(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、視交差上核（SCN）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、視交差上核（SCN）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、サーカディアン周期で発現が変動する哺乳動物遺伝子に関する。
背景技術
微生物から脊椎動物にわたる広範な生物における、多くの生化学的過程、生理学的過程、および行動学的過程が、サーカディアンリズム（概日リズム）を示す（Ｅｄｍｕｎｄｓ，Ｌ．Ｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌｏｃｋ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８））。サーカディアンリズムについてはいくつかの遺伝子が関与することが示唆されている。
例えば、これまでに２つの哺乳動物サーカディアン時計変異が確認されている。マウスのＣｌｏｃｋ（Ｖｉｔａｔｅｒｎａ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４，７１９−７２５（１９９４））およびハムスターのｔａｕ（Ｒａｌｐｈ，Ｍ．Ｒ．＆  Ｍｅｎａｋｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１２２５−１２２７（１９８８））である。Ｃｌｏｃｋ遺伝子は最近同定されたものであり、サーカディアン時計における転写因子をコードしていると考えられている（Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｙ．＆  Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｖ．Ｂ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４２，２０１−２１６（１９７２）；Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｆ．Ｋ．＆  Ｚｕｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，１５８３−１５８６（１９７２））。一方、ｔａｕ遺伝子は、未だクローニングされていない。
また、ショウジョウバエにおいては、運動活性および羽化行動のサーカディアンリズムの発現に必要な遺伝子として、ｐｅｒｉｏｄ（ｐｅｒ）遺伝子が単離されている（Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｒ．Ｊ．＆  Ｂｅｎｚｅｒ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６８，２１１２−２１１６（１９７１））。ハエ脳においてはｐｅｒ  ｍＲＮＡおよびＰＥＲＩＯＤ（ｄＰＥＲ）タンパク質のレベルの振動が、リズムを決定していると考えられている（Ｈａｒｄｉｎ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，５３６−５４０（１９９０）；Ｚｅｒｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，２７４９−２７６２（１９９０））。しかしながら、昆虫以外のｐｅｒホモログは全く同定されていない。
発明の開示
本発明は、サーカディアン周期に関与する新規な哺乳動物タンパク質およびその遺伝子を提供することを課題とする。特に、ショウジョウバエのｐｅｒｉｏｄ（ｐｅｒ）遺伝子産物と同様の機能を有する哺乳動物タンパク質およびその遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、サーカディアンリズムに関与することが知られているショウジョウバエ遺伝子において機能的に重要な役割を担っていると考えられている領域に着目し、該領域の配列を基に作製したプライマーを用いて独自開発したＰＣＲを行なうことにより、上記ショウジョウバエ遺伝子に対応するヒト遺伝子を単離することに成功した。また、本発明者等は、単離したヒト遺伝子をプローブとして用いることにより、該ヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子を単離することにも成功した。さらに、本発明者等は、単離したヒトおよびマウス遺伝子がコードするタンパク質の構造につき解析を行った結果、これらタンパク質がショウジョウバエタンパク質において同定されている機能ドメインおよび構造ドメインを高度に保存していることを見いだした。本発明者等は、さらに、哺乳動物の脳においてサーカディアンペースメーカーとしての役割を担う領域である視交差上核における単離したマウス遺伝子の発現の解析を行った結果、該遺伝子の発現が実際にサーカディアン周期で変動することを見いだした。
