(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄液有核細胞自動分析用システムを用いた骨髄液有核細胞自動分析方法であって、
（１）  骨髄液試料を２つの試料に分配し、
（２）（ｉ）分配した一方の試料を、第１の溶血剤と混合して、前記試料中の赤血球を溶解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を染色に好適な状態にし、少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第１の染色液と混合して染色し、および
（ｉｉ）  分配した他方の試料を、第２の溶血剤と混合し、前記試料中の骨髄系幼若球以外の細胞を損傷させるとともに、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を染色に好適な状態にし、少なくとも、骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第１のグループと、骨髄系幼若球を含む第２のグループとの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第２の染色液と混合して染色し、
（３）  （２）で染色した試料のそれぞれをフローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定し、
（４）（ｉ）  工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を分類計数し、
（ｉｉ）  工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を分類計数し、
（ｉｉｉ）前記骨髄系成熟白血球数と骨髄系幼若球数とから、骨髄系細胞数を算出し、
（５）  赤芽球系細胞数と骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することからなる骨髄液有核細胞自動分析方法。
【請求項２】
さらに、工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、赤芽球系細胞を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数し、かつ赤芽球系細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全赤芽球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、白血球系細胞数と赤芽球系細胞数とから、骨髄有核細胞数を算出することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、白血球系細胞数と赤芽球系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する白血球系細胞の割合を算出することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球を少なくとも２つに分類計数することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系幼若球を少なくとも２つに分類計数することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素が、以下の群：
式（Ｉ）：
【化１】
0004212827.tif 000023
（式中、Ｒ1IおよびＲ2Iは同一または異なって、水素原子、水酸基で置換されていてもよい低級アルキルまたは低級アルキニル基；ＹIおよびＺIは同一または異なって、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩは０、１又は２；ＸI-はアニオンである。）の化合物、
式（ＩＩ）：
【化２】
0004212827.tif 000024
（式中、Ｒ1IIは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IIおよびＲ3IIは同一または異なって、水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4IIは水素原子、アシル基または低級アルキル基；ＺIIは硫黄原子、酸素原子、または低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩＩは０、１又は２；ＸII-はアニオンである。）の化合物、
式（ＩＩＩ）：
【化３】
0004212827.tif 000025
（式中、Ｒ1IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ2IIIは低級アルキル基、Ｒ3IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；ｎIIIは１又は２；ＸIII-はアニオンである。）の化合物、
式（ＩＶ）：
【化４】
0004212827.tif 000026
（式中、Ｒ1IVは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IVはジメチルアミノ基；Ｒ3IVは水素原子又はアミノ基；Ｒ4IVは水素原子、低級アルキル基又はアミノ基；Ｒ5IVは水素原子又はジメチルアミノ基；ＸIV-はアニオン；ＹIVは硫黄又は酸素原子である。）の化合物、
式（Ｖ）：
【化５】
0004212827.tif 000027
（式中、Ｒ1Vは水素原子又は水酸基；Ｒ2Vは水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3Vは水素原子又はスルホン酸基；ＹV+はアルカリ金属イオンである。）の化合物、ならびに
NK-2825、NK-1836、NK-1954、オキサジン750、クリプトシアニン、NK-376、NK-382、NK-2711、NK-138、オキサジン720、LDS730、LD700、ナイルブルー A、ブリリアントグリーン、アイオダイドグリーンおよびマラカイトグリーンからなる群から選択される１以上の色素である請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
第一の溶血剤に含まれる赤血球溶解剤が、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下のｐＨ２．０〜５．０の水溶液である請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
第一の溶血剤が、界面活性剤を含み、界面活性剤が、以下の群：
式（ＶＩ）：
【化６】
0004212827.tif 000028
（式中、Ｒ1VI、Ｒ2VI及びＲ3VIは同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ4VIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ＸVI-はアニオンである。）の化合物、
式（ＶＩＩ）：
【化７】
0004212827.tif 000029
（式中、Ｒ1VIIはＣ8-18のアルキル基；ＸVII-はアニオンである。）の化合物、式（ＶＩＩＩ）：
【化８】
0004212827.tif 000030
（式中、Ｒ1VIIIおよびＲ2VIIIは同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ3VIIIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ｎＶＩＩＩは１又は２である。）の化合物、式（ＩＸ）：
Ｒ1IX−Ｒ2IX−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nIX−Ｈ      （ＩＸ）
（式中、Ｒ1IXはＣ9-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；
Ｒ2IXは式：
【化９】
0004212827.tif 000031
