力、細胞マーカーの発現、および栄養要求において、これら他の細胞型と異なっている。
in vitroで哺乳動物ニューロン限定前駆体細胞を単離し増殖する能力は、移植、発生の選択した段階に特異的な遺伝子の発見、治療と診断用、例えば、標的遺伝子治療などのための細胞特異抗体の生成に、純粋集団ニューロンの使用を可能とする。さらに、ＮＲＰ細胞を使用して、特異的性質をもつニューロン、すなわち、運動性ニューロンおよび他のニューロン細胞の亜集団を生成させ、高い処理能力アッセイで神経伝達物質の機能および小分子を分析することができる。さらに、ＮＥＰ細胞または胎児性幹（ＥＳ）細胞からＮＲＰ細胞を得る方法は、大量の分裂終了ニューロンの簡便な供給源を提供する。腫瘍細胞系から得られる分裂終了細胞はすでに市販されつつある（例えば、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）。本発明はまた、多分化能感覚上皮幹細胞が如何に種々の感覚上皮誘導体に限定されるようになるかを理解するために必要である。特に、哺乳動物ニューロン限定前駆体細胞の増殖と自己再生を可能とする培養条件が、これら哺乳動物幹細胞の発生についての詳細を確認するために必要である。これが必要な理由は多量の感覚上皮誘導体の腫瘍が哺乳動物、特にヒトに存在するからである。それ故、哺乳動物感覚上皮幹細胞発生の知識はこれらヒトの疾病を理解するために必要とされる。
上記の観点から、哺乳動物系列限定ニューロン前駆体細胞およびかかる細胞を生成、単離、培養、移入そして移植する方法が技術上有意な進歩となろうことが認識されよう。
発明の要約
本発明の目的は哺乳動物ニューロン限定前駆体細胞の単離した（純粋な）集団およびその子孫を提供することにある。
本発明の他の目的は哺乳動物系列限定ニューロン前駆体細胞とその子孫を生成、単離、培養、および再生させる方法を提供することにある。
本発明のさらなる他の目的は、ニューロンとグリア両方を生成させることの可能なＣＮＳ多分化能前駆体細胞から系列限定ニューロン前駆体細胞を生成させる方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、系列限定ニューロン前駆体細胞から誘導されるニューロン細胞の純粋な分化した集団を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、かかるニューロン限定前駆体細胞を移入し、そして移植する方法を提供することにある。
これらの目的および他の目的は、哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の単離した純粋な集団を提供することにより達成することができる。好ましくは、かかるニューロン限定前駆体細胞は、自己再生し、ＣＮＳニューロン細胞に分化するがＣＮＳグリア細胞には分化せず、胎児性神経細胞接着分子（Ｅ−ＮＣＡＭ）を発現し得るが、Ａ２Ｂ５抗体によって認識されるガングリオシドを発現しないものである。これらのニューロン限定前駆体細胞はネスチンまたはβ−IIIチューブリンを発現してもしなくてもよい。かくして、胎児性神経細胞接着分子（Ｅ−ＮＣＡＭ）はこれら細胞に対する限定的な抗原である。ＮＲＰ細胞は、神経伝達物質を放出し、それに応答し得るニューロンに分化し得るものである。これらのニューロンはこれらの神経伝達物質のレセプターを表示し得るものであり、また、かかる細胞は神経伝達物質−合成酵素を発現し得るものである。また、ＮＲＰ細胞は、機能的シナプスを形成し、および／または電気的活性を発達させるニューロンにも分化し得るものである。また、ＮＲＰ細胞は、かかる細胞に対する増殖因子、かかる細胞に対する分化因子、かかる細胞に対する成熟因子、およびこれらのいずれかの組合わせからなる群より選択される少なくとも１つの物質を安定に発現することができるものである。さらに、本発明ニューロン限定前駆体細胞は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、およびげっ歯類から選択、選定および単離することができる。
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法は、
（イ）ニューロンおよびグリア両方を生成し得る哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞集団を単離する工程、
（ロ）該多分化能ＣＮＳ幹細胞を、かかる細胞の分化の開始を誘導するように適合させた培地中で培養する工程、
（ハ）ニューロン限定前駆体細胞を規定する選択した抗原を発現する細胞の亜集団を分化細胞から精製する工程、および
（ニ）該細胞の精製亜集団を、その接着増殖を支持するように適合させた培地中で培養する工程、
を含む。
ニューロン限定前駆体細胞を規定する好適に選択した抗原は胎児性神経細胞接着分子である。好ましくは、ＮＲＰ細胞精製工程は、特異抗体捕捉、蛍光活性化細胞選別、および磁気ビーズ捕捉からなる群より選択される手法を含む。特異抗体捕捉がとりわけ好ましい。好適な態様において、哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞は感覚上皮幹細胞である。ＣＮＳ感覚上皮幹細胞集団を単離する好適な手法は、
（イ）神経管の閉塞後であるが、神経管内における細胞の分化前の胚発生段階で哺乳動物胚からＣＮＳ組織を取出すこと、
（ロ）哺乳動物胚から取出した神経管を含む細胞を解離すること、
（ハ）培養基板上において、支持細胞非依存培養を行うために解離細胞を、有効量の線維芽細胞増殖因子とニワトリ胚抽出物を含み、感覚上皮幹細胞の接着増殖を支持するように適合させた培地に播種すること、および
（ニ）播種した細胞を感覚上皮幹細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートすること、
からなる。
好ましくは、哺乳動物胚はヒトおよび非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ目、およびげっ歯類からなる群から選択される。該培養基板はフィブロネクチン、ビントロネクチン、ラミニン、およびＲＧＤペプチドからなる群から選択するのが好ましい。好適な態様において、培地は有効量の線維芽細胞増殖因子とニューロトロフィン３（ＮＴ−３）を含む。
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法は、
（イ）神経管の閉塞後であるが、神経管内におけるグリアおよびニューロン細胞の分化前の胚発生段階で哺乳動物胚からＣＮＳ組織サンプルを取出す工程、
（ロ）哺乳動物胚から取出したＣＮＳ組織サンプルからなる細胞を解離する工程、
（ハ）解離細胞から、ニューロン限定前駆体細胞を規定する選択した抗原を発現する亜集団を精製する工程、
（ニ）培養基板上において、支持細胞非依存培養を行うために、精製亜集団細胞を、ニューロン限定前駆体細胞の接着増殖を支持するように適合させた培地に播種する工程、および
（ホ）播種した細胞をニューロン限定前駆体細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートする工程、
を含む。
好ましくは、ニューロン限定前駆体細胞を規定する選択した抗原は胎児性神経細胞接着分子である。精製工程は特異抗体捕捉、蛍光活性化細胞選別、および磁気ビーズ捕捉からなる群より選択される手法を含むことがまた好ましい。特異抗体捕捉がとりわけ好ましい。さらに好ましいのは、哺乳動物胚がヒトおよび非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ目、およびげっ歯類からなる群から選択されることである。
分裂終了ニューロンを得る方法は、
（イ）ニューロン限定前駆体細胞を供給し、増殖条件下でニューロン限定前駆体細胞を培養する工程；および
（ロ）ニューロン限定前駆体細胞の培養条件を増殖条件から分化条件に変更し、それによってニューロン限定前駆体細胞を分裂終了ニューロンに分化させる工程、
を含む。
培養条件を変更する工程は、好ましくは、基礎培地にレチノイン酸を添加するか、あるいは基礎培地から分裂因子を取り去ることを含む。かかる分裂因子は線維芽細胞増殖因子である。培養条件を変更する工程はまた、基礎培地にニューロン成熟因子を添加することを含む。好適なニューロン成熟因子は、ソニック・ヘッジホッグ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、レチノイン酸、脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、および上記いずれかの組合わせからなる群より選択される。
本発明の他の好適な態様は、本明細書記載の哺乳動物ＣＮＳニューロン限定細胞を含む単離した細胞性組成物からなる。本発明の他の好適な態様は、治療有効量のかかる組成物と製剤上許容し得る担体とを含む製剤組成物からなる。
哺乳動物のニューロン性疾患の治療法は、本明細書記載の哺乳動物ＣＮＳニューロン限定細胞を含む単離した細胞性組成物の治療有効量をかかる哺乳動物に投与する工程を含む。哺乳動物のニューロン性疾患における他の治療法は、かかる製剤組成物の治療有効量と製剤上許容し得る担体とを該哺乳動物に投与する工程を含む。かかる組成物は筋肉内投与、鞘内投与、腹腔内投与、静脈内投与、および上記いずれかの組合わせからなる群から選択される経路にて投与することができる。本方法は分化因子、増殖因子、細胞成熟因子および上記いずれかの組合わせからなる群から選択されるメンバーを投与することをも包含する。かかる分化因子は、好ましくは、レチノイン酸、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、および上記いずれかの組合わせからなる群から選択される。
哺乳動物における神経変性症候群の治療法は、
（イ）ニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を供給する工程、
（ロ）かかるニューロン限定前駆体細胞を、増殖因子、神経伝達物質、神経伝達物質合成酵素、神経ペプチド、神経ペプチド合成酵素、またはフリーラジカル介在損傷に対する防御物質をコードする遺伝子を遺伝子的にて形質転換し、それによってかかる増殖因子、神経伝達物質、神経伝達物質合成酵素、神経ペプチド、神経ペプチド合成酵素、またはフリーラジカル介在損傷に対する防御物質を発現するグリア限定前駆体細胞の形質転換集団を生成させる工程、および
（ハ）該ニューロン限定前駆体細胞の形質転換集団の有効量をかかる哺乳動物に投与する工程、
を含む。
神経学的活性化合物をスクリーニングする方法は、
（イ）in vitroで培養したニューロン限定前駆体細胞またはその誘導体またはその混合物の純粋な集団を供給する工程、
（ロ）かかる細胞またはその誘導体またはそれらの混合物に選択した化合物を種々の濃度で暴露する工程、および
（ハ）かかる細胞またはその誘導体またはそれらの混合物の該選択した化合物に対する応答を選択した時間モニターする工程、
を含む。
神経学的または神経変性疾患の治療法は、かかる治療を必要とする哺乳動物に有効量のニューロン限定前駆体細胞またはその誘導体またはそれらの混合物を投与する工程を含む。かかるニューロン限定前駆体細胞またはその誘導体またはそれらの混合物は異種ドナーまたは自己ドナーからのものである。該ドナーは胎児、幼若体または成体である。
哺乳動物ＣＮＳニューロン限定前駆体細胞の純粋な集団を単離する方法は、
（イ）哺乳動物胚幹細胞のサンプルを供給する工程、
（ロ）ニューロン限定前駆体細胞を規定する選択した抗原を発現する亜集団を該哺乳動物胚幹細胞から精製する工程、
（ハ）培養基板上において、支持細胞非依存培養を行うために精製亜集団細胞を、ニューロン限定前駆体細胞の接着増殖を支持するように適合させた培地に播種する工程、および
（ニ）播種した細胞をニューロン限定前駆体細胞の増殖に資する温度および雰囲気中でインキュベートする工程、
を含む。
【図面の簡単な説明】
図１はＮＥＰ細胞とＮＲＰを含むその子孫の免疫反応性の要約を示す。
図２はラットＥ−ＮＣＡＭ+細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、これによりコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ｐ７５、アイリット−１（Ｉｓｌ−１）、カルビンジン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、グルタミナーゼ、およびサイクロフィリン（ハウスキーピング遺伝子）の発現を定量する。
図３は急激に解離したＥ−ＮＣＡＭ+細胞（白抜き）および分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞（斜線）上、神経伝達物質に応答する細胞数をフラン−２カルシウムイオン画像により測定した棒グラフを示す：ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、Ｇｌｙ（グリシン）、ＤＡ（ドーパミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ａｃｈ（アセチルコリン）、ＲＲ（ラット・リンガー液）、５０ｍＭ Ｋ ＲＲ（Ｎａ+をＫ+と置換し、改変したラット・リンガー液）。
図４は急激に解離したＥ−ＮＣＡＭ+細胞からの経時的Ｃａ2+応答の比（Ｉ340／Ｉ380）を図示プロットしたものである。
図５は分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞からの経時的Ｃａ2+応答の比（Ｉ340／Ｉ380）を図示プロットしたものである。
図６は成熟ニューロンのマーカー発現用単一Ｅ−ＮＣＡＭ+クローンのＰＣＲ分析結果を示す。
図７は神経伝達物質に応答する４種のＥ−ＮＣＡＭ+クローンからの細胞百分比をフラン−２カルシウムイオン画像により測定した棒グラフを示す：ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、Ｇｌｙ（グリシン）、ＤＡ（ドーパミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ａｃｈ（アセチルコリン）、ＲＲ（ラット・リンガー液）、５０ｍＭ Ｋ ＲＲ（Ｎａ+をＫ+と置換し、改変したラット・リンガー液）。
図８および９は１種のＥ−ＮＣＡＭ+クローンから記録した細胞２個からのＣａ2+応答の比（Ｉ340／Ｉ380）を図示トレースしたものである。
図１０は骨形態形成プロテイン２（ＢＭＰ−２）のＥ−ＮＣＡＭ+細胞細胞分裂に対する影響をＢＲＤＵ取込みにより測定したものである。
図１１はソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）のＥ−ＮＣＡＭ+細胞細胞分裂に対する影響をＢＲＤＵ取込みにより測定したものである。