即ち、本発明は、哺乳動物のサーカディアン周期に関与するタンパク質およびその遺伝子に関し、より具体的には、
（１）  視交差上核（ＳＣＮ）においてサーカディアン周期で発現量が変動する哺乳動物由来のタンパク質、
（２）  哺乳動物がヒトである、（１）に記載のタンパク質、
（３）  哺乳動物がマウスである、（１）に記載のタンパク質、
（４）  配列番号：１に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質、
（５）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質、
（６）  配列番号：３に記載のＤＮＡまたは配列番号：３に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質、
（７）  配列番号：４に記載のＤＮＡまたは配列番号：４に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質、
（８）  （１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（９）  配列番号：３に記載のＤＮＡまたは配列番号：３に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（１０）  配列番号：４に記載のＤＮＡまたは配列番号：４に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（１１）  （８）乃至（１０）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（１２）  （８）乃至（１０）のいずれかに記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換体、
（１３）  （１２）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）乃至（７）のいずれかに記載のタンパク質の生産方法、
に関する。
なお、本発明において「サーカディアン周期」とは、生物の内分泌や体温・血圧・睡眠覚醒等の広範な行動に認められる約２４時間周期の活動リズムをさす。
本発明のタンパク質は、哺乳動物の脳における主要なサーカディアンペースメーカーである視交差上核（ＳＣＮ）（Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｙ．＆  Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｖ．Ｂ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４２，２０１−２１６（１９７２）；Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｆ．Ｋ．＆  Ｚｕｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９，１５８３−１５８６（１９７２））において、その発現が自律的にサーカディアン周期で振動する。本発明のタンパク質に含まれるヒトおよびマウス由来のタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１と配列番号：２に示す。これら２つの哺乳動物タンパク質のアミノ酸配列はショウジョウバエのタンパク質（ｐｅｒｉｏｄ遺伝子産物）と最も高い相同性を示す（Ｃｉｔｒｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，４２−４７（１９８７））。ショウジョウバエにおいては、ｐｅｒｉｏｄ遺伝子が、運動活性および孵化行動のサーカディアンリズムの発現に必要である（Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｒ．Ｊ．＆  Ｂｅｎｚｅｒ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６８，２１１２−２１１６（１９７１））。ハエ脳におけるそのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの振動が、リズムを決定していると考えられている（Ｈａｒｄｉｎ，Ｐ．Ｅ，，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，５３６−５４０（１９９０）；Ｚｅｒｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，２７４９−２７６２（１９９０））。これら２つの哺乳動物タンパク質は、遺伝学的研究および生化学的研究から、構造的、機能的に重要であることが示唆されているＰＡＳドメイン（Ｂａｙｌｉｅｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，３９０−３９２（１９８７）；Ｓａｅｚ，Ｌ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｎ１７，９１１−９２０（１９９６））においてショウジョウバエのタンパク質と特に高い相同性を有する。