で表される基または−ＣＯＯ−；ｎＩＸは１０〜４０である。）の化合物、ならびにMEGA-8、シュクロースモノカプレート、デオキシ-BIGCHAP、ｎ−オクチル−β−D−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、
CHAPSおよびCHAPSOからなる群から選択される１種類以上の界面活性剤である請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
第一の溶血剤に含まれる界面活性剤濃度が１０〜１００００ｍｇ／Lである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二の溶血剤が、以下の成分：
（１）骨髄球系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤、
（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤、
（３）骨髄系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのアミノ酸および
（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液
を含む請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第1のグループと、骨髄系幼若球を含む第2のグループとの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素が、以下：
式（Ｘ）：
【化１０】
0004212827.tif 000032
（式中、Ｒ1Xは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2X及びＲ3Xは同一または異なって、水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4Xは水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ5Xは水素原子、または置換されてもよい低級アルキル基；ＺXは硫黄原子、酸素原子、又は低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎＸは１又は２；ＸX-はアニオンである。）の化合物、
エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、
エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３およびＴＯ−ＰＲＯ−３
からなる群から選択される１以上の色素である請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
測定する散乱光が、側方散乱光、前方低角散乱光および前方高角散乱光から選択される少なくとも１つである請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
骨髄液試料を第１試料と第２試料に分配するための分配手段と、
前記第１試料を、第１の溶血剤と混合して、前記第１試料中の赤血球を溶解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を染色に好適な状態にし、少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第１の染色液と混合して染色し、第１測定用試料を調製するための第１反応チャンバと、
前記第２試料を、第２の溶血剤と混合して、前記第２試料中の骨髄系幼若球以外の細胞を損傷させるとともに、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を染色に好適な状態にし、少なくとも、骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第１のグループと、骨髄系幼若球を含む第２のグループとの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第２の染色液と混合して染色し、第２測定用試料を調製するための第２反応チャンバと、
前記第１反応チャンバに前記第１の溶血剤および第１の染色液を供給可能であり、前記第２反応チャンバに前記第２の溶血剤および第２の染色液を供給可能な試薬供給手段と、
フローサイトメータと、
前記第１測定用試料および前記第２測定用試料を前記フローサイトメータのフローセルに導入するための測定用試料導入手段と、を備え、
前記フローサイトメータは、前記第１測定用試料がフローセルに導入された場合、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定し、前記第２測定用試料がフローセルに導入された場合、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定し、前記第１測定用試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を分類計数し、前記第２測定用試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を分類計数し、前記骨髄系成熟白血球数と骨髄系幼若球数とから、骨髄系細胞数を算出し、赤芽球系細胞数と骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することからなる骨髄液有核細胞自動分析用システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は骨髄液有核細胞自動分析方法に関し、より詳細には、フローサイトメータを利用した骨髄液有核細胞の分類計数方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、骨髄有核細胞の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な骨髄では白血球系細胞、赤芽球系細胞などの骨髄有核細胞が一定の比率で存在するが、ある種の疾患が原因となり、骨髄有核細胞数、赤芽球系細胞数、白血球系細胞数、骨髄系細胞数等が変化し、結果として骨髄系細胞と赤芽球系細胞の比率（Myeloid/Erythroid比、以下M/E比）が変動することがある。
例えば、骨髄有核細胞数が増加する疾患として、各種急性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などが挙げられ、骨髄有核細胞数が減少する疾患として、再生不良性貧血や低形成性白血病などが挙げられる。また、赤芽球系細胞数が低下するものとしては、赤芽球癆などが挙げられ、白血球系細胞数が増加する疾患として、各種白血病や悪性リンパ腫の白血化などが挙げられる。さらに、貧血の場合には、赤芽球系細胞が増加する。また、Ｍ／Ｅ比が増加する疾患として、各種白血病や悪性リンパ腫の白血化などが挙げられ、Ｍ／Ｅ比が減少する疾患としては、無顆粒症や各種貧血などが挙げられる。特に急性白血病では、ＦＡＢ分類に従って判定が行われており、骨髄有核細胞数、Ｍ／Ｅ比が使われている。このように骨髄有核細胞、骨髄系細胞、赤芽球系細胞を分類計数し、Ｍ／Ｅ比を求めることは、疾患同定、造血器細胞産生能などを調べる上で極めて有用である。
【０００３】
従来、骨髄に含まれる各種の成分の分類計数を行うには、骨髄の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。
一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動血球分類計数装置が提供されている。例えばリンパ系白血球、骨髄系成熟白血球および脊髄系幼若球を分類計数する方法として、幼若白血球以外に損傷を与えた後に幼若白血球以外の損傷された成熟白血球を選択的に染色する蛍光色素を利用する方法が特開平１０−２０６４２３号に開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この方法では、骨髄系細胞を分類計数することはできるが、赤芽球系細胞を分類計数することができないので、別の方法で赤芽球系細胞を測定し、その結果を用いて、Ｍ／Ｅ比を求めることが必要であった。