図１２はマウスＥ−ＮＣＡＭ+細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、これにより（左端の分子量マーカーに続き左から右へ）ｐ７５、Ｉｓｌ−１、ＣｈＡＴ、カルビンジン、ＧＡＤ、およびグルタミナーゼの発現を定量する。
図１３は分化したマウスＥＳ細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、これにより（左から右へ）ネスチン、Ｎ−ＣＡＭ、ニューロフィラメント−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）、微小細管関連プロテイン２（Ｍａｐ−２）、ＧＦＡＰ、ＤＭ−２０／ＰＬＰの発現を定量する。
図１４は分化したマウスＥＳ細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、これにより（左から右へ）ＣｈＡＴ、ｐ７５、Ｉｓｌ−１、カルビンジン、ＧＡＤ、およびグルタミナーゼの発現を定量する。
発明の詳細な説明
本ニューロン限定前駆体細胞およびその調製法と使用法を開示、説明する前に、本発明は本明細書に開示した特定の構成、製造工程、および物質に限定されるものではなく、かかる構成、製造工程、および物質は多少変化し得るものであることが理解されるべきである。また、本明細書に使用される用語は特定の態様のみを説明するために用いられるものであって、制限しようとする意図のないこと、その理由は本発明の範囲は添付の請求項およびその等価のもののみによって制限されるからと理解すべきものである。
注意しなければならないのは、本明細書および添付の請求項に使用されているように、単数不定冠詞および定冠詞は、前後の関係から明らかに他の意味を示すものでない限り、複数の参照項目を含むことである。このように、例えば、単に「胚」と記載してある場合、２種以上の胚をも包含し、単に「分裂促進因子」と記載してある場合、２種以上の分裂促進因子をも包含し、また、単に「因子」と記載してある場合、２種以上の因子をも包含する。
本発明を説明し、請求範囲を定めるに際し、以下の用語を下記定義に従って使用する。
本明細書に使用する「自己再生」は、例えば、神経上皮幹細胞が分裂して２個の娘細胞を生じ、少なくともその１個を多分化能神経上皮幹細胞とする能力をいうか、あるいはニューロン限定前駆体細胞が分裂して２個の娘細胞を生じ、少なくともその１個をニューロン限定前駆体細胞とする能力をいう。
本明細書に使用する「クローン密度」および同様の用語は、細胞を選択した培養皿に載せたときに、単一の互いに衝突しない細胞を単離することの可能な十分に低い密度をいう。かかるクローン密度の具体例は約２２５細胞／１００ｍｍ培養皿である。
本明細書に使用する「支持細胞非依存接着培養」および同様の用語は、異なる細胞層不存在下におけるin vitroでの細胞増殖をいう。異なる細胞は通常最初に培養皿に播種し、そこに対象組織からの細胞を加えるものである。支持細胞培養において、支持細胞は対象組織からの細胞を接着させるための培養基板を提供し、さらに分裂促進因子および生存因子の供給源として作用する。本明細書にいう支持細胞非依存接着培養では化学的に規定された培養基板、例えば、フィブロネクチンを用い、分裂促進因子または生存因子は、他の細胞または組織からの精製因子または粗製抽出物を含む液体培地を補うことにより供給する。したがって、支持細胞非依存培養では、培養皿内の細胞は主として対象組織から誘導された細胞であり、対象組織から誘導された細胞の増殖を支持するのに必要な他の細胞型を含んでいない。
本明細書に使用する「有効量」とは、増殖因子または生存因子または他の因子の量であって、非毒性であり、しかも所望の効果と性能を提供するのに十分な量を意味する。例えば、本明細書で使用するＦＧＦの有効量は、他の必須栄養、因子などと組合わせて使用する場合に、ＮＥＰ細胞の自己再生および増殖を支持するように選択した量を意味する。ＮＲＰ細胞またはその誘導体またはそれらの混合物を移植するための有効量は、選択した効果を得るために十分な細胞の量または数をいう。ＮＲＰ細胞は通常、約５〜５０，０００細胞／マイクロリッターの濃度で投与される。移植は通常注射部位あたり約１５マイクロリッターまでの容量で行う。しかし、手術後中枢神経系上での移植では多数回このサイズでの容量を必要とする。このように、移植に使用される細胞数は用途によってのみ制限されるが、当業者は過度な実験を実施することなく、かかる数値を決定することができる。
本明細書に使用するＮＲＰ細胞の「誘導体」とは、遺伝的形質導入、分化、または同様の過程によりin vitroでＮＲＰ細胞から誘導した細胞を意味する。
本明細書に使用する「ＮＲＰ細胞を哺乳動物に投与する」とは、かかるＮＲＰ細胞を受容者のＣＮＳ組織またはかかるＣＮＳ組織の隣接位置に移植または埋設することを意味する。かかる投与は手術など技術上周知の方法により、注入カニューレ、注射針などを用い実施することができる。
本明細書に使用する「異種」とは、移植物受容者とは異なる個体、組織または細胞をいう。移植物提供者（ドナー）は移植物受容者と同一種であっても異なる種であってもよい。例えば、移植用ＮＲＰ細胞の異種提供者は移植物受容者とは異なる種のものであってもよい。
本明細書に使用する「自己」とは、自身が生成すること、または体内起源であることをいう。このように、例えば、移植用組織または細胞の自己ドナー（提供者）は移植物を受ける個体と同一の個体である。さらに例示すると、自己細胞とは個体内で生じる、運搬される、あるいは移植される細胞である。in vitroでの取り扱いは細胞の取得とかかる細胞またはその誘導体の移植の間に起こるが、移植の前に必要とされるものではない。
本明細書に使用する「形質転換すること」、「形質導入すること」、「トランスフェクション」および類似の用語は、１個または複数個の遺伝子をＮＲＰ細胞に挿入することまたは移入することを意味し、挿入または移入の方法は問わない。かくして、形質転換はリン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクション、ポリブレン・トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ウイルス感染など、および他の技術上既知の方法により達成し得る。
本発明をラット、マウス、およびヒトから単離したニューロン限定前駆体細胞により説明する。しかし、本発明はすべての哺乳動物ニューロン限定前駆体細胞を包含し、ラット、マウス、およびヒトからのニューロン限定前駆体細胞に限定されるものではない。哺乳動物ニューロン限定前駆体細胞はヒト霊長類、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギなどから単離することができる。
中枢神経系の多能性幹細胞は、直接または系列限定中間前駆体の生成を介して分化したニューロンおよびグリアを生成する。発生分化途上の網膜では、多分化能網膜前駆体はその最終分裂においてさえ分化した細胞の任意の組み合わせを生成し得ると思われ、中間的な前駆体は存在しないことを示している。それに対して、中枢神経系の他の領域では、レトロウイルス標識による研究が、唯一型の細胞または限定数の細胞型を生成する系列限定前駆体の存在を示唆していた。中間段階の前駆体、例えば、２種の異なった組織に発育し得るオリゴデンドロサイト−タイプ−２−星状膠細胞前駆体（Ｏ−２Ａ）およびニューロン前駆体が組織培養の研究においても記載されていた。さらに、多能性胎児もしくは成人幹細胞またはニューロンとグリアに分化し得る他の幹細胞からの中間系列限定前駆体の生成は最近まで観察されていなかった（すなわち、米国特許出願連続番号０８／９０９，４３５、１９９７年７月４日出願）。このように、培養において同定された多能性幹細胞とin vivoおよびin vitroで同定された委任前駆体との直系関係はこれまで未知であった。発生の可能なモデルは（１）直系関係細胞を代表する多能性およびより委任的幹細胞、または（２）独立した分化経路を代表するような細胞を包含する。
発生途上のラット脊髄はこの分化を研究するための理想的なモデルである。胎児期１０．５日（Ｅ１０．５）の尾部神経管はin vivoおよびin vitroでのネスチン−免疫反応分裂細胞の均一集団と思われる。これらの初期均一細胞は数日にわたってパターン形成され、ニューロン、希突起膠細胞、および特徴的な空間的側頭翼形の星状膠細胞を生成する。神経組織発生が先ず腹側−背側勾配上に起こり、同時に最初期のニューロンがラットＥ１３．５に分裂終了となる。神経組織発生はさらに２日間にわたり継続し、希突起膠細胞前駆体の分化と引続いての星状膠細胞の分化が続く。
未分化細胞として、Ｅ１０．５ラット胚から単離した感覚上皮幹（ＮＥＰ）細胞をより長期間in vitroで増殖する方法は米国特許出願連続番号０８／８５２，７４４に記載されており、さらに、これらの集団がＣＮＳにおいて３種の主要細胞型を生成し得ることが示されている。このように、ＮＥＰ細胞は中間の神経芽細胞を経て、あるいは直接その終末分化の一部としてニューロンに分化する分割多分化能幹細胞に相当する。ニューロンがＮＥＰ細胞から中間体のより限定された前駆体を経て分化されるのか否かを決めるために、ＮＥＰ細胞の分化途上培養物からの、免疫学的に規定された種々の集団を単離し、特性化した。形態学的に、また表現型としてＮＲＰ細胞に一致する細胞をＮＥＰ細胞培養物から単離し得ることをここに示す。クローン分析は、個々のＮＥＰ細胞はニューロン前駆体の生成を経てニューロンを生成すること、また、個々のＮＥＰ細胞はニューロン限定前駆体およびグリア限定前駆体を生成し得ることを示す。さらに、Ｅ−ＮＣＡＭ+（胎児性神経細胞接着分子陽性）細胞がＥ１３．５神経管培養物中に存在すること、また、これらの細胞は、多重ニューロン表現型を生成するが、星状膠細胞または希突起膠細胞は生成しない有糸分裂性自己再生幹細胞であることが示されている。このように、ニューロン限定前駆体（ＮＲＰ）はニューロンのin vivo分化において同定し得る段階である。さらに、ＮＲＰはマウス胚、マウス胎児性幹（ＥＳ）細胞、およびヒト胎児性脊髄から単離し、培養することができる。これらのデータは多分化能幹細胞とニューロン限定幹細胞間の直系関係を証明し、神経分化が発生運命において進行性の限定を伴うことを示唆する。
図１は脊髄分化のモデルを示す。このモデルは造血に対して、また、神経冠分化に対して提案されたモデルに似ている（アンダーソン（D.J. Anderson）の総説参照；神経冠系列の問題：神経産生？、３ Neuron １〜１２（１９８９））。このモデルによると、ＮＥＰ細胞１０はネスチンを発現する（すなわち、ネスチン+）が、他の系列マーカーは発現しない（ｌｉｎ-）尾部神経管の均一な細胞集団に相当する。これらの細胞は培養により分化、自己再生し、分化した表現型を生成する。これまでのデータはより限定的な潜在能力をもつ中間分割途上の前駆体を示唆していた。かかる前駆体は、希突起膠細胞１８および星状膠細胞２２を生成するグリア限定前駆体１４、ならびに数種のニューロン３０、３４を生成するニューロン始原細胞２６を包含する。該モデルは神経冠幹細胞３８がＰＮＳニューロン４２、シュワン細胞４６および平滑筋細胞５０に分化可能であって、ＮＥＰ細胞からも生じてくることを示している。したがって、該モデルは多分化能前駆体（ＮＥＰ細胞）が中間的前駆体を経て分化した細胞（すなわち、希突起膠細胞、２型星状膠細胞、１型星状膠細胞、ニューロン、運動性ニューロン、ＰＮＳニューロン、シュワン細胞、および平滑筋細胞）を生成することを示唆する。このモデルと矛盾せず、ここではニューロン限定増殖潜在能力を有する細胞の存在を示す結果を提出する。
ＮＥＰ細胞培養物は分化した細胞を型分け分類することの可能な大規模一過性細胞供給源を提供する。本明細書に記載した結果は、初期多分化能細胞が、ＣＮＳ内で異なる表現型を生成する外因性の影響下で、発生潜在能力において進行性の制限を受けると説明するモデルを支持する直接の証明を提供する。証明は、初期多分化能ＮＥＰ細胞がニューロン限定前駆体をin vitro生成し、かかるニューロン限定前駆体がin vivoでも存在するというものである。ＮＲＰは、芽球の基準をまっとうすること、また、多分化能幹細胞とより限定されたＮＥＰ細胞との間に直系関係が存在することをも示す。
本明細書に提出された結果は、Ｅ−ＮＣＡＭ−免疫反応性細胞がその発生潜在能力において限定されることを支持する。Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は試行したいずれの培養条件でも希突起膠細胞または星状膠細胞に分化し得なかった。それに対して、ＮＥＰ細胞はニューロン、星状膠細胞および希突起膠細胞に分化し、また、Ａ２Ｂ５−免疫反応性細胞は同じ条件下で希突起膠細胞に分化した。このような理由で、Ｅ−ＮＣＡＭ−免疫反応性細胞は本明細書においてニューロン限定前駆体またはＮＲＰとして記載する。
免疫選別および二重標識データが証明するところによると、Ｅ−ＮＣＡＭは多分化能ＮＥＰ細胞から生成する特異ニューロン亜系列を同定するのに使用することができる。しかし、造血系および神経冠における中間前駆体のマーカー同様に、Ｅ−ＮＣＡＭ、およびさらにＡ２Ｂ５グリア前駆体マーカーは中間前駆体に対してユニークではない。Ｅ−ＮＣＡＭはある種の星状膠細胞を標識することが示されている。同様に、Ａ２Ｂ５はある種においてニューロンを認識し、ある培養条件下で星状膠細胞により過渡的に発現されることが示されている。それにもかかわらず、本明細書に規定した特定培養条件下で、これらのマーカーは中間前駆体を選択するのに使用することが可能であり、したがって、発生潜在能力の制限と調和して共発現する最初の細胞表面エピトープを代表する。
本明細書に記載した実験に使用する基礎培地（ＮＥＰ培地）はＤＭＥＭ−Ｆ１２（ギブコ／ＢＲＬ、ゲイターズバーグ、メリーランド）からなり、これに１００μｇ／ｍｌトランスフェリン（カルビオケム、サンジエゴ、カリフォルニア）、５μｇ／ｍｌインシュリン（シグマ・ケミカル（株）、セントルイス、ミズーリ）、１６μｇ／ｍｌプトレッシン（シグマ）、２０ｎＭプロゲステロン（シグマ）、３０ｎＭ亜セレン酸（シグマ）、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ギブコ／ＢＲＬ）、プラスＢ２７添加物（ギブコ／ＢＲＬ）、２０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および１０％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）を補足したものである。一般に、これらの添加物は使用時まで１００倍の濃縮物として−２０℃で貯蔵した。通常、ＮＥＰ培地２００ｍｌをＣＥＥ以外のすべての添加物により調製し、調製から２週間以内に使用した。ＣＥＥは培養細胞の給飼時にＮＥＰ培地に添加した。