最近、Ｋｉｎｇらにより、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ−ｐｏｌｙＱポリペプチドをコードする哺乳動物クロックジーン「Ｃｌｏｃｋ」がクローニングされた（Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９，６４１−６５３（１９９７）；Ａｎｔｏｃｈ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９，６５５−６６７（１９９７））。本発明のタンパク質は、サーカディアン時計システムにおいて、ＰＡＳ−ＰＡＳ相互作用を通して「ＣＬＯＣＫ」などの他の分子とダイマーを形成している可能性がある。
本発明のタンパク質は、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組換えタンパク質であれば、後述の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質であれば、例えば、上記本発明の組換えタンパク質を基に抗体を調製し、該抗体を適当な担体に結合させたアフィニティーカラムにより、脳、膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、心臓、脾臓、精巣などの体細胞組織から単離することが可能である。
また、当業者であれば、公知の方法を用いて配列番号：１に記載のタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、配列番号：１または２に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加などにより配列番号：１または２に記載のタンパク質に対してアミノ酸配列が改変された改変体であって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＯＤＡ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ）−ＬＡ  ＰＣＲ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２  ２７１−２７５、参照）が挙げられる。なお、アミノ酸の置換は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。
さらに、当業者にとっては周知技術であるハイブリダイゼーション技術（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１  １９９１−１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ  Ｅｄ．））などを用いて、配列番号：３または４に記載のＤＮＡ配列（またはその一部）を基に、他の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号：１または２に記載のタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質を得ることも通常行いうろことである。このように配列番号：３または４に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、視交差上核（ＳＣＮ）のサーカディアン周期形成に関与するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ハイブリダイズするＤＮＡの由来となる他の動物、特に哺乳動物の例としては、例えば、ラット、イヌ、ネコ、サル、クジラ、ウシ、ブタ、ウマが挙げられる。なお、このような他の生物由来のタンパク質をコードするＤＮＡは、通常、配列番号：３または４に記載のＤＮＡと高い相同性を有する。高い相同性を有するとは、配列番号：３または４に記載のＤＮＡと、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の配列の同一性を有することをいう。このようなＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションは、例えば、６×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミドという系で、通常は４２℃で、穏やかな条件としては３２℃で、厳しい条件としては６５℃で行うことができる。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡでも、ゲノムＤＮＡでもよく、また合成ＤＮＡであってもよい。本発明のＤＮＡは、例えば、本発明のタンパク質を組換えタンパク質として生産するために利用しうる。即ち、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：３または４に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させタンパク質を精製することにより本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。