従って、Ｍ／Ｅ比を求めるための簡便で精度の高い方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、同一の骨髄液試料を少なくとも２つに分配し、それぞれ試料を溶血処理および染色して、赤芽球系細胞数および骨髄系細胞数を同時に測定し、その結果を用いることにより高精度で簡便にＭ／Ｅ比を得ることが可能な骨髄液有核細胞自動分析方法を提供する。
詳細には、（１）  骨髄液試料を２つの試料に分配し、
（２）（ｉ）分配した一方の試料を、第一の溶血剤と混合して、前記試料中の赤血球を溶解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を染色に好適な状態し、少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第１の染色液と混合して染色し、および
（ｉｉ）  分配した他方の試料を、第二の溶血剤と混合し、前記試料中の骨髄系幼若球以外の細胞を損傷させるとともに、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を染色に好適な状態にし、少なくとも、骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第1グループと、骨髄系幼若球を含む第2グループの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第２の染色液と混合して染色し、
（３）  （２）で染色した試料のそれぞれをフローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定し、
（４）（ｉ）  工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を分類計数し、
（ｉｉ）  工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を分類計数し、
（ｉｉｉ）前記骨髄系成熟白血球と骨髄系幼若球とから、骨髄系細胞数を算出し、
（５）  赤芽球系細胞数と骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することからなる骨髄液有核細胞自動分析方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明でいう骨髄液は、骨髄穿刺液など、骨髄系細胞、赤芽球系細胞を含む試料をいう。本発明では、骨髄液試料の前処理は特に必要としないが、骨片、血球細胞凝集などの存在により、白血球系細胞及び赤芽球系細胞の測定に障害が発生するようであれば、必要に応じて、フィルタレーションを行ってもよい。また、緩衝剤、キレート剤、抗凝固剤等を含む水溶液で希釈してもよい。ここで使用することができる緩衝剤としては、後述するような緩衝剤を使用することができる。また、キレート剤としては、ＥＤＴＡ塩等を使用することができる。抗凝固剤としては、特に限定されないが、例えば、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を使用することができる。水溶液で希釈する場合の希釈倍率は、５〜１００倍程度（容量）が適当であり、好ましくは１０〜５０倍程度である。
【０００７】
本発明では、まず、工程（１）において、骨髄液試料を２つの試料に分配し、それぞれを反応チャンバに導入する。反応チャンバは別々のものでもよいし、同一でもよい。反応チャンバ毎に異なる処理を行い、同一試料から赤芽球系細胞数および骨髄系細胞数をそれぞれ得るためである。
【０００８】
本発明では、工程（２）において、それぞれの試料を溶血処理および染色する。
工程（２）（ｉ）において、骨髄液試料に第１の溶血剤を混合する。これによって、骨髄液試料中に含有される赤血球を、後述する各種細胞成分の測定の障害とならない程度に溶解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞及び／又は脂質粒子を染色に好適な状態にすることができる。ここで、染色に好適な状態とは、各細胞膜にはダメージとならない程度の損傷を与えるが、実質的に生きた細胞と同様の機能、形状等を維持しうる状態を意味する。また、赤芽球系細胞の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ、溶血するが、赤芽球系細胞の細胞核の状態は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。白血球系細胞の細胞膜への傷害は明確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生きた細胞と顕著な差は認められず、実質的に生きた細胞と同様に保つことができる。
【０００９】
第１の溶血剤は、このような作用を示すものであれば、その組成は特に限定されない。赤血球は、若干の個体差があるが、通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、後述する各種細胞成分測定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。したがって、本発明における第１の溶血剤では、個体差を考慮して、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧であることが好ましく、３０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度がより好ましい。また、ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球系細胞及び赤芽球系細胞にも過度の障害を与えることとなり、後述する両者の間の蛍光強度の差異が得にくくなるため、酸性側、特に２．０〜５．０程度のｐＨが適当であり、より好ましくは２．５〜４．５程度である。
【００１０】
このような浸透圧及びｐＨを実現するために、第１の溶血剤は、例えば、電解質、糖類、緩衝剤等を含有する水溶液であることが好ましく、さらに、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩を含有している場合には、より効果的に（短時間に）赤血球を溶血ことができるため好ましい。また、第１の溶血剤は、界面活性剤を含むことが好ましい。電解質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が挙げられる。糖質としては、単糖類、多糖類、オリゴ糖糖が挙げられ、具体的には、グルコース、ラクトース、スクロース糖が挙げられる。緩衝剤としては、設定するｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤が挙げられ、具体的には、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロン酸等が挙げられる。有機酸又はその塩としては、例えばサリチル酸、フタル酸等又はこれらのアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等が挙げられる。これらは、緩衝剤としても作用する。
これらの濃度は、例えば、０．１〜１００ｍＭ程度が適当であり、１〜３０ｍＭ程度が好ましい。
【００１１】
第１の溶血剤中の界面活性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集防止、血小板凝集防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進等を行うことができるものであればよく、例えば、以下の界面活性剤を単独又は２種以上で使用することが好ましい。
【００１２】
式（ＶＩ）：
【化１１】
0004212827.tif 000002
（式中、Ｒ1VI、Ｒ2VI及びＲ3VIは同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ4VIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ＸVI-はアニオンである。）の化合物、
【００１３】
式（ＶＩＩ）：
【化１２】