ＦＧＦおよびＣＥＥは以下の記載に従い調製した；ステンプルおよびアンダーソン（D.L. Stemple ＆ D.J. Anderson）、上記；ラオおよびアンダーソン（M.S. Rao ＆ D.J. Anderson）、上記；ソマーズ（L. Sommers）ら、哺乳動物の神経組織発生におけるｂＨＬＨ転写因子ＭＡＳＨ１の細胞性機能、１５ Neuron １２４５〜５８（１９９５）（参照により本明細書に取込む）。ＦＧＦは市販品としても入手し得る（ＵＢＩ）。
簡単には、ＣＥＥは以下のように調製した。鶏卵を湿潤大気中３８℃で１１日間孵化した。卵を洗い、胚を取出して、滅菌最少必須栄養素培地（グルタミンおよびアールの塩含有ＭＥＭ）を容れたペトリ皿に４℃で置いた。約１０個の胚をそれぞれ３０ｍｌ注射筒を通して５０ｍｌ容量試験管に移し、ばらばらに解離させた。この手法により通常約２５ｍｌの培地を得た。２５ｍｌそれぞれにＭＥＭ２５ｍｌを加えた。試験管を４℃に１時間揺り動かした。滅菌ヒアルロニダーゼ（胚２５ｇあたり１ｍｇ）（シグマ）を加え、混合物を３０，０００ｇで６時間遠心分離した。上清を集め、０．４５μｍフィルターを、次いで０．２２μｍフィルターを通し、使用時まで−８０℃に保存した。
ラミニン（バイオメディカル・テクノロジー・インク）を蒸留水に溶かして２０ｍｇ／ｍｌ濃度とし、組織培養板（ファルコン）に塗付した。フィブロネクチン（シグマ）を再懸濁し、原液濃度１０ｍｇ／ｍｌとして−８０℃に保存し、次いで、Ｄ−ＰＢＳ（ギブコ／ＢＲＬ）中２５０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。フィブロネクチン溶液を組織培養皿に入れ、直ちに取り除いた。引続き、ラミニン溶液を入れ、培養板を５時間培養した。過剰のラミニンを除き、培養板を風乾した。被覆した培養板を水ですすぎ、再度風乾した。フィブロネクチンをＮＥＰ細胞の増殖基質として選んだが、その理由はＮＥＰ細胞がコラーゲンまたはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）には接着せず、また、ラミニンには僅かしか接着しなかったからである。このように、ＮＥＰ細胞を培養物中に維持するための以降の実験はすべてフィブロネクチン被覆皿上で実施した。しかし、ラミニン被覆皿もＮＥＰ幹細胞の分化を促進するために使用した。
クローン分析用に、トリプシン処理によって収獲した細胞は３５ｍｍ皿１枚あたり５０〜１００個の細胞密度で塗付した。個々の細胞は皿上で同定し、位置を決めて油性鉛筆によりその位置に印を付けた。細胞は上記のように、１０〜１５日間、添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で増殖させた。
本発明の細胞は製剤組成物を含む組成物の調製に使用してもよく、該組成物は適切に製剤化し、関連する神経組織の傷害、疾患、または他の変性から生じる欠損、衰弱、および他の機能障害を治療、矯正するために投与される。非限定例により示すと、本発明により調製される適切な細胞は、例えば、細胞の傷害または衰弱の起こっている症例を治療するために、細胞置換療法実施の手段として内移植により投与することができる。このように、例えば、該細胞は適切な増殖培地、例えば、増殖および分化促進のための培地中で調製することができる。適切な培地とは、例えば、増殖または分化因子（例、レチノイン酸、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、またはＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦなどの神経向性因子（neutrophins）の１または2以上のメンバー）を含む。かかる培地においてこのように適切に調製した細胞は鞘内、Ｉ．Ｖ．、Ｉ．Ｐ．、あるいは標的部位に細胞調製物を最も良好に導入し得るいずれかの適所または手段により導入することになる。この型の投与の詳細は多様であり、内科医または開業医の技量範囲内のものである。
本発明の細胞は種々の診断応用面でさらに有用であり、例えば、スクリーニング検定（例、ニューロンマーカーおよび他の結合パートナーまたはリガンド、モジュレーターまたは細胞増殖および／または分化のモジュレーターとして機能する他の因子）に使用するために調製し得る。また、本発明の細胞は、例えば、細胞増殖と分化における欠陥およびその原因となる因子を同定するためのアッセイの陽性対照としても使用し得る。
本発明の細胞は多様な治療適用に利用することもできる。例えば、傷害、疾患または遺伝子的原因によるニューロン欠損と関連する種々の細胞衰弱、機能障害または他の不規則性もしくは異常を治療するために、かかる治療を必要とする個体に投与する目的で、製剤組成物および適切な担体の製剤とする。ここで予期される病弊または症状はパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、傷害または外傷による機能障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、および無脳症を包含する。
実施例１
分裂するニューロン限定前駆体が、インビボで通常存在するか否かを決定するために、Ｓ１３．５ラット脊髄を、初期のニューロンマーカーのパネルを用いて分析した。妊娠１３．５日目で新鮮に凍結した胚の切片を切断し、次いで免疫組識化学によって標識した。染色手順は、当該分野において周知の方法に従って行った。細胞を、Ｅ−ＮＣＡＭ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Iｏｗａ）およびβ−IIIチューブリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Mｉｓｓｏｕｒｉ）に対する抗体で染色するか、またはＥ−ＮＣＡＭで染色し、およびＤＡＰI（全ての細胞を同定するための核マーカー）で対比染色した。全ての二次モノクローナル抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ由来であった。
ポリシアル酸化されたまたは胚のＮ−ＣＡＭ（Ｅ−ＮＣＡＭ）は、ニューロン前駆体についてのマーカーであるようであった。Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性は、先ず、Ｅ１３．５で検出された。Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、神経管の縁において見ることができたが、増殖する室帯域においては、見ることができなかった。β−IIIチューブリンでの二重標識は、ほとんどのＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が、このニューロンマーカーを同時発現したことを示す。より中央に存在する細胞の小さな割合は、Ｅ−ＮＣＡＭ+であったが、β−ＩＩＩチューブリン免疫反応性を発現せず、このことは、Ｅ−ＮＣＡＭが、β−ＩＩＩチューブリンの前に発現されるニューロン前駆体への分化の初期のおよび特異的なマーカーであり得ることを示唆する。
実施例２
Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を特徴付けするために、Ｅ１３．５脊髄を解離し、そしてＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を、抗体のパネル（表１）で染色した。Ｓｐｅａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの胚を、胚の１３．５日齢で取出し、そして、ＨＡNＫの平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含有するペトリディッシュ中に置いた。胚の体幹切片を、タングステン針を使用して切開し、リンスし、次いで新鮮なＨＢＳＳに移した。周囲の結合組織がない脊髄を、鋭くした５番の鉗子を使用して切開した。単離した脊髄を、０．０５％トリプシン/ＥＤTＡ溶液中で、２０分間、インキュベートした。トリプシン溶液を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する新鮮なＨＢＳＳで置換えた。切片を、パスツールピペットで、穏やかに突き崩し、解離させた。解離された細胞を、ＰＬＬ/ラミニンでコートした３５ｍｍディッシュ（Nｕｎｃ）中に、高密度で置き、そして２４時間後に染色した。
細胞表面マーカー（例えば、Ａ２Ｂ５およびα−Ｇａｌｃ）についての染色を、生存する細胞の培養物を用いて行った。内部抗原（例えば、ＧＦＡＰ（これは、神経星状細胞を特異的に認識する（Ａ．Ｂｉｎｇｎａｍｉら、神経星状細胞における膠原線維酸性タンパク質の、免疫蛍光による局在化、４３ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４２９−３５（１９７２））、β−ＩＩＩチューブリン（ＤＡＫＯ）、およびＲT−９７（これは、ニューロンを染色する（Ｅ．Ｇｅｉｓｅｒｔ & Ａ．Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ、ラットにおけるクラスβ−チューブリンの免疫染色によって可視化される、傷に対するニューロン応答、１０２ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１３７−４１（１９８９）、ネスチン（これは、未分化の幹細胞についてのマーカーである（Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌら、ＣNＳ幹細胞は、中間線維タンパク質の新規なクラスを発現する、６０ Ｃｅｌｌ ５８５−９５（１９９０）、または５−ブロモデオキシウリジン（Ｂｒｄｕ、Ｓｉｇｍａ）（これは、分裂する細胞の数を決定するためのマーカーである）に対する抗体で細胞を染色するために、培養物を、氷冷メタノール中で固定した。二重または三重標識化の実験を、一次抗体、続いて非交差反応性の二次抗体の適切な組合せ中で細胞を、同時にインキュベートすることによって行った（例えば、Ｍ．Ｍａｙｅｒら、毛様体神経栄養性因子および白血病阻害因子は、希突起膠細胞の産生、成熟、および生存を促進する、１２０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２−５３（１９９４）（本明細書中に参考として援用される））。三重標識実験において、培養物を、ブロッキング緩衝液中で、１時間、一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳでリンスし、そして、ブロッキング緩衝液中で、１時間、種特異的二次抗体とともにインキュベートした。培養物をＰＢＳで３回リンスし、そして蛍光顕微鏡下で試験した。同時の４つの抗体での標識のために、生存細胞を、先ず、二次層を伴わないで表面抗体Ａ２Ｂ５およびα−Ｇａｌｃとともにインキュベートした。次いで、細胞を、氷冷メタノール中で、１０分間、固定し、そして、α−β−ＩＩＩチューブリンおよび適切な二次抗体で染色した。この染色（通常はネガティブである）の結果をスコアリングした後、クローンを、ＧＦＡＰおよび二次層（最初のセットの表面抗体について）で染色した。最後に、ＧＦＡＰについての二次抗体を添加した。この手順は、３つの蛍光−色結合二次抗体のみを使用する、４つの抗体での染色を許容する。
Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、播種の２４時間後の解離された培養物に存在する全ての細胞の６０％±３％を構成した。残存する細胞の大多数は、Ａ２Ｂ５-であった。発生のこの段階で、Ａ２Ｂ５免疫反応性の細胞は、神経膠細胞前駆体細胞であることが、米国特許出願第０８/８５２，７４４号において示されている。これらの結果と一致して、β−ＩＩＩチューブリンまたはＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、Ａ２Ｂ５を同時発現しなかった。培養したＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞の非常に大多数（８５％±８％）が、β−ＩＩＩチューブリン免疫反応性およびネスチン免疫反応性を同時発現したが、神経膠細胞前駆体免疫反応性の特徴であるマーカーを発現しなかった。約２０％のＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、２４時間中に分裂した。分裂するＥ−ＮＣＡＭ+細胞の大部分は、β−IIIチューブリンを同時発現せず、このことは、細胞のこの集団は、分裂する神経芽細胞を示し得ることを示す。
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より長い標識化期間を伴うこれらの条件下で、より高いパーセントの細胞が分裂することが観察されるか否かは、未だ知られていない。しかし、この集団が、分裂にもはや従事しない、ニューロン分化に十分に拘束される細胞のサブセットを含んだ場合であっても、これらの拘束されるニューロンは、組織培養における拡張および分裂を伴う集団から排除される。表２は、細胞の抗原プロフィールの結果をまとめ、種々の他の抗原を発現するＥ１３．５胚由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞のパーセントを示す。これらの結果は、Ｅ１３．５脊髄由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞が、ニューロンのマーカーを発現するが、神経膠細胞のマーカーを発現しないことを示す。
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実施例３
Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞の分化能を決定するために、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を、免疫パンニングによって精製して、格子化ディッシュ中にクローン密度で置いた。Ｅ１３．５細胞を、実施例２の手順に従って調製した。Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞集団を、Ｌ．Ｗｙｓｏｃｋｉ & Ｓａｔｏ、リンパ球についての「パンニング」：細胞選択のための方法、７５ Ｐｒｏｃ．Nａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２８４４−４８（１９７８）：Ｍ．ｍａｙｅｒら、前出（本明細書中に参考として援用される）の手順に従って、特異的な抗体捕獲技術を使用して、これらのＥ１３．５細胞から精製した。簡潔には、細胞をトリプシン処理し、そして得られる細胞懸濁液を、Ａ２Ｂ５抗体でコートしたディッシュ上に置き、全てのＡ２Ｂ５+細胞を、プレートに結合させた。上清を除去し、そしてプレートを、Ｊ．ＢｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＧ．Ｓａｔｏ、血清非含有補充培地中でのラット神経芽腫細胞株の増殖、７６ Ｐｒｏｃ．Nａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５１４−１７（１９７９）（本明細書中に参考として援用される）によって記載される付加物を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＢＳ）で洗浄した。次いで上清を、Ｅ−ＮＣＡＭ−抗体でコートしたディッシュ上に置き、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を結合させた。結合した細胞を、プレートから掻爬し、そしてフィブロネクチン／ラミニンでコートしたガラスカバーガラス上で、３００ｍｌ ＤＭＥＭ−ＢＳ±増殖因子中に、５０００細胞／ウエルで、再プレートした。
プレートをコート化するために、Ａ２Ｂ５およびＥ−ＮＣＡＭ抗体を、５μｇ/ｍｌの濃度で使用した。細胞を、２０〜３０分間、３７℃のインキュベーター中で、プレートに結合させた。増殖因子を、１０ｎｇ/ｍｌの濃度で、一日おきに添加した。組換えｂＦＧＦおよびニューロトロフィン３（ＮＴ−３）を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入し、そしてレチノイン酸（ＲＡ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。
２４時間後、いくつかの免疫パンニングしたＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例２の手順に従って、免疫細胞化学によってアッセイした。９５％を越える細胞が、この時点でＥ−ＮＣＡＭ+であった。精製し、そして染色した細胞を、格子化クローンディッシュ上に置き、そして個々のＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例２の手順に従って免疫細胞化学によって同定し、そして経時的に追跡した。
試験した全てのサイトカインのうち、至適な増殖が、細胞をＦＧＦ（１０ｎｇ/ｍｌ）およびＮＴ−３（１０ｎｇ/ｍｌ）中で培養した場合に観察された。ＦＧＦおよびＮＴ−３の存在下で、１つのＥ−ＮＣＡＭ+細胞が培養において分裂して、１００〜数１００個の細胞にわたるコロニーを生成した。５日目までに、大部分のコロニーは、これはＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性を発現し続ける２０と５０との間の娘細胞を含んでいた。娘細胞は、明相であり、そして短い突起を有した。この段階で、大部分のＥ−ＮＣＡＭポジティブ細胞は、β−ＩＩＩチューブリンも神経線維−M免疫反応性も発現しなかった。
Ｅ−ＮＣＡＭ+クローンの分化を促進するために、ＦＧＦ−およびＮＴ−３含有培地を、レチノイン酸（ＲＡ）を含有する培地で置換え、ここから、マイトジェン、ｂＦＧＦを抑えた。この分化培地において、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は分裂を停止し、そして広範なプロセスを生成し、そしてニューロンマーカーを発現し始めた。全ての細胞を同定するための、ニューロンマーカーおよび神経膠マーカー、ならびにＤＡＰＩ組識化学でのクローンの四重標識化は、全てのクローンが、β−ＩＩＩチューブリン免疫反応性の細胞および神経線維−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）免疫反応性の細胞を含んだこと、ならびにＥ−ＮＣＡＭ+クローンのいずれもが、希突起膠細胞または神経星状細胞に分化しなかったことを示した。
表３は、ＤＡＰＩ、α−β−ＩＩＩチューブリン、Ａ２Ｂ５、およびα−ＧＦＡＰでの124個のＥ−ＮＣＡＭ+クローンの四重標識化によって得られた。
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実施例４
この実験において、実施例２の手順に従って、切開したＥ１３．５脊髄に由来する免疫パンニングしたＡ２Ｂ５+細胞を、ニューロン促進培地（すなわち、規定培地＋ＦＧＦおよびＮＴ−３）中で培養した。培養物を、５日間、増殖し、次いで、実施例３において記載されるようにＲＡ含有培地に切り替え、そして姉妹プレートをＥ−ＮＣＡＭまたはＡ２Ｂ５免疫反応性のいずれかについて染色した。
Ａ２Ｂ５免疫パンニングした細胞は、ニューロン細胞の増殖を促進する条件下で増殖される場合、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性を発現しなかった。しかし、全てのＡ２Ｂ５免疫パンニングした細胞は、Ａ２Ｂ５免疫反応性を発現し続け、このことは、ニューロン促進条件が、神経膠前駆体細胞の生存および増殖に影響しないことを示す。従って、実施例３において希突起膠細胞および神経星状細胞の分化を検出できないことは、Ｅ−ＮＣＡＭ＋前駆体から分化したかもしれない希突起膠細胞および星状細胞の、ニューロン培養における死に起因しないようであった。なぜなら、ＦＧＦおよびＮＴ−３の存在下で平行して精製および増殖したＡ２Ｂ５神経膠前駆体細胞は、みかけの細胞死を伴わずにＡ２Ｂ５を発現し続け、そして健常な希突起膠細胞および神経星状細胞を、培養の１０日後に生成したからである。さらに、Ａ２Ｂ５+細胞は、ＦＧＦおよびＮＴ−３の存在下でニューロンを決して生成せず、および試験した任意の時点で、Ｅ−ＮＣＡＭの発現を示さなかった。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、Ａ２Ｂ５免疫反応性の神経膠拘束性前駆体とは異なり、希突起膠細胞に分化し得ず、そして多能性のＥ1０．5の神経上皮細胞に比較する場合、ニューロン分化に制限されるようであった。
実施例５
本発明の系において、Ｅ−ＮＣＡＭは、ニューロン拘束性の前駆体細胞を同定することが明らかに示されたが、発生の後期の段階で、ある神経膠前駆体細胞がまた、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性を発現し得ることが報告された。この観察は、本明細書において記載される方法によって同定されるいくつかのＥ−ＮＣＡＭ+細胞が、二分化能であり得るという可能性を提起する。この可能性を試験するために、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を、ニューロン促進培地（ＦＧＦ＋ＮＴ−３）中または神経膠促進培地（ＦＧＦ＋１０％胎児ウシ血清）中のいずれかにクローンでプレートし、そしてそれらの発生について試験した。１０％ウシ胎児血清培地を含有する培地を、米国特許出願第０8／852,744号において示されるように、この培地が脊髄ＮＥＰ細胞およびＡ２Ｂ５免疫反応性のＡ２Ｂ５神経膠前駆体細胞の両方の神経星状細胞分化を促進するので、神経膠分化について選択した。ニューロン促進培地中で増殖した全てのＥ−ＮＣＡＭ+クローン（２４／２４）は、８日後にβ−ＩＩＩチューブリン+細胞のみを含んだが、血清含有培地中で増殖したクローンは、神経星状細胞を生成せず、そして増殖しなかった。神経膠促進条件において増殖した合計９７個のＥ−ＣＡＭ+細胞のうち、９０個のクローン（９２％）は、２４時間後、単一の死細胞から構成されたが、残りの７個のクローン（８％）は、４８時間後に１または２個の死細胞を含んだ。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、神経膠前駆体細胞とは対照的に、神経星状細胞促進条件において増殖も分化もできない。
実施例６
ニューロンの生成に対するＥ−ＮＣＡＭ+細胞の拘束はまた、ニューロンのある亜類型の生成に対する拘束を含むか否かを決定するために、ＦＧＦの不在下でＲＡおよびＮＴ−３中で増殖したＥ−ＮＣＡＭ+クローンを、異なる神経伝達因子の発現について試験した。この実施例において使用した抗体を、表４において記載する。
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これらの結果は、個々のクローンが、ＧＡＢＡ−作動性、グルタミン酸作動性、およびコリン作動性のニューロンを生成し得たことを示す。試験した１０個のクローンのうち、全てが、グルタミン酸作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびコリン作動性のニューロンを含んだ。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、分化するニューロンに制限されるが、興奮性ニューロン、阻害性ニューロン、およびコリン作動性ニューロンを生成し得る。
実施例７
実施例５の手順に従って、ＦＧＦおよびＮＴ−３中で増殖した、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞の一次クローンは、培養の７〜１０日後、大きなサイズの数百個の細胞に増殖し、このことはある程度の自己再生を示す。Ｅ−ＮＣＡＭ+集団の長期の自己再生を実証するために、選択したクローンを、二次および三次の継代培養によって追跡した。Ｅ１３．５脊髄由来の個々のＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、フィブロネクチン／ラミニン中に置き、そしてＦＧＦおよびＮＴ−３の存在下で７日間拡張した。５個の個々のクローンをランダムに選択し、そして同じ拡張条件を使用して、クローン密度で再プレートした。二次クローンの数を計数し、そして大きなクローンを選択し、そして再プレートした。得られた三次クローンの数を計数し、次いで、クローンをＦＧＦおよびＲＡを置き換えることによって有糸分裂後のニューロンに分化するように誘導した。
試験した全てのクローンは、多数の娘クローンを生成し、これは、続いて三次クローンを生成した。小さなクローンおよび非常に大きなクローンは、類似の自己再生能を示した。三次クローンを、ＲＡを含有し、ＦＧＦを欠損する培地に切り替えた場合、クローン中の大多数の細胞が、β−ＩＩＩチューブリンを発現する有糸分裂後ニューロンに分化した。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、長期の自己再生が可能であり、そしてニューロンを生成し得る複数の娘細胞を生成し得る。
これらの結果は、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性が、複数の継代後であっても、培養において複数のニューロン表現型に分化し得る神経芽細胞を同定することを示唆する。ＮＴ−３およびＦＧＦは、増殖段階において、芽細胞を維持するために必要とされるのに対して、ＲＡは分化を促進する。
実施例８
Ｅ１０．５脊髄に由来する個々のＮＥＰ細胞が、Ｅ−ＮＣＡＭ反応性であり、多能性であり、ニューロン、神経星状細胞、および希突起膠細胞を生成し得る細胞の自己再生集団であることが示されている（米国特許出願第０８/８５２；７４４号）。ＮＥＰ前駆体からのニューロン分化が、Ｅ−ＮＣＡＭ−中間ニューロン前駆体細胞の生成を含むか否かを決定するために、インビトロで分化するように誘導されるＮＥＰ細胞培養物を、Ｅ−ＮＣＡＭ＋免疫反応性細胞の存在について試験した。
ＮＥＰ細胞を、出願番号第０8／852,744号において記載される方法に従って調製した。簡潔には、Ｓｐｒａｑｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの胚を、Ｅ１０．５（１３〜２２体節）で取出し、そしてＣａ／Ｍｇ非含有のＨａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むペトリディッシュ中に置いた。胚の体幹切片（最後の１０体節）を、タングステン針を使用して切開し、リンスし、次いで、新鮮なＨＢＳＳに移した。体幹切片を、１０から１２分間、１％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中で、４℃でインキュベートした。トリプシン溶液を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含有する新鮮なＨＢＳＳで置換えた。切片を、パスツールピペットで穏やかに崩し、そして周囲の体節および結合組織がない神経管を放出した。単離した神経管を、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に、さらに1０分間、移した。細胞を、突き崩すによって解離させ、そして３５ｍｍの、フィブロネクチンでコートされたディッシュにおいてＮＥＰ培地中に高密度でプレートした。細胞を、５％ ＣＯ2／９５％空気中、３７℃にて維持した。細胞を、プレートした１から３日後に、低密度（すなわち、３５ｍｍプレートあたり５０００細胞以下）で再プレートした。次いで、いくつかのディッシュからの細胞を、トリプシン処理（００５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液、２分間）によって採集した。次いで、細胞をペレット化し、小容量中に再懸濁し、そして計数した。約５０００個の細胞を、３５ｍｍディッシュ（ＣｏｒｎｉｎｇまたはＮｕｎｃ）中にプレートした。
Ｅ１０．５胚に由来するＮＥＰ細胞を、ＦＧＦおよびＣＥＥの存在下で、５日間、拡張し、そしてＣＥＥの存在下でラミニン上に再プレートすることによって分化させた。分化するＮＥＰ細胞を、Ｅ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＧａｌＣに対する抗体で三重標識した。これは、ＮＥＰ細胞から分化したＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が、神経星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）または希突起膠細胞マーカー（ＧａｌＣ）を発現しなかったことを示した。姉妹プレートを、Ｅ−ＮＣＡＭおよびネスチンに対する抗体で二重標識した。これは、ＮＥＰ細胞から分化したＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が、ネスチンを同時発現することを示した。分化するNEP細胞を、ＢｒｄＵとともに２４時間インキュベートし、そして続いて、ＢｒｄＵおよびＥ−ＮＣＡＭに対する抗体で二重標識した。これは、大部分のＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が２４時間内に分裂したことを示した。このより高い標識速度は、以前の実験と比較した単離手順における差異を反映し得る。表５に、Ｅ１０．５のＮＥＰ細胞に由来するＥ−ＮＣＡＭ+細胞の抗原プロフィールをまとめる。ＮＥＰ由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、Ｅ１３．５のＥ−ＮＣＡＭ+細胞に抗原的に類似し、Ｅ１３．５のＥ−ＮＣＡＭ+のように、試験した神経膠マーカーを全く発現しなかった。