組換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好適に用いられる。これら細胞内で組換えタンパク質を発現させるために用いられるベクターとしては、それぞれ、ｐＥＴ系等、ｐＡＵＲ系等、バキュロウイルスベクター（ｐＢｌｕｅ  Ｂａｃ等）、ＣＭＶまたはＲＳＶプロモーター系ベクターが挙げられる。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、大腸菌および酵母ではエレクトロポレーション法、昆虫細胞および動物細胞ではリポソーム法等の方法により行うことができる。また、酵母には、酢酸リチウム法を用いることもできる。
得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、例えば、イオン交換、ゲル濾過、抗Ｐｅｒ抗体カラムを用いて行うことができる。
本発明のタンパク質またはＤＮＡは、サーカディアンリズムに関連する疾患、例えば、睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、非２４時間型睡眠覚醒症候群、不規則型睡眠覚醒障害、時差症候群（いわゆる時差ボケ）等の治療に適用可能である。また、深夜不規則労働者の労務および健康管理、痴呆症の夜間徘徊の予防等にも適用可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ｐｅｒの哺乳動物ホモログの単離
ｐｅｒの哺乳動物ホモログを単離するため、本発明者らは、新規な方法、ＩＭＳ（ｉｎｔｒａｍｏｄｕｌｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）−ＰＣＲを開発した。本方法の原理は、ヒトゲノムにおいて、短いポリペプチド断片（モチーフ）をコードする短いＤＮＡ配列領域（モジュール）が、長いゲノム距離にわたり散在しているという事実に基づいている。遺伝子全長が包含されるように充分な数の「モジュール内スキャニング（ｉｎｔｒａｍｏｄｕｌｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）」プライマーを用いると、ＰＣＲにより、その発現レベルに無関係に同じ頻度でモジュールをスクリーニングすることができる。
遺伝学的研究および生化学的研究から、ｄＰＥＲのＰＡＳドメインが構造的、機能的に重要であることが示唆されている（Ｂａｙｌｉｅｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，３９０−３９２（１９８７）；Ｓａｅｚ，Ｌ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １７，９１１−９２０（１９９６））。そこで、本発明者らは、ｄＰＥＲのＰＡＳ−ＡリピートおよびＰＡＳ−Ｂリピート内の１８種類のプライマー対を設計した（図１）。ＰＡＳ−ＡリピートおよびＰＡＳ−Ｂリピートの縮重プライマー対の配列は、「ＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＮ（Ａ／Ｃ）ＧＮＧＡ」、「ＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＮＡＴＧ」、「ＧＧＣＴＡＣＣＣＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＮＡＴＧＴＧＧ」、「ＣＴＧＧＧＣＴ（Ａ／Ｔ）ＣＣＴＧＣＣＮＣＡ（Ａ／Ｇ）」、「ＣＴＧＧＧＣＴ（Ａ／Ｔ）ＣＣＴＧＣＣＮＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ」、「ＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣ（Ｃ／Ｔ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡＮ（Ｃ／Ｔ）」、「ＧＣＣＣＧ（Ｇ／Ａ）ＴＣＣＴＴＣＡＧ（Ｇ／Ａ）ＴＧＮＡＣ」、「ＴＣＣＴＣＡＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＣＡＣ（Ａ／Ｇ）（Ｔ／Ａ）ＡＮＴＣ」、「ＡＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）Ａ」、および「ＧＡＣＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣＣＴＣＡＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＡ」である。なお、Ａ／Ｇなどの記号はＡとＧの混合プライマーであることを示す。
