(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Alcanivorax borkumensis由来の核酸と特異的にハイブリダイズし、それを検出もしくは定量しうる、Non-RI標識された、配列番号１に記載の塩基配列またはこれに相当するリボキシヌクレオチド配列からなるDNAまたはRNAプローブ。
【請求項２】
自然環境や人工的な環境から得られた試料中のAlcanivorax borkumensisの核酸をNon-RI法（放射性同位体を利用しない方法）により検出および定量し、その環境中のAlcanivorax borkumensisの優占度を解析する方法であって、以下の工程：
１）自然環境や人工的な環境から採取した微生物含有試料より、標的となる核酸を抽出・精製する工程、
２）１）で抽出・精製した標的となる核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化し、これを請求項１に記載のプローブと接触させてハイブリダイゼーション処理を行った後、洗浄処理を行う工程、
３）ハイブリダイズした請求項１に記載のプローブに由来するシグナルを視覚化して解析し、その定量値を求める工程、
４）求めた定量値を用い、全生物ならびに生物界の各ドメインにつき請求項１に記載のプローブを用いて測定した定量値と比較して、Alcanivorax borkumensisの優占度を算出する工程、を含む前記の方法。
【請求項３】
２）の洗浄処理を、Alcanivorax borkumensisに特異的なNon-RI標識核酸プローブを用いて作成されたプローブの遊離曲線から求めた至適洗浄温度で行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Non-RI標識核酸プローブが、蛍光標識又は化学発光標識されたものであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
Alcanivorax borkumensisが特定の化学物質を分解する微生物であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
特定の化学物質が有害化学物質であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特定の化学物質が石油および石油成分であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれかに記載の方法を用いて、自然環境や人工的な環境中のAlcanivorax borkumensisの優占度を解析することにより、その環境のAlcanivorax borkumensisを解析・評価する方法。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれかに記載の方法を用いて、汚染環境を解析・評価する方法。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の方法を用いて、有害化学物質汚染環境を解析・評価する方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法を用いて、油濁環境を解析・評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、広くは汚染環境の解析・評価法に関し、具体的には、有害化学物質汚染環境、特に石油汚染環境の診断や当該汚染環境の微生物によるバイオ環境修復（バイオレメディエーション）過程を分子遺伝学的に解析・評価する手法、および、有用物質生産微生物または病原微生物等の有害微生物を分子遺伝学的に検出・定量し、解析する手法、ならびに、これらの微生物を含む環境および環境試料を解析・評価する手法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、汚染環境の評価法としては、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー等の各種分画法と各種元素分析法や質量分析法、光学的検出法等を組み合わせた分析機器を用いて、環境中の有害化学物質を定性・定量分析する手法が広く用いられている。また、汚染環境試料の酸素要求量を測定するCOD法およびBOD法もある。しかし、汚染環境に限らず環境試料中に存在する特定微生物（群）を対象とした簡便で信頼性の高い分子遺伝学的評価法は開発途上にあり、特定微生物（群）の優占度解析を可能にするような手法は未だ確立されていない。石油成分等一部の環境汚染物質については、その自然浄化を左右する物理化学的要因の解明を通し様々な処理手法や処理技術が開発されてきている。
【０００３】
しかし、自然浄化の担い手である自然界の微生物群集の構成や群集の変動、汚染環境で優占する汚染物質分解菌の特性等を簡便かつ高精度で解析・評価する方法がなく、処理技術の有効性やその普遍性を評価することが困難な状況にある。
【０００４】
この汚染環境中の微生物を対象とした環境評価を実施する上では、寒天平板培地を用いた平板培養・計数法や液体培地を用いたMPN（最確数）培養・計数法がある。しかし、上述の従来の培養・計数法は、多くの手間と労力がかかり、特定分解微生物の検出に長い培養時間を要するという難点があった。
【０００５】
それに加え、自然界に生息する微生物の内、これら従来の分離・培養法で検出できる微生物の数は極めて少ない。すなわち、蛍光DNA染色剤で染色し顕微鏡下で計数する直接顕微鏡計数法（たとえば、J. E. Hobbie, R.J. Daley,and S. Jasper: Appl. Environ. Microbiol. 33:1225-1228, 1977やK. G. Porter and Y. S. Feig: Limnol. Oceanogr. 25: 943-948, 1980）で得られた全菌数と比較して、分離・培養可能な微生物の割合は１％以下でしかないと考えられる（R. I. Amann, W. Ludwig and K-H. Schleifer: Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual Microbial Cell without Cultivation, Microbial. Rev., 59, 143-169, 1995）。したがって、そこに生息する微生物群集全体の構成や群集変動、特定微生物の挙動等に関する解析を行うことが困難であるという大きな欠点があった。
【０００６】
そこで近年、全微生物または特定微生物を対象として、それらに特異的なDNAプローブを用い、従来の分離・培養法に依存しない分子遺伝学的な検出および定量化が試みられている。たとえば、RIラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを用いたブロットハイブリダイゼーション法による分子レベルでの検出、定量化手法が報告されている（S. J. Giovannoni, T. B. Britschgi, C. L. Moyer, K. G. Field: Genitic diversity in Srgasso Sea bacterioplankton. Nature, 345:60-63, 1990）。また、ハイブリダイゼーションを行う上で必要であるプローブの遊離曲線解析手法が、RI標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて報告されている（D. A. E. Zheng, D. A. Stahl, and L. Raskin：Characterization of Universal Samll-Subunit rRNA Hybridization Probes for Quantitative Molecular Microbial Ecology Studies. Applied and Environmental Microbiology, 62: 4504-4513, 1996）。
【０００７】
しかし、従来の方法は、RI標識したプローブの利用を前提としているため、その検出や定量には特別なRI取扱施設の利用が不可欠であり、そのために、通常の実験室でモニタリングすることができず、したがってこのモニタリング手法のキット化、および、その自動化に向けた技術開発は困難である。
【０００８】
この他の分子遺伝学的な検出および定量化手法として、特定微生物に特異的なDNAプライマーを用い、特定微生物の標的遺伝子領域を増幅し定量的に解析することを可能にする定量PCR手法がある（たとえば、L. G. Lee, C. R. Connell and W. Bloch: Nucleic Acids Research, 21, 3761-3766, 1993）。しかし、この手法では、環境中の全微生物群集の定量値を得ることが困難であり、特定微生物の全微生物に占める割合（優占度）を解析することができないという大きな技術的限界がある。
【０００９】
また、分離・培養法によらず細胞レベルで特定微生物を検出する場合には、FISH法が用いられている（R. I. Amann et al.: 1995、前出）。さらに、水環境試料を対象とし、細胞レベルで全群集に占める特定微生物の割合を解析する場合には、FISH-DC法が有効である（A. Maruyama and M. Sunamura: Simultaneous direct counting of total and specific microbial cells in seawater, using a deep-sea microbe as biomarker. Applied and Environmental Microbiology, 66: 2211-2215, 2000）。しかし、環境中で大多数を占める代謝活性の低い微生物細胞を検出・識別するには、何らかのシグナル増幅手段を併用する必要があり、現時点ではまだ大きな技術的限界がある（A. Maruyama and M. Sunamura: 2000、前出)。