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従って、誘導したＮＥＰ培養物は、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を含む複数の表現型を含んだ。Ｅ１３．５のＥ−ＮＣＡＭ+細胞と同様に、ＮＥＰ由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、神経膠マーカーを発現しなかったが、β−ＩＩＩチューブリン（２０〜３０％）およびネスチン（７０〜８０％）の免疫反応性を同時発現した。パンニングしたＥ−ＮＣＡＭ+細胞のうちの９０％が、培養においてＢｒｄＵを取込み、従って、Ｅ１３．５のＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞に類似するようであった。
実施例９
単一のＮＥＰ由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞がまた、それらの分化能においてニューロンに拘束されるか否かを決定するために、細胞をクローン培養において研究した。ＮＥＰ細胞を、米国特許出願第０８／８５２，７４４号において記載されるように、ラミニン上に再プレートし、そしてＣＥＥを除去することによって分化するように誘導した。Ｅ１０．５胚に由来するＮＥＰ細胞を、ＦＧＦおよびＣＥＥの存在下で、５日間、拡張し、そしてＣＥＥの不在下でラミニン上に再プレートすることによって分化させた。次いで、免疫パンニングしたＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を、フィブロネクチン／ラミニンでコートしたクローン格子化ディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）上にプレートし、そして単一の細胞を培養において追跡した。５日後、クローンをＲＡに切り替え、そしてＦＧＦを除去した。クローンを、さらに３日間、増殖させ、パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＡ２Ｂ５、ならびにＧＦＡＰおよびβ−ＩＩＩチューブリンに対する抗体で三重標識した。さらに、細胞をＤＡＰＩで対比染色して、個々の細胞核を示した。表６は、研究した全ての４７クローンの染色の結果をまとめる（４７個のうちの８個が、再プレートを生存しなかった）。いずれのクローンも、神経星状細胞（ＧＦＡＰ+）細胞または神経膠前駆体細胞（Ａ２Ｂ５+）を含まなかったことに注意のこと。
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細胞を分化するように誘導した４８時間後、細胞の１０〜３０％が、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性を発現し始めた。ＮＥＰ細胞由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例３の手順に従って免疫パンニングすることによって選択し、そして個々のＥ−ＮＣＡＭ+細胞をＦＧＦおよびＮＴ−３を含有する培地中にプレートし、そしてクローンを、１０日後に分析した。
全てのクローンは、Ｅ−ＮＣＡＭ+／β−ＩＩＩチューブリン+細胞のみを含んだが、ＧＦＡＰ免疫反応性細胞およびＡ２Ｂ５免疫反応性細胞を含まなかった。さらに、個々のＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、親のＮＥＰ細胞集団から神経星状細胞および希突起膠細胞の分化を促進する培養条件下で、希突起膠細胞または神経星状細胞に分化できなかった。Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、高濃度のＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、規定された培地中で、分裂する前駆体細胞のように維持され得た。最大３ヶ月まで維持されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、β−ＩＩＩチューブリン+成熟ニューロンに容易に分化され得、これは、ラミニン上で増殖されＲＡに曝露される場合、多様な神経伝達物質表現型を発現した。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、それらの分化能、抗原プロフィールにおいて、および分裂する前駆体細胞集団のように拡張される増殖についての至適な条件において、Ｅ１３．５のニューロン前駆体に類似する。
実施例１０
明らかに同質のネスチン+／Ｅ−ＮＣＡＭ-細胞集団からのＥ−ＮＣＡＭ+集団の分化は、発生運命における前進的な拘束を示唆する。ありそうにはないが、個々のＮＥＰ細胞は、神経芽細胞または神経膠芽細胞を生成するように予め拘束され得ることが考えられ得た。この可能性を除外するために、個々のＮＥＰクローンを、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞およびＡ２Ｂ５免疫反応性の細胞を生成するそれらの能力について試験した。Ａ２Ｂ５免疫反応性が、発生のこの段階で希突起膠細胞−神経星状細胞前駆体に独特であることが示されていたので、Ａ２Ｂ５およびＥ−ＮＣＡＭを選択した。Ｅ１０．５胚に由来するＮＥＰ細胞を、ＦＧＦおよびＣＥＥの存在下で、５日間、拡張し、トリプシン処理によって採集し、そして格子化クローンディッシュにクローン密度で再プレートした。培養の７日後、個々のクローンを、実施例２の手順に従って、Ｅ−ＮＣＡＭおよびＡ２Ｂ５に対する抗体で二重標識した。培養において追跡した１１２個のＮＥＰクローンのうち、８３％は、Ａ２Ｂ５およびＥ−ＮＣＡＭの両方の免疫反応性細胞を生成した。５％のクローンは、Ａ２Ｂ５免疫反応性の細胞のみからなり、そして１２％のクローンは、Ａ２Ｂ５免疫反応性およびＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性のいずれについても確信させる染色を示さなかった。試験した全てのクローンにおいて、Ｅ−ＮＣＡＭおよびＡ２Ｂ５は、重複しない集団において発現された。すなわち、いずれの細胞も、両方のマーカーを同時発現しなかった。表７は、１１２個のクローンを用いて得られた結果をまとめる。
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従って、大多数のＮＥＰ細胞は、神経膠に制限される細胞についての前駆体およびニューロンに拘束される前駆体を生成し得るようである。
実施例１１
大部分のニューロンが、Ｅ−ＮＣＡＭ+中間神経芽細胞を介して生成されるか否かを試験するために、成分媒介性の細胞溶解を利用して、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を選択的に傷害した。ＮＥＰ細胞を分化する条件に置換えた２０時間後、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を、Ｅ−ＮＣＡＭに対するＩｇＭ抗体およびモルモット補体を使用して傷害した。姉妹プレートにおいて、神経膠前駆体を、抗Ａ２Ｂ５ ＩｇＭ抗体および補体を使用して傷害した。発生のこの段階で、大部分のＥ−ＮＣＡＭ＋細胞は、β-ＩＩＩチューブリンを発現しなかった。処置したプレートを、さらに３日間、分化させ、そしてニューロンの発生をモニターした。Ｅ−ＮＣＡＭ媒介性の溶解は、Ａ２Ｂ５で処理した培養物に比較した場合、発生したβ-ＩＩＩチューブリン免疫反応性細胞の数を減少し（それぞれ、２１９±３５対８７９±６３）、このことは、インビトロでＮＥＰ細胞からのニューロン分化は、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性段階を介する移行を必要とすることを示唆する。
実施例１２
分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、急性的に解離されるＮＲＰ細胞から区別され得る
Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例３の手順に従って免疫パンニングすることによって単離し、３５ｍｍディッシュ中にプレートし、そして２４時間増殖させるか（急性的に解離する）、１０日間増殖させた（分化させる）。次いで、培養した細胞を、実施例２の手順に従って、ＢＲＤＵ取込み、Ｅ−ＮＣＡＭ発現、ＮＦ−Ｍ発現、およびシナプトフィジン発現によって細胞分裂について分析した。急性的に解離したＥ−ＮＣＡＭ+細胞のうちの約７０％が、ＢＲＤＵを取込み、このことは、このような細胞が培養において分裂したことを示したが、分化促進培地中で１０日後、ほとんどの細胞が、またはどの細胞も、ＢＲＤＵを取込まず、それゆえ、分裂を停止した。Ｅ−ＮＣＡＭおよびＮＦ−Ｍ免疫反応性についての二重標識において、急性的に解離した細胞のほとんどは、ＮＦ−Ｍを発現しなかったが、ほとんど全ての分化した細胞は、このタンパク質を発現した。同様に、シナプトフィジン（シナプスベシクルおよび機能的なシナプスと特異的に会合するタンパク質、Ｔ．Ｃ．Ｓｕｄｈｏｆ、シナプスベシクルサイクル：タンパク質−タンパク質相互作用のカスケード、３７５ Ｎａｔｕｒｅ ６４５−６５３（１９９５）を参照のこと）は、分化されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞によって発現されたが、急性的に解離されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞によって発現されなかった。シナプトフィジンタンパク質の発現は、シナプスベシクルと関連するが、初期の発現はまた、細胞体において、および神経形成の間にこのタンパク質が最初に発現されたプロセスの期間中、検出され得た。Ｍ．Ｆｕｊｉｔａら、ラット小脳の顆粒細胞におけるシナプトフィジンの発生プロフィール：免疫細胞化学研究、４５ Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｔｏｋｙｏ １８５−１９４（１９９６）；Ｄ．Ｇｒａｂｓら、ラット海馬網の出生前および出生後の発生の間のシナプトフィジンおよびシナプトポリンの特異的な発現、６ Ｅｕｒ Ｊ．Ｎｅｒｏｓｃｉ．１７６５−１７７１（１９９４）。これらの結果は、急性的に解離されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞が、培養において成熟する、未成熟な、分裂細胞であることを示す。これらの結果は、ＮＲＰ細胞が、ＲＡによって、およびマイトジェンの除去によって分化するように誘導される場合、それらは、成熟ニューロンの形態学的および免疫学的な多くの特性を獲得することを示唆する。
実施例１３
多数のニューロン表現型は、分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞において検出され得るが、急性的に解離したＥ−ＮＣＡＭ+細胞においては検出され得ない
ＮＲＰ細胞は有糸分裂後のニューロンに分化し得るが、希突起膠細胞および神経星状細胞に分化し得ないことが、上述で示された。ＮＲＰが脊髄に存在する大部分のニューロン表現型の全てに分化し得るか否か、またはそれらがそれらの分化能においてより制限されるのか否かを決定するために、神経伝達物質合成酵素、および成熟ニューロンについての細胞型特異的なマーカーの発現を、ＮＲＰを分化するように誘導した後に実験した。さらに、ｐ７５（Ｑ．Ｙａｎ ＆ Ｅ．Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、発生するラットにおける神経増殖因子レセプターの免疫細胞化学研究、８ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４８１−３４９８（１９８８））、およびIslet−１（Ｔ．Ｔｓｕｃｈｉｄａら、ＬＩＭホメオボックス遺伝子の発現によって規定される胚の運動ニューロンの組織分布的な構成、７９ Ｃｅｌｌ ９５７−９７０（１９９４））（これらは、脊髄における運動ニューロンの特徴である）、ならびにカルビンジン（これは、しばしば、ＧＡＢＡと同時発現される、Ｃ．Ｂａｔｉｎｉ、ＧＡＢＡおよびカルシウム結合タンパク質Ｄ２８Ｋの小脳局在化、ならびに共存、１２８ Ａｒｃｈ．Ｉｔａｌ．Ｂｉｏｌ．１２７−１４９（１９９０））を、試験した。
Ｅ１３．５のラット神経管由来のＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例３の手順に従って免疫パンニングによって単離し、３５ｍｍディッシュにプレートし、そして分化促進培地中で培養した。培養の１０日後、全ＲＮＡを、これらの細胞から単離し、そして神経伝達因子のアセチルコリン（Ａｃｈ）、ＧＡＢＡ、およびグルタミン酸を、ＲＴ−ＰＣＲによりそれらの合成酵素の発現によって評価した。全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法（ＴＲＩＺＯＬ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の改変によって細胞または全組織から単離した。ｃＤＮＡ合成について、１〜５μｇの全ＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬプロトコルに従って、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、修飾したモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）、およびオリゴ（ｄＴ）12〜18プライマーを使用して、２０μｌの反応中で用いた。
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、ｃＤＮＡのアリコート（逆転写酵素反応の１／２０に等しい）を、５０μｌの反応容量において使用した。ＰＣＲ増幅を、ＥＬＯＮＧＡＳＥポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して行った。ＰＣＲ増幅について使用したプライマー配列およびサイクル温度を、表８において示す。反応を３５サイクル行い、そして７２℃で１０分間のインキュベーションを、完全な伸長を確実にするために最後に加えた。ＰＣＲ産物を、ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ＰＣＲ−ＰＵＲＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して精製し、そしてそれらの同一性を確認するために配列決定した。