相同なポリペプチドは分子内の対応する位置に共通の特徴を有するため、対応するアミノ酸配列をＰＣＲプライマーの合成に用いた場合、ＰＣＲ産物の長さは、それぞれのポリペプチドにおけるドメイン構造の場所に関する特徴を反映する。ヒト遺伝子におけるコドン（各３ｂｐ）およびエキソン（各平均１００ｂｐ）の長さを考慮に入れ、３ｂｐのラダーマーカー（５３〜１１３ｂｐ）を、一連のプライマーおよびｐＵＣ１９を鋳型としたＰＣＲにより合成した。この３ｂｐのラダーマーカーおよび１０ｂｐのＤＮＡラダーマーカー（ＢＲＬ）の電気泳動像を図２に示す。マーカーをＰＣＲ産物と並べて非連続的な緩衝液系（Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｈｊｏｈ，Ｈ．＆  Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １４，２７８−２８２（１９９３））で非変性ＰＡＧＥ（１０％）ゲル上を泳動させた（図３）。
各ＰＣＲ混合液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９））には、０．５μｇのヒトゲノミックＤＮＡが含まれていた。混合液を９４℃で１分間インキュベートし、９４℃で３０秒、３７℃で３０秒、７２℃で３０秒を３サイクル行い、その後、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクル行った。
予測された長さのＤＮＡバンドをクローニングし、その配列を決定した。あるプライマー対（ペプチド配列５’「ＧＹＬＰＱＤ」および３’「ＦＶＨＨＥＤＩ」に対応）を用いたネスティッドＰＣＲで、１２個のバンド由来の３３クローン（５９〜７４ｂｐ）のうち、６５ｂｐのクローンが特に６〜２１倍に増幅された。６５ｂｐの断片を含むゲノミックＤＮＡ配列には、全部で１２５アミノ酸からなるＰＡＳ−Ｂドメインに含まれる３５アミノ酸残基をコードする１０６ｂｐのエキソンが存在することが明らかとなった。対応するｃＤＮＡを単離し、ヒトＰＥＲ（ｈＰＥＲ）ｃＤＮＡと名付けた。次に、ｈＰＥＲのｃＤＮＡをプローブとして用い、マウスホモログ（ｍＰｅｒ）ｃＤＮＡをクローニングした。決定した塩基配列を、ｈＰＥＲについては配列番号：３に、ｍＰｅｒについては配列番号：４にそれぞれ示す。ｈＰＥＲ遺伝子およびｍＰｅｒ遺伝子は、ＦＩＳＨにより、それぞれ、２つの動物間でシンテニーの遺伝子座である１７ｐ１２−１３．１および１１Ｂに位置することが示された。
ｈＰＥＲおよびｍＰｅｒのｃＤＮＡ配列には、それぞれ１２９０アミノ酸残基、１２９１アミノ酸残基をコードすると推定されるＯＲＦが含まれる（図５／ｈＰＥＲ遺伝子産物の推定アミノ酸配列を配列番号：３に、ｍＰｅｒ遺伝子産物の推定アミノ酸配列を配列番号：４にそれぞれ示す）。さらに、ｈＰＥＲとｍＰＥＲとのアミノ酸配列の同一性の程度は９２％であり、ｈＰＥＲおよびｍＰｅｒが両種間で保存されていることは明らかである（図５）。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて重複のないアミノ酸データベースに対してホモロジー検索を行ったところ、２つの哺乳動物ＰＥＲはｄＰＥＲ（タイプＡ）と最も高い相同性を示した（Ｃｉｔｒｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２６，４２−４７（１９８７））。哺乳動物ＰＥＲとショウジョウハエＰＥＲとの有意な相同性は、５つの領域に集中していた（図４および５）：Ｉ）Ｎ末端相同領域（それぞれｈＰＥＲおよびｍＰＥＲの残基４４〜１３１）、ＩＩ）ＰＡＳ−Ａ（両ＰＥＲホモログの残基２１７〜２８２）、ＩＩＩ）ＰＡＳ−Ｂ（両ＰＥＲホモログの残基３３８〜４５６）およびＰＡＳ−Ｂの直下流の配列（両ＰＥＲホモログの残基４５７〜４８５）、ＩＶ）ｐｅｒＳ変異（サーカディアン周期を短くする）が起こる部位（残基５８９）の下流領域に相当する短いセグメント（両ＰＥＲホモログの残基６２４〜６４５）、ならびにＶ）ＰＥＲ−Ｃ領域のＣ末端に相同な領域（ｈＰＥＲの残基１００６〜１０５０、ｍＰＥＲの残基１００５〜１０４９）、それに続くセリン−グリシン（ＳＧ）リピート（ｈＰＥＲの残基１０５１〜１０７２、ｍＰＥＲの残基１０５０〜１０７１）、およびそれよりさらに下流の相同配列（ｈＰＥＲの残基１０７３〜１１０８、ｍＰＥＲの残基１０７２〜１１０７）。これらの領域における相同性の程度は、それぞれ４４％、４７％、５６％、６４％、３７％である（図４）。