(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)を有する化合物、又はその薬学的に許容しうる塩又はエステル。
【化１】
0004354632.tif 000089
[式中、QはCH2又はN-Y (ここで、YはH又はC1-6アルキルである。)であり;
a) QがCH2である場合には、aは0であり、bは0であり、Bは式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはH; カルボキシル又はジ(低級アルキル)アミノで置換されていてもよいC1-10アルキル; C3-7シクロアルキル; C6アリール; C7-10アルキルアリール; (C3-7シクロアルキル)-(C1-6アルキル); 複素環C1-6アルキルであり; R11bはカルボキシル、(C1-6アルコシキ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されたC1-6アルキル; 又は芳香族の部分にカルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル、フェニルメトキシカルボニル、又は複素環C1-6アルキルで置換されたC7-16アラルキルであり; R11aとR11bが結合してカルボキシル又は(C1-6アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよい3〜7員窒素含有環を形成してもよい。)を有するアミド誘導体であり;
b) QがN-Yである場合には、aは0又は1であり、bは0又は1であり、Bは式R11-C(O)- (式中、R11は(i) カルボキシル、C1-6アルカノイルオキシ(例えば、AcOCH2)又はC1-6アルコキシ(例えば、Boc)で置換されていてもよいC1-10アルキル; (ii) カルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; (iii) カルボキシルと1〜3個のC1-6アルキル置換基で置換されたC3-7シクロアルキル; (iv) シクロアルキル部分にカルボキシ、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC4-10 (アルキルシクロアルキル); (v)
【化２】
0004354632.tif 000090
(vi) C1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルである。）を有するアシル誘導体であり;
R6が存在する場合にはカルボキシルで置換されたC1-6アルキルであり;
R5が存在する場合にはカルボキシルで置換されたC1-6アルキルであり;
c) QがCH2か又はN-Yである場合には、
R4はC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zはオキソ又はチオキソであり;
R3はカルボキシル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)で置換されていてもよいC1-10アルキルであり;
Wは下記式III'：
【化３】
0004354632.tif 000091
(式中、R13はOH; SH; NH2; カルボキシル; R12; OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12' であり、
ここで、R12及びR12' は独立して環状C3-16アルキル又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、 前記アルキル又はアルケニルはNH2 、OH、SH、ハロ又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよく;
R12及びR12'は独立してC1-6アルキル、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルでもあり; 前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよく;
前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは第2の5、6、又は7員環と縮合して環系又は複素環系を形成していてもよく、前記第2の環はNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよく; 前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよい。）を有する基であり;
R1'は水素であり、R1はプロピルであり; R1'とR1は共にC1-6アルキルで置換されていてもよい3〜6員環を形成してもよく;
Aはヒドロキシである。］
【請求項２】
下記式(Ia)を有する化合物。
【化４】
0004354632.tif 000092
[式中、YはH又はC1-6アルキルであり;
aは0又は1であり;
bは0又は1であり;
Bは式R11-C(O)-であり；
R3、R4、R5、R6、R11、W、R1 、R1' 及びAは請求項1で定義された通りである。]
【請求項３】
Bが式R11C(O)- (式中、R11は
カルボキシル、C1-6アルカノイルオキシ又はC1-6アルコキシで置換されていてもよいC1-6アルキル;
カルボキシル、MeOC(O)、EtOC(O)又はBnOC(O)で置換されていてもよいC3-7シクロアルキル;
3-カルボキシプロピオニル(DAD)又は4-カルボキシブチリル(DAE); 又は
【化５】
0004354632.tif 000093
である。）を有するアシル誘導体である、請求項２記載の式Iaの化合物。
【請求項４】
Bがアセチル、3-カルボキシプロピオニル、4-カルボキシルブチリル、AcOCH2C(O)、Me3COC(O)、
【化６】
0004354632.tif 000094
である、請求項3記載の式Iaの化合物。
【請求項５】
R6が存在する場合にはAsp又はGluの側鎖である、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
下記式(Ib)を有する化合物。
【化７】
0004354632.tif 000095
[式中、Bは式R11aN(R11b)C(O)- (式中、R11aはC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、カルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、C1-3カルボキシアルキル、C6アリール、C7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チアゾリジルメチルであり; R11bはカルボキシルで置換されたC1-6アルキルである。)を有するアミドであり、
R4はC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zはオキソ又はチオキソであり;
R3はカルボキシル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)で置換されていてもよいC1-10アルキルであり;
Wは下記式III'：
【化８】
0004354632.tif 000096
(式中、R13はOH; SH; NH2; カルボキシル; R12; OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12' であり、
ここで、R12及びR12' は独立して環状C3-16アルキル又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、 前記アルキル又はアルケニルはNH2 、OH、SH、ハロ又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよく;
R12及びR12'は独立してC1-6アルキル、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルでもあり; 前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよく;
前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは第2の5、6、又は7員環と縮合して環系又は複素環系を形成していてもよく、前記第2の環はNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよく; 前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよい。）を有する基であり;
R1'は水素であり、R1はプロピルであり; R1'とR1は共にC1-6アルキルで置換されていてもよい3〜6員環を形成してもよく;
Aはヒドロキシである。]
【請求項７】
R4がイソプロピル、シクロプロピル、tert-ブチル、1-メチルプロピル、又は2-メチルプロピルからなる群より選ばれる、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項８】
Zがオキソである、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項９】
R3がIle、allo-Ile、Chg、Cha、Val、Tbg又はGluの側鎖である、請求項１記載の式Iの化合物。
【請求項１０】
R13がOR12又はSR12 (ここで、R12はC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルであり、前記第1アリール又はアラルキルはC1-6アルキル、C3-7シクロアルキル、NH2 、OH、SH、ハロ、C1-6アルコシキ、カルボキシル、カルボキシ(低級)アルキル、又は第2アリール又はアラルキルで置換されていてもよく; 前記第1及び第2アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を含んでいてもよい。)である、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１１】
R13がBn; PhCH2CH2; PhCH2CH2CH2; O-Bn; o-トリルメトキシ; m-トリルメトキシ; p-トリルメトキシ; 1-ナフチルオキシ; 2-ナフチルオキシ; 1-ナフタレニルメトキシ; 2-ナフタレニルメトキシ; (4-tert-ブチル)メトキシ; (3I-Ph)CH2O; (4Br-Ph)O; (2Br-Ph)O; (3Br-Ph)O; (4I-Ph)O; (3Br-Ph)CH2O; (3,5-Br2-Ph)CH2O;
【化９】
0004354632.tif 000097
である、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１２】
R1' が水素であり、R1がプロピルである、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１３】
R1とR1' が共にC1-6アルキルで置換されていてもよいシクロプロピルを形成する、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１４】
a) QがCH2' である場合には、aが0であり、bが0であり、Bが式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、カルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、(C1-3アルコキシ)カルボニル、フェニルC7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チエニルメチルであり; R11bはカルボキシル又は(C1-4アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよい(C0-2アルキル)フェニル; 又はカルボキシル又は(C1-4アルコキシ)カルボニルで置換されたC1-6アルキルであり; R11aとR11bが結合してカルボキシル又は(C1-6アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよいピペリジン環を形成してもよい。)を有するアミドであり;
b) QがN-Y（ここで、YはH又はC1-6アルキルである。）である場合には、aが0又は1であり、bが0又は1であり、Bが式R11-C(O)- (式中、R11は(i) C1-6アルキル、カルボキシルで置換されたC1-6アルキル、MeC(O)O-、MeO-、EtO-、MeCH2CH2O-又はMe3C-O-; (ii) カルボキシルで置換されていてもよいシクロペンチル又はシクロヘキシル; (iv) シクロアルキル部分にカルボキシルで置換されていてもよいC4-10(アルキルシクロアルキル);
【化１０】
0004354632.tif 000098
(v)
(vi) フェニル、ベンジル又はフェニルエチルである。)を有するアシル誘導体であり;
R6が存在する場合にはCH2COOH又はCH2CH2COOHであり、
R5が存在する場合にはC1-6アルキル又はCH2COOH又はCH2CH2COOHであり;
c) QがCH2か又はN-Yである場合には、
R4がC1-6アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zがオキソ又はチオであり;
R3がC1-6アルキル; C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wは請求項1で定義された通りであり；
R1' が水素であり、R1がプロピルであり; R1' とR1が結合している炭素原子と共にエチルで置換されていてもよいシクロプロピルを形成してもよく;
Aがヒドロキシ又はその薬学的に許容しうる塩; C1-6アルコキシ、又は(アリールC1-6アルコキシ)である、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１５】
Bが式R11C(O)- (式中、R11はC1-6アルコキシ、カルボキシルで置換されていてもよいC1-10アルキル; カルボキシル又はベンジルカルボキシで置換されていてもよいC3-7シクロアルキルである。)を有するアシル誘導体; 又は
【化１１】
0004354632.tif 000099
であり;
R6が存在せず;
R5が存在せず;
R4がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
R3がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wは請求項1で定義された通りであり;
Aがヒドロキシ又はその薬学的に許容しうる塩; メトキシ、エトキシ、フェノキシ、又はベンジルオキシである、請求項2記載の式Iaの化合物。
【請求項１６】
Bがアセチル、3-カルボキシプロピオニル、4-カルボキシルブチリル、AcOCH2C(O)、Me3COC(O)、
【化１２】
0004354632.tif 000100
であり;
YがH又はMeであり、aが0又は1であり、bが0又は1であり;
R6が存在する場合にはAsp又はGluの側鎖であり;
R5が存在する場合にはAsp、D-Asp、Glu、D-Glu、Val、D-Val又はTbgの側鎖であり;
R4がVal、Chg、Tbg、Ile又はLeuの側鎖であり;
R3が水素又はIle、Chg、Val、Gluの側鎖であり;
Wが下記式III':
【化１３】
0004354632.tif 000101
(式中、R13はBn、PhCH2CH2 、PhCH2CH2CH2 、O-Bn、o-トリルメトキシ、m-トリルメトキシ、p-トリルメトキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、(4-tert-ブチル)ベンジルオキシ、(3I-Ph)CH2O、(4Br-Ph)O、(2Br-Ph)O、(3Br-Ph)O、(4I-Ph)O、(3Br-Ph)CH2O、(3,5-Br2-Ph)CH2O、
【化１４】
0004354632.tif 000102
である。）を有する基であり;
R1' がHであり、R1がプロピルであり;
R1' とR1が結合している炭素原子と共にシクロプロピルを形成してもよく; Aがヒドロキシルである、請求項2記載の式Iaの化合物。
【請求項１７】
Bが式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、カルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、(C1-3アルコキシ)カルボニル、フェニル、C7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チエニルメチルであり;
R11bがカルボキシル又は(C1-4アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよい(C0-2アルキル)フェニル; 又はカルボキシル又は(C1-4アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり; R11aとR11bが結合してカルボキシル又は(C1-6アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよいピペリジンを形成してもよい。）を有するアミドであり;R4がシクロヘキシルであり;
Zがオキソであり;
R3が水素又はIle、Chg、Val、Gluの側鎖であり;
Wが下記式III':
【化１５】
0004354632.tif 000103
(式中、R13はBn、PhCH2CH2 、PhCH2CH2CH2 、O-Bn 、o-トリルメトキシ、m-トリルメトキシ、p-トリルメトキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、(4-tert-ブチル)メトキシ、(3I-Ph)CH2O、(4Br-Ph)O、(2Br-Ph)O、(3Br-Ph)O、(4I-Ph)O、(3Br-Ph)CH2O、(3,5-Br2-Ph)CH2O、
【化１６】
0004354632.tif 000104
である。）を有する基であり;
R1' がHであり、R1がプロピルであり;
R1' とR1が結合している炭素原子と共にシクロプロピルを形成してもよく; Aがヒドロキシルである、請求項７記載の式Ibの化合物。
【請求項１８】
Bが式R11C(O)- (式中、R11はカルボキシルで置換されていてもよいC1-10アルキル; カルボキシルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; 又はシクロアルキル部分にカルボキシルで置換されていてもよいC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり; R11はC1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルでもある。)を有するアシル誘導体であり;
aが0又は1であり;
R6が存在する場合にはカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
bが0又は1であり;
R5が存在する場合にはカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
QがN-Yであり、YはH又はC1-6アルキルであり;
R4がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zがオキソであり;
R3がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wは請求項1で定義した通りであり；
R1' が水素であり、R1がプロピルであり;
R1' とR1が共にC1-6アルキルで置換されていてもよい3〜6員環を形成してもよく;
Aはヒドロキシル又はその薬学的に許容しうる塩又はエステルである、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１９】
下記式：
【化１７】
0004354632.tif 000105
で表される請求項1記載の化合物であって、上記式中、B、P6、P5、P4、P3、W及びP1がそれぞれ以下の通りの化合物から選択される、前記化合物。
【化１８】
0004354632.tif 000106
【請求項２０】
下記式：
【化１９】
0004354632.tif 000107
で表される請求項1記載の化合物であって、上記式中、B、P6、P5、P4、P3、R13及びP1がそれぞれ以下の通りの化合物から選択される、前記化合物：
【化２０】
0004354632.tif 000108
【化２１】
0004354632.tif 000109
上記表中、Ｘ1は、
【化２２】
0004354632.tif 000110
であり、Ｘ2は、
【化２３】
0004354632.tif 000111
であり、Ｘ3は、
【化２４】
0004354632.tif 000112
であり、Ｘ4は、
【化２５】
0004354632.tif 000113
であり、Ｘ5は、
【化２６】
0004354632.tif 000114
であり、Ｘ6は、
【化２７】
0004354632.tif 000115
であり、Ｘ7は、
【化２８】
0004354632.tif 000116
であり、Ｘ8は、
【化２９】
0004354632.tif 000117
であり、Ｘ9は、
【化３０】
0004354632.tif 000118
であり、Ｘ10は、
【化３１】
0004354632.tif 000119
であり、Ｘ11は、
【化３２】
0004354632.tif 000120
であり、Ｘ12は、
【化３３】
0004354632.tif 000121
であり、Ｘ13は、
【化３４】
0004354632.tif 000122
であり、Ｘ14は、
【化３５】
0004354632.tif 000123
であり、Ｘ15は、
【化３６】
0004354632.tif 000124
であり、Ｘ16は、
【化３７】
0004354632.tif 000125
であり、Ｘ17は、
【化３８】
0004354632.tif 000126
であり、Ｘ18は、
【化３９】
0004354632.tif 000127
であり、Ｘ19は、
【化４０】
0004354632.tif 000128
であり、Ｘ20は、
【化４１】
0004354632.tif 000129
であり、Ｘ21は、
【化４２】
0004354632.tif 000130
であり、Ｘ22は、
【化４３】
0004354632.tif 000131
であり、Ｘ23は、
【化４４】
0004354632.tif 000132
であり、Ｘ24は、
【化４５】
0004354632.tif 000133
であり、Ｘ25は、
【化４６】
0004354632.tif 000134
であり、Ｘ26は、
【化４７】
0004354632.tif 000135
であり、Ｘ27は、
【化４８】
0004354632.tif 000136
である。
【請求項２１】
下記式：
【化４９】
0004354632.tif 000137
で表される請求項1記載の化合物であって、上記式中、B、P6、P5、P4、P3、W及びP1がそれぞれ以下の通りの化合物から選択される、前記化合物：
【化５０】
0004354632.tif 000138
上記表中、Ｙ1は、
【化５１】
0004354632.tif 000139
であり、Ｙ2は、
【化５２】
0004354632.tif 000140
であり、Ｙ3は、
【化５３】
0004354632.tif 000141
である。
【請求項２２】
下記式：
【化５４】
0004354632.tif 000142
で表される請求項1記載の化合物であって、上記式中、B、R4、P3、R13及びP1がそれぞれ以下の通りの化合物から選択される、前記化合物：
【化５５】
0004354632.tif 000143
【化５６】
0004354632.tif 000144
上記表中、Ｚ1は、
【化５７】
0004354632.tif 000145
であり、Ｚ2は、
【化５８】
0004354632.tif 000146
であり、Ｚ3は、
【化５９】
0004354632.tif 000147
であり、Ｚ4は、
【化６０】
0004354632.tif 000148
であり、Ｚ5は、
【化６１】
0004354632.tif 000149
であり、Ｚ6は、
【化６２】
0004354632.tif 000150
であり、Ｚ7は、
【化６３】
0004354632.tif 000151
であり、Ｚ8は、
【化６４】
0004354632.tif 000152
であり、Ｚ9は、
【化６５】
0004354632.tif 000153
であり、Ｚ10であり、
【化６６】
0004354632.tif 000154
であり、Ｚ11は、
【化６７】
0004354632.tif 000155
であり、Ｚ12は、
【化６８】
0004354632.tif 000156
であり、Ｚ13は、
【化６９】
0004354632.tif 000157
であり、Ｚ14は、
【化７０】
0004354632.tif 000158
である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はＣ型肝炎ウイルス(HCV)感染症の治療のための化合物、組成物及び方法に関する。特に、本発明は新規ペプチド及びその類似体、このようなペプチドを含む医薬組成物並びにHCV感染症の治療におけるこれらのペプチドの使用方法を提供する。
【０００２】
（背景技術）
Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)は世界中の輸血後及び群集獲得性の非Ａ非Ｂ肝炎の主要な病因物質である。世界中の１億を越える人がそのウイルスにより感染されていると推定される。高比率のキャリヤーが慢性感染されるようになり、多くが慢性肝臓疾患、所謂慢性Ｃ型肝炎に進行する。このグループは順にひどい肝臓疾患、例えば、肝硬変、肝細胞性癌及び死に至る末期肝臓疾患について高リスクがある。
HCVがウイルス持続性を確立し、高率の慢性肝臓疾患を生じるメカニズムは充分に解明されていなかった。HCVが宿主免疫系と相互作用し、免疫系を回避する方法は知られていない。加えて、HCV感染症及び疾患に対する保護における細胞免疫応答及び体液性免疫応答の役割が未だ証明されていなかった。免疫グロブリンが輸血関連ウイルス肝炎の予防について報告されていた。しかしながら、疾患防除センター(Center for Disease Control)は現在ではこの目的に免疫グロブリンを推奨していない。
有効な保護免疫応答の欠如はワクチン又は適切な露出後の予防手段の開発を阻止しており、こうして短期間では、希望が抗ウイルス介入にしっかりと注がれている。
種々の臨床研究が慢性Ｃ型肝炎で冒された患者のHCV感染症を有効に治療することができる医薬物質を同定する目標で行なわれていた。これらの研究は単独及びその他の抗ウイルス剤と組み合わせてのインターフェロンαの使用を伴っていた。このような研究は、かなりの数の参加者がこれらの治療に応答しないことを示し、また有利に応答するものの中で、大部分が治療の終了後に再発することがわかった。
【０００３】
最近まで、インターフェロン(IFN)は慢性Ｃ型肝炎の患者について臨床で認められた判明した利点の唯一利用できる治療であった。しかしながら、持続応答率が低く、またインターフェロン治療は治療された患者の寿命の性質を低下するひどい副作用（即ち、網膜症、甲状腺炎、急性膵炎、鬱病）を誘発する。最近、リバビリンと組み合わせてのインターフェロンがIFN単独に非応答性の患者について認可されていた。しかしながら、IFNにより生じた副作用はこの組み合わせ治療で軽減されない。
それ故、既存の医薬療法の制限を解消するHCV感染症の治療に有効な抗ウイルス剤の開発に対する要望が存する。
HCVはフラビウイルス科ファミリー中のエンベロープ＋鎖RNAウイルスである。一本鎖HCV RNAゲノムは長さ約9500のヌクレオチドであり、約3000アミノ酸の単一の大きいポリタンパク質をコードする単一オープンリーディングフレーム(ORF)を有する。感染細胞中で、このポリタンパク質は細胞及びウイルスのプロテアーゼにより多部位で開裂されて構造タンパク質及び非構造(NS)タンパク質を生成する。HCVの場合、成熟非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）の生成が２種のウイルスプロテアーゼにより行なわれる。第一のもの（未だに不充分に特性決定されたもの）はNS2-NS3結合部で開裂する。第二のものはNS3のＮ末端領域内に含まれたセリンプロテアーゼ（それ故、NS3プロテアーゼと称される）であり、NS3-NS4A開裂部位でシス、また残りのNS4A-NS4B部位、NS4B-NS5A部位、NS5A-NS5B部位についてトランスの両方で、NS3の下流のその後の開裂を全て媒介する。NS4Aタンパク質はNS3プロテアーゼのコファクターとして作用し、NS3及びその他のウイルスレプリカーゼ成分の膜局在化をおそらく助けて、多機能を利用できることが明らかである。NS4AとのNS3タンパク質の複合体形成が部位の全てでタンパク質分解効率を増進するプロセシングイベントに必要と思われる。また、NS3タンパク質はヌクレオシドトリホスファターゼ活性及びRNAヘリカーゼ活性を示す。NS5BはHCVの複製に関係するRNA依存性RNAポリメラーゼである。
【０００４】
抗ウイルス剤の開発に一般的な戦略はウイルスの複製に必須であるウイルスによりコードされた酵素を不活化することである。この手法で、特許出願WO 97/06804はヌクレオシド類似体シトシン-1,3-オキサチオラン（また、3TCとして知られている）の(-)鏡像体をHCVに対して活性と記載している。この化合物は、HIV及びHBVに対し従来の臨床試験で安全と報告されたが、HCVに対し臨床上活性と判明される必要がまだあり、そのウイルスに対する作用のそのメカニズムが報告される必要がまだある。
HCVのNS3プロテアーゼ又はRNAヘリカーゼを抑制する化合物を発見しようとする多大な努力が下記の開示をもたらしていた。
・米国特許第5,633,388号明細書は複素環置換カルボキサミド及び類似体をHCVに対し活性であると記載している。これらの化合物はウイルスのNS3タンパク質のヘリカーゼ活性に対し誘導されるが、臨床試験はまだ報告されていなかった。
・フェナントレンキノンはChuら（Tet.Lett., (1996), 7229-7232）によりin vitroでHCV NS3プロテアーゼに対する活性を有すると報告されていた。この化合物についての更なる開発は報告されていなかった。
・抗ウイルス研究に関する第９回国際会議（日本、福島、裏磐梯(1996)）にて発表された論文(Antiviral Research, 30, 1, 1996; A23 (abstract 19))はチアゾリジン誘導体がHCVプロテアーゼに対し抑制性であると報告している。
【０００５】
幾つかの研究がヒト白血球エラスターゼの如きその他のセリンプロテアーゼに対し抑制性の化合物を報告していた。これらの化合物の一つのファミリーがWO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995)に報告されている。その出願に開示されたペプチドは本発明のペプチドとは構造を異にするモルホリニルカルボニル−ベンゾイル−ペプチド類似体である。
・ベルテックス・ファーマシューティカルズ社のWO 98/17679はセリンプロテアーゼ、特にＣ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼのインヒビターを開示している。これらのインヒビターは必須の特徴としてＣ末端活性化カルボニル官能基を含むNS5A/5B天然基質をベースとするペプチド類似体である。これらのペプチドはまたその他のセリンプロテアーゼに対し活性であると報告されており、それ故、HCV NS3プロテアーゼに特異的ではない。
・また、Hoffman LaRocheはHCV感染症の治療のための抗ウイルス剤として有益なプロテイナーゼインヒビターであるヘキサペプチドを報告していた。これらのペプチドはＣ末端にアルデヒド又はホウ酸を含む。
・Steinkuhlerら及びIngallinellaらはNS4A-4B産物抑制について公表していた(Biochemistry (1998), 37, 8899-8905及び8906-8914)。これらのペプチド及びペプチド類似体は本件出願の優先日の後に公表された。
【０００６】
本発明の一つの利点はそれがＣ型肝炎ウイルスのNS3プロテアーゼに対し抑制性であるペプチドを提供することである。
本発明の一局面の更なる利点は、これらのペプチドがNS3プロテアーゼを特異的に抑制し、300μMまでの濃度でその他のセリンプロテアーゼ、例えば、ヒト白血球エラスターゼ(HLE)、ブタ膵臓エラスターゼ(PPE)、もしくはウシ膵臓キモトリプシン、又はシステインプロテアーゼ、例えば、ヒト肝臓カテプシンＢ(Cat B)に対し有意な抑制活性を示さないという事実にある。
（発明の開示）
本発明者らはNS3プロテアーゼに対し潜在的に抑制性のペプチドを研究した。NS3プロテアーゼの天然基質の類似体のＮ末端開裂産物(Ac-D-D-I-V-P-C-OH)が抑制性であるという発見が本発明者らに本発明のペプチド類似体をもたらした。
本発明の範囲内に、式(I)の化合物が含まれる。
【０００７】
【化２５】
0004354632.tif 000002
【０００８】
[式中、QはCH2 又はN-Y (ここで、YはH又はC1-6アルキルである)であり;
a)QがCH2である場合には、aは0であり、bは0であり、Bは式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはH; C1-10アルキル; C6アリール; C7-10アルキルアリール; 必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; (C3-7シクロアルキル)-(C1-6アルキル); 複素環C1-6アルキル、例えば、
【０００９】
【化２６】
0004354632.tif 000003
【００１０】
であり; R11bはカルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されたC1-6アルキル; 又は芳香族の部分にカルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されたC7-16アラルキルであり; 又はR11aとR11bが結合されて必要によりカルボキシル又は(C1-6アルコキシ)カルボニルで置換されていてもよい3〜7員窒素含有環を形成する)のアミド誘導体であり;
b) QがN-Yである場合には、aは0又は1であり、bは0又は1であり、Bは式R11-C(O)- (式中、R11は(i) 必要によりカルボキシル、C1-6アルカノイルオキシ(例えば、AcOCH2)又はC1-6アルコキシ(例えば、Boc)で置換されていてもよいC1-10アルキル; (ii) 必要によりカルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; (iii) カルボキシルと1〜3個のC1-6アルキル置換基で置換されたC3-7シクロアルキル; (iv) 必要によりシクロアルキル部分にカルボキシ、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC4-10 (アルキルシクロアルキル); (v)
【００１１】
【化２７】
0004354632.tif 000004
【００１２】
(vi) 必要によりC1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルである）のアシル誘導体であり;
R6が存在する場合にはカルボキシルで置換されたC1-6アルキルであり;
R5が存在する場合には必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
c) QがCH2又はN-Yである場合には、
R4はC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zはオキソ又はチオキソであり;
R3は必要によりカルボキシル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)で置換されていてもよいC1-10アルキルであり;
Wは下記式II:
【００１３】
【化２８】
0004354632.tif 000005
【００１４】
(式中、R2は必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-10アルキル又はC3-10シクロアルキル; C6又はC10アリール又はC7-16アラルキルである)の基であり; 又はＷは式 II':
【００１５】
【化２９】
0004354632.tif 000006
【００１６】
(式中、XはCH又はNであり;
R2'は2価のC3-4アルキレンであり、Xと、XとR2' が結合している炭素原子と共に5又は6員環を形成し、前記環は必要によりOH; SH; NH2 ;カルボキシル; R12 、OR12 、C(O)OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12'で置換されていてもよく、
ここで、R12及びR12'は独立して環状C3-16アルキル又は又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは必要によりNH2 、OH、SH、ハロ又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S及びNからなる群より独立して選択された少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく; 又は
R12及びR12'は独立して必要によりC1-6アルキル、CF3 、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル、カルボキシルで置換されたC1-6アルキル、又は必要によりC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロ、アセチルアミドもしくはニトロで置換されていてもよいフェニルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルであり、前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく;
【００１７】
前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは必要により第2の5、6、又は7員環と縮合されて環系又は複素環系を形成していてもよく、前記第2の環は必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよく、前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよい; 又は
XはCH又はNであり; R2' は2価のC3-4アルキレンであり、Xと、XとR2' が結合している炭素原子と共に5又は6員環を形成し、これが順に第2の5、6又は7員環と縮合されてその第2の環がOR12'' で置換されている環系を形成し、ここで、R12'' はC7-16アラルキルである）の基であり;
R1'は水素であり、R1は必要によりチオール又はハロで置換されていてもよいC1-6アルキルであり; R1はC2-6アルケニルでもあり; 又はR1'とR1は共に必要によりC1-6アルキルで置換されていてもよい3〜6員環を形成し;
Aはヒドロキシ又はその医薬上許される塩又はエステルである]
【００１８】
本発明の範囲内に、医薬上許される担体媒体又は助剤と混合して、抗Ｃ型肝炎ウイルス有効量の式Ｉの化合物、又はその医薬上許される塩もしくはエステルを含む医薬組成物が含まれる。
本発明の重要な局面は哺乳類に抗Ｃ型肝炎ウイルス有効量の式Ｉの化合物、又はその医薬上許される塩もしくはエステル或いは上記組成物を投与することによる哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症の治療方法を含む。
別の重要な局面はＣ型肝炎ウイルスをＣ型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼ抑制量の式Ｉの化合物、又はその医薬上許される塩もしくはエステル或いは上記組成物に露出することによるＣ型肝炎の複製の抑制方法を含む。
更に別の局面は哺乳類に抗Ｃ型肝炎ウイルス有効量の式Ｉの化合物、又はその医薬上許される塩もしくはエステル、及びインターフェロンの組み合わせを投与することによる哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症の治療方法を含む。医薬上許される担体媒体又は助剤と混合して、その組み合わせを含む医薬組成物がまた本発明の範囲内にある。
【００１９】
（発明を実施するための最良の形態）
本明細書に使用されるように、特にことわらない限り、下記の定義が適用される。
(R)又は(S)が基、例えば、式Ｉの化合物のR4の配置を示すのに使用される場合に関して、その表示は化合物に関して行なわれ、基単独に関して行なわれるのではない。
グリシン以外の天然アミノ酸はキラル炭素原子を含む。特に示されない限り、Ｌ配置を有する天然アミノ酸を含む化合物が好ましい。しかしながら、本件出願人は、明記された場合、式Ｉの幾つかのアミノ酸がＤ配置又はＬ配置であってもよく、又はラセミ体混合物を含むＤ異性体とＬ異性体の混合物であってもよいことを意図している。
本明細書に使用される表示“P1、P2、P3等”はペプチド類似体のＣ末端から開始してＮ末端に向かって延びるアミノ酸残基の位置を表す（即ち、P1はＣ末端からの位置１を表し、P2はＣ末端からの第二の位置を表し、以下同様）(Berger A.及びSchechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)を参照のこと)。
【００２０】
α−アミノ酸に関する略号が表Ａに示される。
【表１】
表Ａ
0004354632.tif 000007
本明細書に使用される“アミノ酪酸”という用語は式
【００２１】
【化３０】
0004354632.tif 000008
【００２２】
の化合物を表す。
本明細書に使用される“アリルグリシン”という用語は式
【００２３】
【化３１】
0004354632.tif 000009
【００２４】
の化合物を表す。
本明細書に使用される“1-アミノシクロプロピル-カルボン酸”(Acca)という用語は式
【００２５】
【化３２】
0004354632.tif 000010
【００２６】
の化合物を表す。
本明細書に使用される“tert-ブチルグリシン”という用語は式
【００２７】
【化３３】
0004354632.tif 000011
【００２８】
の化合物を表す。
アミノ酸又はアミノ酸誘導体に関する“残基”という用語はカルボキシ基のヒドロキシル及びα−アミノ基の１個の水素を排除することにより相当するα−アミノ酸から誘導された基を意味する。例えば、Gln、Ala、Gly、Ile、Arg、Asp、Phe、Ser、Leu、Cys、Asn、Sar及びTyrという用語はL-グルタミン、L-アラニン、グリシン、L-イソロイシン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-フェニルアラニン、L-セリン、L-ロイシン、L-システイン、L-アスパラギン、サルコシン及びL-チロシンの“残基”を夫々表す。
【００２９】
アミノ酸又はアミノ酸残基に関する“側鎖”という用語はα−アミノ酸のα−炭素原子に結合された基を意味する。例えば、グリシンに関するR-基側鎖は水素であり、アラニンに関して、それはメチルであり、バリンに関して、それはイソプロピルである。α−アミノ酸の特定のR-基又は側鎖に関して、生化学に関するA.L.Lehningerの書籍（第４章を参照のこと）が参考にされる。
本明細書に使用される“ハロ”という用語はブロモ、クロロ、フルオロ又はヨードから選ばれたハロゲン基を意味する。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C1-6アルキル”又は“（低級）アルキル”という用語は６個までの炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、1-メチルエチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチルが挙げられる。
同様に、“C1-3アルキル”、“C1-4アルキル”及び“C1-10アルキル”という用語は夫々３個、４個及び10個までの炭素原子を含むアルキル基を表すのに使用される。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C3-7シクロアルキル”という用語は３個〜７個の炭素原子を含むシクロアルキル基を意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。
【００３０】
本明細書に使用される“C4-10（アルキルシクロアルキル）”という用語はアルキル基に結合された３個から７個までの炭素原子を含むシクロアルキル基を意味し、その結合された基は10個までの炭素原子を含み、例えば、シクロプロピルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル又はシクロヘプチルエチルが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C2-10アルケニル”という用語は２個から10個までの炭素原子を含み、更に少なくとも１個の二重結合を含むアルキル基を意味する。例えば、アルケニルとして、アリルが挙げられる。
本明細書に使用される“C3-4アルキレン”という用語は３個から４個までの炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖脂肪族炭化水素からの２個の水素原子の除去により誘導された２価アルキル基を意味し、例えば、-CH2CH2CH2-、CH(CH3)CH2CH2-、-CH2C(CH3)2-及び CH2CH2CH2CH2-が挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C1-6アルコキシ”という用語は基-O-C1-6アルキル（式中、アルキルは６個までの炭素原子を含む先に定義された通りである）を意味する。アルコキシとして、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1-メチルエトキシ、ブトキシ及び1,1-ジメチルエトキシが挙げられる。後者の基は普通tert-ブトキシとして知られている。
【００３１】
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C6又はC10アリール”という用語は６個の炭素原子を含む芳香族単環系又は10個の炭素原子を含む芳香族環系を意味する。例えば、アリールとして、フェニル又はナフタレンが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“C7-16アラルキル”という用語はアルキル基により結合された上記アリールを意味し、そのアルキルは１〜６個の炭素原子を含む先に定義された通りである。アラルキルとして、例えば、ベンジル、及びブチルフェニルが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“カルボキシ（低級）アルキル”という用語は先に定義された通りの（低級）アルキル基により結合されたカルボキシル基(COOH)を意味し、例えば、酪酸又は基：
【００３２】
【化３４】
0004354632.tif 000012
【００３３】
が挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“環式”又は“環系”という用語は、特に示されない限り、３個から７個までの炭素原子を含む飽和又は不飽和環式炭化水素から水素の除去により誘導された１価の基を意味し、必要により１個以上のヘテロ原子を含んでもよい。環式又は環系として、例えば、シクロプロパン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、デカリン、テトラリン、インデン、及びナフタレンが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“複素環”という用語は窒素、酸素及び硫黄から選ばれた１個から４個までのヘテロ原子を含む５員、６員、又は７員の飽和又は不飽和複素環から水素の除去により誘導された１価の基を意味する。好適な複素環の例として、ピロリジン、テトラヒドロフラン、チアゾリジン、ピロール、チオフェン、ジアゼピン、1H-イミダゾール、1-メチル-1H-イミダゾール、イソオキサゾール、チアゾール、2-メチルチアゾール、2-アミノチアゾール、ピペリジン、1,4-ジオキサン、4-モルホリン、ピリジン、2-メチルピリジン、ピリミジン、4-メチルピリミジン及び2,4-ジメチルピリミジンが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“複素環系”という用語は一つ以上の別の環（それは複素環又はあらゆるその他の環であってもよい）に縮合された先に定義された通りの複素環を意味する。好適な複素環系の例として、チアゾロ〔4,5-b〕-ピリジン、キノリン、又はインドールが挙げられる。
単独又は別の基と組み合わせて本明細書に使用される“医薬上許されるエステル”という用語は、分子のカルボキシル官能基のいずれか、好ましくはカルボキシ末端がアルコキシカルボニル官能基：
【００３４】
【化３５】
0004354632.tif 000013
【００３５】
（式中、エステルのＲ部分はアルキル（例えば、メチル、エチル、n-プロピル、t-ブチル、n-ブチル）；アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）；アルコキシアシル（例えば、アセトキシメチル）；アラルキル（例えば、ベンジル）；アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）；必要によりハロゲン、C1-4アルキル又はC1-4アルコキシで置換されていてもよいアリール（例えば、フェニル）から選ばれる）
により置換されている式Ｉの化合物のエステルを意味する。その他の好適なプロドラッグエステルが参考として本明細書に含まれるDesign of prodrugs, Bundgaard, H.編集Elsevier (1985)に見られる。このような医薬上許されるエステルは哺乳類に注射された時にin vivoで通常加水分解され、式Ｉの化合物の酸形態に変換される。
本明細書に使用される“医薬上許される塩”という用語は医薬上許される塩基から誘導された塩を含む。好適な塩基の例として、コリン、エタノールアミン及びエチレンジアミンが挙げられる。また、Na+塩、K+塩、及びCa++塩が本発明の範囲内にあることが意図されている（また、参考として本明細書に含まれるPharmaceutical salts, Birge, S.M.ら, J.Pharm.Sci. (1977), 66, 1-19を参照のこと）。
好ましい実施態様
化合物の更に好ましいグループは式Iaにより表される。
【００３６】
【化３６】
0004354632.tif 000014
【００３７】
[式中、YはH又はC1-6アルキルであり;
aは0又は1であり;
bは0又は1であり;