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図２において示されるように、これらのうちの全てが、分化された細胞（「Ｄ」と標識される）に存在した。対照的に、ハウスキーピング遺伝子、シクロフィリンの発現が両方の細胞集団から容易に検出され得た場合であっても、神経伝達因子のこれらのマーカーのいずれも、単離の２４時間以内に試験した細胞（「急性的に解離した」と呼ばれ；図２において「ＡＤ」と標識される）から検出され得なかった。これらのデータは、ＮＲＰ細胞が、培養において成熟すること、およびＮＣＡＭ発現およびニューロン運命の決定が神経伝達物質の合成を先行することを示す。
神経伝達分子合成酵素の発現をまた、全ての細胞、または分化された細胞のサブセットのみが、これらのマーカーを発現するのかを決定するために、免疫細胞化学によって試験した。細胞を、１０日間、培養において増殖し、そして分化させ、固定し、そして実施例２の手順に従って免疫細胞化学によってプロセスして、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、（ＧＡＤ）、チロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）、グリシン、およびグルタミン酸の発現を検出した。ＣｈＡＴ、ＴＨ、およびＧＡＤに対する抗体を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから得；グルタミン酸およびグリシンに対する抗体は、Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓからであった。分化した細胞の実質的に１００％が、検出可能なグルタミン酸レベルを発現した。はるかに小さなパーセントが、グリシンおよびＧＡＤを発現した。正確なパーセントは、１０〜５０％に実験間で変化した。ＣｈＡＴおよびＴＨ+細胞のパーセントは、さらにより小さく、そして１〜５％の間の範囲であった。しかし、実質的により大きな数が、培養条件を変化することによって観察され得た。実質的に１００％の細胞が、グルタミン酸を合成したので、少なくともいくつかの細胞は、１つよりも多い神経伝達物質を合成したようである。それにもかかわらず、これらの結果は明らかに、分化の際に、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞が、それらの神経伝達分子の表現型に関して、不均一な集団に成熟し得ることを示す。
分化された細胞を用いて得られた結果と対照的に、ＣｈＡＴ、ＧＡＤ、ＴＨ、グリシンのいずれも、急性的に解離された細胞において検出され得なかった。グルタミン酸は、このような細胞の小さなサブセットにおいて検出された（１０％未満）。しかし、グルタミナーゼは、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの細胞において検出され得ず（図２）、このことは、グルタミン酸が、培地からこれらの細胞によって取込まれたことを示唆する。
実施例１４
Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞の神経伝達物質レセプタープロフィールは、成熟とともに変化する
成熟ニューロンの別の重要な特徴は、それらの表面上で適切な神経伝達物質レセプターを発現することによって、複数の神経伝達物質に応答するそれらの能力である。分化されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞が、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、およびアセチルコリンに応答する能力を実験するために、ｆｕｒａ−２ Ｃａ2+画像化技術を使用した。Ｅ１３．５のＥ−ＮＣＡＭ+細胞を、培養において１０日間増殖し、そして分化させた。次いで、それらを、ｆｕｒａ−２でロードし、そして神経伝達物質に対する脱分極性の応答をモニターした。
２０分間、暗所で、２３℃にて、ラットリンガー（ＲＲ）中の５μＭ Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｄ．Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、非常に改善される蛍光特性を用いる、カルシウムインディケーターの新規な生成、２６０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４４０−３４５０（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）＋ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ２１７（８０μｇ／ｍｌ）で、細胞をロードし、続いて、ＲＲで３回洗浄し、３０分間、デステリフィケーション（desterification）した。細胞内のカルシウム濃度の相対的な変化を、３４０／３８０ｎｍでの励起による蛍光強度のバックグラウンド補正した比率から測定した。応答を、比率化したベースライン値の１０％の最小増加として規定した。Ｚｅｉｓｓ−Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ画像化系およびソフトウエア（Ａｔｔｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、データを獲得および分析した。データ点を、１Ｈｚでサンプリングした。神経伝達分子を、ＲＲ中で生成させ、そして小容量のループ注入器（２００μｌ）を使用して、浴交換によって送達した。ＲＲは、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ グルコースを含んだ。さらに、５００μＭのアスコルビン酸を、酸化を防止するためにドーパミン溶液に添加した。５００μＭアスコルビン酸のコントロール適用は、効果を有しなかった。全ての溶液のｐＨを、ＮａＯＨで７．４に調節した。さらに、５０ｍＭ Ｋ+ ＲＲを、通常のＲＲにおけるＮａ+を等モル量のＫ+で置換することによって作製した。
図３は、急性的に解離された細胞および分化された細胞への示された神経伝達物質の適用に応答する、細胞の数の棒グラフである。一般に、神経伝達物質に応答する細胞の数、および神経伝達物質誘導性のＣａ2+応答の振幅は、分化された細胞において増加した。最も顕著な実験はドーパミンであり、分化された細胞の７６％に比較して、ここでは急性的に解離された細胞のわずか１０％が、内部Ｃａ2+の増加（６６％の正味の増加）を伴って５００μＭドーパミンに応答した。同様に、顕著ではないが、応答する細胞の数の変化は、他の興奮性の神経伝達物質について見られた。この傾向に対する例外は、ＧＡＢＡおよびグリシンに対するＣａ2+応答であった。興味深いことに、急性的に解離された細胞の４６％が、分化された細胞のわずか８％に比較して、ＧＡＢＡに対して応答した。同様に、グリシンに対する応答におけるＣａ2+流動は、急性的に解離された細胞における２０％から、分化された細胞における０％まで減少した。阻害性の神経伝達物質プロフィールにおけるこの変化は、おそらく、内部の塩素イオン濃度の減少を反映し、ＧＡＢＡおよびグリシン応答の脱分極から過分極への移行を説明する成熟を伴う。Ｗ．Ｗｕら、ラット脊髄におけるグリシンおよびＧＡＢＡ媒介性のシナップスの初期の発生、１２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３９３５−３９４５（１９９２）。しかし、塩素イオンレベルが、上昇したままであり、そしてより少ないＧＡＢＡおよびグリシンレセプターが、分化された細胞において発現されるという可能性は、排除され得ない。急性的に解離された細胞および分化された細胞からの（Ｉ340／Ｉ380）Ｃａ2+応答の速度の、経時的な代表的なプロットは、それぞれ、図４および図５において示される。急性的に解離された細胞は、ＧＡＢＡおよびグルタミン酸に対して応答し、一方、同じ胚から分化された細胞は、ドーパミン、グルタミン酸、およびアセチルコリンに対して応答したが、ＧＡＢＡおよびグリシンに対して応答しなかった。近接する細胞における種々の伝達因子に対するＣａ2+応答の比較は、細胞間に応答プロフィールにおける不均一性があることを示し、このことは、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、神経伝達物質を合成するそれらの能力において不均一であるのみでなく、これらはまた、伝達物質レセプターの発現に関して選択されることを示す。神経伝達物質に加えて、ラットリンガー中のＫ+を上昇させ（５０ｍＭ Ｋ+ ＲＲ）、細胞を脱分極し、そして電位作動性のチャンネルを介してＣａ2+を侵入させるために適用した。急性的に解離された細胞において、分化された細胞の８５％に比較して、４９％が、５０ｍＭ Ｋ+ ＲＲに応答し、このことは、急性的に解離された細胞よりも多くの、分化された細胞が、電気的に適格性であったことを示唆する。
従って、急性的に解離されたＥ−ＮＣＡＭ+細胞および十分に分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞の種々の特性間の対比は、表９においてまとめられ、顕著である。未成熟な細胞は、有糸分裂が活性であるが、分化した細胞は活性ではない。未成熟な細胞は、ＮＦ−Ｍ、シナプトフィジン、および神経伝達物質合成酵素のような成熟ニューロンタンパク質を全く発現しないが、これらのうちの全てが、分化した細胞において検出され得た。さらに、急性的に解離された細胞は、神経伝達物質誘導性のＣａ2+応答に対して、分化した細胞よりも全体的に応答性が低かった。
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実施例１５
個々のＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、複数の神経伝達物質表現型を生成し得る
上記の大量培養実験は、Ｅ−ＮＣＡＭ+集団が、複数の神経伝達物質表現型を生成し得ることを示した。しかし、個々の細胞が、特定のニューロン表現型を生成するように予め拘束され得るという可能性が存在する。大量培養におけるＮＲＰの分化能が、個々のＮＲＰの潜在性を反映したか否かを決定するために、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞のクローン分析を行った。Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞を、実施例３の手順に従って免疫選択し、クローン密度でプレートし、そしてＦＧＦおよびＮＴ−３（増殖を促進する条件）中で増殖した。クローンは、培養の１０日後、数百の細胞の大きさに増殖し、その後それらの分化は、培地中のＦＧＦの除去およびＲＡの添加によって促進された。
３つの異なる技術：実施例１３の手順に従うＲＴ−ＰＣＲ、実施例２の手順に従う免疫細胞化学、および実施例１４の手順に従うカルシウム画像化、を使用して、個々のＮＲＰ細胞から生成されたクローンが、ニューロンの不均一な集団から構成されるか否かを決定した。６つのクローンを、ＲＴ−ＰＲＣ分析によって試験した。６つのクローンのうちの５つが、複数の神経伝達物質表現型を発現し：１つのクローンは、試験した全ての６つのマーカーを発現し、３つのクローンは、４つのマーカーを発現し、および１つのクローンは、３つのマーカーを発現した。それゆえ、１つ以外の全てのクローンは、細胞の不均一な集団から構成された。１つのクローンは、検出可能なレベルのｐ７５およびIｓ１−１のみを発現し、ＣｈＡＴは発現しなかった。これは、十分に分化されていない未成熟なクローンを示すようであった。図６は、試験した全ての神経伝達物質マーカーを発現する代表的なクローンからの結果を示す。これらの結果は、個々のクローンが、複数の神経伝達物質合成酵素または他の表現型のマーカーを発現すること、および大部分のクローンが、不均一な集団から構成されたことを実証する。
ＰＣＲの結果を確認するために、およびタンパク質レベルの不均一性を示すために、クローンを、ｐ７５の発現について分析した。どのクローンも排他的にｐ７５免疫反応性細胞からならなかったが（０／１７）、全てのクローン（１７／１７）は、ｐ７５免疫反応性の細胞および他のニューロンを含んだ。同様に、グルタミン酸またはグリシン免疫反応性のいずれかについての染色は、各伝達因子が、同じクローン集団における細胞のサブセットのみによって発現されたことを示し、このことは、クローンが不均一な集団であることを示す。
不均一性は、異なる神経伝達物質の合成によってだけでなく、細胞によって発現されるレセプターにおける不均一性によって実証された。ＧＡＢＡ、グリシン、ドーパミン、グルタミン酸、アセチルコリン、および５０ｍＭ Ｋ＋ ＲＲの適用に対する分化したクローン細胞の応答プロフィールを、増加した細胞内カルシウム濃度による証拠として、試験した。Ｃａ2+測定を、４つの異なるクローンからの１１３個の細胞から行った。試験した全てのクローン（４／４）は、それらの応答プロフィールにおいて不均一性を示し、これは個々のクローン間でいくらか変化した。図７は、適用された神経伝達物質のそれぞれに応答した、全ての４つのクローンからの細胞のパーセントの棒グラフを示す。
分化したＥ−ＮＣＡＭ+細胞の大量培養のように、クローン細胞の高いパーセントが、グルタミン酸（９３％）、アセチルコリン（９６％）、５０ｍＭ Ｋ＋ ＲＲ（７０％）、およびドーパミン（５０％）に応答し、一方いくらかの細胞が、ＧＡＢＡ（２７％）およびグリシン（１％）に応答した。図８および９は、１つのクローンから記録される２つの細胞からのＣａ2+応答の速度（Ｉ340／Ｉ380）の代表的な追跡を示す。レセプターのこの不均一な発現はまた、個々のＮＲＰ細胞の多能性の特徴を示唆する。従って、細胞のクローン集団の成熟は、大量培養における細胞の成熟に密接に類似した。
複数の独立した方法によって、このクローン分析は、個々のＮＲＰ細胞の多能性の特徴を実証する。この分析は、ＮＲＰ細胞の発生能を明らかに規定する大量培養の結果を確認する。ニューロンを生成するように拘束されるが、その子孫の特定の表現型は、それらの発生においていくらか後の段階で、指図される。従って、ニューロン前駆体細胞の存在が確立され、これは、精製され得、そして系統拘束性のニューロン前駆体と分化したニューロン子孫との間の移行を規定するように実質的に操作され得る。
実施例１６
細胞外シグナルは、ＮＲＰ細胞の運命に影響する