確かに、ＰＥＲホモログのＰＡＳ領域（領域ＩＩおよびＩＩＩ）がｄＰＥＲの対応する領域と最も関連性が高いが、他の領域も強い相同性を示す。ｄＰＥＲにおいて、５つの構造ドメインおよび機能ドメインが同定されている：ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）（残基６６〜７９）（Ｖｏｓｓｈａｌｌ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，１６０６−１６０９（１９９６））、ｂ）ｄＰＥＲがＴＩＭのＮＬＳと相互作用するために必要なＰＡＳドメイン（残基２３３〜４９０）（Ｓａｅｚ，Ｌ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １７，９１１−９２０（１９９６））、ｃ）ＰＡＳ−Ｂリピートの下流領域に位置する細胞質移行ドメイン（ＣＬＤ）（残基４５３〜５１１）（Ｓａｅｚ，Ｌ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｎ１７，９１１−９２０（１９９６））、の自己ポリペプチドのＰＡＳドメインと相互作用するＰＥＲ−Ｃ領域（残基５２４〜６８５）（Ｈｕａｎｇ，Ｚ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７，１１６９−１１７２（１９９５））、ならびにｅ）ショウジョウバエの種特異的な求愛歌のリズムを調節する、トレオニン−グリジン（ＴＧ）リピート（残基６９４〜７４８）およびその直下流領域（残基７４９〜８６８）（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，１０８２−���０８５（１９９１））。このように、各哺乳動物ＰＥＲにおけるＮＬＳ、ＰＡＳ、ＣＬＤ、ＰＥＲ−Ｃ内の２つの領域、ならびにＴＧリピートおよびその直Ｃ末端側のセグメントは、ｄＰＥＲと全く同一の順序で並んでいる。興味深いことに、ＰＥＲホモログのＣ末端側の半分では、ｄＰＥＲのＴＧリピートが短いＳＧリピートで置き換わっている（図５）。ＰＥＲ−Ｃに隣接するこのセグメント、およびＴＧリピートのＣ末端側周辺に相同な配列は、ｄＰＥＲの本来の位置の約３５０残基下流に位置する（図４）。これらの領域も、ヒトおよびマウスで高度に保存されている（図５）。ショウジョウバエ種間で高度に保存されている６つのＰＥＲセグメント（Ｃ１〜Ｃ６）が同定されている（図４）（Ｃｏｌｏｔ，Ｈ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７  ３９２９−３９３７（１９８８））。カイコガ（ｓｉｌｋｍｏｔｈ）におけるＰＥＲホモログの場合と同様に、ｄＰＥＲに相同な哺乳動物ＰＥＲの部分は、ｄＰＥＲのＣ１〜Ｃ３に相当する領域に集中している（図４）（Ｒｅｐｐｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １３，１１６７−１１７６（１９９４））。これらの発見に基づき、本発明者らは、ｈＰＥＲおよびｍＰｅｒがｐｅｒの構造的ホモログであると結論づけた。
［実施例２］ｈＰＥＲおよびｍＰｅｒの発現
ｈＰＥＲおよびｍＰｅｒの発現パターンを、ノーザンハイブリダイゼーションにより試験した。ノーザンハイブリダイゼーションは、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，１９９１−１９９５（１９８４））により行った。フィルターはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。結果を、図６（ｈＰＥＲ）および図７（ｍＰｅｒ）に示す。約４．６ｋｂの転写産物が、試験した成人のヒトおよびマウスの組織全てに検出された。しかし、解糖系の酵素であり、どの細胞でも多量にかつ比較的恒常的に発現しているＧ３ＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）転写産物のレベルと比較したｈＰＥＲ／ｍＰｅｒ転写産物のレベルは、同一ではなかった。ショウジョウバエにおいて、脳以外の多くの組織にｐｅｒの発現が検出されていることから、この広範なｈＰＥＲ／ｍＰｅｒ発現の分布は、驚くべきものではない（Ｌｉｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２  ２２８−２３８（１９８８）；Ｓａｅｚ，Ｌ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８  ５３７８−５３８５（１９８８））。
［実施例３］マウス脳におけるｍＰｅｒ  ｃＤＮＡの分布