Bは式R11-C(O)- (式中、R11は(i) 必要によりカルボキシル、C1-6アルカノイルオキシ又はC1-6アルコキシで置換されていてもよいC1-10アルキル; (ii) 必要によりカルボキシル、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; (iii) カルボキシルと1〜3個のC1-6アルキル置換基で置換されたC3-7シクロアルキル; (iv) 必要によりシクロアルキル部分にカルボキシ、(C1-6アルコキシ)カルボニル又はフェニルメトキシカルボニルで置換されていてもよいC4-10 (アルキルシクロアルキル); (v)
【００３８】
【化３７】
0004354632.tif 000015
【００３９】
(vi) 必要によりC1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルである）のアシル誘導体であり;
R6 が存在する場合にはカルボキシルで置換されたC1-6アルキルであり;
R5 が存在する場合には必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
R4はC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
R3 、W、R1 、R1' 及びAは先に定義された通りである]
Bが式R11C(O)- (式中、R11は必要によりカルボキシル、C1-6アルカノイルオキシ又はC1-6アルコキシで置換されていてもよいC1-6アルキル;
必要によりカルボキシル、MeOC(O)、EtOC(O)又はBnOC(O)で置換されていてもよいC3-7シクロアルキル;
3-カルボキシプロピオニル(DAD)又は4-カルボキシブチリル(DAE); 又は
【００４０】
【化３８】
0004354632.tif 000016
【００４１】
である）のアシル誘導体であることが好ましい。
更に好ましくは、Ｂはアセチル、3-カルボキシプロピオニル、4-カルボキシルブチリル、AcOCH2C(O)、Me3COC(O)、
【００４２】
【化３９】
0004354632.tif 000017
【００４３】
である。
更に好ましくは、Ｂはアセチル、3-カルボキシプロピオニル(DAD)、4-カルボキシブチリル(DAE)、AcOCH2C(O)、
【００４４】
【化４０】
0004354632.tif 000018
【００４５】
である。
最も好ましくは、Ｂはアセチルである。
好ましくは、R6（存在する場合）はAsp又はGluの側鎖である。
最も好ましくは、R6（存在する場合）はAspの側鎖である。
また、好ましくは、ａが０であり、その時にR6は不在である。
好ましくは、R5（存在する場合）はD-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Val、L-Val、D-tert-ブチルグリシン (Tbg)、及びL-Tbgからなる群から選ばれたアミノ酸の側鎖である。
更に好ましくは、R5（存在する場合）はD-Asp、D-Val、又はD-Gluの側鎖である。
最も好ましくは、R5（存在する場合）はD-Gluの側鎖である。
また、好ましくは、ａは０であり、かつｂは０であり、その時にR6及びR5の両方が不在である。
また、化合物の別の好ましいグループは式(Ib)により表される。
【００４６】
【化４１】
0004354632.tif 000019
【００４７】
[式中、Bは好ましくは式R11aN(R11b)C(O)- (式中、R11aは好ましくはC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、必要によりカルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、C1-3カルボキシアルキル、C6アリール、C7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チアゾリジルメチルであり; R11bは好ましくはカルボキシルで置換されたC1-4アルキルである)のアミドである]
最も好ましくは、R11aはシクロプロピルメチル、イソプロピル、カルボキシエチル、ベンジルメチル、ベンジル、又は2-テトラヒドロフラニルメチルである。更に好ましくは、R11bはカルボキシルで置換されたC1-4アルキルである。最も好ましくは、R11bはエチルカルボキシルである。
本発明の化合物として、好ましくは、R4がイソプロピル、シクロヘキシル、tert-ブチル、1-メチルプロピル、及び2-メチルプロピルからなる群から選ばれる式Ｉの化合物が挙げられる。更に好ましくは、R4はシクロヘキシル又は1-メチルプロピルである。最も好ましくは、R4はシクロヘキシルである。
本発明の化合物として、ｚが好ましくはオキソである式Ｉの化合物が挙げられる。
本発明の化合物として、好ましくは、R3がIle、allo-Ile、Chg、Cha、Val、Tbg又はGluからなる群から選ばれたアミノ酸の側鎖である式Ｉの化合物が挙げられる。R3はVal、Tbg又はChgの側鎖であることが更に好ましい。R3はValの側鎖であることが最も好ましい。
本発明の化合物として、好ましくは、Ｗが式II：
【００４８】
【化４２】
0004354632.tif 000020
【００４９】
（式中、R2はC1-8アルキル；カルボキシル、C1-6アルコキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル又はベンジルアミノカルボニルで置換されたC1-8アルキル；C3-7シクロアルキル又はベンジルである）
の基である式Ｉの化合物が挙げられる。R2はAbu、Leu、Phe、Cha、Val、Ala、Asp、Glu、Glu(Obn)、又はGlu(NHBn)の側鎖であることが好ましい。R2はAsp、アミノ酪酸(Abu)又はValの側鎖であることが最も好ましい。
更に好ましくは、本発明の化合物として、Ｗが式II'：
【００５０】
【化４３】
0004354632.tif 000021
【００５１】
（式中、Ｘは好ましくはCH又はＮである）
の基である式Ｉの化合物が挙げられる。
更に好ましくは、R2'はＸを結合して式III：
【００５２】
【化４４】
0004354632.tif 000022
【００５３】
（式中、ＸはCH又はＮであり、ｎは１又は２であり、かつR13は以下に定義される通りである）
の５員環又は６員環を形成するC3又はC4アルキレン（太字で示される）であり、R2'はあらゆる位置でR13で必要により置換されていてもよい。
最も好ましくは、ＸはＮである。例えば、好ましくは、R2'はＸ（Ｘは窒素である）に結合されてP2でR13で置換されたプロリンを形成するプロピルである。
最も好ましくは、R2'は３位、４位、又は５位でR13（R13は以下に定義される通りである）で置換されたプロリンの側鎖である。
更に、最も好ましくは、R2'は式III'：
【００５４】
【化４５】
0004354632.tif 000023
【００５５】
に示された立体化学を有する４位でR13で置換されたプロリンの側鎖（太字で示される）である。
(式中、R13は好ましくはOH; SH; NH2; カルボキシル; R12; OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12' であり、
ここで、R12及びR12' は独立して環状C3-16アルキル又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、 前記アルキル又はアルケニルは必要によりNH2 、OH、SH、ハロ又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく;
R12及びR12'は独立して必要によりC1-6アルキル、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルであり; 前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく;
前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは必要により第2の5、6、又は7員環と縮合されて環系又は複素環系を形成していてもよく、前記第2の環は必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよく; 前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよい）
【００５６】
更に好ましくは、R13はOR12又はSR12〔式中、R12はC6又はC10アリール又はC7-16アラルキル（前記第一アリール又はアラルキルは必要によりC1-6アルキル、C3-7シクロアルキル、NH2、OH、SH、ハロ、C1-6アルコキシ、カルボキシル、カルボキシ（低級）アルキルで置換されていてもよい）、又は第二アリールもしくはアラルキルであり、前記第一及び第二アリール又はアラルキルは必要によりＯ、Ｓ、及びＮからなる群から独立に選ばれた少なくとも１個のヘテロ原子を含んでいてもよい〕である。
最も好ましくは、R13はBn、PhCH2CH2、PhCH2CH2CH2、O-Bn、o-トリルメトキシ、m-トリルメトキシ、p-トリルメトキシ、1-ナフチルオキシ、2-ナフチルオキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、(4-tert-ブチル)メトキシ、(3I-Ph)CH2O、(4Br-Ph)O、(2BR-Ph)O、(3Br-Ph)O、(4I-Ph)O、(3Br-Ph)CH2O、(3,5-Br2-Ph)CH2O、
【００５７】
【化４６】
0004354632.tif 000024
【００５８】
である。
最も好ましくは、R13はPhCH2CH2CH2、O-Bn、1-ナフチルオキシ、2-ナフチルオキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、
【００５９】
【化４７】
0004354632.tif 000025
【００６０】
である。
更に、R1'が好ましくは水素であり、かつR1が必要によりチオールで置換されていてもよいC1-6アルキルである式Ｉの化合物が本発明に含まれる。例えば、R1はシステイン(Cys)、アミノ酪酸(Abu)、ノルバリン(Nva)、又はアリルグリシン(AlGly)からなる群から選ばれたアミノ酸の側鎖であることが好ましい。更に好ましくは、R1'がＨであり、かつR1がプロピルである。例えば、R1がアミノ酸Nvaの側鎖であることが更に好ましい。
また、R1'及びR1が一緒になって３員環〜６員環を形成することが好ましく、前記環は必要によりエチルで置換されていてもよい。例えば、R1'及びR1が一緒になってシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシル環を形成することが好ましい。また、R1'及びR1が一緒になってシクロプロピルを形成することが更に好ましい。例えば、R1'及びR1が一緒になって1-アミノシクロプロピルカルボン酸(Acca)と称される下記のアミノ酸：
【００６１】
【化４８】
0004354632.tif 000026
【００６２】
の側鎖（太字で示される）であり得る。
Ａが好ましくはヒドロキシ、その塩又はエステルである式Ｉの化合物が本発明に更に含まれる。Ａがヒドロキシ又はそのエステルであることが更に好ましい。Ａがヒドロキシであることが最も好ましい。
エステルはC1-6アルコキシ、又は（アリールC1-6-アルコキシ）であることが更に好ましい。エステルがメトキシ、エトキシ、フェノキシ、又はベンジルオキシであることが最も好ましい。
QがCH2' である場合には、aが0であり、bが0であり、Bが式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、必要によりカルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、C1-3カルボキシアルキル、フェニル、C7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チアゾリジルメチルであり; R11bはフェニル；又はカルボキシル又はC1-4カルボキシアルキルで置換されたC1-6アルキルである)のアミドであり; 又は
QがN-Y（ここで、YはH又はC1-6アルキルである）である場合には、aが0又は1であり、bが0又は1であり、Bが式R11-C(O)- (式中、R11は(i) C1-6アルキル、カルボキシルで置換されたC1-6アルキル、MeC(O)O-、MeO-、EtO-、MeCH2CH2O-又はMe3C-O-; (ii) 必要によりカルボキシルで置換されていてもよいシクロペンチル又はシクロヘキシル; (iv) 必要によりシクロアルキル部分にカルボキシルで置換されていてもよいC4-10(アルキルシクロアルキル);
(v)
【００６３】
【化４９】
0004354632.tif 000027
【００６４】
(vi) フェニル、ベンジル又はフェニルエチルである)のアシル誘導体であり;
R6 が存在する場合にはCH2COOH又はCH2CH2COOHであり、
R5 が存在する場合にはC1-6アルキル又はCH2COOH又はCH2CH2COOHであり;
また、QがCH2又はN-Yである場合には、
R4がC1-6アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zがオキソ又はチオであり;
R3がC1-6アルキル; C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wが式II (式中、R2はC1-10アルキル、C3-10シクロアルキル、C7-11アラルキル; CH2COOH又はCH2CH2COOHである)の基であり; 又はＷが式II' (式中、XはN又はCHであり、R2' は2価の基 -CH2CH2CH2-又は-CH2CH2CH2CH2-であり、Xと、XとR2' が結合している炭素原子と共に5又は6員環を形成し、前記環は必要によりOR12 、C(O)OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12' で置換されていてもよく、
ここで、R12とR12' は独立して環状C3-16アルキル又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく; 又はR12及びR12' は独立して必要によりC1-6アルキル、CF3 、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル、カルボキシルで置換されたC1-6アルキル、又は必要によりC1-6アルキル、C1-6アルコキシ又はハロで置換されていてもよいフェニルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルでもあり; 前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく; 前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは必要により第2の5、6、又は7員環と縮合されて環系又は複素環系を形成していてもよく、前記第2の環は必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシルで置換されたC1-6アルキルで置換されていてもよく; 前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよい; 又はXはNであり; R2' はCH2CH2CH2-又はCH2CH2CH2CH-であり、Xと、XとR2' が結合している炭素原子と共に5又は6員環を形成し、これが順にフェニルに縮合されてそのフェニル環がOR12'' で置換されている環系を形成し、ここで、R12'' はフェニルメチル又はフェニルエチルである)の基であり;
R1' が水素であり、R1がメチル、チオメチル、1-メチルエチル、プロピル、1-メチルプロピル、2-(メチルチオ)エチル又は2-プロピレンであり; 又はR1' とR1が結合している炭素原子と共に必要によりエチルで置換されていてもよいシクロプロピルを形成し;
Aがヒドロキシ又はその医薬上許される塩; C1-6アルコキシ、又は(アリールC1-6アルコキシ)である式Iの化合物が本発明の範囲に含まれる。
【００６５】
Bが式R11C(O)- (式中、R11はC1-6アルコキシ、必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-10アルキル; 必要によりカルボキシル又はベンジルカルボキシで置換されていてもよいC3-7シクロアルキルである)のアシル誘導体; 又は
【００６６】
【化５０】
0004354632.tif 000028
【００６７】
であり;
R6が存在せず;
R5が存在せず;
R4がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
R3がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wが式II:
【００６８】
【化５１】
0004354632.tif 000029
【００６９】
(式中、R2はC1-6アルキル; C3-6シクロアルキル; カルボキシルで置換されたC1-6アルキル; C6又はC10アリール; 又はC7-11アラルキルである)
の基であり; 又はＷが下記式II':
【００７０】
【化５２】
0004354632.tif 000030
【００７１】
(式中、XはNであり、R2' は請求項１で定義した通りである)
の基であり;
Aがヒドロキシ又はその医薬上許される塩; メトキシ、エトキシ、フェノキシ、又はベンジルオキシである式Iaの化合物が本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
Bがアセチル、3-カルボキシプロピオニル、4-カルボキシルブチリル、AcOCH2C(O)、Me3COC(O)、
【００７３】
【化５３】
0004354632.tif 000031
【００７４】
であり;
YがH又はMeであり、aが0又は1であり、bが0又は1であり;
R6 が存在する場合にはAsp又はGluの側鎖であり;
R5 が存在する場合にはAsp、D-Asp、Glu、D-Glu、Val、D-Val又はTbgの側鎖であり;
R4がVal、Chg、Tbg、Ile又はLeuの側鎖であり;
ｚがオキソ又はチオキソであり；
R3が水素又はIle、Chg、Val、Gluの側鎖であり;
WがAbu、Leu、Phe、Val、Ala、Glu、又はGlu(OBn)であり; 又はＷが
式III':
【００７５】
【化５４】
0004354632.tif 000032
【００７６】
(式中、R13はBn、PhCH2CH2 、PhCH2CH2CH2 、O-Bn、o-トリルメトキシ、m-トリルメトキシ、p-トリルメトキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、(4-tert-ブチル)ベンジルオキシ、(3I-Ph)CH2O、(4Br-Ph)O、(2Br-Ph)O、(3Br-Ph)O、(4I-Ph)O、(3Br-Ph)CH2O、(3,5-Br2-Ph)CH2O、
【００７７】
【化５５】
0004354632.tif 000033
【００７８】
【化５６】
0004354632.tif 000034
【００７９】
である）の基であり;
R1' がHであり、R1がCys、Abu、Nva又はアリルグリシンの側鎖であり; 又は
R1' とR1が結合している炭素原子と共にシクロプロピルを形成し; Aがヒドロキシルである式Iaの化合物が本発明の範囲に含まれる。
Bが式R11aN(R11b)-C(O)- (式中、R11aはC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、必要によりカルボキシで置換されていてもよいC3-7 (アルキルシクロアルキル)、C1-3カルボキシアルキル、フェニル、C7-10アリールアルキル、2-テトラヒドロフラニルメチル、又は2-チアゾリジルメチルであり;
R11bがフェニル; 又はカルボキシルもしくはC1-4カルボキシアルキルで置換されたC1-6アルキルである）のアミドであり;
R4がシクロヘキシルであり;
Zがオキソであり;
R3が水素又はIle、Chg、Val、Gluの側鎖であり;
WがAbu、Leu、Phe、Val、Ala、Glu、Glu(OBn)であり; 又はＷが式III':
【００８０】
【化５７】
0004354632.tif 000035
【００８１】
(式中、R13はBn、PhCH2CH2 、PhCH2CH2CH2 、O-Bn 、o-トリルメトキシ、m-トリルメトキシ、p-トリルメトキシ、1-ナフタレニルメトキシ、2-ナフタレニルメトキシ、(4-tert-ブチル)メトキシ、(3I-Ph)CH2O、(4Br-Ph)O、(2Br-Ph)O、(3Br-Ph)O、(4I-Ph)O、(3Br-Ph)CH2O、(3,5-Br2-Ph)CH2O、
【００８２】
【化５８】
0004354632.tif 000036
【００８３】
【化５９】
0004354632.tif 000037
【００８４】
である）の基であり;
R1' がHであり、R1がCys、Abu、Nva又はアリルグリシンの側鎖であり; 又は
R1' とR1が結合している炭素原子と共にシクロプロピルを形成し; Aがヒドロキシルである式Ibの化合物がまた本発明の範囲に含まれる。
Bが式R11C(O)- (式中、R11は必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-10アルキル; 必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC3-7シクロアルキル; 又は必要によりシクロアルキル部分にカルボキシルで置換されていてもよいC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり; 又はR11は必要によりC1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルである)のアシル誘導体であり;
aが0又は1であり;
R6 が存在する場合には必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
bが0又は1であり;
R5 が存在する場合には必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキルであり;
QがN-Yであり、YはH又はC1-6アルキルであり;
R4がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Zがオキソであり;
R3がC1-10アルキル、C3-7シクロアルキル又はC4-10 (アルキルシクロアルキル)であり;
Wが式II:
【００８５】
【化６０】
0004354632.tif 000038
【００８６】
（式中、R2はC1-6アルキル; 必要によりカルボキシルで置換されていてもよいC1-6アルキル; C6又はC10アリール; 又はC7-16アラルキルである）の基であり; 又は
Ｗが式II':
【００８７】
【化６１】
0004354632.tif 000039
【００８８】
(式中、XはCH又はNであり;
R2'はC3-4アルキルであり、Xを結合して5又は6員環を形成し、前記環は必要によりOH; SH; NH2; カルボキシル; R12; OR12 、SR12 、NHR12又はNR12R12'で置換されていてもよく、
ここで、R12及びR12'は独立して環状C3-16アルキル又は非環状C1-16アルキル又は環状C3-16アルケニル又は非環状C2-16アルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、又はカルボキシルで置換されていてもよく; 前記アルキル又はアルケニルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく; 又は
R12及びR12' は独立して必要によりC1-6アルキル、NH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシルで置換されたC1-6アルキルで置換されていてもよいC6又はC10アリール又はC7-16アラルキルでもあり; 前記アリール又はアラルキルはO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよく;
【００８９】
前記環状アルキル、環状アルケニル、アリール又はアラルキルは必要により第2の5、6、又は7員環と縮合されて環系又は複素環系を形成してもよく、前記第2の環は必要によりNH2 、OH、SH、ハロ、カルボキシル又はカルボキシ(低級)アルキルで置換されていてもよく; 前記第2の環はO、S、及びNからなる群より独立して選ばれた少なくとも1種のヘテロ原子を必要により含んでいてもよい）の基であり;
R1' が水素であり、R1が必要によりチオールで置換されていてもよいC1-6アルキル、又はC2-6アルケニルであり; 又は
R1' とR1が共に必要によりC1-6アルキルで置換されていてもよい3〜6員環を形成し;
Aはヒドロキシル又はその医薬上許される塩もしくはエステルである式Iの化合物がまた本発明の範囲に含まれる。
【００９０】
最後に、表１〜４に示された式Ｉの全ての化合物が本発明の範囲に含まれる。
別の実施態様によれば、本発明の医薬組成物は更に抗ウイルス剤を含んでもよい。抗ウイルス剤の例として、リバビリン及びアマンタジンが挙げられる。
別の実施態様によれば、本発明の医薬組成物は更にHCVプロテアーゼのその他のインヒビターを含んでもよい。
更に別の実施態様によれば、本発明の医薬組成物は更にHCV寿命におけるその他の標的、例えば、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、又はメタロプロテアーゼのインヒビターを含んでもよい。