本明細書中に開示される結果は、ニューロン前駆体が、大量培養物およびクローン物の両方において、複数の表現型の成熟ニューロンに、インビトロで発達し得ること、およびＲＡの適用またはＦＧＦの除去のいずれかが、複数の表現型への分化を促進し得ることを示す。しかし、正常な発生において、分化は、空間的におよび一時的に調節され、運動ニューロンは腹側に生成され、および感覚ニューロンは、背側に生成され、このことは、特異的な環境のシグナルが、ニューロン前駆体の分化を偏向し得ることを示唆する。本実施例において、神経形成時に脊髄において発現される２つの潜在的な調節分子の効果が、背側（ＢＭＰ−２／４；Ｊ．Ｍ．Ｇｒａｆｆ、胚のパターン化：ＢＭＰに対するかまたはＢＭＰに対しないか、それが問題である、８９ Ｃｅｌｌ １７１−１７４（１９９７））または腹側（Ｓｈｈ；Ｍ．Ｊ．Ｆｉｅｔｚら、ショウジョウバエおよび脊椎動物の発生におけるハリネズミ遺伝子ファミリー、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（増刊）４３−５１（１９９４））の表現型のいずれかに偏向した細胞に対して示された。
ＢＭＰ−２をＥ−ＮＣＡＭ+細胞の培養物に添加した場合、細胞分裂における劇的な減少が見られた。ＢＭＰ−２の効果は、マイトジェン、ＦＧＦの効果を無効にし、ＦＧＦの存在下であっても、細胞分裂において６０％の減少を引き起こした（図１０）。同一の効果が、ＢＭＰ−４で見られた。ＢＭＰ−２単独において増殖した細胞が生存しなかったので、ＢＭＰ−２は生存因子ではなかった。分裂の減少は、分化した細胞の出現を伴った。細胞の大きさは増加し、そして細胞は広範囲なプロセスを生成した。ＢＭＰ−２中で４８時間増殖した細胞をまた、神経伝達物質の発現について試験した。グルタミン酸作動性、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびコリン作動性のニューロンが検出された。コリン作動性のニューロンの数は、未処理のコントロールにおけるよりも実質的により大きかった（５〜１０％対０〜１％）が、全ての他の表現型の促進はまた、有意に大きかったので、腹側表現型に対する偏向はないようであった。従って、ＢＭＰ−２は、抗有糸分裂剤として作用し、そしてＥ−ＮＣＡＭ+ ＮＲＰ細胞の分化を促進したが、腹側の運命を阻害するようではなかった。
ＢＭＰの抗有糸分裂効果および分化促進効果とは対照的に、Ｓｈｈは、マイトジェンであるようであった。１００ｎｇ／ｍｌ（最大応答）でのＳｈｈの有糸分裂効果は、コントロールよりも３倍高かったが、１０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦの効果よりも低かった（図１１）。Ｓｈｈを用いる実験を、マイトジェンではなく、生存因子として作用するＮＴ−３（Ｙ．Ａ．Ｂａｒｄｅ、ニューロトロフィン：ニューロンの生存を支持するタンパク質のファミリー、３９０ Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．４５−５６（１９９４）の存在下で行った。なぜなら、Ｓｈｈ自身は、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞についての生存因子であるようではなかった（すなわち、Ｓｈｈ単独中で増殖されるＥ−ＮＣＡＭ+細胞は、生存しなかった）からである。有糸分裂に対するＳｈｈの効果は、曝露の２日後にのみ明らかであり、そしてアッセイの５日間にわたって維持された。細胞分裂における差異は、最初の２４時間の間に見られなかった。
Ｓｈｈは、アッセイの５日間にわたって運動ニューロンの分化を促進しないようであった。細胞は、増殖しつづけ、そしてｐ７５免疫反応性ニューロンおよびＣｈＡＴ免疫反応性ニューロンのいずれも検出され得なかった。コリン作動性のニューロンを見ることができなかったことは、姉妹培養物が、ＢＭＰ−２またはＲＡのような分化因子で処理された場合、ＣｈＡＴおよびｐ７５免疫反応性の細胞に容易に分化したので、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞が、ｐ７５またはＣｈＡＴポジティブ細胞に分化し得ないことに起因しなかった。従って、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、増殖することによってＳｈｈに応答した。Ｓｈｈは、予期されなかったことに、少なくとも試験した期間にわたって、運動ニューロン分化を促進しなかった。
これらの結果は、細胞外シグナル伝達物質のＳｈｈおよびＢＭＰが、Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞の表現型の分化を調節することを示す。ＢＭＰ−２は、細胞の増殖を阻害し、そして分化を促進し、そして腹側の表現型の分化を阻害しない。対照的に、Ｓｈｈは、増殖を促進し、そして任意のニューロン表現型（ｐ７５およびＣｈＡＴ免疫反応性のニューロンを含む）の分化を阻害した。
実施例１７
マウス神経管は、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性のニューロン前駆体を含む
ＮＲＰがマウス神経管に存在するか否かを決定するために、Ｅ１１マウス脊髄を解離し、そして実施例２の手順に従って、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞の特性について試験した。
多数のＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が、Ｅ１１で見出され、そしてこれらの細胞は、細胞の全集団の約６０％を含んだ。Ｅ−ＮＣＡＭポジティブ細胞は、広範囲のプロセスを伴うニューロンに形態学的に類似するようであった。発生のこの段階で、Ｅ−ＮＣＡＭと、Ｇａｌ−ＣまたはＧＦＡＰとの同時発現は、二重標識式実験において観察されず、このことは、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性が、ニューロン前駆体を同定し得ることを示唆する。
マウスＥ−ＮＣＡＭポジティブ細胞が、それらのラット対応物と同様に、細胞分裂をうけるか否かを決定するために、細胞をＢＲＤＵでパルス標識し、次いで二重標識して、ＢＲＤＵおよびＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性を同時発現する細胞を検出した。結果は、培養の少なくとも３日間、Ｅ−ＮＣＡＭポジティブ細胞が分裂したことを示した。従って、Ｅ−ＮＣＡＭポジティブ細胞は、ラットにおいて以前に記載されるＮＲＰ細胞に類似するようであった。Ｅ−ＮＣＡＭポジティブ細胞が、複数のニューロン表現型を生成し得ることを確認するために、実施例３の手順に従って調製した免疫選択したＥ−ＮＣＡＭ細胞を、１０日間、培養において分化させた。次いで、プレートを採集し、そしてｃＤＮＡを実施例１３の手順に従って調製して、神経伝達物質合成を評価した。図１２において見られ得るように、Ｐ７５、Islet−１、ＣｈＡＴ、カルビンジン、ＧＡＤ、およびグルタミナーゼは、容易に、分化された集団において検出された。従って、マウスＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、コリン作動性の、興奮性の、および阻害性の表現型を発現するニューロンを生成し得る。
実施例１８
Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の神経芽細胞は、ＥＳ細胞から生成され得た
実施例１７において、マウス脊髄が、ラットＮＲＰ細胞に類似するＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性のＮＲＰを含むことが示された。類似の系統拘束性の前駆体が、ＥＳ細胞から生成され得るか否かを決定するために、マウスＥＳ細胞を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ、Ｉｏｗａ）から得、次いで、培養において増殖させ、そしてＥ−ＮＣＡＭ、Ａ２Ｂ５、および他の神経膠マーカーの発現について実験した。以前に記載されたように、未分化のＥＳ細胞は、試験した任意のマーカーについて検出可能な免疫反応性を発現しなかった。対照的に、ＥＳ細胞を神経分化条件に置いた場合、ＥＳ細胞は形態学的に変化し、そして複数のニューロンマーカーおよび神経膠マーカーを発現し始めた（図１３）。分化したＥＳ細胞を採集し、そして全ＲＮＡを、実施例１３の手順に従って、ＲＴ−ＰＣＲのために調製した。特に重要なものは、Ｅ−ＮＣＡＭ遺伝子（初期のニューロンマーカー）およびＰＬＰ／ＤＭ２０遺伝子（胚の神経膠前駆体によって発現されることが知られる）である。ＰＣＲによる初期のニューロンおよび神経膠のマーカーの検出と一致して、高度にポリシアル酸化されたＮＣＡＭを発現する細胞が、全細胞の小さなパーセントを示した。培養における細胞の５％未満が、培養の５日後に、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性を発現した。Ａ２Ｂ５免疫反応性の細胞のパーセントは有意により高く；約１０％の分化された細胞が、このマーカーを発現した。
Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が、ニューロン前駆体を示したか否かを決定するために、ニューロンおよび神経膠のマーカーを試験した。Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、ＭＡＰ−２およびβ−ＩＩＩチューブリン免疫反応性を同時発現したが、ＧＦＡＰおよびネスチンの免疫反応性を同時発現しなかった。Ｅ−ＮＣＡＭポジティブ細胞は、Ｇａｌ−Ｃマーカーも、他の希突起膠細胞のマーカーも発現しなかった。従って、マウスＥＳ細胞に由来したＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、脊髄由来のＥ−ＮＣＡＭポジティブＮＲＰに類似するようであった。
ＥＳ細胞由来のニューロン前駆体が、複数の種類のニューロンを生成し得たことを確認するために、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞を、実施例３の手順に従って免疫選択し、そしてこのように精製した細胞を、１０日間、分化させた。次いで、細胞を採集し、そして免疫細胞化学およびＲＴ−ＰＣＲによって、表現型マーカーの発現について分析した。図１４は、例証となるＰＣＲ実験の結果を示し、ここでは、ＣｈＡＴ、ｐ７５、Islet−１、カルビンジン、ＧＡＤ、およびグルタミナーゼの発現が、分化された集団において容易に検出された。従って、ＥＳ由来のＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、複数の神経伝達物質（コリン作動性の、興奮性の、および阻害性の表現型を含む）を発現した有糸分裂後のニューロンに分化した。それゆえ、ＥＳ細胞は、系統拘束性のＮＲＰの供給源として使用され得る。
実施例１９
ヒト神経管におけるＮＲＰ
ＮＲＰがヒト神経管に存在するか否かを決定するために、ヒト胚脊髄を解離し、そして高濃度のＦＧＦにおいてＤＭＥＭ／Ｆ１２中で増殖した場合の、細胞の表現型を実験した。
ヒト脊髄細胞（ＨＳＣ）は、ラットおよびマウスの脊髄に、最初は形態学的に類似するようであったが、線維芽細胞に見える細胞に迅速に分化し、有意な割合の細胞が、ニューロンの形態学を有した。ＨＳＣは、迅速に分裂を継続し、そして大部分の細胞（９５％）が、ネスチン免疫反応性であった。この段階で、培養物は、ＧＦＡＰまたは０４／Ｇａｌ−Ｃ免疫反応性の細胞の発現によって検出されたように、神経星状細胞、希突起膠細胞、およびそれらの前駆体を含まなかった。しかし、実質的な数のＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞が存在し、そして全集団の約４０％を構成した。Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、ニューロンに形態学的に類似するようであったが、いくつかの平らなＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞がまた存在した。Ｅ−ＮＣＡＭポジティブな細胞の両方の集団は、ＭＡＰ２Ｋ免疫反応性であり、およびまた、表１０においてまとめられるように、多様な他の初期のニューロンマーカーを発現した。
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発生のこの段階で、Ｇａｌ−ＣまたはＧＦＡＰのいずれかと、Ｅ−ＮＣＡＭの同時発現は、二重標識実験において観察されず、このことは、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性は、ニューロン前駆体を同定することを示唆する。すなわち、Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性のヒト脊髄細胞は、ニューロン抗原を発現したが、非ニューロン抗原を発現しなかった。ヒトＥ−ＮＣＡＭ+細胞が、ラット対応物のように、細胞分化をうけるか否かを決定するために、ＨＳＣの混合した培養物を、ＢＲＤＵでパルス標識し、次いで、二重標識して、ＢＲＤＵおよびＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性を同時発現する細胞を検出した。この実験の結果は、Ｅ−ＮＣＡＭポジティブな細胞が、培養において少なくとも３日間、分裂したことを示した。Ｅ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞がまた、ＮＦ−Ｈを発現するという表１０の結果と一致して、ＢＲＤＵを取り込む細胞はまた、神経線維−Ｈを同時発現した。従って、胎児げっ歯類脊髄におけるように、ヒト由来の分裂するネスチン免疫反応性の前駆体細胞が存在し、そしてＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性の細胞は、この段階で、全前駆体集団の有意な画分を示す。Ｅ−ＮＣＡＭ+細胞は、ラットおよびマウスについて以前に記載されたＮＲＰに類似するようである。
移植された細胞は、任意の様式（化学電気溶解の病変、ニューロン領域の実験的な破壊、または加齢プロセスの結果を含む）において得られる異常な神経学的または神経変性性の症状を有するヒトを含む任意の動物に投与され得る。移植は両側性であり得るか、または例えば、パーキンソン氏病を被る患者において、最も罹患された側に対する対側性であり得る。外科手術が、好ましくは、例えば、特定の脳領域が、頭蓋骨縫合に関して、位置づけられるように行われ、そして外科術は、定位固定的技術を用いて行われる。あるいは、細胞は、定位固定的外科手術の不在下で移植され得る。細胞は、任意の罹患されたニューロン領域に、当該分野において公知の細胞注入または移植の任意の方法を使用して送達され得る。