【００１０】
自然環境中の微生物の多様性や微生物群集構造は、従来の分離・培養法による解析に加えて、環境微生物試料の直接核酸抽出試料を対象としたPCR、クローニング、塩基配列決定および分子系統解析という一連の手法を用い、徐々に解明されつつある（たとえば、T. M. Schmidt, E. F. DeLong and N. R. Pace: Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing, J. Bacteriol., 14, 4371-4378, 1991）。
【００１１】
これらの手法を用いた解析から、石油等で汚染された環境中には、従来の方法では分離・培養が困難であった特殊な微生物群が出現することが明らかにされつつある。たとえば、芳香族炭化水素分解菌Cycloclasticus pugetiiが、米国西海岸（S. E. Dyksterhouse, J. P. Gray, R. P. Herwig, J. C. Lara and J. T. Staley, Cycloclasticus pugetii gen. nov., sp. nov., an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium from marine sediments, Int. J. Syst. Bacteriol., 45, 116-123, 1995）および日本海沿岸で見出されており、また脂肪族炭化水素分解菌Alcanivorax borkumensisが、北海（M. M. Yakimov, P. N. Golyshin, S.Lang, E. R. Moore, W. R. Abraham, H. Lunsdorf and K. N. Timmis: Alcanivorax borkumensis gen. nov.,  sp. nov., a new, hydrocarbon-degrading and surfactant-producing marine bacterium, Int. J. Syst. Bacteriol., 48, 339-348, 1998）、瀬戸内海沿岸、および日本海沿岸等（岸良と原山：生物工学会、講演要旨集P.291、1998）で見出されている。これらの中で、、上述したような全菌数測定法とMPN培養計数法を組み合わせてさらにその精度を向上させた方法を用いて、全菌数に対するCycloclasticus pugetiiの優占度解析は、既に実施されている（特願平11−237818号）。しかし、上記の微生物群の優占度解析を、RI使用の有無に係わらず、分子遺伝学的手法で行った事例はない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、自然環境に生息する全微生物とそこに生育する特定の微生物の両者を対象とし、その分子遺伝学的な検出および定量化を、PCR法および放射性同位体を用いずに、Non-RI法（放射性同位体を利用しない方法）により行うことができる新規手法、並びに該手法を用いる汚染環境の解析・評価法に関し、有害化学物質汚染環境、特に石油汚染環境のモニタリングや該汚染環境の微生物によるバイオ環境修復（バイオレメディエーション）過程を分子遺伝学的に解析・評価するための方法の提供を目的とする。また、本発明は、自然環境または人工的環境中の、有用物質生産微生物、および病原微生物等の有害微生物を分子遺伝学的に検出・定量する手法の提供を目的とする。さらに、自然環境または人工的環境中における、酵素等の有用物質を生産する特定の微生物、および病原微生物等特定機能微生物の優占度を分子遺伝学的に解析し、該環境から採取された環境試料の有用性および有害性を解析・評価する手法を提供することもまた、本発明の目的に包含される。また、本明細書中に開示する、新規に開発された石油分解菌Alcanivorax borkumensisに特異的な核酸プローブは、該石油分解菌の検出・定量、およびそれによる油濁環境および環境試料の解析・評価のための有用なツールとして、本発明により提供されるものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
人為的に管理された環境から外部に流出した石油等の環境汚染物質は、自然界の微生物活動により徐々に分解され、時間とともに自然浄化されていく。それがPCB等の難分解性物質である場合には分解に長い時間を要することになるが、その汚染が一般微生物の生育にも影響を及ぼす場合には、その汚染環境に特異的な微生物（群）が優占していくものと考えられる。
【００１４】
たとえば、海洋には、現場微生物群集の1％以下のレベルで炭化水素分解菌が広く分布していると言われているが、石油汚染海域ではその比率がしばしば10％以上にもなると言われており（R. M. Atlas: Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation, Marine Pollution Bulltetin, 31, 178-182, 1995、R. M. Atlas and R. Bartha: Hydrocarbon Biodegradation and Oil Spill Bioremediation. In: Advances in Microbiolbial Ecology, Ed. K. C. Marshall, PlenumPress, New York, 12, 287-338, 1992）、微生物群集全体に占める分解菌の割合は石油汚染の程度を反映すると考えられている（R. M. Atlas and R. Bartha: 1992、前出）。
【００１５】
また、木材処理施設から排出されるクレオソート（約85％の多環芳香族炭化水素 [PAHs] を含有する）で汚染された港湾の堆積物中のPAHs分解菌数が調査されている（A. D. Geiselbrecht et al: Enumeration and Phylogenetic Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Degrading Mairne Bacteria from Puget Sound Sediment, Appl. Environ. Microbiol., 62, 3344-3349, 1996）。それによると、MPN培養計数法により計数された、PAHs分解菌数は、汚染サイトで104〜107  MPN/g (乾燥重量)、非汚染サイトで103〜104  MPN/g (乾燥重量)であった。一方、堆積物中の全菌数は109  cells/g (乾燥重量)程度で、汚染サイトと非汚染サイト間でほとんど差がみられなかったという。すなわち、クレオソート汚染サイトでは、PAHs分解菌が非汚染サイトの10〜1000倍多いというだけでなく、全微生物群集に占める割合も１％程度にまで増大していた。このように、環境が汚染されたことを反映して微生物群集に占める汚染物質分解菌群の割合が増大していることが見出されており、汚染物質分解菌の優占度は汚染環境のよい指標になると考えられる。
【００１６】
しかし、上記報告の石油分解菌数やPAHs分解菌数は、いずれの場合も多大な労力と時間を要する平板培養法やMPN法による培養法により検出・計数されたものである。また、前述のように分離・培養できる微生物の数は通常全微生物群集の1％以下であることから、培養法による計数では環境微生物群集中の分解微生物数が十分に反映されていないという欠点がある。さらに、本発明による方法にあるように、環境微生物群集中の特定の分解菌（特定属種の微生物または分子系統分類学的に特定化し得る遺伝情報を有する微生物）の計数または定量は未だなされていない。
【００１７】
そこで、それらの分解菌を含む環境の指標となる特定の微生物の挙動、およびそれが全微生物群集に占める割合（優占度）を、簡単、迅速にモニタリングすることが可能になれば、汚染の程度、および汚染環境の修復、回復の程度などを、その汚染環境の診断が高精度かつ早期に可能になるものと考えられる。そのためには、全微生物群集や特定機能微生物の解析を行うには大きな限界を有している従来の分離・培養手法に代わる、環境試料中の特定の微生物の検出・定量手法の開発が不可欠である。さらに、これらの手法は、様々な汚染環境の診断に適用でき、簡便に使用できるものである必要である。これらのことから、以下のステップを踏んでこれらの必要性を満たす新規手法の開発を図った。
【００１８】
まず、実際の油濁環境で優占的に出現することが明らかになりつつある石油成分分解特性の異なる２種の石油分解菌、すなわち脂肪族炭化水素分解菌と芳香族炭化水素分解菌を選別し、そのそれぞれに特異的な核酸プローブを開発した。
【００１９】
ここで選別した脂肪族炭化水素分解菌は、脂肪族炭化水素を分解するが、芳香族炭化水素やグルコース等の糖質を分解しない。一方、芳香族炭化水素分解菌は、難分解性多環芳香族炭化水素を分解するが、脂肪族炭化水素やグルコースなどの糖質を利用しない。したがって、この２種の石油分解菌の優占度は、流出した石油中の炭化水素成分や濃度に依存して変動するものと考えられ、油濁環境中に存在するこの２つの分解菌の核酸を定量的に把握し、微生物相を核酸レベルで解析することによって、環境中の炭化水素成分の比率、濃度および消長など、汚染物質の自然浄化過程やバイオ環境修復過程の解析・評価が可能になるものと考えられる。