【００９１】
本発明の医薬組成物は経口投与、非経口投与又は移植レザバーにより投与されてもよい。経口投与又は注射による投与が好ましい。本発明の医薬組成物はあらゆる通常の無毒性の医薬上許される担体、アジュバント又はビヒクルを含んでもよい。或る場合には、製剤のpHが医薬上許される酸、塩基又は緩衝剤で調節されて製剤化された化合物又はその送出形態の安定性を増進し得る。本明細書に使用される非経口という用語は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、及び病変内の注射技術又は注入技術を含む。医薬組成物は、例えば、無菌注射液又は油性懸濁液として無菌注射製剤の形態であってもよい。この懸濁液は当業界で知られている技術に従って好適な分散剤又は湿潤剤（例えば、トゥイーン80）及び懸濁剤を使用して製剤化されてもよい。
【００９２】
本発明の医薬組成物はあらゆる経口の許される投薬形態で経口投与されてもよく、これらとして、カプセル、錠剤、並びに水性の懸濁液及び溶液が挙げられるが、これらに限定されない。経口用の錠剤の場合、普通に使用される担体として、ラクトース及びトウモロコシ澱粉が挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウムの如き滑剤がまた典型的に添加される。カプセル形態の経口投与について、有益な希釈剤として、ラクトース及び乾燥トウモロコシ澱粉が挙げられる。水性懸濁液が経口投与される場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と合わされる。所望により、或る種の甘味料及び/または矯味矯臭剤及び/または着色剤が添加されてもよい。
上記製剤及び組成物に適したその他のビヒクル又は担体が通常の医薬書籍、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy,第19編, Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995)に見られる。
【００９３】
本明細書に記載されたプロテアーゼインヒビター化合物の毎日体重１kg当り約0.01〜約100mg、好ましくは毎日体重１kg当り約0.5〜約75mgの投薬量レベルがHCV介在性疾患の予防及び治療のモノセラピーに有益である。典型的には、本発明の医薬組成物は毎日約１回〜約５回又は連続注入として投与されるであろう。このような投与が慢性又は急性の療法として使用し得る。単一投薬形態を生じるために担体物質と合わされてもよい活性成分の量は治療される宿主及び投与の特別な様式に応じて変化するであろう。典型的な製剤は約５％から約95％(w/w)までの活性化合物を含むであろう。このような製剤は約20％から約80％までの活性化合物を含むことが好ましい。
当業者が認めるように、上記投与量よりも少ない投与量又は多い投与量が必要とされるかもしれない。あらゆる特別な患者に特別な投与量及び治療レジメは使用される特定の化合物、年齢、体重、全般の健康状態、性別、食事、投与の時間、排泄の速度、薬物組み合わせ、感染の重度及び経過、感染に対する患者の素質並びに治療医師の判断を含む種々の因子に依存するであろう。一般に、治療はペプチドの最適投与量よりも実質的に少ない投与量で開始される。その後、これらの状況下で最適の効果に達するまで、投与量が小さい増分だけ増加される。一般に、化合物は有害又は有毒な副作用を生じないで一般に抗ウイルス有効な結果を与える濃度レベルで投与されることが最も望ましい。
【００９４】
本発明の組成物が式Ｉの化合物と一種以上の付加的な治療薬又は予防薬の組み合わせを含む場合、その化合物と付加的な薬剤の両方がモノセラピーレジメで通常投与される投薬量の約10〜100％、更に好ましくは約10〜80％の投薬量レベルで存在すべきである。
これらの化合物又はそれらの医薬上許される塩が医薬上許される担体と一緒に製剤化される場合、得られる組成物はヒトの如き哺乳類にin vivoで投与されてHCV NS3プロテアーゼを抑制し、又はHCVウイルス感染症を治療もしくは予防し得る。このような治療はまた薬剤と組み合わせて本発明の化合物を使用して得られてもよく、このような薬剤として、免疫調節剤、例えば、α−、β−、又はγ−インターフェロン；その他の抗ウイルス剤、例えば、リバビリン、アマンタジン；HCV NS3プロテアーゼのその他のインヒビター；HCV寿命におけるその他の標的、例えば、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、又は内部リボソームエントリーのインヒビター；又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。付加的な薬剤は本発明の化合物と組み合わされて単一投薬形態を生じ得る。また、これらの付加的な薬剤は多投薬形態の部分として哺乳類に別々に投与されてもよい。
【００９５】
それ故、本発明の別の実施態様は式Ｉの化合物（その置換基は先に定義された通りである）を投与することによる哺乳類のHVC NS3プロテアーゼ活性の抑制方法を提供する。
好ましい実施態様において、これらの方法は哺乳類のHCV NS3プロテアーゼ活性を低下するのに有益である。医薬組成物が活性成分として本発明の化合物のみを含む場合、このような方法は免疫調節剤、抗ウイルス剤、HCVプロテアーゼインヒビター、又はHCV寿命のその他の標的、例えば、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、もしくはメタロプロテアーゼのインヒビターから選ばれた薬剤を前記哺乳類に投与する工程を更に含んでもよい。このような付加的な薬剤は本発明の組成物の投与の前、同時、又はその後に哺乳類に投与されてもよい。
【００９６】
別の好ましい実施態様において、これらの方法は哺乳類のウイルス複製を抑制するのに有益である。このような方法はHCV疾患を治療又は予防するのに有益である。医薬組成物が活性成分として本発明の化合物のみを含む場合、このような方法は免疫調節剤、抗ウイルス剤、HCVプロテアーゼインヒビター、又はHCV寿命のその他の標的のインヒビターから選ばれた薬剤を前記哺乳類に投与する工程を更に含んでもよい。このような付加的な薬剤は本発明の組成物の投与の前、同時、又はその後に哺乳類に投与されてもよい。
本明細書に示された化合物はまた実験試薬として使用されてもよい。本発明の化合物はまた物質のウイルス汚染を処理又は防止し、それ故、このような物質（例えば、血液、組織、手術装置及びガーメント、実験装置及びガーメント、並びに血液回収装置及び物質）と接触する実験室又は医療の個人又は患者のウイルス感染のリスクを軽減するのに使用されてもよい。
【００９７】
方法
本発明の化合物はスキームＩ（スキーム中、PG1はカルボキシル保護基であり、かつPG2はアミノ保護基である）に示された方法に従って合成された。
【００９８】
【化６２】
0004354632.tif 000040
【００９９】
簡単に言えば、P1、P2、P3、P4、そして必要によりP5及びP6が公知のペプチドカップリング技術により結合し得る。P1グループ、P2グループ、P3グループ、P4グループ、並びにP5グループ及びP6グループは、最終化合物が式Ｉのペプチドに相当する限り、あらゆる順序で一緒に結合されてもよい。例えば、P6がP5に結合されてP5-P6を生じることができ、これがP4-P3-P2-P1に結合され、又はP6がP5-P4-P3-P2に結合され、次いで適当にＣ末端保護されたP1に結合される。一般に、ペプチドはＮ末端残基のα−アミノ基を脱保護し、記載された方法を使用してペプチド結合により次の適当にＮ保護されたアミノ酸の保護されていないカルボキシル基をカップリングすることにより延長される。所望の配列が得られるまで、この脱保護及びカップリング操作が繰り返される。このカップリングはスキームＩに示されたような段階的様式で構成アミノ酸を用いて、もしくはフラグメント（２種又は数種のアミノ酸）の縮合により、又は両方の方法の組み合わせにより、或いはMerrifield, J.Am.Chem.Soc. (1963), 85, 2149-2154（その開示が参考として本明細書に含まれる）に最初に記載された方法による固相ペプチド合成により行い得る。
【０１００】
２種のアミノ酸、アミノ酸とペプチド、又は２種のペプチドフラグメントの間のカップリングは通常のカップリング操作、例えば、アジド方法、混合炭酸−カルボン酸無水物（イソブチルクロロホルメート）方法、カルボジイミド（ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、又は水溶性カルボジイミド）方法、活性エステル（p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）方法、ウッドワード試薬K-方法、カルボニルジイミダゾール方法、リン試薬又は酸化−還元方法を使用して行い得る。これらの方法の幾つか（特に、カルボジイミド方法）は1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加することにより増進し得る。これらのカップリング反応は溶液（液相）中又は固相で行い得る。
更に明瞭に、カップリング工程はカップリング剤の存在下で一種の反応体の遊離カルボキシルと別の反応体の遊離アミノ基の脱水カップリングを伴って連鎖アミド結合を形成する。このようなカップリング剤の記載がペプチド化学に関する一般の書籍、例えば、M.Bodanszky,“Peptide Chemistry",第二改訂版, Springer-Verlag, Berlin, Germany, (1993)に見られる。好適なカップリング剤の例はN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール又はN-エチル-N'-〔（3-ジメチルアミノ）プロピル〕カルボジイミドである。非常に実用的かつ有益なカップリング剤は市販の（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートそのもの又は1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下のその市販品である。別の非常に実用的かつ有益なカップリング剤は市販の2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートである。更に別の非常に実用的かつ有益なカップリング剤は市販のO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。
【０１０１】
カップリング反応は不活性溶媒、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル又はジメチルホルムアミド中で行なわれる。過剰の三級アミン、例えば、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン又はN-メチルピロリジンが添加されて反応混合物を約８のpHに保つ。反応温度は通常０℃〜50℃の範囲であり、また反応時間は通常15分〜24時間の範囲である。
固相合成アプローチが使用される場合、Ｃ末端カルボン酸が不溶性担体（通常、ポリスチレン）に結合される。これらの不溶性担体はカルボン酸と反応して延長条件に対し安定であるが、その後に容易に開裂される結合を形成する基を含む。その例はクロロ−又はブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、及びアミノメチル樹脂である。これらの樹脂の多くが所望のＣ末端アミノ酸を既にとり込んで市販されている。また、アミノ酸は既知の方法Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc., (1973), 95, 1328; Atherton, E.; Shepard, R.C. "Solid-phase peptide synthesis; a practical approach" IRL Press: Oxford, (1989); 131-148により固体担体にとり込まれる。以上に加えて、ペプチド合成のその他の方法がStewart 及びYoung, "Solid Phase Peptide Synthesis", 第２編, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, 編集, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, 2, 3, 5, 及び 9, Academic Press, New-York, (1980-1987); Bodansky ら, "The Practice of Peptide Synthesis" Springer-Verlag, New-York (1984)（これらの開示が参考として本明細書に含まれる）に記載されている。
【０１０２】
構成アミノ酸の官能基は望ましくない結合の形成を回避するために一般にカップリング反応中に保護される必要がある。使用し得る保護基がGreene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) 及び "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, New York (1981) （これらの開示が参考として本明細書に含まれる）にリストされている。
Ｃ末端残基のα−カルボキシル基は開裂されてカルボン酸を生じ得るエステル(PG1)として通常保護される。使用し得る保護基として、1)アルキルエステル、例えば、メチルエステル、トリメチルシリルエチルエステル及びt-ブチルエステル、2)アラルキルエステル、例えば、ベンジルエステル及び置換ベンジルエステル、又は3)温和な塩基処理又は温和な還元手段により開裂し得るエステル、例えば、トリクロロエチルエステル及びフェナシルエステルが挙げられる。
【０１０３】
成長しているペプチド鎖にカップリングされる夫々のアミノ酸のα−アミノ基は保護される必要がある(PG2)。当業界で知られているあらゆる保護基が使用し得る。このような基の例として、1)アシル基、例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、及びp-トルエンスルホニル、2)芳香族カルバメート基、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz又はＺ）及び置換ベンジルオキシカルボニル、並びに9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、3)脂肪族カルバメート基、例えば、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニル、4)環状アルキルカルバメート基、例えば、シクロペンチルオキシカルボニル及びアダマンチルオキシカルボニル、5)アルキル基、例えば、トリフェニルメチル及びベンジル、6)トリアルキルシリル、例えば、トリメチルシリル、並びに7)チオール含有基、例えば、フェニルチオカルボニル及びジチアスクシノイルが挙げられる。好ましいα−アミノ保護基はBoc又はFmocである。ペプチド合成のために適当に保護された多くのアミノ酸誘導体が市販されている。
【０１０４】
新たに添加されたアミノ酸残基のα−アミノ保護基は次のアミノ酸のカップリングの前に開裂される。Boc基が使用される場合、特別の方法はニート又はジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸、又はジオキサンもしくは酢酸エチル中のHClである。次いで得られるアンモニウム塩がカップリングの前又はin situで塩基性溶液、例えば、水性緩衝剤、又はジクロロメタンもしくはアセトニトリル又はジメチルホルムアミド中の三級アミンで中和される。Fmoc基が使用される場合、特別の試薬はジメチルホルムアミド中のピペリジン又は置換ピペリジンであるが、あらゆる二級アミンが使用し得る。脱保護が０℃〜室温(RT)、通常20-22℃の温度で行なわれる。
側鎖官能基を有するアミノ酸のいずれもが上記基のいずれかを使用してペプチドの調製中に保護される必要がある。当業者はこれらの側鎖官能基に適した保護基の選択及び使用がアミノ酸及びペプチド中のその他の保護基の存在に依存することを認めるであろう。このような保護基の選択は、その基がα−アミノ酸の脱保護及びカップリング中に除去される必要がある点で重要である。
【０１０５】
例えば、Bocがα−アミノ保護基として使用される場合、下記の側鎖保護基が好適である。P-トルエンスルホニル（トシル）部分がLys及びArgの如きアミノ酸のアミノ側鎖を保護するのに使用し得る。アセトアミドメチル部分、ベンジル(Bn)部分、又はt-ブチルスルホニル部分がシステインのスルフィド含有側鎖を保護するのに使用し得る。ベンジル(Bn)エーテルがセリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのヒドロキシ含有側鎖を保護するのに使用し得る。また、ベンジルエステルがアスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシ含有側鎖を保護するのに使用し得る。
Fmocがα−アミン保護に選ばれる場合、通常tert-ブチルをベースとする保護基が許される。例えば、Bocがリシン及びアルギニンに使用でき、tert-ブチルエーテルがセリン、スレオニン及びヒドロキシプロリンに使用でき、またtert-ブチルエステルがアスパラギン酸及びグルタミン酸に使用し得る。トリフェニルメチル（トリチル）部分がシステインのスルフィド含有側鎖を保護するのに使用し得る。
【０１０６】
ペプチドの延長が一旦完結されると、保護基の全てが除去される。液相合成が使用される場合、どのような様式が保護基の選択により指示されようとも、保護基が除去される。これらの操作は当業者に公知である。
固相合成が使用される場合、ペプチドが保護基の除去と同時に樹脂から開裂される。Boc保護方法がその合成に使用される場合、０℃における無水HFを含む添加剤、例えば、ジメチルスルフィド、アニソール、チオアニソール、又はp-クレゾールによる処理がペプチドを樹脂から開裂するのに好ましい方法である。また、ペプチドの開裂はその他の酸試薬、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸／トリフルオロ酢酸混合物により行い得る。Fmoc保護方法が使用される場合、Ｎ末端Fmoc基が前記試薬で開裂される。その他の保護基及びペプチドはトリフルオロ酢酸及び種々の添加剤、例えば、アニソール等の溶液を使用して樹脂から開裂される。
【０１０７】
ＱがCH2であり、ａが０であり、ｂが０であり、かつＢがR11aN(R11b)C(O)である場合、その化合物がスキームＩ中にペプチドについて記載された一般方法と同様の方法に従って容易に入手し得るスクシニル中間体、t-BuO-C(O)CH2CH(R4)-CO-PG1（例えば、PG1＝2-オキソ-4-置換オキサゾリジン-3-イル）を使用して調製された。このスクシニル中間体はEvansらの方法(J.Am.Chem.Soc.(1982), 104, 1737)に従って強塩基、例えば、リチウムジイソプロピルアミド又はナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド及びt-ブチルブロモアセテートの存在下で適当な4-置換-3-アシル-2-オキサゾリジノンを使用して容易に調製し得る。LiOOHによる2-オキサゾリジノン部分の開裂(Evansら, Tetrahedron Lett. (1987), 28, 6141)後に、得られる酸がP3-P2-P1-PG1セグメントにカップリングされてt-BuO-C(O)CH2CH(R4)-CO-P3-P2-P1-PG1を得た。後者が塩化水素で処理されて末端t-ブチルエステルを相当する酸に選択的に変換し、これが最後にR11aNH(R11b)にカップリングされて、一つ以上の保護基の除去後に、所望のペプチド誘導体を得た。アミンR11aNH(R11b)は市販されており、又はその合成が当業界で公知である。この方法の特別の実施態様が実施例18に示される。
また、同スクシニル中間体（t-BuO-C(O)CH2CH(R4)-CO-PG1）で開始して、反応の順序が逆にされて最初にR11aNH(R11b)を導入し、次いでP3-P2-P1-PG1を導入して所望のペプチド誘導体を得ることができる。
【０１０８】
キャッピング基Ｂ並びにP6部分、P5部分、P4部分、及びP3部分の合成
異なるキャッピング基Ｂが保護されたP6、P5、P4、全ペプチド又は適当なアシルクロリドを有するいずれかのペプチドセグメント（これは市販されており、又はその合成が当業界で公知である）に導入される。
異なるP6部分〜P3部分が市販されており、又はその合成が当業界で公知である。
P2部分の合成
1.前駆体の合成
A)ハロアリールメタン誘導体の合成
ハロメチル-8-キノリンIIdの調製がK.N. Campbell ら, J. Amer. Chem. Soc., (1946), 68, 1844の操作に従って行なわれた。
【０１０９】
【化６３】
0004354632.tif 000041
スキームII
【０１１０】
簡単に言えば、8-キノリンカルボン酸IIaが水素化リチウムアルミニウムの如き還元剤による相当するアシルハライドIIbの還元により相当するアルコールIIcに変換された。適当なハロゲン化水素酸によるアルコールIIbの処理が所望のハロ誘導体IIdを生じる。この方法の特別な実施態様が実施例１に示される。
2.P2の合成
A)4-置換プロリン（R2が炭素原子を介して環に結合されている）（以下に示されるような立体化学を有する）：
【０１１１】
【化６４】
0004354632.tif 000042
【０１１２】
の合成がJ. Ezquerra ら. (Tetrahedron, (1993), 38, 8665-8678) 及びC. Pedregal ら. (Tetrahedron Lett., (1994), 35, 2053-2056)により記載された操作に従ってスキームIIIに示されたようにして行なわれる。
【０１１３】
【化６５】
0004354632.tif 000043
スキームIII
【０１１４】
簡単に言えば、Boc-ピログルタミン酸がベンジルエステルとして保護される。リチウムジイソプロピルアミドの如き強塩基による処理、続いてアルキル化剤（Br-R2又はI-R2）の添加がアミドの還元及びエステルの脱保護後に所望の化合物IIIeを生じる。
B)O-アルキル化4-(R)-ヒドロキシプロリンの合成
【０１１５】
【化６６】
0004354632.tif 000044
【０１１６】
は以下に記載される異なる方法を使用して行い得る。
B.1)R12がアラルキルである場合、その方法はE.M. Smith ら. (J. Med. Chem. (1988), 31, 875-885)により記載された操作に従って行い得る。簡単に言えば、市販のBoc-4(R)-ヒドロキシプロリンが水素化ナトリウムの如き塩基で処理され、得られるアルコキシドがアルキル化剤(Br-R12又はI-R12)と反応させられて所望の化合物を生じる。この方法の特別の実施態様が実施例３及び４に示される。
B.2) R12がアリールである場合、その化合物はミツノブ反応(Mitsunobu (1981), Synthesis, January, 1-28; Rano ら, (1995), Tet. Lett. 36(22), 3779-3792; Krchnak ら, (1995), Tet. Lett. 36(5), 62193-6196; Richter ら, (1994), Tet. Lett. 35(27), 4705-4706)により調製し得る。簡単に言えば、市販のBoc-4(S)-ヒドロキシプロリンメチルエステルがトリフェニルホスフィン及びジエチルアゾジカルボキシレート(DEAD)の存在下で適当なアリールアルコール又はチオールで処理され、得られるエステルが酸に加水分解される。この方法の特別の実施態様が実施例５及び６に示される。
【０１１７】
【化６７】
0004354632.tif 000045
【０１１８】
また、ミツノブ反応は固相で生成し得る（スキームIVに示されるようにして）。モデル396合成装置（アドバンスド・ケムテク）の96ウェルブロックに樹脂結合化合物(IVa)のアリコートが用意され、種々のアリールアルコール又はチオール及び適当な試薬が添加される。インキュベーション後に、夫々の樹脂結合生成物(IVb)が洗浄され、乾燥され、樹脂から開裂される。
B.2.a)スズキ反応(Miyaura ら, (1981), Synth. Comm. 11, 513; Satoら, (1989), Chem. Lett., 1405; Watanabe ら, (1992), Synlett., 207; Takayuki ら, (1993), J. Org. Chem. 58, 2201; Frenette ら, (1994), Tet. Lett. 35(49), 9177-9180; Guiles ら, (1996), J. Org. Chem. 61, 5169-5171)がまたアリール置換基を更に官能化するのに使用し得る。
【０１１９】
（実施例）
本発明が以下の非限定実施例により更に詳しく説明される。
温度を℃で示す。特にことわらない限り、溶液％は重量対容積関係を表し、溶液比は容積対容積関係を表す。核磁気共鳴(NMR)スペクトルをブルカー400 MHzスペクトロメーターで記録した。化学シフト（δ）をppmで報告する。フラッシュクロマトグラフィーをスティルのフラッシュクロマトグラフィー技術(W.C.Stillら, J.Org.Chem. (1978), 43, 2923)に従ってシリカゲル(SiO2)で行った。
【０１２０】