マウス脳におけるｍＰｅｒ  ｃＤＮＡの分布を、インサイチューハイブリダイゼーションにより試験した。マウス脳の連続的な皮質切片（４０μｍの厚さ）は低温保持装置で調製した。インサイチューハイブリダイゼーションおよびｍＲＮＡ定量の方法は、別に記載されている（Ｂａｎ，Ｙ．，Ｓｈｉｇｅｙｏｓｈｉ，Ｙ．，＆  Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，３９２０−３９３１（１９９７））。ハイブリダイゼーションに用いた３３Ｐで標識したプローブは、ｍＰｅｒ  ｃＲＮＡの５’側のセンス鎖およびアンチセンス鎖であった（ヌクレオチド５３８〜１７５２位；データは示していない）。１４Ｃ−アクリル酸スタンダード（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．Ｐｌｃ．）を用いて相対光学濃度へと変換した後、画像解析装置（ＭＣＩＤ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）と連結したマイクロコンピューターを用いることにより、ＢｉｏＭａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ）上の各切片の放射能を分析した。このデータをＳＣＮと脳梁との等しい領域におけるシグナル強度間の差違に対して標準化した。ＳＣＮの吻側の端から尾例の端までの切片（１匹のマウス当たり１０個の切片）の光学濃度の強度を合計し、その合計をこの領域におけるｍＰｅｒ  ｍＲＮＡ量の測定値とした。その結果、皮質構造および非皮質構造を含む脳の大部分の領域においてｍＰｅｒ転写産物の弱いシグナルが検出された。梨状皮質の錘体細胞層、尾状被殻の脳室周辺部、視床核の多く、および小脳皮質の顆粒層には、より強いｍＰｅｒ  ｍＲＮＡシグナルが検出された。驚くべきことに、脳における最も高いｍＰｅｒ発現レベルは、特別な時点においてＳＣＮで観察された（図８および９；以下に説明）。
ＳＣＮにおけるｍＰｅｒ発現の時間依存性を調べるため、マウスを１２ｈ明／１２ｈ暗（ＬＤ）条件下に収容することにより、環境に同調させた。ＳＣＮにおけるｍＰｅｒ  ｍＲＮＡをインサイチューハイブリダイゼーションおよび競合ＲＴ−ＰＣＲ法により定量した。競合ＲＴ−ＰＣＲは、以下のように行った。まず、マウス脳の切片（０．５ｍｍの厚さ）を「Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ」（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、東京）で調製した。顕微解剖用針（直径６００μｍ）を用いて、立体顕微鏡下で、凍結切片からＳＣＮを左右対称に打ち出した。全ＲＮＡを、ＳＣＮ（ｎ＝４）からＴＲＩＺＯＬ溶液（ＢＲＬ）を用いて抽出し、ＤＮＡａｓｅｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理し、ＴＲＩＡＺＯＬ  ＬＳ溶液（ＢＲＬ）を用いて精製した。「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＢＲＬ）を約１μｇのＲＮＡの逆転写に用い、ｍＰｅｒおよびβ−アクチンのｃＤＮＡは競合ＰＣＲ法により定量した。ＰＣＲ産物を非変性ＰＡＧＥ（５．５％）ゲル上で泳動させ、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した後、適当なバンド中のＤＮＡを［ＦＭＢＩＯＩＩ  ｆｕｌｕｏｒｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｚｅｒ］（日立）で定量した。ｍＰｅｒおよびβ−アクチンの競合ＤＮＡ断片は、各々のｃＤＮＡの内部欠失により構築した。ｍＰｅｒ、ｍＰｅｒ競合因子、β−アクチン、およびβ−アクチン競合因子は、それぞれ４８２ｂｐ、２４６ｂｐ、１２２８ｂｐ、１０４４ｂｐであった。
この２つの方法（インサイチューハイブリダイゼーションおよび競合ＲＴ−ＰＣＲ法）により、ＬＤにおける同様の振動プロフィールが得られた（図８および１０；上）。ｍＰｅｒ  ｍＲＮＡの量は、明条件でピークに達し（ＺＴ４からＺＴ８／なおＺＴは、図８〜１０のようにＬＤ条件における時間を表す）、暗条件で最も低下した（ＺＴ１６からＺＴ２０）（図９；上）。さらに、恒常的な暗条件（ＤＤ）において、自由継続変動が起こり（図８および１０；下）、ｍＰｅｒ  ｍＲＮＡレベルはＣＴ４からＣＴ８（なおＣＴは、図８〜１０のようにＤＤ条件における時間を表す）でピークに達し、ＣＴ１６からＣＴ２０で最も低下した（図９；下）。このように、ＳＣＮにおけるｍＰｅｒ  ｍＲＮＡが、恒常的な暗条件下で、強力に、自律的に、サーカディアン周期で発現することから、この遺伝子がサーカディアンリズムペースメーカーとして機能していることが示唆される。ＳＣＮにおけるｍＰｅｒ  ｍＲＮＡのサーカディアン周期変動は、この脳領域における神経の活動度と類似しており（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ−Ｔ．