【００２０】
次に、本発明者らは、環境中の全微生物および特定微生物の分子遺伝学的な検出および定量化のNon-RI手法の開発にはじめて成功した。すなわち、新規プローブを使用する際に不可欠となるハイブリダイゼーションおよび洗浄過程の条件の検討を放射性同位体を用いない手法で検討するとともに、最も重要なハイブリダイゼーションの過程も、蛍光または化学発光標識を用いて実施し、検出過程も蛍光検出法や化学発光検出法で行うことを可能にした。それにより、全工程を通じて放射性同位元素を用いることなく、Non-RI法で環境中の微生物核酸の相対的定量化手法を開発することに成功した。
【００２１】
環境試料中には様々な夾雑物が含まれており、かつ内部標準などの設定が難しく、核酸、特にRNAは酵素分解を受けやすい成分であることから、環境微生物からの核酸の抽出・精製の効率を正確に見積もることが困難である。したがって、精製度の高い核酸試料を定量できたとしても、用いた環境試料中に存在した全核酸含量を正確に定量（絶対定量）するには大きな限界がある。そこで、抽出・精製時に同一の挙動を示す核酸分子（同一分子でも複数分子でもよい）の中から、標的配列と基準配列を選定し、これらの存在量からその存在比を求め、相対量を算出することが、環境試料中の微生物の存在量を評価するためには最も有効だと考えられる。この解析手法は相対分子定量手法と称する。
【００２２】
かかる相対分子定量手法の原理は、同じ試料での複数プローブによるハイブリダイゼーションを前提とし、特定微生物プローブ（標的配列を検出する）のハイブリダイゼーションの定量値を全ての生物に共通なユニバーサルプローブ（基準配列を検出する）のハイブリダイゼーションの定量値で補正し、正確な相対値を求めるというものであり、実際には各種標準菌株について求めた値の平均値を参照データとすることにより標準化を行うことができる。この標準化にあたっては、既存のRI法で提示された手法を用いることができるが、全ての過程を Non-RI法ではじめて実現したことに本発明の新規性がある。また、この解析手法は、PCR法を全く用いないという点にも大きな特徴と利点がある。
【００２３】
1997年の石油流出事故直後に汚染現場で濃縮、採取し凍結保存しておいた現場微生物試料について、新規に開発した本手法を用いて解析を行った。その結果、全微生物群集中に占める前記脂肪族炭化水素分解菌および前記芳香族炭化水素分解菌の優占度を推定できた。また、該脂肪族炭化水素分解菌に対して新規に開発した核酸プローブは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）法による細胞レベルでの検出・定量化をも可能とするものであった。
【００２４】
上記のように、本発明によるNon-RI解析法は、実際の石油汚染環境の分子遺伝学的な診断やバイオ環境修復過程の解析・評価に有効である。また、該解析法は、キット化や自動化を図る上での利便性が高いこと、さらには、この一連の手法は石油以外の有害化学物質等により汚染された環境および環境試料の評価や汚染環境のバイオ環境修復過程の解析・評価を行うためにも極めて有益であることなどの利点を有している。また、有用物質生産微生物および病原微生物等の有害微生物を分離・培養法に依存せず、検出・定量し、解析・評価を行うためにも極めて有益である。
【００２５】
これらの知見に基づいて、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
１．  自然環境や人工的な環境から得られた試料中の特定機能微生物の核酸をNon-RI法（放射性同位体を利用しない方法）により検出および定量し、その環境中の特定機能微生物の優占度を解析する方法であって、以下の工程：
１）自然環境や人工的な環境から採取した微生物含有試料より、標的となる核酸を抽出・精製、保存する工程、
２）特定機能微生物の標的となる核酸塩基配列情報の中から該特定機能微生物に特異的な核酸配列を選抜し、該配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Non-RI標識でこれを標識して、該特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブを作製する工程、
３）１）で抽出・精製した標的となる核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化し、これを特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブと接触させてハイブリダイゼーション処理を行った後、洗浄処理を行う工程、
４）ハイブリダイズしたNon-RI標識核酸プローブに由来するシグナルを視覚化して解析し、その定量値を求める工程、
５）求めた定量値を用い、全生物ならびに生物界の各ドメインにつき測定した定量値と比較して、特定機能微生物の優占度を算出する工程、
を含む前記の方法。
【００２６】
２．  ３）の洗浄処理を、特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブを用いて作成されたプローブの遊離曲線から求めた至適洗浄温度で行うことを特徴とする上記１に記載の方法。
３．  Non-RI標識核酸プローブが、蛍光標識又は化学発光標識されたものであることを特徴とする上記１又は２に記載の方法。
４．  特定機能微生物が特定の化学物質を分解する微生物であることを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．  特定の化学物質が有害化学物質であることを特徴とする上記４に記載の方法。
【００２７】
６．  特定の化学物質が石油および石油成分であることを特徴とする上記４に記載の方法。
７．  特定機能微生物が特定の有用物質生産微生物であることを特徴とする上記1〜３のいずれかに記載の方法。
８．  特定機能微生物が病原微生物を含む特定の有害微生物であることを特徴とする上記1〜３のいずれかに記載の方法。
９．  上記１〜８のいずれかに記載の方法を用いて、自然環境や人工的な環境中の特定機能微生物の優占度を解析することにより、その環境の微生物群集機能を解析・評価する方法。
１０．  上記１〜８にいずれかに記載の方法を用いて、汚染環境を解析・評価する方法。
【００２８】
１１．  上記４又は５に記載の方法を用いて、有害化学物質汚染環境を解析・評価する方法。
１２．  上記６に記載の方法を用いて、油濁環境を解析・評価する方法。
１３．  配列番号５の塩基配列またはこれに相当するリボキシヌクレオチド配列の一部を有し、Alcanivorax系統群または属の石油分解菌由来の核酸と特異的にハイブリダイズしうる、塩基長10-50bpのRNAまたはDNAプローブ。
１４．  Alcanivorax系統群または属の石油分解菌由来の核酸と特異的にハイブリダイズし、それを検出もしくは定量しうる配列番号１に記載の塩基配列またはこれに相当するリボキシヌクレオチド配列を有する、DNAまたはRNAプローブ。
１５．  Alcanivorax系統群または属の石油分解菌がAlcanivorax borkumensis又はその近縁種である、上記１３または１４記載のDNAまたはRNAプローブ。
【００２９】
１６．  特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブとして、Alcanivorax系統群または属の石油分解菌由来の核酸と特異的にハイブリダイズしうる上記１３記載のDNAもしくはRNAプローブ、または配列番号１記載の塩基配列もしくはこれに相当するリボキシヌクレオチド配列を有するDNAもしくはRNAプローブ、および／あるいは、Cycloclasticus属の石油分解菌由来の核酸と特異的にハイブリダイズしうる、配列番号６の塩基配列もしくはこれに相当するリボキシヌクレオチド配列の一部を有する、塩基長10-50bpのRNAもしくはDNAプローブ、または配列番号２〜４に記載された塩基配列もしくはこれに相当するリボヌクレオチド配列を有するDNAもしくはRNAプローブから選択される核酸プローブを使用し、上記１記載の方法により、環境微生物群集中のAlcanivorax系統群もしくは属および/またはCycloclasticus属の石油分解菌の優占度を解析し、油濁環境を解析・評価する方法。
【００３０】
１７．  環境微生物群集中の脂肪族炭化水素分解菌Alcanivorax borkumensisもしくはその近縁種、および/または芳香族炭化水素分解菌Cycloclasticus pugetiiもしくはその近縁種の優占度を解析することを特徴とする、上記１６に記載の方法。
【００３１】