0004212827.tif 000003
（式中、Ｒ1VIIはＣ8-18のアルキル基；ＸVII-はアニオンである。）の化合物、
【００１４】
式（ＶＩＩＩ）：
【化１３】
0004212827.tif 000004
（式中、Ｒ1VIIIおよびＲ2VIIIは同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；Ｒ3VIIIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ｎＶＩＩＩは１又は２である。）の化合物、
【００１５】
式（ＩＸ）：
Ｒ1IX−Ｒ2IX−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nIX−Ｈ      （ＩＸ）
（式中、Ｒ1IXはＣ9-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；
Ｒ2IXは式：
【化１４】
0004212827.tif 000005
で表される基または−ＣＯＯ−；ｎＩＸは１０〜４０である。）の化合物、および以下の式；
【００１６】
【化１５】
0004212827.tif 000006
【００１７】
【化１６】
0004212827.tif 000007
で表される化合物。
【００１８】
式中、Ｃ1-8のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。好ましくは、Ｃ1-3のアルキル基である。Ｃ6-8のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。
【００１９】
Ｃ8-18のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。Ｃ8-18のアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ6-18のアラルキル基としては、フェニルプロピレン、フェニルブテン、ナフチルメチレン、ナフチルエチレン、ナフチルプロピレン、ビフェニルメチレン、ビフェニルエチレン等が挙げられる。
【００２０】
また、Ｃ9-25のアルキル基としては、上記アルキル基の他、イコシル、ヘンイコシル、トコシル、トリコシル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルケニル基としては、上記アルケニル基の他、イコセニル、ヘンイコセニル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルキニル基としては、上記アルキニル基の他、イコシニル、ヘンイコシニル等が挙げられる。
アニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ4-、ＢＣｌ4-、ＢＢｒ4-等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオン又はＢＦ4-が好ましい。
上記に記載した界面活性剤のうち、ＭＥＧＡ−８からＣＨＡＰＳＯまでは株式会社同仁化学研究所より購入することができる。
【００２１】
界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類、併用する赤血球溶解剤の成分及び濃度等により適宜調整することができる。通常、界面活性剤の濃度が高すぎる場合、赤血球のみならず、白血球系細胞及び赤芽球系細胞にも過度の傷害を与え、特に赤芽球系細胞の形状を変化させ、後述する赤芽球系細胞と脂質粒子と白血球系細胞との蛍光強度の差異を小さくする問題がある。したがって、例えば、１０〜１００００ｍｇ／Ｌ程度が好ましく、１００〜５０００ｍｇ／Ｌ程度であることがより好ましく、１０００〜３０００ｍｇ／Ｌがさらに好ましい。なお、この濃度は第１溶血剤における界面活性剤の濃度である。
骨髄液試料と、第１溶血剤との混合は、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間行うことが適当である。
【００２２】
次いで、骨髄液試料を、蛍光色素で染色する。この際、少なくとも脂質粒子、白血球系細胞及び赤芽球系細胞の間に蛍光強度の差異を生じさせる蛍光色素を少なくとも１つ含む第１の染色液を用いることが必要である。このような蛍光色素は、例えば、以下の群から選択することができる。
【００２３】
式（Ｉ）：
【化１７】
0004212827.tif 000008
（式中、Ｒ1IおよびＲ2Iは同一または異なって、水素原子、水酸基で置換されていてもよい低級アルキルまたは低級アルキニル基；ＹIおよびＺIは同一または異なって、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩは０、１又は２；ＸI-はアニオンである。）の化合物、
【００２４】
式（ＩＩ）：
【化１８】
0004212827.tif 000009
（式中、Ｒ1IIは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IIおよびＲ3IIは同一または異なって、水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4IIは水素原子、アシル基または低級アルキル基；ＺIIは硫黄原子、酸素原子、または低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩＩは０、１又は２；ＸII-はアニオンである。）の化合物、
【００２５】
式（ＩＩＩ）：
【化１９】
0004212827.tif 000010
（式中、Ｒ1IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ2IIIは低級アルキル基、Ｒ3IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；ｎIIIは１又は２；ＸIII-はアニオンである。）の化合物、
【００２６】
式（ＩＶ）：
【化２０】
0004212827.tif 000011
（式中、Ｒ1IVは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IVはジメチルアミノ基；Ｒ3IVは水素原子又はアミノ基；Ｒ4IVは水素原子、低級アルキル基又はアミノ基；Ｒ5IVは水素原子又はジメチルアミノ基；ＸIV-はアニオン；ＹIVは硫黄又は酸素原子である。）の化合物、
【００２７】
式（Ｖ）：
【化２１】
0004212827.tif 000012
（式中、Ｒ1Vは水素原子又は水酸基；Ｒ2Vは水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3Vは水素原子又はスルホン酸基；ＹV+はアルカリ金属イオンである。）の化合物、および
以下の式：
【００２８】
【化２２】
0004212827.tif 000013
【００２９】
【化２３】
0004212827.tif 000014
【００３０】
【化２４】
0004212827.tif 000015
【００３１】
式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に結合するアルキル基は、炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１０、より好ましくは１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が挙げられる。
【００３２】
低級アルキル基とは炭素数１〜８の直鎖又は分岐アルキル基であり、例えば、メチル、エチル等が挙げられる。低級アルコキシル基とは炭素数１〜８の直鎖又は分岐アルコキシル基であり、例えば、メトキシ、エトキシ等が挙げられる。
低級アルキニル基とは炭素数２〜５のアルキニル基であり、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル等が挙げられる。
アシル基としては炭素数１〜３のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが挙げられる。