実施例に使用した略号として、Bn：ベンジル、Boc：tert-ブチルオキシカルボニル｛Me3COC(O)｝、BSA：ウシ血清アルブミン、CHAPS：3-〔（3-コラミドプロピル）-ジメチルアンモニオ〕-1-プロパンスルホネート、DBU：1,8-ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデカ-7-エン、CH2Cl2＝DCM：塩化メチレン、DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン、DMAP：ジメチルアミノピリジン、DCC：1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド、DME：1,2-ジメトキシエタン、DMF：ジメチルホルムアミド、DMSO：ジメチルスルホキシド、DTT：ジチオスレイトール又はトレオ-1,4-ジメルカプト-2,3-ブタンジオール、EDTA：エチレンジアミンテトラ酢酸、Et：エチル、EtOH：エタノール、EtOAc：酢酸エチル、Et2O：ジエチルエーテル、HPLC：高性能液体クロマトグラフィー、MS：質量分析法(MALDI-TOF：マトリックス補助レーザー吐き出しイオン化−飛行時間、FAB：高速原子衝撃)、LAH：水素化リチウムアルミニウム、Me：メチル、MeOH：メタノール、MES：（2-｛N-モルホリノ｝エタン-スルホン酸）、NaHMDS：ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、NMM：N-メチルモルホリン、NMP：N-メチルピロリジン、Pr：プロピル、Succ：4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブチル、PNA：4-ニトロフェニルアミノ又はp-ニトロアナリド、TBAF：テトラ-n-ブチルアンモニウムフルオリド、TCEP：トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、TFA：トリフルオロ酢酸、THF：テトラヒドロフラン、TIS：トリイソプロピルシラン、TLC：薄層クロマトグラフィー、TMSE：トリメチルシリルエチル、Tris/HCl：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩が挙げられる。
実施例１
ブロモメチル-8-キノリン(1)の合成
【０１２１】
【化６８】
0004354632.tif 000046
【０１２２】
市販の8-キノリンカルボン酸(2.5g、14.4ミリモル)に、ニートの塩化チオニル(10 ml、144ミリモル)を添加した。この混合物を80℃で１時間加熱し、その後に過剰の塩化チオニルを減圧で蒸留して除いた。得られる褐色の固体に、無水EtOH(15 mL)を添加し、これを80℃で１時間加熱し、その後に真空で濃縮した。残渣をEtOAcと飽和NaHCO3水溶液に分配し、有機相を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮して褐色の油(2.8 g)を得た。この物質（約14.4ミリモル）を-60℃に冷却されたLAH (0.76 g、20.2ミリモル)/Et2O懸濁液に35分にわたって滴下して添加した。その反応混合物を1.5時間にわたって-35℃に徐々に暖め、その後、反応を完結させた。反応を30分間にわたって徐々にMgSO4・10H2O次いで湿潤THFで停止した。混合物をEt2Oと10％NaHCO3水溶液に分配した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮してアルコールに相当する黄色の固体(2.31 g、２工程にわたって80％)を得た。そのアルコール(2.3 g、11.44ミリモル)をAcOH/HBr (20 mL、アルドリッチからの30％溶液)に溶解し、70℃で2.5時間加熱した。その混合物を真空で濃縮、乾燥させ、EtOAc (100 mL)と飽和NaHCO3水溶液に分配し、その後に乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮して所望の化合物(1)を褐色の固体(2.54 g、100％)として得た。
実施例２
Boc-4(R)-(3-フェニルプロピル)プロリン(2d)の合成
【０１２３】
【化６９】
0004354632.tif 000047
【０１２４】
a)化合物2bの合成
-78℃のTHF (10 mL)中のBoc-ピログルタミン酸ベンジルエステル(2a)（A.L Johnson ら, J. Med. Chem. (1985), 28, 1596-1602に記載されたようにして調製した) (500 mg, 1.57ミリモル)の溶液に、リチウムヘキサメチルジシリルアジド(1.72 mL、THF中1Mの溶液)を徐々に添加した。-78℃で１時間攪拌した後、シンナミルブロミド（278μL、1.88ミリモル）を添加し、攪拌を更に２時間続けた。その反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で反応停止し、酢酸エチル(3 x 20 mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(8:2ヘキサン：酢酸エチル)により精製して化合物2bをオフホワイトの固体(367 mg、収率54％)として得た。1H NMR (CDCl3):  7.35-7.19 (m, 10H), 6.43 (d, J=15 Hz, 1H), 6.11 (ddd, J=15, J'=J"=8 Hz, 1 H), 5.26 (d, J=16 Hz, 1H), 5.17 (d, J=16 Hz, 1H), 4.59 (dd, J=9.5, J'=2 Hz, 1 H), 2.83-2.70 (m, 2H), 2.41-2.34 (m, 1H), 2.22-2.16 (m, 1H), 2.10-2.02 (m, 1H) 1.42 (s, 9 H)。
【０１２５】
b)化合物2cの合成
-78℃で、リチウムトリエチルホウ水素化物（THF中1Mの溶液、1.01 mL、1.01ミリモル）を窒素雰囲気下でTHF (5 mL)中の化合物2b (367 mg、0.843ミリモル)の溶液に添加した。30分後に、反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(2 mL)で反応停止し、０℃に温めた。30％H2O2（５滴）を添加し、その混合物を０℃で20分間攪拌した。有機揮発物を真空で除去し、水層をCH2Cl2 (3 x 10 mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮した。CH2Cl2（3 mL）中の残渣及びトリエチルシラン（134μL、0.843ミリモル）の冷却(-78℃)溶液に、三弗化ホウ素エーテラート（118μL、0.927ミリモル）を窒素雰囲気下で滴下して添加した。30分後に、追加のトリエチルシラン（134μL）及び三弗化ホウ素エーテラート（118μL）を添加した。-78℃で２時間攪拌した後、その反応混合物を飽和NaHCO3 水溶液(2 mL)で反応停止し、DCM(3 x 10 mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(8:2ヘキサン：酢酸エチル)により精製して化合物2cを無色の固体(140 mg、収率40％)として得た。1H NMR (CDCl3) は２種の回転異性体を示した:  7.34-7.22 (m, 10H), 6.38 (d, J=15.5 Hz, 1H), 6.15-6.08 (m, 1H), 5.29-5.07 (m, 2H), 4.44 (d, J=7 Hz, 1/3H), 4.33 (d, J=7 Hz, 2/3H), 3.76 (dd, J=10.5, J'=8.5 Hz, 2/3H), 3.69 (dd, J=10.5, J'=8.5 Hz, 1/3H), 3.13 (dd, J=9, J'=8.5 Hz, 2/3H), 3.05 (dd, J=9, J'=8.5 Hz, 1/3H), 2.47-2.40 (m, 1H), 2.35-2.22 (m, 2H) 2.15-1.85 (m, 2H), 1.45 (s, (3/9) 9H), 1.33 (s, (6/9) 9H)。
【０１２６】
c)化合物2dの合成
エタノール(4 mL)中の化合物20 (140 mg、0.332ミリモル)の溶液に、10％パラジウム／木炭(30 mg)を添加した。その混合物を水素の雰囲気下で２時間攪拌した。混合物をミリポア：ミレックス-HV0.45μmのフィルターに通すことにより触媒を除去した。透明溶液を濃縮して所望の化合物2dを無色の油(115 mg、定量的収率)として得た。  1H NMR (DMSO-d6) は２種の回転異性体の存在を示した:  7.28-7.14 (m, 5H), 4.33 (br.s, 1H), 4.06-4.10, (m, 1H), 3.56-3.42 (m, 3H), 2.89-2.79 (m, 1H), ), 2.53-2.49 (m, 1H, DMSO-d6中), 2.24-2.10 (m, 1H), 2.03-1.93 (m, 1H), 1.87-1.75 (m, 1H), 1.62-1.45 (m, 2H), 1.38 (s, (3/9) 9H), 1.33 (s, (6/9) 9H)。
実施例３
Boc-4(R)-（ナフタレン-1-イルメトキシ）プロリン(3)の合成
【０１２７】
【化７０】
0004354632.tif 000048
【０１２８】
市販のBoc-4(R)-ヒドロキシプロリン(5.00 g、21.6ミリモル)をTHF (100 mL)に溶解し、０℃に冷却した。水素化ナトリウム（油中60％の分散液、1.85 g、45.4ミリモル）を10分間にわたって滴下して添加し、懸濁液を室温で１時間攪拌した。次いで、1-（ブロモメチル）ナフタレン(8.00 g、36.2ミリモル)（E.A. Dixon ら. Can. J. Chem., (1981), 59, 2629-2641に記載されたようにして調製した）を添加し、その混合物を18時間にわたって加熱、還流した。その混合物を水(300 mL)に注ぎ、ヘキサンで洗浄した。水層を10％HCl水溶液で酸性にし、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(49:49:2ヘキサン：酢酸エチル：酢酸)により精製して標題化合物を無色の油(4.51 g、収率56％)として得た。  1H NMR (DMSO-d6) は２種の回転異性体の存在を示した:  8.05 (m, 1H), 7.94 (m, 1H), 7.29 (d, J=14 Hz, 1H), 7.55-7.45 (m, 4H), 4.96 (m, 2H), 4.26 (br. s, 1H), 4.12 (dd, J=J=8 Hz, 1H), 3.54-3.42 (m, 2H), 2.45-2.34 (m, 1H), 2.07-1.98 (m, 1H) 1.36 (s, (3/9) 9H), 1.34 (s, (6/9) 9H)。
実施例４
Boc-4(R)-(8-キノリン-メチルオキシ)プロリン(4)の合成
【０１２９】
【化７１】
0004354632.tif 000049
【０１３０】
無水THF (20 mL)中のBoc-4(R)-ヒドロキシプロリン(1.96 g、8.5ミリモル)をTHF (100 mL)中のNaH (1.4 g、油中60％、34ミリモル)の懸濁液に添加した。この混合物を30分間攪拌し、その後に実施例１からのブロモメチル-8-キノリン(2.54 g、11.44ミリモル)をTHF (30 mL)中で添加した。その反応混合物を70℃で加熱し（５時間）、その後に過剰のNaHを湿潤THFで慎重に分解した。反応液を真空で濃縮し、得られる物質をEtOAc及びH2Oに溶解した。その塩基性水相を分離し、10％HCl水溶液でpH約５に酸性にし、その後にEtOAc (150 mL)で抽出した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮して褐色の油を得た。フラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：10％MeOH/CHCl3）により精製して所望の化合物を淡黄色の固体(2.73 g、86％)として得た。HPLC (97.5%); 1H-NMR (DMSO-d6) は6:4の比で回転異性体集団を示す,  12-11.4 (bs, 1H), 8.92 (2 x d, J = 4.14 及び4.14 Hz, 1H), 8.38 (2 x d, J = 8.27 及び8.27 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 7.94 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.63-7.54 (m, 2H), 5.14 (2 x s, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.07 (m, 1H), 3.52-3.44 (m, 2H), 2.43-2.27 (m, 1H), 2.13-2.04 (m, 1H), 1.36 及び1.34 (2 x s, 9H)。
【０１３１】
実施例５
Boc-4(R)-(7-クロロキノリン-4-オキソ)プロリン(5)の調製
【０１３２】
【化７２】
0004354632.tif 000050
【０１３３】
市販のBoc-4(S)-ヒドロキシプロリンメチルエステル(500 mg、2.04ミリモル)及び7-クロロ-4-ヒドロキシキノリン(440 mg、2.45ミリモル)を０℃で乾燥THF (10 mL)に入れた。トリフェニルホスフィン(641 mg、2.95ミリモル)を添加し、続いてDIAD (426 mg、2.45ミリモル)を徐々に添加した。その混合物を室温で20時間攪拌した。次いでその反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに吸収させ、HCl 1Nで３回抽出した。水相をNa2CO3で塩基性にし、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色の油を得た。油をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して化合物(5)メチルエステルを白色の固体(498 mg、収率58％)として得た。
このメチルエステル(400 mg、0.986ミリモル)を０℃のメタノール(4 mL)中で３時間にわたって1Mの水酸化ナトリウム水溶液(1.7 mL、1.7ミリモル)で加水分解した。その溶液を濃縮してメタノールを除去し、1MのHCl水溶液で中和した。その懸濁液を濃縮、乾燥させ、メタノール(20 mL)に吸収させ、塩を濾別し、濾液を濃縮して所望の化合物(5)を白色の固体(387 mg、定量的収率)として得た。1H NMR (DMSO-d6) (回転異性体の約1:1 混合物)  8.74 (d, J = 5 Hz, 1 H), 8.13-8.09 (m, 1 H), 7.99 及び7.98 (s, 1 H), 7.58 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.02 (d, J = 5 Hz, 1 H), 5.26-5.20 (m, 1 H), 4.10- 4.01 (m, 1 H), 3.81-3.72 (m, 1 H), 3.59 (dd, J = 12, 10 Hz, 1 H), 2.41-2.31 (m, 2 H), 1.34 及び1.31 (s, 9H)。
【０１３４】
実施例６
固相中のミツノブ反応の一般操作（スキームIV）
一般構造式IVaのポリマー結合ペプチド（ワング(Wang)樹脂１g当り0.327ミリモルのペプチド）をデシケーター中で高真空でP2O5で乾燥させた。アドバンスド・ケムテク・モデル396合成装置の96ウェルブロックにIVa (120 mg、ウェル当り0.04ミリモルのペプチド)を供給し、夫々のサンプルを５分間にわたって無水CH2Cl2 (5x1200μL)、次いで無水THF (5x1500μL)で洗浄した。無水THF (200μL)を夫々のサンプルに添加し、合成装置を一時的に停止して試薬のマニュアル添加を可能にした。Ph3P (無水THF400μL中５当量)及びジエチルアゾジカルボキシレート（DIAD、無水THF 250μL中５当量）を夫々のサンプルに添加し、その後に、フェノール又はチオフェノール試薬（５当量、0.2ミリモル、無水THF 500μLに溶解した）を添加した。試薬のライブラリーを使用してこの特許出願に記載されたHCVプロテアーゼインヒビターのライブラリーを生成した。全ての試薬の添加後に、その混合物を合計４時間にわたって１時間毎に10分の遅れで振とうした。夫々の樹脂結合生成物をTHF (2x1500 μL)、DMF (4x1500 μL)、イソプロパノール(4x1500 μL)、CH2Cl2 (4x1500 μL)そして最後にメタノール(2x1500 μL)で洗浄した。サンプルを真空で乾燥させ、次いでペプチド生成物（一般構造式IVb）を樹脂から開裂するためにCH2Cl2中で１時間にわたって40％TFAで処理した。５％CH3CN水溶液から100％ CH3CNまでの線形溶媒勾配を使用して逆相C18カラムによる分取HPLCにより全ての生成物を精製した。
以下の記載は固体担体上のスズキカップリングによるビアリール合成（R.Frenette及びR.W.Friesen, Tetrahedron Lett. (1994), 35, 9177を参照のこと）の適用によるP2における側鎖R12の更なる作成の例である。
前駆体、表２の芳香族ブロミド化合物238を最初に上記ミツノブプロトコルを使用してP2位置にシス−ヒドロキシプロリンを有するポリマー結合テトラペプチド及び4-ブロモフェノールから合成した。
【０１３５】
実施例７
固相合成における反応のスズキ・ライブラリー
全ての反応を小さい磁気攪拌棒を備えたテフロンキャップ付きの16x100 mmの高圧スクリュー−キャップ試験管中で行った。夫々の反応について、ポリマー結合ペプチド（結合ペプチド0.033ミリモルを含むワング樹脂100 mg）の脱気懸濁液を最初に試験管に添加し、続いてDME (2 mL)、Pd(Ph3P)3（約3 mg、0.05当量）、Na2CO3 (H2O中2Mの溶液70μL、2.5当量)及び本発明者らのライブラリーからのフェニルホウ酸試薬の一種を添加した。試験管を窒素ガスでフラッシし、シールし、80℃の油浴に入れた。反応液の全てを穏やかに攪拌し、15-18時間にわたって進行させた。続いて夫々の樹脂結合ペプチド生成物をプラスチック濾過管に移し、DME:H2O (1:1、5x2 mL)、DME (5x 2 mL)、メタノール(5x 2 mL)、CH3CN (5x 2 mL)、CH2Cl2 (5x 2 mL)で洗浄し、高真空で乾燥させた。サンプルをCH2Cl2 (1 mL)中で１時間にわたって45％TFAで処理することにより、夫々の生成物を樹脂から開裂した。５％CH3CN水溶液から100％ CH3CNまでの線形溶媒勾配を使用して逆相C18カラムによる分取HPLCにより全ての生成物を精製した。
実施例８
Ac-Chg-Val-Hyp(アリール)-Acca-OHのライブラーの調製
この化合物を実施例６のプロトコルに従って合成し、この場合、適当なペプチドを使用した。
実施例９
表２のポリマー結合化合物#246の合成
【０１３６】
【化７３】
0004354632.tif 000051
【０１３７】
化合物246の合成を方法実施例７に従って行った。
化合物246：
ES- MS m/z 675.3 [(M-H)-]; C18逆相HPLCにより純度約95％；1H NMRに基いて約1:3の比の２種の回転異性体の混合物
主要回転異性体の1H NMR (400 MHz, DMSO):  8.44 (s, 1H), 7.84 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J=~8.6 Hz, 1H), 7.54 (bd, J=8.3 Hz, 4H), 6.99 (d, J=8.9 Hz, 2H), 6.98 (d, J=8.9 Hz, 2H), 5.11 (bs, 1H), 4.29-4.34 (m, 2H), 4.21 (bt, J=7.8 Hz, 1H), 3.94-4.02 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.29-2.33 (m, 2H), 2.15-2.21 (m, 1H), 1.95-1.99 (m, 1H), 1.83 (s, 3H), 1.45-1.70 (m, 8H), 1.33-1.40 (m, 1H), 1.20-1.28 (m, 1H), 1.02-1.18 (m, 2H), ~0.9-1.02 (m, 2H), 0.90 (d, J= 6.7 Hz, 3H) 0.84 (d, J=6.7 Hz, 3H)。
【０１３８】
実施例10
溶液中で行なわれるカップリング反応の一般操作{またR. Knorr ら, Tetrahedron Letters, 30, 1927 (1989)を参照のこと}
反応体、即ち、遊離アミン（１当量）（又はその塩酸塩）及び遊離カルボン酸（１当量）をCH2Cl2、CH3CN又はDMFに溶解した。窒素雰囲気下で、４当量のN-メチルモルホリン及び1.05当量のカップリング剤をその攪拌溶液に添加した。20分後に、１当量の第二反応体、即ち、遊離カルボン酸を添加した（この目的に実用的かつ有効なカップリング試薬は（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(HOBT)又は好ましくは2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)もしくはO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(HATU)である)。その反応をTLCによりモニターした。反応の完結後に、溶媒を減圧で蒸発させた。残渣をEtOAcに溶解した。その溶液を10％クエン酸水溶液、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で連続して洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧で濃縮した。残渣を精製する場合、それを上記のようにフラッシュクロマトグラフィーにより行った。
実施例11
“トリペプチドセグメント”：Ac-Chg-Chg-Pro(4(R)-ナフタレン-1-イルメトキシ)-OH (11g)の合成
【０１３９】
【化７４】
0004354632.tif 000052
【化７５】
0004354632.tif 000053
【０１４０】
化合物11a (4.45g、11.98ミリモル)を無水CH3CN (60 mL)に溶解した。DBU (2.2 mL、14.38ミリモル)及び臭化アリル(1.1 mL、13.18ミリモル)を連続して添加し、その反応混合物を室温で24時間攪拌した。その混合物を濃縮し、得られる油をEtOAc及び水で希釈し、水(2x)及び食塩水(1x)で連続して洗浄した。EtOAc層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発、乾燥させた。黄色の油をフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン：EtOAc；90:10〜85:15）により精製して生成物11bを黄色の油（２、4.17g；収率85％）として得た。MS (FAB)  412 MH+1H NMR (CDCl3) ,約1:2の回転異性体の混合物 ,  (d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (d, J= 8Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.55-7.41 (m, 4H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.34-5.21 (m, 2H), 5.03-4.88 (m, 2H), 4.70-4.56 (m, 2H), 4.48 & 4.39 (t, J= 8, 15Hz, 1H), 4.28-4.23 (m, 1H), 3.81-3.55 (m, 2H), 2.46-2.36 (m, 1H), 2.13-2.05 (m, 1H), 1.44 &1.41 (s, 9H)。
【０１４１】
化合物11b (2.08 g、5.05ミリモル)を室温で30分間にわたって4N HCl/ジオキサンで処理した。蒸発、乾燥させて相当するアミン-HClを油として得た。そのアミン-HCl 11cを無水DCM (25 mL)に溶解し、NMM (2.2 mL、20.22ミリモル)、Boc-Chg-OH・H2O (1.53 g、5.56ミリモル)及びTBTU (1.95 g、6.07ミリモル)を連続して添加した。その反応混合物を室温で一夜攪拌し、次いでEtOAcで希釈し、10％クエン酸水溶液(2x)、飽和NaHCO3水溶液(2x)、水(2x)、及び食塩水(1x)で連続して洗浄した。EtOAc層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発、乾燥させて粗生成物11dを黄色を帯びた白色のフォーム（約2.78 g、収率100％）として得た。MS (FAB)  551.4 MH+.  1H NMR (CDCl3)  8.03(d, J= 8Hz, 1H), 7.86 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 7.84 (d, J= 8Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 4H), 5.92-5.85 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.22 (dd, J= 1, 10Hz, 1H), 5.17 (d, J= 9Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.91 (d, J= 12Hz, 1H), 4.67-4.60 (m, 3H), 4.31-4.27 (m, 2H), 4.16 (b d, J= 11Hz, 1H), 3.71 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.47-2.41 (m, 1H), 2.08-1.99 (m,1H), 1.85-1.63 (m, 5H), 1.44-1.40 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.28-1.00 (m, 5H)。