１８．  上記１３記載のDNAもしくはRNAプローブ、Cycloclasticus属の石油分解菌由来の核酸と特異的にハイブリダイズしうる、配列番号６の塩基配列の一部もしくはこれに相当するリボヌクレオチド配列を有する塩基長10-50bpのDNAもしくはRNAプローブ、および／または、配列番号１〜４に記載された塩基配列もしくはこれに相当するリボヌクレオチド配列を有するDNAもしくはRNAプローブから選択される1種以上の核酸プローブをNon-RI標識して得られたNon-RI標識プローブを含有することを特徴とする、汚染環境および環境試料の分子遺伝学的解析・評価用のキット。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、１）自然環境や人工的な環境から採取した微生物含有試料より、標的となる16S rRNAなどの核酸を抽出・精製、保存する工程、２）特定機能微生物の標的となる16S rDNAなどの塩基配列情報の中から、該特定機能微生物に特異的な配列を選抜し、該配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Non-RI標識でこれを標識して、この特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブを作製する工程、３）１）で抽出・精製された標的となる16S rRNAなどの核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化し、これを２）で作製した特定機能微生物に特異的なNon-RI標識核酸プローブと接触させてハイブリダイゼーション処理を行った後、洗浄処理を行う工程、４）ハイブリダイズしたNon-RI標識核酸プローブに由来するシグナルを視覚化して解析し、その定量値を求める工程、５）求めた定量値を用い、全生物ならびに生物界の各ドメインににつき測定した基準配列の定量値と比較し、特定機能微生物の優占度を算出する工程を含む、自然環境や人工的な環境から特定機能微生物の核酸をNon-RI法（放射性同位体を利用しない方法）により検出および定量し、その環境中の特定機能微生物の優占度を解析する方法を提供する。
【００３３】
この方法において、全生物ならびに生物界の各ドメインの群集の存在量を測定することは、対象とする環境試料中での微生物群集全体の大きさ（母集団の大きさ）を知る上で不可欠なものであり、該群集中の特定機能微生物の優占度を見積もる工程において大変重要な意味をもつ。
【００３４】
「優占度」とは、試料中の全微生物または各ドメインに属する微生物に対する、対象の特定の微生物の占める割合をいう。
ここで「自然環境」とは、地球上の生物圏を意味し、海洋や湖沼、河川等の水圏、土壌や陸上地下、海底地下等の地圏、地球表層のような気圏、および動植物体およびその死骸等、微生物が生息している地球上全ての環境をいう。
【００３５】
「人工的な環境」とは、程度の差はあれ人為的に管理された環境のことを意味し、例えば、実験室のフラスコや実証試験装置内の環境、食品や醸造、製薬等の化学・バイオ分野で使用されている発酵槽などの製造タンク内の環境、または水道水、生活・工業利用水、冷却水、循環水、排水、下水などの水の人工的な製造、加工、貯蔵、輸送、利用、廃棄に係わる環境のことをいい、微生物が存在または混入する可能性がある全ての人為的に管理された環境をいう。
【００３６】
「特定機能微生物」とは、自然環境に生息する微生物の中で、その機能および特性が培養や遺伝子解析などにより特定化された微生物のことをいい、例えば、石油および石油成分などの特定の化学物質を分解する微生物、トリクロロエチレン、および、PCB、ダイオキシン等有機塩素化合物、環境ホルモン物質（アルキルフェノール、ビスフェノールA、フタル酸エステル等）、有機水銀シアン化合物、有機スズ化合物などの有害化学物質を分解する微生物などを例示することができる。 また、キチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニン分解酵素等の有用な酵素および各種抗生物質等の有用物質を生産する微生物、大腸菌O157株を含む大腸菌、コレラ菌、および炭疽菌等の病原微生物、ならびに、硫化水素を生成することによりタンクの腐食および悪臭の原因となる硫酸還元菌なども、特定機能微生物の例として挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
「近縁種」とは、その表現形質、遺伝子配列の相同性から判断して、既知の種には帰属させることはできないが、既知の種の性質と区別して新種を確立するには至らないような菌種で、特定の性質また既知種の間で表現形質が非常に類似し、系統分類学的位置が非常に近い種を指す。本明細書中で用いる場合は、生物の系統分類学の指標として広く用いられる16SrDNAの相同性から判断して、その相同性が、90％以上のもの、好ましくは94％以上のもの、さらに好ましくは96％以上のものを指す。Alcanivorax borkumensisの近縁種の例としては、Alcanivoraxsp.ST-T1、Alcanivorax sp.WF-1、Alcanivorax sp.Shm-2、Alcanivorax sp.K3-3、Alcanivorax sp.K2-1、Alcanivorax sp.TE-9、fFundlbacter jadensisなどが挙げられる。Cycloclasticus pugetiiの近縁種としては、Cycloclasticus sp.M4-6、Cycloclasticus sp.E16-S、Cycloclasticus sp.W、Cycloclasticus sp.G、Cycloclasticus sp.N3-PA321、Cycloclasticus sp.（Cycloclasticus oligotrophus）などが挙げられる(これらのrDNA配列は、日本DNAデータバンク(DDBJ)に登録されている)。しかしながら、ここに列挙した例示に限定されない。
【００３８】
「自然環境や人工的な環境から採取した微生物含有試料」とは、海水や湖水、河川水、底泥、堆積物、土壌、鉱物、地下水、間隙水、動植物などの自然環境試料そのもの、または上記の人工的な環境試料そのもの、および、それらの環境中に微生物が少ない場合は、ろ過や遠心分離などにより環境中の微生物を濃縮した試料のことを意味する。たとえば、大多数の一般的な微生物の大きさより小さい0.2マイクロメーターの孔径の平膜フィルターや中空糸膜フィルターなどのフィルターを用い、ろ過操作により環境水中の微生物をフィルター上で濃縮し、該濃縮物を試料とすることができる。また、孔径0.2マイクロメーターの平膜フィルターを用い、たとえばMillipore社製タンジェンシャルフローろ過器を用いて、液体試料を垂直方向ではなく水平方向に流してろ過濃縮し、その濃縮液を試料とすることができる。また、試料を直接高速遠心分離操作、たとえば約8,000×g以上の遠心力で１０分間以上遠心分離に供することにより、微生物を沈殿させて、濃縮試料を得、これを核酸抽出用試料とすることができる。
【００３９】
上記の微生物含有試料からの核酸抽出には、公知の方法（例えば、M. G. Murray and W. F. Thompson, Nucleic Acids Research 8: 4321-4325, 1980 に記載されている方法）を用いることができる。土壌や堆積物試料のような場合は、ヒドロキシアパタイトを用いた精製手法（例えば、K. J. Purdy, D.B. Nedwell, T. M. Embley and S. Takii: Use of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes to Investigate the occurrence and selection of sulfate-reducing bacteria In response to nutrient addition to sediment slurry microcosms from aJapanese estuary, FEMS Microbiol. Ecol., 24, 221-234, 1997）等も有益である。特に、分析対象が16S rRNA等のRNAである場合、市販のRNA抽出キット、たとえば、Qiagen RNeasy kit、Stratagene RNA RT-PCR Miniprep kit、Clontech NucleoSpin RNA kit、Ambion RNAqueous kitなどを用いることができる。また、試料中に多量の夾雑物が含まれている場合、いくつかの核酸抽出手法を併用し、核酸抽出物の精製度を向上させることができる。この精製度は、たとえば、分光光度計を用い、波長220〜400 nm付近の吸収スペクトルを測定し、純粋なRNAまたはDNA標準試料の吸収スペクトルと比較することにより、簡易に確認することができる。いずれにしても、抽出、精製の操作の際には、微生物、核酸分解酵素および夾雑物の混入を防ぐために、細心の注意が必要である。
【００４０】