＆  Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，５９６２−５９６６（１９７９）；Ｓｃｈｗａｒｔｓ，Ｗ．Ｊ．＆  Ｇａｉｎｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７，１０８９−１０９２（１９７７）；Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ｕ．＆  Ｒｅｐｐｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．１９，１３５−１３９（１９８７））、ｍＰｅｒ  ｍＲＮＡレベルは日中にピークに達し、夜中に最少となる。ｍＰｅｒがＳＣＮにおける神経の活動度の調節因子として機能していることが考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明によりサーカディアン周期に関与する新規な哺乳動物タンパク質およびその遺伝子が提供された。本発明のタンパク質およびＤＮＡは、哺乳動物において、サーカディアンリズム異常を正常化することができると考えられるため、サーカディアンリズムに関連する疾患、例えば、睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、非２４時間型睡眠覚醒症候群、不規則型睡眠覚醒障害、時差症候群（いわゆる時差ボケ）等を治療するために有効である。また、深夜不規則労働者の労務および健康管理、痴呆症の夜間徘徊等にも適用可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＭＳ−ＰＣＲにおけるプライマー配列を設計するために用いたＰＡＳリピート内のアミノ酸配列（矢印）を示す図である。
図２は、３ｂｐのラダーマーカーを、非連続緩衝液条件で１０％非変性ＰＡＧＥゲル上で泳動させた電気泳動像を示す写真である。なお、レーンＭには、１０ｂｐのＤＮＡラダー（ＢＲＬ）を泳動させた。
図３は、ＩＭＳ−ＰＣＲのＰＣＲ産物（矢印で示したレーン）を、５９ｂｐ、６５ｂｐ、および６８ｂｐの３ｂｐラダーマーカー（アステリスクで示したレーン）と並べて泳動させた電気泳動像を示す写真である。
図４は、ＰＥＲＩＯＤファミリーのアミノ酸配列の比較を示す図である。ｈＤＩＡＬ、ｍＤＩＡＬ、ＰＥＲＩＯＤは、それぞれヒト、マウス、ショウジョウバエのＰＥＲＩＯＤを示す。四角で囲まれた、斜線または点による網掛け部分は相同配列、Ｃ１〜Ｃ６はショウジョウバエ種間で保存されているＰＥＲＩＯＤの領域を示す。
図５は、ＰＥＲＩＯＤファミリーのアミノ酸配列の比較を示す図である。ｈＤＩＡＬ、ｍＤＩＡＬ、ＰＥＲＩＯＤは、それぞれヒト、マウス、ショウジョウバエのＰＥＲＩＯＤを示す。相同配列は斜線または点による網掛けにより示した。ＮＬＳ、ＰＡＳ−Ａリピート、ＰＡＳ−Ｂリピート、およびＣＬＤに対応する配列には下線を引き、ＴＧリピート（ヒトおよびマウスのＰＥＲではＳＧリピート）を四角で囲んだ。ヒトＰＥＲＩＯＤとマウスＰＥＲＩＯＤとの間のアミノ酸同一性は、ヒトＰＥＲＩＯＤ配列の上のアステリスクにより示した。哺乳動物ＰＥＲＩＯＤとショウジョウバエＰＥＲＩＯＤとの同一性および類似性は、それぞれ、ショウジョウバエＰＥＲＩＯＤ配列の下のアステリスクおよび丸印により示した。
図６は、ｈＰＥＲのノーザンプロット解析を示す写真である。フィルターに、ｈＰＥＲをプローブとして結合させ、次にローディングコントロールとしてＧ３ＰＤＨをプローブとして結合させた。
図７は、ｍＰｅｒのノーザンプロット解析を示す写真である。フィルターに、ｍＰｅｒをプローブとして結合させ、次にローディングコントロールとしてＧ３ＰＤＨをプローブとして結合させた。
図８は、ＬＤ（上）およびＤＤ（下）条件下でのマウス脳中のｍＰｅｒのインサイチューハイブリダイゼーションを示す写真である。ＳＣＮは矢印で示した。目盛りは２ｍｍを示す。
図９は、ＬＤ（上）およびＤＤ（下）条件下でのインサイチューハイブリダイゼーションデータを定量した結果を示す図である。各値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）である。ＺＴ１６またはＣＴ１６における値と比較して（ＡＮＯＶＡ）、＊＊は有意水準１％で有意であり、＊は有意水準５％で有意であったことを示す。棒の白い部分は明条件の期間、黒い部分は暗条件の期間を示す。
図１０は、ＬＤ（上）およびＤＤ（下）条件下でのｍＰｅｒ  ｍＲＮＡの競合ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。△ｍＰｅｒはｍＰｅｒ競合因子を示し、△β−アクチンはβ−アクチン競合因子を示す。棒の白い部分は明条件の期間、黒い部分は暗条件の期間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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