【０１４２】
粗生成物11d（約5.05ミリモル）を化合物11cについて記載されたようにして4N HCl/ジオキサン(25 mL)で処理した。その粗塩酸塩を化合物11dについて記載されたようにしてDCM (25 mL)中でNMM (2.22 mL、20.22ミリモル)及びTBTU (1.95 g、6.07ミリモル)を用いてBoc-Chg-OH・H2O (1.53g、5.55ミリモル)にカップリングして粗トリペプチドを黄色の油フォームとして得た。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン：EtOAc; 80:20〜75:25）により精製してトリペプチド11eを白色のフォーム(2.75g; ２工程で収率79％)として得た。  MS (FAB)  690.5 MH+.  1H NMR (CDCl3), 主として一種の回転異性体,  8.06 (d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 4H), 6.41 (d, J= 8.5Hz, 1H), 5.92-5.84 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.23 (dd, J= 1, 10.5Hz, 1H), 5.04 (d, J= 12Hz, 1H), 4.98 (b d, J= 7Hz, 1H), 4.93 (d, J=12Hz, 1H), 4.63-4.58 (m, 4H), 4.29-4.25 (m, 1H), 4.10-4.07 (m, 1H), 3.90-3.84 (m, 1H), 3.72 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.48-2.40 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 1H), 1.83-1.55 (m, 12H), 1.43 (s, 9H), 1.23-0.89 (m, 10H)。
【０１４３】
そのトリペプチド11e (2.75 g、3.99ミリモル)を化合物11cについて記載されたようにして4N HCl/ジオキサン(20 mL)で処理した。その粗塩酸塩を無水DCM (20 mL)に溶解した。NMM (1.75 mL、15.94ミリモル)及び無水酢酸(752μL、7.97ミリモル)を連続して添加した。その反応混合物を室温で一夜攪拌し、次いでEtOAcで希釈した。有機層を10％クエン酸水溶液(2x)、飽和NaHCO3水溶液(2x)、水(2x)、及び食塩水(1x)で連続して洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発、乾燥させて粗トリペプチド11fを白色のフォーム(2.48 g、収率98％)として得た。
MS (FAB) 632.4 MH+l.  1H NMR (CDCl3), 主として一種の回転異性体,  8.06(b d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.83 (d, J= 8Hz, 1H), 7.58-7.40 (m, 4H), 6.36 (d, J= 9Hz, 1H), 6.01 (d, J= 9Hz, 1H), 5.94-5.83 (m, 1H), 5.34-5.28 (m, 1H), 5.25-5.21 (m, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.64-4.57 (m, 4H), 4.30-4.23 (m, 2H), 4.12-4.08 (m, 1H), 3.73 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.49-2.42 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.99 (s, 3H), 1.85-1.53 (m, 11H), 1.25-0.88 (m, 11H)。
【０１４４】
粗トリペプチド11f (2.48 g、3.93ミリモル)をCH3CN : DCMの無水混合物(20 mL)に溶解した。トリフェニルホスフィン(53.5 mg、0.200ミリモル)及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム(0)触媒(117.9 mg、0.102ミリモル)を連続して添加し、続いてピロリジン(353.9μL、4.24ミリモル)を添加した。その反応混合物を室温で18時間攪拌した。その後、溶媒を蒸発させた。残渣をEtOAc及び10％クエン酸水溶液に溶解し、次いで10％クエン酸水溶液でもう２回、水(2x)、及び食塩水(1x)で更に洗浄する。有機層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発させた。粗生成物をEt2O:DCM (85:15)中ですり砕いて濾過後にトリペプチド11gを白色の固体(2.09 g、収率90％)として得た。
MS (FAB)  592.4 MH+     614.3 (M+Na) +.  1H NMR (CDCl3), 主として一種の回転異性体,  8.08 (d, J= 8Hz, 1H), 7.93 (b d, J= 9Hz, 1H),  7.88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.57-7.41 (m, 4H), 6.47 (d, J= 8.5Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12.5Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12.5Hz, 1H), 4.73 (t, J= 9.5, 19Hz, 1H), 4.44-4.35 (m, 2H), 4.26 (b s, 1H), 4.19 (d, J= 11.5Hz, 1H), 3.75 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.47 (b dd, J= 7.5, 13.5Hz, 1H), 2.20-2.11 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.88-1.41 (m, 11H), 1.30-0.80 (11H)。
実施例12
“トリペプチドセグメント”-Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-ナフタレン-1-イルメトキシ)-OH (12e)の合成
【０１４５】
【化７６】
0004354632.tif 000054
【０１４６】
化合物12a (2.89 g、7.02ミリモル)を化合物11cについて記載されたようにして4N HCl/ジオキサン(30 mL)で処理した。化合物３について記載されたようにしてDCM (35 mL)中で3.5時間にわたってNMM (3.1 mL、28.09ミリモル)及びTBTU (2.71 g、8.43ミリモル)を用いて、その粗塩酸塩をBoc-Val-OH (1.53 g、7.73ミリモル)にカップリングして粗ジペプチド12bを象牙色の油−フォーム（約3.60 g、収率100％）として得た。  MS (FAB)  509.3 MH-    511.3 MH+   533.2 (M+Na)+.  1H NMR ( CDCl3)  8.04 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 4H), 5.93-5.85 (m, 1H), 5.34-5.28 (m, 1H), 5.24-5.19 (m, 2H), 5.04 (d, J= 12Hz, 1H), 4.92 (d, J= 12Hz, 1H), 4.67-4.60 (m, 3H), 4.31-4.26 (m, 2H), 4.11-4.09 (m, 1H), 3.72 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 1H), 1.44-1.36 (m, 1H), 1.37 (s, 9H), 1.01 (d, J= 7Hz, 3H), 0.93 (d, J= 7Hz, 3H)。
【０１４７】
その粗ジペプチド12b（約7.02ミリモル）を化合物11cについて記載されたようにして4N HCl/ジオキサン(30 mL)で処理した。化合物３について記載されたようにしてCH2Cl2 (35 mL)中でNMM (3.1 mL、28.09ミリモル)及びTBTU (2.71 g、8.43ミリモル)を用いて、その粗塩酸塩をBoc-Chg-OH・H2O(2.13 g、7.73ミリモル)にカップリングして粗トリペプチド12cを象牙色のフォーム（約4.6 g、収率100％）として得た。  MS (FAB)  648.5  MH-    672.4 (M+Na) +.  1H NMR (CDCl3)  8.06 (b d, J=8Hz, 1H), 7.87 (b d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.82 (b d , J= 8Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 4H), 6.46 (b d, J= 8.5Hz, 1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.23 (dd, J= 1, 10.5Hz, 1H), 5.03 (d, J= 12Hz, 1H), 5.00-4.97 (m, 1H), 4.93 (d, J=, 12Hz, 1H), 4.63-4.59 (m, 4H), 4.29-4.27 (m, 1H), 4.10-4.07 (m, 1H), 3.92-3.86 (m, 1H), 3.72 (dd, J= 5, 11Hz, 1H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.10-1.99 (m, 1H), 1.76-1.57 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.20-0.92 (m, 6H), 1.00 (d, J= 7Hz, 3H), 0.93 (d, J= 7Hz, 3H)。
【０１４８】
粗トリペプチド12c（約7.02ミリモル）を化合物11cについて記載されたようにして4N HCl/ジオキサン(30 mL)で処理した。粗塩酸塩を化合物11fについて記載されたようにしてCH2Cl2 (35 mL)中で無水酢酸(1.33 mL、14.05ミリモル)及びNMM (3.1 mL、28.09ミリモル)で更に処理した。粗生成物をフラッシュ精製して（溶離剤：ヘキサン：EtOAc; 30:70）アセチル化された保護トリペプチド12dを白色のフォーム(3.39 g、３工程で収率81％)として得た。  MS (FAB)   590.3 MH-   592.4 MH+   614.4 (M+Na)+1H NMR (CDCl3), 主として一種の回転異性体,  8.06 (d, J= 8Hz, 1H), 7.88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7.83 (d, J=  8Hz, 1H), 7.58-7.41 (m, 4H), 6.37 (d, J= 9Hz, 1H), 5.97 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5.24 (dd, J= 1, 10.5 Hz, 1H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.66-4.57 (m, 4H), 4.31-4.22 (m, 2H), 4.11-4.05 (m, 1H), 3.73 (dd, J= 4.5, 11Hz, 1H), 2.50-2.43 (m, 1H), 2.09-2.01 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 1.68-1.55 (m, 5H), 1.15-0.89 (m, 6H), 0.99 (d, J= 7Hz, 3H), 0.91 (d, J= 7Hz, 3H)。
【０１４９】
アセチル化されたトリペプチド12d (3.39 g、5.73ミリモル)を化合物11gについて記載されたようにして無水CH3CN : DCMの1:1混合物(30 mL)中でトリフェニルホスフィン(78.1 mg、0.298ミリモル)及びピロリジン(516μL、6.19ミリモル)を用いてテトラキス（トリフェニルホスフィン）-パラジウム(0)触媒(172.1 mg、0.149ミリモル)により脱保護した。淡黄色のフォームの粗生成物をEt2O : DCM (85:15)中ですり砕いて濾過後にトリペプチド12eをオフホワイトの固体(3.0 g、収率95％)として得た。  MS (FAB)   550.3  MH-1H NMR (CDCl3)  8.08 (d, J= 8Hz, 1H), 8.04 (b d, J= 9Hz, 1H), 7.88 (b d, J= 7.5Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8Hz, 1H), 7.58-7.37 (m, 5H), 5.05 (d, J= 12Hz, 1H), 4.94 (d, J= 12Hz, 1H), 4.61 (t, J= 9.5, 19.5Hz, 1H), 4.46-4.37 (m, 2H), 4.27 (b s, 1H), 4.17 (d, J= 11Hz, 1H), 3.74 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2.49 (b dd, J= 7.5, 13Hz, 1H), 2.17-2.09 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.79 (b d, J= 12.5Hz, 1H), 1.62-1.43 (m, 5H), 1.08-0.85 (m, 5H), 1.00 (d, J= 7Hz, 3H), 0.90 (d, J= 7Hz, 3H)。
【０１５０】
実施例13
固体担体上で行なわれるカップリング反応に関する一般操作
その合成を96ウェルブロックを含むアドバンスド・ケムテクからの平行合成装置モデルACT396で行った。典型的には、通常の固相技術を使用して24種のペプチドを平行に合成した。出発Fmoc-Nva-ワング樹脂及び1-(Fmoc-アミノ)シクロプロパンカルボン酸-ワング樹脂をDCC/DMAPカップリング方法(Atherton, E; Scheppard, R.C. Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach; IRL Press: Oxford (1989); pp 131-148)により調製した。その他のアミノ酸-ワング樹脂を商業源から得た。
夫々のウェルに出発樹脂100 mg （約0.05ミリモル）を装填した。樹脂を1.5 mLずつのNMP (1 X)及びDMF (3 X)で連続して洗浄した。Fmoc保護基を20分間にわたってDMF中のピペリジンの25％v/v溶液1.5 mLによる処理により除去した。樹脂を1.5 mLずつのDMF (4 X)、MeOH (3 X)及びDMF (3 X)で洗浄した。DMF中のFmoc-アミノ酸/HOBt水和物の0.5M溶液400μL（0.2ミリモル）、DMF中のDIPEAの0.5M溶液400μL (0.4ミリモル)及びDMF中のTBTUの0.5M溶液400μL (0.2ミリモル)を使用して、カップリングをDMF (350 μL)中で行った。１時間振とうした後、ウェルを排液し、樹脂をDMF 1.5 mLで洗浄し、カップリングを同じ条件下でもう１回繰り返した。次いで樹脂を上記のようにして洗浄し、そのサイクルを次のアミノ酸で繰り返した。
【０１５１】
キャッピング基を二つの方法で導入した。
1.上記プロトコルを使用してカルボン酸（例えば、酢酸）の形態で、又は
2.酸無水物又は酸塩化物の如きアシル化剤として。下記の実施例は無水コハク酸によるキャッピングを説明する。Fmoc脱保護及びその後の洗浄プロトコル後に、DMFを添加し(350 μL)、続いて夫々400μLの無水コハク酸(0.5 M、0.2ミリモル)及びDIPEA (1.0 M、0.4ミリモル)のDMF溶液を添加した。樹脂を２時間攪拌し、リカップリング工程を行った。
【０１５２】
合成の終了時に、樹脂を1.5 mLずつのDCM (3 X)、MeOH (3 X)及びDCM (3 X)で洗浄し、２時間にわたって真空で乾燥させた。
樹脂からの開裂及び同時の側鎖脱保護をTFA、H2O、DTT及びTISの混合物(92.5:2.5:2.5:2.5) 1.5 mLの添加により行った。2.5時間にわたって振とうした後、樹脂を濾過し、DCM 1.5 mLで洗浄した。濾液を合わせ、真空遠心分離により濃縮した。
C18カラム(22 mm x 500 mm)を使用して、夫々の化合物を分取逆相HPLCにより精製した。生成物を含むフラクションをMALDI-TOF質量分析法により同定し、合わせ、凍結乾燥させた。
実施例14
化合物210（表２）の合成
【０１５３】
【化７７】
0004354632.tif 000055
【０１５４】
実施例11に記載された実験プロトコルを使用し、Fmoc-Cys（トリチル）-ワング樹脂で開始して、上記化合物を白色の固体(15.7 mg)として得た。  MS (FAB)  849.2 (MH+), 1H NMR (DMSO-d6)  12.8 (broad s, 1H), 12.1 (broad s, 2H), 8.27 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.34-7.27 (m, 5H), 4.54-4.39 (m, 5H), 4.31-4.18 (m, 4H), 4.10 (d, J = 11 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 3.9 Hz, J' = 10.8 Hz, 1H), 2.90-2.82 (m, 1H), 2.78-2.70 (m, 1H), 2.67-2.42 (m, 4H), 2.21-2.17(m, 3H), 2.00-1.85 (m, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.80-1.67 (m, 1H), 1.67-1.42 (m, 6H), 1.15-0.95 (m, 4H), 0.88 (dd, J =  6.9 Hz, J' = 8.9 Hz, 6H)。
実施例15
化合物215（表２）の合成
【０１５５】
【化７８】
0004354632.tif 000056
【０１５６】
その合成を以下に示されるようにして行った。
【０１５７】
【化７９】
0004354632.tif 000057
【０１５８】
a)化合物15bの合成
1-(N-t-Boc-アミノ)シクロプロパンカルボン酸(15a)(997 mg、4.96ミリモル)を無水CH2Cl2 (25 mL)及びTHF (10 mL)の混合物に溶解した。その溶液を０℃に冷却し、2-トリメチルシリルエタノール(0.852 mL、5.95ミリモル)、DMAP (121.1 mg、0.991ミリモル)及びDCC/CH2Cl2溶液(3.65 M; 1.63 mL、5.95ミリモル)を連続して添加した。その反応混合物を０℃で約４時間攪拌し、次いで室温で一夜攪拌した。白色の懸濁液をケイソウ土パッドで濾過した。パッドをCH2Cl2ですすいだ。濾液及び洗浄液を蒸発、乾燥させた。残渣をEtOAcで希釈し、10％クエン酸水溶液(2x)、飽和NaHCO3 (2x)、水(2x)及び食塩水(1x)で連続して洗浄した。有機層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発させてエステル15bを油（約1.5 g、100％）として得た。  1H NMR (CDCl3)    5.08 (s, 1H), 4.20-4.16 (m, 2H), 1.57-1.43 (m, 2H), 1.45 (s , 9H), 1.17-1.12 (m, 2H), 1.00-0.94 (m, 2H), 0.04 (s, 9H)。
【０１５９】
b) 化合物15cの合成:
エステル15b (約700 mg、2.33ミリモル)を4N HCl/ジオキサン(11 ml)でRTにおいて40分間処理した。その溶液を濃縮乾固してアミン塩酸塩を白色固形物として得、次に実施例6に記載された反応条件に供した。粗塩酸塩(950 mg、2.55ミリモル)とBoc-4(R)-(ナフタレン-1-イルメトキシ)プロリン(3)を無水CH2Cl2 に溶解した。NMM (1.02 ml、9.30ミリモル)と HATU (1.06 g、2.79ミリモル)を順次添加し、その混合液をRTで撹拌した。1.75時間後、反応混合液をEtOAcで希釈し、10% 水性クエン酸(2×)、NaHCO3飽和水溶液(2×)、水(2×)、及び食塩水(1×)で順次洗浄した。EtOAc層を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、濃縮乾固して粗ジぺプチド15cをオフホワイトの泡状物(1.22 g)として得た。MS (FAB) 555.4 (MH+).  1H NMR (CDCl3) ; 回転異性体の混合物,     8.06-8.04 (m, 1H), 7.87-7.80 (m, 2H), 7.55-7.41 (m, 5H), 4.99-4.93 (m, 2H), 4.45-4.21 (m, 2H), 4.16-4.11 (m, 2H), 3.97-3.45 (m, 2H), 2.70-1.80 (m, 2H), 1.73-1.40 (m, 2H), 1.53 (s, (6/9) 9H), 1.44 (s, (3/9) 9H), 1.20-1.05 (m , 2H), 0.97-0.93 (m, 2H), 0.02 (s, 9H).
【０１６０】
c) 化合物15dの合成:
粗ジぺプチド15d (約2.20ミリモル)を4N HCl/ジオキサン(11 ml) 40分間、RTで処理し、得られた塩酸塩を化合物15c(2.5時間のカップリング時間に変更した)に記載されたようにNMM (968 ml、8.80ミリモル)及び HATU (1.00 g、2.64ミリモル)でBoc-Val-OH (525 mg、2.42ミリモル)へカップリングした。粗トリぺプチド15dをオフホワイトの泡状物(1.5 g)として得た。MS (FAB) 654.4 (MH+).  1H NMR (CDCl3)    8.05-8.02 (m, 1H), 7.87-7.80 (m, 2H), 7.55-7.40 (m, 5H), 7.30-7.28 (m, 1H), 5.19-4.62 (m, 4H), 4.41-3.70 (m, 1H), 4.35-4.27 (m, 1H), 4.09-3.95 (m, 1H) 3.73-3.62 (m, 2H), 2.69-2.60 (m, 1H) , 2.14-1.94 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.22-1.18 (m, 1H), 1.11-1.07 (m, 1H), 0.98-0.90 (m, 8H), 0.02 (s, 9H).
【０１６１】
d) 化合物15eの合成:
粗トリぺプチド15d (約2.20ミリモル)を4N HCl/ジオキサン(11 ml) 40分間、RTで処理し、得られた塩酸塩を化合物15c (カップリング剤としてTBTUを用い、処理する前にRTで約64時間撹拌することに変更した)に記載されたようにNMM (968 ml、8.80ミリモル)及び TBTU (847 mg、2.64ミリモル)でBoc-Chg-OH (622 mg、2.42ミリモル)へカップリングした。泡状残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離剤: ヘキサン: EtOAc; 6:4)で精製してテトラぺプチド15eを白色泡状物として得た(710.8 mg ; 3工程後の収率41% )。 MS (FAB)  793.4 (MH+).  1H NMR (CDCl3)    8.07-8.05 (m, 1H), 7.87-7.80 (m, 2H), 7.57-7.41 (m, 4H), 7.35 (s, 1H), 6.72-6.64 (m, 1H), 5.02-4.95 (m, 3H), 4.68-4.62 (m, 2H), 4.43-4.40 (m, 1H), 4.15-4.00 (m, 2H), 3.96-3.93 (m, 2H), 3.68 (dd, J= 11, J'= 5 Hz, 1H), 2.62-2.56 (m, 1H), 2.16-2.00 (m, 2H), 1.70-1.54 (m, 6H), 1.49-1.42 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.14-1.02 (m, 5H), 0.95-0.88 (m, 10H), 0.02 (s, 9 H).