「Non-RI標識核酸プローブを作製する」とは、プローブとして選抜した配列を有する、約10〜50塩基長のオリゴヌクレオチドに、蛍光検出や化学発光検出、化学蛍光検出などのRIを用いない検出手法での解析を可能にするような標識化を行ってNon-RI標識核酸プローブを作製することを意味する。ここで、オリゴヌクレオチドは、公知の方法、たとえば、ホスホルアミド法またはトリエステル法により合成できる。あるいは、DNA自動合成機により合成してもよい。オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で直接標識してもよく、また、ジゴキシゲニン等のペプチド性物質で標識し、該ペプチド性物質と結合する物質を介して間接的に標識できることも、当業者には公知である。蛍光色素としては、ローダミン、フルオロセイン-イソチオシアネート (FITC)、ルシファーイエローCH（LuciferYellow CH）、ローダミン123（Rhodamine 123）、ピロニンY（Pyronin Y）、ヨウ化プロピジウム（Propidium iodide）、エチジウムホモダイマー（Ethidium homodimer）、カルボキシフルオレセインジアセテート (CFDA)、フルオレセインジアセテート (FDA)、カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル (CFDA-AM)、5-シアノ-2,30ジトリルテトラゾリウム (CTC)、テトラメチルローダミンイソチオチアネート(TRITC)、スルフォルホダミン101酸塩化物（Sulforhodamine 101 acid chloride ；テキサスレッド（Texas Red）)、Cy3、 Cy5、Cy7、2-ヒドロキシ-3-ナフトール酸-2'-フェニルアニリドホスフェート（2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate； HNPP)などが例示できるが、これらに限定されることなく、当業者に公知のあらゆる蛍光物質を用いてよい。また、オリゴヌクレオチドを抗原物質で標識し、酵素免疫学的手法を用いて基質の酵素分解により生じる化学発光または蛍光（化学蛍光とも言う）を検出する手法も利用できる。間接的標識および酵素免疫学的手法を用いるための標識としては、ビオチン/アビジン、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニンの系などを利用することが可能であるが、これらに限定されない。
【００４１】
上記のいずれの場合でも、ハイブリダイゼーションに用いる膜フィルターおよび有機被膜処理したスライドガラスなどの基盤に由来するバックグラウンドの蛍光または発光がないかもしくは微弱であり、該基盤への非特異的結合がないかもしくは極めて少ない蛍光色素またはタンパク質間結合もしくは酵素-基質反応系を用いることが好ましい。たとえば、膜フィルターをハイブリダイゼーションの基盤として用いて蛍光検出を行う場合はCy 5などの蛍光色素を用いることが好ましく、また同様に化学発光検出を行う場合は、例えば、ジゴキシゲニン（DIG）などで標識し、アルカリフォスファターゼ標識化抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、CDP-Starをアルカリフォスファターゼの基質とする化学発光系（たとえば、Roche社製のキット）を利用するとよい。
【００４２】
「Non-RI法でプローブの遊離曲線を求める」ためには、上記で作製した蛍光色素やジゴキシゲニン等の抗原物質やペプチド性物質で標識した核酸プローブを用い、そのプローブ配列に相補的なrRNA配列を有する微生物の核酸抽出試料をたとえばプラスにチャージしたナイロン膜フィルターやポリ-Ｌ-リシンなどの有機被膜処理を施したスライドガラス等のハイブリダイゼーション用の基盤上でハイブリダイゼーションを行う。次に、Zheng ら（D. A. E. Zheng et al.: 1996、前出）によりRI標識核酸プローブを用いて行われた手法に準じ、蛍光量や化学発光量の測定を行う。すなわち、数℃ずつ温度を上昇させて、温度を上昇させる度に洗浄液を交換して洗浄処理し、各温度での洗浄処理毎に洗浄液中に遊離してくるNon-RI標識核酸プローブに由来する蛍光または化学発光の量を測定し、その測定値を洗浄温度に対してプロットして遊離曲線を求める。最終的には、得られたＳ字型の遊離曲線において、低温域側に見られる変曲点付近の温度をプローブの至適洗浄温度とする。
【００４３】
「核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化する」ためには、まず、たとえばプラスにチャージしたナイロン膜フィルターやポリ-Ｌ-リシンなどの有機被膜処理を施したスライドガラス等のハイブリダイゼーション用の基盤上に、核酸試料を一定量滴下し、核酸を接着させる。次に、フィルターを基盤として用いる場合は、UV照射装置、たとえばUVクロスリンカー（Stratagene社製）などを用いてUV照射処理を行うか、またはやアルカリ溶液処理を行うことにより、核酸をフィルター上に強く吸着または結合させることで、核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化することができる。スライドガラスなどを基盤として用いる場合には、基盤と核酸との間で核酸の吸着を仲介する物質（たとえばポリ-Ｌ-リシンなど）でガラス表面に被膜を形成させた後、核酸試料をその上に滴下し、吸着させることで核酸をハイブリダイゼーション用の基盤上に固定化することができる。
【００４４】
「Non-RI法でハイブリダイゼーション処理および洗浄処理を行う」ためは、以下の工程を行う。上記の方法で基板上に固定化した核酸試料を、まず、ハイブリダイゼーション溶液（たとえば、Raskin L, S. J., Rittmann BE, Stahl DA: Group-Specific 16S rRNA Hybridization Probes to Describe Natural Communities of Methanogens. Applied and Environmental Microbiology, 60: 1232-1240, 1994に記載の溶液）と、任意の温度、たとえば３５℃にて３０分間接触させる（プレハイブリダイゼーション過程）。次に、上述したNon-RI標識核酸プローブを添加した上記ハイブリダイゼーション溶液と、任意の温度、たとえば３５℃にて一晩接触させる（ハイブリダイゼーション過程）。これらの工程で、後者の処理は必須である。最後に、ハイブリダイゼーション後の固定化核酸試料を、洗浄溶液（たとえば、D. A. E. Zheng et al.: 1996 [前出] に記載の溶液）と、用いたプローブについて上記の方法で求めた至適洗浄温度にて３０分間ずつ２回接触させる（洗浄過程）。
【００４５】
「ハイブリダイズしたNon-RI標識核酸プローブに由来する蛍光または化学発光シグナルシグナルを視覚化して解析し、その定量値を求める」は、以下の手順にしたがって行う。上記ハイブリダイゼーションおよび洗浄処理を行った後、核酸の相補的結合により基盤上に固定化された核酸試料にハイブリダイズしているDNAプローブに由来する蛍光または化学発光シグナルを、その標識プローブに由来するシグナルの種類に応じた装置および条件を用いて、即ち、蛍光シグナルの場合は蛍光イメージアナライザー、たとえばFluoroImagerやStorm、Typhoon（以上、Amersham Pharmacia Biotech社製）やFX Pro（BioRad社製）および冷却CCDカメラなど、化学発光シグナルの場合はフォトマルや冷却CCDカメラ、フォトンカウンティングカメラなどの装置を用いて、画像として視覚化し、それを解析することにより、シグナル強度を定量値として獲得する。
【００４６】
「全生物」とは、アーキア（Archaea）、バクテリア(Bacteria)、ユーカリア(Eucarya)といった生物界の全３ドメインの総和を意味し、「全生物または生物界の各ドメインに対する特定機能微生物の優占度を算出する」とは、上記全３ドメインを対象として測定された定量値の総和または対象とする特定機能微生物が属するドメインを対象として測定した定量値を分母とし、特定機能微生物を対象として測定した定量値を分子として算出するものである。ただし、実際上は下記のようないくつかの補正を行う必要がある。
【００４７】
たとえば、16S rRNAを対象とする場合、たとえ２種のプローブの標的塩基配列領域がrRNA１分子中に１対１の比率で存在する場合でも、rRNAの立体構造等の影響により、それらの定量値は同じになるとは限らない。このような場合、標的塩基配列領域の存在比に比例した定量値が得られるよう、補正する必要がある。
【００４８】
また、抽出・精製効率を正確に推定しない限り、特定機能微生物に特異的な標的塩基配列領域の絶対定量は不可能であるが、抽出・精製効率の正確な推定は上述した通り、現在のところ不可能である。したがって、上記３ドメイン全てに共通した塩基配列領域（ユニバーサル領域）を比較対照とし、それに対する標的塩基配列領域の割合をもって、標的塩基配列領域の存在量を相対的に評価する必要がある。
【００４９】
また、rRNAの場合、１細胞あたりの存在量は、細胞の活性に加え、細胞の種類によっても異なっていると考えられる。さらに、上記のユニバーサル領域に対する各種ドメインに特異的な領域の割合も、rRNAの立体構造に起因して、同じドメイン間でも種類によって異なっていると考えられる。したがって、これら種類の違いに基づく定量値のばらつきを、予め代表的ないくつかの標準菌株を用いて測定し、平均値を求め、これを基に計算上の補正を行う必要がある。
【００５０】
最後に、ハイブリダイゼーション用の基盤そのものやそれに非特異的に吸着した核酸プローブがもたらすバックグラウンドの定量値を、測定値より差し引く必要がある。
これら特定機能微生物の優占度を算出する上での補正を行うにあたっては、既にRI法において提唱されている以下の式１（S. J. Giovannoni et al.: 1990、前出）を用いて行うことができる。
【００５１】
【数１】
0004323740.tif 000002
【００５２】
この算出にあたって、バクテリア、アーキア、ユーカリアの各ドメインの検出・定量には、Amannら（R. I. Amann et al.: 1995、前出）に記載されているEuba338、Arch 915、Euka 502などのDNAプローブを用いることができる。また、全生物共通領域を標的としたDNAプローブには、Univ 1390（D. A. E. Zheng et al.: 1996、前出）などを用いることができる。特定機能微生物の検出・定量には、その微生物に固有の遺伝子塩基配列領域、たとえば16S rDNA,、18S rDNA、23SrDNA、gyrBなどの遺伝子塩基配列情報の中からその種に特異的な塩基配列領域を選定し、その配列を含むプローブを合成すればよい。Non-RI標識核酸プローブは、上述した方法により作製できる。