アニオンとしては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-などのハロゲンイオン及びＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-等が挙げられる。アルカリ金属イオンとは、リチウム、ナトリウム、カリウムイオン等が挙げられる。
【００３３】
上記に記載した色素のうちＮＫシリーズは、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、ＬＤ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販品を購入することができる。
【００３４】
蛍光色素は、第１の溶血剤による赤血球の溶解等の工程を経た後、適当な溶媒（水、低級アルコール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ等）に溶解して作用させてもよいし、また、第１の溶血剤に溶解して、これらを骨髄液試料に混合すると同時に作用（混合）させてもよい。
【００３５】
本発明の骨髄液試料を第１の溶血剤および第１の染料液と混合して染色する工程の好ましい具体的態様としては、サリチル酸などの有機酸、色素、及び界面活性剤を精製水に溶解し、ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整して得られる試薬を骨髄液試料と混合し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させるものである。
【００３６】
色素の濃度は使用する色素の種類により異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／Ｌである。なお、この濃度は骨髄液試料と、第１の溶血剤及び蛍光色素とを混合した状態での濃度である。
【００３７】
これにより、白血球系細胞は強く染色され、強い蛍光を発する。赤芽球系細胞は弱く染色され、弱い蛍光を発する。また、脂質粒子も弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球系細胞と赤芽球系細胞との蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく赤芽球系細胞の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されるからであると考えられる。
【００３８】
工程（２）（ｉｉ）において、工程（２）（ｉ）とは別に、骨髄液試料に第２の溶血剤と混合する。これによって、骨髄液試料中に含有される骨髄系幼若白血球以外の白血球を損傷させる。通常の白血球は、細胞内に不要な物質（例えば色素）を排除する物質排除機能を有している。白血球の損傷とは、通常、生きた白血球の細胞膜を通過しない色素がその細胞膜を透過可能にするような操作である。具体的には、特定の組成の溶血剤を細胞に作用させた場合、作用機序は明確ではないが、特定の細胞（例えば、正常白血球）の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出（引き抜く）することにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける。この細孔を通じて、細胞膜を透過可能にし、その結果、特定の細胞内に色素分子が入り込み染色することができる。一方、骨髄系幼若球は、色素の透過を可能とするだけの細孔があけられないために、色素で染色されない。
【００３９】
なお、本発明でいう白血球系細胞は、リンパ系白血球、骨髄系成熟白血球および骨髄系幼若球に分類される。そのうち、リンパ系白血球とは、成熟リンパ球、未成熟リンパ球、異型リンパ球のことをいう。骨髄系成熟白血球とは、成熟した単球、顆粒球のことをいう。骨髄系幼若球とは、通常骨髄に存在し、末梢血に存在しない未成熟な骨髄系白血球をいう。例えば、骨髄系芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球をいう。骨髄系芽球とは、骨髄芽球（Myeloblast）と単芽球（Monoblast）のことをいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて顆粒球系幼若球とすることもある。また骨髄系芽球と顆粒球系幼若球をまとめて骨髄系幼若球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階の細胞である、骨髄系幹細胞（CFU-GEMN）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（CFU-GM）、好酸球コロニー形成細胞（CFU-EOS）等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の骨髄系幼若球の範囲に含む。骨髄系成熟白血球と成熟リンパ球をあわせて成熟白血球とする。
【００４０】
本発明で用いる第二の溶血剤は、界面活性剤、可溶化剤、アミノ酸および緩衝液とからなるのが好ましい。
界面活性剤としては種々のものを使用することができ、たとえば、以下の式（ＸＩ）：
Ｒ1XI−Ｒ2XI−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎXI−Ｈ      （ＸＩ）
（式中、Ｒ1XIはＣ10-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；Ｒ2XIは
【化２５】
0004212827.tif 000016
または−ＣＯＯ−；ｎXIは１０〜４０である。）を有するものが挙げられる。
【００４１】
Ｃ10-25のアルキル基としては、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル等が挙げられる。Ｃ10-25のアルケニル基としては、ドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ10-25のアルキニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシニル等が挙げられる。
具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルが好適である。
【００４２】
界面活性剤の濃度については、使用するものによって異なるが、ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤の場合、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎXIの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎXIが大きくなるほど弱くなる。また、ｎXIの数が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、必要な界面活性剤濃度は実験により簡単に求めることができる。具体的には、前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテルでは、０．１〜２．０ｇ／Ｌ（好ましくは０．５〜１．５ｇ／Ｌ）、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルでは、１〜９ｇ／Ｌ（好ましくは３〜７ｇ／Ｌ）、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、５〜５０ｇ／Ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／Ｌ）の範囲で使用できる。
【００４３】
第２の溶血剤中の可溶化剤は以下のもの：
式（ＸＩＩ）：
【化２６】
0004212827.tif 000017
（式中、Ｒ1XIIはＣ10-22のアルキル基；ｎXIIは１〜５である。）
のサルコシン誘導体あるいはその塩、
【００４４】
式（ＸＩＩＩ）：
【化２７】
0004212827.tif 000018
（式中、Ｒ1XIIIは水素原子または水酸基。）
のコール酸誘導体、および
【００４５】
式（ＸＩＶ）：
【化２８】
0004212827.tif 000019
（式中、ｎXIVは５〜７である。）
メチルグルカンアミドから選択される１またはそれ以上を用いることができる。