【０１６２】
e) 化合物15fの合成:
テトラぺプチド15e (168.1 mg、0.212ミリモル)を4N HCl/ジオキサン溶液(2 ml)で処理し、得られた塩酸塩を化合物15e (17時間のカップリング時間に変更した)に記載されたようにNMM (94 ml、0.848ミリモル)及びTBTU (81.7 mg、0.254ミリモル)でBoc-(D)Glu(OTMSE)-OH (81.0 mg、0.233ミリモル)へカップリングした。粗ペンタぺプチド15fをオフホワイトの泡状物(220 mg、0.212ミリモル)として得た。MS (FAB) 1022.8 (MH+) 1044.8 (MNa+). 1H NMR (CDCl3)  8.07-8.05 (m, 1H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.57-7.41 (m, 4H), 7.29 (s, 1H), 6.70-6.55 (m, 2H), 5.45-5.35 (m, 1H), 4.99-4.98 (m, 2H) , 4.66-4.57 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H), 4.30-4.01 (m , 5H), 3.91 (dd, J= 11, J'= 4 Hz, 1H), 3.76-3.62 (m, 2H), 2.62-2.56 (m , 1H), 2.50-2.30 (m, 3H), 2.18-2.09 (m, 2H), 2.06-1.90 (m, 2H), 1.67-1.53 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 4H), 1.43 (s, 9H ) , 1.14-0.86 (m, 10H), 0.93 (d, J= 7 Hz, 3H),  0.87 (d, J= 7 Hz, 3H), 0.04 (s, 9H), 0.02 (s, 9H).
【０１６３】
f) 化合物15gの合成:
粗ペンタぺプチド15f (約0.212ミリモル)を4N HCl/ジオキサン溶液(2.5 ml) 40分間、RTで処理し、得られた塩酸塩を化合物15e (2.5時間のカップリング時間に変更した)に記載されたようにNMM (93 ml、0.848ミリモル)及びTBTU (81.7 mg、0.254ミリモル)でBoc-Asp(OTMSE)-OH (77.8 mg、0.233ミリモル)へカップリングした。粗ヘキサぺプチド15gをアイボリーの泡状物(278 mg、0.212ミリモル)として得た。MS (FAB)  1237.5 (MH+)  1259(MNa+).
【０１６４】
g) 化合物15hの合成:
粗ヘキサぺプチド15g (約0.2ミリモル)を2.5 mlの4N HCl/ジオキサン溶液でRTにおいて40分間処理した。濃縮乾固してアミン塩酸塩を白色固形物として得た。粗塩酸塩を無水DMF (2.5 ml)に溶解し、ピリジン(377 l、4.66ミリモル)及び酢酸無水物(378 l、4.01ミリモル)で順次処理した。反応混合液をRTで一晩乾固してから食塩水へ注ぎ入れ、EtOAc (3×)で抽出した。合わせた有機層を10% クエン酸水溶液(2×)、NaHCO3飽和溶液(2×)、水(2×)、及び食塩水(1×)で順次洗浄した。有機層を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、蒸発乾固した。泡状残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離剤: ヘキサン: EtOAc; 3:7)で精製してアセチル化ヘキサぺプチド15hをオフホワイトの泡状物として得た(78.5 mg、3工程後の収率31% )。MS (FAB)  1179.6 (MH+)  1201.5 (MNa+).  1H NMR (CDCl3)    8.11-8.09 (m, 1H), 7.86-7.79 (m, 2H), 7.55-7.41 (m, 5H), 7.28 (s, 1H), 7.02-6.96 (m, 2H), 6.70-6.68 (m, 1H), 5.13-5.10 (m, 1H), 4.96-4.91 (m, 2H), 4.58-4.41 (m, 4H), 4.22-4.08 (m, 8H), 3.77 (dd, J= 10.5, J'= 5 Hz, 1H), 3.09 (dd, J= 18, J'= 4 Hz, 1H), 2.76 (dd, J= 17.5, J'= 8 Hz, 1H), 2.51-2.20 (m, 3H), 2.12-2.08 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.73-1.53 (m, 8H), 1.27-1.09 (m, 7H), 1.01-0.85 (m, 8H), 0.98 (d, J= 6.5 Hz, 3H), 0.97(d, J= 6 Hz, 3H), 0.04 (s, 9H), 0.03 (s, 9H), 0.01 (s, 9H).
【０１６５】
h) 化合物215の合成:
アセチル化ヘキサぺプチド15h (76.5 mg、0.065ミリモル)を水性THF (2 ml)に溶解し、TBAF溶液(1M/THF; 389 l、0.389ミリモル)を添加し、混合液をRTで16時間撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、残留物を氷酢酸に溶解し、ミリポア(Millipore)(登録商標): ミレックス(Millex)(登録商標)-HV 0.45 mフィルターユニットでろ過し、緩衝化ワットマンパーチシル(Whatman Partisil)(登録商標) 10-ODS-3 (2.2×50cm) C18逆相カラムへ注入した。精製プログラム:  直線勾配、15 ml/min、 230 nm、5% Aのプログラム10分間、5-30% A 10分間、30% A 10分間、30-60% A 90分間A:0.06% TFA/CH3CN; B:0.06% TFA/H2O。画分を分析用 HPLCで分析した。集めた生成物を凍結乾燥してヘキサぺプチド酸.215を無定形固形物として得た(26.9 mg; のテトラブチルアンモニウム塩を41重量%含有する、収率28%)。MS (FAB)  879.4 (MH+) 901.3 (MNa+).  該テトラブチルアンモニウム塩を除去するために、上記生成物(約18 mg)をEtOAcに溶解し、10% HCl (2×)で洗浄した。EtOAc層を蒸発してから水と凍結乾燥して塩を含まない生成物を無定形固形物として得た(3.8 mg 、収率36%).  1H NMR (DMSO-d6)  8.39 (s, 1H), 8.10-7.81 (m, 7H), 7.57-7.45 (m, 4H), 5.07-4.87 (m, 2H), 4.55-4.00 (m, 7H), 3.76-3.71 (m, 1H), 2.67-2.62 (m,1H), 2.33-2.10 (m, 3H), 2.05-1.42 (m, 8H), 1.79 (s, 3H) , 1.38-0.71 (m, 1H), 0.89 (d, J= 6.68 Hz, 3H), 0.86 (d, J=6.36 Hz, 3H).
実施例16
化合物214 (表2)の合成:
【０１６６】
【化８０】
0004354632.tif 000058
【０１６７】
化合物214の合成については、P2断片を導入するためにBoc-4(R)-(ナフタレン-2-イルメトキシ)プロリンを用い側鎖カルボン酸残基に異なる保護基を用いて実施例15に記載された手順を行った。
合成を次に記載する。
【０１６８】
【化８１】
0004354632.tif 000059
【０１６９】
a) 化合物16bの合成:
0oCにおいて、臭化ベンジル(5.74 ml、48.3ミリモル)をアセトニトリル(200 ml)中Boc-ノルバリン(16a)(10.0 g、46.0ミリモル)とDBU (7.57 ml、50.6ミリモル)の混合液に添加した。RTで20時間撹拌した後、その溶液を濃縮し、残留物をエーテルに溶解した。有機溶液を10% クエン酸水溶液(2×)、NaHCO3飽和水溶液(2×)及び食塩水(1×)で順次洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、濃縮して所望のベンジルエステル16bを無色の油状物として得た(13.7 g、収率97%)。  1H NMR (CDCl3)  7.40-7.32 (m, 5H), 5.16 (dd, J = 26.7, J'= 12.4 Hz, 2H), 4.99 (d, J = 7.9 Hz, 1H),  4.35-4.32 (m, 1H), 1.82-1.73 (m, 1H), 1.66-1.57 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.41-1.32 (m, 2H), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
【０１７０】
b、c、d、e、f、g) 化合物16hの合成:
上記Boc-Nvaベンジルエステル(121 mg、0.48ミリモル)を実施例7と同様の反応順序に供した。しかしながら、P2 (工程b)の導入については、 Boc-4(R)-(ナフタレン-2-イルメトキシ)プロリンを用いた。また、P5 (工程e)及びP6 (工程f)の導入については、対応するBoc-D-Glu-OH及びBoc-Asp-OH残基をカルボン酸側鎖のベンジルエステルとして保護した。
【０１７１】
h) 化合物214の合成:
エタノール(3 ml)ヘキサぺプチド16h (約0.210ミリモル)の溶液に10%パラジウム/木炭(10 mg)と酢酸アンモニウム(10 mg)を添加した。混合液を水素雰囲気下で5時間撹拌してからミリポア(Millipore)(登録商標): ミレックス(Millex)(登録商標)-HV 0.45 mフィルターユニットでろ過し、平衡化ワットマンパーチシル(Whatman Partisil)(登録商標)10-ODS-3 (2.2×50 cm) C18逆相カラムへ注入した。精製プログラム: 直線勾配、15 ml/分、 230 nm、5〜50% A 60分間 A: 0.06% TFA/CH3CN; B: 0.06% TFA/H2O。画分をHPLCで分析した。集めた生成物を凍結乾燥して214を白色固形物として得た(20 mg、0.02ミリモル)。  MS (FAB)  895.5 (MH+).  1H NMR (CDCl3)   8.16 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.91-7.88 (m, 3H), 7.85 (s, 1H), 7.77 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.51-7.46 (m, 3H), 4.70 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 12 Hz, 1H), 4.53-4.45 (m, 2H), 4.33-4.10 (m, 6H), 3.69 (dd, J = 19, J'= 4.4 Hz, 1H), 2.66-2.60 (m, 1H), 2.49-2.43 (m, 1H), 2.21-2.18 (m, 3H), 2.07-1.94 (m, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.76-1.33 (m, 10H), 1.04-0.86 (m, 15H).
実施例17
化合物221 (表2)の合成:
【０１７２】
【化８２】
0004354632.tif 000060
【０１７３】
モノベンジルコハク酸(Bischoff, V.ら, Chem.Ber. (1902), 35, 4078に記載されたように調製した)(27 mg、0.134ミリモル)をアセトニトリル(2 ml)中でTBTU (52 mg、0.160ミリモル)とNMM (47 mg、0.469ミリモル)と共に5分間撹拌した。この混合液に適切なテトラぺプチドの塩酸塩(シクロヘキシルグリシンの代わりにイソロイシン及び4(R)-(ナフタレン-2-イルメトキシ)プロリンの代わりに4(R)-(ナフタレン-1-イルメトキシ)プロリン(97.0 mg、0.134ミリモル)を用いる以外は化合物16eに記載されたように調製した)を添加した。混合液をRTで2.5時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、混合液を10%クエン酸水溶液(2×)、NaHCO3飽和水溶液(2×)及び食塩水(1×)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、濃縮して保護テトラぺプチドを黄色油状物として得た。
【０１７４】
上記化合物(約0.134ミリモル)をエタノール(3 ml)に溶解し、酢酸アンモニウム(10 mg)と20%水酸化パラジウム/活性炭(30 mg)を添加した。混合液を水素1気圧下で18時間撹拌してからミリポア(Millipore)(登録商標): ミレックス(Millex)-HV 0.45 mフィルターユニットでろ過し、平衡化ワットマンパーチシル(Whatman Partisil) 10-ODS-3 (2.2×50 cm) C18逆相カラムに注入した。精製プログラム: 線状勾配、15 ml/min、 230 nm、5% A、10分間、5-60% A 60分間(A: 0.06% TFA/CH3CN; B: 0.06% TFA/H2O)。画分をHPLCで分析した。集めた生成物を凍結乾燥して221を白色固形物(21 mg)を得た。MS (FAB) 683 (MH+).   1H NMR (DMSO-d6)   8.12 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.07-8.03 (m, 1H), 7.96-7.81 (m, 4H), 7.59-7.51 (m, 3H), 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.90 (d, J =8 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.36-4.31 (m, 2H), 4.24-4.12 (m, 3H), 3.74-3.68 (m, 1H), 2.43-2.31 (m, 4H), 2.24-2.18 (m, 1H), 2.01-1.92 (m, 2H), 1.67-1.51 (m, 3H), 1.42-1.32 (m, 3H), 1.14-0.96 (m, 1H), 0.93-0.67 (m, 15H).
実施例18
次の説明は、QがCH2C(O)である式Iの化合物の例である。
化合物413 (表4)の調製
【０１７５】
【化８３】
0004354632.tif 000061
【０１７６】
【化８４】
0004354632.tif 000062
【０１７７】
化合物18b
1) 室温においてDCM (160 ml)中シクロヘキシル酢酸(18a)(8g、56.25ミリモル)へ塩化オキサル(6.4 ml、73.14ミリモル)及び2滴のDMFを添加した。反応混合液を室温で1時間撹拌してから減圧下で濃縮して塩化シクロヘキシルアセチルを得た。
2) キラル補助剤、(4S)-(-)-4-イソプロピル-2-オキサゾリジン(7.63g、59.06ミリモル)をTHF (200 ml)に溶解し、78ーCに冷却した。ヘキサン(36.9 ml、59.06ミリモル)中N-ブチルリチウム(1.6M)を徐々に添加した(10分間)。混合液を78ーCで30分間撹拌した(ゲルを生じた)。上記塩化シクロヘキシルアセチルをTHF (50 ml)中78ーCで添加した。反応混合液を78ーCで30分間、次に0ーCで1時間撹拌した。NH4Cl水溶液(16 ml)を添加することにより反応液を急冷した。反応混合液を減圧下で濃縮した。Et2O (300 ml)を添加した。有機相を分離し、10% クエン酸水溶液(2×200 ml)、NaHCO3飽和水溶液(2×200 ml)及び食塩水(200 ml)で洗浄し、乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、40-60、60×100 mm、9/1  8/2、ヘキサン/EtOAc)で精製して化合物18bを無色の油状物(11.3 g、収率79%)として得た。
1H NMR (CDCl3)  4.40-4.36 (m, 1H), 4.20 (dd, J = 8.3Hz, J=9.1Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 2.9Hz, 9.1Hz, 1H), 2.86 (dd, J = 6.4Hz, 15.7Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 7.1Hz, 15.7Hz, 1H), 2.35-2.27 (m, 1H), 1.83-1.76 (m, 1H), 1.70-1.57 (m, 5H), 1.26-0.90 (m, 5H), 0.85 (d, J = 7.0Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.7Hz, 3H).
【０１７８】
化合物18c
78ーCにおいてTHF (125 ml)化合物18b (11.3 g、44.68ミリモル)の溶液へNaHMDS溶液(1M/THF、49.2 ml、49.15ミリモル)を添加した。反応混合液を78ーCで1.5時間撹拌した。THF (25 ml)中tert-ブチルブロモアセテート(8.67 ml、53.62ミリモル)を78ーCで添加した。混合液をその温度で3時間撹拌した。NH4Cl飽和水溶液(33 ml)を徐々に添加した。冷却浴を取り除き、混合液を室温で10分間撹拌した。THFを除去した。EtOAcを添加した(200 ml)。有機相を分離し、NaHCO3飽和水溶液(200 ml)、H2O (200 ml)、1N HCl水溶液(200 ml)及び食塩水(200 ml)で順次洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をEt2Oで摩砕することにより精製して化合物18cを白色固形物(12.65g、収率77%)として得た。
1H NMR (DMSO-d6)  4.61-4.53 (m, 3H), 4.27-4.25 (m, 1H), 2.84-2.66 (m, 2H), 2.55-2.41 (m, 1H), 1.89-1.76 (m, 6H), 1.58 (s, 9H), 1.35-1.31 (m, 4H), 1.14-1.04 (m, 7H).
【０１７９】
化合物18d
THF/H2O混合液(3/1混合物、495 ml/165 ml)中化合物18c (12.2 g、33.28ミリモル)の氷冷溶液にH2O2 (30%、15.1 ml、133.1ミリモル)を添加し、次にLiOH-H2O (2.79 g、66.56ミリモル)を徐々に添加した。反応混合液を0ーCで1時間、次にRTで一晩撹拌した。混合液を0ーCまで冷却し、1.5N Na2SO3水溶液を徐々に添加して過剰の過酸化物(KI紙でモニターした)を分解した。混合液を減圧下で濃縮し、残留水溶液をDCM (2×150 ml)で洗浄した。水層を10%クエン酸水溶液で酸性にした。混合液をEtOAc (3×200 ml)で抽出した。合わせた有機相を食塩水(200 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。化合物18dを無色の油状物として得た(8.38g、収率98%)。
1H NMR (CDCl3)  2.71-2.66 (m, 1H), 2.59 (dd, J = 10.8Hz, 16.0Hz, 1H), 2.36 (dd, J = 3.8Hz, 16.0Hz, 1H), 1.78-1.57 (m, 6H), 1.41 (s, 9H), 1.30-0.98 (m, 5H).
【０１８０】
化合物18f
1) 化合物18eの対応するBoc誘導体(1.63 g、2.74ミリモル)をHCl 4N/ジオキサン(14 ml、54.91ミリモル)でRTにおいて1時間処理した。反応混合液を減圧下で濃縮した。5% Na2CO3水溶液(25 ml)を残留物に添加し、得られた溶液を5分間激しく撹拌した。EtOAcを添加した(75 ml)。得られた2相を分離した。有機相を食塩水(50 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮して18eを得、そのまま次の工程で用いた。
2) RTにおいてDMF (5 ml)中アミノトリぺプチドへDMF (5 ml)中化合物18d (739 mg、288ミリモル)、次に、DIPEA (1.43 ml、8.24ミリモル)及びTBTU (502 mg、2.88ミリモル)を添加した。反応混合液をRTで一晩撹拌した。EtOAcを添加した(125 ml)。有機相を分離し、NaHCO3飽和水溶液(100 ml)、H2O (100 ml)及び食塩水(100 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、40-60、40×125mm、6/4  5/5ヘキサン/EtOAc)で精製してtert-ブチルエステル化合物18fを白色泡状物(1.18g、収率59%)として得た。
1H NMR (CDCl3)  8,06 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.55-7.40 (m, 4H), 7.35 (s, 1H), 6.28 (d, J = 8.9Hz, 1H), 5.86-5.79 (m, 1H), 5.24 (dd, J = 1.6Hz, 17.2Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 1.3Hz, J = 10.5Hz, 1H), 4.98 (ABq, v=18.7Hz, J = 12.1Hz, 2H), 4.67-4.51 (m, 4H), 4.41-4.38 (m, 1H), 3.99 (dd, J = 3.8Hz, 10.8Hz, 1H), 2.64-2.59 (m, 2H), 2.42-2.38 (m, 2H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.68-1.53 (m, 9H), 1.43-1.41 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.15-1.04 (m, 4H), 0.97-0.91 (m, 8H).
【０１８１】
化合物18h
MeOH (24 ml)中市販の3-[ベンジル-2-メトキシカルボニルエチル)アミノ]プロピオン酸メチルエステル(18g)(2 g、7.16ミリモル)へパラジウム触媒(Pd/C 10%、500 mg、25 % w/w)を添加した。反応混合液を窒素雰囲気(バルーン)下で撹拌した。混合液をケイソウ土でろ過し、フィルターパッドをMeOH (20 ml)で洗浄した。MeOH (ろ過＋洗浄)を蒸発して1.2g (収率89%)の化合物18hを薄黄色の油状物として得た。この生成物をそのまま次の工程で用いた。
【０１８２】
化合物18i
1) t-ブチルエステル化合物18f (1.18 g、1.62ミリモル)をジオキサン(8.5 ml、32.4モル)中4N HClでRTにおいて6時間処理した。混合液を減圧下で濃縮してからベンゼン/Et2Oで共蒸発して1.04 gの対応する酸をベージュの泡状物(収率95%)として得た。
2) RTにおいてDMF (1 ml)中その後者の酸(200 mg、0.29ミリモル)にDMF (2 ml)中アミン(化合物18h、59 mg、0.31ミリモル)、次に、DIPEA (154 l、0.89ミリモル)及びTBTU (100 mg、0.31ミリモル)を添加した。反応混合液をRTで72時間撹拌した。EtOAc (125 ml)を添加した。有機相を分離し、NaHCO3飽和水溶液(75 ml)、H2O (75 ml)及び食塩水(75 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、40-60、20×100 mm、8/2 EtOAc/ヘキサン)で精製して化合物18iを黄色油状物として得た(82 mg、収率33%).
MS (ESI) 869.3 (M+Na)+, 845.4 (M-H)-.