【００５３】
上記の方法を用いて、自然環境や人工的な環境中に優占している特定機能微生物の優占度を解析することにより、その環境の微生物群集機能を評価することができる。ここで、「微生物群集機能」とは、対象とした環境中に生息する複数種の微生物により営まれる総体としての機能のことをいう。ここで言う微生物の種類とは、通常の分類単位である種であることが好ましいが、実験上の機能単位、たとえば石油分解菌群やPCB分解菌群という一つの機能単位であってもよい。したがって、特定機能微生物一種のみの機能を微生物群集機能とは呼ばない。
【００５４】
例えば、石油の分解をめぐっては、脂肪族炭化水素を分解する微生物や芳香族炭化水素を分解する微生物以外にも、それらの分解中間代謝産物を炭酸ガスまで分解する過程には多くの微生物が関与しており、これらの微生物にビタミン等の微量必須栄養素を供給する微生物等も共存しているものと考えられ、複数種の微生物が協同して石油の無機化、無毒化に関与しているものと考えることができる。この場合、ある分解産物が生育阻害物質になりうる場合には、その分解産物を利用可能な微生物と共存することにより分解効率は上昇するものと考えられ、微生物群集全体として高い分解機能が発現されることになる。
【００５５】
具体的には、前述した方法により微生物群集内の一種または複数種の特定機能微生物、たとえば好気性の炭化水素分解菌、PCB分解菌、タンパク質分解菌、グルコース資化性菌等、および嫌気性の硫酸還元菌やメタン生成菌等、ならびに病原菌等の有害微生物、各種酵素または抗生物質を生産する有用物質生産菌等の優占度を調べておき、その時間変化を調べることにより、各々の特定機能微生物の遷移を解析することができる。その結果、たとえば、沿岸表層水において、ある時期に硫酸還元菌の優占度が上昇していれば、その時の微生物群集は潜在的に硫酸還元機能が高いと評価できるし、その原因として、試料採取以前に台風や地殻活動等による底泥の巻き上がりや嫌気的な排水の流入等により、それらが通常の生息環境から移入してきたものと推定することができる。
【００５６】
また、上記の方法を用いて、汚染環境を解析・評価することができる。たとえば、対象とする特定機能微生物が、あるパルプ工場の排水中に特異的に優占する従属栄養細菌である場合、ある時期にその優占度が上昇していれば、その環境はこの排水に汚染されている可能性が高いと判断でき、その優占度の変化を長期間に渡ってモニターしてその遷移の周期性や季節性を把握していれば、その変化が突発的なものであるかどうか、またその負荷が人為的なものかどうかを評価することができる。また、有用物質生産微生物を含む環境試料の採取場所、時期・季節、および有害微生物の発生場所、時期・季節を推定することができる。
【００５７】
さらに、上記の方法を用いて、有害化学物質汚染環境および特定微生物を含むと考えられる環境試料を解析・評価することができる。たとえば、対象とする特定機能微生物がPCB分解菌である場合、ある時期にその優占度が上昇していれば、その環境はPCB汚染されている可能性が高いと判断でき、その微生物群集は総体としてPCB分解機能が高まっていると判定できる。さらに、その優占度の変化を長期間モニターしその遷移の周期性や季節性を把握していれば、その変化が突発的なものであるかどうか、その負荷が工場排水の流入等人為的なものかどうかを推定することができる。
【００５８】
また、上記の方法を用いて、油濁環境を解析・評価することができる。たとえば、対象とする特定機能微生物が石油成分由来のもの、たとえばテトラデカンやアントラセンの分解菌である場合、ある時期にその優占度が上昇していれば、その環境は、前者の場合であれば石油成分の中でもｎ-アルカン等の飽和炭化水素で、後者の場合は芳香族炭化水素で、それぞれ汚染されている可能性が高いと判断でき、その微生物群集は総体としてその石油成分の分解機能が高まっていると判定できる。また、特定機能微生物の優占度の変遷を調べることにより、石油汚染またはその他の汚染の程度やバイオレメディエーション過程の解析・評価を行うことができる。さらに、その優占度の変化を長期間に渡ってモニターしその遷移の周期性や季節性を把握していれば、その変化が突発的なものであるかどうか、その負荷が船舶事故等に起因した人為的なものかどうかを推定することができる。
【００５９】
特定機能微生物として、多くの海域に分布することが知られている脂肪族炭化水素分解菌に着目した場合、四国沿岸域より集積培養を経て純粋分離された脂肪族炭化水素分解菌GR211-P1菌株（特許寄託番号FERM BP-7788：平成１３年１１月５日付け国際寄託へ移管）の16S rDNAの塩基配列（配列表配列番号５）の一部を有し、Alcanivorax 属の石油分解菌、特にAlcanivorax borkumensisおよびその近縁種に由来する核酸と特異的にハイブリダイズし、それを検出または定量しうる配列番号１の塩基配列領域（配列番号５における塩基番号207〜226の領域。Escherichia coli の16S rDNAの塩基配列における５'末端からの位置を示したナンバーリングシステム[H. F. Noller and C. R. Woese, Science, 212: 403-411, 1981]では、塩基番号222〜241に相当する領域）およびこの領域の塩基配列の全部または一部を含む塩基長10〜50 bp、好ましくは塩基長15〜25を有するDNAプローブ、またはそれらに相当するリボヌクレオチド配列を有するRNAプローブを設計するとよい。一例として、以下のプローブを挙げることができる。
（１）5'-CGA CGC GAG CTC ATC CAT CA-3' (Albo 222, 20 mer)（配列番号１）
3'-GCT GCG CTC GAG TAG GTA GT-5' （配列番号７）
これらのプローブを合成し、Non-RI標識、すなわち、蛍光色素や抗原物質などで標識する場合は、前述した方法を用いて行えばよい。
【００６０】
特定機能微生物として、複数の海域でその分布が確認されている芳香族炭化水素分解菌に着目する場合、以下の塩基配列を有するDNAプローブおよびRNAプローブをを用いることができる。
（１）5'-GGAAACCCGCCCAACAGT-3'（Cypug829-846*, 18mer：配列番号６における塩基番号823〜840の領域）（配列番号２）
3'-CCTTTGGGCGGGTTGTCA-5' （配列番号８）
（２）5'-TGCACCACTAAGCGGAAACC-3'（Cypug840-859*, 20mer：配列番号６における塩基番号834〜853の領域）（配列番号３）
3'-ACGTGGTGATTCGCCTTTGG-5' （配列番号９）
（３）5'-TGCACCACTAAGCGGAAACCCGCCCAACAGT-3'
（Cypug829-859*, 31mer：配列番号６における塩基番号823〜853の領域）（配列番号４）
（なお、*（数字）はEscherichia coliの16S rDNA塩基配列における5'末端からの位置（ナンバーリングシステム）を示す（Noller H. F. and C. R. Woese, 1981. Science, 212:403-411）。）  （３）のプローブの塩基配列は、（１）と（２）のプローブの塩基配列が隣接したものであるが、この場合はプローブが自己結合する可能性があるので注意が必要になる。
【００６１】
これらのプローブは、1997年1月2日のロシアタンカーナホトカ号による日本海での石油流出事故後、船首部が着底して大量の流出油が漂着した福井県三国町沿岸海域において1997年1月15日に採取した試料から見出された石油分解菌に由来する16S rDNA塩基配列（配列表配列番号６）の一部を有し、Cycloclasticus属の芳香族炭化水素分解菌、特にCycloclasticus pugetiiおよびその近縁種を検出するために設計されたものである。
【００６２】
これらの特定機能微生物検出用核酸プローブに加え、その特定機能微生物が属するドメインを対象とした検出用核酸プローブや、それを含む全生物を対象としたユニバーサルプローブを用い、対象とする環境微生物含有試料に上述した分子遺伝学的な検出および定量化手法（相対分子定量法）を適用することにより、Alcanivorax 属の脂肪族炭化水素分解菌、特にAlcanivorax borkumensisおよびその近縁種、およびCycloclasticus属の芳香族炭化水素分解菌、特にCycloclasticus pugetiiおよびその近縁種が、全微生物群集および/またはその両者が属するバクテリアドメインの中で、それぞれどの程度の優占度で存在しているのかを、分子レベルで正確に測定することができる。さらに、この優占度の時間的および/または空間的な変化を解析することにより、自然環境や人工的な環境、特に石油で汚染された油濁環境の状態を、微生物学的な観点から解析・評価することが可能となる。
【００６３】