本発明の別の実施態様において、ＮＥＰ細胞は、宿主に移植され、そしてその宿主において、（１）投与される前のインビトロでの増殖および／もしくは分化によって、または（２）投与される前のインビトロでの分化、および投与された後のインビボでの増殖および分化によって、または（３）投与される前のインビトロでの増殖、および次いで、投与された後のさらなる増殖を伴わないインビボでの分化によって、または（４）新鮮に単離された後の直接的な注入後のインビボでの増殖および分化によって、増殖および／または分化するように誘導される。
ＮＲＰ細胞はまた、治療化合物または他の化合物の送達のために使用され得る。治療化合物の送達の目的のために、脳血液関門をバイパスするための方法は、当該分野において公知の方法に従って、カプセル化デバイス中に細胞を移植すること、または細胞自身が治療化合物を生成するように、遺伝子操作された細胞を移植することを包含する。このような化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質、またはウイルス粒子であり得る。細胞は、当該分野において公知の任意の手段（リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ウイルスの感染などを含む）によって遺伝子形質導入され得る。細胞は、先ず、治療物質を発現するように遺伝子操作され、次いで、ＣＮＳ実質内に拡散および取込まれ得る遊離細胞として移植されるか、またはカプセル化デバイス内に含まれる。Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｚａ ＆ Ｗ．Ｌ．Ｃｈｉｃｋ、カプセル化細胞治療、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．Ｓｃｉ．＆ Ｍｅｄ．、７月／８月、１６−２５（１９９５）；Ｐ．Ｍ．Ｇａｌｌｅｔｔｉ、生体人工器官、１６ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ ５５−６０（１９９２）；Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ、１９９０年代以降の医用材料の分子操作：分子生物学とポリマーとの増加する連絡、１６ Ａｒｔｉｆｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｓ ４３−４９（１９９２）；Ｂ．Ｄ．Ｒａｔｎｅｒ、医用材料科学における新規な考え−遺伝子操作された医用材料への道、２７ Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．８３７−８５０（１９９３）；Ｍ．Ｊ．Ｌｙｓａｇｈｔら、免疫単離された細胞治療における最近の前進、５６ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６−２０３（１９９４）（本明細書中に参考として援用される）。
移植された細胞は、ローダミン、またはフルオレセインで標識された微粒子、fastブルー、ビスベンズアミンの予めの取込み、または酵素マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）の発現を許容する、当該分野において公知の任意の遺伝子導入手順によって取込まれる遺伝子マーカーによって、同定され得る。
細胞において活性であるプロモーター、および開始、終結、およびポリアデニル化についての適切な内部シグナルを有する限り、当該分野において公知の任意の発現系が、治療学的化合物を発現するために使用され得る。適切な発現ベクターの例としては、組換えワクシニアウイルスベクター（ｐＳＣ１１を含む）、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、アデノウイルス、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）、ウシパピローマウイルス、エプスタインバールウイルス、レンチウイルスのようなウイルス由来のベクター、または当該分野において公知の任意の他の真核生物発現ベクターが挙げられる。このような発現ベクターの多くは、市販されている。
細胞はまた、宿主においてその発現が所望される、神経伝達物質、神経ペプチド、神経伝達物質合成酵素、または神経ペプチド合成酵素をコードする任意の遺伝子を発現するように形質導入され得る。
ＮＲＰ細胞および／またはインビトロで培養されるそれらの誘導体は、潜在的な神経学的な治療組成物をスクリーニングするために使用され得る。これらの組成物は、種々の投薬量で、培養において細胞に適用され得、そして細胞の応答が、種々の期間、モニターされ得る。酵素のようなタンパク質、レセプター、および他の細胞表面分子の、または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生体アミンの、新規なまたは増加されたレベルの発現の誘導は、このような分子のレベルの変化を同定し得る当該分野において公知の任意の技術（タンパク質アッセイ、酵素アッセイ、レセプター結合アッセイ、固定酵素免疫アッセイ、電気泳動アッセイ、高速液体クロマトグラフィーを用いる分析、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、を用いて分析され得る。核酸分析（例えば、ノーザンブロット）は、これらの分子、またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを試験するために使用され得る。あるいは、これらの薬学的組成物で処理された細胞は、動物に移植され得、そしてそれらの生存、ニューロンを形成する能力、およびこれらの細胞型の任意の機能を発現する能力が、当該分野において利用可能である任意の手順によって分析され得る。
ＮＥＰ細胞は、当該分野において公知の任意の方法によって、凍結保存され得る。
実施例２０
異常な神経学的な症状および神経変性性の症状を処置するためのＮＲＰ細胞および／またはそれらの誘導体の使用
ＮＲＰ細胞を、実施例２、３、８、１８、または１９の方法によって単離する。細胞を、ヒト胚もしくは成体ＣＮＳから、または細胞の免疫拒絶が臨床学的な問題でない異種移植片供給源（例えば、ヒト免疫系に対して外来刺激を示さないように遺伝子操作されたブタ）から得る。胚から回収した細胞を、滅菌回収装置における日常的な吸引手順および組織回収後に、ＣＮＳ組織の切開によって得る。出生直後のＣＮＳからの細胞を、解剖学的な通常の手順に従って組織の消化によって得る。組織を調製し、細胞を免疫精製し、そして得られる精製した細胞を、実施例２におけるように培養する。
細胞は、直接的に移植され得るか、または移植の前に、先ずインビトロで拡張され得る。インビトロで拡張された集団はさらに、ニューロンまたはニューロンの生成に拘束される細胞の生成を増強する条件下で拡張され得る。
移植は、ＰＢＳのような生理学的塩溶液中の５〜５０，０００細胞／μｌの細胞の懸濁物で、日常的に行われ得る。細胞は、疾患または状態によって影響される任意のＣＮＳに、またはその近くに移植され得る。移植手順は、ヒト患者における使用のための適切な改変を伴って、Ｏ−２Ａ前駆体細胞の移植の、当業者に周知の手順に本質的に類似する。例えば、Ａ．Ｋ．Ｇｒｏｖｅｓら、精製したＯ−Ａ前駆体細胞の移植による脱髄された病変の修復、３６２ Ｎａｔｕｒｅ ４５３−４５５（１９９５）（本明細書中に参考として援用される）。
より詳細には、移植は、コンピューターの断層撮影定位固定ガイドを使用して行われる。患者は、当該分野において公知の任意の手順を使用して、手術され得る。正確に局在化される移植が所望される場合、患者は、移植を受ける領域の座標を確立するためにＣＴ走査をうける。注入カニューレは、関連の分野における当業者によって、任意の配置において使用され得る。次いで、カニューレは、正確な座標に、脳へ挿入され、次いで、取出され、そして選択された小容量の細胞懸濁液が予め負荷された１９ゲージの注入カニューレと置換えられる。次いで、カニューレが取り除かれると、細胞は、一般に、１分あたり１〜１０ｍｌの速度で、ゆっくりと注入される。細胞が可能な限り広い領域にわたって広げられることが所望されるいくつかの疾患について、複数の定位固定的な針の通過が、領域を介してなされ得る。患者は、術後に、出血または浮腫について試験され得る。神経学的な評価が、種々の術後の個体で行われ、ならびにＰＥＴ走査が、これらが、移植された細胞の代謝活性を決定するために使用され得る場合に行われる。これらのおよび類似の手順が、本発明において示される任意の目的のために、ＮＲＰ細胞の任意の移植について使用され得る。
手順の成功は、例えば、核磁性共鳴画像スキャナーを使用する非浸潤性の分析によって、および／または当該分野において周知の方法に従う機能的な回復の分析によって、決定され得る。
実施例２１
移植のために遺伝子操作されたＮＲＰ細胞および／またはそれらの誘導体の使用
この実施例において、ＮＲＰ細胞を、疾患の領域にまたはその近くに導入する前に、移植された細胞をインビボでの破壊に耐性にする遺伝子産物を発現するように、および／または宿主細胞への栄養性支持体を提供する遺伝産物を発現するように、および／または宿主において生じる破壊プロセスを制限する遺伝子産物を発現するように、エクスビボで遺伝子改変される。遺伝子改変は、当業者に公知の任意の技術によって行われ、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ウイルスの感染などを含むが、これらに制限されない。細胞を、インビボでの破壊に耐性になるようにする、および／または栄養性支持体を宿主細胞に提供する遺伝子産物を発現するようにする、および／または宿主において生じる破壊プロセスを制限する遺伝子産物を発現するようにする遺伝子産物としては、インスリン様増殖因子−Ｉ、減衰促進因子、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、神経膠由来の神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、白血病阻害因子、ｆａｓリガンド、炎症性プロセスを阻害するサイトカイン、炎症性プロセスを阻害するレセプターフラグメント、炎症性プロセスを阻害する抗体などが挙げられるが、これらに制限されない。
実施例２２
潜在的な神経学的な治療組成物をスクリーニングするためのＮＲＰ細胞および／またはそれらの誘導体の使用
インビトロで培養されたＮＲＰ細胞もしくはそれらの誘導体、またはそれらの混合物は、種々の投薬量で、目的の組成物に曝露され得、そして細胞の応答が種々の期間でモニターされ得る。酵素のようなタンパク質、レセプター、および他の細胞表面分子の、または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生体アミンの、新規なまたは増加されたレベルの発現の誘導は、このような分子のレベルの変化を同定し得る当該分野において公知の任意の技術（タンパク質アッセイ、酵素アッセイ、レセプター結合アッセイ、固定酵素免疫アッセイ、電気泳動アッセイ、高速液体クロマトグラフィーを用いる分析、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ）を用いて分析され得る。核酸分析（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）は、これらの分子、またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを試験するために使用され得る。細胞はまた、例えば、ブロモデオキシウリジンまたはトリチウム化チミジンの取込みによって測定されるように、化合物がＮＲＰ細胞数の増加を引き起こす能力、またはＤＮＡ合成を促進する能力を決定することによって、ＮＲＰ細胞および／またはそれらの誘導体の分裂を促進しする化合物についてスクリーニングするために使用され得る。細胞はまた、細胞が死ぬと予測される条件（例えば、神経毒性薬剤への曝露、全ての栄養性因子の除去）下で、細胞に化合物を適用することによって、および当業者に周知の任意の技術を使用して細胞の生存を試験することによって、ＮＲＰ細胞および／またはそれらの誘導体の生存を促進する化合物についてスクリーニングされ得る。細胞はまた、特定のレセプターへの結合を特異的に阻害する化合物について、当該ブロッキング化合物が当該レセプターに対するアゴニストの結合によって誘発される応答をブロックする能力を調べることによって、スクリーニングするために使用され得る。細胞はまた、当業者に周知のリガンド結合アッセイを使用して、または例えば、レセプターの活性化と関連する生理学的な変化（例えば、カルシウムレベルの流動）を、もしくは当業者に周知の他の変化を調べることによって、特定のレセプターを活性化する化合物についてスクリーニングするために使用され得る。あるいは、これらの薬学的組成物で処理される細胞は、動物に移植され得、そしてそれらの生存、ニューロンを形成する能力、およびこれらの細胞型の任意の機能を発現する能力が、当該分野において利用可能であるの手順によって分析され得る。
実施例２３
この実施例において、細胞を、Ｅ１３．５のラット脊髄から採集し、そしてＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性のニューロン拘束性の前駆体細胞を、実施例３の手順に従って、免疫パンニングによって単離した。次いで、これらの細胞を細胞追跡因子で標識し、そしてガラス微小電極を使用して、異なる皮質領域に移植した。動物を、３．５、１０、または２１日後に屠殺し、そして脳を、当該分野において周知の方法に従って切片化した。このように移植した細胞は、３回全てで、生存および分化したことが示された。
実施例２４
この実施例において、細胞を、実施例３において記載されるように、３５ｍｍディッシュにおいて採集、単離、および播種した。次いで、細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下に含むレトロウイルス構築物とともにインキュベートした。細胞を、８時間、取込ませ、次いでＧＦＰ発現について分析した。ＧＦＰ発現は、感染の２４時間後に検出され、そしてＧＦＰ発現は、２週間まで持続され、この時点で、実験を完了した。これらの結果は、栄養性の遺伝子が、異種プロモーター下でＮＲＰ細胞において発現され得ること、および感染された細胞が、数週間、栄養性のタンパク質を安定に発現し続けることを示す。
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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