【０１８３】
化合物413
1M NaOH水溶液(774 l、0.774ミリモル)をTHF/MeOH混合液 (1/1、各1 ml)の混合液中化合物18i (82 mg、0.097ミリモル)の溶液に添加した。反応混合液をRTで18時間撹拌した。H2Oを添加した(15 ml)。水相を分離し、DCM (3×15 ml)で洗浄した。1N HCl水溶液を添加することにより水相を酸性(pH 3)にした。混合液をEtOAc (3ラ15 ml)で抽出した。有機相を食塩水(25 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物を分取用HPLC (5%  53% MeCN、60分間)で精製して化合物413を白色の凍結乾燥固形物として得た(31 mg、41% )。
MS (ESI) 779.3 (M+H)+, 801.3 (M+Na)+, 777.3 (M-H)-1H NMR (DMSO-d6)  8.38 (S, 1H), 8.06 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.57-7.44 (m, 5H), 5.01 (d, J = 12.1Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.1Hz, 1H), 4.35-4.31 (m, 2H), 4.25 (dd, J = 7.9Hz, 8.3Hz, 1H), 4.18 (d, J = 11.1Hz, 1H), 3.80-3.49 (m, 3H), 3.37-3.34 (m, 2H), 2.63-2.61 (m, 2H), 2.56-2.52 (m, 1H), 2.39-2.35 (m, 2H), 2.25-2.20 (m, 2H), 2.05-1.91 (m, 2H), 1.62-1.59 (m, 1H), 1.41-1.22 (m, 5H), 0.96-0.73 (m, 16H).
【０１８４】
実施例19
組換えHCV NS3プロテアーゼ放射分析
a) 組換えHCV NS3プロテアーゼ1b型のクローニング、発現及び精製
HCV感染した患者からの血清を外部の共同研究を通じて入手した(Bernard Willems MD, Hopital St-Luc, Montr饌l, Canada ; Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Sant  Publique du Qu饕ec, Ste-Anne de Bellevue, Canada)。HCVゲノムの遺伝子操作した全長cDNA鋳型を、血清RNAの逆転写PCR (RT-PCR)によって得られたDNA断片から他の遺伝子型1b株間の相同性に基づいて選択された特定のプライマーを用いて構築した。全ゲノム配列の決定からの遺伝子型1bはSimmondsら(J. Clin. Microbiol. (1993), 31, 1493-1503.)の分類に従ってHCV単離物に帰属した。非構造領域のアミノ酸配列、NS2-NS4Bは、93%より多くがHCV遺伝子型1b (BK、JK及び483単離物)と同じであり、88%がHCV遺伝子型1a (HCV-1単離物)と同じであることがわかった。ポリタンパク質前駆体をコードしているDNA断片(NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B)をPCRによって作成し、真核発現ベクターへ導入した。過渡的トランスフェクション後、HCV NS3プロテアーゼによって仲介されたポリタンパク質プロセシングが成熟NS3タンパク質の存在によってウェスタンブロット分析を用いて示された。成熟NS3タンパク質はNS3プロテアーゼを不活性化する成熟S1165Aを含むポリタンパク質前駆体の発現により見られず、HCV NS3プロテアーゼの機能性が確認された。
【０１８５】
組換えHCV NS3プロテアーゼ(アミノ酸1027〜1206)をコードしているDNA断片をpET11d細菌発現ベクター中でクローン化した。E. coli BL21(DE3)pLysS中でのNS3プロテアーゼ発現を、1 mM IPTGと22Cで3時間インキュベートすることにより誘導した。典型的な発酵(18リットル)により約100 gの湿った細胞ペーストが得られた。細胞を25 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10%グリセロール(v/v)、1 mM EDTA、0.01% NP-40からなる溶解緩衝液(3.0 ml/g)に再懸濁し、-80Cで貯蔵した。細胞を解凍し、5 mM DTTを添加した後にホモジェナイズした。ホモジェネートに塩化マグネシウムとDNaseを各々最終濃度20 mM及び20 g/mlで添加した。4Cで25分インキュベートした後、ホモジェネートを音波処理し、15000×g、4Cで30分間遠心分離した。次に、上清のpHを1Mリン酸ナトリウム溶液を用いて6.5に調整した。
【０１８６】
国際出願第95/22985号(この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)に記載された2工程精製手順に更にゲルろ過クロマトグラフィー工程を加えた。概要としては、細菌抽出液からの上清を緩衝液A (50 mMリン酸ナトリウム、pH 6.5、10%グリセロール、1 mM EDTA、5 mM DTT、0.01% NP-40)に流速2 ml/minで予め平衡化したSPハイトラップ(HiTrap)(登録商標)カラム(Pharmacia)に充填した。次に、カラムを0.15 M NaClを含む緩衝液Aで洗浄し、 10カラム容量の0.15〜0.3 M NaCl直線勾配を加えることによりプロテアーゼを溶離した。NS3プロテアーゼ含有画分をプールし、NaClの最終濃度0.1 Mまで希釈した。酵素を、更に緩衝液B (25 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10%グリセロール、5 mM DTT、0.01% NP-40)で平衡化したハイトラップ(HiTrap)(登録商標)ヘパリンカラムで精製した。試料を流速3 ml/minで充填した。次に、カラムを0.15 M NaClを含む緩衝液Bで流速1.5 ml/minにおいて洗浄した。2工程の洗浄を0.3又は1M NaClを含む緩衝液Bの存在下に行った。プロテアーゼを0.3M NaCl洗浄液に回収し、緩衝液Bで3倍に希釈し、ハイトラップ(HiTrap)(登録商標)ヘパリンカラムに再び加え、0.4 M NaClを含む緩衝液Bで溶離した。最後に、NS3プロテアーゼ含有画分を0.3 M NaClを含む緩衝液Bで平衡化したスーパーデックス(Superdex)75ハイロード(HiLoad)(登録商標)16/60カラム(Pharmacia)に加えた。プールした画分から得られたHCV NS3プロテアーゼの純度はSDS-PAGEにより95%より大きいことがわかり、続いて濃度計測分析を行った。
酵素を-80ーCで貯蔵し、氷上で解凍し、使用直前に希釈した。
【０１８７】
b) 組換えHCV NS3プロテアーゼ放射分析
HCV NS3プロテアーゼ放射分析に用いられる基質、DDIVPC-SMSYTWをシステイン残基とセリン残基間で酵素により切断する。配列DDIVPC-SMSYTWは、P2のプロリンがシステイン残基に置き換えられたNS5A/NS5B天然切断部位に対応している。ぺプチド基質DDIVPC-SMSYTWとトレーサービオチンDDIVPC-SMS[125I-Y]TWを阻害剤の不在又は存在下に組換えNS3プロテアーゼとインキュベートした。アビジン被覆アガロースビーズを分析混合液に加え、続いてろ過することにより基質を産物から分離した。ろ液(阻害剤を含む又は含まない)中に見られるSMS[125I-Y]TW産物の量は基質変換％と阻害％の計算を可能した。
【０１８８】
A. 試薬
トリス及びトリス-HCl(UltraPure)をライフテクノロジーズ(Life Technologies)から入手した。グリセロール(UltraPure)、MES及びBSAをシグマ(Sigma)(登録商標)から購入した。TCEPをピアス(Pierce)、DMSOをアルドリッヒ(Aldrich)(登録商標)及びNaOHをアナケミア(Anachemia)(登録商標)から入手した。
分析緩衝液: 50 mMトリス-HCl、pH 7.5、30% (w/v)グリセロール、2% (w/v) CHAPS、1 mg/ml BSA、1 mM TCEP (TCEPは1 M保存溶液/水から使用直前に添加した)。
基質: DDIVPC-SMSYTW、25 M最終濃度(酸化を避けるために-20ーCで貯蔵した2 mM保存溶液/DMSO)。
トレーサー: モノヨウ素化還元基質(ビオチン-DDIVPC-SMS[125I-Y]TW) ( 1 nM最終濃度)。
HCV NS3プロテアーゼ1b型、25 nM最終濃度(保存溶液/50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10%グリセロール、300 mM NaCl、5 mM DTT、0.01% NP-40)。
【０１８９】
B. プロトコール
96ウェルポリプロピレンプレートで分析を行った。各ウェルは下記成分を含有した。
・20 l基質/トレーサー、分析緩衝液中;
・10 l ア 阻害剤、20% DMSO/分析緩衝液中;
・10 l NS3プロテアーゼ1b。
ブランク(阻害剤も酵素も含まない)及び対照(阻害剤を含まない)を同じ分析プレートで調製した。
酵素溶液を添加することにより酵素反応を開始し、分析混合液を23ーCで60分間弱い撹拌下でインキュベートした。20 lの0.025 N NaOHを添加して酵素反応を急冷した。
20 lのアビジン被覆アガロースビーズ(ピアス(Pierce)(登録商標)から購入した)をミリポア(Millipore)(登録商標)MADP N65ろ過プレートに加えた。急冷した分析混合液をろ過プレートへ移し、23ーCで60分間弱い撹拌下でインキュベートした。
【０１９０】
プレートをミニポア(Millipore)(登録商標)マルチスクリーン真空マニホールドろ過(MultiScreen Vacuum Manifold Filtration)装置を用いてろ過し、40 lのろ液を60 lのシンチレーション液/ウェルを含む不透明な96ウェルへ移した。
ろ液をパッカード(Packard)(登録商標)トップカウント(TopCount)機器により125I-液体プロトコールを用いて1分間計数した。阻害% を下記式により計算した。
100-[(数値inh-数値blank)/(数値ctl-数値blank)×100]
ヒル(Hill)モデルによる非直線カーブフィットを阻害-濃度データにあてはめ、50% 有効濃度(IC50)をSASソフトウェア(統計ソフトウェアシステム; SAS社、ノースカロライナ州ケアリー)を用いることにより計算した。
【０１９１】
実施例20
組換えHCV NS3プロテアーゼ/NS4A補因子ぺプチド放射分析
酵素を実施例19に記載されたプロトコールに従ってクローン化、発現及び調製した。酵素を-80ーCで貯蔵し、氷上で解凍し、NS4A補因子ぺプチドを含む分析緩衝液に用いる直前に希釈した。
NS3プロテアーゼ/NS4A補因子ぺプチド放射分析に用いる基質、DDIVPC-SMSYTWをシステイン残基とセリン残基間で酵素により切断する。配列DDIVPC-SMSYTWはP2のプロリンがシステイン残基に置き換えられたNS5A/NS5B天然切断部位に対応いている。ぺプチド基質DDIVPC-SMSYTWとトレーサービオチン-DDIVPC-SMS[125I-Y]TWを組換えNS3プロテアーゼとNS4Aぺプチド補因子KKGSVVIVGRIILSGRK (酵素: 補因子のモル比 1:100)と阻害剤の不在又は存在下にインキュベートした。アビジン被覆アガロースビーズを分析混合液に加え、続いてろ過することにより基質を産物から分離した。ろ液中に見られるSMS[125I-Y]TW産物の量は基質変換％と阻害％の計算を可能にした。
【０１９２】
A. 試薬
トリス及びトリス-HCl(UltraPure)をライフテクノロジーズ(Life Technologies)から入手した。グリセロール(UltraPure)、MES及びBSAをシグマ(Sigma)(登録商標)から購入した。TCEPをピアス(Pierce)、DMSOをアルドリッヒ(Aldrich)(登録商標)及びNaOHをアナケミア(Anachemia)(登録商標)から入手した。
分析緩衝液: 50 mMトリス-HCl、pH 7.5、30% (w/v)グリセロール、1 mg/ml BSA、1 mM TCEP (TCEPは1 M保存溶液/水から使用直前に添加した)。
基質: DDIVPCSMSYTW、25 M最終濃度(酸化を避けるために-20ーCで貯蔵した2 mM保存溶液/DMSO)。
トレーサー: モノヨウ素化還元基質(ビオチンDDIVPC SMS[125I Y]TW) (〜1 nM最終濃度)。
HCV NS3プロテアーゼ1b型、25 nM最終濃度(保存溶液/50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10%グリセロール、300 mM NaCl、5 mM DTT、0.01% NP-40)。
NS4A補因子ぺプチド: KKGSVVIVGRIILSGRK, 2.5 M最終濃度(-20ーCで貯蔵した2 mM保存溶液/DMSO)。
【０１９３】
B. プロトコール
96ウェルポリプロピレンプレートで分析を行った。各ウェルは下記成分を含有した。
・20 l基質/トレーサー、分析緩衝液中;
・10 l ア 阻害剤、20% DMSO/分析緩衝液中;
・10 l NS3プロテアーゼ1b/NS4補因子ぺプチド(モル比1:100)。
ブランク(阻害剤も酵素も含まない)及び対照(阻害剤を含まない)を同じ分析プレートで調製した。
酵素/NS4Aぺプチド溶液を添加することにより酵素反応を開始し、分析混合液を23ーCで60分間弱い撹拌下でインキュベートした。10 lの0.5 N NaOHを添加し、10 lの1 M MES、pH 5.8を添加して酵素反応を急冷した。
20 lのアビジン被覆アガロースビーズ(ピアス(Pierce)(登録商標)から購入した)をミリポア(Millipore)(登録商標)MADP N65ろ過プレートに加えた。急冷した分析混合液をろ過プレートへ移し、23ーCで60分間弱い撹拌下でインキュベートした。
プレートをミニポア(Millipore)(登録商標)マルチスクリーン真空マニホールドろ過(MultiScreen Vacuum Manifold Filtration)装置を用いてろ過し、40 lのろ液を60 lのシンチレーション液/ウェルを含む不透明な96ウェルへ移した。
ろ液をパッカード(Packard)(登録商標)トップカウント(TopCount)機器により125I-液体プロトコールを用いて1分間計数した。
IC50値を実施例19と同じ方法で計算した。
【０１９４】
実施例21
特異性分析
多種のセリンプロテアーゼ: ヒト白血球エラスターゼ、ブタ膵エラスターゼ及びウシ膵-キモトリプシン及び1種のシステインプロテアーゼ: ヒト肝カテプシンBに対する化合物の特異性を求めた。全ての例において各酵素に特異的な比色p-ニトロアニリド(pNA)基質を用いた96ウェル型式プロトコールを用いた。各分析は、30Cにおける1時間酵素-阻害剤プレインキュベーションに続いて基質の添加及びUVサーモマックス(Thermomax)(登録商標)マイクロプレートリーダーにより測定した変換率 30%までの加水分解が含められた。基質濃度をKM に比べてできるだけ低く保ち基質の競合を減少させた。化合物濃度は効力によって300〜0.06 Mに変化した。各分析の最終条件は次の通りであった。
50mMトリス-HCl pH 8、0.5 M Na2SO4、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、3% DMSO、0.01% トゥイーン20と;
[100 M Succ-AAPF-pNAと250 pM -キモトリプシン]、[133 M Succ-AAA-pNAと8 nMブタエラスターゼ]、[133 M Succ-AAV-pNAと8 nM白血球エラスターゼ]; 又は
[100 mM NaHPO4 pH 6、0.1 mM EDTA、3% DMSO、1mM TCEP、0.01% トゥイーン20、30 M Z-FR-pNA及び5 nMカテプシンB (使用前に保存酵素を20 mM TCEPを含有する緩衝液で活性化した)]。
【０１９５】
代表例としてブタ膵エラスターゼについて次に概要を述べる。
ポリスチレン平底96ウェルプレートにバイオメック(Biomek)(登録商標)液体ハンドラー(Beckman)を用いて添加した。
・40 lの分析緩衝液(50 mMトリス-HCl pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA);
・20 lの酵素溶液(50 mMトリス-/HCl pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02%トゥイーン20, 40 nMブタ膵エラスターゼ); 及び
・20 lの阻害剤溶液(50 mMトリス-HCl、pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02%トゥイーン20、1.5 mM-0.3 M阻害剤、15% v/v DMSO)。
30Cで60分間プレインキュベートした後、20 lの基質溶液(50 mMトリス-HCl、pH 8、0.5 M Na2SO4 、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、665 M Succ-AAA-pNA) を各ウェルに添加し、反応液を更に30Cで60分間インキュベートした後に吸光度をUVサーモマックス(Thermomax)(登録商標)プレートリーダーで読取った。ウェルの列を対照(阻害剤を含まない)とブランク(阻害剤も酵素も含まない)に割り振った。
阻害剤溶液の2倍連続希釈を別個のプレートについて液体ハンドラーにより50 mMトリス-HCl pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02%トゥイーン20、15% DMSOを用いて行った。同様の方法で他の全ての特異性分析を行った。
阻害%を下記式を用いて計算した。
[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))]×100
ヒル(Hill)モデルによる非直線カーブフィットを阻害-濃度データにあてはめ、50% 有効濃度(IC50)をSASソフトウェア(統計ソフトウェアシステム; SAS社、ノースカロライナ州ケアリー)を用いることにより計算した。
【０１９６】
実施例22
化合物表
下記の表は、本発明の代表的な化合物のIC50値を示すものである。
下記の略号を用いる。
IC50: 実施例11のNS3プロテアーゼ/NS4A補因子ぺプチド放射分析において50% 阻害を得るために要した濃度; *印の付いた結果は実施例10の組換えHCV NS3プロテアーゼ放射分析において得られたIC50値を示す;
HLE: ヒト白血球エラスターゼ分析において50% 阻害を得るために要した濃度; PPE: ブタ膵エラスターゼ分析において50% 阻害を得るために要した濃度;
その他: 無印の形はウシ膵-キモトリプシン分析において50% 阻害を得るために要した濃度を示す;
** 印の付いた形はヒトカテプシンB分析において50% 阻害を得るために要した濃度を示す; MS: 質量分析データ(FABからのMH+); AAA: ぺプチド回収% で表されたアミノ酸分析データ; Acca: 1-アミノシクロプロピルカルボン酸; Acpe: 1-アミノシクロペンチルカルボン酸; Abu: 2-アミノ酪酸; Chg: シクロヘキシルグリシン(2-アミノ-2-シクロヘキシル酢酸); Hyp: 4(R)-ヒドロキシプロリン; Hyp(4-Bn): 4(R)-ベンジルオキシプロリン; Pip: ピペコール酸(即ち、ホモプロリル); Tbg: tert-ブチルグリシン; Ac: アセチル; Bn: ベンジル; O-Bn: ベンジルオキシ; DAD: 3-カルボキシプロピオニル; DAE: 4-カルボキシブチリル; AlGly: アリルグリシン(2-アミノ-4-ペンテノン酸); thioxoIle: L-チオノイソロイシン; Ph: フェニル; 3I-Ph: 3-ヨードフェニル; 4I-Ph: 4-ヨードフェニル; 2Br-Ph: 2-ブロモフェニル; 3Br-Ph: 3-ブロモフェニル; 4Br-Ph: 4-ブロモフェニル; 1-NpCH2O: ナフタレン-1-イルメトキシ; 2-NpCH2O: ナフタレン-2-イルメトキシ; 3,5-Br2Ph: 3,5-ジブロモフェニル。
【０１９７】
【表２】
0004354632.tif 000063
【０１９８】
【表３】
0004354632.tif 000064
【０１９９】
【表４】
0004354632.tif 000065
【０２００】
【表５】
0004354632.tif 000066
【０２０１】
【表６】
0004354632.tif 000067
【０２０２】
【表７】
0004354632.tif 000068
【０２０３】
【表８】
0004354632.tif 000069
【０２０４】
【表９】
0004354632.tif 000070
【０２０５】
【表１０】
0004354632.tif 000071
【０２０６】
【表１１】
0004354632.tif 000072
【０２０７】
【表１２】
0004354632.tif 000073
【０２０８】
【表１３】
0004354632.tif 000074
【０２０９】
【表１４】
0004354632.tif 000075
【０２１０】
【表１５】
0004354632.tif 000076
【０２１１】
【表１６】
0004354632.tif 000077
【０２１２】
【表１７】
0004354632.tif 000078
【０２１３】
【表１８】
0004354632.tif 000079
【０２１４】
【表１９】
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【０２１５】
【表２０】
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【０２１６】
【表２１】
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【０２１７】
【表２２】
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【０２１８】
【表２３】
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【０２１９】
【表２４】
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【０２２０】
【表２５】
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【０２２１】
【表２６】
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【０２２２】
【表２７】
0004354632.tif 000088