本発明の方法によると、石油などの有害化学物質で汚染された環境を、その環境中に生息する微生物を、従来の分離・培養手法、およびRI（放射性同位体）ならびにPCR法を用いずに、簡便、迅速に分子遺伝学的に評価することができる。また、本発明の方法は、特に有用酵素や抗生物質等の有用物質生産微生物などの特定機能微生物の検出・定量、およびスクリーニングに応用することができる。さらに、本発明の方法は、病原体等の有害微生物などの特定機能微生物の検出・定量、およびスクリーニングに応用することもできる。したがって、本発明の方法に必要な試薬および器具をキットとして提供すること、ならびに本発明の方法を自動化することが可能かつ有益である。さらに、本発明の方法は、該有害化学物質汚染環境の評価及びバイオ環境修復（バイオレメディエーション）過程の解析や修復効果を評価するための診断ツールとしてきわめて有益である。また、本発明は、自然環境や人工的な環境中に含まれる、有用物質生産微生物、および病原微生物等の有害微生物などの特定機能微生物を検出・定量、およびスクリーニングするために有益である。したがって、本発明は、かかる特定機能微生物を含む環境試料の解析・評価において極めて有益である。
【００６４】
また、本発明で開示したDNAプローブは、近年多くの海域で出現することが報告されている特定の脂肪族炭化水素分解菌を特異的に識別し得るものであり、その検出および定量にきわめて有益である。
【００６５】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
（１）Alcanivorax borkumensis 検出用DNAプローブの開発
四国沿岸域より採取した試料から、集積培養を経て純粋分離に成功した脂肪族炭化水素分解菌GR211-P1菌株（特許寄託番号FERM BP-7788：平成１３年１１月５日付け国際寄託へ移管）の16S rDNA塩基配列情報（配列番号５）の中から、Stahl and Amann （Development and Application of Nucleic Acid Probes. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Ed.: E. Stackebrandt and M. Goodfellow, John Wiley and Sons, Chichester, pp. 205-248, 1991）により示された高次構造による障害が見られないと考えられる領域から、この菌種に特異的な配列を選抜し、該配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、その５'末端をFITC、TRITCまたはCy 5の蛍光色素により標識化し、最終的に配列番号１に示した配列を有するNon-RI標識DNAプローブ（以下、Albo 222ということがある）を作製した。
【００６６】
このプローブの配列は、国際塩基配列データベース上でAlcanivorax borkumensis SK2（基準菌株；M. M. Yakimov et al.: 1998、前出）の配列とのみ100％の相同性を示すことが確認され、Alcanivorax borkumensis検出用のDNAプローブとして有効であることが示された。
【００６７】
本発明に示したDNAプローブの使用にあたっては、Alcanivorax borkumensis DSM11573（標準菌株）を標的微生物、Pseudomonas aeruginosa IFO12689（標準菌株）などを対象微生物とし、Maruyama and Sunamura（Simultaneous direct counting of total and specific microbial cells in seawater, using a deep-sea microbe as biomarker. Applied and Environmental Microbiology, 66: 2211-2215, 2000）に記載した装置や手法を用い、FISH法にて実際にその有効性を確認した。この際のハイブリダイゼーションは、20 ％ホルムアミド存在下で４３℃で行い、洗浄処理は４４℃で行った。
【００６８】
（２）Cycloclasticus pugeti検出用DNAプローブ
もう一つの標的微生物としたCycloclasticus pugetiiを検出するためのDNAプローブとしては、Cyclopug 829-846（配列番号２：以下Cypug829ということがある）を用いた。このプローブの配列は、1997年1月2日に発生したロシアタンカーナホトカ号による日本海での石油流出事故後、船首部が着底して大量の流出油が漂着した福井県三国町沿岸海域において1月15日に採取した試料から、Ｃ重油を唯一の炭素源として用いた石油分解菌の段階希釈培養計数（MPN）試料中の増殖陽性フロント試料を得、そこから直接DNAを抽出し、その配列決定により明らかにされたCycloclasticus pugetii 16S rDNA塩基配列情報から、Cycloclasticus pugetiiに特異的な配列として見出したものである。
【００６９】
〔実施例２〕
これらのDNAプローブを用い、実際の石油汚染海域を対象とし、Cycloclasticus pugetiiおよびAlcanivorax borkumensisの優占度解析を実施した結果を以下に示す。
【００７０】
１）試料の採取と保存
分析対象には、1997年1月2日に発生したロシアタンカーナホトカ号による日本海での石油流出事故後、船首部が着底して大量の流出油が漂着した福井県三国町沿岸海域において、1997年1月15日に採取し凍結保存しておいた試料を用いた。すなわち、現地で採取した油濁海水約３リットルをすみやかに孔径0.2マイクロメーターの中空糸膜フィルターHF400（Millipore社製）を用いて該フィルター上にてろ過濃縮し、該フィルターごと凍結保存した。
【００７１】
２）細胞の破砕とRNAの抽出、保存
得られた環境微生物濃縮試料を中空糸膜フィルターごと12 ml容硬質ガラスチューブに移し、Qiagen社製RNeasy Midi Kitに含まれるRLT緩衝液を添加した。180℃で１時間以上乾熱滅菌しておいたガラスビーズ（Sigma社製GLASS BEADS 106 microns and finer）を、用いたRLT緩衝液1.5 mlに対して1.5 gとなる量で添加した後、細胞破砕器（B.Braun社製 MSK Cell Homogenizer）にて５分間の往復振とう処理により細胞破砕を行った。この処理は、電子温度計でモニターして、液体二酸化炭素を噴霧して試料の温度を5℃程度に維持しながら行った。また、この処理時間は、グラム陰性細菌より細胞壁が堅く、陸上に多く生息するグラム陽性細菌に属するBacillus subtilis IFO13719細胞を用い、顕微鏡下でその細胞破砕状況を観察し、かつ、緩衝液中に溶出された核酸をアガロースゲル電気泳動にて解析し、核酸の溶出量が高く、かつ過度の核酸の断片化を起こさない時間を選定し、処理条件とした。得られた細胞破砕試料より、Qiagen社製RNeasy Midi Kitを用いてRNAを抽出・精製し、各々50-100 μlずつ小分けして-80℃で保存した。
【００７２】
３）全RNA量の測定
ハイブリダイゼーション解析の前に、試料中の全RNA量を、RiboGreen RNA Quantitation Kit（Molecular Probes社製）を用い、蛍光分光光度計RF-5300PC（島津社製）にて励起波長480 nm、蛍光波長520 nm、バンド幅5 nmの設定条件で測定した。
【００７３】
４）Non-RI法でのハイブリダイゼーション
蛍光プローブを用いたNon-RI法でのハイブリダイゼーションは、以下のようにして実施した。まず、凍結保存しておいた試料を緩衝液（Dimethyl pyrocarbonate (DMPC)処理した水、20xSSC [0.15 M NaCl and 0.015 M sodium citrate]、フォルムアルデヒドを5:3:2の割合で混合した溶液）中にて溶解させ、試料中の核酸をポジティブチャージナイロン膜フィルター（Roche Diagnostics社製）上に吸着させ、UV Stratalinker（Stratagene社製）を用いて該フィルター上に固定化した。次に、ハイブリダイゼーション溶液（Raskin L, S. J., Rittmann BE, Stahl DA: Group-Specific 16S rRNA Hybridization Probes to Describe Natural Communities of Methanoges. Applied and Environmental Microbiology, 60: 1232-1240, 1994）を用い、35℃で30分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、終濃度10 pmol/mlとなるように上記Cy 5標識DNAプローブを添加した上記ハイブリダイゼーション溶液を用い、35℃で一晩のハイブリダイゼーションをおこなった後、該フィルターを洗浄溶液（1 % Sodium Dodecyl Sulfateを添加した1xSSC [0.15 M NaCl and 0.015 M sodium citrate]）中で、30分間、合計２回、以下の方法で決定された各々のプローブの至適洗浄温度で洗浄処理に供した。
【００７４】
５）Non-RI法でのプローブ遊離曲線測定と至適洗浄温度の決定