【００４６】
C10-22のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。
具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナイノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が好適に使用できる。
【００４７】
可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／Ｌ、コール酸誘導体では、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、メチルグルカンアミドでは、１．０〜８．０ｇ／Ｌが好ましい。
その他に、可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等が使用でき、０．０１〜５０．０ｇ／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
【００４８】
第２の溶血剤中のアミノ酸としては、タンパク質を構成するアミノ酸を使用でき、グルタミン酸、バリンや、特にメチオニン、シスチン及びシステイン等のような含硫アミノ酸が好適であり、メチオニンが最も好適である。使用量は、１〜５０ｇ／Ｌの範囲で使用でき、グルタミン酸の場合は８〜１２ｇ／Ｌが好適であり、メチオニンの場合には、１６〜２４ｇ／Ｌが好適である。
【００４９】
第２の溶血剤中の緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム等のようなｐＨ調整剤を加え、必要があれば、塩化ナトリウムのような浸透圧調整剤をさらに加え、ｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇとするものが好ましい。
特に、（１）骨髄系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤；（３）骨髄系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのアミノ酸；および（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液からなる、特開平６−２７３４１３号に記載の溶血剤が好ましい。
【００５０】
本発明の第２の染色液中の、骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第1グループと、骨髄系幼若球を含む第2グループの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素は、損傷を与えた細胞又は骨髄系幼若球のうちいずれか一方を染色できるものであればよい。
損傷を与えた細胞を染色するための色素とは、細胞核、特にＤＮＡに対して特異性を有する色素あるいはＲＮＡに特異性を有する色素が挙げられる。この目的には、いくつかのカチオン性色素が好適である。
一般的にカチオン性色素は、生きた細胞の細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染色する。しかしながら、特定のカチオン性色素（例えば、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等）は、生細胞を通過せず、損傷細胞のみを染色することがよく知られている。
【００５１】
第２の染色液中の蛍光色素は、具体的には、前述のエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社より販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３等が挙げられる。さらに光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザを使用する場合に好適な色素として、式（Ｘ）：
【００５２】
【化２９】
0004212827.tif 000020
（式中、Ｒ1Xは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2X及びＲ3Xは水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4Xは水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ5Xは水素原子、置換されてもよい低級アルキル基；ＺXは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎXは１又は２；ＸX-はアニオンである。）で示される色素が使用できる。
【００５３】
上記構造式のＲ1X、Ｒ2X、Ｒ3X、Ｒ4X、Ｒ5XおよびＺXにおける低級アルキル基は、Ｃ1-6の直鎖又は分岐のアルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。
Ｒ2X及びＲ3Xにおける低級アルコキシ基は、Ｃ1-6のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。
Ｒ4Xにおけるアシル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
Ｒ5Xにおける置換されてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
ＺXとしては硫黄原子が好ましい。
ＸX-におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ4-、ＢＣｌ4-、ＢＢｒ4-等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオン又はＢＦ4-が好ましい。
【００５４】
上記色素の具体的な例としては、好ましくは以下のような色素が挙げられるが、これにより本発明が制限されるものではない。
【００５５】
【化３０】
0004212827.tif 000021
【００５６】
本発明の骨髄液試料を第２の溶血剤および第２の染料液と混合して染色する工程の好ましい具体的態様としては、色素を含む第二の溶血剤を骨髄液と混合するものである。色素を含む第二の溶血剤は、あらかじめ色素を第２の溶血剤に溶解させて調製するか、またはエチレングリコール等の水溶性有機溶媒中の色素の溶液を使用時に第二の溶血剤と混合して調製する。この場合、使用時に混合すると、色素の保存安定性を高めることができるので好ましい。色素の濃度は、使用する色素に応じて適宜決定できる。例えば、エチジウムブロマイドの場合、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌであり、０．１〜３０ｍｇ／Ｌが好ましい。
骨髄液試料と色素を含む第二の溶血剤の混合は、骨髄液試料と色素を含む第２の溶血剤の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４０℃、反応時間が５秒〜５分間で好適に実施できる。反応温度が高いときは反応時間を短くすることが好ましい。
【００５７】
工程（３）において、工程（２）（ｉ）または（ｉｉ）で調製したそれぞれの試料をフローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定する。フローサイトメータは市販のいずれのものでも使用することができる。
本発明でいう散乱光は、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好ましくは、側方散乱光が選ばれ、この散乱光は細胞の核形態などのような内部情報を反映する。
蛍光とは、前述の細胞成分を染色した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
【００５８】
工程（４）において、工程（２）（ｉ）または（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、細胞を分類計数する。