上記の至適洗浄温度は、Zhengら（D. A. E. Zheng et al.: 1996、前出）を参考に、Non-RI法により決定した。すなわち、各々の標準菌株（Cycloclasticus pugetii ATCC51542およびAlcanivorax borkumensis DSM11573）の核酸抽出試料を、上記膜フィルター上にドッドブロット（1ドットあたり約2 μgのRNAを添加）して固定化し、上述した方法により各々のDNAプローブとハイブリダイズさせ、35℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、膜フィルターを8ドット分ずつに切り、その断片を2 mlの洗浄溶液を入れた5ml 用のプラスチックチューブに移した。次に、洗浄温度を35℃から80℃まで3℃毎に上げ、温度を上げるごとに新たな洗浄溶液に交換して、洗浄処理を行った。得られた各々の洗浄溶液中に遊離してくるプローブの蛍光シグナルの量を、蛍光分光光度計RF-5300PC（島津社製）にて測定した（測定条件は、励起波長640 nm、蛍光波長662 nm、バンド幅5nmとした）。最後に、各温度での洗浄液中の蛍光シグナルの量から、洗浄温度に対する各プローブの遊離曲線を求めた。該遊離曲線を用いて前述の通りに求めた至適洗浄温度は、Alcanivorax borkumensisの検出用プローブでは47℃、Cycloclasticus pugetiiの検出用プローブでは41℃と決定された。
Alcanivorax borkumensis検出用プローブ（Albo222）について得られた遊離曲線を図１、またCycloclasticus pugetii検出用プローブ（Cypug829）について得られた遊離曲線を図２として示した。
【００７５】
６）蛍光シグナルの視覚化と定量解析
上記のCy 5標識DNAプローブとのハイブリダイゼーション、および洗浄処理を行った試料について、蛍光イメージアナライザーSTORM（Amersham Pharmacia Biotech社製）で、フィルターに固定化された核酸にハイブリダイズしているDNAプローブの蛍光シグナルをレッドレーザーダイオード（出力５mW、波長635nm）により励起し、それに対応する蛍光フィルター（650nmロングパスフィルター）を用いて検出し、その蛍光シグナルをドットイメージ画像として視覚化した。さらに、IPLab（Scanalytics社製）を用い、その蛍光画像を解析し定量値を求めた。すなわち、測定する試料のシグナルのイメージ画像からバックグラウンドのシグナルを差し引き、かつ同一メンブレン上にブロットしておいたE.coliの16SrRNA標準試料の段階希釈試料のイメージ画像から求められた検量線を用いて、試料に由来する蛍光シグナルの真の定量値を求めた。
【００７６】
７）特定微生物の優占度解析
全生物ならびにバクテリアドメインに対する標的微生物の優占度は、RI法で提唱されている上記式１によって算出した。
（測定値の補正）
ここで、各種ドメインの優占度算出に用いた補正値は、下記の標準菌株を用いて求めた。
【００７７】
バクテリアドメイン（Bacteria domain）
Escherichia coli DSM30083
Psychrobacter pacificensis IFO16279
Cycloclasticus pugetii ATCC51542
Alcanivorax borkumensis DSM11573
Arcobacter nitrofigilis DSM7299
Methylobacterium extorquens DSM1053
Methylophilus methylotrophus DSM46235
アーキアドメイン（Archaea domain）
Aeropyrum pernix JCM9820
Methanococcoides methylutens DSM2657
ユーカリアドメイン（Eucarya domain）
Saccharomyces cerevisiae IFO10217
これら補正に用いた標準菌株からの核酸の抽出には、RNeasy Maxi kit（Qiagen社製）を用い、各々200 μlずつ小分けして-80℃で保存した。
【００７８】
次に、上述した手法により、全RNA定量、ハイブリダイゼーション、洗浄処理、ドットイメージ画像の取得、画像の定量解析等を実施した。
ドメインレベルでのハイブリダイゼーションを行うプローブとしては、Ammanら（R. I. Amann et al.: 1995、前出）に記載されているEuba338（バクテリアドメイン）、Euka 502（ユーカリアドメイン）、Arch 915（アーキアドメイン）を用いた。また、全生物共通領域に対するDNAプローブには、Univ 1390（D. A. E. Zheng et al.: 1996、前出）を用いた。
【００７９】
そして、バクテリアドメイン中の標的とする特定機能微生物Cycloclasticus pugetiiおよびAlcanivorax borkumensisに対しては、上述した各々の種特異的DNAプローブCypug 829およびAlbo 222を用いた。
測定結果を表１に示す。表１において、試料１は三国町安島漁港内（Stn.A）で採取した試料、また、試料２は同町安島北部海岸船首部着底付近の岩礁域（Stn.B）で採取した試料である。
【００８０】
【表１】
0004323740.tif 000003
【００８１】
表１に示したように、試料１中にはバクテリアドメインが約４５．２%（全体を１００%とした場合６１．４%）、ユーカリアドメインが約１９．９％、アーキアドメインが約８．５％（合計は、７３．６％）見出された。また、試料２中にはバクテリアドメインが約５３．３%（全体を１００%とした場合５９%）、ユーカリアドメインが約２４．０％、アーキアドメインが約１３．３％（合計は、９０．６％）見出された。
【００８２】
表１において、バクテリアドメインの括弧内の数値は、該ドメイン全体の優占度を表すEuba338に対するCypug829及びAlbo222の割合を示す。すなわち、試料１のバクテリアドメイン中、このドメインに属する標的微生物である芳香族炭化水素分解菌Cycloclasticus pugetiiは２３．６%、もう一つの標的微生物である脂肪族炭化水素分解菌Alcanivorax borkumensisは４．４%の優占度を示す。同様に、試料２のバクテリアドメイン中、このドメインに属する標的微生物である芳香族炭化水素分解菌Cycloclasticus pugetiiは２４．５%、もう一つの標的微生物である脂肪族炭化水素分解菌Alcanivorax borkumensisは６．５%の優占度を示す。
【００８３】
以上、本手法に示したように汚染環境中の微生物の核酸抽出試料を対象とし、Non-RI法で特定機能微生物の優占度を定量化することにより、実際の汚染環境を分子遺伝学的に解析、評価、診断することが可能であることを明らかにした。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、自然環境や人工的な環境中（例えば、石油汚染環境など）に出現する特定機能微生物（例えば、石油分解菌、有用物質生産微生物、病原微生物、硫酸還元菌など）の優占度を、従来の多大な労力と時間を要する培養計数法を用いずに、しかもNon-RI及び（RIを用いない方法）による分子遺伝学的に定量的に解析する手法が提供された。 このような優占度の解析は現在のところPCR法によって実施することはできず、本発明によるNon-RI法による優占度解析は、環境中に含まれる微生物群集の解析・評価にとって極めて有効な手法である。
【００８５】
本発明の手法により、新たに開発された石油分解菌Alcanivorax borkumensisに特異的な核酸プローブの塩基配列は、広く沿岸域の油濁環境で優占する能力を有する天然の石油分解微生物に由来するものである。従って、このプローブの塩基配列は、この石油分解微生物の自然界や油濁環境のバイオ修復過程などの石油処理条件下、および屋外でのバイオ環境修復技術の実証試験や研究室での実験条件下における挙動を解明する上で、また油濁環境の診断ツールや油濁環境のバイオメディエーションによる修復効果を評価するための診断ツールとして、きわめて有益である。
【００８６】
また、本発明により、広く沿岸域に分布することが知られる代表的な脂肪族炭化水素分解菌および/または代表的な芳香族炭化水素分解菌の優占度解析が、分子遺伝学的な手法で実現した。したがって、本発明は、石油汚染海域での石油成分の残存状況や分解過程を生物学的にモニターする上で有益であり、栄養塩等の散布、および栄養塩などとともにこれらの微生物を油濁海域に散布することにより、現場で石油の微生物分解を促進させる環境修復技術（バイオレメディエーション技術）の開発にも有効で、かつ極めて大きな利便性がある。さらに、本発明は、有用物質生産微生物および病原微生物等の有害微生物などの特定機能微生物を検出・定量、スクリーニングするために、ならびに、かかる特定機能微生物を含有する環境試料の解析・評価においても極めて有益である。
【００８７】
【配列表】
0004323740.tif 000004
0004323740.tif 000005
0004323740.tif 000006
0004323740.tif 000007
0004323740.tif 000008
0004323740.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】  Alcanivorax borkumensis検出用プローブ（Albo222）について得られた遊離曲線を示す。
【図２】  Cycloclasticus pugetii検出用プローブ（Cypug829）について得られた遊離曲線を示す。
【図１】
0004323740.tif 000010
【図２】
0004323740.tif 000011