具体的には、工程（４）（ｉ）として、工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、脂質粒子、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類計数する。
「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて、脂質粒子、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類計数する」には、まず、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に側方散乱光をとってスキャッタグラムを描く。この場合、図１に示すように、赤芽球系細胞及び白血球系細胞、脂質粒子及びゴースト化した細胞の各細胞が、集団（クラスター）を形成して分布する。次いで、適当な解析ソフトを用いて、各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。これにより、脂質粒子、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を分類計数することができる。
また、赤芽球系細胞数と白血球系細胞数とから、赤芽球系細胞と白血球系細胞数との割合を算出することができる。また、白血球系細胞数と赤芽球系細胞数とを合わせることにより、骨髄有核細胞数を算出することができる。
【００５９】
工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光との強度差を用いて、赤芽球系細胞を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数することができる。赤芽球系細胞を成熟度ごとに分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャッタグラムを描き、図１に示すように、赤芽球系細胞の成熟度ごとの集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。
これにより、赤芽球系細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全赤芽球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出することができる。
白血球系細胞と赤芽球系細胞との比は、通常２：１〜５：１である。白血病などの疾患により、これらの比率は変化する。また、これらの比率は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）や骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の診断に有用である。したがって、経日的に測定することにより、各種白血病の病態把握、治療モニタリングなどが可能である。
さらに骨髄有核細胞中の赤芽球系細胞数から、骨髄中のエリスロポエーシスの状態を把握することもできる。
【００６０】
また、工程（４）（ｉｉ）として、工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を、それぞれ分類計数する。
「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を、それぞれ分類計数する」には、まず、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に側方散乱光をとってスキャッタグラムを描く。この場合、図２に示すように、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球が、集団（クラスター）を形成して分布する。次いで、適当な解析ソフトを用いて、各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。これにより、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球の数を計数することができる。
【００６１】
さらに、工程（４）（ｉｉｉ）として、前記骨髄系成熟白血球と骨髄系幼若球とを合わせることにより、骨髄系細胞数を算出することができる。
このようにして得られた赤芽球系細胞数と、骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することができる。
【００６２】
工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光との強度差を用いて、骨髄系成熟白血球を少なくとも２つに分類計数することができる。骨髄系成熟白血球を分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャッタグラムを描き、図２に示すように、単球および顆粒球の集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。
【００６３】
また、工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光との強度差を用いて、骨髄系幼若球を少なくとも２つに分類計数することができる。骨髄系幼若球を分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャッタグラムを描き、図２に示すように、骨髄系芽球および顆粒球系幼若球の集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。
【００６４】
なお、本発明の方法においては、工程（２）（ｉ）および（ｉｉ）はいずれを先に行っても同時に行ってもよく、工程（４）（ｉ）および（ｉｉ）もいずれを先に行っても同時に行ってもよい。
【００６５】
また、本発明に従えば、本発明の方法を実現するための、骨髄液試料を分配するための分配手段と、分配された骨髄液試料を試薬と反応させるための反応チャンバと、フローサイトメータと、溶血剤および／または染色液からなる試薬を反応チャンバに供給するための試薬供給手段と、反応チャンバで調製された測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入するための測定用試料導入手段とからなる骨髄液有核細胞自動分析用システムが提供される。
【００６６】
骨髄液有核細胞自動分析用システムは、概略的に図５に示すことができる。分配手段は、吸引吐出ポンプ（１）、サンプリングバルブ（２）、試料吸引ピペット（３）からなる。反応チャンバは、第１の反応チャンバ（１３）および第２の反応チャンバ（１４）からなる。フローサイトメータは、フローセル（１５）、前方（低角または高角）散乱光用検出器（１７）、側方散乱光用検出器（１８）、蛍光用検出器（１９）および解析部（２０）からなる。試薬供給手段は、第１溶血剤庫（５）、第１染料庫（６）、第２溶血剤庫（７）、第２染料庫（８）および各々にチューブを介して接続された吸引吐出ポンプ（９）〜（１２）からなる。測定用試料導入手段は、陰圧ポンプ（１６）を用いることができる。
【００６７】
具体的には、試験管４中の骨髄液試料は試料吸引ピペット（３）から吸引吐出ポンプ（１）によりチューブを介してサンプリングバルブ（２）に導入され、所定量採取される。採取された骨髄液試料は、サンプリングバルブ（２）を経て第１の反応チャンバ（１３）または第２の反応チャンバ（１４）に、吸引吐出ポンプ（９）または（１１）によりチューブを介して導入される。本発明でいうサンプリングバルブとは、セラミック等の円形状板を３枚重ねたものをいう。サンプリングバルブは、2枚の固定素子の間に挟まれた可動素子からなり、固定素子には流入用通路及び／または流出用通路が設けられ、可動素子には定量用通路が設けられている。試料は流入用通路−定量用通路−流出用通路と流れ、可動素子が回転することによって試料が定量される。また、固定素子には試薬流入用通路及び／または試薬流出用通路が設けられており、試薬が試薬流入用通路−定量用通路−試薬流出用通路と流れるように可動素子が回転する。次いで、定量された試料が試薬によって反応チャンバへ送出される。このようなサンプリングバルブは血液分析装置で使用されている。
第１の反応チャンバ（１３）には、第１溶血剤庫（５）から吸引吐出ポンプ（９）により所定量採取された第１の溶血剤がサンプリングバルブ（２）を経て骨髄液試料とともにチューブを介して導入され、該チャンバ（１３）中で骨髄液試料と混合される。その後、第１染色液庫（６）から吸引吐出ポンプ（１０）により所定量採取された第１の染色液を該チャンバ（１３）に導入して、白血球系細胞等を染色する。
このようにして得られた試料を、陰圧ポンプ（１６）などによりチューブを介して該チャンバ（１３）からフローセル（１５）に導入して、散乱光および蛍光を測定する。測定後、前方（低角または高角）散乱光用検出器（１７）、側方散乱光用検出器（１８）および蛍光用検出器（１９）で検出した散乱光および蛍光のデータを解析部（２０）で解析し、骨髄液有核細胞を分類計数する。
第２の反応チャンバ（１４）にも、上記と同様にして第２溶血剤庫（７）および第２染色剤庫（８）から導入された溶血剤および染色剤で処理して、フローセル（１５）にて測定され、得られたデータを解析部（２０）で解析し、骨髄液有核細胞を分類計数してＭ／Ｅ比を算出する。
【００６８】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６９】
実施例
以下の組成の試薬を調製した。
第１の溶血剤
サリチル酸（市販品）                                  １０ｍＭ
ＬＴＡＣ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド）（市販品）         ０．３ｇ／Ｌ
精製水                                                １Ｌ
ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧  ４０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
第１の染色液
ＮＫ−２８２５（日本感光色素研究所（株））            ０．３ｍｇ／Ｌ
（エチレングリコール溶液）
【００７０】
第２の溶血剤
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル            ２４．０ｇ／Ｌ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム                  １．５ｇ／Ｌ
ＤＬ−メチオニン                                      ２０．０ｇ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ                                            １２．０ｇ／Ｌ
１Ｎ−ＮａＯＨ                                        ０．３ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                              ４．０ｇ／Ｌ
第２の染色液
式（ＸＶ）の色素                                      ３．０ｍｇ／Ｌ
（エチレングリコール溶液）
【００７１】
試験管（４）内の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の骨髄液を試料吸引ピペット（３）用いて吸引ポンプ（１）により吸引してチューブを介してサンプリングバルブ（２）に導入し、３０μｌ(試料１)及び３３μｌ(試料２)の骨髄液を定量した。試料１は、0.98ｍｌの第1の溶血剤とともに吸引吐出ポンプ（５）により第１の反応チャンバ（１３）に導入した。試料２は、0.95mlの第2の溶血剤とともに吸引吐出ポンプ（１１）により第2の反応チャンバ（１４）に導入した。
次に第1の反応チャンバ（１３）に0.02mlの第1の染色液を吸引吐出ポンプ（１０）により添加し、４０℃で５秒間反応後、フローセル（１５）にて側方散乱光と蛍光を測定した。また、第2の反応チャンバ（１４）には、0.05ｍｌの第2の染色液を吸引吐出ポンプ（１２）により添加し、３３℃で１０秒間反応後、フローセル（１５）にて側方散乱光と蛍光を測定した。測定において、光源は、６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用し、蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。測定後、前方（低角または高角）散乱光用検出器（１７）、側方散乱光用検出器（１８）および蛍光用検出器（１９）で検出したデータを解析部（２０）で解析した。
【００７２】
図３にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとったスキャッタグラム、図４にＸ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。図３では、白血球系細胞、赤芽球系細胞StageＩ、赤芽球系細胞StageII、赤芽球系細胞StageIII、脂質粒子の５つの集団を形成する。図４では、リンパ系白血球、単球、顆粒球、顆粒球系幼若球、骨髄系芽球の５つの集団を形成する。
【００７３】
上記の骨髄液にメイグリュンワルド染色を施し、顕微鏡により目視を行った。白血球系細胞、赤芽球系細胞を分類し、赤芽球系細胞を前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類した。また、リンパ系白血球、単球、顆粒球系幼若球、骨髄系芽球を分類した。また骨髄系細胞数と赤芽球系細胞数の比を算出し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較した。
表１にフローサイトメータと目視の結果を示す。
【００７４】
【表１】
0004212827.tif 000022
【００７５】
なお、目視法において好塩基性赤芽球及び前赤芽球は０％、多染性赤芽球は１８％、正染性赤芽球は８２％であり、各々本発明による方法における赤芽球系Stage I、赤芽球系Stage II、赤芽球系Stage IIIの分類データとよく一致した。上記より、本発明と目視の結果がよく一致していることが判明した。
【００７６】
【発明の効果】
上記に示したように、本発明の方法により簡便に高い精度でＭ／Ｅ比を求めるための方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の工程（３）で測定した工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて作成したスキャッタグラム中で分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
【図２】本発明の工程（３）で測定した工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて作成したスキャッタグラム中で分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
【図３】本発明の実施例１の方法によって分類計数された各細胞のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の実施例１の方法によって分類計数された各細胞のスキャッタグラムである。
【図５】本発明のシステムを示す概略図である。
【符号の説明】
１  吸引吐出ポンプ
２  サンプリングバルブ
３  試料吸引ピペット
４  試験管
５  第１溶血剤庫
６  第１染色液庫
７  第２溶血剤庫
８  第２染色液庫
９  吸引吐出ポンプ
１０  吸引吐出ポンプ
１１  吸引吐出ポンプ
１２  吸引吐出ポンプ
１３  第１の反応チャンバ
１４  第２の反応チャンバ
１５  フローセル
１６  陰圧ポンプ
１７  前方（低角または高角）散乱光用検出器
１８  側方散乱光用検出器
１９  蛍光用検出器
２０  解析部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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